Brevet FR3126046A1 — publié le 20230210

Support de test biologique (1) à usage unique, destiné à être utilisé avec une station de test pour former un système de test biologique (ST) permettant détecter la présence d’une une ou plusieurs espèces pathogènes et/ou d’une séquence nucléique à révéler, le support de test comprenant : - un réservoir amont (11) pour recevoir un échantillon biologique à tester (ET) sous forme liquide, - une membrane d’extraction (2), agencée dans un premier logement (24), en communication fluidique avec le réservoir amont (11), - une zone de réaction (31) comprenant un logement de réaction (72, 74) contenant un mélange réactionnel de test (33, 34), - un canal de transfert (44) reliant le premier logement (24) au logement de réaction (72, 74), - une membrane de prélèvement (4) agencée dans un troisième logement (73), le troisième logement étant placé en communication fluidique avec le canal de transfert (44). Figure de l’abrégé : Figure 1 Support de test biologique amélioré Le présent document est relatif généralement aux dispositifs de diagnostic par amplification d’acide nucléique, notamment, à partir d'un échantillon biologique tel que des gouttes de sang, d'urine, de salive et de sueur. Plus spécifiquement, la présente invention concerne des plaquettes de test, utilisées dans un système de test biologique automatisé destiné à identifier la présence d’un microorganisme infectieux (bactérie, virus, etc.). Toutefois, le dispositif et la méthode proposés peuvent être appliqués à la détection d’autres marqueurs biologiques pouvant révéler d’autre types de pathologie quelconque, cancer y compris. S’agissant des tests de diagnostic basés sur la détection par amplification de l’ADN/ARN d’un microorganisme infectieux, on connait les méthodes de tests PCR (PCR pour Réaction de Polymérisation en Chaîne) ou les méthodes de test dites LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) ou RT-LAMP (Reverse transcriptase Loop-mediated isothermal amplification). Généralement, un échantillon biologique à tester subit une opération de lyse, puis l’échantillon lysé est incubé avec une membrane d’extraction. Ensuite, après rinçage, séchage éventuel et élution des molécules d’intérêt depuis la membrane d’extraction, on dirige l’éluat résultant vers une ou plusieurs première zone(s) de réaction d’amplification. Selon une réalisation d’intérêt, on pratique les opérations de rinçage, élution et lecture du résultat sur une cartouche à usage unique. Le document US2009325276 enseigne diverses configurations de cartouches pour réaliser de telles méthodes de test. Il a été constaté par les inventeurs que l’échantillon élué qui est transporté depuis la membrane d’extraction jusqu’à la zone de réaction/amplification peut contenir quelques résidus indésirables qui vont gêner voire empêcher les réactions d’amplification de se produire. Ces impuretés sont plus fréquemment trouvées sur des dispositifs point-of-care (« au chevet du patient »), qui automatisent de nombreuses étapes des méthodes d’analyse, plutôt que sur des dispositifs de laboratoire. Les inventeurs ont de plus constaté que ce type d’impuretés se trouve généralement dans une portion de front (i.e. le début du flux) du flux d’échantillon élué, alors que la portion suivante est dépourvue de ce type d’impuretés indésirables. À cet effet, il est proposé ici un support de test biologique, à usage unique, destiné à être utilisé avec une station de test pour former un système de test biologique (ST) permettant de détecter la présence d’une une ou plusieurs espèces pathogènes et/ou d’une séquence nucléique à révéler, le support de test comprenant : - un réservoir amont, pour recevoir un échantillon biologique à tester sous forme liquide, - une membrane d’extraction, agencée dans un premier logement, en communication fluidique avec le réservoir amont, - une zone de réaction comprenant un logement de réaction contenant un mélange réactionnel de test, - un canal de transfert reliant le premier logement au logement de réaction, - une membrane de prélèvement agencée dans un troisième logement, le troisième logement étant placé en communication fluidique avec le canal de transfert. La membrane de prélèvement permet ainsi de piéger le front de l’éluat, qui peut contenir des impuretés et éviter qu’il n’arrive jusqu’au(x) mélange(s) réactionnel(s). En particulier, la capacité d’absorption de la membrane de prélèvement est choisie de sorte qu’un flux de liquide transitant par le canal de transfert soit partiellement prélevé par la membrane de prélèvement. Une portion de front de l’éluat est capturée et retenue par la membrane de prélèvement sans parvenir au premier mélange réactionnel de test, alors qu’une portion suivante de l’éluat parvient au premier mélange réactionnel de test. On peut considérer que la membrane de prélèvement fait office ici de membrane de ‘dépollution’. Une telle membrane permet de gérer efficacement les impuretés sans intervention particulière sur la plaquette de test et en particulier sans pilotage du système de test biologique. Il s’agit d’un piégeage passif. En particulier, ladite communication fluidique est directe. Le terme « placé en communication fluidique » recouvre notamment une disposition où la membrane de prélèvement est placée de manière adjacente à le canal de transfert. Toutefois il n’est pas exclu d’avoir un canal de dérivation spécifique fonctionnant comme une liaison, par exemple capillaire, entre le canal de transfert et la membrane de prélèvement. Quand la membrane de prélèvement est saturée, elle ne capte plus de liquide supplémentaire et laisse passer le fluide qui arrive sans en capturer plus. Le terme « membrane d’extraction » désigne ici un organe poreux permettant d’absorber momentanément les acides nucléiques contenus dans l’échantillon à tester, de retenir ces acides nucléiques pendant une ou plusieurs opérations de rinçage destinées à éliminer des espèces chimiques telles protéines ou débris, résidus de tampon de lyse y compris. Suite à quoi, un éluant à plus forte affinité ionique avec lesdits acides nucléiques est introduit, permet de capter les acides nucléiques d’intérêt et de les entraîner, sous forme d’un éluat , vers les zones de réaction/d’amplification. Le support de test biologique forme une cartouche, c’est-à-dire un objet consommable (i.e. à usage unique) destiné à être utilisé avec une station de test qui reçoit la cartouche et qui interagit avec cette dernière. La station de test permet d’analyser successivement une pluralité de cartouches. Le logement de réaction susmentionné peut comprendre un ou plusieurs logements, appelés deuxième et/ou quatrième logement. Dans divers modes de réalisation de l’invention, on peut éventuellement avoir recours en outre à l’une et/ou à l’autre des dispositions suivantes, prises isolément ou en combinaison. Selon un aspect, la membrane de prélèvement peut présenter une capacité d’absorption représentant un volume compris entre 10% et 90 % du volume prédéfini d’éluant. Le volume prédéfini d’éluant est typiquement embarqué dans un logement de la plaquette de test (dans un blister par exemple). Avantageusement, on capte le début de l’écoulement grâce à la membrane de prélèvement, mais elle devient saturée à un moment donné et il reste encore de l’éluat qui va poursuivre son chemin jusqu’à la zone de réaction . Selon un aspect optionnel, la membrane de prélèvement peut présenter une capacité d’absorption représentant un volume compris entre 20% et 70 % du volume prédéfini d’éluant, voire un volume compris entre 30% et 60 % du volume prédéfini d’éluant. Selon diverses possibilités, on peut prévoir assez précisément le volume qui va être piégé par la membrane de prélèvement et aussi par conséquent le volume qui reste disponible pour aller réagir dans les zones de mélange réactionnel. De plus on écarte par piégeage un volume suffisant de l’éluat qui pourrait comporter des éléments indésirables. Selon un aspect, la membrane de prélèvement peut côtoyer le canal de transfert sur une distance supérieure à 4 mm ou bien N fois un diamètre ou une dimension (largeur ou hauteur) de la section transversale du canal de transfert, N étant de préférence supérieur à 3, 5, ou 10, voire 15. Ainsi on obtient une aspiration par effet buvard (capillarité), avec une surface d’interface suffisante pour capturer la portion précurseuse (i.e. de front) du flux sur une large plage de vitesses et débits possibles. Selon un aspect, le support de test peut comprendre en outre au moins un premier volume de premier liquide de rinçage, et/ou un volume prédéfini d’éluant. Les volumes peuvent être contenus directement dans des logements du support de test ou contenus dans des sachets agencés dans des logements du support de test. Les liquides sont hébergés à bord du support de test, et ainsi la seule interface nécessaire pour la transmission de fluide entre la plaquette de test et la station de test est une interface pneumatique. On minimise ainsi des transferts de fluide entre la station de test et le support de test et, de fait, les risques de fuite et de contamination de la station de test. Selon un aspect, le mélange réactionnel de test est sous forme lyophilisée. La forme lyophilisée permet de conserver le support de test prêt à l’usage sur une période longue avant son utilisation effective. Le mélange peut permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt . Selon un aspect, la zone de réaction comprend une première zone de réaction qui peut contenir un media poreux de réaction agencé dans un deuxième logement du logement de réaction et contenant le premier mélange réactionnel de test sous forme lyophilisée, le premier mélange réactionnel permettant l'amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt. Selon un aspect, le support de test peut comprendre en outre au moins un réservoir de récupération, pour récupérer les liquides issus du rinçage, et le trop plein d’éluat. Aucun liquide ne sort, on garde la station propre et on évite des contaminations croisées. Selon un aspect, le support de test peut comprendre en outre au moins une sortie d’air, pour faciliter le remplissage dudit réservoir. Moyennant quoi l’air qui se trouvait dans le réservoir de récupération peut facilement s’échapper lorsqu’on pousse les liquides en direction du réservoir de récupération. Selon un aspect, le support de test peut comprendre en outre un système de valve pour diriger un flux de fluide (liquide et/ou air) depuis la membrane d’extraction sélectivement vers le réservoir de récupération ou vers la zone de réaction via le canal de transfert. On peut diriger de manière fiable les flux de liquide à l’intérieur du support de test en pilotant le système de valve. Ledit système de valve peut être activé depuis la station de test qui traite le support de test. Selon un aspect, le système de valve peut comprendre une première valve de dérivation et une deuxième valve de dérivation pour diriger un flux de fluide depuis la membrane d’extraction sélectivement vers le réservoir de récupération ou vers la ou les zone(s) de réaction via le canal de transfert. Les valves de dérivation peuvent être des valves de type membrane. Ce genre de valve de type membrane peut être facilement pilotée grâce à des poussoirs agencés dans la station de test qui traite le(s) support(s) de test. Selon un aspect, la membrane de prélèvement (ou le troisième logement) se situe fluidiquement entre le système de valve et la zone de réaction. Dit autrement, la membrane de prélèvement (ou le troisième logement) se situe fluidiquement sur le parcours qui mène du système de valve à la zone de réaction. Ainsi, la membrane de prélèvement est agencée à l’endroit le plus pertinent du circuit microfluidique, i.e. juste en amont des zones de mélange réactionnel et après le système de valve, ce qui évite à la membrane de prélèvement de prélever par exemple des liquides de rinçage qui sont utilisés pour nettoyer la membrane d’extraction. Selon un aspect, la zone de réaction peut comprendre en outre une deuxième zone de réaction contenant un quatrième logement et contenant un deuxième mélange réactionnel de contrôle. Ceci permet de vérifier que l’éluat est bien arrivé à bon port dans les zones de mélange réactionnel ; car en effet le mélange réactionnel de contrôle réagit à la présence de molécules toujours présentes dans l’éluat, que ce dernier contienne ou pas les espèces nucléiques d’intérêt. Selon un aspect, le support de test peut comprendre en outre une zone de lecture de résultat comprenant au moins la zone de réaction et en particulier la première zone de réaction et/ou la deuxième zone de réaction. Par exemple, il peut s’agir d’une lecture optique du résultat. Le résultat peut être obtenu rapidement et directement sur place alors que le support de test n’a pas été manipulé ou transporté, dans une logique d’accessibilité et de rapidité de point-of-care. Selon un aspect, le support de test (plus précisément la zone de réaction) peut comprendre en outre un réservoir de distribution agencé de manière adjacente à la première, et le cas échéant la deuxième, zone(s) de réaction de manière à pouvoir alimenter en éluat les première et deuxième zones de réaction par pompage capillaire. On fiabilise ainsi l’alimentation en éluat à des zones de réaction. Selon un aspect, la membrane de prélèvement peut être formée d’un matériau comprenant au moins un parmi : cellulose, polyfluorure de vinylidène (‘PVDF’). Ces matières ont une porosité adéquate pour capturer et retenir l’éluat. Selon un aspect, la capacité d’absorption de la membrane de prélèvement est déterminée de sorte qu’un flux de liquide transitant par le canal de transfert soit partiellement prélevé par la membrane de prélèvement. Par partiellement prélevé, il est signifié qu’uniquement une portion du flux soit prélevée et pas l’intégralité (par exemple entre 5 et 90%, ou 10 et 90%, ou entre 10 et 50% du flux). La capacité d’absorption est notamment définie par les dimensions de la membrane de prélèvement, son matériau, l’interface avec le canal de transfert, etc. Selon un aspect, la membrane de prélèvement peut être formée d’un matériau présentant une absorption d’eau comprise entre 50 mg/cm 2 et 150 mg/cm 2 , voire entre 95 et 105 mg/cm 2 Selon un aspect, le support de test biologique est configuré pour amener l’échantillon biologique à tester dans la membrane d’extraction, puis après rinçage, séchage et élution de ladite membrane d’extraction, diriger l’éluat résultant vers au moins la première zone de réaction, une portion précurseuse de l’éluat étant piégée par la membrane de prélèvement sans parvenir au mélange réactionnel de test, une portion suivante de l’éluat parvenant au mélange réactionnel de test. Ainsi, on procède à de multiples opérations fluidiques à l’intérieur du support de test de manière à pouvoir en déduire, après réaction d’amplification, un résultat au travers de la zone de lecture. Selon un aspect, le logement de réaction est situé dans une zone d’interaction thermique configurée pour être chauffée par la station d’analyse, et le troisième logement est situé hors de la zone d’interaction thermique. La zone d’interaction thermique est typiquement inférieure à 5cm 2 . Cela permet d’éviter d’éventuelles perturbations optiques, d’une part parce que la membrane de prélèvement n’est pas chauffée (ou moins chauffée), de sorte que les réactions permettant une visualisation optique ne sont pas activées. De plus, la membrane de prélèvement étant éloignée de la zone de réaction (dans laquelle est incluse la zone de lecture optique), les risques d’interférence sont encore réduits. Selon un aspect, le premier logement est agencé la zone de d’interaction thermique ou optique de surface au plus égale à 5 cm². Cela permet d’utiliser le même système de chauffage pour la membrane d’extraction et pour la zone de réaction, ce qui diminue la complexité de la station et augmente la compacité de l’ensemble. Accessoirement, cela peut accélérer le séchage de la membrane d’extraction. Selon un aspect, le support de test peut se présenter comme une plaquette avec un corps dans lequel sont formés des canaux et des logements, lesquels sont généralement isolés de l’environnement extérieur. Un tel support de test peut être fabriqué en grande série à des coûts bien maîtrisés. Selon un aspect, le support peut présenter une forme générale parallélépipédique plate, avec deux faces principales. Il peut être prévu une entrée d’air et il peut être prévu une entrée en communication fluidique avec le réservoir amont pour recevoir un échantillon biologique à tester. Ces deux entrées peuvent être agencées sur une seule face principale. Préférentiellement toutes les interfaces peuvent être agencées sur une seule face principale. On a ainsi une interface avec la station de test particulièrement simple, ce qui permet de fiabiliser les tests et d’augmenter la productivité. Selon un aspect, le support de test est configuré pour coopérer avec une station de test biologique pour former le système de test biologique. Selon un aspect, l’éluant contenu dans le volume d’éluant est de l'eau distillée exempte d'ARNase et/ou d’ADNase et le volume d’éluant présente un volume compris entre 30 microlitres et 100 microlitres. Selon un aspect, il peut être prévu au moins une entrée d’air, confondue ou distincte de l’entrée pour recevoir l’échantillon biologique. L’entrée d’air distincte ou l’entrée combinée peut en outre être munie d’un clapet anti-retour. Selon un aspect, l’entrée pour recevoir l’échantillon biologique peut être de préférence scellable ou refermable, voire être muni d’un clapet anti-retour Selon un aspect, il peut être prévu un deuxième volume d’un deuxième liquide de rinçage, les premier et deuxième volumes de liquide de rinçage ayant un volume compris entre 100 microlitres et 300 microlitres. La présente invention vise aussi un système de test biologique comprenant une station d’analyse et une ou plusieurs supports de test biologique tels que décrits précédemment, la station d’analyse comprenant au moins un connecteur pneumatique configuré pour être accouplé à l’entrée d’air du support de test biologique. D’autres aspects, buts et avantages de l’invention apparaîtront à la lecture de la description suivante de plusieurs modes de réalisation de l’invention, donnés à titre d’exemple non limitatif. L’invention sera également mieux comprise en regard des dessins joints sur lesquels : - la est une vue schématique en plan d’un premier exemple de réalisation de support de test selon la présente invention - la est une vue en plan d’un deuxième exemple de réalisation de support de test selon la présente invention. - la illustre schématiquement en élévation le couplage entre le canal de transfert et la membrane de prélèvement. - la illustre schématiquement en coupe transversale de détail le couplage entre le canal de transfert et la membrane de prélèvement. - la illustre schématiquement l’interface entre la station d’analyse et le support de test biologique dans les zones d’activation des fluides. - la illustre schématiquement l’interface entre la station d’analyse et le support de test biologique, dans la zone de lecture du résultat. - la illustre une station d’analyse avec un support de test biologique. - les figures 8A et 8B sont des vues de détail illustrant une valve de type membrane. - la est une vue de détail illustrant un sachet de liquide embarqué sur la plaquette et poussé par un piston de la station d’analyse. - la est une vue schématique en plan d’un autre exemple de réalisation de support de test selon la présente invention. - la est une vue en plan d’un autre exemple de réalisation de support de test selon la présente invention. - la est une vue tridimensionnelle de l’exemple de la . - la est une vue analogue à la et montre une coupe relative à l’exemple de réalisation des figures 11 et 12. 1 . Support de test biologique (1) à usage unique, destiné à être utilisé avec une station de test pour former un système de test biologique (ST) permettant détecter la présence d’une une ou plusieurs espèces pathogènes et/ou d’une séquence nucléique à révéler, le support de test comprenant : - un réservoir amont (11) pour recevoir un échantillon biologique à tester (ET) sous forme liquide, - une membrane d’extraction (2), agencée dans un premier logement (24), en communication fluidique avec le réservoir amont (11), - une zone de réaction (31) comprenant un logement de réaction (72, 74) contenant un mélange réactionnel de test (33, 34), - un canal de transfert (44) reliant le premier logement (24) au logement de réaction (72, 74), - une membrane de prélèvement (4) agencée dans un troisième logement (73), le troisième logement étant placé en communication fluidique avec le canal de transfert (44). Support de test biologique selon la revendication 1, dans lequel la membrane de prélèvement (4) présente une capacité d’absorption représentant un volume compris entre 10% et 90% d’un volume prédéfini d’éluant. Support de test biologique selon l’une des revendications 1 à 2, dans lequel la membrane de prélèvement (4) côtoie le canal de transfert (44) sur une distance (L4) supérieure à 5 mm, voire 8 mm, ou une distance supérieure à N fois un diamètre ou une dimension de la section transversale du canal de transfert (44), N étant supérieur à 3, ou 5, ou 10 ou 15. Support de test biologique selon l’une des revendications 1 à 3, comprenant en outre au moins un premier volume de premier liquide de rinçage (R1), et/ou un volume prédéfini d’éluant. Support de test biologique (1) selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la zone de réaction (31) contient un media poreux de réaction (35) agencé dans un deuxième logement (72) et contenant le mélange réactionnel de test (33) sous forme lyophilisée. Support de test biologique selon l’une des revendications 1 à 5, comprenant en outre : - un réservoir de récupération (18), pour récupérer les liquides issus du rinçage, et le trop plein d’éluat, et/ou - au moins une sortie d’air (16,17), pour faciliter le remplissage du réservoir. Support de test biologique selon l’une des revendications 1 à 6, comprenant en outre un système de valve (5) pour diriger un flux de fluide depuis la membrane d’extraction (2) sélectivement vers le réservoir de récupération (18) ou vers le canal de transfert (44). Support de test biologique selon la revendication 7, dans lequel le troisième logement se situe fluidiquement entre le système de valve (5) permettant de diriger le flux vers la zone de réaction, et la zone de réaction. Support de test biologique selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel la membrane de prélèvement est formée d’un matériau comprenant au moins un parmi : cellulose, polyfluorure de vinylidène. Support de test biologique selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, dans lequel la capacité d’absorption de la membrane de prélèvement (4) est déterminée de sorte qu’un flux de liquide transitant par le canal de transfert soit partiellement prélevé par la membrane de prélèvement. Support de test biologique selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, dans lequel le support de test biologique est configuré pour amener, via un canal de liaison (11a), l’échantillon biologique à tester (ET) dans la membrane d’extraction (2), puis après rinçage, séchage et élution de ladite membrane d’extraction, diriger l’éluat résultant, via le canal de transfert (44), vers au moins la zone de réaction, une portion de front de l’éluat étant piégée par la membrane de prélèvement sans parvenir au mélange réactionnel de test, une portion suivante de l’éluat parvenant au mélange réactionnel de test (35). Support de test biologique selon l’une quelconque des revendication 1 à 11, dans lequel le logement de réaction (72, 74) est situé dans une zone d’interaction thermique (126) configurée pour être chauffée par la station d’analyse, et dans lequel le troisième logement est situé hors de la zone d’interaction thermique (126). Support de test biologique selon la revendication 12, dans lequel le premier logement (24) est agencé dans la zone d’interaction thermique. Support de test biologique selon l’une des revendications 1 à 13, dans lequel le troisième logement (73) est formé par un agrandissement du canal de transfert (44), la membrane de prélèvement (4) étant positionnée dans ledit agrandissement, de sorte que l’interface fluidique entre ladite membrane de prélèvement (4) et le canal de transfert (44) soit augmentée. Support de test biologique selon l’une des revendications 1 à 14, présentant une forme générale parallélépipédique plate, avec deux faces principales (10A,10B) avec une entrée d’air (14) et une entrée (12) en communication fluidique avec le réservoir amont (11) pour recevoir un échantillon biologique à tester (ET) et, préférentiellement, toutes les interfaces sont agencées sur une seule face principale (10A). Support de test biologique selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le support de test est configuré pour coopérer avec une station de test biologique pour former le système de test biologique (ST). Système de test biologique, comprenant : - une station d’analyse (8), - une ou plusieurs supports de test biologique (1) selon l'une des revendications précédentes, la station d’analyse comprenant au moins un connecteur pneumatique configuré pour être accouplé à l’entrée d’air (14) du support de test biologique.