Brevet FR3150713A1 — publié le 20250110

L’invention concerne une composition pour une utilisation anthelmintique par voie orale, procédé de préparation et utilisation d’une telle composition Composition pour une utilisation anthelmintique par voie orale, procédé de préparation et utilisation d’une telle composition Domaine de l’invention Le domaine de l’invention est celui des traitements antiparasitaires, notamment contre les nématodes gastro-intestinaux. Plus précisément, l’invention concerne une composition à usage pharmaceutique, vétérinaire ou alimentaire pour une utilisation anthelmintique par voie orale et un procédé de préparation d’une telle composition. Art antérieur Les nématodes gastro-intestinaux sont une préoccupation majeure pour la santé humaine et animale dans le monde entier. Chez le bétail, ces parasites affectent la santé des animaux en provoquant inappétence, diarrhée, anémie et, dans les cas graves, la mort. Le parasitisme nuit également à la productivité et entraîne des pertes économiques importantes dans la production animale. En l'absence de stratégies alternatives efficaces, la lutte contre les nématodes parasites affectant la santé humaine ou animale repose essentiellement sur l'utilisation d'anthelminthiques chimiques. Cependant, leur utilisation intensive et parfois inappropriée a conduit au développement de résistances aux anthelminthiques. Par conséquent, il est urgent de trouver des solutions alternatives pour un contrôle durable des helminthes. Afin de prévenir l'émergence d'une résistance aux médicaments anthelminthiques, un nombre croissant d'études se concentrent désormais sur des composés d'origine naturelle susceptibles de contrôler des populations de nématodes gastro-intestinaux. Pour lutter contre les infections parasitaires, il est connu d’utiliser du thymol, du carvacrol, du gamma-terpinène ou des huiles essentielles de terpinénol. Objectifs de l’invention L’invention a notamment pour objectif de fournir un traitement anthelmintique qui soit efficace à la fois contre les parasites nématodoïdes des sous-ordres Rhabditina et/ou Spirurina, sensibles ou résistants aux anthelminthiques connus en médecine vétérinaire ou humaine, et qui préserve d’autre part la santé de l’hôte infecté et l’environnement et en particuleir plus efficace que le thymol ou le carvacrol. Un autre objectif de l’invention est de fournir une telle technique qui soit simple à mettre en œuvre et peu couteuse. La présente invention a pour objet une composition pour une utilisation anthelmintique par voie orale, ladite composition comprenant de l’éléganolone et/ou un diterpène linéaire de type bifurcanol. Les inventeurs ont en effet découvert que l’éléganolone et/ou le bifurcanol ou un diterpène linéaire de type bifurcanol seul ou associés ensemble s’avèrent avoir une efficacité élevée contre des organismes zooparasitaires de type nématodoïdes Dans un mode de réalisation préféré de l’invention, ledit éléganolone ou ledit diterpène de type bifurcanol est présent au sein d’un extrait de Bifurcaria bifurcata incorporé dans ladite composition. Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, ledit extrait de Bifurcaria bifurcata est un extrait aqueux de Bifurcaria bifurcata, un extrait obtenu par extraction de composés de Bifurcaria bifurcata dans un solvant ou un extrait obtenu par extraction de composés de Bifurcaria bifurcata dans une huile. Selon un aspect de l’invention, ladite composition est efficace contre des organismes zooparasitaires de type nématodoïdes du sous-ordre Rhabditina et/ou Spirurina et en particulier des organismes de l’ordre des Ascarididae ou des Trichostrongylidae et encore plus particulièrement contre les organismes des espèces Haemonchus contortus , Ascaridia suum , Parascaris equorum et Ascaridia galli . L’invention concerne également un procédé de préparation d’un anthelmintique destiné à être administré par voie orale comprenant : - préparer une composition comprenant de l’éléganolone et/ou un diterpène linéaire de type bifurcanol - encapsuler ladite composition dans des particules de levure ou l’incorporer dans une matrice d’amidon gélatinisé. Liste des figures D’autres caractéristiques et avantages de l’invention apparaitront plus clairement à la lecture de la description suivante de modes de réalisation de l’invention, donnés à titre de simples exemples illustratifs et non limitatifs, et des figures annexées parmi lesquels : est une comparaison de l'efficacité de différents extraits de Bifurcaria bifurcata provenant de France (congelée) et du Portugal (séchée) pour inhiber le développement des larves d’ Heligmosomoïdes bakeri . Des contrôles, avec de l’eau et avec du DMSO à 1%, ont été réalisés. Les extraits aqueux, les différents extraits organiques (heptane, EtOAc et BuOH) et la fraction aqueuse résiduelle ont été testés à 1 g/L. Les extraits sont issus soit du lot d’algues congelées et récoltées en France (en août 2019), soit du lot d’algues séchées et récoltées au Portugal (en juillet 2020). Les résultats proviennent d'au moins trois expériences indépendantes, avec n=6 par échantillon à chaque fois. Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide d'un test de Kruskal-Wallis avec test de comparaison multiple, avec ***p est une comparaison de l'efficacité entre différents extraits de Bifurcaria bifurcata provenant du Portugal avec deux procédés de conservation différents (séchage ou congélation) sur l’inhibition du développement des larves d’ Heligmosomoïdes bakeri. Un contrôle avec de l’eau a été réalisé. Les extraits aqueux et les différents extraits au butanol (BuOH) ont été testés à 1 g/L. Les extraits sont issus d’un lot d’algue qui a été récoltée en novembre 2021 au Portugal. Ces algues ont été soit séchées (vert) soit congelées (violet) avant l’extraction. Les résultats proviennent d'au moins deux expériences indépendantes, avec n=6 par échantillon à chaque fois. Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide d'un test de Kruskal-Wallis avec test de comparaison multiple, avec ***p présente l’activité d’extraits EtOAc issus de biomasse de Bifurcaria bifurcata provenant de lots différents sur le développement des larves d’ Heligmosomoides bakeri. Les fractions organiques EtOAc ont été réalisées directement sur la biomasse d’algue provenant de lots de B. bifurcata différents. Trois d’entre eux proviennent d’algues récoltées en France à différentes périodes (mars 2022 en marron, juin 2021 en turquoise et août 2019 en bleu) et congelées avant extraction. Deux autres proviennent d’algues récoltées au Portugal en novembre 2021 et soit séchées (vert), soit congelées (violet) avant extraction. Le pourcentage d’inhibition du développement des larves d’ H. bakeri , du stade L1/L2 au stade L3, est observé en présence d’eau (contrôle négatif) et de ces différents extraits EtOAc à 0,5 g/L. sont des spectres RMN 1H (a) et 13C (b) de la fraction heptane de Bifurcaria bifurcata. Deux molécules ont pu être identifiées grâce aux spectres RMN obtenus pour les atomes d’hydrogène (1H, correspond au profil a) et les atomes de carbone (13C, correspond au profil b) que sont l’éléganolone et le bifurcanol, deux diterpènes linéaires. Les positions des atomes d’hydrogène et de carbone sont numérotées (en orange pour l’éléganolone et en vert pour le bifurcanol), ainsi que les pics correspondant sur les spectres RMN obtenus. illustre l’effet pharmacologique de Bifurcaria bifurcata sur le récepteur à l’acétylcholine sensible à la nicotine d’ Ascaris suum. Etude de l’effet pharmacologique d’un extrait aqueux de B. bifurcata en tant qu’agoniste (a,c) ou en tant qu’antagoniste (b,d) sur le récepteur nicotinique formé de la sous-unité ACR-16 d’ A. suum dans le système d’expression en œuf de Xenopus laevis . (a,b) Représentation des courants enregistrés grâce à la technique Two-Electrode Voltage -Clamp suite à l’application de 100 µM d’acétylcholine, de 1 g/L et 5 g/L d’extrait aqueux de B. bifurcata seule ou en co-application avec l’ACh. Les temps d’applications des produits sont indiqués par les barres horizontales (noir pour ACh et vert pour B. bifurcata ). (c,d) Box-plots représentant les courants induits par l’application de 100 µM d’ACh, d’1 g/L ou 5 g/L de l’extrait aqueux de B. bifurcata seul ou en co-application avec 100 µM d’ACh. Les courants sont normalisés avec l’amplitude de courant obtenue à la première application de 100 µM d’ACh. présente les résultats d’une étude de l’effet antagoniste des différents extraits organiques de Bifurcaria bifurcata sur le N-AChR d’ Ascaris suum Box-plots représentant les amplitudes de courants normalisées suite à une co-application d’extraits organiques de B. bifurcata à 0,01 g/L avec 100 µM d’ACh sur le récepteur ACR-16 d’ Ascaris suum. Les extraits organiques utilisés sont les suivants : Bif AE correspond à un extrait à l’acétate d’éthyle obtenu après une extraction à l’heptane, Bif AEP correspond à une extraction à l’acétate d’éthyle comme premier solvant et Bif H correspond à une extraction à l’heptane comme premier solvant . Les courants sont normalisés par rapport au courant induit par la première application d’ACh (100 µM). illustre l’Effet pharmacologique de Bifurcaria bifurcata sur le récepteur sensible à la nicotinique (N-AChR) et le récepteur sensible au Morantel (M-AChR) de Parascaris equorum. Etude de l’effet agoniste et antagoniste d’un extrait de B. bifurcata sur les récepteurs à l’acétylcholine de P. equorum , le N-AChR constitué de la sous-unité ACR-16 (a) et le M-AChR constitué des sous-unités ACR-26 et ACR-27 (b) Box-plots représentant les amplitudes de courants normalisées suite à l’application d’un extrait aqueux de B. bifurcata à 1 g/L et à 5 g/L ou d’une co-application de B. bifurcata à 1 g/L et à 5 g/L avec 100 µM d’ACh. Les courants sont normalisés par rapport au courant induit par la première application d’ACh (100 µM) Description détaillée de l’invention Activité différentielle des fractions organiques Extractions organiques réalisées à partir des extraits aqueux Après avoir identifié une variabilité de l’efficacité de ces différents lots, nous nous sommes intéressés à deux lots très distincts afin de comparer le profil d’activité de plusieurs fractions organiques. Cela dans le but d’apporter des informations complémentaires sur le type de molécules impliquées dans l’activité biologique. Pour cela nous avons sélectionné les lots d’algues collectées en France et congelées ainsi que les algues collectées au Portugal et séchées, pour lesquels les extraits aqueux présentaient une différence d’activité. Le lieu de récolte et le procédé de conservation sont différents. Néanmoins, ces algues ont toutes deux été récoltées en été (juillet pour les algues portugaises et août pour les françaises). Trois extractions organiques ont donc été réalisées à partir des extraits aqueux de façon successive, à l’heptane, puis à l’acétate d’éthyle (EtOAc) et enfin au butanol (BuOH). La fraction aqueuse résiduelle a elle aussi été récupérée et testée. Ces différents extraits ont été testés via un TDL en première intention ( ). Un contrôle négatif avec de l’eau a été réalisé, ainsi qu’un contrôle avec du DMSO à 1% correspondant à la concentration en DMSO des extraits organiques. Ces deux conditions contrôles n’ont pas montré d’inhibition du développement larvaire. Tous les extraits sont testés à 1 g/L. Pour les algues françaises et portugaises, les résultats ont montré que malgré la différence d’activité observée entre les extraits aqueux, les fractions heptane et EtOAc inhibent totalement le développement des larves. De manière surprenante, alors que l'extrait BuOH de l'algue française présente une efficacité élevée (99% d’inhibition du développement larvaire), son homologue portugaise n'a induit qu'une inhibition de 13%, posant ainsi les bases d'une explication potentielle de la différence d’activité entre les extraits aqueux. Il est important de noter que les fractions aqueuses résiduelles n'ont pas montré d'activité résiduelle, indiquant que les molécules actives sont complètement extraites par les solvants organiques. L'activité anthelminthique des fractions organiques a ensuite été étudiée plus en détail à l'aide du test de mortalité des larves après éclosion ( Tableau 1 ). Les extraits organiques ont été testés à différentes concentrations. Alors que les extraits BuOH et les fractions aqueuses résiduelles ont montré un faible impact sur la mortalité des larves, même à 3 g/L, les extraits EtOAc ont été efficaces à 1 g/L et les extraits heptane ont eu une activité totale à 0,5 g/L. Ces résultats indiquent que les molécules actives sont majoritairement présentes dans les extraits heptane et EtOAc. Il est intéressant de souligner qu'aucune différence significative n'a été observée entre les activités des extraits organiques des algues françaises et portugaises. En revanche, contrairement aux résultats du TDL, une faible activité de la fraction BuOH des algues françaises a été observée sur la mortalité des larves. Ces résultats suggèrent que les molécules impliquées dans l'inhibition du développement larvaire pourraient être différentes de celles impliquées dans la mortalité des larves. [Table 1] Comparaison de l'activité nématicide de différents extraits de Bifurcaria bifurcata de France (congelée) et du Portugal (séchée) sur des larves fraîchement écloses d’ Heligmosomoïdes bakeri Les résultats proviennent de trois expériences indépendantes, avec n=6 par échantillon à chaque fois. Les valeurs représentent la moyenne de la mortalité (%) ± l'écart type. nd : non déterminé Pour approfondir les derniers résultats obtenus, et afin de déterminer quel facteur entre le lieu de récolte ou le procédé de conservation de l’algue impacte le plus l’activité biologique in vitro, nous avons travaillé sur deux lots d’algues récoltées en même temps au Portugal (novembre) mais avec des pré-traitements différents (séchage ou congélation). Un TDL a été réalisé sur les extraits aqueux de ces deux lots à 1g/L ainsi que sur les fractions BuOH à 1 g/L qui correspondent aux fractions organiques où un écart d’activité avait été observé précédemment ( ). Les résultats obtenus montrent une forte différence d’activité entre ces deux extraits, que ce soit pour les extraits aqueux ou les extraits BuOH. En effet, l’extrait issus d’algues portugaises congelées présente une forte inhibition du développement larvaire (88% pour l’extrait aqueux et 85% pour la fraction BuOH) contrairement au lot d’algues séchées ( Extractions organiques réalisées à partir de la biomasse d’algue Après avoir obtenu ces premiers résultats à partir de fractions organiques issues d’extraits aqueux, nous avons voulu réaliser des extractions organiques directement sur les biomasses d’algues. Ce procédé permet entre autres de concentrer les composés actifs dans les fractions organiques sans passer par une première étape d’extraction aqueuse. Ces extractions ont été réalisées par la Dr. Maria Matard-Mann et Karel Davalle-Corre (Olmix). Les lots concernés sont ceux d’algues récoltées en France et congelées (en août 2019 et en mars et juin 2021) ainsi que les lots d’algues portugaises récoltées en 2021 (séchées et congelées). Les résultats présentés ici ne concernent que la fraction EtOAc testée via un TDL à 0,5 g/L ( ). Les résultats obtenus avec le TDL démontrent qu’il n’y a pas de différence d’activité entre les lots étudiés et que tous inhibent totalement le développement des larves à la concentration de 0,5 g/L. Ces résultats démontrent ici qu’une extraction effectuée directement à partir de la biomasse d’algue permet une meilleure extraction des composés actifs qui sont très présents dans cette fraction EtOAc, et ce indépendamment des lots d’algues pourtant très variés. Exploration des modes d’action impliqués Caractérisation des molécules actives Afin de caractériser les molécules actives dans les fractions organiques de B. bifurcata , les différents échantillons ont été envoyés à une plateforme spécialisée en RMN (Résonnance Magnétique Nucléaire) de l’Université de Bretagne Occidentale (UBO). A cause de problèmes concernant la solubilisation des extraits, seule la fraction heptane a pu être analysée à l’heure actuelle. L’analyse des spectres RMN (1H et 13C) a permis d’identifier deux molécules différentes présentes dans cet extrait : l’éléganolone et le bifurcanol ( ). Ces deux composés sont des diterpènes linéaires déjà décrits dans la littérature. Le rapport indique : « l es analyses des extraits d’algues fournis ont permis de mettre en évidence la présence d’un composé majoritaire qui correspondrait à un diterpène linéaire, l’ éléganolone . Une structure partielle d’un autre composé significativement présent a également été établie et a conduit à la présence hypothétique d’un autre diterpène linéaire, le bifurcanol (ou de type bifurcanol ). La principale difficulté dans l’identification de ces composés réside dans le fait que l’on ait à faire à un mélange. Afin de confirmer l’identité des composés proposés, principalement dans le cas du bifurcanol , il serait nécessaire de réaliser des fractionnements simples et rapides à mettre en œuvre permettant de les isoler et de déterminer leur structure sans ambiguïté. Cela permettrait également d’avoir accès aux structures d’autres composés, minoritaires, dont la présence a été relevée dans les extraits. » Exploration des modes d’actions par électrophysiologie en œufs de xénope Suite à l’identification de diterpènes dans un extrait de B. bifurcata ¸ nous nous sommes intéressés à la mécanistique et au mode d’action qui pouvaient être impliqués dans les activités biologiques observées. Il a été montré dans la littérature que certains terpènes ont pour cible des récepteurs cholinergique. En s’appuyant sur ces travaux nous avons recherché quels pourraient-être les effets d’extraits de B. bifurcata sur différents récepteurs connus pour être la cible d’anthelminthiques chez deux espèces de nématodes gastro-intestinaux que sont A . suum , un parasite du porc et P . equorum , un parasite du cheval. Ces récepteurs sont des hétéro- ou homopentamères, donc composés de 5 sous-unités différentes ou identiques. Plusieurs familles de récepteurs ont donc été choisies, parmi elles des récepteurs cholinergiques sensibles à la nicotine, composés de la sous-unité ACR-16 d’ A. suum ou de P. equorum , et un récepteur cholinergique sensible au Morantel composé des sous-unités ACR-26 et ACR-27 de P. equorum . Ces récepteurs ont été exprimés à la surface d’œufs de Xenopus laevis et des mesures d’électrophysiologie ont été réalisées afin de déterminer le potentiel effet agoniste ou antagoniste d’extraits aqueux et organiques de B. bifurcata appliqués sur ces récepteurs. Récepteur cholinergique N-AChR d’Ascaris suum Le premier récepteur étudié est un récepteur cholinergique du parasite A. suum composé de 5 sous-unités ACR-16 formant un récepteur sensible à la nicotine. Il a été exprimé à la surface d’œufs de xénope et des courants ont été mesurés grâce à la méthode Two-Electrode Voltage-Clamp afin de déterminer la réponse du récepteur suite à l’application du ligand naturel (100 µM d’ACh) ou suite à l’application d’extraits aqueux de B. bifurcata (à 1 g/L et 5 g/L) seuls ou en co-application avec l’ACh ( ). Dans un premier temps, deux applications successives d’ACh à 100µM sont réalisées afin de contrôler la réplicabilité de l’effet du ligand naturel sur le récepteur. Les résultats observés ici démontrent que le récepteur est correctement exprimé à la surface des œufs de xénope et que l’effet est stable car les amplitudes de courant sont comparables. L’application de l’extrait aqueux de B. bifurcata seul démontre qu’il n’y a pas d’effet agoniste direct sur le récepteur N-AChR d’ Ascaris suum . En effet aucune amplitude de courant n’est observée suite à l’application de 5 g/L ou de 1 g/L d’extrait. A contrario, lorsque l’extrait de B. bifurcata est appliqué en même temps que 100 µM d’ACh, on observe une diminution de l’amplitude de courant normalement obtenu avec l’ACh seule. En effet, lors de la co-application de l’ACh avec 5 g/L de B. bifurcata , le courant obtenu est diminué d’environ 90% comparé à l’ACh seule, et avec 1 g/L de B. bifurcata , le courant est diminué d’environ 50%. Ces résultats démontrent un effet antagoniste dose-dépendant de l’extrait aqueux de B. bifurcata . Il est important de noter ici, qu’après les différentes applications des extraits d’intérêts les récepteurs récupèrent correctement car les amplitudes de courants obtenues avec la troisième application d’ACh sont comparables à celle de la première application d’ACh. Pour compléter les premiers résultats obtenus, des fractions organiques de B. bifurcata ont également été testées sur le récepteur N-AChR d’ Ascaris suum ( ) . Les premières applications d’ACh seule démontrent une stabilité des amplitudes de courant obtenues entre les deux applications. Les fractions testées proviennent d’extraits obtenus avec le solvant heptane (Bif H) en premier puis de façon successive avec le solvant acétate d’éthyle (Bif AE). La troisième fraction a été obtenue en utilisant l’EtOAc directement sans extraction au préalable à l’heptane (Bif AEP). Les extraits ont été testés à 0,01 g/L en co-application avec 100 µM d’ACh. Les résultats obtenus démontrent qu’avec la co-application de l’extrait Bif AE et de l’ACh, une légère diminution du courant est observée (environ 10%) par rapport à l’ACh seule. L’extrait Bif AEP présente une diminution d’environ 25% du courant obtenu par rapport à l’ACh seule. Ce résultat met en évidence une meilleure efficacité de la fraction extraite à l’EtOAc directement et non pas après une première extraction à l’heptane. Enfin la fraction heptane en co-application induit un effet antagoniste plus fort que les fractions acétate d’éthyle en induisant une diminution d’environ 75% du courant par rapport à l’ACh seule. Une récupération totale des récepteurs est observée avec la dernière application d’ACh seule. Les résultats obtenus démontrent que les fractions organiques sont nettement plus efficaces que les fractions aqueuses pour induire un effet antagoniste sur ces récepteurs cholinergiques, surtout concernant la fraction heptane. Récepteurs cholinergiques N-AChR et M-AChR de Parascaris equorum Les seconds récepteurs étudiés sont des récepteurs cholinergiques de P. equorum , l’un sensible à la nicotine (N-AChR) et composé de la sous-unité ACR-16, l’autre sensible au Morantel (M-AChR) et composé des sous-unités ACR-26 et ACR-27. Ces récepteurs ont également été exprimés à la surface d’œufs de Xénope et les courants ont été mesurés grâce à la méthode Two-Electrode Voltage-Clamp afin de déterminer la réponse du récepteur suite à l’application du ligand naturel (100 µM d’ACh) ou suite à l’application d’extraits aqueux de B. bifurcata (à 1 g/L et 5 g/L) seuls ou en co-application avec l’ACh ( ). Les résultats obtenus sur ces deux récepteurs sont très semblables. Ils indiquent que l’application des extraits aqueux de B. bifurcata n’ont pas d’effet agoniste direct. Un léger effet est tout de même observé pour l’extrait à 5 g/L sur le récepteur Peq-M-AChR avec une intensité de courant d’environ 10% par rapport à l’intensité de courant obtenue avec le ligand naturel. Concernant les effets antagonistes observés, lors de la co-application de 100 µM d’ACh et 5 g/L de B. bifurcata , une diminution de l’intensité de courant d’environ 40% est observée sur les deux récepteurs Peq-N-AChR et Peq-M-AChR. Pour la concentration de B. bifurcata à 1g/L en co-application avec l’AChR, une diminution d’environ 10% est observée pour les deux récepteurs. Ces résultats démontrent qu’il y a également un effet antagoniste dose-dépendant de l’extrait aqueux de B. bifurcata sur les récepteurs de P. equorum . Les résultats observés dans un premier temps sur un récepteur cholinergique du parasite A. suum , sont confirmés ici sur une autre espèce de parasite d’animaux d’importance vétérinaire. Résultats et discussion Dans le cadre de cette étude, nous nous sommes intéressés au potentiel anthelmintique des macroalgues. Le criblage d’un panel de macroalgues Le choix des macroalgues étudiées a été déterminé en fonction de plusieurs critères. Nous souhaitions cribler des espèces au sein des trois grandes familles (rouge, brune et verte) en se basant sur des données bibliographiques indiquant des activités biologiques, en favorisant les espèces ayant une activité antiparasitaire. Cependant, aucune des espèces sélectionnées n’avait été décrite comme ayant une activité anthelminthique sur les parasites GI et les activités antiparasitaires mentionnées concernaient essentiellement les parasites protozoaires. Les algues étudiées (pour le criblage) ont été récoltées à Roscoff en Bretagne (France). La potentielle exploitation industrielle des espèces étudiées a également été prise en compte en privilégiant les espèces qui ont une distribution assez importante pour être exploitées à grande échelle ou bien pour lesquelles la culture est envisageable. Le criblage de l’activité anthelmintique de ces algues a été réalisé à partir de deux types d’extraits aqueux : un extrait dit « à froid » (extraction à température ambiante) et un « à chaud » (extraction à 60°C). Le choix de travailler en première intention sur des extraits aqueux s’est fait pour des raisons économiques et des raisons de simplicité. Nous avons émis l’hypothèse que si un extrait aqueux démontre une activité anthelmintique, cela signifie que les molécules actives sont présentes en grande quantité et accessibles. L’efficacité d’un extrait à chaud permet de statuer sur la stabilité des molécules actives, voire même, dans le cas où l’activité biologique serait meilleure, d’améliorer l’extraction de certaines molécules. Les différents extraits ont donc été testés via un TDL, qui est un test de référence en parasitologie. Le modèle d’étude principalement utilisé durant ces travaux de thèse est le parasite murin H. bakeri . Cette espèce de parasite est étroitement liée d’un point de vue phylogénétique à d'autres trichostrongles digestifs d'importance vétérinaire, tels que H . contortus ou Teladorsagia circumcicta . De ce fait, elle est couramment utilisée pour le criblage de molécules anthelminthiques dans l'industrie pharmaceutique. Les résultats obtenus démontrent que parmi les 12 algues testées, 3 algues brunes et l’extrait « à chaud » d’une algue rouge induisent une inhibition totale du développement larvaire à 5g/L et l’effet observé est dose-dépendant. De façon générale dans la littérature, les algues décrites comme ayant des propriétés anthelmintiques sont des algues brunes et rouges. Les algues rouges Digenea simplex et Chondria armata sont les plus connues avec leurs composés actifs que sont l’acide kaïnique et l’acide domoïque, respectivement. Ces résultats ont également pu illustrer que les extraits chauffés présentent toujours une activité biologique, démontrant alors que les composés actifs ne sont pas affectés par des températures allant jusqu’à 60°C. Les résultats obtenus suite au criblage sur le parasite murin H. bakeri laissent donc supposer une importante stabilité des composés anthelmintiques présents dans les algues les plus efficaces. Les résultats obtenus avec l’extrait d’algue rouge indiquent également que la phase de chauffage lors de l’extraction peut permettre une meilleure extraction des molécules actives, comme cela a été observé durant l’expérimentation de criblage des extraits en TDL où l’extrait à chaud est plus efficace que l’extrait à froid (100% d’inhibition du développement contre 83%). Les espèces d’algues les plus efficaces in vitro D’après les résultats obtenus via le TDL, trois espèces d’algues brunes sont particulièrement efficaces pour inhiber le développement des larves. Ces algues sont P. canaliculata , B. bifurcata et S. muticum . Si ces algues ont la capacité d’inhiber le développement des larves avec des IC50 du même ordre de grandeur, elles présentent cependant un profil d’activité in vitro variable. En effet, S . muticum ne présente pas d’activité autre que l’inhibition du développement des larves, tandis que B. bifurcata est capable d’agir sur différents stades du parasite. Enfin, P. canaliculata agit également sur les stades adultes comme B. bifurcata mais de façon totalement différente en inhibant la ponte des œufs par les femelles mais sans impacter la survie des vers. Ces résultats indiquent que ces trois espèces d’algues brunes possèdent sans doute des composés actifs qui leur sont propres et n’agissent pas sur les mêmes cibles. Ces résultats sont intéressants et pourraient être exploités dans de futures expérimentations en testant un « cocktail » composé d’extraits de ces trois algues ensemble. De plus des tests peuvent être réalisés afin de mettre en évidence le potentiel effet synergique entre les extraits d’algues et les anthelmintiques de référence. Seul un lieu d’approvisionnement de l’algue B. bifurcata a été identifié et exploité (via QuintaQuanta au Portugal). Afin de caractériser également les algues S. muticum et P. canaliculata , et dans une optique d’exploitation industrielle, il faudrait également identifier une source pour avoir accès à ces deux espèces en grande quantité. Concernant S. muticum , la sargasse japonaise, sa grande biodisponibilité en fait une excellente candidate dans le cadre d’une exploitation industrielle et permettrait alors de valoriser une espèce considérée comme invasive sur les côtes des îles britanniques, en Europe continentale et en Amérique du Nord. L’algue P. canaliculata , quant à elle, est très utilisée dans le secteur de la cosmétique et plusieurs produits commercialisés en contiennent. Même si elle n’est pas considérée comme espèce invasive, la biodisponibilité de cette algue ne semble pas être un frein à une exploitation industrielle. En quoi Bifurcaria bifurcata est la meilleure candidate pour le contrôle des parasites d’animaux ? Différents phénotypes d’activité in vitro Parmi les douze espèces d’algues testées sur le parasite murin H. bakeri , B. bifurcata est certainement l’une des plus intéressantes. Outre le fait qu’elle soit une très bonne candidate pour inhiber le développement des larves (avec la meilleure IC50 à 0,7 g/L), elle présente également un effet sur l’éclosion des œufs (28 % d’inhibition à 5 g/L) et une activité nématicide directe sur les larves après éclosion (67 % d’efficacité à 5 g/L) et sur les vers adultes (70 % d’efficacité jusqu’à 0,5 g/L en 6 jours). Il peut être intéressant de comparer ces résultats avec des activités anthelmintiques observées à partir d’extraits de plantes terrestres. Par exemple, concernant l’inhibition du développement larvaire, l’extrait aqueux de B. bifurcata présente une IC50 d’environ 0,7 g/L. Cette activité est supérieure à ce qui a été précédemment rapporté avec plusieurs extraits aqueux issus d’espèces de plantes dont Glycyrrhiza glabra , Fumaria parviflora , Urtica dioica et Myrtus communis sur les parasites GI des petits ruminants. En ce qui concerne l'activité larvicide, qui est d'environ 67 % à 5 g/L, elle est comparable à ce qui a été rapporté lorsque des extraits de plantes ont été évalués comme anthelminthiques . Enfin, l'activité nématicide observée sur les vers adultes est plus importante que ce qui est présenté dans la littérature. En effet, une mortalité de 100 % des adultes de H. bakeri en 24 h a été observée avec un extrait aqueux de B. bifurcata à 5 g/L, alors que par exemple, sur H . contortus , Eguale et al. ont noté un taux de mortalité de seulement 29 % en 24 h avec un extrait végétal aqueux à 8 g/L et Lone et al. ont utilisé des concentrations beaucoup plus élevées (25 g/L et 50 g/L) pour observer un effet sur la mortalité des adultes en moins de 24 h. Les résultats obtenus à partir d’extraits aqueux de B. bifurcata indiquent une très bonne activité anthelmintique de l’algue et ce sur de multiples stades de développement du parasite murin. Cependant, de telles comparaisons doivent être prises avec précaution car nous ne pouvons pas exclure que malgré leur étroite relation phylogénétique, H. bakeri et H. contortus puissent également présenter une sensibilité différente aux composés naturels. C’est pourquoi nous avons également testé l’extrait de B. bifurcata sur d’autres espèces de parasites . Transposition à d’autres espèces d’importance vétérinaire et contrôle de la résistance Nous avons travaillé également sur des parasites de mouton H. contortus issus d’une souche sensible aux anthelmintiques (Weybridge) et d’une souche multi-résistante (Kokstad). L’extrait aqueux de B. bifurcata a donc également été testé sur ces deux souches de parasites et une activité nématicide sur les adultes et sur les larves d’ H. contortus a été observée. Ces résultats sont d’autant plus intéressants du fait que cette activité est observée sur la souche sensible, mais également et de façon encore plus efficace, sur la souche multi-résistante. Ces observations sont d’une importance majeure dans le contexte actuel de résistance des parasites GI aux anthelmintiques. En effet, depuis que les premiers cas de résistance ont été identifiés au début des années 1960, les phénomènes de résistance sont devenus récurrents à travers le monde. Désormais il n’est plus rare de trouver des élevages de moutons ou de chèvres qui présentent une résistance à tous les traitements anthelmintiques disponibles sur le marché. Il est très intéressant de voir qu’il est possible de transposer les résultats obtenus sur le modèle murin à d’autres espèces de parasites d’importance vétérinaire. Les perspectives concernant le parasite du mouton seraient de caractériser de façon plus précise l’activité in vitro de B. bifurcata avec des tests complémentaires (éclosion des œufs, développement larvaire, mobilité des larves, …). Quels sont les facteurs pouvant impacter l’activité biologique de B. bifurcata ? Impact de l’environnement (saison et/ou géographie) Les premiers résultats obtenus avec les extraits aqueux de B. bifurcata nous ont encouragé à continuer l’exploration de l’activité de cette algue. Pour cela nous avions besoin d’une plus grande quantité de matière première, pour envisager les futures expérimentations in vivo. C’est pourquoi nous avons fait appel à l’entreprise QuintaQuanta située au Portugal pour nous fournir de la B. bifurcata . Cependant, les algues étant des produits issus de l’environnement, il était important de valider l’activité biologique de nouveaux lots issus de lieux de récolte différents. Les extraits d’algues portugaises ont donc été comparés aux extraits d’algues françaises. Les résultats ont montré que pour deux extraits aqueux identiques (en terme de conservation et d’extraction) mais avec pour seule différence l’origine géographique (France ou Portugal), une différence d’efficacité est observée. Que ce soit via le TDL (IC50 de 0,48 g/L pour l’extrait portugais contre 0,66 g/L pour l’extrait français, avec une différence significative p B. bifurcata peut varier en fonction du lieu de récolte au sein même des côtes atlantiques françaises. Ces variations peuvent être dues à des adaptations chimiques de l’algue aux conditions environnementales biologiques ou physiques qui varient. Il serait alors intéressant de comparer ces deux extraits d’un point de vue biochimique afin d’identifier quels sont les composés impliqués dans ces différences d’activité. La saison de récolte des algues peut également jouer un rôle dans la composition et l’activité biologique. Pour vérifier cela, Olmix a réalisé plusieurs récoltes de B. bifurcata en Bretagne à différentes périodes de l’année : en juin 2021, décembre 2021 et mars 2022. Ces récoltes sont venues compléter la première récolte de B. bifurcata qui avait eu lieu en août 2019. Les résultats obtenus démontrent effectivement une différence d’activité, que ce soit sur le TDL ou sur la mortalité des larves après éclosion. De manière générale les résultats tendent à démontrer que le lot de B. bifurcata collectée en décembre 2021 est le moins efficace, tandis que celui récolté en juin 2021 semble avoir une meilleure efficacité. Des variations d’activité biologique ont déjà été observées pour l’algue verte Ulva rigida collectée en Tunisie durant les 12 mois de l’année. Les résultats ont démontré que l’activité antimicrobienne et antioxydante de l’algue était plus forte sur les échantillons collectés au printemps. Concernant B. bifurcata , une étude a également démontré la variabilité de l’activité « antifouling » de cette algue en fonction des mois de récolte, avec une meilleure activité biologique des algues récoltées d’avril à août et un pic d’activité observé en juin. Cette tendance semble être en accord avec nos résultats. Toutefois, en raison des variations globales de température des océans et de la multitude d’algues dans le monde qui réagissent différemment aux conditions environnementales (que ce soit la salinité, la température ou la pollution par exemple), il est assez difficile de statuer sur une règle générale applicable à toutes les espèces d’algues. C’est pourquoi de nouvelles récoltes devront être réalisées au cours d’une autre année afin de valider ces premiers résultats et déterminer si, pour cette espèce en particulier, il est possible d’identifier une saison plus propice à la récolte. Dans l’optique d’une exploitation industrielle à partir des algues collectées au Portugal, il serait judicieux de réaliser ces expérimentations sur les algues portugaises. Impact des procédés de conservation Au-delà des impacts que peuvent avoir les facteurs environnementaux sur l’activité biologique des algues, les procédés de traitement peuvent aussi jouer un rôle. Les premières algues B. bifurcata qui nous ont été envoyées du Portugal avaient été séchées après récolte. Dès lors, quand nous avons observé une différence d’activité entre ce lot d’algue et les algues françaises (qui avaient été congelées et récoltées à un mois différent), il a été difficile de déterminer si cette baisse d’activité biologique in vitro était due à la zone géographique, à la saison de récolte ou au procédé de conservation de B. bifurcata après récolte. Des extractions organiques ont été réalisées sur ces deux lots d’algues avec 3 solvants différents (heptane, EtOAc et BuOH) afin d’observer une activité différentielle entre ces fractions. Les résultats du TDL ont montré que les fractions heptane et EtOAc étaient très efficaces pour inhiber le développement des larves, indépendamment du lot d’algue. La différence majeure a été observée pour la fraction BuOH. Celle des algues congelées et françaises présente une forte activité à 1 g/L alors que celle issue des algues séchées et portugaises ne présente pas d’activité à la même concentration. Afin de mettre en évidence l’impact du traitement de l’algue après récolte sur l’activité biologique, nous avons alors comparé des lots similaires avec pour seul changement le traitement de l’algue après récolte. Une récolte de B. bifurcata a donc eu lieu au Portugal en novembre 2021, et une partie a été congelée et l’autre séchée. L’activité de ces deux lots d’algues a été comparée également avec un TDL sur H. bakeri à partir d’extraits aqueux et des fractions organiques BuOH . Les résultats obtenus démontrent en effet que le traitement des algues après récolte affecte l’activité biologique. Il a été observé une forte diminution de l’activité des extraits issus d’algues séchées comparées aux extraits issus d’algues congelées, et ce pour les extraits aqueux (8 % d’activité contre 88 % respectivement) et les fractions BuOH (9 % contre 85 % respectivement). En comparaison et à titre d’exemple, LeLann et al. ont mesuré la quantité de composés phénoliques et l’activité antioxydante de S. muticum et de B. bifurcata en fonction de différents traitements : aucun (algues fraîches), congélation, lyophilisation, séchage au four et en serre. Les résultats obtenus démontrent que les procédés de séchage réduisent la quantité de composés phénoliques et également l’activité antioxydante in vitro . Il n’est pas rare que certaines molécules, comme les composés phénoliques, soient dégradées par le séchage des échantillons à des températures avoisinant les 40°C. Cruces et al. ont observé le même phénomène avec une algue brune et ont démontré que la méthode choisie pour conserver les algues peut avoir des conséquences sur le rendement d’extraction de composés naturels (dans ce cas, des phlorotanins) et sur l’activité biologique. Ils ont également montré que le séchage est le plus mauvais procédé car il entraîne une diminution significative de l’activité antioxydante des extraits. Dans notre cas, les molécules actives de la fraction BuOH semblent également particulièrement sensibles au procédé de séchage des algues mais toutes les molécules actives ne semblent pas affectées de la même manière, expliquant que les extraits heptane et EtOAc montrent une forte activité indépendamment du procédé utilisé. Il serait pertinent de vérifier si ces résultats sont répétables entre des lots d’algues séchées et congelées récoltées en France. Dans le but de compléter l’analyse de l’impact des procédés de conservation, nous avons voulu nous assurer que la conservation des algues à +4°C avant la congélation n’avait pas d’impact sur l’activité biologique. Et effectivement les échantillons non conservés à +4°C et les échantillons conservés à +4°C pendant 24 h et 48 h ne présentent pas de différence d’activité pour inhiber le développement des larves, que ce soit à 5 g/L ou 1 g/L. Quelles sont les molécules actives et les modes d’action impliqués dans l’activité biologique de B. bifurcata ? Investigations sur les molécules actives impliquées Comme décrit précédemment, nous avons mis en évidence une différence d’activité entre les deux lots de B. bifurcata provenant de France (congelée) et du Portugal (séchée). Les extraits aqueux du lot portugais ayant une activité moindre comparée aux extraits du lot français, cela suggère que les molécules actives sont encore présentes mais en plus faible quantité. Afin d'approfondir cette hypothèse, nous avons réalisé différentes extractions organiques (heptane, EtOAc et BuOH) et caractérisé leurs activités biologiques respectives. Les résultats ont montré que les fractions portant la principale activité biologique étaient celles obtenues avec l'heptane et l'EtOAc, indépendamment de leur origine (France ou Portugal) et du procédé utilisé avant les extractions aqueuses (congélation ou séchage). Cela a confirmé la présence de molécules actives dans le lot d'algues portugaises. Il convient de noter que des molécules actives ayant une activité antiparasitaire contre les protozoaires Trypanosoma et Plasmodium ont été précédemment identifiées chez B. bifurcata et ont également été extraites en utilisant de l'EtOAc. Nos résultats sont également en accord avec une étude précédente réalisée sur les algues brunes Saccharina latissima et Laminaria digitata , montrant que la fraction organique extraite avec le solvant alcane (correspondant à l'hexane) présentait également une activité larvicide contre deux espèces de parasites GI du mouton ( Teladorsagia circumcincta ) et du porc ( A . suum ). De manière importante, les résultats des expérimentations impliquant les différentes fractions organiques au cours du TDL ont également mis en évidence une caractéristique intéressante concernant l'extrait BuOH. En effet, nous avons observé une différence majeure d'activité entre la fraction BuOH de l'algue française et celle de l'algue portugaise (99 % et 13 % d'inhibition du développement larvaire respectivement à 1 g/L) suggérant que les propriétés anthelminthiques de B. bifurcata pourraient reposer sur différentes familles de molécules. Ceci confirme l'intérêt particulier de l'utilisation des extraits aqueux de B. bifurcata comme source potentielle d'anthelminthiques car ils combinent une gamme de composés actifs conduisant potentiellement à des modes d'action distincts. Bonde et al. ont montré que l'activité anthelminthique des composés algaux individuels est modérée par rapport à l'activité des fractions à partir desquelles ils ont été obtenus. À cet égard, il est tentant de spéculer sur un potentiel effet synergique entre les différents composés actifs présents dans les extraits heptane, EtOAc et BuOH de B. bifurcata . Pour vérifier cela il sera nécessaire dans un premier temps de calculer les IC50 de ces différentes fractions sur l’inhibition du développement larvaire et ensuite comparer les IC50 avec des combinaisons de différentes fractions entre elles. L’analyse par RMN de la fraction heptane (qui est très active in vitro) a permis d’identifier deux diterpènes linéaires : l’éléganolone et le bifurcanol. Concernant les molécules impliquées dans l’activité biologique de B. bifurcata , de nombreuses études se sont intéressées à cette algue et ont décrit un grand nombre de ses composés. Elle est connue pour produire une grande quantité de terpénoïdes, dont la structure est composée de plusieurs unités d’isoprène (C 5 H 8 ). Parmi ces terpénoïdes, Biard et al. ont été les premiers à rapporter la présence de diterpènes linéaires chez B. bifurcata , dont l’éléganolone comme composé majoritaire (2% du poids sec). Le Lann et al. ont également mis en évidence ce composé majoritaire chez cette même espèce d’algue. Ils ont identifié 4 profils chimiques différents dans des extraits collectés à différentes saisons et dans différentes zones géographiques. La présence d’éléganolone ne semble pas impactée par les changements de saison ou par les facteurs environnementaux, mais cela peut affecter grandement d’autres composés. Ce terpène a déjà été décrit comme ayant une activité anti-protozoaire contre Trypanosoma et Plasmodium . Le bifurcanol est, quant à lui, moins bien caractérisé chez B. bifurcata mais il a déjà été isolé dans une étude démontrant son activité antimitotique. Cette étude détaille également la composition de B. bifurcata en fonction de 3 zones géographiques différentes et au cours de l’année. Les résultats indiquent une faible variation du ratio de diterpènes au cours des saisons mais le bifurcanol n’est pas retrouvé dans les mêmes proportions en fonction du lieu de récolte. Une revue reprend de façon très détaillée les différents diterpènes linéaires extraits de B. bifurcata , leurs méthodes d’extraction ou encore le pré-traitement des algues, ainsi que les activités biologiques rapportées à ces différents diterpènes, offrant ainsi de nouvelles perspectives pour leur utilisation en tant qu’anthelmintiques. Composition pour une utilisation anthelmintique par voie orale, ladite composition comprenant de l’éléganolone et/ou un diterpène linéaire de type bifurcanol. Composition selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit éléganolone ou ledit diterpène de type bifurcanol est présent au sein d’un extrait de Bifurcaria bifurcata incorporé dans ladite composition. Composition selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit extrait de Bifurcaria bifurcata est un extrait aqueux de Bifurcaria bifurcata, un extrait obtenu par extraction de composés de Bifurcaria bifurcata dans un solvant ou un extrait obtenu par extraction de composés de Bifurcaria bifurcata dans une huile. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu’elle est efficace contre des organismes zooparasitaires de type nématodoïdes du sous-ordre Rhabditina et/ou Spirurina et en particulier des organismes de l’ordre des Ascarididae ou des Trichostrongylidae et encore plus particulièrement contre les organismes des espèces Haemonchus contortus , Ascaridia suum , Parascaris equorum et Ascaridia galli . Procédé de préparation d’un anthelmintique destiné à être administré par voie orale comprenant - préparer une composition comprenant de l’éléganolone et/ou un diterpène linéaire de type bifurcanol - encapsuler ladite composition dans des particules de levure ou l’incorporer dans une matrice d’amidon gélatinisé.