Brevet FR3132634A1 — publié le 20230818

La présente invention a pour objet de nouveaux conjugués présentant une formule générale (I) telle que définie à la revendication 1. Les conjugués de l’invention comprennent 1/ au moins un analogue du mannose 6-phosphate (M6P) ciblant le récepteur du mannose 6-phosphate cation-indépendant (RM6P-CI) et 2/ un anticorps ou un fragment d’anticorps permettant de lier un antigène cible spécifique ou une molécule cible. L’invention concerne également le procédé de préparation desdits conjugués et leur utilisation médicale, de type thérapeutique ou diagnostique. Les conjugués de formule (I) de l’invention sont particulièrement intéressants pour une utilisation comme médicament, en particulier dans une méthode de traitement thérapeutique qui consiste à administrer un anticorps thérapeutique ou un fragment d’anticorps thérapeutique. Composés bifonctionnels ciblant le récepteur du mannose 6-phosphate cation-indépendant La présente invention relève du domaine de la chimie thérapeutique. Elle concerne plus particulièrement des composés bifonctionnels comprenant 1/ au moins un analogue du mannose 6-phosphate (M6P) ciblant le récepteur du mannose 6-phosphate cation-indépendant (RM6P-CI) et 2/ un anticorps ou un fragment d’anticorps permettant de lier un antigène cible spécifique ou une molécule cible. L’invention concerne également le procédé de préparation desdits composés bifonctionnels et leur utilisation médicale, de type thérapeutique ou diagnostique. La plupart des molécules thérapeutiques ciblant des protéines associées à des maladies neutralisent la cible en question, bloquant ainsi la fonction physiopathologique de leur cible. Cependant, les molécules thérapeutiques ont souvent peu d’effets sur les niveaux d’expression ou de dégradation de la cible. De plus, il existe encore de nombreuses protéines qui ne sont pas encore pharmacologiquement ciblées et dont la dérégulation et l'accumulation provoquent un état pathologique. Ces dernières années, la dégradation ciblée des protéines impliquées dans diverses maladies est apparue comme une stratégie clé pour obtenir une efficacité thérapeutique. Pour la dégradation ciblée des protéines par l'activation du protéasome, des médicaments induisant la dégradation sont utilisés, tels que les chimères ciblant la protéolyse. Cependant la conception de ces chimères est complexe et la perméabilité cellulaire est limitée. De plus, comme le système ubiquitine-protéasome est intracellulaire, l'utilisation desdites chimères ne peut pas être appliquée aux protéines extracellulaires. Une voie physiologique de dégradation des protéines est représentée par la voie endo-lysosomale. Les lysosomes sont les principaux compartiments de dégradation des cellules eucaryotes. En plus du protéasome, les lysosomes peuvent également dégrader des molécules autres que les protéines, comme les glycosaminoglycanes, les oligosaccharides et les lipides. Des molécules capables d’adresser les protéines pathologiques au lysosome pour y être dégradées ont donc été développées. Le récepteur du mannose 6-phosphate cation-indépendant (RM6P-CI), une glycoprotéine transmembranaire de 300 kDa, représente la principale voie de transport et de tri des enzymes lysosomales portant le signal mannose 6-phosphate (M6P) jusqu'aux lysosomes. Le RM6P-CI joue également un rôle de médiateur de l'endocytose des ligands extracellulaires contenant du M6P (Gary-Bobo et al., 2007). Les protéines contenant du M6P, qui diffèrent des enzymes lysosomales et sont internalisées par le transport dépendant du RM6P-CI, comprennent le granzyme B, une protéase impliquée dans l'apoptose induite par les cellules T cytotoxiques, le virus de l'herpès simplex (HSV) et même le facteur inhibiteur de la leucémie, une protéine multifonctionnelle qui joue un rôle important dans la formation des neurones, des plaquettes et des os. La condition pour que les protéines atteignent le lysosome est donc la présence de M6P. Cependant, le M6P peut être déphosphorylé à cause des phosphatases sériques, perdant ainsi sa capacité à se lier au RM6P-CI (El Cheikh K. et al., 2016). Des enzymes lysosomales ont ainsi été modifiées afin d'augmenter considérablement le nombre de résidus de M6P, bien que ces résidus soient toujours dégradés par les phosphatases (Zhu Y., et al., 2009). Des analogues du M6P ont été synthétisés dans lesquels le phosphate est remplacé par d’autres groupes permettant la reconnaissance par le RM6P-CI, sans être dégradés par les phosphatases. Les analogues du M6P désignent un composé un peu différent du composé M6P naturel mais qui présente une capacité de liaison élevée au RM6P-CI. Les analogues du M6P se sont révélés efficaces en améliorant le potentiel thérapeutique d’une enzyme lysosomale produite dans un système d'expression baculovirus/cellules d'insecte dépourvue du signal M6P (El Cheikh K. et al., 2016) et même d'une enzyme lysosomale qui porte déjà le M6P (Basile I. et al., 2018). Les documents EP 2 448 600 B1 et EP 3 350 192 B1 ont décrit des analogues du M6P qui présentent plusieurs avantages pour la fonctionnalisation de glycoprotéines, en particulier pour la fonctionnalisation d’enzymes lysosomales. En effet les analogues du M6P décrits dans ces documents sont de petite taille, sont peu immunogènes et peuvent être facilement greffés sur l’enzyme lysosomale. Ces analogues sont de plus modulables, d’une part au niveau de la longueur et de la structure du bras espaceur et d’autre part au niveau du groupement réactif terminal du bras espaceur en fonction du type de liaison désirée. Dans ces documents, les analogues du M6P sont plus particulièrement utilisés pour internaliser des enzymes lysosomales dans le lysosome de la cellule, afin que lesdites enzymes puissent jouer leur rôle physiologique. Le document PCT/US2019/067228 a décrit des molécules bifonctionnelles obtenues en greffant un polypeptide sur un anticorps, ledit polypeptide comprenant un nombre d’analogues du M6P allant de 20 à 90. L’addition de ce polypeptide sur l’anticorps s’est avérée efficace pour augmenter l’internalisation des antigènes dans les cellules en culture par l’intermédiaire des récepteurs du M6P. Le document PCT/IB2021/050922 décrit des composés bifonctionnels dans lesquels des analogues du M6P (M6Pa) ont été couplés à des ligands antagonistes spécifiques des facteurs PCSK9 et FHR3 afin de diminuer les concentrations extracellulaires de ces facteurs. L’internalisation cellulaire des antagonistes-M6Pa complexés aux facteurs ciblés est suivie d’une dégradation dans les lysosomes. Le couplage des analogues du M6Pa sur des anticorps n’est pas envisagé dans ce document et le devenir des antagonistes-M6Pa après leur entrée cellulaire n’est pas analysé. Les Inventeurs ont maintenant mis au point de nouveaux composés bifonctionnels comprenant au moins un analogue du M6P lié de façon covalente à un anticorps. Ces composés bifonctionnels présentent la propriété surprenante et inattendue de pouvoir être recyclés vers l’extérieur de la cellule après leur première entrée cellulaire par la voie des RM6P-CI. Cette propriété originale et inattendue permet d’envisager une réutilisation multiple du composé de l’invention par les cellules, notamment pour réduire/diminuer la concentration des antigènes extracellulaires solubles ou membranaires. Résumé Selon un premier aspect, la présente invention a pour objet un conjugué caractérisé en ce qu’il présente la formule générale (I) suivante (I) dans laquelle : X est un groupement phosphonate -CH 2 -P(O)(OZ) 2 ou carboxylate -CH 2 -C(O)(OZ) avec Z représentant indépendamment l’un de l’autre H (hydrogène), Na (sodium), Li (lithium), K (potassium) ou NH 4 (ammonium); n est un entier allant de 0 à 2 ; L 1 est un radical choisi dans le groupe comprenant *-O-N=**, , avec * indiquant le point d’attachement de L 1 au groupe (O-CH 2 -CH 2 ) n et ** indiquant le point d’attachement de L 1 à Y 1 ; n 1 est un entier allant de 1 à 20, et de préférence de 1 à 10, Y 1 représente un anticorps Y ou un fragment d’anticorps Y comprenant au moins un domaine de liaison à l’antigène, ledit Y 1 formant n 1 liaison(s) covalente(s) avec L 1 . Selon un deuxième aspect, la présente invention a pour objet un procédé de préparation d’un conjugué de formule (I) tel que défini ci-dessus. Selon un troisième aspect, la présente invention a pour objet un conjugué de formule (I) pour une utilisation médicale, de type diagnostique ou thérapeutique. Elle porte notamment sur un conjugué de formule (I) pour une utilisation dans une méthode de traitement thérapeutique qui consiste à administrer un anticorps thérapeutique ou un fragment d’anticorps thérapeutique. D’autres caractéristiques, détails et avantages apparaîtront à la lecture de la description détaillée ci-après, et à l’analyse des dessins annexés, sur lesquels : Fig. 1 illustre le recyclage extracellulaire des conjugués de formule (I) de l’invention. L’analogue du M6P est représenté par le sigle AMFA. Le conjugué de formule (I) peut être nommé « AMFA-Anticorps ». L’anticorps est représenté par sa forme en Y, l’AMFA par une petite boule, et l’antigène par une forme de petit nuage. Fig. 2 illustre le schéma de synthèse général des conjugués de formule (I) dans laquelle n 1 est égal à 1, en fonction de la signification du groupe chimique réactif L de l’analogue du M6P de formule générale (II). La point 1/ illustre la réaction entre la fonction oxy-amine de l’analogue du M6P de formule (II) avec la fonction carbonyle (-CHO) de l’anticorps Y. L’anticorps Y est représenté par Y 1 ’-CHO, Y 1 ’ représentant l’anticorps Y sans son groupe fonctionnel L’ égal à -CHO. L’analogue (II) est dénommé AMFA1 lorsque X est un groupement phosphonate et n est égal à 0 et AMFA2 lorsque X est un groupement carboxylate et n est égal à 0. La point 2/ illustre la réaction entre la fonction squarate de l’analogue du M6P de formule (II) avec la fonction amine (-NH 2 ) de l’anticorps Y. L’anticorps Y est représenté par Y 1 ’-NH 2 , Y 1 ’ représentant l’anticorps Y sans son groupe fonctionnel L’ égal à -NH 2 . Les analogues (II) sont dénommés AMFA3 lorsque X est un groupement phosphonate et n est égal à 0, et AMFA4 lorsque X est un groupement carboxylate et n est égal à 0. La point 3/ illustre la réaction entre la fonction maléimide de l’analogue du M6P de formule (II) avec la fonction thiol (-SH) de l’anticorps Y. L’anticorps Y est représenté par Y 1 ’-SH, Y 1 ’ représentant l’anticorps Y sans son groupe fonctionnel L’ égal à -SH. Les analogues (II) sont dénommés AMFA5 lorsque X est un groupement phosphonate et n est égal à 0 et et AMFA6 lorsque X est un groupement carboxylate et n est égal à 0. La point 4/ illustre la réaction entre la fonction carbonylacrylique de l’analogue du M6P de formule (II) avec la fonction thiol de l’anticorps Y. Les analogues (II) sont dénommés AMFA7 lorsque X est un groupement phosphonate et n est égal à 0 et AMFA8 lorsque X est un groupement carboxylate et n est égal à 0. Fig. 3 illustre le procédé de préparation de l’intermédiaire 3 : le 2,3,4-tri- O -triméthylsilyl-α-D-mannopyranoside de 2-bromoéthyle, qui servira comme précurseur pour la synthèse des AMFA de formule (II). Fig. 4 illustre le procédé de préparation du composé AMFA1 répondant à la formule générale (II) à partir du composé 3 . Fig. 5 illustre le procédé de préparation du composé AMFA2 répondant à la formule générale (II) à partir du composé 3 . Fig. 6 illustre le procédé de préparation des composés AMFA3 et AMFA5 répondant à la formule générale (II) à partir du composé 6 . Fig. 7 illustre le procédé de préparation des composés AMFA4 et AMFA6 répondant à la formule générale (II) à partir du composé 1 . Fig. 8 illustre le procédé de préparation des composés AMFA7 et AMFA8 répondant à la formule générale (II) à partir du composé 1 6 . Fig. 9 présente les résultats obtenus par électrophorèse SDS-PAGE et Western blots (WB) pour les anticorps mAb1, mAb2, mAb3 et mAb4, seuls ou associés avec AMFA1 (mAb1-AMFA1, mAb2-AMFA1, mAb3-AMFA1 et mAb4-AMFA1). Les anticorps avant et après couplage avec l’AMFA1 sont détectés soit par coloration des protéines par le bleu de Coomassie, soit par reconnaissance avec des anticorps anti-IgG humaines. Les AMFA1 couplés aux anticorps sont détectés par un sérum polyclonal de lapin anti-AMFA1 (représenté par « anti-AMFA » sur la figure). Fig. 10 présente les courbes d'affinité respectivement de l’anticorps mAb1 ou du conjugué mAb1-AMFA1 (A) et de l’anticorps mAb2 ou du conjugué mAb2-AMFA1 (B) pour leur molécule cible, à savoir l’antigène TNF-alpha humain. Fig. 11 présente les données de l'analyse par cytométrie en flux de l'internalisation d’un anticorps IgG témoin non spécifique, de l’anticorps mAb1 et du conjugué mAb1-AMFA1 avec un anticorps secondaire fluorescent anti-IgG humaine (Alexa647) dans des cellules de rhabdomyosarcome (graphe du haut), des cellules de type lymphocytes T (graphe du milieu) et des cellules de cancer du sein (graphe du bas). Fig. 12 présente les données de l'essai de fluorescence cellulaire de cellules de cancer du sein (en haut) et de cellules de rhabdomyosarcome (en bas), traitées par : - un anticorps IgG témoin non spécifique, l’anticorps mAb1 et le conjugué mAb1-AMFA1 avec un anticorps secondaire fluorescent anti-IgG humaine (Alexa647) (cellules du cancer du sein), - l’anticorps mAb3 et le conjugué mAb3-AMFA1 avec un anticorps secondaire fluorescent anti-IgG humaine (Alexa647) (cellules de rhabdomyosarcome). Cet essai de fluorescence permet de définir l’internalisation cellulaire des anticorps seuls et du conjugué de l’invention. ** p Fig. 13 présente l’internalisation de l’anticorps Ab ou du conjugué Ab-AMFA1 détectée par imagerie confocale sur des cellules de rhabdomyosarcome (à droite) et sur des cellules de cancer du sein (à gauche). Les noyaux sont marqués avec le colorant Hoechst 33342. Les marquages de Ab ou Ab-AMFA1 complexés à un anticorps secondaire fluorescent anti-IgG humaine (Alexa647) sont indiqués par des flèches. Les 2 photos du bas concernent le cas où un excès de M6P a été ajouté dans le milieu de culture pour saturer les sites de liaison du RM6P-CI des cellules. Fig. 14 présente les données de l'analyse des échantillons de plasma de souris injectées avec les anticorps mAb1 ou mAb2 ainsi qu’avec les conjugués mAb1-AMFA1 ou mAb2-AMFA1 correspondants. La concentration des anticorps dans le plasma est donnée en fonction du temps après injection. Le graphe du haut (A) concerne celui des souris traitées avec mAb1 ou mAb1-AMFA1 et le graphe du bas (B) celui des souris traitées avec mAb2 ou mAb2-AMFA1. Fig. 15 montre la détection par Western blots des anticorps mAb1 et des conjugués mAb1-AMFA1 présents dans le plasma de souris à 21 jours après injection intraveineuse (i.v.) de 4 mg/kg de mAb1 et de mAb1-AMFA1. Un témoin des mAb1-AMFA1 injectés est ajouté pour comparaison. Les anticorps sont détectés par reconnaissance avec des anticorps anti-IgG humaines et la présence des AMFA couplés aux anticorps est détectée par un sérum de lapin anti-AMFA1 (représenté par « anti-AMFA » sur la figure). Fig. 16 montre l’entrée cellulaire du TNF-alpha humain dans des lymphocytes T humains traités avec 5 ng/mL de TNF-alpha humain et 20 ng/mL de mAb1 ou mAb1-AMFA1, pendant 1 h, 5 h et 17 h. Les lysats cellulaires ont été analysés par Western blot. Les concentrations intracellulaires de TNF-alpha humain sont quantifiées en fonction du temps (heures) après traitement. ** p Fig. 17 montre la neutralisation par l’anticorps mAb1 ou le conjugué mAb1-AMFA1 de l’effet anti-prolifératif du TNF-alpha humain sur des cellules de type fibroblastes murins traitées avec 5 ng/mL de TNF-alpha humain. ** p Fig. 18 montre la réversion de l’effet mitogène du VEGF dans les cellules HUVEC traitées avec 50 ng/mL de VEGF humain et par différentes concentrations de mAb3 ou mAb3-AMFA1 pendant 72 h. Fig. 19 montre la dégradation de la protéine HER2 (ERBB2, Humain) par une méthode d’immunocytochimie des protéines (In Cell ELISA) dans les cellules de cancer du sein SK-BR-3 traitées avec 10 ou 100 nM de mAb4 ou mAb4-AMFA1 pendant 24 h. Fig. 20 montre la capacité de recyclage de l’anticorps mAb1 et du conjugué mAb1-AMFA1 dans les cellules Jurkat. Chaque anticorps/conjugué est incubé pendant 5 h avec les cellules puis le milieu de culture est remplacé par un milieu sans anticorps. La sortie cellulaire de l’anticorps ou du conjugué internalisé est mesurée à 1 h et 5 h. Conjugué caractérisé en ce qu’il présente la formule générale (I) suivante (I) dans laquelle : X est un groupement phosphonate -CH 2 -P(O)(OZ) 2 ou carboxylate -CH 2 -C(O)(OZ) avec Z représentant indépendamment l’un de l’autre H, Na, Li, K ou NH 4 ; n est un entier allant de 0 à 2 ; L 1 est un radical choisi dans le groupe comprenant *-O-N=**, , et , avec * indiquant le point d’attachement de L 1 au groupe (O-CH 2 -CH 2 ) n et ** indiquant le point d’attachement de L 1 à Y 1 ; n 1 est un entier allant de 1 à 20, et de préférence de 1 à 10, Y 1 représente un anticorps Y ou un fragment d’anticorps Y comprenant au moins un domaine de liaison à l’antigène, ledit Y 1 formant n 1 liaison(s) covalente(s) avec L 1 . Conjugué selon la revendication 1, caractérisé en ce que Y 1 est représenté par le groupement L 2 -Y’ 1 dans lequel Y’ 1 représente l’anticorps Y ou fragment d’anticorps Y lié à L 1 par l’intermédiaire du radical L 2 avec L 2 choisi dans le groupe comprenant =CH- , -NH- et -S-, ledit Y 1 pouvant ainsi être représenté par =CH-Y’ 1 , -NH-Y’ 1 et -S-Y’ 1 . Conjugué selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que n 1 est un entier égal à 1 et en ce que ledit conjugué de formule (I) est choisi dans le groupe comprenant : , , et , avec X, n et Y’ 1 tels que définis à la revendication 1 ou 2. Conjugué selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que Y 1 représente un anticorps Y thérapeutique ou de diagnostic. Conjugué selon la revendication 4, caractérisé en ce que Y 1 représente un anticorps Y choisi dans le groupe comprenant les anticorps monoclonaux, les anticorps chimériques, les anticorps humains ou humanisés, les anticorps à chaînes lourde et légère, les anticorps à chaîne unique, les anticorps bispécifiques ou multi-spécifiques et les nanocorps. Conjugué selon la revendication 5, caractérisé en ce que Y 1 représente un anticorps Y qui est une immunoglobuline de type IgG, en particulier de sous-type lgG1, lgG2, lgG3 ou lgG4, ou une immunoglobuline de type IgE, IgD, IgA ou IgM. Conjugué selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu’il présente une affinité IC 50 vis-à-vis du récepteur du mannose 6-phosphate cation indépendant (RM6P-CI) allant de 10 -4 M à 10 -9 M, et de préférence allant de 10 -5 M à 10 -8 M. Procédé de préparation d’un conjugué de formule (I) tel que défini à l’une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l’on fait réagir : - un anticorps Y ou un fragment d’anticorps Y comprenant au moins un domaine de liaison à l’antigène avec - n 1 composé(s) répondant à la formule générale (II) (II) dans laquelle X, n et n 1 sont tels que définis à la revendication 1, L est un groupe chimique réactif choisi dans le groupe comprenant -O-NH 2 , , et , ledit groupe L du composé (II) formant n 1 liaison(s) covalente(s) avec n 1 groupe(s) fonctionnel(s) porté(s) par ledit anticorps Y ou fragment d’anticorps Y. Procédé de préparation selon la revendication 8, caractérisé en ce que le composé (II) est choisi dans le groupe comprenant , , , , , , et . Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu’elle comprend : - un conjugué tel que défini à l’une quelconque des revendications 1 à 7, - au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. Conjugué tel que défini à l’une quelconque des revendications 1 à 7 ou composition pharmaceutique selon la revendication 10, pour une utilisation comme médicament. Conjugué tel que défini à l’une quelconque des revendications 1 à 7 ou composition pharmaceutique selon la revendication 10, pour une utilisation dans une méthode de traitement thérapeutique qui consiste à administrer un anticorps thérapeutique ou un fragment d’anticorps thérapeutique. Conjugué tel que défini à l’une quelconque des revendications 1 à 7 ou composition pharmaceutique selon la revendication 10, pour une utilisation dans une méthode de diagnostic. Conjugué ou composition pharmaceutique pour une utilisation selon l’une quelconque des revendications 11 à 13, caractérisée en ce que le conjugué ou la composition pharmaceutique est sous une forme adaptée pour une administration par voie parentérale, intraveineuse ou sous-cutanée.