Brevet FR3125944A1 — publié le 20230210

L’invention concerne l’utilisation d’un lactosérum acide pour stimuler la germination d’un grain de pollen d’une plante et/ou pour stimuler l’élongation du tube pollinique dudit grain de pollen. Selon un autre aspect, l’invention concerne un procédé pour stimuler la germination d’un grain de pollen d’une plante et/ou pour stimuler l’élongation du tube pollinique dudit grain de pollen, dans lequel un lactosérum acide est appliqué à la plante dans une quantité suffisante pour stimuler la germination du grain de pollen et/ou pour stimuler l’élongation du tube pollinique dudit grain de pollen. Selon un dernier aspect, l’invention concerne une composition comprenant (i) un lactosérum acide et (ii) un extrait d’algue brune. Utilisation d’un lactosérum acide pour stimuler la germination d’un grain de pollen d’une plante L’invention trouve son application dans le domaine agro-écologique et agricole et concerne en particulier la stimulation de la germination d’un grain de pollen d’une plante et/ou l’élongation du tube pollinique dudit grain de pollen. La reproduction sexuée d’une plante est un processus majeur chez les plantes à fleur, qui aboutit à la formation de graines ou de fruits. Cette reproduction sexuée est caractérisée par la rencontre des gamètes mâles d’une plante (présents dans le grain de pollen) et des gamètes femelles d’une plante (ovules). Elle est suivie par plusieurs processus biologiques consécutifs comme la nouaison, la croissance du fruit/de la graine qui est caractérisée par des évènements de division et d’expansion cellulaire, puis par le mûrissement du grain et/ou du fruit. La première étape de la reproduction sexuée, déjà clé, est l’atterrissage d’un grain de pollen sur le pistil d’une plante. Le grain de pollen ou gamète mâle est généré par les anthères situés aux extrémités des étamines des plantes. Ce grain de pollen va être transporté par le vent ou par des insectes pollinisateurs au niveau de l’extrémité du pistil d’une plante, à savoir sur le stigmate. Le gamète femelle de la plante étant situé à la base du pistil, le grain de pollen va germer sur le stigmate, former un tube pollinique qui va s’engager dans le pistil et y progresser en s’allongeant jusqu’au niveau du gamète femelle également appelé ovule. Ce processus aboutit à la rencontre du grain de pollen et de l’ovule, permettant la fécondation, ou reproduction sexuée de la plante La germination du grain de pollen et la croissance du tube pollinique correspondent à la phase progamique. Chez les plantes à fleur, cette phase se déroule relativement vite (de 6 à 24 heures en moyenne ; certaines espèces de plantes à fleur peuvent avoir une phase progamique plus longue). La germination du grain de pollen (hydratation du grain consécutive à l’atterrissage sur l’extrémité d’un stigmate, puis émergence du tube pollinique) peut se mettre en place en une demi-heure jusqu’à quelques heures. L’élongation du tube pollinique qui s’ensuit se caractérise par une croissance polarisée, par une sécrétion massive de matériaux de la paroi cellulaire, comme par exemple les pectines, ainsi que par la synthèse de bouchons de callose au niveau de leurs parois. La rapidité de cette phase progamique confère un avantage évolutif indéniable, quant au succès de la reproduction sexuée. En effet, plus la phase progamique est lente, plus il y a de risques que le grain de pollen n’atteigne jamais l’ovule (risque d’avortement), notamment en raison des facteurs environnementaux. Ainsi, lorsque la germination du grain de pollen ne donne lieu à aucune fécondation, cela conduit à une diminution de la quantité de graines et de fruits produits. Les étapes de germination du grain de pollen et d’élongation du tube pollinique sont donc des étapes critiques de la reproduction sexuée des plantes à fleur, le succès de ces deux étapes sont indispensables pour garantir ultérieurement la formation des graines et des fruits. En outre, des études ont mis en évidence que la reproduction sexuée des plantes est impactée par les changements climatiques et notamment par les variations de température [1]. Or, dans les années à venir la plupart des régions agricoles pourraient être soumis à des fluctuations environnementales importantes avec de fortes variations de température [2]. Il a d’ailleurs été démontré que le stress thermique induit par des températures froides ou chaudes a plusieurs effets majeurs sur les tissus reproducteurs, notamment au moment de la floraison provoquant (i) la formation anormale des organes parentaux, (ii) l'asynchronie de la maturation des gamètes mâles et femelles, (iii) la diminution de la réceptivité du stigmate aux pollens, (iv) la réduction de la viabilité et de la germination des grains de pollen et (v) la diminution de la croissance du tube pollinique [3][4][5]. Face à ces changements, il est important de trouver des solutions agronomiques qui permettraient d’améliorer la capacité des plantes à assurer la reproduction sexuée, afin de garantir la production des graines et des fruits. Une des solutions pour favoriser la germination d’un grain de pollen est de sélectionner de nouvelles espèces, qui soient par exemple tolérantes aux stress thermiques induits par le froid ou par la chaleur et qui puissent ainsi réaliser les étapes de reproduction sexuée, quelle que soit la température extérieure. Cela a notamment été réalisé pour le riz [6], la tomate [7], le pois chiche [8] , le haricot [9] ou l'arachide [10]. Une autre possibilité est d’appliquer des composés sur les grains de pollen afin de stimuler la reproduction sexuée des plantes, par exemple en stimulant la germination des grains de pollen et en favorisant la croissance du tube pollinique. Par exemple, il a été démontré que l’utilisation de 24-épibrassinolide (un type de brassinostéroïde, une hormone végétale naturelle) ou de mélatonine sur les grains de pollen de tomate favorise la germination des grains de pollen et la croissance de leur tube pollinique. Il existe donc un besoin de trouver des solutions pour garantir la reproduction sexuée des plantes, et en particulier la germination des grains de pollen. C’est dans ce contexte que se situe l’invention qui répond à un besoin de nouvelles solutions techniques pour stimuler la germination d’un grain de pollen d’une plante et/ou pour stimuler l’élongation du tube pollinique dudit grain de pollen. C’est dans ce contexte que le demandeur a mis en évidence, et ceci constitue le fondement de la présente invention, que le lactosérum acide permettait de stimuler la germination d’un grain de pollen d’une plante et/ou de stimuler l’élongation du tube pollinique dudit grain de pollen. Selon un premier aspect, l’invention concerne l’utilisation d’un lactosérum acide sous forme liquide pour stimuler la germination d’un grain de pollen d’une plante et/ou pour stimuler l’élongation du tube pollinique dudit grain de pollen. Selon un deuxième aspect, l’invention concerne un procédé pour stimuler la germination d’un grain de pollen d’une plante et/ou pour stimuler l’élongation du tube pollinique dudit grain de pollen, dans lequel un lactosérum acide sous forme liquide est appliqué à la plante dans une quantité suffisante pour stimuler la germination du grain de pollen et/ou pour stimuler l’élongation du tube pollinique dudit grain de pollen. Selon un troisième aspect, l’invention concerne une composition comprenant (i) un lactosérum acide et (ii) un extrait d’algue brune. La représente un schéma de la transformation du lait cru en différents sous-produits, dont le lactosérum. La représente le pourcentage en tube pollinique viable au cours du temps en fonction des traitements appliqués (solution LAA + saccharose ou solution contrôle). Les figures 2 A, 2 B et 2 C montrent le pourcentage en tube pollinique viable au cours du temps en fonction des traitements appliqués (solution LAA + saccharose ou solution contrôle) à une température de 8°C, 13 °C et 22 °C respectivement . Les figures 2 D, 2 E, 2 F, 2 G, 2 H, 2 I montrent les images de l’émergence des tubes polliniques viables au cours du temps dans la condition contrôle (colonne de gauche) et dans la condition LAA + saccharose (colonne de droite) aux températures de 8 °C, 13 °C et 22 °C respectivement. La représente la densité et la longueur du tube pollinique en micromètre (µm) en fonction des traitements appliqués (solution LAA + saccharose ou solution contrôle) après 4 heures. Les figures 3 A, 3 B et 3 C montrent la longueur du tube pollinique en micromètre (µm) en fonction des traitements appliqués (solution LAA + saccharose ou solution contrôle) à une température de 8 °C, 13 °C et 22 °C respectivement. La représente le pourcentage de tubes pollinique ayant de 0 à 6 bouchons de callose en fonction des traitements appliqués (solution LAA + saccharose ou solution contrôle) à une température de 8°C, 13 °C et 22 °C respectivement. Les Figures 4 A, 4 B et 4 C montrent des images de grains de pollens et de tubes polliniques en condition contrôle à une température de 8°C, 13 °C et 22 °C respectivement, et indique la présence de bouchons de callose par une tête de flèche. Les Figures 4 D, 4 E et 4 F montrent des images de grains de pollens et de tubes polliniques en condition LAA + saccharose à une température de 8°C, 13 °C et 22 °C respectivement, et indiquent la présence de bouchons de callose par une tête de flèche. La montre l’expression relative de quatre gènes CalS en fonction des traitements appliqués (solution LAA + saccharose ou solution contrôle) et à une température de 8°C, 13 °C et 22 °C respectivement. Le graphique en haut à gauche montre l’expression du gène Solyc01g006370.3. Le graphique en bas à gauche montre l’expression du gène Solyc01g73750.3. Le graphique en haut à droite montre l’expression du gène Solyc11g005985.1. Le graphique en bas à droite montre l’expression du gène Solyc11g005980.2. La représente le pourcentage de nouaison (à savoir le nombre de fruits formés) chez des abricotiers ayant été traité par pulvérisation foliaire avec un traitement à base d’une solution LAA + saccharose ou un traitement témoin à base d’eau. La représente le poids moyen des abricots à la récolte, chez des abricotiers ayant été traité par pulvérisation foliaire avec un traitement à base d’une solution LAA + saccharose ou un traitement témoin à base d’eau. La représente le rendement en abricots à la récolte, chez des abricotiers ayant été traité par pulvérisation foliaire avec un traitement à base d’une solution LAA + saccharose ou un traitement témoin à base d’eau. La représente le nombre de grappes de vignes chez des vignes ayant été traité par pulvérisation foliaire avec un traitement à base d’une solution LAA + saccharose ou un traitement témoin à base d’eau. La représente le rendement des baies à la récolte, chez des vignes ayant été traité par pulvérisation foliaire avec un traitement à base d’une solution LAA + saccharose ou un traitement témoin à base d’eau. La représente le nombre de fruit obtenu par parcelle, à la récolte chez des poiriers ayant été traité par pulvérisation foliaire avec un traitement à base d’une solution LAA + saccharose, un traitement à base d’une solution LAA + saccharose + extrait d’algue Ascophyllum Nodosum ou un traitement témoin à base d’eau. La représente le poids moyen des fruits à la récolte chez des poiriers ayant été traité par pulvérisation foliaire avec un traitement à base d’une solution LAA + saccharose, un traitement à base d’une solution LAA + saccharose + extrait d’algue Ascophyllum Nodosum ou un traitement témoin à base d’eau. Exemples Exemple 1 : Préparation d’un extrait d’algue brune de type Ascophyllum Nodosum Méthode Un extrait d’ Ascophyllum Nodosum a été préparé en suivant le procédé suivant : Etape 1 : Lavage. Des algues fraîches de type Ascophyllum nodosum ont été soumises à deux lavages successifs afin d’éliminer le sable et les graviers. Etape 2 : Séchage. Les algues ainsi lavées ont été égouttées et ensuite séchées soit dans une étuve à renouvellement d’air ou dans un four tunnel afin d’obtenir un taux d’humidité d’environ 10%. Etape 3 : Broyage. Les algues sèches ont ensuite été broyées en une poudre de granulométrie comprise entre 250 et 600 µm. Etape 4 : Extraction . 100 kg d’algues sèches et broyées ont été dispersées dans un réacteur chauffant contenant 900 kg d’eau acidifiée à pH 2,5 et préalablement chauffée à 45°C. L’ensemble a été maintenu sous agitation pendant 3 heures. Etape 5 : Séparation. L’extrait soluble a été débarrassé des fragments d’algues par centrifugation ou par décantation/filtration sur un filtre à terre de diatomées ou un filtre à plateaux. Etape 6. C onservation . Pour stabiliser bactériologiquement l’extrait, 0,1% de benzoate de sodium et 0,1% de sorbate de potassium ont été ajoutés sous agitation et le pH de l’extrait a été remonté à 3,5 avec une solution de NaOH à 30%. L’extrait liquide concentré ainsi obtenu comprend entre 3,5 et 5 % en poids d’extrait sec (à savoir 35 à 50 g de matière sèche par litre d’extrait concentré). L’extrait concentré ainsi obtenu correspond à l’extrait utilisé dans les exemples ci-après. Exemple 2 : Préparation d’une composition selon l’invention comprenant du lactosérum acide et un extrait d’algue brune de type Ascophyllum Nodosum 15 grammes de lactosérum acide en poudre ont été mis en solution dans 100 mL d’eau afin d’obtenir une solution concentrée en lactosérum acide à 15% en poids sec. 10 gramme de saccharose (sous forme de poudre et solide) a été mis en solution dans 100 mL l’eau afin d’obtenir une solution concentrée en saccharose à 10 % en poids sec. 300 mL d’un d’extrait concentré d’algue brune de type Ascophyllum nodosum (comprenant de 3,5 à 5% en poids sec d’un extrait) obtenu à l’Exemple 1 ont été mélangé à la solution de 100 mL de lactosérum acide et à la solution de 100 mL de saccharose. De l’eau a été ajouté afin d’obtenir une composition finale d’un volume total d’1 litre. La concentration finale en lactosérum acide est de 1,5%, la concentration finale en saccharose est d’un 1 % et la concentration finale en extrait d’algue sec est comprise entre 1 et 1,5 %. Composition sous forme liquide Quantité en poids sec ( %) Quantité en L Extrait d’Algue brune de type Ascophyllum Nodosum (extrait concentré comprenant 3,5 à 5% en matière sèche) 1 à 1,5 % 300 mL Lactosérum acide (solution à 15% en poids sec de lactosérum acide) 1,5 % 100 mL Saccharose (solution à 10 % en poids sec de saccharose) 1 % 100 mL Eau QSP 500 mL Exemple 3 : Effet d’un e solution comprenant du lactosérum acide sur la germination et l’élongation de grains de pollen issus de Solanum lycopersicum Matériel et méthode Des plants de tomates du type Solanum lycopersicum (variété graines de cerasiforme 'West Virginia 106') ont été semés à 1 cm sous la surface du sol stérilisé et cultivés dans une chambre de croissance. Les plants ont été cultivés dans des conditions optimales avec des cycles de 16 h de lumière à une température de 25°C et de 8 h d'obscurité à une température de 22°C. L'humidité relative a été maintenue à 60%, et les plantes ont été arrosées tous les 2 jours. À la floraison, les fleurs ont été récoltées afin de collecter les grains pollens. Culture des grains de pollen et des tubes polliniques Les grains de pollen ont été collectés à partir d’anthères fraîchement déhiscents. Les étamines de cinq fleurs ont été immergés dans 5 mL de milieu BK [1,62 mM H3BO3, 1,25 mM Ca (NO3)2, 4H2O, 2,97 mM KNO3 et 1,65 mM MgSO4, 7H2O] contenant 10% (w/v) de saccharose (Brewbaker et Kwack, 1963). Les grains de pollen ont été mis en suspension dans le milieu BK par vortex et les étamines ont été retirées avec des pincettes. Les tubes polliniques de tomates ont été cultivés dans des plaques à 24 puits (de ThermoFisher), dans l'obscurité, sans agitation, à plusieurs températures: 8, 13, 22°C. Les observations ont été effectuées après 2, 4 et 6 h de croissance. Un grain de pollen a été considéré comme germé lorsque la longueur du tube pollinique dépassait le diamètre du grain de pollen. Procédé de préparation d’une solution de LAA + saccharose : 15 g de poudre de lactosérum acide a été mélange avec 1 L d’eau afin d’obtenir une solution de LAA concentrée à 1,5 % en poids sec (soit 1,5 g pour 100 mL). 10 g de saccharose ont été ajouté à cette solution (soit 1% en poids sec de saccharose ajouté à la solution de LAA, soit 1 g pour 100 mL). Procédé de préparation d’une solution comprena n t un extrait d’ Ascophyllum Nodosum : Une solution aqueuse ayant une concentration de 4% en poids sec d’extrait d’ Ascophyllum nodosum a été préparée. Traitements appliqués : Les traitements suivants ont été ajoutés au milieu de culture des grains de pollen et/ou des tubes polliniques : – Traitement avec une solution de lactosérum acide et saccharose, appelée « LAA + saccharose» préparée selon le procédé décrit ci-dessus. La solution de LAA + saccharose a été diluée avec de l'eau milli-Q pour atteindre une concentration finale de lactosérum acide de 2 µg/mL de milieu BK. – Traitement avec une solution d’eau Milli-Q, utilisée comme contrôle négatif. – Traitement en combinant simultanément une solution de lactosérum acide + saccharose et une solution d’extrait d’ Ascophyllum nodosum . La solution de LAA + saccharose a été diluée avec de l'eau milli-Q pour atteindre une concentration finale de lactosérum acide de 2 µg/mL de milieu BK. La solution d’extrait d’ Ascophyllum nodosum a été diluée avec de l'eau milli-Q pour atteindre une concentration finale en extrait d’ Ascophyllum Nodosum de 2 µg/mL de milieu BK. Paramètres mesurées au microscope Un microscope inversé Leica DMI 6000B équipé de la caméra Leica DFC 450 a été utilisé pour observer l'évolution dans le temps de la germination des grains de pollens et l’élongation du tube pollinique. Le dépôt de bouchons de callose a été observé sous épi-fluorescence à l'aide d'un filtre d'absorption 405 nm et d’un filtre d'émission 523 nm. Le programme ImageJ [11] a été utilisé pour mesurer le taux de germination du tube pollinique, l’élongation du tube pollinique, le nombre de bouchons de callose. Analyses statistiques Les données correspondent à la moyenne de 6 répliques biologiques réalisées à des dates différentes. Les différences significatives entre le contrôle et le traitement ont été déterminées par la méthode ANOVA à un facteur suivi du test de comparaison multiple de Dunnett. Les données sont marquées par des lettres différentes lorsqu'elles diffèrent par rapport aux conditions de contrôle (valeur P Mesure du nombre de germination des grains de pollen, de la longueur des tube s pollinique s et de leur densité Le nombre de grain de pollen ayant germé versus le nombre de grains de pollen non germé ou ayant un tube pollinique éclaté a été compté pour le contrôle, le traitement avec la solution LAA + saccharose, et le traitement avec la solution LAA + saccharose (concentration finale en LAA de 2 µg/mL) en combinaison avec la solution comprenant un extrait d’ Ascophyllum nodosum (concentration finale en extrait d’ Ascophyllum nodosum de 2 µg/mL). Les résultats sont présentés dans le tableau 2 ci-dessous. Il a été observé une augmentation du nombre de grain de pollen pour lequel un tube pollinique « viable » a émergé lorsque la solution LAA + saccharose a été appliquée in vitro sur les grains de pollen de tomates aux températures de 8°C, 13 °C et 22°C. Il a également été observé une augmentation du nombre de grain de pollen pour lequel un tube pollinique « viable » a émergé lorsque la solution LAA + saccharose est appliquée en combinaison avec la solution comprenant un extrait d’ Ascophyllum nodosum , avec notamment 52,99 grains de pollens ayant un tube pollinique viable avec la combinaison LAA + saccharose + extrait d’ Ascophyllum nodosum , 46,91 99 grains de pollens ayant un tube pollinique viable avec la solution LAA + saccharose et 35,91 grains de pollens ayant un tube pollinique viable pour le contrôle. Ces résultats montrent l’effet de l’utilisation du lactosérum acide sur la stimulation de la germination du grain de pollen, ainsi que l’effet de l’association avec le saccharose et l’extrait d’ Ascophyllum nodosum . Température en °C Traitement appliqué Nombre de grain de pollen non germé Nombre de grain de pollen pour lequel un tube pollinique « viable » a émergé Nombre de grain de pollen pour lequel un tube pollinique « éclaté » a émergé 8°C Contrôle 98,30 ± 0,57 0,52 ± 0,28 1,18 ± 0,36 LAA + saccharose 94,08 ± 1,69* 5,05 ± 1,71 0,86 ± 0,30 LAA + saccharose + Extrait d’ Ascophyllum nodosum 99,45 ± 0,30 0,55 ± 0,30 0,00 ± 0,00 13°C Contrôle 61,87 ± 1,94 35,91 ± 1,82 2,22 ± 0,47 LAA + saccharose 50,03 ± 1,85* 46,91 ± 1,82* 3,05 ± 0,59 LAA + saccharose + Extrait d’ Ascophyllum nodosum 45,60 ± 1,88* 52,99 ± 1,72* 1,41 ± 0,56 22°C Contrôle 16,71 ± 2,00 66,95 ± 2,24 16,34 ± 1,48 LAA + saccharose 15,55 ± 2,07 67,23 ± 1,94 17,22 ± 1,40 LAA + saccharose + Extrait d’ Ascophyllum nodosum 14,74 ± 3,71 71,42 ± 2,87 13,84 ± 1,78 La montre l'effet de la température et des traitements sur la morphologie du tube pollinique et la viabilité. À la température optimale de 22°C pour la croissance in vitro de tubes polliniques de tomates, la germination était rapide avec 67% de grains de pollen germés et de tubes polliniques viables après 2 h de culture pour le contrôle (Figures 2C, 2F), et 67% pour le traitement avec la solution LAA + saccharose (Figures 2C, 2I). Le traitement avec la solution LAA + saccharose a favorisé la germination du pollen à 8°C avec une augmentation de la germination des grains de pollen après 4 h (figures 2A, 2D, 2G). Après 6h, 48% des grains de pollen ont germé et les tubes polliniques étaient morphologiquement normaux après l’application du traitement LAA + saccharose par rapport au contrôle (36%) (figure 2A et figures 2D, 2G). Lorsque la germination du pollen et la croissance du tube pollinique ont été effectuées à 13°C, la morphologie et l'intégrité du tube pollinique ont également été très bien préservées (figures 2B, 2E, 2H). Le traitement avec la solution LAA + saccharose a eu des effets positifs sur le nombre de tubes polliniques, à 2, 4 et 6 h de culture (figure 2B) à la température de 13°C. En particulier, après 2 h de culture, le traitement avec la solution LAA + saccharose a permis la germination de 46 % des grains de pollens. Le graphique de densité de la longueur des tubes polliniques après 4 h aux températures de 8, 13 et 22 °C ( ) montre l’effet du traitement avec la solution LAA + saccharose sur l’élongation du tube pollinique. En effet, à une température de 8°C, le tube pollinique a une longueur de 100 µm pour le contrôle, de 150 µm lorsqu'ils sont traités avec la solution LAA + saccharose (figure 3A). A une température de 13°C, le tube pollinique a une longueur de 120 µm pour le contrôle, et était significativement plus élevé lorsqu'ils sont traités avec la solution LAA + saccharose avec une longueur de 150 µm (Figure 3B). A une température de 22°C, le tube pollinique a une longueur de 280 µm pour le contrôle, et était significativement plus élevé lorsqu'ils sont traités avec la solution LAA + saccharose avec une longueur de 300 µm (Figure 3C). La durée nécessaire pour atteindre 50% du taux de germination (valeur D) a été déterminée et les résultats sont présentés dans le tableau 3. Traitement D à 8°C D à 13°C D à 22°C Contrôle 4 h 40 1 h 45 0 h 53 Solution LAA + saccharose 3 h 05 1 h 20 0 h 50 Le traitement avec la solution LAA + saccharose a diminué les valeurs D aux températures testées avec un effet majeur à 8 et 13 ° C. En effet, D 8 ° C et D 13 ° C avec la solution LAA + saccharose étaient respectivement de 3 h 05 et 1 h 20 (tableau 3). Détermination du nombre de bouchons de callose Colorat ion cytochimique des bouchons de callose Les tubes polliniques ont été fixés après une durée de culture correspondant à 4 fois la durée nécessaire pour obtenir 50% du taux de germination le plus élevé du contrôle à chaque température testée (Tableau 4). Le milieu de fixation (100 mM de PIPES, 4 mM MgSO4, 7 H2O, 4 mM EGTA, 10% (w/v) de saccharose et 5% (v/v) de paraformaldéhyde à pH 7,5) a été ajouté au milieu BK et puis incubés pendant une nuit à 4°C avec les tubes polliniques. Les tubes polliniques ont été centrifugés à 4 000 g pendant 7 min. Le culot a été remis en suspension dans 250 µl de milieu BK frais. Traitement 4*D à 8°C 4*D à 13°C 4*D à 22°C Contrôle 18 h 40 7 h 3 h 30 Solution LAA + saccharose 12 h 20 5 h 20 3 h 20 Aux températures de 22°C et 13°C, 0,3% de bleu d'aniline décoloré (DAB) préparé dans un tampon phosphate de 100 mM à pH 12 (Johnson-Brousseau et McCormick, 2004) a été ajouté au milieu à une concentration finale de 0,05%. À 8°C, une double coloration au DAB et au calcofluor blanc a été utilisée aux concentrations finales de 0,05% et 0,1%, respectivement. Les observations ont été effectuées après 2 h d'incubation dans l'obscurité à la température de la pièce. Résultats La montre le nombre de bouchons de callose formés en fonction des traitements appliqués. Le nombre de bouchons de callose est plus élevé lors du traitement avec la solution LAA + saccharose. En condition de culture à une température de 13°C avec le traitement avec la solution LAA + saccharose, le pourcentage de tube pollinique présentant plus de 3 bouchons de callose était de 40 % et le pourcentage de tube pollinique présentant plus de 4 bouchons de callose était de 18 %. En condition témoin à une température de 13°C, le pourcentage de tube pollinique présentant plus de 3 bouchons de callose était de 35% et le pourcentage de tube pollinique présentant plus de 4 bouchons de callose était de 8 %. Ainsi, l’utilisation d’une solution LAA + saccharose sur les pollens et tubes polliniques a permis d’augmenter la formation des bouchons de callose. Mesure de l’expression des gènes CalS par qRT -PCR L’expression génique de quatre séquences de gènes CalS ( ) ( Solyc01g73750.3, Solyc01g006370.3, Solyc11g005980 .2 et Solyc11g005985.1. ) dans le génome de la tomate a été mesurée en utilisant l'analyse TBLASTN [12]. Extraction d'ARN et analyse de l'expression génique L'ARN a été extrait de la culture des grains de pollen de deux fleurs de tomate dans 2 ml de milieu de germination BK pour chaque traitement (témoin, solution LAA) à 8, 13, et 22 ° C. Les échantillons ont été collectés à D8°C, D13°C et D22°C (tableau 3). Au début, le milieu de germination BK a été retiré de la culture des grains de pollen après centrifugation et remplacé par 1 ml de NucleoZOL (Macherey-Nagel, Düren, Allemagne). Les tubes polliniques ont ensuite été fendus par flux-reflux et vortexés. L'extraction de l'ARN total a été réalisée utilisant le Nucleospin® RNA du kit NucleoZOL en suivant le protocole du fabricant (Macherey- Nagel, Düren, Allemagne). La qualité de l'ARN extrait a été vérifiée en 4200 Tapestation (Agilent Technologies, CA, USA), suivie d'un traitement à la DNase (kit Turbo DNA-free®) et la synthèse d'ADNc à partir de 1 μg d'ARN, à l'aide du kit de synthèse d'ADNc clair iScript ™ gDNA (Bio-Rad, CA,ETATS-UNIS). Les échantillons d'ADNc dilués ont été utilisés pour étudier l'expression génique par PCR quantitative en temps réel (CFX384 Touch ™, Bio-Rad, CA, USA) dans un volume total de 10 μl en utilisant la technologie « SoAdvanced Universal SYBR Green Supermix » (Bio-Rad, CA, États-Unis). Toutes les réactions qPCR ont été réalisées en technique triple utilisant des réactions d'ADNc indépendantes pour chacun des six réplicats biologiques et 300 nM de paires d'amorces spécifiques au gène. Le protocole de cyclage thermique comprenait une seule étape d'activation de la polymérase à 98 ° C pendant 3 min suivi de 40 cycles d'amplification, une étape finale d'extension à 72 ° C pendant 5 min également comme analyse de la courbe de fusion. Chaque cycle d'amplification comprenait une étape de dénaturation à 98 ° C pendant 15 s, une étape de recuit de l'amorce pendant 30 s et une brève extension à 72 ° C pendant 15 s. Pour chaque paire d'amorces, l'efficacité des amorces a été déterminée en effectuant une analyse de courbe standard en utilisant des dilutions en série. Les données d'expression ont été acquises et analysées à l'aide du logiciel CFX Maestro version 1.1 (Bio-Rad, CA, ETATS-UNIS). Les amorces spécifiques pour tous les gènes candidats et de référence sont répertoriées dans le tableau 5. Gène Sequence Id Amorce CalsS cDNA XM_019211256.2 Solyc11g005980.2 Amorce directe : CGTCGAGTCTTGCTTCTCGT (SEQ ID NO : 1) Amorce indirecte : AGCTGAGCTCTGTCTGCTTG (SEQ ID NO: 2) CalsS cDNA XM_004228545.4 Solyc11g005985.1 Amorce directe : AGTGGGAAGAACAGCTTCGG (SEQ ID NO : 3) Amorce inverse : CTTCTCCGTGCTTCGAGGTT (SEQ ID NO : 4) CalsS cDNA XM_026029202.1 Solyc01g006370.3 Amorce directe : AAGTGATTGCACGGGAAGC (SEQ ID NO : 5) Amorce inverse : CTGAAGCAGTCCACTGACCA (SEQ ID NO : 6) CalsS cDNA XM_026031249.1 Solyc01g073750.3 Amorce directe : AGGAGGATTATGGAGTTGCTG (SEQ ID NO : 7) Amorce inverse : GCAACTTCCTCTTAACTTTACCAAA (SEQ ID NO : 8) Résultats L'effet des contraintes de froid ne s'est pas accompagné de fortes variations de l’expression des gènes CalS dans la condition témoin. Les résultats présentés en montrent une variation de l’expression des gènes CalS par rapport à la condition témoin lorsque la solution LAA + saccharose a été appliquée, quel que soit la température. On observe notamment une augmentation de l’expression du gène Solyc01g006370.3. Ainsi, l’utilisation de la solution LAA + saccharose sur les grains de pollens et les tubes polliniques a permis d’augmenter de façon globale l’expression des gènes impliqués dans la biosynthèse de callose à différentes températures extérieures, notamment les gènes codant pour les enzymes de type callose synthase CalS et callose synthase-like CalS like. Exemple 4 : Mise en évidence des effets de l’utilisation du lactosérum acide sur des abricotiers Protocole expérimental L’essai s’est déroulé sur une parcelle d’abricotiers plantés en 2007 ( Prunus armeniaca ; variété Mele Cot). Cet essai vise à démontrer l’effet du lactosérum acide sur le développement du fruit, notamment lors de la nouaison, phase initiale de la formation du fruit. Le rendement de la récolte a été mesuré. Cinq arbres de la variété Mele Cot greffés sur porte-greffe Mirabolan (variété connue pour avoir un faible taux de formation du fruit après la reproduction sexuée chez l'abricotier) ont été utilisés. Pour cet essai, deux traitements apportés en pulvérisation foliaire ont été comparés : - un traitement consistant en une solution LAA + saccharose : 15 g de lactosérum acide sous forme poudre a été dissout dans 1 L d’eau et mélangée à 10 g de saccharose sous forme de poudre (soit une solution comprenant 1,5% en poids sec de lactosérum acide et 1% en poids sec de saccharose par rapport au poids total de la solution). Trois applications de la solution LAA + saccharose à une concentration de 2L/ha ont été réalisées au stade phénologique BBCH 59,64 et 69 des arbres. - un traitement témoin pour lequel de l'eau a été appliqué en pulvérisation foliaire aux mêmes stades phénologiques (à savoir BBCH 59,64 et 69). Les abricotiers ont été traités avec un traitement phytosanitaire usuel pour éviter la destruction de la récolte par des parasites. Les abricots ont ensuite été récoltés au stade BBCH99. Résultats Le pourcentage de nouaison (à savoir le nombre de fruits formés) a été calculé pour chacun des deux traitements. Les résultats obtenus sont présentés en . Les résultats montrent que lorsque la solution LAA + saccharose a été appliquée, le pourcentage de nouaison déterminé à BBCH 73 a augmenté, passant de 6,9% pour la condition témoin à 8,5% pour la solution LAA + saccharose. Le poids moyen des abricots à la récolte a été calculé pour chacun des deux traitements. Les résultats obtenus sont présentés en . Les résultats montrent que lorsque la solution LAA + saccharose est appliquée, le poids moyen des abricots à la récolte déterminé à BBCH 99 a augmenté, passant de 58 grammes pour la condition témoin à 70 grammes pour la solution LAA+ saccharose. Enfin, le rendement à la récolte a été calculé pour chacun des deux traitements. Les résultats obtenus sont présentés en . Les résultats montrent que lorsque la solution LAA + saccharose a été appliquée, le rendement à la récolte déterminé à BBCH 99 a augmenté, passant de 4,1 tonnes pour la condition témoin à 4,25 tonnes pour la solution LAA + saccharose. Exemple 5 : Mise en évidence des effets de l’utilisation de lactosérum acide sur la vigne . Protocole expérimental L’essai s’est déroulé sur une parcelle de vignes plantées en 2003 ( Vitis vinifera ; variété Sugraone ). Cet essai vise à démontrer l’effet du lactosérum acide en combinaison avec un extrait d ’ Ascophyllum nodosum sur le rendement et la qualité de la baie de raisin de table à la récolte. Pour cet essai, deux traitements apportés en pulvérisation foliaire ont été comparés : - un traitement consistant en une solution LAA + saccharose: 15 g de lactosérum acide sous forme poudre a été dissout dans 1 L d’eau et mélangée à 10 g de saccharose sous forme de poudre (soit une solution comprenant 1,5% en poids sec de lactosérum acide et 1% en poids sec de saccharose par rapport au poids total de la solution). Trois applications de la solution LAA + saccharose à une concentration de 2 L/ha ont été réalisées au stade phénologique BBCH 59,64 et 69 des pieds de vigne. - un traitement témoin pour lequel de l'eau a été appliqué en pulvérisation foliaire en encadrement de la floraison au stade phénolique BBCH 57, 65 et 69. Sept pieds de vigne ont été traités pour chaque modalité. Les pieds de vignes ont été traités avec un traitement phytosanitaire usuel pour éviter la destruction de la récolte par des parasites. Les grappes et baies de raisin ont ensuite été récoltées au stade 99. Résultats Le nombre de grappes par pied de vignes, à la récolte, a été déterminé pour chacun des trois programmes. Les résultats obtenus sont présentés en . Ils montrent que chez le témoin, 8,12 grappes ont été dénombrées en moyenne par pied de vigne. Lorsque la solution LAA + saccharose a été appliquée, le nombre de grappes dénombré était de 8,78 par pied de vigne. Le rendement des baies à la récolte, a été déterminé pour chacun des deux programmes. Les résultats obtenus sont présentés en . Ils montrent que chez le témoin, le rendement des baies par parcelle était de 53,98 kg (soit 15,93 tonnes par hectare). Lorsque la solution LAA + saccharose a été appliquée, le rendement par parcelle était de 54,68 kg (soit 16,140 tonnes par hectare). Exemple 6 : Mise en évidence de l’utilisation de lactosérum acide en combinaison avec un extrait d’ Ascophyllum nodosum sur des poirier s . Protocole expérimental L’essai s’est déroulé sur une parcelle de poiriers plantées en 2003 poirier ( Pyrus communis ; variété Concorde ). Cet essai vise à démontrer l’effet du lactosérum acide en combinaison avec un extrait d ’ Ascophyllum nodosum sur le rendement et la qualité de la poire. Six arbres de la variété Concorde, ont été utilisés. Pour cet essai, trois traitements apportés en pulvérisation foliaire ont été comparés : - un traitement consistant en une solution LAA + saccharose : 15 g de lactosérum acide sous forme poudre a été dissout dans 1 L d’eau et mélangée à 10 g de saccharose sous forme de poudre (soit une solution comprenant 1,5% en poids sec de lactosérum acide et 1% en poids sec de saccharose par rapport au poids total de la solution). Trois applications de la solution LAA + saccharose à une concentration de 2 L/ha ont été réalisées au stade phénologique BBCH 59,64 et 69 des arbres. - un traitement consistant en une solution LAA + saccharose + algue qui correspond à la solution de l’Exemple 2 a été appliquée. Trois applications de la solution LAA + saccharose + algue (préparée selon l’Exemple 2) à une concentration de 2 L/ha ont été réalisées au stade phénologique BBCH 59, 64 et 69 des arbres. - un traitement témoin pour lequel de l'eau a été appliqué en pulvérisation foliaire en encadrement de la floraison au stade phénologique BBCH 59, 64 et 69 des arbres. Les poiriers ont été traités avec un traitement phytosanitaire usuel pour éviter la destruction de la récolte par des parasites. Les poires ont ensuite été récoltées à BBCH99. Résultats Le nombre de fruit obtenu par parcelle, à la récolte, a été déterminé pour chacun des trois traitements. Les résultats obtenus sont présentés en . Ils montrent que chez le témoin, 10 kg de poire ont été produits par parcelle, alors que lorsque la solution de LAA + saccharose a été appliquée en combinaison avec l’extrait d’ Ascophyllum Nodosum , 12 kg de poires ont été produits par parcelle. Le poids moyen des fruits à la récolte a été déterminé pour chacun des trois traitements. Les résultats obtenus sont présentés en . Ils montrent que dans la condition témoin, le poids moyen d'un fruit était de 116,47 grammes. Lorsque la solution LAA + saccharose a été appliquée, le poids moyen d'un fruit était alors de 117,58 grammes. Enfin, lorsque l'extrait d’ Ascophyllum Nodosum a été apporté avec la solution LAA + saccharose, le poids moyen d’un fruit était de 131,77 grammes. Cela montre donc bien l’effet synergique de la combinaison du lactosérum acide avec un extrait d’ Ascophyllum Nodosum sur le poids des fruits à la récolte. BIBLIOGRAPHIE 1. Lamaoui et al., 2018 2. GIEC 2014, Hoegh-Guldberg et al., 2018 3. Zamir et al., 1981; 4. Kakani et al., 2002; 5. Boavida et McCormick, 2007 6. Prasad et al., 2006 7. Zamir et al., 1982 8. Clarke et Siddique, 2004 9. Porch et Jahn , 2001 10. Kakani et al., 2002 11. Abramoff et al., 2004 12. Altschul et al., 1997 Utilisation d’un lactosérum acide sous forme liquide, pour stimuler la germination d’un grain de pollen d’une plante et/ou pour stimuler l’élongation du tube pollinique dudit grain de pollen. Procédé pour stimuler la germination d’un grain de pollen d’une plante et/ou pour stimuler l’élongation du tube pollinique dudit grain de pollen, dans lequel un lactosérum acide sous forme liquide est appliqué à la plante dans une quantité suffisante pour stimuler la germination du grain de pollen et/ou pour stimuler l’élongation du tube pollinique dudit grain de pollen. Utilisation selon la revendication 1 ou procédé selon la revendication 2, dans lequel/laquelle la plante est en condition de stress thermique. Utilisation ou procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel/laquelle le lactosérum acide présente un pH allant de 2 à 5,5, de préférence un pH allant de 4 à 5. Utilisation ou procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel/laquelle le lactosérum acide est appliqué par pulvérisation sur la plante. Utilisation ou procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel/laquelle le lactosérum acide est appliqué à la plante au moment de la floraison de la plante. Utilisation ou procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel/laquelle le lactosérum acide augmente la vitesse d’élongation du tube pollinique d’au moins 5%, avantageusement d’au moins 10%, au moins 15%, au moins 20%, au moins 25%, au moins 30%, au moins 40%, au moins 50% par rapport à un grain de pollen non traité avec le lactosérum acide. Utilisation ou procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel/laquelle le lactosérum acide est appliqué en association avec du saccharose. Utilisation ou procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel/laquelle le lactosérum acide est appliqué en association avec un extrait d’algue brune, préférentiellement un extrait d’ Ascophyllum nodosum . Composition comprenant (i) un lactosérum acide et (ii) un extrait d’algue brune. Composition selon la revendication 10, comprenant en outre (iii) du saccharose. Composition selon l’une quelconque des revendications 10 ou 11, dans laquelle (ii) l’extrait d’algue brune est choisi parmi un extrait d’ Ascophyllum nodosum , un extrait de Fucus serratus, un extrait de Fucus vesiculosus , un extrait de Laminaria hyperborea , un extrait de Laminaria saccharina , un extrait de Laminaria digitata , un extrait de Laminaria japónica , un extrait de Ecklonia máxima , un extrait de Macrocystis pyrifera , un extrait de Himanthalia elongata ou un extrait de Sargassum spp , préférentiellement un extrait d’ Ascophyllum nodosum . Composition selon l’une quelconque des revendications 10 à 12, dans laquelle - la teneur en lactosérum acide est comprise entre 0,5 % et 25 % en poids sec par rapport au poids sec de la composition, de préférence entre 1 % et 10 %, de préférence encore entre 1 % et 5 %, par exemple 1,5 %, - la teneur en extrait d’algue brune est comprise entre 0,5 % et 25 % en poids sec par rapport au poids sec de la composition, de préférence entre 1% et 10 %, de préférence encore entre 0,5 et 5 %, par exemple entre 0,5 % et 2 %, par exemple entre 1% et 1,5 %, et/ou - la teneur en saccharose est comprise entre 0,5 % et 25 % en poids sec par rapport au poids sec de la composition, de préférence entre 1% et 10 %, de préférence encore entre 1 et 5%, par exemple 1 %. Procédé pour stimuler la germination d’un grain de pollen d’une plante et/ou pour stimuler l’élongation du tube pollinique dudit grain de pollen, dans lequel la composition selon l’une quelconque des revendications 10 à 13 est appliquée sous forme liquide à la plante dans une quantité suffisante pour stimuler la germination du grain de pollen et/ou pour stimuler l’élongation du tube pollinique du grain de pollen.