Brevet FR3130291A1 — publié le 20230616

L’invention concerne une analyse métagénomique d’un échantillon en vue d’une détection d’une présence d’une espèce d’intérêt dans l’échantillon. L’analyse est effectué de façon itérative. Au cours de chaque itération, on identifie et on dénombre des séquences correspondant à chaque espèce d’intérêt. Les itérations cessent lorsque la présence d’une espèce d’intérêt est confirmée ou lorsqu’un nombre maximal d’itérations sont effectuées. La détection d’une espèce d’intérêt peut être suivie d’une caractérisation plus précise du génome de ladite espèce d’intérêt. La caractérisation met en œuvre des itérations complémentaires. Figure 1. Procédé de détection d’une présence d’une espèce biologique d’intérêt par séquençage temps réel itératif. Le domaine technique de l'invention est l'identification d'une espèce biologique d'intérêt par analyse métagénomique, en mettant en œuvre une méthode de séquençage en temps réel. ART ANTERIEUR Récemment, des techniques de séquençage dites « en temps réel »ont émergées. Ces plates-formes permettent un accès immédiat ou légèrement décalé, aux séquences au fur et à mesure de leur lecture. De plus la quantité de séquences lues n’est plus limitée par la nécessité d’une mobilisation des acides nucléiques sur un support, ce qui permet potentiellement d’avoir accès à l’ensemble des séquences d’acides nucléiques présent dans l’échantillon analysé. Un exemple de méthode est le séquençage de l’ADN par nanopores, telle que mise en œuvre par les plateformes de séquençage MinION et GridION de la société Oxford Nanopore Technologies. Le séquençage de l’ADN par nanopores est basé sur le passage d’une molécule, comportant un brin d’oligonucléotides, à travers un nanopore, ce dernier formant un canal. Lorsque la molécule traverse le canal, une différence de potentiel peut être mesuré, de part et d’autre du canal, qui dépend de la nature de chaque base formant le brin. La différence de potentiel permet une distinction entre les cinq bases standard de l’ADN ou de l’ARN (G, C, T ou U). Ainsi, au cours du passage à travers le nanopore, le brin d’oligonucléotides induit une séquence temporelle de différences de potentiel, à partir de laquelle on détermine la suite des bases formant le brin. Le document WO2021/013900 décrit un procédé de détection d’une espèce d’intérêt, en particulier une bactérie, dans un échantillon. Une espèce de contrôle a été préalablement ajoutée à l’échantillon, selon une quantité connue. Après séquençage, le nombre de séquences correspondant à l’espèce de contrôle est utilisé pour quantifier une concentration d’espèce d’intérêt ou pour déterminer une concentration minimale détectable de l’espèce d’intérêt dans l’échantillon. L’utilisation de l’espèce de contrôle permet de s’assurer que le procédé d’extraction et l’éventuelle amplification des séquences de nucléotides est effectué correctement. La quantité d’espèce de contrôle introduite dans l’échantillon étant connue, elle peut être utilisée pour quantifier une concentration ou une concentration minimale détectable de l’espèce d’intérêt. L’inventeur a adapté le procédé précédemment décrit à l’utilisation de séquenceurs en temps réel délivrant leurs séquences nucléotidiques numériques (également appelés « reads » et correspondant à des séquences d’ADN ou d’ARN) à mesure que les fragments nucléotidiques dans l’échantillon sont lus. En effet, ces derniers permettent d’obtenir un résultat d’analyse plus rapidement, par exemple quelques heures, voire quelques dizaines de minutes. Un premier objet de l’invention est un Procédé de détection d'une espèce biologique d'intérêt potentiellement présente dans un échantillon, l'espèce biologique d'intérêt présentant un génome connu ou partiellement connu, l'échantillon comportant un mélange de différentes espèces biologiques, le procédé comportant les étapes : a) ajout d’une espèce de contrôle dans l’échantillon, l’espèce de contrôle présentant un génome connu, l’espèce de contrôle étant ajoutée selon une concentration connue dans l’échantillon ; b) extraction des acides nucléiques de l’échantillon ; c) séquençage d’une partie des séquences d’acides nucléiques extraites lors de l’étape b) à l’aide d’un séquenceur à temps réel durant une durée prédéterminée ou jusqu’à l’obtention d’un nombre de séquençages prédéterminé ; d) suite à l’étape c), assignation de séquences résultant de l’étape c) à l’espèce d’intérêt ainsi qu’à l’espèce de contrôle ; e) mise à jour des quantités de séquences respectivement associées à l’espèce d’intérêt et à l’espèce de contrôle, de telle sorte que les quantités de séquences associées à l’espèce de contrôle et à l’espèce d’intérêt sont : lors d’une première itération de l’étape e), les quantités de séquences assignées à l’espèce de contrôle et à l’espèce d’intérêt lors de l’étape d) ajoutées à des quantités de séquences initiales ; lors de chaque réitération de l’étape e), les quantités de séquences ( ) assignées à l’espèce de contrôle et à l’espèce d’intérêt lors de l’étape d) ajoutées aux quantités de séquences associées à l’espèce de contrôle et à l’espèce d’intérêt résultant de l’itération précédente ; f)comparaison de la quantité de séquences associées à l’espèce d’intérêt mise à jour dans l’étape e) avec un seuil du nombre de séquences ; et/ou comparaison de la quantité de séquences associées à l’espèce de contrôle mise à jour dans l’étape e) avec un seuil de contrôle ; g) en fonction d’au moins une comparaison effectuée lors de l’étape f), détection de la présence de l’espèce biologique d’intérêt dans l’échantillon, ou passage à l’étape h) ; h) réitération des étapes c) à g) jusqu’à l’atteinte d’un critère d’arrêt d’itérations. Selon un mode de réalisation, l’étape d) de chaque itération est effectuée durant une durée prédéterminée ou jusqu’au séquençage d’un nombre prédéterminé de séquences. Le procédé peut être tel que : lors de l’étape f) d’une itération, lorsque la quantité de séquences associées à l’espèce d’intérêt est supérieure au seuil du nombre de séquences; lors de l’étape e) de l’itération, lorsque la quantité de séquences associées à l’espèce de contrôle est strictement supérieure à zéro ; l’étape g) comporte une estimation d’une concentration de l’espèce d’intérêt en fonction : de la quantité de séquences associées à l’espèce d’intérêt lors de la dernière mise à jour (c’est-à-dire lors de la dernière étape e); de la quantité de séquences associées à l’espèce de contrôle lors de la dernière mise à jour ; de la concentration ajoutée de l’espèce de contrôle. Le procédé peut être tel que : lors de l’étape f) d’une itération, lorsque la quantité de séquences associées à l’espèce d’intérêt est supérieure au seuil du nombre de séquences ; lors de l’étape e) de l’itération, lorsque la quantité de séquences associées à l’espèce de contrôle est nulle ; au cours de l’étape g), la concentration de l’espèce d’intérêt est considérée comme supérieure à la concentration de l’espèce de contrôle. Le procédé peut être tel que : lors de l’étape f) d’une itération, lorsque la quantité de séquences associées à l’espèce d’intérêt est inférieure au seuil du nombre de séquences; lors de l’étape f) de l’itération, lorsque la quantité de séquences associées à l’espèce de contrôle est supérieure au seuil de contrôle; au cours de l’étape g), si la quantité de séquences associées à l’espèce d’intérêt est nulle, la concentration de l’espèce d’intérêt est considérée comme nulle. Le procédé peut être tel que : lors de l’étape f) d’une itération, lorsque la quantité de séquences associées à l’espèce d’intérêt est inférieure au seuil du nombre de séquences ; lors de l’étape f) de l’itération, lorsque la quantité de séquences associées à l’espèce de contrôle est supérieure au seuil de contrôle ; au cours de l’étape g), si la quantité de séquences associées à l’espèce d’intérêt est non nulle, l’étape g) comporte une estimation d’une concentration de l’espèce d’intérêt en fonction : de la quantité de séquences associées à l’espèce d’intérêt ; de la quantité de séquences associées à l’espèce de contrôle; de la concentration ajoutée de l’espèce de contrôle. La concentration de l’espèce d’intérêt peut être estimée à partir d’un ratio : où : et sont respectivement les longueurs de génome de l’espèce de contrôle et de l’espèce d’intérêt ; et sont respectivement les quantités de séquences respectivement associées à l’espèce d’intérêt et à l’espèce de contrôle résultant la dernière mise à jour; est la concentration de l’espèce de contrôle ajoutée dans l’échantillon. Le procédé peut être tel que, suite à l’atteinte du critère d’arrêt des itérations, si la quantité de séquences associées à l’espèce d’intérêt est inférieure au seuil du nombre de séquences ; et si la quantité de séquences associées à l’espèce de contrôle est inférieure au seuil de contrôle; le procédé génère une information selon laquelle ni la présence ni l’absence de l’espèce d’intérêt ne peuvent être confirmées. Selon une possibilité, le procédé comporte une prise en compte d’un seuil de décision, le procédé visant à comparer une concentration de l’espèce d’intérêt au seuil de décision le procédé étant tel que lors de l’étape a), la concentration de l’espèce de contrôle, est comprise entre 0.01 fois et 100 fois le seuil de décision. Selon une possibilité, dans l’étape h), le critère d’arrêt des itérations est atteint lorsque : la quantité de séquences associées à l’espèce d’intérêt dépasse le seuil du nombre de séquences; et/ou la quantité de séquences associées à l’espèce de contrôle dépasse le seuil de contrôle; et/ou la durée cumulée des étapes c) atteint une durée maximale prédéterminée ; et/ou le nombre de séquençages cumulés lors des étapes c) atteint un nombre maximal prédéterminé ; et/ou le nombre d’itérations atteint un nombre maximal d’itérations prédéterminé. Selon un mode de réalisation, suite à une détection d’une présence de l’espèce d’intérêt dans l’échantillon, le procédé comporte les étapes : i) séquençage d’une partie des séquences de nucléotides extraites lors de l’étape b) à l’aide du séquenceur temps réel durant une durée prédéterminée ou jusqu’à l’obtention d’un nombre de séquençages prédéterminé ; j) suite à l’étape i), assignation de séquences résultant de l’étape i) à l’espèce d’intérêt détectée; k) mise à jour des quantités de séquences associées à l’espèce d’intérêt, de telle sorte que les quantités de séquences associées à l’espèce d’intérêt sont : lors d’une première itération de l’étape k), la quantité de séquences assignées à l’espèce d’intérêt détectée lors de l’étape j) ajoutées à la quantité de séquences résultant de la dernière itération des étapes c) à g) ; lors de chaque réitération de l’étape k), la quantité de séquences assignées à l’espèce d’intérêt lors de l’étape j) ajoutées à la quantité de séquences résultant de l’itération précédente de l’étape k) ; l) réitération des étapes i) à k) jusqu’à l’atteinte d’un critère d’arrêt d’itérations. Les étapes i) à k) peuvent être réitérées jusqu’à l’atteinte d’un nombre d’itérations prédéterminé. Selon une possibilité : au cours de chaque itération des étapes i) à k), suite à l’étape k), le procédé comporte une détermination d’une profondeur de séquençage de l’espèce biologique d’intérêt, la profondeur de séquençage correspondant à un ratio entre la longueur cumulée des séquences associées à l’espèce et la longueur du génome de l’espèce ; les étapes i) à k) sont réitérées jusqu’à l’atteinte d’une profondeur de séquençage prédéterminée. Selon un mode de réalisation, suite à l’arrêt des itérations des étapes i) à k), une détection d’une séquence type du génome de l’espèce d’intérêt, la séquence type comportant un marqueur d’antibiorésistance ou un marqueur de virulence de l’espèce d’intérêt. De préférence, le séquenceur est configurer pour effectuer des séquençages successifs de différentes séquences d’acides nucléiques, les unes après les autres, le séquençage de chaque séquence étant considéré comme effectué en temps réel. Un deuxième objet de l’invention est un dispositif d’analyse métagénomique d’un échantillon, comportant : une chambre fluidique, destinée à recevoir l’échantillon ; un séquenceur configuré pour effectuer un séquençage temps réel de l’échantillon ; une unité de traitement, comportant un module de bio-informatique, programmé pour assigner des séquences résultant du séquenceur à une espèce, et un module de pilotage, programmé pour mettre en œuvre les étapes c) à h) d’un procédé selon le premier objet de l’invention. Un troisième objet de l’invention est un support d’enregistrement, lisible par ordinateur, ou téléchargeable, comportant les instructions pour la mise en œuvre des étapes c) à h) d’un procédé selon le premier objet de l’invention. L'invention sera mieux comprise à la lecture de l'exposé des exemples de réalisation présentés, dans la suite de la description, en lien avec les figures listées ci-dessous. FIGURES Les figures 1 et 2 schématisent les principales étapes d'un procédé selon l'invention. La concerne une phase de détection d’une espèce d’intérêt. La concerne une phase de caractérisation de chaque espèce d’intérêt détectée lors de la phase de détection. La schématise un dispositif configuré pour mettre en œuvre l’invention. EXPOSE DE MODES DE REALISATION PARTICULIERS L'objectif du procédé est de pouvoir détecter la présence d'une espèce biologique d'intérêt SOI dans un échantillon. L'acronyme SOI signifie "Species of Interest". En cas de détection, le procédé peut permettre une quantification absolue de l'espèce d'intérêt SOI, de façon à permettre une comparaison avec un seuil de décision SD. Par espèce biologique, il est entendu un microorganisme, par exemple une bactérie, ou un virus, un champignon, une archéobactérie, une amibe, un protiste, une microalgue. Une espèce biologique peut également être une cellule ou tout autre matériel ou entité comportant un acide nucléique séquençable. Lorsque l'échantillon est issu d'un organisme humain ou animal, l'espèce biologique d'intérêt peut être une espèce pathogène ou une espèce identifiée comme ayant un impact sur la santé ou le fonctionnement du corps humain ou animal, comme par exemple les espèces bactériennes intestinales, ou les bactéries impactant l’efficacité d’un traitement anti-cancéreux. Lorsque l'échantillon est issu d'un prélèvement dans un procédé industriel ou dans l'environnement, l'espèce biologique d'intérêt peut être une espèce considérée comme contaminante, ou une espèce d'intérêt ayant une importance dans un processus industriel ou dans l'environnement, et dont on souhaite contrôler la présence ou la concentration. L'espèce d'intérêt présente un génome connu, ou partiellement connu. Le génome, ou sa portion connue, est constitué de séquences, dites séquences d'intérêt. Le procédé peut adresser simultanément plusieurs espèces d'intérêt. Aussi, le terme une espèce d'intérêt est à interpréter comme signifiant au moins une espèce d'intérêt. Le seuil de décision SD est un seuil permettant de caractériser une charge de l'espèce biologique d'intérêt, par exemple d'un microorganisme, en fonction de l'application visée. Il est par exemple établi à partir d'une limite réglementaire, ou sanitaire ou industrielle. Par exemple, lorsque l'application est utilisée dans l'aide au diagnostic clinique, l'espèce biologique d'intérêt étant une bactérie, le seuil de décision peut être une concentration en deçà de laquelle la présence de la bactérie correspond à une présence normale, c'est-à-dire un développement non pathologique, et au-delà duquel la présence de la bactérie est considérée comme pathologique, correspondant par exemple à une infection. Lorsque l'invention est appliquée dans un procédé industriel, le seuil de décision peut correspondre à une valeur de conformité, de telle sorte qu'au-delà du seuil de décision, l'échantillon est considéré comme non conforme, et qu'en deçà du seuil de décision, l'échantillon est considéré comme conforme. Quelle que soit l'application, lorsque la concentration de l'espèce biologique d'intérêt est supérieure ou égale au seuil de décision, elle est définie comme étant critique. Dans certaines applications, par exemple dans la fabrication de produits subissant une fermentation, une concentration d'espèce biologique d'intérêt peut être considérée comme critique si elle est inférieure à un seuil de décision, ce dernier correspondant à une concentration minimale admissible de l'espèce biologique. L'échantillon est généralement un échantillon prélevé dans l'environnement, ou dans un organisme, mort ou vivant, ou encore dans un produit agroalimentaire ou manufacturé. L'échantillon peut également avoir été prélevé dans une installation industrielle à des fins de contrôle de procédé. Aussi, l'échantillon comporte différentes espèces biologiques, ne présentant pas le même génome. En particulier, lorsque l'échantillon résulte d'un prélèvement sur un organisme, par exemple un organisme humain ou animal, l'échantillon comporte une quantité significative, voire majoritaire, de cellules provenant de l'organisme sur lequel a été prélevé l’échantillon. Les génomes des organismes humains ou animaux ont une taille 1 000 à 100 000 fois plus importante que les génomes des organismes procaryotes. De plus, l'échantillon comporte généralement des espèces biologiques naturellement présentes dans l'échantillon, et non susceptibles d'entraîner une pathologie ou une contamination critique. Par exemple, lorsque l'échantillon est un prélèvement broncho-alvéolaire, il comporte une flore bactérienne naturellement présente dans les poumons. Lorsque l'échantillon est un prélèvement de selles, il comporte une flore bactérienne naturellement présente dans le tube digestif. En cela, lorsque l'espèce biologique d'intérêt est une bactérie ou un virus, les acides nucléiques provenant de l'espèce biologique d'intérêt peuvent être minoritaires dans l'échantillon. L'échantillon comporte des espèces dites "de matrice", endogènes dans l'échantillon, et susceptibles de masquer l'information métagénomique relative à l'espèce biologique d'intérêt. Par exemple, lorsque l'échantillon est prélevé dans un yaourt, dans une viande ou dans un vaccin, il comporte des espèces de matrice représentatives de ces milieux. Dans le cas d'un prélèvement sur un organisme, la matrice comporte les cellules composant l'organisme. Un aspect important de l’invention est que la présence de l’espèce d’intérêt dans l’échantillon est détectée en mettant en œuvre un séquenceur temps réel évoqué dans l’art antérieur. Un tel séquenceur permet d’obtenir des données exploitables, relatives aux séquences présentes dans l’échantillon, plus rapidement que les séquenceurs antérieurs. Le séquenceur temps réel est configuré pour collecter successivement des signaux, représentatifs de détections successives de bases d’une même séquence. Ainsi, un séquenceur temps réel est configuré pour générer une séquence en temps réel, au fur et à mesure de son décodage. Des séquençages de différentes séquences présentes dans l’échantillon sont effectués successivement, chaque séquence étant séquencée l’une après l’autre. Cela n’exclut pas le fait que certaines séquences peuvent faire l’objet de séquençages simultanés, en parallèle. Par exemple, lorsque le séquenceur est un séquenceur par nanopores, chaque nanopore « lit » plusieurs séquences différentes en parallèle. Chaque nanopore peut lire plusieurs séquences différentes successivement. Un autre avantage d’un tel séquenceur est la possibilité d’effectuer une analyse en temps réel des séquences et la quantité de séquences lue est relative à la durée du séquençage. En fonction des résultats de séquençage disponibles, on peut poursuivre ou arrêter le séquençage, ce qui confère un gain de temps et une grande souplesse d’utilisation. Le séquenceur peut être de type à nanopores, comme décrit dans l’art antérieur. D’une façon plus générale, l’invention concerne le recours à un séquenceur configuré pour générer, en temps réel, des séquences, ces dernières étant identifiées suite à leur séquençage. Ainsi, le séquenceur est configuré pour générer séquentiellement une liste de séquences identifiées, ces dernières étant désignées par le terme « reads ». Les listes de reads sont générées à intervalles réguliers, par exemple tous les minutes, étant par exemple égal à 10. On peut également paramétrer la quantité de séquences lues dans chaque liste. La quantité de séquences (ou reads) dans chaque liste peut par exemple être égale à 4000. De même que dans la demande WO2021/013900, un des objectifs de l’invention est d'évaluer dans quelle mesure une analyse métagénomique est exploitable. Il s'agit en particulier d'évaluer une conformité de l'ensemble des étapes depuis la préparation de l'échantillon, prélèvement exclu, jusqu'à l'analyse bio-informatique des données de séquençage. A cette fin, une espèce de contrôle, notée SPC, acronyme de Sample Processing Control, est ajoutée dans l'échantillon. Une fonction de l'espèce de contrôle est de permettre un contrôle du bon déroulement des étapes d'extraction d'acides nucléiques et de séquençage, décrites par la suite. L'espèce de contrôle SPC peut être une espèce biologique connue, dont le génome est également connu, de préférence en totalité. L'espèce de contrôle SPC peut être une espèce biologique naturelle. Il peut également s'agir d'une espèce artificielle, par exemple un ARN (acide ribonucléique) encapsidé. De préférence, l'espèce de contrôle SPC n'est pas initialement présente dans l'échantillon prélevé, ou selon une quantité négligeable. De préférence, la teneur en espèce de contrôle SPC initialement présente dans l'échantillon, c'est-à-dire présente avant l'ajout, et de préférence au moins 10 fois inférieure, ou de préférence au moins 100 ou 1 000 fois inférieure à la concentration ajoutée C SPC de l'espèce de contrôle SPC dans l'échantillon. L'espèce de contrôle SPC peut par exemple être une bactérie. Il est important que la concentration C SPC de l'espèce de contrôle SPC ajoutée soit maîtrisée. L'espèce de contrôle peut être choisie en tenant compte des aspects listés ci-dessous : L'espèce de contrôle doit de préférence se distinguer des organismes naturellement présents dans l'échantillon, ou organismes endogènes, ainsi que de l'espèce d'intérêt recherchée : ainsi, l'outil bio-informatique peut identifier avec précision les séquences issues du séquençage du SPC. La quantité de séquences assignées à l'espèce de contrôle, au cours du séquençage, doit être suffisante pour pouvoir être détectée de façon correcte, sans pour autant masquer l'information utile, correspondant aux séquences de l'espèce biologique d'intérêt. En d'autres termes, l'espèce de contrôle est de préférence détectable par le séquençage haut débit, tout n'étant pas prépondérante dans l'échantillon. En particulier, lorsqu'on souhaite déterminer une positivité (concentration de l'espèce supérieure au seuil de décision) ou une négativité (concentration de l'espèce inférieure au seuil de décision), il est préférable que l'espèce de contrôle présente au moins une des caractéristiques suivantes: La taille de son génome est de préférence similaire, ou au moins comparable, à la taille du génome de l'espèce biologique d'intérêt. Plus particulièrement, la taille du génome de l'espèce de contrôle est comprise entre 0.1 fois à 10 fois la taille du génome de l'espèce biologique d'intérêt. La concentration C SPC de l'espèce de contrôle peut être déterminée en fonction du seuil de décision. La concentration C SPC de l'espèce de contrôle SPC ajoutée peut être par exemple comprise entre 0,001 fois et 1 000 fois, et de préférence entre 0.01 et 100 fois le seuil de décision. Les acides nucléiques de l'espèce de contrôle SPC subissent un traitement similaire aux acides nucléiques de l'espèce d'intérêt lors des étapes de préparation de l'échantillon, de l'extraction et de séquençage, et de préférence : le pourcentage de bases GC (Guanine, Cytosine) est de préférence proche du pourcentage de bases GC de l'espèce biologique d'intérêt ; Par proche de, on entend compris entre 75% et 125%, et de préférence entre 80% et 120 %. l'espèce biologique de contrôle comporte de préférence, lorsque l'espèce biologique d'intérêt est une bactérie, une membrane ou une paroi cellulaire intègre ou, lorsque l'espèce biologique d'intérêt est un virus, une enveloppe protéique. Cette condition permet en outre un suivi des étapes de lyse ou de l'extraction des acides nucléiques de l'espèce biologique d'intérêt. Les séquences de nucléotides de l'espèce de contrôle ne contiennent pas, de préférence, de marqueurs génomiques, comme par exemple des marqueurs de résistance aux antibiotiques, des marqueurs de virulence, de façon à ne pas fausser des résultats d'un éventuel test de sensibilité aux antibiotiques par la présence de tels marqueurs dans le génome de l'espèce biologique d'intérêt. De préférence, les séquences de nucléotides de l'espèce de contrôle ne contiennent pas tout autre gène présentant un intérêt clinique ou industriel et dont la présence est susceptible d'être contrôlée. L'espèce de contrôle est de préférence aisément manipulable, en particulier : en étant inoffensive pour l'homme ou l'environnement ; et/ou en étant résistante à des traitements thermiques de type lyophilisation ou congélation, ce qui facilite le stockage. L'espèce de contrôle ne doit pas former des spores, ou de façon marginale. L'espèce de contrôle doit présenter une sensibilité à la lyse proche de celle de l'espèce biologique d'intérêt. L'espèce de contrôle peut être présente sous la forme de billes, chaque bille comportant une concentration calibrée d'espèce biologique de contrôle sous forme lyophilisée. Il est précisé qu'une unique espèce de contrôle SPC peut être utilisée, ou que plusieurs espèces de contrôle, de différents types, peuvent être utilisées. Le procédé comporte tout d’abord une phase de détection d’une espèce d’intérêt, dont les étapes sont à présent, en lien avec la . Etape 10 : prélèvement de l'échantillon. Dans cet exemple, l'échantillon est prélevé dans un organisme humain vivant, à des fins d'aide au diagnostic. Cependant, l'invention ne se limite pas à une application dans le domaine du vivant. L'échantillon peut être prélevé dans un environnement naturel, industriel ou hospitalier, de façon à vérifier une conformité à l'égard d'un seuil de décision. Etape 20 : ajout de l’espèce de contrôle. La concentration ajoutée C SPC de l'espèce de contrôle SPC est de préférence connue avec précision, par exemple avec la même précision que celle souhaitée pour la quantification de la ou des espèces d’intérêt. En effet, elle peut permettre, sous réserve que certaines conditions soient remplies, de quantifier la concentration d'espèce biologique d'intérêt dans l'échantillon, l'espèce de contrôle formant alors un calibrateur. Le terme concentration ajoutée désigne la concentration de l'espèce de contrôle dans l'échantillon due à l'ajout de l'espèce de contrôle. Dans la description des étapes 30 à 60, on se base, à titre d'exemple avantageux, sur l'ajout d'un seul type d'espèce de contrôle dans l'échantillon. L'espèce de contrôle remplit alors la fonction de contrôle qualité des étapes de l'analyse métagénomique, ainsi que la fonction de calibrateur, permettant une quantification éventuelle de la concentration de l'espèce biologique d'intérêt. A l'issue de l'étape 20, on dispose d'une concentration ajoutée C SPC de l'espèce de contrôle dans l'échantillon. La concentration ajoutée C SPC de l’espèce de contrôle est exprimée, de préférence, en GEq/mL (génome équivalent par mL). On note que les seuils de détection clinique en bactériologie (e.g. le seuil au-delà duquel une infection est diagnostiquée) sont généralement exprimés en UFC/mL (unité formant une colonie), cependant la méthode de quantification proposé permet de quantifier des acides nucléiques sans informations sur l’équivalence en génome. Il est donc recommandé de déterminer, pour le SPC, la corrélation entre le nombre d’unité formant une colonie par mise en culture par exemple sur un milieu gélosé et l’équivalence en nombre de génomes par exemple par PCR quantitative. Il a par exemple été établi que dans un bioball® B. subtilis strain ATCC 19659 BioBall® MultiShot 10E8 (bioMérieux, Catalog #416721) une unité formant colonie était équivalent à un génome. La concentration ajoutée peut être définie en fonction du seuil de décision SD. De préférence, la concentration ajoutée C SPC de l’espèce de contrôle est égale au seuil de décision SD, ou proche du seuil de décision SD, par exemple à 50% près. Ainsi, 0.1 SD ≤ C SPC ≤ 10 SD . L’impact de la concentration ajoutée C SPC de l’espèce de contrôle est décrit par la suite. Etape 30 : lyse et extraction des acides nucléiques. Au cours de cette étape, les cellules de l'échantillon, et notamment les cellules de l'espèce biologique d'intérêt et de l'espèce de contrôle, subissent une lyse, pour permettre une extraction de leur ADN. Différentes stratégies peuvent être envisagées : la lyse peut être paramétrée pour cibler préférentiellement l'espèce biologique d'intérêt. Selon un tel scénario, l'espèce de contrôle doit présenter une même sensibilité à la lyse que l'espèce biologique d'intérêt, ou une sensibilité à la lyse considérée comme équivalente. la lyse peut inclure une première lyse, destinée à lyser essentiellement des cellules autres que l'espèce d'intérêt. Une telle première lyse peut par exemple être envisagée lorsque l'espèce biologique d'intérêt est très minoritaire par rapport aux cellules d'une matrice composant l'échantillon. A la suite de la première lyse, les acides nucléiques libérés sont évacués, puis une deuxième lyse est réalisée, visant l'espèce biologique d'intérêt. Selon un tel scénario, l'espèce de contrôle est de préférence résistante à la première lyse, et non résistante à la deuxième lyse. Suite à la lyse, l'ADN est extrait de l'échantillon par exemple selon le procédé d'extraction décrit dans WO2014/114896. Etape 40 : séquençage L'ADN extrait de l'échantillon subit un séquençage à l’aide d’un séquenceur permettant l’accès en temps réel aux séquences lues, par exemple à nanopores. Il peut par exemple s’agir d’un séquenceur de type MinION ® de Oxford Nanopore Technologies. Le séquenceur est relié à une chambre fluidique dédiée, comportant les nanopores. L’échantillon est introduit dans la chambre fluidique. Le séquenceur est connecté à une unité de traitement permettant l’analyse des séquences identifiées. L’unité de traitement comporte un microprocesseur, configuré pour exécuter des instructions d’un logiciel de bio-informatique, pour identifier les séquences analysées. L’unité de traitement est par exemple un ordinateur de type MinIT, comportant l’environnement informatique dédié au séquençage. L’invention s’applique particulièrement à des séquenceurs dits « temps réel » présentant les caractéristiques suivantes : une capacité à lire l’ensemble des séquences présentes dans l’échantillon à la différence des séquenceurs se fondant sur une immobilisation des séquences sur un support pour leur lecture, ces séquenceurs séquençant donc un nombre maximal prédéfini de séquences correspondant au nombre d’éléments de fixation des séquences nucléotidiques. Ceci implique notamment que le nombre de séquences produites est proportionnel à la durée de séquençage. une capacité à produire en sortie des données brutes (e.g. des reads ou des signaux bruts comme des potentiels électriques) au fur et à mesure de leur collecte, ou à produire en sortie des données brutes par lots à une fréquence définie par lot de séquences de taille donnée ou régulièrement à une fréquence fixe (par exemple un lot de données brutes par minute ou par dizaine de minutes). Une particularité du séquençage « temps réel » est que les résultats de lecture des séquences d’ADN ou d’ARN sont disponibles en temps réel en sortie du séquenceur, ou en quasi temps réel. Par quasi temps-réel, on entend que les reads (ou les signaux bruts mesurés comme les potentiels électriques) sont produits en sortie du séquenceur par lots à l’issue d’une durée très inférieure à la durée totale nécessaire au séquençage des acides présents dans l’échantillon ou très inférieure à la durée totale de consommation des réactifs nécessaires au séquençage. Chaque lot peut ainsi être produit en quelques minutes ou quelques dizaines de minutes. Le séquenceur temps réel a la capacité de produire des séquences (reads) en temps réel. Cependant, on attend généralement qu’un certain nombre de séquences aient été décodées, dans un fichier généré à intervalles réguliers. A titre d’exemple, le séquenceur MinION d’oxford nanopore génère, par défaut, en quasi-temps réel des fichiers de type « .fast5 » par lots de 4 000 séquences de différences de potentiel qui peuvent être convertis en quasi-temps réel en par un ordinateur en fichier .fastq par lots de 4 000 reads. L’extension .fast5 désigne des fichiers de données brutes. L’extension .fastq désigne des fichiers stockant des séquences, ainsi que des scores de qualité associés. Cela permet une mise en œuvre interactive du procédé, de façon à pouvoir arrêter où poursuivre le séquençage en fonction des résultats obtenus. Le séquençage peut notamment être effectué de façon itérative, chaque itération correspondant à un séquençage d’un nombre de séquences prédéterminé (ou batch) ou à un séquençage effectué durant une durée prédéterminée. Au cours de chaque itération, suite au séquençage, des séquences sont potentiellement assignées à l’espèce de contrôle SPC ou à l’espèce biologique d’intérêt SOI, ou à chaque espèce biologique d’intérêt ou à d’autres espèces présentes dans l’échantillon. A chaque itération correspond un rang . est un entier compris entre 1 et , correspondant au nombre maximal d’itérations décrit en lien avec l’étape 70, ou à un nombre maximal de séquences (reads) obtenus. Au cours de chaque itération, le séquençage assigne des nombres de séquences et respectivement à l’espèce d’intérêt SOI et à l’espèce de contrôle SPC. Les étapes suivantes sont décrites en lien avec une espèce d’intérêt SOI. Elles peuvent être mises en œuvre avec plusieurs espèces d’intérêt différentes. Etape 50 : Mise à jour du nombre de séquences. Au cours de cette étape, les nombres de séquences respectivement assignées, lors de l’étape 40, à chaque espèce biologique d’intérêt et à l’espèce de contrôle sont respectivement au nombre de séquences , respectivement associées à l’espèce biologique d’intérêt SOI et à l’espèce de contrôle SPC lors de l’itération précédente. Cette étape correspond à une mise à jour du nombre de séquences respectivement associées à l’espèce d’intérêt SOI et à l’espèce de contrôle SPC, selon les expressions : où et sont les nombres de séquences respectivement assignées à l’espèce d’intérêt et à l’espèce de contrôle lors de l’étape 40 de l’itération . La notation correspond à un nombre de séquences assigné à une espèce lors de l’itération , tandis que la notation correspond à un nombre total de séquences associé à une espèce pour l’ensemble des itérations jusqu’à l’itération . Lors de la première itération ( = 1), on considère des valeurs initiales et prédéterminées, en général nulles : Selon une possibilité, les nombres de séquences ou peuvent être normalisées par une quantité de référence. La quantité de référence peut par exemple être une quantité totale de séquences produites lors du séquençage, jusqu’à l’itération courante . Etape 60 : Comparaisons à des seuils Au cours de cette étape, le nombre de séquences associées à chaque espèce d’intérêt SOI est comparé à un seuil du nombre de séquences , qui correspond au nombre minimum de reads associé à l’espèce d’intérêt SOI nécessaire pour arrêter le séquençage et débuter l’interprétation quantitative relative à la présence de l’espèce d’intérêt dans l’échantillon. Le seuil du nombre de séquences correspond à un seuil du nombre de séquences, ou seuil du nombre de reads, associés à l’espèce d’intérêt. Le nombre de séquences associées à l’espèce de contrôle SPC est comparé à un seuil de contrôle qui correspond au nombre minimum de reads associé au SPC pour arrêter le séquençage quand le nombre de reads associé à chacun des SOI n’atteint pas le seuil du nombre de séquences S SOI . Lorsque et : cf. étape 61 ; Lorsque et : cf. étape 62 ; Lorsque et : cf. étape 63 ; Lorsque et : cf. étape 64 La détermination du seuil du nombre de séquences et du seuil de contrôle sont décrits par la suite. Etape 61 Au cours de cette étape, on ne peut rien conclure quant à la présence de l’espèce d’intérêt SOI dans l’échantillon. Une nouvelle itération des étapes 40 à 60 est nécessaire, sauf si un critère d’arrêt des itérations est atteint, tel que décrit en lien avec l’étape70 Etape 6 2 : Au cours de cette étape, il est possible de conclure à la présence de l’espèce d’intérêt SOI dans l’échantillon et de quantifier sa concentration, par exemple par l’expression : où : et sont respectivement les longueurs de génome de l'espèce de contrôle et de l'espèce biologique d'intérêt. α est un facteur de correction déterminé de façon empirique, sur la base d'échantillons d'apprentissage dont la concentration en espèce biologique d'intérêt est connue. Le facteur de correction α permet de prendre en compte des différences d'efficacité du processus de séquençage de l'espèce biologique d'intérêt et de l'espèce de contrôle. Par défaut, on peut considérer α = 1. Cette valeur unitaire permet d'obtenir une quantification absolue suffisante pour déterminer la positivité ou la négativité d'un échantillon par rapport au seuil de décision. Lorsque la concentration ajoutée est exprimée en GEq/mL, la concentration de l'espèce biologique d'intérêt est également exprimée dans la même unité. Etape 63 Au cours de cette étape, on considère que l’espèce d’intérêt est présente dans l’échantillon, à une concentration supérieure à la concentration de l’espèce de contrôle mais il n’est pas possible d’en déterminer la concentration absolue. Etape 64 Au cours de cette étape, si , il est possible de conclure en l’absence de l’espèce d’intérêt SOI dans l’échantillon. Sinon il est possible de quantifier sa concentration, avec la formule décrite dans l’étape 62. Etape 70 : Les étapes 40 à 60 sont réitérées, jusqu’à l’atteinte d’un critère d’arrêt des itérations. De préférence, chaque itération correspond à une durée de séquençage prédéterminée, et de préférence identique pour chaque itération, ou à un nombre prédéterminé de séquences lues (nombre de reads). Le critère d’arrêt d’itérations est considéré comme atteint lorsque les conditions menant aux étapes 62 ou 63 ou 64 sont atteintes. Le critère d’arrêt des itérations peut également être un nombre d’itérations égal à un nombre maximal d’itérations , ce dernier ayant été prédéterminé. Par exemple, le critère d’arrêt des itérations est considéré comme atteint lorsque la durée de séquençage est supérieure ou égale à une durée prédéterminée, par exemple 12 heures, ou lorsque le nombre total de séquences issues du séquenceur est supérieur à un nombre maximal prédéterminé. Etape 80 Alerte. L’étape 80 est effectuée si et , c’est-à-dire suite à la dernière itération de rang , les nombres de séquences respectivement associées à l’espèce d’intérêt et au contrôle sont respectivement inférieurs au seuil du nombre de séquences et au seuil de contrôle. Dans ce cas, un signal d’alerte est émis, indiquant que la présence ou l’absence de l’espèce d’intérêt dans l’échantillon ne peut être confirmée. Etape 90 Arrêt Suite à l’étape 70 ou à une éventuelle étape 80, le procédé peut être arrêté. Selon une possibilité, plusieurs espèces d’intérêt, différentes l’une de l’autre, sont analysées simultanément. Lorsqu’une des conditions indiquées dans les étapes 62, 63 et 64 est rencontrée, le séquençage peut être stoppé et chaque espèce d’intérêt est interprétée selon ces critères. De façon optionnelle, après que la présence d’une espèce d’intérêt dans l’échantillon a été reportée, suite aux étapes 62 ou 63 ou 64, il est possible de disposer d’informations génomiques complémentaires quant à l’espèce d’intérêt identifiée. Il peut notamment s’agir de la présence d’un marqueur spécifique dans le génome, par exemple un marqueur d’antibiorésistance ou d’un marqueur de virulence. Les marqueurs d’antibiorésistance ou de virulence sont connus. Les étapes itératives 100 à 130, décrites ci-après, en lien avec la figure 2, peuvent être mises en œuvre pour confirmer la présence du marqueur spécifique dans le génome de l’espèce d’intérêt identifiée. Si désigne le rang de l’itération lors de laquelle le critère d’arrêt d’itérations de l’étape 70 a été atteint, les étapes 100 à 130 sont mises en œuvre pour correspond au rang de la dernière itération. Etape 100 Cette étape est similaire à l’étape 40. Seules les séquences correspondant à chaque espèce d’intérêt SOI détectée suite aux itérations des étapes 40 à 80 sont dénombrées. Etape 110 Cette étape correspond à l’étape 50, si ce n’est qu’on procède à une mise à jour du nombre de séquences de chaque espèce d’intérêt selon l’expression : Etape 120 : réitération des étapes 100 à 110, sauf si un critère d’arrêt d’itérations est atteint. Le critère d’arrêt des itérations peut être l’atteinte d’un nombre maximal d’itérations . On rappelle que ce dernier peut correspondre à une durée de séquençage maximale ou à un nombre maximal de séquences identifiées. Selon une possibilité, on détermine, au cours de chaque itération, une profondeur de séquençage de l’espèce d’intérêt SOI. La profondeur de séquençage correspond à un ratio entre la longueur cumulée des séquences associées à l’espèce d’intérêt et la longueur du génome de l’espèce d’intérêt. Lorsque la profondeur de séquençage atteint une profondeur seuil, le critère d’arrêt des itérations est atteint. Les itérations sont arrêtées. Etape 130 : Caractérisation Au cours de cette étape les séquences correspondant au marqueur recherché sont identifiées et dénombrées. Détermination d u seuil du nombre de séquences S SOI et du seuil de contrôle S SPC La mise en œuvre du procédé préalablement décrit suppose une détermination préalable : du seuil du nombre de séquences , auquel le nombre de séquences de l’espèce d’intérêt est comparé lors de chaque étape 60 ; et du seuil de contrôle , auquel le nombre de séquences de contrôle est comparé lors de chaque étape 60. On a estimé les durées de séquençage nécessaires pour produire des nombres de reads correspondant à l’espèce d’intérêt respectivement égales à 1, 10, 100, 1 000 et 10 000, et cela en prenant en compte différentes concentrations de l’espèce d’intérêt dans l’échantillon. La durée de séquençage (Time to Result) est estimées selon l’expression : où : est le seuil du nombre de séquences ; est la concentration totale d’ADN dans l’échantillon : cela inclut les concentrations de l’espèce d’intérêt, de l’espèce de contrôle et de l’ADN sans intérêt (ADN humain et flore commensale) ; est une quantité de reads obtenue lors de chaque itération c’est-à-dire dans chaque fichier .fastq généré. Par exemple, = 4 000. est une durée moyenne de séquençage pour obtenir un fichier .fastq comportant une quantité de reads égale à ; est le nombre d’échantillons séquencés simultanément. correspond à une proportion d’ADN séquencée que l’on peut attribuer à l’échantillon. est différent de 1 lorsque différents échantillons sont séquencés simultanément. Dans ce cas, désigne la quantité totale d’ADN séquencée divisée par la quantité d’ADN dans l’échantillon considéré. Le tableau 1 donne la durée de séquençage (en HH :MM) qui est calculée en fonction du seuil du nombre de séquences , et de la concentration d’espèce d’intérêt SOI exprimée en fonction du seuil de décision SD. On a considéré que l’espèce de contrôle a été ajoutée selon une concentration C SPC =SD et que la somme de l’ADN humain et de la flore commensale équivalait à 100SD. La quantité d’ADN totale est alors égale à . L’échantillon est considéré comme séquencé en même temps que trois autres échantillons (N sample =4), chacun des échantillons étant séquencé avec une quantité équivalente d’ADN avec un séquenceur qui génère des fichiers de reads comportant R fastq = 4 000 reads avec une fréquence d’environ T fastq = 3 minutes. \ 1 10 100 1 000 10 000 50:33 505:03 5050:03 50500:03 505000:30 5:06 50:33 505:03 5050:03 50500:30 0:33 5:06 50:33 505:03 5050:30 0:06 0:33 5:06 50:33 505:30 0:03 0:06 0:33 5:06 51:00 10 0:03 0:03 0:06 0:36 5:33 100 0:03 0:03 0:03 0:09 1:03 1 00 0:03 0:03 0:03 0:06 0:36 10 0 0:03 0:03 0:03 0:06 0:33 Dans le tableau 1, on observe que lorsque la concentration est égale au seuil de décision , la valeur du seuil du nombre de séquences ne doit pas excéder 100 si on souhaite atteindre le seuil du nombre de séquences en 30 minutes de séquençage. En effet, plus le seuil du nombre de séquences est élevé, plus la durée d’analyse augmente. Logiquement, plus le seuil du nombre de séquences est élevé, plus la durée pour l’atteindre l’est également. Une valeur = 1 est atteinte rapidement, même pour des concentrations faibles d’espèce d’intérêt. Toutefois, le fait d’adopter une valeur trop faible de augmente le risque de faux positif et nuit à la précision de la quantification. De plus, une valeur trop faible limite la possibilité de détection d’autres espèces d’intérêt potentiellement présentes à des concentrations plus faibles. Par exemple l’utilisation d’un seuil du nombre de séquences égal à 100 permet la détection à partir d’un seul read d’une autre espèce d’intérêt SOI’ présent à une concentration 100 fois inférieure. Ainsi, un seuil du nombre de séquences élevé peut être particulièrement intéressant si un majoritaire est présent à une concentration supérieure à 100 fois le : cela permet la détection d’autres SOI minoritaires, notés SOI’, à une concentration jusqu’à 100 fois inférieure à SOI mais supérieure au seuil de décision . En se basant sur les résultats présentés dans le tableau 1 , on conclut que le seuil du nombre de séquences est de préférence compris entre 5 et 500 ou entre 50 et 500. Lorsque l’on privilégie une courte durée d’analyse, on choisit un seuil du nombre de séquences relativement faible, proche de 50, voire inférieure, sachant qu’un seuil du nombre de séquences trop faible est propice à des faux positifs. Lorsque l’on privilégie la dynamique de mesure, et la possibilité de détecter simultanément différentes espèces d’intérêt, présentes dans différentes concentrations, on choisit un seuil du nombre de séquences plus élevé, proche ou supérieure à 500, au détriment de la durée d’analyse. On a étudié l’influence du seuil de contrôle sur la mise en œuvre du procédé. En l’absence de l’espèce d’intérêt, d’importantes quantités d’ADN peuvent-être présentes dans l’échantillon. Dans un échantillon clinique, l’ADN peut avoir diverses origines, par exemple l’ADN provenant des cellules du patient et de la flore commensale. L’ADN peut aussi résulter d’une infection atypique : la concentration d’ADN génomique d’un microorganisme autre que les SOI peut donc atteindre des quantités très supérieures au seuil de décision SD. Le tableau 2 donne, pour différentes concentrations d’ADN , exprimées relativement au seuil de décision SD, la durée de séquençage permettant d’obtenir un nombre de séquences correspondant à l’espèce de contrôle supérieur au seuil de contrôle . On a supposé que la concentration d’espèce d’intérêt correspond au seuil de décision . L’objectif est de déterminer l’effet de la variation du seuil de contrôle sur la durée de séquençage d’un échantillon dans lequel le SOI n’est pas détecté. \ 5 25 125 625 3125 0:03 0:03 0:03 0:03 0:12 0:03 0:03 0:03 0:03 0:12 0:03 0:03 0:03 0:03 0:12 0:03 0:03 0:03 0:03 0:12 0:03 0:03 0:03 0:06 0:21 10 0:03 0:03 0:06 0:21 1:45 100 0:03 0:09 0:39 3:12 15:48 100 0:18 1:18 6:18 31:18 156:27 100 2:33 12:33 62:33 312:33 1562:42 On observe qu’un seuil de contrôle compris entre 5 et 3125 est atteint en moins de 30 minutes de séquençage lorsque la concentration d’ADN est équivalente à ( ). Il est donc possible de conclure pour ces échantillons en l’absence de en moins de 30 minutes de séquençage. Dans les cas où la concentration d’ADN excède , la durée de séquençage augmente significativement, il est donc nécessaire de choisir un seuil de contrôle qui ne soit pas trop élevé pour pouvoir rendre un résultat négatif pour la détection de l’espèce d’intérêt . Par exemple dans le cas d’un échantillon clinique ayant une infection atypique avec une concentration du pathogène équivalente à 1000 , un seuil de contrôle =125 ne permet pas de rendre un résultat négatif pour la détection de l’espèce d’intérêt avant au moins 6h de séquençage. Il est cependant recommandé de ne pas choisir un seuil du nombre de séquences trop faible pour permettre au séquenceur de produire suffisamment de reads pour permettre la détection des SOI et d’identifier une autre espèce, différente de l’espèce d’intérêt, mais dont il peut être intéressant de rapporter la présence à une concentration supérieure à SD. Cette situation peut survenir dans le cadre d’une infection atypique. Détermination de la concentration ajoutée d’espèce de contrôle C SPC Dans les paragraphes précédents, l’espèce de contrôle était présente selon une concentration égale au seuil de décision . L’inventeur a évalué l’effet d’une variation de la concentration ajoutée de l’espèce de contrôle. Le tableau 3 indique pour différentes concentrations de ajouté dans l’échantillon ( = 0,01 ; = et = ) la durée (HH:MM) nécessaire pour le rendu de résultat ainsi que le résultat de détection pour différentes concentrations de comprises entre 0,0001 et 10 000 . Dans la colonne «Résultats » : La présence de concentrations exprimées par rapport au seuil de décision dans les colonnes « Résultats » indique que la détection de reads du ( ) et du ( ) a permis le calcul de cette concentration. Cela correspond à l’étape 62 ou à l’étape 64 avec La mention « NEG » indique qu’aucun read n’a été associé au SOI ( ) mais que le nombre de reads associé au SPC excède le seuil de contrôle fixé à 25 ( ). Cela correspond à l’étape 64 avec . La mention « >SPC » indique qu’aucun read n’a été associé au SPC ( ) mais que le nombre de reads associé au SOI ( ) excède le seuil du nombre de séquences fixé à 100. Dans ces conditions il n’est pas possible de calculer la concentration de l’espèce d’intérêt, mais cette dernière peut être considérée comme étant supérieure à la concentration de l’espèce de contrôle . Cela correspond à l’étape 63. On a tout d’abord pris en compte une faible concentration , égale à 0,01 . Lorsque , on retrouve sensiblement les mêmes durées que dans le tableau 1. Ainsi, la quantité ajoutée de n’influe pas sur la durée pour atteindre le seuil du nombre de séquences . Cependant l’absence de reads du SPC ne permet pas le calcul de la concentration du , et la mention « > » n’est pas suffisante pour permettre la comparaison de cette concentration par rapport à SD. Lorsque la concentration , il est necessaire de sequencer plus de 12 heures pour pouvoir rendre un résultat . Dans ce contexte si la durée totale de séquençage est limitée à 12h, il n’est pas possible de rendre des résultats négatifs pour ces échantillons. 0,01SD SD 100SD TTR Résultats TTR Résultats TTR Résultats 0,0001SD 12:33 0,0001SD 0:09 NEG 0:03 NEG 0,001SD 12:33 0,001SD 0:09 NEG 0:03 NEG 0,01SD 12:33 0,01SD 0:09 0,008SD 0:03 NEG 0,1SD 5:03 >SPC 0:09 0,09SD 0:03 0,05SD SD 0:33 >SPC 0:09 SD 0:03 SD 10SD 0:06 >SPC 0:06 10SD 0:03 10SD 100SD 0:03 >SPC 0:03 100SD 0:03 100SD 1 000SD 0:03 >SPC 0:03 1 000SD 0:03 1 000SD 10 000SD 0:03 >SPC 0:03 >SPC 0:03 10 000SD Une concentration égale au seuil de décision augmente la limite de détection par rapport à une concentration . Cependant, cela permet une quantification de la concentration de l’espèce d’intérêt selon une plus grande dynamique : entre 0.01 et 1000 . On a ensuite considéré une concentration élevée, égale à 100 fois le seuil de décision . La forte quantité de permet un rendu de résultat très rapide car dans la gamme de concentrations de évaluée le résultat est rendu seulement 3 minutes après le début du séquençage. Cependant on observe une augmentation de la limite de détection d’au moins 10 fois par rapport aux essais réalisé avec une concentration =SD. Cela peut se comprendre par le faite que la forte présence de réduit d’autant le nombre de reads associés au SOI. Ainsi, la sensibilité est diminuée. L’ajout d’une grande quantité de permet également de rendre un résultat quantitatif sur une plus large gamme que pour les plus faibles concentrations. Il est donc possible de sélectionner les différents paramètres d’analyse, tels que : la concentration de l’espèce de contrôle ajoutée dans l’échantillon ; le seuil du nombre de séquences ; le seuil de contrôle du ; Le paramétrage permet d’adapter les performances du procédé précédemment décrit en termes de rapidité de séquençage, de dynamique de quantification et de la sensibilité requise. Par exemple dans le cadre d’un diagnostic clinique nécessitant une détection rapide avec une forte sensibilité de détection ainsi qu’une précision de la quantification des détectées autour du seuil de décision clinique il est avantageux d’ajouter le à une concentration proche du seuil de décision clinique (par exemple compris entre 0.1 et 10 voire entre 0.01 et 100 ) avec un seuil du nombre de séquences compris entre 5 et 500 et un seuil de contrôle compris entre 5 et 125. Exemple 1 Au cours d'un premier exemple, on a utilisé Bacillus subtilis en tant qu'espèce de contrôle pour le séquençage métagénomique d'échantillons résultant de lavages broncho-alvéolaire (BAL) pratiqués sur patients humains. On sait que ce type d'échantillon est susceptible de comporter une quantité importante d'ADN humain provenant du patient. 38 échantillons ont été séquencés. La durée maximale de séquençage était fixée à 12 heures. Chaque itération regroupait 4 000 reads. Le volume de chaque échantillon était de 600 µL. L’espèce de contrôle a été ajoutée selon une concentration de 1.7E4 CFU/mL, CFU signifiant Colony-Forming Unit (Unité formant colonies). Ce seuil est considéré comme légèrement au-dessus d’un seuil clinique séparant une présence normale de bactéries d’une présence de bactéries représentative d’une infection. Afin d'éliminer l'ADN du patient, le protocole d'analyse comporte une élimination de l'ADN du patient au cours d'une première lyse. Lors de la première lyse, l'échantillon a été traité avec un agent lysant ciblant spécifiquement les cellules du patient. Un tel agent lysant est par exemple décrit dans WO2014/114896. L'ADN libéré a ensuite été éliminé par action enzymatique et lavage. L'échantillon a ensuite fait l'objet d'une deuxième lyse, mécanique et chimique de manière à extraire l'ADN bactérien. La lyse mécanique a été effectuée à l’aide d’une agitation, de durée 20 minutes, en utilisant des billes de verre de diamètre 1 mm ainsi que des microbilles de Zr/Si de diamètre 0.1 mm. L’ADN a été extrait du lysat en utilisant la plateforme easyMAG (Biomérieux). Le volume résultant de l’élution était de 25 µL. Les extraits d’ADN ont été stockés à -20 °C. La préparation des librairies de séquençage et le barcoding des fragments d’ADN ont été effectués en utilisant le kit « Rapid PCR Barcoding kit » (Oxford Nanopore Technologies). 4 échantillons ont été traités en parallèle. Le séquençage a été effectué avec le séquenceur MinION (Oxford Nanopore Technologies), relié à un ordinateur MinIT (Oxford Nanopore Technologies). Les données de séquençage ont été traitées par le logiciel WIMP (What is in my Pot ?) de la suite EPI2ME (Oxford Nanopore Technologies). Ce logiciel permet une séparation des séquences de chaque échantillon à l’aide des barcodes (codage à barre par marqueur moléculaire, chaque échantillon étant assigné d’un label permettant de l’identifier), une identification des espèces bactériennes ou virales ou fongiques correspondant à chaque séquence lue « read », ainsi qu’un comptage du nombre de read associé à chacune des espèces identifiées . Les étapes 40 à 70 ont été réitérées par séries de 4 000 reads. Les seuils de détection respectivement associés à l’espèce d’intérêt et à l’espèce de contrôle étaient de 100 reads et de 25 reads. On a pris en compte 20 espèces d’intérêt différentes : Escherichia coli , Klebsiella oxytoca , Klebsiella pneumoniae , Klebsiella aerogenes , Enterobacter cloacae , Serratia marcescens , Proteus mirabilis , Proteus vulgaris , Hafnia alvei , Citrobacter freundii , Citrobacter koseri , Morganella morganii , Providencia stuartii , Pseudomonas aeruginosa , Stenotrophomonas maltophilia , Acinetobacter baumannii , Legionella pneumophila , Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus et Streptococcus pneumoniae . Lorsque les concentrations de chaque espèce d’intérêt ont été quantifiées, les concentrations ont été comparées à un seuil métagénomique de 5.53 GEq/mL. Il s’agit d’un seuil de décision, permettant de conclure à la présence pathologique d’une espèce d’intérêt dans un échantillon résultant de BAL. Les 38 échantillons ont été analysés. Lorsqu’au moins une espèce d’intérêt était détectée, la durée médiane de séquençage était 28,5 minutes par échantillon. Cela correspond à la durée de séquençage nécessaire à l’obtention de la condition pour au moins une des espèces d’intérêt. En l’absence de détection d’au moins une des espèces d’intérêt, ( et ), la durée médiane de séquençage était de 2 heures et 13 minutes. La condition permet de s’assurer que le séquençage s’est convenablement effectué. Cela permet de s’assurer qu’un échantillon négatif soit bien un vrai négatif. On a comparé les résultats du séquençage selon le procédé précédemment décrit avec un séquençage de même type, effectué durant une durée fixe de 12 heures. Le tableau 4 résume les principaux résultats obtenus. Les performances de chaque méthode ont été comparées en analysant chaque échantillon par la méthode de référence : la culture microbienne. Séquençage 12 heures Invention Vrais positifs 19 19 Faux positifs 48 38 Faux négatifs 4 4 Vrais négatifs 689 699 Sensibilité 82,6 % 82,6 % Spécificité 93,5 % 94,8 % Valeur prédictive positive 28,4 % 33,3 % Valeur prédictive négative 99,4 % 99,4 % Tableau 4. Les sensibilité, spécificité, valeur prédictive positive (usuellement désignée PPV : Positive Predictive Value), valeur prédictive négative (usuellement désignée NPV : Negative Predictive Value) résultent du nombre des quantités de vrais positifs, faux positifs, vrais négatifs, faux négatifs. On observe que le procédé a des performances équivalentes, voir meilleures que celles obtenues avec un séquençage de 12h. Il a permis la détection de l’ensemble des infections avec un gain de temps médian supérieur à 11 heures et 30 minutes. De plus en l’absence d’infection par la totalité des espèces d’intérêt, la détection du SPC permet de confirmer le bon fonctionnement du procédé en une durée médiane de 2 heures et 13 minutes et de produire un résultat de détection négative. On observe 4 faux négatifs, cependant ces échecs de détection ne sont pas à attribuer au procédé décrit. 2 des 4 faux négatifs n’ont pas été détectés par PCR, il semble donc qu’il s’agisse de faux positifs de culture ou d’erreur d’identification de l’espèces par la méthode de référence. Les 2 autres faux négatifs correspondent à l’espèce S. marcescens qui ont produit un nombre de read inférieure à 100 et qui ont été quantifiés à des concentrations inférieures au seuil de décision clinique. Ces 2 discordance entre le procédé et la méthode de référence ont été confirmées par la PCR. L’augmentation de la durée de séquençage à 12 heures ne permet pas d’améliorer la détection de ces 2 infections par S. marcescens et laisse supposer à une erreur induite par le logiciel WIMP utilisé pour l’assignation des séquences On observe que le procédé permet une amélioration des performances du test, en abaissant le nombre de faux positifs, ce qui améliore la spécificité et la valeur prédictive positive. Cela est dû à l’arrêt opportun du séquençage lorsqu’on dispose de suffisamment d’informations pertinentes, c’est-à-dire au moment où ou lorsque . Dès qu’un de ces seuils est franchi, les itérations cessent et une quantification de la concentration (ou de la concentration minimale) de l’espèce d’intérêt peut être effectuée. On observe qu’il n’est pas utile, ni même souhaitable, de poursuivre les itérations jusqu’au nombre d’itérations maximal initialement fixé, qui correspondait à une durée totale de 12 heures. En effet, l’obtention d’un trop grand nombre de séquences de l’espèce d’intérêt peut induire des faux positifs. Exemple 2 Dans un deuxième exemple, on a utilisé le même protocole que décrit en lien avec le premier mode de réalisation. On a analysé 11 échantillons de BAL, préparés comme précédemment décrit. Les 11 échantillons avaient été préalablement analysés par culture bactérienne et s’étaient avérés positifs à au moins une espèce d’intérêt, avec une concentration supérieure à 1 E 4 CFU/mL. Les 11 échantillons ont été analysés de façon à identifier au moins une des 20 espèces d’intérêt précédemment listées. On a mis en œuvre les étapes itératives 40 à 80. Sur les 11 échantillons, 6 ont été considérés comme positifs pour au moins une espèce d’intérêt en moins de 30 minutes de séquençage. Cependant, une quantité de 100 séquences pour chaque espèce d’intérêt détectée est trop faible pour parvenir à une caractérisation fine de leur génome. Les étapes itératives 100 à 120 ont été mises en œuvre sur les échantillons, de façon à identifier la présence d’éventuels marqueurs d’antibiorésistance dans le génome. Les étapes itératives 100 à 120 ont été effectuées jusqu’à obtenir une durée totale de séquençage de 12 heures. Sur le tableau 5 : la première colonne (ref) correspond à la référence de chaque échantillon ; la deuxième colonne (SOI) correspond à chaque espèce d’intérêt détectée ; la troisième colonne (méthode) correspond à la méthode de détection : culture ou mise en œuvre de l’invention ; la quatrième colonne (C SOI ) correspond à la concentration mesurée ou estimée de chaque espèce bactérienne détectée, la cinquième colonne (prof.) correspond à la profondeur de séquençage, telle que précédemment décrite. la sixième colonne (TTR ID) correspond à la durée, selon le format « heure :minute » des étapes 40 à 80, pour la confirmation de la présence de l’espèce d’intérêt dans l’échantillon. On observe que la durée est comprise entre 3 minutes (échantillon C1-026) et 8 heures 37 (échantillon C1-060). 6 échantillons ont été considérés positifs en moins de 30 minutes. les colonnes suivantes correspondent à la présence d’un marqueur d’antibiorésistance à l’égard de 21 agents antibiotiques. La lettre R indique une résistance observée à l’antibiotique par la culture ou prédite par la présence d’un marqueur tandis que la lettre S indique une sensibilité observée par la culture. Il n’est pas possible de se prononcer sur la sensibilité à un antibiotique en se basant sur l’absence de marqueurs de résistance à celui-ci. C’est la raison pour laquelle il n’y a pas de lettre S dans les lignes correspondant à la mise en œuvre de l’invention. Une lettre R grisée indique la présence d’un marqueur d’antibiorésistance révélée par le séquençage, mais non confirmée par la culture bactérienne (lettre S grisée) : il s’agit donc d’un faux positif résultant du séquençage. Une lettre R blanche sur fond noir indique une présence d’un marqueur d’antibiorésistance révélée par la culture bactérienne, mais non détectée par le séquençage : il s’agit d’un faux négatif résultant du séquençage. On dénombre 9 faux négatifs. Sur les 9 faux négatifs (lettre R blanche sur fond noir), 8 résultent d’échantillons pour lesquels la profondeur de séquençage est faible, c’est-à-dire inférieure à 30. Il est donc probable que le taux de faux négatifs puisse être réduit en poursuivant le séquençage jusqu’à l’atteinte d’un seuil de profondeur de séquençage, ce dernier pouvant être égal à 30 dans cet exemple. On comprend qu’un avantage notable de l’invention réside dans la possibilité d’obtenir, au fur à mesure des itérations, une information de plus en plus précise quant à la constitution de l’échantillon. Lorsqu’il s’agit de déterminer la présence d’espèces d’intérêt, l’invention permet d’optimiser la durée d’analyse, en stoppant les itérations dès qu’une espèce biologique d’intérêt est détectée de façon suffisamment fiable. La durée d’analyse ainsi est raccourcie, sans perte de sensibilité. Comme montré dans l’exemple 2, suite à une détection d’une espèce d’intérêt, des itérations complémentaires peuvent être effectuées, de façon à obtenir une information plus précise quant au génome de chaque espèce d’intérêt détectée. Bien que décrite avec un séquençage effectué à l’aide d’un séquenceur MinION (Oxford Nanopore Technologies), l’invention peut être mise en œuvre à l’aide d’autres types de séquenceurs permettant la lecture et l’analyse temps réel des fragments d’ADN présent dans une libraire de séquençage ou directement dans l’échantillon. Il a été décrit un procédé dont les étapes suivant le séquençage sont mises en œuvre par une unité de traitement connectée au séquenceur, notamment une unité à base de processeur(s) ou microprocesseur(s) et de mémoire informatique mémorisant sous forme d’instructions exécutables par ordinateur l’ensemble des étapes 40 à 130 et configurée pour mémoriser les résultats du procédé et les valeurs, paramètres et résultats intermédiaires. Cette unité est avantageusement connectée à un écran pour l’affichage des résultats du procédé selon l’invention à l’attention de l’utilisateur, cet écran pouvant être constitué d’un écran d’un appareil mobile (e.g. smartphone) connectée à l’unité de traitement pour recevoir et afficher les résultats. Ces étapes peuvent être mises de manière déportée, par exemple sur un serveur distant connecté aux séquenceurs, soit directement, soit au travers d’un système informatique de laboratoire. Ces étapes peuvent également être mises en œuvre sur un appareil mobile (e.g. smartphone, tablette) connecté au séquenceur, par exemple un MinION, l’ensemble constitué du MinION et de l’appareil mobile étant aisément transportable. Ces étapes peuvent également être mises en œuvre par différentes unités de traitement. Par exemple une unité, connectée au séquenceur, met en œuvre les étapes de bioinformatiques (lectures des signaux, traduction en bases nucléotidiques, assemblages, contrôle qualité…) et une autre unité de traitement, connectée à la première, met en œuvre le reste du procédé. Procédé de détection d'une espèce biologique d'intérêt (SOI) potentiellement présente dans un échantillon d'analyse, l'espèce biologique d'intérêt présentant un génome connu ou partiellement connu, l'échantillon comportant un mélange de différentes espèces biologiques, le procédé comportant les étapes : a) ajout d’une espèce de contrôle (SPC) dans l’échantillon, l’espèce de contrôle présentant un génome connu, l’espèce de contrôle étant ajoutée selon une concentration (C SPC ) connue dans l’échantillon ; b) extraction des acides nucléiques de l’échantillon ; c) séquençage d’une partie des séquences d’acides nucléiques extraites lors de l’étape b) à l’aide d’un séquenceur à temps réel durant une durée prédéterminée ou jusqu’à l’obtention d’un nombre de séquençages prédéterminé ; d) suite à l’étape c), assignation de séquences ( ) résultant de l’étape c) à l’espèce d’intérêt ainsi qu’à l’espèce de contrôle ; e) mise à jour des quantités de séquences ( ) respectivement associées à l’espèce d’intérêt et à l’espèce de contrôle, de telle sorte que les quantités de séquences associées à l’espèce de contrôle et à l’espèce d’intérêt sont : lors d’une première itération de l’étape e), les quantités de séquences assignées à l’espèce de contrôle et à l’espèce d’intérêt lors de l’étape d) ajoutées à des quantités de séquences initiales ( ) ; lors de chaque réitération de l’étape e), les quantités de séquences ( ) assignées à l’espèce de contrôle et à l’espèce d’intérêt lors de l’étape d) ajoutées aux quantités de séquence ( ) associées à l’espèce de contrôle et à l’espèce d’intérêt résultant de l’itération précédente ; f)comparaison de la quantité de séquence associées à l’espèce d’intérêt ( ) mise à jour dans l’étape e) avec un seuil du nombre de séquences ( ) et/ou comparaison de la quantité de séquence associées à l’espèce de contrôle ( ) mise à jour dans l’étape e) avec un seuil de contrôle ( ) ; g) en fonction d’au moins une comparaison effectuée lors de l’étape f), détection de la présence de l’espèce biologique d’intérêt dans l’échantillon ou passage à l’étape h) ; h) réitération des étapes c) à g) jusqu’à l’atteinte d’un critère d’arrêt d’itérations. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l’étape d) de chaque itération est effectuée durant une durée prédéterminée ou jusqu’au séquençage d’un nombre prédéterminé de séquences. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel : lors de l’étape f) d’une itération, lorsque la quantité de séquences associées à l’espèce d’intérêt (N SOI ) est supérieure au seuil du nombre de séquences ( ) ; lors de l’étape e) de l’itération, lorsque la quantité de séquences associées à l’espèce de contrôle (N SPC ) est strictement supérieure à zéro ; l’étape g) comporte une estimation d’une concentration de l’espèce d’intérêt (C SOI ) en fonction : de la quantité de séquences associées à l’espèce d’intérêt ( ) lors de la dernière mise à jour; de la quantité de séquences associées à l’espèce de contrôle ( ) lors de la dernière mise à jour ; de la concentration ajoutée de l’espèce de contrôle (C SPC ). Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel : lors de l’étape f) d’une itération, lorsque la quantité de séquences associées à l’espèce d’intérêt ( ) est supérieure au seuil du nombre de séquences ( ); lors de l’étape e) de l’itération, lorsque la quantité de séquences associées à l’espèce de contrôle ( ) est nulle ; au cours de l’étape g), la concentration de l’espèce d’intérêt ( ) est considérée comme supérieure à la concentration de l’espèce de contrôle ( ). Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel : lors de l’étape f) d’une itération, lorsque la quantité de séquences associées à l’espèce d’intérêt ( ) est inférieure au seuil du nombre de séquences ( ); lors de l’étape f) de l’itération, lorsque la quantité de séquences associées à l’espèce de contrôle ( ) est supérieure au seuil de contrôle ( ); au cours de l’étape g), si la quantité de séquences associées à l’espèce d’intérêt ( ) est nulle, la concentration de l’espèce d’intérêt est considérée comme nulle. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel : lors de l’étape f) d’une itération, lorsque la quantité de séquences associées à l’espèce d’intérêt ( ) est inférieure au seuil du nombre de séquences ( ); lors de l’étape f) de l’itération, lorsque la quantité de séquences associées à l’espèce de contrôle ( ) est supérieure au seuil de contrôle ( ); au cours de l’étape g), si la quantité de séquences associées à l’espèce d’intérêt ( ) est non nulle, l’étape g) comporte une estimation d’une concentration de l’espèce d’intérêt (C SOI ) en fonction : de la quantité de séquences associées à l’espèce d’intérêt ( ); de la quantité de séquences associées à l’espèce de contrôle ( ) ; de la concentration ajoutée de l’espèce de contrôle (C SPC ). Procédé selon la revendication 3 ou la revendication 6, dans lequel la concentration de l’espèce d’intérêt est estimée à partir d’un ratio : où : et sont respectivement les longueurs de génome de l’espèce de contrôle et de l’espèce d’intérêt ; et sont respectivement les quantités de séquences respectivement associées à l’espèce d’intérêt et à l’espèce de contrôle résultant la dernière mise à jour; est la concentration de l’espèce de contrôle ajoutée dans l’échantillon. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel suite à l’atteinte du critère d’arrêt des itérations, si la quantité de séquences associées à l’espèce d’intérêt ( ) est inférieure au seuil du nombre de séquences ( ) ; et si la quantité de séquences associées à l’espèce de contrôle ( ) est inférieure au seuil de contrôle ( ) ; le procédé génère une information selon laquelle ni la présence ni l’absence de l’espèce d’intérêt ne peuvent être confirmées. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, comportant une prise en compte d’un seuil de décision ( ) , le procédé visant à comparer une concentration de l’espèce d’intérêt au seuil de décision le procédé étant tel que lors de l’étape a), la concentration de l’espèce de contrôle, est comprise entre 0.01 fois et 100 fois le seuil de décision. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel dans l’étape h), le critère d’arrêt des itérations est atteint lorsque : la quantité de séquences ( ) associées à l’espèce d’intérêt dépasse le seuil du nombre de séquences ( ); et/ou la quantité de séquences ( ) associées à l’espèce de contrôle dépasse le seuil de contrôle ( ); et/ou la durée cumulée des étapes c) atteint une durée maximale prédéterminée ; et/ou le nombre de séquençages cumulés lors des étapes c) atteint un nombre maximal prédéterminé ; et/ou le nombre d’itérations atteint un nombre maximal d’itérations prédéterminé. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes dans lequel, suite à une détection d’une présence de l’espèce d’intérêt dans l’échantillon, le procédé comporte les étapes : i)séquençage d’une partie des séquences de nucléotides extraites lors de l’étape b) à l’aide du séquenceur temps réel durant une durée prédéterminée ou jusqu’à l’obtention d’un nombre de séquençages prédéterminé ; j) suite à l’étape i), assignation de séquences résultant de l’étape i) à l’espèce d’intérêt détectée; k) mise à jour des quantités de séquences associées à l’espèce d’intérêt ), de telle sorte que les quantités de séquences associées à l’espèce d’intérêt sont : lors d’une première itération de l’étape k), la quantité de séquences assignées à l’espèce d’intérêt détectée lors de l’étape j) ajoutées à la quantité de séquences ( ) résultant de la dernière itération des étapes c) à g) ; lors de chaque réitération de l’étape k), la quantité de séquences assignées à l’espèce d’intérêt lors de l’étape j) ajoutées à la quantité de séquences résultant de l’itération précédente de l’étape k) ; l) réitération des étapes i) à k) jusqu’à l’atteinte d’un critère d’arrêt d’itérations. Procédé selon la revendication 11, dans lequel les étapes i) à k) sont réitérées jusqu’à l’atteinte d’un nombre d’itérations prédéterminé. Procédé selon la revendication 12, dans lequel : au cours de chaque itération des étapes i) à k), suite à l’étape k), le procédé comporte une détermination d’une profondeur de séquençage de l’espèce biologique d’intérêt, la profondeur de séquençage correspondant à un ratio entre la longueur cumulée des séquences associées à l’espèce et la longueur du génome de l’espèce ; les étapes i) à k) sont réitérées jusqu’à l’atteinte d’une profondeur de séquençage prédéterminée. Procédé selon l’une quelconque des revendications 11 à 13 comportant, suite à l’arrêt des itérations des étapes i) à k), une détection d’une séquence type du génome de l’espèce d’intérêt, la séquence type comportant un marqueur d’antibiorésistance ou un marqueur de virulence de l’espèce d’intérêt. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le séquenceur est configurer pour effectuer des séquençages successifs de différentes séquences d’acides nucléiques, les unes après les autres, le séquençage de chaque séquence étant considéré comme effectué en temps réel. Dispositif (1) d’analyse métagénomique d’un échantillon, comportant : une chambre fluidique (2), destinée à recevoir l’échantillon ; un séquenceur (3) configuré pour effectuer un séquençage temps réel de l’échantillon ; une unité de traitement (4), comportant un module de bio-informatique (4.1), programmé pour assigner des séquences résultant du séquenceur à une espèce, et un module de pilotage (4.2), programmé pour mettre en œuvre les étapes c) à h) d’un procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes. Support d’enregistrement, lisible par ordinateur ou téléchargeable, comportant des instructions pour la mise en œuvre des étapes c) à h) d’un procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 15.