Brevet FR3116285A1 — publié le 20220520

La présente invention appartient au domaine de l’écotoxicologie, plus particulièrement à la mesure du potentiel écotoxique d’un effluent aqueux. L’objet de la présente invention se rapporte à un procédé de mesure du potentiel écotoxique d’un effluent aqueux et à dispositif de mise en œuvre comprenant une batterie de mésocosmes instrumentés et transportables. L’invention se rapport en outre à l’utilisation du dispositif pour mesure le potentiel écotoxique d’un effluent ainsi qu’à un kit de mésocosmes instrumentés et transportables. PROCEDE DE MESURE DU POTENTIEL ECOTOXIQUE D’UN EFFLUENT AQUEUX ET DISPOSITIF DE MISE EN ŒUVRE DU PROCEDE La présente invention appartient au domaine de l’écotoxicologie, plus particulièrement à la mesure du potentiel écotoxique d’un effluent aqueux. L’objet de la présente invention se rapporte à un procédé de mesure du potentiel écotoxique d’un effluent aqueux et à un dispositif comprenant une batterie de mésocosmes instrumentés et transportables. L’invention se rapporte en outre à l’utilisation du dispositif pour mesurer le potentiel écotoxique d’un effluent ainsi qu’à un kit de mésocosmes instrumentés et transportables. Le nombre de produits chimiques utilisé par l’homme est en constante augmentation. Ces substances qui sont de natures très variées sont utilisées dans la vie quotidienne et dans de nombreux domaines dont l’industrie, l’agriculture ou dans un cadre domestique. Quelles que soient leurs utilisations, ces produits finissent inexorablement par entrer dans les écosystèmes aquatiques où ils peuvent être responsables de nombreux effets néfastes tant pour l’environnement que pour l’homme. A la suite de plusieurs scandales sanitaires et catastrophes écologiques de grande ampleur telles que par exemples les catastrophes de la baie de Minamata, de Bhopal ou de Seveso, les différentes marées noires, la pollution au dichlorodiphényltrichloroéthane et son impact direct sur la disparition de plusieurs espèces d’oiseaux (Ramade F, 2007 Introduction à l’écotoxicologie. Ed Tech & Doc Lavoisier, pp 618), une nouvelle discipline s’est développée : l’écotoxicologie. Le but de cette discipline est d’étudier, de connaître et de prédire les effets de composés potentiellement toxiques dans l’environnement. Cette discipline permet de diagnostiquer la gravité d’une pollution, de déterminer les concentrations maximales acceptables d’une substance dans l’environnement et d’évaluer la toxicité d’une nouvelle substance afin d’autoriser ou non sa mise sur le marché. Aujourd’hui, avec la prise de conscience de protection de l’environnement de plus en plus forte, les normes environnementales sont de plus en plus draconiennes et toute nouvelle substance doit faire l’objet d’évaluations écotoxicologiques de plus en plus nombreuses et de plus en plus poussées avant sa mise sur le marché (avec notamment la réglementation REACH ou règlement européen (règlement n°1907/2006) entré en vigueur en 2007 pour sécuriser la fabrication et l'utilisation des substances chimiques dans l'industrie européenne). Il existe deux types de méthodologies pour étudier les effets d’une substance, d’un mélange de produits chimiques ou d’un effluent industriel sur l’environnement : les études au laboratoire et les études in situ . Dans le cas des études de laboratoire, la grande majorité des essais effectués consistent à étudier les effets des contaminants chez une seule espèce à la fois (essais monospécifiques). Ces tests sont utiles car ils permettent d’obtenir rapidement et dans des conditions contrôlées des informations sur la nature écotoxique d’une substance ou d’un mélange. La réglementation actuelle s’appuie sur ces tests pour fixer des seuils et des limites pour les concentrations dans l’environnement. Ces études en laboratoire ne sont que des modèles et ne peuvent pas prendre en compte tous les paramètres, du fait de l’isolement d’une espèce pour réaliser les tests. A l’opposé, les études de terrain s’appuient sur l’analyse d’indices biologiques, telles que l'Indice Multimétrique I2M2, l’indice diatomique (IBD) ou encore macrophytes (IBMR), dans le but d’analyser la qualité des eaux. Cette approche peut être plus ou moins couplée avec des analyses physico-chimiques. Ces études de terrains cherchent à comprendre les impacts réels des contaminants sur les écosystèmes aquatiques. Dans le cas de ces études in situ , l’impact des contaminants est souvent étudié en comparant un site d’intérêt avec un site dit de « référence » ( i.e. sans contamination connue). Ces approches sont dépendantes des conditions hydrologiques des masses d’eau. Plusieurs critiques peuvent être formulées envers les deux types de méthodologies citées précédemment. Tout d’abord, les essais monospécifiques ne sont pas représentatifs des conditions environnementales réelles. Ils sont réalisés la plupart du temps de manière statique (sans renouvellement de milieux) ou semi-statique (changement périodique de milieux) dans de très petits contenants et dans des conditions similaires entre les différents réplicas (température, luminosité, etc.). A l’inverse, les résultats provenant des tests in situ ne sont pas dépourvus d’erreurs d’interprétations puisque d’une part, il est impossible de trouver des sites de référence exempts de toute pollution et que d’autre part, deux sites d’études ne sont jamais identiques en termes de facteurs abiotiques (températures, pH, luminosité, habitats, nutriments, etc.) mais aussi biotiques (présence de parasites, bactéries, virus, etc.). Ainsi, on peut résumer de la manière suivante : - Les solutions in situ existantes sont très intégratives mais aussi extrêmement dépendantes de la richesse intrinsèque des milieux aquatiques dans lesquels elles sont déployées. - A l’opposé, les expériences de laboratoire sont parfaitement maîtrisées du point de vue des conditions d’expérimentations mais ne prennent pas en compte les interactions multiples qui caractérisent les écosystèmes naturels. De plus, malgré toutes les précautions pouvant être prises, des modifications physico-chimiques et biologiques du produit ou de l’effluent étudié peuvent avoir lieu lors du transport du site d’étude vers le laboratoire et changer significativement les conclusions quant à la toxicité de son rejet. A la connaissance des demanderesses, les bureaux d’études qui étudient les effets de rejets industriels doivent actuellement se contenter de travailler à l’aide d’essais monospécifiques ou d’approches in situ utilisant des indicateurs biologiques basés sur des indices biologiques (présence/absence d’espèces polluo-sensibles, abondance spécifique) et sont donc fortement dépendants des facteurs incontrôlables et des approximations discutés ci-dessus. Ainsi, il existe un besoin pour un procédé et un dispositif innovant d’étude de la qualité des milieux aquatiques qui combine à la fois les avantages des essais monospécifiques (conditions contrôlées et rapidité de la réponse) et les avantages des approches sur le terrain (meilleure représentativité environnementale en prenant en compte les interactions entre les organismes). Il est du mérite des demanderesses d’avoir développé un nouveau procédé et un nouveau dispositif palliant les défauts des deux types de méthodologies citées ci-dessus. Un objet de l’invention est un procédé de mesure du potentiel écotoxique d’un effluent aqueux sur un écosystème simplifié, dans lequel le milieu est alimenté de manière continue en effluent aqueux, étant ainsi représentatif des conditions environnementales réelles. L’invention comprend ainsi un procédé de mesure du potentiel écotoxique d’un effluent aqueux comprenant les étapes : a) formation d’une chaîne trophique artificielle dans un milieu aquatique comprenant un substrat, ledit substrat comprenant une fraction minérale et optionnellement une fraction organique et étant de préférence reconstitué, ladite chaîne trophique comprenant au moins un microorganisme et au moins un macroorganisme et est formée par introduction et stabilisation/temporisation séquentielle desdits micro- et macroorganismes ; b) détermination du potentiel écotoxique de l’effluent aqueux, caractérisé en ce que le milieu est ouvert ou semi-ouvert et est alimenté de manière continue en effluent aqueux. Lors de la mise en œuvre du procédé, l’alimentation continue en effluent aqueux est constante, de sorte que les débits en effluent à l’entrée et à la sortie du milieu sont égaux. Avantageusement, une fraction de l’effluent aqueux peut être récupérée en sortie du milieu (via une boucle de recirculation) et peut constituer une fraction de l’effluent aqueux alimentant le milieu, de sorte que l’effluent aqueux entrant dans le milieu aquatique peut être constitué d’un mélange entre l’effluent aqueux et d’eau issue du mésocosme. Dans le présent texte, « effluent aqueux » vise indifféremment l’effluent entrant dans le milieu et comprenant, ou ne comprenant pas, une fraction de l’effluent aqueux récupérée en sortie du milieu. Le procédé peut ainsi comprendre une étape c) de recyclage partiel de l’effluent aqueux dans le milieu. Au sens de la présente invention, on entend par « potentiel écotoxique », la caractéristique intrinsèque de l’effluent qui lui confère sa capacité à induire des dysfonctionnements à différents niveaux du vivant. Ces dysfonctionnements sont l’expression des variations de réponses significatives, mesurées et quantifiées, pour chaque paramètre biotique et abiotique étudié, entre les cuves de référence et ceux exposés à l’effluent. Les paramètres biotiques étudiés pour déterminer le potentiel écotoxique de l’effluent peuvent par exemple être choisis dans le groupe comprenant le taux de mortalité, le taux de croissance, la génotoxicité, la tératogénicité, le taux d'émergence, le taux de décomposition et/ou le comportement. Les paramètres abiotiques étudiés pour déterminer le potentiel écotoxique de l’effluent peuvent par exemple être choisis dans le groupe comprenant la ou les variation(s) de pH, de conductivité, de potentiel redox, d’oxygène dissous, de concentrations en formes azotées (ammonium, nitrate, nitrite), de concentrations en carbone organique total et dissous, et/ou de concentrations en contaminants métalliques et/ou organiques. Les variations peuvent être quantifiées et il est ainsi possible de déterminer si une variation est significativement différente d’un contrôle. Dans le cadre de l’invention, le dispositif de mise en œuvre du procédé peut comprendre au moins une cuve témoin, de préférence au moins 3 cuves témoins, et au moins autant de cuve exposées à l’effluent étudié. Ainsi, la notion de potentiel écotoxique peut être exprimée par rapport à la dérive des paramètres physico-chimiques et biologiques enregistrés ; c’est à dire les variations de réponse pour chaque paramètre étudié entre les cuves témoins (de référence) et celles exposées à l’effluent. Pour chaque paramètre biotique ou abiotique étudié, la dérive est quantifiée et comparée aux conditions contrôles à l’aide des analyses statistiques. Ces dysfonctionnements sont comparés par rapport à la référence, les conditions optimums pour la chaîne trophique et dans lequel aucun effluent n’est présent (Bour et al., "Impact of Ceo2 NP on the fresch water esocosme studies" environmental nano 2016). La détermination du potentiel écotoxique tient ainsi compte de l’évaluation de différents types de contaminant après exposition d’organismes appartenant aux différents niveaux trophiques d’un écosystème aquatique. De préférence, la détermination du potentiel écotoxique s’obtient par mesure du niveau de toxicité sur le vivant (toxicités aiguë, chronique et génétique) par rapport au contrôle et mesure des variations des conditions physico-chimiques telles que cycle du carbone, décomposition, carbone organique dissous, pH, concentration en oxygène dissous et/ou conductivité de l’effluent par rapport au contrôle. Avantageusement, le potentiel écotoxique de l’effluent aqueux est déterminé entre 4 et 6 semaines après l’introduction des premiers éléments de la chaîne trophique artificielle ( i.e après l’introduction du consortium de microorganismes) dans le milieu. Avantageusement, le potentiel écotoxique peut être déterminé par la mesure de paramètres biotiques et/ou abiotiques. Les paramètres biotiques peuvent être choisis dans le groupe comprenant le taux de mortalité, le taux de croissance, la génotoxicité, la tératogénicité, le taux d'émergence, le taux de décomposition et/ou le comportement. Les paramètres abiotiques peuvent être choisis dans le groupe comprenant la ou les variation(s) de pH, de conductivité, de potentiel redox, d’oxygène dissous, de concentrations en formes azotées (ammonium, nitrate, nitrite), de concentrations en carbone organique total et dissous, et/ou de concentrations en contaminants métalliques et/ou organiques. Avantageusement, la détermination du potentiel écotoxique peut être réalisée par comparaison des paramètres biotiques et abiotiques mesurés avec ceux d’un milieu aquatique témoin, dans lequel le procédé selon l’invention est appliqué à l’identique, à la différence que le milieu aquatique témoin est alimenté de manière continue en eau claire, c’est-à-dire sur de l’eau provenant de la même source, mais exempte de contaminant. On entend par « milieu aquatique », un contenant (généralement une cuve), pouvant être transparent, dans lequel sont introduits le substrat et la chaîne trophique artificielle. Le milieu aquatique comprend une entrée et une sortie, permettant la circulation d’eau, conséquence de l’alimentation en continue du milieu. On entend par « effluent aqueux », un liquide composé principalement d’eau dont la finalité du procédé est d’en mesurer le potentiel écotoxique. Il peut s’agir de tout type d’eau issue de ou impactée par l’activité humaine, dont l’activité industrielle, l’agriculture et l’utilisation domestique. Il s’agit d’eau pouvant comprendre des substances, particules et matériaux chimiques testés isolément dans une eau de référence. L’effluent aqueux peut comprendre de la matière organique ou inorganique, en suspension ou dissoute. Ainsi, il peut s’agir d’eaux naturelles (eau de cours d’eaux tels que rivières ou fleuves, lacs, et plus généralement des eaux de surfaces des et eaux souterraines), d’eaux usées, par exemple issues de stations d’épuration (STEP) traitées ou non traitées, de lixiviats et de percolats de déchets industriels, de matériaux ou de déchets agricoles (eaux vertes, blanches), eaux issues de l’industrie agroalimentaire. L’effluent aqueux peut être dilué ou non dilué. On entend par « alimenté en continu », un renouvellement permanent, sans interruption, de l’effluent aqueux, dilué ou non dilué, pendant toute la durée de mise en œuvre du procédé. L’effluent peut être acheminé à l’aide d’une machinerie. Ainsi, l’effluent circule dans le milieu. Ainsi, l’approche dynamique du procédé mis en œuvre permet de prendre en compte tout changement de la composition intrinsèque de l’effluent aqueux à tester tant qualitatif (composition d’effluent) que quantitatif (débits d’effluents). Le procédé selon l’invention permet ainsi d’évaluer toutes les variations de l’effluent. C’est un avantage par rapport à un système fermé (par opposition à ouvert ou semi-ouvert) dans lequel un seul effluent, aux caractéristiques fixes, peut être évalué. Un autre avantage du procédé selon l’invention, est qu’il est réalisé en milieu ouvert ou semi-ouvert, ce qui permet de se rapprocher davantage des conditions environnementales. Avantageusement, l’effluent aqueux alimentant en continu le milieu est dilué ou non dilué (i.e. brut). L’effluent aqueux peut ainsi être prélevé directement à la sortie d’une station d’épuration ou bien être prélevé dans un cours d’eau ou une canalisation. Quelle que soit son origine, il peut être dilué préalablement à son introduction dans le milieu. Lorsqu’il est dilué, l’effluent aqueux est de préférence dilué avec de l’eau de qualité alimentaire (déchlorée) ou reconstituée fabriquée à partir d’eau déminéralisée et de sels chimiques, et servant à alimenter l’ensemble des cuves témoins. La dilution dépend de l’objet d’étude, par exemple pour un effluent de STEP, la dilution dépend du débit moyen du cours d’eau dans lequel l’effluent est rejeté. La dilution peut varier du 50ème au 500ème, en fonction du type de cours d’eau. Avantageusement, le débit d’alimentation de l’effluent aqueux est compris dans un intervalle allant de 0,3 à 1 L par jour. La quantité d’eau dans le milieu est de préférence maintenue constante, ainsi les débits d’entrée et de sortie en effluent aqueux sont égaux. Avantageusement, le procédé selon l’invention peut comprendre en outre une étape de dilution de l’effluent aqueux, préalablement à son alimentation du milieu. Avantageusement, le procédé selon l’invention peut comprendre en outre une étape de régulation de la température de l’effluent aqueux et/ou du milieu, de préférence à une température comprise dans un intervalle allant de 15 à 25°C. Généralement, la température du milieu aquatique est maintenue à une température comprise dans un intervalle allant de 15 à 25°C pendant toute la durée de la mise en œuvre du procédé. On entend par milieu « ouvert », que l’effluent aqueux qui circule dans le milieu n’est pas recyclé et par « semi-ouvert », qu’une partie de l’effluent est récupérée en sortie du milieu et réinjectée, de préférence via une boucle de recirculation. Ainsi en milieu semi-ouvert, une partie de l’effluent recyclé sert à alimenter le milieu en continu. L’usage de la boucle de recirculation permet seulement d’augmenter le temps de séjour de l’effluent dans le système, sans dilution de l’effluent à tester. Un milieu semi-ouvert peut en outre présenter les avantages de consommer (et donc gaspiller) moins d’eau, mais aussi de limiter la régulation de la température, lorsque celle-ci est nécessaire. Avantageusement, en fonctionnement ouvert, l’effluent aqueux n’est pas recyclé et la totalité de l’effluent aqueux alimentant le milieu est rejeté en sortie du milieu. En fonctionnement semi-ouvert, une fraction de l’effluent aqueux alimentant le milieu est recirculée et utilisée pour alimenter le milieu. La fraction recyclée de l’effluent aqueux peut être de l’ordre de 1 à 90 % de l’effluent, de préférence de 30 à 60 % et de manière encore préférée 40 %. La fraction recyclée est récupérée en sortie du milieu puis mélangée en amont avec l’effluent aqueux alimentant le milieu. Ainsi, le procédé selon l’invention peut comprendre en outre une étape c) de recyclage partiel de l’effluent, de préférence recyclage de 1 à 90 % de l’effluent et de manière encore préférée de 30 à 60 % et de manière encore préférée 40 %. En particulier, si l’effluent aqueux est très toxique (par exemple d’après les résultats d’analyses préalables), on doit faire une dilution importante ce qui explique les pourcentages de 1 à 90%, 40% permet d’avoir un renouvellement de la cuve compatible. Avantageusement, le milieu aquatique comprend un substrat. Le substrat peut être naturel ou reconstitué, de préférence reconstitué. Le substrat comprend une fraction minérale et optionnellement une fraction organique. La fraction minérale peut comprendre un sable normalisé de granulométrie connue, tel que le sable SNL. Il peut comprendre de la silice, de la kaolinite, du carbonate de calcium et comprend généralement a minima de la silice sous forme de sable de granulométrie variée. De préférence, la fraction minérale comprend du sable fin (par exemple du sable de Fontainebleau, VWR, 1/16 ième à 2mm, CAS 7631-86-9 ou : CF EN196-01 « sable normalisé CEN AFAC AFNOR », littoral) en mélange avec du sable plus grossier (par exemple du sable SNL, certifié AFNOR et ISO 9001: 2008 ). Généralement, le pourcentage massique de la fraction minérale dans le substrat peut être supérieur ou égal à 90 %, par rapport à la masse totale du substrat. La fraction organique peut comprendre des feuilles d’arbre de la ripisylve des pays tempérés. De préférence, la fraction organique comprend des feuilles d’aulne ( Alnus sp ) . Généralement, le pourcentage massique de la fraction organique dans le substrat est inférieur ou égal à 10 %, par rapport à la masse totale du substrat. Ainsi, les différents éléments constitutifs du substrat peuvent être choisis en fonction des besoins des organismes qui composent la chaîne trophique artificielle. Par exemple, une chaîne contenant des larves de chironomidae peut comprendre des feuilles d’aulne pour permettre d’étudier la biodégradation des feuilles. Lorsque la chaîne trophique comprend des tubificidae, le substrat peut comprendre du sable avec une granulométrie fin. Il est par exemple possible pour se rapprocher au mieux de la réalité d’avoir un mélange de granulométrie. Dans le cadre de l’invention, on entend par « chaîne trophique », un ensemble de liens qui existe entre les différents maillons qui la composent. Il s’agit de l’ensemble des relations qui s’établissent entre des organismes en fonction de la façon dont ceux-ci se nourrissent. Une chaîne trophique peut ainsi comprendre des producteurs (algues par exemple), des consommateurs primaires (herbivores, phytophages), des consommateurs secondaires (carnivores) et des décomposeurs (ou détritivores). Plus particulièrement, on entend par « chaîne trophique artificielle », de maillons trophiques ajoutés intentionnellement par l’homme pour les besoins de l’expérimentation dans les mésocosmes. Les polluants qui ne se dégradent pas ou peu (métaux lourds) vont se concentrer au sommet de la chaîne trophique, chez les prédateurs. Les décomposeurs sont généralement compris dans le consortium bactérien par exemple, ou bien par les chironomidae. C’est une fonction qui peut être assurée par plusieurs maillons de la chaîne. Avantageusement, selon l’invention, la chaîne trophique artificielle peut comprendre : un consortium de microorganismes, au moins un consommateur primaire, apte à se nourrir du consortium de microorganismes, et optionnellement au moins un consommateur secondaire, apte à se nourrir des consommateurs primaires. On entend par « consortium de microorganismes », un consortium comprenant des bactéries, des champignons microscopiques et des algues unicellulaires. Par exemples, les bactéries peuvent être choisies dans le groupe comprenant Nitrobacter, Nitrosomonas, Pseudomonas et Bacillus, les champignons peuvent être choisis dans le groupe comprenant Hyphomycètes, Eumycètes et Ascomycètes et les microalgues peuvent être des diatomées d’eau douce. On entend par « consommateur primaire », un organisme qui se nourrit au dépend d’organismes autotrophes (microorganismes contenues dans le consortium du biofilm). Il peut de préférence être choisi dans le groupe comprenant des invertébrés (tels que par exemple des chironomes, tubifex, daphnies, crevettes d’eau douce, gammares ou limnés), des amphibiens (tels que par exemple des larves de xénopes (xenopus sp)), et leurs mélanges. On entend par « consommateur secondaire », un organisme qui se nourrit des consommateurs primaires. Il peut de préférence être choisi dans le groupe comprenant des larves d’amphibiens (tels que par exemple des Pleurodèles sp ou des Ambystoma sp), des poissons (tels que par exemple des groupes des poecilidés ou cyprinidés), et leurs mélanges. De préférence, le consommateur secondaire sera un seul parmi les carnivores listés ci-dessus. Avantageusement, l’étape a) du procédé selon l’invention peut comprendre les sous-étapes : i) mise en place dans un milieu (i.e. un compartiment d’analyse), du substrat et d’eau, de préférence de l’eau de qualité alimentaire (déchlorée) ou reconstituée fabriquée à partir d’eau déminéralisée et de sels minéraux, ii) introduction dans le milieu du consortium de microorganismes, iii) stabilisation du milieu pendant une durée allant de 1 à 3 semaines, de préférence 2 semaines, iv) introduction dans le milieu des consommateurs primaires, de préférence en plusieurs étapes successives, lorsqu’il y a plusieurs consommateurs primaires, v) temporisation du milieu pendant une durée allant de 1 à 3 semaines, de préférence 2 semaines, vi) optionnellement introduction dans le milieu des consommateurs secondaires, de préférence en plusieurs étapes successives, lorsqu’il y a plusieurs consommateurs secondaires. Avantageusement, la stabilisation du milieu peut avoir une durée allant de 1 à 3 semaines, de préférence 2 semaines. On entend par « stabilisation du milieu », la période durant laquelle on surveille le pic de concentration en nitrites dans le milieu. Les concentrations en nitrates, nitrites, pH et O 2 sont mesurées pour démontrer la stabilisation du système, pour que le bio film soit opérationnel. Pour la stabilisation soit atteinte, il faut le pic de nitrites soit passé, des mesures quotidiennes sont réalisées et c’est à partir du moment où le pic redescend qu’il est estimé que la stabilisation est atteinte (concentration en nitrites inférieure à 1 mg/L). Les bactéries transforment tout ce qui est ammonium dans le milieu en nitrites, puis en nitrates. Le consortium consomme ainsi les nitrates pour fabriquer de la biomasse. Le développement du biofilm est évalué en observant le changement de couleur du sédiment traduisant le niveau de colonisation. De préférence, le milieu est dit stabilisé lorsque la concentration en nitrites dans le milieu baisse et qu’elle est inférieure à 1 mg/L. Avantageusement, la temporisation du milieu peut avoir une durée allant de 1 à 3 semaines, de préférence 2 semaines. Par exemple les chironomes sont introduits, une période d’au moins une semaine d’exposition est préférable, pour les xénopes, au moins 12 jours d'exposition sont préférables. La durée d’exposition est fonction des espèces introduites (stades de développement notamment) et du paramètre biologique mesuré, les paramètres doivent être adaptés. Ainsi, on entend par « temporisation », le temps nécessaire à ce que le consommateur primaire consomme le maillon inférieur sans que cette étape ne soit limitante. Avantageusement, préalablement à leur introduction dans le milieu, les différents maillons trophiques sont élevés indépendamment dans des milieux de culture adaptés en conditions contrôlées. Le consortium (bactéries, algues, champignons) peut être cultivé à partir de prélèvement en milieu naturel ou à partir de cultures préexistantes. Le consortium est introduit dans le système au moment opportun (10 5 /mL, nombre d’individus par volume, en contrôle avant injection). Parmi les consommateurs primaires, les invertébrés peuvent être élevés 48h dans une eau normalisée (AFNOR, 2004) depuis leur obtention jusqu’au stade expérimental (stade dépendant du paramètre étudié). En ce qui concerne les vertébrés, consommateurs primaires et secondaires, ils peuvent être élevés pendant au moins 2 semaines en eau normalisée (ISO, 2006) depuis leur obtention jusqu’au stade expérimental (stade de développement dépendant du paramètre étudié). Le stade expérimental sera déterminé par le modèle biologique, et sera fonction de l’espèce. Par exemple, la génotoxicité et la croissance sont mesurées chez le xénope au stade 54 de la table de développement de Nieuwkoop and Faber (1956). Chez le chironome le taux d'émergence est mesuré au stade adulte émergé. L’homme du métier saura adapter le stade expérimental en fonction du ou des paramètres qu’il souhaite mesurer dans la détermination du potentiel écotoxique de l’effluent aqueux. Avantageusement, le procédé selon l’invention peut comprendre en outre une étape d) de mesure du pourcentage de dégradation de la fraction organique du substrat. Cette étape d) permet de mesurer l’impact des polluants testés sur l’activité détritique des champignons, évaluée par la mesure du pourcentage de surface foliaire dégradée. Le pourcentage de dégradation de la fraction organique du substrat est généralement mesuré entre 6 et 10 semaines après l’introduction des premiers éléments de la chaîne trophique artificielle ( i.e. le consortium de microorganismes). Avantageusement, le procédé selon l’invention peut comprendre en outre une étape préalable de stérilisation du substrat, de préférence à une température supérieure ou égale à 121°C, pendant une durée supérieure ou égale à 20 minutes. Selon un autre aspect, l’invention se rapporte également à un dispositif de mise en œuvre du procédé selon l’invention. L’invention se rapporte ainsi à un dispositif de mesure du potentiel écotoxique d’un effluent aqueux comprenant un dispositif d’alimentation en eau et une batterie de mésocosmes instrumentés et transportables. Avantageusement, le dispositif d’alimentation en eau peut comprendre : une première arrivée d’eau, une gouttière d’alimentation munie d’un trop plein, une seconde arrivée en effluent aqueux, au moins un compartiment d’alimentation muni d’une surverse d’alimentation munie d’un filtre, de préférence un peigne, une première boucle de recirculation reliée à la gouttière d’alimentation et munie d’un premier système de régulation de température et d’une cuve réservoir, et une évacuation d’eau. On entend par « relié » une connexion directe ou indirecte entre deux éléments du dispositif. Avantageusement, le dispositif comprend un nombre égal de compartiments d’alimentation et de mésocosmes. Un compartiment d’alimentation est généralement relié à un seul mésocosme. Lorsque le dispositif comprend plusieurs compartiments d’alimentation, la gouttière d’alimentation est reliée à chacun compartiment d’alimentation. Ce type d’alimentation permet d’avoir un débit d’alimentation égal de chacun des compartiments d’alimentation. En fonction de la dilution de l’effluent aqueux, on peut considérer comme négligeable son influence sur les débit/volume mis en jeu dans les mésocosmes. Avantageusement, le dispositif d’alimentation peut comprendre une ou plusieurs secondes arrivées en effluent aqueux. La seconde arrivée en effluent aqueux peut alimenter un ou plusieurs compartiments d’alimentation. La seconde arrivée en effluent aqueux peut comprendre une pompe. La seconde arrivée en effluent aqueux peut être reliée à un seul ou plusieurs compartiments d’alimentation. Avantageusement, la batterie de mésocosmes peut comprendre au moins un mésocosme. Lorsque la batterie de mésocosmes comprend plusieurs mésocosmes, certains peuvent être qualifiés de mésocosmes témoins. Un mésocosme témoin est identique à un mésocosme mais n’est pas soumis à l’effluent aqueux lors de la mise en œuvre du procédé. Ainsi, les compartiments d’alimentations reliés au mésocosmes témoins ne sont pas reliés à la seconde arrivée en effluent aqueux. Avantageusement, l’arrivée en eau est reliée à la cuve réservoir. La cuve réservoir peut comprendre un trop-plein, relié à une évacuation d’eau (permettant d’évacuer le surplus d’eau du dispositif). La gouttière d’alimentation est reliée à chacun des compartiments d’alimentation. L’arrivée en effluent aqueux est reliée au compartiment d’alimentation. Le compartiment d’alimentation est relié au mésocosmes (via la surverse d’alimentation). Avantageusement, la régulation des débits entrant en eau (arrivée d’eau) et en effluent aqueux (arrivée d’effluent aqueux) permet de régler le taux de dilution de l’effluent aqueux dont le potentiel écotoxique est mesuré. Avantageusement, le compartiment d’alimentation étant muni d’une surverse d’alimentation, elle-même munie d’un filtre, de préférence un peigne, cette configuration permet une alimentation homogène en effluent aqueux, dilué ou non dilué, dans le mésocosme. On entend par « cuve » ou « compartiment », un récipient apte au stockage de produits liquides. Elle peut être de forme cylindrique ou parallélépipédique. Elle peut comprendre des ouvertures destinées au remplissage, à la vidange, au nettoyage et à la mise en place de toute étape du procédé selon l’invention. Le volume d’une cuve peut varier en fonction de l’utilisation. L’homme du métier pourra adapter les dimensions et le volume des cuves au cas par cas. Par exemple, la cuve réservoir peut avoir un volume de 500 litres et être en polyéthylène. Le compartiment d’alimentation peut avoir un volume allant de 0,5 à 3 litres, de préférence de 1 à 1,5 litres. Le compartiment d’analyse peut avoir un volume allant de 20 à 50 litres, de préférence de 30 à 40 litres. Avantageusement, le premier système de régulation de température peut comprendre un thermostat. Le premier système de régulation de température est relié à la cuve réservoir. Le premier système de régulation peut être installé en parallèle ou en série de la cuve réservoir sur la première boucle de recirculation. La température de l’eau du compartiment de distribution peut ainsi être régulée. Avantageusement, lors de la mise en œuvre du procédé dans le dispositif selon l’invention, une fraction de l’effluent aqueux peut être récupérée à la sortie du mésocosme et peut circuler dans une seconde boucle de recirculation en eau, avant d’être réinjectée dans le compartiment de distribution. La seconde boucle de recirculation peut comprendre un second système de régulation de température. La température de l’eau du compartiment de distribution peut ainsi être régulée. Les premier et second systèmes de régulation de température peuvent être identiques ou différents. Avantageusement, l’effluent aqueux peut être mélangé à de l’eau claire dans le compartiment de distribution. La gouttière d’alimentation est munie d’un trop-plein permettant le retour de l’eau au sein de la cuve réservoir en cas de débordement. La cuve réservoir et la gouttière d’alimentation sont agencés de sorte que lorsque la gouttière d’alimentation déborde, l’eau s’écoule via le trop plein dans la cuve réservoir. Cet agencement permet de maintenir constante la hauteur d’eau dans la gouttière d’alimentation. Avantageusement, le ou les moyens de distribution (cuve, gouttière, compartiment de distribution) sont équipés d’un ensemble de vannes couplées à une source d’eau propre ( i.e. exempte de polluants et autres éléments éventuellement présents dans l’effluent aqueux) configuré de sorte à permettre un contrôle de la dilution de l’effluent aqueux avant son introduction dans le mésocosme (milieu aqueux). Ainsi, il est possible d’obtenir un débit identique dans chaque mésocosme tout en ayant une dilution identique ou différente de l’effluent aqueux d’un mésocosme à un autre. Avantageusement, la gouttière d’alimentation et le ou les répartiteurs peuvent être remplacés par un système de distribution ou être compris dans un système de distribution. Le système de distribution peut être tout système permettant une répartition de l’effluent aqueux entre les différents mésocosmes, avec ou sans dilution. Il permet en outre une alimentation continue de chaque mésocosme, à débit identique et dilution variable. Le système de distribution peut être relié à la cuve de distribution à chacun des mésocosmes, ou relié directement à la cuve tampon. Dans le cadre de l’invention, on entend par « batterie » de mésocosmes, un ensemble de mésocosmes comprenant au moins deux mésocosmes. Une batterie de mésocosmes peut comprendre de 2 à 18 mésocosmes, de préférence de 3 à n*3 mésocosmes, ou n est un nombre entier allant de 1 à 6. Par exemple, dans une batterie à 2 mésocosmes, il y a un mésocosme témoin (dans lequel l’effluent aqueux ne circule pas, seule de l’eau claire, i.e. exempte de contaminant, circule) et un mésocosme soumis à l’effluent aqueux dont on souhaite déterminer le potentiel écotoxique. Dans un dispositif à n*3 mésocosmes (dans lequel n = 2), il y a 3 mésocosmes témoins et 3 mésocosmes soumis à l’effluent aqueux. Dans un dispositif à 9 mésocosmes, il y a 3 mésocosmes témoin, trois mésocosmes soumis à l’effluent aqueux et 3 mésocosmes soumis à l’effluent aqueux soit à une autre concentration/dilution dudit effluent, ou avec un autre effluent aqueux différent. On entend par« transportables », que les mésocosmes peuvent être démontés et déplacé afin d’être aisément accessible par l’effluent. Avantageusement, un mésocosme peut comprendre : un compartiment d’analyse comprenant un substrat, de préférence reconstitué, ledit compartiment d’analyse étant munie d’une surverse d’évacuation munie d’un filtre, de préférence un peigne, un compartiment d’évacuation d’eau relié à la surverse d’évacuation et optionnellement une seconde boucle de recirculation, ladite boucle étant reliée au compartiment de distribution et au compartiment d’évacuation. Avantageusement, le compartiment d’analyse est relié au compartiment de distribution. Le compartiment d’évacuation est relié à une évacuation d’eau (pour évacuer le surplus d’eau du dispositif). Il peut s’agir de la même évacuation d’eau que celle reliée à la cuve réservoir. Avantageusement, le dispositif selon l’invention peut comprendre au moins une pompe, de préférence une pompe péristaltique ou une pompe à eau. Par exemple, pour la distribution il s’agit d’une pompe à eau de type à turbine. Par exemple, les pompes utilisées pour la recirculation sont des pompes d’aquarium de type à turbine, dont le débit est très faible, réglable et mesuré. L’apport en effluent est réalisé via des pompes péristaltiques étalonnables et étalonnées. Avantageusement, le dispositif selon l’invention peut comprendre au moins une lampe. Il peut s’agir de barres de LED avec plusieurs longueurs d'onde adaptées à la croissance des diatomées. De préférence, chaque mésocosme est surmonté d’une lampe à aquarium. Avantageusement, le dispositif 1 selon l’invention peut comprendre : une première arrivé d’eau 111 ; une seconde arrivée en effluent aqueux 112 ; une gouttière d’alimentation 113 munie d’un trop plein ; une première boucle de recirculation 114 comprenant un système de régulation de température (chiller) 115, une cuve réservoir 116 et une pompe 117, ladite boucle étant relié à la gouttière d’alimentation 113 ; au moins un compartiment d’alimentation 118 munie d’une surverse 119 munie d’un peigne ; au moins un mésocosme 120 comprenant : un compartiment d’analyse 121 comprenant un substrat 122, ledit compartiment d’analyse étant munie d’une surverse d’évacuation 123 munie d’un peigne, un compartiment d’évacuation d’eau 124 relié à la surverse d’évacuation 123, et une seconde boucle de recirculation 125 comprenant une pompe 126, ladite boucle étant reliée au compartiment d’alimentation 118 et au compartiment d’évacuation 123 ; et une évacuation d’eau 127 reliée à la cuve réservoir 116 et au compartiment d’évacuation 124. L’invention se rapporte également à une utilisation du dispositif selon l’invention pour déterminer le potentiel écotoxique d’un effluent aqueux. L’invention comprend aussi un kit de mésocosmes instrumentés et transportables comprenant : au moins un mésocosme telle que défini précédemment, un dispositif d’alimentation en eau tel que défini précédemment, un substrat tel que défini précédemment, optionnellement, un consortium de microorganismes tel que défini précédemment, optionnellement, au moins un consommateur primaire tel que défini précédemment, optionnellement, au moins un consommateur secondaire tel que défini précédemment, un système d’évacuation d’eau, et optionnellement au moins une boucle de recirculation. La est une représentation schématique de la chaîne trophique de l’exemple 1. La représente un dispositif 1 selon l’invention comprenant une batterie de 4 mésocosmes : une première arrivé d’eau 111 ; une seconde arrivée en effluent aqueux 112 ; une gouttière d’alimentation 113 munie d’un trop plein ; une première boucle de recirculation 114 comprenant un système de régulation de température (chiller) 115, une cuve réservoir 116 et une pompe 117, ladite boucle étant relié à la gouttière d’alimentation 113 ; au moins un compartiment d’alimentation 118 munie d’une surverse 119 munie d’un peigne ; au moins un mésocosme 120 comprenant : un compartiment d’analyse 121 comprenant un substrat 122, ledit compartiment d’analyse étant munie d’une surverse d’évacuation 123 munie d’un peigne, un compartiment d’évacuation d’eau 124 relié à la surverse d’évacuation, et une seconde boucle de recirculation 125 , ladite boucle étant reliée au compartiment d’alimentation 118 et au compartiment d’évacuation 124 ; et une évacuation d’eau 126 reliée à la cuve réservoir 116 et au compartiment d’évacuation 124. La représente une vue de côté du dispositif 1 selon l’invention. L’invention sera mieux comprise à la lecture des exemples, non limitatifs, qui suivent. Exemple 1 : mis en œuvre du procédé selon l’invention Matériel et méthode Le substrat est du sable fin en mélange (sable de Fontainebleau, VWR) avec du sable plus grossier (sable SNL, certifié AFNOR et ISO 9001: 2008 ). Le mélange représente 5 cm d’épaisseur soit un volume de 50 mm* 275 mm* 477mm = 6 558 750 mm3 soit environ 6,5 L. Le mélange est lavé trois fois avec de l’eau du robinet et stérilisé dans un autoclave, 20 min à 120°C. Chaque cuve mesure 477 mm * 275 mm * 275 mm = 36 073 125 mm3 soit 36 L. L’eau des cuves est de qualité alimentaire (déchlorée) ou reconstituée (fabriquée à partir d’eau déminéralisée et de sels chimiques (norme ISO 21427-1 de 2006): de NaHCO 3 (64,75 mg/L), MgSO 4 (123,25 mg/L), KCl (5,75 mg/L) et CaCl 2 (294 mg/L). Eau AFNOR chironome [CaCl 2 (66,2 mg/L), MgSO 4 (61,4 mg/L), NaHCO 3 (96 mg/L), KCl (4 mg/L), CaSO 4 (63 mg/L) et NaBr (1 mg/L), conformément à la norme AFNOR (2004). Chaîne trophique : consortium de micro-organismes (bactéries, algues, champignons)- chironomes -xénope - pleurodèles. Consortium de microorganismes : les microorganismes proviennent de culture fraîches issues de solutions commerciales proposées par les Sociétés Aquaservice, GBL ou Aquastore, JBL, Daphbio bactofraiche. A cela sont ajoutées des diatomées benthiques ( Nitzschia Palea ) issues de cultures axéniques (10 mL à une concentration de 1.10 7 /mL, 20 mL pour 30 L). Le consortium peut également être issu du milieu naturel Chironome : eau AFNOR [CaCl 2 (66,2 mg/L), MgSO 4 (61,4 mg/L), NaHCO 3 (96 mg/L), KCl (4 mg/L), CaSO 4 (63 mg/L) et NaBr (1 mg/L), conformément à la norme AFNOR (2004)]. Amphibiens : norme ISO 21427-1 de 2006): NaHCO 3 (64,75 mg/L), MgSO 4 (123,25 mg/L), KCl (5,75 mg/L) et CaCl 2 (294 mg/L). Algues : Les diatomées Nitzschia palea sont cultivées au laboratoire EcoLab (France) en milieu de culture CHU 10 contenant du Fe-EDTA comme source de fer (6,4 3 ) 2 4H 2 O (60 mg/L), MgSO 4 7H 2 O (25 mg/L), K 2 HPO 4 (10 mg/L), Na 2 CO 3 (20 mg/L), Na 2 SiO 3 5H 2 O (60 mg/L), Fe-EDTA (5 mg/L), H 3 BO 3 (2,86 mg/L), MnSO 4 , H 2 O (1,5 mg/L), CuSO 4 , 5H 2 O (0,08 mg/L), ZnSO 4 , 7H 2 O (0,25 mg/L), ZnSO 4 , 7H 2 O (0,02 mg/L), Co(NO 3 ) 2 , 6H 2 O (0,05 mg/L),Na 2 MoO 4 2H 2 O (0,025 mg/L), Na2MoO4 2H2O (0,022 mg/L), Biotine B7 C 10 H 16 N 2 O 3 S (0,01 mg/L), Vitamine B12 : C 63 H 88 CoN 14 O 14 P (0,005 mg/L), Thiamine HCl : C 12 H 17 CIN 4 OS, HCL (0,00055 mg/L). Chironomus riparius : L’élevage est réalisé au sein du laboratoire d’après les normes AFNOR (2004) et Environnement Canada (1997). Il est réalisé en aquariums contenant un fond de sable de Fontainebleau et du milieu de culture adapté à l’élevage des chironomes, placés à 21 ± 1°C et soumis à une photopériode de 16h de jour et 8h de nuit. L’apport de nourriture consiste en 400 mg de nourriture pour poisson (Tétramin®) par aquarium et par jour. Quelques jours avant le début des expériences, toutes les masses d’œufs présentes en aquarium d’élevage sont récupérées et placées individuellement en piluliers contenant du milieu de culture. Les masses d’œufs ayant éclos le même jour sont gardées et placées en cristallisoir, à raison de deux à quatre masses par cristallisoir. Les jeunes larves sont récupérées 48h après éclosion. Xenopus laevis : L’élevage et l’obtention de larves ont lieu au laboratoire. Les reproducteurs mâles et femelles sont élevés séparément, en aquarium acclimatés à 22 ± 1°C et soumis à une photopériode de 8h de jour et 16h de nuit. Ils sont nourris deux fois par semaine de granulés pour élevage piscicole (Trouw France SA) et une fois par semaine de cœur de bœuf. L’accouplement et l’obtention de pontes sont stimulés par injection hormonale du couple de reproducteurs préalablement isolés (mâle : 50 UI de Gonadotrophine Sérique de jument 500 [Pregnant Mare’s Serum Gonadotrophin, PMSG ; MSD, France] ; femelle : 750 UI de Gonadotrophine Chorionique Humaine GCH 1500 [Human Chorionic Gonadotropin, HCG ; MSD, France]). Après la ponte, les adultes sont replacés en aquarium d’élevage et seront de nouveau aptes à se reproduire après trois mois de repos. L’éclosion des œufs survient environ 48h après la ponte. Les larves sont alors transférées en aquariums isolés et nourries quotidiennement de paillettes déshydratées commercialisées pour poissons d’ornement (Tétraphyll®) préalablement broyées en fines particules. Le stade 50 de développement (Nieuwkoop and Faber, 1956) survient au bout de deux à trois semaines et est caractérisé par une constriction à la base du membre postérieur. Pleurodeles waltlii : L’élevage et l’obtention de larves ont lieu au laboratoire. Les reproducteurs mâles et femelles sont élevés séparément et sont regroupés aux périodes de reproduction uniquement (septembre à octobre et janvier à mars). L’élevage se fait en aquariums contenant de l’eau de ville déchlorée, maintenue à une température de 18°C ± 1°C et soumis à une photopériode de 8h de jour et 16h de nuit. La fécondation in vivo est naturelle (sans injection hormonale) et a lieu aux saisons propices à la reproduction. Après la ponte, les œufs sont placés dans des récipients isolés, où l’éclosion aura lieu une dizaine de jours plus tard. Les premiers jours, l’apport énergétique des jeunes larves provient des réserves contenues dans leur sac vitellin. Elles sont ensuite quotidiennement nourries avec des nauplies d’artémies ( Artemia salina ), petits crustacés vivant en eaux salées, puis dès que leur taille le permet, avec des larves de chironomes congelées. L’obtention de larves au stade 53 de développement, auquel doit débuter l’exposition, survient environ deux mois après la ponte. L’origine de l’effluent, son débit ainsi que la dilution sont fonctions de la nature de l’effluent et de la dilution à tester. L’effluent testé provient dans un premier temps de la sortie d’une STation d’EPuration et est prélevé juste avant son arrivée dans la rivière. Ensuite, le même effluent a été testé, après avoir subi un traitement dans la station d’épuration avant sa relâche dans la rivière. Une fraction est prélevée régulièrement dans la cuve tampon par un préleveur automatique puis stocké dans un container réfrigéré. L'effluent testé correspond à la somme des fractions sur 24h. Le débit de l'effluent et sa dilution reflètent une représentativité environnementale, calculé sur la base de la configuration STEP/rivière in situ. Le dispositif utilisé dans cet exemple est celui présenté sur les figures 2 et 3. Il comprend 6 mésocosmes soumis à l’effluent aqueux et 3 mésocosmes témoins (seulement 4 sont représentés sur les figures 2 et 3). Le dispositif fonctionne en circuit semi-ouvert, une partie de l’effluent aqueux étant recyclé. Circuit de l’effluent : l’effluent à étudier est introduit directement dans le compartiment d’alimentation. La dilution de l’effluent dans le mésocosme est assurée par l’envoie dans le même compartiment d’alimentation de l’eau déchlorée de qualité alimentaire ou reconstituée issue d’une cuve réservoir régulée en température à l’aide d’un premier système de régulation de température via la gouttière d’alimentation de l’eau située au-dessus des mésocosmes. La gouttière d’alimentation est munie d’un trop plein qui permet le retour de l’eau en excès vers la cuve réservoir. Les mésocosmes sont alimentés par la surverse d’alimentation de chaque compartiment d’alimentation jusqu’à ce que l’eau s’échappe par la surverse d’évacuation. Cette surverse alimente le compartiment d’évacuation relié à une seconde boucle de recirculation munie d’une pompe permettant un retour vers le compartiment compartiment d’alimentation de l’eau en excès. Cette seconde boucle de recirculation permet un recyclage partiel de l’effluent aqueux dilué dans le compartiment d’alimentation puis dans le compartiment d’analyse favorisant ainsi une bonne homogénéisation de l’effluent aqueux dilué ainsi qu’une économie de l’effluent aqueux. La sécurité du système est maintenue grâce à un trop-plein sur le compartiment d’évacuation, permettant l'évacuation de l’excès de liquide du dispositif.. Exemple 2 : détermination du potentiel écotoxique de l’effluent de l’exemple 1 La détermination du potentiel écotoxique est obtenue par mesure du niveau de toxicité sur le vivant (toxicités aiguë, chronique et génétique) par rapport au contrôle et mesure des variations des conditions physico-chimiques telles que cycle du carbone, décomposition, carbone organique dissous, pH, concentration en oxygène dissous et/ou conductivité de l’effluent par rapport au contrôle également. Dans le cadre de cet exemple, les paramètres biotiques et abiotiques suivants ont été mesurés. Les paramètres biotiques sont : diversité chez les bactéries, mortalité, croissance et génotoxicité chez les amphibiens, croissance, développement, sex ratio et tératogénicité chez les chironomes, dégradation matière organique avec les feuilles d'aulne. Les paramètres abiotiques sont : températures, oxygène dissous, conductivité, pH, COT et COD. 1. Microorganismes : 100 mL d'eau et 10 mL de sédiments sont échantillonnés à 3 moments différents au cours de l'expérience (avant l’ajout des chironomes et des amphibiens, à mi exposition et à la fin de l'exposition, c’est-à-dire à 15 jours, 4 semaines et 8 semaines). Les échantillons d'eau sont filtrés à 5 mm (Whatman® Nuclepore™ Track-Etched Membranes) afin de récupérer les microorganismes de la colonne d'eau. Les filtres et les échantillons de sédiments ont été congelés dans de l'azote liquide et stockés à 80 C avant d'être traités pour les analyses. L'ADN total est extrait des échantillons d'eau et des sous-échantillons de sédiments à l'aide du kit d'isolation de l'ADN du sol Mobio® power en suivant les instructions du fabricant. En outre, des contrôles d'extraction négatifs sont effectués pour garantir l'absence de contamination de l'ADN pendant le processus. La quantité et la qualité des extraits d'ADN sont analysées à l'aide d'un spectrophotomètre UV NanoDrop 2000 (Thermo Scientific). Les PCR sont effectuées sur un Système PCR Gene-AmpTM 9700 thermocycleur (Applied Biosystems, Forster City, CA, États-Unis) dans un volume final de 50 ml contenant : 37,5 ml d'eau PCR, 5 ml de tampon PCR 10X, 2 ml d'ADN extrait, 2 ml des deux amorces (10 mM), 1 ml de dNTP (2,5 mM) et 0,5 ml d'ADN polymérase Taq (5 U/mL Sigma Aldrich). Le protocole PCR suivant est appliqué : 94 C pendant 120 s, 30 cycles à 94°C pendant 60 s, à 65°C pendant 40 s, à 72°C pendant 30 s et à 72°C pendant 10 min. Le séquençage des amplicons des gènes ARNr 16S est réalisé à l'aide de la technologie MiSeq d'Illumina (2 250 pb) par la plateforme Get_PlaGe (Genotoul, Toulouse, France). L'analyse bioinformatique est réalisée à l'aide du pipeline FROGS (Find Rapidly Operational Taxonomic Units (OTU) Galaxy Solution) sur Galaxy. Les lectures sont regroupées en OTU en utilisant une méthode de regroupement (méthode Swarm). Les chimères sont retirées et des filtres sont appliqués pour maintenir les OTU présents dans au moins 3 échantillons et représentant au moins 0,005% de toutes les séquences. Les OTU sont attribués à différents niveaux taxonomiques (du royaume aux espèces) en utilisant le classificateur RDP et la méthode NCBI Blast þ sur la base de données Silva 132 (pintail 80). 2. Xénope et pleurodèle 2.1. Les méthodes d’exposition de X. laevis et de P. waltl . sont similaires, et se déroulent selon la procédure normalisée du test micronoyau amphibiens (ISO 21427-1, 2006) et adaptée. L’exposition débute avec des larves de stade 50 de la table normale de Nieuwkoop et Faber (1956) dans le cas de X. laevis et des larves de stade 53 de la table chronologique de développement (Gallien et Durocher, 1957) dans le cas de P. waltl . . Des lots de 15 individus environ issus d’une même ponte, sont nécessaires afin de diminuer la variabilité génétique interindividuelle. L’exposition a lieu au sein des mésocosmes à une température de 20°C ± 0,5°C et avec une photopériode de 16h. 2.2. Toxicités aiguë, chronique et génétique : pour les essais de mortalité et de croissance, les larves mortes sont prélevées chaque 24h tout au long de l’exposition. La toxicité aiguë est évaluée par observation visuelle de la survie (%). La toxicité chronique est évaluée par mesure de la longueur de chaque larve sur photographie au premier (Tinitial) et dernier jour d’exposition (Tfinal) d’exposition à l’aide du logiciel Mesurim (Madre, 2006). Cette mesure permet le calcul du taux de croissance selon l’équation suivante : [(( moyCdt°X Tfinal – moyCdt°X Tinitial ) - (moyCdt°T - Tfinal – moyCdt°T - Tinitial )) / (moyCdt°T - Tfinal – moyCdt°T - Tinitial )] * 100] avec taille moyenne des larves de la condition X à Tfinal : moyCdt°X Tfinal et à T0 : moyCdt°X Tinitial ; taille moyenne des larves de la condition T - à T12 : moyCdt°T - Tfinal et à T0 : moyCdt°T - Tinitial . Le seuil de significativité de la mortalité est établi à 25%. Le traitement statistique des données brutes relatives à la taille des larves est réalisé à l’aide du logiciel Sigma stat 3.1. En début et fin d’exposition, les tailles des larves sont comparées à l’aide de tests statistiques non paramétriques pour données non appariées. Le test statistique de Kruskall-Wallis est effectué pour la comparaison entre toutes les conditions, suivi d’un test de Dunn ou de Dunnett pour isoler le(s) groupe(s) responsable(s) de cette différence. Le test statistique de Mann-Whitney est également utilisé pour effectuer une comparaison deux à deux. Pour la génotoxicité, à la fin de l’exposition, une ponction intracardiaque est pratiquée sur chaque larve au préalable immobilisée par immersion dans une solution de tricaïne méthane sulfonate (MS 222, Sandoz). Une micropipette taillée en biseau et héparinée (solution d’héparine lyophilisée à 7‰ de chlorure de sodium), est introduite dans le ventricule, dont les contractions permettent la montée du sang dans la micropipette. Un frottis sanguin est alors réalisé pour chaque larve à l’aide d’une lame rodée. Ces étalements sanguins sont immédiatement séchés sous air comprimé à pression réduite. Ils sont ensuite fixés au méthanol absolu pendant 10 mn et colorés pendant 30 mn par immersion dans une solution d’hématoxyline de Groat (solution équivolume de 10 g d’hématoxyline de Groat pour 1 litre d’alcool 95° et de 20 g d’hémalum de fer ammoniacal pour 1 litre d’eau à 1,6% d’acide sulfurique concentré). Ce colorant est spécifique du matériel nucléaire des cellules. Après rinçage à l’eau courante, les lames sont finalement séchées à l’air libre avant d’être observées. La lecture des frottis sanguins est réalisée en microscopie à immersion (Olympus CX41). Pour chaque larve, on détermine ainsi le nombre d’érythrocytes micronucléés présentant un, deux, trois ou davantage de micronoyaux pour 1000 érythrocytes (noté EMN‰). Les données de génotoxicité sont traitées selon les recommandations décrites dans le fascicule de la norme AFNOR 2000 et ISO 2006. Basée sur les rangs de la médiane et des quartiles, elle permet en particulier le traitement de résultats obtenus sur de petits échantillons (n≥7 soit 35%) dont la distribution des valeurs n’obéit pas à une loi normale. Un échantillon est constitué par n valeurs correspondant au nombre de frottis réalisés par lot. Pour chaque lot ou échantillon, la conduite du traitement statistique consiste en la détermination des rangs de la médiane M, du quartile inférieur QI et du quartile supérieur QS par les formules du Tableau 1 ci-dessous. - Echantillon comportant un nombre pair de valeur (n=2p) Echantillon comportant un nombre impair de valeur (n=2p+1) Rang de M [p + (p+1)]/2 p +1 Rang de QI (p + 1)/2 (p/2) + 1 Rang de QS P + [(p+1)/2] (3p/2) + 1 Tableau 1 : formules de détermination des rangs de la médiane M, du quartile inférieur QI et du quartile supérieur QS. Les valeurs des EMN °/°° sont classées par ordre croissant, déterminant ainsi un rang à chacune des valeurs. Les valeurs de M, QI, QS sont égales aux valeurs de EMN°/°° de rang correspondant. L’intervalle de confiance IC de la médiane, au seuil de sécurité de 95% est calculé selon la formule : M ± 1,57 x EIQ / √n où M est la valeur de la médiane, n est le nombre de frottis par lot et EIQ est la valeur de l’écart interquartile (QS – QI). La différence entre les médianes de deux échantillons est significative si leurs intervalles de confiance n’ont pas de point commun. Le résultat d’un lot est considéré positif lorsque la médiane est supérieure au double de celle du lot témoin négatif et si les intervalles de confiance ne se chevauchent pas. Le milieu d’exposition est génotoxique pour les larves dans les conditions du test. Le résultat est considéré négatif lorsque l’intervalle de confiance du lot traité n’est pas distinct de celui du lot témoin négatif. Le milieu d’exposition n’est pas génotoxique pour les larves dans les conditions du test. 3. Chironome : 3.1. toxicité chronique (développement, croissance) : l’inhibition de croissance et le retard de développement des larves de chironome sont déterminés à la fin d’une exposition de 7 jours. Les larves sont photographiées sous loupe binoculaire et mesurées grâce à un logiciel d’analyse d’image afin d’évaluer l’inhibition de croissance. Les larves sont ensuite décapitées à la base de la capsule céphalique. Celle-ci est alors photographiée et mesurée dans sa grande largeur. La taille de la capsule céphalique permet de déterminer le stade de développement des larves, indiquant alors un éventuel retard de développement. Les tailles des larves sont comparées par analyse de la variance. L’égalité des variances et la normalité de distribution de la population sont vérifiées en premier lieu (test de Shapiro-Wilk). En cas de distribution non normale, le test non paramétrique de Kruskal-Wallis (ou ANOVA à un facteur sur les rangs) est réalisé, suivi du test de Dunn afin d’analyser les différences entre groupes. La taille de la capsule céphalique permet de déterminer le stade de développement des larves. Celles-ci sont alors réparties en deux groupes suivant qu’elles ont atteint le stade IV de développement ou non (i.e. retard de développement) et les répartitions des différentes conditions d’exposition sont comparées grâce au test du χ². 3.2 Tératogénicité : l’évaluation de l’impact tératogène des NP est donc réalisée sur les capsules céphaliques des larves au stade IV de développement, suite à une exposition de 7 jours. Pour cela, les capsules sont récupérées après décapitation des larves et stockées en éthanol (70%). Les capsules céphaliques sont décolorées par traitement avec une solution d’hydroxyde de potassium (KOH 15%) (Sigma, France) chauffée à 95°C pendant 12 minutes. La réaction est stoppée en remplaçant la solution par de l’éthanol à 70% durant 12h. Les capsules sont alors montées sur lame de microscope avec du milieu de montage Eukitt®(Fluka, France). L’observation microscopique des capsules céphaliques permet ensuite d’évaluer les malformations des parties buccales (mentum et mandibules) chez le chironome. En 1988, Warwick et Tisdale décrivent dans leurs travaux les parties buccales de chironome ne présentant pas d’anomalies, ainsi que l’ensemble des anomalies observées jusqu’alors. Dix ans plus tard, Vermeulen et al. (1998) proposent une méthode de notation des malformations en fonction de leur gravité. Brièvement, chaque dent est virtuellement découpée en quarts, et chaque quart atteint d’une anomalie entraîne un score de 1. La somme des anomalies donne alors le score final de la capsule céphalique étudiée. L’analyse que nous faisons des malformations des parties buccales est basée sur l’ensemble de ces travaux, et prend en compte la fréquence d’apparition de chacune des malformations, la fréquence d’apparition globale, et le score moyen de gravité obtenu pour chaque traitement. Le traitement statistique des données est effectué avec le logiciel SigmaPlot 12.0. Les scores de gravité sont comparés par analyse de la variance (test non paramétrique de Kruskall -Wallis, ou ANOVA à un facteur sur les rangs). Le lien entre l’incidence des malformations et les conditions d’exposition est évalué par le test du χ², en comparant le nombre d’individus ayant des malformations au nombre d’individus « sains ». Les sex ratios sont calculés à la fin de l’exposition en fonction de la proportion de mâles et de femelle collés sur du scotch placé au-dessus de la surface de l’eau de chaque mésocosme. Ces proportions sont comparées entre les conditions traitées et contrôle par des ANOVA ou des tests non paramétriques. Ecomarqueur : dégradation matière organique, Des feuilles d’aulne sont récupérées en période de défeuillaison (mois de novembre ; vallon de Ramade, Haute-Garonne, France, 43°31'04.2"N 1°25'32.1"E) puis séchées à l’étuve (72h, 50°C, Thermo Jouan EB 170) au laboratoire. Des lots de 3,2 g (poids sec) sont constitués, placés en eau déionisée et stérilisés par autoclavage avant introduction dans les microcosmes afin de limiter l’apport de micro-organismes non intentionnels. A la fin de l’exposition, les feuilles sont prélevées, séchées, scannées et pesées pour déterminer la différence de poids sec et de surface foliaire. Les résultats montrent que le traitement appliqué sur l’effluent avant sa relâche dans la rivière n’a pas eu d’effet significatif sur la dégradation des feuilles d’aulne. Une légère diminution de la quantité globale de pigments chlorophylliens de ces feuilles a été observée lors de l’exposition à l’effluent de la STEP non traité par rapport à l’effluent traité et aux mésocosmes témoins. La diversité microbienne évaluée dans les sédiments est supérieure dans les mésocosmes comprenant l’effluent non traité par rapport à l’effluent traité et au témoin. Ces résultats de diversité microbienne montrent que si certains pigments sont ubiquistes et présents dans tous les échantillons (Chlorophylle a, Pheophytine a, Fucoxanthine, Chlorophylle b, Pheophorbide a, β-Carotène ; Antheraxanthine ; Diadinoxanthine, Alloxanthine, Violaxanthine, Cantaxanthine), la présence d’autres pigments semblent particulièrement corrélés à l’effluent de la STEP et sont caractéristiques de familles spécifiques (Myxoxanthophylle = cyanobactéries ; Prasinoxanthine = Prasinophycae). L’analyse de ces pigments révèle donc que malgré l’introduction d’un inoculum bactérien commun aux trois conditions en début d’expérimentation, des divergences sont observées en cours d’expérimentation et traduisent l’implantation de micro-organismes nouveaux qui proviennent des effluents. Par ailleurs, les résultats ont montré que le nombre de chironomes émergés est significativement plus faible dans l’effluent provenant de la STEP par rapport à l’effluent traité et au contrôle. En revanche, il n’y aucune différence significative dans le sex ratio déterminé chez les adultes exposés à l’effluent, qu’il soit traité ou pas, par rapport au contrôle. La croissance des larves de xénope n’a été que peu impactée par l’effluent de la STEP et a contrario les larves exposées à l’effluent traité avant sa relâche dans la rivière ont présenté une croissance légèrement supérieure aux autres conditions au temps intermédiaire. A la fin de l’exposition aux effluents, aucune différence significative de croissance en taille entre les différentes conditions n’a été observée chez les larves de X. laevis. En revanche, les résultats mettent en évidence une légère génotoxicité de l’effluent de la STEP non traité par rapport à l’effluent traité et au contrôle. Exemple 3 : exemple d’essai en condition réelles sur une station d’épuration au sud de Toulouse Dans cette étude, un effluent aqueux est analysé et comparé sur deux saisons (été /hiver) afin de déterminer l’efficacité d’un nouveau système de traitement des eaux usées urbaines (appelé BAM) versus un système conventionnel (appelé STEP). Le choix des deux saisons a été réalisé sur la base de l’hypothèse avérée qu’une station d’épuration classique rejette plus de composés pharmaceutiques l’hiver que l’été. Cette hypothèse formulée sur la base de la littérature a pu être vérifiée dans cette étude. Par ailleurs, dans un souci de réalisme écologique, il a été choisi de diluer les rejets issus de chaque système de traitement au 1/300 e . Cette dilution correspondant à celui des rejets de la STEP dans la Garonne à débit moyen de celle-ci. A ces dilutions, même en hiver, les produits analysés étaient tous en limite de détection au moment de l’analyse. Le dispositif utilisé pour la mise en œuvre de cette étude est le même que celui de l’exemple 2. Les paramètres biotiques et abiotiques mesurés sont les mêmes que dans l’exemples 2. Ils ont été déterminés selon les mêmes méthodes que dans l’exemple 2. Les résultats ont permis de mettre en évidence une différence notable de l’écotoxicité des effluents issus du traitement classique entre les différentes campagnes étudiées (été vs hiver) avec des effets plus marqués en hiver. Notamment en termes de génotoxicité chez les larves de xénopes, et des retards à l’éclosion des larves de chironomes. Les mésocosmes ont aussi permis de montrer que le BAM réduisait de façon significative et très efficacement l’écotoxicité des effluents par rapport à la STEP, qu’elle que soit la période étudiée. En bilan, les mésocosmes selon l’invention permettent d’évaluer le potentiel écotoxique d’un effluent liquide, et donc le risque associé, d’une molécule ou d’un ensemble de molécules même à des très faibles concentrations, sans avoir à connaitre la nature exacte du ou des polluants. Au cours de la campagne estivale, l’effluent de la STEP non traité s’est révélé écotoxique vis –à-vis des larves de chironomes en provoquant une baisse significative de leur émergence et vis-à-vis des larves de xénope en induisant un faible potentiel génotoxique. En outre, l’effluent de la STEP provoque des modifications importantes dans la composition du biofilm présent dans le sédiment. Le traitement de cet effluent est démontré efficace puisqu’il montre une réduction des effets délétères chez les chironomes et les xénopes et que les modifications de la composition du biofilm dans le sédiment sont faibles. Procédé de mesure du potentiel écotoxique d’un effluent aqueux comprenant les étapes : a) formation d’une chaîne trophique artificielle dans un milieu aquatique comprenant un substrat, ledit substrat comprenant une fraction minérale et optionnellement une fraction organique et étant de préférence reconstitué, ladite chaîne trophique comprenant au moins un microorganisme et au moins un macroorganisme et est formée par introduction et stabilisation/temporisation séquentielle desdits micro- et macroorganismes ; b) détermination du potentiel écotoxique de l’effluent aqueux, caractérisé en ce que le milieu est ouvert ou semi-ouvert et est alimenté de manière continue en effluent aqueux. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le débit d’alimentation de l’effluent aqueux non dilué est compris dans un intervalle allant de de 0,3 à 1 L par jour. Procédé selon la revendication 1 ou 2, comprenant en outre une étape de dilution de l’effluent aqueux, préalablement à son alimentation du milieu. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, comprenant une étape de régulation de la température de l’effluent aqueux, de préférence à une température allant de 15 à 25°C. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, comprenant une étape c) de recyclage partiel de l’effluent, de préférence recyclage de 1 à 90 % de l’effluent. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la chaîne trophique artificielle comprend : un consortium de microorganismes, au moins un consommateur primaire, apte à se nourrir du consortium de microorganismes, optionnellement au moins un consommateur secondaire, apte à se nourrir des consommateurs primaires. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel l’étape a) comprend les sous étapes : i) mise en place dans un milieu (i.e. un compartiment d’analyse), du substrat et d’eau, de préférence de l’eau de qualité alimentaire ou reconstituée fabriquée à partir d’eau déminéralisée et de sels minéraux, ii) introduction dans le milieu du consortium de microorganismes, iii) stabilisation du milieu pendant une durée allant de 1 à 3 semaines, de préférence 2 semaines, iv) introduction dans le milieu des consommateurs primaires, de préférence en plusieurs étapes successives, lorsqu’il y a plusieurs consommateurs primaires, v) temporisation du milieu pendant une durée allant de 1 à 3 semaines, de préférence 2 semaines, vi) optionnellement introduction dans le milieu des consommateurs secondaires, de préférence en plusieurs étapes successives, lorsqu’il y a plusieurs consommateurs secondaires. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la température du milieu est comprise dans un intervalle allant de 15 à 25°C. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, comprenant en outre une étape d) de mesure du pourcentage de dégradation de la fraction organique du substrat. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, comprenant une étape préalable de stérilisation du substrat, de préférence à une température supérieure ou égale à 121°C, pendant une durée supérieure ou égale à 20 minutes. Dispositif de mise en œuvre du procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes comprenant un dispositif d’alimentation en eau et une batterie de mésocosmes instrumentés et transportables. Dispositif selon la revendication précédente dans lequel le dispositif d’alimentation comprend : une première arrivée d’eau, une gouttière d’alimentation munie d’un trop plein, une seconde arrivée en effluent aqueux, au moins un compartiment d’alimentation muni d’une surverse d’alimentation munie d’un peigne, une première boucle de recirculation reliée à la gouttière d’alimentation et munie d’un premier système de régulation de température et d’une cuve réservoir, et une évacuation d’eau. Dispositif selon la revendication précédente, dans lequel un mésocosme comprend : un compartiment d’analyse comprenant un substrat, de préférence reconstitué, ledit compartiment d’analyse étant munie d’une surverse d’évacuation munie d’un peigne, un compartiment d’évacuation d’eau relié à la surverse d’évacuation et optionnellement une seconde boucle de recirculation, ladite boucle étant reliée au compartiment de distribution et au compartiment d’évacuation. Dispositif (1) selon la revendication précédente comprenant : une arrivé d’eau (111) ; une arrivée en effluent aqueux (112) ; une gouttière d’alimentation (113) munie d’un trop plein ; une première boucle de recirculation (114) comprenant un système de régulation de température (115), une cuve réservoir (116) et une pompe (117), ladite boucle étant relié à la gouttière d’alimentation (113) ; au moins un compartiment d’alimentation (118) munie d’une surverse (119) munie d’un peigne ; au moins un mésocosme (120) comprenant : un compartiment d’analyse (121) comprenant un substrat (122), ledit compartiment d’analyse étant muni d’une surverse d’évacuation (123) munie d’un peigne, un compartiment d’évacuation d’eau (124) relié à la surverse d’évacuation (123), et une seconde boucle de recirculation (125) comprenant une pompe (126), ladite boucle étant reliée au compartiment d’alimentation (118) et au compartiment d’évacuation (124) ; et une évacuation d’eau (127) reliée à la cuve réservoir (116) et au compartiment d’évacuation (124). Utilisation du dispositif selon l’une quelconque des revendications 11 à 14 pour déterminer le potentiel écotoxique d’un effluent aqueux. Kit de mésocosmes instrumentés et transportables comprenant : au moins un mésocosme telle que défini à la revendication 13, un dispositif d’alimentation en eau selon la revendication 12, un substrat tel que défini à la revendication 1, optionnellement, un consortium de microorganismes, optionnellement, au moins un consommateur primaire, optionnellement, au moins un consommateur secondaire, un système d’évacuation d’eau, et optionnellement au moins une boucle de recirculation.