Brevet FR3146590A1 — publié le 20240920

La présente invention concerne une matrice poreuse de complexes de polyélectrolytes (PEC) à base d’alginate et de chitosan ou de leurs dérivés, particulièrement adaptée à la thérapie cellulaire et notamment à la cicatrisation des tissus mous et la réparation tissulaire. La matrice selon l’invention peut être avantageusement utilisée en combinaison avec des macrophages pour favoriser la cicatrisation des plaies. L’invention concerne également un biomatériau hybride comprenant une telle matrice poreuse et des macrophages pro-cicatrisants, et éventuellement des cellules stromales mésenchymateuses, et un kit comprenant cette matrice. La présente invention concerne aussi un procédé de préparation d’une telle matrice ainsi qu’un procédé de préparation d’un tel biomatériau hybride et l’utilisation d’un tel biomatériau hybride en médecine régénérative. Matrice 3D poreuse à base de complexes de polyélectrolytes et ses applications La présente invention concerne une matrice 3D poreuse obtenue à base de complexes de polyélectrolytes (PEC) formés entre polymères anionique(s) et cationique(s) particulièrement adaptée à la thérapie cellulaire et notamment à la cicatrisation des tissus mous et la réparation tissulaire. La matrice selon l’invention peut être avantageusement utilisée en combinaison avec des macrophages pour favoriser la cicatrisation des plaies. L’invention concerne également un biomatériau comprenant une telle matrice poreuse et des cellules d’intérêt, telles que des macrophages et/ou des cellules stromales mésenchymateuses, et un kit comprenant cette matrice. La présente invention concerne aussi un procédé de préparation d’une telle matrice ainsi qu’un procédé de préparation d’un tel biomatériau et l’utilisation d’un tel biomatériau hybride en médecine régénérative. ARRIERE PLAN TECHNOLOGIQUE L’ingénierie tissulaire, ou médecine régénérative, a généralement recours à des cellules thérapeutiques, des substances nécessaires au développement tissulaire (molécules de signal, facteurs de croissance, etc.) et/ou des biomatériaux implantables. De manière générale, un biomatériau implantable destiné à un ensemencement cellulaire en profondeur doit présenter des caractéristiques de biocompatibilité pour, une fois implanté, ne pas générer une réaction inflammatoire excessive. Au contraire, le matériau doit idéalement permettre l’adhésion des cellules, leur fonctionnement normal, leur migration et la production d’une nouvelle matrice extracellulaire. Le biomatériau doit également favoriser la viabilité des cellules thérapeutiques. De surcroît, le biomatériau doit présenter une structure hautement macroporeuse et interconnectée de manière à permettre la colonisation cellulaire et la diffusion de nutriments. Enfin, le matériau doit présenter des propriétés mécaniques en lien avec celles du tissu visé, de manière à reproduire un environnement biomimétique pour les cellules qu’il accueille. Dans le cas du traitement des plaies, et notamment des plaies chroniques, des cellules thérapeutiques peuvent être utilisées. Il peut être particulièrement intéressant de les administrer via un biomatériau implantable, afin de fournir un environnement 3D protecteur assurant l’administration locale de cellules viables au niveau de la plaie ou plus généralement du tissu ou de l’organe lésé. Les plaies chroniques, et particulièrement les plaies du pied de diabétique, sont « bloquées » dans une phase inflammatoire de faible intensité, les empêchant d’accéder aux étapes ultérieures de cicatrisation et suggérant une résolution défectueuse de l’inflammation (Miao et al., 2012). Le microenvironnement physiopathologique des plaies chroniques est lui-même associé à des dérégulations fonctionnelles des macrophages. La dérégulation et perte de fonctionnalité des macrophages contribuent largement au défaut de cicatrisation des plaies chroniques dont le pied diabétique. Ainsi, les macrophages occupent une place centrale dans l’orchestration du processus cicatriciel. De manière pertinente et adaptée au contexte de la cicatrisation où les macrophages tiennent un rôle central, il a récemment été proposé (Krzyszczyk et al., 2018) la distinction suivante : macrophages pro-inflammatoires, engagés dans l’élimination des pathogènes par phagocytose et qui sécrètent des cytokines pro-inflammatoires, des intermédiaires toxiques et des espèces réactives de l’oxygène, d’une part, et macrophages pro-cicatrisants et macrophages pro-résolutifs, impliqués dans les processus de réparation et de remodelage tissulaire, d’autre part. Une des hypothèses les plus étayées pour expliquer le maintien de l’inflammation au niveau des plaies chroniques est l’absence de changement de phénotype (switch) des macrophages pro-inflammatoires vers un phénotype pro-résolutif. Les macrophages constituent donc une cible thérapeutique de plus en plus attrayante en médecine régénérative. En effet, aux vues des dysfonctions des macrophages au niveau des plaies chroniques et de l’impact délétère de l’absence de transition d’un phénotype pro-inflammatoire vers un phénotype pro-résolutif, il apparaît essentiel de rétablir la fonctionnalité pro-résolutive et pro-réparatrice des macrophages. Des travaux ont porté sur l’élaboration de stratégies de contrôle de l’inflammation au niveau des plaies chroniques par intervention plus ou moins directe sur le phénotype et l’activité des macrophages. En particulier, plusieurs approches complémentaires ont été envisagées comme la modulation du phénotype des macrophages endogènes (par promotion d’un phénotype pro-résolutif ou par atténuation du phénotype pro-inflammatoire), ou directement par apport local de macrophages pro-résolutifs au niveau de la plaie. Cependant, jusqu’à présent, aucune des stratégies thérapeutiques de cicatrisation développées impliquant des macrophages n’a permis un retour à une intégrité anatomique et fonctionnelle satisfaisante des plaies. En travaillant sur la cicatrisation des plaies et notamment des plaies chroniques chez les diabétiques, les inventeurs ont développé une matrice de PEC à base de polymères anionique(s) et cationique(s) particulièrement adaptée à la cicatrisation des tissus mous et la réparation tissulaire. La matrice selon l’invention présente des propriétés mécaniques et structurelles telles qu’elle peut servir simultanément de support 3D pour des cellules, et notamment des macrophages, et de pansement. La matrice selon l’invention est particulièrement adaptée à une utilisation en association avec des macrophages pro-résolutifs. Notamment, les inventeurs ont développé une matrice de PEC alginate/chitosan pouvant être utilisée comme support de thérapie cellulaire adapté aux tissus mous. L’invention a donc pour objet un biomatériau tridimensionnel comprenant une matrice de complexes de polyélectrolytes (PEC) à base d’alginate et de chitosan modifiés ou non, et des macrophages, ladite matrice présentant une macroporosité ouverte interconnectée dans laquelle le ratio massique alginate/chitosan est compris entre 20/80 et 80/20. Dans un mode de réalisation, la matrice de PEC est à base d’alginate et de chitosan, le ratio massique alginate / chitosan étant de 40/60. L’alginate peut notamment présenter un ratio M/G compris entre 1,4 et 2,7, préférentiellement égal à 2 +/-0,2, un poids moléculaire (Mw) compris entre 150.000 et 250.000, et un indice de polydispersité (IP) inférieur à 2, préférentiellement d’environ 1,5. Le chitosan présente avantageusement un degré de déacétylation (DDA) compris entre 75% et 90%, préférentiellement entre 75 et 85%, un Mw compris entre 130.000 et 400.000, préférentiellement entre 200.000 et 400.000, et un indice de polydispersité inférieur à 2, préférentiellement d’environ 1,8. Selon l’invention, le biomatériau peut être un biomatériau hybride comprenant des macrophages pro-cicatrisants. Les macrophages pro-cicatrisants sont par exemple des macrophages pro-résolutifs. Dans un mode de réalisation, le biomatériau hybride comprend des macrophages pro-cicatrisants et des cellules stromales mésenchymateuses (CSM), le ratio macrophages pro-cicatrisant / cellules stromales mésenchymateuses étant préférentiellement compris entre 1/99 et 99/1. L’invention a également pour objet un procédé de préparation d’un biomatériau hybride selon l’invention, comprenant les étapes : (a) cultiver des monocytes et/ou des macrophages dans des conditions permettant d’obtenir des macrophages pro-cicatrisant; (b) préparer une matrice de complexes de polyélectrolytes (PEC) à base d’alginate et de chitosan, dans laquelle les deux polymères sont en proportion relative comprise entre 40/60 et 60/40; (c) éventuellement sécher la matrice de PEC ; (d) stériliser la matrice de PEC ; (e) ensemencer la matrice de PEC avec des macrophages pro-cicatrisants obtenus à l’étape (a) éventuellement combinés avec des CSM. Dans un mode de réalisation, l’étape (d) de stérilisation est une stérilisation par irradiation par faisceaux d’électrons pulsés de faible énergie ou une stérilisation par irradiation par faisceaux d’électrons continus de faible énergie. Comme indiqué ci-dessus, dans un mode de réalisation, la matrice issue de l’étape (b) subie une étape de séchage avant l’étape de stérilisation (d). L’invention concerne également un pansement cutané destiné à la médecine régénérative comprenant un biomatériau tridimensionnel selon l’invention. L’invention a également pour objet des macrophages pro-cicatrisants éventuellement combinés à des CSM pour leur utilisation en médecine régénérative chez un sujet, caractérisés en ce que lesdits macrophages pro-cicatrisants et les éventuels CSM sont sous une forme adaptée à leur administration audit sujet au moyen d’un biomatériau tridimensionnel selon l’invention. De tels macrophages pro-cicatrisants éventuellement combinés à des CSM peuvent notamment être utilisés pour le traitement d’une plaie, notamment d’une plaie chronique. Par exemple, le sujet présente un diabète et/ou est un sujet âgé. Dans un mode de réalisation, le biomatériau tridimensionnel est sous la forme d’un pansement, d’un patch, ou d’une matrice implantable. Lesdits macrophages pro-cicatrisants et les éventuelles CSM peuvent avoir été préalablement obtenus à partir de cellules dudit sujet parmi, des cellules de moelle osseuse, des iPS ou monocytes sanguins, et ASC du tissu adipeux. L’invention a également pour objet un kit destiné à la médecine régénérative, et notamment au traitement d’une plaie, telle qu’une plaie chronique, ledit kit comprenant : une matrice de PEC alginate et de chitosan, ladite matrice présentant une macroporosité ouverte interconnectée dans laquelle le ratio massique polymère anionique / polymère cationique est compris entre 20/80 et 80/20, préférentiellement entre 40/60 et 60/40; un milieu de culture adapté à la culture des monocytes ou macrophages pro-cicatrisants et/ou un milieu de culture adapté à la différenciation de cellules de moelle osseuse en macrophages de phénotype pro-cicatrisants. Avantageusement, la matrice de PEC est stérilisée. DESCRIPTION DES DESSINS montre la structure chimique de l'alginate de sodium et ses unités monomères M et G (A), et un exemple de séquence de chaîne d'alginate (B). montre la structure chimique de la chitine ou du chitosan. Lorsque R= -COCH3 et x>50% il s’agit de la chitine, et lorsque R = H et que y>60-70 il s’agit du chitosan. représente la répartition des différents lots étudiés dans un modèle d’étude in vivo murin de la stratégie de thérapie cellulaire des plaies chroniques. représente la frise chronologique de l'essai de la et les conditions expérimentales. montre le profil de l’expression génique de macrophage (mΦ) M0, M1 et M2 après 24 heures de culture ou au contact des matrices PEC 40/60. (A) Cytokines anti- et pro-inflammatoires. (B) Récepteurs membranaires. Les analyses ont été faites avec 3 réplicats par condition (test ANOVA à 1 facteur ; *P ≤ 0,05 ; **P ≤ 0,01 ; *** P ≤ 0,001 ; **** P ≤ 0,0001). Par souci de clarté sur les graphes, seules les différences significatives entre les mΦ au contact des matrices par rapport à leur groupe de référence (mΦ en culture) sont indiquées. montre les résultats de l’étude par cytométrie en flux de l’expression des marqueurs de surface F4/80, CD206 (MR) et CD86 par les mΦ M2 après 24 heures de culture (A) ou au contact des matrices PEC 40/60 (B). est l’histogramme montrant les pourcentages correspondants des différentes populations F480+CD206+ et F480+CD86+ des figures 5AB (n=3 réplicats). est un diagramme montrant les concentrations en urée pour 100 000 mΦ M0, mΦ M1 ou mΦ M2 après 24 heures de culture ou au contact des matrices PEC 40/60 (mΦ : macrophage). Les analyses ont été faites avec 3 réplicats par condition (n= 3 ; test ANOVA à 1 facteur ; *P ≤ 0,05 ; **P ≤ 0,01 ; **** P ≤ 0,0001) est un diagramme montrant le suivi par luminescence de la production d’espèces réactives de l’oxygène par les macrophages (mΦ) M0, M1 et M2 après 24 heures de culture ou au contact des matrices 3D après stimulation par 100 mM de TPA. montre en microscopie confocale une matrice PEC 40/60 après 24 heures de culture et après marquage différentiel des cellules vivantes/mortes. L’encart en haut à gauche indique les faces imagées de la matrice. La matrice 3D dans son ensemble est présentée en (A), il s’agit d’une reconstruction 3D au grossissement x10 (10X) avec le contraste de phase et la projection en z des canaux. Les images B-C-D correspondent à la projection en z d’une coupe transversale de la matrice au 10X. Les images E-F-G puis H-I-J sont des projections en z de la matrice imagée longitudinalement respectivement au 10X et au 40X. montre la cinétique de fermeture des plaies à partir du premier jour de traitement (J2). L’analyse statistique entre le groupe matrice 3D + mΦ M2 et le groupe contrôle HFD est indiquée par * (p montre des images représentatives des coupes histologiques du groupe contrôle (A) et du groupe traité par les matrices 3D + mΦ M2 (B). montre les scores histologiques associés aux images des figures 10A et 10B. montre la viabilité des différents types cellulaires (M2-Mφ humains et ASC humaines) dans la matrice après 2 jours et 6 jours de culture après marquage avec le kit « ReadyProbes™ Cell Viability Imaging Kit » (kit d’imagerie de la viabilité cellulaire) et analyse de la fluorescence par microscopie confocale. montre la fonctionnalité des Mφ et ASC humains ensemencés dans la matrice à l’état basal ou après stimuli infectieux (LPS). Après 24h de culture, les concentrations d’IL-10, d’IL-6 et d’IL-1β sont déterminées par ELISA. DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION La présente invention a trait à une matrice de complexes de polyélectrolytes particulièrement adaptée à une utilisation dans un pansement dans le cadre de la régénération tissulaire. Notamment, la matrice peut être utilisée en tant que biomatériau en combinaison avec des cellules thérapeutiques, telles que des macrophages et/ou des cellules stromales mésenchymateuses (MSC), pour aider à la cicatrisation d’une plaie. Définitions Dans le cadre de la présente demande, les définitions suivantes s’appliquent. Par « matrice », on entend une structure polymérique en trois dimensions, apte à être travaillée pour prendre la forme souhaitée, en fonction de la finalité de son utilisation. Dans le contexte de l’invention, une matrice est avantageusement biocompatible et/ou biodégradable. On entend par « biocompatible » un matériau, une matrice ou une substance qui n’interfère pas et ne dégrade pas le milieu biologique dans lequel il ou elle est utilisé. Par « biodégradable », on entend un matériau ou une matrice capable d’être décomposé naturellement par des organismes vivants. Dans le cas d’un matériau ou d’une matrice implantable, on entend alors un matériau ou une matrice capable d’être décomposée naturellement par l’organisme dans lequel il doit être implanté. Par « biomatériau », on entend un matériau non vivant, destiné à interagir avec un système biologique, avec une réponse de l'hôte appropriée dans une application spécifique. Dans le contexte de l’invention, un « biomatériau hybride » désigne la combinaison d’une matrice et de cellules thérapeutiques, pouvant être utilisé notamment en tant que pansement ou substitut cutané temporaire, apte à délivrer des substances thérapeutiques (molécules bioactives sécrétées par les cellules, principes actifs) et/ou à stimuler une cible cellulaire. Les « plaies chroniques » désignent des plaies difficiles à cicatriser ou ne suivant pas le processus physiologique classique. Généralement, une plaie est considérée comme chronique si elle n’est pas parvenue à rétablir une intégrité anatomique et fonctionnelle après trois mois. On regroupe généralement dans les plaies chroniques les ulcères vasculaires (veineux et artériels), les escarres, les pieds diabétiques. Le terme « environ » associé à une valeur numérique signifie la valeur indiquée +/- 10%, préférentiellement +/- 5%. Sauf indication contraire, lorsque des gammes sont indiquées, les valeurs aux bornes sont comprises dans lesdites gammes. Matrice La présente invention repose principalement sur une matrice polymérique biocompatible et avantageusement biodégradable. Plus précisément, la matrice est une matrice de complexes de polyélectrolytes (PEC) à base de polymère(s) anionique(s) et de polymère(s) cationique(s). Les PEC présentent de nombreux avantages comme le maintien de la très bonne biocompatibilité des polymères (ici biosourcés) dont ils sont issus. C’est pourquoi, les PEC sont déjà classiquement utilisés en ingénierie tissulaire avec des résultats prometteurs dans ce domaine (Ishihara 2019). La matrice est une matrice en trois dimensions (3D). Plus précisément, la matrice selon l’invention est une matrice PEC présentant une macroporosité ouverte interconnectée. Par « macroporosité ouverte interconnectée », on entend que la matrice comprend plus particulièrement des pores de diamètre moyen compris entre 50 et 300 µm, que lesdits pores communiquent entre eux et qu’il est possible d’accéder auxdits pores depuis la surface externe de la matrice. Selon l’invention, le ratio massique polymère anionique / polymère cationique dans la matrice est compris entre 20/80 et 80/20. Notamment, ledit ratio est d’environ 20/80, 30/70, 40/60, 50/50, 60/40, 70/30, 80/20. Préférentiellement, ledit ratio est compris entre 35/65 et 65/35, plus préférentiellement entre 35/65 et 45/55, et notamment d’environ 40/60. Les polymères anioniques biocompatibles sont avantageusement choisis parmi les alginates et les alginates modifiés,. Les alginates forment une famille de copolymères linéaires constitués de l’enchaînement d’unités d’acide β-D-mannuronique (unité M) et d’acide α-L-guluronique (unité G), liées entre elles par des liaisons glycodisiques β (1-4). Il est possible de faire varier la rigidité des gels d’alginate, en faisant varier le ratio M/G. Par exemple, il est possible d’utiliser de l’alginate de sodium. Les alginates modifiés s’entendent des alginates dont la structure de base est fonctionnalisée par un ou plusieurs groupements, en particulier par un ou plusieurs peptides. Par exemple, il est possible d’utiliser de l’alginate fonctionnalisé par des tripeptides RGD (L-arginine, glycine, acide L-aspartique) participant à l’adhésion cellulaire. Les polymères cationiques biocompatibles sont avantageusement choisis parmi le chitosan, et tout dérivé du chitosan possiblement fonctionnalisé mais conservant une charge globale positive. Le chitosan est un polysaccharide constitué d’un enchaînement de groupes N-acétyl-D-glucosamine liés entre eux par des liaisons β(1-4). Les propriétés du chitosan varient notamment en fonction de sa masse moléculaire et de son degré de déacétylation (DDA). La matrice selon l’invention peut notamment être une matrice PEC à base d’alginate et de chitosan. Le ratio massique alginate/chitosan est compris entre 20/80 et 80/20. Préférentiellement, ledit ratio est compris entre 30/70 et 70/30, plus préférentiellement entre 35/65 et 45/55, et notamment environ de 40/60. Dans le contexte de l’invention, les alginates présentent avantageusement un ratio M/G compris entre 1,4 et 2,7, préférentiellement égal à 2 +/-0,2, un poids moléculaire (Mw) compris entre 150.000 et 250.000, notamment d’environ 195.000, et un indice de polydispersité (IP) inférieur à 2, préférentiellement d’environ 1,5. De même, dans le contexte de l’invention, le chitosan présente avantageusement un degré de déacétylation (DDA) compris entre 75% et 90%, préférentiellement entre 75 et 85%, un Mw compris entre 130.000 et 400.000, préférentiellement entre 200.000 et 400.000, et un indice de polydispersité inférieur à 2, préférentiellement d’environ 1,8. Ainsi, l’alginate utilisé peut avoir un ratio M/G de 2,1 +/-0,1, un poids moléculaire d’environ 193.100 et un indice de polydispersité d’environ 1,5. De même, le chitosan utilisé peut avoir un DDA de 80% +/-5%, un poids moléculaire d’environ 216.300 et un IP d’environ 1,8. Dans un mode de réalisation particulier, la matrice PEC comprend un ratio massique alginate/chitosan compris entre 35/65 et 45/55, préférentiellement d’environ 40/60. L’alginate de la matrice a un ratio M/G de 2,1 +/-0,1, un poids moléculaire d’environ 193.100 et un IP d’environ 1,5, et le chitosan a un DDA de 80% +/-5%, un poids moléculaire d’environ 216.300 et un IP d’environ 1,8. La matrice selon l’invention est adaptée à l’ensemencement en profondeur et à l’immobilisation des cellules thérapeutiques et présente des propriétés absorbantes, particulièrement adaptées à l’utilisation en tant que pansement pour l’absorption des exsudats. La matrice selon l’invention peut être préparée par tout procédé adapté connu de l’homme du métier. Notamment, il est possible de mettre en œuvre le procédé de préparation décrit dans la demande WO2017/017379. Après obtention, la matrice peut être stérilisée et éventuellement séchée ou lyophilisée, ce séchage ou cette lyophilisation étant réalisés préférentiellement avant la stérilisation en vue de son utilisation ultérieure en tant que biomatériau. Avantageusement, la matrice de complexes de polyélectrolytes (PEC) est réalisée en mélangeant le polysaccharide anionique, tel que l’alginate, et le polymère cationique, tel que le chitosan, dans des proportions comprises entre 40/60 et 60/40. Notamment les polymères cationiques et le polymère anionique sont dans des proportions massiques comprises entre 40/60 et 60/40. Notamment, les polymères cationiques et le polymère anionique sont dans des proportions permettant un niveau d’interaction ionique maximal (+/-10%). Par exemple, l’étape de préparation d’une matrice de PEC à base de chitosan et alginate comprend - mélanger une solution d’alginate et une solution de chitosan ; - mouler et congeler le mélange de PEC obtenu ; - lyophiliser le mélange de PEC ; - gélifier la matrice de PEC lyophilisée par ajout d’une solution de CaCl2 à 0,1M ; - rincer, optionnellement recongeler puis optionnellement relyophiliser ladite matrice. La matrice selon l’invention peut être séchée, par exemple par séchage au CO 2 supercritique, et/ou lyophilisée, afin de favoriser sa conservation et son stockage avant utilisation. La matrice selon l’invention peut avantageusement être stérilisée, préférentiellement à sec. La stérilisation peut être réalisée par tout moyen, physique ou chimique, connu de l’homme du métier et adapté aux matrices de PEC. Notamment, il est possible de stériliser la matrice par irradiation par faisceaux d’électrons pulsés de faible énergie ou par irradiation par faisceaux d’électrons continus de faible énergie. Une irradiation de faible énergie s’entend d’une énergie inférieure à 500 keV. La méthode de stérilisation décrite dans Farno et al 2021 (« Low-energy electron beam sterilization of solid alginate and chitosan, and their polyelectrolyte complexes”, Carbohydrate Polymers 261 (2021) 117578) est particulièrement adaptée. Dans un mode de réalisation, la stérilisation est réalisée par irradiation à une dose inférieure à 5 kGy, notamment comprise entre 2 et 3 kGy, préférentiellement de 2,5 kGy, par la technologie pulsée avec une énergie de faisceaux comprise entre 200 et 350 keV, préférentiellement entre 250 et 300 keV, notamment à 280 keV. Dans un autre mode de réalisation, la stérilisation est réalisée par irradiation à une dose comprise entre 10 et 25 kGy, préférentiellement entre 12 et 20 kGy, plus préférentiellement de 15 kGy, par la technologie pulsée avec une énergie de faisceaux comprise entre 350 et 550 keV, préférentiellement entre 400 et 450 keV. Par exemple, la stérilisation est réalisée par irradiation à une dose de 15 kGy, avec une énergie de faisceaux de 430 keV. De telles stérilisations permettent avantageusement de conserver la porosité et l’architecture de la matrice selon l’invention. Biomatériau hybride L’invention a également pour objet un biomatériau combinant une matrice telle que décrite ci-dessus, et des cellules thérapeutiques et/ou des substances thérapeutiques. La matrice selon l’invention présente des propriétés mécaniques et biologiques particulièrement adaptées à la thérapie cellulaire. Notamment la matrice selon l’invention présente des propriétés favorables à l’ensemencement et la survie de cellules particulières, telles que les macrophages et les cellules stromales mésenchymateuses. En effet, la porosité générée permet un ensemencement en profondeur de la matrice, et l’architecture recrée un environnement biomimétique apte au maintien de la viabilité cellulaire, d’un phénotype particulier et/ou d’une activité métabolique. La matrice selon l’invention est ainsi particulièrement adaptée à l’ensemencement et la survie des macrophages et/ou des cellules stromales mésenchymateuses (CSM). Il est ainsi possible d’utiliser la matrice selon l’invention avec des macrophages, ou avec une combinaison de macrophages et CSM. Il est connu que l’infection de la plaie chronique engendre d’importants retards de cicatrisation. En effet, dans 90% des plaies chroniques un biofilm se développe, ce qui représente un obstacle majeur à la cicatrisation. Ainsi, le basculement dans la phase de résolution de l’inflammation ne peut se faire que si ce biofilm est éliminé. Les macrophages pro-inflammatoires, engagés dans l’élimination des pathogènes par phagocytose et en sécrétant des cytokines pro-inflammatoires, des intermédiaires toxiques et des espèces réactives de l’oxygène, sont donc essentiels dans le contrôle de l’infection des plaies. Par ailleurs, dans le processus de cicatrisation des plaies, les macrophages pro-résolutifs sont essentiels pour mettre un terme à l’inflammation et pour diriger la cicatrisation vers la phase de réparation. Dans les dernières phases de la cicatrisation, ces macrophages ont pour objectif le retour à l’homéostasie et la maturation de la peau vers son état initial. La résolution de l’inflammation est en partie activée par la phagocytose des PNN apoptotiques par les macrophages qui en conséquence sécrètent du TGF-β et du VEGF. Les macrophages pro-résolutifs produisent également l’IL-10 en forte quantité, connue comme étant immunosuppressive. De plus, ils contribuent activement à la régulation de la matrice extracellulaire (MEC) et à son remodelage en sécrétant diverses protéases comme les MMP et leurs inhibiteurs les TIMP. De même, ces macrophages interviennent dans l’apoptose des myofibroblastes pour ainsi minimiser le risque de fibrose excessive. Les macrophages pro-résolutifs se caractérisent par la présence de récepteurs PRR (Pattern Recognition Receptor) capables de reconnaitre les modèles moléculaires associés aux agents pathogènes (PAMPs) et/ou les modèles moléculaires associés aux dangers (DAMPs). Ainsi, la matrice selon l’invention comprend avantageusement des macrophages pro-cicatrisants. Selon l'invention, les macrophages pro-cicatrisants désignent des macrophages pro-inflammatoires, des macrophages pro-résolutifs, ou un mélange de ceux-ci. L’ajout dans la matrice de macrophages pro-inflammatoires/anti-bactériens et/ou de macrophages pro-résolutifs est avantageusement conditionné par les statuts infectieux et inflammatoires de la plaie à traiter. L’homme du métier est à même de décider du type de macrophages pro-cicatrisants à utiliser avec la matrice, en fonction de la plaie à traiter. De manière particulièrement surprenante, les inventeurs ont mis en évidence que la matrice selon l’invention permet de maintenir des macrophages de la matrice dans un état pro-résolutif. De manière avantageuse, la matrice selon l’invention comprenant des macrophages pro-résolutifs peut permettre de forcer les macrophages endogènes, en contact avec ladite matrice, vers un phénotype pro-résolutif. Ainsi, dans le cas d’une utilisation de la matrice en tant que pansement appliqué sur une plaie, ladite matrice peut favoriser la cicatrisation en entrainant les macrophages présents au niveau de la plaie vers un phénotype pro-résolutif. La matrice selon l’invention peut également s’utiliser avec d’autres types de cellules thérapeutiques, telles que les CSM et/ou avec des molécules thérapeutiques, et peut éventuellement être fonctionnalisée avec des antibiotiques, des substances naturelles (propolis, proanthocyanidine A). Les CSM sont particulièrement intéressantes dans le cadre du traitement des plaies, en combinaison avec des macrophages, car elles permettent d’induire un phénotype pro-résolutif des macrophages. La polarisation des macrophages vers un phénotype pro-résolutif par les CSM peut concerner aussi bien les macrophages exogènes, apportés par le biomatériau, que les macrophages endogènes, présents au niveau de la plaie sur laquelle le biomatériau hybride est appliqué. De plus, les CSM, par la sécrétion de facteurs paracrines, peuvent moduler et recruter les cellules endogènes de la plaie telles que les fibroblastes et les kératinocytes et donc accélérer la fermeture de la plaie (Shingyochi, Y, 2015, Exp Opinion mol Ther ; Krzyszczyk, P, 2018, Front Physiol). Les CSM jouent également un rôle central dans la néovascularisation de la plaie en sécrétant des facteurs anti-inflammatoires mais aussi en stimulant la production de VEGF par les cellules du microenvironnement (Shingyochi, Y, 2015, Exp Opinion mol Ther ). Les CSM ont donc un fort potentiel pour accélérer le processus de fermeture des plaies par leurs propriétés anti-inflammatoires, par la stimulation de l'angiogenèse ainsi que par la production de facteurs solubles qui améliorent le microenvironnement de la plaie et favorisent ainsi la reconstruction tissulaire. Ainsi, les CMS de la matrice peuvent jouer un rôle dans les différentes phases de la cicatrisation des plaies saines ou infectées. Les CMS utilisées peuvent être issues par exemples de tissus adipeux, de moelle osseuse ou de cordon ombilical. De manière intéressante, les inventeurs ont mis en évidence que l’association entre les macrophages pro-résolutifs et les ASC augmente de manière importante le nombre de cellules viables dans la matrice. De manière avantageuse, l’association entre les macrophages pro-résolutifs et les ASC potentialise l’activité pro-résolutive et thérapeutique des cellules ensemencées dans la matrice. Dans un mode de réalisation particulier, le biomatériau selon l’invention comprend une matrice à base d’alginate et de chitosan, avec avantageusement un ratio massique alginate/chitosan d’environ 40/60, et des macrophages, préférentiellement des macrophages pro-cicatrisants, notamment des macrophages pro-résolutifs. Dans un mode de réalisation particulier, le biomatériau hybride selon l’invention comprend une matrice à base d’alginate et de chitosan, avec avantageusement un ratio massique alginate/chitosan d’environ 40/60, des macrophages pro-cicatrisants et des cellules stromales mésenchymateuses. Dans un mode de réalisation particulier, le biomatériau hybride selon l’invention comprend une matrice à base d’alginate et de chitosan, avec avantageusement un ratio massique alginate/chitosan d’environ 40/60, des macrophages pro-cicatrisants, préférentiellement des macrophages pro-résolutifs, et des cellules stromales mésenchymateuses. Dans un mode de réalisation, le biomatériau hybride selon l’invention est constitué d’une matrice telle que décrite ci-dessus et de macrophages pro-cicatrisants, préférentiellement des macrophages pro-résolutifs. Alternativement, le biomatériau hybride selon l’invention est constitué d’une matrice telle que décrite ci-dessus, de macrophages pro-résolutifs et de CSM. Lorsque le biomatériau hybride selon l’invention contient des macrophages, la concentration volumique en cellules dans la matrice de PEC est préférentiellement comprise entre 500 cellules et 4000 cellules / mm3 de matrice PEC. Les macrophages présentant un phénotype pro-cicatrisant, et notamment un phénotype pro-résolutif, représentent préférentiellement au moins 60% en nombre des macrophages contenus dans la matrice de PEC, plus préférentiellement au moins 70%, 80%, 85%, 90%, 95%. Lorsque le biomatériau hybride selon l’invention contient des cellules stromales mésenchymateuses, la concentration volumique en CSM dans la matrice de PEC est préférentiellement comprise entre 800 et 8000 CSM / mm3 de matrice PEC Lorsque le biomatériau hybride selon l’invention contient des macrophages et des CSM, le ratio macrophages / cellules mésenchymateuses est avantageusement compris entre 1/99 et 99/1. Par exemple, le ratio macrophages / cellules mésenchymateuses peut être de 50/50. Le biomatériau hybride selon l’invention peut être préparé par tout procédé connu de l’homme du métier. D’une manière générale, le procédé de préparation d’un biomatériau hybride selon l’invention peut comprendre les étapes de préparation d’une matrice de complexes de polyélectrolytes (PEC) selon l’invention, éventuellement un séchage, stérilisation de ladite matrice de PEC et ensemencement de la matrice de PEC avec les cellules thérapeutiques, notamment des macrophages pro-cicatrisants. Notamment, une fois que la matrice telle que décrite ci-dessus est fabriquée, séchée et stérilisée, ladite matrice est ensemencée avec des cellules thérapeutiques, par mise en contact de la matrice avec un milieu de culture comprenant lesdites cellules thérapeutiques d’intérêt. Bien entendu, il est possible d’ensemencer directement la matrice selon l’invention, sans passer par une étape de séchage. Ainsi, le procédé de préparation d’un biomatériau hybride selon l’invention peut comprendre les étapes : (a) cultiver des monocytes et/ou des macrophages dans des conditions permettant d’obtenir des macrophages pro-cicatrisants ; (b) préparer une matrice de complexes de polyélectrolytes (PEC) alginate-chitosan, dans laquelle les deux polymères sont en proportions relatives comprises entre 40/60 et 60/40 ; (c) éventuellement le séchage de la matrice de PEC ; (d) stériliser la matrice de PEC ; (d) ensemencer la matrice de PEC avec des macrophages pro-cicatrisants obtenus à l’étape (a) éventuellement combinés avec des CSM. En fonction de l’utilisation envisagée, et notamment en fonction du stade de cicatrisation de la plaie à traiter, l’étape (a) peut comprendre la culture des macrophages dans des conditions permettant d’obtenir des macrophages de phénotype pro-résolutif. Par exemple, l’étape (a) de culture des macrophages comprend la culture de cellules de moelle osseuse préalablement prélevées sur un mammifère humain ou non humain, dans un milieu de culture permettant d’obtenir des macrophages naïfs, la polarisation vers un phénotype pro-résolutif en les cultivant dans un milieu de culture supplémenté en IL-4, IL-13 et dexamethasone pendant plusieurs jours, notamment entre 2 et 10 jours, par exemple au moins 4 jours. La polarisation des macrophages vers un phénotype pro-inflammatoire est obtenue en les cultivant dans un milieu de culture supplémenté en Interféron-γ et/ou LPS pendant plusieurs jours, notamment entre 2 et 10 jours, par exemple au moins 4 jours. De manière alternative, il est possible de cultiver des iPS, des monocytes sanguins, etc., dans un milieu de culture adapté pour différencier lesdites cellules en macrophages et les polariser vers un phénotype pro-résolutif (Douthwaite H. et al. 2022 Bio Protoc.). L’homme du métier est à même d’adapter cette étape de préparation des cellules, en fonction de l’origine des cellules et de l’utilisation finale envisagée. Si la matrice doit être ensemencée avec des macrophages pro-inflammatoires, l’étape (a) peut comprendre la culture de macrophages dans des conditions permettant d’obtenir des macrophages de phénotype pro-inflammatoire. Par exemple, l’étape (a) de culture des macrophages comprend une étape de différentiation en présence de MSCF et une étape de culture de 24h en présence de cytokines inflammatoires, comme l’interféron gamma, et/ou de parois bactériennes dans un milieu défini. Dans le cas où les cellules à ensemencer sont des CSM, l’étape (a) peut comprendre l’isolement de cellules du tissu adipeux, de moelle osseuse ou de cordon ombilical d’un mammifère humain ou non humain et leur culture dans un milieu de culture adapté. Les CSM sont obtenues après une étape de digestion du tissu. Les cellules obtenues sont mises en culture dans du milieu alpha MEM complémenté par du lysat plaquettaire humain. Les cellules seront utilisées après au moins un passage en culture. Bien entendu, il est possible de procéder à plusieurs étapes (a), de manière à ensemencer plusieurs types cellulaires dans la matrice. L’étape (b) de préparation de la matrice PEC et l’étape (d) de stérilisation peuvent être réalisées comme décrit ci-dessus. Bien entendu, l’étape (a) de culture cellulaires et les étapes (b) et (d) peuvent être réalisées indépendamment et dans des périodes de temps différentes. Par exemple, il est possible de préparer la matrice et de la stériliser plusieurs heures, jours, mois, etc. avant l’étape de culture cellulaire. Avant ensemencement, les matrices peuvent être conservées à l’état lyophilisé et stérilisé dans un emballage de stérilisation. Avantageusement, l’étape (e) d’ensemencement comprend la mise en contact la matrice de PEC lyophilisée et stérilisée avec un culot cellulaire (par exemple un culot cellulaire de macrophages et/ou de cellules mésenchymateuses) puis la centrifugation de ladite matrice avant d’ajouter du milieu complet. Les matrices ensemencées peuvent être conservées en culture. Par exemple, les matrices ensemencées sont placées dans des boîtes de culture cellulaire multipuits, dans lesquelles on ajoute un volume de milieu, adapté selon la taille des puits et des matrices, de façon à immerger la matrice ensemencée. Les boîtes sont conservées dans un incubateur à environ 37°C et 5% CO 2 . La durée de conservation peut dépendre du type cellulaire. Le milieu de culture peut être renouvelé à une fréquence dépendant du type cellulaire. L’homme du métier sait adapter le milieu de culture, les volumes et le renouvellement du milieu aux types cellulaires et à l’utilisation finale envisagée du biomatériau. Dans le cas d’une matrice ensemencée de macrophages pro-résolutifs, la conservation en culture peut s’étendre sur une période de plusieurs jours, et notamment 10 jours, 15 jours, 20 jours, 21 jours ou plus, avec un taux de viabilité des macrophages très élevé. Il est également possible de congeler la matrice après ensemencement. Kit L’invention a également pour objet un kit destiné à la médecine régénérative, et notamment au traitement d’une plaie, telle qu’une plaie chronique, ledit kit comprenant : - une matrice de PEC à base d’alginate et de chitosan ou leurs dérivés, telle que décrite ci-dessus ; - un milieu de culture adapté aux cellules destinées à ensemencer la matrice. Par exemple, le milieu de culture est adapté à la culture des macrophages pro-résolutifs et/ou des CSM. Par exemples, les macrophages sont cultivées en RPMI 1640 complémenté, et les CSM sont cultivées dans de l’alpha-MEM complémenté. Le kit peut également comprendre un milieu de culture adapté la différenciation de cellules, telle que des cellules de moelle osseuse, des iPS, etc. en macrophages de phénotype pro-résolutif et/ou pro-inflammatoire. Avantageusement, la matrice de PEC est une matrice à base d’alginate et de chitosan, telle que décrite ci-dessus. La matrice de PEC est avantageusement stérilisée, et éventuellement emballée dans un emballage de stérilisation, dans lequel elle peut être conservée jusqu’à utilisation pour l’ensemencement cellulaire. Le kit selon l’invention peut également comprendre une matrice telle que décrite ci-dessus, déjà ensemencée avec des macrophages pro-cicatrisants et éventuellement des CSM. Une telle matrice ensemencée peut être fournie congelée. Le kit peut alors comprendre un milieu adapté à la décongélation de la matrice et la survie des cellules thérapeutiques. Selon l’invention, le kit peut comprendre une matrice telle que décrite ci-dessus, mise en forme pour être utilisée comme pansement, ou fournie avec des moyens permettant une utilisation en tant que pansement. Ainsi, le kit peut contenir une bande ou tout adhésif, pour permettre de maintenir la matrice en position sur une plaie. Dans un autre mode de réalisation, la matrice peut être fournie dans un format permettant sa découpe afin de l’adapter à la taille/la forme de la plaie. Utilisations La matrice selon l’invention peut être utilisée seule, ou sous forme de biomatériau, en combinaison avec des macrophages pro-cicatrisants et/ou des molécules thérapeutiques. La matrice selon l’invention peut notamment être utilisée en tant que pansement à appliquer sur une plaie. En effet, comme indiqué ci-dessus, une telle matrice est apte à favoriser la polarisation des macrophages endogènes, présents au niveau d’une plaie à traiter par exemple, vers un phénotype pro-résolutif. Ainsi, l’application d’un pansement comprenant une telle matrice peut aider à la cicatrisation d’une plaie. De même, il est possible d’utiliser la matrice selon l’invention en combinaison avec une ou plusieurs molécules thérapeutiques et/ou substances biologiques. Par exemple, il est possible de charger la matrice d’antibiotiques ou de substances naturelles, destinés à diminuer les risques d’infection d’une plaie sur laquelle ladite matrice est destinée à être appliquée. Il est également possible de charger la matrice de molécules aptes à favoriser un phénotype cellulaire, et notamment à favoriser le phénotype pro-résolutif pour les macrophages (par exemples, IL-13/IL-4, dexamethasone, eicosanoides). Ainsi, lorsque la matrice est appliquée sur une plaie, lesdites molécules vont aider à la cicatrisation en favorisant la polarisation des macrophages endogènes vers un phénotype pro-résolutif. La matrice selon l’invention peut avantageusement être utilisée en combinaison avec des macrophages et plus particulièrement des macrophages pro-résolutifs et/ou pro-inflammatoires, et/ou des CSM, en médecine régénérative, et plus particulièrement dans le cadre du traitement des plaies chroniques. Par médecine régénérative, on entend la réparation, le remplacement ou la régénération de cellules ou tissus lésés. Selon l’invention, la réparation tissulaire et la cicatrisation des plaies sont principalement visées. Ainsi, l’invention porte sur des macrophages pro-cicatrisants pour leur utilisation en médecine régénérative chez un sujet, lesdits macrophages cicatrisants étant sous une forme adaptée à leur administration audit sujet au moyen d’un biomatériau hybride selon l’invention. L’invention porte notamment sur des macrophages pro-résolutifs, éventuellement en combinaison avec des CSM, pour leur utilisation en médecine régénérative chez un sujet, lesdits macrophages pro-résolutifs étant sous une forme adaptée à leur administration audit sujet au moyen d’un biomatériau hybride selon l’invention. Un sujet s’entend d’un mammifère, humain ou non humain, en besoin de traitement médical, tel que le traitement d’une plaie, notamment d’une plaie chronique. Préférentiellement, le sujet est un mammifère humain, enfant, adolescent ou adulte. Préférentiellement le sujet présente une maladie limitant les mécanismes de cicatrisation et/ou est un sujet âgé. Notamment, le sujet est un diabétique, préférentiellement un diabétique de type II. Par sujet âge, on entend un mammifère humain de 70 ans ou plus. L’invention vise particulièrement des macrophages pro-résolutifs, éventuellement en combinaison avec des CSM, dans un biomatériau hybride selon l’invention, pour leur utilisation pour le traitement d’une plaie, notamment d’une plaie chronique. L’invention vise également des macrophages pro-inflammatoires, éventuellement en combinaison avec des CSM, dans un biomatériau hybride selon l’invention, pour leur utilisation pour le traitement d’une plaie, notamment d’une plaie chronique. Une telle utilisation est particulièrement adaptée pour les sujets présentant une maladie limitant les mécanismes de cicatrisation, telle qu’un diabète. Lesdits macrophages pro-cicatrisants et/ou CSM peuvent être obtenus à partir de cellules dudit sujet telles que des monocytes sanguins, des CSM du tissu adipeux, de la moelle osseuse ou de cordon ombilical, des macrophages, des cellules de la moelle osseuse et/ou des iPS. Avantageusement, le biomatériau tridimensionnel est sous la forme d’un pansement d’un patch, ou d’une matrice implantable. L’invention vise également l’utilisation d’un biomatériau selon l’invention, notamment sous forme de pansement ou de matrice implantable, en médecine régénérative. Notamment, l’invention vise l’utilisation d’un tel biomatériau selon laquelle ledit biomatériau est mis en contact avec un tissu lésé, tel qu’une plaie. L’invention vise également une méthode de traitement d’un tissu lésé selon laquelle un biomatériau tel que décrit ci-dessus est appliqué contre le tissu lésé pour favoriser la réparation dudit tissu. Notamment, l’invention vise une méthode de traitement d’une plaie, et particulièrement d’une plaie chronique, selon laquelle ledit biomatériau est appliqué contre la plaie pour favoriser la cicatrisation. Dans un tel cas, le biomatériau hybride contient avantageusement des macrophages pro-cicatrisants et notamment des macrophages pro-résolutifs, éventuellement en combinaison avec des CSM. Le biomatériau peut être appliqué sous la forme d’un pansement apte à être maintenu sur la plaie. EXEMPLES MATERIEL ET METHODES A) Matrice Les polymères utilisés sont un alginate « medium viscosity » commercialisé chez Sigma (référence A-2033 ; lot 051M0054V) et un chitosan « medium molecular weight » également fourni par Sigma (référence 448877 ; lot STBF8484V). Pour l’alginate, un ratio M/G de 2,1 a été déterminé par la méthode décrite par Vilén et al. (Vilén et al., 2011). La masse moléculaire moyenne en masse (Mw) et en nombre (Mn) de l’alginate ont été déterminées par chromatographie d’exclusion stérique et sont respectivement de 193 100 et 126 900 g/mol avec un indice de polydispersité de 1,5. Pour le chitosan, le degré de déacétylation (DDA) a été calculé en appliquant la méthode de Heux et al. (Heux et al., 2000) et a été estimé à 80% +/-5%. Les valeurs Mw et Mn obtenues par chromatographie d’exclusion stérique sont respectivement de 216 300 et 120 300 g/mol avec un indice de dispersité de 1,8. Les matrices de PEC sont obtenues par mélange d’une solution d’alginate de concentration fixe de 3% (poids/volume) et d’une solution de chitosan avec 1,5% d’acide acétique et de concentration en chitosan variable selon le ratio de polymère final voulu dans les matrices. Brièvement, les solutions d’alginate et de chitosan sont homogénéisées par agitation mécanique puis sont mélangées en proportions massiques équivalentes. Après l’ajout des deux polyélectrolytes, le mélange est également mis sous agitation mécanique. Le mélange final de PEC est alors mis en plaque de culture, congelé au moins 24 heures à -20°C, puis les matrices sont lyophilisées 24 heures. Les matrices de PEC sont gélifiées pendant 1 heure avec une solution de chlorure de calcium 0,1M. Les matrices sont ensuite rincées, congelées et de nouveau lyophilisées. Ce protocole permet l’obtention d’une famille de matrices 3D de ratio alginate/chitosan allant de 80/20 à 20/80. La Figure 3 présente le cas du mélange pour obtenir une matrice de ratio 40/60. B) Cellules Les macrophages murins utilisés sont issus d’une culture primaire. Ils sont extraits de la moelle osseuse de souris C57BL6/JRj (Janvier Labs). Les ASC murines sont obtenues par digestion enzymatique et mécanique du tissu adipeux inguinal des souris C57BL6/JRj (Janvier Labs). Après euthanasie des souris par surdose de gaz carbonique, les fémurs et les tibias sont prélevés et nettoyés de telle sorte à retirer les muscles environnants. Après une désinfection des os dans de l’éthanol 70%, les deux épiphyses de chaque os sont enlevées puis le canal médullaire est lavé par injection de PBS afin de récupérer les cellules de la moelle osseuse. Une dissociation mécanique de la suspension cellulaire est effectuée à la pipette par refoulages successifs puis la suspension est filtrée à 40μm et centrifugée 10 minutes à 1500 rpm. Le culot cellulaire est alors repris dans 1 mL de tampon ACK afin de lyser les globules rouges. Le culot est repris dans 9 mL de milieu complet (DMEM glutamax, 10% SVF, 1% pénicilline/streptomycine et 1% L-glutamine) et centrifugé une seconde fois. Le culot final est repris dans 5 mL ; 10 μL sont prélevés pour le marquage au bleu trypan et comptage sur cellule de Malassez. En moyenne, on récupère entre 20 et 40 millions de cellules de la moelle osseuse par souris. Les cellules sont reprises en totalité dans du milieu complet supplémenté en M-CSF (30 ng/mL) ; elles sont ensemencées en boîte de pétri de manière à avoir 300 000 cellules/cm². Après 4 jours d’adhésion, on obtient des macrophages M0 (mΦ M0) (Martinez et al., 2006 ; Xia Zhang et al., 2008). Quatre jours après leur isolation et différenciation, les macrophages M0 ne sont pas activés et peuvent être polarisés vers un phénotype pro-résolutif M2 (mΦ M2) avec un milieu complet supplémenté en M-CSF (30 ng/mL), IL-4 (10 ng/mL) et dexamethasone (10-7M) pendant 3 jours, ou vers un phénotype pro-inflammatoire M1 (mΦ M1) avec un milieu complet supplémenté en M-CSF (30 ng/mL), IFN-γ (2 ng/mL) et LPS (100 ng/mL) pendant 24 heures. Les ASCs humaines sont isolées à partir de tissu adipeux humain obtenu après dermolipectomies abdominales. Le tissu adipeux est digéré par action mécanique puis enzymatique. Le culot cellulaire représente la fraction stromale vasculaire du tissu adipeux qui contient les ASCs. La FSV est mise ensuite en culture et les ASC sont obtenues après 8 jours de culture. Les monocytes humains sont isolés à partir de cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC) obtenus à partir de concentrés leucocytaires obtenus de différents donneurs sains. Les PBMC sont isolés par centrifugation sur gradient de Ficoll. L’anneau de PBMC est collecté et les monocytes sont isolés par adhérence ou après tri magnétique. Après une semaine de culture, les macrophages obtenus sont stimulés pendant 24 heures soit avec 100 ng/mL de M-CSF pour obtenir des macrophages non polarisés (M0-Mφ) ou 20 ng/mL d’IL-4 pour induire un phénotype pro-résolutif (M2-Mφ). C) Ensemencement Pour récupérer les macrophages, le milieu de culture est retiré et remplacé par du PBS froid contenant 2 mM d’EDTA, un chélateur de calcium. Après 5 minutes sur glace, les macrophages sont délicatement décollés à l’aide d’un râteau. La suspension est centrifugée 5 minutes à 1500 rpm, avant d’être marquée au bleu trypan pour le comptage sur cellule de Malassez. Dans les expériences de mise au contact des matrices 3D, les macrophages non activés M0 ou polarisés M1 (phénotype pro-inflammatoire) ou M2 (phénotype pro-résolutif) sont mis en culture pendant deux heures. Après adhésion des macrophages, les matrices sont déposées dans le puits de manière à ce qu’elles soient en contact direct avec les cellules. Les cellules ou le surnageant de culture sont récupérés 24 heures après pour les différentes analyses. L’ensemencement des matrices à l’état lyophilisé se fait par dépôt d’un culot cellulaire de 15 μL contenant 400 000 macrophages. La matrice absorbe rapidement le culot cellulaire puis est centrifugée 1 minute à 400 g afin de faciliter la pénétration des cellules sur toute la profondeur des matrices 3D. Enfin, du milieu complet est rajouté délicatement sur le bord du puits et les matrices sont incubées (37°C, 5% CO2). D) Récupération des macrophages après ensemencement dans les matrices 3D La première étape consiste à découper les matrices en 4 afin de maximiser le contact entre les cellules attachées à la matrice et la solution de détachement. Les échantillons sont ensuite incubés avec une solution de détachement, avant filtration. La filtration des débris successivement sur un tamis de 100 μm puis de 40 μm, puis la centrifugation des suspensions cellulaires. E) Étude de l’expression génique par RT-PCR La Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) se déroule en trois étapes successives : l’extraction de l’ARN messager des cellules, la transcription inverse de l’ARNm en ADNc puis la réaction d’amplification de l’ADNc par PCR. Au préalable, les macrophages ensemencés dans les matrices 3D ont été détachés. Le culot de macrophages détachés ainsi que les macrophages cultivés en puits (contrôles dits « 2D ») sont congelés à -80°C dans 100μl de tampon de lyse (Promega). Extraction de l’ARNm Le kit « ReliaPrep™ RNA Cell Miniprep System » (Promega) est utilisé pour extraire l’ARNm en suivant le protocole donné par le fournisseur. Les ARNm sont ensuite dosés au Nanodrop® (ND-1000). Transcription inverse La transcription inverse des ARNm en ADNc est réalisée avec le kit «Superscript Vilo cDNA synthesis kit» (Invitrogen). Pour chaque expérience, un pool d’ADNc pur est constitué en mélangeant 2 μL de chaque échantillon. Le pool est ensuite dilué au 1 /5e, 1 / 10e, 1 / 20e et 1 / 40e pour constituer une courbe standard. Les ADNc restants sont alors dilués au 1 /5e dans de l’eau sans RNAse/DNAse. PCR L’amplification des ADNc est effectuée à l’aide du kit « SYBR Green I-based real-time PCR » (Roche) dans un LightCycler® 480. Les séquences des amorces utilisées sont détaillées dans le Tableau ci-dessous. L’expression relative de chaque gène dans les échantillons est déterminée par rapport à la courbe standard et par rapport au gène de ménage ( Gapdh ). Gène Amorce Séquence Gapdh Sens 5’ AAC-TTT-GGC-ATT-GTG-GAA-GG 3’ Antisens 5’ ACA-CAT-TGG-GGG-TAG-GAA-CA 3’ Il-10 Sens 5’ TTT-TCA-CAG-GGG-AGA-AAT-CG 3’ Antisens 5’ CCA-AGC-CTT-ATC-GGA-AAT-GA 3’ Tgf-β1 Sens 5’ AGG-TTG-GCA-TTC-CAC-TTC-AC 3’ Antisens 5’ AGG-GGC-CTC-TAA-GAG-CAG-TC 3’ Tnf-α Sens 5’ AGG-CTG-TGC-ATT-GCA-CCT-CA 3’ Antisens 5’ GGG-ACA-GTG-ACC-TGC-ACT-GT 3’ Mrc1 Sens 5’ ATG-CCA-AGT-GGG-AAA-ATC-TG 3’ Antisens 5’ TGT-AGC-AGT-GGC-CTG-CAT-AG 3’ Cd36 Sens 5’ GCA-GAA-TCA-AGG-GAG-AGC-AC 3’ Antisens 5’ GAG-CAA-CTG-GTG-GAT-GGT-TT 3’ F) Étude des marqueurs de surface par cytométrie en flux Afin d’étudier l’expression de certains marqueurs de surface, les macrophages cultivés en puits (contrôle 2D) et ceux détachés des matrices 3D sont analysés par cytométrie en flux. Les suspensions cellulaires sont centrifugées, puis les culots cellulaires sont incubés à l’obscurité 20 minutes à 4°C dans du tampon Fc block (saturation des sites non spécifiques). Le marquage est ensuite réalisé à l’obscurité pendant 15 minutes à température ambiante avec les anticorps suivants dilués dans du tampon FACS : F4/80+ FITC Biolegend), CD206 APC (Biorad) et CD86 PE (Biolegend). Puis les suspensions cellulaires sont rincées et centrifugées, avant d’être incubées avec du Live/dead violet (miltenyibiotec). Enfin les échantillons sont repris dans du 186 tampon FACS avant leur acquisition au cytomètre BD Fortessa (BD Biosciences). Les analyses sont réalisées à partir du logiciel BD FACS DVIA™ (BD Biosciences). Tampon Fc block : tampon FACS supplémenté par 3% de sérum de souris, 3% de sérum de rat et le couple d’anticorps anti-CD16/CD32 au ½00 e Tampon FACS : PBS supplémenté par 5% SVF et 5 mM EDTA G) Quantification de la production des espèces réactives de l’oxygène (ROS) La production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) par les macrophages ensemencés ou non dans les matrices de PEC 40/60 a été mesurée par chimioluminescence en présence de 5-amino-2,3-dihydro-1,4- phtalazinedione (luminol) à l’aide d’un luminomètre (Envision, PerkinElmer). La génération de la chimioluminescence a été surveillée en continu pendant 30 minutes après l’incubation des cellules et/ou des matrices biopolymériques avec du luminol (66 μM) puis pendant 1 heure après stimulation à l’acétate de tétradécanoylphorbol (TPA ; 100 nM). L’analyse statistique a été effectuée à l’aide de l’aire sous la courbe exprimée en nombre x secondes. H) Etude de l’activité de l’arginase La mesure de l’activité de l’arginase est déterminée à partir des lysats cellulaires par dosage colorimétrique de la production d’urée. I) Protocole expérimental in vivo Toutes les expériences sur les souris ont été réalisées dans le respect de la règlementation en vigueur concernant l’utilisation des animaux à des fins scientifiques. Les souris utilisées dans cet essai in vivo sont des souris C57Bl/6NRJ mâles âgées de 8 semaines (Janvier Labs). Tous les animaux sont maintenus selon un cycle journalier divisé en 12 heures d’obscurité, suivies de 12h de luminosité à 22°C, avec un accès illimité à l’eau et à la nourriture. Afin d’induire un diabète de type II, un régime hyperlipidique (HFD) pendant 4 mois (régime 260 HF, Safe) est donné aux souris (Gálvez et al., 2019). Les souris sont pesées à intervalles réguliers et leur glycémie est mesurée à jeun afin de vérifier leur hyperglycémie. Les souris sont réparties aléatoirement en 4 groupes de six souris ( ). Le protocole réalisé s’étend sur une dizaine de jours ( ) et commence par la réalisation d’une plaie au jour J0. Pour ce faire, les souris sont anesthésiées à l’aide d’isoflurane. La partie dorsale et les flancs sont tondus et désinfectés puis une excision circulaire d’environ 1 cm2 est réalisée. Immédiatement après, un dispositif expérimental non invasif est implanté, mis au point par PharmaDev (FR2984719/FR2984722). Il permet entre autre le maintien des matrices 3D au niveau des plaies. Après l’opération, les souris sont placées dans une cage chauffée jusqu’à leur réveil et de la nourriture est placée directement dans leur cage pour faciliter la prise de nourriture. Après 48 heures (jour J2), les premiers traitements topiques sont appliqués : Groupe contrôle : 30 μL de milieu de culture (DMEM glutamax) ; Groupe « Matrice 3D seule » : matrice 3D stérilisée et hydratée dans du milieu de culture ; Groupe « Macrophages M2 seuls » : 200 000 macrophages polarisés M2 in vitro ; Groupe « Matrice 3D avec macrophages M2 » : matrice 3D stérilisée, ensemencée de macrophages polarisés M2 in vitro et hydratée. Ces traitements sont laissés 24 heures et sont renouvelés deux fois, aux jours J3 et J4. Le jour du sacrifice des souris, des explants de peau sont prélevés puis inclus en paraffine. Après coupe au microtome (HM 3 40 E Rotary Microtome, Thermo Scientific ™), les coupes sont colorées à l’hématoxyline et à l’éosine (coloration HE). Enfin, les lames sont scannées pour analyse (NanoZoomer Digital Pathology,Hamamatsu). Pour le deuxième protocole in vivo, les souris sont réparties aléatoirement en 4 groupes de cinq souris. Le protocole réalisé s’étend sur une dizaine de jours et commence par la réalisation d’une plaie au jour J0 (cf protocole in vivo Figure 3). Après 48 heures (jour J2), les premiers traitements topiques sont appliqués : Groupe contrôle : 30 μL de milieu de culture (DMEM glutamax) ; Groupe « Matrice 3D seule » : matrice 3D stérilisée et hydratée dans du milieu de culture ; Groupe « Matrice 3D avec macrophages M2 » : matrice 3D stérilisée, ensemencée de macrophages polarisés M2 in vitro et hydratée. Groupe « Matrice 3D avec macrophages M2 et ASC » : matrice 3D stérilisée, ensemencée de macrophages polarisés M2 in vitro et d’ASC et hydratée. Ces traitements sont laissés 24 heures et sont renouvelés deux fois, aux jours J3 et J4. Viabilité des macrophages humains et des ASC humaines dans la matrice Des macrophages pro-résolutifs humains (M2-Mφ : 2x10 5 cellules) et des ASCs humaines (2 x 10 5 cellules) sont ensemencées seuls ou en combinaison dans la matrice 3D et sont mises en culture. Après 2 et 6 jours d’ensemencement, les cellules présentes dans la matrice sont marquées avec le kit un « ReadyProbes™ Cell Viability Imaging Kit » (Invitrogen) selon les instructions du fabricant. Le réactif NucBlue™ Live marque les noyaux de toutes les cellules alors que le NucGreen™ Dead marque uniquement les noyaux des cellules mortes. Après 20 minutes de marquage, les matrices sont lavées 3 fois au PBS et la fluorescence est détectée par microscopie confocale (LSM880, Zeiss). Le nombre de cellules total ainsi que le nombre de cellules mortes sont évaluées par une analyse automatisée des photos sur Fidji (Macro développée au laboratoire Restore) (Analyse de 5 photos par condition). Mesure de la production de cytokines par les macrophages humains et des ASC humaines ensemencés dans la matrice Des ASC humaines (1x10 5 cellules) et différentes populations de Mφ humains (1x10 5 cellules) sont ensemencées seules ou associées dans la matrice 3D. Après 12h d’ensemencement, le milieu est changé et les matrices contenant les cellules sont remises en culture et stimulées ou non avec du LPS (10 ng/mL). Après 24h de culture, les surnageants sont récupérés et les concentrations d’IL-6, d’IL-1β et d’IL-10 sont déterminées par ELISA suivant les instructions du fournisseur (Invitrogen). RESULTATS A) Analyse de la rétention, de la viabilité et répartition des macrophages dans les matrices 3D Pour valider les matrices 3D comme supports de macrophages M2 pro-résolutifs pour la thérapie cellulaire, la rétention, la viabilité et la répartition de ces macrophages au sein des matrices 3D ont été étudiés. Le taux de rétention des mΦ M2 après ensemencement a été évalué par quantification des protéines totales extraites. Les résultats montrent que le taux de rétention est élevée (environ 85%). L’étude de la viabilité des macrophages M2 au sein de la matrice 3D PEC40/60 a été suivie qualitativement par microscopie confocale en « live imaging ». Les matrices 3D hydratées ont été imagées longitudinalement et transversalement ( ). L’analyse des reconstructions a permis de montrer une viabilité des macrophages M2 de 89±3% après 24 heures d’ensemencement dans la matrice 3D. Ce marquage informe également sur la répartition spatiale des mΦ M2 dans les matrices. Aucune régionalisation n’est constatée. Bien au contraire, les mΦ M2 se répartissent de manière homogène autant en surface qu’en profondeur. De façon intéressante, après 21 jours de culture, les mΦ M2 présentent toujours une bonne viabilité dans les matrices 3D. En conclusion, les matrices 3D associant l’alginate et le chitosan PEC 40/60 constituent un support 3D optimal de macrophages M2 pour la thérapie cellulaire. B) Effet de la matrice selon l’invention sur le phénotype des macrophages L’effet des matrices 3D alginate-chitosan (sur la polarisation de macrophages activés vers un phénotype M0, M1 et M2 a été étudié. Pour ce faire des matrices alginate-chitosan (40/60) ont été mises au contact de macrophages (mΦ M0, M1 ou M2) pendant 24 heures et le niveau d’expression des ARNm codant pour les cytokines pro- et anti-inflammatoires (Tnf-α, Il-10, Tgf-β1) a été étudié ( ). L’expression génique et protéique de récepteurs membranaires caractéristiques des phénotypes M1 (Cd86) et M2 (Cd206, Cd36) a également été étudiée ( et Figure 5). Cette première caractérisation phénotypique a ensuite été complétée par des analyses fonctionnelles comme l’étude du métabolisme de l’arginine ou encore la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS). Tout d’abord, ces analyses ont permis de valider la polarisation M0, M1 ou M2 des macrophages en culture après leur isolation de la moelle osseuse et traitement par différents inducteurs. De plus, elles montrent qu’au contact des matrices 3D alginate-chitosan les macrophages s’orientent vers un phénotype M2. En effet, les matrices 3D alginate-chitosan semblent d’une part potentialiser le phénotype des macrophages M2 en augmentant l’expression de marqueurs M2 (Il-10, Tgf-β1, Cd206, Cd36) et en diminuant l’expression de marqueurs M1 (Tnf-α, Cd86) ; et d’autre part orienter les macrophages non activés M0 vers un phénotype M2. De manière tout aussi intéressante, les macrophages M1 au contact des matrices présentent une expression plus faible des marqueurs pro-inflammatoires caractéristiques des macrophages M1 (Tnf-α et le Cd86). L’ensemble de ces résultats démontre que le contact des macrophages M2 avec les matrices 3D alginate-chitosan ne modifie pas leur phénotype. De plus, les matrices semblent orienter les macrophages M0 et M1 vers un phénotype M2 et potentialiser le phénotype M2 des macrophages M2. Dans un but d’explorer l’impact des matrices alginate-chitosan sur les fonctions effectrices des macrophages le métabolisme de l’arginine ( ) et le stress oxydant ( ) ont été évalués. Le métabolisme de l’arginine est au centre des différentes fonctions associées aux phénotypes M1 et M2 des macrophages (mΦ). En effet, il existe une compétition entre l’oxyde nitrique synthase (NOS) et l’arginase pour le substrat L-arginine (Mills, 2012 ; Rath et al., 2014 ; Shearer et al., 1997). Notamment, l’urée est fréquemment dosée pour évaluer l’activité de l’arginase, enzyme caractéristique des macrophages M2 (Csonka et al., 2015). Les macrophages M0 et M2 présentent une production d’urée significativement plus forte au contact des matrices 3D alginate-chitosan, démontrant une activité plus importante de l’arginase au niveau de ces macrophages ( ). Concernant la production de ROS, comme attendu, la capacité des macrophages M1 à produire des ROS est plus importante que celle des macrophages M0 et M2 après stimulation au TPA. Cette capacité à produire des ROS est fortement diminuée dans les macrophages M1 et M2 mis en contact avec les matrices ( ). Ces résultats montrent que les matrices 3D alginate-chitosan sont capables d’orienter les fonctions des macrophages M0 et M1 vers des fonctions caractéristiques des macrophages M2 et de potentialiser les fonctions spécifiques des macrophages M2. Pour conclure, l’ensemble de ces premiers résultats ont permis de mettre en évidence le maintien du phénotype et des fonctions des macrophages M2 par les matrices 3D selon l’invention. De plus, les matrices 3D semblent orienter les macrophages M0 vers un phénotype M2 et atténuer la polarisation M1. C) Étude in vivo de l’association macrophages pro-résolutifs / matrices 3D sur un modèle murin de plaie dans un contexte de diabète de type 2 Avant la réalisation des plaies, la glycémie à jeun ainsi que le poids des souris mises sous régime HFD ont été vérifiées. Ces valeurs ont été comparées à celle d’un groupe contrôle « normal chow » constitué de souris C57Bl/6 alimentées normalement. La masse moyenne des souris sous régime hyperlipidique (HFD) est plus importante que celle des souris contrôles (51,5 ± 0,5 g vs 25,2 ± 0,9 g). Quant à leur glycémie à jeun, elle atteint une valeur significativement plus élevée que celle du groupe contrôle (183,2 ± 6,3 mg/dl vs 128,3 ± 4,5 mg/dl). Une fois ce modèle validé, des plaies cutanées ont été réalisées sur partie dorsale par excision circulaire d’environ 1 cm2. Immédiatement après, un dispositif expérimental non invasif (FR2984719/FR2984722) a été implanté. Il permet entre autres le maintien des matrices 3D au niveau des plaies. Les traitements ont débuté 48 heures après avoir réalisé les plaies, de manière à ne pas interférer avec la phase inflammatoire, dont le bon déroulement permet l’activation des phases ultérieures de la cicatrisation (Jetten et al., 2014). Les traitements consistent à appliquer topiquement sur la plaie soit du milieu de culture (groupe contrôle), 200 000 macrophages M2 (mΦ M2) ou une matrice 3D hydratée seule ou ensemencée avec 200 000 macrophages M2. Grace au dispositif expérimental non invasif, la fermeture des plaies a été suivie quotidiennement par prise de photographies standardisées, depuis la réalisation de la plaie à J0 jusqu’au sacrifice des souris à J15. D’un point de vue quantitatif, la fermeture des plaies a été déterminée par mesure quotidienne de la surface des plaies pour chaque souris. Les résultats sont présentés en pourcentage de fermeture des plaies par rapport à la surface de celles-ci le jour où le traitement est commencé (J2) ( ). On peut ainsi constater que l’ajout local de macrophages M2 au niveau des plaies n’améliore pas la fermeture de la plaie. De façon intéressante, l’application des matrices 3D seules hydratées accélère la fermeture de la plaie avec un effet significatif plutôt aux stades précoces (J4 à J7). Ce résultat corrèle avec l’orientation des macrophages M0 vers un phénotype M2 et l’atténuation du profil M1 constatés lors de la mise en contact des macrophages avec les matrices 3D. Dès J4 et jusqu’à J15, l’application des matrices 3D ensemencées de macrophages M2 accélère significativement la fermeture des plaies par rapport au groupe contrôle. Ainsi, l’effet bénéfique pro-cicatrisant des matrices seules est potentialisé par l’ajout de macrophages M2. Ces résultats montrent que l’association des matrices PEC 40/60 à des macrophages pro-résolutifs permet une fermeture des plaies plus rapide. L’association de la matrice selon l’invention à des macrophages pro-résolutifs montre un effet synergique sur la fermeture des plaies. Le biomatériau selon l’invention permet donc (i) d’ agir comme une barrière aux agents infectieux de l’environnement, (ii) au contact de la plaie d’entrainer une orientation des macrophages endogènes de la plaie vers un phénotype anti-inflammatoire mais aussi (iii) de maintenir la viabilité et la fonctionnalité pro-résolutive des macrophages. D) Evaluation de la qualité cicatricielle Afin d’investiguer la qualité de la peau néoformée, des colorations à l’hématoxyline et à l’éosine sur des coupes histologiques réalisée à J15 ont été réalisées. Plusieurs scores ont été mis au point afin d’homogénéiser l’analyse qualitative des coupes de peau après cicatrisation (Gantwerker & Hom, 2011 ; Gupta & Kumar, 2015) (Figure 10). Le score a été déterminé sur la base des paramètres suivants : la présence de cellules inflammatoires ; la qualité de l’épiderme (continuité et épaisseur par rapport à la peau saine) ; la qualité du derme (continuité, présence de follicules pileux) ; la présence d’une croûte (si oui, détachement et/ou présence de cellules inflammatoires). L’analyse qualitative des lames a été réalisée par deux opérateurs différents, et des scores allant de 0 à 15 ont été attribués (le score est d’autant plus faible que la qualité de la peau néoformée est élevée). Le score histologique est plus faible chez les souris ayant été traitées par la matrice 3D ensemencée par les macrophages pro-résolutifs. L’analyse histologique des coupes de peau par coloration à l’hématoxyline et à l’éosine révèle une meilleure qualité du tissu cicatriciel en termes de continuité du derme et de l’épiderme, ainsi qu’une moindre présence de cellules inflammatoires au niveau des plaies traitées par les matrices 3D associées à des macrophages pro-résolutifs. E) Viabilité et fonctionnalité des différents types cellulaires (M2-Mφ humains et ASC humaines) dans la matrice Les résultats montrent que, bien que les macrophages et les ASC aient été ensemencés en quantité identique, dès J2 les ASC sont présentes en plus grand nombre, révélant ainsi une viabilité un peu plus importante que les M2-MΦ. De manière très intéressante, l’association entre les deux types cellulaires augmente de manière significative le nombre des deux types cellulaires ainsi que leur viabilité dans la matrice ( ). De manière très intéressante, les résultats montrent que l’association entre les ASCs et les différents types de macrophages induit une production plus importante d’IL-10 et une production explosive d’IL-6, deux cytokines jouant un rôle central dans la résolution de l’inflammation et dans la réparation tissulaire. En présence de LPS, l’induction de la production d’IL-1beta par les macrophages de la matrice est fortement inhibée par le co-ensemencement avec les ASC ( ). L’ensemble de ces résultats démontrent l’intérêt d’associer les macrophages et les ASC dans la matrice pour augmenter leur viabilité et promouvoir un environnement pro-résolutif et réparateur. F) Étude in vivo de l’association macrophages pro-résolutifs / ASC dans la matrice 3D sur un modèle murin de plaie dans un contexte de diabète de type 2 Suite aux résultats obtenus précédemment (C-E), un deuxième protocole in vivo murin a été réalisé pour évaluer l’effet de l‘association des Macrophages M2 avec les ASC dans la matrice sur la cicatrisation dans un contexte de diabète de type 2. Grâce au dispositif expérimental non invasif utilisé précédemment, la fermeture des plaies a été suivie quotidiennement par prise de photographies standardisées, depuis la réalisation de la plaie à J0 jusqu’au sacrifice des souris à J14. D’un point de vue quantitatif, la fermeture des plaies a été déterminée par mesure quotidienne de la surface des plaies pour chaque souris. Les résultats sont présentés en pourcentage de fermeture des plaies à J14 (jour du sacrifice) par rapport à la surface de celles-ci le jour où la plaie est réalisée. Comme attendu ( ), l’application des matrices 3D ensemencées de macrophages M2 améliore la fermeture des plaies par rapport au groupe contrôle. De façon intéressante, l’association des macrophages M2 avec les ASC augmente significativement le pourcentage de fermeture de la plaie à J14 par rapport aux souris n’ayant reçu aucun traitement. De plus, la quantification du tissu de comblement montre clairement un tissu de comblement plus important dans le groupe ayant reçu la matrice contenant les macrophages M2 et les ASC par rapport aux autres groupes. Ainsi, l’effet bénéfique pro-cicatrisant des matrices ensemencées de macrophages M2 semble être potentialisé par l’ajout d’ASC. Ces résultats montrent que l’association des matrices PEC 40/60 à des macrophages pro-résolutifs et des ASC permet un comblement des plaies et une fermeture plus rapide. Biomatériau tridimensionnel comprenant une matrice de complexes de polyélectrolytes (PEC) à base d’alginate et de chitosan modifiés ou non, et des macrophages, ladite matrice présentant une macroporosité ouverte interconnectée dans laquelle le ratio massique alginate/chitosan est compris entre 20/80 et 80/20. Biomatériau selon la revendication 1, dans lequel le ratio massique alginate/chitosan est de 40/60. Biomatériau selon la revendication 1 ou 2, dans lequel l’alginate présente un ratio M/G compris entre 1,4 et 2,7, préférentiellement égal à 2 +/-0,2, un poids moléculaire (Mw) compris entre 150.000 et 250.000, et un indice de polydispersité (IP) inférieur à 2, préférentiellement d’environ 1,5. Biomatériau selon l’une des revendications 2 ou 3, dans lequel le chitosan présente un degré de déacétylation (DDA) compris entre 75% et 90%, préférentiellement entre 75 et 85%, un Mw compris entre 130.000 et 400.000, préférentiellement entre 200.000 et 400.000, et un indice de polydispersité inférieur à 2, préférentiellement d’environ 1,8. Biomatériau hybride selon l’une des revendications précédentes, comprenant des macrophages pro-cicatrisants. Biomatériau hybride selon la revendication 5, dans lequel les macrophages pro-cicatrisants sont des macrophages pro-résolutifs. Biomatériau hybride selon l’une des revendications précédentes, comprenant des macrophages pro-cicatrisants et des cellules stromales mésenchymateuses (CSM), le ratio macrophages pro-cicatrisant / cellules stromales mésenchymateuses étant préférentiellement compris entre 1/99 et 99/1. Procédé de préparation d’un biomatériau hybride selon l’une des revendications 1 à 7, comprenant les étapes : (a) cultiver des monocytes et/ou des macrophages dans des conditions permettant d’obtenir des macrophages pro-cicatrisant ; (b) préparer une matrice de complexes de polyélectrolytes (PEC) à base d’alginate et de chitosan dans des proportions relatives comprises entre 40/60 et 60/40 ; (c) éventuellement sécher la matrice de PEC ; (d) stériliser la matrice de PEC ; (e) ensemencer la matrice de PEC avec des macrophages pro-cicatrisants obtenus à l’étape (a) éventuellement combinés avec des CSM. Procédé de préparation d’un biomatériau hybride selon la revendication 8, dans lequel l’étape (d) de stérilisation est une stérilisation par irradiation par faisceaux d’électrons pulsés de faible énergie ou une stérilisation par irradiation par faisceaux d’électrons continus de faible énergie. Pansement cutané destiné à la médecine régénérative comprenant un biomatériau tridimensionnel selon l’une des revendications 1 à 7. Macrophages pro-cicatrisants, éventuellement combinés à des CSM, pour leur utilisation en médecine régénérative chez un sujet, caractérisés en ce que lesdits macrophages pro-cicatrisants et les éventuels CSM sont sous une forme adaptée à leur administration audit sujet au moyen d’un biomatériau tridimensionnel selon l’une des revendications 1 à 7. Macrophages pro-cicatrisants, éventuellement combinés à des CSM, pour leur utilisation selon la revendication 11, pour le traitement d’une plaie, notamment d’une plaie chronique. Macrophages pro-cicatrisants, éventuellement combinés à des CSM, pour leur utilisation selon la revendication 12, caractérisés en ce que le sujet présente un diabète et/ou est un sujet âgé. Macrophages pro-cicatrisants, éventuellement combinés à des CSM, pour leur utilisation selon l’une des revendications 11 à 13, caractérisés en ce que le biomatériau tridimensionnel est sous la forme d’un pansement, d’un patch, ou d’une matrice implantable. Macrophages pro-cicatrisants, éventuellement combinés à des CSM, pour leur utilisation selon l’une des revendications 11 à 14, caractérisé en ce que lesdits macrophages pro-cicatrisants et les éventuelles CSM ont été préalablement obtenus à partir de cellules dudit sujet parmi, des cellules de moelle osseuse, des iPS ou monocytes sanguins, et ASC du tissu adipeux. Kit destiné à la médecine régénérative, et notamment au traitement d’une plaie, telle qu’une plaie chronique, ledit kit comprenant : - une matrice de PEC à base d’alginate et de chitosan, ladite matrice présentant une macroporosité ouverte interconnectée dans laquelle le ratio massique alginate/chitosan est compris entre 20/80 et 80/20, préférentiellement de 40/60 ; - un milieu de culture adapté à la culture des monocytes ou macrophages pro-cicatrisants et/ou un milieu de culture adapté à la différenciation de cellules de moelle osseuse en macrophages de phénotype pro-cicatrisants. Kit selon la revendication 16, dans lequel la matrice de PEC est stérilisée.