Brevet FR3139630A1 — publié le 20240315

PROCEDE D’IDENTIFICATION D’EPITOPES CONFORMATIONNELS La présente invention concerne un procédé d’identification d’un épitope conformationnel d’un antigène protéique formé d’au moins deux peptides distincts comprenant des séquences issues de l’antigène protéique, comprenant : - une étape de sélection d’au moins un premier peptide comprenant une séquence issue de l’antigène protéique reconnu par au moins une composition comprenant des anticorps ou des lymphocytes B porteurs d’anticorps issue d’au moins un individu immunisé contre l’antigène protéique, et - une étape de sélection d’au moins un deuxième peptide comprenant une séquence issue de l’antigène protéique localisé à une distance de 3.10 -9 m ou moins du premier peptide dans une structure tridimensionnelle de l’antigène protéique et reconnu par au moins une composition comprenant des anticorps ou des lymphocytes B porteurs d’anticorps issue d’au moins un individu immunisé contre l’antigène protéique de l’étape précédente, dans lequel l’au moins un premier peptide et l’au moins un deuxième peptide forment un épitope conformationnel de l’antigène protéique. ( pas de figure ) PROCEDE D’IDENTIFICATION D’EPITOPES CONFORMATIONNELS Domaine de l’invention La présente invention concerne un procédé d’identification d’épitopes conformationnels, ainsi qu’un procédé de préparation d’anticorps dirigés contre lesdits épitopes conformationnels. Arrière-plan technique L'intérêt pour les anticorps monoclonaux thérapeutiques ne cesse de croître, année après année. En effet, leur affinité hautement spécifique des antigènes permet de fournir des traitements médicaux très efficaces. Ainsi, de 2005 à 2017 le nombre d’anticorps monoclonaux approuvés par l’agence américaine du médicament est passé de 2 à 64. Toutefois, il reste un obstacle critique à surmonter pour préparer des anticorps monoclonaux efficaces. En effet, la sélection des Lymphocytes B à partir desquels sont dérivés les anticorps monoclonaux se fait souvent par un criblage parmi tous les anticorps reconnaissant tout ou partie de la structure tridimensionnelle de l’antigène protéique ciblé, et ce criblage avec de nombreuses étapes reste complexe comme expliqué dans l’article de Saeed et al . (2017) Front. Microbiol . 8 :495. On obtient aussi souvent des anticorps ciblant des épitopes linéaires qui présentent généralement une moins bonne affinité que les anticorps conformationnels qui reconnaissent simultanément des parties distinctes de la structure tridimensionnelle de l’antigène protéique. Ces anticorps conformationnels correspondent à des épitopes issus de la structure tridimensionnelle, tertiaire ou quaternaire des protéines qui permettent le plus souvent d’obtenir la meilleure affinité pour les anticorps et ainsi d’assurer au mieux leurs fonctions biologiques, notamment la neutralisation de leur cible. Cette neutralisation par l’anticorps monoclonal produit peut se faire par blocage direct de la protéine en question par l’anticorps ou encore par opsonisation du micro-organisme ciblé par cet anticorps. Dans ce dernier cas, la région constante des anticorps peut notamment contenir des séquences peptidiques particulières permettant la reconnaissance par des récepteurs de cellules du système immunitaire ou la reconnaissance par le système du complément. Ainsi, permettre l’obtention d’anticorps monoclonaux spécifiques d’épitopes conformationnels, reconnaissant donc la structure tridimensionnelle des antigènes cibles, devrait améliorer l’avidité de ces anticorps, et donc leur utilisation comme outils à usage expérimental, comme marqueurs à usage diagnostic, ou comme traitements immunothérapeutiques. Dans ce cadre, Tsumoto et al . (2019) Immunotherapy 11 :119–127 proposent de préparer des anticorps monoclonaux dirigés contre des épitopes conformationnels d’un antigène en immunisant des souris à l’aide de molécules d’ADN codant l’antigène, d’isoler les lymphocytes B puis de les fusionner avec des cellules de myélome exprimant cet antigène pour obtenir des hybridomes produisant des anticorps monoclonaux spécifiques de la structure tridimensionnelle de l’antigène. Toutefois, si ce procédé permet bien d’obtenir des anticorps monoclonaux dirigés contre des épitopes conformationnels, il est relativement complexe à mettre en œuvre. Il reste donc à fournir un procédé simple à mettre œuvre permettant d’identifier des épitopes conformationnels et d’obtenir des anticorps monoclonaux dirigés contre ces épitopes conformationnels. La présente invention découle de la mise en évidence inattendue, par les inventeurs, qu’il était possible d’identifier des épitopes conformationnel d’un antigène protéique en combinant le criblage de peptides issus de l’antigène protéique vis-à-vis de sérum d’individus immunisés contre l’antigène protéique et la localisation des peptides les uns par rapport aux autres dans la structure tridimensionnelle de l’antigène protéique. La présente invention concerne un procédé d’identification d’un épitope conformationnel d’un antigène protéique formé d’au moins deux peptides distincts comprenant des séquences issues de l’antigène protéique, comprenant : - une étape de sélection d’au moins un premier peptide comprenant une séquence issue de l’antigène protéique reconnu par au moins une composition comprenant des anticorps ou des lymphocytes B porteurs d’anticorps issue d’au moins un individu immunisé contre l’antigène protéique, et - une étape de sélection d’au moins un deuxième peptide comprenant une séquence issue de l’antigène protéique localisé à une distance de 3.10 -9 m ou moins du premier peptide dans une structure tridimensionnelle de l’antigène protéique et reconnu par au moins une composition comprenant des anticorps ou des lymphocytes B porteurs d’anticorps issue d’au moins un individu immunisé contre l’antigène protéique de l’étape précédente, dans lequel l’au moins un premier peptide et l’au moins un deuxième peptide forment un épitope conformationnel de l’antigène protéique. La présente invention concerne également une pluralité de peptides distincts dont les séquences respectives sont issues de la séquence de l’antigène protéique, chacun des peptides distincts étant lié à un fluorophore ayant une longueur d’onde d’émission de fluorescence distincte. La présente invention concerne également un procédé de sélection de lymphocytes reconnaissant un antigène protéique à partir d’une population de cellules, comprenant une étape d’identification d’au moins un lymphocyte se liant à au moins deux peptides distincts comprenant des séquences issues de l’antigène protéique formant un épitope conformationnel de l’antigène protéique, dans lequel l’épitope conformationnel est identifié par la mise en œuvre du procédé d’identification d’un épitope conformationnel tel que défini ci-dessus. La présente invention concerne également un procédé de préparation d’au moins un anticorps, ou fragment d’anticorps, dirigé contre un antigène protéique, dans lequel l’anticorps, ou le fragment d’anticorps, est préparé à partir d’au moins un lymphocyte B obtenu par la mise en œuvre du procédé de sélection de lymphocytes tel que défini ci-dessus. Description détaillée de l’invention Comme on l’entend ici, le terme « comprenant » est synonyme « d’incluant », « contenant » ou « englobant » c’est-à-dire que lorsqu’un objet « comprend » une ou plusieurs caractéristiques, d’autres caractéristiques que celles mentionnées peuvent également être comprises dans l’objet. A l’inverse, l’expression « consistant en » signifie « constitué de », c’est-à-dire que lorsqu’un objet « consiste en » une ou plusieurs caractéristiques, l’objet ne peut pas comprendre d’autres caractéristiques que celles mentionnées. Composition L’au moins une composition comprenant des anticorps ou des lymphocytes B porteurs d’anticorps est de tout type susceptible de comprendre des lymphocytes B ou des anticorps. L’au moins une composition peut provenir d’un seul individu ou de plusieurs individus. De préférence, l’au moins une composition est obtenue à partir d’un échantillon ou d’un prélèvement biologique d’un ou plusieurs individus, tel qu’un échantillon ou un prélèvement de sang total, de sérum, d’ascite, ou de moelle osseuse. De préférence, l’au moins une composition est une population de cellules mononuclées du sang périphérique (PBMCs, « peripheral blood mononuclear cells »). L’au moins une composition peut comprendre uniquement des lymphocytes B ou être enrichie en lymphocytes B. Cette sélection peut notamment se faire à l’aide de ligands, notamment d’anticorps, ciblant des marqueurs membranaires spécifiques de lymphocytes B, les anticorps pouvant être couplés à des billes magnétiques ou à des luminophores, notamment des fluorophores, pour faciliter la détection, la sélection, l’isolement ou la purification des complexes lymphocyte-anticorps. Par « lymphocyte B » on entend toute cellule de la lignée B, comme par exemple, un lymphocyte B naïf, un lymphocyte B activé, un lymphocyte B mémoire, un plasmablaste ou un plasmocyte, notamment à longue durée. Comme cela apparaitra clairement à la personne du métier, les lymphocytes B reconnaissent l’antigène protéique par l’intermédiaire des anticorps qu’ils portent. Anticorps Comme on l’entend ici, le terme « anticorps » englobe les anticorps en entier ainsi que les fragments d’anticorps comprenant au moins une partie de liaison à l’antigène, tels que les fragments V L et/ou V H , Fab, F(ab’) 2 , et scFv. L’anticorps selon l’invention peut être issu d’une seule espèce, être chimérique, humanisé ou encore humain. L’anticorps selon l’invention peut être monospécifique ou bispécifique. Par ailleurs, l’anticorps selon l’invention peut être monomérique ou multimérique, notamment dimérique ou pentamérique. L’anticorps selon l’invention peut être d’isotype A, D, E, G ou M, de préférence G. L’anticorps dirigé contre un antigène protéique est de préférence un anticorps, reconnaissant un épitope conformationnel de l’antigène protéique. L’anticorps dirigé contre un antigène protéique est de préférence un anticorps spécifique d’une structure tridimensionnelle de l’antigène protéique. L’anticorps dirigé contre un antigène protéique est de préférence un anticorps monoclonal. L’anticorps dirigé contre un antigène protéique peut être préparé à partir d’un lymphocyte B purifié, par de nombreuses techniques bien connues de la personne du métier. A titre d’exemple, le lymphocyte B, éventuellement après multiplication clonale, peut être fusionné avec une cellule de myélome pour donner un hybridome producteur d’anticorps monoclonal. A titre d’exemple également, les séquences d’ADN codant pour tout ou partie de l’anticorps, notamment ses parties variables, peuvent être clonées, notamment à partir des ARN messagers du lymphocyte, puis être exprimées, par voie recombinante, par des cellules de culture, éventuellement après insertion dans une structure d’anticorps humanisés. Individu De préférence, l’individu immunisé contre l’antigène protéique est un mammifère non humain ou un humain. L’immunisation contre l’antigène protéiques peut être naturelle, due à un agent infectieux, tel qu’un virus, une bactérie ou un eucaryote, qui porte et/ou exprime l’antigène protéique chez l’individu. L’immunisation contre l’antigène protéique peut également être induite artificiellement, notamment par immunisation active à l’aide d’un vaccin comprenant l’antigène protéique ou une partie de celui-ci ou induisant la production de l’antigène protéique chez l’individu, en particulier un vaccin vivant, notamment atténué, un vaccin inactivé, un vaccin sous-unitaire, un vaccin à vecteur viral ou un vaccin à ADN ou à ARN. Comme on l’entend ici un « fort répondeur » est un individu dont la réponse immunitaire à l’encontre d’un peptide ou de l’antigène protéique est forte par rapport à celle d’autres individus appartenant à une même population d’individus. Peptides Comme on l’entend ici, des séquences issues de l’antigène protéique sont des portions ou des fragments de séquences de résidus d’acides aminés contigus de la séquence de résidus d’acide aminés totale de l’antigène protéique. De préférence, la séquence de l’antigène protéique est fragmentée en au moins 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 ou 500 séquences de peptide distinctes. De préférence, la séquence de l’antigène protéique est fragmentée en au plus 1000, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 ou 5 séquences de peptide distinctes. De préférence, les aux moins deux peptides distincts sont au moins trois, quatre ou cinq peptides distincts. De préférence, les aux moins deux peptides distincts sont au plus six, cinq ou quatre peptides distincts. De préférence, les au moins deux peptides distincts comprennent respectivement de 6 à 50 résidus d’acides aminés, 6 à 40 résidus d’acides aminés, 6 à 30 résidus d’acides aminés, 6 à 25 résidus d’acides aminés, 6 à 20 résidus d’acides aminés, 6 à 15 résidus d’acides aminés, 10 à 30 résidus d’acides aminés, 10 à 20 résidus d’acides aminés, 12 à 20 résidus d’acides aminés, 10 à 18 résidus d’acides aminés, ou 10 à 15 résidus d’acides aminés. De préférence, les au moins deux peptides distincts comprennent respectivement au moins 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 résidus d’acides aminés. De préférence, les au moins deux peptides distincts comprennent respectivement au plus 50, 40, 30, 25, 20 ou 15 résidus d’acides aminés. De préférence, les au moins deux peptides comprennent des séquences non chevauchantes issues de l’antigène protéique. Comme on l’entend ici, des séquences non chevauchantes sont telles qu’elles ne se recouvrent pas au sein de la structure primaire de l’antigène, il s’agit de peptides disjoints. De préférence, les au moins deux peptides sont à une distance entre eux de 3.10 -9 m (30 Angstrom), 2,5.10 -9 (25 Angstrom) 2.10 -9 m (20 Angstrom), 10 -9 m (10 Angstrom) ou moins dans la structure tridimensionnelle de l’antigène protéique. La structure tridimensionnelle de l’antigène protéique peut être obtenue par cristallographie aux rayons, par résonnance magnétique nucléaire (RMN), microscopie ou encore par prédiction informatique de structure tridimensionnelle, par exemple à l’aide du logiciel Alphafold 2 (Jumper et al . (2021) Nature 596 :583–589 ; URL : alphafold.ebi.ac.uk). La distance entre les au moins deux peptides distincts peut être calculées de nombreuses manières bien connues de la personne du métier. Il peut s’agir de la moyenne des distances entre chaque résidu d’acide aminé d’un des peptides vis-à-vis de chaque résidu d’acide aminé de l’autre ou des autres peptides. De préférence, il s’agit de la distance minimale parmi les distances respectives entre chaque résidu d’acide aminé d’un des peptides vis-à-vis de chaque résidu d’acide aminé de l’autre ou des autres peptides. Comme on l’entend ici, la distance entre deux résidus acides aminés est la distance entre les centres respectifs de carbones en alpha de chaque résidu. Antigène L’antigène protéique selon l’invention peut être une protéine ou un complexe protéique de tout type. Il peut notamment s’agir d’une protéine monomérique ou multimérique, notamment homomultimérique ou hétéromultimérique. De préférence, l’antigène protéique est composé d’une ou de plusieurs protéines comprenant au plus 5000, 2500, 1000 ou 500 résidus d’acides aminés. De préférence, l’antigène protéique est composé d’une protéine ou de plusieurs protéines comprenant au moins 25, 50, 75, 100 ou 200 résidus d’acide aminés. De préférence, l’antigène protéique est composé d’une protéine ou de plusieurs protéines comprenant de 25 à 5000, plus préférablement de 50 à 2500, encore plus préférablement de 75 à 2000 résidus d’acides aminés. L’antigène protéique peut être constitué uniquement de résidus d’acides aminés ou comprendre des composants aprotéiques en plus des résidus d’acides aminés. La protéine peut être substituée par au moins polysaccharide et/ou au moins lipide. Par ailleurs, la protéine peut comprend un ou plusieurs groupements prosthétiques, tels qu’un groupement héminique, un cofacteur, un acide nucléique ou un cluster fer-souffre. L’antigène protéique peut être issu de tout type d’organisme. De préférence, l’antigène protéique est issu d’un agent infectieux ou d’une protéine humaine ou animale. L’antigène protéique peut notamment être obtenu par purification à partir de l’organisme le produisant naturellement ou par voie recombinante, à partir de cultures cellulaires de tout type (eucaryotes ou procaryotes). Reconnaissance De préférence la reconnaissance des peptides par au moins une composition comprenant des anticorps ou des lymphocytes B porteurs d’anticorps est déterminée à l’aide de plaques miniaturisées (« micro-arrays » aussi nommées puce ELISA) de peptides, ou par expression de phage (« phage display ») des peptides, ou par ELISA contre les peptides. Ces techniques sont bien connues de la personne du métier mettant en œuvre des cartographies d’épitopes (« epitope mapping » ). De préférence, les peptides sont marqués par des fluorophores différents et leur reconnaissance par au moins une composition comprenant des lymphocytes B porteurs d’anticorps est mesurée par triage de cellules assisté par fluorescence (FACS). On utilisera dans ce cas un FACS permettant la détection simultanée d’au moins 5, 10, 15, 20 ou 25 longueurs d’onde de fluorescence différentes. Modes de réalisation préférés Dans un premier mode de réalisation du procédé d’identification d’un épitope conformationnel tel que défini ci-dessus, l’au moins un premier peptide et l’au moins un deuxième peptide sont sélectionnés parmi une pluralité de peptides distincts comprenant une séquence issue de l’antigène protéique du fait de leur reconnaissance par au moins une composition comprenant des anticorps ou des lymphocytes B porteurs d’anticorps issue d’au moins deux individus distincts immunisés contre l’antigène protéique. De préférence, selon ce premier mode de réalisation, les au moins deux individus distincts sont des forts répondeurs à l’au moins un premier peptide et l’au moins un deuxième peptide parmi une pluralité d’individus distincts immunisés contre l’antigène protéique. Selon ce premier mode de réalisation on met en œuvre un epitope mapping par puce ELISA où la protéine est découpée en peptides, si possible chevauchants, qui la recouvrent intégralement et on peut mesurer les réponses d’une composition d’anticorps contre les peptides simultanément. Alternativement, on peut utiliser une approche de phage-display, où les séquences exprimées peuvent correspondre aux protéines ciblées ou encore peuvent être aléatoires. Dans ce dernier cas, on ne prendra en considération que les zones des protéines ciblées qui ressemblent suffisamment à la séquence de peptides présentés par les phages et qui sont identifiés comme “positifs“. La structure tridimensionnelle de l’antigène protéique (éventuellement plusieurs si l’antigène a plusieurs conformations possibles) est utilisée pour calculer les distances entre les peptides. Cette distance peut correspondre à la distance la plus petite qui sépare les acides aminés des deux peptides, mais d’autres modes de calcul de distance peuvent être utilisés, par exemple la distance entre les acides aminés centraux des peptides. Si la structure tridimensionnelle de la protéine n’est pas disponible, on peut la prédire avec des outils de prédictions très fiables comme Alphafold 2. Une fois ces données connues, on dispose ainsi d’une matrice de distance entre tous les peptides deux à deux. On peut aussi procéder à des matrice 3x3 si on veut affiner la méthode en travaillant directement au niveau tridimensionnel sur des triplets de peptides disjoints, voire 4x4 ou plus, en identifiant par exemple tous les peptides à une distance inférieure à 3.10 -9 m les uns des autres. On recherche ensuite les peptides pour lesquels les compositions présentent des réponses parallèles ou corrélées, ce qui veut dire par exemple qu’on retrouve les mêmes sujets forts répondeurs contre ces peptides au sein d’un groupe. Comme en général, il n’y a qu’une fraction des sujets qui répondent de manière forte à un peptide donné (rarement plus de la moitié voire rarement plus du tiers), on va rechercher les peptides pour lesquels les « forts répondeurs du groupe » sont les mêmes. On va rechercher par exemple les peptides pour lesquels les sujets situés dans le percentile supérieur en terme des réponse anticorps (par exemple 25%, 30%, voire 50%) sont les mêmes à x individus près. Plus le nombre d’individus dans l’étude est faible plus x sera faible, plus le nombre d’individus étudiés sera élevé plus x pourra être élevé. Typiquement, si on étudie les réponses d’un groupe de 24 individus, on pourra prendre le 25% supérieur (6 individus) ou le 33% supérieur (8 individus) avec une flexibilité possible d’un individu différent dans la population supérieure choisie, aboutissant respectivement à 5 ou 7 individus forts répondeurs en commun sur les 6 ou 8 du percentile supérieur respectivement. Si on dispose de 60 compositions on pourra prendre par exemple le 25% supérieur ou le 30% supérieur, respectivement 15 ou 18 individus communs, avec une flexibilité de 1, 2, ou 3 individus voire plus, respectivement 13, 14 ou 15 individus communs sur 15, ou 15, 16, 17, ou 18 individus sur 18. Pour faire ces calculs, on peut utiliser un logiciel de tests flexible qui permet de lister le nombre d’individus communs obtenus selon les couples, ou triplets, de peptides et les conditions choisies. Alternativement, on peut essayer d’utiliser des coefficients de corrélation entre les réponses contre les peptides, mais cela peut-être moins précis, à moins de se limiter aux groupes de patients à forte réponse, issus des percentiles de réponse anticorps élevés. Suite aux opérations précédentes, on obtiendra un tableau de couples, ou triplets, de peptides avec les coefficients, à savoir nombres de forts répondeurs en communs ou bien coefficients de corrélation, pour chaque couple de peptide. A partir de ces résultats, nombre de compositions forts répondeurs communs ou fort coefficient de corrélation, on peut ainsi définir les meilleurs couples de peptides qui satisfont des critères suffisamment stringents en terme de nombres de forts répondeurs en commun ou en terme de coefficients de corrélation élevés. Si on travaille sur les réponses anticorps contre plusieurs protéines en même temps, une façon de différencier les meilleures corrélations de couples de peptides issus de la même protéine du bruit de fond sera de regarder les meilleures valeurs trouvées pour les couples de peptides situés sur des protéines différentes. Normalement ces couples ne correspondent pas à un épitope conformationnel sauf si les protéines forment un multimère, et on peut donc prendre comme nombre seuil à considérer la meilleure valeur trouvée en inter-protéines ou bien cette meilleure valeur moins un. Comme on connaît les distances entre peptides, pour chaque protéine étudiée, on peut différencier les couples de peptides disjoints avec une distance inférieure à 30, 25 ou 20 Angstrom ( i.e . 3.10 -9 , 2,5.10 -9 ou 2.10 -9 m), correspondant à la taille d’un épitope potentiel d’anticorps, et ceux avec une distance supérieure à 20, 25 ou 30 Angstrom. Comme on l’a vu, ce seuil de distance est important car des études ont montré qu’un épitope reconnu par un anticorps, épitope B, mesure en moyenne 10 à 15 Angstrom avec un maximum de 26-30 Angstrom (Cao et al . (2011) Immunome Research 7:3:1), mais on peut bien-sûr faire varier cette valeur pour prendre des distances plus petites par exemple 10, 15, ou 20 Angstrom, ou des distances plus grandes de 30 voire 35 Angstrom. Il a été observé par les inventeurs que le nombre de couples de peptides présentant une forte valeur de corrélation dans la matrice des couples de peptides est très significativement augmenté en proportion pour les couples ayant une distance inférieure à 25 Angstrom. La seule explication possible pour cet enrichissement en couples de peptides proches, par exemple pour un seuil de distance maximal de 25 Angstrom, est que ces couples de peptides correspondent à des peptides reconnus par les mêmes anticorps dans un sérum donné. Une fois ces épitopes conformationnels identifiés, il est aisé de faire le clonage d’anticorps. On peut en effet identifier les sujets immunisés qui ont une réponse commune contre les deux, ou trois, peptides parce que ce sont ces sujets justement qui ont servi à sélectionner le couple, ou le triplet, de peptides formant un épitope conformationnel. Parmi tous les couples de peptides possibles, on pourra avoir une préférence pour les peptides présentant des valeurs ELISA plus élevées. Parmi les patients possibles, on pourra aussi choisir ceux qui présentent des valeurs ELISA les plus élevées. Une fois ces sujets producteurs d’anticorps conformationnels (et potentiellement neutralisants) identifiés, plusieurs méthodes expérimentales sont alors possibles pour cloner des lymphocytes B producteurs d’anticorps à partir de leurs PBMCs, et ce, grâce à la connaissance des peptides de l’épitope conformationnel. Toute méthode de sélection des lymphocytes B reconnaissant les peptides conformationnels identifiés est utilisable, en voici deux possibles : a. On peut par exemple transformer leur PBMCs par le virus EBV et sélectionner ensuite les clones producteurs d’anticorps par des cycles de dilution/sélection, en choisissant à chaque fois les groupes de cellules qui produisent des anticorps reconnaissant les deux, ou trois ou quatre peptides du couple, selon le nombre de peptides identifiés dans l’épitope conformationnel. Cette sélection peut se faire après avoir obtenu des clones en nombre suffisant. La transformation en lignée B productrice d’anticorps peut aussi se faire par fusion avec des lignées transformées pour obtenir hybridomes, selon la méthode bien connue de la personne du métier. b. On peut essayer de sélectionner directement des lymphocytes B reconnaissant les deux, trois, quatre ou cinq peptides, selon le nombre de peptides identifiés dans l’épitope conformationnel, par FACS à partir des PBMCs des individus après les avoir stimulés en culture le cas échéant. On essaiera alors de marquer les anticorps de surface des lymphocytes B d’intérêt par les peptides choisis marqués avec un fluorochrome, et de les sélectionner par FACS. On peut aussi essayer de sélectionner les lymphocytes B d’intérêt par un tapis de peptides accrochés à une plaque par des cycles d’adhésion/nettoyage pour éliminer les lymphocytes non adhérents. Une fois le clonage des bons lymphocytes B effectué, les anticorps monoclonaux peuvent être produits directement par les méthodes de culture traditionnelles, ou bien identifiés par séquençage, reclonés par génie génétique dans des cassettes qui servent à réinsérer l’ADN correspondant aux gènes des anticorps séquencés dans le génome de lignées adaptées à la production en masse d’anticorps monoclonaux. Dans un deuxième mode de réalisation du procédé d’identification d’un épitope conformationnel tel que défini ci-dessus, l’au moins un premier peptide et l’au moins un deuxième peptide sont sélectionnés parmi une pluralité de peptides distincts comprenant une séquence issue de l’antigène protéique du fait de leur reconnaissance par au moins une composition comprenant des anticorps ou des lymphocytes B porteurs d’anticorps issue d’un même individu. De préférence, selon ce deuxième mode de réalisation, l’au moins un premier peptide et l’au moins un deuxième peptide sont fortement reconnus parmi la pluralité de peptides distincts comprenant une séquence issue de l’antigène protéique. Le premier mode de réalisation précédent peut être moins aisé à appliquer sur des effectifs faibles d’individus à analyser. Une autre approche, selon le deuxième mode de réalisation, est de rechercher les peptides contre lesquels les individus répondent de manière significative, par exemple prendre les peptides pour lesquels la réponse chez un individu est supérieure à la médiane de tous les peptides plus un écart-type, et de les projeter directement sur la ou les structure(s) tridimensionnelle(s) de l’antigène protéique. Si des peptides ainsi définis comme positifs en réponse anticorps chez un même individu se retrouvent voisins à une distance inférieure à 30 Angstrom ( i.e . 3.10 -9 m), on pourra supposer qu’il s’agit d’un épitope tridimensionnel et essayer de purifier les cellules de cet individu qui reconnaissent simultanément les deux peptides comme décrit ci-dessus. Ces seuils sont arbitraires et on peut les modifier selon le nombre de n-uplets de peptides trouvés pour en avoir plus s’il n’y a pas assez de signaux, ou au contraire moins s’il y a trop de n-uplets (n≥2). Par exemple au lieu de prendre la médiane plus un écart-type, on peut prendre la médiane plus deux écart-types, ou le 75 ème percentile, ou le 90 ème percentile des réponses anticorps contre les peptides, etc… On peut aussi jouer sur la taille de l’épitope en passant de 30 à 25, voire à 20, 15, ou 10 Angstrom. Ces approches peuvent être appliquées sur des nombres réduits d’individus en cherchant des n-uplets de peptides voisins (n≥2) retrouvés chez tous ou chez une partie de des individus testés. La méthode de recherche de n-uplets (n>=2) de peptides répondeurs et proches spatialement du paragraphe précédent, s’applique aussi quand on dispose de beaucoup d’individus dans un groupe. On peut ainsi rechercher les peptides reconnus de manière significative par un nombre élevé de sujets (par exemple les répondeurs contre un peptide situés au-dessus du 75 ème percentile, ou de la médiane + un écart-type, des réponses contre ce peptide etc…), et regarder les peptides du voisinage dans la structure tridimensionnelle de la protéine (à moins de 30 Angstrom de distance, ou 25, 20, 15, voire 10 Angstrom) : soit il y en a aussi qui sont bien reconnus et ils correspondent alors à des paires de peptides pouvant potentiellement former un épitope conformationnel, soit il n’y en a pas en apparence, mais on peut alors tester de manière systématique tous les peptides voisins pour voir si les peptides d’une paire ne sont pas reconnus simultanément par un lymphocyte B de l’individu. Une autre façon d’identifier des bons n-uplets (n≥2) de peptides, est de choisir les peptides retrouvés par exemple dans un groupe d’individus protégés ayant donc potentiellement des anticorps neutralisants, et éliminer les n-uplets de peptides qui sont trouvés dans un groupe d’individus malades dont on peut supposer que les anticorps n’auraient donc pas été protecteurs. Cette approche discriminante peut fonctionner de manière efficace pour des petits groupes de sujets pour essayer de sélectionner les meilleurs n-uplets (n≥2) de peptides, c’est à dire les meilleurs épitopes conformationnels. Dans certains cas, on peut ne disposer de données ELISA que sur un nombre limité de peptides et d’individus, voire un seul peptide et un seul individu. Dans ce cas, si on choisit un peptide prioritaire parce qu’on pense observer une réponse contre ce peptide chez un ou plusieurs individus, on peut simplement identifier les peptides présents à moins de 30 Angstrom de distance (ou 25, 20, 15, voire 10 Angstrom) de ce peptide dans la structure de l’antigène protéique, que ce soit un monomère ou un multimère, et rechercher de manière systématique si des paires de peptides comprenant le peptide prioritaire choisi et les peptides voisins dans la structure sont reconnues simultanément par des lymphocytes B de l’individu. Dans un troisième mode de réalisation, les peptides sont marqués par des fluorophores différents et leur reconnaissance par au moins une composition comprenant des lymphocytes B porteurs d’anticorps est mesurée par FACS. Dans ce cas on procède directement à la détection de l’épitope conformationnel sur les cellules d’un individu en 2 étapes par FACS : une première étape de sélection d’une série de peptides marqués de fluorophores ayant une longueur d’onde d’émission de fluorescence distincte dont les séquences sont issues de la séquence de l’antigène protéique qui seront testés par FACS sur les cellules de l’individu. Cette étape permettra d’identifier des peptides reconnus par les cellules de l’individu et d’en choisir certains comme prioritaires. On pourra ensuite dans une deuxième étape zoomer sur chacun de ces peptides prioritaires, en testant par FACS cette fois chacun de ces peptides marqués avec une série de peptides proches spatialement de ce peptide et marqués avec des fluorophores ayant des longueurs d’onde d’émission de fluorescence distinctes. Typiquement si on part d’un antigène protéique, on pourra tester dans un premier temps au moins 3 peptides marqués de fluorophores distincts de taille maximale 60, mais de taille minimale 10 résidus, préférentiellement d’au moins 15 résidus, notamment d‘au moins 20 résidus, possiblement d’au moins 30 résidus. Bien entendu si l’antigène protéique est grand, il sera intéressant de le couvrir d’un maximum de peptides pour identifier le maximum de peptides reconnus par les cellules de l’individu, et on peut très bien tester un plus grand nombre de peptides colorés dans la mesure des possibilités de détection de longueurs d’onde de fluorescence distinctes du FACS dont on dispose. Cela va permettre de sélectionner les peptides reconnus par les cellules de l’individu en fonction de leur intérêt : niveau de réponse, localisation dans la protéine ciblée etc…). Pour chaque peptide sélectionné, on peut ensuite recommencer à tester par FACS en combinaison avec lui une série de peptides proches de lui spatialement, à moins de 25 ou 30 Angstrom par exemple, cette série comprenant typiquement au moins deux peptides mais cela peut aller jusqu’à plusieurs dizaines selon la zone protéique située autour du peptide sélectionné et le nombre de marquages par fluorophores distincts possibles, et on pourra ainsi sélectionner dans la série les peptides reconnus par des lymphocytes B de l’individu en combinaison avec ce peptide prioritaire, et qui forment donc avec ce peptide un épitope conformationnel. Si on ne souhaite pas choisir de peptide prioritaire, on peut même essayer de tester de manière systématique la reconnaissance de tous les couples de peptides distincts présentant une distance spatiale inférieure à 30 Angstrom de distance, ou 25, 20, 15, voire 10 Angstrom, dans la structure de l’antigène protéique par les lymphocytes B de l’individu, de manière similaire au deuxième mode de réalisation sauf qu’on fait cela pour tous les peptides de l’antigène protéique ou pour des peptides choisis dans des zones spécifiques de l’antigène protéique. L’invention est davantage explicitée à l‘aide des Exemples, non limitatifs, qui suivent. EXEMPLES Exemple 1 : Identification d’anticorps ciblant un épitope conformationnel de la protéine Spike (S) du virus SARS-CoV2. L’Exemple 1 ci-dessous démontre expérimentalement l’existence d’épitopes conformationnels comprenant au moins deux peptides, détectés suite à une cartographie d’épitope (« epitope mapping » ) contre les protéines E, M, N, et S de SARS-CoV-2. Les inventeurs ont réalisé à partir du sérum de patients infectés par SARS-CoV-2 et de contrôles l’ epitope mapping des protéines E, M, N et S du virus SARS-CoV-2 en utilisant des peptides consécutifs de taille 15 acides aminés se chevauchant sur 11 acides aminés et recouvrant ces 4 protéines. Il y avait ainsi 16 peptides pour E, 53 peptides pour M, 102 peptides pour N, et 316 peptides pour S. L’ epitope mapping a été réalisé sur les sera de 41 contrôles non infectés, de 27 sujets asymptomatiques, de 23 sujets symptomatiques, et 32 sujets à évolution sévère. Les données ELISA d’ epitope mapping ont été obtenues à partir de puces ELISA de la société JPT Technology, pour les 3 types d’immunoglobulines IgA, IgG, et IgM. Les inventeurs ont nettoyé les données en traitant les immunoglobulines séparément, selon les procédures classiques basées sur les valeurs ELISA des contrôles négatifs (sans sérum), la présence éventuelle d’effets de lot (« batch ») et de sur-réactivités de sérums aspécifiques. A partir des données ELISA nettoyées, les inventeurs ont recherché les épitopes spécifiques de SARS-CoV-2 reconnus par des IgG. Les inventeurs ont utilisé un t-test statistique et une correction de Bonferroni (sur le nombre de peptides testés), et avec ce test stringent, les inventeurs ont identifié une dizaine d’épitopes linéaires publics SARS-CoV-2 (voir le Tableau 1). Numéro du peptide Début du peptide Fin du peptide p N041 161 175 1,3E-07 N056 221 235 2,3E-05 N099 393 407 1,4E-06 N100 397 411 6,3E-05 S139 553 567 2,7E-05 S140 557 571 1,0E-05 S204 813 827 1,3E-05 S287 1145 1159 7,2E-07 Peptides correspondant à des épitopes linéaires, qui sont reconnus le plus fortement par epitope mapping Ensuite, les inventeurs ont cherché à déterminer les épitopes conformationnels en appliquant la procédure selon l’invention en procédant de la façon suivante : A. Calculs bioinformatiques pour identifier des paires d’épitopes conformationnels. 1. Calcul du nombre de sujets forts répondeurs communs entre deux peptides. Pour chaque paire des 483 peptides utilisés dans l’ epitope mapping , les inventeurs identifié le nombre de forts répondeurs identiques entre les peptides de chaque paire, et ceci pour chaque groupe de patients. Dans le cadre de cet exemple, les forts répondeurs sont choisis comme étant des sujets dans les 25% ayant la réponse la plus élevée. On pourrait aussi prendre d’autres valeurs comme les 10% ayant la réponse la plus élevée, les 30%, ou bien les 50%, ce sont des choix à faire en fonction des objectifs de sélection des paires de peptides. On peut aussi choisir d’autres critères de seuil pour sélectionner les forts répondeurs, par exemple un seuil de réponse ELISA, seuil qui pourrait éventuellement être modulable selon les peptides en jeu, ou la protéine en jeu, ou le type d’immunoglobuline. Pour le présent exemple, on choisit comme forts répondeurs contre un peptide, les sujets qui sont simplement dans les 25% ayant la réponse ELISA la plus forte contre ce peptide. 2. Calcul des distances entre deux peptides. Pour toutes les paires de peptides issus de la protéine S, les inventeurs ont aussi calculé la distance entre ces peptides. Les distances ont été obtenues à partir de la structure 3D de la protéine S disponible dans la Protein Data Bank (Référence 6VXX), et ici, la distance mesurée entre deux peptides correspond à la distance minimale entre 2 acides aminés de ces peptides. Il y avait 50086 paires de peptides testés pour S (pour 316 peptides recouvrant S), parmi eux 48827 paires de peptides disjoints, et parmi ces derniers, 7287 paires de peptides disjoints présentaient une distance inférieure à 20 Angstrom et 41540 paires de peptides disjoints une distance supérieure à 20 Angstrom. 3. Calcul du nombre maximal Nmax-groupe de sujets forts répondeurs communs entre deux peptides dans le cas des paires de peptides issus de protéines différentes, pour servir de contrôle de base. Pour les paires de peptides issus de protéines différentes, les inventeurs ont ensuite pu comptabiliser la valeur maximale du nombre de sérums forts répondeurs (dans les 25% les plus forts) communs aux peptides de chaque paire. Ce travail est effectué séparément pour les données issues de chaque groupe de sujets : 41 contrôles non infectés, de 27 sujets asymptomatiques, de 23 sujets symptomatiques, et 32 sujets à évolution sévère. Pour le groupe sévère, la valeur maximale de sujets communs dans les 8 plus forts répondeurs (25% de 32) obtenue entre des peptides de protéines différentes était 6. 4. Pour chaque groupe, sélection des paires de peptides issus de la protéine S pour lesquels le nombre de sujets forts répondeurs communs est supérieur ou égal à Nmax-groupe. Dans la suite de cet exemple, les inventeurs continuent avec la protéine S car c’est la plus grande et elle permet de démontrer la validité de l’approche entreprise pour identifier des épitopes tridimensionnels. Dans chacun des groupes de sujets, les inventeurs ont identifié toutes les paires de peptides disjoints pour lesquelles le nombre de sérums forts répondeurs communs était supérieur à la valeur maximale Nmax-groupe obtenue au point 3 précédent. Dans le cas de la protéine S, les inventeurs ont ainsi obtenu le tableau des paires de peptides de distance inférieure au seuil choisi de 20 Angstrom, ayant un nombre d’individus communs supérieur ou égal à 6 (valeur maximale trouvée en inter-protéines E-M, E-N, E-S, M-N, M-S, N-S), ici avec le groupe sévère qui avait une bonne réponse IgG (voir le Tableau 2). Peptide_1 Peptide_ 2 Nb de sujets Liste des patients S008 S021 6 Patient_40;Patient_34;Patient_37;Patient_38;Patient_33;Patient_41 S008 S025 6 Patient_37;Patient_41;Patient_40;Patient_33;Patient_38;Patient_34 S008 S049 6 Patient_37;Patient_34;Patient_33;Patient_38;Patient_40;Patient_41 S009 S021 6 Patient_40;Patient_34;Patient_37;Patient_38;Patient_33;Patient_41 S009 S049 6 Patient_37;Patient_34;Patient_33;Patient_38;Patient_40;Patient_41 S013 S056 6 Patient_41;Patient_43;Patient_37;Patient_38;Patient_50;Patient_36 S013 S057 6 Patient_43;Patient_50;Patient_37;Patient_38;Patient_41;Patient_36 S021 S025 6 Patient_37;Patient_41;Patient_40;Patient_33;Patient_38;Patient_34 S021 S049 6 Patient_37;Patient_34;Patient_33;Patient_38;Patient_40;Patient_41 S022 S038 6 Patient_38;Patient_37;Patient_43;Patient_51;Patient_41;Patient_34 S022 S042 6 Patient_34;Patient_43;Patient_38;Patient_51;Patient_41;Patient_37 S023 S070 6 Patient_49;Patient_38;Patient_36;Patient_37;Patient_51;Patient_41 S025 S049 6 Patient_37;Patient_34;Patient_33;Patient_38;Patient_40;Patient_41 S026 S048 6 Patient_41;Patient_34;Patient_38;Patient_50;Patient_33;Patient_37 S026 S067 6 Patient_37;Patient_34;Patient_50;Patient_33;Patient_38;Patient_41 S038 S042 6 Patient_34;Patient_43;Patient_38;Patient_51;Patient_41;Patient_37 S048 S067 6 Patient_37;Patient_34;Patient_50;Patient_33;Patient_38;Patient_41 S074 S150 6 Patient_49;Patient_36;Patient_38;Patient_50;Patient_37;Patient_43 S078 S172 6 Patient_38;Patient_43;Patient_40;Patient_37;Patient_50;Patient_41 S084 S117 6 Patient_37;Patient_51;Patient_38;Patient_41;Patient_43;Patient_36 S088 S110 6 Patient_41;Patient_34;Patient_36;Patient_38;Patient_37;Patient_51 S089 S121 6 Patient_41;Patient_50;Patient_33;Patient_34;Patient_38;Patient_37 S098 S104 6 Patient_38;Patient_43;Patient_41;Patient_37;Patient_34;Patient_50 S099 S104 6 Patient_38;Patient_43;Patient_41;Patient_37;Patient_34;Patient_50 S113 S118 6 Patient_38;Patient_37;Patient_36;Patient_51;Patient_56;Patient_41 S187 S211 6 Patient_41;Patient_38;Patient_36;Patient_43;Patient_51;Patient_37 S191 S238 6 Patient_41;Patient_33;Patient_38;Patient_50;Patient_34;Patient_36 S227 S254 6 Patient_37;Patient_34;Patient_43;Patient_36;Patient_50;Patient_56 S284 S289 6 Patient_41;Patient_37;Patient_50;Patient_49;Patient_38;Patient_42 Couples d’épitopes conformationnels reconnus fortement par les mêmes individus. On remarque que les épitopes linéaires du Tableau 1 ne sont pas retrouvés dans la Table 2, suggérant un mécanisme de reconnaissance différent. De manière intéressante, on observe que les peptides identifiés dans les paires à faible distance, ne correspondent généralement pas aux épitopes linéaires très forts en ELISA identifiés dans le Tableau 1. Les réponses ne montent pas jusqu’à 60 000 comme on peut voir pour le peptide épitope linéaire S du Tableau 1 chez les patients sévères, mais on peut trouver des répondeurs ayant un niveau quand même élevé d’anticorps contre les peptides identifiés de 5000 voire 10000. 5. Mesure de l’enrichissement des paires de peptides proches (distance inférieure à 20 Angstrom) parmi les paires sélectionnées au point précédent. Les inventeurs ont sélectionné les paires de peptides présentant un nombre important de sérums forts répondeurs communs et ont évalué sur ces paires de peptides celles qui présentaient une distance supérieure 20 Angstrom entre les peptides, et celles qui présentaient une distance inférieure à 20 Angstrom (décrites de manière extensive dans le Tableau du paragraphe précédent). Les inventeurs ont pu comparer la répartition du nombre de paires de peptides obtenues avec celle de toutes les paires de peptides disjoints issus de la protéine S par un test exact de Fisher. Dans les conditions décrites dans l’exemple, voici les résultats obtenus pour les différents groupes : Objet Valeur Protéine S Groupe de patients Sévères Seuil de Distance 20 Angstrom Nombre total de paires sélectionnées (avec nombre ≥ N-max=6) 85 Nombre de paires sélectionnées 29 Nombre de paires sélectionnées > 20 Angstrom 56 Nombre global de paires de la protéine 7287 Nombre global de paires de la protéine > 20 Angstrom 41540 Nombre global de paires de la protéine 48827 Valeur p entre nombre observé et nombre dans la protéine S (Fisher) p=10-5 OR 3 RR 2,28 Paires de peptides de la protéine S sélectionnées car reconnus par les mêmes forts répondeurs, et mesures de l’enrichissement en peptides spatialement proches par comparaison avec l’ensemble des paires de peptides de la protéine S (valeur p et RR). On voit que l’enrichissement obtenu pour le groupe des patients sévères, celui qui développe le plus d’anticorps du fait d’une infection prolongée, est très important : Il y a 29 paires de peptides de distance inférieure à 20 Angstrom sur 85 paires de peptides reconnus par les mêmes patients (soit 34%), alors qu’il y a 7287 paires de peptides de distance inférieure à 20 Angstrom sur 48827 paires de peptides disjoints dans la protéine (soit 15%). Cet enrichissement en paires de peptides présentant une distance inférieure à 20 Angstrom est extrêmement significatif sur le plan statistique avec une valeur p=10 -5 . L’enrichissement en paires de peptides proches spatialement correspond à un rapport de 2,28 (rapport des fractions 29/85 et 7287/48827) au lieu de la valeur 1 attendue si c’était lié au hasard. Si on ne dispose de données d’ epitope mapping ne provenant que d’une seule protéine, on peut quand même calculer la valeur maximale de sujets communs sur toutes les paires de peptides et prendre cette valeur comme seuil du nombre de forts répondeurs communs, ou cette valeur moins 1 (voire -2 ou moins). Il suffit ensuite de regarder sur ces meilleures valeurs s’il y a un enrichissement en paires de peptides séparés d’une distance acceptable pour un épitope (par exemple moins de 10, 15, 20, ou 25 Angstrom). Pour les valeurs N-max-groupe on peut souhaiter une recherche moins stringente en fonction du nombre d’individus présents dans le groupe et du seuil choisi. On peut suivre la même approche avec cette fois les triplets de peptides pour trouver des épitopes impliquant non plus deux mais 3 peptides à la fois. Dans ce cas, on pourra calculer par exemple la distance des peptides deux à deux, voire on pourra vérifier leur présence au sein d’une même sphère de diamètre inférieur à la taille souhaitée d’un épitope (par exemple, 10, 15, 20 ou 25 Angstrom). B. Sélection des PBMCs des patients produisant des anticorps ciblant des épitopes conformationnels Lorsque les inventeurs ont recherché les sujets forts répondeurs communs entre deux peptides dans les différents groupes, ces sujets étaient nominativement connus à partir des données qui ont justement permis de construire la matrice des couples de peptides ayant des forts répondeurs en commun. Afin de trouver les épitopes conformationnels les plus intéressants, plusieurs paramètres peuvent être pris en compte. On peut essayer de cibler des patients ayant des fortes réponses contre les deux (ou plus) peptides identifiés dans l’épitope conformationnel. On peut aussi essayer de favoriser les peptides qui correspondent à des sites connus pour ne pas avoir muté au cours du temps (ici il s’agit de la protéine S du SARS-Cov-2 qui est connue pour muter au cours du temps). Comme autre exemple de paramètre pour sélectionner les peptides, on peut aussi privilégier les peptides reconnus par des patients présentant des caractéristiques biologiques ou cliniques particulières. Dans le présent exemple, on a choisi 3 peptides proches qui montrent un niveau de réponse assez élevé : les peptides S008, S021, et S049 (voir Tableau 2). Il y a deux raisons pour le choix de ces peptides : ils sont trois ce qui peut suggérer une meilleure liaison pour les anticorps qui les reconnaissent en même temps, le niveau de réponse contre ces peptides est relativement fort par rapport à d’autres peptides du Tableau 2. On aura donc tendance à préférer des paires de peptides exhibant des niveaux de réponse ELISA élevé, mais ce n’est pas une obligation bien-sûr car il peut aussi y avoir des épitopes reconnus moins fortement mais effectifs pour leur effet neutralisant. Comme on connaît les individus répondeurs contre les 3 peptides (voir Tableau 2, colonne 4), on va choisir ceux qui présentent globalement la plus forte réponse contre ces peptides pour aller récupérer leur PBMCs qui seront utilisés pour la sélection de clones B dans l’étape suivante. Dans le cas présent il s’agissait des patients 40 et 41. C. Sélection des clones B à partir des PBMCs des sujets ayant des anticorps reconnaissant l’épitope conformationnel Il y a plusieurs protocoles de sélection de clones B reconnaissant les peptides. Dans le présent exemple, on a choisi un protocole basé sur une sélection par FACS. Les peptides ont été marqués par un fluorochrome, et les lymphocytes B mémoires reconnaissant les 3 peptides sont reconnus. Pour cela on utilise des anticorps marquant les lymphocytes B (anti-CD19), et on ajoute les peptides marqués à plusieurs concentrations allant 10 ng/ml à 10 microgramme/ml. Le passage au FACS des cellules en présence de l’anticorps marqueur de lymphocytes B mémoire et des peptides a permis de voir d’une part qu’il y avait des clones B marqués par les 3 peptides à la concentration optimale de 1 microgramme/ml, d’autre part de purifier une par une les cellules B marquées par les 3 peptides dans un puits individuel sur microplaque. L’étape suivante a consisté en l’amplification de l’ARN cellulaire et le clonage des fragments variables de la chaîne lourde et de la chaîne légère des IgG dans une cassette d’expression spécifique pour les anticorps monoclonaux. Ces différentes étapes de purification par FACS et clonage sont bien connues de la personne du métier et notamment décrites dans la publication de Corsiero et al . (2016) Ann Rheum Dis . 75 (10):1866-75. Des tests d’expression ont ensuite permis de produire de petites quantités d’anticorps monoclonal sur douze lignées productrices d’anticorps monoclonaux. Sur 12 anticorps testés, 8 d’entre eux reconnaissaient bien les 3 peptides S008, S021, et S049 utilisés pour leur sélection ainsi que la protéine Spike par ELISA, montrant que ces anticorps sont bien des anticorps conformationnels. Exemple 2 L’exemple 2 ci-dessous décrit une méthode systématique de recherche d’épitopes conformationnels comprenant au moins 2 peptides discontinus, grâce à la connaissance de la structure 3D de la protéine Spike (S) du SARS-CoV-2 et grâce à l’analyse par cytométrie de flux (FACS) de cellules de sujets immunisés contre SARS-CoV-2, et ce, à partir d’un peptide connu pour être immunogène par ELISA chez cet individu. Dans cet exemple, les inventeurs ont pris les cellules d’un individu ayant manifesté une forme prolongée de Covid-19, pour les inventeurs disposaient de suffisamment d’échantillons de PBMCs prélevés à des temps différents. L’approche utilisée ici pour rechercher des lymphocytes B reconnaissant un épitope conformationnel est différente de la précédente car les inventeurs savaient seulement que l’individu avait été infecté, et que ses anticorps reconnaissaient le peptide S025 de Spike correspondant aux résidus 97 à 111. Ce dernier peptide a été biotinylé en utilisant les recommandations du fournisseur Thermo ScientificTM (EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-Biotinylation kit) puis couplé à un conjugué fluorescent, Streptavidin-BV510™. Les inventeurs ont regardé grâce aux données de structure connues pour la protéine Spike, quels étaient les acides aminés de la protéine Spike proches dans l’espace de ce peptide, et les inventeurs ont recherché si des peptides contenant ces acides aminés pouvaient être reconnus par FACS en même temps que ce peptide S025, à partir de lymphocytes B provenant de cet individu. Le peptide S025 est dans la région NTD de Spike qui englobe environ les 290 premiers résidus de Spike. Quand on recherche tous les résidus de Spike qui ne font pas partie du peptide S025 et qui sont situés à une distance inférieure à 20 Angstrom de ce peptide (taille possible d’un épitope conformationnel), on retrouve en fait tout le domaine NTD (à l’exception de quelques résidus). Les inventeurs disposaient de peptides de taille 15 résidus et se chevauchant sur 11 résidus recouvrant toute la région NTD (les peptides S001, S002,…S070). Les inventeurs ont ainsi pu sélectionner les 24 peptides suivants, couvrant bien la région NTD, pour voir si l’un d’eux allumait aussi des lymphocytes B mémoires du patient en conjonction avec S025 : S001, S004, S007, S010, S013, S016, S019, S021, S023, S028, S031, S034, S037, S040, S043, S046, S049, S05, S055, S058, S061, S064, S067, S070. Ces 24 peptides ont été biotinylés en utilisant les recommandations du fournisseur Thermo ScientificTM (EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-Biotinilation kit) puis couplés au conjugué fluorescent Streptavidin-phycoérythrine (PE). Les inventeurs les ont ensuite testés un par un dans des expériences de marquage de cellules B mémoire (marqués par des anticorps anti-CD19-APC et anti-CD27-BV711), pour voir ceux qui marquaient les lymphocytes B de l’individu en conjonction avec le peptide S025. Les inventeurs ont ainsi identifié 2 autres peptides qui marquaient les lymphocytes B en même temps que S025 : S021 (résidus 81 à 95 de Spike) et S049 (résidus 193 à 207 de Spike). On pouvait se poser la question de savoir si des résidus de chacun de ces 3 peptides ne formaient pas un même épitope conformationnel (reconnus par le même anticorps). Les inventeurs ont donc biotinylé puis couplé le peptide S049 avec un troisième fluorochrome, le FITC, et recherché à nouveau par FACS dans les cellules du patient, si un lymphocyte B ne reconnaissait pas les 3 peptides en même temps. Les inventeurs ont réussi à identifier un lymphocyte B mémoire du patient présentant les 3 couleurs à la fois. Cela montre que ces 3 peptides disjoints contiennent des résidus formant un même épitope conformationnel. Il est alors aisé d’utiliser un trieur de cellule pour récupérer les clones B reconnaissant ces 3 peptides à la fois, et d’utiliser les outils bien connus de la personne du métier pour dériver un anticorps monoclonal ciblant cet épitope conformationnel. La démarche développée dans cet exemple est très intéressante car elle permet facilement d’identifier des épitopes conformationnels (ici impliquant les acides aminés de 3 peptides disjoints), même à partir de cellules d’un seul individu. Il est ensuite possible de dériver des anticorps monoclonaux reconnaissant un épitope conformationnel en purifiant par tri cellulaire en cytométrie de flux (FACS) les cellules B reconnaissant les peptides impliqués dans l’épitope conformationnel (tous ou une partie des peptides). Ces cellules B peuvent provenir du même individu, ou d’autres individus eux aussi immunisés (naturellement ou par vaccin) contre l’antigène ciblé. Ces cellules peuvent être cultivées pour obtenir des surnageants contenant des anticorps évaluables in vitro, puis les ARNm des parties variables des anticorps peuvent être par exemple clonés dans des cassettes de production sur lignée pour la production de grandes quantités d’anticorps monoclonal. On peut aussi cloner directement les ARNm des lymphocytes B qui ont été triés par FACS dans un système de cassette pour la production d’anticorps monoclonal en lignée. Exemple 3 L’exemple 3 ci-dessous décrit une méthode de recherche directe d’épitope conformationnel par cytométrie de flux (FACS) basée sur l’utilisation de séries de peptides marqués par des couleurs de fluorescence différentes. Cet exemple montre ainsi comment on peut directement retrouver un épitope conformationnel par criblage basé sur des séries de peptides marqués de couleurs de fluorescence différentes, issus de la même protéine ciblée. Les inventeurs ont repris les cellules de l’individu de l’Exemple 2, ayant manifesté une forme prolongée de Covid-19, pour lequel les inventeurs disposaient de suffisamment d’échantillons de PBMCs prélevés à des temps différents. Les inventeurs ont produit 6 peptides de la Spike de SARS-CoV2 de taille 20 résidus recouvrant les domaines NTD (domaine N terminal) et RBD (domaine de liaison au récepteur) de Spike : Peptide 1 de résidus 15-34 dans NTD, appelé P1, Peptide 2 de résidus 93-112 dans NTD, appelé P2, Peptide 3 de résidus 217-236 dans NTD, appelé P3, Peptide 4 de résidus 438-457 dans RBD, appelé P4, Peptide 5 de résidus 458-477 dans RBD, appelé P5, Peptide 6 de résidus 501-520 dans RBD, appelé P6. Ces 6 peptides ont été biotinylés en utilisant les recommandations du fournisseur Thermo ScientificTM (EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-Biotinilation kit) et couplés à des fluorochromes de 6 couleurs d’émission différentes pour l’analyse par FACS. Dans une première expérience, les inventeurs ont testé simultanément la liaison de ces 6 peptides sur des lymphocytes B mémoires (identifiés par des anticorps anti-CD19-APC et anti-CD27-BV711, fluorochromes de couleurs d’émission différentes de celles des peptides). Sur cette première expérience, les inventeurs ont obtenu 4254 lymphocytes B mémoire sur 181 000 PBMCs testés. Cette expérience a montré que les lymphocytes B mémoires de l’individu reconnaissent bien 2 peptides en particulier : Le peptide P2 qui est reconnu par 23 lymphocytes B mémoires, et le peptide P4 reconnu par 34 lymphocytes B mémoires, les autres peptides étant reconnus par moins de 5 lymphocytes B mémoires. Le peptide P2 contient le peptide S025 de l’Exemple 2. Le peptide P4 correspond à la région RBM (Motif de liaison au récepteur) connue elle aussi pour induire souvent la production d’anticorps chez les sujets infectés. Afin de voir si les résultats de l’Exemple 2 pouvaient être reproduits par cette approche directe par FACS, les inventeurs ont recherché des peptides situés à une distance de moins de 10 Angstrom du peptide P2 dans la structure de Spike. Les inventeurs se sont appuyés sur les 15 mers (chevauchants de 11 résidus) recouvrant toute la protéine Spike de l’Exemple 2. L’analyse bioinformatique de la structure 3D de la protéine Spike a montré qu’il y avait 42 de ces peptides, disjoints du peptide P2, situés à une distance de moins de 10 Angstrom du peptide P2 dans la structure 3D de Spike. Il s’agit des peptides S5, S6, S15, S16, S19, S20, S21, S28, S29, S30, S31, S32, S33, S34, S35, S39, S40, S41, S42, S43, S44, S45, S46, S47, S48, S49, S50, S51, S52, S53, S54, S56, S57, S58, S59, S60, S61, S63, S64, S65, S66, S67. Comme beaucoup des 42 peptides étaient chevauchants, les inventeurs en ont choisi 16 représentant bien l’ensemble des zones de la protéine couvertes par ces 42 peptides : les peptides S5, S15, S19, S28, S31, S34, S39, S42, S45, S48, S51, S54, S57, S60, S63, S66. Comme cela a été fait précédemment pour les 6 peptides de la première série, ces 16 peptides ont été biotinylés en utilisant les recommandations du fournisseur Thermo ScientificTM (EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-Biotinylation kit) et couplés à des conjugués fluorescents de couleurs d’émission différentes pour l’analyse par FACS, ces couleurs étant aussi différentes des couleurs de marquage des anticorps anti-CD19 et anti-CD27 utilisés pour identifier les lymphocytes B mémoires, et de la couleur de marquage du peptide P2 déjà réalisé. Les inventeurs ont marqué les 8 premiers peptides sur 16 (S5 à S42) avec 8 fluorochromes, et les 8 derniers peptides (S45 à S66) avec les mêmes fluorochromes, et réalisé les expérimentations de marquage combiné entre le peptide P2 et chacun de ces deux groupes de peptides. Les résultats du FACS ont été les suivants pour l’expérimentation avec les 8 premiers peptides S5 à S42 : Nombre de lymphocytes B mémoire = 3750 sur 152000 cellules analysées. Nombre de cellules B marquées par le peptide P2 seulement : 14 Nombre de cellules B marquées par le peptide P2 et le peptide S19 : 4 Il y avait 10 cellules B marquées par le peptide S19 seulement. Pour les 7 autres peptides testés, on ne voyait aucune cellule marquée. Les résultats du FACS ont été les suivants pour l’expérimentation avec les 8 autres peptides S45 à S66 : Nombre de lymphocytes B mémoire = 3794 sur 165000 cellules analysées. Nombre de cellules B marquées par le peptide P2 seulement : 19 Nombre de cellules B marquées par le peptide P2 et le peptide S48 : 2 Il y avait 5 cellules B marquées par le peptide S48 seulement. Pour les 7 autres peptides testés, on ne voyait aucune cellule marquée sauf pour le peptide S66 marquant 2 cellules B. Cette expérience confirme que les peptides S19 et S48 peuvent chacun former un épitope conformationnel avec le peptide P2. De manière intéressante S19 est très proche du peptide S21 identifié dans l’Exemple 2, de même S48 est très proche du peptide S49 aussi identifié dans l’Exemple 2. Les inventeurs ont tenté de vérifier par FACS si l’épitope S19/P2 et l’épitope S48/P2 étaient reconnus par le même anticorps. Lors d’une expérimentation similaire aux précédentes, mais impliquant les seuls peptides marqués P2, S19, et S48 (qui portaient des fluorochromes différents), les inventeurs ont pu identifier deux cellules marquées par les trois peptides en même temps indiquant qu’il s’agit du même épitope conformationnel. Cet exemple montre que l’approche basée sur l’analyse combinée de série de peptides marqués par différentes couleurs de fluorescence permet bien d’identifier des épitopes conformationnels. Comme pour l’exemple 2, il est ensuite facile, grâce aux peptides identifiés, de purifier par FACS les lymphocytes B porteurs des anticorps reconnaissant les épitopes conformationnels souhaités, et de procéder à la production d’anticorps monoclonaux selon les bien méthodes connues de la personne du métier. Procédé d’identification d’un épitope conformationnel d’un antigène protéique formé d’au moins deux peptides distincts comprenant des séquences issues de l’antigène protéique, comprenant : - une étape de sélection d’au moins un premier peptide comprenant une séquence issue de l’antigène protéique reconnu par au moins une composition comprenant des anticorps ou des lymphocytes B porteurs d’anticorps issue d’au moins un individu immunisé contre l’antigène protéique, et - une étape de sélection d’au moins un deuxième peptide comprenant une séquence issue de l’antigène protéique localisé à une distance de 3.10 -9 m ou moins du premier peptide dans une structure tridimensionnelle de l’antigène protéique et reconnu par au moins une composition comprenant des anticorps ou des lymphocytes B porteurs d’anticorps issue d’au moins un individu immunisé contre l’antigène protéique de l’étape précédente, dans lequel l’au moins un premier peptide et l’au moins un deuxième peptide forment un épitope conformationnel de l’antigène protéique. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l’au moins un premier peptide et l’au moins un deuxième peptide sont sélectionnés parmi une pluralité de peptides distincts comprenant une séquence issue de l’antigène protéique du fait de leur reconnaissance par au moins une composition comprenant des anticorps ou des lymphocytes B porteurs d’anticorps issue d’au moins deux individus distincts immunisés contre l’antigène protéique. Procédé selon la revendication 2, dans lequel les au moins deux individus distincts sont des forts répondeurs à l’au moins un premier peptide et l’au moins un deuxième peptide parmi une pluralité d’individus distincts immunisés contre l’antigène protéique. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l’au moins un premier peptide et l’au moins un deuxième peptide sont sélectionnés parmi une pluralité de peptides distincts comprenant une séquence issue de l’antigène protéique du fait de leur reconnaissance par au moins une composition comprenant des anticorps ou des lymphocytes B porteurs d’anticorps issue d’un même individu. Procédé selon la revendication 4, dans lequel l’au moins un premier peptide et l’au moins un deuxième peptide sont fortement reconnus parmi la pluralité de peptides distincts comprenant une séquence issue de l’antigène protéique. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel les peptides comprennent respectivement de 6 à 30 résidus d’acides aminés. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel les peptides comprennent des séquences non chevauchantes issues de l’antigène protéique. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel l’antigène protéique est issu d’un agent infectieux ou d’une protéine humaine ou animale. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel la reconnaissance des peptides par au moins une composition comprenant des lymphocytes B porteurs d’anticorps est déterminée par expression de phage (« phage display ») ou par ELISA. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel les peptides sont marqués par des fluorophores différents et leur reconnaissance par au moins une composition comprenant des lymphocytes B porteurs d’anticorps est mesurée par FACS. Procédé de sélection de lymphocytes reconnaissant un antigène protéique à partir d’une population de cellules, comprenant une étape d’identification d’au moins un lymphocyte se liant à au moins deux peptides distincts comprenant des séquences issues de l’antigène protéique formant un épitope conformationnel de l’antigène protéique, dans lequel l’épitope conformationnel est identifié par la mise en œuvre du procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 10. Procédé de préparation d’au moins un anticorps, ou fragment d’anticorps, dirigé contre un antigène protéique, dans lequel l’anticorps, ou le fragment d’anticorps, est préparé à partir d’au moins un lymphocyte B obtenu par la mise en œuvre du procédé de sélection de lymphocytes tel que défini dans la revendication 11.