Brevet FR3117599A1 — publié le 20220617

M éthode de pronostic et/ou de diagnostic d’un état pelliculaire du cuir chevelu La présente invention concerne une méthode de pronostic et/ou de diagnostic d’un état pelliculaire du cuir chevelu, basée sur la mesure de la quantité de la forme active de la transglutaminase 3. La présente invention porte également sur une méthode traitement cosmétique du cuir chevelu, une méthode d’identification de composés permettant la réduction et/ou l’élimination de l’état pelliculaire. Enfin la présente invention concerne un kit et son utilisation pour l’identification d’un composé permettant la réduction et/ou l’élimination de l’état pelliculaire. Figure pour l'abrégé : néant Méthode de pronostic et/ou de diagnostic d’un état pelliculaire du cuir chevelu La présente invention concerne une méthode de pronostic et/ou de diagnostic d’un état pelliculaire du cuir chevelu, basée sur la mesure de la quantité de la forme active de la transglutaminase 3. La présente invention porte également sur une méthode traitement cosmétique du cuir chevelu, une méthode d’identification de composés permettant la réduction et/ou l’élimination de l’état pelliculaire. Enfin la présente invention concerne un kit et son utilisation pour l’identification d’un composé permettant la réduction et/ou l’élimination de l’état pelliculaire. La peau, et notamment le cuir chevelu, est un épithélium à renouvellement continuel. Le renouvellement, ou desquamation, est un processus coordonné et finement régulé aboutissant à l'élimination des cellules superficielles, de façon insensible et non visible. Toutefois, une desquamation anormale ou irrégulière des cellules du stratum corneum, pour diverses raisons, peut conduire à la formation d'amas de cellules de grandes tailles, épais, visibles à l'œil nu, et dénommés « squames », ou « pellicules » dans le cadre du cuir chevelu, ou dans d'autres situations, à un amincissement du stratum corneum. A titre d'exemple de facteurs favorisant l'apparition de squames ou de pellicules, on peut mentionner le stress, la période hivernale, un excès de sébum, un défaut d'hydratation, et/ou la colonisation de la peau ou des follicules pileux par la levure Malassezia sp. . En particulier, les levures de type Malassezia sp. , constituant une partie de la flore commensale normale à la surface du cuir chevelu chez des sujets sans pellicule, voient leur proportion croître substantiellement en cas de pellicule. La présence de squames ou les états pelliculaires peuvent être des états chroniques, fréquents, récidivants, et socialement invalidants du fait de leur caractère inesthétique manifeste. Qui plus est, les états pelliculaires du cuir chevelu ou la desquamation anormale de la peau peuvent se traduire par des sensations de démangeaison, conduisant à des comportements de grattage amplifiant le phénomène d'apparition de squames ou de pellicules. Les états pelliculaires du cuir chevelu peuvent être de type gras ou de type sec. Les états pelliculaires secs du cuir chevelu se manifestent plus fréquemment. Le cuir chevelu étant riche en glandes sébacées, un état pelliculaire peut se développer plus facilement en présence excessive de sébum. Ainsi, une sécrétion excessive de sébum, ou hyperséborrhée, favorise l'apparition d'un état pelliculaire gras du cuir chevelu, ou pellicules grasses, généralement associé à des désagréments, des sensations d'inconfort et des désordres esthétiques. Les états pelliculaires répondent, en général, à différents traitements locaux ou systémiques. Cependant, l'efficacité de ces traitements n'est que suspensive et implique souvent un suivi rigoureux de la part de l'utilisateur (fréquence d'utilisation et temps d'application suffisant). Or, un usage quotidien et à long terme de ces traitements peut entraîner un phénomène d'accoutumance réduisant leur efficacité, et généralement associée à un phénomène de rebond survenant à la cessation du traitement. Ce phénomène se manifeste par une hyperséborrhée, aggravant l'état pelliculaire. Par ailleurs, l'agressivité de certains actifs antipelliculaires vis-à-vis des cellules épidermiques ou de l'écoflore du cuir chevelu peut également provoquer une aggravation de l'état pelliculaire. De nombreux facteurs épidermiques, dont l'expression, l'activité biologique ou la maturation sont altérées, diminuées ou augmentées, sont connus pour être impliqués, directement ou indirectement, dans le processus de renouvellement, ou de desquamation de la peau, et notamment du cuir chevelu. Toutefois, il demeure encore de nombreuses inconnues quant au mécanisme intime et aux facteurs impliqués dans la desquamation de la peau, et en particulier dans l'apparition des pellicules. Il existe donc un besoin de disposer de nouveaux biomarqueurs permettant la caractérisation d’un état pelliculaire du cuir chevelu ou la prédiction de l’apparition d’état pelliculaire, permettant notamment d’anticiper les rechutes. La présente invention vise à répondre à ce besoin. La présente invention résulte de la découverte inattendue des inventeurs que la quantité de la forme active de la transglutaminase 3 (TGM3) était liées à l’état pelliculaire dans un cuir chevelu. Ils ont en effet montré une augmentation significative de la quantité de la forme active de TGM3 dans des échantillons de cuir chevelu pelliculaire par rapport au cuir chevelu normal. La TGM3 catalyse la formation de liaisons croisées isopeptidiques entre les résidus glutamine et lysine dans diverses protéines, ainsi que la conjugaison de polyamine aux protéines. Dans les follicules pileux, elle est impliquée dans la réticulation des protéines structurelles permettant de durcir la gaine interne de la racine. La TGM3 est codée par un gène de 42,8 kb contenant 13 exons. Il est situé sur le chromosome 20: 2 296 001-2 341 079, sur le brin sens. La TGM3 est produite sous forme d’une proforme ayant pour séquence en acides aminés la séquence SEQ ID NO : 3, de 693 acides aminés (et ayant pour séquence nucléotidique SEQ ID NO : 4). Cette enzyme est activée par traitement protéolytique de la proforme, générant la forme active. La forme active ainsi produite a pour séquence en acides aminés la séquence SEQ ID NO : 1 de 470 acides aminés (et pour séquence nucléotidique SEQ ID NO : 2). L’expression de la proforme de TGM3 a été identifiée par spectrométrie de masse comme étant diminuée dans les scalps pelliculaires par rapport au scalps normaux (Cavusoglu et al. , Archives of Dermatological Research volume 308, pages 631–642(2016). Cependant, les inventeurs ont ici découvert que la quantité de la forme active, détectable par un simple test Elisa, était augmentée et non diminuée dans les cuirs chevelus pelliculaires. Or il n’y a pas de corrélation directe entre la quantité de la proforme et la quantité de la forme active d’une protéine, ces deux quantités étant dépendantes de divers facteurs (tel que la vitesse de production de la proforme, la vitesse de conversion de la proforme en forme active, la vitesse de dégradation de la proforme et la vitesse de dégradation de la forme active). La présente invention concerne ainsi une méthode de pronostic et/ou diagnostic d’un état pelliculaire du cuir chevelu, chez un sujet, ladite méthode comprenant l’étape suivante : mesurer la quantité de la forme active de la transglutaminase 3 (TGM3), dans un échantillon de cuir chevelu dudit sujet. La présente invention a également pour objet une méthode de prévention et/ou de traitement cosmétique du cuir chevelu présentant un état pelliculaire chez un sujet, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : mesurer la quantité de la forme active de la TGM3, dans un échantillon de cuir chevelu dudit sujet ; déduire de l’étape a) si le cuir chevelu dudit sujet présente un état pelliculaire ou si le cuir chevelu dudit sujet est susceptible de développer un état pelliculaire ; si le cuir chevelu est identifié comme présentant un état pelliculaire ou comme étant susceptible de développer un état pelliculaire à l’étape b), traiter ledit cuir chevelu avec une composition cosmétique contre l’état pelliculaire. La présente invention concerne aussi une méthode d’identification d’un composé permettant la prévention et/ou la réduction et/ou l’élimination de l’état pelliculaire d’un cuir chevelu, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : mesurer la quantité de la forme active de la TGM3, dans un échantillon de cuir chevelu exposé audit composé candidat; comparer ladite quantité mesurée à l’étape a) à la quantité de la forme active de la TGM3 dans un échantillon de cuir chevelu non exposé audit composé ; identifier ledit composé candidat comme un composé permettant la prévention et/ou la réduction et/ou l’élimination de l’état pelliculaire d’un cuir chevelu lorsqu’une diminution de la quantité de la forme active de la TGM3 dans l’échantillon de cuir chevelu qui a été exposé audit composé candidat est détectée, par rapport à la quantité de la forme active de la TGM3 dans l’échantillon de cuir chevelu qui n’a pas été exposé au composé candidat. La présente invention a également pour objet un kit comprenant : un moyen pour la mesure dans un échantillon de cuir chevelu, de la quantité de la forme active de la TGM3, et une notice d’instructions. La présente invention concerne aussi l’utilisation d’un kit selon l’invention pour l’identification d’un composé permettant la prévention et/ou la réduction et/ou l’élimination de l’état pelliculaire d’un cuir chevelu. La présente la régression linéaire basée sur le logarithme des mesures moyennes de TGM3 par rapport au score global de l’état pelliculaire. Le logarithme des mesures moyennes de TGM3 est en ordonnée et le score pelliculaire est en abscisse. La présente la courbe ROC de l’utilisation du logarithme de la quantité de TGM3 pour détecter les états pelliculaires du cuir chevelu. Exemples : Exemple 1 : Développement d'anticorps humains recombinants dirigés contre TGM3 et sélection d'une paire d'anticorps Des anticorps humains recombinants hautement spécifiques contre TGM3 ont été générés en utilisant la technologie HuCAL® de Bio-Rad AbD Serotec. En bref, une banque HuCAL® contenant 4,5 x 10 10 anticorps, qui sont présentés sur des particules de phage, a été criblée avec 200 µg de la forme active de la protéine TGM3 recombinante humaine. Trois cycles d'amplification ont été effectués dans E. coli en utilisant un phage auxiliaire pour enrichir le phage d'anticorps sélectionné. L'ADN des phages d'anticorps sélectionnés a été rassemblé et sous-cloné dans un vecteur d'expression Fab - format Fab-A_FSx2 - anticorps de fusion Fab bivalent - phosphatase alcaline bactérienne, suivi par FLAG® et un marqueur His6. Après transformation et expression dans E. coli, l'ADN des clones positifs a été sélectionné et séquencé pour identifier des clones d'anticorps uniques. Chaque clone unique a été exprimé dans E. coli et purifié par chromatographie d'affinité. L'affinité et la spécificité de chaque anticorps ont été évaluées par ELISA direct, en utilisant une TGM3 recombinante et en utilisant des antigènes et des marqueurs non apparentés. Exemple 2 : Test S andwich basé sur l'anticorps TGM3 Cartouches microfluidiques Des cartouches microfluidiques TGM3 personnalisées ont été utilisées pour mesurer la quantité de TGM3 dans des extraits de protéines solubles à partir d'échantillons de stratum corneum prélevés l'aide d’écouvillon stérile sur le cuir chevelu d'individus avec et sans pellicules. L'anticorps recombinant de capture a été fixé à l'intérieur des rainures microfluidiques (NanoEnTek comme décrit dans le brevet publié FR3023486). Une courbe standard, de 1 à 170 ng/ml a été établie en utilisant une TGM3 recombinante (forme active). Les protéines de l'échantillon sur l’écouvillon stérile ont été solubilisées dans un tampon (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0) et 35 µl ont été injectés à l'intérieur des cartouches microfluidiques. La détection a été réalisée en utilisant des billes fluorescentes revêtues d'un anticorps de détection anti-TGM3. Exemple 3 : Etude clinique Conception de l'étude C’est une étude comparative monocentrée en double aveugle, randomisée, avec 3 groupes parallèles et sous contrôle médical. Un période de 2 semaines sans traitement est suivie de 4 semaines de traitements. Les traitements consistent en l’utilisation d’un shampoing. Trois shampoings sont testés et chaque condition est suivie sur un échantillon de 20 personnes. Les personnes sélectionnées pour l’étude sont des volontaires masculins ou féminins en bonne santé, âgés de 18 à 60 ans inclus, dont la longueur des cheveux est supérieure à 2 cm et de préférence plus courte que la longueur des épaules; présentant un état pelliculaire modéré à sévère du cuir chevelu ; utilisant habituellement un shampooing 3 fois / semaine et souhaitant avoir trois shampooings par semaine au cours de l'étude; Critères d’évaluation Le critère principal est le score global de l'état pelliculaire du cuir chevelu : évaluation des pellicules adhérentes et non adhérentes selon une échelle ordinale allant de 0 à 5 (score total des pellicules allant de 0 à 10), à baseline et après 4 semaines de traitement. Analyse des résultats La concentration de protéine TGM3 a été transformée en échelle logarithmique. Les volontaires ont été classés comme pellicules ‘+’ ou ‘-‘ en fonction de leur score global de l’état pelliculaire (pellicules adhérentes + non adhérentes) de toute la zone du cuir chevelu en suivant ces règles: Pellicules ‘+’ = (score global de l’état pelliculaire)> 2,5 Pellicules ‘-‘ = (score global de l’état pelliculaire) Régression linéaire La représente la régression linéaire basée sur les mesures moyennes de TGM3 par rapport au score global de l’état pelliculaire. L’analyse suggère une bonne corrélation entre la concentration en TGM3 et le score global de l’état pelliculaire avec un coefficient de détermination R 2 de 0,968. Courbe ROC La fonction d’efficacité du récepteur, ou courbe ROC, est un tracé graphique qui illustre la capacité de diagnostic d'un système de classification binaire lorsque son seuil de discrimination varie. Le taux de vrais positifs est également connu sous le nom de sensibilité. Le taux de faux positifs est également appelé probabilité de fausse alarme et peut être calculé comme (1 - spécificité). La représente la courbe ROC de l’utilisation du logarithme de la quantité de TGM3 pour détecter les états pelliculaires. Cette analyse permet de déterminer le seuil qui différencie le plus les deux groupes (avec et sans pellicules) et la sensibilité et la spécificité du biomarqueur. Sur la base de la meilleure sensibilité et spécificité de la courbe ROC, le seuil pour séparer les deux groupes est ici de 10,44 ng/ml de TGM3 (soit 2,346 sur une échelle logarithmique, correspondant au troisième point à partir de la gauche sur la ). Méthode de pronostic et/ou diagnostic d’un état pelliculaire du cuir chevelu, chez un sujet, ladite méthode comprenant l’étape suivante : mesurer la quantité de la forme active de la transglutaminase 3 (TGM3), dans un échantillon de cuir chevelu dudit sujet. Méthode de prévention et/ou de traitement cosmétique du cuir chevelu présentant un état pelliculaire chez un sujet, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : mesurer la quantité de la forme active de la TGM3, dans un échantillon de cuir chevelu dudit sujet ; déduire de l’étape a) si le cuir chevelu dudit sujet présente un état pelliculaire ou si le cuir chevelu dudit sujet est susceptible de développer un état pelliculaire ; si le cuir chevelu est identifié comme présentant un état pelliculaire ou comme étant susceptible de développer un état pelliculaire à l’étape b), traiter ledit cuir chevelu avec une composition cosmétique contre l’état pelliculaire. Méthode d’identification d’un composé permettant la prévention et/ou la réduction et/ou l’élimination de l’état pelliculaire d’un cuir chevelu, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : mesurer la quantité de la forme active de la TGM3, dans un échantillon de cuir chevelu exposé audit composé candidat; comparer ladite quantité mesurée à l’étape a) à la quantité de la forme active de la TGM3 dans un échantillon de cuir chevelu non exposé audit composé ; identifier ledit composé candidat comme un composé permettant la prévention et/ou la réduction et/ou l’élimination de l’état pelliculaire d’un cuir chevelu lorsqu’une diminution de la quantité de la forme active de la TGM3 dans l’échantillon de cuir chevelu qui a été exposé audit composé candidat est détectée, par rapport à la quantité de la forme active de la TGM3 dans l’échantillon de cuir chevelu qui n’a pas été exposé au composé candidat. Méthode selon la revendication 3, dans laquelle ledit échantillon de cuir chevelu consiste en une culture de cellules issues d’une peau présentant des poils ou d’un cuir chevelu, des cellules issues d’une peau présentant des poils ou d’un cuir chevelu, un cuir chevelu complet reconstruit ou un explant de cuir chevelu humain. Méthode selon l’une des revendications 1 à 4, dans laquelle l’échantillon de cuir chevelu est prélevé en frottant la surface de cuir chevelu ou en utilisant une surface adhésive. Méthode selon l’une des revendications 1 à 5, dans laquelle la quantité de la forme active de la TGM3 est mesurée à l’aide d’un ligand spécifique de la forme active de la TGM3. Kit comprenant : un moyen pour la mesure dans un échantillon de cuir chevelu, de la quantité de la forme active de la TGM3, et une notice d’instructions. Kit selon la revendication 7, dans lequel le moyen pour la mesure, dans un échantillon de cuir chevelu, de la quantité de la forme active de la TGM3, comprend un ligand spécifique de la forme active de la TGM3. Kit selon l’une des revendications 7 à 8, dans lequel le moyen pour la mesure dans un échantillon de cuir chevelu comprend un test immunochromatographique. Utilisation d’un kit selon l’une des revendications 7 à 9 pour l’identification d’un composé permettant la prévention et/ou la réduction et/ou l’élimination de l’état pelliculaire d’un cuir chevelu.