Brevet FR3133609A1 — publié le 20230922

La présente demande concerne un ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1, caractérisé en ce qu’il s’agit d’un nanocorps. Elle concerne également un ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1, caractérisé en ce qu’il inhibe son activité . Figure à publier avec l’abrégé : Fig 3A Ligands spécifiques de la glycoprotéine PCPE-1 et leurs utilisations DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne des ligands spécifiques de la protéine PCPE-1 ( Procollagen C-proteinase enhancer-1 ). Elle concerne également leur utilisation en imagerie médicale et dans des méthodes de diagnostic et de traitement. Plus particulièrement elle porte sur deux types de ligands : certains capables de se lier à PCPE-1 pour une utilisation en imagerie, et d’autres ligands dit antagonistes capables de se lier à PCPE-1 et d’inhiber son activité, pour une utilisation en thérapeutique. Dans un mode de réalisation de l’invention, ces ligands antagonistes sont utilisés pour le diagnostic et le traitement des fibroses et du cancer. ARRIERE PLAN DE L'INVENTION Les collagènes fibrillaires sont les protéines les plus abondantes dans le corps humain et les principaux composants des matrices extracellulaires. Ils façonnent les organes et les tissus et jouent un rôle crucial dans le maintien de leur homéostasie ou de leur réparation après des blessures. Longtemps considérés comme ayant un rôle structurel dans les tissus, les collagènes sont maintenant reconnus comme étant des acteurs à part entière de nombreux processus cellulaires tels que l’adhésion, la prolifération, la migration et la différenciation cellulaire. Cependant ces collagènes sont également associés à de nombreux processus pathologiques et sont des cibles de choix pour le développement de nouveaux outils de diagnostic ou de nouveaux traitements. Ainsi, la fibrose, qui se caractérise par un dépôt excessif de matrice extracellulaire composée principalement de fibres de collagène, est un dénominateur commun majeur de nombreuses pathologies qui affecte fortement la progression de la maladie, l’efficacité et la délivrance de thérapies (Henderson et coll. 2020). Par ailleurs, la production de collagène anormal par des cellules tumorales ou par le microenvironnement joue un rôle majeur dans l’échappement immunitaire de ces cellules et contribue fortement à leur capacité métastatique ainsi qu’à leur dormance et leur résistance aux traitements (Shi et coll. 2022). De fait, le ciblage du collagène et plus précisément de toutes les étapes clés permettant sa biosynthèse, sa sécrétion, sa maturation ou sa macrostructuration sont autant de cibles d’intérêt pour limiter la production excessive de collagène associée à ces processus. On peut citer LARP6, le complexe P4H, l’HSP47, SHMT2, les LOX, … (Shi et coll. 2022). Parmi les cibles évoquées, celles impliquées dans la maturation protéolytique des régions N- et C-terminales semblent particulièrement intéressantes. Ainsi les BTP ( bone morphogenetic protein-1 (BMP1)/tolloid-like proteinases ) sont les principales protéases responsables de l'élimination des C-propeptides des procollagènes fibrillaires, généralement considérée comme l'étape limitant la vitesse de formation des fibrilles de collagène de type 1. Cependant, bien que les BTP soient des cibles de choix, elles possèdent, outre les collagènes, une activité dirigée contre de nombreux autres substrats impliqués dans plusieurs voies (activation de facteurs de croissance, angiogenèse, minéralisation, progression tumorale...), ce qui signifie qu'inhiber leur activité pourrait entraîner des effets secondaires indésirables. Un autre régulateur clé de la fibrillogenèse du collagène est PCPE-1 ( Procollagen C-Proteinase Enhancer-1 ), une glycoprotéine sécrétée qui stimule spécifiquement le traitement C-terminal du procollagène fibrillaire par les BTP. PCPE-1 est composé de deux domaines CUB (Complement-Uegf-BMP-1) et d'un domaine C-terminal NTR (Netrin-like), séparés par un long linker. Les domaines CUB sont nécessaires et suffisants pour l'activité de PCPE-1 (Kronenberg 2009 ; Vadon 2011) et cela est dû à leur interaction directe et étroite avec le C-propeptide des procollagènes. On pense que cette interaction permet la déstructuration locale du trimère du procollagène qui facilite le clivage par les BTP, et explique pourquoi PCPE-1 n'a aucun effet sur les autres substrats de BMP-1. Par ailleurs, des données ont décrit la surexpression de PCPE-1 dans différents contextes fibrotiques (Lagoutte et al. Matrix Biol Plus 2021), la désignant comme une cible prometteuse pour suivre et/ou traiter la fibrose. En particulier, une corrélation entre le taux d’expression de PCPE-1 et les fibroses, en particulier la fibrose cardiaque, a été établie (Lagoutte et al., BioRxiv, 2021). La détection directe de PCPE-1 dans les fluides biologiques par immuno-essai a également été proposée comme méthode de diagnostic (US2012270246 pour la formation des os, WO2017065206A1 pour la NASH). Cependant, il n’existe à l’heure actuelle aucune méthode robuste pour détecter PCPE-1 de manière non invasive dans les tissus, et ainsi suivre l’accumulation du collagène fibrotique. D’autre part, l’absence d’outils performants permettant d’inhiber l’action de PCPE-1 empêchait jusqu’à présent d’évaluer une stratégie pharmacologique ciblant cette protéine. De plus, à ce jour, aucun médicament capable de bloquer l'interaction entre PCPE-1 et les C-propeptides du procollagène n'a été rapporté. Au niveau du diagnostic de la fibrose cardiaque, l’analyse histologique de biopsies cardiaques reste la technique traditionnelle, malgré son caractère invasif et le fait que cette technique ne permet d’analyser qu’une petite portion du tissu cardiaque, pas forcément représentative de l’ensemble. L’utilisation de l’IRM associée à l’injection de gadolinium permet désormais l’imagerie de grandes zones fibrotiques mais n’est pas complètement spécifique de la fibrose, et ne détecte pas la fibrose interstitielle. Une des caractéristiques des pathologies fibrosantes et des cancers est leur caractéristique évolutive, ce qui implique que même si, notamment dans le cas de la fibrose elle est la résultante d’un stress ou d’une blessure, la production excessive de collagène est continue et ne conduit à des effets pathologiques et fonctionnels qu’au terme d’une période parfois très longue. De-là un besoin important de pouvoir détecter précocement et suivre dans le temps l’évolution de cette production excessive de collagène. A ce titre, l’imagerie moléculaire, couplée à des systèmes de détection de plus en plus sensibles (imagerie isotopique, fluorescence, …), apparaît aujourd’hui comme un outil indispensable pour le suivi longitudinal de ces pathologies ainsi que pour le suivi de l’effet thérapeutique de nouveaux traitements. A ce jour, la principale approche retenue pour l’imagerie moléculaire directe du collagène, notamment dans des contextes fibrotiques, repose sur l’utilisation de sondes ciblant directement le collagène, principalement par hybridation. On peut citer les peptides collagelin, EP-3533 ou CBP8 (Désogère et al ., 2019). Bien que les résultats soient prometteurs, d’autres voies indirectes, comme celle décrite dans la présente invention, présenteraient des avantages certains en limitant possiblement le rapport signal/bruit de fond. C’est le cas notamment des sondes ciblant les récepteurs intégrines au collagène. Le recours à des immunoglobulines pour le ciblage de protéines d’intérêt a largement fait ses preuves, aussi bien dans une finalité thérapeutique que d’imagerie moléculaire et celles-ci représentent aujourd’hui la majorité des biomédicaments commercialisés. Au cours des dernières années, les échafaudages d'immunoglobulines, dépourvus des propriétés indésirables des immunoglobulines conventionnelles (grand poids moléculaire, composition hétérotétramérique, liaisons disulfure), sont apparus comme des alternatives aux anticorps classiques. Parmi eux, les nanocorps, également appelés VHH (Variable Heavy-chain domains of Heavy-chain antibodies), dérivés de la chaîne lourde des immunoglobulines de camélidés, découverts au début des années 90, ont démontré leur intérêt aussi bien en thérapeutique qu’en diagnostic (Muyldermans 2021). Les nanocorps sont les plus petits fragments d'anticorps (environ 15 kDa), hautement solubles et stables, ils peuvent être facilement produits en grande quantité dans des systèmes procaryotes. De plus, leur paratope convexe est bien adapté pour se lier aux cavités difficiles à cibler à la surface de l'antigène. Trois types d’approches peuvent être utilisés pour sélectionner des nanocorps spécifiques d'un antigène : à partir de banques immunitaires, de banques naïves ou de banques synthétiques. Une banque immunitaire est générée par l'immunisation d'un camélidé avec la cible. Ce sont les banques de nanocorps les plus utilisées, avec cependant une limite pour certaines cibles qui ne sont pas immunogènes ou trop toxiques pour l'immunisation des animaux. En raison de ces limitations, plusieurs banques synthétiques ont été développées. Une sélection peut être effectuée parmi ces banques, pour identifier des nanocorps spécifiques d’une ou plusieurs protéine(s) cible(s). A ce jour, plus de 1400 VHH ont été sélectionnés avec succès et sont utilisés comme outils de recherche, dans des applications biotechnologiques ou diagnostiques. BREVE DESCRIPTION DE L’INVENTION La présente invention concerne un ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1, caractérisé en ce qu’il s’agit d’un nanocorps, aussi désigné par l’abbréviation VHH ( Variable domain of the Heavy chain of Heavy chain-only antibodies ). La présente invention est également relative à un ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1, caractérisé en ce qu’il inhibe son activité. Ce ligand spécifique est également dénommé ligand antagoniste de PCPE-1. Il s’agit en particulier d’un nanocorps antagoniste de PCPE-1. Un autre objet de l’invention est un ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 constitué d’une combinaison de deux ou trois nanocorps tels que décrits ci-dessus. La présente invention concerne aussi un acide nucléique codant pour un nanocorps ou une combinaison de deux ou trois nanocorps, tel(le) que décrit(e) dans la présente demande. La présente invention a également pour objet un ligand spécifique antagoniste de la glycoprotéine PCPE-1 pour son utilisation en tant que médicament, et plus spécifiquement pour son utilisation médicale dans le traitement du cancer ou d’une fibrose, notamment de la fibrose cardiaque. La présente invention concerne aussi un ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 tel que décrit dans la présente demande, caractérisé en ce qu’il est couplé à un marqueur détectable, notamment un marqueur utilisé en imagerie médicale. Un autre objet de l’invention est l’utilisation d’un tel ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 couplé à un marqueur détectable, pour le suivi in vivo d’un état pathologique par imagerie médicale. Un autre objet de l’invention est un ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 tel que décrit ci-dessus, pour son utilisation théranostique pour le traitement et le suivi in vivo d’un état pathologique par imagerie médicale. Enfin, la présente demande concerne un kit pour déterminer l’activité et/ou la quantité de la glycoprotéine PCPE-1 dans un échantillon biologique in vitro ou ex vivo , comprenant : - un ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 tel que décrit ci-dessus, et - des réactifs de détection. LEGENDES DES FIGURES Figure 1 : Caractérisation par SPR de l’interaction PCPE-1 / VHHs Injection de 200 nM de VHHs sélectionnés par immunisation sur PCPE-1 immobilisé (645 RU c’est-à-dire Resonance Units ). Injection de 200 nM de VHHs sélectionnés à partir d’une banque synthétique sur PCPE-1 immobilisé (645 RU). Figure 2 : Spécificité des VHHs % d’inhibition de l’interaction entre VHHs (50 nM) et PCPE-1 immobilisé lorsque l’on co-injecte le domaines CUB1 ou CUB2 (250 nM). Injection de 250 nM de VHH-I5 suivie d’une injection de la même concentration de VHH-I5 en combinaison avec 250 nM d’un second VHH. Injection de 250 nM de VHH-H4 suivie d’une injection de la même concentration de VHH-H4 en combinaison avec 250 nM d’un second VHH. Le VHHs I5 (813 RU) est biotinylé et immobilisé sur puce streptavidine, puis des concentrations croissantes de PCPE-1 (en noir) ou PCPE-2 (en gris) sont injectées. Le VHH H4 (491 RU) est biotinylé et immobilisé sur puce streptavidine, puis des concentrations croissantes de PCPE-1 ou PCPE-2 sont injectées. D, E : Les interactions sont modélisées (en pointillé) à l’aide du modèle de Langmuir (logiciel Biacore T200 Evaluation, Cytiva) Figure 3 : Inhibition de l’activité de PCPE-1 par les VHHs % d’inhibition de l’interaction PCPE-1 / mini-procollagène III en présence des VHHs : l’interaction de PCPE-1 (5 nM) avec le mini-procollagène III immobilisé est mesurée puis comparée à l’interaction obtenue lorsque l’on co-injecte PCPE-1 (5 nM) avec 250 nM de VHHs. Moyenne ± SD, n = 3. Effet des VHHs sur l’activité de PCPE-1 : CPIII-Long est incubé avec BMP-1 et 75 nM de PCPE-1 en absence ou présence de 2 µM de VHHs (1 h, 37°C). Analyse par SDS-PAGE (gel 4-20%, en présence de DTT, coloration au bleu de Coomassie). Le % d’inhibition est calculé par comparaison avec la condition PCPE-1 seul (gel représentatif de n=3 expériences). Immuno-détection du procollagène I et de ses produits de clivage C-terminaux dans le milieu de culture de fibroblastes de cœur de rats, après 48h de culture en absence ou en présence de PCPE-1 (5 µg/ml) et de VHHs (15 µg/ml). Analyse par western blot à l’aide d’un anticorps anti C-propeptide du procollagène I (LF41). Quantification relative du C-propeptide libéré par densitométrie (moyenne ± SD, n = 3). Figure 4 : Caractérisation du diacorps D1 (H4-GS 8 -I5) de séquence SEQ ID NO. 21 Analyse par SPR de l’interaction de D1 avec PCPE-1 immobilisé. Injections séquentielles de concentrations croissantes de D1 (0-250 nM) et modélisation de l’interaction (en pointillé) à l’aide du modèle de Langmuir (logiciel Biacore T200 Evaluation, Cytiva). Inhibition de l’interaction PCPE-1 / mini-procollagène III en présence du diacorps D1 : l’interaction de PCPE-1 (5 nM) avec le mini-procollagène III immobilisé est mesurée puis comparée à l’interaction obtenue lorsque l’on co-injecte PCPE-1 (5 nM) avec des quantités croissantes (0-200 nM) de D1. Le % de fixation résiduelle de PCPE-1 est représenté en fonction de la concentration en D1. D1 inhibe l’activité de PCPE-1 : CPIII-Long est incubé avec BMP-1 et 75 nM de PCPE-1 en absence ou présence de 2 µM de nanocorps monovalent ou bivalent (1 h, 37°C). Analyse par SDS-PAGE (gel 4-20%, en présence de DTT, coloration au bleu de Coomassie). Le % d’inhibition est calculé par comparaison avec la condition PCPE-1 seul. Immuno-détection du procollagène I et de ses produits de clivage C-terminaux dans le milieu de culture de fibroblastes de cœur de rats, après 48h de culture en absence ou en présence de PCPE-1 (5 µg/ml) et du diacorps D1(15 µg/ml). Analyse par western blot à l’aide d’un anticorps anti C-propeptide du procollagène I (LF41). Quantification relative du C-propeptide libéré par densitométrie (moyenne ± SD, n = 3) en absence ou en présence de PCPE-1 (5 µg/ml) et avec ou sans le diacorps D1. Ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 présentant une constante d’affinité K D inférieure à 100 nM, caractérisé en ce qu’il s’agit d’un nanocorps. Ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 présentant une constante d’affinité K D inférieure à 100 nM, caractérisé en ce qu’il inhibe son activité, en particulier en inhibant son interaction avec le domaine C-terminal des procollagènes . Ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 selon la revendication 2, caractérisé en ce qu’il s’agit d’un nanocorps. Ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 selon l’une des revendications 1 ou 3, caractérisé en ce que chaque nanocorps comprend trois régions déterminant la complémentarité (CDRs) avec PCPE-1, lesdits trois CDRs présentant au moins 80% d’identité de séquence avec les séquences suivantes : a) CDR1 : SEQ ID NO. 1, CDR2 : SEQ ID NO. 2 et CDR3 : SEQ ID NO. 3 ; ou b) CDR1 : SEQ ID NO. 4, CDR2 : SEQ ID NO. 5 et CDR3 : SEQ ID NO. 6 ; ou c) CDR1 : SEQ ID NO. 7, CDR2 : SEQ ID NO. 8 et CDR3 : SEQ ID NO. 9 ; ou d) CDR1 : SEQ ID NO. 10, CDR2 : SEQ ID NO. 11 et CDR3 : SEQ ID NO. 12 ; ou e) CDR1 : SEQ ID NO. 13, CDR2 : SEQ ID NO. 14 et CDR3 : SEQ ID NO. 15. Ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 selon l’une des revendications 1, 3 ou 4, dont la séquence peptidique présente au moins 90% d’identité avec l’une des séquences SEQ ID NO. 16 à SEQ ID NO. 20. Ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 constitué d’une combinaison de deux ou trois nanocorps selon l’une des revendications 1, 3, 4 ou 5, en particulier d’une combinaison de deux séquences polypeptidiques présentant chacune au moins 90% d’identité avec l’une des séquences SEQ ID NO. 16 à SEQ ID NO. 20, optionnellement comprenant de plus un ou deux peptides de liaison. Ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 selon la revendication 6, dont la séquence polypeptidique présente au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO. 21. Acide nucléique codant pour un nanocorps selon l’une des revendications 1, 3, 4 ou 5, ou codant pour une combinaison de deux ou trois nanocorps selon l’une des revendications 6 ou 7. Ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 selon l’une des revendication 2 à 7, pour son utilisation en tant que médicament. Ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 selon l’une des revendication 2 à 7, pour son utilisation médicale dans le traitement du cancer ou d’une fibrose, notamment de la fibrose cardiaque. Ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 selon l’une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu’il est couplé à un marqueur détectable. Utilisation d’un ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 selon la revendication 11, pour le suivi in vivo d’un état pathologique par imagerie médicale. Ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 selon la revendication 11, pour son utilisation théranostique pour le traitement et le suivi in vivo d’un état pathologique par imagerie médicale. Kit pour déterminer l’activité et/ou la quantité de la glycoprotéine PCPE-1 dans un échantillon biologique in vitro ou ex vivo , comprenant : - un ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 selon l’une des revendications 1 à 7, et - des réactifs de détection.