Brevet FR3121442A1 — publié le 20221007

PROCÉDÉS ET TROUSSES POUR LA SYNTHÈSE ENZYMATIQUE DE POLYNUCLÉOTIDES POUVANT FORMER DES G4 La présente invention concerne des procédés, des compositions et des trousses pour la synthèse enzymatique sans matrice de polynucléotides ayant des séquences capables de former des structures G-quadruplexes (G4). Selon l’invention, des réactions d’allongement affectées par la formation de G4 sont réalisées en présence de polyC oligonucléotides, tels que des amorceurs polyC, qui inhibent ou empêchent la formation de structures G4 intrabrins ou inter-brins. PROCÉDÉS ET TROUSSES POUR LA SYNTHÈSE ENZYMATIQUE DE POLYNUCLÉOTIDES POUVANT FORMER DES G4 ARRIÈRE-PLAN L’intérêt porté à des approches enzymatiques d’une synthèse des polynucléotides a récemment augmenté, non seulement en raison de la demande accrue de polynucléotides synthétiques dans de nombreux domaines tels que la biologie de synthèse, les applications de CRISPR-Cas9 et le séquençage à haut débit, mais aussi en raison des limitations des approches chimiques portant sur la synthèse des polynucléotides, telles que les limites supérieures portant sur la longueur des produits et l’utilisation et la nécessité de disposer de solvants organiques, Jensen et al, Biochemistry, 57 : 1821-1832 (2018). La synthèse enzymatique est intéressante, en raison de sa spécificité et de son efficacité, et du fait qu’elle n’exige que des réactifs doux compatibles avec un milieu aqueux et des conditions de réaction ménagées. Actuellement, la plupart des approches enzymatiques de la synthèse de l’ADN et de l’ARN utilisent des polymérases sans matrice pour ajouter d’une manière répétitive des nucléoside triphosphates bloqués en 3’-O à un amorceur simple brin ou à un brin allongé fixé à un support, l’opération étant suivie d’un déblocage jusqu’à obtention d’un polynucléotide ayant la séquence souhaitée, par exemple Hiatt et Rose, publication de brevet international WO96/07669. Les inventeurs ont découvert que les polymérases sans matrice, telles que les désoxynucléotidyltransférases terminales (TdT), ne couplent pas efficacement des nucléotides à des brins allongés au niveau de séquences qui sont capables de former des G-quadruplexes (G4). Les structures G4 sont des structures secondaires apparaissant fréquemment, importantes pour leur implication dans différents processus naturels, par exemple Kwok et al, Trends in Biotechnology, 35(10) : 997-1013 (2017) ; Murat et al, Curr. Opin. Genet. Devel., 25 : 22-29 (2014) ; et analogues. Ainsi, l’état de la technique, pour ce qui est de la synthèse enzymatique, ne dispose pas actuellement de la capacité de synthétiser des polynucléotides pouvant former des structures G4. Compte tenu de l’intérêt qu’il y a à étendre l’application de la synthèse enzymatique sans matrice de polynucléotides, on pourrait faire des progrès à ce domaine si l’on disposait de procédés permettant d’augmenter l’efficacité et le rendement des structures G4 contenant des polynucléotides cibles. La présente invention concerne des procédés et des trousses pour la synthèse enzymatique sans matrice de polynucléotides ADN ou ARN, qui utilisent des agents dans une réaction de synthèse destinée à interrompre la formation de structures G4. Selon un aspect, ces agents sont des polycytidylate ou polydésoxycytidylate oligonucléotides (collectivement appelés dans l’invention des « polyC oligonucléotides »). Dans certains modes de réalisation, les polyC oligonucléotides sont des composants d’amorceurs et/ou des supports de synthèse, tels ceux qui sont capables d’interagir avec les domaines riches en G de polynucléotides subissant la synthèse. Dans d’autres modes de réalisation, les polyC oligonucléotides sont libres en solution au cours d’étapes sélectionnées de couplage ou d’allongement en cours de synthèse. Dans certains modes de réalisation, l’invention porte sur des procédés de synthèse d’un polynucléotide ayant une séquence prédéterminée capable de former une structure G4, le procédé comprenant les étapes suivantes : (a) fourniture, fixés à un support de synthèse, d’amorceurs ayant chacun un 3’-hydroxyle libre ; (b) répétition, dans un mélange réactionnel comprenant le support de synthèse, jusqu’à formation du polynucléotide, de cycles de (i) mise en contact dans des conditions d’allongement des amorceurs ou des fragments allongés ayant des 3’-O-hydroxyles libres avec un nucléoside triphosphate bloqué en 3’-O et une polymérase indépendante de la matrice, de sorte que les amorceurs ou les fragments allongés sont allongés par incorporation d’un nucléoside triphosphate bloqué en 3’-O pour former des fragments allongés bloqués en 3’-O, et (ii) déblocage des fragments allongés pour former des fragments allongés ayant des 3’-hydroxyles libres, le mélange réactionnel destiné à l’allongement des amorceurs ou des fragments allongés comprenant des polyC oligonucléotides capables de former des duplexes avec des régions du polynucléotide. Dans certains modes de réalisation, chaque amorceur comprend un segment consistant en un polyC oligonucléotide. Dans d’autres modes de réalisation, un support de synthèse est fourni, auquel sont fixés des polyC oligonucléotides, éventuellement en plus d’amorceurs. Dans encore d’autres modes de réalisation, les polyC oligonucléotides sont en solution en tant que composant d’un mélange réactionnel d’allongement pour des cycles sélectionnés d’allongement dans lesquels la formation de structures G4 présente une grande probabilité de survenance. Dans certains modes de réalisation, ces cycles sélectionnés d’allongement peuvent être déterminés par un algorithme classique de prédiction des G4. La illustre sous forme d’un diagramme un procédé de synthèse enzymatique sans matrice d’un polynucléotide. Les [Figures 2A-2D] illustrent sous forme de diagrammes différents modes de réalisation permettant d’inclure dans un mélange réactionnel des polyC oligonucléotides. DESCRIPTION DÉTAILLÉE DES DESSINS Les principes généraux de l’invention sont exposés plus en détail, notamment à l’aide d’exemples, tels ceux qui sont présentés dans les dessins et décrits en détail. Il est cependant bien entendu que l’intention n’est pas de limiter l’invention aux modes de réalisation particuliers décrits. L’invention est susceptible de subir différentes modifications et de prendre d’autres formes, dont les particularités sont présentées pour de nombreux modes de réalisation. L’intention est de couvrir toutes les modifications, tous les équivalents et toutes les autres possibilités entrant dans le cadre des principes et de la portée de l’invention. La mise en œuvre pratique de la présente invention peut, sauf mention contraire, utiliser des techniques et descriptions classiques de la chimie organique, de la biologie moléculaire (y compris les techniques de recombinaison), de la biologie cellulaire et de la biochimie, qui entrent dans le cadre des connaissances de l’homme du métier. Ces techniques classiques peuvent comprendre, mais sans y être limités, la préparation et l’utilisation de peptides synthétiques, de polynucléotides synthétiques, d’anticorps monoclonaux, le clonage, l’amplification, le séquençage et l’analyse des acides nucléiques, et les techniques associées. Des protocoles correspondant à ces techniques classiques pourront être trouvés dans la littérature spécialisée provenant de fabricants et dans des manuels de laboratoire standards, tels que Genome Analysis : A Laboratory Manual Series (Vol. I-IV) ; PCR Primer : A Laboratory Manual ; et Molecular Cloning : A Laboratory Manual (tous de Cold Spring Harbor Laboratory Press) ; Lutz et Bornscheuer, Eds, Protein Engineering Handbook (Wiley-VCH, 2009) ; Hermanson, Bioconjugate Techniques, deuxième édition (Academic Press, 2008) ; et les références analogues. L’invention concerne des améliorations portant sur la synthèse enzymatique sans matrice de polynucléotides, en particulier l’ADN ou l’ARN, qui permettent d’obtenir des rendements plus élevés de polynucléotides de grande longueur en fournissant des conditions de synthèse qui suppriment ou interrompent la formation de structures secondaires G-quadruplexes (ou G4) dans les chaînes en croissance. Sans vouloir être limité par une théorie ou une hypothèse particulière, on pense que la formation de structures G4 limite l’accès à des réactifs de synthèse, tels que les polymérases sans matrice, en inhibant ainsi l’extension ou l’allongement de chaîne, et en augmentant ainsi la variabilité de la longueur du produit. En partie, l’invention se fonde sur une reconnaissance et une appréciation de ce que les effets négatifs de ces structures secondaires sur le rendement en le produit peuvent être atténués ou supprimés grâce à la fourniture de conditions d’allongement (ou d’extension, ou de couplage) qui comprennent des agents, en particulier des polyC oligonucléotides, qui interrompent la formation des structures G4. En particulier, on pense que cette interruption a lieu par fourniture d’autres configurations stables, par exemple des duplexes avec des régions polyC, qu’un brin en cours de croissance comportant des régions riches en G peut occuper. Eu égard à ce qui précède, dans certains modes de réalisation, les amorceurs de l’invention peuvent comprendre des polyG oligonucléotides dans lesquels une autre configuration stable peut être une structure G4 entre le polyG oligonucléotide de l’amorceur et les séquences riches en G du polynucléotide en cours de synthèse. Ces polyG oligonucléotides peuvent avoir une longueur dans la plage de 2 à 20 guanylates ou désoxyguanylates. Les structures G-quadruplexes sont courantes dans la nature et peuvent être prédites par utilisation d’algorithmes disponibles, par exemple Lombardi et al, Nucleic Acids Research, 48(1) : 1-15 (2020), et les références analogues. G 3+ N 1-7 G 3+ N 1-7 G 3+ N 1-7 G 3+ est un motif G4 courant, où « N » est un nucléotide quelconque et « 3+ » désigne la présence de 3 G ou plus dans une rangée. Dans le cadre de l’invention, l’expression « polynucléotide pouvant former des G4 » désigne un polynucléotide ayant une séquence nucléotidique qui peut former une structure G4 dans les conditions d’une réaction d’allongement. Dans certains modes de réalisation, « polynucléotide pouvant former des G4 » désigne un polynucléotide ayant une séquence nucléotidique qu’un algorithme classique de prédiction des G4 indique comme étant susceptible de former une structure G4, par exemple Burge et al, Nucleic Acids Research, 34(19) : 5402-5415 (2006) ; Huppert et al, Nucleic Acids Research, 33(9) : 2908-2916 (2005) ; Kwok et al, Trends in Biochemistry, 35(10) : 997-1013 (2017) ; Lombardi et al (loc. cit.) ; Murat et al, Curr. Opin. Genetic & Development, 25 : 22-29 (2014) ; Todd et al, Nucleic Acids Research, 33(9) : 2901-2907 (2005) ; Bedrat et al, Nucleic Acids Research, 44(4) : 1746-1759 (2016) ; et analogues. Les polyC oligonucléotides de l’invention peuvent avoir une longueur de 2 nucléotides ou plus. Dans certains modes de réalisation, les polyC oligonucléotides de l’invention ont une longueur dans la plage de 2 à 60 nucléotides, ou de 2 à 50 nucléotides, ou de 2 à 40 nucléotides, ou de 2 à 30 nucléotides, ou de 2 à 20 nucléotides. Dans d’autres modes de réalisation, les polyC oligonucléotides de l’invention ont une longueur dans la plage de 6 à 60 nucléotides, ou de 6 à 50 nucléotides, ou de 6 à 40 nucléotides, ou de 6 à 30 nucléotides, ou de 6 à 20 nucléotides. Dans certains modes de réalisation, les amorceurs de l’invention ont une longueur dans la plage de 6 à 50 nucléotides et les polyC oligonucléotides complètent cinquante pour cent ou plus de la séquence de l’amorceur. Dans certains modes de réalisation, les polyC oligonucléotides de l’invention ont une longueur, une concentration et/ou une configuration (à savoir le segment de l’amorceur, fixé d’une manière indépendante au même support solide que l’amorceur, ou en solution libre) ayant des valeurs suffisantes pour augmenter la pureté des polynucléotides synthétisés de 20 pour cent ou plus par comparaison avec une synthèse équivalente utilisant un amorceur polyT. Dans certains modes de réalisation, une pluralité de polyC oligonucléotides peuvent être présents dans un oligonucléotide plus gros, tel qu’un amorceur, qui est un composant d’un mélange de réaction d’allongement. Par exemple, un amorceur peut avoir un segment comprenant plusieurs polyC oligonucléotides séparés par un nucléotide non-C, par exemple –CCCTCCCTCCCT- (SEQ ID NO : 159), -CCCTCCCCTCCCCCT- (SEQ ID NO : 160), ou analogues. Dans certains modes de réalisation, ces composites de polyC oligonucléotides peuvent être choisis dans le but de faciliter la fabrication. Chaque fois que des amorceurs (décrits plus en détail ci-dessous) comprennent des polyC oligonucléotides, les polyC oligonucléotides peuvent comprendre la totalité ou une partie des amorceurs. Dans différents modes de réalisation, des polyC oligonucléotides peuvent être fournis avec l’une quelconque ou la totalité des configurations suivantes : (i) en tant que partie d’amorceurs, (ii) en tant qu’oligonucléotides fixés au même support de synthèse que les amorceurs, et (iii) en tant que partie d’oligonucléotides en solution libre. Dans chaque cas, la partie d’un oligonucléotide ou d’un amorceur qui est polyC peut être la totalité de l’oligonucléotide ou de l’amorceur. Pour ce qui concerne (ii), ces oligonucléotides peuvent être fixés à un support de synthèse par une extrémité 5’ ou une extrémité 3’. Dans certains modes de réalisation, chaque fois qu’un oligonucléotide de (ii) est fixé par une extrémité 5’, son extrémité 3’ est coiffée de sorte que les nucléotides n’y sont pas fixés pendant les étapes de couplage ou d’allongement. De même, pour ce qui concerne (iii), les polyC oligonucléotides en solution libre ont leur extrémité 3’ coiffée, de sorte que les nucléotides n’y sont pas fixés au cours des étapes de couplage ou d’allongement. Les [Figures 2A-2D] illustrent différents aspects de l’invention. La illustre le support de synthèse (200), avec les amorceurs oligonucléotidiques (202) fixés par leur extrémité 5’ au support (200). Après synthèse (205) des polynucléotides (208) contenant des segments polyG, il peut se former des structures G4 inter-brins (204) ou des structures G4 intrabrin (206), pour inhiber une extension plus poussée des polynucléotides. Dans certains cas (par exemple 206), l’inhibition n’a pas lieu tant que ne se produit pas la synthèse du segment final riche en G des polynucléotides, ce qui permet la formation de G4. Ainsi, dans certains modes de réalisation, il est nécessaire d’introduire des polyC oligonucléotides en solution libre dans les réactions de couplage, uniquement au cours d’étapes sélectionnées de couplage, qui peuvent être déterminées pour des polynucléotides particuliers grâce à l’utilisation d’algorithmes de prédiction des G4 tels celui qui est décrit dans Lombardi et al (loc. cit.). La illustre le mode de réalisation (i) du paragraphe précédent, dans lequel les polyC oligonucléotides sont des composants d’amorceurs. Dans le panneau supérieur de la , des amorceurs (210) sont fixés au support de synthèse (206). Chaque amorceur contient un segment de polyC oligonucléotide (212). Après synthèse jusqu’au début de la formation d’une structure G4 intrabrin, le panneau inférieur de la montre trois configurations possibles des polynucléotides, au niveau de leurs interactions avec eux-mêmes et les uns avec les autres. Les brins (216) et (226) illustrent, respectivement en (214) et (232), des structures G4 au niveau de leur extrémité 3’, et qui empêchent une polymérase sans matrice, telle qu’une TdT, de participer à une réaction d’extension. Le brin (222) illustre un polynucléotide dans lequel l’un de ses segments polyG forme un duplexe intrabrin avec le composant polyC de l’amorceur, ce qui va empêcher la formation d’une structure G4 au niveau de son extrémité 3’. Les brins (216) et (225) illustrent la formation d’un duplexe inter-brins entre le composant polyC de l’amorceur du brin (216) et l’un des segments polyG du brin (225), en interrompant ainsi la formation d’une structure G4 au niveau de l’extrémité du brin (225). Comme mentionné ci-dessus, on pense que, en raison de la formation des duplexes G-C et des transitions (par exemple (218) et (220)) des brins entre les états duplexes et les états G4, les polymérases sans matrice ont une possibilité d’interagir avec les 3’-hydroxyles libres des chaînes en cours de croissance pour catalyser une réaction de couplage qui autrement se produirait avec une efficacité beaucoup plus faible. La illustre un mode de réalisation dans lequel des polyC oligonucléotides (236) sont fournis sous forme d’oligonucléotides distincts, fixés au même support de synthèse (206) que les amorceurs (238). Les polyC oligonucléotides peuvent être fixés par leur extrémité 5’ ou leur extrémité 3’ ; toutefois, s’ils sont fixés par leur extrémité 5’, ce sont de préférence les extrémités 3’ qui sont coiffées (ce qu’indique un « x » sur la figure), de sorte qu’ils ne subissent pas d’extension au cours des étapes d’extension. Les amorceurs et les polyC oligonucléotides peuvent être fixés par utilisation de techniques chimiques classiques de fixation. Habituellement, les deux devraient avoir des fragments réactifs (par exemple des amines) sur leurs extrémités de fixation, et devraient réagir avec des fragments complémentaires se trouvant sur le support de synthèse, selon des concentrations relatives choisies de façon que la densité des polyC oligonucléotides soit suffisamment élevée pour permettre la formation de duplexes inter-brins. Le panneau inférieur de la présente l’interaction des régions polyC et polyG après synthèse (240) jusqu’au point où des structures G4 intrabrins, par exemple (242) et (244), peuvent se former. Dans ce mode de réalisation, seuls les duplexes C-G inter-brins, par exemple (246) et (248), entre les brins en cours de synthèse et les polyC oligonucléotides. Comme ci-dessus, les polyC oligonucléotides à proximité des brins synthétisés (237, 238, 243, 245) permettent des transitions, par exemple (247) et (249), respectivement entre les états duplexes (246) et (248) et les états G4 (242) et (244), ce qui permet la réalisation de réactions d’extension plus efficaces. La illustre un mode de réalisation dans lequel des polyC oligonucléotides sont fournis en solution en tant que composant d’un mélange réactionnel. Dans le panneau supérieur de la , un support de synthèse (206) est illustré avec des amorceurs (250) et sans polyC oligonucléotides. Après la synthèse (252) des polynucléotides cibles jusqu’au point où les structures G4 intrabrins commencent à se former, par exemple (255) et (256), une pluralité d’étapes d’extension peuvent être effectuées dans des mélanges réactionnels qui contiennent des polyC oligonucléotides (254). Comme on le voit pour les brins (258) et (259), les polyC oligonucléotides en solution forment des duplexes avec les segments polyG qui autrement contribueraient à des structures G4. Synthèse enzymatique sans matrice de l’ADN D’une manière générale, les procédés de synthèse enzymatique d’ADN ou de synthèse enzymatique d’ARN sans matrice (ou, d’une manière équivalente, « indépendante de la matrice »), comprennent des cycles répétés d’étapes, telles qu’illustrées sur la , dans lesquelles un nucléotide prédéterminé est couplé à un amorceur ou à une chaîne en cours de croissance dans chaque cycle. Les éléments généraux de la synthèse enzymatique sans matrice de polynucléotides sont décrits dans les références suivantes : Ybert et al, publication de brevet international WO/2015/159023 ; Ybert et al, publication de brevet international WO/2017/216472 ; Hyman, brevet U.S. 5436143 ; Hiatt et al, brevet U.S. 5763594 ; Jensen et al, Biochemistry, 57 : 1821-1832 (2018) ; Mathews et al, Organic & Biomolecular Chemistry, DOI : 0.1039/c6ob01371f (2016) ; Schmitz et al, Organic Lett., 1(11) : 1729-1731 (1999). Des polynucléotides amorceurs (100) sont fournis, par exemple fixés à un support solide (120), qui ont des groupes 3’-hydroxyle libre (130). On ajoute aux polynucléotides amorceurs (100) (ou aux polynucléotides amorceurs allongés au cours de cycles ultérieurs) un dNTP protégé en 3’-O ou un rNTP protégé en 3’-O et une polymérase sans matrice, telle qu’une TdT ou un variant de celle-ci, habituellement pour la synthèse de l’ADN (par exemple Ybert et al, WO/2017/216472 ; Champion et al, WO2019/135007) ou une polyA polymérase (PAP) ou une polyU polymérase (PUP) ou un variant de celle-ci habituel pour la synthèse de l’ARN (par exemple Heinisch et al, WO2021/018919) dans des conditions (140) efficaces pour l’incorporation enzymatique du NTP protégé en 3’-O sur l’extrémité 3’ des polynucléotides amorceurs (100) (ou des polynucléotides amorceurs allongés). Cette réaction produit des polynucléotides amorceurs allongés dont les 3’-hydroxyles sont protégés (106). Si la séquence allongée n’est pas complète, alors on effectue un autre cycle d’addition (108). Si le polynucléotide amorceur allongé contient une séquence complétée, alors le groupe de protection en 3’-O peut être enlevé, ou déprotégé, et la séquence souhaitée peut être clivée du polynucléotide amorceur original (110). Ce clivage peut être effectué par l’utilisation de l’une quelconque de toute une gamme de techniques de clivage d’un brin unique, par exemple par insertion d’un nucléotide clivable sur une localisation prédéterminée à l’intérieur du polynucléotide amorceur original. Un exemple de nucléotide clivable peut être un nucléotide uracile, qui est clivé par l’uracile ADN glycosylase. Si le polynucléotide amorceur allongé ne contient pas de séquence complétée, alors les groupes de protection 3’-O sont enlevés par exposition des 3’-hydroxyles libres (103), et les polynucléotides amorceurs allongés sont soumis à un autre cycle d’addition et de déprotection de nucléotides. Dans le cadre de l’invention, les termes « protégé » et « bloqué », par référence à des groupes spécifiés tels qu’un 3’-hydroxyle d’un nucléotide ou d’un nucléoside, sont utilisés d’une manière interchangeable et veulent désigner un fragment qui est fixé par liaison covalente au groupe spécifié, qui empêche une modification chimique du groupe au cours d’un processus chimique ou enzymatique. Chaque fois que le groupe spécifié est un 3’-hydroxyle d’un nucléoside triphosphate, ou un fragment étendu (ou « intermédiaire d’extension ») dans lequel un nucléoside triphosphate protégé (ou bloqué) en 3’ a été incorporé, la modification chimique empêchée est une extension supplémentaire, ou ultérieure, du fragment étendu (ou de l’« intermédiaire d’extension ») par une réaction de couplage enzymatique. Dans le cadre de l’invention, un « amorceur » (ou des termes équivalents tels que « fragment d’amorçage », « acide nucléique amorceur », « oligonucléotide amorceur », ou analogues) désigne une courte séquence oligonucléotidique ayant à son extrémité un 3’-hydroxyle libre, qui peut en outre être allongée par une polymérase sans matrice, par exemple la TdT. Dans un mode de réalisation, le fragment d’amorçage est un fragment d’amorçage d’ADN. Dans un autre mode de réalisation, le fragment d’amorçage est un fragment d’amorçage d’ARN. Dans certains modes de réalisation, un fragment d’amorçage possède entre 3 et 100 nucléotides, en particulier entre 3 et 20 nucléotides, qui peuvent en totalité ou en partie être des polyC. Dans certains modes de réalisation, le fragment d’amorçage est simple brin. Dans d’autres modes de réalisation, le fragment d’amorçage peut être double brin. Dans certains modes de réalisation, un oligonucléotide amorceur peut être fixé à un support de synthèse par son extrémité 5’ ; et dans d’autres modes de réalisation, un oligonucléotide amorceur peut être fixé indirectement à un support de synthèse par formation d’un duplexe avec un oligonucléotide complémentaire qui est directement fixé au support de synthèse, par exemple par l’intermédiaire d’une liaison covalente. Dans certains modes de réalisation, un support de synthèse est un support solide qui peut être une région discrète d’un solide plan, ou peut être une perle. Dans certains modes de réalisation, un amorceur peut comprendre un composé non-acide nucléique ayant un hydroxyle libre, auquel une TdT peut se coupler à un dNTP protégé en 3’-O, par exemple Baiga, brevets U.S. publiés US2019/0078065 et US2019/0078126. Des supports de synthèse auxquels des amorceurs contenant des polyC sont fixés peuvent comprendre des polymères, des solides poreux ou non poreux, y compris des perles ou des microsphères, des surfaces planes, telles qu’une lame de verre, une membrane ou analogue. Dans certains modes de réalisation, un support solide, ou support de synthèse, peut comprendre des perles magnétiques, des résines à base de particules telles que l'agarose, ou analogues. Les supports de synthèse peuvent comprendre, mais sans y être limités, les supports solides, tels que les supports polymères, y compris les supports de polyéthylèneglycol (PEG), les supports dendrimères et analogues ; les supports solides ne pouvant gonfler, tels que les particules de polystyrène, les Dynabeads et analogues ; les supports solides pouvant gonfler, tels que les résines ou les gels, y compris la gélose. Les supports de synthèse peuvent aussi former une partie de chambres de réaction, notamment la membrane filtrante d’une plaque filtrante. Des instructions permettant de sélectionner les supports solubles pourront être trouvées dans les références Bonora et al, Nucleic Acids Research, 212(5) : 1213-1217 (1993) ; Dickerson et al, Chem. Rev. 102 : 3325-3344 (2002) ; Fishman et al, J. Org. Chem., 68 : 9843-9846 (2003) ; Gavert et al, Chem. Rev. 97 : 489-509 (1997) ; Shchepinov et al, Nucleic Acids Research, 25(22) : 4447-4454 (1997) : et les références analogues. Des instructions permettant de sélectionner les supports solides pourront être trouvées dans Brown et al, Synlett 1998(8) : 817-827 ; Maeta et al, brevet U.S. 9045573 ; Beaucage et Iyer, Tetrahedron, 48(12) : 2223-2311 (1992) ; et analogues. Des instructions permettant de fixer des oligonucléotides à des supports solides pourront être trouvées dans Arndt-Jovin et al, Eur. J. Biochem., 54 : 411-418 (1975) ; Ghosh et al, Nucleic Acids Research, 15(13) : 5353-5372 (1987) ; Integrated DNA Technologies, « Strategies for attaching oligonucleotides to solid supports » (Stratégies de fixation d’oligonucléotides à des supports solides), 2014 (v6) ; Gokmen et al, Progress in Polymer Science 37 : 365-405 (2012) ; et les références analogues. Dans certains modes de réalisation, le support en phase solide va habituellement être constitué de perles ou de particules poreuses sous forme d’une résine ou d’un gel. De nombreux matériaux conviennent en tant que supports en phase solide pour la synthèse de polynucléotides. Dans le cadre de l’invention, le terme « particule » englobe, sans limitation, une « microparticule » ou une « nanoparticule » ou une « perle » ou une « microperle » ou une « microsphère ». Les particules ou perles pouvant être utilisées dans l’invention comprennent par exemple les perles ayant un diamètre de 1 à 300 micromètres, ou un diamètre de 20 à 300 micromètres, ou un diamètre de 30 à 300 micromètres, ou les perles ayant un diamètre supérieur à 300 micromètres. Une particule comprenant des amorceurs contenant des polyC peut être constituée de verre, de plastique, de polystyrène, de résine, d’un gel, d’agarose, de Sepharose et/ou d’autres matériaux appropriés. Présentent un intérêt particulier les particules ou perles de résine poreuse, telles que les perles d’agarose. Des exemples de particules d’agarose comprennent les perles de Sepharose TM . Dans certains modes de réalisation, des perles d’agarose réticulées à 4 %, activées par du bromure de cyanogène, ayant un diamètre dans la plage de 40 à 165 μm, peuvent être dérivatisées avec des amorceurs contenant des polyC pour une utilisation avec les procédés de l’invention. Dans d’autres modes de réalisation, on peut utiliser avec les procédés de l’invention des perles d’agarose réticulées à 6 %, activées par du bromure de cyanogène, ayant un diamètre dans la plage de 200 à 300 μm. Dans ces deux derniers modes de réalisation, des amorceurs oligonucléotidiques contenant des polyC, ayant un lieur 5’-amino, peuvent être couplés aux perles de Sepharose TM pour une utilisation avec l’invention. D’autres lieurs souhaitables pour perles d’agarose comprennent les lieurs thiol et époxy. Dans certains modes de réalisation, un support de résine poreuse dérivatisé avec des amorceurs contenant des polyC a un diamètre moyen des pores d’au moins 10 nm, ou d’au moins 20 nm, ou d’au moins 50 nm. Dans d’autres modes de réalisation, un tel support de résine poreuse a un diamètre moyen des pores dans la plage de 10 nm à 500 nm, ou dans la plage de 50 nm à 500 nm. Dans certains modes de réalisation, des amorceurs contenant des polyC sont fixés à des supports plans pour une synthèse massivement parallèle d’oligonucléotides, par exemple par mise en place de réactifs par jet d’encre, comme décrit par Horgan et al, publication de brevet international WO2020/020608, incorporé dans l’invention par renvoi. Dans certains modes de réalisation, ces supports plans comprennent un revêtement uniforme d’amorceurs contenant des polyC avec des 3’-hydroxyles protégés, où par exemple des sites de réaction discrets peuvent être définis par mise en place d’une solution de déprotection en des points discrets. Dans d’autres modes de réalisation, ces supports plans comprennent une matrice de sites de réaction discrets contenant chacun des amorceurs contenant des polyC, qui peuvent être formés par exemple sur un substrat par les procédés photolithographiques de Brennan, brevet U.S. 5474796 ; Peck et al, brevet U.S. 10384189 ; Indermuhle et al, brevet U.S. 10669304 ; Fixe et al, Materials Research Society Symposium Proceedings. Volume 723, Molecularly Imprinted Materials - Sensors and Other Devices. Symposia (San Francisco, Californie, du 2 au 5 avril, 2002) ; ou les références analogues. Après la fin de la synthèse, les polynucléotides ayant la séquence nucléotidique souhaitée peuvent être dégagés des amorceurs et des supports solides par clivage. On peut utiliser à cette fin une large gamme de liaisons clivables ou de nucléotides clivables. Dans certains modes de réalisation, le clivage du polynucléotide souhaité laisse un 5’-hydroxyle libre naturel sur un brin clivé ; cependant, dans d’autres modes de réalisation, une étape de clivage peut laisser un fragment, par exemple un 5’-phosphate, qui peut être enlevé au cours d’une étape ultérieure, par exemple par traitement par une phosphatase. Les étapes de clivage peuvent être réalisées chimiquement, thermiquement, par voie enzymatique ou par des procédés photochimiques. Dans certains modes de réalisation, les nucléotides clivables peuvent être des analogues nucléotidiques tels que la désoxyuridine ou la 8-oxo-désoxyguanosine, qui sont reconnues par des glycosylases spécifiques (par exemple respectivement une uracile désoxyglycosylase, suivie d’une endonucléase VIII, et une 8-oxoguanine ADN glycosylase). Dans certains modes de réalisation, le clivage peut être réalisé par fourniture d’amorceurs ayant une désoxyinosine en tant qu’avant-dernier nucléotide en 3’, qui peuvent être clivés par une endonucléase V à l’extrémité 3’ de l’amorceur en laissant un 5’-phosphate sur le polynucléotide libéré. D’autres procédés de clivage de polynucléotides simple brin sont exposés dans les références ci-après, qui sont incorporées par renvoi : brevets U.S. n° 5 739 386, 5 700 642 et 5 830 655 ; et les publications de brevets U.S. n° 2003/0186226 et 2004/0106728 ; et dans Urdea et Horn, brevet U.S. 5367066. Dans certains modes de réalisation, un clivage par des glycosylases et/ou des endonucléases peut exiger un substrat d’ADN double brin. Revenant à la , dans certains modes de réalisation, une séquence ordonnée de nucléotides sont couplés à un acide nucléique amorceur par utilisation d’une polymérase sans matrice, telle que la TdT, en présence de NTP protégés en 3’-O dans chaque étape de synthèse. Dans certains modes de réalisation, le procédé de synthèse d’un oligonucléotide comprend les étapes de (a) fourniture d’un amorceur ayant un 3’-hydroxyle libre (100) ; (b) réaction (104) dans les conditions d’une extension de l’amorceur ou d’un intermédiaire d’extension ayant un 3’-hydroxyle libre avec une polymérase sans matrice en présence d’un nucléoside triphosphate protégé en 3’-O pour produire un intermédiaire d’extension protégé en 3’-O (106) ; (c) déprotection de l’intermédiaire d’extension pour produire un intermédiaire d’extension ayant un 3’-hydroxyle libre (108) ; et (d) répétition des étapes (b) et (c) (110) jusqu’à synthèse du polynucléotide. (Quelquefois, les expressions « intermédiaire d’extension » et « fragment d’allongement » sont utilisées d’une manière interchangeable). Dans certains modes de réalisation, un amorceur est fourni en tant qu’oligonucléotide fixé à un support solide, par exemple par son extrémité 5’. Le procédé ci-dessus peut aussi comprendre une étape de lavage après chaque étape de réaction ou d’extension, ainsi qu’après chaque étape de déprotection. Par exemple, l’étape de réaction peut comprendre une sous-étape d’élimination des nucléoside triphosphates non incorporés, par exemple un lavage, après une période d’incubation prédéterminée, ou après un temps de réaction prédéterminé. Ces périodes d’incubation ou temps de réaction prédéterminés peuvent être habituellement de quelques secondes, par exemple de 30 secondes, à plusieurs minutes, par exemple 30 minutes. Lorsque la séquence de polynucléotides sur un support de synthèse comprend des sous-séquences complémentaires inverses, des structures intramoléculaires ou transmoléculaires secondaires peuvent être créées par formation de liaisons hydrogène entre les régions complémentaires inverses. Dans certains modes de réalisation, des fragments protecteurs de bases, pour des amines exocycliques, sont sélectionnés de telle sorte que les hydrogènes se trouvant sur l’azote protégé ne peuvent participer à la liaison hydrogène, ce qui empêche la formation de telles structures secondaires. Plus précisément, des fragments de protection de bases peuvent être utilisés pour empêcher la formation de liaisons hydrogène, telles celles qui sont formées par exemple par un appariement normal de bases entre les nucléosides A et T et entre G et C. À la fin de la synthèse, les fragments protecteurs de bases peuvent être éliminés, et le produit polynucléotide peut être éliminé par clivage du support solide, par exemple par clivage à partir de son amorceur. Outre la fourniture de monomères de NTP bloqués en 3’-O comportant des groupes protecteurs de bases, des réactions d’allongement peuvent être réalisées à des températures plus élevées par utilisation de polymérases thermostables sans matrice. Par exemple, une polymérase thermostable sans matrice ayant une activité au-delà de 40 °C peut être utilisée ; ou encore, dans certains modes de réalisation, on peut utiliser une polymérase thermostable sans matrice ayant une activité dans la plage de 40 à 85 °C ; ou encore, dans certains modes de réalisation, on peut utiliser une polymérase thermostable sans matrice ayant une activité dans la plage de 40 à 65 °C. Dans certains modes de réalisation, les conditions d’allongement peuvent comprendre l’addition de solvants à un mélange de réaction d’allongement, qui inhibent la liaison hydrogène ou l’empilement des bases. Ces solvants comprennent les solvants miscibles à l’eau ayant une faible constante diélectrique, tels que le diméthylsulfoxyde (DMSO), le méthanol et analogues. De même, dans certains modes de réalisation, les conditions d’allongement peuvent comprendre la fourniture d’agents chaotropiques qui comprennent, mais sans y être limités, le n-butanol, l’éthanol, le chlorure de guanidinium, le perchlorate de lithium, l’acétate de lithium, le chlorure de magnésium, le phénol, le 2-propanol, le dodécylsulfate de sodium, la thiourée, l’urée, et analogues. Dans certains modes de réalisation, les conditions d’allongement comprennent la présence d’une quantité de DMSO supprimant les structures secondaires. Dans certains modes de réalisation, les conditions d’allongement peuvent comprendre la fourniture de protéines de liaison à l’ADN qui inhibent la formation de structures secondaires, ces protéines comprenant, mais sans y être limitées, les protéines de liaison simple brin, les hélicases, les ADN glycolases et analogues. Des dNTP bloqués en 3’-O sans protection des bases peuvent être achetés auprès de fournisseurs commerciaux ou synthétisés par utilisation de techniques publiées, par exemple le brevet U.S. 7057026 ; Guo et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 105(27) : 9145-9150 (2008) ; Benner, brevet U.S. 7544794 et 8212020 ; les publications de brevets internationaux WO2004/005667, WO91/06678 ; Canard et al, Gene (loc. cit.) ; Metzker et al, Nucleic Acids Research, 22 : 4259-4267 (1994) ; Meng et al, J. Org. Chem., 14 : 3248-3252 (3006) ; la publication de brevet U.S. 2005/037991. Des dNTP bloqués en 3’-O avec protection des bases peuvent être synthétisés comme décrit ci-dessous. Lorsqu’on utilise des dNTP à bases protégées, le procédé de la peut comprendre en outre une étape (e) éliminant les fragments de protection des bases, qui, dans le cas de groupes de protection acyle ou amidine, peut comprendre (par exemple) un traitement avec de l’ammoniaque concentrée. Le procédé ci-dessus peut aussi comprendre une ou plusieurs étapes de coiffage en plus des étapes de lavage après l’étape de réaction, ou d’extension. Une première étape de coiffage peut coiffer, ou rendre inertes vis-à-vis d’extensions plus poussées, les groupes 3’-OH n’ayant pas réagi se trouvant sur les polynucléotides partiellement synthétisés. Une telle étape de coiffage est habituellement réalisée après une étape de couplage et, chaque fois que l’on utilise un composé de coiffage, il est choisi de façon à être non réactif vis-à-vis des groupes de protection du monomère juste après couplage aux brins en cours de croissance. Dans certains modes de réalisation, ces étapes de coiffage peuvent être réalisées par couplage (par exemple, par une deuxième étape de couplage enzymatique) d’un composé de coiffage qui rend le polynucléotide partiellement synthétisé incapable de subir des couplages plus poussés, par exemple avec la TdT. De tels composés de coiffage peuvent être un didésoxynucléoside triphosphate. Dans d’autres modes de réalisation, des brins non étendus comportant des 3’-hydroxyles libres peuvent être dégradés par traitement avec une activité de 3’-exonucléase, par exemple Exo I. Par exemple, voir Hyman, brevet U.S. 5436143. De même, dans certains modes de réalisation, les brins qui ne peuvent être débloqués peuvent être traités de façon à éliminer le brin ou à le rendre inerte vis-à-vis d’extensions plus poussées. Une deuxième étape de coiffage peut être réalisée après une étape de déprotection, pour rendre inertes les brins affectés, à partir de toute opération ultérieure de couplage ou de déprotection de tous groupes de protection ou de blocage en 3’-O. Les composés de coiffage de cette deuxième étape de coiffage sont choisis de façon à ne pas réagir avec les 3’-hydroxyles libres susceptibles d’être présents. Dans certains modes de réalisation, ce deuxième composé de coiffage peut être un conjugué d’un groupe aldéhyde et d’un groupe hydrophobe. Ce dernier groupe permet une séparation sur la base de l’hydrophobicité, par exemple Andrus, brevet U.S. 5047524. Des exemples de conditions de réaction d’une étape d’allongement (quelquefois appelée aussi étape d’extension ou étape de couplage) comprennent ce qui suit : 2,0 à 20,0 μM de TdT purifiée ; 125 à 600 μM de dNTP bloqué en 3’-O (par exemple dNTP bloqué en 3’-O-NH 2 ) ; environ 10 à environ 500 mM d’un tampon cacodylate de potassium (pH entre 6,5 et 7,5) et d’environ 0,01 à environ 10 mM d’un cation divalent (par exemple CoCl 2 ou MnCl 2 ), la réaction d’allongement pouvant être réalisée dans un volume réactionnel de 50 μl, à une température comprise entre la température ambiante et 45 °C, pendant 3 à 5 minutes. Dans des modes de réalisation dans lesquels les dNTP bloqués en 3’-O sont des dNTP bloqués en 3’-O-NH 2 , les conditions de réaction pour une étape de déblocage peuvent comprendre ce qui suit : 700 à 1 500 mM de NaNO 2 ; 500 à 1 000 mM d’acétate de sodium (ajusté à pH de 4,8 à 6,5 avec de l’acide acétique), où la réaction de déblocage peut être réalisée dans un volume de 50 μl à une température comprise entre la température ambiante et 45 °C pendant 30 secondes à plusieurs minutes. Des lavages peuvent être réalisés avec le tampon cacodylate sans les composants de la réaction de couplage (par exemple, enzyme, monomère, cations divalents). En fonction des applications particulières, les étapes de déblocage et/ou de clivage peuvent comprendre toute une gamme de conditions chimiques ou physiques, par exemple lumière, chaleur, pH, présence de réactifs spécifiques tels que des enzymes, qui sont capables de cliver une liaison chimique spécifiée. Des instructions portant sur la sélection de groupes bloquants en 3’-O et sur les conditions de déblocage correspondantes pourront être trouvées dans les références ci-après, qui sont incorporées par renvoi : Benner, brevets U.S. 7544794 et 8212020 ; brevet U.S. 5808045 ; brevet U.S. 8808988 ; publication de brevet international WO91/06678 ; et les références citées ci-dessous. Dans certains modes de réalisation, l’agent de clivage (appelé aussi quelquefois réactif ou agent de déblocage) est un agent de clivage chimique, tel que par exemple le dithiothréitol (DTT). Dans d’autres modes de réalisation, un agent de clivage peut être un agent de clivage enzymatique, tel que par exemple une phosphatase, qui peut cliver le groupe bloquant 3’-phosphate. L’homme du métier comprendra sans peine que la sélection de l’agent de déblocage dépend du type de groupe bloquant 3’-nucléotide utilisé, que l’on utilise un ou plusieurs groupes bloquants, que des amorceurs sont fixés à des cellules ou des organismes vivants ou à des supports solides, et analogues, exigeant un traitement ménagé. Par exemple, une phosphine, telle que la tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP), peut être utilisée pour cliver un groupe 3’O-azidométhyle, on peut utiliser des complexes du palladium pour cliver un groupe 3’O-allyle, ou on peut utiliser du nitrite de sodium pour cliver un groupe 3’O-amino. Dans des modes de réalisation particuliers, la réaction de clivage implique de la TCEP, un complexe de palladium ou du nitrite de sodium. Comme observé ci-dessus, dans certains modes de réalisation, il est souhaitable d’utiliser deux groupes bloquants ou plus, qui peuvent être éliminés par utilisation de conditions de déblocage orthogonales. Les exemples ci-après de paires de groupes bloquants peuvent être utilisés dans des modes de réalisation de synthèse parallèle. Il est bien entendu que d’autres paires de groupes bloquants, ou d’autres groupes contenant plus de deux, peuvent être utilisés dans ces modes de réalisation de l’invention. 3’-O-NH2 3’-O-azidométhyle 3’-O-NH2 3’-O-allyle, 3’-O-propargyle 3’-O-NH2 3’-O-phosphate 3’-O-azidométhyle 3’-O-allyle, 3’O-propargyle 3’-O-azidométhyle 3’-O-phosphate 3’-O-allyle, 3’O-propargyle 3’-O-phosphate La synthèse d’oligonucléotides sur des cellules vivantes exige des conditions ménagées de déblocage, ou de déprotection, c’est-à-dire des conditions qui ne perturbent pas les membranes cellulaires, ne dénaturent pas les protéines, n’interfèrent pas avec des fonctions cellulaires clés, ou analogues. Dans certains modes de réalisation, les conditions de déprotection entrent dans une gamme de conditions physiologiques compatibles avec la survie des cellules. Dans certains modes de réalisation, une déprotection enzymatique est souhaitable, car elle peut être réalisée dans des conditions physiologiques. Dans certains modes de réalisation, des groupes bloquants spécifiques, éliminables par voie enzymatique, sont associés à des enzymes spécifiques permettant leur élimination. Par exemple, des groupes bloquants à base d’ester ou d’acyle peuvent être éliminés avec une estérase, telle qu’une acétylestérase ou une enzyme analogue, et un groupe bloquant phosphate peut être éliminé avec une 3’ phosphatase, telle que la polynucléotide kinase de T4. À titre d’exemple, les 3’-O-phosphates peuvent être éliminés par traitement avec une solution de 100 mM de Tris-HCl (pH 6,5), 10 mM de MgC1 2 , 5 mM de 2-mercaptoéthanol et une unité de polynucléotide kinase de T4. La réaction se déroule pendant une minute à une température de 37 °C. Dans certains modes de réalisation, les groupes bloquants en 3’-O comprennent les groupes 3’-O-azidométhyle, 3’-O-NH 2 , 3’-O-allyle. Dans certains modes de réalisation, les groupes bloquants comprennent les groupes 3’-O-méthyle, 3’-O-(2-nitrobenzyle), 3’-O-allyle, 3’-O-amine, 3’-O-azidométhyle, 3’-O-tert-butoxyéthoxy, 3’-O-(2-cyanoéthyle), 3’-O-nitro et 3’-O-propargyle. Dans d’autres modes de réalisation, le nucléotide triphosphate bloqué en 3’ est bloqué par un 3’-O-azidométhyle ou un 3’-O-NH 2 . La synthèse et l’utilisation de ces nucléoside triphosphates bloqués en 3’ sont décrites dans les références suivantes : brevets U.S. 9410197 ; 8808988 ; 6664097 ; 5744595 ; 7544794 ; 8034923 ; 8212020 ; 10472383 ; Guo et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 105(27) : 9145-9150 (2008) ; et les références analogues. Selon les applications particulières, les étapes de déblocage et/ou de clivage peuvent comprendre toute une gamme de conditions chimiques ou physiques, par exemple lumière, chaleur, pH, présence de réactifs spécifiques tels que des enzymes, qui sont capables de cliver une liaison chimique spécifiée. Des instructions portant sur la sélection de groupes bloquants en 3’-O et sur les conditions de déblocage correspondantes pourront être trouvées dans des références telles que Wuts, Green’s Protection Groups in Organic Chemistry, 5e édition (Wiley 2014). Dans certains modes de réalisation, l’agent de clivage (appelé aussi quelquefois réactif ou agent de déblocage) est un agent de clivage chimique, tel que par exemple le dithiothréitol (DTT). Dans d’autres modes de réalisation, un agent de clivage peut être un agent de clivage enzymatique, tel que par exemple une phosphatase, qui peut cliver un groupe bloquant 3’-phosphate. L’homme du métier comprendra sans peine que la sélection de l’agent de déblocage dépend du type de groupe bloquant de nucléotide en 3’ utilisé, que l’on utilise un ou plusieurs agents bloquants, que des amorceurs sont fixés à des cellules ou des organismes vivants ou à des supports solides, et analogues, qui nécessitent un traitement ménagé. Par exemple, une phosphine, telle que la tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP) peut être utilisée pour cliver un groupe 3’O-azidométhyle, on peut utiliser des complexes du palladium pour cliver un groupe 3’O-allyle et un groupe 3’-O-propargyle, ou on peut utiliser du nitrite de sodium pour cliver un groupe 3’O-amino. Synthèse enzymatique de l’ARN sans matrice Les procédés de l’invention comprennent la synthèse enzymatique de l’ARN. Dans certains modes de réalisation, ces procédés comprennent les étapes décrites sur la utilisant comme polymérase sans matrice une poly(A) polymérase (PAP) ou une poly(U) polymérase. Dans certains modes de réalisation, on utilise des PAP et/ou des PUP pour synthétiser un acide polyribonucléique par utilisation de précurseurs de rNTP à protection réversible en 3’-O, où un variant unique de PUP ou de PAP peut être utilisé pour coupler tous les monomères ribonucléoside triphosphates, ou dans d’autres modes de réalisation. Dans certains modes de réalisation, on peut utiliser différentes PUP et PAP pour le couplage de différents types de ribonucléoside triphosphates monomères lors de la synthèse d’un ARN particulier. De même, dans d’autres modes de réalisation, on peut utiliser des PAP et/ou des PUP pour synthétiser un acide polydésoxyribonucléique par utilisation de précurseurs de dNTP à protection réversible en 3’-O, où on utilise une PUP ou une PAP unique pour coupler tous les désoxyribonucléoside triphosphates (dNTP) monomères, ou, dans un autre mode de réalisation, dans lequel différentes PUP et PAP polymérases peuvent être utilisées pour coupler différents types de désoxyribonucléoside triphosphates monomères. Dans certains modes de réalisation portant sur la synthèse de l’ARN, on peut aussi utiliser avec des ribonucléotides monomères les mêmes groupes de protection réversible en 3’-O que ceux qui sont décrits ci-dessus pour les désoxyribonucléotides. Dans certains modes de réalisation portant sur la synthèse de l’ARN, ce nucléoside triphosphate bloqué en 3’-O est un 3’-O-azidométhyl-ribonucléoside triphosphate. Dans certains modes de réalisation, les procédés peuvent utiliser des variants de PAP et/ou de PUP qui ont été modifiés par manipulation génétique pour améliorer l’efficacité du couplage des ribonucléoside triphosphates bloqués en 3’-O et des 2’-désoxyribonucléoside triphosphates bloqués en 3’-O pour faire croître des chaînes polynucléotidiques lors d’une synthèse, par exemple, comme décrit ci-dessous. Dans certains modes de réalisation, le procédé de synthèse d’un oligoribonucléotide ayant une séquence prédéterminée comprend les étapes de (a) fourniture d’un amorceur ayant un 3’-hydroxyle libre ; (b) réaction dans des conditions d’allongement de l’amorceur ou d’un fragment d’allongement ayant un 3’-hydroxyle libre avec une PAP ou une PUP en présence d’un ribonucléoside triphosphate bloqué en 3’-O pour produire un fragment d’allongement bloqué en 3’-O ; (c) déblocage du fragment d’allongement pour produire un fragment d’allongement ayant un 3’-hydroxyle libre ; et (d) répétition des étapes (b) et (c) jusqu’à synthèse du polyribonucléotide ayant la séquence prédéterminée, le mélange réactionnel permettant l’allongement des amorceurs ou des fragments allongés comprenant des polyC oligonucléotides capables de former des duplexes avec le polynucléotide. Dans certains modes de réalisation, les amorceurs comprennent chacun un segment consistant en un polyC oligonucléotide. Dans d’autres modes de réalisation, un support de synthèse est fourni, auquel sont fixés des polyC oligonucléotides, éventuellement en plus d’amorceurs. Dans encore d’autres modes de réalisation, des polyC oligonucléotides sont fournis en solution en tant que composant d’un mélange de réaction d’allongement pour des cycles d’allongement sélectionnés dans lesquels la formation de structures G4 présente une grande probabilité de survenance. Dans certains modes de réalisation, comme observé ci-dessus, un amorceur est fourni en tant qu’oligonucléotide fixé à un support solide, par exemple par son extrémité 5’. Le procédé ci-dessus peut aussi comprendre des étapes de lavage après la réaction, ou une étape d’extension, et aussi après l’étape de déblocage. Par exemple, l’étape de réaction peut comprendre une sous-étape d’élimination des ribonucléoside triphosphates non incorporés, par exemple par lavage, après une période d’incubation ou un temps de réaction prédéterminé. Ces périodes d’incubation ou temps de réaction prédéterminés peuvent être de quelques secondes, par exemple 30 secondes, à plusieurs minutes, par exemple 30 minutes. Le procédé ci-dessus peut aussi comprendre une ou plusieurs étapes de coiffage, ainsi que des étapes de lavage après l’étape de réaction, ou d’extension, et aussi après l’étape de déblocage. Comme mentionné ci-dessus, dans certains modes de réalisation, les étapes de coiffage peuvent être incluses, dans lesquelles des 3’-hydroxyles libres non étendus sont mis à réagir avec des composés qui empêchent toutes extensions plus poussées du brin coiffé. Dans certains modes de réalisation, un tel composé peut être un didésoxynucléoside triphosphate. Dans d’autres modes de réalisation, des brins non étendus ayant des 3’-hydroxyles libres peuvent être dégradés par traitement avec une activité de 3’-exoribonucléase, par exemple la RNase R (Epicentre). De même, dans certains modes de réalisation, les brins qui ne sont pas débloqués peuvent être traités pour éliminer le brin ou le rendre inerte vis-à-vis d’extensions ultérieures. Des exemples de conditions de réaction pour une étape d’extension ou d’allongement utilisant la PAP ou la PUP comprennent ce qui suit : conditions de réaction 1 (pour amorce + AM-rATP) : 250 uM d’AM-rATP, 0,1 uM d’ATTO488-(rA)5, 1 uM de PAP, 1x tampon ATP (20 mM de Tris-HCl, 0,6 mM de MnCl2, 0,02 mM d’EDTA, 0,1 % de BSA, 10 % de glycérol, 100 mM d’imidazole, pH 7 à 8), 37 °C, 30 minutes. Conditions de réaction 2 (pour amorce + AM-rGTP) : 250 uM de rGTP, 0,1 uM d’ATTO488-(rA)5, 1 uM de PAP, 1x tampon GTP (0,6 mM de MnCl 2 , 0,1 % de BSA, 10 mM d’imidazole, pH 6), 37 °C, 30 minutes. Ci-dessus, « AM-rNTP » désigne le 3’-O-azidométhyl-ribonucléoside triphosphate. Polymérases sans matrice pour synthèse de polynucléotides On dispose de toute une gamme de différentes polymérases sans matrice, pour une utilisation dans les procédés de l’invention. Les polymérases sans matrice comprennent, mais sans y être limitées, les polymérases de la famille polX (y compris les ADN polymérases β, λ et μ), les poly(A) polymérases (PAP), les poly(U) polymérases (PUP), l’ADN polymérase θ, et analogues, par exemple, décrits dans les références suivantes : Ybert et al, publication de brevet international WO2017/216472 ; Champion et al, brevet U.S. 10435676 ; Champion et al, publication de brevet international WO2020/099451 ; Heinisch et al, publication de brevet international WO2021/018919. En particulier, les désoxynucléotidyltransférases terminales (TdT) et leurs variants sont utiles pour la synthèse d’ADN sans matrice, et les PAP et les PUP et leurs variants sont utiles pour la synthèse d’un ARN sans matrice. Dans certains modes de réalisation, on utilise des variants de la TdT avec l’invention, qui présentent une activité d’incorporation accrue par rapport aux nucléoside triphosphates modifiés en 3’-O. Par exemple, ces variants de la TdT peuvent être produits par utilisation de techniques décrites dans Champion et al, brevet U.S. 10435676, qui est incorporé dans l’invention par renvoi. Dans certains modes de réalisation, un variant de la TdT est utilisé, qui présente une séquence d’acides aminés ayant une identité d’au moins 80 pour cent avec une TdT ayant une séquence d’acides aminés selon l’une quelconque des SEQ ID NO : 7 à 20, limites comprises, et 24 à 39, limites comprises, et une ou plusieurs des substitutions listées dans le Tableau 1, le variant de la TdT (i) étant capable de synthétiser un fragment d’acide nucléique sans matrice, et (ii) étant capable d’incorporer un nucléotide modifié en 3’-O sur un 3’-hydroxyle libre d’un fragment d’acide nucléique. Dans certains modes de réalisation, les variants ci-dessus de la TdT comprennent une substitution sur chaque position listée dans le Tableau 1. Dans certains modes de réalisation, le pourcentage d’identité ci-dessus est d’au moins 85 pour cent d’identité avec les SEQ ID NO indiquées ; dans certains modes de réalisation, le pourcentage d’identité ci-dessus est d’au moins 90 pour cent d’identité avec les SEQ ID NO indiquées ; dans certains modes de réalisation, le pourcentage d’identité ci-dessus est d’au moins 95 pour cent d’identité avec les SEQ ID NO indiquées ; dans certains modes de réalisation, le pourcentage d’identité ci-dessus est d’au moins 97 pour cent d’identité ; dans certains modes de réalisation, le pourcentage d’identité ci-dessus est d’au moins 98 pour cent d’identité ; dans certains modes de réalisation, le pourcentage d’identité ci-dessus est d’au moins 99 pour cent d’identité. Dans le cadre de l’invention, les pourcentages d’identité utilisés pour comparer une séquence de référence à une séquence variante ne comprennent pas les positions d’acides aminés expressément spécifiées contenant les substitutions de la séquence variante ; cela signifie que la relation de pourcentage d’identité se fait entre les séquences d’une protéine de référence et les séquences d’une protéine variante à l’extérieur des positions expressément spécifiées contenant des substitutions dans le variant. Ainsi, par exemple, si la séquence de référence et la séquence variante comprenaient chacune 100 acides aminés, et que la séquence variante possédait des mutations sur les positions 25 et 81, alors le pourcentage d’homologie se ferait par rapport aux séquences 1 à 24, 26 à 80 et 82 à 100. SEQ ID NO Animal Substitutions 1 Souris M192R/Q C302G/R R336L/N R454P/N/A/V E457N/L/T/S/K 7 Souris M63R/Q C173G/R R207L/N R325P/N/A/V E328N/L/T/S/K 8 Bovin M63R/Q C173G/R R207L/N R324P/N/A/V E327N/L/T/S/K 9 Humain M63R/Q C173G/R R207L/N R324P/N/A/V E327N/L/T/S/K 10 Poulet --- C172G/R R206L/N R320P/N/A/V --- 11 Opossum M63R/Q C173G/R R207L/N R331P/N/A/V E334N/L/T/S/K 12 Musaraigne M63R/Q C173G/R R207L/N --- E328N/L/T/S/K 13 Python --- C174G/R R208L/N R331P/N/A/V E334N/L/T/S/K 14 Canin M73R/Q C173G/R R207L/N R325P/N/A/V E328N/L/T/S/K 15 Taupe M64R/Q C174G/R R208L/N --- E329N/L/T/S/K 16 Pika M61R/Q C171G/R R205L/N R323P/N/A/V E326N/L/T/S/K 17 Hérisson M63R/Q C173G/R R207L/N R328P/N/A/V E331N/L/T/S/K 18 Musaraigne des arbres --- C173G/R R207L/N R325P/N/A/V E328N/L/T/S/K 19 Ornithorynque M63R/Q C182G/R R216L/N R338P/N/A/V E341N/L/T/S/K 20 Gerboise M66R/Q C176G/R R210L/N R328P/N/A/V E331N/L/T/S/K 24 Canari --- C170G/R R204L/N R326P/N/A/V E329N/L/T/S/K 25 Manakin --- C158G/R R192L/N R314P/N/A/V E317N/L/T/S/K 26 Alligator --- --- R205L/N R327P/N/A/V E330N/L/T/S/K 27 Xenopus --- --- R205L/N R324P/N/A/V E327N/L/T/S/K 28 Serpent-tigre --- --- R205L/N R327P/N/A/V E330N/L/T/S/K 29 Truite brune --- --- R192L/N R311P/N/A/V E314N/L/T/S/K 30 Gymnote --- --- R205L/N R321P/N/A/V E325N/L/T/S/K 31 Poisson à pattes --- --- R205L/N R322P/N/A/V E325N/L/T/S/K 32 Guppy --- --- R205L/N R322P/N/A/V E325N/L/T/S/K 33 Rat M48R/Q C158G/R R192L/N R310P/N/A/V E313N/L/T/S/K 34 Rat M61R/Q C171G/R R205L/N R323P/N/A/V E326N/L/T/S/K 35 Singe colobus M61R/Q C171G/R R205L/N R323P/N/A/V E326N/L/T/S/K 36 Porc M61R/Q C171G/R R205L/N R323P/N/A/V E326N/L/T/S/K 37 Tigre M61R/Q C171G/R R205L/N R323P/N/A/V E326N/L/T/S/K 38 Buffle d'Asie M48R/Q C158G/R R192L/N R310P/N/A/V E313N/L/T/S/K 39 Marmotte M61R/Q C171G/R R205L/N R323P/N/A/V E326N/L/T/S/K Dans certains modes de réalisation, un variant de la TdT de l’invention dérive d’une TdT comprenant une séquence d’acides aminés ayant une identité d’au moins 80 pour cent avec une séquence d’acides aminés choisie parmi les SEQ ID NO 40 à 75, limites comprises, et une ou plusieurs des substitutions listées dans le Tableau 1, le variant de la TdT (i) étant capable de synthétiser un fragment d’acide nucléique sans matrice et (ii) étant capable d’incorporer un nucléotide modifié en 3’-O sur un 3’-hydroxyle libre d’un fragment d’acide nucléique. Dans certains modes de réalisation, les variants de la TdT ci-dessus comprennent une substitution sur chaque position listée dans le Tableau 2. Dans certains modes de réalisation, le pourcentage d’identité ci-dessus est d’au moins 85 pour cent d’identité avec les SEQ ID NO indiquées ; dans certains modes de réalisation, le pourcentage d’identité ci-dessus est d’au moins 90 pour cent d’identité avec les SEQ ID NO indiquées ; dans certains modes de réalisation, le pourcentage d’identité ci-dessus est d’au moins 95 pour cent d’identité avec les SEQ ID NO indiquées ; dans certains modes de réalisation, le pourcentage d’identité ci-dessus est d’au moins 97 pour cent d’identité ; dans certains modes de réalisation, le pourcentage d’identité ci-dessus est d’au moins 98 pour cent d’identité ; dans certains modes de réalisation, le pourcentage d’identité ci-dessus est d’au moins 99 pour cent d’identité. Comme ci-dessus, les pourcentages d’identité utilisés pour comparer une séquence de référence à une séquence variante ne comprennent pas les positions d’acides aminés expressément spécifiées contenant des substitutions de la séquence variante ; cela signifie que la relation de pourcentage d’identité est entre les séquences d’une protéine de référence et les séquences d’une protéine variante à l’extérieur des positions expressément spécifiées contenant des substitutions dans le variant. Les variants de la TdT de SEQ ID NO 40 à 54, limites comprises, 56, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 70, 73 et 74 comprennent des substitutions sur une ou plusieurs des positions indiquées d’acides aminés, telles que listées dans le Tableau 2, en plus d’une substitution stabilisante de la glutamine en position 4 (ou sur une position fonctionnellement équivalente). Dans d’autres modes de réalisation, les variants de la TdT de l’invention dérivent de TdT naturelles telles celles qui sont listées dans le Tableau 2, avec une substitution sur chacune des positions indiquées d’acides aminés en plus de la substitution stabilisante de la glutamine en position 4. Dans certains modes de réalisation, cet acide aminé stabilisant remplaçant la glutamine est choisi dans le groupe consistant en E, S, D et N. Dans d’autres modes de réalisation, l’acide aminé stabilisant est E. SEQ ID NO Animal Substitutions 1 Souris M192R/Q C302G/R R336L/N R454P/N/A/V E457N/L/T/S/K 40 Souris M44R/Q C154G/R R188L/N R306P/N/A/V E309N/L/T/S/K 41 Bovin M44R/Q C154G/R R188L/N R305P/N/A/V E308N/L/T/S/K 42 Humain M44R/Q C154G/R R188L/N R305P/N/A/V E308N/L/T/S/K 43 Poulet --- C154G/R R188L/N R302P/N/A/V --- 44 Opossum M44R/Q C154G/R R188L/N R312P/N/A/V E315N/L/T/S/K 45 Musaraigne M44R/Q C154G/R R188L/N --- E309N/L/T/S/K 46 Canin M44R/Q C154G/R R188L/N R306P/N/A/V E309N/L/T/S/K 47 Taupe M44R/Q C154G/R R188L/N --- E309N/L/T/S/K 48 Pika M44R/Q C154G/R R188L/N R306P/N/A/V E309N/L/T/S/K 49 Hérisson M44R/Q C154G/R R188L/N R309P/N/A/V E312N/L/T/S/K 50 Musaraigne des arbres --- C154G/R R188L/N R306P/N/A/V E309N/L/T/S/K 51 Ornithorynque M44R/Q C163G/R R197L/N R319P/N/A/V E322N/L/T/S/K 52 Canari --- C153G/R R187L/N R309P/N/A/V --- 53 Manakin --- C154G/R R188L/N R310P/N/A/V E311N/L/T/S/K 54 Alligator --- --- R188L/N R310P/N/A/V E313N/L/T/S/K 56 Xenopus --- --- R188L/N R307P/N/A/V E310N/L/T/S/K 59 Truite brune --- --- R188L/N --- E310N/L/T/S/K 61 Gymnote --- --- R188L/N --- --- 63 Poisson à pattes --- --- R188L/N R305P/N/A/V E308N/L/T/S/K 65 Guppy --- --- R188L/N R305P/N/A/V E308N/L/T/S/K 67 Rat --- --- R188L/N R306P/N/A/V E309N/L/T/S/K 69 Piliocolobus --- --- R188L/N R306P/N/A/V E309N/L/T/S/K 70 Porc M44R/Q C154G/R R188L/N R306P/N/A/V E309N/L/T/S/K 73 Buffle d'Asie M44R/Q C154G/R R188L/N R305P/N/A/V E308N/L/T/S/K 74 Marmotte M44R/Q C154G/R R188L/N R306P/N/A/V E309N/L/T/S/K Dans certains modes de réalisation, des variants de la TdT supplémentaires, pour une utilisation avec les procédés de l’invention, comprennent une ou plusieurs des substitutions de méthionine, cystéine, arginine (première position), arginine (seconde position) ou acide glutamique, comme on le voit dans le Tableau 2. Dans certains modes de réalisation, on peut aussi utiliser avec la présente invention un variant de la TdT comprenant une séquence d’acides aminés ayant une identité d’au moins quatre-vingt-dix pour cent avec une séquence d’acides aminés de SEQ ID NO 55, 57, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 71, 72 et 75 à 112, limites comprises. Pour ce qui est des variants de la TdT de SEQ ID NO 7 à 112, dans certains modes de réalisation, un nucléotide modifié en 3’-O peut comprendre un 3’-O-NH 2 -nucléoside triphosphate, un 3’-O-azidométhyl-nucléoside triphosphate, un 3’-O-allyl-nucléoside triphosphate, un 3’O—(2-nitrobenzyl)-nucléoside triphosphate, ou un 3’-O-propargyl-nucléoside triphosphate. On peut utiliser avec le procédé de l’invention une large gamme de PAP, y compris les variants de PAP qui ont été manipulés pour améliorer les caractéristiques, telles que des taux d’incorporation plus élevés de rNTP protégés en 3’-O (y compris pour des groupes de protection particuliers, tels que le 3’-O-azidométhyle), une plus grande stabilité et une plus grande durée de conservation, la thermostabilité, la solubilité et analogues. En particulier, une PAP de levure portant une mutation en M310 (SEQ ID NO : 1), ou un résidu équivalent fonctionnel d’autres PAP, telles que les PAP provenant de différentes autres espèces, présente une meilleure incorporation des rNTP protégés en 3’-O, par rapport à une PAP de type sauvage. Dans certains modes de réalisation, un variant de PAP de levure de l’invention a une séquence d’acides aminés de SEQ ID NO : 1 sauf pour ce qui est d’une substitution en M310. Dans certains modes de réalisation, cette substitution est choisie parmi M310F/Y/V/E/T. En particulier, les substitutions M310F/Y permettent l’incorporation de 3’-O-amino-rATP et les substitutions M310V/E/T améliorent le taux d’incorporation des rGTP protégés en 3’-O. Dans d’autres modes de réalisation, un variant de PAP de levure de l’invention a une séquence d’acides aminés ayant une identité d’au moins 90 pour cent avec la SEQ ID NO : 1, sauf pour ce qui est d’une substitution en M310. Les variants de PAP utilisés avec l’invention comprennent ceux qui sont listés dans le Tableau 3 ci-dessous. Dans certains modes de réalisation, les variants de PAP de l’invention comprennent au moins une substitution sur la seconde position indiquée dans le Tableau 3. Dans d’autres modes de réalisation, des modes de réalisation de variants de PAP de l’invention comprennent au moins une substitution sur une première position indiquée dans le Tableau 3. Tableau 3 : Variants de PAP : Position des substitutions SEQ ID NO Organisme Première position Seconde position 113 levure V234 M310 114 Myceliophthora V240 M318 115 Thielavia V240 M318 116 Pyronema I237 M316 117 Tilletia V232 M309 118 Clathrospora V240 M316 119 Drechslerella V196 M272 120 Magnaporthiopsis V240 M316 121 Cryptococcus V229 M307 122 Golovinomyces V236 M313 123 Hortaea V236 M312 124 Valsa V241 M317 125 Wallemia V233 M316 126 Xylaria V240 M316 127 Chaetomium V240 M312 128 Lachancea V234 M310 129 Schizosaccharomyces V233 M309 130 Exophiala V237 M317 131 Scedosporium V238 M314 132 Trichoderma V231 M307 133 Aspergillus V239 M315 134 Sodiomyces V240 M316 135 Neohortaea V235 M311 Dans certains modes de réalisation, une substitution sur la première position telle qu’indiquée dans le Tableau 3 est A ou G (ainsi, par exemple pour SEQ ID NO : 113, la substitution peut être écrite V234A/G). Dans certains modes de réalisation, une substitution sur une seconde position telle qu’indiquée dans le Tableau 3 est F, Y, V, E, ou T (ainsi, par exemple pour la SEQ ID NO : 113, la substitution peut être écrite M310F/Y/V/E/T) Dans certains modes de réalisation, un variant de PAP de l’invention a une ou plusieurs des substitutions du Tableau 3 et un pourcentage d’identité d’au moins 80 pour cent d’identité avec la SEQ ID NO indiquée ; dans certains modes de réalisation, le pourcentage d’identité ci-dessus est d’au moins 90 pour cent d’identité avec la SEQ ID NO indiquée ; dans certains modes de réalisation, le pourcentage d’identité ci-dessus est d’au moins 95 pour cent d’identité avec la SEQ ID NO indiquée ; dans certains modes de réalisation, le pourcentage d’identité ci-dessus est d’au moins 97 pour cent d’identité ; dans certains modes de réalisation, le pourcentage d’identité ci-dessus est d’au moins 98 pour cent d’identité ; dans certains modes de réalisation, le pourcentage d’identité ci-dessus est d’au moins 99 pour cent d’identité. Dans certains modes de réalisation, on utilise une PAP thermostable, le procédé pouvant ainsi être mis en œuvre à une température qui réduit ou élimine la formation de structures secondaires dans l’ARN ou l’ADN synthétisé. Dans certains modes de réalisation, la plage de températures dans laquelle a lieu le taux d’incorporation le plus élevé pour la PAP thermostable est supérieure à 40 °C. Dans certains modes de réalisation, la plage de températures dans laquelle se produit le taux d’incorporation le plus élevé pour la PAP thermostable est supérieure à 50 °C. Dans certains modes de réalisation, la plage de températures dans laquelle se produit le taux d’incorporation le plus élevé pour la PAP thermostable est entre 40 °C et 85 °C. Dans certains modes de réalisation, la plage de températures dans laquelle se produit le taux d’incorporation le plus élevé pour la PAP thermostable est entre 50 °C et 85 °C. Comme avec les PAP, on peut utiliser une large gamme de PUP avec le procédé de l’invention, y compris les variants de PUP qui ont été manipulés pour avoir des caractéristiques améliorées, telles que des taux d’incorporation plus élevés des rNTP protégés en 3’-O (y compris pour les groupes de protection particuliers, tels que le 3’-O-azidométhyle), une plus grande stabilité et une plus grande durée de conservation, la thermostabilité, la solubilité et analogues. Les variants de PUP destinés à être utilisés avec l’invention comprennent ceux qui sont listés dans le Tableau 4 ci-dessous. Dans certains modes de réalisation, les variants de PUP de l’invention comprennent au moins une substitution sur la première position indiquée dans le Tableau 4. Dans d’autres modes de réalisation, des modes de réalisation de variants de PUP de l’invention comprennent au moins une substitution sur la seconde position indiquée dans le Tableau 4. Tableau 4 : Variants de PUP : Position des substitutions SEQ ID NO Organisme Première position Seconde position 136 S. pombe Y212 H336 137 T. brucei Y189 L303 138 S. pombe Y184 H308 139 T. boudieri Y227 H364 140 D. stenobrocha Y478 H613 141 Phytomonas Y192 L306 142 B. saltans Y186 L326 143 A. deanei Y243 L392 144 P. lactucaedebilis Y196 H330 145 S. culicis Y253 L392 146 B. meristosporus Y284 H408 147 N. californiae Y182 H310 148 Perkinsela Y187 L394 149 S. complicate Y203 H331 150 S. ochraceum Y224 F349 151 G. androsaceus Y204 Y332 152 T. equiperdum Y337 L473 153 M. conica Y296 H431 154 P. murina Y291 H423 155 S. japonicus Y218 H340 156 A. nigricans Y366 H509 Dans certains modes de réalisation, une substitution sur une première position telle qu’indiquée dans le Tableau 4 est A ou G (ainsi, par exemple pour la SEQ ID NO : 136, la substitution peut être écrite Y212A/G). Dans certains modes de réalisation, une substitution sur une seconde position telle qu’indiquée dans le Tableau 4 est F, Y, V, E, ou T (ainsi, par exemple pour la SEQ ID NO : 4, la substitution peut être écrite H336F/Y/V/E/T) Dans certains modes de réalisation, un variant de PUP de l’invention a une ou plusieurs des substitutions du Tableau 4 et une identité en pourcentage d’au moins 80 pour cent d’identité avec la SEQ ID NO indiquée ; dans certains modes de réalisation, le pourcentage d’identité ci-dessus est d’au moins 90 pour cent d’identité avec la SEQ ID NO indiquée ; dans certains modes de réalisation, le pourcentage d’identité ci-dessus est d’au moins 95 pour cent d’identité avec la SEQ ID NO indiquée ; dans certains modes de réalisation, le pourcentage d’identité ci-dessus est d’au moins 97 pour cent d’identité ; dans certains modes de réalisation, le pourcentage d’identité ci-dessus est d’au moins 98 pour cent d’identité ; dans certains modes de réalisation, le pourcentage d’identité ci-dessus est d’au moins 99 pour cent d’identité. Dans certains modes de réalisation, on utilise une PUP thermostable, le procédé pouvant ainsi être mis en œuvre à une température qui réduit ou élimine la formation de structures secondaires dans l’ARN ou l’ADN synthétisé. Dans certains modes de réalisation, la plage de températures dans laquelle se produit le taux d’incorporation le plus élevé pour la PUP thermostable est supérieure à 40 °C. Dans certains modes de réalisation, la plage de températures dans laquelle se produit le taux d’incorporation le plus élevé pour la PUP thermostable est supérieure à 50 °C. Dans certains modes de réalisation, la plage de températures dans laquelle se produit le taux d’incorporation le plus élevé pour la PUP thermostable est entre 40 °C et 85 °C. Dans certains modes de réalisation, la plage de températures dans laquelle se produit le taux d’incorporation le plus élevé pour la PUP thermostable est entre 50 °C et 85 °C. Les variants de TdT, de PAP et de PUP destinés à être utilisés avec l’invention comprennent chacun une séquence d’acides aminés ayant une identité de séquence en pourcentage avec une SEQ ID NO spécifiée, sous réserve de la présence de substitutions indiquées. Dans certains modes de réalisation, le nombre et le type de différences de séquence entre un variant de l’invention décrit de cette manière et la SEQ ID NO indiquée peuvent être dus à des substitutions, une délétion et/ou des insertions, et les acides aminés substitués, délétés et/ou insérés peuvent comprendre un acide aminé quelconque. Dans certains modes de réalisation, ces délétions, substitutions et/ou insertions ne comprennent que des acides aminés naturels. Dans certains modes de réalisation, les substitutions ne comprennent que des changements d’acides aminés conservatifs ou synonymes, comme décrit dans Grantham, Science, 185 : 862-864 (1974). Ainsi, une substitution d’un acide aminé peut n’apparaître que parmi les membres de son ensemble d’acides aminés synonymes. Dans certains modes de réalisation, des ensembles d’acides aminés synonymes peuvent être utilisés, comme il ressort du Tableau 5A. Tableau 5A : Ensembles synonymes d’acides aminés I Acide aminé Ensemble synonyme Ser Ser, Thr, Gly, Asn Arg Arg, Gln, Lys, Glu, His Leu Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu Pro Gly, Ala, Thr, Pro Thr Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr Ala Gly, Thr, Pro, Ala Val Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val Gly Gly, Ala, Thr, Pro, Ser Ile Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile Phe Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe Tyr Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr Cys Cys, Ser, Thr His His, Glu, Lys, Gln, Thr, Arg Gln Gln, Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg Asn Asn, Gln, Asp, Ser Lys Lys, Glu, Gln, His, Arg Asp Asp, Glu, Asn Glu Glu, Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg Met Met, Phe, Ile, Val, Leu Trp Trp Dans certains modes de réalisation, des ensembles d’acides aminés synonymes pouvant être utilisés sont présentés dans le Tableau 5B. Tableau 5B : Ensembles synonymes d’acides aminés II Acide aminé Ensemble synonyme Ser Ser Arg Arg, Lys, His Leu Ile, Phe, Met, Leu Pro Ala, Pro Thr Thr Ala Pro, Ala Val Met, Ile Val Gly Gly Ile Met, Phe, Val, Leu, Ile Phe Met, Tyr, Ile, Leu, Phe Tyr Trp, Met Cys Cys, Ser His His, Gln, Arg Gln Gln, Glu, His Asn Asn, Asp Lys Lys, Arg Asp Asp, Asn Glu Glu, Gln Met Met, Phe, Ile, Val, Leu Trp Trp Les variants de TdT, de PAP et de PUP destinés à être utilisés avec l’invention sont produits par des techniques classiques de biotechnologie et peuvent comprendre une étiquette d’affinité pour purification, qui peut être fixée au site N-terminal, au site C-terminal ou sur une position intérieure de la polymérase sans matrice. Dans certains modes de réalisation, les étiquettes d’affinité sont clivées avant utilisation de la polymérase sans matrice. Dans d’autres modes de réalisation, les étiquettes d’affinité ne sont pas clivées avant utilisation. Dans certains modes de réalisation, une étiquette d’affinité peptidique est insérée dans la région de la boucle 2 d’un variant de la TdT. Un exemple d’étiquette His N-terminale destinée à être utilisée avec des variants de la TdT de l’invention est MASSHHHHHHSSGSENLYFQTGSSG- (SEQ ID NO : 6)). Des instructions permettant de sélectionner une étiquette d’affinité peptidique sont décrites dans les références suivantes : Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol., 60 : 523-533 (2003) ; Arnau et al, Protein Expression and Purification, 48 : 1-13 (2006) ; Kimple et al, Curr. Protoc. Protein Sci., 73 : Unit-9.9 (2015) ; Kimple et al, brevet U.S. 7309575 ; Lichty et al, Protein Expression and Purification, 41 : 98-105 (2005) ; et analogues. Des instructions permettant de sélectionner une étiquette d’affinité peptidique sont décrites dans les références suivantes : Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol., 60 : 523-533 (2003) ; Arnau et al, Protein Expression and Purification, 48 : 1-13 (2006) ; Kimple et al, Curr. Protoc. Protein Sci., 73 : Unit-9.9 (2015) ; Kimple et al, brevet U.S. 7309575 ; Lichty et al, Protein Expression and Purification, 41 : 98-105 (2005) ; et analogues. Mesure de l’activité d’incorporation des nucléotides L’efficacité de l’incorporation de nucléotides par des variants utilisés avec l’invention peut être mesurée par un essai d’extension, ou d’allongement, par exemple tel que décrit dans Boule et al (cité ci-dessous) ; Bentolila et al (cité ci-dessous) ; et Hiatt et al, brevet U.S. 5808045, ce dernier étant incorporé dans l’invention par renvoi. En bref, dans une forme d’un tel essai, un oligonucléotide marqué par fluorescence ayant un 3’-hydroxyle libre est mis à réagir avec une polymérase sans matrice, telle qu’une TdT, dans des conditions d’extension pendant une durée prédéterminée en présence d’un nucléoside triphosphate à blocage réversible, ce après quoi la réaction d’extension est interrompue, et les quantités des produits d’extension et de l’oligonucléotide non étendu sont quantifiées après séparation par électrophorèse sur gel. Avec ces essais, il est possible de comparer facilement l’efficacité d’incorporation d’une polymérase variante sans matrice avec l’efficacité d’autres variants, ou celle de polymérases de type sauvage ou de référence. Dans certains modes de réalisation, une mesure du rendement en la polymérase sans matrice peut être un rapport (en pourcentage) entre la quantité de produit étendu utilisant la polymérase variante sans matrice et la quantité de produit étendu utilisant la polymérase sans matrice de type sauvage, ou la polymérase de référence, dans un essai équivalent. Dans certains modes de réalisation, l’essai d’extension particulier ci-après peut être utilisé pour mesurer les efficacités d’incorporation des TdT. L’amorce utilisée est la suivante : 5'-AAAAAAAAAAAAAAGGGG-3' (SEQ ID NO : 5) L’amorce possède aussi un colorant fluorescent ATTO en son extrémité 5’. Les nucléotides modifiés représentatifs utilisés (notés dNTP dans le Tableau 6) comprennent les 3'-O-amino-2',3'-didésoxynucléotides-5'-triphosphates (-ONH 2 , Firebird Biosciences), tels que le 3'-O-amino-2',3'-didésoxyadénosine-5'-triphosphate. Pour chaque variant différent testé, un tube est utilisé pour la réaction. Les réactifs sont introduits dans le tube, en commençant par de l’eau, puis dans l’ordre du Tableau 6. Au bout de 30 minutes à 37 °C, on interrompt la réaction par addition de formamide (Sigma). Tableau 6 : Réactifs de l’essai d’activité d’extension Réactif Concentration Volume H 2 O - 12 μl Tampon d'activité 10x 2 μl dNTP 250 μM 2 μl Enzyme purifiée 20 μM 2 μl Amorce fluorescente 500 nM 2 μl Le tampon d’activité comprend, par exemple, le tampon de réaction de la TdT (disponible auprès de New England Biolabs) supplémenté par du CoCl 2 . Le produit de l’essai est analysé par une électrophorèse classique sur gel de polyacrylamide. Par exemple, les produits de l’essai ci-dessus peuvent être analysés dans un gel dénaturant de polyacrylamide à 16 pour cent (Bio-Rad). Les gels sont fabriqués juste avant l’analyse par versement de polyacrylamide à l’intérieur de plaques de verre, et abandon pour polymérisation. Le gel à l’intérieur des plaques de verre est monté sur une cuve adaptée, remplie d’un tampon TBE (Sigma) pour l’étape d’électrophorèse. Les échantillons à analyser sont chargés à la partie supérieure du gel. On applique une tension de 500 à 2 000 V entre la partie supérieure et la partie inférieure du gel pendant 3 à 6 heures à la température ambiante. Après séparation, la fluorescence du gel est analysée, par exemple, par utilisation d’un scanner Typhoon (GE Life Sciences). L’image du gel est analysée à l’aide du logiciel ImageJ (imagej.nih.gov/ij/) ou son équivalent, pour calculer le pourcentage d’incorporation des nucléotides modifiés. Le rendement d’allongement d’une polymérase sans matrice peut aussi être mesuré dans l’essai ci-après de complétion d’une épingle à cheveux. Dans cet essai, un polynucléotide d’essai est fourni, comportant un 3’-hydroxyle libre, de telle sorte que, dans les conditions de réaction, il ne soit essentiellement que simple brin mais, après extension avec une polymérase telle qu’un variant de la TdT, il forme une structure stable en épingle à cheveux comprenant une boucle simple brin et une tige double brin. Cette façon de faire permet la détection d’une extension de l’extrémité 3’ grâce à la présence du polynucléotide double brin. La structure double brin peut être détectée par de nombreuses techniques comprenant, mais sans limitation, (i) les colorants fluorescents qui, de préférence, présentent une fluorescence après intercalation dans une structure double brin, (ii) un transfert d’énergie de résonance en fluorescence (FRET) entre un accepteur (ou donneur) sur le polynucléotide étendu et un donneur (ou accepteur) sur un oligonucléotide qui forme un triplexe avec la tige en épingle à cheveux nouvellement formée, (iii) des accepteurs et des donneurs FRET, qui sont tous les deux fixés au polynucléotide d’essai et qui sont placés au voisinage de FRET après formation d’une épingle à cheveux, ou analogues. Dans certains modes de réalisation, une partie tige d’un polynucléotide d’essai après extension par un nucléotide unique a une longueur comprise dans la plage de 4 à 6 paires de bases ; dans d’autres modes de réalisation, cette partie tige a une longueur de 4 à 5 paires de bases ; et dans encore d’autres modes de réalisation, cette partie tige a une longueur de 4 paires de bases. Dans certains modes de réalisation, un polynucléotide d’essai a une longueur dans la plage de 10 à 20 nucléotides ; dans d’autres modes de réalisation, un polynucléotide d’essai a une longueur dans la plage de 12 à 15 nucléotides. Dans certains modes de réalisation, il est avantageux ou commode d’étendre le polynucléotide d’essai avec un nucléotide qui va maximiser la différence entre les températures de fusion de la tige sans extension et de la tige avec extension ; ainsi, dans certains modes de réalisation, un polynucléotide d’essai est étendu avec un dC ou un dG (et en conséquence le polynucléotide d’essai est choisi de façon à avoir un nucléotide complémentaire convenant à la formation de la tige). Des exemples de polynucléotides d’essai pour des essais de complétion d’épingles à cheveux comprennent p875 (5’- CAGTTAAAAACT) (SEQ ID NO : 2), qui est complété par extension avec un dGTP ; p876 (5’- GAGTTAAAACT) (SEQ ID NO : 3) qui est complété par extension avec un dCTP ; et p877 (5’- CAGCAAGGCT) (SEQ ID NO : 4) qui est complété par extension avec un dGTP. Des exemples de conditions de réaction pour ces polynucléotides d’essai peuvent comprendre : 2,5 à 5 μM du polynucléotide d’essai, dilution au 1:4 000 de GelRed ® (colorant d’intercalation de Biotium, Inc., Fremont, CA), 200 mM de Cacodylate KOH pH 6,8, 1 mM de CoCl 2 , 0 à 20 % de DMSO et 3’-ONH 2 dGTP et TdT aux concentrations souhaitées. La complétion de l’épingle à cheveux peut être suivie par une augmentation de la fluorescence du colorant GelRed® par utilisation d’un fluorimètre classique, tel qu’un lecteur TECAN à une température de réaction de 28 à 38 °C, par utilisation d’un ensemble de filtres d’excitation à 360 nm et d’un filtre d’émission ajusté à 635 nm. Trousses L’invention englobe une variété de trousses pour la mise en œuvre pratique des procédés de l’invention. Selon un aspect, les trousses de l’invention comprennent un support de synthèse auquel est fixé, éventuellement par une extrémité 5’, un amorceur comprenant un polyC oligonucléotide. Dans certains modes de réalisation, ce support de synthèse est un support solide. Dans d’autres modes de réalisation, ce support solide peut comprendre des particules, qui peuvent être des particules poreuses ou des particules non poreuses. Les particules non poreuses peuvent comprendre par exemple des perles magnétiques. Dans d’autres modes de réalisation, ces particules peuvent comprendre des particules poreuses, telles que des résines ou des gels. Dans certains modes de réalisation, ces résines comprennent une résine d’agarose. Dans certains des modes de réalisation ci-dessus, des amorceurs fixés à un support solide comprennent chacun un ou plusieurs polyC oligonucléotides, ayant chacun une longueur dans la plage de 2 à 30 nucléotides. Dans certains modes de réalisation, ce support solide est une population de microparticules, en particulier de microparticules non poreuses. Dans d’autres modes de réalisation, ce support solide est une population de microparticules poreuses. Dans certains modes de réalisation, ces microparticules poreuses sont des microparticules d’agarose. Dans certains modes de réalisation, ce support solide est un support plan, tel qu’une lame de verre. Dans certains modes de réalisation, ce support plan porte un revêtement uniforme d’amorceurs contenant un ou plusieurs polyC oligonucléotides. Dans d’autres modes de réalisation, ce support plan possède une matrice de sites de réaction discrets comprenant chacun un revêtement d’amorceurs contenant un ou plusieurs polyC oligonucléotides. Dans certains modes de réalisation, les trousses de l’invention comprennent en outre un ou plusieurs variants de polymérase sans matrice dans une formulation, ou dans des formulations, si elles sont fournies séparément, convenant à la mise en œuvre d’une synthèse enzymatique de polynucléotides sans matrice telle que décrite dans l’invention. Ces trousses peuvent aussi comprendre des tampons de synthèse pour chaque variant de polymérase sans matrice, qui donnent des conditions de réaction permettant d’optimiser l’addition ou l’incorporation sans matrice d’un dNTP protégé en 3’-O à un brin en cours de croissance. Dans des modes de réalisation permettant la synthèse de l’ADN, une polymérase sans matrice est un variant de la TdT. Dans des modes de réalisation servant à la synthèse de l’ARN, une polymérase sans matrice est un variant de PAP et/ou de PUP. Dans certains modes de réalisation, les trousses de l’invention peuvent comprendre un support solide auquel est fixé par une extrémité 5’ un amorceur comprenant un polyC oligonucléotide et des polyC oligonucléotides distincts fixés au même support solide. Dans des modes de réalisation additionnels, ces trousses peuvent comprendre des polyC oligonucléotides en solution. Dans certains modes de réalisation, les trousses de l’invention comprennent en outre des dNTP à protection réversible en 3’-O. Dans ces modes de réalisation, les dNTP à protection réversible en 3’-O peuvent comprendre des 3’-O-amino-dNTP ou des 3’-O-azidométhyl-dNTP. Dans d’autres modes de réalisation, les trousses peuvent comprendre un ou plusieurs des éléments suivants, séparément ou ensemble avec les éléments mentionnés ci-dessus : (i) des réactifs de déprotection ou de déblocage pour la mise en œuvre d’une étape de déprotection ou de déblocage telle que décrite dans l’invention, (ii) des supports solides auxquels sont fixés des amorceurs, (iii) des réactifs de clivage pour libérer des supports solides les polynucléotides complétés, (iv) des réactifs ou des tampons de lavage pour éliminer les dNTP à protection réversible en 3’-O n’ayant pas réagi à la fin de l’étape d’addition enzymatique ou de couplage, et (v) des réactifs de traitement après synthèse, tels que des colonnes de purification, des réactifs de dessalement, des réactifs d’élution et analogues. Pour ce qui concerne les éléments (ii) et (iii) ci-dessus, certains amorceurs et certains réactifs de clivage se réunir. Par exemple, un amorceur comprenant un nucléotide clivable par l’inosine peut être réuni à un réactif de clivage par une endonucléase V ; un amorceur comprenant un lieur photoclivable par nitrobenzyle peut être réuni à une source lumineuse convenant au clivage du lieur photoclivable ; un amorceur comprenant un uracile peut être réuni à un réactif de clivage par uracile ADN glycosylase ; et analogues. EXEMPLE Synthèse de polynucléotides formant des G4 Avec et sans amorceurs PolyC Dans cet exemple, huit polydésoxyribonucléotides ayant des séquences formant des G4 sont synthétisés avec et sans amorceurs PolyC, essentiellement conformément au protocole de synthèse décrit ci-dessus à titre d’exemple. Les supports solides sont des perles d’agarose de 45 μm activées par du CNBr, ayant un amorceur polyC (-CCCCCCCCCCCCCCCTdIT-3’ (SEQ ID NO : 157)) fixé par l’intermédiaire d’un lieur C15 ou un amorceur non-polyC (-TTTTTTTTTTdIT-3’ (SEQ ID NO : 158)) fixé par l’intermédiaire d’un lieur C15. La polymérase sans matrice est le variant de la TdT M77 (SEQ ID NO : 106) ayant une étiquette d’affinité N-terminale (SEQ ID NO : 6). Après la synthèse, le produit polynucléotide est éliminé par clivage des supports solides par utilisation d’une EndoV endonucléase, en suivant le protocole décrit dans Creton, publication de brevet international WO/2020/165137. Les produits de synthèse clivés sont analysés par électrophorèse capillaire pour déterminer la pureté du polynucléotide souhaité, et des échantillons du produit sont séquencés pour évaluer les erreurs par délétion, substitution et insertion. Grâce à ces deux mesures, l’utilisation d’amorceurs contenant polyC a montré des rendements significativement améliorés en les produits souhaités. Les données de pureté indiquent que l’utilisation de l’amorceur polyC a augmenté la pureté des produits polynucléotides formant des G4, en moyenne de 20 pour cent ou plus. Les tableaux ci-après comparent les taux d’erreur de différents types dans les séquences échantillonnées à partir des polynucléotides synthétisés avec et sans amorceurs contenant polyC. Taux d’erreur en pourcentage moyen par utilisation d’amorceurs non-PolyC A C G T Substitutions 0,08 0,66 0,17 0,04 Insertions 0,16 0,10 0,13 0,17 Délétions 1,11 0,62 0,64 0,52 Taux d’erreur en pourcentage moyen par utilisation d’amorceurs PolyC A C G T Substitutions 0,08 0,21 0,09 0,03 Insertions 0,06 0,05 0,09 0,08 Délétions 0,94 0,28 0,37 0,30 Définitions À moins d’être autrement et spécifiquement définis dans l’invention, les termes et symboles de la chimie des acides nucléiques, de la biochimie, de la génétique et de la biologie moléculaire utilisés dans l’invention respectent ceux des traités et textes standards dans ce domaine, par exemple Kornberg et Baker, DNA Replication, seconde édition (W.H. Freeman, New York, 1992) ; Lehninger, Biochemistry, seconde édition (Worth Publishers, New York, 1975) ; Strachan et Read, Human Molecular Genetics, seconde édition (Wiley-Liss, New York, 1999). « Fonctionnellement équivalent », par référence aux positions d’acides aminés dans deux TdT différentes ou plus, signifie (i) les acides aminés sur les positions respectives jouent le même rôle fonctionnel dans l’activité des TdT, et (ii) les acides aminés apparaissent sur des positions d’acides aminés homologues dans les séquences d’acides aminés des TdT respectives. Il est possible d’identifier des résidus d’acides aminés positionnellement équivalents ou homologues dans les séquences d’acides aminés de deux TdT différentes ou plus en se fondant sur l’alignement des séquences et/ou la modélisation moléculaire. Dans certains modes de réalisation, des positions d’acides aminés fonctionnellement équivalentes appartiennent à des motifs d’inefficacité, qui sont conservés parmi les séquences d’acides aminés des TdT d’espèces apparentées du point de vue de l’évolution, par exemple genres, familles ou analogues. Des exemples de tels motifs d’inefficacité conservés sont décrits dans Motea et al, Biochim. Biophys. Acta. 1804(5) : 1151-1166 (2010) ; Delarue et al, EMBO J., 21 : 427-439 (2002) ; et les références analogues. « Trousse » désigne tout système de livraison, tel qu’un conditionnement, pour livrer des matériaux ou des réactifs destinés à la mise en œuvre d’un procédé réalisé par un système ou un appareil de l’invention. Dans certains modes de réalisation, des matériaux consommables ou des réactifs sont délivrés à un utilisateur d’un système ou d’un appareil de l’invention dans un conditionnement appelé dans l’invention une « trousse ». Dans le contexte de l’invention, ces systèmes de livraison comprennent habituellement des méthodes et matériels de conditionnement qui permettent le stockage, le transport ou la livraison de matériaux, tels que des supports de synthèse, des oligonucléotides, des dNTP protégés en 3’-O, et analogues. Par exemple, les trousses peuvent comprendre un ou plusieurs compartiments (par exemple des boîtes) contenant des supports solides auxquels sont fixés des amorceurs polyC et/ou des matériaux de support. Ces éléments contenus peuvent être délivrés au receveur prévu, ensemble ou séparément. Par exemple, un premier récipient peut contenir des supports solides auxquels sont fixés des amorceurs polyC, tandis qu’un deuxième récipient, ou des récipients supplémentaires, contiennent un désoxynucléoside triphosphate protégé en 3’-O, une polymérase sans matrice, par exemple, un variant de la TdT spécifique, et des tampons appropriés. « Mutant » ou « variant », qui sont utilisés d’une manière interchangeable, désignent des polypeptides obtenus à partir d’un polypeptide TdT naturel ou de référence décrit dans l’invention, et comprenant une modification ou une altération, par exemple une substitution, une insertion et/ou une délétion, sur une ou plusieurs positions. Les variants peuvent être obtenus par différentes techniques bien connues. En particulier, des exemples de techniques pour altérer la séquence d’ADN codant pour la protéine de type sauvage comprennent, mais sans y être limités, la mutagenèse dirigée, la mutagenèse aléatoire, le brassage des séquences et la construction d’oligonucléotides de synthèse. Les activités de mutagenèse consistent en la délétion, l’insertion ou la substitution d’un ou plusieurs acides aminés dans la séquence d’une protéine ou, dans le cas de l’invention, d’une polymérase. La terminologie ci-après est utilisée pour désigner une substitution : L238A indique que le résidu d’acide aminé (Leucine, L) sur la position 238 d’une séquence de référence ou de type sauvage est changé en une alanine (A). A132V/I/M indique que le résidu d’acide aminé (alanine, A) sur la position 132 de la séquence parente est remplacé par l’un des acides aminés suivants : valine (V), isoleucine (I) ou méthionine (M). La substitution peut être une substitution conservative ou non conservative. Des exemples de substitutions conservatives sont à l’intérieur des groupes d’acides aminés basiques (arginine, lysine et histidine), des acides aminés acides (acide glutamique et acide aspartique), des acides aminés polaires (glutamine, asparagine et thréonine), des acides aminés hydrophobes (méthionine, leucine, isoleucine, cystéine et valine), des acides aminés aromatiques (phénylalanine, tryptophane et tyrosine), et des petits acides aminés (glycine, alanine et sérine). « Polynucléotide » ou « oligonucléotide » sont utilisés d’une manière interchangeable, et chacun désigne un polymère linéaire de monomères nucléotidiques ou d’analogues de ceux-ci. Les monomères constituant les polynucléotides et les oligonucléotides sont capables de se lier spécifiquement à un polynucléotide naturel conformément à un schéma régulier d’interactions monomère à monomère, comme le type Watson-Crick d’appariement des bases, l’empilement des bases, les types d’appariement des bases de Hoogsteen ou de Hoogsteen inverse, ou analogues. Ces monomères et leurs liaisons internucléosidiques peuvent être naturels ou peuvent être leurs analogues, par exemple des analogues naturels ou non naturels. Les analogues non naturels peuvent comprendre les PNA, les liaisons internucléosidiques phosphorothioates, les bases contenant des groupes de liaison permettant la fixation de marqueurs tels que des fluorophores, ou des haptènes, et analogues. Chaque fois que l’utilisation d’un oligonucléotide ou d’un polynucléotide exige un traitement enzymatique, tel qu’une extension par une polymérase, une ligature par une ligase, ou analogues, l’homme du métier comprendrait que les oligonucléotides ou polynucléotides, dans ces cas, ne contiendraient pas certains analogues de liaisons internucléosidiques, certains fragments sucre, ou des bases sur une position quelconque ou sur certaines positions. Les polynucléotides ont habituellement une taille allant de quelques motifs monomères, par exemple 5 à 40 lorsqu’ils sont habituellement désignés par « oligonucléotides », à plusieurs milliers de motifs monomères. Chaque fois qu’un polynucléotide ou un oligonucléotide est représenté par une séquence de lettres (majuscules ou minuscules), par exemple « ATGCCTG », on comprendra que les nucléotides sont dans l’ordre 5'→3' de gauche à droite, et que « A » désigne la désoxyadénosine, « C » désigne la désoxycytidine, « G » désigne la désoxyguanosine et « T » désigne la thymidine, « I » désigne la désoxyinosine, « U » désigne l’uridine, sauf indication contraire ou ressortant du contexte. Sauf mention contraire, la terminologie et les conventions de numérotation des atomes vont suivre celles qui sont présentées dans Strachan et Read, Human Molecular Genetics 2 (Wiley-Liss, New York, 1999). Habituellement, les polynucléotides comprennent les quatre nucléosides naturels (par exemple désoxyadénosine, désoxycytidine, désoxyguanosine, désoxythymidine pour l’ADN ou leurs contreparties riboses pour l’ARN) liés par des liaisons phosphodiester ; cependant, ils peuvent aussi comprendre des analogues nucléotidiques non naturels, par exemple comprenant des bases modifiées, des sucres ou des liaisons internucléosidiques. L’homme du métier comprendra que, lorsqu’une enzyme présente, pour son activité, des exigences spécifiques de substrat oligonucléotidique ou polynucléotidique, par exemple un ADN simple brin, un duplexe ARN/ADN ou analogue, alors la sélection de la composition appropriée aux substrats oligonucléotidiques ou polynucléotidiques entrera bien dans le cadre des connaissances de l’homme du métier, en particulier à l’aide des instructions provenant de traités tels que Sambrook et al, Molecular Cloning, seconde édition (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989) et les références analogues. De même, l’oligonucléotide et le polynucléotide peuvent désigner une forme simple brin ou une forme double brin (c’est-à-dire des duplexes d’un oligonucléotide ou d’un polynucléotide et de son complément respectif). L’homme du métier saura, à partir du contexte lié à l’utilisation des termes, de quelle forme il s’agit, et s’il s’agit des deux formes. « Amorce » désigne un oligonucléotide, naturel ou synthétique, qui est capable, après formation d’un duplexe avec une matrice polynucléotidique, d’agir comme point d’amorçage d’une synthèse d’acides nucléiques et d’être étendu à partir de son extrémité 3′ le long de la matrice de façon à former un duplexe étendu. L’extension d’une amorce est habituellement effectuée avec une acide nucléique polymérase, telle qu’une ADN ou une ARN polymérase. La séquence de nucléotides ajoutée lors du processus d’extension est déterminée par la séquence du polynucléotide matrice. Habituellement, les amorces sont étendues par une ADN polymérase. Les amorces ont habituellement une longueur dans la plage de 14 à 40 nucléotides, ou dans la plage de 18 à 36 nucléotides. Les amorces sont utilisées dans toute une gamme de réactions d’amplification nucléique, par exemple, des réactions d’amplification linéaire utilisant une amorce unique, ou des réactions en chaîne par polymérase utilisant deux amorces ou plus. Les instructions permettant de sélectionner la longueur et la séquence des amorces pour des applications particulières sont bien connues de l’homme du métier, comme il ressort des références ci-après, qui sont incorporées par renvoi : Dieffenbach, eds, PCR Primer : A Laboratory Manual, 2nd Edition (Cold Spring Harbor Press, New York, 2003). « Identité de séquence » désigne le nombre (ou la fraction, habituellement exprimée en pourcentage) de concordances (par exemple, des résidus d’acides aminés identiques) entre deux séquences, par exemple deux séquences polypeptidiques ou deux séquences polynucléotidiques. L’identité de séquence est déterminée par comparaison des séquences lors de leur alignement de façon à maximiser le chevauchement et l’identité tout en minimisant les brèches entre séquences. En particulier, l’identité de séquence peut être déterminée par utilisation de l’un quelconque d’un certain nombre d’algorithmes mathématiques d’alignement global ou local, en fonction de la longueur des deux séquences. Les séquences ayant des longueurs semblables sont de préférence alignées par utilisation d’un algorithme d’alignement global (par exemple l’algorithme de Needleman et Wunsch ; Needleman et Wunsch, 1970), qui aligne les séquences d’une manière optimale sur la totalité de leur longueur, tandis que les séquences ayant des longueurs sensiblement différentes sont de préférence alignées par utilisation d’un algorithme d’alignement local (par exemple l’algorithme de Smith et Waterman (Smith et Waterman, 1981), ou de l’algorithme d’Altschul (Altschul et al., 1997 ; Altschul et al., 2005)). Un alignement dans le but de déterminer le pourcentage d’identité de séquences d’acides aminés peut être réalisé de différentes manières qui entrent dans le cadre des connaissances de l’homme du métier, par exemple par utilisation d’un logiciel informatique accessible au public, disponible sur les sites web de l’internet tels que http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ ou ttp://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/. L’homme du métier peut déterminer les paramètres convenant à la mesure d’un alignement, parmi lesquels tout algorithme nécessaire pour atteindre un alignement maximal sur toute la longueur des séquences faisant l’objet d’une comparaison. Dans le cadre de l’invention, les % d’identité de séquences d’acides aminés désignent des valeurs générées par utilisation du programme d’alignement de séquences par paires EMBOSS Needle, qui crée un alignement global optimal de deux séquences par utilisation de l’algorithme de Needleman-Wunsch, tous les paramètres de recherche étant définis aux valeurs par défaut, à savoir Scoring matrix = BLOSUM62, Gap open = 10, Gap extend = 0,5, End gap penalty = false, End gap open = 10 et End gap extend = 0,5. « Substitution » indique qu’un résidu d’acide aminé est remplacé par un autre résidu d’acide aminé. De préférence, le terme « substitution » désigne le remplacement d’un résidu d’acide aminé par un autre choisi parmi les 20 résidus d’acides aminés standards naturels, les résidus d’acides aminés naturels rares (par exemple hydroxyproline, hydroxylysine, allohydroxylysine, 6-N-méthyllysine, N-éthylglycine, N-méthylglycine, N-éthylasparagine, allo-isoleucine, N-méthylisoleucine, N-méthylvaline, pyroglutamine, acide aminobutyrique, ornithine, norleucine, norvaline), et les résidus d’acides aminés non naturels, souvent fabriqués par voie de synthèse (par exemple cyclohexyl-alanine). De préférence, le terme « substitution » désigne le remplacement d’un résidu d’acide aminé par un autre choisi parmi les 20 résidus d’acides aminés standards naturels. Le signe « + » indique une combinaison de substitutions. Les acides aminés sont représentés dans l’invention par leur code à une lettre ou à trois lettres selon la nomenclature suivante : A : alanine (Ala) ; C : cystéine (Cys) ; D : acide aspartique (Asp) ; E : acide glutamique (Glu) ; F : phénylalanine (Phe) ; G : glycine (Gly) ; H : histidine (His) ; I : isoleucine (Ile) ; K : lysine (Lys) ; L : leucine (Leu) ; M : méthionine (Met) ; N : asparagine (Asn) ; P : proline (Pro) ; Q : glutamine (Gln) ; R : arginine (Arg) ; S : sérine (Ser) ; T : thréonine (Thr) ; V : valine (Val) ; W : tryptophane (Trp) et Y : tyrosine (Tyr). Dans le présent document, la terminologie ci-après est utilisée pour désigner une substitution : L238A indique que le résidu d’acide aminé (Leucine, L) en position 238 de la séquence parente est remplacé par une alanine (A). A132V/I/M indique que le résidu d’acide aminé (alanine, A) en position 132 de la séquence parente est remplacé par l’un des acides aminés suivants : valine (V), isoleucine (I), ou méthionine (M). La substitution peut être une substitution conservative ou non conservative. Des exemples de substitutions conservatives sont dans les groupes des acides aminés basiques (arginine, lysine et histidine), des acides aminés acides (acide glutamique et acide aspartique), des acides aminés polaires (glutamine, asparagine et thréonine), des acides aminés hydrophobes (méthionine, leucine, isoleucine, cystéine et valine), des acides aminés aromatiques (phénylalanine, tryptophane et tyrosine) et des petits acides aminés (glycine, alanine et sérine). La présente divulgation ne veut pas être limitée par la portée des formes particulières présentées, mais veut couvrir les alternatives, modifications et équivalents des variations décrites dans l’invention. En outre, la portée de la divulgation englobe complètement d’autres variations pouvant devenir évidentes pour l’homme du métier à la lecture de cette divulgation. La portée de la présente invention n’est limitée que par les revendications jointes. Procédé de synthèse d’un polynucléotide ayant une séquence prédéterminée, capable de former une structure G4, le procédé comprenant les étapes de : (a) fourniture, fixés à un support de synthèse, d’amorceurs ayant chacun un 3’-hydroxyle libre ; et (b) répétition, dans un mélange réactionnel comprenant le support de synthèse, jusqu’à formation du polynucléotide, de cycles de (i) mise en contact dans des conditions d’allongement des amorceurs ou des fragments allongés ayant des 3’-O-hydroxyles libres avec un nucléoside triphosphate bloqué en 3’-O et une polymérase indépendante de la matrice, de sorte que les amorceurs ou les fragments allongés sont allongés par incorporation d’un nucléoside triphosphate bloqué en 3’-O pour former des fragments allongés bloqués en 3’-O, et (ii) déblocage des fragments allongés pour former des fragments allongés ayant des 3’-hydroxyles libres, le mélange réactionnel destiné à l’allongement des amorceurs ou des fragments allongés comprenant des polyC oligonucléotides capables de former des duplexes avec des régions du polynucléotide. Procédé selon la revendication 1, dans lequel lesdits amorceurs comprennent lesdits polyC oligonucléotides. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel ledit support de synthèse comprend en outre lesdits polyC oligonucléotides qui y sont fixés. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel ledit mélange réactionnel comprend des polyC oligonucléotides en solution chaque fois que lesdits fragments allongés sont des polynucléotides pouvant former des G4. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel ledit polynucléotide est un ARN, et dans lequel ladite polymérase indépendante de la matrice est une poly(A) polymérase ou une poly(U) polymérase ou un variant de celles-ci. Procédé selon la revendication 5, dans lequel ledit nucléoside triphosphate bloqué en 3’-O est un 3’-O-azidométhyl-ribonucléoside triphosphate. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel ledit polynucléotide est un ADN et dans lequel ladite polymérase indépendante de la matrice est une désoxynucléotidyltransférase terminale (TdT) ou un variant de celle-ci. Procédé selon la revendication 7, dans lequel ledit polyC oligonucléotide a une longueur dans la plage de 2 à 20 nucléotides. Procédé selon la revendication 7 ou 8, comprenant en outre une étape de clivage dudit polynucléotide à partir dudit support de synthèse. Procédé selon l’une quelconque des revendications 7 à 9, dans lequel ledit nucléoside triphosphate bloqué en 3’-O est choisi dans le groupe consistant en le 3’-O-(2-nitrobenzyl) nucléoside triphosphate, le 3’-O-allyl nucléoside triphosphate, le 3’-O-amine nucléoside triphosphate, le 3’-O-azidométhyl nucléoside triphosphate, le 3’-O-(2-cyanoéthyl) nucléoside triphosphate et le 3’-O-propargyl nucléoside triphosphate. Procédé selon la revendication 10, dans lequel ledit nucléoside triphosphate bloqué en 3’-O est un 3’-O-azidométhyl nucléoside triphosphate. Procédé selon la revendication 10, dans lequel ledit nucléoside triphosphate bloqué en 3’-O est un 3’-O-amine nucléoside triphosphate. Trousse destinée à la synthèse d’un polynucléotide d’une séquence prédéterminée par utilisation d’une polymérase sans matrice comprenant un support de synthèse auquel sont fixés des amorceurs comprenant des polyC oligonucléotides. Trousse selon la revendication 13, dans laquelle ledit polynucléotide est un polydésoxyribonucléotide et dans laquelle ladite polymérase sans matrice est une désoxynucléotidyltransférase terminale ou un variant de celle-ci. Trousse selon la revendication 13, dans laquelle ledit polynucléotide est un polyribonucléotide et dans laquelle ladite polymérase sans matrice est une poly(A) polymérase ou une poly(U) polymérase ou un variant de celle-ci. Trousse selon l’une quelconque des revendications 13, 14 ou 15, dans laquelle ledit support de synthèse comprend une population de microparticules.