Brevet FR3128231A1 — publié le 20230421

TITRE DE L’INVENTION : PROCÉDÉ ET DISPOSITIF DE DESSALAGE ET DE CONCENTRATION OU D’ANALYSE D’UN ÉCHANTILLON D’ACIDES NUCLÉIQUES Le procédé de dessalage et de concentration d’un échantillon d’acides nucléiques plus conducteur qu’un tampon d’analyse, comporte, au moins une itération d’une alternance : - d’une étape d’écoulement laminaire de l’échantillon dans un capillaire muni d’une restriction locale de sa section, dans un premier sens d’écoulement, pendant laquelle l’échantillon est soumis à une première différence de potentiel électrique dont l’action sur les molécules d’acides nucléiques est opposée au premier sens d’écoulement et provoque la retenue de molécules d’acides nucléiques dans le capillaire, - d’une étape d’écoulement laminaire de l’échantillon, dans un deuxième sens d’écoulement opposé au premier sens d’écoulement. Figure pour l’abrégé : Figure 10. PROCÉDÉ ET DISPOSITIF DE DESSALAGE ET DE CONCENTRATION OU D’ANALYSE D’UN ÉCHANTILLON D’ACIDES NUCLÉIQUES Domaine technique de l’invention La présente invention vise un procédé et un dispositif de dessalage et de concentration ou d’analyse d’un échantillon d’acides nucléiques. Elle s’applique, en particulier, à la concentration et à l’analyse de fragments d’ADN circulant et au diagnostic médical, notamment pour certains cancers. État de la technique L’ADN circulant dans le plasma sanguin est l’enjeu d’une intense recherche clinique actuellement en oncologie, car on peut y retrouver des mutations de l’ADN génomique présentes dans les cellules tumorales, qui orientent la thérapie à administrer au patient. Ces mutations, ou d’autres modifications du génome, peuvent servir de biomarqueur pour suivre l’évolution du cancer. Or, d’une façon générale, il manque des biomarqueurs faciles à suivre dans le cadre des cancers. Par exemple, pour le cancer du pancréas, le seul biomarqueur de suivi utilisé en routine actuellement est le Ca 19.9 (Antigène carbohydrate 19.9) dosé dans le sang circulant. La sensibilité de ce biomarqueur est de 79% et sa spécificité de 82% dans ce cadre-là. Cependant, le taux de Ca 19.9 est élevé dans d’autres pathologies pancréatiques bénignes comme la pancréatite aiguë, et dans d’autres cancers digestifs. La recherche de biomarqueurs innovants est donc nécessaire, non seulement pour améliorer le diagnostic précoce du cancer du pancréas, mais aussi pour évaluer le pronostic de ces patients, leur suivi et notamment leur réponse aux traitements. Il est établi que le sang véhicule une petite quantité d’ADN libre circulant provenant de la libération de matériel génétique par les tissus. Cet ADN libre circulant hors cellule (ADNcf) est sous la forme d’ADN double-brin d’une taille moyenne de 150-180pb correspondant à l’enroulement de l’ADN autour du nucléosome. Sa durée de vie est de moins de deux heures, avant qu'il ne soit filtré et éliminé de la circulation sanguine par la rate, le foie et les reins. Toutes les études s’accordent en une détection quantitative de base de l’ADNcf chez les individus sains et en son augmentation liée à différentes situations cliniques telles que les Accidents Vasculaires Cérébraux (AVC) et infarctus myocardiques, les exercices musculaires intensifs, l’insuffisance rénale aiguë, la cytolyse hépatique, les traumatismes, la chirurgie, le cancer, la présence d’un fœtus lors de la gestation... Dans le cas du cancer, les progrès récents de la biologie moléculaire et du séquençage de l’ADN ont permis d’identifier de nombreuses mutations de gènes impliqués dans l’oncogenèse à partir de l’ADN circulant tumoral (ADNct). Une étude de 2014 de Bettegowda et al. a montré que le taux d’ADN tumoral circulant serait corrélé à la charge tumorale et au stade du cancer : il serait plus bas pour les cancers localisés que pour les cancers métastatiques. L’utilisation en routine de l’ADNct comme biomarqueur tumoral donne des perspectives dans le dépistage, le diagnostic, la décision thérapeutique et le suivi des patients atteints de cancer. Seulement une dizaine d’études se sont intéressées à l’ADNct chez des patients porteurs d’un cancer du pancréas réséqué. Dans la majorité de ces publications l’ADNct est détecté par la recherche de mutations KRAS par PCR (acronyme de Polymerase Chain Reaction pour réaction en chaine par polymérase). Mais l’adénocarcinome pancréatique présente de nombreuses autres mutations portants sur les gènes Tp53 ou p16. Ainsi il est plus avantageux du point de vue clinique d’effectuer des analyses complémentaires de ces gènes par séquençage haut débit (NGS). Les mécanismes contribuant à la production d'ADNcf comportent l'apoptose, la nécrose, la NETose, la sécrétion active des cellules qui entraine la libération d’ADN sous forme de véhicules extracellulaires (VE), l'altération des mécanismes de clairance. Ces mécanismes peuvent se différencier en fonction de la taille d’ADNcf qui est détecté dans la circulation sanguine. Ainsi, les phénomènes physiologiques et pathologiques à l’origine de la libération passive et active d’ADN libre, se distinguent à l’aune de leur taille. Dans le cas du cancer du pancréas, quelques articles très récents traitent de l’intérêt de mesurer la taille de l’ADNcf. Ainsi, Lapin M. et al. (“ Fragment size and level of cell-free DNA provide prognostic information in patients with advanced pancreatic cancer ”. J Transl Med, 2018. 16(1): p. 300.) montrent, en 2018, que la taille des fragments d'ADNct et les concentrations d'ADNct peuvent être utilisées pour prédire l'issue de la maladie chez les patients atteints d'un cancer du pancréas avancé. Zvereva M. et al. (“ Circulating tumour-derived KRAS mutations in pancreatic cancer cases are predominantly carried by very short fragments of cell-free DNA .” EBioMedicine, 2020. 55: p. 102462.) montrent que la proportion de cas présentant des mutations KRAS détectables par PCR est inversement proportionnelle à l'augmentation de la longueur des amplicons ; seulement la moitié des cas avec une PCR de 218 pb présente un ADNct détectable par rapport à ceux détectés avec des amplicons de moins de 80 pb. Enfin Liu X. et al. (“ Enrichment of short mutant cell-free DNA fragments enhanced detection of pancreatic cancer. ” EBioMedicine, 2019. 41: p. 345-356.) montrent qu’il est possible d’enrichir la détection de mutations en créant des processus NGS adaptés à des fragments de très courtes tailles. Concernant les limites actuelles à l’utilisation de l’ADNcf comme biomarqueur en routine diagnostic, les principaux obstacles sont liés : a/ aux processus pré-analytiques ; l’ADNcf peut être contaminé par la libération artéfactuelle d'ADN leucocytaire in vitro, il est donc fondamental d’utiliser des protocoles standardisés. b/ à la normalisation de l'extraction d’ADNcf et sa quantification ; il existe une grande variété de "protocoles internes" mais dans la plupart des cas, il n’existe aucune véritable stratégie de contrôle qualité et de standardisation des méthodes de quantification et normalisation de l'ADNcf extrait. c/ à l’absence de méthode générale pan-tumeurs permettant de caractériser l’ADNcf ; en l’absence d’anomalies génomiques somatiques, la caractérisation du profil de la taille du cfDNA, et donc son origine, est une piste très intéressante mais les approches actuelles sont soit trop complexes et coûteuses, soit insuffisamment sensibles pour un profilage de tous les patients, quel que soit le stade de la maladie, sujets sains compris. Le dispositif décrit dans les documents PCT/EP2015/067826 et WO/2014/020271 permet de déterminer facilement et de façon économique la caractérisation du profil de taille du cfDNA. Afin d'analyser l'ADN, le dispositif opère en deux étapes de concentration et de séparation réalisées en ligne. D'abord, l'ADN est concentré via un système de capillaires formé de la jonction d'un petit capillaire et d'un autre de plus grande section. Les chercheurs font s’écouler de façon laminaire une solution contenant de l'ADN dans le grand capillaire et utilisent un champ électrique pour ralentir la migration. A cause du cisaillement apporté par l’écoulement laminaire, cette contre-électrophorèse fait apparaître une force transverse, dépendante de la taille de l’ADN, qui pousse l’ADN vers les parois. Le changement de vitesse d'écoulement et de champ électrique au niveau de la constriction permet d'arrêter l'ADN et de le concentrer comme une « galette ». En effet, en amont de la constriction, l’écoulement et la contre-électrophorèse sont lents, provoquant une faible force transverse. L’ADN se trouve donc dans la masse de l’écoulement, et avance vers la constriction. En revanche, en aval de la constriction, l’écoulement et la contre-électrophorèse sont rapides plaquant fortement l’ADN à la paroi, à un endroit où l’écoulement laminaire est très faible, et où la contre-électrophorèse domine. L’ADN recule alors vers la constriction, par contre-électrophorèse, le long de la paroi. Cette galette est ensuite libérée par la baisse progressive du champ électrique, ce qui permet également d'effectuer l'opération de séparation en fonction de la taille des fragments. Cette technologie est appelée « µLAS » dans la suite de la description. La est un schéma d’un tel dispositif 40. Ce dispositif 40 peut être installé dans une CE (acronyme de « Capillary electrophoresis » ou électrophorèse capillaire) Agilent (marque déposée), à la place d’un capillaire standard. La longueur totale du dispositif est d’environ 30 cm, longueur minimale qui peut être installée dans une CE Agilent, qui permet d’appliquer pression et voltage aux bornes du dispositif capillaire. On trouve, de l’entrée (« inlet ») 41 vers la sortie (« outlet ») 42 : - un embout d’injection 43, de 5,5 cm de long et de 40µm de diamètre ; cet embout sert de filtre, et permet de positionner la chambre d’injection à l’intérieur de la cassette ventilée de la CE Agilent, au-delà de l’électrode. - une chambre d’injection 44, constituée d’un segment de capillaire de deux cm de long, qui présente un grand diamètre interne, par exemple de 350 µm. - un capillaire de séparation 45, de diamètre interne de 40 µm et long de neuf cm. La mesure 46 en fluorescence des molécules d’ADN a lieu sept cm après la jonction de concentration. - un capillaire distal 47 de 100 µm de diamètre interne et de 13 cm de long, qui permet de rejoindre le flacon de sortie sur la CE Agilent. Ce capillaire 47 présente un plus grand diamètre que le capillaire 45 de façon que sa résistance électrique et sa résistance hydraulique soient petites devant les résistances cumulées de l’embout d’injection 43 et du capillaire de séparation 45. Si le capillaire de séparation 45 allait jusqu’à l’outlet 42, le voltage et la pression à appliquer pour retenir des petits fragments d’ADN seraient au-delà de ce que permet l’instrument. Les dimensions données ci-dessus, ne sont que des exemples. Par exemple, un diamètre de capillaire un peu plus élevé peut être adapté aux très grands fragments d’ADN (200 kb), ou la façon d’assembler les capillaires peut être modifiée pour faire du fractionnement d’ADN, par exemple pour favoriser la quantité d’ADN qu’on peut stocker à une jonction, au détriment de la résolution d’analyse. La zone de concentration se trouve à la jonction entre la chambre d’injection 44 et le capillaire de séparation 45. Dans la suite de la description, on considère que ce capillaire distal 47 ne joue pas de rôle dans la concentration des fragments d’ADN. La représente la séquence typique d’une analyse d’ADN avec ce dispositif 40. Le capillaire distal 47 n’est pas représenté dans cette figure. Au cours d’une opération 51, l’échantillon est injecté dans le dispositif, par l’application d’une pression pendant une durée donnée. Au cours d’une opération 52, l’échantillon injecté est poussé par pression au milieu de la chambre d’injection 44. Au cours d’opérations 53 et 54, l’ADN est concentré à la jonction de concentration 48 de la chambre d’injection 44, par l’application d’une pression et d’un voltage. Au démarrage de la concentration, le capillaire de séparation 45 se remplit de la solution de l’échantillon, sauf les plus grands fragments d’ADN, qui restent retenus à la jonction de concentration 48. Au cours d’une opération 55, l’ADN retenu à la jonction de concentration 48 est séparé selon la taille par une baisse progressive du champ électrique appliqué entre l’inlet 41 et l’outlet 42, la pression étant en général maintenue constante. Les fragments d’ADN sont détectés par fluorescence lors de leur passage devant le détecteur 46. Typiquement, lors de l’étape de concentration, on applique les ordres de grandeurs physiques suivants pour retenir des fragments d’ADN aussi petits que 100 bp : - voltage : 25 000 V - pression : 10 bars - la viscosité et la résistivité de la solution dans le capillaire sont respectivement de 40 mPa.s et 12,4 Ω.m à 25°C. Dans le capillaire de séparation 45, on obtient : - un champ électrique de 1500 V/cm et - une vitesse fluidique moyenne de 9 mm/s. La valeur du champ électrique donnée ci-dessus est valable tant que la conductivité de l’échantillon est proche de, ou inférieure à, celle du tampon d’analyse (environ 12,4 Ω.m à 25°C). Ceci est en général le cas quand l’ADN est purifié au préalable, et repris dans un tampon peu conducteur. Mais quand l’échantillon contient des sels, la résistance électrique du capillaire de séparation chute soudainement au démarrage de la concentration (étape 53), et le champ électrique présent au niveau de la jonction de concentration 48 chute brutalement, et peut ne plus suffire à concentrer les plus petits fragments d’ADN. Le phénomène est exposé de façon analytique et schématique ci-dessous, pour un dispositif qui serait parfaitement symétrique de part et d’autre de la chambre d’injection 44. Quand on applique un voltage U aux bornes du dispositif capillaire, un courant électrique s’établit, selon la loi d’Ohm , R étant la résistance électrique du dispositif, et i le courant électrique. Localement, en tout point de la longueur du dispositif, la loi d’Ohm s’écrit : , avec E le champ électrique en Volt par mètre, ρ la résistivité électrique de l’électrolyte en Ohm.mètre, et S la section du dispositif capillaire en mètre carré, au point considéré, i , exprimé en ampère, étant constant tout le long du dispositif. Quand on injecte un échantillon salé, donc de faible résistivité ρ, dans un dispositif, puis qu’on applique pression et voltage pour le concentrer, après un court moment, l’embout 43 du dispositif est rempli du tampon d’analyse, typiquement de l’ordre de ρ=10 Ω.m, alors que le capillaire de séparation 45 est rempli de la solution de l’échantillon, typiquement ρ=0,7 Ω.m pour du plasma humain, ce qui correspond environ à 130 mM de NaCl. Puisque, dans l’embout 43 comme dans le capillaire de séparation on a [Math 1] , les champs électriques E 1 et E 2 présents respectivement dans l’embout et le capillaire de séparation sont dans un rapport [Math 2] . Le champ électrique dans le capillaire de séparation 45, qui doit retenir l’ADN dans la chambre d’injection 44, ne vaut donc que 7% de la valeur du champ électrique dans l’embout du dispositif. Pour obtenir un champ électrique de 1500 V/cm dans le capillaire de séparation, il faudrait alors un champ électrique de 21400 V/cm dans l’embout 43, qui n’est pas atteignable en pratique à cause de l’échauffement par effet Joule que cela engendrerait, cet échauffement entrainant à son tour un dégazage de l’électrolyte dans le capillaire, d’où la formation de bulles d’air coupant la continuité électrique de l’électrolyte, annulant quasiment tout champ électrique en aval, dans le capillaire de séparation. On peut modéliser le champ électrique à la sortie de la jonction de concentration 48 et à la sortie du dispositif tout au long d’un procédé de concentration/séparation tel que décrit dans les étapes 53 à 55, pour un dispositif 40 auquel on applique 25000 Volts. On représente, en , le champ électrique 70 calculé à un millimètre en aval de la jonction de concentration 48, en fonction du temps. A t=0, l’échantillon est au milieu de la chambre d’injection 44, avec un volume égal à la moitié du volume de la chambre d’injection 44, soit environ 1 µL. L’échantillon a une conductivité de 0,7 Ω.m. Le champ électrique est calculé un mm après la jonction de concentration 48, sans tenir compte de l’effet de l’échauffement du capillaire 45 par effet Joule sur la conductivité et la viscosité de la solution, ni du phénomène d’électroosmose qui accélère l’écoulement. Le débit est alors de 0,68 µL/min tout au long de l’analyse. Pendant une phase 71, l’échantillon est complètement à l’intérieur de la chambre d’injection 44 ; le capillaire de séparation et le capillaire d’entrée, ainsi que le capillaire distal, sont complètement remplis du tampon d’analyse, qui a une conductivité de 12,4 Ω.m. Le champ électrique vaut 1500 V/cm, champ largement suffisant pour retenir les fragments de 100 bp. Pendant une phase 72, l’échantillon de faible résistivité rempli rapidement le capillaire de séparation 45, qui représente un volume de 0,11 µL. Quand l’interface entre l’échantillon et le tampon d’analyse arrive au point d’observation, à 1 mm en aval de la jonction de concentration, le champ électrique chute brutalement à environ 90 V/cm ; puis il remonte légèrement au fur et à mesure que le capillaire de séparation se rempli d’échantillon. Pendant une phase 73, l’échantillon rempli encore en partie la chambre d’injection 44, il remplit complètement le capillaire de séparation 45, et il remplit progressivement le capillaire distal 47, qui représente un volume de 1,02 µL. Le champ électrique s’élève lentement jusqu’à 215 V/cm. Un tel champ est très insuffisant pour retenir les plus petits fragments d’ADN. Pendant une phase 74, l’échantillon est complètement évacué de la chambre d’injection 44, et se retire rapidement du capillaire de séparation 45, puis plus lentement du capillaire distal 47 ; le champ augmente brutalement au moment où l’échantillon ne remplit plus le point d’observation, mais remplit encore l’essentiel du capillaire de séparation 45. Pendant une phase 75, l’échantillon de conductivité 0,7 Ω.m est complètement évacué du dispositif. On retrouve le champ électrique initial de 1500 V/cm. A l’extrémité distale du capillaire de séparation 45, avant le capillaire distal 47, on observe un profil similaire, mais décalé dans le temps puisque l’interface entre échantillon et tampon d’analyse arrive plus tard à ce niveau. La faiblesse du champ électrique pendant les phases 72 et 73 empêche la concentration des plus petits fragments d’ADN. La description en regard des figures 5 à 9 illustre expérimentalement le phénomène sur un échantillon d’ADN étalon ainsi que sur un échantillon réel d’ADN circulant. On y voit qu’au-delà de 10 mM NaCl dans l’échantillon, les fragments de 100 bp ne sont plus complètement retenus, et qu’au-delà de 20 mM NaCl, ces fragments ne sont quasiment plus retenus. En outre, la , qui montre l’ampérage circulant dans le capillaire pendant l’étape de concentration, illustre la cinétique d’évacuation des sels du dispositif. Présentation de l’invention La présente invention vise à remédier à tout ou partie de ces inconvénients. A cet effet, selon un premier aspect, la présente invention vise un procédé de dessalage et de concentration d’un échantillon d’acides nucléiques plus conducteur qu’un tampon d’analyse, procédé qui comporte, au moins une itération d’une alternance : - d’une étape d’écoulement laminaire de l’échantillon dans un capillaire muni d’une restriction locale de sa section, dans un premier sens d’écoulement, pendant laquelle l’échantillon est soumis à une première différence de potentiel électrique dont l’action sur les molécules d’acides nucléiques est opposée au premier sens d’écoulement et provoque la retenue de molécules d’acides nucléiques dans le capillaire, - d’une étape d’écoulement laminaire de l’échantillon, dans un deuxième sens d’écoulement opposé au premier sens d’écoulement. Les inventeurs ont découvert que, quand le champ électrique est insuffisant pour retenir les petits fragments d’ADN à la jonction de concentration, ces fragments fuient dans le capillaire de séparation. Mais les phénomènes mis en œuvre les poussent toujours vers la paroi, même si ce plaquage à la paroi est insuffisant pour que la contre-électrophorèse soit plus forte que l’écoulement fluidique. Il s’ensuit que la vitesse de migration de ces fragments d’ADN est plus faible que la vitesse moyenne de l’écoulement. En revanche, les ions formant les sels sont trop petits pour qu’il apparaisse une force transverse les poussant vers la paroi, et ils avancent à la vitesse moyenne de l’écoulement, plus ou moins leur vitesse d’électrophorèse selon leur charge positive ou négative. Ainsi, on arrête l’opération de concentration avant que les plus petits fragments arrivent à l’extrémité du capillaire de séparation 45 et on applique une pression, seule ou en présence d’une différence de potentiel, en sens contraire de la pression initiale pour ramener le volume du capillaire de séparation dans la chambre d’injection. Puis, on effectue une nouvelle étape de concentration et, éventuellement, on réitère cette alternance de phases de retour et de concentration. Les sels s’évacuent ainsi progressivement du dispositif, alors que les molécules d’ADN sont essentiellement conservées. Les petits fragments d’ADN peuvent donc être analysés correctement, ce qui était impossible avec les dispositifs et procédés de l’art antérieur. Dans des modes de réalisation, au cours de l’étape d’écoulement laminaire de l’échantillon, dans le deuxième sens d’écoulement, l’échantillon est soumis à une deuxième différence de potentiel électrique dont l’action sur les molécules d’acides nucléiques est opposée au premier sens d’écoulement. On note que la deuxième différence de potentiel peut être égale, supérieure ou inférieure à la première différence de potentiel. Ainsi, les molécules encore proches des parois du capillaire de séparation reviennent plus rapidement dans la chambre d’injection que lors d’un retour par pression simple. En effet, d’une part l’électrophorèse s’ajoute à l’écoulement, et l’électrophorèse est de vitesse constante dans un plan transversal à l’écoulement, contrairement à l’écoulement fluidique laminaire, qui est nul à la paroi et maximal au centre. Et, d’autre part, il apparaît une force transverse poussant cette fois les molécules vers le centre de la veine fluidique (et non vers les parois, comme c’est le cas pendant la phase de concentration), là où l’écoulement est plus rapide. Dans des modes de réalisation, le procédé comporte, de plus, une étape de mesure de l’ampérage circulant dans le capillaire pendant au moins une étape d’écoulement dans le premier sens d’écoulement et une étape de sélection d’un nombre d’itérations de l’alternance en fonction de l’ampérage mesuré. Grâce à ces dispositions, on estime la conductivité de l’échantillon, représentative de sa salinité par l’intermédiaire de la mesure du courant traversant l’échantillon et, en fonction de cette salinité, on choisit un nombre d’alternances d’écoulements dans un sens puis dans l’autre permettant de réduire cette salinité à un niveau favorable. Dans des modes de réalisation, le nombre d’itérations de l’alternance est une fonction croissante de l’ampérage d’un pic de cet ampérage mesuré ou d’un pic d’une dérivée de cet ampérage mesuré. Les inventeurs ont observé que la hauteur d’au moins un pic de l’ampérage mesuré ainsi que le pic de la dérivée première de l’ampérage mesuré sont des fonctions croissantes de la salinité de l’échantillon. Dans des modes de réalisation, le procédé comporte, de plus, une étape de mesure de l’ampérage circulant dans le capillaire pendant au moins une étape d’écoulement dans le premier sens d’écoulement et une étape de sélection d’une durée d’au moins une étape d’écoulement dans le premier sens d’écoulement. L’estimation de la salinité permet d’estimer la vitesse de déplacement des petits fragments d’acides nucléiques. On choisit donc une durée d’écoulement évitant que ces petits fragments sortent du capillaire. Dans des modes de réalisation, la durée sélectionnée est une fonction décroissante de l’ampérage d’un pic de cet ampérage mesuré ou d’un pic d’une dérivée de cet ampérage mesuré. Dans des modes de réalisation, le procédé comporte, après une itération de l’alternance, une étape de changement de tampon d’analyse, le nouveau tampon d’analyse présentant un pH inférieur à celui du tampon d’analyse précédemment utilisé. Par exemple, dans un échantillon biologique comportant des protéines, certaines de ces protéines sont chargées positivement et se fixent alors aux parois du capillaire, ainsi qu’aux acides nucléiques, qui sont chargées négativement. Ceci entraîne un collage des acides nucléiques aux parois, collage délétère pour l’analyse. En choisissant un tampon à pH élevé, la majorité des protéines est chargée négativement, et le collage des acides nucléiques aux parois est réduit, voire disparaît. Mais, à pH élevé, une séparation des acides nucléiques n’est pas aussi résolue qu’à pH neutre ou légèrement acide. Avec un changement de tampon, on restaure la capacité de séparation des acides nucléiques. Selon un deuxième aspect, la présente invention vise un procédé d’analyse d’un échantillon d’acides nucléiques, qui comporte les étapes du procédé de dessalage et de concentration d’un échantillon objet de l’invention et, après la dernière itération de l’alternance, une étape de séparation par écoulement laminaire de l’échantillon dans le capillaire dans le premier sens d’écoulement, pendant laquelle l’échantillon est soumis à une différence de potentiel électrique inférieure ou égale à la première différence de potentiel, dont l’action sur les molécules d’acides nucléiques est opposée au premier sens d’écoulement et provoque une retenue partielle de molécules d’acides nucléiques dans le capillaire. On retient ainsi partiellement, les acides nucléiques, ce qui améliore leur séparation en fonction de leur taille. Dans des modes de réalisation, au cours de l’étape de séparation, la différence de potentiel électrique est décroissante. Les plus grands fragments d’acides nucléiques sont ainsi retenus plus longtemps dans le dispositif capillaire, si bien que l’analyse des tailles des acides nucléiques est plus fine. Dans des modes de réalisation, le procédé d’analyse comporte, pendant ou après l’étape de séparation, une étape de mesure d’un profil temporel de fluorescence des molécules d’acides nucléiques et une étape de conversion du profil temporel de fluorescence en un profil de concentration en molécules d’acides nucléiques de différentes longueurs, par la mise en œuvre d’un profil de fluorescence d’un échantillon étalon, dont on connaît la concentration pour chaque longueur de molécule d’acide nucléiques. On réalise ainsi une analyse des échantillons avec une compensation des variations expérimentales qui existent d’un jour à l’autre, en termes de temps de passage de l’ADN devant le détecteur 46 et en termes d’intensité de fluorescence. Selon un troisième aspect, la présente invention vise un dispositif de dessalage et de concentration ou d’analyse d’un échantillon d’acides nucléiques plus conducteur qu’un tampon d’analyse, qui comporte : - un capillaire muni d’une restriction locale de sa section, - un moyen de mise en écoulement laminaire de l’échantillon dans le capillaire, dans un premier sens d’écoulement, - un moyen d’application d’une première différence de potentiel électrique pendant l’écoulement dans le premier sens, différence de potentiel dont l’action sur les molécules d’acides nucléiques est opposée au premier sens d’écoulement et provoque la retenue de molécules d’acides nucléiques dans le capillaire, - un moyen de mise en écoulement laminaire de l’échantillon dans le capillaire, dans un deuxième sens d’écoulement opposé au premier sens d’écoulement et - un moyen de commande des moyens de mise en écoulement laminaire et du moyen d’application de la première différence de potentiel configuré pour commander au moins une itération d’une alternance, - d’un écoulement laminaire de l’échantillon dans le capillaire dans le premier sens d’écoulement, écoulement pendant lequel l’échantillon est soumis à la première différence de potentiel électrique et - d’un écoulement laminaire de l’échantillon dans le deuxième sens d’écoulement. Dans des modes de réalisation, le capillaire est formé d’un canal microfluidique. Les avantages, buts et caractéristiques particulières de ce procédé d’analyse et de ce dispositif étant similaires à ceux du procédé de dessalage et de concentration ou d’analyse d’un échantillon d’acides nucléiques objet de l’invention, ils ne sont pas rappelés ici. Brève description des figures D’autres avantages, buts et caractéristiques particulières de l’invention ressortiront de la description non limitative qui suit d’au moins un mode de réalisation particulier du dispositif de dessalage et de concentration ou d’analyse objet de la présente invention, en regard des dessins annexés, dans lesquels : représente, schématiquement, un dispositif capillaire de l’art antérieur. représente une séquence de fonctionnement typique d’une analyse d’ADN avec le dispositif illustré en . représente un champ électrique calculé, au cours du temps, à un mm en aval de la jonction de concentration du dispositif illustré en fonctionnant comme illustré en , quand l’échantillon présente une conductivité 18 fois plus élevée que celle du tampon d’analyse. représente un résultat d’analyse pour un échantillon d’ADN non salé, avec le dispositif illustré en fonctionnant comme illustré en . représente un résultat d’analyse pour des échantillons d’ADN étalon plus ou moins salés, avec le dispositif illustré en fonctionnant comme illustré en . rapporte les aires des pics de la , en fonction de la concentration en NaCl dans l’échantillon. montre l’ampérage circulant dans le capillaire pendant l’étape de concentration des analyses représentées en , illustrant la cinétique d’évacuation des sels du dispositif illustré en . représente l’analyse d’un échantillon d’ADN circulant purifié contenant plus ou moins de sel, avec le dispositif illustré en fonctionnant comme illustré en . représente l’évolution de l’aire du premier pic et du deuxième pic des graphes de la en fonction de la concentration en NaCl dans l’échantillon, avec le dispositif illustré en fonctionnant comme illustré en . représente une séquence de fonctionnement typique d’une analyse d’ADN avec le procédé objet de l’invention mettant en œuvre deux retours. représente une analyse réalisée avec le dispositif illustré en fonctionnant selon la séquence illustrée en , pour des échantillons comportant plus ou moins de sel. rapporte les aires des pics de la , en fonction de la concentration en NaCl dans l’échantillon. illustre le positionnement temporel des deux durées de retours dans le chronogramme d’un mode de réalisation du procédé, retours pendant lesquels, puisqu’aucun voltage électrique n’est appliqué, le courant électrique est nul. représente le résultat d’une analyse avec le dispositif illustré en fonctionnant selon la séquence illustrée en pour des échantillons d’ADNcf préalablement purifiés comportant plus ou moins de sel. représente l’évolution de l’aire du premier pic et du deuxième pic des courbes la en fonction de la concentration en NaCl, avec le dispositif illustré en fonctionnant comme illustré en . représente une analyse réalisée avec le dispositif illustré en fonctionnant selon une séquence à six retours, pour des échantillons étalons comportant plus ou moins de sel. rapporte les aires des pics de la , en fonction de la concentration en NaCl dans l’échantillon. représente le résultat d’une analyse avec le dispositif illustré en fonctionnant selon une séquence à six retours pour des échantillons d’ADNcf préalablement purifiés comportant plus ou moins de sel. représente l’évolution de l’aire du premier pic et du deuxième pic des courbes de la en fonction de la concentration en NaCl, avec le dispositif illustré en fonctionnant selon une séquence à six retours. montre le résultat de l’analyse d’un plasma avec une séquence comportant sept retours avec changement de tampon. montre le courant électrique obtenu lors de l’étape de concentration à pH8 de l’analyse illustrée en , avec sept retours. montre le courant électrique obtenu lors de la dernière étape de concentration de l’analyse illustrée en avec un changement de tampon. montre la comparaison de migrations d’un échantillon étalon seul ou dans le plasma, dans un procédé à sept retours. montre la comparaison des migrations d’un échantillon étalon seul ou dans le plasma, dans un procédé à sept retours. représente une analyse d’un échantillon d’ADN circulant directement à partir du plasma avec tracé de fluorescence représente un profil de concentration selon la taille pour l’analyse illustrée en . représente une analyse du même échantillon d’ADN circulant que celui des figures 25 et 26, après purification de l’ADN à partir du plasma, avec tracé de fluorescence. représente un profil de concentration selon la taille pour l’analyse illustrée en . représente un résultat d’analyse avec un procédé de concentration/séparation sans retour sur des grands fragments d’ADN. représente un résultat d’analyse avec un procédé de concentration/séparation avec un retour sur des grands fragments d’ADN. représente un dispositif microfluidique pour la mise en œuvre du procédé objet de l’invention. illustre, sous forme d’un logigramme, des étapes d’un mode de réalisation particulier du procédé objet de l’invention. Procédé de dessalage et de concentration d’un échantillon d’acides nucléiques plus conducteur qu’un tampon d’analyse, procédé caractérisé en ce qu’il comporte, au moins une itération d’une alternance : - d’une étape d’écoulement laminaire de l’échantillon dans un capillaire muni d’une restriction locale de sa section, dans un premier sens d’écoulement, pendant laquelle l’échantillon est soumis à une première différence de potentiel électrique dont l’action sur les molécules d’acides nucléiques est opposée au premier sens d’écoulement et provoque la retenue de molécules d’acides nucléiques dans le capillaire, - d’une étape d’écoulement laminaire de l’échantillon, dans un deuxième sens d’écoulement opposé au premier sens d’écoulement. Procédé selon la revendication 1, dans lequel, au cours de l’étape d’écoulement laminaire de l’échantillon dans le deuxième sens d’écoulement, l’échantillon est soumis à une deuxième différence de potentiel électrique dont l’action sur les molécules d’acides nucléiques est opposée au premier sens d’écoulement. Procédé selon l’une des revendications 1 ou 2, qui comporte, de plus, une étape de mesure de l’ampérage circulant dans le capillaire pendant au moins une étape d’écoulement dans le premier sens d’écoulement et une étape de sélection d’un nombre d’itérations de l’alternance en fonction de l’ampérage mesuré. Procédé selon la revendication 3, dans lequel le nombre d’itérations de l’alternance est une fonction croissante de l’ampérage d’un pic de cet ampérage mesuré ou d’un pic d’une dérivée de cet ampérage mesuré. Procédé selon l’une des revendications 1 à 4, qui comporte, de plus, une étape de mesure de l’ampérage circulant dans le capillaire pendant au moins une étape d’écoulement dans le premier sens d’écoulement et une étape de sélection d’une durée d’au moins une étape d’écoulement dans le premier sens d’écoulement. Procédé selon la revendication 5, dans lequel la durée sélectionnée est une fonction décroissante de l’ampérage d’un pic de cet ampérage mesuré ou d’un pic d’une dérivée de cet ampérage mesuré. Procédé selon l’une des revendications 1 à 6, qui comporte, après une itération de l’alternance, une étape de changement de tampon d’analyse, le nouveau tampon d’analyse présentant un pH inférieur à celui du tampon d’analyse précédemment utilisé. Procédé d’analyse d’un échantillon d’acides nucléiques, qui comporte les étapes du procédé de dessalage et de concentration d’un échantillon selon l’une des revendications 1 à 7 et, après la dernière itération de l’alternance, une étape de séparation par écoulement laminaire de l’échantillon dans le capillaire dans le premier sens d’écoulement, pendant laquelle l’échantillon est soumis à une différence de potentiel électrique inférieure ou égale à la première différence de potentiel, dont l’action sur les molécules d’acides nucléiques est opposée au premier sens d’écoulement et provoque une retenue partielle de molécules d’acides nucléiques dans le capillaire. Procédé selon la revendication 8, dans lequel, au cours de l’étape de séparation, la différence de potentiel électrique est décroissante. Procédé selon l’une des revendications 8 ou 9, qui comporte, pendant ou après l’étape de séparation, une étape de mesure d’un profil temporel de fluorescence des molécules d’acides nucléiques et une étape de conversion du profil temporel de fluorescence en un profil de concentration en molécules d’acides nucléiques de différentes longueurs, par la mise en œuvre d’un profil de fluorescence d’un échantillon étalon, dont on connaît la concentration pour chaque longueur de molécule d’acide nucléiques. Dispositif de dessalage et de concentration ou d’analyse d’un échantillon d’acides nucléiques plus conducteur qu’un tampon d’analyse, caractérisé en ce qu’il comporte : - un capillaire muni d’une restriction locale de sa section, - un moyen de mise en écoulement laminaire de l’échantillon dans le capillaire, dans un premier sens d’écoulement, - un moyen d’application d’une première différence de potentiel électrique pendant l’écoulement dans le premier sens, différence de potentiel dont l’action sur les molécules d’acides nucléiques est opposée au premier sens d’écoulement et provoque la retenue de molécules d’acides nucléiques dans le capillaire, - un moyen de mise en écoulement laminaire de l’échantillon dans le capillaire, dans un deuxième sens d’écoulement opposé au premier sens d’écoulement et - un moyen de commande des moyens de mise en écoulement laminaire et du moyen d’application de la première différence de potentiel configuré pour commander au moins une itération d’une alternance, - d’un écoulement laminaire de l’échantillon dans le capillaire dans le premier sens d’écoulement, écoulement pendant lequel l’échantillon est soumis à la première différence de potentiel électrique et - d’un écoulement laminaire de l’échantillon dans le deuxième sens d’écoulement. Dispositif selon la revendication 11, dans lequel le capillaire est formé d’un canal microfluidique.