Brevet FR3145682A1 — publié le 20240816

L’invention concerne une composition à usage pharmaceutique, vétérinaire ou alimentaire contenant au moins une algue et/ou au moins un extrait d’une algue pour une utilisation anthelmintique par voie orale, ladite algue appartenant à l’ordre des fucales, l’utilisation d’une telle composition dans la préparation d’un médicament pour traiter, contrôler et prévenir les infections endoparasitaires chez un animal à sang chaud ou un être humain et un procédé de préparation d’un médicament à partir d’une telle composition. Composition pour une utilisation anthelmintique par voie orale à base de fucales, procédé de préparation et utilisation d’une telle composition Domaine de l’invention Le domaine de l’invention est celui des traitements antiparasitaires, notamment contre les nématodes gastro-intestinaux. Plus précisément, l’invention concerne une composition à usage pharmaceutique, vétérinaire ou alimentaire pour une utilisation anthelmintique par voie orale, son utilisation comme médicament et un procédé de préparation d’une telle composition. Art antérieur Les nématodes gastro-intestinaux sont une préoccupation majeure pour la santé humaine et animale dans le monde entier. Chez le bétail, ces parasites affectent la santé des animaux en provoquant inappétence, diarrhée, anémie et, dans les cas graves, la mort. Le parasitisme nuit également à la productivité et entraîne des pertes économiques importantes dans la production animale. En l'absence de stratégies alternatives efficaces, la lutte contre les nématodes parasites affectant la santé humaine ou animale repose essentiellement sur l'utilisation d'anthelminthiques chimiques. Cependant, leur utilisation intensive et parfois inappropriée a conduit au développement de résistances aux anthelminthiques. Par conséquent, il est urgent de trouver des solutions alternatives pour un contrôle durable des helminthes. Afin de prévenir l'émergence d'une résistance aux médicaments anthelminthiques, un nombre croissant d'études se concentrent désormais sur des composés d'origine naturelle susceptibles de contrôler des populations de nématodes gastro-intestinaux. Des études récentes ont montré le fort potentiel des algues à travers leurs activités anti-inflammatoires, antimicrobiennes, anticancéreuses mais aussi anti-parasitaires. Il est connu au Japon depuis de nombreux siècles que l'algue rouge Digenea simplex agit comme un vermifuge puissant pour les humains et est efficace pour le traitement de l'ascaridiase. Un inconvénient de l’algue rouge Digenea simplex est que son aire de répartition est limitée. Par ailleurs, il n’existe pas de système de culture efficace de Digenea simplex. Enfin l’efficacité de Digenea simplex n’a été démontrée que sur l’Ascaris lumbricoïdes. On connait également de Santos, F. O., A. P. M. Cerqueira, A. Branco, M. J. M. Batatinha and M. B. Botura. "Anthelmintic activity of plants against gastrointestinal nematodes of goats: A review." Parasitology 146 (2019): 1233-46, des résultats du potentiel antiparasitaire de certains extraits organiques d’algues sur les nématodes gastro-intestinaux de la chèvre. Il existe donc un besoin de pouvoir proposer des compositions alternatives contenant notamment des algues qui soient efficaces contre des espèces différentes de nématodes gastro-intestinaux qui affectent d’autres mammifères. On connait par ailleurs de l’article Nour El-Deen, A. and A. Issa. "Nematicidal properties of some algal aqueous extracts against root-knot nematode, meloidogyne incognita in vitro." Egyptian Journal of Agronematology 15 (2016): 67-78, que des extraits aqueux de macroalgues présentent un potentiel anthelminthique sur le nématode phytoparasite Meloidogyne incognita. Cette étude a montré que différentes espèces de macroalgues ont une activité sur l'inhibition de l'éclosion des œufs et la mortalité des larves juvéniles. Outre que ces résultats concernent un parasite des plantes, et non un nématode gastro-intestinal, il convient de noter que les concentrations efficaces rapportées dans cette étude sont bien supérieures à 5g/L. Objectifs de l’invention L’invention a notamment pour objectif de fournir un traitement anthelmintique qui soit efficace à la fois contre les parasites nématodoïdes des sous-ordres Rhabditina et/ou Spirurina, sensibles ou résistants aux anthelminthiques connus en médecine vétérinaire ou humaine, et qui préserve d’autre part la santé de l’hôte infecté et l’environnement. Un autre objectif de l’invention est de fournir une telle technique qui soit simple à mettre en œuvre et peu couteuse. La présente invention a pour objet une composition à usage pharmaceutique, vétérinaire ou alimentaire contenant au moins une algue et/ou au moins un extrait d’une algue pour une utilisation anthelmintique par voie orale, ladite algue appartenant à l’ordre des fucales. Les inventeurs ont en effet découvert, de façon surprenant et inattendue, que les algues et/ou les extraits d’algues de l’ordre des fucales s’avèrent efficaces contre des organismes zooparasitaires de type nématodoïdes des sous-ordres Rhabditina et/ou Spirurina au stade de l’œuf, au stade larvaire et/ou au stade adulte et notamment qu’elles peuvent permettre d’inhiber l’éclosion des œufs, de tuer des larves, d’inhiber le développement des larves et/ou d’agir la survie des individus adultes. Dans le cadre de l’invention, on entend par le terme « extrait d’une algue » un jus d’algues obtenu par pressage d’algues fraîches, éventuellement avec ajouts d’additifs, ou une substance obtenue à partir d’algues fraîches, séchées ou congelées par tout procédé connu d’extraction assisté ou non, de séparation solide-liquide, de fractionnement, ou de concentration. Il convient par ailleurs de noter que l’invention ne se limite pas à une composition comprenant une seule espèce d’algue, plusieurs espèces d’algues de l’ordre des fucales pouvant être incorporées dans la composition. Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, ladite algue appartient à la famille des Sargassaceae ou des Fucaceae . Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, ladite algue est du genre Sargassum , Bifurcaria , Cystoseira , Pelvetia , Fucus , ou Ascophyllum . Selon un aspect particulier, ladite algue est du sous-genre Bactrophycus. Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, ladite algue est de l’espèce Bifurcaria bifurcata , Sargassum muticum ou Pelvetia canaliculata . Selon un aspect particulier de l’invention, ledit extrait est un extrait aqueux d’une algue ou un extrait organique obtenu à partir d’un extrait aqueux d’une algue ou un extrait organique obtenu par extraction directe de l’algue fraiche ou sechée. Avantageusement, une composition telle que décrite ci-dessus est efficace contre des organismes zooparasitaires de type nématodoïdes du sous-ordre Rhabditina ou Spirurina et en particulier des organismes de l’ordre des Ascarididae ou des trichostrongylidae et encore plus particulièrement contre les organismes des espèces Haemonchus contortus , Heligmosomoides polygyrus et Ascaridia galli , de sorte qu’elle inhibe l’éclosion des œufs, entraine la mort de larves, inhibe le développement au stade larvaire et/ou agit sur la survie des individus adultes. Selon un aspect particulier de l’invention, ladite algue est sous forme séchée ou congelée et ledit extrait d’algue est obtenu à partir d’algues séchées ou congelées. Il convient de noter que l’algue séchée peut être obtenue par séchage à l’air libre, par exemple au soleil, ou en étuve ou par lyophilisation. Dans un autre mode de réalisation de l’invention, l’algue entrant dans la composition ou l’algue dont est tiré l’extrait d’algue peut être une algue fraiche. De préférence, une composition telle que décrite ci-dessus comprend au moins 0,1% en masse de ladite algue rapportée à la masse totale de ladite composition en poids humide. Préférentiellement, une composition telle que décrite ci-dessus comprend au moins 0,01 % en masse dudit extrait d’algue rapporté à la masse totale de ladite composition en poids humide. Dans un mode de réalisation avantageux de l’invention, ladite algue a été collectée sur l’estran ou en mer pendant les mois de mars à août et en ce que ledit extrait d’algue est obtenu à partir d’une algue collectée sur l’estran ou en mer pendant les mois de mars à août. Cette période de collecte est notamment préférée pour des algues prélevées ou cultivées dans l’hémisphère nord. Dans un mode de réalisation avantageux de l’invention, une composition telle que décrite ci-dessus est efficace sur des isolats d’organismes du sous-ordre Rhabditina , et en particulier sur des isolats de l’organismes de l’ordre des Trichostrongylidae , lesdits organismes étant sensibles ou résistants aux anthelmintiques appartenant aux groupes des Lactones macrocycliques, tels que l’ivermectine, la moxidectine et l’eprinomectine, des Benzimidazoles, tels que le Thiabendazole, des Imidazothiazoles, tels que le levamsiole et/ou des Tetrahydropyrimidines, tels que le pyrantel. L’invention concerne également l’utilisation d’une composition telle que décrite ci-dessus dans la préparation d’un médicament pour traiter, contrôler et prévenir les infections endoparasitaires chez un animal à sang chaud ou un être humain. L’invention concerne encore un procédé de préparation d’un médicament à usage pharmaceutique ou vétérinaire comprenant les étapes suivantes : - préparer un extrait d’une algue de l’ordre des fucales, de préférence de la famille des Sargassaceae ou des Fucaceae , plus préférentiellement du genre Sargassum , Bifurcaria , Cystoseira , Pelvetia , Fucus , ou Ascophyllum , encore plus préférentiellement de l’espèce Bifurcaria bifurcata , Sargassum muticum ou Pelvetia canaliculata ; - incorporation dudit extrait dans un liquide ou dans une pâte de sorte à former ledit médicament. Liste des figures D’autres caractéristiques et avantages de l’invention apparaitront plus clairement à la lecture de la description suivante d’un mode de réalisation de l’invention, donné à titre de simple exemple illustratif et non limitatif, et des figures annexées parmi lesquels : est un graphique représentant le pourcentage d'inhibition du développement d’ H. bakeri , du stade L1-L2 au stade L3, en présence d'eau (contrôle), d'ivermectine (1µM) et de différents extraits de Bifurcaria bifurcata (extraction à froid (1) et extraction à chaud (2)) à 5g/L. Les résultats proviennent d'au moins trois expériences indépendantes, avec n=6 par échantillon à chaque fois. Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide d'un test de Kruskal-Wallis avec test de comparaison multiple, ***p représente une courbe dose-réponse pour l’extrait 1 de B. bifurcata pour l'inhibition du développement jusqu’au stade larvaire L3. La ligne continue représente la courbe de régression logistique ajustée et la zone ombrée indique l'intervalle de confiance à 95 % ; représente une courbe dose-réponse pour l’extrait 2 de B. bifurcata pour l'inhibition du développement jusqu’au stade larvaire L3. La ligne continue représente la courbe de régression logistique ajustée et la zone ombrée indique l'intervalle de confiance à 95 % ; est un graphique représentant le pourcentage d'inhibition du développement d’ H. polygyrus bakeri , du stade L1-L2 au stade L3, en présence d'eau (Contrôle), ou de différents lots de B. bifurcata à 5g/L. Les algues de France ont été collectées en 2019 (FR-1) et 2021 (FR-2, FR-3, FR-4) et ont été congelées soit directement (FR-2), soit après 24 h à +4°C (FR-3), soit après 48 h à +4°C (FR-1 et FR-3). Les résultats proviennent d'au moins trois expériences indépendantes, avec n=6 par échantillon à chaque fois. Les analyses statistiques sont réalisées avec un test de Kruskal-Wallis et un test de comparaison multiple Wilcoxon avec ns, non significatif. illustre l’effet de l'eau (contrôle), du thiabendazole (TBZ) à 0,5µg/mL et de l'extrait de B. bifurcata à 5g/L sur H. polygyrus bakeri sur l’inhibition de l'éclosion des œufs après 48h. Les résultats proviennent d’au moins trois expériences indépendantes, avec n=6 par échantillon. Les analyses statistiques ont été effectuées en utilisant un test de Kruskal-Wallis avec un test de illustre l’effet de l'eau (contrôle), du thiabendazole (TBZ) à 0,5µg/mL et de l'extrait de B. bifurcata à 5g/L sur H. polygyrus bakeri sur le taux de mortalité des larves après éclosion. Les résultats proviennent d’au moins trois expériences indépendantes, avec n=6 par échantillon. Les analyses statistiques ont été effectuées en utilisant un test de Kruskal-Wallis avec un test de comparaison multiple Wilcoxon avec ***p est un graphique représentant des courbes de survie des adultes d’ H. polygyrus bakeri exposés à différentes concentrations d'extrait aqueux de Bifurcaria bifurcata pendant 6 jours. Les courbes de survie ont été obtenues en utilisant la méthode Kaplan-Meier et la zone ombragée indique l'intervalle de confiance à 95%. représente des courbes dose-réponse du développement larvaire d’ H. polygyrus bakeri , du stade L1-L2 au stade L3, pour différents lots de B. bifurcata collectés en France et au Portugal. Les deux lots proviennent d'algues collectées en France et congelées avant extraction (bleu), et d'algues séchées et collectées au Portugal (rouge). Les différentes IC50 ont été estimées à partir de ces courbes. La ligne continue représente la courbe de régression log-logistique ajustée et la zone ombrée indique l'intervalle de confiance à 95%. ***p est une comparaison, sous forme de graphique, de l'efficacité de différents extraits de B. bifurcata provenant de France (congelé) et du Portugal (séché) pour inhiber le développement des larves d’ H. polygyrus bakeri . Un contrôle avec de l’eau a été réalisé. Les extraits aqueux, les différents extraits organiques (heptane, acétate d'éthyle et butanol) et la fraction aqueuse résiduelle ont été testés à 1g/L. Les extraits sont issus soit du lot d’algues congelées et récoltée en France (bleu), soit du lot d’algues séchées et récoltée au Portugal (rouge). Les résultats proviennent d'au moins trois expériences indépendantes, avec n=6 par échantillon à chaque fois. Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide d'un test de Kruskal-Wallis avec test de comparaison multiple, avec ***p illustre les résultats, obtenus avec l’algue Bifurcaria bifurcata , du test d'éclosion et de mortalité après éclosion, de tests de développement larvaire et de tests de survie des vers adultes sur le parasite H. contortus . est un graphique résumant les résultats du test de développement larvaire L3 de l’espèce H. contortus pour différentes espèces d’algues à une concentration de 0,5 ou 5 g/L. illustre les résultats avec un dose de 5g/L d’extrait d’algue Bifurcaria bifurcata du test de mortalité des larves après éclosion des œufs pour la souche sensible Weybridge de H. contortus et pour la souche résistante Kokstadt de H. contortus sont des courbes dose-éclosion pour la souche sensible Weybridge et pour la souche résistante Kokstadt sont des résultats d’un test de migration (MTA) sur les larves d’ Ascaridia galli obtenus pour des extraits d’algue obtenus à partir d’un lot d’algues B. bifurcata de France et d’un lot d’algue B. bifurcata du Portugal. illustre l’activité biologique des fractions organiques Heptane et EtOAc réalisée sur Bifurcaria bifurcata a) en termes d’inhibition du développement larvaire et b) en termes de mortalité des larves après éclosion, pour des algues récoltées en France ou au Portugal en fonction de la saisonnalité ou du mode de préparation (séchage et/ou congélation). est une courbe dose-réponse du développement larvaire des larves de H. Bakeri au stade L3 en fonction du dosage en extrait de Pelvetia caniculata . est le résultat du test de développement larvaire L3 de l’espèce H. contortus pour des extraits de Pelvetia caniculata à 5g/L (codes AM228-19 et AM229-19). illustre des résultats d’un test de ponte montrant l’effet de l’extrait de Pelvetia caniculata à différents dosages sur la ponte des vers adultes de H. bakeri . est un graphique résumant le nombre de ponte anormales (moins de 50 œufs par vers) obtenus par un test de ponte des vers adultes de H. bakeri pour le contrôle négatif (eau), pour de l’eau avec une concentration en NaCl de 3,55g/L, qui correspond à la salinité d’un extrait d’algue à 5g/L, et pour un extrait de Pelvetia caniculata à 5g/L. est le résultat du test de développement larvaire L3 des larves de H. Bakeri pour des extraits de Sargassum muticum à 5g/L (codes AM244-19 et AM245-19). est le résultat du test de développement larvaire L3 des larves de H. contortus pour des extraits de Sargassum muticum à 5g/L (codes AM244-19 et AM245-19). est une courbe dose-réponse du développement larvaire des larves de H. Bakeri au stade L3 en fonction du dosage en extrait de Sargassum muticum . Description détaillée de l’invention Par la suite on présente à titre d’exemple des résultats d’essais in vitro relatifs aux propriétés anthelminthiques de l’espèce d'algue Bifurcaria bifurcata , de l’espèce Sargassum muticum (famille des Sargassaceae ) et de l’espèce Pelvetia caniculata (famille des Fucaceae ). On notera à titre liminaire que l’espèce Bifurcaria bifurcata , l’espèce Sargassum muticum et l’espèce Pelvetia caniculata présentent l’avantage d’être disponibles en grande quantité. • Résultats d’essais concernant Bifurcaria bifurcata Collecte d'algues Bi furcaria bifurcata et préparation d'extraits aqueux Les algues brunes B. bifurcata (FR-1) ont été récoltées à Roscoff (Bretagne, France, 48°43'53.6''N 3°59'15.5''W) en 2019. Les algues ont été lavées à l'eau de mer et stockées pendant 24 à 48 heures à 4°C avant traitement. Les algues nettoyées ont été dessalées dans de l'eau osmosée et conservées à -20°C. Pour réaliser les extractions aqueuses, les algues ont été décongelées à température ambiante et broyées à l'aide d'un ULTRA-TURRAX(marque déposée). Les algues broyées ont été incubées 1h à Température ambiante puis centrifugées 20min à 10000g pour récupérer le surnageant (extrait 1). Le culot résiduel a été remis en suspension dans un volume d'eau équivalent au poids du culot et incubé pendant une heure à 60°C dans un bain-marie. Après centrifugation à 10000g pendant 20 min, le surnageant a été récupéré (extrait 2). Les deux extraits obtenus ont été lyophilisés séparément pour une conservation optimale. Afin d'étudier la variation potentielle de l'activité vermifuge liée à l'origine géographique et au process, des lots de B. bifurcata ont également été collectés à Peniche (Leiria, Portugal, 39°19'33''N 9°21'35.4''W) en 2020. QuintaQuanta / Mermaid Fragrance était le fournisseur de biomasse. Les algues du Portugal étaient envoyées séchées ou congelés. Elles n'ont pas été lavées avant le séchage, un dessalage est donc effectué lors de la phase de réhydratation avec de l'eau osmosée. L'extraction a ensuite été réalisée de la même manière que pour les algues congelées. Tous les extraits ont été remis en suspension à une concentration de 15 g/L dans de l'eau minérale (de marque Volvic), aliquotés et conservés à -20°C jusqu'à utilisation. Préparation d'extraits organiques La matière algale lyophilisée (3g) a été solubilisée dans 30 ml d'eau MilliQ avant extraction, puis extraite séquentiellement trois fois avec chaque solvant (n-heptane, acétate d'éthyle (EtOAC) et enfin n-butanol (BuOH): (1: 1 , v/v)). Tous les solvants étaient de qualité analytique et ont été achetés chez Carlo Erba France. Ces trois extraits différents ont été filtrés à travers un papier filtre et évaporés à sec, ainsi que la fraction d'eau résiduelle, dans un évaporateur rotatif sous vide (Hei-VAP Core, Heidolph) à 33°C, conduisant à une moyenne de récupération de 6 mg (Heptane), 34 mg (EtOAc), 147 mg (BuOH) et 1,7 g (Eau) d'extraits secs résultants. Les extraits séchés ont été dissous dans du DMSO à 100 mg/ml pour une solution mère stockée à -20°C et ensuite dilués selon la dose requise. Matériel parasitaire Des œufs, des stades larvaires et des vers adultes de H. polygyrus bakeri ont été obtenus à partir de souris infectées par voie expérimentale (C57BL/6JRj) dans des conditions contrôlées. Les infestations expérimentales, le maintien des souris et l'euthanasie ont été conduits dans le strict respect des consignes nationales d'éthique et approuvés par le Comité d'Ethique en Expérimentation Animale (CEA VdL N°19) sous le numéro de protocole APAFIS# 21504. Des souris ont été inoculées par voie orale avec 200 L3s de H. polygyrus bakeri . Dix jours après l'infection, des échantillons fécaux ont été prélevés pour l'extraction des œufs. Les matières fécales collectées ont été regroupées, mélangées avec de l'eau dans un mortier et filtrées à travers différents filtres de 100 µm et 35 µm. Les œufs ont été collectés dans le filtre de 35 µm et mélangés avec du kaolin pour les agglomérer. Après 5min de centrifugation à 600g, le culot est remis en suspension dans une solution de NaCl à 360g/L. Une deuxième centrifugation de 5 min à 900g a été réalisée, le surnageant a été jeté et les oeufs rincés à l'eau avant d'être collectés et comptés. Pour collecter les vers adultes, les souris ont été sacrifiées par dislocation cervicale et l'intestin grêle a été récupéré. Celui-ci a été ouvert sur toute sa longueur avec une paire de ciseaux à dissection. L'intestin a ensuite été placé dans un filtre au sommet d'un entonnoir en verre relié à un tube de prélèvement. Les vers migrent à travers le milieu de culture DMEM préchauffé (37°C) du filtre vers le tube de récolte comme décrit précédemment. Test d'éclosion et test de mortalité après éclosion Cent œufs (60µL) ont été placés dans des tubes en verre en présence de l'extrait d'algue (30µL). Les tubes ont été placés à 21°C pendant 48h pour induire l'éclosion des œufs. Le test consiste à compter le nombre d'œufs non éclos et le nombre de larves libérées après l'éclosion des œufs. Le taux d'éclosion des œufs est calculé (larves / (larves + œufs)) et les résultats corrigés en fonction du contrôle négatif pour obtenir le pourcentage d'inhibition de l'éclosion des œufs, comme suit : Parmi les larves écloses, le nombre de larves vivantes et mortes a également été compté pour obtenir le pourcentage de mortalité des larves post-éclosion, qui se calcule comme suit : Test de développement larvaire (LDA) La LDA a été réalisée en prenant 7,8 ml de suspension d'œufs, qui contenait environ 1666 œufs/mL, et en ajoutant 2 ml d'une suspension d'E. coli et 200 µl d'amphotéricine B. Le mélange résultant a ensuite été distribué dans des tubes en verre (80 µl par tube). Les tubes sont placés à 21°C pendant 48h pour permettre aux œufs d'éclore correctement. A 48h, 20µL de milieu d'Earl ont été ajoutés ainsi que les extraits d'algues à tester (50µL). Les tubes ont été replacés dans l'incubateur à 21°C pendant 7 jours pour permettre le bon développement des larves. Le test consiste alors à compter le nombre de jeunes larves L1/L2 par rapport au nombre de larves pleinement développées au stade L3. Le ratio de développement larvaire a été calculé (L3 / (L3 + L1/L2)) et les résultats corrigés en fonction du contrôle négatif pour obtenir le pourcentage d'inhibition du développement larvaire, comme suit : Test de survie Les vers adultes ont été placés dans des plaques 48 puits contenant 120µL de milieu DMEM additionné d'antibiotiques (Pénicilline 100U/mL et Streptomycine 100µg/mL) et 60µL d'extraits d'algues pour obtenir les différentes concentrations finales (5g/L, 1g/L, 0.5g /L et 0,1g/L). Les vers ont été placés à 37°C et le nombre de survivants a été compté chaque jour pendant l'expérience. Les vers étaient considérés comme morts lorsqu'ils ne réagissaient pas à la stimulation par contact (piquage avec un pic à vers). Analyses statistiques R Studio 4.2.1 a été utilisé pour l'analyse statistique de la moyenne, de la médiane, du calcul de l'IC50 par régression non linéaire et de l'analyse de survie en utilisant la méthode de Kaplan-Meier. En fonction de la distribution des données et de l'homogénéité des variances, le test de Krus-kal-Wallis avec test de comparaison multiple (test de Dunn et test de Wilcoxon) a été utilisé. Résultats Le test de développement larvaire (LDA) révèle l'activité anthelminthique des extraits aqueux de B. bifurcata sur H. polygyrus bakeri L'inhibition du développement larvaire des larves de H. polygyrus bakeri par des extraits aqueux de B. bifurcata a été étudiée en utilisant de l'eau comme contrôle négatif et de l'ivermectine 1 µM (anthelminthique de référence) comme contrôle positif. Dans l'eau, le développement du stade L1/L2 au stade L3 est d'environ 97 %, alors que l'application d'Ivermectine 1 µM inhibe complètement le développement larvaire. Comme contrôle supplémentaire, nous avons également étudié l'effet potentiel du sel (NaCl) pour faire la distinction entre l'activité putative des composés bioactifs et la teneur en sel des algues. A 5g/L, la solution de NaCl n'a eu aucun effet sur le développement larvaire (similaire au témoin dans l'eau seulement). Afin de prendre en compte un effet potentiel de la température d'extraction sur l'activité biologique, deux extraits aqueux (extractions froide et chaude) ont été testés ( ). Les deux extraits de 5 g/L de B. bifurcata ont induit une inhibition complète du développement larvaire. Leurs valeurs respectives d'IC50 étaient de 0,68 g/L pour l'extrait « froid » 1 ( ) et de 0,97 g/L pour l'extrait « chaud » 2 ( ). Il est important de noter que l'activité vermifuge de B. bifurcata à 5g/L a été confirmée sur quatre lots d'algues FR-1 à FR-4 collectés en 2019 et 2021 qui ont été congelés soit directement, soit après 24 h à +4°C, soit après 48 h à +4°C ( ). De façon générale, ces résultats démontrent que l’espèce d'algue B. bifurcata criblée au LDA présente une activité vermifuge forte, reproductible et dose-dépendante sur les stades larvaires de H. polygyrus . Par la suite, les extraits « froids » et « chauds » présentant tous deux une activité anthelminthique significative, on a testé les extraits froids de B. bifurcata qui présentent la plus faible IC50. Action de B. bifurcata sur de l’inhibition l'éclosion des œufs et activité nématicide sur les vers adultes de H. polygyrus bakeri Afin d'étudier plus avant l'activité anthelminthique de B. bifurcata sur d'autres stades de vie du parasite, des tests complémentaires ont été réalisés sur des œufs et des vers adultes. Dans un premier temps, des tests d'éclosion des œufs (48 heures) ont été réalisés en utilisant de l'eau comme contrôle négatif et du Thiabendazole (médicament vermifuge de référence pour les tests d'éclosion des œufs) comme contrôle positif ( ). L'application d'extrait aqueux de B. bifurcata (5 g/L) a induit une inhibition de 28 % de l'éclosion des œufs par rapport au témoin négatif (p De manière frappante, une forte activité nématicide a également été observée sur les larves fraîchement écloses avec 67 % (p ). Cela suggère que B. bifurcata a une double activité anthelminthique, c'est-à-dire sur l'éclosion des œufs et une activité nématicide directe sur les larves fraîchement écloses. Il convient de noter que les mêmes tests ont été effectués en utilisant des périodes d'incubation plus longues (72h et 96h) et les mêmes résultats ont été obtenus (données non présentées). Deuxièmement, l'activité nématicide directe de B. bifurcata a également été étudiée sur des vers adultes via un test de survie. Le test a duré 6 jours, pendant lesquels le taux de survie des vers adultes était de 100% dans le milieu de culture. L'extrait aqueux d'algue B. bifurcata a été appliqué à quatre concentrations différentes (de 5 g/L à 0,1 g/L ; ). Pour la concentration la plus élevée, tous les vers sont morts dans les 24 heures. Pour la concentration de 1g/L, nous avons observé un faible taux de survie de 10% après trois jours. Enfin, l'activité nématicide était toujours détectable à une concentration de 0,5 g/L avec un taux de survie de 30 % après 6 jours. Ces résultats soutiennent fortement une activité nématicide directe de B. bifurcata sur les vers adultes H. polygyrus bakeri . Il convient de noter que le test n'a pas été effectué sur une plus longue période de temps car le taux de survie des vers dans la condition de contrôle a commencé à diminuer. Pris ensemble, ces résultats démontrent clairement que les extraits aqueux d'algues B. bifurcata ont des activités anthelminthiques contre le parasite murin H. polygyrus bakeri. Impact du procédé d'extraction et/ou de l'origine géographique sur l'activité vermifuge de B. bifurcata . En travaillant avec des biomasses algales, il était important d'étudier la reproductibilité du résultat en fonction de l'origine géographique et du procédé d'extraction. En effet, ces deux facteurs sont bien connus pour influencer la composition phytochimique des extraits puis l'activité biologique. Ainsi, nous avons utilisé des dosages LDA pour comparer l'activité anthelminthique de B. bifurcata de France (congelé avant extraction aqueuse) avec des lots de B. bifurcata récoltés sur la côte portugaise (séché avant extraction aqueuse). Afin de surveiller l'impact potentiel des facteurs géographiques et de processus combinés, des courbes dose-réponse ont été générées pour les deux types d'extraits ( ). Si nos résultats confirment des activités vermifuges dose-dépendantes des deux lots de B. bifurcata , ils mettent également en évidence une variabilité d'efficacité (par exemple IC50= 0,7g/L pour le lot congelé français vs IC50= 1,5g/L pour le lot séché portugais) qui pourrait refléter soit l'origine géographique des algues et/ou l'impact du process de séchage avant l'extraction aqueuse. Afin d'explorer plus avant la famille phytochimique potentiellement à l'origine de la variabilité de l'activité anthelminthique de B. bifurcata , nous avons réalisé des extractions organiques sur les extraits aqueux à 1g/L obtenus à partir de lots d'algues de France (congelées) et du Portugal (séchées). A 1 g/L, l'extrait aqueux de France est toujours très actif, alors que ses homologues du Portugal sont presque inefficaces, augmentant ainsi notre capacité à détecter le composant chimique correspondant responsable de l'activité anthelminthique différentielle. Le fractionnement des extraits aqueux a été effectué séquentiellement avec trois solvants distincts (heptane, EtOAc et BuOH), et leur propriété anthelmintique respective a été surveillée à l'aide de LDA comme décrit précédemment ( ). Les extraits organiques (heptane, EtOAc et BuOH) et la fraction aqueuse résiduelle ont été testés à 1g/L. Pour les algues françaises et portugaises, les extraits d'heptane et d'acétate d'éthyle ont induit une inhibition totale du développement larvaire. Étonnamment, alors que l'extrait butanolique de l'algue française présentait une efficacité élevée sur le développement larvaire (99 %), son homologue portugais n'induisait qu'une inhibition de 13 %, jetant ainsi les bases d'une explication potentielle de leur activité différentielle. Fait important, les fractions aqueuses résiduelles n'ont montré aucune activité restante indiquant que les molécules actives sont complètement récupérées par les solvants organiques. L'activité anthelminthique des fractions organiques a ensuite été étudiée plus avant à l'aide d'un test de mortalité larvaire après l'éclosion. Les extraits organiques ont été testés à différentes concentrations. Alors que les extraits au BuOH et les fractions aqueuses résiduelles ont montré un faible impact sur la mortalité des larves même à 3g/L, les extraits à l'acétate d'éthyle étaient efficaces à 1g/L et les extraits à l'heptane avaient une pleine activité à 0,5g /L. Ces résultats indiquent que les molécules actives sont principalement présentes dans l'extrait à l'heptane mais également dans l'extrait à l'acétate d'éthyle. Fait intéressant, aucune différence significative n'a été observée entre les activités des extraits organiques des algues françaises et portugaises. Contrairement aux résultats de la LDA, il n'y avait qu'une faible activité de la fraction BuOH des algues françaises en ce qui concerne la mortalité larvaire. Ces résultats suggèrent que les molécules impliquées dans l'inhibition du développement larvaire pourraient différer de celles impliquées dans la mortalité larvaire. L'activité nématicide de différents extraits de B. bifurcata de France (congelés) et du Portugal (séchés) sur des larves fraîchement écloses de H. polygyrus bakeri est reportée dans le tableau récapitulatif ci-dessous. Les résultats indiqués dans ce tableau proviennent de trois expériences indépendantes, avec n = 6 par échantillon à chaque fois. Les valeurs reportées sont la moyenne de la mortalité (%) ± l'écart type. Extra it Concentration (g/L) Localisation géographique / process Mortalit é (% ± SD) p -value France (congelé) vs Portugal (séché) Control - 0 - 0,065 ± 0,34 - Bifurcaria bifurcata Extrait aqueux 3 France (congelé) 12 ± 7,15 3,1.10 -5 Portugal (séché) 0,318 ± 0,74 Heptane 0,5 France (congelé) 100 ± 0,00 1 Portugal (séché) 99,8 ± 0,51 EtOAc 1 France (congelé) 73,2 ± 17,90 1 Portugal (séché) 55,3 ± 31,20 BuOH 3 France (congelé) 2,49 ± 3,42 1 Portugal (séché) 3,54 ± 4,07 Fraction aqueuse résiduelle 3 France (congelé) 0 ± 0,00 Non déterminé Conclusions sur l’effet de B. bifurcata sur H. polygyrus bakeri Pris ensemble, les résultats obtenus démontrent que les extraits aqueux de l'algue B. bifurcata contiennent des composés bioactifs ayant une activité vermifuge in vitro sur les différents stades de vie du parasite murin H. polygyrus bakeri . Il a ainsi été observé que l’extrait aqueux de B. bifurcata est suffisamment puissant pour inhiber le développement larvaire sur le parasite murin H. polygyrus bakeri avec une efficacité de 100% à une concentration de 5g/L. Cet extrait d’algue a également montré des effets sur l'éclosion des œufs (28% d'inhibition à 5g/L) et une activité nématicide directe sur les larves (67% d'efficacité à 5g/L) et les vers adultes (70% d'efficacité jusqu'à 0,5g/L en 6 jours). On a par ailleurs comparé les résultats obtenus avec B. bifurcata aux efficacités anti-helminthiques rapportées pour des extraits végétaux. A titre d’exemple, le test de développement larvaire a montré une activité très élevée de l'algue B. bifurcata avec une IC50 d'environ 0,8 g/L. Cette activité est supérieure à ce qui a été rapporté pour les espèces de plantes Glycyrrhiza glabra , Fumaria parviflora , Urtica dioica et Myrtus communis sur les parasites gastro-intestinaux des petits ruminants. Concernant l'activité larvicide, qui est d'environ 67% à 5g/L, elle est comparable à ce qui a été rapporté lorsque des extraits de plantes ont été évalués comme anthelminthiques. Enfin, l'activité nématicide observée sur les vers adultes est plus importante que ce qui est connu de l’art antérieur. En effet, on observe 100% de mortalité des adultes de H. polygyrus bakeri en 24h avec un extrait aqueux de B. bifurcata à 5g/L, alors que par exemple, sur Haemonchus contortus , Eguale et al. (Eguale, T., G. Tilahun, A. Debella, A. Feleke and E. Makonnen. " Haemonchus contortus : In vitro and in vivo anthelmintic activity of aqueous and hydro-alcoholic extracts of hedera helix." Experimental Parasitology 116 (2007): 340-45) ont remarqué un taux de mortalité de seulement 29% en 24h avec un extrait aqueux de plantes à 8g/L et Lone et al. (Lone, B., M. Chishti, F. Bhat, H. Tak, S. Bandh and A. Khan. "Anthelmintic activities of aqueous and methanol extracts of prunella vulgaris l." Nat Prod Chem Res 5 (2017): 269) ont utilisé des concentrations beaucoup plus élevées (25g/L et 50g/L) pour observer un effet sur la mortalité adulte en moins de 24h. Cependant, une telle comparaison doit être prise avec précaution car nous ne pouvons pas exclure que malgré leur relation phylogénétique étroite, H. polygyrus bakeri et H. contortus pourraient également présenter une sensibilité différentielle aux composés naturels. Il a également été observé que les extraits chauffés présentaient toujours une activité biologique démontrant ainsi que les composés actifs ne sont pas affectés par des températures jusqu'à 60°C. Parce qu'il a déjà été rapporté dans Michalak, I., Ł. Tuhy and K. Chojnacka. "Seaweed extract by microwave assisted extraction as plant growth biostimulant." Open Chemistry 13 (2015): que la température peut avoir un impact sur la stabilité de certaines molécules telles que les polyphénols d'algues, une hypothèse est que les molécules actives sont soit présentes en grande quantité, soit qu'elles ne soient pas affectées par la température, mettant ainsi en évidence une stabilité importante des composés anthelmintiques solubles de B. bifurcata . Il a par ailleurs été mis en évidence une différence d'activité vermifuge entre B. bifurcata de France (congelé) et du Portugal (séché). Les fractions aqueuses des lots d'algues du Portugal ont une activité moindre par rapport à leurs homologues de France. Cependant, les lots portugais ont conservé environ 30% d'inhibition du développement larvaire, ce qui tend à indiquer que les molécules actives étaient toujours présentes mais en moindre quantité. Cette hypothèse a également été confirmée par la comparaison des bilans de masse du fractionnement des deux lots d'algues. En effet, la fraction BuOH représentait 3,1% de la masse globale pour les algues françaises alors qu'elle ne représente que 2,6% de celle portugaise (tableau S1). Afin d'approfondir cette hypothèse, différentes extractions organiques (heptane, acétate d'éthyle et butanol) ont été réalisés et leur activité biologique respective ont été caractérisées (voir la ). Les résultats ont montré que les fractions portant l'activité biologique principale étaient celles obtenues avec l'heptane et EtOAc, indépendamment de leur origine et du procédé utilisé avant les extractions aqueuses (c'est-à-dire congelé ou séché). Ceci a confirmé la présence de molécules actives dans le lot d'algues portugais. Il convient de noter que des molécules actives abritant une activité antiparasitaire contre les protozoaires Trypanosoma et Plasmodium précédemment identifiés chez B. bifurcata ont également été extraites à l'aide d'EtOAc. Ces résultats sont en accord avec l’étude de Bonde et al. (Bonde, C. S., L. Bornancin, Y. Lu, H. T. Simonsen, M. Martínez-Valladares, M. Peña-Espinoza, H. Mejer, A. R. Williams and S. M. Thamsborg. "Bio-guided fractionation and molecular networking reveal fatty acids to be principal anti-parasitic compounds in nordic seaweeds." Frontiers in Pharmacology 12 (2021): 674520) réalisée sur les algues brunes Saccharina latissima et Laminaria digitata, montrant que la fraction organique extraite avec un autre solvant alcane (c'est-à-dire l'hexane) présentait également une activité larvicide sur deux espèces de parasites gastro-intestinaux du mouton ( Teladorsagia circumcincta ) et le porc ( Ascaris suum ). Par ailleurs les résultats des différentes fractions organiques sur le test de développement larvaire ont également mis en évidence une action spécifique de l'extrait de butanol. En effet, il a été observé une différence majeure d'activité entre la fraction BuOH entre l'algue française et l'algue portugaise (respectivement 99% et 13% d'inhibition du développement larvaire) suggérant que les propriétés anthelminthiques de B. bifurcata pourraient reposer sur différentes familles de molécules. Cela confirme l'intérêt particulier d'utiliser des extraits aqueux de B. bifurcata comme sources anthelminthiques car ils combinent une gamme de composés actifs conduisant à des modes d'action distincts. Bonde et al. ont montré que l'activité vermifuge des composés algaux individuels est modérée par rapport à l'activité des fractions à partir desquelles ils ont été obtenus. A cet égard, il est tentant de spéculer sur un effet synergique putatif entre les différents composés actifs présents à la fois dans l'heptane et l'extrait de BuOH de B. bifurcata . Résultats sur Haemonchus contortus On présente par la suite des résultats obtenus avec un extrait d’algue Bifurcaria bifurcata (identifié par le code AM242-19 sur les figures suivantes) sur le parasite gastrointestinal du mouton H. contortus. Sur la , on peut voir les résultats obtenus pour le test d'éclosion pour une dose de 5g/L d’extrait de B. bifurcata , en utilisant de l'eau comme contrôle négatif et du Thiabendazole comme contrôle positif, et pour le test de développement larvaire (LDA) et pour le test de survie des vers adultes pour différentes concentrations (0,5 g/L, 1g/L et 5g/L) en extrait de B. bifurcata . On observe pour une dose de 5g/L d’extrait de B. bifurcata une inhibition du développement larvaire et une activité nématicide sur les larves de H. contortus et dans une moindre mesure sur les vers adultes de H. contortus (IC50 de 4,39 g/L). On présente sur la les résultats du test de développement larvaire au stade L3 de l’espèce H. contortus pour différentes espèces d’algues à une concentration de 0,5 ou 5 g/L. On peut constater sur la , que l’extrait d’algue Bifurcaria bifurcata (AM 242-19 et AM 243-19) à 5g/L inhibe totalement le développement larvaire L3 de H. contortus, tout comme les extraits de Pelvetia caniculata (AM 228-19 et AM229-19) et de Sargassum muticum (AM244-19 et AM 245-19). La illustre les résultats du test de mortalité des larves après éclosion des œufs avec une dose de 5g/L d’un extrait de B. bifurcata pour la souche sensible Weybridge de H. contortus et pour la souche résistante Kokstadt de H. contortus . Les courbes dose-éclosion pour cette souche sensible Weybridge (IC50=0,05 µg/mL) et pour la souche résistante Kokstadt (IC50=2,31 µg/mL) sont représentées sur la . Résultats sur Ascaridia galli L’extrait d’algue Bifurcaria bifurcata à 5g/L a montré un effet sur le parasite gastrointestinal des volailles Ascaridia galli à la fois sur la mortalité des adultes et sur le développement des œufs. Les résultats ont par ailleurs montré que l’activité sur les larves d’ Ascaridia galli des extraits d’algue Bifurcaria bifurcata était sensiblement semblable quel que soit l’origine géographique de Bifurcaria bifurcata , comme on peut le voir sur la où sont représentés des résultats obtenus in vitro d’un test de migration (MTA) pour des extraits d’algue Bifurcaria bifurcata obtenus à partir de deux lots d’algues, l’un de France, l’autre du Portugal. • Résultats d’essais concernant Pelvetia caniculata Activité de Pelvetia caniculata L’activité anthelminthique des extraits aqueux de l’algue Pelvetia caniculata a également été testée. On peut voir sur la courbe dose/développement larvaire de la , que l’extrait de Pelvetia caniculata (désigné sous le code AM228-19) a un effet sur le développement larvaire au stade L3 des larves de H. Bakeri , avec un IC50 estimé à 1,03 g/L. On a également observé avec l’extrait de Pelvetia caniculata à 5g/L une inhibition quasi-totale du développement larvaire au stade L3 des larves de H. contortus au stade L3 (voir la ). Il a par ailleurs été observé via un test de ponte par des vers adultes de H. bakeri (voir la ) que l’extrait de Pelvetia caniculata à 8g/L réduit significativement la quantité d’œufs produites par les larves adultes et que le nombre de ponte anormales (dénombrant moins de 50 œufs) des larves de H. bakeri augmente d’environ 50% avec l’extrait de Pelvetia caniculata à 5g/L par rapport au nombre de pontes anormales observées avec le contrôle négatif (voir la ). • Résultats d’essais concernant Sargassum muticum L’activité anthelminthique des extraits aqueux de l’algue Sargassum muticum a aussi été testée. On a observé avec deux extraits de Sargassum muticum à 5g/L (extraits désignés sous les codes AM244-19 et AM245-19) une inhibition quasi-totale du développement larvaire au stade L3 des larves de H. bakeri (voir la ) et des larves de H. contortus (voir la ). La courbe dose/développement larvaire des larves de H. bakeri nous a permis par ailleurs d’estimer que l’IC50 de l’extrait de Sargassum muticum 245-19 était égal à 1,57 g/L (voir la ). Composition à usage pharmaceutique, vétérinaire ou alimentaire contenant au moins une algue et/ou au moins un extrait d’une algue pour une utilisation anthelmintique, ladite composition étant sous une forme adaptée à une administration par voie orale, ladite algue appartenant à l’ordre des fucales. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite algue appartient à la famille des Sargassaceae ou des Fucaceae. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite algue est du genre Sargassum, Bifurcaria, Cystoseira, Pelvetia, Fucus, ou Ascophyllum . Composition selon la revendication 3, caractérisée en ce que ladite algue est du sous-genre Bactrophycus. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite algue est de l’espèce Bifurcaria bifurcata, Sargassum muticum ou Pelvetia canaliculata . Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que ledit extrait est un extrait aqueux ou organique d’une algue ou un extrait organique obtenu à partir d’un extrait aqueux d’une algue. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu’elle est efficace contre des organismes zooparasitaires de type nématodoïdes du sous-ordre Rhabditina et/ou Spirurina et en particulier des organismes de l’ordre des Ascarididae ou des Trichostrongylidae et encore plus particulièrement contre les organismes des espèces Haemonchus contortus, Heligmosomoides polygyrus et Ascaridia galli . Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, dans laquelle ladite algue est sous forme fraiche, séchée ou congelée et ledit extrait d’algue est obtenu à partir d’algues fraiches, séchées ou congelées. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce qu’elle comprend au moins 0,1% en masse de ladite algue rapporté à la masse totale de ladite composition, en poids humide. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce qu’elle comprend au moins 0,01% en masse dudit extrait d’algue rapporté à la masse totale de ladite composition, en poids humide. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que ladite algue a été collectée sur l’estran ou en mer pendant les mois de mars à août et en ce que ledit extrait d’algue est obtenu à partir d’une algue collectée sur l’estran ou en mer pendant les mois de mars à août. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisée en ce qu’elle est efficace sur des isolats d’organismes du sous-ordre Rhabditina, et en particulier sur des isolats de l’organismes de l’ordre des Trichostrongylidae, lesdits organismes étant sensibles ou résistants aux anthelmintiques appartenant aux groupes des Lactones macrocycliques, tel que l’ivermectine, la moxidectine et l’eprinomectine, des Benzimidazoles, tel que le Thiabendazole, des Imidazothiazoles, tel que le levamsiole et/ou des Tetrahydropyrimidines, tel que le pyrantel. Utilisation d’une composition selon l’une des revendications 1 à 12 dans la préparation d’un médicament pour traiter, contrôler et prévenir les infections endoparasitaires chez un animal à sang chaud ou un être humain. Procédé de préparation d’un médicament à usage pharmaceutique ou vétérinaire comprenant les étapes suivantes : - préparer un extrait d’une algue de l’ordre des fucales, de préférence de la famille des Sargassaceae ou des Fucaceae, plus préférentiellement du genre Sargassum , Bifurcaria , Cystoseira , Pelvetia , Fucus , ou Ascophyllum , encore plus préférentiellement de l’espèce Bifurcaria bifurcata , Sargassum muticum ou Pelvetia canaliculata ; - incorporation dudit extrait dans un liquide ou dans une pâte de sorte à former ledit médicament.