Brevet FR3127233A1 — publié le 20230324

Procédé pour augmenter le pouvoir antioxydant de microorganismes L’invention concerne un procédé, pour augmenter le pouvoir antioxydant de microorganismes, avec les étapes : - dans une enceinte (1) de culture, on inocule à t0, un milieu réactionnel (3) avec lesdits microorganismes, et on permet la croissance desdits microorganismes ; - au cours de la phase de croissance, on applique, à partir de t1, une pression comprise entre 4 et 8 bars dans l’enceinte ; - on mesure, à partir de t1, la quantité de ROS libérées dans ledit milieu et on compare la quantité de ROS libérées au cours du temps à la quantité de ROS libérée à t1 ; - on récolte, à t2 postérieur à t1, lesdits microorganismes, avec un pouvoir antioxydant amélioré par rapport au pouvoir antioxydant des microorganismes à t1, la quantité de ROS à t2 étant équivalente ou inférieure à la quantité de ROS produite à t1. Figure pour l’abrégé : Fig. 1 Procédé pour augmenter le pouvoir antioxydant de microorganismes La présente invention concerne un procédé pour augmenter le pouvoir antioxydant de microorganismes, qu’ils soient eucaryotes ou procaryotes. Le procédé de la présente invention permet, de manière particulièrement avantageuse, en plus d’une amélioration du pouvoir antioxydant des microorganismes, une augmentation du pouvoir antioxydant des fractions de ces derniers, pouvant être obtenues, par exemple, par différents types d’extraction, notamment au méthanol, au chloroforme, ou encore à l’eau. Ainsi, la présente invention peut être mise en œuvre afin d’augmenter également, par exemple, le pouvoir antioxydant d’une fraction de phénols ou de flavonoïdes extraite d’une culture de microalgues conduite au moyen du procédé de la présente invention, dont les caractéristiques seront détaillées ci-dessous. La présente invention concerne donc, plus particulièrement, le domaine de la croissance de microorganismes eucaryotes ou procaryotes en bioréacteurs. Les microorganismes obtenus par la mise en œuvre du procédé de la présente invention, ou les fractions extraites de ceux-ci, pourront trouver une application, notamment, dans le domaine de l’alimentation humaine ou animale, ou bien encore dans le domaine cosmétique ou nutraceutique. Ainsi, plus particulièrement, le procédé de l’invention peut être mis en œuvre afin de produire des levures antioxydantes vivantes, qui seront utilisées ensuite, par exemple, dans le domaine de la vinification. Le procédé de l’invention peut également être mis en œuvre pour produire des levures destinées à être utilisées sous forme sèche, autrement dit des levures inactivées. Les microorganismes qui sont multipliés au moyen du procédé de la présente invention peuvent également entrer dans la composition de probiotiques. Traditionnellement, dans l’état de la technique, il existe plusieurs méthodes pour entraîner un stress des microorganismes. Toutefois, de telles méthodes ne présentent pas un objectif d’augmentation du pouvoir antioxydant de ces derniers. Ainsi, on connait, par exemple, l’utilisation d’une espèce chimique, comme le peroxyde d’hydrogène H 2 O 2 , qui peut être ajouté au milieu de culture des microorganismes pour générer un stress sur ces derniers. Cela étant, une telle méthode présente l’inconvénient de la nécessité d’une approbation, par les autorités compétentes, de l’espèce chimique utilisée dans le procédé de croissance, notamment lorsque les microorganismes mis en contact avec cette espèce chimique sont destinés à une application dans l’alimentation humaine ou animale. A défaut, ou dans le cas de l’utilisation d’une molécule chimique toxique, cette dernière devra nécessairement être retirée du milieu avant utilisation de la biomasse, et une telle étape de séparation d’une espèce chimique est coûteuse et chronophage. Ainsi, par exemple, dans le cas d’une manipulation par stress salin, une quantité importante de sels doit être ajoutée à la culture, en sorte qu’une telle méthode est coûteuse, en termes de matières premières, d’éléments techniques et de recyclage des sels. Une telle application d’un stress salin est utilisée notamment dans les cultures de microalgues afin de déclencher une accumulation de pigments dans les cellules, lesdits pigments étant les produits d’intérêt que l’on cherche à produire ici. Une autre méthode connue dans l’état de la technique et pouvant être mise en œuvre dans le but d’augmenter le pouvoir antioxydant de microorganismes en phase de croissance consiste à transférer la culture sur un milieu carencé en un élément essentiel à la croissance. Dans l’approche par stress azoté, on peut ainsi, par exemple, effectuer un tel transfert depuis un milieu de culture initial, contenant de l’azote en quantité suffisante pour la multiplication des microorganismes, vers un second milieu qui est, lui, carencé en azote. Cependant, préalablement au transfert entre le milieu de culture initial et le milieu de culture carencé, il est nécessaire d’effectuer une étape de lavage de la culture. Là encore, la mise en œuvre de cette étape implique des coûts, afin de pouvoir séparer les microorganismes et le milieu de culture initial. Une autre solution réside dans le fait de calculer de manière extrêmement précise les quantités des nutriments à ajouter, en l’occurrence la quantité d’azote lors de la préparation du milieu de culture initial. L’objectif ici est de faire en sorte d’éviter une étape de transfert car le milieu de culture devient naturellement carencé. Une telle solution reste toutefois compliquée à mettre en œuvre, en particulier au niveau d’une production industrielle de biomasse, étant donné, notamment, que les intrants présents dans les milieux de culture sont variables selon la souche de microorganismes à multiplier. La présente invention se veut à même de remédier, au moins en partie, aux inconvénients des procédés et dispositifs connus dans l’état de la technique, en proposant une solution présentant l’avantage de pouvoir être mise en œuvre dans des bioréacteurs de culture ou de maturation, notamment sans aucun ajout de produit chimique supplémentaire. En outre, le procédé de la présente invention permet une augmentation du pouvoir antioxydant des microorganismes en évitant une étape de lavage additionnel, et est, par ailleurs, robuste vis-à-vis des intrants. A ces effets, l’invention consiste, plus particulièrement, à exposer les microorganismes à une pression élevée, de l’ordre de plusieurs bars de pression, lors de leur culture ou de leur maturation, avant la phase de récolte de ces microorganismes, et ce pendant une durée d’exposition limitée et contrôlée afin d’optimiser le pouvoir antioxydant des microorganismes, préalablement à la récolte de ceux-ci. Ainsi, la présente invention est relative à un procédé pour augmenter le pouvoir antioxydant de microorganismes. Celui-ci consiste plus particulièrement en un procédé de culture d’au moins une espèce de microorganismes et de production de biomasse à partir de ces microorganismes. Un tel procédé est réalisé dans un milieu réactionnel adéquat, comportant l’ensemble des nutriments nécessaires à la croissance et à la multiplication des microorganismes, ledit milieu réactionnel étant contenu dans une enceinte de culture d’un bioréacteur. Dans le procédé de l’invention : - on inocule, au temps t0, ledit milieu réactionnel avec lesdits microorganismes, et on permet la croissance et la multiplication desdits microorganismes ; - au cours de la phase de croissance des microorganismes, on applique, à partir d’un instant t1, une pression comprise entre 4 et 8 bars dans l’enceinte de culture du bioréacteur ; - on mesure, à partir de t1, la quantité d’espèces réactives à l’oxygène (ROS) produites au sein des microorganismes en croissance dans ledit milieu réactionnel et on compare la quantité de ROS Q ROS-t produite au cours du temps à la quantité de ROS Q ROS-t1 produite à t1, la valeur Q ROS-t 1 au temps t1 étant considérée comme valeur de référence et étant égale à 1 ; - on récolte, au temps t2, t2 étant postérieur à t1, lorsque la quantité de ROS à t2 Q ROS-t2 est comprise entre 1,05*Q ROS-t1 et 0,1*Q ROS-t1 , lesdits microorganismes, ces derniers présentant, au temps t2, un pouvoir antioxydant amélioré par rapport au pouvoir antioxydant des microorganismes à t1. De manière particulièrement avantageuse, on applique, au cours de la phase de croissance, une pression à l’intérieur de l’enceinte du bioréacteur, entre 6 et 8 bars, et en ce que l’on récolte lesdits microorganismes à un temps t2, t2 étant postérieur à t1, lorsque la quantité de ROS à t2 Q ROS-t2 est inférieure à 0,5*Q ROS-t1 et supérieure ou égale à 0,2*Q ROS-t1 . Tout préférentiellement, on applique, au cours de la phase de croissance, une pression à l’intérieur de l’enceinte du bioréacteur égale à 6 bars. Avantageusement, on maintient la pression à l’intérieur de l’enceinte du bioréacteur par apport d’oxygène pur O 2 ou d’air. Lesdits microorganismes mis en culture consistent par exemple en des levures appartenant à l’espèce Saccharomyces cerevisiae . Le procédé de l’invention est particulièrement avantageux. Notamment, la manipulation de la pression au sein d’un bioréacteur de culture, pour générer un stress en vue d’obtenir une augmentation du pouvoir antioxydant des microorganismes, est aisée à mettre en œuvre, et peu coûteuse. De plus, en mettant en œuvre le présent procédé, aucun produit chimique supplémentaire, potentiellement toxique ou néfaste à une culture microbienne, ne doit être ajouté. Par conséquent, il n’est pas non plus nécessaire de retirer cet éventuel produit chimique du milieu pour l’application à laquelle est destinée le microorganisme, notamment lorsque cette application est dans le domaine de l’agroalimentaire ou de l’alimentation animale. Le procédé de l’invention permet, par conséquent, d’éviter des surcoûts de purification. A noter également que le procédé de l’invention ne nécessite pas l’emploi de microorganismes génétiquement modifiés, tout en permettant d’améliorer leur pouvoir antioxydant. Enfin, les inventeurs ont réussi à mettre au point un procédé de croissance et de multiplication de microorganismes dans lequel, malgré le stress auquel ils sont soumis, le taux de croissance desdits microorganismes n’est pas altéré. D’autres buts et avantages de la présente invention apparaîtront au cours de la description qui va suivre se rapportant à des modes de réalisation qui ne sont donnés qu’à titre d’exemples indicatifs et non limitatifs. La compréhension de cette description sera facilitée en se référant aux dessins joints en annexe et dans lesquels : représente, de manière schématique, une enceinte de culture d’un bioréacteur pour la mise en œuvre du procédé de l’invention ; est un graphique représentant le contenu en ROS (espèces réactives à l’oxygènes) présentes dans les cellules au cours du temps, en heures, selon la pression appliquée dans l’enceinte de culture, à savoir 4 bars (-♦-), 6 bars (-■-), 8 bars (-▲-) et 9 bars (-X-), le contenu en ROS dans les cellules étant mesuré au moyen d’H 2 DCFDA (2,7-dichlorodihydrofluoresceine diacétate), apte à pénétrer dans les cellules et à émettre de la fluorescence à un niveau proportionnel à la quantité de ROS présente dans les cellules, la fluorescence étant mesurée au moyen d’un cytomètre en flux, et étant exprimée de manière relative en comparaison avec le niveau de fluorescence de référence, égal à 1, à t1 (0h) au moment où l’on commence à appliquer le niveau de pression choisi ; correspond à un graphique illustrant l’évolution du pouvoir réducteur d’une culture de levures appartenant à l’espèce Saccharomyces cerevisiae , en fonction du temps d’application (en heures) de différentes pressions, à savoir 4 (-♦-), 6 (-■-), 8 (-▲-) et 9 bars (-X-). En référence à ces dessins, la présente invention est plus particulièrement relative à un procédé pour augmenter le pouvoir antioxydant de microorganismes. Au sens de la présente invention, on entend par une augmentation du pouvoir antioxydant, en ce qui concerne un microorganisme, un effet qui limite, ralentit ou empêche l’oxydation d’autres substances chimiques, en comparaison avec le même microorganisme pour lequel on n’a pas cherché à agir sur le pouvoir antioxydant. L’amélioration de ce pouvoir antioxydant au moyen de la mise en œuvre du procédé de l’invention peut être mesurée par détermination du pouvoir réducteur, qui est obtenu soit en mesurant le contenu en phénol, en mesurant le contenu en flavonoïdes, en mesurant le pouvoir chélatant du fer Fe 2+ , en mesurant le piégeage des radicaux HO· ou bien encore en mesurant l’activité équivalente au bêtacarotène. Le procédé de l’invention est, dans un premier temps, un procédé classique de culture d’au moins une espèce de microorganismes, en vue d’une production de biomasse à partir de ces microorganismes, notamment. Au cours de la mise en œuvre du procédé, des conditions particulières de pression dont il sera question plus en détails ci-après, sont appliquées. Plus particulièrement, le procédé de la présente invention permet une amélioration du pouvoir antioxydant des microorganismes par rapport au pouvoir antioxydant de ces mêmes microorganismes avant l’application des conditions particulières de pression spécifiques au procédé de la présente invention. Le présent procédé permet, en outre, une amélioration du pouvoir antioxydant d’une culture de microorganisme par rapport à une autre culture de microorganismes dont la croissance et la multiplication a été effectuée avec application de paramètres similaires, à l’exception des conditions de pression spécifiques audit procédé. En référence, plus particulièrement, à la des dessins ci-joints, le procédé de l’invention est mis en œuvre dans une enceinte de culture 1 d’un bioréacteur 2, lequel contient un milieu de croissance, ou milieu réactionnel 3, adéquat et adapté aux besoins nutritionnels des microorganismes que l’on souhaite multiplier pour obtenir une biomasse présentant un pouvoir antioxydant amélioré. Ainsi, dans une première étape du procédé de l’invention, on inocule le milieu réactionnel 3 avec la souche de microorganismes que l’on souhaite cultiver. Les microorganismes mis en culture peuvent consister soit en des organismes eucaryotes, soit en des procaryotes. Avantageusement, il s’agit de microorganismes non photosynthétiques. A noter que le procédé de l’invention peut être mis en œuvre aussi bien sur une seule souche pure de microorganismes, que sur un mélange de plusieurs souches de microorganismes. Tout préférentiellement, les microorganismes qui sont mis en culture dans le procédé de l’invention consistent en des levures, et plus préférentiellement encore appartenant à l’espèce Saccharomyces cerevisiae . Une fois l’inoculation du milieu effectuée avec le ou les microorganisme(s), on applique ensuite, dans l’enceinte de culture 1 du bioréacteur 2, des conditions permettant la croissance et la multiplication de ces microorganismes, notamment en termes de température, de pH, d’agitation etc. Finalement, une fois la quantité de microorganismes souhaitée atteinte, on stoppe la croissance et on récolte la biomasse qui a été produite. Selon une caractéristique propre au procédé de l’invention, pendant un certain laps de temps, qui pourra être optimisé selon la souche de microorganismes mis en culture selon les conditions définies ci-après dans la description, et durant la phase de croissance des microorganismes, on applique, à l’intérieur de l’enceinte 1 du bioréacteur 2, une pression élevée, de l’ordre de plusieurs bars, notamment à une pression comprise entre 2 et 8 bars, plus préférentiellement entre 6 et 8 bars, et plus préférentiellement encore, une pression égale à 6 bars, ou de l’ordre de 6 bars, par exemple entre 5,5 et 6,5 bars. Le niveau de pression appliqué, de même que la durée d’application de cette pression pourront avantageusement être adaptées selon la souche de microorganismes que l’on souhaite multiplier. Quoiqu’il en soit, la durée d’application de la pression d’une pression comprise entre 4 et 8 bars, ou entre 6 et 8 bars, est avantageusement supérieure 3h, et plus avantageusement supérieure à 4h, de préférence comprise entre 3 et 6h. Il a pu être mis en évidence, par les inventeurs qu’une exposition des microorganismes, en particulier des levures S. cerevisiae , à une pression élevée lors de leur culture ou de leur maturation, pendant un temps déterminé, avant la phase de récolte, génère un stress libérateur d’espèces réactives à l’oxygène (ou ROS pour Reactive Oxygen Species), ce qui va alors entrainer une augmentation de la défense oxydante des microorganismes, pour faire face à la libération de ces ROS. Par conséquent, immédiatement après le début de l’application de conditions hyperbares dans l’enceinte 1 de culture du bioréacteur 2, la quantité de ROS va évoluer à l’intérieur des cellules de microorganismes mis en culture dans le milieu réactionnel 32. Ces ROS sont produites par les microorganismes en réponse à la forte pression appliquée dans leur milieu de culture, soit via les mitochondries, soit comme signaux de stress, via le complexe enzymatique NADPH oxydase. Suite à cela, pour se défendre contre la production des ROS, les microorganismes vont augmenter leur pouvoir antioxydant, ce qui va alors entrainer, progressivement, une diminution du niveau de ROS dans les cellules, jusqu’à ce que celui-ci redevienne, en fonction de la pression appliquée, sensiblement équivalent au niveau de départ, voire, de préférence, inférieur au niveau de ROS initial, ce dernier étant déterminé au moment du démarrage de l’application des conditions hyperbares dans l’enceinte 1. A noter qu’il a pu être déterminé par les inventeurs qu’un stress trop peu important, en l’occurrence l’application d’une pression trop faible, typiquement inférieure à 4 bars, ne conduira pas à une évolution significative de la quantité de ROS dans les cellules. Par conséquent, le pouvoir antioxydant des microorganismes sera inchangé. Dans le cas contraire, lorsque le stress appliqué à la culture de microorganismes est trop important, autrement dit lorsque les conditions de pression sont trop élevées, ou si la pression élevée est appliquée pendant un temps trop important, une quantité trop élevée de ROS sera produite et accumulée au sein des cellules et celles-ci ne pourront pas contrer le stress oxydatif généré. Plus spécifiquement, cette quantité importante de ROS conduira à une augmentation substantielle du pouvoir oxydant cette fois, entrainant, par conséquent, une perte nette du pouvoir antioxydant. Ainsi, il ressort, de ce qui précède que, même si le pouvoir antioxydant augmente, le pouvoir oxydant lui aussi augmente. Pour maximiser le gain de pouvoir antioxydant au sein de microorganismes, il est essentiel d’appliquer à ceux-ci des conditions hyperbares suffisamment longtemps en sorte d’aboutir à une baisse du pouvoir oxydant tout en ayant un maintien du gain en pouvoir antioxydant. En outre, il est à noter également que si les conditions appliquées ne sont pas optimales, la croissance des microorganismes sera fortement ralentie, voire complètement stoppée. Cependant, si une croissance de la culture concomitante au traitement n'est pas recherchée, alors le traitement hyperbare peut être appliqué en fin de culture. Il convient donc, pour obtenir une augmentation du pouvoir antioxydant net de microorganismes mis en culture, sans influer de manière négative sur la dynamique de croissance d’appliquer, dans l’enceinte 1 du bioréacteur 2, une pression élevée donnée mais cela uniquement pendant un temps optimisé. Ainsi, dans le procédé de l’invention pour augmenter le pouvoir antioxydant des microorganismes mis en culture dans un milieu réactionnel 3 contenant les nutriments nécessaires à la croissance desdits microorganismes, ceux-ci étant préférentiellement des levures S. cerevisiae , au sein d’une enceinte 1 d’un bioréacteur 2, on met en œuvre, au moins, les étapes suivantes : on inocule, au temps noté t0, ledit milieu réactionnel 3 avec lesdits microorganismes, et on permet la croissance et la multiplication desdits microorganismes en appliquant les conditions adéquates dans ladite enceinte 1 ; au cours de la phase de croissance des microorganismes, on applique, à partir d’un temps t1, des conditions hyperbares dans l’enceinte 1 de culture du bioréacteur 2, avec une pression plus préférentiellement comprise entre 4 et 8 bars, et plus préférentiellement encore une pression comprise entre 6 et 8 bars et, plus préférentiellement encore, une pression égale à, ou de l’ordre de, 6 bars ; on mesure, au moins à partir du temps t1 au moment où l’on commence à appliquer les conditions hyperbares, la quantité d’espèces réactives à l’oxygène (ROS) produites au sein des microorganismes en croissance dans ledit milieu réactionnel 3 ; à noter qu’il est également envisageable d’effectuer un tel suivi à partir du temps t0 ; on compare la quantité de ROS Q ROS-t produite par les levures au cours du temps à la quantité de ROS Q ROS-t1 produite à t1, la valeur Q ROS-t1 au temps t1 étant considérée comme étant la référence et à laquelle on donne une valeur égale à 1 ; on récolte lesdits microorganismes au temps t2, t2 étant postérieur à t1, lorsque la quantité de ROS à t2, notée Q ROS-t2 , est comprise entre 1,05*Q ROS-t1 et 0,1*Q ROS-t1 , ces microorganismes présentant, au temps t2, un pouvoir antioxydant amélioré par rapport au pouvoir antioxydant des microorganismes à t1. Ainsi, on détermine le niveau de ROS dans la culture au moment t1 où l’on commence à appliquer les conditions hyperbares dans l’enceinte. Ce niveau de ROS, noté Q ROS-t1 , et considéré comme étant égal à 1, sert de référence pour la suite du procédé. Après le démarrage de l’application des conditions hyperbares dans l’enceinte de culture, on suit l’évolution du taux de ROS produites dans les cellules au cours du temps, cette quantité étant cette fois notée Q ROS-t . Après démarrage du procédé et de l’application des conditions hyperbares, Q ROS-t fluctue en comparaison avec Q ROS-t1 . Plus particulièrement, cette quantité augmente avant de progressivement diminuer jusqu’à atteindre, au temps t2 postérieur à t1, après donc une certaine durée d’application de la pression, généralement de plusieurs heures, sensiblement la même quantité de ROS qu’à t1, au moment où l’on a commencé à augmenter la pression dans ladite enceinte 1, voire, de préférence, une quantité de ROS à t2 inférieure ou substantiellement inférieure à la quantité de ROS qui a été mesurée au temps t1. La mise en œuvre des étapes du procédé de l’invention permet avantageusement une mesure et un suivi de la quantité de ROS au sein des microorganismes en culture afin de déterminer, de manière optimale, le moment t2 où il est intéressant de stopper la culture et de récolter une biomasse présentant un pouvoir antioxydant amélioré. De manière intéressante, on stoppe la culture après quelques heures d’application de pression, typiquement entre 3 et 6 h ou entre 4 et 6h, lorsque la quantité de ROS à t2, notée Q ROS-t2 , présente une valeur comprise entre 1,05*Q ROS-t1 et 0,1*Q ROS-t1 , Q ROS-t1 étant la valeur de référence considérée comme étant égale à 1 . En d’autres termes, si la quantité Q ROS-t1 est considérée comme étant égale à 1, on stoppera la culture après avoir appliqué les conditions hyperbares à ladite culture pendant un certain temps, typiquement plusieurs heures, à un temps noté t2, lorsque la quantité Q ROS-t2 sera comprise entre 0,1 et 1,05 relativement à la quantité de ROS produite à t1 Q ROS-t1 . Dans un exemple de réalisation particulièrement avantageux, la pression appliquée lors de la mise en œuvre du procédé de l’invention est comprise entre 6 et 8 bars et on stoppe la culture à t2, pour récolter les microorganismes, lorsque la quantité de ROS à t2 est comprise entre 0,2*QROS t1 et 0,5*ROS t1. Tout préférentiellement, on mesure la quantité de ROS, produites dans les microorganismes, au moins à partir de t1, et au cours du temps jusqu’à t2, au moyen d’H 2 DCFDA (2,7-dichlorodihydrofluoresceine diacétate). Ce composé consiste en une substance non fluorescente apte à pénétrer dans les cellules et à émettre de la fluorescence après avoir été transformée en dichlorofluorescéine 2’,7’ (DCF) par clivage des groupements acétate, le niveau de fluorescence émis étant proportionnel à la quantité de ROS présente dans les cellules. La fluorescence émise par la DCF, et par conséquent le niveau de ROS, peut être évaluée, par exemple, au moyen d'un cytomètre en flux ou d'un fluorimètre, ce dernier étant particulièrement préféré car plus simple d'utilisation. Dans un exemple de réalisation particulièrement intéressant du procédé pour augmenter le pouvoir oxydant de microorganismes de l’invention, on obtient les conditions hyperbares indiquées ci-dessus par introduction, dans l’enceinte 1 du bioréacteur 2, d’un gaz ou d’un mélange de gaz, notamment d’oxygène O 2 pur ou d’air (à 21% d’oxygène). On peut donc pressuriser, de manière préférentielle, l’enceinte 1 à l'air, par exemple en introduisant de l’air à une pression de 6 bars. Il est ainsi avantageux que l’enceinte 1 soit équipée de moyens de mesure de la pression, non représentés sur la jointe, afin de pouvoir suivre, contrôler, et éventuellement ajuster, les conditions de pression à l’intérieur du bioréacteur 1 tout au long de la conduite du procédé de l’invention. En outre, afin d’appliquer et de maintenir les conditions hyperbares spécifiques au procédé de culture de l’invention, l’enceinte 1 du bioréacteur 2 est équipée de moyen d’injection 4 d’un gaz comprimé, en particulier sous la forme d’une arrivée d’air ou d’oxygène comprimé à l’intérieur de ladite enceinte 1, dans le milieu réactionnel 3, pour une pressurisation de ce dernier. Eventuellement, un moyen 41 d’évacuation des gaz peut être prévu, afin de maintenir un flux constant d’arrivée de gaz, notamment pour permettre une alimentation suffisante en dioxygène O 2 , nécessaire aux microorganismes pour l’oxydation du glucose. Les conditions optimales de température au sein de l’enceinte 1 de culture sont assurées par des moyens adaptés et usuels dans le domaine de la culture de microorganismes, et connus de l’homme du métier, et comprenant notamment une enveloppe d’isolation thermique 5 qui entoure ladite enceinte 1. En ce qui concerne la mesure du niveau de ROS dans les microorganismes, cette étape peut être effectuée en continu ou de manière régulière, par exemple toutes les heures suivant le début de l’application des conditions hyperbares dans l’enceinte de culture 1. Comme déjà indiqué précédemment dans la description, la mesure du niveau de ROS au sein des cellules peut être effectuée au moyen de la technique du H 2 DCFDA. Un tel suivi du niveau de ROS dans les microorganismes permet de déterminer, de manière optimale, le moment où il est opportun de stopper la culture pour récolter lesdits microorganismes dont le pouvoir antioxydant a été amélioré, en comparaison avec le pouvoir antioxydant des microorganismes de l’inoculum de départ. Lorsque les conditions de pression appliquées dans l’enceinte 1 sont optimales, et comme cela sera illustré en détail dans l’exemple ci-dessous en référence, en particulier, à la , à partir de t1, correspondant au moment où l’on commence à appliquer les conditions hyperbares dans l’enceinte 1 du bioréacteur 2, la quantité de ROS dans les microorganismes évolue jusqu’à atteindre, à t2, moment où l’on stoppe la croissance pour récolter la biomasse, un niveau de ROS sensiblement égal à celui de départ, à t1. Le niveau de ROS à t2 peut également être inférieur à celui de t1, considérant même qu’il est particulièrement avantageux que le niveau de ROS dans les cellules à t2 soit substantiellement inférieur au niveau de ROS à t1. Une telle évolution de la quantité de ROS, notamment la diminution de celle-ci entre t1 et t2, traduit une forte augmentation du pouvoir antioxydant des microorganismes, tandis que, dans le même temps, le taux de croissance de ces microorganismes reste stable. Finalement, le procédé de l’invention aboutit à un gain net de pouvoir antioxydant. Dans un exemple de réalisation tout particulièrement avantageux du procédé selon l’invention pour augmenter le pouvoir antioxydant de microorganismes, l’augmentation de la pression dans l’enceinte 1 du bioréacteur 2 peut être réalisée progressivement, par paliers de pression. Une telle caractéristique permet aux microorganismes en croissance de s’adapter progressivement à l’augmentation de la pression dans le milieu réactionnel et de mieux supporter le traitement à haute pression qui est mis en œuvre dans le présent procédé. L’application de paliers de pression est tout particulièrement indiquée lorsque le procédé implique la mise en croissance de souches de microorganismes qui présentent une sensibilité particulière à une augmentation de pression. Un tel procédé dans lequel on augmente la pression progressivement par paliers est également applicable à des levures S. cerevisae . Tout préférentiellement, l’augmentation de pression dans l’enceinte 1 du bioréacteur 2 est effectuée en mettant en œuvre les étapes suivantes : - on inocule, au temps t0 ledit milieu réactionnel 3 avec les microorganismes sensibles, et on applique des conditions permettant la croissance et la multiplication desdits microorganismes ; – au cours de la phase de croissance des microorganismes, on applique, à partir d’un temps t1 postérieur au temps t0, un premier niveau de pression P1 dans l’enceinte 1 de culture du bioréacteur 2 ; cette pression P1 est par exemple comprise entre 4 et 6 bars ; – on mesure, à partir de t1, la quantité d’espèces réactives à l’oxygène (ROS) libérées dans les microorganismes (Q ROS-t ) et on compare cette quantité de ROS Q ROS-t libérées au cours du temps à la quantité de ROS Q ROS -t 1 libérée à t1 ; – suite à l’application de la pression P1 dans l’enceinte de culture 1, la quantité de ROS dans les microorganismes évolue jusqu’à se stabiliser en atteignant Q ROS-t2 , à un temps t2 (postérieur à t1) après un certain laps de temps d’application de la pression P1, Q ROS-t2 étant sensiblement équivalente à Q ROS-t1 , ou inférieure à Q ROS-t1 , au moment où l’on a commencé à augmenter la pression dans ladite enceinte 1 ; plus particulièrement, si on considère que Q ROS-t1 est égale à 1, on stoppe la culture lorsque Q ROS-t2 est comprise entre 0,1*Q ROS-t1 et 1,05*Q ROS-t1 , après avoir appliqué les conditions hyperbares dans l’enceinte de culture pendant 3 à 6h . – à partir de t2, on applique, un deuxième niveau de pression P2, avec P2>P1, dans l’enceinte 1 de culture du bioréacteur 2 ; la pression P2 est avantageusement comprise entre (P1 +0,5 bar) et (P1+1bar) ; – on mesure, à partir de t2, la quantité d’espèces réactives à l’oxygène libérées dans les microorganismes et on compare la quantité de ROS libérées au cours du temps à la quantité de ROS libérée à t2 ; - suite à l’application de la pression P2 dans l’enceinte de culture 1, la quantité de ROS dans les microorganismes évolue à nouveau avant d’atteindre une valeur considérée comme intéressante Q ROS-t3 , à un temps t3 après un certain laps de temps d’application de la pression P2 (donc t3 postérieur à t2, typiquement de plusieurs heures), sensiblement la même quantité de ROS qu’à t2 ou une quantité inférieure (qui est également sensiblement la même que la quantité de ROS mesurée à t1 ; plus particulièrement, là encore, Q ROS-t3 est avantageusement comprise entre 0,1*Q ROS-t1 et 1,05*Q ROS-t1 ), au moment où l’on a commencé à appliquer la pression P2 dans ladite enceinte 1 ; – on applique, autant de fois que souhaité et que nécessaire, des paliers croissants de pression P3, P4, Pn, P3 étant supérieure à P2, P4 étant supérieure à P3, etc., en répétant les étapes de mesure, de suivi et d’augmentation de pression précédemment décrites ; - on récolte, à tn, n>2, lesdits microorganismes, qui présentent un pouvoir antioxydant amélioré par rapport à pouvoir antioxydant des microorganismes à t1. Là encore, préférentiellement, on considère particulièrement intéressantes des valeurs de quantité de ROS à t2 (Q ROS-t2 ), à t3 (Q ROS-t3 ), jusqu’à tn (Q ROS- tn ) lorsque celles-ci sont inférieures à 0,5*Q ROS-t1 et supérieures ou égales à 0,2*Q ROS-t1 . L’exemple détaillé ci-après est destiné à démontrer l’intérêt du procédé de l’invention, en référence aux figures 2 et 3. Les paramètres qui ont été mis en œuvre pour obtenir les résultats qui sont illustrés sur ces figures ne doivent cependant pas être considérés comme étant limitatifs de l’invention. Exemple : Mesure du contenu en ROS et mesure du pouvoir réducteur au cours du temps en fonction de différentes conditions de pressions La mesure des ROS a été réalisée pour une espèce de levure appartenant à l’espèce S. cerevisiae . Différents niveaux de pression ont été investigués, en particulier 2, 4, 6, 8 et 9 bars, et les niveaux de ROS ont été mesurées à t1 (0h), où l’on a commencé à appliquer les différents niveaux de pression susmentionnés dans l’enceinte du bioréacteur, puis à différents moments, à savoir 0,25h ; 2,42h ; 4,22h et 6,03h après t1. Les résultats obtenus relatifs à la mesure du contenu en ROS sont visibles sous la forme d’un graphique sur la . Des mesures du pouvoir réducteur d’une culture de levure ont également été effectuées, toujours avec application de conditions de pression de 4, 6, 8 et 9 bars. Les résultats obtenus sont illustrés sous la forme d’un graphique sur la . Des tests supplémentaires ont été menés, et dont les résultats ne sont pas nécessairement montrés ici. Cela étant, l’ensemble des résultats obtenus montrent trois tendances : – lorsque la pression est trop faible, par exemple 2 bars, la quantité de ROS libérée reste sensiblement stable au cours du temps, et il n’y a qu’une faible augmentation du pouvoir antioxydant, tandis que le taux de croissance reste stable ; – lorsque le niveau de pression appliqué dans l’enceinte de culture est adéquat, en l’occurrence 6 ou 8 bars de pression, la quantité de ROS évolue en diminuant jusqu’à se stabiliser autour de 0,2, tenant compte d’une valeur de référence (Q ROSt1 ) égale à 1 au moment où l’on commence à appliquer les différents niveaux de pression dans l’enceinte ; la diminution du niveau de ROS produites par les levures traduit forte augmentation du pouvoir antioxydant des microorganismes ; une telle augmentation concerne à la fois le pouvoir antioxydant absolu et le pouvoir antioxydant net. Le graphique de la illustrant l’évolution du pouvoir réducteur d’une culture de levures appartenant à l’espèce Saccharomyces cerevisiae , en fonction du temps d’application (en heures) de différentes pressions, à savoir 4, 6, 8 et 9 bars montre également une bonne augmentation du pouvoir réducteur notamment lorsque la pression appliquée à la culture de levure est de 6 bars. Les cultures sous 6 et 8 bars montrent un niveau de ROS qui reste en dessous de 1, ce qui traduit une adaptation de la part des microorganismes, celle-ci étant plus lente à 8 bars. De plus, la culture à 6 bars montre une nette augmentation du pouvoir réducteur ( ) et du taux de phénols (résultats non montrés). - A noter également que, dans le même temps, le taux de croissance de la culture de microorganismes reste stable, comme cela sera illustré sur le tableau 1 repris ci-dessous ; - lorsque le niveau de pression est trop élevé, notamment à 9 bars de pression dans l’enceinte de culture et au-delà de 9 bars, les ROS libérées dans le milieu de culture augmentent continuellement ; ainsi, cela entraîne une forte augmentation du pouvoir antioxydant absolu des microorganismes pour lutter contre ces ROS libérées, mais pas du pouvoir antioxydant net, car le niveau de ROS ne baisse pas au cours du temps bien que le pouvoir réducteur de la culture soit élevé ; en outre, dans le même temps, le taux de croissance chute. L’adaptation des microorganismes n’est pas assez puissante pour contrer le stress oxydatif. Ainsi, avantageusement, les inventeurs ont réussi à déterminer qu’il convenait de trouver un couple optimum « pression appliquée / temps de traitement pendant lequel est appliquée cette pression ». Le tableau 1 ci-dessous illustre le taux de croissance de la culture de levures S. cerevisiae en fonction des conditions de pression appliquées dans l’enceinte de culture. Les levures S. cerevisiae présentent un taux de croissance, exprimé en 1/d (1/day ou 1/jour) acceptable jusqu’à 8 bars de pression, où celui-ci présente encore une valeur de 0,24. A 9 bars de pression appliquée dans l’enceinte de culture, il est considéré que le taux de croissance baisse de manière trop importante. A noter que des tests ont également été effectués pour évaluer l’évolution, au cours du temps, du pouvoir chélatant, du contenu phénolique, et de l’activité antioxydante équivalente au bêtacarotène d’une culture de levures S. cerevisiae en fonction de différentes pression (4, 6, 8 et 9 bars) appliquées dans l’enceinte du bioréacteur (résultats non illustrés). Le pouvoir chélatant est globalement stable au cours du temps, quelle que soit la pression appliquée dans l’enceinte ; il est supérieur lorsque la pression appliquée est égale à 6 ou 8 bars, en comparaison avec une pression appliquée de 4 bars. Le contenu phénolique est supérieur lorsque la pression appliquée est de 6 bars, en comparaison avec le contenu phénolique produits lors de pressions de 4 et 8 bars. Pour une pression de 9 bars, le contenu phénolique est également important ; cependant, à cette pression, le contenu en ROS augmente de manière trop importante sans diminuer au cours du temps. Les résultats obtenus concernant l’activité antioxydante équivalente au bêtacarotène sont également particulièrement intéressants pour les pressions appliquées de 6 et 8 bars, avec une remarque similaire concernant la pression appliquée de 9 bars. Procédé pour augmenter le pouvoir antioxydant de microorganismes, consistant en un procédé de culture d’au moins une espèce de microorganismes et de production de biomasse à partir de ces microorganismes, dans un milieu réactionnel (3) adéquat contenu dans une enceinte (1) de culture d’un bioréacteur (2), ledit procédé étant caractérisé en ce qu’il comporte, au moins, les étapes suivantes : on inocule, au temps t0, ledit milieu réactionnel (3) avec lesdits microorganismes, et on permet la croissance et la multiplication desdits microorganismes ; au cours de la phase de croissance des microorganismes, on applique, à partir d’un temps t1, une pression comprise entre 4 et 8 bars dans l’enceinte (1) de culture du bioréacteur (2) ; on mesure, à partir de t1, la quantité d’espèces réactives à l’oxygène (ROS) produites au sein des microorganismes en croissance dans ledit milieu réactionnel (3) et on compare la quantité de ROS Q ROS-t produite au cours du temps à la quantité de ROS Q ROS-t1 produite à t1, la valeur Q ROS-t1 au temps t1 étant considérée comme valeur de référence et étant égale à 1 ; on récolte lesdits microorganismes à un temps t2, t2 étant postérieur à t1, lorsque la quantité de ROS à t2 Q ROS-t2 est comprise entre 0,1*Q ROS-t1 et 1,05*Q ROS-t1, lesdits microorganismes présentant à t2 un pouvoir antioxydant amélioré par rapport au pouvoir antioxydant des microorganismes à t1. Procédé pour augmenter le pouvoir antioxydant de microorganismes selon la revendication 1, caractérisé en ce que l’on applique, au cours de la phase de croissance, une pression à l’intérieur de l’enceinte (2) du bioréacteur (1), entre 6 et 8 bars, et en ce que l’on récolte lesdits microorganismes à un temps t2, t2 étant postérieur à t1, lorsque la quantité de ROS à t2 Q ROS-t2 est inférieure à 0,5*Q ROS-t1 et supérieure ou égale à 0,2*Q ROS-t1 . Procédé pour augmenter le pouvoir antioxydant de microorganismes selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que l’on applique, au cours de la phase de croissance, une pression à l’intérieur de l’enceinte (2) du bioréacteur (1) égale à 6 bars. Procédé pour augmenter le pouvoir antioxydant de microorganismes l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l’on maintient la pression à l’intérieur de l’enceinte (2) du bioréacteur (1) par apport d’oxygène pur O 2 ou d’air. Procédé pour augmenter le pouvoir antioxydant de microorganismes selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que lesdits microorganismes mis en culture consistent en des levures appartenant à l’espèce Saccharomyces cerevisia e .