Brevet FR3135892A1 — publié le 20231201

Traitement d’un syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) chez un patient L’invention concerne ESM-1 (Endothelial cell Specific Molecule) ou composition pharmaceutique en contenant pour utilisation dans une méthode de traitement ou de prévention d’un syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) chez un patient. traitement d’un syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) chez un patient L’invention concerne une méthode de traitement ou de prévention d’un syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) chez un patient avec ESM-1 (Endothelial cell Specific Molecule) ou une composition pharmaceutique en contenant. Le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) est un œdème pulmonaire dit « lésionnel », c’est à dire entraîné par une hausse de la perméabilité capillaire pulmonaire survenant à la suite d’une agression directe ou indirecte de la membrane alvéolo-capillaire, associé à une inflammation pulmonaire intense et une hypoxémie sévère. Le SDRA est défini par l'association de quatre critères : détresse respiratoire depuis moins d'une semaine, opacités pulmonaires bilatérales sur la radiographie thoracique ou la tomodensitométrie (TDM), pas d'argument pour une cause cardiaque d'œdème pulmonaire, et hypoxémie avec rapport PaO 2 /FIO 2 2 O ou plus avec 3 stades de gravité définis en fonction de l’hypoxémie. Le SDRA est causé par une atteinte de la membrane alvéolo-capillaire, dont la capacité d'échanges gazeux chute radicalement. Ceci entraîne également un défaut de compliance pulmonaire. Cette manifestation peut apparaître dans un grand nombre de situations pathologiques avec des mécanismes différents. Il est caractérisé par une inflammation du parenchyme pulmonaire qui mène à des anomalies d'échanges de gaz avec une libération en parallèle de médiateurs inflammatoires du parenchyme pulmonaire qui causent une inflammation et une hypoxémie. Souvent une défaillance multiviscérale résulte rapidement de cet état. Son traitement, à la fois étiologique et symptomatique, ne permet une survie que dans la moitié des cas pour les SDRA dits « sévères ». Son pronostic reste donc encore très sombre et il peut laisser des séquelles importantes. Les causes peuvent être pulmonaires ou extra-pulmonaires. Les causes pulmonaires comprennent les pneumopathies bactérienne, virale, fongique, les embolies, les infiltrations, les traumatismes thoraciques, les aspirations trachéo-bronchiques ou gastriques, la ventilation mécanique, les inhalations, les noyades, les phénomènes d’ischémie-reperfusion. Les causes extra-pulmonaire comprennent les chocs, le sepsis (ou septicémie), les polytraumatismes, l’exposition à des agents toxiques, les transfusions, les shunts cardiopulmonaires, la pancréatite, les intoxications médicamenteuses, les brulures graves, les éclampsies, l’exposition à des produits de contraste et l’acidocétose. L’éthylisme chronique, le tabagisme actif et passif, constituent des facteurs environnementaux augmentant le risque de développer un SDRA en cas d’agression pulmonaire, via des effets sensibilisateurs de l’épithélium, de l’endothélium et des autres cellules immunitaires de la membrane alvéolocapillaire. La présence d’un sepsis, d’une maladie pulmonaire chronique et d’un pH plasmatique abaissé ont également été montrés comme des facteurs précipitants la survenue de SDRA. Le 31 décembre 2019, l'Organisation mondiale de la santé (OMS) a été informée d'un groupe de cas de pneumonie de cause inconnue détectés dans la ville de Wuhan, province du Hubei, Chine. Le 12 janvier 2020, il a été annoncé qu'un nouveau coronavirus avait été identifié Ce virus a été appelé SARS-CoV-2 et la maladie associée « COronaVIrus Disease 2019 » (COVID-19). Depuis, l'agent étiologique SARS-CoV-2 s'est répandu dans le monde entier. L'infection par le SARS-CoV-2 présente un large spectre clinique allant d'une maladie inapparente, à des formes respiratoires qui vont d’un simple essoufflement jusqu’au SDRA. Les formes respiratoires symptomatiques présentent une fièvre, une toux nouvelle et continue, un essoufflement, une fatigue, une perte d'appétit, une anosmie et une agueusie. Le délai d'apparition du SDRA lié au COVID-19 se situe entre 8 et 12 jours après l’apparition des symptômes. L’aggravation respiratoire observée lors de la deuxième semaine d’évolution de la maladie est la principale cause d’hospitalisation et de mortalité. Sur le plan thérapeutique, l’arme principale demeure l’assistance respiratoire. Cependant ce SDRA est plus lié à une réponse inflammatoire très intense secondaire à l’agression virale qu’au virus lui-même. Il existe donc un rationnel fort à tenter de moduler cette réponse afin de limiter les dommages induits au niveau pulmonaire. L’effet positif de la dexamethasone prouve la pertinence de cette approche, mais l’effet reste modeste. La Demanderesse a mis en évidence une solution thérapeutique anti-inflammatoire spécifique du SDRA, éventuellement guidée par des biomarqueurs périphériques compagnons, qui permet de changer le pronostic des patients atteints de SDRA, notamment chez les patients atteints de la COVID-19. Ainsi, la présente invention, qui trouve application dans le domaine du traitement des insuffisances respiratoires, concerne ESM-1 (Endothelial cell Specific Molecule) ou une composition pharmaceutique en contenant pour son utilisation dans une méthode de traitement ou de prévention d’un syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) chez un patient. illustre les protocoles expérimentaux mis en œuvre dans les exemples. Le premier protocole (A) a été réalisé pour étudier les différences des paramètres inflammatoires entre des souris WT et des souris Esm1 -/- , en réponse à une inflammation aigue pulmonaire induite par LPS. Une instillation intra-trachéale de LPS a été réalisée à J0, des évaluations cliniques avec mesures non-invasives de l’oxymétrie ont été réalisées quotidiennement, et les souris ont été sacrifiées à différents temps pour déterminer l’évolution des paramètres inflammatoires en fonction du temps. Le second protocole (B) a été réalisé pour étudier l’effet d’une administration continue d’endocan murin par des osmopompes chez des souris Esm1 -/- . Les osmopompes ont administré en continu soit de l’endocan soit du PBS et ont été implantées en sous-cutanée un jour avant l’instillation intra trachéale de LPS. Des évaluations cliniques et des mesures non-invasives de l’oxymétrie ont été réalisées quotidiennement, les souris ont été sacrifiées à J5 pour évaluer les paramètres de l’inflammation pulmonaire. LPS : Lipopolysaccharides, i.t. : instillation intra trachéale. . représente les résultats qui montrent que la présence d’endocan endogène module la réponse inflammatoire et améliore la dysfonction physiologique pulmonaire. Réponse inflammatoire, à différents temps, au décours d’une instillation trachéale de LPS, chez les souris WT (hachuré noir et blanc) et Esm1-/- (blanc). L’évolution des concentrations sériques au cours du temps d’endocan endogène est présentée en (A). Les résultats des analyses des LBA sont présentés en nombres absolus de cellules (cellules.mL -1 ) pour les leucocytes en (B), pour les polynucléaires neutrophiles en (C) et pour les macrophages en (D). Les concentrations de mMPO des LBA sont présentées en (E), les concentrations de m TNFα des LBA en (F), et celle des protéines dans le LBA en (G). L’évolution de l’oxymétrie transcutanée à différents temps est représentée en (H). Les données sont présentées avec leurs médianes, et leurs 25 e et 75 e percentiles. Δ représente le résultat du test de l’effet du groupe par le modèle linéaire mixte. Φ est le résultat du test de Kruskal-Wallis test. * représente un p représente les résultats qui montrent que l ’ administration continue d’endocan chez les souris Esm1 -/- réduit la réponse inflammatoire et améliore la dysfonction physiologique pulmonaire . Paramètres de la réponse inflammatoire pulmonaire estimés à J5 d’une instillation intra-trachéale de LPS, chez des souris Esm1 -/- traitées par une administration continue sur 3 jours soit d’endocan (hachuré gris) soit de PBS (hachuré noir). Les résultats des examens des LBA sont présentés en nombres absolus avec les leucocytes en (A), les polynucléaires neutrophiles en (B) et les macrophages en (C). Les concentrations de m MPO des LBA sont présentées en (D), les concentrations de m TNFα des LBA en (E) et celle des protéines dans le LBA en (F). L’évolution de l’oxymétrie transcutanée à différents temps est représentée en (G). Les données sont présentées avec leurs médianes, et leurs 25 e et 75 e percentiles. ∆ représente le résultat du test de l’effet du groupe par le modèle linéaire mixte. Φ est le résultat du test de Kruskal-Wallis test. * représente un p représente des évaluations histologiques des poumons réalisées à J5 au décours d’une instillation intra-trachéale de LPS chez des souris Esm1 -/- traitées par une administration continue sur 3 jours soit par du PBS soit par de l’endocan murin (A, 200x; B, 200x). Les figures qui montrent que l’administration continue d’endocan chez des souris Esm1 -/- diminue l’atteinte histologique de l’infection aigue pulmonaire. En A, est présenté une photographie d’une lame histologique d’une souris Esm1 -/- traitée par une administration continue de PBS. On retrouve de nombreux infiltrats neutrophiles alvéolaires et interstitiels, des membranes hyalines et des dépôts de fibrine. En B, est présentée une photographie d’une lame histologique d’une souris Esm1 -/- traitée par une administration continue d’endocan murin glycosylé. représente des valeurs du Lung Injury Severity Score (LISS) réalisées à J5 au décours d’une instillation intra-trachéale de LPS chez des souris Esm1 -/- traitées par une administration continue sur 3 jours soit par du PBS soit par de l’endocan murin (A, 200x; B, 200x). Les résultats montrent que l’administration continue d’endocan chez des souris Esm1 -/- diminue l’atteinte histologique de l’infection aigue pulmonaire. L’ensemble des valeurs du LISS des deux protocoles sont présentés conjointement avec, de gauche à droite sur la figure, les souris WT, les souris Esm1 -/- , les souris Esm1 -/- traitées par PBS et les souris Esm1 -/- traitées par endocan. Les données sont présentées avec leurs médianes, et leurs 25 e et 75 e percentiles. * représente un p Exemples Exemple 1 : effet de l’ESM-1 murin glycosylé dans un modèle de SDRA chez la souris déficiente en ESM-1 (endocan) L’objectif de ce travail était d’étudier spécifiquement l’effet anti-inflammatoire de l’endocan, en s’affranchissant des interférences causées par l’endocan endogène. Par ailleurs, l’effet préemptif et/ou thérapeutique propre de l’endocan sur l’hypoxémie secondaire à un tableau de SDRA, n’ont encore jamais été investigués. Dans ce but, nous avons comparé d’une part les caractéristiques de l’atteinte inflammatoire pulmonaire et d’autre part la sévérité de l’hypoxémie et de la dysfonction pulmonaire dans un modèle d’agression pulmonaire aigue chez la souris déficiente en endocan (Esm1 -/- ) et la souris sauvage (WT). Secondairement, nous avons validé ces résultats en évaluant l’effet d’une administration continue d’endocan dans un même modèle identique d’agression pulmonaire chez la souris déficiente (Esm1 -/- ). 1. Matériels et méthodes 1.1 Production et purification de l’endocan murin L’endocan recombinant murin glycosylé a été produit, puis purifié, dans des cellules CHO transfectées comme précédemment décrit [9]. Les cellules CHO ont été mises en cultures en suspension dans un milieu sans sérum (serum-free CHO media (Gibco, Waltham, Massachusetts, USA)) et placées dans des bioréacteurs (réf. CL1000 bioreactors (réf. Z688029, Integra Biosciences, Cergy, France)) afin d’obtenir un surnageant cellulaire riche en endocan murin glycosylé. Après recueil du surnageant, l’endocan recombinant a été purifié sur une colonne échangeuse d’ions (HiTrap Q FF (réf. 17-5156-01, GE healthcare, USA)), puis sur une colonne d’affinité coatée par l’anticorps anti endocan murin MEP14, comme précédemment décrit [9]. L’endocan murin a ensuite été concentré par centrifugation en utilisant une membrane semi-perméable (Amicon® Ultra Centrifugal Filters). Une détermination de la concentration finale en endocan a été réalisée avec un kit ELISA spécifique de dosage d’endocan (réf. LIK-1101, DIYEK EndoMark M1, Biothelis, France). Chaque lot d’endocan produit a finalement été contrôlé par la technique de Western Blot pour s’assurer de la présence exclusive de la forme glycosylée, et un dosage de LPS par un test spécifique (LAL test (réf. 50-650U, Lonza, Switzerland)) a été réalisé sur chaque lot pour garantir de l’absence de LPS. 1.2 Animaux et aspect éthiques Nous avons eu recours à des souris mâles C57Bl/6 Esm1-/- et WT littermate, âgées de 7 – 11 semaines et en reproductions dans notre animalerie. Le protocole de l’étude a été approuvé par la commission d’éthique locale et toutes les expérimentations animales ont suivi les règles de bonnes pratiques éthiques (n° APAFIS#6059). 1.3 Obtention des souris Esm1-/- Pour obtenir les lignées C57Bl/6 Esm1-/-, nous avons inséré des loci de reconnaissance loxP autours des exons 1 et 2 du gène murin Esm1 (Ensembl ID ENSMUSG00000042379), puis, en collaboration avec l’Institut Clinique de la Souris (Strasbourg, France), nous avons transfecté par électroporation un fragment d’ADNc porteur d’une cassette de résistance à la néomycine encadrée par des loci loxP dans des cellules souches embryoniques murines. Nous avons alors obtenu par recombinaison homologue un remplacement des exons 1 et 2 du gène Esm1 par le fragment porteur du gène de résistance à la néomycine. Nous avons ensuite sélectionné les cellules souches embryonnaires transfectée par culture dans du milieu contenant du G418, puis nous avons vérifié la délétion par technique Southern blot. Pour finir, nous avons injecté les cellules embryonnaires déficientes Esm1-/- dans des blastocystes secondairement placés dans l’utérus de souris femelles pseudo gestantes. Nous avons ensuite croisé la progéniture obtenue pour obtenir des lignées de souris déficientes homozygote en exon 1 et 2 du gène Esm1. Enfin, nous avons croisé ces souris avec d’autres souris porteuses d’une délétion Cre pour éliminer le gène de résistance à la néomycine. Pour vérifier la délétion Esm1-/-, un génotypage a été réalisé après extraction d’ADN à partir d’un prélèvement biologique, et une PCR a été réalisée avec le kit REDExtract-N-Amp™ Tissue PCR kit (réf. 254-457-8, Sigma-Aldrich, USA avec les amorces suivantes : 1f (SEQ ID NO : 2 : ATGTCTATGTCAGTCTCCTC) et 1r (SEQ ID NO : 3 : CTCTTGCCAGCCTCTCTTGT) pour générer un fragment de 310 paires de bases pour l’allèle sauvage et 1f et 2r (SEQ ID NO : 4 : CTCCAAAATCCAGAAACCC) pour générer un fragment de 442 paires de bases pour l’allèles KO. Les échantillons ont ensuite été analysés sur gel d’agarose. 1.4 Protocoles expérimentaux Les deux protocoles expérimentaux utilisés pour cette étude sont décrits . Dans le premier protocole (Figure 1A), nous avons eu recours à des souris C57Bl/6 Esm1-/- et WT littermate obtenues comme précédemment décrit. Après avoir réalisé une instillation intratrachéale de LPS comme précisé plus loin, des évaluations cliniques et de la fonction physiologique pulmonaire ont été réalisées quotidiennement. Les souris ont été sacrifiées à différents moments spécifiquement déterminés pour obtenir une cinétique des variations des paramètres étudiés allant de J0 à J10. Dans le second protocole (Figure 1B), nous avons spécifiquement eu recourt à des souris C57Bl/6 Esm1-/-. Des osmopompes sous cutanée (réf. 1003D, Alzet, USA) préalablement remplies soit par de l'endocan recombinant murin soit par du PBS, ont été implantée en sous cutanée comme décrit ultérieurement. A J0, un prélèvement sanguin non létal par ponction rétro orbitaire a été réalisé sur souris anesthésiée, puis, une injection intratrachéale de LPS a été réalisée selon la même méthodologie que pour le premier protocole. Un suivi identique au premier protocole a été réalisé excepté le fait que les souris ont été sacrifiées à J5 par injection intra péritonéale de pentobarbital (100 mg/kg). 1.5 Préparation des osmopompes et implantation sous cutanée Nous avons eu recours à des osmopompes permettant une administration continue de la solution chargée durant 3 jours, à un débit fixe de 1 µL.h -1 . Chaque osmopompe de 100 µL a été remplie soit avec 200 µg d'endocan recombinant murin glycosylé (100 µl de solution d'endocan à une concentration finale de 2 mg.mL -1 ), soit par 100 µL de PBS. Les osmopompes ont ensuite été immergées dans du PBS pour une durée maximale de 4 heures avant leur implantation en sous cutanée. Après avoir anesthésié les souris conformément au protocole défini plus loin, nous avons réalisé une désinfection cutanée puis nous avons implanté les osmopompes en sous cutané. L'anesthésie générale a alors été antagonisée par injection intrapéritonéale de 5 mg.kg -1 d'atipamezole. 1.6 Préparation et administration du LPS pour le modèle d'agression pulmonaire Le LPS utilisé dans notre protocole (E. Coli O111 : B4, Sigma-Aldrich, USA) a été préparé en conditions stériles. Pour chaque souris, 10 mg.kg -1 de LPS ont été dilués dans du PBS pour obtenir un volume final de 50 µL. Pour le protocole d'agression aigue pulmonaire induite par le LPS, les souris ont été placées sous anesthésie générale par injection intrapéritonéale de 75 mg.kg -1 de kétamine et de 0,5 mg.kg -1 demedetomidine, puis, la solution contenant le LPS a été administrée par instillation intratrachéale. L'anesthésie générale a ensuite été antagonisée comme précédemment décrit. 1.7 Évaluation clinique quotidienne et mesure non invasive de l'oxymétrie Dans chaque protocole, un examen clinique quotidien des souris a été réalisé afin d’évaluer la viabilité de la souris et de mesurer son poids. Un enregistrement continu non invasif de l'oxymétrie transcutanée, du rythme cardiaque ainsi que de la fréquence respiratoire a été réalisé sur souris vigile quotidiennement par le dispositif MouseOx® Plus device (Starr Life Sciences Corp, USA). Toutes les données obtenues ont été moyennées sur une durée d'enregistrement continue durant entre 5 et 10 minutes. 1.8 Prélèvement biologiques et bio-conservation Immédiatement après le sacrifice de la souris, des prélèvements sanguins et des lavages broncho-alvéolaires (LBA) ont été réalisés et les poumons ont été prélevées. Les prélèvements sanguins ont été réalisés par section des gros vaisseaux thoraciques et stockés dans des aliquotes placés à température ambiante jusqu'à coagulation complète. Au décours, les aliquotes de sang coagulés ont été centrifugés à 1500g pendant 5 minutes à température ambiante. Le sérum et le culot de centrifugation ont alors été séparés et le sérum a été conservé à -20°C. Les LBA ont été réalisés uniquement sur le poumon droit après ligature soigneuse de la bronche souche du poumon gauche, par deux lavages successifs de 500 µL de PBS stérile, puis stockés immédiatement dans des aliquots placés dans de la glace. Les LBA ont alors été centrifugés à 1500g pendant 10 minutes à 4°C. Le surnageant et le culot de centrifugation ont été séparés et le surnageant conservé à -20°C. Le culot de centrifugation a été suspendu à nouveau dans 1 mL de PBS et homogénéisé. Les cellules re-suspendues ont été comptées manuellement sur cellule de Thoma. 100 000 cellules ont alors été étalées sur une lame de verre grâce à un Shandon Cytospin 4 (Thermo electron corporation, USA), puis colorées par une coloration de May-Grünwald Giemsa. Le poumon gauche a été placé dans une solution d'Antigenfix® (réf. 2545826, MM FRANCE, France) pendant 4 heures, rincé par deux bains successifs de PBS, puis progressivement déshydraté par immersion successive dans des bains d’alcool ayant une concentration croissante. Les pièces de poumons ont ensuite été placées dans un bain de Diasolv® (réf. 2545839, MM FRANCE, France) pendant 30 minutes puis inclues en paraffine pendant toute une nuit. 1.9 Comptage des cellules inflammatoire et examen histologique Pour chaque spot cellulaire de LBA préparé par Cytospin, un minimum de 200 cellules ont été manuellement comptées par un opérateur en aveugle du groupe expérimental de la souris étudiée. Chaque leucocyte visualisé a été catégorisé en tant que polynucléaire neutrophile, macrophage/monocyte, ou lymphocyte. Les proportions respectives et les nombres absolus de chaque type cellulaire ont été calculés. Les poumons inclus en paraffine ont été préparés pour l’analyse histologique à l’aide d’un microtome de façon à obtenir des coupes de 5 µm d’épaisseur. Les lames ont ensuite été colorées et examinées par un anatomopathologiste entrainé et en aveugle du groupe expérimental de la souris, de manière à déterminer le score Lung Injury Scoring System (LISS) comme décrit par [10]. 1.10 Détermination de la concentration en protéines totale, en mMPO, en mTNFα et en endocan dans les échantillons Les échantillons de sérum et de LBA ont été décongelés puis homogénéisés par agitation. La concentration en protéines des LBA a été déterminée par le kit Pierce™ BCA Protein Assay (réf. 23227, Thermo Fisher Scientific, USA). La concentration des LBA en mMPO a été déterminée par le kit mMPO DuoSet ELISA kit (réf. DY3667, R&D Systems, USA). La concentration des LBA en mTNFα a été déterminée par le kit mTNFα DuoSet ELISA (réf. DY410, R&D Systems, USA). Le dosage des taux sériques en endocan a été réalisé par le kit DIYEK M1 ELISA kit (réf. LIK-1101, Biothelis, France). 1.11 Statistiques Toutes les analyses statistiques ont été réalisé avec le logiciel SPPS® 26 software (IBM, USA) pour Windows et tous les graphiques présentés avec le logiciel GraphPad Prism 6.0 software. La normalité des variables quantitatives n’a pas été retenue du fait des faibles effectifs. Un test de Mann–Whitney a été utilisé pour comparer la distribution des variables quantitatives non appariées. Pour le premier protocole, l’évaluation de l’effet du groupe expérimental de chaque souris sur les paramètres inflammatoires et l’évolution de l’oxymétrie, a été testé à l’aide d’un modèle mixe linéaire sur l’ensemble de la période étudiée de J0 à J10 en utilisant une approximation de Satterwaite. La variable « Groupe » a été considérée comme un effet fixe et la variable « Temps » comme un effet variable. Nous avons évalué l’effet du groupe expérimental de la même manière pour l’évolution de l’oxymétrie dans le second protocole. Les distributions des évaluations répétées dans le temps d’une même variable quantitative ont été testées par un test de Kruskal-Wallis. Tous les tests ont été réalisés en bilatéral avec un risque alpha fixé à 0.05. 2. Résultats 2.1 L’endocan endogène murin diminue la sévérité de l’inflammation aigue pulmonaire et améliore la dysfonction physiologique pulmonaire. Dans notre premier modèle d’inflammation aigue pulmonaire induite par le LPS, nous avons mis en évidence que le taux sérique d’endocan variait en fonction du temps (p -1 [2.39; 2.78] à J0, 0.42 [0.35; 0.68] à H12 et 2.28 [1.94; 2.57] à J10. Nous avons observé sur l’ensemble de la période allant de J0 à J10, que les phénomènes de diapédèse leucocytaire étaient moins importants chez les souris WT que chez les souris Esm1 -/- (p -/- (respectivement à J1: 450x10 3 cellules [340; 465] vs 775 x10 3 cellules [700; 1500] p 3 cellules [870; 1140] vs 1440x10 3 cellules [1130; 1850] p = 0.011, à J4: 1365x10 3 cellules [985; 2180] vs 2280x10 3 cellules [1520; 3010] p = 0.03 et à J5: 945x10 3 cellules [690; 1160] vs 2270x10 3 cellules [2090; 3300] p = 0.004) (Figure 2B). Le taux maximal de recrutement de leucocytes se situait à J3 pour les souris WT et J4 pour les souris Esm1 -/- . Sur la même période, des résultats comparables étaient trouvés pour les polynucléaires neutrophiles avec une diminution du nombre de neutrophiles retrouvés chez les souris WT versus les souris Esm1 -/- (p -/- à J1, J2, J4 et J5 (respectivement à J1: 335x10 3 cellules [278; 406] vs 696 x10 3 cellules [602; 1425] p = 0.003, à J2: 853x10 3 cellules [689; 950] vs 1117x10 3 cellules [1029; 1756] p = 0.007, à J4: 577x10 3 cellules [195; 1765] vs 1932x10 3 cellules [1251; 2153] p = 0.02 et à J5: 365x10 3 cellules [198; 646] vs 1636x10 3 cellules [1407; 1698] p = 0.01) (Figure 2C). Le recrutement maximal des neutrophiles était observé à J3 pour les souris WT contre J4 pour les souris Esm1 -/- . Sur l’ensemble de la période, nous n’avons pas mis en évidence de différence entre les groupes concernant le recrutement de macrophage (p = 0.57) (Figure 2D). Le recrutement maximal en macrophage était observé à J5 chez les souris WT (687x10 3 cellules.mL -1 [620; 940]) contre J6 chez les souris Esm1 -/- (536x10 3 cellules.mL -1 [358; 753]). Sur la période allant de J0 à J10, les concentrations de mMPO dans les LBA étaient moins importante chez les souris WT que chez les souris Esm1 -/- (p -/- (respectivement 547 µg.mL -1 [441; 1110] vs 1437 µg.mL -1 [1200; 1657] p = 0.015, et 211 µg.mL -1 [191; 417] vs 796 µg.mL -1 [512; 1070] p -1 [772; 1815]) versus J5 pour les souris Esm1-/- (1437 µg.mL -1 [1200; 1657]). Nous n’avons pas mis en évidence de différence entre les groupes concernant les concentrations alvéolaire en mTNFα, ou les concentrations de protéine dans le LBA (Figure 2F and 2G). A l’aide du dispositif de mesure non invasif de l’oxymétrie et en considérant l’ensemble de la période entre J0 à J10, nous avons mis en évidence une amélioration significative de la fonction physiologique pulmonaire en faveur des souris WT (p 2 chez les souris WT à J4 et J5, comparés aux souris Esm1 -/- (respectivement pour le groupe WT et Esm1 -/- : 84% [63; 92] vs 74% [71; 78], p = 0.035 et 81% [61; 85] vs 69% [64; 70], p = 0.017) (Figure 2H). Nous n’avons pas mis en évidence de différence concernant les fréquences cardiaque et respiratoire sur la période entre J0 et J10 (respectivement p = 0.539 and p = 0.075). 2.2 L’administration d’endocan chez des souris Esm1 -/- au décours d’un stimulus inflammatoire diminue l’inflammation pulmonaire et améliore la dysfonction physiologique pulmonaire Le second protocole a examiné les effets biologiques d’une administration continue et sous cutanée d’endocan recombinant murin, 5 jours après l’administration intratrachéale de LPS. Au moment de l’administration intratrachéale de LPS (D0), les taux sériques d’endocan observés chez les souris Esm1 -/- traitées par endocan murin, étaient de 67.8 ng.mL -1 [45.9; 85.3]. A J5, on observait chez les souris Esm1 -/- traitées par endocan une diminution significative du recrutement leucocytaire total, du recrutement en polynucléaires neutrophiles, ainsi que du recrutement en macrophages comparées aux souris Esm1 -/- traitées par PBS (respectivement, 865x10 3 cellules.mL -1 [640; 1130] vs 2130x10 3 cellules [1540; 2550], p = 0.012 pour les leucocytes totaux, 638x10 3 cellules.mL -1 [476; 855] vs 1489x10 3 cellules [1285; 2146] p = 0.012 pour les neutrophiles, et 164x10 3 cellules.mL -1 [141; 255] vs 404x10 3 cellules [354; 610] p = 0.018 pour les macrophages) (Figure 3A, 3B, and 3C). Les concentrations en protéines dans les LBA étaient moins importantes dans le groupe traité par endocan (965 µg.mL -1 [690; 1040] vs 1417µg.mL -1 [1306; 1655], p = 0.05) (Figure 3F). Nous n’avons pas mis en évidence de différence concernant les concentrations en mMPO et mTNFα entre les différents groupes (respectivement pour le groupe traité par endocan et le groupe traité par PBS 1275 µg.mL -1 [774; 1930] vs 1840 µg.mL -1 [1390; 2890] p = 0.145, et 207 pg.mL -1 [178; 373] vs 348 pg.mL -1 [183; 631] p = 0.388) (Figure 3D and 3E). L’évaluation de la dysfonction physiologique pulmonaire est représentée sur la Figure 3G. Sur l’ensemble de la période s’étalant de J0 à J5, les souris traitées par endocan avaient des valeurs de SpO 2 plus élevées comparées aux souris traitées par PBS (p 2 , nous avons observé une différence significative à J4 et J5 en faveur du groupe traité par endocan (84% [76; 89] vs 67% [65; 78], p = 0.023 à J4, et 78% [73; 90] vs 69% [63; 73], p = 0.02 à J5). Sur la même période, aucune différence n’était mise en évidence pour la fréquence cardiaque ou la fréquence respiratoire (respectivement p = 0.771 et p = 0.522). 2.3 La supplémentation en endocan de souris Esm1 -/- diminue les altérations histologiques induite par l’inflammation aigue pulmonaire Dans le premier protocole, nous n’avons pas mis en évidence de différence de valeur de LISS entre le WT et Esm1 -/- (respectivement 0.578 [0.541; 0.680] vs 0.756 [0.530; 0.772], p = 0.699) ( ). Dans le second protocole, une diminution significative des altérations histologiques était observée dans le groupe traité par endocan comparées au groupe traité par PBS (Figure 4A et Figure 4B), avec des valeurs de LISS moins importante dans le groupe endocan (0.571 [0.527; 0.732] vs 0.711 [0.644; 0.794] pour le groupe contrôle, p = 0.04) ( ). 3. Discussion Les tableaux de SDRA sont des entités syndromiques graves secondaires à une atteinte alvéolaire diffuse (DAD). Cette atteinte alvéolaire peut être la conséquence d’un recrutement non contrôlé des polynucléaires neutrophiles du compartiment sanguin vers le compartiment alvéolaire. (2) L’endocan, un protéoglycane excrété par l’endothélium pulmonaire surexprimé en condition inflammatoire, pourrait, en se liant à l’intégrine leucocytaire LFA-1 entrainant une limitation des mécanismes de diapédèse leucocytaire, avoir un rôle anti-migratoire sur les neutrophiles. [11] Pour permettre de pouvoir comparer nos résultats avec les données déjà disponibles, nous avons recueilli tous les paramètres inflammatoires ainsi que réalisé les examens histologiques selon les recommandations internationales de l’American Thoracic Society traitant des mesures validées pour l’étude des inflammations aigues pulmonaires dans des modèle animaux [10]). Pour étudier spécifiquement les effets de l’endocan, toutes les souris C57Bl/6 utilisées dans cette étude étaient identiques en terme d’âge, de poids et de conditions d’élevage. La seule condition qui différait était la présence ou non d’endocan. Pour étudier de manière spécifique les effets d’une administration continue d’endocan, nous avons choisi d’avoir recours à des osmopompes sous cutanées permettant une administration de traitement continue et à débit constant sur une durée totale de 3 jours. Nous avons ensuite sacrifié les souris à J5, au regard des résultats acquis lors du premier protocole réalisé. Pour l’administration d’endocan, nous avons eu recours uniquement à la forme glycosylée de l’endocan murin. Pour s’assurer de la pureté de la forme glycosylée et de l’absence de contaminant, des étapes de qualification ont été réalisé de manière systématique comme décrit précédemment. Les résultats du premier protocole ont mis en évidence que la présence d’endocan endogène (souris WT) diminue la sévérité de l’atteinte inflammatoire pulmonaire induite par le LPS, et améliore la dysfonction physiologique pulmonaire (SpO 2 supérieur dans le groupe WT) ( ). Au décours de l’injection intra-trachéale de LPS, nous avons observé à J1 une importante diminution des taux sériques d’endocan endogène. Au-delà d’une diminution de l’ensemble des paramètres inflammatoires, la présence d’endocan endogène (souris WT) a aussi entrainé une résolution plus précoce de la réaction inflammatoire ( ). Nous n’avons toutefois pas mis en évidence de différence concernant les valeurs du LISS entre les groupes WT et Esm1 -/- ( ). Dans notre second protocole, l’administration continue d’endocan glycosylé murin chez des souris Esm1 -/- au décours d’une instillation intra-trachéale de LPS, a d’une part diminué les paramètres de l’inflammation pulmonaire et d’autre part amélioré la dysfonction physiologique pulmonaire. Nous avons vérifié par des dosages sériques que lors de l’administration continue d’endocan il existait bien de l’endocan circulant. Les résultats montrent des taux circulants d’endocan murin glycosylé se situant entre 60 et 70 ng/ml. Sur l’ensemble de la période entre J0 et J5, le traitement par endocan a entrainé une diminution significative du nombre de leucocytes, du nombre de neutrophiles et de macrophages recrutés au niveau alvéolaire, mais aussi a entrainé une amélioration des paramètres de l’oxygénation sanguine ( ). Enfin, l’administration continue d’endocan chez les souris Esm1 -/- a limité les altérations histologiques pulmonaires représentées par les valeurs de LISS ( ). Au total, toutes ces valeurs confirment que la présence d’endocan (endogène ou exogène) peut, en réponse à un stimulus inflammatoire, non seulement diminuer l’importance de l’inflammation aigue pulmonaire mais aussi améliorer la défaillance physiologique pulmonaire. Par ailleurs, nous avons observé un effet dose avec une réponse plus importante si la concentration sérique en endocan dépasse les taux physiologiques (second protocole). Grâce à l’administration continue d’endocan, nous avons pu restaurer des taux circulant important d’endocan permettant d’étudier et de mettre en évidence son action physiologique propre. Cette étude montre pour la première fois l’efficacité de l’endocan glycosylé dans un modèle d’inflammation aigue pulmonaire induite par LPS. Nous avons étudié l’effet de la forme endogène de l’endocan ainsi que l’effet d’une administration continue d’endocan permettant d’obtenir des concentrations sériques supra physiologiques. Des expérimentations préliminaires avaient montré que des taux sériques élevés en endocan ne pouvaient être atteint et maintenus pendant plusieurs heures au décours d’une injection intra-péritonéale unique en endocan (données non publiées). De façon à mieux étudier l’effet de l’administration d’endocan, une administration par perfusion continue semble donc à privilégier. En conclusion, les résultats ont montré qu’au décours d’un stimulus inflammatoire aigu pulmonaire par instillation intra-trachéale de LPS chez la souris C56Bl/6, la perfusion continue d’endocan chez des souris Esm1 -/- permet de diminuer significativement l’inflammation pulmonaire et améliorer la dysfonction physiologique pulmonaire. Ces résultats confirment que l’endocan glycosylé constitue une solution thérapeutique efficace pour traiter les SDRA. ESM-1 (Endothelial cell Specific Molecule) ou composition pharmaceutique en contenant pour utilisation dans une méthode de traitement ou de prévention d’un syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) chez un patient. ESM-1 ou composition pharmaceutique en contenant pour utilisation dans une méthode selon la revendication 1, dans laquelle le patient est atteint d’une pathologie choisie parmi (i) une infection respiratoire d’origine bactérienne ou virale, telle que la COVID-19, (ii) une dysplasie bronchopulmonaire, (iii) une septicémie, et (iv) un polytraumatisme nécessitant une prise en charge du patient en réanimation. ESM-1 ou composition pharmaceutique en contenant pour utilisation dans une méthode selon l’une quelconque des revendications 1 et 2, dans laquelle le patient est atteint d’une infection respiratoire d’origine bactérienne ou virale. ESM-1 ou composition pharmaceutique en contenant pour utilisation dans une méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle le patient est atteint de la COVID-19. ESM-1 ou composition pharmaceutique en contenant pour utilisation dans une méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle l’ESM-1 formulé pour une administration par voie parentérale, telle que par voie intraveineuse, par voie intramusculaire ou par voie sous-cutanée. ESM-1 ou composition pharmaceutique en contenant pour utilisation dans une méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle l’ESM-1 est administrée au patient à une dose allant de 250 µg/jour à 2000 µg/jour, par exemple à une dose allant de 500 µg/jour à 1000 µg/jour, de préférence à une dose d’environ 600 µg/jour. ESM-1 ou composition pharmaceutique en contenant pour utilisation dans une méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle l’ESM-1 est administrée au patient avec une dose de charge allant de 50 µg à 500 µg, de préférence une dose d’environ 150 µg, puis une dose allant de 50 µg à 250 µg, de préférence une dose d’environ 75 µg, toutes les 4 heures. ESM-1 ou composition pharmaceutique en contenant pour utilisation dans une méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, dans laquelle l’ESM-1 est administrée au patient pendant une durée allant de 5 jours à 10 jours. ESM-1 ou composition pharmaceutique en contenant pour utilisation dans une méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, dans laquelle l’ESM-1 est administré à une dose adaptée pour maintenir chez le patient une concentration plasmatique en ESM-1 supérieure à 5 ng/mL de plasma. ESM-1 ou composition pharmaceutique en contenant pour utilisation dans une méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, dans laquelle l’ESM-1 est administré au patient en association avec une corticothérapie, par exemple en association avec de la dexamethasone. ESM-1 ou composition pharmaceutique en contenant pour utilisation dans une méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, dans laquelle la méthode comprend les étapes consistant à : (a) mesurer la quantité d’ESM-1 dans un échantillon de sang du patient, (b) administrer au patient l’ESM-1 ou la composition en contenant lorsque la quantité d’ESM-1 mesurée à l’étape (a) est inférieure à une valeur de référence. ESM-1 ou composition pharmaceutique en contenant pour utilisation dans une méthode selon la revendication 11, dans laquelle la valeur de référence va de 2,5 ng/mL de plasma à 5 ng/mL de plasma, de préférence la valeur de référence est égale à 5 ng/mL de sang. ESM-1 ou composition pharmaceutique en contenant pour utilisation dans une méthode selon l’une quelconque des revendications 11 et 12, dans laquelle les étapes (a) et (b) sont répétées pendant 5 jours à 10 jours, par exemple tous les jours pendant 5 jours à 10 jours.