Brevet FR3144164A1 — publié le 20240628

La présente invnetion concerne le domaine du diagnostice des maladues neurodégénératives. Elle concerne plus particulièrement un procédé de diagnostic pour la qualification du statut (« prédisposition avant que le sujet ne développe la pathologie » « qualification de la pathologie » « âge prévisionnel de survenance des signes pathologiques ») d'un sujet vis-à-vis de la maladie d'Alzheimer, basé sur l’analyse du niveau d’expresion de biomaqueurs qualifiés. Figure d’abrégé : Fig. 7 Détermination du statut d’un individu vis-à-vis de la maladie d’Alzheimer La présente invnetion concerne le domaine du diagnostice des maladues neurodégénératives. Elle concerne plus particulièrement un procédé de diagnostic pour la qualification du statut (« prédisposition avant que le sujet ne développe la pathologie » « qualification de la pathologie » « âge prévisionnel de survenance des signes pathologiques ») d'un sujet vis-à-vis de la maladie d'Alzheimer, basé sur l’analyse du niveau d’expresion de biomaqueurs qualifiés. Domaine de l’invention La présente invention concerne le diagnostic de la prédisposition d’un sujet à une maladie neurodégénérative, et notamment la maladie d’Alzheimer. On désigne par maladies dégénératives les maladies qui évoluent progressivement et qui entraînent chez les personnes atteintes des déficiences physiques, physiologiques ou mentales. L’ensemble de ces maladies évolutives et graves comprennent des maladies variées telles que les démences (dont la maladie d'Alzheimer), la maladie de Parkinson, la sclérose en plaques, la paraplégie, la myopathie ou myasthénie, l’épilepsie, l’accident vasculaire cérébral ou AVC, et d’autres affections neurologiques. Les plus connues des maladies dégénératives, et certainement les plus répandues, sont les maladies neurodégénératives qui provoquent une dégénérescence du système nerveux. Ces maladies se traduisent par une perte progressive des fonctions cognitives et une démence touchant une personne sur huit avant l'âge de 65 ans. Ces maladies peuvent frapper des personnes à un âge plus précoce de 40 à 50 ans. Les maladies dégénératives sont généralement d’origine génétique, c’est-à-dire qu’elles sont héréditaires et transmises d’une génération à l’autre. Mais ces pathologies peuvent aussi être causées par une exposition importante et longue à des substances biologiques et toxiques tout au long de la vie, ou à d’autres troubles tels que les apnées du sommeil sévères. Le diagnostic précoce de ces maladies constitue un enjeu majeur pour anticiper la survenance des signes cliniques et l’apparition d’un handicap lourd, physique et mental, afin d’aider le sujet à organiser un cadre de vie sécurisant et adapté à la probable perte d’autonomie, à pratiquer des exercices physiques et intellectuels susceptibles de retarder la perte d’autonomie, et ralentir la progression de la maladie en organisant les actions pouvant soulager ou réduire certains des symptômes. Le diagnostic précoce permet d’inciter le sujet à stimuler au mieux les facultés cognitives et de mémorisation d’anticiper, et de prendre des dispositions pour l’avenir tant qu’il possède encore toutes ses facultés de discernement et de prise de décision. Pourtant, à l’heure actuelle, environ 1 malade sur 2 ignore qu’il est atteint de la maladie et ne l’apprendra qu’à un stade avancé. Ainsi, près d’un demi-million de personnes ne bénéficie pas d’une prise en charge adaptée en France. Cela a des conséquences dramatiques pour les malades et les familles. Ce diagnostic était pratiqué longtemps de manière empirique, par exemple par le médecin généraliste alerté par les proches du sujet sur des troubles apparents, tes que l’anosognosie., qui se caractérisé par des oublis des oublis : le sujet ne se rend pas compte qu’il est en situation de difficulté et son entourage l’inciter à consulter un médecin, un neurologue ou un gériatre afin de caractériser l’origine de ces troubles. Le diagnostic habituel d'une maladie dégénérative possible ou probable repose essentiellement sur des critères cliniques et des tests neuropsychologiques qui visent tout d'abord à établir si un individu présente un syndrome démentiel, en général selon les critères du DSM IV (Diagnostic and Statistical Manual for Mental Disorders, édité par l’association « American Psychiatrie Association »), puis à déterminer l'étiologie de la démence. Les critères de démences comprennent essentiellement l'association d'un trouble de la mémoire et d'autres fonctions cognitives retentissant sur les activités socio-professionnelles et entraînant un déclin par rapport au fonctionnement antérieur. Le diagnostic se renforce par le suivi de l'évolution du patient, ce qui permet de préciser les causes de la démence, notamment en écartant les autres causes de déclin cognitif. On a également développé des méthodes de diagnostic efficace mais très invasive, à partir de l'examen des tissus cérébraux, qui sont adaptés principalement à un constat post-mortem. Des tranches de tissu cérébral de victimes de la maladie d’Alzheimer présentent en effet la présence d'amyloïde sous la forme de noyaux extracellulaires protéiniques des plaques neuritiques caractéristiques de la maladie d’Alzheimer. Les efforts de recherche ont également porté sur le développement de méthodes non invasives in vivo par des techniques d'imagerie ou des méthodes biochimiques ou génomiques pour la détection de biomarqueurs. Les techniques d'imagerie sont disponibles depuis de nombreuses années. L'imagerie cérébrale permet par exemple d’évaluer l'atrophie régionale hippocampique, qui peut toutefois être présente dans d'autres maladies atteignant les personnes âgées, et en excluant d'autres causes de troubles cognitifs, telles que des séquelles d'accidents vasculaires cérébraux. Pour l'imagerie des maladies du cerveau telles que la fibrille amyloïde ou les maladies neurologiques formant des plaques, une série de dérivés non chargés de la thioflavine T ont été développés en tant qu'agents d'imagerie amyloïde et radiotraceurs qui présentent une forte affinité pour les dépôts amyloïdes et une haute perméabilité à travers le sang-cerveau barrière. Des études approfondies in vitro et in vivo de ces agents d'imagerie amyloïde représentés par la thioflavine BTA-1 suggèrent qu'ils se lient spécifiquement aux dépôts amyloïdes à des concentrations typiques de celles détectables lors des études de tomographie par émission de positrons. Dans le milieu complexe du cerveau humain, la liaison non spécifique des composés d'imagerie amyloïde est faible, même dans les cerveaux témoins dépourvus de dépôts amyloïdes. Les voies les plus attendues porte sur un test pouvant être pratiqué sur un fluide biologiques prélevé sur le sujet, par exemple un test sanguin simple. Un certain nombre d'études récentes (O'Bryant, S. E., Xiao, G., Barber, R., Reisch, J., Hall, J., Cullum, C. M., Doody, R., Fairchild, T., Adams, P., Wilhelmsen, K., Diaz-Arrastia, R., & Texas Alzheimer’s Research and Care Consortium (2011). A blood-based algorithm for the detection of Alzheimer's disease. Dementia and geriatric cognitive disorders, 32(1), 55–62. https://doi.org/10.1159/000330750) ont proposé des panels de biomarqueurs. Ce test est pratiqué sur des échantillons de sang à jeun prélevés dans des tubes séparateurs de sérum, puis laissés coaguler à température ambiante pendant 30 minutes, centrifugés, aliquotés et conservés à -80°C dans des flacons en plastique. Les échantillons groupés provenant des examens de base ou des examens de suivi après un an ont été décongelés pour être analysés sans cycles de congélation-décongélation supplémentaires à l'aide de leur test immunologique multiplexé human Multi-Analyte Profile (humanMAP). Les protéines individuelles ont été quantifiées à l'aide de dosages immunologiques sur des microsphères colorées. Les informations relatives à la dose la moins détectable, au coefficient de variation entre les séries, à la plage dynamique, à la récupération globale de l'étalon dopé et à la réactivité croisée avec d'autres analytes ont été obtenues auprès de d’autres centres. Cependant, ces tests récents se sont avérés non reproductibles. Certains kits commerciaux avec des panels de biomarqueurs spécifiques sont maintenant disponibles dont le choix est basé sur des études hors du Kings College de Londres (Proteomics Sciences, Thambisetty et al, PLoS ONE, 6, 2001). Ces kits utilisent cependant des instruments coûteux tels que la spectrométrie de masse et, dans certains cas, nécessitent l'utilisation de CSF. Cependant, on considère généralement qu'environ seulement 85% des cas de maladie d'Alzheimer probable sont confirmés post-mortem. Les 15% de faux positifs résultent généralement d'autres maladies neurodégénératives, telles que les démences fronto-temporales, dont notamment la démence avec corps de Lewy. Les méthodologies actuelles de diagnostic de maladies neurodégénératives manquent donc de spécificité. Etat de la technique Plus récemment, on a découvert certains marqueurs biologiques qui semblent être spécifiques de la maladie d’Alzheimer. Le dosage des taux de protéines bêta-amyloïdes et Tau dans le liquide céphalo-rachidien ont été utilisés pour confirmer les pronostics du neurochirurgien. La protéine Tau est une protéine qui possède un rôle majeur dans le développement de la maladie d’Alzheimer. Son accumulation dans les cellules nerveuses est responsable de nombreux dysfonctionnements, conduisant à la mort des cellules. Dans la maladie d’Alzheimer, la protéine Tau et ses dérivés ont été utilisés comme biomarqueurs de la maladie d’Alzheimer. La grande majorité des cas de maladie d'Alzheimer correspond à des patients pour lesquels il existe un déterminisme multifactoriel, y compris parmi les formes précoces. La part génétique de ce déterminisme est importante et est représentée par différents facteurs de risque. D’autres biomarqueurs ont été envisagés notamment l’allèle 4 du gène APOE (APOE4) codant pour l’apolipoprotéine E. L’article Ward A, Crean S, Mercaldi C, J, Collins J, M, Boyd D, Cook M, N, Arrighi H, M: Prevalence of Apolipoprotein E4 Genotype and Homozygotes (APOE e4/4) among Patients Diagnosed with Alzheimer’s Disease: A Systematic Review and Meta-Analysis. Neuroepidemiology 2012;38:1-17. doi: 10.1159/000334607 expose que le gène APOE existe sous trois « formes » que l’on appelle des allèles E2, E3 (le plus fréquent) et E4. Les porteurs de l’allèle E2 ont moins de risque de développer une maladie d’Alzheimer alors que les porteurs d’au moins un allèle E4 ont un risque plus élevé. Un autre biomarqueur, GSNOR, est étudié dans l’article Zhang, Yuying et al. “Increased GSNOR Expression during Aging Impairs Cognitive Function and Decreases S-Nitrosation of CaMKIIα.” The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience vol. 37,40 (2017): 9741-9758. doi:10.1523/JNEUROSCI.0681-17.2017. L’auteur observe que la S-nitrosoglutathione réductase (GSNOR), enzyme qui métabolise l'oxyde nitrique (NO) intracellulaire et régule la S-nitrosation, était significativement augmentée dans l'hippocampe des humains et des souris vieillissants. Les souris transgéniques surexprimant le GSNOR exclusivement dans les neurones ont présenté une déficience cognitive dans les tests comportementaux, notamment le labyrinthe aquatique de Morris, le conditionnement à la peur et le test du labyrinthe en Y. Nous avons également constaté que les souris transgéniques GSNOR présentent des défauts de LTP et une plus faible densité des épines des dendrites, tandis que les souris knock-out GSNOR ont résolu la déficience cognitive liée à l'âge. Un autre article scientifique « Une ubiquitine ligase polyvalente : garante de la qualité mitochondriale et de l’immunité antibactérienne ? de Olga Corti Med Sci (Paris) 30 (4) 350-352 (2014) DOI: 10.1051/medsci/20143004004 » observe que le gène PARK2 est responsable de près de la moitié des cas de maladie de Parkinson de transmission autosomique récessive avec début précoce. La grande variété de mutations couvrant l’ensemble du gène sont à l’origine de la maladie par un mécanisme de perte de fonction. On a aussi proposé dans la demande de brevet WO2012149607 des méthodes pour prédire si un sujet développera une maladie capable d'affecter une fonction cognitive. L'invention concerne, de manière plus spécifique, la détection prédictive d'une maladie neurologique chez un sujet. Les méthodes et les systèmes utilisés permettent une évaluation quantitative et des prédictions théoriques de charge amyloïde néocorticale ou de niveaux d'amyloïde bêta en fonction de mesures de biomarqueurs dans des fluides biologiques qui indiqueront si un sujet est susceptible de développer une maladie neurologique, telle que la maladie d'Alzheimer. Enfin, l’article Hu WT, Chen-Plotkin A, Arnold SE, Grossman M, Clark CM, Shaw LM, Pickering E, Kuhn M, Chen Y, McCluskey L, Elman L, Karlawish J, Hurtig HI, Siderowf A, Lee VM, Soares H, Trojanowski JQ. Novel CSF biomarkers for Alzheimer's disease and mild cognitive impairment. Acta Neuropathol. 2010 Jun;119(6):669-78. doi: 10.1007/s00401-010-0667-0. Epub 2010 Mar 16. PMID: 20232070; PMCID: PMC2880811 reprend une étude ante-mortem menée auprès de 66 patients atteints de la MA et de 25 patients atteints d'autres démences neurodégénératives suivis longitudinalement jusqu'à la confirmation neuropathologique, ainsi que le LCR de 33 sujets cognitivement normaux. Cette étude est basée sur la mesure des niveaux de 151 nouveaux analytes via un panel multiplex ciblé enrichi en cytokines, chimiokines et facteurs de croissance, ainsi que les biomarqueurs établis du LCR de la MA (niveaux d'Abeta42, tau et p-tau). Une approche analytique à a montré que les patients atteints de la maladie d'Alzheimer se distinguaient mieux des autres cas (y compris les sujets cognitivement normaux et les patients atteints d'autres troubles neurodégénératifs) par une combinaison de biomarqueurs traditionnels de la maladie d'Alzheimer et de nouveaux biomarqueurs multiplex. Six nouveaux biomarqueurs (C3, CgA, IL-1alpha, I-309, NrCAM et VEGF) ont été corrélés avec la gravité de la déficience cognitive au moment du prélèvement du LCR, et les niveaux modifiés d'IL-1alpha et de TECK ont été associés à un déclin cognitif ultérieur chez 38 sujets atteints de déficience cognitive légère et suivis longitudinalement. On connait aussi le brevet FR2963791B1 Méthode de diagnostic in vitro d'une maladie neurodégénérative, sélectionnée dans le groupe constitué de la maladie d'Alzheimer, de la maladie de Huntington, de la maladie de Creutzfeld-Jakob, et de la maladie de Parkinson, à partir d'un échantillon de liquide céphalorachidien d'un individu, dans laquelle : - on mesure le niveau de la protéine kinase ARN double-brin dépendante (PKR) phosphorylée dans l'échantillon par une méthode immunologique comprenant la mise en contact de l'échantillon de liquide céphalorachidien avec un anticorps, un fragment d'anticorps ou un aptamère reconnaissant spécifiquement cette PKR phosphorylée, - on mesure le niveau de la protéine kinase ARN double-brin dépendante (PKR) total dans l'échantillon par une méthode immunologique comprenant la mise en contact de l'échantillon de liquide céphalorachidien avec un anticorps, un fragment d'anticorps ou un aptamère reconnaissant spécifiquement cette PKR, - on compare le rapport du niveau de la PKR phosphorylée sur le niveau de la PKR total à une valeur prédéfinie, et, - on en déduit si l'individu souffre de ladite maladie neurodégénérative, le rapport du niveau de la PKR phosphorylée sur le niveau de la PKR total supérieur à la valeur prédéfinie indiquant que l'individu souffre de ladite maladie neurodégénérative. Le brevet EP3102950B1 présente une autre méthode de diagnostic ou de détermination du risque de développement de la maladie d'Alzheimer (MA) chez un sujet, comprenant les étapes consistant à : a) mesurer le niveau ou la quantité d'un biomarqueur de maladie d'Alzheimer, où le biomarqueur se présente sous la forme d'une protéine ou d'un peptide dans un échantillon biologique issu d'un sujet ; et b) déterminer ou diagnostiquer la présence ou le risque de développement de la MA avec une spécificité élevée en se basant sur le niveau ou la quantité dudit biomarqueur, dans laquelle le biomarqueur de MA est constitué d'au moins cinq biomarqueurs choisis parmi les suivants : BDNF (facteur neurotrophique dérivé du cerveau), IGF-1 (facteur de croissance apparenté à l'insuline 1), TGF-bêta 1 (facteur de croissance tumorale bêta 1), VEGF (facteur de croissance de l'endothélium vasculaire), IL-18 (interleukine 18) et MCP-1 (protéine chimiotactique des monocytes), et dans laquelle une augmentation d'IL-18 et de MCP-1, et la diminution de BDNF, IGF-1, VEGF et TGF-bêta 1 par rapport à un niveau ou une quantité de référence dudit biomarqueur indiquent la présence ou le risque de développement de la MA. Inconvénients de l’art antérieur Les solutions de l’art antérieur ne sont pas totalement satisfaisantes car leur valeur prédictive est insuffisante pour permettre de prendre des décisions pertinentes, susceptibles d’affecter profondément la vie d’un sujet. La mesure de l’association entre les biomarqueurs proposés dans l’art antérieur et la prédisposition à une maladie neurodégénérative montre que la caractérisation du statut d'un sujet vis-à-vis d’une maladie neurodégénérative. L’article « Diagnostic précoce d'Alzheimer : quels biomarqueurs ? " paru dans la revue Biologiste infos n°110 de Février-Mars 2021 explique que « la signature de la maladie évolue dans le temps entre la phase silencieuse, les premiers signes de déclin, et la démence ». C’est pourquoi un biomarqueur spécifique ou une combinaison de biomarqueurs ne permet pas de qualifier l’état d’un sujet dont on ne connaît pas la situation, est insuffisante pour modifier la classification des sujets en malade ou non malade et a fortiori de caractérisé de manière fiable le degré de prédisposition du sujet. L’article de Therriault J et collaborateurs (Therriault J, Zimmer ER, Benedet AL, Pascoal TA, Gauthier S, Rosa-Neto P. Staging of Alzheimer's disease: past, present, and future perspectives. Trends Mol Med. 2022 Jun 15:S1471-4914, aborde l'utilisation d'informations cliniques et de biomarqueurs dans la classification des stades de la maladie passée, présente et future . des application potentielles de la Tomographie par Emission de Positons (TEP), et des biomarqueurs plasmatiques pour la classification de la gravité de la maladie d’Alzheimer in vivo. Néanmoins, les auteurs soulignent que bien que ces pistes soient prometteuses, elle nécessitent des examens poussés qui ne permettent pas de caractériser de manière fiable le degré de prédisposition du sujet. Solution apportée par l’invention Afin de remédier à ces inconvénients, la présente invention concerne selon son acception la plus générale un procédé de diagnostic pour la qualification du statut (« prédisposition avant que le sujet ne développe la pathologie » « qualification de la pathologie » « âge prévisionnel de survenance des signes pathologiques ») d'un sujet vis-à-vis de la maladie d'Alzheimer, comportant : A. une étape initiale consistant à collecter des données de références comprenant : a) une base de valeurs témoins VT x de référence pour des sujets sains pour chacun des gènes ATM, APOE, GSNOR, PARKIN2, STOX2, d’ADN mitochondrial b) des classes de statuts connus, déterminées à partir de n-uplets normalisés CR x obtenus à partir des prélèvements biologiques sur des cohortes homogènes par rapport à un ou plusieurs critères de classification de patients présentant un statut R de référence commun pour déterminer un sous-espace R correspondant à un statut donné B. des étapes de diagnostic, pour un nouveau sujet, consistant à : a. procéder à un prélèvement biologique b. extraire le matériel génomique, puis c. réaliser une quantification (par une technique connue, par exemple PCR ou western Blot) comprenant une partie au moins des marqueurs suivants : du gène ATM et de son expression pour établir une première valeur V ATM du gène APOE et de son expression pour établir une deuxième valeur V APOE du gène GSNOR et de son expression pour établir une troisième valeur V GSNOR du gène PARKIN2 et de son expression pour établir une quatrième valeur V PARKIN2 du gène STOX2 et de son expression pour établir une cinquième valeur V STOX2 de la quantité d’ADN mitochondrial pour établir une sixième valeur V ADNM d. procéder à une normalisation desdites valeurs V x pour déterminer six coefficients normalisés C x = I V x - VT x I /VT x I e. déterminer le sous-espace le plus proche (au sens de distance euclidienne) dudit n-uplet C x pour déterminer le statut dudit sujet. Selon des variantes, elle concerne également : un procédé de diagnostic tel que défini précédemment dans lequel lesdits prélèvements biologiques sont des prélèvements sanguins. Un procédé de diagnostic tel que défini précédemment dans lequel lesdits prélèvements biologiques sont des prélèvements de peau. Un procédé de diagnostic tel que défini précédemment dans lequel lesdits prélèvements biologiques sont des prélèvements de cellules cérébrales ou des cellules provenant d’une ponction de liquide céphalo-rachidien. Un procédé de diagnostic tel que défini précédemment comportant une étape additionnelle consistant à isoler les cellules pour caractériser la morphologie des noyaux cellulaires et le taux de progérine, pour déterminer la valeur P de la proportion de cellules présentant un noyau déformé et à déterminer le statut de vieillissement en fonction de la classe d’appartenance de cette valeur P pour pondérer par analyse de la morphologie des noyaux (80% des noyaux normaux) par immunofluorescence et anticorps et ou un intercalant de l’ADN fluorescent, pour confirmer la probabilité d’AD, même asymptomatique et/ou un taux de progérine plus élevé que la normale. Un procédé de diagnostic tel que défini précédemment comportant une étape d’analyse des cellules pour vérifier la présence en périnucléaire de la protéine phosphoAPOE et/ ou quantifier la protéine phosphoAPOE. Un procédé de diagnostic tel que défini précédemment comportant une étape d’analyse par une méthode de régression sur un N-uplet de valeurs V x correspondant au sujet à diagnostiquer et un N-uplet de valeurs témoins VT x . Un procédé de diagnostic tel que défini précédemment comportant une étape de dosage d’un biomarqueur pATM-pAPOE dans un prélèvement cutané provenant du sujet. Un procédé de diagnostic tel que défini précédemment comportant la quantification du pourcentage de fibroblastes présentant des accumulations périnucléaires spontanées et / ou post-irradiation de pATM et de pAPOE sur un échantillon significatif de cellules. L’invention concerne également un kit de diagnostic pour la qualification du statut (« prédisposition avant que le sujet ne développe la pathologie » « qualification de la pathologie » « âge prévisionnel de survenance des signes pathologiques ») d'un sujet vis-à-vis de la maladie d'Alzheimer, conformément au procédé objet de la revendication 1 caractérisé en ce qu’il comprend une partie au moins des marqueurs suivants : du gène ATM et de son expression pour établir une première valeur V ATM du gène APOE et de son expression pour établir une deuxième valeur V APOE du gène GSNOR et de son expression pour établir une troisième valeur V GSNOR du gène PARKIN2 et de son expression pour établir une quatrième valeur V PARKIN2 du gène STOX2 et de son expression pour établir une cinquième valeur V STOX2 de la quantité d’ADN mitochondrial pour établir une sixième valeur V ADNM et un calculateur pour : a. procéder à une normalisation desdites valeurs V x pour déterminer six coefficients normalisés C x = I V x - VT x I /VT x I b. déterminer le sous-espace le plus proche (au sens de distance euclidienne) dudit n-uplet C x pour déterminer le statut dudit sujet. Description détaillée d’un exemple non limitatif de réalisation La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui suit, concernant un exemple non limitatif de réalisation illustré par les dessins annexés où : la représente la distribution des génotypes APOE des patients en fonction de l’âge. la représente la courbe ROC de la détection des patients de génotype APOE4 via la quantification d’ATM par qPCR. la représente la courbe ROC de de la détection des patients de génotype APOE4 via la quantification cytoplasmique de la protéine ATM. la représente la distribution de l’expression relative normalisée du gène ATM en fonction de l’âge des patients sous la forme d’une variable binaire ( 60 ans= 0). la représente la distribution de la quantification des focis de la protéine ATM 24h post-irradiation en fonction de l’âge des patients sous la forme d’une variable binaire ( 60 ans= 0). la représente le % de cellules avec des noyaux de forme normale et anormale de patients Alzheimer. la représente l’analyse de la morphologie nucléaire de cellules de patients Alzheimer. la représente un western blot de quantification des protéines pATM, Progérine à partir d’extraits protéiques de cellules de patients Azheimer. la représente la quantification d’ATM, GSNOR et de l’ADN mitochondrial dans les cellules de patients Alzheimer. Sélection de la combinaison de biomarqueurs La première étape consiste à sélectionner un ensemble de biomarqueurs comprenant au moins trois des biomarqueurs suivants, connus comme facteurs de risques génétiques : ATM (Ataxia telangiectasia mutated), sérine/thréonine kinase qui appartient à la famille des kinases apparentées à la phosphatidylinositol 3-kinase contribuant à la régulation de la réponse aux dommages de l'ADN. APOE, (apolipoprotéine E) GSNOR (S-nitrosoglutathion réductase), ou ADH5, enzyme de la famille des alcool déshydrogénases (ADH) PARKIN2, gène situé sur le chromosome 6 humain, enzyme de type ubiquitine ligase. STOX2, gène de macaca nemestrina ADN mitochondrial. La combinaison sélectionnée comprend au moins trois et de préférence au moins 4 des six biomarqueurs ci-dessus, et peut comporter des biomarqueurs additionnels. Cette combinaison de N bio forme une espace à N dimensions qui sera utilisé pour déterminer des sous-ensembles spécifiques caractérisant un état de prédisposition d’un sujet à une maladie neurodégénérative. Cette étape consiste aussi à définir le protocole de dosage de chacun des N biomarqueurs retenus. Préparation d’un référentiel. L’étape suivante consiste à tester des cohortes de sujets dont l’état de prédisposition à une maladie neurodégénérative est connu, en procédant à des prélèvements biologiques pour appliquer ensuite le protocole de dosage des N biomarqueurs retenus. Le résultat de ces dosages détermine, pour chaque sujet, un N-uplet de valeurs, associé à une classe de prédisposition à une maladie neurodégénérative connue. L’ensemble des N-uplets associés à une même classe de prédisposition défini un domaine formant un sous-ensemble homogène de l’espace à N dimensions susvisé. Ce référentiel n’est pas figé mais s’enrichit au fur et à mesure de nouveaux prélèvements qualifiés ainsi que par les prélèvements anciens concernant des sujets dont l’état de prédisposition devient au fil du temps vérifiable. Préparation d’un référentiel Pour déterminer l’état de prédisposition d’un sujet, on procède à un prélèvement biologique. Le prélèvement est préférentiellement un prélèvement sanguin, mais peut aussi être un prélèvement cutané ou un prélèvement de liquide céphalo-rachidien. On procède au dosage des N biomarqueurs susvisés, et un détermine un N-uplet définissant un point dans l’espace à N dimension. On associe à ce point l’état de prédisposition à une maladie neurodégénérative du domaine le plus proche. Traitement d’un prélèvement A titre d’exemple non limitatif, le dosage des biomarqueurs est effectuée à partir d’un échantillon de tissu sain, de préférence des lymphoblastes / lymphocytes ou des fibroblastes. Les premiers sont de préférence prélevés à partir du sang et les seconds sur le tissu conjonctif ou la peau d'un individu. Cet échantillon peut être prélevé par prélèvement sanguin ou biopsie. Le dosage des biomarqueurs peut être réalisée par une procédure bien connue de l’homme de métier consistant à effectuer : 1- une analyse par qPCR de l’expression des différents biomarqueurs sur l’ADN codant et comportant : a) des moyens pour extraire l’ARN et synthétiser les ADN codants de l'échantillon cellulaire, c'est-à-dire des réactifs tels qu'un tampon de lyse et un KIT de RT-PCR connus de l'homme du métier, b) des moyens pour déterminer au niveau de l’ADN codant dudit échantillon cellulaire l’expression de certains gènes en l'état basal (dans l’état dans laquelle on trouve l‘ADN dans la cellule, sans modification externe), par l’utilisation de réactifs de qPCR connus de l’homme de métier et d’un appareil de qPCR. Les informations d’expression sont ensuite analysées in silico afin de déterminer les expressions des gènes testés pour chaque individu. 2- Une analyse de la morphologie nucléaire de fibroblastes à l’aide de biomarqueurs spécifiques comportant : Des moyens pour visualiser l’ADN (DAPI) et la lamina nucléaire (anticorps anti-lamine A/C) Des moyens pour confirmer l’accumulation de biomarqueurs dans la cellule (anticorps anti-pATM, anticorps anti-progérine) Réalisation d’un dosage Un premier objet de l’invention est un procédé pour caractériser la sévérité de la maladie d’Alzheimer à partir d’un échantillon prélevé sur un patient dans lequel: On réalise une extraction d’ADN à partir d’un échantillon sanguin ou de peau et un séquençage de l’allèle APOE afin de connaître le statut du patient On réalise une extraction d’ARN puis une synthèse d’ADN codant appelé « échantillon génomique » On détermine sur cet échantillon génomique l’expression des marqueurs ATM, APOE, GSNOR, PARKIN2, SOX2 ainsi que la quantification d’ADN mitochondrial On détermine la sévérité de la pathologie par une association des expressions de ces marqueurs avec le génotype APOE qui permet de séparer les patients « jeunes alzheimer » des « vieux alzheimers » Un deuxième objet de l’invention est un procédé pour caractériser le statut « malade alzheimer » à partir d’un échantillon prélevé de peau sur un patient dans lequel : On amplifie les cellules prélevées On détermine la morphologie des noyaux des cellules à l’aide de marquages réalisés au DAPI ou avec un marqueur de la lamina nucléaire (anticorps anti-lamine A/C) On détermine une accumulation spécifique de biomarqueurs en périnucléaire pour la protéine ATM (présence d’accumulation périnucléaire) et à l’intérieur de la lamina nucléaire par immunofluorescence. Exemples : Des fibroblastes issus de 10 patients atteints par la maladie ont été amplifiés puis le matériel génétique (ADN et ARN) a été extrait et un certain nombre d’analyses ont été réalisées par séquençage, qPCR et Immunofluorescence. Les figures 1 à 4 illustrent les courbes de quantification d’ATM en fonction des génotypes de patients. La quantification d’ATM permet de détecter les patients ayant un génotype APOE4. Les figures 1 et 2 illustrent la détection des cas APOE4 plus sévères via la quantification d’ATM par qPCR) sur des lignées cellulaires provenant de 10 patients Alzheimer. Nous avons tout d’abord observé que tous les patients avec un génotype APOE4 (résultats obtenus par séquençage) avaient moins de 60 ans ( ). De plus, la quantité d’ATM détectée par qPCR permet d'identifier avec une performance de 80% ( : courbe ROC à droite) les patients ayant un génotype APOE4 et par extension, les patients les plus jeunes (donc ayant un phénotype plus sévère). La illustre la détection des cas APOE4 plus sévères via la quantification de l’accumulation périnucléaire d’ATM par immunofluorescence sur des lignées cellulaires provenant de 10 patients Alzheimer. De plus, la quantité de cellules ayant des accumulations périnucléaires de pATM détectée par immunofluorescence permet d'identifier avec une performance de 80% ( : courbe ROC à droite) les patients ayant un génotype APOE4 et par extension, les patients les plus jeunes (donc ayant un phénotype plus sévère). Les figures 5 et 6 illustrent la distribution des patients en fonction de l’âge de déclaration des symptômes (n=10) via la quantification d’ATM par qPCR ou le nombre de foci de pATM à 24h quantifiés par immunofluorescence. Les patients Alzheimer ont été répartis en 2 classes en : Patients Patients >= 60 ans (0 sur la figure) On observe que les patients ayant plus de 60 ans sont ceux pour lesquels l’expression d’ATM est la plus forte ( ). De la même façon la distribution du nombre de foci de pATM à 24h post-irradiation diffère en fonction de l’âge ( ). Les patients les plus jeunes sont ceux qui ont le plus de foci donc une réparation défectueuse. Les figures 6 à 8 illustrent les graphes d’augmentation des anomalies morphologiques observées en fonction de l’âge des patients. La illustre les comptages du nombre de cellules avec anomalies nucléaires détectées par un marquage au DAPI. La illustre des anomalies de la lamina nucléaire par un marquage lamine A/C. A. % de cellules ayant des anomalies de la lamina nucléaire (visualisée par immunofluorescence avec un anticorps anti-lamine A/C). 100 noyaux comptés. **P=0,01 B. Marquage de la lamina nucléaire au niveau de noyaux de fibroblastes d’un patient Alzheimer. La flèche indique les anomalies nucléaires. C. Distribution du % d’anomalies de la Lamina Nucléaire dans des fibroblastes de patients Alzheimer en fonction du sexe (p=0,0078). On observe que ces anomalies de la lamina nucléaires augmentaient significativement en fonction de l’âge des patientes (Test de Wilcoxon p =0,0076) et du sexe des patients (Test de Wilcoxon p=0,0078). La illustre la quantification de la progérine par western blot dans les cellules Alzheimer. Nous avons pu observer que tous les patients atteints par la maladie d’Alzheimer exprimaient la progérine, qui est une version anormale de la protéine Lamine A/C contenue dans la lamina nucléaire et qui est responsable de la maladie de vieillissement prématuré, le syndrome Progéria de Hutchinson Gilford (Varela et al, Nature Medecine 2008). La illustre l’expression des gènes ATM, GSNOR, et la quantification de l’ADN mitochondrial chez 10 patients atteints par la maladie d’alzheimer. Elle met en évidence une corrélation significative entre les patients ayant un génotype APOE4, et la diminution de la quantité de ces 3 biomarqueurs chez des patients ayant moins de 60 ans. La combinaison de l’ensemble de ces facteurs permet de détecter par le biais de plusieurs biomarqueurs les patients de moins de 60 ans, ayant un phénotype APOE4 et atteints par la maladie d’alzheimer. – Procédé de diagnostic pour la qualification du statut d'un sujet vis-à-vis de la maladie d'Alzheimer, comportant : A. une étape initiale consistant à collecter des données de références comprenant : une base de valeurs témoins VT x de référence pour des sujets sains pour chacun des gènes ATM, APOE, GSNOR, PARKIN2, STOX2, d’ADN mitochondrial des classes de statuts connus, déterminées à partir de n-uplets normalisés CR x obtenus à partir des prélèvements biologiques sur des cohortes homogènes par rapport à un ou plusieurs critères de classification de patients présentant un statut R de référence commun pour déterminer un sous-espace R correspondant à un statut donné B. des étapes de diagnostic, pour un nouveau sujet, consistant à : a. procéder à un prélèvement biologique b. extraire le matériel génomique, puis c. réaliser une quantification comprenant une partie au moins des marqueurs suivants : du gène ATM et de son expression pour établir une première valeur V ATM du gène APOE et de son expression pour établir une deuxième valeur V APOE du gène GSNOR et de son expression pour établir une troisième valeur V GSNOR du gène PARKIN2 et de son expression pour établir une quatrième valeur V PARKIN2 du gène STOX2 et de son expression pour établir une cinquième valeur V STOX2 de la quantité d’ADN mitochondrial pour établir une sixième valeur V ADNM d. procéder à une normalisation desdites valeurs V x pour déterminer six coefficients normalisés C x = I V x - VT x I /VT x I e. déterminer le sous-espace le plus proche au sens de distance euclidienne dudit n-uplet C x pour déterminer le statut dudit sujet. – Procédé de diagnostic pour la qualification du statut d'un sujet vis-à-vis de la maladie d'Alzheimer, selon la revendication 1 caractérisé en ce que lesdits prélèvements biologiques sont des prélèvements sanguins. – Procédé de diagnostic pour la qualification du statut d'un sujet vis-à-vis de la maladie d'Alzheimer, selon la revendication 1 caractérisé en ce que lesdits prélèvements biologiques sont des prélèvements de peau. – Procédé de diagnostic pour la qualification du statut d'un sujet vis-à-vis de la maladie d'Alzheimer, selon la revendication 1 caractérisé en ce que lesdits prélèvements biologiques sont des prélèvements de cellules cérébrales ou des cellules provenant d’une ponction de liquide céphalo-rachidien. – Procédé de diagnostic pour la qualification du statut d'un sujet vis-à-vis de la maladie d'Alzheimer, selon la revendication 1 caractérisé en ce qu’il comporte une étape additionnelle consistant à isoler les cellules pour caractériser la morphologie des noyaux cellulaires et le taux de progérine, pour déterminer la valeur P de la proportion de cellules présentant un noyau déformé et à déterminer le statut de vieillissement en fonction de la classe d’appartenance de cette valeur P pour pondérer par analyse de la morphologie des noyaux (80% des noyaux normaux) par immunofluorescence et anticorps et ou un intercalant de l’ADN fluorescent, pour confirmer la probabilité d’AD, même asymptomatique et/ou un taux de progérine plus élevé que la normale. – Procédé de diagnostic pour la qualification du statut d'un sujet vis-à-vis de la maladie d'Alzheimer, selon la revendication 1 caractérisé en ce qu’il comporte une étape d’analyse des cellules pour vérifier la présence en périnucléaire de la protéine phosphoAPOE et/ ou quantifier la protéine phosphoAPOE. – Procédé de diagnostic pour la qualification du statut d'un sujet vis-à-vis de la maladie d'Alzheimer, selon la revendication 1 caractérisé en ce qu’il comporte une étape d’analyse par une méthode de régression sur un N-uplet de valeurs V x correspondant au sujet à diagnostiquer et un N-uplet de valeurs témoins VT x . – Procédé de diagnostic pour la qualification du statut d'un sujet vis-à-vis de la maladie d'Alzheimer, selon la revendication 1 caractérisé en ce qu’il comporte une étape de dosage d’un biomarqueur pATM-pAPOE dans un prélèvement cutané provenant du sujet. – Procédé de diagnostic pour la qualification du statut d'un sujet vis-à-vis de la maladie d'Alzheimer, selon la revendication précédente caractérisé en ce que ledit dosage comporte la quantification du pourcentage de fibroblastes présentant des accumulations périnucléaires spontanées et / ou post-irradiation de pATM et de pAPOE sur un échantillon significatif de cellules. - Kit de diagnostic pour la qualification du statut d'un sujet vis-à-vis de la maladie d'Alzheimer, conformément au procédé objet de la revendication 1 caractérisé en ce qu’il comprend une partie au moins des marqueurs suivants : du gène ATM et de son expression pour établir une première valeur V ATM du gène APOE et de son expression pour établir une deuxième valeur V APOE du gène GSNOR et de son expression pour établir une troisième valeur V GSNOR du gène PARKIN2 et de son expression pour établir une quatrième valeur V PARKIN2 du gène STOX2 et de son expression pour établir une cinquième valeur V STOX2 de la quantité d’ADN mitochondrial pour établir une sixième valeur V ADNM et un calculateur pour : a. procéder à une normalisation desdites valeurs V x pour déterminer six coefficients normalisés C x = I V x - VT x I /VT x I b. déterminer le sous-espace le plus proche (au sens de distance euclidienne) dudit n-uplet C x pour déterminer le statut dudit sujet.