Brevet FR3148478A1 — publié le 20241108

L’invention concerne un procédé pour le diagnostic in vitro d’une maladie neurodégénérative, chez un individu humain ou animal, et un procédé de criblage d’un médicament pour traiter une maladie neurodégénérative, lesdits procédés comprenant l’étape qui consiste à détecter la présence d’au moins un marqueur choisi parmi les peptides béta-amyloïdes (Aβ), les formes dérivées desdits peptides, les protéines tau phosphorylées et les formes dérivées desdites protéines, dans un échantillon de selles dudit individu. PROCEDE POUR LE DIAGNOSTIC IN VITRO D’UNE MALADIE NEURODEGENERATIVE La présente invention concerne la détection de maladies neurodégénératives (MND), et plus précisément la détection de ces maladies à un stade précoce. Par maladie neurodégénérative, on entend une maladie chronique progressive qui affecte le système nerveux et entraine des troubles irréversibles d’ordre cognitif, comportemental, sensoriel et moteur. La maladie d’Alzheimer est la forme la plus fréquente de démence chez l’individu humain, elle représente de 60 à 70% des cas de démence, viennent ensuite la maladie de Parkinson au second rang, puis des maladies comme la maladie de Charcot, la maladie de Huntington. Elles sont toutes caractérisées par une perte progressive de la fonction des neurones et par un facteur de risque majeur, le vieillissement. Plusieurs maladies neurodégénératives et en particulier les maladies précitées, sont classées dans les protéinopathies, en ce qu’elles sont associées à la présence de protéines sous une forme anormalement agrégée et/ou mal repliée dont l’accumulation dans le cerveau entraîne une toxicité. Appartiennent à ce groupe de pathologies, les tauopathies qui ont en commun une accumulation anormale de protéines tau sous forme d’amas et qui partagent des similitudes cliniques et pathologiques. L’invention se rapporte au diagnostic de telles maladies et particulièrement celles associées à au moins l’une des protéines beta amyloïde et tau. La présente invention est décrite en référence aux tauopathies, en particulier à la maladie d’Alzheimer, mais elle n’y est pas limitée et s’étend à toutes les MND répondant à la définition ci-dessus. La maladie d'Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative incurable qui débute par une longue phase asymptomatique et qui est caractérisée par un déclin progressif des capacités cognitives accompagné d'une perte neuronale et synaptique. Il n’existe actuellement aucun traitement curatif de la maladie d’Alzheimer et l'échec des dernières stratégies thérapeutiques résulte en grande partie d’un diagnostic trop tardif de la maladie alors que les premiers signes caractéristiques sont déjà visibles. Le diagnostic de la MA a pourtant considérablement évolué ces dernières années avec la mise en évidence de la présence concomitante de deux types de lésions cérébrales, caractéristiques de la maladie : des dépôts extracellulaires de peptides amyloïdes (Aβ), en particulier d’Aβ42, désignés par plaques amyloïdes ou plaques séniles, et des dépôts intraneuronaux de protéines tau hyperphosphorylées (P-tau), associés à une dégénérescence neurofibrillaire (DNF). Ainsi, à ce jour, la détection de la MA repose sur des tests neuropsychologiques, le dosage des peptides amyloïdes et des protéines tau hyperphosphorylées dans le liquide céphalorachidien (LCR), les imageries morphologiques (IRM) et la technologie de tomographie par émission de positons (TEP) pour détecter les traceurs fonctionnels (TEP au fluorodésoxyglucose radioactif ou 18 FDG) ou moléculaires (TEP-amyloïde et TEP-tau). La détection des marqueurs de la MA, Aβ et tau, est effectuée dans le LCR car il contient des protéines provenant du cerveau, mais la collecte du LCR peut être difficile en fonction de l'âge et de l'état de santé du patient car elle nécessite une ponction lombaire, une procédure invasive. L’intérêt de ces marqueurs réside dans leur utilisation synergique pour affiner le diagnostic positif et commencer à apporter des informations de pronostic au patient. Cependant, même s’ils sont très sensibles et spécifiques pour le diagnostic positif et pour détecter les lésions physiopathologiques dès le stade de la plainte de mémoire ou de troubles cognitifs mineurs, bien avant le déclin cognitif et la perte d’autonomie, le diagnostic intervient à la phase clinique de la MA, alors qu’elle est précédée d’une phase préclinique de l’ordre de 20 ans, voire plus, au cours de laquelle aucun ou seulement des symptômes subtils de la maladie sont observés. L’identification de marqueurs dans cette phase précoce de la maladie permettrait : 1) de retarder l'apparition de la maladie ou même de prévenir la démence de la MA ; en effet, les traitements actuels peuvent seulement contribuer à améliorer les symptômes cliniques, mais ne peuvent pas retarder ou inverser la progression de la MA ; 2) une intervention plus en amont de stratégies thérapeutiques qui pourraient avoir une meilleure efficacité ; et 3) un suivi systématique des patients et de l’efficacité des traitements. Des études ont été menées sur la détection d’une signature moléculaire de la MA dans un fluide corporel comme le sang ou la salive, qui peut être collecté de manière peu invasive. S’agissant du marqueur Aβ, celui-ci est produit dans le cerveau et se retrouve effectivement présent dans le plasma sanguin. Toutefois, il est aussi produit dans les plaquettes et les tissus périphériques, complexifiant sa distinction, dans le plasma, entre l’Aβ provenant du cerveau et celui produit. De plus, les concentrations plasmatiques d’Aβ42 sont au moins 100 fois plus faibles que dans le LCR (typiquement, de l'ordre de quelques pg/ml) et sont diluées par la concentration élevée des autres composants protéiques non spécifiques. Enfin, les peptides Aβ plasmatiques, en raison de leur nature hydrophobe, ont tendance à se lier aux érythrocytes et à d'autres protéines plasmatiques ce qui est susceptible d’entraîner un masquage des épitopes et alors empêcher la détection des peptides. Quant au marqueur P-tau, sécrété dans le LCR, il est aussi présent dans le plasma sanguin. Un test semi-sensible pour ce marqueur phosphorylé sur la thréonine 181 (similaire au test LCR le plus utilisé) avec détection par électrochimioluminescence a été a été mis au point. Ce test a permis de mettre en évidence que la concentration plasmatique de P-tau était plus élevée chez les patients atteints de démence Alzheimer que chez les témoins (2 à 4 fois). Cette augmentation apparaît dans la phase précoce (préclinique) de la maladie, mais peut aussi surgir dans d’autres circonstances de façon épisodique comme les lésions cérébrales hypoxiques aiguës dans le cas d'une commotion cérébrale et pendant une anesthésie, ce qui a conduit à écarter ce test. D’autres protéines candidates dans le sang ont été trouvées par l'approche protéomique (Kitamura Y. et al., Plasma protein profiling for potential biomarkers in the early diagnosis of Alzheimer’s disease, Neurological Research. Taylor & Francis, 39(3), pp231-238, (2017) mais elles n’ont pas permis d’obtenir des résultats satisfaisants. A ce jour, il existe toujours un crucial besoin d’identifier des marqueurs viables pour la MA, qui suivent la progression de la maladie dans le temps et dont les concentrations peuvent changer en réponse à un traitement de la maladie. Il a été découvert, de manière surprenante, qu’une signature moléculaire viable et fiable de la MA est présente dans les selles d’un humain ou d’un animal. Ces marqueurs sont les peptides béta-amyloïdes (Aβ) et les protéines tau phosphorylées (P-tau) et leurs formes dérivées respectives, dont les variations permettent de caractériser un stade précoce de maladie neurodégénérative de type protéinopathie telle qu’une tauopathie, et notamment la maladie d’Alzheimer. Ainsi l’invention concerne un procédé pour le diagnostic in vitro d’une maladie neurodégénérative, chez un individu humain ou animal, comprenant l’étape qui consiste à détecter la présence d’au moins un marqueur choisi parmi les peptides béta-amyloïdes (Aβ), les formes dérivées desdits peptides, les protéines tau phosphorylées (P-tau) et les formes dérivées desdites protéines, dans un échantillon de selles dudit individu. Selon une mise en œuvre du procédé de l’invention, la maladie neurodégénérative est une tauopathie, et on détecte la présence d’au moins un marqueur choisi parmi les protéines tau phosphorylées et leurs formes dérivées, dans un échantillon de selles dudit individu. Selon une autre mise en œuvre du procédé de l’invention, la présence d’au moins un marqueur choisi parmi les peptides béta-amyloïdes et leurs formes dérivées, et d’au moins un marqueur choisi parmi les protéines tau phosphorylées et leurs formes dérivées, est déterminée. Dans tous les objets de l’invention décrits dans le présent texte, l’expression « au moins un marqueur choisi parmi les peptides béta-amyloïdes (Aβ), les formes dérivées desdits peptides, les protéines tau phosphorylées (P-tau) et les formes dérivées desdites protéines », il convient de comprendre que ledit objet implique un ou plusieurs marqueurs choisis indifféremment parmi les peptides béta-amyloïdes (Aβ), les formes dérivées desdits peptides, les protéines tau phosphorylées (P-tau) et les formes dérivées desdites protéines. Lorsqu’il implique plusieurs marqueurs, toute combinaison de ceux-ci peut être envisagée. La détection dans les selles de ces marqueurs qui présente l’avantage d’être moins invasive et moins coûteuse que leur détection dans le LCR, est en outre reproductible et sensible. De manière inattendue, elle se révèle spécifique pour le diagnostic précoce d’une MA, voire en mesure de révéler des sujets à risque de développer une MA. De plus, les biomarqueurs analysés à l’issue du prélèvement se sont montrés stables dans le temps et leur concentration ne varie pas jusqu’à 7 jours post-prélèvement indiquant qu’il y a peu voire aucune dégradation du prélèvement durant cette période. La présente invention apporte une réelle contribution au diagnostic des maladies neurodégénératives, telles que la maladie d’Alzheimer. Comme évoqué précédemment, les peptides béta-amyloïdes (Aβ) et les protéines tau phosphorylées sont un groupe de molécules connues et bien identifiées. Leurs définitions sont rappelées ci-dessous. On entend par peptide béta-amyloïde (Aβ), une structure de 38 à 42 acides aminés issue du clivage enzymatique de la protéine précurseur de l’amyloïde (PPA) impliquant des enzymes de type beta- ou gamma-sécrétase. Le gène codant pour cette protéine est situé sur le chromosome 21. Le peptide béta-amyloïde qui est soluble a la capacité de s’oligomériser pour donner des oligomères de différentes tailles et de s’agréger pour former des plaques amyloïdes fibrillaires qui sont insolubles. Ainsi, par forme dérivée du peptide béta-amyloïde, on entend les oligomères du peptide béta-amyloïde quelle que soit leur taille, et les formes agrégées fibrillaires (Chen, Gf., et al. Amyloid beta: structure, biology and structure-based therapeutic development. Acta Pharmacol Sin 38 , 1205–1235 (2017). Il doit être observé que, selon une mise en œuvre particulière de l’invention, à savoir une détection par DotBlot, ces différentes conformations peuvent être distinguées. C’est un atout supplémentaire pour l’invention, car les formes oligomériques, qui ne sont pas encore agrégées, sont les plus toxiques. Dans la définition de forme dérivée du peptide Aβ, entre aussi les peptides modifiés résultant d’une ou de modifications post-traductionnelles tels qu’un peptide Aβ tronqué. La protéine tau est une protéine codée par le gène de la protéine tau associée aux microtubules (MAPT) sur le chromosome 17 humain et est décrite dans Xia et al. Molecular Neurodegeneration 16, 37 (2021). C’est une protéine hydrosoluble, elle présente environ 80 sites potentiels de phosphorylation, sur les acides aminés sérine et thréonine. Chez un individu sain, certains de ces sites sont phosphorylés dans les conditions physiologiques, mais dans certaines conditions pathologiques, et en particulier dans les MND, la protéine est fortement phosphorylée (désignée par P-tau, protéine tau phosphorylée ou protéine tau hyperphosphorylée). Selon l’invention, on entend par protéine tau phosphorylée, une phosphorylation anormale de certains sites clés préalablement identifiés de la protéine tau. Par forme dérivée de la protéine tau phosphorylée, on comprend les formes hyperphosphorylées que l’on retrouve sur les sites pathologiques, des protéines tau agrégées et des protéines modifiées résultant d’une ou de modifications post-traductionnelles telles qu’une protéine tau tronquée. Les formes dérivées du peptide Aβ ou de la protéine tau résultant de modification(s) post-traductionnelle(s) sont une notion connue de l’homme du métier. A titre d’exemples, il peut se référer aux articles suivants : Carroll T, Guha S, Nehrke K and Johnson GVW ; Tau Post-Translational Modifications: Potentiators of Selective Vulnerability in Sporadic Alzheimer’s Disease. Biology 2021, 10, 1047 ; Alquezar C, Arya S et Kao AW ; Tau Post-translational Modifications: Dynamic Transformers of Tau Function, Degradation, and Aggregation. Front. Neurol. 2021, 11:595532 ; et Barykin EP, Mitkevich VA, Kozin SA et Makarov AA ; Amyloid β Modification: A Key to the Sporadic Alzheimer’s Disease? Front. Genet. 2017, 8:58. Le peptide Aβ et la protéine tau sont des entités hydrosolubles ; comme indiqué précédemment, elles tendent à former des oligomères qui, en augmentant de taille, deviennent de moins en moins hydrosolubles pour évoluer vers des agrégats qui sont insolubles en milieu aqueux. En tant que marqueur choisi parmi les peptides béta-amyloïdes (Aβ) et les protéines tau phosphorylées (P-tau), ainsi que leurs formes dérivées respectives, on entend qu’ils sont à l’état libre, ou dans un état combiné à une ou d’autres entités telles que d’autres protéines/peptides, n’empêchant pas leur détection. Selon une mise en œuvre préférentielle de chacun des procédés, kit et utilisations de l’invention, on détecte au moins un marqueur choisi parmi les peptides béta-amyloïdes et leurs formes dérivées, et au moins un marqueur choisi parmi les protéines tau phosphorylées et leurs formes dérivées. Par stade précoce selon l’invention, on entend un stade auquel les symptômes légers de démence ne sont pas encore apparus ou apparaissent, sans qu’un lien direct n’ait été établi avec une maladie neurodégénérative. A titre d’exemples, il peut correspondre au stade auquel les premiers troubles mnésiques sont détectés ou auquel d’autres troubles sont observés notamment lors de campagnes de dépistage telles qu’elles sont mises en place à partir de 50 ans pour des cancers. Dans une variante, le procédé de l’invention comprend les étapes suivantes : on met en contact ledit échantillon de selles dudit individu en présence d’au moins un anticorps ou partie d’anticorps reconnaissant spécifiquement au moins l’un desdits marqueurs, dans des conditions permettant la formation d’un complexe entre ledit anticorps ou partie d’anticorps et ledit marqueur, et on détecte la présence d’un dit complexe, le cas échéant, la présence d’un dit complexe déterminant l’atteinte de l’individu par une maladie neurodégénérative. Selon une variante de l’invention, ce procédé permet le diagnostic in vitro de la maladie d’Alzheimer, chez un individu. Comme dit précédemment, un des intérêts de l’invention est d’obtenir un diagnostic précoce. En cela, l’individu testé peut être asymptomatique ou présenter quelques troubles cognitifs mineurs qui peuvent ne pas être directement associés à une MND. L’invention concerne aussi un procédé de suivi de l’état d’un individu humain ou animal suspecté d’être atteint d’une maladie neurodégénérative, comprenant les étapes suivantes : on met en contact un premier échantillon de selles dudit individu en présence d’au moins un anticorps ou partie d’anticorps reconnaissant spécifiquement au moins un marqueur choisi parmi les peptides béta-amyloïdes, les formes dérivées desdits peptides, les protéines tau phosphorylées et les formes dérivées desdites protéines, dans des conditions permettant la formation d’un complexe entre ledit anticorps ou partie d’anticorps et ledit marqueur, on mesure la teneur d’un dit complexe dans le premier échantillon, puis on met en contact un second échantillon de selles dudit individu, ledit second échantillon étant prélevé après le premier échantillon, en présence dudit anticorps ou partie d’anticorps, dans des conditions permettant la formation d’un complexe entre ledit anticorps ou partie d’anticorps et ledit marqueur, on mesure la teneur d’un dit complexe dans le second échantillon, une variation entre les teneurs dudit complexe dans le premier échantillon et dans le second échantillon, indiquant une progression de la maladie ou une régression de la maladie. Dans une variante de ce procédé, l’anticorps ou partie d’anticorps reconnait spécifiquement au moins un peptide béta-amyloïde ou une forme dérivée d’un peptide béta-amyloïde et forme avec celui-ci un complexe, et une teneur dudit complexe dans le second échantillon supérieure à la teneur de ce même complexe dans le premier échantillon indique une progression de la maladie, à un stade précoce, ou une teneur dudit complexe dans le second échantillon inférieure à la teneur de ce même complexe dans le premier échantillon indique une régression de la maladie. Selon une autre variante d’un procédé de suivi de l’état d’un individu, qui peut être combinée à la ou une précédente, l’anticorps ou partie d’anticorps reconnait spécifiquement au moins une protéine tau phosphorylée soluble ou une forme dérivée d’une protéine tau phosphorylée et forme avec celle-ci un complexe, et une teneur dudit complexe dans le second échantillon supérieure à la teneur de ce même complexe dans le premier échantillon indique une progression de la maladie, à un stade précoce, ou une teneur dudit complexe dans le second échantillon inférieure à la teneur de ce même complexe dans le premier échantillon indique une régression de la maladie. Le procédé de suivi de l’état d’un individu humain ou animal suspecté d’être atteint d’une maladie neurodégénérative tel que présenté ci-dessus s’inscrit préférentiellement à un stade précoce de la maladie jusqu’à un stade où l’individu présente des troubles qui viennent d’être associés à une MND, par opposition à un stade tardif de la maladie. Il a effectivement été observé qu’à un stade tardif de la maladie, un individu peut subir des altérations de l’élimination des plaques, ce qui se traduit par une diminution de la teneur en marqueurs de l’invention dans les selles, ce qui, à ce stade, ne doit pas être interprétée comme une régression de la maladie. L’une quelconque des variantes d’un procédé de suivi ci-dessus peut être mise en œuvre sur un échantillon de selles d’un individu traité pour ladite maladie, permettant notamment d’évaluer l’efficacité du traitement. Ainsi, l’invention a aussi pour objet un procédé de criblage d’un médicament pour traiter une maladie neurodégénérative, chez un individu suspecté d’être atteint d’une telle maladie, comprenant les étapes suivantes : on met en contact un premier échantillon de selles dudit individu en présence d’au moins un anticorps ou partie d’anticorps reconnaissant spécifiquement au moins un marqueur choisi parmi les peptides béta-amyloïdes, les formes dérivées desdits peptides, les protéines tau phosphorylées et les formes dérivées desdites protéines, dans des conditions permettant la formation d’un complexe entre ledit anticorps ou partie d’anticorps et ledit marqueur, on mesure la teneur d’un dit complexe dans le premier échantillon, puis on met en contact un second échantillon de selles dudit individu, ledit second échantillon étant prélevé après le premier échantillon, en présence dudit anticorps ou partie d’anticorps, dans des conditions permettant la formation d’un complexe entre ledit anticorps ou partie d’anticorps et ledit marqueur, on mesure la teneur d’un dit complexe dans le second échantillon, une variation entre les teneurs dudit complexe dans le premier échantillon et dudit complexe dans le second échantillon, indiquant l’efficacité ou l’inefficacité dudit médicament. Dans une variante de ce procédé, l’anticorps ou partie d’anticorps reconnait spécifiquement au moins un peptide béta-amyloïde ou une forme dérivée d’un peptide béta-amyloïde et forme un complexe avec celui-ci, et la teneur dudit complexe dans le second échantillon inférieure à la teneur de ce complexe dans le premier échantillon indique une efficacité du médicament. Dans une autre variante du procédé, qui peut être combinée à la ou une variante ci-dessus, l’anticorps ou partie d’anticorps reconnait spécifiquement au moins une protéine tau phosphorylée ou une forme dérivée d’une protéine tau phosphorylée soluble et forme un complexe avec celle-ci, et une teneur dudit complexe dans le second échantillon inférieure à la teneur de ce complexe dans le premier échantillon indique une efficacité du médicament. La durée séparant le prélèvement du premier et du second échantillons sera variable selon le procédé mis en œuvre. Ainsi dans un procédé de suivi de l’état d’un individu ayant un traitement thérapeutique, cette durée pourra être courte et le procédé répété plus fréquemment que dans un procédé pour le diagnostic. Néanmoins, le procédé étant non invasif, il est envisageable de multiplier les prélèvements pour un suivi individualisé et rapproché. L’invention se rapporte en outre à un kit pour la détection in vitro d’une maladie neurodégénérative, au stade précoce, d’un individu humain ou animal, comprenant au moins un anticorps ou partie d’anticorps reconnaissant spécifiquement au moins un marqueur choisi parmi les peptides béta-amyloïdes (Aβ), les formes dérivées desdits peptides, les protéines tau phosphorylées et les formes dérivées desdites protéines, et les moyens permettant l’extraction, à partir d’un échantillon de selles dudit individu, d’au moins un marqueur choisi parmi les peptides béta-amyloïdes (Aβ), les formes dérivées, les protéines tau phosphorylées et les formes dérivées desdites protéines, et la formation d’un complexe entre ledit anticorps ou partie d’anticorps et ledit marqueur, L’invention a également pour objet l’utilisation d’un marqueur choisi parmi les peptides béta-amyloïdes, les formes dérivées desdits peptides, les protéines tau phosphorylées et les formes dérivées desdites protéines, pour le diagnostic in vitro d’une maladie neurodégénérative, chez un individu, ledit marqueur étant détecté dans les selles dudit individu. Selon une utilisation de l’invention le diagnostic est effectué à un stade précoce de la maladie. En particulier, elle est destinée pour le diagnostic in vitro de la maladie d’Alzheimer. La présente invention est illustrée dans l’exemple qui suit et à l’appui des figures selon lesquelles : et représentent la quantité, déterminée par analyse densitométrique et exprimée en intensité relative, des peptides amyloïdes oligomériques toxiques (E22P), des peptides amyloïdes préfibrillaires (OC) et des protéines P-tau (Tau-P Thr181 , Tau-P Thr205 ) d’une fraction de peptides et protéines solubles et d’une fraction de peptides et protéines insolubles , extraites de fèces de souris sauvages (WT) et de souris transgéniques de la MA (APP/PS1-21), en fonction du temps exprimé en mois :à 1 mois, Fig. 1A et Fig. 2A ; à 4 mois, Fig. 1B et Fig. 2B ; à 6 mois, Fig. 1C et Fig. 2C ; à 9 mois, Fig. 1D et Fig. 2D. Exemple Dans un modèle de souris transgénique (TG) de la maladie d’Alzheimer (MA) (souris APP/PS1-21), la progression temporelle (de 1 à 9 mois) de la MA a été suivie respectivement dans les selles, dans le cerveau et dans les intestins. 1) Suivi dans les selles Des fèces de souris de type sauvage (WT) et de souris APP/PS1 ont été collectées et les protéines de ces échantillons ont été extraites. Mode opératoire 1.1) Récupération des selles Les souris sont installées dans une cage propre pendant deux heures au bout desquelles les crottes sont ramassées et comptées avant d’être congelées à -80°C. Puis les échantillons sont décongelés, 5-6 crottes (100 mg) sont transférées dans un tube et placées toute la nuit dans un incubateur à 56°C pour y être déshydratées. Le matériel sec est pesé à nouveau afin de déterminer le % en eau qui reflète en partie le fonctionnement intestinal. 1.2) Extraction protéique Les selles desséchées sont reprises dans 1 ml de tampon RIPA (50 mM Tris-HCl pH8, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% sodium désoxycholate et 0,1% SDS) contenant un cocktail d’inhibiteurs de protéases et de phosphatases. L’homogénat est incubé 10 minutes sur glace avant d’être soumis à 5 cycles de sonication dans les conditions suivantes : 10 secondes de sonication (Amplitude 45) + 10 secondes dans la glace. L’homogénat est ensuite centrifugé 10 minutes à 4°C à 14 000 tours/minutes. Le surnageant est récupéré dans un tube propre. Il contient les protéines solubles. Le culot est re-suspendu dans 1 mL de tampon 5M guanidine HCl / 50 mM Tris-HCl pH 8 contenant un cocktail d’inhibiteurs de protéases et phosphatases. L’homogénat est à nouveau soumis à 5 cycles de sonication dans les conditions suivantes : 10 secondes de sonication (Amplitude 45) + 10 secondes dans la glace. L’homogénat est ensuite centrifugé 10 minutes à 4°C à 14 000 tours/minute. Le surnageant est récupéré dans un tube propre. Il contient les protéines insolubles. Le contenu en protéines de chacune des fractions est déterminé en utilisant le kit de dosage protéique BCA (Pierce™). 1.3) Analyse des fractions par DotBlot Dix µg de protéines sont absorbés par capillarité sur une membrane de nitrocellulose (appareil Biorad) et traités pour une analyse DotBlot avec des anticorps anti-peptide amyloïde oligomérique toxique (Aβo, E22P), anti-peptide amyloïde fibrillaire (Aβ-F, OC) et anti-Tau phosphorylé sur Thréonine 181 (pTau Thr181 ) ou Thréonine 205 (pTau Thr205 ). La normalisation des résultats est réalisée à l’aide d’un anticorps anti-GAPDH ou une coloration à l’amido-black pour la fraction soluble ou après coloration au Rouge Ponceau pour la fraction insoluble. 2) Suivi dans le cerveau et dans les intestins Les protéines et les peptides sont récupérés des différents tissus et organes Mode opératoire 2.1) Dissection Aux différents âges étudiés, les souris sont sacrifiées par dislocation cervicale. Les cerveaux et les intestins de souris de type sauvage (WT) et de souris APP/PS1 sont collectés. Le cerveau est extrait de la boîte crânienne et disséqué afin de séparer le cortex et l’hippocampe. Les intestins sont récupérés et compartimentés comme suit : duodénum, jéjunum, iléum et colon. Ces échantillons sont séparés en 2 lots avant d’être congelés (dans l’azote liquide puis conservés à -80°C, dans l’OCT) : - un des lots va servir à une analyse microscopique après préparation de coupe de 30 µm) - l’autre lot va être utilisé pour des expériences biochimiques (Western Blot) ou de biologie moléculaire (QPCR). 2.2) Extraction protéique Les échantillons d’intestins et de cerveaux sont repris dans 1 ml de tampon RIPA (50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% sodium désoxycholate et 0,1% SDS) contenant un cocktail d’inhibiteurs de protéases et phosphatases. Les tissus sont broyés grâce à un programme automatisé sur broyeur Milteny. L’homogénat est ensuite centrifugé 10 minutes à 4°C à 2 500 tours/minute. Le surnageant est récupéré dans un tube propre. Il contient les protéines. Le contenu en protéines de chacune des fractions est déterminé en utilisant le kit de dosage protéique BCA (Pierce™). 2.3) Analyse des lysats par Western Blot Quinze µg de protéines sont mises à migrer sur gel de polyacrylamide SDS-PAGE (BioRad) à 100 volts pendant une heure et 30 minutes. Le gel est ensuite électrotransféré sur une membrane de polyfluorure de vinylidène (BioRad) et traité pour analyse avec des anticorps anti-peptide amyloïde oligomérique (Aβo, A11), anti-peptide amyloïde fibrillaire (Aβ-F, OC) et anti-Tau phosphorylé sur Thréonine 205 (pTau Thr205 ) ou Thréonine 181 (pTau Thr181 ). 2.4 Microscopie confocale Les tissus fixés au paraformaldéhyde (PFA) des souris WT et APP/PS1 ont été immergés dans du saccharose à 20% en PBS pendant une nuit, puis congelés dans du PFA refroidi et conservés à -30°C. Des sections (20-30 μm d'épaisseur) ont été coupées avec un microtome cryostat (HM 500M, Microm). Les sections sont bloquées par incubation avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 0,1% (v/v) de Triton X100 et 3% de BSA pendant 30 min à température ambiante. Les coupes de tissus ont ensuite été incubées pendant une nuit à 4°C avec des anticorps primaires dirigés contre les différentes protéines d’intérêt, lavées 3 fois avec du PBS contenant 0,2% de Tween20 (PBS-T) et incubées pendant 2h à température ambiante avec les anticorps secondaires conjugués à différents fluorochromes. Après trois lavages dans du PBS-T, les noyaux ont été colorés par incubation dans une solution de Hoescht (1:200) pendant 5 minutes et les lames ont été montées dans un milieu de montage fluorescent (Dako). 2.5) Suivi dans le cerveau L’étude morphologique des épines et de la densité synaptique est réalisée par microscopie confocale en utilisant le modèle murin Thy1-eYFP APP/PS1-21. La distribution des protéines Aβ et P-tau est également analysée par microscopie confocale avec des anticorps spécifiques des différentes protéines. La présence des plaques amyloïdes est détectée par microscopie confocale en utilisant la thioflavine-T. Les niveaux d’expression de ces différentes protéines sont déterminés par Western Blot, DotBlot et/ou Elisa. 2.6) Suivi dans les intestins Comme pour le cerveau, la distribution des protéines Aβ et P-tau est analysée par microscopie confocale avec des anticorps spécifiques des différentes protéines. Cette technique permet également d’appréhender la structure et la morphologie des villosités et des cryptes intestinales. Les niveaux d’expression de ces différentes protéines sont déterminés par Western Blot, DotBlot. Le contexte inflammatoire sera validé par dosage en QPCR et en Elisa de différentes cytokines. 3) Résultats L'analyse des peptides Aβ fécaux (formes oligomériques toxiques E22P et pré-fibrillaires OC par des anticorps conformationnels spécifiques) et des protéines Tau-P Thr181 et Tau-P Thr205 a révélé une différence significative dans les fractions solubles extraites des fèces entre les animaux WT et TG, dès 1 mois, avant toute accumulation détectable dans le cerveau Fig. 1A. En effet les souris transgéniques éliminent significativement plus d’Aβo toxiques (E22P), de pTau Thr181 et de pTau Thr205 que les animaux WT, à 1 mois. Ces différences se maintiennent à 2 mois (résultats non montrés). A partir de 4 mois Fig. 1B et Fig. 1C, les différences entre les animaux WT et TG sont moins importantes. A 9 mois Fig. 1D, la différence d’élimination des formes Aβo toxiques (E22P) et de pTau Thr181 entre les animaux WT et TG persistent et augmentent. De même à cet âge on observe une élimination significative des formes pré-fibrillaires d’Aβ (OC) chez les animaux TG. Dans les fractions insolubles, on observe une augmentation de la détection des protéines Tau-P Thr181 , Tau-P Thr205 et Aβ-F (OC) chez les animaux TG par rapport aux animaux WT à l'âge de 4 mois Fig. 2B. A partir de 6 mois Fig. 2C et Fig. 2D, les animaux WT éliminent de façon identique pTau Thr181 , voire plus de pTau Thr205 ou Aβ-F (OC) que les animaux transgéniques. Au niveau du cerveau, des plaques amyloïdes sont détectées dans le cortex et l’hippocampe chez des souris à partir de 3 mois. Ces observations s’accompagnent de changements morphologiques et d’une diminution de la densité des synapses. Au niveau intestinal, dès 6 semaines, on observe une accumulation de la forme oligomérique toxique d’Aβ (Aβo) et de la forme pré-fibrillaire (A β-F). Cependant il n’y a pas de plaques amyloïdes au niveau intestinal. Cette accumulation est associée à une désorganisation de la barrière épithéliale. Ces observations suggèrent une modification des propriétés de la barrière entraînant une altération des capacités d'absorption des nutriments et/ou de la motilité de transit des souris TG et le développement d’un contexte inflammatoire. Ces résultats démontrent que, de manière inattendue, le tractus gastro-intestinal reflète ce qui se passe dans le cerveau au niveau d’Aβ et de tau. Selon l’invention, des modifications moléculaires et histologiques solides sont observées, annonciateurs de la MA dans l’intestin, avant même l’apparition des premiers symptômes, i.e. avant toute atteinte du cerveau et spécifiquement à cette maladie. L’utilisation des fèces par rapport aux marqueurs sanguins ou salivaires présente l’avantage d’être beaucoup plus précoce et plus sensible (les peptides Aβ et les protéines tau éliminés sont stables et en quantités importantes). Le dosage de ces marqueurs dans les selles constitue donc un outil performant pour le diagnostic précoce de la MA et le suivi de la progression de la maladie. L'ensemble de ces observations indique que les changements intestinaux suivent la progression du cerveau de la MA. L'intestin révèle également une accumulation des peptides Aβ et des protéines tau-phosphorylées dans les fèces qui a été détectée avant toute accumulation dans le cerveau. En effet, une accumulation puis une élimination des protéines solubles associées aux changements morphologiques intestinaux, suivie d'une clairance des protéines insolubles dans les fèces ont été observées. Procédé pour le diagnostic in vitro d’une maladie neurodégénérative, chez un individu humain ou animal, comprenant l’étape qui consiste à détecter la présence d’au moins un marqueur choisi parmi les peptides béta-amyloïdes (Aβ), les formes dérivées desdits peptides, les protéines tau phosphorylées et les formes dérivées desdites protéines, dans un échantillon de selles dudit individu. Procédé pour le diagnostic in vitro d’une maladie neurodégénérative, à un stade précoce, chez un individu humain ou animal, asymptomatique ou non, comprenant l’étape qui consiste à détecter la présence d’au moins un marqueur choisi parmi les peptides béta-amyloïdes (Aβ), les formes dérivées desdits peptides, les protéines tau phosphorylées et les formes dérivées desdites protéines, dans un échantillon de selles dudit individu. Procédé pour le diagnostic in vitro de la maladie d’Alzheimer, chez un individu humain ou animal, comprenant l’étape qui consiste à détecter la présence d’au moins un marqueur choisi parmi les peptides béta-amyloïdes (Aβ), les formes dérivées desdits peptides, les protéines tau phosphorylées et les formes dérivées desdites protéines, dans un échantillon de selles dudit individu. Procédé pour le diagnostic in vitro d’une maladie d’Alzheimer, à un stade précoce, chez un individu humain ou animal, asymptomatique ou non, comprenant l’étape qui consiste à détecter la présence d’au moins un marqueur choisi parmi les peptides béta-amyloïdes (Aβ), les formes dérivées desdits peptides, les protéines tau phosphorylées et les formes dérivées desdites protéines, dans un échantillon de selles dudit individu. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, pour le diagnostic in vitro d’une tauopathie, chez un individu humain ou animal, comprenant l’étape qui consiste à détecter la présence d’au moins un marqueur choisi parmi les protéines tau phosphorylées et leurs formes dérivées, dans un échantillon de selles dudit individu. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes suivantes : on met en contact ledit échantillon de selles dudit individu en présence d’au moins un anticorps ou partie d’anticorps reconnaissant spécifiquement au moins l’un desdits marqueurs, dans des conditions permettant la formation d’un complexe entre ledit anticorps ou partie d’anticorps et ledit marqueur, on détecte la présence d’un dit complexe, le cas échéant, la présence d’un dit complexe déterminant l’atteinte de l’individu par une maladie neurodégénérative. Procédé de suivi de l’état d’un individu humain ou animal suspecté d’être atteint d’une maladie neurodégénérative, ledit individu pouvant être traité pour ladite maladie, comprenant les étapes suivantes : on met en contact un premier échantillon de selles dudit individu en présence d’au moins un anticorps ou partie d’anticorps reconnaissant spécifiquement au moins un marqueur choisi parmi les peptides béta-amyloïdes (Aβ), les formes dérivées desdits peptides, les protéines tau phosphorylées et les formes dérivées desdites protéines, dans des conditions permettant la formation d’un complexe entre ledit anticorps ou partie d’anticorps et ledit marqueur, on mesure la teneur d’un dit complexe dans le premier échantillon, puis on met en contact un second échantillon de selles dudit individu, ledit second échantillon étant prélevé après le premier échantillon, en présence dudit anticorps ou partie d’anticorps, dans des conditions permettant la formation d’un complexe entre ledit anticorps ou partie d’anticorps et ledit marqueur, on mesure la teneur d’un dit complexe dans le second échantillon, une variation entre les teneurs dudit complexe dans le premier échantillon et dudit complexe dans le second échantillon, indiquant une progression de la maladie ou une régression de la maladie. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l’anticorps ou partie d’anticorps reconnait spécifiquement au moins un peptide béta-amyloïde ou une forme dérivée d’un peptide béta-amyloïde soluble et forme avec celui-ci un complexe, et une teneur dudit complexe dans le second échantillon supérieure à la teneur de ce même complexe dans le premier échantillon indique une progression de la maladie, à un stade précoce, ou une teneur dudit complexe dans le second échantillon inférieure à la teneur de ce même complexe dans le premier échantillon indique une régression de la maladie. Procédé selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce que l’anticorps ou partie d’anticorps reconnait spécifiquement au moins une protéine tau phosphorylée soluble ou une forme dérivée d’une protéine tau phosphorylée et forme avec celle-ci un complexe, et une teneur dudit complexe dans le second échantillon supérieure à la teneur de ce même complexe dans le premier échantillon indique une progression de la maladie, à un stade précoce, ou une teneur dudit complexe dans le second échantillon inférieure à la teneur de ce même complexe dans le premier échantillon indique une régression de la maladie. Procédé de criblage d’un médicament pour traiter une maladie neurodégénérative, chez un individu suspecté d’être atteint d’une telle maladie, comprenant les étapes suivantes : on met en contact un premier échantillon de selles dudit individu en présence d’au moins un anticorps ou partie d’anticorps reconnaissant spécifiquement au moins un marqueur choisi parmi les peptides béta-amyloïdes (Aβ), les formes dérivées desdits peptides, les protéines tau phosphorylées et les formes dérivées desdites protéines, dans des conditions permettant la formation d’un complexe entre ledit anticorps ou partie d’anticorps et ledit marqueur, on mesure la teneur d’un dit complexe dans le premier échantillon, puis on met en contact un second échantillon de selles dudit individu, ledit second échantillon étant prélevé après le premier échantillon, en présence dudit anticorps ou partie d’anticorps, dans des conditions permettant la formation d’un complexe entre ledit anticorps ou partie d’anticorps et ledit marqueur, on mesure la teneur d’un dit complexe dans le second échantillon, une variation entre les teneurs dudit complexe dans le premier échantillon et dudit complexe dans le second échantillon, indiquant l’efficacité ou l’inefficacité dudit médicament. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l’anticorps ou partie d’anticorps reconnait spécifiquement au moins un peptide béta-amyloïde ou une forme dérivée d’un peptide béta-amyloïde soluble et forme un complexe avec celui-ci, et la teneur dudit complexe dans le second échantillon inférieure à la teneur de ce complexe dans le premier échantillon indique une efficacité du médicament. Procédé selon la revendication 10 ou 11, caractérisé en ce que l’anticorps ou partie d’anticorps reconnait spécifiquement au moins une protéine tau phosphorylée ou une forme dérivée d’une protéine tau phosphorylée soluble et forme un complexe avec celle-ci, et une teneur dudit complexe dans le second échantillon inférieure à la teneur de ce complexe dans le premier échantillon indique une efficacité du médicament. Kit pour la détection in vitro d’une maladie neurodégénérative, au stade précoce, d’un individu humain ou animal, comprenant au moins un anticorps ou partie d’anticorps reconnaissant spécifiquement au moins un marqueur choisi parmi les peptides béta-amyloïdes (Aβ), les formes dérivées desdits peptides, les protéines tau phosphorylées et les formes dérivées desdites protéines, et les moyens permettant l’extraction, à partir d’un échantillon de selles dudit individu, d’au moins un marqueur choisi parmi les peptides béta-amyloïdes (Aβ), les formes dérivées desdits peptides, les protéines tau phosphorylées et les formes dérivées desdites protéines, et la formation d’un complexe entre ledit anticorps ou partie d’anticorps et ledit marqueur, Utilisation d’un marqueur présent dans les selles d’un individu et choisi parmi les peptides béta-amyloïdes (Aβ), les formes dérivées desdits peptides, les protéines tau phosphorylées et les formes dérivées desdites protéines, pour le diagnostic in vitro d’une maladie neurodégénérative, chez ledit individu. Utilisation selon la revendication 14, caractérisée en ce que le diagnostic est effectué à un stade précoce de la maladie. Utilisation selon la revendication 14 ou 15, caractérisée en ce que la maladie neurodégénérative est la maladie d’Alzheimer.