Brevet FR3145861A1 — publié le 20240823

Procédé non-invasif de détection, quantification et/ou localisation de certains types de mélanines Procédé de détection, quantification et/ou localisation des eumélanines et/ou des phéomélanines et/ou des mélanines mixtes et/ou de leurs dérivés au sein d’un tissu biologique ou d’un échantillon mélanisé, le procédé comportant les étapes consistant à : acquérir par imagerie multiphoton FLIM, au moins une image du tissu biologique ou de l’échantillon mélanisé, générer à partir de la ou des images acquises, au moins une information relative à la présence, quantification et/ou localisation des eumélanines et/ou des phéomélanines et/ou des mélanines mixtes et/ou de leurs dérivés, en se basant sur la connaissance du déclin temporel propre de l’intensité de fluorescence excitée à plusieurs photons, notamment deux photons, d’au moins un type d’eumélanines, d’au moins un type de phéomélanines et/ou d’au moins un type de mélanines mixtes, notamment lorsque considérés isolément. Figure 1 Procédé non-invasif de détection, quantification et/ou localisation de certains types de mélanines La présente invention concerne l’observation des tissus biologiques, notamment les épithelia stratifiés kératinisés comme la peau. L’invention concerne plus particulièrement mais non exclusivement les procédés visant à déterminer la présence, quantité et/ou répartition de différents types de mélanines dans des tissus biologiques ou dans tout autre échantillon contenant de la mélanine, ainsi que des modifications de leur structure photo-induites. Ces procédés visent notamment à évaluer l’action de l’exposition solaire sur les mélanines au sein de la peau. Les mélanines sont les principaux pigments responsables de la pigmentation des tissus biologiques. Il existe deux types majeurs de mélanines : l’eumélanine, un pigment sombre brun foncé ou noir, et la phéomélanine, un pigment clair de couleur jaune ou rouge brun. Les eumélanines et les phéomélanines sont toutes les deux synthétisées dans les mélanosomes des mélanocytes. La première étape, sous l’action de l’enzyme Tyrosinase est l’hydroxylation de l’acide aminé Tyrosine en L-3,4-dihydroxyphénilalanine (DOPA) et ensuite son oxydation en DOPAquinone. Le type de pigment eumélanine ou phéomélanine synthétisé dans les mélanosomes dépend de la disponibilité de l’acide aminé cystéine dans ceux-ci. En présence de cystéine, celle-ci réagit avec la DOPAquinone pour former les cystéinyldopas, qui sont ensuite oxydées par la DOPAquinone pour former l’intermédiaire phéomélanine de type benzothiazine, qui est ensuite converti partiellement en phéomélanine de type benzothiazole. Lorsque le taux de cystéine dans les mélanosomes est épuisé, la DOPAquinone réagit spontanément pour donner via la DOPAchrome le 5,6-dihydroxyindole (DHI) et le 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylique (DHICA). Les mélanines de la peau humaine sont constituées d’un mélange d’eumélanines (DHI et DHICA) et de phéomélanines (benzothiazine et benzothiazole). Sous l’effet des rayonnements ultra-violets (UV) ou de la lumière bleue, on observe des modifications structurelles des mélanines. Les eumélanines naturelles et synthétiques (DHI et DHICA) subissent un clivage oxydatif du groupement d’indolequinone pour donner du pyrrole-2,3,5-acide tricarboxylique libre (PTCA libre) et de l’eumélanine photo-dégradée (diarylketone). La réaction du DHI (et/ou DHICA) avec l'indolequinone produit le DHI réticulé (et/ou DHICA réticulé). Les phéomélanines naturelles et synthétiques subissent aussi des dégradations sous l’effet des rayonnements UV qui induisent la conversion de la benzothiazine en benzothiazole. La caractérisation des mélanines est cruciale pour comprendre les pigmentations constitutives de la peau et des cheveux humains et comment leur quantité et leur qualité sont modulées dans des conditions physiologiques, dans différents désordres pigmentaires, avec une exposition à la lumière solaire ou une application topique d'actifs. En particulier, en photoprotection, il existe un besoin de caractérisation in vivo des photo-modifications de la mélanine (oxydation, photo-dégradation et réticulation) et de compréhension de leur lien avec les pigmentations immédiates (IPD – immédiate pigment darkening) et retardées (PPD – persistent pigment darkening). L'IPD est une pigmentation cutanée grisâtre transitoire et réversible qui se développe pendant et après l'exposition aux UV et s'estompe après quelques minutes à deux heures après l'exposition. Lorsque la peau est exposée à une dose suffisante d'UVA (> 10J/cm² UVA 320-400 nm), l'IPD est plus intense et est suivie de PPD, cette dernière ayant une coloration brune qui dure 24 h et se fond dans le bronzage retardé 3 à 5 jours après l'exposition. Contrairement au bronzage retardé dû à la néomélanogénèse, l'IPD et la PPD seraient dues à la photo-oxydation et/ou à la polymérisation des mélanines préexistantes (IPD), ou de leurs précurseurs et métabolites. Cependant, les modifications structurelles induites par les UVA dans les mélanines cutanées humaines n'ont pas encore été caractérisées in vivo ni ex vivo dans la peau. Dans l’état de la technique actuel, les eumélanines et phéomélanines natives et photo-modifiées (oxydées, dégradée, réticulées) sont analysées ex vi vo par analyse chimique, par chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) des produits de dégradation de la mélanine. Cette méthode, permettant de faire la différence entre eumélanines et phéomélanines, quantifie les mélanines en mesurant les produits de la dégradation de l’eumélanine native (PTCA) ou de la phéomélanine de type benzothiazine (TTCA) après oxydation alcaline à l’H 2 O 2 et des produits de dégradation de la phéomélanine de type benzothiazole (4-AHP) après hydrolyse réductive avec HI. Elle permet également l’analyse des produits d’oxydation/réticulation des mélanines après exposition UVA : Free PTCA et PTeCA pour l’eumélanine et ratio TTCA/4-AHP pour la phéomélanine. En utilisant cette méthode, il a été démontré que l'exposition aux UVA ou à la lumière bleue induisait une dégradation/modification photo-oxydative partielle des mélanines synthétiques et des mélanines naturelles de l'épithélium pigmenté rétinien (EPR), des mélanocytes en culture 2D et des échantillons de cheveux humains. Malgré sa grande spécificité, l’analyse chimique par HPLC est une méthode invasive qui nécessite beaucoup de matériel et qui est par conséquent, difficilement réalisable dans le cadre des études cliniques ou sur un point de conseil ou de vente. Elle nécessite aussi la dégradation de l’échantillon et ne permet donc pas une localisation 2D / 3D, ni un suivi des eumélanines et phéomélanines et de leurs modifications in vivo . De plus, la phéomélanine de type benzothiazine est analysée dans un aliquot d'échantillon différent (soumis à l'hydrolyse réductive) de celui utilisé pour l'analyse de la phéomélanine de type benzothiazole et de l'eumélanine (soumis à l'AHPO). Pour pallier ces manquements, de nombreuses études se sont intéressées aux microscopies multiphoton et multiphoton FLIM (imagerie de durée de vie de fluorescence) pour détecter et quantifier en 2D ou 3D de manière non invasive les mélanines dans un échantillon biologique grâce à leur fluorescence endogène. Le brevet FR 2 944 425 divulgue une méthode de détection de la mélanine basée sur l’intensité de fluorescence (décrite aussi dans J. Biomed. Opt. 17, 026009, 2012). Dans la couche basale de l’épiderme, les mélanines très concentrées émettent un signal de fluorescence d’intensité plus forte que celui des autres fluorophores endogènes. La méthode suggère ainsi de considérer les pixels de forte intensité comme des zones contenant de la mélanine. Cette approche ne fonctionne cependant pas de façon totalement satisfaisante dans d’autres couches de l’épiderme contenant des kératines avec de fortes intensités de fluorescence. Par ailleurs, les pixels contenant une faible concentration de mélanines et qui ont une faible intensité de fluorescence sont intrinsèquement non détectés par cette approche. D’autres études s’intéressent à la durée de vie de fluorescence des mélanines. La durée de vie de fluorescence (τ), une mesure du temps moyen qu’une molécule reste dans l’état excitée avant d’émettre un photon de fluorescence et de revenir à son état fondamental, est globalement indépendante de la concentration des fluorophores mais dépend de leur microenvironnement local (pH, changement conformationnel, liaison...). Les mélanines naturelles et synthétiques présentent un déclin temporel de l’intensité de fluorescence spécifique, pouvant être approximée par une fonction bi-exponentielle du type où sont les durées de vie de fluorescence courte et longue et et leurs amplitudes respectives. JP2009-142597 décrit une méthode par microscopie multiphoton FLIM, qui utilise la mesure du ratio des contributions et pour déterminer un seuil limite caractéristique à partir duquel les pixels présentant une intensité supérieure à celui-ci sont considérés comme des zones contenant de la mélanine. La demande WO2013/068943 décrit une méthode de détection, visualisation et quantification 3D de la mélanine par imagerie multiphoton Pseudo-FLIM (3D XYZ) basée sur la mesure de la pente du déclin temporel de l’intensité de fluorescence. La méthode est également décrite dans l’article de Pena et al. “ In vivo melanin 3D quantification and z- epidermal distribution by multiphoton FLIM, phas or and Pseudo - FLIM analyses ”, Sci Rep 12, 1642 (2022), dans lequel elle est comparée à l’imagerie multiphoton FLIM couplée à l’analyse par une approche bi-exponentielle et à l’analyse phasor. L'imagerie multiphoton FLIM a déjà été appliquée à la caractérisation de différents échantillons de mélanine (synthétiques, Dopa, Sepia, les mélanocytes de l'œil humain, les cheveux et la peau comme référencé dans l’article Pena et al. 2022). Cependant, les propriétés de durée de vie de fluorescence de différents types de mélanines (eumélanines DHI et DHICA, phéomélanines benzothiazole et benzothiazine et mélanges d’eumélanines et de phéomélanines), généralement trouvées dans des échantillons de peau et de cheveux humains n'ont pas encore été caractérisées tout comme leurs changements avec l'exposition solaire, tels que les UVA. En résumé, ces différents documents proposent diverses méthodes pour détecter, quantifier ou localiser en 2D ou en 3D la mélanine dans un tissu biologique, mais n’investiguent pas la possibilité de distinction entre les différents types de mélanines. Pareillement, ces documents ne suggèrent aucune approche pour détecter des modifications structurelles photo-induites (oxydation/dégradation/réticulation) des mélanines. Ces différences structurales entre les mélanines natives et entre les mélanines natives et photo-modifiées pourraient avantageusement être détectées grâce à la sensibilité et la spécificité de la durée de vie de fluorescence. Il existe donc un besoin pour bénéficier d’un procédé non invasif de détection, quantification et/ou localisation in situ des différents types de mélanines ainsi que de leurs modifications structurelles photo-induites (oxydation/dégradation/réticulation), ce procédé pouvant être mis en œuvre sur un échantillon in tubo , in vitro , ex vivo et in vivo . L’invention vise à répondre à ce besoin et a pour objet, selon l’un de ses aspects, un procédé de détection, quantification et/ou localisation des eumélanines et/ou des phéomélanines et/ou des mélanines mixtes et/ou de leurs dérivés au sein d’un tissu biologique ou d’un échantillon mélanisé, le procédé comportant les étapes consistant à : acquérir par imagerie multiphoton FLIM, au moins une image du tissu biologique ou de l’échantillon mélanisé, générer à partir de la ou des images acquises, au moins une information relative à la présence, quantification et/ou localisation des eumélanines et/ou des phéomélanines et/ou des mélanines mixtes et/ou de leurs dérivés, en se basant sur la connaissance du déclin temporel propre de l’intensité de fluorescence excitée à plusieurs photons, notamment deux photons, d’au moins un type d’eumélanines, d’au moins un type de phéomélanines et/ou d’au moins un type de mélanines mixtes, notamment lorsque considérés isolément, notamment des eumélanines et phéomélanines lorsque considérées isolément. Avantageusement, l’utilisation de l’imagerie multiphoton FLIM permet de détecter, quantifier et/ou localiser de façon relativement précise les types de mélanines et leurs modifications structurelles de manière non invasive et in vivo à la différence de l’analyse chimique par HPLC qui nécessite de dégrader ex vivo des échantillons de tissu biologique. Types de mélanines On entend par : « eumélanines », différents types d’eumélanines comme les eumélanines DHI, DHICA ou Dopa, « phéomélanines », différents types de phéomélanines comme les phéomélanines de type benzothiazine et/ou benzothiazole, « mélanines mixtes » différents types de mélanges d’au moins un type d’eumélanines et d’au moins un type de phéomélanines à des ratios donnés d’eumélanines et de phéomélanines, par exemple un mélange d’un type d’eumélanines avec un type de phéomélanines avec un ratio donné, « dérivés », des macromolécules issues de modifications structurelles des mélanines dites « natives » sous l’action d’un stimulus et/ou d’un traitement, notamment de l’oxydation, dégradation et réticulation photo-induites des mélanines. Les dérivés peuvent inclure le PTCA libre, l’eumélanine dégradée et l’eumélanine réticulée PTeCA, provenant de modifications structurelles photo-induites des eumélanines natives. Stimulus et traitement Le stimulus à l’origine des modifications structurelles des mélanines peut être un rayonnement lumineux, notamment solaire, ultraviolet (UVA et/ou UVB) ou de la lumière visible notamment la lumière bleue. Le procédé selon l’invention peut détecter, quantifier et/ou localiser au moins un dérivé photo-induit des eumélanines et/ou des phéomélanines et/ou des mélanines mixtes, en particulier ceux induits par les rayonnements ultra-violets (UV), notamment UVA et/ou la lumière bleue. Le traitement à l’origine des dérivés des mélanines peut être non thérapeutique, notamment cosmétique. Le traitement peut comporter : 1'application, 1'injection, 1'ingestion, l'inhalation d'un produit, notamment d’un produit cosmétique, et/ou la prise de compléments alimentaires et/ou de médicaments. Par « produit cosmétique », on entend un produit tel que défini dans la Directive 93/35/CEE du 14 juin 1993, modifiant la Directive 76/768/CEE. Le produit peut avoir un effet dépigmentant. Ainsi, le traitement peut comporter 1'application de tout agent chimique modulateur de la pigmentation. Le produit peut avoir un effet anti-oxydant ou être un filtre solaire. Ainsi, le traitement peut comporter 1'application de tout agent chimique ou physique permettant de limiter ou d’éviter les photo-modifications des mélanines, tels que l’oxydation. Echantillon mélanisé et tissu biologique L’échantillon mélanisé peut être tout type d’échantillon contenant des mélanines en solution, suspension ou en poudre, des mélanines synthétiques ou des mélanines extraites d’un échantillon tels qu’une cellule ou un tissu biologique. Le tissu biologique peut être un épithélium pluristratifié kératinisé (peau, muqueuses, cuir chevelu) ou des phanères (cheveux, sourcils, ongles). Le tissu biologique, en particulier l’épithélium kératinisé, selon l’invention peut être naturel ou artificiel, le tissu étant par exemple de la peau humaine, de la peau reconstruite ou artificielle, ou des cellules pigmentées (mélanocytes) en culture. Le procédé selon l’invention peut être mis en œuvre sur un échantillon mélanisé ou un tissu biologique in tubo , in vitro , ex vivo et in vivo . Imagerie multiphoton FLIM L’imagerie multiphoton FLIM, encore dénommée « microscopie multiphoton FLIM », telle que décrite dans les références ci-dessous, rend compte de la distribution des paramètres de durées de vie de fluorescence au sein d’une image et ouvre la possibilité d’identifier spécifiquement les fluorophores, offrant ainsi une imagerie fonctionnelle : Lakowicz, J. R., Principles of fluorescence spectroscopy . third ed.; Springer: New York, 2006; p 1-954. Periasamy, A.; Clegg, R. M., FLIM Microscopy in Biology and Medicine . 1st ed.; Chapman and Hall/CRC, Taylor & Francis Group: Boca Raton, Florida, 2009. König, K., Multiphoton Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging, Applications in Biology and Medicine . De Gruyter: Berlin, Boston, 2018. L’imagerie multiphoton FLIM se base sur le fait que la durée de vie de fluorescence d’un fluorophore est globalement indépendante de sa concentration mais dépend de son microenvironnement local (pH, conformation moléculaire, liaison avec d’autres molécules, changement affectant sa structure…). La ou les images FLIM peuvent être obtenues au moyen d’une excitation multiphoton, notamment à deux photons, dans l’infrarouge proche, en particulier dans la gamme 700-900 nm, de préférence à une longueur d’onde d’excitation de 760 nm et dans une plage de détection de la fluorescence endogène allant de 400 à 650 nm. La ou les images acquises peuvent être bidimensionnelles ou tridimensionnelles. Chaque image tridimensionnelle correspond à une pile d’images bidimensionnelles représentatives à une profondeur donnée de la structure du tissu biologique ou de l’échantillon mélanisé. Identification des différents types de mélanines et/ou ses dérivés Une information peut être générée par l’identification d’au moins un type de mélanines et/ou ses dérivés en approximant le déclin temporel de l’intensité de fluorescence obtenue à partir de la ou des images FLIM acquises par une fonction multi-exponentielle et en comparant au moins un des paramètres de fluorescence calculés par cette approximation avec des paramètres de référence d’au moins un type d’eumélanines, d’au moins un type de phéomélanines et/ou d’au moins un type de mélanines mixtes. Dans le cas où l’on utilise le procédé avant et après exposition à un stimulus et/ou un traitement, les résultats obtenus avant exposition peuvent servir de références pour analyser les résultats après exposition afin notamment de mettre en évidence l’effet du stimulus et/ou du traitement. La fonction multi-exponentielle utilisée peut être de la forme et les paramètres de fluorescence calculés peuvent inclure les durées de vie de fluorescence courte et longue , avec , et leurs amplitudes respectives et , ainsi que les durées de vie de fluorescence moyennes pondérées en amplitude ou en intensité , ou tout autre paramètre issu de la combinaisons des paramètres , , et . Une analyse par phaseur, dite « phasor », peut également être réalisée. En appliquant une transformée de Fourier à chaque pixel d’une image, chaque déclin temporel de l’intensité de fluorescence est converti en coordonnées g et s correspondant respectivement aux parties réelles et imaginaires de la transformée de Fourier. L’identification d’au moins un type de mélanines et/ou ses dérivés peut s’effectuer en utilisant des paramètres comme les coordonnées g et s, les durées de vie de fluorescence pondérées en modulation et en phase et différents paramètres de fraction des mélanines, notamment la fraction des mélanines modifiées par les UVA , la fraction des eumélanines ou des phéomélanines au sein d’un mélange d’au moins un type d’eumélanines et d’au moins un type de phéomélanines, calculés en utilisant comme références les paramètres de durée de vie de fluorescence des eumélanines, phéomélanines et/ou des mélanines mixtes. Le procédé peut ainsi comporter l’identification d’au moins un type de mélanines et/ou ses dérivés en utilisant une analyse phasor et en extrayant des paramètres de durée de vie de fluorescence, notamment les coordonnées g et s dans un graphe phasor , les durées de vie de fluorescence pondérées en modulation et en phase et les paramètres de fraction des mélanines, notamment la fraction des mélanines modifiées par les UVA , calculés en utilisant comme références les paramètres de durée de vie de fluorescence des eumélanines, phéomélanines et/ou des mélanines mixtes. Autrement dit, la connaissance du déclin temporel propre d’au moins un type de mélanines permet le calcul d’un paramètre de fraction de ce type de mélanines modifié par un stimulus et/ou un traitement. Par paramètre de fraction des mélanines modifiées, on entend la proportion des dérivés dans le mélange de mélanines natives et de dérivés résultant de l’action d’un stimulus et/ou d’un traitement induisant des modifications structurelles des mélanines natives, par exemple un stimulus tel qu’un rayonnement UV. Dans le cas d’une exposition aux UVA, cette fraction des mélanines modifiées par les UVA est nommée . D’autres proportions des espèces fluorescentes au sein d’un mélange de mélanines natives et/ou de leurs dérivés peuvent également être calculées comme la fraction des eumélanines ou des phéomélanines au sein d’un mélange d’au moins un type d’eumélanine et d’au moins un type de phéomélanine. L’identification d’au moins un type de mélanines et/ou ses dérivés peut avoir recours à des paramètres calculés par analyse phasor et/ou l’approximation bi-exponentielle. Paramètres de référence Les « paramètres de référence » des eumélanines, phéomélanines et/ou des mélanines mixtes peuvent être obtenus en analysant par analyse phasor et/ou par approximation bi-exponentielle le déclin temporel de l’intensité de fluorescence dans des images acquises sur ces eumélanines, phéomélanines, et/ou mélanines mixtes, notamment lorsque considérés isolément, en particulier en solution ou en suspension ou sous forme de poudre. Les paramètres de référence peuvent être ceux qui sont mesurés avant exposition à un stimulus et/ou un traitement susceptible d’induire des modifications structurelles des mélanines natives. Quantification et/ou localisation des mélanines et/ou de leurs dérives La quantification et/ou localisation des mélanines et/ou de leurs dérivés se fait préférentiellement en générant au moins une information représentative, notamment une image, de la distribution spatiale au sein du tissu biologique ou de l’échantillon mélanisé d’au moins un des paramètres de durées de vie de fluorescence précédemment calculés, et en déterminant au moins à partir de cette distribution au moins une information sur la densité volumique ou surfacique d’au moins un type de mélanines et/ou de ses dérivés au sein du tissu biologique ou de l’échantillon mélanisé. Au moins une mesure de seuil associée à au moins un type de mélanines et/ou de ses dérivés peut être calculée pour créer à partir d’au moins une image au moins un masque spécifique permettant d’obtenir au moins une information sur sa densité volumique ou surfacique au sein de l’échantillon mélanisé ou du tissu biologique. L’information peut être générée sous la forme d’au moins une image, notamment une image bidimensionnelle ou tridimensionnelle. L’information générée peut renseigner sur la surface et/ou sur le volume occupé par au moins l’un des types de mélanines et/ou ses dérivés au sein du tissu biologique, ainsi que sur sa répartition 2D ou 3D par rapport aux autres constituants du tissu ou de l’échantillon mélanisé. Procédés d’évaluation Selon un autre de ses aspects, l’invention a pour objet un procédé pour évaluer l’effet d’un stimulus, notamment un rayonnement lumineux, et/ou d’un traitement, notamment propigmentant, dépigmentant, anti-oxydant ou offrant une protection solaire sur un échantillon mélanisé ou un tissu biologique, notamment sur la peau reconstruite, la peau humaine ex vivo ou in vivo , ou sur des cellules en culture, comportant les étapes consistant à : détecter, quantifier et/ou localiser au moins un type de mélanines et/ou ses dérivés au sein de l’échantillon mélanisé ou tissu biologique à l’aide du procédé de détection tel que précédemment défini, répéter l’étape a), après que l’échantillon ou tissu a été exposé à l’action dudit stimulus ou traitement, comparer les informations générées par les deux évaluations et générer au moins une information relative à l’action du stimulus ou du traitement sur l’échantillon ou tissu à partir au moins de cette comparaison. Le procédé selon 1'invention peut être utilisé pour évaluer 1'efficacité d’actifs dépigmentant, anti-pigmentant, propigmentant, anti-oxydant ou offrant une protection solaire. Les actifs peuvent être à visée thérapeutique et/ou à visée cosmétique. Le procédé selon l’invention peut être également utilisé pour évaluer les effets de certains produits sur la pigmentation, notamment sur les modifications structurelles des mélanines. Selon un autre de ses aspects, l’invention a pour objet un procédé pour évaluer l’action d’un stimulus et/ou d’un traitement sur un échantillon mélanisé ou un tissu biologique, notamment de la peau reconstruite ou de la peau humaine ex vivo ou in vivo , dans lequel au moins deux régions du tissu ou deux aliquots de l’échantillon mélanisé sont exposés différemment au stimulus et/ou au traitement, notamment à différents temps d’exposition à un rayonnement solaire tels que les UV et donc à différentes doses du rayonnement solaire, et dans lequel on compare l’information sur la présence et/ou la quantité et/ou la localisation d’au moins un type de mélanines et/ou ses dérivés dans lesdites régions ou aliquots, obtenue à l’aide du procédé tel que précédemment défini, avant et après exposition audit stimulus ou traitement. Pour déterminer l’évolution des modifications structurelles des mélanines en fonction de la dose du rayonnement solaire reçue, on peut comparer les informations générées dans deux régions différentes du tissu biologique exposées plus au moins longtemps à un même rayonnement solaire. Les régions peuvent avoir été traitées de la même façon par un produit offrant une protection solaire avant exposition et on peut évaluer l’évolution des modifications structurelles des mélanines en présence d’un produit offrant une protection solaire en fonction de la dose du rayonnement solaire reçue. Dans le cadre d’un échantillon mélanisé telle qu’une solution de mélanine synthétique ou naturelle, cette comparaison pourra se faire entre un aliquot de solution non exposée et un autre exposé. On peut tester l’action d’un produit en comparant des évaluations faites dans une région non traitée ou traitée avec un placebo du produit et dans une région traitée avec ce produit. Le placébo est par exemple le même milieu cosmétique que celui du produit utilisé pour le traitement mais sans le ou les actifs correspondants. L’invention a encore pour objet, selon un autre de ses aspects, un procédé pour évaluer l’efficacité d’au moins un traitement sur l’action d’un stimulus, notamment un rayonnement solaire tels que les UV, sur un échantillon mélanisé ou un tissu biologique, notamment sur la peau reconstruite ou la peau humaine ex vivo ou in vivo , dans lequel au moins deux régions du tissu ou deux aliquots de l’échantillon mélanisé sont traités différemment et dans lequel on compare l’information sur la présence et/ou la quantité et/ou la localisation d’au moins un type de mélanines et/ou ses dérivés dans lesdites régions ou aliquots, obtenue à l’aide d’un procédé tel que précédemment défini, avant et après exposition audit stimulus. Le procédé peut permettre d’évaluer la protection offerte par un produit offrant une protection solaire face aux modifications induites par le rayonnement solaire, en comparant les évaluations réalisées dans au moins deux régions différentes du tissu biologique ou deux aliquots différents d’une solution mélanisée, l’un traité avec le produit et l’autre non-traité ou traité avec un placebo du produit, avant et après exposition à un même rayonnement solaire. Système de mise en œuvre L’invention a encore pour objet, selon un autre de ses aspects, un système pour la mise en œuvre d’un procédé selon l’invention, comportant : - une unité d’acquisition des images multiphoton FLIM, - un moyen de calcul, notamment une unité capable de stocker les images et/ou de les envoyer à un calculateur intégré ou à un serveur de calcul distant par le biais d’une connexion filaire ou sans fil, ce moyen de calcul étant configuré pour générer à partir de la ou des images acquises, au moins une information relative à la présence, quantification et/ou localisation des eumélanines et/ou des phéomélanines et/ou des mélanines mixtes et/ou dérivés, en se basant sur la connaissance des paramètres de durée de vie de fluorescence calculés par analyse phasor ou par approximation bi-exponentielle du déclin temporel propre de l’intensité de fluorescence des eumélanines, des phéomélanines ou des mélanines mixtes, notamment lorsque considérées isolément, et de présenter cette information sous la forme de texte et/ou d’image via une interface utilisateur. La ou les images acquises par l’unité d’acquisition sont transmises pour traitement au moyen de calcul pour présenter après traitement au moins une information sous la forme de texte et/ou image via l’interface utilisateur. L’unité d’acquisition des images, par exemple un microscope multiphoton FLIM, peut être séparée du reste du système et reliée par une connexion filaire ou sans fil. Le moyen de calcul peut comporter un calculateur intégré au système, comme mentionné plus haut, comme un microordinateur, ou être distant comme un serveur de calcul connecté au système par une connexion filaire ou sans fil. L’interface utilisateur peut être incluse dans le système ou séparée, comme un écran d’affichage. Le dispositif peut être miniaturisé pour être utilisé au niveau d’un point de conseil ou de vente. L’invention pourra être mieux comprise à la lecture de la description qui va suivre, d’exemples de mise en œuvre non limitatifs de l’invention, et à l’examen du dessin annexé, sur lequel : la représente différentes étapes d’un exemple de procédé de détection conforme à l’invention. la représente des exemples de données brutes multiphoton FLIM montrant le déclin temporel de l’intensité de fluorescence excitée à deux photons de différents types de mélanines natives avant et après exposition à un rayonnement UVA pendant des périodes variées. la illustre des méthodes d’analyse des données multiphoton FLIM : a) une approximation bi-exponentielle ; b) une analyse phasor. la représente des images de distributions spatiales de plusieurs paramètres de durée de vie de fluorescence, calculés par approximation bi-exponentielle, d’eumélanine DHICA, de phéomélanine Dopa-Cystéine(Cys)-1-1 et d’un mélange d’eumélanines et de phéomélanines à un ratio 75% / 25%, avant et après exposition à un rayonnement UVA pendant des périodes variées. la figure 5 illustre des données brutes multiphoton FLIM d’eumélanines de type DHICA avant et après différents temps d’exposition à un même rayonnement UVA et le calcul des paramètres de fraction de mélanines modifiées par les UVA associés dans un graphe phasor. la représente des images de distributions spatiales de plusieurs paramètres de durée de vie de fluorescence de l’eumélanine de type DHICA, calculés par analyse phasor et leurs distributions dans le graphe phasor associé, avant et après exposition à un rayonnement UVA pendant des périodes variées. la représente une série de masques correspondant à des seuillages effectués sur des images de distributions spatiales du paramètre de fraction d’eumélanines DHICA modifiées par les UVA, avant et après exposition à un rayonnement UVA pendant des périodes variées. la représente un exemple de système pour la mise en œuvre d’un procédé de détection conforme à l’invention. Description détaillée On va décrire en référence aux figures 1 à 7 différentes étapes d’un exemple de procédé de détection, quantification et/ou localisation conforme à l’invention. L’étape 1 peut consister à acquérir par imagerie multiphoton FLIM au moins une image bidimensionnelle ou tridimensionnelle d’un tissu biologique ou d’un échantillon mélanisé. Dans une étape 2, on calcule au moins un paramètre de durée de vie de fluorescence à partir des données brutes issues de la ou des images acquises (figure 2). On peut en particulier, approximer la courbe de décroissance de l’intensité de fluorescence par une fonction bi-exponentielle de la forme et extraire les durées de vie de fluorescence et , avec , leurs amplitudes respectives et , ainsi que la durée de vie de fluorescence moyenne pondérée en amplitude et la durée de vie de fluorescence moyenne pondérée en intensité (figures 3a) ou tout autre paramètre issu de la combinaison des paramètres , , et . On peut également calculer des paramètres de fluorescence en utilisant une analyse phasor et en extrayant des paramètres, notamment les coordonnées g et s dans un graphe phasor , les durées de vie de fluorescence pondérée en modulation et en phase et le paramètre de fraction des mélanines, notamment la fraction des mélanines modifiées par les UVA (figures 3b et 5). Ces paramètres peuvent être comparés à des paramètres de référence des eumélanines, phéomélanines et/ou des mélanines mixtes, pour mettre en évidence la présence de certains types de mélanines et/ou de leurs dérivés. L’étape 3 peut comporter la génération d’au moins une image de la distribution spatiale d’au moins l’un desdits paramètres au sein du tissu biologique ou de l’échantillon mélanisé (figures 4 et 6). Dans une étape 4, on peut déterminer au moins une valeur de seuil permettant de catégoriser chaque pixel de l’image et de créer ainsi au moins un masque de la présence d’au moins un type de mélanines et/ou de ses dérivés. A partir de ce masque, est générée une information sur la distribution surfacique et/ou volumique et/ou sur la répartition du fluorophore concerné ( ). La illustre un exemple de système mettant en œuvre un procédé conforme à l’invention. Le dispositif D capture au moyen d’une unité d’imagerie multiphoton FLIM 1 au moins une image d’un échantillon mélanisé ou d’un tissu biologique T. Les images sont conservées et traitées dans une unité de gestion 2 qui envoie des données pour calcul à un serveur intégrée 3a dans D ou distant 3b, communiquant avec D par une connexion filaire ou sans fil. Les résultats des calculs sont retournés à 2, qui transfère au moins une information sous la forme d’une image et/ou d’un texte à une interface 4 à destination d’un utilisateur U. Exemple 1 : évaluation de l’action d ’un rayonnement UV A in tubo Pour évaluer l’effet d’un rayonnement UVA, différents types d’eumélanine (Eu-DHI, Eu-DHICA et Eu-Dopa), de phéomélanine (Phéo-Dopa-Cys-1-1) et un mélange de mélanines (Eu/Phéo-Dopa-Cys-4-1, 75% eumélanine et 25% phéomélanine) ont été préparés en solution ou en suspension. Des images bidimensionnelles (512x512 pixels x 763 canaux de temps, 16 ps / canal temporel ; 12,5 ns plage temporelle) des échantillons ont été acquises avec un microscope multiphoton FLIM (Leica TCS SP8 MP FLIM, Leica, Germany) équipé d’un laser IR pulsé (InSight X3, Spectra-Physics®, Santa Clara, USA; plages de longueurs d’onde d’émission 680 – 1300 nm ; fréquence de répétition de 80,08 MHz, durée de l’impulsion laser 2 . Les données brutes multiphoton FLIM du déclin temporel de l’intensité de fluorescence excitée à deux photons, obtenues à partir des images des différents échantillons sont illustrées pour chaque configuration d’acquisition . Chaque courbe de la illustre le déclin temporel global de l’intensité de fluorescence dans une image et a été normalisé en utilisant la courbe de l’eumélanine native de type DHICA. On constate que l’intensité de fluorescence et la forme que prend sa décroissance varient à la fois entre les différents types de mélanines native mais aussi avant et après différents temps d’exposition à un rayonnement UVA pour chaque échantillon. Par approximation bi-exponentielle sous la forme (figure 3a), les durées de vie de fluorescence et , les amplitudes et , ainsi que les durées de vie de fluorescence moyennes pondérées en amplitude et en intensité ont été calculées pour chaque pixel des images. Cette analyse bi-exponentielle a été réalisée grâce au logiciel SymPhoTime 64 (v2.1.3813, Picoquant, Berlin, Germany) en effectuant préalablement un « binning » (regroupement de données) spatial et temporel des images pour augmenter l’intensité du signal dans chaque canal temporel. La représente les distributions spatiales au sein des images de chacun des paramètres mentionnés ci-dessus pour les eumélanines de type DHICA, la phéomélanine et le mélange d’eumélanines et de phéomélanines. On peut également utiliser une analyse phasor pour calculer d’autres paramètres de durée de vie de fluorescence. Cette approche transforme, par le biais de la transformée de Fourier, chaque déclin temporel de l’intensité de fluorescence en un phasor (mode de représentation d’une fonction). Celui-ci peut être représenté dans un graphe (histogramme) par des coordonnées g et s , correspondant respectivement aux parties réelle et imaginaire de la transformée de Fourier, qui peuvent aussi s’exprimer comme une fonction de la modulation et de l’angle de phase φ (figure 3b). Le déclin temporel de l’intensité de fluorescence de chaque pixel d’une image est représenté par un point du graphe phasor, identifié par des coordonnées g , s . Chaque point du graphe phasor peut ainsi être associé à un pixel de l’image et réciproquement. Les pixels de l’image avec des déclins temporels de l’intensité similaires, c’est-à-dire ayant des propriétés similaires de durée de vie de fluorescence, ont des coordonnées proches et sont donc regroupés sur le graphe phasor. Dans un graphe phasor, les pixels des images de fluorophores ayant une courbe de déclin temporel de l’intensité de fluorescence suivant une forme mono-exponentielle, sont situés sur le demi-cercle (représenté en rouge dans les graphes de la figure 5) de rayon 0.5 reliant les points de coordonnées (1,0) et (0,0) comme cela est illustré pour les fluorophores A et B figure 3b. Un mélange de ces deux fluorophores a une courbe de déclin suivant une forme bi-exponentielle et sa représentation dans le graphe de l’analyse phasor est située à l’intérieur du demi-cercle précédemment mentionné, sur une droite reliant les deux positions des fluorophores A et B. Les fractions et correspondant aux proportions de chacun des fluorophores dans le mélange peuvent être déterminées en calculant la distance de la position du mélange dans le graphe par rapport aux positions des fluorophores B et A. Ce calcul peut être extrapolé à un mélange de n fluorophores, où le phasor du mélange est situé à l’intérieur d’un polygone à n sommets correspondant aux n positions des phasors de chaque fluorophore. Pareillement, la contribution de chaque fluorophore au mélange peut être déterminée en utilisant les aires des polygones. Les mélanines natives, ayant un déclin temporel de l’intensité de fluorescence pouvant être approximé par une fonction bi-exponentielle, sont représentées par des phasors situés à l’intérieur du demi-cercle. Sous l’effet de l’exposition à un rayonnement solaire tel que les UVA, les mélanines natives se transforment en un mélange de mélanines natives et de dérivés. En utilisant la distance séparant la position du phasor des mélanines natives et du phasor du mélange après exposition au rayonnement UVA, on peut ainsi calculer le paramètre de fraction de mélanines modifiées par les UVA comme illustré pour l’eumélanine de type DHICA . Le rond rose de la représente la moyenne des coordonnées g et s du phasor des mélanines natives, considéré comme la position de référence du phasor. Les paramètres de durées de vie de fluorescence moyenne pondérées en modulation et en phase , où f est le taux de répétition du laser du microscope, peuvent également être calculés. La illustre les distributions spatiales de ces paramètres au sein des images et représente également les distributions de ces paramètres dans le graphe phasor légendé par une échelle de niveaux de gris selon chacun de ces paramètres. En utilisant la distribution du paramètre de fraction de mélanines modifiées par les UVA calculé sur un échantillon d’eumélanines de type DHICA (figures 5 et 6), on peut déterminer des valeurs de seuil pour isoler les dérivés des eumélanines natives. La représente : en première colonne, les images de distributions spatiales du paramètre de fraction de mélanines modifiées par les UVA dans l’échantillon d’eumélanines DHICA avant, après un jour et après 7 jours d’exposition à un rayonnement UVA. en deuxième colonne, les masques obtenus en seuillant les images paramétriques de la première colonne en utilisant un seuil de 0.12. Tout pixel supérieur à ce seuil, représenté en blanc, contient un mélange d’eumélanines natives et de ses dérivés. Le masque de l’image avant exposition est entièrement noir car aucun pixel ne contient de dérivés photo-induits d’eumélanines DHICA natives. Après exposition peu importe la durée, chaque pixel contient un mélange d’eumélanines et de ses dérivés (fortement ou très fortement modifiés par les UVA, i.e. ayant une fraction grande ou très grande) et les masques correspondants sont donc entièrement blancs. en troisième colonne, les masques obtenus en seuillant les images paramétriques de la première colonne en utilisant un seuil minimum 0.12 et un seuil maximum 0.34. Les pixels de valeur comprise entre ces deux seuils contiennent un mélange d’eumélanines DHICA avec une forte proportion de dérivés photo-induits et sont représentés en blanc. Un tel cas ne s’observe que lors d’une exposition d’un jour à un rayonnement UVA. en quatrième colonne, les masques obtenus en seuillant les images paramétriques de la première colonne en utilisant un seuil de 0.34. Les pixels supérieurs à ce seuil contiennent un mélange d’eumélanines DHICA avec une très forte proportion de dérivés photo-induits. Un tel cas ne s’observe que lors d’une exposition de 7 jours à un rayonnement UVA. A partir de ces masques, une information sur la présence, quantité et répartition des dérivés et des mélanines natives peut alors être générée, comme la surface volumique occupée par les dérivés au sein de l’échantillon. L’invention n’est pas limitée aux exemples qui viennent d’être décrits. Par exemple, des images de distributions spatiales d’autres paramètres phasor ou des paramètres issus de l’analyse bi-exponentielle comme les durées de vie et , leurs amplitudes ou des paramètres combinatoires de ceux-ci peuvent être utilisées pour générer des masques. Le choix de la valeur de seuil peut être déterminé dans le but d’isoler un type de mélanines au sein d’un mélange de mélanines natives et de leurs dérivés. Procédé de détection, quantification et/ou localisation des eumélanines et/ou des phéomélanines et/ou des mélanines mixtes et/ou de leurs dérivés au sein d’un tissu biologique ou d’un échantillon mélanisé, le procédé comportant les étapes consistant à : acquérir par imagerie multiphoton FLIM, au moins une image du tissu biologique ou de l’échantillon mélanisé, générer à partir de la ou des images acquises, au moins une information relative à la présence, quantification et/ou localisation des eumélanines et/ou des phéomélanines et/ou des mélanines mixtes et/ou de leurs dérivés, en se basant sur la connaissance du déclin temporel propre de l’intensité de fluorescence excitée à plusieurs photons, notamment deux photons, d’au moins un type d’eumélanines, d’au moins un type de phéomélanines et/ou d’au moins un type de mélanines mixtes, notamment lorsque considérés isolément. Procédé selon la revendication 1, comportant l’identification d’au moins un type de mélanines et/ou ses dérivés en approximant le déclin temporel de l’intensité de fluorescence obtenue à partir de la ou des images FLIM acquises par une fonction multi-exponentielle et en comparant au moins un des paramètres de fluorescence calculés par cette approximation avec des paramètres de référence d’au moins un type d’eumélanines, d’au moins un type de phéomélanines et/ou d’au moins un type de mélanines mixtes. Procédé selon la revendication 2, la fonction multi-exponentielle étant de la forme et des paramètres de durée de vie de fluorescence courte et longue étant et , avec , et leurs amplitudes respectives et , ainsi que les durées de vie de fluorescence moyennes pondérées en amplitude et en intensité , ou tout autre paramètre issu de la combinaisons des paramètres , , et . Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, comportant l’identification d’au moins un type de mélanines et/ou ses dérivés en utilisant une analyse phasor et en extrayant des paramètres de durée de vie de fluorescence, notamment les coordonnées g et s dans un graphe phasor , les durées de vie de fluorescence pondérées en modulation et en phase et les paramètres de fraction des mélanines, notamment la fraction des mélanines modifiées par les UVA , calculés en utilisant comme références les paramètres de durée de vie de fluorescence des eumélanines, phéomélanines et/ou des mélanines mixtes. Procédé selon l’une quelconque des revendications 2 à 4, dans lequel on génère au moins une information représentative, notamment une image, de la distribution spatiale au sein du tissu biologique ou de l’échantillon mélanisé d’au moins l’un des paramètres de durées de vie de fluorescence, et l’on détermine au moins à partir de cette distribution au moins une information sur la densité volumique ou surfacique d’au moins un type de mélanines et/ou de ses dérivés au sein du tissu biologique ou de l’échantillon mélanisé. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel on détecte, quantifie et/ou localise au moins un dérivé photo-induit des eumélanines et/ou des phéomélanines et/ou des mélanines mixtes, en particulier ceux induits par les rayonnements ultra-violets (UV), notamment UVA et/ou la lumière bleue. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, la ou les images étant obtenues au moyen d’une excitation multiphoton dans l’infrarouge proche, en particulier dans la gamme 700-900 nm. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, étant mis en œuvre in tubo dans un échantillon mélanisé en solution, suspension ou poudre, in vitro sur des cellules en culture tels que les mélanocytes ou sur peau reconstruite ou ex vivo ou in vivo sur un tissu biologique, notamment sur la peau humaine. Procédé pour évaluer l’effet d’un stimulus, notamment un rayonnement lumineux, et/ou d’un traitement, notamment propigmentant, dépigmentant, anti-oxydant ou offrant une protection solaire sur un échantillon mélanisé ou un tissu biologique, notamment sur la peau reconstruite, la peau humaine ex vivo ou in vivo , ou sur des cellules en culture, comportant les étapes consistant à : détecter, quantifier et/ou localiser au moins un type de mélanines et/ou ses dérivés au sein de l’échantillon mélanisé ou tissu biologique à l’aide du procédé de détection selon l’une quelconque des revendications précédentes, répéter l’étape a), après que l’échantillon ou tissu a été exposé à l’action dudit stimulus ou traitement, comparer les informations générées par les deux évaluations et générer au moins une information relative à l’action du stimulus ou du traitement sur l’échantillon ou tissu à partir au moins de cette comparaison. Procédé selon la revendication précédente, le traitement étant un produit cosmétique, notamment propigmentant, dépigmentant, anti-pigmentant, antioxydant ou un filtre solaire. Procédé pour évaluer l’action d’un stimulus et/ou d’un traitement sur un échantillon mélanisé ou un tissu biologique, notamment de la peau reconstruite ou de la peau humaine, dans lequel au moins deux régions du tissu ou deux aliquots de l’échantillon mélanisé sont exposés différemment au stimulus et/ou au traitement, notamment à différents temps d’exposition à un rayonnement solaire tels que les UV et donc à différentes doses du rayonnement solaire, et dans lequel on compare l’information sur la présence et/ou la quantité et/ou la localisation d’au moins un type de mélanines et/ou ses dérivés dans lesdites régions ou aliquots, obtenue selon l’une quelconque des revendications1 à 8, avant et après exposition audit stimulus ou audit traitement. Procédé pour évaluer l’efficacité d’au moins un traitement sur l’action d’un stimulus, notamment un rayonnement solaire tels que les UV, sur un échantillon mélanisé ou un tissu biologique, notamment sur la peau reconstruite ou la peau humaine, dans lequel au moins deux régions du tissu ou deux aliquots de l’échantillon mélanisé sont traités différemment et dans lequel on compare l’information sur la présence et/ou la quantité et/ou la localisation d’au moins un type de mélanines et/ou ses dérivés dans lesdites régions ou aliquots, obtenue selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, avant et après exposition audit stimulus. Système (D) pour la mise en œuvre du procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, comportant une unité (1) permettant d’acquérir au moins une image multiphoton FLIM d’un tissu biologique ou d’un échantillon mélanisé, et un moyen de calcul, notamment une unité (2) capable de stocker la ou les images et/ou de les envoyer à un calculateur intégré (3a) ou à un serveur de calcul distant (3b) par le biais d’une connexion filaire ou sans fil, ce moyen de calcul étant configuré pour générer à partir de la ou des images acquises, au moins une information relative à la présence, quantification et/ou localisation des eumélanines et/ou des phéomélanines et/ou des mélanines mixtes et/ou dérivés, en se basant sur la connaissance des paramètres de durée de vie de fluorescence calculés par analyse phasor ou par approximation bi-exponentielle du déclin temporel propre de l’intensité de fluorescence des eumélanines, des phéomélanines ou des mélanines mixtes, notamment lorsque considérées isolément, et de présenter cette information sous la forme de texte et/ou d’image via une interface utilisateur (4).