Brevet FR3136367A1 — publié le 20231215

La présente invention détaille une composition permettant de faire exprimer le facteur V dans les cellules d’un patient, à l’aide d’ARN messager encodant le facteur V, encapsulé dans des nanoparticules lipidiques. Les nanoparticules lipidiques sont composées de phospholipides, de cholestérol, de lipides PEGylés et de lipides cationiques ionisables. Le brevet détaille également une méthode permettant de traiter le déficit en facteur V principalement chez des patients atteints, ainsi que d’autres maladies hémorragiques, où l’utilisation de facteur V serait une opportunité thérapeutique. Compositions et méthodes concernant des molécules d’ARN messager codant le facteur V encapsulées dans des nanoparticules lipidiques De nos jours, la plupart des autres maladies hémorragiques, comme l’hémophilie A ou B, peuvent être traitées avec l’infusion régulière de concentrés du facteur de coagulation en déficit chez l’organisme concerné via prophylaxie. Concernant le déficit en facteur V, il n’existe, sur le marché, aucun concentré de facteur V en 2021. Le seul traitement disponible est donc l’injection de plasma sanguin frais congelé. Il y a donc plusieurs inconvénients : le plasma frais congelé peut porter des risques d’infections, au VIH ou à l’hépatite C par exemple, ou encore peut entraîner des risques d’allergie, des complications métaboliques liées aux molécules de citrate présentes, pouvant être toxiques, ou encore des surcharges circulatoires. Le déficit en facteur V est une maladie hémorragique héréditaire autosomique récessive très rare. Aussi nommée parahémophilie, maladie d’Owren ou encore déficit en proaccélerine, elle se caractérise par un déficit ou une réduction du taux de facteur V, qui est une protéine impliquée dans la coagulation qui conduit normalement à l’hémostase et permet une guérison rapide et des saignements moins longs et sévères. Elle résulte de mutations du gène F5, altérant les propriétés biologiques de la protéine traduite dans l’organisme, touchant environ un individu sur 1000000. Ce défaut est explicable par l’expression altérée du gène concerné codant la protéine ou du mécanisme de son expression, les taux de synthèses nuls ou très réduits, par l’absence de la protéine ou encore par la synthèse d’une protéine ayant des propriétés biologiques réduites. Dans les cas les plus graves, les conséquences peuvent être fatales. Cependant, le développement d’un concentré de facteur V semblerait ne pas être judicieux, car cette protéine possède une demi-vie assez courte, d’environ 12 à 36 heures dans l’organisme humain. Cette demi-vie courte nécessite donc de nombreuses infusions hebdomadaires afin de maintenir des niveaux de facteur V raisonnables pour le patient. De plus, cette stratégie thérapeutique pourrait aussi augmenter les risques de développement d’inhibiteurs découlant d’une réaction immunitaire, ne reconnaissant pas les facteurs V injectés dans l’organisme et rendant donc le traitement inefficace. En général, les thérapies géniques, aussi appelée génothérapie ou encore thérapie génétique sont des techniques faisant appel à des particules et outils moléculaires afin de traiter des maladies génétiques. Cette stratégie thérapeutique consiste en l’introduction de gènes sains dans des cellules ou tissus présentant ce même gène, mais muté et dysfonctionnel. Cette thérapie permettrait d’exprimer donc un gène fonctionnel chez des organismes présentant des maladies génétiques. Cependant, les génothérapies à base d’ADN possèdent de nombreux défauts : elles peuvent altérer l’état physiologiques des cellules concernées et changent le génome humain, pouvant alors provoquer des effets indésirables, étant donné leur effet non transitant. De plus, de manière conventionnelle, la livraison des gènes lors de thérapies géniques sont effectuées via des vecteurs viraux. Il en existe plusieurs sortes, comme les vecteurs lentiviraux, adénoviraux, rétroviraux et adénoassociés et possèdent une immunogénicité accrue. Les thérapies géniques ADN ont aussi un coût important, limitant le nombre de personnes pouvant bénéficier d’un traitement. Les traitements utilisant des compositions moléculaires sont des méthodes de traitement relativement nouvelles dans le domaine de la médecine pouvant porter des effets thérapeutiques subséquents lorsqu’ils sont utilisés afin de lutter contre des maladies rares. En particulier, l’utilisation d’ARN messager à des fins de traitement de maladies génétiques est prometteuse, bien qu’elle soit encore à ses balbutiements. La présente invention consiste en une composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs complexes de nanoparticules lipidiques (aussi appelé LNP, pour Lipid NanoParticle) et ARNm (ARN messager) permettant de traiter le déficit en facteur V ainsi que d’autres maladies concernant un déficit de facteur de coagulation, autrement désignés par maladies hémorragiques. Les molécules d’ARNm, encapsulées dans un vecteur lipidique, comportent la séquence d’intérêt codant une version fonctionnelle du facteur V une fois transfectées dans les cellules de l’organisme concerné. Elle comprend aussi une méthode de traitement consistant en l’administration d’une dose effective de LNP-ARNm permettant de traiter le déficit en facteur V chez les patients atteints de cette maladie, mais ne se limite pas uniquement à cette maladie et peut toucher tout type de maladie hémorragique caractérisé par un déficit d’un facteur de coagulation. Ce traitement pourrait donc limiter les symptômes du déficit en question, marqué par des saignements fréquents et souvent sévères. L’utilisation de cette formulation ne se limite pas seulement au traitement du déficit au facteur V, bien qu’elle soit son objectif à l’origine. En première caractéristique, cette présente invention comprend une ou plusieurs molécules d’ADN permettant de traduire le facteur de coagulation V. Lorsque ces molécules d’ADN seront transfectées dans les cellules visées, l’organisme produit donc le facteur V exprimé, qui est normalement en déficit chez les patients atteints de ce déficit ou qui aurait un intérêt thérapeutique chez d’autres patients Les modifications peuvent comprendre, en premier lieu, l’ajout d’une coiffe. Les coiffes, présentes sur l’extrémité 5’ chez les eucaryotes, peuvent consister en l’ajout d’une guanosine méthylée liée au premier nucléotide par une liaison 5’-5’, avec trois groupes phosphates. Les deux premiers nucléotides suivant la coiffe peuvent, chez les eucaryotes, subir une méthylation, la coiffe cap-1 concernant uniquement la méthylation du premier nucléotide sur le groupe hydroxyle du deuxième carbone du ribose, et la coiffe cap-2 concernant la même méthylation mais cette fois-ci, sur deux premiers nucléotides. La coiffe permet la protection de l’ARNm aux exonucléases, risquant alors la dégradation de cette dernière. Elle permet aussi de se lier aux facteurs d’initiation, entraînant le processus de traduction ARNm en protéine. En effet, la protéine EIF4E ( Eukaryotic Translation Initiation Factor 4E ) se lie à la coiffe et facilite le contact au ribosome, particulièrement à sa petite sous-unité ribosomique 40S. La coiffe est donc un élément critique à la bonne traduction de l’ARNm, et est une modification permettant de s’assurer de l’efficacité thérapeutique de la formulation. La molécule d’ARNm présentée modifications peut donc comprendre une coiffe dite « naturelle », pouvant par exemple comporter des aussi présentes dans la nature comme une méthylation cap-1 ou cap-2, permettant alors d’éviter une réponse immunitaire in vivo. De plus, la coiffe « naturelle », c’est-à-dire celle majoritaire dans la nature, peut être échangée pour une coiffe « artificielle », c’est-à-dire modifiée, dans le cadre de la molécule d’ARNm. Les coiffes artificielles peuvent être, mais ne se limitent pas, à ARCA ( Anti-Reverse Cap Analog ). La molécule d’ARN messager de cette présente invention comprend aussi des régions UTR (UnTranslated Region) 5’ UTR et 3’ UTR, qui sont des parties qui ne seront pas traduites lors du processus de traduction. La région 5’UTR, qui se trouve à l’extrémité 5’ et en amont de la séquence codante de la molécule d’ARN message permet au ribosome de se lier à la molécule et d’initier la traduction de la séquence. La région 3’UTR, qui suit la séquence codant la protéine d’intérêt et plus particulièrement le codon stop de cette séquence, permet d’induire la terminaison de la traduction et régule la stabilité de la molécule d’ARN messager. La molécule d’ARN messager dans cette présente invention comprend une séquence d’intérêt codant le facteur de coagulation V. Cette séquence codante peut découler du gène F5 SEQ NO ID 1 provenant d’un organisme humain et peut comporter une ou plusieurs modifications chimiques d’une ou plusieurs nucléotides afin d’augmenter les bénéfices thérapeutiques. La molécule d’ARN messager dans cette présente invention comprend une queue poly(A), étant une succession de ribonucléotides d’adénosine permettant de protéger la molécule d’ARN messager de la dégradation et initie le recrutement des ribosomes afin de traduire la molécule d’ARN messager. La queue poly(A) est normalement ajoutée dans des cellules par polyadénylation et consiste en l’addition de séquences d’adénosine monophosphate, et est présente à l’extrémité 3’. En seconde caractéristique, la composition pharmaceutique comprend des LNP faisant office de vecteurs pour des molécules d’ARNm. Les LNP sont des vésicules artificielles formés d’une bicouche de lipides concentriques la plupart du temps, dans cette présente invention et comprennent dans leur enceinte des lipides ionisables. Les molécules d’ARN messager, étant hydrophiles, se situent une fois encapsulées à l’intérieur, au centre du LNP et les lipides ionisables, de charge positive, forment des agrégats autour des molécules d’ARNm. Une fois en contact avec des cellules, les LNP sont endocytées et relâchent les molécules d’ARN messager précédemment encapsulées dans le cytoplasme de la cellule visée. Dans cette présente invention, les LNP eux-mêmes sont caractérisés en étant des vésicules unilamellaires, ainsi que par leurs lipides les constituants, pouvant être de différentes catégories et compositions. Les lipides utilisés sont en général des lipides cationiques ionisables, permettant de se lier à la molécule d’ARNm, des phospholipides formant la bicouche lipidique, des lipides PEGylés ainsi que d’autres molécules permettant de stabiliser les LNP, généralement du cholestérol. Les lipides cationiques ionisables possèdent une charge positive, contrairement aux acides nucléiques qui ont une charge négative. En effet, la présence de molécules chargées positivement ont pour but de neutraliser la charge nettement négative de l’ARNm, qui ne permettait alors pas avant l’utilisation de lipides cationiques des grands taux d’encapsulation dans des liposomes, qui étaient eux neutres. Ces lipides ont le pouvoir, grâce à leur charge, de former des agrégats au centre du LNP du autour des molécules d’ARNm et donc de l’encapsuler. De plus, elles sont capables d’adopter une charge neutre dans des conditions physiologiques, afin d’éviter une potentielle réaction immunitaire, puis d’adopter une charge positive une fois endocytée dans une cellule, capturée dans un endosome tardif à pH bas, permettant leur échappement et la libération de l’ARNm dans le cytoplasme. Les lipides cationiques ionisables pouvant être utilisés dans cette formulation comprennent, le C12-200, aussi appelé 1,1‘-((2-(4-(2-((2-(bis(2-hydroxydodécyl)amino)éthyl) (2-hydroxydodécyl)amino)éthyl)piperazin-1-yl)éthyl)azanédiyl)bis(dodécan-2-ol), le D-Lin-MC3-DMA, aussi appelé (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriacont-6,9,28,31-tetraène-19-yl 4-(diméthylamino)butanoate, le DOTMA, aussi appelé 1,2-di-O-octadecényl-3-triméthylammonium propane,le DOTAP, aussi appelé 1,2-dioléoyl-3-triméthylammonium-propane, le L319, aussi appelé di((Z)-Non-2-en-1-yl)9-((4-(diméthylamino)butanoyl)oxy)heptadécanedioate. Les phospholipides sont utilisés afin de former une bicouche caractérisant le complexe LNP, et peuvent être synthétiques ou naturels. Les phopholipides sont souvent utilisés pour préparer des liposomes, qui sont similaires aux LNP. Elles forment leur structure. Les phospholipides utilisés dans cette présente invention sont [mais ne sont pas limités à] les familles des phosphatidylcholines, des phosphatidylsérines, des phosphatidyléthanolamines ou encore des phosphatidylglycérols. Leur composition chimique similaire à celle des membranes cellulaires permettent de s’y fusionner. Les molécules de cholestérol contribuent aussi à la structure du LNP, et forment à deux le complexe lipid-ARNm. Les LNP possèdent des chaînes de polyéthylène glycol (PEG) ancrées à des lipides qui permettent d’augmenter la stabilité et prolonger la demi-vie du LNP concerné, et donc augmente les taux d’expression de l’ARN messager, en réduisant les chances de provoquer des réactions immunitaires de l’organisme. En effet, ces lipides PEGylés présents à la surface du LNP limitent les réactions immunitaires et permettent donc de réduire leur élimination une fois introduites dans l’organisme. Ces lipides permettent donc d’augmenter la stabilité. Cela implique alors une baisse de la fréquence des injections nécessaires dans un cadre thérapeutique. Des ligands spécifiques se liant uniquement aux hépatocytes, qui sont les cellules qui produisent le facteur de coagulation V, peuvent être présents à la surface, afin d’obtenir un taux d’expression optimisé. La présente invention consiste aussi en une méthode de traitement du déficit congénital en facteur V chez les patients atteints de cette dernière maladie, mais ne se limite pas qu’à cette dernière. Elle comprend une méthode d’administration de la composition pharmaceutique comprenant qui peut être, de manière préférable, subcutanée, intraveineuse ou encore intramusculaire. La composition pharmaceutique peut comprendre au moins un complexe d’ARN messager codant le facteur V fonctionnel encapsulé dans un vecteur lipidique, permettant donc l’expression du facteur de coagulation V dans les hépatocytes. Les compositions pharmaceutiques et méthodes présentées dans cette invention peuvent traiter et contrôler le déficit congénital en facteur V, ainsi que d’autres maladies, de préférence hémorragiques. Elles permettent de produire, dans les hépatocytes, une protéine qui est fonctionnelle et ne présente aucun défaut pouvant compromettre ses propriétés ou ses fonctions biologiques. L’utilisation de l’ARN messager en tant qu’agent thérapeutique est une stratégie médicinale nouvelle et moderne. L’ARN messager a des avantages signifiants dans le domaine pharmaceutique : les molécules d’ARNm introduites dans une cellule n’altèrent en aucun cas l’état physiologique de la cellule, contrairement aux thérapies géniques ADN. Elles sont moins onéreuses, plus faciles à manipuler et moins immunogènes que les thérapies géniques ADN. Les thérapies ARN n’interviennent pas non plus sur le génome humain, évitant alors des effets indésirables qui pourraient être fatals. De plus, la thérapie ARN peut utiliser des vecteurs lipidiques, qui ont une immunogénicité beaucoup plus basse que les vecteurs viraux, traditionnellement utilisés lors des thérapies géniques à base d’ADN. Ces LNP facilitent le transport de l’ARN messager et leur introduction dans les hépatocytes. L’utilisation de polyéthylène glycol permet de limiter les risques de réaction immunitaire et d’immunogénicité de la composition pharmaceutique, ainsi que les risques de développement de potentiels inhibiteurs. Cette caractéristique augmente donc la stabilité de la composition, allonge sa demi-vie et réduit la fréquence d’injections nécessitées. La présence de ligands spécifiques aux hépatocytes permet aussi d’augmenter les taux d’expression en favorisant leur affinité envers les hépatocytes, et d’aussi réduire la fréquence d’injections nécessitées. Selon des modes particuliers de réalisation : La région 5’UTR de la molécule d’ARN messager peut comprendre des modifications au niveau de sa séquence de ladite molécule, comme des insertions, des délétions, des substitutions d’un ou plusieurs nucléotides de manière partielle ou totale. La région 3’UTR de la molécule d’ARN messager peut comprendre des modifications au niveau de sa séquence de ladite molécule, comme des insertions, des délétions, des substitutions d’un ou plusieurs nucléotides de manière partielle ou totale. La séquence coiffe de la molécule d’ARN messager peut comprendre des modifications au niveau de sa séquence de ladite molécule, comme des insertions, des délétions, des substitutions d’un ou plusieurs nucléotides de manière partielle ou totale. La séquence polyA de la molécule d’ARN messager peut comprendre des modifications au niveau de sa séquence de ladite molécule, comme des insertions, des délétions, des substitutions d’un ou plusieurs nucléotides de manière partielle ou totale. Elle peut aussi avoir une longueur variable. La séquence d’intérêt FV SEQ NO ID : 1 des molécules d’ARN messager correspondantes peuvent comprendre des modifications au niveau de sa séquence de ladite molécule, comme des insertions, des délétions, des substitutions d’un ou plusieurs nucléotides de manière partielle ou totale. Les lipides formant les LNP peuvent être de différentes catégories. Les LNP peuvent comprendre d’autres molécules ou autres modifications afin d’augmenter les bénéfices thérapeutiques. Les molécules d’ARN messager peuvent inclure d’autres séquences pouvant augmenter les bénéfices thérapeutiques. La composition pharmaceutique peut comprendre d’autre particules biologiques permettant d’augmenter les bénéfices thérapeutiques comme des peptides, des protéines, des séquences de nucléotides et autres. La composition pharmaceutique peut comprendre d’autres espèces chimiques permettant d’augmenter les bénéfices thérapeutiques comme des molécules organiques, des sels ou autres. Le patient concerné par le traitement peut présenter un déficit sévère, modéré ou léger en facteur V. Le patient concerné par le traitement peut présenter un déficit sévère, modéré ou léger en facteur de coagulation autre que le V. Le dispositif est formé d’au moins un LNP, qui est une vésicule formée par des bicouches lipidiques de lipides concentriques possédant un centre hydrophile. A la surface extérieure, des chaînes de polyéthylène glycol sont placées de telle façon qu’elles permettent de limiter la réaction immunitaire pouvant être potentiellement provoquée. De plus, sur cette même surface extérieure, des ligands sont présents des protéines d’asialofetuine ou encore des anticorps spécifiques à des récepteurs uniquement présents sur les hépatocytes. A l’intérieur du LNP, hydrophile, au moins une molécule d’ARN messager est présente, encapsulée. Cette molécule s’intégrera aux hépatocytes lorsque le LNP entrera en contact avec ces dernières, et l’ARNm pourra donc utiliser la machinerie génétique afin d’initier le processus de traduction de l’ARN en protéine, permettant donc l’expression du facteur de coagulation V, manquant aux organismes affectés par ce déficit. Autour de chaque molécule d’ARNm se trouve des lipides cationiques ionisables de charge positive formant des agrégats et conférant aux molécules d’ARN messager une surface positive. La molécule d’ARN messager est composée de plusieurs séquences. Premièrement, une séquence Cap1 codant la coiffe est présente, cruciale à la traduction de l’ARNm. Ensuite, une séquence 5’UTR spécifique au gène F5 suit, et précède la séquence d’intérêt codant la protéine du facteur V. Puis, une séquence 3’UTR s’ensuit, et la molécule d’ARN messager se finit par une séquence polyA. Dans cette invention, le terme « complexe » est défini par l’association d’au moins un LNP qui encapsule au moins une molécule d’ARN messager. Ce complexe est destiné pour l’utilisation thérapeutique aux patients atteints de déficit congénital en facteur V, et permet la traduction de l’ARNm en protéine une fois la molécule d’ARNm introduite dans la cellule. Dans cette invention, le terme « traitement » est défini par une stratégie thérapeutique visant à réduire les symptômes et effets de la maladie pouvant altérer la santé ou la qualité de vie du patient. Elle permet donc, dans cette stratégie, d’augmenter les taux de facteur V de manière notable. Dans cette invention, le terme « vecteur » est défini par une structure chimique permettant de transporter dans un organisme du matériel génétique étranger ou autre, comme de l’ARN messager dans ce cas. Elles permettent de délivrer ces molécules ainsi que de les introduire dans les cellules de l’organisme le matériel génétique. Dans cette invention, le terme « bénéfice thérapeutique » signifie les bienfaits amenés au patient grâce à la composition et méthode décrites dans ce document. Augmenter le bénéfice thérapeutique peut donc signifier augmenter son efficacité, sa demi-vie, ou encore sa sûreté, ou autre. Une composition permettant in vivo la production du facteur de coagulation V humain, caractérisé par la présence d’ARN messager (ARNm) encapsulé dans des nanoparticules lipidiques. Dispositif selon la revendication 1, où la molécule d’ARNm est caractérisée par la présence d’une coiffe à l’extrémité 5’, pouvant être naturelle ou artificielle. Dispositif selon la revendication 1, où la molécule d’ARNm est caractérisée par la présence d’une séquence 5’UTR (UnTranslated Region). Dispositif selon la revendication 1, où la molécule d’ARNm est caractérisée par la présence d’une séquence 3’UTR (UnTranslated Region). Dispositif selon la revendication 1, où la molécule d’ARNm est caractérisée par la présence d’une queue polyadénylée. Dispositif selon la revendication 1, où la molécule d’ARNm est caractérisée par la présence de la séquence codant le facteur V de coagulation humain, sauvage ou modifié. Dispositif selon la revendication 1, où la molécule d’ARNm est caractérisée par la présence de nucléotides naturels ou modifiés chimiquement. Dispositif selon la revendication 1, où la nanoparticule nanolipidique encapsulant l’ARNm est caractérisé par la présence d’un ou plusieurs lipides comprenant des chaînes de polyéthylène glycol. Dispositif selon la revendication 1, où la nanoparticule nanolipidique encapsulant l’ARNm est caractérisé par la présence de cholestérol. Dispositif selon la revendication 1, où la nanoparticule nanolipidique encapsulant l’ARNm est caractérisé par la présence de lipides cationiques ionisants. Dispositif selon la revendication 1, où la nanoparticule nanolipidique encapsulant l’ARNm est caractérisé par la présence de phospholipides ou autres lipides non cationisants non décrits auparavant. Dispositif selon la revendication 1, où la composition peut comprendre des peptides, nucléotides, séquences de nucléotides, espèces chimiques organiques, espèces chimiques minérales ou sels afin d’augmenter les bénéfices thérapeutiques. Méthode consistant au traitement d’une maladie hémorragique caractérisée par l’administration de la composition d’ARNm codant le facteur de coagulation V encapsulée dans une nanoparticule lipidique, comme le déficit en facteur V ou l’hémophilie A. Dispositif selon la revendication 12, où l’administration se caractérise par une injection subcutanée, intraveineuse ou encore intramusculaire.