Brevet FR3146146A1 — publié le 20240830

Plasmide comprenant les gènes menF , menD , menH , menB , menC et menE . Figure pour l’abrégé : Fig. 1 Production d’acide 1-4-dihydroxy-2-naphtoïque par Escherichia coli L’invention concerne le domaine technique de la production fermentaire. Plus précisément, l’invention concerne le domaine technique de la production fermentaire par l’utilisation d’une bactérie Escherichia coli modifiée, d’acide 1,4-dihydroxy-2-naphtoïque. Dans le cadre de la présente description, un intervalle décrit par l’expression « entre […] et […] » comprend les bornes. Par exemple, l’intervalle « entre 1 et 2 » comprend les deux valeurs « 1 » et « 2 » ainsi que l’ensemble des valeurs étant à la fois strictement supérieures à 1 et strictement inférieures à 2. Dans le cadre de la présente description, le terme « environ » précédent une valeur numérique signifie que la valeur peut être modifiée de plus ou moins 10%. Dans le cas particulier d'une valeur numérique étant une borne d'intervalle, le terme « environ » signifie que la borne basse peut être réduite de 10% ou la borne haute peut être augmentée de 10%. Il est également possible de supprimer le terme « environ » précédent une valeur numérique. L’acide 1,4-dihydroxy-2-naphtoïque, également appelé DHNA, CAS 31519-22-9, est un composé d’intérêt, appartenant à la famille des quinones. Ce composé favorise la prolifération de bactéries de genre Bifidobacterium . Il a également une application thérapeutique potentielle pour le traitement du psoriasis. Il s’agit d’un probiotique réputé antiinflammatoire, mais également un intermédiaire pour la synthèse d’autres composés à valeur ajoutée entrant par exemple dans la composition de colorants capillaires. Il existe ainsi un intérêt certain à son obtention aux fins de son utilisation dans le cadre de différents procédés et/ou produits. La bactérie Escherichia coli , également appelé colibacille et pouvant être abrégé en E. coli , et une bactérie qui se trouve principalement dans les intestins des mammifères. Chez l’Homme, elle compose environ 80 % de la flore intestinale aérobie. La voie du shikimate est une voie métabolique donnant lieu à la biosynthèse de nombreux composés d’intérêt, dont certains acides aminés. Elle est présente notamment chez certaines bactéries, chez certains champignons et chez certaines algues, mais est absente chez les animaux. Si cette voie métabolique est globalement commune aux organismes qui l'utilisent, chacun d'entre eux la met en œuvre d'une manière particulière, de sorte qu’il en existe, en réalité, de nombreuses variantes. Le DHNA est naturellement produit en petites quantités par la bactérie Escherichia coli dans la biosynthèse de la ménaquinone, en tant qu’intermédiaire de biosynthèse de la ménaquinone, au sein de la voie du shikimate. De manière générale, la production de molécules chimiques au niveau industriel peut s’avérer être complexe, et/ou avoir des conséquences négatives sur l’environnement. S’agissant de la synthèse chimique, évidemment, elle n’est pas sans conséquences sur l’environnement, et elle ne conduit pas à une molécule susceptible d’être qualifiée de naturelle, notamment d’un point de vue réglementaire, au contraire de la molécule obtenue par synthèse bactérienne. L’élaboration de procédés naturels alternatifs aux synthèses chimiques est difficile, notamment s’agissant de procédés de fermentation, car il est nécessaire dans ce cas de transformer des organismes afin de faire évoluer leur fonctionnement, toujours complexe, dans le sens d’une production de molécules d’intérêt particulières. Dans ce cadre, la maitrise d’un procédé de synthèse fermentaire de DHNA simple à mettre en œuvre et efficace est particulièrement stratégique. Dans ce contexte, un certain nombre de démarches ont été entreprises dans l’art antérieur, sans toutefois donner lieu à l’élaboration d’une synthèse par voie fermentaire de DHNA simple à mettre en œuvre et efficace. Par exemple, dans l’art antérieur, de nombreuses méthodes de production de DHNA au moyen de bactéries anaérobies sont divulguées. C’est ainsi que dans la publication Furuichi, Keisuke, Ken-ichi Hojo, Yoshio Katakura, Kazuaki Ninomiya, et Suteaki Shioya. « Aerobic Culture of Propionibacterium Freudenreichii ET-3 Can Increase Production Ratio of 1,4-Dihydroxy-2-Naphthoic Acid to Menaquinone. », Journal of Bioscience and Bioengineering 101, no 6 (juin 2006): 464-70, il est divulgué que certaines cultures de bactéries anaérobies Propionebacterium freudenreichii ET-3 peuvent présenter de forte production de DHNA et de ménaquinone. Il y est précisé qu’en présence d’oxygène, les bactéries peuvent utiliser le propionate pour synthétiser du DHNA, mais que l’oxygène empêche le développement des bactéries et oxyde le DHNA à terme. Globalement, cette publication dissuade l’homme du métier de produire du DHNA en présence d’oxygène, quel que soit le procédé employé. De plus, ce procédé apparait immédiatement à l’homme du métier comme étant relativement complexe. Par ailleurs, dans la publication Furuichi, Keisuke, Atsuko Amano, Yoshio Katakura, Kazuaki Ninomiya, et Suteaki Shioya. « Optimal Aerobic Cultivation Method for 1,4-Dihydroxy-2-Naphthoic Acid Production by Propionibacterium Freudenreichii ET-3 . », Journal of Bioscience and Bioengineering 102, no 3 (septembre 2006): 198-205, il est divulgué une optimisation de la culture de bactéries anaérobies Propionebacterium freudenreichii ET-3 dans des conditions d’anaérobie puis aérobie, aux fins de la production de DHNA. Une des conclusions tirées est qu’il est opportun de prévoir plusieurs cycles anaérobie-aérobie, notamment trois cycles anaérobie-aérobie. Ce procédé apparait immédiatement à l’homme du métier comme étant relativement complexe. Par ailleurs, dans la publication Furuichi, Keisuke, Yoshio Katakura, Kazuaki Ninomiya, et Suteaki Shioya. « Enhancement of 1,4-Dihydroxy-2-Naphthoic Acid Production by Propionibacterium Freudenreichii ET-3 Fed-Batch Culture. », Applied and Environmental Microbiology 73, no 10 (mai 2007): 3137-43, il est divulgué qu’une culture de bactéries anaérobies Propionebacterium freudenreichii ET-3 peut donner lieu à la production d’une grande quantité de DHNA, notamment en combinant des étapes anaérobies avec supplémentation et aérobies. Ce procédé apparait immédiatement à l’homme du métier comme étant relativement complexe. Dans ces trois publications, il n’est pas question de changer de microorganisme dans le cadre de la production de DHNA, malgré les difficultés d’adaptations des procédés. Elles dissuadent en particulier l’homme du métier d’employer des bactéries différentes de Propionebacterium freudenreichii ET-3 , et en particulier des bactéries aérobies, du fait de l’absence de stabilité du DHNA en présence d’oxygène. Également, dans l’art antérieur, des bactéries anaérobies ont été utilisées pour la production de diverses molécules d’intérêt. C’est ainsi que dans la publication Navone, Laura, Tim McCubbin, Ricardo A. Gonzalez-Garcia, Lars K. Nielsen, et Esteban Marcellin. « Genome-scale model guided design of Propionibacterium for enhanced propionic acid production ». Metabolic Engineering Communications 6 (24 novembre 2017): 1-12, il est divulgué plusieurs stratégies d’ingénierie génétique pour l’amélioration de la production d’acide propionique par voie fermentaire avec utilisation de bactéries Propionebacterium . Par ailleurs, dans la publication Wang, Zhongqiang, Meng Lin, Liqun Wang, Ehab M. Ammar, et Shang-Tian Yang. « Metabolic Engineering of Propionibacterium Freudenreichii Subsp. Shermanii for Enhanced Propionic Acid Fermentation: Effects of Overexpressing Three Biotin-Dependent Carboxylases », Process Biochemistry 50, no 2 (1 février 2015): 194-204, il est divulgué une investigation concernant les bactéries Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii DSM 4902 dans le cadre de la production d’acide propionique. Deux enzymes, à savoir la méthylmalonyl-CoA décarboxylase et la méthylmalonyl-CoA carboxyltransférase sont considérées comme étant susceptibles de provoquer une augmentation significative des flux métaboliques en faveur de la biosynthèse de l’acide propionique. Par ailleurs, dans la publication Wang, Zhongqiang, Ehab M. Ammar, An Zhang, Liqun Wang, Meng Lin, et Shang-Tian Yang. « Engineering Propionibacterium Freudenreichii Subsp. Shermanii for Enhanced Propionic Acid Fermentation: Effects of Overexpressing Propionyl-CoA:Succinate CoA Transferase », Metabolic Engineering 27 (1 janvier 2015): 46-56, il est divulgué une investigation concernant la bactérie Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii DSM 4902 dans le cadre de la production d’acide propionique, au terme de laquelle il est mis en évidence que la surexpression de l’enzyme succinate CoA transférase augmente la production d’acide propionique. Également, dans l’art antérieur, des bactéries aérobies ont été utilisées pour la production de molécules d’intérêt. C’est ainsi que dans la demande WO08089102 au nom de REGENTS OF THE UNIVERSITY OF COLORADO, il est divulgué une méthode de production fermentaire d’acide 3-hydroxypropionique par des bactéries Escherichia coli . Cette production est réalisée au moyen d’une modulation de la voie du shikimate. Plus de 30 gènes correspondants à cette voie sont mentionnés dans la demande, par exemple en de ladite demande WO08089102. Également, dans l’art antérieur, les quinones ont été abondamment étudiées. C’est ainsi que dans la publication Alvarez, Adrián F., Claudia Rodriguez, et Dimitris Georgellis. « Ubiquinone and Menaquinone Electron Carriers Represent the Yin and Yang in the Redox Regulation of the ArcB Sensor Kinase ». Journal of Bacteriology, 3 mai 2013, il est divulgué un lien existant entre les quinones et le système Arc. Par ailleurs, dans la demande WO2012162496 au nom de NORTHEASTERN UNIVERSITY, il est divulgué des milieux de culture contenant des quinones susceptibles d’être produites par des microorganismes. Également, dans l’art antérieur, la voie de biosynthèse de la ménaquinone chez Escherichia coli a fait l’objet de nombreuses investigations. C’est ainsi que dans la publication Chen, Minjiao, Xinyu Ma, Xiaolei Chen, Ming Jiang, Haigang Song, et Zhihong Guo. « Identification of a Hotdog Fold Thioesterase Involved in the Biosynthesis of Menaquinone in Escherichia Coli », Journal of Bacteriology 195, no 12 (juin 2013) 2768-75, il est divulgué que la principale enzyme impliquée dans la conversion du DHNA-CoA au DHNA semble être la DHNA-CoA thioestérase YdiI (gène nouvellement appelé MenI ). Cette publication incite l’homme du métier à particulièrement considérer le gène MenI en tant que gène influençant potentiellement la production de DHNA. Par ailleurs, dans la publication Jun, Daniel, Tomas Richardson-Sanchez, Amita Mahey, Michael E. P. Murphy, Rachel C. Fernandez, et J. Thomas Beatty. « Introduction of the Menaquinone Biosynthetic Pathway into Rhodobacter sphaeroides and de Novo Synthesis of Menaquinone for Incorporation into Heterologously Expressed Integral Membrane Proteins », ACS Synthetic Biology 9, no 5 (15 mai 2020): 1190-1200, il est divulgué que la synthèse de ménaquinone chez Escherichia coli est réalisée sous la dépendance de neuf gènes : menF , menD , menH , menC , menE , menB , menI , menA et ubiE . Un plasmide comprenant ces gènes issus d’ Escherichia coli est transformé dans une bactérie d’espèce Rhodobacter sphaeroides , aux fins de la production de ménaquinone. Cette publication dissuade l’homme du métier d’employer directement la bactérie Escherichia coli dans le cadre d’une potentielle production fermentaire de DHNA. Par ailleurs, dans la publication Sharma, V., M. E. Hudspeth, et R. Meganathan. « Menaquinone (Vitamin K2) Biosynthesis: Localization and Characterization of the MenE Gene from Escherichia Coli », Gene 168, no 1 (2 février 1996): 43-48, il est divulgué une investigation à propos du gène menE de la bactérie Escherichia coli , au terme de laquelle il est établi que ce gène code pour la o-succinylbenzoate-CoA ligase. Cette publication incite l’homme du métier à particulièrement considérer le gène menE aux dépends d’autres gènes. Par ailleurs, dans la demande KR20200122006 au nom de GENOFOCUS, il est divulgué une méthode de production fermentaire de ménaquinone-7 au moyen d’un microorganisme recombinant. Enfin, dans la demande KR20130043382 au nom de AJOU UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION, il est divulgué une méthode de production fermentaire de ménaquinone-8 au moyen d’un microorganisme recombinant. Également, dans l’art antérieur, certaines investigations concernant des bactéries anaérobies peuvent être notées. C’est ainsi que dans la publication McCubbin, Tim, R. Axayacatl Gonzalez-Garcia, Robin W. Palfreyman, Chris Stowers, Lars K. Nielsen, et Esteban Marcellin. « A Pan-Genome Guided Metabolic Network Reconstruction of Five Propionibacterium Species Reveals Extensive Metabolic Diversity », Genes 11, no 10 (23 septembre 2020), il est divulgué des investigations globales concernant les espèces de genre Propionebacterium . Il y est précisé que l’oxydation du lactate peut être facilitée par une lactate déshydrogénase qui dépend de la ménaquinone chez Propionebacterium propionicum . Également, dans l’art antérieur, des bactéries Escherichia coli ont été utilisées aux fins de production d’une protéine recombinante. C’est ainsi que dans la demande WO2013148249 au nom de GENENTECH, INC., il est divulgué une bactérie Escherichia coli utilisée dans une méthode pour la production d’une protéine recombinante. Globalement, il découle de ce qui précède que la voie du shikimate est relativement complexe, et a fait l’objet d’un grand nombre d’investigations chez différentes espèces, notamment des bactéries. Également, cette voie est caractérisée par l’intervention de dizaines de gènes. Une des conclusions que l’on peut tirer est qu’actuellement, le DHNA n’est synthétisé que chimiquement ou par des bactéries anaérobies difficiles à cultiver ( Propionibacterium notamment). De plus, le rendement est faible. Par ailleurs, la synthèse chimique de DHNA ne conduit pas à une molécule qualifiée de « naturelle », au contraire de la synthèse bactérienne. Il existe un besoin de disposer de synthèse de quinones, et notamment de DHNA, par voie bactérienne fermentaire, dans des conditions scientifiques, économiques et d’ergonomie appropriées. De manière surprenante, il a été mis en évidence par la demanderesse qu’une telle synthèse par voie fermentaire pouvait être mise en place. L’invention concerne ainsi un plasmide comprenant les gènes menF , menD , menH , menB , menC et menE . Dans un mode de réalisation, le plasmide est choisi dans le groupe constitué de pET-3(a-c), pET-5(a-c), pET-9(a-d), pET-11(a-d), pET-12(a-c), pET-14b, pET-15b, pET-16b, pET-17b, pET-19b, pET-20b(+), pET-21a-d(+), pET-22b(+), pET-23a-d(+), pET-24a-d(+), pET-25b(+), pET-26b(+), pET-27b(+), pET-28a-c(+), pET-29a-c(+), pET-30a-c(+), pET-31b(+), pET-32a-c(+), pET-33b(+), pET-34b(+), pET-35b(+), pET-36b(+), pET-37b(+), pET-38b(+), pET-39b(+), pET-40b(+), pET-41a-c(+), pET-42a-c(+), pUC18, pUC19, pUC57 (Thermofischer), pBBR1MCS (Kovach et al., 1995), pBAD (tous les plasmides de l'article Guzman et al., 1995), pACYC184, pBR322, pUC57-amp, pCR2.1-TOPO, pGEM-T Easy, pBluescript II SK, pRS415, pRS416, pET28b, pET30a, pET32a, pET45b, pET46b, pET47b, pET48b, pQE30, pQE80, pACYCDuet-1, pETDuet-1, pGEX-4T, pGEX-6P, pMAL-c2x et pMAL-p2x. Dans un mode de réalisation, le plasmide est choisi dans le groupe constitué de pET-3(a-c), pET-5(a-c), pET-9(a-d), pET-11(a-d), pET-12(a-c), pET-14b, pET-15b, pET-16b, pET-17b, pET-19b, pET-20b(+), pET-21a-d(+), pET-22b(+), pET-23a-d(+), pET-24a-d(+), pET-25b(+), pET-26b(+), pET-27b(+), pET-28a-c(+), pET-29a-c(+), pET-30a-c(+), pET-31b(+), pET-32a-c(+), pET-33b(+), pET-34b(+), pET-35b(+), pET-36b(+), pET-37b(+), pET-38b(+), pET-39b(+), pET-40b(+), pET-41a-c(+), pET-42a-c(+), pUC18, pUC19, pUC57 (Thermofischer), pBBR1MCS (Kovach et al., 1995), pBAD (tous les plasmides de l'article Guzman et al., 1995) et pACYC184. Dans un mode de réalisation, ledit plasmide est un plasmide choisi dans le groupe constitué des plasmides pET-28a-c(+). Dans un mode de réalisation, ledit plasmide est un plasmide pET-28b(+) vendu par la société Novagen sous la référence 69865 et comprenant lesdits gènes. Le plasmide pET-28b(+) est connu de l’art antérieur. La carte de ce plasmide pET-28b(+)_pT7_menFDHBCE incluant les gènes menF , menD , menH , menB et menE est donnée en . Dans un mode de réalisation, les gènes menF , menD , menH , menB et menE sont clonés dans le plasmide pET-28b(+) vendu par la société Novagen sous la référence 69865. Dans un mode de réalisation, ledit plasmide est de type pET-28b(+). Dans un mode de réalisation, lesdits gènes sont compris au sein de l’opéron menFDHBCE . Dans un mode de réalisation, le plasmide exprime lesdits gènes. Dans un mode de réalisation, le plasmide exprime lesdits gènes, sous le contrôle d’un promoteur. Dans un mode de réalisation, ledit promoteur est un promoteur fort. Dans un mode de réalisation, le promoteur est choisi dans le groupe constitué de pT7, pTrc, PlacUV5, PxylS/pm, ParaBAD, PrhaBAD, Ptet, Ptac, PbAD, Pveg, PPhoA, P1, P43, PBCS, PT7lacO, P26s, PompF et PrpsJ. Dans un mode de réalisation, le promoteur est choisi dans le groupe constitué de pT7, pTrc, PlacUV5, PxylS/pm, ParaBAD, PrhaBAD, Ptet et Ptac. Dans un mode de réalisation préféré, il s’agit du promoteur T7. Ce promoteur est particulièrement indiqué, car il s’agit d’un promoteur fort particulièrement adéquat. Autrement formulé, il permet une forte expression des gènes menF , menD , menH , menB , menC et menE . Dans un mode de réalisation, ledit plasmide est caractérisé en ce qu’il exprime lesdits gènes menF , menD , menH , menB , menC et menE sous le contrôle dudit promoteur. Dans un mode de réalisation, ledit plasmide est non intégratif. L’invention concerne également une souche de bactérie comprenant un plasmide selon l’invention. L’invention concerne également une souche de bactérie transformée par le plasmide selon l’invention. Dans un mode de réalisation, ladite souche est choisie dans le groupe constitué des bactéries aérobies. Dans un mode de réalisation, ladite souche est choisie dans le groupe constitué des Protéobactéries et des Cyanobactéries. Dans un mode de réalisation, ladite souche est une Protéobactérie, de préférence appartenant à la famille des Entérobactéries. Dans un mode de réalisation, ladite souche est une Entérobactérie, de préférence choisie dans le groupe constitué des genres Escherichia , Salmonella et Citrobacter . Dans un mode de réalisation, ladite souche de bactérie est aérobie. Ce mode de réalisation est particulièrement préféré, car ces souches sont plus simples à manipuler, et les procédés correspondants sont moins complexes à mettre en œuvre. Dans un mode de réalisation, ladite souche est de genre Escherichia . Dans un mode de réalisation, ladite souche est d’espèce Escherichia coli . Dans un mode de réalisation, ladite souche est d’espèce Escherichia coli DE3. Dans un mode de réalisation, la souche est choisie dans le groupe constitué d’ Escherichia coli BELT21 (par exemple vendue par la société BGene Genetics), BL21(DE3) (par exemple vendue par la société Novagen), BL21(DE3)pLys, HMS174(DE3) (par exemple vendue par la société Novagen), Lemo21(DE3) (par exemple vendue par la société New England BioLabs), NiCo21(DE3) (par exemple vendue par la société New England BioLabs), NovaBlue(DE3) (par exemple vendue par la société Novagen) et de Pseudomonas putida KT2440 (DE3) (Liang et al.). Dans un mode de réalisation, la souche est choisie dans le groupe constitué d’ Escherichia coli BELT21 (par exemple vendue par la société BGene Genetics), BL21(DE3) (par exemple vendue par la société Novagen), BL21(DE3)pLys, HMS174(DE3) (par exemple vendue par la société Novagen), Lemo21(DE3) (par exemple vendue par la société New England BioLabs), NiCo21(DE3) (par exemple vendue par la société New England BioLabs) et NovaBlue(DE3) (par exemple vendue par la société Novagen).. Dans un mode de réalisation, la souche est Pseudomonas putida KT2440 (DE3) (Liang et al.). Dans un mode de réalisation, ladite souche est d’espèce Escherichia coli permettant l’expression de gènes sous le contrôle du promoteur T7. Dans un mode de réalisation, ladite souche est d’espèce Escherichia coli BELT21. Cette espèce est particulièrement préférée car elle permet l’expression de gènes sous le contrôle du promoteur T7, inductible à l’isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). Dans un mode de réalisation, ladite souche est d’espèce Escherichia coli surexprimant l’ARN polymérase T7. Dans un mode de réalisation, ladite souche d’espèce Escherichia coli surexprimant l’ARN polymérase T7 est Escherichia coli BELT21. Dans un mode de réalisation, le plasmide est compris dans ladite souche dans une quantité comprise entre environ 2 et environ 60 copies par cellule, de préférence entre environ 5 et environ 40 copies par cellule, de préférence entre environ 10 et environ 30 copies par cellule, de préférence entre environ 15 et environ 20 copies par cellule. Dans un mode de réalisation, ladite souche de bactérie est modifiée au moins en ce qu’elle présente une sous-expression ou non-expression chromosomique du gène menA . Dans un mode de réalisation, ladite souche de bactérie est modifiée au moins en ce qu’elle présente une non-expression chromosomique du gène menA . Ce mode de réalisation est préféré, car il permet une diminution de la consommation de DHNA. Dans un mode de réalisation, la non-expression est due à une suppression du gène menA . Dans un mode de réalisation, ladite souche de bactérie est modifiée au moins en ce qu’elle présente une surexpression chromosomique des gènes menF , menD , menH , menB , menC et menE . Dans un mode de réalisation, ladite souche de bactérie est modifiée au moins en ce qu’elle présente une surexpression chromosomique des gènes menF , menD , menH , menB , menC et menE sous le contrôle d’un promoteur choisi dans le groupe constitué de pT7, pTrc, PlacUV5, PxylS/pm, ParaBAD, PrhaBAD, Ptet, Ptac, PbAD, Pveg, PPhoA, P1, P43, PBCS, PT7lacO, P26s, PompF et PrpsJ. Dans un mode de réalisation, le promoteur est choisi dans le groupe constitué de pT7, pTrc, PlacUV5, PxylS/pm, ParaBAD, PrhaBAD, Ptet et Ptac. Dans un mode de réalisation, le promoteur est pTrc. Ce promoteur est préféré. Dans un mode de réalisation, ladite souche de bactérie est modifiée au moins en ce qu’elle présente une surexpression chromosomique des gènes menF , menD , menH , menB , menC et menE. Dans un mode de réalisation, ladite souche de bactérie est modifiée au moins en ce qu’elle présente une surexpression chromosomique des gènes menF , menD , menH , menB , menC et menE sous le contrôle d’un promoteur fort, de préférence le promoteur ptrc. Dans un mode de réalisation, cette surexpression est due à la substitution du promoteur natif par le promoteur ptrc. Dans un mode de réalisation, cette surexpression est due à la présence promoteur ptrc, sous le contrôle duquel les gènes chromosomiques menF , menD , menH , menB , menC et menE sont exprimés. Dans un mode de réalisation, ladite souche de bactérie est modifiée au moins en ce qu’elle présente une surexpression chromosomique du gène aroL . Dans un mode de réalisation, ladite souche de bactérie est modifiée au moins en ce qu’elle présente une surexpression chromosomique du gène aroL sous le contrôle d’un promoteur choisi dans le groupe constitué de pT7, pTrc, PlacUV5, PxylS/pm, ParaBAD, PrhaBAD, Ptet, Ptac, PbAD, Pveg, PPhoA, P1, P43, PBCS, PT7lacO, P26s, PompF et PrpsJ. Dans un mode de réalisation, le promoteur est choisi dans le groupe constitué de pT7, pTrc, PlacUV5, PxylS/pm, ParaBAD, PrhaBAD, Ptet et Ptac. Dans un mode de réalisation, le promoteur est pT7. Ce promoteur est préféré. Dans un mode de réalisation, ladite souche de bactérie est modifiée au moins en ce qu’elle présente une surexpression chromosomique du gène aroL sous le contrôle d’un promoteur fort, de préférence le promoteur T7. Dans un mode de réalisation, ladite souche de bactérie est modifiée au moins en ce qu’elle contient une copie additionnelle du gène aroL sous contrôle du promoteur T7, de préférence au sein du locus chromosomique ybfP. Dans un mode de réalisation, ladite souche de bactérie est modifiée au moins en ce qu’elle présente une sous-expression chromosomique ou une non-expression chromosomique du gène ubiC . Dans un mode de réalisation, ladite souche de bactérie est modifiée au moins en ce qu’elle présente une sous-expression chromosomique ou une non-expression chromosomique du gène ubiC par ajout de plusieurs thymines devant le codon d'initiation ATG. Dans un mode de réalisation, ladite souche de bactérie est modifiée au moins en ce qu’elle présente une sous-expression chromosomique ou une non-expression chromosomique du gène ubiC par ajout de deux thymines devant le codon d'initiation ATG. Dans un mode de réalisation, ladite sous-expression chromosomique du gène ubiC est réalisée au moyen de l’ajout de quatre thymines devant le codon d'initiation ATG. Dans un mode de réalisation, ladite souche de bactérie est modifiée : - selon un des modes de réalisation concernant les gènes menF , menD , menH , menB , menC et menE présentés ci-avant ; et - selon un des modes de réalisation concernant le gène aroL présentés ci-avant ; et - selon un des modes de réalisation concernant le gène ubiC présentés ci-avant. Dans un mode de réalisation préféré, ladite souche de bactérie est de préférence aérobie, de préférence de genre Escherichia , de préférence d’espèce Escherichia coli , de préférence Escherichia coli BELT21 , caractérisée en ce : - qu’elle est transformée par la présence d’un plasmide exprimant les gènes menF , menD , menH , menB , menC et menE , de préférence sous le contrôle du promoteur T7 ; - de préférence, elle présente une surexpression chromosomique des gènes menF , menD , menH , menB , menC et menE , de préférence sous le contrôle d’un promoteur fort, de préférence le promoteur ptrc ; - de préférence, elle présente une sous-expression chromosomique ou une non-expression chromosomique du gène menA , de préférence une non-expression chromosomique, de préférence une non-expression chromosomique due à une suppression ; - de préférence, elle présente une surexpression chromosomique du gène aroL , de préférence par ajout d’une copie du gène aroL sous contrôle d’un promoteur, de préférence le promoteur T7, de préférence au sein du locus chromosomique ybfP ; - de préférence, elle présente une sous-expression chromosomique du gène ubiC , de préférence par ajout de plusieurs thymines devant le codon d'initiation ATG, de préférence par ajout de 4 thymines devant le codon d’initiation ATG. Dans un mode de réalisation préféré, ladite souche de bactérie est de préférence aérobie, de préférence de genre Escherichia , de préférence d’espèce Escherichia coli , de préférence Escherichia coli BELT21, caractérisée en ce : - qu’elle est transformée par la présence d’un plasmide exprimant les gènes menF , menD , menH , menB , menC et menE , de préférence sous le contrôle du promoteur T7 ; - de préférence, elle présente une surexpression chromosomique des gènes menF , menD , menH , menB , menC et menE , de préférence sous le contrôle d’un promoteur fort, de préférence le promoteur ptrc ; - de préférence, elle présente une sous-expression chromosomique ou une non-expression chromosomique du gène menA , de préférence une non-expression chromosomique, de préférence une non-expression chromosomique due à une suppression ; - de préférence, elle présente une surexpression chromosomique du gène aroL , de préférence par ajout d’une copie du gène aroL sous contrôle d’un promoteur, de préférence le promoteur T7, de préférence au sein du locus chromosomique ybfP. Dans un mode de réalisation ladite souche présente : - une surexpression chromosomique des gènes menF , menD , menH , menB , menC et menE ; - une surexpression chromosomique du gène aroL . Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, ladite souche de bactérie est de préférence aérobie, de préférence de genre Escherichia , de préférence d’espèce Escherichia coli , de préférence Escherichia coli BELT21 , caractérisée en ce : - qu’elle est transformée par la présence d’un plasmide exprimant les gènes menF , menD , menH , menB , menC et menE , de préférence sous le contrôle du promoteur T7 ; - de préférence, elle présente une surexpression chromosomique des gènes menF , menD , menH , menB , menC et menE , de préférence sous le contrôle d’un promoteur fort, de préférence le promoteur ptrc ; - de préférence, elle présente une surexpression chromosomique du gène aroL , de préférence par ajout d’une copie du gène aroL sous contrôle d’un promoteur, de préférence le promoteur T7, de préférence au sein du locus chromosomique ybfP. L’invention concerne également un procédé de production de DHNA, comprenant les étapes suivantes : – mise en préculture d’une souche de bactérie selon l’invention ; – mise en culture de ladite souche de bactérie pendant une durée comprise entre environ 1 minute et environ 10 heures ; – récupération du DHNA. Dans un mode de réalisation, la mise en préculture est réalisée en conditions aérobies. Dans un mode de réalisation, la mise en culture est réalisée en conditions aérobies. Dans un mode de réalisation, la mise en préculture et la mise en culture sont réalisées en conditions aérobies. Ce mode de réalisation est préféré car il permet de disposer d’un procédé simplifié et efficace. Dans un mode de réalisation, ladite mise en culture a une durée comprise entre environ 30 minutes et environ 8 heures. Dans un mode de réalisation, ladite mise en culture a une durée comprise entre environ 1 heure et environ 7 heures. Dans un mode de réalisation, ladite mise en culture a une durée comprise entre environ 2 heures et environ 6 heures. Dans un mode de réalisation, ladite mise en culture a une durée comprise entre environ 2 heures et environ 5 heures. Dans un mode de réalisation, ladite mise en culture a une durée comprise entre environ 3 heures et environ 4 heures. Ce mode de réalisation est préféré, car il permet une production importante de DHNA, sans toutefois qu’une grande partie de ce dernier ne soit dégradée. Dans un mode de réalisation, la mise en culture est réalisée en milieu M9. Dans un mode de réalisation, la mise en culture est réalisée en milieu comprenant entre environ 2 et environ 30 grammes par litre de glucose. Dans un mode de réalisation, la mise en culture est réalisée en milieu comprenant environ 20 grammes par litre de glucose. Dans un mode de réalisation, la mise en culture est réalisée en milieu comprenant environ 10 grammes par litre de glucose. Dans un mode de réalisation, la mise en culture est réalisée en milieu comprenant environ 5 grammes par litre de glucose. Dans un mode de réalisation, la mise en culture est réalisée en milieu M9 comprenant environ 5 grammes par litre de glucose. Dans un mode de réalisation, la mise en culture est réalisée à une température comprise entre environ 20°C et environ 40°C, de préférence comprise entre environ 25°C et environ 35°C, de préférence environ 30°C. Dans un mode de réalisation, la mise en culture est réalisée en milieu M9 comprenant 5 grammes par litre de glucose et incubée à une température comprise entre environ 20°C et environ 40°C, de préférence comprise entre environ 25°C et environ 35°C, de préférence environ 30°C. Dans un mode de réalisation, ladite récupération du DHNA comprend une étape de lyse de la souche. Dans un mode de réalisation, ladite récupération du DHNA est réalisée par une lyse de la souche suivie d’une purification du DHNA. Exemple 1 : Préparation des plasmides Les plasmides sont préparés par la méthode de Gibson Assembly (Gibson et al., 2009). Cette méthode utilise une réaction enzymatique pour assembler des fragments d'ADN et produire un plasmide circulaire. Après la réaction de Gibson, le produit est transformé dans des bactéries Escherichia coli NEB10β vendues par la société New England BioLabs (NEB). Les bactéries Escherichia coli NEB10β transformées sont ensuite étalées sur un milieu gélosé contenant un antibiotique pour sélectionner les colonies contenant effectivement le plasmide recombinant. Les colonies ainsi obtenues sont vérifiées par PCR et séquencées pour confirmer l'intégrité de la construction du plasmide. Exemple 2 : Exemple 2.1 : Mesure de la concentration de DHNA Dans le présent exemple, la concentration en DHNA a été mesurée par chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP), selon la méthode suivante, qui a été validée avec un standard de DHNA : Méthode Kinetex Evo Colornat Colonne Kinetex Evo Solvants / Phase mobile 60% d’acide trifluoroacétique à 0,1% 40% d’acétonitrile Température four 55°C Débit de pompe 1 millilitre par minute Volume d’injection 10 µm Temps d’analyse 30 minutes Détecteur utilisé UV (détecteur à barrettes de diodes) 220 nm UV (détecteur à barrettes de diodes) 254 nm Tableau 1 : Méthode de CLHP détectée Exemple 2.2 : Culture des souches Les souches sont mises en préculture à 37°C en milieu Lysogeny Broth (LB) durant une nuit. Ensuite, les souches sont remises en culture à une DO600 de 0,1 en milieu M9 comprenant 5 grammes par litre de glucose, et incubées à 30°C. Le milieu M9 utilisé est le suivant : - chlorure de calcium (CaCl2) (5 µL d'une solution 1 M) ; - sulfate de magnésium (MgSO4) (100 µL d'une solution 1 M) ; - eau osmosée stérile (38,595 mL) ; - M9 5x (M9 sigma, M6030-1KG) (10 mL) ; - glucose à 20 grammes par litre (12,5 mL) ; - d'ATB (50 µL). Lorsque la DO600 est comprise entre 0.7 et 0.8, 1 mM d’IPTG est ajouté et la culture est poursuivie à 30°C. Après 3h et 24h de culture, des prélèvements sont réalisés pour doser le DHNA selon la méthode décrite en Exemple 2.1. Exemple 2.3 : Souches concernées et résultats Tout d’abord, des souches d’ Escherichia coli BELT21 ont été transformées par le plasmide réplicatif pET-28b(+)_pT7_men FDHBCE exprimant l’opéron menFDHBCE sous le contrôle du promoteur T7. La préparation de ce plasmide a été décrite au sein de l’Exemple 1 de la présente description. La carte de ce plasmide est également donnée en . Sur ces souches d’ Escherichia coli BELT21 transformées par le plasmide, des modifications chromosomiques ont pu être, en outre, effectuées, selon les modalités suivantes : Référence Modification(s) effectuée(s) Concentration en DHNA au bout de 3 heures de culture (en µM) / Concentration en DHNA au bout de 24 heures de culture (en µM) Plasmide pET-28b(+)_pT7_menFDHBCE Plasmide pET-28b(+) exprimant l’opéron menFDHBCE sous le contrôle du promoteur T7 31 / 0 PlasmidepET-28b(+)_pT7_menFDHBCE + Δ menA Plasmide pET-28b(+) exprimant l’opéron menFDHBCE sous le contrôle du promoteur T7 Suppression du gène menA 17 / 0 PlasmidepET-28b(+)_pT7_menFDHBCE + ybfp::pT7_aroL Plasmide pET-28b(+) exprimant l’opéron menFDHBCE sous le contrôle du promoteur T7 Ajout d’une copie du gène aroL sous contrôle du promoteur T7 au sein du locus chromosomique ybfP 19 / 0 PlasmidepET-28b(+)_pT7_menFDHBCE + Δ menA + ybfp::pT7_aroL Plasmide pET-28b(+) exprimant l’opéron menFDHBCE sous le contrôle du promoteur T7 Suppression du gène menA Ajout d’une copie du gène aroL sous contrôle du promoteur T7 au sein du locus chromosomique ybfP 29 / 0 PlasmidepET-28b(+)_pT7_menFDHBCE + Δ menA + ybfp::pT7_aroL + DownUbiC Plasmide pET-28b(+) exprimant l’opéron menFDHBCE sous le contrôle du promoteur T7 Suppression du gène menA Ajout d’une copie du gène aroL sous contrôle du promoteur T7 au sein du locus chromosomique ybfP Sous-expression du gène ubiC au moyen de l’ajout de deux thymines devant le codon d'initiation ATG 27 / 0 PlasmidepET-28b(+)_pT7_menFDHBCE + Δ menA + ybfp::pT7_aroL + DownUbiC Plus forte Plasmide pET-28b(+) exprimant l’opéron menFDHBCE sous le contrôle du promoteur T7 Suppression du gène menA Ajout d’une copie du gène aroL sous contrôle du promoteur T7 au sein du locus chromosomique ybfP Sous-expression du gène ubiC au moyen de l’ajout de quatre thymines devant le codon d'initiation ATG 36 / 0 PlasmidepET-28b(+)_pT7_menFDHBCE + Δ menA + PmenFDHBCE::pTRC Plasmide pET-28b(+) exprimant l’opéron menFDHBCE sous le contrôle du promoteur T7 Suppression du gène menA Surexpression de l’opéron menFDHBCE par utilisation du promoteur ptrc 22 / 0 PlasmidepET-28b(+)_pT7_menFDHBCE + Δ menA + PmenFDHBCE::pTRC + ybfp::pT7_aroL Plasmide pET-28b(+) exprimant l’opéron menFDHBCE sous le contrôle du promoteur T7 Suppression du gène menA Surexpression de l’opéron menFDHBCE par utilisation du promoteur ptrc Ajout d’une copie du gène aroL sous contrôle du promoteur T7 au sein du locus chromosomique ybfP 61 / 0 PlasmidepET-28b(+)_pT7_menFDHBCE + Δ menA + PmenFDHBCE::pTRC + ybfp::pT7_aroL + DownUbiC Plasmide pET-28b(+) exprimant l’opéron menFDHBCE sous le contrôle du promoteur T7 Suppression du gène menA Surexpression de l’opéron menFDHBCE par utilisation du promoteur ptrc Ajout d’une copie du gène aroL sous contrôle du promoteur T7 au sein du locus chromosomique ybfP Sous-expression du gène ubiC au moyen de l’ajout de deux thymines devant le codon d'initiation ATG 35 / 0 PlasmidepET-28b(+)_pT7_menFDHBCE + Δ menA + PmenFDHBCE::pTRC + ybfp::pT7_aroL + DownUbiC Plus forte Plasmide pET-28b(+) exprimant l’opéron menFDHBCE sous le contrôle du promoteur T7 Suppression du gène menA Surexpression de l’opéron menFDHBCE par utilisation du promoteur ptrc Ajout d’une copie du gène aroL sous contrôle du promoteur T7 au sein du locus chromosomique ybfP Sous-expression du gène ubiC au moyen de l’ajout de quatre thymines devant le codon d'initiation ATG 62 / 0 Tableau 2 : Souches testées Bien entendu, parmi ces souches modifiées d’ Escherichia coli BELT21, plus la concentration en DHNA est forte, plus la souche correspondante est préférée. Par ailleurs, des souches d’ Escherichia coli BELT21 modifiées de la même manière que décrit précédemment, mais sans présence de plasmide, ont été étudiées quant à leur production de DHNA. Aucune production de DHNA n’a pu être mesurée, que ce soit à 3 heures de culture ou à 24 heures de culture. Il en résulte que la présence du plasmide est indispensable. Enfin, des manipulations complémentaires s’agissant des souches produisant du DHNA ont mis en évidence que la durée idéale de culture est comprise entre 3 heures et 4 heures. Des cultures d’une telle durée permettent une récupération optimale de DHNA. Plasmide choisi dans le groupe constitué des plasmides de type pET28b, pET-3(a-c), pET-5(a-c), pET-9(a-d), pET-11(a-d), pET-12(a-c), pET-14b, pET-15b, pET-16b, pET-17b, pET-19b, pET-20b(+), pET-21a-d(+), pET-22b(+), pET-23a-d(+), pET-24a-d(+), pET-25b(+), pET-26b(+), pET-27b(+), pET-28a-c(+), pET-29a-c(+), pET-30a-c(+), pET-31b(+), pET-32a-c(+), pET-33b(+), pET-34b(+), pET-35b(+), pET-36b(+), pET-37b(+), pET-38b(+), pET-39b(+), pET-40b(+), pET-41a-c(+), pET-42a-c(+), pUC18, pUC19, pUC57, pBBR1MCS, pBAD, pACYC184, pBR322, pUC57-amp, pCR2.1-TOPO, pGEM-T Easy, pBluescript II SK, pRS415, pRS416, pET30a, pET32a, pET45b, pET46b, pET47b, pET48b, pQE30, pQE80, pACYCDuet-1, pETDuet-1, pGEX-4T, pGEX-6P, pMAL-c2x et pMAL-p2x , ledit plasmide comprenant les gènes menF , menD , menH , menB , menC et menE . Plasmide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu’il exprime lesdits gènes menF , menD , menH , menB , menC et menE sous le contrôle d’un promoteur choisi dans le groupe constitué de pT7, pTrc, PlacUV5, PxylS/pm, ParaBAD, PrhaBAD, Ptet, Ptac, PbAD, Pveg, PPhoA, P1, P43, PBCS, PT7lacO, P26s, PompF et PrpsJ . Souche de bactérie comprenant un plasmide selon l’une quelconque des revendications précédentes. Souche selon la revendication 3, caractérisée en ce qu’elle est choisie dans le groupe constitué des bactéries aérobies, de préférence choisie dans le groupe constitué des Protéobactéries et des Cyanobactéries . Souche selon l’une quelconque des revendications 3 à 4, caractérisée en ce que ladite souche est de genre Escherichia. Souche selon l’une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisée en ce qu’elle présente une surexpression chromosomique des gènes menF , menD , menH , menB , menC et menE sous le contrôle d’un promoteur choisi dans le groupe constitué de pTrc, pT7, PlacUV5, PxylS/pm, ParaBAD, PrhaBAD, Ptet, Ptac, PbAD, Pveg, PPhoA, P1, P43, PBCS, PT7lacO, P26s, PompF et PrpsJ . Souche selon l’une quelconque des revendications 3 à 6, caractérisée en ce qu’elle présente : - une surexpression chromosomique des gènes menF , menD , menH , menB , menC et menE sous le contrôle d’un promoteur choisi dans le groupe constitué de pTrc, pT7, PlacUV5, PxylS/pm, ParaBAD, PrhaBAD, Ptet, Ptac, PbAD, Pveg, PPhoA, P1, P43, PBCS, PT7lacO, P26s, PompF et PrpsJ ; - une surexpression chromosomique du gène aroL sous le contrôle d’un promoteur choisi dans le groupe constitué de pT7, pTrc, PlacUV5, PxylS/pm, ParaBAD, PrhaBAD, Ptet, Ptac, PbAD, Pveg, PPhoA, P1, P43, PBCS, PT7lacO, P26s, PompF et PrpsJ . Procédé de production de DHNA, comprenant les étapes suivantes : - mise en préculture d’une souche de bactérie selon l’une quelconque des revendications 3 à 7 ; - mise en culture de ladite souche de bactérie pendant une durée comprise entre 1 minute et 10 heures ; - récupération du DHNA. Procédé de culture selon la revendication 8, caractérisé en ce que la mise en culture est réalisée en milieu M9.