Brevet FR3127571A1 — publié le 20230331

L'invention concerne une méthode de détection et quantification simultanée des fungi et des bactéries présentes dans un solide divisé contenant des matières organiques cellulosiques, selon laquelle on réalise une extraction solide-liquide dudit solide divisé, on introduit un échantillon dudit liquide obtenu, dans un cytomètre en flux et on établit un histogramme bi paramétrique donnant pour chaque point l’intensité de la lumière diffractée et l’intensité de la lumière réfléchie et réfractée de manière à discriminer un premier groupe de points attribuables aux fungi et un deuxième groupe de points attribuables aux bactéries. Selon l’invention, on ajoute dans ledit échantillon avant introduction dans ledit cytomètre, au moins un premier fluorochrome apte à se lier à l’ADN, on excite en outre ledit échantillon de manière à obtenir la fluorescence dudit premier fluorochrome et on établit également ledit histogramme bi paramétrique pour les points correspondant à des particules émettant en fluorescence dans la longueur d’onde d’émission dudit fluorochrome pour le premier groupe de points et pour le deuxième groupe de points, pour chacun desdits groupes on détermine un nuage de points qui correspond à une intensité de fluorescence due au premier fluorochrome supérieure à celle des autres points dudit groupe et éventuellement on compte les points dudit nuage, lesquels correspondent respectivement aux cellules de fungi ou de bactéries. méthode de détection et de quantification par cytométrie en flux des fungi et bactéries contenus dans un solide divisé contenant des matières organiques cellulosiques La présente invention concerne une méthode en cytométrie de flux qui permet de détecter et quantifier simultanément les fungi et les bactéries présentes dans un solide à l’état divisé contenant des matières organiques. Art antérieur Un substrat de culture, qu’il soit naturel comme la terre végétale ou artificiel comme le terreau est un milieu complexe dans lequel vivent de nombreuses espèces de bactéries et de fungi. Il en est de même pour les composts, fumiers et autres substrats d’amendement. Ces bactéries et fungi peuvent être utiles pour la croissance des végétaux ou au contraire être pathogènes. Il est de plus connu que l’activité des micro-organismes du sol (surtout les microbes et les champignons) a aussi une action, en présence d’oxygène, sur l’émission de CO 2 par respiration et sur celle de méthane. Dans tous les cas, on voit qu’il est important de pouvoir quantifier rapidement les bactéries et les fungi du sol. . La publication intitulée A rapid flow cytometry method to assess bacterial abundance in agricultural soil « de M. Bressan et publiée dans la revue Applied Soil ecology en 2015 (88 (2015) pages 60-68) indique que le nombre de cellules bactériennes contenues dans un sol peut être déterminée par cytométrie de flux en utilisant le fluorochrome SYBR Green. Cette publication suggère que le fluorochrome SYTOX-green pourrait également être utilisé. La difficulté de l’analyse réside dans le traitement de l’échantillon de sol car les bactéries sont souvent très liées aux particules du sol. Cette publication indique que l’échantillon de sol est dilué dans une solution de chlorure de sodium à 85% et filtrée à 0,22µm. Le mélange est homogénéisé au moyen d’un vortex pendant 5 minutes à pleine vitesse Après une centrifugation pour éliminer les plus grosses particules, le surnageant est analysé par cytométrie en flux. Cette méthode n’est pas appliquée aux fungi. La publication intitulée « Optimization of a Method To Quantify Soil Bacterial Abundance by Flow Cytometry » de B. Khalili publiée le 16 juillet 2021 dans la revue American Socitéy for Microbiology indique qu’il est possible de quantifier la population de bactéries contenues dans un échantillon de sol par cytométrie en flux. Les bactéries sont extraites avec un surfactant ajouté au milieu Nicodenz® (lequel provient d’un dérivé de l’acide benzoïque sur lequel ont été greffées trois chaines aliphatiques hydrophiles). Cette publication s’applique à un échantillon de sol dans lequel on a ajouté des cellules de E. coli . Il ne s’agit donc pas d’un échantillon de sol réel. De plus, la publication est muette en ce qui concerne les fungi. La publication intitulée « Schrödinger’s microbes: Tools for distinguishing the living from the dead in microbial ecosystems » de J. B. Emerson et publiée en 2017 dans la revue Microbiome (DOI 10.1186/s40168-017-0285-3) passe en revue toutes les techniques utilisables pour déterminer si un microorganisme est vivant ou non. On constate que certains fluorochromes ne permettent pas de distinguer les organismes vivants des morts. C’est par exemple, le cas de l’iodure de propidium dans le cas de protéobacteries particulières et de mycobactéries. La publication indique que des réactifs peuvent être utilisés également pour les levures. Dans le cas des levures, on utilise un marqueur fluorescent qui se lie avec la chitine (laquelle forme la paroi de la cellule du fungi) couplé avec un marqueur qui n’émet en fluorescence que lorsque la membrane cellulaire et la fonction métabolique sont intactes. Cette publication ne vise pas spécifiquement l’étude des sols, lesquels sont des milieux complexes. La publication intitulée « Specific and Rapid Enumeration of Viable but Nonculturable and Viable-Culturable Gram-Negative Bacteria by Using Flow Cytometry » de M. M. Taimu Khan publiée en août 2010 dans la revue APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, (pages 5088–5096 Vol. 76, No. 15) indique qu’il est possible de dénombrer les cellules bactériennes latentes par cytométrie en flux. Les bactéries étudiées sont les suivantes : Escherichia coli O157:H7 , Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas syringae, et Salmonella enterica serovar Typhimurium ; les marqueurs fluorescents utilisés sont les suivants SYTO 9®, SYTO 13®, SYTO 17®, SYTO 40® et l’iodure de propidium. Cette publication ne s’intéresse pas aux sols et ne fait pas état des champignons (fungi). La publication intitulée « Monitoring physiological status of GFP-tagged Pseudomonas fluorescens SBW25 under different nutrient conditions and in soil by flow cytometry » publiée dans la revue FEMS microbiology Ecology en 2004 (volume 51, Page 123-132) indique qu’il est possible de déterminer la quantité de Pseudomonas -une bactérie utile à la croissance des plantes - en marquant la bactérie avec un gène fluorescent. La publication intitulée « Flow cytometry as a tool to assess the effects of gamma radiation on the viability, growth and metabolic activity of fungal spores » de N. Mesquita et publiée dans la revue International Biodeterioration & Biodegradation en 2013 (Volume 84, page 250-257) indique qu’il est possible de déterminer la viabilité de spores de Penicillium chrysogenum , Aspergillus nidulans et Aspergillus niger par cytométrie en flux. Les marqueurs utilisés sont l’iodure de propidium et le dihydroéthidium. Le dihydroéthidium s’intercale dans l’ADN ces cellules colorant le noyau en rouge. Cette publication ne s’intéresse qu’aux spores et non aux fungi eux-mêmes. La publication intitulée « The filamentous fungus Penicillium chrysogenum analysed via flow cytometry—a fast and statistically sound insight into morphology and viability » de L. Veiter & al, publiée dans la revue applied microbial and cell physiology en 2019 (103 : 6725-6735) indique qu’il est possible d’extraire P. chrysogenum de son milieu de culture avec une solution saline contenant 50 g/l d’une solution de CaCl 2 de concentration 2.65 g/l solution, et présentant une concentration en KCl de 0,2g/l, en KH 2 PO 4 de 0,2g/l, en MgCl∙6 H 2 O de 0.1 g/l, de NaCl de 8 g/l et 0.764 g/l en Na 2 HPO 4 + 2H 2 O. Les cellules sont colorées à l’iodure de propidium, lequel permet de discriminer les cellules dont la paroi est lésée. Le diacétate de fluorescéine est également utilisé pour déterminer l’activité métabolique des cellules. Cette méthode est utilisée pour des milieux de culture de fungi peu complexes. Elle n’est pas applicable aux sols, lesquels sont trop complexes et pour lesquels les fungi, notamment les hyphes sont intimement liées aux particules du milieu. Problèmes techniques à résoudre Un premier but de la présente invention est de proposer une méthode par cytométrie en flux qui permet de quantifier simultanément les fungi et les bactéries présentes dans un solide à l’état divisé notamment un échantillon de sol, contenant des matières organiques. Un autre but de la présente invention est de proposer une méthode qui permet de plus de déterminer simultanément pour les bactéries et pour les fungi l’état de leur cellules, à savoir, latent, vivant ou mort. Un autre but de la présente invention est de proposer une méthode qui permet de prendre en compte les hyphes contenues dans le substrat. Brève description de l’invention La présente invention concerne une méthode de détection et quantification simultanée des fungi et des bactéries présentes dans un solide divisé contenant des matières organiques cellulosiques, selon laquelle on réalise une extraction solide-liquide dudit solide divisé, on introduit un échantillon dudit liquide obtenu, éventuellement dilué, dans un cytomètre en flux et on établit un histogramme bi paramétrique donnant pour chaque point l’intensité de la lumière diffractée et l’intensité de la lumière réfléchie et réfractée de manière à discriminer un premier groupe de points attribuables aux fungi et un deuxième groupe de points attribuables aux bactéries. De manière caractéristique, selon l’invention, on ajoute dans ledit échantillon avant introduction dans ledit cytomètre, au moins un premier fluorochrome apte à se lier à l’ADN, on excite en outre ledit échantillon de manière à obtenir la fluorescence dudit premier fluorochrome, on établit également ledit histogramme bi paramétrique pour les points correspondant à des particules émettant en fluorescence dans la longueur d’onde d’émission dudit fluorochrome pour le premier groupe de points et pour le deuxième groupe de points et pour chacun desdits groupes on détermine un nuage de points qui correspond à une intensité de fluorescence due au premier fluorochrome supérieure à celle des autres points dudit groupe et éventuellement on compte les points dudit nuage, lesquels correspondent respectivement aux cellules de fungi ou de bactéries. Le premier fluorochrome étant apte à se lier à l’ADN, il permet de distinguer les microorganismes du bruit de fond formé par les particules en suspension. Avantageusement, ledit premier fluorochrome est apte à se lier à l’ADN des cellules vivantes et à l’ADN des cellules dont la paroi est perméable, lesquelles correspondent aux cellules mortes. Bien que les fungi et les bactéries possèdent tous deux de l’ADN, il n’était pas évident qu’un seul fluorochrome permettent de les séparer du bruit de fond. En effet, il est à noter que les cellules des fungi se distinguent de celles des bactéries. Les fungi sont des eucaryotes alors que les bactéries sont des procaryotes. De plus, la paroi des fungi est composée de chitine alors qu’elle est composée de peptidoglycanes chez les bactéries. La perméabilité de la membrane aux divers marqueurs fluorochromiques n’est donc pas la même chez les bactéries et chez les fungi. Le solide peut contenir de la cellulose et des matières organiques cellulosiques. Le solide peut également contenir des matières minérales comme des argiles ou du sable, par exemple. Selon un mode de mise en œuvre particulier, le solide est constitué de matières organiques cellulosiques. Selon un mode de réalisation avantageux combinable avec chacun des autres modes de réalisation, on ajoute également audit échantillon avant introduction dans ledit cytomètre au moins un deuxième et au moins un troisième fluorochrome, ledit deuxième fluorochrome est apte à se lier uniquement à l’ADN des cellules dont la paroi est perméable et ledit troisième fluorochrome devient fluorescent par réaction avec les estérases contenues dans les cellules vivantes et, pour au moins un desdits groupes, on établit un histogramme bi paramétrique donnant l’intensité de la fluorescence due au deuxième fluorochrome et l’intensité de la fluorescence due au troisième fluorochrome, on détermine sur ledit histogramme trois nuages de points : un premier nuage de point pour lesquelles la fluorescence du troisième fluorochrome est la plus forte, un deuxième nuage de points pour lesquels la fluorescence due au deuxième fluorochrome est la plus faible et un troisième nuage de point et on déduit que le premier nuage de points corresponds aux bactéries/fungi vivant(e)s, le deuxième nuage de points correspond au fungi/bactéries à l’état latent et le troisième nuage de points correspond aux fungi/bactéries mort(e)s, éventuellement en comptant les points dans chaque nuage, on détermine le nombre de bactéries ou de fungi et leur état respectif. Ainsi qu’expliqué précédemment, il est surprenant qu’un mélange de trois fluorochrome parvienne à distinguer les états de vie (latent, mort, vivant) des fungi et des bactéries. En effet, les fungi et les bactéries ont des métabolismes différents qui ne permet souvent pas de les analyser ensemble. De plus, il est à noter que la méthode tient également compte des hyphes, lesquelles sont comptabilisées comme un évènement (un point). Avantageusement, ledit premier fluorochrome est choisi parmi les fluorochromes apte à se lier à l’ADN des cellules et présentant une longueur d’onde d’absorption en fluorescence maximale égale ou supérieure à 599nm et égale ou inférieure à 657nm et une longueur d’onde d’émission en fluorescence maximale égale ou supérieure à 619nm et égale ou inférieure à 678nm et un rendement quantique égale ou supérieur à 0,16 et égal ou inférieur à 0,39. En particulier, ledit premier fluorochrome peut être choisi parmi les fluorochromes apte à se lier à l’ADN des cellules et présentant une longueur d’onde d’absorption en fluorescence maximale de 652 nm et une longueur d’onde d’émission en fluorescence maximale de 676 nm et un rendement quantique de fluorescence sur l’ADN de 0,27 et les fluorochromes aptes à se lier à l’ADN et présentant une longueur d’onde d’absorption maximale en fluorescence de 657nm et une longueur d’onde d’émission maximale en fluorescence de 673nm et un rendement quantique de fluorescence sur l’ADN de 0,17. De tels fluorochromes sont commercialisés sous les appellations SYTO62® et SYTO 63® par la société Thermofischer. Avantageusement, ledit deuxième fluorochrome est choisi parmi les fluorochromes présentant une longueur d’onde d’absorption maximale en fluorescence de 547nm et une longueur d’onde d’émission maximale en fluorescence de 570nm et un rendement quantique de fluorescence sur l’ADN de 0,9 et en ce que ledit troisième fluorochrome est choisi parmi le diacétate de 5-carboxyfluoresceine, le diacétate de 6-carboxyfluoresceine, les mélanges de diacétate de 5-carboxyfluoresceine et de diacétate de 6-carboxyfluoresceine et le diacétate fluorescéine 5,6 carboxylate de succinimidyl de formule générale suivante : [Formule 1] Avantageusement, le deuxième fluorochrome est le fluorochrome commercialisé par la société Thermofischer sous l’appellation SYTOX-orange. Avantageusement, le troisième fluorochrome est le mélange cFDA. Avantageusement, le premier fluorochrome est le SYTO62®, le deuxième fluorochrome est le SYTOX-orange et le troisième fluorochrome est le mélange cFDA Le solide divisé contenant des matières cellulosiques peut être choisi parmi la terre végétale, le terreau, le compost, le fumier, le mulch, l’humus et leurs mélanges, notamment leurs mélanges deux à deux. Le ou les fungi ainsi que la ou les bactéries contenues dans le solide divisé ne sont pas limitées selon l’invention. Il peut s’agir des fungi et des bactéries pouvant dégrader la celluloses mais également d’autres bactéries ou fungi provenant d’animaux. En effet, lorsque le solide est par exemple du fumier ou en contient, il est susceptible de contenir également des bactéries fécales. Ainsi, la méthode de l’invention permet de détecter et quantifier au moins un fungi et de préférence un mélange de fungi choisi parmi les champignons microscopiques capables de former des mycorhyzes, les fungi imparfaits, Lichtheimia corymbifera corymbilfer mucor, mucor mucedo, les levures, et les hyphes des champignons microscopiques et une moins une bactérie ou un mélange de bactéries choisie(s) parmi cytophaga spp , streptomyces spp , Bacillus radicola , Candida albicans , Phycomycètes Rhizopus, Penicillium spp, Aspergillus spp, verticillium, Helminthosporium, Fusarium, Cladosporium, les actynomycètes, Nitrosomonas, Nitrosocoocus, Azotobacter, Clostridium spp, Rhizobium, acidobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Actinobacteria, Alphaproteobacteria et Betaproteobacteria , , Saccharomyces spp, Pseudomonas spp, Staphylococcus aureus. E. coli, Micrococcus luteus, Bacillus megaterium, Bacillus polymyxa et Enterococcus faecium . Il est à noter que la méthode permet également de détecter et quantifier les hyphes qui sont des regroupements de cellules non séparées par des parois. La fluorescence détectée étant corrélable à la quantité d’ADN, la méthode permet également de quantifier les hyphes, lesquelles sont comptabilisées comme plusieurs cellules en fonction du nombre de noyaux qu’elles contiennent. Avantageusement, on réalise l’extraction solide-liquide avec une solution aqueuse de chlorure de sodium contenant de 7 à 12g/L de chlorure de sodium et notamment 8,5g/L de chlorure de sodium et filtrée avec un filtre ayant un seuil de coupure à 0,22µm. Il est également surprenant qu’en dépit de l’absence de surfactant, il soit possible selon l’invention d’extraire les fungi et les bactéries qui sont tous deux intimement liés aux particules du solide divisé. De plus, cette méthode permet également et de manière surprenante, d’extraire les hyphes, lesquelles sont intimement liées de manière physicochimique au particules du solide. Avantageusement, ledit solide divisé est tamisé avant l’extraction de manière à ne conserver que les fragments de taille inférieure ou égale à 2 mm. Il est probable, bien que la Demanderesse ne soit pas liée à cette explication, que le tamisage permet déjà de préparer l’extraction des fungi et des bactéries et les séparant déjà légèrement des particules du solide divisé. Avantageusement, ledit échantillon est dilué une première fois au 1/10 ou au 1/100 puis dilué au 5/100. Une telle dilution facile la détection et la quantification. La présente invention concerne également un mélange fluorochromique contenant un premier fluorochrome choisi parmi les fluorochromes apte à se lier à l’ADN des cellules et présentant une longueur d’onde d’absorption en fluorescence maximale égale ou supérieure à 599nm et égale ou inférieure à 657nm et une longueur d’onde d’émission en fluorescence maximale égale ou supérieure à 619nm et égale ou inférieure à 678nm et un rendement quantique égale ou supérieur à 0,16 et égal ou inférieur à 0,39 et leurs mélanges et en particulier parmi les fluorochromes apte à se lier à l’ADN des cellules et présentant une longueur d’onde d’absorption en fluorescence maximale de 652 nm et une longueur d’onde d’émission en fluorescence maximale de 676 nm et un rendement quantique de fluorescence sur l’ADN de 0,27 et les fluorochromes aptes à se lier à l’ADN et présentant une longueur d’onde d’absorption maximale en fluorescence de 657nm et une longueur d’onde d’émission maximale en fluorescence de 673nm et un rendement quantique de fluorescence sur l’ADN de 0,17 et leurs mélanges, un deuxième fluorochrome choisi parmi les fluorochromes présentant une longueur d’onde d’absorption maximale en fluorescence de 547nm et une longueur d’onde d’émission maximale en fluorescence de 570nm et un rendement quantique de fluorescence sur l’ADN de 0,9 et un troisième fluorochrome choisi parmi le diacétate de 5-carboxyfluoresceine, le diacétate de 6-carboxyfluoresceine, les mélanges de diacétate de 5-carboxyfluoresceine et de diacétate de 6-carboxyfluoresceine et le diacétate fluorescéine 5,6 carboxylate de succinimidyl de formule générale suivante: [Formule 2] Avantageusement, le mélange contient une concentration en troisième fluorochrome supérieure à la concentration en deuxième et premier fluorochrome et en ce que qu’il contient une concentration en premier fluorochrome supérieure à celle dudit deuxième fluorochrome. Les Inventeurs ont en effet mis en évidence qu’un tel mélange pouvait, avec une seule analyse avec un cytomètre en flux, permettre la détection, la quantification et la détermination de l’état de vie (latent, mort, vivant) des fungi et des bactéries. Définitions Les termes « état divisé » désignent au sens de l’invention une poudre, des granules, des fibres, des particules et leurs mélanges. Les termes « matières organiques cellulosiques » désignent au sens de l’invention la cellulose, l’hémicellulose, les matières organiques issues de la dégradation biologique de la cellulose et/ou de l’hémicellulose et les mélanges d’au moins deux de ces composés. En particulier, ces termes désignent un mélange de cellulose, d’hémicellulose et de matières issues de la dégradation biologique de la cellulose et de l’hémicellulose. Les termes « terre végétale » désignent toute terre issue d’horizons de surface humifères ou d’horizons profonds pouvant être mélangée avec des matières organiques d’origine végétale, des amendements organiques et/ou des matières minérales ». Le terme englobe, au sens de l’invention, la terre végétale sableuse, la terre végétale limoneuse, la terre végétale calcaire, la terre végétale humifère et la terre végétale franche qui est un mélange de ces quatre terres. Le terme « compost » désigne le substrat obtenu par la décomposition du fait des organismes vivant dans le sol ou sur le sol de matières organiques végétales et/ou animale. Le terme « terreau » désigne un mélange de terre végétale et/ou de compost et/ou de fumier. Le terme « humus » désigne la couche supérieure du sol présente sous les arbres, en particulier en forêt. Le terme « mulch » désigne un matériau divisé comprenant ou constitué de copeaux de bois et/ou d’écorces et/ou d’aiguilles et/ou de tontes de gazon séchées et/ou de feuilles mortes et/ou de foin et/ou de paillette et/ou de sciure de bois et/ou de paillettes de chanvre et/ou de paillettes de lin et/ou de bois raméal fragmenté. Le terme « simultané » signifie que les résultats peuvent être obtenu par un seul passage d’un même échantillon dans un cytomètre en flux. Le terme « fungi » englobe tous les champignons microscopiques et particulier les champignons microscopiques pouvant dégrader la cellulose et/ou l’hémicellulose, les hyphes des champignons microscopiques et les fungi imparfaits. Le terme « bactérie » désigne selon l’invention toute les bactéries pates à dégrader la cellulose et/ou l’hémicellulose et les bactéries d’originaires du tractus animal (végétarien ou carnivore). L’acronyme FSC fait référence au signal correspondant à la lumière diffractée (FSC: Forward Scatter) ; ce signal dépend de la taille et de la surface de la particule analysée ; L’acronyme SSC (SSC: Side Scatter) fait référence au signal correspondant à la lumière réfléchie et réfractée ; ce signal dépend de la granularité et de la complexité cellulaire de la particule analysée. L’acronyme SSC-H fait référence à l’intensité du signal correspondant à la lumière réfléchie et réfractée ; L’acronyme SSC-A fait référence à l’intensité par unité de surface du signal correspondant à la lumière réfléchie et réfractée ; Les acronymes FSC-H et FSC-A font référence, respectivement à l’intensité et à l’intensité par unité de surface du signal correspondant à la lumière difractée ; L’acronyme cFDA ou c-FDA désigne un mélange de diacétate de 5-carboxy fluorescéine et de diacétate de 6-carboxy fluorescéine. Dans toute la demande, les valeurs maximales de fluorescence en absorption et en émission définissant les fluorochromes sont déterminées en présence d’ADN avec un ratio d’environ 100 paires de bases et notamment 100 paires bases d’acide nucléique pour une molécule de fluorochrome dans un milieu Tris de pH 7,5 et de concentration en EDTA égale à 1mM. Dans toute la demande, le rendement quantique de fluorescence qui définit les fluorochromes est mesuré en présence d’ADN et exprimé de manière relative au rendement déterminé pour le violet de crésyle dans le méthanol. D’autres caractéristiques et avantages de l’invention ressortiront à la lecture de la description qui suit, en référence aux figures annexées, qui illustrent : : La est un histogramme bi paramétrique indiquant pour chaque point l’intensité de la fluorescence émise par le fluorochrome SYTO63® et l’intensité de la lumière réfléchie et réfractée ; : La est un histogramme bi paramétrique indiquant pour chaque point dans la fenêtre TOTAL visible sur la l’intensité de la lumière diffractée et l’intensité de la lumière réfléchie et réfractée ; : La est un histogramme bi paramétrique indiquant pour chaque point de la fenêtre « bactéries » visible sur la , l’intensité de la fluorescence due au fluorochrome SYTOX-orange et l’intensité de la fluorescence due au mélange cFDA ; et : La est un histogramme bi paramétrique indiquant pour chaque point de la fenêtre « champignon (champi) » visible sur la , l’intensité de la fluorescence due au fluorochrome SYTOX-orange et l’intensité de la fluorescence due au mélange cFDA ; et : Représente des photographies d’hyphes fongique détectées par le cytomètre en flux et indiquées comme un évènement (un point) sur l’histogramme des résultats ; leur état (latent, vivant, mort) peut être déterminé par la méthode selon l’invention. EXEMPLES Dans l’exemple ci-dessous, le terme « champignon » est synonyme de fungi. Mélange de fluorochromes De l’eau physiologique (eau osmosée/ultra pure + NaCl à 8,5g/L) est préparée puis autoclavée et filtrée avant utilisation (filtre 0.22µm). Le SYTOX ® -Orange (Thermofischer, 5µM) et la 5,6 carboxyfluorescein diacetate (c-FDA) sont diluées dans du DMSO (respectivement 12,5µM et 2g/L en concentrations finales) puis stockées au congélateur ; le SYTO 63® (Thermofischer, 5mM) est directement utilisé dans la solution de marquage. Les concentrations finales de fluorochromes dans le mélange de marquage sont de 7.5µM de SYTO 63®, 0,05µM de SYTOX ® -Orange (SYTOX-or) et 10 mg/L de c-FDA (21,7 µM) dans la solution de chlorure de sodium. Préparation des échantillons Un échantillon de 2.5 +/- 0.1 g de sol (terre végétale) ou de compost frais est tamisé à 2 mm ; 22.5 mL d’eau physiologique filtrée sont alors ajoutés. L’extraction solide-liquide est ensuite réalisée à l’aide d’un agitateur rotatif pendant 15 min. L’échantillon est ensuite laissé à décanter une nuit à température ambiante. Le surnageant est dilué au 1/10 (sol) ou au 1/100 (compost), les dilutions sont vortexées, une seconde dilution au 5/100 est enfin réalisée dans le mix de marquage, l’ensemble est vortéxé. Le marquage incube environ 30 min à l’obscurité avant analyse. Matériel utilisé Le cytomètre utilisé est un cytomètre ATTUNE® NXT acoustic focusing cytometer (thermofischer scientific). Ce cytomètre en flux est doté de 3 lasers: bleu (488 nm), vert (532 nm) et rouge (637 nm). Le cytomètre peut être muni d’un passeur automatique pour la lecture de microplaques 96 puits. Cet équipement est doté d’un système de focalisation acoustique du flux permettant d’utiliser un débit jusqu’à 1000 µL/min. Le débit du flux est fixé à 25 µL/min. Ce dernier est ralenti lorsque la charge microbienne est importante. Les données sont récoltées sur les canaux FSC, SSC, BL1 (525/50) pour c-FDA, GL1 (575/36) pour SYTOX-orange et RL1 (670/14) pour SYTO 62 ou 63. Les valeurs des voltages pour chacun de ces canaux sont respectivement 320V, 340V, 460V, 480V et 570V. Des valeurs différentes peuvent être appliquées. Il n’existe pas de problème de compensation à corriger dans cette configuration. Traitement des résultats Afin de séparer les micro-organismes du bruit de fond le SYTO63® est utilisé, ainsi sont considérés comme micro-organismes les événements SYTO63® positifs. Le SYTO62® peut également être utilisé. Le triple marquage de l’échantillon et une stratégie de « gatting » (détermination de fenêtres) ont permis la séparation des bactéries et des champignons dans les sols et compost. Dans un premier temps, la majorité des micro-organismes sont séparés du bruit de fond par le plot SSC-H/RL1-H (670/14 nm) (voir ). Les points pour lesquels on obtient une fluorescence correspondent à des microorganismes puisque le fluorochrome SYTO63® se fixe sur l’ADN et non sur les particules en suspension dans l’échantillon. Ensuite, grâce au plot SSC-H/FSC-H appliqué sur la fenêtre TOTAL visible sur la et englobant les bactéries et les champignons (microorganisme contenant de l’ADN), les bactéries et champignons sont séparés en raison de leurs différences morphologiques et structurales. On définit donc deux fenêtres visibles sur la : une fenêtre CHAMPI qui contient les points attribuables aux fungi et une fenêtre BACT qui contient les points attribuables aux bactéries. Ces fenêtres ont pu être validées par comparaison entre les résultats obtenus en cytométrie, microscopie et sur boîtes de pétri. Les analyses effectuées en microscopie et sur boîte de Pétri permettent une détermination des fenêtres servant également d’étalonnage pour un même type de substrat, par exemple. Les différents états des micro-organismes étudiés (population totale, Bactéries et Champignons) sont obtenus par croisement des données obtenues par les différents fluorochromes sur chacune des fenêtres déterminées. Ainsi pour chaque fenêtre correspondant soit aux fungi (champignon), soit aux bactéries, on réalise les histogrammes bi paramétriques donnant les intensités de fluorescence émise pour chacun des deux fluorochromes qui sont le SYTOX-orange et le mélange cFDA. L’état “mort” correspond à une émission de fluorescence due au SYTOX-Orange et une absence de fluorescence due au mélange cFDA (SYTOX-or + / cFDA -). L’état “vivant latent (VNC vivant non cultivable)” correspond à une absence ou faible émission de fluorescence due au SYTOX-orange et une absence ou faible émission de fluorescence due au mélange cFDA ( SYTOX-Orange - / c-FDA -).L’état “vivant actif/vitale” correspond aux points présentant une absence d’émission de fluorescence due au SYTOX orange et une émission de fluorescence due au mélange cFDA (SYTOX-Orange - / c-FDA +). La méthode de l’invention permet ainsi de réaliser en même temps, avec un même échantillon et avec un seul passage dans le cytomètre : la séparation des microorganismes d’intérêt (fungi et bactéries) du bruit de fond, la séparation des microorganismes vivants des microorganismes morts, à l’intérieur de la population des microorganismes vivants, séparer les microorganismes physiologiquement actifs, des microorganismes en dormance (état latent) ; Elle apporte également toutes les informations sur la vitalité et la viabilité en même temps. La méthode est rapide, avec un marquage actif en 15 minutes environ, peu couteuse et industrialisable pour de l’analyse à haut débit. De plus, comme cela est visible sur les photographies de la , la méthode permet d’extraire les hyphes, de les détecter par cytométrie en flux par marquage et de déterminer leur état de vie (latent, mort, actif) via le triple marquage. Naturellement, l’invention est décrite dans ce qui précède à titre d’exemple. Il est entendu que l’homme du métier est à même de réaliser différentes variantes de réalisation de l’invention sans pour autant sortir du cadre de l’invention. Méthode de détection et quantification simultanée des fungi et des bactéries présentes dans un solide divisé contenant des matières organiques cellulosiques, selon laquelle on réalise une extraction solide-liquide dudit solide divisé, on introduit un échantillon dudit liquide obtenu, éventuellement dilué, dans un cytomètre en flux et on établit un histogramme bi paramétrique donnant pour chaque point l’intensité de la lumière diffractée et l’intensité de la lumière réfléchie et réfractée de manière à discriminer un premier groupe de points attribuables aux fungi et un deuxième groupe de points attribuables aux bactéries, caractérisé en ce l’on ajoute dans ledit échantillon avant introduction dans ledit cytomètre, au moins un premier fluorochrome apte à se lier à l’ADN, en ce que l’on excite en outre ledit échantillon de manière à obtenir la fluorescence dudit premier fluorochrome, en ce que l’on établit également ledit histogramme bi paramétrique pour les points correspondant à des particules émettant en fluorescence dans la longueur d’onde d’émission dudit fluorochrome pour le premier groupe de points et pour le deuxième groupe de points et en ce que pour chacun desdits groupes on détermine un nuage de points qui correspond à une intensité de fluorescence due au premier fluorochrome supérieure à celle des autres points dudit groupe et en ce qu’éventuellement on compte les points dudit nuage, lesquels correspondent respectivement aux cellules de fungi ou de bactéries. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que l’on ajoute également audit échantillon avant introduction dans ledit cytomètre au moins un deuxième et au moins un troisième fluorochrome, en ce que ledit deuxième fluorochrome est apte à se lier uniquement à l’ADN des cellules dont la paroi est perméable et un troisième fluorochrome qui devient fluorescent par réaction avec les estérases contenues dans les cellules vivantes et en ce que pour au moins un desdits groupes on établit un histogramme bi paramétrique donnant l’intensité de la fluorescence due au deuxième fluorochrome et l’intensité de la fluorescence due au troisième fluorochrome, on détermine sur ledit histogramme deux ou trois nuages de points : un premier nuage de point pour lesquelles la fluorescence du troisième fluorochrome est la plus forte, un deuxième nuage de points pour lesquels la fluorescence due au deuxième fluorochrome est la plus faible et un troisième nuage de point et on déduit que le premier nuage de points corresponds aux bactéries/fungi vivant(e)s, le deuxième nuage de points correspond au fungi/bactéries à l’état latent et le troisième nuage de points correspond aux fungi/bactéries mort(e)s, en comptant les points dans chaque nuage, on détermine le nombre de bactéries ou de fungi et leur état respectif. Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit premier fluorochrome est choisi parmi les fluorochromes apte à se lier à l’ADN des cellules et présentant une longueur d’onde d’absorption en fluorescence maximale égale ou supérieure à 599nm et égale ou inférieure à 657nm et une longueur d’onde d’émission en fluorescence maximale égale ou supérieure à 619nm et égale ou inférieure à 678nm et un rendement quantique égale ou supérieur à 0,16 et égal ou inférieur à 0,39 et en particulier parmi les fluorochromes apte à se lier à l’ADN des cellules et présentant une longueur d’onde d’absorption en fluorescence maximale de 652 nm et une longueur d’onde d’émission en fluorescence maximale de 676 nm et un rendement quantique de fluorescence sur l’ADN de 0,27 et les fluorochromes aptes à se lier à l’ADN et présentant une longueur d’onde d’absorption maximale en fluorescence de 657nm et une longueur d’onde d’émission maximale en fluorescence de 673nm et un rendement quantique de fluorescence sur l’ADN de 0,17. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que ledit deuxième fluorochrome est choisi parmi les fluorochromes présentant une longueur d’onde d’absorption maximale en fluorescence de 547nm et une longueur d’onde d’émission maximale en fluorescence de 570nm et un rendement quantique de fluorescence sur l’ADN de 0,9 et en ce que ledit troisième fluorochrome est choisi parmi le diacétate de 5-carboxyfluoresceine, le diacétate de 6-carboxyfluoresceine, les mélanges de diacétate de 5-carboxyfluoresceine et de diacétate de 6-carboxyfluoresceine et le diacétate fluorescéine 5,6 carboxylate de succinimidyl de formule générale suivante : [Formule 3] Méthode selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit solide divisé contenant des matières cellulosiques est choisi parmi la terre végétale, le terreau, le compost, le fumier, le mulch, l’humus et leurs mélanges, notamment leurs mélanges deux à deux. Méthode selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu’elle permet de détecter et quantifier au moins un fungi et de préférence un mélange de fungi choisi parmi les champignons microscopiques capables de former des mycorhyzes, les fungi imparfaits, Lichtheimia corymbifera corymbilfer mucor, mucor mucedo, les levures, et les hyphes des champignons microscopiques et une moins une bactérie ou un mélange de bactéries choisie(s) parmi cytophaga spp , streptomyces spp , Bacillus radicola , Candida albicans , Phycomycètes Rhizopus, Penicillium spp , Aspergillus spp , verticillium, Helminthosporium, Fusarium, Cladosporium, les actynomycètes, Nitrosomonas, Nitrosocoocus, Azotobacter, Clostridium spp , Rhizobium, acidobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Actinobacteria, Alphaproteobacteria et Betaproteobacteria , , Saccharomyces spp , Pseudomonas spp , Staphylococcus aureus. E. coli, Micrococcus luteus, Bacillus megaterium, Bacillus polymyxa et Enterococcus faecium . Méthode selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que on réalise l’extraction solide liquide avec une solution aqueuse de chlorure de sodium contenant de 7 à 12g/L de chlorure de sodium et notamment 8,5g/L de chlorure de sodium et filtrée avec un filtre ayant un seuil de coupure à 0,22µm. Méthode selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit solide divisé est tamisé avant l’extraction de manière à ne conserver que les fragments de taille inférieure ou égale à 2 mm. Mélange fluorochromique contenant un premier fluorochrome choisi parmi les fluorochromes apte à se lier à l’ADN des cellules et présentant une longueur d’onde d’absorption en fluorescence maximale égale ou supérieure à 599nm et égale ou inférieure à 657nm, une longueur d’onde d’émission en fluorescence maximale égale ou supérieure à 619nm et égale ou inférieure à 678nm et un rendement quantique égal ou supérieur à 0,16 et égal ou inférieur à 0,39 et leurs mélanges et en particulier parmi les fluorochromes apte à se lier à l’ADN des cellules et présentant une longueur d’onde d’absorption en fluorescence maximale de 652 nm et une longueur d’onde d’émission en fluorescence maximale de 676 nm et un rendement quantique de fluorescence sur l’ADN de 0,27 et les fluorochromes aptes à se lier à l’ADN et présentant une longueur d’onde d’absorption maximale en fluorescence de 657nm et une longueur d’onde d’émission maximale en fluorescence de 673nm et un rendement quantique de fluorescence sur l’ADN de 0,17 et leurs mélanges, un deuxième fluorochrome choisi parmi les fluorochromes présentant une longueur d’onde d’absorption maximale en fluorescence de 547nm et une longueur d’onde d’émission maximale en fluorescence de 570nm et un rendement quantique de fluorescence sur l’ADN de 0,9 et un troisième fluorochrome choisi parmi le diacétate de 5-carboxyfluoresceine, le diacétate de 6-carboxyfluoresceine, les mélanges de diacétate de 5-carboxyfluoresceine et de diacétate de 6-carboxyfluoresceine et le diacétate fluorescéine 5,6 carboxylate de succinimidyl de formule générale suivante : [Formule 4] Mélange fluorochromique selon la revendication 10, caractérisé en ce qu’il contient une concentration en troisième fluorochrome supérieure à la concentration en deuxième et premier fluorochrome et en ce que qu’il contient une concentration en premier fluorochrome supérieure à celle dudit deuxième fluorochrome.