Brevet FR3147288A1 — publié le 20241004

BACTERIES CLOSTRIDIUM MODIFIEES, OUTIL D’EDITION GENETIQUE DU PLASMIDE PSOL DE BACTERIES CLOSTRIDIUM, ET UTILISATIONS La présente invention concerne la modification génétique de bactéries du genre Clostridium , typiquement de bactéries solvantogènes du genre Clostridium , et l’utilisation possible d’un outil d’édition génétique adapté à la modification du mégaplasmide pSOL au sein desdites bactéries. Elle concerne en outre des méthodes, outils et kits permettant l’élimination, la modification ou l’introduction de séquence(s) codant, ou contrôlant la transcription de séquence(s) codant, des produits d’intérêt, les bactéries génétiquement modifiées obtenues et leurs utilisations, en particulier pour produire une molécule biosourcée par exemple un biocarburant. BACTERIES CLOSTRIDIUM MODIFIEES, OUTIL D’EDITION GENETIQUE DU PLASMIDE PSOL DE BACTERIES CLOSTRIDIUM, ET UTILISATIONS La présente invention concerne la modification génétique de bactéries du genre Clostridium , typiquement de bactéries solvantogènes du genre Clostridium , et l’utilisation possible d’un outil d’édition génétique adapté à la modification du mégaplasmide pSOL au sein desdites bactéries. Elle concerne en outre des méthodes, outils et kits permettant l’élimination, la modification ou l’introduction de séquence(s) codant, ou contrôlant la transcription de séquence(s) codant, des produits d’intérêt, les bactéries génétiquement modifiées obtenues et leurs utilisations, en particulier pour produire une ou plusieurs molécules biosourcées, par exemple un solvant, un biocarburant ou tout produit intermédiaire (bio)chimique. ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE Les bactéries appartenant au genre Clostridium sont des bacilles anaérobies strictes à Gram positif, capables de former des endospores et appartenant au phylum des Firmicutes. Ce genre contient de nombreuses espèces étudiées en raison de leur caractère pathogène ou de leur intérêt industriel et médical. Les espèces de Clostridium dites d’intérêt industriel, non pathogènes, sont capables de produire des composés d’intérêt tels que des acides et solvants à partir d'une large variété de sucres et substrats allant du glucose à la cellulose. La croissance des bactéries Clostridium productrices de solvants (dites « solvantogènes ») est dite biphasique. Des acides sont produits lors de la phase d’acidogenèse, qui correspond à la phase exponentielle de croissance. Lorsque la croissance cellulaire cesse et que les bactéries entrent en phase stationnaire, elles entrent en phase de solvantogenèse, réassimilent les acides produits et les transforment en solvants. Clostridium acetobutylicum est naturellement capable de produire un mélange d’éthanol, d’acétone et de n-butanol au cours d’une fermentation dite ABE ( ). C. acetobutylicum est considéré comme un organisme modèle pour l’étude des micro-organismes solvantogènes, en raison des titres relativement élevés obtenus lors de fermentations. Son génome a été séquencé en 2001, et est constitué d’un chromosome et du mégaplasmide pSOL de 180 Kb (Nölling J. et al. , 2001), nommé ainsi parce qu’il contient de nombreux gènes impliqués dans la phase de solvantogénèse, dont les produits sont signalés en foncé sur la . La connaissance de ce micro-organisme a longtemps été limitée par les difficultés rencontrées lors de son édition génétique, en particulier du fait des faibles efficacités de transformation et des faibles fréquences de recombinaison homologue entre un acide nucléique exogène et le chromosome de ce micro-organisme. De nombreux outils génétiques ont été spécifiquement développés pour pallier ces limitations (Joseph RC. et al. , 2018). En particulier, la création d’outils dédiés basés sur la technologie CRISPR-Cas9 permet désormais de réaliser des éditions génomiques spécifiques, précises, rapides et ne laissant aucune marque dans le génome. La force de l’outil CRISPR-Cas9 repose sur la capacité de la nucléase Cas9 à créer une coupure double brin au sein de l’acide nucléique ciblé à un site précis. Lorsqu’un acide nucléique essentiel – tel que le chromosome – est ciblé, le micro-organisme ne pourra survivre qu’en réparant cette coupure, via une modification de la séquence ciblée à l’aide d’une matrice d’édition fournie. Il est également possible d’éliminer un acide nucléique non essentiel, puisque la création d’une coupure double brin dans sa séquence mènera à sa perte plutôt qu’à sa réparation. Il est cependant impossible, ou très fastidieux, d’éditer un acide nucléique non essentiel, dans le cas où aucune condition de culture ne permet de le rendre essentiel). L’inventeur décrit dans le contexte de la présente invention une stratégie d’édition du mégaplasmide pSOL à l’aide d’un outil CRISPR-Cas9 via la création d’un mutant bactérien dans lequel les inventeurs ont découvert, de manière inattendue, que cet élément génétique devenait indispensable. Ce caractère indispensable peut-être exploité afin de réaliser des modifications de manière beaucoup plus simple et rapide que ce qu’il est envisageable de réaliser dans la souche sauvage. La modification décrite dans la présente invention et qui confère au mégaplasmide pSOL son caractère indispensable peut-être annulée en réintroduisant l’information génétique supprimée à l’aide d’un outil génétique tel que l’outil CRISPR-Cas9 par exemple. Les inventeurs décrivent, dans le contexte de la présente invention, des bactéries du genre Clostridium , typiquement les bactéries solvantogènes, dont le mégaplasmide pSOL peut être modifié génétiquement. Ils décrivent en particulier, pour la première fois, une bactérie C. acetobutylicum dont le gène hbd a été rendu non fonctionnel et son utilisation dans un procédé visant à transformer et de préférence modifier génétiquement son plasmide pSOL, en particulier à l’aide d’un outil de type CRISPR-Cas. Les inventeurs décrivent en particulier l’utilisation d’un outil d’édition génétique, de préférence l’outil CRISPR-Cas, pour modifier génétiquement le plasmide pSOL d’une bactérie appartenant au genre Clostridium , en particulier Clostridium acetobutylicum , ladite bactérie se distinguant de la souche sauvage en ce qu’elle comprend une modification chromosomique rendant la présence du plasmide pSOL essentielle à sa survie. Une modification chromosomique particulière, préférée dans le cas de C. acetobutylicum , est la délétion ou l’inactivation du gène hbd . Une bactérie génétiquement modifiée particulière n’exprimant pas le produit du gène hbd , n’exprime pas le produit du gène de séquence SEQ ID NO : 34, ou exprime une version non fonctionnelle dudit produit. Une bactérie particulière décrite par les inventeurs dans le présent texte n’exprime en outre pas le gène pdc de séquence SEQ ID NO : 35 ou exprime une version non fonctionnelle de celui-ci. La bactérie génétiquement modifiée particulière n’exprimant pas le produit du gène hbd ou exprimant une version non fonctionnelle dudit produit peut en effet être avantageusement utilisée pour obtenir une bactérie n’exprimant pas en outre un acide nucléique présent sur le mégaplasmide pSOL, par exemple un acide nucléique non essentiel tel que le gène pdc , ou exprimant une version non fonctionnelle de celui-ci. Une bactérie génétiquement modifiée particulièrement préférée selon l’invention correspond à la souche identifiée dans la présente description en tant que IFP 969, telle qu’enregistrée le 17 février 2023 sous le numéro de dépôt LMG P-32993 auprès de la collection BCCM-LMG (également identifié dans le présent texte en tant que « Δ hbd »). L’invention vise également toute bactérie dérivée, clone, mutant ou version génétiquement modifiée de celle-ci. Les inventeurs décrivent en outre des procédés de production d’une bactérie recombinante telle que décrite dans le présent texte, en particulier des procédés comprenant la délétion ou l’inactivation du gène hbd , de manière à empêcher ou diminuer l’expression de la protéine fonctionnelle correspondante. Les inventeurs décrivent en outre les plasmides pCas9acr de séquence SEQ ID NO : 23, pEC750C de séquence SEQ ID NO : 24, pGRNAind de séquence SEQ ID NO : 25, pGRNAcon de séquence SEQ ID NO : 26, pAN2 de séquence SEQ ID NO : 27 , pGRNA-hbd de séquence SEQ ID NO : 28, pGRNA-Δhbd de séquence SEQ ID NO : 29, pGRNA-pdc de séquence SEQ ID NO : 30, pGRNA-Δpdc de séquence SEQ ID NO : 31 et pGRNA-CΔhbd de séquence SEQ ID NO : 32, ainsi que l’utilisation de l’un, de plusieurs ou de l’ensemble d’entre eux pour transformer, et de préférence modifier génétiquement, une bactérie du genre Clostridium de manière à améliorer sa capacité de production de molécule(s) biosourcée(s), par exemple de solvant(s), de biocarburant(s) ou de tout produit(s) intermédiaire(s) (bio)chimique(s). L’invention vise en particulier un outil CRISPR, en particulier CRISPR-Cas, pour transformer et modifier génétiquement une bactérie. Cet outil génétique comprend une nucléase capable de cibler le mégaplasmide pSOL. Il comprend en outre i) un ARN guide (ARNg) comprenant une structure ARN de fixation à l’enzyme Cas et une séquence complémentaire d’une portion du plasmide pSOL ciblée par l’enzyme Cas, et ii) une matrice de réparation permettant, par un mécanisme de recombinaison homologue, le remplacement de la portion ciblée au sein de pSOL par une séquence d’intérêt. L’invention vise également les outils d’échange allélique, tel que l’outil ACE®, pour transformer et modifier génétiquement une bactérie. Cet outil génétique comprend i) un marqueur de sélection, ii) un marqueur de contre-sélection et iii) un acide nucléique, permettant, par un mécanisme de recombinaison homologue, de modifier la portion reconnue ou de remplacer la portion reconnue au sein de pSOL par une séquence d’intérêt. L’invention vise aussi un procédé pour transformer, et de préférence modifier génétiquement, une bactérie appartenant au genre Clostridium comprenant un plasmide pSOL à l’état sauvage, ainsi que la bactérie modifiée génétiquement susceptible d’être obtenue par ce procédé. Ledit procédé comprend une étape de transformation de la bactérie par introduction dans ladite bactérie d’un plasmide sélectionné parmi les plasmides pCas9acr de séquence SEQ ID NO : 23, pEC750C de séquence SEQ ID NO : 24, pGRNAind de séquence SEQ ID NO : 25, pGRNAcon de séquence SEQ ID NO : 26, pAN2 de séquence SEQ ID NO : 27 , pGRNA-hbd de séquence SEQ ID NO : 28, pGRNA-Δhbd de séquence SEQ ID NO : 29, pGRNA-pdc de séquence SEQ ID NO : 30, pGRNA-Δpdc de séquence SEQ ID NO : 31 et pGRNA-CΔhbd de séquence SEQ ID NO : 32. De préférence, ledit procédé comprend aussi une étape de délétion ou d’inactivation d’un gène rendant la présence du plasmide pSOL essentielle à la survie de ladite bactérie, ou implique autrement une bactérie recombinante du genre Clostridium comprenant déjà une modification chromosomique rendant la présence du plasmide pSOL essentielle à sa survie. Les inventeurs décrivent également l’utilisation d’une bactérie appartenant au genre Clostridium se distinguant de la souche sauvage correspondante en ce qu’elle comprend une modification chromosomique rendant la présence du plasmide pSOL essentielle à sa survie, dans un procédé de modification génétique d’une bactérie du genre Clostridium , ou pour fabriquer une bactérie dérivée modifiée génétiquement. Ils décrivent aussi l’utilisation d’une bactérie appartenant au genre Clostridium se distinguant de la souche sauvage correspondante en ce qu’elle comprend une modification chromosomique rendant la présence du plasmide pSOL essentielle à sa survie, ou d’une bactérie dont la modification chromosomique ayant rendu la présence du plasmide pSOL essentielle à la survie de ladite bactérie a été corrigée, pour produire une molécule biosourcée ou un mélange de molécules biosourcées, par exemple un solvant, un biocarburant ou un mélange de carburants, en particulier à l’échelle industrielle. L’invention vise aussi un procédé de fermentation impliquant l’utilisation d’une bactérie génétiquement modifiée telle que décrite dans le présent texte, typiquement d’une bactérie appartenant au genre Clostridium se distinguant de la souche sauvage en ce qu’elle comprend une modification chromosomique rendant la présence du plasmide pSOL essentielle à sa survie, ou d’une bactérie dont la modification chromosomique ayant rendu la présence du plasmide pSOL essentielle à la survie de ladite bactérie a été corrigée. Les inventeurs décrivent enfin des kits, en particulier un kit pour transformer et de préférence modifier génétiquement une bactérie appartenant au genre Clostridium , et un kit pour produire une molécule biosourcée, par exemple un solvant, un biocarburant ou tout produit intermédiaire (bio)chimique, à l’aide d’une bactérie appartenant au genre Clostridium , ledit kit comprenant i) une bactérie appartenant au genre Clostridium selon l’invention, en particulier une bactérie se distinguant de la souche sauvage en ce qu’elle comprend une modification chromosomique rendant la présence du plasmide pSOL essentielle à sa survie ou une bactérie dont la modification chromosomique ayant rendu la présence du plasmide pSOL essentielle à la survie de ladite bactérie a été corrigée, et ii) un milieu de conservation ou un milieu de culture de ladite bactérie, en particulier un milieu de culture adapté contenant un sucre ou un mélange de sucres, préférentiellement un hexose et/ou un pentose, encore plus préférentiellement du glucose, de l’arabinose et/ou du xylose. DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION Bien qu’utilisées en industrie depuis plus d’un siècle, les connaissances sur les bactéries appartenant au genre Clostridium , en particulier sur les bactéries solvantogènes, restent très limitées. Une contrainte majeure rencontrée par les industriels concerne l’impossibilité de modifier de manière simple la séquence du mégaplasmide pSOL à l’aide d’une technologie d’édition, en particulier à l’aide d’une technologie faisant intervenir une nucléase responsable d’une coupure double brins, telle que la nucléase Cas9. L’emploi d’une nickase (enzyme de type endonucléase responsable d’une coupure simple brin au niveau d’un site de restriction) est envisageable mais reste compliquée. Malgré les difficultés, bien connues de l’homme du métier, rencontrées pour modifier génétiquement les bactéries appartenant au genre Clostridium , les inventeurs sont parvenus, pour la première fois dans le contexte de la présente invention, à obtenir une bactérie C. acetobutylicum dont la séquence du mégaplasmide pSOL peut être très avantageusement modifiée de manière simple et rapide, en particulier à l’aide d’une technologie d’édition génétique telle que la technologie CRISPR-Cas. Les inventeurs sont en effet parvenus à réaliser des modifications génétiques précises au sein du mégaplasmide pSOL de la souche de C. acetobutylicum DSM 792. La bactérie Clostridium acetobutylicum étant considérée comme un représentant modèle des Clostridium solvantogènes, les données expérimentales divulguées dans le cadre de la présente description fournissent une preuve de concept à l’homme du métier. Une telle stratégie de modification n’avait jusqu’à présent jamais été employée chez C. acetobutylicum . Les inventeurs révèlent ainsi pour la première fois que le mégaplasmide pSOL est indispensable dans une souche C. acetobutylicum dont le gène hbd a été inactivé (également identifiée dans le présent texte entant que souche « ∆hbd »). La possibilité de modifier le mégaplasmide pSOL avec un outil d’édition génétique tel que l’outil CRISPR-Cas permet de bénéficier des points forts de cet outil et des outils similaires, i.e., de leur précision, de leur facilité d’utilisation, de leur rapidité, du fait qu’ils permettent de réaliser des modifications au nucléotide près, et du fait qu’ils ne nécessitent pas l’intégration d’un marqueur de résistance dans le génome du micro-organisme à modifier, et peuvent donc être utilisés pour introduire de manière séquentielle un nombre non limité de modifications. Grâce à la présente invention, l’ensemble des éléments génétiques constituant en particulier le génome de C. acetobutylicum est désormais modifiable avec un outil d’édition de ce type. Une fois les différentes modifications désirées réalisées, la modification chromosomique ayant rendu la présence du plasmide pSOL essentielle à la survie bactérienne peut facilement être corrigée (par exemple le gène hbd délété peut être réintroduit) dans le génome à son locus d’origine, permettant ainsi d’obtenir un micro-organisme ne possédant plus que les modifications génétiques d’intérêt, par exemple des modifications permettant d’améliorer sa capacité à produire un biocarburant ou une molécule biosourcée, tel que par exemple un solvant ou un produit intermédiaire chimique, à partir d’une biomasse ou à partir d’une culture énergétique dédiée. Dans le contexte de la présente invention, on entend par « molécule biosourcée » une molécule, de type alcool ou cétone, dont la spécificité est que la matière première utilisée pour sa production est obligatoirement issue de biomasse végétale, par exemple de biomasse lignocellulosique, et non pas issue de ressources d’origines fossiles telles que le pétrole, le charbon ou le gaz naturel. La mise en œuvre de la présente invention peut, de manière plus générale, être envisagée pour modifier tout élément génétique non essentiel, tel que le plasmide pSOL, dès lors qu’une modification chromosomique préalable a permis de rendre ledit « élément génétique non essentiel » indispensable à la survie de la bactérie (dans au moins une condition de culture donnée de ladite bactérie). La présente description vise ainsi en particulier l’utilisation d’un outil d’édition génétique, de préférence un outil CRISPR, faisant intervenir une (endo)nucléase capable de cibler le mégaplasmide pSOL pour modifier génétiquement ledit plasmide pSOL d’une bactérie appartenant au genre Clostridium , ladite bactérie se distinguant de la souche sauvage en ce qu’elle comprend une modification chromosomique rendant la présence du plasmide pSOL essentielle à sa survie. Elle vise également les outils d’échange allélique pour transformer et modifier génétiquement une bactérie. Un outil d’échange allélique particulier est par exemple un outil ACE® comprenant un acide nucléique comprenant une séquence complémentaire d’une portion du plasmide pSOL utilisable en tant que matrice de recombinaison homologue, permettant, par un mécanisme de recombinaison homologue, de modifier la portion reconnue ou de remplacer la portion reconnue au sein de pSOL par une séquence d’intérêt. Par « bactérie du genre Clostridium », on entend en particulier les espèces de Clostridium dites d’intérêt industriel, typiquement les bactéries solvantogènes ou acétogènes du genre Clostridium . L’expression « bactérie du genre Clostridium » englobe les bactéries sauvages ainsi que les souches dérivées de celles-ci, modifiées génétiquement dans le but d’améliorer leur performance. Par « espèce de Clostridium d’intérêt industriel » ou bactérie « Clostridium d’intérêt industriel » on entend les espèces capables de produire, par fermentation, des solvants tels que l’éthanol, le butanol, l’acétone ou l’isopropanol et/ou des acides tels que l’acide butyrique, l’acide acétique ou l’acide lactique, à partir de sucres ou d’oses, typiquement à partir de sucres comprenant 5 atomes de carbone tels que le xylose, l’arabinose ou le fructose, de sucres comprenant 6 atomes de carbones tels que le glucose ou le mannose, de polysaccharides ou polyosides tels que la cellulose ou une hémicellulose, et/ou de toute autre source de carbone assimilable et utilisable par les bactéries du genre Clostridium (CO, CO 2 , et méthanol par exemple). Des exemples de bactéries solvantogènes d’intérêt sont les bactéries du genre Clostridium productrices d’acétone, de butanol, d’éthanol et/ou d’isopropanol (propan-2-ol), telles que les souches identifiées dans la littérature en tant que « souche ABE » [souches réalisant des fermentations permettant la production d’acétone, de butanol et d’éthanol], « souche IBE » [souches réalisant des fermentations permettant la production d’isopropanol (ou propan-2-ol) par réduction de l’acétone, de butanol et d’éthanol] et « souche AIBE » [souches réalisant des fermentations permettant la production d’acétone, d'isopropanol (ou propan-2-ol), de butanol et d’éthanol]. Dans un mode de réalisation particulier préféré, la bactérie appartenant au genre Clostridium est la bactérie Clostridium acetobutylicum , par exemple une souche sélectionnée parmi ATCC 824, ATCC 55025, LMG 5710, DSM 792, DSM 1731, DSM 1732, LMG 5710, en particulier la souche DSM 792. Dans le présent texte, les termes « outil d’édition génétique » visent tout outil génétique connu de l’homme du métier dont ce dernier sait qu’il ne permet pas de modifier un élément génétique non indispensable à la survie bactérienne de la bactérie sauvage, tel que le plasmide pSOL. Il s’agit par exemple d’un outil génétique permettant de modifier le génome d’un microorganisme telle qu’une bactérie dont le fonctionnement implique des événements de recombinaison homologue requérant l’utilisation d’un marqueur de contre-sélection. L'expression « recombinaison homologue » fait référence à l'événement de substitution d'un segment d'ADN par un autre qui possède des régions identiques (homologues) ou presque. Les procédés de modification connus les plus performants pour obtenir des souches modifiées génétiquement sont basés sur des événements de recombinaison homologue, ceux-ci permettant de modifier le génome de manière précise et stable. Dans le contexte de la présente invention, un « élément génétique non indispensable à la survie bactérienne » est un élément qui peut être supprimé ou inactivé sans que cela ne nuise à la survie de la bactérie, tel que par exemple un plasmide ou tout élément mobilisable ne contenant pas de gène essentiel à la survie de la bactérie dans les conditions de cultures classiquement utilisées par l’homme de métier. Les termes « marqueur de contre-sélection » ou « marqueur de sélection négative » désignent tout produit capable de provoquer la mort de la cellule ou du microorganisme (par exemple de la bactérie) génétiquement modifié dans certaines conditions, contrôlables et connues de l’homme du métier, par exemple toute molécule toxique (toxine) ou tout gène dont le produit d’expression permet la synthèse d’une molécule toxique pour le microorganisme, ainsi que toute nucléase capable de cibler spécifiquement une séquence d’acide nucléique d’intérêt au sein du microorganisme, et toute protéine associée à l’outil CRISPR. La toxine peut être par exemple le 5-Fluorouridine monophosphate (5-FUMP) ou la toxine MazF du système Toxine-antitoxine MazE-MazF d’ Escherichia coli . Le gène dont le produit d’expression permet la synthèse d’une molécule toxique pour le microorganisme peut être par exemple upp , dont le produit permet, entre autres, la formation de 5-FUMP à partir de 5-Fluorouracile, ou mazF . La nucléase capable de cibler (reconnaître et lier) spécifiquement une séquence d’acide nucléique d’intérêt au sein du microorganisme, peut être par exemple une enzyme de type TALEN, une nucléase à doigt de zinc, ou une nucléase Cas de type Cas9 ou Cas12, en particulier Cas12a, par exemple MAD7. Dans le contexte de la présente invention, la séquence d’acide nucléique d’intérêt reconnue par la nucléase est un élément génétique non essentiel à la survie de la forme sauvage du microorganisme d’intérêt, par exemple de la bactérie. L’outil d’édition génétique est typiquement un outil de modification du matériel génétique d’un microorganisme par recombinaison homologue, typiquement par mutation, insertion ou délétion d’une séquence d’intérêt. Il peut être sélectionné par exemple parmi les outils d’échange allélique (par exemple l’outil ACE®) ou les outils CRISPR utilisant des nucléases réalisant des coupures double brin au niveau de l’ADN cible. Quel que soit l’outil d’édition génétique choisi, l’enzyme de type (endo)nucléase susceptible d’être utilisée dans le cadre de l’invention doit être capable de reconnaître un élément génétique non essentiel à la survie de la forme sauvage du microorganisme d’intérêt. Dans le cas de la bactérie appartenant au genre Clostridium , en particulier dans le cas de C. acétobutylicum , l’enzyme reconnaît de préférence le mégaplasmide pSOL. Dans un mode de réalisation préféré, l’outil d’édition génétique est un outil CRISPR, de manière préférée CRISPR-Cas9 ou CRISPR-Cas12, de manière encore plus préférée CRISPR-Cas9. L’introduction dans la bactérie de tout acide nucléique d’intérêt peut être réalisée par toute méthode, directe ou indirecte, connue de l’homme du métier, par exemple par transformation, conjugaison, microinjection, transfection, électroporation, etc., de préférence par électroporation (Mermelstein et al , 1993). Par ailleurs, ces acides nucléiques d’intérêt (par exemple des fragments d’ADN, fragments d’ARN, cassettes d’expression ou vecteurs d’expression) peuvent être intégrés au sein du génome bactérien par des techniques elles-aussi bien connues de l’homme du métier. Un objet particulier de l’invention vise ainsi un outil d’édition génétique CRISPR-Cas ou un outil d’échange allélique, pour transformer et modifier génétiquement une bactérie. Le terme « transformation » fait référence à l'incorporation d’au moins un acide nucléique exogène par une cellule, cette acquisition de nouvelle(s) séquence(s), par exemple de nouveau(x) gène(s), étant transitoire (si l’acide nucléique exogène porteur des gènes peut par la suite être éliminé) ou permanente (dans le cas où l’acide nucléique exogène est intégré dans l’ADN de la cellule hôte). Lorsque l’outil d’édition génétique est un outil CRISPR-Cas, il comprend de préférence une nucléase capable de cibler le mégaplasmide pSOL. Il comprend en outre i) un ou plusieurs ARN guides (ARNg), chaque ARN guide comprenant une structure ARN de fixation à l’enzyme Cas et une séquence complémentaire de tout ou partie, typiquement d’une portion, du plasmide pSOL (de 180 kB) ciblée par l’enzyme Cas, et ii) une matrice de réparation permettant, par un mécanisme de recombinaison homologue, le remplacement de la portion ciblée au sein de pSOL par une séquence d’intérêt. Les inventeurs ont en particulier mis au point des outils et méthodes, décrits dans le brevet EP3 362 559 et dans la demande EP3 578 662 ainsi que dans les demandes EP3 898 970 et FR3 096 373 (incorporées par référence), permettant de modifier de façon ciblée le génome de ce microorganisme. Ils ont en particulier décrit un outil faisant intervenir la technologie CRISPR-Cas comprenant deux acides nucléiques, l’un contenant les éléments génétiques permettant l’expression contrôlée de la nucléase Cas (qui réalise une coupure double brin au sein d’une molécule d’acide nucléique), et l’autre au moins un ARN guide (ARNg) ciblant la région d’ADN à modifier ainsi qu’une matrice de réparation. De manière préférée (cf. EP 3 578 662), au moins l’un desdits acides nucléiques comprend en outre une séquence codant une protéine anti-CRISPR placée sous le contrôle d’un promoteur inductible. L’outil génétique peut autrement comprendre en outre un troisième acide nucléique codant une protéine anti-CRISPR de préférence placée sous le contrôle d’un promoteur inductible. Un outil CRISPR-Cas particulier préféré comprend au moins : un « premier » acide nucléique codant au moins une endonucléase d’ADN, par exemple l’enzyme Cas9, dans lequel la séquence codant l’endonucléase d’ADN est placée sous le contrôle d’un promoteur, et au moins un « deuxième » acide nucléique contenant une matrice de réparation permettant, par un mécanisme de recombinaison homologue, le remplacement d’une portion de l’ADN bactérien ciblée (« séquence d’ADN cible ») par l’endonucléase par une « séquence d’intérêt ». Dans cet outil, soit au moins l’un desdits acides nucléiques code en outre un ou plusieurs ARN guides (ARNg) soit l’outil génétique comprend en outre un ou plusieurs ARN guides, chaque ARN guide comprenant une structure ARN de fixation à l’endonucléase d’ADN et une séquence complémentaire de la portion ciblée de l’ADN bactérien. De préférence, soit au moins l’un desdits acides nucléiques comprend en outre une séquence codant une protéine anti-CRISPR placée sous le contrôle d’un promoteur inductible, soit l’outil génétique comprend en outre un troisième acide nucléique codant une protéine anti-CRISPR placée sous le contrôle d’un promoteur inductible. L’homme du métier peut aisément définir la séquence et la structure des ARNg selon la région chromosomique ou l’élément génétique mobile à cibler en utilisant des techniques bien connues (voir par exemple l’article de DiCarlo et al. , 2013). Un autre objet particulier de l’invention vise un outil d’édition génétique de type outil d’échange allélique, par exemple un outil ACE®, pour transformer et modifier génétiquement une bactérie, basé sur l’utilisation d’au moins un marqueur de sélection et d’au moins un marqueur de contre-sélection localisés entre deux séquences nucléiques homologues aux régions situées de part et d’autre de la séquence nucléique à modifier. L’outil ACE selon l’invention comprend i) un marqueur de sélection, ii) marqueur de contre-sélection, et iii) une séquence complémentaire d’une portion du plasmide pSOL utilisable en tant que matrice de recombinaison homologue, permettant, par un mécanisme de recombinaison homologue, de modifier la portion reconnue ou de remplacer la portion reconnue au sein de pSOL par une séquence d’intérêt en outre. L’expression « marqueur » ou « gène marqueur » fait référence à une séquence codant une protéine marqueur sous le contrôle d'éléments régulateurs fonctionnels permettant la synthèse de ladite protéine dans Clostridia. Les gènes marqueurs de sélection peuvent être divisés en plusieurs sous-catégories selon qu'ils confèrent une sélection positive ou négative, et selon que la sélection est conditionnelle ou non-conditionnelle à la présence de substrats externes. Les gènes marqueurs dits « de sélection positive » favorisent la croissance des cellules dont le génome a été génétiquement modifiée. La détection de ces gènes marqueurs à sélection positive est subordonnée à l'utilisation d'agents toxiques (antibiotiques, herbicides ou médicaments). Ces gènes sont par exemple des gènes de résistance à un antibiotique comme les gènes nptI et nptII conférant une résistance à l'antibiotique kanamycine; dans ce cas, toutes les cellules ayant acquis le transgène résisteront à l'antibiotique alors que les autres seront tuées. L'utilisation de gènes marqueurs de sélection positive de ce type présente le double « avantage » de permettre à la fois le repérage et un tri rapide des cellules génétiquement modifiées (les seuls à survivre), par rapport à celles n'ayant pas acquis l’acide nucléique d’intérêt (le « transgène »). Inversement, les gènes marqueur dits « de contre-sélection » ou « de sélection négative », « négativement sélectionnables » provoquent la mort des cellules ou organismes génétiquement modifiés dans certaines conditions, contrôlables et connues de l'expérimentateur. Dans le cadre de l’invention, le marqueur de sélection permet typiquement de sélectionner l’événement d’intégration, par recombinaison homologue, dans le génome hôte de la séquence d'intérêt apportée par l’outil génétique. Lorsqu’il est présent, le marqueur de contre-sélection permet de sélectionner le second évènement de recombinaison homologue en lien avec l’excision de l’outil génétique. La technologie ACE® repose par exemple sur l’utilisation d’un mutant auxotrophe (pour l’uracile chez C. acetobutylicum ATCC 824 par délétion du gène pyrE , qui provoque également une résistance à l’acide 5- fluoroorotique (A-5-FO) ; Heap et al. , 2012). Le système utilise le mécanisme d’échange allélique, bien connu de l’homme de métier. Suite à une transformation avec un vecteur pseudo-suicide, l’intégration de ce dernier dans le chromosome bactérien par un premier évènement d’échange allélique est sélectionné grâce au gène de résistance présent initialement sur le plasmide. L’étape d’intégration peut être réalisée de deux manières différentes, soit au sein du locus pyrE soit au sein d’un autre locus : dans le cas de l’intégration au locus pyrE , le gène pyrE est également placé sur le plasmide, sans toutefois être exprimé (pas de promoteur fonctionnel). La deuxième recombinaison restaure un gène pyrE fonctionnel et peut alors être sélectionnée par auxotrophie (milieu minimum, ne contenant pas d’uracile). Le gène pyrE non-fonctionnel présentant également un caractère sélectionnable (sensibilité au A-5-FO), d’autres intégrations sont ensuite envisageables sur le même modèle, en alternant successivement l’état de pyrE entre fonctionnel et non-fonctionnel. Dans le cas de l’intégration à un autre locus, une zone génomique permettant une expression du marqueur de contre-sélection après recombinaison est ciblée (typiquement, en opéron après un autre gène, de préférence un gène fortement exprimé). Cette deuxième recombinaison est alors sélectionnée par auxotrophie (milieu minimum ne contenant pas d’uracile). Dans le contexte de la présente invention, l'expression « séquence d'ADN cible » désigne tout gène, région intergénique, promoteur et/ou séquence régulatrice d'intérêt choisi par l'homme du métier de préférence localisée sur le mégaplasmide pSOL. Il s'agit notamment de gènes codant pour des protéines d'intérêt, par exemple des enzymes impliquées dans le métabolisme cellulaire. Un autre exemple particulier de séquence d’ADN cible correspond i) à tout ou partie de la séquence codant le gène hbd (SEQ ID NO : 34), à une séquence comprenant au moins 1 nucléotide, de préférence au moins 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 ou 40 nucléotides, typiquement entre 1 et 40 nucléotides, de préférence une séquence comprenant 14, 15, 16, 17, 18 ,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucléotides de ladite séquence codante, ii) à une séquence contrôlant la transcription de ladite séquence codante, typiquement une séquence promotrice, ou iii) une séquence flanquant ladite séquence codante. Une séquence flanquante comprend typiquement 1, 10 ou 20 et 1000 nucléotides, par exemple entre 1, 10 ou 20 et 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300 ou 200 nucléotides, entre 1, 10 ou 20 et 100 nucléotides, entre 1, 10 ou 20 et 50 nucléotides, ou entre 1, 10 ou 20 et 40 nucléotides, par exemple entre 10 et 40 nucléotides, entre 10 et 30 nucléotides, entre 10 et 20 nucléotides, entre 20 et 30 nucléotides, entre 15 et 40 nucléotides, entre 15 et 30 nucléotides ou entre 15 et 20 nucléotides. Les expressions « séquence d'intérêt » et « acide nucléique d’intérêt » désignent une séquence codante ou non. Par « acide nucléique », on entend au sens de l’invention, toute molécule d’ADN ou d’ARN naturelle, synthétique, semi-synthétique ou recombinante, éventuellement modifiée chimiquement (i.e. comprenant des bases non naturelles, des nucléotides modifiés comprenant par exemple une liaison modifiée, des bases modifiées et/ou des sucres modifiés), ou optimisée de manière à ce que les codons des transcrits synthétisés à partir des séquences codantes soient les codons les plus fréquemment trouvés chez une bactérie du genre Clostridium en vue de son utilisation chez celle-ci. Dans le cas du genre Clostridium , les codons optimisés sont typiquement des codons riches en bases adénines (« A ») et thymines (« T »). Dans un mode de réalisation particulier décrit, l’acide nucléique d’intérêt comprend au moins deux régions complémentaires chacune d’une séquence cible, identiques à 100% ou identiques à 80% au moins, de préférence à 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% au moins à ladite région/portion/séquence d’ADN ciblée au sein du génome du microorganisme, par exemple du génome bactérien. Ces régions sont capables de s’hybrider à tout ou partie de la séquence complémentaire de ladite région/portion/séquence, typiquement à une séquence telle que décrite ci-dessus comprenant au moins 1 nucléotide, de préférence au moins 100 nucléotides, typiquement entre 100 et 1000 nucléotides. Les régions complémentaires de la séquence cible présentes au sein de l’acide nucléique d’intérêt peuvent reconnaître, de préférence cibler, les régions flanquantes en 5’ et en 3’ de la séquence ciblée dans un outil de modification génétique connu de l’homme du métier, typiquement tout outil basé sur la recombinaison homologue. Dans un mode de réalisation particulier préféré, une partie de l’acide nucléique d’intérêt reconnait en outre (lie au moins en partie), et de préférence cible, i.e. reconnait et permet la coupure, dans le génome d’une bactérie Clostridium d’intérêt, d’au moins un brin i) d’une séquence cible, ii) d’une séquence contrôlant la transcription d’une séquence cible, ou iii) d’une séquence flanquant une séquence cible. La séquence reconnue est également identifiée dans le présent texte en tant que « séquence cible » ou « séquence ciblée ». Dans ce même mode de réalisation particulier préféré, l’acide nucléique d’intérêt comprend au moins une région complémentaire de la séquence cible identique à 100% ou identique à 80% au moins, de préférence à 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% au moins à la région/portion/séquence d’ADN ciblée au sein du génome bactérien et est capable de s’hybrider à tout ou partie de la séquence complémentaire de ladite région/portion/séquence, typiquement à une séquence comprenant au moins 5 nucléotides, de préférence au moins 5, 10, 14, 15, 20, 25, 30, 35 ou 40 nucléotides, typiquement entre 15 et 30 nucléotides, de préférence à une séquence comprenant 18 ,19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 nucléotides. Le ou les acides nucléiques d’intérêt tels que décrits dans le cadre de la présente l’invention sont capables de supprimer la ou lesdites séquences cibles du génome du microorganisme ou de modifier leur expression, par exemple de les moduler/ réguler, en particulier de les inhiber, de préférence de les modifier de manière à rendre ledit microorganisme incapable d’exprimer une ou plusieurs protéines, en particulier une ou plusieurs protéines fonctionnelles, à partir de ladite ou desdites séquences. Selon un autre aspect de l’invention, le ou les acides nucléiques d’intérêt tels que décrits dans le cadre de la présente l’invention sont capables d’introduire une séquence d’intérêt dans le génome du microrganisme de manière à rendre ledit microorganisme capable d’exprimer une ou plusieurs protéines, en particulier une ou plusieurs protéines fonctionnelles, à partir de ladite ou desdites séquences. La séquence d’intérêt peut être une séquence mutée de la séquence d’ADN cible, par exemple du gène cible, du promoteur ou de la séquence régulatrice et/ou d'un marqueur tel qu'un gène de résistance aux antibiotiques ou une enzyme génératrice de couleur. La séquence d’intérêt peut être qualifiée d’« acide nucléique exogène » si sa portion codante ne présente aucune homologie avec la séquence sauvage dont la modification génétique est recherchée. La séquence d’intérêt peut être plus longue ou plus courte que la séquence remplacée (« séquence d'ADN cible »), selon la distance séparant les deux régions homologues. L’acide nucléique d’intérêt peut être un ARN naturel, synthétique ou produit par une technique de recombinaison. Cet acide nucléique d’intérêt peut être préparé par toute méthode connue de l’homme du métier telles que, par exemple, la synthèse chimique, la transcription in vivo ou des techniques d’amplification. Lorsque le ou les acides nucléiques d’intérêt sont introduits dans la cellule directement sous la forme de molécules d’ARN (matures ou précurseurs), par exemple d’ARN guide (ARNg), ces molécules peuvent contenir des nucléotides modifiés ou des modifications chimiques leur permettant, par exemple, d’augmenter leur résistance aux nucléases et d’augmenter ainsi leur durée de vie dans la cellule. Ils peuvent notamment comprendre au moins un nucléotide modifié ou non naturel tel que, par exemple, un nucléotide comportant une base modifiée, telle que l'inosine, la méthyl-5-désoxycytidine, la diméthylarnino-5-désoxyuridine, la désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5-désoxyuridine ou toute autre base modifiée permettant l'hybridation. Les acides nucléiques d’intérêt utilisés selon l’invention peuvent également être modifiés au niveau de la liaison internucléotidique comme le sont par exemple les phosphorothioates, les H-phosphonates ou les alkyl-phosphonates, ou au niveau du squelette comme le sont par exemple les alpha-oligonucléotides, les 2'-O-alkyl riboses ou les PNA (Peptide Nucleic Acids) (Egholm et al. , 1992). Un exemple particulier d’acide nucléique d’intérêt, utilisé pour transformer et/ou modifier génétiquement une bactérie Clostridium d’intérêt, est un fragment d’ADN i) reconnaissant une séquence codant, ii) contrôlant la transcription d’une séquence codant, ou iii) flanquant une séquence codant, l’enzyme Hbd (3-hydroxybutyryl-CoA déshydrogénase). L’acide nucléique d’intérêt tel que décrit dans le cadre de la présente invention est de préférence capable de supprimer ladite séquence cible du génome du microorganisme, par exemple de la bactérie, ou de modifier son expression, par exemple de la moduler/ réguler, en particulier de l’inhiber, de préférence de la modifier de manière à rendre ledit microorganisme incapable d’exprimer une protéine (typiquement une protéine Hbd), en particulier une protéine fonctionnelle, à partir de ladite séquence. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, l’acide nucléique d’intérêt est capable de modifier le microorganisme de manière à le rendre incapable d’exprimer la protéine Hbd. La protéine anti-CRISPR est une protéine capable d’inhiber ou d’empêcher/de neutraliser l’action de l’endonucléase d’ADN, typiquement de Cas, et/ou une protéine capable d’inhiber ou d’empêcher/de neutraliser l’action d’un système CRISPR-Cas, par exemple d’un système CRISPR-Cas de type II lorsque la nucléase est une nucléase de type Cas9, de préférence durant la phase d’introduction des séquences d’acide nucléique de l’outil génétique dans la souche bactérienne d’intérêt. Cette séquence est typiquement placée sous le contrôle d’un promoteur inductible différent des promoteurs contrôlant l’expression de l’endonucléase d’ADN et/ou du ou des ARNg, et est inductible par un autre agent inducteur. Ce promoteur peut être par exemple sélectionné parmi le promoteur Pbgal (inductible au lactose), le promoteur du gène tetA , du gène xylA ou du gène lacI , ou un dérivé de ceux-ci. Le promoteur contrôlant l’expression de la protéine anti-CRISPR permet de maîtriser avantageusement l’action de l’endonucléase d’ADN, par exemple de l’enzyme Cas9, et d’ainsi faciliter la transformation des bactéries et l’obtention de transformants ayant subi les modifications génétiques souhaitées. La protéine anti-CRISPR est typiquement une protéine « anti-Cas9 » ou une protéine « anti-MAD7 », i.e. une protéine capable d’inhiber ou d’empêcher/de neutraliser l’action de Cas9 ou de MAD7. La protéine anti-CRISPR est avantageusement une protéine « anti-Cas9 », par exemple sélectionnée parmi AcrIIA1, AcrIIA2, AcrIIA3, AcrIIA4, AcrIIA5, AcrIIC1, AcrIIC2 et AcrIIC3 (Pawluk et al , 2018). De manière préférée la protéine « anti-Cas9 » est AcrIIA2 ou AcrIIA4. De manière encore plus préférée la protéine « anti-Cas9 » est AcrIIA4. Une telle protéine est typiquement capable de limiter très significativement, idéalement d’empêcher, l’action de Cas9, par exemple en se fixant sur l’enzyme Cas9 (Dong et al , 2017 ; Rauch et al , 2017). Une autre protéine anti-CRISPR avantageusement utilisable est une protéine « anti-MAD7 », par exemple la protéine AcrVA1 (Marino et al , 2018). Une modification chromosomique particulière, préférée en particulier dans le cas de C. acetobutylicum , est la délétion ou l’inactivation du gène hbd . Une bactérie génétiquement modifiée particulière n’exprime pas le produit du gène de séquence SEQ ID NO : 34, ou exprime une version non fonctionnelle dudit produit. Dans le contexte de la présente invention, le terme « gène hbd » vise en particulier la séquence SEQ ID NO : 34 (CA_C2708). Le terme « gène hbd » vise aussi les variants de ladite séquence SEQ ID NO : 34, en particulier les variants présentant une homologie de séquence avec ladite séquence SEQ ID NO : 34. Le terme « gène hbd » vise également une séquence codant un fragment ou variant fonctionnel de la protéine (enzyme) (S)-3-hydroxybutyryl-CoA déshydrogénase (Hbd), en particulier une protéine apte à/ capable d’exercer une activité 3-hydroxybutyryl-CoA déshydrogénase. Le terme « gène hbd » vise aussi une séquence nucléotidique variante codant une protéine capable de lier en particulier le promoteur du gène « hbd » (CA_C2708, SEQ ID NO : 34). Dans un mode de réalisation particulier, Le terme « gène hbd » vise également une séquence codant un fragment ou variant fonctionnel de la protéine Hbd, en particulier une protéine apte à/ capable d’exercer une activité 3-hydroxybutyryl-CoA déshydrogénase. A contrario , la version non fonctionnelle du produit du gène hbd est incapable d’exercer cette activité. Une bactérie particulière décrite par les inventeurs dans le présent texte n’exprime en outre pas le gène pdc de séquence SEQ ID NO : 35 ou exprime une version non fonctionnelle de celui-ci. Dans le contexte de la présente invention, le terme « gène pdc » vise en particulier la séquence SEQ ID NO : 35 (CA_P0025). Le terme « gène pdc » vise aussi les variants de ladite séquence SEQ ID NO : 35, en particulier les variants présentant une homologie de séquence avec ladite séquence SEQ ID NO : 35. Le gène pdc n’est qu’un exemple visant à démontrer la mise en œuvre possible de la présente invention avec n’importe quel gène d’intérêt. Un exemple typique de variant selon l’invention présente une homologie de séquence avec une séquence d’intérêt telle que la séquence SEQ ID NO : 34 ou avec la SEQ ID NO : 35 comprise entre 95% et 100%, et de préférence entre 96% et 100%. La séquence SEQ ID NO : 34 ou SEQ ID NO : 35 et son variant sont par exemple homologues à au moins 95%, par exemple à au moins 96%, à au moins 97%, à au moins 98%, ou à au moins 99%. Selon un mode de réalisation préféré, la séquence SEQ ID NO : 34 ou SEQ ID NO : 35 et son variant présentent des séquences homologues à au moins 96%, au moins 97%, ou au moins 98%. La bactérie génétiquement modifiée particulière n’exprimant pas le produit du gène hbd ou exprimant une version non fonctionnelle dudit produit peut être avantageusement utilisée pour obtenir une bactérie présentant au moins une autre modification génétique, typiquement une modification génétique du mégaplasmide pSOL. Dans un mode de réalisation particulier, cette bactérie présentant au moins une autre modification génétique, n’exprime pas un acide nucléique présent sur le mégaplasmide pSOL, par exemple un acide nucléique tel que le gène pdc , le gène adhE1 , le gène adhE2 , le gène ctfA , le gène ctfB , ou le gène adc , ou exprime une version non fonctionnelle de celui-ci. Dans un autre mode de réalisation particulier, cette bactérie présentant au moins une autre modification génétique, exprime une version modifiée d’un gène présent sur le mégaplasmide pSOL et/ou exprime un gène exogène, i.e. absent de la version sauvage du mégaplasmide pSOL. Des bactéries génétiquement modifiées particulièrement préférées selon l’invention correspondent à la souche identifiée dans la présente description en tant que IFP 969 telle qu’enregistrée le 17 février 2023 sous le numéro de dépôt LMG P-32993 auprès de la collection BCCM-LMG (également identifié dans le présent texte en tant que « Δ hbd »). L’invention vise également toute bactérie dérivée, clone, mutant ou version génétiquement modifiée de celles-ci. Les inventeurs décrivent en outre des procédés de production d’une bactérie recombinante telle que décrite dans le présent texte, en particulier des procédés comprenant la délétion ou l’inactivation du gène hbd , de manière à empêcher ou diminuer l’expression de la protéine fonctionnelle correspondante, ou encore, voire éventuellement en outre, l’ajout d’une séquence codant un produit d’intérêt, de préférence un procédé faisant intervenir la technologie CRISPR, ainsi que les bactéries modifiées génétiquement susceptibles d’être obtenues par ce procédé, en particulier la bactérie IFP 969. Lorsque le procédé mis en œuvre utilise la technologie CRISPR, il comprend typiquement les étapes d’une méthode décrite dans le brevet EP3 362 559 ou dans la demande EP3 578 662. Les inventeurs décrivent en outre des acides nucléiques utilisés pour transformer une bactérie, ou une population de bactéries, appartenant au genre Clostridium . Un tel acide nucléique se présente typiquement sous la forme d’une cassette d’expression (ou « construction ») telle que par exemple un acide nucléique comprenant au moins un promoteur transcriptionnel ou une séquence régulatrice d’intérêt, lié(e) de manière opérationnelle (au sens où l’entend l’homme du métier) à une ou plusieurs séquences (codantes ou non) d’intérêt, par exemple à un opéron comprenant plusieurs séquence codantes d’intérêt dont les produits d’expression concourent à la réalisation d'une fonction d’intérêt au sein de la bactérie, ou un acide nucléique comprenant en outre une séquence activatrice et/ou un terminateur de transcription. Il se présente typiquement sous la forme d’un vecteur, circulaire ou linéaire, simple ou double brin, par exemple un plasmide, un phage, un cosmide, un chromosome artificiel ou synthétique, comprenant une ou plusieurs cassettes d’expression telles que définies ci-dessus. De manière préférée, le vecteur est un plasmide. Les acides nucléiques d’intérêt, typiquement les cassettes ou vecteurs d’expression, peuvent être construits par des techniques classiques bien connues de l’homme du métier et peuvent comporter un(e) ou plusieurs promoteurs, origines de réplication bactérienne (séquences ORI), séquences de terminaison, gènes de sélection, par exemple gènes de résistance à un antibiotique, et séquences (« régions flanquées ») permettant l’insertion ciblée de la cassette ou du vecteur. Par ailleurs, ces cassettes et vecteurs d’expression peuvent être intégrés au sein du génome bactérien par des techniques bien connues de l’homme du métier. Des séquences ORI d’intérêt peuvent être choisies parmi pIP404, pAMβ1, repH (origine de réplication chez C. acetobutylicum ), ColE1 ou rep (origine de réplication chez E. coli ), ou toute autre origine de réplication permettant le maintien du vecteur, typiquement du plasmide, au sein d’une cellule bactérienne appartenant au genre Clostridium . Des séquences de terminaison d’intérêt peuvent être choisies parmi celles des gènes adc, thl , de l’opéron bcs , ou de tout autre terminateur, bien connu de l’homme de l’art, permettant l’arrêt de la transcription au sein d’une cellule bactérienne. Des gènes de sélection (gènes de résistance) d’intérêt peuvent être choisis parmi ermB , catP , bla , tetA , tetM , et/ou tout autre gène de résistance à l’ampicilline, à l’érythromycine, au chloramphenicol, au thiamphénicol, à la spectinomycine, à la tétracycline ou à tout autre antibiotique pouvant être utilisé pour sélectionner des bactéries du genre Clostridium bien connu de l’homme de l’art. Sont ainsi décrits les plasmides pCas9acr de séquence SEQ ID NO : 23, pEC750C de séquence SEQ ID NO : 24, pGRNAind de séquence SEQ ID NO : 25, pGRNAcon de séquence SEQ ID NO : 26, pAN2 de séquence SEQ ID NO : 27 , pGRNA-hbd de séquence SEQ ID NO : 28, pGRNA-Δhbd de séquence SEQ ID NO : 29, pGRNA-pdc de séquence SEQ ID NO : 30, pGRNA-Δpdc de séquence SEQ ID NO : 31 et pGRNA-CΔhbd de séquence SEQ ID NO : 32, ainsi que l’utilisation de l’un, de plusieurs ou de l’ensemble d’entre eux pour transformer, et de préférence modifier génétiquement, une bactérie du genre Clostridium de manière à améliorer sa capacité de production de biocarburant(s) et/ou de molécule(s) biosourcée(s). L’invention vise aussi un procédé pour transformer, et de préférence modifier génétiquement, une bactérie appartenant au genre Clostridium comprenant un plasmide pSOL à l’état sauvage, de préférence C. acetobutylicum , ainsi que la bactérie modifiée génétiquement susceptible d’être obtenue par ce procédé. Ledit procédé comprend une étape de transformation de la bactérie par introduction dans ladite bactérie d’un outil de modification par recombinaison homologue tel que décrit ci-dessus, typiquement d’une cassette ou d’un vecteur d’expression, par exemple d’un plasmide sélectionné parmi les plasmides pCas9acr de séquence SEQ ID NO : 23, pEC750C de séquence SEQ ID NO : 24, pGRNAind de séquence SEQ ID NO : 25, pGRNAcon de séquence SEQ ID NO : 26, pAN2 de séquence SEQ ID NO : 27 , pGRNA-hbd de séquence SEQ ID NO : 28, pGRNA-Δhbd de séquence SEQ ID NO : 29, pGRNA-pdc de séquence SEQ ID NO : 30, pGRNA-Δpdc de séquence SEQ ID NO : 31 et pGRNA-CΔhbd de séquence SEQ ID NO : 32. Dans un mode de réalisation particulier dans lequel l’outil d’édition est un outil CRISPR, l’étape de transformation est de préférence réalisée en présence d’un agent inducteur de l’expression de la protéine anti-CRISPR codée par l’une des séquences de l’outil d’édition. Le procédé comprend de préférence également une étape de culture de la bactérie transformée. Cette étape de culture peut être réalisée sur un milieu ne contenant pas (ou dans des conditions n’impliquant pas) l’agent inducteur de l’expression de la protéine anti-CRISPR lorsque celle-ci est utilisée, et permettant typiquement l’expression du complexe ribonucléoprotéique endonucléase d’ADN et de l’ARNg, par exemple Cas9-ARNg (afin de stopper la production de ladite protéine anti-CRISPR et de permettre l’action de l’endonucléase). De préférence, le procédé pour transformer, et de préférence modifier génétiquement, une bactérie appartenant au genre Clostridium comprenant un plasmide pSOL à l’état sauvage comprend une étape de modification génétique, typiquement de délétion ou d’inactivation, du ou des gènes rendant la présence du plasmide pSOL essentielle à la survie de ladite bactérie, ou implique autrement une bactérie recombinante du genre Clostridium comprenant déjà une modification chromosomique rendant la présence du plasmide pSOL essentielle à sa survie. L’étape de délétion ou d’inactivation est de préférence réalisée à l’aide d’un outil d’édition génétique de type CRISPR, par exemple de type CRISPR-Cas. Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie du genre Clostridium comprenant une modification chromosomique rendant la présence du plasmide pSOL essentielle à sa survie est une bactérie dépourvue du gène hbd ou comprenant un gène hbd non fonctionnel. Le procédé pour transformer, et de préférence modifier génétiquement, une bactérie appartenant au genre Clostridium comprenant un plasmide pSOL à l’état sauvage comprend de préférence une étape d’introduction dans la bactérie d’un outil génétique selon l’invention. Le procédé pour transformer, et de préférence modifier génétiquement, une bactérie appartenant au genre Clostridium comprenant un plasmide pSOL à l’état sauvage comprend de préférence une étape supplémentaire de modification génétique de la bactérie transformée à l’aide d’un outil génétique selon l’invention, de préférence d’un outil de type CRISPR, par exemple de type CRISPR-Cas, de manière à corriger la modification chromosomique ayant rendu la présence du plasmide pSOL essentielle à la survie de ladite bactérie en restaurant la version sauvage de la séquence correspondante. Un procédé particulier selon l’invention est caractérisé en ce que la bactérie du genre Clostridium est une bactérie du genre Clostridium dépourvue du gène hbd ou comprenant un gène hbd non fonctionnel et en ce que l’étape supplémentaire de modification génétique de la bactérie transformée vise à réintroduire le gène hbd dans le génome de ladite bactérie ou à le rendre fonctionnel. Les inventeurs décrivent également l’utilisation d’une bactérie appartenant au genre Clostridium se distinguant de la souche sauvage correspondante en ce qu’elle comprend une modification chromosomique rendant la présence du plasmide pSOL essentielle à sa survie, dans un procédé de modification génétique d’une bactérie du genre Clostridium , ou pour fabriquer une bactérie dérivée modifiée génétiquement. Un objet préféré vise ainsi l’utilisation d’une bactérie recombinante selon l’invention, de préférence la bactérie identifiée dans la présente description en tant que IFP 969 telle qu’enregistrée le 17 février 2023 sous le numéro de dépôt LMG P-32993 auprès de la collection BCCM-LMG (également identifié dans le présent texte en tant que « Δ hbd »), dans un procédé de modification/d’amélioration génétique d’une bactérie du genre Clostridium . Une telle bactérie est typiquement utilisable comme outil de laboratoire pour obtenir des souches de bactéries du genre Clostridium génétiquement améliorées. Les inventeurs décrivent ainsi également l’utilisation d’une bactérie appartenant au genre Clostridium se distinguant de la souche sauvage correspondante en ce qu’elle comprend une modification chromosomique rendant la présence du plasmide pSOL essentielle à sa survie, ou d’une bactérie dont la modification chromosomique ayant rendu la présence du plasmide pSOL essentielle à la survie de ladite bactérie a été corrigée, pour fabriquer une bactérie dérivée modifiée génétiquement, utilisable à l’échelle industrielle pour produire une molécule biosourcée ou un mélange de molécules biosourcées, par exemple un solvant, un biocarburant ou tout produit intermédiaire (bio)chimique, en particulier un mélange de carburants, ou directement pour produire une ou des molécule(s) biosourcée(s), en particulier à l’échelle industrielle. La présente description vise également les bactéries recombinantes dérivées ainsi obtenues. Elle vise aussi l’utilisation de la bactérie recombinante dérivée ainsi obtenue, pour produire, grâce à l’expression du ou des acides nucléiques d’intérêt introduits volontairement dans son génome, un ou plusieurs biocarburant(s) et/ou molécule(s) biosourcée(s), de préférence à l’échelle industrielle. L’invention vise également un procédé de fermentation impliquant l’utilisation d’une bactérie génétiquement modifiée telle que décrite dans le présent texte, typiquement d’une bactérie appartenant au genre Clostridium se distinguant de la souche sauvage en ce qu’elle comprend une modification chromosomique rendant la présence du plasmide pSOL essentielle à sa survie, ou d’une bactérie dont la modification chromosomique ayant rendu la présence du plasmide pSOL essentielle à la survie de ladite bactérie a été corrigée. Les inventeurs décrivent enfin des kits (trousses), en particulier un kit pour transformer et de préférence modifier génétiquement une bactérie appartenant au genre Clostridium , et un kit pour produire un biocarburant, une molécule biosourcée ou un mélange de l’un et/ou l’autre, à l’aide d’une telle bactérie. Le kit pour transformer et de préférence modifier génétiquement une bactérie appartenant au genre Clostridium comprend de préférence au moins un acide nucléique d’intérêt tel que décrit dans le présent texte (par exemple deux ou trois acides nucléiques d’intérêt, typiquement fragment d’ADN, reconnaissant chacun une séquence cible) et tout ou partie des éléments d’un outil d’édition génétique tel que décrit dans le présent texte permettant de transformer, et typiquement modifier génétiquement une bactérie appartenant au genre Clostridium de manière à ce qu’elle comprenne une modification chromosomique rendant la présence du plasmide pSOL essentielle à sa survie et/ou à corriger la modification chromosomique ayant rendu la présence du plasmide pSOL essentielle à sa survie. Ce kit peut en outre comprendre un ou plusieurs consommables tels que par exemple un milieu de conservation ou un milieu de culture, un ou plusieurs ARNg, un acide nucléique utilisable en tant que matrice de réparation, au moins une paire d’amorces, une nucléase, une ou plusieurs molécules de sélection, un inducteur adapté à un promoteur inductible présent au sein de l’outil d’édition génétique, au moins une bactérie compétente du genre Clostridium (i.e. conditionnée en vue de la transformation), etc. Il peut autrement comprendre les éléments essentiels au fonctionnement d’un outil d’échange allélique (typiquement au moins deux acides nucléiques utilisables en tant que matrice de recombinaison homologue, et au moins un couple d’amorces). L’invention concerne plus particulièrement un kit pour produire une ou plusieurs molécule(s) biosourcée(s), par exemple un solvant ou un mélange de solvants, un biocarburant ou un mélange de biocarburants, un produit (bio)chimique intermédiaires ou un mélange de tels produits intermédiaires, à l’aide d’une bactérie appartenant au genre Clostridium , comprenant i) une bactérie modifiée génétiquement appartenant au genre Clostridium selon l’invention, i.e., une bactérie se distinguant de la souche sauvage en ce qu’elle comprend une modification chromosomique rendant la présence du plasmide pSOL essentielle à sa survie, par exemple IFP 969, ou une bactérie dont la modification chromosomique ayant rendu la présence du plasmide pSOL essentielle à la survie de ladite bactérie a été corrigée, et ii) un milieu, typiquement un milieu de conservation ou un milieu de culture de ladite bactérie. Le kit peut en outre comprendre une notice explicative. L’invention concerne par ailleurs les utilisations possibles du procédé ou du kit selon l’invention pour transformer et/ou modifier génétiquement une bactérie du genre Clostridium , typiquement une bactérie solvantogène du genre Clostridium , par exemple pour générer des variants améliorés de ladite bactérie. Elle concerne enfin les utilisations possibles du procédé, du kit ou d’une bactérie du genre Clostridium transformée et de préférence modifiée génétiquement selon l’invention, en particulier pour permettre la production de molécules biosourcées, par exemple de solvants, biocarburants, intermédiaires (bio)chimiques, ou de mélanges de ceux-ci, typiquement à l’échelle industrielle. Un kit particulier comprend un variant amélioré de la bactérie dont la modification chromosomique ayant rendu la présence du plasmide pSOL essentielle à la survie de ladite bactérie a été corrigée, typiquement un variant dont le plasmide pSOL a été modifié génétiquement de manière à permettre ou à améliorer la production d’une ou plusieurs molécule(s) biosourcée(s). Chacun des kits selon l’invention peut comprendre un ou plusieurs consommables tels que par exemple un milieu de conservation ou un milieu de culture, un ou plusieurs ARNg, une nucléase, une ou plusieurs molécules de sélection, un inducteur adapté à un promoteur inductible présent au sein de l’outil d’édition génétique, etc. Le milieu de conservation ou de culture de la bactérie modifiée génétiquement (appartenant au genre Clostridium ) selon l’invention présent au sein du kit est de préférence supplémenté en une source de carbone composée de glucose et/ou d’au moins un pentose, de préférence i) de glucose et/ou ii) d’arabinose et/ou i) de xylose. Ce milieu comprend de préférence entre 0,1 et 250 g/L, plus préférentiellement entre 1 et 100 g/L, de ladite source de carbone (composée de glucose et/ou d’arabinose et/ou de xylose). Le milieu de conservation ou de culture de la bactérie modifiée génétiquement est de préférence un milieu de culture de type RCM, plus préférentiellement un milieu de culture de type GAPES, encore plus préférentiellement un milieu de culture de type CGM. Les exemples et figures ci-après ont pour but d’illustrer plus pleinement l’invention sans pour autant en limiter la portée. En particulier, ces exemples présentent l’obtention et la caractérisation de bactéries selon l’invention, dans lesquels l’inactivation du gène hbd , celle d’un autre gène d’intérêt et/ou l’insertion d’au moins un gène additionnel (simulant un gène d’intérêt), est réalisée selon un mode de réalisation particulier préféré à l’aide d’un outil CRISPR-Cas9. Lesdits gènes peuvent être inactivés, ou introduits, selon d’autres modes de réalisation particuliers, bien connus de l’homme de métier, basés par exemple sur l’inactivation, ou l’introduction, de gène par recombinaison homologue ou par mutagénèse insertionnelle, comme expliqué ci-dessus. FIGURE La représente le métabolisme central de C. acetobutylicum . C. acetobutylicum produit de l’acétate, du butyrate et éventuellement du lactate lors de l’acidogenèse. Lors de la phase de solvantogenèse, le butyrate et l’acétate sont réassimilés, et le flux de carbone est réorienté vers la production d’acétone, d’éthanol et de n-butanol. Ack, acétate kinase ; Adc, acétoacétate décarboxylase ; Adh, alcool déshydrogénase ; Ald, aldéhyde déshydrogénase ; Aldc, acétolactate décarboxylase ; Als, acétolactate synthase ; Bcd, butyryl-CoA déshydrogénase ; Buk, butyrate kinase ; CtfA-CtfB, butyrate-acétoacétate CoA-transférase (sous-unités A et B) ; Crt, crotonase ; EtfA-EtfB, flavoprotéine de transfert d'électrons (sous-unités α et β) ; Fnor, ferrédoxine-NAD(P) + oxydoréductase ; Hbd, 3-hydroxybutyryl-CoA déshydrogénase ; HydA, hydrogénase ; Ldh, lactate déshydrogénase ; Pdc, pyruvate décarboxylase ; Pfor, pyruvate ferrédoxine oxydoréductase ; Pta, phosphate acétyltransférase ; Ptb, phosphate butyryltransférase ; Thl, thiolase. EXEMPLES EXEMPLE n°1 : Matériels et méthodes Souches, plasmides et milieux de culture C. acetobutylicum DSM 792 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, DSMZ) a été cultivée à 34°C en conditions anaérobies (90 % N 2 , 5 % CO 2 , 5 % N 2 ) en milieu 2YTG (tryptone 16 g.L -1 , extrait de levure 10 g.L -1 , glucose 5 g.L -1 , NaCl 4 g.L -1 ). Escherichia coli NEB 10-beta (New England Biolabs, NEB) a été cultivée à 37°C en conditions aérobies en milieu LB (tryptone 10 g.L -1 , extrait de levure 5 g.L -1 , NaCl 10 g.L -1 ). Les milieux solides ont été réalisés en ajoutant 15 g.L -1 d’agarose aux milieux liquides. Si nécessaire, de l’érythromycine (Em, 40 mg.L -1 ) et/ou du thiamphénicol (Tm, 15 mg.L -1 ) ont été utilisés pour les cultures de C. acetobutylicum . De même, du chloramphénicol (12,5 mg.L -1 en milieu liquide et 25 mg.L -1 en milieu solide) et/ou de la tétracycline (20 mg.L -1 ) ont été utilisés pour les cultures d’ E. coli . Les plasmides utilisés dans cette étude sont présentés dans le Tableau 1 ci-dessous. Plasmides Caractéristiques a pCas9 acr (SEQ ID NO : 23) ermB , ColE1, pCB102, Pcm-tetO2/1- cas9 , Pbgal- acrIIA4 , tetR, bgaR (Wasels F. et al. , 2020) pEC750C (SEQ ID NO : 24) catP , ColE1, pIP404 (Wasels F. et al. , 2017) pGRNA ind (SEQ ID NO : 25) Dérivé de pEC750C contenant une cassette d’expression d’ARNg (promoteur Pcm-2tetO1) (Wasels F. et al. , 2020) pGRNA con (SEQ ID NO : 26) Dérivé de pEC750C contenant une cassette d’expression d’ARNg (promoteur miniPthl) (Wasels F. et al. , 2020) pAN2 (SEQ ID NO : 27) tetA, p15A ori, Φ3TI (Heap JT et al. ) pGRNA- hbd (SEQ ID NO : 28) Dérivé de pGRNA ind , ciblant hbd pGRNA-Δ hbd (SEQ ID NO : 29) Dérivé de pGRNA- hbd , avec matrice d’édition Δ hbd pGRNA- pdc (SEQ ID NO : 30) Dérivé du pGRNA con , ciblant pdc pGRNA-Δ pdc (SEQ ID NO : 31) Dérivé de pGRNA- pdc , avec matrice d’édition Δ pdc pGRNA-CΔ hbd (SEQ ID NO : 32) Dérivé de pGRNA ind , ciblant la matrice d’édition Δ hbd pGRNA-C hbd (SEQ ID NO : 33) Dérivé de pGRNA- hbd , avec matrice d’édition permettant l’insertion d’ hbd a ermB , gène de résistance à l’érythromycine ; catP , gène de résistance au thiamphénicol et au chloramphénicol ; tetA , gène de résistance à la tétracycline ; ColE1 et p15A ori, origines de réplication chez E. coli ; pIP404, pAMB1 et pCB102, origines de réplication chez C. acetobutylicum . Construction de plasmides Les acides nucléiques ont été purifiés à l’aide des kits QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen), QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) et GenElute Bacterial Genomic DNA Kit (Sigma-Aldrich). Les amplifications PCR ont été réalisées avec la Q5 High-Fidelity DNA Polymerase (NEB). Les oligonucléotides utilisés pour la construction des plasmides sont présentés dans le Tableau 2 ci-dessous. Oligonucléotide Séquence (5’-3’) P01 (SEQ ID NO : 1) TCATACTTGGAGCTAATCACCCAA P02 (SEQ ID NO : 2) AAACTTGGGTGATTAGCTCCAAGT P03 (SEQ ID NO : 3) ATGCATGTCGACCAAAATCCTTCTCTGTAAATTCATG P04 (SEQ ID NO : 4) GAAAAAGGTATATTCAAAATAAGTTTACAAGAATCCCC P05 (SEQ ID NO : 5) ATTTTGAATATACCTTTTTCATTAAACAGACCTCC P06 (SEQ ID NO : 6) ATGCATGAATTCTGCAAATGTTTCTGATGATAAAATAG P07 (SEQ ID NO : 7) TAAGGTACACCACACATTAGGTGA P08 (SEQ ID NO : 8) AAACTCACCTAATGTGTGGTGTAC P09 (SEQ ID NO : 9) AAAAAAGTCGACGCGATCATAATCAGATTCTTTAC P10 (SEQ ID NO : 10) TTTAAAGGTTAACGGTCTAACAAATATCTTC P11 (SEQ ID NO : 11) TTAGACCGTTAACCTTTAAAGTACAAAGTGAAAC P12 (SEQ ID NO : 12) AAAAAAGTCGACATCTTCTTCCTTATCCTCAG P13 (SEQ ID NO : 13) TCATAGAATCCCCATTATCAAATG P14 (SEQ ID NO : 14) AAACCATTTGATAATGGGGATTCT P15 (SEQ ID NO : 15) TTGAAGCTTGAGCTCGGTACCCGGGCTTACCCTTGTATTCTAGTTTCTTGCC P16 (SEQ ID NO : 16) GGGGATTATCAAATCCCCATTTTTTATATATAATATAATTTTAGAGGAGGGA P17 (SEQ ID NO : 17) GGGGATTTGATAATCCCCATTCTTGTAAACTTATTTTGAATAATCG P18 (SEQ ID NO : 18) TCGAGATCTCCATGGACGCGTGACGACAGCTGTTTTACTTGGACATAATACT Le plasmide pGRNA- hbd (SEQ ID NO : 28) a été construit en clonant le produit d’hybridation des oligonucléotides P01 et P02 dans le pGRNA ind (SEQ ID NO : 25) à l’aide de BsaI et de la T4 DNA ligase (NEB). Le fragment obtenu par PCR chevauchante des amplifications obtenues à partir de l’ADNg de DSM 792 à l’aide des couples d’oligonucléotides P03-P04 et P05-P06 a été cloné au niveau des sites BamHI et SalI dans le pGRNA- hbd pour obtenir pGRNA-∆ hbd (SEQ ID NO : 29). Le plasmide pGRNA- pdc (SEQ ID NO : 30) a été construit en clonant le produit d’hybridation des oligonucléotides P07 et P08 dans le pGRNA con (SEQ ID NO : 26) à l’aide de BsaI et de la T4 DNA ligase (NEB). Le fragment obtenu par PCR chevauchante des amplifications obtenues à partir de l’ADNg de DSM 792 à l’aide des couples d’oligonucléotides P09-P10 et P11-P12 a été cloné au niveau des sites BamHI et SalI dans le pGRNA- pdc pour obtenir le pGRNA-∆ pdc (SEQ ID NO : 31). Le plasmide pGRNA-C∆ hbd (SEQ ID NO : 32) a été construit en clonant le produit d’hybridation des oligonucléotides P13 et P14 dans le pGRNA ind à l’aide de BsaI et de la T4 DNA ligase (NEB). Le pGRNA-C hbd (SEQ ID NO : 33) a été obtenu par Assemblage HiFi (NEB) du pGRNA-C∆ hbd digéré par BamHI et SalI et des produits d’amplifications obtenus à partir de l’ADNg de DSM 792 à l’aide des couples d’oligonucléotides P15-P16 et P17-P18. Edition génétique Les constructions plasmidiques ont été introduites dans C. acetobutylicum comme décrit par Mermelstein LD et al. . Les événements d’édition génétique ont été sélectionnés comme décrit par Wasels F. et al. (2020) et Wasels F. et al. (2017). Les oligonucléotides utilisés pour la confirmation des éditions génétiques sont présentés dans le Tableau 3 ci-dessous. Locus Oligonucléotide Séquence (5’-3’) hbd P19 (SEQ ID NO : 19) GTAATATTATAGCAGCTATTTTAAGTTTAC P20 (SEQ ID NO : 20) AAAGGTAAGGAAATGGCTGAG pdc P21 (SEQ ID NO : 21) TTGGCGCTGTTAATGGGCTA P22 (SEQ ID NO : 22) ACCCAGCTAAATGAATGGCCT L’emploi d’autres outils génétiques, telle que ceux basés sur la recombinaison homologue ou l’insertion d’éléments génétiques mobiles, peut permettre d’obtenir des mutants possédant des génotypes équivalents, i.e. n’exprimant plus les produits des gènes hbd et pdc , ou exprimant une version non fonctionnelle de ceux-ci. Fermentation Les performances fermentaires des micro-organismes décrits dans cette étude ont été évaluées en batch. Des précultures ont été réalisées en chambre anaérobie dans un volume de 1 mL de milieu CGM (KH 2 PO 4 0,75 g.L -1 , K 2 HPO 4 0,75 g.L -1 , MgSO 4 ∙H 2 O 0,4 g.L -1 , MnSO 4 ∙H 2 O 0,01 g.L -1 , FeSO 4 ∙7H 2 O 0,01 g.L -1 , NaCl 1,0 g.L -1 , Asparagine 2,0 g.L -1 , Extrait de levure 5,0 g.L -1 , (NH 4 ) 2 SO 4 2,0 g.L -1 , Glucose 80 g.L -1 ). Après une incubation de 18h, un volume de 500 µL de ces précultures a été utilisé pour inoculer 9,5 mL de milieu CGM dans des fioles. Une fois serties, ces dernières ont ensuite été incubées pendant 96h à 34°C, 100 rpm. En fin de fermentation, des échantillons ont été centrifugés à 5000 g pendant 5 minutes, et les surnageants ont été dilués à l’aide d’un standard interne (concentration finale de 0,5 g.L -1 de n-propanol) puis filtrés à 0,22 µm avant d’être analysés par chromatographie. La détection des solvants a été réalisée par chromatographie en phase gazeuse sur une colonne PoraBOND-Q (Agilent Technologies) avec un détecteur à ionisation de flamme. L’hélium a été utilisé comme gaz vecteur à un débit de 1,6 mL.min -1 , et la colonne chauffée de 50 à 250°C au cours d’un run de 30 min. La détection des acides a été réalisée par chromatographie en phase liquide à haute performance sur une colonne Aminex HPX-87H (Biorad) couplée à un refractomètre Spectra System RI-150 et un détecteur UV Waters 2487 dual λ réglé à 210 nm. La phase mobile consistait en une solution d’acide sulfurique 0,1 M, et la température de la colonne a été fixée à 60°C. Les résultats présentés sont la moyenne d’au moins trois essais indépendants. Résultats Un mutant Δ hbd a été construit dans la souche DSM 792 de C. acetobutylicum . Les performances fermentaires de ce mutant par rapport à la souche sauvage sont présentées dans le tableau 4 ci-dessous. Souches Solvants (g.L -1 ) Ethanol Acétone Propan-2-ol n-Butanol Total DSM 792 1,1 ± 0,2 8,6 ± 0,8 0,1 ± 0,0 12,3 ± 0,7 22,1 ± 0,4 Δ hbd 33,3 ± 1,3 2,9 ± 0,2 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 36,3 ± 1,5 Acides (g.L -1 ) Ac. acétique Ac. Butyrique Ac. Lactique Total DSM 792 1,6 ± 0,5 1,6 ± 0,5 0,0 ± 0,0 3,1 ± 1,0 Δ hbd 0,7 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,5 ± 0,0 1,3 ± 0,0 Ce mutant n’est plus capable de produire de n-butanol ni de butyrate. Il permet la production de quantités importantes d’éthanol, qui devient son produit de fermentation largement majoritaire. La quantité d’acétone produite est diminuée de plus de 65% par rapport à la souche sauvage. Afin de diminuer la quantité d’éthanol produite par ce mutant, le mégaplasmide pSOL contenant les gènes adhE1 et adhE2 codant des enzymes à activité acétaldéhyde déshydrogénase (Ald) a été ciblé à l’aide de l’outil CRISPR-Cas9 (décrit dans la demande WO2017/064439) employé pour la création du mutant ∆ hbd . La perte du mégaplasmide est facilement réalisable dans la souche sauvage, et ne nécessite que l’introduction d’un plasmide permettant l’expression d’un ARNg ciblant cet acide nucléique (Wasels et al. , 2017). La fréquence d’obtention de transformants de la souche sauvage contenant le plasmide pCas9 acr avec le plasmide pEC750C est de l’ordre de 10 1 à 10 2 ufc.µg ADN -1 . La fréquence d’obtention de transformants de la souche sauvage contenant le plasmide pCas9 acr avec un plasmide dérivé de pGRNA con ciblant le chromosome du micro-organisme et ne contenant pas de matrice d’édition du locus ciblé, en présence d’anhydrotétracycline (aTc), l’inducteur de l’expression de cas9 , est nulle. De plus, la fréquence d’obtention de transformants de la souche sauvage contenant le plasmide pCas9 acr avec un plasmide dérivé de pGRNA con ciblant le mégaplasmide pSOL en présence d’aTc est de l’ordre de 10 1 à 10 2 ufc.µg ADN -1 . L’analyse des transformants obtenus montre que ceux-ci ont perdu le mégaplasmide pSOL. La fréquence d’obtention de transformants du mutant ∆ hbd contenant le plasmide pCas9 acr avec le plasmide pEC750C est habituellement de l’ordre de 10 3 ufc.µg ADN -1 . De manière surprenante, la fréquence de transformation de ce mutant avec un plasmide dérivé de pGRNA con ciblant le mégaplasmide pSOL en présence d’aTc et ne contenant pas de matrice d’édition du locus ciblé est nulle. Ce résultat indique que le mégaplasmide pSOL est indispensable dans le mutant ∆ hbd et ne peut être éliminé, au contraire de ce qui est observé dans la souche sauvage. Il devient donc possible d’utiliser l’outil CRISPR-Cas9 pour réaliser des modifications précises au sein du mégaplasmide dans le mutant ∆ hbd . A titre d’exemple, le plasmide pGRNA-∆ pdc a été utilisé pour inactiver le gène pdc qui se trouve sur le pSOL. La transformation de la souche sauvage DSM 792 avec ce plasmide induit la perte du mégaplasmide pSOL dans les transformants obtenus. En revanche, il a été possible d’obtenir des mutants ∆ hbd ∆ pdc dont les performances fermentaires sont présentées dans le Tableau 5 ci-dessous. Souches Solvants (g.L -1 ) Ethanol Acétone Propan-2-ol n-Butanol Total DSM 792 1,1 ± 0,2 8,6 ± 0,8 0,1 ± 0,0 12,3 ± 0,7 22,1 ± 0,4 Δ hbd 33,3 ± 1,3 2,9 ± 0,2 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 36,3 ± 1,5 Δ hbd Δ pdc 32,7 ± 0,7 4,5 ± 0,2 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 37,3 ± 0,9 Acides (g.L -1 ) Ac. acétique Ac. Butyrique Ac. Lactique Total DSM 792 1,6 ± 0,5 1,6 ± 0,5 0,0 ± 0,0 3,1 ± 1,0 Δ hbd 0,7 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,5 ± 0,0 1,3 ± 0,0 Δ hbd Δ pdc 0,2 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,2 ± 0,0 A la suite des différentes éditions génétiques qui peuvent être réalisées dans le mégaplasmide pSOL à l’aide de l’outil CRISPR-Cas9, ce dernier peut être utilisé pour réintroduire le gène hbd , et ne conserver ainsi que les modifications autres, situées sur le megaplasmide et/ou sur le chomosome. Cette complémentation au locus peut être réalisée par exemple avec le plasmide pGRNA-C hbd (SEQ ID NO : 33) qui permet de réintroduire un gène fonctionnel n’impactant pas les performances du micro-organisme par rapport à la souche sauvage. Les performances de mutants DSM 792 hbd C issus du mutant ∆ hbd sont présentées dans le Tableau 6 ci-dessous. Souches Solvants (g.L -1 ) Ethanol Acétone Propan-2-ol n-Butanol Total DSM 792 1,1 ± 0,2 8,6 ± 0,8 0,1 ± 0,0 12,3 ± 0,7 22,1 ± 0,4 Δ hbd 33,3 ± 1,3 2,9 ± 0,2 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 36,3 ± 1,5 hbd C 1,8 ± 0,4 6,7 ± 0,1 0,1 ± 0,0 12,3 ± 0,1 20,9 ± 0,6 Acides (g.L -1 ) Ac. acétique Ac. Butyrique Ac. Lactique Total DSM 792 1,6 ± 0,5 1,6 ± 0,5 0,0 ± 0,0 3,1 ± 1,0 Δ hbd 0,7 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,5 ± 0,0 1,3 ± 0,0 hbd C 0,9 ± 0,0 0,2 ± 0,1 0,1 ± 0,1 1,2 ± 0,0 Les résultats obtenus montrent que la complémentation du gène hbd est fonctionnelle et que le mutant dans lequel le gène a été réintroduit à son locus d’origine se comporte de la même manière que la souche sauvage. Conclusions Au cours de ce travail, les inventeurs sont parvenus à démontrer la possibilité et l’intérêt d’utiliser un outil CRISPR-Cas9 pour réaliser des modifications génétiques précises au sein du mégaplasmide pSOL de la souche de C. acetobutylicum DSM 792. Cette stratégie peut être envisagée pour la modification de tout élément génétique non essentiel à la survie du micro-organisme dès lors qu’une modification chromosomique préalable permet de le rendre indispensable (/ essentiel) à la survie de la bactérie (dans au moins dans une condition de culture donnée). Une telle modification n’avait jusqu’à présent jamais été identifiée chez C. acetobutylicum , et le fait que le mégaplasmide pSOL soit indispensable dans la souche ∆ hbd est inattendu. La possibilité de modifier le mégaplasmide pSOL avec CRISPR-Cas9 permet de bénéficier des points forts de l’outil qui sont sa précision, sa facilité d’utilisation, sa rapidité, et le fait qu’il permette de réaliser des modifications au nucléotide près. L’ensemble des éléments génétiques constituant le génome de C. acetobutylicum est désormais modifiable avec un outil de ce type. Une fois les différentes modifications désirées réalisées, le gène hbd peut facilement être réintroduit dans le génome à son locus d’origine, permettant d’obtenir un micro-organisme ne possédant que les modifications d’intérêt. Utilisation d’un outil d’édition génétique pour modifier génétiquement le plasmide pSOL d’une bactérie Clostridium acetobutylicum , ladite bactérie se distinguant de la souche sauvage en ce qu’elle comprend une modification chromosomique rendant la présence du plasmide pSOL essentielle à sa survie, caractérisée en ce que la bactérie est dépourvue du gène hbd ou comprend un gène hbd non fonctionnel. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que la bactérie est la souche IFP 969 enregistrée le 17 février 2023 sous le numéro LMG P-32993 auprès de la collection BCCM-LMG. Procédé pour transformer, et de préférence modifier génétiquement, une bactérie appartenant au genre Clostridium comprenant un plasmide pSOL à l’état sauvage, caractérisé en ce que le procédé comprend la délétion ou l’inactivation d’un gène rendant la présence du plasmide pSOL essentielle à la survie de ladite bactérie, ou en ce que la bactérie du genre Clostridium est une bactérie recombinante comprenant une modification chromosomique rendant la présence du plasmide pSOL essentielle à sa survie, caractérisée en en ce que la bactérie du genre Clostridium comprenant une modification chromosomique rendant la présence du plasmide pSOL essentielle à sa survie est une bactérie dépourvue du gène hbd ou comprenant un gène hbd non fonctionnel. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu’il comprend une étape de transformation de la bactérie à l’aide d’un outil CRISPR et une étape de modification génétique de la bactérie transformée visant à réintroduire le gène hbd dans le génome de ladite bactérie ou à le rendre fonctionnel. Bactérie modifiée génétiquement appartenant au genre Clostridium susceptible d’être obtenue par le procédé selon la revendication 3 ou 4. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, procédé selon la revendication 3 ou 4, ou bactérie selon la revendication 5, caractérisé en ce que la bactérie est C. acetobutylicum . Utilisation d’une bactérie appartenant au genre Clostridium se distinguant de la souche sauvage en ce qu’elle comprend une modification chromosomique rendant la présence du plasmide pSOL essentielle à sa survie, caractérisée en ce que ladite bactérie est dépourvue du gène hbd ou comprend un gène hbd non fonctionnel, ou d’une bactérie selon la revendication 5, pour produire une molécule biosourcée, par exemple un solvant ou un biocarburant, ou un mélange de molécules biosourcées. Procédé de fermentation impliquant l’utilisation d’une bactérie appartenant au genre Clostridium se distinguant de la souche sauvage en ce qu’elle comprend une modification chromosomique rendant la présence du plasmide pSOL essentielle à sa survie, caractérisé en ce que ladite bactérie est dépourvue du gène hbd ou comprend un gène hbd non fonctionnel, ou d’une bactérie selon la revendication 5. Kit pour produire une molécule biosourcée, par exemple un solvant ou un biocarburant, à l’aide d’une bactérie appartenant au genre Clostridium , comprenant i) une bactérie appartenant au genre Clostridium se distinguant de la souche sauvage en ce qu’elle comprend une modification chromosomique rendant la présence du plasmide pSOL essentielle à sa survie, caractérisée en ce que ladite bactérie est dépourvue du gène hbd ou comprend un gène hbd non fonctionnel, ou une bactérie selon la revendication 5, et ii) un milieu de conservation ou de culture de la bactérie.