Brevet FR3124510A1 — publié le 20221230

La présente invention décrit de nouveaux peptides synthétiques qui sont des inhibiteurs de phosphorylation de c-Fos par les kinases ERK1/2. Une composition pharmaceutique contenant lesdits peptides ainsi que leur utilisation en tant que médicaments sont également décrites. Une méthode d’identification de nouveaux inhibiteurs de phosphorylation de c-Fos par ERK1/2 est également décrite. Nouveaux inhibiteurs de phosphorylation de Fos par ERK1/2 La présente invention décrit de nouveaux peptides synthétiques qui sont des inhibiteurs de phosphorylation de c-Fos par les kinases ERK1/2. Une composition pharmaceutique contenant lesdits peptides ainsi que leur utilisation en tant que médicaments sont également décrites. Une méthode d’identification de nouveaux inhibiteurs de phosphorylation de c-Fos par ERK1/2 est également décrite. ARRIERE PLAN TECHNOLOGIQUE Les MAP kinases (pour « Mitogen-Activated Protein kinase ») ERK1 et ERK2 (ERK pour « Extracellular signal-Regulated Kinase ») sont des enzymes dont la fonction est d’ajouter des groupements phosphate à des protéines cibles afin de les activer. Ce sont des protéines ubiquitaires impliquées dans de nombreuses fonctions cellulaires. Elles ont un rôle primordial dans la transduction de signaux intracellulaires. Leur activation se fait par des signaux extracellulaires qui agissent sur des récepteurs membranaires pour induire l’activation en cascade de différents acteurs intracytoplasmiques, en amont de ERK1/2, en particulier les protéines Ras, Raf et MEK ; on parle également de voie de signalisation Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2. Les MAP kinases de type ERK ont de nombreux substrats intracellulaires, membranaires, cytoplasmiques ou nucléaires (Yang et al., Trends Pharmacol. Sci. 2019 Nov;40(11):897-910 ) et c’est l’amplitude et la durée des activations de la cascade de signaux intracellulaire qui va diriger ERK1/2 vers l’un de ses substrats. Dans les cancers chez l’humain, la voie de signalisation Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2 semble être l’une des voies de transduction les plus perturbées. Ainsi, consécutivement à des mutations des protéines Ras, Raf ou MEK rencontrées dans une grande variété de cancers, une activité aberrante de ERK1/2 conduit à des proliférations cellulaires et une mobilité anarchiques des cellules. Il est donc logique de développer des inhibiteurs de cette voie de signalisation en vue de ralentir voire de stopper cette perturbation. De nombreux inhibiteurs des MAP kinase de type ERK ont été développés. Ils ciblent en général la voie Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2 en amont de ERK ce qui bloque totalement son activité et sa liaison à ses divers substrats en aval. À titre d’exemple on citera PD98059 (2'-amino-3'-méthoxyflavone) et U0126 (1,4-Diamino-2,3-dicyano-1,4-bis(2-aminophenylthio) butadiène), le Trametinib (GSK1120212), le Cobimetinib (GDC0973), le Mirdametinib (PD0325901) ou le Selumetinib (AZD6244) qui sont des inhibiteurs spécifiques des MEKs. Les inhibiteurs spécifiques des kinases en amont des MAP kinases de type ERK bloquent la voie de signalisation Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2 mais comme leur action se situe en amont des MAP kinases de type ERK, ceci résulte en une inhibition complète des MAP kinases de type ERK, et par conséquent de tous les substrats en aval, sans discrimination entre ceux-ci et sans distinction de leur localisation cellulaire. Être capable d’agir au niveau de l’interaction entre la MAP kinase de type ERK et son substrat, donc en aval de la voie de signalisation intracellulaire ERK permet de bloquer la voie de signalisation ERK de façon spécifique tout en autorisant ses autres fonctions, notamment sur l’homéostasie cellulaire normale. Dans EP1693458 les inventeurs ont mis en évidence des peptides synthétiques permettant l’inhibition sélective de la voie des MAP kinases de type ERK envers un substrat donné. Les différents substrats de ERK1/2 présentent des séquences consensus dites sites de fixation ou de docking, connues de l’homme de l’art, qui permettent la fixation de ERK1/2 sur ses substrats. Ces séquences sont connues sous les termes, DEF et/ou FXFP et D ou LXL (voir EP1693458). Le domaine de liaison DEF des substrats spécifiques de ERK1/2 est responsable du recrutement de ERK1/2 vers les gènes à expression précoce immédiate (ou gène immédiat précoce) et les facteurs de transcription (voir EP1988169). Ce domaine de liaison DEF peut fixer des peptides ayant une séquence consensus de type FXFP ou (F/Y)X(F/Y)P dans lequel F désigne la Phénylalanine (Phe) Y designe la Tyrosine (Tyr), P la Proline (Pro) et X n’importe quel aminoacide naturel (Sharrocks et al., Trends Biochem Sci. 2000 Sep;25(9):448-53 ). Le domaine D est indispensable à l’activation de différentes séries de substrats, incluant RSK (pour 90 kDA ribosomal S6 kinase) et les phosphatases (MAP kinases Phosphatases ou MPK). C’est également le site de liaison des MEK1/2 qui sont situées en amont de ERK1/2 dans la cascade de signalisation intracellulaire. De nombreuses équipes développent des inhibiteurs de MEK1/2 dans le but de proposer des solutions thérapeutiques dans diverses pathologies et notamment en oncologie, dans les troubles du système nerveux central et dans l’inflammation. On citera à titre d’exemple d’inhibiteurs de MEK1/2 qui sont ou ont été étudiés durant des essais cliniques Selumetinib, Refametinib, Cobimetinib, Trametinib (Samatar et al., Nat Rev Drug Discov. 2014 Dec;13(12):928-42 ). Ces inhibiteurs de MEK1/2 ont un effet global sur l’inhibition de ERK1/2 et de ses substrats et ils ont ainsi un effet pleïotrope, non spécifique et délétère. Les essais cliniques en cours montrent notamment que les effets secondaires sont nombreux en fonction des doses administrées et qu’une résistance au médicament s’installe. Les peptides contenant le domaine DEF d’un substrat spécifique en aval de ERK inhibent la liaison et la phosphorylation dudit substrat sans impacter les autres activités de ERK1/2 ou la phosphorylation d’autres substrats. Il y a donc beaucoup moins d’effets secondaires de cette inhibition dans la transduction du signal intracellulaire ERK1/2. Le brevet EP1988167 décrit l’utilisation de peptides de type TAT-DEF, capables de pénétrer dans les cellules, en tant qu’inhibiteurs spécifiques de substrats en aval de ERK. La présente invention décrit de nouveaux peptides qui sont des inhibiteurs de la phosphorylation de Fos par ERK1/2 et qui sont dérivés de ceux décrits dans EP1988167. Ces nouveaux peptides synthétiques sont modifiés afin de les rendre plus stables et plus efficaces que ceux décrits dans EP1988167. Les inventeurs ont utilisé la modélisation 3D in silico de la poche de fixation du domaine d’ancrage de ERK2 envers des substrats contenant le domaine DEF de façon à pouvoir positionner des ligands connus, en particulier des peptides TAT-DEF-Fos selon le brevet EP1988169 et caractériser leur interaction avec cette poche de fixation. Ceci permet de définir les positions essentielles et non essentielles dans la liaison de peptides connus, en particulier des peptides de type TAT-DEF-Fos au domaine d’ancrage DEF de ERK2 et d’optimiser de potentiels inhibiteurs de phosphorylation de Fos par ERK1/2. Cette étude permet d’optimiser les peptides contenant des domaines TAT-DEF-Fos (SEQ ID N°1) soit par stabilisation et notamment par D-racémisation des aminoacides non essentiels à la liaison, soit par suppression des aminoacides non essentiels à la liaison, soit encore de combiner ces différentes modifications, et enfin d’envisager de nouveaux inhibiteurs. Dans la présente description il est fait référence à la voie de signalisation intracellulaire Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2 ou Ras-Raf-MEK-ERK ou ERK ou ERK1/2. Ces termes sont équivalents et font référence à la même voie ou cascade de signalisation. Le terme « docking method » ou « méthode de docking » fait référence à la méthode qui permet de calculer l'orientation préférée d'une molécule envers une seconde lorsqu'elles sont liées pour former un complexe stable. Le fait de déterminer cette orientation préférée sert à prévoir la solidité de l'union entre deux molécules et éventuellement son efficacité. Les études de docking, de fixation, d’ancrage ou d’amarrage, servent donc à déterminer l’affinité entre les molécules étudiées et de quantifier les conséquences de la fixation d’un ligand sur un récepteur. Les termes de méthode de fixation, méthode d’ancrage ou méthode d’amarrage peuvent être utilisés pour désigner la méthode de docking. DESCRIPTION DES DESSINS décrit la modélisation in silico de l’interaction entre le domaine DEF-Fos de MLK1001 et la poche de fixation du domaine ERK2-DEF de la kinase active. Cette modélisation permet la visualisation des aminoacides essentiels à ladite interaction. Les aminoacides représentés débutent au premier aminoacide. décrit les propriétés antiprolifératives de l’inhibition de TAT-DEF-Fos par MLK1001 sur différentes lignées cellulaires tumorales d’origine humaine. La prolifération cellulaire est mesurée par incorporation de BrdU en présence de sérum bovin. représente les propriétés antiprolifératives des nouveaux peptides selon l’invention sur des cellules de carcinome de pancréas HPAF-II. décrit la progression du cycle cellulaire par immunocoloration Ki-67 sur des cellules HPAF-II après addition de sérum (10%) en présence de Selumetinib (MEK inhibiteur, produit de référence), du peptide MLK-1001 et de certains des nouveaux peptides selon l’invention. décrit la méthode de surface plasma résonance (SPR) par Biacore, pour déterminer les niveaux d’interaction et les affinités de certains peptides (MLK1001 et MLK1008) selon l’invention. décrit la cinétique d’association et de dissociation du peptide MLK1001 selon l’invention à 1,25 ; 2 ; 5 ; 10 et 20 nM sur la protéine ERK2 par la méthode de Biacore. décrit la cinétique d’association et de dissociation du peptide MLK1008 selon l’invention à 1,25 ; 2 ; 5 ; 10 et 20 nM sur la protéine ERK2 par la méthode de Biacore. Ces figures viennent illustrer la présente invention et ne sont pas limitatives de la portée revendiquée. Peptide de type TAT-DEF-Fos caractérisé en ce que la séquence DEF-Fos CTTYTSSFVFTYPEADSFPS de la SEQ ID n°1 est modifiée par suppression et/ou substitution et/ou racémisation d’au moins un aminoacide sur une position située entre les positions 13 à 32 de la SEQ ID N°1. Peptide selon la revendication 1 caractérisé en ce que la séquence DEF-Fos est raccourcie dans la région N-ter de 1 à 4 aminoacides, préférentiellement de 4 aminoacides. Peptide selon la revendication 1 caractérisé en ce que la séquence DEF-Fos est raccourcie dans la région C-ter de 1 à 8 aminoacides, préférentiellement de 8 aminoacides. Peptide selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que au moins un aminoacide T (Thr) de la séquence consensus FVFT est remplacé par l’aminoacide D (Asp). Peptide selon l’une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce qu’une racémisation de type D est appliquée à un ou plusieurs aminoacides non essentiels situés en position 18, 28 et 32 de la SEQ ID N°1. Peptide selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la région N-ter de la SEQ ID N°1 est acétylée. Peptide selon l’une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce qu’il présente une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID N° 2 à 13. Peptide selon l’une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisé en ce qu’il est sélectionné parmi les peptides de SEQ ID N°8 et de SEQ ID N°12. Peptide selon l’une quelconque des revendications 1 à 8 pour une utilisation médicale. Méthode d’identification de molécules capables de se lier au domaine DEF de ERK2 envers c-Fos de façon similaire aux peptides selon les revendications 1 à 8, caractérisée en ce qu’elle comprend les étapes suivantes : utiliser le modèle 3D du domaine DEF de ERK2 envers c-Fos basé sur la structure cristalline du complexe ERK2 AMP-PNP en qualité de récepteur ; tester in silico la fixation ou « docking » de différentes molécules sur la poche de liaison du domaine DEF de ERK2 envers c-Fos ; synthétiser lesdites molécules présentant une bonne affinité de liaison ; étudier l’affinité de chaque molécule pour la poche de liaison du domaine DEF de ERK2 et sélectionner les meilleures affinités de liaison ; tester l’activité biologique et/ou les propriétés de la ou des molécules synthétisées en c. et sélectionnées en d.