Brevet FR3128229A1 — publié le 20230421

L’invention concerne un procédé in vitro ou ex vivo de production et d’isolement d’une sous-population de cellules T spécifiques d’un antigène lié à une maladie d’intérêt, qui comporte des étapes d’obtention, à partir d’un échantillon biologique humain isolé, d’une population de cellules mononucléées comprenant des cellules T spécifiques dudit antigène à forte capacité de prolifération, de culture de ces cellules mononucléées dans un milieu de culture cellulaire adapté contenant l’antigène, et d’isolement de cellules T spécifiques de l’antigène qui n’expriment pas à leur surface les marqueurs CD45RO et CD27. Les cellules T effectrices terminales humaines ainsi obtenues et isolées trouvent notamment application pour le traitement de ladite maladie d’intérêt. CELLULES T EFFECTRICES TERMINALES, PROCÉDÉ POUR LEUR PRODUCTION ET LEUR ISOLEMENT ET LEUR UTILISATION THÉRAPEUTIQUE La présente invention s’inscrit dans le domaine de la thérapie cellulaire contre les pathologies infectieuses et chroniques, notamment les maladies infectieuses sévères telles que la Covid-19. Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé pour la production et l’isolement de cellules T effectrices terminales spécifiques d’un antigène lié à une maladie d’intérêt, ainsi que les cellules T effectrices terminales obtenues par un tel procédé. L’invention concerne également l’utilisation thérapeutique de telles cellules, et une composition pharmaceutique les contenant. L’émergence du nouveau coronavirus humain SARS-CoV-2 à l’automne 2019 et l’expansion de son épidémie en pandémie mondiale a révélé la nécessité de disposer de solutions thérapeutiques d’urgence afin d’enrayer rapidement la progression de la pandémie en l’absence de vaccin. Plusieurs traitements utilisés contre les maladies infectieuses et/ou chroniques ont été repositionnés pour la prise en charge des patients de la Covid-19, comme décrit notamment dans la publication de Mashouri et al., 2021, Biochem. Pharmacol. 183: 114296. Il s’agit par exemple de la chloroquine et l’hydroxychloroquine, l’azithromycine, l’oméprazole, l’ivermectine, etc. Cependant, les essais cliniques conduits dans de nombreux pays sur les patients infectés n’ont pas été concluants. Les molécules antivirales connues pour être des inhibiteurs de l’ARN polymérase virale, telles que le remdesivir, la ribovirine ou le favipiravir, ont également été testées sans succès. D’autres molécules inhibitrices de la protéase virale, telles que le dolutégravir, le nelfinavir ou le lopinavir, n’ont pas non plus montré d’effets thérapeutiques contre la Covid-19. Enfin, des inhibiteurs de l’endocytose et de la fusion entre la membrane virale et cellulaire, telles que l’arbidol et l’hydrochloroquine, ont été aussi testés, mais sans succès. Il en résulte que ni le repositionnement, ni le développement de molécules n’ont montré d’efficacité convaincante contre la Covid-19. Le transfert de plasma de donneurs convalescents qui ont contrôlé et éliminé l’infection par le SARS-CoV-2 a été un des grands espoirs de traitement de première urgence, comme décrit notamment dans la publication de Ghareeb et al., 2021, J. Pharm. Investig., p1-16. L’innocuité et l’efficacité du plasma de convalescents de la Covid-19 ont été testées d’abord dans le traitement des patients présentant des symptômes légers à modérés de Covid-19 arrivant aux services d’urgence, afin de prévenir la sévérité de cette maladie causée par le SARS-CoV-2. Par la suite, les autorités sanitaires des Etats-Unis ont délivré une autorisation d’utilisation d’urgence pour traiter les patients hospitalisés atteints de Covid-19 avec du plasma convalescent de personnes qui se sont rétablies du virus. Cependant, cet espoir thérapeutique s’est voué à l’échec pour plusieurs raisons : la quantité de plasma disponible est insuffisante ; les titres d’anticorps neutralisants dans ce plasma sont faibles ; un grand nombre de convalescents perdent les anticorps neutralisants très rapidement. Enfin, des traitements à base d’anticorps monoclonaux produits artificiellement ont été associés à des résultats encourageants. On peut citer à cet égard le bamlanivimab et le REGN-CoV, anticorps monoclonaux produits respectivement par les sociétés Eli Lilly et Regeneron. Ces anticorps sont conçus pour se fixer directement sur les spicules du virus et bloquer leur interaction avec les récepteurs cellulaires, de sorte à abolir l’infection. Ils sont cependant très coûteux et donc peu accessibles. Plusieurs études montrent que lors de l'infection par le SARS-CoV-2, la réactivité des lymphocytes T, impliqués dans la réponse immune cellulaire, semble déterminante pour le contrôle de l'évolution de la maladie (Yang et al., 2021, Clin. Transl. Immunol. 10(3): e1259). Des essais de thérapies cellulaires ont ainsi été réalisés visant à stimuler les réponses immunes cellulaires. La première stratégie proposée par l’art antérieur concerne l’utilisation des cellules souches issus de sang de cordon ou de placenta comme sources capables de stimuler l’immunité chez les patients infectés. La seconde stratégie concerne la réimplantation de cellules T autologues du patient (CAR/TCR-T). Cette technologie consiste à modifier ex vivo les cellules T du patient à l’aide de récepteur à l’antigène chimérique. Ces cellules T modifiées reconnaissent spécifiquement les cellules exprimant les antigènes et les éradiquent par cytolyse. Cependant, outre la lourdeur de la mise en place de cette technologie pour une application à large échelle, elle est aussi associée à des effets secondaires très importants représentés essentiellement par le syndrome de libération de cytokine, qui correspond à une réaction sévère des réponses immunitaires. Un intérêt a par ailleurs été porté sur l’utilisation des cellules T de l’immunité de donneurs convalescents. En effet, plusieurs études ont révélé que contrairement aux anticorps neutralisants qui tendent à disparaitre rapidement dans le sang périphérique chez les patients convalescents de la Covid-19, les cellules T spécifiques du virus persistent plus longtemps et peuvent être amplifiées en culture in vitro . Cependant, l’utilisation des cellules T spécifiques du virus en transfert adoptif d’immunité se heurte aux problèmes liés aux effets secondaires associés au syndrome des réponses immunitaires du greffon contre l’hôte ("Graft versus host" : GVH), entrainant des maladies très graves. Pour espérer une chance de succès, les donneurs et les receveurs doivent posséder une compatibilité préalable de leurs antigènes des leucocytes humains (HLA). Ceci limite fortement et alourdit le processus thérapeutique. La présente invention vise à proposer une solution pour le traitement thérapeutique de la Covid-19, et plus généralement des maladies infectieuses, notamment virales, et/ou des maladies chroniques, qui présente une bonne efficacité, qui soit simple et rapide à mettre en œuvre, et qui ne soit pas associée à des effets secondaires pouvant entrainer la mort du patient, notamment à des maladies du type du rejet du greffon et des réponses immunes du greffon contre l’hôte. A cet effet, les présents inventeurs se sont intéressés à un type de cellules T particulier, plus précisément les cellules T effectrices à différenciation terminale, également nommées « cellules T effectrices terminales ». Ces cellules, qui se caractérisent par une très courte durée de vie, de l’ordre de quelques jours, seront désignées dans la présente description, pour plus de commodité, par le sigle CTEACDs (pour Cellules T Effectrices A Courte Durée). Les présents inventeurs ont découvert que de telles cellules spécifiques d’une maladie, après avoir été traitées in vitro d’une manière spécifique, et isolées des autres sous-populations de lymphocytes T, de par leur cytotoxicité, sont capables de reconnaitre les cellules atteintes par cette maladie et de les éliminer rapidement de l’organisme. En particulier, il a été découvert par les présents inventeurs que : plus de 95 % de telles CTEACDs d’origine humaine de type CD8+ sont granzyme B+ et plus de 40 % d’entre elles sécrètent également l’IFN-gamma ; et plus de 50 % de telles CTEACDs d’origine humaine de type CD4+ sont granzyme B+ et plus de 40 % d’entre elles produisent l’IFN-gamma. De telles CTEACDs présentent ainsi toutes les caractéristiques de cellules effectrices cytotoxiques armées pour éradiquer les cellules infectées, si bien que la mise en œuvre de telles cellules dans un traitement par thérapie cellulaire curative permet de combattre efficacement la maladie, et ce de manière tout à fait inattendue étant donné la courte durée de vie qui les caractérise, de l’ordre de 3 à 5 jours en culture cellulaire. Cette courte durée de vie évite par ailleurs avantageusement, après introduction de ces cellules dans l’organisme, les effets secondaires indésirables tels que les réactions de rejet connues sous le nom de maladie du greffon contre l’hôte. Ces cellules T spécifiques sont en outre simples et rapides à produire et purifier, si bien qu’elles constituent un actif thérapeutique facile d’accès. Selon un premier aspect, la présente invention concerne un procédé in vitro ou ex vivo de production et d’isolement d’une sous-population de cellules T spécifiques d’un antigène lié à une maladie d’intérêt, plus précisément d’une population de cellules T effectrices terminales (CTEACDs), se caractérisant par un caractère cytotoxique et une courte durée de vie, spécifiques de cet antigène. Ce procédé comporte des étapes de : - a/ à partir d’un échantillon biologique humain isolé, obtention d’une population de cellules mononucléées comprenant des cellules T spécifiques dudit antigène à forte capacité de prolifération, - b/ culture desdites cellules mononucléées pendant 24 à 72 heures dans un milieu de culture cellulaire adapté contenant ledit antigène, de sorte à provoquer la différenciation des cellules T effectrices à mémoire, pour produire des cellules T effectrices terminales, de préférence dans des conditions permettant de maximaliser la production de ces dernières, - et c/ isolement du milieu de culture de cellules T spécifiques dudit antigène qui n’expriment pas à leur surface les marqueurs CD45RO et CD27. Ces cellules T spécifiques de l’antigène qui n’expriment pas à leur surface les marqueurs CD45RO et CD27 sont des CTEACDs spécifiquement dirigées contre les cellules pathologiques associées à la maladie d’intérêt. Elles présentent, administrées à un sujet atteint de la maladie d’intérêt, dans le cadre d’un traitement de la maladie par thérapie cellulaire, la capacité de reconnaitre ces cellules pathologiques et de les éliminer rapidement de l’organisme. Elles ne provoquent en outre chez ce sujet aucune réaction indésirable, notamment du type de rejet du greffon, susceptible d’entrainer sa mort. Le procédé selon l’invention est avantageusement simple et rapide à mettre en œuvre. Il peut comprendre une étape préalable d’identification, pour une maladie d’intérêt visée, d’un antigène lié à cette maladie, contre lequel les cellules T produites dans l’organisme vont être spécifiquement dirigées, et qui sera mis en œuvre dans le cadre du procédé, pour l’étape b/ de culture cellulaire. L’homme du métier pourra, pour une telle identification, se référer à la littérature publiée sur le sujet, ou procéder de manière empirique. A titre d’exemple, pour la maladie Covid-19, un antigène associé est, comme indiqué ci-avant, le virus SARS-CoV-2 ; le virus H1N1 est un antigène associé à la grippe ; la protéine de la myéline basale est un antigène associé à la sclérose en plaque ; dans le cadre des cancers, on connait également par exemple les néoantigènes associés au développement tumoral ou les antigènes spécifiques de tumeur (AST). L’étape a/ d’obtention d’une population de cellules mononucléées comprenant des cellules T spécifiques de l’antigène à forte capacité de prolifération peut être réalisée de toute manière connue de l’homme du métier. On entend dans la présente description, par cellules T à forte capacité de prolifération, de manière classique en elle-même, des cellules T qui sont capables d’effectuer au moins une à deux divisions par 24 heures. De telles cellules T sont notamment des cellules T effectrices à différentiation terminale et des cellules T effectrices à mémoire. Dans des modes de mise en œuvre particuliers de l’invention, l’étape a/ d’obtention d’une population de cellules mononucléées comprenant des cellules T spécifiques de l’antigène, à forte capacité de prolifération, comprend l’identification d’un échantillon biologique de sang périphérique adulte humain, isolé du corps humain, comprenant une population de cellules T spécifiques de l’antigène à forte capacité de prolifération, et l’isolement de cellules mononucléées à partir de cet échantillon biologique. L’identification d’un échantillon biologique de sang périphérique humain comprenant une population de cellules T spécifiques de l’antigène visé et à forte capacité de prolifération peut être réalisée de toute manière classique en elle-même. Après s’être procuré un échantillon de sang périphérique humain isolé du corps humain, l’homme du métier peut notamment procéder à des tests visant tout d’abord à déterminer si cet échantillon comprend une population de cellules T spécifiques de l’antigène, puis si ces cellules T présentent ou non une forte capacité de prolifération. A cet effet, toutes méthodes classiques en elles-mêmes pour l’homme du métier peuvent être mises en œuvre. A titre d’exemple, pour déterminer si un échantillon de sang périphérique humain isolé du corps humain donné contient ou non une population de cellules T spécifiques de l’antigène visé, il peut être mis en œuvre la technique immunoenzymatique connue sous le nom d’Elispot (pour l’anglais « enzyme-linked immunospot »), méthode utilisée de manière standard pour la mesure de la proportion des cellules effectrices dans une population hétérogène de cellules. Schématiquement, cette méthode consiste à déposer, dans des puits de plaques multi-puits sur les surfaces desquels sont fixés des anticorps spécifiques de cytokines (IL-2, IFN-γ ou TNF-α par exemple), l’échantillon à analyser en mélange avec l’antigène cible. En présence de cellules T spécifiques de cet antigène dans l’échantillon, il se produit alors une sécrétion de cytokines, qui sont capturées par les anticorps présents dans les puits. Les spots ainsi formés témoignent de la présence dans l’échantillon de cellules effectrices spécifiques de l’antigène étudié, la proportion ces cellules dans l’échantillon pouvant en outre même être quantifiée. Il entre dans les compétences de l’homme du métier de déterminer les conditions opératoires exactes de mise en œuvre de cette technique Elispot pour chaque échantillon de sang périphérique humain et chaque antigène spécifique visés. Afin de déterminer si la capacité de prolifération de certaines au moins de ces cellules T spécifiques de l’antigène visé présentes dans l’échantillon est ou n’est pas suffisamment forte pour pouvoir utiliser l’échantillon pour la suite du procédé selon l’invention, l’homme du métier peut mettre en œuvre toute méthode classique en elle-même de déterminer de la cadence de division cellulaire d’une cellule. Cette cadence de division peut par exemple être mesurée soit par un test de prolifération disponible dans le commerce, soit par marquage des cellules avec un colorant vital, notamment l’ester succinimidylique de carboxyfluorescéine (CFSE, pour l’anglais Carboxyfluorescein succinimidyl ester), suivi par cytométrie en flux de la dilution du colorant suite aux divisions cellulaires se produisant. L’étape d’isolement de cellules mononucléées de sang périphérique (désignées par l’abréviation PBMCs, pour l’anglais Peripheral Blood Mononuclear Cells) à partir de l’échantillon de sang périphérique humain identifié comme comprenant une population de cellules T spécifiques de l’antigène à forte capacité de prolifération, c’est-à-dire identifié comme adéquat pour servir de base à la mise en œuvre des étapes du procédé selon l’invention, peut être réalisée de toute manière connue de l’homme du métier, par exemple par centrifugation d’un échantillon de sang périphérique humain recueilli sur acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA 5mM) afin d’éviter sa coagulation, et récupération du culot cellulaire obtenu. La population de cellules mononucléées ainsi isolées obtenues à l’issue de cette étape d’isolement contient typiquement des cellules T effectrices à mémoire spécifiques de l’antigène. Dans des modes de mise en œuvre préférés de l’invention, l’échantillon biologique de sang périphérique humain est un échantillon de sang périphérique d’un individu humain ayant été atteint au moins une fois par la maladie d’intérêt, et se trouvant de préférence en phase de convalescence, c’est-à-dire quelques jours à quelques mois après la cessation des symptômes de la maladie. Un tel échantillon est hautement susceptible de contenir une forte proportion de cellules T spécifiques de l’antigène associé à la maladie et à forte capacité de prolifération, ayant été produites par l’individu en réaction à la contraction de la maladie. Autrement, l’échantillon biologique de sang périphérique humain peut par exemple être un échantillon de sang périphérique d’un individu humain ayant été immunisé contre la maladie, par vaccination (cet individu pouvant également, le cas échéant, avoir contracté la maladie avant et/ou après l’administration du vaccin). L’étape b/ du procédé selon l’invention, de culture des cellules mononucléées obtenues à partir de l’échantillon biologique, notamment d’un échantillon biologique de sang périphérique humain, en présence de l’antigène, permet avantageusement de produire des CTEACDs spécifiques de cet antigène, par différenciation in vitro des cellules T effectrices à mémoire présentes dans la population de cellules mononucléées mises en œuvre. Il entre dans les compétences de l’homme du métier de choisir un milieu de culture cellulaire adéquat pour cette culture. A titre de tel milieu de culture, on peut citer par exemple le milieu commercial RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute), notamment supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal, 1% de solution de pénicilline/streptomycine, 1% de tampon HEPES et 1% de glutamine. Un autre exemple de tel milieu de culture cellulaire est le milieu sans sérum commercialisé sous la dénomination AIM-V® par la société Gibco. Les cellules peuvent cultivées dans un incubateur pour culture cellulaire, de préférence à 37 °C, et préférentiellement sous 5% de CO 2 et/ou une humidité saturante. La concentration d’antigène à appliquer dans le milieu de culture cellulaire dépend de l’antigène particulier mis en œuvre. Il est du ressort de l’homme du métier de déterminer cette concentration, de sorte à maximaliser la quantité de CTEACDs spécifiques de l’antigène produites à l’issue de l’étape b/ de culture cellulaire. A cet effet, l’homme du métier peut procéder de manière empirique, en testant plusieurs doses d’antigène différentes et en déterminant la dose qui, tout en étant non léthale pour les cellules, permet d’obtenir le plus haut taux de production des CTEACDs. Ce taux de production peut par exemple être déterminé par le test Elispot décrit ci-dessus. Dans des modes de mise en œuvre particuliers de l’invention, l’étape b/ de culture des cellules mononucléées est réalisée pendant une durée comprise entre 36 à 60 heures, par exemple pendant une durée d’environ 48 heures. Une telle caractéristique permet avantageusement de produire une quantité importante de CTEACDs tout en assurant que la durée de vie restant à ces CTEACDs à l’issue de cette étape de culture soit la plus longue possible. L’étape c/ d’isolement du milieu de culture des cellules T effectrices spécifiques de l’antigène qui n’expriment pas à leur surface les marqueurs CD45RO et CD27 peut être réalisée de toute manière connue de l’homme du métier. Elle peut notamment être réalisée par recueil de cellules T effectrices enrichies en cellules T spécifiques de l’antigène contenues dans le milieu de culture, puis chromatographie d’affinité au moyen d’anticorps spécifiques des marqueurs moléculaires CD45RO et CD27, les cellules T qui n’expriment pas à leur surface les marqueurs CD45RO et CD27 étant présentes dans la fraction non liée. Le recueil des cellules T effectrices enrichies en cellules spécifiques de l’antigène, grâce à la stimulation antigénique préalable, contenues dans le milieu de culture peut par exemple être réalisé au moyen de centrifugation à 3000 t/min à 4°C puis re-suspension du culot dans du tampon phosphate salin. L’étape suivante d’isolement des CTEACDs du reste des cellules T spécifiques de l’antigène, c’est-à-dire des cellules T indifférenciées ou non totalement différenciées, tire avantageusement profit du fait que les CTEACDs humaines n’expriment pas à leur surface les marqueurs moléculaires CD45RO et CD27, glycoprotéines qui sont exprimées par les autres types de cellules T humaines, en particulier par les cellules T à mémoire. La mise en œuvre d’une étape de chromatographie d’affinité, au moyen d’anticorps anti-CD45RO et anti-CD27, immobilisés sur support solide, permet avantageusement de séparer rapidement et efficacement les CTEACDs des autres sous-populations lymphocytaires du milieu. Le support solide mis en œuvre à cet effet peut être de tout type classique en lui-même. Il peut notamment s’agir de billes magnétiques sur lesquelles sont greffés ces anticorps, mises en œuvre au sein d’un système de purification par effet magnétique tel que le système magnétique commercialisé par la société Miltenyi Biotec sous la dénomination MidiMACS®. Préférentiellement, l’ensemble des étapes du procédé sont réalisées en environnement stérile, et de préférence à une température comprise entre 18 et 20 °C, à l’exception de l’étape b/ de culture cellulaire, qui est quant à elle de préférence réalisée à 37 °C. Un autre aspect de l’invention concerne des cellules T effectrices terminales humaines isolées obtenues par un procédé selon l’invention, c’est-à-dire sous forme d’une sous-population purifiée de cellules T obtenue in vitro ou ex vivo , séparée des autres sous-populations de cellules T par purification, ces cellules T effectrices terminales étant spécifiques de l’antigène lié à la maladie d’intérêt. Comme indiqué ci-avant, ces cellules T effectrices terminales CTEACDs présentent un phénotype CD45RO- et CD27-. Elles sont particulièrement adaptées pour une utilisation en tant que médicament, en particulier pour le traitement de la maladie d’intérêt associée à l’antigène contre lequel elles sont spécifiquement dirigées. Transférées chez le sujet qui développe cette maladie, ces CTEACDs éradiquent efficacement les cellules pathologiques, et elles disparaissent dans les 5 jours post-administration, si bien qu’elles ne déclenchent aucune réaction de rejet par l’organisme. Les CTEACDs obtenues par le procédé selon l’invention peuvent notamment être utilisées pour le traitement d’une maladie d’intérêt de type maladie infectieuse, en particulier d’une pathologie virale, telle que la grippe ou une infection provoquée par un coronavirus, en particulier par un SARS-CoV responsable du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS) ou par un MERS-CoV responsable d’une atteinte respiratoire potentiellement sévère (MERS). Cette pathologie peut notamment être la Covid-19, provoquée par le virus SARS-CoV-2. Les CTEACDs obtenues par le procédé selon l’invention peuvent autrement être utilisées pour le traitement d’une maladie d’intérêt de type maladie chronique non transmissible, telle que le cancer, la sclérose en plaque, etc. De manière plus générale, les CTEACDs obtenues par le procédé selon l’invention peuvent notamment être utilisées pour le traitement de toute maladie d’intérêt à laquelle peut être associé un antigène susceptible de provoquer la production par l’organisme humain de lymphocytes T spécifiques. On entend dans la présente description, par le terme « traitement », l'obtention d’un effet pharmacologique et physiologique souhaité. Le terme « traitement », tel qu’il est utilisé dans la présente description, comprend la guérison partielle ou totale de la maladie et/ou la disparition totale ou partielle d’un ou plusieurs de ses symptômes. Les CTEACDs selon l’invention peuvent être administrées à tout sujet en ayant besoin, c’est-à-dire atteint ou susceptible d’être atteint par la maladie d’intérêt. Ce sujet peut notamment être un mammifère, et en particulier un humain. Préférentiellement, les cellules T effectrices terminales selon l’invention sont administrées à un sujet en ayant besoin, c’est-à-dire atteint par la maladie, moins de 4 jours, de préférence moins de 3 jours et préférentiellement moins de 2 jours, après leur production, c’est-à-dire après la fin de l’étape b/ de culture cellulaire du procédé selon l’invention. Les CTEACDs selon l'invention sont administrées au sujet dans une quantité thérapeutiquement efficace. Par "quantité thérapeutiquement efficace", on entend la quantité suffisante pour assurer le traitement de la maladie. Cette quantité dépend de plusieurs facteurs, tels que la maladie et sa gravité, l'âge, le poids, etc., du sujet à traiter, la voie et la forme d'administration, etc. La quantité thérapeutiquement efficace des CTEACDs utilisée selon l'invention sera déterminée par le médecin pour chaque cas individuel. L’administration des CTEACDs selon l’invention au sujet à traiter peut être réalisée par toute voie classique en elle-même dans le domaine de la thérapie cellulaire, les voies parentérales, par exemple la voie sous-cutanée, intradermique, sous-durale, intraveineuse, intramusculaire, intrathécale, intrapéritonéale, intracérébrale, intra-artérielle ou intra-lésionnelle, ou la voie intranasale, étant particulièrement préférées dans le cadre de l’invention. En particulier, les modes d’administration systémiques sont privilégiés pour le traitement des maladies infectieuses, notamment les modes d’administration par injection, par exemple l’injection intraveineuse. Pour le traitement des maladies chroniques non transmissibles, l’injection intra-tumorale ou l’administration par voie muqueuse, notamment intranasale, seront plus particulièrement privilégiées. La détermination de la posologie d’administration des CTEACDs selon l’invention relève des compétences du médecin. Les CTEACDs peuvent notamment être administrées au sujet à traiter à une seule reprise, ou à plusieurs reprises, espacées de quelques jours à quelques semaines. L’invention s’exprime également dans les termes d’un procédé de traitement thérapeutique d’un sujet souffrant d’une maladie d’intérêt, en particulier d’une maladie infectieuse, notamment virale, ce procédé comprenant une étape d’administration à ce sujet en ayant besoin d’une quantité thérapeutiquement efficace de cellules T effectrices terminales selon l’invention spécifiques d’un antigène lié à cette maladie d’intérêt. Ce procédé peut répondre à l’une ou plusieurs des caractéristiques décrites ci-avant en référence à l’utilisation thérapeutique de ces cellules T effectrices terminales en tant que médicament. L’invention concerne également l’utilisation de cellules T effectrices terminales selon l’invention pour la fabrication d’un médicament, notamment d’un médicament pour traiter les maladies infectieuses, en particulier virales. Un autre aspect de l’invention concerne une composition pharmaceutique contenant des cellules T effectrices terminales selon l’invention, en tant que principe actif, dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable. On entend dans la présente description, par « véhicule pharmaceutiquement acceptable », tout véhicule utile pour la préparation d'une composition pharmaceutique et qui est généralement sûr, non toxique et ni biologiquement ni autrement indésirable pour le sujet à traiter, en particulier pour les mammifères et notamment les humains. Le véhicule de la composition pharmaceutique selon l'invention peut être liquide ou semi-solide. Il peut s'agir d'un diluant, d'un adjuvant ou de tout autre véhicule classique en lui-même pour la constitution des compositions pharmaceutiques, par exemple d’un véhicule aqueux, huileux, etc. La composition pharmaceutique selon l’invention peut se présenter sous toute forme galénique, notamment sous forme adaptée à une administration par voie parentérale, notamment intraveineuse, ou intranasale. A titre d’exemples de telles formes galéniques, non limitatives de l’invention, on peut citer les formes de suspension injectable. La composition pharmaceutique selon l'invention peut en outre contenir un ou plusieurs excipients / additifs classiques en eux-mêmes pour la constitution des compositions pharmaceutiques dans le domaine de la thérapie cellulaire, par exemple choisis parmi les stabilisants, les antioxydants, les agents de suspension, les agents isotoniques, les tensioactifs, les ajusteurs de pH, les agents tampons, etc., ou l'un quelconque de leurs mélanges. La composition pharmaceutique selon l’invention peut en outre contenir un ou plusieurs principes actifs autres que les CTEACDs selon l’invention, ces principes actifs pouvant ou non agir de manière synergique avec ces cellules. La composition pharmaceutique selon l’invention est de préférence formulée sous forme de doses unitaires. L’invention concerne également l’utilisation thérapeutique d’une composition pharmaceutique selon l’invention, telle que définie ci-avant, pour le traitement d’une maladie, en particulier d’une maladie infectieuse, notamment virale. Cette utilisation peut répondre à l’une ou plusieurs des caractéristiques décrites ci-avant en référence à l’utilisation thérapeutique des CTEACDs selon l’invention. Les caractéristiques et avantages de l’invention apparaîtront plus clairement à la lumière des exemples de mise en œuvre ci-après, fournis à simple titre illustratif et nullement limitatifs de l’invention, avec l’appui des figures 1 à 5, dans lesquelles : La montre des images de cytométrie de flux pour des CTEACDs humaines isolées de cellules mononucléées de sang humain issues d’un individu immunisé ayant été infecté par le virus de la grippe dans le passé, stimulées avec l’antigène de la grippe, les différentes fenêtres représentant respectivement : a/ la totalité des cellules mononucléées de sang humain (PBMCs) ; b/ les cellules individuelles, non agrégées entre elles ; c/ les cellules vivantes ; d/ les lymphocytes ; e/ les lymphocytes T CD8+ ; f/ les lymphocytes T CD8+ effectrices ; g/ les lymphocytes T CD8+ effectrices qui produisent les granules lytiques Granzyme B. La représente un graphe montrant, pour une analyse immunologique par ELISPOT mesurant le nombre de cellules sécrétant l’IFN-gamma, la caractérisation immunologique de la fonctionnalité de cellules mononucléées de sang humain (PBMCs) et de CTEACDs humaines isolées de ces PBMCs stimulées avec l’antigène de la grippe, issues de deux individus donneurs différents convalescents ayant été infectés par le virus de la grippe dans le passé (donneur 1 et donneur 2). La représente un graphe montrant, en fonction du temps, le % de viabilité cellulaire de CTEACDs humaines isolées de cellules mononucléées de sang humain issues d’un individu ayant été infecté par le virus de la grippe dans le passé et ayant développé une immunité contre ce virus, stimulées avec l’antigène de la grippe, le jour 0 correspond au jour d’isolement des CTEACDs après leur production. La représente un graphe montrant le % de viabilité cellulaire in vitro pour des cellules humaines HEK293 (« HEK ») et des cellules canines MDCK (« MDCK ») infectées par le virus H1N1, 7 jours après l’infection par 103 ou 105 particules infectieuses, les cellules ayant été cultivées seules (« 103 H1N1 », « 105 H1N1 ») ou en présence, à partir de 2 jours après l’infection, de CTEACDs humaines isolées de cellules mononucléées de sang humain issues d’un individu ayant été infecté par le virus de la grippe dans le passé et ayant développé une immunité contre le virus, stimulées avec l’antigène de la grippe H1N1 (« 103 H1N1 + CTEACD », « 105 H1N1 + CTEACD ») ; « Contrôle » représente des cellules non infectées cultivées seules et « CTEACD » représente des cellules non infectées co-cultivées avec les CTEACD. La représente des graphes montrant le % de viabilité cellulaire in vitro pour des cellules humaines HEK293 en A/ et des cellules canines MDCK en B/, ces cellules ayant été transfectées pour exprimer les antigènes S, M, N et E du SARS-Cov2, les cellules transfectées ayant été cultivées pendant 48 h seules (« T ») ou en présence, à partir de 2 jours après la transfection, de CTEACDs humaines isolées de cellules mononucléées de sang humain issues d’un individu convalescent du Covid-19, à raison de 25000 CTEACDs (« T + 25000 CTEACD ») ou de 50000 CTEACDs (« T + 50000 CTEACD ») ; « NT + 25000 CTEACD » et « NT + 50000 CTEACD » représente des cellules non transfectées cultivées pendant 48 h en présence des CTEACDs humaines isolées de cellules mononucléées de sang humain issues d’un individu convalescent du Covid-19, à raison respectivement de 25000 CTEACDs et de 50000 CTEACDs. Exemple 1 – Production et isolement de CTEACDs humaines spécifiques d’un antigène grippal Toutes les étapes du procédé sont réalisées à 18 à 20 °C, à l’exception de l’étape de culture cellulaire, et en conditions aseptiques. 1.1/ Isolement et stimulation des PBMCs à partir de sang périphérique humain Matériel Prélèvements de 30 ml (4 x 7,5 ml) de de sang périphérique de deux donneurs humains sains convalescents ayant été infectés par le virus de la grippe par le passé, dans des tubes à prélèvement Vacutainer® contenant de l’EDTA Tubes UNI-SEP et UNI-SEPMAXI, UNI-SEP+ et UNI-SEPMAXI+ (Eurobio) Solution saline tampon de Hanks (10x) (Eurobio) NaHCO 3 (Eurobio) Sérum de veau fœtal SVF (Eurobio) Tampon phosphate salin PBS 1X (Eurobio) acide éthylènediaminetétraacétique EDTA à partir d'une solution mère à 500 mM, pH = 7,8 stérilisé à l'autoclave Solution de lyse érythrocytaire 10x (BD Biosciences) Bleu de trypan filtré Eau distillée stérile Tubes Falcon® stériles de 50 et 15 ml (Dutscher France) Centrifugeuse de culture tissulaire Hettich® ROTINA 420 / 420R Milieu de culture cellulaire AIM-V® (Gibco, Fisher) Isolement des PBMCs On utilise du sang périphérique d’adulte humain prélevé dans l'EDTA. 25 mL de sang sont dilués avec un volume égal de tampon Hanks 1X + 1% EDTA 0,5M. Le sang dilué est transféré dans un tube UNI-SEP, qui est fermé et centrifugé (à 18-20 °C) à 3000 tr/min pendant 20 min (accélération = 9 / décélération = 0). Les tubes sont retirés de la centrifugeuse et transférés dans un poste de sécurité biologique classe II. La couche de cellules mononucléées est récoltée à l'aide d'une pipette et la suspension cellulaire est transférée dans un nouveau tube Falcon®. Dix ml de plasma riche en plaquettes sont récoltés dans des tubes fermés et stockés à -20 °C. La suspension de cellules mononucléées est diluée avec un volume de Hanks 1x + EDTA 5mM puis centrifugée à 3000 tr/min, à 20 °C pendant 10 min (accélération = 9 / décélération = 9). Le surnageant est éliminé, et le culot de PBMCs est remis en suspension dans 20 mL de solution contenant du PBS 1X et de l’EDTA 5 mM. La suspension est centrifugée à 3000 tr/min, à 20 °C pendant 10 min accélération = 9 / décélération = 9). Le surnageant est éliminé et le culot cellulaire, contenant les PBMCs, est remis en suspension dans 10 ml de solution contenant du PBS 1X et d’EDTA 5 mM. La concentration / quantité de cellules dans la suspension cellulaire obtenue est déterminée par comptage sur une cellule de Malassez. A cet effet, 10 µl de suspension cellulaire sont mélangés avec 10 µL de bleu de trypan préalablement filtré, et le mélange est transféré dans la chambre de Malassez. Le comptage est réalisé sous microscope sur 5 carrés in dépendants pris au hasard et le total est divisé par 5. Etant donné que chaque carré représente 0,01 µL, le nombre de cellules par carré est multiplié par 10 5 pour avoir le nombre de cellules par mL selon la formule suivante : Concentration (cellules / ml) = (nombre de cellules x 10 5 ) x 2 / 5 La congélation des cellules est réalisée comme suit : centrifugation de la suspension cellulaire à 3000 tr/min, 20 °C pendant 10 min (accélération = 9 / décélération = 9) ; élimination du surnageant ; remise en suspension dans X mL de milieu SVF (10 millions de cellules dans 2 mL de volume final) (X = 9/10 ème du volume pour avoir 5x10 6 cellules/ml - 1/10 du volume est du DMSO ajouté goutte à goutte aux cellules sous agitation douce). Les suspensions cellulaires sont immédiatement refroidies dans de la glace avant transfert à -80 °C. Stimulation des PBMCs 10 millions de cellules PBMCs fraîches récemment isolées ou décongelées sont introduites dans un tube conique en polypropylène de 15 ml. Les cellules sont centrifugées à 1500 tr/min, à température ambiante, pendant 10 min et le surnageant décanté. Les cellules sont remises en suspension dans 5 ml d'AIM-V® (cellules non colorées). 1 ml de cellules sont aliquotées dans 3 puits d’une plaque à 96 puits profonds et 0,5 ml de cellules sont aliquotées dans 4 puits de la plaque. Sont ajoutés dans chaque puits : de la concanavaline A (Con-A à 2 μg/ml) ou 15 μL des antigènes du vaccin grippal Vaxigrip (vaccin grippal à virion fragmenté quadrivalent inactivé injectable contenant 2 souches de type A (H1N1 et H3N2) et 2 souches de type B (lignées Yamagata et Victoria)), à raison de 15 mg d’hémagglutinine pour chaque souche. La plaque est placée dans un incubateur pour culture de cellules pendant 48-72 h à 37 °C, 5% de CO 2 . Les cellules sont par la suite utilisées pour la purification des CTEACDs. 1.2/ Purification des CTEACDs humaines Matériel Microbilles magnétiques greffées par un anticorps anti-CD45RO (Miltenyi, réf. 130-046-001) Microbilles magnétiques greffées par un anticorps anti-CD27 (Miltenyi, réf. 130-051-601) Compteur de cellules à fluorescence automatisé LUNA-FL® (Dutscher) Tubes de prélèvement de 5 ml en polystyrène SIMPT415-6 (VWR) Séparateur MidiMACS® (Miltenyi Biotec) Colonne LS pour séparation magnétique (Miltenyi Biotec, réf 130-042-401). Protocole Le nombre de cellules dans chaque puits est déterminé à l'aide du compteur de cellules à fluorescence comme décrit précédemment. La suspension cellulaire est centrifugée à 300 g pendant 10 min. Le surnageant est aspiré complètement et éliminé. Le culot cellulaire est remis en suspension dans 80 μL de tampon A (solution contenant un tampon phosphate salin (PBS) à pH 7,2 ; 0,5 % d'albumine sérique bovine (BSA) et 2 mM d'EDTA) pour 10 7 cellules. 20 μL de suspension de microbilles CD45RO sont ajoutées pour 10 7 cellules. L’ensemble est mélangé et incubé 15 min à 4 °C. Après centrifugation à 300 g pendant 10 min, le culot cellulaire complexé aux microbilles est remis en suspension dans 2 ml de tampon A. La colonne LS est placée dans le champ magnétique du séparateur MidiMACS®. Elle est préparée par rinçage avec 3 mL de tampon A, puis la suspension cellulaire est déposée sur la colonne. Les cellules non marquées qui passent à travers la colonne sont recueillies et les cellules complexées aux microbilles retenues par la colonne sont lavées avec une quantité appropriée de tampon A. La fraction obtenue est nommée (-)CD45RO. Trois étapes de lavage de la colonne sont réalisées successivement chacune par 3 ml de tampon A. Les fractions obtenues successivement sont nommées, respectivement : (-)CD45RO/W1, (-)CD45RO/W2, (-)CD45RO/W3 (ces fractions permettront de récupérer davantage de cellules (-)CD45RO si elles n’ont pas été totalement collectées dans la première fraction nommée (-)CD45RO). La colonne est retirée du séparateur et placée sur un tube de prélèvement approprié. 3 ml d’un tampon approprié (# 130-091-222) livré avec le kit de séparation, sont déposés sur la colonne puis les cellules magnétiquement marquées sont décrochées rapidement en poussant fermement le piston dans la colonne. La fraction obtenue est nommée (+)CD45RO et permet d’évaluer avec la fraction négative le rendement de la purification. Une nouvelle colonne est préparée. Le nombre de cellules de la fraction cellulaire non marquée (-)CD45RO est déterminé. Cette suspension de cellules (-)CD45RO est centrifugée à 300 g pendant 10 min. Le surnageant est complètement éliminé. Le culot cellulaire est remis en suspension dans 80 μL de tampon A pour 10 7 cellules (comme indiqué ci-dessus). 20 μL de microbilles CD27 sont ajoutées pour 10 7 cellules. L’ensemble est mélangé puis incubé 15 min à 4 °C. Les cellules sont lavées par ajout de 2 ml de tampon A pour 10 7 cellules, puis, après centrifugation à 300 g pendant 10 min, le culot cellulaire est remis en suspension dans 2 ml de tampon A. Il est procédé à la séparation magnétique des cellules (+)CD27 et des cellules de la fraction (-)CD27. A cet effet, la colonne est placée dans le champ magnétique du séparateur MidiMACS®. La colonne est préparée en rinçant avec 3 ml de tampon puis la suspension cellulaire (-)CD45RO est appliquée sur la colonne et la fraction non fixée nommée (-)CD45RO/(-)CD27 est collectée. Elle correspond aux CTEACDs spécifiques de l’antigène grippal. La colonne est lavée avec 3 × 3 mL de tampon et les fractions qui sont obtenues successivement sont nommées, respectivement : (-)CD45RO/(-)CD27/W1, (-)CD45RO/(-)CD27/W2, (-)CD45RO/(-)CD27/W3 (ces fractions permettront de récupérer davantage de cellules (-)CD45RO/(-)CD27 si elles n’ont pas été totalement collectées dans la première fraction nommée (-)CD45RO/(-)CD27)). La colonne est retirée du séparateur et placée sur un tube de prélèvement approprié. 3 ml de tampon sont déposés sur la colonne, puis les cellules magnétiquement marquées sont rincées rapidement en poussant fermement le piston dans la colonne. La fraction obtenue est nommée (-)CD45RO/(+)CD27. 1.3/ Analyse des CTEACDs humaines Analyse par cytométrie de flux Le protocole de l’expérience est comme suit. La cytométrie en flux polychromatique est réalisée en utilisant un cytomètre BD® LSR-II disposant de 3 rayons lasers et l’analyse des données obtenues après acquisition est réalisée avec le logiciel FlowJo. Les cellules PBMCs et CTEACDs sont mises en culture dans du milieu de culture AIM5 sans sérum dans des plaques 96 puits à puits profonds à une densité de 2x10 6 par mL, puis stimulées avec les antigènes comme indiqué pour l’ELISPOT. Les cellules sont incubées pendant 5 jours à 37 °C, 5% CO 2 et humidité saturante dans un incubateur à culture cellulaire. Les cellules sont restimulées pendant 6 h en présence des anticorps de co-stimulation CD28 (BD, Clone CD28.2) et CD49d (BD, Clone 9F10) (BD Biosciences, France) et la Bréfeldine A (Invitrogen® 00-4506-51). Les cellules sont ensuite rincées avec du 1xPBS+1%BSA et incubées pendant 30 min à température ambiante avec une combinaison d’anticorps de marquage de surface cellulaire (Pacific Blue® anti-CD3 (BD, Clone SP34-2), APC-H7 anti-CD8 (SK1), PE anti-CD4 (BD, Clone L200), APC anti-CD45RA (BD, Clone 5H9), FITC anti-CD197 (BD, Clone 150503). Le monoazide d’éthidium (EMA) à raison de 0,5 mg par puits est aussi ajouté pour permettre la détection et l’exclusion des cellules mortes. Après 15 min d’incubation à température ambiante, les cellules sont rincées avec 1xPBS+1%BSA, puis les cellules sont fixées et perméabilisées par incubation 15 min à température ambiante dans 2 mL de la solution BD Cytofix/Cytoperm® diluée à 1x. Les cellules sont rincées 5 min avec la solution Perm/Wash de BD puis les marquages intracellulaires sont réalisés avec les anticorps monoclonaux PE-Cy®7 anti-IFN-γ (BD, Clone B27) et Alexa Fluor® 700 anti-Granzyme B (BD, Clone GB11). Après 30 min d’incubation à température ambiante, les cellules sont rincées avec 1xPBS+1%BSA, puis les culots cellulaires re-suspendus dans 250 mL de paraformaldéhyde 1% dans 1xPBS puis stockés à l’obscurité à 4 °C jusqu’à l’acquisition par le LSR-II. Les cellules sont acquises au cytomètre de flux et sélectionnées selon leur granulométrie et taille (prodiffusion et diffusion latérale) correspondant aux lymphocytes (FSC/SSC), puis aux populations EMA-, CD3+, CD4+ élevé et CD8+ élevé (>100,000 événements). Le résultat de l’analyse par cytométrie de flux est montré sur la . On y observe que les cellules T CD8+ et CD4+ des CTEACDs humaines (fraction (-)CD45RO/(-)CD27) isolées du sujet ayant été infecté par l’influenza et vacciné contre la grippe à plusieurs reprises, sont composées de plus 98% et 91% de cellules effectrices respectivement. Plus de 96% des cellules CTEACDs T CD8+ sont Granzyme B+ et 40% secrètent aussi l’IFN-gamma. Pour les CTEACDs T CD4+ près de 55% produisent le granzyme B et 45% produisent l’IFN-gamma. Analyse par Elispot Le protocole de l’expérience est réalisé comme suit. Deux cent cinquante mille PBMCs ou CTEACDs [(-)CD45RO/(-)CD27] des donneurs 1 et 2 sont inoculées en tripliquât dans des puits d’une plaque 96 puits d’un kit ELISA IFN-gamma humain (Mabtech) dans un volume final de 200 mL, puis stimulées avec 15 mL des antigènes contenus dans le vaccin grippal VaxiGripTetra, pendant la nuit dans un incubateur à culture cellulaire. Des contrôles négatifs (cellules non stimulées avec l’antigène) et positifs (cellules stimulées avec la ConA) sont utilisés en parallèle. A la suite d’une nuit d’incubation, les cellules sont éliminées de chaque puits et la détection des spots spécifiques de l’IFN-gamma est réalisée selon le protocole du kit Mabtech. L’anticorps secondaire (human 7-B6-1 biotinylé, anti-INF-γ) est dilué au 1/1000 dans 1xPBS avec Ca 2+ et Mg 2+ et supplémenté avec 0,5% de SVF. En parallèle le substrat Streptavidine-ALP (phosphatase alcaline) est aussi dilué au 1/1000 dans 1xPBS avec Ca 2+ et Mg 2+ et supplémenté avec 0,5% de SVF. Les plaques ne contenant plus de cellules sont rincées 5 fois avec 200 μl PBSx1 par puits, puis égouttées sur un papier absorbant propre. 100 μl d’anticorps dilué sont ajoutés dans chaque puits et la plaque est incubée à température ambiante pendant 2 h. La solution est ensuite éliminée, les puits rincés 5 fois avec le tampon PBSx1 puis 100 μl de Streptavidine-ALP diluée au 1/1000 sont ajoutés et les plaques incubées 1 h à température ambiante. Cette solution est ensuite éliminée, les plaques rincées 5 fois au PBSx1 avant de rajouter 100 μl du substrat BCIP/NBT (0,4 μm). Les plaques sont incubées à température ambiante à l’obscurité jusqu’à l’apparition des spots (environ 12-15 min). Les plaques sont immédiatement rincées à l’eau du robinet, égouttées puis laissées sécher totalement avant de compter les spots. Chaque spot est considéré provenir d’une cellule sécrétrice d’IFN-gamma spécifique des antigènes. Les résultats obtenus, en termes de nombre de cellules sécrétant l’IFN-gamma, sont montrés sur la , pour chacun des deux individus donneurs, pour les PBMCs et pour les CTEACDs. On observe que la stimulation in vitro des CTEACDs permet une sécrétion massive de l’IFN-gamma. Les cellules mononucléées (PBMCs) du donneur 2 possèdent une proportion plus élevée de cellules T spécifiques de l’antigène grippal qui sont plus réactives et qui se différencient plus fortement en cellules T effectrices terminales (CTEACDs). Ces résultats démontrent clairement que les cellules réactives dans les PBMCs du donneur 2 sont plus prépondérantes que dans les PBMCs du donneur 1. L’ensemble des résultats ci-dessus démontre que les CTEACDs possèdent toutes les caractéristiques de cellules effectrices cytotoxiques armées pour éradiquer les cellules infectées par la grippe. Test de cytotoxicité Des CTEACDs (10 6 cellules (-)CD45RO/(-)CD27 /puits) sont mises en culture en suspension dans du milieu RPMI supplémenté de 10% de sérum de veau fœtal dans des puits d’une plaque de 12 puits, puis incubées dans un incubateur à culture cellulaire (37 °C, 5% CO 2 et humidité saturante). A différents temps post-incubation, des fractions (20 ml) sont prélevées pour la mesure de la viabilité cellulaire. La viabilité cellulaire est mesurée au moyen d’un compteur de cellules Luna ® , pendant trois jours après la fin de l’étape de purification. Le jour 0 correspond au jour d’isolement et la mise en culture des CTEACDs. Les résultats obtenus sont montrés sur la . On observe que la durée de vie des CTEACDs ne dépasse pas 3 jours en culture cellulaire. Exemple 2 A/ Etude in vitro de la capacité des CTEACDs humaines spécifiques d’un antigène grippal à éliminer les cellules humaines ou canines infectées par la grippe L’objectif principal de cette expérience est d’évaluer l’efficacité des CTEACDs isolées du sang d’un donneur convalescent ayant été infecté par le virus grippal et ayant été vacciné contre ce virus dans le passé, à reconnaitre et cytolyser les cellules infectées par le virus H1N1 in vitro . Les cellules humaines HEK-293 et les cellules canines MDCK, connues pour leur susceptibilité aux virus Influenza, sont utilisées pour cette expérience. Ces cellules cultivées dans le milieu DMEM avec 10 % de sérum de veau fœtal sont ensemencées dans des plaques 24 puits à raison de 10 4 cellules par puits, et dans des plaques de 6 puits à raison de 10 6 cellules par puits. Les monocouches de cellules sont inoculées avec le virus H1N1 (avec 10 3 (pour les cellules en plaque 24 puits) et 10 5 (pour les cellules en plaque 6 puits) particules infectieuses du virus), à une multiplicité d’infection de 0,1, puis elles sont soit maintenues telles quelles, soit co-cultivées 48 h après l’infection avec des CTEACDs (-)CD45RO/(-)CD27 préparées comme indiqué ci-dessus. Les cellules sont analysées après 5 jours de culture à l’aide du kit de test de cytotoxicité Abcam ab112118, afin de déterminer le taux de viabilité cellulaire. Des témoins de cellules non infectées (« contrôle ») et de cellules non infectées co-cultivées avec les CTEACDs (« CTEACD ») sont également réalisés. Les résultats obtenus sont montrés sur la . Ils démontrent que les cellules infectées sont toutes cytolysées par l’infection virale, alors qu’il n’y a pas de cytolyse des cellules non infectées utilisées comme témoins. Les cellules infectées co-cultivées avec les CTEACDs ont été protégées de la diffusion virale et se sont mises à proliférer. Ceci témoigne du fait que les CTEACDs lysent rapidement les cellules infectées par le virus et protègent les cellules non-infectées de la mort par ré-infection par le virus. B/ Etude in vitro de la capacité des CTEACDs humaines spécifiques des antigènes de SARS-CoV-2 à éliminer les cellules humaines ou canines transfectées par les plasmides exprimant les gènes de structure S, M, N et E du coronavirus Les quatre plasmides recombinants exprimant respectivement les gènes S, M, N et E de SARS-CoV-2 ont été obtenus gracieusement du BEI, USA (références BEI : NR-52394, NR-53508, NR-52973 et NR-52967). Ces plasmides sont introduits dans la souche bactérienne E coli JM109 compétente par transformation classique en utilisant le protocole fourni par Promega. Les bactéries portant les plasmides sont sélectionnées par culture dans un milieu sélectif contenant 100 mg/mL d’ampicilline. Les bactéries recombinantes portant les plasmides sont amplifiées dans des cultures de milieu LB liquide (1 L) supplémenté avec 100 mg/mL d’ampicilline et cultivées 24 h à 32 °C sous agitation. L’extraction d’ADN plasmidique est réalisée en utilisant un kit Maxiprep (Macherey Nagel) et le protocole exact livré avec le kit. La concentration des ADNs isolés est déterminée par lecture spectrophotométrique à la longueur d’onde de 260 nm. Les ADNs sont transfectés dans les cellules HEK-293 et MDCK en utilisant un kit commercial (TransIT®, Mirus/Euromedex) et le protocole du kit MIR 5404. Un mélange d’ADN contenant 1,25 mg de chacun des 4 plasmides est utilisé pour chaque transfection. A 24 h post-transfection, les cellules transfectées sont dissociées et inoculées à raison de 200 000 cellules par puits en tripliquât dans une plaque de 24 puits de culture cellulaire. 24 h plus tard, les tripliquâts de cellules (HEK-293 et MDCK) sont cocultivés soit avec 25 000 CTEACDs [(-)CD45RO/(-)CD27] soit avec 50 000 CTEACDs [(-)CD45RO/(-)CD27] isolées (comme décrit ci-dessus) du sang périphérique d’un donneur convalescent de Covid-19 depuis 4 mois. Ce donneur était tel que les cellules mononucléées contenues dans son sang périphérique possédaient une très forte proportion de cellules spécifiques du SARS-CoV-2 qui secrètent l’IFN-γ (> 3500/10 6 PBMCs), déterminée par un test ELISPOT. Après 48 h de coculture, les cellules sont examinées pour les proportions de survie et de cytolyse. Les résultats de cette analyse sont rapportés sur la . Ces résultats confirment la forte efficacité de cytolyse des cellules exprimant les antigènes de SARS-CoV-2 par les CTEACDs anti-Covid. Exemple 3 - Etude in vi v o de la capacité des CTEACDs murines spécifiques d’un antigène grippal à traiter des souris infectées par la grippe 3.1/ Production et isolement de CTEACDs Des CTEACDs sont produites à partir de cellules de rate de souris, selon le protocole suivant. Matériel Compteur de cellules à fluorescence automatisé LUNA-FL® (Dutscher) Cytomètre de flux BD® LSR-II Tubes de prélèvement de 5 ml en polystyrène SIMPT415-6 (VWR) Milieu RPMI (GIBCO, réf 21875-034) SVF (Eurobio) PBS 1X (Eurobio) EDTA à partir d’une solution mère à 500 mM Solution de lyse (BD Biosciences, réf 555 899) Lame et lamelles stérilisées Tubes Falcon® de 15 ml Concanavaline A (ConA) (Thermo Fisher, réf 00-4978-03) Vaccin VaxigripTetra (Sanofi Pasteur) Protéines structurales recombinantes de SARS-CoV-2 (BEI, USA) Microbilles magnétiques anti-biotine (Miltenyi Biotec, réf. 130-090-485) Anticorps anti-KLRG1-Biotine, souris, REA1016, (Miltenyi Biotec réf.130-117-096) Anticorps anti-CD27-Biotine, humain et souris, REA499, (Miltenyi Biotec réf. 130-114-164) Séparateur MidiMACS® (Miltenyi Biotec réf. 130-042-302) Colonne LS pour séparation magnétique (Miltenyi Biotec, réf. 130-042-401). Récolte de sang de souris et de splénocytes Des souris (2 groupes de 4 souris) C57Bl6 âgées de 8 semaines en provenance des établissements Janvier et logées dans le complexe animalier du LBFA/UGA sont immunisées par injection intramusculaire avec 1/100éme (0,5 ml du vaccin dans 49,5 ml de PBSx1) d’une dose vaccinale humaine du vaccin commercial VaxigripTetra pour le groupe 1. Les souris du groupe 2 sont immunisées avec un mélange des 4 protéines structurales (S, M, N et E) à raison de 0,5 mg de chacune des protéines dans un volume final de 100 mL de 1xPBS. A trois semaines post-immunisation les souris sont mises en sommeil profond (anesthésie) avec de la vapeur d'isoflurane. Après incision de la cavité abdominale, les rates des souris sont isolées aseptiquement et directement transférées dans les tubes Falcon® contenant 7 ml de milieu RPMI et conservées dans de la glace. Les rates sont ensuite placées entre une lame stérile/lamelle, puis dilacérées. Les splénocytes sont collectés dans 5 ml de milieu RPMI supplémenté de 10% SVF. Après centrifugation pendant 10 min à 300 g à 4 °C, les splénocytes sont lavés avec 5 mL de solution de PBS 1x + 5 mM ETDA. Après centrifugation pendant 10 min à 300 tr/min à 4 °C, les splénocytes sont traités pendant 2 min avec une solution de lyse des érythrocytes (BD Biosciences) pour éliminer les globules rouges. Après centrifugation pendant 5 min à 300 g à 4 °C, les cellules sont comptées en présence du bleu de trypan en utilisant le compteur de cellules LUNA-FL®. Stimulation des splénocytes ConA est utilisée pour stimuler la prolifération des splénocytes, en tant que contrôle positif. Le vaccin VaxigripTetra, contenant des antigènes de la grippe, est utilisé pour stimuler la différenciation des cellules T en CTEACDs. 3 µL d’une solution de ConA (dans du PBSx1) à 1 µg.mL -1 , 15 µL de solution de vaccin antigénique VaxigripTetra ou 2 mL du mélange (S+M+N+E) de protéines recombinantes structurales de SARS-CoV-2 sont ajoutés dans 3 mL d’une suspension cellulaire (2x10 7 cellules/mL) dans du RPMI + 10% SVF. Les suspensions de cellules sont transférées dans des tubes en polystyrène et incubées pendant 3 jours à 37 °C dans un incubateur de culture cellulaire sous atmosphère de CO 2 . Isolement des CTEACDs Le nombre de cellules est déterminé à l'aide du compteur de cellules à fluorescence. Après centrifugation de la suspension cellulaire à 300 g pendant 10 min, le surnageant est éliminé complètement. On remet en suspension jusqu'à 10 7 cellules nucléées par 45 µL de tampon (PBS pH 7,2 + 0,5 % d’albumine de sérum bovin + 2 mM EDTA). On ajoute 5 µL de l'anticorps anti-KLRG1-Biotine, on mélange et incube 10 min dans l'obscurité à 4 °C. On lave les cellules en ajoutant 2 ml de tampon et centrifuge à 300 g pendant 10 min. On aspire complètement le surnageant. On répète cette étape de lavage. On remet le culot cellulaire en suspension dans 80 μL de tampon. On ajoute 20 μL de microbilles magnétiques anti-Biotine pour 10 7 cellules. Après mélange on incube 15 min à 4 °C, puis on lave les cellules en ajoutant 2 ml de tampon pour 10 7 cellules et on centrifuge à 300 g pendant 10 min. On aspire complètement le surnageant et on remet en suspension le culot avec 2 ml de tampon. On place la colonne LS dans le champ magnétique du séparateur MidiMACS® et on la prépare en rinçant avec 3 ml de tampon. On applique les 2 ml de suspension cellulaire sur la colonne. On recueille la fraction cellulaire non liée, nommée (+)KLRG1. On centrifuge cette suspension cellulaire à 300 g pendant 10 min. On aspire complètement le surnageant et on remet le culot cellulaire en suspension, à raison de jusqu'à 10 7 cellules nucléées par 100 µL de tampon. On ajoute 10 µL de l'anticorps anti-CD27 souris / humain, on mélange et incube 10 min à l'obscurité à 4 °C. On lave les cellules en ajoutant 2 ml de tampon et centrifuge à 300 g pendant 10 min. On aspire complètement le surnageant puis on répète l'étape de lavage. On remet le culot cellulaire en suspension dans 80 μL de tampon, et on ajoute 20 μL de microbilles magnétiques anti-biotine pour 10 7 cellules. Après mélange on incube 15 min à 4 °C. On lave les cellules en ajoutant 2 ml de tampon pour 10 7 cellules et on centrifuge à 300 g pendant 10 min. On aspire complètement le surnageant et on remet le culot cellulaire en suspension dans 2 mL de tampon. On place la colonne LS dans le champ magnétique du séparateur MidiMACS®. On prépare la colonne LS en la rinçant avec 3 mL de tampon. On applique la suspension cellulaire sur la colonne et on recueille la fraction cellulaire non liée. Elle contient des cellules CTEACDs (+)KLRG1/(-)CD27. 3.2/ Efficacité thérapeutique 4 groupes de souris BALB/c ont été infectées avec le virus influenza H1N1 (20 000 particules infectieuses dans 20 ml) par la voie intra-nasale. Un groupe (Groupe 1) a été gardé tel quel. Au jour 2 post-infection, à un groupe, ont été transférées, par injection intrapéritonéale, des CTEACDs [(+)KLRG1/(-)CD27] issues de souris C57BL/6 non immunisées avec VaxiGripTetra (Groupe 2, 10 5 CTEACDs/souris). En parallèle, à deux autres groupes, ont été transférées, par injection intrapéritonéale, des CTEACDs [(+)KLRG1/(-)CD27] issues de souris C57BL/6 ayant été préalablement immunisées contre la grippe comme ci-dessus décrit. (Groupe 3, 5.10 4 CTEACDs/souris et Groupe 4, 2,5.10 5 CTEACDs/souris). Après 4 à 5 jours, dans le Groupe 1, 3 souris sur 7 sont mortes et les 4 autres, se trouvant dans un état très détérioré en raison de l’infection par H1N1, ont été euthanasiées. L’état de santé des souris du Groupe 2 auxquelles ont été administrées des CTEACDs de souris normales, s’est détérioré 5 à 6 jours après l’infection par H1N1. Ces souris malades ont été euthanasiées au jour 6 post-infection. A l’inverse, toutes les souris du Groupe 3 et du Groupe 4 sont restées vivantes pendant plus de 6 mois sans montrer aucun signe clinique. Ces résultats apportent la démonstration claire que le transfert adoptif de CTEACDs issues de souris immunisées est associé à une thérapie curatrice persistante chez tous les animaux traités (14/14). Il est en outre démontré que le transfert de CTEACDs isolées de souris C57BL/6 chez des souris BALB/c de fond génétique différent n’induit aucun signe de maladie de rejet ou de réaction du greffon contre l’hôte après plus de 3 mois d’observation. L’ensemble des exemples ci-avant apporte la preuve de la capacité des CTEACDs produites conformément à l’invention à éliminer les cellules infectées, et par conséquent à empêcher le développement de la maladie, à la fois en culture de cellules humaines ou canines in vitro , et in vivo chez la souris. Procédé in vitro ou ex vivo de production et d’isolement d’une sous-population de cellules T spécifiques d’un antigène lié à une maladie d’intérêt, caractérisé en ce qu’il comporte des étapes de : - a/ à partir d’un échantillon biologique humain isolé, obtention d’une population de cellules mononucléées comprenant des cellules T spécifiques dudit antigène à forte capacité de prolifération, - b/ culture desdites cellules mononucléées pendant 24 à 72 heures dans un milieu de culture cellulaire adapté contenant ledit antigène, - et c/ isolement du milieu de culture de cellules T spécifiques dudit antigène qui n’expriment pas à leur surface les marqueurs CD45RO et CD27. Procédé selon la revendication 1, selon lequel l’étape a/ d’obtention d’une population de cellules mononucléées comprenant des cellules T spécifiques dudit antigène à forte capacité de prolifération comprend l’identification d’un échantillon biologique de sang périphérique humain comprenant une population de cellules T spécifiques dudit antigène à forte capacité de prolifération, et l’isolement de cellules mononucléées à partir dudit échantillon biologique. Procédé selon la revendication 2, selon lequel ledit échantillon biologique de sang périphérique humain est un échantillon de sang périphérique d’un individu humain ayant été atteint par ladite maladie. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, selon lequel l’étape b/ de culture desdites cellules mononucléées est réalisée pendant 36 à 60 heures. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, selon lequel l’étape c/ d’isolement du milieu de culture des cellules T spécifiques dudit antigène qui n’expriment pas à leur surface les marqueurs CD45RO et CD27 est réalisée par recueil de cellules spécifiques dudit antigène contenues dans le milieu de culture, puis chromatographie d’affinité au moyen d’anticorps spécifiques des marqueurs moléculaires CD45RO et CD27, lesdites cellules T qui n’expriment pas à leur surface les marqueurs CD45RO et CD27 étant présentes dans la fraction non liée. Cellules T effectrices terminales humaines isolées obtenues par un procédé selon l’une des revendications 1 à 5, spécifiques dudit antigène lié à ladite maladie d’intérêt. Cellules T effectrices terminales selon la revendication 6, pour leur utilisation en tant que médicament. Cellules T effectrices terminales pour leur utilisation selon la revendication 7, pour le traitement de ladite maladie d’intérêt. Cellules T effectrices terminales pour leur utilisation selon l’une des revendications 7 ou 8, pour le traitement d’une maladie infectieuse, en particulier d’une maladie virale. Cellules T effectrices terminales pour leur utilisation selon l’une des revendications 7 ou 8, pour le traitement d’une maladie chronique non transmissible. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu’elle contient des cellules T effectrices terminales selon la revendication 6 dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Composition pharmaceutique selon la revendication 11, se présentant sous une forme convenant pour une administration par voie parentérale.