Brevet FR3122259A1 — publié le 20221028

Méthode de caractérisation de l’organisation tridimensionnelle interne d’un échantillon biologique Un aspect de l’invention concerne une méthode de caractérisation de l’organisation tridimensionnelle interne d’un échantillon de tissu biologique comprenant une pluralité de types d’éléments biologiques (201, 202), comportant les étapes suivantes : Pour au moins un type d’éléments biologiques (201, 202) d’intérêt, segmentation automatique ou semi-automatique dans chaque image (I Z ) d’un empilement d’images (I 3D ), d’au moins une région contenant au moins un élément biologique (201, 202) ayant pour type le type d’éléments biologiques (201, 202) d’intérêt, l’empilement d’images (I 3D ) ayant été acquis par imagerie sériée en Z par ultramicrotomie automatisée en microscopie électronique à balayage ; Caractérisation d’au moins un élément biologique (201, 202) par calcul d’au moins un indicateur (301, 302) relatif à la structure, à la morphologie, à la taille, à la polarité, à la texture, à la constitution ou à l’orientation de l’élément biologique (201, 202) à partir de chaque région segmentée correspondante. Figure à publier avec l’abrégé : Figure 2 Méthode de caractérisation de l’organisation tridimensionnelle interne d’un échantillon biologique DOMAINE TECHNIQUE DE L’INVENTION Le domaine technique de l’invention est celui des échantillons biologiques et plus particulièrement celui de l’étude de l’organisation tridimensionnelle interne des échantillons biologiques. La présente invention concerne une méthode de caractérisation d’un échantillon biologique et en particulier une méthode de caractérisation de l’organisation tridimensionnelle interne d’un échantillon biologique. La présente invention concerne également une méthode de comparaison de l’organisation tridimensionnelle interne d’une pluralité d’échantillons de tissu biologique, et un dispositif, un produit-programme d’ordinateur et un support d’enregistrement pour la mise en œuvre des méthodes. ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE DE L’INVENTION Un tissu biologique qu’il soit sain ou pathologique, d’origine humaine ou non, comporte de nombreux types d’éléments biologiques de taille microscopique ou nanométrique. Parmi ces éléments biologiques, on retrouve notamment des éléments organisationnels et structurels comme les capillaires sanguins et les canalicules biliaires, des cellules d’origine tissulaire (cellules du muscle, hépatocytes, cellules du système immunitaire, cellules endothéliales, cellules nerveuses, globules rouges, globules blancs circulants ou infiltrants dont des lymphocytes et des macrophages…) de nature très variée (cellules normales, tumorales, stromales, accessoires…), mais aussi des éléments subcellulaires (ou organelles) tels que les noyaux, les nucléoles, les mitochondries, les membranes cytoplasmiques, les membranes nucléaires, les vésicules lipidiques, les réticulum endoplasmiques, les exosomes etc. Il existe aujourd’hui plusieurs techniques de microscopie électronique, dont l’imagerie sériée en Z par ultramicrotomie automatisée en microscopie électronique à balayage ou SBF-SEM pour « serial block face scanning electron microscopy », permettant d’imager l’organisation, l’architecture et l’ultrastructure interne d’un tissu biologique à l’échelle nanométrique, sur un large volume pouvant atteindre 1000 picolitres. La technique SBF-SEM consiste à imager la surface d’un bloc d'échantillon de tissu biologique en collectant les électrons rétro-diffusés. Le principe est de réaliser des cycles de coupes et d’acquisitions d’images de la surface d’un échantillon. Une première image de la surface de l’échantillon est réalisée en collectant les électrons rétro-diffusés, puis le système de coupe génère une première coupe ultrafine de l’échantillon afin d’exposer une couche inférieure de l’échantillon au faisceau d’électrons. Les cycles « Acquisition-Coupe » vont alors s’enchaîner de manière automatique, sachant qu’il est possible d’acquérir plusieurs centaines voire quelques milliers d’images successives (comportant les axes X et Y) selon l’axe Z avec une résolution de quelques nm. Cette technique permet également d’acquérir des images de la surface de l’échantillon de grande taille (à l’échelle microscopique, quelques dizaines à plusieurs centaines de µm²) avec une résolution nanométrique (taille de pixel en XY de 1 à plusieurs dizaines de nm). Pour pouvoir étudier la structure tridimensionnelle d’un élément biologique donné et ainsi pouvoir le caractériser pour quantifier, étudier et évaluer son rôle dans un phénomène biologique donné, il est alors nécessaire de l’identifier précisément sur chacune des images de la série d’images acquises. Une telle identification est donc souvent réalisée manuellement par un spécialiste, ce qui rend la tâche fastidieuse et incompatible avec l’étude de l’organisation interne complète de l’échantillon qui nécessiterait l’identification d’un grand nombre d’éléments biologiques dans chaque image. Il existe donc un besoin à propos d’une méthode permettant d’obtenir de manière précise et fiable et en un temps raisonnable, c’est-à-dire de l’ordre de quelques heures, une caractérisation de l’organisation tridimensionnelle interne d’un échantillon biologique. L’invention offre une solution aux problèmes évoqués précédemment, en permettant de caractériser précisément et de manière fiable, l’organisation tridimensionnelle interne d’un échantillon biologique en minimisant le nombre d’étapes nécessitant l’intervention d’un spécialiste et en automatisant la procédure d’analyse des éléments d’un échantillon biologique, d’origine humaine, animale, végétale ou fongique, à l’aide d’approches mathématiques et d’intelligence artificielle. Un premier aspect de l’invention concerne une méthode de caractérisation de l’organisation tridimensionnelle interne d’un échantillon de tissu biologique comprenant une pluralité de types d’éléments biologiques, comportant les étapes suivantes : Pour au moins un type d’éléments biologiques d’intérêt parmi la pluralité de types d’éléments biologiques, segmentation automatique ou semi-automatique dans chaque image d’un empilement d’images, d’au moins une région contenant au moins un élément biologique ayant pour type le type d’éléments biologiques d’intérêt, l’empilement d’images ayant été acquis par imagerie sériée en Z par ultramicrotomie automatisée en microscopie électronique à balayage et comportant une pluralité d’images acquises chacune selon un plan perpendiculaire à un axe de profondeur et chacune associée à une position sur l’axe de profondeur, la pluralité d’images étant ordonnées par position croissante dans l’empilement d’images ; Caractérisation d’au moins un élément biologique ayant pour type le type d’éléments biologiques d’intérêt, par calcul d’au moins un indicateur relatif à la structure, à la morphologie, à la taille, à la polarité, à la texture, à la constitution ou à l’orientation de l’élément biologique à partir de chaque région segmentée correspondante. Grâce à l’invention, l’organisation tridimensionnelle interne complète ou quasi-complète d’un échantillon peut être caractérisée puisqu’une caractérisation de chaque élément biologique de l’échantillon peut être obtenue. Comme la segmentation de chaque élément biologique est obtenue automatiquement ou semi-automatiquement, la caractérisation de l’organisation tridimensionnelle de l’échantillon est obtenue beaucoup plus rapidement que dans l’art antérieur, le nombre d’étapes nécessitant une intervention humaine, et plus particulièrement l’intervention d’un spécialiste, étant diminué d’au moins 90%. Des paramètres physiques, géométriques, morphologiques, constitutionnels et organisationnels sont ensuite extraits de l’ensemble des segmentations pour être directement corrélés à des concepts biologiques ou pour être comparés avec des paramètres obtenus à partir d’autres échantillons. Ainsi, dans le domaine de l’oncologie par exemple, la méthode selon l’invention permet de faciliter l’étude de tous les types de cancers ou de tumeurs solides issus de biopsies ou d’échantillons tissulaires de patients, d’animaux ou de modèles expérimentaux variés, par exemple les sphéroïdes, les tumoroïdes, les organoïdes tumoraux ou encore les xénogreffes de cellules tumorales chez la souris, l’embryon de poulet, l’embryon de Xénope, le poisson zèbre ou tout autre modèle animal hôte. Outre les caractéristiques qui viennent d’être évoquées dans le paragraphe précédent, la méthode selon le premier aspect de l’invention peut présenter une ou plusieurs caractéristiques complémentaires parmi les suivantes, considérées individuellement ou selon toutes les combinaisons techniquement possibles. Selon une variante de réalisation, la méthode selon l’invention comprend en outre une étape de reconstruction tridimensionnelle d’au moins un élément biologique ayant pour type le type d’éléments biologiques d’intérêt, à partir de chaque région segmentée correspondante. Il est ainsi possible d’obtenir une reconstruction complète ou quasi-complète de l’organisation tridimensionnelle interne de l’échantillon biologique. La méthode selon l’invention peut alors permettre à terme la création d’une base de données d’imagerie tridimensionnelle accessible aux chercheurs et aux cliniciens, contenant des images tridimensionnelles à haute résolution de tissus biologiques de types et d’origines variés, ainsi que l’ensemble d’indicateurs associés, de données mathématiques et de paramètres morphologiques, constitutionnels ou organisationnels. Selon une variante de réalisation compatible avec la variante de réalisation précédente, la méthode selon l’invention comprend en outre une étape de modification, d’alignement et d’optimisation de l’empilement d’images avant l’étape de segmentation. Ainsi, l’étape de modification peut consister à aligner les images selon l’axe de profondeur pour faciliter la reconstruction tridimensionnelle et/ou à convertir les images dans un format moins lourd pour consommer moins de ressources et faciliter la segmentation, et/ou à ajuster la luminosité et le contraste des images et/ou à supprimer le bruit dans les images pour faciliter la segmentation ultérieure. Selon une variante de réalisation compatible avec les variantes de réalisation précédentes, le type d’éléments biologiques d’intérêt est choisi parmi les types suivants : capillaire sanguin, zone d’hémolyse, canalicule biliaire, cellule, membrane cytoplasmique, noyau, nucléole, membrane nucléaire, mitochondrie, réticulum endoplasmique, vésicule lipidique, exosome, lumière des vaisseaux, vacuole, péroxysome, paroi cellulaire, leucoplaste, chloroplaste ou tout autre élément biologique composant le tissu biologique ou les cellules. Selon une variante de réalisation compatible avec les variantes de réalisations précédentes, l’étape de segmentation est réalisée à l’aide d’un réseau de neurones artificiels entraîné pour être capable de détecter dans une image, chaque région comprenant au moins un élément biologique ayant pour type le type d’éléments biologiques d’intérêt, le réseau de neurones artificiels ayant été entraîné de manière supervisée sur une base de données d’entraînement comprenant une pluralité d’images dans lesquelles chaque région contenant au moins un élément biologique ayant pour type le type d’éléments biologiques d’intérêt a été identifiée. Ainsi, l’étape de segmentation est automatique, fiable et ne nécessite aucune intervention humaine. Le taux de précision/fiabilité obtenu est par exemple supérieur à 90% pour la segmentation des mitochondries et des noyaux. Selon une sous-variante de réalisation de la variante de réalisation précédente, l’étape de segmentation à l’aide du réseau de neurones artificiels entraîné est suivie d’une vérification visuelle et d’une correction manuelle. Ainsi, l’étape de segmentation est semi-automatique et les images corrigées peuvent ensuite être utilisées pour ré-entraîner le réseau de neurones artificiels et ainsi améliorer sa précision et sa fiabilité. Selon une sous-variante de réalisation de la variante de réalisation précédente compatible avec la sous-variante de réalisation précédente, la base de données d’entraînement est complétée avec les images de l’empilement d’images dans lesquelles chaque région contenant au moins un élément biologique ayant pour type le type d’éléments biologiques d’intérêt a été segmentée par le réseau de neurones artificiels et le réseau de neurones artificiels est réentraîné sur la base de données d’entraînement complétée. Ainsi, plus le réseau de neurones artificiels est ré-entraîné, plus sa précision et sa fiabilité augmentent, ce qui permet de diminuer le nombre d’étapes de vérifications visuelles et corrections manuelles, et de réduire encore d’avantage le temps nécessaire à l’étape de segmentation automatique, tout en maintenant un taux élevé de fiabilité. Selon une variante de réalisation compatible avec les variantes de réalisations précédentes exceptée la variante de réalisation précédente, l’étape de segmentation est réalisée manuellement ou semi-manuellement sur un ensemble d’images de l’empilement d’images et automatiquement à l’aide d’un algorithme de propagation sur chaque image de l’empilement d’images située entre deux images de l’ensemble d’images dans l’empilement d’images. Ainsi, l’étape de segmentation est semi-automatique et permet de segmenter des éléments biologiques, par exemple des cellules, dont les contours ne sont pas toujours nets sur toutes les images de l’empilement d’images. Selon une variante de réalisation compatible avec les variantes de réalisations précédentes, l’indicateur est choisi parmi les indicateurs suivants : volume, distance à un autre élément biologique donné, surface dans un plan donné, axe principal, alignement avec un axe ou un plan donné, polarisation vers un point donné, longueur des petits axes/grands axes, indicateur de texture, périmètre de l’enveloppe extérieure, dimension fractale de la surface, nombre d’éléments biologiques en contact, surface de contact avec des éléments biologiques voisins, densité d’éléments biologiques dans une région proche. Selon une variante de réalisation compatible avec les variantes de réalisations précédentes, la méthode selon l’invention comprend en outre une étape de comparaison entre les indicateurs calculés pour un ensemble d’éléments biologiques de l’échantillon de tissu biologique. Ainsi, il est possible d’étudier les liens entre les structures tridimensionnelles de différents types d’éléments biologiques au sein de l’échantillon. Un deuxième aspect de l’invention concerne une méthode de comparaison de l’organisation tridimensionnelle interne d’une pluralité d’échantillons de tissu biologique comprenant les étapes de la méthode selon le premier aspect de l’invention pour chaque échantillon de tissu biologique d’un ensemble d’échantillons de tissu biologique comprenant une pluralité d’échantillons de tissu biologique, et une étape de comparaison entre les indicateurs calculés pour un ensemble d’éléments biologiques de chaque échantillon de tissu biologique de l’ensemble d’échantillons de tissu biologique. Ainsi, il est possible d’étudier les liens entre les structures tridimensionnelles de plusieurs échantillons biologiques de même origine tissulaire ou d’origine différente, y compris des comparaisons entre tissus de règnes différents (animal versus végétal versus fongique…), mais également les liens entre les structures tridimensionnelles de plusieurs échantillons biologiques issus d’analyses réalisées à différents temps. Ainsi, dans le domaine de l’oncologie par exemple, la méthode selon le deuxième aspect de l’invention permet d’étudier les liens potentiels entre l’organisation tridimensionnelle interne d’un tissu tumoral, son contenu cellulaire et subcellulaire, et la réponse des patients à un traitement en comparant les paramètres du tissu avant et après la prise du traitement et ce, quel que soit le traitement considéré (chimiothérapie, immunothérapie, chirurgie, radiothérapie, cryothérapie, électroporation, électrofocalisation, thermothérapie, luminothérapie…). Un troisième aspect de l’invention concerne un dispositif comprenant un processeur configuré pour mettre en œuvre les étapes de la méthode selon le premier ou le deuxième aspect de l’invention. Un quatrième aspect de l’invention concerne un produit-programme d’ordinateur comprenant des instructions qui, quand le programme est exécuté sur un ordinateur, conduisent celui-ci à mettre en œuvre les étapes de la méthode selon le premier ou le deuxième aspect de l’invention. Un cinquième aspect de l’invention concerne un support d'enregistrement lisible par ordinateur comprenant des instructions qui, lorsqu'elles sont exécutées par un ordinateur, conduisent celui-ci à mettre en œuvre les étapes de la méthode selon le premier ou le deuxième aspect de l’invention. L’invention et ses différentes applications seront mieux comprises à la lecture de la description qui suit et à l’examen des figures qui l’accompagnent. BREVE DESCRIPTION DES FIGURES Les figures sont présentées à titre indicatif et nullement limitatif de l’invention. La figure 1 est un schéma synoptique illustrant l’enchaînement des étapes d’une méthode selon un premier aspect de l’invention. La figure 2 illustre le résultat d’étapes de segmentation, de caractérisation et de comparaison de la méthode selon le premier aspect de l’invention en choisissant les cellules et les capillaires sanguins comme types d’éléments biologiques d’intérêt, et l’axe principal comme indicateur. La figure 3a montre un empilement d’images acquises par imagerie sériée en Z par ultramicrotomie automatisée en microscopie électronique à balayage, ordonnées de gauche à droite par position croissante selon un axe de profondeur Z, comportant un canalicule biliaire. La figure 3b montre le résultat d’une étape de reconstruction de la méthode selon le premier aspect de l’invention pour le canalicule biliaire à partir de l’empilement d’images représenté sur la figure 3a. La figure 4 illustre un mode de réalisation d’une étape de segmentation de la méthode selon le premier aspect de l’invention ayant recours à un algorithme de propagation. La figure 5 montre le résultat de l’étape de reconstruction de la méthode selon le premier aspect de l’invention en choisissant les noyaux et les capillaires sanguins comme types d’éléments biologiques d’intérêt. La figure 6 est un schéma synoptique illustrant l’enchaînement des étapes d’une méthode selon un deuxième aspect de l’invention. DESCRIPTION DETAILLEE Sauf précision contraire, un même élément apparaissant sur des figures différentes présente une référence unique. Un premier aspect de l’invention concerne une méthode de caractérisation de l’organisation tridimensionnelle interne d’un échantillon de tissu biologique. On entend par « organisation tridimensionnelle d’un échantillon », la structure interne de l’échantillon décelable à l’aide d’un microscope électronique, c’est-à-dire dans une gamme de valeurs d’environ un à plusieurs centaines de nanomètres. Le tissu biologique peut être humain, animal, végétal ou fongique. L’échantillon a par exemple été prélevé par biopsie ou par résection chirurgicale sur un patient, sur un animal ou à partir de tout autre modèle expérimental pertinent ou de n’importe quelle source biologique, animale, végétale ou fongique. L’échantillon a par exemple un volume de l’ordre de 1 mm 3 . Un tissu biologique comporte une pluralité d’éléments biologiques de types différents. Un type d’éléments biologiques est par exemple une cellule, une hématie, une membrane cytoplasmique, un noyau, un nucléole, une membrane nucléaire, une mitochondrie, un capillaire sanguin, une vésicule lipidique, un canalicule biliaire, un réticulum endoplasmique, une zone d’hémolyse, la lumière des vaisseaux ou encore un exosome, une vacuole, un péroxysome, une paroi cellulaire, un leucoplaste, un chloroplaste. Le type de cellule analysé peut être d’origine variée, comme les cellules végétales, fongiques, animales ou humaines cardiaques, musculaires, endothéliales, neuronales, immunitaires, rénales, pancréatiques, pulmonaires, hépatocytaires, biliaires, astrocytaires, macrocytaires, gliales, intestinales, stomacales. La est un schéma synoptique illustrant l’enchaînement des étapes de la méthode 100 selon le premier aspect de l’invention. La méthode 100 selon l’invention est réalisée sur un empilement d’images de l’échantillon de tissu biologique obtenu par SBF-SEM. En considérant que l’échantillon est placé dans un repère orthogonal (X, Y, Z) où Z correspond à la profondeur de l’échantillon, chaque image de l’empilement d’images est acquise selon un plan comprenant les axes X et Y et perpendiculaire à l’axe de profondeur Z. Les plans des images acquises sont parallèles entre eux et non confondus, c’est-à-dire que les plans sont espacés entre eux selon l’axe de profondeur Z. Chaque plan peut donc être associé à une position sur l’axe de profondeur Z. Par exemple, si l’on réalise l’acquisition de trois images perpendiculairement à l’axe de profondeur Z selon des plans espacés chacun de 25 nm, la première image est par exemple associée à la position 0 nm sur l’axe de profondeur Z, la deuxième image à la position 25 nm sur l’axe de profondeur Z et la troisième image à la position 50 nm sur l’axe de profondeur Z. Les images de l’empilement d’images sont ordonnées par position croissante selon l’axe de profondeur Z. La montre un empilement d’images I3D acquis par SBF-SEM et un exemple d’image IZ constituant l’empilement d’images I3D. La méthode 100 selon l’invention peut comporter une première étape 101 de modification, d’alignement, et d’optimisation de l’empilement d‘images I 3D . La première étape 101 peut consister à aligner les images I Z de l’empilement d’images I 3D selon l’axe de profondeur Z et/ou à convertir les images I Z de l’empilement d’images I 3D dans un format moins lourd, par exemple de 32 bits vers 8 bits, et/ou à ajuster la luminosité et le contraste des images I Z de l’empilement d’images I 3D , et/ou à supprimer le bruit dans les images I Z de l’empilement d’images I 3D , par exemple par application d’un filtre gaussien. Une deuxième étape 102 de la méthode 100 selon l’invention consiste, pour au moins un type d’éléments biologiques d’intérêt, à segmenter automatiquement ou semi-automatiquement dans chaque image I Z de l’empilement d’images I 3D éventuellement modifié à la première étape 101, au moins une région de l’image I Z comportant au moins un élément biologique présentant le type d’éléments biologiques d’intérêt. Le type d’éléments biologiques d’intérêt est choisi parmi les types d’éléments biologiques classiquement présents dans le tissu biologique constituant l’échantillon. Ainsi, si l’on choisit deux types d’éléments biologiques d’intérêt, par exemple les cellules 202 et les capillaires sanguins 201, la deuxième étape 102 consiste d’une part à segmenter chaque région comprenant une cellule 202 dans chaque image I Z de l’empilement d’images I 3D et d’autre part à segmenter chaque région comprenant un capillaire sanguin 201 dans chaque image I Z de l’empilement d’images I 3D . On entend par « segmenter un élément dans une image », identifier les contours de l’élément visible dans l’image. La région de l’image I Z segmentée peut comporter uniquement l’élément biologique, c’est-à-dire que les contours de la région coïncident avec les contours de l’élément biologique. La région de l’image I Z segmentée peut également comporter, en son sein, d’autres éléments biologiques en plus de l’élément biologique d’intérêt. Selon un premier mode de réalisation, la deuxième étape 102 est réalisée à l’aide d’un réseau de neurones artificiels préalablement entraîné de manière supervisée sur une base de données d’entraînement pour segmenter dans chaque image I Z de l’empilement d’images I 3D , chaque région comportant au moins un élément biologique d’un type donné. Un réseau de neurones artificiels comporte au moins une couche de neurones artificiels comportant chacune au moins un neurone artificiel. Les neurones artificiels du réseau de neurones artificiels sont reliés entre eux par des synapses et à chaque synapse est affecté un coefficient synaptique. L’entraînement ou apprentissage permet d’entraîner le réseau de neurones artificiels à une tâche prédéfinie, en mettant à jour les coefficients synaptiques de manière à minimiser l’erreur entre la donnée de sortie fournie par le réseau de neurones artificiels et la vraie donnée de sortie, c’est-à-dire ce que le réseau de neurones artificiels devrait fournir en sortie pour remplir la tâche prédéfinie sur une certaine donnée d’entrée. Une base de données d’entraînement comporte donc des données d’entrée, chacune associée à une vraie donnée de sortie. La base de données d’entraînement comporte donc des images I Z d’échantillons de tissus biologiques acquises par SBF-SEM, ainsi que des données sur les contours de chaque région comportant au moins un élément biologique du type donné présente dans chaque image I Z . Les données sur les contours de chaque région ont été obtenues manuellement et/ou automatiquement et/ou par la combinaison des deux. Le réseau de neurones artificiels est par exemple un réseau de neurones artificiels convolutifs, tel que le réseau U-Net. La deuxième étape 102 selon le premier mode de réalisation est alors réalisée automatiquement. La segmentation réalisée à l’aide du réseau de neurones artificiels peut être éventuellement suivie d’une vérification visuelle et d’une correction manuelle pour contrôler la qualité de la donnée de sortie fournie par le réseau de neurones artificiels. Dans ce cas, la deuxième étape 102 selon le premier mode de réalisation est réalisée de façon semi-automatique. Une fois la deuxième étape 102 terminée, la base de données d’entraînement peut être complétée avec les images de l’empilement d’images dans lesquelles chaque région contenant au moins un élément biologique d’intérêt a été segmentée et le réseau de neurones artificiels peut être ré-entraîné sur la base de données d’entraînement ainsi complétée. Selon un deuxième mode de réalisation, la deuxième étape 102 est réalisée par segmentation manuelle ou semi-manuelle de chaque région comportant au moins un élément biologique d’un type donné dans un ensemble d’images de l’empilement d’images I 3D et par segmentation automatique de chaque région comportant au moins un élément biologique d’un type donné dans chaque image I Z de l’empilement d’images I 3D située entre deux images de l’ensemble d’images dans l’empilement d’images I 3D à l’aide d’un algorithme de propagation. On entend par « segmentation semi-manuelle d’un élément », une segmentation réalisée manuellement sur une portion de l’élément, la portion de l’élément segmenté manuellement étant utilisée comme données d’entrée pour un algorithme alors capable de segmenter intégralement l’élément de manière automatique. Un tel algorithme est par exemple un réseau de neurones artificiels ou un algorithme de traitement d’images, par exemple de croissance de région ou region-growing en anglais. La illustre la mise en œuvre du deuxième mode de réalisation de la deuxième étape 102 sur une pluralité d’images IZ ordonnées par position croissante selon l’axe de profondeur Z de gauche à droite et de haut en bas, en choisissant les cellules 202 comme type d’éléments biologiques d’intérêt. Sur chaque image I’ de l’ensemble d’images représentées encadrées en pointillés sur la , les contours de la cellule 202 présente dans l’image I’ ont été identifiés semi-manuellement et sur chaque autre image IZ, c’est-à-dire sur chaque image IZ n’appartenant pas à l’ensemble d’images I’, les contours de la cellule 202 présente dans l’image IZ ont été identifiés automatiquement par l’algorithme de propagation à partir des contours de la cellule 202 obtenus pour l’image I’ de l’ensemble d’images I3D précédant immédiatement l’image IZ à segmenter. Sur la , la segmentation semi-manuelle est réalisée sur une image IZ sur 10, c’est-à-dire que l’ensemble d’images I’ comprend une image IZ sur 10 de l’ensemble d’images I3D. La segmentation manuelle ou semi-manuelle est par exemple réalisée à l’aide d’un logiciel d’annotations d’images. L’algorithme de propagation est par exemple un algorithme basé sur le flux optique ou « optical flow » en anglais. La deuxième étape 102 selon le deuxième mode de réalisation est alors réalisée semi-automatiquement. Si l’on choisit une pluralité de types d’éléments biologiques d’intérêt, la deuxième étape 102 peut être réalisée selon le premier mode de réalisation pour certains types d’éléments biologiques d’intérêt et selon le deuxième mode de réalisation pour les autres types d’éléments biologiques d’intérêt. Ainsi, si l’on choisit deux types d’éléments biologiques d’intérêt, par exemple les cellules 202 et les mitochondries, la deuxième étape 102 peut être réalisée selon le premier mode de réalisation pour les mitochondries et selon le deuxième mode de réalisation pour les cellules 202. La méthode 100 selon l’invention peut comporter une troisième étape 103 consistant à reconstruire la structure tridimensionnelle de chaque élément biologique compris dans une région segmentée à la deuxième étape 102 à partir de la segmentation de la région comprenant l’élément biologique dans chaque image I Z de l’empilement d’images I 3D . La montre un empilement d’images comportant huit images IZ acquises par SBF-SEM et ordonnées de gauche à droite par position croissante selon l’axe de profondeur Z. La première image I Z correspond à une position de 2.5 μm selon l’axe de profondeur Z, la deuxième image I Z correspond à une position de 5 μm selon l’axe de profondeur Z, la troisième image I Z correspond à une position de 7.5 μm selon l’axe de profondeur Z, la quatrième image I Z correspond à une position de 10 μm selon l’axe de profondeur Z, la cinquième image I Z correspond à une position de 12.5 μm selon l’axe de profondeur Z, la sixième image I Z correspond à une position de 15 μm selon l’axe de profondeur Z, la septième image I Z correspond à une position de 17.5 μm selon l’axe de profondeur Z et la huitième image I Z correspond à une position de 20 μm selon l’axe de profondeur Z. Sur la , chaque image IZ présente une section de canalicule biliaire 203. La montre la reconstruction tridimensionnelle du canalicule biliaire 203 présent dans les images IZ de la obtenue à partir de la segmentation du canalicule biliaire 203 dans chaque image IZ de la . Sur la est représentée la reconstruction tridimensionnelle des cellules 202 et des capillaires sanguins 201 d’un échantillon obtenu à partir d’un empilement d’images I3D acquises par SBF-SEM. La montre la reconstruction tridimensionnelle des noyaux 204 et des capillaires sanguins 201 d’un échantillon, obtenue à partir d’un empilement d’images I3D acquises par SBF-SEM. Une quatrième étape 104 de la méthode 100 consiste à caractériser au moins un élément biologique d’un type d’éléments biologiques d’intérêt en calculant au moins un indicateur à partir de chaque région segmentée pour l’élément biologique dans l’empilement d’images I 3D . Un indicateur peut être relatif à la structure, à la morphologie, à la taille, à la polarité, à la texture, à la constitution ou à l’orientation de l’élément biologique. L’indicateur est par exemple le volume de l’élément biologique, la distance entre l’élément biologique et un autre élément biologique donné de l’échantillon, la surface de l’élément biologique dans un plan donné, l’axe principal de l’élément biologique, l’alignement de l’élément biologique avec un axe ou un plan donné, la polarisation de l’élément biologique vers un point donné, la longueur des petits axes/grands axes de l’élément biologique, un indicateur de texture de l’élément biologique, par exemple la matrice de cooccurrence, le périmètre de l’enveloppe extérieure de l’élément biologique, la dimension fractale de la surface de l’élément biologique, le nombre d’éléments biologiques de l’échantillon en contact avec l’élément biologique, la surface de contact entre l’élément biologique et des éléments biologiques voisins dans l’échantillon, la densité d’éléments biologiques dans la région dans laquelle se situe l’élément biologique ou dans une région voisine. L’indicateur peut par exemple être l’orientation de l’axe noyau-mitochondrie, le nombre de cellules en contact avec une cellule d’intérêt, ou encore la surface de contact d’une cellule d’intérêt avec des cellules voisines. Sur la est représenté par un bâtonnet l’axe principal 302 de chaque cellule 202 et par une forme cylindrique l’axe principal 301 de l’unique capillaire sanguin 201 obtenus à partir de la reconstruction tridimensionnelle de chaque cellule 202 et du capillaire sanguin 201. L’axe principal 301, 302 d’un élément biologique est par exemple obtenu par analyse en composante principale sur les coordonnées des voxels constituant la reconstruction tridimensionnelle de l’élément biologique. La méthode 100 selon l’invention peut comporter une cinquième étape 105 consistant à comparer entre eux les indicateurs calculés à la quatrième étape 104 pour un ensemble d’éléments biologiques donné. La comporte un histogramme représentant pour différentes valeurs d’angle entre l’axe principal 301 du capillaire sanguin 201 et l’axe principal 302 de la cellule 202, le nombre de cellules 202 présentant un axe principal 302 séparé de l’axe principal 301 du capillaire sanguin 201 de la valeur d’angle. L’histogramme comporte aussi le nombre de cellules cumulé pour chaque valeur d’angle. Il est alors possible d’en déduire que plus des trois quarts des cellules 202 de l’échantillon sont orientées avec un angle d’inclinaison de 0 à 20° par rapport au capillaire sanguin 201, et donc que le capillaire sanguin 201, qui a un angle d’inclinaison de 8°, pourrait avoir un rôle dans l’orientation des cellules 202. Un deuxième aspect de l’invention concerne une méthode de comparaison de l’organisation tridimensionnelle interne d’une pluralité d’échantillons de tissu biologique. La est un schéma synoptique illustrant l’enchaînement des étapes de la méthode 400 selon le deuxième aspect de l’invention. La méthode 400 selon l’invention comporte les étapes de la méthode 100 selon le premier aspect de l’invention pour chaque échantillon de tissu biologique d’un ensemble d’échantillons de tissu biologique. L’ensemble d’échantillons de tissu biologique comprend une pluralité d’échantillons d’un même tissu biologique ou de tissus biologiques différents. Sur la , l’ensemble d’échantillons de tissu biologique comporte deux échantillons et les étapes de la méthode 100 selon le premier aspect de l’invention sont donc réalisées deux fois. La méthode 400 selon l’invention comporte en outre une étape 401 de comparaison entre les indicateurs calculés pour un ensemble d’éléments biologiques de chaque échantillon de tissu biologique de l’ensemble d’échantillons de tissu biologique. Méthode (100) de caractérisation de l’organisation tridimensionnelle interne d’un échantillon de tissu biologique comprenant une pluralité de types d’éléments biologiques (201, 202, 203, 204), comportant les étapes suivantes : Pour au moins un type d’éléments biologiques (201, 202, 203, 204) d’intérêt parmi la pluralité de types d’éléments biologiques (201, 202, 203, 204), segmentation automatique ou semi-automatique dans chaque image (I Z ) d’un empilement d’images (I 3D ), d’au moins une région contenant au moins un élément biologique (201, 202, 203, 204) ayant pour type le type d’éléments biologiques (201, 202, 203, 204) d’intérêt, l’empilement d’images (I 3D ) ayant été acquis par imagerie sériée en Z par ultramicrotomie automatisée en microscopie électronique à balayage et comportant une pluralité d’images (I Z ) acquises chacune selon un plan perpendiculaire à un axe de profondeur (Z) et chacune associées à une position sur l’axe de profondeur (Z), la pluralité d’images (I Z ) étant ordonnées par position croissante dans l’empilement d’images (I 3D , 102) ; Caractérisation d’au moins un élément biologique (201, 202, 203, 204) ayant pour type le type d’éléments biologiques (201, 202, 203, 204) d’intérêt, par calcul d’au moins un indicateur (301, 302) relatif à la structure, à la morphologie, à la taille, à la polarité, à la texture, à la constitution ou à l’orientation de l’élément biologique (201, 202, 203, 204), à partir de chaque région segmentée correspondante (104). Méthode selon la revendication 1, comprenant en outre une étape de reconstruction tridimensionnelle d’au moins un élément biologique (201, 202, 203, 204) ayant pour type le type d’éléments biologiques (201, 202, 203, 204) d’intérêt, à partir de chaque région segmentée correspondante (103). Méthode (100) selon l’une quelconque des revendications précédentes, comprenant en outre une étape (101) préalable de modification, d’alignement et d’optimisation de l’empilement d’images (I 3D ). Méthode (100) selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le type d’éléments biologiques (201, 202, 203, 204) d’intérêt est choisi parmi les types suivants : cellule (202), membrane cytoplasmique, noyau (204), nucléole, membrane nucléaire, mitochondrie, capillaire sanguin (201), vésicule lipidique, canalicule biliaire (203), réticulum endoplasmique, exosome, lumière des vaisseaux, zone d’hémolyse, vacuole, péroxysome, paroi cellulaire, leucoplaste, chloroplaste. Méthode (100) selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle l’étape (102) de segmentation est réalisée à l’aide d’un réseau de neurones artificiels entraîné pour être capable de détecter dans une image (I Z ), chaque région contenant au moins un élément biologique (201, 202, 203, 204) ayant pour type le type d’éléments biologiques (201, 202, 203, 204) d’intérêt, le réseau de neurones artificiels ayant été entraîné de manière supervisée sur une base de données d’entraînement comprenant une pluralité d’images (I Z ) dans lesquelles chaque région contenant au moins un élément biologique (201, 202, 203, 204) ayant pour type le type d’éléments biologiques (201, 202, 203, 204) d’intérêt a été identifiée. Méthode (100) selon la revendication 5, dans laquelle l’étape (102) de segmentation à l’aide du réseau de neurones artificiels entraîné est suivie d’une vérification visuelle et d’une correction manuelle. Méthode (100) selon l’une quelconque des revendications 5 ou 6, selon laquelle la base de données d’entraînement est complétée avec les images de l’empilement d’images dans lesquelles chaque région contenant au moins un élément biologique ayant pour type le type d’éléments biologiques d’intérêt a été segmentée par le réseau de neurones artificiels et le réseau de neurones artificiels est ré-entraîné sur la base de données d’entraînement complétée. Méthode (100) selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle l’étape (102) de segmentation est réalisée manuellement ou semi-manuellement sur un ensemble d’images (I’) de l’empilement d’images (I 3D ) et automatiquement à l’aide d’un algorithme de propagation sur chaque image (I Z ) de l’empilement d’images (I 3D ) située entre deux images (I Z ) de l’ensemble d’images (I’) dans l’empilement d’images (I 3D ). Méthode (100) selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle l’indicateur (301, 302) est choisi parmi les indicateurs suivants : volume, distance à un autre élément biologique (201, 202, 203, 204) donné, surface dans un plan donné, axe principal (301, 302), alignement avec un axe ou un plan donné, polarisation vers un point donné, longueur des petits axes/grands axes, indicateur de texture, périmètre de l’enveloppe extérieure, dimension fractale de la surface, nombre d’éléments biologiques (201, 202, 203, 204) en contact, surface de contact avec des éléments biologiques (201, 202, 203, 204) voisins, densité d’éléments biologiques (201, 202, 203, 204) dans une région proche. Méthode (100) selon l’une quelconque des revendications précédentes, comportant en outre une étape (105) de comparaison entre les indicateurs (301, 302) calculés pour un ensemble d’éléments biologiques (201, 202, 203, 204) de l’échantillon de tissu biologique. Méthode (400) de comparaison de l’organisation tridimensionnelle interne d’une pluralité d’échantillons de tissu biologique comprenant les étapes de la méthode (100) selon l’une quelconque des revendications précédentes pour chaque échantillon de tissu biologique d’un ensemble d’échantillons de tissu biologique comprenant une pluralité d’échantillons de tissu biologique, et une étape (401) de comparaison entre les indicateurs (301, 302) calculés pour un ensemble d’éléments biologiques (201, 202, 203, 204) de chaque échantillon de tissu biologique de l’ensemble d’échantillons de tissu biologique. Dispositif comprenant un processeur configuré pour mettre en œuvre les étapes de la méthode (100, 400) selon l’une quelconque des revendications précédentes. Produit-programme d’ordinateur comprenant des instructions qui, quand le programme est exécuté sur un ordinateur, conduisent celui-ci à mettre en œuvre les étapes de la méthode (100, 400) selon l’une quelconque des revendications 1 à 11. Support d'enregistrement lisible par ordinateur comprenant des instructions qui, lorsqu'elles sont exécutées par un ordinateur, conduisent celui-ci à mettre en œuvre les étapes de la méthode (100, 400) selon l’une quelconque des revendications 1 à 11.