Brevet FR3147115A1 — publié le 20241004

La présente invention concerne une puce microfluidique (30) pour générer et trier des microgouttes (32) monodispersées. Selon l’invention, la puce microfluidique (30) comprend une zone de jonction (7), une zone de détente (8) en aval de la zone de jonction (7), et une zone de tri (18) disposée en aval de la zone de détente (8), la zone de jonction (7) comprenant une buse centrale (21) d’injection de fluide central (3), deux buses latérales (22, 23) d’injection de fluide de gaine (1), la buse centrale (21) ayant une plus petite largeur x comprise entre 2 et 10 micromètres, chacune des deux buses latérales (22, 23) ayant une plus petite largeur x1 comprise entre 3 et 10 micromètres, un microcanal fluidique (24) ayant une largeur y comprise entre 2 et 7 micromètres et une longueur z comprise entre 2 et 10 micromètres, et une zone de détente (8) ayant une plus grande largeur u comprise entre 20 et 75 micromètres et une longueur V comprise entre 100 et 600 micromètres, la zone de jonction (7), le microcanal fluidique (24) et la zone de détente (8) ayant une profondeur h comprise entre 2 et 10 µm. Figure pour l’abrégé : Fig. 2 Puce microfluidique et procédé pour générer et trier des microgouttes monodispersées à haute fréquence Domaine technique de l'invention La présente invention concerne le domaine technique des puces microfluidiques et procédés pour générer et trier à haute fréquence des microgouttes monodispersées et ordonnées ayant un volume dans la gamme entre 1 femtolitre (fL) et 200 fL. Elle concerne en particulier une puce microfluidique permettant de générer des microgouttes d’un volume déterminé, monodispersées et ordonnées, à haute fréquence, c’est-à-dire à une fréquence supérieure ou égale à 1 kilohertz (kHz), de préférence à supérieure ou égale 10 kHz, par exemple de 60 kHz. Elle concerne aussi une puce microfluidique permettant de générer et de trier activement une par une chaque microgoutte du train de microgouttes monodispersées, le tri pouvant être effectué à haute fréquence, c’est-à-dire à une fréquence supérieure à 10 kHz, par exemple de 60 kHz. Etat de la technique Dans le domaine ci-dessus, il est connu d’utiliser des cytomètres en flux pour détecter, dénombrer, identifier des cellules ou des particules de dimensions micrométriques mises en suspension dans un fluide en écoulement en les faisant défiler, une par une et à grande vitesse, dans le faisceau d'un ou de plusieurs lasers. Certains cytomètres trieurs permettent en outre de trier ces particules par la mise en œuvre de méthodes de tri basées sur des techniques variées. Les progrès en microscopie et en biologie ont permis de s’intéresser à des objets de taille toujours plus petite, en particulier à des nano-objets de taille inférieure à 100 nm. Cependant, les cytomètres en flux traditionnels génèrent des gouttes de diamètre compris entre 30 micromètres (µm) et 300 µm, soit des volumes compris entre 10 picolitres et 10 nanolitres et ne permettent de trier que des objets de taille supérieure à plusieurs centaines de nanomètres. Pour des objets de taille inférieure à 100 nm, les cytomètres sont actuellement limités par leur capacité de détection. De plus, concernant l’opération de tri de nano-objets, les volumes de fluide généralement utilisés par les trieurs de cellules connus et la taille des gouttes servant à encapsuler les objets à trier ne sont pas compatibles avec le tri d’objets de taille nanométrique. En effet, les études portant sur des objets de taille nanométrique (comprise entre quelques nanomètres et quelques dizaines voire quelques centaines de nanomètres) nécessitent de pouvoir analyser ces objets un par un. Compte tenu de la très faible taille de ces objets, il s’est avéré intéressant d’un point de vue pratique d’encapsuler ces objets dans des gouttes de fluide, ces gouttes étant alors plus aisées à manipuler, analyser, trier. Lorsque l’on extrait des gouttes d’un liquide contenant une certaine concentration de ces particules, la loi de Poisson permet très classiquement de calculer les probabilités qu’une goutte donnée contienne N particules, N étant un entier positif ou nul. Cette loi s’écrit : dans laquelle P(N) est la probabilité qu’une goutte contienne N particules, et λ est le nombre moyen de particules par goutte, pour une goutte de volume donné et une concentration volumique de particules donnée. En particulier, si l’on cherche à encapsuler des objets individuels, cette loi permet de déterminer, pour une dilution ou une concentration volumique données, le volume optimal des gouttes pour lequel le nombre de gouttes contenant plus d’une particule est minimisé, tout en maximisant le nombre de gouttes non vides. Les concentrations typiques de liquides contenant des nanoparticules organiques sont en général comprises entre 10 9 et 10 10 particules par ml. Selon les calculs ci-dessus, des gouttes sphériques de 30 µm à 300 µm de diamètre (de volume compris entre 10 picolitres et 10 nanolitres) sont adaptées à des échantillons ayant une concentration comprises entre 10 3 et 10 6 particules par ml, ce qui est tout à fait insuffisant pour des échantillons usuels de particules nanométriques biologiques. Pour atteindre ces concentrations, il serait nécessaire de diluer les échantillons biologiques de manière tout à fait excessive (par exemple un échantillon typique de 1ml devrait être dilué jusqu’à un volume au minimum de 1 litre, voire 1000 litres. Au contraire, les biologistes souhaitent concentrer de tels échantillons. Pour une concentration moyenne de 5.10 9 particules par ml, la loi de Poisson permet de déterminer les probabilités qu’une goutte donnée contienne 0, 1 ou 2 particules en fonction du volume de la goutte. Pour que le nombre de gouttes contenant une seule particule soit supérieur ou égal à 10%, tout en maintenant le nombre de gouttes contenant plus d’une particule inférieur ou égal à 1%, le volume des gouttes est compris entre 30 fL et 40 fL. A cette concentration de 5.10 9 particules par ml, pour des gouttes de volume inférieur à 30 fL, le pourcentage de gouttes vides, c’est-à-dire sans aucune particule, est supérieur à 90%, ce qui allonge les durées d’analyse, toutes les gouttes devant être analysées alors que la plupart sont vides. Inversement pour des gouttes de volumes supérieur à 40 fl, le pourcentage de gouttes contenant plus d’une particule est supérieur à 1%, ce qui est une source d’erreur significative, réduisant ainsi la qualité de l’analyse et du tri. Les microgouttes de fluide échantillon (i.e. le fluide central) peuvent être générées par émulsification dans un fluide de gaine, le fluide échantillon et le fluide de gaine étant immiscibles entre eux, par exemple à base d’eau dans l’huile ou d’huile dans l’eau. Les microgouttes peuvent être générées par focalisation de flux dans un microcanal d’une puce microfluidique, de façon à ce que le fluide échantillon se scinde en microgouttes dispersées dans le fluide de gaine. Le diamètre ou le volume des microgouttes dépend généralement de la taille des microcanaux de la puce microfluidique et varie aussi en fonction de nombreux paramètres environnementaux, tels que des variations de pression ou de débit des fluides injectés. Cependant, les phénomènes hydrodynamiques à l’échelle microscopique sont complexes à prévoir et modéliser. Dans un même dispositif microfluidique, la génération de gouttes est très dépendante des conditions d’injection. On observe au cours du temps des variations du volume des microgouttes qu’il est difficile de contrôler. Dans le présent document, on entend par microgouttes monodispersées, des microgouttes ayant toutes un même volume +/- 20% par exemple. Autrement dit, le volume des microgouttes monodispersées est uniforme. Les microgouttes monodispersées sont généralement en suspension dans un flux de fluide d’encapsulation ou fluide de gaine. On connait des dispositifs microfluidiques permettant de générer des microgouttes monodispersées ayant un volume de l’ordre de 10 pL, c’est-à-dire un diamètre supérieur à 30 μm, pouvant fonctionner à une fréquence de génération inférieure à 5 kHz en général et parfois jusque 30 kHz. Toutefois, le volume de ces microgouttes est trop grand par rapport à des nano-objets que l’on souhaite analyser individuellement. La publication « Shui, L., van den Berg, A. & Eijkel, J.C.T. Scalable attoliter monodisperse droplet formation using multiphase nano-microfluidics. Microfluid Nanofluid 11, 87–92 (2011). https://doi.org/10.1007/s10404-011-0776-7 » décrit un dispositif comprenant une interface nanocanal-microcanal permettant de générer des gouttes monodispersées ayant un diamètre compris entre 0.4 et 3.5 µm (avec un volume minimum de 30 aL). Toutefois, la fréquence de génération de ces microgouttes est limitée à quelques centaines de hertz. Les gouttes générées sont stockées dans un réservoir et forment en empilement compact à 2D. La publication Shim JU, Ranasinghe RT, Smith CA, Ibrahim SM, Hollfelder F, Huck WT, Klenerman D, Abell C. Ultrarapid generation of femtoliter microfluidic droplets for single-molecule-counting immunoassays. ACS Nano. 2013 Jul 23;7(7):5955-64. doi: 10.1021/nn401661d. Epub 2013 Jul 8. PMID: 23805985, décrit un dispositif de génération de gouttes ayant un volume de 32 fL. Toutefois, ce dispositif ne permet pas un tri de gouttes individuelles à la volée. Les systèmes microfluidiques comprennent en général une puce microfluidique pour la production de gouttes et une autre puce microfluidique pour le tri des gouttes, les gouttes étant stockées dans l’intervalle entre leur production et leur tri. Un tel arrangement nécessite la réinjection des gouttes dans une autre puce, ce qui est particulièrement complexe, et augmente notablement à la fois le temps du traitement et les risques d’erreurs ou autres difficultés telles que fusion des gouttes, fuite du liquide des gouttes vers le liquide de gaine, difficultés de manipulation et nécessite des gouttes de volume relativement grand. Il existe un besoin pour un dispositif et une méthode permettant d’isoler, détecter, analyser et trier individuellement des objets de taille inférieure au micromètre, qui sont par exemple encapsulés dans des microgouttes, à haute cadence. A cet effet, il existe un besoin pour un dispositif et une méthode permettant de générer des microgouttes monodispersées ayant un volume déterminé de l’ordre du femtolitre, par exemple compris entre 1 fL et 200 fL, à une fréquence de génération supérieure à 1kHz, de préférence supérieure ou égale à 10 kHz et pouvant atteindre plusieurs dizaines de kHz ou la centaine de kHz, et permettant une analyse et/ou un tri individuel de chaque microgoutte également à haute cadence, idéalement à la même cadence que la fréquence de génération. Il existe un besoin pour un dispositif et une méthode permettant de générer de telles microgouttes monodispersées qui soit stable, reproductible, insensible aux variations de paramètres environnementaux et de fabrication aisée. De plus, il existe un besoin pour un dispositif et une méthode permettant de générer de telles microgouttes monodispersées, puis de détecter individuellement et trier activement chaque microgoutte sur la même puce fluidique, à une haute cadence de tri, supérieure à 10 kHz et pouvant atteindre plusieurs dizaines de kHz ou la centaine de kHz. Présentation de l'invention Dans ce contexte, la présente invention propose une puce microfluidique pour générer et trier des microgouttes monodispersées à base d’un fluide central dans un fluide de gaine, le fluide central et le fluide de gaine étant immiscibles entre eux. Selon l’invention, la puce microfluidique comprend un canal d’injection de fluide central, deux canaux d’injection de fluide de gaine et en ce que la puce microfluidique comprend une zone de jonction, une zone de détente en aval de la zone de jonction et une zone de tri disposée en aval de la zone de détente, un microcanal fluidique reliant fluidiquement la zone de jonction à la zone de détente, la zone de tri comprenant un canal fluidique relié fluidiquement en entrée à la zone de détente et en aval à au moins deux canaux de sortie, la zone de jonction comprenant une buse centrale reliée fluidiquement au canal d’injection de fluide central, deux buses latérales disposées sur deux côtés opposés de la zone de jonction, chacune des deux buses latérales étant reliée fluidiquement à l’un des deux canaux d’injection de fluide de gaine, le microcanal fluidique étant disposé sur une face opposée de la zone de jonction par rapport à la buse centrale, la buse centrale ayant une plus petite largeur x comprise entre 2 et 10 micromètres, chacune des deux buses latérales ayant une plus petite largeur x1 comprise entre 3 et 10 micromètres, le microcanal fluidique ayant une largeur y comprise entre 2 et 7 micromètres et une longueur z comprise entre 2 et 10 micromètres, la zone de détente ayant une plus grande largeur u comprise entre 20 et 75 micromètres et la zone de détente ayant une longueur V comprise entre 100 et 600 micromètres, et en ce que la zone de jonction, le microcanal fluidique, la zone de détente et le canal fluidique de la zone de tri ont une profondeur h comprise entre 2 micromètres et 10 micromètres, la puce microfluidique étant apte à générer via le microcanal fluidique des microgouttes monodispersées ayant un volume déterminé compris entre 1 femtolitre et 200 femtolitres. Ainsi, la puce microfluidique permet de générer séquentiellement, une par une, des microgouttes d’un fluide central monodispersées dans un fluide de gaine à une fréquence de production stable supérieure à 10 kilohertz, par exemple de 60 kHz. Les microgouttes ont un diamètre déterminé par les dimensions et la géométrie des buses d’entrée de fluide central et de fluide de gaine, et de la buse de sortie (i.e. le microcanal fluidique reliant la zone de jonction à la zone de détente), par exemple un diamètre compris entre 4 et 5 micromètres. Ainsi, les microgouttes sont monodispersées, c’est-à-dire que toutes les microgouttes ont le même volume et ce volume est prédéterminé. De plus, les microgouttes monodispersées ainsi générées restent ordonnées en une seule colonne dans la zone de détente. D’autres caractéristiques non limitatives et avantageuses de la puce microfluidique conforme à l’invention, prises individuellement ou selon toutes les combinaisons techniquement possibles, sont les suivantes : - la zone de tri comprend une électrode active disposée sur un côté du canal fluidique et deux électrodes de masse disposées des deux côtés du canal fluidique, les deux électrodes de masse encadrant l’électrode active dans la zone de tri autour du canal fluidique, l’électrode active étant à une distance minimum du canal fluidique comprise entre 5µm et 40 µm ; - la zone de tri comprend deux électrodes actives et deux électrodes de masse, les deux électrodes actives étant disposées sur deux côtés opposés du canal fluidique, les deux électrodes de masse étant disposées sur deux côtés opposés du canal fluidique, chacune des deux électrodes de masse encadrant une des deux électrodes actives dans la zone de tri autour du canal fluidique, chacune des deux électrodes actives étant à une distance minimum du canal fluidique comprise entre 5µm et 40 µm ; - la puce microfluidique comprend au moins un canal latéral relié fluidiquement à l’entrée de la zone de tri, le au moins un canal latéral étant adapté pour injecter un flux de fluide de gaine ; - la puce microfluidique comprend au moins un microcanal d’équilibrage reliant fluidiquement un des canaux de sortie à un autre canal de sortie, ledit au moins un microcanal d’équilibrage ayant une profondeur égale à la faible profondeur h ; - la zone de détente a en sortie du microcanal fluidique une largeur réduite r comprise entre 5 et 15 micromètres et la zone de détente s’élargit vers l’aval de la largeur réduite r jusqu’à la plus grande largeur u ; - la zone de détente est reliée au canal fluidique de la zone de tri par un canal fluidique ayant une profondeur égale à la faible profondeur h et une largeur d’environ 20µm, la largeur de la zone de détente se rétrécissant vers l’aval de la plus grande largeur u jusqu’à la largeur d’environ 20µm du canal fluidique; - le canal d’injection de fluide central, les deux canaux d’injection de fluide de gaine et les au moins deux canaux de sortie ont une profondeur égale à la faible profondeur h ; - le canal d’injection de fluide central, les deux canaux d’injection de fluide de gaine et les au moins deux canaux de sortie ont une profondeur H supérieure à la profondeur h de la zone de jonction, la profondeur H étant comprise entre 6 micromètres et 20 micromètres ; - la puce microfluidique comprend un dispositif à base de micro-pompes ou de pousses-seringues adapté pour injecter le fluide de gaine et respectivement le fluide central dans la puce microfluidique. L’invention concerne aussi un procédé de génération et de tri de microgouttes monodispersées au moyen d’une puce microfluidique selon la présente divulgation. Ainsi, la puce microfluidique de la présente divulgation permet de réaliser trois fonctions sur la même puce : création de gouttes monodispersées de volume déterminé, compris entre 1 fL et 200 fL, propagation ordonnée des gouttes vers une zone de mesure et de tri, les gouttes étant disposées en une seule colonne, puis mesure et déflexion des gouttes individuelles selon le résultat de la mesure. La configuration de la puce microfluidique , notamment les dimensions de la zone de jonction, de la zone de détente et de la zone de tri ainsi que la faible distance entre la zone de production des microgouttes et la zone de tri permettent à la fois de générer des microgouttes monodispersées de faible volume, entre 1fL et 200 fL, à haute fréquence (par exemple plusieurs dizaines de kHz) et de les conduire en une seule colonne ordonnée de la zone de génération vers la zone de tri, puis de trier activement et individuellement chaque microgoutte, avec une grande efficacité et avec une haute fréquence de tri. Ainsi la présente divulgation présente les conditions pour réaliser un train de gouttes d’un diamètre connu, puis la propagation des gouttes en maintenant l’alignement de celles-ci en une colonne unique, orientée dans la direction d’écoulement du fluide de gaine, et à vitesse stable, puis le tri individuel des gouttes qui se présentent séquentiellement à la zone de mesure et de tri. Bien entendu, les différentes caractéristiques, variantes et formes de réalisation de l'invention peuvent être associées les unes avec les autres selon diverses combinaisons dans la mesure où elles ne sont pas incompatibles ou exclusives les unes des autres. De plus, diverses autres caractéristiques de l'invention ressortent de la description annexée effectuée en référence aux dessins qui illustrent des formes, non limitatives, de réalisation de l'invention et où : est une vue schématique du circuit fluidique d’une puce microfluidique selon un exemple de réalisation de la présente divulgation ; est une vue agrandie de la partie centrale de la puce microfluidique de la ; est une vue agrandie de la zone de jonction et d’une partie de la zone de détente de la puce microfluidique des figures 1 à 3 ; est une vue agrandie de la zone de jonction, la zone de détente et la zone de tri de la puce microfluidique des figures 1 et 2, avec des flèches indiquant la direction des différents flux ; ] est une vue de dessus agrandie de la zone de tri de la puce microfluidique des figures 1 à 4 ; est une vue en coupe AA de la zone de tri de la puce microfluidique illustrée en ; est une vue agrandie d’une zone de jonction et d’une zone de tri selon une variante de la puce microfluidique à trois canaux de sortie ; est une vue agrandie d’un dispositif microfluidique en fonctionnement, montrant la génération d’un train de gouttes et sa propagation en une colonne unique dans la zone de détente. Il est à noter que sur ces figures les éléments structurels et/ou fonctionnels communs aux différentes variantes peuvent présenter les mêmes références. Description détaillée Dans le présent document, on entend par fluide un liquide pur ou en mélange,ou une émulsion. La puce microfluidique 30 est généralement de forme planaire. La puce microfluidique 30 est fabriquée dans une plaque. Différents matériaux conviennent pour la plaque, tels que du verre ou encore un polymère, par exemple le polydiméthylsiloxane (PDMS), ayant une épaisseur de quelques millimètres par exemple de 5 mm. La puce microfluidique comporte une lame 31 formant couvercle qui est fixée par exemple par collage ou adhésion. La lame 31 est de préférence transparente pour permettre l’observation et la détection de particules en suspension dans un fluide. Par exemple, la lame 31 est une lame de microscope pour permettre l’observation de la puce microfluidique sous un objectif de microscope optique. Un circuit microfluidique comprenant notamment des canaux microfluidiques est formé sur la face de la puce microfluidique 30 disposée en regard de la lame 31. Nous allons décrire de manière détaillée un exemple de puce microfluidique en lien avec les figures 1 à 8. Sur la , on a représenté un exemple de puce microfluidique en vue de dessus, par exemple à travers la lame 31. La puce microfluidique comprend une entrée 2 de fluide de gaine et une entrée 4 de fluide central. Le fluide central et le fluide de gaine sont immiscibles entre eux. Le fluide central ou fluide échantillon est par exemple une solution aqueuse comprenant en suspension des micro- ou nanoparticules à analyser. Le fluide de gaine est un fluide non miscible avec le fluide central, par exemple une huile ou un mélange d’huile et de tensio-actif. L’entrée 2, respectivement 4, est reliée fluidiquement à un réservoir externe de fluide de gaine, respectivement à un réservoir externe de fluide central, les réservoirs (non représentés) étant équipés de micro-pompes ou de pousses-seringues pour injecter le fluide de gaine et respectivement le fluide central dans la puce microfluidique. En option, l’entrée 2, respectivement 4, comporte un filtre constitué par exemple de canaux de dimensions prédéterminées formés entre des piliers micrométriques 43 disposés en cercles concentriques autour d’une ouverture 41 traversant la puce microfluidique vers le réservoir correspondant. De façon avantageuse, d’autres piliers espaceurs 42 micrométriques sont par exemple disposés autour de l’ouverture 41, pour maintenir la profondeur des espaces où circule le fluide entre l’ouverture 41 et les canaux entre les piliers 43. Les piliers micrométriques 42 et 43 font partie de la plaque de la puce microfluidique et sont en général fixés à leur autre extrémité à la lame 31 formant couvercle. Un tel filtre permet de filtrer le fluide de gaine et respectivement le fluide central lors de leur injection dans la puce microfluidique, comme illustré schématiquement sur les figures 1-2. L’entrée 2 du fluide de gaine est reliée à deux canaux d’injection de fluide de gaine 1 par une jonction en T à une entrée et deux sorties. L’entrée 4 du fluide central est reliée à un canal d’injection de fluide central 3. En option, le canal d’injection de fluide central 3 comporte une portion 5 en méandre, par exemple en forme de S, qui permet de stabiliser la production des microgouttes. La puce microfluidique comprend une zone de jonction 7 entre les deux canaux d’injection de fluide de gaine 1 et le canal d’injection de fluide central 3, illustrée notamment sur la . Les deux canaux d’injection de fluide de gaine 1 conduisent le fluide de gaine vers la zone de jonction 7 et le canal d’injection de fluide central 3 conduit le fluide central vers la zone de jonction 7. La zone de jonction 7 fluidique comprend ici trois buses d’entrées et une buse de sortie. Plus précisément, la zone de jonction 7 comprend une buse centrale 21 reliée fluidiquement au canal d’injection de fluide central 3 et deux buses latérales 22, 23 disposées sur deux côtés opposés de la zone de jonction 7, chacune des deux buses latérales 22, 23 étant reliée fluidiquement à l’un des deux canaux d’injection de fluide de gaine 1. La buse de sortie de la zone de jonction est formée par un microcanal fluidique 24 disposé sur une face opposée de la zone de jonction 7 par rapport à la buse centrale 21. On note 28 une direction longitudinale de la buse centrale 21. De façon avantageuse, les buses latérales 22, 23 sont disposées transversalement à la direction longitudinale 28 et le microcanal fluidique 24 est dans l’axe de la direction longitudinale 28. La zone de production de microgouttes est située dans le microcanal fluidique 24. De façon avantageuse, comme illustré sur la , les deux canaux d’injection de fluide de gaine 1 comportent des filtres 6 constitués de plots répartis sur les trajets du fluide de gaine en amont de la zone de jonction 7. En option, un filtre analogue est disposé sur le canal d’injection de fluide central 3 en amont de la zone de jonction 7. Ces filtres 6 servent à retenir d’éventuelles particules indésirables de dimensions supérieures à la largeur des buses 21, 22, 23. De telles particules indésirables sont susceptibles de boucher les buses 21, 22, 23 et d’empêcher la formation des microgouttes. Selon la présente divulgation, les entrées et la sortie de la zone de jonction 7 présentent des dimensions micrométriques particulières. Dans le présent document, on entend par profondeur d’un canal microfluidique une dimension prise perpendiculairement au plan des figures 1 à 5. On entend par longueur d’un élément de la puce microfluidique, par exemple longueur d’un microcanal, une dimension prise selon l’axe longitudinal de cet élément, c’est-à-dire dans la direction d’écoulement du fluide dans ce microcanal, dans le plan des figures 1 à 5 et 7-8. On entend par largueur d’un élément de la puce microfluidique, par exemple largueur d’un microcanal, une dimension prise transversalement à l’axe longitudinal de cet élément, c’est-à-dire perpendiculairement à la direction d’écoulement du fluide dans ce microcanal, dans le plan des figures 1 à 5 et 7-8. La buse centrale 21 relie fluidiquement le canal d’injection de fluide central 3 à la zone de jonction 7 en réduisant progressivement sa largeur. A l’extrémité de raccordement de la zone de jonction 7, la buse centrale 21 présente une plus petite largeur x comprise entre 4 et 10 micromètres. La buse centrale 21 a ici par exemple une longueur t inférieure ou égale à 7 micromètres. Chacune des deux buses latérales 22, 23 relie fluidiquement l’un des deux canaux d’injection de fluide de gaine 1 à la zone de jonction 7 en réduisant progressivement leur largeur. A l’extrémité de raccordement de la zone de jonction 7, chacune des deux buses latérales 22, 23 a une plus petite largeur x1 comprise entre 4 et 10 micromètres. Chacune des deux buses latérales 22, 23 a ici par exemple une longueur S inférieure ou égale à 7 micromètres. De façon avantageuse, les deux buses latérales 22, 23 sont symétriques par rapport à la direction longitudinale 28. Le microcanal fluidique 24 a une largeur y comprise entre 2 et 7 micromètres et une longueur z comprise entre 2 et 10 micromètres Le microcanal fluidique 24 relie la sortie de la zone de jonction 7 à une zone de détente 8. La zone de détente 8 présente une forme évasée depuis la sortie du microcanal fluidique 24 vers l’aval de la puce microfluidique. La zone de détente 8 a une largeur réduite r comprise entre 5 et 15 micromètres au niveau de la jonction avec le microcanal fluidique 24. La zone de détente 8 s’élargit vers l’aval jusqu’à une plus grande largeur u comprise entre 20 et 75 micromètres. La zone de détente 8 a une longueur v comprise entre 100 et 600 micromètres. Par exemple, comme illustré sur la , la zone de détente 8 comprend un chanfrein 38 adapté pour élargir linéairement la zone de détente 8 de la largeur réduite r jusqu’à la plus grande largeur u. De façon avantageuse, la zone de détente 8 présente une forme se rétrécissant vers l’aval de la puce microfluidique de façon à faire passer les microgouttes une par une dans la zone de mesure et de tri, ci-après appelée zone de tri 18. Un canal fluidique 25 relie la sortie de la zone de détente 8 à la zone de tri 18. Le canal fluidique 25 a une largeur de 20µm et une longueur par exemple de 300µm. La zone de tri 18 comprend un canal fluidique 27 formant l’entrée d’une jonction à au moins deux canaux de sortie 13, 14. Le canal fluidique 27 est relié en aval du canal fluidique 25. En sortie de la zone de tri 18, le canal de sortie 13 permet par exemple de conserver les gouttes sélectionnées tandis que le canal de sortie 14 sert de poubelle pour collecter les gouttes non sélectionnées. Les canaux de sortie 13, 14 ont par exemple une largeur de 50µm. Selon un mode de réalisation particulier et avantageux, la puce microfluidique a des canaux ayant un profondeur h, aussi appelée faible profondeur, uniforme sur toute la puce microfluidique. La profondeur h est comprise entre 2 micromètres et 10 micromètres. Ainsi, la zone de jonction 7, la buse centrale 21, les buses latérales 22, 23, le microcanal fluidique 24, la zone de détente 8, le canal fluidique 25 et les canaux fluidiques dans la zone de tri 18 ont une profondeur égale à la profondeur h. L’entrée 4 et le canal d’injection de fluide central 3 ont une profondeur égale à la profondeur h. De même, le canal latéral a une profondeur égale à la faible profondeur h. Selon un autre mode de réalisation particulier et avantageux, la puce microfluidique comprend deux profondeurs de canaux : une grande profondeur H et une faible profondeur h, telle que h Dans tous les modes de réalisation, la zone de jonction 7 et le microcanal fluidique 24 où sont produites les microgouttes ont une profondeur h qui permet de limiter le diamètre des microgouttes et donc leur volume. Cette faible profondeur h est conservée depuis la zone de jonction 7 tout au long de la zone de propagation des gouttes, en particulier dans la zone de détente 8, le canal fluidique 25 et dans la zone de tri 18. Le maintien de la faible profondeur h continument sur tout le trajet des microgouttes depuis leur génération jusqu’au tri permet d’assurer le maintien du séquencement des gouttes en une seule colonne ordonnée dans le sens de l’écoulement du fluide de gaine (voir par exemple ). En sortie du microcanal fluidique 24, les microgouttes 32 générées forment une seule colonne qui est entraînée par le fluide de gaine. De façon non-intuitive, bien que la largeur de la zone de détente 8 soit supérieure au diamètre des microgouttes 32 d’environ un ordre de grandeur, les microgouttes 32 restent ordonnées suivant une seule colonne depuis la sortie du microcanal 24 jusqu’à la zone de mesure et de tri. Par exemple, une valeur de profondeur réduite h de 4,5 µm contribue à la formation de microgouttes ayant un diamètre inférieur ou égal à la profondeur réduite. Toutefois, le déplacement des fluides dans les zones de faible profondeur n’est possible que par le moyen d’un fort gradient de pression entre l’amont et l’aval. En particulier dans la zone de jonction 7 et le microcanal fluidique 24 où sont produites les microgouttes, les canaux sont les plus étroits et peu profonds. Dans un mode de réalisation, certains canaux sont plus profonds (H=10 μm) dans les zones qui ne sont pas critiques à la production, ni à la propagation ordonnée ni à la détection de microgouttes. Considérons un canal fluidique de section rectangulaire et un débit de fluide donné, la perte de charge est inversement proportionnelle au cube de la profondeur du canal fluidique, pour une même largeur de canal. Ainsi, un canal fluidique de profondeur H égale à 10 μm nécessite une pression amont ~10 fois moins élevée qu’un canal ayant une profondeur réduite de 4.5 μm et de même largeur. La fabrication, sur une même puce microfluidique, de canaux de grande profondeur H permet de réduire les contraintes mécaniques sur la puce microfluidique partout où la profondeur du canal n’est pas un paramètre critique pour la formation, la propagation ordonnée ou la détection des microgouttes. Dans tous les modes de réalisation, la géométrie de la buse de sortie, i.e. le microcanal fluidique 24 permet de générer de manière contrôlée des gouttes, de manière prédictible. Le volume des gouttes est déterminé par la géométrie de la jonction 7, et notamment du microcanal fluidique 24 formant la buse de sortie, et ne dépend pas des autres facteurs, en particulier est pratiquement indépendant des pressions du fluide de gaine et du fluide central. La fréquence de production des gouttes peut être contrôlée par variation du débit de fluide échantillon : par conservation de masse, le débit du fluide échantillon en entrée, noté Q, est égal au produit du volume des gouttes V par la fréquence de production f : Q=V . f. Le volume des gouttes étant constant, la variation du débit du fluide échantillon se traduit par une variation de fréquence de production des gouttes. Un aspect important de la présente divulgation est lié à la configuration et au fonctionnement de la zone de détente 8 qui est couplée au microcanal fluidique 24, i.e. la buse de sortie de la zone de jonction 7. Expérimentalement, selon la présente divulgation, la zone de détente 8 a une géométrie définie ni trop longue, ni trop courte, pour maintenir une séquence linéaire de gouttes 42. Comme indiqué plus haut, la zone de détente 8 a une profondeur égale à la faible profondeur h. Cette zone de détente 8 permet de maintenir les gouttes 42 produites en colonne unique, autrement dit permet de maintenir le séquencement des gouttes. La configuration et le fonctionnement de cette zone de détente 8 sont totalement contre-intuitifs pour l’homme du métier et la théorie fluidique ne sait pas prédire pourquoi cette zone est si importante. Au contraire, dans l’art antérieur, la plupart des dispositifs microfluidiques de production de gouttes génèrent des ensembles de gouttes dans lesquels les gouttes soit se mélangent soit se répartissent en deux ou plusieurs rangées parallèles, sans doute du fait des phénomènes de variation de vitesse entre les gouttes et le fluide de gaine. A titre d’exemple non limitatif, la puce microfluidique 30 est fabriquée par moulage sur une plaque de silicium préalablement structurée en relief par des techniques de microgravure. Une première couche de résine photosensible de faible épaisseur h (par exemple d’épaisseur h égale à 4,5 μm) est déposée sur une plaque de silicium initialement plane, par exemple par enduction centrifuge (ou « spin coating » en terminologie anglo-saxonne). Cette première couche est exposée par photolithographie avec un premier masque correspondant aux canaux ou éléments microfluidiques de faible profondeur h. Une fois cette couche développée, il reste la forme en positif (relief) des futurs canaux ou éléments microfluidiques de faible profondeur h. Dans le cas où certains canaux ont une plus grande profondeur, une seconde couche de résine plus épaisse, d’épaisseur H (par exemple d’épaisseur H égale à 10 μm) est déposée par-dessus la première couche, de manière analogue. La seconde couche est exposée par photolithographie avec un second masque correspondant aux canaux ou éléments microfluidiques de grande profondeur H puis développée pour faire apparaitre en positif les canaux ou éléments microfluidiques de grande profondeur H. Le second masque est aligné par rapport à la première couche de résine de façon à ce que les canaux de faible profondeur h (4.5 μm) et les canaux de grande profondeur H (10 μm) communiquent fluidiquement, en particulier au niveau des buses 22, 23. Le moule en silicium microstructuré est utilisé pour y déposer le PDMS, par exemple par coulage. La fabrication de la puce microfluidique repose sur des techniques de photolithographie et de micro-gravure avec des dimensions critiques supérieures au micromètre, la plus petite profondeur étant supérieure ou égale à 2 micromètres et la plus petite largeur étant supérieure ou égale à 2 micromètres. La fabrication de la puce microfluidique ne nécessite pas de mettre en œuvre des technologies de nanophotolithographie et de nanogravure, techniquement plus exigeantes et beaucoup plus coûteuses. Nous allons maintenant expliquer le fonctionnement de la puce microfluidique ainsi formée pour la génération de microgouttes monodispersées. La puce microfluidique est fixée à la lame 31 formant un côté des canaux microfluidiques. Le fluide central est injecté à travers l’entrée 4 de fluide central et circule dans le canal d’injection de fluide central 3 en direction de la zone de jonction 7. Le fluide de gaine est injecté à travers l’entrée 2 et circule dans les deux canaux d’injection de fluide de gaine 1 en direction de la zone de jonction 7. Le fluide central entre dans la zone de jonction 7 à travers la buse centrale 21 tandis que le fluide de gaine entre dans la zone de jonction 7 simultanément à travers les deux buses latérales 22, 23. La zone de jonction 7 forme ainsi une constriction du fluide central et du fluide de gaine. Au croisement de la zone de jonction, dans la zone de formation 29 de microgouttes, le fluide de gaine pince le fluide central qui se scinde en microgouttes 32 dans le microcanal fluidique 24. Des microgouttes 32 de fluide central sont ainsi générées une par une au sein du fluide de gaine. En sortie du microcanal fluidique 24, ces microgouttes 32 sont entrainées par le fluide de gaine dans la zone de détente 8 tout en étant transportées de manière ordonnée. Plus précisément, dans la zone de détente 8, depuis la sortie du microcanal 24, les microgouttes 32 sont alignées l’une derrière l’autre, en une seule colonne, orientée dans la direction d’écoulement du fluide de gaine (voir ). Le tableau I résume les gammes de valeurs des différents paramètres de dimensions de la zone de jonction et les gammes de valeurs de profondeur des microcanaux, ainsi que l’ensemble de ces valeurs pour un exemple de réalisation ayant deux profondeurs de canaux. La combinaison des valeurs de ces différents paramètres permet d’obtenir la formation de microgouttes monodispersées de diamètre déterminé et leur propagation en file unique ordonnée. Paramètre Valeur min (µm) Valeur max (µm) Valeur d’un exemple (µm) x 2 10 5 y 2 7 5 z 2 10 7 x1 3 10 5 u 20 75 50 V 100 600 300 – 400 t 0 7 5 S 0 7 5 r 5 15 7 h 2 10 4,5 H 6 20 10 Bien que ces paramètres ne soient pas indépendants les uns des autres, il est possible d’associer certains paramètres au régime de formation des microgouttes ou aux propriétés dimensionnelles des microgouttes ainsi obtenues. Selon la présente divulgation, la plus petite largeur x et la longueur t de la buse centrale 21 permettent à la buse centrale de former une constriction du fluide central. La plus petite largeur x1 de chacune des deux buses latérales 22, 23 est aussi un paramètre critique pour la formation de microgouttes. Les gammes de valeurs des paramètres x et x1 de la zone de jonction 7 permettent la formation des gouttes ayant un volume déterminé en sortie du microcanal fluidique 24 et avec une production stable de gouttes monodispersées. La plus petite largeur x1 et la longueur S de chacune des deux buses latérales 22, 23 permettent de former une zone de constriction du fluide de gaine. La faible profondeur h, la largeur y et la longueur z du microcanal fluidique 24 déterminent le diamètre des microgouttes 32. On a ici déterminé un ensemble de paramètres critiques pour la formation de microgouttes et qui influent sur la valeur du diamètre de la microgoutte 32. La plus grande largeur u de la zone de détente 8 détermine le régime fluidique permettant la formation et l’écoulement régulier et linéaire des microgouttes sur une seule colonne ordonnée. La longueur V de la zone de détente 8 permet de stabiliser le train de microgouttes en le maintenant sur une seule colonne ordonnée. La largeur réduite r de la zone de détente 8 permet la fabrication aisée par photolithographie de la zone de détente 8 qui s’étend sur plus grande largeur u et la longueur V et contribue également à la stabilisation de l’écoulement des gouttes. Les valeurs de l’exemple indiquées dans le tableau I permettent de générer des microgouttes ayant un diamètre stable de 4.5 µm environ soit un volume de 45 fL environ. De façon remarquable, les microgouttes 32 sont monodispersées et ont toutes le même diamètre environ égal à la faible profondeur h de 4,5 µm. De plus, les microgouttes 32 sont produites à une fréquence comprise entre 10.000 gouttes/sec et 60.000 gouttes/sec. Cette géométrie permet non seulement de contrôler le volume des gouttes de manière stable, mais aussi de conserver le volume constant sur une large plage de débits des fluides de gaine et de fluides échantillon. Lorsque les débits sont modifiés, la fréquence de production des gouttes est modifiée, mais leur volume reste constant. Ceci est particulièrement important pour permettre une bonne prédiction du nombre de particules contenues dans chaque goutte comme indiqué plus haut. Plus précisément, la largeur y et la longueur z du microcanal fluidique 24 influent sur le diamètre des microgouttes 32. Par exemple, la faible profondeur h étant égale à 4,5 µm, la plus petite largeur x étant égale à 5 µm et la largeur y étant égale à 4 µm, on obtient des microgouttes 32 ayant un diamètre compris entre 4 et 5 micromètres, par exemple de 4,5 μm. La profondeur de la zone de jonction 7, du microcanal fluidique 24 et de la zone de détente 8 étant dans cet exemple de 4,5 µm, les microgouttes 32 sont généralement de forme quasi-sphérique. La modification proportionnelle des valeurs de la longueur z, de la largeur y et de la profondeur h permet de produire des microgouttes de diamètre différent. De façon avantageuse, les valeurs de x, y et h sont égales : x=y=h. Par exemple, avec y=x=h = 3µm on obtient des gouttes de diamètre 3µm et de volume 13fl environ, ou avec y=x=h= 6µm on obtient des gouttes de volume 100fl. La puce microfluidique permet de générer des microgouttes monodispersées, de volume déterminé, compris entre 1 fL et 200 fL, par exemple entre 10 fL et 100 fL, de préférence entre 20 fL et 50 fL, et de manière encore préférée entre 30 fL et 40 fL. Le respect de cette relation entre y, x et h (avec certaines tolérances, de l’ordre de 20% à 30%) permet d’assurer la stabilité de l’écoulement en aval. Si la longueur z du microcanal fluidique 24 est trop petite, les gouttes générées ont un diamètre mal contrôlé, le plus souvent trop grand et fluctuant, ou beaucoup plus petites et irrégulières : on obtient alors des microgouttes polydispersées et non pas monodispersées. Si la longueur z du microcanal fluidique 24 est trop grande, les gouttes générées ont un volume trop important ce qui entraine des instabilités dans le flux aval et des erreurs sur le nombre de particules par goutte. Certains paramètres dimensionnels de la puce microfluidique sont ajustés pour permettre une fabrication aisée par les technique de photolithographie et de moulage. La longueur t de la buse centrale 21 est de préférence de 5 µm. Si la longueur t de la buse centrale 21 est trop petite, la buse centrale 21 risque d’être mal formée lors de la fabrication. Avantageusement, la longueur t est supérieure ou égale à la plus petite largeur x de la buse centrale 21. Si la longueur t de la buse centrale 21 est trop grande, la buse centrale 21 présente une résistance hydrodynamique élevée susceptible de freiner l’avancée du fluide central. Pour compenser une telle résistance, il serait nécessaire d’augmenter la pression du fluide central, ce qui risque d’induire des dommages sur la puce microfluidique, par exemple un décollement entre la plaque de PDMS et la lame de verre par délamination. La longueur t est ici inférieure ou égale à 7 µm. Les mêmes contraintes que pour la longueur t de la buse centrale 21 s’appliquent à la longueur S des deux buses latérales 22, 23. La zone de détente 8 est une zone où la vitesse linéaire des fluides est réduite, ce qui permet de stabiliser la formation des gouttes et évite le regroupement des gouttes, soit de manière chaotique, soit en plusieurs colonnes. Tout au long de la zone d’expansion, les gouttes sont accélérées par effet de viscosité avec le fluide de gaine, par exemple de l’huile, jusqu’à atteindre une vitesse quasiment égale à celle de l’huile. Les valeurs de la largeur u et de la longueur V de la chambre d’expansion sont ainsi relativement tolérantes, mais présentent des limites au-delà desquelles l’écoulement n’est plus stable en une seule colonne. Ces valeurs maximales sont respectivement de 50µm et de 500µm par exemple. Une fois l’écoulement stabilisé dans la zone de détente 8, un autre chanfrein 39 permet une transition vers le canal fluidique 25 et le canal fluidique 27 de la zone de tri 18 de largeur plus faible (par exemple 20µm). Cette largeur réduite du canal fluidique 27 dans la zone de tri 18 permet le positionnement des électrodes 10, 11 à faible distance de la rangée de gouttes 32, ce qui augmente l’effet de diélectrophorèse utilisé pour le tri. La zone de détente 8 présente avantageusement un chanfrein 38 à l’entrée (voir ) qui permet d’élargir la zone de détente de la largeur réduite r à la plus grande largeur u. De façon avantageuse, la zone de détente 8 présente aussi un autre chanfrein 39 vers l’aval (voir ) qui permet de réduire la zone de détente 8 de la plus grande largeur u à la largeur du canal fluidique 25 en sortie de la zone de détente 8. Lors de l’utilisation de la puce microfluidique, ce(s) chanfrein(s) favorise(nt) l’écoulement de fluide. Les microgouttes 32 peuvent être détectées individuellement par exemple par un système de détection de fluorescence en dirigeant un faisceau laser d’excitation vers le canal fluidique 25 en sortie de la zone de détente 8 ou vers le canal fluidique 27 dans la zone de tri 18. En sortie de la zone 8, le rétrécissement provoque une accélération du flux par conservation du débit ; les gouttes 32 ayant un diamètre stable, cette accélération a pour effet d’espacer les gouttes, qui sont mieux séparées pour les analyser et trier individuellement. Le canal latéral 9 apporte un débit supplémentaire de fluide de gaine, ce qui permet d’espacer les gouttes d’autant plus. De façon particulièrement avantageuse, la détection se fait dans le canal fluidique 25 ou 27 de faible profondeur h. Par exemple, un faisceau laser d’excitation est dirigé dans un plan transverse au plan de la puce microfluidique et un signal de fluorescence est détecté dans ce même plan transverse. La faible profondeur h, est environ égale au diamètre des microgouttes, ce qui permet de maintenir l’ordre des gouttes. De plus, la faible profondeur h permet aussi de limiter la contribution du fluide de gaine au signal détecté. Suite à la détection d’une microgoutte d'intérêt comportant un marqueur fluorescent, cette microgoutte peut être extraite sélectivement du flux dans la zone de tri 18 pour être orientée vers un canal de collection déterminé. Le système de détection génère un signal qui déclenche le tri de la microgoutte ainsi détectée. Différents dispositifs et méthodes de tri peuvent être utilisés, par exemple basé sur la diélectrophorèse, comme dans l’exemple détaillé ci-dessous. De façon particulièrement avantageuse, la puce microfluidique comprend aussi une zone de tri 18 intégrée sur la même plaque support. La zone de tri 18 est disposée en aval de la zone de détente 8. Le canal fluidique 25 relie par exemple la zone de détente 8 à la zone de tri 18. La zone de tri 18 comprend un canal fluidique 27 relié fluidiquement en entrée à la zone de détente 8 via le canal fluidique 25 et en sortie à au moins deux canaux de sortie 13, 14, par exemple via une jonction Y notée 12 dont la une branche commune est le canal fluidique 27. Le canal fluidique 25, le canal fluidique 27 et la jonction Y vers les deux canaux de sortie ont une profondeur égale à la faible profondeur h. Dans un exemple de réalisation, les deux canaux de sortie 13, 14 ont une profondeur égale à la grande profondeur H. En variante, les deux canaux de sortie 13, 14 ont une profondeur égale à la faible profondeur h. En option, un canal latéral 9 est relié fluidiquement à l’entrée de la zone de tri 18 via une buse 26. Le canal latéral 9 conduit un flux de fluide de gaine injecté via une entrée 19 (voir ). Le canal latéral 9 est adapté pour injecter un flux de fluide de gaine sur un côté du canal fluidique 27 à l’entrée de la zone de tri 18. Dans un exemple de réalisation, le canal latéral 9 a une profondeur égale à la grande profondeur H. En variante, le canal latéral 9 a une profondeur égale à la faible profondeur h. La buse 26 a une profondeur égale à la faible profondeur h. De façon avantageuse, comme illustré sur la , le canal latéral 9 comporte un filtre 6 constitués de plots répartis sur les trajets du fluide de gaine en amont de la buse 26. Comme indiqué plus haut, un tel filtre permet de retenir d’éventuelles particules indésirables de dimensions supérieures à la largeur de la buse 26 susceptibles d’obturer la buse 26 et de nuire à son fonctionnement. Le canal latéral 9 canal permet d’apporter du fluide de gaine supplémentaire au train de microgouttes déjà formé. Le canal latéral 9 canal permet, d’une part, de modifier l’espacement entre les microgouttes. En effet, en sortie de la zone de détente 8, les microgouttes 32 peuvent être relativement proches les unes des autres. Ceci rend le tri très difficile, puisqu’il nécessite une grande précision d’action pour trier une microgoutte sans influencer les microgouttes adjacentes. L’ajout de fluide de gaine via le canal latéral 9 permet d’augmenter l’espacement entre microgouttes à des valeurs de plusieurs diamètres de microgoutte, ce qui permet d’augmenter la sélectivité du tri. D’autre part, le canal latéral 9 a pour effet de dévier latéralement le flux de microgouttes, qui est orienté vers l’un des deux canaux de sortie par défaut, par exemple le canal de sortie 14 qui correspond par exemple à une poubelle collectant les microgouttes non sélectionnées. Le tri consiste à extraire activement une microgoutte sélectionnée individuellement en fonction d’un signal détecté pour l’orienter vers l’autre canal de sortie 13, les microgouttes non sélectionnées étant orientées de manière passive vers la sortie poubelle. Dans une moindre mesure, le débit de fluide de gaine dans le canal latéral 9 influe également la fréquence de production en modifiant la résistance hydrodynamique des fluides circulant dans la zone de détente 8. De façon avantageuse, la zone de tri 18 est une zone de tri par diélectrophorèse. A cet effet, de la puce microfluidique comprend des électrodes 10, 11 disposées de part et d’autre du canal fluidique 27 dans la zone de tri 18 (voir figures 2 et 4). Les canaux des électrodes sont formés de manière identique aux canaux fluidiques avec des entrées à leurs extrémités. Ces canaux sont ensuite remplis d’un matériau conducteur qui peut être de l’indium injecté à chaud, par exemple à environ 80°C. D’autres matériaux peuvent être envisagés pour fabriquer les électrodes, tels que liquide ionique, résine chargée ou gel conducteur. Plus précisément, une électrode active 10 est disposée sur un côté du canal fluidique 27, une électrode de masse 11 est disposée du même côté que l’électrode active 10 et une autre électrode de masse 11 est disposée sur un côté opposé du canal fluidique 27. L’électrode active 10 a une forme de U avec la base du U au plus près du canal fluidique 27. Les deux électrodes de masse 11 sont avantageusement de forme symétrique par rapport à la direction longitudinale du canal fluidique 27 de la zone de tri 18. Chaque électrode de masse 11 a une forme de M, les pointes du M étant disposées au plus près du canal fluidique 27. L’électrode active 10 en forme de U est disposée entre les deux pointes de l’électrode de masse 11 en forme de M. La distance minimum entre chacune des électrodes 10, 11 et le canal fluidique 27 est comprise entre 5µm et 40 µm, par exemple ici d’environ 10 µm. L’électrode active 10 est à la distance minimum du canal fluidique 27 à peu près au milieu de la zone de tri 18 dans la direction d’écoulement des fluides. Chacune des deux électrodes de masse 11 est à la distance minimum du canal fluidique 27 vers l’entrée de la zone de tri 18, par exemple juste en aval de la buse 26 du le canal latéral 9. Chacune des deux électrodes de masse 11 est aussi à la distance minimum du canal fluidique 27 vers la sortie de la zone de tri 18, en amont de la jonction 12 entre les deux canaux de sortie 13, 14. Par contre, au milieu de la zone de tri 18, les deux électrodes de masse 11 s’éloignent du canal fluidique 27 de façon à éviter d’interférer avec l’électrode active 10. De cette manière, les deux électrodes de masse 11 entourent l’électrode active 10 dans le plan du dispositif microfluidique et permettent de limiter l’extension spatiale du gradient de champ électrique vers l’amont et l’aval de la zone de tri 18. L’électrode active 10 est encadrée par le canal fluidique 27 et par une des électrodes de masse 11. La disposition des électrodes 10, 11 permet à la fois de maximiser le gradient de champ électrique sur la zone centrale du canal fluidique 27 au milieu de la zone de tri 18, et de confiner spatialement le gradient de champ électrique à la zone centrale dans laquelle se trouve la microgoutte à trier. Les deux électrodes de masse 11 permettent de limiter l’extension spatiale du gradient de champ électrique vers l’amont de la zone de tri 18, où ce gradient de champ serait susceptible d’influencer la microgoutte suivante. Les deux électrodes de masse 11 permettent de limiter l’extension spatiale du gradient de champ électrique en aval de la zone de tri 18, où ce gradient de champ serait susceptible d’affecter les microgouttes déjà triées qui se trouvent dans une zone plus large et plus profonde et éviter ainsi la fusion de plusieurs microgouttes déjà triées. La disposition des électrodes 10, 11 permet une plus grande efficacité du champ électrique notamment du fait que le canal fluidique 27 présente une largeur réduite, par exemple une largeur de 20µm, par rapport à la zone de détente 8. En effet l’effet de diélectrophorèse est d’autant plus efficace et spatialement contraint que les gouttes 32 sont proches des électrodes 10, 11. Ainsi les électrodes sont placées le plus près possible technologiquement du canal fluidique 27. Par exemple, la distance entre les électrodes et le canal fluidique 27 est de 10µm, le canal a une largeur de de 20µm et les gouttes 32 circulent au milieu du canal fluidique 27. La distance entre les électrodes 10, 11 et les gouttes 32 est dans cet exemple d’environ 20µm. Le procédé de tri comprend l’application d’une impulsion électrique haute-tension, par exemple entre 500 V et 1000 V crête (ou 1000V et 2000 V crête à crête pour les signaux alternatifs), et de durée courte T à l’électrode active 10. La durée T est par exemple comprise entre 10µs et 200µs ; il peut s’agir d’une impulsion positive, d’une impulsion négative, d’une période de sinusoïde ou carrée ou toute forme d’onde de moyenne nulle, ou de plusieurs périodes de sinusoïdes, carrés ou forme d’one de moyenne nulle. Cette impulsion peut être de tension continue. De préférence, cette impulsion est de tension alternative, à une fréquence électrique f choisie, d’une part, pour que la durée de l’impulsion T soit égale à une ou plusieurs période de la fréquence alternative 1/f, de façon à éviter de polariser le contenu du canal fluidique 27 dans la zone de tri 18. Et, d’autre part, la durée de l’impulsion électrique est choisie plus courte que, ou égale à ou légèrement supérieure à, le temps entre le passage de deux microgouttes 32 successives dans la zone de tri 18, afin d’assurer l’extraction d’une seule microgoutte 32. La gamme de fréquence électrique f est par exemple comprise entre 20 kHz et 200 kHz et la gamme de durées T entre 10µs et 50µs pour permettre un tri pour une fréquence de passage des gouttes comprise entre 10 kHz et 50 kHz. Les électrodes 10, 11 créent un champ électrique spatialement variable (gradient de champ), qui agit sur une microgoutte au moyen d’une force générée par un effet de diélectrophorèse. L’application d’une impulsion électrique sur une microgoutte dévie la microgoutte pour la diriger sélectivement vers l’un des deux canaux de sortie 13. Au contraire, en absence d’impulsion électrique, une microgoutte est dirigée vers l’autre des deux canaux de sortie 14. Les fractions triées dans les deux canaux de sortie 13, 14 peuvent être recueillies dans des collecteurs distincts reliés respectivement aux sorties 16 et 17. En variante, la puce microfluidique à deux canaux de sortie 13, 14 peut comporter deux électrodes 10 actives disposées symétriquement de part et d’autre du canal fluidique 27, comme illustré sur la . A titre d’exemple, les deux électrodes 10 actives peuvent être pilotées alternativement: l'une des électrodes étant utilisée pour diriger une microgoutte 32 vers la sortie 14 (poubelle) et l’autre électrode 10 étant utilisée pour diriger une autre microgoutte 32 vers le canal 13 de collection. De plus, les deux électrodes 10 actives peuvent être pilotées simultanément avec des tensions différentes, de façon à diminuer la tension requise pour obtenir l’effet de diélectrophorèse. Selon la présente divulgation, de manière continue sur le trajet fluidique des microgouttes 32 depuis la zone de formation 29 des microgouttes jusqu’à la zone de tri 18 inclus, tous les canaux et toutes les zones ont une profondeur égale à la faible profondeur h, qui détermine le diamètre des microgouttes, de 4,5 μm dans l’exemple du tableau I. La zone de jonction 7, y compris les buses d’entrée 21, 22, 23, le microcanal fluidique 24, la zone de détente 8, le canal fluidique 25, la buse 26 et la zone de tri 18, y compris le canal fluidique 27 et la jonction Y 12, ont une profondeur égale à la faible profondeur h. Dans un mode de réalisation particulier, la puce microfluidique comporte des canaux ou des zones ayant deux profondeurs distinctes. Dans ce mode de réalisation, les canaux d’injection de fluide de gaine 1 et 9, et les canaux de sortie 13, 14 sont plus profonds (profondeur H ~10 μm dans le même exemple), ces zones n’étant pas critiques à la production et à la détection et au tri de microgouttes. Par exemple sur la , les zones 3, 4, 5, 7 et 8 sont les zones de faible profondeur h ~4,5 μm. Entre la connexion du canal d’injection de fluide central 3 et la buse 21, la vitesse linéaire du fluide est déterminée par le débit volumique divisé par la section du canal. Choisir à cet endroit une faible profondeur de canal (4,5 μm) permet d’assurer une vitesse linéaire plus élevée, et ainsi d’éviter que les particules transportées par le fluide central ne se déposent. Par contre, depuis la buse 21 jusqu’à la sortie de la zone de tri 18, la faible profondeur h permet de maintenir le volume des microgouttes et de garantir que les microgouttes produites et détectées dans un certain ordre arrivent dans le même ordre dans la zone de tri 18. Les autres zones 1, 2, 9, 19, 13, 14, 16, 17, peuvent présenter une grande profondeur H de 10 μm, pour permettre de réduire les contraintes à l’écoulement du fluide et donc la pression nécessaire. De façon avantageuse, la puce microfluidique comprend un ou plusieurs microcanaux 15 d’équilibrage reliant fluidiquement l’un des deux canaux de sortie 13 à l’autre des deux canaux de sortie 14. Le ou les microcanaux 15 permettent d’équilibrer la pression entre les deux canaux de sortie 14, qui peuvent présenter des débits différents, liées à des pressions différentes, pouvant nuire à l’efficacité du tri. Les microcanaux 15 d’équilibrage ont une profondeur égale à la faible profondeur h, de 4.5μm par exemple, et une faible largeur de l’ordre de 5μm. Ces dimensions permettent d’éviter le passage de microgouttes triées entre les des deux canaux de sortie 14 via l’un des les microcanaux 15 d’équilibrage (voir figures 5-6). A titre d’exemple non limitatif, les microgouttes sont à base d’eau et le fluide de gaine à base d’une huile utilisée en microfluidique. La puce microfluidique est disposée horizontalement, les microcanaux 15 d’équilibrage de faible profondeur étant orientés vers le bas de la puce, de façon à ce que les microgouttes 32 plus légères que l’huile, remontent rapidement dans le haut du canal de sortie 13, ou 14 de grande profondeur H, par exemple égale à 10 μm. Ainsi, les microgouttes 32 ayant un diamètre de 4.5μm ont peu de risque d’être capturées par les microcanaux 15 d’équilibrage situés plus bas. La représente une puce microfluidique selon une variante de la puce microfluidique décrite en lien avec les figures 1 à 6. Dans cette variante, la zone de tri 18 comporte trois canaux de sortie. Le canal de sortie 14 est disposé au centre et correspond au canal poubelle. Deux canaux de sortie 13, 131 ou bras de collection sont disposés latéralement, par exemple symétriquement par rapport au canal de sortie 14, pour permettre un tri suivant deux critères distincts. De façon avantageuse, deux canaux latéraux 9 sont reliés fluidiquement via une buse 26 à l’entrée de la zone de tri 18, sur deux côtés opposés du canal fluidique 27. Chaque canal latéral 9 conduit un flux de fluide de gaine. Chaque canal latéral 9 est adapté pour injecter un flux de fluide de gaine sur un côté du canal fluidique 27 de la zone de tri 18. Dans un mode de réalisation, chaque canal latéral 9 a une profondeur égale à la grande profondeur H. De plus, le système d’électrodes comporte ici deux électrodes actives 10, 110 et deux électrodes de masse 11. Une électrode active 10 ou 110 en forme de U et une électrode de masse 11 en forme de M sont disposées de chaque côté du canal fluidique 27, symétriquement par rapport à la direction longitudinale du canal fluidique 27. Chacune des deux électrodes actives 10, 110 est à une distance minimum du canal fluidique 27 comprise entre 5µm et 40 µm, par exemple d’environ 10 µm. De préférence, les pointes du M de chaque électrode de masse 11 sont disposées au plus près du canal fluidique 27, par exemple à une distance minimum comprise entre 5µm et 40 µm, par exemple d’environ 10 µm. Chaque électrode active 10, 110 est encadrée par le canal fluidique 27 et par une des électrodes de masse 11. En l’absence de tension électrique sur les électrodes actives 10 et 110, toutes les gouttes 32 sont envoyées dans le canal de sortie 14. L’application d’une impulsion électrique sur l’une des deux électrodes 10 ou 110 a pour effet de dévier une goutte 32 se propagent dans la zone de tri 18 entre les deux électrodes 10 et 110 vers l’un des deux canaux de sortie 13 ou 131. La configuration illustrée sur la présente plusieurs avantages. Tout d’abord, elle permet une plus grande symétrie du flux qui améliore la stabilité. En effet, le dédoublement du canal latéral 9 en deux canaux latéraux situés de part et d’autre du canal fluidique 27 central, a pour effet de rendre symétrique l’apport de fluide de gaine, qui est utilisé alors uniquement pour contrôler l’espacement des gouttes 32. Enfin, on dispose d’une électrode 10, 110 pour diriger sélectivement les gouttes vers l’un ou l’autre des bras de sortie 13, 131. Cette configuration permet de séparer et collecter deux populations différentes de gouttes triées dans deux bras de collection différents 13 et 131 respectivement. Au contraire, le dispositif de la comporte une seule électrode active pour diriger les gouttes sélectionnées vers un seul bras de collection 13. De façon résumée, la zone de création de gouttes de la puce microfluidique comprend un microcanal fluidique 24 en sortie de la zone de jonction 7, le microcanal fluidique 24 présentant des dimensions telles que y~h environ, et z ≥ y et h. La zone de constriction du fluide central (par exemple un fluide aqueux) dans le flux de fluide de gaine (par exemple un fluide huileux) sont telles que x~x1~y. La zone de détente 8 a une largeur u d’environ 50µm et une longueur V d’environ 500µm. La sortie de la zone de détente 8 reliée au canal fluidique 25 présente en un rétrécissement jusqu’à la largeur d’environ 20µm dans la zone de mesure et de tri 18. Dans un mode de réalisation particulier, la puce microfluidique comporte des canaux et des zones ayant deux profondeurs distinctes : une faible profondeur h, continument sur le trajet fluidique des microgouttes 32 depuis la zone de formation 29 des microgouttes jusqu’à la zone de tri 18 incluse, et une grande profondeur H en dehors des zones critiques à la production, à la détection et au tri de microgouttes, telles que notamment les canaux d’injection de fluide de gaine et les canaux de sortie. Dans la zone de tri 18, les électrodes actives 10, 110 sont disposées au plus près du canal fluidique 27, par exemple à une distance d’environ 10 µm. L’utilisation d’électrodes de masse 11 de part et d’autre des électrodes actives 10, 110 permet de limiter l’extension spatiale du champ électrique dans le sens longitudinal du canal fluidique 27 dans la zone de tri 18. Le dispositif et procédé microfluidique de la présente divulgation permettent de sélectionner et trier les gouttes qui contiennent une nanoparticule détectée par exemple par fluorométrie, et de diriger uniquement les gouttes contenant le type de nanoparticule recherchée vers une sortie déterminée. Le dispositif et procédé microfluidique permettent de collecter sur cette sortie uniquement les gouttes contenant le type de nanoparticule recherchée à l’exclusion des gouttes vides et des gouttes contenant d’autres types de nanoparticules. Le dispositif et procédé microfluidique permettent ainsi de concentrer les nanoparticules recherchées dans le fluide collecté. L’intégration sur une même puce microfluidique d’une zone de production de microgouttes monodispersées, d’une zone de détente, d’une zone de détection et de tri, à faible distance les unes des autres permet à la fois de générer des microgouttes monodispersées de faible volume, entre 1fL et 200 fL, à haute fréquence (par exemple plusieurs dizaines de kHz) et de trier activement et individuellement chaque microgoutte, avec une grande efficacité et aussi avec une haute fréquence de tri. La zone de détente permet de maintenir les gouttes ordonnées en une seule colonne jusqu’à la zone de détection et de tri. Une telle configuration permet d’éviter le stockage intermédiaire et le transport de microgouttes d’un dispositif de génération de microgouttes à un autre dispositif de tri. Cette configuration permet d’éviter que les microgouttes se collent entre elles ou à la paroi d’un récipient de stockage. Au total, la génération et le tri de microgouttes sont à la fois plus rapides et plus fiables. La présente divulgation trouve des applications pour la génération de microgouttes monodispersées de volume compris entre 1 fL et 200 fL contenant des particules chimiques ou biologiques de dimensions nanométriques. De plus, la présente divulgation trouve des applications dans le tri sans dilution de microgouttes ainsi générées, via la détection d’un signal associé à une propriété de la particule chimique ou biologique de dimensions nanométriques, et le déclenchement du tri en fonction du signal détecté. En particulier, la présente divulgation trouve des applications pour la génération et le tri de microgouttes monodispersées contenant des nano-objets avec une concentration aussi élevée que 10 9 à 10 10 nano-objets par millilitre, tels que par exemple des vésicules extracellulaires ou sécrétions cellulaires, en particulier des exosomes, mais aussi des vecteurs viraux, ou encore des grosses molécules individuelle. La puce microfluidique divulguée permet l’encapsulation de nanoparticules fluorescentes et leur tri en fonction de la fluorescence mesurée. La puce microfluidique divulguée permet aussi la mesure et le tri de particules organiques marqués par fluorescence, en les encapsulant dans des gouttes. La présente divulgation trouve encore d’autres applications en chimie par exemple pour la purification de sondes nanométriques ou en granulométrie d’objets nanométriques. De plus, la puce microfluidique intègre les fonctions de génération et de tri de gouttes sans stockage intermédiaire, ce qui permet non seulement de la génération des gouttes à haute fréquence mais aussi le tri individuel des gouttes, à la volée, tout de suite après leur génération, et à haute fréquence, par exemple de quelques kHz à plus de 100kHz. Puce microfluidique (30) pour générer et trier des microgouttes (32) monodispersées à base d’un fluide central dans un fluide de gaine, le fluide central et le fluide de gaine étant immiscibles entre eux, caractérisé en ce que : la puce microfluidique (30) comprend un canal d’injection de fluide central (3), deux canaux d’injection de fluide de gaine (1) et en ce que la puce microfluidique (30) comprend une zone de jonction (7), une zone de détente (8) en aval de la zone de jonction (7) et une zone de tri (18) disposée en aval de la zone de détente (8), un microcanal fluidique (24) reliant fluidiquement la zone de jonction (7) à la zone de détente (8), la zone de tri (18) comprenant un canal fluidique (27) relié fluidiquement en entrée à la zone de détente (8) et en aval à au moins deux canaux de sortie (13, 131, 14), la zone de jonction (7) comprenant une buse centrale (21) reliée fluidiquement au canal d’injection de fluide central (3), deux buses latérales (22, 23) disposées sur deux côtés opposés de la zone de jonction (7), chacune des deux buses latérales (22, 23) étant reliée fluidiquement à l’un des deux canaux d’injection de fluide de gaine (1), le microcanal fluidique (24) étant disposé sur une face opposée de la zone de jonction (7) par rapport à la buse centrale (21), la buse centrale (21) ayant une plus petite largeur x comprise entre 2 et 10 micromètres, chacune des deux buses latérales (22, 23) ayant une plus petite largeur x1 comprise entre 3 et 10 micromètres, le microcanal fluidique (24) ayant une largeur y comprise entre 2 et 7 micromètres et une longueur z comprise entre 2 et 10 micromètres, la zone de détente (8) ayant une plus grande largeur u comprise entre 20 et 75 micromètres et la zone de détente (8) ayant une longueur V comprise entre 100 et 600 micromètres, et en ce que la zone de jonction (7), le microcanal fluidique (24), la zone de détente (8) et le canal fluidique (27) de la zone de tri (18) ont une profondeur h comprise entre 2 micromètres et 10 micromètres, la puce microfluidique étant apte à générer via le microcanal fluidique (24) des microgouttes (32) monodispersées ayant un volume déterminé compris entre 1 femtolitre et 200 femtolitres. Puce microfluidique selon la revendication 1 dans laquelle la zone de tri (18) comprend une électrode active (10) disposée sur un côté du canal fluidique (27) et deux électrodes de masse (11) disposées des deux côtés du canal fluidique (27), les deux électrodes de masse (11) encadrant l’électrode active (10) dans la zone de tri (18) autour du canal fluidique (27), l’électrode active (10) étant à une distance minimum du canal fluidique (27) comprise entre 5 µm et 40 µm. Puce microfluidique selon la revendication 1 dans laquelle la zone de tri (18) comprend deux électrodes actives (10, 110) et deux électrodes de masse (11), les deux électrodes actives (10, 110) étant disposées sur deux côtés opposés du canal fluidique (27), les deux électrodes de masse (11) étant disposées sur deux côtés opposés du canal fluidique (27), chacune des deux électrodes de masse (11) encadrant une des deux électrodes actives (10, 110) dans la zone de tri (18) autour du canal fluidique (27), chacune des deux électrodes actives (10, 110) étant à une distance minimum du canal fluidique (27) comprise entre 5µm et 40 µm. Puce microfluidique selon l’une des revendications 1 à 3 comprenant au moins un canal latéral (9) relié fluidiquement à l’entrée de la zone de tri (18), le au moins un canal latéral (9) étant adapté pour injecter un flux de fluide de gaine. Puce microfluidique selon l’une des revendications 1 à 4 dans laquelle la zone de détente (8) a en sortie du microcanal fluidique (24) une largeur réduite r comprise entre 5 et 15 micromètres et la zone de détente (8) s’élargit vers l’aval de la largeur réduite r jusqu’à la plus grande largeur u. Puce microfluidique selon l’une des revendications 1 à 5 dans laquelle la zone de détente (8) est reliée au canal fluidique (27) de la zone de tri (18) par un canal fluidique (25) ayant une profondeur égale à la profondeur h et une largeur d’environ 20µm, la largeur de la zone de détente (8) se rétrécissant vers l’aval de la plus grande largeur u jusqu’à la largeur d’environ 20µm du canal fluidique (25). Puce microfluidique selon l’une des revendications 1 à 6 dans laquelle le canal d’injection de fluide central (3), les deux canaux d’injection de fluide de gaine (1) et les au moins deux canaux de sortie (13, 131, 14) ont une profondeur égale à la profondeur h. Puce microfluidique selon l’une des revendications 1 à 6 dans laquelle le canal d’injection de fluide central (3), les deux canaux d’injection de fluide de gaine (1) et les au moins deux canaux de sortie (13, 131, 14) ont une profondeur H supérieure à la profondeur h de la zone de jonction (7), la profondeur H étant comprise entre 6 micromètres et 20 micromètres. Puce microfluidique selon l’une des revendications 1 à 8 comprenant un dispositif à base de micro-pompes ou de pousses-seringues adapté pour injecter le fluide de gaine et respectivement le fluide central dans la puce microfluidique. Procédé de génération et de tri de microgouttes monodispersées au moyen d’une puce microfluidique selon l’une des revendications 1 à 9 comprenant les étapes suivantes : - injection simultanée d’un fluide central dans le canal d’injection de fluide central (3) en direction de la zone de jonction (7) de la puce microfluidique et d’un fluide de gaine dans les deux canaux d’injection de fluide de gaine en direction de la zone de jonction (7) ; - génération de microgouttes (32) monodispersées de fluide central au sein du fluide de gaine dans le microcanal fluidique (24) reliant fluidiquement la zone de jonction (7) à la zone de détente (8) de la puce microfluidique, les microgouttes ayant un volume déterminé, compris entre 1 femtolitre et 200 femtolitres, - propagation ordonnée des microgouttes vers une zone de tri de la puce microfluidique de façon à trier activement et individuellement chaque microgoutte.