Brevet FR3127134A1 — publié le 20230324

SUPPORT BICOUCHE POUR LA PREPARATION D’UN EQUIVALENT DE DERME OU D’UN EQUIVALENT DE PEAU La présente invention concerne un procédé de production d’un équivalent de derme ou de peau ou d’épiderme sur un support bicouche comprenant une couche d’au moins 200 nm d’épaisseur et d’une porosité inférieure ou égale à 5 µm formée par électrofilage d’une composition comprenant au moins un polymère, et une couche d’au moins 20 µm d’épaisseur et d’une porosité supérieure ou égale à 20 µm formée par électrofilage en impression 3D d’une composition comprenant au moins un polymère. La demande concerne également l’équivalent de peau ou de derme ou d’épiderme susceptible d’être obtenu par ledit procédé, l’utilisation d’un équivalent de derme ou d’un équivalent de peau ou d’un équivalent d’épiderme pour le criblage de composés et enfin leur utilisation dans le pansement de plaie ou pour la greffe de peau. Figure pour l'abrégé : néant SUPPORT BICOUCHE POUR LA PREPARATION D’UN EQUIVALENT DE DERME OU D’UN EQUIVALENT DE PEAU La présente invention concerne un procédé de production d’un équivalent de derme ou de peau ou d’épiderme sur un support bicouche comprenant une couche d’au moins 200 nm d’épaisseur et d’une porosité inférieure ou égale à 5 µm formée par électrofilage d’une composition comprenant au moins un polymère, et une couche d’au moins 20 µm d’épaisseur et d’une porosité supérieure ou égale à 20 µm formée par électrofilage en impression 3D d’une composition comprenant au moins un polymère. La demande concerne également l’équivalent de peau ou de derme ou d’épiderme susceptible d’être obtenu par ledit procédé, l’utilisation d’un équivalent de derme ou d’un équivalent de peau ou d’un équivalent d’épiderme pour le criblage de composés et enfin leur utilisation dans le pansement de plaie ou pour la greffe de peau. L'électrofilage (electrospinning ES) est une méthode de production de fibres qui utilise la force électrique pour dessiner des fils chargés de solutions de polymère ou de polymère fondu. Cela permet de produire des fibres dont le diamètre peut descendre jusqu'à 50 nm. Cependant, le dépôt est aléatoire résultant en un maillage de fibres non tissé. L'écriture par électrofilage en impression 3D est une technique émergente qui utilise des polymères avec un dépôt contrôlé de la fibre électrofilée et a permis de construire in situ des structures complexes ou de les assembler. Ces technologies peuvent être utilisées pour produire des supports poreux pour l'ingénierie tissulaire, spécialement pour reconstruire la partie dermique et éventuellement hypodermique des tissus cutanés. De nos jours, les modèles en treillis (lattice) sont les modèles de peau in vitro les plus utilisés pour acquérir de nouvelles connaissances et pour les études d'évaluation. Cependant, ils présentent une faible néosynthèse de la matrice extracellulaire et de mauvaises propriétés mécaniques en raison d'une teneur élevée en eau. Les supports poreux ont l'avantage de permettre la néosynthèse de la matrice extracellulaire conduisant à un compartiment dermique dynamique et sont également permissifs à de nombreux types cellulaires. Cependant, lors de la reconstruction de tissus cutanés, la porosité est également une limitation car le compartiment dermique doit être complètement rempli de matrice pour pouvoir déposer des cellules épidermiques dessus et réaliser une reconstruction épidermique correcte sans invagination des kératinocytes dans le derme. Ceci est généralement réalisé en ajoutant une concentration élevée de vitamine C pour stimuler la néosynthèse de matrice par les fibroblastes dermiques, en sélectionnant des fibroblastes spécifiques qui sécrètent une teneur élevée en matrice extracellulaire et/ou en cultivant le compartiment dermique pendant une longue période pour permettre le remplissage complet. Cela devient un réel problème lors de l'utilisation de fibroblastes de donneurs âgés, et/ou exposé à la pollution et/ou pathologiques car ils synthétisent moins de matrice extracellulaire rendant le remplissage du compartiment dermique difficile donc par voie de conséquence, la reconstruction épidermique. L’utilisation de Vitamine C dans la reconstruction d’un équivalent de derme ou de peau n’est pas toujours souhaitable pour certaines études d’évaluation de matières premières car elle présente un spectre d’action assez large et peut induire des interférences avec les molécules évaluées. En outre, les supports poreux traditionnels ont une faible capacité à imiter l'architecture nanostructurale de la peau en raison des limitations de fabrication. L'électrofilage seul est une solution permettant notamment de créer des supports poreux comprenant des fibres d'un diamètre proche ou similaire aux fibres de la matrice extracellulaire. Ils permettraient d’améliorer l'attachement cellulaire, la croissance et la différenciation. Cependant, en raison d'une porosité non contrôlée et faible, l'infiltration des cellules à l'intérieur du support est complexe et médiocre. Le support bicouche selon l’invention présente de nombreux avantages par rapport aux supports connus: - la couche d’au moins 200 nm d’épaisseur et d’une porosité inférieure ou égale à 5 µm est une interface empêchant le passage des cellules qui permet de reconstruire un épiderme indépendamment de la composition et de la quantité de la matrice dermique (c'est-à-dire qu'il peut être reconstruit sur un compartiment dermique vide ou presque vide). Elle évite les invaginations des kératinocytes tout en permettant le passage des nutriments et des protéines ainsi que les communications entre le derme et l’épiderme. - la couche d’au moins 20 µm d’épaisseur et d’une porosité supérieure ou égale à 20 µm est très poreuse et permet donc la néosynthèse et le remodelage de la matrice extracellulaire. Sa conception influence le comportement cellulaire, la composition et l’organisation de la matrice extracellulaire, et les propriétés mécaniques du support. Différents supports bicouches ont été créés dans lesquels la couche formée la plus poreuse a été imprimée par électrofilage en impression 3D suivant différents designs. Les inventeurs ont observé que la reconstruction épidermique est possible sur ces supports et permet l’expression des principaux marqueurs épidermiques tout en ne dépendant pas du remplissage du compartiment dermique et de la conception de la couche plus poreuse. De plus, les inventeurs ont observé que la conception du support a un impact sur le contenu et l'organisation de la matrice extracellulaire et la réponse à la vitamine C. Ces supports ont aussi l’avantage d’être biocompatibles et hautement personnalisables, ouvrant une nouvelle voie dans les modèles de peau pour l’acquisition de nouvelles connaissances, les tests in vitro , la préparation de pansement et la greffe. La présente invention concerne ainsi un procédé de production d’un équivalent de derme comprenant : la formation d’une couche (i) d’au moins 200 nm d’épaisseur et d’une porosité inférieure à 5 µm par électrofilage (electrospinning ES) ou par électrofilage en impression 3D (electrowriting EW) d’une composition comprenant au moins un polymère, la formation d’une couche (ii) d’au moins 20 µm d’épaisseur et d’une porosité supérieure ou égale à 20 µm par électrofilage en impression 3D (electrowriting EW) d’une composition comprenant au moins un polymère, l’ensemencement de la couche (ii) avec des cellules du derme et/ou de l’hypoderme, dans lequel l’étape a et l’étape b sont réalisées séquentiellement dans cet ordre (a puis b) ou dans l’ordre inverse (b puis a), et dans lequel la deuxième étape d’électrofilage a lieu longitudinalement sur la couche créée par la première étape d’électrofilage. Un autre objet de l’invention a trait à un procédé de production d’un équivalent de peau comprenant le procédé de production d’un équivalent de derme ci-dessus et comprenant en outre après l’étape c) et/ou après les deux étapes a) et b), l’ensemencement de la couche (i) avec des cellules de l’épiderme. Un autre objet de l’invention se rapporte à un procédé de production d’un équivalent d’épiderme comprenant : la formation d’une couche (i) d’au moins 200 nm d’épaisseur et d’une porosité inférieure ou égale à 5 µm par électrofilage (electrospinning ES) ou par électrofilage en impression 3D (electrowriting EW) d’une composition comprenant au moins un polymère, la formation d’une couche (ii) d’au moins 20 µm d’épaisseur et d’une porosité supérieure ou égale à 20 µm par électrofilage en impression 3D (electrowriting EW) d’une composition comprenant au moins un polymère, l’ensemencement de la couche (i) avec des cellules de l’épiderme, dans lequel l’étape a et l’étape b sont réalisées séquentiellement dans cet ordre (a puis b) ou dans l’ordre inverse (b puis a), et dans lequel la deuxième étape d’électrofilage a lieu longitudinalement sur la couche créée par la première étape d’électrofilage. La présente invention concerne également un équivalent de derme et un équivalent de peau ou un équivalent d’épiderme, susceptibles d’être obtenus par les procédés de préparation selon l’invention. La présente invention a également pour objet l’utilisation d’un support comprenant : une couche d’au moins 200 nm d’épaisseur et d’une porosité inférieure ou égale à 5 µm obtenue par électrofilage (electrospinning ES) ou par électrofilage en impression 3D (electrowriting EW) d’une composition comprenant au moins un polymère, superposée longitudinalement à une couche d’au moins 20 µm d’épaisseur et d’une porosité supérieure ou égale à 20 µm, obtenue par électrofilage en impression 3D (electrowriting EW) d’une composition comprenant au moins un polymère, pour former un équivalent de peau ou un équivalent de derme ou un équivalent d’épiderme. La présente invention concerne également l’utilisation d’un équivalent de derme ou d’un équivalent de peau ou d’un équivalent d’épiderme selon l’invention pour le criblage de composés, de préférence de composés susceptibles de présenter une activité cosmétique, dermatologique ou pharmaceutique pour la peau, de préférence une activité cosmétique ou dermatologique après application topique sur la peau ou injection dans la peau. Un autre objet de l’invention concerne également un procédé de criblage d'un composé présentant une activité, de préférence de composés susceptibles de présenter une activité cosmétique, dermatologique ou pharmaceutique pour la peau, de préférence une activité cosmétique ou dermatologique après application topique sur la peau ou injection dans la peau, ledit procédé de criblage comprenant l'application d'un composé candidat sur l'équivalent de derme selon l’invention ou sur l'équivalent de peau selon l’invention ou sur l’équivalent d’épiderme selon l’invention. La présente invention concerne également un équivalent de derme selon l’invention, un équivalent de peau selon l’invention, ou un équivalent d’épiderme selon l’invention pour son utilisation dans le pansement de plaie ou pour la greffe de peau. La présente un schéma du support bicouche en coupe transversale servant à la production d’un équivalent de derme, avec en 1 la représentation schématique de la couche (i) et en 2 la couche (ii). La présente une photographie du support bicouche servant à la production d’un équivalent de derme (la barre fait 20 µm). On observe au premier plan des portions de fibres de la couche (ii) et en arrière-plan la couche (i) moins poreuse. La présente différents types de design crées par électrofilage en impression 3D et testés par les inventeurs. La barre d’échelle correspond à 100 µm. Sont représentés, de gauche à droite, un design octogonal avec des fibres de diamètre = 8,7±0,48µm, un design ondulé avec des fibres de diamètre = 11,71±0,38µm, un design décagonal avec des fibres de diamètre= 12,38±1,18 µm et un design ondulé avec des fibres de diamètre≈ 14, 5µm. La présente le support bicouche monté sur un insert Episkin à l’aide d’un joint torique. Exemples : Les inventeurs ont obtenu des modèles de peau in vitro de pleine épaisseur avec : - différents design de la couche (ii) (fibres droites selon un design octogonal et décagonal, et fibres ondulées ) - différentes distributions de porosités : couche (i) : entre 0.01 µm 2 et 0.3 µm 2 couche (ii) imprimée par électrofilage en impression 3D de polymère fondu (melt electrowriting MEW) droite octogonale : entre 10 µm 2 et 500 µm 2 couche (ii) MEW ondulée : entre 20 µm 2 et 1000 µm 2 - différentes concentrations de cellules ensemencées, (fibroblastes : de 58 000 à 1 million de cellules/cm², kératinocytes de 150 000 à 400 000 cellules/cm²) - différents revêtements de fibres (revêtement avec de l'éthanol, de la fibronectine, de la Poly-L-Lysine (PLL)), et traitement au plasma - différents diamètres de fibres (testées de 9 à 14 µm pour la couche (ii)), - différents temps de culture (pendant 11, 18, 28 et 36 jours). Dans toutes les conditions testées, les fibroblastes et les kératinocytes ont pu se fixer et reconstruire un modèle de derme (si fibroblaste uniquement) ou de peau complète (si fibroblastes et kératinocytes). Les kératinocytes forment un épiderme totalement différencié avec toutes les couches (basale, spineuse, granuleuse et stratum corneum) et expriment les marqueurs associés (kératine 10 pour les couches spineuse et granuleuse et la filaggrine pour la couche granuleuse et le stratum corneum). Grace à la couche (i), les inventeurs n'ont jamais observé d'invagination, d’infiltration ou de migration de kératinocytes dans le derme et ceci indépendamment du remplissage de la partie dermique. Les kératinocytes peuvent être ensemencés en même temps que les fibroblastes, ce qui n'est possible dans aucun support poreux sans membrane séparatrice entre l'épiderme et le derme. Suivant les designs, les inventeurs ont observé des différences. En effet la néosynthèse de la matrice extracellulaire dépend du design : - L'élastine est préférentiellement exprimée en design avec des fibres droites (et moins poreux), - La teneur en collagène 1 semble augmenter en design avec des fibres droites. En général, l'organisation de la matrice extracellulaire est corrélée au design. Exemple 1 : Formation du support bicouche avec un premier design ondulé de la couche (ii) Matériel Polycaprolactone (PURASORB PC, Corbion Inc., Gorinchem, Pays-Bas) Insert Episkin : Nacelle Episkin et joint torique (décrit dans le brevet FR688226A) Seringues pour filage électrostatique en solution : Henke-Sass, Wolf GmbH ; Tuttlingen, Allemagne Seringues pour électro-écriture fondue : Nordson EFD ; Pforzheim, Allemagne Microscope électronique à balayage, TM3030Plus, Hitachi ; Tokyo, Japon Microscope électronique à balayage Crossbeam 340, Zeiss; Oberkochen, Allemagne Imprimante par électrofilage en impression 3D de polymère fondu (melt electrowriting MEW) (Pink), sur mesure ; Université de (Würzburg ou Wuerzburg), Allemagne Système de revêtement par pulvérisation (sputter coater) EM ACE600, Leica ; Wetzlar, Allemagne Pousse seringue, World Precision Instruments; Sarasota, FL, USA Machine de découpe laser, Rayjet ; Plymouth, Michigan, États-Unis Electrofilage de la couch e (i) : Une solution à 15 % en poids de polycaprolactone (PCL) de qualité médicale (Corbion, PC-12) a été préparée dans un solvant mixte de dichlorométhane et de diméthylformamide (rapport DCM:DMF de 3:2). Le flacon en verre a été scellé et la solution a été laissée sous agitation pendant une nuit. Une seringue de 5 ml a été chargée avec la solution préparée et attachée à une buse de 27G. Un débit de 0,5 ml/h a été utilisé pour l'électrofilage des fibres de polymère. Une différence de tension de 18 kV a été appliquée entre la buse et le collecteur. Une distance buse-collecteur de 14 cm a été utilisée. Les fibres électrofilées ont été recueillies sur des lames de verre fixées à un collecteur rotatif pendant 30 minutes. La température et l'humidité de la pièce étaient respectivement de 20,8°C et 43 %. Les lames de verre recouvertes de fibres ont ensuite été utilisées comme substrats pour l'électrofilage en fusion de la couche (ii). Electrofilage en impression 3D de la couche (ii ) , Design ondulé : Une seringue remplie de pastilles de PCL a été préchauffée pendant au moins 24 heures à 75°C. Pour imprimer des grilles sinusoïdales, une buse 25G a été utilisée et la distance buse-collecteur a été fixée à 3,75 mm. Une température de buse légèrement inférieure de 70°C a été utilisée et une différence de tension de 6kV (+4,5kV à la buse et -1,5kV au collecteur) a été appliquée pour initier le jet. La pression utilisée pour extruder le polymère était de 1,5 bar. Un total de 36 couches (12 couches dans chaque direction ; trois directions) a été déposées, où chaque couche a été déposée à un angle de 120° par rapport à la couche précédente. La longueur d'onde des ondes sinusoïdales a été fixée à 2 mm et l'amplitude a été alternée entre 500 µm et 250 µm toutes les trois couches. Un diamètre de fibre de 9 à 15 µm approximativement, de préférence de 10 µm a été obtenu et la hauteur totale des échafaudages était de 400 µm environ. Exemple 2 : Formation du support bicouche avec un second design ondulé de la couche (ii) Matériel Polycaprolactone (PURASORB PC, Corbion Inc., Gorinchem, Pays-Bas) Insert Episkin : Nacelle Episkin et joint torique (décrit dans le brevet FR688226A) Seringues pour filage électrostatique en solution : Henke-Sass, Wolf GmbH ; Tuttlingen, Allemagne Seringues pour électro-écriture fondue : Nordson EFD ; Pforzheim, Allemagne Microscope électronique à balayage, TM3030Plus, Hitachi ; Tokyo, Japon Microscope électronique à balayage Crossbeam 340, Zeiss; Oberkochen, Allemagne Imprimante par électrofilage en impression 3D de polymère fondu (melt electrowriting MEW) (Pink), sur mesure ; Université de (Würzburg ou Wuerzburg), Allemagne Système de revêtement par pulvérisation (sputter coater) EM ACE600, Leica ; Wetzlar, Allemagne Pousse seringue, World Precision Instruments; Sarasota, FL, USA Machine de découpe laser, Rayjet ; Plymouth, Michigan, États-Unis Electrofilage de la couch e (i) : Une solution à 15 % en poids de polycaprolactone (PCL) de qualité médicale (Corbion, PC-12) a été préparée dans un solvant mixte de dichlorométhane et de diméthylformamide (rapport DCM:DMF de 3:2). Le flacon en verre a été scellé et la solution a été laissée sous agitation pendant une nuit. Une seringue de 5 ml a été chargée avec la solution préparée et attachée à une buse de 27G. Un débit de 0,5 ml/h a été utilisé pour l'électrofilage des fibres de polymère. Une différence de tension de 18 kV a été appliquée entre la buse et le collecteur. Une distance buse-collecteur de 14 cm a été utilisée. Les fibres électrofilées ont été recueillies sur des lames de verre fixées à un collecteur rotatif pendant 30 minutes. La température et l'humidité de la pièce étaient respectivement de 20,8°C et 43 %. Les lames de verre recouvertes de fibres ont ensuite été utilisées comme substrats pour l'électrofilage en fusion de la couche (ii). Electrofilage en impression 3D de la couche (ii ), Design ondulé : Une seringue remplie de pastilles de PCL a été préchauffée pendant au moins 24 heures à 80°C. Pour imprimer des grilles sinusoïdales, une buse 25G a été utilisée et la distance buse-collecteur a été fixée à 3,6 mm, avec une vitesse du collecteur de 180mm/min. Une température de buse légèrement inférieure de 80°C a été utilisée et une différence de tension de 6kV (+4,5kV à la buse et -1,5kV au collecteur) a été appliquée pour initier le jet. La pression utilisée pour extruder le polymère était de 2 bar. Un total de 30 couches (15 couches dans chaque direction ; deux directions) a été déposées, où chaque couche a été déposée à un angle de 90° par rapport à la couche précédente. Un diamètre de fibre de 13 à 15 µm approximativement, de préférence de 14 µm a été obtenu et la hauteur totale des échafaudages était de 400 µm environ. Exemple 3 : Formation du support bicouche avec un design droit de la couche (ii) Electrofilage de la couche (i) Une solution à 15 % de polycaprolactone (PCL) de qualité médicale (Corbion, PC-12) a été préparée dans un solvant mixte de dichlorométhane et de diméthylformamide (rapport DCM:DMF de 3:2). Le flacon en verre a été scellé et la solution a été laissée sous agitation pendant une nuit. Une seringue de 5 ml a été chargée avec la solution préparée et attachée à une buse de 27G. Un débit de 0,5 ml/h a été utilisé pour l'électrofilage de fibres polymères. Une différence de tension de 18 kV a été appliquée entre la buse et le collecteur. Une distance buse-collecteur de 14 cm a été utilisée. Les fibres électrofilées ont été recueillies sur des lames de verre fixées à un collecteur rotatif pendant 30 minutes. La température et l'humidité de la pièce étaient respectivement de 20,8 °C et 43 %. Electrofilage en impression 3D de la couche (ii) Design décagonal : Une seringue a été remplie de pastilles de PCL et préchauffée pendant au moins 24 heures à 77°C. La seringue chargée était équipée d’une buse 22G. Une pression d'air de 1,5 bar a été appliquée à la seringue et une différence de tension de 6 kV (+4,5 kV au niveau de la buse et -1,5 kV au niveau du collecteur) a été appliquée pour initier le jet de liquide. Une impression de stabilisation a été réalisée avant l'impression des structures décagonales. La conception décagonale est composée de 30 couches de fibres imprimées en quadrillage, où chaque couche a été imprimée/électro-écrite à un angle de rotation de 72° (360/5) par rapport à la couche précédente. Un espacement des fibres de 150 µm a été utilisé pour chaque couche. Une distance buse-collecteur de 3,6 mm a été utilisée pour toutes les impressions. Un diamètre de fibre de 8 à 13 µm approximativement, de préférence de 10 µm a été obtenu et la hauteur totale de la couche produite était de 400 µm environ. Exemple 4 : Obtention d’un équivalent de derme avec support bicouche ayant un design droit de la couche (ii) Pour stériliser et augmenter l'attachement des cellules, les supports bicouches ont été traités à l'éthanol. Pour permettre la culture à l’interface air-liquide, les supports bicouches ont été fixés sur des inserts de culture avec des joints toriques selon le positionnement suivant : couche (i) à l'intérieur de l’insert, couche (ii) en bas. La couche (ii) a un design octogonal. Les supports bicouches ont été lavés avec une solution saline tamponnée au phosphate. Puis, les supports bicouches ont été incubés dans un milieu de culture de fibroblastes ("FHN2D": DMEM avec 2 mM de glutamine, des antibiotiques et 10% de sérum de veau). Les fibroblastes (NHF) ont été isolés à partir tissus cutanés provenant de chirurgie plastique obtenus après consentement éclairé du patient. Ils ont été amplifiés dans un milieu FHN2D. Les NHF ont été trypsinisés (trypsine EDTA 0,05%) (4-6min à 37°C), comptés et culottés par centrifugation 5 min à 190 g. Le culot a été remis en suspension dans un milieu pour fibroblastes (« FHN3D » : DMEM avec 2mM de Glutamine, des antibiotiques, 10% de sérum de veau et 1mM d'acide ascorbique) : la concentration finale en NHF étant de 6 millions de NHF/ml de milieu FHN3D. Les inserts de culture ont été placés dans une boîte de Pétri avec les supports bicouches vers le haut (couche (ii) sur le dessus). Pour l’ensemencement des NHF : la solution de cellules a été ensemencée sur les inserts sur la couche (ii) à raison de 100 µL/insert soit 0,6 millions de NHF /cm², puis, pour permettre l'adhésion des cellules, les inserts avec cellules ont été incubés à 37°C pendant 1 heure. Pour l'étape de culture de l’équivalent de derme, les inserts ont été suspendus dans une plaque à 6 puits avec du milieu FHN3D au-dessus et en dessous des supports bicouches. Les inserts ont ensuite été incubés dans ce milieu FHN3D à 37°C, 5% CO 2 pendant 11 jours. L’équivalent de derme obtenu a été observé par microscope optique et par microscopie multiphotons. Les inventeurs ont observé l’accrochage des fibroblastes par histologie (éosine, hématoxyline, safran) avec une forme fusiforme spécifique de ces cellules, le remplissage du support par de la matrice extra-cellulaire (MEC). La microscopie multiphoton a montré une organisation du collagène 1 proche de la peau humaine. Exemple 5 : Obtention d’un équivalent de derme avec un design ondulé de la couche (ii) Dans cet exemple le même protocole que celui de l’exemple 3 est appliqué à la différence que le support bicouche utilisé a pour couche (ii) une couche avec un design ondulé. L’équivalent de derme obtenu a été observé par microscope optique et par microscopie multiphotons. Les inventeurs ont observé qu’entre l’équivalent de derme de l’exemple 4 et celui de l’exemple 5, l’accrochage des fibroblastes par histologie (éosine, hématoxyline et safran) avec une forme fusiforme spécifique de ces cellules ainsi que le remplissage du support par de la matrice extra-cellulaire (MEC) étaient plus homogènes dans l’exemple 4 ceci potentiellement due à une porosité hétérogène dans l’exemple 5. Par ailleurs la microscopie multiphoton a permis d’observer une organisation des fibres de collagène 1 différente entre les exemples 4 et 5. Ces résultats prouvent que le changement de design entraine des changements d’organisation et de remplissage de la MEC dans les supports. Exemple 6 : Obtention d’un équivalent de peau complète avec un design droit de la couche (ii) Dans cet exemple, la couche (ii) a un design décagonal. Le support a été préparé de manière similaire à l’exemple 4. Dans cet exemple, le culot de NHF a été remis en suspension dans un milieu FHN3D, la concentration finale en NHF étant de 4 millions de NHF/ml de milieu FHN3D. Les inserts de culture ont été placés dans une boîte de Pétri avec les supports bicouches vers le haut (couche (ii) sur le dessus). Pour l’ensemencement des NHF: la solution de cellules a été ensemencée sur les inserts à raison de 100µL/insert soit 0,4 millions de NHF /cm², puis, pour favoriser l'adhésion des cellules, les inserts avec cellules sont incubés à 37°C pendant 1 heure. Pour l'étape de culture de l’équivalent de derme, les inserts ont été suspendus dans une plaque à 6 puits avec du milieu FHN3D au-dessus et en dessous des supports bicouches. Puis l’équivalent de derme a été incubé dans le milieu FHN3D à 37°C, 5% CO 2 pendant 4 jours (pour 18 jours au total de culture) ou 14 jours (pour 36 jours au total de culture). Les kératinocytes (NHK) ont été isolés à partir tissus cutanés provenant de chirurgie plastique obtenus après consentement éclairé du patient et ensuite les NHK ont été amplifiés dans le milieu d'amplification G7F (Black et al. (2005) Tissue Eng. 11 :723-733), en utilisant des cellules nourricières. Les NHK obtenus ont été trypsinisés (trypsine EDTA 0,05% de 8-10 min à 37°C), comptées et culottés par centrifugation 5 min à 190g, puis le culot a été remis en suspension dans le milieu d'amplification G7F (avec acide ascorbique de 0 jusqu'à 1mM). Après avoir centrifugé les kératinocytes, ils ont été suspendus dans le milieu G7F de sorte que la concentration finale de NHK est de 0,3 million NHK/ml de milieu G7F, puis ils ont été ensemencés manuellement à l'intérieur des inserts : la concentration finale étant d’environ 0,15million NHK/cm 2 . L’équivalent de peau complète a ensuite été immergé dans un milieu G7F avec acide ascorbique de 0 jusqu'à 1mM à 37°C, 5% CO 2 et incubée pendant 3 jours pour 18 jours au total de culture et 7 jours pour 36 jours au total de culture. Puis l’équivalent de peau complète a été émergée à l’interface air-liquide dans un milieu de différentiation G3F (Black et al. (2005) Tissue Eng. 11 :723-733 + acide ascorbique 0 jusqu'à 1mM) pendant 11 pour 18 jours au total de culture ou 15 jours pour 36 jours au total de culture à 37°C, 5 % CO 2 . Les inventeurs ont observé une différentiation correcte de l’épiderme qui présente toutes les couches attendues (basale, supra-basale, granuleuse et stratum corneum). Par ailleurs le derme garde un accrochage correct des fibroblastes et aucune invagination de l’épiderme dans le derme n’est observée. La synthèse de matrices extra-cellulaire (MEC) dermique par histologie (éosine, hématoxyline et safran) et par immunofluorescence comme le collagène 1, la fibrilline, ou l’élastine, de MEC de la jonction dermo-épidermique comme le Collagène 4 et le Perlecan avec une augmentation de la quantité de ces protéines entre 18 jours et 36 jours de culture totale. Par ailleurs il a été observé une organisation du collagène par microscopie multiphoton avec un enroulement des fibres autour des fibres du support. Il a aussi été constaté une augmentation du remplissage de MEC dans le support notamment du collagène 1 (marqué par le safran ou observé en microscopie multiphoton) en réponse à la vitamine C. Exemple 7 : Obtention d’un équivalent de peau complète avec un design droit ondulé de la couche (ii) Dans cet exemple le même protocole que celui de l’exemple 6 a été appliqué, à la différence que le support bicouche utilisé a pour couche (ii) une couche avec un design ondulé. Après avoir centrifugé les kératinocytes, ils ont été suspendus dans le milieu G7F de sorte que la concentration finale de NHK est de 0,3 millions° NHK/ml de milieu G7F, puis ils ont été ensemencés manuellement à l'intérieur des inserts : la concentration finale étant d’environ 0,15 millions NHK/cm 2 . L’équivalent de peau complète a ensuite été immergé dans un milieu G7F avec acide ascorbique de 0 jusqu'à 1mM à 37°C, 5% CO 2 et incubé pendant 7 jours. Puis l’équivalent de peau complète a été émergée à l’interface air-liquide dans un milieu de différentiation G3F (Black et al. (2005) Tissue Eng. 11 :723-733) + acide ascorbique 0 jusqu'à 1mM) pendant 14 jours à 37°C, 5 % CO 2 . Les inventeurs ont observé qu’entre l’équivalent de peau de l’exemple 6 et celui de l’exemple 7 la synthèse de matrices extra-cellulaire (MEC) dermiques par histologie (éosine, hématoxyline et safran) et par immunofluorescence comme le collagène 1, la fibrilline, ou l’élastine, de MEC de la jonction dermo-épidermique comme le Collagène 4 et le Perlecan avec une augmentation de la quantité de ces protéines entre 18 jours et 36 jours de culture totale. Par ailleurs il a été observé une organisation du collagène par microscopie multiphoton avec un enroulement des fibres autour des fibres du support. Il a aussi été constaté une augmentation du remplissage de MEC dans le support notamment du collagène 1 (marqué par le safran ou observé en microscopie multiphoton) en réponse à la vitamine C. Les différences entre les exemples 6 et 7 résident dans l’organisation des protéines de la matrice plus hétérogène dans l’exemple 7 avec présence de zones vides, une plus faible expression de l’élastine dans l’exemple 7 et une organisation des fibres de collagène 1 différente (vue par microscopie multiphoton) avec association des fibres de collagène 1 en bundle plus importants dans l’exemple 7. Ces résultats prouvent que le changement de design et de porosité entraine des changements d’organisation, de remplissage et de contenu de la MEC dans les supports. Procédé de production d’un équivalent de derme comprenant : la formation d’une couche (i) d’au moins 200 nm d’épaisseur et d’une porosité inférieure ou égale à 5 µm par électrofilage (electrospinning ES) ou par électrofilage en impression 3D (electrowritting EW) d’une composition comprenant au moins un polymère, la formation d’une couche (ii) d’au moins 20 µm d’épaisseur et d’une porosité supérieure ou égale à 20 µm par électrofilage en impression 3D (electrowriting EW) d’une composition comprenant au moins un polymère, l’ensemencement de la couche (ii) avec des cellules du derme et/ou de l’hypoderme, dans lequel l’étape a et l’étape b sont réalisées séquentiellement dans cet ordre ou dans l’ordre inverse, et dans lequel la deuxième étape d’électrofilage a lieu longitudinalement sur la couche créée par la première étape d’électrofilage, à l’exclusion de cellules souches embryonnaires humaines. Procédé de production d’un équivalent de peau comprenant le procédé de production d’un équivalent de derme selon la revendication 1 et comprenant en outre après l’étape c) et/ou après les deux étapes a) et b), l’ensemencement de la couche (i) avec des cellules de l’épiderme. Procédé de production selon l’une quelconque des revendications 1 à 2, dans lequel la couche (i) est remplie ou enduite avec un ou des agents bioactifs, éventuellement sous forme d’hydrogel mimant la matrice de la jonction dermo-épidermique, et/ou dans lequel la couche (ii) est remplie ou enduite avec un ou des agents bioactifs, éventuellement sous forme d’un hydrogel mimant la matrice du derme. Procédé de production selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel les cellules du derme et/ou de l’hypoderme sont cultivées en immersion ou à l’interface air-liquide dans un milieu adapté. Procédé de production d’un équivalent d’épiderme comprenant : la formation d’une couche (i) d’au moins 200 nm d’épaisseur et d’une porosité inférieure ou égale à 5 µm par électrofilage (electrospinning ES) ou par électrofilage en impression 3D (electrowriting EW) d’une composition comprenant au moins un polymère, la formation d’une couche (ii) d’au moins 20 µm d’épaisseur et d’une porosité supérieure ou égale à 20 µm par électrofilage en impression 3D (electrowriting EW) d’une composition comprenant au moins un polymère, l’ensemencement de la couche (i) avec des cellules de l’épiderme, dans lequel l’étape a et l’étape b sont réalisées séquentiellement dans cet ordre ou dans l’ordre inverse, et dans lequel la deuxième étape d’électrofilage a lieu longitudinalement sur la couche créée par la première étape d’électrofilage, à l’exclusion de cellules souches embryonnaires humaines. Procédé de production selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel la couche (ii) est formée par électrofilage en impression 3D d’une composition comprenant au moins un polymère fondu (melt electrowriting MEW) ou comprenant au moins un polymère en solution. Procédé de production selon les revendications 2 à 6, dans lequel les cellules de l’épiderme sont cultivées en immersion ou à l’interface air-liquide dans un milieu adapté. Equivalent de derme obtenu par le procédé de l’une quelconque des revendications 1, 3 à 4 et 6. Equivalent de peau obtenu par le procédé de l’une quelconque des revendications 2 à 4 et 6 à 7. Equivalent d’épiderme obtenu par le procédé de l’une quelconque des revendications 5 à 7. Utilisation d’un support comprenant : une couche d’au moins 200 nm d’épaisseur et d’une porosité inférieure ou égale à 5 µm obtenue par électrofilage (electrospinning ES) ou par électrofilage en impression 3D (electrowriting EW) d’une composition comprenant au moins un polymère, superposée longitudinalement à une couche d’au moins 20 µm d’épaisseur et d’une porosité supérieure ou égale à 20 µm, obtenue par électrofilage en impression 3D (electrowriting EW) d’une composition comprenant au moins un polymère, pour former avec des cellules un équivalent de peau ou un équivalent de derme ou un équivalent d’épiderme, à l’exclusion de cellules souches embryonnaires humaines. Utilisation d’un support selon la revendication 11, dans lequel la couche d’au moins 20 µm d’épaisseur et d’une porosité supérieure ou égale à 20 µm, est formée par électrofilage en impression 3D d’une composition comprenant au moins un polymère fondu (melt electrowriting MEW) ou en solution. Utilisation in vitro d’un équivalent de derme selon la revendication 8 ou d’un équivalent de peau selon la revendication 9 ou d’un équivalent d’épiderme selon la revendication 10 pour le criblage de composés, de préférence de composés présentant une activité cosmétique, dermatologique ou pharmaceutique pour la peau. Procédé in vitro de criblage d'un composé présentant une activité, de préférence de composés présentant une activité cosmétique, dermatologique ou pharmaceutique pour la peau, ledit procédé de criblage comprenant l'application d'un composé candidat sur l'équivalent de derme selon la revendication 8 ou sur l'équivalent de peau selon la revendication 9 ou sur l’équivalent d’épiderme selon la revendication 10. Equivalent de derme selon la revendication 8, pour son utilisation dans le pansement de plaie ou pour la greffe de peau. Equivalent de peau selon la revendication 9, pour son utilisation dans le pansement de plaie ou pour la greffe de peau. Equivalent d’épiderme selon la revendication 10, pour son utilisation dans le pansement de plaie ou pour la greffe de peau.