Brevet FR3127570A1 — publié le 20230331

L'invention concerne une méthode de détection, de quantification et de discrimination par cytométrie en flux des cellules des levures Brettanomyces spp contenues dans un substrat liquide organique lequel contient des sucres fermentescibles, selon laquelle on prélève un échantillon dudit substrat, éventuellement on le dilue, on ajoute dans ledit substrat éventuellement dilué au moins un premier fluorochrome apte à se lier à l’ADN des cellules mortes et/ou vivantes, on irradie ledit échantillon de manière à obtenir l’émission de fluorescence dudit premier fluorochrome et on irradie ledit échantillon également de manière à obtenir une émission de fluorescence dudit échantillon à 670 nm, on établit un histogramme bi paramétrique donnant pour chaque point l’intensité de la fluorescence due au premier fluorochrome couplée à l’intensité de la fluorescence émise à 670nm, on obtient ainsi au moins un premier nuage de points correspondant à une intensité de fluorescence émise et détectée à 670nm supérieure à celle détectée pour les autres points, on en déduit que les points dudit premier nuage correspondent aux cellules de Brettanomyces spp. METHODE DE DETECTION, DE QUANTIFICATION ET DE DISCRIMINATION DES LEVURES BRETTANOMYCES SPP ET DES AUTRES LEVURES CONTENUES DANS UN SUBSTRAT LIQUIDE ORGANIQUE CONTENANT DES SUCRES FERMENTESCIBLES La présente invention concerne une méthode permettant avec un même échantillon et un seul passage dans un cytomère, la détection, la quantification et la discrimination des levures Brettanomyces et des autres levures, notamment Saccharomyces spp contenues dans un substrat liquide organique contenant des sucres fermentescibles. Art antérieur Les levures du genre Brettanomyces sont capables de produire des composés produisant entre autres, des odeurs d’écurie. Brettanomyces est relativement résistante à l’alcool et à des pH bas. Dans la majorité des cas, elle est sensible au SO 2 , certaines souches peuvent y être particulièrement résistantes. Les levures Brettanomyces sont de plus petite taille comparées à Saccharomyces cerevisiae mais elles restent difficiles à identifier du fait d’un important polymorphisme. De plus, dans un milieu complexe comme le vin, le vinaigre, ou un moût, par exemple, leur discrimination est encore plus compliquée du fait des interactions avec le milieu. La plus commune des levures Brettanomyces est Brettanomyces bruxellensis qui comprend un genre sporulant appelé Dekkera bruxellensis . Ces levures produisent notamment du 4-éthyl-phénol, lequel est stable dans le vin et lui donne une odeur d’écurie qu’il est souhaitable d’éviter. Le même phénomène peut apparaître dans d’autres jus fermentés et éventuellement alcoolisés comme le cidre, la bière, la téquila, le kombucha, le kéfir, par exemple. Brettanomyces spp étant présente dans le milieu environnant, elle est susceptible de contaminer n’importe quel substrat liquide contenant des sucres fermentescibles dans lequel elle peut se développer. Les levures Brettanomyces peuvent se présenter sous plusieurs états : vivante (donc active et produisant le composé précité), morte (non inactive et ne produisant pas le composé précité) ou latente. Les cellules latentes sont susceptibles de redevenir active et donc de produire entre autres, du 4-éthyl-phénol lors du vieillissement du vin, par exemple. Les cellules à l’état latent ne sont détectables par mise en culture du substrat ce qui signifie que la mise en culture d’un échantillon de substrat ne permet pas de garantir dans le futur l’absence de fragrances indésirables. La publication intitulée « The application of flow cytometry in microbiological monitoring during winemaking: two case studies » de R. Guzzon & al et publiée dans la revue Ann Microbiol ((2015) 65/1865-1878) indique qu’il est possible de différentier par cytométrie en flux une cellule vivante d’une cellule morte dans une culture de S. cerevisiae pure ou dans un vin dans lequel on a ajouté un mélange de sucre et de S. cerevisiae . La méthode appliquée au le vin avant ajout du mélange précité pour une seconde fermentation ne donne aucun résultat. Un mélange de marqueurs est utilisé dans cette méthode : le mélange cFDA combiné à l’iodure de propidium. La publication intitulée « Rapid detection of viable yeasts and bacteria in wine by flow cytometry » de Malacrino & al publiée dans la revue Journal of Microbiological Methods (45 (2001) 127–134) indique qu’il est possible de déterminer le nombre de levures et de bactéries malolactiques dans du jus de Pinot noir dans lequel on a jouté des levures pré cultivées dans un milieu particulier (1% d’extrait de levure +2% de peptone +2% de dextrose) par cytométrie en flux. Le meilleur marqueur est le mélange fluorescéine cFDA. La même méthode appliquée sur un échantillon de vin ne donne pas des résultats cohérents avec les résultats obtenus par comptage sur des cultures. Le vin doit donc être préalablement lavé avant la mesure. La publication suggère que cette méthode pourrait être utilisée pour la détection de levures non désirables telles que Brettanomyces spp . La publication intitulée « Survival and metabolism of hydroxycinnamic acids by Dekkera bruxellensis in monovarietal wines » de Nine de Lima, publiée dans la revue Food microbiology en février 2021 (volume 93) indique qu’il est possible de mesurer la population de Dekkera bruxellensis dans du vin préalablement inoculé avec une souche de Dekkera bruxellensis par cytométrie en flux. Deux marqueurs ont été utilisés en combinaison : l’iodure de propidium et SYTO 9 ®. La publication intitulée « Specific Identification and Quantification of the Spoilage Microorganism Brettanomyces in Wine by Flow Cytometry: A Useful Tool for Winemakers », de H. Alexandre & al, publiée en ligne le 11 février 2010 dans la revue Wiley Interscience décrit une méthode d’identification et de quantification de Brettanomyces dans le vin par spectrométrie de flux par utilisation de la méthode d’hybridation de fluorescence in situ. Le marqueur fluorescents utilisé (Alexa Fluor® 488) cible des séquences particulières d’acides aminés qui correspondent à l’ARN de Brettanomyces. La membrane de Brettaomyces contenue dans le vin est d’abord perméabilisée ce qui ne permet pas de différencier les cellules mortes des vivantes ou latentes. Le seuil de détection est de 102 cellules /mL. Problème Technique Un but de la présente invention est de proposer une méthode par cytométrie en flux qui permet de déterminer, de quantifier et de discriminer les levures Brettanomyces spp des autres levures et notamment des levures Saccharomyces spp dans un substrat liquide contenant des sucres fermentescibles et éventuellement des particules fines de la taille des bactéries ou levures. Un autre but de la présente invention est de proposer une méthode par cytométrie en flux qui permet de discriminer et de quantifier les cellules vivantes des levures Brettanomyces spp , les cellules mortes des levures Brettanomyces spp et les cellules latentes de levures Brettanomyces spp . Un autre but de la présente invention est de proposer une méthode qui soit applicable à un produit fini, comme du vin, du cidre, de la bière, du vinaigre ou du jus de fruit, éventuellement mis en cuve ou en bouteille et apte à la vente. Un autre but de l’invention est de proposer une méthode qui permet avec une analyse d’un même échantillon de dénombrer également les bactéries et éventuellement leur état (morte, latente ou vivante) Brève description de l’invention La présente invention concerne une méthode de détection, de quantification et de discrimination par cytométrie en flux des cellules des levures Brettanomyces spp contenues dans un substrat liquide organique lequel contient des sucres fermentescibles, selon laquelle on prélève un échantillon dudit substrat, éventuellement on le dilue, on ajoute dans ledit substrat éventuellement dilué au moins un premier fluorochrome apte à se lier à l’ADN des cellules mortes et/ou vivantes, on irradie ledit échantillon de manière à obtenir l’émission de fluorescence dudit premier fluorochrome et on irradie ledit échantillon également de manière à obtenir une émission de fluorescence dudit échantillon à 670 nm, on établit un histogramme bi paramétrique donnant pour chaque point l’intensité de la fluorescence due au premier fluorochrome et l’intensité de la fluorescence émise à 670nm, on obtient ainsi au moins un premier nuage de points correspondant à une intensité de fluorescence émise et détectée à 670nm supérieure à celle détectée pour les autres points, on en déduit que les points dudit premier nuage correspondent aux cellules de Brettanomyces spp et on dénombre éventuellement le nombre de cellules de Brettanomyces spp en comptant les points dudit premier nuage. C’est en effet le mérite de la Demanderesse que d’avoir mis en évidence l’autofluorescence des cellules de Brettanomyces spp à 670nm après excitation avec un laser émettant dans les longueurs d’ondes correspondant au rouge (de 620 nm inclus à 750 nm inclus) et en particulier à 637nm. Le premier fluorochrome se liant à l’ADN, il permet de supprimer le bruit de fond dû aux particules en suspension, par exemple. Seules les cellules des microorganismes présents, c’est-à-dire les levures, les champignons et les bactéries seront marquées. Si le premier fluorochrome ne pénètre que dans les cellules dont la paroi est altérée et donc perméable (cellules mortes), le signal de fluorescence ne permet de détecter que les cellules mortes mais la détermination de la première fenêtre comme expliqué ultérieurement et l’utilisation d’un deuxième fluorochrome se liant à la fois aux cellules mortes et aux cellules vivantes permet de détecter toutes les cellules de Brettanomyces spp . Par ailleurs, la mise en évidence de l’autofluorescence des cellules de Brettanomyces spp permet de rapidement et précisément définir une fenêtre sur les histogramme bi paramétrique, ce qui confère à la méthode de l’invention une grande précision, une grande fiabilité et une grande rapidité de mise en œuvre. Avantageusement, le premier fluorochrome se lie à l’ADN des cellules mortes et vivantes. L’échantillon peut être dilué au 1/10, 1/40,1/100, 1/300 ou 1/1000, en fonction de sa charge en levures et bactéries. Méthode de détection, de quantification et de discrimination par cytométrie en flux des cellules des levures Brettanomyces spp contenues dans un substrat liquide organique lequel contient des sucres fermentescibles, selon laquelle on prélève un échantillon dudit substrat, éventuellement on le dilue, on ajoute dans ledit substrat éventuellement dilué au moins un premier fluorochrome apte à se lier à l’ADN des cellules mortes et/ou vivantes, on irradie ledit échantillon de manière à obtenir l’émission de fluorescence dudit premier fluorochrome et on irradie ledit échantillon également de manière à obtenir une émission de fluorescence dudit échantillon à 670 nm, on établit un histogramme bi paramétrique donnant pour chaque point l’intensité de la fluorescence due au premier fluorochrome et l’intensité de la fluorescence émise à 670nm, on obtient ainsi au moins un premier nuage de points correspondant à une intensité de fluorescence émise et détectée à 670nm supérieure à celle détectée pour les autres points, on en déduit que les points dudit premier nuage correspondent aux cellules de Brettanomyces spp et on dénombre éventuellement le nombre de cellules de Brettanomyces spp en comptant les points dudit premier nuage. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit substrat contient en majorité des levures Brettanomyces spp et des levures Sacharomyces spp , en ce que l’on obtient sur ledit histogramme bi paramétrique deux nuages de points, un premier nuage comprenant les points correspondant à une intensité de fluorescence émise à 670nm supérieure à celle des points du deuxième nuage de points, en ce que l’on en déduit que les points dudit premier nuage correspondent aux cellules de Brettanomyces spp et que les points dudit deuxième nuage correspondent aux cellules de Saccharomyces spp et on dénombre éventuellement le nombre de cellules de Brettanomyces spp et/ou de Saccharomyces spp en comptant les points de chacun desdits nuages. Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu’avant de mesurer la fluorescence, on réalise une première discrimination entre les particules et les cellules contenues dans ledit échantillon en mesurant l’intensité de la lumière réfléchie et réfractée et l’intensité de la lumière difractée, on établit un histogramme bi paramétrique donnant pour chaque point correspondant à une particule ou cellule détectée la valeur desdites intensités, on détermine ainsi en fonction des valeurs desdites intensités une première fenêtre qui contient des points affectables à des cellules de levure et éventuellement une deuxième fenêtre qui correspond à des points affectables à des cellules bactériennes, on établit ledit histogramme bi paramétrique donnant l’intensité de la fluorescence due au premier fluorochrome et l’intensité de la fluorescence émise à 670nm pour chaque point situé dans ladite première fenêtre. Méthode selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit premier fluorochrome étant apte à se lier à l’ADN des cellules vivantes et à l’ADN des cellules dont la paroi est perméable, en ce qu’avant toute mesure, on ajoute en outre, audit échantillon éventuellement dilué, un deuxième fluorochrome apte à se lier uniquement à l’ADN des cellules dont la paroi est perméable , en ce que l’on détermine en outre, une troisième fenêtre qui entoure les points dudit premier nuage, en ce qu’on excite l’échantillon de manière à provoquer l’émission de fluorescence du premier et du deuxième fluorochrome et pour les points situés dans ladite troisième fenêtre, on établit également un histogramme bi paramétrique donnant pour chaque point l’intensité de la fluorescence du premier et celle du deuxième fluorochrome ou l’intensité de la fluorescence par unité de surface d’un des deux fluorochromes et celle due à l’autre fluorochrome et en ce que l’on détermine en outre, deux groupes de points, un premier groupe pour lesquels la fluorescence due au fluorochrome qui se fixe uniquement à l’ADN des cellules dont la paroi est perméable est supérieure à celle du deuxième groupe et on compte le nombre de points de chacun des groupes, lequel correspond au nombre de cellules de Brettanomyces sppp vivantes pour le deuxième groupe et le nombre de cellules de Brettanomyces spp mortes pour le premier groupe. Méthode selon les revendications 2 et 3, caractérisée en ce que l’on détermine ladite deuxième fenêtre et en ce qu’on excite également ledit échantillon de manière à provoquer l’émission de fluorescence du premier et du deuxième fluorochrome et pour les points situés dans ladite deuxième fenêtre, on établit un histogramme bi paramétrique donnant pour chaque point l’intensité de la fluorescence du premier et celle du deuxième fluorochrome ou l’intensité de la fluorescence par unité de surface d’un des deux fluorochromes et celle due à l’autre fluorochrome et en ce que l’on détermine deux groupes de points, un premier groupe pour lesquels la fluorescence due au fluorochrome qui se fixe uniquement à l’ADN des cellules dont la paroi est perméable est supérieure à celle du deuxième groupe et on compte le nombre de points de chacun des groupes, lequel correspond au nombre de cellules bactériennes vivantes pour le deuxième groupe et le nombre de cellules bactériennes mortes pour le premier groupe. Méthode selon la revendication 5 ou 6, caractérisée en ce que avant toute mesure, l’on ajoute, en outre, audit échantillon éventuellement dilué un troisième fluorochrome qui n’émet un signal de fluorescence que lorsqu’il qu’il réagit avec une cellule vivante, on excite ledit échantillon de manière à obtenir également l’émission de fluorescence dudit troisième fluorochrome et on établit pour les points de ladite deuxième et/ou troisième fenêtre, un histogramme bi paramétrique donnant pour chaque point l’intensité de la fluorescence due au fluorochrome qui ne se lie qu’à l’ADN des cellules dont la paroi est perméable et l’intensité de la fluorescence due au troisième fluorochrome, on détermine alors pour chaque fenêtre, trois sous-groupes de points, un premier sous-groupe de points correspondants à une intensité de fluorescence due au troisième fluorochrome supérieure à celle des autres sous-groupes, ce premier sous-groupe de points représentant les cellules de Brettanomyces spp /cellules bactériennes vivantes et actives, un deuxième sous-groupe de points correspondant à une intensité de fluorescence due au troisième fluorochrome inférieure à celle du premier sous-groupe et couplée avec une intensité de fluorescence due au premier/deuxième fluorochrome inférieure à celle du troisième sous-groupe, les points de ce deuxième sous-groupe correspondent aux cellules de Brettanomyces spp /cellules bactériennes à l’état latent et un troisième sous-groupe de points correspondant à une intensité de fluorescence due au premier/deuxième fluorochrome supérieure à celle du premier et du deuxième sous-groupe, ces points correspondent aux cellules de Brettanomyces spp /cellules bactériennes mortes. Méthode selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit premier et ledit deuxième fluorochrome sont différents et choisis parmi les fluorochromes aptes à se lier à l’ADN des cellules et présentant une longueur d’onde d’absorption maximale en fluorescence égale ou supérieure à 599nm et égale ou inférieure à 657nm, une longueur d’onde d’émission en fluorescence maximale égale ou supérieure à 619nm et égale ou inférieure à 678nm et un rendement quantique égal ou supérieur à 0,16 et égal ou inférieur à 0,39 et leurs mélanges, en particulier les fluorochromes apte à se lier à l’ADN des cellules et présentant une longueur d’onde d’absorption en fluorescence maximale de 652 nm, une longueur d’onde d’émission en fluorescence maximale de 676 nm et un rendement quantique de fluorescence sur l’ADN de 0,27 et les fluorochromes aptes à se lier à l’ADN et présentant une longueur d’onde d’absorption maximale en fluorescence de 657nm, une longueur d’onde d’émission maximale en fluorescence de 673nm et un rendement quantique de fluorescence sur l’ADN de 0,17, les fluorochromes aptes à se lier uniquement à l’ADN des cellules dont la paroi est perméable et qui présentent une longueur d’onde d’absorption maximale en fluorescence de 547nm, une longueur d’onde d’émission maximale en fluorescence de 570nm et un rendement quantique de fluorescence sur l’ADN de 0,9 et leur mélanges et en ce que lorsque ledit premier fluorochrome est choisi parmi les fluorochromes aptes à se lier à l’ADN et présentant une longueur d’onde d’absorption maximale en fluorescence de 657nm, une longueur d’onde d’émission maximale en fluorescence de 673nm et un rendement quantique de fluorescence sur l’ADN de 0,17 et les fluorochromes apte à se lier à l’ADN des cellules et présentant une longueur d’onde d’absorption en fluorescence maximale de 652 nm, une longueur d’onde d’émission en fluorescence maximale de 676 nm et un rendement quantique de fluorescence sur l’ADN de 0,27, le deuxième fluorochrome est choisi parmi les fluorochromes aptes à se lier uniquement à l’ADN des cellules dont la paroi est perméable et qui présentent une longueur d’onde d’absorption maximale en fluorescence de 547nm et une longueur d’onde d’émission maximale en fluorescence de 570nm et un rendement quantique de fluorescence sur l’ADN de 0,9 et en ce que ledit troisième fluorochrome est choisi parmi le diacétate de 5-carboxyfluoresceine, le diacétate de 6-carboxyfluoresceine, les mélanges de diacétate de 5-carboxyfluoresceine et de diacétate de 6-carboxyfluoresceine et le diacétate fluorescéine 5,6 carboxylate de succinimidyl de formule générale suivante : [Formule 3] Méthode selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit substrat est choisi parmi le vin pétillant ou non, le vin rouge, le vin blanc, le vin rosé, le cidre, la bière, le saké, les jus de fruits, notamment de raisin ou de pomme, le kéfir d’eau, le kéfir de jus de fruit, le kéfir de lait, le lait, la tequila, le whisky, la vodka, les moûts notamment de raisin, les vins en cours de première ou de deuxième fermentation, les vins finis, pétillants ou non et les vinaigres. Méthode selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu’elle permet de détecter quantifier et discriminer au moins une espèce de levure Brettanomyces spp choisie parmi les espèces suivantes B. anomalus , B. bruxellensis , B. custersianus , B. nanus , B. dekkera bruxellensis et B. naardenensis d’au moins une autres espèce de levure et notamment d’au moins une espèce de Saccharomyces spp choisie parmi les espèces suivantes : Saccharomyces bailii Linder, Saccharomyces carlsbergensis , Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces delbrueckii , Saccharomyces exiguus , Saccharomyces fermentati , Saccharomyces florentinus , Saccharomyces fragilis , Saccharomyces fructuum , Saccharomyces heterogenicus , Saccharomyces oleaginosus , Saccharomyces rosei , Saccharomyces steineri , Saccharomyces boulardii , Saccharomyces kefir , Saccharomyces kluyveri et en particulier Saccharomyces cerevisiae. Mélange fluorochromique contenant ou constitué d’un solvant et d’un premier fluorochrome choisi parmi les fluorochromes aptes à se lier à l’ADN et présentant une longueur d’onde d’absorption en fluorescence maximale de 652 nm et une longueur d’onde d’émission en fluorescence maximale de 676 nm et un rendement quantique de fluorescence sur l’ADN de 0,27, les fluorochromes aptes à se lier à l’ADN et présentant une longueur d’onde d’absorption maximale en fluorescence de 657nm et une longueur d’onde d’émission maximale en fluorescence de 673nm et un rendement quantique de fluorescence sur l’ADN de 0,17 et leur mélanges, un deuxième fluorochrome choisi parmi les fluorochromes présentant une longueur d’onde d’absorption maximale en fluorescence de 547nm et une longueur d’onde d’émission maximale en fluorescence de 570nm et un rendement quantique de fluorescence sur l’ADN de 0,9 et un troisième fluorochrome ledit troisième fluorochrome est choisi parmi le diacétate de 5-carboxyfluoresceine, le diacétate de 6-carboxyfluoresceine, les mélanges de diacétate de 5-carboxyfluoresceine et de diacétate de 6-carboxyfluoresceine et le diacétate fluorescéine 5,6 carboxylate de succinimidyl de formule générale suivante : [Formule 4]