Brevet FR3141471A1 — publié le 20240503

L’invention porte sur une bactérie génétiquement modifiée pour produire au moins un métabolite, un peptide ou une protéine recombinante comprenant un gène codant pour une protéine recombinante d’intérêt ou au moins un gène codant pour une enzyme impliquée dans la production d’un peptide ou d’un métabolite d’intérêt, et comprenant en outre des gènes codant pour les sous-unités ββ’ d’une ARN polymérase liée de manière fonctionnelle à un promoteur inductible, le promoteur naturel desdits gènes étant remplacé par ledit promoteur inductible, caractérisée en ce qu’elle comprend en outre un gène codant pour la sous-unité α de l’ARN polymérase liée de manière fonctionnelle à un deuxième promoteur inductible, le promoteur naturel du gène étant remplacé par ledit deuxième promoteur inductible. L’invention porte en outre sur une méthode utilisant la bactérie pour produire au moins un métabolite, un peptide ou une protéine recombinante. Figure de l’abrégé : Figure 1 Bactérie génétiquement modifiée et méthode génétiquement stable pour la production de métabolites, peptides et/ou protéines recombinantes La présente invention est relative à une bactérie génétiquement modifiée capable de produire au moins un métabolite, un peptide ou une protéine recombinante et à une méthode pour la bioproduction d’au moins un métabolite, un peptide ou une protéine recombinante. Dans un aspect plus général, la présente invention est relative à des applications de biologie synthétique en génie métabolique, pour la production de métabolites, de peptides et de protéines hétérologues d’intérêt biotechnologique ou médical. De nombreux microorganismes sont aptes à synthétiser des composés, tels que des biocarburants, des produits de chimie lourde et fine, ou des molécules pour applications médicales. La modification de tels microorganismes afin d’optimiser ou d’augmenter au maximum la production des composés souhaités est l’un des défis majeurs dans le domaine de la biotechnologie. Le génie génétique permet la restructuration du flux métabolique dans les microorganismes ou plus généralement dans les cellules. En particulier, les cellules modifiées de microorganisme sont idéalement aptes à passer de la croissance (à savoir production de biomasse), à la synthèse de produits (à savoir production d’un composé d’intérêt). En conséquence, les procédés industriels comprennent généralement deux étapes majeures : une première étape dans laquelle une population cellulaire est cultivée jusqu’à une taille souhaitée et dans laquelle le composé d’intérêt cible est produit parallèlement, et une deuxième étape dans laquelle la croissance cellulaire est interrompue pour permettre aux cellules de produire le composé cible sans utiliser de ressources sinon nécessaires à la croissance cellulaire. Pendant la première étape, la majeure partie de l’énergie et des ressources disponibles est utilisée pour la formation de biomasse. En conséquence, le rendement du composé d’intérêt est faible pendant cette première étape. Toutefois, l’inhibition de la croissance cellulaire découple la production du composé cible de la production de biomasse. Autrement dit, lorsque la croissance cellulaire est interrompue, les cellules des microorganismes peuvent se concentrer sur la production du composé cible ; voir Chotani et al. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1543 : 434-455 et Sonderegger M, Schüperli M, Sauer U. 2005. Selection of quiescent Escherichia coli with high metabolic activity. Metab Eng 7 : 4–9 . Généralement, l’arrêt de la croissance se produit spontanément lorsque la densité cellulaire atteint une certaine valeur limite. Cependant, lorsque la densité cellulaire est trop élevée, elle est généralement accompagnée d’un niveau élevé de morbidité cellulaire et d’une sévère réduction de l’activité métabolique dans les cellules. Ceci a un effet négatif sur le procédé industriel puisque cela diminue drastiquement la productivité du composé cible. C’est la raison pour laquelle des procédés biotechnologiques, notamment à une échelle industrielle, doivent contrôler la croissance bactérienne. La possibilité de contrôler de manière externe la croissance bactérienne est essentielle pour de nombreuses applications dans le génie métabolique, où l’objectif est d’optimiser simultanément le titre, la productivité et le rendement ; voir Stephanopoulos G. 2012, Synthetic biology and metabolic engineering, ACS Synth Biol 1 : 514–525 et Van Dien S. 2013, From the first drop to the first truckload: Commercialization of microbial processes for renewable chemicals, Curr Opin Biotechnol 24 : 1061–1068 . Les approches classiques pour le contrôle de la croissance sont basées sur les réponses des bactéries à la température, aux antibiotiques ou à la limitation des nutriments Sonderegger M, Schüperli M, Sauer U. 2005, Selection of quiescent Escherichia coli with high metabolic activity, Metab Eng 7 : 4–9 ; Tunner JR, Robertson CR, Schippa S, Matin A. 1992, Use of glucose starvation to limit growth and induce protein production in Escherichia coli, Biotechnol Bioeng 40 : 271–279 ; Li S, Jendresen CB, Nielsen AT. 2016, Increasing production yield of tyrosine and mevalonate through inhibition of biomass formation, Process Biochem 51 : 1992–2000 ; Rowe DC, Summers DK. 1999, The quiescent-cell expression system for protein synthesis in Escherichia coli, Appl Environ Microbiol 65 : 2710–2715 ; Harder BJ, Bettenbrock K, Klamt S. 2018, Temperature-dependent dynamic control of the TCA cycle increases volumetric productivity of itaconic acid production by Escherichia coli, Biotechnol Bioeng 115 : 156–164 ; and Schramm T, Lempp M, Beuter D, Sierra SG, Glatter T, Link H. 2020, High-throughput enrichment of temperature-sensitive argininosuccinate synthetase for two-stage citrulline production in E. coli, Metab Eng 16 : 14–24 . Cette dernière décennie, la biologie synthétique a enrichi les technologies disponibles pour le contrôle de la croissance bactérienne. Les nouvelles technologies comportent le génie génomique et plasmidique (voir Kosuri S, Church G. 2014, Large-scale de novo DNA synthesis: technologies and applications, Nat Methods 11 : 499–507 , et Csörgő B, Nyerges Á, Pósfai G, Fehér T. 2016, System-level genome editing in microbes, Curr Opin Microbiol 33 : 113–122 ), la conception et la construction assistées par ordinateur de circuits génétiques (voir Nielsen AAK, Der BS, Shin J, Vaidyanathan P, Paralanov V, Strychalski EA, Ross D, Densmore D, Voigt CA. 2016, Genetic circuit design automation, Science (80- ) 352:aac7341 ), le contrôle optogénétique de l’expression génique (voir Olson EJ, Tabor JJ. 2014, Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology, Nat Chem Biol 10 : 502–511 ), et les gènes reporteurs fluorescents pour la surveillance in vivo de l’expression génique (voir Zaslaver A, Bren A, Ronen M, Itzkovitz S, Kikoin I, Shavit S, Liebermeister W, Surette MG, Alon U. 2006, A comprehensive library of fluorescent transcriptional reporters for Escherichia coli, Nat Methods 3 : 623–628 ), permettant le contrôle rétroactif des processus cellulaires. En effet, les approches de biologie synthétique vers un contrôle de la croissance ont exploité le contrôle rétroactif des gènes responsables de la synthèse d’acides aminés (voir Milias-Argeitis A, Rullan M, Aoki SK, Buchmann P, Khammash M. 2016, Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth, Nat Commun 7 : 12546 ), la compétition entre ARN polymérase hôte et l’ARN polymérase du phage T7 (voir Stargardt P, Feuchtenhofer L, Cserjan-Puschmann M, Striedner G, Mairhofer J. 2020, Bacteriophage inspired growth-decoupled recombinant protein production in Escherichia coli, ACS Synth Biol 9 : 1336–1348 ), le contrôle rétroactif de la désintégration de l’ARNm (voir Venturelli OS, Tei M, Bauer S, Chan LJG, Petzold CJ, Arkin AP. 2017, Programming mRNA decay to modulate synthetic circuit resource allocation, Nat Commun 8 : 15128 ), et un commutateur à bascule pour découpler la croissance et la production de lactate (voir Venayak N, Raj K, Jaydeep R, Mahadevan R. 2018, An optimized bistable metabolic switch to decouple phenotypic states during anaerobic fermentation, ACS Synth Biol 7 : 2854–2866 ). Le Demandeur de la présente invention a précédemment mis au point une approche radicalement différente pour le contrôle de la croissance bactérienne qui est basée sur un commutateur dit commutateur de croissance synthétique. Les détails des techniques impliquées dans ce commutateur de croissance synthétique sont divulgués dans l’EP 3 047 031, et en outre dans Izard J, Gomez Balderas C, Ropers D, Lacour S, Song X, Yang Y, Lindner AB, Geiselmann J, De Jong H. 2015, A synthetic growth switch based on controlled expression of RNA polymerase, Mol Syst Biol 11 : 840 . En bref, un commutateur de croissance synthétique permet le contrôle de la croissance cellulaire au moyen du contrôle de l’expression de gènes codant pour l’ARN polymérase par des composés chimiques spécifiques. Cette technique implique ainsi des gènes liés à la croissance qui peuvent être sélectivement exprimés ou réprimés par apport d’un composé chimique aux microorganismes. Autrement dit, l’expression ou la répression du gène muté est dépendante de la présence ou de l’absence du composé chimique. Cependant, les commutateurs de croissance synthétiques sont fragiles par nature. Ceci est principalement dû à l’effet de la tendance des cellules à accumuler des mutations dans le système responsable de l’inhibition de l’ARN polymérase, favorisant ainsi la croissance. En conséquence, les systèmes de commutateurs de croissance synthétiques sont souvent rendus inopérants par des mutations spontanées. La présente invention améliore la situation. À cette fin, l’objet de l’invention est une bactérie génétiquement modifiée pour produire au moins un métabolite, un peptide ou une protéine recombinante comprenant un gène codant pour une protéine recombinante d’intérêt ou au moins un gène codant pour une enzyme impliquée dans la production d’un peptide ou d’un métabolite d’intérêt, et comprenant en outre des gènes codant pour les sous-unités ββ’ d’une ARN polymérase liée de manière fonctionnelle à un promoteur inductible, le promoteur naturel desdits gènes étant remplacé par ledit promoteur inductible, caractérisée en ce qu’elle comprend en outre un gène codant pour la sous-unité α de l’ARN polymérase liée de manière fonctionnelle à un deuxième promoteur inductible, le promoteur naturel du gène étant remplacé par ledit deuxième promoteur inductible. Selon un mode de réalisation de l’invention, chaque promoteur inductible est un promoteur dépendant de l’IPTG. Selon un autre mode de réalisation de l’invention, les gènes codant pour les sous-unités ββ’ de l’ARN polymérase sont les gènes rpoBC de l’opéron rpoBC et le gène codant pour la sous-unité α de l’ARN polymérase est le gène rpoA de l’opéron rpsM . Selon un autre mode de réalisation de l’invention, la bactérie est de l’espèce Escherichia coli . Selon un autre mode de réalisation de l’invention, le gène codant pour la sous-unité α de l’ARN polymérase bactérienne liée de manière fonctionnelle à un deuxième promoteur inductible est inséré au niveau des loci de la séquence sokA-insKJ-hokA par recombinaison homologue. Selon un autre mode de réalisation de l’invention, dans laquelle le locus rpoA d’origine est remplacé par un marqueur de sélection, préférentiellement un marqueur de sélection conférant une résistance au chloramphénicol (cmR), par recombinaison homologue. Selon un autre mode de réalisation de l’invention, la bactérie comprend au moins trois copies du gène lacI . Selon un autre mode de réalisation de l’invention, la bactérie de l’invention comprend une séquence nucléotidique ayant au moins 80 %, préférentiellement 90 %, et plus préférentiellement 100 % d’identité avec au moins une séquence nucléotidique du groupe constitué de la SEQ ID NO : 1, de la SEQ ID NO : 2 et de la SEQ ID NO : 3 Selon un autre mode de réalisation de l’invention, la bactérie de l’invention comprend une séquence nucléotidique ayant au moins 80 %, préférentiellement 90 %, et plus préférentiellement 100 % d’identité avec la SEQ ID : 1, la SEQ ID : 2 et la SEQ ID : 3. Un autre objet de la présente invention est une méthode A pour produire au moins un métabolite, un peptide ou une protéine recombinante d’intérêt comprenant les étapes de a. culture de bactéries comprenant : (i) un gène codant pour ladite protéine recombinante ou au moins un gène codant pour une enzyme impliquée dans la production dudit peptide ou dudit métabolite, (ii) des gènes codant pour les sous-unités ββ’ de l’ARN polymérase bactérienne liée de manière fonctionnelle à un premier promoteur inductible, le promoteur naturel desdits gènes étant remplacé par ledit premier promoteur inductible, et (iii) un gène codant pour la sous-unité α de l’ARN polymérase bactérienne liée de manière fonctionnelle à un deuxième promoteur inductible, le promoteur naturel du gène étant remplacé par ledit deuxième promoteur inductible dans un premier milieu de culture induisant l’expression des gènes codant pour les sous-unités ββ’ et induisant en outre l’expression du gène codant pour la sous-unité α, induisant ainsi une croissance bactérienne ; b. culture desdites bactéries dans un deuxième milieu de culture inhibant l’expression des gènes codant pour les sous-unités ββ’ et inhibant en outre l’expression du gène codant pour la sous-unité α, produisant ainsi ledit (ladite) métabolite, peptide ou protéine recombinante tout en inhibant la croissance bactérienne ; c. optionnellement itération des étapes a. et b. successivement ; et d. optionnellement récupération dudit (de ladite) métabolite, peptide ou protéine recombinante produit(e) par lesdites bactéries. Selon un mode de réalisation de la méthode de l’invention, chaque promoteur inductible est un promoteur dépendant de l’IPTG ou un promoteur dépendant du lactose. Selon un autre mode de réalisation de la méthode de l’invention, le premier milieu de culture de l’étape a. comprend de l’IPTG ou du lactose et le deuxième milieu de culture de l’étape b. est exempt d’IPTG ou de lactose. Selon un autre mode de réalisation de la méthode de l’invention, le gène codant pour ladite protéine recombinante ou ledit au moins un gène codant pour une enzyme impliquée dans la production dudit peptide ou dudit métabolite est transcrit par une deuxième ARN polymérase ayant une sous-unité catalytique ou des sous-unités catalytiques qui sont différentes des sous-unités ββ’ et de la sous-unité α de l’ARN polymérase liée de manière fonctionnelle au promoteur inductible. Selon un autre mode de réalisation de la méthode de l’invention, la deuxième ARN polymérase est la polymérase du bactériophage T7. Selon un autre mode de réalisation de la méthode de l’invention, les bactéries sont des bactéries Escherichia coli . D’autres caractéristiques et avantages de l’invention ressortiront et/ou deviendront clairs à la lecture de la description suivante, qui comprend des exemples spécifiques donnés de manière illustrative et non limitative, ainsi que d’après les dessins dans lesquels : La montre une vue conceptuelle de l’invention ; La montre la construction génétique pour le contrôle dépendant de l’IPTG de la transcription de rpoBC et rpoA de l’invention ; La montre une séquence selon un mode de réalisation de l’invention dans laquelle rpoBC est sous le contrôle d’un promoteur dépendant de l’IPTG ; La montre une première partie d’une séquence selon un mode de réalisation de l’invention dans laquelle rpoA est remplacé par Cm dans l’opéron de protéines ribosomales commençant par rpsM ; La montre une deuxième partie de la séquence de la ; La montre une première partie d’une séquence selon un mode de réalisation de l’invention dans laquelle rpoA , qui est sous le contrôle d’un promoteur dépendant de l’IPTG ; La montre une deuxième partie de la séquence de la ; La montre une troisième partie de la séquence de la ; La montre une quatrième partie de la séquence de la ; La montre la stabilité génétique accrue d’une souche bactérienne selon l’invention ; et La montre la croissance, la consommation de glucose, et la production de glycérol d’une souche de type sauvage et des souches à simple et à double contrôle de l’expression de l’ARN polymérase. Les dessins et la description contiennent ici, dans l’ensemble, des éléments de nature définie. Par conséquent, la description et les dessins non seulement sont utilisés pour mieux comprendre la présente invention, mais également pour contribuer à la définition de celle-ci, le cas échéant. Le Demandeur a développé précédemment une souche bactérienne de l’espèce Escherichia coli où la transcription d’un composant clé de la machinerie d’expression génique, l’ARN polymérase, est sous le contrôle d’un promoteur inductible, voir EP 3 047 031. En changeant la concentration d’inducteur dans le milieu, il est possible d’ajuster la concentration d’ARN polymérase et ainsi de commuter la croissance bactérienne entre zéro et le taux de croissance maximal supporté par le milieu. Le Demandeur a doté à la fois la souche E. coli de type sauvage et la souche modifiée de l’invention de la capacité de produire du glycérol lorsqu’elles sont nourries de glucose. Les cellules dans lesquelles la croissance a été interrompue continuent d’être métaboliquement actives et produisent du glycérol à un rendement deux fois plus élevé que dans les cellules présentant un contrôle naturel de l’expression de l’ARN polymérase. Il a été montré que le rendement résultant était proche du maximum théorique ; voir Izard J, Gomez Balderas C, Ropers D, Lacour S, Song X, Yang Y, Lindner AB, Geiselmann J, De Jong H. 2015, A synthetic growth switch based on controlled expression of RNA polymerase, Mol Syst Biol 11 : 840 . Le commutateur synthétique sépare ainsi la croissance de la production de composé cible. Cette approche est optimale d’un point de vue théorique du contrôle (voir Yegorov I, Mairet F, de Jong H, Gouzé JL. 2019, Optimal control of bacterial growth for the maximization of metabolite production, J Math Biol 78 : 985–1032 ), et ceci a été généralement adopté dans l’art, voir Lo TM, Chng SH, Teo WS, Cho HS, Chang MW. 2016, A two-layer gene circuit for decoupling cell growth from metabolite production, Cell Syst 3 : 133–143 ; Venayak N, Anesiadis N, Cluett WR, Mahadevan R. 2015, Engineering metabolism through dynamic control, Curr Opin Biotechnol 34 : 142–152 ; et Lalwani MA, Zhao EM, Avalos JL. 2018, Current and future modalities of dynamic control in metabolic engineering, Curr Opin Biotechnol 52 : 56–65 . Tel que mentionné ci-dessus, la plupart des circuits synthétiques sont fragiles d’un point de vue évolutif, au sens où la souche hôte portant le circuit est contre-sélectionnée par l’environnement dans lequel elle doit fonctionner ( Renda BA, Hammerling MJ, Barrick JE. 2014, Engineering reduced evolutionary potential for synthetic biology, Mol Biosyst 10 : 1668–1678 ). Ceci est particulièrement vrai dans le cas du commutateur de croissance, où une mutation atténuant la répression des gènes codant pour les sous-unités ββ’ de l’ARN polymérase conduirait les bactéries mutantes en cours de croissance à supplanter rapidement la population dont la croissance a été arrêtée. La conception des commutateurs de croissance comporte des dispositifs de sécurité, en particulier la redondance des gènes codant pour le LacI répresseur (voir EP 3 047 031). Lorsque l’on passe à des cultures haute densité dans des bioréacteurs à grande échelle, toutefois, on s’attend à voir apparaître des mutants délétères à plus haute fréquence et ces dispositifs de sécurité peuvent ne pas être suffisants. Bien que plusieurs stratégies pour augmenter la fiabilité génétique des circuits synthétiques aient été proposées dans les documents scientifiques portant sur le sujet, des améliorations restent possibles. La présente invention améliore drastiquement le circuit synthétique de manière à augmenter la stabilité génétique de la souche de production. Pour ceci, l’invention fournit une architecture génétique telle que de simples mutations n’affectent pas son fonctionnement (également appelée : robustesse mutationnelle). En particulier, l’architecture génétique du microorganisme de l’invention introduit une redondance dans le contrôle de l’expression de l’ARN polymérase. Plus précisément, le Demandeur a placé une sous-unité additionnelle d’ARN polymérase, la sous-unité α, sous le contrôle du même système d’induction chimique que celui utilisé pour contrôler l’expression des sous-unités ββ’. En conséquence, seules des mutations simultanées dans les deux régions promotrices en amont des gènes codant pour α et ββ’ désactiveront le contrôle de l’expression de l’ARN polymérase, et par conséquent le contrôle de la croissance. En pratique, il s’agit d’un événement très improbable, en ce que la probabilité théorique qu’une mutation désactive le commutateur de croissance modifié est le carré de la probabilité de mutation du circuit génétique d’origine. Le commutateur de croissance présentant un contrôle redondant de l’expression de l’ARN polymérase est ainsi génétiquement plus stable. En conséquence, la méthode de l’invention comprend une étape de croissance bactérienne dans laquelle l’expression des gènes codant pour les sous-unités ββ’ et la sous-unité α est induite, à savoir l’expression de rpoB , rpoC et rpoA . Ceci conduit à la production d’ARN polymérase à l’intérieur des cellules. Pendant cette étape, la croissance bactérienne a lieu et le métabolite, le peptide ou la protéine recombinante est produit naturellement en une quantité naturelle. La méthode comprend ensuite une étape supplémentaire dans laquelle l’expression des gènes codant pour les sous-unités ββ’ et la sous-unité α est inhibée. Sans la synthèse de nouvelles sous-unités, la concentration cellulaire de l’ARN polymérase diminue jusqu’à un niveau en dessous duquel elle ne peut plus supporter la croissance bactérienne. Toutefois, puisque les enzymes de la voie métabolique pertinente sont suffisamment exprimées et sont stables, elles restent présentes après l’arrêt de la croissance et la production du métabolite continue. De plus, même en présence de faibles concentrations d’ARN polymérase, l’expression de peptides ou de protéines recombinantes peut continuer. La méthode ci-dessus sera renforcée lorsque l’expression des enzymes de la voie métabolique ou l’expression du peptide ou de la protéine homologue sera mise sous le contrôle transcriptionnel d’un promoteur fort. En fait, les quantités restantes d’ARN polymérase à l’intérieur des cellules transcriront préférentiellement ce promoteur fort. Un promoteur fort est un promoteur dont la force est au moins 10 % de celle d’un promoteur appelé promoteur rrn , voir Liang et al. (1999), J. Mol. Biol. 292 : 19-37 . L’expression des gènes codant pour les enzymes produisant le métabolite, ou l’expression du peptide ou de la protéine recombinante d’intérêt peut être en outre améliorée par l’ajout d’une deuxième polymérase ayant des sous-unités catalytiques qui sont différentes des sous-unités ββ’ et/ou de la sous-unité α de l’ARN polymérase hôte liée de manière fonctionnelle au promoteur inductible. Cette deuxième ARN polymérase peut spécifiquement augmenter la transcription des gènes codant pour les enzymes cibles produisant le métabolite, ou spécifiquement augmenter la transcription du peptide ou de la protéine recombinante. Toutefois, la présence d’une telle deuxième ARN polymérase n’est pas essentielle. En effet, le Demandeur a intégré un gène reporteur fluorescent (mCherry sous le contrôle du promoteur rrnBp2) dans le génome de la souche IJ40 de E. coli . Les résultats ont montré que la fluorescence moyenne par cellule augmente après arrêt de la croissance, de 80 à 120 unités de fluorescence relative. Ceci signifie que les cellules dont la croissance a été arrêtée synthétisent des protéines et sont donc métaboliquement actives. Pour réaliser la méthode de l’invention, le Demandeur a conçu une bactérie dans laquelle un promoteur inductible est utilisé pour réguler l’expression à la fois de l’opéron rpoBC et de l’opéron rpoA , qui codent respectivement pour les sous-unités ββ’ et la sous-unité α de l’ARN polymérase. Avec la bactérie (ou souche bactérienne) de l’invention, la concentration intracellulaire d’ARN polymérase peut être fixée de manière externe à un niveau souhaité. En conséquence, l’expression des gènes bactériens peut être contrôlée. Le promoteur inductible est, par exemple un promoteur dépendant du lactose ou du β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG), des variants du promoteur lac endogène. En supprimant l’IPTG (ou le lactose) du milieu de culture, la croissance cellulaire peut être interrompue, ou au moins drastiquement réduite à partir du taux des bactéries de type sauvage jusqu’à un taux de croissance très faible. La croissance cellulaire restante en l’absence d’IPTG dans le milieu est due aux molécules d’ARN polymérases restantes présentes dans la bactérie avant la diminution de la concentration d’IPTG. En augmentant la concentration d’IPTG (ou de lactose) dans le milieu de culture, la croissance cellulaire peut être à nouveau déclenchée, afin de régénérer ou d’augmenter davantage la taille de la population bactérienne. D’autres promoteurs régulés chimiquement, tels que le promoteur tet ou le promoteur araBAD , ou promoteurs régulés physiquement, tels que les promoteurs dépendant de la lumière ou de la température, peuvent être utilisés pour l’invention. De tels promoteurs sont bien connus de l’homme du métier ; voir Terpe (2006), Appl. Microbiol Biotechnol, 72 : 211–222 . Tel qu’abordé ci-dessus, la présente invention est une amélioration basée sur la méthode et les bactéries modifiées décrites dans l’EP 3 047 031 (déposé initialement sous la référence PCT/EP2014/069719, publié sous la référence WO 2015/036622, sur la base de l’EP13306266 prioritaire). En conséquence, la terminologie de la présente description est bien connue de l’homme du métier. Des détails supplémentaires relatifs aux définitions spécifiques utilisées ici sont donnés dans l’EP 3 047 031, qui doit être consulté par le lecteur. La montre une vue conceptuelle de l’invention. Les composants moléculaires du côté droit de la , concernant la régulation dépendante de l’IPTG de rpoBC , étaient déjà présents dans la version précédente du commutateur de croissance divulguée dans l’EP 3 047 031. Les composants du côté gauche améliorent drastiquement le commutateur de croissance connu, en particulier relativement à la robustesse et à la stabilité du système génétique. Plus précisément, les composants du côté gauche concernent la régulation de rpoA par le même mécanisme régulateur dépendant de l’IPTG que celui pour la régulation du rpoBC . La robustesse mutationnelle du système est obtenue par le fait que toute mutation dans seulement l’une des deux régions promotrices ( rpoBC ou rpoA ) ne conduit pas à la perte de contrôle de la croissance, alors que l’occurrence de mutations simultanées dans les deux régions promotrices est très improbable. Cette mesure de robustesse s’ajoute aux dispositifs de sécurité déjà inclus dans la conception d’origine, à savoir la présence de trois copies lacI sur le génome, qui protège contre les mutations simples désactivant la liaison de LacI au promoteur. Plus précisément, la montre l’architecture du circuit synthétique contrôlant l’expression de l’ARN polymérase. Les gènes rpoBC , codant pour les sous-unités ββ’, et le gène rpoA , codant pour la sous-unité α, sont placés sous le contrôle du répresseur LacI en remplaçant les promoteurs naturels par un promoteur synthétique. L’ajout de β-D-1-thiogalactopyranoside d’isopropyle (IPTG) au milieu de croissance atténue la répression de LacI et permet la croissance, tandis qu’en l’absence d’IPTG, les gènes rpoA et rpoBC ne sont pas exprimés, et par conséquent l’ARN polymérase n’est pas produite. La sous-unité α est présente dans deux copies par molécule d’ARN polymérase : α I et α II , également appelée α 2 . Chaque sous-unité α contient deux domaines : αNTD (domaine N-terminal) et αCTD (domaine C-terminal). αNTD contient des déterminants pour l’assemblage de l’ARN polymérase. αCTD contient des déterminants pour l’interaction avec l’ADN promoteur, à savoir le domaine C-terminal de la sous-unité α reconnaît des éléments de promoteur en amont. La sous-unité α est produite en excès pendant la croissance cellulaire. Étant donné l’abondance de la sous-unité α de l’ARN polymérase, les résultats de l’invention sont absolument surprenants en ce qu’un commutateur de contrôle situé dans la zone rpoA peut radicalement augmenter la stabilité génétique du commutateur de contrôle connu tout en préservant sa capacité de production métabolique. La stabilité génétique combinée à la capacité de production métabolique à haut débit de l’invention est une amélioration drastique comparativement aux systèmes de l’état de l’art. La montre la construction génétique pour le contrôle dépendant de l’IPTG de la transcription de rpoBC et rpoA de l’invention. La figure 2A montre le contrôle de l’expression de rpoBC par l’intermédiaire du promoteur T5 inductible par IPTG (tel que divulgué et abordé dans l’EP 3 047 031). Plus particulièrement, la séquence en amont de rpoBC a été modifiée par insertion du promoteur T5 inductible par IPTG (T5p) avec deux sites de liaison à lacO et un marqueur de sélection avec le gène de résistance à la spectinomycine et son promoteur spcRp. L’insertion de cette séquence par recombinaison homologue permet la régulation de l’expression de rpoBC par ajustement de la concentration d’IPTG dans le milieu (cf. Lutz R, Bujard H. 1997, Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/I1-I2 regulatory elements, Nucleic Acids Res 25:2003–20) . En l’absence de l’inducteur, la protéine LacI se lie aux sites lacO et empêche la liaison à l’ARN polymérase. La figure 2B montre le contrôle de l’expression de rpoA par l’intermédiaire du même système régulateur. Elle montre la réalisation du contrôle génétique de rpoA de l’invention au niveau des séquences. La sous-unité α de l’ARN est codée par le gène rpoA . Le locus rpoA d’origine sur le génome de E. coli a été modifié par recombinaison homologue (Sharan, S.K., Thomason, L.C., Kuznetsov, S.G., et Court, D.L. (2009). Recombineering: a homologous recombination-based method of genetic engineering. Nat Protoc 4 , 206–223), en remplaçant la région de codage de rpoA par la région de codage d’un marqueur de sélection conférant une résistance au chloramphénicol (cmR). L’introduction du gène codant pour la résistance au chloramphénicol fournit une sélection idéale des recombinants concluants. Selon l’invention, le gène rpoA , comportant le promoteur inductible, a été déplacé de son emplacement naturel sur le chromosome à un autre emplacement, la séquence sokA-insKJ-hokA . Cette séquence a été choisie puisqu’elle se trouve approximativement à la même distance de l’origine de la réplication que l’opéron rpoBC . Les gènes sokA-insKJ-hokA ne sont pas essentiels à la croissance de la bactérie et ont été supprimés par la procédure de clonage. Selon l’invention, l’expression de rpoBC et de rpoA peut être contrôlée en ajustant la concentration d’IPTG dans le milieu. La figure 2C montre l’emplacement des gènes sur le chromosome de E. coli. Elle résume les changements résultants sur le chromosome de E. coli dus aux modifications ci-dessus. La montre une séquence selon un mode de réalisation de l’invention dans laquelle rpoBC est sous le contrôle d’un promoteur dépendant de l’IPTG. Tous les éléments de promoteur et les gènes sont indiqués. La et la montrent une séquence selon un mode de réalisation de l’invention dans laquelle rpoA est remplacé par Cm dans l’opéron de protéines ribosomales commençant par rpsM . Ce mode de réalisation est destiné à éviter l’expression de rpoA dans les conditions naturelles et à conférer une résistance au chloramphénicol (cmR). Tous les gènes pertinents sont annotés sur la figure selon la nomenclature standard. La , la , la et la montrent une séquence selon un mode de réalisation de l’invention dans laquelle rpoA , qui est sous le contrôle d’un promoteur dépendant de l’IPTG, est inséré au niveau de la position et en remplacement de la séquence sokA-insKJ-hokA. Tous les gènes pertinents sont annotés sur la figure selon la nomenclature standard. En conséquence, un mode de réalisation de la bactérie (ou d’une souche bactérienne) de la présente invention comprend une séquence nucléotidique ayant au moins 80 %, préférentiellement 90 %, et plus préférentiellement 100 % d’identité avec la séquence de la (SEQ ID : 1). Un autre mode de réalisation de la bactérie de la présente invention comprend une séquence nucléotidique ayant au moins 80 %, préférentiellement 90 %, et plus préférentiellement 100 % d’identité avec la séquence des figures 4 et 5 (SEQ ID : 2). Un autre mode de réalisation de la bactérie de la présente invention comprend une séquence nucléotidique ayant au moins 80 %, préférentiellement 90 %, et plus préférentiellement 100 % d’identité avec la séquence des figures 6, 7, 8 et 9 (SEQ ID : 3). Préférentiellement, la bactérie de la présente invention comprend une séquence nucléotidique ayant au moins 80 %, préférentiellement 90 %, et plus préférentiellement 100 % d’identité avec les séquences des figures 3 à 9 (SEQ ID : 1, SEQ ID : 2 et SEQ ID : 3). La procédure pour augmenter les rendements de production dans les bioréacteurs en utilisant la nouvelle souche est la même que pour la souche précédente, voir EP 3 047 031. Des tests ont montré que la nouvelle souche préserve l’aptitude à déclencher et interrompre la croissance en apportant l’IPTG au milieu et en le supprimant du milieu, respectivement. Les résultats démontrent également que le rendement de production de glycérol à partir du glucose après arrêt de la croissance est préservé. De plus, les résultats montrent que la stabilité génétique de la souche améliorée est supérieure à celle de la souche d’origine. La montre la stabilité génétique accrue de la souche avec le contrôle de l’expression des sous-unités ββ’ et de la sous-unité α comparativement au contrôle de l’expression des sous-unités ββ’ seulement. Sur la figure 10A, la souche, dans laquelle l’expression des gènes rpoBC est sous le contrôle d’un promoteur inductible par l’IPTG, a été précultivée dans un milieu minimal M9 avec du glucose à 0,2 % auquel a été ajouté de l’IPTG (250 µM) dans 40 réplicats biologiques. Ensuite, chaque culture répliquée a été lavée, diluée et remise en suspension dans le même milieu sans IPTG, empêchant ainsi la synthèse de nouvelles sous-unités ββ’ d’ARN polymérase. En tant que témoin, trois réplicats ont été lavés, dilués et remis en suspension dans le même milieu avec de l’IPTG. En partant d’une densité optique faible de 0,005, la croissance a alors été surveillée à 24 h et 96 h après le début de la culture. Alors qu’aucune des cultures ne s’était échappée après 24 h, 33 des 40 cultures s’étaient échappées après 96 h, tel qu’indiqué par une densité optique proche de la densité optique des témoins. La figure 10B montre la même chose pour la souche dans laquelle l’expression des gènes rpoBC et du gène rpoA est sous le contrôle d’un promoteur inductible par l’IPTG. Aucune des cultures ne s’est échappée après 96 h. Ceci prouve une stabilité génétique drastiquement supérieure de la souche à double contrôle de l’expression selon l’invention. La montre la croissance, la consommation de glucose et la production de glycérol de la souche de type sauvage et des souches à simple et à double contrôle de l’expression de l’ARN polymérase. Sur la figure 11A, la souche de type sauvage, transformée avec un plasmide permettant la surexpression d’enzymes responsables de la synthèse de glycérol, a été cultivée dans un milieu minimal M9 avec du glucose à 0,2 % dans trois réplicats biologiques. La densité optique (OD600) a été mesurée à différents moments de l’expérience (points bleus, à savoir points relatifs à x). Les mêmes mesures, dans les mêmes conditions, ont été réalisées pour la souche dans laquelle l’expression des gènes rpoBC est sous le contrôle d’un promoteur inductible par l’IPTG (points rouges, à savoir points relatifs à +) et la souche dans laquelle l’expression des gènes rpoBC et du gène rpoA est sous le contrôle d’un promoteur inductible par l’IPTG (points jaunes, à savoir points relatifs à ∙). Contrairement à la souche de type sauvage, les deux dernières souches arrêtent de croître après inoculation, car le milieu ne contient pas d’IPTG. La figure 11B montre la mesure de la concentration de glucose dans le milieu. Les souches présentant un contrôle dépendant de l’IPTG de l’expression de l’ARN polymérase continuent de consommer du glucose après arrêt de la croissance. La figure 11C montre la mesure de la concentration de glycérol dans le milieu. Tandis que la souche de type sauvage produit seulement une petite quantité de glycérol, qui est consommée après l’appauvrissement du glucose, les souches dont la croissance a été arrêtée convertissent le glucose en glycérol à des niveaux bien supérieurs. Ceci étaye la revendication selon laquelle l’inhibition de l’expression de l’ARN polymérase empêche la croissance de la population et permet la réaffectation des flux métaboliques vers la biosynthèse d’un métabolite d’intérêt (glycérol dans ce cas) à un rendement élevé. Comme le sait l’homme du métier, dans les bactéries, l’enzyme ARN polymérase centrale est généralement composée de cinq sous-unités : β, β’, α’, α" et ω, moyennant quoi la dernière sous-unité, ω, peut souvent être supprimée sans effets indésirables. L’homme du métier sait en outre que l’architecture de l’ARN polymérase bactérienne est universelle. Ceci est abordé, par exemple, dans l’article de synthèse des auteurs Borukhov et Nudler, RNA polymerase: the vehicle of transcription, Trends in Microbiol., 2008, 16, 126-134. Cet article de synthèse déclare que « Le cœur catalytiquement compétent (composition de sous-unité 2α, β’, β et ω) a été conservé de manière évolutive en termes de sa séquence primaire, de sa structure ternaire et de sa fonction », voir p. 126 de l’article de synthèse. Ceci signifie que le comportement transcriptionnel, qui est directement dépendant de ce cœur catalytiquement compétent, est également conservé dans les espèces bactériennes. En conséquence, la bactérie génétiquement modifiée et la méthode de l’invention fonctionnent dans E. coli ou d’autres bactéries, par exemple Bacillus subtilis , Bacillus thuringiensis , Lactobacillus fermentum , Synechocystis espèce PCC6803, Corynebacterium glutanicum , Deinococcus radiodurans . Des modes de réalisation supplémentaires de l’invention comportent une bactérie ou une méthode selon l’invention : dans laquelle les gènes codant pour les sous-unités ββ’ de l’ARN polymérase sont les gènes rpoBC de l’opéron rpoBC ; dans laquelle ledit gène codant pour la sous-unité α de l’ARN polymérase est le gène rpoA de l’opéron rpoA . La méthode de l’invention peut comprendre des modes de réalisation particuliers, combinés ou non, tels que : un mode de réalisation dans lequel les bactéries sont cultivées à l’étape a. jusqu’à ce qu’une densité de population comprise de 0,1 à 100 OD 600 soit atteinte ; un mode de réalisation comprenant une sous-étape a1. entre les étapes a. et b. consistant à récolter et préférentiellement laver les bactéries cultivées dans l’étape a. et à les transférer dans le deuxième milieu de culture de l’étape b. ; un mode de réalisation comprenant la mesure de l’activité métabolique des bactéries cultivées pendant l’étape b. ; un mode de réalisation dans lequel l’étape c. est réalisée lorsque l’activité métabolique mesurée pendant l’étape b. diminue ; un mode de réalisation dans lequel ledit premier milieu de culture de l’étape a. comprend un milieu minimal M9 auquel a été ajouté du glucose à 0,4 % et de l’IPTG 0,5 mM (ou d’autres inducteurs, tels que du lactose) et ledit deuxième milieu de culture de l’étape b. comprend un milieu minimal M9 auquel a été ajouté du glucose à 0,4 % et est exempt d’IPTG ; un mode de réalisation dans lequel ledit premier milieu de culture de l’étape a. comprend un milieu minimal M9 auquel a été ajouté du glucose à 0,2 % et de l’IPTG 0,25 mM (2,5 µl d’IPTG 100 mM dans 1 ml de M9) et ledit deuxième milieu de culture de l’étape b. comprend un milieu minimal M9 auquel a été ajouté du glucose à 0,2 % et est exempt d’IPTG ; un mode de réalisation comprenant une étape pré-a. avant l’étape a. consistant à fournir des bactéries comprenant : (1) un gène codant pour ladite protéine recombinante ou au moins un gène codant pour une enzyme impliquée dans la production dudit peptide ou dudit métabolite, et (2) des gènes codant pour les sous-unités ββ’ et un gène codant pour la sous-unité α d’une ARN polymérase liée de manière fonctionnelle à un promoteur inductible. Le promoteur inductible particulier pourrait impliquer des produits chimiques autres que l’IPTG ou même différentes fréquences de lumière (optogénétique). Bactérie génétiquement modifiée pour produire au moins un métabolite, un peptide ou une protéine recombinante comprenant un gène codant pour une protéine recombinante d’intérêt ou au moins un gène codant pour une enzyme impliquée dans la production d’un peptide ou d’un métabolite d’intérêt, et comprenant en outre des gènes codant pour les sous-unités ββ’ d’une ARN polymérase liée de manière fonctionnelle à un promoteur inductible, le promoteur naturel desdits gènes étant remplacé par ledit promoteur inductible, caractérisée en ce qu’elle comprend en outre un gène codant pour la sous-unité α de l’ARN polymérase liée de manière fonctionnelle à un deuxième promoteur inductible, le promoteur naturel du gène étant remplacé par ledit deuxième promoteur inductible. Bactérie génétiquement modifiée selon la revendication 1, dans laquelle chaque promoteur inductible est un promoteur dépendant de l’IPTG. Bactérie génétiquement modifiée selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle lesdits gènes codant pour les sous-unités ββ’ de l’ARN polymérase sont les gènes rpoBC de l’opéron rpoBC et ledit gène codant pour la sous-unité α de l’ARN polymérase est le gène rpoA de l’opéron rpsM . Bactérie génétiquement modifiée selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle la bactérie est de l’espèce Escherichia coli . Bactérie génétiquement modifiée selon la revendication 4, dans laquelle le gène codant pour la sous-unité α de l’ARN polymérase bactérienne liée de manière fonctionnelle à un deuxième promoteur inductible est inséré au niveau des loci de la séquence sokA-insKJ-hokA par recombinaison homologue. Bactérie génétiquement modifiée selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le locus rpoA d’origine est remplacé par un marqueur de sélection, préférentiellement un marqueur de sélection conférant une résistance au chloramphénicol (cmR), par recombinaison homologue. Bactérie génétiquement modifiée selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle ladite bactérie comprend au moins trois copies du gène lacI . Bactérie génétiquement modifiée selon l’une quelconque des revendications précédentes comprenant une séquence nucléotidique ayant au moins 80 %, préférentiellement 90 %, et plus préférentiellement 100 % d’identité avec au moins une séquence nucléotidique du groupe constitué de la SEQ ID NO : 1, de la SEQ ID NO : 2 et de la SEQ ID NO : 3. Bactérie génétiquement modifiée selon l’une quelconque des revendications précédentes comprenant une séquence nucléotidique ayant au moins 80 %, préférentiellement 90 %, et plus préférentiellement 100 % d’identité avec la SEQ ID : 1, la SEQ ID : 2 et la SEQ ID : 3. Méthode pour produire au moins un métabolite, un peptide ou une protéine recombinante d’intérêt comprenant les étapes de a. culture de bactéries comprenant : (i) un gène codant pour ladite protéine recombinante ou au moins un gène codant pour une enzyme impliquée dans la production dudit peptide ou dudit métabolite, (ii) des gènes codant pour les sous-unités ββ’ de l’ARN polymérase bactérienne liée de manière fonctionnelle à un premier promoteur inductible, le promoteur naturel desdits gènes étant remplacé par ledit premier promoteur inductible, et (iii) un gène codant pour la sous-unité α de l’ARN polymérase bactérienne liée de manière fonctionnelle à un deuxième promoteur inductible, le promoteur naturel du gène étant remplacé par ledit deuxième promoteur inductible dans un premier milieu de culture induisant l’expression des gènes codant pour les sous-unités ββ’ et induisant en outre l’expression du gène codant pour la sous-unité α, induisant ainsi une croissance bactérienne ; b. culture desdites bactéries dans un deuxième milieu de culture inhibant l’expression des gènes codant pour les sous-unités ββ’ et inhibant en outre l’expression du gène codant pour la sous-unité α, produisant ainsi ledit (ladite) métabolite, peptide ou protéine recombinante tout en inhibant la croissance bactérienne ; c. optionnellement itération des étapes a. et b. successivement ; et d. optionnellement récupération dudit (de ladite) métabolite, peptide ou protéine recombinante produit(e) par lesdites bactéries. Méthode selon la revendication 10, dans laquelle chaque promoteur inductible est un promoteur dépendant de l’IPTG ou un promoteur dépendant du lactose. Méthode selon l’une quelconque des revendications 10 et 11, dans laquelle le premier milieu de culture de l’étape a. comprend de l’IPTG ou du lactose et le deuxième milieu de culture de l’étape b. est exempt d’IPTG ou de lactose. Méthode selon l’une quelconque des revendications 10 et 12, dans laquelle le gène codant pour ladite protéine recombinante ou ledit au moins un gène codant pour une enzyme impliquée dans la production dudit peptide ou dudit métabolite est transcrit par une deuxième ARN polymérase ayant une sous-unité catalytique ou des sous-unités catalytiques qui sont différentes des sous-unités ββ’ et de la sous-unité α de l’ARN polymérase liée de manière fonctionnelle au promoteur inductible. Méthode selon l’une quelconque des revendications 10 à 13, dans laquelle ladite deuxième ARN polymérase est la polymérase du bactériophage T7. Méthode selon l’une quelconque des revendications 10 à 14, dans laquelle lesdites bactéries sont des bactéries Escherichia coli .