Brevet FR3124509A1 — publié le 20221230

La présente invention décrit de nouveaux peptides synthétiques qui sont des inhibiteurs de phosphorylation de Elk-1 par les kinases ERK1/2. Une composition pharmaceutique contenant lesdits peptides ainsi que leur utilisation en tant que médicaments sont également décrites. Une méthode d’identification et d’optimisation de nouveaux inhibiteurs de phosphorylation de Elk-1 par ERK1/2 est également décrite. Nouveaux inhibiteurs de phosphorylation de Elk-1 par ERK1/2 La présente invention décrit de nouveaux peptides synthétiques qui sont des inhibiteurs de phosphorylation de Elk-1 par les kinases ERK1/2. Une composition pharmaceutique contenant lesdits peptides ainsi que leur utilisation en tant que médicaments sont également décrites. Une méthode d’identification et d’optimisation de nouveaux inhibiteurs de phosphorylation de Elk-1 par ERK1/2 est également décrite. ARRIERE PLAN TECHNOLOGIQUE Les MAP kinases (pour « Mitogen-Activated Protein kinase ») ERK1 et ERK2 (ERK pour « Extracellular signal-Regulated Kinase ») sont des enzymes dont la fonction est d’ajouter des groupements phosphate à des protéines cibles afin de les activer. Ce sont des protéines ubiquitaires impliquées dans de nombreuses fonctions cellulaires. Elles ont un rôle primordial dans la transduction de signaux intracellulaires. Leur activation se fait par des signaux extracellulaires qui agissent sur des récepteurs membranaires pour induire l’activation en cascade de différents acteurs intracytoplasmiques, en amont de ERK1/2, en particulier les protéines Ras, Raf et MEK ; on parle également de voie de signalisation Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2. Les MAP kinases de type ERK ont de nombreux substrats intracellulaires, membranaires, cytoplasmiques ou nucléaires (Yang et al., Trends Pharmacol. Sci. 2019 Nov;40(11):897-910 ) et c’est l’amplitude et la durée des activations de la cascade de signaux intracellulaire qui va diriger ERK1/2 vers l’un de ses substrats. Dans le système nerveux central, la voie de signalisation Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2 est activée dans les neurones par des neurotransmetteurs, des neuromodulateurs ou des facteurs neurotrophiques. En agissant via des récepteurs couplés à des protéines G (récepteurs des monoamines, ou métabotropiques du glutamate par exemple), à des entrées calciques (récepteurs NMDA du glutamate) ou à des récepteurs à activité tyrosine kinase (facteurs neurotrophiques tel que BDNF) l’activation de cette cascade de signalisation est impliquée dans de multiples fonctions cellulaires, au cours du développement ou dans le cerveau adulte. Ainsi la voie ERK contrôle la différenciation et la maturation neuronale au cours du développement. Dans le cerveau adulte, elle joue un rôle clé dans la plasticité neuronale et les processus d’apprentissage et de mémoire, notamment impliqués dans la cognition, les apprentissages par récompense et l’humeur. Une hyperactivité de la voie ERK est observée dans de nombreuses maladies neurodéveloppementales, y compris les troubles autistiques et les Rasopathies : neurofibromatose type 1, syndrome de Noonan, syndrome de malformation capillaire-arterioveneux, syndrome de Costello, syndrome cardio-facio-cutané et syndrome de Legius. Des dérégulations de la voie ERK sont également responsables de maladies psychiatriques telles que l’addiction, la dépression, le stress post-traumatique ou les troubles de l’anxiété et de l’humeur. De nombreux inhibiteurs des MAP kinase de type ERK ont été développés. Ils ciblent en général la voie Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2 en amont de ERK ce qui bloque totalement son activité et sa liaison à ses divers substrats en aval. À titre d’exemple on citera PD98059 (2'-amino-3'-méthoxyflavone) et U0126 (1,4-Diamino-2,3-dicyano-1,4-bis(2-aminophenylthio) butadiène), le Trametinib (GSK1120212), le Cobimetinib (GDC0973), le Mirdametinib (PD0325901) ou le Selumetinib (AZD6244) qui sont des inhibiteurs spécifiques des MEKs. Les inhibiteurs spécifiques des kinases en amont des MAP kinases de type ERK bloquent la voie de signalisation Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2 mais comme leur action se situe en amont des MAP kinases de type ERK, ceci résulte en une inhibition complète des MAP kinases de type ERK, et par conséquent de tous les substrats en aval, sans discrimination entre ceux-ci et sans distinction de leur localisation cellulaire. Être capable d’agir au niveau de l’interaction entre la MAP kinase de type ERK et un substrat unique en aval de la voie de signalisation intracellulaire ERK permet de bloquer la voie de signalisation ERK de façon spécifique tout en autorisant ses autres fonctions, notamment sur l’homéostasie cellulaire normale. Dans EP1988167 les inventeurs ont mis en évidence des peptides synthétiques permettant l’inhibition sélective de la voie des MAP kinases de type ERK envers un substrat donné. Les différents substrats de ERK1/2 présentent des séquences consensus dites sites de fixation ou de docking, connues de l’homme de l’art, qui permettent la fixation de ERK1/2 sur ses substrats. Ces séquences sont connues sous les termes, DEF (ou FXFP) et D (ou DEJL) (voir EP1988167). Le domaine de liaison DEF (docking site for ERK FXFP) des substrats spécifiques de ERK1/2 est responsable du recrutement de ERK1/2 vers les gènes à expression précoce immédiate (ou gène immédiat précoce) et des facteurs de transcription (voir EP1988169). Ce domaine de liaison DEF peut fixer des peptides ayant une séquence consensus de type FXFP ou (F/Y)X(F/Y)P dans lequel F désigne la Phénylalanine (Phe) Y designe la Tyrosine (Tyr), P la Proline (Pro) et X n’importe quel aminoacide naturel (Sharrocks et al., Trends Biochem Sci. 2000 Sep;25(9):448-53 ). Le domaine DEF est spécifique des substrats de ERK1/2. Le domaine DEJL (docking site for ERK and JNK LXL) est indispensable à l’activation de différentes séries de substrats, incluant RSK (pour 90 kDA ribosomal S6 kinase) et les phosphatases (MAP kinases Phosphatases ou MPK). C’est également le site de liaison des MEK1/2 qui sont situées en amont de ERK1/2 dans la cascade de signalisation intracellulaire. Il est à noter que ce site n’est pas spécifique des kinases de type ERK, mais permet aussi la fixation et la phosphorylation de substrats sur les MAPkinases de la famille JNK et p38/MAPK. De nombreuses équipes développent des inhibiteurs de MEK1/2 dans le but de proposer des solutions thérapeutiques dans diverses pathologies et notamment en oncologie, dans les troubles du système nerveux central et dans l’inflammation. On citera à titre d’exemple d’inhibiteurs de MEK1/2 qui sont ou ont été étudiés durant des essais cliniques Selumetinib, Refametinib, Cobimetinib, Trametinib (Samatar et al., Nat Rev Drug Discov. 2014 Dec;13(12):928-42 ). Ces inhibiteurs de MEK1/2 ont un effet global sur l’inhibition de ERK1/2 et de ses substrats et ils ont ainsi un effet pleïotrope, non spécifique et délétère. Les essais cliniques en cours montrent notamment que les effets secondaires sont nombreux en fonction des doses administrées et qu’une résistance au médicament s’installe (Balagula et al., Invest. New Drugs, 2010 ; 29:1114-21). Des études sont également menées pour découvrir des molécules susceptibles d’agir sur l’activation de ERK1/2 afin de réguler la prolifération et la survie de cellules, et notamment de cellules cancéreuses. Durant les dix dernières années, des études in silico ont permis de mettre en évidence des ligands susceptibles d’interagir avec des sites de liaison spécifiques de ERK1/2 et d’inhiber sélectivement les interactions avec des substrats impliqués dans la prolifération cellulaire (Boston et al., BMC Cancer. 2011; 11: 7 ; Samadani et al., Biochem J. 2015 May 1; 467(3): 425–438 ). Elles ont également permis de mettre en évidence certaines des caractéristiques structurelles des domaines de liaison de ERK1/2. Les peptides contenant le domaine DEF (ou FXFP), et les acides aminés environnants dans les régions N- et C-terminales, d’un substrat spécifique en aval de ERK inhibent la liaison et la phosphorylation subséquente dudit substrat sans impacter les autres activités de ERK1/2 ou la phosphorylation d’autres substrats. Il y a donc beaucoup moins d’effets secondaires de cette inhibition dans la transduction du signal intracellulaire ERK1/2. Les brevets EP1988167 et EP2337576 décrivent l’utilisation de peptides synthétiques de type TAT-DEF en tant qu’inhibiteurs spécifiques de substrats en aval de ERK et en particulier l’utilisation d’un peptide de type TAT-DEF-Elk-1 pour le traitement d’un désordre de l’anxiété et de l’humeur ; la protéine Elk-1 étant un facteur de transcription agissant en aval la voie de signalisation de ERK. La présente invention décrit de nouveaux peptides qui sont des inhibiteurs de la phosphorylation de Elk-1 par ERK1/2 et qui sont dérivés de ceux décrits dans EP1988167. Ces nouveaux peptides synthétiques sont modifiés afin de les rendre plus stables et plus efficaces que ceux décrits dans EP1988167. Les inventeurs ont utilisé la modélisation 3D in silico de la poche de fixation du domaine d’ancrage de ERK2 envers des substrats contenant le domaine DEF de façon à pouvoir positionner des ligands connus, en particulier le peptide TAT-DEF-Elk-1 selon le brevet EP1988167 et caractériser leur interaction avec cette poche de fixation. Ceci permet de définir les positions essentielles et non essentielles dans la liaison du peptide TAT-DEF-Elk-1 au domaine d’ancrage de ERK2 et d’optimiser de potentiels inhibiteurs de la phosphorylation de Elk-1 par ERK1/2. Cette étude permet d’optimiser les peptides contenant des domaines DEF-Elk-1 (SEQ ID N°1) soit par stabilisation et notamment par D-racémisation des aminoacides non essentiels à la liaison, soit par suppression des aminoacides non essentiels à la liaison, soit de modifier les résidus Ser de phosphorylation par ERK en Asp, soit encore de combiner ces différentes modifications, et enfin d’envisager de nouveaux inhibiteurs. Dans la présente description il est fait référence à la voie de signalisation intracellulaire Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2 ou Ras-Raf-MEK-ERK ou ERK ou ERK1/2. Ces termes sont équivalents et font référence à la même voie ou cascade de signalisation. Le terme « docking method » ou « méthode de docking » fait référence à la méthode qui permet de calculer l'orientation préférée d'une molécule envers une seconde lorsqu'elles sont liées pour former un complexe stable. Le fait de déterminer cette orientation préférée sert à prévoir la solidité de l'union entre deux molécules et éventuellement son efficacité. Les études de docking, de fixation, d’ancrage ou d’amarrage, servent donc à déterminer l’affinité entre les molécules étudiées et de quantifier les conséquences de la fixation d’un ligand sur un récepteur. Les termes de méthode de fixation, méthode d’ancrage ou méthode d’amarrage peuvent être utilisés pour désigner la méthode de docking. DESCRIPTION DES DESSINS La décrit la modélisation in silico de l’interaction entre le domaine DEF-Elk1 de MLK2001 et la poche de fixation du domaine ERK2-DEF de la kinase active. Cette modélisation permet la visualisation des aminoacides essentiels à ladite interaction. Les aminoacides représentés débutent au premier aminoacide. La décrit l’affinité de liaison du peptide MLK2001 (50nM) envers ERK2 actif par la technique de résonance de plasmons de surface (biaccore). La protéine recombinante ERK2 a été immobilisée par un couplage amine et le peptide MLK2001 (analyte) est mobile. Un peptide TAT-NR2B9c a été utilisé comme contrôle négatif. La décrit l’affinité de liaison du peptide MLK2001, de 3 peptides selon l’invention (MLK2002, 2003 et 2004), et deux peptides contrôles : la sequence TAT seule, et un peptide « Scramble » (au hasard) de la séquence MLK2001, par la technique de biacore. Le signal de résonance (RU) représente l’affinité des analytes (peptides) envers les protéines ERK2 active immobilisées. Le graphique représente les profils obtenus à 50nM pour chaque analyte. Plus le signal RU est élevé plus l’affinité de l’analyte pour ERK2 est importante. Il est à noter que le signal RU pour MLK2002 est 1,5 fois plus important que pour MLK2001. La propose un graphique représentant la liaison dose-dépendante des peptides MLK 2001 à 2004 ainsi que les peptides contrôle TAT et Scr. La décrit la phosphorylation de Elk-1 et ERK par le peptide MLK2001 et le peptide modifié MLK2002 à faible dose. La décrit la toxicité après 24h de traitement avec le peptide MLK2001 et le peptide MLK2002 modifié selon la présente invention. La illustre le résultat de la mise en œuvre de la méthode de criblage in silico de la fixation de petites molécules envers le site de liaison du peptide DEF-Elk-1 au sein du domaine d’ancrage de ERK2. Trois importants sites de liaison ont été identifiés et séparés. Ces figures viennent illustrer la présente invention et ne sont pas limitatives de la portée revendiquée. Peptide de type TAT-DEF-Elk-1 caractérisé en ce que la séquence DEF-Elk-1 de SEQ ID N°25 est modifiée par suppression et/ou racémisation et/ou substitution d’au moins un aminoacide sur une position située entre les positions 13 à 31 de la SEQ ID N°1. Peptide selon la revendication 1 caractérisé en ce que la séquence DEF-Elk-1 est raccourcie dans la région N-ter de 1 à 2 aminoacides. Peptide selon l’une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que au moins un aminoacide sérine (S) de la séquence SSGS située en positions 23 à 26 de la SEQ ID N°1 est remplacé par un aminoacide asparagine (D). Peptide selon la revendication 3, caractérisé en ce que deux résidus sérine (S) de la séquence SSGS située en positions 23 à 26 de la SEQ ID N°1 sont remplacés par deux résidus asparagine (D), lesdits résidus étant préférentiellement situés en positions 24 et 26 de la SEQ ID N°1. Peptide selon l’une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce qu’une racémisation de type D est appliquée à un ou plusieurs aminoacides situés en position 18, 20 23 et 28 de la SEQ ID N°1. Peptide selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la région N-ter de la SEQ ID N°1 est acétylée. Peptide selon l’une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce qu’il présente une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID N° 2 à 24, préférentiellement parmi les SEQ ID N° 2, 8 et 12, et encore plus préférentiellement qu’il est de SEQ ID N°2. Peptide selon l’une quelconque des revendications 1 à 7 pour une utilisation médicale. Peptide selon l’une quelconque des revendications 1 à 8 pour une utilisation dans le traitement du cancer, des troubles de l’anxiété et de l’humeur et en particulier des dépressions résistantes, des addictions, du syndrome de Down, de la maladie d’Alzheimer, du lupus érythémateux et de l’amyotrophie spinale proximale. Méthode d’identification de peptides ou de molécules de petite taille, capables de se lier au domaine d’ancrage de ERK1/2 envers le domaine DEF de Elk-1, caractérisée en ce qu’elle comprend les étapes suivantes : utiliser un modèle 3D du domaine d’ancrage de ERK2 envers le peptide DEF-Elk-1 basé sur la structure cristalline du complexe ERK2 AMP-PNP en qualité de récepteur ; tester in silico la fixation ou « docking » de différentes molécules sur la poche de liaison du domaine d’ancrage de ERK2 envers le peptide DEF-Elk-1; synthétiser lesdites molécules présentant une bonne affinité de liaison ; étudier l’affinité de chaque molécule pour la poche d’ancrage de ERK2 et sélectionner les meilleures affinités de liaison ; tester l’activité biologique et/ou les propriétés de la ou des molécule(s) synthétisée(s) en c) et sélectionnée(s) en d).