Brevet FR3116065A1 — publié le 20220513

La présente invention concerne un procédé in vitro de libération, de détection et/ou quantification d’acides nucléiques d’un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes : a) lyse et dénaturation protéique de l’échantillon par une protéase, b) inactivation de la protéase par un inhibiteur de ladite protéase, c) optionnellement amplification des acides nucléiques présents dans le lysat, et d) éventuellement détection et/ou quantification desdits acides nucléiques. Détection d’acides nucléiques dans un échantillon biologique DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne le domaine des technologies de détection d’acides nucléiques dans un échantillon biologique, en particulier d’acides nucléiques non purifiés. ETAT DE LA TECHNIQUE Les techniques de détection d’acides nucléiques, avec ou sans amplification, ont connu un développement dans de très nombreux domaines de la biologie. Dans une très grande majorité des cas, ces techniques de détection (ex : hybridation) précédées ou non d’une amplification (ex : PCR) supposent une libération des acides nucléique par lyse suivie d’une purification préalable des acides nucléiques. Cette étape de purification complique la mise en œuvre de la technique. On s’est donc intéressé par le passé au développement de techniques de détection directe sur l’échantillon biologique, sans purification préalable des acides nucléiques. L’échantillon biologique est soumis à une simple étape de lyse permettant la libération des acides nucléiques avant amplification (optionnelle) et détection et/ou quantification des acides nucléiques. La libération des acides nucléiques à partir d’un échantillon peut se faire par chauffage à haute température (ex : 95-98°C) et/ou par lyse chimique (ex : soude), et/ou par lyse enzymatique (ex : protéinase K). La protéinase K est une enzyme de la famille des protéases, utilisée largement dans les processus d’extraction d’acides nucléiques en biologie et plus particulièrement en biologie moléculaire pour libérer les acides nucléiques des histones, ou de leur enveloppe (capside virale par exemple), dégrader les protéines du milieu pouvant digérer et dégrader les contaminants de préparation d’acides nucléiques (DNase ou RNase). La protéinase K dégrade les protéines en coupant les liaisons peptidiques au niveau des acides aminés hydrophobes ou aromatiques. Elle est ainsi très souvent utilisée dans la préparation des acides nucléiques, comme étape préalable aux techniques de PCR et en particulier dans le cadre de PCR directe où elle permet de nettoyer les milieux. La « PCR directe » est une technique d’amplification d’une séquence cible (acides nucléiques) directement à partir d’un d’échantillon, sans purification préalable, requises pour une PCR classique. Cette technique est plus rapide que la PCR classique et est notamment utilisée pour la détection de gènes et le screening haut-débit. Les kits de PCR directe sur échantillons comprennent généralement un tampon de lyse spécifique à l'échantillon traité et un mix PCR contenant des enzymes capables d'amplifier des acides nucléiques à partir d'un extrait non purifié. Dans le cas d’une amplification par PCR avec libération des acides nucléiques par lyse puis purification des acides nucléiques, la protéinase K se retrouve éliminée lors de la phase de purification. Dans le cas d’une amplification par PCR directe où il n’y a pas d’étape de purification, la protéinase K doit être inactivée avant l’étape d’amplification de ces acides nucléiques (par exemple : PCR, RT-PCR, qPCR, RT-qPCR, digital PCR), sinon elle dégraderait les enzymes (ex : taq polymérase ou reverse transcriptase RT) nécessaires à la réalisation de l’amplification PCR. On connaît de l’art antérieur l’utilisation classique d’une étape de chauffage pour inactiver la protéinase K, par exemple une température entre 75°C et 100°C pour une durée entre 10min et 1h en fonction du type de protéinase K. On parlera d’inactivation par chauffage. Mais cette étape de chauffage présente des inconvénients : elle requiert un équipement de chauffage à haute température, génère une perte de temps dans le processus global, une perte de sensibilité (les acides nucléiques fragiles, notamment les ARNs, peuvent être dégradés par de trop fortes chaleurs), et des incertitudes métrologiques lors de la manipulation d’un grand nombre d’échantillons. Il subsiste donc le besoin de développer une nouvelle méthode d’inactivation des enzymes présentes dans le tampon de lyse d’un échantillon, en particulier d’inactivation de la protéinase K, qui permettrait en outre de ne pas altérer, en particulier dans le cas d’une amplification des acides nucléiques avant l’étape de détection, la fonctionnalité des enzymes de l’étape d’amplification PCR (ex : Taq et RT). Le Demandeur a justement démontré que l’utilisation d’un composé inactivateur de protéase (ex : protéinase K) à l’étape de lyse de l’échantillon, permettait de répondre à ce besoin et pouvait notamment être utilisé avant une amplification enzymatique des acides nucléiques sans purification préalable (ex : PCR directe). De façon inattendue, le Demandeur a en effet montré qu’il était possible de combiner avec succès une inactivation de la protéinase K par un composé inhibiteur et une amplification enzymatique des acides nucléiques présents dans le digestat (lysat) après inactivation, sans altération des enzymes nécessaires à l’amplification PCR, et sans perte de sensibilité par rapport à une inactivation classique à la chaleur. Cette nouvelle méthode, selon l’invention, d’inactivation de la protéase par un composé inhibiteur présente dans le tampon de lyse, présente de nombreux avantages par rapport à la méthode classique d’inactivation à la chaleur : Gain de temps entre 10 min et 1h (plus besoin de chauffage) ; Coût réduit : plus besoin d’appareillage de chauffage ; et Pas de perte d’acide nucléique par chauffage (pas de perte de sensibilité due à l’inactivation de la protéinase K, contrairement à la sensibilité de certains ARNs à de fortes températures). L’invention concerne, selon un premier aspect un procédé in vitro de libération, de détection et/ou quantification d’acides nucléiques d’un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes : lyse et dénaturation protéique de l’échantillon par une protéase, inactivation de la protéase par un inhibiteur de ladite protéase, optionnellement amplification des acides nucléiques présents dans le lysat, et éventuellement détection et/ou quantification desdits acides nucléiques. Un autre objet de l’invention est un kit ou ensemble pour la mise en œuvre d’un procédé in vitro de libération, de détection et/ou quantification d’acides nucléiques d’un échantillon, comprenant au moins : des réactifs pour la libération des acides nucléiques par lyse , une protéase à sérine, de préférence la protéinase K, un inhibiteur de protéase à sérine choisi dans le groupe constitué par le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), l’aminoethylbenzenesulfonyl fluoride hydrochloride (AEBSF), et leurs mélanges, de préférence le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) optionnellement un substrat de protéinase K, de préférence une albumine de sérum bovin ; et/ou un agent tensioactif non ionique, et/ou un inhibiteur de RNase, de préférence une RNasine, optionnellement en outre un colorant, éventuellement en outre des réactifs pour l’amplification desdits acides nucléiques et/ou l’amplification de gènes de ménage (contrôle endogène) et/ou de gènes d’autres pathogènes témoins (contrôle exogène), et/ou éventuellement en outre des réactifs pour la détection desdits acides nucléiques L’invention porte également sur l’utilisation d’un inhibiteur de protéase, en particulier d’un inhibiteur de protéase à sérine, de préférence choisi dans le groupe constitué par le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), l’aminoethylbenzenesulfonyl fluoride hydrochloride (AEBSF), la protéinase K inhibitor, et leurs mélanges, de préférence le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), pour inactiver la protéase présente dans un lysat d’échantillon destiné notamment à une amplification par PCR et/ou une détection et/ou quantification des acides nucléiques présents dans l’échantillon. D’autres caractéristiques, buts et avantages de l’invention ressortiront de la description qui suit, qui est purement illustrative et non limitative. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Un premier objet de l’invention est donc un procédé in vitro de libération, de détection et/ou quantification d’acides nucléiques d’un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes : a) lyse et dénaturation protéique de l’échantillon par une protéase, b) inactivation de la protéase par un inhibiteur de ladite protéase, c) optionnellement amplification des acides nucléiques présents dans le lysat, et d) éventuellement détection et/ou quantification des acides nucléiques. Selon un premier mode de réalisation, le procédé in vitro de l’invention comprend les étapes suivantes : lyse et dénaturation protéique de l’échantillon par une protéase, inactivation de la protéase par un inhibiteur de ladite protéase, et éventuellement détection et/ou quantification des acides nucléiques. Selon un autre mode particulier et préféré de réalisation, le procédé in vitro de l’invention comprend les étapes suivantes : a) lyse et dénaturation protéique de l’échantillon par une protéase, b) inactivation de la protéase par un inhibiteur de ladite protéase, c) amplification des acides nucléiques présents dans le lysat, et d) éventuellement détection et/ou quantification des acides nucléiques amplifiés. Le procédé in vitro selon l’invention comprend une étape de libération des acides nucléiques de l’échantillon, par simple lyse, sans purification. Selon un mode particulier, le procédé de l’invention comprend une étape c) d’amplification par PCR, en particulier par PCR directe en temps réel couplée avec sondes à hydrolyse ou couplée avec l’analyse HMR (high resolution melting) ou PCR digitale ou isothermale ou toute autre technique d’amplification d’acides nucléiques. La PCR directe est une technique d’amplification de ces acides nucléiques directement à partir d’un d’échantillon, sans purification préalable. Par ‘acides nucléiques’, on entend notamment les ADNs et ARNs génomiques (endogènes) du sujet et/ou les ADNs et ARNs de pathogènes ayant infecté le sujet (exogènes). En particulier, les acides nucléiques détectés (éventuellement amplifiés) selon le procédé de l’invention sont des acides nucléiques génomiques du sujet testé, ou des acides nucléiques de pathogènes ayant infecté le sujet testé ou un milieu environnemental, en particulier des ADNs et/ou ARNs de bactéries, de virus ou de parasites. On parlera ultérieurement ‘d’acides nucléiques cibles’ ou ‘séquences cibles’, par opposition aux ‘séquences contrôles’, exogènes ou endogènes de validation de la méthode. Selon un mode particulier, il s’agit d’acides nucléiques du sujet testé, par exemple pour détecter et/ou quantifier des mutations et/ou autres anomalies corrélées à des désordres physiologiques ou pathologiques. Selon un mode particulier, il s’agit d’acides nucléiques de pathogènes ayant infecté le sujet, par exemples des acides nucléiques de virus, de bactéries, ou de parasites, pour détecter et/ou quantifier une charge bactérienne ou virale. ‘L’échantillon biologique’ selon l’invention peut-être notamment un échantillon environnemental ou un échantillon de sujet animal ou humain, en particulier un échantillon de fluide corporel, un échantillon de tissu ou d’organe, ou un éluât de chiffonnette ou tout autre support permettant de tester l’environnement. Selon un mode particulier, l’échantillon biologique est un échantillon d’un sujet, en particulier un échantillon de fluide corporel choisi dans le groupe constitué par le sang et ses dérivés (ex : sérum, plasma, fractions leucocytaires, en particulier le sérum), l’urine, la salive, les selles, les sécrétions de muqueuses, les écouvillons nasopharyngés ou oropharyngés, les liquides broncho-alvéolaires, les aspirations trans-trachéales, ou un échantillon de tissu, d’organe ou biopsie, ou un éluât de chiffonnette. Le ‘sujet testé’ selon l’invention peut-être un animal ou un humain. Selon un mode particulier, le sujet est un animal choisi dans le groupe constitué par les ruminants, les chevaux, les oiseaux, les porcs, ou les animaux de compagnie. Selon un autre mode particulier, le sujet est un humain. Il peut d’agir d’un sujet sain ou un sujet affecté ou susceptible d’être affecté par un désordre physiologique ou pathologique. Selon un mode particulier, il s’agit d’un sujet affecté par un désordre physiologique ou pathologique, tel qu’un cancer, une maladie inflammatoire, une maladie infectieuse, une maladie auto-immune. En particulier, le sujet testé est un sujet infecté ou susceptible d’être infecté par un pathogène, en particulier un virus ou une bactérie. Comme virus, et sans que cette liste soit limitative, on peut notamment citer les coronavirus, tels que SARS-COV-2, 229 E , OC43, HKU1, NL63 (coronavirus humains), ainsi que le virus de la diarrhée virale bovine ou la peste porcine africaine (african swine fever virus). On peut également citer d’autres virus respiratoires humains, tels qu’influenza virus, parainfluenza virus, metapneumovirus, respiratory syncitial virus, rhinovirus, Adenovirus, Bocavirus, et Enterovirus. Comme bactéries, et sans que cette liste soit limitative, on peut notamment citer les bactéries respiratoires humaines telles que M.pneumniae , C.pneumoniae , B.pertussis , B.parapertussis , et L. pneumophila . a) Etape de lyse et dénaturation protéique de l’échantillon par une protéase Les protéases ou peptidases ont pour fonction de cliver des protéines ou peptides en hydrolysant leurs liaisons peptidiques. Selon un mode particulier et préféré, on utilise une protéase à sérine. Les protéases à sérine (EC 3.4.21) ont dans leur site actif un résidu de sérine qui joue un rôle essentiel dans la catalyse. Parmi les protéases à sérine, on peut citer notamment : La trypsine La chymotrypsine La protéinase K. Ainsi, selon un mode particulier de l’invention, la protéase utilisée à l’étape a) est choisie dans le groupe constitué par les protéases à sérine, en particulier la protéinase K, la trypsine ou la chymotrypsine, de préférence la protéinase K. Selon un mode particulier et préféré, on utilise à l’étape de lyse et dénaturation de l’échantillon à tester, une protéinase K. La protéinase K est communément utilisée en biologie moléculaire pour digérer les protéines et enlever les contaminants de préparation d’acides nucléiques. Elle permet de digérer des cellules et d’extraire des acides nucléiques (ADN ou ARN) à partir de cellules de mammifères ou de micro-organismes. La protéase sera généralement présente dans le tampon de lyse. La teneur en protéase, en particulier en protéinase K, ira généralement de 0,01mg/mL à 1mg/mL, de préférence de 0,04mg/mL à 0,35mg/mL de milieu réactionnel (tampon de lyse). L’homme du métier ajustera la teneur en protéase en fonction de la nature de l’échantillon et volume du milieu réactionnel. Le tampon de lyse comprendra généralement d’autres ingrédients, tels qu’un agent régulateur de pH, par exemple un tampon TRIS (tris(hydroxyméthyl)aminométhane), et/ou un agent réducteur tel que le B mercapto-éthanol ou le Dithiothreitol (DTT) et/ou un analogue de bases nucléiques capable d’inhiber les RNases telles le vanadyl ou vanadyl ribonucleoside complex (VRC). On peut utiliser des solutions tampons commerciales dédiées à la préparation d’acides nucléiques, notamment pour amplification par PCR. On peut citer notamment les solutions tampons (pH 8.0) commercialisées par Fisher et Eurobio notamment. L’étape de lyse et dénaturation protéique de l’échantillon par une protéase, peut se réaliser à température ambiante ou à la chaleur. Selon un mode particulier, l’étape de lyse est réalisée sans chauffage. Selon un mode particulier et préféré, l’étape de lyse est réalisée avec chauffage à une température allant de 50°C à 70°C, pendant une durée allant de 15 minutes à 1h. A l’issue de cette étape, on obtient un lysat contenant les acides nucléiques à amplifier (optionnel) et détecter. L’inactivation de la protéase, en particulier la protéinase K, est nécessaire en particulier dans le cas d’une amplification afin qu’elle n’interfère pas avec les enzymes de la réaction d’amplification par PCR. b) Etape d’inactivation de la protéase par un inhibiteur de ladite protéase Par ‘inhibiteur’ ou ‘inhibiteur enzymatique’ selon l’invention, on entend notamment un composé se liant à une enzyme et qui en diminue l’activité. L’inhibiteur peut empêcher la fixation du substrat sur le site actif en se fixant à sa place, ou provoquer une déformation de l’enzyme la rendant inactive. La liaison d'un inhibiteur peut empêcher un substrat de se fixer au site actif de l’enzyme et/ou l'enzyme de catalyser sa réaction. Cette inhibition peut être réversible ou irréversible. Les inhibiteurs irréversibles se fixent de manière covalente à l’enzyme et modifient des résidus amino-acides clés, nécessaires à l'activité enzymatique. En revanche, les inhibiteurs réversibles se lient de façon non covalente et différents types d'inhibition en résultent selon que ces inhibiteurs lient l'enzyme, le complexe enzyme-substrat, ou les deux. Dans le cadre de la présente invention, on utilise un inhibiteur de protéase. L’inhibiteur de protéase sera généralement présent dans le tampon d’arrêt, mais il peut être dans un tampon séparé. Selon un mode préféré, l’inhibiteur de protéase est dans le tampon d’arrêt. Par ‘tampon d’arrêt’ autrement nommé ‘tampon d’inactivation’ , on entend selon l’invention un tampon destiné à inactiver la protéase, c’est-à-dire empêcher son activité protéolytique en fin d’étape de lyse, et avant l’étape d’amplification des acides nucléiques. L’inhibiteur de protéase peut être un composé chimique ou un composé peptidique. Selon un mode particulier, il s’agit d’un composé peptidique. Comme exemple, on peut citer notamment le tetrapeptidyl chloromethyl ketone autrement nommé Proteinase K inhibitor de Calbiochem. Ce peptide de formule MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Phe-CH₂Cl agit comme un inhibiteur irréversible au niveau du site actif de la protéinase K. Selon un autre mode particulier et préféré, il s’agit d’un composé chimique. Comme exemples de composés chimiques utilisables dans le cadre de l’invention, on peut citer notamment les composés de type fluorure de benzènesulfonyle, leurs dérivés aminés (e.g. fluorure de benzènesulfonyle substitué, notamment sur le noyau phényle, par un groupe amino-(C1-C6) alkyle) et leurs sels, les dialkylfluorophosphates (e.g. di(C1-C6) alkylfluorophosphate), et en particulier : le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), encore appelé fluorure de benzènesulfonyle, (CAS Number 329-98-6), qui est un inhibiteur de protéase à sérine qui se lie de façon covalente au site active de la protéase, empêchant son activité protéolytique ; le fluorure de 4-(2-aminoéthyl)benzènesulfonyl (AEBSF) et ses seuls, en particulier sous forme de son chlorhydrate (CAS Number 30827-99-7), qui est un inhibiteur irréversible de protéase à sérine. Il inhibe également la trypsine, et la chymotrypsine ; le diisopropylfluorophosphate (DFP) ; de préférence le PMSF ou l’AEBSF, de préférence encore le PMSF. Ainsi, selon un mode particulier de l’invention, l’inhibiteur de protéase utilisé à l’étape b) du procédé de l’invention est un inhibiteur de protéase à sérine choisi dans le groupe constitué par le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), l’aminoethylbenzenesulfonyl fluoride hydrochloride (AEBSF), et leurs mélanges, de préférence le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF). A titre d’exemple, on utilise le PMSF de la société Merck ou l’AEBSF de la société Merck. La concentration en inhibiteur de protéase utilisée dans le procédé de l’invention pourra aller de 0,1mM à 30mM, notamment de 0,5mM à 20mM, et notamment de 0,5mM à 15mM. L’homme du métier saura ajuster la concentration d’inhibiteur de protéase en fonction de sa nature et de la nature et concentration de la protéase cible. Selon un mode particulier, la protéase est une protéinase K et l’inhibiteur de protéase est choisi parmi le PMSF et l’AEBSF, de préférence le PMSF. Selon un mode particulier, pour une concentration de protéinase K de 0,35mg/mL, on utilisera avantageusement une concentration allant de 20mM à 60mM, de préférence de 30mM à 50mM de PMSF et allant de 6,5mg/mL à 13mg/mL de AEBSF. Cette étape d’inactivation chimique de la protéase est généralement réalisée à température ambiante. Protéine leurre (optionnelle) Selon un mode particulier de l’invention, le procédé de l’invention comprend en outre la mise en contact du lysat avec une protéine leurre Par ‘protéine leurre’ selon l’invention, on entend une protéine substrat de la protéase, permettant d’éliminer l’activité protéolytique résiduelle de la protéase dans le milieu réactionnel. Comme substrat de la protéase, en particulier de la protéinase K, on peut utiliser une protéine quelconque non inhibitrice de la PCR, notamment les protéines plasmatiques, en particulier l’albumine, de préférence l’albumine de sérum bovin (BSA pour Bovine Albumine Serum), ou les collagènes, par exemple le collagène porcin. Ainsi, selon un mode particulier de l’invention, l’étape d’inactivation b) comprend en outre la mise au contact du lysat avec un substrat de ladite protéase, en particulier une protéine plasmatique ou un collagène, de préférence une protéine plasmatique telle que l’albumine, de préférence encore l’albumine de sérum bovin (BSA). De préférence, on utilise une protéine plasmatique, de préférence encore une albumine telle que la BSA. La concentration en protéine leurre ira généralement de 4mg/mL à 20mg/mL, de préférence de 6mg/mL à 10mg/mL de milieu réactionnel. L’homme du métier saura ajuster la concentration en protéine leurre en fonction de la concentration de la protéase cible. La protéine leurre peut être présente dans le tampon d’arrêt (tampon d’inactivation) ou dans un tampon séparé, ajouté avant ou après le tampon d’arrêt. Selon un mode préféré, la protéine leurre est dans le tampon d’arrêt. Agent tensioactif (optionnel) Selon un mode particulier de l’invention, le procédé de l’invention comprend en outre la mise en contact du lysat avec un agent tensioactif choisi dans le groupe constitué par les agents tensioactifs non ioniques, les agents tensioactifs anioniques, les agents tensioactifs cationiques, les agents tensioactifs zwittérioniques, et leurs mélanges. Cet agent tensioactif va faciliter la libération des acides nucléiques, avant l’étape d’amplification, améliorant ainsi la sensibilité du processus de lyse. Selon un mode particulier, l’agent tensioactif est un agent tensioactif non ionique. Comme agent tensioactif non ionique, on peut citer notamment l’octylphénoxypolyéthoxyéthanol (Triton TM X100), le nonylphenol ethoxylate (Tergitol TM de type NP-40) ou les polysorbates, en particulier le polysorbate 20 autrement nommé Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (CAS Number: 9005-64-5). On peut citer par exemple le polysorbate 20 commercialisé sous la dénomination TWEEN ® 20 par la société Merck. Ainsi, selon un mode particulier de l’invention, l’étape d’inactivation b) du procédé de l’invention comprend en outre la mise au contact du lysat avec un agent tensioactif non ionique, en particulier un octylphénoxypolyéthoxyéthanol (Triton TM X 100), un nonylphenol ethoxylate (Tergitol TM de type NP-40) ou un polysorbate, tel que le polysorbate 20. La teneur en agent tensioactif utilisée dans le procédé selon l’invention ira généralement de 0,1% à 20% en poids par rapport au poids du milieu réactionnel. L’homme du métier saura adapter la teneur en agent tensioactif en fonction de sa nature et de la séquence cible. Par exemple pour un polysorbate 20, on pourra utiliser une teneur de 5% à 20% en particulier de 8% à 15% en poids par rapport au poids du milieu réactionnel. Pour un octylphénoxypolyéthoxyéthanol (Triton TM X 100), on pourra utiliser une teneur de 1% à 10% en particulier de 2% à 5% en poids par rapport au poids du milieu réactionnel. Pour un nonylphenol ethoxylate (Tergitol TM de type NP-40), on pourra utiliser une teneur de 0,1% à 5%, en particulier de 0,2 à 1% en poids par rapport au poids du milieu réactionnel. L’agent tensioactif peut être présent dans le tampon d’arrêt ou dans un tampon séparé, utilisé avant, avec ou après le tampon d’arrêt. De préférence, l’agent tensioactif est dans le tampon d’arrêt. Protecteurs d’ARNs (optionnels) Selon un mode particulier de l’invention, le procédé de l’invention comprend en outre la mise en contact du lysat avec un protecteur d’ARN. Par ‘protecteur d’ARN’, on entend un agent qui empêche la dégradation des ARNs. On peut citer notamment les inhibiteurs de RNase, en particulier la RNasine. La teneur en RNasine utilisée dans le procédé selon l’invention ira généralement de 0,05U/µl à 25U/µl en poids par rapport au poids du milieu réactionnel. L’agent protecteur d’ARN peut être présent dans le tampon d’arrêt ou dans un tampon séparé, utilisé avant, avec ou après le tampon d’arrêt. De préférence, l’agent protecteur d’ARN est dans le tampon d’arrêt. Selon un mode particulier, l’étape b) d’inactivation comprend en outre la mise au contact du lysat avec : - un substrat de ladite protéase, notamment une protéine plasmatique ou un collagène, de préférence une protéine plasmatique telle que l’albumine, de préférence encore l’albumine de sérum bovin (BSA), et/ou - un agent tensioactif choisi dans le groupe constitué par les agents tensioactifs non ioniques, anioniques, cationiques, zwittérioniques, et leurs mélanges, notamment un agent tensioactif non ionique, en particulier un octylphénoxypolyéthoxyéthanol, un nonylphenol ethoxylate, ou un polysorbate tel que le polysorbate 20, et/ou - un inhibiteur de RNase, en particulier la RNasine. Ainsi, le tampon d’arrêt selon l’invention comprend avantageusement : un inhibiteur de protéase tel que décrit ci-dessus, pour inactiver en particulier la protéinase K, une protéine leurre telle que décrite ci-dessus, pour éliminer l’activité protéolytique résiduelle de la protéase dans le milieu réactionnel, un agent tensioactif tel que décrit ci-dessus, pour faciliter la libération ultime des acides nucléiques de leur environnement protéique, et un inhibiteur de RNase tel que décrit ci-dessus, en particulier une RNasine, et avantageusement en outre un colorant, en particulier un colorant non inhibiteur de la PCR La présence d’un colorant permet en effet de faciliter la mise en œuvre du procédé de l’invention. Selon un mode particulier et préféré de l’invention, le procédé in vitro de libération, de détection et/ou quantification d’acides nucléiques d’un échantillon d’un sujet comprend les étapes suivantes : lyse et dénaturation protéique d’un échantillon choisi dans le groupe constitué par un échantillon salivaire, un échantillon oropharyngé ou nasopharyngé, avec une protéinase K, en particulier mise en œuvre à une température de 50 à 60°C pendant 15 à 60 minutes, inactivation de la protéinase K par ajout de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), avantageusement en outre d’une albumine de sérum bovin (BSA), avantageusement en outre d’un agent tensioactif non ionique, et avantageusement en outre d’une RNasine, optionnellement amplification des acides nucléiques présents dans le lysat, et éventuellement détection et/ou quantification des acides nucléiques. c) Etape d’amplification (optionnelle) des acides nucléiques présents dans le lysat Cette étape d’amplification des séquences cibles et des séquences contrôles est réalisée par les méthodes bien connues de PCR (ex : qPCR, RT-PCR, digital PCR, PCR isothermale…), en présence d’enzymes (ex : Taq polymérase et RT-transcriptase). Par ‘séquences cibles’ ou ‘acides nucléiques cibles’, on entend des acides nucléiques génomiques du sujet testé, ou des acides nucléiques de pathogènes ayant infecté le sujet testé, en particulier des ADNs et/ou ARNs de bactéries, de virus, de parasites ou de champignons. Selon un mode particulier, il s’agit d’acides nucléiques du sujet testé, par exemple pour détecter et/ou quantifier des mutations et/ou autres anomalies corrélées à des désordres physiologiques ou pathologiques. Selon un mode particulier, il s’agit d’acides nucléiques de pathogènes ayant infecté le sujet, par exemples des acides nucléiques de virus, de bactéries ou de parasites, pour détecter et/ou quantifier une charge bactérienne ou virale. L’étape d’amplification peut nécessiter l’utilisation de séquences contrôles, endogènes et/ou exogènes. Par ‘séquences contrôle’, on entend notamment : des séquences endogènes telles que des gènes de ménage, caractérisés par leur présence intrinsèque dans toutes les cellules de l’échantillon de manière constitutive. On peut citer notamment les gènes codant pour des protéines hautement conservées telles que la protéine microglobuline bêta 2 ou la protéine d’actine et notamment la forme bêta (on parle de ‘contrôle endogène’) et/ou des séquences exogènes telles que des gènes de pathogènes autres que celui recherché mais de nature très proche de la cible ; on peut citer par exemple le mengovirus, également connu sous le nom de virus Columbia SK, le virus Elberfield de souris et d'encéphalomyocarditevirus, virus non-pathogène pour l’homme servant de contrôle exogène pour les cibles virales ARN ; pour les cibles bactériennes à ADN, on peut citer par exemple la séquence d’un micro-organisme non pathogène tel que Mycobacterium smegmatis ou E.coli (on parle de ‘contrôle exogène’). Les contrôles endogènes permettent de valider la présence et l’intégrité de l’échantillon pendant toutes les phases du processus analytique. Ils permettent de valider la présence de cellules, la bonne manipulation et libération des acides nucléiques de l’échantillon et de vérifier l’absence d’inhibiteurs de PCR. Les contrôles exogènes sont ajoutés dans l’échantillon pendant le processus analytique et permettent de valider l’efficacité et le bon déroulement des phases de libération des acides nucléiques et d’amplification. L’homme du métier saura adapter le procédé selon l’invention (présence ou non de séquences contrôles endogènes et/ou exogènes) en fonction de la cible et de la finalité (procédé de détection et/ou quantification, procédé de diagnostic…). Selon un mode particulier, le procédé de l’invention permet une co-amplification, en particulier dans un même puits, des séquences cibles (ex : séquence génomique cible du sujet ou séquence d’un pathogène susceptible d’avoir infecté ledit sujet), et de séquences contrôles. Ainsi, le procédé selon l’invention, de préférence pour PCR directe, comprend : - un système d’amplification des séquences cibles comprenant des amorces sens et antisens d’amplification des ‘séquences cibles’ sus-décrites et des sondes spécifiques, avantageusement marquées par des fluorophores, de détection des séquences cibles amplifiées ; et - éventuellement un système d’amplification des séquences contrôles endogènes (gènes de ménage) et exogènes (séquences d’un autre pathogène) comprenant des amorces sens et antisens d’amplification desdites séquences contrôles et des sondes spécifiques, avantageusement marquées par des fluorophores, de détection desdites séquences contrôles amplifiées. L’homme du métier saura choisir les amorces sens et antisens spécifiques des séquences cibles à amplifier, ainsi que les sondes spécifiques adaptées à la détection des séquences cibles et contrôle amplifiées. Selon un mode particulier, le procédé comprend : - un système d’amplification de séquences virales de coronavirus aviaire (Infectious bronchitis virus, IBV) comprenant des amorces sens et antisens d’amplification desdites séquences virales et des sondes spécifiques, avantageusement marquées par des fluorophores, de détection des séquences cibles amplifiées ; et - éventuellement un système d’amplification des séquences contrôles exogènes (ex : séquences de mengovirus) comprenant des amorces sens et antisens d’amplification desdites séquences contrôles et des sondes spécifiques, avantageusement marquées par des fluorophores, de détection desdites séquences contrôles amplifiées. Le kit pour la mise en œuvre d’un tel procédé de détection d’IBV pourra comprendre en outre un réactif comportant le virus exogène (mengovirus) inactivé et calibré à ajouter de manière constante à chaque échantillon avant le début du procédé On peut utiliser des réactifs, amorces et sondes disponibles commercialement et adaptés à une amplification PCR, en suivant les recommandations du fournisseur. d) Etape détection et/ou quantification des acides nucléiques amplifiés ou non Cette étape de détection et/ou quantification des séquences cibles amplifiées ou non est réalisée par les méthodes bien connues de l’homme du métier. Pour une détection directe (sans amplification), on peut citer les méthodes d’hybridation bien connues de l’homme du métier (ex : Northern blot, dotblot…). Pour une détection avec amplification préalable (ex : amplification Taqman, amplification isothermale, amplification digitale), on peut citer les méthodes de détection de fluorescence bien connues de l’homme du métier. Kit La présente invention porte également sur un kit ou ensemble pour la mise en œuvre d’un procédé selon l’invention, comprenant au moins : des réactifs pour la libération des acides nucléiques par lyse; une protéase à sérine, de préférence la protéinase K, un inhibiteur de protéase à sérine choisi dans le groupe constitué par le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), l’aminoethylbenzenesulfonyl fluoride hydrochloride (AEBSF), et leurs mélanges, de préférence le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), optionnellement en outre un substrat de protéinase K, de préférence une albumine de sérum bovin (BSA) et/ou un agent tensioactif non ionique, et/ou un inhibiteur de RNase, de préférence une RNasine, optionnellement en outre un colorant, éventuellement des réactifs pour l’amplification desdits acides nucléiques et/ou l’amplification de gènes de ménage (contrôle endogène) et/ou de gènes d’autres pathogènes témoins (contrôle exogène), et/ou éventuellement des réactifs pour la détection desdits acides nucléiques. La protéase à sérine est généralement présente dans le tampon de lyse. L’inhibiteur de protéase à sérine est généralement présent dans le tampon d’arrêt. Le substrat de protéinase K et l’agent tensioactif non ionique peuvent être présents dans le tampon d’arrêt ou dans un tampon séparé. Ainsi selon un mode particulier, le kit ou ensemble selon l’invention comprend au moins : Un tampon de lyse comprenant la protéinase K, Un tampon d’arrêt comprenant : un inhibiteur de protéase à sérine choisi de préférence dans le groupe constitué par le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), l’aminoethylbenzenesulfonyl fluoride hydrochloride (AEBSF), et leurs mélanges, de préférence le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) un substrat de protéinase K, de préférence une albumine de sérum bovin (BSA) un agent tensioactif non ionique, de préférence un octylphénoxypolyéthoxyéthanol, un nonylphenol ethoxylate, ou un polysorbate tel que le polysorbate 20, éventuellement en outre un inhibiteur de RNase, de préférence une RNasine et éventuellement en outre un colorant. Selon un mode particulier, le kit ou ensemble selon l’invention comprend : Un tampon de lyse comprenant une protéinase K (de 0,04mg/mL à 0,08mg/mL) Un tampon d’arrêt comprenant PMSF (20mM à 40mM) + BSA (3,25mg/mL à 6,5 mg/mL) + Tampon commercial pH 8.0 + un tensioactif non ionique de type Tween ® 20 (5% à 10%) ou alternativement Triton TM X-100 (1,25% à 2,5%) ou Tergitol TM de type NP-40 (0,25% à 0,5%), éventuellement une RNasine, et avantageusement en outre un colorant. L’homme du métier saura ajuster les teneurs en réactifs, en particulier les teneurs en protéase à sérine, inhibiteur de protéase à sérine, protéine leurre et agent tensioactif non ionique, en fonction de la nature de l’échantillon et des acides nucléiques à détecter (génomiques, pathogènes). L’invention porte également sur l’utilisation d’un inhibiteur de protéase, en particulier d’un inhibiteur de protéase à sérine, de préférence choisi dans le groupe constitué par le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), l’aminoethylbenzenesulfonyl fluoride hydrochloride (AEBSF), la protéinase K inhibitor, et leurs mélanges, de préférence le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), pour inactiver la protéase présente dans un lysat d’échantillon destiné notamment à une amplification et/ou une détection et/ou quantification des acides nucléiques présents dans l’échantillon. FIGURES Résultats qPCR du test d’inhibition de la PK par chauffage et alternativement par un inhibiteur de protéase (PMSF). Evaluation d’une amplification PCR (mesure fluorescence) avec et sans inactivation de la PK. Evaluation d’une amplification PCR (mesure fluorescence) avec ou sans PK, sur un échantillon d’écouvillon nasopharyngé positif au SARS-Cov-2. Evaluation d’une amplification PCR (mesure fluorescence) avec inactivation par chauffage ou inactivation chimique de la PK, sur un échantillon d’écouvillon nasopharyngé positif au SARS-Cov-2. Résultats qPCR du test d’inhibition de la PK avec PMSF en présence ou non de BSA. Résultats qPCR du test d’inhibition de la PK avec PMSF, BSA et en présence ou non de Tween 20. Résultats qPCR du test d’inhibition de la PK avec PMSF en présence de mix réactionnels d’enzymes Taq et RT. Résultats qPCR du test d’inhibition de la PK avec AEBSF. L’invention va être illustrée dans les exemples non limitatifs suivants. EXEMPLES Exemple 1 : Effet d’un inhibiteur de protéinase K (PK) comparée à une inhibition classique de PK par chauffage L’effet technique de l’efficacité de l’inactivation de la protéinase K (PK) par un composé inhibiteur comparé à une inactivation classique par chauffage a été démontré sur un modèle ARN purifié de coronavirus aviaire (Infectious bronchitis virus, IBV). L’objectif ici était de démontrer que l’inhibiteur de PK permettait bien d’inactiver la PK aussi bien que peut le faire l’inactivation classique par chauffage à 95°C pendant 10 minutes. Pour cela nous avons réalisé une amplification PCR de l’ARN du virus IBV purifié, selon différentes conditions comparatives : - sans chauffage (Témoin), - après chauffage à 95°C 10minutes (effet de chauffage sur la détection de l’ARN), - après chauffage 95°C pendant 10min en présence de PK (impact du chauffage sur l’inactivation de la PK), - avec ajout de 10mM ou 16mM d’un inhibiteur de PK, le Fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), en présence de PK (impact de l’inhibiteur sur l’inactivation de la PK). Les résultats sont présentés à la et dans le tableau 1 ci-dessous : Méthode Cq ARN seul 24,82 ARN seul 95°C 10’ 25,10 ARN+ PK 95°C 28,71 ARN + PK + PMSF 10 mM 28,61 ARN + PK + PMSF 10 mM 26,55 Le C q (cycle de seuil) correspond à l'intersection entre une courbe d'amplification et une ligne de seuil. Il correspond à une mesure relative de la concentration de la cible dans la réaction de PCR. « Cq » correspond à une valeur de sensibilité de détection des Acides Nucléiques. Ainsi, plus le Cq est précoce, plus il y a de matière (Acide Nucléique au départ) donc plus la charge de l’agent pathogène est importante chez le patient testé. Le Cq va donc être en biologie moléculaire une des données principales pour établir une quantification relative de « la charge infectieuse ». Ces résultats montrent que le chauffage de l’ARN pendant 10min n’induit pas de perte de Cq, donc pas de perte de matière. En revanche le chauffage en présence de PK induit un décalage dans la détection de l’ARN traduisant une perte de matière, la PK ne semble donc pas totalement inactivée par le chauffage à 95°C pendant 10min. L’ajout d’un inhibiteur de PK (PMSF) à 10mM permet une détection de l’ARN équivalente à l’inactivation classique au chauffage. Cela indique que la présence du PMSF à cette concentration est suffisante pour inactiver la PK, aussi bien que l’inactivation classique par chauffage. Par ailleurs, quand on augmente la concentration de PMSF, on observe que la détection se rapproche encore plus du témoin seul, indiquant que l’on inactive la PK encore mieux que par l’inactivation classique par chauffage. L’utilisation d’un inhibiteur est donc avantageuse, dans une condition de lyse et dénaturation protéique d’un échantillon avec une protéase (ex : PK), comparativement à une inactivation classique par chauffage. Exemple 2 : Inactivation nécessaire de la PK avant l’amplification PCR Exemple 2-1 : amplification et détection d’un ARN viral IBV extrait L’intérêt d’inactiver la PK avant l’utilisation en PCR a été ici redémontré. Pour ce faire, nous avons utilisé un ARN viral IBV déjà extrait, et rajouté de la PK selon 3 conditions opératoires : de la PK inactivée par chauffage (comparatif), ou de la PK non inactivée (témoin) ou de la PK en présence de PMSF 10mM (invention). Puis nous avons amplifié cet ARN viral par RT-qPCR. Le premier échantillon contient une quantité définie d’ARN IBV extrait dans lequel on a rajouté de la PK à une concentration de 0,3 mg/mL, inactivée par chauffage 95°C 10 minutes (comparatif). Pour la quantité définie d’ARN IBV, on utilise une dilution au 1/3000 e qui sort à un Cq de 24-25. Le second échantillon contient la même concentration d’ARN IBV extrait, mais la PK (même concentration) n’est pas inactivée (témoin). Le troisième échantillon contient toujours la même concentration en ARN et en PK mais cette fois-ci, la PK est inactivée par une solution d’arrêt contenant le PMSF seul 10 mM (invention). 5 µL de chaque échantillon est ajouté aux 15 µL de mix réactionnel (ID Gene™ Infectious Bronchitis Duplex d’IDvet) et l’amplification de l’ARN par RT-qPCR est réalisée selon les préconisations du fournisseur : ID Gene™ Infectious Bronchitis Duplex d’IDvet Programme d’Amplification : 10 min à 50°C 2 min à 95°C 10 sec à 95°C 40 steps 30 sec à 60°C *acquisition de la fluorescence. Les résultats sont présentés à la . On observe qu’aucune amplification n’est pas détectée dans le cas où la Protéinase K n’est pas inactivée (témoin), alors que l’ARN est bien détecté dans les deux autres cas (présence d’une courbe caractéristique). Les résultats nous montrent bien qu’en l’absence d’inactivation (par un composé inhibiteur ou par chauffage), la protéinase K ne peut en aucun cas être utilisée avec une technique de PCR car elle dégrade les enzymes nécessaires à la réalisation de la réaction. Exemple 2-2 : amplification et détection d’un ARN viral de SARS-Cov-2 Nous avons utilisé des surnageants d’écouvillons nasopharyngés testés positifs au coronavirus SARS-CoV-2 et montré l’intérêt d’une inactivation chimique de la PK par rapport à une inactivation par chauffage. Dans un premier temps, on a testé comparativement des conditions de chauffage ou traitement à la PK : Chauffage simple sans protéinase K (PK) à 56°C 30min Chauffage simple sans protéinase K (PK) à 95°C 10min ; Ajout d’un tampon de lyse avec PK (0,04mg/mL) puis incubation 30min à 56°C Ajout d’un tampon de lyse avec PK puis incubation 30min à 56°C à température ambiante. Puis nous avons amplifié cet ARN viral par RT-qPCR. Pour la quantité définie d’ARN viral SARS-Cov-2, on utilise un échantillon de surnageant d’écouvillons nasopharyngés d’un patient préalablement testés par purification et amplification et ressorti positif à un Cq de 18-19. 5 µL de chaque échantillon est ajouté aux 8 µL de mix réactionnel et l’amplification de l’ARN par RT-qPCR est réalisée selon les préconisations du fournisseur (voir programme d’amplification ci-dessous). Pour chaque réaction d’amplification, on utilise 0,4 µM de chacune des amorces et 0,2 µM de sonde. Le Master Mix et la Reverse Transcriptase (RT) sont ajoutés selon les concentrations préconisées par le fournisseur : Capital™ qRT-PCR Probe Mix 4X de chez Biotechrabbit (Ref : BR0502003) : pour les conditions ‘sans PK’ : prélèvement direct des 5µl après le chauffage ; pour les conditions ‘avec PK’ : prélèvement de 20µl après chauffage avec PK et ajout de 5µl de tampon d’arrêt puis prélèvement de 5µl et ajout de 8µl de mix pour PCR. Programme d’Amplification : 10 min à 50°C 2 min à 95°C 10 sec à 95°C 40 steps 30 sec à 60°C *acquisition de la fluorescence (fluorophore FAM= fluorescéine). Les résultats sont présentés dans le tableau 4 suivant et à la . Méthode Cq (FAM) Chauffage 56°C 30min sans PK 23.1 Chauffage 56°C 30min avec PK 19.9 Chauffage 95°C 10 min sans PK 22.0 Incubation TA 30 min avec PK 19.5 On observe que l’ajout de PK présente un réel intérêt pour sortir des signaux plus précoces et donc gagner en sensibilité par rapport à un simple chauffage. Dans un second temps, on a testé comparativement des conditions d’inactivation de la PK par chauffage ou par traitement avec un inhibiteur chimique selon l’invention (PMSF 4mM), avant l’étape d’amplification PCR sur le protocole décrit ci-dessus. Les résultats sont présentés dans le tableau 5 suivant et à la . Méthode Cq (FAM) Chauffage 56°C 30min avec PK + blocage chimique 19.9 Chauffage 56°C 30min avec PK + blocage chaleur 23.8 Incubation TA 30 min avec PK + blocage chimique 19.5 Incubation TA 30 min avec PK + blocage chaleur 22.7 On observe que l’utilisation d’un blocage chimique permet de détecter le signal plus précocement et donc d’être plus sensible sur la détection des échantillons. Exemple 3 : Effet de l’ajout d’une protéine leurre de la PK à l’inhibiteur de PK L’objectif ici était de démontrer que l’ajout d’une protéine « leurre » comme l’albumine de sérum bovin (BSA) permet d’inactiver l’activité résiduelle de la PK restante, et ainsi de diminuer la quantité de PMSF à ajouter pour inactiver totalement l’activité de la PK. Pour cela nous avons amplifié par PCR l’ARN purifié IBV seul (témoin de détection attendue), l’ARN purifié avec PMSF 10mM ou 16mM en présence de PK (témoin inactivation par un composé inhibiteur) et l’ARN purifié avec PMSF 10mM ou 16mM en présence de PK + BSA à 4mg/ml ou 8mg/ml. Les résultats sont présentés dans la et le tableau 6 suivant : PMSF 10Mm Cq Cq PMSF 16 mM ARN seul 24,82 24,82 ARN seul ARN seul 95°C 10’ 25,1 25,1 ARN seul 95°C 10’ ARN + PK PMSF 10mM 28,61 26,55 ARN + PK PMSF 16mM ARN + PK PMSF 10mM+ BSA 4mg/mL 25,41 25,38- 26,18 ARN + PK PMSF 16mM+ BSA 4mg/mL ARN + PK PMSF 10mM+ BSA 8 mg/mL 25,01 25,09 ARN + PK PMSF 16mM+ BSA 8 mg/mL En présence de PMSF à 10mM avec la PK à 0.3mg/ml, le signal n’est pas restauré à 100% (Cq plus tardif) ce qui signifie que la PK n’est pas entièrement inactivée. Quand on augmente la quantité de PMSF on constate que le retard de Cq devient plus faible, ce qui indique que l’augmentation du PMSF permet bien de mieux inactiver la PK. Mais des concentrations trop importantes de PMSF peuvent interférer avec les enzymes de la PCR et nuire à l’étape d’amplification PCR. L’ajout d’une protéine leurre (ici BSA) permet de restaurer la détection du signal à un Cq équivalent au témoin (ARN seul), ce qui indique qu’elle permet d’éliminer les activités résiduelles de la PK, en protégeant ainsi les enzymes de PCR. Plus on ajoute de BSA plus la restauration du signal semble importante. Ces résultats montrent qu’il peut être avantageux d’associer une protéine leurre telle que la BSA à un inhibiteur de PK tel que PMSF, pour obtenir une inactivation totale de la PK, à des teneurs plus faibles en PMSF. Exemple 4 : Effet de l’ajout d’un agent tensioactif non ionique à l’inhibiteur de PK L’effet de l’ajout d’un agent tensioactif non ionique tel que le polysorbate-20 (Tween 20) dans le tampon d’arrêt a été évalué dans cet exemple. L’objectif était de montrer qu’il permettait une meilleure libération de l’ARN viral et d’améliorer ainsi le processus de lyse, avant l’étape d’amplification. Un écouvillon sec de 25µl de surnageant d’écouvillon nasopharyngé positif pour sars-cov2 a été préparé et est ensuite repris dans le tampon de lyse (TE + PK 0,08 mg/mL) puis chauffé à 56°C pendant 30min. Un volume de 20µl du lysat ainsi obtenu a été inactivé avec 5µl d’un tampon d’arrêt contenant le Tween 20 (PMSF 40 mM / BSA 6,5 mg/mL / Tween20 10 %) ou d’un tampon d’arrêt de composition similaire mais sans Tween 20 (PMSF 40 mM / BSA 6,5 mg/mL). Les résultats sont présentés à la . On observe qu’en ajoutant du Tween 20 dans le tampon d’arrêt, on constate un gain de sensibilité se traduisant par l’obtention d’un Cq plus précoce en PCR. Ces résultats montrent que l’ajout d’un agent tensioactif non ionique dans le tampon d’arrêt favorise la libération de l’ARN viral pas encore extrait, et améliore ainsi la sensibilité du processus de lyse. Exemple 5 : Utilisation de la PK inactivée par PMSF avec différentes enzymes Taq et RT de PCR Différentes Taq et RT (avec leurs tampons respectifs) ont été testées. Nous avons amplifié l’ARN viral extrait seul (témoin) ou en présence de différentes doses de PK (0,12mg/mL et 0,24mg/mL) et des doses constantes d’inhibiteur PMSF (8mM) et de BSA (1,3mg/mL). Pour chaque réaction d’amplification, on utilise 0,4 µM de chacune des amorces et 0,2 µM de sonde. Le Master Mix et la Reverse Transcriptase (RT) sont ajoutés selon les concentrations préconisées par le(s) fournisseur(s). On a notamment testé les mix Taq et RT suivants : Le Mix A : Capital™ qRT-PCR Probe Mix 4X de chez Biotechrabbit (Ref : BR0502003) Et le Mix B : Lyoready 1-Step RT-qPCR Mix 2X de chez Meridian-Bioline (Ref : MDX024) Les résultats sont présentés à la . La PK est bien inactivée puisque le signal observé avec les mix A et B est équivalent au signal sans PK. Ces résultats montrent que l’utilisation d’une PK inactivée par PMSF n’altère pas les réactions d’amplification PCR en présence d’enzymes Taq et RT. L’homme du métier saura ajuster les conditions opératoires (teneurs Taq, RT et PK inactivée) en fonction de la nature des mix Taq et RT commercialisées et des recommandations des fournisseurs. Exemple 6 : Effet de l’AEBSF sur l’inactivation de la PK La PK est utilisée à une concentration classique de 0,35 mg/mL. Différentes concentrations de AEBSF ont été testées et une concentration de 1mg/mL a été choisie pour réaliser l’amplification PCR en présence d’ARN extrait (ARN viral IBV) pour identifier son éventuel effet inhibiteur sur les enzymes Taq et RT de l’amplification PCR. Les résultats sont illustrés au tableau 7 ci-dessous et à la . Méthode Cq ARN seul 24,93 ARN + PMF BSA 24,82 ARN+ AEBSF 1 mg/mL 27,23 10mM de PMSF correspond à 1,742 mg/mL sur la base du calcul suivant : Masse molaire PMSF = 174,2 g/mol 0,01 mol/L * 174,2 g/mol = 1,742 g/L de PMSF = 1,742 mg/mL Ces résultats montrent que AEBSF, comme le PMSF, est un autre inhibiteur de PK efficace et compatible avec une amplification PCR (n’altère pas les enzymes de PCR). Exemple 7 : Mise en œuvre d’un procédé selon l’invention 7-1 : amplification et détection d’ARN viral IBV Dans cet exemple, on a cherché à détecter des acides nucléiques de coronavirus aviaire (Infectious bronchitis virus, IBV) dans un écouvillon naso-pharyngé. Le procédé a consisté à : 1/ Récupérer le surnagent d’écouvillon à tester et ajouter à l’intérieur le tampon de lyse comprenant la protéinase K (0,08mg/mL) 3/ Vortexer 30s 4/ Centrifuger quelques secondes pour ramener la totalité de l’échantillon au fond du tube 5/ Faire chauffer l’échantillon 30min à 56°C 6/ Vortexer 7/ Centrifuger quelques secondes pour ramener la totalité de l’échantillon au fond du tube 8/ Homogénéiser la solution d’arrêt (tampon d’arrêt comprenant 40mM de PMSF, 6,5mg/mL de BSA et 10% de Tween 20 ou 2,5% de Triton X-100 ou 0,5% de Tergitol TM de type NP-40) délicatement par aspire-refoulement 9/ Dans une pré-plaque de dilution (ou dans des tubes eppendorf), distribuer 5µl de tampon d’arrêt par puits d’échantillon lysé 10/ Prélever 20µl du surnagent de lysat (après chauffage) et les mélanger délicatement par aspiration/refoulement au 5µl de solution d’arrêt. 11/ Dans une plaque ou des barrettes PCR, distribuer le mix réactionnel suivant le protocole d’amplification du fournisseur (ID Gene™ Infectious Bronchitis Duplex d’IDvet) 12/ Ajouter 5µl du lysat inactivé 13/ Réaliser la PCR suivant les recommandations du fournisseur. 7-2 : amplification et détection d’ARN viral de SARS-Cov-2 Dans cet exemple, on a cherché à détecter des acides nucléiques de coronavirus humain (SARS-Cov-2) dans un écouvillon naso-pharyngé. Le procédé a consisté à : 1/ Récupérer le surnagent d’écouvillon à tester et ajouter à l’intérieur le tampon de lyse comprenant la protéinase K (0.04mg/ml en présence de l’échantillon) 3/ Vortexer 30s 4/ Centrifuger quelques secondes pour ramener la totalité de l’échantillon au fond du tube 5/ Faire chauffer l’échantillon 30min à 56°C 6/ Vortexer 7/ Centrifuger quelques secondes pour ramener la totalité de l’échantillon au fond du tube 8/ Homogénéiser la solution d’arrêt (tampon d’arrêt comprenant 20mM de PMSF, 3.25mg/mL de BSA et 5% de Tween 20 ou 1.25% de Triton X-100 ou 0.25% de Tergitol TM de type NP-40) délicatement par aspire-refoulement, 9/ Dans une pré-plaque de dilution (ou dans des tubes eppendorf), distribuer 5µl de tampon d’arrêt par puits d’échantillon lysé, 10/ Prélever 20µl du surnagent de lysat (après chauffage) et les mélanger délicatement par aspiration/refoulement au 5µl de solution d’arrêt 11/ Dans une plaque ou des barrettes PCR, distribuer 8µl d’un mix composé de 0,4 µM de chacune des amorces et 0,2 µM de sonde. Le Master Mix et la Reverse Transcriptase (RT) sont ajoutés selon les concentrations préconisées par le fournisseur : Capital™ qRT-PCR Probe Mix 4X de chez Biotechrabbit (Ref : BR0502003) 12/ Ajouter 5µl du lysat inactivé, 13/ Réaliser la PCR suivant les recommandations du fournisseur. Procédé in vitro de libération, de détection et/ou de quantification d’acides nucléiques d’un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes : lyse et dénaturation protéique de l’échantillon par une protéase, inactivation de la protéase par un inhibiteur de ladite protéase, optionnellement amplification des acides nucléiques présents dans le lysat, et éventuellement détection et/ou quantification desdits acides nucléiques. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu’il comprend une étape c) d’amplification desdits acides nucléiques par PCR, en particulier par PCR directe ou par PCR digitale ou isothermale. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que la protéase utilisée à l’étape a) de lyse est choisie dans le groupe constitué par les protéases à sérine, en particulier la protéinase K, la trypsine ou la chymotrypsine, de préférence la protéinase K. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l’inhibiteur de protéase utilisé à l’étape b) d’inactivation est un inhibiteur de protéase à sérine choisi dans le groupe constitué par le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), l’aminoethylbenzenesulfonyl fluoride hydrochloride (AEBSF), et leurs mélanges, de préférence le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF). Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l’étape b) d’inactivation comprend en outre la mise au contact du lysat avec : - un substrat de ladite protéase, notamment une protéine plasmatique ou un collagène, de préférence une protéine plasmatique telle que l’albumine, de préférence encore l’albumine de sérum bovin (BSA), et/ou - un agent tensioactif choisi dans le groupe constitué par les agents tensioactifs non ioniques, anioniques, cationiques, zwittérioniques, et leurs mélanges, notamment un agent tensioactif non ionique, en particulier un octylphénoxypolyéthoxyéthanol, un nonylphenol ethoxylate, ou un polysorbate tel que le polysorbate 20, et/ou un inhibiteur de RNase, en particulier la RNasine. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l’échantillon biologique est un échantillon d’un sujet, en particulier d’un animal ou d’un humain, notamment un échantillon de fluide corporel choisi dans le groupe constitué par le sang et ses dérivés, l’urine, la salive, les selles, les sécrétions de muqueuses, les écouvillons nasopharyngés ou oropharyngés, les liquides broncho-alvéolaires, les aspirations trans-trachéales ou un échantillon de tissu, d’organe ou biopsie, ou un éluât de chiffonnette. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les acides nucléiques détectés à partir du lysat sont des acides nucléiques génomiques du sujet testé, ou des acides nucléiques de pathogènes ayant infecté le sujet testé, en particulier des ADNs et/ou ARNs de bactéries, de virus, de parasites ou de champignons. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes suivantes : a) lyse et dénaturation protéique d’un échantillon choisi dans le groupe constitué par un échantillon salivaire, un échantillon oropharyngé ou nasopharyngé, avec une protéinase K, en particulier mise en œuvre à une température de 50 à 60°C pendant 15 à 60 minutes, b) inactivation de la protéinase K par ajout de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), avantageusement en outre d’une albumine de sérum bovin (BSA), avantageusement en outre d’un agent tensioactif non ionique, et avantageusement en outre d’une RNasine, c) optionnellement amplification des acides nucléiques présents dans le lysat, et d) éventuellement détection et/ou quantification des acides nucléiques. Kit ou ensemble pour la mise en œuvre d’un procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu’il comprend au moins : des réactifs pour la libération des acides nucléiques par lyse, une protéase à sérine, de préférence la protéinase K ; un inhibiteur de protéase à sérine choisi de préférence dans le groupe constitué par le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), l’aminoethylbenzenesulfonyl fluoride hydrochloride (AEBSF), et leurs mélanges, de préférence le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) ; optionnellement en outre un substrat de protéinase K, de préférence une albumine de sérum bovin (BSA) ; et/ou un agent tensioactif non ionique, et/ou un inhibiteur de RNase, de préférence une RNasine, optionnellement un colorant, éventuellement en outre des réactifs pour l’amplification desdits acides nucléiques et éventuellement l’amplification de gènes de ménage (contrôle endogène) et/ou de gènes d’autres pathogènes témoins (contrôle exogène) et/ou éventuellement en outre des réactifs pour la détection desdits acides nucléiques. Kit ou ensemble selon la revendication 9, caractérisé en ce qu’il comprend au moins : Un tampon de lyse comprenant la protéinase K, Un tampon d’arrêt comprenant : un inhibiteur de protéase à sérine choisi de préférence dans le groupe constitué par le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), l’aminoethylbenzenesulfonyl fluoride hydrochloride (AEBSF), et leurs mélanges, de préférence le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) un substrat de protéinase K, de préférence une albumine de sérum bovin (BSA) un agent tensioactif non ionique, de préférence un octylphénoxypolyéthoxyéthanol, un nonylphenol ethoxylate, ou un polysorbate tel que le polysorbate 20, éventuellement en outre un inhibiteur de RNase, de préférence une RNasine et éventuellement en outre un colorant. Utilisation d’un inhibiteur de protéase, en particulier d’un inhibiteur de protéase à sérine, de préférence choisi dans le groupe constitué par le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), l’aminoethylbenzenesulfonyl fluoride hydrochloride (AEBSF), la protéinase K inhibitor, et leurs mélanges, de préférence le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), pour inactiver la protéase présente dans un lysat d’échantillon destiné notamment à une amplification par PCR et/ou une détection et/ou quantification des acides nucléiques présents dans l’échantillon.