Brevet FR3126990A1 — publié le 20230317

La présente invention concerne un milieu de culture spécifique aux bactéries de l’espèce Christensenella minuta , son procédé de préparation et ses utilisations. Milieu de culture adapté aux bactéries de l’espèce Christensenella minuta L’invention concerne un milieu de culture spécifique aux bactéries de l’espèce Christensenella minuta , son procédé de préparation et ses utilisations. Etat de l’art Notre microbiote intestinal ou « flore intestinale » est constitué d’un ensemble de bactéries, virus, parasites et champignons non pathogènes, soit 10 12 à 10 14 micro-organismes présents dans le tube digestif de chaque individu, ce qui représente 2 à 10 fois plus que le nombre de cellules présent dans notre corps. Dès lors, son rôle est de plus en plus étudié ces dernières années. En 2012, un microbiologiste a identifié et cultivé à partir de fèces humaines une nouvelle espèce : Christensenella minuta ( C. minuta ci-après) appartenant aux Clostridiales gram-négatifs. (Morotomi et al ., Description of Christensenella minuta gen. nov., sp. nov., isolated from human faeces, which forms a distinct branch in the order Clostridiales , and proposal of Christensenellaceae fam. nov. , International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2012). Cette nouvelle espèce bactérienne est dorénavant connue pour son potentiel thérapeutique dans la prévention et/ou le traitement de pathologies liées à la dysbiose intestinale, en particulier l’obésité ou les maladies inflammatoires telles que les maladies inflammatoires de l’intestin, voire de certains cancers. Cette espèce est donc de plus en plus étudiée par la communauté scientifique, y compris en clinique afin de développer un candidat médicament pour prévenir et/ou traiter les patients souffrant de ces pathologies et ainsi, apporter une solution thérapeutique pour ces maladies dites « non transmissibles » (MNT). En effet, l’ensemble des MNT est devenu la première cause de mortalité et de surmortalité dans le monde en 2016 avec près de 71% des décès. Les bactéries lorsqu’elles ne sont pas présentes chez un hôte, nécessitent un support, en particulier un milieu de culture, leur apportant tous les nutriments nécessaires à leur développement et ainsi permettant leur croissance. Lors de la découverte de C. minuta , la communauté scientifique a adapté, modifié des milieux de culture déjà connus des microbiologistes. Or, chaque espèce bactérienne à ses propres besoins et nécessitent donc un milieu de culture spécifique pour maintenir une croissance optimale lors d’une culture bactérienne. D’autant plus lors du développement d’un candidat médicament basé sur le microbiome. En outre, une telle solution thérapeutique nécessite de mettre en place des Bonnes Pratiques de Fabrication (BPF) ou Good Manufacturing Practices, en Anglais (GMP) afin d’assurer la qualité et la sécurité du candidat médicament mais également des procédures de fabrication, des locaux, des équipements et du personnel. Il est donc nécessaire que le milieu de culture utilisé lors du procédé de fabrication des bactéries utilisées comme médicament répondent à ces critères de qualité et soit « GMP ». Or, il n’existe pas à ce jour de milieu de culture dit « GMP » permettant la préparation et le développement d’un candidat médicament à base de bactéries de l’espèce C. minuta. Les milieux connus tels que le milieu renforcé pour Clostridi a (Reinforced Clostridial Medium) dit milieu RCM, le milieu peptone-levure glucose (peptone-yeast glucose) dit milieu PYG, mais également le milieu anaérobie de Gifu (Gifu Anaerobic Medium) dit milieu GAM ne répondent pas à ces critères GMP, étant donné la présence d’ingrédients non réglementaires en production GMP, tels que des ingrédients d’origine animale. Or, les ingrédients d’origine animale apportent aux bactéries un complément nutritif important, voir essentiel leur permettant une croissance optimale, mais le remplacement de ces ingrédients est particulièrement complexe étant donné : la spécificité des bactéries C. minuta qui évoluent au sein d’une niche écologique très spécifique, située dans l’iléon terminal et le colon proximal, une zone de l’intestin pour laquelle nous ne disposons que de très peu d’informations concernant la composition du milieu, et leur source de production (non animale). De plus, les milieux de culture actuels ne sont pas spécifiques et donc non optimisés pour la croissance de C. minuta . De plus, les milieux de culture actuels ne sont pas spécifiques et donc non optimisés pour la croissance de C. minuta . Il existe donc un besoin pour un milieu de culture spécifique aux bactéries de l’espèce C. minuta qui répondent à la réglementation dites GMP et qui soit au moins aussi efficace, voire plus que les milieux déjà connus et qui soit optimisé et approprié pour C. minuta . Pour répondre à ce besoin, l’invention propose un nouveau milieu de culture de bactéries de l’espèce C. minuta comprenant notamment une solution de vitamine B12 ainsi qu’une solution minérale spécifique comprenant au moins le dipotassium phosphate (K 2 HPO 4 ), le chloride de sodium (NaCl), le Calcium chloride dihydrate (CaCl2.2H 2 O), le magnésium sulfate heptahydrate (MgSO 4 .7H 2 O), le potassium dihydrogène phosphate (KH 2 HPO 4 ) et l’ammonium sulfate ((NH 4 ,) 2 SO 4 ). Ainsi, l’invention concerne un nouveau milieu de culture de bactéries de l’espèce C. minuta comprenant au moins les ingrédients suivants : un extrait de levure, une source végétale d’hydrolysat protéique, un hexose, une solution minérale comprenant le dipotassium phosphate (K 2 HPO 4 ), le chloride de sodium (NaCl), le Calcium chloride dihydrate (CaCl2.2H 2 O), le magnesium sulfate heptahydrate (MgSO 4 .7H 2 O), le potassium dihydrogene phosphate (KH 2 HPO 4 ) et l’ammonium sulfate ((NH 4 ,) 2 SO 4 ). la vitamine B12, un agent réducteur choisi parmi la vitamine C et la L-cystéine, une source végétale de fer choisie parmi une porphyrine contenant du fer ou un composé organique chélatant du Fer (III) ou une source de Fer (III), une source de souffre, et au moins un acide aminé choisi parmi : la glycine, la valine, l’asparagine, la phénylalanine, l’acide aspartique, la cystéine et leur mélange. L’invention se rapporte également à un procédé de préparation d’un tel milieu de culture comprenant notamment une étape de mélange dans une chambre anaérobie et ce au moins 24h avant utilisation dudit milieu. Enfin, l’invention concerne l’utilisation d’un milieu de culture selon l’invention pour favoriser la croissance de C. minuta , mais également pour obtenir une production à l’échelle industrielle de C. minuta (en particulier, à une concentration satisfaisante permettant d’obtenir l’effet thérapeutique souhaité) et répondant aux normes GMP. D’autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description détaillée de l’invention, des exemples et des figures qui vont suivre. Brève description des Figures représente la croissance bactérienne de 3 souches de C. minuta incubées dans le milieu selon l’Exemple 2. La densité optique (croissance bactérienne) est mesurée à 600nm. représente la croissance bactérienne d’une souche de C. minuta incubée dans le milieu selon l’Exemple 2 dépourvu d’un des ingrédients (Milieu 2 : Milieu selon l’Exemple 2 dépourvu d’hémine ; Milieu 3 : Milieu selon l’Exemple 2 dépourvu de Vitamine K1 ; Milieu 4 : Milieu selon l’Exemple 2 dépourvu d’acides gras volatiles ; Milieu 5 : Milieu selon l’Exemple 2 dépourvu de sodium acétate). représente la croissance bactérienne d’une souche de C. minuta incubée dans le milieu selon l’Exemple 2 dépourvu de Vitamine K1 ou dans le milieu selon l’Exemple 3. représente un essai comparatif en doublant la quantité de glucose disponible dans le milieu selon l’Exemple 2 dépourvu de Vitamine K1 (9 g/L vs. 18 g/L). ] représente la croissance bactérienne de 4 souches de C. minuta incubées dans le milieu selon l’Exemple 2 dépourvu de Vitamine K1. La densité optique est mesurée à 600nm. représente la croissance bactérienne d’une souche de C. minuta incubée dans différents milieux dépourvus de certains des ingrédients essentiels (cf. Tableau 8). Milieu de culture de bactéries de l’espèce C hristensenella minuta comprenant au moins les ingrédients suivants : un extrait de levure, une source végétale d’hydrolysat protéique, un hexose, une solution minérale comprenant le dipotassium phosphate (K 2 HPO 4 ), le chloride de sodium (NaCl), le Calcium chloride dihydrate (CaCl2.2H 2 O), le magnesium sulfate heptahydrate (MgSO 4 .7H 2 O), le potassium dihydrogene phosphate (KH 2 HPO 4 ) et l’ammonium sulfate ((NH 4 ,) 2 SO 4 ). la vitamine B12, un agent réducteur choisi parmi la vitamine C et la L-cystéine, une source végétale de fer choisie parmi une porphyrine contenant du fer ou un composé organique chélatant du Fer (III) ou une source de Fer (III), une source de souffre, et au moins un acide aminé choisi parmi : la glycine, la valine, l’asparagine, la phénylalanine, l’acide aspartique, la cystéine et leur mélange. Milieu de culture selon la revendication précédente caractérisé en ce que la source végétale d’hydrolysat protéique est une peptone ou une tryptone. Milieu de culture selon la précédente revendication, caractérisé en ce que la source végétale de peptone représente au moins 1% en volume du volume total du milieu. Milieu de culture selon l’une des revendications précédentes caractérisé en ce que l’hexose est choisi parmi le glucose, fructose, fucose, maltose, galactose, mannose et le mannitol. Milieu de culture selon la revendication précédente caractérisé en ce que la source végétale de fer est l’hème de chlorure ferrique. Milieu de culture selon l’une des revendications 4 ou 5, caractérisé en ce que le glucose représente au moins 0,9% en volume du volume total du milieu. Milieu de culture selon l’une des revendications précédentes caractérisé en ce que la source de souffre est l’Hydrate d’hydrochlorure de L-Cystéine. Milieu de culture selon l’une des précédentes revendications comprenant au moins une autre vitamine choisie parmi la vitamine B1, B2, B6, B8, B9, K1 et l’acide 4-aminobenzoïque. Milieu de culture selon l’une des précédentes revendications, comprenant également de l’acétate de sodium et/ou du sodium bicarbonate. Milieu de culture selon l’une des revendications précédentes, comprenant également une solution d’acide gras comprenant l’acide isobutyrique, l’acide isovalérique, l’acide butyrique, l’acide propionique, l’acide valérique, l’acide acétique et l’acide caproïque. Milieu de culture selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le pH du milieu est compris entre 7 et 8. Milieu de culture selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu’il ne comprend pas d’ingrédient d’origine animale. Milieu de culture selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la solution minérale représente au moins 20% en volume du volume total du milieu. Milieu de culture selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la source végétale de fer représente au moins 1% en volume du volume total du milieu. Milieu de culture selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la vitamine B12 représente au moins 1% en volume du volume total du milieu. Milieu de culture selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’il se présente sous forme liquide ou solide. Milieu de culture selon la précédente revendication, caractérisé en ce qu’il comprend également de l’agar-agar et se présente sous forme solide.