Brevet FR3127501A1 — publié le 20230331

L’invention se rapporte à une technique permettant de déplacer différents objets tels que des cellules (6) et des particules (7) d’hydrogel ou d’un matériau compressible, en suspension dans un fluide (5), de manière à former une structure en couches semblable à un tissu d’organe humain. Une onde acoustique stationnaire (4) est propagée dans le fluide (5), de manière à positionner les cellules (6) sur un nœud de pression et les particules (7) sur un ventre de pression. A cet effet, les cellules (6) ont un contraste acoustique positif par rapport au fluide (5), tandis que les particules (7) ont un contraste acoustique négatif par rapport au fluide (5). Figure pour l’abrégé : Fig. 2 Structuration d’un ensemble d’objets du type cellules et particules micrométriques par force acoustique L’invention se rapporte au domaine de la biotechnologie et en particulier de la structuration d’ensembles cellulaires, par exemple en vue de reconstruire ou de modéliser des tissus vivants. L’invention présente un intérêt particulier mais nullement limitatif dans les secteurs de la thérapie cellulaire, de la modélisation pharmacologique, de l’agro-alimentaire par exemple pour la culture de viande, de micro-algues ou de végétaux, ou encore de l’aérospatial, notamment pour la culture cellulaire en conditions de microgravité. État de la technique antérieure Dans le contexte de la recherche portant sur la reconstruction et la modélisation d’organes sur puces (« organ-on-a-chip » en anglais) et d’organoïdes, un nombre croissant d’approches expérimentales visent à permettre la structuration d’ensembles cellulaires. Les techniques les plus utilisées dans cet objectif incluent la manipulation de cellules au sein de dispositifs microfluidiques et la formation de tissus par fabrication additive. Une autre technique, décrite dans le document suivant, connue consiste à structurer des cellules par lévitation acoustique : Bouyer et al. A bio- Acoustic Levitational (BAL) Assembly Method for Engineering of Multilayered , 3D Brain- Like Constructs , Using Human Embryonic Stem Cell Derived Neuro- Progenitors , Adv. Mater. 2016, 28, 161-167 . Cette technique permet de structurer des cellules en couches dans l’objectif d’établir des connexions entre cellules de différentes couches mais ne permet pas toutefois pas de contrôler de manière satisfaisante le développement de telles connexions. De manière générale, les techniques connues dans ce domaine sont complexes et coûteuses, peuvent nécessiter des durées importantes pour structurer et cultiver des cellules et, dans la mesure où elles sont mises en œuvre in vitro, peuvent entraîner la mort d’un grand nombre de cellules. Dans le but de surmonter les inconvénients précités, il est proposé dans le cadre de la présente invention un procédé de structuration d’un ensemble d’objets, comprenant : – une étape de disposition dans une cavité d’un fluide et desdits objets en suspension dans le fluide, et – une étape de génération d’une onde acoustique stationnaire dans la cavité de manière à produire une force de radiation acoustique entraînant un déplacement des objets dans la cavité, lesdits objets comprenant : – des premiers objets qui présentent un contraste acoustique positif par rapport au fluide, et – des deuxièmes objets qui présentent un contraste acoustique négatif par rapport au fluide. La propagation d’une onde acoustique stationnaire dans la cavité permet de former dans la cavité, le long de la direction de propagation, un ou plusieurs nœuds, c’est-à-dire des endroits où la pression du fluide est nulle, et un ou plusieurs ventres ou anti-nœuds, c’est-à-dire des endroits où cette pression est maximale. Les premiers objets présentant un contraste acoustique, c’est-à-dire un facteur de densité-compressibilité, positif par rapport au fluide, ceux-ci vont être transportés par la force de radiation acoustique vers un nœud de pression. Les deuxièmes objets présentant quant à eux un contraste acoustique, ou facteur de densité-compressibilité, négatif, ceux-ci vont être transportés par la force de radiation acoustique vers un ventre de pression. L’invention permet ainsi de former dans la cavité un ou plusieurs agrégats de premiers objets et un ou plusieurs agrégats de deuxièmes objets sous forme de couches, ou feuillets, qui se succèdent le long de la direction de propagation, cela de manière extrêmement rapide – typiquement en quelques secondes – et à l’aide d’un matériel particulièrement simple à mettre en œuvre et peu coûteux. Une telle structure en couches s’apparente à la structure de tissus d’organes humains qui comprennent typiquement des couches de cellules séparées par des couches d’une matrice extracellulaire. Par exemple, les épithéliums, notamment cardiaques ou pulmonaires ou endothéliaux, peuvent comprendre des couches différenciées ou non qui reposent dans un certain nombre de cas sur des lames basales de nature protéique, par exemple des cellules épithéliales ou musculaires. Pour autre exemple, la barrière hémato-encéphalique ou le parenchyme cérébral comprennent typiquement des couches de neurones interconnectés entre elles. De surcroît, l’invention permet de maintenir en lévitation acoustique l’ensemble des objets ainsi structuré, sous l’action de l’onde acoustique stationnaire dont la génération peut être maintenue pendant la durée requise, par exemple plusieurs heures ou jours, afin de favoriser les interactions entre objets lorsque ceux-ci sont vivants, en particulier lorsqu’ils sont formés par des cellules biologiques. L’invention permet ainsi de réaliser une culture cellulaire en lévitation acoustique, en contrôlant la perméabilité et par suite le développement des connexions et interactions entre couches de cellules formant les premiers objets, par un choix de deuxièmes objets formant une ou plusieurs couches de porosité choisie. Cette approche innovante permet aussi de limiter le contact des objets avec des parois ou surfaces, en préservant ainsi leur intégrité mécanique et fonctionnelle. Dans la présente description, un « objet » désigne un élément vivant ou inerte ayant de préférence une taille petite par rapport à la longueur de l’onde acoustique générée dans la cavité. A titre d’exemple non limitatif, les objets peuvent typiquement avoir une taille micrométrique, par exemple comprise entre 1 µm et 100 ou plusieurs centaines de µm. Ainsi, dans un mode de réalisation préféré mais nullement limitatif, lesdits premiers objets sont des éléments vivants tels que des cellules biologiques, par exemple du type eucaryotes ou prokaryotes. Lesdits deuxièmes objets peuvent quant à eux être des éléments inertes tels que des particules comprenant un hydrogel, par exemple à base de collagène, de gélatine, ou encore de fibrine et de protéine de matrice extracellulaire. En variante non limitative, les deuxièmes objets peuvent comprendre un élastomère compressible, par exemple du polydiméthylsiloxane. L’invention peut toutefois être mise en œuvre avec des objets de taille différente, c’est-à-dire située en-dehors de la plage précitée. Ainsi, les objets ou certaines d’entre eux peuvent avoir une taille inférieure à 1 µm, en étant par exemple formés par des bactéries ou des virus, et/ou avoir une taille de plusieurs centaines de µm. Les objets, notamment les premiers objets, ou certains d’entre eux, peuvent être des éléments muli-cellulaires ou des objets formés artificiellement ou encore des objets prélevés sur un organe. Le fluide dans lequel les objets sont en suspension est de préférence un liquide qui, selon l’application envisagée, peut comprendre de l’eau ou former un milieu de culture. L’invention fournit ainsi une solution simple pour reconstituer des tissus artificiels à des fins de recherche ou encore dans le cadre de thérapies cellulaires. L’invention fournit par ailleurs une solution particulièrement précise en termes de positionnement des objets dans l’espace et qui permet le cas échéant de contrôler le développement d’interactions intercellulaires. La simplicité et la précision de cette technique tiennent notamment au nombre limité de paramètres de contrôle, à savoir la masse volumique et la vitesse de propagation d’onde sonore respectives du fluide et des objets, ainsi que la vitesse et la fréquence de l’onde acoustique. Bien entendu, de nombreuses variantes peuvent être mises en œuvre sur la base du principe décrit ci-dessus. Par exemple, d’autres objets peuvent être injectés dans le fluide après positionnement des premiers et deuxièmes objets, de manière à former par exemple des agrégats supplémentaires ou complémentaires. Dans un mode de réalisation particulier, l’onde acoustique stationnaire générée dans la cavité a une longueur d’onde inférieure au double d’une dimension de la cavité selon une direction de propagation de l’onde acoustique stationnaire. De préférence, cette longueur d’onde est inférieure ou égale à cette dimension. Il est préféré que l’onde acoustique stationnaire présente au moins un ventre et au moins un ou deux nœuds. Cela permet, dans le cadre d’une variante de réalisation privilégiée, de former deux couches de premiers objets séparés par une couche de deuxièmes objets. Notamment dans le cadre d’une telle variante, l’utilisation d’hydrogel ou d’élastomère compressible pour former les deuxièmes objets permet de constituer une couche intermédiaire poreuse, autorisant le développement d’interactions entre les couches de premiers objets s’étendant de part et d’autre de cette couche intermédiaire, lorsque les premiers objets comprennent des cellules vivantes. L’invention permet non seulement de réaliser une culture cellulaire en lévitation acoustique mais aussi, de manière alternative ou complémentaire, d’initier ou de poursuivre un tel processus en maintenant les objets en position à l’aide d’une matrice. Notamment, le procédé peut comprendre, après positionnement des objets sous l’action de la force de radiation acoustique, une étape d’introduction dans la cavité d’une substance de manière à former une matrice apte à soutenir les premiers objets. Cette substance est de préférence une substance active biocompatible favorisant le changement de phase du milieu constitué par le fluide. Cette substance peut comprendre un prépolymère d’hydrogel ou un autre élément apte à former une matrice sous forme de gel. Cette substance peut comprendre un catalyseur et/ou un photoinitiateur. Une matrice sous forme de gel permet de maintenir adéquatement les objets en position dans l’espace tout en étant élastiquement déformable. Par ailleurs, il est préféré que la matrice soit poreuse, que celle-ci soit sous forme de gel ou sous une autre forme. La porosité de la matrice rend celle-ci perméable et perfusable, de manière à autoriser le développement de connexions cellulaires. Dans une variante de réalisation, ladite substance comprend un matériau photopolymérisable, le procédé comprenant, après introduction de la substance dans la cavité, une étape de stimulation lumineuse de la substance de manière à la polymériser. L’invention permet ainsi de sculpter une matrice de soutien de l’ensemble structuré des objets, en particulier des premiers objets. Dans le cadre des différentes variantes de réalisation qui viennent d’être décrites, le procédé peut comprendre, après positionnement des objets sous l’action de la force de radiation acoustique, une étape d’incubation des objets. Par exemple, la cavité et son contenu peuvent à cet effet être placés dans un incubateur. L’incubation permet de favoriser la différenciation, l’auto-organisation et la maturation de couches cellulaires. Dans un mode de réalisation, le procédé comprend, après positionnement des objets sous l’action de la force de radiation acoustique, une étape de chauffage des deuxièmes objets de manière à les fusionner. L’étape de chauffage peut être réalisée à l’aide d’une nappe laser. Lorsqu’il est recouru à une matrice de soutien telle que décrite ci-dessus, une telle étape de chauffage est de préférence réalisée avant formation de cette matrice. Dans un mode de réalisation, le procédé comprend, après positionnement des objets sous l’action de la force de radiation acoustique, une étape d’encapsulation des premiers objets. De préférence, cette étape d’encapsulation comprend une introduction dans la cavité de troisièmes objets présentant un contraste acoustique positif par rapport au fluide. Les troisièmes objets peuvent ainsi être transportés par la force de radiation acoustique vers un nœud de pression pour former autour des premiers objets qui s’y trouvent une coque de protection. A titre d’exemple, les troisièmes objets peuvent comprendre des billes d’hydrogel ou un autre matériau permettant de former une coque de protection poreuse. L’étape d’encapsulation est de préférence mise en œuvre, mais non obligatoirement, lorsqu’il n’est pas recouru à l’utilisation d’une matrice de soutien. L’invention peut aussi être mise en œuvre à des fins de thérapie cellulaire, par exemple par injection in vivo d’une culture ou proto-culture réalisée à l’aide des principes décrits dans ce document. D’autres avantages et caractéristiques de l’invention apparaîtront à la lecture de la description détaillée, non limitative, qui suit. La description détaillée qui suit fait référence aux dessins annexés sur lesquels : est une vue schématique d’un dispositif comprenant une cavité et un transducteur apte à générer une onde acoustique stationnaire dans la cavité, la cavité contenant un fluide avec des objets en suspension qui sont distribués de manière relativement homogène dans la cavité avant de subir les effets de l’onde acoustique ; est une vue schématique du dispositif de la , dans laquelle les objets ont été déplacés par une force de radiation acoustique produite par l’onde acoustique de sorte à être respectivement alignés sur un nœud ou un ventre de cette onde ; est une vue schématique illustrant un phénomène de diffusion entre couches de cellules ; est une vue schématique illustrant un phénomène de développement d’extensions cellulaires ; est une vue schématique illustrant un phénomène de migration de cellules ; est une vue schématique du dispositif de la , les objets étant maintenus dans la configuration de la à l’aide d’une matrice de gel. Description détaillée de modes de réalisation Il est représenté sur les figures 1 et 2 un dispositif permettant de mettre l’invention en œuvre. Ce dispositif comprend d’une part un récipient qui forme une cavité 1 apte à contenir un fluide et/ou différentes substances sous forme par exemple de liquide ou encore de gel. De manière générale, la cavité 1 s’étend le long d’une direction A1, qui correspond dans cet exemple à une direction verticale. La cavité 1 présente le long de la direction A1 une dimension B1 qui correspond dans cet exemple à une hauteur de la cavité 1. La cavité 1 a ici une forme globalement cylindrique. Bien entendu, la cavité 1 peut avoir une autre géométrie, par exemple une section rectangulaire. D’autre part, le dispositif des figures 1 et 2 comprend un système de génération d’ondes acoustiques. Dans cet exemple, ce système comprend un transducteur piézoélectrique 2 disposé au niveau d’une première extrémité de la cavité 1 selon la direction A1, en l’occurrence verticalement en-dessous de la cavité 1, ainsi qu’un réflecteur acoustique 3 qui délimite une deuxième extrémité de la cavité 1 selon la direction A1, en étant en l’occurrence disposé verticalement au-dessus de la cavité 1. Ce système est configuré pour pouvoir générer dans la cavité 1 et propager dans le fluide qu’elle contient une onde acoustique stationnaire 4, selon une direction de propagation qui correspond à la direction A1. L’onde stationnaire 4 ainsi générée peut avoir une fréquence identique à la fréquence de résonance de la cavité 1, laquelle forme par conséquent un résonateur. Alternativement, cette onde stationnaire 4 peut avoir une fréquence différente de la fréquence de résonance de la cavité 1. Dans tous les cas, le système est configuré pour pouvoir générer, notamment, une onde 4 ayant une longueur d’onde inférieure ou égale au double de la hauteur B1 de la cavité 1, afin de former le long de la direction A1 au moins un nœud de pression et au moins un ventre de pression. Dans cet exemple, le transducteur 2 est un transducteur à large bande équipé d’une source ultrasonore. Un tel transducteur 2 permet de modifier la position du ou des nœuds de l’onde 4 le long de la direction A1 et/ou la distance entre différents nœuds de l’onde 4, en jouant sur la fréquence de cette onde 4. Dans le cadre de l’invention, le dispositif qui vient d’être décrit, ou tout dispositif analogue, est mis en œuvre afin de positionner des objets de petites tailles, typiquement de taille micrométrique, au sein de la cavité 1 selon une organisation spatiale déterminée par un ou plusieurs paramètres de l’onde 4, notamment sa fréquence. A cet effet, la cavité 1 est remplie d’un fluide 5 et d’objets 6 et 7 en suspension dans ce fluide 5. Dans cet exemple non limitatif, les objets 6 sont des cellules biologiques, le fluide 5 forme un milieu de culture pour ces cellules 6 et les objets 7 sont des billes de polydiméthylsiloxane. A titre indicatif, chacun des objets 6 et 7 a une taille comprise entre 1 µm et 100 µm et la hauteur B1 de la cavité 1 est de plusieurs centimètres. Dans cet exemple, chacun des objets 6 présente une masse volumique supérieure à la masse volumique du fluide 5. A contrario, chacun des objets 7 présente une masse volumique inférieure à la masse volumique du fluide 5. Les objets 6 sont en outre choisis de sorte que la vitesse de propagation d’une onde acoustique dans ces objets 6 soit supérieure à la vitesse de propagation de cette onde acoustique dans le fluide 5. A contrario, les objets 7 sont choisis de sorte que la vitesse de propagation de l’onde acoustique dans ces objets 7 soit inférieure à la vitesse de propagation de cette onde acoustique dans le fluide 5. Après disposition du fluide 5 dans la cavité 1 et des objets 6 et 7 en suspension dans le fluide 5 de la manière illustrée à la , le transducteur 2 est actionné de manière à générer une onde acoustique stationnaire 4 dans la cavité 1. La génération de cette onde 4 permet de produire une force de radiation acoustique qui s’exerce sur les objets 6 et 7. Cette force de radiation acoustique peut notamment être décrite selon le modèle suivant, connu en soi, de K. Yosioka et Y. Kawasima : où est la vitesse de l’onde 4, le nombre d’onde, un facteur de densité-compressibilité et la position de l’objet 6 ou 7 considéré le long de la direction A1, c’est-à-dire le long de la direction de propagation de l’onde 4. Le facteur de densité-compressibilité peut être défini de la manière suivante : où est la masse volumique ou de l’objet 6, ou respectivement 7, considéré, et est la vitesse de propagation ou de l’onde 4 au sein de l’objet 6, ou respectivement 7, considéré. Compte tenu de la masse volumique respective et de la vitesse respective de propagation de l’onde acoustique des objets 6 et 7 par rapport au fluide 5, les objets 6 présentent un facteur de densité-compressibilité, ou contraste acoustique, positif, tandis que les objets 7 présentent un facteur de densité-compressibilité, ou contraste acoustique, négatif. Dans l’exemple des figures 1 et 2, l’onde 4 a une longueur d’onde égale à la hauteur B1 de la cavité 1, formant respectivement le long de la direction A1 un premier nœud à une coordonnée C1, un ventre à une coordonnée C2 et un deuxième nœud à une coordonnée C3. Compte tenu des propriétés respectives précitées du fluide 5 et des objets 6 et 7, à partir de la configuration de la dans laquelle les objets 6 et 7 sont distribués de manière relativement homogène dans l’ensemble de la cavité 1, la force de radiation acoustique produite par l’onde 4 entraîne ainsi un déplacement des objets 6 vers les nœuds de l’onde 4 et un déplacement des objets 7 vers le ventre de l’onde 4, de manière à atteindre une configuration telle que celle illustrée à la . L’invention permet ainsi d’organiser spatialement les objets 6 et 7 sous forme de couches espacées le long de la direction A1 et de les maintenir ainsi positionnés en lévitation acoustique, sous l’action de l’onde 4. Dans cet exemple, les objets 7 forment une couche intermédiaire, située à mi-hauteur de la cavité 1, tandis que les objets 6 forment deux couches s’étendant de part et d’autre de la couche intermédiaire. Les objets 7 étant des billes de polydiméthylsiloxane, leur agrégation ou regroupement sous forme de couche permet de constituer une barrière poreuse qui autorise le développement d’interactions entre les couches de cellules 6, cela sans contact avec les parois de la cavité 1. L’invention permet ainsi de réaliser une culture cellulaire en lévitation acoustique. L’invention permet aussi de contrôler les interactions entre couches de cellules 6 puisqu’il est notamment possible de choisir différents matériaux, géométries et tailles pour les objets 7, ces paramètres ayant une incidence directe sur la porosité de la barrière qu’ils constituent sous l’action de la force de radiation acoustique. A titre d’exemple, il est ainsi possible de déclencher ou autoriser la diffusion de solutés ou secrétât 10 de cellules ( ), le développement d’extensions cellulaires 11 du type axones neuronaux ( ), ou encore la migration de cellules 6 ( ). Dans une variante de réalisation, les objets 7 comprennent des particules d’hydrogel qui, après positionnement sous l’action de la force de radiation acoustique tel que décrit ci-dessous, sous fusionnées par chauffage local, par exemple à l’aide d’une nappe laser. Il est ainsi possible de constituer une couche continue d’hydrogel interposée entre deux couches de cellules 6. L’invention permet aussi de poursuivre la culture cellulaire, ou de l’initier après positionnement des objets 6 et 7 de la manière décrite ci-dessus, en produisant dans la cavité 1 une matrice de soutien. Pour ce faire, une fois les objets 6 et 7 positionnés selon la configuration de la ou selon une configuration analogue, une substance à base de prépolymère d’hydrogel peut être introduite dans la cavité 1. Une telle substance permet de constituer une matrice 20 poreuse sous forme de gel, permettant de soutenir les couches d’objets 6 et 7 ( ). Dans un mode de réalisation, cette substance comprend aussi un matériau photopolymérisable qui est soumis, après introduction dans la cavité 1, à une stimulation lumineuse entraînant la polymérisation de la matrice. L’onde acoustique 4 peut ensuite être interrompue de sorte que la culture cellulaire se produise au sein d’une telle matrice, en disposant par exemple le récipient dans un incubateur. Dans une variante de réalisation, à partir de la configuration de la , il est introduit dans la cavité 1 d’autres objets (non représentés) tels que des billes d’hydrogel à contraste acoustique positif. Sous l’action de la force de radiation acoustique résultant de l’onde 4, ces billes ou tous autres objets à contraste acoustique positif vont se déplacer vers les nœuds de pression de manière à envelopper les couches formées par les objets 6. Il est ainsi possible d’encapsuler les couches d’objets 6 à l’aide d’une coque de porosité contrôlée par les propriétés des objets qui la forment, par exemple pour des applications de thérapie cellulaire in vivo. Il découle de la description non limitative qui précède que l’invention permet de reconstruire et de stimuler des architectures complexes comportant différentes couches de cellules séparées par une variété d’objets permettant de contrôler les interactions entre les couches cellulaires, à l’aide d’un procédé et d’un dispositif particulièrement simples à mettre en œuvre. Procédé de structuration d’un ensemble d’objets (6,7), comprenant : – une étape de disposition dans une cavité (1) d’un fluide (5) et desdits objets (6, 7) en suspension dans le fluide (5), et – une étape de génération d’une onde acoustique stationnaire (4) dans la cavité (1) de manière à produire une force de radiation acoustique entraînant un déplacement des objets (6, 7) dans la cavité (1), caractérisé en ce que lesdits objets (6, 7) comprennent : – des premiers objets (6) qui présentent un contraste acoustique positif par rapport au fluide (5), et – des deuxièmes objets (7) qui présentent un contraste acoustique négatif par rapport au fluide (5). Procédé selon la revendication 1, dans lequel l’onde acoustique stationnaire (4) générée dans la cavité (1) a une longueur d’onde inférieure au double d’une dimension (B1) de la cavité (1) selon une direction de propagation (A1) de l’onde acoustique stationnaire (4), de préférence inférieure ou égale à cette dimension (B1). Procédé selon la revendication 1 ou 2, comprenant, après positionnement des objets (6, 7) sous l’action de la force de radiation acoustique, une étape d’introduction dans la cavité (1) d’une substance de manière à former une matrice (20) apte à soutenir les premiers objets (6). Procédé selon la revendication 3, dans lequel ladite substance comprend un prépolymère d’hydrogel. Procédé selon la revendication 3 ou 4, dans lequel la matrice (20) est poreuse. Procédé selon l’une quelconque des revendications 3 à 5, dans lequel ladite substance comprend un matériau photopolymérisable, le procédé comprenant, après introduction de la substance dans la cavité (1), une étape de stimulation lumineuse de la substance de manière à la polymériser. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, comprenant, après positionnement des objets (6, 7) sous l’action de la force de radiation acoustique, une étape d’incubation des objets (6, 7). Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, comprenant, après positionnement des objets (6, 7) sous l’action de la force de radiation acoustique, une étape de chauffage des deuxièmes objets (7) de manière à les fusionner. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, comprenant, après positionnement des objets (6, 7) sous l’action de la force de radiation acoustique, une étape d’encapsulation des premiers objets (6), cette étape comprenant une introduction dans la cavité (1) de troisièmes objets présentant un contraste acoustique positif par rapport au fluide (5).