Brevet FR3125538A1 — publié le 20230127

La présente invention concerne la préparation d’un échafaudage microstructuré correspondant à un matériau de support de type membrane biocompatible pour la culture cellulaire. La présente invention concerne également une composition comprenant l’échafaudage microstructuré et des cellules en particulier des photorécepteurs. La présente invention s’applique notamment à la préparation d’un greffon implantable pour le traitement de maladies de l’épithélium pigmentaire rétinien et de la rétine neurale. Fig. 1 ECHAFAUDAGE MICROSTRUCTURE POUR LA PREPARATION D’UN IMPLANT TISSULAIRE La présente invention concerne la préparation d’un échafaudage microstructuré correspondant à un matériau de support de type membrane biocompatible pour la culture cellulaire. La présente invention concerne également une composition comprenant l’échafaudage microstructuré et des cellules en particulier des photorécepteurs, avec ou sans cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien. La présente invention s’applique notamment à la préparation d’un greffon implantable pour le traitement de maladies de l’épithélium pigmentaire rétinien et de la rétine neurale. La rétine est la couche sensorielle qui tapisse la face postérieure de l'œil, reçoit l'image formée par la lentille, et traduit cette image en impulsions neuronales qui sont transmises au cerveau par le nerf optique. La rétine est un tissu neuronal qui interagit de façon critique avec l’épithélium pigmentaire rétinien qui lui est nécessaire à sa survie et son bon fonctionnement. La macula constituant la partie centrale de la rétine, est enrichie en photorécepteurs capables de percevoir les différentes couleurs et les détails visuels fins. La macula est cruciale notamment pour la reconnaissance faciale et la lecture. De nombreuses maladies peuvent affecter l’épithélium pigmentaire rétinien ou la rétine neurale et entrainer une altération de la vision pouvant conduire à la cécité. Parmi ces maladies, on peut citer en particulier les dégénérescences maculaires héréditaires ou liées à l’âge, les dystrophies maculaires, et les rétinites pigmentaires. L’épithélium rétinien ou la rétine neurale peut également présenter des lésions d’origine traumatique ou infectieuse. Des recherches récentes semblent démontrer que les lésions de la rétine peuvent être retardées, arrêtées, voire être réparées par la transplantation de cellules d’épithélium pigmentaire rétinien ou de cellules rétiniennes dans l’espace sous-rétinien, ce qui peut prévenir la réduction des capacités visuelles provoquée par ces maladies ou les améliorer dans le cas de greffes de cellules de la rétine neurale. On a proposé diverses formes de greffes ou de techniques de transplantation pour tenter de préserver la rétine. Plus récemment, des résultats prometteurs ont été obtenus en transplantant une culture de cellules d’épithélium pigmentaire rétinien obtenues par différenciation de cellules souches pluripotentes, les cellules étant cultivées sur une membrane biocompatible. Dans le cas de maladie de la rétine à un stade avancé, la transplantation seule de cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien n’est pas suffisante. Les photorécepteurs doivent également être remplacés. Les photorécepteurs sont un type cellulaire hautement polarisé et spécialisé avec des segments externes apicaux contenant des photopigments photosensibles et des terminaisons axonales basales. La transplantation de photorécepteurs polarisés avec ou sans cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien présente d’importants défis en raison de la nécessité de fournir un greffon multicouche possédant une structure organisée. La technologie de microfabrication de support tridimensionnel offre des solutions potentielles à ces problèmes. C’est ainsi que la fabrication de système d'échafaudage pour la culture cellulaire de photorécepteurs a déjà été proposée. Par exemple, le document WO2017164992 décrit un système d'échafaudage microstructuré qui comprend un élément de support comprenant des micropores permettant aux photorécepteurs de croître dans une direction verticale. Les micropores de l'échafaudage microstructuré sont constitués d’une partie sphérique ou conique appelée « récepteur de cellule curviligne » connectée à au moins une partie cylindrique appelée « canal de guidage de cellule ». La densité des micropores de l’élément de support est un paramètre très important, car il conditionne le nombre de connexions possibles entre les photorécepteurs et les cellules de l’épithélium rétinien. Dans le cas du document WO2017164992, la distance entre 2 micropores adjacents est de 0,1-5 μm (bord à bord) ou de 16 μm de centre à centre. Cet échafaudage est favorable à la réalisation de nombreuses connexions intercellulaires. Mais la profondeur des pores n’est pas favorable à une maturation optimale des photorécepteurs. Une profondeur de l’ordre de 100 µm (correspondant à la taille d’un photorécepteur mature humain) est souhaitée pour ce type de cellule. Cependant la réalisation de membranes microstucturées avec une épaisseur voisine de 100 µm et une périodicité des pores voisine de celle présentée dans le document WO2017164992 ne serait pas compatible actuellement avec les procédés de fabrication. Il y a un risque d’arracher les motifs (de la présente invention) du moule maître lors du démoulage de la membrane du fait que la période est inférieure à la hauteur des motifs (50 µm versus 100-120 µm). Cependant la réalisation de ce type d’échafaudage peut être problématique en raison de contraintes physiques importantes de fabrication, notamment des risques de déchirure de la membrane microstructurée lors de son démoulage. On peut également indiquer que l’état de la technique décrit de nombreux échafaudages microstructurés pour la culture de cellules, en particulier de photorécepteurs comprenant des micropores de forme cylindrique. Lorsqu’un échafaudage de ce type est ensemencé avec des photorécepteurs matures ou immatures, une partie des cellules tombe au fond des micropores, ce qui est problématique. En effet, les photorécepteurs sont des cellules polarisées et orientées avec des segments externes (allongement des photorécepteurs) qui forment des contacts, au niveau basal, avec des cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien et au niveau apical, avec des synapses dans un tissu in vivo . Sans support de culture adapté et d’indices de signalisation appropriés, l'orientation correcte des photorécepteurs dans un tissu reconstruit in vitro pourrait être difficile à obtenir. Pour surmonter cela, la bonne maturation est guidée à travers un échafaudage polymère microstructuré spécialement conçu avec des micropores dans lesquels des photorécepteurs immatures peuvent être ensemencés tandis que leur orientation est imposée par la microstructure d'un tel échafaudage. L'échafaudage microstructuré guide la maturation des photorécepteurs en imposant des contraintes physiques latérales à l'intérieur des micropores au-dessus d'un épithélium pigmentaire rétinien qui fournit des indices pour guider la maturation des photorécepteurs avec l'orientation attendue. Il existe donc un besoin de préparer de nouveaux échafaudages pour la culture cellulaire, qui soient plus faciles à manipuler en raison des contraintes de fabrication et qui permettent une optimisation de la maturation et de l’organisation des photorécepteurs à l'intérieur des micropores. Un des objectifs de l'invention est donc proposer un échafaudage de type membrane microstructurée pour la culture cellulaire, en particulier de photorécepteur, dont la densité des micropores a été optimisée pour à la fois limiter les problèmes de fabrication de l’échafaudage et de proposer une organisation cellulaire la plus proche possible d’un tissu rétinien in vivo . Dans un premier aspect, l'invention concerne donc un échafaudage qui comprend ou est constitué d’une membrane microstructurée pourvue d’une pluralité de micropores traversants de forme conique. Un autre aspect de l’invention concerne l’échafaudage microstructuré pour son utilisation comme support de culture cellulaire, en particulier de photorécepteur. Dans un deuxième aspect, l'invention concerne une composition comprenant l’échafaudage microstructuré et des cellules, en particulier des photorécepteurs. Un autre aspect de l’invention concerne un procédé de préparation d’une composition comprenant l’échafaudage microstructuré et des cellules, en particulier des photorécepteurs. Dans un troisième aspect, l'invention concerne un greffon implantable comprenant l’échafaudage microstructuré, des cellules, en particulier des photorécepteurs et des cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien cultivées sur un support. Un autre aspect de l’invention concerne un procédé de préparation d’un greffon implantable comprenant l’échafaudage microstructuré, des cellules en particulier des photorécepteurs et des cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien cultivées sur un support. Un autre aspect de l’invention concerne un procédé de préparation d’un échafaudage microstructuré, en particulier par photolithographie. Le terme « échafaudage » est utilisé ici pour désigner un support biocompatible de type membrane microstructurée utile pour la culture de cellules, en particulier de photorécepteurs. L’échafaudage selon la présente invention est une membrane microstructurée qui comprend des micropores traversants de forme conique. Les micropores de forme conique sont soit coniques sur toute la hauteur de la membrane, soit partiellement coniques sur une première partie du micropore (hauteur h1) située dans la partie apicale de la membrane ; une seconde partie du micropore (hauteur h2) située dans la partie basale de la membrane est formée d’au moins deux canaux, de préférence trois ou quatre canaux, de forme conique ou sensiblement conique. Lesdits canaux, de préférences ne sont pas de forme cylindrique ou sensiblement cylindrique. Structure de l’échafaudage de culture cellulaire Au sens de la présente invention, l’échafaudage comprend ou consiste en une membrane microstructurée qui présente des micropores traversants de forme conique. Le diamètre et la distribution des micropores sont différents en fonction de l’orientation de la membrane. La surface apicale de la membrane (1) correspond à la surface orientée vers le haut. La surface basale de la membrane (2) correspond à la surface de la membrane orientée vers le bas, c’est-à-dire la surface de la membrane qui dans certains modes de réalisation de l’invention se trouve au contact d’une couche de cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien et comprenant des micropores d’un diamètre inférieur à ceux se trouvant sur la surface apicale de la membrane. Dans un aspect particulier de l’invention, -la surface apicale de la membrane (1) présente des micropores d’un diamètre (d1) supérieur à au moins trois fois, de préférence à au moins quatre fois le diamètre (d2) des micropores de la surface basale de la membrane (2). Dans un aspect particulier de l’invention, l’échafaudage comprend ou est constitué d’une membrane microstructurée comprenant des micropores de forme conique traversants ladite membrane au niveau d’une première surface (1) et au niveau d’une seconde surface (2) caractérisée en ce que, -la surface apicale de la membrane (1) présente des micropores d’un diamètre (d1) supérieur à au moins trois fois, de préférence à au moins quatre fois le diamètre (d2) des micropores de la surface basale de la membrane (2). Dans un autre aspect particulier de l’invention, le micropore de forme conique, présente une première partie (apicale) de hauteur (h1) et une seconde partie (basale) de hauteur (h2) qui présente plusieurs canaux formant plusieurs micropores à la surface basale de la membrane (2). La hauteur (h1) du micropore présente une valeur correspondant à environ un quart à la moitié de la hauteur totale du micropore. De préférence, la hauteur (h1) du micropore présente une valeur correspondant à environ un tiers de la hauteur totale du micropore. La hauteur (h1) du micropore présente une valeur comprise de 20 µm à 60 µm, de préférence comprise de 30 µm à 50 µm, de préférence de 30 µm à 40 µm, soit de 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 µm. La hauteur (h2) du micropore présente une valeur comprise de 40 µm à 80 µm, de préférence comprise de 50 µm à 70 µm, de préférence de 55 µm à 65 µm, soit de 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 ou 65 µm. Selon la présente invention, lorsque le micropore de forme conique présente deux canaux, le micropore est dit bipode ; lorsque le micropore de forme conique présente trois canaux, le micropore est dit tripode et lorsque le micropore de forme conique présente quatre canaux, le micropore est dit quadripode. Dans un aspect particulier de l’invention, les micropores de forme conique sont de type bipode, tripode ou quadripode. Selon la présente invention le micropore de forme conique présente un diamètre (d1) à la surface apicale de la membrane (1) compris de 15 µm à 25 µm, de préférence compris de 18 µm à 22 µm. Le diamètre (d1) du micropore à la surface apicale de la membrane (1) présente une valeur de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 µm. Selon la présente invention le micropore de forme conique présente un diamètre (d2) à la surface basale de la membrane (2), compris de 4 µm à 8 µm, de préférence compris de 5 µm à 6 µm. Le diamètre (d2) du micropore à la surface basale de la membrane (2) présente une valeur de 4, 5, 6, 7 ou 8 µm. Selon la présente invention la membrane microstructurée présente une pluralité de micropores de forme conique de type bipode, tripode, ou quadripode, les micropores étant caractérisés par -un diamètre (d1) à la surface apicale de la membrane (1), compris de 15 µm à 25 µm, de préférence compris de 18 µm à 22 µm, - un diamètre (d1’) dont la valeur correspond au diamètre (d1) diminué de 2 à 6 µm, de préférence de 3 à 5 µm -un diamètre (d2) à la surface basale de la membrane (2), compris de 4 µm à 8 µm, de préférence compris de 5 µm à 6 µm, - une hauteur h1 comprise de 20 µm à 60 µm, - une hauteur h2 comprise de 40 µm à 80 µm, étant entendu que la hauteur totale (h1+h2) de la membrane microstructurée est comprise de 80 µm à 120 µm. Selon la présente invention, le diamètre (d1’) du micropore de forme conique de type bipode, tripode, ou quadripode, correspond au diamètre du micropore dans la zone où la partie conique du micropore présente plusieurs canaux, de préférence coniques. Selon la présente invention, le diamètre (d1’) du micropore de forme conique de type bipode, tripode, ou quadripode est compris de 9 µm à 23 µm, de préférence de 16 µm à 20 µm. Dans un aspect particulier de l’invention l’échafaudage comprend ou est constitué d’une membrane microstructurée comprenant des micropores de forme conique traversants ladite membrane au niveau d’une première surface (1) et au niveau d’une seconde surface (2) caractérisée en ce que, -la surface apicale de la membrane (1) présente des micropores d’un diamètre (d1) compris de 15 µm à 25 µm, de préférence compris de 18 µm à 22 µm, -la surface basale de la membrane (2) présente des micropores d’un diamètre (d2) compris de 4 µm à 8 µm, de préférence compris de 5 µm à 6 µm. Dans un aspect particulier de l’invention, l’épaisseur de la membrane microstructurée est comprise de 80 µm à 120 µm, de préférence de 90 µm à 110 µm, encore plus de préférence de 95 µm à 105 µm ou encore plus de préférence d’environ 100 µm. Dans un aspect particulier de l’invention, les micropores sont espacés d’une distance comprise de 20 µm à 40 µm, de préférence de 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 38, 39 ou 40 µm de bord à bord. Pour augmenter le nombre de contacts des photorécepteurs avec les cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien, le nombre de micropores du côté basal de la membrane microstructurée est augmenté d’un facteur 2, 3 ou 4 ou plus. Cette stratégie technique améliore le nombre d'interactions cellulaires sans qu'il soit nécessaire d'augmenter la densité des micropores comme c’est le cas dans le document WO2017164992. En raison des contraintes physiques de fabrication de la membrane microstructurée, la densité des micropores de la membrane microstructurée de la présente invention est telle que la distance entre deux micropores adjacents sur la face apicale de la membrane est de 20 µm au minimum, de préférence de 25 µm au minimum, encore plus de préférence de 30 µm au minimum et encore plus de préférence de 35 µm au minimum. Dans un aspect particulier de l’invention l’échafaudage est constitué d’une membrane microstructurée comprenant des micropores de forme conique traversants ladite membrane au niveau d’une première surface (1) et au niveau d’une seconde surface (2) caractérisée en ce que, -la surface apicale de la membrane (1) présente des micropores d’un diamètre (d1) compris de 18 µm à 22 µm, de préférence de 20 µm, -la surface basale de la membrane (2) présente des micropores d’un diamètre (d2) compris de 4 µm à 8 µm, de préférence de 5 µm, -les micropores sont espacés d’une distance comprise de 20 µm à 40 µm, de préférence de 35 µm, de bord à bord, -l’épaisseur de la membrane microstructurée est comprise de 80 µm à 120 µm, de préférence de 100 µm. L'échafaudage selon la présente invention comprend ou est constitué d’une membrane microstructurée constituée d'un polymère biocompatible, flexible et/ou extensible, et dans certains modes de réalisation particulièrement appropriés, le polymère est biodégradable. Les polymères appropriés comprennent, sans s'y limiter, les caoutchoucs synthétiques tels que les caoutchoucs de silicone (par exemple, le polydiméthylsiloxane (PDMS)), le caoutchouc polyuréthane, le caoutchouc styrène butadiène et le caoutchouc acrylonitrile butadiène, les caoutchoucs naturels élastomères (par exemple, polyuréthane thermoplastique, copolyester thermoplastique, polyamide thermoplastique), époxy (par exemple, SU-8), polyimides, polyuréthanes, polyamides, polyesters (par exemple, poly(acide lactique-co-glycolique) (PLGA), acide polylactique (PLA), l'acide polyglycolique (PGA), la polycaprolactone (PCL), le poly(sébaçate de glycérol) (PGS)), les polysaccharides (par exemple, le chitosan), le parylène, et leurs combinaisons. Avantageusement, ces polymères sont « de type plastique » ce qui facilite la manipulation de l’échafaudage. Dans un aspect particulier, le polymère est le PDMS ou le PLGA. Un autre aspect de l'invention concerne une composition comprenant l’échafaudage microstructuré et des cellules, en particulier des photorécepteurs. Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, les cellules ensemencées sont en particulier des photorécepteurs, des précurseurs de photorécepteurs ou des progéniteurs rétiniens. Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, l’échafaudage est caractérisé en ce que la membrane microstructurée est ensemencée avec des cellules en particulier des photorécepteurs, des précurseurs de photorécepteurs ou des progéniteurs rétiniens. La présente composition utile pour une thérapie cellulaire pour traiter un tissu endommagé comprend : -la membrane microstructurée telle que décrite précédemment, et - au moins un photorécepteur, ou précurseur de photorécepteur ou progéniteur rétinien par micropore. Les micropores de la membrane microstructurée sont configurés pour permettre l’adhérence d’au moins un photorécepteur (ou précurseur de photorécepteur ou progéniteur rétinien) à la paroi intérieure d’un micropore. Les micropores de la membrane microstructurée sont configurés pour permettre aux précurseurs de photorécepteur ou aux progéniteurs rétiniens de se différencier en photorécepteur et/ou de maturer. L'échafaudage microstructuré peut permettre de favoriser la maturation, la survie, la différenciation, l'attachement cellulaire et/ou l'intégration cellulaire dans la rétine de l'hôte par l'ajout de différents produits biologiques ou de petites molécules. Ces produits biologiques peuvent être des neurotrophines (par exemple CNTF, BDNF, NT-3, NT-4, NGF, GDNF, IGF1) ou des cytokines (par exemple IL-13, IL-11, IL-10, IL-6, IL-4, IL-1ra, TGF-beta) ou de petites molécules ou protéines d'enrobage (par exemple le collagène, la laminine, la vitronectine, la fibronectine). Ces produits biologiques peuvent être également des vésicules extracellulaires comprenant des exosomes, des microvésicules, des corps apoptotiques qui peuvent être dérivés de divers types cellulaires tels que des cellules souches pluripotentes, des cellules souches mésenchymateuses, des cellules différenciées ou progénitrices dérivées d'embryons ou de fœtus, des cellules différenciées d'adultes (cellules primaires) ou des lignées cellulaires. Ces produits biologiques sont progressivement libérés lors de la culture cellulaire et/ou après transplantation dans la rétine de l'hôte. Le contrôle de la libération progressive de produits biologiques peut être induit par la dégradation du polymère (si biodégradable) ou par concentration/densité de polymère ou dimension de la matrice polymère ou concentration initiale de produits biologiques. En effet, dans le cas particulier d’un polymère non dégradable, le réseau crée par ce polymère enferme ces produits biologiques et permet un relargage progressif de ceux-ci. Plus le réseau est dense, plus le relargage est lent. Des photorécepteurs ou des précurseurs de photorécepteurs ou des progéniteurs rétiniens (qui peuvent poursuivre la différenciation en photorécepteurs à l'intérieur de l'échafaudage microstructuré) peuvent être ensemencés dans l'échafaudage microstructuré après dissociation et comptage cellulaire. Ces cellules peuvent être ensemencées à une concentration allant de 10 000 cellules par cm 2 à 1 000 000 par cm 2 . Ces cellules peuvent être différenciées à partir de cellules souches pluripotentes humaines (cellules souches pluripotentes induites humaines ou cellules souches embryonnaires humaines). La population cellulaire ensemencée dans l'échafaudage microstructuré peut être pure ou peut contenir une population mixte de cellules rétiniennes immatures et/ou matures (par exemple des cellules bipolaires, cellules ganglionnaires, cellules amacrines). Dans un autre mode de réalisation de l’invention, le nombre de cellules, en particulier de photorécepteurs par micropore est compris de 1 à 20, ou plus, de préférence de 5 à 15, encore plus de préférence de 7 à 12, ou environ 10 c’est-à-dire 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 cellules par micropores de la membrane microstructurée. Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, les micropores de la membrane microstructurée sont remplis d'un polymère mou (par exemple, l'acide hyaluronique) ou d’un milieu de culture contenant des nutriments et des facteurs de croissance. Un autre aspect de l’invention, concerne un greffon implantable qui comprend ou est constitué d’une couche supérieure de photorécepteurs ou de précurseurs de photorécepteurs ou de progéniteurs rétiniens ensemencés à l'intérieur, d'un échafaudage microstructuré, d'une couche inférieure de cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien cultivées sur un support de nature biologique ou polymérique. Un autre aspect de l’invention concerne une utilisation d’un greffon implantable en tant que composition pharmaceutique, ledit greffon comprend ou est constitué d’une couche supérieure de photorécepteurs ou de précurseurs de photorécepteurs ou de progéniteurs rétiniens ensemencés à l'intérieur, d'un échafaudage microstructuré, d'une couche inférieure de cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien cultivées sur un support de nature biologique ou polymérique. Un autre aspect de l’invention, concerne une composition utile pour une thérapie cellulaire pour traiter un tissu endommagé comprenant : -la membrane microstructurée telle que décrite, -au moins un photorécepteur (ou précurseur de photorécepteur ou progéniteur rétinien), dans laquelle les micropores sont configurés pour permettre l’adhérence d’au moins un photorécepteur (ou précurseur de photorécepteur ou progéniteur rétinien) à la paroi intérieure d’un micropore, et -une monocouche de cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien, dans laquelle le au moins un photorécepteur est capable d’interagir physiquement ou par communication à distance via une sécrétion de facteur biologique avec un ou plusieurs type(s) de cellules situées au contact de la première surface (1) de la membrane et au niveau de la seconde surface (2) de la membrane reposant sur la monocouche de cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien. Les cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien peuvent être cultivées d'abord afin de former un épithélium fonctionnel au-dessus d'un échafaudage mince qui peut être constitué de polymères flexibles et qui peuvent être extensibles, et biodégradables (PDMS, PLLA/PLGA, parylène, polyester, polyimide, Polyéther uréthanes, membranes PET, PHA : PHB-HV, ePTFE, PCL, polybutylène, PEGDMA, PTMC) ou peut être un substrat biologique (un gel de collagène, un gel de gélatine, un gel de fibrine, une membrane amniotique humaine, une membrane de Bruch, une fibroïne de soie, une cellulose bactérienne ou une membrane en un matériau synthétique biocompatible, biodégradable ou non). Lorsque l'épithélium pigmentaire rétinien est reconstruit in vitro, l'échafaudage microstructuré est placé à la surface de celui-ci. Selon un mode de réalisation, les cellules disposées sur la membrane sont dérivées de cellules souches pluripotentes, de cellules souches adultes multipotentes ou bien sont issues de cultures primaires ou de lignées cellulaires, ou bien correspondent à un type cellulaire de la zone d’implantation, ou bien sont des cellules épithéliales simples ou de différents sous-types, tels que des photorécepteurs, des cellules ganglionnaires, des cellules bipolaires, des cellules amacrines, des cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien, des cellules endothéliales. Les cellules souches pluripotentes humaines utilisées pour la mise en œuvre de l’invention ne nécessitent pas la destruction d’embryon humain. Selon un exemple de réalisation, les cellules de la culture sont des cellules d’épithélium pigmentaire rétinien obtenues à partir de cellules souches pluripotentes humaines disposées sur une membrane amniotique dénudée, puis cultivées durant quatre semaines. L’invention peut s’appliquer à d’autres implants que des implants de cellules d’épithélium pigmentaire rétinien. En effet, l’invention peut s’appliquer à la transplantation de cellules de la rétine de sous-types variés et utilisés seuls ou en association (par exemple pour la rétine : des photorécepteurs, des cellules ganglionnaires, des cellules bipolaires, des cellules amacrines, des cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien, des cellules endothéliales). Ces cellules peuvent être associées en monocouches ou en couches pluristratifiées de façon à reconstruire une rétine artificielle. Il peut s’agir également notamment de cellules de la cornée ou de tout autre type de cellules épithéliales. Plus généralement, l’invention peut s’appliquer à tout type d’épithélium ou de culture de cellules en monocouche sur une membrane biologique ou synthétique. Selon un mode particulier de l’invention, la membrane microstructurée ou l’implant selon l’invention présente une hauteur comprise de 80 à 120 µm,une longueur et une largeur comprise de 2 mm à 10 mm, de préférence une hauteur de 120 µm, une longueur et une largeur de 5 mm. Selon un mode particulier de l’invention, la membrane microstructurée présente un nombre de pores/mm 2 compris de 250 à 1000. Par exemple, une membrane microstructurée selon l’invention présente 400 pores/mm 2 soit 10 4 pores pour 25 mm 2 avec une périodicité de 50 µm ou 625 pores /mm 2 pour 25 mm 2 avec une périodicité de 40 µm. Selon un mode particulier de l’invention, la membrane microstructurée comprenant des tripodes présente sur la face basale 3600 pores/mm 2 soit 9*10 4 pour 25 mm 2 avec une périodicité de 50 µm ou 5625 pores/mm 2 soit 140625 pour 25 mm 2 avec une périodicité de 40 µm. Des exemples de réalisation de l’invention seront décrits dans ce qui suit, à titre non limitatif en relation avec les figures jointes parmi lesquelles : la représente un tissu rétinien modifié composé de 4 éléments comprenant (a) une couche supérieure de photorécepteurs ensemencés à l'intérieur (b) d'une membrane polymère microstructurée et (c) d'une couche inférieure de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes cultivées sur (d) un support biologique ou composé de polymères. la décrit les étapes principales (a-c) de la préparation d’une membrane microstructurée de l’invention par lithographie 2 photons. Les faces (1) et (2) de l’échafaudage correspondent respectivement aux faces apicales et basales. la (Image obtenue par microscopie électronique à balayage (MEB)) décrit des structures de forme conique d’un moule maitre obtenu par lithographie à 2 photons et utilisé pour réaliser les échafaudages coniques. la décrit une membrane microstructurée (face 2) (4A) obtenue après moulage/démoulage d’un polymère sur un moule maitre de forme conique tripode (4B) obtenu par lithographie à 2 photons. la représente un schéma d’un micropore conique, d’un micropore conique/tripode et d’un micropore conique hexagonal. la représente une image obtenue par microscopie à fluorescence confocale de plusieurs micropores d’une membrane microstructurée montrant la croissance verticale de photorécepteurs exprimant la recoverine et reposant sur des cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien. (PR= photorécepteurs ; RPE : épithélium pigmentaire rétinien). Méthodes de préparation de l'échafaudage primaire L’échafaudage selon la présente invention peut être préparé en formant un moule maître. Par exemple, pour préparer un échafaudage primaire, un moule maître comprenant le négatif des micropores (= micropiliers) est préparé en utilisant une lithographie à 2 photons, une gravure au plasma ou toute autre technique connue de l’homme du métier. Plus typiquement, la membrane microstructurée est moulée sur le moule maître puis démoulée et enfin les pores sont ouverts à l'aide d'une gravure plasma isotrope. La membrane microstructurée de l’invention est fabriquée à l'aide de polymères moulables (par exemple, PDMS), moulés à partir du moule maître en Silicium sur lequel les micropiliers sont structurés avec de la résine, dans lequel le PDMS ou tout autre polymère (pour l'échafaudage) est coulé par la suite. Bien qu'il soit décrit ici comme la préparation des échafaudages en utilisant la photolithographie, le moulage et la gravure au plasma, il doit être compris que tout moyen pour préparer des échafaudages polymères comme connu dans l'art peut être utilisé sans s'écarter de la présente invention. D'autres méthodes appropriées incluent, par exemple, l'impression directe à l'aide d'une imprimante 3D ou le moulage à l'aide d'une machine de moulage par micro-injection. Pour préparer l'élément de support, un film polymère ultramince est préparé en utilisant n'importe quel procédé connu dans l'art. Des exemples de polymères à utiliser comme élément de support comprennent ceux énumérés ci-dessus. Avantageusement, les échafaudages de la présente invention peuvent être utilisés pour la culture cellulaire, la transplantation, la modélisation du développement des cellules, et pour le criblage de médicaments. Lithographie 3D Dans le domaine de la lithographie par écriture laser, la stéréolithographie par absorption biphotonique ou à 2 photons (anglais : two-photon stereolithography, TPS) est utilisée. Un faisceau laser focalisé balaie point par point un photopolymère dans son volume pour former l'objet 3D désiré. Le recours à des impulsions ultracourtes (en général quelques centaines de femtoseconde) et un fort confinement de l'onde lumineuse permettent de déclencher le phénomène d'absorption biphotonique qui conduit le photoamorceur dans un état excité. A partir de cet état excité, des espèces réactives peuvent être créées pour amorcer une réaction de polymérisation classique. Une méthode courante pour créer des échafaudages microstructurés est la lithographie douce utilisant la résine photosensible à tonalité négative, par exemple SU8, pour répartir les caractéristiques sur des plaquettes de silicium pour créer des maîtres (SU8-Si) pour le moulage de répliques en polymère dur. La décrit les étapes principales de la formation de la membrane microstructurée de l’invention. L’étape a) concerne la préparation d’un substrat en silicium, le dépôt d’une résine par enduction centrifuge sur ledit substrat, et le traitement thermique du substrat enrésiné. L’étape b) concerne la lithographie laser bi-photon (ou à 2 photons). La résine polymérise dans les zones exposées aux rayonnements des 2 lasers focalisés. L’étape c) concerne la formation des motifs de formes coniques sur le substrat de silicium obtenus après développement de la résine. Les zones non exposées sont solubles dans un développeur. Un séchage du moule maître est réalisé à partir d’un séchage super critique à base de CO 2 . Le moule maître est obtenu avec des motifs de formes coniques (et/ou multipodes) dont la hauteur est d’environ 100 µm. Un traitement spécifique pour assurer les étapes de démoulage est ensuite appliqué sur le moule maître. Le polymère est ensuite déposé par enduction centrifuge sur le moule maître. Une étape de dégazage permet d’évacuer les microbulles d’air. Un film souple enduit d’une couche sacrificielle soluble dans l’eau est ensuite déposée sur le polymère. Une force est appliquée sur le film pour réduire l’épaisseur résiduelle du polymère. Un recuit est réalisé pour durcir le polymère. Le démoulage est obtenu en décollant le film souple avec la membrane en PDMS qui a été moulée par les motifs du moule maître. La libération de la membrane par rapport au film souple est obtenue par dissolution de la couche sacrificielle. Une gravure plasma est réalisée pour éliminer l’épaisseur résiduelle du polymère et obtenir des ouvertures traversantes dans la membrane. La décrit un exemple de moule maître en silicium avec une résine microstructurée en micropiliers coniques, obtenu par lithographie 2 photons. Les micropiliers d’une hauteur de 100µm sont espacés bord à bord de 35µm. L’image a été réalisée au microscope électronique à balayage. La correspond à un exemple (A) de face basale (2) d’un échafaudage conique/tripode réalisé en PDMS à partir d’un moule maître (B) en silicium recouvert d’une résine microstructurée en micropiliers d’une hauteur de 100µm et espacés bord à bord de 35µm. Le moule maître a été obtenu par la technique de lithographie à 2 photons. Le procédé selon l'invention est utilisé pour la réalisation d'un objet moulé microstructuré particulièrement adapté à la culture de cellules biologiques. Le procédé implique, tout d'abord, une étape dans laquelle une membrane poreuse déformable plastiquement est préparée, ayant une pluralité de micropores. Les micropores sont de préférence configurés comme des micropores et sont répartis régulièrement sur le film. Les micropores sont façonnés pour être continus d'un côté à l'autre du film, de sorte qu'ils soient perméables. La décrit les différents exemples de motifs de micropores utilisés pour réaliser les échafaudages microstructurés. Dans ces exemples, les motifs peuvent être conique simple, conique/tripode ou conique avec des bases hexagonales sur chaque face. EXEMPLES Exemple 1 Préparation d’un échafaudage Le processus de fabrication d’un l'échafaudage selon la présente invention a été initié par la création d’un moule maître à partir d’un wafer silicium 2 pouces d’orientation [100] et d’une épaisseur de 280 microns. Le wafer a été préalablement nettoyé avec des solvants avant de déposer une résine photosensible du type SU8 par enduction centrifuge à 3000 rotations par minutes (rpm). Un traitement thermique à 180 °C a été réalisé après cette enduction pour permettre l’évaporation du solvant contenu dans la résine. La lithographie 3D à 2 photons a été réalisée sur la base d’un fichier STL préalablement téléchargé dans l’équipement. Ce fichier comporte tous les motifs tripodes sur une surface de 5 mm x 5 mm avec une périodicité de 50 µm. Après l’écriture des 25 mm 2 sur le substrat enrésiné, la résine a été développée dans une base puis rincée dans l’isopropanol. Un séchage « support critique » à base de C0 2 pendant 45 minutes a permis de fixer définitivement les motifs conique/tripodes en SU8 d’une hauteur de 120 microns sur le substrat de silicium, l’ensemble formant le moule maître. Un traitement anti adhésif à base trimethylchlorosilane pendant 5 minutes a été déposé en phase vapeur sur ce moule. Le polymère, du PDMS à l’état liquide a été mélangé avec son catalyseur au platine dans un rapport de 13:1 puis dégazé et déposé sur le moule maître par enduction centrifuge à 900 rpm pendant 60 secondes. Un film souple de 20 µm en polycarbonate enduit d’une couche sacrificielle de 100 nm de PVA soluble dans l’eau a été déposé sur le PDMS. Une pression de 190 Pa a été exercée pour réduire l’épaisseur résiduelle du polymère. Un recuit de 30 min à 80°C a permis de durcir le polymère. Le décollement du film avec la membrane se fait manuellement, la membrane microstructurée avec des tripodes de 100 microns de haut a ainsi été séparée du moule maître. La séparation entre la membrane et le film souple a été obtenue par dissolution de la couche sacrificielle. La gravure de l’épaisseur résiduelle de la membrane microstructurée pour obtenir des trous traversant sur chaque face a été réalisée dans un bâti de type RIE avec un mélange gazeux de 0 2 et de CF 4 et une puissance de 25 W. Le temps de gravure est fonction de l’épaisseur résiduelle, typiquement il est compris entre 6 et 7 minutes. Exemple 2 Mode opératoire pour obtenir le tissu composé de photorécepteurs et une couche de RPE selon la Dans cet exemple, le tissu composé de photorécepteurs et de cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien a été réalisé selon le mode opératoire suivant : Dans un premier temps, des cellules souches embryonnaires humaines ont été différenciées pendant 3 semaines en cellules progénitrices rétiniennes (caractérisées par l’expression des gènes VSX2 et PAX6 ). Puis d’autres cellules souches embryonnaires humaines ont été différenciées en cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien pendant 3 mois. Ces dernières ont ensuite été congelées en banque d’ampoules dans des cuves d’azote liquide. Les cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien ont ensuite été décongelées et remises en culture sur un support plastique poreux pour reformer un épithélium pendant 4 semaines. Le milieu de culture a été remplacé deux fois par semaine. Un échafaudage avec des micropores coniques (réalisé selon l’exemple 1) a été stérilisé par des bains d’éthanol à 70% puis des bains de solution saline. Celui-ci a été recouvert d’une solution de matrice commerciale L7 (Lonza) diluée au 1/100 e dans une solution saline contenant du calcium et du magnésium, puis incubé 1heure à 37°C et 5% de dioxyde de carbone. La solution de matrice a été retirée à l’issue de l’incubation. L’échafaudage a ensuite été placé au-dessus de l’épithélium pigmentaire rétinien. Les progéniteurs rétiniens dérivés des cellules souches embryonnaires à 3 semaines de culture ont ensuite été dissociés avec une solution de Tryple puis comptés et ensemencés dans l’échafaudage à la densité de 500 000 cellules par cm 2 . Le milieu de culture a été renouvelé 3 fois par semaine pendant 3 mois. A l’issue des 3 mois de culture, le tissu a été fixé dans une solution de paraformaldéhyde à 4% pendant 15 minutes. Le tissu a été ensuite rincé et perméabilisé dans une solution saline contenant 0,1% de tritonX100. Le tissu a été incubé 30 minutes dans cette même solution contenant 5% de sérum animal puis exposé durant la nuit à un anticorps primaire dirigé contre la protéine recoverine (exprimée par les photorécepteurs matures). Le lendemain, le tissu a été rincé dans une solution saline puis exposé 1 heure à un anticorps secondaire dirigé contre le premier anticorps et couplé à une molécule fluorescente. Le tissu a été ensuite rincé, coloré avec du DAPI (pour marquer l’ADN du noyau des cellules) et monté sur des lames de microscopie. L’imagerie du tissu a été réalisée à l’aide d’un microscope à fluorescence confocal. La montre sur l’image de gauche, la reconstruction d’une section réalisée dans l’épaisseur du tissu où sont visualisés sur la partie inférieure les noyaux des cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien avec juste au-dessus des prolongements des photorécepteurs identifiés par le marquage à la recoverine. L’image de droite est une reconstruction en 3 dimensions du tissu où le signal à la recoverine est visualisé dans chacun des micropores. L’échelle indiquée est en µm. Le signal à la recoverine est un marqueur des photorécepteurs et montre la polarisation verticale des cellules dans les micropores au-dessus des cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien. Echafaudage qui comprend ou est constitué d’une membrane microstructurée comprenant des micropores de forme conique traversants ladite membrane au niveau d’une première surface apicale (1) et au niveau d’une seconde surface basale (2) caractérisée en ce que, -la surface apicale (1) de la membrane présente des micropores d’un diamètre supérieur au moins trois fois, de préférence au moins quatre fois au diamètre des micropores de la surface basale (2) de la membrane. Echafaudage selon la revendication 1, caractérisé en ce que, -la surface apicale de la membrane (1) présente des micropores d’un diamètre (d1) compris de 15 µm à 25 µm, de préférence compris de 18 µm à 22 µm, -la surface basale de la membrane (2) présente des micropores d’un diamètre (d2) compris de 4 µm à 8 µm, de préférence compris de 5 µm à 6 µm. Echafaudage selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les micropores de forme conique sont de type bipode, tripode ou quadripode. Echafaudage selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l’épaisseur de la membrane microstructurée est comprise de 80 µm à 120 µm. Echafaudage selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les micropores sont espacés d’une distance comprise de 20 µm à 40 µm de bord à bord. Echafaudage selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la membrane microstructurée est constituée d'un polymère biocompatible, et optionnellement biodégradable. Echafaudage selon la revendication 6, caractérisé en ce que le polymère est le PDMS ou le PLGA. Echafaudage selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la membrane microstructurée est ensemencée avec des cellules en particulier des photorécepteurs, des précurseurs de photorécepteurs ou des progéniteurs rétiniens et pourvu que les cellule souches pluripotentes humaines utilisées pour la mise en œuvre desdites cellules de l’échafaudage ne nécessitent pas la destruction d’embryon humain et n’ont pas la capacité à induire le processus de développement d’un être humain. Utilisation de l’échafaudage selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, pour réaliser un greffon implantable. Utilisation de l’échafaudage selon la revendication 9, caractérisé en ce que le greffon implantable comprend ou est constitué d’une couche supérieure de photorécepteurs ou de précurseurs de photorécepteurs ou de progéniteurs rétiniens ensemencés à l'intérieur d'un échafaudage microstructuré, d'une couche inférieure de cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien cultivées sur un support de nature biologique ou polymérique.