Brevet FR3146214A1 — publié le 20240830

Lame optique (LO) destinée à recevoir un échantillon biologique (E) dans un dispositif de microscopie de fluorescence par réflexion totale interne, la lame optique comprenant : une couche dite substrat (SB) transparente dans une région spectrale prédéterminée un empilement dit optimisé disposé au dessus du substrat (SB) et comprenant un nombre de couches minces diélectriques successives et alternées d’un premier matériau diélectrique et d’un deuxième matériau diélectrique, chacune des couches présentant une épaisseur dite optimisée respective, les épaisseurs optimisées et le nombre de couches minces diélectriques étant adaptés de manière à ce que ladite lame optique présente au moins : une première absorption résonnante à une longueur d’onde dite d’illumination et à un premier angle d’incidence en régime de réflexion totale interne, et une deuxième absorption résonnante à la longueur d’onde d’illumination et à un deuxième angle d’incidence en régime de réflexion totale interne, avec et ou . Fig. 3 Lame optique destinée à la microscopie par réflexion totale interne, dispositif de microscopie par réflexion totale interne comportant une telle lame et procédé de fabrication d’une telle lame L’invention s’inscrit dans le domaine de la microscopie optique. Plus particulièrement, l’invention concerne un nouveau concept de lame optique basée sur un empilement multicouche comme support d’exaltation du champ électromagnétique adapté à la microscopie à réflexion totale interne. L’invention s’applique notamment, mais non exclusivement, au domaine de l’imagerie d’échantillons biologiques par microscopie de fluorescence à réflexion totale interne ou microscopie TIRF (pour « Total Internal Reflection Fluorescence » ). Une telle technique d’imagerie est particulièrement bien adaptée à la visualisation, l’analyse et la quantification d’évènements moléculaires s’effectuant notamment à la membrane plasmique des cellules biologiques. La microscopie de fluorescence à onde évanescente est une technique de microscopie de fluorescence dans laquelle l’excitation des molécules fluorescentes contenues dans l’échantillon observé est confinée à une région d’épaisseur nanométrique, située à proximité immédiate de la lamelle porte-échantillon. Elle permet, en particulier, d’observer de manière sélective des structures et processus localisés sur une membrane cellulaire, avec une résolution spatiale dans une direction axiale bien meilleure que la limite de diffraction. En outre, par rapport aux techniques d’épi-fluorescence plus conventionnelles, elle permet d’obtenir un meilleur contraste de l’image de fluorescence et de réduire les effets de photo-blanchiment et des dégâts d’irradiation des cellules. Le principe à la base de la microscopie de fluorescence à onde évanescente est illustré sur la figure 1A. On considère le cas d’un substrat SB d’indice de réfraction n 2 , présentant une surface Se en contact avec un milieu ambiant MA d’indice n 1 2 . Par exemple, le substrat SB peut être constitué par une lamelle porte-échantillon, ou par un élément en verre sur lequel est posée une telle lamelle, tandis que le milieu ambiant MA peut être une solution aqueuse contenant, en suspension, des cellules marquées par des fluorophores. Un faisceau lumineux FLI, provenant du substrat SB, est incident sur la surface Se ; sa direction de propagation forme avec la normale z s à la surface un angle θ supérieur à une valeur critique θ c (angle limite) (1). Par conséquent le faisceau FLI subit une réflexion totale interne (RTI) formant un faisceau réfléchi FLR et produisant une onde évanescente OE dans le milieu ambiant MA. Cette onde évanescente présente une intensité qui décroit exponentiellement avec la distance z de la surface S : , où la longueur de pénétration δ est donnée par (1bis), λ étant la longueur d’onde du rayonnement lumineux. L’onde évanescente excite les fluorophores contenus dans le milieu ambiant, mais seulement sur une épaisseur de l’ordre de δ, car au-delà son intensité devient rapidement négligeable. A titre d’exemple, pour λ=488 nm, n 2 =1,514 (verre BK7), n 1 =1,33 (eau) et on trouve 93 nm, ce qui signifie que seuls les fluorophores situés dans une couche d’environ 100 nm d’épaisseur sont excités et contribuent à la réalisation d’une image de fluorescence. La illustre la configuration la plus communément utilisée en microscopie TIRF. Dans le cas de la , un même objectif de microscope OBJ, situé du côté du substrat opposé au milieu MA, est utilisé à la fois pour générer les ondes évanescentes par RTI et pour collecter le rayonnement de fluorescence. Ainsi, par cette technique connue, les images obtenues présentent de multiples qualités : elles bénéficient tout d’abord d’un faible bruit de fond (car les fluorophores situés dans les couches profondes de l’échantillon (hors du champ évanescent) ne sont que très faiblement excités) et d’une résolution axiale relativement élevée. Des lames de microscope à structure complexe, comme celles basées sur une métallisation en surface ont été par ailleurs conçues pour exalter localement le champ électromagnétique évanescent. De telles lames optiques, qui reposent sur le principe de la résonance de plasmon de surface, permettent d’améliorer la sensibilité de l’imagerie de microscopie. Toutefois, cette solution connue reste limitée en termes de valeur d’exaltation du champ et dans le choix des matériaux, i.e. métaux nobles, qui limitent les conditions d’illumination utilisables ainsi que la biocompatibilité, ce qui n’est pas optimal. Une autre technique connue, décrite dans le document de brevet US 2016/0238830, repose sur un guide d’onde multicouches dont les épaisseurs de couche et les indices de réfraction sont choisis pour supporter un mode de fuite guidé. Or les expériences d’imagerie de microscopie effectuées avec cette technique demeurent encore limitées du point de vue sensibilité et résolution notamment. En outre, il est connu de la demande FR2108879 de réaliser des lamelles de microscopie recouvertes d’empilements de couches nanométriques de matériaux diélectriques conçus pour exalter le champ électromagnétique évanescent à l’interface entre la lamelle et les objets biologiques déposés dessus. Ce type de structure permet d’améliorer la sensibilité des microscopes en réflexion totale interne qui utilisent un objectif du microscope pour atteindre l’angle critique de réflexion totale comme illustré dans la . L’utilisation de ces empilements diélectriques permet de générer cette exaltation à toutes les longueurs d’ondes du spectre visible/proche infrarouge et à tous les angles d’illumination au-delà de l’angle critique de RTI. Cependant cette méthode est optimisée pour des illuminations avec des ondes planes, ce qui n’est pas le cas dans un microscope éclairant l’objet au travers de l’objectif. En effet, une des limitations principales des structures résonantes en RTI est leur faible tolérance angulaire, celle-ci étant d’autant plus faible que la structure est résonante. Or, contrairement aux applications capteur qui recherchent une exaltation du champ évanescent la plus intense et la plus fine spectralement et angulairement, en microscopie, la résonance voulue est associée à une exaltation plus faible (de la dizaine à quelques centaines) avec une tolérance angulaire au moins de l’ordre de grandeur de la divergence de l’illumination par l’objectif du microscope. En conséquence, il existe un besoin pour une lame optique destinée à un microscope en réflexion totale interne permettant d’exalter le champ évanescent à l’interface entre la lamelle et les objets biologiques déposés dessus avec une tolérance angulaire accrue par rapport aux lames de l’art antérieur. A cet effet, un objet de l’invention est un procédé de fabrication d’une lame optique destinée a recevoir un échantillon biologique dans un dispositif de microscopie par réflexion totale interne, ledit procédé comprenant une étape de conception de ladite lame optique et une étape de fabrication matérielle de ladite lame optique ainsi conçue, ledit procédé étant caractérisé en ce que la phase de conception comprend les étapes suivantes : la sélection d’un premier matériau diélectrique présentant un indice de réfraction et d’un deuxième matériau diélectrique présentant un indice de réfraction tel que la sélection d’une longueur d’onde dite d’illumination et d’un angle d’incidence dit optimal en fonction dudit dispositif de microscopie par réflexion totale interne auquel ladite lame optique est destinée la conception d’une première structure comprenant un premier empilement de couches minces diélectriques disposé au dessus d’une couche dite substrat (SB) transparente dans une région spectrale prédéterminée comprenant ladite longueur d’onde d’illumination ledit premier empilement comprenant de couches minces successives et alternées du premier matériau diélectrique et du deuxième matériau diélectrique, une première épaisseur respective de chaque couche mince diélectrique et ledit nombre de couches minces diélectriques étant adaptés de manière à ce que la première structure présente une absorption résonnante à la longueur d’onde d’illumination et à l’angle d’incidence optimal en régime de réflexion totale interne la détermination d’une première fonction représentative d’une valeur d’une transmission de la première structure dans la région spectrale prédéterminée en fonction d’un nombre de couches minces diélectriques et d’une épaisseur de chaque couche mince diélectrique, et la détermination d’une deuxième fonction représentative d’une intensité d’un champ électrique évanescent généré par la lame optique en régime de réflexion totale interne à la longueur d’onde d’illumination et à l’angle d’incidence optimal en fonction d’un nombre de couches minces diélectriques et de ladite première épaisseur de chaque couche mince diélectrique la conception de ladite lame optique qui comprend un deuxième empilement de couches minces diélectriques dit empilement optimisé disposé au dessus du substrat (SB), l’empilement optimisé comprenant un nombre de couches minces diélectriques successives et alternées du premier matériau diélectrique et du deuxième matériau diélectrique, chacune des couches présentant une épaisseur dite optimisée respective, les épaisseurs optimisées et le nombre de couches minces diélectriques étant déterminés par une optimisation d’une fonction de mérite basée sur la première fonction et la deuxième fonction de manière à ce que ladite lame optique présente une première absorption résonnante à la longueur d’onde d’illumination et à un premier angle d’incidence en régime de réflexion totale interne et présente une deuxième absorption résonnante à la longueur d’onde d’illumination et à un deuxième angle d’incidence en régime de réflexion totale interne, avec et ou . De manière préférentielle, la fonction de mérite est telle que , avec un paramètre permettant de pondérer un poids respectif de la première fonction et de la deuxième fonction dans ladite optimisation. De manière préférentielle, est compris en 0.3 et 0.7. De manière préférentielle, l’optimisation est telle que . Selon un mode de réalisation, l’optimisation consiste à trouver les épaisseurs optimisées et le nombre de couches minces diélectriques pour lesquels ladite valeur de la transmission de la première structure dans la région spectrale prédéterminée est maximale et pour lesquels ladite intensité du champ électrique évanescent est maximale. Selon un mode de réalisation, dans le premier empilement, une couche supérieure du premier empilement est dans le deuxième matériau diélectrique et présente une première épaisseur comprise entre et et dans laquelle les couches inférieures du premier empilement présentent chacune une première épaisseur comprise entre et et dans laquelle dans l’empilement optimisé une couche supérieure du premier empilement est dans le deuxième matériau diélectrique. Selon un mode de réalisation, la première fonction F1 est représentative d’une transmission d’un rayonnement de fluorescence induit indirectement par une absorption de ladite longueur d’onde d’illumination en réflexion totale interne dans ledit premier empilement illuminé avec ledit angle d’incidence optimal , le rayonnement de fluoresence présentant un spectre compris dans ladite région spectrale, la transmission étant intégrée sur une gamme angulaire d’incidence du rayonnement de fluorescence sur ladite lame optique comprise entre 0 et 80°. Un autre objet de l’invention est une lame optique destinée a recevoir un échantillon biologique dans un dispositif de microscopie par réflexion totale interne, la lame optique comprenant : une couche dite substrat transparente dans une région spectrale prédéterminée un empilement dit optimisé disposé au dessus du substrat et comprenant un nombre de couches minces diélectriques successives et alternées d’un premier matériau diélectrique et d’un deuxième matériau diélectrique, chacune des couches présentant une épaisseur dite optimisée respective, les épaisseurs optimisées et le nombre de couches minces diélectriques étant adaptés de manière à ce que ladite lame optique présente au moins : une première absorption résonnante à une longueur d’onde dite d’illumination et à un premier angle d’incidence en régime de réflexion totale interne, et une deuxième absorption résonnante à la longueur d’onde d’illumination et à un deuxième angle d’incidence en régime de réflexion totale interne, avec . Selon un mode de réalisation : le premier matériau diélectrique présente un indice de réfraction compris entre 1,8 et 3,5 ; le deuxième matériau diélectrique présente un indice de réfraction compris entre 1,2 et 1,7. Selon un mode de réalisation, le premier matériau est à base de Nb 2 O 5 , le deuxième matériau est à base de SiO 2 . Selon un mode de réalisation, le nombre de couches minces diélectriques est inférieur à 30, préférentiellement inférieur à 20. Selon un mode de réalisation, les épaisseurs optimisées et le nombre de couches minces diélectriques sont tels que ladite lame optique présente une épaisseur inférieure à 5 et préférentiellement comprise entre 0,5 et 2 . Selon un mode de réalisation, les épaisseurs optimisées sont supérieures ou égales à 10 nm. Un autre objet de l’invention est un dispositif de microscopie par réflexion totale interne comprenant : une lame optique selon l’invention une source de lumière adaptée pour émettre un faisceau lumineux présentant la longueur d’onde d’illumination un dispositif optique adapté pour mettre en forme le faisceau lumineux de manière à ce qu’il illumine ladite lame optique avec ledit angle d’incidence optimisé un détecteur adapté pour détecter un rayonnement de fluorescence émis lorsqu’un échantillon est déposé en correspondance d’une région d’une surface de ladite lame optique où sont produites des ondes évanescentes par une réflexion totale interne dans ladite lame optique du faisceau lumineux mis en forme, ledit rayonnement de fluorescence étant excité par lesdites ondes évanescentes. D’autres caractéristiques, détails et avantages de l’invention ressortiront à la lecture de la description faite en référence aux dessins annexés donnés à titre d’exemple et qui représentent, respectivement : et une vue schématique d’un microscope en réflexion totale interne de l’art antérieur ; , une vue schématique d’un dispositif de microscopie par réflexion totale interne selon l’invention ; , une vue schématique d’une lame optique selon l’invention, destinée à recevoir un échantillon biologique dans un dispositif de microscopie par réflexion totale interne ; , l’absorption d’une lame optique selon un mode de réalisation préféré de l’invention en régime de réflexion totale interne, en fonction de l’angle d’incidence et de la longueur d’onde du faisceau incident ; , le facteur d’exaltation du champ électrique évanescent généré à la surface d’une lame optique selon un mode de réalisation préféré de l’invention en régime de réflexion totale interne, en fonction de l’angle d’incidence du faisceau incident ; , et , le facteur d’exaltation du champ électrique évanescent généré à la surface d’une lame optique selon un mode de réalisation préféré de l’invention en régime de réflexion totale interne, en fonction de l’angle d’incidence du faisceau incident, pour deux divergences différentes du faisceau incident , le facteur d’exaltation normalisé par rapport à une lame en verre du champ électrique évanescent généré à la surface d’une lame optique selon un mode de réalisation préféré de l’invention en régime de réflexion totale interne, en fonction de l’angle d’incidence du faisceau incident, , une représentation schématique des étapes de la phase de conception du procédé de fabrication selon l’invention. Dans les figures, sauf contre-indication, les éléments ne sont pas à l’échelle et les références identiques désignent des éléments identiques ou des étapes identiques. La illustre de manière simplifiée un dispositif D de microscopie par réflexion totale interne selon l’invention. Le dispositif D comprend une lame optique LO selon l’invention, une source de lumière SL, un dispositif optique Obj et un détecteur de fluorescence Det. On s’attache tout d’abord à décrire le fonctionnement du dispositif D avant de détailler la structure de la lame optique LO. Enfin, on décrira un procédé de fabrication selon l’invention permettant d’obtenir la lame optique LO. La lame optique LO est une lame, préférentiellement biocompatible, destinée a recevoir un échantillon biologique E à des fins d’imagerie de microscopie selon une configuration en RTI. Un exemple de structure de lame optique conforme à l’invention est décrit plus loin en relation avec la figure 3 qui illustre schématiquement une coupe selon le plan de la lame optique LO selon l’invention. La source de lumière SL est adaptée pour émettre un faisceau lumineux L in présentant une longueur d’onde dite d’illumination prédéterminée. La source SL est une source laser configurée pour émettre à une longueur d’onde typiquement comprise entre 350 et 1300 nm de manière à exciter les fluorophores contenus dans l’échantillon E et ainsi produire l’émission d’un rayonnement de fluorescence FL en étant au moins partiellement transmis par la lame optique LO. Le dispositif optique Obj est adapté pour mettre en forme le faisceau lumineux L in de manière à ce qu’il illumine la lame optique avec un angle d’incidence dit optimisé supérieur à l’angle critique. De manière préférentielle, comme illustré dans la figure 2, le dispositif optique Obj est un objectif de microscope. L’objectif de microscope peut être à focale variable et à ouverture numérique variable (supérieure à 1,45). Il comprend une optique ou un assemblage plus ou moins complexe de lentilles optiques apte à permettre la formation du faisceau lumineux L in en le focalisant en direction de la lame optique. Il est en outre apte à collecter le faisceau réfléchi et/ou rétrodiffusé issu de la lame optique dans un cône angulaire de 0 à un angle maximum donné par l’ouverture numérique de l’objectif.. L’objectif est généralement du type à immersion dans l’huile et peut présenter une ouverture numérique (O.N.) importante, par exemple de l’ordre de 1,45, ce qui permet d’obtenir une résolution spatiale latérale (perpendiculairement à la direction z) élevée car la résolution spatiale latérale est donnée par . De plus, un objectif Obj avec une ouverture numérique O.N. élevée est avantageux car cela permet de déplacer le faisceau lumineux incident par rapport à l’axe optique OA et ainsi obtenir une forte déviation du faisceau incident par l’objectif, le faisceau pouvant ainsi se propager avec un angle d’incidence élevé et suffisant pour obtenir une RTI. Alternativement, le dispositif optique Obj comprend un ou plusieurs lentilles et/ou miroirs pour focaliser le faisceau lumineux L in et éventuellement un prisme ou une métasurface pour que le faisceau lumineux L in illumine la lame optique avec l’angle d’incidence optimisé Cet angle d’incidence optimisé est supérieur à l’angle critique à l’interface entre une surface SE de la lame destinée à recevoir l’échantillon E et le milieu ambiant (typiquement liquide) comprenant l’échantillon. L’angle d’incidence optimisé est typiquement compris entre 62 et 80 degrés pour un environnement biologique d’indice de réfraction compris entre 1,33 et 1,35. Ainsi, la RTI du faisceau lumineux L in sur ladite interface produit des ondes évanescentes OE. L’échantillon E étant placé en correspondance d’une région de la surface SE où sont produites les ondes évanescentes, les fluorophores de l’échantillon vont générer un rayonnement de fluorescence FL excité par les ondes évanescentes OE. Le rayonnement de fluorescence FL émis est alors collecté par l’objectif Obj puis est dirigé, vers le détecteur Det afin d’être détecté. Ce détecteur Det est typiquement une caméra CCD ou CMOS dont la bande spectrale est adaptée à la détection du rayonnement de fluorescence FL réémis en provenance de l’échantillon E. Il convertit l’intensité lumineuse reçue en un signal électrique à destination d’une unité de traitement (non représentée sur les figures). L’unité de traitement est raccordée électriquement à la source de lumière SL, au détecteur Det et à l’objectif de microscope Obj de manière à pouvoir piloter ces éléments à des fins d’acquisition d’images de l’échantillon E en régime de RTI. A titre d’exemple non limitatif, le dispositif D illustré dans la figure 2 repose sur le principe d’épifluorescence dont l’observation de la fluorescence est effectuée dans une configuration par réflexion au moyen d’une lame ou d’un miroir dichroïque 50 par exemple. Cette configuration particulière permet de dissocier le chemin optique emprunté par la lumière d’excitation , du chemin optique emprunté par le rayonnement de fluorescence FL. De manière préférentielle, l’angle d’incidence optimisé est compris entre 62 et 80 degrés. La borne basse de la plage précitée (62 degrés) est donnée par la valeur d’indice de réfraction de l’échantillon étudié. Quant à la borne haute de la plage précitée (80 degrés), elle est définie en fonction de la valeur de l’ouverture numérique utilisée pour l’observation de microscopie. L’ouverture numérique typique de l’objectif de microscope Obj du dispositif D est supérieure ou égale à 1,45. L’objectif de microscope Obj est de préférence à ouverture numérique et à focale variable. On s’attache à décrire ci-après avec plus de détails la structure de la lame optique selon l’invention, telle que représentée dans la . La lame optique LO possède la première face SE, et une deuxième face SI, opposée à la première, et définit un axe d’empilement s’étendant entre ces deux faces opposées selon la direction . La première face SE est destinée à recevoir l’échantillon biologique E à observer et la deuxième face SI est la face illuminée par le faisceau lumineux . La première face SE constitue l’interface où une exaltation du champ électromagnétique évanescent OE est produite par la lame optique 10. Selon le mode de réalisation illustré dans la figure 2, la lame optique LO et l’objectif de microscope Obj sont agencés de sorte que l’axe d’empilement de la lame soit confondu avec l’axe optique OA de l’objectif. Autrement dit, la lame optique LO et l’objectif de microscope Obj sont orientés l’un par rapport à l’autre de manière à ce que l’interface optique formée entre la lame optique LO et l’échantillon E soit perpendiculaire à l’axe optique OA, selon la direction . Selon l’invention, la lame optique LO comprend un substrat SB transparent optiquement dans une région spectrale qui comprend la longueur d’onde d’illumination et qui comprend la gamme spectrale du rayonnement de fluorescence FL. Par exemple, le substrat SB est une lamelle de microscope en verre sodocalcique d’indice 1,5 (ou tout autre support optiquement transparent calibré en épaisseur). En outre, la lame optique LO comprend un empilement de couches diélectriques (appelé empilement optimisé EO ci-après) disposé directement au dessus du substrat SB. Cet empilement optimisé EO est particulièrement adapté pour permettre une exaltation du champ électrique évanescent OE produit à la surface SE dans une configuration de RTI du faisceau . Ainsi, lorsque le dispositif de la figure 2 est en fonctionnement, l’échantillon biologique E qui est disposé sur la couche supérieure est illuminé par le faisceau à la longueur d’onde d’illumination après avoir traversé la lame optique. Plus précisément, le faisceau traverse le substrat SB, puis l’empilement diélectrique EO jusqu’à atteindre l’interface entre la couche supérieure et l’échantillon E sous l’angle d’incidence optimisé . L’onde évanescente OE créée par la RTI voit son intensité amplifiée grâce à la structure résonnante de l’empilement EO, ce qui permet d’augmenter significativement les performances d’imagerie de microscopie TIRF, en particulier en termes de sensibilité et de résolution axiale. Comme illustré sur la figure 3, cet empilement EO est formé d’une succession de couches minces alternées d’un premier matériau diélectrique à indice de réfraction (couches minces référencées ) et d’un deuxième matériau diélectrique à indice de réfraction (couches minces référencées ), avec . La couche mince destinée a être contact avec l’échantillon E (appelée couche supérieure) est réalisée dans l’un des deux matériaux diélectriques. De préférence, cette couche est réalisée dans un matériau diélectrique biocompatible, par exemple en SiO 2 , TiO 2 , Nb 2 O 5 … . La face supérieure de cette couche supérieure correspond à la face SE précédemment introduite. Quant à la face SI illuminée par le faisceau , elle correspond à la face inférieure du substrat SB. Dans la lame optique LO de l’invention, chacune des couches diélectriques présente une épaisseur dite optimisée respective choisie notamment en fonction de la longueur d’onde d’illumination , de l’angle d’incidence optimisé , de la polarisation incidente et des indices de réfraction et . Le procédé de fabrication et la face de conception de la lame optique LO de l’invention seront détaillés plus loin dans la description de la figure 7. On se limitera brièvement à préciser que les épaisseurs optimisées et le nombre de couches minces diélectriques sont adaptés de manière à ce que la lame optique LO présente au moins une double résonance à la longueur d’onde d’illumination en RTI pour deux angles d’incidence distincts. Plus précisément, les épaisseurs optimisées et le nombre de couches minces diélectriques sont tels que la lame optique présente : une première absorption résonnante à la longueur d’onde d’illumination et à un premier angle d’incidence en RTI, et une deuxième absorption résonnante à la longueur d’onde d’illumination et à un deuxième angle d’incidence en RTI. Les angles d’incidence et sont choisis de manière à ce que soit compris entre 0.4° et 3°, préférentiellement compris entre 0.4° et 1.5°. Plus précisément, on souhaite avoir de l’ordre de grandeur de la divergence du microscope donc selon les systèmes Il est entendu que la lame optique LO de l’invention peut comprendre plus de deux résonances tant que les conditions précitées restent vérifiées. L’empilement EO de multicouches diélectriques couplé au substrat SB permet d’assurer une exaltation significative du champ électromagnétique évanescent OE à l’interface entre la lame optique et l’échantillon avec une tolérance angulaire très supérieure aux lames optiques de l’art antérieur. Cette exaltation permet d’accroitre l’intensité du rayonnement de fluorescence FL, ce qui améliore la sensibilité de l’imagerie microscopique ainsi que la résolution axiale du dispositif D. En effet, les lames optiques résonantes de l’art antérieur sont optimisées pour présenter une résonance étroite spectralement et angulairement, pour un angle d’incidence optimal prédéterminé et pour une onde d’illumination théoriquement plane. Elles présentent ainsi un facteur d’exaltation « théorique » du champ électromagnétique évanescent très élevé. Cependant, selon les lois de l’optique géométrique, le faisceau présente une divergence angulaire naturelle non négligeable après avoir traversé l’objectif (typiquement comprise entre 0.5° et 1°). Aussi, le faisceau incident sur la lame optique LO présente en réalité une pluralité d’angles d’incidences centrés autour de l’angle d’incidence optimal. Cela implique que le facteur d’exaltation des ondes évanescentes OE induit par la lame optique pour rayons selon les angles d’incidences autres que l’angle d’incidence optimal est en pratique nettement plus faible que le facteur d’exaltation « théorique ». Dans l’invention, la présence de deux résonances (ou plus) proches angulairement permet un recouvrement partiel entre les bandes de résonnances. Ce chevauchement permet d’élargir la tolérance angulaire de la lame optique LO afin qu’elle présente un facteur d’exaltation « réel » six à dix fois plus important que les lames optiques de l’art antérieur (voir figure 6) (voir plus dans le cas de multi-résonances). La tolérance angulaire de la lame de l’invention est spécifiquement choisie afin d’être supérieure ou égale à la divergence du faisceau après sa traversée de l’objectif du microscope Obj qui est typiquement comprise entre 0.5° et 1°. Par de nombreuses simulations et expériences, les inventeurs ont observé que cette résonance multiple n’était possible qu’avec un empilement EO comprenant un nombre de couches minces diélectriques. Comme évoqué précédemment, l’épaisseur optimisée de chaque couche de l’empilement est choisie notamment en fonction de la longueur d’onde d’illumination , de l’angle d’incidence optimisé , de la polarisation et des indices de réfraction et . L’angle d’incidence optimisé correspond ici à l’angle d’incidence sous lequel le faisceau doit illuminer la lame optique à longueur d’onde d’illumination pour obtenir un facteur d’exaltation des ondes évanescentes OE avec une tolérance angulaire optimisée. Il est compris entre et (ou entre et si ) pour bénéficier du chevauchement de la bande de la première absorption résonante et de la bande de la deuxième absorption résonante. Préférentiellement, les épaisseurs optimisées et le nombre sont tels que . Les épaisseurs optimisées sont généralement comprises entre 5 et 500 nanomètres. De manière préférentielle, les épaisseurs optimisées sont supérieures ou égale à 10 nm afin de faciliter la fabrication de la lame optique LO. En effet, le contrôle précis de l’épaisseur de couches d’épaisseur inférieure à 10 nm est techniquement complexe à réaliser. De manière préférentielle, le premier matériau diélectrique présente un indice de réfraction compris entre 1,8 et 3,5 et le deuxième matériau diélectrique présente un indice de réfraction compris entre 1,2 et 1,7. Par exemple, le premier matériau est à base de Nb 2 O 5 , le deuxième matériau est à base de SiO 2 . De manière préférentielle, le nombre de couches minces diélectriques est inférieur à 30, préférentiellement inférieur à 20. En effet, les inventeurs ont observés que, comparativement à une lame optique LO avec un nombre de couche inférieur à 20, un nombre de couches diélectriques supérieur ou égal à 20 augmente la complexité du procédé de fabrication mais ne permet qu’un gain minime (voir nul) du facteur d’exaltation des ondes évanescentes. De manière préférentielle, afin de limiter les aberrations optiques induites par l’utilisation de la lame optique dans le dispositif D, les épaisseurs optimisées et le nombre de couches minces diélectriques sont tels que ladite lame optique présente une épaisseur inférieure à 5 et préférentiellement comprise entre 0,5 et 2 . Exemple préféré : Selon un mode de réalisation préféré de l’invention, l’empilement optimisé EO de la lame optique LO comprend 14 couches diélectriques alternées de SiO 2 et Nb 2 O 5. La couche supérieure de l’empilement (celle destinée à être en contact avec l’échantillon) est en SiO 2 . Les épaisseurs optimisées des couches minces diélectriques sont, de la couche supérieure à la couche inférieure en contact avec le substrat, respectivement : 20 nm, 26.5 nm, 91.6 nm, 101.8 nm, 242.7 nm, 60.25 nm, 30.2 nm, 20 nm, 273.4 nm, 29.1 nm, 83.1 nm, 20 nm, 530.6 nm, 97.6 nm. Cette structure est optimisée pour une longueur d’onde d’illumination et pour un angle d’incidence optimisé Ces épaisseurs optimisées sont déterminées par la méthode de la décrite plus loin. Les indices des couches sont respectivement n 2 (SiO 2 ) = 1.486 et n 1 (Nb 2 O 5 ) = 2.292 à 561 nm. La transmission moyenne de cette structure, intégrée angulairement entre 0 et 80 degrés, et spectralement entre 561 et 700 nm est de 53%. La figure 4A est un graphique présentant l’absorption optique de l’empilement EO selon le mode de réalisation préféré de l’invention, avec un milieu liquide au-dessus de la couche supérieure, en fonction de l’angle d’incidence et la longueur d’onde d’illumination. On observe quatre bandes de résonances, dont la bande de la première absorption résonante (référencée B1 sur la figure 4A) et la bande de la deuxième absorption résonante (référencée B2 sur la figure 4A). A la longueur d’onde d’illumination , la première absorption résonante est centrée sur l’angle et la deuxième absorption résonante est centrée sur l’angle On rappelle ici que le tracé de la figure 4A représente une courbe d’absorption et, par conséquent, n’est qu’un tracé indirect de l’exaltation du champ évanescent généré en RTI sur la surface SE. En effet, la dépendance entre l’exaltation et l’absorption n’est pas linéaire, et la tolérance angulaire de l’exaltation résonante ne peut être directement déterminée à partir de la figure 4A. Le calcul exact montre qu’elle est néanmoins d’environ 1°. Comme évoqué précédemment, cette valeur de tolérance angulaire correspond à la borne supérieure de la divergence typique du faisceau après sa traversée de l’objectif du microscope Obj. La figure 4B est une courbe qui représente la valeur du facteur d‘exaltation du champ évanescent généré en RTI par la lame optique selon le mode de réalisation préféré de l’invention en fonction de l’angle d’incidence du faisceau , à la longueur d’onde d’illumination . La courbe de la figure 4B correspond à une coupe horizontale de la figure précédente pour la longueur d’onde d’illumination , mais pour l’intensité du champ évanescent et non pas l’absorption. Comme attendu, la courbe de la figure 4B comprend les deux pics d’exaltation associés à la première et la deuxième absorption résonante . On observe que ces absorptions résonantes permettent d’obtenir un facteur d’exaltation respectif de l’intensité du champ évanescent de l’ordre de 75. Cependant, cette valeur du facteur d’exaltation est une valeur « théorique » obtenue pour une illumination avec une onde plane. En pratique, il faut tenir compte de la divergence du faisceau pour estimer la valeur réelle du facteur d’exaltation. Pour cela, les figures 5A et 5B représentent une courbe de la valeur du facteur l’exaltation de l’intensité du champ évanescent généré en RTI en fonction de l’angle d’incidence du faisceau , à la longueur d’onde d’illumination et pour deux divergences différentes du faisceau . La courbe de la est obtenue pour une divergence de 0,6° alors que la courbe de la est obtenue pour une divergence de 0,9°. On observe que la prise en compte de la divergence du faisceau produit une intégration angulaire de la première et la deuxième absorption résonante qui fait disparaitre cette double résonance au profit d’une seule résonance « moyennée » centrée sur l’angle d’incidence optimisé . Cette résonance « moyennée » présente un facteur d’exaltation de valeur inférieure aux valeurs associées aux résonances simples (c’est-à-dire la valeur « théorique » de la ) mais plus élevée que ce qui peut être obtenu avec une unique résonance optimisée. Ainsi, pour un faisceau à la longueur d’onde d’illumination et pour l’angle d’incidence optimisé la lame optique LO selon le mode de réalisation préféré de l’invention permet d’obtenir un facteur d’exaltation d’environ 35 pour une divergence de 0,6° et d’environ 30 pour une divergence de 0,9°. De manière logique, une divergence plus importante implique un moyennage angulaire plus important de la première et la deuxième absorption résonante et donc une réduction plus importante du facteur d’exaltation. La figure 6 est une courbe qui présente la valeur du facteur d’exaltation du rayonnement de fluorescence produit par la lame optique LO selon le mode de réalisation préféré de l’invention en fonction de la divergence du faisceau incident, pour l’angle d’incidence optimisé . La valeur du facteur d’exaltation est calculée avec une intégration sur un cône angulaire allant de 0° à 80° du rayonnement de fluorescence FL, en tenant compte de la transmission moyenne de la lame optique LO, puis est normalisée par rapport à la valeur du facteur d’exaltation obtenue par une lame en verre. En outre, la comprend une zone grisée qui correspond à la gamme de divergence d’un faisceau laser focalisé par un microscope commercial. La permet d’observer que la lame optique LO selon le mode de réalisation préféré de l’invention permet d’obtenir des facteurs d’exaltations élevés pour une plage de divergences larges qui regroupe la plupart des microscopes commerciaux existants. Plus précisément, la lame optique LO permet d’obtenir un facteur d’exaltation de fluorescence normalisé de l’ordre de 7. Bien que les courbes des figures 4A à 6 aient été décrites en relation avec la lame optique LO selon le mode de réalisation préféré de l’invention, l’homme de l’art saura reproduire des résultats équivalents sans sortir du cadre de l’invention avec des matériaux diélectriques différents, et/ou des épaisseurs optimisées différentes et/ou un nombre de couches différent en les adaptant à une longueur d’onde et un angle d’incidence optimisé prédéterminés. On s’attache maintenant à décrire le procédé de fabrication de la lame optique LO selon l’invention. Ce procédé de fabrication comprend une phase de conception de la lame optique puis une phase de fabrication matérielle de la lame optique conçue. Les différentes étapes A à E de la phase de conception sont illustrées dans la . Dans une première étape A, on sélectionne le premier matériau diélectrique d’indice et le deuxième matériau diélectrique d’indice tel que . Le matériau d’indice n 2 est de préférence de la silice pour la compatibilité biologique et le matériaux d’indice n 1 peut être par exemple du Nb 2 O 5 , du TiO 2 , du HfO 2 ou du Ta 2 O 5 . Dans une deuxième étape B, on sélectionne la longueur d’onde d’illumination et l’angle d’incidence optimal en fonction du dispositif de microscopie par réflexion totale interne auquel la lame optique est destinée. Il s’agit ici typiquement de choisir une longueur d’onde d’illumination égale à la longueur d’onde de la source de lumière du dispositif de microscopie. L’angle d’incidence optimal est choisi de manière à être supérieur à l’angle critique de RTI pour une interface formée entre un milieu liquide et une couche dans le deuxième matériau diélectrique et en fonction de la valeur de l’ouverture numérique utilisée pour l’observation de microscopie. Après l’étape B, la phase de conception comprend une étape C consistant à concevoir une première structure comprenant un premier empilement de couches minces diélectriques disposé au-dessus d’un substrat SB. Le substrat SB est transparent dans une région spectrale prédéterminée comprenant la longueur d’onde d’illumination et le rayonnement de fluorescence FL généré indirectement par la longueur d’onde d’illumination . Le premier empilement comprend couches minces successives et alternées du premier matériau diélectrique et du deuxième matériau diélectrique, chaque couche mince diélectrique présentant une première épaisseur respective. Les premières épaisseurs et le nombre de couches minces diélectriques sont adaptés de manière à ce que la première structure présente une unique absorption résonnante à la longueur d’onde d’illumination et à l’angle d’incidence optimal en régime de réflexion totale interne. Cette étape C est connue en soit et est effectuée par le biais d’un logiciel de simulation et d'optimisation de couches minces optiques comme par exemple Optilayer ou par le biais d’un calcul direct. Selon un mode de réalisation, dans le premier empilement, la couche supérieure du premier empilement est dans le deuxième matériau diélectrique et présente une première épaisseur comprise entre et . La valeur exacte de l’épaisseur de la couche supérieure dépend des indices des matériaux diélectriques, de la longueur d’onde de résonnance souhaitée et de l’angle de résonnance souhaité. En outre, les couches inférieures du premier empilement (c’est-à-dire celles en dessous de la couche supérieure) présentent chacune une première épaisseur comprise entre et . Préférentiellement, ce sont des couches d’épaisseur . Par exemple, afin de concevoir la lame optique du mode de réalisation préféré de l’invention précédemment décrite, le premier empilement de l’étape B comprend N=15 couches diélectriques alternées de SiO 2 et de Nb 2 O 5 . La couche supérieure est en SiO 2 et présente une première épaisseur égale à . Les autres couches présentent une première épaisseur égale à . Après l’étape C, la phase de conception comprend une étape D consistant à déterminer deux fonctions et chacune représentative des deux paramètres critiques de la lame optique pour l’application visée : la transmission du rayonnement de fluorescence et l’exaltation du champ évanescent généré en RTI. Plus précisément, la fonction est représentative de la valeur de la transmission du rayonnement de fluorescence FL en fonction du nombre de couches minces diélectriques et de l’épaisseur de chaque couche mince diélectrique. Pour clarifier, il s’agit ici du rayonnement de fluorescence FL induit indirectement par l’absorption dans le premier empilement de la longueur d’onde d’illumination en RTI avec l’angle d’incidence optimal . Afin de tenir compte de l’émission lambertienne du rayonnement de fluorescence, la transmission est intégrée sur une gamme angulaire étendue d’angle d’incidence du rayonnement de fluorescence sur la lame optique, par exemple pour un angle d’incidence compris entre 0° et 80° ainsi que sur la gamme spectrale associée à l’émission de fluorescence. La fonction est représentative de l’intensité du champ électrique évanescent généré par le premier empilement en RTI à la longueur d’onde d’illumination et à l’angle d’incidence optimal en fonction du nombre de couches minces diélectriques et de l’épaisseur de chaque couche mince diélectrique En effet, le facteur d’exaltation réel de la lame optique, c’est-à-dire celui du rayonnement de fluorescence collecté par l’objectif de microscope, est multifactoriel et dépend de : la transmission de la structure pour le rayonnement de fluorescence. Celui-ci doit être maximisée afin d’augmenter le rayonnement de fluorescence collecté. Cela revient par exemple à maximiser la transmission de la lame pour un angle d’incidence compris entre 0 et 80 degrés, pour une illumination avec une longueur d’onde comprise entre 400 nm et 800 nm, le facteur d’exaltation du champ évanescent généré en RTI, qui doit aussi être maximisé la tolérance angulaire de ce facteur d’exaltation, comme expliqué précédemment. L’optimisation simultanée de ces trois paramètres n’est réellement possible qu’en augmentant le nombre de degrés de libertés. C’est pourquoi il est nécessaire de construire les fonctions et qui serviront pour l’étape suivante E. Par exemple, selon le mode de réalisation préféré de l’invention, les fonctions et ont la forme suivante pour la conception de la lame optique LO: avec T la transmission de la structure pour une onde plane éclairée sous incidence à la longueur d’onde avec E l’amplitude du champ électrique à l’interface supérieure de la structure,Δθ l’intervalle angulaire choisi pour l’optimisation du champ, typiquement entre 0.2 et 1.5 degrés. Enfin, après la détermination des fonctions et , la phase de conception comprend une dernière étape E d’optimisation du premier empilement de manière à obtenir l’empilement optimisé EO de la lame optique LO. Les épaisseurs optimisées et le nombre de couches minces diélectriques de l’empilement optimisé EO sont déterminés par l’optimisation d’une fonction de mérite basée sur la première fonction et la deuxième fonction de manière à ce que la lame optique présente : la première absorption résonnante à la longueur d’onde d’illumination et à l’angle d’incidence en RTI, et la deuxième absorption résonnante à la longueur d’onde d’illumination et au deuxième angle d’incidence en RTI. Comme mentionné plus haut, l’optimisation est telle que et ou . Cette optimisation est effectuée par le biais d’un logiciel de simulation et d'optimisation de couches minces optiques comme par exemple Optilayer. De manière préférentielle, la fonction de mérite à maximiser est telle que , avec un paramètre permettant de pondérer un poids respectif de la première fonction et de la deuxième fonction dans l’optimisation. Le paramètre alpha influe sur les poids respectifs de la transmission de la fluorescence par la lame vis-à-vis de l’exaltation du champ évanescent et est préférentiellement compris entre 0.3 et 0.7 car les deux paramètres étant importants, il convient de les considérer tous les deux de manière non négligeable. Cette forme de fonction de mérite présente un nombre suffisant de degrés de liberté suffisant pour optimiser simultanément les trois paramètres influant sur le facteur d’exaltation réel de la lame optique. L’optimisation consiste typiquement à trouver les épaisseurs optimisées et le nombre de couches minces diélectriques pour lesquels la valeur de la transmission du rayonnement de fluorescence est maximale et pour lesquels l’intensité du champ électrique évanescent est maximale. Selon un mode de réalisation préféré, l’optimisation est telle que . Cela permet d’obtenir une double résonance séparée angulairement d’une valeur correspondant à la divergence typique d’un faisceau laser focalisé par un objectif de microscope commercial. On maximise ainsi la valeur du facteur d’exaltation réel de la lame optique LO de l’invention. Concernant la phase de fabrication matérielle, le dépôt de chaque couche mince est réalisé au moyen de toute technique connue de l’homme de l’art, par exemple par une des techniques suivantes : évaporation sous vide, pulvérisations sous vide, procédé sol-gel, enduction centrifuge, dépôt chimique en phase vapeur, dépôt par plasma. L’invention offre ainsi la possibilité d’une production de lames optiques à exaltation de champ électromagnétique dont les caractéristiques peuvent être aisément adaptées en fonction des paramètres d’imagerie requis par le système de microscopie. Comme indiqué plus haut, l’épaisseur, le nombre et le type de matériau sont des caractéristiques de l’empilement selon l’invention qui peuvent être adaptées au cas par cas, en fonction notamment des paramètres d’imagerie du système et des conditions d’éclairage souhaitées ou imposées. On privilégiera des matériaux optiquement transparents dans la bande spectrale utilisée pour mener l’étude, dont les valeurs de dispersion de l’indice de réfraction et du coefficient d’absorption sont connues et maitrisées. De telles caractéristiques doivent permettre, à un angle d’incidence optimisé et une longueur d’onde d’illumination prédéterminés de la lame optique en régime de réflexion totale, une absorption optique à tolérance angulaire améliorée dans la couche supérieure de l’empilement optimisé, exaltant ainsi le champ électromagnétique évanescent à l’interface dudit empilement. Procédé de fabrication d’une lame optique (LO) destinée à recevoir un échantillon biologique (E) dans un dispositif de microscopie par réflexion totale interne, ledit procédé comprenant une étape de conception de ladite lame optique (LO) et une étape de fabrication matérielle de ladite lame optique (LO) ainsi conçue, ledit procédé étant caractérisé en ce que la phase de conception comprend les étapes suivantes : la sélection d’un premier matériau diélectrique présentant un indice de réfraction et d’un deuxième matériau diélectrique présentant un indice de réfraction tel que la sélection d’une longueur d’onde dite d’illumination et d’un angle d’incidence dit optimal en fonction dudit dispositif de microscopie par réflexion totale interne auquel ladite lame optique est destinée la conception d’une première structure comprenant un premier empilement de couches minces diélectriques disposé au dessus d’une couche dite substrat (SB) transparente dans une région spectrale prédéterminée comprenant ladite longueur d’onde d’illumination ledit premier empilement comprenant de couches minces successives et alternées du premier matériau diélectrique et du deuxième matériau diélectrique, une première épaisseur respective de chaque couche mince diélectrique et ledit nombre de couches minces diélectriques étant adaptés de manière à ce que la première structure présente une absorption résonnante à la longueur d’onde d’illumination et à l’angle d’incidence optimal en régime de réflexion totale interne la détermination d’une première fonction représentative d’une valeur d’une transmission de la première structure dans la région spectrale prédéterminée en fonction d’un nombre de couches minces diélectriques et d’une épaisseur de chaque couche mince diélectrique, et la détermination d’une deuxième fonction représentative d’une intensité d’un champ électrique évanescent généré par la lame optique en régime de réflexion totale interne à la longueur d’onde d’illumination et à l’angle d’incidence optimal en fonction d’un nombre de couches minces diélectriques et de ladite première épaisseur de chaque couche mince diélectrique la conception de ladite lame optique qui comprend un deuxième empilement de couches minces diélectriques dit empilement optimisé disposé au dessus du substrat (SB), l’empilement optimisé comprenant un nombre de couches minces diélectriques successives et alternées du premier matériau diélectrique et du deuxième matériau diélectrique, chacune des couches présentant une épaisseur dite optimisée respective, les épaisseurs optimisées et le nombre de couches minces diélectriques étant déterminés par une optimisation d’une fonction de mérite basée sur la première fonction et la deuxième fonction de manière à ce que ladite lame optique présente une première absorption résonnante à la longueur d’onde d’illumination et à un premier angle d’incidence en régime de réflexion totale interne et présente une deuxième absorption résonnante à la longueur d’onde d’illumination et à un deuxième angle d’incidence en régime de réflexion totale interne, avec et ou . Procédé de fabrication selon la revendication précédente, dans lequel ladite fonction de mérite est telle que , avec un paramètre permettant de pondérer un poids respectif de la première fonction et de la deuxième fonction dans ladite optimisation. Procédé de fabrication selon la revendication précédente, dans lequel est compris en 0.3 et 0.7. Procédé de fabrication selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ladite optimisation est telle que . Procédé de fabrication selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ladite optimisation consiste à trouver les épaisseurs optimisées et le nombre de couches minces diélectriques pour lesquels ladite valeur de la transmission de la première structure dans la région spectrale prédéterminée est maximale et pour lesquels ladite intensité du champ électrique évanescent est maximale. Procédé de fabrication selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel, dans le premier empilement, une couche supérieure du premier empilement est dans le deuxième matériau diélectrique et présente une première épaisseur comprise entre et et dans laquelle les couches inférieures du premier empilement présentent chacune une première épaisseur comprise entre et . Procédé de fabrication selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la première fonction F1 est représentative d’une transmission d’un rayonnement de fluorescence induit indirectement par une absorption de ladite longueur d’onde d’illumination en réflexion totale interne dans ledit premier empilement illuminé avec ledit angle d’incidence optimal , le rayonnement de fluoresence présentant un spectre compris dans ladite région spectrale, la transmission étant intégrée sur une gamme angulaire d’incidence du rayonnement de fluorescence sur ladite lame optique comprise entre 0 et 80°. Lame optique (LO) destinée à recevoir un échantillon biologique (E) dans un dispositif (D) de microscopie par réflexion totale interne, la lame optique comprenant : une couche dite substrat (SB) transparente dans une région spectrale prédéterminée un empilement dit optimisé disposé (EO) au dessus du substrat (SB) et comprenant un nombre de couches minces diélectriques successives et alternées ( d’un premier matériau diélectrique et d’un deuxième matériau diélectrique, chacune des couches présentant une épaisseur dite optimisée respective, les épaisseurs optimisées et le nombre de couches minces diélectriques étant adaptés de manière à ce que ladite lame optique présente au moins : une première absorption résonnante à une longueur d’onde dite d’illumination et à un premier angle d’incidence en régime de réflexion totale interne, et une deuxième absorption résonnante à la longueur d’onde d’illumination et à un deuxième angle d’incidence en régime de réflexion totale interne, avec . Lame optique selon la revendication précédente, dans laquelle : - le premier matériau diélectrique présente un indice de réfraction compris entre 1,8 et 3,5 ; - le deuxième matériau diélectrique présente un indice de réfraction compris entre 1,2 et 1,7. Lame optique selon la revendication précédente, dans laquelle le premier matériau est à base de Nb 2 O 5 , le deuxième matériau est à base de SiO 2 . Lame optique selon l’une quelconque des revendications 8 à 10, dans laquelle le nombre de couches minces diélectriques est inférieur à 30, préférentiellement inférieur à 20. Lame optique selon l’une quelconque des revendications 8 à 11, dans laquelle les épaisseurs optimisées et le nombre de couches minces diélectriques sont tels que ladite lame optique présente une épaisseur inférieure à 5 et préférentiellement comprise entre 0,5 et 2 . Lame optique selon l’une quelconque des revendications 8 à 12, dans laquelle les épaisseurs optimisées sont supérieures ou égales à 10 nm. Dispositif (D) de microscopie par réflexion totale interne comprenant : une lame optique (LO) selon l’une quelconque des revendications 8 à 13, une source de lumière (SL) adaptée pour émettre un faisceau lumineux (L in ) présentant la longueur d’onde d’illumination un dispositif optique (Obj) adapté pour mettre en forme le faisceau lumineux (L in ) de manière à ce qu’il illumine ladite lame optique avec ledit angle d’incidence optimisé un détecteur (Det) adapté pour détecter un rayonnement de fluorescence (FL) émis lorsqu’un échantillon (E) est déposé en correspondance d’une région d’une surface (SE) de ladite lame optique où sont produites des ondes évanescentes (OE) par une réflexion totale interne dans ladite lame optique du faisceau lumineux (L in ) mis en forme, ledit rayonnement de fluorescence (Fl) étant excité par lesdites ondes évanescentes (OE). Dispositif selon la revendication précédente, dans lequel le dispositif optique (Obj) est un objectif de microscope.