Brevet FR3147690A1 — publié le 20241018

L’invention concerne une composition comprenant une source de carbonate de calcium, de l’amidon prégélatinisé et un microorganisme, un procédé pour la préparation d’une composition selon l’invention, comprenant une étape qui consiste à mélanger un microorganisme avec une source de carbonate de calcium et de l’amidon prégélatinisé, et l’utilisation d’un mélange d’amidon prégélatinisé et d’une source de carbonate de calcium pour protéger un microorganisme dans un environnement acide. Composition pour protéger un microorganisme dans un environnement acide. L’invention concerne une composition comprenant une source de carbonate de calcium, de l’amidon prégélatinisé et un microorganisme, un procédé pour la préparation d’une composition selon l’invention, comprenant une étape qui consiste à mélanger un microorganisme avec une source de carbonate de calcium et de l’amidon prégélatinisé, et l’utilisation d’un mélange d’amidon prégélatinisé et d’une source de carbonate de calcium pour protéger un microorganisme dans un environnement acide. Les microorganismes sont de plus en plus utilisés dans de nombreux domaines, notamment en santé humaine ou animale (domaine nutraceutique) et en santé végétale (domaine agricole). Dans le domaine nutraceutique, les microorganismes sont de plus en plus utilisés pour leurs intérêts probiotiques. Dans le domaine agricole, les sols sont des systèmes dynamiques qui contiennent une grande variété de microorganismes. Cependant de nombreux facteurs, comme les techniques agricoles utilisées ces dernières décennies, ainsi que les changements climatiques ont bouleversé l’ensemble des équilibres préexistants. Ainsi, l’utilisation de grandes quantités d'intrants chimiques, les travaux culturaux etc. ont provoqué une raréfaction, voire une élimination de certains microorganismes de la plupart des sols cultivés, ce qui contribue à une perte de productivité des sols. Pour exercer leurs effets bénéfiques, les microorganismes doivent rester fonctionnels jusqu’à leur site d’action, par exemple dans le tractus gastro-intestinal en santé animale ou humaine, ou dans le sol en santé végétale. Cependant, ces microorganismes sont fragiles car ils sont très sensibles aux stress environnementaux, notamment aux variations de pH. Dans le domaine nutraceutique, le compartiment gastrique, de par son pH très acide, est connu pour dégrader les microorganismes d’intérêt probiotique qui sont ingérés par l’Homme ou l’animal. De par l’acidification des sols, les microorganismes utilisés dans le domaine agricole sont également exposés aux mêmes types de stress que ceux rencontrés dans le domaine nutraceutique, ce qui empêche leur croissance, leur stabilité et/ou altère leurs effets. Le faible taux de survie des microorganismes après leur incorporation dans le sol constitue l’un des facteurs limitant majeurs de leur efficacité. Il existe donc un besoin de trouver de nouvelles stratégies pour protéger les microorganismes face aux pH acides. C’est dans ce contexte que le demandeur a mis en évidence, et ceci constitue le fondement de la présente invention, que l’utilisation d’un mélange d’amidon prégélatinisé et d’une source de carbonate de calcium permettait de protéger des microorganismes face à un stress acide. Ainsi, la présente invention, qui trouve application dans le domaine nutraceutique et dans le domaine de l’agriculture, vise à proposer une composition qui permet de protéger un microorganisme face à un stress acide. Selon un premier aspect, l’invention concerne une composition comprenant une source de carbonate de calcium, de l’amidon prégélatinisé et un microorganisme. Selon un second aspect, l’invention concerne un procédé de préparation d'une composition selon l’invention, comprenant une étape qui consiste à mélanger un microorganisme avec une source de carbonate de calcium et de l’amidon prégélatinisé. Selon un troisième aspect, l’invention concerne l’utilisation d’un mélange d’amidon prégélatinisé et d’une source de carbonate de calcium pour protéger un microorganisme dans un environnement acide. Description détaillée Définitions Les termes « amidon prégélatinisé » et « amidon précuit » sont utilisés indifféremment pour désigner tout amidon natif ayant subi un traitement thermique en présence d'eau, de sorte qu'il perde totalement sa structure granulaire et qu'il devienne soluble dans l'eau froide. Ainsi par amidon prégélatinisé ou amidon précuit, on entend au sens de l'invention un état dans lequel l'amidon n'est plus dans un état granulaire, c'est-à-dire dans un état où il n'est plus dans un état en granules semi-cristallins caractéristiques de l'état dans lequel il est naturellement présent dans les organes et tissus de réserve des végétaux supérieurs, en particulier dans les graines de céréales, les graines de légumineuses, les tubercules de pomme de terre ou de manioc, les racines, les bulbes, les tiges et les fruits. Cet état semi-cristallin est essentiellement dû aux macromolécules d'amylopectine, l'un des deux constituants principaux de l'amidon. A l'état natif, les grains d'amidon présentent un taux de cristallinité qui varie de 15 à 45%, et qui dépend essentiellement de l'origine botanique et du traitement éventuel qu'il a subi. L'amidon granulaire, placé sous lumière polarisée, présente en microscopie une croix noire caractéristique, dite « croix de Malte ». Ce phénomène de biréfringence positive est dû à l'organisation semi-cristalline de ces granules : l'orientation moyenne des chaînes de polymères est radiale. Pour une description plus détaillée de l'amidon granulaire, on pourra se référer au chapitre II intitulé « Structure et morphologie du grain d'amidon » de S. Perez, dans l'ouvrage « Initiation à la chimie et à la physico-chimie macromoléculaires », Première Edition, 2000, Volume 13, pages 41 à 86, Groupe Français d'Etudes et d'Applications des Polymères [1]. Selon la présente invention, l'amidon utilisé pour la préparation dudit amidon prégélatinisé est avantageusement un amidon natif, et n'a donc subi aucun traitement ou modification préalable. Alternativement, l'amidon utilisé pour la préparation dudit amidon prégélatinisé peut être un amidon modifié ayant subi un traitement ou une modification préalable, par exemple une modification chimique telle qu’une réticulation. L'état prégélatinisé de l'amidon s'obtient par cuisson d'amidon granulaire, par incorporation d'eau et par apport d'énergie thermique et mécanique. La déstructuration de l'état granulaire semi-cristallin de l'amidon conduit à des amidons prégélatinisés amorphes avec disparition de la croix de malte de polarisation. Dans la présente invention, l'amidon prégélatinisé peut présenter un taux de cristallinité inférieur à 15%, de préférence inférieur à 5% et plus préférentiellement encore inférieur à 1%, c'est-à-dire dans un état essentiellement amorphe. Ce taux de cristallinité peut en particulier être mesuré par diffraction aux rayons X, comme décrit dans le brevet US 5 362 777 (colonne 9, lignes 8 à 24). Selon un mode préférentiel de la présente invention, l'amidon prégélatinisé est avantageusement substantiellement dépourvu de grains d'amidon présentant, en microscopie sous lumière polarisée, une croix de malte, signe indicateur de la présence d'amidon granulaire semi-cristallin. Les amidons prégélatinisés selon la présente invention peuvent être obtenus par traitement hydrothermique de gélatinisation d'amidons natifs, en particulier par cuisson vapeur, cuisson jet-cooker, cuisson sur tambour, cuisson dans des systèmes de malaxeur/extrudeuse puis séchage, par exemple en étuve, par air chaud sur lit fluidisé, sur tambour rotatif, par atomisation, par extrusion ou par lyophilisation. De tels amidons présentent généralement une solubilité dans l'eau déminéralisée à 20°C supérieure à 5%, et plus généralement comprise entre 10 et 100%, et un taux de cristallinité en amidon inférieur à 15%, généralement inférieur à 5%, et le plus souvent inférieur à 1%, voire nul. A titre d'exemple, on peut citer les produits fabriqués et commercialisés par la société Roquette sous le nom de marque PREGEFLO ® . L'amidon sélectionné pour la préparation de l'amidon prégélatinisé natif peut être de toutes origines botaniques ne contenant pas de gluten ou dont la teneur en gluten ne dépasse pas 20mg/kg. Ainsi, les amidons dérivés de blé (ou froment ou épeautre), d'orge, de seigle ou de triticale (blé + seigle) sont généralement à bannir car ils contiennent du gluten ; à moins que leurs procédés de préparation n'aient permis d'éliminer totalement le gluten. Il existe en effet des amidons de blé garantis gluten free, obtenus par un procédé bien particulier. De manière préférentielle, on utilisera pour la préparation de l'amidon prégélatinisé natif une source botanique ne contenant pas de gluten à la base. Il peut s'agir par exemple d'amidon de céréales telles que le maïs, le millet, le sarrasin, l'avoine, le tapioca, le sorgo ou le riz, de tubercules tels que la pomme de terre ou le manioc, ou de légumineuses telles que le pois et le soja, les amidons riches en amylose ou, inversement riches en amylopectine (waxy), issus de ces plantes, et les mélanges quelconques des amidons précités. Le « carbonate de calcium » ou « CaCO 3 » est composé d'ions carbonate (CO 3 2- ) et d'ions calcium (Ca 2+ ). Le carbonate de calcium est le composé majeur des calcaires comme la craie, mais également le composé majeur du marbre. C'est aussi le constituant principal des coquilles d'animaux marins, du corail et des escargots, ainsi que des coquilles d'œufs des amniotes (à l'exception des mammifères thériens dont les œufs, internes, sont sans coquille). Dans le cadre de la présente invention, la source de carbonate de calcium est choisie parmi les calcaires (ex. la craie), les coquilles d’escargots, les coquilles d’œufs, les coquilles d’animaux marins, les coraux et les algues de l’ordre des Corallinales (ex. le lithothamne). Dans un mode de réalisation particulièrement préféré de la présente invention, la source de carbonate de calcium est le lithothamne. Le terme « lithothamne » (lithothamnium) désigne un genre d’algue rouge de la famille des Corallinaceae qui a la capacité de cristalliser les minéraux et les oligo-éléments contenus dans la mer. Cette algue pousse principalement dans l’océan Atlantique Nord, et particulièrement dans les fonds marins (jusqu’à 28 mètres) car les courants y sont moins importants. Le lithothamne comprend 25 espèces. Le lithothamne est connu pour sa richesse en carbonate de calcium. Le lithothamne est utilisé dans le domaine nutraceutique et dans le domaine de l'agriculture, mais aussi dans le domaine cosmétique, la médecine et le traitement de l'eau. Le terme « microorganismes » désigne des organismes microscopiques tels que les bactéries, les champignons microscopiques, par exemple les champignons microscopiques filamenteux, les levures. Le microorganisme peut être viable et/ou non viable. Par microorganisme « non viable » (ex. bactérie probiotique non-viable), on entend un microorganisme qui n'est pas capable de se multiplier dans aucune des conditions de croissance connues. Par microorganisme « viable » (ex. bactérie probiotique viable), on entend un microorganisme qui est capable de se multiplier dans des conditions appropriées dans lesquelles une multiplication de microorganisme est possible. Un microorganisme qui ne répond pas à la définition de « non viable » (comme indiqué ci-dessus) est considérée comme « viable ». Par ailleurs, une population de microorganismes dont seulement une partie (par exemple 10% ou moins) est encore capable de se multiplier dans des conditions de croissance appropriées, rentre dans le champ du terme « viable ». Dans le cadre de la présente invention, le microorganisme peut être un microorganisme d’intérêt probiotique ou un microorganisme d’intérêt agronomique. Un « microorganisme d’intérêt probiotique » (aussi désigné « probiotique » dans la présente description) désigne un microorganisme viable ou non-viable ayant un effet bénéfique sur la santé chez l’Homme ou l’animal. L’effet bénéfique peut être, par exemple, le maintien ou l’amélioration de l’équilibre du microbiote intestinal, la décomposition (ou à la fermentation) des aliments (ex. fibres alimentaires) non digérées dans la partie supérieure du tube digestif, la synthèse de vitamines, la prévention de la prolifération des bactéries pathogènes, le renforcement du système immunitaire, et/ou la prévention des infections gastro-intestinales causées par des bactéries résistantes aux antibiotiques. Différents microorganismes, tels que les levures, les bactéries et en particulier les bifidobactéries, les lactobacilles, les leuconostoques, les pédiocoques et les lactocoques peuvent avoir un intérêt probiotique. Dans l'alimentation humaine ou animale, les microorganismes d’intérêt probiotiques peuvent être proposés comme compléments alimentaires. Un « microorganisme d’intérêt agronomique » désigne un microorganisme vivant ayant un effet bénéfique sur une plante. L’effet bénéfique peut être, par exemple, l’apport de nutriments utiles à la croissance de la plante, par exemple la fixation de l’azote atmosphérique par le microorganisme. Différents microorganismes, tels que les bactéries, les levures et les champignons microscopiques, par exemple les champignons microscopiques filamenteux, peuvent avoir un intérêt agronomique. Dans le cadre de la présente invention, les micro-organismes peuvent être choisis parmi (i) les bactéries fixatrices de l’azote atmosphérique, telles que Azotobacter ou Azospirillum (ii) les rhizobactéries favorisant la croissance des plantes (PGPR ou Plant Growth Promoting Rhizobacteria), (iii) les bactéries solubilisatrices du phosphore telles que Bacillus amyloliquefaciens , (iv) les bactéries phytoprotectrices des racines (PGPR) capables de s’opposer à l’activité d’agents pathogènes telles que Bacillus subtilis ou Pseudomonas spp. , (v) les bactéries productrices de phytohormones telles que Bacillus amyloliquefaciens ou Bacillus radicola , (vi) les bactéries impliquées dans le processus de minéralisation de la matière organique telles que Lactobacillus rhamnosus ou Lactobacillus faciminis , (vii) les bactéries solubilisatrices de fer telles que Pseudomonas spp. , (viii) les bactéries solubilisatrices de la silice, (ix) les bactéries oxydatrices du soufre, (x) les bactéries lactiques telles que Lactobacillus spp., Lactococcus spp., Bifidobacterium spp ., (xi) les bactéries du genre Enterococcus spp ., (xii) les bactéries du genre Pediococcus spp ., (xiii) les bactéries du genre Bacillus licheniformis , (xiv) les champignons mycorhizes tel que Rhizophagus irregularis , (xv) les levures du genre Saccharomyces cerevisiae et (xvi) un mélange d’au moins deux micro-organismes choisis parmi (i) à (xv). Le terme « composition nutraceutique » désigne une composition destinée à l’alimentation humaine ou animale qui est capable d’améliorer l’état de bien-être, la performance et/ou la santé de l’Homme ou de l’animal. Le terme « composition d’intérêt agronomique » désigne une composition destinée à l’agriculture ayant un effet bénéfique sur une plante. Par l'expression « administration par voie orale » on entend désigner une administration par ingestion, via le tractus gastro-intestinal. On entend par « substance fertilisante » un engrais et/ou un amendement. Le terme « engrais » désigne des matières fertilisantes dont la fonction principale est d’apporter aux plantes des éléments directement utiles à leur nutrition (éléments fertilisants majeurs, éléments fertilisants secondaires et oligo-éléments). Le terme « amendement » désigne une substance destinée à améliorer la qualité des sols, et notamment destinée à améliorer le pH des sols. Avantageusement, l’amendement est choisi parmi les amendements minéraux basiques de type calcaire et/ou calcaires et magnésiens ; les amendements humifères de type composts ou les fumiers. L'activité de l'eau (symbole « a w » pour « activity of water ») représente la pression de vapeur d'eau p d'un produit humide divisée par la pression de vapeur saturante p0 à la même température. Ce paramètre traduit les interactions de l'eau avec la matrice d’une composition. Les microorganismes ont besoin d'eau libre (libre pour les réactions biochimiques) pour se développer. Plus l'activité de l'eau est élevée, plus la quantité d'eau libre est grande (1 étant le maximum) et plus les micro-organismes se développeront. On peut diminuer l’activité de l’eau par exemple par séchage ou en ajoutant un soluté qui va fixer l’eau et la rendre non utilisable par les microorganismes. La distribution granulométrique reflète la taille des particules contenues dans un échantillon. La valeur taille médiane (ou « Dv(50) ») indique que la moitié du volume de l’échantillon contient des particules de taille inférieure à cette valeur et l'autre moitié du volume de l’échantillon contient des particules de taille supérieure à cette valeur. De même, les valeurs Dv(10) et Dv(90) indiquent que respectivement 10% et 90% du volume de l’échantillon contient des particules de taille inférieure à cette valeur. La diffusion dynamique de la lumière (ou « Dynamic light scattering » en anglais, DLS) et la diffraction laser sont des techniques couramment utilisées pour mesurer la distribution granulométrique des particules contenues dans un échantillon. La DLS est particulièrement utilisée. La présente invention découle des avantages surprenants mis en évidence par l’inventeur de l’effet d’un mélange d’une source de carbonate de calcium et d’amidon prégélatinisé pour protéger un microorganisme dans un environnement acide. Composition Selon un premier aspect, l’invention concerne une composition comprenant une source de carbonate de calcium, de l’amidon prégélatinisé et un microorganisme. La demanderesse a montré que le microorganisme était particulièrement bien protégé au sein de la composition selon l’invention, notamment dans des environnements acides, tels que le suc gastrique ou les sols acides. L’activité de l’eau (a w ) de la composition selon l’invention est de préférence très basse, de telle sorte que la composition contient très peu d’eau libre, ce qui permet d’assurer une bonne conservation du microorganisme avant l’utilisation de la composition. Ainsi, l’activité de l’eau (a w ) de la composition selon l’invention est de préférence inférieure à 0,1, de préférence inférieure à 0,06. Une activité de l’eau (a w ) particulièrement préférée va de 0,005 à 0,1, par exemple de 0,01 à 0,1, par exemple de 0,02 à 0,06, par exemple d’environ 0,05. La source de carbonate de calcium permet d’augmenter le pH de l’environnement acide dans lequel il se trouve. La Demanderesse a montré que cette propriété préserve les microorganismes des effets négatifs de l’acidité sur leur structure et fonction. La source de carbonate de calcium peut être choisie parmi les calcaires (ex. la craie), les coquilles d’escargots, les coquilles d’œufs, les coquilles d’animaux marins, les coraux et les algues de l’ordre des Corallinales (ex. le lithothamne). Une source de carbonate de calcium particulièrement préférée est le lithothamne. Le lithothamne est vendu sous différentes formes dans le commerce, par exemple sous forme de poudre. Le lithothamne le plus utilisés dans l’industrie, et donc préféré dans le cadre de la présente invention, est Lithothamnium calcareum et/ou Lithothamnium corallioides . Le lithothamne sous forme de poudre est particulièrement adapté pour une composition nutraceutique. Un lithothamne sous forme de poudre particulièrement adapté pour la mise en œuvre de la présente invention est vendu sous la référence Algalithe ® par la société Setalg (produit fabriqué à partir de Lithothamnium calcareum ). Le lithothamne peut par exemple être obtenu par séchage puis broyage de lithothamne récolté vivant dans la mer, ou il peut être obtenu par séchage puis broyage de lithothamne mort collecté sur les plages à marée basse ou dans des renfoncements proches des côtes. Etant donné que le lithothamne se calcifie au fil du temps et vient former des bancs sédimentaires, ces algues fossilisées sont charriées par les marées et s’accumulent dans les renfoncements proches des côtes. Elles sont notamment récoltées dans ces renfoncements sur des parcelles bien définies afin de respecter le renouvellement de l’écosystème. Le lithothamne est sous une forme adaptée à l’application envisagée de la composition selon l’invention. De préférence sous forme de poudre ou de granulés. Selon un mode de réalisation, le lithothamne mis en œuvre dans la présente invention est obtenu par séchage puis broyage de lithothamne récolté vivant dans la mer. Selon un autre mode de réalisation, le lithothamne mis en œuvre dans la présente invention est obtenu par séchage puis broyage de lithothamne mort collecté sur les plages à marée basse ou dans des renfoncements proche des côtes. La source de carbonate de calcium peut se présenter sous différentes formes, par exemple sous forme de poudre ou sous forme de granulés. Le choix de la forme va notamment dépendre de l’usage envisagé de la composition. Lorsque la source de carbonate de calcium se présente sous forme de poudre, elle a une distribution granulométrique : - Dv(90) qui va de 29 µm à 750 µm, par exemple de 50 µm à 500 µm, par exemple de 50 µm à 300 µm, par exemple de 75 µm à 250 µm, de préférence de 90 µm à 200 µm ; et/ou - une Dv(50) allant de 7 µm à 500 µm, par exemple de 7 µm à 250 µm, par exemple de 7 µm à 150 µm, par exemple de 10 µm à 100 µm, par exemple de 10 µm à 50 µm, par exemple de 10 µm à 30 µm, de préférence de 15 µm à 25 µm ; et/ou - une Dv(10) allant de 1 µm à 270 µm, par exemple de 1 µm à 100 µm, par exemple de 1 µm à 50 µm, par exemple de 1 µm à 25 µm, par exemple de 1 µm à 10 µm, de préférence de 1 µm à 5 µm. La quantité de la source de carbonate de calcium dans la composition de l’invention peut aller de 10% à 95% en masse par rapport à la masse totale de la composition, de préférence de 25% à 85%, de préférence de 30% à 80%, de préférence de 40% à 65%, de préférence de 50% à 65%. La quantité de la source de carbonate de calcium dans la composition peut varier, par exemple, en fonction de l’usage envisagé de la composition ou de la nature de la source de carbonate de calcium. L’amidon prégélatinisé a la propriété de former un gel à pH acide. La Demanderesse a mis en évidence qu’il permettait d’amplifier l’effet protecteur observé sur les microorganismes lorsqu’il est associé avec le carbonate de calcium. L’amidon prégélatinisé est de préférence préparé à partir d’une source végétale contenant de l’amidon, de préférence choisi parmi un amidon prégélatinisé de maïs, un amidon prégélatinisé de pois, un amidon prégélatinisé de pomme de terre, un amidon prégélatinisé de tapioca, un amidon prégélatinisé de riz, un amidon prégélatinisé de manioc. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, la composition selon l’invention contient un amidon prégélatinisé de maïs ou un amidon prégélatinisé de pomme de terre. L’amidon prégélatinisé peut se présenter sous différentes formes, par exemple sous forme de poudre ou sous forme de granulés. Le choix de la forme va notamment dépendre de l’usage envisagé de la composition. Lorsque la source d’amidon prégélétinisé se présente sous forme de poudre, elle a une distribution granulométrique : - Dv(90) qui va de 90 µm à 1300 µm, par exemple allant de 90 µm à 500 µm, par exemple allant de 90 µm à 250 µm, de préférence allant de 90 µm à 150 µm ; et/ou - une Dv(50) allant de 40 µm à 500 µm, par exemple allant de 40 µm à 250 µm, par exemple allant de 40 µm à 100 µm, de préférence allant de 40 µm à 60 µm ; et/ou - une Dv(10) allant de 10 µm à 150 µm, par exemple allant de 10 µm à 100 µm, par exemple allant de 10 µm à 50 µm, de préférence allant de 10 µm à 20 µm . La quantité d’amidon prégélatinisé dans la composition de l’invention peut aller de 10% à 90% en masse par rapport à la masse totale de la composition, de préférence de 10% à 70%, de préférence de 25% à 50%. La quantité d’amidon prégélatinisé dans la composition peut également varier, par exemple, en fonction de l’usage envisagé de la composition ou de la nature de l’amidon prégélatinisé. Dans un mode de réalisation préféré de la composition selon l’invention, le rapport [masse de la source de carbonate de calcium] : [masse d’amidon prégélatinisé] va de 0,4 à 5,7, par exemple de 0,4 à 3, par exemple de 0,5 à 2, par exemple de 0,8 à 1,9, de préférence égal à 1 +/- 0,1. Le microorganisme est choisi en fonction de l’usage envisagé de la composition selon l’invention. Ainsi, le microorganisme peut par exemple être un microorganisme d’intérêt probiotique ou un microorganisme d’intérêt agronomique. Pour une composition nutraceutique selon l’invention, le microorganisme est de préférence un microorganisme d’intérêt probiotique, par exemple une bactérie probiotique. Les bactéries probiotiques visées dans la présente invention peuvent être l'une quelconque des bactéries probiotiques connues et disponibles auprès de sources commerciales et/ou publiques, telles que la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), l’American Tissue Culture Collection (ATCC), la Belgian Coordinated Collections of Microorganisms/Laboratorium voor Microbiologie Universiteit Gent (BCCM/LMG) ou autres. En particulier, les bactéries probiotiques convenant à l'invention peuvent être choisies dans le groupe comprenant les bactéries probiotiques de type ferments lactiques, choisies parmi les bactéries des genres Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp . et leurs mélanges. A titre d’exemple non limitatif de bactéries du genre Lactobacillus spp., on peut notamment citer : Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus . A titre d’exemple non limitatif de bactéries du genre Bifidobacterium spp ., on peut notamment citer : Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium thermophilum . Selon un mode de réalisation, une bactérie probiotique convenant à l'invention est choisie parmi Lactobacillus rhamnosus, Bifidobacterium animalis subsp. lactis , et leurs combinaisons. A titre d'exemple, on peut utiliser une ou plusieurs des souches probiotiques suivantes : - Lactobacillus rhamnosus HN001™ commercialisée par la société Dupont ; - Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 ® commercialisée par la société Chr. Hansen ; - Lactobacillus plantarum (LMG P-21021) commercialisé sous la dénomination LP01 par la société Probiotical ® S.p.A., située en Italie; déposée en 2001 à BCCM/LMG (Belgian Coordinated Collections of Microorganisms/Laboratorium voor Microbiologie Universiteit Gent) ; – Lactobacillus gasseri (LMG 26661) commercialisée sous la dénomination THT 031301 par la société THT s.a. située en Belgique) et déposée en 2011 à BCCM/LMG; - Lactobacillus gasseri SGL09 commercialisée par la société Nutraceutica ® S.r.l. située en Italie. D'autres bactéries probiotiques pouvant convenir sont également disponibles, comme celles décrites dans EP1945235B1 et WO2009014421A1. Il convient de rappeler que les espèces Lactobacillus rhamnosus et Bifidobacterium animalis subsp. lactis sont naturellement présentes dans l’appareil digestif de l’Homme et des animaux. Les bactéries probiotiques mises en œuvre dans le cadre de la présente invention peuvent être produites en utilisant n'importe quel procédé de fermentation standard connu dans l’art antérieur. Elles peuvent être sous forme lyophilisées, présentées sous forme de poudre notamment. Les bactéries probiotiques mises en œuvre dans le cadre de la présente invention peuvent être viables ou non viables. L'utilisation de bactéries probiotiques viables offre l'avantage que ces bactéries peuvent faire partie du microbiote intestinal, offrant ainsi des avantages supplémentaires pour la santé. La viabilité des bactéries probiotiques présentes dans la composition de l’invention peut être évaluée par toute technique de numération (ou dénombrement) bactérienne classique connue de l’Homme du métier, par exemple par la méthode des Unités Formant Colonies (UFC) après dilutions décimales et étalement sur boites de Pétri. La quantité de microorganismes doit être suffisance pour avoir l’effet désiré, ce qui dépend de l’usage envisagé de la composition selon l’invention. De préférence, la quantité de microorganismes va de 10 3 à 10 13 cellules/g de composition (ou UFC pour « Unité Formant Colonie, lorsque le microorganisme est viable), de préférence de 10 5 à 10 12 cellules/g de composition, par exemple de 10 5 à 10 11 cellules/g de composition. La quantité de microorganismes dans la composition peut varier, par exemple, en fonction de l’usage envisagé de la composition ou de la nature du microorganisme. La composition selon l’invention peut être encapsulées dans un ou plusieurs matériaux d’encapsulation appropriés, ce qui permet notamment de protéger le microorganisme par exemple vis-à-vis de l’oxygène et de l’humidité et de faciliter la manipulation de la composition selon la présente l’invention et d’assurer la conservation du microorganisme dans la composition selon l’invention lors de son stockage. A titre d’exemples non limitatifs de matériaux d’encapsulation appropriés, on peut citer les acides gras et les cires, les monoglycérides d'acides gras saturés, les diglycérides d'acides gras saturés, les polyglycérols estérifiés avec des acides gras saturés, les acides gras saturés libres, le dipalmitostéarate de glycéryle, les complexes à base de beepolle et d’argile, ou autres (voir par exemple les demande de brevets WO 01/68808 (LALLEMAND S.A.), WO2013114185A1 (Probiotical S.P.A.), et WO 2013/153117 (Laboratoire BEEPRATTE)). Les matériaux d’encapsulation appropriés peuvent être gastrorésistants afin de protéger le microorganisme des fluides gastriques durant son trajet gastro-intestinal (résistance à l'acidité gastrique par exemple) pour une meilleure activité au niveau de l’intestin ou le côlon de l’hôte. Comme expliqué précédemment, la composition selon l’invention peut être utilisée des domaines différents, tel que l’alimentation humaine ou animale, on parlera alors de composition nutraceutique, ou en agriculture, on parlera alors de composition d’intérêt agronomique. La personne du métier n’aura aucune difficulté à adapter la composition à l’usage envisagé. Par exemple, la composition selon l’invention peut se présenter sous forme de poudre ou sous forme de granulés. La présentation sous forme de poudre est particulièrement adaptée pour une composition nutraceutique étant donné que cette dernière doit être adaptée à une administration par voie orale. Néanmoins, il est tout à fait possible d’avoir une composition nutraceutique qui se présente sous forme de granulés adaptés à une administration par voie orale, notamment en alimentation animale. Une composition sous forme de granulés est particulièrement adaptée pour une composition d’intérêt agronomique car cette forme facilite l’épandage sur de grandes surfaces de sol. Néanmoins, il est tout à fait possible d’avoir une composition d’intérêt agronomique qui se présente sous forme de poudre, notamment lorsque la composition ne nécessite pas d’être appliquée sur de grandes surfaces de sol. De la même manière, le microorganisme sera choisi en fonction de l’usage envisagé. Par exemple, une composition nutraceutique contiendra un ou plusieurs microorganisme(s) d’intérêt probiotique et une composition d’intérêt agronomique contiendra un ou plusieurs microorganisme(s) d’intérêt agronomique. Lorsque la composition est une composition nutraceutique, elle peut également comprendre, outre le microorganisme, le carbonate de calcium et l’amidon prégélatinisé, un ou plusieurs ingrédients actifs supplémentaires. Bien entendu, l'Homme du métier veillera à choisir ce ou ces éventuels ingrédients actifs supplémentaires, et/ou leur quantité, de manière telle que les propriétés avantageuses de la composition selon l'invention ne soient pas, ou substantiellement pas, altérées. Préférentiellement, le ou les ingrédients actifs supplémentaires sont choisis parmi les extraits secs de plantes et/ou de fruits, les vitamines, les acides aminés, les sels minéraux, les oligoéléments et leurs mélanges. Une composition nutraceutique selon l’invention peut également comprendre des excipients appropriés tel que la gélatine, l’amidon modifié, les gommes végétales, les maltodextrines, les alginates, le dextran, la poudre de lait, le stéarate de magnésium, ou autre. Le stéarate de magnésium a la propriété d’améliorer l’écoulement de la composition, ce qui permet par exemple de faciliter la préparation de gélules qui comprennent la composition selon l’invention. Dans un mode de réalisation particulier, la composition nutraceutique consiste essentiellement en une source de carbonate de calcium, de l’amidon prégélatinisé et un microorganisme. Lorsque la composition est une composition d’intérêt agronomique, elle peut également comprendre, outre le microorganisme, le carbonate de calcium et l’amidon prégélatinisé, un ou plusieurs composés supplémentaires. Bien entendu, l'Homme du métier veillera à choisir ce ou ces éventuels composés supplémentaires, et/ou leur quantité, de manière telle que les propriétés avantageuses de la composition selon l'invention ne soient pas, ou substantiellement pas, altérées. Préférentiellement, le ou les composés supplémentaires sont choisis parmi les substances fertilisantes, tels que les engrais ou les amendements. L’engrais peut être une ou plusieurs substances actives choisie parmi l’azote, le phosphore, le potassium, l'urée, le sulfate d'ammonium, le nitrate d’ammonium, le phosphate, le chlorure de potassium, du sulfate d'ammonium, le nitrate de magnésium, le nitrate de manganèse, le nitrate de zinc, le nitrate de cuivre, l'acide phosphorique, le nitrate de potassium, l'acide borique et leurs mélanges, de préférence un mélange d’azote, de potassium et de phosphore ou un mélange de phosphore et de potassium. L’amendement peut être une ou plusieurs substances actives choisie parmi les amendements minéraux basiques de type calcaire, les amendements minéraux basiques de type magnésien, les amendements humifères de type composts et/ou les amendements humifères de type fumiers. Procédé et utilisation Selon un second objet, l’invention concerne un procédé de préparation d'une composition selon l’invention, comprenant une étape qui consiste à mélanger un microorganisme avec une source de carbonate de calcium et de l’amidon prégélatinisé. La préparation d’une composition selon l’invention est réalisée selon les méthodes classiques décrites dans la littérature. La personne du métier n’aura aucune difficulté à procéder au mélange, par exemple en mélangeant des poudres et/ou des granulés. Selon un troisième objet, l’invention concerne l’utilisation d’un mélange d’amidon prégélatinisé et d’une source de carbonate de calcium pour protéger un microorganisme dans un environnement acide. La demanderesse s’est en effet aperçu qu’un mélange d’amidon prégélatinisé et d’une source de carbonate de calcium permettait de protéger un microorganisme dans un milieu acide, tel que la partie supérieure du tractus gastro-intestinal ou un sol acide. Dans le cadre de la présente invention, l’expression « protéger un microorganisme dans un environnement acide » correspond à une amélioration du taux de survie du microorganisme dans un environnement acide et/ou à une amélioration de l’intégrité de la membrane cellulaire du microorganisme dans un environnement acide. Ainsi, la présente invention concerne également l’utilisation d’un mélange d’amidon prégélatinisé et d’une source de carbonate de calcium pour améliorer le taux de survie du microorganisme dans un environnement acide et/ou pour améliorer l’intégrité de la membrane cellulaire d’un microorganisme dans un environnement acide. La demanderesse s’est en effet aperçu que le taux de survie des microorganismes et/ou l’intégrité de la membrane cellulaire des microorganismes dans un environnement acide étaient sensiblement améliorés lorsque lesdits microorganismes étaient mélangés avec de l’amidon prégélatinisé et une source de carbonate de calcium, par rapport à des microorganismes non-mélangés avec de l’amidon prégélatinisé et une source de carbonate de calcium. L’intégrité de la membrane cellulaire des microorganismes peut être facilement mesurée par des techniques bien décrites dans la littérature, par exemple la cytométrie en flux. On peut par exemple utiliser deux marqueurs en cytométrie en flux, le Syto ® 24 et l’iodure de propidium, qui sont plus ou moins perméables en fonction de l’état membranaire des cellules (voir la méthode décrite dans les Exemples). Le taux de survie des microorganismes est généralement mesuré en déterminant le taux de survie UFC (voir la méthode décrite dans les Exemples). Les caractéristiques détaillées dans la partie « composition » de la présente description, notamment en ce qui concerne l’amidon prégélatinisé, la source de carbonate de calcium et le microorganisme, s’appliquent au procédé et à l’utilisation selon la présente invention. Des modes de réalisation particuliers de la présente invention sont illustrés dans les exemples ci-après. Description des figures : Schéma qui détaille le Modèle Gastro-Duodéno-Iléal (MGDI) utilisé dans les exemples. : Taux de survie des UFC de la souche L. rhamnosus HN001™ en fin de MGDI avec l’utilisation d’amidon natif, de lithothamne ou de carbonate de calcium terrestre, seuls et en mélanges : Taux de survie des UFC de la souche L. rhamnosus HN001™ en fin de MGDI avec l’utilisation d’amidon de maïs prégélatinisé, de lithothamne ou de carbonate de calcium terrestre, seuls et en mélanges. : Schéma de la cytométrie en flux (CMF) mise en œuvre dans les exemples. : Répartition des populations cellulaires de la souche L. rhamnosus HN001™ en fonction de leur état membranaire, en amont et aval du MGDI, en fonction des excipients / mélanges d’excipients utilisés. : Taux de survie des UFC de la souche L. rhamnosus HN001™ en fin de MGDI avec l’utilisation d’amidon prégélatinisé et de lithothamne, seuls et en mélanges à différents ratios. : Taux de survie des UFC de la souche L. rhamnosus HN001™ en fin de MGDI avec l’utilisation de mélanges 50/50 d’amidons prégélatinisés de différentes origines végétales et de lithothamne. ] : Taux de survie des UFC de la souche B. animalis subsp. lactis BB-12 ® en fin de MGDI avec l’utilisation d’amidon de maïs prégélatinisé seul ou en mélange 50/50 avec du lithothamne. : Gain du taux de survie UFC mesuré pour les souches L. rhamnosus HN001™ et B. animalis subsp. lactis BB-12 ® avec un mélange 50/50 lithothamne/amidon de maïs prégélatinisé en comparaison avec l’amidon de maïs prégélatinisé seul. Exemples Exemple 1 : Préparation des formulations testées Les formulations testées ont été préparées en mélangeant la source de carbonate de calcium et l’amidon prégélatinisé, puis mélangé au microorganisme. Le mélange a ensuite été placé dans des gélules HPMC de taille 0 à l’aide d’un gélulier. Les compositions des formulations préparées sont détaillées dans le Tableau 1. Référence de la formulation Microorganisme Source de carbonate de calcium Amidon HN001 – 100 % amidon de maïs natif 1 gramme de Lactobacillus rhamnosus HN001™ à 5,0.10 11 UFC/g - 24 g d’amidon de maïs natif (amidon de maïs à 5 % d’humidité résiduelle (Roquette) HN001 – 50 % amidon de maïs natif / 50 % lithothamne 1 gramme de Lactobacillus rhamnosus HN001™ à 5,0.10 11 UFC/g 12 g de lithothamne (Algalithe ® Dv(90) 12 g d’amidon de maïs natif (amidon de maïs à 5 % d’humidité résiduelle (Roquette) HN001 – 100 % amidon de maïs prégélatinisé 1,1 gramme de Lactobacillus rhamnosus HN001™ à 4,5.10 11 UFC/g - 23,9 g d’amidon de maïs prégélatinisé (Prégéflo ® M) HN001 – 50 % amidon de maïs prégélatinisé / 50 % lithothamne 1,1 gramme de Lactobacillus rhamnosus HN001™ à 4,5.10 11 UFC/g 11,95 g de lithothamne (Algalithe ® Dv(90) 11,95 g d’amidon de maïs prégélatinisé (Prégéflo ® M) HN001 – 100 % lithothamne 1,1 gramme de Lactobacillus rhamnosus HN001™ à 4,5.10 11 UFC/g 23,9 g de lithothamne (Algalithe ® Dv(90) - HN001 – 100 % carbonate de calcium terrestre 1 gramme de Lactobacillus rhamnosus HN001™ à 5,0.10 11 UFC/g 24 g de carbonate de calcium terrestre - HN001 – 50 % amidon de maïs natif / 50 % carbonate de calcium terrestre 1 gramme de Lactobacillus rhamnosus HN001™ à 5,0.10 11 UFC/g 12 g de carbonate de calcium terrestre 12 g d’amidon de maïs natif HN001 – 50 % amidon de maïs prégélatinisé / 50 % carbonate de calcium terrestre 1 gramme de Lactobacillus rhamnosus HN001™ à 5,0.10 11 UFC/g 12 g de carbonate de calcium terrestre 12 g d’amidon de maïs prégélatinisé (Prégéflo ® M) HN001 – 70 % amidon de maïs prégélatinisé / 30 % lithothamne 1,1 gramme de Lactobacillus rhamnosus HN001™ à 4,5.10 11 UFC/g 7,2 g de lithothamne (Algalithe ® Dv(90) 16,7 g d’amidon de maïs prégélatinisé (Prégéflo ® M) HN001 – 35 % amidon de maïs prégélatinisé / 65 % lithothamne 1,1 gramme de Lactobacillus rhamnosus HN001™ à 4,5.10 11 UFC/g 15,5 g de lithothamne (Algalithe ® Dv(90) 8,4 g d’amidon de maïs prégélatinisé (Prégéflo ® M) HN001 – 15 % amidon de maïs prégélatinisé / 85 % lithothamne 1,1 gramme de Lactobacillus rhamnosus HN001™ à 4,5.10 11 UFC/g 20,3 g de lithothamne (Algalithe ® Dv(90) 3,6 g d’amidon de maïs prégélatinisé (Prégéflo ® M) HN001 – 50 % amidon de pomme de terre prégélatinisé / 50 % lithothamne 1 gramme de Lactobacillus rhamnosus HN001™ à 5,0.10 11 UFC/g 12 g de lithothamne (Algalithe ® Dv(90) 12 g d’amidon de pomme de terre prégélatinisé (Prégéflo ® P100G) HN001 – 50 % amidon de pois prégélatinisé / 50 % lithothamne 1 gramme de Lactobacillus rhamnosus HN001™ à 5,0.10 11 UFC/g 12 g de lithothamne (Algalithe ® Dv(90) 12 g d’amidon de pois prégélatinisé (Prégéflo ® L100G) Bb12 – 100 % lithothamne 3 grammes de Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 ® à 1,5.10 11 UFC/g 12 g de lithothamne (Algalithe ® Dv(90) - Bb12 – 100 % amidon de maïs prégélatinisé 3 grammes de Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 ® à 1,5.10 11 UFC/g - 12 g d’amidon de maïs prégélatinisé (Prégéflo ® M) Bb12 – 50 % amidon de maïs prégélatinisé / 50 % lithothamne 3 grammes de Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 ® à 1,5.10 11 UFC/g 6 g de lithothamne (Algalithe ® Dv(90) 6 g d’amidon de maïs prégélatinisé (Prégéflo ® M) Exemple 2 : Modèle Gastro-Duodéno-Iléal (MGDI) Le Modèle Gastro-Duodéno-Iléal (MGDI) est un modèle statique de digestion humaine in vitro . Il mime certaines conditions de la partie supérieure du tractus digestif humain (pH, enzymes…). Le modèle MGDI simule le passage dans 3 compartiments successifs : - Le premier compartiment (qui simule l’estomac) est composé d’un tampon Citrate / Phosphate de sodium pH 3,0 additionné d’une solution électrolytique et de pepsine à 0,003 % (p/p). - Le deuxième compartiment (qui simule le compartiment duodénal) est réalisé par ajout dans le premier compartiment d’une solution de Di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate (HNa 2 O 4 P, 2H 2 O) permettant d’atteindre un pH de 6,5, de bile à 0,3 % (p/p) et de trypsine à 0,007 % (p/p). - Le troisième compartiment (qui simule le compartiment iléal) est réalisé par ajout dans le deuxième compartiment d’une solution de Di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate (HNa 2 O 4 P, 2H 2 O) permettant d’atteindre un pH de 7,0. Le modèle MGDI permet d’évaluer la capacité des compositions testées à protéger les microorganismes dans un environnement acide. Le MGDI est détaillé dans la référence [2] et schématisé à la . 3.1 Préparation des mélanges et conditionnement en gélules HPMC (HydroxyPropylMethylCellulose) Les mélanges source de carbonate de calcium /Amidon / microorganisme ont été préparés à une concentration cible comprise entre 2.10 10 UFC/g et 3.10 10 UFC/g puis conditionnés en gélules HPMC selon le protocole détaillé à Exemple 1. 3.2 Réalisation des essais MGDI Mise en œuvre du modèle Tous les essais ont été réalisés au minimum en triplicat. En début et fin de chacun des 3 compartiments du MGDI, les pH ont été mesurés et des observations visuelles ont été réalisées. 4 mL d’eau ont été ajoutés dans un pot stérile contenant la gélule et son support en spirale (permettant d’assurer une bonne immersion de la gélule dans le modèle). Le contenu du pot a ensuite immédiatement été versé dans le premier compartiment gastrique (flacon). Le flacon a été mis à incuber 30min à 37°C sous agitation orbitale. Le passage dans le deuxième compartiment a été réalisé par ajout dans le flacon d’une solution de Di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate (HNa 2 O 4 P, 2H 2 O) permettant d’atteindre un pH de 6,5, de bile à 0,3 % (p/p) et de trypsine à 0,007 % (p/p). Le flacon a été mis à incuber 30min à 37°C sous agitation orbitale. Le passage dans le compartiment iléal a été réalisé par ajout d’une solution de Di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate (HNa 2 O 4 P, 2H 2 O) permettant d’atteindre un pH de 7,0. Le flacon a été mis à incuber 60min à 37°C sous agitation orbitale. En fin de modèle, le contenu du compartiment a été versé dans un sac à Stomacher, et la gélule a été libérée de son support en spirale et dissoute manuellement (si encore présente). Après homogénéisation au Stomacher, des dilutions en cascade au 1/10 ème ont été effectuées dans de l’eau peptonée. Mesure des viabilités (UFC) Des mesures de viabilité ont été réalisées en amont et aval du modèle MGDI par ensemencement dans la masse avec une gélose MRS additionnée de cystéine, à partir de plusieurs dilutions (minimum de 3 géloses / dilution). Les boites de Pétri ont ensuite été incubées à 37°C en anaérobiose pendant au moins 48h. Ces mesures de viabilité ont permis de mesurer le taux de survie UFC du microorganisme pour chacune des formulations testées selon la formule suivante : Taux de survie UFC (%) = (Nombre d’UFC après MGDI / Nombre d’UFC avant MGDI) x 100. Les résultats sont présentés à la Figure 2. Les résultats obtenus avec l’amidon de maïs natif ( ) indiquent que les taux de survie obtenus avec les différentes sources de carbonate de calcium utilisées seules sont supérieurs à ceux mesurés pour les mélanges amidon de maïs natif / source de carbonate de calcium, ne montrant ainsi aucun effet synergique. En revanche, les résultats obtenus avec l’amidon de maïs prégélatinisé ( ) indiquent que les taux de survie obtenus pour les mélanges amidon de maïs prégélatinisé / source de carbonate de calcium sont supérieurs à ceux mesurés pour chacun des ingrédients utilisés séparément, signifiant ainsi l’existence d’un effet synergique pour la survie bactérienne. Mesure de l’intégrité membranaire par cytométrie en flux Des analyses de cytométrie en flux (CMF) ont été réalisées en amont et aval du modèle MGDI selon le protocole B issu de la norme ISO 19344 IDF 232 v2015, utilisant les marqueurs d’intégrité membranaire Syto ® 24 et iodure de propidium. La CMF est une technique de caractérisation individuelle, quantitative et qualitative de particules en suspension dans un liquide. Les cellules passent une à une au travers d’une source lumineuse. La lumière diffusée et émise est mesurée par un éventail de détecteurs. Les mesures obtenues sont traitées informatiquement pour générer un ensemble de données à paramètres multiples. La CMF est schématisée à la . La mesure de l’intégrité membranaire est basée sur le principe suivant : - Le Syto ® 24 pénètre au travers des membranes de toutes les cellules et émet une fluorescence verte lors de sa fixation sur les acides nucléiques, - L’iodure de propidium pénètre seulement dans les bactéries possédant des membranes endommagées et émet une fluorescence rouge lors de sa fixation sur les acides nucléiques. Ainsi, la dualité entre ces 2 marqueurs permet de distinguer 3 populations cellulaires en fonction de leur état membranaire : - Les bactéries ayant des membranes cellulaires intactes émettent une fluorescence verte (cellules intactes = CI). - Les bactéries ayant des petits dommages membranaires montrent à la fois une fluorescence verte et une fluorescence rouge (cellules endommagées = CE). - Les bactéries ayant des membranes fortement endommagées émettent une fluorescence rouge plus intense (cellules mortes = CM). Ces mesures de cytométrie permettent donc de qualifier et quantifier l’évolution de ces populations en amont et aval du modèle. La mesure de l’intégrité membranaire a été réalisée parallèlement à la mesure de viabilité en milieu gélosé, décrite précédemment. La dilution contenant une concentration d’environ 10 7 cellules/mL a été utilisée pour la réalisation du marquage. 50 µL de cette dilution ont été prélevés et placés dans un microtube contenant 440 µL d’eau peptonée additionnée de Tween 80, auxquels ont été additionnés 5 µL de Syto ® 24 à 0,1 mM et 5 µL d’iodure de propidium à 0,2 mM. Après avoir été vortexé au moins 5 secondes, ce mélange a été mis à incuber 15 minutes à 37°C à l’obscurité. Puis le mélange réactionnel a été de nouveau vortexé et immédiatement analysé à l’aide d’un cytomètre en flux. Ces mesures de cytométrie ont permis de mesurer le taux de survie CI du microorganisme pour chacune des formulations testées selon la formule suivante : Taux de survie CI (%) = (Nombre de CI après MGDI / Nombre de CI avant MGDI) x 100. Les résultats sont présentés à la . Les résultats obtenus en amont du modèle montrent que, pour chacune des galéniques testées, entre 82 et 90 % des cellules sont considérées comme intactes. Après passage dans le modèle de digestion in vitro , cette population de cellules intactes chute à une moyenne de 5, 16 et 25 % pour l’amidon de maïs natif, l’amidon de maïs prégélatinisé et le lithothamne, respectivement. L’utilisation du mélange amidon de maïs natif / lithothamne ne permet pas une amélioration de l’intégrité cellulaire, puisqu’en fin de modèle le taux de cellules intactes est de 22 % en moyenne. En revanche, l’utilisation du mélange amidon de maïs prégélatinisé / lithothamne permet de préserver 37 % des cellules intactes en fin de modèle. L’effet synergique observé pour les UFC à la Figure 2 est donc également visible pour l’intégrité cellulaire avec l’utilisation d’un mélange d’une source d’amidon prégélatinisé et de carbonate de calcium. Les résultats obtenus avec différents ratios lithothamne / amidon de maïs prégélatinisé sont présentés à la . Les résultats obtenus indiquent que l’effet protecteur du mélange amidon de maïs prégélatinisé et lithothamne est visible pour les 4 ratios testés, avec une légère diminution pour le ratio 85 % lithothamne / 15 % amidon de maïs prégélatinisé. Nous pouvons noter que les écart-types sont plus importants lorsque le lithothamne est utilisé seul ou avec une teneur élevée dans le mélange. Cela pourrait être dû à la variation plus importante du pH dans le milieu lorsque le gel est absent (lithothamne seul) ou moins stable (85 % lithothamne / 15 % amidon de maïs prégélatinisé). Les résultats obtenus avec différentes sources d’amidon prégélatinisé sont présentés à la . Les résultats obtenus indiquent que les taux de survie mesurés avec des mélanges 50/50 lithothamne / amidon prégélatinisé de pomme de terre et 50/50 lithothamne / amidon prégélatinisé de pois donnent des taux de survie supérieurs à ceux déjà obtenus avec un mélange 50/50 lithothamne / amidon prégélatinisé de maïs, confirmant la protection offerte par une association lithothamne/amidon prégélatinisé pour la survie de microorganismes en milieu acide. Les résultats obtenus avec différents groupes bactériens sont présentés à la Figure 7. Les résultats obtenus indiquent une amélioration significative du taux de survie des UFC de la souche B. animalis subsp. lactis BB-12 ® avec l’utilisation du mélange 50/50 lithothamne / amidon prégélatinisé de maïs en comparaison avec l’utilisation d’amidon prégélatinisé de maïs seul ( ). Le gain en taux de survie pour chacune des 2 souches ( L. rhamnosus HN001™ et B. animalis subsp. lactis BB-12 ® ) peut être calculé de la façon suivante, afin de mieux visualiser l’effet protecteur de l’association source de carbonate de calcium / amidon prégélatinisé : Gain taux de survie (%) = ((Taux de survie mélange – taux de survie amidon prégélatinisé seul) / taux de survie amidon prégélatinisé seul) x 100 Les résultats ( ) indiquent une amélioration de la survie substantielle des UFC de ces 2 bactéries appartenant à 2 groupes bactériens différents (Firmicutes et Actinobactéries). L’amélioration de la survie de la souche B. animalis subsp. lactis BB-12 ® est d’autant plus importante que cette souche est connue pour sa forte sensibilité aux pH acides, en comparaison à la souche L. rhamnosus HN001™ qui est plus robuste envers ce paramètre (7 % + / - 1% et 16 % + / - 1% avec 100% d’amidon de maïs prégélatinisé, respectivement) . Utilisation d’un mélange d’amidon prégélatinisé et d’une source de carbonate de calcium pour protéger un microorganisme dans un environnement acide, caractérisée en ce que l’environnement acide est un sol acide. Utilisation selon la revendication 1, dans laquelle la source de carbonate de calcium est choisie parmi les calcaires, les coquilles d’escargots, les coquilles d’œufs, les coquilles d’animaux marins, les coraux et les algues de l’ordre des Corallinales , de préférence la source de carbonate de calcium est le lithothamne. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 ou 2, dans laquelle la source de carbonate de calcium a une distribution granulométrique Dv(90) allant de 29 µm à 750 µm et/ou une Dv(50) allant de 7 µm à 500 µm et/ou une Dv(10) allant de 1 µm à 270 µm. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle l’amidon prégélatinisé est préparé à partir d’une source végétale contenant de l’amidon, de préférence choisi parmi un amidon prégélatinisé de maïs, un amidon prégélatinisé de pois, un amidon prégélatinisé de pomme de terre, un amidon prégélatinisé de tapioca, un amidon prégélatinisé de riz, un amidon prégélatinisé de manioc, de préférence un amidon prégélatinisé de maïs ou amidon prégélatinisé de pomme de terre. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle l’amidon prégélatinisé a une distribution granulométrique Dv(90) allant de 90 µm à 1300 µm et/ou une Dv(50) allant de 40 µm à 500 µm et/ou une Dv(10) allant de 10 µm à 150 µm. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle le rapport [masse de la source de carbonate de calcium] : [masse d’amidon prégélatinisé] va de 0,4 à 5,7, de préférence de 0,8 à 1,9. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle le microorganisme est une bactérie, un champignon ou une levure. Mélange d’amidon prégélatinisé et d’une source de carbonate de calcium pour son utilisation pour protéger un microorganisme dans un environnement acide chez l’Homme ou l’animal, caractérisé en ce que l’environnement acide est la partie supérieure du tractus gastro-intestinal. Mélange pour son utilisation selon la revendication 8, dans lequel la source de carbonate de calcium est choisie parmi les calcaires, les coquilles d’escargots, les coquilles d’œufs, les coquilles d’animaux marins, les coraux et les algues de l’ordre des Corallinales , de préférence la source de carbonate de calcium est le lithothamne. Mélange pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 8 ou 9, dans laquelle la source de carbonate de calcium a une distribution granulométrique Dv(90) allant de 29 µm à 750 µm et/ou une Dv(50) allant de 7 µm à 500 µm et/ou une Dv(10) allant de 1 µm à 270 µm. Mélange pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 8 à 10, dans laquelle l’amidon prégélatinisé est préparé à partir d’une source végétale contenant de l’amidon, de préférence choisi parmi un amidon prégélatinisé de maïs, un amidon prégélatinisé de pois, un amidon prégélatinisé de pomme de terre, un amidon prégélatinisé de tapioca, un amidon prégélatinisé de riz, un amidon prégélatinisé de manioc, de préférence un amidon prégélatinisé de maïs ou amidon prégélatinisé de pomme de terre. Mélange pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 8 à 11, dans laquelle l’amidon prégélatinisé a une distribution granulométrique Dv(90) allant de 90 µm à 1300 µm et/ou une Dv(50) allant de 40 µm à 500 µm et/ou une Dv(10) allant de 10 µm à 150 µm. Mélange pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 8 à 12, dans laquelle le rapport [masse de la source de carbonate de calcium] : [masse d’amidon prégélatinisé] va de 0,4 à 5,7, de préférence de 0,8 à 1,9. Mélange pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 8 à 13, dans laquelle le microorganisme est un microorganisme d’intérêt probiotique. Mélange pour utilisation selon l’une quelconque des revendications 8 à 14, dans laquelle le microorganisme est une bactérie, un champignon ou une levure. Mélange pour utilisation selon l’une quelconque des revendications 8 à 15, dans laquelle le microorganisme est une bactérie probiotique choisie parmi les bactéries des genres Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp . et leurs mélanges.