Brevet FR3132099A1 — publié le 20230728

L’invention concerne un composé de formule I suivante où X - est un anion, où R1 et R2 sont - soit conjointement -CH 3 , - soit un alkyle en C 1 -C 4 , tel que si R1 est un alkyle en C n+ i , R2 est un alkyle en C n , et inversement, n étant un entier variant de 1 à 3, i étant un entier variant de 1 à 3 et ou n+i varie de 1 à 4; et où R3 est un -CH 3 , ou un alkyle en C 2 -C 8 , ledit alkyle en C 2 -C 8 étant possiblement substitué par un ou plusieurs hétéroatomes ; Figure pour l’abrégé : pas de figure Composé cyclique pour mesurer l’efflux bactérien L’invention concerne des composés cycliques, et notamment leur utilisation dans le cadre de la mesure de l’efflux bactérien. En biologie, l'efflux est un mécanisme par lequel les cellules rejettent dans le milieu extérieur des composés qui sont toxiques pour leur métabolisme, tels que les antibiotiques, les métaux lourds, des drogues, etc... L'efflux est un mécanisme de transport actif, énergie-dépendant, assuré par des protéines transmembranaires appelées pompes d'efflux. Chez les procaryotes, et notamment les bactéries, de nombreux systèmes d'efflux ont été décrits, mais ces mécanismes peuvent également être observés chez certains eucaryotes. Du fait de l’expulsion de composés dans le milieu extérieur, les mécanismes responsables de l'efflux contribuent entre autres à l'émergence de résistances à différents traitements pharmacologiques comme la résistance aux antibiotiques ou résistance aux chimiothérapies anticancéreuses. Le spectre large de certaines pompes d'efflux observé chez certaines bactéries peut conduire à l'apparition de phénotypes de multirésistance, rendant ainsi très difficile le traitement des infections. Aussi, existe-t-il un besoin de mesurer l’efflux afin d’anticiper les résistances bactériennes. L’un des buts de l’invention est de proposer des composés et des méthodes permettant de mesurer l’efflux bactérien. Un autre but de l’invention consiste à proposer une méthode permettant d’évaluer la résistance aux antibiotiques des bactéries. Aussi, l’invention concerne-t-elle un composé de formule I suivante : (I) où X - est un atome halogène, ou un contre ion acceptable, notamment Cl, où R1 et R2 sont - soit conjointement -CH 3 , - soit un alkyle en C1-C4, tel que si R1 est un alkyle en Cn+i, R2 est un alkyle en Cn, et inversement, n’étant un entier variant de 1 à 3, i étant un entier variant de 1 à 3 et ou n+i varie de 1 à 4; et où R3 est un -CH 3 , ou un alkyle en C2-C8, ledit alkyle en C2-C8 étant possiblement substitué par un ou plusieurs hétéroatomes ; ou un sel ou un solvate de ce composé de formule I, ou une forme protonée de celui-ci. En d’autres termes, l’invention concerne-t-elle un composé de formule I susmentionné X- est un atome halogène, ou un contre ion acceptable, notamment Cl, où R1 et R2 sont - soit conjointement -CH3, - soit un alkyle en C1-C4, tel que - si R1 est un alkyle en Cn+i, R2 est un alkyle en Cn, - si R1 est un alkyle en Cn, R2 est un alkyle en Cn+i, n étant un entier variant de 1 à 3, i étant un entier variant de 1 à 3 et où n+i varie de 2 à 4; et où R3 est un -CH3, ou un alkyle en C2-C8, ledit alkyle en C2-C8 étant possiblement substitué par un ou plusieurs hétéroatomes ; ou un sel ou un solvate de ce composé de formule I, ou une forme protonée de celui-ci. L’invention repose sur la constatation surprenante faite par les inventeurs que les composés de formule I susmentionnés sont des composés colorés et fluorescents qui sont efficacement efflués par des bactéries au moyen des différentes pompes d’efflux, de sorte que lesdits composés permettent de mesurer l’efflux bactérien et de mesurer une potentielle résistance desdites bactéries. Les composés de formule I sont des phénaziniums, c’est à dire des formes protonées cationiques de phénazines. Les formes alkylées des phénaziniums de l’invention sont également envisagées. Dans les composés de formule I, X - est un contre-anion acceptable et notamment pharmaceutiquement acceptable, c’est à dire un contre-anion dont l’utilisation est compatible avec la physiologie animale ou bactérienne. Des contre-anions avantageux sont notamment des contre-anions où X est un atome d’halogène tel que F, Cl, Br ou encore I, l’halogène avantageux étant Cl. D’autres contre-ions sont envisageables tels que les chlorates, les bromates, les hydrogénocarbonates, les acétates, les butyrates, les formiates, les tartrates, les aluminates, les salicylates, les mésylates, les anions de bore, les anions de phosphore tels que notamment l’hexafluorophosphate (PF 6 - ) ou encore le tétrafluoroborate (BF 4 - ). Les composés selon la formule I sont donc des phénaziniums où les groupements R1, R2 et R3 sont définis comme suit : - soit R1 et R2 sont des groupes - CH 3 , - soit R1 et R2 sont des alkyles en C1-C4, c’est-à-dire des alkyles en C1, C2, C3 ou C4, de préférence linéaires, de telle sorte que R1 et R2 ont toujours un atome de carbone de différence. C’est ce que définit la phase précisant que si R1 est alkyle en Cn, R2 est un alkyle en Cn+i, et si R1 est alkyle en Cn+i, R2 est un alkyle en Cn, où i étant un entier variant de 1 à 3 et où n+i varie de 2 à 4. En d’autres termes, R1 et R2 sont - conjointement un -CH 3 , ou, lorsque R1 et R2 sont des alkyles linéaires en C1-C4, - R1 = -CH 3 et R2 = -C 2 H 5 ou R1 = -C 2 H 5 et R2 = -CH 3 , ou - R1 = -C2H 5 et R2 = -C 3 H 7 ou R1 = -C 3 H 7 et R2 = -C 2 H 5 , ou - R1 = -C 3 H 7 et R2 = -C 4 H 9 ou R1 = - C 4 H 9 et R2 = -C 3 H 7 . Bien évidemment, lors que R1 ou R3 sont des alkyles en C3, ils peuvent être -C 3 H 7 (i.e. -CH 2 -CH 2 -CH3) ou -CH(CH 3 ) 2 , et lorsqu’ils sont des alkyles en C4 ils peuvent être de -C 4 H 9 (i.e. -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 3 ), -CH(CH 3 )-CH 2 -CH 3 ou -CH 2 -CH(CH 3 ) 2 ou -C(CH 3 ) 3 . En ce qui concerne R3, celui-ci est un méthyle (-CH 3 ) ou un alkyle en C2-C8, c’est-à-dire un alkyle : - en C1, i.e. -CH 3 , ou - en C2, i.e. -C2H 5 (i.e. -CH 2 -CH 3 ), ou - en C3, i.e. -C 3 H 7 (i.e. -CH 2 -CH 2 -CH3) ou -CH(CH 3 ) 2 , ou - en C4, i.e. -C 4 H 9 (i.e. -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 3 ), -CH(CH 3 )-CH 2 -CH 3 ou -CH 2 -CH(CH 3 ) 2 ou -C(CH 3 ) 3 , ou - en C5, i.e. -C5H11 (i.e. -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 3 ), -CH(CH 3 )-CH 2 -CH 2 -CH 3 , -CH 2 -CH(CH 3 )-CH 2 -CH 3 , - CH 2 -CH 2 -CH(CH 3 ) 2 , -C(CH 3 ) 2 -CH 2 -CH 3 , -CH(CH 3 )-CH(CH 3 )-CH 3 , -CH 2 -C(CH 3 ) 3 ou -CH(CH 3 )-CH(CH 3 ) 2 , ou - en C6, i.e. -C6H13 (i.e. -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 3 ), ou une forme ramifiée, ou - en C7, i.e. -C7H15 (i.e. -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 3 ), ou une forme ramifiée, ou - en C8, i.e. -C8H17 (i.e. -CH2-CH2--CH2CH2-CH2-CH2-CH2-CH3), ou une forme ramifiée. Lorsque R3 est un alkyle en C2-C8, chacun des atomes de carbone peut être substitué par un hétéroatome, c’est à dire par un atome d’oxygène (O), d’azote (N) ou de soufre (S), voire même du phosphore (P). Par exemple, un alkyle en C4, peut avoir un de ses carbones substitué par un oxygène, et l’on obtiendra les résidus R3 suivants : - -O-CH 2 -CH 2 -CH 3 , ou - - CH 2 -O-CH 2 -CH 3 , ou - -CH 2 -CH 2 -O-CH 3 , ou - -CH 2 -CH 2 -NH-CH 3 , ou encore - -CH2-CH2-CH2-OH. Ces exemples sont illustratifs et ne sauraient limiter la portée de l’invention. Les formes protonées du composé de formule I susmentionné sont également couvertes par la présente invention. De manière avantageuse, l’invention concerne le composé tel que défini ci-dessus, où R1 et R2 sont chacun un alkyle en C2-C4, tels que : - si R1 est un alkyle en Cn+i, R2 est un alkyle en Cn, ou - si R2 est un alkyle en Cn+i, R1 est un alkyle en Cn, n variant de 1 à 3, i étant un entier variant de 1 à 3 et ou n+i varie de 1 à 4, et R3 est tel que défini ci-dessous. De manière avantageuse, l’invention concerne le composé tel que défini ci-dessus, où R3 est un groupement alcoxy en C2-C4, notamment méthoxyéthyle, un groupe diméthylamineéthyle ou méthylaminexéthyle. De manière encore plus avantageuse, l’invention concerne le composé susmentionné, ledit composé étant choisi dans le groupe des composés de formule I, où R1, R2 et R3 sont conjointement tels qu’indiqués dans chaque ligne du tableau qui suit : composé R1 R2 R3 méthyle méthyle propyle méthyle éthyle propyle éthyle méthyle propyle éthyle propyle propyle propyle éthyle propyle propyle butyle propyle butyle propyle propyle méthyle méthyle butyle méthyle éthyle butyle éthyle méthyle butyle éthyle propyle butyle propyle éthyle butyle propyle butyle butyle #47 butyle propyle butyle méthyle méthyle méthoxyéthyle méthyle éthyle méthoxyéthyle éthyle méthyle méthoxyéthyle éthyle propyle méthoxyéthyle propyle éthyle méthoxyéthyle propyle butyle méthoxyéthyle #53 butyle propyle méthoxyéthyle #52 butyle propyle octyle De manière encore plus avantageuse, l’invention concerne le composé susmentionné, ledit composé étant choisi parmi les composés de formules 47, 52 et 53 suivantes : (47), (52), et (53). Ces trois composés sont les composés les plus avantageux de l’invention et leur synthèse est décrite en détail dans l’Exemple 1, ci-après. De manière avantageuse, l’invention concerne le composé tel que défini précédemment, en tant que médicament, ou pour son utilisation en tant que médicament. Il est également envisagé une utilisation du composé tel que défini ci-dessus, pour la fabrication d’un médicament. Il est également envisagé une composition pharmaceutique comprenant à titre de substance active un composé tel que défini précédemment, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. De préférence, le composé de formule (I) telle que définie ci-dessus, ou son sel pharmaceutiquement acceptable, est administré ou administrable à une dose unitaire, ou est conditionné en une dose unitaire, d'environ 50 mg à environ 1500 mg, notamment d'environ 150 à environ 200 mg. De préférence également, le composé de formule (I) telle que définie ci-dessus, ou son sel pharmaceutiquement acceptable est administré ou administrable avec un régime de dosage de 50 mg/j à environ 1500 mg/j, notamment d'environ 150 mg/j à environ 200 mg/j. De préférence, le composé de formule (I) telle que définie ci-dessus, ou son sel pharmaceutiquement est administré ou administrable sous une forme convenant pour une administration par voie orale ou injectable. Plus préférablement, le composé de formule (I) telle que définie ci-dessus, ou son sel pharmaceutiquement acceptable, est administré ou administrable sous la forme d'une poudre, de cachets, de gélules ou de sachets. De manière encore plus avantageuse, le composé susmentionné ou la composition pharmaceutique susmentionnée est utilisé dans le cadre du traitement, ou pour le traitement des infections à bactéries gram positive. Le composé susmentionné a des propriétés antibactériennes qui peuvent s’avérer utiles dans le cadre du traitement d’infections. De manière plus avantageuse, le composé susmentionné est utilisé dans le cadre de thérapies antibactériennes, pour traiter des pathologies ou des infections liées à la contamination par des bactéries à gram positif qui ne sont pas capables d’effluer des composés, ou des bactéries qui n’expriment pas ou peu de pompes responsables de la résistance aux antibiotiques. Dans un autre aspect, le composé susmentionné, qui possède des propriétés antibiotiques, ou du moins antibactérien, peut être utilisé dans le cadre de la décontamination de surfaces inertes infectées, ou contaminées par des bactéries. Le composé est alors mis en contact avec la surface contaminée afin de tuer et/ou inhiber la croissance des bactéries contaminantes. Le composé peut être utilisé sous forme d’une poudre à répartir sur la surface à décontaminer, ou sous la forme d’une solution qui peut être versée ou pulvériser sur la surface à décontaminer. Il est également envisagé d’utiliser le composé susmentionné, en vue de colorer ou de réaliser un marquage coloré ou fluorescent, de bactéries à gram positif, et plus particulièrement les bactéries à gram positives qui ne sont pas capable d’effluer des composées, c’est à dire des bactéries qui n’expriment pas ou peu de pompes responsables de la résistance multiple aux drogues (pompes permettant l’efflux). L’invention concerne également l’utilisation d’un composé tel que défini précédemment, pour évaluer ou mesurer, c’est à dire pour observer de manière qualitative ou quantifier l’efflux dudit composé par une bactérie. Comme cela est illustré dans les exemples, le composé selon l’invention est capable d’être expulsé des bactéries par le mécanisme d’efflux. Aussi, dans la mesure où le composé selon l’invention est coloré et/ou fluorescent, il est facile de suivre son efflux depuis l’intérieur de la bactérie vers l’extérieur. Il est également possible d’utiliser le composé de l’invention pour identifier si un isolat bactérien surproduit ou non ses pompes d’efflux. Aussi, en mesurant ou en évaluant l’efflux du composé de l’invention, il est possible de déterminer si une pompe est surproduite ou surexprimée, ou au contraire sous produite ou sous exprimée. Il est ainsi possible de mesurer des caractéristiques telles que la vitesse d’efflux, ce qui peut éventuellement informer sur la quantité de pompes d’efflux présente à la membrane des bactéries, ou de mesurer la variation d’activité (capacité d’efflux) de pompes suite à une mutagenèse (induite ou naturelle). Dans la mesure où le composé est coloré et/ou fluorescent, il sera possible de mesurer d’une part la coloration/fluorescence au début de l’expérience lors de la mise en contact du composé avec les bactéries, et après un temps déterminé, soit la fluorescence ou la couleur dans la bactérie, soit dans le milieu extérieur. De manière plus avantageuse l’invention concerne l’utilisation susmentionnée, pour évaluer ou mesurer l’efflux par des bactéries à gram positif. Plusieurs gènes codant pour des systèmes d’efflux ont été décrits chez les bactéries à Gram positif. Leur produit forme un transporteur protéique qui diminue l’accumulation de l’antibiotique dans la cellule. A titre d’exemple, les gènes msrA et msrB sont responsables d’un phénotype de résistance de type MS, c’est-à-dire d’une résistance inductible vis-à-vis des macrolides dont le noyau comporte 14 et 15 carbones (C14 et C15) et au composé B des streptogramines, après induction par l’érythromycine. Le gène mef entraîne un phénotype de résistance nommé M, caractérisé par une résistance limitée aux macrolides en C14 et en C15. Les gènes vga, vgaB codent des protéines d’efflux du seul composé A des synergistines. Tous ces gènes sont retrouvés chez différentes espèces de Staphylococcus aureus (SA) et les staphylocoques à coagulase négative (SCN). Il ne s’agit ici que d’exemples, et cette liste n’est en aucun cas à considérer comme limitative de l’invention. De manière avantageuse, l’utilisation susmentionnée concerne la mesure ou l’évaluation Dans un autre aspect, l’invention concerne un kit, ou trousse, de détection ou de mesure de l’efflux bactérien, comprenant - un composé tel que défini ci-dessus, et - au moins une bactérie contrôle. Le kit de l’invention contient donc un composé selon l’invention qui est capable d’être efflué par des bactéries, et en outre un contrôle de l’expérience, une bactérie contrôle pour laquelle on connaît l’efflux dudit composé. Cette bactérie contrôle peut exprimer, soit une pompe sauvage, et dont l’efflux est connu notamment avec précision et de manière reproductible, soit une pompe mutante que ne permet plus l’efflux du fait d’une absence d’expression des protéines formant la pompe ou d’une modification structurelle affectant la fonction. D’autres bactéries contrôle peuvent évidemment être utilisées et dans un aspect avantageux il peut être fourni avec le kit, ou la trousse, à la fois un contrôle positif (une bactérie avec une pompe à efflux fonctionnelle) et un contrôle négatif (une bactérie avec une pompe à efflux non fonctionnelle ou absente). Dans la mesure où le composé selon l’invention est coloré et/ou fluorescent, il est possible également d’inclure dans le kit selon l’invention des palettes de couleur permettant de définir si une bactérie est capable d ‘effluer ou non un composé, ou encore des moyens de détection de la fluorescence. De manière avantageuse, l’invention concerne l’utilisation du kit tel que défini ci-dessus, pour la mesure ou la quantification de l’efflux dudit composé par une bactérie, notamment une bactérie à gram positif, en particulier des S. aureus et des B. subtilis . Dans encore un autre aspect, l’invention concerne l’utilisation d’un composé tel que défini précédemment, pour évaluer la résistance d’une bactérie à un composé bactériostatique ou bactéricide Dans la mesure où le composé selon l’invention peut être efflué par les pompes bactériennes, ce dernier peut donc logiquement être utilisé pour évaluer l’efficacité de l’efflux de bactéries. S’il est établi que le composé selon l’invention est efflué, cela signifie que l’efflux est fonctionnel et donc que les bactéries seront capables d’éliminer des antibiotiques. On conclura donc, sans avoir besoin de mesurer la résistance en utilisant un antibiotique, que les bactéries concernées sont résistantes aux antibiotiques par un phénomène d’efflux. A l’inverse, si le composé selon l’invention n’est pas efflué, cela signifie que les pompes d’efflux ne sont pas fonctionnelles, et donc que des antibiotiques ne seront pas non plus efflués. Aussi, de la même manière que pour la résistance, il sera possible de déterminer facilement, sans utiliser d’antibiotique, que les bactéries sont sensibles auxdits antibiotiques par défaut d’efflux. Dans encore un autre aspect, l’invention concerne une méthode d’évaluation de la résistance, notamment une résistance due à un mécanisme d’efflux, d’une bactérie à un composé bactériostatique ou bactéricide, comprenant : - la mise en culture de bactéries dans un milieu de culture approprié, pour obtenir une culture de bactéries, - la mise en contact de la culture de bactéries avec un composé susmentionné, pour obtenir une culture de bactéries traitées, - le lavage de la culture de bactérie traitées, et la précipitation des bactéries contenues dans la culture de bactéries traitées pour obtenir un culot de bactéries, - l’observation de la coloration du culot de bactéries, telle que - si le culot de bactéries présente la couleur d’un culot de bactéries issues de la culture de bactéries non traitées, ladite bactérie est résistante audit composé bactériostatique ou bactéricide, et - si le culot de bactéries présente une couleur différente de la couleur d’un culot de bactéries issues de la culture de bactéries non traitées, ladite bactérie n’est pas résistante audit composé bactériostatique ou bactéricide. De manière avantageuse, l’invention concerne une méthode d’évaluation d’une résistance due à un mécanisme d’efflux d’une bactérie à un composé bactériostatique ou bactéricide, comprenant : - la mise en culture de bactéries dans un milieu de culture approprié, pour obtenir une culture de bactéries, - la mise en contact de la culture de bactéries avec un composé tel que défini ci-dessus, pour obtenir une culture de bactéries traitées, - le lavage de la culture de bactérie traitées, et la précipitation des bactéries contenues dans la culture de bactéries traitées pour obtenir un culot de bactéries, - l’observation de la coloration du culot de bactéries, tel que - si le culot de bactéries présente la couleur d’un culot de bactéries issues de la culture de bactéries non traitées, ladite bactérie est résistante audit composé bactériostatique ou bactéricide, par efflux dudit composé bactériostatique ou bactéricide, et - si le culot de bactéries présente une couleur différente de la couleur d’un culot de bactéries issues de la culture de bactéries non traitées, ladite bactérie n’est pas résistante audit composé bactériostatique ou bactéricide par efflux dudit composé bactériostatique ou bactéricide. Le composé susmentionné est très simple et se base sur les propriétés colorées des composés selon l’invention. En incubant des bactéries avec le composé selon l’invention, ce dernier va s’accumuler dans la bactérie. Si les pompes d’efflux sont fonctionnelles, le composé sera efflué, et relargué dans le milieu. Les bactéries n’auront plus de composés et le culot bactérien issu de la culture aura la couleur d’un culot qui n’a pas été traité avec le composé coloré. A l’inverse, si les pompes d’efflux ne sont pas fonctionnelles, le composé va s’accumuler dans les bactéries, et le culot prendra alors une couleur qui sera celle (à une variation d’intensité près) du composé coloré. Aussi, par un simple test colorimétrique il est possible, après des lavages pour éliminer les composés résiduels qui ont été efflués, ou qui n’ont pas été incorporés dans les bactéries, de déterminer si une bactérie est capable de réaliser un efflux de composés, et donc si elle sera résistante ou non à des antibiotiques. Brève description des figures L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui va suivre donnée uniquement à titre d'exemple et faite en se référant aux dessins annexés dans lesquels : la est une photographie représentative d’un test de l’activité de la pompe d’efflux NorA dans des souches de Staphylococcus aureus en utilisant le composé 053 à une concentration de 0,75 µg.mL -1 . Le culot A représente un culot de souche CIP 76.26, souche de référence ayant une activité d’efflux normale – le culot est rose pâle. Le culot B représente un culot de souche SA 1199, souche clinique ayant une activité d’efflux légère à modérée – le culot est orange. Le culot C représente un culot de souche SA 1199 B qui correspond à une souche mutante ayant une forte activité d’efflux – le culot est blanc/blanc cassé. Le culot D représente un culot de souche SA K1758, souche mutante n’ayant pas de pompe d’efflux – le culot est rose foncé brillant. la est un graphique montrant l’intensité de fluorescence en fonction de la longueur d’onde (en nm) pour : A : le tampon, B : la souche SA K1758, C : la souche CIP 76.26, D : la souche SA 1199 B et E : la souche SA K1758. la est un histogramme représentant sous forme de barres les valeurs maximales d’émission de fluorescence à 642 nm (après une excitation à une longueur d’onde 530 nm) pour : A : le tampon, B : la souche SA K1758, C : la souche CIP 76.26, D : la souche SA 1199 B et E : la souche SA K1758. la représente une photo représentative d’un test d’utilisation du composé 053 à une concentration de 0,75 µg.mL -1 sur des mutants de la pompe d’efflux BmrA de Bacillus subtilis . Le culot A représente un culot de souche BmrA sauvage – le culot est rose pâle. Le culot B représente un culot de souche surexprimant BmrA – le culot est blanc. Le culot C représente un culot de bactéries ayant une délétion de BmrA (BmrA∆) – le culot est rose foncé. la est un graphique montrant l’intensité de fluorescence en fonction de la longueur d’onde (en nm) pour : A : le tampon, B : la souche de B. subtilis surexprimant BrmA, C : la souche la souche sauvage de B. Subtilis et D : la souche BrmA ∆. la est un histogramme représentant sous forme de barres les valeurs maximales d’émission de fluorescence à 642 nm (après une excitation à une longueur d’onde 530 nm) pour : A : le tampon, B : la souche de B. subtilis surexprimant BrmA, C : la souche la souche sauvage de B. Subtilis et D : la souche BrmA ∆. Exemples Exemple 1 – Synthèses 1- Schéma générique de synthèse de composés selon l’invention Le schéma de synthèse des différents composés de l’invention est donné ci-après. Concernant trois composés spécifiques, le détail de la synthèse y compris des étapes intermédiaires et également détaillé ci-après. 2- Synthèse du composé 053 2a -étape 1 A une solution agitée de 1,4-dinitrofluorobenzène (DFNB - 2 mL, 2,9 g, 18,23 mmol, 1 éq.) dans du dichlorométhane (DCM- 50 mL) à 0 °C, a été ajoutée la propylamine (1,5 mL, 1,08 g, 18,23 mmol, 1 éq.), suivie par l'addition de N, N-diisopropyléthylamine (DIPEA - 3,49 mL, 2,6 g, 20 mmol, 1,1 éq.). Le mélange réactionnel est laissé se réchauffer jusqu'à température ambiante (plus de 30 min), après quoi la réaction était complète (suivie par chromatographie en couche mince (CCM)). Le solvant a été évaporé sous vide pour donner un résidu jaune qui a été purifié par chromatographie sur colonne de gel de SiO 2 pour donner le produit souhaité FBP-002 sous forme d'huile jaune (2,74 g, 13,8 mmol, 76%). 1 H-RMN (400 MHz ; CDCl 3 ): δ 8,16 (m, 2H), 6,46 (dd, J 1 = 11,6 Hz, J 2 = 2,4 Hz, 1H), 6,34 (ddd, J 1 = 9,6 Hz, J 2 = 4,8 Hz, J 3 = 2,4 Hz, 1H), 3,21 (td, J 1 = 7 Hz, J 2 = 5,2 Hz, 2H), 1,75 (sext, J = 7,3 Hz, 2H), 1,05 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 13 C-RMN (101 MHz ; CDCl 3 ): δ 167,7 (d, J C-F = 257 Hz), 147,7 (d, J C-F = 14 Hz), 130,1 (d, J C-F = 13 Hz), 128,8, 103,9 (d, J C-F = 25 Hz), 99,3 (d, J C-F = 27 Hz), 45,1, 22,1, 11,6. 2b -étape 2 A une solution de FBP-002 (3 g, 15 mmol, 1,0 éq.) dans du tétrahydrofurane (THF - 40 mL) a été ajoutée la butylamine (3,32 g, 4,48 mL, 45 mmol, 3 éq.) et le DIPEA (3,3 g, 4,3 mL, 25,5 mmol, 1,7 éq.). Le mélange réactionnel a été agité à 60 °C pendant une nuit. Puis le solvant a été évaporé et le résidu a été repris dans de l’acétate d’éthyle (EtOAc - 150 mL), lavé avec une solution aqueuse de chlorure d'ammonium saturé (2 x 150 mL) et de la saumure (100 mL). Les couches organiques combinées ont ensuite été séchées sur du MgSO 4 , filtrées et évaporées sous vide. Le brut obtenu a été purifié par chromatographie sur colonne de gel de SiO2 pour obtenir le produit souhaité FBP-043 sous forme d'huile orange. (1,2 g, 4,8 mmol, rendement de 32 %). 1 H-RMN (400 MHz ; CDCl 3 ): δ 8,16 (m, 2H), 6,46 (dd, J 1 = 11,6 Hz, J 2 = 2,4 Hz, 1H), 6,34 (ddd, J 1 = 9,6 Hz, J 2 = 4,8 Hz, J 3 = 2,4 Hz, 1H), 3,21 (td, J 1 = 7 Hz, J 2 = 5,2 Hz, 2H), 1,75 (sext, J = 7,3 Hz, 2H), 1,05 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 13 C-RMN (101 MHz ; CDCl 3 ): δ 167,7 (d, J C-F = 257 Hz), 147,7 (d, J C-F = 14 Hz), 130,1 (d, J C-F = 13 Hz), 128,8, 103,9 (d, J C-F = 25 Hz), 99,3 (d, J C-F = 27 Hz), 45,1, 22,1, 11,6. 2c -étape 3 Une solution de FBP-043 (1,174 g, 4,67 mmol, 1 éq.) dans du THF (70 mL) a été hydrogénée (P = 20 bars) en présence de Pd/C (5%, 100 mg, 1,0 %mol) pendant une nuit. Après avoir réduit la pression, la solution a été dégazée en faisant barboter de l’Argon dans le mélange. Le 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzène (905 mg, 4,4 mmol, 0,95 éq.) a été ajouté à 0 °C sous agitation. En maintenant cette condition pendant 20 min, la fin de la réaction a été détectée par CCM (DCM/CH, 70/30). Le Pd/C a ensuite été éliminé par filtration à travers un bouchon de Celite®. Le produit brut a été purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice (DCM/EP, 50/50) pour donner le produit souhaité FB-005 sous forme d'un solide rougeâtre profond (1,466 g, 3,62 mmol, rendement de 77%). 1 H-RMN (400 MHz ; CDCl 3 ): δ 9,30 (br, 1H), 9,14 (d, J = 8 Hz, 1H), 6,82 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 6,53 (d, J = 13,6 Hz, 1H), 5,99 (dd, J 1 = 8,4 Hz, J 2 = 2,4 Hz, 1H), 5,95 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 3,75 (br, 1H), 3,69 (br, 1H), 3,13 (t, J = 6 Hz, 2H), 3,06 (q, J = 6,4 Hz, 1H), 1,67-1,51 (m, 4H), 1,46 (sext, J = 7,4 Hz, 2H), 0,97 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 0,92 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 13 C RMN (101 MHz ; CDCl 3 ): δ 159,9 (d, J C-F = 271 Hz), 150,5 (d, J C-F = 13 Hz), 150,3, 145,2, 128,7, 127,8, 126,9, 110,8, 103,9 (d, J C-F = 27 Hz), 101,7, 95,2, 45,3, 43,6, 43,2, 31,7, 22,6, 20,4, 14,0, 11,7. 1d -étape 4 À une solution agitée de FB-045 (343 mg, 0,85 mmol, 1 éq.) dans de l'acétonitrile (15 mL), on a ajouté de la méthoxyéthylamine (221 µL, 191 mg, 2,54 mmol, 3 éq.). Le mélange a été agité à température ambiante pendant 2 heures, lorsque l'achèvement a été suivi par CCM. Après évaporation du solvant, de l'éthanol chaud (10 mL) a été ajouté au résidu brut. Un matériau résultant ressemblant à de l'asphalte a été recueilli par filtration et lavé avec de l'eau chaude (30 mL), puis récupéré par dissolution dans du dichlorométhane, séché sur du MgSO 4 anhydre et filtré. Après élimination du solvant sous pression réduite et séchage du solide sous vide, le produit souhaité FBP-051 a été isolé sous la forme d'un solide foncé de type asphalte (383 mg ; 0,83 mmol ; 98 %). 1 H-RMN (400 MHz ; CDCl 3 ): δ 9,26 (s, 1H), 9,13 (br, 1H), 8,36 (t, J = 4,6 Hz, 1H), 6,86 (d, J = 8 Hz, 1H), 5,99 (dd, J 1 = 8,4 Hz, J 2 = 2,4 Hz, 1H), 5,95 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 5,71 (s, 1H), 3,79 (br, 1H), 3,67 (br, 1H), 3,54 (t, J = 5,4 Hz, 2H), 3,35 (s, 3H), 3,19-3,10 (m, 4H), 3,06 (t, J = 7 Hz, 2H), 1,67-1,51 (m, 4H), 1,45 (sext, J = 7,4 Hz, 2H), 0,97 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 0,91 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 13 C RMN (101 MHz ; CDCl 3 ): δ 149,7, 149,3, 148,6, 145,4, 129,5, 128,8, 125,2, 124,5, 112,1, 101,6, 95,4, 93,2, 69,6, 59,1, 45,4, 43,8, 42,9, 31,8, 22,7, 20,4, 14,0, 11,7. 2e -étape 5 Une solution du composé FBP-051 (433 mg, 0,94 mmol, 1 équiv.) dans du méthanol (20 mL) a été hydrogénée (20 bars) en présence de Pd/C (5 % en poids, 36 mg) et de HCl (12M, 0,30 mL) pendant 6 h. Puis le mélange a été agité sous air pendant 16 h. Le Pd/C a été éliminé par filtration à travers un bouchon de Celite® qui a été rincé plusieurs fois avec du méthanol et du dichlorométhane. Après élimination du solvant sous pression réduite, le solide résultant a été repris avec du dichlorométhane (50 mL), et extrait avec de la saumure (2 x 50 mL), la couche organique a ensuite été séchée sur MgSO4, filtrée et évaporée sous vide pour donner un solide noir brut qui a ensuite été purifié sur colonne de chromatographie sur gel d'oxyde d'alumine (DCM / MeOH) et a conduit à un solide violet profond de composé FBP-053 ou composé 053 (177 mg, 0,44 mmol, rendement de 49%). 1 H-NMR (400 MHz ; CD 3 OD): δ 7,68 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,17 (dd, J 1 = 9,2 Hz, J 2 = 1,6 Hz, 1H), 6,94 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 6,78 (s, 1H), 6,52 (br, 1H), 4,52 (t, J = 8 Hz, 2H), 3,73 (t, J = 5,2 Hz, 2H), 3,45 (t, J = 5,2 Hz, 2H), 3,42 (s, 3H), 3,32 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 3,29 (sext, J = 1,6 Hz, 2H), 1,96 (sext, J = 7,6 Hz, 2H), 1,71 (quint, J = 7 Hz, 2H), 1,51 (sext, J = 7 Hz, 2H), 1,19 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 1,01 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 13 C NMR (101 MHz; CD 3 OD): δ 150,9, 139,2, 138,4, 135,5, 132,9, 131,4, 130,9, 92,4, 69,9, 57,8, 43,3, 42,7, 30,5, 20,1, 19,7, 12,9, 10,1; 5 signaux masqués ou chevauchants. Spectrométrie de masse à haute résolution: calculé pour C 22 H 32 N 5 O + : 382,2601; obtenu: 382,2593 3- synthèse du composé 052 3a -étape 1 A une solution agitée de DFNB (2 mL, 2,9 g, 18,23 mmol, 1 eq.) dans du DCM (50 mL) à 0 °C, a été ajoutée la propylamine (1,5 mL, 1,08 g, 18,23 mmol, 1 eq.), suivie par l'addition de DIPEA (3,49 mL, 2,6 g, 20 mmol, 1,1 eq.). On a laissé le mélange réactionnel se réchauffer jusqu'à température ambiante (plus de 30 min), après quoi la réaction était complète (suivie par CCM). Le solvant a été évaporé sous vide pour donner un résidu jaune qui a été purifié par chromatographie sur colonne de gel de SiO2 pour donner le produit FBP-002 souhaité sous forme d'huile jaune (2,74 g, 13,8 mmol, 76%). 1 H-RMN (400 MHz ; CDCl 3 ): δ 8,16 (m, 2H), 6,46 (dd, J 1 = 11,6 Hz, J 2 = 2,4 Hz, 1H), 6,34 (ddd, J 1 = 9,6 Hz, J 2 = 4,8 Hz, J 3 = 2,4 Hz, 1H), 3,21 (td, J 1 = 7 Hz, J 2 = 5,2 Hz, 2H), 1,75 (sext, J = 7,3 Hz, 2H), 1,05 (t, J = 7,4 Hz, 3H). 13 C RMN (101 MHz ; CDCl 3 ): δ 167,7 (d, J C-F = 257 Hz), 147,7 (d, J C-F = 14 Hz), 130,1 (d, J C-F = 13 Hz), 128,8, 103,9 (d, J C-F = 25 Hz), 99,3 (d, J C-F = 27 Hz), 45,1, 22,1, 11,6. 3b -étape 2 A une solution de FBP-002 (3 g, 15 mmol, 1,0 eq.) dans THF (40 mL) a été ajoutée la butylamine (3,32 g, 4,48 mL, 45 mmol, 3 eq.) et le DIPEA (3,3 g, 4,3 mL, 25,5 mmol, 1,7 eq.). Le mélange réactionnel a été agité à 60 °C pendant une nuit. Puis le solvant a été évaporé et le résidu a été repris dans EtOAc (150 mL), lavé avec une solution aqueuse de chlorure d'ammonium saturé (2 x 150 mL) et de la saumure (100 mL). Les couches organiques combinées ont ensuite été séchées sur MgSO 4 , filtrées et évaporées sous vide. Le brut obtenu a été purifié par chromatographie sur gel sur colonne de SiO2 pour obtenir le produit FBP-043 souhaité sous forme d'huile orange. (1,2 g, 4,8 mmol, rendement de 32 %). 1 H- RMN (400 MHz ; CDCl 3 ): δ 8,52 (br, 1H), 7,99 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 5,89 (d, J = 9,6 Hz, 1H), 5,61 (s, 1H), 4,41 (br, 1H), 3,18 (m, 4H), 1,75 (sext, J = 7,2 Hz, 2H), 1,62 (quint, J = 7,2 Hz, 2H), 1,43 (sext, J = 7,5 Hz, 2H), 1,04 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 0,96 (t, J = 7,2 Hz, 3H). 13 C RMN (101 MHz ; CDCl 3 ): δ 154,5, 148,7, 129,3, 123,7, 104,8, 90,0, 44,8, 43,0, 31,3, 22,2, 20,3, 13,9, 11,8. 3c -étape 3 Une solution de FBP-043 (1,174 g, 4,67 mmol, 1 éq.) dans du THF (70 mL) a été hydrogénée (P = 20 bars) en présence de Pd/C (5%, 100 mg, 1,0 %mol) pendant une nuit. Après avoir réduit la pression, la solution a été dégazée en faisant barboter Ar dans le mélange. Le 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzène (905 mg, 4,4 mmol, 0,95 éq.) a été ajouté à 0 °C sous agitation. En maintenant cette condition pendant 20 min, la fin de la réaction a été détectée par TLC (DCM/CH, 70/30). Le Pd/C a ensuite été éliminé par filtration à travers un bouchon de Celite®. Le produit brut a été purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice (DCM/EP, 50/50) pour donner le produit souhaité FB-045 sous forme d'un solide rougeâtre profond (1,466 g, 3,62 mmol, rendement de 77%). 1 H-RMN (400 MHz ; CDCl 3 ): δ 9,30 (br, 1H), 9,14 (d, J = 8 Hz, 1H), 6,82 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 6,53 (d, J = 13,6 Hz, 1H), 5,99 (dd, J 1 = 8,4 Hz, J 2 = 2,4 Hz, 1H), 5,95 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 3,75 (br, 1H), 3,69 (br, 1H), 3,13 (t, J = 6 Hz, 2H), 3,06 (q, J = 6,4 Hz, 1H), 1,67-1,51 (m, 4H), 1,46 (sext, J = 7,4 Hz, 2H), 0,97 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 0,92 (t, J = 7,4 Hz, 3H). 13 C RMN (101 MHz ; CDCl 3 ): δ 159,9 (d, J C-F = 271 Hz), 150,5 (d, J C-F = 13 Hz), 150,3, 145,2, 128,7, 127,8, 126,9, 110,8, 103,9 (d, J C-F = 27 Hz), 101,7, 95,2, 45,3, 43,6, 43,2, 31,7, 22,6, 20,4, 14,0, 11,7. 3d -étape 4 À une solution agitée de FB-045 (327 mg, 0,81 mmol, 1 éq.) dans de l'acétonitrile (15 mL), on a ajouté de l'octylamine (398 µL, 311 mg, 2,41 mmol, 3 éq.). Le mélange a été agité à température ambiante pendant 2 heures, lorsque l'achèvement a été suivi par CCM. Après évaporation du solvant, de l'éthanol chaud (10 mL) a été ajouté au résidu brut. Un matériau résultant ressemblant à de l'asphalte a été recueilli par filtration et lavé avec de l'eau chaude (30 mL), puis récupéré par dissolution dans du dichlorométhane, séché sur du MgSO4 anhydre et filtré. Après élimination du solvant sous pression réduite et séchage du solide sous vide, le produit souhaité FBP-050 a été isolé sous la forme d'un solide foncé (392 mg, 0,76 mmol, rendement de 94 %). 1 H-RMN (400 MHz ; CDCl 3 ): δ 9,26 (s, 1H), 9,12 (s, 1H), 8,20 (t, J = 5 Hz, 1H), 6,86 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 5,99 (dd, J 1 = 8,2 Hz, J 2 = 2,4 Hz, 1H), 5,95 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 5,69 (s, 1H), 3,79 (t, J = 5 Hz, 1H), 3,65 (br, 1H), 3,13 (t, J = 7 Hz, 2H), 3,06 (q, J = 6,3 Hz, 2H), 2,99 (q, J = 6,3 Hz, 2H), 1,97-1,50 (m, 8H), 1,45 (sext, J = 8 Hz, 2H), 1,30 (m, 8H), 0,97 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 0,91 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 0,87 (t, J = 7,4 Hz, 3H). 13 C RMN (101 MHz ; CDCl 3 ): δ 149,7, 149,2, 148,6, 129,6, 128,8, 125,0, 124,5, 112,1, 101,6, 95,3, 93,1, 45,4, 43,9, 43,2, 31,9, 31,8, 29,3, 29,2, 28,4, 27,0, 22,7, 22,6, 20,4, 14,2, 14,0, 13,9, 11,7. 3e -étape 5 Une solution du composé FBP-050 (316 mg, 0,61 mmol, 1 équiv.) dans du méthanol (20 mL) a été hydrogénée (20 bars) en présence de Pd/C (5 % en poids, 24 mg) et de HCl (12M, 0,25 mL) pendant 6 h. Puis le mélange a été agité sous air pendant 16 h. Le Pd/C a été éliminé par filtration à travers un bouchon de Celite® qui a été rincé plusieurs fois avec du méthanol et du dichlorométhane. Après élimination du solvant sous pression réduite, le solide résultant a été repris avec du dichlorométhane (50 mL), et extrait avec de la saumure (2 x 50 mL), la couche organique a ensuite été séchée sur MgSO4, filtrée et évaporée sous vide pour donner un solide noir brut qui a ensuite été purifié sur colonne de chromatographie sur gel d'oxyde d'alumine (DCM / MeOH) et a conduit à un solide violet profond, le composé FBP-052 ou composé 052 (129 mg, 0,27 mmol, rendement de 45%). 1 H- RMN (400 MHz ; CD 3 OD): δ 7,72 (d, J = 9,6 Hz, 1H), 7,18 (dd, J 1 = 9,2 Hz, J 2 = 2 Hz, 1H), 6,96 (s, 1H), 6,75 (s, 1H), 6,56 (br, 1H), 4,55 (t, J = 8,2 Hz, 2H), 3,32 (m, 2H), 3,28 (quint, J = 1,6 Hz, 2H), 3,25 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 1,98 (sext, J = 8 Hz, 2H), 1,80-1,66 (m, 4H), 1,49 (quint, J = 8 Hz, 4H), 1,41-1,26 (m, 8H), 1,20 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 1,01 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 0,88 (t, J = 7,4 Hz, 3H). 13 C RMN (101 MHz ; CDCl 3 ): δ 153,3, 150,9, 139,2, 138,6, 135,4, 131,3, 130,9, 102,8, 92,4, 48,9, 43,7, 42,7, 31,7, 30,5, 29,3, 29,1, 28,1, 27,1, 22,4, 20,1, 19,7, 13,1, 12,9, 10,1. 3 signaux sont masqués ou chevauchants. 4- synthèse du composé 047 4a -étape 1 A une solution agitée de 1,4-dinitrofluorobenzène (DFNB - 2 mL, 2,9 g, 18,23 mmol, 1 éq.) dans du dichlorométhane (DCM- 50 mL) à 0 °C, a été ajoutée la propylamine (1,5 mL, 1,08 g, 18,23 mmol, 1 éq.), suivie par l'addition de N, N-diisopropyléthylamine (DIPEA - 3,49 mL, 2,6 g, 20 mmol, 1,1 éq.). Le mélange réactionnel est laissé se réchauffer jusqu'à température ambiante (plus de 30 min), après quoi la réaction était complète (suivie par chromatographie en couche mince (CCM)). Le solvant a été évaporé sous vide pour donner un résidu jaune qui a été purifié par chromatographie sur gel sur colonne de SiO 2 pour donner le produit souhaité FBP-002 sous forme d'huile jaune (2,74 g, 13,8 mmol, 76%). 1 H-RMN (400 MHz ; CDCl 3 ): δ 8,16 (m, 2H), 6,46 (dd, J 1 = 11,6 Hz, J 2 = 2,4 Hz, 1H), 6,34 (ddd, J 1 = 9,6 Hz, J 2 = 4,8 Hz, J 3 = 2,4 Hz, 1H), 3,21 (td, J 1 = 7 Hz, J 2 = 5,2 Hz, 2H), 1,75 (sext, J = 7,3 Hz, 2H), 1,05 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 13 C-RMN (101 MHz ; CDCl 3 ): δ 167,7 (d, J C-F = 257 Hz), 147,7 (d, J C-F = 14 Hz), 130,1 (d, J C-F = 13 Hz), 128,8, 103,9 (d, J C-F = 25 Hz), 99,3 (d, J C-F = 27 Hz), 45,1, 22,1, 11,6. 4b -étape 2 A une solution de FBP-002 (3 g, 15 mmol, 1,0 éq.) dans du tétrahydrofurane (THF - 40 mL) a été ajoutée la butylamine (3,32 g, 4,48 mL, 45 mmol, 3 éq.) et le DIPEA (3,3 g, 4,3 mL, 25,5 mmol, 1,7 éq.). Le mélange réactionnel a été agité à 60 °C pendant une nuit. Puis le solvant a été évaporé et le résidu a été repris dans de l’acétate d’éthyle (EtOAc - 150 mL), lavé avec une solution aqueuse de chlorure d'ammonium saturé (2 x 150 mL) et de la saumure (100 mL). Les couches organiques combinées ont ensuite été séchées sur du MgSO 4 , filtrées et évaporées sous vide. Le brut obtenu a été purifié par chromatographie sur gel sur colonne de SiO2 pour obtenir le produit souhaité FBP-043 sous forme d'huile orange. (1,2 g, 4,8 mmol, rendement de 32 %). 1 H-RMN (400 MHz ; CDCl 3 ): δ 8,16 (m, 2H), 6,46 (dd, J 1 = 11,6 Hz, J 2 = 2,4 Hz, 1H), 6,34 (ddd, J 1 = 9,6 Hz, J 2 = 4,8 Hz, J 3 = 2,4 Hz, 1H), 3,21 (td, J 1 = 7 Hz, J 2 = 5,2 Hz, 2H), 1,75 (sext, J = 7,3 Hz, 2H), 1,05 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 13 C-RMN (101 MHz ; CDCl 3 ): δ 167,7 (d, J C-F = 257 Hz), 147,7 (d, J C-F = 14 Hz), 130,1 (d, J C-F = 13 Hz), 128,8, 103,9 (d, J C-F = 25 Hz), 99,3 (d, J C-F = 27 Hz), 45,1, 22,1, 11,6. 4c -étape 3 Une solution de FBP-043 (1,174 g, 4,67 mmol, 1 éq.) dans du THF (70 mL) a été hydrogénée (P = 20 bars) en présence de Pd/C (5%, 100 mg, 1,0 %mol) pendant une nuit. Après avoir réduit la pression, la solution a été dégazée en faisant barboter de l’Argon dans le mélange. Le 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzène (905 mg, 4,4 mmol, 0,95 éq.) a été ajouté à 0 °C sous agitation. En maintenant cette condition pendant 20 min, la fin de la réaction a été détectée par CCM (DCM/CH, 70/30). Le Pd/C a ensuite été éliminé par filtration à travers un bouchon de Celite®. Le produit brut a été purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice (DCM/EP, 50/50) pour donner le produit souhaité FB-005 sous forme d'un solide rougeâtre profond (1,466 g, 3,62 mmol, rendement de 77%). 1 H-RMN (400 MHz ; CDCl 3 ): δ 9,30 (br, 1H), 9,14 (d, J = 8 Hz, 1H), 6,82 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 6,53 (d, J = 13,6 Hz, 1H), 5,99 (dd, J 1 = 8,4 Hz, J 2 = 2,4 Hz, 1H), 5,95 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 3,75 (br, 1H), 3,69 (br, 1H), 3,13 (t, J = 6 Hz, 2H), 3,06 (q, J = 6,4 Hz, 1H), 1,67-1,51 (m, 4H), 1,46 (sext, J = 7,4 Hz, 2H), 0,97 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 0,92 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 13 C RMN (101 MHz ; CDCl 3 ): δ 159,9 (d, J C-F = 271 Hz), 150,5 (d, J C-F = 13 Hz), 150,3, 145,2, 128,7, 127,8, 126,9, 110,8, 103,9 (d, J C-F = 27 Hz), 101,7, 95,2, 45,3, 43,6, 43,2, 31,7, 22,6, 20,4, 14,0, 11,7. 4d -étape 4 À une solution agitée de FB-045 (341 mg, 0,7 mmol, 0,84 mmol, 1 éq.) dans de l'acétonitrile (15 mL), on a ajouté de la butylamine (249 µL, 186 mg, 2,52 mmol, 3 éq.). Le mélange a été agité à température ambiante pendant 2 heures, lorsque l'achèvement a été suivi par CCM. Après évaporation du solvant, de l'éthanol chaud (10 mL) a été ajouté au résidu brut. Un matériau résultant ressemblant à de l'asphalte a été recueilli par filtration et lavé avec de l'eau chaude (30 mL), puis récupéré par dissolution dans du dichlorométhane, séché sur du MgSO4 anhydre et filtré. Après élimination du solvant sous pression réduite et séchage du solide sous vide, le produit souhaité a été isolé sous la forme d'un solide foncé (354 mg ; 0,67 mmol ; 96 %). 1 H-RMN (400 MHz ; CDCl 3 ): δ 9,26 (s, 1H), 9,11 (s, 1H), 8,20 (t, J = 5 Hz, 1H), 6,86 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 5,98 (dd, J 1 = 8,4 Hz, J 2 = 2,4 Hz, 1H), 5,96 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 5,69 (s, 1H), 3,80 (t, J = 5,2 Hz, 1H), 3,67 (br, 1H), 3,13 (t, J = 7 Hz, 2H), 3,06 (q, J = 6,7 Hz, 2H), 3,01 (q, J = 6,7 Hz, 2H), 3,06 (t, J = 7 Hz, 2H), 1,67-1,51 (m, 4H), 1,45 (sext, J = 7,4 Hz, 2H), 1,33 (sext, J = 7,4 Hz, 2H), 0,97 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 0,91 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 0,88 (t, J = 7,4 Hz, 3H). 13 C RMN (101 MHz ; CDCl 3 ): δ 149,7, 149,2, 148,6, 145,4, 129,6, 128,8, 125,0, 124,5, 112,1, 101,6, 95,3, 93,1, 45,4, 43,9, 42,9, 31,8, 30,4, 22,7, 20,4, 20,2, 14,0, 13,8, 11,7. 4e -étape 5 Une solution du composé FBP-046 (340 mg, 0,74 mmol, 1 équiv.) dans du méthanol (20 mL) a été hydrogénée (20 bars) en présence de Pd/C (5 % en poids, 29 mg) et de HCl (12M, 0,3 mL) pendant 6 heures. Puis le mélange a été agité sous air pendant 16 heures. Le Pd/C a été éliminé par filtration à travers un bouchon de Celite® qui a été rincé plusieurs fois avec du méthanol et du dichlorométhane. Après élimination du solvant sous pression réduite, le solide résultant a été repris avec du dichlorométhane (50 mL), et extrait avec de la saumure (2 x 50 mL), la couche organique a ensuite été séchée sur MgSO 4 , filtrée et évaporée sous vide pour donner un solide brut noir/violet qui a ensuite été purifié sur colonne de chromatographie sur gel d'oxyde d'alumine (DCM / MeOH) et a conduit à un solide violet profond le composé FBP-047 ou composé 047 (130 mg, 0,31 mmol, rendement 42%). 1 H-RMN (400 MHz ; CD 3 OD): δ 7,72 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,19 (dd, J 1 = 9,2 Hz, J 2 = 2 Hz, 1H), 6,97 (s, 1H), 6,76 (s, 1H), 6,5 (br, 1H), 4,55 (t, J = 8 Hz, 2H), 3,35-3,24 (m, 8H), 1,98 (sext, J = 7,6 Hz, 2H), 1,80-1,64 (m, 4H), 1,51 (quint, J = 7,2 Hz, 4H), 1,20 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 1,02 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 1,01 (t, J = 7,4 Hz, 3H). 13 C RMN (101 MHz ; CD 3 OD): δ 153,3, 150,8, 139,2, 138,5, 135,3, 132,6, 131,3, 130,8, 119,7, 102,7, 92,4, 89,3, 48,9, 43,4, 42,8, 30,5, 30,2, 20,3, 20,1, 19,7, 13,0, 10,1. 1 signal est masqué ou chevauchant. Exemple 2 – Identification de l’efflux d’antibiotique et de quantification de son efficacité L’efflux d’antibiotiques est un phénomène reconnu d’une extrême gravité par les instances de santé du monde entier. Il concerne l’ensemble des bactéries mais est évidemment majoritairement préoccupant dans un contexte hospitalier, en réanimation, chirurgie orthopédique ou thoracique et dans les infections associées au diabète. L’efflux d’antibiotique, par sa polyspécificité, est identifié depuis longtemps comme un complément aux mécanismes de résistance plus classiques (mutation de cible, enzymes telles que Beta-lactamase, etc.), mais plus récemment, comme intervenant en amont des autres mécanismes, favorisant leur sélection. Alors qu’il existe des méthodes d’identification des principaux mécanismes de résistance dans les laboratoires de biologie, l’efflux n’est pas identifié et pas identifiable par une méthode standardisée sauf par des déductions pas toujours très fiable. Il est donc nécessaire de mettre au point une méthode d’identification de l’efflux d’antibiotique et de quantification de son efficacité. Le composé 053 par ses caractéristiques de coloration et de fluorescence s’est avéré un excellent outil pour mener à bien ce type de projet. Exemple 2-1 : Staphylococcus aureus Matériels et méthodes : Souches bactériennes : les inventeurs ont utilisé les souches de Staphylococcus aureus suivantes : - CIP 76.25, souche de référence produisant un niveau basal de NorA, - SA1199 souche de référence produisant un niveau basal de NorA, - SA 1199B surproductrice de la pompe NorA, et - SA K1758 délétée du gène NorA, (Kaatz et al., 2003, Antimicrob Agents Chemother. 2003 Feb;47(2):719-26). Composé : Le composé 053 (voir synthèse en exemple 1) est préparé dans du DMSO pur (Sigma) à une concentration de 20 mg/mL. Il sera ensuite dilué dans de l'eau milliQ pour obtenir une solution mère de 1000 μg/mL. Coloration des bactéries : les bactéries en phase exponentielle de croissance sont incubées pendant 15 min en présence du composé 053. Ensuite les bactéries sont lavées deux fois en tampon phosphate et centrifugées, les culots sont observés à l’œil nu. Mesure de fluorescence : Les bactéries en phase exponentielle de croissance sont incubées pendant 15 min en présence du composé 053. La densité optique à 600nm est ensuite ajustée à 0,5 et 50 µL sont transférés dans une plaque de micro-titration noire. La fluorescence est lue dans un lecteur de microplaques Tecan M200. Le protocole suivant a été suivi : 1. Cultiver les bactéries sur une plaque de gélose Muller Hilton-II (MH-II) fraîchement préparée. Incuber la boîte de Petri pendant une nuit à 37°C (Remarque : la température d'incubation et le temps de croissance dépendent des bactéries utilisées pour l'expérience). 2. Le lendemain matin, prélever une ou deux colonies de la plaque cultivée pendant la nuit et les inoculer dans un erlenmeyer contenant 20 ml de bouillon MH-II. 3. Incuber l’erlenmeyer sur un incubateur à agitation orbitale à 37°C et 160 rpm pendant 3-4 h. Note : Cette étape permet d'obtenir des cellules en phase exponentielle, il faut donc considérer le temps de doublement des bactéries utilisées. 4. Après l'incubation, transférer les cellules dans un tube de centrifugation et centrifuger les cellules à 4500 rpm pendant 10 minutes. Jeter le surnageant. Ajouter du bouillon MH-II frais dans le tube de centrifugation et ajuster la densité optique des cellules à 0,5. 5. Transférer une partie aliquote (5 mL) des cellules dont la densité optique a été ajustée dans un nouveau tube à centrifuger (50 mL). Ajouter à ce tube 3,75 µL de la solution mère du composé 053 (1000 µg/mL). Boucher les tubes et les agiter soigneusement pour mélanger le composé. Ensuite, gardez le tube de centrifugation sur la table pendant 15 minutes à température ambiante. Note : Il est préférable d'avoir une plus grande surface pour faciliter l'agitation. La concentration finale de 053 utilisée pour l'expérience est de 0,75 µg/mL. Ne pas incuber plus de 15 minutes. 6. Après 15 minutes de temps de contact, centrifuger les tubes pendant 10-15 minutes à 4 500 rpm pour obtenir des culots cellulaires et éliminer le surnageant. À l'aide de 5 mL de solution saline tampon phosphate (PBS, pH 7) ou de tampon phosphate de potassium, laver soigneusement les culots cellulaires (PBS, pH 7) répéter deux fois cette opération. Note : Pipeter à plusieurs reprises avec une pipette de 5 mL ou 1 mL pendant le lavage. S'assurer qu'il n'y a pas de grumeaux pendant le pipetage. Le but du lavage est d'éliminer l'excès de colorant de la surface des cellules. 7. La variation de couleur dans les cellules est visible à l'œil nu sur le culot cellulaire après les deux lavages. a. Les cellules qui surexpriment la pompe d'efflux (c'est-à-dire qui sont résistantes) seront de couleur blanche ou blanc cassé (couleur par défaut des cellules). b. Les cellules présentant une activité d'efflux normale ou modérée seront de couleur légèrement rose. c. Les cellules dépourvues de pompes d'efflux ou dont les pompes d'efflux sont dysfonctionnelles seront colorées en rose foncé. d. Parfois, les culots cellulaires sont de couleur orange, ce qui indique une activité d'efflux modérée, ceci est principalement dû à la couleur jaune inhérente des cellules. RESULTATS : Les figures 1 à 3 montre la différence de couleur (1A) et la différence spectrofluorométrique (1B) observées dans différentes souches de référence (souche A, CIP 76.25), une souche clinique (souche B, SA1199) et des mutants de la pompe d'efflux NorA construits en laboratoire de la souche B : NorA surexprimant (souche C, SA 1199B) et NorA délété (souche D, SA K1758). Comme la souche C présente une pompe d'efflux surexprimée, l'efflux de 053 est plus fort, et le culot cellulaire apparaît blanc (053 est complètement éliminé par efflux). En revanche, comme la souche D n'a pas de pompe d'efflux, le culot cellulaire apparaît rose foncé. Des couleurs intermédiaires peuvent être observées pour les souches de référence (souche A) et les souches cliniques (souche B), suggérant une activité légère à modérée. Ceci est confirmé par la spectroscopie de fluorescence ( figure s 2 et 3 ). La montre le spectre d’émission de fluorescence du composé 053 dans les cellules bactériennes après une excitation à 530nm. La montre les histogrammes obtenus en rapportant les valeurs d’intensité de fluorescence à 642 nm obtenues après une excitation à 530 nm. Les résultats obtenus en colorimétrie ( Figure s 1 à 3 ) montrent clairement que le composé 053 permet de distinguer visuellement 3 niveaux de coloration des souches : 1. Une coloration rose foncé correspondant à des souches dépourvues de la pompe d'efflux NorA (SAK 1758). 2. Une absence de coloration pour les souches surproduisant la pompe NorA (SA 1199B). 3. Une coloration rose pâle intermédiaire pour les souches produisant des niveaux basaux de pompe (SA 1199 et CIP 76.25). Il est donc possible d'identifier, parmi les isolats, ceux qui surproduisent la pompe d'efflux NorA, qui ont donc un potentiel de résistance aux antibiotiques très élevé, et de les différencier des isolats produisant un niveau basal. Les résultats spectrofluorimétriques ( ) montrent que le composé 053 est fluorescent lorsqu'il est accumulé dans les bactéries et que, comme la coloration, la fluorescence dépend du niveau de production de la pompe NorA. 1. La fluorescence de la souche surproductrice (SA 1199B) est presque nulle ( Figure s 2 et 3 , courbe et histogramme verts). 2. Le mutant sans pompe NorA (SAK 1758) a une fluorescence élevée à 670 nm ( Figure s 2 et 3 , courbe et histogramme noirs). 3. Les deux souches produisant de faibles niveaux de pompes (CIP 76.25, SA 1199) présentent des niveaux intermédiaires de fluorescence ( Figure s 2 et 3 , courbes et histogrammes rouges et bleus). Contrairement au test colorimétrique qui ne nécessite pas de matériel de lecture particulier, la fluorescence nécessite un spectrofluorimètre adapté. En revanche, la mesure de fluorescence est quantitative et permet de déterminer avec précision le niveau d'activité d'efflux des isolats. Exemple 2-2 : Bacillus subtilis MATERIELS ET METHODES : Souches bactériennes : les inventeurs ont utilisé - la souche de référence Bacillus subtilis 168 (DSM 402) produisant un niveau basal de BmrA, - Bacillus subtilis BmrA+++ surproduisant la pompe BmrA et - Bacillus subtilis BmrA Δ délétée du gène BmrA. (voir Steinfels E et al. Biochemistry 43: 7491–7502 et Krügel H et al. FEMS Microbiol Lett. 2010 Dec;313(2):155-63 ). Les protocoles utilisés sont identiques à ceux mis en œuvre pour l’exemple 2-1. RÉSULTATS : Les figures 4 à 6 montrent la différence de couleur ( ) et la différence spectrofluorométrique (Figures 5 et 6) observées sur les différentes souches de Bacillus subtilis . La souche A est la souche sauvage de B. subtilis 168 (DSM 402), la souche B, BmrA+++, est un mutant surexprimant BmrA et la souche C est un mutant délété de BmrA (BmrAΔ). Puisque la souche B présente une surexpression de la pompe d'efflux BmrA, le composé 053 est complètement efflué hors de la cellule, et le culot cellulaire apparaît blanc. En revanche, la souche C ne possède pas de pompe d'efflux, le culot cellulaire apparaît rose foncé. La souche A est une souche sauvage normale exprimant une activité d'efflux normale ; le composé 053 est donc partiellement efflué et le culot cellulaire apparaît rose pâle, ce qui suggère une activité légère à modérée. Une activité similaire est confirmée et quantifiée en utilisant une spectroscopie de fluorescence (Figures 5 et 6). Comme observé sur la en colorimétrie, il est clair que le composé 053 permet de distinguer visuellement le mutant BmrA à 3 niveaux de coloration : 1. Une coloration rose foncé correspondant aux souches dépourvues de la pompe d'efflux BmrA (BmrAΔ), 2. Absence de coloration pour les souches surproduisant la pompe BmrA (BmrA +++) 3. Une coloration rose pâle intermédiaire pour les souches produisant des niveaux basaux (normaux, type sauvage) de pompe. Il est donc possible d'identifier, parmi les isolats cliniques, ceux qui surproduisent la pompe d'efflux BmrA, un transporteur ABC (ATP-binding cassette) de taille moyenne impliqué dans la multirésistance aux médicaments. Les résultats spectrofluorimétriques (Figures 5 et 6) sont conformes et valident quantitativement les résultats. Le composé 053 est fluorescent lorsqu'il est accumulé dans les bactéries et que, comme la coloration, la fluorescence dépend du niveau de production de la pompe BmrA. 1. La fluorescence de la souche surproductrice (BmrA+++) est presque nulle (Figures 5 et 6, courbe et histogramme rouges) 2. Celle du mutant dépourvu de pompe (BmrAΔ) est très élevée avec un maximum à 642 nm (Figures 5 et 6, courbe et histogramme noirs). 3. La souche sauvage (DSM 402) produisant de faibles niveaux de pompes présente des niveaux intermédiaires de fluorescence (Figures 5 et 6, courbe et histogramme verts). Contrairement au test colorimétrique qui ne nécessite pas de matériel de lecture particulier, la fluorescence nécessite un spectrofluorimètre adapté. En revanche, la mesure de fluorescence est quantitative et permet de déterminer avec précision le niveau d'activité d'efflux des isolats. L'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation présentés et d'autres modes de réalisation apparaîtront clairement à l'homme du métier. Composé de formule I suivante : (I) où X - est un atome halogène, ou un contre ion acceptable, notamment Cl, où R1 et R2 sont - soit conjointement -CH 3 , - soit un alkyle en C 1 -C 4 , tel que si R1 est un alkyle en C n+ i , R2 est un alkyle en C n , et inversement, n étant un entier variant de 1 à 3, i étant un entier variant de 1 à 3 et ou n+i varie de 1 à 4; et où R3 est un -CH 3 , ou un alkyle en C 2 -C 8 , ledit alkyle en C 2 -C 8 étant possiblement substitué par un ou plusieurs hétéroatomes ; ou un sel ou un solvate de ce composé de forme I, ou une forme protonée de celui-ci. Composé selon la revendication 1, où R1 et R2 sont chacun un alkyle en C 2 -C 4 , tels que : - si R1 est un alkyle en C n+ i , R2 est un alkyle en C n , ou - si R2 est un alkyle en C n+ i , R1 est un alkyle en C n , n variant de 1 à 3, i étant un entier variant de 1 à 3 et ou n+i varie de 1 à 4. Composé selon la revendication 1 ou la revendication 2, où R3 est un groupement alcoxy en C2-C4, un groupe dimethylamineéthyle ou methylaminexethyle. Composé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, ledit composé étant choisi dans le groupe des composés de formule I, où R1, R2 et R3 sont conjointement tels qu’indiqués dans chaque ligne du tableau qui suit : composé R1 R2 R3 méthyle méthyle propyle méthyle éthyle propyle éthyle méthyle propyle éthyle propyle propyle propyle éthyle propyle propyle butyle propyle butyle propyle propyle méthyle méthyle butyle méthyle éthyle butyle éthyle méthyle butyle éthyle propyle butyle propyle éthyle butyle propyle butyle butyle #47 butyle propyle butyle méthyle méthyle méthoxyéthyle méthyle éthyle méthoxyéthyle éthyle méthyle méthoxyéthyle éthyle propyle méthoxyéthyle propyle éthyle méthoxyéthyle propyle butyle méthoxyéthyle #53 butyle propyle méthoxyéthyle #52 butyle propyle octyle Composé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, ledit composé étant choisi parmi les composés de formules 47, 52 et 53 suivantes : (47), (52), et (53). Utilisation d’un composé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, pour évaluer ou mesurer in vitro l’efflux dudit composé par une bactérie. Utilisation selon la revendication 6, pour évaluer ou mesurer in vitro l’efflux par une bactérie à gram positif. Kit de détection ou de mesure de l’efflux bactérien, comprenant - un composé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, et - au moins une bactérie contrôle Utilisation d’un composé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, pour évaluer in vitro la résistance d’une bactérie à un composé bactériostatique ou bactéricide. Méthode d’évaluation d’une résistance due à un mécanisme d’efflux d’une bactérie à un composé bactériostatique ou bactéricide, comprenant : - la mise en culture de bactéries dans un milieu de culture approprié, pour obtenir une culture de bactéries, - la mise en contact de la culture de bactéries avec un composé tel que défini dans l’une quelconque des revendications 1 à 5, pour obtenir une culture de bactéries traitées, - le lavage de la culture de bactérie traitées, et la précipitation des bactéries contenues dans la culture de bactéries traitées pour obtenir un culot de bactéries, - l’observation de la coloration du culot de bactéries, tel que - si le culot de bactéries présente la couleur d’un culot de bactéries issues de la culture de bactéries non traitées, ladite bactérie est résistante audit composé bactériostatique ou bactéricide, par efflux dudit composé bactériostatique ou bactéricide, et - si le culot de bactéries présente une couleur différente de la couleur d’un culot de bactéries issues de la culture de bactéries non traitées, ladite bactérie n’est pas résistante audit composé bactériostatique ou bactéricide par efflux dudit composé bactériostatique ou bactéricide.