Brevet FR3127502A1 — publié le 20230331

La présente invention concerne un nouveau procédé de préparation de spores de Hansfordia pulvinata (H. pulvinata), permettant d’obtenir un support de culture de ces spores qui peut être stocké, transporté et utilisé pour la préparation d’une suspension desdites spores, suspension qui peut être appliquée sur une culture agricole afin de la protéger contre des champignons parasites, en particulier contre Passolora fulva PROCEDE DE PREPARATION DE SUSPENSION DE SPORE DE H. PULVINATA La présente invention concerne un nouveau procédé de préparation de spores de Hansfordia pulvinata (H. pulvinata), permettant d’obtenir un support de culture de ces spores qui peut être stocké, transporté et utilisé pour la préparation d’une suspension desdites spores, suspension qui peut être appliquée sur une culture agricole afin de la protéger contre des champignons parasites, en particulier contre Passolora fulva . Passalora fulva , anciennement Fulvia fulva (P. fulva) ou Cladosporium fulvum , est un champignon parasite foliaire de la tomate responsable de la cladosporiose. Il est fréquemment rencontré sur des cultures de tomates sous serres à l’échelle mondiale. Lorsque les cultures sont fortement atteintes cela va affecter le rendement et engendrer d’importantes pertes économiques. De plus, de l’asthme allergique a été rapporté par des ouvriers travaillant dans des serres fortement contaminées avec une teneur élevée de spores dans l’air ambiant. Depuis les années 1970 de nombreuses variétés résistantes à la cladosporiose ont été commercialisées. Cependant, depuis la fin des années 90 et début des années 2000 des phénomènes de contournement des gènes de résistances ont été observés sur l’ensemble des zones de production de tomates sous abris. Le champignon parasite se développe dans les parenchymes foliaires, on observe des tâches chlorotiques diffuses de couleur vert clair à jaune pâle sur la face supérieure des feuilles et un mycélium brun-olive qui sporule à la face inférieure des feuilles. L’invasion commence généralement par les feuilles du bas avant de gagner la partie haute des plantes. La phase d’incubation est de 10 à 15 jours. P. fulva est ensuite disséminée dans les abris de plante à plante via les conidies (spores) véhiculées par les courants d’air, les vêtements de travail, les insectes, les gouttelettes d’eau etc… Le pathogène peut survivre en tant que saprophyte sur les débris de culture, les outils et les parois des abris. Ainsi, P. fulva est capable de contaminer une nouvelle culture si la désinfection des abris et des outils n’est pas réalisée correctement. P. fulva secrète des facteurs de virulences sous forme de petites protéines riches en cystéine, appelés effecteurs, au sein de l’apoplaste des cellules végétales lors de l’infection. Ces protéines interfèrent avec le système de défense des plantes, sont reconnues par les produits des gènes de résistance Cf (dominants) et induisent une réaction d’hypersensibilité (HR). Divers gènes de résistance ont été introgressés progressivement dans de nombreuses variétés cultivées à partir des années 1970 et confèrent des niveaux de résistance variables face aux différentes races de P. fulva . L’usage intensif de ces variétés résistantes a généré une pression de sélection importante sur P. fulva au point de faire émerger de nouvelles souches capables de contourner l’ensemble des gènes de résistance introduits dans les variétés commerciales actuelles. En plus du contournement des résistances, des phénomènes de tolérance / résistance aux fongicides sont également décrits chez P. fulva ce qui complexifie d’autant plus la lutte contre ce pathogène. En 1978 une étude a mis en évidence la présence d’un champignon hyperparasite de P. fulva dans des serres maraichères du nord Finistère. Cet hyperparasite, appartenant à la famille des Deutéromycètes ou Fungi imperfecti , a été identifié comme étant Hansfordia pulvinata , espèce décrite pour la première fois dans la littérature dans les années 1950 et signalé en Italie sous le nom de Botrytis yuae. Le potentiel de H. pulvinata en tant qu’agent de lutte biologique contre la cladosporiose est mise en avant à de nombreuses reprises au fil des dernières décennies. Cependant, malgré ces perspectives encourageantes aucun développement d’un produit de biocontrôle à partir de H. pulvinata n’a vu le jour. En effet, les spores (ou conidies) de ce champignon se conservent très mal dans l’eau et l’inoculation des spores doit se faire extemporanément, c’est-à-dire immédiatement après la préparation d’une suspension de spores à la concentration voulue pour une application sur une culture. Le transport sur une longue distance d’une suspension de spores de H. pulvinata n’est donc pas possible compte tenu du risque important de mortalité de celles-ci et d’une inefficacité du traitement par la suite. Il existe donc un besoin en un procédé de production de spores de H. pulvinata qui permette d’une part d’optimiser la production de spores en quantité suffisante et de permettre leur transport en garantissant leur viabilité et leur efficacité lorsqu’une suspension est prépararée et appliquée sur une culture à traiter. L’applicateur n’aurait ensuite plus qu’à préparer une suspension à une concentration de spores donnée et appliquer extemporanément cette suspension de spores sur les plants à traiter. A l’heure actuelle, la seule étude de mise au point d’un milieu de culture adapté à la production de grandes quantités de conidies (spores) de H. pulvinata est décrite par équipe brésilienne datant de 2009 (Melo et Mello 2009, Melo, Débora Ferreira, et Sueli Corrêa Marques de Mello. 2009. « Ideal culture conditions for Dicyma pulvinata conidia mass production ». Pesquisa Agropecuária Brasileira 44 (10): 1232‑38). Y sont décrit différents supports de culture à base de riz, maïs et de blé cuit, inoculés avec H. pulvinata dans plusieurs types de contenants tel que des bacs en aluminium, des sacs en polypropylène et des erlenmeyers. Plusieurs conditions d’incubation du champignon ont été testées en parallèle avec les différents supports et contenants : lumière continue, obscurité, alternance lumière/obscurité, gamme de température allant de 19 à 31°C. L’étude montre que le meilleur support semble être le riz cuit, placé dans des sacs de polypropylène et placé dans une chambre de culture réglée entre 19 et 25°C avec un éclairage permanent pour favoriser la sporulation. L’objectif de cette équipe est de produire d’importantes quantités de conidies (spores) afin de les utiliser comme agent de biocontrôle contre le champignon pathogène Microcyclus ulei, aussi connu sous le nom de Fusicladium macrosporum, responsable de la maladie Sud-américaine des feuilles de l'hévéa (arbre à caoutchouc). Une autre étude de 2015 confirme que la condition d’incubation optimale pour la production de conidies est une température constante de 21°C combinée à une photopériode de 12h (J. M. S. Vivas, Vivas, et Silveira 2015. Vivas, Janieli Maganha Silva, Marcelo Vivas, et Silvaldo Felipe da Silveira. 2015. « Effect of temperature on in vitro growth and sporulation of hyperparasites fungi of Asperisporium caricae ». Pesquisa Agropecuária Tropical 45 (1): 73‑81). L’invention vise ainsi la mise au point d’un support de culture adapté à la production de conidies (spores) de H. pulvinata à destination d’un usage professionnel à grande échelle pour couvrir des milliers de m² de serres de production de tomates. La technique proposée par les inventeurs est adaptée à la production d’un support de culture propice au développement et à la sporulation de H. pulvinata , permettant une récolte simplifiée des spores (ou conidies) et la préparation d’un inoculum à usage extemporané par pulvérisation sur les plants infectés par P. fulva . Ainsi selon un premier mode de réalisation, l’invention vise : Un procédé de préparation d’un support de culture de spores de H. pulvinata comprenant les étapes suivantes : Fournir des graines de millet cuites, Remplir un récipient équipé d’un dispositif permettant les échanges gazeux, avec les graines de millet cuites, Fermer et stériliser le récipient ainsi rempli, Inoculer le récipient stérile rempli de graines de millet cuites avec une suspension de H. pulvinata contenant un mélange de spores et de mycélium de H. pulvinata, Incubation du récipient inoculé à une température, des conditions d’éclairage et durant un temps suffisant pour permettre la colonisation homogène des graines par H. pulvinata et l’apparition d’un duvet gris à la surface de l’ensemble des graines comprenant des spores de H. pulvinata. Par l’expression « récipient », en entend ici un emballage refermable, de préférence souple, tel qu’un sac, sachet, poche ou encore un bidon. De préférence, le récipient est un sac en matière plastique souple, de type polymère thermoplastique, par exemple en polypropylène, ou polyéthylène, en particulier polypropylène. Le volume du récipient n’est pas critique et il pourra être choisi selon la destination choisie afin de faciliter le transport, le stockage et la mise en œuvre ultérieure. Typiquement le récipient pourra présenter un volume compris en 0.2 litre et 20 litres, par exemple, plus particulièrement entre 0.2 litre et 10 litres, plus particulièrement encore entre 0.2 litre et 5 litres, voire encore entre 0.2 litre et 2 litres, et plus particulièrement environ 1 litre. Avantageusement, les récipients sont remplis aux environs des 2/3 pour être correctement scellés/férmés et remués, ainsi que pour la respiration du futur mycélium. Par l’expression « dispositif permettant les échanges gazeux », on entend ici un dispositif qui permet aux gaz de sortir et/ou d’entrer hors et dans le récipient afin de permettre la bonne croissance de H. pulvinata. Typiquement, un tel dispositif peut être un filtre dont la taille est de 0.5 µm qui permet un échange gazeux plus important, mais augmente aussi le risque potentiel de contamination, leurs pores étant relativement larges. Plus avantageux sont les filtres de 0.2 µm qui sont bien adaptés à la culture de mycélium. Des filtres à glissière présentent l’avantage de permettre un meilleur échange de gaz et sont encore plus adaptés. A titre d’exemple, comme récipient adapté à la culture de mycélium selon l’invention on peut citer des sacs en polyéthylène munis de filtre de taille de pore de 0.2 µm, en particulier des filtres à glissière de taille de pore de 0.2 µm. De tels types de sacs sont disponibles auprès de la société UNICORNBAGS (Texas, USA). Les inventeurs ont choisi et sélectionné les graines de millet comme support de culture particulière adapté à l’objectif. Par l’expression « graines de millet cuites », on entend des graines de millets qui ont subit un traitement thermique en milieu aqueux, eau ou vapeur, de manière conventionnelle, de manière à les rendre digestibles, en particulier pour réaliser une hydratation de l’amidon contenu, un ramollissement de l’enveloppe du grain et permettre au mycélium de se développer. Le millet, ou Panicum miliaceum , de noms communs , « millet commun », « millet blanc » ou « millet à grappes » est une plante de 1,3 m environ, à inflorescences en panicules lâches, ramifiées et tombantes. Cette céréale est cultivée dans des régions tempérées, en Europe de l’est, aux USA, en Argentine et Australie. Panicum miliaceum, le millet commun, est une espèce de plantes monocotylédones de la famille des Poaceae, sous-famille des Panicoideae, originaire de l'Asie tempérée. Cette plante annuelle herbacée, cultivée pour ses graines comestibles, est une céréale secondaire, bien adaptée aux zones semi-arides, qui constitue encore une culture vivrière dans certaines régions d'Asie. Le millet commun est le vrai millet (milium) des Romains. Cultivé dès les temps préhistoriques, et probablement avant la culture du froment en Europe. Le millet commun est une plante herbacée annuelle de 30 cm à 1 m de haut environ, mais peut dépasser 1,5 m4. Les tiges sont rudes, ligneuses et velues. C'est une plante à photosynthèse de type C4, tout comme le maïs. L'inflorescence composée est une panicule assez dense, très ramifiée, retombante à maturité. Selon la variété, la panicule peut être penchée (fermée, en balais) ou dressée (largement ouverte). Le fruit est un caryopse ovoïde de 3 mm de long sur 2 de large, enveloppée de deux glumelles robustes, la lemme (glumelle inférieure) et la paléole (glumelle supérieure). La graine enveloppée est de couleur très variée, de très clair à très sombre : blanc, crème, jaune, rouge orange, brun olive, gris, noir brunâtre ; nue elle est blanc crème. Il faut 175 graines en moyenne pour faire un gramme. Le millet commun comprend les sous-espèce Panicum miliaceum subsp. agricola H. Scholz & Mikoláš, Panicum miliaceum subsp. Miliaceum, Panicum miliaceum subsp. ruderale (Kitagawa) Tzvelev, Panicum miliaceum var. badium Körn, Panicum miliaceum 'Album' ainsi que Panicum miliaceum 'Violaceum'. Ainsi, par l’expression « graines de millet » au sens de la présente invention, on entend des graines de millet commun, P. miliaceum ainsi que ses sous-espèces. Les graines de millet sont ainsi cuites de manière conventionnelle dans l’eau chaude ou à la vapeur jusqu’à obtenir des graines ramollies et gonflées. Les graines peuvent être étalées, par exemple sur des tablettes de séchage, ou mises à égoutter afin d’éliminer l’excès d’eau. Cette étape de séchage ou égouttage peut durer quelques heures à température ambiante ou sous réfrigération et permet l’élimination de l’eau de cuisson ; typiquement pendant 12 à 24h à température ambiante par exemple, à savoir de l’ordre de 20°C environ. Les inventeurs ont en effet noté que l’utilisation de graines de millet, par rapport à d’autres support de culture que peuvent être le riz, le blé ou le seigle par exemple, donnait un résultat particulièrement avantageux et aussi surprenant sur la production et surtout sur la récupération de spores actives après élimination du support constitué par ladite graine de millet. Les inventeurs ne s’expliquent pas ce phénomène et, sans être liés par la théorie, supposent que la taille et la géométrie sphérique du grain de millet permet le développement harmonieux du mycélium et des spores ainsi que leur récupération par séparation solide/liquide. Le récipient est ensuite rempli avec les graines de millet cuites, typiquement à moitié ou au 2/3 de son volume. Le récipient est fermé hermétiquement, par exemple par un bouchon s’il s’agit d’un bidon ou flacon, et préférentiellement par thermoscellage s’il s’agit d’un sac, en particulier d’un sac en polypropylène. Le récipient rempli des graines de millet cuites et fermé hermétiquement peut ensuite être stérilisé. L’étape de stérilisation peut être réalisée par toute technique adaptée au matériau du récipient de manière à assurer la stérilisation du contenu. Par exemple, il pourra s’agir d’une stérilisation dans un autoclave à 120°C pendant 15 min à 1 heure selon la taille du contenant. L’autoclavage pourra être réalisé deux fois afin d’assurer une stérilisation complète des graines de millet. L’étape d’ensemencement/inoculation du récipient contenant les graines de millet cuite par H. pulvinata est réalisée ensuite avec une suspension comprenant mycelium et spores. H. pulvinata est cultivé soit sur milieu solide (tel que par exemple PDA, potato dextrose agar), soit dans un milieu de culture liquide agité à base d’extrait de pomme de terre par exemple. Une suspension contenant un mélange de spores et de mycélium de H. pulvinata est préparée à partir d’une culture fraîche (moins de 10 jours) provenant soit d’un milieu de culture solide ou liquide agité. Cette suspension de H. pulvinata est utilisée pour inoculer les récipients contenant les grains de millet cuites et stérilisés. De manière avantageuse H. pulvinata est la souche HP1-OBS-2021 déposée auprès du NCIMB (Aberdeen, Ecosse) sous le Numéro NCIMB 43776 le 26 mai 2021. Cette souche s’est avérée particulièrement avantageuse tant sur le point de vue de la productivité de spores mais aussi quant à l’activité des spores ainsi produites vis-à-vis de la protection d’une culture agricole contre des champignons parasites, en particulier contre Passolora fulva . Après inoculation les récipients peuvent être incubés dans une chambre de culture à une température comprise entre 18 et 30°C, en particulier entre 20 et 25°C, plus particulièrement aux environs de 22°C. La photopériode de la culture correspond avantageusement à une photopériode naturelle, durant environ 7 à 21 jours, en particulier entre 10 et 15 jours, afin d’obtenir une colonisation homogène des graines par le mycélium blanc de H. pulvinata et un développement de spores qui s’observe par l’apparition d’un duvet gris clair à la surface de l’ensemble des graines. Les récipients contenant des graines recouvertes par les spores de H. pulvinata peuvent ensuite se conserver durant plusieurs jours et être transportés sur les lieux de traitement pour servir à la préparation de suspension de spores destinées à être appliquées sur les cultures à traiter. C’est ainsi qu’il s’agit d’un autre objet de l’invention que de fournir un procédé de préparation de suspension de spores de H. pulvinata comprenant les étapes suivantes : Mélanger le support de culture obtenu précédemment et comprenant les graines de millet comprenant un duvet gris à leur surface comprenant des spores de H. pulvinata, avec une phase aqueuse dans un récipient fermé, Agiter le mélange, Réaliser une séparation liquide/solide à l’aide d’un dispositif adapté permettant le passage des spores la phase liquide et la rétention des graines de millet dans la phase solide Récupérer la phase liquide contenant les spores de H. pulvinata. Le ratio v/v de support de culture (ie les graines de millet revetues de sprores) / phase aqueuse dans le mélange à agiter pourra être compris entre ½ et 1/10 voire entre ½ et 1/3. Ce ratio sera dépendant de la concentration en spores souhaitée dans la phase liquide obtenue. Cette concentration sera avantageusement comprise en 10 3 et 10 7 , en particulier entre 10 4 et 10 6 , voire encore entre 10 5 et 10 6 spores/ml. La phase aqueuse pourra être de l’eau, en particulier de l’eau déminéralisée, ou toute phase aqueuse adaptée, c’est-à-dire de l’eau complémentée en divers excipients convenables pour l’utilisation de la phase solide subséquente. L’étape de mélange phase aqueuse/support de culture consiste à séparer les spores et les mettre en suspension dans ladite phase aqueuse. Le mode de réalisation de cette agitation n’est pas critique en soit et pourra être réalisé par tout moyen connu d’un homme du métier, par exemple des tables à agitation, des agitateurs magnétiques par exemple. L’étape de séparation liquide/solide vise à la récupération d’une phase liquide contenant les spores et débarrassée des graines de millets et de tout débris végétaux contenu. Cette séparation liquide/solide pourra être réalisée par une technique adaptée, telle que la centrifugation ou la filtration. En particulier il s’agira d’une filtration à l’aide d’un filtre retenant les graines, particules et débris végétaux tout en laissant passer les spores de H. pulvinata. Typiquement une filtration à l’aide d’un filtre de taille 200µm, voire 100 µm, permettra ainsi de laisser passer les spores tout en retenant les débris végétaux et les graines. L’intérêt de cette étape de séparation liquide/solide et de disposer d’une phase liquide contenant les spores en suspension et utilisable dans un équipement de vaporisation classique utilisé en agriculture. En particulier, la méthode permet de lutter contre Passolora fulva. De manière avantageuse encore, la parcelle agricole et une parcelle de tomates, en particulier une serre de tomates. La phase liquide obtenue contenant les spores pourra éventuellement faire l’objet d’une dilution avec de l’eau ou tout autre liquide aqueux afin d’obtenir la concentration en spores adéquate. La suspension obtenue doit pouvoir passer ainsi dans les buses de pulvérisation utilisée dans les serres sans que celles-ci ne soient colmatées. Il est avantageux d’appliquer une suspension suspension selon l’invention à des pressions relativement faibles afin d’éviter l’altération des spores. MODES DE REALISATION DE L’INVENTION Mode de réalisation 1. Selon un premier mode de réalisation, l’invention vise un procédé de préparation d’un support de culture de spores de H. pulvinata comprenant les étapes suivantes : Fournir des graines de millet cuites, Remplir un récipient équipé d’un dispositif permettant les échanges gazeux, avec les graines de millet cuites, Fermer et stériliser le récipient ainsi rempli, Inoculer le récipient stérile rempli de graines de millet cuites avec une suspension de H. pulvinata contenant un mélange de spores et de mycélium de H. pulvinata, Incubation du récipient inoculé à une température, des conditions d’éclairage et durant un temps suffisant pour permettre la colonisation homogène des graines par H. pulvinata et l’apparition d’un duvet gris à la surface de l’ensemble des graines comprenant des spores de H. pulvinata. Mode de réalisation 2. Dans un autre mode de réalisation, l’invention vise un procédé selon le mode de réalisation 1, caractérisé en que le récipient est un sac en matière plastique souple, par exemple en polypropylène. Mode de réalisation 3. Dans un autre mode de réalisation, l’invention vise un procédé selon l’un des modes de réalisations précédents dans lequel la souche de H. pulvinata est la souche HP1-OBS-2021 déposée auprès du NCIMB (Aberdeen, Ecosse) sous le Numéro NCIMB 43776. Mode de réalisation 5. Dans un autre mode de réalisation, l’invention vise un procédé de préparation de suspension de spores de H. pulvinata comprenant les étapes suivantes : -Mélanger le support de culture obtenu selon l’un des modes de réalisation 1 à 4 et comprenant les graines de millet comprenant un duvet gris à leur surface comprenant des spores de H. pulvinata, avec une phase aqueuse dans un récipient fermé, -Agiter le mélange, -Réaliser une séparation liquide/solide à l’aide d’un dispositif adapté permettant le passage des spores la phase liquide et la rétention des graines de millet dans la phase solide -Récupérer la phase liquide contenant les spores de H. pulvinata. Mode de réalisation 6. Dans un autre mode de réalisation, l’invention vise un procédé selon le mode de réalisation 5, caractérisé en ce que ratio v/v de support de culture / phase aqueuse dans le mélange à agiter est compris entre ½ et 1/10 voire entre ½ et 1/3. Mode de réalisation 7. Dans un autre mode de réalisation, l’invention vise un procédé selon l’un des modes de réalisations 5 ou 6, caractérisé en ce que concentration en spores dans la phase liquide obtenue est comprise en 10 3 et 10 7 spores/ml. Mode de réalisation 8. Dans un autre mode de réalisation, l’invention vise un procédé selon l’un des modes de réalisations 5 à 7, caractérisé en ce que l’étape de séparation liquide/solide est réalisée par filtration, en particulier avec un filtre de taille 200µm. Mode de réalisation 9. Dans un autre mode de réalisation, l’invention vise une suspension de spores de H. pulvinata obtenue selon l’un des modes de réalisations 5 à 8. Mode de réalisation 10. Dans un autre mode de réalisation, l’invention vise une méthode de traitement d’une parcelle agricole contre les parasites, comprenant l’application d’une suspension de spores de H. pulvinata, en particulier une suspension selon le mode de réalisation 9. En particulier, la méthode permet de lutter contre Passolora fulva. De manière avantageuse encore, la parcelle agricole et une parcelle de tomates, en particulier une serre de tomates. EXEMPLE Une souche de Hansfordia pulvinata a été purifiée en 2020 à partir d’un échantillon de feuille de tomate infectée par P. fulva issu d’une serre Costarmoricaine. Cette souche a été identifiée sur la base de critères morphologiques décrits par Peresse et Le Picard (Peresse et Le Picard 1980). Cette souche de H. pulvinata est stockée dans la mycothèque du laboratoire de pathologie d’OBS innovation (souche HP1-OBS-2021 déposée auprès du NCIMB (Aberdeen, Ecosse) sous le Numéro NCIMB 43776 le 26 mai 2021). Les graines de millet sont préalablement cuites jusqu’à obtenir des graines ramollies et gonflées, puis étalées sur des tablettes de séchage afin d’éliminer l’excès d’eau pendant 24h à 20°C. Les graines sont ensuite ensachées dans des sacs en polypropylène de 18cm x 32cm (largeur x hauteur) souple de 75µm d’épaisseur dotés de filtres permettant les échanges gazeux, à raison de 1l de graines par sac. Ces sacs sont fermés par soudure puis autoclavés 2 fois afin de garantir une stérilité parfaite des graines. H. pulvinata est cultivé soit sur milieu solide (PDA, potato dextrose agar), soit dans un milieu de culture liquide agité à base d’extrait de pomme de terre. Une suspension contenant un mélange de spores et de mycélium de H. pulvinata est préparée à partir d’une culture fraîche (moins de 10 jours) provenant soit d’un milieu de culture solide ou liquide agité. Cette suspension de H. pulvinata est utilisée pour inoculer les sacs contenant les grains de millet préalablement stérilisés. Après inoculation les sacs sont incubés dans une chambre de culture à 22°C, photopériode naturelle, durant environ 10 à 15 jours afin d’obtenir une colonisation homogène des graines par le mycélium blanc de H. pulvinata et un développement de spores qui s’observe par l’apparition d’un duvet gris clair à la surface de l’ensemble des graines. Les sacs contenant des graines recouvertes par les spores de H. pulvinata peuvent ensuite se conserver durant plusieurs jours et être transportées sur les lieux de traitement. La préparation des suspensions de spores se réalise en extemporané sur le lieu de traitement en suivant les consignes de préparation comme suit. Pour préparer 5l de suspension de spores à une concentration comprise entre 10 5 et 10 6 spores/ml il faut placer le contenu d’un sac bien sporulé dans un récipient fermé en agitant les grains dans une quantité d’eau, si possible déminéralisée, de l’ordre de 2 litres. Après agitation il faut filtrer le liquide avec une filtre de maillage adapté (200 µm), permettant le passage des spores de H. pulvinata tout en retenant les grains de millet et autres débris, puis ajuster la suspension à pour obtenir un volume final de 5l à la concentration voulue. La suspension obtenue doit pouvoir passer dans les buses de pulvérisation des serristes sans que celles-ci ne soient pas colmatées. L’ensemble des étapes citées ci-dessus ont été mises en œuvre et ont été validées par application sur une surface de 2000m² de culture de tomates sous abris. Les résultats observés sont très prometteurs sur la prévention des champignons parasites, en particulier contre Passolora fulva . Procédé de préparation d’un support de culture de spores de H. pulvinata comprenant les étapes suivantes : - Fournir des graines de millet cuites, - Remplir un récipient équipé d’un dispositif permettant les échanges gazeux, avec les graines de millet cuites, - Fermer et stériliser le récipient ainsi rempli, - Inoculer le récipient stérile rempli de graines de millet cuites avec une suspension de H. pulvinata contenant un mélange de spores et de mycélium de H. pulvinata, - Incubation du récipient inoculé à une température comprise entre 18 et 30°C, à une photopériode naturelle, durant un temps d’environ 7 à 21 jours, pour permettre la colonisation homogène des graines par H. pulvinata et l’apparition d’un duvet gris à la surface de l’ensemble des graines comprenant des spores de H. pulvinata. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en que le récipient est un sac en matière plastique souple, par exemple en polypropylène. Procédé selon l’une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l’étape d’incubation est réalisée dans une chambre de culture à une température comprise entre 20 et 25°C, plus particulièrement aux environs de 22°C, durant entre 10 et 15 jours. Procédé selon l’une des revendications précédentes dans lequel la souche de H. pulvinata est la souche HP1-OBS-2021 déposée auprès du NCIMB (Aberdeen, Ecosse) sous le Numéro NCIMB 43776. Procédé de préparation de suspension de spores de H. pulvinata comprenant les étapes suivantes : - Mélanger le support de culture obtenu selon le procédé de l’une des revendication 1 à 4 et comprenant les graines de millet comprenant un duvet gris à leur surface comprenant des spores de H. pulvinata, avec une phase aqueuse dans un récipient fermé, - Agiter le mélange, - Réaliser une séparation liquide/solide à l’aide d’un dispositif adapté permettant le passage des spores la phase liquide et la rétention des graines de millet dans la phase solide - Récupérer la phase liquide contenant les spores de H. pulvinata. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que ratio v/v de support de culture / phase aqueuse dans le mélange à agiter est compris entre ½ et 1/10 voire entre ½ et 1/3. Procédé selon l’une des revendications 5 ou 6, caractérisé en ce que la concentration en spores dans la phase liquide est comprise entre 10 3 et 10 7 spores/ml. Procédé selon l’une des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que l’étape de séparation liquide/solide est réalisée par filtration, en particulier avec un filtre de taille 200µm. Suspension de spores de H. pulvinata obtenue selon le procédé de l’une des revendications 5 à 8. Méthode de traitement d’une parcelle agricole contre les parasites, comprenant l’application d’une suspension de spores de H. pulvinata, en particulier une suspension selon la revendication 9.