Brevet FR3133198A1 — publié le 20230908

La présente invention concerne un modèle de peau reconstituée comprenant 1) un substitut cutané et 2) une composante microbienne et une composante lipidique sur la surface dudit substitut cutané, ainsi qu’un procédé d’obtention du modèle de peau reconstituée. Le modèle de peau reconstituée peut notamment être utilisé dans une méthode de criblage pour l’identification in vitro d’un actif ou d’une formulation cosmétique pour prévenir et/ou améliorer au moins un trouble cutané induit suite à au moins un stress exogène ; une méthode d’évaluation de l’efficacité in vitro d’un actif ou d’une formulation cosmétique pour prévenir et/ou traiter au moins un trouble cutané induit suite à au moins un stress exogène ; ou une d'évaluation in vitro de la tolérance d’un actif ou d’une formulation cosmétique. MODELE DE PEAU RECONSTITUEE Domaine de l’invention Le domaine de l’invention concerne un nouveau modèle cutané intégrant une composante microbienne et un composant lipidique. Ce modèle est particulièrement adapté pour étudier et développer des nouveaux actifs/produits dans le domaine dermo-cosmétique. En effet, à ce modèle intégré, un stress physique ou chimique peut être ajouté pour reproduire des lésions ou des situations pathologiques, pouvant provoquer des déséquilibres du microbiote cutané. État de la technique La peau est bien plus qu’une enveloppe externe, elle est en effet un véritable organe nécessaire à la vie. Elle constitue un terrain d’échange entre notre environnement intérieur et l’environnement extérieur et est de ce fait exposée à de multiples agressions et variations auxquelles elle s’adapte en permanence. La peau assure donc, entre autres, une véritable fonction barrière, autrefois attribuée à sa seule structure et composition. La peau est composée de cellules regroupées entre elles pour former un tissu à la fois résistant et souple. Ces cellules sont réparties en trois couches : l’hypoderme, le derme et l’épiderme. L’hypoderme est la couche la plus profonde de la peau. Il est constitué de tissu adipeux blanc qui permet de protéger l’organisme des chocs, de constituer une réserve énergétique et de thermoréguler le corps. Le derme est la couche comprise entre l’hypoderme et l’épiderme. Elle est la couche la plus épaisse de la peau. Le derme héberge les vaisseaux sanguins et lymphatiques, les nerfs, les glandes sudoripares qui produisent la sueur et les follicules pilo-sébacés. Il est majoritairement composé de macromolécules, de cellules fibroblastiques et de cellules du système immunitaire. L’épiderme est la surface la plus mince de la peau. Il est composé à 90 % de kératinocytes qui servent à synthétiser la kératine et permettent, grâce à leur différenciation, d’assurer une imperméabilité et une protection à la peau. L’épiderme est constitué de quatre principales couches : la couche basale ( stratum basale ), constituée de kératinocytes à larges noyaux, qui permettent d’assurer le renouvellement constant de l’épiderme ; la couche spineuse ( stratum spinosum ), composée de kératinocytes volumineux qui s’aplatissent progressivement en allant vers les couches supérieures ; la couche granuleuse ( stratum granulosum ), composé de kératinocytes aplatis qui permettent de transformer les kératinocytes en cornéocytes (cellules anucléées) et enfin la couche cornée ( stratum corneum ), couche supérieure composée des cornéocytes qui vont desquamer. L’épiderme n’est pas uniquement composé de cornéocytes mais aussi de lipides entre ces différentes cellules. Les lipides sont organisés sous forme de bicouches lipidiques. Les principales classes de ces lipides sont les céramides, le cholestérol et les acides gras libres. Ils assurent en partie la fonction barrière de la peau. Le sébum est un film hydrolipidique produit par les glandes sébacées. Il est excrété à la surface de la peau où il va former une couche protectrice, mais aussi servir de substrat au microbiote cutané. Le sébum est majoritairement lipophile et anaérobie, et va donc permettre de conserver des espèces microbiennes lipophiles et anaérobies. Il va aussi protéger la peau en la graissant et en l’acidifiant pour réguler le pH cutané. Le microbiote cutané joue également un rôle clé dans les fonctions protectrices de la peau. Il participe également à la régulation du pH de la peau. Le microbiote cutané, appelé également flore cutanée, se situe au niveau de l’épiderme. Il est constitué de micro-organismes comme des bactéries, des virus, des champignons et parasites. Le microbiote cutané évolue au fur et à mesure de l’avancée en âge, pour atteindre en moyenne 1 000 milliards de bactéries, et 1 000 espèces de virus, parasites et champignons. Pour les bactéries, les souches les plus connues et étudiées sont Staphylococcus a ureus , Staphylococcus e pidermidis et Cutibacterium acnes . Certaines sont aérobies et vivent donc avec l’apport d’oxygène et d’autres sont anaérobies et vivent plus en profondeur dans le stratum corneum sans apport d’oxygène. Certaines de ces bactéries produisent des acides gras, d’autres des peptides antimicrobiens et même dans certains cas des acides aminés. La plupart de ces bactéries utilisent les lipides du sébum pour croitre et produire ces composés. Le microbiote cutané varie de manière quantitative et qualitative d’une personne à l’autre. Des variables telles que l’âge, le sexe, le système immunitaire, le pH, la température ou encore l’humidité peuvent modifier la composition du microbiote de la peau. Par exemple, l’utilisation de produits cosmétiques ou pharmaceutiques créent des différences. Toutefois, deux catégories distinctes peuvent être identifiées au sein du microbiote cutané : la flore « résidente » et la flore « transitoire ». Comme son nom l’indique, la flore cutanée résidente vit en totale symbiose avec la peau. On parle d’organismes commensaux. Elle est importante pour la défense contre les micro-organismes pathogènes, car la place qu’elle occupe sature l’espace et empêche la fixation d’organismes indésirables. La flore transitoire ne s’établit pas de façon permanente à la surface de la peau, elle varie au cours de la journée, dépend des activités réalisées et des variations des conditions environnantes. Elle peut être présente quelques heures, ou quelques jours. Les micro-organismes qui la composent sont pour la plupart inoffensifs, dits saprophytes. Cette flore peut également être constituée de bactéries pathogènes opportunistes et entraîner des maladies, si les défenses de l’hôte faiblissent. Une des espèces transitoires les plus communes est S. aureus , mise en cause dans la dermatite atopique (DA). Les micro-organismes présents sur la peau et composant la flore résidente ne sont pas opportunistes, ils remplissent des fonctions très utiles pour la protection de l’organisme. En effet, le microbiote cutané assure différents rôles dans le maintien de l’intégrité de notre peau. Il constitue une barrière en régulant l’homéostasie de la peau, en lui fournissant des nutriments ou bien encore en rentrant en compétition avec des pathogènes. S. epidermidis sécrète par exemple des peptides antimicrobiens contre S. aureus . Corynebacterium striatum et C . acnes inhibent quant à eux l’expression de gènes de virulence de ce dernier (Sanford and Gallo, Seminars in Immunology, 25, pp370-7, 2013). La symbiose entre hôte et microorganismes est notamment indispensable à la bonne santé de la peau. Lorsque cet équilibre est rompu, on parle alors de dysbiose. Il a été montré dans de nombreuses études que les dysbioses sont corrélées à l’apparition de certaines pathologies cutanées inflammatoires, comme l’acné, la dermatite atopique ou l’eczéma. La compréhension des interactions entre le microbiote cutané et la peau constitue donc un enjeu dans l’élaboration de nouveaux traitements cosmétiques et pharmaceutiques. Aujourd’hui, l’évaluation d’agents cosmétiques et pharmacologiques peut notamment être fait sur des modèles de peaux humaines reconstruites in vitro. Ces modèles contiennent une barrière épidermique différenciée et reflètent les conditions morphologiques d’une peau humaine in vivo . Parmi les modèles de peau humaines reconstruites, Van Der Krieken et son équipe ont développé un modèle de stratum corneum à partir de kératinocytes prélevés au talon de volontaires (Acta Derm Venereol. 2016 ; 96(7) : 873-879). Un microbiote est notamment ajouté aux kératinocytes en suspension. Cependant, la composition de ces modèles de peaux diffère encore beaucoup de la composition réelle de la peau humaine. En particulier, il ne comprend pas de lipides ayant un rôle protecteur pour la peau et le microbiote et qui sont sécrétés par les glandes sébacées. De plus, il ne comporte pas de kératinocytes viables. Ainsi, l’interaction entre micro-organismes et kératinocytes (sécrétion de cytokines, de peptides antimicrobiens, etc.) n’est pas observable. Des modèles 3D d’épidermes reconstruites ayant un composé microbien ont également été utilisés pour étudier les interactions entre le microbiote et la peau (Rademacher et al., Experimental Dermatology, 27, pp489-494, 2018). Toutefois, la plupart de ces modèles comprend la colonisation d’une seule espèce de micro-organisme, tel que C. amycolatum , et ne reflètent donc pas les conditions réelles de notre peau. La présence de lipides dans les modèles de peau sain n’est pas non plus décrite. Par conséquent, il existe toujours un besoin de modèle permettant de reproduire les conditions les plus proches de la peau naturelle, de préférence pouvant être obtenu de façon aisée et à un coût réduit. De façon avantageuse, les inventeurs ont mis au point un nouveau modèle de peau comprenant une composante microbienne et une composante lipidique qui permet avantageusement de se rapprocher de la véritable peau. De façon avantageuse, le coût associé à un tel modèle est notamment réduit comparé aux explants. Par ailleurs, ce modèle peut être utilisé avec différents stress afin de mimer des troubles de la peau. En effet, les inventeurs ont notamment observé que l’application d’un stress exogène sur le modèle de peau induisait des caractéristiques moléculaires et métaboliques semblables à celles observées in vivo chez les sujets ayant une peau exposée au soleil ou à des conditions inflammatoires. Le modèle peut avantageusement servir d’outil afin de cribler des actifs ou encore des formulations cosmétiques ou pharmacologiques d’intérêts. Le premier objet de l’invention concerne donc un modèle de peau reconstituée comprenant : - un substitut cutané, et - une composante microbienne et une composante lipidique sur la surface dudit substitut cutané. Un autre objet de l’invention porte sur un procédé d’obtention d’un modèle de peau reconstituée comprenant : Fourniture d’un substitut cutané, Application sur ledit substitut cutané, de façon concomitante ou séquentielle, d’une composante microbienne et d’une composante lipidique. L’invention concerne également une méthode de criblage pour l’identification in vitro d’un actif ou d’une formulation cosmétique pour prévenir et/ou améliorer au moins un trouble cutané induit suite à au moins un stress exogène comprenant les étapes suivantes : L’application dudit actif ou de ladite formulation cosmétique sur le modèle de peau reconstituée selon l’invention ; La réalisation d’au moins un stress exogène sur ledit modèle ; Au moins une mesure du niveau d’expression d’au moins un marqueur biologique ; et Déterminer si ledit actif ou de ladite formulation cosmétique permet de prévenir et/ou améliorer au moins un trouble cutané en fonction d’au moins un niveau d’expression mesuré à l’étape c). L’invention concerne également une méthode d’évaluation de l’efficacité in vitro d’un actif ou d’une formulation cosmétique pour prévenir et/ou traiter au moins un trouble cutané induit suite à au moins un stress exogène comprenant les étapes suivantes : L’application dudit actif ou de ladite formulation cosmétique sur le modèle de peau reconstituée selon l’invention ; La réalisation d’au moins un stress exogène sur ledit modèle ; Au moins une mesure du niveau d’expression d’au moins un marqueur biologique ; et Évaluer l’efficacité dudit actif ou de ladite formulation cosmétique en fonction d’au moins un niveau d’expression mesuré à l’étape c). L’invention concerne également une méthode d'évaluation in vitro de la tolérance d’un actif ou d’une formulation cosmétique, comprenant les étapes suivantes : L’application dudit actif ou de ladite formulation cosmétique sur le modèle de peau reconstituée selon l’invention ; Au moins une mesure du niveau d’expression d’au moins un marqueur biologique dans le modèle de peau de l’étape a) ; et Évaluer si ledit actif ou formulation cosmétique est bien toléré par le modèle de peau. L’invention concerne enfin un kit comprenant une composante microbienne et une composante lipidique destiné à être appliqué sur un substitut cutané, la composante microbienne comprenant au moins quatre genres de micro-organismes sélectionnés parmi les genres Cutibacterium , Staphylococcus, Streptococcus, Burkholderia , Finegoldia , Gemella , Veillonella , Kocuia , Corynebacterium, Methylobacterium , et Brevibacterium . Description des figures Profil chromatographique du sébum collecté Modèle de peau reconstituée comprenant : - un substitut cutané, et - une composante microbienne et une composante lipidique sur la surface dudit substitut cutané Ladite composante microbienne comprenant au moins quatre genres de micro-organismes sélectionnés parmi les genres Cutibacterium, Staphylococcus, Streptococcus, Burkholderia, Finegoldia, Gemella, Veillonella, Kocuia, Corynebacterium, Methylobacterium, et Brevibacterium, préférentiellement au moins les genres Cutibacterium, Staphylococcus, Streptococcus, et Burkholderia. . Modèle selon la revendication 1, caractérisé en ce que la composante lipidique comprend un mélange d’acides gras libres, de triglycérides, de squalène, de cire et/ou esters de cire, et de cholestérol et/ou esters de cholestérol. Modèle selon la revendication 2, caractérisé en ce que la composante lipidique comprend 30 à 50 % p/p de triglycérides, de 15 à 30 % p/p d’acides gras libres, de 25 à 30 % p/p de cires et/ou esters de cire, de 12 à 20 % p/p de squalène et de 4,5 à 8,5 % p/p de cholestérol et/ou esters de cholestérol. Modèle selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la composante lipidique est issu d’un prélèvement d’au moins un sujet, préférentiellement au niveau du visage. Modèle selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la composante microbienne est une composante microbienne cutanée issu d’un prélèvement d’au moins un sujet, préférentiellement au niveau du visage et encore plus préférentiellement au niveau du front. Procédé d’obtention d’un modèle de peau reconstituée selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, comprenant a) Fourniture d’un substitut cutané, b) Application sur ledit substitut cutané, de façon concomitante ou séquentielle, d’une composante microbienne et d’une composante lipidique. Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que la peau reconstituée est stressée et en ce que le procédé comprend en outre une étape c) Réalisation d’au moins un stress exogène. Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que le stress exogène est un stress chimique ou physique. Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce que le stress physique est une irradiation dans le domaine UV dont UVA et/ou UVB ; et/ou lumière visible dont lumière bleue haute énergie visible et/ou infrarouge. Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce que le stress chimique est un réactif de stimulation pro-inflammatoire ou du cortisol. Méthode de criblage pour l’identification in vitro d’un actif ou d’une formulation cosmétique pour prévenir et/ou améliorer au moins un trouble cutané induit suite à au moins un stress exogène comprenant les étapes suivantes : a) L’application dudit actif ou de ladite formulation cosmétique sur le modèle de peau reconstituée selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 ; b) La réalisation d’au moins un stress exogène sur ledit modèle ; c) Au moins une mesure du niveau d’expression d’au moins un marqueur biologique ; et d) Déterminer si ledit actif ou de ladite formulation cosmétique permet de prévenir et/ou améliorer au moins un trouble cutané en fonction d’au moins un niveau d’expression mesuré à l’étape c). Méthode d’évaluation de l’efficacité in vitro d’un actif ou d’une formulation cosmétique pour prévenir et/ou traiter au moins un trouble cutané induit suite à au moins un stress exogène comprenant les étapes suivantes : a) L’application dudit actif ou de ladite formulation cosmétique sur le modèle de peau reconstituée selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 ; b) La réalisation d’au moins un stress exogène sur ledit modèle ; c) Au moins une mesure du niveau d’expression d’au moins un marqueur biologique ; et d) Évaluer l’efficacité dudit actif ou de ladite formulation cosmétique en fonction d’au moins un niveau d’expression mesuré à l’étape c). Méthode selon la revendication 11 ou 12, selon laquelle le au moins un trouble cutané est choisi parmi les troubles liés au vieillissement, à la pollution, au rayonnement ; les dermatoses inflammatoires, préférentiellement la dermatite atopique, l’acné, le psoriasis ; la rosacée ; le prurit ; une altération de la fonction barrière ; les peaux réactives ; les xéroses. Méthode selon la revendication 12 d’évaluation de l’efficacité in vitro d’au moins un filtre solaire ou d’une formulation cosmétique pour prévenir et/ou traiter au moins un trouble cutané induit suite à au moins un stress exogène consistant en une irradiation UV, infrarouge, ou lumière bleue. Méthode d'évaluation in vitro de la tolérance d’un actif ou d’une formulation cosmétique, comprenant les étapes suivantes : a) L’application dudit actif ou de ladite formulation cosmétique sur le modèle de peau reconstituée selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 ; b) Au moins une mesure du niveau d’expression d’au moins un marqueur biologique dans le modèle de peau de l’étape a) ; et c) Évaluer si ledit actif ou formulation cosmétique est bien toléré par le modèle de peau. Méthode selon la revendication 15, caractérisée en ce que la tolérance consiste au maintien de l’équilibre de la composante microbienne. Kit comprenant une composante microbienne et une composante lipidique destiné à être appliqué sur un substitut cutané, la composante microbienne comprenant au moins quatre genres de micro-organismes sélectionnés parmi les genres Cutibacterium, Staphylococcus, Streptococcus, Burkholderia, Finegoldia, Gemella, Veillonella, Kocuia, Corynebacterium, Methylobacterium, et Brevibacterium .