Brevet FR3131745A1 — publié le 20230714

La présente invention concerne un procédé de détermination des propriétés de résistance à la méticilline d’une souche de Staphylococcus aureus présente dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes : a) incubation de l’échantillon biologique contenant ladite souche de Staphylococcus aureus pendant au moins 15 minutes, en présence d’un antibiotique de la classe des beta-lactamines choisi parmi le groupe suivant : céfoxitine et 6-APA (acide 6-aminopenicillanique), b) isolement des bactéries présentes dans ledit échantillon biologique, c) lyse des bactéries et hydrolyse des protéines bactériennes, afin d’obtenir un mélange de peptides, d) analyse de ce mélange de peptides par spectrométrie de masse ciblée, la détection d’au moins un peptide issu de la protéine PBP2a (SEQ ID NO. 1) ou PBP2c (SEQ ID NO. 2) lors de cette étape d’analyse étant indicative de la résistance à la méticilline de la souche de Staphylococcus aureus présente dans ledit échantillon biologique. PROCEDE DE DETERMINATION DE LA RESISTANCE A LA METICILLINE DE SOUCHES DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne un procédé de caractérisation de souches bactériennes appartenant à la famille des staphylocoques, et en particulier à un procédé permettant d’identifier les souches bactériennes résistantes à certains antibiotiques. Ceci permet au personnel de santé de sélectionner des antibiotiques adaptés à chaque patient infecté, en fonction de ces données de résistance. ETAT DE LA TECHNIQUE L’utilisation accrue d’antibiotiques au cours des dernières décennies a entrainé l’apparition de mécanismes de résistance chez de nombreuses espèces bactériennes. Les premières souches de Staphylococcus aureus (staphylocoques dorés) résistantes à la pénicilline ont été caractérisées seulement deux ans après l’introduction de cet antibiotique dans la chaine de traitement des infections bactériennes (Kirby, 1944) et se sont rapidement propagées, entrainant l’arrêt progressif de l’utilisation de la pénicilline en clinique au profit de nouvelles molécules antibactériennes semi-synthétiques telles que la méticilline et l’oxacilline. Puis dans les années 1960, de nouvelles souches de Staphylococcus aureus résistantes à la méticilline, mais également à d’autres composés antibiotiques, sont apparues. Ces souches sont désignées par l’acronyme SARM ou plus communément par leur acronyme anglais MRSA ( Meticillin Resistant Staphylococcus ureus ). Ces souches MRSA expriment une toxine particulière, la LPV ou leucocidine de Panton-Valentine. Cette toxine dite « porogène » induit des pores dans les parois cellulaires, notamment des cellules du système immunitaire, tuant ainsi les cellules capables de lutter contre l’infection. Bien qu’initialement confinées au milieu hospitalier, les souches MRSA se sont ensuite propagées dans la population. En 2019, en Europe, on estimait que les souches MRSA représentent entre 1% et 46% des infections à Staphylococcus aureus . D’après l’Organisation Mondiale de la Santé, une personne souffrant d’une infection par une souche MRSA présente une probabilité de décès 64% plus élevée qu’une personne infectée par une souche non résistante. La détection des souches MRSA est donc un enjeu majeur pour la prise en charge et le traitement des patients atteints d’infections à Staphylococcus aureus . Le phénotype MRSA est dû à l’expression d’une protéine spécifique, la PBP2a pour « Penicillin binding protein 2a », codée par le gène MecA, et dans de plus rares cas à l’expression de la protéine PBP2c codée par le gène MecC . Ces protéines « remplacent » la transpeptidase PBP2, une enzyme impliquée dans la formation de la paroi cellulaire bactérienne. Les protéines alternatives PBP2a et PBP2c ayant une faible affinité pour la méthicilline et la pénicilline, la présence de ces antibiotiques n’inhibe pas leur activité, et la synthèse de la paroi cellulaire continue normalement, assurant ainsi la croissance bactérienne même en présence de ces antibiotiques. Depuis l’apparition des premières souches MRSA, plusieurs méthodes de détection de cette propriété de résistance ont été élaborées, et ce selon trois approches principales : - Les méthodes phénotypiques sont basées sur une évaluation de la croissance bactérienne en présence d’antibiotique ; - Les méthodes de biologie moléculaire sont basées sur la détection des gènes MecA et/ou MecC dans le génome bactérien des souches étudiées ; - Les méthodes immunologiques et protéomiques sont basées sur la détection de la protéine PBP2a ou de ses peptides. Parmi ces technologies, les méthodes d’immuno-chromatographie (détection grâce à des anticorps) et de spectrométrie de masse sont particulièrement utilisées. Ces différentes approches son brièvement présentées ci-après. Méthodes phénotypiques Les méthodes traditionnelles de diffusion sur gélose, bien qu’anciennes, sont encore largement utilisées dans les laboratoires du fait de leur simplicité et de leur faible cout. Elles consistent à cultiver sur gélose la bactérie en présence d’un disque d’antibiotique, usuellement de l’oxacilline ou de la céfoxitine. Le phénotype sensible ou résistant de la souche bactérienne est déterminé en évaluant le diamètre de la zone d’inhibition de croissance autour du disque. Le principal désavantage de cette technologie est le délai nécessaire, d’environ 12 à 18 heures, pour obtenir le résultat (Felten, 2002). L’arrivée sur le marché d’instruments tels que le Vitek® 2 distribué par BioMérieux, ou le Phoenix TM distribué par Becton Dickinson, a permis l’automatisation à haut débit des tests de susceptibilité aux antibiotiques. Bien que plus robustes que les méthodes de diffusion sur gélose, ces tests sont également limités par le temps de croissance des bactéries. Le résultat est, dans le cas d’un Staphylococcus aureus , obtenu en environ 10 à 13 heures. De plus, cette technologie est sensible aux facteurs pouvant influencer la croissance bactérienne tels que le volume d’inoculum, la durée et la température d’incubation, le milieu, le pH ou la concentration en sels (Tenover et al., 1999). Méthodes de biologie moléculaire L’arrivée des méthodes de biologie moléculaire a considérablement amélioré les délais d’identification des souches MRSA par rapport aux méthodes phénotypiques. La haute sensibilité et la grande spécificité des tests actuellement commercialisés font de la détection du gène MecA par PCR (Polymerase Chain Reaction) le « gold standard » pour le diagnostic des MRSA. Parmi les tests couramment utilisés, citons geneXpert MRSA/SA BC distribuée par Cepheid, GeneOhm™ StaphSR Assay distribué par Becton Dickinson, eazyplex®MRSAplus distribué par AmplexDiagnostics ou encore FilmArray BCID distribué par Biomérieux. Ces tests permettent la détection des souches MRSA en 1 à 3 heures, directement à partir d’un flacon d’hémoculture positif, en s’affranchissant des étapes de sous-culture préalables, consistant à isoler les bactéries et à les faire proliférer. Le principal désavantage de cette technologie est qu’elle a tendance à générer des « faux positifs », notamment dans le cas de souches portant une cassette SSCmec ne contenant pas le gène MecA , ou pour des souches exprimant une protéine variante codée par un gène présentant une séquence légèrement différente de celle établie pour le gène MecA . De plus, le cout élevé d’une analyse de biologie moléculaire reste un obstacle majeur à leur utilisation systématique. Tests immunologiques : détection de la protéine PBP2A L’utilisation de billes de latex couplées avec un anticorps monoclonal spécifique détectant la protéine PBP2a permet une visualisation à l’œil nu de l’agglutination, témoin de la présence de l’antigène dans l’échantillon. Il s’agit du principe sur lequel se basent les tests PBP2’ Oxoid distribué par Thermofischer Scientific ou Mastalex-MRSA distribué par Mast Diagnostic. La durée du test en tant que tel est comprise entre 15 et 20 minutes. Ce test a très bonnes performances avec une sensibilité de 100% et une spécificité supérieure à 99%. Le désavantage majeur de cette technique est qu’elle nécessite une quantité minimale de 1,5 x 10 9 bactéries dans l’échantillon testé, ce qui implique une étape de culture bactérienne durant au minimum 10 heures. De plus, ces tests ne permettent pas la détection des souches MRSA exprimant la protéine PBP2c, non reconnue par certains anticorps monoclonaux utilisés. Cela a notamment été montré pour le test PBP2’ Oxoid (Dupieux et al., 2017). Des tests immuno-chromatographiques ont également été commercialisés pour la détection des souches MRSA, par exemple le kit Clearview™ PBP2a SA Culture Colony Test distribué par Alere. Bien que très rapide et possédant une sensibilité et une spécificité supérieurs à 98%, ce test nécessite également une étape de culture bactérienne. Le test Clearview™ PBP2a SA Culture Colony Test peut avantageusement détecter la PBP2c à partir de colonies poussant en bordure d’un disque de céfoxitine après culture sur gélose. Cette étape d’induction nécessaire à la détection de MecC entraine cependant un délai supplémentaire d’environ 18 heures avant le rendu de résultat (Dupieux et al., 2017). Spectrométrie de masse ciblée De récentes études ont mis en évidence le potentiel des approches protéomiques dites « bottom-up » (ou ascendantes), c’est-à-dire basées sur des spectres de fragmentation de peptides par spectrométrie de masse ciblée, pour l’identification de pathogènes et la mise en évidence de mécanismes de résistance. Ces approches comprennent les étapes suivantes : 1) Une lyse, mécanique ou chimique, de l’échantillon bactérien afin de libérer les protéines intracellulaires, 2) Une digestion enzymatique des protéines bactériennes à l’aide de protéases (typiquement la trypsine) pour générer un mélange de peptides 3) Une séparation chromatographique couplée à une analyse par spectrométrie de masse ciblée de l’échantillon, où le spectromètre de masse fonctionne en mode MS/MS pour la détection de peptides marqueurs des protéines de résistance 4) Le retraitement des résultats pour la validation de la présence/absence des peptides marqueurs dans l’échantillon. La spectrométrie de masse ciblée a été utilisée avec succès pour caractériser la résistance et la virulence de souches de Staphylococcus aureus par détection notamment de la PBP2a ou de facteurs de virulence tels que la PVL (Charretier et al., 2015). La demande internationale WO 2011/045544 décrit une méthode comprenant la caractérisation de la résistance et de la virulence de Staphylococcus aureus par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse ciblée, où le matériel biologique de départ est une colonie isolée sur milieu gélosé. Enfin, il a récemment été montré que la protéine PBP2a pouvait être détectée sous sa forme intacte, après séparation par chromatographie liquide et analyse MS (technologie « top-down » basée sur l’analyse de spectres de fragmentation de protéines entières). En l’absence de l’étape de digestion enzymatique de la protéine, le temps nécessaire pour obtenir un résultat est raccourci (Neil et al., 2021). Cependant, les auteurs n’ont pas démontré l’applicabilité de leur procédé à la détection de la PBP2a directement dans des échantillons d’hémoculture, sans étape de sous-culture préalable. A ce jour, aucune technologie remplissant tous les critères requis pour une implantation en milieu hospitalier, notamment un temps d’analyse court, une simplicité de préparation d’échantillon, un coût limité et une performance satisfaisante, n’est connue. Afin de répondre aux besoins actuels des laboratoires d’analyse, une méthode d’identification des souches MRSA devrait répondre au moins aux critères suivants : - Pas d’étape de sous-culture des bactéries isolées du sang (analyse directement à partir du flacon d’hémoculture lorsque celui-ci est détecté comme positif), - temps de préparation d’échantillon et d’analyse court (inférieur à 2 heures) afin d’obtenir un résultat rapidement, et ainsi permettre l’administration au patient d’un traitement antibiotique adapté dans les plus brefs délais, - coût faible afin que le test puisse être réalisé systématiquement, - test détectant les deux protéines PBP2a et PBP2c avec une sensibilité et spécificité proches de 100%, y compris des protéines variantes présentant une séquence peptidique présentant une identité de séquence avec les séquences SEQ ID NO. 1 ou 2. Les inventeurs ont mis au point une méthode ciblée de détection des souches MRSA par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse, réalisée directement à partir d’un flacon d’hémoculture positif, incluant une étape d’induction et une préparation rapide d’échantillon, et permettant d’obtenir un résultat en moins de 1h30 à compter de la constatation de la présence d’une souche de Staphylococcus aureus dans un échantillon biologique. La présente invention concerne un procédé de détermination des propriétés de résistance à la méticilline d’une souche de Staphylococcus aureus présente dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes : a) incubation de l’échantillon biologique contenant ladite souche de S. aureus pendant au moins 15 minutes, en présence d’un antibiotique de la classe des beta-lactamines choisi parmi le groupe suivant : céfoxitine et 6-APA (acide 6-aminopenicillanique), b) isolement des bactéries présentes dans ledit échantillon biologique, c) lyse des bactéries et hydrolyse des protéines bactériennes, afin d’obtenir un mélange de peptides, d) analyse de ce mélange de peptides par spectrométrie de masse ciblée, la détection d’au moins un peptide issu de la protéine PBP2a (SEQ ID NO. 1) ou PBP2c (SEQ ID NO. 2) lors de cette étape d’analyse étant indicative de la résistance à la méticilline de la souche de Staphylococcus aureus présente dans ledit échantillon biologique. La présente invention concerne également un kit pour la mise en œuvre de ce procédé, comprenant : - un antibiotique de la classe des beta-lactamines choisi parmi le groupe suivant : céfoxitine et 6-APA (acide 6-aminopenicillanique), - de la trypsine, - un réactif permettant une lyse sélective des cellules non-bactériennes présentes dans l’échantillon biologique, en particulier un détergent choisi parmi la saponine, le Triton X100 et le Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), - optionnellement, des réactifs pour la réalisation d’une spectrométrie de masse ciblée. DESCRIPTION DES FIGURES représente un chromatogramme résultant d’une analyse de type MRM de la souche MRSA26b. A) Echantillon préparé sans l’étape d’induction. B) Echantillon préparé avec l’étape d’induction. Les pics correspondant aux transitions des peptides de la PBP2a sont indiqués par des flèches. représente les chromatogrammes résultant d’une analyse de type MRM3 de la souche MRSA26b. A1 et A2) Chromatogrammes MRM3 des peptides VALELGSK (A1) et FQITTSPGSTQKK (A2) pour l’échantillon préparé sans l’étape d’induction. B1 et B2) Chromatogrammes MRM3 des peptides VALELGSK (B1) et FQITTSPGSTQKK (B2) pour l’échantillon préparé avec l’étape d’induction. représente un chromatogramme résultat d’une analyse de type MRM de la souche MRSA28b. A) Echantillon préparé sans l’étape d’induction. B) Echantillon préparé avec l’étape d’induction. Les pics correspondant aux transitions des peptides de la PBP2a sont indiqués par des flèches. représente les chromatogrammes résultant d’une analyse de type MRM3 de la souche MRSA28b. A1 et A2) Chromatogrammes MRM3 des peptides VALELGSK (A1) et FQITTSPGSTQKK (A2) pour l’échantillon préparé sans l’étape d’induction. B1 et B2) Chromatogrammes MRM3 des peptides VALELGSK (B1) et FQITTSPGSTQKK (B2) pour l’échantillon préparé avec l’étape d’induction. représente des chromatogrammes de la souche MSSA16b après une étape d’induction. A) Chromatogrammes MRM. B1 et B2) Chromatogrammes MRM3 pour les peptides VALELGSK (B1) et FQITTSPGSTQKK (B2). Aucun peptide n’est détecté pour les deux types d’analyse. représente des chromatogrammes de la souche MSSA1b après une étape d’induction. A) Chromatogrammes MRM. B1 et B2) Chromatogrammes MRM3 pour les peptides VALELGSK (B1) et FQITTSPGSTQkk (B2). Aucun peptide n’est détecté pour les deux types d’analyse. représente un chromatogramme résultant d’une analyse de type MRM d’une souche exprimant la PBP2c. A) Echantillon préparé sans l’étape d’induction. B) Echantillon préparé avec l’étape d’induction. Les pics correspondant aux transitions des peptides de la PBP2c sont indiqués par des flèches. Procédé de détermination des propriétés de résistance à la méticilline d’une souche de Staphylococcus aureus présente dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes : a) incubation de l’échantillon biologique contenant ladite souche de Staphylococcus aureus pendant au moins 15 minutes, en présence d’un antibiotique de la classe des beta-lactamines choisi parmi la céfoxitine et le 6-APA (acide 6-aminopenicillanique), b) isolement des bactéries présentes dans ledit échantillon biologique, c) lyse des bactéries et hydrolyse des protéines bactériennes, afin d’obtenir un mélange de peptides, d) analyse de ce mélange de peptides par spectrométrie de masse ciblée couplée à une séparation des peptides, la détection d’au moins un peptide issu de la protéine PBP2a (SEQ ID NO. 1) ou de la protéine PBP2c (SEQ ID NO. 2) lors de l’étape d’analyse (d) étant indicative de la résistance à la méticilline de la souche de Staphylococcus aureus présente dans ledit échantillon biologique. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séparation des peptides est une séparation par chromatographie ou par électrophorèse. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l’analyse par spectrométrie de masse est ciblée pendant l’analyse (mode de type SRM/MRM, MRM3, PRM) ou après l’analyse (mode de type DIA/SWATH). Procédé selon l’une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l’étape d’incubation (a) est réalisée à une température comprise entre 30° et 40° Celsius, pendant une durée comprise entre 15 et 40 minutes. Procédé selon l’une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l’étape (b) comprend également une étape de lyse sélective des cellules non-bactériennes présentes dans l’échantillon biologique. Procédé selon l’une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l’hydrolyse des protéines bactériennes à l’étape (c) est une hydrolyse enzymatique. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l’enzyme est la trypsine. Procédé selon l’une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le au moins un peptide détecté est choisi parmi le groupe de 12 peptides présentant les séquences suivantes : SEQ ID NO. 3 à SEQ ID NO. 14. Procédé selon l’une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l’échantillon biologique est choisi parmi : - Un fluide biologique tel que sang, sérum, plasma, urine, liquide céphalo-rachidien, et larmes ; - Une culture bactérienne telle que hémoculture, colonie sur gélose, bouillon de culture ; - Un échantillon alimentaire, et - tout autre type d’échantillon biologique. Kit pour la mise en œuvre du procédé selon l’une des revendications 1 à 9, comprenant : - au moins un antibiotique de la classe des beta-lactamines choisi parmi la céfoxitine et le 6-APA (acide 6-aminopenicillanique), - de la trypsine, et - un réactif permettant une lyse sélective des cellules non-bactériennes présentes dans l’échantillon biologique, par exemple un détergent.