Brevet FR3123921A1 — publié le 20221216

L’invention concerne des améliorations à des procédés de synthèse enzymatique de polynucléotides employant des monomères de 3’-O-amino-nucléoside triphosphate où des agents de piégeage d’aldéhyde réduisent ou empêchent le coiffage parasite de chaînes de polynucléotides en cours de croissance, augmentant ainsi le rendement de produit de pleine longueur. SYNTH È SE ENZYMATIQUE DE POLYNUCL É OTIDES EN UTILISANT DES MONOMÈRES DE 3’-O-AMINO-2’-DÉSOXYRIBONUCLÉOSIDE TRIPHOSPHATE ArriÈre-plan L’intérêt pour des approches enzymatiques de la synthèse de polynucléotides a augmenté non seulement en raison de la demande accrue pour des polynucléotides synthétiques dans de nombreux domaines, tels qu’en biologie synthétique, les applications de CRISPR–Cas9 et le séquençage à haut débit, mais également en raison des limitations des approches chimiques de la synthèse de polynucléotides, telles que les limites supérieures de la longueur de produit, l’utilisation de monomères sensibles à l’humidité et l’utilisation de solvants peu écologiques, Jensen et al. Biochemistry, 57 : 1821-1832 (2018). Actuellement, la plupart des approches enzymatiques à la fois pour la synthèse d’ADN et d’ARN emploient des polymérases sans matrice qui sont utilisées pour mettre en œuvre des cycles répétés d’allongement d’un nucléoside triphosphate 3’-O-protégé à un initiateur ou un brin allongé et de déprotection jusqu’à ce qu’un polynucléotide de la séquence souhaitée soit obtenu, par ex. Hiatt et Rose, publication de brevet international WO96/07669. Champion et al, ont modifié des variants de TdT qui s’intègrent efficacement dans des monomères de 3’-O-amino nucléoside triphosphate protégés de manière réversible de brins de polynucléotide en cours de croissance développés par Steven Benner (Champion et al, brevet U.S. 10752887, les publications de brevet international WO2020/099451 ; Benner et al, brevets américains 7544794, 8034923, 8212020, 10472383, et Hutter et al, Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 29(11): 879-895 (2010). Malheureusement cette chimie de protection est sujet à plusieurs réactions secondaires qui ont pour effet soit de convertir le groupe de protection d’amino en un groupe de coiffage, soit de l’éliminer prématurément, de sorte qu’il y a soit une perte d’efficacité du fait de la présence d’espèces coiffées, soit la génération de séquences incorrectes par additions successives de monomères déprotégés prématurément. Benner a abordé ce dernier problème par des modifications à la synthèse de monomères (brevet U.S. 10472383), mais le problème de coiffage parasite subsiste. Au vu de l’intérêt de l’extension de l’application de la synthèse enzymatique sans matrice de polynucléotides, le domaine serait avancé si des procédés étaient disponibles pour éviter le problème de coiffage parasite du groupe protecteur 3’-amino dans le contexte de la synthèse enzymatique de polynucléotides. La présente invention concerne des procédés et kits améliorés pour la synthèse enzymatique sans matrice de polynucléotides en utilisant des monomères de nucléoside triphosphate 3’-O-amino–protégé. Sans avoir l’intention d’être limité par un principe de fonctionnement particulier, les inventeurs pensent que l’exposition de mélanges réactionnels ou de réactifs contenant des monomères à des aldéhydes fortuits ou environnementaux permet à de tels aldéhydes de convertir des groupes de protection 3’-O-amino en 3’-oximes qui possèdent l’effet de coiffer le brin affecté, réduisant ainsi les rendements. Les inventeurs ont découvert que des augmentations significatives de rendements de produit peuvent être obtenues en incorporant au moins un agent de piégeage d’aldéhyde dans des mélanges réactionnels et d’autres réactifs employés en synthèse. Dans certains modes de réalisation, l’invention concerne des procédés de synthèse d’un polynucléotide, le procédé comprenant les étapes de : (a) fourniture d’initiateurs comportant chacun un 3’-hydroxyle libre ; (b) répétition dans un mélange réactionnel jusqu’à ce que le polynucléotide soit formé, de cycles de (i) mise en contact dans des conditions d’allongement des initiateurs ou des fragments allongés possédant des 3’-hydroxyles libres avec un 3’-O-amino nucléoside triphosphate et une polymérase indépendante d’une matrice de sorte que les initiateurs ou les fragments allongés soient allongés par incorporation d’un 3’-O-amino nucléoside triphosphate pour former des fragments allongés 3’-O-amino, et (ii) déprotection des fragments allongés pour former des fragments allongés possédant des 3’-hydroxyles libres, une quantité efficace d’au moins un agent de piégeage d’aldéhyde étant présente dans le mélange réactionnel. Dans un ou plusieurs modes de réalisation, ledit agent de piégeage d’aldéhyde est apporté audit mélange réactionnel par au moins un réactif de synthèse. Dans un ou plusieurs modes de réalisation, ladite quantité efficace dudit agent de piégeage d’aldéhyde est apportée au mélange réactionnel par ledit réactif de synthèse comprenant un 3’-O-amino nucléoside triphosphate ou une polymérase indépendante d’une matrice, ou un mélange des deux. En d’autres termes, le procédé de l’invention peut permettre la synthèse d’au moins un polynucléotide. Ledit procédé comprenant une étape de fourniture d’initiateurs chacun possédant un nucléotide 3’-terminal doté d’un 3’-hydroxyle libre, une étape de mise en contact dans des conditions d’allongement des initiateurs possédant des 3’-hydroxyles libres avec un nucléoside triphosphate 3’-O-bloqué et une polymérase indépendante d’une matrice, de sorte que les initiateurs soient allongés par incorporation d’un nucléoside triphosphate 3’-O-bloqué pour former des fragments allongés 3’-O-bloqués, et une étape de déblocage des fragments allongés pour former des fragments allongés possédant des 3’-hydroxyles libres, et une étape de répétition de l’étape de mise en contact et de l’étape de déblocage par mise en contact dans des conditions d’allongement des fragments allongés obtenus dans l’étape de déblocage, jusqu’à ce que le polynucléotide soit formé, la synthèse du polynucléotide étant réalisée avec une quantité efficace d’au moins un agent de piégeage d’aldéhyde. Dans un ou plusieurs modes de réalisation, l’agent de piégeage d’aldéhyde peut être apporté par au moins un réactif de synthèse. Les procédés selon l’invention peuvent permettre la synthèse de plusieurs copies d’une séquence de polynucléotide ou de plusieurs copies d’une pluralité de séquences de polynucléotides. Dans certains modes de réalisation, le polynucléotide peut avoir une séquence prédéterminée. Dans certains modes de réalisation, une quantité efficace d’au moins un agent de piégeage d’aldéhyde est apportée au mélange réactionnel par un réactif de synthèse comprenant un 3’-O-amino nucléoside triphosphate ou une polymérase indépendante d’une matrice, ou les deux. BrÈve description des figures La illustre sous forme de diagramme un procédé de synthèse enzymatique sans matrice d’un polynucléotide. Les figures 2A-2C présentent des données concernant les augmentations de rendements de produits en fonction de la concentration en agent de piégeage d’aldéhyde. Les figures 3A-3B présentent des formules d’agents de piégeage d’aldéhyde de type monohydroxylamine et polyhydroxylamine O-substituées donnés à titre d’exemple qui peuvent être utilisés dans des procédés de l’invention. Procédé de synthèse d’un polynucléotide, le procédé comprenant les étapes de : (a) fourniture d’initiateurs comportant chacun un 3’-hydroxyle libre ; (b) répétition dans un mélange réactionnel jusqu’à ce que le polynucléotide soit formé, de cycles de (i) mise en contact dans des conditions d’allongement des initiateurs ou des fragments allongés possédant des 3’-hydroxyles libres avec un 3’-O-amino nucléoside triphosphate et une polymérase indépendante d’une matrice de sorte que les initiateurs ou les fragments allongés soient allongés par incorporation d’un 3’-O-amino nucléoside triphosphate pour former des fragments allongés 3’-O-amino, et (ii) déprotection des fragments allongés pour former des fragments allongés possédant des 3’-hydroxyles libres, dans lequel une quantité efficace d’au moins un agent de piégeage d’aldéhyde est présente dans le mélange réactionnel. Procédé selon la revendication 1, dans lequel ledit agent de piégeage d’aldéhyde est apporté audit mélange réactionnel par au moins un réactif de synthèse. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 2, dans lequel ladite quantité efficace dudit agent de piégeage d’aldéhyde est apportée au mélange réactionnel par ledit réactif de synthèse comprenant un 3’-O-amino nucléoside triphosphate ou une polymérase indépendante d’une matrice, ou un mélange des deux. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel ledit polynucléotide est un ADN et ladite polymérase indépendante d’une matrice étant une désoxynucléotidyltransférase terminale (TdT). Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel ledit agent de piégeage d’aldéhyde est une monohydroxylamine ou polyhydroxylamine O-substituée. Procédé selon la revendication 5, dans lequel ladite monohydroxylamine ou polyhydroxylamine O-substituée est choisie dans le groupe constitué par des composés définis par la formule : Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel ladite quantité efficace est fournie par une concentration dudit agent de piégeage d’aldéhyde dans la plage allant de 1 à 100 mM dans ledit mélange réactionnel. Kit pour la synthèse d’un polynucléotide utilisant une polymérase sans matrice comprenant un ou plusieurs flacons de réactifs de synthèse contenant chacun une quantité efficace d’au moins un agent de piégeage d’aldéhyde. Kit selon la revendication 8, dans lequel ledit agent de piégeage d’aldéhyde est une monohydroxylamine ou polyhydroxylamine O-substituée.