Brevet FR3114323A1 — publié le 20220325

Procédé de production de globules rouges de culture La présente invention concerne un procédé de production de globules rouges de culture à partir de cellules souches ou de cellules d’une lignée cellulaire immortalisée du lignage érythroïde. (Pas de figure) Procédé de production de globules rouges de culture Objet de l’invention La présente invention concerne un procédé de production de globules rouges de culture. Arrière-plan technique La transfusion de globules rouges, ou érythrocytes, est couramment utilisée pour de nombreuses applications médicales et chirurgicales. Cette procédure a sauvé à elle seule des millions de vies au cours des 60 dernières années. La demande de telles transfusions est amenée à augmenter dans le futur du fait du vieillissement de la population. La transfusion de globules rouges est utilisée comme traitement de l'anémie. L'approvisionnement dépend du don de sang volontaire, mais une main-d’œuvre importante est nécessaire pour la collecte, la préparation et le stockage afin d'assurer son approvisionnement continu. En outre, les préparations de globules rouges issues du don de sang ne sont pas totalement exemptes de tous risques infectieux résiduels. Dans de telles circonstances, afin de fournir de manière stable des globules rouges sûrs, il existe un besoin croissant de fabriquer artificiellement des globules rouges comme complément au don de sang. La production ex vivo de globules rouges de culture, également dits produits artificiellement, présente de nombreux intérêts et applications thérapeutiques et scientifiques. Par exemple, la transfusion sanguine, le transport de médicaments, les « Globules rouges médicaments » et comme support de test pour le développement de médicaments. Bien que de nombreuses tentatives aient été faites, à ce jour, pour dériver des globules rouges in vitro à partir de cellules souches et/ou progéniteurs hématopoïétiques (dérivés de moelle osseuse, de sang de cordon ombilical ou de sang périphérique), de cellules souches embryonnaires, d’iPSC ou de lignées cellulaires immortalisées du lignage érythroïde, elles ont échoué à passer au stade industriel pour diverses raisons, notamment pour des questions de coûts, de durée du protocole, d’étapes trop nombreuses, de l’utilisation de cellules nourricières, de l’intensité du travail, du faible rendement ou encore de l’incapacité à différencier complètement les cellules érythroïdes en cellules anucléées. Ainsi, Giarratana et al . (2011) “ Proof of principle for transfusion of in vitro–generated red blood cells”, Blood 118 :5071–5079 décrivent la production ex vivo de globules rouges de culture à partir de cellules souches hématopoïétiques isolées du sang périphérique. Toutefois, le procédé utilisé n’est pas industrialisable. Il existe donc un besoin pour un procédé de production industriel de globules rouges de culture sûrs et ayant une fonctionnalité similaire aux globules rouges natifs, notamment caractérisée par une bonne déformabilité et la présence d’hémoglobine fonctionnelle. La présente invention a ainsi pour objet un procédé de production de globules rouges de culture, en particulier à partir de cellules fraiches ou congelées, les cellules étant des cellules souches et/ou des progéniteurs ou des cellules d’une lignée cellulaire immortalisée du lignage érythroïde, comprenant les étapes suivantes : a) au moins une culture en bioréacteur de type batch ou fed-batch des cellules ; b) culture en bioréacteur de type perfusion des cellules obtenues à l'étape a) ; c) Lavage et tri particulaire des cellules obtenues à l’étape b) pour obtenir une population de globules rouges de culture. La présente invention concerne également des globules rouges de culture obtenus, ou susceptibles d’être obtenus, par la mise en œuvre du procédé défini ci-dessus. La présente invention concerne également une population de globules rouges de culture, qui peut être obtenue par la mise en œuvre du procédé défini ci-dessus, laquelle population de globules rouges de culture présente au moins 1, de préférence au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou l’ensemble, des caractéristiques suivantes : Un pourcentage de Hoechst+ inférieur à 30% ; Eventuellement un pourcentage de cellule CD36+ inférieur à 50% ; Eventuellement un pourcentage de cellules CD71+ supérieur à 50% ; Eventuellement un pourcentage de cellules marquées au thiazole orange supérieur à 50% ; Un VGM de 80 fL à 160 fL ; Une TCMH supérieure à 24 pg/cellule ; Une CCMH supérieure à 19 g/dl ; Une p50 de 18 à 28 mmHg ; Eventuellement une proportion de HbA de 70% à 100% ; Eventuellement une proportion de HbF de 0% à 30% ; Eventuellement une proportion de HbA2 inférieure à 8% ; Une proportion de HbCO de 0% à 10% ; Une proportion de MetHb de 0% à 3% ; Une déformabilité supérieure à 75% de celle de globules rouges natifs ; Une teneur en ATP de 4 à 12 µmol/g Hb. La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant des globules rouges de culture tels que définis ci-dessus à titre de substance active, éventuellement en association avec au moins un excipient ou véhicule pharmaceutiquement acceptable. La présente invention concerne également des globules rouges de culture tels que définis ci-dessus, ou une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, pour une utilisation dans une méthode de diagnostic, de prévention ou de traitement d'une maladie, ou d'un trouble, caractérisé par une carence en globules rouges ou en hémoglobine fonctionnelle chez un individu. La présente invention concerne également une méthode de diagnostic, de prévention ou de traitement d'une maladie, ou d'un trouble, caractérisé par une carence en globules rouges ou en hémoglobine fonctionnelle chez un individu, dans laquelle on administre à l’individu une quantité efficace de globules rouges de culture tels que définis ci-dessus ou d’une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus. La présente invention concerne également l’utilisation de globules rouges de culture tels que définis ci-dessus pour la préparation d’un réactif destiné au diagnostic, ou d’un médicament destiné à la prévention ou au traitement, d'une maladie, ou d'un trouble, caractérisé par une carence en nombre de globules rouges ou en hémoglobine fonctionnelle chez un individu. Description de l’invention A titre préliminaire, on rappellera que le terme « comprenant » signifie « incluant », « contenant » ou « englobant », c’est-à-dire que lorsqu’un objet « comprend » un élément ou plusieurs éléments, d’autres éléments que ceux mentionnés peuvent également être compris dans l’objet. A contrario , l’expression « consistant en » signifie « constitué de », c’est-à-dire que lorsqu’un objet « consiste en » un élément ou plusieurs éléments, l’objet ne peut pas comprendre d’autres éléments que ceux mentionnés. Cellules Il est possible d’envisager la production de globules rouges à partir de diverses sources cellulaires. Le procédé selon l’invention utilise comme source cellulaire des cellules souches, des progéniteurs, ou des cellules d’une lignée cellulaire immortalisée du lignage érythroïde. Les cellules souches peuvent être des cellules souches embryonnaires (ESC), des cellules souches pluripotentes induites (iPSC), ou des cellules souches et/ou progéniteurs hématopoïétiques (HSC/HP). De préférence le procédé selon l’invention utilise comme source cellulaire des cellules souches hématopoïétiques (HSC). Les cellules d’une lignée cellulaire immortalisée du lignage érythroïde peuvent être immortalisées au stade d’un progéniteur érythroïde ou d’un précurseur érythroïde. Par ailleurs, les cellules souches hématopoïétiques (HSC) peuvent également être immortalisées. L’immortalisation est préférentiellement réalisée de façon conditionnelle. Ces cellules immortalisées peuvent alors être passées indéfiniment in vitro , cryoconservées et récupérées, et, de manière conditionnelle, produire des globules rouges totalement différenciés à partir d'une source définie et bien caractérisée. L'immortalisation de manière conditionnelle peut être obtenue par n'importe quel procédé bien connu de la personne du métier. Les cellules souches embryonnaires (ESC) et les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) sont des cellules souches pluripotentes. Ces cellules sont à la fois capables de différenciation en de nombreux types de cellules et capables d'autoréplication. Elles peuvent maintenir cette pluripotence de différenciation même après avoir subi une prolifération par division. Les cellules souches embryonnaires font référence aux cellules souches pluripotentes dérivées d'embryons au stade blastocyste, qui est le stade précoce du développement animal. Les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) sont produites en introduisant plusieurs types de gènes de facteurs de transcription dans des cellules somatiques telles que les fibroblastes. Les cellules souches embryonnaires (ESC) selon l’invention sont obtenues par tout moyen ne nécessitant pas la destruction d’embryons humains. Par exemple en utilisant la technologie décrite par Chung et al. ( Chung et al, Human Embryonic Stem Cell lines generated without embryo destruction, Cell Stem Cell (2008) ). Selon un mode de réalisation de l’invention, lesdites cellules souches utilisées dans le procédé selon l’invention ne sont pas des cellules souches embryonnaires humaines (hESC) et/ou des iPSC. Les cellules souches hématopoïétiques (HSC) utilisées dans le procédé selon l’invention sont des cellules multipotentes. Elles sont capables de se différencier pour donner tous les lignages de différenciation des cellules sanguines et capables de s'auto-répliquer tout en maintenant leur multipotence. Les cellules d’une lignée cellulaire immortalisée du lignage érythroïde sont des cellules déjà engagées dans le lignage érythroïde mais capables de s’auto-répliquer et sous contrôle externe de se différencier en cellules du lignage érythroïde. Les cellules souches et/ou progéniteurs hématopoïétiques (HSC/HP) utilisées dans le procédé selon l’invention peuvent provenir de n’importe quelle source, y compris, être dérivées de la moelle osseuse, du sang du cordon ombilical/placentaire ou du sang périphérique avec ou sans mobilisation préalable. L'origine des cellules souches et cellules d’une lignée cellulaire immortalisée du lignage érythroïde n'est pas particulièrement limitée tant qu'elle est dérivée d'un mammifère. Les exemples préférés comprennent les humains, les chiens, les chats, les souris, les rats, les lapins, les porcs, les vaches, les chevaux, les moutons, les chèvres et similaires, les humains étant plus préférés. Les cellules utilisées dans le procédé selon l’invention peuvent produire, sans limitation, des globules rouges de donneurs universels, des globules rouges d'un groupe sanguin rare, des globules rouges pour une médecine personnalisée (par exemple, une transfusion autologue, éventuellement avec génie génétique) et des globules rouges conçus pour inclure une ou plusieurs protéines d'intérêt. Dans certains modes de réalisation qui peuvent être combinés avec l'un quelconque des modes de réalisation précédents, lesdites cellules utilisées dans le procédé selon l’invention peuvent être isolées à partir d'un patient ayant un groupe sanguin rare comprenant, sans limitation, Oh, CDE / CDE, CdE / CdE, CwD- / CwD- , -D - / - D-, Rhnull, Rh: -51, LW (a-b +), LW (ab-), SsU-, SsU (+), pp, Pk, Lu (a + b-), Lu (ab-), Kp (a + b-), Kp (ab-), Js (a + b-), Ko, K: -11, Fy (ab-), Jk (ab-), Di (b- ), I-, Yt (a-), Sc: -1, Co (a-), Co (ab-), Do (a-), Vel-, Ge-, Lan-, Lan (+), Gy ( a-), Hy-, At (a-), Jr (a-), In (b-), Tc (a-), Cr (a-), Er (a-), Ok (a-), JMH - et En (a-). Selon un mode de réalisation de l’invention, lesdites cellules peuvent être des cellules souches embryonnaires (ESC), de préférence humaines (hESC) et de préférence sélectionné dans le groupe constitué des lignées H1, H9, HUES-1, HUES-2, HUES-3, HUES-7, CLO1 et des cellules souches pluripotentes (iPSC), de préférence humaine (hiPSC) De préférence, lesdites cellules sont des cellules souches hématopoïétiques (HSC), plus préférablement humaines. Dans le cas de cellules dérivés du sang du cordon ombilical/ placentaire ou du sang périphérique, de la moelle osseuse, ou d’un prélèvement par aphérèse, une étape de sélection spécifique des cellules CD34+ peut être effectuée avant l’étape a) du procédé selon l’invention. L'aphérèse est une technique de prélèvement de certains composants sanguins par circulation extracorporelle du sang. Les composants que l'on souhaite prélever sont séparés par centrifugation et extraits, tandis que les composants non prélevés sont réinjectés au donneur (de sang) ou au patient (aphérèse thérapeutique). Le qualificatif CD34+ (positif) signifie que l'antigène CD (cluster de différenciation) 34 est exprimé sur la surface cellulaire. Cet antigène est un marqueur des cellules souches hématopoïétiques et des cellules progénitrices hématopoïétiques, et disparaît à mesure qu'elles se différencient. Des populations cellulaires similaires comprennent également des cellules positives au CD133. Dans le cas où les cellules d’origine sont des ESC, des iPSC ou des cellules d’une lignée cellulaire immortalisée du lignage érythroïde, des étapes de pré-culture peuvent être ajoutées en amont de l’étape de culture en bioréacteur de type batch ou fed-batch pour multiplier les cellules et éventuellement les engager dans la voie de différenciation de la lignée érythroïde. Quelle que soit la source cellulaire, une étape préalable de congélation des cellules de départ est souvent requise pour des raisons de transport et de conservation. Les méthodes de congélation de cellules sont bien connues de l’état de l’art et font notamment appel à une descente en température programmée ainsi qu’à l’utilisation de cryoprotectant comme le lactose ou le diméthylsulfoxyde (DMSO). Lorsqu'il est ajouté au milieu, le DMSO empêche la formation de cristaux intracellulaires et extracellulaires dans les cellules pendant le processus de congélation. Ainsi, dans un mode de réalisation particulier de l’invention, le procédé selon l’invention comprend une étape de décongélation des cellules, préalable à l’étape a), dans le cas où les cellules de départ sont congelées. Les méthodes de décongélation de cellules sont bien connues de la personne du métier. La décongélation est une étape du procédé à ne pas négliger notamment lorsque du DMSO a été utilisé pour la congélation. Ce composé est en effet cryopréservant tant que la suspension cellulaire est conservée en azote liquide ou en vapeur d’azote. Par contre, il devient cytotoxique dès que la suspension cellulaire est décongelée. Il convient donc d’éliminer très rapidement le DMSO par plusieurs étapes de lavage sitôt les cellules décongelées, comme cela est bien connu de la personne du métier. Une fois les cellules décongelées, lesdites cellules sont mises en culture dans un bioréacteur de type batch, c’est-à-dire par lot, ou fed-batch, c’est-à-dire par lot alimenté (étape a) du procédé selon l’invention. Dans d’autres cas, les cellules de départ peuvent être fraiches, c’est-à-dire que le temps entre le prélèvement des cellules et la mise en culture est suffisamment court pour ne pas nécessiter de congélation, de préférence ce temps est inférieur à 48H. Cette situation peut exister par exemple lorsque le centre de prélèvement est localisé sur le même site ou à proximité du centre de production. Dans cette situation, le procédé selon l’invention commence directement avec l’étape b) de mise en culture dans un bioréacteur de type batch ou fed-batch. Etape a) Le(s) culture(s) en bioréacteur de type batch ou fed-batch ont pour but d’engager ou de différencier les cellules de départ, ou de renforcer leur engagement ou leur différenciation, dans le lignage érythroïde. Autrement dit, selon l’invention, on poursuit de préférence l’étape a) jusqu’à ce que les cellules cultivées soient engagées dans le lignage érythroïde. Selon l’invention, on considère que des cellules sont suffisamment engagées dans le lignage érythroïde lorsqu’elles présentent une ou plusieurs caractéristiques spécifiques du lignage érythroïde, telles qu’un pourcentage de cellules présentant le marqueur CD235, mesurable par exemple par cytométrie en flux, supérieur à 50%, ou un pourcentage de cellules de phénotype érythroïde, mesurable par exemple par comptage cytologique après coloration au colorant May-Grünwald Giemsa, supérieur à 50% Une ou plusieurs cultures successives, ou itératives, en bioréacteur de type batch ou fed-batch peuvent être conduites. L’étape a) du procédé selon l’invention peut donc être répétée plusieurs fois, de préférence entre 1 et 4 fois. Dans les cultures en "batch", le milieu n'est pas renouvelé, les cellules ne disposent ainsi que d'une quantité limitée d'éléments nutritifs. La culture en "fed-batch" correspond quant à elle à une culture en "batch" avec une alimentation notamment en nutriments et/ou en milieu de culture. Le modèle de bioréacteur utilisé pour la culture des cellules à l’étape a) n'est pas particulièrement limité tant qu'il peut généralement cultiver des cellules animales. De préférence, le bioréacteur de l’étape a) a une contenance de 0,5 à 5000 L, plus préférablement de 0,5 à 500 L. Les cultures selon l’invention sont conduites en bioréacteur avec les cellules en suspension dans un milieu de culture adapté dans des conditions contrôlées ou régulées, à savoir notamment l’agitation, la température, le pH, et l’oxygène dissous (DO). Des exemples spécifiques de bioréacteurs, de conditions de culture et de méthodes de propagation bien connus de la personne du métier peuvent être combinés de toute manière appropriée pour favoriser la différenciation ou l’engagement des cellules de départ dans le lignage érythroïde et peuvent être adaptées selon le type de cellules de départ. La personne du métier est à même de sélectionner ou de préparer un milieu de culture adapté selon l’invention. A titre d’exemple de milieux de culture adaptés on peut citer ceux décrits dans la publication internationale WO2011/101468A1 et dans l’article Giarratana et al . (2011) “ Proof of principle for transfusion of in vitro–generated red blood cells”, Blood 118 :5071–5079. Le milieu de culture comprend généralement un milieu de culture basal pour cellule eucaryotes, tel qu’un milieu DMEM, IMDM, RPMI 1640, MEM ou DMEM/F1, lesquels sont bien connus de la personne du métier et largement disponibles commercialement. Le milieu de culture peut également comprendre du plasma, en particulier dans une quantité de 0,5% à 6% (v/v). Par ailleurs, divers cytokines, hormones et facteurs de croissance peuvent être compris dans le milieu de culture, ainsi que d'autres composés, notamment de bas poids moléculaire, qui agissent sur les cellules. La personne du métier est à même d’adapter le milieu de culture en ajoutant certains composants ou en modulant les quantités de certains composants, notamment du sodium, du potassium, du calcium, du magnésium, du phosphore, du chlore, divers acides aminés, diverses vitamines, divers antioxydants, des acides gras, des sucres et analogues, du sérum bovin fœtal, du plasma humain, du sérum humain, du sérum de cheval, de la transferrine, de la lactoferrine, de l’héparine, du cholestérol, de l'éthanolamine, du sélénite de sodium, du monothioglycérol, du mercaptoéthanol, de l'albumine sérique bovine, de l'albumine sérique humaine, du pyruvate de sodium, du polyéthylène glycol, des poloxamères, des tensioactifs, des gouttelettes lipidiques, des antibiotiques de la gélose, du collagène, de la méthylcellulose, diverses cytokines, diverses hormones, divers facteurs de croissance, diverses petites molécules, diverses matrices extracellulaires et diverses molécules d'adhésion cellulaire. Des exemples de cytokines comprises dans le milieu de culture comprennent l'interleukine-1 (IL-1), l'interleukine-2 (IL-2), l'interleukine-3 (IL-3), l'interleukine-4 (IL-4), l'interleukine-5 (IL- 5), interleukine-6 (IL-6), interleukine-7 (IL-7), interleukine-8 (IL-8), interleukine-9 (IL-9), interleukine-10 (IL-10), interleukine- 11 (IL-11), interleukine-12 (IL-12), interleukine-13 (IL-13), interleukine-14 (IL-14), interleukine-15 (IL-15), interleukine-18 (IL-18) ), Interleukine-21 (IL-21), Interféron -Α (IFN-α), interféron-β (IFN-β), interféron-γ (IFN-γ), facteur de stimulation des colonies de granulocytes (G-CSF), facteur de stimulation des colonies de monocytes (M-CSF), facteur de stimulation des colonies de cellules granulo-macrophagiques (GM-CSF), facteur de cellules souches (SCF), ligand flk2 / flt3 (FL), facteur inhibiteur des cellules leucémiques (LIF), oncostatine M (OM), érythropoïétine (EPO), thrombopoïétine (TPO) Cependant, elle n'est pas limitée à ces derniers. Les diverses petites molécules comprises dans le milieu de culture peuvent comprendre des antagonistes du récepteur d’aryl hydrocarbone comme la StemRegenin1 (SR1), des agonistes de l’auto-renouvellement des cellules souches hématopoïétiques comme l’UM171, et similaires, mais sans s’y limiter. Les facteurs de croissance compris dans le milieu de culture peuvent comprendre le facteur de croissance transformant-α (TGF-α), le facteur de croissance transformant-β (TGF-β), la protéine inflammatoire macrophage-la (MIP-1α), le facteur de croissance épidermique (EGF), facteur de croissance des fibroblastes-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 (FGF-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9), facteur de croissance des cellules nerveuses (NGF), facteur de croissance vasculo-endothélial (VEGF), facteur de croissance hépatocytaire (HGF), facteur inhibiteur de la leucémie (LIF), protéase nexine I, protéase nexine II, facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF), facteur de différenciation cholinergique (CDF), diverses chimiokines, ligands Notch (tels que Delta1), Protéines Wnt, protéines de type angiopoïétine 2, 3, 5 ou 7 (Angpt 2, 3, 5, 7), facteurs de croissance de type insuline (GF), protéine de liaison au facteur de croissance analogue à l'insuline (IGFBP), la pléiotrophine, et similaires, mais sans s'y limiter. Les hormones comprises dans le milieu de culture peuvent comprendre des hormones, notamment de la famille des glucocorticoïdes comme la dexaméthasone ou l’hydrocortisone, de la famille des hormones thyroïdiennes, comme la T3 et la T4, de l’ACTH, de l’alpha-MSH ou de l’insuline. De préférence, afin de favoriser l’engagement ou la différenciation des cellules de départ dans le lignage érythroïde, le milieu de culture comprend au moins un facteur de différenciation érythrocytaire, en particulier sélectionné dans le groupe constitué de : facteur de cellules souches (SCF), interleukine-3 (IL-3), interleukine-6 (IL-6), interleukine-11 (IL-11), ligand flk2 / flt3 (FL), thrombopoïétine (TPO) et l'érythropoïétine (EPO), plus préférablement le milieu de culture comprend au moins un facteur de différenciation érythrocytaire sélectionné dans le groupe constitué de : facteur de cellule souche (SCF), ligand flk2 / flt3 (FL), interleukine-3 (IL-3), thrombopoïétine (TPO) et érythropoïétine (EPO), et encore plus préférablement le milieu de culture comprend un, deux ou trois facteurs de différenciation érythrocytaire sélectionnés dans le groupe constitué de SCF, IL-3 et EPO. La concentration d'une cytokine ou d'un facteur de croissance dans le milieu de culture, notamment au moment de son ajout dans le milieu de culture, peut être fixée dans une plage dans laquelle la différenciation des cellules souches hématopoïétiques et/ou des cellules progénitrices hématopoïétiques en érythrocytes peut être obtenue, et généralement dans une plage de 0,1 ng/ml à 1000 ng/ml, de préférence de 1 ng/ml à 200 ng/ml. La concentration d'une hormone dans le milieu de culture, notamment au moment de son ajout dans le milieu de culture, peut être fixée de manière appropriée dans une plage dans laquelle la différenciation des cellules souches hématopoïétiques et/ou des cellules progénitrices hématopoïétiques en les érythrocytes peut être obtenue, et généralement dans une plage de 0,1 ng/ml à 1000 µg/ml, de préférence de 1 µg/ml à 500 µg/ml. De manière particulièrement préférée, le milieu de culture utilisé dans l’étape a) comprend un milieu de culture basal pour cellules eucaryotes, de l’héparine, notamment dans une concentration de 0,2 à 2 U/ml, du plasma, notamment dans une concentration de 0,5 à 6% (v/v), de la transferrine, notamment dans une concentration de 100 à 500 µg/ml, de l’Insuline, notamment dans une concentration de 1 à 15 µg/ml, du SCF, notamment dans une concentration de 50 à 300 ng/ml, de l’EPO, notamment dans une concentration de 1 à 5 UI/ml, de l’IL-3, notamment dans une concentration de 1 à 10 ng/ml et un glucocorticoïde, notamment dans une concentration de 0,5 à 5 µM. De préférence, la culture de l’étape a) est effectuée pendant une période de temps suffisante pour obtenir une concentration de cellules supérieure à 0,1 millions de cellules/ml. De préférence cette période de temps est de 1 jour à 15 jours, plus préférablement de 3 jours à 10 jours, et encore plus préférablement de 6 à 8 jours. De préférence, la température de culture de l’étape a) est comprise entre 33°C et 40°C, plus préférablement entre 35°C et 39°C, et encore plus préférablement entre 36°C et 38°C. De préférence, le pH de culture de l’étape a) est compris entre 7 et 8, plus préférablement entre 7,2 et 7,7. De préférence, la DO de culture de l’étape a) est comprise entre 1% et 100%, plus préférablement entre 10% et 100%. De préférence, un renouvellement ou un apport de milieu neuf ou frais est réalisés au cours de l’étape a), notamment pour éviter une intoxication des cellules par des catabolites ou une pénurie de nutriments. Etape b) A la suite de(s) culture(s) en batch ou fed-batch de l’étape a), les cellules sont transférées dans un autre bioréacteur, opéré en perfusion (étape b)). L’étape b) a pour objet de multiplier les cellules cultivées et de terminer leur différenciation pour les amener jusqu’à un stade de réticulocyte énucléé. La perfusion est une méthode de culture continue dans laquelle les cellules sont retenues dans le bioréacteur ou renvoyées dans le bioréacteur tandis que du milieu de culture usagé est évacué, compensé par l’addition de milieu de culture neuf ou frais. Le milieu usagé et évacué ne contient donc pas de cellules. Une concentration de cellules et un rendement en produits cellulaires plus élevés peuvent être atteints dans un bioréacteur à perfusion, pour un volume de réaction réduit, par rapport à un bioréacteur de type batch ou fed-batch. L’étape b) est conduite dans un bioréacteur adapté à une culture par perfusion. De nombreux modèles de bioréacteurs adaptés pour la culture des cellules à l’étape b) sont connus de la personne du métier. De préférence, le bioréacteur comprend un moyen d’élimination du milieu de culture usagé qui permette de conserver les cellules cultivées. De préférence, ce moyen est sélectionné est du type spin-filter (filtre à spin ou rotatif), centrifugation continue, centrifugation discontinue, ou filtration tangentielle, plus préférentiellement le moyen est du type filtration tangentielle. Le bioréacteur de l’étape a de préférence une contenance de 1 à 5000 L. De préférence, le bioréacteur utilisé à l’étape b) est ainsi un bioréacteur à filtration tangentielle, qui peut également comprendre une pompe à déplacement continu ou alternatif. De préférence, la pompe à déplacement continu ou alternatif est une pompe à faible cisaillement, ce qui permet de préserver les cellules. De préférence, le bioréacteur de l’étape b), notamment le bioréacteur à filtration tangentielle, comprend d’un organe filtrant, qui peut notamment être une cassette de filtration ou un module de fibres creuses. De préférence, le bioréacteur de l’étape b) est un bioréacteur à filtration tangentielle équipé d’un organe filtrant comprenant un module de fibres creuses. De préférence, le seuil de coupure de l’organe filtrant permet de conserver les cellules au sein du bioréacteur. De préférence, le seuil de coupure de l’organe filtrant est de 1 kDa à 1.3 µm ou 500 kDa. De préférence, le bioréacteur de l’étape b) comprend un moyen d’échange gazeux permettant de satisfaire les besoins en oxygène des cellules et de maîtriser le pH en contrôlant l’apport et/ou l’évacuation du dioxyde de carbone (CO 2 ). De préférence, le moyen d’échange gazeux est à faible cisaillement. De préférence, l’une au moins des conditions de culture suivantes, plus préférablement toutes, sont contrôlées ou régulées lors de l’étape b) : L’agitation ; Le pH ; La DO ; La température ; Le volume ou niveau du bioréacteur ; Le débit de perfusion ; L’apport en nutriments, notamment choisi parmi les glucides, les acides aminés, les vitamines et le fer ; L’apport en facteurs de croissance, notamment choisis parmi EPO, SCF, et Insuline ; L’encrassement du bioréacteur et le colmatage des organes filtrants. De préférence, la culture de l’étape b) est effectuée pendant une période de temps suffisante pour obtenir une concentration de cellules supérieure à 30 millions de cellules/ml. De préférence cette période de temps est de 5 jours à 25 jours, plus préférablement de 10 jours à 20 jours. De préférence, également la culture de l’étape b) est poursuivie jusqu’à ce qu’au moins 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%, plus préférablement au moins 50%, des cellules cultivées soient énucléées. De préférence, la température de culture de l’étape b) est comprise entre 33°C et 40°C, plus préférablement entre 35°C et 39°C, et encore plus préférablement entre 36°C et 38°C. De préférence, le pH de culture de l’étape b) est compris entre 7 et 8, plus préférablement entre 7,2 et 7,7. De préférence, la DO de culture de l’étape b) est comprise entre 1% et 100%, plus préférablement entre 10% et 100%. La description du milieu de culture donnée pour l’étape a) du procédé de l’invention s’applique également pour la présente étape b). De manière particulièrement préférée, le milieu de culture utilisé dans l’étape b) comprend un milieu de culture basal pour cellules eucaryotes, de l’héparine, notamment dans une concentration de 0,2 à 2 U/ml, du plasma, notamment dans une concentration de 0,5 à 6% (v/v), de la transferrine, notamment dans une concentration de 100 à 500 µg/ml, de l’Insuline, notamment dans une concentration de 5 à 15 µg/ml, du SCF, notamment dans une concentration de 50 à 300 ng/ml, et de l’EPO, notamment dans une concentration de 1 à 5 UI/ml et éventuellement un glucocorticoïde, notamment dans une concentration de 0,5 à 5 µM. Avantageusement, l’étape b) du procédé de l’invention permet de concentrer les cellules à des niveaux inatteignables en culture batch et fed-batch, c’est-à-dire au-delà de 30 millions de cellules/ml et jusqu’à 200 millions de cellules/ml. Avantageusement également, l’étape b) du procédé de l’invention permet de poursuivre la différenciation des cellules cultivées. Avantageusement, en fin de culture de l’étape b) le taux de cellules énucléées dépasse 50%. Etape c) Les cellules obtenues à l’étape b) sont ensuite purifiées lors de l’étape c) pour donner une population de globules rouges de culture. L’étape c) du procédé selon l’invention comprend deux opérations, une opération de tri particulaire et une opération de lavage. L’opération de lavage peut être effectuée indifféremment avant et/ou après l’opération de tri particulaire. L’étape c) a pour objet : - de trier les cellules pour concentrer au maximum les cellules énucléés ; et - de laver les cellules pour éliminer les résidus potentiellement toxiques issus du procédé. Le tri particulaire permet d’augmenter le taux de cellules énucléées, en éliminant notamment les érythroblastes et les éventuelles cellules myéloïdes résiduelles. Les érythroblastes sont des cellules cultivées qui ne se sont pas arrivées au stade de différenciation cellules énucléées, c’est-à-dire en réticulocytes ou globules rouges. Le tri particulaire permet également d’éliminer des déchets cellulaires, tels que des débris cellulaires, de l’ADN et des pyrénocytes. Le tri particulaire selon l’invention peut comprendre au moins une opération sélectionnée dans le groupe constitué d’une filtration tangentielle, d’une filtration frontale et d’une élutriation. La filtration tangentielle (ou « tangential-flow filtration ») est bien connue de la personne du métier. Il s’agit d’un procédé de filtration permettant de séparer les particules d'un liquide en fonction leur taille. En filtration tangentielle, le flux de liquide est parallèle au filtre, contrairement à la filtration frontale (ou « dead-end filtration ») dans laquelle le flux de liquide est perpendiculaire au filtre. C'est la pression du fluide qui permet à celui-ci de traverser le filtre. Ceci a pour conséquence que les particules assez petites passent au travers du filtre alors que celles qui sont de taille trop importante continuent leur route via le flux de liquide. La filtration frontale est bien connue de la personne du métier. Son principe consiste à retenir les particules à éliminer à l'intérieur d’un réseau poreux constitutif du filtre. La filtration repose sur 4 mécanismes : (i) les forces d’adhésion particules/paroi, (ii) les forces d’adhésion entre particules, (iii) la gêne stérique et (iv) la force de trainée du fluide sur les particules. Son efficacité dépend notamment du matériau, des tailles des pores, du type d’enchevêtrement des fibres et du rapport surface de filtration sur quantité de matière à filtrer. L'élutriation est une technique de séparation et d'analyse granulométrique de particules de tailles différentes. L’élutriation se base sur la loi de Stokes. On envoie dans une chambre un fluide contenant les cellules à une vitesse connue où les particules sont soumises à une force centrifuge maîtrisée. Ces dernières restent en suspension quand les deux forces (d’entraînement par le fluide et centrifuge) s’annulent. De préférence, l’opération de tri particulaire selon l’invention comprend une succession de filtrations frontales et éventuellement d’élutriation. L’opération de lavage a notamment pour objet d’abaisser les quantités des composés toxiques potentiellement présents dans la culture de cellules de l’étape b) en-dessous de leur seuil de toxicité. L’opération de lavage peut comprendre une ou plusieurs centrifugations et/ou une ou plusieurs élutriations. La centrifugation est bien connue de la personne du métier. Il s’agit d’un procédé de séparation des composés d'un mélange en fonction de leur différence de densité et de leur traînée en les soumettant à une force centrifuge unidirectionnelle et éventuellement à un flux opposé. De préférence, l’étape de lavage selon l’invention comprend une succession d’opérations d’élutriation. Les étapes de tri particulaire, de lavage et de formulation sont effectuées dans une période de temps inférieure à 72h, plus préférablement inférieure à 12h. A l’issue de l’étape c) on obtient selon l’invention une population de globules rouges de culture. Globules rouges de culture De préférence, la population de globules rouges de culture obtenue par la mise en œuvre du procédé selon l’invention, ou population de globules rouges de culture selon l’invention, est produite en 14 à 30 jours. Plus préférablement, la population de globules rouges de culture obtenue par la mise en œuvre de procédé selon l’invention est produite en environ 14 jours, environ 15 jours, environ 16 jours, environ 17 jours, environ 18 jours, environ 19 jours, environ 20 jours, environ 21 jours, environ 22 jours, environ 23 jours, environ 24 jours, environ 25 jours, environ 26 jours, environ 27 jours, environ 28 jours, environ 29 jours ou environ 30 jours. Les globules rouges de culture selon l’invention ont des caractéristiques similaires à celles de réticulocytes natifs. Comme cela est bien connu de l’homme du métier, les réticulocytes dérivent des érythroblastes par énucléation. Cela est illustré par l’Exemple qui suit. Certains globules rouges de culture selon l’invention peuvent avoir des caractéristiques similaires à celles de globules rouges natifs. De préférence, les globules rouges de culture ou la population de globules rouges de culture selon l’invention, obtenus, susceptibles d’être obtenus ou pouvant être obtenus, par la mise en œuvre du procédé selon l’invention, présentent au moins 1, de préférence au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou l’ensemble, des caractéristiques suivantes : Un pourcentage de Hoechst+ inférieur à 30%, de préférence inférieur à 10%, plus préférablement inférieur à 5%, encore plus préférablement inférieur à 3% et le plus préférablement inférieur à 1% ; Eventuellement un pourcentage de cellule CD36+ inférieur à 50%, de préférence de 8% à 22% ; Eventuellement un pourcentage de cellules CD71+ supérieur à 50%, de préférence de 79% à 92% ; Eventuellement un pourcentage de cellules marquées au thiazole orange supérieur à 50%, de préférence de 83% à 95% ; Un VGM de 80 fL à 160 fL, de préférence de 130 à 154 fL ; Une TCMH supérieure à 24 pg/cellule, de préférence supérieure à 28 pg/cellule, plus préférablement supérieure à 32 pg/cellule et encore plus préférablement supérieure à 36 pg/cellule; Une CCMH supérieure à 19 g/dl, de préférence supérieure à 21 g/dl, plus préférablement supérieure à 23 g/dl et encore plus préférablement de 21 g/dl à 29 g/dl ; Une p50 de 18 à 28 mmHg, de préférence de 18 mmHg à 22 mmHg ; Eventuellement une proportion de HbA de 70% à 100%, de préférence de 74% à 86% ; Eventuellement une proportion de HbF de 0% à 30%, de préférence de 11,5% à 21% ; Eventuellement une proportion de HbA2 inférieure à 8%, de préférence de 2% à 5% ; Une proportion de HbCO de 0% à 10%, de préférence de 1,5% à 6,5% ; Une proportion de MetHb de 0% à 3%, de préférence inférieure à 0,5% ; Une déformabilité supérieure à 75% de celle de globules rouges natifs, de préférence de 81,5% à 85,5% de celle de globules rouges natifs ; Une teneur en ATP de 4 à 12 µmol/g Hb, de préférence de 7,5 µmol/g Hb à 10,5 µmol/g Hb. De préférence, les caractéristiques ci-dessus comprennent : un pourcentage de cellule CD36+ inférieur à 50%, de préférence de 8% à 22% ; un pourcentage de cellules CD71+ supérieur à 50%, de préférence de 79% à 92% ; un pourcentage de cellules marquées au thiazole orange supérieur à 50%, de préférence de 83% à 95%. Comme la personne du métier le comprendra bien, lorsque les caractéristiques ci-dessus, ou deuxième liste de caractéristiques, sont ajoutées aux précédentes caractéristiques, ou première liste de caractéristiques, les globules rouges de culture ou la population de globules rouges de culture selon l’invention, obtenus, susceptibles d’être obtenus ou pouvant être obtenus, par la mise en œuvre du procédé selon l’invention, présentent au moins 1, de préférence au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou l’ensemble, des caractéristiques. De préférence également, les caractéristiques ci-dessus comprennent : une proportion de HbA de 70% à 100%, de préférence de 74% à 86% ; une proportion de HbF de 0% à 30%, de préférence de 11,5% à 21% ; une proportion de HbA2 inférieure à 8%, de préférence de 2% à 5% ; Comme la personne du métier le comprendra bien, lorsque les caractéristiques ci-dessus, ou troisième liste de caractéristiques, sont ajoutées aux précédentes caractéristiques, de la première liste de caractéristiques et le cas échéant de la deuxième liste de caractéristiques, les globules rouges de culture ou la population de globules rouges de culture selon l’invention, obtenus, susceptibles d’être obtenus ou pouvant être obtenus, par la mise en œuvre du procédé selon l’invention, présentent au moins 1, de préférence au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 et le cas échéant 13, 14, ou l’ensemble, des caractéristiques. Les pourcentages (en nombre) de cellules Hoechst+, CD36+, CD71+, et marquées au thiazole orange (TO+) peuvent être déterminée par cytométrie en flux, selon des techniques bien connues de la personne du métier, notamment à l’aide d’un appareil FACSCalibur (BD Biosciences) avec le logiciel Cell Quest. Les mesures de VGM, CCMH et TCMH sont des mesures standards d’hématologie déterminables par des automates commerciaux, tel que le XN 9100 (Sysmex). La p50 ou pression partielle d'oxygène pour laquelle la saturation de l'hémoglobine en oxygène est de 50% peut être déterminée par des techniques bien connues de la personne du métier et notamment à l’aide d’un appareil Hemox Analyzer (TCS). Les pourcentages (m/m) de HbA, HbF et HbA2 se rapportent respectivement à la quantité (en masse) de l’hémoglobine (Hb) considérée rapportée à la quantité totale d’hémoglobine (en masse). Ces pourcentages peuvent être déterminés par chromatographie liquide haute performance (HPLC) sur colonne échangeuse de cations, notamment comme cela est décrit par Ou & Rognerud (1993) « Rapid analysis of hemoglobin variants by cation-exchange HPLC » Clinical Chemistry 39: 820–824 (incorporé ici par référence). Les pourcentages (m/m) de HbCO, c’est-à-dire d’hémoglobine fixée au monoxyde de carbone, et de MetHb, c’est-à-dire de méthémoglobine, peuvent être déterminés par des techniques bien connues de la personne du métier, notamment à l’aide d’un analyseur de gaz du sang, tel que le Rapidlab (Siemens) Le pourcentage de déformabilité peut être déterminé à l’aide de l’équipement LORRCA, notamment comme cela est décrit dans l’article Giarratana et al . (2011) « Proof of principle for transfusion of in vitro–generated red blood cells » , Blood 118 :5071–5079 (incorporé ici par reference), page 5072, paragraphe « Deformability measurements ». La déformabilité est exprimée en pourcentage de la déformabilité des globules rouges de culture rapportée à la déformabilité de globules rouges natifs, c’est dire de globules rouges de sang périphérique d’un donneur de même espèce que les globules rouges de culture, en particulier un donneur humain, notamment adulte, pour des globules rouges de culture humains. La teneur en ATP peut être déterminée par colorimétrie ou fluorimétrie, notamment par mesure du produit de la réaction du glycérol avec l’ATP dont la quantité mesurable par colorimétrie ou fluorimétrie est proportionnelle à la quantité d’ATP, par exemple à l’aide d’un kit MAK190 (Sigma). La teneur en ATP est exprimée en µmol et rapportée à la quantité totale (en g) d’hémoglobine. Dans certains modes de réalisation qui peuvent être combinés avec l'un quelconque des modes de réalisation précédents, la population de globules rouges de culture selon l’invention est une population de cellules humaines. Dans certains modes de réalisation qui peuvent être combinés avec l'un quelconque des modes de réalisation précédents, la population de globules rouges de culture selon l’invention a un ou plusieurs groupes sanguins choisis parmi A +, A-, B +, B-, AB +, AB-, O + et O-. Dans certains modes de réalisation qui peuvent être combinés avec l'un quelconque des modes de réalisation précédents, les globules rouges de culture selon l’invention ont un groupe sanguin rare ou universel. Selon un mode de réalisation de l’invention, la population de globules rouges de culture selon l’invention est formulée dans une solution de conservation de globules rouges. Toute formulation connue dans l’état de la technique pour la conservation d’une population de globules rouges peut être utilisée. Application thérapeutique Tout excipient ou véhicule pharmaceutiquement acceptable connu dans l’état de la technique qui est approprié pour une utilisation avec des globules rouges peut être utilisé. A titre d’exemple, l'excipient ou le véhicule pharmaceutiquement acceptable est une solution saline à pH équilibré. Les compositions pharmaceutiques selon l’invention peuvent également comprendre une ou plusieurs protéines exogènes d'intérêt utiles dans la prévention, le traitement ou le diagnostic d'une ou plusieurs maladies ou troubles, notamment en lien avec un déficit ou une carence de globules rouges ou d’hémoglobine fonctionnelle. Toute formulation connue dans l’état de la technique pour l'administration à un individu d'une composition pharmaceutique contenant une population de globules rouges peut être utilisée. De préférence, la composition pharmaceutique selon l’invention est formulée sous forme d’une poche de transfusion sanguine. L’individu selon l’invention est un animal, de préférence un mammifère, plus préférablement un humain. L’invention sera davantage explicitée à l’aide de l’Exemple non limitatif qui suit. Exemple Les globules rouges de culture obtenus par la mise en œuvre du procédé selon l’invention ont été comparés à des globules rouges natifs, plus particulièrement à des réticulocytes de sang placentaire. Brièvement, les cellules mises en cultures selon l’invention sont des cellules nucléées totales collectées par cytaphérèse sur des donneurs volontaires préalablement mobilisés au G-CSF. L’étape a) du procédé selon l’invention est conduite sur 7 jours en fed-batch à une température de 37°C, sous une atmosphère à 5% de CO 2 et dans un milieu de culture adapté de celui décrit par Giarratana et al . (2011) “ Proof of principle for transfusion of in vitro–generated red blood cells”, Blood 118 :5071–5079 pour la première étape de la procédure d’expansion décrite dans l’article (page 5072). A la moitié de la durée de l’étape a) du milieu de culture frais est ajouté à la culture de façon à diluer la culture au demi (on ajoute le même volume de milieu de culture que le volume présent initialement). L’étape b) du procédé selon l’invention est conduite sur 15 jours dans un bioréacteur à perfusion à une température de 37°C, sous une atmosphère à 5% de CO 2 , avec un milieu de culture semblable à celui de l’étape a) à l’exception de l’IL-3 et du glucocorticoïde qui sont absents. Des apports ponctuels de SCF et d’EPO sont également réalisés ainsi qu’un apport continu en fer. L’étape c) du procédé selon l’invention est conduite en effectuant un tri particulaire par une succession de filtrations frontales, suivi du lavage de cellules par élutriation. Les caractéristiques de la population de globules rouges de culture obtenues ont été déterminées et sont résumées dans le Tableau 1 ci-dessous. Les moyennes et écart-types obtenus lors des cultures sont comparées aux valeurs attendues pour des réticulocytes natifs. Ces indicateurs permettent de vérifier que : Les phénotypes exprimés correspondent bien à ceux des réticulocytes (CD71 et CD36) ; La présence d’acides nucléiques résiduels correspond bien au statut de réticulocytes (TO) ; Les cellules ont une quantité d’hémoglobine suffisante et fonctionnelle pour assurer le transport de l’oxygène (TGM, CCMH, HbF, HbA, HbA 2 et P50) ; Les teneurs en HbCO et MetHb sont contenues dans les normes physiologiquement admises des individus sains ; Les cellules ont une réserve d’énergie suffisante pour assurer le maintien (ATP) ; Les cellules sont déformables et de taille raisonnable pour assurer une bonne circulation sanguine (Déformabilité, VGM) ; La seule différence significative avec les réticulocytes natifs étudiés est la teneur inversée en Hb fœtale et adulte. Cette différence se justifie par le fait que les globules rouges de culture sont désormais produits à partir de cellules souches adultes (et contiennent donc en majorité de l’hémoglobine adulte), quand les réticulocytes témoins proviennent de sang placentaire (et contiennent donc en majorité de l’hémoglobine fœtale). Tous ces critères ont été mesurés systématiquement sur pour plusieurs mises en œuvre de procédé selon l’invention, ce qui permet de faire une étude de stabilité du procédé (voir colonne CV : coefficient de variation). Ces résultats montrent que les globules rouges de synthèse ont des caractéristiques très proches de réticulocytes natifs (excepté la répartition entre HbA et HbF qui est inversée). En outre, le procédé est stable en comparaison de la variabilité des mesures faites sur des réticulocytes natifs. Le procédé selon l’invention produit des globules rouges de culture ayant des caractéristiques proches de réticulocytes natifs. En outre, la faible variabilité des mesures effectuées indique que le risque de s’éloigner des caractéristiques de réticulocytes natifs est faible Par ailleurs, le procédé selon l’invention permet d’améliorer significativement la concentration de globules rouges de culture dans la population obtenue avec de l’ordre de 50 à 130 millions de cellules par ml contre moins de 5 millions de cellules par ml avec le procédé de l’état de la technique décrit par Giarratana et al . (2011) “ Proof of principle for transfusion of in vitro–generated red blood cells”, Blood 118 :5071–5079. On estime en outre qu’alors qu’il faudrait de l’ordre 9000 flasques de 175 cm 2 tels que ceux utilisés dans l’article Giarratana et al . (2011) “ Proof of principle for transfusion of in vitro–generated red blood cells”, Blood 118 :5071–5079 pour produire une unité de transfusion de globules rouges de culture, ce qui souligne la difficile mise en œuvre industrielle du procédé de l’état de la technique, la mise en œuvre du procédé selon l’invention permettrait d’obtenir la même quantité de globules rouges de culture en une fois à l’aide d’un bioréacteur à perfusion d’un contenance de quelques dizaines de litre. Procédé de production de globules rouges de culture à partir de cellules souches ou de cellules d’une lignée cellulaire immortalisée du lignage érythroïde, comprenant les étapes suivantes : a) au moins une culture en bioréacteur de type batch ou fed-batch des cellules ; b) culture en bioréacteur de type perfusion des cellules obtenues à l'étape a) ; c) Lavage et tri particulaire des cellules obtenues à l’étape b) ; pour obtenir une population de globules rouges de culture, les cellules souches n’étant pas des cellules souches embryonnaires humaines. Procédé de production de globules rouges de culture selon la revendication 1, dans lequel les cellules sont des cellules souches embryonnaires (ESC), des cellules souches pluripotentes (iPSC) ou des cellules souches et/ou progéniteurs hématopoïétiques (HSC/HP). Procédé de production de globules rouges de culture selon la revendication 1, dans lequel lesdites cellules sont des cellules d’une lignée cellulaire immortalisée du lignage érythroïde, de préférence sélectionnées parmi les progéniteurs érythroïdes ou les précurseurs érythroïdes précoces. Procédé de production de globules rouges de culture selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel les cellules proviennent de sang de cordon ombilical/placentaire, de sang périphérique, de la moelle osseuse, ou d’un prélèvement par aphérèse. Procédé de production de globules rouges de culture selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel la culture de l’étape a) est effectuée pendant une période de temps suffisante pour obtenir une concentration de cellules supérieure à 0,1 million de cellules/ml, de préférence cette période de temps est de 1 à 15 jours, plus préférablement de 3 à 10 jours. Procédé de production de globules rouges de culture selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel la culture de l’étape b) est effectuée pendant une période de temps suffisante pour obtenir une concentration des cellules à un niveau supérieur à 30 millions de cellules/ml, de préférence cette période de temps est de 5 jours à 25 jours, de manière encore plus préférentielle de 10 jours à 20 jours. Procédé de production de globules rouges de culture selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel le tri particulaire comprend une succession de filtrations frontales et éventuellement d’élutriation. Procédé de production de globules rouges de culture selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel le lavage comprend une ou plusieurs centrifugations et/ou une ou plusieurs élutriations. Population de globules rouges de culture susceptible d’être obtenue par la mise en œuvre du procédé tel que défini dans l’une quelconque des revendications 1 à 8. Population de globules rouges de culture selon la revendication 9, présentant au moins 6, de préférence l'ensemble, des caractéristiques suivantes : Un pourcentage de Hoechst+ inférieur à 30% ; Un VGM de 80 fL à 160 fL ; Une TCMH supérieure à 24 pg/cellule ; Une CCMH supérieure à 19 g/dl ; Une p50 de 18 à 28 mmHg ; Une proportion de HbCO de 0% à 10% ; Une proportion de MetHb de 0% à 3% ; Une déformabilité supérieure à 75% de celle de globules rouges natifs ; Une teneur en ATP de 4 à 12 µmol/g Hb. Population de globules rouges de culture selon la revendication 9 ou 10, dans laquelle les caractéristiques comprennent également : un pourcentage de cellule CD36+ inférieur à 50% ; un pourcentage de cellules CD71+ supérieur à 50% ; un pourcentage de cellules marquées au thiazole orange supérieur à 50%. Population de globule rouges de culture selon l’une des revendications 9 à 11, dans laquelle les caractéristiques comprennent également : une proportion de HbA de 70% à 100% ; une proportion de HbF de 0% à 30% ; une proportion de HbA2 inférieure à 8%. Composition pharmaceutique comprenant une population de globules rouges de culture selon l’une quelconque des revendications 9 à 12 à titre de substance active, éventuellement en association avec au moins un véhicule ou excipient pharmaceutiquement acceptable.