Brevet FR3144749A1 — publié le 20240712

MÉTHODE NON INVASIVE DE DÉTECTION, VISUALISATION ET/OU QUANTIFICATION D’UN FLUOROPHORE ENDOGÈNE TEL QUE LA MÉLANINE DANS UN TISSU BIOLOGIQUE Méthode de détection, quantification et/ou visualisation d’un fluorophore endogène, tel que la mélanine, dans un tissu biologique, la méthode comprenant : - l’acquisition d’une pluralité d’images multiphotoniques bidimensionnelles (2D) de l’intensité de fluorescence, ou d’images FLIM multiphotoniques combinées, chaque image étant acquise dans un plan sensiblement perpendiculaire à une surface du tissu biologique, - le traitement des images pour détecter une limite de la surface du tissu biologique et pour détecter le fluorophore endogène, et - la génération, sur la base des images traitées, d’informations représentatives d’une distribution du fluorophore endogène dans ledit tissu biologique par rapport à la limite, notamment en fonction de la distance à partir de la limite. Figure pour l'abrégé : Fig. 1 MÉTHODE NON INVASIVE DE DÉTECTION, VISUALISATION ET/OU QUANTIFICATION D’UN FLUOROPHORE ENDOGÈNE TEL QUE LA MÉLANINE DANS UN TISSU BIOLOGIQUE La présente invention concerne l’observation de tissus biologiques, en particulier de matières kératiniques telles que la peau. L’invention concerne plus particulièrement, mais pas exclusivement, les méthodes visant à déterminer la distribution de mélanine dans les tissus biologiques, notamment en vue d’évaluer l’action d’un traitement cosmétique sur ceux-ci. CONTEXTE La couleur de certains tissus biologiques est étroitement liée à la quantité et à la distribution tridimensionnelle de mélanine. Aujourd’hui, la caractérisation de la quantité et de la distribution de mélanine peut être réalisée soit ex vivo, soit in vivo à l’aide de différentes méthodes. Actuellement, la méthode de référence pour la quantification de la mélanine dans la peau est l’analyse chimique par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) des produits de dégradation de la mélanine. Bien que très spécifique, elle nécessite une dégradation des échantillons ex vivo et ne fournit aucune information sur la distribution épidermique de la mélanine. La coloration de Fontana-Masson des coupes de peau transversales permet d’obtenir des informations sur la distribution 2D et la teneur en mélanine, mais présente l’inconvénient d’une coloration non spécifique de la couche cornée (stratum corneum) (SC), tandis que la coloration de Warthin-Starry peut fournir une détection de mélanine plus sensible et plus spécifique. La microscopie électronique en transmission permet l’analyse du profil des mélanosomes dans les cellules épidermiques et ses variations en fonction du phénotype de peau. Au fil des ans, la possibilité de fournir une détection non invasive de la mélanine basée sur ses propriétés optiques, son absorption UV-visible à large bande, son spectre d’émission de fluorescence et sa durée de vie a été étudiée à l’aide de différentes techniques. La spectroscopie Raman spontanée a révélé que la phéomélanine présentait un pic spécifique dans la « région silencieuse » du spectre Raman, offrant ainsi une voie directe vers une détection 3D non invasive spécifique de la phéomélanine dans les échantillons de peau par imagerie CARS (Coherent anti-Stokes Raman Scattering). Récemment, une analyse combinée de bandes Raman spécifiques avec l’autofluorescence NIR par excitation monophotonique de la peau a été utilisée pour estimer un profil de profondeur xz de la fraction de mélanine in vivo , mais cette méthode ne permet pas de localiser spatialement la mélanine dans les cellules et ne peut pas refléter l’ensemble de l’épiderme. L’imagerie pompe-sonde s’est également avérée utile pour l’analyse 2D de la mélanine dans les coupes de peau fine de lésions pigmentées, notamment pour sa discrimination eumélanine/phéomélanine. L’imagerie de la mélanine basée sur sa fluorescence endogène a été mise en évidence en 1979 par la microscopie de fluorescence par excitation monophotonique conventionnelle sur des coupes de peau humaine et 20 ans plus tard in vivo sur la peau de l’avant-bras à l’aide d'une microscopie à deux photons/multiphotonique. L’imagerie multiphotonique permet la caractérisation tridimensionnelle des tissus biologiques avec une résolution inférieure au micromètre. La profondeur d’imagerie varie selon les tissus ; elle peut être d’environ 200 μm pour la peau humaine. À l'aide des signaux d’autofluorescence endogènes de la kératine, des coenzymes métaboliques NAD(P)H et FAD et de la mélanine, la microscopie multiphotonique fournit une visualisation 3D non invasive sans marquage des couches de l'épiderme et de la distribution de la mélanine dans l'épiderme. Lors de l'excitation multiphotonique à 760 nm, une méthode de détection de la mélanine basée sur l’intensité a été proposée in vitro sur épiderme reconstruit pigmenté, par exemple in FR 2 944 425 et in vivo sur peau humaine, par exemple in Ait El Madani, H. et al. « In vivo multiphoton imaging of human skin: assessment of topical corticosteroid-induced epidermis atrophy and depigmentation » J Biomed Opt 17, 026009 (2012). Cette méthode a été également appliquée à l’évaluation quantitative in vitro de la teneur en mélanine sur le modèle d’épiderme reconstruit pigmenté (ERP) chinois, comme expliqué in Qiu, J. et al. « The skin-depigmenting potential of Paeonia lactiflora root extract and paeoniflorin: In vitro evaluation using reconstructed pigmented human epidermis » Int J Cosmet Sci 38, 444-451, (2016). La méthode de détection de la mélanine basée sur l’intensité, divulguée in FR 2 944 425, repose sur le fait que, dans la peau, au niveau des couches basales de l’épiderme, la mélanine hautement concentrée présente de hautes intensités de signal de fluorescence, plus fortes que celles des autres fluorophores endogènes. Les pixels qui ont une forte intensité sont attribués à la mélanine. Cette approche basée sur l’intensité fonctionne dans les couches basales de l’épiderme où la mélanine est hautement concentrée et présente des intensités de signal de fluorescence plus fortes que celles d’autres fluorophores endogènes, mais pas dans la couche cornée contenant des kératines présentant de fortes intensités de fluorescence. De plus, les pixels à faible concentration de mélanine et à faible intensité de fluorescence ne sont pas pris en compte. Une méthode plus spécifique consiste à prendre en compte la durée de vie de fluorescence de la mélanine. La durée de vie de fluorescence est indépendante de la concentration de fluorophore, mais dépend du micro-environnement local de la molécule, de variables telles que le pH, l’état de liaison et les changements de conformation moléculaire. La durée de vie d’autofluorescence de la peau va de centaines de picosecondes (par exemple, mélanine, NAD(P)H libre, FAD lié) aux nanosecondes (par exemple, NAD(P)H lié, FAD libre, kératine). L’imagerie FLIM multiphotonique d’échantillons de mélanine tels que les mélanines synthétique, Dopa ou Sepia, les mélanocytes de la peau et des yeux, les cheveux et les bulbes capillaires humains et la peau humaine) indique un comportement de déclin bi-exponentiel spécifique avec un composant principalement à courte durée de vie de fluorescence (> 90 % de contribution relative) avoisinant 100 à 200 ps et un tracé de phaseur d’espèce mixte avec une distribution de courte durée de vie de phase. JP2009-142597 décrit une méthode de visualisation de la mélanine qui combine la microscopie multiphotonique et la microscopie de fluorescence résolue en temps (FLIM). Cependant, le temps d’acquisition d’image nécessaire à l’acquisition de déclins de fluorescence corrects pour l’analyse bi-exponentielle ou par phaseur n’est pas compatible avec l’imagerie 3D de la peau dans une configuration clinique et est en pratique limité à l’imagerie 2D à des profondeurs épidermiques sélectionnées, ce qui limite les possibilités d’appliquer cette technique, en particulier dans le contexte de l’imagerie tridimensionnelle. Afin de détecter spécifiquement la mélanine à partir de données multiphotoniques 3D de type FLIM, également compatibles avec les acquisitions 3D in vivo sur des sujets humains, une autre approche a été proposée, combinant (i) la FLIM multiphotonique, (ii) des temps d’acquisition d’image rapides et iii) une méthode de détection de la mélanine, appelée pseudo-FLIM, qui repose sur l’analyse de la pente des déclins de l’intensité de l’autofluorescence à partir de données regroupées dans le temps. WO2013/068943 divulgue cette méthode pour la détection, visualisation et/ou quantification 3D spécifique d’un fluorophore endogène tel que la mélanine, dans un tissu biologique, la méthode étant également décrite et comparée aux analyses par FLIM et phaseur in Pena, A. M. et al. « In vivo melanin 3D quantification and z-epidermal distribution by multiphoton FLIM, phasor and Pseudo-FLIM analyses ». Sci Rep 12, 1642 (2022). À l’aide de paramètres de densité globale et de distribution z-épidermique 3D de la mélanine, les modulations in vivo de la mélanine ont été évaluées dans différentes conditions : pigmentation constitutive et acquise, vieillissement, exposition naturelle aux UV ou application de rétinoïdes topiques connus pour avoir un effet sur la pigmentation. Cependant, l’imagerie 3D prend beaucoup de temps et limite considérablement son utilisation de routine pour l’évaluation de l’efficacité des modulateurs de la mélanine. L’imagerie verticale multiphotonique 2D (acquisition d’images similaires à une coupe histologique transversale) pourrait être une solution alternative pour un protocole d’évaluation de la mélanine plus rapide. Bien que l’imagerie XZ multiphotonique ait déjà été appliquée à la caractérisation du vieillissement dermique de la peau humaine (par exemple, Czekalla, C. et al. « Impact of Body Site, Age, and Gender on the Collagen/Elastin Index by Noninvasive in vivo Vertical Two-Photon Microscopy », Skin Pharmacol Physiol 30, 260-267 (2017)), son intérêt et son avantage par rapport à l’imagerie 3D n’ont pas encore été étudiés dans le contexte de l’évaluation de la mélanine. RÉSUMÉ Il reste nécessaire de bénéficier d’une méthode sensible et non invasive qui soit facile à mettre en œuvre, pour la visualisation tridimensionnelle de la distribution de mélanine dans les tissus biologiques, permettant d’obtenir des résultats fiables, rapides et pertinents. L’objectif de la présente invention est de développer une méthode qui peut être plus simple et plus rapide que les méthodes de l’état de la technique, qui permet de détecter la mélanine et de caractériser sa distribution tridimensionnelle dans un tissu biologique, en particulier l’épiderme. Il est également nécessaire de permettre la vérification de l’efficacité ou de l’innocuité d’un produit, par exemple à partir d’agents actifs anti-pigmentants, dépigmentants ou pro-pigmentants, utilisés au cours du traitement. Par ailleurs, dans le cadre de la recherche afin de développer de nouveaux tissus reconstruits ou synthétiques, il est nécessaire d’objectiver les différences de quantité et de distribution de la mélanine, selon le type de modèle tissulaire, en particulier de modèle cutané. L’invention vise à répondre à tout ou partie de ces besoins. Des exemples de modes de réalisation de l’invention concernent une méthode de détection, quantification et/ou visualisation d’un fluorophore endogène, tel que la mélanine, dans un tissu biologique, la méthode comprenant : l’acquisition d’une pluralité d’images multiphotoniques bidimensionnelles (2D) d’intensité de fluorescence, ou d’images FLIM multiphotoniques combinées, chaque image étant acquise dans un plan sensiblement perpendiculaire à une surface du tissu biologique, et le traitement des images pour détecter une limite de la surface du tissu biologique et pour détecter le fluorophore endogène, en particulier la mélanine, et la génération, sur la base des images traitées, d'informations représentatives d’une distribution du fluorophore endogène dans ledit tissu biologique par rapport à la limite, en particulier en fonction de la distance à partir de la limite. Au moyen de la présente invention, une nouvelle méthode plus rapide d’évaluation de la mélanine, en particulier dans le modèle d'ERP, peut être obtenue sur la base de l’acquisition de plusieurs images transversales XZ 2D. Chacune des images est par exemple similaire ou équivalente à celles fournies par la coloration histologique de Fontana-Masson. La FLIM multiphotonique combinée, telle que connue de l’homme du métier, est la microscopie de fluorescence résolue en temps (FLIM) utilisant l’excitation multiphotonique. La FLIM multiphotonique combinée est par exemple décrite in Periasamy, A. & Clegg, R. M. FLIM Microscopy in Biology and Medicine. 1st edn, (Chapman and Hall/CRC, Taylor & Francis Group, 2009). De préférence, le fluorophore endogène est détecté à l’aide d’analyses d’intensité de fluorescence ou par pseudo-FLIM. Comme le sait l’homme du métier, les images multiphotoniques peuvent être traitées pour la détection de la mélanine à l’aide d’une analyse de l’intensité de fluorescence par exemple comme décrit in FR 2 944 425. Les images FLIM multiphotoniques peuvent être traitées pour la détection de la mélanine et analysées à l’aide d’une quelconque analyse bi-exponentielle par FLIM, analyse par phaseur et analyse par pseudo-FLIM, cette dernière étant décrite ci-dessus in WO2013/068943 et in Pena et al. Sci Rep 12, 1642 (2022). L’analyse bi-exponentielle par FLIM est par exemple décrite in Dancik, Y., Favre, A., Loy, C. J., Zvyagin, A. V. & Roberts, M. S. « Use of multiphoton tomography and fluorescence lifetime imaging to investigate skin pigmentation in vivo » J. Biomed. Opt. 18, 26022 ; Ehlers, A., Riemann, I., Stark, M. & Konig, K. « Multiphoton fluorescence lifetime imaging of human hair » Microsc. Res. Tech. 70, 154-161 ; Dimitrow, E. et al. « Spectral fluorescence lifetime detection and selective melanin imaging by multiphoton laser tomography for melanoma diagnosis. Exp. Dermatol » 18, 509-515; Sugata, K. et al. « Imaging of melanin distribution using multiphoton autofluorescence decay curves » Skin Res. Technol. 16, 55–59. L’analyse par phaseur est par exemple décrite in Stringari, C. et al. « Phasor approach to fluorescence lifetime microscopy distinguishes different metabolic states of germ cells in a live tissue » Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13582-13587 ; Digman, M. A., Caiolfa, V. R., Zamai, M. & Gratton, E. « The phasor approach to fluorescence lifetime imaging analysis » Biophys. J. 94, L14-16 ; Vallmitjana, A. et al. « Resolution of 4 components in the same pixel in FLIM images using the phasor approach » Methods and Appl. Fluorescence 8, 035001. Dans ce qui suit, la direction Z désigne une direction le long d’une profondeur du tissu biologique, sensiblement perpendiculaire à ladite surface. Les directions X et Y désignent deux directions définissant un plan parallèle à ladite surface du tissu biologique. Par exemple, pour une peau, la direction Z est une direction depuis la couche basale (stratum basale) vers la couche cornée ( stratum corneum) de la peau, ou vice versa, et les directions X et Y désignent les directions définissant un plan parallèle à la surface de la peau. Une image XZ désigne donc une image sensiblement perpendiculaire à une surface du tissu biologique. La densité de mélanine estimée par un sous-ensemble d’images XZ 2D selon la présente invention est équivalente à celle estimée en 3D, tandis que la présente invention permet un protocole d'évaluation plus rapide en acquérant un sous-ensemble d’images XZ 2D au lieu d’images XYZ 3D empilées. Chaque pixel d’une image XZ 2D peut être défini par des coordonnées spatiales (x, z), z étant la profondeur dans l’échantillon. Pour une image XZ 2D, une ligne de pixels peut être acquise à chaque position z correspondant à une profondeur donnée du tissu biologique. Le nombre de pixels dans les directions X et Z et la taille des pixels en μm sont des paramètres dépendant du système d’imagerie (champ de vision et résolution). La taille des pixels dans la direction Z dépend de la profondeur d’imagerie et de l’épaisseur de l’échantillon. Par exemple, des images XZ 2D de 1024 × 1024 pixels peuvent être acquises dans le modèle d'ERP. De préférence, pour des temps d’acquisition d’image plus rapides, chaque image XZ peut être acquise par l'intermédiaire d'un objectif en mesure d'effectuer une translation dans la direction Z, par exemple à l'aide d'un dispositif piézoélectrique. De préférence, la méthode de la présente invention comprend l’acquisition, au sein d’un échantillon tel que le modèle d'ERP, entre 20 et 80, mieux entre 30 et 70, d’images ayant des coordonnées y différentes, par exemple environ 50 images XZ 2D tous les dy = 100 μm. Le nombre d’images et la valeur du pas de dy, c’est-à-dire la distance d’acquisition entre deux images XZ le long de la direction Y, peuvent être ajustés en fonction de l’homogénéité de la distribution de mélanine. La méthode peut comprendre l’acquisition d’au moins cinquante images multiphotoniques bidimensionnelles (2D) ou images FLIM multiphotoniques combinées dans différents plans sensiblement perpendiculaires à la surface du tissu biologique. De préférence, pour augmenter la profondeur d’imagerie et garantir une bonne intensité du signal de fluorescence au sein d'un échantillon biologique tel que le modèle d'ERP, sa couche basale est placée à la surface de l’échantillon. Dans l’analyse histologique actuelle de Fontana-Masson, seules 10 à 15 images XZ sont acquises et étudiées. Les images acquises peuvent être traitées ultérieurement pour détecter la mélanine à l'aide des méthodes telles que celles divulguées in FR 2 944 425 pour la détection de mélanine basée sur l’intensité ou in WO2013/068943 pour la détection de mélanine basée sur la durée de vie. D’autres informations peuvent être générées avec des outils de quantification de la mélanine associés, tels que des algorithmes informatiques, pour extraire des paramètres quantitatifs de la mélanine dans un tissu biologique, tels que la densité de mélanine 2D et/ou son profil de distribution z. La détermination de la limite entre l’air et la surface du tissu biologique peut être effectuée en trouvant des points de signal le long des colonnes de chaque image XZ. La méthode peut comprendre la détection d’une limite entre l’air et la couche basale, par exemple en déterminant une position médiane des pixels d’intensité de fluorescence la plus forte dans un intervalle environnant dans la direction X. La longueur de l’intervalle environnant peut dépendre de la taille de l’image dans la direction X. Pour des images XZ 2D de 1024 × 1024 pixels, l’intervalle environnant peut présenter une longueur d’environ 20 pixels le long de la direction X. De préférence, la méthode comprend l’application d’un premier seuil de détection d’intensité pour segmenter la surface de l’échantillon pour la détection des limites. La méthode peut comprendre la binarisation de l’image XZ 2D pour la débruiter. La ligne limite peut être affichée sur l’image traitée. La méthode peut comprendre l’application, après la détection des limites, d’un second seuil de détection d’intensité pour binariser et appliquer un flou gaussien à l’image 2D pour la détection de pixels contenant de la mélanine, à l'aide de la méthode de détection de mélanine basée sur l’intensité décrite in FR 2 944 425. Au sein de l’épiderme vivant, des pixels de mélanine présentant de fortes intensités de fluorescence supérieures au niveau d’intensité de fluorescence d’autres fluorophores endogènes (par exemple, les NAD(P)H dans la couche granuleuse ( stratum granulosum ) sont sélectionnés en appliquant un seuil d’intensité. Ce second seuil de détection d’intensité est de préférence fixé à une valeur plus élevée par rapport à celle du premier seuil de détection de limite. L’application d’un flou gaussien permet d’éliminer les pixels de bruit, avant d’appliquer le second seuil d’intensité pour la détection de mélanine. Le second seuil d’intensité peut être le même que pour l’imagerie 3D, par exemple comme enseigné dans le brevet FR 2 944 425 et dans l’article « The skin-depigmenting potential of Paeonia lactiflora root extract and paeoniflorin: In vitro evaluation using reconstructed pigmented human epidermis » susmentionné. Le nombre moyen de pixels contenant de la mélanine par rapport à leur distance à partir de la limite basale de l’épiderme peut être utilisé pour estimer un profil de distribution z de la mélanine de la couche basale jusqu’à, par exemple, 100 μm de profondeur. L’association de l’acquisition XZ 2D et des outils de quantification de la mélanine selon la présente invention permet de visualiser et de quantifier la distribution et la quantité de mélanine dans le modèle d’épiderme ERP avec un temps opérationnel par exemple au moins 5 fois plus rapide par rapport à l’imagerie 3D, fournissant ainsi une méthode puissante pour l’évaluation de routine de l’efficacité des modulateurs de la mélanine dans les études cosmétiques et dermatologiques. La méthode est non invasive et peut être utilisée dans un contexte cosmétique non thérapeutique. La méthode peut permettre d’évaluer la pigmentation. La méthode selon l’invention peut être mise en œuvre in vivo , mais aussi sur des échantillons ex vivo et in vitro. L’invention améliore la rapidité du processus d’évaluation de l’efficacité de la mélanine, en diminuant le nombre d’images XZ nécessaires pour estimer de manière robuste la densité de mélanine dans le modèle d'ERP par rapport à l’imagerie 3D. La méthode permet également d’améliorer la rapidité de traitement des images pour générer les informations représentatives de la distribution du composant fluorophore endogène dans ledit tissu biologique. En vertu de l’invention, la caractérisation 3D du tissu est possible et pourrait être utilisée pour une application in vivo à haut rendement. Le tissu biologique, en particulier les matières kératiniques, selon l’invention peut être naturel ou artificiel ; l’échantillon est, par exemple, de la peau humaine, de la peau reconstruite ou artificielle. Le tissu biologique peut être des cellules mélanisées en culture. Les informations peuvent être générées sous la forme d’au moins une image, en particulier une image bidimensionnelle ou tridimensionnelle. Les informations générées peuvent fournir des informations sur la surface et/ou le volume occupé par la mélanine dans ledit tissu, ainsi que sur sa distribution 3D par rapport aux autres constituants du tissu. Des exemples de modes de réalisation de l’invention concernent également une méthode (en particulier une méthode non thérapeutique) d’évaluation de l’action d’un stimulus et/ou d’un traitement, qui est notamment pro-pigmentant, dépigmentant ou anti-pigmentant, sur un tissu biologique, comprenant : - l’évaluation de la pigmentation dans un tissu biologique au moyen d’une méthode telle que décrite précédemment, l'exposition de l’échantillon à un stimulus (en particulier un stimulus non thérapeutique) choisi parmi : un rayonnement lumineux, en particulier un rayonnement solaire, ultraviolet (UVA et/ou UVB) ou infrarouge (IR), un stimulus provoquant une réponse inflammatoire et une action mécanique (tension, pression, décollement, détachement, exfoliation, abrasion), ou à un traitement, en particulier avec au moins un produit pro-pigmentant dépigmentant ou anti-pigmentant, par exemple du lucinol ou tout autre agent chimique modulateur de pigmentation, - la réalisation d'une seconde évaluation de la pigmentation dans le tissu biologique au moyen d’une méthode décrite précédemment, - la comparaison des informations générées lors des deux évaluations, et l’évaluation de l’action du stimulus ou du traitement sur la pigmentation au moins sur la base de cette comparaison. Le traitement peut être non thérapeutique, en particulier cosmétique. Le traitement peut être choisi parmi : l’application, l’injection, l’ingestion ou l’inhalation d’un produit, en particulier un produit cosmétique. Le traitement peut correspondre à la prise de compléments alimentaires et/ou de médicaments. Elle peut également comprendre l’exposition des tissus biologiques à un traitement choisi parmi : l’application, l’injection, l’ingestion ou l’inhalation d’un produit, en particulier d’un produit cosmétique, ou la prise de compléments alimentaires et/ou de médicaments. L’expression « produit cosmétique » s’entend d’un produit tel que défini dans la directive 93/35/CEE du 14 juin 1993 modifiant la directive 76/768/CEE. Le produit peut avoir un effet dépigmentant. Ainsi, le traitement peut comprendre l’application de tout agent chimique modulateur de pigmentation. La méthode selon l’invention peut être utilisée pour évaluer l’efficacité ou l’innocuité des agents actifs dépigmentants, anti-pigmentants ou pro-pigmentants. Les agents actifs peuvent être à des fins thérapeutiques, par exemple l’hydroquinone ou les rétinoïdes, et/ou à des fins cosmétiques. La méthode selon l’invention peut être également utilisée pour évaluer les effets secondaires de certains produits sur la pigmentation, par exemple les dermocorticoïdes. Des modes de réalisation de l’invention donnés à titre d’exemples concernent également une méthode d’évaluation de l’action d’un stimulus et/ou d’un traitement, qui est notamment l'anti-pigmentation, la pro-pigmentation ou la dépigmentation, sur un tissu biologique, dans laquelle au moins deux régions du tissu sont exposées différemment au stimulus et/ou traitées différemment, et dans laquelle sont comparées les informations sur la présence et/ou la quantité de mélanine dans lesdites régions, obtenues au moyen d’une méthode telle que décrite précédemment, avant et après exposition audit stimulus ou audit traitement. Pour tester l’action d’un produit, une évaluation réalisée après le traitement avec un placebo du produit et une évaluation effectuée après le traitement avec ce produit peuvent être comparées. Le placebo est, par exemple, le même agent cosmétique que celui du produit utilisé pour le traitement, mais sans l'agent ou les agents actif(s) correspondant(s). Il est possible de réaliser une évaluation de la distribution de mélanine dans les tissus biologiques d’un individu ou sur des échantillons de peau artificielle ou reconstruite qui ont été traités avec un composé cosmétique, et de la comparer à une évaluation de la distribution de mélanine dans les tissus biologiques du même individu ou des mêmes échantillons de peau artificielle ou reconstruite qui ont été traités avec un placebo du composé cosmétique. Le traitement peut correspondre à l’application d’un produit, en particulier d'un produit cosmétique. Le produit peut, par exemple, se présenter sous la forme d’une crème, d’une lotion, d’une pommade, d’une huile, d’une poudre, cette liste n'étant pas restrictive. Le produit peut être également contenu dans un support à appliquer sur les tissus biologiques, en particulier la peau humaine reconstruite ou artificielle, par exemple un patch, un pansement, un bandage ou un masque. Le produit peut ne pas être un produit pigmentant ou dépigmentant uniquement destiné à agir sur la quantité et/ou la distribution de mélanine dans les tissus biologiques. Le produit peut ainsi être destiné, par exemple, au maquillage, à l’hydratation ou à la protection des tissus biologiques, en particulier à la protection contre le soleil, ou à la réparation des tissus biologiques, tout en ayant des effets sur la quantité et/ou la distribution de mélanine dans les tissus biologiques. Le produit peut donc contenir divers composés, en particulier des agents actifs autres que des agents actifs destinés à agir sur la mélanine des tissus biologiques. Des modes de réalisation de l’invention donnés à titre d'exemples concernent également une méthode de promotion d’un traitement, en particulier un traitement non thérapeutique, dans lequel il est fait référence à une action du traitement sur la mélanine, démontrée au moyen d’une méthode telle que définie ci-dessus. L’invention peut être mieux comprise à la lecture de la description suivante d’exemples non restrictifs de sa mise en œuvre, et en examinant les figures du dessin joint, sur lequel : - La illustre les différentes étapes d’une méthode conformément à l’invention, - La représente, schématiquement et partiellement, un exemple de dispositif multiphotonique qui peut être utilisé dans une méthode selon l’invention, - La illustre un exemple d’image d’intensité de fluorescence XZ 2D multiphotonique acquise selon l’invention, - La illustre l’image de la sur laquelle la détection de limite est appliquée, - La correspond à l’image de la obtenue après détection de mélanine par intensité de fluorescence, - La illustre l’image de la après alignement de la limite dans la direction Z, - La montre le profil de distribution z 2D de la mélanine correspondant à l’image de la . Comme illustré sur la , l’étape 1 d’une méthode selon l’invention comprend l’acquisition, par microscopie FLIM multiphotonique ou microscopie multiphotonique, d’une pluralité d’images XZ bidimensionnelles. Chaque image comprend une pluralité de lignes de pixels représentées à différentes profondeurs du tissu biologique. L’utilisation d’un dispositif de microscopie multiphotonique peut permettre l’automatisation des étapes d’acquisition d’images du tissu biologique. Le nombre d’images XZ 2D à acquérir et leurs étapes dy sont des paramètres à ajuster, comme susmentionné, en fonction de l’échantillon biologique et du système d’imagerie. Pour le modèle cutané d'ERP, un empilement de 50 images peut être acquis toutes les dy = 100 μm. Les images acquises peuvent être stockées dans différents formats, par exemple sous forme d’images individuelles ou d'empilement d’images. Au moins deux empilements d’images XZ 2D peuvent également être acquis avec différents emplacements X,Y d’échantillon. À l’étape 2, un algorithme est utilisé pour traiter l'empilement d’images et lire une couche unique à partir d’un empilement d’images. Un exemple d’image XZ 2D obtenue pour la peau par la méthode de la présente invention est illustré sur la . L’image montre l’intensité de fluorescence épidermique du modèle cutané d’ERP, dans un plan transversal sensiblement perpendiculaire à la surface de la peau. Dans le cas présent, l’image XZ à traiter comprend un nombre total de 1024 × 1024 pixels. L’étape 3 comprend la détermination ou la détection de limite pour le tissu biologique. L’étape consiste à appliquer un premier seuil de détection d’intensité pour binariser l’image XZ 2D extraite, c’est-à-dire pour débruiter à des fins de détection de limite. Après débruitage, un algorithme trouve les points de signal le long de l’axe x sur la colonne où se trouve chaque pixel et détermine la position médiane des pixels d’intensité de fluorescence maximale dans un intervalle environnant. L’algorithme peut alors concaténer les points de signal correspondant aux pixels d’intensité de fluorescence maximale. Les points de signal concaténés forment la ligne limite, c’est-à-dire la limite entre l’air et la couche basale. Une limite ainsi déterminée est illustrée sur la . L’étape 4 comprend la détection de mélanine dans la limite de l’image XZ 2D détectée. Cette étape comprend le réglage d’un second seuil de détection d’intensité qui est également utilisé pour la binarisation à des fins de débruitage. Ensuite, un flou gaussien est appliqué pour faciliter la réduction du bruit afin d’aider à détecter les points du signal de la mélanine. Comme le montre la , la partie brillante correspond aux points de signal de la mélanine détectés après réduction du bruit. Un masque de mélanine est ainsi obtenu après application du second seuil de détection d’intensité à l'aide de la méthode de détection de la mélanine basée sur l’intensité de fluorescence. À l’étape 5, une courbe représentant la distribution de mélanine dans le plan transversal correspondant à la couche unique de l’image XZ 2D extraite à l’étape 2 est calculée. Dans l’exemple actuel, un algorithme retire 256 pixels du point de départ sur la ligne limite dans chaque colonne de pixels et aligne les points de départ, formant l’image montrée sur la . L’algorithme détecte ainsi la zone cutanée. L’alignement des points de départ peut faciliter la génération d’une courbe représentative de la distribution de mélanine, comme le montre la . Le nombre de pixels retirés peut varier, par exemple, en fonction des points du signal de mélanine détectés à l’étape 4. Ces pixels de mélanine peuvent ensuite être comptés par rapport à leur distance à partir de la ligne limite. Les étapes ci-dessus peuvent être appliquées à au moins une partie ou à chacune des images XZ 2D acquises. Ensuite, en calculant la moyenne, pour chaque profondeur correspondant à une distance d’une ligne de pixels retirés à l’étape 5 à partir de la ligne limite, cette quantité dans chaque image XZ 2D le long de la direction X et parmi les images XZ 2D, la distribution de mélanine de la couche basale de la peau à la couche profonde peut être obtenue comme indiqué sur la , dans laquelle l’abscisse représente la distance entre la couche basale et la surface de la peau en micromètres et l’ordonnée représente la moyenne du nombre de pixels de mélanine dans l’image XZ 2D à une profondeur z donnée. Différentes images XZ peuvent être acquises à différentes positions Y afin de donner des informations sur la distribution de mélanine à différents emplacements de l’échantillon. Dans cet exemple, le profil de distribution z 2D de la mélanine est présenté à partir de la surface de l’échantillon jusqu’à une profondeur de 250 μm. Tout système de microscopie multiphotonique connu, combiné ou non à un système de mesure de la durée de vie de fluorescence, peut être utilisé pour mettre en œuvre la méthode ci-dessus. En particulier, le système de microscopie multiphotonique est par exemple du type A1RMP/FN1 de Nikon®. La longueur d’onde d’excitation utilisée peut être comprise entre 700 et 1000 nm, de préférence d'environ 760 nm. Cette plage de longueurs d’onde permet de refléter la plupart des constituants fluorescents endogènes des tissus. La représente, schématiquement et partiellement, un exemple de dispositif multiphotonique 100 qui peut être utilisé dans une méthode selon l’invention. Le dispositif 100 comprend un laser femtoseconde 10, par exemple un laser saphir-titane (Ti: Sa), qui peut être réglé dans une plage de longueurs d’onde infrarouge et qui peut fournir des impulsions de l’ordre de 100 femtosecondes à un taux de répétition de l’ordre de 80 MHz. Le laser 10 émet un faisceau infrarouge 11 qui est dirigé vers un dispositif de balayage par faisceau laser 12 sous la forme d’un « scanner XY ». Le faisceau est ensuite réfléchi par un premier miroir dichroïque 14 et il est focalisé sur les matières kératiniques 13 au moyen de l’objectif 15. Un balayage du faisceau laser peut être obtenu par mouvement angulaire d’une première paire de miroirs galvanométriques 22 du dispositif de balayage 12, ce qui permet de balayer le point focal dans le plan (x, y) perpendiculaire à la direction Z. Un dispositif piézoélectrique 26 permet la translation de l’objectif 15 et donc de changer le plan de mise au point à différentes profondeurs dans les matières kératiniques 13 lors de l’acquisition d’une image XZ 2D. Pour chaque profondeur, une ligne de pixels est acquise en déplaçant le point focal dans la direction X par le scanner XY. Les signaux créés au point focal peuvent alors être détectés, par exemple par épicollection via l’objectif d’excitation 15. Le premier miroir dichroïque 14 permet de sélectionner les signaux multiphotoniques créés, en particulier l’autofluorescence (AF) provenant des matières kératiniques 13. Le premier miroir dichroïque 14 permet notamment de réfléchir les longueurs d’onde de la lumière laser (par exemple, dans une plage de 700 à 1000 nm) et la transmission du signal multiphotonique (par exemple, de 350 à 650 nm). Ensuite, un second miroir dichroïque 16 permet de séparer les signaux d’autofluorescence (AF) des autres signaux multiphotoniques, ce qui correspond par exemple à la génération de seconde harmonique (GSH). Une seconde paire de miroirs galvanométriques 23 peut être positionnée entre le premier miroir dichroïque 14 et le second miroir dichroïque 16 pour effectuer l’alignement de la lumière, afin de s’assurer que tous les signaux peuvent être détectés par le détecteur, quelle que soit la position XZ. Dans tous les cas, les signaux traversent des filtres spectraux et atteignent au moins un détecteur 18, ce qui permet de produire une image fluorescente. Les données sont ensuite transférées sur un autre ordinateur pour le traitement d’images. La méthode peut donc être utilisée pour tout type de tissu contenant de la mélanine. Méthode de détection, quantification et/ou visualisation d’un fluorophore endogène, tel que la mélanine, dans un tissu biologique, la méthode comprenant : - l’acquisition d’une pluralité d’images multiphotoniques bidimensionnelles (2D) de l’intensité de fluorescence ou d’images FLIM multiphotoniques combinées, chaque image étant acquise dans un plan sensiblement perpendiculaire à une surface du tissu biologique, - le traitement des images pour détecter une limite de la surface du tissu biologique et pour détecter le fluorophore endogène, et - la génération, sur la base des images traitées, d’informations représentatives d’une distribution du fluorophore endogène dans ledit tissu biologique par rapport à la limite, notamment en fonction de la distance à partir de la limite. Méthode selon la revendication 1, la méthode comprenant au moins cinquante images multiphotoniques bidimensionnelles (2D) ou FLIM multiphotoniques combinées dans différents plans sensiblement perpendiculaires à la surface du tissu biologique, de préférence le fluorophore endogène étant détecté à l’aide d’analyses de l’intensité de fluorescence ou par pseudo-FLIM. Méthode selon la revendication 1 ou 2, les informations étant générées sous forme d’au moins une représentation 2D de la densité de mélanine et/ou de son profil de distribution le long d’une profondeur du tissu biologique. Méthode selon l’une quelconque des revendications précédentes, comprenant l’application, après la détection de limite, d’un second seuil de détection d’intensité pour binariser et réaliser un flou gaussien sur l’image 2D pour la détection de pixels contenant de la mélanine. Méthode selon l’une quelconque des revendications précédentes, le tissu biologique étant la peau et le composant de fluorophore endogène étant la mélanine, la méthode comprenant la représentation de la distribution de mélanine en fonction de la distance à partir de la couche basale cutanée. Méthode selon l’une quelconque des revendications précédentes, comprenant l’acquisition, pour chaque image 2D, d’une pluralité de lignes de pixels à différentes profondeurs du tissu biologique, la méthode comprenant la translation d’un objectif perpendiculairement à une surface du tissu biologique lors de l’acquisition de chaque image 2D, à chaque acquisition d’une ligne de pixels, l’objectif étant focalisé sur une profondeur correspondante du tissu biologique. Méthode selon l’une quelconque des revendications précédentes, les informations générées fournissant des informations sur la surface et/ou le volume occupé par la mélanine dans le tissu. Méthode selon l’une quelconque des revendications précédentes, le tissu étant de la peau humaine, de la peau reconstruite ou artificielle, ou des cellules mélanisées en culture.