Brevet FR3150203A1 — publié le 20241227

Nouveaux précurseurs de sondes pour le stress oxydant La présente invention concerne un composé de formule (I) : dans laquelle n = 1 ou 2, A et A’ sont indépendamment choisi dans le groupe constitué des substituants (II-a) et (II-b) suivants : et , R et R’ étant indépendamment choisis parmi H et les alkyles linéaires ou ramifiés en C1-C3, Z étant choisi parmi un groupement alkyle linéaire ou ramifié en C1-C4 et un groupement aryle éventuellement substitué par un groupement alkyle linéaire ou ramifié en C1-C3 ou/et par un groupement hydroxyle, et le motif de formule (N) est choisi parmi les motifs (III-a), (III-b), (III-c), (III-d) et (III-e) suivants : , , , et , Ra, Rb, Rc et Rd étant, pour chaque motif (III-a), (III-b), (III-c), (III-d) et (III-e), indépendamment choisis parmi les alkyles, linéaires ou ramifiés, en C1-C4. Figure pour l'abrégé : Aucune Nouveaux précurseurs de sondes pour le stress oxydant La présente invention concerne de nouveaux précurseurs de sondes pour le stress oxydant, et leurs différentes utilisations. L’un des plus grands défis sociétaux est de favoriser un vieillissement actif et en bonne santé de la population. Pour y parvenir, il est essentiel de découvrir de nouvelles méthodes de diagnostic ou des thérapies efficaces contre les pathologies cardiovasculaires et neurologiques ou le cancer. Il est de plus en plus clair que le stress oxydant a un impact majeur sur l’évolution de l’ensemble de ces maladies. Une méthode de détection et de cartographie non invasive du stress oxydant in vivo fournirait donc de précieuses informations sur le développement de ces pathologies et aiderait à la conception d’outils de diagnostic et de traitement. Les biomarqueurs d’oxydation protéiques et lipidiques des fluides biologiques sont des outils intéressants mais ils ne permettent pas de localiser la pathologie. C’est pourquoi les méthodes d’imagerie structurales et/ou fonctionnelles basées sur la tomographie par émission de positons (TEP), l’imagerie de susceptibilité magnétique (SWI) et la résonance magnétique (IRM) sont couramment employées. Cependant elles présentent certaines limitations. La TEP nécessite des traceurs radioactifs couteux et à courte durée de vie ainsi qu’un accès à un cyclotron local pour leur production, et n’est pas compatible avec certaines pathologies. L’imagerie de susceptibilité magnétique (SWI) évalue le contenu des tissus en métaux (Cu, fer non héminique) comme sources potentielles d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) par réaction de Fenton, mais de nombreuses régions accumulent du fer (dans la ferritine par exemple) sans engendrer de surproduction de radicaux. Plus spécifique, la spectroscopie de résonance magnétique est capable de mesurer une partie des défenses antioxydantes (ascorbate, glutathion) mais ignore les enzymes essentielles de détoxification des ROS. Les méthodes utilisant la résonance paramagnétique électronique (RPE), peu invasives, et des sondes moléculaires exogènes, ont déjà démontré leur utilité dans l’évaluation et la cartographie du "statut redox" dans le cerveau dans des conditions de stress oxydant, par exemple chez des modèles de rat souffrant d’hypertension, d’AVC ou d’épilepsie et chez des rongeurs exposés à des lésions d’ischémie-reperfusion. L’association américaine de cardiologie (American Heart Association) considère même la RPE associée à l’utilisation de sondes moléculaires comme la méthode d’excellence en physiologie rédox (K.K. Griendling, R.M. Touyz, J.L. Zweier, S. Dikalov, W. Chilian, Y.-R. Chen, D.G. Harrison, A. Bhatnagar, Measurement of Reactive Oxygen Species, Reactive Nitrogen Species, and Redox-Dependent Signaling in the Cardiovascular System: A Scientific Statement From the American Heart Association, Circ. Res. 119 (2016) e39–e75. doi: 10.1161/RES.0000000000000110). Parmi les sondes moléculaires déjà connues, on distingue les sondes de la famille des hydroxylamines, qui sont oxydées dans les cellules en nitroxyde qui est détectable par RPE. Il est en particulier connu d’utiliser des précurseurs de ces sondes, comme le composé 1-acétoxy-3-carbamoyl-2,2,5,5-tétraméthylpyrrolidine (ACP) suivant : Ce composé comprend une fonction ester protectrice du groupement hydroxylamine. L’objectif de ces précurseurs est d’acheminer, avec le moins de dégradation possible, la sonde jusqu’à l’intérieur des cellules. Le masquage de la fonction hydroxylamine permet de limiter l’oxydation spontanée des hydroxylamines avant l’internalisation dans les cellules, ce qui facilite la manipulation par des expérimentateurs non-chimistes. Une fois internalisée, les fonctions esters sont hydrolysées par les estérases de la cellule, libérant ainsi le motif hydroxylamine, qui peut être oxydé en nitroxyde et devenir détectable en RPE. Toutefois, ces sondes présentent un certain nombre de limitations, comme leur faible stabilité biologique, en particulier in vivo , leur manque de spécificité et/ou de sensibilité et le faible nombre de sondes disponibles commercialement. Il existe donc un besoin pour de nouvelles sondes moléculaires plus performantes. Ce besoin se fait d’autant plus ressentir que récemment, de nouvelles avancées technologiques dans les spectromètres RPE ont été commercialisées, et que les limitations des sondes constituent un frein au développement des applications de la RPE rédox. Le but de l’invention est donc de proposer de nouvelles sondes moléculaires pour le stress oxydant, présentant des performances améliorées par rapport aux sondes déjà existantes. En particulier, un but de l’invention est de proposer de nouvelles sondes moléculaires pour le stress oxydant, présentant une stabilité améliorée, et/ou une meilleure sensibilité et/ou une manipulation facilitée. A cet effet, l’invention a pour objet un composé de formule (I) : dans laquelle n = 1 ou 2, de préférence n = 1, A et A’ sont indépendamment choisi dans le groupe constitué des substituants (II-a) et (II-b) suivants : et , R et R’ étant indépendamment choisis parmi H et les alkyles linéaires ou ramifiés en C1-C4, Z étant choisi parmi un groupement alkyle linéaire ou ramifié en C1-C4 et un groupement aryle éventuellement substitué par un groupement alkyle linéaire ou ramifié en C1-C4 ou/et par un groupement méthoxyle (comme le 4-méthoxyphényle), et le motif de formule (N) est choisi parmi les motifs (III-a), (III-b), (III-c), (III-d) et (III-e) suivants : , , , ,et Ra, Rb, Rc et Rd étant, pour chaque motif (III-a), (III-b), (III-c), (III-d) et (III-e), indépendamment choisis parmi les alkyles, linéaires ou ramifiés, en C1-C4. Par alkyle, linéaire ou ramifié, en C1-C4, on entend une chaîne hydrocarbone comprenant n atomes de carbone, n étant égal à 1, 2, 3 ou 4, et comprenant 2n+2 atomes d’hydrogène. Il s’agit par exemple d’un groupement méthyle, éthyle, n-propyle, iso-propyle, n-butyl, iso-butyle ou tert-butyle. En effet, les inventeurs ont découvert de manière surprenante que les composés de formule (I) selon l’invention sont des précurseurs de sonde pour le stress oxydant, détectable en particulier par spectroscopie RPE présentant des performances nettement améliorées par rapport aux composé existants, notamment en termes de stabilité in vivo et de sensibilité. Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, les inventeurs estiment que les groupements Ra, Rb, Rc et Rd du motif de formule (N) dans les précurseurs de sonde de l’art antérieur induisent un encombrement stérique qui empêche les estérases de la cellule d’hydrolyser l’ester protégeant la fonction hydroxylamine. En effet, la cinétique de déprotection étant faible et la réaction incomplète, une très faible quantité de sonde est effectivement libérée dans les cellules, difficilement détectable en imagerie médicale ou par spectroscopie RPE. Dans les composés de formule (I) selon l’invention, la présence d’un groupe espaceur entre l’azote du motif de formule (N) et le carboxyle ciblé par l’estérase dans le groupement A’ permet de déprotéger rapidement, et complètement, la fonction hydroxylamine. Par exemple, lorsque A’ est le substituant (II-a) avec R=R’=CH 3 , 100% d’hydroxylamine est libérée en 10 min à 37°C vs. une déprotection de la sonde commerciale ACP (1-acétoxy-3-carbamoyl-2,2,5,5-tétraméthylpyrrolidine) limitée à 27% dans les mêmes conditions.. Les composés de formule (I) selon l’invention permettent ainsi une manipulation facilitée (adaptée aux expérimentateurs non chimistes pour des applications en biologie), une libération plus efficace de la sonde, ce qui entraîne un gain en sensibilité. Dans la formule (I), et sauf dans le cas où le motif de formule (N) est le motif de formule (III-e), l’homme du métier comprendra que chaque groupement peut être lié à n’importe quel atome de carbone substituable (portant au moins un atome d’hydrogène) constituant le ou les cycles du motif de formule (N) de formule (III-a), (III-b), (III-c) et (III-d). La présence du groupement A dans le composé de formule (I) permet avantageusement d’améliorer l’accumulation de la sonde dans les cellules, donc la quantité de sonde détectable dans les cellules après oxydation, et donc la qualité de l’image ou du signal obtenu. Les groupements A permettent la pénétration des composés de façon passive dans les cellules et sont sensibles à l’hydrolyse par les estérases intracellulaires, ce qui conduit à la libération d’un ion carboxylate chargé négativement qui lui ne diffuse pas librement à travers les membranes. Il est entendu que chaque atome du composé de formule (I) peut être présent sous la forme de n’importe lequel de ses isotopes naturels. Selon un mode de réalisation particulier, l’atome d’azote du motif de formule N est un azote 15. Alternativement, ou en combinaison, les atomes d’hydrogène du motif de formule (N), et en particulier des groupements Ra, Rb, Rc et Rd, sont de préférence de l’hydrogène 2 (plus communément appelé deutérium). La composition isotopique du composé de formule (I), et notamment sa teneur en azote 15 et/ou en hydrogène 2, se détermine selon des techniques connues de l’homme du métier. Par exemple, la spectrométrie de masse à haute résolution (HRMS) permet de déterminer la moyenne de la concentration de l’isotope étudié sur l'ensemble des sites de du composé de formule (I). La résonance magnétique nucléaire (RMN) quantitative du deutérium et de l’azote-15 peut aussi être utilisée, et permet d’étudier la distribution isotopique spécifique à chaque position du composé de formule (I). Egalement, après hydrolyse et oxydation (par le ferricyanure de potassium, par exemple) d’un composé de formule (I), le spectre de résonance paramagnétique électronique (RPE), est différent pour une molécule contenant de l’azote-15 (2 raies) et une contenant de l’azote-14 (3 raies). De préférence, dans le substituant (II-b), Z est choisi parmi un méthyle, un éthyle, un propyle, un isopropyle, un tertiobutyle, un phényle et un 4-méthoxyphényle. Avantageusement, pour la suite de la description, Z = Me. De préférence, A est choisi dans le groupe constitué du substituant (II-b) dans lequel Z = Me et du substituant (II-a) dans lequel R = H, et A’ est choisi dans le groupe constitué du substituant (II-b) dans lequel Z = Me et du substituant (II-a) dans lequel R = Me. De préférence, R’ est un méthyle ou un éthyle, de préférence un méthyle. De préférence, A et A’ sont identiques. Selon certains modes de réalisation, A = A’ = (II-a). Selon d’autres modes de réalisation, A = A’ = (II-b). L’utilisation des groupements (II-b) permet avantageusement d’éviter le relargage d’un équivalent d’acétaldéhyde et d’un équivalent de formaldéhyde après action de l’estérase, qui pourraient induire un potentiel problème de toxicité à très forte dose ainsi qu’un potentiel stress cellulaire qui pourrait interférer avec la mesure du stress oxydant. En effet, l’hydrolyse par estérases du groupement (II-b) entraîne uniquement la formation de 3-hydroxybutan-2-one et de 2,3-butanediol, non toxiques. De préférence, le motif de formule (N) est choisi parmi les motifs (III-b), (III-c), (III-d) et (III-e), préférentiellement parmi les motifs (III-b), (III-c) et (III-d), plus préférentiellement (III-b) et (III-d), ou alternativement (III-c). De préférence, le composé de formule (I) est choisi parmi les composés (I-a), (I-b), (I-b’’), (I-c), (I-c’’), (I-d), (I-d’), (I-d’’), (I-d’’’) et (I-e) suivants : , , , , , , , , et A, A’, Ra, Rb, Rc et Rd étant, pour chaque composé (I-a), (I-b), (I-b’’), (I-c), (I-c’’), (I-d), (I-d’), (I-d’’), (I-d’’’) et (I-e), chacun indépendamment tels que définis ci-dessus. De préférence, le composé de formule (I) est choisi parmi les composés (I-a), (I-b), (I-b’’), (I-c), (I-d) et (I-e), préférentiellement parmi les composés (I-a), (I-b), (I-b’’), (I-c) et (I-d), plus préférentiellement parmi les composés (I-b), (I-c) et (I-d), encore plus préférentiellement (I-b) et (I-d), ou alternativement (I-c). Plus préférentiellement, le composé de formule (I) est choisi parmi les composés (IV), (V), (VI) et (VII) suivants, , , et A et A’ étant tels que définis ci-dessus. Préférentiellement, le composé de formule (I) est choisi parmi les composés (IV), (V) ou alternativement parmi les composés (VI). De préférence, Ra, Rb, Rc et Rd sont indépendamment choisis parmi un méthyle, un éthyle et un isopropyle, préférentiellement parmi un méthyle et un éthyle. De préférence, Ra, Rb, Rc et Rd sont identiques, et sont de préférence choisis parmi un méthyle et un éthyle. Les groupements Ra, Rb, Rc et Rd permettent avantageusement d’obtenir une meilleure qualité d’image ou de signal. Sans être liés par une quelconque théorie, les inventeurs estiment que l‘encombrement induit par les quatre groupements Ra, Rb, Rc et Rd permet de stabiliser le radical nitroxyde, et permet en outre de réduire l’activité mime de superoxyde-dismutase du nitroxyde produit, ce qui améliore la réponse de la sonde hydroxylamine à la production d’anion superoxyde. Selon un mode de réalisation particulier, le composé de formule (I) est choisi parmi : et Selon un mode de réalisation, le composé de formule (I) est le composé . Selon un autre mode de réalisation, le composé de formule (I) est le composé . Selon un mode de réalisation alternatif, le composé de formule (I) est différent du composé suivant : . La présente invention concerne aussi une méthode de préparation de composés de formule (I) selon l’invention. Cette méthode est notamment telle que décrite dans les exemples. Une méthode typique de préparation de composés de formule (I) selon l’invention comprend au moins une étape (S1) de réduction en hydroxylamine du composé de formule (X) par exemple en présence de dihydrogène, pour obtenir un composé de formule (X’) puis une étape (S1’) d’addition nucléophile du composé (X’) sur un composé de formule (XI), , ou de formule (XI’) pour donner un composé de formule (XII) , ou de formule (XII’), respectivement A, A’, n, R, et le motif de formule (N) étant tels que définis ci-dessus pour les composés de formule (I). De préférence, l’étape (S1) s’effectue en présence de palladium sur charbon et de dihydrogène. Le dihydrogène est ensuite éliminé par purge à l’argon avant la mise en œuvre de l’étape (S1’). De préférence, l’étape (S1’) d’addition du composé de formule (XI) sur le composé de formule (X’) s’effectue entre -5°C et 8°C, puis le mélange réactionnel est agité de 12 à 20 h à température ambiante (20-28°C). Cette méthode peut en outre comprendre une étape (S2) de substitution nucléophile entre le composé de formule (XII) et un composé de formule (XIII) R’-C(O)-O - (XIII), R’ étant tel que défini ci-dessus pour les composés de formule (I), pour donner un composé de formule (I) selon la présente invention. De préférence, l’étape (S2) s’effectue en présence d’un sel d’acétate, de préférence l’acétate de mercure. De préférence, le mélange réactionnel est agité de 12 à 20 h à température ambiante (20-28°C). La méthode peut en outre comprendre une étape (S0) de substitution nucléophile entre un composé de formule (XIV) et un composé de formule (XV) , pour obtenir un composé de formule (X), A, n, et le motif de formule (N) étant tels que définis ci-dessus pour les composés de formule (I) et X = Cl ou Br, de préférence A = (II-a). De préférence, l’étape (S0) s’effectue en présence d’une base inorganique, de préférence en présence de carbonate de potassium. De préférence, le mélange réactionnel est agité de 1 à 5 h à température ambiante (20-28°C). Alternativement, la méthode peut en outre comprendre un étape (S0’) d’activation du composé de formule (XIV) en chlorure d’acyle de formule (XIV’) , suivi d’une étape (S0’’) de couplage entre le composé (XIV’) et un composé (XV’) pour obtenir un composé de formule (X), A, n et le motif de formule (N) étant tels que définis ci-dessus pour les composés de formule (I), de préférence A = (II-b). L’étape d’activation (S0’) s’effectue de préférence en présence d’un dichlorure d’acyle, par exemple de chlorure d’oxalyle et de diméthylformamide. L’étape (S0’’) s’effectue de préférence en présence de bases, par exemple la triéthylamine et la 4-diméthylaminopyridine. De préférence, le mélange réactionnel est agité de 10 à 48 h à température ambiante (20-28°C). Toute méthode alternative bien connue de l’art antérieur peut être utilisée. La présente invention concerne par ailleurs une composition pharmaceutique, comprenant dans un milieu physiologiquement acceptable, au moins le composé de formule (I) selon l’invention. De préférence, la composition pharmaceutique selon l’invention est sous la forme d’une nanoémulsion, de préférence d’une nanoémulsion huile-dans-eau. De préférence, la nanoémulsion comprend une phase aqueuse et une phase huileuse, la phase huileuse comprenant le composé de formule (I). De préférence, au moins 90% en masse, préférentiellement de 95 à 99,99% en masse, de la quantité massique totale du composé de formule (I) de la nanoémulsion est compris dans la phase huileuse. De préférence, la phase huileuse comprend en outre au moins un composé huileux comprenant un triglycéride, de préférence un triglycéride en C4-C24, préférentiellement en C8-C18. Les triglycérides sont en général des triesters d'acides gras et de glycérol dont les acides gras peuvent avoir des longueurs de chaînes variées de C4 à C24, ces dernières pouvant être linéaires ou ramifiées, saturées ou insaturées. De préférence, le composé huileux est choisi parmi les huiles végétales et les triglycérides à chaînes moyennes en C6-C12, de préférence en C8-C10. Les triglycérides selon l’invention sont notamment les huiles de germe de blé, de tournesol, de pépins de raisin, de sésame, de maïs, d'abricot, de ricin, de karité, d'avocat, d'olive, de soja, l'huile d'amande et notamment l'huile d'amande douce, de palme, de colza, de coton, de noisette, de macadamia, de jojoba, de luzerne, de pavot, de potimarron, de sésame, de courge, de colza, de cassis, d'onagre, de millet, d'orge, de quinoa, de seigle, de carthame, de bancoulier, de passiflore, de rosier muscat, de noix de coco ; ou encore les triglycérides des acides caprylique/caprique. Avantageusement, le composé huileux de la phase huileuse est choisi parmi l’huile d’olive et le Labrafac® lipophile WL 1349. De préférence, la phase aqueuse comprend de l'eau, et éventuellement du NaOH, du NaCl, du glycérol, du sorbitol, du dextrose ou du xylitol. Préférentiellement, la phase aqueuse comprend du NaOH afin d’ajuster le pH de la nanoémulsion entre 6,8 et 7,2, de préférence autour de 7, et éventuellement du glycérol, en une quantité allant de préférence entre 0,5 et 5% en masse par rapport à la masse totale de l’émulsion De préférence, la composition, de préférence la nanoémulsion, comprend en outre au moins un tensioactif, de préférence un tensioactif non ionique, de préférence choisi parmi les tensioactifs organosilicones, le polysorbate, l'alcool cétostéarylique, l'alcool cétylique, l'alcool oléylique, l'alcool stéarylique, le cocamide DEA, le cocamide MEA, le polyalkylglucoside, le décyl glucoside, le lauryl glucoside, l'octyl glucoside, la monolaurine, le poloxamère, le monostéarate de sorbitan, le tristéarate de sorbitan, ou toute combinaison de ceux-ci, préférentiellement parmi les poloxamères et le monostéarate de sorbitan. De préférence, la composition, de préférence la nanoémulsion, comprend un premier tensioactif tel que défini ci-dessus, et un deuxième tensioactif différent du premier tensioactif et tel que défini ci-dessus. Avantageusement, le premier tensioactif est le monostéarate de sorbitan et le deuxième tensioactif est choisi parmi les poloxamères, de préférence le poloxamère 188. Un exemple de monostéarate de sorbitan est le produit commercial Span® 80. Un exemple de poloxamère est le produit commercial Kolliphor® P 188. De préférence, la teneur totale massique en tensioactif va de 4% à 12% par rapport à la masse totale de la composition, de préférence de la nanoémulsion, de préférence va de 5% à 10%. De préférence, la teneur massique en premier tensioactif va de 3% à 7% par rapport à la masse totale de la composition, de préférence de la nanoémulsion, de préférence va de 4% à 6%. De préférence, la teneur massique en deuxième tensioactif va de 1% à 5% par rapport à la masse totale de la composition, de préférence de la nanoémulsion, de préférence va de 1% à 4%. De préférence, dans la composition, de préférence dans la nanoémulsion, le ratio massique entre le premier tensioactif et le deuxième tensioactif va de 1 à 6, de préférence de 1,2 à 4,5, avantageusement de 1,5 à 4,2. De préférence, dans la composition, de préférence dans la nanoémulsion, le ratio massique entre la phase aqueuse et la phase huileuse va de 1 à 8, de préférence de 2 à 6, de préférence de 3 à 5, avantageusement de 3,5 à 4,5. De préférence, dans la composition, de préférence dans la nanoémulsion, le ratio massique entre le composé huileux et l’ensemble des tensioactifs va de 1 à 5, de préférence de 1,5 à 4, de préférence de 2 à 3,5, avantageusement de 2,5 à 3,5. De préférence, la nanoémulsion présente une taille moyenne de gouttelettes comprise allant de 50 à 500 nm, de préférence allant de 80 à 300 nm, avantageusement allant de 100 à 200 nm. De préférence, la nanoémulsion présente une distribution de la taille des gouttelettes allant de 0,05 à 0,20, de préférence allant de 0,07 à 0,15. La taille moyenne de gouttelettes est déterminée par spectroscopie de corrélation de photons à l'aide d'un Zetasizer® Nano ZS (Malvern Panalytical, Worcestershire, UK). 10 μL de nanoémulsion sont dilués cent fois avec de l'eau ultrapure. Toutes les mesures sont enregistrées à 25°C avec un angle de diffusion de 173°. L'ajustement des courbes des fonctions de corrélation est effectué en utilisant un ajustement exponentiel (approche cumulante) pour l'évaluation du diamètre hydrodynamique et du PDI. Toutes les mesures sont effectuées en triplicata afin de déterminer la taille moyenne des gouttelettes exprimée en diamètre moyen Z (Z-Ave) et en PDI. De préférence, dans la nanoémulsion, le ratio massique entre le composé de formule (I) et la phase huileuse va de 0,1 à 0,5, de préférence de 0,15 à 0,45, préférentiellement de 0,2 à 0,4, plus préférentiellement de 0,25 à 0,35, avantageusement de 0,30 à 0,35. De préférence, la concentration molaire du composé de formule (I) dans la phase huileuse va de 0,01 mol/L à 0,5 mol/L, de préférence de 0,05 mol/L à 0,25 mol/L, avantageusement de 0,08 mol/L à 0,12 mol/L. De préférence, la concentration molaire du composé de formule (I) dans la nanoémulsion va de 1 mmol/L à 500 mmol/L, de préférence de 5 mmol/L à 250 mmol/L, avantageusement de 10 mmol/L à 50 mmol/L. La présente invention concerne en outre l’utilisation du composé de formule (I) ou de la composition selon l’invention, comme précurseur de composés pour spectroscopie par résonance paramagnétique électronique ou pour imagerie, de préférence imagerie médicale ou pré-clinique, en particulier pour spectroscopie par résonance paramagnétique électronique, pour imagerie par résonance paramagnétique électronique ou pour imagerie par résonance magnétique. Selon un mode de réalisation, le composé de formule (I) ou la composition, de préférence la nanoémulsion, selon l’invention sont utilisés comme précurseurs de sonde radicalaire pour spectroscopie par résonnance paramagnétique électronique ou pour imagerie par résonance paramagnétique électronique. Selon un autre mode de réalisation, le composé de formule (I) ou la composition, de préférence de la nanoémulsion, selon l’invention sont utilisés comme précurseurs d’agent de contraste pour imagerie par résonance magnétique. Comme mentionné ci-dessus, les composés de formule (I) ont la capacité de pénétrer à l’intérieur des cellules, d’être hydrolysés par les estérases desdites cellules afin de générer une sonde comprenant un motif hydroxylamine. Ce motif hydroxylamine peut être oxydé sous l’action d’un stress oxydant de la cellule, devenant un radical nitroxyde, directement détectable en spectroscopie ou imagerie par résonance paramagnétique électronique. Le radical nitroxyde paramagnétique peut également engendrer une modification du temps de relaxation magnétique longitudinal (T 1 ) et/ou transverse (T 2 ) des protons de l’eau à proximité, voire des protons aliphatiques des tissus, conduisant à une variation du contraste en imagerie par résonance magnétique. De préférence, l’utilisation du composé de formule (I) ou de la composition selon l’invention est in vivo ou in vitro . Selon un mode de réalisation, l’utilisation du composé de formule (I) ou la composition selon l’invention est in vitro . La présente invention concerne également une méthode de détection in vitro du stress oxydant, comprenant les étapes suivantes : - mettre en contact le composé de formule (I) ou la composition selon l’invention, avec un milieu comprenant des cellules, un fluide ou un tissu biologique, et - enregistrer le signal du milieu par spectroscopie de résonance paramagnétique électronique, ou capturer une ou plusieurs images du milieu par une technique d'imagerie, de préférence médicale ou pré-clinique, de préférence par imagerie par résonance paramagnétique électronique ou par imagerie par résonance magnétique. La présente invention concerne également une méthode de détection in vivo du stress oxydant chez un sujet, comprenant : - soit une étape de capture d’une ou plusieurs images d’un sujet ou d’au moins une partie d’un sujet préalablement traité par le composé de formule (I) selon l’invention, ou par la composition selon l’invention, par une technique d'imagerie, de préférence par une technique d’imagerie médicale ou pré-clinique, de préférence par imagerie par résonance paramagnétique électronique ou par imagerie par résonance magnétique . - soit une étape d’enregistrement du signal d’un sujet ou d’au moins une partie d’un sujet préalablement traité par le composé de formule (I) selon l’invention, ou par la composition selon l’invention, par spectroscopie de résonance paramagnétique électronique. De préférence, le sujet est traité avec une quantité détectable par ladite technique d'imagerie ou par ladite spectroscopie de résonance paramagnétique électronique. Par « quantité détectable », on entend selon l’invention une quantité de composé de formule (I) ou de la composition suffisante pour obtenir, par la technique d’imagerie considérée, une image interprétable ou pour obtenir, par ladite spectroscopie de résonance paramagnétique électronique, un spectre interprétable. De préférence, la méthode de détection in vivo du stress oxydant chez un sujet comprend les étapes suivantes : - administrer au sujet une quantité de composé de formule (I) ou de la composition selon l’invention détectable par ladite technique d'imagerie, - capturer la ou les images du sujet ou d’au moins une partie du sujet traité par ladite technique d'imagerie, de préférence par imagerie par résonance paramagnétique électronique ou par imagerie par résonance magnétique ou enregistrer le signal d’au moins une partie du sujet par spectroscopie de résonance paramagnétique électronique. Selon un mode de réalisation, la méthode de détection in vivo du stress oxydant selon l’invention comprend la capture de la ou des images du sujet ou d’au moins une partie du sujet traité par imagerie par résonance paramagnétique électronique. Selon un autre mode de réalisation, la méthode de détection in vivo du stress oxydant selon l’invention comprend la capture de la ou des images du sujet ou d’au moins une partie du sujet traité par imagerie par résonance magnétique. Selon encore un autre mode de réalisation, la méthode de détection in vivo du stress oxydant selon l’invention comprend l’enregistrement du signal d’au moins une partie du sujet par spectroscopie de résonance paramagnétique électronique. L’invention concerne également le composé de formule (I) ou la composition selon l’invention, pour leur utilisation comme outil de diagnostic, de préférence en combinaison avec une technique de spectroscopie de résonance paramagnétique électronique, une technique d’imagerie par résonance paramagnétique électronique ou une technique d’imagerie par résonance magnétique. De préférence, le composé de formule (I) ou la composition selon l’invention sont utilisés comme outil de diagnostic dans une méthode de diagnostic in vivo , comprenant de préférence une technique de spectroscopie de résonance paramagnétique électronique, une technique d’imagerie par résonance paramagnétique électronique ou une technique d’imagerie par résonance magnétique. De préférence, la méthode de diagnostic in vivo comprend : - soit une étape de capture d’images par une technique d'imagerie d’un sujet ou d’au moins une partie d’un sujet préalablement traité avec une quantité de composé de formule (I) ou de composition selon l’invention détectable par ladite technique d'imagerie, la technique d'imagerie étant de préférence choisie parmi une technique d’imagerie par résonance paramagnétique électronique et une technique d’imagerie par résonance magnétique, - soit une étape d’enregistrement par spectroscopie de résonance paramagnétique électronique du signal d’un sujet ou d’au moins une partie d’un sujet préalablement traité avec une quantité de composé de formule (I) ou de composition selon l’invention détectable par ladite spectroscopie de résonance paramagnétique électronique. La présente invention concerne également le composé de formule (I) ou la composition selon l’invention, pour leur utilisation comme précurseur de sonde radicalaire dans une méthode de diagnostic in vivo , ladite méthode comprenant de préférence une technique d’imagerie par résonance paramagnétique électronique. La présente invention concerne également le composé de formule (I) ou la composition selon l’invention, pour leur utilisation comme précurseur d’agent de contraste dans une méthode de diagnostic in vivo , ladite méthode comprenant de préférence une technique d’imagerie par résonance magnétique. La présente invention concerne également le composé de formule (I) ou la composition selon l’invention, pour leur utilisation comme précurseur d’agent de contraste dans une méthode de diagnostic in vivo , ladite méthode comprenant de préférence une technique de spectroscopie de résonance paramagnétique électronique. La présente invention concerne également le composé de formule (I) ou la composition selon l’invention, pour leur utilisation dans une méthode de détection d’une maladie d’un sujet diagnostiqué, comprenant les étapes suivantes : - capturer une ou plusieurs images par une technique d'imagerie, de préférence médicale, d’un sujet sain préalablement traité avec une quantité de composé de formule (I) ou de composition selon l’invention détectable par ladite technique d'imagerie, - capturer une ou plusieurs images par la technique d'imagerie du sujet diagnostiqué préalablement traité avec une quantité de composé de formule (I) ou de composition selon l’invention détectable par ladite technique d'imagerie, - déterminer l’écart entre le sujet sain et le sujet diagnostiqué, et - comparer cet écart avec des valeurs de référence afin de déterminer la présence ou l’absence de la maladie chez le sujet diagnostiqué. La présente invention concerne également le composé de formule (I) ou la composition selon l’invention, pour leur utilisation dans une méthode de détection d’une maladie d’un sujet diagnostiqué, comprenant les étapes suivantes : - enregistrer un signal par spectroscopie de résonance paramagnétique électronique d’un sujet sain préalablement traité avec une quantité de composé de formule (I) ou de composition selon l’invention détectable par ladite spectroscopie de résonance paramagnétique électronique, - enregistrer un signal par spectroscopie de résonance paramagnétique électronique du sujet diagnostiqué préalablement traité avec une quantité de composé de formule (I) ou de composition selon l’invention détectable par ladite spectroscopie de résonance paramagnétique électronique, - déterminer l’écart entre le sujet sain et le sujet diagnostiqué, et - comparer cet écart avec des valeurs de référence afin de déterminer la présence ou l’absence de la maladie chez le sujet diagnostiqué. La présente invention concerne également le composé de formule (I) ou la composition selon l’invention, pour son utilisation dans une méthode de suivi d’une maladie d’un sujet, comprenant les étapes suivantes : - à un instant t0, capturer une ou plusieurs images par une technique d'imagerie du sujet préalablement traité avec une quantité de composé de formule (I) ou de composition selon l’invention détectable par ladite technique d'imagerie, - à un instant t1 postérieur à l’instant t0, capturer une ou plusieurs images par ladite technique d'imagerie du sujet préalablement traité avec une quantité de composé de formule (I) ou de composition selon l’invention détectable par ladite technique d'imagerie, - déterminer l’écart entre la ou les images capturées à l’instant t0 et la ou les images capturées à l’instant t1, - déterminer une évolution de la maladie. La présente invention concerne également le composé de formule (I) ou la composition selon l’invention, pour son utilisation dans une méthode de suivi d’une maladie d’un sujet, comprenant les étapes suivantes : - à un instant t0, enregistrer au moins un signal par spectroscopie de résonance paramagnétique électronique du sujet préalablement traité avec une quantité de composé de formule (I) ou de composition selon l’invention détectable par ladite spectroscopie de résonance paramagnétique électronique, - à un instant t1 postérieur à l’instant t0, enregistrer au moins un signal par spectroscopie de résonance paramagnétique électronique du sujet préalablement traité avec une quantité de composé de formule (I) ou de composition selon l’invention détectable par ladite spectroscopie de résonance paramagnétique électronique, - déterminer l’écart entre le signal enregistré à l’instant t0 et le signal enregistré à l’instant t1, - déterminer une évolution de la maladie. La présente invention concerne également le composé de formule (I) ou la composition selon l’invention, pour son utilisation dans une méthode de détermination de l’efficacité d’un traitement d’une maladie d’un sujet malade, comprenant les étapes suivantes : - à un instant t0, capturer une ou plusieurs images par une technique d'imagerie du sujet malade préalablement traité avec une quantité de composé de formule (I) ou de composition selon l’invention détectable par ladite technique d'imagerie, et éventuellement également traité avec une quantité efficace dudit traitement d’une maladie, - à un instant t1 postérieur à l’instant t0, capturer une ou plusieurs images par ladite technique d'imagerie du sujet malade préalablement traité avec une quantité de composé de formule (I) ou de composition selon l’invention détectable par ladite technique d'imagerie, et éventuellement également traité avec une quantité efficace dudit traitement d’une maladie, - déterminer l’écart entre la ou les images capturées à l’instant t0 et la ou les images capturées à l’instant t1, - déterminer l’efficacité du traitement. Ces étapes peuvent être répétées plusieurs fois pour un suivi dans le temps du traitement. La présente invention concerne également le composé de formule (I) ou la composition selon l’invention, pour son utilisation dans une méthode de détermination de l’efficacité d’un traitement d’une maladie d’un sujet malade, comprenant les étapes suivantes : - à un instant t0, enregistrer au moins un signal par spectroscopie de résonance paramagnétique électronique du sujet malade préalablement traité avec une quantité de composé de formule (I) ou de composition selon l’invention détectable par ladite spectroscopie de résonance paramagnétique électronique, - à un instant t1 postérieur à l’instant t0, enregistrer au moins un signal par spectroscopie de résonance paramagnétique électronique du sujet malade préalablement traité avec une quantité de composé de formule (I) ou de composition selon l’invention détectable par ladite spectroscopie de résonance paramagnétique électronique, - déterminer l’écart entre la ou les signaux capturés à l’instant t0 et le ou les signaux capturés à l’instant t1, - déterminer l’efficacité du traitement. FIGURES La est un spectre RPE obtenu pour l’incubation du composé 106 (100 µM) avec 5 millions de cellules U87 dans du milieu DMEM sans sérum montrant une composante majoritaire (étoiles), caractéristique d’un nitroxyde en régime isotrope, et une minoritaire (flèches), caractéristique d’un nitroxyde en régime intermédiaire. La est un spectre RPE de 5 millions de cellules U87 en suspension incubées avec le composé 106 (100 µM) avec (pointillés) et sans Tempone- 15 N (trait plein). La est un spectre RPE représentatif obtenu en bande X à partir du sang et de l’homogénat de cerveau d’une souris injectée avec le composé 106 (0,5 µmol/g de masse corporelle) formulé dans une nanoémulsion huile-dans-eau (émulsion 106 NE-OO 100 mM) avant (traits pleins) et après l’addition de ferricyanure de potassium (pointillés). La présente invention va maintenant être décrite à l’aide des exemples suivants, non limitants. EXEMPLES Exemple 1 : Synthèse de composés de formule (I) Matériels et méthodes Tous les réactifs ont été achetés auprès de fournisseurs commerciaux et utilisés sans purification. La chromatographie sur couche mince (CCM) a été réalisée à l'aide de plaques CCM en gel de silice 60 F254 et la chromatographie préparative sur colonne a été réalisée à l'aide de gel de silice (230-400 mesh). Le THF sec exempt d'oxygène a été préparé par un système de purification de micro-solvant Pure SolvTM (SigmaAldrich). Les spectres de RMN 1 H et 13 C ont été enregistrés sur des spectromètres Bruker Biospin Advance II de 500 MHz ou Bruker ARX 250 de 250 MHz et référencés par rapport au pic du solvant correspondant (CDCl 3 ; δ H =7,26 ppm, δ C =77,0 ppm). Les spectres infrarouges à transformée de Fourier (IR) ont été enregistrés sur un spectromètre FT-IR Perkin Elmer équipé d'un objectif ATR. Les spectres de masse à haute résolution ont été enregistrés sur un spectromètre Thermo Exactive_HCD (Thermo Scientific, Les Ulis, France). Les spectres de résonance paramagnétique électronique (RPE) ont été obtenus à 21°C sur un spectromètre Elexsys E500 (Bruker, Wissembourg, France) opérant en bande X (9.8 GHz) et équipé d’une cavité haute sensibilité SHQ. La constante de couplage à l’azote A N et la largeur de raie à mi-hauteur ΔB sont donnés en gauss (G) pour une solution de radical nitroxyde à 100 µM dans un tampon phosphate de potassium à 0,1 M et pH 7,4 contenant 1 mM d’acide diéthylènetriaminepentaacétique (DTPA). Synthèse du composé 106 Radical 5-acétoxyméthoxycarbonyl-1,1,3,3-tétraéthylisoindolin-2-yloxyle 91 Le composé 83 a été obtenu à partir de l'anhydride 4-méthylphtalique en suivant la procédure publiée par Fairfull-Smith et al (K.E. Fairfull-Smith, F. Brackmann, S.E. Bottle, The Synthesis of Novel Isoindoline Nitroxides Bearing Water-Solubilising Functionality, Eur. J. Org. Chem. (2009) 1902–1915). A une solution du composé 83 (250 mg, 0,861 mmol, 1,00 éq.) dans du DMSO sec (1,60 mL) a été ajouté du carbonate de potassium anhydre (236 mg, 1,71 mmol, 2,00 éq.). Ce mélange a été agité à 22 °C pendant 5 min, après quoi l'acétate de bromométhyle (149 mg, 95,6 µL, 0,975 mmol, 1,13 éq.) a été ajouté. La réaction a été agitée à 22 °C pendant 2 h. Un mélange de glace et d'eau a ensuite été ajouté et la solution a été extraite avec du dichlorométhane. La solution organique a été séchée sur sulfate de sodium anhydre, et évaporée à sec. Le produit brut a été purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice (cyclohexane/acétate d’éthyle, 8:1) donnant le nitroxyde 91 sous forme d'une huile jaune épaisse (309 mg, 87%). Rf = 0,47 (cyclohexane/acétate d’éthyle, 4:1), IR ν max (ATR, ZnSe, pur, cm -1 ) : 2973, 2940, 2881, 1767, 1738, 1617, 1457, 1418, 1370, 1284, 1259, 1231, 1203, 1159, 1101, 1032, 983, 909, 885, 846, 769, 743 ; HRMS-ESI : m/z (C 20 H 28 NO 5 ) calculé pour [M+H] + 363,2040, trouvé 363,2027, calculé pour [M+2H] + 364,2118, trouvé 364,2110 ; RPE (solution 100 µM dans un tampon phosphate de potassium (0,1 M, pH 7,4, DTPA 1 mM)) : A N = 15,4 G, ΔB = 1,7 G. 2) 2-(((1-chloroéthoxy)carbonyl)oxy)-1,1,3,3-tétraéthylisoindoline-5-carboxylate d’acétoxyméthyle 105 Dans un ballon fermé par un septum, on a placé le composé 91 (259 mg, 0,715 mmol, 1 éq.) et du palladium (30 mg, 10% sur charbon) et l'atmosphère a été échangée avec de l'argon. Du THF sec exempt d'oxygène (7,0 mL) a été ajouté et on a fait barboter du dihydrogène dans le mélange sous agitation pendant 30 minutes puis de l'argon pendant 5 minutes pour éliminer le dihydrogène. Après refroidissement à 0 °C, de la triéthylamine (149,6 µL, 108,5 mg, 1,07 mmol, 1,5 éq.) a été ajoutée, suivie du chloroformate de 1-chloroéthyle (106 µL, 120 mg, 0,979 mmol, 1,37 éq.) et le mélange résultant a été agité pendant 1 h à 22 °C. Le mélange réactionnel a été filtré sur coton dans une pipette Pasteur et concentré sous vide. Le produit brut a été purifié par chromatographie sur gel de silice (dichlorométhane/cyclohexane, 2:1) pour donner le composé 105 sous forme d'huile incolore (227 mg, 68 %). Rf = 0,56 (dichlorométhane) ; 1 H NMR (CDCl 3 , 500 MHz) : δ = 0,77-0,82 (m, 6 H, (H11)), 0,94-1,01 (m, 6 H, (H11)), 1,73-1,84 (m, 4 H, (H10)), 1,87 (d, J = 5,8 Hz, 3 H, (H26)), 1,91-2,02 (m, 2 H, (H10)), 2,02-2,13 (m, 2 H, (H10)), 2,14 (s, 3 H, (H20)), 6,00 (s, 2 H, (H16)), 6,49 (q, J = 5,8 Hz, 1 H, (H24)), 7,15 (br. d, J = 8,0 Hz, 1 H, (H3)), 7,77 (br. s, 1 H, (H6)), 8,00 (dd, J = 8,0, 1,6 Hz, 1 H, (H2)) ppm ; 13 C NMR (CDCl 3 , 125 MHz) : δ = 169,8 (C18), 165,3 (C13), 154,1 (C21), 147,6 (C5), 142,1 (C4), 129,1 (C2), 128,1 (C1), 125,4 (C6), 123,9 (C3), 85,0 (C24), 79,8 (C16), 74,7 (C7), 74,5 (C9), 30,2 (C10), 29,13 (C10), 29,06 (C10), 29,00 (C10), 25,3 (C26), 20,9 (C20), 9,4 (C11), 8,7 (C11), 8,6 (C11) ppm ; HRMS-ESI : m/z (C 23 H 32 NO 7 Cl) calculé pour [M+H] + 470,1940, trouvé 470,1930, calculé pour [M+Na] + 492,1760, trouvé 492,1748, calculé pour [M+K]+ 508,1499, trouvé 508,1486. 3) 2-(((1-acétoxyéthoxy)carbonyl)oxy)-1,1,3,3-tétraéthylisoindoline-5- carboxylate d’acétoxyméthyle 106 De l’acétate de mercure (II) (158 mg, 0,496 mmol, 1,22 éq.) a été additionné à une solution du composé 105 (192 mg, 0,408 mmol, 1,00 éq.) dans l’acide éthanoïque (0,73 mL), et le mélange a été agité à 22 °C pendant une nuit au cours de laquelle un fin précipité blanc de chlorure de mercure(II) est apparu. La majeure partie de l'acide éthanoïque a été éliminée sous pression réduite et le résidu a été mis en suspension dans l’éther diéthylique et filtré. La solution d'éther a été lavée avec de l'eau, une solution aqueuse d’hydrogénocarbonate de sodium saturée puis à nouveau de l'eau, séchée sur du sulfate de sodium anhydre, et le solvant a été éliminé sous vide. Le produit brut a été purifié par chromatographie sur gel de silice (dichlorométhane) pour donner le produit 106 une huile incolore épaisse (164 mg, 82%). Rf = 0,47 (dichlorométhane) ; 1 H NMR (CDCl 3 , 500 MHz) : δ = 0,75-0,81 (m, 6 H, (H14)), 0,92-1,00 (m, 6 H, (H14)), 1,56 (d, J = 5,5 Hz, 3 H, (H32)), 1,72-1,85 (m, 4 H, (H13)), 1,90-2,02 (m, 2 H, (H13)), 2,03-2,12 (m, 2 H, (H13)), 2,10 (s, 3 H, (H35)), 2,14 (s, 3 H, (H26)), 6,00 (s, 2 H, (H22)), 6,77 (q, J = 5.5 Hz, 1 H, (H30)), 7,15 (d, J = 8,0 Hz, 1 H, (H3)), 7,76 (s, 1 H, (H6)), 7,99 (dd, J = 8,0, 1,6 Hz, 1 H, (H2)) ppm ; 13 C NMR (CDCl 3 , 125 MHz) : δ = 169,8 (C24), 169,0 (C33), 165,4 (C19), 154,1 (C27), 147,8 (C5), 142,2 (C4), 129,0 (C2), 128,0 (C1), 125,4 (C6), 123,9 (C3), 92,2 (C30), 79,8 (C22), 74,6 (C7), 74,4 (C9), 30,1 (C13), 30,2 (C13), 29,0 (C13), 29,1 (C13), 20,9 (C26, C35), 19,6 (C32), 9,4 (C14), 8,6 (C14) ppm ; IR ν max (ATR, ZnSe, pur, cm -1 ) : 2968, 2942, 1790, 1765, 1740, 1450, 1373, 1283, 1245, 1204, 1159, 1103, 1079, 1032, 1010, 983, 944, 864, 768 ; HRMS-ESI : m/z (C 25 H 35 NO 9 ) calculé pour [M+H] + 494,2385, trouvé 494,2370, calculé pour [M+Na] + 516,2204, trouvé 516,2189, calculé pour [M+K] + 532,1943, trouvé 532,1926. Synthèse du composé 108 1) 1-(((1-chloroéthoxy)carbonyl)oxy)-2,2,5,5-tétraméthylpyrrolidine-3-carboxylate d’acétoxyméthyle 110 Le radical 3-acétoxyméthoxycarbonyl-2,2,5,5-tétraméthylpyrrolidin-1-yloxyle 109 (500 mg, 1,94 mmol), synthétisé selon les procédures publiées (Hatano, H. Araya, Y. Yoshimura, H. Sato, T. Ito, T. Ogata, T. Kijima, Facile Synthesis of 3-Methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetra-methylpyrrolidine-1-oxyl and Derivatives, Heterocycles , 81 (2010) 349–356, et J.P.Y. Kao, G.M. Rosen, Esterase-assisted accumulation of 3-carboxy-2,2,5,5-tetramethyl1-pyrrolidinyloxyl into lymphocytes, Org. Biomol. Chem. 2 (2004) 99–102), a été dissous dans du THF sec (10 mL), traité avec du palladium sur charbon (10%, 50 mg, 47 µmol, 2,5 mol-%), et agité sous atmosphère de dihydrogène (ballon) pendant 1,5 h à 25°C. Le mélange réactionnel a été refroidi à 0°C, puis la triéthylamine (540 µL, 3,9 mmol, 2 éq.) et le chloroformiate de 1-chloroéthyle (520 µL, 4,8 mmol, 2,5 éq.) ont été ajoutés goutte à goutte en prolongeant l’agitation à 0°C pendant 30 min. Le bain de refroidissement a été retiré et le mélange a été agité pendant une nuit à 25°C. Le catalyseur a été éliminé par filtration à travers de la célite et le solvant a été évaporé sous vide. L'huile résiduelle a été diluée avec de l'eau (25 mL) et extraite avec de l'acétate d'éthyle (3 x 25 mL). Les extraits organiques combinés ont été séchés sur du sulfate de sodium anhydre, filtrés et évaporés sous pression réduite. Le produit a été isolé sous forme d'huile incolore (640 mg, 91%) après chromatographie sur colonne de gel de silice (cyclohexane/acétate d’éthyle = 4:1). Rf = 0,40 (cyclohexane/acétate d’éthyle = 4:1 ; coloration à l'acide phosphomolybdique), 1 H NMR (CDCl 3 , 500 MHz, diastéréo-isomère principal ≈ 90%) : δ = 1,00-1,15 (s large, 3 H, CH 3 ), 1,15-1,25 (m large, 6 H, 2 × CH 3 ), 1,30-1,35 (s, 3 H, CH 3 ), 1,76-1,88 (m, 4 H, C H H + C H 3 CHCl), 2,08 (s, 3 H, C H 3 CO), 2,13-2,35 (m large, 1 H, CH H ), 2,80-3,05 (m large, 1 H, CH), 5,70 (d, J = 5,2 Hz, 1 H, OCH H O), 5,78 (d, J = 5,2 Hz, 1 H, OC H HO), 6,43 (q, J = 5,7 Hz, 1 H, CH 3 C H Cl) ppm, 13 C NMR (CDCl 3 , 125 MHz, l'inversion relativement lente de l'azote divise et élargit certains des signaux) : δ = 17,2 (large, CH 3 ), 20,8 ( C H 3 CO), 22,1 (large, CH 3 ), 25,3 (CH C H 3 ), 25,7 (large, CH 3 ), 28,0 (large, CH 3 ), 31,6 (large, CH 3 ), 37,1 (large, CH 2 ), 38,2 (large, CH 2 ), 47,9 (large, CH), 50,7 (large, CH), 59,7 (large, C quat ), 62,8 (large, C quat ), 64,7 (large, C quat ), 67,3 (large, C quat ), 79,6 (OCH 2 O), 85,0 ( C HCH 3 ), 85,1 ( C HCH 3 ), 154,1 (O(C=O)O), 154,2 (O(C=O)O), 169,6 (C=O), 170,9 (C=O) ppm. HRMS-ESI : m/z (C 15 H 24 ClNO 7 ) calculé pour [M+H] + 366,1314, trouvé 366,1306, calculé pour [M+Na] + 388,1134, trouvé 388,1124, calculé pour [M+K] + 404,0873, trouvé 404,0863. 2) 1-(((1-acétoxyéthoxy)carbonyl)oxy)-2,2,5,5-tétraméthylpyrrolidine-3-carboxylate d’acétoxyméthyle 108 Le composé 110 (0,3 g, 0,8 mmol) a été dissous dans l'acide acétique (1,2 mL) et l'acétate de mercure(II) (0,25 mg, 0,8 mmol) a été ajouté. Le mélange résultant a été agité pendant une nuit à 25°C. Un fin précipité blanc de chlorure de mercure(II) s'est formé. Le mélange réactionnel a été concentré sous vide et le résidu a été mis en suspension dans l’éther diéthylique et filtré. La solution d'éther a été lavée avec de l'eau, une solution aqueuse d’hydrogénocarbonate de sodium saturée, et à nouveau de l'eau, puis séchée sur du sulfate de sodium anhydre, et le solvant a été éliminé sous pression réduite. L'huile résultante a été purifiée par chromatographie sur colonne de gel de silice (cyclohexane/acétate d’éthyle = 4:1) et le produit souhaité a été isolé sous forme d'huile incolore (302 mg, 94%). Rf = 0,21 (cyclohexane/acétate d’éthyle = 4:1 ; coloration à l'acide phosphomolybdique), 1 H NMR (CD 3 OD, 500 MHz, diastéréo-isomère principal ≈ 90%) : δ = 1,00-1,36 (m, 12 H, 4 × CH 3 ), 1,51 (m, 3 H, CHC H 3 ), 1,86 (m large, 1 H, C H H), 2,07 (s, 6 H, 2 × CH 3 CO), 2,10-2,35 (m large, 1 H, CH H ), 2,80-3,15 (m large, 1 H, CH), 5,70 (m, 1 H, OC H HO), 5,82 (m, 1 H, OCH H O), 6,71 (m, 1 H, C H CH 3 ) ppm, 13 C NMR (CD 3 OD, 125 MHz, l'inversion lente de l'azote divise et élargit certains des signaux) : δ = 17,5 (large, CH 3 ), 19,7 (CH C H 3 ), 20,6 ( C H 3 CO), 20,7 (CH 3 CO), 22,2 (large, CH 3 ), 26,2 (large, CH 3 ), 26,4 (large, CH 3 ), 26,8 (large,CH 3 ), 28,2 (large, CH 3 ), 28,9 (large, CH 3 ), 31,7 (large, CH 3 ), 37,7 (large, CH 2 ), 39,1 (large, CH 2 ), 48,3 (large, CH), 51,6 (large, CH), 63,7 (large, C quat ), 65,5 (large, C quat ), 67,3 (large, C quat ), 68,5 (large, C quat ), 80,8 (OCH 2 O), 93,3 ( C HCH 3 ), 156,2 (O(C=O)O), 170,7 (C=O), 171,2 (C=O), 172,1 (C=O) ppm. HRMS-ESI : m/z (C 17 H 27 NO 9 ) calculé pour [M+H] + 390,1759, trouvé 390,1751, calculé pour [M+Na] + 412,1578, trouvé 412,1570, calculé pour [M+K] + 428,1317, trouvé 428,1308. Synthèse du composé 112 1) Radical 5-(((5-méthyl-2-oxo-1,3-dioxol-4-yl)méthoxy)carbonyl)-1,1,3,3-tétraéthylisoindolin-2-yloxyle 112 Le radical 5-carboxy-1,1,3,3-tétraéthylisoindol-2-yloxyle 83 (103 mg, 0,35 mmol) a été dissous dans du dichlorométhane sec sous atmosphère d'argon. Le chlorure d'oxalyle (152 μL, 1,75 mmol, 5 éq.) a été ajouté goutte à goutte, suivi d'une solution à 0,15 M de diméthylformamide anhydre dans du dichlorométhane sec (118 μL, 0,02 mmol, 0,05 éq.). Le mélange réactionnel a été laissé à réagir pendant deux heures sous argon à 20 °C, puis le mélange a été évaporé sous vide. Dans un deuxième ballon sous argon, la 4-hydroxyméthyl-5-méthyl-1,3-dioxol-2-one 111 (33 µL, 0,35 mmol, 1 éq.) a été dissoute dans du dichlorométhane sec (1,3 mL). La triéthylamine (59 µL, 0,42 mmol, 1,2 éq.) et la 4-diméthylaminopyridine (2,2 mg, 0,02 mmol, 0,05 éq.) ont été ajoutées sous vive agitation. Ce mélange a été transféré dans le ballon contenant le chlorure d'acyle précédemment synthétisé dissous dans du dichlorométhane sec (1 mL), et le mélange réactionnel a été agité pendant 24 h sous argon à 20 °C. Il a été lavé avec une solution aqueuse d’hydrogénocarbonate de sodium saturée. La phase organique a été lavée avec de la saumure et séchée sur du sulfate de sodium anhydre, filtrée et concentrée pour donner un produit brut. Ce dernier a été purifié sur une colonne flash avec du gel de silice comme phase stationnaire et un mélange de cyclohexane et d'acétate d'éthyle (4:1) comme système d'élution. Le composé 112 a été obtenu sous forme d'huile jaune avec un rendement de 66 % sur les deux étapes (91 mg). Rf = 0,22 (cyclohexane:acétate d'éthyle = 4:1) ; HRMS-ESI m/z (C 22 H 28 NO 6 ) calculé pour [M + ] 402,1911 Da, trouvé 402,1916 Da, calculé pour [(M+H) + ] 403,1995 Da, trouvé 403,1957 Da, calculé pour [(M+2H) + ] 404,2073 Da, trouvé 404,2050 Da ; IR ν max (ATR, ZnSe, pur, cm -1 ) : 1740 (C=O ester), 1830 (C=O carbonate). Exemple 2 : Stabilité et r éactivité des composés de formule (I) vis-à-vis des estérases et comparaison avec un précurseur de sonde radicalaire de l’art antérieur Pour confirmer que la déprotection des composés de formule (I) est estérase-dépendante, des essais en présence d’estérase modifiée et de lipase ont été réalisés. Le clivage de la protection a été testé en incubant les composés de formule (I) avec l’estérase ou la lipase, suivi par l'oxydation de l'hydroxylamine libérée par le ferricyanure de potassium et la mesure du signal RPE du nitroxyde produit. Le ferricyanure de potassium est un oxydant doux qui réagit rapidement avec les hydroxylamines en acceptant un électron. La sonde commerciale ACP tétraméthylée et protégée par un acétyle a été utilisée comme contrôle. Préparation de la solution de composé 106 : Deux volumes de solution mère de composé 106 dans le DMSO (50 ou 500 mM) ont été soigneusement mélangés avec un volume de solution de Pluronic F-127 (Sigma-Aldrich) à 20 % m/v dans le DMSO. Le mélange résultant a été dilué dans le milieu aqueux souhaité et mélangé vigoureusement au vortex. Incubation avec les enzymes : 100 µM de solution du composé 106 ont été incubés pendant 10 minutes à 37 °C avec de la carboxylestérase de foie de porc (1 U ml -1 ; Sigma E3019 ; une unité hydrolyse 1,0 micromole de butyrate d'éthyle en acide butyrique et en éthanol par minute à pH 8,0 à 25 °C), ou avec de la lipase (0,51 mg mL -1 ; Sigma L3126 ;1 mg d’enzyme hydrolyse 25,6 nmol d’acétate de 4-nitrophénol par minute à pH 7,4 à 25°C dans un tampon phosphate de potassium (0,1 M, pH 7,4, DTPA 1 mM) puis l’hydroxylamine libérée a été mélangée avec 1 µL de ferricyanure de potassium à 100 mM (1 mM final). Le mélange a été transféré dans un capillaire en verre de 50 µL (Hirschmann) et le signal RPE du nitroxyde a été enregistré avec un spectromètre RPE Bruker Elexsys E500 en bande X (9,86 GHz) à 21 °C, équipé d'une cavité haute sensibilité SHQ. Les paramètres typiques utilisés étaient les suivants : puissance micro-ondes, 10 mW ; fréquence de modulation, 100 kHz ; amplitude de modulation, 0,14 mT ; gain du récepteur, 60 dB ; constante de temps, 40,96 ms ; temps de conversion, 40,96 ms ; 1024 points ; largeur de balayage, 5 mT ; temps de balayage, 41,94 s. Il a été observé que la lipase présentait une faible activité (comme prévu avec les esters à chaîne courte), alors que la carboxylestérase de foie de porc (EC 3.1.1.1) était plus efficace. L'incubation du composé 106 avec 1 U mL -1 d'estérase de foie de porc pendant 10 minutes à 37 °C, suivie d'une réaction avec du ferricyanure (1 mM), a permis la récupération complète du nitroxyde par rapport à une solution de composé 83 (nitroxyde isoindoline authentique) préparée indépendamment à 100 µM. Lorsque le composé ACP (précurseur comparatif de sonde connu de l’art antérieur, acétylé et substitué par quatre groupes méthyle) a été soumis aux mêmes conditions, seulement 27 % du nitroxyde correspondant a été récupéré. Stabilité du composé 106 : pour tester la stabilité du composé 106 en solution aqueuse, une solution de 100 µM de composé 106 a été incubé dans un tampon de phosphate de potassium (0,1 M, pH 7,4, DTPA 1 mM) pendant 24 heures à 21 °C. Après addition de ferricyanure de potassium, aucun signal de nitroxyde n'a été détecté, ce qui confirme que la protection de l’hydroxylamine tétraéthylée par un carbonate d'(acyloxy)alkyle est stable contre l'hydrolyse spontanée à pH neutre dans ces conditions. Exemple 3 : Comportement des composés de formule (I) sur des cellules Après la synthèse et la caractérisation initiale des composés de formule (I), plusieurs tests in vitro ont été réalisés en vue de répondre aux questions suivantes : 3.1. Les composés de formule (I) sont-ils toxiques ? 3.2. Les composés de formule (I) s'accumulent-t-ils à l'intérieur de la cellule ? 3.3. La déprotection des composés de formule (I) est-elle une étape limitante vers l'oxydation de l'hydroxylamine ? 3.4. Les composés de formule (I) rendent-ils compte du stress oxydant ? 3.5. Est-il possible de détecter le stress oxydant dans des conditions plus physiologiques ? Le modèle in vitro sur lequel ces tests ont été majoritairement réalisés est la lignée cellulaire U-87 MG. Protocole de c ulture cellulaire de lignées de cellules cancéreuses Les cellules cérébrales humaines (glioblastome astrocytome) U87-MG ont été cultivées dans du milieu minimal essentiel de Dulbecco (DMEM), 10 % de sérum de veau fœtal (SVF), 200 U/mL de pénicilline et 50 mg/mL de streptomycine (Invitrogen, Cergy-Pontoise, France) dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO 2 . Les cellules de la lignée cellulaire de cancer du sein humain MCF-7 (ATCC® HTB-22™) ont été cultivées à 37°C dans du DMEM supplémenté par des acides aminés non essentiels et complété par 10 µg/mL d'insuline recombinante humaine, 10 % de SVF, 200 U/mL de pénicilline, 50 µg/mL de streptomycine (Invitrogen, Cergy-Pontoise, France) et 0,5 µg/mL de fungizon dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO 2 . 3. 1. Les composés de formule (I) sont-ils toxique s ? Protocoles : Traitement des cellules pour la mesure de la toxicité des composés de formule (I) Les cellules U87 ont été ensemencées dans une plaque 96 puits (10 000 par puits un jour avant l'expérience). Le milieu de culture a été retiré, les cellules ont été lavées avec du PBS (solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco à pH 7,1-7,5) puis incubées avec une série de concentrations du composé 106 solubilisé en utilisant le Pluronic F-127 dans le DMSO selon la méthode décrite précédemment (de 1 à 500 µM dans du DMEM sans SVF, 100 µL par puits) pendant 6 heures. Test de toxicité cellulaire Pour l’analyse par imagerie de fluorescence, le milieu d'incubation a été retiré et les cellules lavées une fois avec du PBS puis incubées 30 minutes avec du milieu sans SVF contenant du colorant Hoechst (0,1 µg/mL) et de l’iodure de propidium (0,1 mg/mL). La fluorescence a été lue et analysée à l’aide d’un appareil ImageXpress ® Pico (Molecular Devices). Résultats : Le tableau suivant présente les résultats du comptage des cellules mortes après 6h d’incubation mesuré en imagerie de fluorescence avec marquage à l’iodure de propidium par rapport au nombre de cellules total dans les puits (marquage Hoechst). Comptage en imagerie de fluorescence (marquage iodure de propidium) Echantillon Cellules mortes (%) Milieu de culture 16,7 ± 5,9 Véhicule solubilisant 15,3 ± 2,3 5 µM 13,2 ± 0,8 50 µM 12,7 ± 3,7 100 µM 13,6 ± 1,6 250 µM 13,7 ± 4,9 500 µM 12,8 ± 1,4 Le nombre de cellules mortes ne varie pas de manière significative, quelle que soit la concentration du composé 106 de formule (I). Ces résultats montrent que le composé 106 n'est pas toxique pour les cellules U87, même à la plus forte concentration testée de 500 µM pendant 6 heures. Ceci est conforme aux conditions d'incubation couramment utilisées pour une sonde hydroxylamine sur cellules en culture (50 - 500 µM pendant 15 - 60 min). 3. 2. Les composés de formule (I) s'accumule nt -t- ils à l'intérieur de la cellule ? La perméation membranaire et l'accumulation cellulaire du composé 106 a été testée sur des cellules U87 en suspension. Des cellules trypsinées ont été incubées avec le composé pendant 30 minutes à 37°C dans le DMEM sans sérum sous une atmosphère de CO 2 à 5% (dans un incubateur à enveloppe d'eau). Après centrifugation, le culot cellulaire a été soigneusement lavé trois fois avec du milieu, et remis en suspension dans 50 µL de milieu frais sans sérum avant l'enregistrement RPE. Protocole de mesure par RPE sur des cellules en suspension Après trypsinisation, une suspension de cellules U87 a été préparée dans un milieu sans sérum (10 millions de cellules par mL). Dans une expérience habituelle, le composé 106 (émulsionné dans un mélange de Pluronic F-127 et de DMSO comme dans l’exemple 2) a été dilué dans 500 µL de la suspension cellulaire (5 millions de cellules). La concentration finale en composé 106 était généralement de 100 µM. Après incubation (30 min, 37 °C, 5% CO 2 , avec mélange occasionnel pour remettre les cellules en suspension), les cellules ont été séparées par centrifugation (2000 rpm pendant 3 min sur microcentrifugeuse miniSpin, Eppendorf), le milieu d'incubation a été éliminé et les cellules ont été lavées 3 fois par remise en suspension dans 500 µL de milieu sans sérum suivie d'une centrifugation. Enfin, le culot cellulaire a été remis en suspension dans 50 µL de milieu sans sérum contenant éventuellement de la 15 N-TEMPONE (radical 4-oxo-2,2,6,6-tétraméthylpipéridine-1-oxyle marqué à l’azote-15, 100 µM), placé dans un tube en PTFE perméable aux gaz (Extruded Sub-LiteWall®, diamètre intérieur : 0,635 mm, épaisseur de paroi : 0,051 mm, Zeus Industrial Products Ltd, Irlande), plié en forme de W, inséré dans un tube de quartz de 4 mm et le spectre RPE enregistré comme précédemment (voir exemple 2). Résultats : Les cellules incubées avec le composé 106 ont montré de forts signaux RPE de nitroxyde après lavage. Le groupe carboxylique masqué par un groupe acétoxyméthyle sensible aux estérases du composé 106 lui permet de traverser la membrane et, une fois à l'intérieur de la cellule, d’être déprotégé par les estérases de la cellule. La déprotection donne un produit chargé qui ne peut plus traverser facilement la membrane et, par conséquent, s'accumule à l'intérieur de la cellule. La déprotection de l'hydroxylamine a également lieu, avec oxydation de l'hydroxylamine libérée en nitroxyde. Le spectre RPE expérimental résulte de la superposition de deux composantes, l’une principale (repérée par des étoiles dans la ), caractéristique d’un nitroxyde en régime isotrope et compatible avec une localisation dans le cytosol, et l’autre minoritaire (repérée par des flèches), caractéristique d’un nitroxyde en régime intermédiaire et compatible avec une localisation dans la membrane cellulaire. 3.3. La déprotection des composés de formule (I) est-elle une étape limitante vers l'oxydation de l'hydroxylamine ? La vitesse de déprotection d'un précurseur de sonde hydroxylamine protégée contre le stress oxydant doit être plus rapide que la vitesse d'oxydation. La présence d'hydroxylamine non oxydée dans les cellules peut être testée en utilisant la 15 N-TEMPONE. Cette méthode repose sur la capacité de la TEMPONE à traverser librement la membrane cellulaire et sur le transfert rapide d'hydrogène entre les nitroxydes et les hydroxylamines. La 15 N-TEMPONE marquée isotopiquement est utilisée car son spectre ne présente que deux raies qui ne se superposent pas complètement au signal du 14 N-nitroxyde dérivé du composé 106 (qui présente trois raies), ce qui permet une mesure simultanée des deux espèces. Pour cela, 5 millions de cellules U87 en suspension ont été incubées avec le composé 106 (100 µM dans du DMEM sans sérum, 30 min à 37 °C, 5 % CO 2 ). Après le lavage final, une partie a été suspendue dans du DMEM sans sérum, tandis que l'autre partie a été suspendue dans du DMEM sans sérum contenant 100 µM de 15 N-TEMPONE. Les spectres RPE ont été acquis selon le protocole décrit dans la partie 3.2 ci-dessus. Résultats : L'échantillon des cellules traitées avec la 15 N-TEMPONE a montré un signal significativement plus élevé du 14 N-nitroxyde dérivé du composé 106 (4 fois plus) par rapport à l'échantillon non traité ( ). Cette expérience a montré qu'une quantité importante d'hydroxylamine libre est présente dans les cellules, ce qui indique que la déprotection n'est pas une réaction limitante dans la transformation du composé 106 en nitroxyde dans la cellule. 3.4. Les composés de formule (I) rendent-ils compte du stress oxydant ? Pour tester les composés de formule (I) dans des conditions de stress oxydant, un modèle cellulaire d’induction de stress oxydant par la juglone a été choisi. La juglone (5-hydroxy-1,4-naphtalènedione) est un produit naturel de type quinone qui peut produire du superoxyde par un cycle redox futile dans la cellule. Principe : Des cellules U87 confluentes ont été incubées sur des lamelles couvre-objet avec le composé 106 (250 µM dans DMEM sans sérum, 30 min à 37 °C, 5 % CO 2 ) avec ou sans juglone (2,5 et 5 µM) avant l'enregistrement RPE. Dans certains cas, les cellules ont été préincubées avec les antioxydants potentiels dans du DMEM contenant 10 % de SVF : SOD-PEG (superoxyde dismutase-polyéthylène glycol, 100 U mL -1 pendant 2 h), Cat-PEG (catalase-polyéthylène glycol, 100 U mL -1 pendant 2 h), chélateurs (diéthyldithiocarbamate de sodium, DETC, 5 µM et déféroxamine, DFO, 25 µM pendant 1h), NAC (N-acétylcystéine, 5 mM pendant 1 h). Le signal du spectre RPE correspond au nitroxyde engendré par l’incubation de cellules avec la juglone. L'intensité du signal a été normalisée en fonction de la teneur moyenne en protéines des échantillons de chaque jour. Toutes les expériences ont été réalisées avec du milieu DMEM contenant du rouge de phénol, ce qui n’interfère pas avec les mesures. Protocole pour la mesure par RPE en utilisant des précurseurs de sondes hydroxylamine sur des cellules cultivées sur des lamelles de verre Les cellules U87-MG ont été cultivées sur des lamelles de microscope rondes (diamètre 12 mm, épaisseur 0,13-0,16 mm, Thermo Scientific Menzel, Braunschweig, Allemagne) insérées dans chaque puits d'une plaque à 24 puits. En général, une confluence élevée (les cellules recouvrant presque complètement la surface du verre sur lequel elles se développent) était nécessaire pour obtenir une intensité suffisante du signal RPE. Les cellules ont été ensemencées au moins 24 heures avant les expériences de RPE afin d'éviter les interférences dues au stress du passage des cellules. En général, 56 × 10 3 cellulesU87 par puits ont été ensemencées trois jours avant les expériences de RPE. (Quant aux cellules MCF-7, elles ont été ensemencées à une concentration de 4 × 10 5 cellules par puits deux jours avant l’expérience.) Pour chaque mesure de RPE, deux lamelles ont été transférées dans des puits propres d'une plaque de 24 puits, chaque lamelle a été lavée avec 500 µL de milieu sans SVF et incubée pendant 30 minutes (37 °C, 5 % de CO 2 ) avec 300 µL d'une solution/émulsion de 250 µM de composé 106 ou d’ACP dans un milieu sans SVF contenant différentes concentrations de juglone (préparée à partir d'un stock de juglone 100 mM dans du DMSO ; des aliquots de stock de juglone dans le DMSO peuvent être conservés pendant des semaines à -80 °C, mais une fois décongelés, ils doivent être utilisés rapidement avant qu'ils ne deviennent brun foncé ; la solution intermédiaire de juglone dans le milieu de culture a été préparée fraîchement pour chaque échantillon et utilisée en quelques minutes). L'hydroxylamine protégée 106 n'étant pas soluble dans l'eau, une suspension a été préparée à l'aide du surfactant Pluronic F-127. La solution mère de 106 (10 µL d'une solution 500 mM dans du DMSO) a été mélangée avec une solution de Pluronic F-127 (5 µL d'une solution 20% m/v dans du DMSO). Le mélange a été dispersé dans 85 µL de milieu sans sérum par mélange au vortex, donnant une émulsion blanche de 50 mM qui a été utilisée pour d'autres dilutions pendant la journée. La concentration finale maximale totale de DMSO dans les expériences cellulaires était de 0,08 % (y compris la dilution du stock de juglone). Lorsque cela était indiqué, une préincubation avec des antioxydants (2 h dans le cas de SOD-PEG (100 U/mL), Cat-PEG (100 U/mL) ; 1 h pour NAC (5 mM), DETC (5 µM) et DFO (25 µM)) a été effectuée dans un milieu avec 10% de SVF. Les lamelles ont été retirées des puits à l'aide d'une aiguille à pointe recourbée et d'une pince à épiler, l'excès de liquide a été soigneusement éliminé avec une serviette en papier et les deux lamelles ont été placées sur le côté plat d'une cellule plate en quartz suprasil (WG-806-A-Q, Wilmad), la couche cellulaire étant tournée vers elle (pour éviter le dessèchement de l'échantillon). Les lamelles ont été attachées à la cellule tissulaire uniquement par des forces capillaires (attention : si un excès de liquide est laissé sur les lamelles, elles ont tendance à glisser vers le bas sur la surface lisse de la cellule RPE). La cellule RPE a été fixée à l'intérieur du résonateur RPE à mode cylindrique (EM4103TM, Bruker), l'échantillon étant orienté vers l'expérimentateur, et l'enregistrement RPE a commencé immédiatement. Les paramètres utilisés étaient les suivants : fréquence des micro-ondes, 9,81 GHz ; puissance des micro-ondes, 10 mW ; fréquence de modulation, 100 kHz ; amplitude de modulation, 0,14 mT ; gain du récepteur, 60 dB ; constante de temps, 40,96 ms ; temps de conversion, 41,04 ms ; 512 points ; champ central, 346 mT ; largeur de balayage, 6 mT ; durée de balayage, 20,97 s. Les spectres RPE ont été enregistrés séquentiellement à 21°C pendant 5 min. L'acquisition et le traitement des données ont été effectués à l'aide du logiciel Bruker Xepr et du logiciel MathWorks MATLAB avec la boîte à outils Easyspin. Après l'acquisition, chaque lamelle a été placée dans un puits propre d'une plaque de 24 puits et les cellules ont été lysées et recueillies sur les lamelles par le tampon de lyse RIPA (Thermo Scientific) (50 µL/lamelle) pour le titrage des protéines à l'aide du test BCA. Un test d’égalité des espérances avec observations appariées a été appliqué sur un ensemble de 3 à 5 expériences indépendantes avec une valeur critique p Résultats : Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau suivant : Concentration en juglone (µM) Intensité normalisée du signal RPE # (AU.mg prot -1 ) Sans antioxydant Avec SOD-PEG Avec Cat-PEG Avec chélateurs Avec NAC 0 6,6 ± 1,1 5,8 ± 0,9 7,2 ± 0,7 7,2 ± 0,5 6,7 ± 1,0 2,5 8,3 ± 1,3 * - - - - 5 10,4 ± 1,3 ** 10,8 ± 2,2 10,9 ± 1,3 * 12,6 ± 2,9 * 12,9 ± 2,6 * # Moyenne ± écart-type obtenus pour 3 à 5 expériences indépendantes. Deux concentrations de juglone ont été testées (2,5 et 5 µM), et une augmentation dose-dépendante du signal RPE a été observée. L'augmentation maximale du signal a été obtenue avec 5 µM (~ 50 % par rapport aux cellules non traitées). Ces résultats démontrent que le composé 106 est bien un rapporteur du stress oxydant intracellulaire. L'oxydation basale du composé 106 dans les échantillons de cellules non traitées était relativement élevée, ce qui peut suggérer que le composé 106 est sensible aux processus d’oxydation intracellulaire même en conditions basales dans les cellules cancéreuses. Le DETC, un chélateur universel des ions métalliques "doux", et la DFO, un chélateur du fer, sont couramment ajoutés aux incubations avec des sondes de type hydroxylamine non protégées (comme le CMH, 1-hydroxy-3-méthoxycarbonyl-2,2,5,5-tétraméthylpyrrolidine) pour empêcher l'autoxydation dans le tampon. Pour vérifier si la chélation des ions métalliques est nécessaire dans l’emploi des composés de formule (I), les cellules ont été préincubées avec de la DFO et du DETC. Nous confirmons ici qu'ils ne sont pas nécessaires avec le composé 106 puisque ces composés ne modifient pas la réponse en RPE. Ceci rend le composé 106 plus simple à utiliser que les sondes de type hydroxylamine non protégées car moins sujet aux interférences. Aucun antioxydant (SOD-PEG, Cat-PEG ou NAC) n'a réduit l'oxydation basale, ni l'oxydation induite par la juglone, ce qui ne nous permet pas de conclure précisément sur l’espèce chimique responsable de l’oxydation dans les cellules. Mais de façon intéressante, l’inspection visuelle des cellules a montré que la contraction cellulaire induite par la juglone est reversée par le traitement à la NAC. Il est connu que l’effet antioxydant de la NAC passe par une augmentation de la concentration de glutathion intracellulaire. Il est donc vraisemblable que le composé 106 soit sensible à des processus du stress oxydant en amont du glutathion. En parallèle, la sonde ACP disponible dans le commerce a été testée selon le même protocole. Dans les conditions testées, aucun signal de nitroxyde n'a pu être détecté avec l'ACP, indépendamment du traitement à la juglone. Ceci démontre que le composé 106 est un meilleur rapporteur du stress oxydant induit par la juglone dans les cellules que l’ACP dans les conditions testées. En outre, une autre lignée de cellules (cellules MCF-7) a été testée, et a donné des résultats similaires à ceux obtenus avec les cellules U87. L'effet dose-dépendant de la juglone était clairement visible, avec une augmentation maximale du signal de ~60 % avec 5 µM de juglone. 3.5 . Est-il possible de détecter le stress oxyd ant dans des conditions plus physiologiques ? Il était important de tester le composé 106 sur des cellules normales, ainsi que d'avoir un modèle plus physiologique de stress oxydant pour tester le seuil de détection. Un bon modèle était celui de chondrocytes articulaires de lapin (également des cellules adhérentes) induits à exprimer un phénotype inflammatoire de type arthrose par l'ajout d'interleukine 1 beta (IL-1). L'IL-1 est une famille de cytokines - petites protéines importantes dans la signalisation cellulaire - qui jouent un rôle dans la régulation de la réponse inflammatoire. Des chondrocytes articulaires de lapin ont été cultivés sur des lamelles de microscope (voir le protocole ci-dessous). Protocole de récolte et culture des chondrocytes Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives éthiques. Un lapin blanc de Nouvelle-Zélande âgé de 5 semaines a été euthanasié par dislocation vertébrale suivie d'une strangulation. Le cartilage articulaire a été prélevé sur les têtes fémorales et humérales, le plateau tibial et les condyles fémoraux. Le cartilage a été prélevé sur les surfaces articulaires de manière tangentielle et coupé en petits morceaux dans une solution de 0,5 mg/mL de hyaluronidase. Les échantillons ont ensuite été lavés avec du PBS et placés dans une chambre de digestion pour une trypsinisation puis une digestion à la collagénase. Les chondrocytes ont été isolés de la solution de collagénase par centrifugation. Les cellules obtenues ont ensuite été ensemencées à 60 000 cellules/cm² dans 2 flacons T75 et cultivées dans un milieu de prolifération (milieu Ham's Nutrient Mixture F12 complété par 10% de SVF, 1% de L-glutamine et 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine) à 8% de CO 2 pendant cinq jours. Le milieu a ensuite été changé pour du DMEM avec 1 g/L de D-glucose, 4 mM de L-glutamine et 10% de SVF. Après deux jours, les cellules ont été passées, ensemencées à 250 000 cellules/puits dans des plaques 24 puits sur des lamelles de verre (préalablement enduites de SVF et séchées ; diamètre 12 mm, épaisseur 0,13-0,16 mm, Thermo Scientific Menzel, Braunschweig, Allemagne) avec 2 mL de DMEM complet et cultivées pendant 3 jours à 37 °C sous 5 % de CO 2 avant l’expérience. Un essai sur culture secondaire a également été réalisé, pour lequel 80 000 cellules par puits ont été ensemencées sur des lamelles et cultivées pendant 3 jours avant l’expérience. Protocole de mesure par RPE L'enregistrement RPE a été effectué, comme indiqué dans la partie 3.4, 1h, 24h ou 48h après la stimulation par l’IL-1 (1 ng/mL dans du DMEM sans SVF) ou le changement de milieu pour du DMEM sans sérum. Les cellules ont été incubées avec le composé 106 (250 µM ou 500 µM dans du DMEM sans sérum à 37 °C, 5 % CO 2 ) pendant 1 h ou 30 min avant l'enregistrement RPE. Pour une incubation de 1 h, l'IL-1 a été ajoutée en même temps que le composé 106, tandis que dans les cas de 24 h et 48 h, les cellules ont été préincubées avec l'IL-1. Etant donnée la faible quantité de cellules disponibles, chaque condition n’a été testée qu’une seule fois sauf indication contraire. Résultats : Les résultats obtenus sont présentés dans les tableaux ci-dessous. Culture primaire Conditions Intensité du signal RPE (AU) Temps d’incubation des cellules avec le composé 106 avant enregistrement du spectre RPE Concentration de la solution de composé 106 Temps entre le début de la stimulation par IL-1 et l’enregistrement du signal RPE (si protéine présente) 0 ng/mL de protéine IL-1 1 ng/mL de protéine IL-1 (variation par rapport au contrôle sans IL-1 ) 1h 250 µM 1h 15,8 15,1 (-4%) 30 min 250 µM 24h 6,3 6,6 (+5%) 30 min 250 µM 48h 4,8 7,9 (+65%) 30 min 500 µM 48h 4,5 7,2 (+60%) Culture secondaire Conditions Intensité du signal RPE (AU) Temps d’incubation des cellules avec le composé 106 avant enregistrement du spectre RPE Concentration de la solution de composé 106 Temps entre le début de la stimulation par IL-1 et l’enregistrement du signal RPE (si protéine présente) 0 ng/mL de protéine IL-1 1 ng/mL de protéine IL-1 1h 250 µM 1h 10,7 10,0 (-7%) 30 min 250 µM 24h 8,4 10,8 (+29%) 30 min 250 µM 48h 6,1 ± 1,1 (n=2) 10,4 ± 0,4 (n=2) (+70%) Le traitement des chondrocytes par l'IL-1 induit rapidement l'expression de protéines pro-inflammatoires par diverses voies de signalisation. Une quantité significative de nitrite peut être détectée dans le milieu de culture 12 à 24 heures après le traitement à l'IL-1, ce qui indique une surexpression de la iNOS, alors qu'elle est absente dans les conditions basales. L’incubation prolongée dans le DMEM sans SVF induit vraisemblablement la mort d’une partie des cellules au cours du temps, ce qui explique que le signal obtenu avec le composé 106 sans stimulation à l’IL-1 diminue au cours du temps, mais le signal RPE n’a pas été normalisé par rapport à la quantité de protéines. En utilisant le composé 106, la différence entre les cellules traitées et non traitées n'a pu être détectée qu’à 48 heures sur des cellules en culture primaire (Tableau 3), et à partir de 24 heures, avec un effet plus prononcé à 48 heures, sur des cellules en culture secondaire (Tableau 4), ce qui suggère que le composé n'est sensible qu'aux événements en aval et non au stimulus initial. Bien que préliminaires, ces résultats montrent que le composé 106 peut détecter une partie de la réponse des chondrocytes de lapin à l'IL-1. Exemple 4 : Préparation et caractérisation d’émulsions selon l’invention Des nanoémulsions comprenant le composé 106 obtenu selon l’exemple 1 ont été préparées comme suit : la phase aqueuse (composée d'eau ultrapure avec Kolliphor® 188) et la phase huileuse (Labrafac® ou huile d’olive avec Span® 80) ont été chauffées séparément à 40°C, puis la phase aqueuse a été ajoutée goutte à goutte à la phase huileuse maintenue à 40°C sous agitation constante. Une solution aqueuse d’hydroxyde de sodium à 0,1 M a été utilisée pour ajuster le pH à 7,0. L'isotonicité a été ajustée en ajoutant du glycérol à une concentration finale de 2,5 % (m/m). L’émulsion grossière obtenue a été directement introduite dans le microfluidiseur (LV1, Microfluidics) sans homogénéisation. La microfluidisation a été effectuée à 20 kpsi pendant 10 cycles. Une concentration de 0,1 M et 0,5 M du composé 106 dans la phase huileuse a été utilisée pour préparer les nanoémulsions chargées, soit des concentrations finales à 20 mM et 100 mM dans les nanoémulsions, respectivement. Le tableau 5 ci-dessous résume les différentes émulsions préparées. Emulsion Huile Rapport massique phase huile use / phase aqueuse Rapport massique huile/ tensioactifs Rapport massique Span 80: K188 NE—L1 * Labrafac® 20:80 74:26 75:25 NE—L2 * Labrafac® 20:80 74:26 63:37 NE—OO * Huile d’olive 20:80 75:25 80:20 106 NE—L1 Labrafac® 20:80 74:26 75:25 106 NE—L2 Labrafac® 20:80 74:26 63:37 106 NE—OO Huile d’olive 20:80 75:25 80:20 D étermination de la t aille des gouttelettes et distribution de taille Le diamètre hydrodynamique et l'indice de polydispersité (PDI) des gouttelettes des nanoémulsions ont été déterminés par spectroscopie de corrélation de photons à l'aide d'un Zetasizer® Nano ZS (Malvern Panalytical, Worcestershire, UK). Environ 10 μL de chaque échantillon de nanoémulsion ont été dilués cent fois avec de l'eau ultrapure pour les mesures. Toutes les mesures ont été enregistrées à 25℃ avec un angle de diffusion de 173°. L'ajustement des courbes des fonctions de corrélation a été effectué en utilisant un ajustement exponentiel (approche cumulante) pour l'évaluation du diamètre hydrodynamique et du PDI. Toutes les mesures ont été effectuées en triplicata afin de déterminer la taille moyenne des gouttelettes exprimée en diamètre moyen Z (Z-Ave) et en PDI. D étermination du p otentiel zêta Le potentiel Zêta (ZP) des nanoémulsions a été mesuré par vélocimétrie laser doppler en utilisant le Zetasizer® Nano ZS (Malvern Panalytical, Worcestershire, UK). L'approximation de Smoluchowski a été utilisée pour déterminer la mobilité électrophorétique nécessaire à la détermination des ZP. Toutes les mesures ont été effectuées en triplicata à 25°C en diluant 10 μl de chaque échantillon à 1000 μl avec 20 mM NaCl. Le tableau 6 ci-dessous présente un résumé de l'hydrodynamisme, de la polydispersité et du potentiel Zêta des gouttelettes pour les nanoémulsions vierges (NE vierges) et les nanoémulsions chargées du composé 106 à la concentration finale de 20 ou 100 mM (NE comprenant le composé 106). Formulation Span 80: K188 Taille de gouttelettes (nm) PDI ZP (mV) NE—L1 75:25 127,8 ±1,4 0,107 ±0,00 -4,95 ± 0,23 NE—L2 63:37 112,3 ±1,3 0,105 ±0,00 -3,37 ± 0,26 NE—OO 80:20 166,9 ±1,0 0,118 ±0,01 -5,91 ± 0,81 106 NE—L1 (2 0 mM ) 75:25 136,9 ±1,9 0,073 ±0,00 -4,17 ± 0,55 106 NE—L2 (2 0 mM ) 63:37 126,3 ±0,6 0,110 ±0,02 -3,78 ± 0,39 106 NE — OO (20 mM) 80:20 158,6 ±1,6 0,115 ±0,01 -5,45 ± 0,62 106 NE—OO (100 mM) 80:20 172,6 ±1,6 0,127 ±0,00 - E fficacité d’encapsulation des émulsions L'efficacité d'encapsulation du composé 106 dans la nanoémulsion a été déterminée en séparant la phase aqueuse de la formulation par ultrafiltration/centrifugation, à l'aide de filtres centrifuges Amicon ultra-0,5 mL 30KD (Merck Millipore, France). La nanoémulsion a été centrifugée à 14 000 g pendant 30 minutes dans une microcentrifugeuse Minispin plus (Eppendorf, Suisse). La phase aqueuse a ensuite été analysée pour déterminer la teneur en composé 106 à l'aide du système HPLC SHIMADZU LC-20 avec une colonne Nucleosil 100 Å C18 (25 cm x 4,6 mm ; 5 μm), maintenue à 40°C. Phase mobile composée de 0,1% d'acide formique dans l'eau (phase mobile A) et de 0,1% d'acide formique dans l'acétonitrile (phase mobile B). Un gradient de 40%B à 90%B en 30 minutes a été utilisé avec un volume d'injection de 50 μl et un débit de 1,0 mL/min. La détection UV du composé 106 a été réalisée à 254 nm. Le composé 106 a été dilué dans la phase mobile à des concentrations allant de 10 μM à 50 μM et passé dans le système HPLC-UV pour obtenir la courbe d'étalonnage de formule y (UA) = 2474,4*x(concentration en µM) + 5717,1 (R² = 0,9986). En utilisant cette courbe d'étalonnage, la concentration du composé 106 dans la phase aqueuse a été estimée et l'efficacité d'encapsulation (EE) déterminée comme indiqué ci-dessous : La capacité de chargement en précurseur de sonde (drug loading = DL) de la nanoémulsion encapsulant la plus forte concentration du composé 106 (0,5 M dans la phase huileuse) dans cette étude a été estimée comme suit : Dans tous les cas, le composé 106 n’a pas été détecté dans la phase aqueuse ( Stabilité dans les conditions de stockage La stabilité des nanoémulsions a été étudiée par spectroscopie de corrélation de photons comme décrit précédemment pour la détermination de la taille des gouttelettes. L'analyse de la taille des gouttelettes et de la distribution de taille a été réalisée à différents temps (J1, J7, J14, J28, J50) jusqu'à 50 jours. Les échantillons ont été conservés à 25℃ pendant toute cette période. Les études ont été réalisées sur deux échantillons indépendants pour chaque formulation. Aucune séparation de phase visible n'a été observée pour les formulations tout au long de la période d'étude. Toutes les formulations ont démontré une bonne stabilité. Exemple 5 : Evaluation de la cytotoxicité des nanoémulsions comprenant le composé 106 Un test d'exclusion de colorant a été utilisé pour étudier la cytotoxicité des nanoémulsions du composé 106 sur les cellules endothéliales du cerveau (b.End 3). Initialement, les cellules ont été cultivées dans un milieu approprié composé de milieu DMEM, de SVF à 10%, de pénicilline (100 UI/mL) et de streptomycine (100 μg/mL). L'incubation a été réalisée dans un environnement humidifié à 37°C, avec 5% de CO 2 . Une sous-culture à environ 90 % de confluence a été effectuée chaque semaine par dilution 1:10 après avoir détaché les cellules avec de la trypsine. Ensuite, ces cellules ont été ensemencées dans des plaques à 24 puits (2,5 x 10 5 cellules/puits) et incubées pendant 24 heures avant d'être traitées avec les échantillons de nanoémulsion et incubées pendant 4 heures supplémentaires. Chaque puits a été traité soit avec des nanoémulsions chargées du composé 106 (gamme 0,1 mM - 5 mM), soit avec des nanoémulsions vierges, soit avec le milieu de culture comme témoins. Toutes les formulations ont été diluées dans le milieu de culture cellulaire pour préparer les concentrations requises. Après 4 heures, les milieux contenant les nanoémulsions ont été retirés et les cellules ont été lavées avec 100 μL de trypsine. Par la suite, elles ont été incubées avec 200 μL de solution de trypsine/EDTA à 0,25 %. Enfin, les cellules récoltées (20 μL) ont été mélangées avec du colorant bleu trypan à 0,4 % (20 μL) après neutralisation des enzymes avec du DMEM complet. Le nombre de cellules vivantes et mortes a été compté à l'aide d'un hémocytomètre sous un microscope inversé (Primo Vert, Zeiss). Les cellules traitées avec le milieu de culture cellulaire (contrôle) ont été considérées comme ayant une viabilité de 100%. Résultats : Emulsion 106 NE-OO Emulsion 106 NE-L1 Emulsion 106 NE-L2 Contrôle milieu 100 ± 5,7% 100 ± 4,3% 100 ± 5,3% NE vierge 96,4 ± 7,5% 96,5 ± 4,0% 94,0 ± 6,0% Concentration en composé 106 dans la nanoémulsion 0,1 mM 93,0 ± 7,0% 93,0 ± 6,2% 85,5 ± 4,7% 0,25 mM 91,1 ± 8,3% 83,3 ± 5,5% 78,3 ± 4,7% 0,5 mM 94,8 ± 7,7% - 73,7 ± 6,2% 1 mM 89,2 ± 1,6% 84,6 ± 6,0% 71,7 ± 6,2% 2,5 mM 78,3 ± 7,0% 79,3 ± 6,3% 69,6 ± 5,4% 5 mM 36,2 ± 3,4% 50,9 ± 6,8% 65,8 ± 6,1% L'évaluation de la cytotoxicité des nanoémulsions 106 NE-OO et 106 NE-L1 a révélé une viabilité cellulaire supérieure à 80 % à des concentrations allant de 0,1 mM à 2,5 mM. Pour la nanoémulsion 106 NE-L2, une viabilité cellulaire >80% a été observée à 0,25 mM et en dessous, mais une diminution un peu plus significative de la viabilité cellulaire a été observée à partir de 0,5 mM. Cependant, un pourcentage de viabilité plus élevé a été observé à une concentration de 5 mM (69,8 %) pour cette formulation, par rapport aux nanoémulsions 106 NE-OO (36,17 %) et 106 NE-L1 (50,91 %). Exemple 6 : Etudes RPE des nanoémulsions comprenant le composé 106 Protocoles : Toutes les procédures d'expérimentation animale ont été examinées par le Comité d'éthique animale local (CEEA 34), conformément à la réglementation française et à la directive du Conseil des communautés européennes sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques. Le projet a été autorisé par le Ministère français de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche sous le numéro de référence APAFIS#4594-2015092117546157 v9. Les expériences ont été réalisées sur des souris mâles BALB/c Ola Hsd en bonne santé (15-21 g, âgées de 4 semaines, Envigo) préalablement adaptées au laboratoire pendant sept jours avec un accès libre à l'eau et à la nourriture de laboratoire. Étude s RPE in vivo des nanoémulsions comprenant le composé 106 Les nanoémulsions chargées du composé 106 ont été injectées dans la veine caudale de souris BALB/c à l'aide d'une aiguille 26 G (0,45x13 mm). Le volume d'injection était de 5 µL/g de masse corporelle, conformément aux directives de bonnes pratiques en matière d'expérimentation animale. La dose injectée était de 0,1 - 0,5 μmol de composé par g de masse corporelle des souris, avec deux souris injectées par groupe. Les nanoémulsions ont été préparées avec des concentrations finales du composé 106 de 20 et 100 mM. Après l'injection, les souris ont été anesthésiées par inhalation d'isoflurane. Ensuite, les têtes ont été placées dans la cavité du spectromètre RPE à l'aide d'un support de souris modifié. Pendant l'enregistrement, les souris étaient sous anesthésie (2-3% d'isoflurane) grâce à un masque facial. La température corporelle des souris a été maintenue entre 32 et 37 °C. La fréquence respiratoire a été contrôlée pendant l'expérience. L'acquisition du signal RPE a débuté environ 4 minutes après l'injection. Les mesures RPE ont été effectuées à l'aide d'un spectromètre RPE Bruker Elexsys 540 (Bruker, Wissembourg, France) fonctionnant en bande L (1,2 GHz) avec une cavité BLGR_23. Les paramètres utilisés pour la spectroscopie RPE étaient les suivants : puissance des micro-ondes, 10 mW ; fréquence de modulation, 100 kHz ; amplitude de modulation, 0,17 mT ; gain du récepteur, 60 dB ; constante de temps, 81,92 ms ; temps de conversion, 81,92 ms ; 512 points; centre du champ, 39,52 mT ; largeur de balayage, 19 mT ; temps de balayage, 41,98 s. Les spectres ont été enregistrés séquentiellement en fonction du temps pendant environ 100 minutes. Le logiciel Bruker Xepr a été utilisé pour l'acquisition et le traitement des données. Étude s RPE ex vivo des nanoémulsions comprenant le composé 106 Une étude ex vivo a été menée pour évaluer la distribution des NE du composé 106 et confirmer le clivage intracellulaire du composé 106 par les estérases in vivo . Les souris auxquelles on a injecté les nanoémulsions ont été euthanasiées environ 100 min après l'injection intraveineuse. Une anesthésie profonde a été pratiquée avec de la kétamine (100 mg/kg) /xylazine (10 mg/kg) injectée dans le péritoine. Des échantillons de sang total ont été prélevés dans le ventricule gauche, conservés dans des tubes héparinés et congelés dans l'azote liquide. Le remplacement du sang par perfusion cardiaque des souris a été effectué avec 10 à 15 mL de solution saline contenant 25 U/mL d'héparine. Les principaux organes, dont le cerveau, le cœur, le foie, la rate, les poumons et les reins, ont ensuite été prélevés, pesés et congelés dans l'azote liquide à -80°C pour l'analyse RPE ex vivo . Des homogénats de chaque organe ont été préparés en les mélangeant avec du sérum physiologique (0,1 g de tissu humide/0,1 mL de sérum physiologique) et en les désagrégeant à l'aide d'un potter (homogénéiseur de Dounce). Après avoir été passés au vortex, les échantillons (30 µL) ont été transférés dans un morceau de tube PTFE perméable aux gaz de 5 cm de long (Extruded Sub-Lite-Wall, diamètre intérieur 0,635 mm, épaisseur de paroi 0,051 mm ; Zeus Industrial Products Ltd., Irlande) qui a été plié (en forme de V) dans un tube de quartz de 4 mm, puis placé dans la cavité RPE. Le sang n'a pas été dilué avant l'enregistrement. Les spectres ont été enregistrés avec un spectromètre RPE Elexsys E500 en bande X (9,8 GHz) à 21 °C et équipé d'une cavité haute sensibilité SHQ. Les paramètres utilisés étaient les suivants : puissance micro-ondes, 1 mW ; fréquence de modulation, 100 kHz ; amplitude de modulation, 0,1 mT ; gain du récepteur, 60 dB ; constante de temps, 40,96 ms ; temps de conversion, 40,96 ms ; 1024 points ; centre du champ magnétique, 350 mT ; largeur de balayage, 8 mT ; temps de balayage, 41,94 s. Du ferricyanure de potassium 100 mM a été ajouté progressivement (0,2-1 μL) aux échantillons pour une analyse RPE ultérieure. Le ferricyanure de potassium est un oxydant doux dont l'ajout au composé devrait oxyder l'hydroxylamine libérée par le composé 106 en nitroxyde visible par RPE. Résultats : Aucune toxicité aiguë n'a été observée au cours des expériences in vivo . Comme mentionné précédemment, la sonde issue du composé 106 est une sonde invisible par RPE qui est clivée au niveau intracellulaire par l'estérase en hydroxylamine libre. L'hydroxylamine résultante réagit dans des conditions de stress oxydant pour produire un radical nitroxyde visible par RPE. Aucun signal n'est attendu dans un système sain puisque le niveau d'oxydant est très faible et qu'il y aura peu ou pas de réaction avec l'hydroxylamine libre. Comme prévu, aucun signal RPE n'a été observé dans la tête des souris après injection du composé 106 NEs pendant toute la durée de l'enregistrement, c'est-à-dire 100 min. Ni la concentration du composé 106 dans la phase huileuse ni le type d'huile utilisé pour formuler les nanoémulsions n'ont affecté leur stabilité in vivo chez les souris saines. Les résultats in vivo suggèrent que la sonde issue du composé 106 n'a pas été oxydée de manière significative en forme de nitroxyde chez les souris saines. Cependant, la sensibilité du spectromètre RPE en bande L est inférieure à la sensibilité du spectromètre en bande X, ce qui signifie que l'analyse en bande X des échantillons ex vivo permet de quantifier la quantité de sonde qui atteint les différents tissus et qui est clivée et/ou oxydée. Dans un premier temps, une acquisition RPE des homogénats d'organes a été réalisée. Ensuite, du ferricyanure de potassium [K 3 (FeCN 6 )] a été ajouté progressivement pour récupérer la quantité totale de précurseur de sonde 106 clivé distribué à chaque organe. Le ferricyanure de potassium oxyde le produit hydroxylamine libre de la sonde 106 en un nitroxyde visible par RPE. Pour chaque organe, l'ajout de l'oxydant a conduit à une augmentation de l'intensité du signal RPE, indiquant ainsi la sensibilité des sondes formulées aux espèces oxydantes. Les résultats obtenus (moyenne ± écart-type) sont repris dans le Tableau 8 suivant : Concentration (µM) Emulsion 106 NE-OO (20 mM) (0,1 µmol/g de masse corporelle) Emulsion 106 NE-OO (100 mM) (0,5 µmol/g de masse corporelle) Emulsion 106 NE-L1 (100 mM) (0,5 µmol/g de masse corporelle) Tel qu’isolé Après oxydation Tel qu’isolé Après oxydation Tel qu’isolé Après oxydation Sang 0,47 ± 0,47 0,99 ± 0,16 7,44 ± 3,55 12,4 ± 0,34 1,47 ± 0,06 1,82 ± 0,12 Cœur 0,60 ± 0,60 0,60 ± 0,60 7,54 ± 2,40 8,38 ± 3,12 1,94 ± 0,66 2,53 ± 0,73 Foie 3,87 ± 0,65 9,05 ± 0,65 27,9 ± 4,3 70,1 ± 10,4 16,5 ± 9,3 28,3 ± 11,4 Rate 0,60 ± 0,60 0,88 ± 0,88 6,60 ± 0,90 7,90 ± 1,22 2,65 ± 0,07 3,45 ± 0,53 Reins 1,36 ± 1,36 1,51 ± 1,51 19,9 ± 4,9 26,8 ± 7,1 4,17 ± 1,15 5,47 ± 1,09 Poumons 0 ± 0 0,83 ± 0,83 9,84 ± 1,06 11,1 ± 2,05 14,8 ± 11,8 27,7 ± 24,2 Cerveau 0,82 ± 0,82 0,96 ± 0,96 4,53 ± 0,75 6,89 ± 2,73 1,95 ± 0,33 2,30 ± 0,60 Un signal RPE a été observé dans différents organes, indiquant l'absorption réussie du composé 106. Comme prévu, une augmentation de l'intensité a été remarquée lorsque la dose du précurseur de sonde a augmenté de 0,1 à 0,5 µmol/g de masse corporelle en utilisant des formulations à base d'huile d'olive. De plus, l'évaluation RPE a révélé une accumulation plus importante du composé 106 dans le foie par rapport aux autres organes. L'accumulation préférentielle du précurseur de sonde dans le foie a été observée pour les deux concentrations testées. À la dose la plus élevée du composé 106 (0,5 µmol/g de masse corporelle) dans une nanoémulsion à base d'huile d'olive avec Span80:K188 = 80:20 (émulsion 106 NE-OO), le spectre RPE de l'échantillon de sang indique la présence d'un nitroxyde libre dans un environnement aqueux caractérisé par une constante de couplage à l'azote de 1,56 mT (étoiles, ) et d'un nitroxyde dans un environnement plus lipophile comme les membranes cellulaires (flèches, ). Des traces de nitroxyde lié aux protéines ont été détectées après l'ajout de ferricyanure (triangle, ). Une espèce non identifiée à six raies (A N = 1,58 mT, AH = 2,36 mT), est apparue lors de l'oxydation dans le sang (diamants, ). L'espèce non identifiée à six raies n'a pas été observée dans les spectres RPE des autres organes. La distribution du nitroxyde dans les organes avant et après le traitement au ferricyanure est présentée dans le Tableau 7. Une proportion significative d'hydroxylamine libre n'est observée que dans le foie, alors que la plupart du précurseur de sonde détecté est oxydé en nitroxyde dans les autres organes. Composé de formule (I) : dans laquelle n = 1 ou 2, A et A’ sont indépendamment choisi dans le groupe constitué des substituants (II-a) et (II-b) suivants : et , R et R’ étant indépendamment choisis parmi H et les alkyles linéaires ou ramifiés en C1-C4, Z étant choisi parmi un groupement alkyle linéaire ou ramifié en C1-C4 et un groupement aryle éventuellement substitué par un groupement alkyle linéaire ou ramifié en C1-C4 ou/et par un groupement méthoxyle, et le motif de formule (N) est choisi parmi les motifs (III-a), (III-b), (III-c), (III-d) et (III-e) suivants : , , , et , Ra, Rb, Rc et Rd étant, pour chaque motif (III-a), (III-b), (III-c), (III-d) et (III-e), indépendamment choisis parmi les alkyles, linéaires ou ramifiés, en C1-C4. Composé selon la revendication 1, dans lequel A est choisi dans le groupe constitué du substituant (II-b) dans lequel Z = Me et du substituant (II-a) dans lequel R = H, et A’ est choisi dans le groupe constitué du substituant (II-b) dans lequel Z = Me et du substituant (II-a) dans lequel R = Me. Composé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel R’ est un méthyle ou un éthyle, de préférence un méthyle. Composé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le composé de formule (I) est choisi parmi les composés (I-a), (I-b), (I-b’’), (I-c), (I-d) et (I-e) suivants : , , , , , . Composé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel le motif de formule (N) est choisi parmi les motifs (III-b), (III-c), (III-d) et (III-e). Composé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel Ra, Rb, Rc et Rd sont identiques, et choisis parmi un méthyle et un éthyle. Composé selon l‘une quelconque des revendications 1 à 6, choisi parmi : et Composition pharmaceutique, comprenant dans un milieu physiologiquement acceptable, au moins le composé de formule (I) selon l’une quelconque des revendications 1 à 7. Composition pharmaceutique selon la revendication 8, caractérisée en ce qu’elle est sous la forme d’une nanoémulsion, de préférence d’une nanoémulsion huile-dans-eau. Composition pharmaceutique selon la revendication 9, dans laquelle la nanoémulsion comprend une phase aqueuse et une phase huileuse, la phase huileuse comprenant le composé de formule (I) et comprenant en outre au moins un composé huileux comprenant un triglycéride, de préférence un triglycéride en C4-C24, préférentiellement en C8-C18. Composition pharmaceutique selon l’une quelconque des revendication 8 à 10, comprenant en outre au moins un tensioactif non ionique, de préférence choisi parmi les tensioactifs organosilicones, le polysorbate, l'alcool cétostéarylique, l'alcool cétylique, l'alcool oléylique, l'alcool stéarylique, le cocamide DEA, le cocamide MEA, le polyalkylglucoside, le décyl glucoside, le lauryl glucoside, l'octyl glucoside, la monolaurine, le poloxamère, le monostéarate de sorbitan, le tristéarate de sorbitan, ou toute combinaison de ceux-ci, préférentiellement parmi les poloxamères et le monostéarate de sorbitan. Utilisation du composé de formule (I) selon l’une quelconque des revendications 1 à 7 ou de la composition pharmaceutique selon l’une quelconque des revendications 8 à 11, comme précurseur de composés pour spectroscopie par résonance paramagnétique électronique ou pour imagerie, en particulier pour spectroscopie par résonance paramagnétique électronique, pour imagerie par résonance paramagnétique électronique ou pour imagerie par résonance magnétique. Méthode de détection in vitro du stress oxydant, comprenant les étapes suivantes : - mettre en contact le composé de formule (I) selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, ou la composition selon l’une quelconque des revendications 8 à 11, avec un milieu comprenant des cellules ou un tissu biologique, et - enregistrer le signal du milieu par spectroscopie de résonance paramagnétique électronique, ou capturer une ou plusieurs images du milieu par une technique d'imagerie, de préférence par imagerie par résonance paramagnétique électronique ou par imagerie par résonance magnétique. Méthode de détection in vivo du stress oxydant chez un sujet, comprenant : - soit une étape de capture d’une ou plusieurs images d’un sujet ou d’au moins une partie d’un sujet préalablement traité par le composé de formule (I) selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, ou par la composition selon l’une quelconque des revendications 8 à 11, par une technique d'imagerie, de préférence par imagerie par résonance paramagnétique électronique ou par imagerie par résonance magnétique, - soit une étape d’enregistrement du signal d’un sujet ou d’au moins une partie d’un sujet préalablement traité par le composé de formule (I) selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, ou par la composition selon l’une quelconque des revendications 8 à 11, par spectroscopie de résonance paramagnétique électronique. Composé de formule (I) tel que défini selon l’une quelconque des revendications 1 à 7 ou composition selon l’une quelconque des revendications 8 à 11, pour son utilisation comme outil de diagnostic.