Brevet FR3116008A1 — publié le 20220513

Ce document décrit une technologie pour fabriquer des barrettes de puces filtrantes fonctionnalisées. Dans le descriptif qui suit, la presse peut être une machine plus ou moins automatisée ou un serrage identique à un étau comme cela a été fait dans notre laboratoire de Baldersheim. Les barrettes obtenues peuvent être utilisées pour détecter et quantifier des biomolécules complexes dans des matrices biologiques : sang, plasma, sérum, organes ou extrait d’organes, milieu réactionnel dans lequel sont produits des bio molécules complexes (anticorps, protéines). Figure pour l’abrégé : figure 1 Production de puces filtrantes biofonctionnalisées Ce document décrit une technologie pour fabriquer des barrettes de puces filtrantes fonctionnalisées. Dans le descriptif qui suit, la presse peut être une machine plus ou moins automatisée ou un serrage identique à un étau comme cela a été fait dans notre laboratoire de Baldersheim. Les barrettes obtenues peuvent être utilisées pour détecter et quantifier des biomolécules complexes dans des matrices biologiques : sang, plasma, sérum, organes ou extrait d’organes, milieu réactionnel dans lequel sont produits des bio molécules complexes (anticorps, protéines). La détection se fait par une analyse immunologique de type ELISA : une fois le complexe molécule de capture / biomolécule d’intérêt formé sur les puits de la puce filtrante, un anticorps de révélation est ajouté qui se lie spécifiquement au complexe molécule de capture / biomolécule. La fluorescence qui apparait dans chaque puit, est mesurée à l’aide d’un photomultiplicateur ou d’une caméra type CMos couplé à un programme informatique qui réalise les calculs. Étape 2.1 La bande support a 20mm de large et 25 m de long par exemple. La largeur et la longueur peuvent être changées en fonction du type de barrettes à fabriquer. L’épaisseur de la bande support est de 0,12 mm soit l’épaisseur actuelle des membranes filtrante (Nitrocellulose) elle pourrait aussi être de l’ordre de 0,10 mm. En laboratoire, nous utilisons une membrane filtrante carrée de 20mm de coté. La bande support peut être en métal ex : acier, cuivre, laiton ou alors en plastique ; pourvu que le support soit assez rigide pour permettre les différentes opérations qui vont suivre. Il s’agit de réaliser un outil emporte-pièces et deux contre pièces correspondantes afin de pouvoir perforer convenablement la bande support et ainsi réaliser les puits (spots) dans la bande support dans un premier temps. Cet outil sera en acier (par exemple) afin que sa rigidité et sa tenue dans le temps soient garanties. Les dimensions seront adaptées aux types de membranes à réaliser. Dans notre cas présent ce sont 25 trous de 500 micromètres de diamètre espacés de 200 micromètres, soit un carré de 6mm x 6mm placé au centre de notre membrane filtrante (20x20mm). Cet outil emporte-pièce aura 25 pitons d’un diamètre de 500 microns. Pour d’autres membranes les pitons pourront avoir des diamètres différents (200 à 600 microns). Cet ensemble « emporte-pièces ainsi que deux contre pièces » sera fixé sous une presse. La bande support viendra se dérouler d’une manière automatique dans la partie basse de la première contre pièce et ajustée au milieu de cet « emporte-pièces ; contre pièce ; contre pièce » afin de réaliser des puits automatiquement par simple mouvement de haut en bas à la place prévue. Des que ce premier emboutissage est terminé il sera nécessaire d’introduire le ruban de membrane filtrante au-dessus de la deuxième contre pièce quand l’emporte pièce sera en position « haute » et un deuxième emboutissage (de la membrane filtrante) sera effectué. Ce sont les découpes de pastilles de membrane filtrante. La course de descente des pitons sera alors réglée de telle manière à ce que la position basse s’arrête au début de la bande support déjà percée. De cette manière les pitons vont pousser les pastilles de Nitrocellulose fraichement découpées et remplir les trous de la membrane support. Ceci étant fait la bande la bande pourra avancer sous une deuxième presse qui aura pour fonction de sertir les pastilles de Nitrocellulose dans la bande support par un choc (pression) qui sera exercée sur toute la surface de la membrane afin de bien bloquer les pastilles dans la bande support. La force de cette pression ou (choc) sera à déterminer par des tests. Le procédé fabrication est réalisé en continu. En sortie de machine, nous récupérons un rouleau d’une bande de matière (acier, cuivre, laiton ou plastique) sur laquelle sont serties de manière régulière des puits de Nitrocellulose de 300 à 500 microns de diamètre délimités sur lesdites membranes (20mmx 20mm). Ce rouleau pourra être maintenu de la sorte ou coupé en portions horizontales de différentes longueurs pour être stocké a 20 degrés +/-5 °C au sec pendant 6 à 12 mois (Il s’agit d’un minimum. La shelf life doit être déterminée de manière précise). Des barrettes contenant un nombre moindre puces (par ex. 8, 12, 24 ou 20…puits) sur la même surface peuvent être fabriquées en utilisant les mêmes procédés et changeant le nombre d’emporte-pièces sur la plaque d’acier fixée à la presse de formation des puits. Il est possible de repartir plus de puits que les 25 testés dans les procédures utilisées. Bio Fonctionnalisation La bio fonctionnalisation des puces consiste à fixer une molécule de capture (par exemple un anticorps pour détecter un antigène) ciblant la biomolécule complexe à détecter et quantifier dans le liquide biologique. Typiquement, le rouleau de barrettes de puces filtrantes est mis en place sur une machine de « spoting ». Il est déroulé pour faire défiler les barrettes de puces sur un plateau filtrant relié à une pompe à vide. La tête d’injection de la machine de « Spoting » va déposer en 2-3 injections 10 µL d’une solution contenant la molécule capture, par exemple, à une concentration de 10 à 30 µg/mL. Le vide d’aspiration doit permettre une filtration lente sur un temps d’environ 20 secondes des 10 µL de solution. Les 25 puces de chaque barrette sont ainsi traitées de la même façon. Une deuxième application est ensuite réalisée dans les mêmes conditions mais avec une solution de BSA (Bovine Sérum Albumine) à une concentration 100 µg/mL. Cette solution permet de saturer les sites polaires de la puce filtrante pour éviter des liaisons non spécifiques entre la biomolécule qui sera détectée et la surface de nitrocellulose de la puce. Après incubation du rouleau de barrettes de puces filtrantes à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, les barrettes sont prêtes. Elles peuvent être séparées les unes des autres avec un outil de coupage qui permette d’obtenir des barrettes isolées de mêmes dimensions. Des modes de réalisation de l’invention seront décrits ci-dessous par référence aux dessins, décrits brièvement ci-dessous : représente une barrette de puces filtrantes préparée selon le procédé de l’ETH Zurich. représente une barrette de puces filtrantes selon un mode de réalisation de l’invention. représente une barrette en laiton avec des spots en nitrocellulose. représente la même barrette que la , utilisée avec une solution colorée par aspiration. est un exemple d’une barrette de 5 mm x 5 mm contenant 20 puces filtrantes. est un exemple d’une feuille de nitrocellulose pressée de 25 spots (exp : 17/04/2020).