Brevet FR3145211A1 — publié le 20240726

L’invention concerne notamment une méthode de détection d’un biomarqueur peptidique dans un liquide biologique comprenant les étapes suivantes : fournir un échantillon de liquide biologique ; ajouter le liquide dans un système senseur comprenant, dans une solution d’halogénure de métal alcalin, d’halogénure d’alcalino-terreux ou leurs mélanges, de 2 M à 5 M et d’un pH de 3 à 10, au moins un nanopore d’aérolysine inséré dans une membrane lipidique ou polymérique, ledit liquide étant ajouté du côté cis de la membrane ; appliquer audit système comprenant le liquide une différence de potentiel comprise entre -300 mV et +300 mv, de nature à favoriser le passage dudit au moins un biomarqueur ; enregistrer le signal électrique généré à une fréquence de 100 kHz à 1 Mhz ; analyser le signal, ladite analyse du signal électrique généré permettant de détecter la présence et/ou de déterminer la concentration ou l’absence du biomarqueur. Figure à publier avec l’abrégé : Figure 2 Méthode de détection de biomarqueurs peptidiques La présente invention concerne le secteur des biotechnologies. Plus particulièrement, l’invention concerne le domaine du diagnostic médical ou animal par la détection de biomarqueurs peptidiques. Plus de 200 biomarqueurs protéiques sanguins sont déjà utilisés actuellement en biologie médicale, mais les besoins pour améliorer le diagnostic et le suivi des patients sont encore importants. Si des techniques basées sur la spectrométrie de masse permettent l’identification de nombreux biomarqueurs peptidiques, leurs utilisations de routine en clinique posent encore des difficultés (https://www.inserm.fr/dossier/proteomique/). Par ailleurs les méthodes basées sur les anticorps posent des problèmes de réactions croisées et ne permettent pas, par exemple, d’identifier la présence de peptides se différenciant par exemple, uniquement par un acide aminé, ou encore plus difficilement des conformations différentes. Ainsi, par exemple, la détection du fibrinopeptide A (FPA), bien qu’étant un biomarqueur avéré de la coagulation ou encore de certains cancers, n’est pas mise en œuvre en clinique du fait notamment de réactions croisées lors de l’utilisation de techniques basées sur la reconnaissance par des anticorps. Le principe de la détection électrique du transport de molécules à travers un nanopore constitué d’un canal protéique inséré dans une membrane lipidique séparant deux compartiments est bien connu : la membrane est soumise à une différence de potentiel qui induit un courant ionique à travers le nanopore en présence d’une solution d’électrolytes. Le passage d’une molécule à travers le nanopore, ou l’interaction de la molécule avec le nanopore, induit une chute du courant mesurable. Dans ce domaine, l’utilisation du nanopore d’aérolysine est connue et il a été montré que l’aérolysine forme un canal sensible au courant électrique dans une bicouche lipidique. Le brevet EP3270139 décrit la détection électrique de peptides par un nanopore d’aérolysine et ce à l’échelle d’un acide aminé. Néanmoins des méthodes qui permettraient la détection, au sein de milieux biologiques complexes tels que les liquides biologiques (sérum, urine, liquide céphalorachidien), de biomarqueurs peptidiques par l’analyse du signal électrique d’un nanopore d’aérolysine ne sont pas connues de l’état l’art. Les inventeurs ont mis au point une méthode d’analyse de biomarqueurs peptidiques par nanopore d’aérolysine dans des liquides biologiques qui sont des mélanges complexes. Comparée, par exemple, aux méthodes de spectrométrie de masse, l’invention permet la détection de ces biomarqueurs de manière fiable et sensible, et ainsi un test de diagnostic rapide « au lit du patient ». Cette méthode présente notamment également l’intérêt particulier des gains en sensibilité et spécificité pour des biomarqueurs présentant une demi-vie faible, et/ou non atteintes par les méthodes basées sur l’utilisation d’anticorps pour les raisons évoquées ci-dessus. Ces méthodes sont d’un intérêt particulier à mettre en œuvre dans des méthodes diagnostiques. Ainsi, un objet de l’invention est de proposer une méthode de diagnostic comprenant la détection d’au moins un biomarqueur peptidique dans un mélange complexe tel qu’un liquide biologique, par l’analyse du signal électrique associé à l’aérolysine en présence du liquide biologique, en réponse à l’application d’une différence de potentiel. [Bref exposé de l’invention] Comme évoqué ci-dessus, les inventeurs ont mis au point une méthode de caractérisation et de quantification des peptides présents dans un liquide biologique. Les inventeurs se sont notamment rendu compte que les composantes ou caractéristiques du signal électrique généré lors du passage de peptides au travers du nanopore étaient des caractéristiques de celui-ci et permettaient de différencier un même peptide avec des conformations différentes, de modifications post traductionnelles et seulement légèrement différents dans leur séquence. Une telle méthode est d’intérêt tant dans le domaine des biotechnologies que dans le domaine médical. Partant, un premier objet de l’invention est une méthode de détection d’au moins un biomarqueur peptidique dans un liquide biologique comprenant les étapes suivantes : fournir un échantillon de liquide biologique, ajouter le liquide biologique dans un système senseur comprenant, dans une solution d’halogénure de métal alcalin, d’halogénure d’alcalino-terreux ou leurs mélanges, de 2 M à 5 M et d’un pH de 3 à 10, au moins un nanopore d’aérolysine inséré dans une membrane lipidique ou polymérique définissant un côté cis et un côté trans, ledit liquide biologique étant ajouté du côté cis de la membrane, appliquer audit système senseur comprenant le liquide biologique une différence de potentiel comprise entre -300 mV et +300 mv, de préférence entre -200 mV et +200 mV, de nature à favoriser le passage dudit au moins un biomarqueur peptidique, enregistrer le signal électrique généré à une fréquence de 100 kHz à 1 Mhz, et analyser le signal électrique généré, ladite analyse du signal électrique généré permettant de détecter la présence et/ou de déterminer la concentration ou l’absence de l’au moins un biomarqueur peptidique dans ledit liquide biologique. De manière avantageuse, dans ladite méthode, l’analyse du signal électrique généré comprend : déterminer un temps d’occupation moyen, médian, minimum et/ou maximum, de l’au moins un nanopore d’aérolysine du système senseur, ou déterminer un taux de blocage moyen, minimum, médian et/ou maximum de l’au moins un nanopore d’aérolysine du système senseur, ou analyser la forme du signal électrique généré, déterminer la déviation standard du signal mesuré lors du passage dudit biomarqueur peptidique au travers dudit nanopore, ou déterminer le nombre d’événements. En effet, ces caractéristiques permettent de différencier des peptides identiques mais de conformations différentes, ou portant des modifications post traductionnelles ou encore des peptides ne se différenciant par des séquences que de quelques acides aminés. Selon d’autres caractéristiques optionnelles de la méthode, cette dernière peut inclure facultativement une ou plusieurs des caractéristiques suivantes, seules ou en combinaison : l’au moins un biomarqueur peptidique correspond, pour un peptide donné, à la détection de la présence et/ou l’absence d’au moins une modification post traductionnelle et/ou d’au moins une conformation dudit peptide ; en effet, la méthode de l’invention permet la caractérisation efficace de la présence dans un mélange de peptides qui ne présentent que de telles différences, sans équipement lourds et de manipulation compliquées, l’au moins un biomarqueur peptidique a une taille comprise entre de 3 à 100 acides aminés ; l’au moins un biomarqueur peptidique est sélectionné parmi : les histones H1, H2A, H2B, H3 et/ou H4, le peptide natriurétique de type B, les chimiokines, l’adiponectine, NLRP3, la chaine A de l’insuline, la chaine B de l’insuline, un cytochrome C, le fibrinopeptide A (FPA), le FPA phosphorylé (FPA-P), FPA-3, FPA-6, la bradykinine, la des-arginine 9 bradykinine, Aβ 1-15 , Aβ 1-16 , Aβ 1-17 , Aβ 1-40 , Aβ 1-42 , Aβ 11-40 , Aβ 17-40 et Aβ 17-42 ; ces biomarqueurs présentent un intérêt particulier en médecine et en biotechnologie, le signal électrique est récolté sur une période de temps d’au moins 1 minute ; en effet, un temps d’acquisition suffisamment long permet d’augmenter la précision, et la probabilité de détection du biomarqueur, le système senseur comprend au moins deux systèmes senseurs ; multiplier les systèmes senseurs permet de gagner en sensibilité, le liquide biologique est sélectionné parmi : le sang, le plasma, le sérum, le liquide céphalorachidien, du lavage bronchoalvéolaire, la salive, le liquide synovial, du liquide amniotique, de l’urine, un lysat cellulaire, un milieu de culture de cellules eucaryotes ou bactériennes ; en effet la méthode de l’invention est peu ou pas sensible au liquide biologique comprenant le au moins un biomarqueur ; le ratio du volume de liquide biologique sur le volume de l’électrolyte dans le compartiment du côté cis de la membrane de l’au moins un système senseur est inférieur ou égal à 1/50 ; en effet la méthode selon l’invention est particulièrement sensible et permet donc de détecter le au moins un biomarqueur à des dilutions du liquide biologique, ce qui limite, s’il en est besoin, les risques d’interférences inopinées de certains composés du liquide biologique avec la fonction du nanopore d’aérolysine. Un deuxième objet de l’invention concerne une méthode de diagnostic d’une pathologie associée avec un trouble de la coagulation chez un sujet suspecté de souffrir ou souffrant d’une telle pathologie comprenant la détection du FPA ou de ses dérivés tels que le FPA phosphorylé (FPA-P), FPA-3, FPA-6, ou de leurs mélanges, dans un liquide biologique provenant dudit sujet, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : fournir un échantillon de liquide biologique dudit sujet, introduire le liquide biologique dans un système senseur comprenant, dans une solution d’halogénure de métal alcalin, d’halogénure d’alcalino-terreux ou leurs mélanges, de 2M à 5M et d’un pH de 4,1 à 10, au moins un nanopore d’aérolysine inséré dans une membrane lipidique ou polymérique définissant un côté cis et un côté trans, ledit liquide biologique étant ajouté du côté cis de la membrane, appliquer audit système senseur comprenant le liquide biologique une différence de potentiel comprise entre +1 mV et +300 mV, de préférence entre +10 mV et +100 mV, de préférence +50mV de nature à favoriser le passage du FPA et de ses dérivés, enregistrer le signal électrique généré à une fréquence de 100 kHz à 1 Mhz, et analyser le signal électrique généré, ladite analyse du signal électrique généré permettant de détecter la présence et/ou de déterminer la concentration ou l’absence du FPA ou de ses dérivés dans ledit liquide biologique, un nombre d’événements détectés, dans ledit liquide biologique, pour l’un ou plusieurs des biomarqueurs sélectionnés parmi FPA, FPA-P FPA-3, et FPA-6, supérieur à celui d’un contrôle ou d’une valeur seuil déterminée pour des sujets ne comprenant d’événement thrombotique, étant le signe d’une augmentation de l’activité thrombotique chez ledit sujet. Une telle méthode est efficace dans la caractérisation et la quantification de biomarqueurs tels que FPA, FPA-P FPA-3, et FPA-6 du FPA et leurs différentes conformations qui sont en lien avec les processus de coagulation en cours dans l’organisme. Un troisième objet de l’invention concerne une méthode de diagnostic d’un angioœdème bradykinique chez un sujet suspecté de souffrir ou souffrant d’une telle pathologie comprenant les étapes suivantes : fournir un échantillon de liquide biologique dudit sujet, introduire le liquide biologique dans un système senseur comprenant, dans une solution d’halogénure de métal alcalin ou alcalino-terreux de 2M à 5M et d’un pH de 3,1 à 10, un nanopore d’aérolysine inséré dans une membrane lipidique ou polymérique, ledit liquide biologique étant ajouté du côté cis de la membrane, appliquer audit système senseur comprenant le liquide biologique une différence de potentiel comprise entre -300 mV et -1 mV, de préférence entre -100 mV et -10 mV, de préférence -50 mV, de nature à favoriser le passage de la bradykinine et/ou de la des-arginine 9 bradykinine, enregistrer le signal électrique généré à une fréquence de 100 kHz à 1 Mhz, analyser le signal électrique généré, ledit signal électrique généré permettant de détecter la présence et/ou de déterminer la concentration ou l’absence de la bradykinine et/ou de la des-arginine 9 bradykinine ou de leurs différentes conformations dans le liquide biologique, la caractérisation de la présence de niveaux de la bradykinine et/ou de la des-arginine 9 bradykinine supérieurs au contrôle ou à une valeur seuil déterminée pour des sujets ne souffrant pas d’angioœdème bradykinique ou d’angioœdème étant le signe de la présence d’un angioœdème bradykinique chez ledit sujet. Une telle méthode présente un intérêt significatif car à présent il n’existe de méthode rapide de diagnostic de ces angioœdèmes qui ont une solution thérapeutique spécifique et différente des angioœdèmes histaminiques et pour lesquels le mauvais diagnostic peut avoir des conséquences vitales pour le sujet. D’autres caractéristiques, avantages et détails de l’invention seront mieux compris à la lecture du complément de description qui va suivre des modes de réalisations à titre d’exemple en relation avec les dessins annexés sur lesquels : - la représente les différents fragments issus de la fibrinolyse du fibrinogène, qui résulte en la libération du fibrinopeptide A (FPA), qui peut être dans l’organisme phosphorylé (FPA-P) ou non, ou clivé en sa partie terminale générant ainsi la perte de 3 (FPA-3) ou de 6 acides aminés (FPA-6). Le P cerclé d’une ligne pointillée indique l’emplacement de la phosphorylation présente dans FPA-P. - la représente une partie d’un système senseur utilisé dans la méthode selon l’invention comprenant la bicouche lipidique dans laquelle est enchâssée un nanopore d’aérolysine, dans un mélange d’électrolyte (4M KCl, 25 Tris HCl mM, pH7.5). La membrane définit un compartiment cis et un compartiment trans, le compartiment cis étant celui où se situe la partie du nanopore extérieure à la membrane. La différence de potentiel appliquée au système génère une force permettant d’attirer les peptides compris dans le mélange d’électrolyte dans le compartiment en cis par rapport à l’orientation du nanopore. Le signal électrique est détecté et analysé selon différents paramètres qui permettent d’identifier la présence des peptides dans le compartiment cis, à la suite de l’ajout du liquide biologique. La est une représentation d’un signal électrique généré lors du passage d’un biomarqueur peptidique au travers du nanopore d’aérolysine, dans le système senseur utilisé dans la méthode. I0 est le courant ionique de base quand aucun analyte ne traverse le nanopore. Le passage du biomarqueur au travers du nanopore entraine une chute du courant mesuré (Ib). ΔI représente donc le blocage du nanopore engendré par le passage de l’analyte. Le temps de blocage (Dt) est la durée que met l’analyte à perturber le courant. Cette durée correspond donc au temps de passage de l’analyte (le biomarqueur peptidique) au travers du nanopore ou au temps d’interaction de l’analyte avec le nanopore. - La représente l’analyse des signaux électriques générés par le FPA (panneau de gauche), FPA-P (milieu) et leur mélange (panneau de droite). La représentation, pour chaque événement, du courant de blocage en fonction du temps de blocage fait apparaitre les différentes populations, et permet de distinguer les deux espèces dans leur mélange (panneau de droite). La concentration dans le compartiment en cis du système senseur du FPA et du FPA-P, ajoutés seuls, est de 40 µM. La concentration de chacune de ces espèces dans le mélange de FPA et de FPA-P est de 10 µM. Les données sont filtrées à 5 kHz et enregistrées à des intervalles de 250 kHz. - Sur la , le panneau supérieur représente l’analyse du signal électrique généré par un mélange de FPA (10 µM), FPA-P (20 µM), FPA-3 (10 µM) et FPA-6 (2.5 µM). La représentation du signal de chaque événement en fonction de ΔI norm en fonction de Dt permet clairement de différencier et détecter chacune des espèces et leur conformation. Le panneau inférieur est une représentation du ΔI norm en fonction du nombre d’événement pour le même mélange. Cette représentation permet d’estimer pour chaque espèce le temps de blocage normalisé moyen. - La présente pour chaque espèce de FPA et ses dérivés, la détermination du temps de blocage moyen. Une loi log-normale est utilisée. - La représente une analyse combinatoire des ΔI norm et des Dt d’un enregistrement du signal électrique d’un mélange comprenant du FPA (10 µM), FPA-P (20 µM), FPA-3 (10 µM) et FPA-6 (2.5 µM), à50 mV. - La représente la détermination des différents ΔI norm pour la bradykinine (2 µM, panneau de gauche) et la des-arginine 9 bradykinine (2 µM, panneau central) et leur mélange équimolaire (1,3 µM). Pour la bradykinine comme pour la des-arginine 9 bradykinine, deux conformations caractérisées chacune par un ΔI norm spécifique sont détectées. Une loi gaussienne est utilisée. Les acquisitions sont effectuées à une différence de potentiel de –50mV et l’électrolyte du système senseur est du 4M KCL 25 mM Tris pH 7.5. - La représente une analyse combinatoire du ΔI norm et de Dt d’un enregistrement du signal électrique d’un mélange comprenant leur mélange équimolaire 1,3 µM de bradykinine et 1,3 µM de des-arginine 9 bradykinine. On distingue sur cette représentation les deux conformations de la bradykinine (BK1 et BK2) et les deux conformations de la des-arginine 9 bradykinine (DAB1 et DAB2). Les acquisitions sont effectuées à une différence de potentiel de –50mV et l’électrolyte du système senseur est du 4M KCL 25 mM Tris pH 7.5. - La représente l’analyse d’un sérum comprenant 100 nM de des-arginine 9 bradykinine. Le sérum a été dilué au centième dans le compartiment cis du système senseur. La représentation du nombre d’événements en fonction de leurs ΔI norm permet d’identifier les deux formes DAB1 et DAB2. Les signaux électriques ont été enregistrés sur 27 minutes. Les ΔI norm moyens déterminés en assumant une répartition gaussienne des données correspondent à ceux déterminés à la . Les acquisitions sont effectuées à une différence de potentiel de –50mV et l’électrolyte du système senseur est du 4M KCL 25 mM Tris pH 7.5. [Description de modes de réalisation de l’invention] Comme il ressort de ce qui précède, il est possible maintenant, suivant la méthode selon l’invention, de détecter à partir d’une mesure électrique et l’analyse de ses différentes composantes, de distinguer et caractériser directement dans un liquide biologique la présence de biomarqueurs peptidiques, qui se distinguent, par exemple, uniquement par au moins une modification post-traductionnelle ou leur conformation, et ce pour une même séquence primaire, et/ou une différence aussi faible d’un seul acide aminé. Cela est illustré par les données expérimentales accumulées par les chercheurs. Par exemple, la méthode selon l’invention permet de discriminer de manière certaine le FPA dans sa forme phosphorylée ou non et également différentes conformations du FPA, ce qui n’est pas possible par des méthodes basées sur la reconnaissance épitope/anticorps du fait de la proximité des séquences ou de masses moléculaires très proches voire identiques. Selon un autre exemple, la méthode selon l’invention permet de discriminer la bradykinine de la des-arginine 9 bradykinine, et d’identifier la présence de différentes conformations de ces molécules, et ce directement dans du sérum humain sans traitement ou purification particulière. Dans la suite de la description ci-après, on va décrire plus particulièrement à des fins d’illustration la mise en œuvre de la méthode selon l’invention pour la détection de biomarqueurs en fonction de leur conformation, leurs modifications postranscriptionnelles ou leur séquence. Le courant de blocage normalisé ΔI norm , ou taux de blocage, se définit selon la formule : [math1] ΔI norm =(I 0 -I b )/I 0 Dans laquelle I 0 est le courant passant au travers du nanopore quand le nanopore est libre, Ib est le courant de blocage qui passe au travers du nanopore lorsque celui est obturé transitoirement lors du passage d’une molécule de biomarqueur peptidique au travers du nanopore. Le temps de blocage Dt est la durée d’occupation du nanopore par le biomarqueur et correspond à la durée de la chute de courant engendrée par le passage du biomarqueur peptidique ou de son temps d’interaction avec le nanopore. Le nombre d’événements correspond au nombre de chutes de courant observées sur une durée donnée en présence du ou d’un mélange de biomarqueurs peptidiques, pour un système senseur. Un événement correspond donc au passage d’une espèce au travers du nanopore ou une interaction prolongée avec celui-ci : sont considérés au sens de l’invention les événements d’une durée supérieure ou égale à 75 µs. Le nombre d’événements est donc associé à la concentration du biomarqueur peptidique. Un système senseur est par exemple décrit à la . Aux fins de la méthode selon l’invention, plusieurs systèmes senseurs peuvent être utilisés indépendamment et séparément. Bien que la méthode de l’invention soit particulièrement sensible et permet de détecter des concentrations en biomarqueur peptidique de l’ordre du nanomolaire, utiliser plusieurs systèmes senseurs en parallèle présente l’avantage d’augmenter le nombre d’événements analysés et par voie de conséquence de baisser encore plus le seuil de détection de la méthode selon l’invention. Egalement, utiliser un système senseur comprenant plusieurs nanopores d’aérolysine est possible, cependant cette configuration est moins préférée. Tout nanopore d’aérolysine fonctionnel est utilisable aux fins de la présente invention. Le nanopore d’aérolysine de Aeromonas hydrophila (référence uniprot P09167 ; https://www.uniprot.org/uniprotkb/P09167/entry) dit « sauvage » peut être utilisé. Un biomarqueur peptidique se définit comme un peptide dont la présence, la concentration ou l’absence dans un échantillon biologique est associée à un état pathologique, physiologique ou métabolique. Détectée au niveau d’un organisme d’un sujet, la présence, la concentration ou l’absence dans un échantillon biologique est associée avec la présence ou une augmentation du risque de l’occurrence d’un état pathologique, métabolique ou physiologique chez ledit sujet. Selon un mode de réalisation particulier, un biomarqueur peptidique pouvant être détecté avec la méthode de l’invention peut comprendre 3 à 100 acides aminés. Les biomarqueurs peptidiques détectés par la méthode selon l’invention peuvent être sélectionnés parmi le groupe de biomarqueurs peptidiques suivants : les histones H1, H2A, H2B, H3 et/ou H4, le peptide natriurétique de type B, les chimiokines telles que celles listées dans les tableaux 1, 2 et 3, l’adiponectine , NLRP3, la chaine A de l’insuline, la chaine B de l’insuline, un cytochrome C, le fibrinopeptide A (FPA), le FPA phosphorylé (FPA-P), le FPA3, le FPA6, la bradykinine (BK), la des-arginine 9 bradykinine (DAB), Aβ 1-15 , Aβ 1-16 , Aβ 1-17 , Aβ 1-40 , Aβ 1-42 , Aβ 11-40 , Aβ 17-40 , Aβ 17-42 . Les chimiokines sont une famille de petites protéines solubles, de 8-12 kilodaltons. Les chimiokines sont impliquées dans divers processus biologiques comme l’hématopoïèse et l’angiogenèse. A ce titre, elles peuvent être marqueur par exemple de la prolifération des tumeurs ou de l’inflammation. Elles sont pour la plupart caractérisées par la présence de quatre résidus cystéine en des positions conservées et essentiels à leur structure tridimensionnelle. On distingue 4 familles de chimiokine, en fonction, notamment, du positionnement des deux cystéines proximales de leur extrémité N-terminale. Les chimiokines CXC (tableau 1) présentent un acide aminé entre les deux premières cystéines, les chimiokines dites CC (cf tableau 2 spécifiant, mais non limitativement, les chimiokines CC humaines) présentent les deux premières cystéines adjacentes, les chimiokines dites CX3C (tableau 3, spécifiant, mais non limitativement, la chimiokine CX3C humaine), dont l'unique membre (la fractalkine) possède trois acides aminés entre les deux premières cystéines, les chimiokines C (la Lymphotactine alpha et beta) ne possèdent que 2 cystéines au total (cf tableau 3 spécifiant, mais non limitativement, les chimiokines C humaines). La méthode selon l’invention est particulièrement adaptée à caractériser et quantifier la présence dans un liquide biologique de telles protéines de structure et/ou séquences proches dont la présence est en lien avec un état pathologique, physiologique ou métabolique. Chimiokines CXC Nom Référence Uniprot Nom Référence Uniprot CXCL1 P09341 CXCL10 P02778 CXCL2 P19875 CXCL11 O14625 CXCL3 P19876 CXCL12 P48061 CXCL4 P02776 CXCL13 O43927 CXCL5 P42830 CXCL14 O95715 CXCL6 P80162 CXCL15 Q9WVL7 CXCL7 P02775 CXCL16 Q9H2A7 CXCL8 P10145 CXCL17 Q6UXB2 CXCL9 Q07325 Chimiokines CC Nom Référence Uniprot Nom Référence Uniprot CCL1 P22362 CCL16 O15467 CCL2 P13500 CCL17 Q92583 CCL3 P10147 CCL18 P55774 CCL4 P13236 CCL19 Q99731 CCL5 P13501 CCL20 P78556 CCL6 P27784 CCL21 O00585 CCL7 P80098 CCL22 O00626 CCL8 P80075 CCL23 P55773 CCL9/CCL10 P51670 CCL24 O00175 CCL11 P51671 CCL25 O15444 CCL12 Q62401 CCL26 Q9Y258 CCL13 Q99616 CCL27 Q9Y4X3 CCL14 Q16627 CCL28 Q9NRJ3 CCL15 Q16663 Chimiokines C nom Référence Uniprot XCL1 P47992 XCL2 Q9UBD3 Chimiokines CX3C nom Référence Uniprot CX3CL1 P78423 Le peptide natriurétique de type B (BNP) est un marqueur bien connu de l’insuffisance cardiaque. Le précurseur du BNP est sécrété par les cellules musculaires cardiaques des oreillettes et des ventricules. La synthèse en est augmentée en cas de distension de ce tissu. Le BNP est notamment un biomarqueur de l’insuffisance cardiaque aiguë. Le BNP compte 32 acides aminés. Les histones sont des éléments du nucléosome, qui comprend 2 copie de chacun des quatre histones et une portion d’ADN de 147 paire de bases. Les modifications post traductionnelles des histones sont nombreuses telles que, par exemple, l’acétylation, méthylation, phosphorylation, ubiquitylation, sumoylation, ADP-ribosylation, déamination, et proline isomérisation ou citrullination. Ces modifications sont fortement impliquées dans les mécanismes épigénétiques de régulation des gènes, et constituent autant de biomarqueurs de certaines pathologies telles que la sclérose en plaque, la maladie d’Alzheimer, le sepsis. La méthode selon l’invention est particulièrement adaptée à caractériser et quantifier la présence dans un liquide biologique de telles protéines de structure et/ou séquences proches présentant des modifications post traductionnelles, dont la présence est en lien avec un état pathologique, physiologique ou métabolique. L’adiponectine (référence Uniprot : Q15848) est une protéine dont les niveaux plasmatiques sont inversement corrélés avec le risque de pathologies métaboliques telles que l’insulino-résistance, le diabète ou encore le syndrome métabolique. Le niveau d’adiponectine est notamment utilisé dans l’orientation diagnostique et la prise en charge thérapeutique des syndrome de lipodystrophie et de résistance sévère à l’insuline. NLRP3 (référence Uniprot : Q96P20) est une protéine faisant partie d’un des complexes inflammasomes, et qui est identifiée comme biomarqueur de l’état d’inflammation d’un organisme. Des niveaux élevés des protéines constituants des inflammasomes sont détectés dans les biofluides des patients souffrant de pathologies inflammatoires chroniques telles que le diabète, HIV, la Bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO), la pneumonie, le psoriasis l’arthrite psoriasique, la dégénérescence maculaire, les pathologie neurodégénératives. Plus particulièrement, NRLP3 est décrite comme biomarqueur de pronostic dans la septicémie, ou de diagnostic des pathologies neuroinflammatoires telles que la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson, la sclérose en plaque, la sclérose latérale amyotrophique. Par exemple, des niveaux supérieurs de NLRP3 plasmatique sont détectés chez des sujets souffrant de la maladie de Parkinson. Les références Uniprot citées sont communément accessibles sur le site https://www.uniprot.org/ qui recense les données de séquences et fonctionnelles issues de la recherche internationale. Aβ 1-15 , Aβ 1-16 , Aβ 1-17 , Aβ 1-40 , Aβ 1-42 , Aβ 11-40 , Aβ 17-40 , Aβ 17-42 correspondent aux différents peptides issus du peptide amyloïdes retrouvés notamment dans le liquide céphalo rachidien des sujets atteints de la maladie d’Alzheimer. Un liquide biologique s’entend de tout échantillon liquide sécrété, produit ou isolé d’un organisme vivant. Plus particulièrement, un tel liquide biologique peut comprendre : le sang, le plasma, le sérum, le liquide céphalorachidien, du lavage bronchoalvéolaire, la salive, le liquide synovial, le liquide amniotique, de l’urine, un lysat cellulaire, un milieu de culture de cellules eucaryotes ou bactériennes. Bien que cela ne soit pas nécessaire, ledit liquide biologique peut-être traité avant son application au système senseur, le prétraitement visant à faciliter la détection, ou l'identification du ou des biomarqueur(s) peptidique(s) présents dans le liquide biologique. Le FPA est un peptide de 16 acides aminés, provenant de la protéolyse de l’extrémité amino-terminale de la chaîne Aα du fibrinogène. Il peut subir diverses dégradations en son extrémité N-terminale générant ainsi plusieurs peptides d’une taille inférieure à 16 acides aminés, notamment par exemple les peptides FPA-3 et FPA-6. Une augmentation de la phosphorylation de FPA est rapportée chez les patients ayant subi des interventions chirurgicales. Ainsi, « FPA et ses dérivés » comprend tous les peptides issus d’une dégradation, coupure ou modification post traductionnelle du FPA. « FPA et ses dérivés » comprend notamment les peptides sélectionnés dans le groupe constitué de FPA, FPA-3, FPA-6, FPA-P. Sujet , dans le cadre des méthodes d’identification d’au moins un biomarqueur peptidique et des méthodes diagnostiques de l’invention s’entend d’un mammifère, de préférence un humain. Méthode de détection d’au moins un biomarqueur peptidique dans un liquide biologique. Comme évoqué précédemment la méthode de détection d’au moins un biomarqueur peptidique dans un liquide biologique selon l’invention permet de détecter la présence ou l’absence dudit au moins un biomarqueur peptidique, et ce que celui-ci varie faiblement en taille, ou en conformation ou en modification post traductionnelle. Cette méthode est particulièrement avantageuse au regard des méthodes usuelles de reconnaissance par des anticorps dédiés qui ne permettent pas ou de manière insatisfaisante d’identifier spécifiquement au sein d’un échantillon des biomarqueurs de séquences proches du fait des réactions croisées. En outre cette méthode est particulièrement aisée à mettre en œuvre et ne nécessite notamment pas de prétraitement du liquide biologique comme cela peut être le cas pour d’autres méthodes telle que par exemple la spectrométrie. En outre cette méthode peut facilement et rapidement être mise en œuvre au plus proche du patient et des soins. Dans la méthode d’identification d’au moins un biomarqueur peptidique dans un liquide biologique selon l’invention, l’électrolyte est une solution d’halogénure de métal alcalin ou d’alcalino-terreux ou leur mélange. Ledit électrolyte peut être choisi parmi le groupe constitué par LiCl, NaCl, KCl ou KBr, RbCl, CsCl, KF, le chlorure d’ammonium, le chlorure de tétraméthylammonium, BeCl2, CaCl2, MgCl2, SrCl2, BrCl2, BaCl2 ou toute combinaison de ceux-ci. KCl est particulièrement préféré. La concentration de l’électrolyte est comprise entre 2M et 5M, bornes comprises. Le pH de la solution d’électrolyte peut varier, par exemple en fonction du biomarqueur que l’on souhaite caractériser et/ou détecter. Ce pH ne doit pas cependant être de nature à remettre en cause la structure ou l’activité du nanopore d’aérolysine du système senseur. Ainsi, le pH de la solution d’électrolyte est compris entre de 3 à 10. Avantageusement, le pH peut être choisi pour augmenter la force motrice via le changement de la sélectivité du nanopore, ainsi que la charge nette du biomarqueur peptidique analysé. La température de l’au moins un système senseur est telle qu’il n’y a pas formation de cristaux de glace et/ou que le nanopore d’aérolysine ne se dénature pas. Dans certaines instances, placer le système senseur à température basse, par exemple inférieure à 15°C, voire inférieure à 10°C présente l’avantage de ralentir les événements et donc de permettre de caractériser plus aisément des composantes du signal électrique associé au passage d’un biomarqueur peptidique. Inversement, placer le au moins système senseur à une température élevée, par exemple une température supérieure à 40°C, supérieure à 45 °C, voire supérieure à 55 °C, peut permettre de dénaturer au moins en partie le biomarqueur peptidique et ainsi de faciliter son passage au travers du nanopore d’aérolysine. Ainsi, l’au moins un système senseur, dans la méthode de l’invention, est à une température de 5 °C à 55 °C. Dans le système senseur utilisé dans la méthode de l’invention, la membrane dans laquelle est inséré le nanopore d’aérolysine est : - soit de nature lipidique, constituée, par exemple, de diphytanoylphosphatidylcholine, 1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine DLPC ; 1,2-dipalmitoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine DDPPC ; 1,2-dieicosenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine DEPC ou leur mélange, - soit de nature polymérique, à base de polymères diblock (poly(1,2-butadiène)-b-poly(éthylène oxide) ou triblock PDMS-PMOXA-PDMS qui présente l’avantage de contrôler plus facilement le nombre de nanopores formés dans le système, mais également présentant une meilleure stabilité qu’une membrane lipidique dans le temps et soumise à des différences de potentiel électrique élevées (> 200 mV). Dans la méthode de l’invention, la fréquence d’acquisition varie de 100 kHz à 1 Mhz, de préférence de 250 kHz et 400 Khz. La fréquence d’acquisition peut notamment être ajustée en fonction de la taille du biomarqueur ; en effet plus les peptides sont de petite taille plus la détection adéquate des événements nécessite une fréquence d’acquisition importante. Avantageusement, un filtre de Bessel est utilisé. Le filtre de Bessel utilisé sera lui aussi ajusté en fonction de la taille des biomarqueurs (il peut avoir pour valeur une fréquence variant de 1 kHz à 100 kHz). Ce filtre Bessel permet de diminuer le bruit sans modifier l’information contenue dans le signal électrique. Dans la méthode de l’invention, les analytes (biomarqueurs peptidiques) sont directement ajoutés dans le compartiment cis de la membrane de l’au moins un système censeur. Un tel système senseur est illustré à la . Ledit au moins un biomarqueur peptidique ajouté en cis peut être compris dans le liquide biologique sans traitement de ce dernier visant à faciliter la détection dudit au moins un biomarqueur. Ledit liquide biologique peut également avoir été soumis à un traitement préalable visant à faciliter la détection de l’au moins un biomarqueur tel que, par exemple, une filtration, un fractionnement, une précipitation, l’ajout de réactif visant à rajouter au moins un groupement sur au moins un des acides aminés dudit biomarqueur. Ce traitement préalable peut par exemple viser à modifier la charge de l’au moins un biomarqueur peptidique de manière à faciliter sa translocation du côté cis au côté trans de la membrane du système senseur à l’application de la différence de potentiel. Cela est avantageux dans les cas où l’au moins un biomarqueur peptidique que l’on souhaite caractériser et/ou détecter présente une charge neutre ou insuffisante. Ce traitement peut également comprendre un traitement enzymatique visant à produire des peptides à partir d’une protéine biomarqueur de grande taille, dans le but de détecter et caractériser au moins un de ces peptides par le système senseur de l’invention. Ce traitement peut également comprendre l’utilisation de conditions suffisamment dénaturantes de manière à dissocier des complexes impliquant les biomarqueurs peptidiques dont on souhaite détecter la présence, et/ou déplier au moins en partie des structures secondaires ou tertiaires. Le liquide biologique peut être compris dans le groupe comprenant le sang, le plasma, le sérum, le liquide céphalorachidien, du lavage bronchoalvéolaire, la salive, le liquide synovial, le liquide amniotique, de l’urine, un lysat cellulaire, un milieu de culture de cellules eucaryotes ou bactériennes. Comme le montre la , la méthode de l’invention permet l’identification de biomarqueurs peptidiques dans un liquide biologique tel que le sérum, qui est un liquide biologique complexe sans traitement préalable. Ainsi, cela peut éviter une perte en sensibilité, en raison de la perte de biomarqueurs du fait de ces traitements, et contribue également à la rapidité de mise en œuvre de la méthode. A la , on a utilisé le FPA et le FPA-P dans un système senseur selon la méthode de l’invention. La représentation pour chaque événement du ΔI norm en fonction de la durée de blocage permet d’identifier une signature spécifique pour FPA et FPA-P. La méthode de l’invention permet de mettre au jour deux signaux pour FPA-P, FPA-P1 et FPA-P2. Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, on pense que ces deux signaux correspondent à deux confirmations différentes du peptide FPA-P, induite par la phosphorylation du peptide. Comme illustré dans le panneau de droite de la , la méthode permet d’identifier la présence de FPA, et FPA-P dans un mélange. Ainsi la méthode selon l’invention permet de distinguer jusqu’à une unique modification post traductionnelle d’un biomarqueur peptidique, telle que par exemple, une phosphorylation. En outre, la distinction de plusieurs conformations pour une même espèce permet d’inférer un gain en sensibilité et spécificité pour ladite méthode. En effet une telle information additionnelle augmente la probabilité de la détection et l’identification correcte du biomarqueur peptidique. La représentation de ΔI norm en fonction du nombre d’événements permet d’aboutir, en ce qui concerne FPA, à la détermination d’un taux de blocage moyen de 0,64±0,01, 0,70±0,01 pour FPA-P1 et 0,61±0,01 pour FPA-P2. La méthode de l’invention est ainsi suffisamment puissante pour permettre la détection de modifications post traductionnelles uniques et/ou des conformations différentes d’un même biomarqueur peptidique. Ces performances sont confirmées par les données présentées à la , où l’on voit que l’analyse du signal électrique d’un mélange de FPA, FPA-P, FPA-3 et FPA-6, permet d’identifier la présence de ces espèces sans ambigüité dans ce mélange. Le panneau supérieur de la montre les signatures spécifiques de ces biomarqueurs peptidiques telles que déterminées par la représentation du taux de blocage en fonction de la durée de blocage du nanopore. Le panneau inférieur de la montre la détermination du taux de blocage moyen pour chacune des espèces déduites en fonction du nombre d’événements. Un taux de blocage moyen de 0,64±0,01, 0,70±0,01 pour FPA-P1, de 0,62±0,01 pour FPA-P2, de 0,56±0,01 pour FPA-3 et de 0,44±0,01 pour FPA-6. La méthode selon l’invention permet donc de discriminer des peptides se différenciant par des clivages en N-terminal, une confirmation et/ou une modification post traductionnelle, en mélange, en utilisant par exemple le ΔI norm ou le ΔI norm moyen tels que définis ci-dessus. La montre la détermination pour chacune des espèces FPA, FPA-3, FPA-6 et FPA-P, qu’il est possible de déterminer un temps d’occupation moyen pour chacune de celles-ci, qui leur est spécifique, malgré la similitude de ces peptides. Comme illustré, celui-ci est obtenu en reportant le temps de blocage de chaque événement en fonction du nombre d’événements et en estimant ainsi le temps d’occupation moyen par l’ajustement à une distribution gaussienne. Des temps d’occupation moyens de 5,74±0.22 ms pour FPA, de 0,62±0,04 ms pour FPA-P1, de 4,41±0.33 ms pour FPA-P2, de 2,50±0,12 ms pour FPA-3, et de 0,95±0.04 ms pour FPA-6 sont ainsi déterminés. Ainsi, il est déterminé que le signal électrique peut être utilisé pour déterminer des caractéristiques telles que : le temps d’occupation moyen, médian, minimum et/ou maximum, le taux de blocage moyen, minimum, médian et/ou maximum de l’au moins un nanopore d’aérolysine du système senseur, la forme du signal électrique qui, étant spécifique des biomarqueurs peptidiques, peut être utilisée pour les différencier quand bien même ces différences consistent seulement en une unique modification post traductionnelle ou des clivage N-terminaux. le nombre d’événements qui permettent de déterminer la concentration du biomarqueur peptidique identifié, ou la déviation standard du signal mesuré lors du passage dudit biomarqueur peptidique. Ces données du signal électrique, étant spécifiques des biomarqueurs peptidiques, peuvent être utilisées pour les différencier quand bien même ces différences consistent seulement en une unique modification post traductionnelle ou des clivages N-terminaux. Ces données permettent également de différencier des conformations différentes d’un même biomarqueur peptidique. Dans un mode de réalisation particulier, les biomarqueurs peptidiques de la méthode selon l’invention sont identifiés et caractérisés par l’analyse couplée d’au moins deux paramètres du signal électrique tels que ceux décrits ci-dessus, cela permet d’augmenter la résolution de la méthode et d’améliorer la discrimination et l’identification des biomarqueurs peptidiques. Dans un mode de réalisation particulier, les biomarqueurs peptidiques de la méthode selon l’invention sont identifiés et caractérisés par l’analyse couplée d’au moins deux paramètres du signal électrique sélectionnés parmi : le temps d’occupation moyen, médian, minimum et/ou maximum, le taux de blocage moyen, minimum, médian et/ou maximum de l’au moins un nanopore d’aérolysine du système senseur, la forme du signal électrique qui, étant spécifique des biomarqueurs peptidiques, peut être utilisée pour les différencier quand bien même ces différences consistent seulement en une unique modification post traductionnelle ou des clivage N-terminaux. le nombre d’événements qui permettent de déterminer la concentration du biomarqueur peptidique identifié, ou la déviation standard du signal mesuré lors du passage dudit biomarqueur peptidique. Dans un mode de réalisation particulier, les biomarqueurs peptidiques de la méthode selon l’invention sont identifiés et caractérisés par l’analyse couplée : du temps d’occupation moyen, médian, minimum et/ou maximum, avec le taux de blocage moyen, minimum médian et/ou maximum, ou du temps d’occupation moyen, médian, minimum et/ou maximum, avec la forme du signal électrique, ou du temps d’occupation moyen, médian, minimum et/ou maximum, avec la déviation standard du signal électrique, ou du taux de blocage moyen, minimum, médian et/ou maximum, avec la déviation standard du signal électrique, ou du taux de blocage moyen, minimum, médian et/ou maximum, avec la forme du signal électrique. Dans un mode de réalisation encore plus particulier de la méthode selon l’invention, analyser le signal électrique généré comprend : déterminer le taux de blocage moyen, et déterminer le temps de blocage moyen tel que décrit ci-dessus. Ainsi, ces données peuvent être utilisées dans des représentations bi dimensionnelles telles qu’illustrées à la qui montrent que chaque population d’événements, et donc chaque biomarqueur peptidique peut clairement être caractérisé et identifié au sein d’un mélange de biomarqueurs peptidiques. La illustre la mise en œuvre de la méthode de l’invention pour la bradykinine. La bradykinine et la des-arginine 9 bradykinine sont caractérisées chacune par deux conformations détectées par le système senseur de la méthode selon l’invention. Des taux de blocage de 0,47 et 0,75 sont déterminés pour la bradykinine (formes BK1 et BK2), et des taux de blocage de 0,69 et de 0,32 pour la des-arginine 9 bradykinine (forme DAB1 et DAB2). De la même manière, des temps d’occupation correspondant à chacune des espèces sont déterminés (non montré). La représentation bi dimensionnelle de la confirme que les biomarqueurs peptidiques sont efficacement identifiés et discriminés par une analyse couplée de deux paramètres du signal électrique, en l’occurrence ici le temps de blocage et le taux de blocage. La confirme la caractérisation dans un sérum humain de la présence de des-arginine 9 bradykinine, par l’identification de deux conformations caractérisées par un taux de blocage moyen de 0,32±0,004 et de 0,72±0,002 un taux de blocage. Cela est cohérent avec les taux de blocage déterminés pour les peptides purifiés ( ). Dans la méthode selon l’invention la durée d’enregistrement des événements est au moins d’une minute. Plus la durée d’enregistrement est longue et plus la probabilité de détecter un biomarqueur faiblement représenté dans le liquide biologique est importante ; la sensibilité et la spécificité de la méthode s’en trouvent également améliorées. Ainsi la durée d’enregistrement des événements est au moins de 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 45, 60, 90, voire au moins 120 min. Également, la méthode de détection d’au moins un biomarqueur peptidique dans un liquide biologique selon l’invention peut comprendre l’utilisation de plusieurs systèmes senseurs indépendants, démultipliant ainsi la probabilité de détection d’un biomarqueur peptidique faiblement représenté dans le liquide biologique. Alternativement, une membrane comprenant plusieurs nanopores peut être utilisée. Ainsi dans ce mode de réalisation un système senseur comprend plusieurs nanopores. Egalement, plus la différence de potentiel appliquée est importante, plus la sensibilité de la méthode est importante. Ainsi la différence de potentiel appliquée est inférieure ou égale, en valeur absolue, à 300 mV, inférieure ou égale à 200 mV, inférieure ou égale à 200 mV, inférieure ou égale à 150 mV, inférieure ou égale à 100 mV, ou encore inférieure ou égale à 50 mV. De manière évidente, lorsque l’au moins un biomarqueur peptidique recherché est chargé négativement, la différence de potentiel appliquée est positive, et inversement lorsque l’au moins un biomarqueur peptidique recherché est chargé positivement, la différence de potentiel appliquée est négative. Dans la méthode selon l’invention, le ratio du volume de l’électrolyte sur le volume du liquide biologique dans le compartiment cis est supérieur à 10, supérieur à 50, supérieur à 75, supérieur à 100, supérieur à 500, voire supérieur à 1000. Dans un mode de réalisation particulier de la méthode selon l’invention, les valeurs des paramètres du signal électrique caractérisant un biomarqueur peptidique recherché sont préalablement établies. Par exemple par l’analyse du biomarqueur peptidique purifié par le système senseur de l’invention. Ainsi, la méthode selon l’invention comprend une étape de comparaison des valeurs de paramètres du signal électrique obtenues lors de l’analyse du liquide biologique avec les paramètres caractérisant le biomarqueur peptidique prédéterminés, tels que par exemple pour une préparation de biomarqueur peptidique pur ou purifié. Ladite méthode de détection d’au moins un biomarqueur peptidique dans un liquide biologique selon l’invention peut être implémentée dans des applications biotechnologiques, mais également dans des méthodes diagnostiques. Ainsi d’autres objets de la présente invention sont des méthodes diagnostiques implémentant les étapes de la méthode de détection d’au moins un biomarqueur peptidique dans un liquide biologique telle que décrite ci-dessus. Méthodes de diagnostic d’au moins un biomarqueur peptidique dans un liquide biologique. Diagnostic de pathologies en lien avec les troubles de la coagulation . Comme le montrent les données expérimentales illustrées notamment par les figures présentées ici, la méthode selon l’invention est particulièrement adaptée à la détection de FPA et de ses dérivés. Le FPA est un produit du clivage du fibrinogène par la thrombine. Le FPA et ses dérivés sont associés à l’occurrence d’une coagulation dans l’organisme. Le FPA et ses dérivés sont donc utilisés dans le diagnostic ou le suivi des maladies de la coagulation ou associés à la coagulation. Les troubles de la coagulation sont associés avec de nombreuses et diverses pathologies, telles que les thromboses veineuses, la coagulation intravasculaire disséminée qui jouent un rôle dans de nombreux cancers (du poumon, pancréas, prostate, de l'estomac, gastro-intestinal, la leucémie), la cardiopathie ischémique, le COVID, l’AVC, le lupus érythémateux disséminé. Ainsi la détection de FPA ou de ses dérivés dans un liquide biologique issu d’un sujet reflète l’activation de la fibrine et donc un événement thrombotique. Également, pour certains cancers, l’activation de la cascade thrombotique peut être associée à un facteur de mauvais pronostic chez le patient souffrant de cancer. Ainsi un deuxième objet de l’invention concerne la détection d’une thrombogénèse chez un sujet comprenant la détection du FPA ou de ses dérivés tels que le FPA phosphorylé (FPA-P), FPA-3, FPA-6, ou de leurs mélanges, dans un liquide biologique provenant dudit sujet. Dans un mode de réalisation particulier cette méthode permet le diagnostic d’une pathologie associée avec un trouble de la coagulation chez un sujet suspecté de souffrir ou souffrant d’une telle pathologie comprenant la détection du FPA ou de ses dérivés tels que le FPA phosphorylé (FPA-P), FPA-3, FPA-6, ou de leurs mélanges, dans un liquide biologique provenant dudit sujet. Cette méthode diagnostique d’une pathologie associée avec un trouble de la coagulation de l’invention comprend la méthode de détection d’au moins un biomarqueur peptidique dans un liquide biologique exposée ci-dessus et adaptée dans tous ses modes de réalisation, au FPA et à ses dérivés. Dans un mode de réalisation particulier, un nombre d’événements détectés, dans un liquide biologique, pour l’un ou plusieurs des biomarqueurs sélectionnés parmi FPA, FPA-P FPA-3, et FPA-6, supérieur à celui d’un contrôle, ou d’une valeur seuil déterminée pour des sujets ne comprenant d’événement thrombotique est le signe d’une augmentation de l’activité thrombotique chez le sujet. Dans un mode de réalisation particulier, cette détection d’une thrombogénèse chez un sujet comprend la détection du FPA ou de ses dérivés tels que le FPA phosphorylé (FPA-P), FPA-3, FPA-6, ou de leurs mélanges, dans un liquide biologique provenant dudit sujet, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : fournir un échantillon de liquide biologique dudit sujet, introduire le liquide biologique dans un système senseur comprenant, dans une solution d’halogénure de métal alcalin ou d’alcalino-terreux de 2M à 5M et d’un pH de 4,1 à 10, au moins un nanopore d’aérolysine inséré dans une membrane lipidique ou polymérique, ledit liquide biologique étant ajouté du côté cis de la membrane, appliquer audit système senseur comprenant le liquide biologique une différence de potentiel comprise entre +1 mV et +300 mV, entre +10 mV et +100 mV, de préférence de +50 mV, de nature à favoriser le passage du FPA et de ses dérivés, enregistrer le signal électrique généré à une fréquence de 100 kHz à 1 Mhz, et analyser le signal électrique généré, ladite analyse du signal électrique généré permettant de détecter la présence et/ou de déterminer la concentration ou l’absence du FPA ou de ses dérivés dans ledit liquide biologique, un nombre d’événements détectés, dans ledit liquide biologique, pour l’un ou plusieurs des biomarqueurs sélectionnés parmi FPA, FPA-P FPA-3, et FPA-6, supérieur à celui d’un contrôle ou d’une valeur seuil déterminée pour des sujets ne comprenant d’événement thrombotique, étant le signe d’une augmentation de l’activité thrombotique chez ledit sujet. Diagnostic des angioedèmes bradykiniques . Les angioedèmes (AE) bradykiniques (BK) sont caractérisés par des épisodes d’œdèmes sous-cutanés ou sous-muqueux pouvant mettre en jeu le pronostic vital en cas de localisation pharyngée. Aucun examen biologique en urgence ne permet d’affirmer le diagnostic. Le dosage de la bradykinine n’est pas réalisable en pratique courante. Cette complication aigüe est donc souvent confondue avec l’angiœdème d’origine allergique, ce qui peut faire errer le diagnostic et la prise en charge spécifique et mettre en jeu le pronostic vital. D’autres atteintes graves sont les crises douloureuses abdominales responsables d’un syndrome subocclusif, voire plus rarement d’un choc hypovolémique (javaud et al, 2016). La prise en charge des crises graves implique un diagnostic et un traitement rapide. Il existe donc un besoin non satisfait concernant un test diagnostic permettant : de caractériser la bradykinine dans un liquide biologique, et de détecter et quantifier la présence de la bradykinine et de la des-arginine 9 bradykinine Comme illustré figures 8 et 9 la méthode selon l’invention permet d’identifier et de quantifier la bradykinine ainsi que la des-arginine 9 bradykinine dans un liquide biologique. Ainsi un troisième objet de l’invention concerne une méthode de diagnostic d’un angioœdème bradykinique chez un sujet suspecté de souffrir ou souffrant d’une telle pathologie comprenant la détection de la bradykinine et/ou de la des-arginine 9 bradykinine ou de leurs mélanges, dans un liquide biologique provenant dudit sujet. Cette méthode diagnostique d’un angioœdème bradykinique comprend la méthode de détection d’au moins un biomarqueur peptidique dans un liquide biologique exposée ci-dessus et adaptée dans tous ses modes de réalisation, la bradykinine et/ou de la des-arginine 9 bradykinine ou de leurs mélanges. Dans un mode de réalisation particulier, un nombre d’événements détectés, dans un liquide biologique, pour la bradykinine et/ou pour la des-arginine 9 bradykinine, supérieur à celui détecté dans un échantillon contrôle, ou à une valeur seuil déterminée pour des sujets ne souffrant pas d’angioœdème bradykinique ou d’angioœdème, est le signe de la présence d’un angioœdème bradykinique chez le sujet. Un objet particulier de l’invention est une méthode diagnostique d’un angioœdème bradykinique chez un sujet suspecté de souffrir ou souffrant d’une telle pathologie comprenant les étapes suivantes : fournir un échantillon de liquide biologique dudit sujet, introduire le liquide biologique dans un système senseur comprenant, dans une solution d’halogénure de métal alcalin ou alcalino-terreux de 2M à 5M et d’un pH de 3,1 à 10, un nanopore d’aérolysine inséré dans une membrane lipidique ou polymérique, ledit liquide biologique étant ajouté du côté cis de la membrane, appliquer audit système senseur comprenant le liquide biologique une différence de potentiel comprise entre -300 mV et -1 mV, entre -100 mV et -10mV, de préférence -50 mV, de nature à favoriser le passage de la bradykinine et/ou de la des-arginine 9 bradykinine, enregistrer le signal électrique généré à une fréquence de 100 kHz à 1 Mhz, analyser le signal électrique généré, ledit signal électrique généré permettant de détecter la présence et/ou de déterminer la concentration ou l’absence de la bradykinine et/ou de la des-arginine 9 bradykinine ou de leurs différentes conformations dans le liquide biologique, la caractérisation de la présence de niveaux de la bradykinine et/ou de la des-arginine9 bradykinine supérieurs au contrôle ou à une valeur seuil déterminée pour des sujets ne souffrant pas d’angioœdème bradykinique ou d’angioœdème étant le signe de la présence d’un angioœdème bradykinique chez ledit sujet. Un autre objet de l’invention est une méthode de traitement d’un angioœdème bradykinique chez le sujet comprenant les étapes suivantes : fournir un échantillon de liquide biologique dudit sujet, introduire le liquide biologique dans un système senseur comprenant, dans une solution d’halogénure de métal alcalin ou alcalino-terreux de 2M à 5M et d’un pH de 3,1 à 10, un nanopore d’aérolysine inséré dans une membrane lipidique ou polymérique, ledit liquide biologique étant ajouté du côté cis de la membrane, appliquer audit système senseur comprenant le liquide biologique une différence de potentiel comprise entre -300 mV et -1 mV, entre -100 mV et -10 mV, de préférence -50 mV, de nature à favoriser le passage de la bradykinine et/ou de la des-arginine 9 bradykinine, enregistrer le signal électrique généré à une fréquence de 100 kHz à 1 Mhz, analyser le signal électrique généré, ledit signal électrique généré permettant de détecter la présence et/ou de déterminer la concentration ou l’absence de la bradykinine et/ou de la des-arginine 9 bradykinine ou de leurs différentes conformations dans le liquide biologique, et administrer au sujet un traitement spécifique des angioœdèmes bradykiniques en cas de la caractérisation de la présence de niveaux de la bradykinine et/ou de la des-arginine9 bradykinine supérieurs au contrôle ou à une valeur seuil déterminée pour des sujets ne souffrant pas d’angioœdème bradykinique ou d’angioœdème. Méthode de détection d’au moins un biomarqueur peptidique dans un liquide biologique comprenant les étapes suivantes : fournir un échantillon de liquide biologique, ajouter le liquide biologique dans un système senseur comprenant, dans une solution d’halogénure de métal alcalin, d’halogénure d’alcalino-terreux ou leurs mélanges, de 2 M à 5 M et d’un pH de 3 à 10, au moins un nanopore d’aérolysine inséré dans une membrane lipidique ou polymérique définissant un côté cis et un côté trans, ledit liquide biologique étant ajouté du côté cis de la membrane, appliquer audit système senseur comprenant le liquide biologique une différence de potentiel comprise entre -300 mV et +300 mV, de préférence entre -200 mV et +200 mV, de nature à favoriser le passage dudit au moins un biomarqueur peptidique, enregistrer le signal électrique généré à une fréquence de 100 kHz à 1 Mhz, et analyser le signal électrique généré, ladite analyse du signal électrique généré permettant de détecter la présence et/ou de déterminer la concentration ou l’absence de l’au moins un biomarqueur peptidique dans ledit liquide biologique. Méthode selon la revendication précédente dans laquelle l’analyse du signal électrique généré comprend : déterminer un temps d’occupation moyen, médian, minimum et/ou maximum, de l’au moins un nanopore d’aérolysine du système senseur, ou déterminer un taux de blocage moyen, minimum, médian et/ou maximum de l’au moins un nanopore d’aérolysine du système senseur, ou analyser la forme du signal électrique généré, déterminer la déviation standard du signal mesuré lors du passage dudit biomarqueur peptidique au travers dudit nanopore, ou déterminer le nombre d’événements. Méthode selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle l’au moins un biomarqueur peptidique correspond, pour un peptide donné, à la présence et/ou l’absence d’au moins une modification post traductionnelle et/ou d’au moins une conformation dudit peptide. Méthode selon l’une quelconque des revendications précédentes dans laquelle l’au moins un biomarqueur peptidique a une taille comprise entre de 3 à 100 acides aminés. Méthode selon l’une quelconque des revendications précédentes dans laquelle l’au moins un biomarqueur peptidique est sélectionné parmi : les histones H1, H2A, H2B, H3 et/ou H4, le peptide natriurétique de type B, les chimiokines, l’adiponectine, NLRP3, la chaine A de l’insuline, la chaine B de l’insuline, un cytochrome C, le fibrinopeptide A (FPA), le FPA phosphorylé (FPA-P), FPA-3, FPA-6, la bradykinine, la des-arginine 9 bradykinine, Aβ 1-15 , Aβ 1-16 , Aβ 1-17 , Aβ 1-40 , Aβ 1-42 , Aβ 11-40 , Aβ 17-40 et Aβ 17-42 . Méthode selon l’une quelconque des revendications précédentes dans laquelle le signal électrique est récolté sur une période de temps d’au moins 1 minute. Méthode selon l’une quelconque des revendications précédentes dans laquelle le système senseur comprend au moins deux systèmes senseurs. Méthode selon l’une des revendications précédentes dans laquelle le liquide biologique est sélectionné parmi : le sang, le plasma, le sérum, le liquide céphalorachidien, du lavage bronchoalvéolaire, la salive, le liquide synovial, du liquide amniotique, de l’urine, un lysat cellulaire, un milieu de culture de cellules eucaryotes ou bactériennes. Méthode selon l’une des revendications précédentes dans laquelle le ratio du volume de liquide biologique sur le volume de l’électrolyte dans le compartiment du côté cis de la membrane de l’au moins un système senseur est inférieur ou égal à 1/50. Méthode de diagnostic d’une pathologie associée avec un trouble de la coagulation chez un sujet suspecté de souffrir ou souffrant d’une telle pathologie comprenant la détection du FPA ou de ses dérivés tels que le FPA phosphorylé (FPA-P), FPA-3, FPA-6, ou de leurs mélanges, dans un liquide biologique provenant dudit sujet, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : fournir un échantillon de liquide biologique dudit sujet, introduire le liquide biologique dans un système senseur comprenant, dans une solution d’halogénure de métal alcalin, d’halogénure d’alcalino-terreux ou leurs mélanges, de 2M à 5M et d’un pH de 4,1 à 10, au moins un nanopore d’aérolysine inséré dans une membrane lipidique ou polymérique définissant un côté cis et un côté trans, ledit liquide biologique étant ajouté du côté cis de la membrane, appliquer audit système senseur comprenant le liquide biologique une différence de potentiel comprise entre +1 mV et +300 mV, entre +10 mV et +100 mV, de préférence +50 mV, de nature à favoriser le passage du FPA et de ses dérivés, enregistrer le signal électrique généré à une fréquence de 100 kHz à 1 Mhz, et analyser le signal électrique généré, ladite analyse du signal électrique généré permettant de détecter la présence et/ou de déterminer la concentration ou l’absence du FPA ou de ses dérivés dans ledit liquide biologique, un nombre d’événements détectés, dans ledit liquide biologique, pour l’un ou plusieurs des biomarqueurs sélectionnés parmi FPA, FPA-P FPA-3, et FPA-6, supérieur à celui d’un contrôle ou d’une valeur seuil déterminée pour des sujets ne comprenant d’événement thrombotique, étant le signe d’une augmentation de l’activité thrombotique chez ledit sujet. Méthode de diagnostic d’un angioœdème bradykinique chez un sujet suspecté de souffrir ou souffrant d’une telle pathologie comprenant les étapes suivantes : fournir un échantillon de liquide biologique dudit sujet, introduire le liquide biologique dans un système senseur comprenant, dans une solution d’halogénure de métal alcalin ou alcalino-terreux de 2M à 5M et d’un pH de 3,1 à 10, un nanopore d’aérolysine inséré dans une membrane lipidique ou polymérique, ledit liquide biologique étant ajouté du côté cis de la membrane, appliquer audit système senseur comprenant le liquide biologique une différence de potentiel comprise entre -300 mV et -1 mV, de préférence entre -100 mV et -10 mV, de préférence de -50 mV, de nature à favoriser le passage de la bradykinine et/ou de la des-arginine 9 bradykinine, enregistrer le signal électrique généré à une fréquence de 100 kHz à 1 Mhz, analyser le signal électrique généré, ledit signal électrique généré permettant de détecter la présence et/ou de déterminer la concentration ou l’absence de la bradykinine et/ou de la des-arginine 9 bradykinine ou de leurs différentes conformations dans le liquide biologique, la caractérisation de la présence de niveaux de la bradykinine et/ou de la des-arginine 9 bradykinine supérieurs au contrôle ou à une valeur seuil déterminée pour des sujets ne souffrant pas d’angioœdème bradykinique ou d’angioœdème étant le signe de la présence d’un angioœdème bradykinique chez ledit sujet.