Brevet FR3144752A1 — publié le 20240712

Composition comprenant une quantité efficace de polysulfate de pentosane pour une utilisation comme médicament dans le traitement de la toux sèche. UTILISATION DE POLYSULFATE DE PENTOSANE POUR LE TRAITEMENT DE LA TOUX SECHE La présente invention concerne l’utilisation de composition comprenant du polysulfate de pentosane pour la fabrication d’un médicament destiné au traitement de la toux sèche. La toux est une réaction normale à une irritation des voies respiratoires. La toux est provoquée par une irritation de la gorge, de la trachée et des bronches. La toux n’est pas une maladie mais un symptôme provoqué par une irritation. La toux est donc généralement un mécanisme endogène de protection et de nettoyage. Les toux peuvent être regroupées en deux familles : les toux grasses et les toux sèches. Une toux dite grasse est une toux productive ou encombrée, destinée à l’évacuation des voies aériennes de corps obstruant ces voies, due à la production abondante de glaires et mucosités. Le réflexe de défense dû aux sécrétions bronchiques ou nasales, d’une toux grasse, s’attenu dès l’expulsion des corps provoquant l’irritation. Une toux dite sèche est une toux non-productive qui se caractérise par des accès de toux spasmodiques et durs dans lesquels aucun flegme n’est expulsé. Le réflexe de défense dû aux sensations d’irritations d’une toux sèche est difficile à atténuer. La durée d’une toux est variable, il est considéré une toux aiguë, si une personne tousse depuis moins de trois semaines, une toux subaiguë, entre trois et huit semaines, et une toux chronique, si la toux se prolonge au-delà de huit semaines. Une toux sèche qui ne disparaît pas spontanément peut-être invalidante ou nuire à la qualité de vie. En général, des médicaments pour soulager la toux sèche sont des médicaments dits antitussifs. Ils diminuent le réflexe de la toux en agissant via le système nerveux central. Les médicaments antitussifs se divisent en plusieurs catégories, les médicaments antitussifs opiacés, antitussifs antihistaminiques et antitussifs non opiacés et non antihistaminiques. Les médicaments antitussifs opiacés ont un effet sédatif et ne doivent pas être utilisés en cas d’insuffisance respiratoire ou de toux liée à l’asthme. Ils ne peuvent être achetés que sur présentation d’une ordonnance. Les antitussifs antihistaminiques sont recommandés en cas de toux sèche et irritante survenant la nuit, en raison de leur effet sédatif. Ils ont également des effets dits atropiniques, à savoir sécheresse de la bouche, constipation, blocage des urines et troubles visuels. Les antitussifs non opiacés et non antihistaminiques sont indiqués dans le traitement de courte durée des toux sèches. Ils sont généralement des médicaments d’homéopathie traditionnellement proposés lors des affections respiratoires bénignes. D’autres alternatives ont été également proposés, tels que des suppléments à base de plantes ou l’utilisation d’anti-inflammatoire non stéroïdien. Le document EP 0 274 845 divulgue la combinaison d’ibuprofène en tant qu’un anti-inflammatoire non stéroïdien avec un antitussif opiacé. Le document EP 2 106 258 décrit l’utilisation d’ibuprofène en tant qu’un anti-inflammatoire non stéroïdien, comme antitussif, pour le traitement contre la toux sèche d’origine virale ou bactérienne. Le document WO 2014/161811 divulgue l’utilisation d’une substance astringente et de substance mucilagineuse, telle que la mousse islandaise, pour le traitement des irritations des muqueuses de la bouche et de la gorge, ainsi que de la toux sèche. Le document EP 3 086 799 décrit le traitement de toux persistantes par un mécanisme de protection physique des muqueuses des voies aériennes supérieures, par l’utilisation d’agents d’origine végétale. Le mécanisme exact d’une toux chronique n’est pas clairement explicité à ce jour. Cependant, il est largement reconnu qu’une toux chronique est associée à une inflammation des voies aériennes. La toux est engendrée par le reflex de la toux, un stimulus induit par l’activation de nerfs afférents, sensoriels, innervant les voies respiratoires. Ces signaux sont transmis de manière centrale via le nerf vague, qui est connecté aux réseaux du tronc cérébral. De tels réseaux coordonnent l’activation de la production motrice (par exemple, les nerfs phréniques, intercostaux et laryngés récurrents (RLN) et l'expression ultime de la toux) (Taylor-Clark TE. Peripheral neural circuitry in cough. Curr Opin Pharmacol. 2015 Jun;22:9-17.). La majorité des fibres nerveuses sensorielles innervant les voies respiratoires sont des afférences vagales pulmonaires sensibles à la capsaïcine (CSLV) (Agostoni, E., Chinnock, J. E., De Daly, M. B., and Murray, J. G. (1957). Functional and histological studies of the vagus nerve and its branches to the heart, lungs and abdominal viscera in the cat. J. Physiol. 135, 182–205.), les terminaisons nerveuses sensorielles nociceptives. Ces fibres sont très chimiosensibles et peuvent être activées par plusieurs médiateurs endogènes dont les libérations sont élevées lors de l'inflammation pulmonaire (Carr, M. J., and Undem, B. J. (2003). Bronchopulmonary afferent nerves. Respirology 8, 291–301.; Hsu, C. C., Lin, R. L., Lee, L. Y., and Lin, Y. S. (2013). Hydrogen sulfide induces hypersensitivity of rat capsaicin-sensitive lung vagal neurons: role of TRPA1 receptors. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 305, R769–R779.). Anatomiquement parlant, il existe deux types de neurones : les neurones sensoriels à fibres Aδ myélinisées et les neurones sensoriels à fibres C. Les fibres Aδ myélinisées jouent un rôle dans la génération de la toux. Les fibres Aδ sont responsables de la toux violente et soudaine qui survient lors de l'aspiration (Lieu T, Undem BJ: Neuroplasticity in vagal afferent neurons involved in cough. Pulm Pharmacol Ther 2011, 24(3):276–279. ; Canning BJ, Mori N, Mazzone SB: Vagal afferent nerves regulating the cough reflex. Respir Physiol Neurobiol 2006, 152(3):223–242.). Ces dernières années, d'énormes progrès ont été accomplis dans notre compréhension du mécanisme neuronal des démangeaisons. En tant que neurotransmetteur endogène, la sérotonine s'est imposée comme un acteur clé dans les démangeaisons aiguës comme chroniques (X. Dong (2018): “Peripheral and central mechanisms of itch”. Neuron 98, 482–494.). Dans notre corps, il semble que 95% de la sérotonine soit synthétisée et libérée par les cellules entérochromaffines dans l'intestin, en réponse à une stimulation mécanique ou chimique (Linan-Rico, A., et al. (2016), Front. Neurosci. 10 :564.) Récemment, la sérotonine et son récepteur 5HT7 ont été identifiés comme l'acteur clé dans la médiation de la sensation de démangeaison aiguë et chronique de la peau (Morita T, McClain SP, Batia LM, et al. 2015: HTR7 Mediates Serotonergic Acute and Chronic Itch. Neuron. 87:124–38). Il a été démontré que la sérotonine produit des démangeaisons fortes et robustes chez la souris et le rat, ainsi que chez l'homme (Akiyama et al., 2009: T. Akiyama, A.W. Merrill, M.I. Carstens, et al. Activation of superficial dorsal horn neurons in the mouse by a PAR-2 agonist and 5-HT: potential role in itch. J Neurosci, 29, pp. 6691-6699 ; Morita T, McClain Shannan P, Batia Lyn M, Pellegrino M, Wilson Sarah R, Kienzler Michael A, Lyman K, Olsen Anne Sofie B, Wong Justin F, Stucky Cheryl L, et al. (2015): “HTR7 Mediates Serotonergic Acute and Chronic Itch”. Neuron. ; 87:124–138.) Les fibres C sont également impliquées dans la génération de la toux. On pense que les fibres C sont importantes pour la toux de type sèche, qui est utilisé pour se débarrasser d'une sensation de démangeaison dans la gorge. Ce sentiment est plus typique de la toux chronique. La sérotonine et ses récepteurs peuvent également jouer un rôle similaire dans les poumons (Pecova T, Kocan I, Vysehradsky R, Pecova R. Itch and Cough - Similar Role of Sensory Nerves in Their Pathogenesis. Physiol Res. 2020 Mar 27;69(Suppl 1):S43-S54.). En effet, la sérotonine exerce un effet stimulant intense sur les terminaisons de la fibre C pulmonaire par l'intermédiaire d'une activation du récepteur de la sérotonine 5-HT3, ce qui peut contribuer à l'hypersensibilité des voies respiratoires sous inflammation pulmonaire (Potenzieri C, Meeker S, Undem BJ. Activation of mouse bronchopulmonary C-fibres by serotonin and allergen-ovalbumin challenge. J Physiol. 2012 Nov 1;590(21):5449-59. ; Hsu CC, Ruan T, Lee LY, Lin YS. Stimulatory Effect of 5-Hydroxytryptamine (5-HT) on Rat Capsaicin-Sensitive Lung Vagal Sensory Neurons via Activation of 5-HT3 Receptors. Front Physiol. 2019 May 28;10:642.). Lors d’infections et d’inflammation des tissus, le nombre des cellules d’origine myéloïde à caractère suppressif augmentent très significativement (Ost, M., Singh, A., Peschel, A., Mehling, R., Rieber, N., and Hartl, D. (2016). Myeloid Derived Suppressor Cells in Bacterial Infections. Front. Cell. Infect. Microbiol. 6). En réponse à un signal inflammatoire, les cellules myéloïdes produites par la moelle osseuse, migrent dans le sang et deviennent fonctionnellement actives, dans le but de restaurer ou de remplacer les populations périphériques endommagées (Panopoulos, A.D., and Watowich, S.S. (2008). Granulocyte colony-stimulating factor: molecular mechanisms of action during steady state and emergency hematopoiesis. Cytokine 42, 277–288.). En plus de ces cellules immunitaires effectrices conventionnelles, il a été démontré que les cellules souches hématopoïétiques participent directement au processus inflammatoire dans des maladies respiratoires, telle que l’asthmes, l’allergies, etc… (Massberg S, Schaerli P, Knezevic-Maramica I, Köllnberger M, Tubo N, Moseman EA, Huff IV, Junt T, Wagers AJ, Mazo IB, von Andrian UH. (2007) “Immunosurveillance by hematopoietic progenitor cells trafficking through blood, lymph, and peripheral tissues.” Cell. 131(5):994-1008 ; Allakhverdi, Z., Comeau, M. R., Smith, D. E., Toy, D., Mfuna Endam, L., Desrosiers, M., Liu, Y-. J., Howie, K. J., Denburg, J. A., Gauvreau, G. M., Delespesse, G. (2009): “CD34+ hemopoietic progenitor cells are potent effectors of allergic inflammation”. Journal of Allergy and Clinical Immunology, Volume 123, Issue 2, Pages 472-478.e1; Blanchet, M. R., McNagny, K. M. (2009) : “Stem cells, inflammation and allergy”. Allergy Asthma Clin Immunol. 5(1):13; Fischer, K. D., & Agrawal, D. K. (2013): “Hematopoietic stem and progenitor cells in inflammation and allergy”. Frontiers in immunology, 4, 428.). Ces résultats sont confirmés par les travaux de l’inventeur : une grande quantité de cellules souches hématopoïétiques sont visible sur les biopsies issues des patients souffrant des maladies inflammatoires. De plus, la sérotonine a été détecté dans ces cellules souches hématopoïétiques. Tel que mentionné précédemment, lors d’une inflammation, les cellules hématopoïétiques s’agrègent et produisent de la sérotonine, responsable en partie des démangeaisons, stimulus de la toux sèche. Le demandeur a découvert que le polysulfate de pentosane modifiait la morphologie des cellules hématopoïétiques. La modification de morphologie de ces cellules, limite voire empêche leurs agrégations lors d’un processus d’inflammation, limitant la libération de sérotonine. Le polysulfate de pentosane, également nommé, pentosane polysulfate ou polyester sulfurique de pentosane, a été utilisé dans différentes applications thérapeutiques. Le polysulfate de pentosane est un analogue des glucosaminoglycanes, dérivé de l’héparine, aux propriétés anticoagulante, fibrinolytique et anti-inflammatoire. Le document WO 93/23059 décrit l’utilisation de composition comprenant du polysulfate de pentosane dans le traitement des thrombopénies. Le document WO 2019/023761 divulgue l’utilisation de polysulfate de pentosane dans le traitement de maladies ou de troubles associés à des pathologies de la moelle osseuse. Le document EP 1 038 528 décrit l’utilisation de polysulfate de pentosane dans le traitement de la fibrose. Le document EP 1 488 788 décrit l’utilisation de composition comprenant du polysulfate de pentosane dans le traitement des troubles gastro-intestinaux. Le document EP 2 164 501 divulgue l’utilisation de polysulfate de pentosane dans le traitement de maladies telles que l'asthme, la rhinite allergique et la bronchopneumopathie chronique obstructive. Le polysulfate de pentosane est également employé en tant que principe actif dans des crèmes visant à lutter contre l'inflammation. Elles sont utilisées dans le traitement local des contusions et des hématomes, voire des douleurs musculaires et articulaires. Le polysulfate de pentosane est également indiqué dans le traitement du syndrome de la vessie douloureuse caractérisé par des glomérulations ou bien des ulcères de Hunner chez les adultes souffrant de douleurs modérées à importantes, d'impériosité urinaire et de pollakiurie. Son mécanisme d'action dans le traitement du syndrome de la vessie douloureuse est mal connu ; le polysulfate de pentosane semble agir par un effet local dans la vessie par liaison des glycosaminoglycanes à la muqueuse vésicale et par un effet anti-inflammatoire. Une toux excessive ou chronique est un problème majeur qui est mal gérée par les thérapies actuellement disponibles. Ainsi, un besoin de développement de nouveau médicament se fait ressentir. La présente invention propose de traiter les toux sèches excessives ou chroniques par l’utilisation de compositions comprenant du polysulfate de pentosane. La présente invention concerne donc une composition comprenant une quantité efficace de polysulfate de pentosane (PPS) pour une utilisation comme médicament dans le traitement de la toux sèche. La mise en œuvre de l’invention sera mieux comprise à l’aide de la description détaillée qui est exposée ci-après en regard des figures annexées dans lesquels : Les figures 1 à 3 illustrent des images de poumons, de morceau de parenchyme pulmonaire et de morceaux d’anneaux bronchiques. est une image représentant des poumons normaux, de couleur uniforme et lisse en surface. est une image représentant un morceau de parenchyme pulmonaire d'un patient atteint de fibrose pulmonaire. est une image représentant deux morceaux d'anneaux bronchiques, à gauche, d'un donneur d'organe sans maladie respiratoire ; à droite, d’un patient qui a reçu une greffe de poumon. est une image rapprochée de congestions sanguines dans la lumière des bronches d'un patient avec une maladies pulmonaire chronique. Les figures 5 et 6 illustrent des images obtenues par microscope optique de cellules de congestions sanguines d'un donneur allergique, avec un agrandissement x20. est une image de phase de contraste. est une image fluorescente montrant un sous-ensemble de cellules de congestions sanguines exprimant une grande quantité de sérotonine représentée par une couleur rouge en couleur réelle, et illustrée par des zones claires. Les figures 7 et 8 illustrent des images obtenues par microscope optique de cellules de congestions sanguines colorées positives pour le récepteur de la sérotonine 5HT2C par un anticorps monoclonal spécifique, avec un agrandissement x20. est une image de la phase de contraste. est une image fluorescente de la coloration 5-HT2C, de couleur verte en couleur réelle, et illustrée par des zones claires. Les figures 9 à 11 illustrent des images obtenues par microscope optique de cellules de congestions sanguines. illustre une image contrôle de cellules de congestions sanguines sans traitement, agrandissement x20. illustre une image de cellules de congestions sanguines après avoir été exposées à une solution aqueuse de 0,5% de polysulfate de pentosane, pendant 24 heures, les cellules de congestions sanguines ont pris la forme d’aiguilles, agrandissement x20. est un agrandissement de la . Ainsi l’invention concerne le traitement de la toux sèche comprenant l'administration d’une composition comprenant une quantité efficace de polysulfate de pentosane, pendant une durée et dans des conditions suffisantes pour le traitement de la toux sèche. Plus précisément, l’invention concerne l'utilisation de polysulfate de pentosane dans la fabrication d'un médicament pour le traitement de la toux sèche. Le terme "quantité efficace" de polysulfate de pentosane tel qu'utilisé, signifie une quantité suffisante de polysulfate de pentosane pour fournir l'effet thérapeutique ou physiologique souhaité. La quantité exacte requise varie d'un sujet à l'autre, de l'âge et de l'état général du sujet, du mode d'administration, etc. Une "quantité efficace" appropriée peut être déterminée en utilisant une expérimentation de routine. La quantité efficace dans ce contexte comprend une quantité requise pour traiter la toux sèche. Ces compositions sont proposées pour une utilisation en tant que compositions ou formulations pharmaceutiques. Les compositions comprennent des solutions avantageusement aqueuses et stériles. Les solutions stériles sont préparées en incorporant une quantité requise de polysulfate de pentosane dans un solvant approprié, avec éventuellement d'autres ingrédients actifs, suivis d'une stérilisation ou au moins d'un processus pour réduire les virus, bactéries ou autres entités biologiques contaminants à des niveaux acceptables. Le polysulfate de pentosan (PPS) est de préférence choisi dans le groupe constitué par : le sel de sodium de polysulfate de pentosane (NaPPS), le sel de magnésium de polysulfate de pentosane (MgPPS), le sel de calcium de polysulfate de pentosane (CaPPS), et le sel de zinc de polysulfate de pentosane (ZnPPS). De préférence, le polysulfate de pentosane (PPS) est le polysulfate de pentosane sodique (NaPPS). Selon des modes de réalisation, le médicament est administré par inhalation ou sous forme de pulvérisation nasale, délivré par un inhalateur. Selon une caractéristique, la concentration massique de polysulfate de pentosane, exprimée en pourcentage, est comprise entre 0,5 et 3 %. Selon un mode d’exécution, la concentration massique de polysulfate de pentosane, exprimée en pourcentage, est égale à 1 %. Le solvant est de préférence une solution aqueuse saline, par exemple comprenant une concentration massique, exprimée en pourcentage, de chlorure de sodium de 0,9 %, tamponnée avec 10mM HEPES (ou acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthane sulfonique). Il est entendu par autres ingrédients actifs, une molécule antibiotique ou antivirale. Des poumons sains sont plus ou moins uniformes en couleur et en forme, tels qu’illustrés à la . Les parenchymes pulmonaires ainsi que les bronches de patients atteints de maladies respiratoires chroniques, telles que la fibrose kystique, la fibrose pulmonaire idiopathique, la sarcoïdose, présentent des zones d’agrégation de cellules hématopoïétiques de couleurs rouges en couleurs réelles et illustrées par des zones sombres, telles qu’illustrées aux figures 2 à 4. Ces zones d’agrégation cellulaires sont communément appelées congestion sanguine des poumons. Ces congestions sanguines participent ainsi directement aux réponses inflammatoires et à la réparation des tissus. Par immuno-cytochimie, le demandeur a découvert que l’agrégation de cellules hématopoïétiques dans les poumons expriment une grande quantité de sérotonine, telles qu’illustrées à la . Ces observations de la présence de la sérotonine ont été confirmées par deux anticorps différents dans plusieurs expériences indépendantes, avec les mêmes résultats, un exemple d’une telle confirmation est illustré à la . Ainsi, non seulement l’agrégation de cellules hématopoïétiques dans les poumons expriment la sérotonine, mais également un récepteur de la sérotonine, 5-HT2C ( ). Sur la base de ces données, le demandeur propose le schéma suivant de la toux chronique : lors d'infections virales ou bactériennes, ou de lésions tissulaires, les médiateurs pro-inflammatoires, dont la sérotonine, sont libérés dans la zone touchée. Ces médiateurs recruteront les cellules hématopoïétiques à partir des tissus pulmonaires environnants ainsi que de la circulation sanguine. La sérotonine agirait sur les cellules hématopoïétiques principalement via les récepteurs 5HT2C de manière paracrine et autocrine, amplifiant la réponse inflammatoire. Un grand nombre de cellules hématopoïétiques s'accumuleront rapidement dans la zone affectée, ce qui rendra la zone affectée de couleur rouge. Les cellules hématopoïétiques libèrent une quantité croissante de sérotonine qui active les fibres C provoquant une sensation de démangeaison via le récepteur 5HT3 ou 5HT7, activant le réflexe de la toux. Tant que des zones d’agrégation importantes de cellules hématopoïétiques sont présentes, par exemple telles qu’illustrées aux figures 2 et 3, la toux sèche ne devrait pas s'arrêter, en raison de la libération continue de sérotonine par les agrégats de cellules hématopoïétiques. De plus, la toux sèche peut encore augmenter la sécrétion de sérotonine, créant une boucle de rétroaction positive. Le demandeur a découvert que le polysulfate de pentosane, a un effet direct sur les cellules hématopoïétiques localisées dans les agrégats de cellules : en tant qu'anticoagulant. En effet, le polysulfate de pentosane modifie considérablement la morphologie des cellules hématopoïétiques in vitro, telle qu’illustrée à la . Lors du traitement avec le polysulfate de pentosane, les cellules hématopoïétiques extraites des agrégats, ont changées de morphologie, vers une forme d’aiguille, ou de clou, tels qu’illustrés aux figures 10 et 11. Pour s'agréger, les cellules doivent avoir la forme d'un disque, telles qu’illustrées à la . Ce changement morphologique induit par le polysulfate de pentosane empêcherait les cellules hématopoïétiques de former des agrégats cellulaires. Cette hypothèse fournit non seulement une explication sur le fonctionnement du polysulfate de pentosane, mais également une justification de son utilisation comme médicament pour briser le cercle vicieux de l'inflammation chronique dans diverses maladies inflammatoires, en particulier les maladies respiratoires, fréquemment associées à la toux chronique. Une application locale et directe de polysulfate de pentosane par inhalation ou sous forme de pulvérisation nasale, sur les voies respiratoires, aura un double bénéfice, à savoir une efficacité médicamenteuse accrue et une réduction de la toxicité du médicament. De plus, en agissant directement sur les agrégats de cellules hématopoïétiques, le polysulfate de pentosane n'altère pas le réflexe de la toux, préservant ainsi les effets protecteurs de la toux contre les agents nocifs des voies respiratoires. Matériels et méthodes : Les poumons et les biopsies pulmonaires : Les morceaux d’organes illustrés aux figures 2 à 4 ont été obtenus à partir de patients ayant subi une transplantation pulmonaire ou une polypectomie. Toutes les procédures expérimentales ont été expliquées dans leur intégralité, et tous les sujets ont reçu consentement éclairé. L'étude a été menée conformément à la déclaration de Helsinki sur la recherche biomédicale (amendement de Hong Kong, 1989), et a reçu l'approbation de la commission d'éthique locale. Isolation des cellules souches hématopoïétiques du parenchyme pulmonaire : Les échantillons de tissu pulmonaire ont été disséqués en morceaux d'environ 5 mm 3 . Environ 10 g de tissus hachés ont été placés dans des tubes coniques de 50 ml, remplis de tampon de lavage (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) contenant chacun 100U/mL de pénicilline et streptomycine). Les tubes ont été retournés pour laver le tissu et le surnageant retiré, en répétant ces opérations trois fois. Le plus possible de liquide a été retiré, les tissus hachés et lavés ont été filtrés à travers une couche de gaze stérile. Les tissus sur la gaze ont été répartis dans des tubes Falcon de 15 ml, comprenant environ 1,5 g de tissus par tube. Les filtrats ont été passés à travers un tamis cellulaire de 10 μm. Les cellules ont été recueillies par centrifugation. Immuno-coloration, figures 5, 6 et 8 : Les cellules sont cultivées sur une lamelle, puis fixées avec une solution de formaldéhyde titrée à 2%, et de glutaraldéhyde titrée à 2,5% dans du tampon de 0,1 M phosphate de sodium, pendant 30 minutes à température ambiante. Les cellules fixées sont ensuite rincées plusieurs fois (3 X) avec du PBS (tampon phosphate salin). Pour faciliter l’accès d’anticorps, les cellules fixées sont ensuite perméabilisées avec 0,25% Triton-X-100. Les cellules fixées sont rincées plusieurs fois (3 X) avec du PBS. Une solution de 100 µl de PBS supplémentée de 10% de sérum (bovin, Chèvre, ou humain, en fonction de l’anticorps primaire utilisé), a été appliquée pendant 60 minutes à température ambiante. 100 µl, ou un volume suffisant pour couvrir les cellules, d'anticorps primaire ont été appliqué et incubé pendant 30-60 minutes. Les cellules ont été rincées avec du PBS 3 fois pendant 2 minutes. 100 µl, ou un volume suffisant pour couvrir les cellules a été appliqué, d'une solution d’anticorps secondaire conjugué avec un fluorophore (Alexa 488, Alexa 560 ). La lamelle est ensuite montée sur une lame de verre pour l’observation sous un microscope à fluorescence. Pour l’échantillon illustré à la , l’anticorps primaire est un anticorps spécifique dirigé contre la sérotonine (Sigma, S5545). Cet anticorps a été produit chez le lapin (dilution 1 sur 50 dans PBS). L’anticorps secondaire utilisé est donc un anticorps anti-IgG de lapin, produit chez la chèvre, conjugué avec un fluorochrome rouge [Alexa Fluor 568, Goat anti-rabbit IgG (H+L), dilution 1 sur 500 dans PBS], (Invitrogen, A11011). La photo a été prise sur un microscope à fluorescence. Pour l’échantillon illustré à la , l’anticorps primaire est un anticorps spécifique dirigé contre le récepteur de Sérotonine, 5HT2C (R&D Systems, Minneapolis, MAB5764). Cet anticorps a été produit chez la souris (dilution 1 sur 50 dans PBS). L’anticorps secondaire utilisé est donc un anticorps anti-IgG de la souris, produit chez la chèvre, conjugué avec un fluorochrome vert [Alexa Fluor 488, Goat anti-rabbit IgG (H+L), dilution 1 sur 500 dans PBS], (Invitrogen, A11011). La photo a été prise sur un microscope à fluorescence. Composition comprenant une quantité efficace de polysulfate de pentosane pour une utilisation comme médicament dans le traitement de la toux sèche. Composition selon la revendication 1, caractérisé en ce que la concentration massique, exprimée en pourcentage, de polysulfate de pentosane est comprise entre 0,5 et 3%. Composition selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu’elle comprend une molécule antibiotique ou antivirale. Composition selon l’une quelconque des revendication 1 à 3, caractérisé en ce qu’elle est apte à être conditionnée dans un inhalateur pour être apte à être administrée par inhalation ou sous forme de pulvérisation nasale.