Brevet FR3149977A1 — publié le 20241220

Dans ce procédé d’analyse métabolomique d’un échantillon biologique, on met en œuvre les étapes suivantes : - on réalise une spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) de l’échantillon pour déterminer un spectre en concentration (2) des métabolites compris dans l’échantillon et une mesure d’au moins un paramètre dynamique des métabolites, - on discrétise les spectres pour obtenir une matrice de données de concentration et au moins une matrice de données de paramètre dynamique, et - on réalise une comparaison, par exemple au moyen d’une analyse en composantes principales, entre les données des matrices et des données de référence. Figure pour l’abrégé : figure 1 Procédé d’analyse métabolomique d’échantillons biologiques par intégration des paramètres dynamiques de la RMN L’invention concerne la métabolomique. Plus particulièrement, l’invention concerne un procédé d’analyse métabolomique d’échantillons biologiques qui permet d’augmenter le pouvoir de discrimination de la méthode par l’intégration des paramètres dynamiques RMN dans le traitement statistique, ainsi que des moyens techniques permettant la mise en œuvre d’un tel procédé. La métabolomique vise à caractériser et identifier des biomarqueurs produits, utilisés et excrétés par les cellules, organes ou organisme, associés à des états systémiques définis. Parmi les applications courantes de la métabolomique, on peut citer l’identification des conditions de santé humaine, le diagnostic des maladies et le test de l’efficacité et de la toxicité des médicaments. A titre d’exemple plus précis, il est possible d’appliquer la métabolomique dans le diagnostic du cancer par analyse de tissus ou de liquide physiologique et par comparaison avec des échantillons de référence sains ou avec une base de données de référence. Il est connu de l’état de la technique de réaliser une telle analyse en effectuant une spectroscopie par résonance magnétique nucléaire, communément désigné par le sigle RMN, de l’échantillon pour déterminer un spectre en concentration des métabolites compris dans l’échantillon. Cette technique de mesure permet d’identifier les métabolites compris dans l’échantillon et de déterminer leur concentration, de manière connue en soi. Le spectre obtenu est ensuite traité puis comparé à des données de références, issues généralement d’un spectre similaire obtenu par spectroscopie RMN d’un échantillon sain ou d’une base de données de référence préétablie, dans le but d’identifier d’éventuelles différences significatives entre les deux spectres et d’obtenir un diagnostic. Le document WO 2011 041892 A1 décrit la mise en œuvre d’une telle analyse. Ce type d’analyse permet d’obtenir des résultats intéressants mais peuvent présenter des limites dans l’exploitation qui peut être faite des résultats de l’analyse. L'invention a notamment pour but d’améliorer la robustesse du procédé d’analyse métabolomique. A cet effet l’invention a pour objet un procédé d’analyse métabolomique d’un échantillon biologique, dans lequel on met en œuvre les étapes suivantes : - on réalise une spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) de l’échantillon pour déterminer un spectre en concentration des métabolites compris dans l’échantillon et un spectre d’au moins un paramètre dynamique des métabolites, - on discrétise les spectres pour obtenir une matrice de données de concentration et au moins une matrice de données de paramètre dynamique, et - on réalise une comparaison, par une analyse statistique multivariée, par exemple au moyen d’une analyse en composantes principales (ACP) ou supervisée (analyse discriminante par projection orthogonale, OPLS-DA), avantageusement entre les données des matrices et des données de référence. Ainsi, en supplément de l’obtention et de l’exploitation d’un spectre RMN en concentration des métabolites de l’échantillon conformément à l’approche conventionnelle décrite plus haut, on obtient et on exploite au moins un spectre additionnel permettant de caractériser un ou plusieurs paramètres dynamiques des métabolites fournissant des informations sur leurs mouvements moléculaires et les interactions qu’ils subissent au sein de l’échantillon. Ces informations supplémentaires permettent de raffiner l’analyse métabolomique réalisée en augmentant son pouvoir discriminant et donc sa robustesse. Ainsi, en combinant des données quantitatives (concentration) et dynamiques, il est possible non seulement d’augmenter le pouvoir discriminant de certains métabolites mais également de révéler des métabolites significatifs par leurs dynamiques alors qu’ils ne l’étaient pas par leurs concentrations considérées isolément. En effet, on comprend que la multiplication des données mesurées, et implicitement des données de référence, permet de réaliser une comparaison plus fine entre les données d’un échantillon et des données de référence. Avantageusement, on réalise une spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) de l’échantillon pour déterminer un spectre d’au moins un des paramètres dynamiques des métabolites parmi la liste suivante : coefficient de diffusion (D), premier temps de relaxation longitudinale (T 1 ), second temps de relaxation transversale (T 2 ), troisième temps de relaxation longitudinale dans le repère tournant (T 1rho ). L’au moins un paramètre dynamique peut ainsi être facilement mesuré par une spectroscopie par résonance magnétique nucléaire, tout comme les données de concentration, de sorte que le procédé n’exige pas des moyens techniques supplémentaires considérables pour sa mise en œuvre. En d’autres termes, ce procédé ne demande pas beaucoup plus de ressources techniques que le procédé conventionnel de l’art antérieur. En outre, les paramètres de la liste correspondent à des paramètres qui permettent de caractériser efficacement les aspects dynamiques des métabolites compris dans l’échantillon. De préférence, on réalise une spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) de l’échantillon pour mesurer plusieurs paramètres dynamiques de la liste, voire tous les paramètres de la liste. On améliore ainsi davantage la robustesse du procédé d’analyse métabolomique. Selon un premier mode de réalisation de l’invention, pendant l’étape de réalisation de la comparaison, les données de concentration et les données de paramètre dynamique sont comparées, en tant que telles, aux données de référence. Selon un deuxième mode de réalisation de l’invention, après l’étape de discrétisation, on assemble la matrice de données de concentration et l’au moins une matrice de données de paramètre dynamique pour obtenir une matrice de données globale. Dans ce cas, plusieurs traitements statistiques peuvent être envisagés, comme par exemple le traitement en multi-blocs. Selon un troisième mode de réalisation de l’invention, après l’étape de discrétisation, on pondère la matrice de données de concentration par l’au moins une matrice de données de paramètre dynamique. Cette pondération peut également être obtenue directement par spectroscopie RMN par l’application de filtres de relaxation ou de diffusion pour obtenir un spectre en concentration pondéré par un paramètre dynamique. Dans le premier mode de réalisation, on compare les données de chacun des spectres avec autant de données de référence. Dans le deuxième mode de réalisation, les données sont d’abord regroupées, puis ce sont ces données regroupées qui sont comparées à des données de référence. Dans le troisième mode de réalisation, on effectue une pondération des données de concentration par les données de paramètres dynamiques avant d’effectuer la comparaison avec des données de référence. Les données des spectres RMN peuvent ainsi être exploitées de plusieurs façons différentes, ce qui confère une certaine souplesse à la mise en œuvre de l’invention. On prévoit également selon l’invention un support d’enregistrement lisible par ordinateur comprenant des instructions qui, lorsqu’elles sont exécutées par un ordinateur, conduisent celui-ci à mettre en œuvre un procédé tel que défini dans ce qui précède. On prévoit aussi selon l’invention un programme d’ordinateur comprenant des instructions qui, lorsque le programme est exécuté par un ordinateur, conduisent celui-ci à mettre en œuvre un procédé tel que défini dans ce qui précède. Brève description des figures L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui va suivre donnée uniquement à titre d'exemple et faite en se référant aux dessins annexés dans lesquels : est une représentation graphique d’un spectre RMN obtenu lors de la mise en œuvre d’un procédé d’analyse métabolomique selon l’invention, illustre des matrices de données obtenues par discrétisation de spectres tels que celui de la , et est une représentation graphique d’une étape de comparaison par analyse en composantes principales basée sur les données des matrices de la . Description détaillée On a représenté en le résultat d’une première étape d’un procédé d’analyse métabolomique d’un échantillon biologique selon l’invention. Cet échantillon biologique est par exemple un échantillon de liquide physiologique, il s’agit ici d’un échantillon contenant des lignées cellulaires cancéreuses provenant d’un cancer du sein. Dans cette première étape, on réalise une spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) de l’échantillon pour déterminer un spectre en concentration 2 des métabolites compris dans l’échantillon et un spectre avec une mesure d’au moins un paramètre dynamique des métabolites. Le paramètre dynamique est ici choisi parmi la liste suivante : coefficient de diffusion D, premier temps de relaxation longitudinale T 1 , second temps de relaxation transversale T 2 , troisième temps de relaxation longitudinale dans le repère tournant T 1rho . On désignera ces spectres obtenus par spectroscopie de l’échantillon par l’expression « spectres échantillons ». Alternativement, on réalise également de telles spectroscopies avec des échantillons biologiques de référence, ou bien on importe d’une base de données préexistante un ou plusieurs spectres de référence. Dans les deux cas, on appellera dans ce qui suit « spectre de référence » tout spectre effectivement obtenu par spectroscopie d’un échantillon de référence ou bien importé de la base de données. La illustre le spectre en concentration 2 obtenu par la mise en œuvre d’une telle spectroscopie, dont la représentation graphique présente le déplacement chimique δ en abscisse et l’amplitude A du signal en ordonnée. De manière connue en soi, la présence d’un pic à une certaine valeur de déplacement chimique est attribuée à la présence d’un métabolite déterminé en concentration proportionnelle à l’amplitude du signal. De la même manière, pour un spectre en paramètre dynamique choisi parmi la liste précitée, la présence d’un pic à une certaine valeur de déplacement chimique est attribuée à la présence d’un métabolite déterminé pour lequel la valeur du paramètre dynamique est mesurée avec les techniques disponibles dans la bibliothèque des séquences d’impulsions des spectromètres RMN. Après la mise en œuvre de cette première étape, on dispose d’un spectre échantillon en concentration, d’un ou plusieurs spectres échantillons en paramètre dynamique. On dispose également de p spectres de référence en concentration et de m x p spectres de référence en paramètre dynamique, p étant un entier naturel non nul et m correspondant au nombre de paramètres dynamiques de la liste retenus, m étant compris entre 1 et 4 dans le cas présent. On procède alors à une deuxième étape du procédé d’analyse métabolomique lors de laquelle on discrétise chacun des spectres. Comme cela est illustré sur la , la discrétisation consiste à séparer l’axe des abscisses en un nombre fini n d’intervalles 4 permettant de couvrir l’intégralité du spectre. On attribue à chacun de ces intervalles 4 une valeur centrale de déplacement chimique et une valeur du signal obtenue par intégration de la courbe sur l’intervalle. Il en est de même pour les paramètres dynamiques où on attribue à chaque intervalle au moins une valeur d’un paramètre dynamique. Cette discrétisation permet de faciliter le traitement de données des spectres. On a représenté en le résultat d’une deuxième étape du procédé d’analyse métabolomique. Dans cette deuxième étape, on construit une matrice 6 de concentration dans laquelle chaque ligne correspond à un des spectres notés S1, S2, …etc., le spectre échantillon en concentration ou l’un des spectres de référence en concentration, et chaque colonne correspond à un des intervalles 4 construits lors de la discrétisation des spectres. Chaque intersection ligne/colonne est rempli avec la valeur de l’intégrale de l’intensité du signal du spectre sur l’intervalle en question, transformé de manière connue en soi en la valeur de la concentration. Par construction, la matrice 6 en concentration comprend n colonnes et p +1 lignes. De la même manière, on construit m matrices 6 de paramètre dynamique. Pour chaque paramètre dynamique retenu, la matrice de paramètre dynamique est telle que chaque ligne correspond à un des spectres, le spectre échantillon en paramètre dynamique ou l’un des spectres de référence en paramètre dynamique, et chaque colonne correspond à un des intervalles 4 construits lors de la discrétisation des spectres. Chaque intersection ligne/colonne est rempli avec la valeur du paramètre dynamique. Par construction, on obtient m matrices 6 en paramètre dynamique, chacune d’entre elles comprenant n colonnes et p +1 lignes. On a représenté en le résultat d’une troisième étape du procédé d’analyse métabolomique. Dans cette troisième étape, on réalise une comparaison par analyse en composantes principales entre les données des matrices 6 correspondant aux spectres échantillons et les données des matrices 6 correspondant aux spectres de référence. La est une représentation graphique d’une opération communément désignée par l’expression anglo-saxonne « score plotting » et largement connue dans le domaine de l’analyse statistique, de sorte qu’elle ne sera pas décrite davantage dans ce qui suit. A l’aide de cette comparaison, il est possible de qualifier un état de l’échantillon, notamment dans l’une des applications mentionnées dans le préambule de la présente demande de brevet. D’un point de vue technique, la comparaison dans le cadre de l’invention peut être mise en œuvre de plusieurs façons différentes. Selon un premier mode de réalisation de l’invention, pendant l’étape de réalisation de la comparaison, les données de concentration et les données de paramètre dynamique sont comparées, en tant que telles, aux données de référence. Il s’agit d’une méthode simple à mettre en œuvre ne nécessitant pas un traitement supplémentaire des matrices. Selon un deuxième mode de réalisation de l’invention, après l’étape de discrétisation, on assemble la matrice de données de concentration et l’au moins une matrice de données de paramètre dynamique pour obtenir une matrice de données globale. Selon cette méthode, on effectue une seule opération de comparaison, par exemple une seule opération dite de « score plotting », ce qui diminue le temps de traitement lié à la mise en œuvre de l’opération de comparaison. Selon un troisième mode de réalisation de l’invention, après l’étape de discrétisation, on pondère la matrice de données de concentration par l’au moins une matrice de données de paramètre dynamique. Cette pondération permet de raffiner les données obtenues. D’un point de vue mathématique, pour réaliser cette pondération, on multiplie ou on divise les valeurs de chaque cellule de la matrice de données de concentration par la ou les valeurs de la ou les matrices de données de paramètre dynamiques contenue(s) dans la même cellule. En d’autres termes, pour tout couple (i ; j) définissant une cellule existante de la matrice de concentration, on multiplie ou on divise la valeur de concentration de la cellule (i ; j) par la ou les valeurs de la cellule (i ; j) de la ou les matrices de données de paramètre dynamique. L'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation présentés et d'autres modes de réalisation apparaîtront clairement à l'homme du métier. On peut prévoir que plusieurs échantillons fassent l’objet d’une spectroscopie RMN. Si on note q le nombre d’échantillons testés, alors les matrices comprennent p + q lignes. L’invention est applicable à l’analyse d’échantillons autres que des échantillons biologiques. On peut notamment citer des échantillons alimentaires, par exemple du miel ou des produits animaliers en sortie d’abattoir, et des échantillons relevant de la science des matériaux pour réaliser du contrôle de qualité. Liste de références 2 : spectre en concentration 4 : intervalle 6 : matrice 8 : analyse en composant principal Procédé d’analyse métabolomique d’un échantillon biologique, caractérisé en ce qu’on met en œuvre les étapes suivantes : - on réalise une spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) de l’échantillon pour déterminer un spectre en concentration (2) des métabolites compris dans l’échantillon et un spectre avec une mesure d’au moins un paramètre dynamique des métabolites, - on discrétise les spectres pour obtenir une matrice (6) de données de concentration et au moins une matrice (6) de données de paramètre dynamique, et - on réalise une comparaison, par une analyse statistique multivariée, entre les données des matrices et des données de référence. Procédé d’analyse métabolomique d’un échantillon biologique selon la revendication précédente, dans lequel la comparaison est réalisée au moyen d’une analyse en composantes principales (8) ou supervisée. Procédé d’analyse métabolomique d’un échantillon biologique selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel on réalise une spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) de l’échantillon pour déterminer un spectre d’au moins un des paramètres dynamiques des métabolites parmi la liste suivante : coefficient de diffusion (D), premier temps de relaxation longitudinale (T 1 ), second temps de relaxation transversale (T 2 ), troisième temps de relaxation longitudinale dans le repère tournant (T 1rho ). Procédé d’analyse métabolomique d’un échantillon biologique selon la revendication précédente, dans lequel on réalise une spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) de l’échantillon pour mesurer plusieurs paramètres dynamiques de la liste, voire tous les paramètres de la liste. Procédé d’analyse métabolomique d’un échantillon biologique selon l’une quelconque des revendications 2 à 4, dans lequel pendant l’étape de réalisation de la comparaison, les données de concentration et les données de paramètre dynamique sont comparées, en tant que telles, aux données de référence. Procédé d’analyse métabolomique d’un échantillon biologique selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel après l’étape de discrétisation, on assemble la matrice (6) de données de concentration et l’au moins une matrice (6) de données de paramètre dynamique pour obtenir une matrice de données globale. Procédé d’analyse métabolomique d’un échantillon biologique selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel après l’étape de discrétisation, on pondère la matrice (6) de données de concentration par l’au moins une matrice (6) de données de paramètre dynamique. Support d’enregistrement lisible par ordinateur comprenant des instructions qui, lorsqu’elles sont exécutées par un ordinateur, conduisent celui-ci à mettre en œuvre un procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 7. Programme d’ordinateur comprenant des instructions qui, lorsque le programme est exécuté par un ordinateur, conduisent celui-ci à mettre en œuvre un procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 7.