Brevet FR3119770A1 — publié le 20220819

La présente invention concerne un principe actif cosmétique obtenu à partir d’une levure de l’espèce Pichia naganishii et ses utilisations cosmétiques, en particulier pour maintenir l’hydratation et restaurer l’intégrité de la peau. Extrait de Pichia naganishii et ses utilisations cosmétiques L’invention concerne un principe actif cosmétique obtenu à partir d’une levure de l’espèce Pichia naganishii et ses utilisations cosmétiques, en particulier pour favoriser l’hydratation de la peau et restaurer l’intégrité de la peau. Etat de l’art La peau nécessite d’être hydratée et protégée afin qu’elle joue correctement son rôle de barrière vis-à-vis des agressions extérieures. Dans nos modes de vie actuels effrénés, en particulier citadin, la peau est constamment agressée par des facteurs externes tels que la fatigue, le stress, la pollution, le tabagisme, l’alcool, certains traitements médicamenteux, aggravant la déshydratation naturelle qui apparaît dès l’âge de 25 ans. Le renouvellement cellulaire s’affaiblit alors et la microcirculation ralentit. Le teint devient terne, perd en uniformité et la peau est plus sujette aux rougeurs. Or, l’éclat du teint traduit la santé de la peau, un teint terne donne un air fatigué et peut accentuer les signes de l’âge. Ainsi, une peau déshydratée peut avoir un impact important sur l’estime de soi et l’image que l’on renvoie. C’est pourquoi, de nombreux produits cosmétiques visent à maintenir l’hydratation de la peau et renforcer son rôle de barrière protectrice afin d’éviter la sensation de tiraillement. Or, certains produits cosmétiques peuvent se révéler être trop agressifs pour la peau et aggraver la déshydratation. Il existe donc un besoin pour de nouveaux produits cosmétiques naturels qui permettent de maintenir l’hydratation et renforcer la fonction barrière de la peau, tout en apportant aux consommateurs une routine non agressive. C’est l’objectif de la présente invention qui, à cet effet, propose un nouveau principe actif cosmétique obtenu à partir d’une levure de l’espèce Pichia naganishii . La levure Pichia naganishii , également dénommée Ogataea naganishii peut être isolée à partir d’un exsudat du Camélia du Japon ou Camellia japonica . Cette levure spécifique a été identifiée jusqu’à présent uniquement sur deux plantes, le Camellia japonica et Sakaki ochnacea et dans une seule zone géographique située au Japon. Une souche de la levure Pichi a naganishii peut également être obtenue auprès de la Banque ATCC sous le numéro ATCC 32418. Il est connu de l’art antérieur, des brevets portant sur la production de molécules par la levure Pichia naganishii telles que l’acide glycolique, le dérivé de chioropropanediol, l’hydroxy-ketoester, le propanol, la muscone et la glycolate, mais aucun art antérieur ne décrit une utilisation cosmétique ou un principe actif issu de cette levure. Or, l’invention vise un principe actif issu de la biomasse de la levure Pichia naganishii . En particulier, l’invention concerne un principe actif cosmétique comprenant au moins un extrait de levure de l’espèce Pichia naganishii. Préférentiellement, l’extrait est un hydrolysat de Pichia naganishii. L’invention se rapporte également à un procédé de préparation du principe actif selon l’invention, comprenant notamment une solubilisation de la levure Pichia naganishii dans l’eau, une hydrolyse enzymatique, une séparation de la phase soluble et insoluble et récupération de la phase soluble, une inactivation enzymatique, et éventuellement une concentration de l’extrait suivi d’une filtration stérilisante. Le principe actif selon l’invention est d’origine naturelle et présente avantageusement un effet hydratant et renforce la fonction barrière sans l’agresser. Il répond ainsi aux problématiques de l’art antérieur. Il peut être utilisé pour des applications cosmétiques, préférentiellement lorsqu’il est intégré dans une composition cosmétique, préférentiellement une composition sous une forme adaptée à une application topique. L’invention se rapporte donc également à une utilisation cosmétique d’une composition comprenant au moins 0,1% en poids du principe actif selon l’invention, en particulier pour hydrater la peau et renforcer sa fonction barrière. D’autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description détaillée de l’invention et des exemples qui vont suivre. Description détaillée de l’invention Définition Par « principe actif cosmétique » au sens de l’invention, on entend un extrait comprenant au moins une molécule, préférentiellement un ensemble de molécules présentant un effet cosmétique sur la peau. Préférentiellement l’effet cosmétique sur la peau est un effet hydratant. Par « hydrolysat de Pichia naganishii » au sens de l’invention, on entend tout principe actif issu de la levure Pichia naganishii , obtenu par un procédé comprenant au moins une étape d'hydrolyse de Pichia naganishii . Le terme hydrolysat de Pichia naganishii exclut les molécules produites uniquement par fermentation de Pichia naganishii . Par « Pichia naganishii » au sens de l’invention, on entend toute levure de la famille des Saccharomycetaceae , du genre Pichia et de l’espèce Pichia naganishii . Une souche de la levure Pichia naganishii a été enregistrée dans une collection de levures, sous le numéro ATCC 32418. Elle est également connue sous le nom : Ogataea naganishii . Pichia naganishii peut être isolée à partir d’un exsudat du Camellia japonica . Principe actif selon l’invention La présente invention a donc pour objet un principe actif cosmétique comprenant au moins un extrait de levure de l’espèce Pichia naganishii . Selon un mode de réalisation préféré, la levure Pichia naganishii est obtenue à partir d’un exsudat de Camellia japonica ou à partir de la souche déposée sous le numéro ATCC 32418. Préférentiellement, l’extrait de levure est un hydrolysat. L’extrait peut notamment comprendre des protéines et/ou des carbohydrates. Lorsque l’extrait comprend des protéines, l’extrait comprend préférentiellement entre 20% et 60% de protéines, en poids de matière sèche de l’extrait. Selon un mode de réalisation, l’extrait comprend entre 5% et 25% de carbohydrates, plus préférentiellement 12% en poids de matière sèche de l’extrait. Préférentiellement, le taux de cendres est compris entre 5 et 35% en poids, encore plus préférentiellement compris entre 20 et 30%. La teneur en cendres brutes peut être déterminée par la pesée des résidus issus de l’incinération des échantillons de l’hydrolysat à 550°C dans un four à moufle électrique. L’extrait selon l’invention est préférentiellement un hydrolysat obtenu par une hydrolyse enzymatique. Ainsi, l’extrait est préférentiellement un hydrolysat enzymatique. A titre d’exemple, les enzymes utilisées pour l’hydrolyse peuvent être une protéase ou une carbohydrase. Le principe actif selon l’invention peut se présenter sous forme solide ou sous forme liquide. Lorsqu’il se présente sous forme liquide, le principe actif selon l’invention est préférentiellement l’extrait tel que décrit précédemment en tant que tel. Il se présente sous forme d’un liquide limpide, de couleur jaune clair à l’odeur caractéristique. Lorsqu’il se présente sous forme solide le principe actif selon l’invention est préférentiellement constitué par l’extrait de Pichia naganishii tel que précédemment décrit et par un support choisi parmi la maltodextrine, la gomme arabique, la lécithine de soja ou l’isomalt. Selon un mode de réalisation, particulièrement adapté, l’extrait représente au moins 10% en poids du principe actif et le support au plus 90% en poids du principe actif. Dans le cas d’une forme solide dans laquelle le principe actif est associé à un support, les teneurs en protéines, en sucres et en cendres dans le principe actif sont modifiées, le support étant généralement constitué majoritairement de sucres. Le principe actif selon l’invention peut éventuellement être intégré dans une composition cosmétique, notamment une composition comprenant au moins 0,1% en poids dudit principe actif. En particulier, la composition est sous une forme adaptée à une application topique tel qu’une crème ou une lotion. Procédé d’extraction L’extrait constituant ou contenu dans le principe actif selon l’invention peut être obtenu par tout procédé comprenant au moins une étape d’extraction de Pichia naganishii , en particulier une étape d’hydrolyse. De façon particulièrement préférée, il est obtenu par un procédé comprenant une étape d’hydrolyse enzymatique. Préalablement au procédé d’obtention de l’extrait en tant que tel, il convient de produire la biomasse de Pichia naganishii . Cette étape est réalisée selon le mode de culture des levures dans un milieu adapté à leur développement, de manière classique pour l’homme de métier. Une fois la biomasse obtenue, on réalise une extraction, préférentiellement une hydrolyse, en vue d’obtenir des molécules actives. Selon un mode de réalisation particulièrement adapté, le principe actif selon l’invention est obtenu par la mise en œuvre des étapes suivantes : - solubilisation à raison d’au moins 40 g/L de la levure Pichia naganishii dans l’eau, - hydrolyse, préférentiellement hydrolyse enzymatique, - séparation de la phase soluble et insoluble et récupération de la phase soluble, - inactivation enzymatique, et éventuellement filtration, - éventuellement concentration et filtration stérilisante. Les conditions d’hydrolyse sont choisies pour hydrolyser à la fois les parois des levures et le milieu intracellulaire des levures, préférentiellement l’hydrolyse est réalisée par voie enzymatique. La séparation des phases soluble et insoluble est réalisée par tout moyen connu de l’homme du métier, par exemple par centrifugation, filtration ou décantation. Préférentiellement la séparation des phases soluble et insoluble est réalisée par centrifugation, permettant ainsi la récupération de la phase soluble contenant entre autres les protéines solubles. L’inactivation de l’enzyme est préférentiellement réalisée par traitement thermique. Cette inactivation est alors réalisée selon les préconisations du fournisseur de l’enzyme. Eventuellement, le procédé comprend une étape de filtration après la récupération de la phase soluble pour éliminer les particules encore en suspension. Ainsi, cette étape de filtration permet la purification de la phase soluble récupérée et est réalisée afin d’éliminer les molécules de haut poids moléculaire (les enzymes et les polymères…). L’hydrolysat obtenu à ce stade peut éventuellement être encore concentré et/ou purifié, préférentiellement par des étapes d’ultrafiltrations successives à travers des filtres de porosité différentes, en conservant les filtrats à chaque étape et/ou par une méthode de type chromatographique. L’hydrolysat obtenu après hydrolyse et filtration, avant ou après concentration et filtration stérilisante, est un hydrolysat de Pichia naganishii , et constitue une première forme du principe actif selon l’invention, se présentant alors sous forme liquide. L’hydrolysat obtenu peut ensuite être séché et associé à un support, pour se présenter sous forme solide. Cette phase peut être réalisée par la mise en œuvre des étapes suivantes : - un support d’atomisation, de préférence la maltodextrine, est ajouté dans l’hydrolysat de Pichia naganishii , d’au plus 90% (en masse/volume) ; - cette solution est ensuite concentrée sous vide ; - une élimination des bactéries éventuellement présentes est réalisée par traitement thermique ; - l’atomisation permet d’obtenir une poudre. Les étapes des procédés décrits ci-avant, prises individuellement sont usuelles dans le domaine des extractions d’actifs à partir de matières premières naturelles et l’homme du métier est à même d’en ajuster les paramètres réactionnels sur la base de ses connaissances générales. Utilisation cosmétique Le principe actif selon l’invention est particulièrement efficace pour hydrater la peau et renforcer la fonction barrière de la peau. En particulier l’extrait de Pichia naganishii selon l’invention, lorsqu’il est appliqué sur la peau permet de : - maintenir l’hydratation, - renforcer la fonction barrière mécanique et immune de la peau. Avantageusement, le principe actif selon l’invention est capable de stimuler la synthèse d’acide hyaluronique dans des kératinocytes humains et ainsi promouvoir une action hydratante. Le principe actif selon l’invention permet également d’augmenter l’expression des gènes des β-défensine, de la psoriasine, des récepteurs de type Toll et de la ribonucléase Rnase 7 afin d’ainsi renforcer la barrière immune. Le principe actif selon l’invention augmente également l’expression des gènes codant : occludine, claudine-1, desmogléine-1, fillaggrine, loricrine, caspase 14 afin de renforcer la barrière mécanique. Le principe actif selon l’invention permet d’augmenter l’expression de la hyaluronane synthase 2 et de l’aquaporine 3, permettant ainsi d’améliorer l’hydratation de la peau en maintenant l’homéostasie de la fonction barrière. Enfin, le principe actif permet également de réduire l’inflammation de la peau notamment en limitant ou en n’activant pas la sécrétion des interleukines 13 et 17. L’invention vise ainsi une utilisation cosmétique, non thérapeutique, d’un principe actif selon l’invention pour ses effets cosmétiques, seul ou dans une composition, en particulier pour au moins un effet cosmétique choisi parmi un effet hydratant et un effet de renforcement de la barrière cutanée. Par utilisation non thérapeutique, on entend au sens de l’invention une utilisation cosmétique du principe actif selon l’invention ou d’une composition le comprenant, destinée à des sujets sains non malades, en particulier à des sujets avec une peau saine. Préférentiellement l’utilisation du principe actif selon l’invention, seul ou dans une composition, est une utilisation en application topique sur la peau. L’utilisation cosmétique selon l’invention vise également l’utilisation d’une composition comprenant le principe actif selon l’invention. Le principe actif selon l’invention est en effet préférentiellement utilisé dans des compositions, en particulier des compositions comprenant un milieu cosmétiquement acceptable. Il peut s’agir de compositions dans différentes formes galéniques, adaptées à une application topique. Ces compositions peuvent se présenter notamment sous forme d’émulsions huile-dans-eau, émulsions eau-dans-huile, émulsions multiples (Eau/Huile/Eau ou Huile/Eau/Huile) qui peuvent être éventuellement des microémulsions ou des nanoémulsions, ou sous forme de solutions, suspensions, hydrodispersions, gels aqueux. Elles peuvent être plus ou moins fluides et avoir l’aspect de lotion, crème ou mousse. Il peut s’agir de compositions comprenant au moins 0,1% en poids du principe actif selon l’invention. Ces compositions comprennent, outre l’actif, un milieu physiologiquement acceptable et de préférence cosmétiquement acceptable, c'est-à-dire qui ne provoque pas de sensations d’inconfort inacceptables pour l’utilisateur telles que des rougeurs, tiraillements ou picotements. Les compositions selon l’invention peuvent contenir comme adjuvant au moins un composé choisi parmi : - les huiles, qui peuvent être choisies notamment parmi les huiles de silicone, linéaires ou cycliques, volatiles ou non volatiles ; - les cires, telles que l’ozokérite, la cire de polyéthylène, la cire d’abeille ou la cire de carnauba, - les élastomères de silicone, - les tensioactifs, de préférence émulsionnants, qu’ils soient non ioniques, anioniques, cationiques ou amphotères, - les co-tensioactifs, tels que les alcools gras linéaires, - les épaississants et/ou gélifiants, - les humectants, tels que les polyols comme la glycérine, - les colorants, les conservateurs, les charges, - les tenseurs, - les séquestrants, - les parfums, - et leurs mélanges, sans que cette liste soit limitative. Des exemples de tels adjuvants sont cités notamment dans le Dictionnaire CTFA ( International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook publié par le Personal Care Product Council ). Bien entendu, l’homme du métier veillera à choisir les éventuels composés complémentaires, actifs ou non-actifs, et leur quantité, de telle sorte que les propriétés avantageuses du mélange ne soient pas, ou sensiblement pas, altérées par l’adjonction envisagée. Les compositions comprenant un principe actif selon l’invention sont notamment destinées à être utilisées pour des effets hydratant et/ou pour renforcer la barrière épithéliale cutanée. Préférentiellement, ladite composition comprenant un principe actif selon l’invention est appliquée, préférentiellement au moins une fois par jour pendant au moins un mois. L’invention est à présent illustrée par des exemples non limitatifs de principe actif et composition selon l’invention et par des résultats. Exemples Exemple 1 – Principe actif selon l’invention (PA1) Le principe actif de l’exemple 1 est obtenu par le procédé suivant : - Solubilisation de P. naganishii dans l’eau, préférentiellement à raison de 50g/l, - Hydrolyse enzymatique avec une carbohydrase, - Séparation des phases solubles et insolubles - Inactivation enzymatique par traitement thermique - Filtration - Concentration - Filtration et filtration stérilisante Le principe actif obtenu possède les caractéristiques suivantes : 45% de carbohydrates et 7% de protéines (en pourcentage par rapport à la matière sèche) Exemple 2 – Principe actif selon l’invention (PA2) Le principe actif de l’exemple 2 est obtenu par le procédé suivant : - Solubilisation de P. naganishii dans l’eau, préférentiellement à raison de 50g/l, - Hydrolyse enzymatique avec une protéase, - Séparation des phases solubles et insolubles - Inactivation enzymatique par traitement thermique - Filtration - Concentration - Filtration et filtration stérilisante Le principe actif obtenu possède les caractéristiques suivantes : 12% de carbohydrates, 29% de cendres et 59% de protéines (en pourcentage par rapport à la matière sèche). L’extrait est sous la forme d’une solution aqueuse liquide limpide, couleur jaune clair à l’odeur caractéristique. Exemple 3 – Principe actif selon l’invention (PA3) Le principe actif de l’exemple 3 est obtenu par un procédé similaire à celui de l’exemple 2 et comprend une étape de filtration à l’aide de charbon. Le principe actif obtenu possède les caractéristiques suivantes : 45% de carbohydrates et 11% de protéines (en pourcentage par rapport à la matière sèche). Exemple 4 – Principe actif hors invention (PA4) Le principe actif de l’exemple 4 est obtenu par le procédé suivant : - solubilisation de Pichia anomala dans l’eau, préférentiellement à raison de 20g/l - hydrolyse basique de la solution de Pichia anomala, - séparation des phases soluble et insoluble, par exemple par filtration, centrifugation ou décantation, - récupération de la phase soluble - filtration et purification pour récupérer les molécules - hydrolyse enzymatique des protéines, préférentiellement au moyen d’une protéase, - filtration et purification pour récupérer les bio-peptides de taille inférieure à 5000Da. Exemple 5 – Principe actif hors invention (PA5) Le principe actif de l’exemple 5 est obtenu par le procédé suivant : - solubilisation de levures Pichia anomala dans l’eau, - hydrolyse enzymatique afin de couper les protéines et d’obtenir une fraction protéique de masse moléculaire inférieure à 5000Da, - inactivation des enzymes utilisées pour l’hydrolyse, - séparation des phases soluble et insoluble, - ultrafiltration pour éliminer la fraction protéique, et - filtrations. Exemple 6 – Effet du principe actif selon l’invention sur la synthèse d’acide hyaluronique. L’objectif de cet essai est de comparer l’effet d’un principe actif selon l’invention, en particulier celui de l’Exemple 2 (PA2) in vitro sur kératinocytes humains, sur la synthèse d’acide hyaluronique avec l’effet d’un principe actif hors invention correspondant au principe actif de l’Exemple 4 (PA4). Le protocole opératoire de l’étude est décrit en suivant. Les kératinocytes humains normaux sont ensemencés puis incubés à 37°C dans une étuve contenant 5% de CO2. Puis le milieu de culture est éliminé et remplacé par du milieu contenant les principes actifs : - PA 2 à 1,00% (V/V) - PA 4 à 1,00% (V/V) Les cellules sont ensuite incubées à 37°C dans une atmosphère contenant 5% de CO2 pendant 48 heures. Les surnageants sont récupérés avant d’être analysés par dosage ELISA. Les résultats sont présentés dans le tableau 1 ci-après. Synthèse d’acide hyaluronique (%) Taux d’acide hyaluronique / Témoin (%) Témoin 100 PA2 1,00% 150 + 50 PA4 1,00% 80 - Ainsi, seul le principe actif selon l’invention (PA2) stimule la synthèse d’acide hyaluronique. L’étude est également réalisée à différentes doses de principes actifs comme suit : - PA 1 à 0,25% et 1,00% (V/V) - PA 2 à 0,25% et 1,00% (V/V) - PA 3 à 0,25% et 1,00% (V/V) Les résultats sont présentés dans le tableau 2 ci-après. Synthèse d’acide hyaluronique (pg/µg protéines) Taux d’acide hyaluronique / Témoin (%) Témoin 399 ± 64 PA 1 0,25% 527 ± 141 + 32 PA 1 1,00% 628 ± 94 + 57 PA 2 0,25% 559 ± 113 + 40 PA 2 1,00% 598 ± 90 + 50 PA 3 0,25% 541 ± 100 + 36 PA 3 1,00% 591 ± 84 + 48 Ainsi, les principes actifs selon l’invention à 1% stimulent la synthèse de l’acide hyaluronique de 57% pour PA1, 50% pour PA2, 48% pour PA3. Exemple 7 – Effet du principe actif sur l’expression des gènes β-défensine 4 et Toll Like Recepteur 2 (TLR2) . Cette étude a été réalisée sur kératinocytes humains normaux par PCR quantitative pour évaluer la capacité à augmenter l’expression des gènes : β-défensine 4 et Toll Like Recepteur 2. Le principe actif utilisé pour cet essai est le principe actif de l’exemple 2 ainsi que les principes actifs hors invention PA4 et PA5. Le protocole opératoire de l’étude est décrit en suivant. Les kératinocytes humains normaux sont ensemencés puis incubés à 37°C dans une étuve contenant 5% de CO2. Puis, le milieu de culture est éliminé et remplacé par du milieu contenant le produit issu des principes actifs. Les cellules sont ensuite incubées à 37°C dans une atmosphère contenant 5% de CO2. Les ARN totaux extraits ont été reverses-transcripts et les ADN complémentaires obtenus ont été analysés par la technique de PCR quantitative. La fluorescence (SYBR Green) est mesurée en continu à l’aide d’un thermocycleur. L’analyse des Ct (quantification relative) est réalisée à l’aide d’un logiciel. Les résultats sont présentés dans le tableau 3 et le tableau 4 ci-après. β-défensine 4 (%) Expression/Témoin (%) Témoin 100 PA2 1,00% 300 +200 PA2 2,00% 401 +301 PA5 1,00% 103 PA4 1,00% 80 TLR2 (%) Expression/Témoin (%) Témoin 100 PA2 1,00% 132 +32 PA2 2,00% 174 +74 PA4 1,00% 99 0 Ainsi, seul le principe actif selon l’invention (PA2) augmente l’expression des gènes de la barrière immune cutanée : β-défensine 4 et TLR2. Exemple 8 – Effet du principe actif selon l’invention sur l’expression de HAS-2 et l’aquaporine 3. L’objectif de cette étude est d’évaluer l’effet des principes actifs selon l’invention sur leur capacité à augmenter l’expression des ARNm codant pour HAS-2 et l’aquaporine 3. Cette étude a été réalisée sur kératinocytes humains normaux par PCR quantitative. Le protocole opératoire de l’étude est décrit en suivant. Les kératinocytes humains normaux sont ensemencés puis incubés à 37°C dans une étuve contenant 5% de CO2. Puis le milieu de culture est éliminé et remplacé par du milieu contenant les principes actifs issus de Pichia naganishii : - PA 1 à 0,25% et 1,00% (V/V) - PA 2 à 0,25% et 1,00% (V/V) - PA 3 à 0,25% et 1,00% (V/V) Les cellules sont ensuite incubées à 37°C dans une atmosphère contenant 5% de CO2. Les cellules sont récupérées et les ARN totaux extraits pour l’étude de HAS-2 et de l’aquaporine 3. Les ARN ont été reverses-transcripts et les ADN complémentaires obtenus ont été analysés par la technique de PCR quantitative. Les ARNm de témoins de référence, ont été également analysés en parallèle des ARNm de l’aquaporine 3 et de HAS-2. La quantification de l’incorporation de fluorescence (SYBR Green) est mesurée en continu à l’aide d’un thermocycleur. L’analyse des Ct (quantification relative) est réalisée à l’aide d’un logiciel. Les résultats sont présentés dans le tableau 5 ci-après. Expression / Témoin (%) HAS-2 aquaporine 3 PA 1 0,25% +20 +14 PA 1 1,00% +4 +43 PA 2 0,25% +50 +46 PA 2 1,00% +36 +130 PA 3 0,25% +12 +9 PA 3 1,00% +18 +95 Ainsi, le principe actif selon l’invention augmente l’expression de HAS-2 et de l’aquaporine 3. Exemple 9 – E ffet du principe actif selon l’invention sur le réseau membranaire, en particulier sur les fonctions serrées . Le but de cette étude est de visualiser l’effet des principes actifs issus de Pichia naganishii sur le réseau membranaire formé par zonula occludens ZO-1, un des constituants majeurs des jonctions serrées. L’étude a été réalisée par immunocytologie sur des kératinocytes humains normaux après agression au Sodium Lauryl Sulfate (SLS) à 0,4mM. Le protocole opératoire de l’étude est décrit en suivant. Les kératinocytes humains normaux sont ensemencés puis incubés à 37°C dans une étuve contenant 5% de CO2. Puis, les kératinocytes humains normaux sont traités avec une solution de CaCl2 à 1 mM pendant 48h afin de permettre la formation du réseau de jonctions serrées. Ensuite, les kératinocytes humains normaux sont traités avec une solution de SLS à 0,4 mM pendant 30 minutes. A la fin de l’incubation, la solution de SLS est éliminée et remplacée par du milieu contenant les principes actifs issus de Pichia naganishii : - PA 1 à 0,25% et 1,00% (V/V) - PA 2 à 0,25% et 1,00% (V/V) - PA 3 à 0,25% et 1,00% (V/V). Les cellules sont incubées pendant 48h dans une étuve à 37°C en atmosphère humide contenant 5% de CO2. Les cellules sont immunomarquées à l’aide d’un fluorophore. La visualisation est réalisée sur microscope couplé à un système d’analyse d’image. L’intensité du marquage des ZO-1 est proportionnelle à l’intensité de fluorescence verte présente au niveau membranaire des cellules. Plus la couleur verte est importante, plus le taux de synthèse des ZO-1 est élevé. De plus, une analyse quantitative des images a été réalisée à l’aide du logiciel Matlab. Cette quantification est exprimée en Unité Arbitraire (UA). Les résultats sont les suivants. Après agression SLS de kératinocytes humains, le réseau de ZO-1 membranaire induit par le CaCl2 est fortement altéré. Testés à 0,25% puis à 1% sur kératinocytes humains agressés, les principes actifs augmentent respectivement la synthèse et la formation du réseau membranaire de ZO-1 de : – 127% et 139% pour PA 1 – 33% et 46% pour PA 2 – 47% et 79% pour PA 3 Ainsi, quelle que soit l’enzyme utilisée et la filtration choisie, les principes actifs selon l’invention issus de la culture de Pichia naganishii augmentent la synthèse d’acide hyaluronique et l’expression des gènes impliqués dans la formation des jonctions serrées. Exemple 10 - Effet du principe actif selon l’invention sur les gènes de la barrière mécanique épidermique et sur les gènes de la barrière immune cutanée . L’étude vise à évaluer l’effet du principe actif selon l’invention sur sa capacité à augmenter l’expression des gènes : - de la barrière mécanique épidermique : occludine, claudine-1, desmogléine-1, fillaggrine, loricrine, caspase 14 - de la barrière immune cutanée : β-défensine 1, : β-défensine 4, psoriasine, Toll Like Recepteur 2, Toll Like Recepteur 3, ribonucléase Rnase 7. Cette étude a été réalisée sur kératinocytes humains normaux par PCR quantitative. Le principe actif utilisé pour cet essai est le principe actif de l’exemple 2. Le protocole opératoire de l’étude est décrit en suivant. Les kératinocytes humains normaux sont ensemencés puis incubés à 37°C dans une étuve contenant 5% de CO2. Puis, le milieu de culture est éliminé et remplacé par du milieu contenant le produit issu de PA2 à 0,5%, 1,0% et 2,0% (V/V). Les cellules sont ensuite incubées à 37°C dans une atmosphère contenant 5% de CO2. Les ARN totaux extraits ont été reverses-transcripts et les ADN complémentaires obtenus ont été analysés par la technique de PCR quantitative. Les ARNm des gènes : occludine, claudine-1, desmogléine-1, filaggrine, loricrine, caspase 14, β-défensine 1, β -défensine 4, psoriasine, Toll Like Recepteur 2, Toll Like Recepteur 3 et la ribonucléase Rnase 7 ont été analysés en parallèle des ARNm de témoins de référence pour la normalisation. La fluorescence (SYBR Green) est mesurée en continu à l’aide d’un thermocycleur. L’analyse des Ct (quantification relative) est réalisée à l’aide d’un logiciel. Les résultats sont présentés dans les tableaux 6 et 7 ci-après. Expression / Témoin (%) Principe actif selon l’invention PA2 0,5% 1,0% 2,0% Occludine 0 0 0 Claudine-1 0 0 0 Desmogléine-1 80 84 184 Filaggrine 33 Va 64 Loricrine 91 Va 89 Caspase 95 150 370 Va = valeurs aberrantes Expression / Témoin (%) Principe actif selon l’invention PA2 0,5% 1,0% 2,0% β-défensine 1 24 34 100 β-défensine 4 107 200 301 Psoriasine 0 8 8 Toll Like Recepteur 2 27 32 74 Toll Like Recepteur 3 34 67 106 Ribonucléase RNase 7 0 0 0 Testé à 2,0%, le principe actif selon l’invention augmente significativement l’expression des gènes de la barrière mécanique épidermique : - desmogléine-1 : +184% - filaggrine : +64% - loricrine : +89% - caspase 14 : +370% Le principe actif selon l’invention augmente également significativement l’expression des gènes de la barrière immune cutanée : - β -défensine 1 : +100% - β -défensine 4 : +301% - Toll Like Recepteur 2 : +74% - Toll Like Recepteur 3 : +106% Exemple 11 - Effet du principe actif selon l’invention sur la sécrétion cytokinique des lymphocytes T helper A. Effet du principe actif sur la s écrétion d’IL-13 par les LTh2 L’IL-13 a un fort impact sur la peau. Elle déclenche une réponse inflammatoire et une diminution de la fonction barrière de l’épiderme. Cette cytokine est sécrétée par les lymphocytes T helper de type 2 (LTh2). L’abondance de la population LTh2 est une composante majeure de la peau atopique. L’objectif de cette étude est d’évaluer le potentiel d’activité du principe actif selon l’invention sur la sécrétion d’IL-13 par des LTh2. Cette étude a été réalisée sur LTh2 par dosage de leur sécrétion d’IL 13. Le principe actif utilisé pour cet essai est le principe actif de l’exemple 2. Le protocole opératoire de l’étude est décrit en suivant. Les lymphocytes T naïfs sont isolés de cellules mononucléaires du sang périphérique et ensemencés dans du milieu culture contenant un mix permettant la différenciation des LT naïfs en LTh2. Les cellules sont ensuite incubées à 37°C dans une atmosphère contenant 5% de CO2. Au bout de quelques jours, le milieu de culture est éliminé et remplacé par du milieu contenant les mix de différenciation en présence ou non de la cyclosporine (1 µg/mL) ou du produit issu de PA2. Les cellules sont ensuite incubées à 37°C dans une atmosphère contenant 5% de CO2 pendant 48 heures. Les surnageants sont récupérés et le dosage de l’IL-13 est réalisé par ELISA. Les résultats sont présentés dans le tableau 8 ci-après. Sécrétion d’IL-13 (pg/mL) % d’inhibition d’IL-13 Témoin 1267 Cyclosporine 1 µg/mL 805 -36 Principe actif selon l’invention 0,5% 1323 0 Principe actif selon l’invention 1,0% 1167 -8 Au contact de mix de différenciation, les LT naïfs s’orientent en LTh2. Le principe actif selon l’invention n’a pas d’effet significatif sur la sécrétion d’IL-13 par les LTh2 et donc n’influe pas la réponse inflammatoire et la fonction barrière de la peau par cette voie. B. Effet du principe actif sur la sécrétion d’IL-17 par les lymphocytes T helper de type 17 L’interleukine 17 (IL-17), cytokine produite par les lymphocytes T helper de type 17 (LTh17), a un effet sur la biologie de l’épiderme. Elle induit une inflammation ainsi qu’une prolifération épidermique anormale. L’IL-17 est impliquée dans la pathologie du psoriasis. L’objectif de cette étude est d’évaluer le potentiel d’activité du principe actif selon l’invention sur la sécrétion d’IL-17 par des LTh17. Le principe actif utilisé pour cet essai est le principe actif de l’exemple 2. Le protocole opératoire de l’étude est décrit en suivant. Les lymphocytes T naïfs sont isolés de cellules mononucléaires du sang périphérique et ensemencés dans du milieu culture contenant un mix permettant la différenciation des LT naïfs en LTh17. Les cellules sont ensuite incubées à 37°C dans une atmosphère contenant 5% de CO2. Au bout de quelques jours, le milieu de culture est éliminé et remplacé par du milieu contenant les mix de différenciation en présence ou non de la cyclosporine (1 µg/mL) ou du produit issu de PA2. Les cellules sont ensuite incubées à 37°C dans une atmosphère contenant 5% de CO2 pendant 48 heures. Les surnageants sont récupérés et le dosage de l’IL-17 est réalisé par ELISA. Cette étude a été réalisée sur LTh17 par dosage de leur sécrétion d’IL 17. Les résultats sont présentés dans le tableau 9 ci-après. Sécrétion d’IL-17 (pg/mL) % d’inhibition d’IL-17 Témoin 4276 Cyclosporine 1 µg/mL 1192 -72 Principe actif 0,5% 4077 -5 Principe actif 1,0% 3651 -15 Au contact d’un mix de différenciation, les LT naïfs s’orientent en LTh17. Testé à 1% sur des lymphocytes Th17, le principe actif selon l’invention limite significativement la sécrétion d’IL 17 de 15%. Principe actif cosmétique comprenant au moins un extrait de levure de l’espèce Pichia naganishii . Principe actif cosmétique selon la revendication précédente, caractérisé en ce que l’extrait est un hydrolysat de Pichia naganishii. Principe actif cosmétique selon la revendication précédente, caractérisé en ce que l’hydrolysat est un hydrolysat enzymatique. Principe actif cosmétique selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la levure Pichia naganishii est obtenue à partir d’un exsudat de Camellia japonica . Principe actif cosmétique selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’il comprend entre 20% et 60% de protéines, en poids de matière sèche de l’extrait. Principe actif cosmétique selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’il se présente sous forme liquide ou sous forme solide. Principe actif cosmétique selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu’il est susceptible d’être obtenu par un procédé comprenant les étapes suivantes : - solubilisation d’au moins 40 g/L de Pichia naganishii dans l’eau, - hydrolyse enzymatique - séparation de la phase soluble et insoluble et récupération de la phase soluble, - inactivation enzymatique, et - éventuellement concentration et filtration stérilisante. Utilisation cosmétique d’un principe actif selon l’une des précédentes revendications ou d’une composition comprenant au moins 0,1% en poids d’un principe actif selon l’une des revendications précédentes, destiné à une application topique sur la peau pour un effet hydratant et/ou renforcer la fonction barrière de la peau. Procédé de préparation d’un principe actif selon l’une des revendications 1 à 7 comprenant les étapes suivantes : - solubilisation d’au moins 40 g/L de Pichia naganishii dans l’eau, - hydrolyse enzymatique - séparation de la phase soluble et insoluble et récupération de la phase soluble, - inactivation enzymatique, et - concentration et filtration stérilisante.