Brevet FR3125593A1 — publié le 20230127

L’invention concerne un procédé d’acquisition d’image en trois dimensions d’un échantillon biologique par microscopie à balayage. L’échantillon est situé dans un volume de référence (V) défini par une pluralité de voxels. Le procédé comprend les étapes suivantes : a) pré-balayage des voxels du volume de référence (V), au cours duquel seul un sous-ensemble des voxels du volume de référence (V), dit ensemble initial de voxels sondés (Ω pré-balayage ), est illuminé, b) calcul, par interpolation numérique de l’ensemble initial de voxels sondés, d’une structure géométrique présomptive de l’échantillon biologique, c) détermination d’un ensemble de voxels correspondant à la structure géométrique présomptive, dit ensemble de voxels présomptifs (Ω Présomptif ), d) sélection, à partir de l’ensemble de voxels présomptifs, d’un ensemble de voxels à illuminer (Ω sonde ), dit ensemble de voxels à sonder. e) balayage du volume de référence (V), au cours duquel seul l’ensemble de voxels à sonder (Ω sonde ) est illuminé. Figure pour l’abrégé : figure 4 Procédé d’acquisition d’image en deux dimensions d’un échantillon biologique à balayage ciblé L’invention concerne le domaine de l’imagerie destinée à l’observations d’échantillons biologiques, et plus particulièrement un procédé de balayage d’image en deux dimensions d’un échantillon biologique composés d’une pluralité de cellules. Lors de l’observation par microscopie d’échantillons biologiques, notamment par microscopie optique à fluorescence, un microscope traditionnel balaye tout le volume (cuboïde) englobant la structure d’intérêt. Ceci présente toutefois un inconvénient majeur, car les fluorophores ont des effets délétères sur les cellules de l’échantillon, dont les processus biologiques peuvent être compromis par une trop longue exposition : ce phénomène est notamment qualifié de phototoxicité. Il est donc désirable, afin d’éviter leur dégradation, de limiter autant que possible l’exposition des échantillons, tant au niveau spatial que temporel. Dans l’art antérieur, il est connu, pour tenter de limiter les effets de la phototoxicité, d’accélérer la vitesse d’imagerie en remplaçant des miroirs galvanométriques de balayage laser par des systèmes résonnants ou par des déflecteurs acousto-optiques. Toutefois ces approches ne permettent pas d’obtenir une qualité d’image aussi bonne que celles obtenues par balayage classique. De plus, elles ne résolvent pas entièrement le problème de la phototoxicité, car la même quantité de lumière incidente est délivrée à l’échantillon in fine , mais seulement plus rapidement. Une autre méthode pour tenter de limiter l’illumination subie par les cellules, dite d’illumination adaptative, consiste à contrôler l’instrument d’acquisition pour moduler l’intensité lumineuse et maintenir un rapport signal sur bruit constant dans l’image capturée. Ceci est notamment réalisé à l’aide d’un marquage des membranes cellulaires. Néanmoins, cette approche a tendance à illuminer davantage le centre des cellules, nécessairement plus sombre que leur contour, qui n’est pas une zone d’intérêt pour l’observateur, qui cherche au contraire à étudier le contour cellulaire. L'invention a donc pour but de fournir un procédé d’acquisition d’échantillons biologiques qui surmonte ces inconvénients, c’est-à-dire en limitant autant que possible l'exposition lumineuse de l’échantillon tant au niveau spatial que temporel, tout en fournissant une image de bonne qualité. Pour ce faire, l’invention tire parti du fait que certains échantillons biologiques, tels que les tissus cellulaires, sont organisés dans l’espace et que l’utilisateur possède une information préalable sur ladite organisation. Ainsi, par exemple, les tissus biologiques épithéliaux sont organisés en monocouches, c’est-à-dire que le marquage des jonctions cellulaires s’organise en un maillage (des contours cellulaires) réparti sur une surface. L’invention se propose de fournir une méthode qui illumine un volume restreint à l’objet d’intérêt, telle qu’une surface épithéliale. A cet effet l’invention a pour objet un procédé d’acquisition d’image en trois dimensions d’un échantillon biologique par microscopie à balayage, ledit échantillon étant situé dans un volume de référence défini par une pluralité de voxels, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes suivantes : a) pré-balayage des voxels du volume de référence, au cours duquel seul un sous-ensemble des voxels du volume de référence, dit ensemble initial de voxels sondés, est illuminé, b) calcul, par interpolation numérique de l’ensemble initial de voxels sondés, d’une structure géométrique présomptive de l’échantillon biologique, c) détermination d’un ensemble de voxels correspondant à la structure géométrique présomptive, dit ensemble de voxels présomptifs, d) sélection, à partir de l’ensemble de voxels présomptifs, d’un ensemble de voxels à illuminer, dit ensemble de voxels à sonder, et e) balayage du volume de référence, au cours duquel seul l’ensemble de voxels à sonder est illuminé. Grâce au fait que l’on calcule, à partir d’un pré-balayage illuminant un faible nombre de voxels, une structure géométrique présomptive de l’échantillon, et que l’on en détermine les voxels à illuminer à partir de ce calcul, on peut en déduire des voxels à sonder qui ont de fortes chances de correspondre à une zone d’intérêt du volume de référence dans lequel se trouve l’échantillon. Le calcul de structure géométrique présomptive et/ou la sélection de l’ensemble de voxels à sonder peut notamment s’appuyer sur les connaissances de l’utilisateur sur l’organisation dans l’espace de l’échantillon. De cette manière, on ne sonde pas de façon systématique tout le volume de référence, ce qui limite l’illumination du volume de référence. Ainsi, l’on peut obtenir une image à haute résolution sans avoir à illuminer l’ensemble ou une grande partie de l’échantillon, et donc en réduisant significativement la phototoxicité de l’acquisition. Par exemple, grâce à l’invention, pour un tissu biologique épithélial, il est possible d’obtenir une image de qualité comparable à une acquisition traditionnelle en n’illuminant que moins de 10% du volume de référence dans lequel se trouve l’échantillon. Par exemple, les voxels de l’ensemble de voxels à sonder est choisi aléatoirement parmi l’ensemble de voxels présomptifs. De manière alternative, ils sont répartis en bordure externe ou interne, c’est-à-dire que l’on sélectionne 30% des voxels les plus proches de la surface extérieure de la structure géométrique présomptive. De préférence, on réitère les étapes b), c), d) et e) jusqu’à interruption volontaire par un opérateur ou jusqu’à détermination que l’ensemble des voxels illuminés inclut l’ensemble de voxels présomptifs. Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, la taille des voxels des voxels présomptifs et à sonder correspond à la taille des voxels de l’ensemble initial de voxels sondés. Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, la structure géométrique présomptive est au moins une surface. Une telle structure géométrique est particulièrement adaptée à la configuration géométrique réelle de certains échantillon biologiques, tels que les tissus épithéliaux. Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, l’ensemble des voxels à sonder est une fraction de l’ensemble des voxels présomptifs. Le procédé concentre ainsi l’acquisition à un volume présomptif plus proche de la structure d’intérêt réelle. Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, l’ensemble des voxels à sonder correspond exactement à l’ensemble des voxels présomptif. Le procédé effectue ainsi l’acquisition de façon plus rapide. Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, la structure géométrique présomptive est construite à partir d’au moins une surface. Ceci permet d’améliorer la rapidité du procédé d’observation. Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, l'interpolation numérique est une interpolation polynomiale, une interpolation polynomiale par morceaux, une interpolation par splines, une estimation basée sur les proches voisins, une inférence bayésienne, ou une estimation utilisant des réseaux de convolution. De tels choix d’interpolation numérique permettent de réduire la puissance de calcul nécessaire et donc de limiter le temps de réponse du dispositif d’acquisition mettant en œuvre le procédé selon l’invention, et sont adaptés à la plupart des structures géométriques représentatives d’échantillons biologiques. Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, l’étape c) de détermination de l’ensemble de voxels présomptifs comporte les sous-étapes suivantes : - sélection d’une épaisseur pour la surface présomptive, et - détermination des voxels correspondant au volume défini par la surface présomptive et l’épaisseur sélectionnée. Ceci est une façon pour l’utilisateur de tirer parti de sa connaissance de l’échantillon observé, et notamment de son épaisseur potentielle. En outre, ceci permet à l’utilisateur de contrôler l’illumination de l’échantillon et d’affiner la surface présomptive, et en particulier d’effectuer un compromis entre les deux. Selon une variante de l’invention, l’étape a) consiste à balayer tous les voxels du volume de référence et n’illuminer que l’ensemble initial de voxels sondés. Cette variante est bien adaptée aux cas d’utilisation d’un microscope à miroirs résonants, à miroirs galvanométriques, et à miroirs polygonaux. En revanche, elle nécessite la connaissance de la position de balayage en temps réel afin de moduler, également en temps réel, l’illumination pour éclairer les voxels voulus. Selon une autre variante de l’invention, l’étape a) consiste à ne balayer et illuminer que l’ensemble initial de voxels sondés. L’avantage de cette variante est que l’acquisition d’image sera plus rapide du fait qu’un volume restreint est balayé, en plus de générer une illumination réduite. En contrepartie, dans le cas d’utilisation d’un microscope à miroirs galvanométriques, il doit être fait attention à ce que les sauts ne soient pas trop fréquents ou soient faits suffisamment lentement pour ne pas entraîner les miroirs dans un régime instable. Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, les voxels de l’ensemble initial de voxels sont répartis aléatoirement dans le volume de référence. Afin de limiter autant que possible l’illumination de l’échantillon tout en permettant le calcul d’une structure géométrique présomptive proche de la structure réelle de l’échantillon, le sous-volume du volume de référence représente entre 0,01% et 0,2% des voxels du volume de référence, de préférence entre 0,05% et 0,1% des voxels du volume de référence. L’invention concerne également un dispositif d’acquisition d’image en trois dimensions d’un échantillon biologique par microscopie à balayage, caractérisé en ce qu’il est configuré pour mettre en œuvre le procédé selon l’invention. Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, le balayage des échantillons est réalisé par un microscope confocal utilisant un contraste d’excitation linéaire ou non-linéaire, pour lequel le scanner peut utiliser un balayage laser à miroir galvanométrique ou acousto-optique, ou un microscope à matrice d’illumination. De préférence, le dispositif d’acquisition d’image comprend un système d’illumination comprenant au moins un laser, une matrice de micro-miroirs et un relais optique. Brève description des figures L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui va suivre donnée uniquement à titre d'exemple et faite en se référant aux dessins annexés dans lesquels : la est une vue schématique d’un dispositif d’acquisition d’image selon un mode de réalisation particulier de l’invention. la est une vue schématique en perspective d’un volume de référence dans lequel se trouve un tissu épithélial. la est un diagramme schématique représentant le procédé selon l’invention. la est une vue schématique en perspective d’ensembles de voxels détectés comme brillants à la suite du pré-balayage contenus dans le volume de référence de la acquis par le procédé d’acquisition d’image selon l’invention. la est une vue schématique en coupe, représentant la structure d’intérêt réelle, un ensemble de voxels illuminés lors du pré-balayage et une surface présomptive calculée au cours de l’étape de calcul du procédé selon l’invention ; la est vue similaire à la , comprenant en outre la surface présomptive calculée au cours de l’étape de calcul du procédé. la est vue similaire à la représentant une nouvelle surface présomptive calculée lors d’une deuxième itération du procédé selon l’invention,. Procédé d’acquisition d’image en trois dimensions d’un échantillon biologique par microscopie à balayage, ledit échantillon étant situé dans un volume de référence défini par une pluralité de voxels, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes suivantes : a) pré-balayage (100) des voxels du volume de référence (V), au cours duquel seul un sous-ensemble des voxels du volume de référence (V), dit ensemble initial de voxels sondés (Ω P ré-balayage ), est illuminé, b) calcul (200), par interpolation numérique de l’ensemble initial de voxels sondés (Ω Pré-balayage ), d’une structure géométrique présomptive (S P ) de l’échantillon biologique (B), c) détermination (300) d’un ensemble de voxels correspondant à la structure géométrique présomptive (S P ) , dit ensemble de voxels présomptifs (Ω P résomptif ), d) sélection (400), à partir de l’ensemble de voxels présomptifs (Ω Présomptif ), d’un ensemble de voxels à illuminer (Ω sonde ), dit ensemble de voxels à sonder, et e) balayage (500) du volume de référence (V), au cours duquel seul l’ensemble de voxels à sonder (Ω sonde ) est illuminé. Procédé d’acquisition d’image selon la revendication 1, dans lequel on réitère les étapes b), c) et d) et e) (100, 200, 300, 400, 500) jusqu’à interruption volontaire (600) par un opérateur ou jusqu’à détermination (700) que l’ensemble de voxels illuminés sur l’ensemble des itérations inclut l’ensemble de voxels présomptifs (Ω P résomptif ). Procédé d’acquisition d’image selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la taille des voxels des voxels présomptifs (Ω P résomptif ) et à sonder (Ω sonde ) correspond à la taille des voxels de l’ensemble initial de voxels sondés (Ω Pré-balayage ). Procédé d’acquisition d’image selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l’ensemble des voxels à sonder (Ω Sonde ) correspond exactement à l’ensemble des voxels présomptifs (Ω P résomptif ). Procédé d’acquisition d’image selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel l’ensemble des voxels à sonder (Ω Sonde ) est une fraction de l’ensemble des voxels présomptifs (Ω P résomptif ). Procédé d’acquisition d’image selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la structure géométrique présomptive (S P ) est construite à partir d’au moins une surface. Procédé d’acquisition d’image selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'interpolation numérique est une interpolation polynomiale, une interpolation polynomiale par morceaux, une interpolation par splines, une estimation basée sur les proches voisins, une inférence bayésienne, ou une estimation utilisant des réseaux de convolution. Procédé d’acquisition d’image selon l’une quelconque des revendications 6 ou 7, dans lequel l’étape c) de détermination (300) de l’ensemble de voxels présomptifs comporte les sous-étapes suivantes : - sélection (310) d’une épaisseur pour la surface présomptive (S P ), et - détermination (320) des voxels correspondant au volume défini par la surface présomptive (S P ) et l’épaisseur sélectionnée. Procédé d’acquisition d’image selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l’étape a) (100) consiste à balayer tous les voxels du volume de référence (V) et n’illuminer que l’ensemble initial de voxels sondés (Ω Pré-balayage ). Procédé d’acquisition d’image selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel l’étape a) (100) consiste à ne balayer et illuminer que l’ensemble initial de voxels sondés (Ω Pré-balayage ). Procédé d’acquisition d’image selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les voxels de l’ensemble initial de voxels sondés (Ω Pré-balayage ) sont répartis aléatoirement dans le volume de référence (V). Procédé d’acquisition d’image selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le sous-ensemble des voxels du volume de référence (V) représente entre 0,01% et 0,2% des voxels du volume de référence (V), de préférence entre 0,05% et 0,1% des voxels du volume de référence (V). Dispositif d’acquisition d’image en trois dimensions d’un échantillon biologique par microscopie à balayage, caractérisé en ce qu’il est configuré pour mettre en œuvre le procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes. Dispositif d’acquisition d’image selon la revendication 13, dans lequel le balayage des échantillons est réalisé par un microscope confocal utilisant un contraste d’excitation linéaire ou non-linéaire, pour lequel un scanner peut utiliser un balayage laser à miroir galvanométrique ou acousto-optique, ou un microscope à matrice d’illumination. Dispositif d’acquisition d’image selon la revendication 14, comprenant un système d’illumination (20) comprenant au moins un laser, une matrice de micro-miroirs et un relais optique.