Brevet FR3114235A1 — publié le 20220325

------ INHIBITION DU CANAL TRPA1 ASTROCYTAIRE COMME NOUVELLE CIBLE THERAPEUTIQUE NEUROPROTECTRICE DANS LES PHASES PRODROMALES DE LA MALADIE D’ALZHEIMER L’invention concerne un inhibiteur du canal calcique TRPA1 pour l’utilisation en tant que neuroprotecteur dans le traitement et/ou la prévention des stades précoces de la maladie d’Alzheimer et en tant qu’anti-inflammatoire dans le traitement et/ou la prévention des processus neuroinflammatoires de la maladie d’Alzheimer. L’invention concerne en particulier l’inhibiteur HC030331 du canal calcique TRPA1 pour son utilisation en tant que neuroprotecteur dans le traitement et/ou la prévention des stades précoces de la maladie d’Alzheimer et en tant qu’anti-inflammatoire dans le traitement et/ou la prévention des processus neuroinflammatoires de la maladie d’Alzheimer. L’invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant au moins ledit inhibiteur de l’invention et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. INHIBITION DU CANAL TRPA1 ASTROCYTAIRE COMME NOUVELLE CIBLE THERAPEUTIQUE NEUROPROTECTRICE DANS LES PHASES PRODROMALES DE LA MALADIE D’ALZHEIMER ARRIERE-PLAN DE L’INVENTION La présente invention concerne le domaine du traitement et de la prévention des maladies neurodégénératives, notamment de la maladie d’Alzheimer, et porte en particulier sur la neuroprotection contre la maladie d’Alzheimer. La maladie d’Alzheimer est la principale cause de démence chez l’Homme et elle s’accompagne d’une perte sévère des principales fonctions cognitives et mnésiques. Il n’existe actuellement aucun traitement curatif de la maladie et l’échec des récentes stratégies thérapeutiques a souligné le besoin urgent de cibles thérapeutiques efficaces. Cette pathologie débute bien avant l’apparition des troubles mnésiques et cette longue phase asymptomatique est celle que les thérapeutiques futures devront cibler afin de prévenir les mécanismes de neurodégénérescence. Des études récentes ont mis en évidence des symptômes prodromaux annonciateurs caractérisés par une activité neuronale anormalement élevée dans des circuits spécifiques au sein de l’hippocampe chez l’Homme et les modèles animaux de la maladie d’Alzheimer. Cette hyperactivité neuronale a été associée à des déficits mnésiques qui n’altèrent pas de manière significative l’activité quotidienne (Haberman et al., Neurotherapeutics 2017). C’est à cette phase précoce que nous nous intéressons dans cette demande de brevet. Au niveau du système nerveux central, les astrocytes ne peuvent plus être considérés uniquement comme des cellules de soutien et il est désormais admis qu’ils influencent leur environnement et modulent fonctionnellement les cellules neuronales voisines. Notamment, ils peuvent être des contributeurs importants à la progression des maladies neurodégénératives. Leur rôle dans la maladie d’Alzheimer a principalement été observé aux stades avancés de la pathologie où le phénotype inflammatoire astrocytaire et l’astrogliose ont été associés à la formation des plaques séniles (Osborn et al., Prog. Neurobiol. 2016 ; Kuchibhotla et al., Science 2009). De manière surprenante, la mise en jeu et le rôle des astrocytes dans les premières phases de la maladie d’Alzheimer restent largement inexplorés. Pourtant, en dehors de l’astrogliose et de l’inflammation, des modifications de certaines fonctions astrocytaires, telles que la diminution de la clairance des substances toxiques, le déséquilibre de l’activité neuronale locale, la dyshoméostasie glutamatergique, pourraient amplifier voire induire une toxicité synaptique délétère pour les neurones. Les inventeurs ont mis en évidence que ces cellules étaient impliquées dans la mise en place de l’hyperactivité neuronale précoce des réseaux hippocampiques dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer. Ils ont identifié un canal exprimé par ces cellules astrocytaires, le canal TRPA1, qui joue un rôle crucial dans la mise en place de cette hyperactivité. Le canal TRPA1 a initialement été mis en évidence dans une sous-population de neurones nociceptifs des ganglions sensitifs de la racine dorsale de la moelle épinière, du noyau trigéminal et du nodosum (Lee et al., J. Chem. Neuroanat. 2012). Il est notamment impliqué dans la transmission nociceptive des douleurs inflammatoires aiguës. Dans le noyau trigéminal, il a été montré une expression de TRPA1 dans certains neurones nociceptifs mais également dans les prolongements fins des astrocytes. Cette expression astrocytaire augmente en cas d’inflammation (Lee SM et al., J. Chem. Neuroanat. 2012). Au niveau du système nerveux central, l’expression du canal TRPA1 est peu décrite. Cependant, il a été rapporté une expression spécifiquement astrocytaire au sein de l’hippocampe de rat et de souris. Chez le rat, ce canal TRPA1 astrocytaire a été impliqué dans la régulation du niveau de GABA extracellulaire et donc de la transmission inhibitrice des interneurones GABAergiques de l’hippocampe (Shigetomi et al., Nat. Neurosci. 2012). Chez la souris, la même équipe de recherche a mis en évidence une implication de TRPA1 astrocytaire dans le phénomène de potentialisation à long terme par l’intermédiaire d’un relâchement de D-sérine astrocytaire (Shigetomi et al., J. Neurosci. 2013). Dans le contexte pathologique de la maladie d’Alzheimer, un rôle anti-inflammatoire du canal TRPA1 a été décrit dans les stades tardifs de la maladie (8 mois chez le modèle souris). Ce rôle anti-inflammatoire a été lié à une libération de cytokines pro-inflammatoires astrocytaires (Lee KI et al., J. Neuroinflammation 2016). HC030031 est un inhibiteur spécifique de TRPA1 (CI 50 ~6,2µM) dont le site de fixation a été identifié dans la partie intracellulaire « linker » du canal, entre les domaines transmembranaires TM4 et TM5 (McNamara et al., Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A. 2007 ; Gupta et al., Sci.Rep. 2016). L’administration orale d’HC030031 (100 mg/kg) a montré un effet antalgique notable dans des modèles de douleurs neuropathiques et inflammatoires chez le rat (Eid et al., Mol. Pain. 2008). L’administration sous-cutanée (100µg/10µl) ou intra-gastrique (300mg/kg) d’HC030031 a également aboli les comportements douloureux de type neuropathie trigéminale chez la souris (Trevisan et al., Brain 2016). Ces études valident l’utilisation de cette substance pharmacologique dans des études chez le rongeur. Les inventeurs de la présente invention ont porté leur attention sur les stades précoces de la maladie d’Alzheimer, en particulier ce que l’on dénomme le « stade prodromal » qui est de plus en plus étudié chez l’homme. Ce stade annonciateur précède de plusieurs années l’apparition des premiers symptômes. Lors du stade prodromal de la maladie d’Alzheimer, le sujet présente de légères difficultés de mémoire, des modifications de son comportement ou de son humeur. Ces difficultés sont associées à une hyperactivité du réseau de l’hippocampe (siège de la mémoire) détectée par imagerie médicale et qui empêcherait le codage correct des nouveaux souvenirs (Haberman et al., Neurotherapeutics 2017). Néanmoins, à ce stade, les performances dans les tests neuropsychologiques peuvent être préservées et ne pas permettre de détecter un signe avant-coureur de la maladie. Sur le plan neurobiologique, les biomarqueurs tels que le peptide amyloïde βsont déjà présents. C’est donc sur les événements précédant l’apparition des manifestations cliniques, en particulier des troubles mnésiques, que vont porter l’objet de la présente invention. BREVE DESCRIPTION DE L’INVENTION Les inventeurs ont mis en évidence que le canal TRPA1 est responsable d’une hyperactivité calcique astrocytaire précoce dans la région CA1 de l’hippocampe dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer (animaux APP/PS1-21 âgés de 1 mois). Cette hyperactivité astrocytaire est inhibée par l’application d’un inhibiteur du canal TRPA1, HC030031, à 40 µM sur des tranches aiguës d’hippocampe ( in vitro ). Les inventeurs ont également montré que l’inhibition de ce canal TRPA1 restaure l’hyperactivité neuronale hippocampique caractéristique des phases précoces de la maladie d’Alzheimer et annonciatrice des symptômes mnésiques. Ainsi, ce canal TRPA1 présente une potentielle implication dans la mise en place de la synaptotoxicité et des dysfonctions neuronales bien avant l’apparition des premières plaques séniles (>3 mois chez la souris), des processus inflammatoires (>4 mois chez la souris) ou des troubles mnésiques et cognitifs (>8 mois chez la souris). Les résultats observés par les inventeurs permettent d’envisager l’importance de TRPA1 comme cible thérapeutique dans les stades précoces de la maladie d’Alzheimer. En effet, in vivo , l’inhibiteur spécifique de TRPA1, HC030031, administré à l’animal permet de restaurer l’activité neuronale de l’hippocampe à son niveau basal au stade prodromal chez les souris modèles de la maladie d’Alzheimer. L’inhibition pharmacologique par un inhibiteur du canal TRPA1 tel que HC030031 est envisagée en prévention de la mise en place de la toxicité neuronale du peptide amyloïde β et est envisagée jouer ainsi un rôle neuroprotecteur dans les phases précoces de la maladie d’Alzheimer. Ainsi, un traitement chronique avec l’inhibiteur du canal TRPA1 qui passe la barrière hématoencéphalique préviendrait la mise en place des effets délétères neuronaux et donc la survenue des troubles mnésiques et du déclin cognitif qui accompagnent les stades plus avancés de la maladie d’Alzheimer. Cet effet neuroprotecteur de l’inhibiteur du canal TRPA1 tel que HC030031 et l’utilisation de celui-ci dans la prévention et/ou le traitement des stades précoces de la maladie d’Alzheimer est particulièrement novateur compte-tenu du fait que les stades prodromaux restent peu étudiés. Les inventeurs ont également mis en évidence que l’inhibition du canal TRPA1 restaure certains phénomènes d’inflammation du système nerveux central responsables de l’embrasement pathologique dans un stade un peu plus tardif. Par ailleurs, le canal TRPA1 constitue une cible d’intérêt particulier puisqu’il semble avoir peu d’impact physiologiquement sur la fonction astrocytaire tout en étant mis en jeu très précocement dans le cas d’agression, notamment celle due à la toxicité caractérisée par la présence du peptide amyloïde βSon inhibition spécifique par l’inhibiteur HC030031 ou tout autre inhibiteur approprié permettrait de bloquer les conséquences neuronales (dysfonction puis mort neuronale) de l’agression avec potentiellement peu d’effets indésirables ce qui constitue un avantage considérable du point de vue clinique. En effet, les données obtenues par les inventeurs ont montré que le blocage chronique du canal TRPA1 chez les souris WT (wild-type, de type sauvage) saines n’avait aucun effet sur l’activité des astrocytes, la fonction neuronale, la structure des synapses et la performance mnésique. Ceci renforce la pertinence du canal TRPA1 en tant que cible thérapeutique. L’observation que l’hyperactivité hippocampique préclinique est un dysfonctionnement neuronal précoce impliqué dans la progression de la maladie représente un virage conceptuel majeur dans la compréhension de la maladie d’Alzheimer, en particulier car elle semble pouvoir être restaurée si on agit à cette phase précoce. DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION La présente invention concerne un inhibiteur du canal calcique TRPA1 pour l’utilisation en tant que neuroprotecteur dans le traitement et/ou la prévention des stades précoces de la maladie d’Alzheimer et en tant qu’anti-inflammatoire dans le traitement et/ou la prévention des processus neuroinflammatoires de la maladie d’Alzheimer. On entend ici par « stades précoces » de la maladie d’Alzheimer, la phase prodromale, à savoir le stade annonciateur qui précède, chez l’homme, de plusieurs années l’apparition des premiers symptômes. Lors du stade prodromal de la maladie d’Alzheimer, le sujet présente de légères difficultés de mémoire, des modifications de son comportement ou de son humeur. Ces difficultés sont associées à une hyperactivité du réseau de l’hippocampe (siège de la mémoire) détectée par imagerie médicale. Néanmoins, à ce stade, les performances dans les tests neuropsychologiques peuvent être préservées et ne pas permettre de détecter un signe avant-coureur de la maladie. Sur le plan neurobiologique, les biomarqueurs tels que le peptide amyloïde βsont déjà présents. Les « processus neuroinflammatoires » correspondent à l’astrogliose et à la microgliose qui se rencontrent dans les stades plus évolués de la maladie d’Alzheimer, se manifestant par une modification des fonctions gliales qui aboutit notamment à la sécrétion de molécules pro-inflammatoires. Ces processus neuroinflammatoires délétères sont associés à la formation des plaques amyloïdes et participent à la pathogenèse de la maladie d’Alzheimer. Les « astrocytes » sont des cellules gliales du système nerveux central et ont un rôle important dans le support et la protection des neurones. Les astrocytes sont capables d’assurer une forme de communication, reposant sur des vagues intracellulaires de calcium ou « événements calciques » qui se transmettent aux astrocytes voisins. Dans les conditions physiologiques (cerveau sain), les astrocytes possèdent une activité calcique spontanée basale qui contribue au maintien de l’intégrité structurale et fonctionnelle des synapses. Dans les stades précoces de la maladie d’Alzheimer, la présence des formes oligomériques solubles du peptide amyloïde bêta (Aβ) perturbe le fonctionnement de l’astrocyte. Par l’intermédiaire d’un effet activateur du canal calcique TRPA1, l’astrocyte devient hyperactif, ce qui a pour conséquence d’induire une hyperactivité des neurones voisins. Ces phénomènes combinés mènent à terme au phénomène de toxicité synaptique qui se traduit par une hyperactivité neuronale, un effondrement des épines dendritiques, un désenrobage astrocytaire des synapses et une dysfonction de la communication neuronale (stade pré symptomatique tardif). Ceci conduit à terme à une mort neuronale, prélude des désordres mnésiques et de la démence (stade symptomatique de la maladie d’Alzheimer). L’inhibiteur de la présente invention peut être choisi dans le groupe consistant en HC030031, Chembridge-5861528, A-967079, AP–18, GRC-17536, CB-625, ODM-108, GSK205, GDC-0334 et leurs dérivés. D’autres inhibiteurs connus principalement pour leurs propriétés antalgiques qui ont été présentés dans les demandes de brevets PCT WO2015103060 au nom de Algomedix, WO2015155306, WO2017060488, WO2017064058 au nom de Almirall, WO2016028325, WO2017177200 au nom de Duke University/The Regents of the University of California, WO2015115507, WO2017018495 et WO2017135462 au nom de EA Pharma, WO2019152465 au nom de Eli Lilly and Company, WO2018109155 au nom de Galderma, WO2014049047, WO2015052264, WO2016128529, WO2018015410, WO2018015411, WO2018029288, WO2018096159, WO2018162607 et WO2019182925 au nom de Genetech, Inc., WO2015056094 et WO2016042501 au nom de Glenmark Pharmaceuticals, WO2015164643 et WO2016044792 au nom de Hydra Biosciences, WO2015002095 au nom de Kao Corporation, WO2018180460 au nom de Mandom Corporation, WO2015144976 et WO2015144977 au nom de Orion Corporation, WO2016067143 au nom de Pfizer, Inc. peuvent également être utilisés. Sont également envisagés dans la présente invention les sels et dérivés des composés mentionnés ci-dessus, et leurs formes pharmaceutiquement acceptables. Dans un mode de réalisation préféré, l’inhibiteur de la présente invention est HC030331 de formule suivante: . HC030331 est un inhibiteur spécifique du canal TRPA1 découvert par Hydra Bioscience en 2007. Dans un mode de réalisation, l’inhibiteur du canal calcique TRPA1 peut être destiné à être administré à un sujet en ayant besoin dès la phase prodromale de la maladie d’Alzheimer caractérisée par une hyperactivité neuronale au niveau de l’hippocampe détectable par imagerie cérébrale et des troubles mnésiques légers. Des études sont en cours sur l’identification de biomarqueurs précoces chez l’homme qui pourront alors être utilisés pour mieux identifier cette phase prodromale. Ainsi, chez les personnes à risque (maladie d’Alzheimer familiales) ou dans un contexte où les méthodes de diagnostic évoluent (mise au point de biomarqueurs précoces) ou si un diagnostic par imagerie cérébrale est réalisé (de type Imagerie par Résonance Magnétique fonctionnelle (IRMf, Habermann et al., Neurotherapeutics 2017) et met en évidence une hyperactivité neuronale au niveau de l’hippocampe il deviendrait possible d’administrer précocement l’inhibiteur et d’enrayer les processus de neurodégénérescence irréversibles. En ce qui concerne les biomarqueurs précoces, de nombreuses études sont en cours afin d’identifier des biomarqueurs détectables au niveau sanguin ce qui pourrait faciliter et étendre le diagnostic (pour revue, voir Scheltens et al., The Lancet, 2016). A ce moment-là, l’utilisation de l’inhibiteur sera possible en prévention dans une population large. On entend par « hippocampe » la structure du télencéphale qui joue un rôle central dans la mémoire et la navigation spatiale. L’hippocampe est l’une des premières structures atteintes dans la maladie d’Alzheimer, ce qui explique les problèmes de mémoire et de désorientation qui marquent l’émergence de cette maladie neurodégénérative. Une hyperactivité de cette structure empêche le codage correct de la mémorisation et détruit progressivement les connections existantes. Elle engendre alors un cercle vicieux délétère qui aboutit à une dégénérescence irréversible d’où l’intérêt de cibler cette phase précoce. Dans un mode de réalisation particulier, l’inhibiteur peut être destiné à être administré à un sujet en ayant besoin dans une quantité pharmaceutiquement efficace. Le terme « sujet » se réfère à un sujet animal ou humain des deux sexes. On entend par « quantité pharmaceutiquement efficace » la quantité qui est suffisante pour effectuer le traitement ou la prévention lorsqu'elle est administrée à un sujet qui nécessite un tel traitement ou une telle prévention. La quantité thérapeutiquement efficace dépend du sujet, du stade de la maladie à traiter et/ou prévenir et du mode d'administration, et peut être déterminée par des opérations de routine par l'homme du métier. Elle ainsi peut varier avec l’âge et le sexe du sujet. A titre d’exemple, chez l’animal, l’inhibiteur peut être administré à une concentration de l’ordre de 100 mg/kg de poids corporel par voie d’administration orale ou de 5 mg/kg de poids corporel par voie d’administration intra-péritonéale ou sous-cutanée. La détermination de la concentration et du mode d’administration de l’inhibiteur peut s’effecture par des opérations de routine par l’homme du métier. Dans un mode de réalisation particulier, l’inhibiteur est destiné à être administré par l’une quelconque des voies d’administration choisies dans le groupe consistant en la voie orale, la voie intraveineuse, la voie intra-artérielle, la voie intradermique, la voie intrapéritonéale, la voie intracardiaque, la voie intracérébroventriculaire, la voie transdermique, la voie topique, la voie sous-cutanée, la voie nasale ou la voie pulmonaire. Ainsi, le mode d'administration peut être par injection ou par perfusion graduelle. L'injection peut être intraveineuse, intra-péritonéale, intramusculaire, sous-cutanée ou transdermale. De préférence, l’inhibiteur est destiné à être administré par voie orale ou intraveineuse. Des exemples de formes adaptées pour l’administration par voie orale comprennent, mais sans y être limitées, des comprimés, des comprimés à orodispersion, des comprimés effervescents, des poudres, des granules, des pilules (comprenant des pilules édulcorées), des dragées, des gélules (comprenant des gélules de gélatine molle), des sirops, des liquides, des gels ou d’autres solutions, des suspensions, des bouillies, des formes liposomales et similaires. Des exemples de formes adaptées à l’injection comprennent, mais sans y être limitées, des solutions, telles que, par exemple, des solutions aqueuses stériles, des dispersion, des émulsions, des suspensions, des formes solides appropriées pour l’utilisation pour préparer des solutions ou suspensions par l’ajout d’un liquide avant l’utilisation, par exemple, une poudre, des formes liposomales ou similaires. Un inhibiteur comme HC030031, grâce à sa petite taille et sa lipophilie, peut franchir la barrière hémato-encéphalique et peut donc être délivré au cerveau sans difficulté. L’invention concerne également une composition pharmaceutique pour l’utilisation dans le traitement et/ou la prévention des stades précoces de la maladie d’Alzheimer et dans le traitement et/ou la prévention des processus neuroinflammatoires de la maladie d’Alzheimer, comprenant au moins l’inhibiteur de l’invention et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. Par « excipient pharmaceutiquement acceptable », on entend un matériel non toxique qui n'interfère pas avec l'efficacité de l'activité biologique des principes actifs de la composition et qui est compatible avec un système biologique tel qu'une cellule, une culture cellulaire, un tissu ou un organisme. Les caractéristiques de l'excipient dépendront du mode d'administration. Ceci comprend n'importe quel solvent, milieu de dispersion, revêtements, agents antibactériens et antifongiques, agents isotoniques et agents retardateurs d'absorption, et similaires. Un support pharmaceutiquement ou excipient acceptable se réfère à une charge solide, semi-solide ou liquide non-toxique, un diluent, une matière d'encapsulation ou une formulation accessoire de tout type. Dans un mode de réalisation particulier, la composition est destinée à être administrée à un sujet en ayant besoin dans une quantité pharmaceutiquement efficace. Dans un autre mode de réalisation particulier, la composition est destinée à être administrée à un sujet en ayant besoin par l’une quelconque des voies d’administration choisies dans le groupe consistant en la voie orale, la voie intraveineuse, la voie intra-artérielle, la voie intradermique, la voie intrapéritonéale, la voie intracardiaque, la voie intracérébroventriculaire, la voie transdermique, la voie topique, la voie sous-cutanée, la voie nasale ou la voie pulmonaire. De préférence, la composition peut être administrée par voie orale ou intraveineuse. Dans un mode de réalisation particulier, la composition est destinée à être administrée à un sujet en ayant besoin dès la phase prodromale de la maladie d’Alzheimer caractérisée par une hyperactivité neuronale au niveau de l’hippocampe détectable par imagerie cérébrale et des troubles mnésiques légers. Pour mieux illustrer l’objet de la présente invention, on va maintenant en décrire ci-dessous, à titre illustratif et non limitatif, les exemples ci-après en liaison avec les dessins annexés. Sur ces dessins : est une représentation graphique de la fréquence des sEPSC (courants post-synaptiques excitateurs spontanés) de neurones pyramidaux CA1 chez des souris contrôles WT (wild-type, gris clair) et transgéniques APP/PS1 (gris foncé) âgées de 1 mois (n=8 neurones à partir de 6 souris APP/PS1 et n=7 neurones à partir de 5 souris WT), 2 mois (n=8 neurones à partir de 5 souris APP/PS1 et n=7 neurones à partir de 4 souris WT)et 3 mois (n=14 neurones à partir de 7 souris APP/PS1 et n=10 neurones à partir de 5 souris WT), respectivement. est une représentation graphique de l’amplitude des sEPSC de neurones pyramidaux CA1 chez des souris WT (gris clair) et APP/PS1 (gris foncé) âgées de 1 mois (n=8 neurones à partir de 6 souris APP/PS1 et n=7 neurones à partir de 5 souris WT), 2 mois (n=8 neurones à partir de 5 souris APP/PS1 et n=7 neurones à partir de 4 souris WT) et 3 mois (n=14 neurones à partir de 7 souris APP/PS1 et n=10 neurones à partir de 5 souris WT), respectivement. est une représentation graphique de l’activité des microdomaines au niveau d’une arborisation astrocytaire chez des souris WT (gris clair) et APP/PS1 (gris foncé) âgées de 1 mois (n=8 astrocytes à partir de 7 souris APP/PS1 et n=8 astrocytes à partir de 6 souris WT) et de 3 mois (n=10 astrocytes à partir de 4 souris APP/PS1 et n=8 astrocytes à partir de 3 souris WT), respectivement. est une représentation graphique de la fréquence des événements calciques à l’intérieur de chaque microdomaine actif chez des souris WT (gris clair) et APP/PS1 (gris foncé) âgées de 1 mois (n=650 microdomaines à partir de 8 astrocytes chez des souris APP/PS1 et n=454 microdomaines à partir de 8 astrocytes chez des souris WT) et 3 mois (n=1504 microdomaines à partir de 10 astrocytes chez des souris APP/PS1 et n=840 microdomaines à partir de 8 astrocytes chez des souris WT). Chaque point correspond à la fréquence moyenne enregistrée dans chaque astrocyte individuel. correspond aux images prises en microscopie à fluorescence de parties de dendrites de neurone pyramidal CA1 exprimant l’eYFP chez des souris transgéniques Thy1-eYFP-H-APP/PS1-21 et les souris WT de la même portée, à 1 mois et à 3 mois. Barre d’échelle 2µm. est une représentation graphique de la densité des épines dendritiques par µm chez des souris WT (gris clair) et APP/PS1 (gris foncé) âgées de 1 mois (n=32 dendrites à partir de 3 souris APP/PS1 et n=28 dendrites à partir de 3 souris WT) et de 3 mois (n=23 dendrites à partir de 3 souris APP/PS1 et n=22 dendrites à partir de 3 souris WT). est une représentation graphique de la répartition de la morphologie des épines dendritiques chez des souris WT (gris clair) et APP/PS1 (gris foncé) âgées de 1 mois (n=32 dendrites à partir de 3 souris APP/PS1 et n=28 dendrites à partir de 3 souris WT) et de 3 mois (n=23 dendrites à partir de 3 souris APP/PS1 et n=22 dendrites à partir de 3 souris WT). correspond aux images prises en microscopie électronique du stratum radiatum chez des souris WT et APP/PS1 âgées de 3 mois montrant la présence de synapse enveloppée par des processus périsynaptiques astrocytaires chez les souris WT (flèches blanches) et l’absence de ces prolongements astrocytaires chez les animaux APP/PS1. Barre d’échelle approximative : 0,5 µm. est une représentation graphique de la proportion de synapses enveloppées par des astrocytes chez des souris WT (gris clair) et APP/PS1 (gris foncé) âgées de 3 mois (n=480 synapses à partir de 3 souris APP/PS1 et n=441 synapses à partir de 3 souris WT). Chaque point correspond à la proportion moyenne mesurée chez chaque souris individuelle. * p est une représentation graphique de la fréquence des sEPSC (courants post-synaptiques excitateurs spontanés) de neurones pyramidaux CA1 chez des souris âgées de 1 mois WT (n=4 neurones à partir de 2 souris traitées par HC030031 et n=7 neurones à partir de 4 souris traitées par le véhicule) et APP/PS1-21 (n=11 neurones à partir de 5 souris traitées par HC030031 et n=7 neurones à partir de 5 souris traitées par le véhicule). est une représentation graphique de l’amplitude des sEPSC de neurones pyramidaux CA1 chez des souris âgées de 1 mois WT (n=4 neurones à partir de 2 souris traitées par HC030031 et n=7 neurones à partir de 4 souris traitées par le véhicule) et APP/PS1-21 (n=11 neurones à partir de 5 souris traitées par HC030031 et n=7 neurones à partir de 5 souris traitées par le véhicule). est une représentation graphique de l’activité calcique des microdomaines au niveau d’une arborisation astrocytaire chez des souris âgées de 1 mois WT (n=7 astrocytes à partir de 2 souris traitées par HC030031 et n=8 astrocytes à partir de 3 souris traitées par le véhicule) et APP/PS1-21 (n=10 astrocytes à partir de 3 souris traitées par HC030031 et n=8 astrocytes à partir de 3 souris traitées par le véhicule). est une représentation graphique de la fréquence des événements calciques à l’intérieur de chaque microdomaine actif chez des souris âgées de 1 mois WT (n=816 microdomaines à partir de 7 astrocytes chez des souris traitées par HC030031 et n=995 microdomaines à partir de 8 astrocytes chez des souris traitées par le véhicule) et APP/PS1-21 (n=771 microdomaines à partir de 10 astrocytes chez des souris traitées par HC030031 et n=1303 microdomaines à partir de 8 astrocytes chez des souris traitées par le véhicule). Chaque point correspond à la fréquence moyenne enregistrée dans chaque astrocyte individuel. * p est une représentation graphique de la fréquence des sEPSC de neurones pyramidaux CA1 chez des souris âgées de 3 mois WT (n=11 neurones à partir de 6 souris traitées par HC030031 et n=10 neurones à partir de 9 souris traitées par le véhicule) et APP/PS1-21 (n=11 neurones à partir de 7 souris traitées par HC030031 et n=12 neurones à partir de 8 souris traitées par le véhicule). est une représentation graphique de l’amplitude des sEPSC de neurones pyramidaux CA1 chez des souris âgées de 3 mois WT (n=11 neurones à partir de 6 souris traitées par HC030031 et n=10 neurones à partir de 9 souris traitées par le véhicule) et APP/PS1-21 (n=11 neurones à partir de 7 souris traitées par HC030031 et n=12 neurones à partir de 8 souris traitées par le véhicule). est une représentation graphique de l’activité calcique des microdomaines au niveau d’une arborisation astrocytaire chez des souris âgées de 3 mois WT (n=8 astrocytes à partir de 4 souris traitées par HC030031 et n=8 astrocytes à partir de 3 souris non traitées) et APP/PS1-21 (n=7 astrocytes à partir de 3 souris traitées par HC030031 et n=10 astrocytes à partir de 3 souris non traitées). est une représentation graphique de la fréquence des événements calciques à l’intérieur de sous-régions astrocytaires chez des souris âgées de 3 mois WT (n=1267 microdomaines à partir de 8 astrocytes chez des souris traitées par HC030031 et n=840 microdomaines à partir de 8 astrocytes chez des souris non traitées) et APP/PS1-21 (n=1052 microdomaines à partir de 7 astrocytes chez des souris traitées par HC030031 et n=1504 microdomaines à partir de 10 astrocytes chez des souris non traitées). Chaque point correspond à la fréquence moyenne enregistrée dans chaque astrocyte individuel. correspond aux images prises en microscopie à fluorescence de parties de dendrites de neurone pyramidal CA1 exprimant l’eYFP chez des souris âgées de 3 mois transgéniques Thy1-eYFP-H-APP/PS1-21 et les souris WT de la même portée traitées par le véhicule ou par HC030031. Barre d’échelle 2µm. est une représentation graphique de la densité des épines dendritiques par µm chez des souris WT (n=24 dendrites à partir de 3 souris APP/PS1 traitées par HC030031 et n=14 dendrites à partir de 2 souris traitées par le véhicule) et Thy1-eYFP-H-APP/PS1-21 (n=21 dendrites à partir de 3 souris APP/PS1 traitées par HC030031 et n=14 dendrites à partir de 2 souris traitées par le véhicule) âgées de 3 mois. est une représentation graphique de la répartition de la morphologie des épines dendritiques chez des souris WT et Thy1-eYFP-H-APP/PS1-21 âgées de 3 mois. est une représentation de l’analyse morphologique par microscopie électronique du stratum radiatum chez une souris APP/PS1-21 âgée de 3 mois traitée par HC030031 montrant un exemple de synapse enveloppée par des processus périsynaptiques astrocytaires (flèche). Barre d'échelle approximative : 0,5 μm. L’histogramme montre l’impact de l'injection intra-péritonéale de HC030031 sur la proportion de synapses enveloppées chez des souris âgées de 3 mois (n= 441 synapses de 3 souris non traitées et 124 synapses de 3 souris traitées par HC030031) et chez des souris APP/PS1-21 (n= 480 synapses de 3 souris non traitées et 122 synapses de 3 souris traitées par HC030031). * p est une représentation graphique des résultats du test du labyrinthe de Barnes pour évaluer l’apprentissage spatial de tâches chez des souris âgées de 6 mois WT traitées par le véhicule (n= 6 souris), APP/PS1-21 traitées par le véhicule (n=10 souris), WT traitées par HC030031 (n= 9 souris) et APP/PS1-21 traitées par HC030031 (n= 11 souris) quotidiennement pendant 6 mois. est une représentation graphique de l’aire sous la courbe de la latence pour atteindre la boîte d’échappement du labyrinthe de Barnes chez des souris âgées de 6 mois selon les conditions de la . est une représentation graphique de la vitesse de déplacement des souris dans le labyrinthe de Barnes chez des souris âgées de 6 mois selon les conditions de la . est une représentation graphique de la latence pour rejoindre la cible lors de la phase de test chez des souris âgées de 6 mois selon les conditions de la . * p Si l’on se réfère à la , on peut y voir que la fréquence de sEPSC des neurones CA1 chez les souris APP/PS1-21 de 1 mois augmente par rapport aux souris contrôles WT. En revanche, à l’âge de 3 mois, l’hyperactivité a progressivement évolué vers une hypoactivité chez les souris APP/PS1-21. Les souris transgéniques surexprimant l’APP mutante en combinaison avec la PS1 mutante produisent des taux élevés d’amyloïde β et développent une pathologie amyloïde qui est similaire à celle trouvée dans le cerveau humain (Radde et al., EMBO Rep., 2006). Sur la , on peut noter que l’amplitude des sEPSC n’est pas affectée à l’âge de 1 mois mais est réduite à 3 mois chez les souris APP/PS1, ce qui accentue l’hypoactivité neuronale CA1 nette. Sur la , la sonde calcique fluorescente Fluo-4 a permis de mettre en évidence les microdomaines actifs des astrocytes. La proportion des microdomaines actifs a accru chez les souris APP/PS1 de 1 mois et est restée élevée chez les souris âgées de 3 mois. D’une manière similaire, sur la , on peut voir que la fréquence des événements calciques à l’intérieur de chaque microdomaine actif a augmenté à 1 mois et est restée élevée à 3 mois, révélant une hyperactivité calcique astrocytaire stable au cours du temps. Ainsi, la surproduction d’Aβ a un impact précoce sur l’activité neuronale et astrocytaire, déclenchant une hyperactivité astrocytaire prolongée chez les souris âgées de 1 et 3 mois, conjointement avec une hyperactivité neuronale temporaire à 1 mois qui évolue en une hypoactivité à 3 mois. Si l’on se réfère à la , les images capturées montrent qu’à 1 mois, il n’y a pas de différence dans la densité ou la morphologie des épines dendritiques entre les souris contrôles et APP/PS1-21. En revanche, à 3 mois, il apparaît que la densité diminue chez les souris APP/PS1 par comparaison aux souris contrôles du même âge. Ces constatations ont pu être confirmées par quantification sur les Figures 1F et 1G, où, à 1 mois, il n’y a pas de différence dans la densité ou la morphologie des épines dendritiques que ce soit chez les souris APP/PS1 ou les souris contrôles alors qu’à 3 mois, on observe une réduction de la densité des épines dendritiques et parallèlement, il y a une augmentation de la proportion d’épine fine immature et une réduction de la proportion d’épine mature en forme de champignon. La morphologie nommée « bourgeon » correspond à des épines très immatures et non fonctionnelles alors que la morphologie appelée « champignon » correspond à des épines matures et fonctionnelles. L’imagerie en microscopie électronique présentée à la révèle que les synapses tripartites (où les astrocytes sont étroitement associés au compartiment synaptique) sont prédominantes chez les souris contrôles par opposition aux souris APP/PS1. La illustre effectivement la réduction de la proportion de synapses tripartites chez les souris APP/PS1 âgées de 3 mois par comparaison aux souris contrôles de la même portée. Si l’on se réfère à la Figure 2, on peut y voir les effets du traitement chronique par l’inhibiteur du canal TRPA1 (HC030031) sur les souris WT contrôles et APP/PS1-21 âgées de 1 mois. Sur la , on observe que le traitement par HC030031 a permis de prévenir l’occurrence de l’hyperactivité neuronale hippocampique chez les souris transgéniques, restaurant la fréquence des sEPSC à la valeur physiologique à 1 mois. Le traitement par HC030031 n’a pas eu d’effet sur les souris contrôles de la portée. Selon la , l’amplitude des sEPSC n’était pas affectée chez les souris transgéniques de 1 mois et le traitement par HC030031 n’a pas eu d’impact sur ce paramètre. La Figures 2C et 2D montrent que le traitement par HC030031 permet de prévenir l’occurrence de l’hyperactivité calcique astrocytaire de l’hippocampe chez les souris APP/PS1-21, affectant à la fois les proportions de microdomaines actifs et la fréquence d’événement calcique et ces deux paramètres ont été restaurés à la valeur physiologique telle que représentée par la condition WT + véhicule. Si l’on se réfère à la Figure 3, on peut y voir les effets du traitement chronique par l’inhibiteur du canal TRPA1 (HC030031) sur les souris contrôles et APP/PS1-21 âgées de 3 mois. Sur la , on observe que le traitement chronique par HC030031 a permis de prévenir l’occurrence de l’hypoactivité neuronale comme en témoigne la restauration de la fréquence des sEPSC au niveau physiologique obtenu chez les souris WT + véhicule. La permet de visualiser que l’amplitude des sEPSC a également été restaurée à son niveau physiologique. Les niveaux d’activité neuronale chez les souris APP/PS1-21 traitées par HC030031 étaient similaires à ceux des souris contrôles de la même portée. Comme en témoignent les Figures 3C et 3D, le traitement chronique par HC030031 chez les souris APP/PS1-21 a persisté à réduire l’hyperactivité calcique des astrocytes à 3 mois puisqu’à la fois la proportion des microdomaines actifs et la fréquence des événements calciques au sein de ces microdomaines ont été réduits jusqu’à s’approcher du niveau physiologique. Le traitement chronique par HC030031 n’avait pas d’effet sur la proportion de microdomaines actifs dans le reste de la portée de souris contrôles et a légèrement augmenté la fréquence des événements calciques au sein de ces microdomaines. Sur les Figures 3E et 3F, on peut voir que l’inhibition chronique de TRPA1 a résulté en la normalisation de la densité des épines dendritiques vers une densité observée chez les animaux contrôles. Finalement, sur la , on peut voir que la maturation des épines dendritiques suivant le traitement chronique par HC030031 sur les souris APP/PS1-21 se rapproche de celle des animaux contrôles et que la proportion des épines dendritique fines ou en forme de champignon est restaurée par le traitement chronique. Les altérations morphologiques observées chez les souris APP/PS1-21 traitées par le véhicule sont le corolaire des altérations fonctionnelles décrites sur la (hypoactivité neuronale) et sont le prélude de la mort neuronale. Un traitement quotidien par HC030031 restaure ces paramètres à des valeurs proches de ce qui est mesuré chez les animaux contrôles (WT) aussi bien en termes de densité que de morphologie synaptique. Comme l’indique la , parallèlement à cette protection de l'intégrité des épines dendritiques, une analyse par microscope électronique a révélé que les défauts d’enrobage astrocytaire des synapses du stratum radiatum de l’hippocampe sont entièrement restaurés chez les souris transgéniques traitées par HC030031. Par ailleurs, le traitement par HC030031 n'a eu aucun effet sur l’enrobage astrocytaire chez les souris contrôles. Si l’on se réfère à la Figure 4, on peut y voir les effets du traitement chronique par l’inhibiteur du canal TRPA1 (HC030031) sur les troubles mnésiques des souris contrôles WT et APP/PS1-21 âgées de 6 mois. Sur la , on visualise la phase d’apprentissage du test mesurant la latence pour que les souris s’échappent du labyrinthe de Barnes. Ce test permet de tester la mémoire spatiale de travail des animaux. Au bout de la période d’apprentissage de 3 jours et 8 essais, la latence temporelle jusqu’à ce que la souris atteigne la boîte d’échappement a diminué au cours du temps, que ce soit chez les souris transgéniques et les souris contrôles WT. Cependant, les souris APP/PS1-21 ont présenté une augmentation de la période de temps globale prise pour atteindre la boîte d’échappement pendant cette phase d’apprentissage, ce qui suggère un défaut de mémoire spatiale de travail chez ces souris transgéniques. Le traitement chronique par HC030031 rétablit la mémoire spatiale de travail à un niveau similaire de celle des souris contrôles WT. La permet de visualiser l’aire sous la courbe de la latence et caractérise la même tendance à la restauration de la mémoire spatiale de travail grâce au traitement chronique par HC030031 des souris APP/PS1-21. Comme en témoigne la , la fonction motrice, mesurée par la vélocité des souris sur les 3 jours, est similaire dans tous les groupes testés. Sur la , le test permet de visualiser la latence pour rejoindre la zone cible. Comme prévu, la latence pour trouver la zone cible pour la première fois a augmenté chez les souris APP/PS1-21. Par conséquent, à la fois la mémoire spatiale de référence et la mémoire spatiale de travail étaient altérées chez les souris APP/PS1-21 de 6 mois par comparaison aux souris contrôles WT de la même portée. Le traitement par HC030031 à partir du début de la surproduction du peptide amyloïde β a partiellement restauré ces défauts mnésiques, mais la mémoire de référence n’a pas été améliorée contrairement à la mémoire de travail. Ainsi, l’ensemble de ces résultats suggère qu’un traitement précoce par un inhibiteur du canal TRPA1 tel que HC030031 protège les neurones de la toxicité du peptide Aβ et empêche la survenue des dysfonctions neuronales caractéristiques des phases pré-symptomatiques précoces et tardives. Cette protection fonctionnelle s’accompagne d’un maintien de la structure même des synapses. Ces hyper- puis hypoactivités neuronales associées aux altérations structurales des synapses sont précurseurs de la mort neuronale associée aux symptômes mnésiques et cognitifs de la pathologie. EXEMPLES Les exemples suivants illustrent l’invention. Matériel et Méthodes Animaux Le modèle utilisé est un modèle transgénique murin obtenu sur un fond génétique C57BL/6J qui co-exprime la forme humaine mutée de la protéine précurseur amyloïde (APP mutée KM670/671NL) et de la préséniline 1 (PS1 mutée L166P) sous le contrôle du promoteur neuronal Thy1. La présence de ces deux mutations permet une production accrue du peptide Aβ dès le 14 ème jour post-natal. Celle-ci aboutit à une amyloïdose cérébrale avec apparition des premières plaques séniles vers 8 semaines post-natales. Cette pathologie amyloïde s’accompagne d’une gliose inflammatoire (microgliose et astrogliose détectables à partir de 4 mois), de dystrophie des épines dendritiques et d’une hyperphosphorylation de tau (vers 8 mois). Les troubles comportementaux cognitifs, et notamment de l’apprentissage et de la mémoire spatiale, se mettent en place vers 6-8 mois. Ce modèle a été mis en place et décrit par Rebecca Radde en 2006 (Radde et al., EMBO reports, 2006) et est largement utilisé par la communauté scientifique. Ce modèle est disponible au sein de l’animalerie de l’Institut des Neurosciences de Grenoble et élevé par les inventeurs depuis 2014. Ce modèle étant hétérozygote, les inventeurs utilisent comme contrôle sain les souris issues des mêmes portées mais n’exprimant pas le transgène APP/PS1 (souris wild-type, WT). Les animaux mâles et femelles sont utilisés et l’effet du traitement est comparé en fonction du genre. Le protocole de traitement a été soumis au comité d’éthique local où il a reçu un avis favorable. Il a reçu une autorisation par le ministère de l’enseignement supérieur et de la recherche pour une durée de 5 ans à partir du 03 mars 2019 (APAFIS#19142-2018121715504298). Dans certaines expériences, des souris APP/PS1-21 ont été croisées avec la lignée transgénique murine Thy1-eYFP-H qui exprime la protéine fluorescente eYFP dans des sous-populations de neurones spécifiques. Traitements L’HC030031 [2-(1,3-Dimethyl-2,6-dioxo-1,2,3,6-tetrahydro-7H-purin-7-yl)-N-(4-isopropylphenyl)acetamide] de formule : est un inhibiteur spécifique du canal TRPA1 découvert par Hydra Bioscience en 2007. C’est un alcaloïde à structure xanthine qui inhibe les formes humaines et rongeurs de TRPA1 avec une CI 50 de 6.2 et 7.6 µM respectivement (McNamara et al., PNAS, 2007, Eid et al., 2008). La forme solide est fournie par Tocris Bioscience (50 mg, ref. #2896) et est solubilisée dans du DMSO à la concentration de 10 mg/ml. Cette solution est ensuite diluée à 1 µg/µl dans une solution isotonique contenant du Pluronic F-127 1 % et du NaCl 0.9 %. Les animaux sont injectés quotidiennement par voie intra-péritonéale à une dose de 5 mg/kg de poids corporel. Des seringues BD MicroFine stériles de 0.5 ml sans volume mort, munies d’une aiguille de 30G (0.3 mm) sont utilisées pour les injections. Le véhicule (DMSO 10 %, Pluronic F-127 1 %, NaCl 0.9 %) est utilisé comme contrôle et est injecté également quotidiennement, selon la même procédure aux animaux contrôles WT et APP/PS1 (groupes véhicules). L’injection est débutée à partir du 14 ème jour post-natal (apparition de l’expression du promoteur du gène Thy1 dans l’hippocampe, déclenchant la surexpression d’Aβ dans le modèle murin APP/PS1-21) Préparation de tranches aiguës de cerveau Des coupes coronales d’hippocampe (épaisseur 300 µm) ont été préparées à partir de souris transgéniques APP/PS1-21 (âgées d’1 mois et de 3 mois) ou à partir de souris WT de la même portée. Les souris ont été sacrifiées par décérébration et décapitation. Le cerveau a été rapidement retiré et sectionné dans de l’ACSF glacé contenant (en mM) : 2,5 KCl, 7 MgCl 2 , 0,5 CaCl 2 , 1,2 NaH 2 PO 4 , 25 NaHCO 3 , 11D-glucose et 234 saccharose bullé avec 95% d’O 2 et 5% de CO 2 avec un vibratome VT1200S (Leica, Germany). Les coupes contenant l’hippocampe ont été placées dans de l’ACSF contenant (en mM) : 126 NaCl, 2,5 KCl, 1,2 MgCl 2 , 2,5 CaCl 2, 1,2 NaH 2 PO 4 bullé avec 95% d’O 2 et 5% de CO 2 et supplémenté par 1mM de pyruvate de sodium à température ambiante pendant une période de récupération. Chargement individuel des astrocytes par une sonde calcique fluorescente, Fluo-4 Des coupes coronales de 300 µm ont été transférées dans une chambre permettant une perfusion constante avec ACSF à température ambiante, sous barbotage avec 95% d’O 2 et 5% de CO 2 sur le plateau d’un microscope droit (Eclipse E600 FN, Nikon, France) équipé avec un objectif à immersion à l’eau de 60x (NA 1.0) et des systèmes optiques à contraste interférentiel infrarouge avec une caméra CCD (Optronis VX45, Allemagne). Des pipettes de verre 8-11 MΩ (Harvard Apparatus) ont été remplies d’une solution intracellulaire contenant (en mM) : 105 K-gluconate, 30 KCl, 10 phosphocréatine, 10 HEPES, 4 ATP-Mg, 0,3 GTP-Tris, 0,2 sel de Fluo-4-pentapotassium (Life Technlogies), ajustée à pH 7,2 avec du KOH. Les signaux ont été amplifiés par Axopatch 200B, échantillonnés par une interface Digidata 1440A et enregistrés par le logiciel pClamp8 (Molecular Devices, USA). Les astrocytes ont été identifiés sur la base de leur morphologie, leur emplacement dans le stratum radiatum et un potentiel au repos négatif (entre -70 et -80 mV). Le potentiel de membrane a été maintenu à -80 mV. La résistance d’entrée a été calculée par la mesure du courant en réponse à une impulsion de 10 mV de durée 80 ms à proximité de l’extrémité de la commande de tension. Seuls les astrocytes passifs présentant une relation I/V linéaire et une faible résistance à l’entrée (≈ 50MΩ) sont enregistrés. Après la mise en place de la configuration en cellule entière, la résistance d’accès a été constamment surveillée et les astrocytes ont été exclus de cette étude lorsque ce paramètre évoluait de plus de 20% au cours de l’expérience. Pour permettre la diffusion suffisante de la sonde fluorescente et éviter la dialyse des astrocytes, la configuration sur cellule entière a été limitée à moins de 5 minutes. Ensuite, la pipette de patch a été délicatement retirée pour permettre à l’astrocyte de récupérer. De façon à rendre maximale la diffusion de la sonde dans les prolongements astrocytaires, les inventeurs ont attendu au moins 5 minutes avant l’imagerie calcique. Imagerie calcique Des coupes chargées en astrocytes individuels ont été soumises à l’enregistrement dans une chambre constamment perfusée sur le plateau d’un microscope droit (Eclipse E600, Nikon, France) équipé avec un objectif à immersion à eau de 60x (NA 1.0) et une tête confocale (tête confocale C1, Nikon, France). L’excitation a été réalisée avec de la lumière laser à 488 nm et l’émission a été filtrée par un filtre 515 ± 15 nm. Les images ont été acquises avec le logiciel EZ-C1 (Nikon, France) à des intervalles de 1,2 s dans un plan confocal unique sur une période de 5 minutes. Les événements calciques transitoires ont été mesurés dans des images bidimensionnelles au cours du temps, dans des sous-régions correspondant à la forme de l’astrocyte isolée. Des régions d’intérêt ROI (≈ 1µm 2 ) ont été placées le long des prolongements astrocytaires se situant dans le plan focal et une ROI a également été sélectionnée dans le soma si celle-ci était accessible. Avant l’analyse, les images brutes ont été stabilisées (si nécessaire) à l’aide du plugin Template Matching d’ImageJ et filtrées avec le 3D Hybrid Median Filter. Le logiciel CalSignal a été utilisé pour mesurer l’activité Ca 2+ intracellulaire, analyser les variations du signal de fluorescence F dans chaque ROI. Des changements significatifs de fluorescence ont été détectés sur la base des rapports ΔF/F 0 calculés. F 0 a été calculé pour chaque ROI sur la période d’enregistrement. Sur la base des rapports ΔF/F 0 , des variations de fluorescence significatives ont été détectées et un événement calcique a été défini comme une augmentation de signal significative et continue supérieure à seuil fixé, suivi par une diminution de signal significative et continue. Ainsi, les ROI ont été définies comme actives lorsque la fluorescence a augmenté d’au moins 2 écart-types par rapport à la fluorescence de base. Après la détection de pic, chaque courant calcique transitoire a été visuellement vérifié par l’opérateur. Enregistrements électrophysiologiques Les enregistrements sur cellule entière ont été réalisés sur des somas de neurones pyramidaux CA1 visuellement identifiés. Les pipettes de patch (4-6 MΩ) ont été remplies d’une solution interne contenant (en mM) : 105 K-gluconate, 30 KCL, 10 phosphocréatine, 10 HEPES, 4 ATP-Mg, 0,3 GTP-Tris, 0,3 EGTA, ajustée à pH 7,2 avec du KOH. Les courants post-synaptiques excitateurs spontanés (sEPSC) ont été collectés à un potentiel de maintien de membrane de -60 mV qui est proche du potentiel d’inversion de GABA. Tous les enregistrements ont été réalisés à température ambiante (22-24°C) et seul un neurone unique a été étudié par coupe. Les sEPSC et leurs cinétiques ont été analysés, après une période de stabilisation de 10 minutes, à 5 minutes des enregistrements. La résistance d’accès a été constamment surveillée et les enregistrements ont été exclus de cette étude lorsque ce paramètre a varié plus de 20% au cours de l’expérience. Les enregistrements ont été analysés à l’aide du module Clampfit du logiciel pClamp8 (Molecular Devices, USA) avec un seul à 20 pA pour exclure les sEPSC miniatures. Immunohistochimie Les souris ont été profondément anesthésiées par une injection intrapéritonéale de 320 mg/kg de pentobarbital de sodium et perfusé par voie intracardiaque avec 25 ml de PBS 0,1M, suivi par 25 ml de 4% paraformaldéhyde dans du PBS 0,1M, pH 7,3. Les cerveaux ont été rapidement retirés, post-fixés au cours de la nuit à 4°C dans 4% de paraformaldéhyde, en immersion dans 20% de saccharose dans du PBS 0,1M, pH 7,5 au cours de la nuit, congelé dans de l’isopentane refroidi (-35°C) et stocké à -30°C. Des coupes frontales en série (épaisseur de 30µm) ont été découpées avec un microtome cryostat (HM 500M, Microm, France). Les coupes ont été bloquées par incubation avec 3% de sérumalbumine bovine dans TBS-Tween-Triton (TBSTT) (0,1M Tris base 0,15M NaCl, 0,1% Tween, 0,1% Triton X-100) pendant 30 minutes (tampon dilution/blocage). Les coupes de tissu ont ensuite été incubées sur la nuit à 4°C avec soit un anticorps anti-GFAP (Molecular Probes, USA, monoclonal de souris, 1 :1000), un anti-TRPA1 (Novus, USA, polyclonal de lapin, 1 :100) ou un anti-Iba-1 (Wako, USA, polyclonal de lapin, 1 :500). Les coupes de tissu ont été lavées dans TBSTT et incubées pendant 2 heures à température ambiante avec des anticorps secondaires conjugués à la Cynanine3 (Jackson ImmunoReseach Laboratories, USA, 1 :1000) ou à Alexa 488 (Life Technology, USA, 1 :1000). Les coupes ont été lavées avec du tampon TBS (0,1M Tris base, 0,15M NaCl), incubées dans de la Thioflavine S aqueuse à 1% (Sigma, France) pendant 8 minutes à température ambiante, à l’obscurité et lavées plusieurs fois dans le tampon TBS. Analyse des épines dendritiques Des coupes hippocampiques de souris Thy1-eYFP-H-APP/PS1-21 ont été imagées à l’aide d’un module Airyscan de Zeiss avec un objectif 100x Plan Apochromat à immersion à huile (NA 1.4). Des empilements d’images confocales (incrément de 200 nm) ont été réalisé avec une taille de voxel de 0,041 x 0,041 x 0,2 µm. L’analyse 3D de la densité des épines, du volume des épines et de la classification des épines a été réalisée à l’aide du logiciel NeuronStudio (Icahn School of Medicine à Mount Sinai, USA). La longueur des dendrites individuelles a été automatiquement mesurée ainsi que le nombre et le volume des épines dendritiques associées qui ont été classées en bourgeon, fine ou champignon à l’aide de la classification de formes 3D automatisée. Pour chaque condition, 10 dendrites ont été imagées et 700 épines dendritiques ont été analysées. Immunoblotting Des hippocampes disséqués provenant de souris APP/PS1-21 âgées de 1 mois, 3 mois et 6 mois ont été homogénéisés dans un tampon froid contenant 0,32M de saccharose et 10 mM d’HEPES, pH 7,4. Les échantillons ont été conservés à 4°C pendant toutes les étapes des expériences. Les homogénats ont été clarifiés à 1000 g pendant 10 minutes pour éliminer les noyaux et les gros débris. Les échantillons dans le tampon de charge ont été portés à ébullition pendant 10 minutes et des quantités égales de protéines (20 µg, quantifié par un essai micro-BCA (Pierce) en duplicat) ont été déposées sur des gels non marqués précoulés sur gradient 4-20% de Bis-Tris polyacrylamide (Bio-Rad) dans des conditions dénaturantes. Les protéines ont été transférées sur une membrane de difluorure de polyvinylidène (Millipore) pendant 30 minutes à 4°C. Les membranes ont été bloquées avec 3% de lait déshydraté dans un tampon salin Tris (TBS : 10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,4) contenant 0,1% de Tween pendant 1 heure à température ambiante. Les membranes ont été marquées avec un anticorps anti-GFAP (Molecular Probes, USA, monoclonal de souris, 1 :1000) ou anti-TRPA1 (Novus, USA, 1 :2000) dilué dans 3% de lait déshydraté dans 0,1% Tween TBS au cours de la nuit à 4°C. Les membranes ont été lavées dans 0,2% Tween TBS et marquées par un anticorps IgG anti-lapin HRP-conjugué (Fab’) (Interchim, France, 1 :40000) pendant 45 minutes à température ambiante. Après les lavages, les protéines spécifiques ont été visualisées par un système de détection ECL (Bio-Rad) à chimioluminescence améliorée et le système chemidoc (Bio-Rad). Les signaux de chimioluminescence ont été normalisés en des signaux de charge de protéine acquis à l’aide de gels précoulés sans marquage (Bio-Rad). Microscopie électronique Les hippocampes ont été disséqués et fixés avec 1,7 % de glutaraldéhyde dans un tampon phosphate 0,1 M à pH 7,4 pendant 48 heures à température ambiante. La région CA1 a été disséquée sous une loupe binoculaire et fixée à nouveau pendant 2 heures dans la même solution. Les échantillons ont ensuite été lavés avec du tampon et post-fixés avec du tétroxyde d'osmium à 1 % et du tampon de phosphate 0,1 M à pH 7,2 pendant 1 heure à 4°C. Après un lavage approfondi à l'eau, les cellules ont ensuite été colorées avec de l'acétate d'uranile à 1 % pH 4 dans de l'eau pendant 1 heure à 4°C avant d'être déshydratées par des bains d'alcool successifs (30 % - 60 % - 90 % - 100 % - 100 % - 100 %) et incubées avec un mélange 1/1 epon/éthanol à 100 % pendant 1 heure et plusieurs bains de résine époxy fraîche (Sigma-Aldrich, France) pendant 3 heures. Enfin, les échantillons ont été inclus dans une capsule remplie de résine que l'on a laissé polymériser pendant 72 h à 60°C. Des sections ultrafines des échantillons (60 nm) ont été coupées avec un ultramicrotome (Leica, USA). Les sections ont été post-colorées avec 5 % d'acétate d'uranile et 0,4 % de citrate de plomb. L'acquisition des images a été faite avec un microscope électronique à transmission à 80 kV (JEOL 1200EX, Japon), en utilisant une caméra numérique (Veleta, SIS, Olympus, Allemagne), le grossissement a été fixé à 50 000 X. La présence d'un prolongement astrocytaire en contact avec la synapse a été estimée dans le stratum radiatum à partir de 42 sections choisies au hasard, provenant de trois souris par condition. Les processus astrocytaires ont été identifiés par leur cytoplasme relativement clair, leur forme angulaire par rapport à leurs homologues neuronaux plus lisses et par la présence de granules de glycogène. Expériences sur labyrinthe de Barnes Les souris ont été placées au centre d’une plateforme ouverte bien éclairée (BioSeb, diamètre 120 cm). La plateforme comporte 20 trous (diamètre 5 cm) avec une boîte d’échappement (cible) fixée au-dessous de l’un des trous. Le premier jour de l’entrainement, les souris ont été d’abord placées au milieu de la plateforme et délicatement guidées vers la cible après 5 minutes d’exploration libre. Une fois que les souris sont entrées dans la boîte d’échappement, elles y restaient pendant 1 minute avant d’être retournées dans leur cage. Pendant les 3 jours de la phase d’entrainement/acquisition, les souris ont réalisé 3 essais par jour avec un intervalle entre les essais de 20 minutes. Les souris avaient 180 secondes pour trouver la boîte d’échappement ou étaient délicatement guidées vers celle-ci. Le jour 4 (jour du test), la boîte d’échappement a été retirée et les souris ont été laissées explorer librement le labyrinthe pendant 60 secondes. Le temps mis pour rejoindre la cible (latence) et la durée d’exploration de la zone cible (trou cible ±1) ont été analysées. Toutes les données ont été enregistrées et analysées avec EthoVision XT9 (Noldus). Analyse statistique La taille des échantillons pour les différents ensembles de données est mentionnée dans le descriptif des Figures. Les résultats sont exprimés comme moyenne ± écart-type à partir d’échantillons biologiques indépendants accompagnés par la distribution des points expérimentaux. Les données ont été analysées à l’aide du logiciel GraphPad Prism 6.0. Les comparaisons entre les deux groupes ont été réalisées avec le test de Mann-Whitney à deux variables. Le test de Kruskal-Wallis suivi du test de comparaison multiple de Dunn a été utilisé pour les comparaisons multiples. Les proportions de synapses tripartites ont été comparées avec le test exact de Fischer. Les inventeurs ont vérifié la possible dépendance au genre de l’activité neuronale, de l’activité astrocytaire et de la performance mnésique dans les groupes traités et n’ont pas trouvé de différence significative, alors les résultats ont été regroupés pour l’analyse. Les niveaux de significativité sont les suivants : * p Résultats : Altérations structurelle et fonctionnelle des neurones et des astrocytes aux stades précoces et intermédiaires de la maladie d’Alzheimer Les inventeurs ont étudié la progression de l’activité des neurones et des astrocytes dans l’hippocampe de souris APP/PS1-21. Les souris transgéniques surexprimant l’APP mutante en combinaison avec la PS1 mutante produisent des taux élevés d’amyloïde β et développent une pathologie amyloïde qui est similaire à celle trouvée dans le cerveau humain. Des taux significatifs d’Aβ sont détectés à partir de l’âge de 1 mois chez ce modèle, alors que les premières plaques amyloïdes apparaissent dans l’hippocampe vers l’âge de 3-4 mois. Ces âges peuvent être associés aux stades précoce et intermédiaire de la progression de la maladie d’Alzheimer. Les inventeurs ont enregistré les courants postsynaptiques excitateurs spontanés (sEPSC) en réalisant des enregistrements patch-clamp sur cellule entière sur des corps cellulaires de neurones CA1 chez des souris de 1, 2 et 3 mois. Les résultats ont montré que la fréquence de sEPSC des neurones CA1 chez les souris APP/PS1-21 de 1 mois (0,20 ± 0,06 Hz chez les souris APP/PS1 vs. 0,08 ± 0,03 Hz chez les souris WT ; p=0,0266 – ) augmente. Cette hyperactivité a progressivement évolué vers une hypoactivité chez les souris APP/PS1-21 de 3 mois (0,03 ± 0,01 Hz chez les souris APP/PS1 vs. 0,08 ± 0,02 Hz chez les souris WT ; p=0,0029 – ). L’amplitude des sEPSC n’était pas affectée à l’âge de 1 mois (33,7 ± 1,9 pA chez les souris APP/PS1 vs. 33,0 ± 2,3 pA chez les souris WT ; p=0,9551 – ) et était réduit à l’âge de 3 mois (28,9 ± 1,0 pA chez les souris APP/PS1 vs. 35,2 ± 1,9 pA chez les souris WT ; p=0,0038 – ), ce qui accentuait l’hypoactivité neuronale CA1 nette. Pour étudier l’activité calcique astrocytaire, les inventeurs ont chargé des astrocytes individuels avec une sonde calcique fluorescente Fluo-4 permettant d’avoir accès à l’activité des microdomaines dans l’ensemble du territoire astrocytaire et notamment au niveau des prolongements cellulaires. La proportion des microdomaines actifs a accru chez les souris APP/PS1 de 1 mois (67,9 ± 3,3% chez les souris APP/PS1 vs. 56,2 ± 2,9% chez les souris WT ; p=0,0145 – ) et est restée élevée chez les souris âgées de 3 mois (66,2 ± 2,5% chez les souris APP/PS1 vs. 53,3 ± 4,1% chez les souris WT ; p=0,0266 – ). La fréquence des événements calciques à l’intérieur de chaque microdomaine actif a accru à 1 mois (0,65 ± 0,10 événement/minute chez les souris APP/PS1 vs. 0,49 ± 0,05 événement/minute chez les souris WT ; p ) et est restée élevée à 3 mois (0,68 ± 0,06 événement/minute chez les souris APP/PS1 vs. 0,50 ± 0,05 événement/minute chez les souris WT ; p , révélant une hyperactivité calcique astrocytaire stable au cours du temps. Ainsi, la surproduction d’Aβ a un impact précoce sur l’activité neuronale et astrocytaire, déclenchant une hyperactivité astrocytaire prolongée chez les souris âgées de 1 et 3 mois, conjointement avec une hyperactivité neuronale temporaire à 1 mois qui évolue en une hypoactivité à 3 mois. Au niveau structural, les inventeurs ont analysé la densité des épines dendritiques et leur morphologie dans des neurones CA1 pyramidaux chez des souris transgéniques Thy1-eYFP-H croisées avec des souris APP/PS1-21 ( ).A 1 mois, il n’y avait pas de différence dans la densité ou la morphologie des épines dendritiques que ce soit chez les souris APP/PS1 ou les souris WT ( , ), alors qu’à 3 mois, on observe une réduction de la densité des épines dendritiques (1,13 ± 0,05 épine/µm chez les souris APP/PS1 vs. 1,54 ± 0,08 épine/µm chez les souris WT ; p ). Parallèlement, il y a une augmentation de la proportion d’épine fine immature (40 ± 2,5% chez les souris APP/PS1 vs. 21,9 ± 1,6 chez les souris WT ; p ) et une réduction de la proportion d’épine mature en forme de champignon (45,7 ± 2,5% chez les souris APP/PS1 vs. 62,4 ± 2,0% chez les souris WT ; p ). Cette dystrophie des épines est accompagnée d’une perte d’enrobage astrocytaire des synapses du stratum radiatum ( ). Chez les souris transgéniques de 3 mois, on observe une réduction de la proportion de synapses tripartites (41,7 ± 2,8% de synapses tripartites chez les souris APP/PS1 vs. 54,3 ± 3,7 chez les souris WT ; p ). Ainsi, la mise en place de la réduction de la fréquence et de l’amplitude de sEPSC neuronales CA1 était concomitante de la réduction significative de la densité et de la maturité des épines dendritiques à 3 mois chez les souris APP/PS1, conjointement à une réduction de l’enrobage astrocytaire des synapses. Les exemples suivants illustrent la présente invention sans toutefois en limiter la portée. Exemple 1 : L’inhibition chronique de TRPA1 restaure complètement l’hyperactivité des astrocytes CA1 et l’hyperactivité neuronale chez des souris APP/PS1-21 de 1 mois Les inventeurs ont montré que les astrocytes contribuent à la toxicité du peptide amyloïde β(Aβ) et sont associés à la mise en place de l’hyperactivité neuronale précoce via la mise en jeu des canaux calciques TRPA1. Sur un modèle de tranches aiguës de cerveau de souris, ils ont mis en évidence qu’une hyperactivité calcique rapide et généralisée induite par Aβ se met en place dans l’arborisation des astrocytes de l’hippocampe ( stratum radiatum ) bien avant la mise en place des processus inflammatoires (souris APP/PS1-21, 1 mois). Cette hyperactivité astrocytaire est entièrement restaurée par le blocage aigu du canal TRPA1 par HC030031. Les inventeurs ont observé que cette hyperactivité dépendante du canal TRPA1 influence les neurones voisins, déclenchant une augmentation de l’activité neuronale de la région CA1 de l’hippocampe. Cette hyperactivité neuronale a récemment été identifiée comme étant une caractéristique de la phase prodromale de la maladie d’Alzheimer et associée à des déficits mnésiques annonciateurs. Tout comme l’hyperactivité astrocytaire, cette hyperactivité neuronale est entièrement restaurée par l’application aiguë in vitro d’HC030031 chez des animaux transgéniques APP/PS1-21 de 1 mois. Les résultats ont permis d’émettre l’hypothèse qu’une inhibition précoce du canal TRPA1 pourrait prévenir la mise en place de l’hyperactivité neuronale et cela a été testé in vivo . L’inhibiteur spécifique de TRPA1 a été administré quotidiennement par voie intrapéritonéale (5 mg/ kg de poids corporel) à partir du 14 ème jour post-natal jusqu’à un mois chez des souris APP/PS1-21. Le même volume de véhicule a été administré comme témoin chez des groupes de souris témoin d’âge et de sexe correspondant. Les inventeurs ont observé que le traitement pharmacologique par HC030031 a permis de prévenir l’occurrence de l’hyperactivité calcique astrocytaire de l’hippocampe chez les souris APP/PS1-21, affectant à la fois les proportions de microdomaines actifs (56,1 ± 3,9% chez les souris APP/PS1-21 vs. 71,8 ± 2,5% chez les souris témoins ; p=0,0439 – ) et la fréquence d’événement calcique (0,48 ± 0,02 événement calcique/minute chez les souris traitées par HC030031 vs. 0,79 ± 0,04 événement calcique/minute chez les souris témoins traitées par le véhicule ; p ). Ces deux paramètres ont été restaurés à des valeurs proches de la valeur physiologique (56,9 ± 3,6% de microdomaines actifs et 0,56 ± 0,03% événement calcique/minute chez des souris WT traitées par le véhicule ; p=0,7211 et 0,1456, respectivement). Inversement, HC030031 n’a pas eu d’effet sur la proportion de microdomaines actifs dans la portée de souris contrôle WT (53,0 ± 2,7% chez les souris traitées par HC030031 vs. 56,9 ± 3,6% chez les souris traitées par le véhicule, p=0,8627 – ) et a légèrement diminué la fréquence d’événements calciques à l’intérieur des microdomaines (0,51 ± 0,02 événement calcique/minute chez les souris traitées par HC030031 vs. 0,56 ± 0,03 événement calcique/minute chez les souris traitées par le véhicule ; p=0,031 – ). De manière concomitante, le traitement par HC030031 a permis de prévenir l’occurrence de l’hyperactivité neuronale hippocampique chez les souris transgéniques (0,10 ± 0,02 Hz chez les souris traitées par HC030031 vs. 0,24 ± 0,04 Hz chez les souris traités avec le véhicule ; p=0,0311 – ), restaurant la fréquence des sEPSC à des valeurs proches de la valeur physiologique (0,10 ± 0,02 Hz chez les souris WT traitées par le véhicule ; p=0,7213) à 1 mois. Le traitement par HC030031 n’a pas eu d’effet sur les souris de la portée WT (0,10 ± 0,04 Hz avec le traitement par HC030031 vs. 0,10 ± 0,02 Hz avec le traitement par le véhicule ; p>0,999 – ). L’amplitude des sEPSC n’était pas affectée chez les souris transgéniques de 1 mois ( ) et le traitement par HC030031 n’a pas eu d’impact sur ce paramètre p>0,999 ; ). Ces données suggèrent que l’inhibition de TRPA1 à partir de la mise en place de la surproduction de Aβ dans le modèle de souris transgéniques de la maladie d’Alzheimer était suffisante pour empêcher l’hyperactivité neuronale hippocampique à 1 mois, ce qui confirme que les astrocytes jouent un rôle majeur dans cette toxicité précoce dépendante du peptide β-amyloïde. Dans ces conditions, l’activité neuronale des animaux à 1 mois est complètement restaurée à des valeurs basales identiques à celles des animaux sains. Ainsi, l’inhibition précoce de TRPA1 par HC 030031 prévient la survenue de l’hyperactivité neuronale chez ces souris APP/PS1-21, suggérant un rôle neuroprotecteur. Exemple 2 : L’inhibition chronique de TRPA1 restaure complètement l’hypoactivité neuronale CA1, l’hyperactivité calcique astrocytaire et l’altération morphologique des épines dendritiques chez des souris APP/PS1-21 de 3 mois Dans ce modèle transgénique à 3 mois, les inventeurs ont observé la mise en place de plusieurs phénomènes concomitants dans la zone CA1 de l’hippocampe : une diminution de la densité des épines dendritiques (synapses) des neurones CA1, une diminution de l’enrobage astrocytaire des synapses restantes, une diminution de l’activité neuronale (hypoactivité), une persistance de l’hyperactivité astrocytaire et l’apparition progressive des premières plaques séniles. Ces phénomènes précèdent les troubles comportementaux mnésiques et cognitifs qui se mettent en place vers 6 mois chez ces souris transgéniques. Les inventeurs ont montré que l’injection quotidienne d’HC030031 du 14 ème au 90 ème jour post-natal, prévient la mise en place de l’hypoactivité neuronale et restaure à la fois la fréquence et l’amplitude des courants post-synaptiques spontanés dans la région CA1 de l’hippocampe. Cette protection fonctionnelle s’accompagne d’une protection de l’intégrité structurale de la synapse (densité, morphologie et enrobage astrocytaire des épines dendritiques). De manière très intéressante, l’injection d’HC030031 n’a aucun effet sur les animaux contrôles WT, ni au niveau fonctionnel, ni au niveau structural. L’hyperactivité neuronale est présumée être un élément clé des stades précoces de la maladie d’Alzheimer, déclenchant un cercle vicieux conduisant à la dérégulation du réseau entier. Les inventeurs se sont demandés si bloquer l’activation de TRPA1 induite par Aβ pouvait protéger les neurones de ce cercle vicieux. Les inventeurs ont administré l’inhibiteur spécifique du canal TRPA1 (HC030031) ou le véhicule par voie intrapéritonéale (5 mg/kg de poids corporel) à partir du 14 ème jour post-natal jusqu’aux 3 mois des souris APP/PS1-21. Ces expériences ont révélé que l’inhibition chronique de TRPA1 chez les souris APP-PS1-21 permet de prévenir l’occurrence d’hypoactivité neuronale, que ce soit dans la fréquence des sEPSC (0,10 ± 0,01 Hz pour le traitement par HC030031 vs. 0,04 ± 0,01 pour le véhicule ; p=0,01 - ) ou dans l’amplitude (33,4 ± 1,4 pA pour le traitement par HC030031 vs. 28,5 ± 1,2 pour le véhicule ; p=0,0358 – ). Les niveaux d’activité neuronale chez les souris APP/PS1-21 traitées par HC030031 étaient similaires à ceux des souris WT de la même portée (0,11 ± 0,01 Hz et 32,2 ± 1,1 pA chez les souris WT traitées par le véhicule ; p=0,386 et 0,6362, respectivement). Ce traitement chronique n’avait pas d’effet sur la fréquence des sEPSC ou sur l’amplitude chez les souris WT (p>0,999 pour les deux ; – ). Parallèlement, le traitement chronique par HC030031 chez les souris APP/PS1-21 a persisté à réduire l’hyperactivité calcique des astrocytes à 3 mois puisqu’à la fois la proportion des microdomaines actifs (49,4 ± 6,4% chez les souris traitées par HC030031 vs. 66,2 ± 2,5% chez les souris non traitées ; p=0,033 – ) et la fréquence des événements calciques au sein de ces microdomaines (0,50 ± 0,06 événement/minute chez les souris traitées vs. 0,68 ± 0,06 événement/minute chez les souris non traitées ; p ) ont été réduits jusqu’à atteindre un niveau physiologique. Le traitement chronique par HC030031 n’avait pas d’effet sur la proportion de microdomaines actifs dans le reste de la portée de souris WT (60,2 ± 3,8% chez les souris traitées par HC030031 vs. 53,2 ± 4,1% chez les souris non traitées ; p=0,2786 – ) et a légèrement augmenté la fréquence des événements calciques au sein de ces microdomaines (0,62 ± 0,04 événement calcique/minute chez les souris traitées par HC030031 vs. 0,50 ± 0,05 chez les souris non traitées ; p=0,001 – ). Pour évaluer l’impact du traitement chronique sur la densité et la morphologie des épines dendritiques, les inventeurs ont administré l’inhibiteur de TRPA1 ou le véhicule à partir du 14 ème jour post-natal jusqu’à 3 mois chez des souris transgéniques Thy1-eYFP-H-APP/PS1-21. L’inhibition chronique de TRPA1 a résulté en la normalisation de la densité des épines dendritiques (1,32 ± 0,08 épine/µm chez les souris traitées par HC030031 vs. 1,01 ± 0,04 épine/µm chez les souris traitées par le véhicule ; p=0,0019 – ) et la maturation de celles-ci (26,7 ± 2,0% épines fines chez les souris traitées par HC030031 vs. 32,0 ± 1,6% chez les souris traitées par le véhicule et 64,0 ± 1,7% épines en forme de champignon chez les souris traitées par HC030031 vs. 57,3 ± 1,5% chez les souris traitées par le véhicule ; p=0,05 et 0,0117, respectivement – ). Parallèlement à cette protection de l'intégrité de la structure des épines dendritiques, une analyse par microscope électronique a révélé que la couverture astrocytaire des synapses du radiatum du stratum était entièrement restaurée chez les souris transgéniques traitées par HC030031 (64,0 ± 1,5 % de synapses enveloppées chez les souris APP/PS1 traitées par HC030031 contre 41,7 ± 2,7 % chez les souris APP/PS1 non traitées ; p ). Par ailleurs, le traitement HC030031 n'a eu aucun effet sur l’enrobage astrocytaire chez les souris WT (62,7 ± 2,7 % de synapses enveloppées chez les souris WT traitées par HC030031 contre 54,3 ± 3,7 % chez les souris WT non traitées ; p = 0,08 - ). Globalement, ces données ont montré qu’une inhibition chronique précoce du canal TRPA1 évite l’apparition de l’hyperactivité neuronale qui semble être la force génératrice des insuffisances progressives précoces déclenchant la perte d’épines dendritiques fonctionnelles et l’hypoactivité neuronale. Exemple 3 : L’inhibition chronique de TRPA1 prévient les défauts de mémoire de travail chez des souris APP/PS1-21 de 6 mois La mémoire de travail est peut-être l’un des aspects les plus étudiés du défaut de mémoire dans la maladie d’Alzheimer. Les inventeurs ont administré quotidiennement l’inhibiteur spécifique du canal TRPA1 (HC030031) ou le véhicule par voie intrapéritonéale (5 mg/kg de poids corporel) à partir du 14 ème jour post-natal jusqu’à 6 mois chez des souris APP/PS1-21 et de type sauvage WT. Une expérience portant sur des taches de mémoire spatiale de référence et de travail dépendante de l’hippocampe a été réalisée à l’aide du test de paradigme sur labyrinthe de Barnes chez des souris de 6 mois. Pendant la période d’acquisition de 3 jours (8 essais), la latence temporelle jusqu’à ce que la souris atteigne la boîte d’échappement a diminué au cours du temps, que ce soit chez les souris transgéniques et les souris contrôles WT. Ceci indique que toutes les souris ont appris à utiliser les indices spatiaux pour trouver la boîte d’échappement ( ). Cependant, les souris APP/PS1-21 ont présenté une augmentation de la période de temps nécessaire pour atteindre la boîte d’échappement pendant cette phase d’apprentissage, ce qui suggère un défaut de mémoire spatiale de travail chez ces souris transgéniques (matérialisé par la zone sous la courbe pour la latence : 731,8 ± 91,1 chez les souris APP/PS1-21 traitées par le véhicule vs. 554,1 ± 78,9 chez les souris WT traitées par le véhicule ; p=0,0012 – ). La fonction motrice, mesurée par la vélocité des souris sur les 3 jours, était similaire dans tous les groupes (p=0,1718 – ). Pour évaluer la mémoire de référence, 24 heures après le dernier jour d’acquisition, les souris ont été soumises à un essai dans lequel la boîte d’échappement a été retirée. Comme prévu, la latence pour trouver la zone cible pour la première fois a augmenté chez les souris APP/PS1-21 (13,74 ± 2,1 s chez les souris transgéniques traitées par le véhicule vs. 4,8 ± 2,7 s chez les souris WT traitées par le véhicule ; p=0,0057 – ). Par conséquent, à la fois la mémoire spatiale de référence et la mémoire spatiale de travail étaient altérées chez les souris APP/PS1-21 de 6 mois par comparaison aux souris contrôles WT de la même portée. Le traitement par HC030031 à partir du début de la surproduction du peptide amyloïde β a partiellement restauré ces défauts mnésiques. En effet, les défauts de mémoire de travail soulignés pendant la phase d’apprentissage chez les souris transgéniques étaient complètement restaurés (AUC : 595,9 ± 77,2 chez les souris APP/PS1-21 traitées par HC030031 vs. 731,8 ± 91,1 chez les souris APP/PS1-21 traitées par le véhicule ; p=0,0089 – et ) et sont devenus similaires aux souris WT (554,1 ± 78,9 ; p=0,8054). Inversement, le traitement à long terme par HC030031 n’a pas amélioré la mémoire de référence puisque la première latence jusqu’à la zone cible pendant l’essai était augmentée de manière similaire chez les souris transgéniques traitées par HC030031 (18,5 ± 4,2 s chez les souris APP/PS1-21 traitées par HC030031 vs. 13,74 ± 2,1 s chez les souris APP/PS1-21 chez les souris traitées par le véhicule ; p=0,6109 – ). Le traitement chronique par HC030031 n’a pas eu d’impact sur les performances de mémoire de référence et de travail chez les souris contrôles WT ( - ). Les résultats présentés ci-dessus montrent qu’un traitement prophylactique par un inhibiteur du canal TRPA1 normalise l’activité astrocytaire vers des niveaux normalement détectés chez des animaux de type sauvage. Cette normalisation prévient l’implémentation de l’hyperactivité neuronale hippocampique, ce qui confirme le rôle pivot des astrocytes pour préserver l’intégrité de la synapse. Le blocage du canal TRPA1 apparaît donc suffisant pour prévenir le cercle vicieux de neurodégénérescence qui est rencontrée dans la maladie d’Alzheimer. De plus, les inventeurs ont observé que, en absence de traitement, l’hypoactivité neuronale et l’hyperactivité astrocytaire n’étaient plus dépendantes de l’activation du canal TRPA1 chez les souris transgéniques de 3 mois. Ce remodelage fonctionnel astrocytaire est le corollaire du remodelage morphologique et de l’établissement d’un phénotype inflammatoire au sein de ces cellules. Le rôle des astrocytes dans un stade avancé de la maladie d’Alzheimer est bien connu puisque le phénotype inflammatoire astrocytaire et l’astrogliose ont longtemps été associés avec la formation de plaques, contenant potentiellement l’effet toxique des espèces amyloïdes β dans la compaction des plaques mais induisant une neuroinflammation délétère. Dans un modèle murin âgé de la maladie d’Alzheimer, il a été montré que l’activité calcique astrocytaire augmente dramatiquement et devient synchrone avec les plaques Aβ corticales à proximité (Kuchibhotla, K.V. et al., Science 2009 Feb 27;323(5918) ; Delekate, A. et al., Nat. Commun. 5, 5422 (2014)). D’une manière intéressante, cette hyperactivité astrocytaire mettait en jeu le P2YR astrocytaire à la fois dans les zones corticale et hippocampique, suggérant que la signalisation calcique astrocytaire se réorganisait dans les stades pathogéniques tardifs mettant en jeu une voie purinergique. En effet, les astrocytes réactifs inflammatoires s’accompagnent de changements structuraux qui affectent probablement la machinerie de signalisation moléculaire au sein des microdomaines astrocytaires. Il se peut donc que, dans les stades plus tardifs, l’implication de TRPA1 se dirige vers la régulation de la réponse inflammatoire médiée par Aβ chez les astrocytes puisque son ablation génétique atténue les processus inflammatoires dérivés des astrocytes dans les stades tardifs de la maladie d’Alzheimer. Par conséquent, il est possible que l’inhibition du canal TRPA1 permette de bloquer la progression de la maladie d’Alzheimer par l’intermédiaire de plusieurs voies, une neuroprotectrice, l’autre anti-inflammatoire. La présente invention propose ainsi l’utilisation d’un inhibiteur du canal TRPA1 pour la prévention et le traitement de la maladie d’Alzheimer, en particulier dès un stade précoce, asymptomatique. L’inhibiteur de l’invention présente un rôle à la fois d’agent neuroprotecteur et d’agent anti-inflammatoire pour prévenir les mécanismes neurodégénératifs et inflammatoires mis en jeu dans la maladie d’Alzheimer. - Inhibiteur du canal calcique TRPA1 pour l’utilisation en tant que neuroprotecteur dans le traitement et/ou la prévention des stades précoces de la maladie d’Alzheimer et en tant qu’anti-inflammatoire dans le traitement et/ou la prévention des processus neuroinflammatoires de la maladie d’Alzheimer, choisi dans le groupe consistant en HC030031, Chembridge-5861528, A-967079, AP–18, GRC-17536, CB-625, ODM-108, GSK205, GDC-0334 et leurs dérivés. - Inhibiteur du canal calcique TRPA1 pour l’utilisation selon la revendication 1, dans lequel l’inhibiteur est HC030331. - Inhibiteur du canal calcique TRPA1 pour l’utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 ou 2, destiné à être administré à un sujet en ayant besoin dès la phase prodromale de la maladie d’Alzheimer caractérisée par une hyperactivité neuronale au niveau de l’hippocampe détectable par imagerie cérébrale et des troubles mnésiques légers. - Inhibiteur du canal calcique TRPA1 pour l’utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, destiné à être administré à un sujet en ayant besoin dans une quantité pharmaceutiquement efficace. - Inhibiteur du canal calcique TRPA1 pour l’utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel l’inhibiteur est destiné à être administré par l’une quelconque des voies d’administration choisies dans le groupe consistant en la voie orale, la voie intraveineuse, la voie intra-artérielle, la voie intradermique, la voie intrapéritonéale, la voie intracardiaque, la voie intracérébroventriculaire, la voie transdermique, la voie topique, la voie sous-cutanée, la voie nasale ou la voie pulmonaire. - Composition pharmaceutique pour l’utilisation dans le traitement et/ou la prévention des stades précoces de la maladie d’Alzheimer et dans le traitement et/ou la prévention des processus neuroinflammatoires de la maladie d’Alzheimer, comprenant : au moins l’inhibiteur selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 ; au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. - Composition pharmaceutique pour l’utilisation dans le traitement et/ou la prévention des stades précoces de la maladie d’Alzheimer et dans le traitement et/ou la prévention des processus neuroinflammatoires de la maladie d’Alzheimer selon la revendication 6, dans laquelle la composition est destinée à être administrée à un sujet en ayant besoin dans une quantité pharmaceutiquement efficace. 8 - Composition pharmaceutique pour l’utilisation dans le traitement et/ou la prévention des stades précoces de la maladie d’Alzheimer et dans le traitement et/ou la prévention des processus neuroinflammatoires de la maladie d’Alzheimer selon l’une des revendications 6 ou 7, dans laquelle la composition est destinée à être administrée à un sujet en ayant besoin par l’une quelconque des voies d’administration choisies dans le groupe consistant en la voie orale, la voie intraveineuse, la voie intra-artérielle, la voie intradermique, la voie intrapéritonéale, la voie intracardiaque, la voie intracérébroventriculaire, la voie transdermique, la voie topique, la voie sous-cutanée, la voie nasale ou la voie pulmonaire. - Composition pharmaceutique pour l’utilisation dans le traitement et/ou la prévention des stades précoces de la maladie d’Alzheimer et dans le traitement et/ou la prévention des processus neuroinflammatoires de la maladie d’Alzheimer selon l’une des revendications 6 à 8, dans laquelle la composition est destinée à être administrée à un sujet en ayant besoin dès la phase prodromale de la maladie d’Alzheimer caractérisée par une hyperactivité neuronale au niveau de l’hippocampe détectable par imagerie cérébrale et des troubles mnésiques légers.