Brevet FR3145570A1 — publié le 20240809

Méthode d’identification de composés anti-âge mimétiques de rétinoïdes La présente invention concerne un procédé d’identification d’un composé anti-âge ayant une action mimétique de l’acide rétinoïque, du rétinol ou d’un de leurs dérivés. Elle a également pour objet l’utilisation cosmétique d’au moins un composé anti-âge ayant une action mimétique de l’acide rétinoïque, du rétinol ou d’un de leurs dérivés, identifié par un tel procédé, pour prévenir et/ou traiter le vieillissement cutané. Elle a également pour objet une méthode d’évaluation de l’efficacité d’une composition cosmétique comprenant à titre d’agent actif du rétinol, de l’acide rétinoïque, l’un de leurs dérivés ou un composé anti-âge identifié par un tel procédé. Figure pour l'abrégé : néant Méthode d’identification de composés anti-âge mimétiques de rétinoïdes La présente invention concerne un procédé d’identification d’un composé anti-âge ayant une action mimétique de l’acide rétinoïque, du rétinol ou d’un de leurs dérivés. Elle a également pour objet l’utilisation cosmétique d’au moins un composé anti-âge ayant une action mimétique de l’acide rétinoïque, du rétinol ou d’un de leurs dérivés, identifié par un tel procédé, pour prévenir et/ou traiter le vieillissement cutané. Elle a également pour objet une méthode d’évaluation de l’efficacité d’une composition cosmétique comprenant à titre d’agent actif du rétinol, de l’acide rétinoïque, l’un de leurs dérivés ou un composé anti-âge identifié par un tel procédé. Les glycosaminoglycanes (GAGs) sont un composant majeur de la matrice extracellulaire. Ce sont de gros polysaccharides linéaires constitués d'unités disaccharidiques répétitives. Les six types de GAG ​​comprennent les chondroïtine sulfate (CS), dermatane sulfate (DS), kératane sulfate (KS), héparine sulfate (HS), héparine (HP) et acide hyaluronique (HA). Les GAGs interagissent avec une variété de molécules, y compris des molécules d'adhésion cellulaire et des facteurs de croissance. Plusieurs études ont montré divers changements dans les GAGs, les protéoglycanes (PGs) et les glycoprotéines dans la peau âgée (Donovan et al, N-glycans are stratum corneum biomarkers of aging skin, J Invest Dermatol 2022 Aug 31 ; S0022-202X(22)01877-2), suggérant que ces molécules sont des contributeurs importants du vieillissement cutané (Carrino et al., Age-related changes in the proteoglycans of human skin, Archives of Biochemistry and Biophysics, Volume 373, Issue 1, 1 January 2000, Pages 91-101). Il existe donc un besoin pour des méthodes d’identification d’actifs efficaces dans la prévention et/ou le traitement du vieillissement cutané. Il existe également un besoin pour des actifs cosmétiques capables d’améliorer l’hydratation de la peau. La présente invention répond à ce besoin. De manière surprenante, la Demanderesse a maintenant découvert que l'application de rétinol ou d'acide rétinoïque sur la peau diminue l’expression de 14 enzymes glycoside-hydrolases qui clivent les liaisons glycosidiques des glycosides. Ces enzymes sont principalement impliquées dans la déglycosylation de plusieurs types de N-glycanes, gangliosides, HS, DS, CS et KS. Ces résultats montrent que les rétinoïdes inhibent la dégradation des glycanes en diminuant l’expression de glycoside-hydrolases spécifiques : cela assure une protection des chaînes oligosaccharidiques des GAGs vis-à-vis d'un éventuel raccourcissement. La présente invention a donc pour objet un procédé d’identification d’un composé anti-âge ayant une action mimétique de l’acide rétinoïque, du rétinol ou d’un de leurs dérivés, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : mettre en contact au moins un composé candidat avec un échantillon de peau d’un sujet, ou avec un modèle de peau ou un modèle cellulaire dans lequel au moins une glycoside-hydrolase est exprimée, puis mesurer le niveau d’expression et/ou de l’activité enzymatique de cette glycoside-hydrolase dans ledit échantillon ou modèle ; comparer l’expression mesurée à l’étape a), à l’expression de cette glycoside-hydrolase dans un échantillon de peau du sujet ou dans un modèle de peau ou un modèle cellulaire, non exposé audit composé ; et identifier ledit composé candidat comme ayant un effet anti-âge mimétique de l’acide rétinoïque, du rétinol ou d’un de leurs dérivés, lorsqu’une diminution de l’expression de cette glycoside-hydrolase dans l’échantillon de peau du sujet ou le modèle de peau ou modèle cellulaire qui a été exposé audit composé candidat est détectée, par rapport à l’expression de cette glycoside-hydrolase dans l’échantillon de peau du sujet ou le modèle de peau ou modèle cellulaire qui n’a pas été exposé au composé candidat. Elle a également pour objet l’utilisation cosmétique d’au moins un composé anti-âge ayant une action mimétique de l’acide rétinoïque, du rétinol ou d’un de leurs dérivés, identifié par le procédé selon l’invention, pour prévenir et/ou traiter le vieillissement cutané. Elle a également pour objet une méthode d’évaluation de l’efficacité d’une composition cosmétique comprenant à titre d’agent actif du rétinol, de l’acide rétinoïque, l’un de leurs dérivés ou un composé anti-âge identifié par le procédé selon l’invention, comprenant les étapes suivantes : la mesure du niveau d’expression et/ou de l’activité enzymatique d’au moins une glycoside-hydrolase dans un échantillon de peau d’un sujet après application de la composition cosmétique; puis la comparaison de la mesure de l’étape a) avec un échantillon contrôle. Toutes les méthodes décrites dans la présente invention sont des méthodes in vitro . Procédé d’identification d’un composé anti-âge ayant une action mimétique de l’acide rétinoïque, du rétinol ou d’un de leurs dérivés La présente invention a pour objet un procédé d’identification d’un composé anti-âge ayant une action mimétique de l’acide rétinoïque, du rétinol ou d’un de leurs dérivés, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : mettre en contact au moins un composé candidat avec un échantillon de peau d’un sujet, ou avec un modèle de peau ou un modèle cellulaire dans lequel au moins une glycoside-hydrolase est exprimée, puis mesurer le niveau d’expression et/ou de l’activité enzymatique de cette glycoside-hydrolase dans ledit échantillon ou modèle ; comparer l’expression mesurée à l’étape a), à l’expression de cette glycoside-hydrolase dans un échantillon de peau du sujet ou dans un modèle de peau ou un modèle cellulaire, non exposé audit composé ; et identifier ledit composé candidat comme ayant un effet anti-âge mimétique de l’acide rétinoïque, du rétinol ou d’un de leurs dérivés, lorsqu’une diminution de l’expression de cette glycoside-hydrolase dans l’échantillon de peau du sujet ou le modèle de peau ou modèle cellulaire qui a été exposé audit composé candidat est détectée, par rapport à l’expression de cette glycoside-hydrolase dans l’échantillon de peau du sujet ou le modèle de peau ou modèle cellulaire qui n’a pas été exposé au composé candidat. Le procédé d’identification de l’invention est de préférence mis en œuvre ex vivo . Les composés anti-âges identifiés par le procédé selon l’invention ont une action mimétique de l’acide rétinoïque, du rétinol ou d’un de leurs dérivés. Ce sont des mimétiques des rétinoïdes, en particulier sur les glycoside-hydrolases de la peau. Par « dérivé » de l’acide rétinoïque ou du rétinol, on entend un dérivé naturel ou synthétique. Notamment, un tel dérivé naturel est un composé choisi parmi les isomères de l’acide rétinoïque ou du rétinol, la vitamine A, l’acide 9-cis-rétinoïque et le rétinal. Un tel dérivé synthétique est un composé choisi parmi l’acide 13-cis-rétinoïque, l’acitrétine, le tazarotène, l’adapalène et le bexarotène. Le sujet est de préférence un sujet humain, de préférence une femme âgée d’au moins 40 ans, de préférence d’au moins 45 ans, encore mieux d’au moins 50 ans. De manière préférée, le sujet est de préférence un sujet humain, de préférence une femme âgée de 40 à 80 ans, de préférence de 45 à 75 ans, de préférence de 50 à 70 ans. L’échantillon du sujet est de préférence un échantillon de peau. Typiquement, l’échantillon peut être prélevé par biopsie et/ou D-squame. Le modèle de peau ou le modèle cellulaire dans lequel au moins une glycoside-hydrolase est exprimée est tout modèle in vitro de peau reconstruite, ou modèle in vitro cellulaire, dans lequel le niveau d’expression et/ou de l’activité enzymatique d’une glycoside-hydrolase est détecté. Le modèle cellulaire est par exemple constitué de kératinocytes, de préférence de kératinocytes humains. Par « glycoside-hydrolase », on entend une enzyme capable d’hydrolyser une liaison glycosidique. De préférence, la glycoside-hydrolase est présente dans la peau. De préférence, la glycoside-hydrolase est impliquée dans la dégradation des glycosaminoglycanes (GAGs). De préférence, la glycoside-hydrolase est impliquée dans la dégradation d’au moins une GAG choisie parmi la chondroïtine sulfate (CS), dermatane sulfate (DS), kératane sulfate (KS), héparine sulfate (HS), héparine (HP) et acide hyaluronique (HA). De préférence, la glycoside-hydrolase est choisie parmi l’aspartylglucosaminidase, la fucosidase alpha-L-1, la glucosidase alpha, la galactosamine-6-sulfate sulfatase, l’acide bêta glucosidase, la galactosidase bêta 1, l’hexosaminidase A, l’hexosaminidase B, l'iduronate 2-sulfatase, la mannosidase alpha classe 2B membre 2, la N-acétylgalactosaminidase alpha, la sialidase 2, la N-sulfoglucosamine sulfohydrolase et la glucosamine (N-acétyl)-6-sulfatase. L'aspartylglucosaminidase (AGA) est une hydrolase lysosomale qui participe à l'une des dernières étapes lors de la dégradation des protéines N-glycosylées. L’AGA clive la liaison entre la N-acétylglucosamine et l'asparagine après que le squelette polypeptidique a été dégradé. La protéine AGA humaine est accessible dans Uniprot sous le numéro P20933. La fucosidase alpha-L-1 (FUCA1) est une enzyme lysosomale impliquée dans la dégradation de glycoprotéines et de glycolipides contenant du fucose. Elle implique le clivage de la liaison alpha 1,2 fucoside au cours de la dégradation du N-glycane. La protéine FUCA1 humaine est accessible dans Uniprot sous le numéro P04066. La glucosidase alpha (GAA) est une hydrolase glucidique lysosomale qui hydrolyse les résidus terminaux alpha-glucose non réducteurs pour libérer une seule molécule d'alphaglucose. Elle est responsable de l'élimination des molécules de glucose de N-glycanes des glycoprotéines du réticulum endoplasmique. La protéine GAA humaine est accessible dans Uniprot sous le numéro P10253. La galactosamine-6-sulfate sulfatase (GALNS) est une enzyme lysosomale qui hydrolyse les groupes 6-sulfate des unités N-acétyl-D-galactosamine 6-sulfate de la chondroïtine sulfate et des unités D-galactose 6-sulfate du kératane sulfate. La protéine GALNS humaine est accessible dans Uniprot sous le numéro P34059. L'acide bêta glucosidase (GBA) est une enzyme lysosomale qui hydrolyse la liaison glycosidique à un résidu bêta-D-glucosyle terminal non réducteur, libérant du glucose. La protéine GBA humaine est accessible dans Uniprot sous le numéro P04062-2. La galactosidase bêta 1 (GLB1) est une hydrolase lysosomale qui catalyse l'hydrolyse des galactosides en monosaccharides par la rupture d'une liaison glycosidique. Les galactosides comprennent les glucides contenant du galactose où la liaison glycosidique se trouve au-dessus de la molécule de galactose. Les substrats des différentes galactosidases comprennent le ganglioside GM1, lactosylcéramides, lactose et diverses glycoprotéines. La protéine GLB1 humaine est accessible dans Uniprot sous le numéro P16278-3. L’hexosaminidase A (HEXA) et l’hexosaminidase B (HEXB) sont deux sous-unités de l’hexomidase, une enzyme lysosomale impliquée dans l'hydrolyse des résidus N-acétyl-D-hexosamine terminaux en N-acétyl-D-hexosaminides. Cette enzyme, associée à la protéine activatrice cofacteur GM2, catalyse la dégradation du ganglioside GM2. La protéine HEXA humaine est accessible dans Uniprot sous le numéro H3BP20, et la protéine HEXB humaine est accessible dans Uniprot sous le numéro P07686. L'iduronate 2-sulfatase (IDS) est impliquée dans la dégradation lysosomale de l'héparane sulfate et du dermatane sulfate. La protéine IDS humaine est accessible dans Uniprot sous le numéro P22304. La mannosidase alpha classe 2B membre 2 (MAN2B2) est nécessaire au catabolisme des glucides N-liés libérés lors du renouvellement des glycoprotéines. Elle clive tous les types de liaisons alpha-mannosidiques connues. La protéine MAN2B2 humaine est accessible dans Uniprot sous le numéro Q9Y2E5. La N-acétylgalactosaminidase alpha (NAGA) est une enzyme lysosomale qui clive des groupes alpha-N-acétylgalactosaminyle de glycoconjugués. La protéine NAGA humaine est accessible dans Uniprot sous le numéro P17050. La sialidase 2 (NEU2) est une sialidase lysosomale catalysant l'élimination des acides sialiques terminaux des sialyloconjugués. La protéine NEU2 humaine est accessible dans Uniprot sous le numéro Q9Y3R4. La N-sulfoglucosamine sulfohydrolase (SGSH) est une sulfamidase, l'une des nombreuses enzymes impliquées dans la dégradation lysosomale de l'héparane sulfate. La protéine SGSH humaine est accessible dans Uniprot sous le numéro P51688. La glucosamine (N-acétyl)-6-sulfatase (GNS) est une enzyme lysosomale présente dans toutes les cellules. Elle est impliquée dans le catabolisme de l'héparine, de l'héparane sulfate et du kératane sulfate. La protéine GNS humaine est accessible dans Uniprot sous le numéro P15586. De préférence, la glycoside-hydrolase est choisie parmi la glucosidase alpha, la galactosamine-6-sulfate sulfatase, la mannosidase alpha classe 2B membre 2 et la N-acétylgalactosaminidase alpha. Par « niveau d’expression de la glycoside-hydrolase », on entend la quantité d’ARNm produite, ou bien la quantité de protéine produite, par l’expression du gène codant pour la glycoside-hydrolase considérée. Cette quantité peut être exprimée en tant que telle, ou sous forme de concentration ou de ratio. Le niveau d’expression de la glycoside-hydrolase peut être mesuré par toute technique appropriée connue de l’art antérieur. Pour mesurer la quantité d'ARNm, les ARN peuvent être extraits par n'importe quelle méthode d'extraction d'ARN de la peau, puis peuvent être traités pour une quantification spécifique de l'ARNm par n'importe quelle méthode de quantification de l'ARNm, par exemple par PCR quantitative. Pour mesurer la quantité de protéine, les protéines peuvent être extraites à l'aide d'un tampon approprié pour l'extraction des protéines de la peau, par exemple un Tampon RIPA ou un tampon d'urée, puis être traitées par toute méthode d'évaluation de protéine spécifique, par exemple Western blot ou ELISA. Pour mesurer l’activité enzymatique d’une glycoside-hydrolase, on peut évaluer la quantité de GAGs dégradées. En particulier, le niveau d’expression et/ou de l’activité enzymatique de la glycoside-hydrolase est mesuré par PCR quantitative, séquençage NGS, spectrométrie de masse, Western blot ou ELISA. De préférence, le procédé d’identification selon l’invention comprend les étapes suivantes: mettre en contact au moins un composé candidat avec un échantillon de peau d’un sujet, ou avec un modèle de peau ou un modèle cellulaire dans lequel au moins (i) la glucosidase alpha, (ii) la galactosamine-6-sulfate sulfatase, (iii) la mannosidase alpha classe 2B membre 2 et (iv) la N-acétylgalactosaminidase alpha sont exprimées, puis mesurer le niveau d’expression et/ou de l’activité enzymatique de chacune des glycoside-hydrolases (i) à (iv) dans ledit échantillon ou modèle ; comparer les expressions mesurées à l’étape a), aux expressions de ces glycoside-hydrolases (i) à (iv) dans un échantillon de peau du sujet ou dans un modèle de peau ou un modèle cellulaire, non exposé audit composé ; et identifier ledit composé candidat comme ayant un effet anti-âge mimétique de l’acide rétinoïque, du rétinol ou d’un de leurs dérivés, lorsque les expressions de chacune des glycoside-hydrolases (i) à (iv) dans l’échantillon de peau du sujet ou le modèle de peau ou modèle cellulaire qui a été exposé audit composé candidat sont diminuées, par rapport aux expressions de ces glycoside-hydrolases dans l’échantillon de peau du sujet ou le modèle de peau ou modèle cellulaire qui n’a pas été exposé au composé candidat. De préférence, les expressions des glycoside-hydrolases (i) à (iv) dans l’échantillon de peau du sujet ou le modèle de peau qui a été exposé audit composé candidat, sont au moins 1,2 fois inférieures aux expressions de ces glycoside-hydrolases dans l’échantillon de peau du sujet ou le modèle de peau ou modèle cellulaire qui n’a pas été exposé au composé candidat. De préférence, le procédé d’identification selon l’invention comprend en outre les étapes suivantes : d. comparer l’expression mesurée à l’étape a), à l’expression de cette glycoside-hydrolase dans un échantillon de peau du sujet ou dans un modèle de peau ou un modèle cellulaire, ledit échantillon ou modèle étant exposé à l’acide rétinoïque, au rétinol ou l’un de leurs dérivés ; et e. identifier ledit composé candidat comme ayant un effet anti-âge mimétique de l’acide rétinoïque, du rétinol ou d’un de leurs dérivés, lorsque l’expression de cette glycoside-hydrolase dans l’échantillon de peau du sujet ou le modèle de peau ou modèle cellulaire qui a été exposé audit composé candidat n’est pas significativement différente de l’expression de cette glycoside-hydrolase dans l’échantillon de peau du sujet ou le modèle exposé à l’acide rétinoïque, au rétinol ou l’un de leurs dérivés. Par « composé ayant un effet anti-âge mimétique de l’acide rétinoïque, du rétinol ou d’un de leurs dérivés », on entend un composé qui diminue le niveau d’expression et/ou l’activité enzymatique d’au moins une glycoside-hydrolase. De préférence, la glycoside-hydrolase est choisie parmi l’aspartylglucosaminidase, la fucosidase alpha-L-1, la glucosidase alpha, la galactosamine-6-sulfate sulfatase, l’acide bêta glucosidase, la galactosidase bêta 1, l’hexosaminidase A, l’hexosaminidase B, l'iduronate 2-sulfatase, la mannosidase alpha classe 2B membre 2, la N-acétylgalactosaminidase alpha, la sialidase 2, la N-sulfoglucosamine sulfohydrolase et la glucosamine (N-acétyl)-6-sulfatase. De préférence, le composé ayant un effet anti-âge mimétique de l’acide rétinoïque, du rétinol ou d’un de leurs dérivés diminue le niveau d’expression et/ou l’activité enzymatique d’au moins 2, de préférence d’au moins 3, de préférence d’au moins 4, de préférence d’au moins 5, de préférence d’au moins 6, de préférence d’au moins 7, de préférence d’au moins 8, de préférence d’au moins 9, de préférence d’au moins 10, de préférence d’au moins 11, de préférence d’au moins 12, de préférence d’au moins 13, de préférence de toutes les glycoside-hydrolases, les glycoside-hydrolases étant choisies dans la liste précitée. Dans l’étape e), on identifie le composé candidat comme ayant un effet anti-âge mimétique de l’acide rétinoïque, du rétinol ou d’un de leurs dérivés, lorsque l’expression de la glycoside-hydrolase dans l’échantillon de peau du sujet ou le modèle de peau ou le modèle cellulaire qui a été exposé audit composé candidat n’est pas significativement différente de l’expression de cette glycoside-hydrolase dans l’échantillon de peau du sujet ou le modèle exposé à l’acide rétinoïque, au rétinol ou l’un de leurs dérivés. En d’autres termes, dans les conditions du procédé, le composé candidat a des effets similaires à l’acide rétinoïque, au rétinol ou l’un de leurs dérivés. Par « n’est pas significativement différente », on entend que l’expression de la glycoside-hydrolase dans l’échantillon ou le modèle exposé audit composé candidat est identique ou similaire à l’expression de cette glycoside-hydrolase dans l’échantillon ou le modèle exposé à l’acide rétinoïque, au rétinol ou l’un de leurs dérivés. De préférence, un composé anti-âge identifié par le procédé selon l’invention est l’adénosine. Utilisation cosmétique La présente invention a également pour objet l’utilisation cosmétique d’au moins un composé anti-âge ayant une action mimétique de l’acide rétinoïque, du rétinol ou d’un de leurs dérivés, identifié par le procédé selon l’invention, pour prévenir et/ou traiter le vieillissement cutané. Le composé anti-âge identifié par le procédé selon l’invention est un mimétique de l’acide rétinoïque, du rétinol ou d’un de leurs dérivés. De préférence, un tel composé anti-âge est l’adénosine. Le composé anti-âge identifié par le procédé selon l’invention est de préférence appliqué par voie topique, i.e. sur la peau et/ou les muqueuses. Un tel composé anti-âge identifié par le procédé selon l’invention peut être formulé dans une composition cosmétique. La composition cosmétique comprend de préférence un milieu physiologiquement acceptable, i.e. un milieu compatible avec la peau et/ou les muqueuses. De préférence, la composition cosmétique est une composition anti-âge. Elle peut être appliquée par toute voie d’administration appropriée, en particulier par voie topique. Elle peut se présenter par exemple sous forme de crème, de lotion, de gel ou de suspension. Méthode d’évaluation de l’efficacité d’une composition cosmétique L’invention a également pour objet une méthode d’évaluation de l’efficacité d’une composition cosmétique comprenant à titre d’agent actif du rétinol, de l’acide rétinoïque, l’un de leurs dérivés ou un composé anti-âge identifié par le procédé selon l’invention, comprenant les étapes suivantes : la mesure du niveau d’expression et/ou de l’activité enzymatique d’au moins une glycoside-hydrolase dans un échantillon de peau d’un sujet après application de la composition cosmétique; puis la comparaison de la mesure de l’étape a) avec un échantillon contrôle. De préférence, la composition est efficace lorsque le niveau d’expression et/ou de l’activité enzymatique de la glycoside-hydrolase mesuré à l’étape a) dans l’échantillon de peau du sujet est inférieur, en particulier significativement inférieur, à un contrôle. Dans un mode de réalisation particulier, le contrôle est une valeur de référence. De préférence, le contrôle est une valeur de référence déterminée par la valeur moyenne du niveau d’expression et/ou de l’activité enzymatique de la glycoside-hydrolase, mesurée dans une population déterminée, par exemple une population âgée de 40 à 80 ans. La mesure de l’étape a) est de préférence effectuée comme décrit dans la section « Procédé d’identification d’un composé anti-âge ayant une action mimétique de l’acide rétinoïque, du rétinol ou d’un de leurs dérivés » ci-dessus. La glycoside-hydrolase, l’échantillon de peau dudit sujet et le sujet peuvent être comme décrits dans la section « Procédé d’identification d’un composé anti-âge ayant une action mimétique de l’acide rétinoïque, du rétinol ou d’un de leurs dérivés » ci-dessus. La composition cosmétique est telle que décrite ci-dessus. Elle peut être appliquée par toute voie d’administration appropriée, en particulier par voie topique. Elle peut se présenter par exemple sous forme de crème, de lotion, de gel ou de suspension. De préférence, la composition cosmétique est évaluée comme efficace, lorsque le niveau d’expression et/ou de l’activité enzymatique d’une glycoside-hydrolase mesuré à l’étape a) dans l’échantillon de peau du sujet est au moins 1,2 fois inférieur, de préférence significativement inférieur, à un contrôle. Dans un mode de réalisation particulier, la valeur de référence est déterminée par une étude ROC (« La courbe ROC (receiver operating characteristic) principes et principales applications en biologie clinique », H. Delacour et al., Ann Biol Clin 2005 ; 63 (2) : 145-54). Par « significativement inférieur » au sens de l’invention, on entend une variation statistiquement significative du niveau d’expression et/ou de l’activité enzymatique d’une glycoside-hydrolase. La présente invention sera décrite plus en détail par les exemples ci-dessous. Exemples Exemple 1 : étude clinique avec le rétinol et l’acide rétinoïque Matériels & Méthodes Étude clinique Les résultats cliniques obtenus à partir de l'étude clinique d'un an ont été partiellement publiés (Tancrede-Bohin et al., In vivo multiphoton imaging for non-invasive time course assessment of retinoids effects on human skin, Skin Res Technol 2020 Nov ;26(6) :794-803). L'étude clinique a été menée à Paris, France, entre février 2011 et avril 2012, et le protocole expérimental a été agréé par le comité d'éthique de l'Hôpital Saint Louis (référence CE 2010/58) conforme à la Déclaration d'Helsinki. Cette étude a impliqué 30 femmes volontaires (50-65 ans) avec une couleur de peau constitutive déterminée par une valeur ITA comprise entre 10° et 41° (ITA groupe III / IV). Quinze bénévoles ont appliqué du rétinol (RE) à 0,3% (formule du groupe L'Oréal) sur un avant-bras dorsal versus un produit témoin (excipient contenant de la paraffine blanche, DIPROBASE® Bayer) sur l'autre avant-bras, et quinze volontaires ont appliqué de l’acide rétinoïque tout-trans (RA) à 0,025 % (formule à 0,025 %, RETACNYL® Galderma) versus un produit témoin (excipient contenant de la paraffine blanche, DIPROBASE® Bayer) sur l'autre avant-bras. Le produit (250 mg) a été appliqué une fois par jour pendant 1 an. Des strippings non invasifs (DSquames TM ) ont été réalisés sur la zone aux mois M00 (mars), M03 (juin), M06 (septembre), M12 (mars +1an) (Tancrède-Bohin et al., In vivo multiphoton imaging for non-invasive time course assessment of retinoids effects on human skin, Skin Res Technol 2020 Nov ;26(6) :794-803). Extraction de protéines, marquage iTRAQ et analyse par spectrométrie de masse Les extractions de protéines ont été effectuées à partir de chaque DSquame individuel le comme suit : 550 µl de tampon DOC (0,5 % de désoxycholate de sodium, 50 mM de bicarbonate d'ammonium, 50 mM DTT, pepstatine 1 µM et cocktail inhibiteur sans EDTA) ont été ajoutés/DSquame. L'extraction mécanique à l'aide d'un lyseur de tissus (Retsch MM300) et de billes d'inox a été réalisée avec 2 cycles de 2min à 30Hz. Le surnageant a été filtré sur des membranes PVDF 0.45µm par centrifugation (Millipore). Les protéines ont été précipitées pendant une nuit dans 4 volumes d'acétone glacé à -20°C suivi d'une centrifugation à 16000g pendant 20min à 4°C. Le culot de protéines a été remis en suspension dans 50 µl de tampon TEAB (0,5 M) en présence de désoxycholate de sodium à 0,5 %. Les échantillons ont ensuite été soniqués dans de l’eau pendant 5min pour resolubiliser les protéines. La concentration totale en protéines a été mesurée à l'aide du test de Bradford (Pierce BCA). Pour l'analyse, 35µg de protéines ont été réduits dans du TCEP (5mM) pendant 60min à 60°C, puis alkylés par addition de 6mM de MMTS pendant 10min à température ambiante (TA) dans l'obscurité. 0,25% de désoxycholate de sodium sont ensuite ajoutés à chaque échantillon avant la digestion à la trypsine par addition de 1,5 µg de trypsine porcine modifiée (Promega) et incubation pendant 18h à 37°C. Après digestion, les échantillons sont acidifiés à pH2 avec de l'acide formique à 5% et incubés 10min à température ambiante. La centrifugation à 16 000g pendant 5min permet l'élimination du désoxycholate de sodium. Les peptides sont ensuite traités à travers une colonne de dessalage (oasis HLV, 1cc/10mg, Waters). Après élution et lyophilisation, les échantillons sont remis en suspension dans 30 µl de TEAB 500 mM. Ensuite, 200 µl d'isopropanol ont été ajoutés à un flacon de réactif iTRAQ 4-plex (AB SCIEX, Toronto, Canada) et centrifugés deux fois. Puis 100 µl de réactif de marquage iTRAQ ont été ajoutés aux échantillons et mélangés. Le mélange a été incubé pendant 2h à température ambiante dans l'obscurité. Les peptides marqués sont ensuite traités à nouveau dans une colonne de dessalage (oasis HLV, 1cc/10mg, Waters), puis lyophilisés en vue de la préparation de l'étape suivante. Les peptides sont alors séparés par isofocalisation dans un gel à gradient de pH allant de 3 à 10. Pour cela, les peptides ont été remis en suspension dans 320 µl d'eau HPLC contenant 3 µl d'ampholites (Biolyte 3-10, BioRad). Cette solution est utilisée pour réhydrater un gel à pH immobilisé de 18cm. La migration des peptides marqués à travers le gel à pH immobilisé est la suivante : réhydratation passive (5h à 20°C) ; 250V pendant 15min, 10 000V pendant 3h avec lente augmentation de tension, 10 000V jusqu'à 60 000V*h et enfin 500V pendant 20h. Après la focalisation du peptide, le gel pH est découpé en 36 fragments de 5mm. Les peptides sont élués à l'aide de 1µl de solution d'acide formique/2% d'acétonitrile puis avec 1µl d'acide formique/50% d'acétonitrile. Pour l'analyse MS, les 36 fractions sont regroupées 2 à la fois afin d'obtenir finalement 18 fractions à injecter dans le spectromètre de masse 5600 Triple-TOF (ABSciex). Les analyses par spectrométrie de masse (MS) ont été réalisées sur un appareil 5600 Triple-TOF ABSciex couplé à une HPLC Agilent 1200. Le dispositif expérimental a permis trois analyses LC-MS/MS indépendantes. Brièvement 500 ng d'échantillons ont été injectés sur une colonne de piégeage pour un dessalage suivi d'une séparation chromatographique sur colonne C18, 75 µm x 15 cm. Les échantillons ont été analysés en utilisant un gradient de 90 min de 10 à 35 % de solvant B (le solvant A étant une solution à 0,1 % d'acide formique et le solvant B 0,1 % d’acide formique dans l'acétonitrile) à un débit de 300 nl/min. Les données ont été acquises à l'aide d'un mode ESI positif avec une tension de 2,4 kV en mode positif. Des scans complets ont été obtenus dans la gamme de masse de 400-1250 en 250ms. L’acquisition dépendante des données (DDA) a été utilisée pour la collecte de données pour les ions de haute intensité dans la gamme m/z 100-1600. Identification des protéines Les fichiers de données ont été soumis pour des recherches simultanées à l'aide du logiciel Protein Pilot version 4.0 (ABSciex) et du moteur de recherche Mascot (Matrix Science) avec les éléments suivants : Critères : Digestion trypsique, modification fixe sur la cystéine du méthylthio, modification variable iTRAQ (4 plex iTRAQ (K), iTRAQ (N-term), iTRAQ (Y)) et oxydation de la méthionine. La charge peptidique était limitée à +2, +3 et +4. Tolérance de masse peptidique (+/-0,1) et tolérance de masse des fragments +/-0,1. Les protéines ont été définies comme différentiellement modulées si elles répondent aux critères suivants : au moins deux peptides à haut intervalle de confiance (95 %) pour l'identification (p-value Analyse des données L'expression différentielle des protéines a été calculée avec l'outil DESEQ2 (https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-014-0550-8). Les protéines différentiellement exprimées du sujet traité aux rétinoïdes et du sujet placebo ont été définies par un Fold Change |1.5| en 2 ou 3 répétitions. L’interprétation biologique de ces listes de protéines a été réalisée par des calculs d'enrichissement en utilisant le package R ClusterProfiler (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3339379/) et en utilisant les bases de données « Gene Ontology » (AmiGO : Carbon S, Ireland A, Mungall CJ, Shu S, Marshall B, Lewis S, AmiGO Hub, groupe de travail Web. AmiGO : accès en ligne aux données d'ontologie et d'annotation. Bioinformatique. janv. 2009 ; 25 (2): 288-289) et la base "KEGG" (Kanehisa, M. et Goto, S. ; KEGG : Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. Nucleic Acids Res. 28, 27-30, 2000). Un terme de Gene Ontology ou une voie de la base de données KEGG a été considéré comme significativement impacté lorsqu'il avait une p-value corrigée ≤0,05 avec la liste des protéines donnée en entrée. Résultats Les résultats sont les suivants : Numéro d’accession Gène Protéine Traitement au rétinol Traitement à l’acide rétinoïque FC* 3 M FC* 3 M P20933 AGA aspartylglucosaminidase -1,5 -2,2 P04066 FUCA1 fucosidase alpha-L-1 -1,8 -1,6 P10253 GAA glucosidase alpha -1,6 P34059 GALNS galactosamine-6-sulfate sulfatase -1,7 P04062-2 GBA glucosidase beta acid -1,6 P16278-3 GLB1 galactosidase beta 1 -1,9 -1,5 H3BP20 HEXA hexosaminidase A -1,6 -1,9 P07686 HEXB hexosaminidase B -1,9 -2,2 P22304 IDS iduronate 2-sulfatase -1,7 -1,6 Q9Y2E5 MAN2B2 mannosidase alpha class 2B member 2 -1,6 P17050 NAGA N-acetylgalactosaminidase alpha -1,5 Q9Y3R4 NEU2 sialidase 2 -1,6 -1,5 P51688 SGSH N-sulfoglucosamine sulfohydrolase -1,7 -1,8 P15586 GNS glucosamine (N-acetyl)-6-sulfatase -1,4 -2,0 *Fold Change : FC Un impact important du rétinol et de l’acide rétinoïque a été observé sur le métabolisme des glycanes avec 14 glycosidases impliquées dans la déglycosylation de plusieurs types de glycanes fortement régulées à la baisse, suggérant le raccourcissement des GAG, des protéoglycanes et des glycoprotéines par les deux rétinoïdes. En particulier, GLB1 et Alpha-L-Fucosidase 1 (FUCA1) sont tous deux constamment régulés à la baisse par les rétinoïdes. Ces résultats montrent un impact important des rétinoïdes sur la modulation de la voie de dégradation des glycanes. Exemple 2 : étude in vitro avec l’adénosine Des kératinocytes de peau humaine en culture ont été traités à l’adénosine 10 µM pendant 24 heures versus des kératinocytes contrôles traités avec le DMSO pendant 24 heures. Chaque condition a été réalisée en 3 répétitions. Extraction des ARN Le protocole d’extraction a été effectué avec le kit RNeasy micro-kit (Qiagen, Germantown, MD, USA) en incluant un traitement à la DNase 1. Les ARN purifiés ont été élués avec 30-40 µl d’eau RNase-free et dosés en duplicata par spectrophotométrie avec le NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA). Une quantité de 5 ng d’ARN total a été utilisée pour la vérification de l’intégrité de l’ARN total au Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) avec le RNA 6000 Pico Kit (Agilent). La valeur de l’intégrité (RIN), indicateur de la qualité des ARN variait de 8.5 à 10 sur 10. Préparation des librairies et séquençage Le kit de préparation des librairies NEBNext Ultra II directional RNA library prep pour Illumina (New Englands Biolabs Inc., Ipswich, MA, USA) a été utilisée pour la préparation des librairies d'ARN, selon les instructions du fabricant. La qualité des librairies finales a été vérifiée au TapeStation 2200 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) et la quantification a été effectuée au fluorimètre QBit 3.0 (ThermoFisher Scientific, Canada). Par la suite, les librairies mRNA-seq ayant chacune 2 index uniques ont été regroupées dans un rapport équimolaire en 7 pools. Chaque pool a été déposé sur ligne d’une flowcell S4 haute performance et séquencé sur un système Illumina NovaSeq 6000 (Illumina Inc., San Diego, CA, USA). Un séquençage pairé de 100 pb a été effectué à la Plateforme de séquençage de nouvelle génération du Centre de recherche du CHU de Québec –Université Laval, Québec (Canada). La couverture moyenne/échantillon obtenue a été d’environ 29 millions de Reads pairés. Analyses bio-informatique Les Reads ont été coupées à l'aide de fastp v0.22.0 (Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y., & Gu, J. (2018). fastp: an ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor. Bioinformatics, 34(17), i884-i890). Le contrôle de la qualité a été effectué sur les matières premières et des données découpées pour assurer la qualité des Reads à l'aide de FastQC v0.11.9 (Andrews, Simon. "FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data." (2010)) et MultiQC v1.11 (Ewels, Philip, Måns Magnusson, Sverker Lundin, and Max Käller. "MultiQC: summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report." Bioinformatics 32, no. 19 (2016): 3047-3048. J). La quantification a été réalisée avec Kallisto v0.46.1 (Bray, Nicolas L., Harold Pimentel, Páll Melsted, and Lior Pachter. "Near-optimal probabilistic RNA-seq quantification." Nature biotechnology 34, no. 5 (2016) : 525) contre les transcrits codant pour les protéines du transcriptome d'Homo sapiens (GRCh38 téléchargé à partir de la version 104 d'Ensembl). L'analyse de l'expression différentielle a également été effectuée à l'aide du DESeq2 v1.34.0 (Love, Michael I., Wolfgang Huber, and Simon Anders. "Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2." Genome biology 15, no. 12 (2014) : 550). Toutes les analyses R ont été effectuées dans R v4.1.2 (R: Team, R. Core. "R : A language and environment for statistical computing." (2013): 201). La signature a été obtenue après analyse d'expression différentielle des conditions traités avec l’Adénosine versus les conditions contrôles en fixant les paramètres qvalue corrigée =|1.2|. Les résultats de séquençage montrent une sous-régulation de 4 enzymes glycoside-hydrolase, ce qui est cohérent avec l'effet attendu : Numé r o d’accession G è ne Prot é in e Traitement à l’a d é nosine Fold change Q9Y2E5 MAN2B2 mannosidase alpha class 2B member 2 -1,2 P34059 GALNS galactosamine-6-sulfate sulfatase -1,3 P10253 GAA glucosidase alpha -1,4 P17050 NAGA N-acetylgalactosaminidase alpha -1,2 La sous-régulation de ces 4 glycoside-hydrolases après le traitement par l’adénosine, un composé connu pour son effet anti-âge, valide l’invention et suggère un effet anti-âge mimétique du rétinol et/ou de l’acide rétinoïque. Procédé d’identification d’un composé anti-âge ayant une action mimétique de l’acide rétinoïque, du rétinol ou d’un de leurs dérivés, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : mettre en contact au moins un composé candidat avec un échantillon de peau d’un sujet, ou avec un modèle de peau ou un modèle cellulaire dans lequel au moins une glycoside-hydrolase est exprimée, puis mesurer le niveau d’expression et/ou de l’activité enzymatique de cette glycoside-hydrolase dans ledit échantillon ou modèle ; comparer l’expression et/ou de l’activité mesurée à l’étape a), à l’expression et/ou de l’activité de cette glycoside-hydrolase dans un échantillon de peau du sujet ou dans un modèle de peau ou un modèle cellulaire, non exposé audit composé ; et identifier ledit composé candidat comme ayant un effet anti-âge mimétique de l’acide rétinoïque, du rétinol ou d’un de leurs dérivés, lorsqu’une diminution de l’expression et/ou de l’activité de cette glycoside-hydrolase dans l’échantillon de peau du sujet ou le modèle de peau ou modèle cellulaire qui a été exposé audit composé candidat est détectée, par rapport à l’expression et/ou de l’activité de cette glycoside-hydrolase dans l’échantillon de peau du sujet ou le modèle de peau ou modèle cellulaire qui n’a pas été exposé au composé candidat. Procédé selon la revendication 1, comprenant en outre les étapes suivantes : d. comparer l’expression et/ou de l’activité mesurée à l’étape a), à l’expression et/ou de l’activité de cette glycoside-hydrolase dans un échantillon de peau du sujet ou dans un modèle de peau ou un modèle cellulaire, ledit échantillon ou modèle étant exposé à l’acide rétinoïque, au rétinol ou l’un de leurs dérivés ; et e. identifier ledit composé candidat comme ayant un effet anti-âge mimétique de l’acide rétinoïque, du rétinol ou d’un de leurs dérivés, lorsque l’expression et/ou de l’activité de cette glycoside-hydrolase dans l’échantillon de peau du sujet ou le modèle de peau ou le modèle cellulaire qui a été exposé audit composé candidat n’est pas significativement différente de l’expression de cette glycoside-hydrolase dans l’échantillon de peau du sujet ou le modèle exposé à l’acide rétinoïque, au rétinol ou l’un de leurs dérivés. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel l’échantillon de peau d’un sujet est une biopsie, de préférence le sujet est un sujet humain, de préférence une femme âgée d’au moins 40 ans, de préférence d’au moins 45 ans, encore mieux d’au moins 50 ans, de préférence une femme âgée de 40 à 80 ans, de préférence de 45 à 75 ans, de préférence de 50 à 70 ans. Procédé selon l’une des revendications précédentes, dans lequel la glycoside-hydrolase est impliquée dans la dégradation des glycosaminoglycanes (GAGs). Procédé selon l’une des revendications précédentes, dans lequel la glycoside-hydrolase est choisie parmi l’aspartylglucosaminidase, la fucosidase alpha-L-1, la glucosidase alpha, la galactosamine-6-sulfate sulfatase, l’acide bêta glucosidase, la galactosidase bêta 1, l’hexosaminidase A, l’hexosaminidase B, l'iduronate 2-sulfatase, la mannosidase alpha classe 2B membre 2, la N-acétylgalactosaminidase alpha, la sialidase 2, la N-sulfoglucosamine sulfohydrolase et la glucosamine (N-acétyl)-6-sulfatase ; de préférence la glycoside-hydrolase est choisie parmi la glucosidase alpha, la galactosamine-6-sulfate sulfatase, la mannosidase alpha classe 2B membre 2 et la N-acétylgalactosaminidase alpha. Procédé selon l’une des revendications précédentes, dans lequel le niveau d’expression est soit la quantité d’ARNm produite, soit la quantité de protéine produite, par l’expression du gène codant pour la glycoside-hydrolase ; et/ou l’activité enzymatique de glycoside-hydrolase est la quantité de GAGs dégradées. Procédé selon l’une des revendications précédentes, dans lequel le niveau d’expression et/ou de l’activité enzymatique de la glycoside-hydrolase est mesuré par PCR quantitative, séquençage NGS, spectrométrie de masse, Western blot ou ELISA. Méthode d’évaluation de l’efficacité d’une composition cosmétique comprenant à titre d’agent actif du rétinol, de l’acide rétinoïque, l’un de leurs dérivés ou un composé anti-âge identifié par le procédé selon l’une des revendications 1 à 7, comprenant les étapes suivantes : la mesure du niveau d’expression et/ou de l’activité enzymatique d’au moins une glycoside-hydrolase dans un échantillon de peau d’un sujet après application de la composition cosmétique; puis la comparaison de la mesure de l’étape a) avec un échantillon contrôle. Méthode selon la revendication 8, dans laquelle la composition est efficace lorsque le niveau d’expression et/ou de l’activité enzymatique de la glycoside-hydrolase mesuré à l’étape a) dans l’échantillon de peau du sujet est inférieur, en particulier significativement inférieur, à un contrôle. Méthode selon la revendication 8 ou 9, dans laquelle le contrôle est une valeur de référence déterminée par la valeur moyenne du niveau d’expression et/ou de l’activité enzymatique de la glycoside-hydrolase, mesurée dans une population déterminée, par exemple une population âgée de 40 à 80 ans.