Brevet FR3128226A1 — publié le 20230421

La présente invention concerne un procédé de production d’alcool(s), selon lequel on introduit un milieu de culture contenant un substrat carboné sucré (2) dans une section réactionnelle (1) comprenant un support (4) sur lequel sont immobilisés des micro-organismes, afin de produire par fermentation sous l’action desdits micro-organismes un moût (3) enrichi en alcool(s) et un/des gaz de fermentation, tel que le procédé est opéré en continu en phase liquide, et tel qu’on opère, pour piloter la production, un suivi de la quantité de micro-organismes vivants immobilisés sur le support sans intervention sur lesdits supports. Figure pour l’abrégé : Fig 1 Procédé de production d’alcools par fermentation La présente invention concerne un procédé de production d’alcools par fermentation continue à cellules immobilisées d’un milieu de culture contenant un substrat carboné sucré. Afin de répondre aux enjeux de la transition énergétique, de nombreuses recherches sont menées pour développer des procédés dits « verts », permettant d’accéder à des intermédiaires chimiques d’une façon alternative au raffinage du pétrole et/ou à la pétrochimie. Les alcools issus de procédés fermentaires (par exemple isopropanol et n-butanol) sont parmi les substituts de dérivés pétrochimiques les plus prometteurs. La fermentation ABE (Acétone – Butanol – Ethanol), réalisée par des microorganismes appartenant au genre Clostridium , est une des plus anciennes fermentations à avoir été industrialisée, et a été depuis largement étudiée. Plus récemment, la fermentation IBE (Isopropanol – Butanol – Ethanol) produisant un mélange d’isopropanol, butanol et éthanol et réalisée également par des micro-organismes solvantogènes, appartenant notamment au genre Clostridium, a fait l’objet de nombreuses études. Concernant le mode de conduite fermentaire employé dans ce type de procédé, la production en mode discontinu (« batch » selon la terminologie anglo-saxonne) reste la méthode conventionnelle pour les fermentations ABE et IBE, malgré la faible productivité affichée pour ce type de procédé, dans l’intervalle 0,1-0,7 g/L.h (voir, par exemple, Jones D. T., Woods D.R., 1986, Acetone-Butanol Fermentation Revisited. Microbiol. Rew., 50 (4), 484-524 ou Tableau 16.6 Lopez-contreras A. et al chapter book 16, Bioalcohol Production: Biochemical Conversion of Lignocellulosic Biomass, 2010). Mais ces productivités restent trop faibles pour envisager un procédé industriel économiquement viable. Un procédé continu avec des cellules en suspension dans un réacteur homogène peut également être envisagé. Mais la productivité est également assez faible et peut difficilement être augmentée de façon significative. Un problème technique est la concentration des cellules dans le milieu fermentaire, principalement contrôlée par le taux de dilution appliqué dans le procédé. Celui-ci ne peut pas être élevé pour éviter le lavage cellulaire (« wash out » selon la terminologie anglo-saxonne) dans le bioréacteur. Pour ces raisons, depuis quelques années, un fort intérêt est porté aux méthodes visant une forte rétention de la biomasse microbienne, notamment par immobilisation des micro-organismes dans le bioréacteur. L’utilisation du procédé en continu et à cellules immobilisées permet une augmentation significative de la productivité volumique en alcool, puisque le temps de séjour des micro-organismes, dans ces conditions, est décorrélé du temps de séjour hydraulique du bioréacteur étudié. De plus, la concentration en micro-organismes est plus élevée dans le bioréacteur. La présente invention s’intéressera donc plus particulièrement à la technique d’immobilisation des cellules : Il a ainsi été proposé dans le brevet FR-3 086 670 un procédé où l’on vient fixer dans le réacteur fermentaire au moins une partie de la biomasse bactérienne par adsorption sous forme de biofilm sur un matériau poreux à base de mousse polymérique, de type mousse de polyuréthane. Ce matériau s’est révélé particulièrement performant, en permettant un procédé fermentaire en continu, la mousse permettant de fixer les bactéries de façon suffisamment importante, c’est-à-dire au-delà du taux de dilution causant le lavage cellulaire. Ce matériau ouvre une nouvelle voie pour la production de mélanges de type IBEA, en donnant aussi accès à une production en mode continu par immobilisation de la biomasse bactérienne. Il est utile, pour la conduite du procédé de fermentation, d’évaluer l’efficacité des micro-organismes immobilisés sur des supports dans le réacteur de fermentation. En effet, les micro-organismes sont immobilisés sous forme d’un biofilm sur le support solide. Ce biofilm est composé d’un mélange de cellules de micro-organismes et de polymères extracellulaires. Le processus de formation du biofilm est peu contrôlable et dépend de nombreux facteurs. En effet, les conditions hydrodynamiques dans le bioréacteur, les propriétés physico-chimiques des supports utilisés ainsi que leur nombre, notamment, peuvent influencer son développement. La part de cellules viables et donc productrices de métabolites au sein de cette structure peut également largement varier en fonction de l’âge du biofilm étudié ainsi que des conditions opératoires du procédé. En outre, les micro-organismes immobilisés tendent à produire du butanol, qui est un composé inhibiteur de la croissance des micro-organismes, ce qui conduit à devoir augmenter le débit volumique d’entrée du fluide contenant les sucres à fermenter (et de sortie du fluide contenant les produits de fermentation). Pour toutes ces raisons, il s’est avéré que le contrôle de la quantité totale de micro-organismes vivants du biofilm qui se dépose sur les supports dans le bioréacteur est un paramètre-clé pour piloter de façon optimale le procédé de fermentation. Or, il est difficile de procéder à son suivi. En effet, il est délicat d’envisager des prélèvements des supports hors du bioréacteur, car le bioréacteur fonctionne généralement avec des conditions drastiques de stérilité et d’anoxie, qui seraient fortement perturbées par l’ouverture régulière du bioréacteur pour procéder à ces prélèvements. De plus, il est complexe d’avoir un échantillon représentatif à partir duquel on pourrait quantifier la concentration totale en cellules viables. Enfin les méthodes d’extractions prennent du temps et peuvent introduire un biais important sur la mesure. Par ailleurs, des études se sont intéressées à des moyens pour estimer la vitesse de croissance des biofilms, notamment par voie électro-chimique, comme décrit notamment dans la demande de brevet EP- 3 035 052, sans pour autant parvenir à estimer la proportion de micro-organismes vivants dans ces biofilms. Et la mise en œuvre de ces solutions est complexe dans une installation à l’échelle industrielle. L’invention a alors pour but de remédier à ces inconvénients. Elle a notamment pour but la mise au point de procédés de fermentation utilisant des micro-organismes immobilisés sur des supports qui soient plus faciles à piloter. Elle a notamment pour but de quantifier plus facilement et/ou plus précisément l’évolution de l’activité de ces micro-organismes immobilisés. L’invention a tout d’abord pour objet un procédé de production d’alcool(s), selon lequel on introduit un milieu de culture contenant un substrat carboné sucré dans une section réactionnelle comprenant un support sur lequel sont immobilisés des micro-organismes, afin de produire par fermentation sous l’action desdits micro-organismes un moût enrichi en alcool(s) et un/des gaz de fermentation (CO 2 /H 2 ), tel que le procédé est opéré en continu en phase liquide, et tel qu’on opère, pour piloter la production, un suivi de la quantité de micro-organismes vivants immobilisés sur le support sans intervention sur lesdits supports. On comprend par « section réactionnelle » au moins un bioréacteur avec tous les équipements permettant d’opérer une fermentation. Si la section réactionnelle comprend plusieurs bioréacteurs, ils peuvent être opérés en parallèle et/ou en série. Certains peuvent être en fonctionnement pendant que un/plusieurs autres sont en maintenance, notamment pour changer les supports d’immobilisation, afin de ne pas interrompre la production. On entend par « support » un matériau, par exemple du type de celui décrit dans le brevet FR-3 086 670 précité, sur les parois duquel les micro-organismes peuvent se déposer (et former progressivement des biofilms), on parle alors de micro-organismes immobilisés. C’est généralement un matériau poreux, qui peut être de nature polymérique, comme une mousse de type mousse à base de polyuréthane, ou de nature minéral, comme un matériau poreux de type céramique …Il peut se présenter sous forme d’un monobloc, ou sous forme de plusieurs blocs, agencés de manière ordonnée (en couches superposées par exemple)ou désordonnée (en vrac) dans le volume de la section réactionnelle où s’opère la fermentation. Ces blocs peuvent être de forme géométrique régulière et de mêmes taille (des cubes par exemple), ou être de forme irrégulière et/ou de tailles différentes. On comprend par « sans intervention sur lesdits supports » le fait que l’invention n’opère pas de manipulation sur les supports, notamment qu’elle s’abstient de faire des prélèvements de support hors de la section réactionnelle, notamment en vue de les analyser. Cela signifie que la mise en œuvre de l’invention se fait sans ouvrir la section réactionnelle, sans ouvrir le ou les bioréacteurs que comporte la section réactionnelle, sachant que dans le domaine de la fermentation les sections réactionnelles (le ou les bioréacteurs) fonctionnent en étant fermées, étanches, sans entrée d’atmosphère extérieure. On comprend par «micro-organismes » des organismes aptes à convertir des molécules en d’autres molécules d’intérêt par fermentation. Dans la description qui suit, on pourra aussi les désigner sous forme de « cellules » ou encore de « bactéries ». Le terme « vivant » a la même signification, dans le présent texte, que « viable » au sujet des micro-organismes : il s’agit des micro-organismes qu’on considère actifs vis-à-vis de la fermentation. Le terme « en suspension » a la même signification que le terme « libres » et désigne des cellules qui sont en suspension dans la phase liquide, par opposition aux cellules immobilisées sur substrat. On a ainsi choisi selon l’invention de piloter la production d’alcool(s) en fonction des micro-organismes vivants sur support, ce qui est la façon la plus fiable de le faire, tout particulièrement au démarrage de la production. En effet, quand on démarre la production, la première étape consiste, dans le bioréacteur, à disposer des supports, par exemple poreux comme des mousses de polymère, puis à y déposer les micro-organismes en injectant dans le bioréacteur un fluide contenant des micro-organismes appelé préculture. Ces micro-organismes viennent progressivement, pour partie, coloniser les supports en créant des biofilms, qui sont un mélange de micro-organismes et de polymères extra-cellulaires. Une autre part des micro-organismes va rester en phase liquide dans le bioréacteur. La croissance des biofilms est difficile à contrôler, et plus encore la part de micro-organismes vivants qu’ils contiennent. Les micro-organismes à la fois en suspension et immobilisés sont actifs vis-à-vis de la conversion des sucres en alcools, cependant les micro-organismes en suspension sont susceptibles d’être lessivés (c’est-à-dire soutirés avec les alcools lors de leur extraction du bioréacteur). Et il s’avère que les micro-organismes immobilisés qui sont vivants produisent, eux aussi, du butanol, qui est un composé inhibiteur de la croissance des micro-organismes. Concrètement, au fur et à mesure de la croissance du biofilm rendant compte de l’augmentation de la quantité de micro-organismes vivants immobilisés, on doit faire évoluer les paramètres du procédé, et on vient généralement augmenter le débit d’entrée des réactifs dans le réacteur (celui du fluide contenant les sucres à convertir), ainsi que le débit de sortie des produits de réaction depuis le réacteur (celui du fluide contenant les alcools obtenus par la fermentation des sucres). On choisit ainsi, pour piloter le procédé, et donc, notamment faire évoluer ces débits d’entrée/sortie, d’évaluer la quantité de micro-organismes vivants immobilisés. Mais ce qui est le cœur de l’invention, c’est que ce suivi se fait sans intervention sur les supports, c’est-à-dire, concrètement, sans avoir à ouvrir le bioréacteur pour faire des manipulations ou des traitements, notamment sans prélever des portions de support. Or c’est extrêmement avantageux de faire cette évaluation sans ouvrir le bioréacteur ni perturber son fonctionnement. En effet, ces bioréacteurs fonctionnent en général en conditions stériles et anoxiques : toute ouverture du réacteur, tout prélèvement de support notamment, est très complexe à réaliser pour parvenir à maintenir ces conditions stériles et anoxiques, voire impossibles, tout particulièrement à l’échelle industrielle. Pour ce faire, selon l’invention, on opère le suivi de la quantité de micro-organismes vivants immobilisés sur le support à partir d’analyses réalisées à la fois sur la phase liquide de la section réactionnelle et sur le/les gaz de fermentation produits. L’invention a ainsi développé un suivi indirect de la quantité de micro-organismes vivants immobilisés, en couplant : - des mesures sur la phase liquide (qui, elle, peut être facilement prélevée depuis le bioréacteur, voire en ligne), qui vont permettre de déterminer la quantité de micro-organismes vivants en suspension dans le réacteur, - et des mesures sur les gaz fermentaires (qui peuvent également être facilement prélevés depuis le réacteur), qui vont permettre d’estimer la quantité totale de micro-organismes vivants, c’est-à-dire la somme des micro-organismes vivants (actifs) en suspension et immobilisés. Avec ce couplage de données, on peut alors en déduire une estimation de la quantité des micro-organismes vivants immobilisés, et ceci sans toucher au support, sans ouvrir le bioréacteur, sans modifier/perturber le fonctionnement du bioréacteur. Avec cette estimation, l’invention permet de moduler (augmenter) les débits entrants/sortants de façon très précise pour tenir compte et contrer, au plus juste, la formation de butanol inhibiteur. Cette estimation peut aussi permettre de piloter la production selon d’autres critères que la formation de composés inhibiteurs : elle peut permettre par exemple d’évaluer la saturation des supports par les micro-organismes. En effet, au-delà d’une certaine période de temps, le support se trouve largement colonisé par les micro-organismes, et des phénomènes de bouchage apparaissent : quand le matériau support se présente sous forme de blocs ou de particules, le bouchage peut être observé entre les particules/blocs et/ou au sein même des particules/blocs quand leur matériau est poreux, ce qui fait alors chuter la production. En outre, il faut prendre en compte la mortalité des cellules dans le biofilm, la saturation observée étant donc la conjonction de phénomènes de bouchage croissants et de la mort croissante des bactéries au cours du temps. L’invention permet ainsi d’évaluer la diminution progressive de micro-organismes vivants, donc l’augmentation de la quantité de micro-organismes morts, et ainsi aider à la décision de changer les supports, en tout ou partie. De préférence, l’analyse sur la phase liquide de la section réactionnelle comprend une mesure de viabilité des micro-organismes en suspension dans la phase liquide de la section réactionnelle. Avantageusement, on mesure la viabilité des micro-organismes en suspension dans la phase liquide de la section réactionnelle par cytométrie en flux sur un échantillon de ladite phase liquide. La cytométrie en flux (CMF) est une technologie permettant l'analyse individuelle de cellules. Les cellules sont alignées selon le principe du centrage hydrodynamique avant de passer devant un faisceau laser. Les phénomènes optiques engendrés permettent une analyse des caractéristiques physiques (taille, structure) des cellules ou biologiques après incubation avec des réactifs le plus souvent. Cette technique d’analyse est très intéressante dans le cadre de l’invention, dans la mesure où, d’une part, elle est capable de cibler la mesure de la quantité des micro-organismes vivants, et d’autre part parce qu’elle permet d’obtenir rapidement les résultats, notamment en moins de 1 heure (15 ou 30 minutes par exemple). De préférence, l’échantillon analysé est prélevé dans la section réactionnelle ou dans le flux du moût de fermentation sortant de la section réactionnelle, les prélèvements étant de préférence réalisés selon une fréquence fixe ou évolutive. On peut ainsi choisir une fréquence plus élevée au démarrage de la production, et moins élevée par la suite. La fréquence des prélèvements et des mesures associées peut par exemple être de l’ordre de la dizaine de minutes, de l’heure ou de la journée selon l’avancement de la campagne de production. L’analyse peut aussi être réalisée en continu, en ligne, sur le flux du moût de fermentation sortant de la section réactionnelle, et être automatisée. L’analyse sur le/les gaz de fermentation produits comprend de préférence une mesure de leur débit en sortie de section réactionnelle. En effet, dans un bioréacteur, il est généralement prévu en partie haute, au niveau du ciel gazeux, une sortie équipée d’une vanne qui permet facilement de récupérer un échantillon ou de mesurer le débit sortant de gaz, sachant que la fermentation produit des gaz, généralement un mélange d’hydrogène et de gaz carbonique H 2 /CO 2 . Evaluer la quantité produite de gaz de fermentation permet d’estimer la quantité de micro-organismes vivants totale dans le bioréacteur (en suspension et immobilisées). Selon l’invention, on opère donc l’analyse sur la phase liquide de la section réactionnelle pour déterminer la concentration en micro-organismes viables de ladite phase liquide, on opère l’analyse (notamment l’analyse de débit) sur le/les gaz de fermentation produits pour évaluer la concentration en micro-organismes viables totale de la section réactionnelle, et on déduit de ces analyses une évaluation de la concentration des micro-organismes viables immobilisés sur le support. On comprend la concentration comme la quantité de cellules /micro-organismes par ml de volume réactionnel dans le bioréacteur. On va ainsi pouvoir, selon l’invention, moduler le débit entrant de flux sucré dans la section réactionnelle et/ou le débit sortant de moût depuis la section réactionnelle en fonction du suivi de la quantité de micro-organismes vivants immobilisés sur le support, ce qui revient en fait à moduler le taux de dilution de la fermentation dans le bioréacteur. Comme indiqué plus haut, les micro-organismes forment un biofilm croissant progressivement sur le support, et on peut évaluer la croissance dudit biofilm sur le support en fonction du suivi de la quantité de micro-organismes vivants immobilisés sur le support, ce qui peut donner des informations intéressantes en début de production (pour suivre l’accroche initiale des micro-organismes sur le support), et plus avant dans la campagne de production : on peut en effet évaluer au moins en partie le niveau de saturation du support en fonction du suivi de la croissance dudit biofilm. Avantageusement, on produit selon l’invention un moût fermentaire comprenant de l’isopropanol, du butanol et de l’éthanol, les micro-organismes étant issus d’une souche appartenant au genre Clostridium . L’invention a également pour objet un système de production d’alcool(s) à partir d’un fluide contenant un substrat carboné sucré, afin de produire par fermentation sous l’action de micro-organismes un moût enrichi en alcool(s) et un/des gaz de fermentation mettant en œuvre le procédé décrit plus haut. L’invention a également pour objet un système de production d’alcool(s) à partir d’un fluide sucré, afin de produire par fermentation sous l’action de micro-organismes un moût enrichi en alcool(s) et un/des gaz de fermentation, tel que ledit système comprend : - une section réactionnelle comprenant un support, notamment sous forme de mousse de polymère du type polyuréthane, sur lequel sont immobilisés des micro-organismes, ladite section réactionnelle étant munie d’une entrée pour le fluide sucré et d’une sortie pour le moût, - des moyens de suivi de la quantité de micro-organismes vivants immobilisés sur le support sans intervention sur lesdits supports. De préférence, les moyens de suivi comprennent : - un dispositif de cytométrie en flux mesurant la viabilité des micro-organismes en suspension dans la phase liquide de la section réactionnelle à partir de prélèvements depuis la section réactionnelle, - un dispositif de mesure de débit du/des/ gaz de fermentation produits en sortie de section réactionnelle, - des moyens de calcul (tout moyen de type électronique/informatique) déduisant des mesures de cytométrie et de débit de gaz la quantité de micro-organismes vivants immobilisés sur le support. La section réactionnelle selon l’invention comprend de préférence un ou plusieurs bioréacteurs fonctionnant en conditions stériles et anoxiques. L’invention sera décrite plus en détails ci-après, et sera illustrée à l’aide d’exemple(s) et de figures non limitatives de ladite invention. Liste des figures La représente de façon très schématique un bioréacteur mettant en œuvre l’invention. La représente de façon très schématique le schéma-bloc du procédé selon l’invention. La est un graphe représentant le débit de gaz (de fermentation) en fonction de la concentration en micro-organismes vivants (en cellules dites actives). La est un graphe représentant l’évolution de la concentration en micro-organismes vivants (cellules dites actives) en fonction du temps. La est un graphe représentant la concentration en micro-organismes vivants (en cellules actives) estimées en fonction de la même concentration mesurée expérimentalement. La est un graphe représentant la variation de concentration en micro-organismes vivants immobilisés sur support en fonction du temps, telle que déduite selon le procédé de l’invention. Procédé de production d’alcool(s), selon lequel on introduit un milieu de culture contenant un substrat carboné sucré (2) dans une section réactionnelle (1) comprenant un support (4) sur lequel sont immobilisés des micro-organismes, afin de produire par fermentation sous l’action desdits micro-organismes un moût (3) enrichi en alcool(s) et un/des gaz de fermentation, caractérisé en ce que le procédé est opéré en continu en phase liquide, et en ce qu’on opère, pour piloter la production, un suivi de la quantité de micro-organismes vivants immobilisés sur le support sans intervention sur lesdits supports, à partir d’analyses réalisées à la fois sur la phase liquide (V1) de la section réactionnelle (1) et sur le/les gaz de fermentation produits. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que l’analyse sur la phase liquide (V1) de la section réactionnelle (1) comprend une mesure de viabilité des micro-organismes en suspension dans la phase liquide de la section réactionnelle. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce qu’on mesure la viabilité des micro-organismes en suspension dans la phase liquide (V1) de la section réactionnelle (1) par cytométrie en flux sur un échantillon de ladite phase liquide. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que l’échantillon analysé est prélevé dans la section réactionnelle (1) ou dans le flux du moût (3) de fermentation sortant de la section réactionnelle, les prélèvements étant de préférence réalisés selon une fréquence fixe ou évolutive. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l’analyse sur le/les gaz de fermentation produits comprend une mesure de leur débit en sortie de section réactionnelle (1). Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l’analyse sur la phase liquide (V1) de la section réactionnelle (1) détermine la concentration en micro-organismes viables de ladite phase liquide, en ce que l’analyse sur le/les gaz de fermentation produits évalue la concentration en micro-organismes viables totale de la section réactionnelle, et en ce qu’on déduit de ces analyses une évaluation de la concentration des micro-organismes viables immobilisés sur le support. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’on module le débit entrant de flux sucré (2) dans la section réactionnelle et/ou le débit sortant de moût (3) depuis la section réactionnelle (1) en fonction du suivi de la quantité de micro-organismes vivants immobilisés sur le support. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les micro-organismes forment un biofilm croissant progressivement sur le support (4), et en ce qu’on évalue la croissance dudit biofilm sur le support en fonction du suivi de la quantité de micro-organismes vivants immobilisés sur le support. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’on évalue le niveau de saturation du support (4) en fonction du suivi de la croissance dudit biofilm. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’on produit un moût fermentaire (3) comprenant de l’isopropanol, du butanol et de l’éthanol, les micro-organismes étant issus d’une souche appartenant au genre Clostridium . Système de production d’alcool(s) à partir d’un fluide contenant un substrat carboné sucré, afin de produire par fermentation sous l’action de micro-organismes un moût enrichi en alcool(s) et un/des gaz de fermentation, caractérisé en ce que ledit système comprend : - une section réactionnelle (1) comprenant un support (4), notamment sous forme de mousse de polymère du type polyuréthane, sur lequel sont immobilisés des micro-organismes, ladite section réactionnelle étant munie d’une entrée pour le fluide sucré et d’une sortie pour le moût, - des moyens de suivi de la quantité de micro-organismes vivants immobilisés sur le support sans intervention sur lesdits supports, par analyses réalisées à la fois sur la phase liquide (V1) de la section réactionnelle (1) et sur le/les gaz de fermentation produits. Système selon la revendication précédente, caractérisé en ce que les moyens de suivi comprennent : - un dispositif de cytométrie en flux mesurant la viabilité des micro-organismes en suspension dans la phase liquide de la section réactionnelle à partir de prélèvements depuis la section réactionnelle, - un dispositif de mesure de débit du/des/ gaz de fermentation produits en sortie de section réactionnelle, - des moyens de calcul déduisant des mesures de cytométrie et de débit de gaz la quantité de micro-organismes vivants immobilisés sur le support. Système selon l’une des revendications 11 ou 12, caractérisé en ce que la section réactionnelle (1) comprend un ou plusieurs bioréacteurs fonctionnant en conditions stériles et anoxiques.