Brevet FR3149323A1 — publié le 20241206

L’invention a pour objet une composition de collagène natif issu d’écailles de poisson, la composition comprenant des fibres de collagène natif à une concentration comprise entre 80% et 99,9% en poids de la composition totale. Figure pour l’abrégé : figure 1 Composition de collagène natif purifié L’invention concerne l’extraction de collagène natif issu d’écailles de poisson. Les industries de la pêche et de l’aquaculture produisent de grandes quantités de déchets, dont les écailles de poisson sont un des co-produits les moins valorisés. Plusieurs centaines de milliers de tonnes d’écailles de poissons sont en effet produites chaque année par les industries de la pêche et de l’aquaculture. Aujourd’hui les écailles de poisson sont des coproduits très peu valorisés. Le collagène et l'hydroxyapatite qui composent l’écaille constituent pourtant des molécules d’intérêt à haute valeur ajoutée. Le collagène est le biopolymère le plus répandu dans le monde animal. Le collagène est une chaîne polypeptidique composée d’acides aminés, notamment présent dans la peau et les os. Les peaux et os d’origine bovine, porcine ou marine sont d’ailleurs les sources d’approvisionnement les plus communes de collagène et de sa forme hydrolysée, la gélatine. Ces composants sont très utiles pour l’industrie agro-alimentaire, où ils sont utilisés en tant que liant et agent texturant. La cosmétique et le nutraceutique sont également des marchés importants notamment grâce au caractère biocompatible du collagène. Cela est aussi vrai pour l’industrie biomédicale qui est aussi en demande croissante de collagène natif, à une échelle plus réduite cependant. L’hydroxyapatite est un biominéral également présent dans les structures minéralisées du monde animal. Il présente des propriétés intéressantes notamment pour les secteurs du biomédical et de la cosmétique. Les écailles de poisson sont encore peu utilisées pour l’extraction de collagène natif, les peaux de poissons leur étant préférées. Le procédé conventionnel d’extraction de collagène issu d’écailles de poisson s’inspire directement des procédés d’extraction de collagène issu des peaux. Le collagène issu des écailles de poisson est donc aujourd’hui principalement extrait de manière chimique avec l’utilisation de solutions acides et basiques afin de déstructurer la matière naturelle et d’isoler les molécules ciblées. La technique d’extraction conventionnelle consiste en un prétraitement à l’aide d’une solution basique forte comme la soude, suivi d’un traitement à base d’acide acétique ou d’acide chlorhydrique. L’EDTA (pour « ethylenediaminetetraacetic acid » ou acide éthylènediaminetétraacétique en français), un agent chélatant complexant les métaux lourds, est souvent utilisé pour déminéraliser les écailles en amont de l’étape d’extraction. Les étapes standard d’extraction de collagène natif en laboratoire sont les suivantes : prétraitement à la soude, déminéralisation des écailles à l’EDTA, extraction du collagène à 4°C à l’aide d’acide acétique, centrifugation, « salting out » (ou précipitation saline en français), pour purifier le collagène, Dialyse, et séchage par lyophilisateur. Une étape d’hydrolyse enzymatique peut être ajoutée, ou remplacer la phase d’extraction à l’acide acétique pour améliorer le rendement. Cette méthode d’ extraction présente plusieurs inconvénients. Tout d’abord, le collagène extrait peut être dénaturé car les diverses hydrolyses sont difficiles à contrôler. Les chaînes de collagène sont découpées de manière aléatoire, la nature des peptides produits étant donc difficile à prédire et à contrôler. De plus, la concentration en collagène des compositions extraites n’est pas optimale. L’invention a donc pour but de fournir une composition en collagène permettant de résoudre les problèmes mentionnés ci-dessus. A cet effet, l’invention a pour objet une composition de collagène natif issu d’écailles de poisson, la composition comprenant des fibres de collagène natif à une concentration comprise entre 80% et 99,9% en poids de la composition totale. On entend par « fibres de collagène natif » un assemblage de fibrilles de collagène ayant conservé leur structure en triple hélice, et ayant également gardé leur superstructure naturelle de fibres. L’avantage d’une telle solution est double. Tout d’abord, la concentration en fibres de collagène dans la composition est optimale, à un niveau de pureté non atteint dans l’art antérieur. De plus, le collagène a gardé sa forme native, c’est-à-dire celle du collagène dans les écailles de poisson, ce qui permet d’envisager un nombre d’utilisations potentielles varié. En effet, il peut s’agir d’une part d’une utilisation directe du collagène sous forme de fibres, et d’autre part d’une utilisation de collagène soluble, après solubilisation du collagène sous forme de fibre, pour d’autres types d’utilisations (cosmétique, alimentaire, etc.). Cette solubilisation peut être réalisée en deux temps : il peut s’agir d’une première transformation via des protocoles conventionnels d’extraction chimiques et enzymatiques en « collagène soluble natif ». Ce terme fait référence à des fibrilles de collagène ayant conservé leur structure en triple hélice, mais sans superstructure en forme de fibres, et étant soluble dans un acide faiblement concentré (on parle alors de ASC, pour « Acid-Soluble Collagen » ou collagène soluble dans l’acide) ou une solution enzymatique (on parle généralement de PSC, pour « Pepsin-Soluble Collagen », la pepsine étant l’enzyme la plus couramment utilisée). La conservation de la structure fibrillaire du collagène natif permet une augmentation significative du rendement (entre 300% et 3000% d’augmentation de rendement) de solubilisation des fibrilles de collagène natif dans l’acide acétique 0,5M après 48h. Tout comme le collagène soluble natif, les fibres de collagène natif sont biocompatibles. Suivant d’autres caractéristiques optionnelles de la composition prises seules ou en combinaison : les fibres de collagène natif sont directement disponibles pour une utilisation ultérieure ; les fibres de collagène natif sont des fibres de collagène natif de type I ; les fibres de collagène ont une longueur comprise entre 100 µm et 10 mm ; les fibres de collagène ont un diamètre compris entre 1 et 100 µm ; et les fibres de collagène peuvent être transformées en collagène natif soluble. L’invention concerne également une utilisation d’une composition de collagène natif selon l’invention afin de réaliser des matériaux biomédicaux, des compléments alimentaires, des produits cosmétiques, des matériaux bio-composites et/ou des éléments de papeterie. Brève description des figures L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui va suivre, donnée uniquement à titre d'exemple, et faite en se référant aux dessins annexés dans lesquels : est un ensemble d’images (figures 1a à 1d) par microscopie électronique à balayage du collagène de la composition selon l’invention, est une image par microscopie électronique à balayage de collagène natif soluble, est un ensemble de deux graphiques (figures 3a et 3b) d’une représentation de résultats d’une analyse par dichroïsme circulaire d’une composition de collagène selon l’invention en comparaison d’une composition de collagène soluble natif, est une photographie des résultats d’une analyse par électrophorèse SDS-PAGE d’une composition de collagène selon l’invention en comparaison d’une composition de collagène de queue de rat, est une représentation de résultats d’une analyse thermogravimétrique d’une composition de collagène selon l’invention en comparaison de compositions de collagène soluble natif ainsi que de collagène insoluble natif, est une représentation de résultats d’une analyse par spectroscopie infrarouge d’une composition de collagène selon l’invention en comparaison de compositions de collagène soluble natif ainsi que de collagène insoluble natif, est une représentation de résultats d’une analyse par spectroscopie RMN d’une composition de collagène selon l’invention en comparaison de compositions de collagène soluble natif ainsi que de collagène insoluble natif, est une représentation de résultats d’une analyse de cytotoxicité d’une composition de collagène selon l’invention en comparaison de compositions de collagène soluble natif ainsi que de collagène insoluble natif, et est un tableau d’analyse de dosage d’acides aminés d’une composition de collagène selon l’invention. Description détaillée On se réfère désormais à la illustrant des images par microscopie électronique à balayage d’une composition de collagène natif issu d’écailles de poisson, la composition comprenant des fibres de collagène natif, préférentiellement de type I, à une concentration comprise entre 80% et 99,9% en poids de la composition totale. Procédé d’extraction du collagène Le procédé d’extraction de la composition de collagène à partir d'écailles de poisson est un procédé d’extraction mécanique. On entend par « extraction mécanique » une extraction de collagène natif ne nécessitant pas l’utilisation de produits chimique tels que ceux mentionnés précédemment, par exemple par bains successifs. Une première étape peut être un nettoyage (à l’eau claire ou un nettoyage enzymatique) et un séchage des écailles de poisson. Les moyens de nettoyage des écailles de poisson peuvent comprendre au moins un bain d’eau claire, de préférence légèrement acide, pour rincer les écailles de poisson. Il peut également s’agir d’un nettoyage par lavage enzymatique. Concernant les moyens de séchage des écailles de poisson, ils peuvent être formés par au moins une grille de support et au moins un souffleur à air chaud. Avantageusement, les moyens de séchage sont alimentés en énergie par une source d’énergie renouvelable (par exemple solaire) et/ou d’énergie fatale. Suite à cette étape, un volume d’écailles de poisson est placé à l’intérieur d’une cuve. La cuve est de préférence réalisée à partir d’un alliage de dureté supérieure à celle de l’hydroxyapatite (composé présent dans les écailles de poisson). Cela limite la pollution des fibres de collagène natif par des particules d’acier. Par exemple, la cuve peut être réalisée au moins en partie en acier inoxydable. Il est ensuite possible de régler la hauteur d’un organe de fermeture (par exemple un couvercle plein) sur la cuve pour déterminer le volume de la cuve, notamment en fonction du volume d’écailles de poisson introduit dans la cuve. Une étape de défibrage des écailles de poisson par mise en rotation de pales motorisées est mise en œuvre. Les pales motorisées sont disposées dans la cuve et dimensionnées pour défibrer les écailles de poisson. Ces dernières agissent comme des fléaux lorsqu’elles sont mises en rotation dans la cuve, ce qui permet le défibrage des écailles de poissons présentes dans la cuve. Au moins une pale motorisée peut être formée par une barre métallique, par exemple de section droite rectangulaire, comprenant une portion centrale de préférence perforée (i.e. comprenant un orifice traversant) reliée à un axe, s’étendant au centre de la cuve et relié à un moteur, et au moins une portion terminale formant un angle compris entre 30° et 70° avec la portion centrale. Alternativement ou en complément, au moins une pale motorisée peut être plane et de préférence perforée elle aussi. Avantageusement, la forme d’au moins une partie des pales motorisées permet d’éviter une stagnation des écailles de poisson dans la cuve (par exemple une pale motorisée plane en fond de cuve). Les pales motorisées peuvent être mises en rotation à une vitesse comprise entre 5 000 et 30 000 tours par minute, de préférence entre 15 000 et 25 000 tours par minute, pendant une période variant de préférence 10 secondes à 3 minutes (on prévoit un moteur capable d’obtenir les vitesses de rotation susmentionnées). La vitesse de rotation des pales motorisées peut varier lors de l’étape de défibrage des écailles de poisson (on peut par exemple coupler le moteur à un variateur de vitesse). Lors de cette étape de défibrage des écailles de poisson, la cuve peut être inclinée afin de permettre la séparation mécanique des fibres de collagène natif par rapport à d'autres éléments issus du défibrage. Une étape de séparation mécanique des fibres de collagène natif par rapport à d'autres éléments issus du défibrage des écailles de poisson peut se faire de manière concomitante à celle de défibrage des écailles de poisson. Un système d’aspiration peut par exemple être placé face à une ouverture d’introduction d’écailles de poisson de la cuve. Ce système d’aspiration est dimensionné et placé de manière à aspirer le contenu de la cuve. Dans ce cas, la cuve comprend des moyens agencés pour empêcher le passage de collagène natif et autoriser le passage d’hydroxyapatite et d’impuretés. La cuve peut par exemple comprendre des ouvertures autorisant l’extraction de la cuve de certains produits issus du défibrage des écailles de poisson, tout en interdisant la sortie de la cuve d’autres produits issus de ce défibrage. Alternativement, il est possible de séparer mécaniquement le collagène des autres éléments issus du défibrage après défibrage, par exemple par récupération des écailles défibrées puis passage sur un tamis vibrant. Il est possible de prévoir une étape de mesure de la température à l’intérieur de la cuve pendant l’étape de défibrage des écailles de poisson. Cela permet d’identifier un éventuel échauffement de l’intérieur de la cuve pouvant dénaturer les fibres de collagène. En effet, pour éviter tout risque de dénaturation du collagène natif, il est préférable de maintenir la température à l’intérieur de la cuve inférieure à 60°C. En cas d’augmentation de la température dans la cuve au-dessus d’une valeur seuil, une étape d’abaissement de la température à l’intérieur de la cuve peut être mise en œuvre par réduction de la vitesse de rotation des pales motorisées, par arrêt de la rotation des pales motorisées, ou encore par injection d’au moins un agent refroidissant tel que l’azote liquide, par exemple tout autour de la cuve. Enfin, il est possible de prévoir une étape de micronisation des fibres de collagène natif extraites, par exemple dans un broyeur à rotors, afin d’augmenter la solubilité du collagène dans l’acide. Exemple de procédé d’extraction Selon un exemple de mise en œuvre de l’invention, 20 grammes d’écailles sèches (taux d’humidité résiduelle autour de 11%) de tilapia du Nil ( Oreochromis niloticus ) sont placés dans la cuve en inox de 14 centimètres de diamètre. Deux pales motorisées plates et droites en inox, d’une longueur égale à 13,5cm, et une pale motorisée de la forme décrite ci-dessus (d’une longueur de 6 centimètres et d’une hauteur de 2 centimètres) sont positionnés les unes à la suite des autres sur un axe, le tout étant serré et sécurisé par un boulon de serrage. Un organe de fermeture de la cuve est positionné de façon à ce que la hauteur de la chambre définie par la cuve et l’organe de fermeture soit de 7 centimètres. Un système d’aspiration est installé au niveau de la cuve pour réaliser la séparation des produits issus du défibrage. Une entrée d’air dans la cuve est prévue pour éviter de créer un vide. La vitesse des pales motorisées est fixée à 28 000 rotations par minute, et l’étape de défibrage des écailles de poisson est de 1 minute et 30 secondes. Après défibrage des écailles de poisson et séparation mécanique des fibres de collagène natif par rapport à d'autres éléments issus du défibrage, on collecte 6 grammes de collagène natif pur (le taux d’impuretés est inférieur à 2%) sous forme fibreuse. Composition de collagène natif Une composition de collagène natif selon l’invention est extraite à partir d’écailles sèches de tilapia du Nil ( Oreochromis niloticus ) par mise en œuvre de l’exemple de procédé ci-dessus. Les analyses effectuées par la suite l’ont été sur la base de cette composition extraite. La composition extraite peut également l’être en utilisant des écailles d’autres poissons comme par exemple le saumon ou encore la carpe, et selon un procédé différent de l’exemple ci-dessus et s’inscrivant dans la définition générale du procédé d’extraction ci-dessus. Caractérisation structurelle du collagène natif Une première analyse d’échantillons provenant de la composition obtenue a consisté à vérifier la structure du collagène natif présent dans la composition. Pour ce faire, une analyse par microscopie électronique à balayage a été réalisée à partir de la composition extraite. Les figures 1a à 1d illustrent une portion de l’échantillon analysé à des grossissements respectifs x50, x2 000, x35 000 et x 70 000. Les images des figures 1b, 1c et 1d ont été réalisées avec une tension d’accélération de 10kV et un courant de 1,6 nA. Au préalable, les échantillons ont été recouverts d’une couche de platine de 4nm avec un métaliseur. L‘image de la figure 1a ainsi que celle de la ont été réalisées avec une tension d’accélération de 25kV. Les échantillons ont été au préalable recouverts d’une couche d’or pendant 60 secondes à 30mA avec un métaliseur. Les images montrent les différences structurelles des échantillons. Les fibres 1 de collagène natif visibles sur les figures 1a à 1d sont composées d’un assemblage de fibrilles de collagène natif, reconnaissable au motif répétitif 2 d’anneaux sombres et claires, caractéristique du collagène natif. Ces fibres ont ainsi conservé leur structure naturelle d’assemblage, que ce soit à l’échelle microscopique (visualisation de fibres de collagène formées par des fibrilles de collagène) et macroscopique (présence d’un échantillon formé par des fibres visibles formant un « coton » de collagène). Le collagène soluble natif, défini plus haut, perd cette structuration et forme une mousse 3 visible sur la , notamment selon la méthode de séchage (il pourrait s’agir d’un film). Les fibres obtenues par électrofilage à partir du collagène soluble natif ne présentent pas non plus cette structuration observée sur les fibres du collagène natif de la composition selon l’invention. Une seconde analyse de structure est illustrée en et correspond à une analyse en dichroïsme circulaire. Cette analyse vise à déterminer la structure élémentaire en triple hélice des fibres de collagène de la composition selon l’invention. L’analyse en dichroïsme circulaire a été réalisé à 20°C avec un spectromètre et une gamme de mesure allant de 190nm à 300nm et une cadence de 200nm/min. Des cellules en quartz ayant un chemin optique de 1cm ont été utilisées. Deux scans ont été accumulés pour chaque échantillon : un échantillon correspondant à la composition de collagène natif selon l’invention (figure 3a) ainsi qu’une composition de collagène soluble natif (figure 3b). Les échantillons ont été dispersés dans de l’eau distillée ou une solution de HCl à 0,01M à des concentrations entre 0,02 et 0,05 mg/mL. Les spectres obtenus présentent un pic positif maximum 10 à 220nm et un pic négatif maximum 12 à 200nm. Ce basculement dans le signal atteste de la structure en triple hélice du collagène, structure élémentaire de collagène natif, comme cela est reportée de manière extensive dans l’état de l’art. Cette analyse permet donc de confirmer la présence d’une structure élémentaire en complément de l’identification de la superstructure fibrillaire du collagène natif extrait. Une troisième analyse de structure, représentée en , correspond à une électrophorèse SDS-PAGE afin de quantifier la taille des protéines. Elle est notamment utilisée pour identifier le type de collagène, chaque type ayant une configuration différente, la triple hélice du collagène de type I étant formée de deux chaînes α1 et d’une chaîne α2. L’électrophorèse a été réalisée avec des gels précoulés. Les échantillons de collagène ont été dissous dans du tris-HCl 0,5M pH 6,8 à une concentration de 3mg/mL. La solution a ensuite été mélangée en ratio 1:1 à une solution dénaturante composée de Laemmli buffer et de β-mercaptoethanol (ratio 90:10) avant d’être déposée dans les puits du gel. 10µL ont été déposés dans chaque puit. 5µL de marqueur de taille ont été déposés dans deux puits différents. Un courant de 200V a été utilisé pendant 40 minutes. Après migration, le gel a été teinté pendant 1h, avant d’être nettoyé à l’eau distillé et à l’éthanol pendant plusieurs heures jusqu’à apparition des bandes. Deux échantillons ont été analysés : le collagène natif selon l’invention (profil de migration 14) et un collagène commercial de queue de rat en guise de référence (profil de migration 16). Les deux échantillons montrent le profil de gel classique du collagène de type I, avec une double bande autour de 130 kDa correspondant aux chaînes α1 (référence 20) et α2 (référence 22), en plus d’une chaîne β (référence 18). La bande α1 est deux fois plus intense que la bande α2, attestant de la présence d’un collagène de type I. Les résultats sont cohérents avec l’état de l’art. Le tableau suivant détaille une comparaison entre le collagène de la composition selon l’invention, du collagène de queue de rat, du collagène d’écailles de Oreochromis niloticus , du collagène d’écailles de Nibea coibor et du collagène humain. Collagène HADDOCK Collagène queue de rat Collagène écaille de poisson (Oreochromis niloticus) Collagène poisson (Nibea coibor) Collagène humain Source étude interne étude interne J.Kuwahara (2021) DOI:10.3390/pr9020288 National Library of Medicine National Library of Medicine Chaîne α1 139 138 136 137 139 Chaîne α2 126 126 127 127 129 Ce tableau atteste de la similarité en termes de composition chimique entre les différents collagènes et la présence d’un collagène de type I. Caractérisation de la pureté en collagène natif Une analyse d’échantillons provenant de la composition obtenue a consisté à vérifier la pureté du collagène natif présent dans la composition extraite. Pour ce faire, une analyse thermogravimétrique a été réalisée. Cette analyse thermique permet d’obtenir des informations sur la composition d’un matériau par suivi gravimétrique de sa cinétique de dégradation à la température. Dans le cas présent, une rampe de température de 30°C à 900°C à 20°C/minute a été utilisée dans une atmosphère sous air. Les échantillons solides ont été placés dans des creusets en oxyde d’aluminium de 150µL. Les résultats d’analyse sont représentés en . Trois échantillons ont été analysés : les fibres de collagène natif de la composition selon l’invention (courbe de dégradation 4), le collagène soluble natif (courbe de dégradation 6) et du collagène insoluble natif (courbe de dégradation 8). On entend par « collagène insoluble natif » des fibrilles de collagène ayant conservé leur structure en triple hélice mais n’étant pas soluble après un certain nombre d’heures d’extraction en présence d’un acide ou d’une enzyme. Les collagènes natifs solubles et insolubles ont une pureté en collagène comprise entre 98 et 99,9%. Les trois courbes de dégradation sont comparables à celles de l’état de l’art avec trois paliers de dégradation : une première dégradation entre 80°C et 100°C associée à l’évaporation de l’humidité résiduelle ; une seconde dégradation entre 300 et 330°C correspondant à la principale dégradation du collagène ; et enfin une dernière dégradation entre 550 et 600°C associée à l’évaporation du carbone ayant carbonisé lors de la seconde dégradation. On notera d’ailleurs que cette dernière dégradation ne se produit pas si on utilise une atmosphère inerte comme l’azote, l’oxygène étant nécessaire pour dégrader complètement le carbone. Le taux de résidu sec (aussi appelé taux de cendre) obtenus après dégradation est inférieur à 3%, attestant de la pureté du collagène. Un taux de résidu sec inférieur à 3% atteste d’une pureté en collagène supérieure à 97%. Une seconde analyse de la pureté du collagène présent dans la composition selon l’invention consiste à la réalisation d’une spectroscopie infrarouge (ou FTIR), permettant d’obtenir des informations sur la composition chimique d’un matériau, dont les résultats sont illustrés en . La illustre les résultats de spectroscopie infrarouge d’une composition de collagène natif selon l’invention (courbe A), de collagène soluble natif (courbe B) et de collagène insoluble natif (courbe C). Les collagènes natifs solubles et insolubles ont une pureté en collagène comprise entre 98 et 99,9%. Les analyses ont été réalisés en mode réflectance totale atténuée. La gamme de longueur d’onde est comprise entre 500 et 4000 cm-1. L’acquisition s’est faite avec 64 scans pour chaque échantillon. Les spectres FTIR sont eux aussi conformes à l’état de l’art pour le collagène, sans impuretés observées. Les pics des spectres FTIR sont similaires les uns aux autres, sans pics parasites synonymes d’impuretés, ce qui atteste d’une pureté en collagène natif de la composition extraite de manière qualitative, en complément de l’analyse thermogravimétrique quantitative ci-dessus. Les pics caractéristiques du collagène identifiés sur les spectres FTIR sont répertoriés dans le tableau 2. La position de ces pics est similaire à l’état de l’art. Bandes caractéristiques (cm-1) Amide A Amide I Amide II Amide III Fibres de collagène natif (A) 3280 1635 1524 1232 Collagène natif soluble (B) 3300 1635 1544 1237 Collagène natif insoluble (C) 3288 1632 1535 1235 La illustre une seconde analyse par spectrométrie, mais une spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN), afin de déterminer la concentration en collagène de la composition selon l’invention. L’expérience RMN du carbone 13 en rotation à l’angle magique (CPMAS) a été menée à 33°C, avec une rotation de 11kHz, un rotor de 4mm et un support en oxyde de zirconium 100µL. Pour chaque échantillon, 4096 scans ont été réalisés. Trois échantillons ont été analysés : les fibres de collagène natif selon l’invention (courbe D), le collagène soluble natif (courbe E) et le collagène insoluble natif (courbe F). Les collagènes natifs solubles et insolubles ont une pureté en collagène comprise entre 98 et 99,9%. Les spectres RMN de la attestent également de la pureté du collagène. Par ailleurs, tous les spectres obtenus ont la signature typique des acides aminés contenus dans le collagène et reportés dans l’état de l’art, ce qui atteste par ailleurs de la nature du collagène extrait. L’alignement des spectres atteste de l’absence significative d’impuretés, ce qui atteste d’une pureté en collagène natif de la composition extraite de manière qualitative, en complément de l’analyse thermogravimétrique quantitative ci-dessus. Caractérisation chimique de la composition de collagène Un test de caractérisation chimique de la composition de collagène natif fibreux selon l’invention concerne la biocompatibilité de cette dernière. Pour ce faire, des essais de biocompatibilité in vitro ont été réalisés à partir de fibroblastes L-929 (American Type Culture Collection, ATCC) qui ont été cultivés dans un milieu MEM (pour « Minimum Essential Medium » ou milieu minimum essentiel) mélangé avec 10% de FBS (pour « Fetal Bovine Serum » ou sérum de veau fœtal) à 37°C et sous une atmosphère à 5% de CO 2 . Pour l’étude de la cytotoxicité, les échantillons de collagène (composition de collagène natif fibreux selon l’invention, composition de collagène soluble natif et composition de collagène insoluble natif) sont stérilisés par rayonnement UV pendant 30 minutes de chaque côté. Ensuite, des milieux d’extraction ont été obtenus par incubation des échantillons pendant 24h à 37°C dans le milieu de culture à une concentration de 0,022 mg/mL. Les cellules ont été placées en quadruplicata dans une plaque à 96 puits (4.10 3 cellules/puits) et ont été incubées pendant 24h pour permettre leur adhésion. Ensuite, le milieu de culture a été remplacé soit par le milieu d’extraction obtenus plus tôt à partir des trois types d’échantillons, soit par le milieu du contrôle négatif ou par le milieu du contrôle positif C+ sur la (contenant 10% de DMSO). La prolifération cellulaire a été quantifiée toutes les 24 heures pendant 72h avec un indicateur coloré à base de résazurine. Les résultats sont reportés sur la . Les échantillons analysés sont les suivants : C1 = composition de fibres de collagène natif selon l’invention C2 = composition de collagène soluble natif C3 = composition de collagène insoluble natif Des solutions de milieux sans cellules ont été utilisés comme référence pour faire les blancs. La viabilité des cellules a été calculée par rapport au contrôle négatif (ayant la viabilité maximale) avec la formule suivante : , Où OD correspond à l’absorbance à 570nm avec l’absorbance à 600nm soustraite pour chaque puit. La viabilité mesurée après 24 heures était bien au-dessus des 70% exigée par la norme ISO 10993-5, démontrant ainsi qu’aucune cytotoxicité n’est observable pour l’échantillon issu de la composition de collagène natif selon l’invention. Un second test de caractérisation de la composition chimique, illustré en , correspond à un dosage d’acides aminés de la composition en collagène natif extraite. L’analyse du profil d’acides aminés a été réalisée selon la norme ISO 13903-2005. 50g de fibres de collagène natif ont été utilisés. Le profil de distribution des acides aminés visible sur la est similaire à celle du collagène, avec notamment des taux de proline et d’hydroxyproline élevés et supérieurs à 10%. Le ratio observé en est typique d’un collagène, plus particulièrement d’un collagène marin. Liste de références 1 : fibres de collagène natif 2 : motifs répétitifs 3 : mousse 4 : courbe de dégradation du collagène natif selon l’invention 6 : courbe de dégradation du collagène soluble natif 8 : courbe de dégradation du collagène insoluble natif 10 : pic positif maximum 12 : pic négatif maximum 14 : profil de migration de collagène natif selon l’invention 16 : profil de migration de collagène de queue de rat 18 : chaîne β 20 : chaîne α1 22 : chaîne α2 A : spectroscopie infrarouge du collagène natif selon l’invention B : spectroscopie infrarouge du collagène soluble natif C : spectroscopie infrarouge du collagène insoluble natif D : spectroscopie RMN du collagène natif selon l’invention E : spectroscopie RMN du collagène soluble natif F : spectroscopie RMN du collagène insoluble natif Composition de collagène natif issu d’écailles de poisson, la composition comprenant des fibres de collagène natif à une concentration comprise entre 80% et 99,9% en poids de la composition totale. Composition de collagène natif selon la revendication 1, dans laquelle les fibres de collagène natif sont des fibres de collagène natif de type I. Composition de collagène natif selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle les fibres de collagène ont une longueur comprise entre 100 µm et 10 mm. Composition de collagène natif selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle les fibres de collagène ont un diamètre compris entre 1 et 100 µm. Composition de collagène natif selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle les fibres de collagène peuvent être transformées en collagène natif soluble. Utilisation d’une composition de collagène natif selon l’invention afin de réaliser des matériaux biomédicaux, des compléments alimentaires, des produits cosmétiques, des matériaux bio-composites et/ou des éléments de papeterie.