Brevet FR3145867A1 — publié le 20240823

L’invention a trait au domaine des compositions vaccinales. Elle concerne plus particulièrement une composition vaccinale prophylactique à destination des mammifères et des oiseaux comprenant une bactérie entière tuée, ladite bactérie étant recouverte d’un agent cationique, en particulier des nanoparticules cationiques. COMPOSITION VACCINALE COMPRENANT UN SYSTEME DE DELIVRANCE D’UNE BACTERIE ENTIERE INACTIVEE VIA DES NANOPARTICULES POLYSACCHARIDIQUES CATIONIQUES SANS ADJUVANT L’invention a trait au domaine des compositions vaccinales. Elle concerne plus particulièrement une composition vaccinale prophylactique à destination des mammifères et des oiseaux comprenant une bactérie entière tuée, ladite bactérie étant recouverte d’un agent cationique, en particulier des nanoparticules cationiques. Les bactéries sont responsables de nombreuses maladies. Une infection par une bactérie peut suffire à induire une maladie mortelle, avec des conséquences économiques fatales pour les élevages, et notamment les élevages de volailles. La bactérie Escherichia coli est une bactérie commensale du tractus digestif des animaux et des humains. Il s’agit de la bactérie la plus courante. Elle se retrouve tant dans leur environnement que dans leur flore intestinale. D’autres bactéries pathogènes tels que par exemple Salmonella enterica responsable de la Salmonellose, représentent également un enjeu majeur pour la santé des volailles. Pour prévenir le risque d’infection des animaux d’élevages, des vaccins prophylactiques ont été développés dans le but d’immuniser les individus et d’écarter les risques d’infections et les conséquences sanitaires qui en résultent. La vaccination prophylactique consiste à induire une réponse immunitaire chez un individu sain n’ayant pas encore été en contact avec un pathogène dans le but d’activer ses défenses immunitaires. Pour cela, un antigène tel qu’un pathogène ou un fragment de pathogène, est présenté aux cellules immunitaires de l’individu. Cette présentation permet l’activation des cellules immunitaires adaptatives, les lymphocytes B et T. Elles se multiplient et produisent des anticorps qui neutralisent et éliminent l’antigène et/ou une réponse cellulaire qui détruit les cellules infectées. Ce mécanisme induit une mémoire immunitaire, permettant à l’individu d’être protégé lors de la prochaine rencontre avec ledit pathogène. La vaccination prophylactique permet donc d’immuniser des individus sains afin de les préserver de futures maladies. Pour que ce mécanisme soit efficace, il est primordial que le pathogène soit identifié comme un intru par le système immunitaire de l’individu afin qu’il développe une réponse immunitaire protectrice contre l’infection. L’art antérieur nous enseigne qu’il existe plusieurs types de vaccins prophylactiques permettant d’immuniser des volailles contre des bactéries pathogènes. Le brevet EP2911688A1 concerne un serovar de Salmonella enterica sérogroupe CI destiné à être utilisé pour protéger les volailles contre un trouble résultant d'une infection à Salmonella enterica . Ce serovar de Salmonella enterica étant sous forme inactivée. Le sérovar est utilisé pour fabriquer des vaccins pouvant être multivalents. Les poussins sont vaccinés à 30h de vie. Le sérovar est utilisé pour formuler un vaccin contenant un adjuvant, tel que par exemple hydroxyde d'aluminium à environ 25 % v/v. Le brevet EP0256792A2 décrit un vaccin pour la protection des volailles contre les infections à la colibacillose, comprenant comme ingrédient actif des cellules E. coli inactivées via un traitement aux ultrasons qui détruit la bactérie. Le vaccin peut contenir des adjuvants, par exemple un composé d'aluminium tel qu'un gel d'hydroxyde d'aluminium. L’inoculation du vaccin à la volaille est préférentiellement effectuée par le cloaque. Toutefois, le vaccin peut également être inoculé de manière conventionnelle, par exemple, par voie intramusculaire, intraveineuse ou sous-cutanée. L'essence de l'invention est la mise en œuvre de la rupture de la membrane cellulaire par ultrasons dans la fabrication d'un vaccin contre la colibacillose de la volaille. L’accessibilité des campagnes de vaccinations est souvent limitée par le coût d’une dose de composition vaccinale. En effet, les vaccins actuels sont souvent coûteux, ce qui limite leurs utilisations à grande échelle, notamment dans les élevages où le nombre d’individus à traiter est conséquent. Bien que des vaccins soient commercialisés pour prévenir les infections causées par des bactéries pour des mammifères et des oiseaux, ces vaccins ne sont pas satisfaisants car ils ne permettent pas de générer une protection totale et efficace à un coût accessible. De plus, les compositions proposées dans l’art antérieur comprennent toutes des adjuvants vaccinaux, nécessaires à leur efficacité, mais dont les effets secondaires sont largement documentés. Les inventeurs ont mis au point une composition vaccinale prophylactique sans adjuvant, permettant d’immuniser des mammifères et des oiseaux, en particulier des volailles contre des bactéries pathogènes. Particulièrement, les inventeurs ont mis au point un nouveau système de délivrance, dans lequel le recouvrement d’au moins une bactérie pathogène entière et tuée, par des nanoparticules cationiques (NP) permet d’améliorer le mécanisme de captation cellulaire. Cela a pour effet d’améliorer le mécanisme de présentation des antigènes bactériens aux cellules immunitaires et donc d’activer le système immunitaire plus rapidement et plus efficacement. De manière avantageuse, la composition vaccinale peut être multivalente de sorte à induire une protection de large spectre. La composition vaccinale peut ainsi permettre de réaliser des vaccins combinés. L’endocytose est un mécanisme qui d’entrée de matériel extracellulaire dans une cellule, par invagination de la membrane plasmique suivie de la formation de vésicules s'isolant dans le cytoplasme. Lorsque l’endocytose est réalisée par des cellules immunitaires spécialisées (polynucléaires neutrophiles, macrophages, cellules dendritiques), on parle alors de phagocytose. Notamment, le vaccin prophylactique peut être utilisé comme traitement contre la Salmonellose aviaire, la colibacillose, la campylobactériose, ou toute autre infection bactérienne. Ainsi, l’invention concerne une composition vaccinale prophylactique sans adjuvant, en particulier à destination des mammifères et des oiseaux, et plus particulièrement des volailles, comprenant des nanoparticules cationiques constituées d’un noyau de polysaccharide et au moins une bactérie inactivée, caractérisée en ce que ladite bactérie est entière et en ce que ledit agent cationique recouvre ladite bactérie dans un ratio protéines bactériennes : NP en poids inférieur à 1 : 1 (poids/poids ; bactérie/NP). Cette composition permet de limiter les risques de contaminations à au moins une maladie résultant d’une infection par une bactérie pathogène. Dans un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une composition vaccinale prophylactique multivalente destinée au traitement de la salmonellose ou de la colibacillose notamment à destination des mammifères et oiseaux, plus spécifiquement des volailles telles que les poules pondeuses, les poulets de chair, dindes, canards, pintades, autruches, émeus, cailles… L’invention concerne également l’utilisation d’une composition vaccinale pour prévenir une infection bactérienne, en particulier une colibacillose, salmonellose, campylobactériose. Avantage de l’invention De manière tout à fait surprenante, les inventeurs ont démontré que l’administration d’une composition vaccinale comprenant des bactéries pathogènes entières inactivées recouvertes partiellement d’agents cationiques, tels que par exemple, des nanoparticules cationiques, constituait un nouveau système de délivrance d’antigènes permettant d’immuniser efficacement contre un pathogène d’origine bactérienne. Il est connu de l’art antérieur que des nanoparticules cationiques ont la capacité d’augmenter le phénomène d’endocytose des cellules immunitaires en délivrant de petits antigènes d’une taille de l’ordre de 5 à 15 nanomètres, telles que des antigènes protéiques provenant de pathogènes fragmentés. Dans cette configuration, une quantité importante de nanoparticules est nécessaire pour internaliser chaque élément de la cellule bactérienne fragmentée. Ces systèmes de délivrance utilisent des nanoparticules cationiques associées à un extrait total ou partiel d’une bactérie pathogène fragmentée qui est, dans ce cas, contenu dans le noyau des nanoparticules ; cette configuration « antigène dans le noyau de la nanoparticule » nécessite un ratio protéines bactériennes : NPL en poids supérieur à 1 : 1 (antigène : NPL), de préférence entre 1 :3 et 1 :10 ou même supérieur à 1 :100 obtenu avec des nanoparticules de type PLGA ou liposomes par exemple. Dans le présent travail, les inventeurs ont démontré, de manière inattendue, que les nanoparticules cationiques permettent le phénomène de phagocytose des cellules bactériennes entières. La taille des cellules entières est de l’ordre minimum de 1 à 10 microns, c’est-à-dire que ces cellules sont au moins 100 fois plus grande que les antigènes protéiques. Les inventeurs ont donc mis au point un nouveau système de délivrance, dans lequel la cellule bactérienne est recouverte par de nanoparticules chargées positivement selon l’invention, ce qui rend possible son interaction avec la membrane cellulaire et son entrée dans les cellules immunitaires par phagocytose. Cette configuration présente l’avantage de réduire considérablement le nombre de nanoparticules à utiliser dans la composition vaccinale De manière très intéressante, une faible quantité de nanoparticules est suffisante pour que la cellule bactérienne entière entre par phagocytose. Les inventeurs ont montré qu’un ratio protéines bactériennes : NPL cationiques en poids inférieur à 1 :1 (antigène : NPL) permet une immunisation efficace. Réduire le nombre de nanoparticules utiles à la vaccination permet de réduire considérablement les coûts de production de la composition vaccinale, rendant la vaccination contre des bactéries pathogènes accessible à grande échelle, notamment dans des domaines où le coût est une réelle limite aux campagnes de vaccination. On peut citer par exemple l’élevage des volailles avec la vaccination in ovo. De plus, la composition vaccinale a pour avantage de pouvoir être, en fonction du mode de réalisation de l’invention, multivalente. C’est-à-dire qu’elle peut comprendre au moins deux souches de bactéries dont chacune assure la prévention d'une infection. Ainsi, l’invention permet d’obtenir facilement un vaccin combiné. La composition vaccinale permet également, en fonction du mode de réalisation de l’invention, d’acquérir une immunité croisée. En effet, la composition vaccinale peut comprendre une bactérie qui induit une immunité contre des variants de la souche considérée. Une application d’intérêt pour la présente technologie est l’inoculation in ovo . Cette approche est innovante : aucune stratégie vaccinale décrite auparavant n’a proposé d’administrer une bactérie entière inactive directement dans l’œuf. Ici, la combinaison de bactéries inactives entières et de nanoparticules cationiques s’avère très efficace en termes de protection vaccinale et sans effet délétère sur l’éclosion, ni sur le poussin. De plus, en intervenant avant l’éclosion les risques de contamination au sein de l’élevage (entre poussins) sont diminués ainsi que la transmission de la maladie dans les élevages. En particulier, les inventeurs ont montré qu’une composition vaccinale comprenant 3 souches différentes de E . Coli administrée in ovo chez le poussin, permet de protéger le poussin d’une infection de type colibacillose à dose non létale mais également à dose létale dans des expériences de challenge bactérien. La charge bactérienne est diminuée et le taux d’éclosion est équivalent à celui d’œufs non vaccinés. D’autre part, dans une autre application, une injection intramusculaire d’une composition vaccinale comprenant une souche bactérienne de Salmonella et des nanoparticules cationiques (NPL) chez la poule pondeuse permet de diminuer la charge bactérienne et les poules pondent plus d’œufs que les poules non immunisées. La composition vaccinale ne contient aucun adjuvant, ce qui évite les effets indésirables. Ceci est avantageux puisque les adjuvants minéraux (à savoir des sels minéraux tels que sels d’aluminium) restent très longtemps dans le corps. Les nanoparticules jouent le rôle d’agent de délivrance des bactéries tuées aux cellules immunitaires et permettent d’induire une réponse protectrice contre l’infection. Dans le cas de la vaccination in ovo , le fait de ne pas introduire de molécules susceptibles de perturber le développement du poussin in ovo contribue à l’efficacité de l’approche vaccinale, le vaccin ne perturbant pas le développement du poussin et ni de l’éclosion. La composition vaccinale peut être administrée in ovo, mais également par voie mucosale (orale, oculaire, nasale) ou intra-musculaire. De plus, l’approche vaccinale selon l’invention peut être mise en œuvre chez les mammifères ainsi que chez les oiseaux, notamment chez les volailles. La composition selon la présente invention, fournit donc une composition de formulation simple, facile à préparer et peu coûteuse pouvant être notamment administrée in ovo . De plus, le fait que la composition comprenne une bactérie entière et inactivée présente également l’avantage d’être un antigène plus simple à caractériser qu’un extrait partiel ou total d’antigène. Un premier objet de la présente invention concerne une composition vaccinale sans adjuvant comprenant des nanoparticules cationiques constituées d’un noyau de polysaccharide et au moins une bactérie inactivée, caractérisée en ce que ladite bactérie est entière et en ce que ledit agent cationique recouvre ladite bactérie dans un ratio protéines bactériennes : NP en poids inférieur à 1 :1. Dans un mode de réalisation particulier, la composition vaccinale est à destination des mammifères et oiseaux. Par « nanoparticule cationique constituée d’un noyau de polysaccharide cationique », on entend une nanoparticule est solide comprenant un noyau de polysaccharide cationique (NP). La NP peut être réticulée ou non. Son noyau peut être chargé ou non d’un phospholipide anionique. Cette NP n’est entourée d’aucune couche phospholipidique. Au sens de la présente invention, les nanoparticules cationiques sont des particules ayant une gamme de taille comprise entre 1 et 500 nanomètres. Plus préférentiellement, les nanoparticules polysaccharidiques ont une gamme de taille comprise entre 10 et 300 nm, notamment entre 20 et 250 nm. Par ailleurs, une nanoparticule selon l'invention est avantageusement utilisée en solution. Ainsi, le terme nanoparticule comprend également des particules ou des molécules qui sont sous une forme nanoparticulaire en solution, comme par exemple le chitosan et ses dérivés. La solution peut être une solution aqueuse, une solution tampon ou une solution sérique. Les inventeurs ont en effet constaté que certaines molécules linéaires telles que le chitosan forment en solution des serpentins nanométriques, qui se comportent comme des nanoparticules classiques. Le chitosan peut ainsi être utilisé sous forme de nanoparticule classique (eg Qi et al, Carbohydrate Research, 2004, 339(16), 2693-2700) ou tel quel ou sous forme d'hydrolysat en solution. Dans un premier mode de réalisation particulier, le polysaccharide cationique formant le noyau de la NP est un polymère non réticulé obtenu par la réaction entre un polysaccharide choisi parmi l’amidon, le dextrane, le chitosan, la dextrine, et la maltodextrine, des poly-fructoses (inuline), poly-mannoses, poly-galactoses, poly-galacto-mannanes (gomme de guar) et au moins un ligand cationique choisi entre une amine primaire, secondaire, tertiaire ou des ammoniums quaternaires. Le noyau n’est pas chargé en lipides. Autrement dit, dans ce mode de réalisation, la nanoparticule est une nanoparticule cationique constituée d’un noyau polysaccharide non réticulé et non chargé en lipide constitué (i) d’un polysaccharide choisi parmi l’amidon, le dextrane, le chitosan, la dextrine, et la maltodextrine, des poly-fructoses (inuline), poly-mannoses, poly-galactoses, poly-galacto-mannanes (gomme de guar) et (ii) d’un au moins un ligand cationique choisi parmi une amine primaire, secondaire, tertiaire ou des ammoniums quaternaires. Dans un deuxième mode de réalisation particulier, le polysaccharide cationique formant le noyau de la NP est un polymère réticulé obtenu par la réaction entre un polysaccharide choisi parmi l’amidon, le dextrane, le chitosan, la dextrine, et la maltodextrine, des poly-fructoses (inuline), poly-mannoses, poly-galactoses, poly-galacto-mannanes (gomme de guar) et au moins un ligand cationique choisi parmi une amine primaire, secondaire, tertiaire ou des ammoniums quaternaires, puis l’ajout d’un agent de réticulation. L’agent de réticulation est choisi parmi l’épichloridrine, un diacide carboxylique ou un chlorure d’acide, tel que l’acide sébacique. Le noyau n’est pas chargé en lipides. Autrement dit, dans ce mode de réalisation, la nanoparticule est une nanoparticule cationique constituée d’un noyau polysaccharide réticulé et non chargé en lipide constitué (i) d’un polysaccharide choisi parmi l’amidon, le dextrane, le chitosan, la dextrine, et la maltodextrine, des poly-fructoses (inuline), poly-mannoses, poly-galactoses, poly-galacto-mannanes (gomme de guar) (ii) d’un au moins un ligand cationique choisi parmi une amine primaire, secondaire, tertiaire ou des ammoniums quaternaires, et (iii) d’un agent de réticulation est choisi parmi l’épichloridrine, un diacide carboxylique ou un chlorure d’acide, tel que l’acide sébacique. Dans un troisième mode de réalisation, la NP est une nanoparticule constituée d’un noyau de polysaccharide cationique est non réticulé et chargé en phospholipide. Autrement dit, dans ce mode de réalisation, la nanoparticule est une nanoparticule cationique constituée d’un noyau polysaccharide non réticulé et chargé en phospholipide anionique constitué (i) d’un polysaccharide choisi parmi l’amidon, le dextrane, le chitosan, la dextrine, et la maltodextrine, des poly-fructoses (inuline), poly-mannoses, poly-galactoses, poly-galacto-mannanes (gomme de guar), (ii) d’un au moins un ligand cationique choisi parmi une amine primaire, secondaire, tertiaire ou des ammoniums quaternaires, et (iii) d’un phospholipide anionique choisi parmi le glycérol de diacylphosphatidyle, la sérine de diacylphosphatidyle ou l’inositol de diacylphosphatidyle Dans un quatrième mode de réalisation de l’invention, la nanoparticule est une nanoparticule cationique constituée d’un noyau polysaccharide réticulé et chargé en phospholipide anionique constitué (i) d’un polysaccharide choisi parmi l’amidon, le dextrane, le chitosan, la dextrine, et la maltodextrine, des poly-fructoses (inuline), poly-mannoses, poly-galactoses, poly-galacto-mannanes (gomme de guar), (ii) d’un au moins un ligand cationique choisi parmi une amine primaire, secondaire, tertiaire ou des ammoniums quaternaires, (iii) d’un agent de réticulation est choisi parmi l’épichloridrine, un diacide carboxylique ou un chlorure d’acide, tel que l’acide sébacique, et (iv) d’un phospholipide anionique choisi parmi le glycérol de diacylphosphatidyle, la sérine de diacylphosphatidyle ou l’inositol de diacylphosphatidyle. Dans un mode de réalisation préféré s’appliquant aux quatre types de NP décrites ci-dessus, le polysaccharide cationique est à base de maltodextrine ; il est obtenu par la réaction entre la maltodextrine et le glycidyltriméthylammonium, que la NP soit réticulée ou non, lipidée ou non. Autrement dit, le noyau de polysaccharide cationique comprend de la maltodextrine et un glycidyltriméthylammonium. Dans un mode de réalisation préféré applicable aux NP dont le noyau est chargé en phospholipide, la NP est une nanoparticule de polysaccharide cationique chargée en DPPG, que la NP soit réticulée ou non. Parmi le groupe des oiseaux, on entend particulièrement les volailles. Les volailles, au sens de l’invention, sont des oiseaux domestiques qui servent de source d'œufs ou de viande et qui comprennent des espèces commercialement importantes telles que, par exemple, les poulets, les poules pondeuses, les dindes, les canards, les oies, les pintades, les faisans, les pigeons et les paons. Dans un mode de réalisation préféré, la bactérie est choisie parmi le groupe suivant : Salmonella enterica ser.Typhi; Streptococcus Pneumoniae, Haemophilus influenzae type b, Mycobacterium tuberculosis, Extraintestinal pathogenic E.Coli (ExPEC), enterotoxigenic E.Coli (ETEC); S.enterica ser., Paratyphi A; Neisseria Gonorheae; Clostridium Difficile; Campylobacter spp: Shigella spp; Staphulobacter Aureus, Helicobacter pylori . Par « bactérie entière » on entend au sens de l’invention, une bactérie non fragmentée, sous sa forme complète, en particulier dont la membranaire cellulaire est intacte. Autrement dit, cela signifie que les membranes des bactéries restent inaltérées. A contrario , des bactéries dont les membranes sont abimées, fragmentées ou explosées ne peuvent être considérées comme des bactéries entières au sens de la présente invention. Par « par bactéries inactivées ou inactives » on entend au sens de l’invention, une bactérie non vivante, qui a été préalablement tuée mais qui est intacte. Par intacte, on entend une bactérie dont la membrane est inaltérée. Elles peuvent être tuées par exemple par traitement au formaldehyde ou toute autre méthode d’inactivation connue de l’homme du métier. Par « recouverte de nanoparticules cationiques » on entend au sens de l’invention, que les nanoparticules tapissent la surface de la bactérie inactivée. Les nanoparticules recouvrent d’une couche homogène les bactéries tuées. Le taux de recouvrement peut être défini par le ratio en poids des protéines bactériennes : NP qui est inférieur ou égal à 1. Une bonne efficacité des bactéries recouvertes de NP associée à une prévention de l’infection a été observée pour un ratio protéines bactériennes (en poids sec) : NP en poids compris entre 1 : 0,01 et 1 : 10 et plus particulièrement entre 1 : 0,01 et 1 : 3. Soit environ 100 fois moins de nanoparticules en poids par rapport au poids des bactéries. Dans un mode de réalisation particulier, ce ratio est inférieur à 1 :1, en particulier compris entre 1 : 0,01 et 1 : 1. Dans un mode de réalisation encore plus préféré, ce ratio est compris entre 1 :0,01 et 1 : 0,5. Dans un mode de réalisation encore préféré, le ratio est compris entre 1 : 0,01 et 1 : 0,1. Dans des modes de réalisation particuliers, ce ratio peut être compris entre 1 : 0,1 et 1 : 10 voire entre 1 : 0,1 et 1 : 3. La composition vaccinale comprend au moins une bactérie dans une quantité suffisante pour induire une protection efficace pour éviter, ou tout du moins réduire, une infection bactérienne. Par « éviter une infection » on entend au sens de l’invention, que la composition vaccinale peut protéger à 100% contre les risques d’infection ou, si elle n’évite pas totalement le risque d’infection, alors la protection conférée par le vaccin est suffisante pour que l’individu ne déclenche pas la maladie ou s'il la déclenche, les symptômes de l'infection sont au moins réduits et que l’individu évite la mort. Dans un mode de réalisation de l’invention, la composition vaccinale est prophylactique. Dans un autre mode de réalisation de l’invention, la composition vaccinale est à destination des oiseaux. Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, la composition vaccinale prophylactique est à destination des volailles. En particulier, l’embryon dans l’œuf. Par « composition vaccinale multivalente » on entend au sens de l’invention que la composition vaccinale comprend plusieurs bactéries différentes pouvant permettant d’induire une immunité contre plusieurs maladies associées aux différentes bactéries. Dans un mode de réalisation particulier, la composition vaccinale permet d’élaborer des vaccins combinés. Par « vaccins combinés » on entend au sens de l’invention, une composition vaccinale comprenant plusieurs bactéries d’espèces ou de familles différentes de sorte à induire, simultanément, une immunité contre plusieurs bactéries différentes. Dans un mode de réalisation, la composition vaccinale comprend au moins une bactérie entière et inactivée qui permet d’induire une immunité croisée chez l’individu ayant été vacciné. Par « immunité croisée » on entend au sens de l’invention, une immunité acquise contre un pathogène bactérien qui confère une immunité contre un autre pathogène bactérien d’espèce, de souche ou de famille différente qui ne fait pas partie de la composition vaccinale. L'immunité croisée est liée au phénomène de réactivité croisée. Les anticorps sont habituellement spécifiques d’un antigène particulier. C’est grâce à cette spécificité que les anticorps ciblent et éliminent les antigènes qu’ils ont détectés. Une bactérie mutante conserve des antigènes communs qui peuvent être la cible d’une réponse induite par la vaccination. Ainsi, il peut exister des réactions croisées avec des bactéries d'espèces proches. Une bactérie possède de nombreux antigènes de surface. Lorsqu’un animal est immunisé contre une bactérie grâce à une injection de bactéries entières, il produit des anticorps contre de nombreux antigènes bactériens. Si deux bactéries possèdent un antigène identique ou similaire, l'individu aura acquis une immunité contre ces deux bactéries. Dans un autre mode de réalisation de l’invention, la composition vaccinale est multivalente et comprend au moins 2 souches différentes de bactéries d’espèces ou de familles différentes, lesdites bactéries étant entières et inactivées. La composition vaccinale peut, par exemple, être composée de 3 souches d'E. coli inactivées mélangées à des nanoparticules de maltodextrine lipidées (NPL) afin de prévenir la colibacillose. Ainsi, selon les différents modes de réalisation de la composition vaccinale, ladite composition peut comprendre : - Une bactérie inactivée et entière, recouverte de nanoparticules cationiques constituées d’un noyau de polysaccharide poreux sous forme réticulée chargé en phospholipide anionique. - Une bactérie inactivée et entière, recouverte de nanoparticules cationiques constituées d’un noyau de polysaccharide poreux sous forme réticulée non chargé en lipide. - Une bactérie inactivée et entière, recouverte de nanoparticules cationiques constituées d’un noyau de polysaccharide sous forme non réticulée chargé en phospholipide anionique. - Une bactérie inactivée et entière, recouverte de nanoparticules cationiques constituées d’un noyau de polysaccharide sous forme non réticulée non chargé en lipide. - Au moins deux bactéries de souches et/ou d’espèces ou de familles différente, lesdites bactéries étant inactivées et entières, recouvertes de nanoparticules cationiques constituées d’un noyau de polysaccharide poreux sous forme réticulée chargé en phospholipide. - Au moins deux bactéries de souches et/ou d’espèces ou de familles différente, lesdites bactéries étant inactivées et entières, recouvertes de nanoparticules cationiques constituées d’un noyau de polysaccharide sous forme réticulée non chargé en lipide. - Au moins deux bactéries de souches et/ou d’espèces ou de familles différente, lesdites bactéries étant inactivées et entières, recouvertes de nanoparticules cationiques constituées d’un noyau de polysaccharide poreux sous forme non réticulée chargé en phospholipide. - Au moins deux bactéries de souches et/ou d’espèces ou de familles différente, lesdites bactéries étant inactivées et entières, recouvertes de nanoparticules cationiques constituées d’un noyau de polysaccharide sous forme non réticulée non chargé en lipide. Un deuxième objet de l’invention concerne une composition vaccinale multivalente à destination des mammifères et oiseaux comprenant au moins deux bactéries inactivées différentes caractérisée en ce que lesdites bactéries sont entières et qu’elles sont recouvertes de nanoparticules cationiques constituées d’un noyau de polysaccharide pour utilisation par voie intra-musculaire, mucosale ou par administration in ovo . Un troisième objet de l’invention concerne un vaccin combiné à destination des mammifères et oiseaux comprenant au moins deux bactéries d’espèces ou de familles différentes inactivées caractérisé en ce que lesdites bactéries sont entières et recouvertes de nanoparticules cationiques constituées d’un noyau de polysaccharide pour utilisation par voie intra-musculaire, mucosale ou par administration in ovo . Un quatrième objet de l’invention concerne l’utilisation d’une composition vaccinale telle que définie précédemment pour prévenir une infection bactérienne chez un mammifère ou un oiseau. Dans des modes particuliers de l’invention, l’infection bactérienne est une salmonellose, une colibacillose ou une campylobactériose. Dans un mode de réalisation préférée, cette utilisation s’applique à la prévention d’une infection bactérienne chez l’embryon de volaille in ovo (par administration in ovo ). L’invention concerne aussi une méthode de prévention d’une maladie liée à une infection bactérienne à destination des animaux mammifères et oiseaux, comprenant une composition vaccinale comprenant au moins une bactérie pathogène entière inactivée recouverte de nanoparticules cationiques constituées d’un noyau de polysaccharide et comprenant les étapes suivantes : Disposer de nanoparticules cationiques constituées d’un noyau de polysaccharide et d’au moins une bactérie entière. Procéder à l’inactivation de ladite bactérie entière à l’aide de formaldéhyde. Mélanger lesdites nanoparticules cationiques avec ladite bactérie entière inactivée dans un ratio protéines bactériennes : nanoparticules en poids inférieur ou égal à 1. Dans laquelle, lesdites nanoparticules cationiques peuvent être choisies parmi : Des nanoparticules cationiques constituées d’un noyau polysaccharide non réticulé et non chargé en lipide constitué (i) d’un polysaccharide choisi parmi l’amidon, le dextrane, le chitosan, la dextrine, et la maltodextrine, des poly-fructoses (inuline), poly-mannoses, poly-galactoses, poly-galacto-mannanes (gomme de guar) et (ii) d’un au moins un ligand cationique choisi parmi une amine primaire, secondaire, tertiaire ou des ammoniums quaternaires ; Des nanoparticules cationiques constituées d’un noyau polysaccharide réticulé et non chargé en lipide constitué (i) d’un polysaccharide choisi parmi l’amidon, le dextrane, le chitosan, la dextrine, et la maltodextrine, des poly-fructoses (inuline), poly-mannoses, poly-galactoses, poly-galacto-mannanes (gomme de guar) (ii) d’un au moins un ligand cationique choisi parmi une amine primaire, secondaire, tertiaire ou des ammoniums quaternaires, et (iii) d’un agent de réticulation est choisi parmi l’épichloridrine, un diacide carboxylique ou un chlorure d’acide, tel que l’acide sébacique ; Des nanoparticules cationiques constituées d’un noyau polysaccharide non réticulé et chargé en phospholipide anionique constitué (i) d’un polysaccharide choisi parmi l’amidon, le dextrane, le chitosan, la dextrine, et la maltodextrine, des poly-fructoses (inuline), poly-mannoses, poly-galactoses, poly-galacto-mannanes (gomme de guar), (ii) d’un au moins un ligand cationique choisi parmi une amine primaire, secondaire, tertiaire ou des ammoniums quaternaires, et (iii) d’un phospholipide anionique choisi parmi le glycérol de diacylphosphatidyle, la sérine de diacylphosphatidyle ou l’inositol de diacylphosphatidyle ; Des nanoparticules cationiques constituées d’un noyau polysaccharide réticulé et chargé en phospholipide anionique constitué (i) d’un polysaccharide choisi parmi l’amidon, le dextrane, le chitosan, la dextrine, et la maltodextrine, des poly-fructoses (inuline), poly-mannoses, poly-galactoses, poly-galacto-mannanes (gomme de guar), (ii) d’un au moins un ligand cationique choisi parmi une amine primaire, secondaire, tertiaire ou des ammoniums quaternaires, (iii) d’un agent de réticulation est choisi parmi l’épichloridrine, un diacide carboxylique ou un chlorure d’acide, tel que l’acide sébacique, et (iv) d’un phospholipide anionique choisi parmi le glycérol de diacylphosphatidyle, la sérine de diacylphosphatidyle ou l’inositol de diacylphosphatidyle. Dans un mode de réalisation préféré, le polysaccharide cationique est obtenu par la réaction entre la maltodextrine et le glycidyltriméthylammonium, que la NP soit réticulée ou non. Dans un mode de réalisation particulier, ladite méthode de prévention comprend une composition vaccinale inoculée par voie mucosale, injectable et/ou bien administrée in ovo . Dans des modes de réalisation particuliers de l’invention, la composition vaccinale est administrée chez les volailles à savoir in ovo , mucosale et orale chez le poussin et en intramusculaire chez la poule pondeuse. : : Captation d'E. coli après recouvrement par les NPL par les cellules. La délivrance de bactéries E. coli entières a été évaluée dans des cellules humaines H292. Les E. coli-FITC fluorescentes, seules ou associées aux NPL (ratio 1/3 à 1/0.05) ont été incubées avec des cellules humaines H292 pendant 4h, et le pourcentage de cellules positives a été mesuré par cytométrie en flux sans ou avec bleu trypan (TB). Les résultats représentent la moyenne ± SEM de 3 expériences. Analyse statistique : two-way ANOVA, ** p : Délivrance intracellulaire par microscopie confocale, avec un ratio 1/3. La délivrance de bactéries E. coli a été évaluée dans des cellules H292. Les E. coli-FITC fluorescent associées aux NPL (ratio 1/3) ont été incubées avec des cellules H292 pendant 4h, et la localisation intracellulaire a été observée par microscopie confocale. Une image représentative a été prise. Rouge : membrane plasmique ; bleu : noyaux ; vert : E. coli. Barre d'échelle : 10µm. : Schéma du protocole vaccinal de l'essai de vaccination in ovo. Le vaccin commercial a été administré uniquement sur le contrôle positif. : Test de perméabilité intestinale pour 8 oiseaux de chaque groupe, 6 jours après le challenge (J20). Les résultats représentent la moyenne ± SD. : Analyse des sIgA anti-E. coli dans les fèces de 8 oiseaux issus de chaque groupe, 13 jours après le challenge (J27). Les résultats représentent la moyenne ± SD des valeurs d'absorbance obtenues par ELISA. Analyse statistique : one-way Anova, * p : Score clinique des lésions hépatiques issus de 8 oiseaux de chaque groupe, 6 jours après le challenge (J20). Les résultats représentent la moyenne ± SD des scores des groupes. Analyse statistique : one-way Anova, * p : Schéma du protocole de l'essai de vaccination in ovo. Seul le groupe positif a été vacciné à J1 avec le vaccin commercial (Poulvac). : Le pourcentage de mortalité sur chaque groupe après le challenge léthal à J14 (n=30). : La mesure de la charge bactérienne dans les sacs aériens des oiseaux issus de chaque groupe, évaluée 2 jours après le challenge (J16) sur 8 oiseaux, par MPN. Les résultats représentent la moyenne ± SD. Les analyses statistiques ont été réalisées par one-way ANOVA, * p : perméabilité intestinale de 8 oiseaux issus de chaque groupe 6 jours après le challenge (J20). Les résultats représentent la moyenne ± SD. Les analyses statistiques ont été réalisées par one-way ANOVA, * p : Score de lésion intestinale de 8 oiseaux issus de chaque groupe 6 jours après le challenge (J20). Les résultats représentent la moyenne ± SD. Les analyses statistiques ont été effectuées par one-way ANOVA, * p : Schéma du protocole de l'essai de vaccination intra-musculaire. : Ponte des œufs. En haut : nombre quotidien d'œufs pondus par les poules de chaque groupe après le challenge. Les barres d'erreur sont cachées pour clarifier le graphique. En bas : Nombre quotidien moyen d'œufs pondus par les poules de chaque groupe après le challenge. Analyses statistiques : one-way Anova * p : Quantification de la charge bactérienne dans le caecum du poulet de chaque groupe, mesurée par qPCR. Les résultats représentent la moyenne ± SEM. Analyse statistique : one -way ANOVA ** p : quantification de la charge bactérienne dans le caecum du poulet de chaque groupe, mesurée par qPCR. Les résultats représentent la moyenne ± SEM. : Calendrier du protocole de l'essai de vaccination in ovo. Seul le groupe « contrôle positif » a été vacciné à J1 avec le vaccin commercial (Poulvac). : Mesure de l'infection bactérienne dans la trachée (ci-dessus) et les alvéoles (ci-dessous) des oiseaux de chaque groupe, évaluée sur 8 oiseaux, par most probable number (MPN). Les résultats représentent le nombre d'oiseaux positifs et négatifs par groupe. : Analyse des sIgA anti-E.coli dans les fèces de 8 oiseaux de chaque groupe après le challenge. Les résultats représentent la moyenne ± ET des titres d'Ac. Analyse statistique : Anova unidirectionnelle pour chaque jour. : score des lésions du poumon de 8 oiseaux par groupe après le challenge. Les résultats représentent la moyenne de chaque groupe. Des analyses statistiques ont été faites pour chaque jour par one-way ANOVA. : délivrance de bactéries E. coli entières a été évaluée dans des cellules H292. Les E. coli-FITC fluorescentes, seules ou associées aux NP, ont été incubées avec des cellules H292 pendant 4h, et le pourcentage de cellules positives a été mesuré par cytométrie en flux. Les résultats représentent la moyenne ± SD de 2 expériences. : délivrance de bactéries E. coli entières a été évaluée dans des cellules THP-1. Les E. coli-FITC fluorescentes, seules ou associées aux NP, ont été incubées avec des cellules THP-1 pendant 4h, et le pourcentage de cellules positives a été mesuré par cytométrie en flux. Les résultats représentent la moyenne ± SD de 2 expériences. EXEMPLES Abréviations : NPL : Nanoparticules de maltodextrine lipidées réticulées i.d : Intradermique i.n : Intranasal i.p : Intrapéritonéal i.m : Intramusculaire EXEMPLE 1 : Optimisation de la formulation avec des nanoparticules cationiques L’objectif de cette étude est de confirmer l’efficacité en tant que système de délivrance d’une composition, à base de nanoparticule et d’une souche E. coli entière inactivée, pour activer les cellules immunitaires. 1-A Matériel et méthodes : A-Formulations vaccinales Les nanoparticules cationiques (NPL) sont des nanoparticules de maltodextrine lipidées cationiques. La composition a été réalisée avec une souche d' E. coli inactivée mélangées avec des nanoparticules cationiques. Les bactéries E. coli ont été inactivées avec du formaldéhyde à 0.4 %, puis purifiées par centrifugation. La quantité protéique a été mesurée par dosage micro BCA. La composition a été faite en mélangeant les bactéries tuées avec une solution aqueuse de NPL, à différents ratios de poids (100µg de protéines de E. coli avec 5, 10, 30, 50, 100 ou 300µg de NPL). La taille et la charge de surface de la formulation ont été caractérisées respectivement par diffusion dynamique de la lumière (DLS) et diffusion électrophorétique de la lumière (ELS) (Zetasizer NanoZS, Malvern Analytical, France), pour pouvoir observer si les nanoparticules recouvrent la surface des bactéries tuées. B-Délivrance d'E. coli La capacité des NPL à augmenter la captation d' E. coli entière inactivée par les cellules immunitaires a été évaluée par cytométrie en flux et microscopie confocale. Marquage de E. coli avec de la fluorescéine : Les bactéries inactivées ont été marquées avec de l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC), en mélangeant 5 mg d' E. coli avec 50µg de FITC (1%, Sigma, France) dans un tampon de carbonate de sodium à pH 8.3 pendant 2h. Elles ont ensuite été dialysées sur une cassette de dialyse 10kDa (Thermofisher, France). La teneur en protéines a été mesurée par dosage micro BCA (Pierce, France). Les bactéries marquées ont ensuite été associées à des NPL à différents rapports de poids. Cytométrie en flux : Les lignées cellulaires H292 ont été ensemencées dans des plaques de 24 puits à raison de 50.000 cellules par puits, jusqu'à confluence. Les cellules ont ensuite été incubées avec l'équivalent de 1µg de protéines seules ou associées à différents ratios de NPL, pendant 4 heures. Puis les cellules été lavées avec une solution saline de tampon phosphate (PBS), récoltées avec de la trypsine, et analysées par cytométrie en flux sur un Attune Nxt (ThermoFisher, France). Pour distinguer la délivrance intracellulaire des bactéries, à une fixation membranaire, les cellules ont été incubées avec 40 µg/mL de bleu Trypan (TB, Sigma France) pour quencher la fluorescence FITC externe. Microscopie confocale Les lignées cellulaires H292 ont été ensemencées dans des chambres Labtek (Fisher Sci., France) à raison de 10.000 cellules par puits, jusqu'à confluence. Ensuite, les cellules ont été incubées avec l'équivalent de 1µg de protéines seules des bactéries entières tuées ou associées aux NPL, pendant 4 heures. Les cellules ont été lavées, et le noyau a été coloré en incubant du Hoechst 33342 (Sigma, France) à 0.1 µg/mL pendant 5 minutes à 37°C. Les cellules ont ensuite été lavées et la membrane plasmique a été marquée avec de l'agglutinine (WGA, Invitrogen France) marquée au AF-633 à 1 µg/mL pendant 10 minutes à 37°C. Les lames ont été lavées à nouveau avec du PBS, fixées avec du formaldéhyde à 0.4 % pendant 20 minutes, et montées pour une observation au microscope (LSM 710 Zeiss, France). 1-B Résultats : Caractérisation des formulations : Z-average (nm) PDI Potentiel zêta (mV) E. coli 1420 0.08 -4.6 E. coli /NPL 1/0.05 2451 0.60 -3.6 E. coli /NPL 1/0.1 1125 0.30 -1.6 E. coli /NPL 1/0.3 716.9 0.57 -1.1 E. coli /NPL 1/0.5 1120 0.52 +2.7 E. coli /NPL 1/1 915.5 0.68 +3.8 E. coli /NPL 1/3 1010 0.75 +14 Tableau 1 : Caractérisation de la taille des formulations E. coli/NPL par diffusion dynamique de la lumière (DLS) et du potentiel zêta par diffusion électrophorétique de la lumière (ELS). Des E. coli entières inactivées ont été mélangées avec une quantité croissante de NPL. Les analyses DLS et ELS ont montré que les E. coli inactivées avaient une taille homogène de 1.42 µm avec un PDI de 0.08, et une charge de surface anionique de -4.6 mV. Cela indique que la structure de la bactérie est restée intacte malgré l'inactivation. Lorsque des quantités croissantes de NPL ont été ajoutées, la taille globale n'a pas variée, mais le potentiel zêta a augmenté progressivement, jusqu’à devenir cationique à partir du ratio 1/0.5. Ceci indique que les bactéries ont été progressivement recouvertes par les NPL sans aucune agrégation. La délivrance d' E. coli par les NPL a été évaluée par cytométrie de flux (voir ), sur des cellules épithéliales des voies respiratoires humaines (H292). Sans NPL, les bactéries ont été endocytées par 14 % des cellules. Comme aucune différence n'a été observée en présence de TB, cela suggère que les bactéries ont été réellement endocytées (à l'intérieur des cellules). Lorsqu'elles sont recouvertes par les NPL, les bactéries sont absorbées par au moins 40 % de cellules, ce qui confirme leur potentiel en tant que système de délivrance. De plus, la délivrance était significativement plus efficace avec une faible quantité de NPL, et la libération la plus importante a été observée avec un ratio 1/0.3 (77%) et 1/0.1 (75.7%). En présence de TB, 65.6 % des cellules étaient encore positives avec un ratio de 1/0.3 et 63 % avec un ratio de 1/0.1, ce qui confirme que la plupart des bactéries se trouvaient à l'intérieur des cellules. La délivrance intracellulaire a également été confirmée par microscopie confocale, avec un ratio 1/3. Environ 20 à 30 bactéries E. coli (vert) ont été observées dans chaque cellule, près des noyaux, confirmant la localisation intracellulaire. Conclusion : La formulation vaccinale E. coli/NPL est constituée de bactéries entières inactivées, recouvertes de NPL. Le recouvrement de cette bactérie, même avec une faible quantité de NPL, a un impact significatif sur la capacité de cette bactérie à être captée par les cellules. EXEMPLE 2 : Essai de vaccination in ovo contre la colibacillose 2-A Matériel et méthodes : A- Préparation des vaccins Le vaccin est constitué de 3 souches d' E. coli inactivées mélangées à des nanoparticules de maltodextrine lipidées (NPL). En bref, les souches O78:K80, O1:K1, O2:K1 ont été inactivées avec 0.4% de formaldéhyde, et la teneur en protéines a été mesurée par dosage µBCA. Enfin, 33.3µg par souche ont été mélangés à la NPL pour obtenir 100µg de protéines par dose de vaccin. B- Animaux Tous les travaux sur les animaux ont été évalués et approuvés par le Comité d'éthique pour la recherche sur les animaux d'Imunova Análises Biológicas, numéro de protocole 06/2021. Pour cette expérience, une quantité de 390 œufs fertiles ont été acquis d'une couveuse commerciale et incubés, à l'unité expérimentale d'Imunova. Les œufs ont été répartis au hasard dans sept groupes expérimentaux différents et placés dans un couvoir industriel, avec un contrôle précis de la température, et de l'humidité, pendant 21 jours. Les groupes utilisés dans ce test étaient composés de 30 animaux et sont identifiés dans le tableau 1. Groupe Identification Challenge¹ 1 Contrôle négatif - 2 Contrôle positif Challenge E. coli² 3 Contrôle commercial Vacciné par voie muqueuse avec Poulvac® E. coli (Zoetis) + challenge² E. coli 4 Vaccinés in ovo Vacciné in ovo avec NP/100 µg + challenge E . coli². Tableau 2 : Identification des groupes expérimentaux. ¹Tous les groupes, y compris le témoin négatif, ont reçu par voie orale le vaccin vivant atténué Mass I - H120, contre le virus de la bronchite infectieuse (VBI), à une dose 100 fois supérieure à celle recommandée par le fabricant, afin de sensibiliser les animaux à un challenge à E. coli. ²Infection avec 10 8 CFU d' Escherichia coli , à la dose de 100 µL/oiseau par voie orale. Le challenge a été confirmée par la récupération microbiologique des bactéries de l'inoculum. C-Vaccination Les animaux du groupe 3 ont reçu, à J1 après l'éclosion, une dose de vaccin vivant Poulvac® E. coli . Les animaux du groupe 4 ont reçu, le 18 ème jour d'incubation, une application in ovo du vaccin avec une dose vaccinale règlementaire de 50 µL. Après l'éclosion, les groupes de poulets de chair âgés d'un jour ont été logés dans des isolateurs (1,2 m²) et ont été nourris ad libitum selon les recommandations pour leur âge. D-Challenge À J10, tous les animaux, y compris ceux du groupe témoin négatif, ont reçu par voie orale un vaccin vivant atténué Mass I - H120, contre le virus de la bronchite infectieuse (VBI), à une dose 100 fois supérieure à celle recommandée par le fabricant. À J14, les animaux du groupe 2, 3 et 4 ont été infecté par 10 8 UFC d' Escherichia coli (souche 19501, une souche différente de celle utilisée dans le vaccin), 100 µL/oiseau, par voie orale. Le protocole vaccinal est représenté à la . E-Échantillonnage Les prélèvements et analyses ont été effectués sur 8 oiseaux, à J16, J20 ou J27. F-Analyse Perméabilité intestinale : La perméabilité intestinale a été évaluée par administration orale de FITC-Dextran, un marqueur fluorescent non absorbable (FITC-Dextran, 3000 à 4000 kDa), et identifié dans le plasma/sérum, pour suivre l'intégrité épithéliale gastro-intestinale (Vicuña et al., 2015). Expression des cytokines L'expression des cytokines a été évaluée par qPCR (IL-1β, IFNγ, IL-10, IL-4), en utilisant des amorces spécifiques pour chaque cible. Dans ce type d'analyse, chaque combinaison de cible et d'échantillon génère une valeur seuil, le Ct (cycle seuil) est une mesure relative de la concentration d'ARN messager (ARNm) spécifique à la cible dans l'échantillon. Cette valeur doit être normalisée en fonction de l'expression d'un certain gène de référence, dans ce cas, la moyenne géométrique des gènes GAPDH et ACTB a été utilisée, générant une valeur de ΔCt (Ct de la cible/Moyenne du Ct de GAPHD+ACTB) (Bustin et al., 2009). En plus de cette normalisation, les données ont également été normalisées par rapport à la moyenne des ΔCt du groupe contrôle, générant un ΔΔCt (ΔCt/moyenne des ΔCt Contrôle). Pour les résultats non définis, la valeur maximale de CT (40) a été considérée et, à des fins d'analyse, a été artificiellement modifiée à 41. Quantification des sIgA anti-E . coli : La production d'IgA sécrétoires spécifique à E. coli a été évaluée par ELISA. En bref, les échantillons ont été dilués dans de la caséine à 1% dans du PBS. Les plaques ELISA ont été recouvertes de LPS d' E. coli (souche isolée sur le terrain). Les plaques ont ensuite été lavées trois fois avec 200 μL/puits de PBS + 0.05 % de Tween20 pendant 5 min/lavage. Les puits ont été bloqués avec 1% de caséine dans du PBS. Les échantillons ont été testés en dilution sérielle. Les plaques ont été lavées, et un anti IgA de poulet a été ajouté (BioRad) dilué dans 0,1% de caséine. Après lavage, le test a été révélé avec une solution de TMB (Life Technologies). L'absorbance a été lue à 450 nm. Détection et quantification d' E. coli : La détection et la quantification par MPN (Most probable number) d' E. coli a été effectuée selon la norme ISO 7251:2005. Les numérations d' E. coli ont été déterminées selon les méthodes microbiologiques standard (dilution dans un milieu d'enrichissement suivie d'un ensemencement dans un milieu sélectif/différent). En bref, les échantillons ont été enrichis dans de l'eau peptonée tamponnée (EPT), puis dans du bouillon EC et enfin dans des géloses EMB et MacConkey. Les échantillons ont été dilués en série en trois exemplaires dans l'EPB avant l'incubation, afin de permettre la quantification par la technique du nombre le plus probable (Blodgett et al., 2015). Pour la détection d' E. coli , seule l'étape de la dilution en série n'a pas été prise en compte. Les colonies suspectes isolées ont été testées par biochimie et confirmées. Histologie hépatique : Les oiseaux ont été euthanasiés, et des échantillons de foie ont été collectés et fixés selon la méthode de Rebel et al (2011). Les échantillons ont été inclus dans de la paraffine et ont été montés sur des lames. Toutes les évaluations et lectures histopathologiques ont été effectuées au microscope par un vétérinaire histopathologiste expérimenté. Score Foie 0 Aspect normal 1 Histologiquement normal, avec parfois une discrète hyperplasie mononucléaire focale ou multifocale. Absence de nécrose. 2 Possible lésion hépatique dégénérative avec des degrés variables de vacuolisation et/ou de nécrose. Réaction de type prolifératif centrale ou péricentrale impliquant des cellules mononucléaires. Présence d'un infiltrat de neutrophiles interstitiel et multifocal. Hyperémie/hémorragies. 3 Mêmes lésions que celles décrites ci-dessus, avec en plus une périhépatite fibrineuse et/ou des réactions granulomateuses parenchymateuses. Tableau 3 : Liste des paramètres histologiques pour le scoring des lésions hépatiques. 2-B Résultats : La perméabilité intestinale des oiseaux non vaccinés et non challengés (contrôle négatif) était de 0.26 µg/mL, et de 0.31 µg/mL pour les oiseaux challengés et non vaccinés (contrôle positif). Lors de la vaccination avec le vaccin commercial, la perméabilité était de 0,26 µg/mL, comme pour le contrôle négatif, ce qui confirme l'efficacité de ce vaccin. De plus, lorsqu'ils ont été vaccinés in ovo par la formulation VXN-E . coli , tous les oiseaux ont présenté une faible perméabilité (0,18 µg/mL), inférieure à celle du témoin négatif, bien que non significative. A-sIgA intestinaux anti-E. coli (LPS) Les IgA sécrétoires anti-LPS dirigés contre E. coli ont été analysés dans les fèces par ELISA. L'absorbance obtenue pour les oiseaux du contrôle négatif était d'environ 0.05 UA, et de 0.095 µg/mL pour les oiseaux du contrôle positif, ce qui indique que le challenge oral n'a pas induit de sécrétion d'IgA intestinale. De plus, pour les oiseaux vaccinés par voie muqueuse avec le vaccin commercial, la DO est restée à 0.055 UA, comme pour le témoin négatif, ce qui suggère que ce vaccin n'a pas réussi à promouvoir une réponse humorale muqueuse. Au contraire, les oiseaux vaccinés in ovo avec la formulation VXN- E. coli ont présenté une DO significativement plus élevée de 0.16 UA. B-Histopathologie du foie Le score des lésions hépatiques a été mesuré 6 jours après le challenge. Les oiseaux du groupe témoin négatif avaient un score moyen d'environ 1, représentatif d'une discrète hyperplasie. Au contraire, les oiseaux non vaccinés du groupe témoin positif ont obtenu un score moyen de 2,35, suggérant des lésions hépatiques et une nécrose, induites par l'infection à E. coli . Lorsqu'ils ont été vaccinés avec le vaccin commercial, le score moyen des lésions de l'oiseau était de 1, comme dans le groupe témoin négatif. Les oiseaux vaccinés in ovo avaient un score moyen des lésions in ovo protègent contre les lésions hépatiques induites par E. coli . Conclusion : Ce premier essai indique que la vaccination in ovo avec le vaccin VXN- E. coli protège les oiseaux contre l'infection hépatique par E. coli et induit la sécrétion de sIgA contre la bactérie dans l'intestin. EXEMPLE 3 : vaccination in ovo contre un challenge léthal à E. coli Ce deuxième essai était identique au premier essai in ovo en termes de calendrier, d'animaux par groupes et de traitement, mais avec un challenge léthal à E. coli . Les analyses ont ensuite été centrées sur la protection apportée par les vaccins contre la charge bactérienne dans les organes représentatifs, les anomalies physiologiques et la mortalité subséquente, observés dans chaque groupe. 3-A. Matériel et méthodes A-Challenge À J10, tous les animaux, y compris le témoin négatif, ont reçu par voie orale un vaccin vivant atténué Mass I - H120, contre le virus de la bronchite infectieuse (VBI), à une dose 100 fois supérieure à celle recommandée par le fabricant. À J14, chaque animal du groupe déterminé a été confronté à 4.2x10 12 CFU d' Escherichia coli (souche 19501), à raison de 100 µL/oiseau dans les sacs aériens. Le calendrier général est détaillé à la . B-Analyse Perméabilité intestinale : La perméabilité intestinale a été évaluée par administration orale de FITC-Dextran, un marqueur fluorescent non absorbable (FITC-Dextran, 3000 à 4000 kDa), et identifié dans le plasma/sérum, pour suivre l'intégrité épithéliale gastro-intestinale (Vicuña et al., 2015). Détection et quantification d' E. coli : La détection et la quantification par MPN (most probable number) d' E. coli a été effectuée selon la norme ISO 7251:2005. Les numérations d' E. coli ont été déterminées selon les méthodes microbiologiques standard (dilution dans un milieu d'enrichissement suivie d'un ensemencement dans un milieu sélectif/différent). En bref, les échantillons ont été enrichis dans de l'eau peptonée tamponnée (EPT), puis dans du bouillon EC et enfin dans des géloses EMB et MacConkey. Les échantillons ont été dilués en série en trois exemplaires dans l'EPB avant l'incubation, afin de permettre la quantification par la technique du nombre le plus probable (Blodgett et al., 2015). Pour la détection d' E. coli , seule l'étape de la dilution en série n'a pas été prise en compte. Les colonies suspectes isolées ont été testées par biochimie et confirmées. Histologie intestinale : Les oiseaux ont été euthanasiés, et des échantillons intestinaux ont été collectés et fixés selon la méthode de Rebel et al (2011) . Les échantillons d’iléon ont été inclus dans de la paraffine et ont été montés sur des lames. Toutes les évaluations et lectures histopathologiques ont été effectuées au microscope par un vétérinaire histopathologiste expérimenté. Score Iléon 0 Aspect normal. 1 Intégrité épithéliale, présence appropriée de cellules inflammatoires, absence de nécrose, troubles vasculaires, desquamation anormale. Hyperplasie lymphoïde possible, avec production de follicules primaires. 2 Lésions légères à modérées : hyperémie de la muqueuse et de la sous-muqueuse, faible desquamation, nécrose épithéliale superficielle de la muqueuse, infiltration hétérophile modérée de la lamina propria ou de la sous-muqueuse, atrophie ou hypertrophie de la muqueuse, hémorragies modérées. Hyperplasie modérée des cellules productrices de mucus et des cellules mononucléaires. 3 Lésions comme ci-dessus, mais de degré majeur. Infiltration hétérophile intense, ainsi que nécrose épithéliale et sous-muqueuse des glandes, hyperplasie mononucléaire intense entre les cryptes, hémorragies abondantes, et hyperplasie des cellules productrices de mucus. Tableau 4 : Liste des paramètres histologiques pour l'évaluation des lésions intestinale (iléon). 3-B. Résultats A-Éclosion Groupe Éclosion (n = 60) Contrôle négatif 81.2 % Contrôle positif Vaccin commercial VXN in ovo 78.3 % Tableau 5 : Pourcentage d'éclosion dans le groupe vacciné in ovo par rapport aux groupes non vaccinés (contrôle négatif, contrôle positif, vaccin commercial). L'éclosion a été mesurée dans cette étude afin d'évaluer la sureté du vaccin in ovo VXN/ E. coli . Ainsi, l'éclosion des œufs vaccinés (n=60) a été comparée à celle des œufs non vaccinés (n=180), et ce avant la randomisation dans chaque groupe (contrôle négatif, contrôle positif, et vaccin commercial). Un pourcentage similaire d'éclosion a été observé entre les œufs vaccinés (78,3 %) et non vaccinés (81,2 %). Par conséquent, la formulation du vaccin est sûre car elle n'a aucun impact sur l'éclosion. B-Survie des oiseaux après challenge léthal Le challenge par E. coli a été effectuée à J14 avec 4.2x10 12 CFU et directement dans les sacs aériens. La survie des oiseaux après challenge léthal est représentée à la . Cette dose élevée a eu un impact sur la survie des oiseaux, puisque 26 % de mortalité a été observé chez les oiseaux non vaccinés. De plus, la mortalité a augmenté à 36 % chez les oiseaux vaccinés avec le vaccin mucosal commercial, ce qui suggère qu'il n'a pas induit de protection contre l'infection mortelle à E. coli . En revanche, elle n'était que de 10% pour les oiseaux vaccinés in ovo avec le vaccin VXN/ E. coli , ce qui suggère une meilleure protection contre l'infection. C-Quantification d'E. coli dans les sacs aériens par MPN L'infection a été évaluée en quantifiant les bactéries dans les sacs aériens, par MPN. La mesure de la charge bactérienne dans les sac aériens par MPN est représentée à la . Les oiseaux du control négatif ne présentaient qu'une faible quantité de bactéries dans les sacs aériens, relative à la flore bactérienne naturelle. Les oiseaux non immunisés et challengés avaient une quantité plus élevée d' E. coli (10 4 MPN/g), ce qui confirme l'efficacité du challenge. Une infection significativement plus forte a été observée dans les sacs aériens des oiseaux vaccinés avec le vaccin mucosal commercial (10 6 MPN/g), corroborant les résultats de survie. En revanche, comme pour les résultats de survie, une infection plus faible a été observée pour les oiseaux vaccinés in ovo avec le vaccin E. coli/NPL (3x10 3 MPN/g), confirmant son efficacité à protéger contre cette infection bactérienne. D-Perméabilité intestinale La perméabilité intestinale des oiseaux non vaccinés et non challengés était de 0.22 µg/mL, et de 0.18 µg/mL pour les oiseaux challengés et non vaccinés. La perméabilité intestinale est représentée à la . Lors de la vaccination avec le vaccin commercial ou in ovo avec le vaccin VXN/ E. coli , la perméabilité a significativement diminué à 1.2 µg/mL, ce qui suggère une protection induite par la vaccination. E-Histopathologie intestinale Le score des lésions de l'iléon a été mesuré 6 jours après le challenge. Le score de lésion intestinal est représenté à la . Les oiseaux du groupe témoin négatif ont obtenu un score moyen inférieur à 1 (0.25), représentant un iléon sain et d'aspect normal, comme attendu. Au contraire, les oiseaux non vaccinés du groupe témoin positif ont obtenu un score moyen significativement plus élevé de 1.7, suggérant des lésions de l'iléon avec des troubles vasculaires et une desquamation, induits par l'infection à E. coli . De manière surprenante, lorsque les oiseaux ont été vaccinés avec le vaccin commercial, les lésions se sont significativement aggravées avec un score moyen de 2. Au contraire, les oiseaux vaccinés in ovo avaient un score moyen de 1, suggérant une protection contre les lésions intestinales induites par E. coli . Conclusion : Ce deuxième essai indique que le vaccin in ovo VXN- E. coli protège les oiseaux de la mortalité induite par une infection mortelle à E. coli . De plus, ce vaccin diminue la charge bactérienne dans les sacs aériens et les lésions intestinales dues à l'infection, confirmant l'intérêt de ce vaccin. EXEMPLE 4 : Essai de vaccination intramusculaire contre Salmonella sur des poules pondeuses 2-A. Matériel et méthodes : A-Préparation des vaccins Le vaccin est fabriqué à partir d'une souche inactivée de Salmonella enteritidis mélangée à des nanoparticules lipidées de maltodextrine (NPL). En bref, la souche de Salmonella SE147 a été inactivée et la teneur en protéines a été mesurée par un test µBCA. Enfin, 200µg de bactéries tuées ont été mélangées soit avec des NPL (formulation nommée "Vaxinano 1") soit avec des NPL non réticulées (formulation nommée "Vaxinano 2"), à hauteur de 200µg de protéines par dose de vaccin. La NPL non réticulée est composée de maltodextrine cationique linéaire avec un noyau interne anionique. B-Animaux Pour cette expérience, un total de 84 poulets LSL (provenant d'une ferme d'élevage commerciale) ont été répartis au hasard dans 12 enclos (7 oiseaux/enclos) comme décrit dans le tableau 7. Le sérum a été collecté et testé pour le titre d'anticorps contre Salmonella (effectué par DGZ en utilisant le kit Biochek). Groupe (7 animaux/groupe) Description 1, 5, 9 Vacciné avec une solution saline 2, 6, 10 Vacciné avec 200µg de "Vaxinano 1" 3, 7, 11 Vacciné avec 200µg de "Vaxinano 2" 4, 8, 12 Vaccinés avec un vaccin commercial (Salenvac) Tableau 6 : Identification des groupes expérimentaux. C-Vaccination A l'âge de W12, tous les poulets ont été vaccinés par voie IM dans la poitrine, avec soit 500µL d'une solution saline, soit 500µL de la formulation Vaxinano 1 ou Vaxinano 2 (contenant 200µg de protéines de Salmonella), soit avec le vaccin commercial. Un mois après, à W16, les animaux ont reçu une seconde dose de la même formulation vaccinale. D-Challenge Un mois après le boost, tous les animaux ont été challengés par voie intraveineuse avec 500µL de 1.3x10 8 CFU de S. enteritidis SE147. Le programme général est représenté . E-Prélèvements De W20 à W25, les œufs ont été collectés et analysés bactériologiquement individuellement pour la recherche de Salmonella. À W25, tous les poulets ont été euthanasiés, le sérum et le foie ont été collectés et stockés à -20°C. La rate et le caecum ont été analysés bactériologiquement pour la recherche de Salmonella. F-Analyses Ponte : Les œufs ont été collectés quotidiennement après le challenge (sauf le samedi) et stockés à 4°C. Le nombre d'œufs par groupe a été rapporté. Infection : l'infection a été quantifiée par qPCR dans la rate et le caecum de chaque poulet à W25. 2-B. Résultats A-Ponte des œufs Le nombre moyen d'œufs pondus dans chaque groupe a été compté chaque jour après le test. La ponte d’œufs est représenté . Les poules vaccinées avec un vaccin fictif ont pondu un faible nombre d'œufs après le challenge, avec une moyenne de 2.6 œufs par jour, ce qui confirme l'infection de l'oiseau. Au contraire, les oiseaux vaccinés avec Salenvac ont pondu significativement plus d'œufs que le groupe control, avec une moyenne de 4.9 œufs par jour (p B-Infection du cæcum et de la rate L'infection a été évaluée par une quantification de la charge bactérienne dans le cæcum et dans la rate. L'infection après challenge a été évaluée par une quantification de la charge bactérienne dans le caecum et dans la rate. Cette quantification est représentée . Les poulets qui ont reçu une injection saline ont eu une importante infection, avec une infection moyenne de 400 UFC/g, mais avec plus de 50% d'oiseaux au-dessus de 1000 UFC/g. Au contraire, tous les oiseaux vaccinés avec la formulation de Vaxinano ou avec Salenvac ont eu une infection significativement plus faible, avec une moyenne d'infection inférieure au seuil des oiseaux vaccinés avec Vaxinano 1. Ceci confirme la forte protection apportée par la vaccination IM. L'infection a finalement été quantifiée dans la rate. Cette quantification est représentée à la . Bien que l'infection ait été plus faible que dans le caecum, 77% des oiseaux vaccinés avec la solution saline étaient encore positifs dans la rate, alors que seulement 35% des oiseaux vaccinés avec Vaxinano 1, 36% des oiseaux vaccinés avec Vaxinano 2 et 35% des oiseaux vaccinés avec le vaccin commercial, confirmant la protection apportée par la vaccination IM. Conclusion : Cet essai indique que le vaccin entier inactivé Salmonella/NP administré par voie intramusculaire protège les oiseaux d'une provocation par S. enteritidis , quelle que soit la formulation, ce qui permet aux oiseaux de pondre beaucoup plus d'œufs que les animaux non immunisés. EXEMPLE 5 : Vaccination mucosale contre la colibacillose Cet essai était planifié de la même manière que l'essai in ovo. Les analyses ont ensuite été centrées sur la protection apportée par les vaccins contre l’infection dans les organes cibles, les anomalies physiologiques et les titres d'anticorps muqueux. 5-A Matériel et méthode : A-Préparation du vaccin Le vaccin est fabriqué à partir de 3 souches de bactéries d'E. coli inactivées, mélangées à des nanoparticules de maltodextrine lipidées (NPL). Les souches O78:K80, O1:K1, O2:K1 ont été inactivées avec du formaldéhyde à 0,4% et la teneur en protéines a été mesurée par dosage BCA. Enfin, 33,3 µg par souche ont ensuite été mélangés avec du NPL à raison de 100 µg de protéines par dose de vaccin. B-Animaux Tous les travaux sur les animaux ont été évalués et approuvés par le comité d'éthique pour la recherche animale d'Imunova Análises Biológicas, numéro de protocole 06/2021. Pour cette expérience, 150 poussins âgés d'un jour ont été acquis dans un couvoir commercial, et triés aléatoirement en cinq groupes expérimentaux, dans des unités d'isolement individuelles au sein d'Imunova, et ont été traités conformément au tableau suivant : Groupe (30 animaux/groupe) Challenge 1 Contrôle négatif Non vacciné, non challengé Control positif Non vacciné, challengé 2 Vaccin commercial Vaccin Poulvac E. coli (mucosal), challenge 2 Vaccin VXN mucosal vaccination VXN mucosal, challenge 2 Vaccin VXN s.c vaccination VXN SC, challenge 2 Tableau 7 : Identification des groupes expérimentaux. ¹Tous les groupes, y compris le contrôle négatif, ont été infectés avec le vaccin vivant atténué Mass I - H120, contre le virus de la bronchite infectieuse (IBV), par voie orale, à une dose 100x de celle recommandée par le fabricant afin de sensibiliser les animaux au challenge E. coli. ² Infection par 108 UFC d'Escherichia coli, à une dose de 100 µL/oiseau par voie orale. L’infection a été confirmée par la récupération microbiologique des bactéries à partir de l'inoculum. C-Vaccination Les animaux des groupes ‘Vaccin VXN SC’, ‘Vaccin VXN Mucosal’ et ‘Vaccin Commercial’ (Poulvac® E. coli, Zoetis) ont reçu une primo-immunisation à J1 et une seconde dose à J12. Pour le « vaccin VXN mucosal » les administrations ont été faites dans l’œil, bec et narine et pour le « vaccin commercial » les doses ont été administrées dans l'eau de boisson. D-Challenge La souche du challenge était un isolat de terrain qui a été confirmé comme étant un APEC par identification par PCR de 5 gènes de pathogénicité (iuaT, iroN, ompC, iss, hly). Il a également été vérifié qu'il appartenait au phylogroupe F par la méthode de typage décrite par Clermont (Clermont et al., 2013). Tous les animaux ont reçu à J14 une dose 100x de vaccin IBV atténué (souche Massachusetts H-120, Mass® I, Zoetis). Le challenge avec E. coli a été réalisée dans tous les groupes, sauf dans le « contrôle négatif » et 108 UFC/oiseau ont été utilisées. Le calendrier global du protocole de l’essai de vaccination in ovo est présenté à la . E-Analyses Quantification des IgA anti-E. coli : La production d'IgA spécifiques anti-E. coli a été évaluée par ELISA. En bref, les échantillons ont été dilués dans 1 % de caséine en PBS. Les plaques ELISA ont été tapissées de LPS d'E. coli (souche d'isolat de terrain). Les plaques ont ensuite été lavées trois fois avec 200 μL/puits de PBS + 0,05 % de Tween-20 pendant 5 min/lavage. Les puits ont été bloqués avec 1 % de caséine en PBS. Les échantillons ont été testés par dilution en série. Les plaques ont été lavées et une IgA anti-poulet a été ajoutée (Bio-Rad) diluée dans 0,1 % de caséine. Après lavage, le test a été révélé avec une solution unique de TMB (Life Technologies). L'absorbance a été lue à 450 nm et la quantification a été réalisée avec une méthodologie/kit exclusif développé par Imunova. Quantification et détection de l’infection à E. coli : La détection d'E. coli par MPN (most probable number) a été effectuée sur la base de la norme ISO 7251:2005. Les numérations d'E. coli ont été déterminées selon les méthodes microbiologiques standard (dilution dans un milieu d'enrichissement suivie d'un étalement dans un milieu sélectif/différentiel). En bref, les échantillons ont été enrichis dans de l'eau peptonée tamponnée (BPW), suivis d'un bouillon EC et enfin d'un étalement dans de l'EMB et de la gélose MacConkey. Les échantillons ont été dilués en série en trois exemplaires dans du BPW avant l'incubation, pour permettre la quantification par la technique du MPN (Blodgett et al., 2015). Dans la détection d'E. coli, seule l'étape de dilution en série a été ignorée. Les colonies isolées suspectes ont été testées biochimiquement et confirmées. Histologie des poumons : Les oiseaux ont été euthanasiés et des échantillons pulmonaires ont été prélevés et fixés. Les échantillons ont été inclus dans de la paraffine et ont été montés sur des lames. Toutes les évaluations et lectures histopathologiques ont été effectuées au microscope par un histopathologiste vétérinaire expérimenté. Score Poumons 0 Aspect normal 1 Hyperémie. Œdème parabronchique. Matériel fibrineux parabronchique luminal et desquamation endobronchique. Infiltration luminale et muqueuse mononucléaire et hétérophile. Aération discrètement compromise. 2 Hyperémie. Endobronchite oblitérante par exsudation mucofibrineuse et infiltration à un moindre degré par des cellules inflammatoires, hétérophiles et mononucléaires. Atteinte bronchique secondaire. Allongement auriculaire. Aération raisonnablement entretenue. 3 Hyperémie, œdème périvasculaire. L'atteinte bronchique tertiaire ou parabronchique est assez étendue, avec une infiltration hétérophile diffuse. Les bronchioles antérieures enregistrent une péribronchite lymphopurulente et une endobronchite. Aération raisonnablement entretenue. 4 Hyperémie. La bronche primaire montre une exsudation fibrino-nécrotique/purulente avec le reste épithélial de la muqueuse desquamée montrant une vacuolisation intense. Matière inflammatoire dans la lumière, associée à des produits de nécrose et sans aération significative des capillaires aériens les plus touchés. Infiltration par des hétérophiles, mononucléaires, dont des macrophages. Tableau 8 : Liste des paramètres histologiques pour l’évaluation des scores atteintes pulmonaires 5-B : Résultats Présence des E.coli dans les voies aériennes (MPN) L'infection a été évaluée en quantifiant le nombre d'oiseaux infectés dans la trachée et dans les sacs aériens, par MPN. La mesure d’infection bactérienne dans la tachée et les alvéoles est représentée à la . Trois oiseaux non challengés étaient infectés dans la trachée et sept dans les sacs aériens, probablement en raison de la présence d'E. coli pathogènes naturels dans l'environnement. Au contraire, les oiseaux challengés non vaccinés étaient plus infectés dans la trachée confirmant l'efficacité du challenge. Le même nombre d'oiseaux était infecté dans le groupe recevant le vaccin commercial par rapport au groupe de contrôle infecté, suggérant une absence de protection. Cependant, parmi les oiseaux vaccinés avec le vaccin VXN mucosal, un seul oiseau était infecté dans la trachée et aucun dans les sacs aériens. Cela confirme que le vaccin VXN E. coli administré par voie muqueuse a protégé les oiseaux du challenge. Présence d’sIgA anti E. coli sIgA dans les fèces Les IgA sécrétoires anti-LPS d’ E. coli ont été analysées dans les fèces, par ELISA. Les résultats de l’analyse des slgA anti- E.coli sont représentés . De J16 à J28, le titre d'Ac des oiseaux du contrôle négatif était le même que celui du contrôle positif, indiquant que le challenge oral n'a pas induit de sécrétion d'IgA intestinales. Cependant, pour les oiseaux vaccinés par voie muqueuse, tant avec la formulation VXN E. coli qu’avec le vaccin commercial, une augmentation significative des titres d'Ac a été observée à J21. Le vaccin muqueux a ainsi pu induire une réponse humorale au niveau de l'intestin. Score clinique dans les poumons Les scores des lésions pulmonaires ont été mesurés de J16 à J28. Les scores des lésions sont représentés à la . Bien qu'ils aient eu le score histopathologique le plus bas de J16 (score = 2) à J28 (score = 1,7), les oiseaux du groupe témoin négatif présentaient une endobronchite, une exsudation mucofibrineuse et une infiltration de neutrophiles polynucléaires, ce qui est probablement lié à l'infection naturelle ( ). De plus, les oiseaux challengés non vaccinés du groupe témoin positif avaient le score le plus élevé, de 3,4 à J16 et 2,7 à J28, en raison de la provocation par E. coli. Au contraire, les oiseaux vaccinés par voie muqueuse avec la formulation VXN-E. coli avaient un score lésionnel moyen de 2,3 à J16, inférieur au vaccin commercial (score = 2,9). Enfin, à J28, les deux groupes d'oiseaux vaccinés par voie muqueuse avaient un score comparable au témoin négatif (1,6 pour le vaccin commercial, 1,8 pour le vaccin VXN) suggérant une protection contre les lésions pulmonaires induites par l’infection E. coli . EXEMPLE 6 : Optimisation de la formulation avec différentes particules cationiques Une étude a été réalisée sur une souche d’E. coli entière inactivée, pour comparer des formulations préparées avec différentes particules à base de maltodextrine, en mesurant leur captation par les cellules immunitaires in vitro . 6-A Matériel et méthodes : A- Formulations vaccinales Les formulations vaccinales ont ici été réalisées avec une des souches d'E. coli inactivées utilisées dans le vaccin (11101), mélangée à des nanoparticules de maltodextrine (NP+) ou lipidées (NPL), ainsi qu’à de la maltodextrine cationisée mais non réticulée, simple (NP+NR) ou lipidée (NPL-NR). Les nanoparticules recouvrent d’une manière partielle à très partielle les bactéries. B- Synthèse des particules et caractérisation Les NP+ sont des nanoparticules synthétisées à partir de maltodextrine cationique et réticulée. Plus précisément, la synthèse consiste en de la maltodextrine (Roquette, France) dissoute dans une solution de NaOH 2M sous agitation magnétique et à température ambiante. De l’épichlohydrine (Merck groupe, France) a ensuite été ajoutée comme agent de réticulation, ainsi que du glycydyltrimethylammonium (GTMA, Merck groupe, France) comme agent cationisant. Le gel obtenu a ensuite été neutralisé à l’acide acétique, puis broyé à travers un homogénéisateur à très haute pression (LM20, Microfluidics, France). Le broyat a enfin été purifiée par filtration à flux tangentiel (AKTA flux 6, GE Healthcare, France) à travers une membrane de 750 kDa (GE Healthcare, France) pour obtenir des NP+ purifiée. Ces NP+ sont capables d’encapsuler des antigènes provenant de divers agents pathogènes (virus, bactéries ou parasites) et de les délivrer aux cellules immunitaires (1). De même, les NPL sont des NP+ dans lesquelles un cœur de phospholipides anioniques (DPPG) a été ajouté. Plus précisément, une solution de dipalmitoyl-phosphatidylglycerol (DPPG, Lipoid, Allemagne) est dissoute dans du solutol, puis est injectée dans une solution de NP+ sous agitation, à un pourcentage massique de 70%. Les phospholipides s’incorporent dans le cœur de la nanoparticule, formant ainsi des NPL. Ces NPL et sont également capables d’encapsuler des antigènes provenant de divers agents pathogènes (virus, bactéries ou parasites) et de les délivrer aux cellules immunitaires (2–4). Enfin, les NP+NR et NPL-NR constituent leurs équivalents respectifs, synthétisés selon le même schéma de synthèse mais sans agent de réticulation, formant ainsi des polymères cationiques linéaires. Les particules ont été caractérisées selon leur taille par diffusion dynamique de la lumière (DLS) et selon leur charge de surface (ou potentiel zêta) par diffusion électrophorétique de la lumière (ELS), à l’aide d’un Zetasizer Nano ZS (Malvern, France). C - Inactivation des bactéries E.coli Les bactéries ont été inactivées avec du formaldéhyde à 0.4 %, puis purifiées par centrifugation. La quantité protéique des bactéries entières a été mesurée par dosage micro BCA. La formulation a été faite en mélangeant les bactéries tuées avec une solution aqueuse particules, à différents ratios de poids (100µg de protéines de E. coli avec 1, 5, 10, 30, 50 ou 100 µg de particules). D- Délivrance d'E.coli dans les cellules par les particules La capacité des particules à augmenter la captation par phagocytose d'E.coli entières inactivées par les cellules épithéliales et en macrophage a été évaluée par cytométrie en flux. Marquage des protéines avec de la fluorescéine : Les E.coli inactivées ont été marquées avec de l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC), en mélangeant 5 mg d'E. coli avec 50µg de FITC (1% w/w, Merck, France) dans un tampon de carbonate de sodium à pH 8.3 pendant 2h. Elles ont ensuite été dialysées sur une cassette de dialyse 10kDa (Thermofisher, France). La teneur en protéines des bactéries entières a été mesurée par dosage micro BCA (Pierce, France). Les bactéries marquées ont ensuite été associées aux particules à différents rapports de poids. E- Cytométrie en flux : Les lignées cellulaires H292 ont été ensemencées dans des plaques de 24 puits à raison de 50.000 cellules par puits, et traitées après 3 jours de culture. Les lignées cellulaires THP-1 ont été ensemencées dans des plaques de 24 puits à raison de 100.000 cellules par puits, et différenciées en macrophage avec 20ng/mL de PMA pendant 24h. Après avoir changé le milieu de culture, les cellules ont été incubées avec l'équivalent de 1µg de bactérie tuées, seules ou associées aux particules, pendant 4 heures. Les cellules ont ensuite été lavées avec une solution saline de tampon phosphate (PBS), récoltées avec de la trypsine, et analysées par cytométrie en flux sur un Attune Nxt (ThermoFisher, France). 6-B Résultats : Caractérisation des particules Z-Average (nm) Number (nm) Potentiel-zêta (mV) NP + 92 ± 7 33 ± 4 36 ± 5 NP + NR 50 ± 3 17 ± 3 32 ±2 NPL 83 ±15 36 ± 5 39 ± 2 NPL-NR 54 ± 12 23 ± 9 38 ± 3 Tableau 9 : Caractérisation de la taille des différentes particules (Z-average et Number) ainsi que de leur charge de surface (potentiel zêta). Les caractéristiques physicochimiques des différentes particules ont été analysées après leur synthèse (Tableau 9). Les NP+ avaient un diamètre de 33 nm ainsi qu’une charge de surface de 36 mV, et les NPL avaient un diamètre de 36 nm et une charge de surface de 39 mV, indiquant que les phospholipides étaient bien associés aux particules non pas à leur surface mais à l’intérieur de leur structure de maltodextrine. Les NP+NR présentaient un diamètre de 17 nm pour une charge de surface de 32 mV, et les NPL-NR avaient un diamètre de 23 nm avec une surface de 38 mV, indiquant de la même manière que les phospholipides étaient bien associés à l’intérieur de la structure de maltodextrine. En l’absence d’agent réticulant, les particules obtenues semblaient avoir un diamètre inférieur. En effet, sans agent réticulant, la maltodextrine en solution devrait rester majoritairement linéaire, mais elle pourrait également se replier sur elle-même à la faveur de liaison hydrophobes, formant ainsi des nanoparticules détectées lors de l’analyse. Phagocytose d'E. coli par les cellules après association avec les particules La délivrance d' E.coli par les particules a tout d’abord été évaluée sur des cellules épithéliales respiratoires (H292). Sans particules, les bactéries n’ont pas été endocytées par les cellules ( ). Lorsqu'elles étaient recouvertes par les particules, leur captation a grandement augmenté, atteignant 20 à 50 % de cellules positives, et ce quelles que soient les particules utilisées. Par ailleurs, l’amélioration de la phagocytose a pu être observée dès le ratio 1/0.01 ce qui démontre qu’une faible quantité de particules recouvrant partiellement les bactéries est suffisante pour améliorer la délivrance intra-cellulaire. De même, la phagocytose d’ E.coli par les particules a été évaluée sur les macrophages différenciés (THP-1). Sans particules, les bactéries ont été phagocytées par 0.2% des cellules ( ). Lorsqu'elles furent recouvertes par les particules, leur phagocytose a augmenté pour atteindre 4 à 15% de cellules positives selon les ratios. Par ailleurs, l’amélioration de la phagocytose a pu être observée dès le ratio 1/0.01 ce qui démontre à nouveau qu’une faible quantité de particules recouvrant les bactéries est suffisante pour améliorer la délivrance des bactéries. Conclusion L’adhésion et la captation des bactéries par les cellules épithéliales respiratoires et par les macrophages peuvent être améliorées par des nanoparticules de maltodextrine cationisées simples (NP + ) ou lipidées (NPL), ainsi que par de la maltodextrine cationique non réticulée, simple (NP + NR) ou lipidée (NPL-NR), et ce de manière équivalente entre les NP. Une faible dose de particules (10 à 100 fois moins de particules que de bactéries en %massique) est suffisante pour améliorer cette délivrance aux cellules. Composition vaccinale sans adjuvant comprenant des nanoparticules cationiques constituées d’un noyau de polysaccharide et au moins une bactérie inactivée, caractérisée en ce que ladite bactérie est entière et en ce que ledit agent cationique recouvre ladite bactérie dans un ratio protéines bactériennes : NPL en poids inférieur ou égal à 1. Composition vaccinale selon la revendication 1, dans laquelle lesdites nanoparticules sont des nanoparticules cationiques constituées d’un noyau polysaccharide réticulé et non chargé en lipide constitué (i) d’un polysaccharide choisi parmi l’amidon, le dextrane, le chitosan, la dextrine, et la maltodextrine, des poly-fructoses (inuline), poly-mannoses, poly-galactoses, poly-galacto-mannanes (gomme de guar) (ii) d’un au moins un ligand cationique choisi parmi une amine primaire, secondaire, tertiaire ou des ammoniums quaternaires, et (iii) d’un agent de réticulation est choisi parmi l’épichloridrine, un diacide carboxylique ou un chlorure d’acide, tel que l’acide sébacique. Composition vaccinale selon la revendication 1, dans laquelle lesdites nanoparticules sont des nanoparticules cationiques constituées d’un noyau polysaccharide non réticulé et non chargé en lipide constitué (i) d’un polysaccharide choisi parmi l’amidon, le dextrane, le chitosan, la dextrine, et la maltodextrine, des poly-fructoses (inuline), poly-mannoses, poly-galactoses, poly-galacto-mannanes (gomme de guar) et (ii) d’un au moins un ligand cationique choisi parmi une amine primaire, secondaire, tertiaire ou des ammoniums quaternaires. Composition vaccinale selon la revendication 1, dans laquelle lesdites nanoparticules sont des nanoparticules cationiques constituées d’un noyau polysaccharide réticulé et chargé en phospholipides constitué (i) d’un polysaccharide choisi parmi l’amidon, le dextrane, le chitosan, la dextrine, et la maltodextrine, des poly-fructoses (inuline), poly-mannoses, poly-galactoses, poly-galacto-mannanes (gomme de guar), (ii) d’un au moins un ligand cationique choisi parmi une amine primaire, secondaire, tertiaire ou des ammoniums quaternaires, (iii) d’un agent de réticulation est choisi parmi l’épichloridrine, un diacide carboxylique ou un chlorure d’acide, tel que l’acide sébacique, et (iv) d’un phospholipide anionique choisi parmi le glycérol de diacylphosphatidyle, la sérine de diacylphosphatidyle ou l’inositol de diacylphosphatidyle. Composition vaccinale selon la revendication 1, dans laquelle lesdites nanoparticules sont des nanoparticules cationiques constituées d’un noyau polysaccharide non réticulé et chargé en phospholipide constitué (i) d’un polysaccharide choisi parmi l’amidon, le dextrane, le chitosan, la dextrine, et la maltodextrine, des poly-fructoses (inuline), poly-mannoses, poly-galactoses, poly-galacto-mannanes (gomme de guar), (ii) d’un au moins un ligand cationique choisi parmi une amine primaire, secondaire, tertiaire ou des ammoniums quaternaires, et (iii) d’un phospholipide anionique choisi parmi le glycérol de diacylphosphatidyle, la sérine de diacylphosphatidyle ou l’inositol de diacylphosphatidyle. Composition vaccinale selon l’une des revendications 2 à 5, dans lequel ledit noyau de polysaccharide cationique comprend de la maltodextrine et un glycidyltriméthylammonium. Composition selon l’une des revendications 4 ou 5 dans laquelle ledit noyau de polysaccharide cationique est chargé en phospholipide anionique choisi parmi le glycérol de diacylphosphatidyle, la sérine de diacylphosphatidyle ou l’inositol de diacylphosphatidyle. Composition vaccinale selon l’une des revendications précédentes, comprenant au moins 2 souches différentes de bactéries. Composition vaccinale selon l’une des revendications précédentes, dans laquelle ladite bactérie est choisie dans le groupe suivant : Salmonella enterica ser.Typhi; Streptococcus Pneumoniae, Haemophilus influenzae type b, Mycobacterium tuberculosis, Extraintestinal pathogenic E.Coli (ExPEC), enterotoxigenic E.Coli (ETEC); S.enterica ser., Paratyphi A; Neisseria Gonorheae; Clostridium Difficile; Campylobacter spp: Shigella sppStaphulobactus Aureus, Helicobacter pylori. Composition vaccinale selon la revendication 9, pour son utilisation dans la prévention de la salmonellose, de la colibacillose ou de la campylobactériose.