Brevet FR3128021A1 — publié le 20230414

------ Procédé de détection d’un analyte cible dans un échantillon à l’aide de Bleu du Nil, composition pour la détection d’un analyte cible et son utilisation. La présente invention porte sur un procédé de détection d’un analyte cible dans un échantillon, comprenant les étapes suivantes : on prépare une composition en phase aqueuse comportant du bleu du Nil, un sel capable de s’agréger au bleu du Nil et un oligonucléotide spécifique de la cible ; on met en contact la composition ainsi préparée avec l’échantillon à tester ; et on observe la modification attendue de couleur du mélange de la composition et de l’échantillon à tester. Pas de figure à publier avec l’abrégé Procédé de détection d’un analyte cible dans un échantillon à l’aide de Bleu du Nil, composition pour la détection d’un analyte cible et son utilisation. La présente invention porte sur un procédé de détection d’un analyte cible dans un échantillon à l’aide de Bleu du Nil, sur une composition pour la détection d’un analyte cible comprenant du Bleu du Nil et sur l’utilisation dudit procédé et de ladite composition. Stojanovic et Landry (« Aptamer-Based Colorimetric Probe for Cocaine », Journal of the American Chemical Society 124, no 33 (1 août 2002): 9678‑9679 ) décrivent un procédé de détection colorimétrique de cocaïne à l’aide d’un aptamère anti-cocaïne et d’un colorant apte à se complexer avec ledit aptamère anti-cocaïne. Lorsque le colorant et l’aptamère sont en solution, le colorant et l’aptamère vont se complexer et la solution présentera à ce moment-là une couleur bleue. Lorsque la cocaïne est introduite dans la solution, cette dernière va déplacer le colorant complexé avec l’aptamère, ledit aptamère ayant une plus forte affinité pour la cocaïne que pour le colorant. Ce déplacement du colorant va faire diminuer l’absorbance de la solution ce qui permet de détecter visuellement la présence de cocaïne. Cette détection visuelle est une méthode simple et rapide pour détecter la présence d’un analyte cible. Cependant, cette méthode est basée sur l’affinité du colorant avec l’aptamère pour pouvoir présenter une modification de couleur suffisante lors du déplacement dudit colorant par l’analyte. Stojanovic et Landry indiquent que de nombreux colorants ont été testés mais que seul un colorant s’est révélé satisfaisant pour le test de la cocaïne. De plus, comme la littérature décrit de nombreux aptamères qui sont spécifiques de petites molécules organiques, il pourrait être souhaitable d’utiliser la méthode de détection colorimétrique décrite ci-dessus pour détecter la présence de ladite molécule organique. Afin de simplifier la mise au point de telle méthode de détection, il pourrait être souhaitable de disposer d’une molécule capable d’interagir avec de nombreux aptamères ou oligonucléotides spécifiques d’une molécule cible différents, tout en étant capable de présenter un changement de couleur lorsque la molécule cible est présente. Les présents demandeurs ont découvert que le Bleu du Nil pouvait répondre à ces besoins en étant capable d’interagir avec de nombreux aptamères ou oligonucléotides différents, tout en présentant une modification de couleur lors de la présence de la molécule cible, rendant possible la détection de cette dernière. A cet effet, la présente invention porte sur un procédé de détection d’un analyte cible dans un échantillon, caractérisé par le fait que : on prépare une composition en phase aqueuse comportant du bleu du Nil, un sel capable de s’agréger au bleu du Nil et un oligonucléotide spécifique de la cible ; on met en contact la composition ainsi préparée avec l’échantillon à tester ; et on observe la modification attendue de couleur du mélange de la composition et de l’échantillon à tester. Avant d’utiliser le procédé pour détecter la présence ou non d’un analyte cible dans un échantillon de test, la réaction de l’analyte cible avec la composition telle que définie ci-dessus a été étudiée afin de déterminer la modification de couleur de la composition qui résulte de la réaction entre l’analyte cible et la composition. Cette étude permet donc de déterminer la modification de couleur attendue de la composition lors de la présence de l’analyte cible dans l'échantillon à tester. Lorsque l’on mesure l’absorbance d’une solution de test, on prend en compte l’incertitude de la mesure, comme cela est fait lors de toutes mesures quantitatives. En effet, dans certains cas, on peut constater tout de même une modification attendue de l’absorbance sans la présence de l’analyte cible. Cette modification de l’absorbance, invisible à l’œil nu, est liée à la précision de la mesure. Par conséquent, on peut considérer qu’une différence d’absorbance entre la solution témoin (sans analyte cible) et la solution à tester d’au moins 0,1 unité est significative et permet de conclure à la présence de l’analyte cible. A l’étape (3) d’observation de la modification de couleur, on peut observer à l’œil nu la modification de couleur. Si la modification de couleur correspond à la modification attendue de la couleur, cela signifie que l’analyte cible est présent dans l’échantillon. Dans les autres cas, cela signifie que l’analyte cible est absent. On peut en particulier évaluer la concentration de l’analyte cible par comparaison avec des bandelettes d’étalonnage présentant les couleurs attendues à la concentration de l’analyte cible. On peut également mesurer l’absorbance du mélange de la composition et de l’échantillon à tester que l’on compare avec une courbe d’étalonnage de l’absorbance établie au préalable en présence de quantités connues de l’analyte cible. L’absorbance peut être mesurée à une longueur d’onde comprise entre 450 et 700 nm, de préférence à une longueur d’onde de 600 nm ou de 632 nm. L’oligonucléotide peut être un aptamère. Le bleu du Nil peut être présent dans la composition à une concentration de 10 à 80 µmol/L, de préférence de 45 à 55 µmol/L. Le sel capable de s’agréger au bleu du Nil peut être du chlorure de sodium ou du chlorure de potassium à une concentration de 50 à 1000 mmol/L, de préférence de 150 à 500 mmol/L dans la composition. L’agrégation du sel avec le bleu du Nil permet d’observer un effet hypochrome sur le spectre d’absorbance du bleu du Nil. Cela permet de diminuer l’absorbance du bleu du Nil seul. Le pH de la composition peut se situer entre 6 et 8, le pH étant ajusté par un tampon choisi parmi le tampon MES et le tampon Hepes. On choisit le tampon que l’on utilise en fonction du pKa du couple impliqué. La composition peut comprendre un sel permettant la reconnaissance aptamère-cible, tel que CaCl 2 ou MgCl 2 , notamment à une concentration de 0,5 à 10 mmol/L. La composition peut comprendre un co-solvant organique, notamment choisi parmi des solvants polaires tels que le méthanol, l’éthanol, l’acétonitrile, en particulier à raison de 10 % en volume de la composition totale. En effet, dans certains cas, il peut être souhaitable d’ajouter un solvant organique si la solubilité de l’analyte dans l’eau n’est pas suffisante. L’analyte cible peut être : une molécule organique de masse moléculaire inférieure à 2000 Da, telle qu’un acide aminé, l’oligonucléotide étant un aptamère spécifique de ladite molécule organique ; ou l’ion mercurique Hg 2+ , l’oligonucléotide étant un ADN riche en thymine non structuré et spécifique de l’ion mercurique Hg 2+ ; ou un peptide, l’oligonucléotide étant un aptamère spécifique du peptide. L’invention porte également sur une composition en phase aqueuse de détection d’un analyte cible dans un échantillon, caractérisée par le fait que la composition comprend du bleu du Nil, un sel capable de s’agréger au bleu du Nil et un oligonucléotide spécifique de la cible. Le bleu du Nil peut être présent dans la composition à une concentration 10 à 80 µmol/L, de préférence de 45 à 55 µmol/L. Le sel capable de s’agréger au bleu du Nil peut être du chlorure de sodium ou du chlorure de potassium et peut être présent dans la composition à une concentration de 50 à 1000 mmol/L, de préférence de 150 à 500 mmol/L dans la composition. Le pH de la composition peut se situer entre 6 et 8, le pH étant réglé par un tampon choisi parmi le tampon MES et le tampon Hepes. On choisit le tampon que l’on utilise en fonction du pKa du couple impliqué. La composition peut comprendre un sel permettant la reconnaissance aptamère-cible, tel que CaCl 2 ou MgCl 2 , notamment à une concentration de 0,5 à 10 mmol/L. La composition peut comprendre un co-solvant organique, notamment choisi parmi les solvants polaires tels que le méthanol, l’éthanol, l’acétonitrile, en particulier à raison de 10 % en volume de la composition totale. Dans le cas de la détection d’une molécule organique de masse moléculaire inférieure à 2000 Da, telle qu’un acide aminé, l’oligonucléotide est un aptamère spécifique de ladite molécule organique. Dans le cas de la détection de l’ion mercurique Hg 2+ , l’oligonucléotide est un ADN riche en thymine non structuré et spécifique de l’ion mercurique Hg 2+ . Dans le cas de la détection d’un peptide, caractérisée par le fait que l’oligonucléotide est un aptamère spécifique du peptide. La présente invention porte également sur l’utilisation de la composition telle que définie ci-dessus pour la détection d’un analyte cible choisi parmi les molécules organiques de masse moléculaire inférieure à 2000 Da, telles que la tyrosinamide ou l’ochratoxine A, les ions tels que l’ion mercurique Hg 2+ , les peptides tels que l’arginine vasopressine. Les exemples ci-dessous illustrent la présente invention sans toutefois en limiter sa portée. Exemple I : L-tyrosinamide I-1 : effet du sel On a testé l’importance du sel sur le dosage du L-tyrosinamide. L’aptamère utilisé est un aptamère spécifique du L-tyrosinamide obtenu dans la littérature (Vianini, E.; Palumbo, M.; Gatto, B. Bioorg. Med. Chem. 2001, 9, 2543) et ensuite raccourci (Challier L. et al, Anal. Chem. 2016, 88, 11963−11971. On a préparé une gamme de solutions pour montrer l’effet de l’agrégation du sel capable de s’agréger au bleu du Nil avec ce dernier. Dans cet exemple, le sel capable de s’agréger au bleu du Nil est le chlorure de sodium. La composition de chacune de ces solutions est indiquée dans le tableau ci-dessous. Solution 1 2 3 4 5 6 7 8 Tampon 10 X (Mes à 500 mM et 50 mM MgCl 2 ; pH 6) (µL) Cf = 50 mM MES Cf = 5 mM MgCl 2 10 10 10 10 10 10 10 10 Bleu du Nil à 107,95 µM (µL) Cf= 53,96 µM 50 50 50 50 50 50 50 50 NaCl à 2,5 M (µL) Cf= 300(mM) - - - - 12 12 12 12 Aptamère à 10 - 4 M (µL) Cf = 3,5(µM) - - 3,5 3,5 - - 3,5 3,5 L-tyrosinamide à 60 mM Cf = 6(mM) - 10 - 10 - 10 - 10 H 2 O en µL 40 30 36,5 26,5 28 18 24,5 14,5 Cf = concentration finale dans le tube. Volume final = 100 µL. Préparation de la solution à 107,95 µM de bleu du Nil : Peser 7,91 mg de bleu du Nil les mettre dans 100 mL d’eau ultrapure. Mettre aux ultrasons pendant 30 min, puis filtration de la solution avec des filtres Nylon 0,2 µm. Préparation de la solution de NaCl à 2,5 M : Peser 7305 mg de NaCl et les mettre dans une fiole jaugée de 50 ml. Compléter avec de l’eau ultrapure après dissolution. Avant l’ajout de cible et de bleu du Nil l’aptamère est dénaturé à 80°C pendant 5 min dans le tampon en présence de sel et de magnésium. Puis la cible est ajoutée et la solution est incubée pendant 15 min à 10°C ce qui permet l’incubation de la cible lorsqu’elle est présente. Après ajout du Bleu du Nil, on mesure l’absorbance de la solution après un repos de 60 minutes à 10°C dans la plage visible de longueurs d’onde de 400 à 800 nm. On obtient alors les spectres de la . Sur la , NB signifie le Bleu du Nil, L-Tym le L-tyrosinamide, et Apt-L-Tym l’aptamère spécifique du L-tyrosinamide. Comme on peut le constater sur les courbes d’absorbance des solutions 1 et 2, l’absorbance du Bleu du Nil est laissée pratiquement inchangée lors de l’ajout de L-tyrosinamide. La présence de l’aptamère fait diminuer l’absorbance du mélange, ce qui s’explique par l’interaction du Bleu du Nil avec l’aptamère, comme on peut le voir sur la courbe de la solution 3. La solution 4 est identique à la solution 3 à la différence que la cible L-tyrosinamide est présente dans la solution 4. Comme on peut le voir sur les courbes des solutions 3 et 4, la différence d’absorbance n’est pas significative entre celles-ci, ce qui ne permet pas de pouvoir détecter la présence de la cible de façon satisfaisante. Les solutions 5 et 6 ont été préparées avec la présence de NaCl. Comme on peut le voir en comparant les courbes d’absorbance entre les solutions 1 et 2 et les solutions 5 et 6, l’absorbance des solutions avec le NaCl diminue de façon importante par rapport aux solutions sans NaCl. Ceci est dû à l’agrégation du Bleu du Nil en présence du NaCl qui permet de diminuer l’absorbance de la solution. Avec la présence de l’aptamère, une partie du Bleu du Nil va être déplacée de l’agrégat Bleu du Nil et NaCl pour venir s’intercaler entre les nucléotides de l’aptamère. Ceci a pour conséquence d’augmenter l’absorbance de la solution comme on peut le voir par comparaison des courbes des solutions 5 et 7. En présence de L-tyrosinamide, celui-ci va interagir avec son aptamère qui lui est spécifique, ce qui va libérer une partie du Bleu du Nil qui était intercalé avec l’aptamère. Ce Bleu du Nil, ainsi libéré, va s’agréger avec le NaCl, ce qui va provoquer une diminution de l’absorbance. C’est ce que l’on peut observer par comparaison des courbes des solutions 7 et 8 où la présence de la cible fait chuter l’absorbance de façon significative de la solution dans laquelle la cible est présente par rapport à celle dans laquelle la cible est absente. Cette modification significative de l’absorbance permet de pouvoir détecter de façon visuelle la présence de la cible en raison de la plus ou moins grande agrégation du Bleu du Nil avec le NaCl en fonction de la quantité de Bleu du Nil qui est disponible pour une telle agrégation. I-2 Spécificité du dosage On a testé la spécificité du dosage du L-tyrosinamide par rapport à son énantiomère D-tyrosinamide. On a préparé une gamme de solutions pour montrer la spécificité du dosage pour sa cible. La composition de chacune de ces solutions est indiquée dans le tableau ci-dessous. Solution 1 2 3 4 5 6 7 Tampon 10 X (Mes à 500 mM et 50 mM MgCl 2 ;pH 6) (µL) Cf = 50 mM MES Cf = 5 mM MgCl 2 10 10 10 10 10 10 10 Bleu du Nil à 107,95 µM (µL) Cf= 53,96 µM 50 50 50 50 50 50 50 NaCl à 2,5 M (µL) Cf= 300(mM) 12 12 12 12 12 12 12 Aptamère 1 à 10 - 4 M (µL) Cf = 3,5(µM) 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 - - Aptamère 2 à 10 - 4 M (µL) Cf = 3,5(µM) 3,5 3,5 L-tyrosinamide à 60 mM Cf = 6(mM) ou à *2,5 mM - 10 - 10* 10* - 10 D-tyrosinamide à 60 mM Cf = 6(mM) ou à 100 mM Cf= 12,5 mM - - 10 - 12,5 - - H 2 O en µL 24,5 14,5 14,5 14,5 2 24,5 14,5 Volume final = 100 µL. Aptamère 1 : aptamère spécifique du L-tyrosinamide obtenu comme à l’Exemple I-1. Aptamère 2 : Scramble aptamère possédant une séquence différente de l’aptamère 1 et sélectionné contre l’adénosine (Huizenga D. E. and Szostak J. W. Biochemistry 1995,34,656—665). Après dénaturation des aptamères et après mélange des composés excepté le bleu du Nil à une température de 10°C, on laisse reposer la solution pendant 15 minutes à cette même température, ce qui permet l’incubation de la cible lorsqu’elle est présente. On mesure l’absorbance de la solution après ajout de bleu du Nil et un repos de 60 minutes à 10°C dans la plage visible de longueurs d’onde de 400 à 800 nm. On obtient alors les spectres de la . Sur la , NB signifie le Bleu du Nil, L-Tym le L-tyrosinamide, D-Tym le D-tyrosinamide et Apt-L-Tym l’aptamère spécifique du L-tyrosinamide et SA le Scramble aptamère. Comme on peut le voir, sur les courbes des solutions 1 et 2, la présence de la cible L-tyrosinamide est détectée par le changement d’absorbance entre les solutions présentant la cible (solution 2) de la solution dans laquelle la cible n’est pas présente (solution 1). Les courbes des solutions 6 et 7 ne présentent pas de modification de l’absorbance selon que la cible est absente ou présente. Dans ces deux cas, l’aptamère utilisé n’est pas spécifique de la cible. Cela montre qu’en l’absence de l’aptamère spécifique de la cible, la présence de la cible ne permet pas le déplacement d’une partie du Bleu du Nil qui intercalé dans l’aptamère pour ainsi modifier l’absorbance de la solution. Les solutions 3 et 5 sont préparées avec du D-tyrosinamide. Si l’on compare les absorbances des solutions 1, 2 et 3, on constate que la présence de L-tyrosinamide conduit à une absorbance réduite par rapport à la solution sans la cible alors que la présence de D-tyrosinamide ne présente pas une diminution de l’absorbance mais présente une absorbance quasi-identique à la solution sans tyrosinamide. La solution 5 est préparée avec un fort excès de D-tyrosinamide par rapport au L-tyrosinamide. La comparaison de l’absorbance des solutions 4 et 5 permet de constater que la présence de D-tyrosinamide ne modifie pas l’absorbance de la solution et que la détection de la cible L-tyrosinamide n’est pas affectée par sa présence. Il est donc bien montré que la détection de la cible L-tyrosinamide est bien spécifique même par rapport à son énantiomère D-tyrosinamide. I-3 Courbe d’étalonnage On a préparé une gamme de solutions de concentrations connues en L-tyrosinamide. La composition de chacune de ces solutions est indiquée dans le tableau ci-dessous. Solution 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Tampon 10 X (Mes à 500 mM et 50 mM MgCl 2 ;pH 6) (µL) Cf = 50 mM MES Cf = 5 mM MgCl 2 10 10 10 10 10 10 10 Bleu du Nil à 107.95 µM (µL) Cf= 53.96 µM 50 50 50 50 50 50 50 50 50 NaCl à 2,5 M (µL) Cf= 300(mM) 12 12 12 12 12 12 12 12 12 Aptamère à 10 - 4 M (µL) Cf= 3,5(µM) 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 L-tyrosinamide 10 µL d’une solution 10X plus concentrée que la Cf en (mM) 0 0,0625 0,125 0,250 0,5 0,750 1,5 3 6 H 2 O en µL 24,5 14,5 14,5 14,5 14,5 14,5 14,5 14,5 14,5 Volume final = 100 µL. Aptamère : aptamère spécifique du L-tyrosinamide obtenu comme à l’Exemple I-1. Après dénaturation des aptamères et après mélange des composés excepté le bleu du Nil à une température de 10°C, on laisse reposer la solution pendant 15 minutes à cette même température, ce qui permet l’incubation de la cible. On obtient les solutions indiquées dans le tableau ci-dessus et qui présentent les couleurs montrées en . On mesure l’absorbance de la solution après un ajout de bleu du Nil et repos de 60 minutes à 10°C dans la plage visible de longueurs d’onde de 400 à 800 nm. On obtient alors les spectres de la . On a choisi la longueur d’onde de 632 nm pour réaliser la courbe d’étalonnage présentée à la et que l’on a obtenue à partir de la valeur d’absorbance des solutions 1 à 9 à cette longueur d’onde. A partir de cette courbe d’étalonnage, il est donc possible de connaître la concentration en L-tyrosinamide dans un échantillon de test par mesure de l’absorbance telle que réalisée pour les solutions connues ci-dessus. Exemple II : ion mercurique Hg2+ II-1 Courbe d’étalonnage On a préparé une gamme de solutions de concentrations connues en ion mercurique Hg 2+ . La composition de chacune de ces solutions est indiquée dans le tableau ci-dessous. Solution 1 2 3 4 5 6 7 Tampon Hepes à 500mM (µL) (pH 8) Cf = 50 mM 10 10 10 10 10 10 10 Bleu du Nil à 107,95 µM (µL) Cf= 53,96 µM 50 50 50 50 50 50 50 NaCl à 2,5 M (µL) Cf= 300(mM) 12 12 12 12 12 12 12 Oligonucléotide à 10 - 4 M (µL) Cf= 2(µM) 2 2 2 2 2 2 2 Hg 2+ 10 µL d’une solution 10 fois plus concentrée que la Cf en (µM) 0 1,875 2,5 3,75 5 7,5 15 H 2 O en µL 26 16 16 16 16 16 16 Volume final = 100 µL. Oligonucléotide : oligonucléotide spécifique à l’ion mercurique et obtenu d’après Ono A. and Togashi H. Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 4300 –4302. Après mélange des composés à une température de 10°C, on laisse reposer la solution pendant 60 minutes à cette même température, ce qui permet l’incubation de la cible. On obtient les solutions indiquées dans le tableau ci-dessus et qui présentent les couleurs montrées en . On mesure l’absorbance de la solution ajout de bleu du Nil et après un repos de 60 minutes à 10°C dans la plage visible de longueurs d’onde de 400 à 800 nm. On obtient alors les spectres de la . Contrairement au L-tyrosinamide, l’absorbance de la solution obtenue augmente avec la concentration en ion mercurique. En effet, l’ion mercurique permet le repliement de son oligonucléotide en double brin lorsqu’il est présent. La formation d’un double brin d’oligonucléotide favorise l’intercalation du Bleu du Nil dans ce double brin. Une plus grande quantité d’ion mercurique dans la solution va mener à une plus grande quantité de double brin d’oligonucléotide et donc à une plus grande intercalation de Bleu du Nil. Cette plus grande intercalation de Bleu du Nil avec l’oligonucléotide double brin fait qu’il a moins de Bleu du Nil disponible pour s’agréger avec le sel capable de s’agréger au bleu du Nil. Par conséquent, une augmentation de la quantité d’ion mercurique dans la solution entraîne une augmentation de l’absorbance. On a choisi la longueur d’onde de 632 nm pour réaliser la courbe d’étalonnage présentée à la et que l’on a obtenue à partir de la différence d’absorbance entre la solution 1 (sans ion mercurique) et chacune des autres solutions 1 à 7 à cette longueur d’onde. II-2 Spécificité du test On a testé la spécificité du dosage de l’ion mercurique Hg2+ par rapport à d’autres cations monovalents ou divalents. On a préparé une gamme de solutions pour montrer la spécificité du dosage pour Hg 2+ . La composition de chacune de ces solutions est indiquée dans le tableau ci-dessous, avec une concentration finale de 15µM pour le cation étudié. Solution 1 2 4 5 6 7 Tampon Hepes à 500mM (µL) (pH 8) Cf = 50 mM 10 10 10 10 10 10 Bleu du Nil à 107,95 µM (µL) Cf= 53,96 µM 50 50 50 50 50 50 NaCl à 2,5 M (µL) Cf= 300(mM) 12 12 12 12 12 12 Oligonucléotide à 10 - 4 M (µL) Cf= 2(µM) 2 2 2 2 2 2 Cation 10 µL - Hg 2+ Li + Mg 2+ Ni 2+ Pb 2+ H 2 O 26 16 16 16 16 16 Solution 8 9 10 11 Tampon Hepes à 50mM (mL) (pH 8) Cf = 50 mM Bleu du Nil à 107,95 µM (µL) Cf= 53,96 µM 50 50 50 50 NaCl à 2,5 M (µL) Cf= 300(mM) 12 12 12 12 Oligonucléotide à 10 - 4 M (µL) Cf= 2(µM) 2 2 2 2 Cation 10 µL Sr 2+ Zn 2+ Ca 2+ Mn 2+ H 2 O 16 16 16 16 Volume final = 100 µL. Oligonucléotide : oligonucléotide spécifique à l’ion mercurique tel qu’obtenu à l’Exemple II-1 Après mélange des composés à une température de 10°C, on laisse reposer la solution pendant 60 minutes à cette même température, ce qui permet l’incubation de la cible. On mesure l’absorbance de la solution après ajout de bleu du Nil et après un repos de 60 minutes à 10°C à la longueur d’onde de 632 nm. Puis on mesure la différence entre l’absorbance de la solution 1 sans cation ajouté à chacune des autres solutions. Ces valeurs de différence d’absorbance (ΔA 632 ) sont rapportées à la . Comme on peut le voir sur cette figure, seule la présence de l’ion mercurique permet une augmentation significative de l’absorbance par rapport à la solution sans cation ajouté. En effet, les ions Mg 2+ , Ni 2+ Zn 2+ provoquent une modification de l’absorbance contraire à celle attendue pour les ions mercuriques. Les ions Ca 2+ ne modifient pas l’absorbance de la solution. Les ions Li + , Pb 2+ , Sr 2+ et Mn 2+ provoquent une augmentation minimale de l’absorbance, liée à la précision de la mesure, et bien inférieure à une différence d’absorbance (ΔA 632) de 0,1. Le test présente donc bien une spécificité par rapport à l’ion mercurique. Exemple III : ochratoxine A On a préparé une gamme de solutions de concentrations connues en ochratoxine A pour préparer une courbe d’étalonnage. La composition de chacune de ces solutions est indiquée dans le tableau ci-dessous. Solution 1 2 3 4 5 6 7 Tampon 10 X (Hepes à 500 mM et 50 mM CaCl 2 ; pH 7) (µL) Cf = 50 mM Hepes Cf = 5 mM CaCl 2 10 10 10 10 10 10 10 Bleu du Nil à 107,95 µM (µL) Cf= 53,96 µM 50 50 50 50 50 50 50 NaCl à 2,5 M (µL) Cf= 300(mM) 12 12 12 12 12 12 12 Aptamer à 10 - 4 M (µL) Cf= 4(µM) 4 4 4 4 4 4 4 Ochratoxine A (µM) 10 µl d’une solution 10 fois plus concentrée que la Cf dans la composition. Solutions préparées dans le MeOH. 10% de MeOH en final dans les tubes 0 5 10 20 30 40 40 (aflatoxine B1) H 2 O en µL 24 14 14 14 14 14 14 Volume final = 100 µL. Aptamer : aptamer spécifique de l’ochratoxine A et obtenu selon (Cruz-Aguado J. A. and Penner G. Anal. Chem. 2008, 80, 8853–8855) Après dénaturation des aptamères et après mélange des composés excepté le bleu du Nil à une température de 10°C, on laisse reposer la solution pendant 15 minutes à cette même température, ce qui permet l’incubation de la cible. On obtient les solutions indiquées dans le tableau ci-dessus et qui présentent les couleurs montrées en . On mesure l’absorbance de chaque solution après ajout de bleu du Nil et après un repos de 60 minutes à la longueur d’onde de 632 nm. Puis on mesure la différence entre l’absorbance de la solution 1 sans ajout de toxine à chacune des autres solutions. Ces valeurs de différence d’absorbance (ΔA 632 ) sont rapportées dans la . Comme on peut le voir sur la , l’ajout de l’ochratoxine A provoque une diminution de l’absorbance par rapport à la solution témoin (ΔA 632 négatif) avec la concentration en ochratoxine A. La mesure est spécifique car l’aflatoxine B1 en présence du même aptamer n’entraîne pas la modification de couleur attendue pour l’ochratoxine A. En effet, la modification de couleur attendue pour l’ochratoxine A est une diminution de l’absorbance et non une légère augmentation provoquée par l’aflatoxine B1 probablement liée à une interaction entre le bleu de Nil et l’aflatoxine B1. Exemple IV : D-arginine vasopressine On a préparé une gamme de solutions de concentrations connues en D-arginine vasopressine pour préparer une courbe d’étalonnage. La composition de chacune de ces solutions est indiquée dans le tableau ci-dessous. Solution 1 2 3 4 5 6 7 8 Tampon 10 X (Hepes à 500 mM et 50 mM MgCl 2 ; pH 7,5) (µL) Cf = 50 mM Hepes Cf = 5 mM MgCl 2 10 10 10 10 10 10 10 10 Bleu du Nil à 107,95 µM (µL) Cf= 53,96 µM 50 50 50 50 50 50 50 50 NaCl à 2,5 M (µL) Cf= 300(mM) 12 12 12 12 12 12 12 12 Aptamer à 10 - 4 M (µL) Cf= 2(µM) 2 2 2 2 2 2 2 3 D-arginine vasopressine (µM) 10 µL d’une solution 10 fois plus concentrée que la Cf en (µM) 0 15,625 31,25 62,5 125 250 500 500 (L-arginine vasopressine) H 2 O 26 16 16 16 16 16 16 16 Volume final = 100 µL. Aptamer : aptamer spécifique à la D-arginine vasopressine et obtenu selon (Williams K. P. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1997, 94, 11285). Après dénaturation des aptamères et après mélange des composés excepté le bleu du Nil à une température de 10°C, on laisse reposer la solution pendant 15 minutes à cette même température, ce qui permet l’incubation de la cible. On obtient les solutions indiquées dans le tableau ci-dessus et qui présentent les couleurs montrées en . On mesure l’absorbance de chaque solution après ajout de bleu du Nil et après un repos de 60 minutes à 10°C à la longueur d’onde de 632 nm. Puis on mesure la différence entre l’absorbance de la solution 1 sans ajout de peptide à chacune des autres solutions. Ces valeurs de différence d’absorbance (ΔA 632 ) sont rapportées à la . Comme on peut le voir sur la , l’ajout de la D-arginine vasopressine provoque une diminution de l’absorbance par rapport à la solution témoin (ΔA 632 négatif) avec la concentration en D-arginine vasopressine. La mesure est spécifique car l’ajout de L-arginine vasopressine en présence du même aptamer n’entraîne pas la modification de couleur attendue pour la D-arginine vasopressine. En effet la modification de couleur attendue pour la D-arginine vasopressine est une diminution de l’absorbance, et la présence de L-arginine vasopressine provoque une augmentation minimale de l’absorbance. – Procédé de détection d’un analyte cible dans un échantillon, caractérisé par le fait que : on prépare une composition en phase aqueuse comportant du bleu du Nil, un sel capable de s’agréger au bleu du Nil et un oligonucléotide spécifique de la cible ; on met en contact la composition ainsi préparée avec l’échantillon à tester ; et on observe la modification attendue de couleur du mélange de la composition et de l’échantillon à tester. – Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu’à l’étape (3) d’observation de la modification de couleur, on observe à l’œil nu la modification de couleur. – Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait qu’on évalue la concentration de l’analyte cible par comparaison avec des bandelettes d’étalonnage présentant les couleurs attendues à la concentration de l’analyte cible. – Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l’on mesure l’absorbance du mélange de la composition et de l’échantillon à tester que l’on compare avec une courbe d’étalonnage de l’absorbance établie au préalable en présence de quantités connues de l’analyte cible. – Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que l’absorbance est mesurée à une longueur d’onde comprise entre 450 et 700 nm, de préférence à longueur d’onde de 600 nm ou de 632 nm. – Procédé selon l’une des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait que l’oligonucléotide est un aptamère. – Procédé selon l’une des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait que le bleu du Nil est présent dans la composition à une concentration de 10 à 80 µmol/L, de préférence de 45 à 55 µmol/L. – Procédé selon l’une des revendications 1 à 7, caractérisé par le fait que le sel capable de s’agréger au bleu du Nil est du chlorure de sodium ou du chlorure de potassium à une concentration de 50 à 1000 mmol/L, de préférence de 150 à 500 mmol/L dans la composition. – Procédé selon l’une des revendications 1 à 8, caractérisé par le fait que le pH de la composition se situe entre 6 et 8, le pH étant réglé par un tampon choisi parmi le tampon MES et le tampon Hepes. – Procédé selon l’une des revendications 6 et 7 à 9 dans leur dépendance de la revendication 6, caractérisé par le fait que la composition comprend un sel permettant la reconnaissance aptamère-cible, tel que CaCl 2 ou MgCl 2 , notamment à une concentration de 0,5 à 10 mmol/L. – Procédé selon l’une des revendications 1 à 10, caractérisé par le fait que la composition comprend un co-solvant organique, notamment choisi parmi les solvants polaires tels que le méthanol, l’éthanol, l’acétonitrile, en particulier à raison de 10 % en volume de la composition totale. – Procédé selon l’une des revendications 1 à 11 dans lequel l’analyte cible est une molécule organique de masse moléculaire inférieure à 2000 Da, telle qu’un acide aminé, caractérisé par le fait que l’oligonucléotide est un aptamère spécifique de ladite molécule organique. – Procédé selon l’une des revendications 1 à 11 dans lequel l’analyte cible est l’ion mercurique Hg 2+ , caractérisé par le fait que l’oligonucléotide est un ADN riche en thymine non structuré et spécifique de l’ion mercurique Hg 2+ . – Procédé selon l’une des revendications 1 à 11 dans lequel l’analyte cible est un peptide, caractérisé par le fait que l’oligonucléotide est un aptamère spécifique du peptide. – Composition en phase aqueuse de détection d’un analyte cible dans un échantillon caractérisée par le fait que la composition comprend du bleu du Nil, un sel capable de s’agréger au bleu du Nil et un oligonucléotide spécifique de la cible. – Composition selon la revendication 15, caractérisée par le fait que le bleu du Nil est présent dans la composition à une concentration 10 à 80 µmol/L, de préférence de 45 à 55 µmol/L. – Composition selon l’une des revendications 15 et 16, caractérisée par le fait que le sel capable de s’agréger au bleu du Nil est du chlorure de sodium ou du chlorure de potassium et est présent dans la composition à une concentration de 50 à 1000 mmol/L, de préférence de 150 à 500 mmol/L dans la composition. – Composition selon l’une des revendications 15 à 17, caractérisée par le fait que le pH de la composition se situe entre 6 et 8, le pH étant réglé par un tampon choisi parmi le tampon MES et le tampon Hepes. – Composition selon l’une des revendications 15 à 18, caractérisée par le fait que l’oligonucléotide spécifique de la cible est un aptamère et que la composition comprend un sel permettant la reconnaissance aptamère-cible, tel que CaCl 2 ou MgCl 2 , notamment à une concentration de 0,5 à 10 mmol/L. – Composition selon l’une des revendications 15 à 19, caractérisée par le fait qu’elle comprend un co-solvant organique, notamment choisi parmi les solvants polaires tels que le méthanol, l’éthanol, l’acétonitrile, en particulier à raison de 10 % en volume de la composition totale. – Composition selon l’une des revendications 15 à 20 pour la détection d’une molécule organique de masse moléculaire inférieure à 2000 Da, telle qu’un acide aminé, caractérisée par le fait que l’oligonucléotide est un aptamère spécifique de ladite molécule organique. – Composition selon l’une des revendications 15 à 20 pour la détection de l’ion mercurique Hg 2+ , caractérisée par le fait que l’oligonucléotide est un ADN riche en thymine non structuré et spécifique de l’ion mercurique Hg 2+ . – Composition selon l’une des revendications 15 à 20 pour la détection d’un peptide, caractérisée par le fait que l’oligonucléotide est un aptamère spécifique du peptide. – Utilisation de la composition selon l’une des revendications 15 à 23 pour la détection d’un analyte cible choisi parmi les molécules organiques de masse moléculaire inférieure à 2000 Da, telles que la tyrosinamide ou l’ochratoxine A, les ions tels que l’ion mercurique Hg 2+ , les peptides tels que l’arginine vasopressine.