Brevet FR3123658A1 — publié le 20221209

L’invention vise un procédé in vitro pour déterminer si un échantillon contient un coronavirus en réplication, ledit procédé comprenant la détection d’une activité protéasique Papaïne-like (PLpro) de coronavirus. PROCEDE DE DETECTION D'UN CORONAVIRUS EN REPLICATION Domaine de l'invention L’invention concerne un test rapide permettant de détecter la présence d’un coronavirus dans un échantillon. Etat de la technique La communauté internationale fait actuellement face à une pandémie de syndrome respiratoire aigu due au coronavirus désigné SARS-CoV-2. Le test de diagnostic par RT-PCR à partir d'écouvillons nasopharyngés est le test le plus répandu pour détecter la présence de ce virus au niveau individuel ou au niveau d’une population. Cependant, en raison de ses caractéristiques techniques (détection de la présence d’ARN), ce test ne peut être utilisé pour détecter en temps réel une personne qu’elle soit symptomatique ou non, mais contagieuse. D’autres tests individuels existent, basés sur des techniques d’immunochromatographie ou sur des techniques d’amplification géniques, mais ils n’apportent pas de réponse concernant la contagiosité immédiate de la personne. La perception du risque et les comportements à risque deviennent des variables importantes pour prédire la propagation de la pandémie. Fournir des outils abordables, fiables et faciles d’utilisation, reste un défi pour évaluer le risque réel au niveau individuel. Des tests rapides systématiques et hautement performants sont essentiels pour réduire l'impact médical et économique de la Covid-19. Dans ce contexte, les inventeurs proposent maintenant un test rapide et fiable pour détecter le risque contagieux. Plus généralement, l’invention concerne un procédé in vitro pour déterminer si un échantillon contient un coronavirus en réplication, notamment un SARS-Cov-2, ledit procédé comprenant la détection d’une activité protéasique Papaïne-like (PLpro) de coronavirus. Pour cela, le procédé comprend de préférence la mise en contact de l’échantillon avec au moins un peptide substrat de la protéase PLpro, de préférence marqué de manière détectable. De préférence l’activité de la PLpro est révélée par un test de fluorescence. Un autre objet préféré de l’invention est un procédé in vitro pour déterminer si un sujet humain est infecté par un coronavirus, notamment un SARS-Cov-2, et est contagieux, ledit procédé comprenant la mise en contact d’un échantillon biologique dudit sujet, comme un échantillon de salive, avec au moins un peptide substrat de la protéase PLpro, de préférence marqué de manière détectable par un fluorophore, ledit peptide comprenant ou consistant en la séquence X 1 LX 2 GG, où X 1 et X 2 sont n’importe quels acides aminés, identiques ou différents, le peptide consistant de préférence en la séquence RLRGG. Le test permet la révélation de la présence de la PLpro en moins de 30 minutes. Figures est un graphe qui montre le dosage par fluorescence de l’activité de la PLpro sur le substrat Z-RLRGG-AMC, en comparaison avec l’activité de la PLpro sur le substrat ISG15-AMC pendant une durée de 60 minutes. Les concentrations du peptide z-RLRGG-AMC ont été augmentées en respectant un rapport enzyme/substrat de 1/200. est un graphe qui rapporte la mesure de la fluorescence émise par le peptide substrat marqué en présence de salive humaine (3 échantillons) et de PLPro et de Triton X100, pendant une durée de 30 minutes. Chaque salive a été testée en triplicata et les moyennes et écart-types sont représentés. Procédé in vitro pour déterminer si un échantillon contient un coronavirus en réplication, ledit procédé comprenant la détection d’une activité protéasique Papaïne-like (PLpro) de coronavirus. Procédé selon la revendication 1, comprenant la mise en contact de l’échantillon avec au moins un peptide substrat de la protéase PLpro, de préférence marqué de manière détectable. Procédé selon la revendication 2, dans lequel le peptide substrat comprend la séquence X 1 LX 2 GG, où X 1 et X 2 sont n’importe quels acides aminés, identiques ou différents. Procédé selon la revendication 3, dans lequel le peptide substrat consiste en la séquence X 1 LX 2 GG, où X 1 et X 2 sont n’importe quels acides aminés, identiques ou différents. Procédé selon la revendication 3 ou 4, dans lequel X 2 est un acide aminé basique, de préférence une arginine (R). Procédé selon la revendication 5, dans lequel le peptide consiste en la séquence RLRGG. Procédé selon l’une des revendications 1 à 6, dans lequel la détection de l’activité PLpro est mise en évidence par mesure de fluorescence, ledit procédé comprenant de préférence la mise en contact de l’échantillon avec au moins un peptide substrat de la protéase PLpro porteur d’un fluorophore. Procédé selon la revendication 7, comprenant la mise en contact de l’échantillon avec au moins un peptide substrat de la protéase PLpro, ledit peptide substrat portant un fluorophore à une extrémité, et un groupement protecteur à l’autre. Procédé selon l’une des revendications 7 ou 8, comprenant la mise en contact de l’échantillon avec au moins un peptide substrat de la protéase PLpro porteur d’un fluorophore, le fluorophore étant un groupe aminométhyl coumarine (AMC), de préférence porté à l’extrémité C-terminale du peptide substrat. Procédé selon la revendication 9, dans lequel le peptide substrat est Z- RLRGG-(AMC), où (AMC) est l’aminométhyl coumarine, et Z est un groupement carboxybenzyle. Procédé selon l’une des revendications 1 à 6, dans lequel la détection de l’activité PLpro est mise en évidence par mesure de colorimétrie. Procédé selon l’une des revendications 1 à 11, dans lequel le coronavirus est un SARS-CoV-2. Procédé selon l’une des revendications 1 à 12, dans lequel l’échantillon est un échantillon de salive. Procédé in vitro pour déterminer si un sujet humain est infecté par un coronavirus et est contagieux, ledit procédé comprenant la détection d’une activité protéasique Papaïne-like (PLpro) de coronavirus par mise en contact d’un échantillon biologique dudit sujet avec au moins un peptide substrat de la protéase PLpro, de préférence marqué de manière détectable par un fluorophore, ledit peptide consistant en la séquence X 1 LX 2 GG, où X 1 et X 2 sont n’importe quels acides aminés, identiques ou différents, le peptide consistant de préférence en la séquence RLRGG. Procédé selon la revendication 14, dans lequel l’échantillon est un échantillon de salive.