Brevet FR3129833A1 — publié le 20230609

L’invention a trait à une nanoparticule comprenant un lipide cationique, un lipide neutre, et un lipide sensible au pH, différent dudit lipide cationique, utile comme vecteur pour le transport et la libération d’acides nucléiques à l’intérieur de cellules. NANOPARTICULES POUR LA LIBERATION D’ACIDES NUCLEIQUES La présente invention se rapporte à de nouveaux vecteurs pour l'administration intracellulaire d’acides nucléiques, dans des modèles in vitro ou ex vivo , ou pour des applications thérapeutiques in vivo . Etat de la technique antérieure Les acides nucléiques simple et double brin (oligonucléotides antisens, petits ARN interférents, ADN plasmidique et, plus récemment, ARNm) nécessitent typiquement un système de libération pour atteindre leurs cibles de manière intacte et efficace, système qui peut être physique (électroporation, délivrance assistée par ultrasons) ou au moyen de vecteurs de taille nanométrique. Les vecteurs couramment utilisés et les plus efficaces pour faire pénétrer des acides nucléiques dans le cytoplasme d'une cellule sont des molécules chimiques cationiques, de type lipide ou polymère, qui s'associent par leur charge à l'acide nucléique et lui permettent d'entrer dans la cellule. Ces molécules, qui sont chargées de manière permanente ou deviennent positives en réponse au pH de leur environnement, sont utilisées très couramment pour faire pénétrer des acides nucléiques (ADN ou ARN, de petite ou grande taille) dans des cellules en culture ou des cellules de l'organisme. Très efficaces dans les cellules en culture, elles le sont moins dans l'organisme du fait de phénomènes de piégeage par les protéines et les cellules contenues dans le sang. Le brevet antérieur EP 2389158 décrit une composition à base d’une macromolécule anionique, qui peut être par exemple un acide alginique, et d’un lipide cationique. Cette composition, qui comprend en outre du cholestérol, permet la libération d’un acide nucléique d’une taille inférieure à 200 nucléotides. Il est également connu de délivrer des acides nucléiques par des liposomes formés des combinaisons DOTAP et DOPE, et de cholestérol, comme dans la demande de brevet WO2013/143555 de BioNTech, liposomes qui sont éventuellement recouverts d’acide hyaluronique (HA). Voir Gasperini, Langmuir 31.11 (2015) : 3308-3317 ; Hattori, et al, Journal of drug targeting 21.7 (2013) : 639-647 ; Ruponen et al, Glycobiology and extracellular matrices, 276 (2001) : 33875-33880. Les inventeurs proposent maintenant de nouvelles nanoparticules qui sont à la fois stables et permettent une libération ciblée, intracellulaire, de l’acide nucléique. Les nanoparticules de l’invention comprennent (a) un lipide cationique, (b) un lipide neutre, et (c) un lipide sensible au pH, différent du lipide cationique (a). Dans un mode de réalisation particulier, la nanoparticule est chargée avec un acide nucléique. Une telle nanoparticule est utile pour la délivrance intracellulaire dudit acide nucléique. De préférence, la nanoparticule de l’invention est recouverte par un polysaccharide anionique, de préférence de l’acide hyaluronique. De manière avantageuse, la nanoparticule de l’invention est typiquement dépourvue de cholestérol, voire d’un quelconque stéroïde. Figures est une représentation schématique de complexes lipoplexes non revêtus (LRC) et revêtus d’acide hyaluronique (HLRC). représente des images de cryo-MET de liposomes. Dans la Figure 2A, la morphologie classique des liposomes uni-lamellaires est montrée sans ARNm. Les interactions des liposomes avec l’ARNm et l’ARNm/HA sont rapportées respectivement dans les Figures 2B et 2C. rapporte les résultats en termes d’efficacité de transfection, viabilité cellulaire et internalisation des cellules THP-1 après transfection avec des liposomes (fabrication par hydratation du film lipidique) complexées avec le eGFP-ARNm à différents rapports N/P. Analyse de cytométrie en flux de l’efficacité de transfection et de l’intensité de fluorescence des monocytes THP-1 avec A) des nanoparticules lipidiques (LRC) et avec B) des nanoparticules revêtues d’HA (HLRC) à différents rapports N/P (1, 3, 3,5, 5) au bout de 24 h. C) La viabilité cellulaire a été évaluée avec de l’iodure de propidium (PI) et de l’annexine V colorante pour visualiser la nécrose et l’apoptose à des moments indiqués après la transfection avec soit LRC soit HLRC au rapport N/P de 3. L’internalisation des LRC D) et HLRC E) par des cellules THP-1 a été mesurée à des moments indiqués par cytométrie en flux en utilisant des nanoparticules fluorescentes à la rhodamine et avec contraste de phase et microscopie de fluorescence 24 h post-transfection. Toutes les valeurs sont des moyennes ± écart-type de la moyenne et les analyses statistiques ont été calculées en utilisant le test ANOVA à un facteur. rapporte les résultats en termes d’efficacité de transfection et viabilité cellulaire des cellules THP-1 après transfection avec des LRC et HLRC complexés (fabrication par microfluidique) avec eGFP-mARN à différents rapports N/P. Analyse de cytométrie en flux de l’efficacité de transfection et de l’intensité de fluorescence des monocytes THP-1 avec A) LRC et B) HLRC à différents rapports N/P (1, 2, 2,5, 3, 3,5, 5) au bout de 24 h. C) Viabilité cellulaire évaluée par coloration à l’iodure de propidium (PI) et à l’annexine V pour visualiser la nécrose et l’apoptose à des moments indiqués après transfection avec soit des LRC soit des HLRC au rapport N/P de 2. Toutes les valeurs sont des moyennes ± écart-type de la moyenne et des analyses statistiques ont été réalisées en utilisant le test ANOVA à un facteur. montre les propriétés physico-chimiques des HLRC (produits par microfluidique) chargés en ADNp. Diamètre moyen et indice de polydispersité (A) et valeurs de potentiel zêta (B) des HLRC chargés en ADNp à différents rapports N/P. Analyse électrophorétique des HLRC chargés en ADNp pour rechercher l’efficacité d’association d’ADN dans des HLRC (C). Image cryo-MET des HLRC chargés en ADNp à un rapport N/P de 1,5 (D). montre le taux d’internalisation des HLRC chargés en ADNp sur des myoblastes C2C12. montre l’efficacité de transfection des HLRC chargés en ADNp à différents rapports N/P sur des myoblastes C2C12. montre le résultat des tests de viabilité cellulaire sur des myoblastes C2C12 transfectés par des HLRC chargés en ADNp à différents rapports N/P. Les valeurs représentent des moyennes ± S.D (deviation standard). montre le résultat d’efficacité de transfection des ARNsi-HLRC à différentes doses, sur myoblastes C2C12. Nanoparticule comprenant : (a) un lipide cationique, (b) un lipide neutre, et (c) un lipide sensible au pH, différent du lipide cationique (a). Nanoparticule selon la revendication 1, chargée avec un acide nucléique. Nanoparticule selon la revendication 1 ou 2, recouverte par un polysaccharide anionique, de préférence de l’acide hyaluronique. Nanoparticule selon l’une des revendications 1 à 3, dépourvue de cholestérol, voire d’un quelconque stéroïde. Nanoparticule selon l’une des revendications 1 à 4, dans laquelle le rapport molaire de lipide cationique par rapport aux autres lipides va de 1 :1 à 2 :1. Nanoparticule selon l’une des revendications 1 à 5, dans laquelle le lipide cationique est choisi parmi les ammoniums quartenaires tels que le chlorure de 1,2-dioleoyloxypropyl-N,N,N-triméthylammonium (DOTAP), le bromure de 1,2-dimyristoyloxypropyl-3-diméthyl-hydroxy éthyl ammonium bromide (DMRIE), le chlorure de N-(2,3-dioleoyloxypropyl]-N,N,N-triméthylammonium (DOTMA), la diméthyldioctadécylammonium bromide (DDAB), le bromure de 1,2-dioleyloxypropyl-3- diméthylhydroxyéthylammonium (DORIE), la N-(4-carboxybenzyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(oleoyloxy)propan-1-aminium (DOBAQ), la 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (sel de chlorure) (DOEPC), le chlorure de N-N-dioleoyl-N,N-diméthylammonium (DODAC), 1,2-dioleoyl-3-diméthylammonium-propane (DODAP), le chlorure de N-methyl-4(dioleyl)methylpyridinium (SAINT-2) ; de préférence le lipide cationique étant du DOTAP. Nanoparticule selon l’une des revendications 1 à6, dans laquelle le lipide neutre est choisi parmi le l,2-dioleoyl-sn-glycero-3- phosphoethano lamine (DOPE), le dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), le dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) et le N'-(rac-l-[l 1-(F- octyl)undec- 10-enyl]-2-(hexadecyl)glycero-3-phosphoethanoyl)-sperminecarboxamide) ; le lipide neutre étant de préférence du DOPE. Nanoparticule selon l’une des revendications 1 à 7, dans laquelle le lipide sensible au pH est un lipide de formule (I) suivante : (I) dans laquelle : RCOO est un groupement choisi parmi le groupement myristoyle, le groupement α-D-tocophérolsuccinoyle, le groupement linoléyle et le groupement oléoyle ; et X est choisi parmi les groupements de structures (II), (III) ou (IV) suivantes : (II) (III) (IV) Nanoparticule selon la revendication 8, dans laquelle le lipide sensible au pH est un lipide de formule (I), dans laquelle : RCOO est un groupement myristoyle et X est un groupement de formule (II) ; RCOO est un groupement α-D-tocophérolsuccinoyle et X est un groupement de formule (II) ou (III) ; RCOO est un groupement linoléyle ou oléoyle et X est un groupement de formule (III) ; ou RCOO est un groupement oléoyle et X est un groupement de formule (IV). Nanoparticule selon la revendication 8 ou 9, dans laquelle le lipide sensible au pH est un lipide de formule (I), dans laquelle RCOO est un groupement myristoyle et X est un groupement de formule (II) (II). Nanoparticule selon la revendication 10, comprenant (a) du DOTAP en tant que lipide cationique, (b) du DOPE en tant que lipide neutre, et (c) un lipide de formule (I) en tant que lipide sensible au pH, dans laquelle RCOO est un groupement myristoyle et X est un groupement de formule (II) (II). Nanoparticule selon l’une des revendications 1 à 11, chargée avec un acide nucléique qui est de l’ARNm. Nanoparticule selon l’une des revendications 1 à 12, chargée avec un acide nucléique qui est de l’ADN.