Brevet FR3140378A1 — publié le 20240405

Procédé de production d’un modèle de myélome multiple humain en trois dimensions La présente invention concerne le procédé de production d’un modèle tridimensionnel (3D) de myélome multiple (MM), sous forme de sphéroïdes, par co-culture de cellules souches/ stromales mésenchymateuses, de progéniteurs endothéliaux et de plasmocytes primaires de patient(s) atteint(s) de MM. La présente invention concerne également les sphéroïdes obtenus par ledit procédé et leurs utilisations. Figure pour l'abrégé : aucune Procédé de production d’un modèle de myélome multiple humain en trois dimensions La présente invention concerne le procédé de production d’un modèle tridimensionnel (3D) de myélome multiple (MM), sous forme de sphéroïdes, par co-culture de cellules souches/stromales mésenchymateuses, de progéniteurs endothéliaux et de plasmocytes primaires de patient(s) atteint(s) de MM. La présente invention concerne également les sphéroïdes obtenus par ledit procédé et leurs utilisations. Le myélome multiple (MM) est une hémopathie maligne, aussi appelé cancer de la moelle osseuse. Il se caractérise par la prolifération excessive dans la moelle osseuse d’un type de globule blanc, le plasmocyte, devenu anormal. Les plasmocytes sont des cellules du système immunitaire dérivées de la moelle osseuse (MO) qui produisent des anticorps dans le but de protéger l’organisme contre des attaques extérieures (bactéries, virus). Pendant le développement, des anomalies génétiques (délétion, translocation chromosomique) peuvent survenir, transformant ainsi des plasmocytes sains en plasmocytes malins. A l’état normal, ces plasmocytes circulent dans le sang alors que dans la pathologie du MM elles reviennent dans la moelle osseuse où elles causent des dommages à plusieurs niveaux. Le myélome multiple reste une maladie incurable malgré de récents progrès thérapeutiques remarquables. La prise en charge permet actuellement de prévenir ou soulager les symptômes et les complications, en détruisant les plasmocytes pathologiques et en ralentissant la progression de la maladie. A ce jour, le myélome multiple souffre de l’absence de modèles précliniques pertinents. En effet, les modèles murins sont coûteux, chronophages, et non représentatifs de la pathologie humaine. Les modèles en deux dimensions (2D) standards ne permettent pas la viabilité des plasmocytes primaires de patients et privilégient l’utilisation de lignées cellulaires, ce qui rend ces modèles trop éloignés de la physiopathologie de la maladie du MM. La reproduction de moelle osseuse ex vivo humaine adulte est de plus en plus décrite dans la littérature afin de pallier aux modèles animaux qui sont couteux, consommateurs en temps et tributaires de la barrière des espèces. Des études ont commencé à mettre en évidence des modèles 3D de moelle osseuse ex vivo humaine regroupant les compartiments mésenchymateux et vasculaire, généralement à partir de cellules issues de lignées. Par exemple, le compartiment vasculaire, jouant un rôle actif dans la prolifération des cellules souches hématopoïétiques (CSH), est souvent incorporé par l’intermédiaire de lignées cellulaires endothéliales de type HUVEC. D’autres modèles nécessitent une étape chez la souris pour permettre la vascularisation ou des approches fonctionnelles. En outre, la demi-vie courte des plasmocytes ne permet pas leur incorporation de manière autologue dans les modèles 3D actuels et oblige à les ignorer ou à ajouter des lignées de plasmocytes tumoraux, ce qui ne permet pas une réponse pertinente du modèle par rapport au patient. Les inventeurs ont créé un nouveau modèle tissulaire 3D humain de myélome multiple. Il comprend le compartiment mésenchymateux, le compartiment vasculaire et les plasmocytes, obtenus à partir de prélèvement(s) de patient(s) atteint(s) de myélome multiple, sans utilisation de lignée cellulaire. La maintenance de la viabilité des plasmocytes en coculture sur plus de 14 jours a notamment été résolue. Cela permet de générer un modèle ex vivo préclinique totalement humain de myélome multiple, pertinent génétiquement pour ledit patient, et comportant les compartiments mésenchymateux, vasculaire et plasmocytaire sous forme de sphéroïde. Ce modèle permet d’envisager une avancée dans la médecine personnalisée grâce à la constitution rapide d’un modèle représentatif des tissus tumoraux de la moelle osseuse de chaque patient. Description détaillée de l’invention Procédé de production de sphéroïdes de myélome multiple humain L’invention concerne un procédé de production de sphéroïdes de myélome multiple (MM) humain, comprenant : La culture de cellules souches/stromales mésenchymateuses (CSM), de cellules endothéliales et de progéniteurs endothéliaux dans un milieu de culture ; La récolte des CSM, cellules endothéliales et progéniteurs endothéliaux cultivés ; et La co-culture des CSM, cellules endothéliales et progéniteurs endothéliaux récoltés avec des plasmocytes primaires CD138+ d’un patient atteint de MM dans des conditions permettant la formation de sphéroïdes. Par « cellules souches mésenchymateuses », aussi appelées « cellules stromales mésenchymateuses », on entend des cellules souches d'origine mésodermique. Elles sont caractérisées phénotypiquement par la co-expression d'un certain nombre de marqueurs tels que par exemple CD73, CD90, CD105, CD146, et l'absence d'expression d'autres marqueurs, en particulier le CD45, le CD31 et le CD34. Elles peuvent être issues de la moelle osseuse, du tissu adipeux, ou du sang de cordon ombilical. Les cellules souches ou stromales mésenchymateuses sont d’origine humaine et proviennent d’un patient atteint de MM ou d’un sujet sain. Dans un mode préférentiel, les cellules souches/ stromales mésenchymateuses mises en culture à l’étape a. sont des cellules primaires. Par « progéniteurs endothéliaux » on entend des cellules engagées dans la différenciation endothéliale mais qui ne sont pas encore reconnaissable comme cellules endothéliales au microscope. Elles sont caractérisées phénotypiquement par l’expression d'un certain nombre de marqueurs tels que par exemple CD133, CD34, CD31, VEGFR2. Par « cellules endothéliales » on entend des cellules complétement différenciées dans la voie endothéliale et donc reconnaissables comme cellules endothéliales au microscope. Elles sont caractérisées phénotypiquement par l’expression d'un certain nombre de marqueurs tels que par exemple CD31, VE-Cadherine, von Willebrand factor, VEGFR2. Les progéniteurs endothéliaux et les cellules endothéliales ont la capacité de s’organiser en réseau de cellules endothéliales, ou encore réseau vasculaire, et donc de s’organiser en vaisseaux. Dans un mode préférentiel, les progéniteurs endothéliaux et les cellules endothéliales mis en culture à l’étape a) sont des cellules primaires. Les progéniteurs endothéliaux et des cellules endothéliales peuvent par exemple être obtenus à partir de cellules mononuclées de la moelle osseuse. Dans un mode de réalisation, les CSM, les cellules endothéliales et les progéniteurs endothéliaux ont été obtenus à partir d’un même sujet, c’est-à-dire d’un même sujet sain ou d’un même patient atteint de MM. De préférence, les CSM, les cellules endothéliales et les progéniteurs endothéliaux ont été obtenus à partir d’un seul ou d’un même prélèvement, en particulier un prélèvement de moelle osseuse, à partir dudit sujet sain ou patient atteint de MM. Par « cellule primaire », on entend une cellule directement issue d’un tissu et/ou d’un prélèvement de cellules d’un individu. Le terme « culture » se rapporte à la sélection et à la multiplication des cellules cultivées. Dans un mode de réalisation du procédé, à l’étape a), les cellules souches/ stromales mésenchymateuses (CSM), les progéniteurs endothéliaux et les cellules endothéliales sont cultivées conjointement dans un même milieu de culture et, de préférence, dans un même contenant de culture. Après extraction de la moelle brute, les cellules sont ensemencées par exemple à une densité de 50 000 cellules/cm 2 dans des flasques. Les trois types cellulaires coexistent et prolifèrent dans cette culture. Dans un mode de réalisation la culture a lieu en 2 dimensions (2D), sous forme de monocouche au moins en partie adhérente. La culture se déroule de préférence jusqu’à confluence des cellules. La culture dure typiquement pendant 3 à 30 jours, de préférence pendant 5 à 25 jours, ou encore 10 à 20 jours, 12 à 16 jours, 13 à 15 jours, environ 2 semaines. Par « milieu pour la culture », on entend un milieu adapté pour la culture de cellules souches/stromales mésenchymateuses, progéniteurs endothéliaux et cellules endothéliales. Le milieu de culture est par exemple un milieu RPMI supplémenté de 10% de sérum de veau fœtal (SVF), un milieu essentiel minimal α (MEM α), ou un milieu Endothelial cell Growth Medium 2 (EGM2, de Promocell) supplémenté de 2% de SVF ou de lysat plaquettaire (LP). Il peut se présenter sous différentes formes mais est de préférence liquide et permet la culture de cellules eucaryotes, en particulier de cellules de mammifères et plus particulièrement de cellules humaines. Selon l’invention, le sujet sain ou patient atteint de MM est un être humain. Selon certains modes de réalisation, le patient vient d’être diagnostiqué comme atteint de MM. Selon certains modes de réalisation, le patient atteint de MM est diagnostiqué en rechute. A l’issue de l’étape de culture a), les CSM, cellules endothéliales et progéniteurs endothéliaux cultivés sont récoltés. La récolte se fait typiquement par trypsination, puis lavage. D’autres agents permettant le décollement des cellules adhérentes sans endommagement peuvent remplacer la trypsine. Les CSM, cellules endothéliales et progéniteurs endothéliaux récoltés sont ensuite co-cultivés avec des plasmocytes primaires CD138+ d’un patient atteint de MM dans des conditions permettant la formation de sphéroïdes. Par « plasmocytes » on entend des cellules du système immunitaire dérivées de la moelle osseuse (MO) exprimant le marqueur CD138+. Dans le cas du MM, les plasmocytes expriment les marqueurs CD38+ et CD138+. Par « sphéroïdes », on entend un regroupement de cellules liées entre elles dans les trois dimensions de l’espace. De préférence un sphéroïde comprend de 500 à 750 000 cellules, ou encore de 1 000 à 500 000 cellules. Les sphéroïdes de la composition selon l’invention ont un diamètre moyen compris entre 50 µm et 750 µm, de préférence compris entre 100 µm et 500 µm. Selon un mode de réalisation, les plasmocytes primaires CD138+ proviennent d’un patient atteint de MM différent du patient atteint de MM, ou du sujet sain, à partir duquel les CSM, cellules endothéliales et progéniteurs endothéliaux cultivés ont été obtenus. Le procédé de production permet alors l’obtention de sphéroïdes de myélome multiple (MM) humain hétérologues. Le modèle de sphéroïdes de MM humain hétérologues obtenu permet de combiner un stroma d’un patient ou sujet sain avec les plasmocytes tumoraux d’un autre patient atteint de MM afin d’étudier l’impact de plasmocytes MM sur un stroma sain et révéler des cibles thérapeutiques. Inversement, des plasmocytes sains peuvent être associés à un stroma MM afin d’étudier l’impact d’un stroma MM sur des plasmocytes sains et révéler des cibles thérapeutiques. Selon un autre mode de réalisation, les CSM, cellules endothéliales, progéniteurs endothéliaux et plasmocytes primaires CD138+ ont été obtenus à partir d’un même patient atteint de MM. Le procédé de production permet alors l’obtention de sphéroïdes de myélome multiple (MM) humain autologues. Le prélèvement de moelle osseuse étant une procédure invasive, de préférence, les CSM, cellules endothéliales, progéniteurs endothéliaux et plasmocytes primaires CD138+ ont été obtenus à partir d’un même prélèvement de moelle osseuse dudit patient atteint de MM. Ce mode de réalisation présente la difficulté supplémentaire de réussir à conserver les plasmocytes primaires CD138+, et préserver leur viabilité, le temps de la culture des CSM, cellules endothéliales, et progéniteurs endothéliaux, c’est-à-dire pendant 3 à 30 jours de culture et généralement environ deux semaines. En effet pour pouvoir constituer des sphéroïdes autologues sans recourir à un nouveau prélèvement de moelle osseuse chez le patient atteint de MM, il est nécessaire de congeler les plasmocytes primaires CD138+ tout en assurant une viabilité optimale de ces plasmocytes au cours de la culture des sphéroïdes qui suit. Ainsi, de préférence, les plasmocytes primaires CD138+ issus d’un même prélèvement chez le patient que les CSM, cellules endothéliales, et progéniteurs endothéliaux, ont été conservés, avant mise en co-culture, par congélation à une température inférieure ou égale à -70°C, de préférence inférieure ou égale à -75°C ou encore à -80°C, dans un milieu de cryopréservation. Ce milieu de cryopréservation peut être un milieu constitué de 90% SVF + 10% DMSO (v/v), ou de 90% de solution d’albumine humaine à 4 % + 10% DMSO (v/v), ou des solutions de cryopréservation commerciales comme par exemple Cryostor® CS10 (Sigma-Aldrich C2874). De préférence, la congélation des plasmocytes primaires CD138+ est réalisée dans un intervalle de temps n’excédant pas 2h après l’isolement des plasmocytes primaires CD138+ à partir du prélèvement de moelle osseuse. La co-culture des CSM, cellules endothéliales et progéniteurs endothéliaux avec les plasmocytes primaires CD138+ se fait en plaque ULA (Ultra-Low Adherence) afin de favoriser la formation de sphéroïdes. Les plasmocytes primaires CD138+ et les CSM sont mis en co-culture avec un ratio, en nombre, de 1 :1 à 4 :1, de préférence un ratio d’environ 2 :1. La co-culture est réalisée pendant 4 à 14 jours, par exemple 4 à 10 jours, de préférence pendant 6 à 8 jours ou encore environ 7 jours. Le milieu de culture est par exemple un milieu RPMI supplémenté de 10% de sérum de veau fœtal (SVF), un milieu essentiel minimal α (MEM α), ou de préférence, un milieu Endothelial Growth Medium 2 (EGM2, de Promocell) supplémenté de 2% de SVF ou de lysat plaquettaire (LP). L’invention concerne aussi les sphéroïdes obtenus ou susceptibles d’être par le procédé de production de sphéroïdes ci-dessus. Ces sphéroïdes de myélome multiple (MM) humain comprennent un stroma, un compartiment vasculaire et des plasmocytes CD138+ d’un patient atteint de MM. Les sphéroïdes sont de préférence autologues, obtenus par co-culture de CSM, cellules endothéliales et progéniteurs endothéliaux avec des plasmocytes primaires CD138+ issus d’un même patient atteint de MM, de préférence issus d’un même prélèvement. Les sphéroïdes peuvent aussi être hétérologues dans le cas où les plasmocytes primaires CD138+ proviennent d’un patient atteint de MM différent du patient atteint de MM ou sujet sain à partir duquel les CSM, cellules endothéliales et progéniteurs endothéliaux cultivés ont été obtenus. Utilisation des sphéroïdes L’invention a pour objet l’utilisation de sphéroïdes autologues de myélome multiple pour la sélection d’un traitement thérapeutique adapté au patient atteint de MM, c‘est à dire pour la sélection d’un traitement thérapeutique auquel un patient atteint de myélome multiple (MM) est susceptible de répondre. En effet la construction d’un modèle 3D de MM le plus représentatif possible des tumeurs du malade permet un suivi clinique et une médecine personnalisée. Les modèles sphéroïdes, de préférence autologues, selon l’invention peuvent être utilisés afin d’étudier les réponses du tissu tumoral du patient atteint de MM (celui dont proviennent les cellules utilisées pour constituer les sphéroïdes) à différents traitements ou combinaison de traitements. Ainsi l’objectif est de sélectionner un traitement thérapeutique auquel le patient est le plus susceptible de répondre. Par « traitement » ou « traiter », on entend ici atteindre, partiellement ou substantiellement, un ou plusieurs des résultats suivants : réduire partiellement ou totalement l'étendue de la maladie, améliorer un symptôme clinique ou un indicateur associé à la maladie, retarder, inhiber ou prévenir la progression de la maladie, ou partiellement ou totalement retarder, inhiber ou prévenir la survenue d'une rechute de la maladie. Par « sujet », « patient » ou « malade », on entend ici un être humain atteint de myélome multiple. Procédé de sélection d’un traitement thérapeutique L’invention comprend également un procédé de sélection d’un traitement thérapeutique auquel un patient atteint de myélome multiple (MM) est susceptible de répondre grâce à des sphéroïdes autologues issus dudit patient. Ce procédé de sélection comprend : -la culture des sphéroïdes autologues dudit patient dans un milieu de culture en présence d’au moins un candidat médicament pour le traitement du MM, pendant une période d’au moins 3 jours, - la récolte des sphéroïdes autologues et leur dissociation de manière à collecter leurs plasmocytes myélomateux, - l’analyse de la viabilité des plasmocytes myélomateux collectés ; et - la sélection dudit au moins un candidat médicament en tant que traitement thérapeutique auquel le patient atteint de MM est susceptible de répondre, sur la base de la viabilité mesurée des plasmocytes myélomateux collectés. Selon un mode de réalisation, ledit au moins un candidat médicament est sélectionné en tant que traitement thérapeutique auquel le patient atteint de MM est susceptible de répondre si la viabilité des plasmocytes myélomateux mesurée est diminuée par rapport à la viabilité de plasmocytes myélomateux obtenus de sphéroïdes autologues cultivés en condition contrôle (c’est-à-dire sans ajoute de candidat médicament ou avec ajout d’un tampon témoin), ou cultivés en présence d’au moins un autre candidat médicament. La culture des sphéroïdes se fait dans les mêmes conditions que définies précédemment dans le procédé de production de sphéroïdes autologues, si ce n’est l’ajout dudit au moins un candidat médicament. Selon un mode de réalisation, le procédé de sélection inclut la préparation de sphéroïdes autologues selon le procédé de l’invention. Les CSM, les cellules endothéliales, les progéniteurs endothéliaux et les plasmocytes constituant les sphéroïdes autologues sont issus d’un même patient, de préférence d’un même prélèvement de moelle osseuse. Ce procédé de sélection permet de tester l’efficacité d’un candidat médicament, ou d’une combinaison de médicaments. Le candidat médicament, ou la combinaison de médicaments sont ajoutés au milieu de culture des sphéroïdes entre le moment de la formation des sphéroïdes et jusqu’à 48h après leur formation, et la culture est poursuivie pendant une période d’au moins 3 jours, par exemple 4 à 10 jours, de préférence pendant 6 à 8 jours ou encore environ 7 jours. En parallèle, une culture de contrôle est réalisée, sans présence de candidat médicament ou en présence de tampon, dans les mêmes conditions de culture qu’en présence dudit au moins un candidat médicament. Des exemples de médicaments ou candidats médicaments utilisables pour le traitement du MM incluent le melphalan, le lenalidomide, le bortezomib, la dexaméthasone, le C34 (composé de formule (I) tel que décrit dans la demande WO 2018/115476 A1, . Les sphéroïdes sont ensuite récoltés et dissociés mécaniquement, par exemple dans un thermomixer et/ou par une répétition d’aspirations et de refoulements à l’aide d’une micropipette, avec ou sans aide d’un ou plusieurs agent(s) chimique(s) tel(s) que la trypsine, la collagénase, ou la solution de dissociation AccuMax (Capricorn Scientific GmbH). En particulier la dissociation des sphéroïdes peut être réalisée par incubation des sphéroïdes dans une solution de dissociation (comprenant une protéase et/ou collagénase, et comprenant de préférence une association de protéase, collagénase et DNase, par exemple la solution AccuMax) sous agitation (par exemple dans un appareil thermomixer à 37°C et à 1200-1500 rpm ou encore environ 1400 rpm, pendant environ 10 min), puis la dissociation des sphéroïdes par aspiration/refoulement à l’aide d’une micropipette, et la récolte des cellules dissociées (par exemple par centrifugation). Les cellules sont ensuite marquées avec des marqueurs permettant d’identifier les plasmocytes myélomateux, par exemple, avec des fluorochromes associés à des anticorps spécifiques tels que CD38 pour marquer notamment les plasmocytes, et CD138 pour identifier les plasmocytes myélomateux CD38+ CD138+. Les cellules sont ensuite re-suspendues et filtrées avant d’être analysées par cytométrie en flux (FACS). Les marqueurs fluorochromes associés à des anticorps spécifiques peuvent être par exemple CD38 FITC et CD138 AF700. La solution de suspension et de marquage est de préférence une solution MACS et les cellules sont de préférences filtrées à 70µm. La viabilité des plasmocytes myélomateux est comparée entre les différentes conditions de culture (condition contrôle ou avec au moins un candidat médicament), une viabilité diminuée des plasmocytes myélomateux par rapport au contrôle étant le signe d’un traitement prometteur. Ce procédé est plus rapide que l’utilisation de modèles murins et une réponse plus pertinente en raison de la proximité génétique entre le modèle et le patient, d’autant plus quand le modèle sphéroïdal est autologue. En effet, les sphéroïdes peuvent être générés en 2 semaines environ, en moyenne, et la sélection d’un traitement adapté au patient peut être réalisée en 1 semaine environ à partir de l’obtention des sphéroïdes, ce qui représente un total de 3 semaines, en règle générale, pour pouvoir définir un traitement personnalisé pour le patient atteint de MM. Description des figures La présente le taux de viabilité de plasmocytes MM au sein de sphéroides hétérologues suite à leur culture pendant 7 jours avec un ou plusieurs candidats médicaments (melphalan 10µM, lenalidomide 10µM, C34 5µM, combinaison melphalan 10µM + C34 5µM, combinaison lenalidomide 10µM + C34 5µM) ainsi qu’une condition de contrôle. En abscisse, les CSM MM (MM91, MM97, MM100) représentent la composante stromale du sphéroïde. Les plasmocytes MM (P64/65, P66) sont la composante plasmocytaire du sphéroïde. Chaque numéro correspond à un patient MM donné. Exemples Exemple 1 : Etudes de différents protocoles de congélation des plasmocytes et étude de viabilité des cellules Dans cet exemple, les inventeurs ont cherché à sélectionner un protocole de congélation/décongélation des plasmocytes le plus efficace pour la conservation de la viabilité des plasmocytes. Ils ont étudié cet impact en quantifiant leur viabilité après décongélation en comptant au bleu trypan à la cellule de Malassez. Suite à un prélèvement de moelle osseuse totale au diagnostic chez des patients touchés par le myélome multiple (MM), les cellules de plasmocytes MM sont séparées puis dénombrées en cellule de Malassez. Elles ont ensuite été soumises à une congélation selon un des protocoles suivant : A : Tampon 90% sérum de veau fœtal (SVF) : 10%DMSO ; congélation -80°C immédiate B : Tampon 90% sérum albumine humaine (HSA) : 10%DMSO ; congélation -80°C immédiate C : Tampon CryoStor® CS10 (Sigma-Aldrich, référence de produit C2874) ; congélation -80°C immédiate D : Tampon CryoStor® CS10 ; congélation -20°C pendant 2h puis -80°C E : Tampon CryoStor® CS10 ; congélation -20°C pour la nuit puis -80°C Le temps de congélation a été de 31 jours en moyenne. Les plasmocytes ont été ensuite décongelés puis comptés au bleu trypan à la cellule de Malassez. Condition Ratio des plasmocytes vivants après décongélation par rapport aux plasmocytes vivants avant congélation (%) Moyenne des ratio de plasmocytes viables par rapport aux plasmocytes dénombrés après décongélation (%) Nombre de tests A 42,61 60,78 5 B 31,04 61,85 7 C 41,39 71,51 15 D 47,32 69,25 4 E 40,58 66,80 5 Les résultats du tableau ci-dessus montrent que les conditions de congélation courantes, à savoir 90% SVF ou HSA + 10% DMSO, semblent moins efficaces en comparaison à des conditions de congélation immédiates avec CryoStor®. Exemple 2 : Culture des sphéroïdes hétérologues et autologues et étude de viabilité des cellules par cytométrie en flux Dans cet exemple, les inventeurs ont cherché à montrer le faible impact sur la viabilité des plasmocytes des étapes de congélation et décongélation, de culture au sein des sphéroïdes et de dissociation des sphéroïdes avant leur marquage. Ils ont étudié cet impact en quantifiant leur viabilité par cytométrie en flux. Pour cela, ils ont cherché à marquer les cellules avec des anticorps anti-CD38 et anti-CD138 couplés à des fluorochromes pour sélectionner spécifiquement les plasmocytes MM. Suite à un prélèvement de moelle osseuse totale au diagnostic chez des patients touchés par le myélome multiple (MM), les cellules de plasmocytes MM sont séparées puis dénombrées en cellule de Malassez. Puis elles sont congelées en CRYOSTOR ou utilisés directement fraiches pour les cocultures hétérologues. Issu d’un autre patient, les cellules de moelle totale MM sont ensemencées selon leur nombre de départ et les cellules sont incubées à une température de 37°C et sous une atmosphère avec 5% de dioxyde carbone durant environ 2 semaines. Une fois la confluence atteinte, les cellules souches/ stromales mésenchymateuses (CSM), les cellules endothéliales et les progéniteurs endothéliaux sont traités à la trypsine et dénombrées. Sur des plaques ULA (Ultra-Low Adherence) sont mise en suspension dans 50µL de milieu RPMI (10% SVF, 1% PS) les cellules CSM, les cellules endothéliales et les progéniteurs endothéliaux traités à la trypsine et les plasmocytes frais ou décongelés dans un ratio de 1 CSM pour 2 plasmocytes. Les cellules sont ensuite incubées à une température de 37°C et une atmosphère avec 5% de dioxyde de carbone sous agitation. 150µL de milieu RPMI complet sont ajoutés après 24h d’incubation et le milieu est renouvelé 2 fois par semaine en retirant 100µL de surnageant de culture et en ajoutant 100µL de milieu RPMI complet. Les cellules des sphéroïdes sont dissociées mécaniquement à 1400rpm avec de l’AccuMax® et puis transférées en tube adapté à la cytométrie en flux et lavées avec du PBS et marquées avec les anticorps anti-CD38 FITC et anti-CD138 AF700 en tampon MACS. Les cellules sont ensuite incubées à 4°C pendant 30 minutes, lavées et resuspendues dans un milieu tampon MACS et filtrées à 70µm, marquées au DAPI avant de passer en cytométrie en flux. Les inventeurs ont observé que la quantification de la viabilité des plasmocytes MM était possible avec ce protocole et que la viabilité des plasmocytes MM reste haute après les manipulations de ce protocole, même après 14 jours de co-culture. Exemple 3 : Sphéroïdes 3D avec plasmocytes d’un patient à myélome multiple et réaction au traitement avec melphalan Dans cet exemple, les inventeurs ont cherché à démontré la viabilité des plasmocytes au sein des sphéroïdes ainsi que l’accessibilité de ceux-ci pour les molécules thérapeutiques testées. Suite à un prélèvement de moelle osseuse totale au diagnostic chez des patients touchés par le myélome multiple (MM), les cellules de plasmocytes MM sont séparées puis dénombrées en cellule de Malassez. Puis elles sont utilisés fraichement pour les cocultures ou congelées en CRYOSTOR. Les cellules de moelle totale MM sont ensemencées selon leur nombre de départ et les cellules sont incubées à une température de 37°C et sous une atmosphère avec 5% de dioxyde carbone durant environ 2 semaines. Une fois la confluence atteinte, les cellules souches/stromales mésenchymateuses (CSM), les cellules endothéliales et les progéniteurs endothéliaux sont traités à la trypsine et dénombrées. Sur des plaques ULA (Ultra-Low Adherence) sont mise en suspension dans 50µL de milieu RPMI (10% SVF, 1% PS) les CSM, les cellules endothéliales et les progéniteurs endothéliaux traités à la trypsine et les plasmocytes frais ou décongelés dans un ratio de 1 CSM pour 2 plasmocytes. Les cellules sont ensuite incubées à une température de 37°C et une atmosphère avec 5% de dioxyde de carbone sous agitation. 150µL de milieu RPMI sont ajoutés après 24h d’incubation et le milieu est renouvelé 2 fois par semaine en retirant 100µL de surnageant. Un traitement de melphalan 10µm est ajouté au milieu de culture des sphéroïdes 48h après leur formation et la culture est poursuivie pendant 14 jours. Ce procédé de sélection est complété par une situation de contrôle, sans présence de candidat médicament. Une partie des cultures est arrêté au bout de 7 (J+7) et 11 (J+11) jours pour analyser la viabilité des plasmocytes tandis que le reste des cultures est arrêté au bout de 14 jours de culture (J+14). Les cellules des sphéroïdes sont dissociées mécaniquement à 1400rpm avec de l’AccuMax® et puis transférées en tube adapté à la cytométrie en flux et lavées avec du PBS et marquées avec les anticorps spécifiques CD38 FITC et CD138 AF700 en tampon MACS. Les cellules sont ensuite incubées à 4°C pendant 30 minutes, lavées et resuspendues dans un milieu tampon MACS et filtrées à 70µm, et enfin marquées avec le marqueur de viabilité DAPI, avant de passer en cytométrie en flux. La viabilité des plasmocytes en sphéroïdes MM non traités passent de 50% à J+7 et J+11 à 60% en J+14 alors que les plasmocytes en sphéroïdes MM traités avec 10µM de melphalan ont une viabilité de 5% à J+7, moins de 5% à J+11 et moins de 10% en J+14. Premièrement les inventeurs montrent donc que la viabilité des plasmocytes en sphéroïdes non-traités est plus importante (J7, J11, J14) que dans le cas des cultures 2D où les plasmocytes primaires ne survivent pas au-delà de quelques jours. Ensuite, les inventeurs montrent que la localisation des plasmocytes au sein des sphéroïdes n’empêche pas une forte réponse au traitement (ici melphalan 10µM). Exemple 4 : Réponse de sphéroïdes MM hétérologues à différents candidats médicaments Suite à un prélèvement de moelle osseuse totale au diagnostic chez des patients touchés par le myélome multiple (MM), les cellules de plasmocytes MM sont séparées puis dénombrées en cellule de Malassez. Puis elles sont utilisées fraichement ou congelées à -80°C en CRYOSTOR. Issu du même ou d’un patient différent, les cellules de moelle totale MM sont ensemencées selon leur nombre de départ et les cellules sont incubées à une température de 37°C et sous une atmosphère avec 5% de dioxyde carbone durant environ 2 semaines. Une fois la confluence atteinte, les cellules souches/ stromales mésenchymateuses (CSM), les cellules endothéliales et les progéniteurs endothéliaux sont traités à la trypsine et dénombrées. Sur des plaques ULA (Ultra-Low Adherence) sont mise en suspension dans 50µL de milieu RPMI (10% SVF, 1% PS) les CSM, les cellules endothéliales et les progéniteurs endothéliaux traités à la trypsine et les plasmocytes frais ou décongelés dans un ratio de 1 CSM pour 2 plasmocytes. Les cellules sont ensuite incubées à une température de 37°C et une atmosphère avec 5% de dioxyde de carbone sous agitation. 150µL de milieu RPMI sont ajoutés après 24h d’incubation et le milieu est renouvelé 2 fois par semaine en retirant 100µL de surnageant de culture et en ajoutant 100µL de milieu RPMI. Le candidat médicament, la candidate combinaison ou la combinaison des candidats sont ajoutés au milieu de culture des sphéroïdes entre le moment de leur formation et 48h après leur formation et la culture est poursuivie pendant 7 jours. Ce procédé de sélection est complété par une situation de contrôle, sans présence de candidat médicament, de même durée de culture qu’en présence de candidat médicament. Les traitements testés sont les suivants : melphalan 10µM, lenalidomide 10µM, C34 5µM, combinaison melphalan 10µM + C34 5µM, combinaison lenalidomide 10µM + C34 5µM Les cellules des sphéroïdes sont dissociées mécaniquement à 1400rpm avec de l’AccuMax® et puis transférées en tube adapté à la cytométrie à flux et lavées avec du PBS et marquées avec les anticorps spécifiques CD38 FITC et CD138 AF700 en tampon MACS. Les cellules sont ensuite incubées à 4°C pendant 30 minutes, lavées et resuspendues dans un milieu tampon MACS et filtrées à 70µm, et enfin marquées au DAPI avant de passer en cytométrie en flux. La présente le taux de viabilité de plasmocytes MM au sein de sphéroides hétérologues suite à leur culture pendant 7 jours avec les différents traitements potentiels testés ainsi qu’une condition de contrôle. En abscisse, les CSM MM (MM91, MM97, MM100) représentent la composante stroma du sphéroïde. Les plasmocytes MM (P64/65, P66) sont la composante plasmocytaire du sphéroïde. Chaque numéro correspond à un patient MM donné. La montre bien la différence de comportement des plasmocytes dans les différentes conditions et l’efficacité des traitements combinés melphalan + C34 et lenalidomide + C34 pour diminuer la viabilité des plasmocytes MM. Procédé de production de sphéroïdes de myélome multiple (MM) humain, comprenant : La culture de cellules souches/ stromales mésenchymateuses (CSM), de cellules endothéliales et de progéniteurs endothéliaux dans un milieu de culture ; La récolte des CSM, cellules endothéliales et progéniteurs endothéliaux cultivés ; et La co-culture des CSM, cellules endothéliales et progéniteurs endothéliaux récoltés avec des plasmocytes primaires CD138+ d’un patient atteint de MM dans des conditions permettant la formation de sphéroïdes. Procédé de production selon la revendication 1, dans lequel les CSM, cellules endothéliales, progéniteurs endothéliaux et plasmocytes primaires CD138+ ont été obtenus à partir d’un même patient atteint de MM. Procédé de production selon la revendication 1 ou 2, dans lequel les CSM, cellules endothéliales, progéniteurs endothéliaux et plasmocytes primaires CD138+ ont été obtenus à partir d’un même prélèvement de moelle osseuse dudit patient atteint de MM. Procédé de production selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel les CSM, cellules endothéliales et progéniteurs endothéliaux sont cultivés à l’étape a. pendant 3 à 30 jours. Procédé de production selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel les plasmocytes primaires CD138+ ont été conservés, avant mise en co-culture, par congélation à une température inférieure ou égale à -70°C dans un milieu de cryopréservation. Procédé de production selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel les plasmocytes primaires CD138+ et les CSM sont mis en co-culture avec un ratio d’environ 2 :1. Procédé de production selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel la co-culture des CSM, cellules endothéliales et progéniteurs endothéliaux avec les plasmocytes primaires est réalisée pendant 4 à 14 jours. Sphéroïdes de myélome multiple (MM) humain obtenus par un procédé de production selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, comprenant un stroma, un compartiment vasculaire et des plasmocytes CD138+ de patient(s) atteint(s) de MM. Sphéroïdes de MM selon la revendication 8, où lesdits sphéroïdes sont des sphéroïdes autologues. Utilisation de sphéroïdes autologues de myélome multiple (MM) tels que définis dans la revendication 9 pour la sélection d’un traitement thérapeutique auquel un patient atteint de MM est susceptible de répondre. Procédé de sélection d’un traitement thérapeutique auquel un patient atteint de myélome multiple (MM) est susceptible de répondre comprenant : La culture de sphéroïdes autologues selon la revendication 9, dans un milieu de culture en présence d’au moins un candidat médicament pour le traitement du MM, pendant une période d’au moins 3 jours ; La récolte des sphéroïdes autologues et leur dissociation de manière à collecter les plasmocytes myélomateux présents dans les sphéroïdes autologues ; L’analyse de la viabilité des plasmocytes myélomateux collectés ; et La sélection dudit au moins un candidat médicament en tant que traitement thérapeutique auquel le patient atteint de MM est susceptible de répondre, sur la base de la viabilité mesurée des plasmocytes myélomateux collectés. Procédé de sélection d’un traitement thérapeutique selon la revendication 11, dans lequel ledit au moins un candidat médicament est sélectionné en tant que traitement thérapeutique auquel le patient atteint de MM est susceptible de répondre si la viabilité des plasmocytes myélomateux mesurée est diminuée par rapport à la viabilité de plasmocytes myélomateux obtenus de sphéroïdes autologues cultivés en condition contrôle ou cultivés en présence d’au moins un autre candidat médicament. Procédé de sélection d’un traitement thérapeutique selon la revendication 11 ou 12, dans lequel ledit au moins un candidat médicament est ajouté dans le milieu de culture des sphéroïdes autologues entre le moment de formation des sphéroïdes et jusqu’à 48 h après leur formation, et la culture est poursuivie pendant ladite période d’au moins 3 jours.