Brevet FR3122829A1 — publié le 20221118

La présente demande de brevet concerne un procédé d’obtention d’un extrait aqueux de microalgues et/ou macroalgues comprenant des composés hydrophiles et des composés hydrophobes issus d’au moins deux microalgues, ou d’au moins une microalgue et d’au moins une macroalgue, ou d’au moins deux macroalgues. En outre, l’invention concerne lesdits extraits aqueux, ainsi que leur utilisation dans la prévention des pathologies cardiovasculaires, et en tant qu’ingrédient fonctionnel en alimentaire. Co-extraction de composés actifs à caractères hydrophiles et hydrophobes issus de microalgues et macroalgues La présente demande de brevet concerne un procédé d’obtention d’un extrait aqueux de microalgues et/ou macroalgues comprenant des composés hydrophiles et des composés hydrophobes issus d’au moins deux microalgues, ou d’au moins une microalgue et d’au moins une macroalgue, ou d’au moins deux macroalgues. En outre, l’invention concerne lesdits extraits aqueux, ainsi que leur utilisation dans la prévention des pathologies cardiovasculaires, et en tant qu’ingrédient fonctionnel en alimentaire. Art antérieur A l’heure actuelle, les extraits issus de microalgue disponibles sur le marché sont pour la majorité des extraits purifiés ne contenant qu’une seule famille de molécule : protéines, sucres ou lipides… Il est cependant envisageable de trouver des extraits combinés contenant plusieurs molécules de même nature, issues de différentes étapes d’extraction. Ainsi le document ES2728088 décrit un procédé de microencapsulation d’huiles au sein de microalgues en milieu aqueux. Néanmoins, ce brevet fait intervenir plusieurs étapes d’extraction dont une étape préliminaire à l’homogénéisation consistant en la rupture cellulaire et la formation d’émulsion avec les différents composés. De plus, le procédé évoqué fait intervenir des composés exogènes à la biomasse initiale. Par ailleurs, le document CN104413077 propose une extraction simultanée d’origan et de trèfle pour l’élaboration d’un mélange avec une activité de pesticide. Ladite invention fait intervenir un solvant éthanolique d’une part et ne comporte pas d’enjeu de solubilisation de composés de nature lipophile d’autre part. Le document ES2335333 décrit quant à lui une émulsion huile dans eau (H/E) ou eau dans huile (E/H) réalisée avec un filtrat issu d’une macération de macroalgue dans de l’eau. Ce procédé n’a donc pas vocation à solubiliser des composés de nature apolaire issus d’une matrice végétale brute puisque l’huile utilisée est une source exogène vis-à-vis de la macroalgue employée. De plus, ce procédé ne fait intervenir qu’une seule espèce de macroalgue et ne propose donc pas d’enjeu de co-extraction ou de solubilisation de composés hydrophobes ou peu solubles dans l’eau. Le document GR1008712 s’intéresse quant à lui à la solubilisation de composés aromatiques d’herbes dans une huile d’olive préalablement extraite. Ce procédé ne permet donc pas l’obtention de composés hydrosolubles et comporte deux étapes distinctes d’extraction. Enfin, le brevet FR3052064 met en jeu une extraction d’huile de graines d’une même espèce ou d’un mélange de 2 espèces. Cette huile est ensuite mélangée avec de l’eau ainsi que des mucilages de lin pour l’obtention d’une émulsion. Parallèlement à l’invention citée précédemment, celle-ci ne permet pas non plus la solubilisation de composés hydrosolubles contenus dans les graines. De plus aucune synergie d’activité n’est démontrée ici. Ainsi, aucun ingrédient issu de microalgue généré en une seule étape d’extraction ne présente à la fois des composés hydrosolubles et liposolubles. En effet, ayant des polarités différentes, toutes les molécules d’intérêt nutritionnel/santé ne peuvent être solubles dans le même solvant. La Demanderesse a développé un procédé permettant d’obtenir un ingrédient alimentaire de composition unique grâce à un procédé innovant de co-extraction simultanée de 2 espèces de microalgues différentes permettant de surmonter les problèmes ci-dessus. Contrairement aux documents cités ci-dessus, l’invention emploie l’ensemble des matières premières sous leurs formes brutes, limitant ainsi le nombre d’opérations unitaires telle que l’extraction préalable de l’huile d’une des espèces. Ceci permet en conséquent une réduction du temps de traitement ainsi que du coût de production de l’extrait final. De plus, ledit procédé ne fait intervenir aucun solvant dérivé de la pétrochimie ou présentant une toxicité quelconque ou encore un risque d’inflammabilité. Ainsi, selon un premier aspect, l’invention concerne un procédé d’obtention d’un extrait de microalgues et/ou de macroalgues comprenant des composés hydrophiles et des composés hydrophobes issus d’au moins deux microalgues, ou d’au moins une microalgue et d’au moins une macroalgue, ou d’au moins deux macroalgues comprenant les étapes de : Mélange d’au moins deux espèces de microalgues, ou d’au moins une espèce de microalgue et d’au moins une espèce de macroalgue, ou d’au moins deux espèces de macroalgues, sous forme de poudre avec un solvant aqueux, de préférence à un ratio d’entre 1% et 20% en poids total desdites au moins deux microalgues du poids du mélange microalgues/solvant ; Traitement physique du mélange obtenu à l’étape a. à une température comprise entre 4 et 30°C, de préférence par agitation ou ultrasons ; Extraction dudit mélange obtenu à l’étape b. par une méthode physique choisie parmi des micro-ondes, un broyage à billes, un traitement ultrasonore ou une homogénéisation haute pression ; Macération du mélange obtenu à l’étape c., de préférence à une température comprise entre 4 et 25°C entre 30 minutes et 12h ; Obtention d’un extrait aqueux de microalgues comprenant des composés hydrophiles et des composés hydrophobes issus desdites au moins deux microalgues. Ainsi, le procédé selon l’invention permet la co-extraction séquentielle (ou simultanée) de métabolites primaires et secondaires, de nature hydrophile et hydrophobe, issus de microalgues en milieu aqueux. Classiquement, l’eau apparaît comme un excellent solvant au sein de la plante mais est un solvant médiocre dès lors que l’on cherche à extraire des composés hydrophobes. Le procédé selon l’invention permet le développement d’un solvant auto généré à partir d’une unique étape d’extraction de microalgues et/ou macroalgues en milieu aqueux. Le solvant complexe obtenu se trouve alors structuré par les composés amphiphiles co-extraits de sorte à pouvoir inclure des composés hydrophobes desdites microalgues. Le procédé développé par la Demanderesse repose sur le fait que les composés extraits d’une souche de microalgue favorisent la solubilisation et l’extraction des composés de l’autre souche de microalgue co-extraite du fait de leurs propriétés intrinsèques. Ces composés ne pourraient être extraits seuls dans l’eau du fait de leur nature peu polaire. Par ailleurs, de tels extraits ne pourraient avoir la même composition en étant extraits séparément puis assemblés. En effet, le procédé selon l’invention permet la solubilisation et l’extraction de composés normalement insolubles dans un tel solvant grâce à leur co-extraction simultanée, difficilement possible dans le cas d’une simple extraction à l’eau. Ce phénomène de solubilisation implique des espèces telles que des hydrotropes ou molécules amphiphiles jouant le rôle de tensio-actif et améliorant ainsi la solubilité de certains composés peu polaires dans l’eau. Par « composés hydrophiles et composés hydrophobes » est entendu selon l’invention des composés choisis parmi : protéines, vitamines hydrosolubles (vitamines du groupe B), sucres, pigments hydrophiles (phycocyanine), minéraux (Fe, Ca…), et composés phénoliques pour les composés hydrophiles ; les acides gras, stérols, vitamines liposolubles (vitamine E ou tocophérols), pigments liposolubles (caroténoïdes) pour les composés hydrophobes. Par « solvant aqueux » on entend désigner de l’eau, de l’eau distillée, de l’eau milliQ, de l’eau osmosée, de l’eau acidifiée ou basifiée, une solution aqueuse tamponnée dont le pH peut varier de 5 à 12 une solution aqueuse agrémentée d’enzymes, de composés de nature amphiphile ou d’agents technologiques variés. De manière préférée, le solvant aqueux est choisi parmi de l’eau, de l’eau distillée, de l’eau acidifiée ou basifiée ou une solution aqueuse tamponnée. De manière encore plus préférée le solvant aqueux est choisi parmi un tampon phosphate et un tampon acétate, dont le pH est compris entre 6 et 11. De manière préférée, à l’étape a., le ratio entre les au moins deux espèces de microalgues et/ou macroalgues est entre 1 :10 et 10 :1. De manière préférée, à l’étape b., le traitement physique, est réalisé par : Agitation à l’aide d’une pale d’agitation pour une durée de 1 à 20 minutes, à une vitesse de 150 à 800 rpm, ou Agitation à l’aide d’un Ultraturrax sur une période allant de 1 à 20 minutes, à une vitesse comprise entre 1000 et 16000 rpm, ou Ultrasons à une fréquence comprise entre 10 et 40 kHz, de puissance 50-1000 W pour une durée comprise entre 30s et 20 minutes. De manière encore plus préférée, l’étape b. de traitement physique est réalisé par agitation à l’aide d’un Ultraturrax sur une période allant de 1 à 20 minutes, à une vitesse comprise entre 1000 et 16000 rpm. De manière préférée, l’étape c. d’extraction est réalisée par Traitement micro-ondes pour une durée de 5 à 60 min à une fréquence comprise entre 300 MHz et 30 GHz et à une puissance électrique située entre 0,5 et 30 watts/cm 3 ; ou Broyage à billes, avec des billes de diamètre 0,4 à 2 mm, un remplissage de la chambre d’extraction compris entre 60 et 90%, à une vitesse de rotation de 1000 à 4000 rpm durant 15 à 90 minutes ; ou Traitement ultrasonore (US) à une fréquence comprise entre 10 et 40 kHz, de puissance 50-1000 W pour une durée comprise entre 5 et 60 minutes ; ou Homogénéisation haute pression (HHP) à une pression cible de 500 à 2500 bars, entre 1 et 10 passages à une température comprise entre 4 et 55°C. De manière encore plus préférée, l’étape c. d’extraction est réalisée par homogénéisation haute pression (HHP) à une pression cible de 500 à 2500 bars, entre 1 et 10 passages à une température comprise entre 4 et 55°C. De manière préférée, ledit procédé comprend en outre une étape f. de séparation solide/liquide de l’extrait aqueux obtenu à l’étape e., de préférence par filtration papier, filtration membranaire ou par centrifugation. De manière préférée, l’étape f. de séparation solide/liquide de l’extrait aqueux obtenu à l’étape e. est réalisée par : Filtration papier ; ou Filtration membranaire, avec emploi d’un vide ou non, de porosité comprise entre 2 et 50µm ; ou Centrifugation durant 5 à 30 minutes à une puissance comprise entre 2500g et 10000g. De manière encore plus préférée, l’étape f. est réalisée par filtration membranaire. Cette étape f. permet d’obtenir un filtrat et un surnageant. De manière préférée, ledit procédé comprend en outre une étape g. de séchage du surnageant obtenu à l’étape f., de préférence par lyophilisation, séchage basse température ou séchage sous pression. Grâce à l’étape g., l’extrait obtenu est un extrait sec sous forme de poudre comprenant des composés hydrophiles et des composés hydrophobes issus desdites microalgues et/ou macroalgues. De manière préférée, l’étape g. de séchage du surnageant est réalisée par : Lyophilisation, Séchage basse température entre 40 et 80°C, Séchage sous pression, De manière encore plus préférée, l’étape g. de séchage est réalisée par lyophilisation ou atomisation, dans un flux d’air chaud à une température comprise entre 80°C et 300°C, de préférence entre 90°C à 220°C, Par « microalgue » on entend désigner selon la présente invention les microalgues eucaryotes, qui sont caractérisée par un noyau, comprenant par exemple les chlorophytes, les rhodophytes, les haptophytes, les bacillariophytes, les eustigmatophytes, les euglenophytes, les thraustochytriaceae ou encore les dinophytes, lesdits microalgues eucaryotes étant communément dénommées « microalgues », et les microalgues procaryotes, qui ne possèdent pas de noyau, comprenant les cyanophytes, ci-après dénommées spécifiquement « cyanobactéries ». De manière préférée selon l’invention, les microalgues eucaryotes sont choisies parmi les chlorophytes, de préférence parmi Chlorella, Auxenochlorella, Dunaliella, Tetraselmis, Haematococcus, Scenedesmus ; les eustigmatophytes, de préférence Nannochloropsis ; les euglénophytes, de préférence, Euglena ; les rhodophytes, de préférence Porphyridium ; les bacillariophyceae, de préférence Phaeodactylum et Odontella , et les thraustochytriaceae, de préférence Schizochytrium . De manière préférée, les cyanobactéries sont choisies parmi la spiruline ( Arthrospira platensis ou Arhtrospira maxima ) et l’AFA ( Aphanizomenon Floes-aquae ). De manière encore plus préférée, ladite microalgue est choisie parmi la Chlorelle, Chlorella sp., Chlorella vulgaris, Chlorella protothecoides, Chlorella sorokiniana, Chlorella pyrenoidosa, Nannochloropsis sp, Nannochloropsis gaditana, Nannochloropsis oceanica. Par « macroalgue » on entend désigner selon la présente invention les algues macroscopiques pluricellulaires dont l’appareil végétatif est visible à l’œil nu et comprenant par exemple les algues rouges, brunes et vertes. Les macroalgues seront aussi dénommées algues dans les paragraphes suivants. De manière préférée selon l’invention, les algues rouges (Rhodophyta) sont choisies parmi les genres Chondrus, Gracilaria, Porphyra, Pyropia, Kappaphycus, Euchema et/ou Palmaria . De manière préférée, les algues brunes (Phaeophyta) sont choisies parmi les genres Ascophyllum, Fucus, Undaria, Alaria, Laminaria, Sargassum , et/ou Saccharina . De manière préférée, les algues vertes (Chlorophyta) sont choisies parmi les genres Ulva, Caulerpa, Enteromorpha, Chladophora . Selon un deuxième aspect, l’invention concerne les extraits obtenus par le procédé selon l’invention. Selon un troisième aspect, l’invention concerne lesdits extraits pour utilisation en tant que médicament, de préférence dans la prévention des pathologies cardiovasculaires. Selon un quatrième aspect, l’invention concerne l’utilisation des extraits selon l’invention en tant qu’ingrédient fonctionnel en alimentaire. De manière préférée, lesdits extraits sont utilisés dans des compléments alimentaires. Exemples Exemple 1 : Procédé de co-extraction de composés hydrophiles et lipophiles en milieu aqueux en comparaison à des extractions simples Introduction : Le procédé selon l’invention est étudié pour produire une composition aqueuse enrichie en composés de nature lipophile, peu polaire, en plus des composés hydrophiles extraits par affinité dans le solvant aqueux utilisé. Le défi ici est de parvenir à extraire des composés lipidiques dans un solvant aqueux (dans lequel ils ne sont pas solubles) grâce à la coextraction. Nous nous focalisations donc au travers de cet exemple sur les lipides. La composition en lipides de l’extrait a été évaluée par la méthode de référence de Bligh and Dyer (1959), qui a permis une quantification efficace des lipides totaux. Les protéines totales seront quantifiées par la méthode de Kjeldhal, les vitamines et minéraux par HPLC, et les pigments seront quantifiés par spectrophotométrie. Étapes du procédé d’extraction : Préparation de 3 solutions distinctes, à savoir les solutions A, B et C. Dans un premier temps, une solution A d’ Arthrospira platensis à 2% dans du tampon phosphate à pH7, La solution B est préparée dans les mêmes conditions que la solution A, avec cette fois-ci à 2% de Nannochloropsis sp . , Enfin, la solution C est préparée avec 2% d’ Arthrospira platensis ainsi que 2% de Nannochloropsis sp., Pré-homogénéisation des solutions A, B et C grâce à un passage à l’Ultraturrax durant 2 minutes à 10000 rpm. Lesdites suspensions sont ensuite traitées individuellement grâce à l’homogénéisateur haute pression avec une pression cible de 1500 bars. Lesdites suspensions sont traitées en circuit ouvert et la recirculation est effectuée pour un total de 4 passages. Les extraits homogénéisés sont centrifugés à 3000 rpm pendant 10 min après une nuit de macération à 4°C puis les lipides sont quantifiés comme suit. Pour chacun des extraits issus des solutions A, B et C, ci-après nommés extraits A, B et C, un volume précis de 5,6 mL est prélevé et transféré dans un tube Drive Control (Système IKA Ultraturrax), préalablement agrémenté de 2g de billes d’agitation. L’agitation est paramétrée sur 4000 rpm durant 10min. Chaque échantillon est soumis au préalable au mode turbo (8000 rpm) durant les 30 premières secondes du traitement pour assurer la bonne répartition des billes d’agitation. Un volume précis de 7mL de chloroforme ainsi qu’un second volume de 14mL de méthanol sont ajoutés à l’extrait à doser A, B ou C avant la première mise en agitation. Un second volume de 7 mL de chloroforme est ajouté puis la solution est agitée en mode turbo durant 30 secondes. Enfin, 7 mL d’une solution de KCl à 0,85% sont ajoutés avant une nouvelle agitation à 4000 rpm pendant 10 min. Les extraits A, B et C sont centrifugés à 7000 rpm pendant 10 min et la phase inférieure est prélevée à la seringue puis transférée dans un tube à hémolyse dont la masse aura été préalablement mesurée. Les tubes sont placés sur un thermobloc paramétré à 50°C sous flux d’azote pour permettre l’évaporation totale des solvants. Enfin, les tubes correspondant aux extraits A, B et C sont à nouveau pesés et la différence de masse obtenue correspond à la masse de lipides contenue dans lesdits extraits. Les masses lipidiques obtenus pour chaque extrait sont moyennées (à raison de trois essais par extrait) puis les masses moyennes des extraits A et B sont sommées et comparées à la masse moyenne issue de l’extrait C. Paramètre d’extraction de l’exemple Paramètre s Valeurs Concentration en soluté solution A 2 % m/m ( Arthrospira platensis ) Concentration en soluté solution B 2 % m/m ( Nannochloropsis sp . ) Concentration en soluté solution C 2 % m/m ( Nannochloropsis sp . ) + 2 % m/m ( Arthrospira platensis ) Nature du solvant Tampon phosphate pH 7 Pré-homogénéisation à l’ultraturrax 2 min – 10000 rpm Homogénéisation haute pression 4 passages à 1500 bars Macération post-extraction 12h – 4°C Centrifugation 3000 rpm – 10 min Phase analysée surnageant Le procédé suivant l’invention permet l’obtention d’une quantité de composés lipophiles deux fois plus importante par coextraction simultanée que dans le cas de l’addition des extraits générés indépendamment. Procédé d’obtention d’un extrait de microalgues et/ou macroalgues comprenant des composés hydrophiles et des composés hydrophobes issus d’au moins deux microalgues, ou d’au moins une microalgue et d’au moins une macroalgue, ou d’au moins deux macroalgues comprenant les étapes de : Mélange d’au moins deux espèces de microalgues ou d’au moins une espèce de microalgue et d’au moins une espèce de macroalgue, ou d’au moins deux espèces de macroalgues, un solvant aqueux, de préférence à un ratio d’entre 1% et 20% en poids total desdites au moins deux microalgues du poids du mélange microalgues/solvant ; Traitement physique du mélange obtenu à l’étape a. à une température comprise entre 4 et 30°C, de préférence par agitation ou ultrasons ; Extraction dudit mélange obtenu à l’étape b. par une méthode physique choisie parmi des micro-ondes, un broyage à billes, un traitement ultrasonore ou une homogénéisation haute pression ; Macération du mélange obtenu à l’étape c., de préférence à une température comprise entre 4 et 25°C entre 30 minutes et 12h ; Obtention d’un extrait aqueux de microalgues comprenant des composés hydrophiles et des composés hydrophobes issus desdites au moins deux microalgues. Procédé d’obtention d’un extrait de microalgues selon la revendication précédente, caractérisé en ce que ledit procédé comprend en outre une étape f. de séparation solide/liquide de l’extrait aqueux obtenu à l’étape e., de préférence par filtration papier, filtration membranaire ou par centrifugation. Procédé d’obtention d’un extrait de microalgues selon la revendication précédente, caractérisé en ce que ledit procédé comprend en outre une étape g. de séchage du surnageant obtenu à l’étape f., de préférence par lyophilisation, séchage basse température ou séchage sous pression, permettant d’obtenir un extrait sec sous forme de poudre. Procédé d’obtention d’un extrait selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que lesdites microalgues sont choisis parmi les genres : Chlorella , Auxenochlorella , Dunaliella , Tetraselmis , Haematococcus , Scenedesmus ; Eustigmatophytes ; Euglénophytes,; Rhodophytes, Bacillariophyceae, Thraustochytriaceae. Procédé d’obtention d’un extrait selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que lesdites macroalgues sont choisis parmi les genres Chondrus , Gracilaria , Porphyra, Pyropia , Kappaphycus , Euchema , Palmaria , Ascophyllum , Fucus, Undaria , Alaria, Laminaria , Sargassum , Saccharina , Ulva , Caulerpa , Enteromorpha , et/ou Chladophora . Extraits de microalgues et/ou macroalgues comprenant des composés hydrophiles et des composés hydrophobes issus d’au moins deux espèces de microalgues, ou d’au moins une espèce de microalgue et d’au moins une espèce de macroalgue, ou d’au moins deux espèces de macroalgues, obtenus par le procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes. Extraits de microalgues comprenant des composés hydrophiles et des composés hydrophobes issus d’au moins deux espèces de microalgues, ou d’au moins une espèce de microalgue et d’au moins une espèce de macroalgue, ou d’au moins deux espèces de macroalgues selon la revendication précédente, pour utilisation en tant que médicament, de préférence dans la prévention des pathologies cardiovasculaires. Utilisation des extraits de microalgues ou macroalgues comprenant des composés hydrophiles et des composés hydrophobes issus d’au moins deux espèces de microalgues, ou d’au moins une espèce de microalgue et d’au moins une espèce de macroalgue, ou d’au moins deux espèces de macroalgues selon la revendication 6, en tant qu’ingrédient fonctionnel en alimentaire.