Brevet FR3145363A1 — publié le 20240802

Procédé d’obtention de sphéroïdes et sphéroïdes obtenus L’invention concerne un procédé d’obtention de sphéroïdes comprenant les étapes suivantes de prélèvement sanguin sur un individu, préparation d’un sérum sanguin appauvri à partir d’un prélèvement, culture de sphéroïdes à partir de cellules humaines caractérisé en ce que la culture de sphéroïdes est réalisée dans un milieu de culture de reprogrammation comprenant de 30 à 60% en volume du sérum sanguin appauvri. L’invention trouvera son application dans le domaine de la médecine de précision et notamment pour le développement de solution pour l’identification et le développement de molécule de médicament personnalisé. Plus précisément, l’invention trouvera des applications lors des tests d’hépatotoxicité d'origine médicamenteuse et de l’efficacité lors de développement de médicaments. Procédé d’obtention de sphéroïdes et sphéroïdes obtenus La présente invention concerne un procédé d’obtention de sphéroïdes et les sphéroïdes obtenus. L’invention trouvera son application dans le domaine de la médecine de précision et notamment pour le développement de solution pour l’identification et le développement de molécule de médicament personnalisé. Plus précisément, l’invention trouvera des applications lors des tests d’hépatotoxicité d'origine médicamenteuse et de l’efficacité lors de développement de médicaments. ETAT DE LA TECHNIQUE Lors du développement de nouveau médicament, le contrôle de la toxicité hépatique est un enjeu majeur. Au cours de cette phase, il est estimé que 20 à 40% des patients arrêtent le traitement du fait d’hépatotoxicité constatée au cours des essais cliniques. Il est bien connu que les DILI (drug-induced liver injury ou lésions hépatiques d'origine médicamenteuse) sont un défi majeur dans le développement de médicaments. La plupart des composés qui ont réussi les tests précliniques échouent aux essais cliniques en raison de leur toxicité hépatique. Une des raisons de cet échec est que les modèles précliniques existants sont incapables de reproduire l'hétérogénéité inter-individuelle de la réponse aux médicaments dans une population. Il existe plusieurs solutions de tests précliniques de la toxicité hépatique. Tout d’abord, l’utilisation de lignées cellulaires qui présentent l’avantage d’être faciles à produire, à utiliser et à maintenir à faible coût. Toutefois, ces lignées cellulaires sont des modèles en deux dimensions qui sont peu pertinents d’un point de vue physiologique. On connait également l’utilisation d’hépatocytes humains primaires (en anglais PHH pour primary human hepatocytes). Les PHH sont préparés à partir de tissus hépatiques humains. Cette préparation à partir de tissus humains permettait d’avoir une conservation du fond génétique du donneur. Toutefois, la quantité de tissus prélevés est limitée, ce qui nécessite de regrouper les PPH de plusieurs donneurs résultant donc à l’effacement de la contribution, si toutefois elle existe, du génome du donneur dans la sensibilité à un médicament. De plus, la collecte est invasive avec un risque majeur pour le sujet. Enfin, pour se rapprocher d’une médecine de précision, des organoïdes ont été développés. Les organoïdes sont des organes miniatures cultivés in vitro . Ce sont des structures cellulaires en trois dimensions qui miment l’architecture et le fonctionnement de l’organe entier. Les organoïdes se composent généralement d’une co-culture de cellules qui présentent un ordre supérieur d’autoassemblage permettant une représentation encore meilleure des interactions et des réponses cellulaires in vivo complexes. Les organoïdes sont obtenus à partir de cellules souches grâce à un processus d’auto-organisation, favorisé par un milieu de culture contenant les facteurs de croissance et de différenciation adéquats. Ces organoïdes présentent l’avantage d’être physiologiquement pertinents et de pouvoir imiter davantage l’environnement in vivo par rapport aux équivalents cellulaires 2D. Toutefois, leurs qualités sont très dépendantes des cellules souches de départ. De plus, ils sont encore particulièrement coûteux à développer et à utiliser du fait des conditions de culture complexe pour leur production et leur maintien. Des sphéroïdes ont également été développés. Les sphéroïdes sont des agrégats cellulaires tridimensionnels (3D) qui peuvent imiter les tissus et les microtumeurs. Contrairement aux organoïdes, les sphéroïdes ont une structure 3D plus simplifiée les rendant adaptés à l’évolution et à la reproductibilité. Ces différentes solutions bien que représentant des avancées essentielles dans les domaines de la recherche sur le cancer et du criblage de médicaments ne permettent pas de représenter les variations inter-individus que l’on retrouve lors d’essais cliniques sur une cohorte d’individus. Il existe donc le besoin de proposer une nouvelle solution pour réaliser des tests in vitro les plus représentatifs de la physiologie et des variations inter-individus tout en étant facile à produire et à mettre en œuvre. RESUME Pour atteindre cet objectif, selon un mode de réalisation, on prévoit un procédé d’obtention de sphéroïdes comprenant les étapes suivantes : prélèvement sanguin sur un individu, préparation d’un sérum sanguin appauvri à partir du prélèvement sanguin, culture de sphéroïdes à partir de cellules humaines, caractérisé en ce que la culture de sphéroïdes est réalisée dans un milieu de culture de reprogrammation comprenant de 30 à 60% en volume du sérum sanguin appauvri. Avantageusement, le procédé comprend la détermination d’une cohorte d’individus représentative d’une étude et le procédé est réalisé pour chaque individu de la cohorte, c’est-à-dire qu’un prélèvement sanguin, la préparation d’un sérum sanguin appauvri et la culture des sphéroïdes sont réalisés pour chaque individu de la cohorte. Le procédé selon l’invention permet d’obtenir des sphéroïdes qui sont faciles à manipuler tout en étant spécifiques d’un individu. Les sphéroïdes obtenus sont dits donneur dépendant, car ils sont spécifiques d’un individu. Le procédé selon l’invention, et notamment l’étape de culture des sphéroïdes par le milieu de culture de reprogrammation comprenant un sérum sanguin appauvri permet d’apporter avantageusement des facteurs de croissance et autres éléments tels que les exosomes, les cytokines, les hormones et les résidus microbiotiques utiles à la culture des sphéroïdes qui sont spécifiques d’un individu. Les sphéroïdes sont également dénommés sphéroïdes reprogrammés en comparaison aux sphéroïdes cultivés sans l’apport du milieu de culture de reprogrammation. L’invention propose un procédé pour obtenir un nouveau modèle de sphéroïde multicellulaire reprogrammé dépendant du donneur qui représente l'hétérogénéité interindividuelle trouvée dans une cohorte d’individus. Selon un autre aspect, l’invention concerne un procédé de test sur des sphéroïdes obtenus par le précédent procédé. Selon un autre aspect, l’invention concerne un sphéroïde obtenu par le procédé décrit ci-dessus. Selon un autre aspect, l’invention concerne une utilisation de sphéroïdes obtenus par le procédé décrit ci-dessus pour évaluer l’hépatotoxicité ou l’efficacité d’une molécule ou d’une composition. Le procédé selon l’invention n’implique pas la destruction d’embryons humains. Les cellules primaires humaines et les lignées cellulaires humaines ne comprennent et ne sont pas obtenues à partir de cellules souches embryonnaires. Les tests réalisés sur des sphéroïdes obtenus par le présent procédé sont particulièrement représentatifs des différences inter-individus et donnent ainsi des résultats in vitro d’une meilleure fiabilité que les systèmes de l’état de la technique. BREVE DESCRIPTION DES FIGURES Les buts, objets, ainsi que les caractéristiques et avantages de l’invention ressortiront mieux de la description détaillée d’un mode de réalisation de cette dernière qui est illustré par les dessins d’accompagnement suivants dans lesquels : La représente des photos de sphéroïdes non reprogrammés 100 et de sphéroïdes reprogrammés 200 après 1 jour, 2 jours et 3 jours de culture selon l’exemple 1. La représente un graphe de la viabilité cellulaire en pourcentage en fonction du log de la concentration d’un médicament le bosentan sur des sphéroïdes non reprogrammés 100 et de sphéroïdes reprogrammés 200. La représente un graphe de composants principaux de type PCA (en anglais Principal Component Analysis) après séquençage RNAseq des sphéroïdes non reprogrammés 100 et des sphéroïdes reprogrammés 200. La représente une analyse des gènes différentiellement exprimés après un séquençage RNAseq des sphéroïdes non reprogrammés 100 et de sphéroïdes reprogrammés 200. La représente des images de microscopie confocale des canalicules biliaires dans un sphéroïde reprogrammé 200 d’une femme de 41 ans. La représente des images de microscopie confocale de sphéroïdes reprogrammés 200 de 6 individus différents montrant l’activation des cellules stellaires hépatiques de manière donneur dépendant. La représente des images de microscopie confocale de sphéroïdes reprogrammés 200 de 3 individus différents montrant le dépôt de matrice extracellulaire (collagène) donneur dépendant. La représente une analyse transcriptomique par RNAseq des sphéroïdes reprogrammés 200 et des sphéroïdes non reprogrammés 100. La représente une analyse du type « Gene Ontology » qui permet de structurer, selon les fonctions cellulaires, les gènes qui sont différentiellement exprimés dans les sphéroïdes reprogrammés 200 par rapport aux sphéroïdes non reprogrammés 100. La représente l’efficacité des sphéroïdes reprogrammés obtenus à l’exemple 1 pour détecter la toxicité hépatique médicamenteuse en comparaison avec les modèles in vitro et in vivo existants. La représente la stratification des degrés de sévérité de la toxicité hépatique en fonction du sexe et de l’âge du donneur. Les sphéroïdes reprogrammés 200 sont suffisamment sensibles pour réaliser cette analyse. Les dessins sont donnés à titre d'exemple et ne sont pas limitatifs de l’invention. DESCRIPTION DÉTAILLÉE Avant d’entamer une revue détaillée de modes de réalisation de l’invention, sont énoncées ci-après des caractéristiques optionnelles qui peuvent éventuellement être utilisées en association ou alternativement : - Selon un exemple, la préparation du sérum sanguin appauvri comprend une phase d’obtention d’un sérum sanguin et une phase de filtration du sérum par un filtre de 0,45µm ; - Selon un exemple, le milieu de culture de reprogrammation est utilisé pendant au moins 3 jours ; - Selon un exemple, les cellules humaines sont issues d’au moins une lignée cellulaire humaine ou de cellules primaires humaines ; - Selon un exemple, au moins une lignée de cellules est choisie parmi les lignées cellulaires suivantes : PANC-1, TWNT-1, THP-1, HepG2 ou un mélange de celles-ci ; - Selon un exemple, les cellules primaires humaines sont choisies parmi les cellules primaires humaines suivantes : hépatocytes humains primaires (PHH), cellules hépatiques primaires, cellules circulantes ou cellules tumorales circulantes (CTC), cellules mononucléées sanguines périphériques (PBMC) ou un mélange de celles-ci ; – selon un exemple, le procédé de test de l’effet d’une molécule ou d’une composition comprenant l’obtention de sphéroïdes comprend les étapes suivantes : Prélèvement sanguin d’un individu, Préparation d’un sérum sanguin appauvri à partir du prélèvement sanguin, caractérisé en ce que la culture de sphéroïdes à partir de cellules humaines est réalisée dans un milieu de culture de reprogrammation comprenant de 30 à 60% en volume du sérum sanguin appauvri, et que le procédé comprend une étape d’exposition des sphéroïdes obtenus à l’étape précédente à une molécule ou une composition à tester, l’exposition des sphéroïdes étant réalisée avec un milieu de culture de reprogrammation comprenant de 30 à 60% en volume du sérum sanguin appauvri. Les sphéroïdes sont des agrégats de cellules croissant de manière tridimensionnelle en suspension et développant des interactions complexes entre cellules et avec avantageusement une matrice tridimensionnelle. Les sphéroïdes sont donc multi-cellulaires. Une cohorte est un groupe d’individus sélectionnés pour un but spécial notamment pour une étude pré-clinique. On entend par prélèvement sanguin, au moins un prélèvement ou une pluralité de prélèvements d'un volume de sang déterminé au niveau d'un vaisseau sanguin veineux, capillaire ou artériel. Le sang est placé dans un ou plusieurs tubes. Dans la suite de la description, l’utilisation « d’un prélèvement » ou « du prélèvement » n’est pas limitative. Le sérum sanguin est le fluide que l'on obtient après retrait des facteurs de coagulation du plasma sanguin. Le sérum sanguin est le liquide surnageant obtenu après coagulation et centrifugation du sang dans un tube « sec », c'est-à-dire sans inhibiteur de la coagulation. Le sérum est un mélange d'hormones, de facteurs de croissance et d'adhérence, d'agents tampons et d'autres éléments nutritionnels, d’exosomes et de résidus microbiotiques. Selon l’invention, le sérum sanguin appauvri s’entend comme un sérum sanguin dont une partie a été retirée, il peut être dénommé éventuellement sang humain déplété. Le procédé selon l’invention est destiné à l’obtention de sphéroïdes et plus préférentiellement de sphéroïdes dépendants du donneur et avantageusement reprogrammés. On entend par donneur dépendant ou dépendant du donneur d’avoir un sphéroïde qui est mis en culture à partir ou avec un élément biologique du donneur ou d’un individu. Dans la présente invention, l’élément est un sérum sanguin appauvri obtenu à partir d’un individu et qui est utilisé pour supplémenter le milieu de culture du sphéroïde et former le milieu de culture de reprogrammation. Le présent procédé comprend avantageusement une étape de détermination d’une cohorte d’individus. Cette étape est destinée à définir un groupe d’individus qui vont être étudiés. Préférentiellement, les individus sont sélectionnés en fonction d’un objectif d’une étude sur des critères prédéfinis tel que par exemple l’âge, le sexe, la présence d’une ou plusieurs pathologies, la présence d’un ou plusieurs marqueurs prédéfinis. Le procédé selon l’invention utilise le sang d’un individu pour préparer un sérum sanguin appauvri. Préférentiellement, un prélèvement sanguin est réalisé pour chaque individu. Le prélèvement sanguin est à titre d’exemple réalisé par prélèvement sanguin veineux. À titre préféré, le volume de sang prélevé, en un ou plusieurs prélèvement(s), est supérieur ou égal à 5ml, préférentiellement supérieur ou égal à 10ml. Le procédé selon l’invention comprend avantageusement une étape de préparation d’un sérum sanguin appauvri. Ce sérum appauvri est réalisé à partir d’un prélèvement de sang d’un individu. Selon un mode de réalisation préféré, le prélèvement sanguin est mis à décanter, par exemple à température ambiante au minimum 30 minutes jusqu’à 1h. Le prélèvement sanguin décanté est avantageusement centrifugé, à titre d’exemple à une vitesse comprise entre 1000G et 2000G pendant 10 minutes . La phase translucide supérieure formant le sérum sanguin est récupérée. Selon un mode de réalisation, le sérum sanguin est filtré. De manière surprenante, la filtration est réalisée sur un filtre de maille 0,45µm qui assure la déplétion du sérum, mais conserve avantageusement notamment le microbiote. Le sérum obtenu après filtration est dénommé sérum sanguin appauvri. Le sérum appauvri représente environ 40% en volume du prélèvement sanguin. Le sérum sanguin appauvri est un sérum dont une partie a été retirée. La partie retirée correspond aux constituants du sérum qui sont de dimensions supérieures à 0,45µm et qui ne passent donc pas au travers de la maille du filtre. Le présent procédé comprend la culture de sphéroïdes. La culture de sphéroïdes est réalisée à partir de cellules avantageusement humaines. Les cellules sont par exemple issues de cellules primaires humaines telles que des hépatocytes humains primaires (en anglais PHH pour primary human hepatocytes), des cellules hépatiques primaires humaines, des cellules circulantes ou cellules tumorales circulantes (en anglais CTC pour circulating tumor cells) ou des PBMC pour cellules mononucléées sanguines périphériques ou des mélanges de celles-ci. Selon une autre possibilité, les cellules sont par exemple issues de lignées cellulaires avantageusement immortalisées et/ou génétiquement modifiées et/ou cancéreuses, à titre d’exemple les lignées cellulaires PANC-1, TWNT-1, THP-1, HepG2 ou des mélanges de celles-ci. Selon une possibilité préférée, des mélanges sont utilisés dans des proportions définies, par exemple les proportions sont du type 100 :10 :1 ou 10 :1. À titre d’exemple, les lignées de cellules immortalisées humaines HepG2, TWNT-1 et THP-1 sont utilisées dans les proportions (100 :10 :1). À titre d’exemple, les lignées de cellules immortalisées humaines PANC-1, TWNT-1 et THP-1 sont utilisées dans les proportions (100 :10 :1). À titre d’exemple, les lignées de cellules immortalisées humaines HepG2, TWNT-1 et des PBMC sont utilisées dans les proportions (100 :10 :1). À titre d’exemple, les lignées de cellules immortalisées humaines PANC-1, TWNT-1 et des PBMC sont utilisées dans les proportions (100 :10 :1). La culture des sphéroïdes se fait classiquement dans des plaques de culture par exemple à fond de type U et à faible adhérence. La culture des sphéroïdes peut se faire dans un système de culture statique ou micro-fluidique. Avantageusement, la culture des sphéroïdes se fait avec un milieu de culture qui est supplémenté par le sérum sanguin appauvri formant un milieu de culture de reprogrammation. Le milieu de culture de reprogrammation comprend de 30 à 60% de sérum sanguin appauvri en volume par rapport au volume total du milieu de culture de reprogrammation. De manière avantageuse, l’utilisation d’un sérum sanguin appauvri pour supplémenter le milieu de culture des sphéroïdes permet d’obtenir des sphéroïdes dépendants du donneur et également dénommés sphéroïdes reprogrammés. Selon une possibilité préférée, le milieu de culture de reprogrammation des sphéroïdes est le MammoCult basal, commercialisé par la société StemCell. Avantageusement, le milieu de culture est complété par l’ajout de l’héparine, d’hydrocortisone, de pénicilline et streptomycine, d’amphotéricine B et d’un mélange d’antibiotiques à large spectre, préférentiellement le Primocin commercialisé par la société Invivogen. Optionnellement, le milieu MammoCult basal peut être remplacé par tous types de milieux de culture cellulaire (à titre d’exemple DMEM, MEM ou RPMI). À titre préféré, le milieu de culture de reprogrammation est utilisé au moins pendant 3 jours pour la culture des sphéroïdes. Préférentiellement, le milieu de reprogrammation est utilisé pour toute la culture des sphéroïdes et le maintien des sphéroïdes également. Avantageusement, le milieu de culture de reprogrammation est également utilisé lors de tests sur les sphéroïdes tels que des essais de molécules ou compositions. Avantageusement, les sphéroïdes sont reprogrammés dans un système de culture statique ou micro-fluidique pendant 3 jours par l’ajout de 30 à 60% en volume de sang humain déplété dans un milieu de culture MammoCult Basal. Selon un aspect, le procédé selon l’invention permet l’obtention de sphéroïdes qui peuvent être utilisés pour des tests in vitro, à titre d’exemple, des tests in vitro d’évaluation des lésions hépatiques induites par des médicaments, des produits chimiques. Ce procédé permet avantageusement d’analyser de la toxicité ou l’efficacité thérapeutique produite par une molécule chimique de synthèse ou une molécule naturelle, sur un organe ou sur une pathologie. Avantageusement, dans le procédé selon l’invention, le sérum est préparé à partir du sang de chaque individu puis appauvri par une filtration à travers une maille de 0,45µm. Le sérum appauvri est utilisé à hauteur de 30 à 60% en volume dans un milieu de culture pour former un milieu de culture de reprogrammation pour reprogrammer les sphéroïdes pendant au moins 3 jours. Après cette étape, les sphéroïdes reprogrammés (donneur dépendant) peuvent être utilisés par exemple pour faire une analyse de la sensibilité aux médicaments. Selon une possibilité, les sphéroïdes reprogrammés sont utilisés pour analyser la toxicité ou l’efficacité thérapeutique induite par une molécule chimique de synthèse ou naturelle, préférentiellement après une exposition de 2 jours jusqu’à 14 jours avantageusement à des concentrations multiples. La toxicité ou l’efficacité thérapeutique est déterminée par exemple par des mesures de viabilité cellulaire, des fonctions cellulaires et de la structure cellulaire. EXEMPLES Exemple 1 : procédé d’obtention d’un sphéroïde selon l’invention Un prélèvement sanguin de 10ml dans un tube sec est effectué sur un individu. Le sang est laissé au repos à température ambiante pendant au moins 30min avant d’être centrifugé à 1000G pendant 10min. La phase supérieure translucide (le sérum) est collectée puis filtrée à travers d’un filtre avec une maille de 0,45µm pour obtenir le sérum appauvri qui sera conservé préférentiellement à +4°C ou à -20°C pour une conservation au-delà de deux semaines. Pour la culture des sphéroïdes et notamment la reprogrammation des sphéroïdes selon l’invention, des cellules HepG2 et TWNT-1 dans les proportions 10 :1 sont mises en culture dans des plaques à fond de type U et à faible adhérence avec un milieu de culture de reprogrammation supplémenté en volume à hauteur de 50% de ce sérum appauvri. La formation et la reprogrammation des sphéroïdes se font naturellement pendant 3 jours. Exemple 2 : caractérisation de sphéroïdes obtenus à l’exemple 1. Les sphéroïdes obtenus à l’exemple 1 sont caractérisés par caractérisation phénotypique en comparaison de sphéroïdes dits non reprogrammés 100 mis en culture uniquement dans un milieu de culture non supplanté en sérum sanguin appauvri. Les résultats sont visibles à la . Les sphéroïdes reprogrammés 200 se forment plus rapidement, sont plus denses et plus compactes que les sphéroïdes non reprogrammés 100. En , la viabilité cellulaire des sphéroïdes reprogrammés 200 est comparée à celle des sphéroïdes non reprogrammés 100 en réponse à une exposition de quatre jours à un médicament bosentan. Les sphéroïdes reprogrammés 200 sont plus résistants de l’ordre d’un Log, c’est-à-dire 10 fois plus résistants. Avantageusement, cette augmentation de la résistance montre un changement du comportement des sphéroïdes après la reprogrammation, un comportement similaire aux cellules primaires humaines. En , il est représenté un graphe de composants principaux de type PCA (en anglais Principal Component Analysis) après séquençage RNAseq des sphéroïdes non reprogrammés 100 et des sphéroïdes reprogrammés 200. Avantageusement, la reprogrammation des sphéroïdes avec le sérum appauvri des donneurs modifie la signature globale de l’expression des gènes tout en conservant l’hétérogénéité inter-individus. En , une analyse des gènes différentiellement exprimés après un séquençage RNAseq des sphéroïdes non reprogrammés 100 et de sphéroïdes reprogrammés 200. Le profil transcriptomique des gènes différentiellement exprimés change significativement notamment 40,5% des ARNm subissent une augmentation tandis que 59,5% subissent une réduction de l’expression après la reprogrammation. Les sphéroïdes obtenus à l’exemple 1 sont caractérisés sur le plan structural et fonctionnel par la microscopie confocale démontrant qu’il y a une hétérogénéité inter-individus après la reprogrammation telle qu’illustrée aux figures 5 à 7. En , on peut voir des sphéroïdes obtenus selon le procédé de l’exemple 1 correspondant à une femme de 41 ans. On constate une formation des structures fonctionnelles, les canalicules biliaires. En , six sphéroïdes reprogrammés sont illustrés et permettent de montrer une activation des cellules stellaires hépatiques de manière donneur dépendant. En , trois sphéroïdes reprogrammés permettent de montrer un dépôt de matrice extracellulaire (collagène) donneur dépendant. En , une carte de chaleur (en anglais heatmap) à partir d’une analyse transcriptomique par RNAseq des sphéroïdes reprogrammés obtenus à l’exemple 1 démontre un changement massif du profil avec une hétérogénéité inter-individus au sein du groupe des sphéroïdes reprogrammés 200 par rapport aux sphéroïdes non reprogrammés 100. En , une analyse du type « Gene Ontology » qui permet de structurer, selon les fonctions cellulaires, les gènes qui sont différentiellement exprimés dans les sphéroïdes reprogrammés 200 par rapport aux sphéroïdes non reprogrammés 100. Le changement de l’expression des gènes concerne ceux impliqués dans les processus cellulaires de régulation biologique et métabolique, de la réponse aux stimulations externes, mais aussi ceux qui contrôlent les activités enzymatiques, transcriptomiques et du transport moléculaire. Exemple 4 : utilisation de sphéroïdes obtenus par le présent procédé pour la prédiction de la toxicité hépatique. Une étude comparative de l’efficacité des sphéroïdes reprogrammés obtenus à l’exemple 1 pour détecter la toxicité hépatique médicamenteuse est faite avec les modèles in vitro et in vivo existants. Les résultats illustrés à la démontrent que la reprogrammation donneur dépendant des sphéroïdes permet de prédire avec une fiabilité et une sensibilité de 100% la toxicité clinique de ces médicaments, un net avantage par rapport aux modèles existants. L’analyse de la toxicité hépatique a révélé que le modèle pouvait prédire avec précision la toxicité clinique sur un panel de médicaments approuvés par la FDA. En , l’utilisation des sphéroïdes reprogrammés obtenus à l’exemple 1 pour stratifier les degrés de sévérité de la toxicité induite par les produits chimiques en fonction des facteurs de risque de l’hôte tels que l’âge et le sexe. La reprogrammation des sphéroïdes de manière donneur dépendant permet de confirmer que la toxicité de certains médicaments est dépendante du sexe (en exemple ici le bosentan) et d’autres de l’âge (en exemple ici le stavudine). L’invention n’est pas limitée aux modes de réalisations précédemment décrits et s’étend à tous les modes de réalisation couverts par l’invention. Procédé d’obtention de sphéroïdes comprenant les étapes suivantes : préparation d’un sérum sanguin appauvri à partir d’un prélèvement sanguin d’un individu, culture de sphéroïdes à partir de cellules humaines, Caractérisé en ce que la culture de sphéroïdes est réalisée dans un milieu de culture de reprogrammation comprenant de 30 à 60% en volume du sérum sanguin appauvri. Procédé selon la revendication précédente dans lequel la préparation du sérum sanguin appauvri comprend une phase d’obtention d’un sérum sanguin et une phase de filtration du sérum par un filtre de 0,45µm. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes dans lequel le milieu de culture de reprogrammation est utilisé pendant au moins 3 jours. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes dans lequel les cellules humaines sont issues d’au moins une lignée cellulaire humaine ou de cellules primaires humaines. Procédé selon la revendication précédente dans lequel au moins une lignée de cellules est choisie parmi les lignées cellulaires suivantes : PANC-1, TWNT-1, THP-1, HepG2 ou un mélange de celles-ci. Procédé selon la revendication 4 dans lequel les cellules primaires humaines sont choisies parmi les cellules primaires humaines suivantes : hépatocytes humains primaires (PHH), cellules hépatiques primaires, cellules circulantes ou cellules tumorales circulantes (CTC), cellules mononucléées sanguines périphériques (PBMC) ou un mélange de celles-ci. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes dans lequel la préparation d’un sérum sanguin appauvri et la culture des sphéroïdes sont réalisées pour chaque individu d’une cohorte déterminée d’individus représentative d’une étude. Procédé de test de l’effet d’une molécule ou d’une composition comprenant l’obtention de sphéroïdes comprenant les étapes suivantes : Préparation d’un sérum sanguin appauvri à partir d’un prélèvement sanguin d’un individu, culture de sphéroïdes à partir de cellules humaines, Caractérisé en ce que la culture de sphéroïdes à partir de cellules humaines est réalisée dans un milieu de culture de reprogrammation comprenant de 30 à 60% en volume du sérum sanguin appauvri, et que le procédé comprend une étape d’exposition des sphéroïdes obtenus à l’étape précédente à une molécule ou une composition à tester, l’exposition des sphéroïdes étant réalisée avec un milieu de culture de reprogrammation comprenant de 30 à 60% en volume du sérum sanguin appauvri. Sphéroïde obtenu par le procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 7. Utilisation de sphéroïdes obtenus par le procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 7 pour évaluer l’hépatotoxicité ou l’efficacité d’une molécule ou d’une composition.