Brevet FR3134822A1 — publié le 20231027

L’invention concerne un milieu réactionnel gélifié pour la détection, l’identification, le dénombrement et/ou l’isolement d’au moins un micro-organisme cible dans un échantillon susceptible de le contenir comprenant au moins un partenaire de liaison spécifique d’un composant d’un micro-organisme cible ou d’un composant issu dudit micro-organisme, couplé à au moins une nanoparticule pour former au moins un conjugué agglutinant. Milieu réactionnel et méthode associée pour la détection, d’un micro-organisme cible. Domaine technique de l’invention La présente invention concerne le domaine du contrôle microbiologique au sens large, tel que le contrôle microbiologique d’un échantillon d’origine industrielle ou clinique. Plus particulièrement, la présente invention a trait à un milieu réactionnel et à la méthode associée pour la détection, l’identification, le dénombrement et/ou l’isolement d’un micro-organisme cible. Le contrôle microbiologique d’échantillons d’origines diverses requiert la mise en œuvre de techniques qui permettent la détection - par exemple aux fins d’identification et/ou de dénombrement et/ou de caractérisations biochimiques - de micro-organismes et dont le rendu en termes de résultats doit être le plus rapide possible. Dans le domaine médical, il est nécessaire de prévoir et diagnostiquer le risque infectieux : plus le diagnostic est rapide et précis, plus la prise en charge des malades est efficace et le risque de transmission minimisé. L'approche est similaire pour la santé animale dans le domaine vétérinaire. Dans le domaine agro-alimentaire, la problématique est identique. Elle distingue cependant : - les micro-organismes pathogènes tels que les bactéries productrices de shiga-toxines (STEC), Salmonella, Listeria, Cronobacter, Bacillus, Staphylococcus dont la recherche s'applique aux matières premières, produits intermédiaires, produits finis commercialisés, - les micro-organismes non pathogènes, utilisés comme indicateurs-qualité du processus de production, des matières premières aux produits finis, tout au long de la chaîne, - les bactéries d'intérêt technologique telles que les ferments, - les micro-organismes marqueurs de contamination. La détection rapide et précise des contaminations présumées (au sein des lots alimentaires) permet de les contrôler et d'engager ainsi à bref délai des actions correctives. Techniquement, une des principales difficultés est de pouvoir isoler la bactérie recherchée pour pouvoir l’identifier. Généralement, l’analyse microbiologique se fait en deux temps. La première est une phase de détection qui peut faire appel à de nombreuses technologies telles que les milieux de culture, les immuno-essais, la biologie moléculaire. Elle peut être suivie, notamment dans le domaine agro-alimentaire, d’une phase de confirmation afin de confirmer la présence du pathogène recherché et répondre aux normes en vigueur dans ce domaine. L’étape de confirmation impose donc des étapes supplémentaires et ici encore, nécessite une étape d’isolement de la bactérie recherchée. Ainsi, dans le cas des E. coli productrices de shiga-toxines (STEC), le diagnostic repose sur l’utilisation de géloses sélectives et chromogéniques comme le SMAC (Sorbitol MacConkey Agar), le RMAC (Rhamnose MacConkey Agar) ou le Rainbow Agar O157, afin de sélectionner la pousse de certaines bactéries et de colorer les souches d’intérêt. Mais finalement aucune de ces géloses n’est suffisamment spécifique aux STEC, sans une mise en culture permettant d’isoler et de confirmer l’identité de la souche à l’aide de tests de biologie moléculaire de type PCR. En effet, leur pathogénicité implique l’expression de plusieurs gènes de virulence, notamment stx1 et stx2 codant pour les deux types de shiga-toxines : STX1 et STX2. Ces deux toxines agissent en inhibant la synthèse protéique dans les cellules eucaryotes, ce qui in fine provoque l’apoptose. Afin d’identifier les STEC pathogènes avec précision, il est indispensable de réaliser une PCR pour les gènes stx1, stx2 ou eae (un autre facteur de virulence). Ces procédés sont donc longs, fastidieux et le germe portant les deux gènes (stx et eae) n’est pas systématiquement retrouvé en culture. Il existe également des méthodes immunologiques. Un grand nombre de tests permettent la détection de E. coli O157:H7 dans les aliments et/ou dans les échantillons environnementaux. Ces systèmes comprennent des tests conventionnels ELISA en microplaques, des systèmes immunologiques en une étape et des systèmes complètement automatisés. Les méthodes immunologiques en "une étape" sont très employées par les industriels du fait de leur rapidité d’exécution et de leur simplicité. Une grande partie de ces systèmes est basée sur le principe d’immuno-chromatographie. Le dispositif consiste en un support plastique contenant une membrane imprégnée de particules d’or ou de latex recouverte d’anticorps spécifiques d’E. coli O157:H7 (i.e. O157 et éventuellement H7), un puits pour l’échantillon et une fenêtre de test et de contrôle. L’apparition d’une ligne colorée dans la fenêtre test indique un résultat positif signant la présence probable de E. coli O157 dans l’aliment. On peut citer en exemple, le test « VIP EHEC » (BioControl, Montesson, France) qui permet, après un enrichissement de plusieurs heures de visualiser si un échantillon donné est contaminé ou non par E. coli O157. Néanmoins, cette méthode ne permet pas de repérer la souche E. coli O157 dans l’échantillon, ni de voir son caractère pathogène. Les systèmes ELISA/ELFA sont des méthodes immunologiques donnant un résultat en 2 heures en microplaque après une phase d’enrichissement (le plus souvent d’une durée de 24 heures). La société bioMérieux® a mis au point des kits ELISA (ELFA) automatisées reposant sur la technologie VIDAS®. Ces méthodes présentent l’inconvénient en cas de test positif de ne pas isoler directement la colonie suspecte. Il sera donc nécessaire de mettre en culture l’échantillon afin d’isoler la colonie positive et de confirmer par PCR que cette bactérie est bien celle ayant positivée le test. Il existe également des méthodes ELISA pour la détection des STEC non-O157 reposant essentiellement sur la détection de la production des Shiga-toxines, éventuellement après une étape d'enrichissement. Certaines d'entre elles utilisent des anticorps monoclonaux ou polyclonaux dirigés contre la toxine STX, et la révélation avec des anticorps liés à la phosphatase alcaline. Parmi les kits ELISA disponibles, on peut citer le « Premier EHEC » ciblant les Shiga-toxines (Meridian Diagnostics Inc, USA). Des kits utilisant la technique de « reverse passive agglutination assay » (RPLA) adaptés à la détection des toxines STX ont également été conçus et commercialisés. Cette technique met en jeu des billes enduites d’anticorps qui interagissent avec les Shiga-toxines et produisent une couche diffuse à la base des puits dans lesquels se trouve le surnageant de culture. Ces méthodes nécessitent ensuite l’isolement de la colonie positive puis une étape de confirmation. La méthode de séparation immuno-magnétique (IMS) a également été adaptée à la détection et l’isolement des souches appartenant aux 5 sérogroupes majeurs de STEC. Elle a lieu en milieu liquide et est réalisée à l'aide de billes magnétiques recouvertes d'anticorps dirigés contre les antigènes O26, O111, O103 et O145. Toutefois, les souches isolées par cette méthode doivent être confirmées pour la présence du gène stx avant d’être considérées comme des souches de STEC. Il existe donc un réel besoin de mettre au point une méthode fiable et rapide d’isolement et d’identification de bactéries cibles et notamment de bactéries pathogènes. [00011] Un premier objet de l’invention concerne un milieu réactionnel gélifié pour la détection, l’identification, le dénombrement et/ou l’isolement d’au moins un micro-organisme cible dans un échantillon susceptible de le contenir comprenant au moins un partenaire de liaison spécifique d’un composant d’un microorganisme cible ou d’un composant issu dudit micro-organisme, couplé à au moins une nanoparticule pour former au moins un conjugué agglutinant. [0012] Le composant permettant de détecter le micro-organisme cible est un composant relargué par ledit micro-organisme dans le milieu réactionnel. Il peut s’agir d’un élément constitutif dudit micro-organisme cible tel qu’un lipopolysaccharide (LPS) ou un composant produit par le micro-organisme cible tel qu’une toxine. [0013] De façon tout à fait avantageuse, le milieu permet ainsi de localiser sur le milieu de culture la colonie ciblée relarguant ledit composant. Ceci permet une meilleure détection du micro-organisme cible et un gain de temps très précieux dans le domaine du contrôle microbiologique, notamment au cours de l’étape de confirmation. [0014] Préférentiellement, le conjugué comprend une nanoparticule colloidale ayant des propriétés optiques. [0015] Avantageusement, le milieu selon l’invention comprend un inducteur de toxine. Ainsi, le milieu selon l’invention permet de façon tout à fait avantageuse de détecter les souches E. coli productrices de shiga-toxines (STEC). [0016] Un autre objet de l’invention concerne une méthode de détection d’identification, de dénombrement et/ou d’isolement d’un micro-organisme cible dans un échantillon susceptible de le contenir, comprenant les étapes suivantes : - Mettre en contact ledit échantillon avec un milieu réactionnel selon l’invention - Incuber - Détecter la présence dudit micro-organisme cible. [0017] De manière avantageuse, la détection se fait par l’apparition d’un halo autour du micro-organisme cible sur le milieu réactionnel. DESCRIPTION DES FIGURES [0018] La est une photo d’un milieu de culture selon l’invention permettant la détection de la souche E. coli O26, comprenant une protéine de phage couplée à une nanoparticule d’or. [0019] La est une photo d’un milieu de culture selon l’invention permettant la détection de la souche E.coli O111, comprenant un anticorps couplé à une nanoparticule d’or. [0020] La est une photo d’un milieu de culture selon l’invention permettant la détection d’une bactérie cible productrice de la toxine STX1 comprenant un anticorps anti STX1 couplé à une nanoparticule d’or, en présence de la ciprofloxacine comme inducteur de toxine. [0021] La est une photo d’un milieu de culture selon l’invention permettant la détection d’une bactérie cible productrice de la toxine STX1 comprenant un anticorps anti STX1 couplé à des nanoparticules d’argent, en présence de la mitomycine comme inducteur de toxine [0022] La est une photo d’un milieu de culture selon l’invention permettant la détection d’une bactérie cible productrice de la toxine STX1 et/ou STX2 comprenant un anticorps anti stx1 couplé à une nanoparticule d’argent, un anticorps anti STX2 couplé à une nanoparticule d’or, en présence de mitomycine [0023] La est une photo d’un milieu de culture selon l’invention permettant la détection, d’une bactérie cible productrice de toxine STX1 et/ou STX2 comprenant un anticorps anti STX1 ou anti STX2 couplé à une même nanoparticule d’or, en présence de ciprofloxacine comme inducteur de toxine. Milieu réactionnel gélifié pour la détection, l’identification, le dénombrement et/ou l’isolement d’au moins un micro-organisme cible dans un échantillon susceptible de le contenir comprenant au moins un conjugué agglutinant formé par au moins un partenaire de liaison spécifique d’un composant d’un micro-organisme cible ou d’un composant issu dudit micro-organisme, couplé à au moins une nanoparticule. Milieu réactionnel gélifié selon la revendication 1 caractérisé en ce qu’il s’agit d’un milieu de culture microbiologique comprenant les éléments nécessaires à la culture dudit micro-organisme cible. Milieu réactionnel gélifié selon la revendication 1 caractérisé en ce qu’il s’agit d’un milieu de révélation microbiologique comprenant les éléments nécessaires à la révélation dudit micro-organisme cible. Milieu réactionnel selon l’une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que le partenaire de liaison est choisi parmi les anticorps, les aptamères, les protéines de phage, les amorces. Milieu selon l’une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que la nanoparticule est une nanoparticule colloidale ayant des propriétés optiques. Milieu selon la revendication précédente caractérisé en ce que la nanoparticule est choisie parmi l’or, l’argent, le cuivre. Milieu selon l’une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que les nanoparticules ont une taille comprise entre 10 et 200 nm, préférentiellement entre 20 et 90 nm. Milieu selon l’une quelconque des revendications précédentes dans lequel le milieu réactionnel est en contact avec un milieu de culture gélosé. Milieu selon l’une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que le milieu comprend un inducteur du composant issu dudit micro-organisme. Milieu selon la revendication 9 caractérisé en ce que le milieu comprend un inducteur de toxine. Milieu selon la revendication 10 caractérisé en ce que l’inducteur de toxine est un antibiotique. Milieu selon la revendication 11 caractérisé en ce que l’inducteur de toxine est la ciprofloxacine à une concentration comprise entre 0,005 et 0,030 mg/l. Milieu selon la revendication 11 caractérisé en ce que l’inducteur de toxine est la mitomycine C à une concentration comprise entre 0,10 mg/l à 0 ,50 mg/l. Milieu réactionnel gélifié selon l’une quelconque des revendications 1 à 13 pour la détection, l’identification, le dénombrement et/ou l’isolement d’une souche d’ E. coli caractérisé en ce qu’il comprend une protéine de phage spécifique du LPS de ladite souche couplée à une nanoparticule pour former un conjugué agglutinant. Milieu réactionnel gélifié selon la revendication 14 caractérisé en ce que les protéines de phage spécifiques de LPS recouvre au minimum la moitié de la surface de la nanoparticule. Milieu réactionnel gélifié selon la revendication 14 ou 15 caractérisé en ce que la nanoparticule est en or, de taille comprise entre 20 et 90 nm et à une concentration comprise entre 10 10 et 10 12 nanoparticules/ml de milieu réactionnel. Milieu réactionnel gélifié selon l’une quelconque des revendications 1 à 13 pour la détection, l’identification, le dénombrement et/ou l’isolement d’une souche d’E. coli caractérisé en ce qu’il comprend un anticorps monoclonal spécifique de ladite souche couplé à une nanoparticule pour former un conjugué agglutinant. Milieu réactionnel gélifié selon l’une quelconque des revendications 1 à 13 pour la détection, l’identification, le dénombrement et/ou l’isolement d’au moins une souche d’E. coli productrice de shigatoxine caractérisé en ce qu’il comprend au moins un inducteur de toxine, au moins un anticorps spécifique de STX1 et/ou au moins un anticorps spécifique de STX2, ledit au moins anticorps étant couplé à une nanoparticule pour former un conjugué agglutinant. Milieu réactionnel gélifié selon la revendication 18 pour la détection, l’identification, le dénombrement et/ou l’isolement d’au moins une E. coli productrice de shigatoxine caractérisé en ce que l’inducteur de toxine est de la ciprofloxacine, à une concentration comprise entre 0,005 et 0,030 mg/l. Milieu réactionnel gélifié selon la revendication 18 pour la détection, l’identification, le dénombrement et/ou l’isolement d’au moins une E. coli productrice de shigatoxine caractérisé en ce que l’inducteur de toxine est de la mitomycine C, à une concentration comprise entre 0,10 mg/l à 0 ,50 mg/l. Milieu réactionnel gélifié selon l’une quelconque des revendications 18 à 20 pour la détection, l’identification, le dénombrement et/ou l’isolement d’au moins une E. coli productrice de shigatoxine caractérisé en ce que la nanoparticule est une nanoparticule d’or de taille entre 20 et 90 nm et à une concentration comprise entre 10 10 et 10 12 nanoparticules/ml de milieu réactionnel. Kit de diagnostic permettant la préparation d’un milieu réactionnel selon l’une quelconque des revendications précédentes comprenant un conjugué agglutinant un milieu gélifiant Préparation d’un milieu réactionnel selon les revendications 1 à 13 comprenant l’étape de mise en contact d’un conjugué agglutinant avec un milieu gélifiant pour former le milieu réactionnel. Méthode de culture microbiologique in vitro, dans laquelle des micro-organismes susceptibles d’être présents dans un échantillon sont ensemencés dans ou sur un milieu de culture tel que défini aux revendications 1 à 13. Méthode de détection, d’identification, de dénombrement et/ou d’isolement d’un micro-organisme cible dans un échantillon susceptible de le contenir, comprenant les étapes suivantes : Mettre en contact ledit échantillon avec un milieu réactionnel selon l’une quelconque des revendications 1 à 21. Incuber Détecter la présence dudit micro-organisme cible. Méthode selon la revendication précédente caractérisée en ce que la détection se fait par l’observation de l’apparition d’un halo autour du micro-organisme cible sur le milieu réactionnel selon l’une quelconque des revendications 1 à 21.