Brevet FR3123125A1 — publié le 20221125

La présente invention concerne un procédé in vitro destiné à déterminer le potentiel inflammatoire d’une substance comprenant les étapes de : ia) administration à un explant de peau, par voie topique ou par injection sous-cutanée, d’une composition comprenant la substance ; lequel explant de peau comprend l’épiderme, le derme et les annexes épidermiques ainsi qu’une épaisseur d’au moins 5 millimètres d’hypoderme ; ib) détermination de la réponse inflammatoire au sein de l’explant de peau ; ic) détermination du niveau de dégranulation des mastocytes au sein de l’explant de peau ; et ii) détermination du potentiel inflammatoire de la substance . Modèle humain ex vivo destiné à l’évaluation du potentiel inflammatoire de type allergique ou pseudo-allergique La présente invention est relative au domaine de l’inflammation, qu’elle soit de nature allergique, pseudo-allergique ou autre, et propose, plus spécifiquement, le premier modèle humain ex vivo pour déterminer le potentiel inflammatoire d’un composé. Art antérieur La réponse inflammatoire fait partie intégrante de la réaction du système immunitaire en réponse à une agression. Maintenant, une telle réponse inflammatoire peut être induite chez un sujet suite à une injection. Au-delà de la gêne occasionnée, cette réponse peut être problématique, notamment s’il s’agit d’une réponse allergique. Aussi, il importe de pouvoir prédire, préalablement à toute injection, la réponse inflammatoire susceptible d’être induite par une substance. En lien avec l’allergie, le phénomène biologique conduisant au développement d'une telle allergie se réalise à partir de 2 phases successives, avec une phase initiale dite de « sensibilisation » asymptomatique et une deuxième phase de « réaction allergique » symptomatique. La première phase dite de sensibilisation débute lorsque l'individu entre pour la première fois en contact avec un composé que l’on appelle l'allergène car générateur d’une réponse allergique. Celui-ci est alors reconnu et considéré comme une substance étrangère par certaines cellules du système immunitaire qui sont présentes en grande quantité au niveau de la peau et des muqueuses (les cellules présentatrices d’antigènes, ex. les cellules dendritiques). Ces cellules vont présenter l'allergène à leur surface et permettre la production d'Immunoglobulines E (IgE) par d'autres cellules. Ces IgE vont rapidement passer dans le sang et aller se fixer sur des cellules appelées mastocytes qui siègent notamment au niveau de la peau et des muqueuses (localisations où les allergènes sont susceptibles de pénétrer). Ce processus de liaison des IgE est appelé «sensibilisation», car il rend les mastocytes sensibles à une activation en cas de rencontre ultérieure avec le même antigène. Cette première phase est muette, c'est-à-dire que le sujet en phase de sensibilisation est asymptomatique. Lors d'un contact ultérieur entre l'allergène et l'organisme « sensibilisé », l'allergène va se fixer sur les IgE présents à la surface des mastocytes, provoquant l’activation de ces derniers. Cette activation résulte en la dégranulation des mastocytes qui entraine la libération massive dans l’organisme d’histamine et de médiateurs de l'inflammation. Le mastocyte est une cellule présente dans les tissus conjonctifs, qui fait partie des globules blancs et se caractérise par la présence dans son cytoplasme de très nombreuses granulations contenant des médiateurs chimiques comme la sérotonine, l’histamine, la tryptase ou l’héparine. Lorsqu'il est en contact avec un allergène et qu'il présente à sa surface les IgE spécifiques de celui-ci ou en contact d'agents infectieux, il dégranule et libère ses médiateurs de façon très rapide, par un mécanisme d'exocytose. Il déclenche ainsi des réactions inflammatoires immédiates, parfois graves, comme un choc anaphylactique qui engendre une hypotension. La même activation induit, de façon plus retardée (quelques heures), la synthèse de nombreuses cytokines (comme le TNF-alpha), chimiokines et médiateurs lipidiques. Lors de manifestations allergiques, cette histamine va exercer ses effets en se fixant principalement sur les récepteurs H1 présents dans le nez, où l'histamine augmente l'œdème et l'obstruction, et provoque démangeaisons, éternuements et sécrétions de mucus, dans la peau, où l’histamine provoque érythème, œdème et démangeaisons, et dans les poumons où l’histamine provoque une bronchoconstriction. En lien avec les mastocytes, on doit également prendre en compte le potentiel pseudo-allergique. Il s’agit là d’un mécanisme qui n’est pas médié par les IgE (à la différence de l’allergie), mais par le récepteur MRGPRX2 (Mas-Related G-Protein coupled Receptor member X2). Ce mécanisme est alors dose-dépendant. Dès lors, ces réactions pseudo-allergiques pourraient être prévenues, ou limitées, en cas de nouvelle administration de la substance par réduction de la dose ou diminution de la vitesse d’administration. Maintenant, il est particulièrement difficile de prédire le potentiel inflammatoire chez l’homme et notamment le risque allergique ou pseudo-allergique associé à un composé ou à une composition. Le seul moyen existant aujourd’hui consiste en l’utilisation de modèles animaux chez lesquels on va réaliser une injection et constater, si oui ou non, il s’ensuit une réaction inflammatoire et, en outre, une dégranulation des mastocytes. On comprendra aisément qu’il est souhaitable de se passer de tels modèles animaux pour arriver à déterminer ce potentiel inflammatoire et, notamment, le risque allergique ou pseudo-allergique. Aussi, il existe un besoin permettant de déterminer facilement et rapidement, et sans recourir à l’animal, le potentiel inflammatoire, et notamment allergique ou pseudo-allergique chez l’homme d’une composition injectable. Les inventeurs ont préalablement développé un modèle ex vivo de peau humaine permettant de tester l’injection sous-cutanée d’une solution ne nécessitant pas de recourir à l’animal. Ils ont maintenant mis en évidence que, non seulement les granulocytes étaient présents dans ce modèle de peau humaine, mais encore qu’ils restaient fonctionnels avec une capacité de dégranulation. Ce résultat était d’autant plus inattendu que c’est plutôt une perte de fonctionnalité des mastocytes qui était documentée, avec notamment une apoptose importante de ces derniers durant les premiers jours (voir notamment KIVINEN et al. , Experimental Dermatology, vol.12, p : 53-60, 2003). Dès lors, la découverte des inventeurs permet, suite à l’injection « sous-cutanée » ou à l’application sur l’épiderme d’une composition dans ce même modèle de peau humaine ex vivo , de déterminer le comportement des granulocytes présents et finalement d’en déduire le potentiel inflammatoire d’une composition, injectée ou appliquée, et notamment l’existence ou d’une réaction allergique ou pseudo-allergique, mais également de trancher sur la nature de celle-ci. En conséquence, il devient possible de tester le potentiel inflammatoire chez l’homme, notamment le potentiel allergique ou pseudo-allergique d’une solution injectable sans recourir à un modèle animal. Aussi, un premier objet de l’invention concerne un procédé in vitro destiné à déterminer le potentiel inflammatoire d’une substance comprenant les étapes de : ia) administration à un explant de peau, par voie topique ou par injection sous-cutanée, d’une composition comprenant la substance ; lequel explant de peau comprend l’épiderme, le derme et les annexes épidermiques ainsi qu’une épaisseur d’au moins 5 millimètres d’hypoderme ; ib) détermination de la réponse inflammatoire au sein de l’explant de peau; ic) détermination du niveau de dégranulation des mastocytes au sein de l’explant de peau ; et ii) détermination du potentiel inflammatoire de la substance, de préférence de son potentiel allergique ou pseudo-allergique. Avantageusement, l’étape ia) consiste en l’injection sous-cutanée au sein de l’explant d’une composition comprenant la substance. Selon un mode de réalisation préféré, le procédé comprend en outre une étape id) de détermination du niveau de dégranulation d’une culture de mastocytes, de préférence d’une culture de mastocytes primaires humains, après incubation de celle-ci en présence de différentes concentrations de la substance. Cette étape complémentaire permet, outre la confirmation d’une dégranulation des mastocytes en présence de la substance qui permet d’établir un potentiel allergique ou pseudo-allergique, de déterminer la concentration efficace médiane (CE50) correspondant à la concentration nécessaire de substance pour induire une dégranulation médiane (entre l’absence de dégranulation des mastocytes et la dégranulation maximale de ceux-ci). Selon un autre mode de réalisation préféré, le procédé comprend en outre une étape ie) de détermination du potentiel agoniste de la substance vis-à-vis du récepteur MRGPRX2 (Mas-Related G-Protein coupled Receptor member X2). La méthode selon l’invention permet alors de trancher entre un potentiel allergique ou pseudo-allergique de la substance et, dans le cas d’un potentiel pseudo-allergique, de déterminer la concentration maximale de substance pouvant être injectée de sorte à ne pas induire de réaction pseudo-allergique. un procédé in vitro destiné à déterminer le potentiel inflammatoire d’une substance comprenant les étapes de : ia) administration à un explant de peau, par voie topique ou par injection sous-cutanée, d’une composition comprenant la substance ; lequel explant de peau comprend l’épiderme, le derme et les annexes épidermiques ainsi qu’une épaisseur d’au moins 5 millimètres d’hypoderme ; ib) détermination de la réponse inflammatoire au sein de l’explant de peau ; ic) détermination du niveau de dégranulation des mastocytes au sein de l’explant de peau ; et ii) détermination du potentiel inflammatoire de la substance, de préférence de son potentiel allergique ou pseudo-allergique. Le procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l’étape ia) consiste en l’injection sous-cutanée d’une composition comprenant la substance. Le procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l’étape ib) de détermination de la réponse inflammatoire au sein de l’explant de peau s’effectue par le suivi de marqueurs de l’inflammation choisi dans le groupe comprenant MCSF, GCSF, TNFSF6, IFNA2, IFNG, RANTES, MCP-3, MCP-2, CX3CL1, TNFA, TNFB, MIF, NAMPT, TRAIL et IFNA1TNFA, MCP1, VEGF, IP-10, MDC, MIP-1B, IL-17A, IL-17C, IL-17F, TNFB, IL-27, MCP-4, MIP-1A, IL-22, IL-1B, IL-12/IL-23p40, GMCSF, IFNG, IL-12p70, IL-23, IL-31, EOTAXIN, IL-6, IL-4, IL-13, IL-5, IL-8, IL-15, BETA-HEXOSAMINISASE, HISTAMINE, TRYPTASE et CHYMASE. .Le procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l’étape ic) de détermination du niveau de dégranulation des mastocytes au sein de l’explant de peau utilise l’avidine. Le procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l’étape ic) de détermination du niveau de dégranulation des mastocytes au sein de l’explant de peau est réalisée dans un délai maximum de 6 heures suivant l’étape ia) d’administration. Le procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l’étape ii) de détermination du potentiel inflammatoire de la substance et plus spécifiquement de son potentiel allergique ou pseudo-allergique est réalisée au regard des proportions de mastocytes subissant une dégranulation faible, modérée, ou forte au terme de l’étape ia), avec : * une substance associée à une proportion de granulocytes présentant pour plus de 50% un faible niveau de dégranulation et/ou pour moins de 10% un fort niveau de dégranulation présentera un potentiel allergique ou pseudo-allergique faible, voire nul ; * une substance associée à une proportion de granulocytes présentant pour plus de 50% un fort niveau de dégranulation présentera elle un potentiel allergique ou pseudo-allergique élevé. Le procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu’il comprend en outre une étape id) de détermination du niveau de dégranulation d’une culture de mastocytes après incubation de celle-ci en présence de différentes concentrations de la substance. Le procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l’étape ii) de détermination du potentiel inflammatoire de la substance permet en outre de déterminer la concentration efficace médiane (CE50) de la substance pour l’induction de la dégranulation des mastocytes et en ce que le procédé est alors destiné en outre à déterminer la concentration efficace médiane (CE50) de la substance pour l’induction de la dégranulation des mastocytes. Le procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu’il comprend en outre une étape ie) de détermination du potentiel agoniste de la substance vis-à-vis du récepteur MRGPRX2 (Mas-Related G-Protein coupled Receptor member X2). Le procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l’étape ii) de détermination du potentiel inflammatoire de la substance permet en outre de déterminer si la dégranulation des mastocytes induite par la substance résulte d’une réaction pseudo-allergique ou non et en ce que le procédé est alors destiné en outre à déterminer si la dégranulation des mastocytes induite par la substance résulte d’une réaction pseudo-allergique ou non.