Brevet FR3135991A1 — publié le 20231201

La présente invention concerne un procédé de détermination des propriétés de résistance aux antibiotiques de type beta-lactamines d’une souche d’entérobactérie présente dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes : a) lyse des bactéries et hydrolyse des protéines bactériennes, pour obtenir un mélange de peptides, b) analyse de ce mélange de peptides par spectrométrie de masse ciblée couplée à une chromatographie liquide en phase inverse, la détection d’au moins un peptide spécifique d’une enzyme à activité beta-lactamase à spectre étendu (BLSE) étant indicative de la résistance aux beta-lactamines de la souche d’entérobactérie présente dans ledit échantillon biologique, ledit procédé étant caractérisé en ce que l’étape (b) d’analyse est effectuée en présence d’un agent d’appariement d’ion (IPR). Procédé d’identification des enzymes BLSE chez les entérobactéries DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne une méthode d’analyse utilisant la chromatographie liquide en phase inverse couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS/MS) pour détecter les activités de type β-lactamase à spectre étendu (BLSE) liées à la présence de certaines enzymes produites par les entérobactéries. ETAT DE LA TECHNIQUE La septicémie désigne toute réaction inflammatoire généralisée associée à une infection bactérienne grave. Selon l'Institut Pasteur, une personne meurt de septicémie toutes les 5 secondes dans le monde. En France, cette infection est fatale pour 27% des patients, et ce chiffre peut monter jusqu’à plus de 50% en cas de choc septique. En 2017, l'OMS a classé la septicémie comme priorité de santé publique, et a publié une liste des agents pathogènes devant être étudiés de manière prioritaire pour la détermination de nouvelles approches thérapeutiques ; cette liste contient notamment les bactéries Acinetobacter baumannii , Pseudomonas aeruginosa et les entérobactéries productrices de carbapénémases ou d’enzymes à activité de β-lactamases à spectre étendu (BLSE). Actuellement, différentes familles d'antibiotiques sont utilisées pour soigner les septicémies en milieu hospitalier. L'une des plus connues et utilisées est la famille des β-lactamines, qui regroupe les pénicillines, les céphalosporines, les monobactames et les carbapénèmes. Les β-lactamines agissent en inhibant la synthèse de la paroi bactérienne en bloquant la production du peptidoglycane. Ces molécules ont une structure commune correspondant à la présence d’un cycle à quatre atomes, le β-lactame, qui est leur site actif. Les enzymes β-lactamases à spectre étendu (BLSE) Il existe des mécanismes dits « de résistance » qui empêchent l'action de ces antibiotiques : en particulier les systèmes d'efflux, l’imperméabilité de la paroi bactérienne et les β-lactamases. Ces enzymes inactivent les β-lactamines en hydrolysant leur cycle β-lactame. La première β-lactamase TEM, qui hydrolyse l’ampicilline et les céphalosporines de première génération, a été identifiée chez la bactérie Escherichia coli . Pour faire face à ce problème, de nouveaux antibiotiques à spectre étendu ont été mis au point, mais leur utilisation abusive chez l’Homme et dans les élevages d’animaux a conduit à l'apparition des β-lactamases à spectre étendu (BLSE). La classification d’Ambler et celle de Bush-Jacoby-Medeiros sont les deux classifications existantes pour les β-lactamases. Le schéma d’Ambler propose une classification moléculaire et répartit ces enzymes en 4 classes : A, B, C et D. Celles de classe A, C et D sont dites à sérine active tandis que celles de classe B sont appelées métallo-β-lactamases (carbapénèmases). A l’exception des BLSE de type OXA (classe D), les BLSE sont des β-lactamases de classe A. La classification de Bush-Jacoby-Medeiros permet de classer ces enzymes selon leurs groupes fonctionnels. Cette classification a été mise à jour en 2010 et répartit les β-lactamases en 3 groupes : 1, 2 et 3 (Bush & Jacoby, 2010). Les enzymes du groupe 1 sont des céphalosporinases qui appartiennent à la classe moléculaire C. Elles sont portées par les plasmides de nombreuses entérobactéries et par quelques autres organismes, et sont généralement résistantes à l'inhibition par l'acide clavulanique et actives sur les céphamycines (exemple : la céfoxitine). Elles ont une grande affinité pour l'aztréonam contrairement aux céphalosporinases de classe A. Les enzymes appartenant à ce sous-groupe sont CMY, MIR, MOX, LAT, FOX, DHA, ACT, ACC et CFE. Les enzymes du groupe 2 représentent le plus grand groupe de β-lactamases. Les enzymes des sous-groupes 2a, 2b, 2be, 2br, 2ber, 2c, 2ce, 2e et 2f appartiennent à la classe moléculaire A, et celles des sous-groupes 2d, 2de et 2df appartiennent à la classe moléculaire D. Le sous-groupe 2a regroupe des pénicillinases majoritairement chromosomiques. Ce sont les β-lactamases prédominantes des bactéries à Gram-positifs telles que les staphylocoques et occasionnellement les entérocoques. Ces enzymes hydrolysent la benzylpénicilline et de nombreux dérivés de la pénicilline, mais difficilement les céphalosporines, les carbapénèmes et les monobactames. Ces enzymes sont inhibées par l'acide clavulanique et le tazobactam. Ce sous-groupe contient notamment l’enzyme PC-1. Le sous-groupe 2b regroupe des pénicillinases et des céphalosporinases. Ces enzymes hydrolysent facilement les pénicillines et les céphalosporines de première génération, et sont fortement inhibées par l'acide clavulanique et le tazobactam. TEM-1, TEM-2 et SHV-1 font partie de ce sous-groupe. Le sous-groupe 2br regroupe les enzymes qui hydrolysent les pénicillines et les céphalosporines de première génération, et qui résistent à l'acide clavulanique et au tazobactam. A ce jour, 2br regroupe des variants de TEM (ex : TEM-30) et de SHV (ex : SHV-10). Le sous-groupe 2be contient les BLSE. Ces enzymes hydrolysent les pénicillines, les céphalosporines de première à quatrième génération, les monobactames et hydrolysent en outre une ou plusieurs oxyimino-β-lactamines, telles que la céfotaxime, la ceftazidime et l'aztréonam. En général, les souches productrices de BLSE restent sensibles aux céphamycines, aux carbapénèmes et à l'inhibition par l'acide clavulanique. Ce composé est donc parfois administré en association avec les antibiotiques β-lactamines, pour limiter l'action des enzymes de résistance. Ce sous-groupe regroupe notamment les enzymes TEM-3, SHV-2 et CTX-M-15. Le sous-groupe 2ber comprend les enzymes TEM avec une activité de type BLSE et une résistance à l'acide clavulanique et au tazobactam. Ces enzymes sont aussi nommées β-lactamase CMT (complex mutant TEM). TEM-50 fait partie du sous-groupe 2ber. Le sous-groupe 2c contient les pénicillinases qui peuvent hydrolyser la carbénicilline. L'acide clavulanique ou le tazobactam peut inhiber ces enzymes. PSE-1 et CARB-3 font partie du sous-groupe 2c. Le sous-groupe 2ce contient la carbénicillinase avec une activité étendue contre le céfépime et le cefpirome. RTG-4 fait partie de ce sous-groupe. Le sous-groupe 2d comprend des β-lactamases qui hydrolyse l'oxacilline. Ces enzymes sont connues sous le nom d'enzymes OXA et sont variablement inhibées par l'acide clavulanique. Les enzymes notamment retrouvées dans ce sous-groupe sont OXA-1 et OXA-10. Le sous-groupe 2de regroupe les enzymes OXA avec un spectre étendu qui inclut les oxyimino-β-lactames mais pas les carbapénèmes. OXA-11 et OXA-15 font partie du sous-groupe 2de. Le sous-groupe 2df contient les enzymes OXA avec des activités d'hydrolyse des carbapénèmes. OXA-23 et OXA-48 font partie du sous-groupe 2df. Le sous-groupe 2e contient les céphalosporinases à spectre étendu et sont inhibées par l'acide clavulanique ou le tazobactam. Une enzyme retrouvée dans ce groupe est notamment CepA. Le sous-groupe 2f contient les carbapénémases de la classe moléculaire A. Ces enzymes sont mieux inhibées par le tazobactam que par l'acide clavulanique. KPC-2, IMI-1 et SME-1 sont des enzymes qui appartiennent au sous-groupe 2f. Les enzymes du groupe 3 sont des carbapénémases qui appartiennent à la classe moléculaire B. Elles sont résistantes à l'inhibition par l'acide clavulanique et au tazobactam. Les enzymes qui appartenant à ce sous-groupe sont IMP-1, VIM-1, CcrA, IND-1, L1, CAU-1, GOB-1, FEZ-1, CphA et Sfh-1. Les BLSE de type TEM et SHV font partie des sous-groupes 2be et 2ber, c'est-à-dire qu’elles sont capables d’hydrolyser les pénicillines, les céphalosporines de 1 ère à 4 ème génération et les monobactames. En général, les souches productrices de BLSE restent sensibles aux céphamycines et aux carbapénèmes. Par ailleurs, les BLSE du sous-groupe 2be sont inhibées par l'acide clavulanique. Ce composé est donc parfois administré en association avec les antibiotiques β-lactamines, pour limiter l'action des enzymes de résistance. Conséquences cliniques de l’existence de ces enzymes BLSE induisant une résistance aux antibiotiques β-lactamines Les enzymes à activité BLSE, désignées ci-après "BLSE", sont de plus en plus retrouvées lors d’infections sanguines chez des patients. Ces enzymes sont induites par les plasmides des bactéries gram-négatives, résultant pour la plupart de mutations de beta-lactamases naturelles telles que TEM-1, TEM-2 ou SHV-1. Les BLSE sont une source de préoccupation majeure en termes de santé publique. En effet, elles induisent un degré élevé de résistance aux antibiotiques, y compris aux céphalosporines de troisième génération. La septicémie se caractérise déjà par un taux de mortalité élevé qui augmente rapidement au cours des heures, en absence de traitement adapté. Après 5 heures sans traitement adapté, le taux de survie des patients a déjà diminué de moitié. Il n’est plus que de 10% après 24 heures et descend à moins de 5% après 36 heures. Lorsqu’il y a une suspicion de sepsis chez un patient, un prélèvement sanguin est réalisé et ce sang est mis en culture (hémoculture). Si des bactéries sont présentes dans l’échantillon recueilli, elles vont se multiplier au cours des heures jusqu’à atteindre une concentration suffisante pour que l’échantillon soit déclaré positif. Il faut au minimum 6 à 8 heures pour qu’une hémoculture soit déclarée positive et 6 heures supplémentaires pour réaliser l’identification de la bactérie. L’évaluation d’une potentielle résistance aux antibiotiques est l’étape la plus longue à réaliser, et nécessite parfois jusqu’à 24h-48h avant d’obtenir les résultats. Cependant, il est fréquent de débuter le traitement antibiotique avant d’obtenir ces résultats, car un tel laps de temps sans traitement induirait un taux de survie des patients très faible. La solution utilisée en milieu hospitalier pour pallier aux longues méthodes d’identification de la bactérie et de l’évaluation des mécanismes de résistance est de donner au patient des antibiotiques à spectre étendu, puis d’ajuster le traitement au cours du temps. Cependant, ce choix implique différents problèmes subséquents, notamment une augmentation de l’antibiorésistance dans la population. Techniques actuelles de détection et d’identification des BLSE L’élaboration de méthodes analytiques rapides, efficaces et robustes est primordiale en diagnostic afin de pouvoir offrir dès que possible le traitement approprié à chaque patient. Actuellement, les méthodes de détection des BLSE en routine sont limitées et nécessitent plusieurs dizaines d’heures pour obtenir un antibiogramme. Ils reposent majoritairement sur l’utilisation des disques de diffusion, notamment le test de synergie entre le mélange amoxicilline et acide clavulanique (AMC), et une C3G (par exemple la ceftazidime) ou l’aztréonam. Les automates de bactériologie (Vitek 2®, Alfred 60AST®, Mini-Api®, Phoenix®, Microscan®) sont de plus en plus utilisés car plus rapides, par exemple VITEK® 2 peut fournir des résultats d’identification et d'antibiogramme en moins de 5 heures. Cependant, la sensibilité et la spécificité de ces automates ne sont pas toujours suffisantes et peuvent nécessiter des tests supplémentaires. De nombreuses études en biologie moléculaire utilisant l’amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction) suivies d’un séquençage ont été testées. La PCR en temps réel et le pyroséquençage direct des produits peuvent notamment permettre l’identification des variants de CTX-M à caractère BLSE. Le pyroséquençage est réalisé grâce à des cycles de dénaturation, annihilation et extension de la chaîne, puis d’un séquençage. Toutefois, l’utilisation de la PCR présente des inconvénients tels que le coût élevé des sondes, ainsi que l’absence d'information sur l'expression réelle des protéines impliquées dans les mécanismes de résistances. En réponse au besoin actuel de détection et évaluation des niveaux d’expression des BLSE, de nouvelles stratégies d’analyse commencent à émerger afin de déterminer rapidement les profils de résistance des bactéries. Suite aux premières études concernant l’identification de bactéries par MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption lonization - Time Of Flight), la spectrométrie de masse est de plus en plus utilisée. Le MALDI-TOF est utilisé comme méthode d'analyse bactériologique de routine dans les hôpitaux depuis sa mise en œuvre il y a dix ans. Cette technique a permis de réduire le temps nécessaire à l'identification des bactéries, notamment dans le cas d'infections sanguines. Le MALDI-TOF nécessite moins de temps de retraitement des données que les méthodes d'analyse biochimique conventionnelles en termes d'identification. C'est pourquoi l'utilisation de cette technique analytique s'est rapidement répandue dans les laboratoires des hôpitaux et est devenue une technique de choix pour les tests de routine en microbiologie clinique. Au cours des dernières années, différentes études ont mis en évidence la possibilité d'utiliser le MALDI-TOF pour identifier le mécanisme d'antibiorésistance et l'activité des β-lactamases (Oviano et al ., 2014). Certaines études utilisent aussi le MALDI-TOF pour réaliser un mini-séquençage notamment dans le domaine de l'antibiorésistance aux β-lactamases à spectre étendu (BLSE). Malgré son efficacité, le MALDI-TOF n’est toujours pas utilisé en méthode de routine pour la caractérisation des BLSE. En effet, pour le groupe des entérobactéries notamment, la différenciation entre certains mécanismes de résistance n'est pas toujours possible, car ils présentent un profil remarquablement similaire (Hou et al ., 2019). Deux types d'approches sont généralement utilisés pour étudier les protéines par spectrométrie de masse : la protéomique descendante et la protéomique ascendante. La protéomique descendante permet l'analyse directe des protéines grâce à l'utilisation de la spectrométrie de masse haute résolution (HRMS) telle que la technologie Orbitrap, de logiciels puissants et de bases de données étendues. Cette technologie est particulièrement adaptée aux analyses de criblage à haut débit et peut être utilisée dans des approches ciblées ainsi que pour des analyses quantitatives. Cependant, la difficulté d'obtenir une compréhension précise de cette instrumentation et son coût élevé expliquent les limites de son application dans un cadre de routine. Au contraire, la spectrométrie de masse ascendante est une technique plus abordable basée sur l'analyse des peptides par spectrométrie de masse, le plus souvent à basse résolution (LRMS). La LC-MS/MS est notamment très prometteuse et permet la séparation et l'identification des peptides en bactériologie. Les peptides sont obtenus par digestion enzymatique des protéines. Cette approche est plus facile à appliquer dans les laboratoires hospitaliers car elle est plus simple à utiliser, plus abordable, et moins longue en termes de retraitement. Contrairement à la protéomique descendante, la protéomique ascendante ne couvre pas la totalité de la séquence protéique. Il est donc nécessaire de choisir les meilleurs peptides candidats issus de la séquence complète, c’est-à-dire ceux particulièrement spécifiques d’une BLSE, qui seront caractérisés par spectrométrie de masse pour détecter et identifier précisément la ou les BLSE(s) présente(s) dans l’échantillon étudié. Le brevet EP 2 699 692 détaille une stratégie d’analyse en RPLC-MS/MS basse résolution pour détecter au moins un mécanisme de résistance aux céphalosporines. Différents mécanismes de résistance sont recherchés tels que la résistance au β-lactamines de type TEM chez des souches d’ Escherichia coli , Klebsiella pneumoniae , Proteus mirabilis , Enterobacter aerogenes et d’autres espèces susceptibles de produire des β-lactamases. Ce procédé indique que « seule la partie du gradient comprise entre 3 et 34 minutes est utile à l’analyse ». Toutefois, plusieurs peptides spécifiques des BLSE, cités dans ce brevet, éluent avant 3 minutes. Par exemple, le peptide SGASER (SEQ ID NO. 7) retrouvé dans certains variants de TEM élue à 1,4 minutes, et ne peut donc pas être identifié avec la méthode telle que décrite. Il a été constaté par les inventeurs que certains peptides de courte séquence, constitués de 5 ou 6 acides aminés, sont très peu retenus en phase inverse, ce qui est un véritable obstacle à leur détection par LC-MS/MS. La présente invention propose une solution à ce problème de non-détection de certains peptides spécifiques des BLSE, du fait de leur courte séquence et donc de leur non-rétention sur les colonnes de chromatographie en phase inverse, par la spectrométrie de masse ascendante. BREF EXPOSE DE L'INVENTION La présente invention concerne un procédé de détermination des propriétés de résistance aux antibiotiques de type beta-lactamines d’une souche d’entérobactérie présente dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes : a) lyse des bactéries et hydrolyse des protéines bactériennes, pour obtenir un mélange de peptides, b) analyse de ce mélange de peptides par spectrométrie de masse ciblée couplée à une chromatographie liquide en phase inverse, la détection d’au moins un peptide spécifique d’une enzyme à activité beta-lactamase à spectre étendu (BLSE) étant indicative de la résistance aux beta-lactamines de la souche d’entérobactérie présente dans ledit échantillon biologique, ledit procédé étant caractérisé en ce que l’étape (b) d’analyse est effectuée en présence d’un agent d’appariement d’ion (IPR). La présente invention concerne également un kit pour son utilisation dans la mise en œuvre du procédé décrit ci-dessus, ledit kit comprenant de la trypsine et de l’acide heptafluorobutyrique. DESCRIPTION DES FIGURES représente un chromatogramme qui illustre la détection du peptide SGAGK (SEQ ID NO. 8) dans l’échantillon n°27. Le temps de rétention de ce peptide est de 2,2 minutes, dans les conditions du procédé de l’invention. représente l’impact de la concentration de la solution d’HFBA injectée en amont de l’analyse pour augmenter le temps de rétention desdits peptides sur la phase stationnaire, c’est-à-dire pour ralentir leur élution avec la phase mobile. Le pourcentage d’HFBA testé est compris entre 0 et 0.5%. Le temps de rétention pour chaque peptide testé est indiqué en minutes. 7 peptides de courte séquence (moins de 7 résidus) et présentant donc très peu de rétention en phase inverse ont été utilisés : SGASER (SEQ ID NO.7), SGAGER (SEQ ID NO.21), TGASER (SEQ ID NO.25), TGAGER (SEQ ID NO.33), SGAGK (SEQ ID NO.8), TGASK (SEQ ID NO.26), et SGTGK (SEQ ID NO.9). Procédé de détermination des propriétés de résistance aux antibiotiques de type beta-lactamines d’une souche d’entérobactérie présente dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes : a) lyse des bactéries et hydrolyse des protéines bactériennes, pour obtenir un mélange de peptides, b) analyse de ce mélange de peptides par spectrométrie de masse ciblée couplée à une chromatographie liquide en phase inverse, la détection d’au moins un peptide spécifique d’une enzyme à activité beta-lactamase à spectre étendu (BLSE) étant indicative de la résistance aux beta-lactamines de la souche d’entérobactérie présente dans ledit échantillon biologique, ledit procédé étant caractérisé en ce que l’étape (b) d’analyse est effectuée en présence d’un agent d’appariement d’ion (IPR). Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l’IPR est présent en une quantité suffisante pour ralentir l’élution des peptides de moins de 7 résidus d’acides aminés. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l’IPR est soit injecté en amont de la séparation des peptides, soit ajouté au mélange de peptides. Procédé selon l’une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l’analyse par spectrométrie de masse est ciblée pendant l’analyse (mode de type SRM/MRM, MRM3, PRM) ou après l’analyse (mode de type DIA/SWATH). Procédé selon l’une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l’agent d’appariement d’ion est l’acide heptafluorobutyrique. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l’acide heptafluorobutyrique est présent dans une solution aqueuse à une concentration d’au moins 0.4%. Procédé selon l’une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l’hydrolyse des protéines bactériennes à l’étape (a) est une hydrolyse enzymatique, en particulier est une hydrolyse par la trypsine. Procédé selon l’une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la spectrométrie de masse est ciblée pour la détection de peptides constitués de 5 à 20 acides aminés. Procédé selon l’une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la spectrométrie de masse est ciblée pour la détection de peptides choisis parmi le groupe de 34 peptides présentant les séquences suivantes : SEQ ID NO. 1 à SEQ ID NO. 34. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la spectrométrie de masse est ciblée pour la détection de peptides choisis parmi le groupe de 7 peptides présentant les séquences suivantes : - SGASER (SEQ ID NO. 7) - SGAGK (SEQ ID NO. 8) - SGTGK (SEQ ID NO. 9) - SGAGER (SEQ ID NO. 21) - TGASER (SEQ ID NO. 25) - TGASK (SEQ ID NO. 26) - TGAGER (SEQ ID NO. 33). Procédé selon l’une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l’entérobactérie est de l’espèce Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis ou Enterobacter cloacae. Procédé selon l’une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que l’échantillon biologique est choisi parmi : - Un fluide biologique tel que le sang, le sérum, le plasma, l’urine, le liquide céphalo-rachidien ou les larmes, - Une culture bactérienne telle qu’une hémoculture, une colonie sur gélose ou un bouillon de culture, - Un échantillon alimentaire, et - tout autre type d’échantillon biologique. Kit pour son utilisation dans la mise en œuvre du procédé selon l’une des revendications 1 à 12, comprenant de la trypsine et de l’acide heptafluorobutyrique.