Brevet FR3126508A1 — publié le 20230303

La présente invention concerne une lame optique (10) destinée a recevoir un échantillon biologique à des fins d’imagerie microscopique à réflexion totale interne. Une telle lame optique comprend un substrat de base en verre (11) et un empilement (12), de couches minces de matériaux diélectriques alternés, disposé sur ce substrat, la couche libre de l’empilement étant biocompatible. L’empilement présente des caractéristiques d’indice et d’épaisseur de couches permettant de supporter des ondes de surface à l’interface entre la couche libre et l’échantillon, tel que la sensibilité et la résolution d’imagerie microscopique à réflexion totale interne se trouvent augmentées. Figure pour l’abrégé : [Fig. 2] Lame optique biocompatible destinée à la microscopie à réflexion totale interne et système d’imagerie microscopique comportant une telle lame L’invention s’inscrit dans le domaine de la microscopie optique. Plus particulièrement, l’invention concerne un nouveau concept de lame optique basée sur un empilement multicouche comme support d’exaltation du champ électromagnétique adapté à la microscopie à réflexion totale interne. L’invention s’applique notamment, mais non exclusivement, au domaine de l’imagerie d’échantillons biologiques par microscopie de fluorescence à réflexion totale interne ou microscopie TIRF (pour « Total Internal Reflection Fluorescence » ). Une telle technique d’imagerie est particulièrement bien adaptée à la visualisation, l’analyse et la quantification d’évènements moléculaires s’effectuant notamment à la membrane plasmique des cellules biologiques. Arrière-plan technologique On s’attache plus particulièrement dans la suite de ce document à décrire la problématique existant dans le domaine de l’imagerie en microscopie de fluorescence à réflexion totale interne, à laquelle ont été confrontés les inventeurs de la présente invention. L’invention ne se limite bien sûr pas à ce contexte particulier d’application, mais présente un intérêt pour toute technique ou modalité de microscopie exploitant le principe d’imagerie en réflexion totale interne. La microscopie de fluorescence à réflexion totale interne (TIRF) est devenue une technique de référence pour étudier la dynamique et l’organisation membranaire dans les cellules biologiques. Un de ses avantages réside dans la possibilité de confiner la lumière d’excitation dans une section ultra-mince de l’échantillon située à l’interface entre l’échantillon et la lame de microscope en verre de sorte qu’une excitation sélective de l’échantillon peut être réalisée. Une telle technique permet ainsi la faisabilité d’images de molécules uniques à l’échelle nanométrique. La technique TIRF repose sur le principe suivant. L’échantillon biologique qui est disposé sur la lame de microscope (par exemple un substrat de verre) est illuminé à travers la lame de microscope à l’aide d’un faisceau d’excitation laser. Lorsque le faisceau d’excitation heurte l’interface entre la lame de verre et l’échantillon sous un angle d’incidence supérieur ou égal à l’angle critique de réflexion totale interne, une des composantes électromagnétiques de la lumière, appelée onde évanescente, se propage à ladite interface dans une section ultra-mince de l’échantillon, avec une intensité lumineuse qui décroît exponentiellement avec la distance à ladite interface. La profondeur de pénétration du champ évanescent est typiquement inférieure à 100 nm. Le signal de fluorescence résultant - autrement dit les ondes électromagnétiques émises par les molécules fluorescentes observées - est ensuite collecté vers un détecteur de lumière à des fins d’imagerie. Ainsi, par cette technique connue, les images obtenues présentent de multiples qualités : elles bénéficient tout d’abord d’un faible bruit de fond (car les fluorophores situés dans les couches profondes de l’échantillon (hors du champ évanescent) ne sont que très faiblement excités) et d’une résolution axiale relativement élevée. Des lames de microscope à structure plus complexe, comme celles basées sur une métallisation en surface ont été par ailleurs conçues pour exalter localement le champ électromagnétique. De telles lames optiques, qui reposent sur le principe de la résonance plasmonique de surface, permettent d’améliorer la sensibilité de l’imagerie de microscopie. Toutefois, cette solution connue reste limitée en termes de valeur d’exaltation du champ et dans le choix des matériaux, i.e. métaux nobles, qui limitent les conditions d’illumination utilisables ainsi que la biocompatibilité, ce qui n’est pas optimal. Une autre technique connue, décrite dans le document de brevet US 2016/0238830, repose sur un guide d’onde multicouches dont les épaisseurs de couche et les indices de réfraction sont choisis pour supporter un mode de fuite guidé. Or les expériences d’imagerie de microscopie effectuées avec cette technique demeurent encore limitées du point de vue sensibilité et résolution notamment. En conséquence, il existe un besoin de fournir une technique de microscopie haute résolution capable d’imager des échantillons biologiques dans des conditions d’éclairage stables et reproductibles avec un rapport signal à bruit amélioré. Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, il est proposé une lame optique destinée a recevoir un échantillon biologique à des fins d’imagerie microscopique à réflexion totale interne, la lame optique comprenant un substrat de base optiquement transparent et un empilement de couches de matériaux diélectriques. La couche dudit empilement destinée a être contact avec l’échantillon étant à base d’un matériau diélectrique biocompatible. L’empilement est tel qu’il est disposé directement sur le substrat de base et formé d’une succession de couches minces alternées d’un premier matériau diélectrique et d’un deuxième matériau diélectrique apte à produire une résonance optique à un angle d’incidence et une longueur d’onde d’éclairage prédéterminés de la lame optique en régime de réflexion totale. Ainsi, l’invention repose sur une nouvelle conception d’une lame optique pour réaliser de la microscopique à réflexion totale interne. Un tel empilement de multicouches diélectriques couplé au substrat de base permet d’assurer une exaltation significative du champ électromagnétique évanescent se propageant à l’interface entre la lame et l’échantillon. Cette sorte de « résonateur diélectrique » est donc conçue pour amplifier par résonance optique l’intensité lumineuse des ondes évanescentes confinées en surface de la lame optique en contact avec l’échantillon. Grâce à cette approche, la sensibilité de l’imagerie microscopique ainsi que la résolution spatiale s’en trouvent améliorées. Il apparaît de plus, comparativement aux lames à résonance plasmonique existantes, que ce type de lame optique proposé est plus facilement exploitable car elle s’adapte à une plus grande gamme de paramètres d’imagerie de microscopie TIR. Selon une mise en œuvre particulière, le premier matériau diélectrique présente un indice de réfraction élevé compris entre 1,8 et 3,5 et le deuxième matériau diélectrique présente un indice de réfraction faible compris entre 1,2 et 1,7. Ainsi, l’invention offre un choix relativement large d’indices de réfraction pouvant être utilisés pour concevoir le résonateur diélectrique. Plus particulièrement, les couches minces présentent chacune une épaisseur qui est fonction de la longueur d’onde d’éclairage, de l’angle d’incidence et de l’indice de réfraction du matériau pour lesquels elle est constituée. Il est ainsi possible de concevoir aisément une lame optique quels que soient les paramètres d’imagerie imposés par le système de microscopie TIR. Selon une mise en œuvre particulière, le substrat optiquement transparent est à base d’un matériau appartenant au groupe suivant : Verre sodocalcique, Saphir, Quartz, Fluorure de calcium. Selon une mise en œuvre particulière, le premier matériau diélectrique est à base de Nb 2 O 5 et le deuxième matériau diélectrique est à base de SiO 2 . De manière générale, conforme à l’invention, l’épaisseur de chaque couche mince est comprise entre 1 et 300 nanomètres, et plus particulièrement entre 75 et 150 nanomètres, tandis que l’épaisseur du substrat de base est comprise entre 50 et 2000 micromètres. L’empilement présente une épaisseur totale inférieure à 10 micromètres, et plus particulièrement comprise entre 0,2 et 4,0 micromètres. L’empilement comprend un nombre de couches minces typiquement compris entre 4 et 20. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, il est proposé un système de microscopie à réflexion totale interne, comprenant : - une lame optique définie dans l’un quelconque de ses modes de réalisation précitée ; - une source de lumière configurée pour émettre un faisceau d’éclairage ; - un objectif de microscope configuré pour former le faisceau d’éclairage vers la lame optique ; la lame et l’objectif de microscope étant configurés pour que l’angle d’incidence soit supérieur ou égal à un angle critique de réflexion totale interne. On rappelle que l’angle d’incidence correspond à l’angle compris entre l’axe du faisceau d’éclairage et l’axe d’empilement de la lame optique. A noter que, plus les valeurs d’angle d’incidence choisies se rapprochent de la borne haute de la plage précitées, et plus la résolution axiale du système s’en trouve augmentée. Selon une caractéristique avantageuse, l’angle d’incidence est inférieur ou égal à une valeur limite définie par l’ouverture numérique de l’objectif de microscope. Plus précisément, l’angle d’incidence est compris entre 62 et 80 degrés. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, il est proposé un procédé de fabrication d’une lame optique destinée a recevoir un échantillon biologique à des fins d’imagerie microscopique à réflexion totale interne. Le procédé est tel qu’il comprend : - une étape de dépôt sur un substrat de base optiquement transparent d’une pluralité de couches minces successives et alternées d’un premier matériau diélectrique et d’un deuxième matériau diélectrique de manière à former un empilement de multicouches diélectriques apte à produire une résonance optique à un angle d’incidence et une longueur d’onde d’éclairage prédéterminés de la lame optique en régime de réflexion totale, la couche dudit empilement destinée a être contact avec l’échantillon étant à base d’un matériau diélectrique biocompatible. Il est ainsi possible de concevoir une lame optique à exaltation du champ électromagnétique configurable quels que soient les paramètres d’imagerie imposés par le système de microscopie. Liste des figures D’autres caractéristiques et avantages de l’invention apparaîtront à la lecture de la description suivante, donnée à titre d’exemple indicatif et non limitatif, et des dessins annexés, dans lesquels : est un schéma simplifié d’un système de microscopie à réflexion totale interne selon un mode de réalisation particulier de l’invention ; présente un exemple de lame optique selon l’invention pouvant être utilisée dans le système d’imagerie de la . Lame optique (10) destinée a recevoir un échantillon biologique (E) à des fins d’imagerie microscopique à réflexion totale interne, la lame optique comprenant : - un substrat de base optiquement transparent (11) ; - un empilement de couches de matériaux diélectriques (12), la couche dudit empilement destinée a être contact avec l’échantillon étant à base d’un matériau diélectrique biocompatible ; la lame optique (10) étant caractérisée en ce que ledit empilement (12) est disposé directement sur le substrat de base (11) et formé d’une succession de couches minces alternées d’un premier matériau diélectrique et d’un deuxième matériau diélectrique apte à produire une résonance optique à un angle d’incidence et une longueur d’onde d’éclairage prédéterminés de la lame optique en régime de réflexion totale. Lame optique selon la revendication 1, dans laquelle : - le premier matériau diélectrique (MD1) présente un indice de réfraction élevé compris entre 1,8 et 3,5 ; - le deuxième matériau diélectrique (MD2) présente un indice de réfraction faible compris entre 1,2 et 1,7. Lame optique selon l’une quelconque des revendications 1 et 2, dans laquelle les couches minces présentent chacune une épaisseur qui est fonction de la longueur d’onde d’éclairage, de l’angle d’incidence et de l’indice de réfraction du matériau pour lesquels elle est constituée. Lame optique selon la revendication 3, dans laquelle l’épaisseur de chaque couche mince est comprise entre 1 et 300 nanomètres, et plus particulièrement entre 75 et 150 nanomètres, tandis que l’épaisseur du substrat de base est comprise entre 50 et 2000 micromètres. Lame optique selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle ledit empilement présente une épaisseur totale inférieure à 10 micromètres, et plus particulièrement comprise entre 0,2 et 4,0 micromètres. Lame optique selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle ledit empilement comprend un nombre de couches minces typiquement compris entre 4 et 20. Lame optique selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle ledit substrat de base est à base d’un matériau appartenant au groupe comprenant : Verre sodocalcique, Saphir, Quartz, Fluorure de calcium. Lame optique selon l’une quelconque des revendications 2 à 7, dans laquelle le premier matériau diélectrique est à base de Nb 2 O 5 et le deuxième matériau diélectrique est à base de SiO 2 . Système de microscopie à réflexion totale interne, caractérisé en ce qu’il comprend : - une lame optique (10) définie selon l’une quelconque des revendications 1 à 8 ; - une source de lumière (30) configurée pour émettre un faisceau d’éclairage ; - un objectif de microscope (20) configuré pour former le faisceau d’éclairage vers la lame optique (10) ; le système étant caractérisé en ce que la lame optique et l’objectif de microscope sont configurés pour que l’angle d’incidence soit supérieur ou égal à un angle critique de réflexion totale interne. Système d’imagerie microscopique selon la revendication 9, dans lequel l’angle d’incidence est inférieur ou égal à une valeur limite définie en fonction de l’ouverture numérique de l’objectif de microscope. Système d’imagerie microscopique selon l’une quelconque des revendications 9 et 10, dans lequel l’angle d’incidence est compris entre 62 et 80 degrés. Procédé de fabrication d’une lame optique (10) destinée a recevoir un échantillon biologique (E) à des fins d’imagerie microscopique à réflexion totale interne, caractérisé en ce qu’il comprend : - une étape de dépôt sur un substrat de base optiquement transparent (11) d’une pluralité de couches minces successives et alternées d’un premier matériau diélectrique et d’un deuxième matériau diélectrique de manière à former un empilement de multicouches diélectriques (12) apte à produire une résonance optique à un angle d’incidence et une longueur d’onde d’éclairage prédéterminés de la lame optique en régime de réflexion totale, la couche dudit empilement destinée a être contact avec l’échantillon étant à base d’un matériau diélectrique biocompatible.