Brevet FR3136092A1 — publié le 20231201

Dispositif de traitement de mesures de PCR temps réel à milieu de réaction homogène dans lequel les réactifs de PCR peuvent diffuser Un dispositif de traitement de mesures de PCR temps réel à milieu de réaction homogène dans lequel les réactifs de PCR peuvent diffuser comprend une mémoire agencée pour recevoir une pluralité d'images de fluorescence obtenues en filmant une réaction PCR temps réel dans une chambre plate, un analyseur agencé pour produire une image d'activité PCR à partir de la pluralité d'images de fluorescence obtenues en filmant une réaction PCR temps réel dans une chambre plate à milieu de réaction homogène dans lequel les réactifs de PCR peuvent diffuser, laquelle image d'activité PCR présente une pluralité de zones d'activité dans chacune desquelles une activité PCR est déterminée comme probable sur la base de la valeur de fluorescence des pixels de ces zones d'activité dans la pluralité d'images de fluorescence obtenues en filmant une réaction PCR temps réel dans une chambre plate, les pixels des zones d'activité recevant chacun une valeur de pondération associée à la probabilité d'une réaction PCR telle que la somme de toutes les valeurs de pondération vaut un, et les pixels hors des zones d'activité recevant une valeur nulle, et un évaluateur agencé pour analyser la pluralité d'images de fluorescence obtenues en filmant une réaction PCR temps réel dans une chambre plate en pondérant dans chaque image la valeur de fluorescence de chaque pixel par la valeur de pondération de ce pixel dans l'image d'activité, et pour retourner un ou plusieurs parmi une valeur indiquant si la réaction PCR temps réel filmée présente une amplification PCR, une valeur de cycle seuil, et une courbe de concentration au cours de la réaction PCR. Dispositif de traitement de mesures de PCR temps réel à milieu de réaction homogène dans lequel les réactifs de PCR peuvent diffuser L’invention concerne le domaine de la PCR ("Polymerase Chain Reaction") temps réel. La PCR permet de détecter de manière très sensible la présence de séquences d’acide nucléique dans un échantillon. Elle est néanmoins peu utilisée pour les applications sur le terrain car la réaction – environ 1h30 – est relativement lente. En effet, l’amplification par PCR est réalisée avec des cycles dont le profil de température comprend un ou plusieurs paliers lors de la remontée de la température vers la température de fusion voisine de 95°C. Les paliers de température sont choisis entre les températures de fusion des sondes, et le signal de fluorescence est enregistré à chacun de ces paliers. La vitesse de la réaction est donc limitée par la durée de chaque cycle qui est directement liée à la vitesse des changements de température dans la chambre de réaction. Pour contourner ce problème, des "micro heater" très rapides (environ 20 minutes pour 40 cycles) ont été développés. Cependant, le volume traité est très petit (environ 10 μl) ce qui limite la LOD (pour "Limit of detection" en anglais ou seuil de détection), et donc la capacité à détecter des petites quantités d'acide nucléique. Des systèmes de PCR en goutte (voir par exemple l'article de Hindson et al "High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number", Analytical Chemistry 2011 83 (22), 8604-8610) ont été développés, mais ils présentent l'inconvénient que la température n’est pas homogène dans la chambre de réaction et qu'ils sont compliqués à mettre en œuvre. Dans ces systèmes de PCR numérique (ou " digital PCR " en anglais), la PCR est compartimentée dans des zones de forme définie (les gouttes) si bien que le signal de PCR est numérisé pour permettre la quantification des ADN cibles individuellement par comptage des gouttes produisant une PCR positive. Cette quantification est réalisée par segmentation de l’image des gouttes en fin de réaction pour en déterminer leur position et à partir de cette position mesurer individuellement leur niveau de fluorescence pour déterminer si le contenu de la goutte est positif à la PCR ou non. Les algorithmes utilisés pour analyser les images de PCR numérique comme la PCR en goutte mesurent l’activité de la réaction de PCR dans une zone prédéfinie. Ces algorithmes ne sont pas adaptés à l’analyse de l’activité d’une PCR réalisée dans un milieu homogène tel qu’un liquide ou un gel où l’activité de la PCR peut avoir lieu dans une zone dont la taille et la forme n’est pas définie a priori et peut potentiellement changer au cours du temps à cause de la diffusion des produits de la réaction de PCR dans le milieu. A cause de ces spécificités, le domaine de la PCR numérique reste un domaine isolé, et ses enseignements ne sont pas utilisés dans d'autres domaines de la PCR. La Demanderesse a développé une solution en réponse à ces problèmes, solution qui a fait l'objet des demandes de brevet FR1601823 et FR1762058. Ces demandes de brevet enseignent l'utilisation de chambres qui ont pour caractéristique d’utiliser des puces plates permettant un échange thermique homogène sur toute la surface et de faible épaisseur pour que les variations de températures soient rapides sur l’ensemble du volume. Cependant, ces solutions tendent à limiter les mouvements de convection à l’intérieur du volume de réactif. Les amplifications locales ne se propagent pas, notamment en cas de faible concentration de l’ADN recherché. Le signal local est alors atténué par celui de l’ensemble de la puce ce qui limite la sensibilité des tests PCR réalisés sur ces puces. Ces solutions présentent un milieu de réaction homogène dans lequel les réactifs de PCR peuvent diffuser, par opposition à la PCR numérique mentionnée précédemment. Par milieu homogène, on entend un réactif liquide ou un gel où la réaction de PCR peut diffuser librement et former ainsi des zones d'activité de forme indéterminée. Cela signifie que les zones dans lesquelles l'amplification a lieu sont de forme indéterminée, contrairement aux gouttes dont la forme est connue. Aucune solution de l’état de l’art ne permet donc de faire des PCR en temps réel à la fois très rapide et avec une sensibilité à la molécule unique. L’invention vient améliorer la situation. À cet effet, elle propose un dispositif de traitement de mesures de PCR temps réel à milieu de réaction homogène dans lequel les réactifs de PCR peuvent diffuser comprend une mémoire agencée pour recevoir une pluralité d'images de fluorescence obtenues en filmant une réaction PCR temps réel dans une chambre plate, un analyseur agencé pour produire une image d'activité PCR à partir de la pluralité d'images de fluorescence obtenues en filmant une réaction PCR temps réel dans une chambre plate à milieu de réaction homogène dans lequel les réactifs de PCR peuvent diffuser, laquelle image d'activité PCR présente une pluralité de zones d'activité dans chacune desquelles une activité PCR est déterminée comme probable sur la base de la valeur de fluorescence des pixels de ces zones d'activité dans la pluralité d'images de fluorescence obtenues en filmant une réaction PCR temps réel dans une chambre plate, les pixels des zones d'activité recevant chacun une valeur de pondération associée à la probabilité d'une réaction PCR telle que la somme de toutes les valeurs de pondération vaut un, et les pixels hors des zones d'activité recevant une valeur nulle, et un évaluateur agencé pour analyser la pluralité d'images de fluorescence obtenues en filmant une réaction PCR temps réel dans une chambre plate en pondérant dans chaque image la valeur de fluorescence de chaque pixel par la valeur de pondération de ce pixel dans l'image d'activité, et pour retourner un ou plusieurs parmi une valeur indiquant si la réaction PCR temps réel filmée présente une amplification PCR, une valeur de cycle seuil, et une courbe de concentration au cours de la réaction PCR Ce dispositif est particulièrement avantageux car il permet de détecter les zones d'activité PCR et donc de retraiter le signal de fluorescence sans être pénalisé par les absences de propagation d'amplifications locales dues aux limitations des mouvements de convection à l’intérieur du volume de réactif. Selon divers modes de réalisation, l’invention peut présenter une ou plusieurs des caractéristiques suivantes : - l'analyseur est agencé pour déterminer une image de différences à partir de la pluralité d'images de fluorescence obtenues en filmant une réaction PCR temps réel dans une chambre plate, dans laquelle chaque pixel correspond à la différence entre la valeur la plus élevée et la valeur la plus faible pour ce pixel parmi la pluralité d'images de fluorescence obtenues en filmant une réaction PCR temps réel dans une chambre plate, et pour déterminer l'image d'activité à partir de l'image de différences, - l'analyseur est agencé pour déterminer des zones d'activé dans l'image des différences par seuillage de l'image des différences, - l'analyseur est agencé pour déterminer une valeur de pondération unique pour chacun des pixels de l'image d'activité PCR, - l'analyseur est agencé pour déterminer la valeur de pondération en appliquant une fonction de binarisation à seuil fixe, d'Otsu, de Bernsen, ou de Niblack, - l'analyseur est agencé pour appliquer une fonction de binarisation comprenant la régularisation des zones d'activité par application de dilatation, d'érosion, ou d'enveloppes convexes, - l'analyseur est agencé pour appliquer une fonction de binarisation dans laquelle la dilatation des zones d'activités est obtenue par ajout d'un pixel autour de chaque zone d'activité jusqu'à ce que la somme des surfaces des zones d'activité excède un seuil choisi, ou pour appliquer une fonction de binarisation dans laquelle l'érosion des zones d'activité comprend la suppression des zones d'activité dont le nombre de pixels est inférieur à un seuil choisi, - l'analyseur est agencé pour déterminer la valeur de pondération par division de la valeur de chaque pixel appartenant à une zone d'activité par la somme de toutes les valeurs de pixel de toutes les zones d'activité, - l'analyseur est un réseau de neurones de type masque R-CNN ou de type U-Net réalisant une segmentation sémantique des pixels à partir de la pluralité d'images de fluorescence obtenues en filmant une réaction PCR temps réel dans une chambre plate, et - l'évaluateur est agencé pour déterminer une valeur de cycle seuil pour chaque zone d'activité, et pour calculer une valeur de cycle seuil selon la formule , où St est la surface totale des zones d'activité, Si est la surface de chaque zone d'activité, et Cti est la valeur de cycle seuil de la zone d'activité d'indice i. L’invention concerne également un procédé de traitement de mesures de PCR temps réel à milieu de réaction homogène dans lequel les réactifs de PCR peuvent diffuser comprenant : a) recevoir une pluralité d'images de fluorescence obtenues en filmant une réaction PCR temps réel dans une chambre plate à milieu de réaction homogène dans lequel les réactifs de PCR peuvent diffuser, b) produire une image d'activité PCR à partir de la pluralité d'images de fluorescence obtenues en filmant une réaction PCR temps réel dans une chambre plate, laquelle image d'activité PCR présente une pluralité de zones d'activité dans chacune desquelles une activité PCR est déterminée comme probable sur la base de la valeur de fluorescence des pixels de ces zones d'activité dans la pluralité d'images de fluorescence obtenues en filmant une réaction PCR temps réel dans une chambre plate, les pixels des zones d'activité recevant chacun une valeur de pondération associée à la probabilité d'une réaction PCR telle que la somme de toutes les valeurs de pondération vaut un, et les pixels hors des zones d'activité recevant une valeur nulle, c) analyser la pluralité d'images de fluorescence obtenues en filmant une réaction PCR temps réel dans une chambre plate en pondérant dans chaque image la valeur de fluorescence de chaque pixel par la valeur de pondération de ce pixel dans l'image d'activité, et pour retourner un ou plusieurs parmi une valeur indiquant si la réaction PCR temps réel filmée présente une amplification PCR, une valeur de cycle seuil, et une courbe de concentration au cours de la réaction PCR. Selon divers modes de réalisation, le procédé peut présenter une ou plusieurs des caractéristiques suivantes : - l'opération b) comprend b1) déterminer une image de différences à partir de la pluralité d'images de fluorescence obtenues en filmant une réaction PCR temps réel dans une chambre plate, dans laquelle chaque pixel correspond à la différence entre la valeur la plus élevée et la valeur la plus faible pour ce pixel parmi la pluralité d'images de fluorescence obtenues en filmant une réaction PCR temps réel dans une chambre plate, et b2) déterminer l'image d'activité à partir de l'image de différences, - l'opération b) comprend déterminer une valeur de pondération unique pour chacun des pixels de l'image d'activité PCR, ou déterminer la valeur de pondération par division de la valeur de chaque pixel appartenant à une zone d'activité par la somme de toutes les valeurs de pixel de toutes les zones d'activité, - l'opération b) est obtenue par application d'un réseau de neurones de type masque R-CNN ou de type U-Net réalisant une segmentation sémantique des pixels à partir de certaines au moins des images de l'opération a), et - l'opération c) comprend déterminer une valeur de cycle seuil pour chaque zone d'activité, et calculer une valeur de cycle seuil selon la formule , où St est la surface totale des zones d'activité, Si est la surface de chaque zone d'activité, et Ct i est la valeur de cycle seuil de la zone d'activité d'indice i. L’invention concerne également un programme informatique comprenant des instructions pour exécuter le procédé selon l'invention, un support de stockage de données sur lequel est enregistré un tel programme informatique et un système informatique comprenant un processeur couplé à une mémoire, la mémoire ayant enregistré un tel programme informatique. D’autres caractéristiques et avantages de l’invention apparaîtront mieux à la lecture de la description qui suit, tirée d’exemples donnés à titre illustratif et non limitatif, tirés des dessins sur lesquels : - la représente un schéma générique d'un dispositif selon l'invention, - la représente un exemple de réalisation d'une fonction mise en œuvre par l'analyseur de la , - la représente un exemple de réalisation d'une fonction mise en œuvre par l'évaluateur de la , - la représente une image de fluorescence obtenue en filmant une réaction PCR temps réel dans une chambre plate, - la représente une image intermédiaire du cycle 10 déterminée par l'analyseur de la , - la représente une image intermédiaire du cycle 41 déterminée par l'analyseur de la , - la représente une image de différences obtenue à partir des images intermédiaires du type de celles des figures 5 et 6, - la représente une image résultat obtenue par l'évaluateur de la à partir de l'image de la , - la représente un signal d'amplification obtenu par combinaison de l'image de la avec les images du film correspondant, et - la représente une architecture de réseau de neurone U-Net selon l'une des variantes de l'invention. Les dessins et la description ci-après contiennent, pour l'essentiel, des éléments de caractère certain. Ils pourront donc non seulement servir à mieux faire comprendre la présente invention, mais aussi contribuer à sa définition, le cas échéant. La représente un schéma générique d'un dispositif selon l'invention. Le dispositif 2 comprend une mémoire 4, un analyseur 6 et un évaluateur 8. La mémoire 4 reçoit plusieurs types de données. Elle reçoit ainsi des images de fluorescence obtenues en filmant une réaction PCR temps réel dans une chambre plate à milieu de réaction homogène dans lequel les réactifs de PCR peuvent diffuser. Prises ensembles, ces images représentent le film de la fluorescence émise suite aux cycles PCR mis en œuvre. Par milieu homogène, on entend un réactif liquide ou un gel où la réaction de PCR peut diffuser librement et former ainsi des zones d'activité de forme indéterminée. Cela signifie que les zones dans lesquelles l'amplification a lieu sont de forme indéterminée, raison pour laquelle la fluorescence est classiquement moyennée sur toute la chambre pour mesurer la réaction. Dans l'exemple décrit ici, il y a environ 45 cycles dans chaque réaction PCR temps réel, et 45 images correspondantes, chacune associée à un cycle PCR de la réaction. En variante, il pourrait y avoir un autre nombre de cycles dans chaque réaction, et plusieurs images pourraient être associées à un même cycle au sein d'une réaction PCR temps réel donnée, ce qui permet de stocker des données plus riches sur la réaction PCR dans chaque cycle. Dans la suite, on parlera d'un film comme désignant l'ensemble des images des cycles PCR d'une réaction PCR temps réel donnée, et lorsqu'il sera question de comparer deux images entre elles, il est implicite qu'il s'agira d'images relatives à la même réaction PCR temps réel. L'analyseur 6 traite les films pour produire pour chaque film une image d'activité PCR dans laquelle chaque pixel présente une couleur associée à une valeur (comprise entre zéro et un) qui indique une probabilité qu'une réaction PCR a été détectée pour ce pixel. En variante, la valeur et la couleur pourraient ne pas être reliées. L'ensemble des valeurs des pixels a une somme qui vaut un, de sorte que les valeurs des pixels définissent ensemble une densité de probabilité. Ce point sera explicité plus bas. Cette image d'activité PCR peut être obtenue de diverses manières qui seront décrites par la suite, parmi lesquelles l'évaluateur 6 produit une image de différences, qui correspond à la différence entre une moyenne d'images associées à une activité PCR haute et une moyenne d'images associées à une activité PCR basse. Là encore, cela sera explicité après. Toutes ces images sont propres à être stockées dans la mémoire 4. Enfin, la mémoire 4 reçoit également des données de réaction PCR temps réel, qui peuvent indiquer si une séquence d'acide nucléique a été détectée et/ou préciser un cycle à partir duquel la réaction PCR temps réel est considérée comme ayant révélé cette détection. Cette dernière valeur est également connue sous la référence "Ct" dans le domaine de la PCR temps réel. D'une manière générale, la valeur Ct est un indicateur de la quantité de la séquence nucléique recherchée qui a été détectée. En effet, plus il y a de matériel à détecter dans un échantillon, et plus la réaction PCR produira une grande quantité de matériel détecté à partir d'un cycle dont l'indice est faible (c’est-à-dire rapproché du début de la réaction). Ainsi, un Ct de 15 indique qu'il y avait beaucoup plus de matériel de la séquence d'acide nucléique recherchée dans un échantillon donné qu'un Ct de 30. La mémoire 4 peut être tout type de stockage de données propre à recevoir des données numériques : disque dur, disque dur à mémoire flash, mémoire flash sous toute forme, mémoire vive, disque magnétique, stockage distribué localement ou dans le cloud, etc. Les données calculées par le dispositif peuvent être stockées sur tout type de mémoire similaire à la mémoire 4, ou sur celle-ci. Ces données peuvent être effacées après que le dispositif a effectué ses tâches ou conservées. L'invention repose selon le principe décrit ci-après. Du fait des limitations des mouvements de convection à l’intérieur du volume de réactif dans la chambre plate, certaines portions de la chambre ne présentent pas de réaction alors qu'elles le devraient. De ce fait, le signal de fluorescence, qui est moyenné sur toute la surface de la chambre plate, est artificiellement rabaissé, ce qui diminue la LOD. Le dispositif 2 permet de contourner ce problème en analysant toutes les images d'un film donné, et en en tirant une image sur laquelle la détection d'une réaction PCR est codée via une densité de probabilité. Cela permet ensuite de retraiter le film en tenant compte de cette densité de probabilité pour réaliser la détection. Ainsi, seules les portions de la chambre plate qui sont pertinentes sont prises en compte, et la densité de probabilité permet de normaliser la participation relative de chaque portion au résultat final. Pour cela, l'analyseur 6 traite un film donné pour en tirer une image d'activité PCR dans laquelle les pixels d'une pluralité de zones d'activité dans chacune desquelles une activité PCR est déterminée comme probable reçoivent chacun une valeur de pondération associée à la probabilité d'une réaction PCR telle que la somme de toutes les valeurs de pondération vaut un, et les pixels hors des zones d'activité reçoivent une valeur nulle. Ensuite, l'évaluateur 8 utilise l'image d'activité PCR et combine les valeurs de pondérations avec le film donné afin d'analyser les zones pertinentes des images pour en tirer une information de détection d'une séquence d'acide nucléique et/ou une valeur de type Ct. L'analyseur 6 et l'évaluateur 8 accèdent directement ou indirectement à la mémoire 4. Ils peuvent être réalisés sous la forme d’un code informatique approprié exécuté sur un ou plusieurs processeurs. Par processeurs, il doit être compris tout processeur adapté aux calculs décrits plus bas. Un tel processeur peut être réalisé de toute manière connue, sous la forme d’un microprocesseur pour ordinateur personnel, portable, tablette ou smartphone, d’une puce dédiée de type FPGA ou SoC, d’une ressource de calcul sur une grille ou dans le cloud, d’une grappe de processeurs graphiques (GPUs), d’un microcontrôleur, ou de toute autre forme propre à fournir la puissance de calcul nécessaire à la réalisation décrite plus bas. Un ou plusieurs de ces éléments peuvent également être réalisés sous la forme de circuits électroniques spécialisés tel un ASIC. Une combinaison de processeur et de circuits électroniques peut également être envisagée. Dans le cas de l’unité d’apprentissage automatique basé sur renforcement du gradient, des processeurs dédiés à l’apprentissage automatique pourront aussi être envisagés. L'analyseur 6 a donc pour but de déterminer des zones d'intérêt dans les images d'un film donné, et de qualifier ces zones d'intérêt pour les restituer sous la forme d'une densité de probabilité. Pour mettre en œuvre l'analyseur 6, plusieurs solutions sont disponibles : - utilisation image des différences entre fluorescences selon les différents cycles, - utilisation de réseaux de neurones profonds dédiés à la segmentation d’objets dans les images de type mask R-CNN (décrit plus bas), et - utilisation de réseaux de neurones de segmentation sémantique donnant directement une image des classes recherchées. Dans l'exemple décrit ici, ces classes peuvent comprendre zone de PCR active, zone de PCR inactive, extérieur de la chambre plate, trou d’alimentation, bulles, points de forte luminosité. En effet, hormis les zones de PCR active ou inactive du fait des limites de convection, certains artefacts peuvent venir perturber les images de fluorescence. Ainsi, la caméra utilisée pour filmer la réaction présente un champ plus grand que la chambre plate, et donc il existe une zone qui n'est pas pertinente par définition. De plus, des anomalies sont régulièrement constatées au niveau du trou qui sert à introduire les éléments de la réaction dans la chambre plate. De la même manière, certaines imperfections de la chambre plate induisent des points de forte luminosité. Enfin, des bulles peuvent se former au cours de la réaction. Les bulles sont l’artefact le plus gênant, parce qu’elles ne sont pas stables au cours de la réaction PCR, et leur bordure est souvent plus lumineuse que le reste de l’échantillon. La première solution nécessite un traitement à part pour chaque classe autre que la zone PCR active afin d'écarter les zones correspondantes. La deuxième et la troisième solution présentent l'avantage d'être directes, mais les réseaux de neurones sont toujours difficiles à rendre efficaces sans pour autant suradapter ("overfit" en anglais). La représente un exemple d'une fonction mise en œuvre par l'analyseur 6 qui utilise la première solution. Dans le cadre de la première solution, l'analyseur 6 opère en quatre étapes principales : - comparaison des images d'un film donné pour créer une image d'écart maximale de fluorescence, - filtrage de cette image pour déterminer les zones d'intérêt, - traitement de l'image filtré pour compenser les effets de bords et pour sortir les artefacts, et - modification de l'image résultant pour produire une densité de probabilité avec les zones d'intérêt restantes. Ainsi, dans une première opération 200, les images d'un film donné sont traitées pour créer l'image d'écart maximale de fluorescence. La représente un exemple des images de film reçues en entrée. Lorsque plusieurs images sont disponibles pour un même cycle d'un film donné, une moyenne d’images prises au cours de la phase froide de chaque cycle est utilisée pour produire une image représentative de chaque cycle. Cela permet de limiter le bruit d'acquisition de la caméra, et est préférentiellement fait avec les images correspondant à la phase froide du cycle, qui est connue pour présenter une fluorescence plus stable. Le nombre exact d'images pour calculer la moyenne ainsi que la période exacte du cycle où elles sont tirées peuvent être des paramètres ou être fixés. La réalisation de plusieurs expérience peut permettre de calibrer le dispositif 2 à cet effet. Les figures 5 et 6 représentent des exemples de ces images pour les cycles 10 et 41 respectivement. Ensuite, dans une opération 210, une image de fluorescences maximales et une image de fluorescences minimales sont générées. Pour l'image de fluorescences maximales, les images issues de l'opération 200 associées aux cycles d'indice 25 à 45 sont combinées de sorte que, pour chaque pixel, c'est la valeur de fluorescence parmi les 20 images qui est retenue. De même, l'image de fluorescences minimales est obtenue en retenant pour chaque pixel la fluorescence minimale dans les images issues de l'opération 200 correspondant aux cycles 5 à 15. Bien sûr, les plages d'indice pour déterminer l'image de fluorescences maximales et l'image de fluorescences minimales pourront varier, tant dans leurs extrémités que dans leur largeur. Une fois ces deux images calculées, leur différence est réalisée, et représente pour chaque pixel l'écart de fluorescence maximal au cours des cycles les plus pertinents. La représente une image de différences obtenue en sortie de l'opération 220. Cette image des différences est traitée dans une opération 220 afin de déterminer les contours des zones d'intérêt. Cela peut par exemple être réalisé par seuillage à deux unités de mesure de fluorescence. En variante, le seuil peut être modifié. De plus, des méthodes en variante pourraient être employées pour sélectionner les zones d'intérêt, comme une méthode de type Niblack ou de type Bernsen. L'image seuillée de l'opération 220 est alors traitée dans une opération 230 pour retirer les artefacts. Comme cela a été expliqué plus haut, ce traitement peut comprendre l'annulation des zones qui sont hors de la chambre plate, la détection des points de forte luminosité et de la zone d'introduction de la chambre plate, ainsi que la suppression des bulles. Pour la zone d'introduction de la chambre plate, celle-ci peut être déterminée de manière empirique en réalisant plusieurs cycles de calibration ou faire l'objet d'une détection adhoc. Les bulles sont pour leur part déterminées par détection dans les images du film avant le traitement par l'analyseur 6. Pour cela, les images sont traitées par indice de cycle croissant, et chaque pixel est qualifié dans chaque image comme appartenant à une bulle ou pas. Lorsqu'un pixel est qualifié dans une quelconque image comme appartenant à une bulle, il est ajouté à une liste de pixels de bulle. La détection d'appartenance à une bulle peut être réalisée en appliquant un algorithme dans lequel, pour une image donnée : - un filtre de Canny est appliqué afin de déterminer les bordures d'objets, - des composantes connexes induites par les bordures trouvées sont crées – la présence de bulles est détectée par des bordures les entourant, et une bordure fermée (formant une boucle) détermine deux composantes connexes différentes, - chaque composante connexe est considérée comme une bulle si son niveau de gris moyen est en dessous d’un seuil déterminé dynamiquement par rapport aux valeurs de d'unité de fluorescence de la chambre plate, et - la composante connexe est dilatée pour que la zone de bulle contienne le bord. Les pixels de la liste de pixels de bulle sont ainsi annulés, comme les autres artefacts. En variante, la liste de pixels de bulle pourrait être déterminée lors de l'opération 200 ou 210. A l'issue de cette opération, l'image des différences comprend donc des pixels dont la valeur est non nulle, qui représentent les zones d'intérêt, et tous les autres pixels présentent une valeur nulle. Enfin, l'image traitée issue de l'opération 230 est modifiée dans une opération 240 afin de construire la densité de probabilité. Pour cela, les valeurs de l'image des différences peuvent être traitées de deux manières : - création d'une densité de probabilité variable, en divisant pour chaque pixel d'une zone d'intérêt la valeur de ce pixel par la somme de toutes les valeurs des pixels des zones d'intérêt, - application d'une fonction de binarisation, de sorte que tous les pixels ont le même poids. Parmi les fonctions de binarisation, on pourra utiliser une méthode à seuil fixe, d'Otsu, de Bernsen, ou encore de Niblack. Dans ce qui suit, l'expression "zone d'intérêt" et l'expression "zone d'activité" pourront être utilisées de manière interchangeable, puisque les zones d'intérêt correspondent aux zones dans lesquelles une activité PCR est probable. Dans le cas où une fonction de binarisation est utilisée, les zones d'intérêt peuvent être lissées en appliquant une ou plusieurs opérations de dilatation, érosion ou d'application d'enveloppe convexe. L'idée de ce lissage est que les zones d'intérêts correspondent à un endroit ou la réaction PCR a eu lieu, et sont donc normalement fermées. Par exemple la dilatation des zones d'intérêt peut prévoir l'ajout d'un pixel autour de la frontière de chaque zone jusqu'à ce que somme surface totale des zones excède un seuil choisi. Toujours en exemple, l'érosion peut prévoir la suppression des zones dont le nombre de pixels est inférieur à un seuil donné (par exemple 2). Une fois l'opération 240 terminée, l'image d'activité PCR résultante est transmise à l'évaluateur 8 qui va la combiner aux images du film pour retourner un résultat de détection et/ou un Ct. La représente un exemple d'image obtenue en sortie de l'opération 240. Comme on peut le voir sur cette figure, les bords de la chambre plate délimitent un coin. Comme décrit plus haut, l'analyseur 6 peut également être mis en œuvre au moyen d'un masque R-CNN (pour " Region Based Convolutional Neural Networks" en anglais). Ce type de réseaux de neurones permet de détecter des régions dans une image et de réaliser de la classification des régions détectées. L'article de He et al "Mask R-CNN", arXiv:1703.06870, accessible à l'adresse https://doi.org/10.48550/arXiv.1703.06870 décrit comment les mettre en œuvre. Dans l'exemple décrit ici, la base d’apprentissage est constituée à partir de données issues de PCR effectuées sur des machines CHRONOS Dx de la société BforCure. Afin de garantir une variabilité dans les données d’apprentissage, les machines sont au nombre de 20. Les données d’apprentissage et de test sont séparées suivant les machines, de sorte que les données d’une machine servant à l’apprentissage ne sont pas utilisées pour les tests. Ces données sont annotées en utilisant un logiciel dédié selon un masque sémantique qui utilise une valeur par classe considérée pour chaque pixel de l’image. Ces données sont pré-traitées pour être mises au format compatible avec l’algorithme d’entraînement de chaque type de réseau. Compte tenu de la nature des données, le réseau de masque RCNN comprend un backbone correspondant à un Resnet-50 (voir par exemple https://web.archive.org/web/20211227064145/https://iq.opengenus.org/resnet50-architecture/ pour une description de Restnet-50), dont les entrées sont les mêmes que celles du réseau U-Net décrit plus bas, c’est-à-dire une pile de 20 images de différents cycles. La seule modification par rapport à un masque RCNN classique est que l’entrée n’a pas 3 canaux mais 20. Le réseau ne peut donc pas être ré-appris à partir d’un réseau pré-entraîné. L’apprentissage est effectué comme dans l’article de He cité plus haut. Un post-traitement peut être nécessaire en sortie de réseau, par exemple lorsque certains pixels sont recouverts par plusieurs instances d’objets ou par aucune. Pour les pixels qui ne sont recouverts par aucune instance d’objet, si le pixel est dans la zone de la chambre plate, il se voit attribuer la classe “zone de PCR inactive”, et si le pixel est hors de la zone de la chambre plate, il se voit attribuer la classe “extérieur de la chambre plate”. Pour les pixels recouverts par plusieurs instances d’objets, ils se voient attribuer la classe ayant le score le plus élevé. De la même manière que dans l’article de référence, nous appliquons des méthodes d’augmentation de données : rotations, bruit sur les pixels et déformations élastiques. De plus, comme notre entrée comprend 20 cycles de PCR parmi une quarantaine (valeur dépendant des kits de réactifs utilisés), nous pouvons augmenter nos données en décalant les cycles proposés en entrée au cours de l’apprentissage. Dans ce cas les images de chaque film sont fournies à l'analyseur 6 qui retourne les zones classifiées sémantiquement. Toujours en variante, l'analyseur 6 pourrait être mis en œuvre au moyen d'un réseau de neurones de type U-Net simplifié. L'article de Ronneberger et al. "U-Net: Convolutional Networks for Biomedical Image Segmentation", Medical Image Computing and Computer-Assisted Intervention (MICCAI) LNCS 9351, pages 234--241 (2015), Springer disponible à l'adresse https://arxiv.org/pdf/1505.04597.pdf décrit la mise en œuvre de ce type de réseau de neurones. Dans le cas présent, la Demanderesse a identifié qu'il est favorable d'utiliser un U-Net à 3 couches au lieu des 5 du modèle originel, avec 20 canaux d'entrée qui correspondent chacun à une image d'un cycle répartis au cours de la réaction PCR temps réel dont est tiré le film. L'entraînement du réseau U-Net a été réalisé avec les images et les données issues de 1000 réactions PCR temps réel, dont 10% ont été préservés pour la réalisation des tests. Comme dans l'article de référence cité ci-dessus, il est avantageux d'utiliser des méthodes d’augmentation de données : rotations, bruit sur les pixels et déformations élastiques. Le rééquilibrage des différentes classes considérées est assuré par une carte de pondération qui prend aussi en compte la distance des pixels aux zones de frontières. La représente un exemple de mise en œuvre de l'architecture du réseau U-Net décrit ici. La sortie du masque R-CNN et du réseau U-NET est à chaque fois une liste de zones classifiées sémantiquement, avec la densité de probabilité pour la classe "zone de PCR active". La représente un exemple de réalisation d'une fonction mise en œuvre par l'évaluateur 8. Cette fonction commence par une opération de mixage 300 dans laquelle les images du film et l'image d'activité PCR déterminée par l'évaluateur 6 sont combinées. Dans l'exemple décrit ici, la valeur de chaque pixel dans chaque image du film est pondérée par la valeur du pixel qui lui correspond dans l'image d'activité PCR. Ensuite, dans une opération 320, l'évaluateur 8 applique un algorithme sur les images résultantes à chaque zone d'intérêt ou à chaque pixel, de la même manière que cela est fait pour l'ensemble de l'image dans l'état de l'art. La sortie de cet algorithme peut être une valeur indiquant la détection ou non d'une amplification et/ou une valeur d'indice de cycle à partir duquel l'amplification est significative. Cet algorithme est connu par ailleurs. La sortie de cet algorithme peut aussi être la courbe de concentration représentée sur la . Sur cette figure, la courbe continue représente la courbe de concentration mesurée grâce au dispositif de l'invention, tandis que la courbe en pointillés représente la concentration mesurée avec la méthode de l'état de l'art. Il est donc possible d'obtenir une valeur Ct pour chaque zone d'intérêt, voire pour chaque pixel dont la probabilité associée dans la densité de probabilité de l'image d'activité PCR est non nulle. De manière optionnelle, l'évaluateur 8 peut retourner une valeur Ct pour la réaction PCR temps réel à partir de ces valeurs Ct locales. Ainsi, la valeur Ct peut être calculée comme , où St est la surface totale des zones d'intérêt (par exemple en pixels), Si est la surface de chaque zone d'intérêt (par exemple en pixels), et Ct i est la valeur de Ct de la zone d'intérêt d'indice i. Cette approche peut être poussée à l'extrême en réduisant chaque zone d'intérêt à un pixel unique. Comme la concentration en séquence d'acide nucléique recherchée double à chaque cycle, la concentration de cette séquence est donc proportionnelle à 2 -Ct . Les figures 4 à 6 illustrent les images obtenues par la mise en œuvre du dispositif 2 avec un analyseur 6 conforme à celui décrit avec la . Ainsi, l'image d'activité PCR est obtenue de la façon suivante : - pour chaque cycle, détermination d'une image de fluorescence correspondant à la phase froide du cycle. Cette image est obtenue en moyennant les images prises au cours de cette phase, tirées de la seconde moitié du cycle, - construction de l'image de différences à partir d'une image des fluorescences maximales des derniers cycles, de laquelle est soustraite une image des fluorescences minimales des premiers cycles. Les cycles utilisés pour le calcul de cette image sont les cycles 5 à 15 pour l’image minimale et les cycles 26 à 45 pour l’image maximale, - transformation de l’image des différences en image binaire en appliquant un seuil fixe de 2 valeurs de fluorescence avec application d'une érosion, d'une enveloppe convexe pour "boucher les trous", et d'une dilatation jusqu'à obtenir une surface totale d'au moins 1000 pixels, - suppression des zones de l’image qui ne correspondent pas à la chambre plate avec laquelle est effectuée la PCR, et - suppression des zones qui correspondent à des bulles. Ainsi, en partant de la , qui représente l'image moyennée pour le cycle 41, on obtient une image des différences représentée sur la . Enfin, l'opération de seuillage donne l'image de la . Cette image est combinée aux images du film pour produire la , qui montre un Cti à 35,6849, ce qui donne un Ct de 38.363 en appliquant la formule explicitée précédemment. Dispositif de traitement de mesures de PCR temps réel à milieu de réaction homogène dans lequel les réactifs de PCR peuvent diffuser comprenant : - une mémoire (4) agencée pour recevoir une pluralité d'images de fluorescence obtenues en filmant une réaction PCR temps réel dans une chambre plate, - un analyseur (6) agencé pour produire une image d'activité PCR à partir de la pluralité d'images de fluorescence obtenues en filmant une réaction PCR temps réel dans une chambre plate à milieu de réaction homogène dans lequel les réactifs de PCR peuvent diffuser, laquelle image d'activité PCR présente une pluralité de zones d'activité dans chacune desquelles une activité PCR est déterminée comme probable sur la base de la valeur de fluorescence des pixels de ces zones d'activité dans la pluralité d'images de fluorescence obtenues en filmant une réaction PCR temps réel dans une chambre plate, les pixels des zones d'activité recevant chacun une valeur de pondération associée à la probabilité d'une réaction PCR telle que la somme de toutes les valeurs de pondération vaut un, et les pixels hors des zones d'activité recevant une valeur nulle, - un évaluateur (8) agencé pour analyser la pluralité d'images de fluorescence obtenues en filmant une réaction PCR temps réel dans une chambre plate en pondérant dans chaque image la valeur de fluorescence de chaque pixel par la valeur de pondération de ce pixel dans l'image d'activité, et pour retourner un ou plusieurs parmi une valeur indiquant si la réaction PCR temps réel filmée présente une amplification PCR, une valeur de cycle seuil, et une courbe de concentration au cours de la réaction PCR. Dispositif selon la revendication 1, dans lequel l'analyseur (6) est agencé pour déterminer une image de différences à partir de la pluralité d'images de fluorescence obtenues en filmant une réaction PCR temps réel dans une chambre plate, dans laquelle chaque pixel correspond à la différence entre la valeur la plus élevée et la valeur la plus faible pour ce pixel parmi la pluralité d'images de fluorescence obtenues en filmant une réaction PCR temps réel dans une chambre plate, et pour déterminer l'image d'activité à partir de l'image de différences. Dispositif selon la revendication 2, dans lequel l'analyseur (6) est agencé pour déterminer des zones d'activé dans l'image des différences par seuillage de l'image des différences. Dispositif selon la revendication 2 ou 3, dans lequel l'analyseur (6) est agencé pour déterminer une valeur de pondération unique pour chacun des pixels de l'image d'activité PCR. Dispositif selon la revendication 4, dans lequel l'analyseur (6) est agencé pour déterminer la valeur de pondération en appliquant une fonction de binarisation à seuil fixe, d'Otsu, de Bernsen, ou de Niblack. Dispositif selon la revendication 4 ou 5, dans lequel l'analyseur (6) est agencé pour appliquer une fonction de binarisation comprenant la régularisation des zones d'activité par application de dilatation, d'érosion, ou d'enveloppes convexes. Dispositif selon la revendication 6, dans lequel l'analyseur (6) est agencé pour appliquer une fonction de binarisation dans laquelle la dilatation des zones d'activités est obtenue par ajout d'un pixel autour de chaque zone d'activité jusqu'à ce que la somme des surfaces des zones d'activité excède un seuil choisi, ou pour appliquer une fonction de binarisation dans laquelle l'érosion des zones d'activité comprend la suppression des zones d'activité dont le nombre de pixels est inférieur à un seuil choisi. Dispositif selon la revendication 2 ou 3, dans lequel dans lequel l'analyseur (6) est agencé pour déterminer la valeur de pondération par division de la valeur de chaque pixel appartenant à une zone d'activité par la somme de toutes les valeurs de pixel de toutes les zones d'activité. Dispositif selon la revendication 1, dans lequel l'analyseur (6) est un réseau de neurones de type masque R-CNN ou de type U-Net réalisant une segmentation sémantique des pixels à partir de la pluralité d'images de fluorescence obtenues en filmant une réaction PCR temps réel dans une chambre plate. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, dans lequel l'évaluateur (8) est agencé pour déterminer une valeur de cycle seuil pour chaque zone d'activité, et pour calculer une valeur de cycle seuil selon la formule , où St est la surface totale des zones d'activité, Si est la surface de chaque zone d'activité, et Ct i est la valeur de cycle seuil de la zone d'activité d'indice i. Procédé de traitement de mesures de PCR temps réel à milieu de réaction homogène dans lequel les réactifs de PCR peuvent diffuser comprenant : a) recevoir une pluralité d'images de fluorescence obtenues en filmant une réaction PCR temps réel dans une chambre plate à milieu de réaction homogène dans lequel les réactifs de PCR peuvent diffuser, b) produire une image d'activité PCR à partir de la pluralité d'images de fluorescence obtenues en filmant une réaction PCR temps réel dans une chambre plate, laquelle image d'activité PCR présente une pluralité de zones d'activité dans chacune desquelles une activité PCR est déterminée comme probable sur la base de la valeur de fluorescence des pixels de ces zones d'activité dans la pluralité d'images de fluorescence obtenues en filmant une réaction PCR temps réel dans une chambre plate, les pixels des zones d'activité recevant chacun une valeur de pondération associée à la probabilité d'une réaction PCR telle que la somme de toutes les valeurs de pondération vaut un, et les pixels hors des zones d'activité recevant une valeur nulle, c) analyser la pluralité d'images de fluorescence obtenues en filmant une réaction PCR temps réel dans une chambre plate en pondérant dans chaque image la valeur de fluorescence de chaque pixel par la valeur de pondération de ce pixel dans l'image d'activité, et pour retourner un ou plusieurs parmi une valeur indiquant si la réaction PCR temps réel filmée présente une amplification PCR, une valeur de cycle seuil, et une courbe de concentration au cours de la réaction PCR. Procédé selon la revendication 11, dans lequel l'opération b) comprend : b1) déterminer une image de différences à partir de la pluralité d'images de fluorescence obtenues en filmant une réaction PCR temps réel dans une chambre plate, dans laquelle chaque pixel correspond à la différence entre la valeur la plus élevée et la valeur la plus faible pour ce pixel parmi la pluralité d'images de fluorescence obtenues en filmant une réaction PCR temps réel dans une chambre plate, et b2) déterminer l'image d'activité à partir de l'image de différences. Procédé selon la revendication 12, dans lequel l'opération b) comprend déterminer une valeur de pondération unique pour chacun des pixels de l'image d'activité PCR, ou déterminer la valeur de pondération par division de la valeur de chaque pixel appartenant à une zone d'activité par la somme de toutes les valeurs de pixel de toutes les zones d'activité. Procédé selon la revendication 11, dans lequel l'opération b) est obtenue par application d'un réseau de neurones de type masque R-CNN ou de type U-Net réalisant une segmentation sémantique des pixels à partir de certaines au moins des images de l'opération a). Procédé selon l'une des revendications 10 à 14, dans lequel l'opération c) comprend déterminer une valeur de cycle seuil pour chaque zone d'activité, et calculer une valeur de cycle seuil selon la formule , où St est la surface totale des zones d'activité, Si est la surface de chaque zone d'activité, et Ct i est la valeur de cycle seuil de la zone d'activité d'indice i. Produit de programme d'ordinateur, caractérisé en ce qu'il est agencé pour mettre en œuvre le procédé selon l'une des revendication 11 à 15 lorsqu'il est exécuté par un ordinateur.