Brevet FR3119325A1 — publié le 20220805

La présente invention concerne une composition liposomale administrable par voie orale, nasale ou pulmonaire comprenant un phospholipide chargé négativement, optionnellement un phospholipide zwitterionique, un stérol, et une ou plusieurs substance(s) amphiphile(s) d'intérêt biologique, de préférence un immunostimulant lipophile utile pour traiter et / ou prévenir toute pathologie mettant en œuvre l’activation des monocytes et/ou des macrophages. (pas de figure) COMPOSITIONS LIPOSOMALES ORALES DOMAINE DE L’INVENTION L’invention concerne de nouvelles compositions liposomales orales et leurs utilisations. CONTEXTE DE L’INVENTION L'effet thérapeutique d'une substance administrée est habituellement directement lié à la quantité et à la vitesse à laquelle la substance atteint la circulation sanguine. De nombreux facteurs affectent la capacité de la substance à atteindre la circulation systémique, notamment: le site d'entrée dans l'organisme, la forme physique de la substance, la conception de la formulation du produit, les propriétés physico-chimiques de la substance active et des excipients, et une absorption appropriée de ladite substance active. L'administration orale d'une substance thérapeutique est la forme d'administration la plus courante aujourd'hui en raison de la commodité et de la facilité d'administration. Les facteurs qui influencent l'absorption, et donc la capacité de la substance à atteindre la circulation sanguine d'une substance administrée par voie orale sont liés aux propriétés physico-chimiques de la substance, aux facteurs physiologiques du tractus gastro-intestinal et aux caractéristiques de la forme posologique. Les formes posologiques orales conventionnelles se composent de solutions, suspensions, poudres, capsules de gélatine en deux parties, capsules de gélatine molle, comprimés avec ou sans enrobage. La présente invention concerne une composition liposomale administrable par voie orale, nasale ou pulmonaire comprenant un phospholipide chargé négativement, un phospholipide zwitterionique, un stérol, et une ou plusieurs substance(s) amphiphile(s) d'intérêt biologique, de préférence un immunostimulant lipophile utile pour traiter et / ou prévenir toute pathologie mettant en œuvre l’activation des monocytes et/ou des macrophages (système immunitaire inné). Il existe des médicaments anticancéreux sous la forme de liposomes qui stimulent le système immunitaire des patients. Cependant ces médicaments sont le plus souvent administrés sous formes parentérales, notamment par la voie intraveineuse. L’un de ces médicaments est le mifamurtide liposomal, commercialisé sous le nom de Mepact®. Le mode d’administration de ce médicament est très contraignant pour le patient puisqu’il est administré une à deux fois par semaine, sous forme d’une perfusion intraveineuse pendant 1 heure. De plus, le traitement doit être administré sous surveillance médicale, donc préférentiellement dans un hôpital. Ce médicament est indiqué pour le traitement de l’ostéosarcome non-métastatique. Le terme "liposomes" se réfère généralement à des structures lipidiques uni- ou multilamellaires qui peuvent être chargés d'agents thérapeutiques, par exemple l'agent thérapeutique est encapsulé à l'intérieur du liposome, et / ou l'agent thérapeutique peut être attachés au liposome ou incorporés dans la ou les bicouche(s) lipidique(s). Ces formulations liposomales se sont avérées avoir une efficacité accrue par rapport au médicament libre. Par exemple, il a été démontré qu'une formulation liposomale comprenant la vinca alcaloïde vincristine a une plus grande efficacité contre les cellules leucémiques, par rapport à la vincristine libre et qu'elle présente une toxicité globale réduite. Outre leur capacité à améliorer l'efficacité thérapeutique des composés biologiquement actifs encapsulés, les liposomes présentent des avantages importants tels que la réduction de la dose efficace de substances biologiquement actives formulées par rapport à l'utilisation des mêmes composés libres. Les problèmes pharmaceutiques associés à l'administration orale de liposomes sont: 1) le pH de l'estomac, 2) les sels biliaires et 3) les enzymes digestives, principalement les lipases. Le pH non tamponné de l'estomac peut varier de 1,5 à 2,5 et peut provoquer une instabilité chimique de la surface de la membrane liposomale. Les sels biliaires agissent comme des détergents et provoquent une instabilité de la bicouche liposomique par émulsification. Lors d'une exposition à des lipases et à d'autres enzymes, les groupes de tête polaire ou les chaînes acyle des phospholipides peuvent être clivés et ainsi rompre la vésicule liposomique. La dégradation des liposomes doit être évitée car les médicaments formulés sous forme de liposomes et administrés par voie orale doivent être absorbés sous la forme de liposomes intacts et non dégradés dans la circulation sanguine générale afin de conserver leurs propriétés pharmacologiques. La dégradation des liposomes entraine également une variabilité de l’absorption du principe actif contenu dans les liposomes. Cette variabilité de l’absorption du principe actif est un problème puisque la proportion de principe actif absorbé après une administration orale doit être contrôlée et raisonnablement prédictible. L’état de la technique a déjà proposé plusieurs types de liposomes renfermant différentes combinaisons de lipides avec ou sans immunostimulant lipophile. Cependant, l’état de la technique n’a pas divulgué de formulations liposomales suffisamment stables en présence de sels biliaires et optionnellement dans un milieu acide et enzymatique simulant l’environnement gastro-intestinal, pour assurer un traitement efficace lorsqu’une formulation liposomale renfermant une ou plusieurs substance(s) amphiphile(s) d'intérêt biologique, de préférence un immunostimulant lipophile est administrée par voie orale. Par exemple, le document WO2007014754 décrit une composition constituée d'une ou plusieurs substance(s) amphiphile(s) d'intérêt biologique, préférentiellement un immunostimulant lipophile et une combinaison de phospholipides, en présence de cholestérol, utile pour l'activation in vivo du système immunitaire. Ce document décrit spécifiquement une composition renfermant du MTP-PE (muramyl tripeptide phosphatidyl éthanolamine), et comprenant 62,5% de palmitoyl-oléoyl-phosphatidylcholine (POPC), 26,8% de di-oléoyl-phosphatidylsérine (DOPS) et 10,7% de cholesterol. Ce document décrit la préparation de comprimés constitué d'Avicel, de polyvinylpyrollidone et de lyophilisat d’une composition liposomale comprenant un lipopeptide synthétique, 70% de POPC et 30% de DOPS. Un autre document décrit l'activité biologique in vivo du muramyl tripeptide synthétique, CGP 19835A, lorsqu'il est encapsulé dans des liposomes de phosphatidylcholine (POPC-19835A) et administré par voie orale comme immunomodulateur à des souris. Les liposomes ont été rapidement absorbés dans l'intestin et ont atteint la circulation systémique en 4 h. Les macrophages alvéolaires récoltés dans les poumons de souris 24 h après une alimentation unique de POPC-19835A étaient tumoricides vis-à-vis des cellules cibles du carcinome rénal murin (S. Tanguay et al., Cancer Res. 1994 Nov. 15;54(22):5882-8) Ainsi, malgré l’existence de plusieurs compositions liposomales pouvant être administrées par voie orale, il existe toujours un besoin de nouvelles compositions liposomales administrables par voie orale, renfermant une ou plusieurs substance(s) amphiphile(s) d'intérêt biologique, dont la stabilité est améliorée en présence de sels biliaires. BREF APERÇU DE L’INVENTION Dans ce contexte d’une recherche de nouvelles compositions thérapeutiques améliorées, un premier but de l’invention est de proposer une nouvelle composition liposomale. Un second but de l’invention est de proposer un procédé permettant de produire ladite composition liposomale. Enfin, un autre but de l’invention est de proposer des compositions pharmaceutiques et leurs utilisations. DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION Le demandeur de la présente invention a donc montré qu'un liposome comprenant un phospholipide chargé négativement, un phospholipide zwitterionique, un stérol dans certaines gammes en % en poids ou en mole et une ou plusieurs substance(s) amphiphile(s) d'intérêt biologique, de préférence un immunostimulant lipophile utile pour l'activation du système immunitaire, en particulier l’activation des cellules de types monocytes ou macrophages présente une stabilité à pH acide et/ou en présence de sels biliaires améliorée. La présente invention concerne ainsi plus particulièrement une composition liposomale utile pour une administration orale constituée ou comprenant : a) une ou plusieurs substance(s) amphiphile(s) d'intérêt biologique, de préférence un immunostimulant lipophile, encore plus de préférence de 0,1 à 10 % en poids du dérivé lipophile du Muramyl di ou tri peptide (MDP ou MTP), par rapport au poids total de la composition liposomale; b) un liposome constitué ou comprenant: i) de 25% à 35% en poids ou en mole d'au moins un phospholipide chargé négativement par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, ii) de 30% à 50% en poids ou en mole d'au moins un phospholipide zwitterionique, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, iii) de 20% à 30% en poids ou en mole d'au moins un stérol, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, pourvu que le au moins un phospholipide zwitterionique ne soit ni la palmitoyl-oleoyl-phosphatidyl-choline (POPC), ni la 1 ,2-didecanoyl 1-sn- glycero-3-phosphocholine (DDPC). Selon la présente invention, le au moins un phospholipide zwitterionique est un phospholipide zwitterionique dont la ou les chaines carbonées est (sont) saturée(s). Selon la présente invention, les % molaires des constituants i) à iii) concernent uniquement les lipides du liposome, considérés comme des excipients, et ne tiennent pas compte de la partie lipidique d’une ou plusieurs substance(s) amphiphile(s) d'intérêt biologique, par exemple de l’immunostimulant lipophile. La gamme de 25% à 35% d'au moins un phospholipide chargé négativement signifie que le au moins un phospholipide chargé négativement est présent dans le liposome à une concentration en poids ou en mole de préférence 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, ou 35%. La gamme de 30% à 50% d'au moins un phospholipide zwitterionique signifie que le au moins un phospholipide zwitterionique est présent dans le liposome à une concentration en poids ou en mole de 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, ou 50%. La gamme de 20% à 30% d'au moins un stérol signifie que le au moins un stérol est présent dans le liposome à une concentration en poids ou en mole de 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, ou 30%. Selon un mode de réalisation préféré, la présente invention concerne une composition liposomale dont le liposome est constitué ou comprend par rapport à la composition lipidique en poids ou en mole totale du liposome: i) de 25% à 35% en poids ou en mole d'au moins un phospholipide chargé négativement par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, de préférence de 26% à 32%, plus préférentiellement 30%, ii) de 30% à 50% en poids ou en mole d'au moins un phospholipide zwitterionique par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, de préférence de 30% à 40%, plus préférentiellement 40%, iii) de 20% à 30% en poids ou en mole d'au moins un stérol par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, de préférence de 22% à 28%, plus préférentiellement 25%, ou 30%, caractérisée en ce que ladite composition liposomale est stable en présence de sels biliaires, pourvu que le au moins un phospholipide zwitterionique ne soit ni la palmitoyl-oleoyl-phosphatidyl-choline (POPC), ni la 1 ,2-didecanoyl 1-sn- glycero-3-phosphocholine (DDPC). Selon l’invention, un phospholipide chargé négativement doit être compris comme un phospholipide possédant une charge négative à pH physiologique. Par exemple, la phosphatidylsérine (PS) contient un groupement sérine estérifié à l’acide phosphatidique. Du fait d’une charge unique sur le groupement phosphate, la PS est chargée négativement à pH physiologique. Le phosphatidylinositol (PI) et le phosphatidylglycérol (PG) ont, respectivement un groupement glycérol estérifié à l’acide phosphorique ou un sucre estérifié à l’acide phosphorique ; le PI et PG sont chargés négativement à pH physiologique. Plus particulièrement selon l’invention, le au moins un phospholipide chargé négativement est choisi dans le groupe comprenant le phosphatidylinositol (PI), la phosphatidylsérine (PS), le phosphatidylglycérol (PG), l'acide phosphaphatique (PA), le diphosphatidylglycérol (DPG) ou cardiolipin (CL), leurs dérivés comprenant un ou plusieurs résidu(s) d’acide(s) gras, et leurs mélanges. Selon un mode de réalisation préféré, le au moins un phospholipide chargé négativement est la phosphatidyl sérine (PS) ou un dérivé de la phosphatidyl sérine choisi dans le groupe comprenant la palmitoyloléoyl-phosphatidylsérine (POPS), palmitoyl-linoeoyl phosphatidylsérine (PLPS), palmitoyl-arachidonoyl-phosphatidylsérine (PAPS), palmitoyl docosa-hexaénoyl phosphatidylsérine (PDPS) , stéaroyl-oleoyl-phosphatidylsérine (OSPS), stéaroyl-linoléoyl-phosphatidylsérine (GPPS), stéaroyl- arachidonoyl-phosphatidylsérine (SAPS), stéaroyl docosa-hexaénoyl phosphatidylsérine (SDPS), di-capryl-phosphatidylsérine (C10PS), di-lauroyl-phosphatidylsérine (DLPS), di-myristoyl-phosphatidylsérine (DMPS), di-phytanoyl-phosphatidylsérine (DPhPS), di-heptadecanoyl phosphatidylsérine (PS 17:0/17:0), di-oléoyl-phosphatidylsérine (DOPS), di-palmitoyl-phosphatidylsérine (DPPS), di-stéaroyl phosphatidylsérine (DSPS), di-linoleoyl phosphatidylsérine (di18:3 PS) di-erucoyl phosphatidylsérine, di-docosahexaenoyl- phosphatidylsérine, et leurs mélanges, de préférence la dioleoyl- phosphatidylsérine (DOPS). Selon un mode de réalisation préféré, le au moins un phospholipide chargé négativement est le phosphatidylglycérol ou un dérivé deuphosphatidylglycérol choisi dans le groupe comprenant le palmitoyloléoyl-phosphatidylglycérol, palmitoyl-linoleoyl phosphatidylglycérol, palmitoyl-arachidonoyl-phosphatidylglycérol, palmitoyl-docosahexaenoyl-phosphatidylglycérol, stéaroyl-oléoyl-phosphatidylglycérol, stéaroyl-linoleoyl-phosphatidylglycérol, stéaroyl-arachidonoyl-phosphatidylglycérol, stéaroyl-docosahexaenoyl-phosphatidylglycérol, di-capryl phosphatidylglycérol di-lauroyl phosphatidylglycérol, di-heptadecanoyl-phosphatidylglycérol, di-phytanoyl-phosphatidylglycérol, di-myristoyl phosphatidylglycérol , di-palmitoyl-phosphatidylglycérol (DPPG), di-élaidoyl-phosphatidylglycérol (DEPG), di-stéaroyl-phosphatidylglycérol, di-oléoyl-phosphatidylglycérol, di-linoéoyl-phosphatidylglycérol, di-arachidonoyl-phosphatidylglycérol, et leurs mélanges, en particulier le di-oléoyl-phosphatidylglycérol. Selon l’invention, un phospholipide zwitterionique doit être compris comme un phospholipide neutre à pH physiologique. Par exemple, la phosphatidylcholine (PC) contient un groupement choline estérifié à l’acide phosphatidique. Au pH physiologique, La PC possède à la fois une charge négative portée par le groupement phosphate et une charge positive portée par le groupement choline. La phosphatidyléthanolamine (PE) contient un groupement éthanolamine estérifié à l’acide phosphatidique. La PE ayant une structure similaire à la PC, c’est également un PL neutre à pH physiologique. Plus particulièrement selon l’invention, le au moins un phospholipide zwitterionique est choisi dans le groupe comprenant la phosphatidylcholine, la phosphatidyléthanolamine, leurs dérivés comprenant un ou plusieurs résidu(s) d’acide(s) gras, la lécithine, la lysolécithine, la lysophatidyl-éthanolamine, les phosphoglycérides, et leurs mélanges. Selon un mode de réalisation préféré, le au moins un phospholipide zwitterionique est la phosphatidylcholine ou un dérivé de la phosphatidylcholine choisi dans le groupe comprenant la di-arachidonoyl-phosphatidyl-choline (DAPC), la di-élaidoyl-phosphatidyl-choline (DEPC), la dilauroyl-phosphatidyl-choline (DLaPC), la di-linoléoyl-phosphatidyl-choline (DLPC), la di-linolénoyl-phosphatidyl-choline (DLnPC), la di-myristoyl-phosphatidyl-choline (DMPC), la di-myristoleoyl phosphatidylcholine (DMoPC), la dioléoyl phosphatidyl-choline (DOPC), la di-palmitoyl-phosphatidyl-choline (DPPC), la dipentadécanoyl phosphatidyl-choline (DPePC), la dipalmitoléoyl-phosphatidyl-choline (DPoPC), la diphytanoyl phosphatidyl-choline (DPhPC), la di-petrosélénoyl-phosphatidyl-choline (DPsPC), la di-tridécanoyl phosphatidyl-choline (DTPC), la 1-hexadécyl-2-arachidonoyl phosphatidylcholine (HAPC), la palmitoyl-arachidonoyl-phosphatidyl-choline (PAPC), la 1,2-dihexadécanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC), et la 1,2-distéaroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) et leurs mélanges, de préférence la 1,2-distéaroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) et encore plus de préférence la di-myristoyl-phosphatidyl-choline (DMPC). Selon un mode de réalisation préféré, le au moins un phospholipide zwitterionique est la phosphatidyl-éthanolamine ou un dérivé de la phosphatidyl-éthanolamine choisi dans le groupe comprenant la palmitoyl-oléoyl- phosphatidyl-éthanolamine, palmitoyllinoleoyl-phosphatidyl-éthanolamine, palmitoyl-arachidonoyl-phosphatidyl-éthanolamine, palmitoyl-docosahexaenoyl phosphatidyl-éthanolamine, stéaroyl-oleoyl phosphatidyl-éthanolamine, stéaroyl-linoleoyl-phosphatidyl-éthanolamine, stéaroyl-arachidonoyl phosphatidyl-éthanolamine, stéaroyl-docosahexaenoyl-phosphatidyl-éthanolamine, di-lauroyl phosphatidyl-éthanolamine, di-myristoyl-phosphatidyl-éthanolamine, di-phytanoyl phosphatidyl-éthanolamine, dipalmitoyl phosphatidyl-éthanolamine, diheptadecanoyl phosphatidyl-éthanolamine, distéaroyl phosphatidyl-éthanolamine, di-élaidoyl phosphatidyl-éthanolamine, diarachidonoyl phosphatidyl-éthanolamine, docosa-hexaenoyl phosphatidyl-éthanolamine, et leurs mélanges. Selon l’invention, le au moins un stérol est choisi dans le groupe constitué par le cholestérol, les dérivés du cholestérol tels que le cholestérol-phosphocholine, le cholestérolpolyéthylèneglycol et le cholestérol-S04, les esters de cholestéryle, la vitamine D, les phytostérols, tels que le sitostérol, le campestérol et le stigmastérol et leurs mélanges, de préférence le cholestérol. Selon un mode de réalisation préféré, la présente invention concerne une composition liposomale dont le liposome est constitué ou comprend par rapport à la composition lipidique en poids ou en mole totale du liposome: i) de 25% à 35% de DOPS, de préférence 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, ou 35%, ii) de 30% à 50% de DSPC, DPPC, DMPC, ou DLPC de préférence 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, ou 50%, iii) de 20% à 30% de cholestérol, de préférence 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, ou 30% par rapport au poids total ou à la masse molaire totale du liposome. Selon un autre mode de réalisation préféré, la présente invention concerne une composition liposomale dont le liposome est constitué ou comprend par rapport à la composition lipidique en poids ou en mole totale du liposome : i) 30% de DOPS, ii) 40% de DSPC, DPPC, DMPC, ou DLPC, de préférence le DSPC et encore plus de préférence le DMPC, iii) 30% de cholestérol. Selon un mode de réalisation préféré, les liposomes de la composition liposomale sont stables en présence de sels biliaires, c’est-à-dire la bicouche lipidique des liposomes n’est pas destructurée. Selon un mode de réalisation préféré, l'agent thérapeutique est un immunostimulant lipophile utile pour l'activation du système immunitaire, pour soigner et / ou prévenir un cancer, en particulier l’ostéosarcome. Cette activation du système immunitaire est obtenue par absorption de la suspension liposomale par des cellules immunocompétentes qui sont ensuite activées après la liaison de la substance amphiphile immunostimulante à des récepteurs spécifiques. Cette activation peut également être obtenue via une étape initiale d'activation ex vivo dans des conditions de culture de cellules immunocompétentes spécifiques telles que des monocytes, des macrophages ou des cellules dendritiques. Selon un mode de réalisation préféré l'agent thérapeutique est un dérivé lipophile du Muramyl di ou tri peptide (MDP ou MTP). Dans un autre mode de réalisation préféré le dérivé lipophile du MTP correspond à la formule (I) ou (II) dans laquelle R représente un groupe -NH 2 , ou un groupe -NH-CO-R 1 où R 1 représente un résidu d’acide gras en C 8 -C 24 ou un groupe alkyle linéaire ou ramifié, en C 1 -C 30 , comportant optionnellement une ou plusieurs double liaison carbone-carbone, de préférence un groupe alkyle en C 8 -C 18 , comportant optionnellement une ou plusieurs double liaison carbone-carbone. Dans un autre mode de réalisation préféré, R 1 est choisi parmi un résidu d’acide caprylique (8:0), d’acide caprique(10:0), d’acide laurique(12:0), d’acide myristique(14:0) d’acide palmitique (16:0), d’acide stéarique (18:0), d’acide arachidique (20:0), d’acide béhénique (22:0), d’acide lignocérique (24:0), d’acide cérotique (26:0), d’acide myristoléique (14:1), d’acide palmitoléique(16:1), d’acide sapiénique(16:1), d’acide oléique(18:1), d’acide élaïdique (18:1), d’acide trans-vaccénique (18:1), d’acide linoléique (18:2), d’acide linolélaïdique (18:2), d’acide α-linolénique (18:3), d’acide γ-linolénique(18:3), d’acide dihomo-γ-linolénique(20:3), d’acide arachidonique (20:4), d’acide eicosapentaénoïque (20:5), d’acide clupanodonique (22:5), ou d’acide docosahexaénoïque (22:6) ; ou Dans un mode de réalisation préféré l’immunostimulant lipophile est le MTP-PE (mifamurtide). Ce tripeptide muramyl comprend des résidus phospholipidiques qui permettent l'association de la partie hydrophobe de la molécule avec un environnement lipidique tandis que la partie muramyl peptide s'associe à l'environnement aqueux. Le muramyl tripeptide phosphatidyl éthanolamine a été décrit comme un adjuvant pour les études de protection contre les antigènes tumoraux ou les antigènes viraux (virus Herpes simplex ou VIH-1). MTP-PE a un effet stimulant sur la prolifération cellulaire et est capable d'activer les capacités cytotoxiques des monocytes. Le mifamurtide est commercialisé sous la dénomination Mepact® et est indiqué chez des patients âgés de deux à 30 ans pour le traitement de l’ostéosarcome non métastatique de haut grade (un type de cancer des os). Mepact® est utilisé en association avec d’autres médicaments anticancéreux après élimination chirurgicale du cancer. Selon le résumé du rapport européen public d'évaluation (EPAR) relatif à Mepact®, l’utilisation du mifamurtide en association avec d’autres médicaments anticancéreux, augmente la durée de survie des patients sans récidive de la maladie: 68% des patients sous Mepact® (231 sur 338) ont survécu sans récidive de la maladie, par comparaison à 61% des patients (207 sur 340) qui ne l’ont pas reçu. Le risque de décès était également réduit de 28% chez les patients sous Mepact®. Ce traitement est injecté par perfusion. La dose de mifamurtide recommandée pour l’ensemble des patients est de 2 mg/m 2 de surface corporelle. Elle doit être administrée deux fois par semaine à 3 jours d’intervalle minimum pendant 12 semaines, puis une fois par semaine pendant 24 semaines supplémentaires, soit un total de 48 perfusions en 36 semaines. Après perfusion intraveineuse de Mepact®, les liposomes sont sélectivement pris en charge par les macrophages, phagocytés et progressivement dégradés dans les cellules. Les effets indésirables observés sous Mepact® (chez plus d’un patient sur 10) sont les suivants: anémie (faible numération de globules rouges), perte d’appétit, maux de tête, vertiges, tachycardie (rythme cardiaque rapide), hypertension (tension artérielle élevée), hypotension (tension artérielle basse), dyspnée (difficultés à respirer), tachypnée (respiration rapide), toux, vomissements, diarrhées, constipation, douleurs abdominales (maux d’estomac), nausées, hyperhydrose (transpiration excessive), myalgies (douleurs musculaires), arthralgies (douleurs dans les articulations), douleurs dans le dos, douleurs dans les extrémités (les bras et les jambes), fièvre, frissons, fatigue, hypothermie (faible température corporelle), douleurs générales, malaises, asthénie (faiblesse) et douleurs dans la poitrine. La composition liposomale Mepact® contient 0,4% (4 mg de mifamurtide). Le liposome est constitué de 1-Palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (POPC) et de 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phospho-L-sérine (DOPS) selon le ratio molaire 7:3. Selon un mode de réalisation préféré, la présente invention concerne une composition liposomale, dont l’immunostimulant lipophile est constitué ou comprend une concentration de 0,1 à 10 % en poids du dérivé lipophile du Muramyl di ou tri peptide (MDP ou MTP), de préférence 0,4% ou moins en poids de MTP-PE. Selon un autre mode de réalisation préféré, la présente invention concerne une composition liposomale, constituée ou comprenant : a) de 0,1 à 1 % en poids du dérivé lipophile du Muramyl di ou tri peptide (MDP ou MTP), de préférence 0,4% ou moins en poids de MTP-PE, b) un liposome constitué ou qui comprend par rapport à la composition lipidique en poids ou en mole totale du liposome: i) de 25% à 35% d’une phosphatidylsérine, de préférence DOPS, de préférence de 26% à 32%, plus préférentiellement 30%, ii) de 30% à 50% d’une phosphatidylcholine, de préférence DSPC, DPPC, DMPC, ou DLPC, de préférence de 30% à 40%, plus préférentiellement 40%, iii) de 20% à 30% d'au moins un stérol, de préférence le cholestérol, de préférence de 22% à 28%, plus préférentiellement 25%, ou 30%. Selon un autre mode de réalisation préféré, la présente invention concerne une composition liposomale, constituée ou comprenant : a) de 0,1 à 10 % en poids du dérivé lipophile du Muramyl di ou tri peptide (MDP ou MTP), de préférence 0,4% ou moins en poids de MTP-PE, b) un liposome constitué ou qui comprend par rapport à la composition lipidique en poids ou en mole totale du liposome : i) 30% de DOPS, ii) 40% de DSPC, DPPC, DMPC, ou DLPC, de préférence le DSPC et encore plus de préférence le DMPC, iii) 30% de cholestérol. Selon un autre mode de réalisation préféré, la présente invention concerne une composition liposomale pour la préparation d’une composition pharmaceutique destinée à une administration par voie orale. L'administration orale désigne une administration par ingestion de comprimés, pilules ou capsules contenant la poudre selon l'invention. L'administration orale désigne également une administration d’une suspension de la poudre dans un solvant aqueux pharmaceutiquement acceptable, par exemple sous la forme d’un sirop. Selon un autre mode de réalisation préféré, la présente invention concerne une composition liposomale pour la préparation d’une composition pharmaceutique administrée par voie nasale. Selon un autre mode de réalisation préféré, la présente invention concerne une composition liposomale pour la préparation d’une composition pharmaceutique administrée par voie pulmonaire. Selon un autre mode de réalisation préféré, la présente invention concerne une composition liposomale pour son utilisation dans une méthode d’activation du système immunitaire inné. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la présente composition liposomale est utilisée pour le traitement de patients atteints de cancer, de préférence l’ostéosarcome. Selon un autre mode de réalisation particulier de l'invention, la présente composition liposomale est utilisée pour la prévention des récidives cancéreuses. Préparation des liposomes Les liposomes de la présente invention sont préparés selon des techniques connues de l’Homme du métier. Par exemple, cette méthode de préparation est basée sur deux étapes séparées de solubilisation, dans lesquelles les lipides sont solubilisés dans un solvant polaire miscible à l'eau (butanol tertiaire ci-après également nommé t-butanol) ou bien un mélange de chloroforme et de méthanol (dans les proportions 5:1) (solution A) et l'agent biologiquement actif est dispersé dans un milieu aqueux physiologiquement compatible contenant éventuellement un cryoprotecteur (solution B). La solution A et la solution B sont ensuite mélangées. Par conséquent, selon cette méthode, la substance amphiphile d'intérêt biologique n'est initialement pas présente dans la phase t-butanol mais uniquement dans le milieu aqueux. Alternativement, les lipides et l'agent biologiquement actif sont directement mélangés dans un solvant polaire miscible à l'eau. Le document WO2007014754 décrit un autre procédé qui est particulièrement adapté à la préparation des liposomes selon la présente invention. Ce procédé, qui comprend une étape de dispersion (suivie d'une étape d’atomisation/séchage) de phospholipides, et de cholestérol, et d'une ou plusieurs substances amphiphiles d'intérêt biologique dans un mélange approprié de solvants, permet la production d'une suspension liposomale. Plus particulièrement le procédé de préparation de la suspension liposomale comprend: a) une étape de préparation d'un mélange d’un immunostimulant lipophile et d’un liposome constitué ou qui comprend par rapport à la composition lipidique en poids ou en mole totale du liposome : i) de 25% à 35% d'au moins un phospholipide chargé négativement, ii) de 30% à 50% d'au moins un phospholipide zwitterionique, iii) de 20% à 30% d'au moins un stérol, b) une étape de dispersion dudit mélange dans un solvant polaire miscible à l'eau. Selon un mode de réalisation particulier, le solvant polaire est constitué de t-butanol dihydraté et de t-butanol ou d’un mélange de chloroforme/méthanol en particulier dans un ratio 5:1. Le solvant polaire peut aussi être constitué d'un mélange de 60 à 100% de t-butanol dihydraté et de 0 à 40% de t-butanol, de préférence dans un mélange de 75% à 100% (p / p) de t-butanol dihydraté et de 0 à 25% (p / p) de t-butanol. L'invention concerne également un procédé de préparation d'une poudre selon l'invention, comprenant une étape c) d’atomisation/séchage de la suspension liposomale obtenue à l’étape b). Selon un mode de réalisation particulier, la suspension liposomale contient un excipient hydrophile, de préférence du mannitol ajouté avant l’étape d’atomisation/séchage. Selon un autre aspect de l’invention la suspension liposomale est extrudée à travers un dispositif poreux et ensuite passée à travers une buse. L'utilisation d'une buse de diamètre suffisamment petit limite l'écoulement de la suspension après avoir été extrudée à travers le dispositif poreux. Des buses utiles pour réaliser cette étape du procédé de l'invention sont également généralement connues de l'homme du métier. Ils comprennent, par exemple, des buses à disque rotatif, des buses à jet d'impact, des buses capillaires, des buses à un seul orifice, des buses à ultrasons de type vibrant ou pulsé, des buses à deux fluides telles que des buses coaxiales à deux fluides, etc. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la buse est une buse à orifice. Dans la présente invention, la taille de pore préférée de la buse est comprise entre environ 0,05 mm et environ 1 mm, plus préférablement entre environ 0,1 mm et environ 0,2 mm. Dans l'appareil de l'invention, la buse peut être comprise dans un récipient adapté à la déshydratation du liposome obtenu, en particulier adapté à la déshydratation par atomisation ou par atomisation. Le débit de la suspension peut être compris entre environ 1 ml / min et environ 1000 ml / min. Plus typiquement, les liposomes ont été préparés par le procédé de l'invention en appliquant un débit de 10 ml / min à 200 ml / min, et plus préférablement d'environ 20 ml / min à environ 100 ml / min. Selon un autre mode de réalisation, la pression utilisée pour l'extrusion de la suspension liposomale à travers le dispositif poreux et la pression de passage de la suspension liposomale à travers la buse peuvent être sensiblement identiques, en particulier être comprises entre 0,5 bar et 1200 bars. Plus typiquement, les liposomes peuvent être préparés par le procédé de l'invention avec 5 bars à 600 bars, de préférence d'environ 10 bars à environ 500 bars et plus préférablement d'environ 20 bars à environ 150 bars. Le séchage des liposomes après la formation de gouttelettes peut être réalisé en mettant en contact les gouttelettes avec un courant gazeux, de préférence un courant gazeux chauffé, pour obtenir des particules solides. De préférence, le flux gazeux utilisé est un gaz inerte. Le gaz de séchage peut être de préférence un gaz à faible teneur en oxygène contenant moins de 0,1 vol. %, de préférence moins de 0,05 vol. % en oxygène. Les gaz inertes augmentent la sécurité d'un système de séchage chauffé. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, l'azote est utilisé comme gaz inerte. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le gaz inerte protège les ingrédients actifs et les excipients contenus dans la formulation. De préférence, le séchage par atomisation est effectué dans un dispositif approprié pour le séchage par atomisation. Le séchage par atomisation peut par exemple être réalisé dans une tour de séchage. Les liposomes déshydratés sont séparés du courant gazeux et collectés. Dans un mode de réalisation préféré, la suspension liposomale comprend éventuellement un excipient hydrophile. Les excipients hydrophiles utiles peuvent être monomères, oligomères ou polymères et peuvent être trouvés parmi plusieurs classes chimiques de composés. Selon l'un des modes de réalisation préférés de l'invention, l'excipient hydrophile est un saccharide, par ex. un mono-, di-, oligo- ou polysaccharides, un alcool de sucre, un acide aminé, un peptide, une protéine, un polymère hydrosoluble ou une combinaison de ceux-ci. Un saccharide, ou hydrate de carbone, est défini comme un composé principalement composé de carbone, d'hydrogène et d'oxygène. Les saccharides utiles comprennent les sucres et les alcools de sucre, les oligosaccharides, les polysaccharides hydrosolubles et leurs dérivés. Les saccharides préférés selon l'invention comprennent, mais sans s'y limiter, le glucose, le fructose, le lactose, le saccharose, le tréhalose, le maltose, le cellobiose, le galactose, le maltotriose, le maltopentose, le raffinose, la dextrine, le dextran, l'inuline, le mannitol, le sorbitol, le xylitol, le chitosane; les dérivés de cellulose hydrosolubles tels que la méthylcellulose, l'hydroxypropylcellulose, l'hydroxyéthylcellulose et l'hypromellose; les alginates, les amidons solubles ou les fractions d'amidon, la gomme xanthane, la gomme de guar, la pectine, la carraghénine, le galactomannane, la gomme gellane, la gomme adragante, y compris tout dérivé de ceux-ci. Les saccharides particulièrement préférés sont le glucose et le tréhalose. D'autres excipients hydrophiles utiles peuvent être choisis parmi d'autres classes chimiques, telles que des acides aminés, des peptides ou des protéines solubles dans l'eau. Par exemple, la glycine ou d'autres acides aminés naturels peuvent être utilisés. Les protéines utiles comprennent, mais sans s'y limiter, la gélatine, l'albumine, la protéine de lactosérum, la protéine de soja ou d'autres protéines alimentaires ou végétales. D'autres exemples d'excipients hydrophiles utiles sont des polymères tels que des polymères solubles dans l'eau tels que des polyéthylèneglycols solides, de l'alcool polyvinylique, des polyacrylates ou de la polyvinylpyrrolidone. Selon l'invention, des mélanges de plus d'un excipient hydrophile peuvent être utilisés. Par exemple, il peut être nécessaire d'ajuster indépendamment plusieurs paramètres tels que le pH, la solubilité et la mouillabilité. Dans ce cas, un premier excipient hydrophile peut être choisi comme matériau support basique pour les systèmes colloïdaux, tandis qu'un ou plusieurs excipients hydrophiles supplémentaires peuvent être incorporés pour obtenir un certain pH et / ou mouillabilité. Bien entendu, le milieu aqueux comprenant la suspension liposomale peut comprendre d'autres excipients ou substances auxiliaires, hydrophiles ou hydrosolubles. Ces substances sont solubles et extraites par le milieu d'extraction ou non, ces substances peuvent être incluses dans les particules sèches ou éliminées avec l'eau et le solvant organique. Les substances, qui sont comprises dans les particules sèches, doivent être pharmaceutiquement acceptables. D'autres excipients préférés comprennent des stabilisants, des tensioactifs, des agents mouillants, des agents gonflants, des auxiliaires de lyophilisation, des antioxydants, des agents chélatants, des conservateurs, des agents osmotiques, des excipients acides ou alcalins pour ajuster le pH, etc. Parmi les excipients préférés selon l'invention figurent les stabilisants et les antioxydants. Les antioxydants peuvent empêcher l'oxydation d'un composé actif incorporé, mais aussi celle des composants du colloïdal en particulier si l'on utilise des lipides sensibles à l'oxydation. Des composés utiles comprennent, par exemple, des antioxydants liposolubles tels que l'alpha, bêta et gamma-tocophérol, l'ubiquinol, le lycopène, l'alpha et le bêta-carotène, l'acide nordihydroguaiarétique, le butyl hydroxyanisole, le butyl hydroxytoluène, l'acide éthylènediamine tétraacétique, l’acide dienta-étriamine pentaacétique, etc. L'alpha-tocophérol et l'acide éthylènediamine tétraacétique sont particulièrement préférés, y compris leurs dérivés pharmaceutiquement acceptables. D'autre part, si des lipides saturés chimiquement purs, semi-synthétiques ou synthétiques sont utilisés pour la composition des systèmes colloïdaux, aucun antioxydant ne peut être nécessaire. L'invention concerne également une poudre décrite ci-dessus telle que celle préparée par un procédé comprenant les étapes a-c), ladite poudre étant constituée ou comprend un liposome constitué ou qui comprend par rapport à la composition lipidique en poids ou en mole totale du liposome : i) de 25% à 35% d'au moins un phospholipide chargé négativement, ii) de 30% à 50% d'au moins un phospholipide zwitterionique, iii) de 20% à 30% d'au moins un stérol, v) de 0,1 à 10 % en poids du dérivé lipophile du Muramyl di ou tri peptide (MDP ou MTP). L'invention concerne également un procédé pour la préparation de liposomes avec une taille et une distribution de taille appropriées pour une administration par voie orale. De préférence, les liposomes de la composition de la présente invention peuvent avoir un diamètre compris de 100 nm à 10 µm, de préférence de 1 à 10 µm et plus préférentiellement de 2 à 5 µm. Le diamètre des liposomes peut être contrôlé, par exemple, par l'extrusion de la composition liposomale à travers un filtre en polycarbonate ayant une taille de pore connue. Les procédés de contrôle de la taille des liposomes sont bien connus dans l'art et sont décrits, par exemple, dans Mayhew et al. (1984) Biochim. Biophys. Acta. Il est possible de déterminer la granulométrie moyenne des liposomes. En effet, une distribution granulométrique est caractérisée par les valeurs moyennes (valeurs moyennes): nombre de diamètre moyen (NMD), volume moyen diamètre (VMD) et la polydispersité en taille est généralement caractérisée par le rapport VMD / NMD (polydispersity index, PI ). Une valeur de 1,00 ou proche de 1,00 signifie que toutes les particules ont la même taille, plus l'écart par rapport à 1,00 est élevé, plus la polydispersité de taille est élevée. La distribution granulométrique peut être déterminée par la technique NANOTRAC basée sur l'analyse du mouvement brownien des particules dispersées dans un liquide par acquisition du spectre d'énergie correspondant au décalage de Doppier. L'appareil MTUPA 250 - NANOTRAC 250, équipé d'un laser à 780 nm, fonctionne par diffusion laser pour des particules de taille de 0,8 à 6500 nm. Les liposomes obtenus selon la présente invention sont caractérisés par une polydispersité de 1,00 à 1, 20. Les liposomes, les particules sèches ou une poudre les comprenant, tels qu'obtenus par le procédé de l'invention, peuvent être utilisés dans la fabrication d'un médicament. Si les particules satisfont à toutes les exigences d'une forme galénique pharmaceutique, elles peuvent être utilisées telles quelles et introduites directement dans des récipients appropriés. La poudre contenant les liposomes peut contenir de l'eau résiduelle (0,1 à moins de 5%), étroitement liée aux lipides, résultant du procédé de préparation de ladite poudre. En variante, la poudre contenant les liposomes peut être mélangée avec d'autres ingrédients actifs et / ou inactifs comme par exemple des supports pharmaceutiquement acceptables. Selon un mode de réalisation particulier, la poudre est micronisée à une taille moyenne comprise entre 1 et 5 micromètres, adaptée à une administration par inhalation. Pour une application par inhalation, la poudre selon l'invention est chargée dans un dispositif de pulvérisation à sec pour délivrer ladite poudre sous la forme d'un aérosol. Ledit dispositif de pulvérisation à sec permet de déposer ladite poudre par exemple dans la gorge, sur les amygdales, ou avantageusement directement dans les alvéoles pulmonaires où les macrophages résidents peuvent être directement activés par suspension liposomale formée in situ. L'invention concerne également une suspension liposomale, de préférence multi-lamellaire obtenue par mise en contact d'une poudre selon l'invention avec un milieu aqueux. Le milieu aqueux peut être de l’eau stérile, éventuellement tamponnée à pH 7,0 - 7,5 et contient éventuellement des conservateurs ou anti-oxydants. L'invention concerne également l'utilisation d'une poudre ou d'une suspension liposomale multi-lamellaire selon l'invention pour l'activation in vivo du système immunitaire. Cette activation du système immunitaire est obtenue par absorption de la suspension liposomale par des cellules immunocompétentes qui sont ensuite activées après la liaison de la substance amphiphile immunostimulante à des récepteurs spécifiques. Cette activation peut également être obtenue via une étape initiale d'activation ex vivo dans des conditions de culture de cellules immunocompétentes spécifiques telles que des monocytes, des macrophages ou des cellules dendritiques. Dans un mode de réalisation préféré, la composition pharmaceutique selon l'invention contient la poudre présente dans une gamme de 50 mg à 2 g en une seule application ou unité. Les liposomes de la présente invention sont stables en présence de sels biliaires. Selon la présente invention, on entend par « liposome stable en présence de sels biliaires », un liposome, dispersé dans un milieu aqueux, dont la bicouche lipidique n’est pas destructurée par un traitement par les sels biliaires, de préférence en présence de taurocholate de sodium, déoxycholate de sodium et cholate hydrate de sodium ou leurs mélanges, de préférence un mélange contenant les trois sels biliaires. Le test de stabilité des liposomes est réalisé en présence de sels biliaires à une concentration comprise de 2 à 10 mM chacun, de préférence 4 mM. Le test est effectué à une température ambiante de 20°C ou de 37°C. Les liposomes sont mis en contact avec les sels biliaires pendant au moins 1 heure, de préférence 2 heures ou 3 heures. La stabilité des liposomes après traitement en présence de sels biliaires est mise en évidence par un test visuel. En effet, la suspension de liposomes avant traitement apparait légèrement opaque d’une couleur blanchâtre ; lorsque les liposomes sont dénaturés par les sels biliaires, la suspension de liposomes dénaturés est transparente. Une observation au microscope optique montre des débris de liposomes (voir ). La présente invention est par ailleurs illustrée, sans toutefois s’y limiter, par les figures et exemples suivants. LISTE DES FIGURES La montre un flacon contenant une suspension de liposome avant traitement par des sels biliaires. La montre des images de microscopie optique de liposomes avant filtration (image A) et après filtration à 5 μm (image B). Le grossissement est de x1030. La montre la distribution de tailles des liposomes obtenue par une méthode d’analyse d’image automatisée. La montre une image de microscopie optique de liposomes formant des agrégats d’une taille supérieure à 20 µm. La montre un flacon contenant une suspension de liposome après traitement par des sels biliaires. L’observation du flacon montre que les liposomes sont dénaturés et la suspension devient transparente (Image A) La montre une image de microscope optique d’une suspension de liposomes dénaturés. PARTIE EXPERIMENTALE : Exemple 1: Fabrication et analyses des suspensions de MTP-PE liposomal Les réactifs suivants ont été utilisés (les fournisseurs sont indiqués entre parenthèses) : MTP-PE (ou mifamurtide, Sigma-Aldrich), méthanol (VWR Chemicals), éthanol (Sigma-Aldrich), chloroforme (Sigma-Aldrich), dichlorométhane (Carlo Erba), acétonitrile (VWR Chemicals), acétone (Sigma-Aldrich), acétate d’éthyle (Carlo Erba), tétrahydrofurane (VWR Chemicals), dimethylsulfoxide (Honey Well), acide trifluoroacétique (VWR Chemicals), formate d’ammonium formate (Fluka), 2-oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine ou POPC (Lipoid), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine ou DOPS, sous forme de sel de sodium (Avanti Polar Lipids), cholesterol (Sigma-Aldrich), 1,2-didecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine ou DDPC (Lipoid), 1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine ou DLPC (Lipoid), 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine ou DMPC (Lipoid), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine ou DPPC (Lipoid) et 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine ou DSPC (Lipoid). Méthode : Les lipides et le mifamurtide ont été dissouts dans un mélange de chloroforme et de méthanol (5:1), à la concentration de 30 mg/mL approximativement, puis concentré par séchage dans un évaporateur rotatif (2 heures à 40°C) pour former un film lipidique. Le film lipidique a ensuite été réhydraté dans une solution aqueuse saline (0.9% NaCl, 5 mL) à température ambiante et sous agitation magnétique. La suspension obtenue a ensuite été filtrée 10 fois au travers d’une membrane polycarbonate de 5 µm avec l’aide d’un Mini-Extruder Avanti Polar afin d’obtenir une suspension liposomale. Plusieurs types de liposomes, contenant 0,4 % de MTP-PE (soit 1 mg de mifamurtide pour 250 mg de lipides), ont été préparés en utilisant des proportions de lipides variables (exprimées en %). Suspension N° (code utilisé au laboratoire) DOPS Phospholipide zwitterionique Cholestérol N°1 (Tanguay) POPC 100 % N°2 (Mepact) 30 % POPC 70 % N°4 (HPX-0) 30 % POPC 40 % 30% N°4 (HPX-1) 30 % DSPC 70 % N°5 (HPX-2) 30 % POPC 30 % 40 % N°6 (HPX-3) 30 % DSPC 30 % 40 % N°7 (HPX-4) 30 % DSPC 50 % 20 % N°8 (HPX-5) 30 % DSPC 40 % 30 % N°9 (HPX-6) 30 % DPPC 40 % 30 % N°10 (HPX-7) 30 % DMPC 40 % 30 % N°11 (HPX-8) 30 % DLPC 40 % 30 % N°12 (HPX-9) 30 % DDPC 40 % 30 % N°13 (B-IDM) 30% POPC 55% 15% Les suspensions liposomales ainsi préparées ont été analysées de trois façons : 1.) par l’observation visuelle des flacons, 2.) par l'observation visuelle des liposomes au microscope optique et 3.) par la mesure de la distribution de tailles des particules (DTP), par un système d’analyse d’image automatisé. Pour cette analyse, une aliquote de 5 μL est placée entre deux lamelles de microscope, et plusieurs champs sont examinés pour l'évaluation de la distribution granulométrique. L’analyse d’image automatisée mesure la taille d’environ 30 000 particules liposomale pour chaque suspension. Résultats : La méthode de préparation permet d’obtenir des suspensions liposomales translucides et légèrement opaque, par exemple la montre un flacon contenant la suspension N°8. La montre des images de microscopie optique des liposomes de la suspension N°8, avant filtration (image A) et après filtration à 5 μm (image B). Le grossissement est de x1030. Dans la , l’image A montre une suspension liposomale obtenue sans aucune filtration. Les liposomes sont hétérogènes, sans forme ronde, et ont des tailles qui peuvent dépasser 50 μm. L’image B montre une suspension liposomale après une série de dix filtrations à travers une membrane filtrante de 5 μm. Dans ce cas, les liposomes observées étaient beaucoup plus homogènes en termes de forme et de tailles (inférieures à 10 μm.) La donne un exemple typique de la distribution de tailles des particules qui est obtenue par la méthode d’analyse d’image automatisée. Les résultats de cette analyse sont caractérisés par les valeurs d10, d50 et d90 qui indiquent la taille maximale (en µm) atteinte par 10%, 50 et 90% des particules liposomale, respectivement, de chaque suspension analysée. Le tableau 2 ci-dessous résume les résultats de ces analyses pour les suspensions de liposomes décrites dans le Tableau 1. Suspension N° (code utilisé au laboratoire) d50 (µm) d10 (µm) d90 (µm) N°1 (Tanguay) De gros agrégats de particules ont été observés au microscope. Ces agrégats avaient une taille supérieure à 20 µm malgré l’extrusion au travers d’un filtre de 5 µm, ainsi qu’illustré par la Figure 4. La présence de ces agrégats a empêché de réaliser une mesure pertinente de la distribution des particules liposomale par analyse d’image. N°2 (Mepact) 3 2 6 N°3 (HPX-0) 3 1 6 N°4 (HPX-1) 3 1 7 N°5 (HPX-2) La fabrication de ces suspensions n’a pas été faisable puisque le filtre de 5 µm a été bloqué par la suspension, rendant l’extrusion impossible. N°6 (HPX-3) N°7 (HPX-4) 5 2 11 N°8 (HPX-5) 5 2 10 N°9 (HPX-6) 4 2 9 N°10 (HPX-7) 3 1 6 N°11 (HPX-8) 4 2 7 N°12 (HPX-9) 3 2 7 N°13 (B-IDM) 4 2 8 L’observation des flacons de suspensions liposomales N° 2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12 et 13 montrent des liquides translucides, légèrement opaques et similaires à la . L’observation au microscope de ces suspensions a montré qu’elles étaient similaires à celle qui est illustrée dans la -Image B. Ces suspensions ont fait l’objet d’une étude de distribution de tailles des particules par analyse d’image automatisée. Les résultats sont indiqués dans le Tableau 2. Ces résultats montrent que sans addition de DOPS, les particules liposomales obtenues après extrusion au travers d’un filtre 5 µm sont instables et reforment spontanément de gros agrégats. L’addition de DOPS est donc nécessaire pour obtenir des suspensions de particules liposomales stables et homogènes. Ces résultats montrent également que la proportion de cholesterol ne doit pas dépasser 30% puisqu’une proportion supérieure empêche l’obtention de suspensions liposomales homogènes. Exemple 2 : Analyse de la concentration de MTP-PE La fraction soluble de MTP-PE (sous forme libre ou encapsulée dans des liposomes) a été quantifiée dans chaque préparation, après dilution d’un aliquote dans un mélange de solvant afin de permettre son injection dans un appareil de chromatographie. La concentration en solution a été mesurée par HPLC. Les conditions d’analyse HPLC sont résumées dans le Tableau 3. HPLC Injecteur & pompe: Alliance 2695 Waters Détecteur : Photo Diode Array 996 Waters Logiciel: Empower Waters Colonne Phenomenex Synergi Polar RP-80Å 150 mm x 4.6 mm – dp = 4 μm Phase mobile A: 5 mM NH5CO2 dans H2O (20%) B: MeOH (80%) Elution isocratique Flux 1 mL/min Température de la colonne 30°C Détection UV = 205 nm Solution standard Pour l’évaluation de MTP-PE: 1 mg/mL de solution dans l’eau Pour la calibration: T100% ≈ 10 mg de MTP-PE, qs 10 mL d’eau Deux solutions standard indépendantes testées Calibration de T5% à T100% Solution test Dilution dans H2O ou H2O/THF (1:1) Volume d’injection 10 ou 20 μL Temperature de l’injecteur 20°C Temps de rétention ≈ 6.4 min pour le MTP-PE Dans ces conditions, un pic de rétention est observé à 6,5 minutes. Les analyses des pics des suspensions n° 2, 3, 4, 7 et 8 révèlent des concentrations de 0,08 mg/ml qui sont cohérentes avec leurs préparations. Exemple 3 : Effets des sels biliaires sur la stabilité des suspensions de MTP-PE liposomal Les suspensions liposomales N° 2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12 et 13 décrites dans l’exemple 1 ont été exposées à un mélange de sels biliaires (taurocholate de sodium, déoxycholate de sodium et cholate hydrate de sodium) à la concentration de 4 mM chacun, à 37°C et pendant 3 heures. La stabilité a été évaluée à l’aide des méthodes indiquées dans l’exemple 1, à T-0h (immédiatement après exposition aux sels biliaires), puis à T-1h et à T-3h (au bout d’une heure et de trois heures d’exposition aux sels biliaires, respectivement.) Les résultats sont résumés dans le Tableau 4. Suspension N° (code utilisé au laboratoire) T-0 T-1h T-3h N°2 (Mepact) L’observation des flacons qui contiennent ces suspensions révèlent qu’elles deviennent transparentes au bout de quelques minutes, ainsi qu’illustré par la Figure 5 – Image A. L’observation au microscope de ces suspensions liposomales ne révèle que de tout petits débris de liposomes, ce qui rend l’analyse de la distribution des tailles des particules impossible. N°3 (HPX-0) N°4 (HPX-1) N° 13 (B-IDM) N°7 (HPX-4) d50 = 5 d10 = 2 d90 = 11 d50 = 5 d10 = 2 d90 = 10 D50 = 5 d10 = 2 d90 = 5 N°8 (HPX-5) D50 = 5 d10 = 2 d90 = 10 D50 = 5 d10 = 2 d90 = 11 D50 = 5 d10 = 2 d90 = 11 N°9 (HPX-6) D50 = 5 d10 = 2 d90 = 11 D50 = 4 d10 = 2 d90 = 10 D50 = 4 d10 = 2 d90 = 10 N°10 (HPX-7) D50 = 3 d10 = 2 d90 = 7 D50 = 3 d10 = 2 d90 = 7 D50 = 3 d10 = 1 d90 = 6 N°11 (HPX-8) D50 = 3 d10 = 1 d90 = 7 D50 = 3 d10 = 1 d90 = 6 D50 = 3 d10 = 1 d90 = 6 N° 12 (HPX-9) d50 = 3 d10 = 1 d90 = 7 L’observation au microscope de ces suspensions liposomales révèle des particules liposomales très petites et en faible quantité, ainsi qu’illustré par la Figure 6. L’analyse de distribution de tailles n’a pas été possible. La montre des photographies de flacons contenant une suspension N°2 à gauche (image A) et une suspension N°8 à droite (image B). Ces deux suspensions ont été mélangées avec des sels biliaires. La suspension N°2 est devenue limpide et transparente après quelques minutes d’exposition aux sels biliaires. A l’observation microscopique, il a été impossible de retrouver des liposomes. A l’inverse, la suspension N°8 a résisté à la dégradation par les sels biliaires. La montre une photographie prise au microscope optique de la suspension N°12 après une heure d’exposition aux sels biliaires. L’image révèle une dégradation presque totale des liposomes puisque seuls quelques débris sont visibles. Pris collectivement, ces résultats montrent que seules les formulations liposomales qui incluent à la fois la DSPC, DPPC, DMPC et DLPC à la place de la POPC, ainsi que la DOPS à 30% et une proportion de cholestérol comprise entre 20 et 30% permettent de résister à la dégradation par les sels biliaires pendant plusieurs heures. Exemple 4: Effets du pH acide sur la stabilité des suspensions de MTP-PE liposomal Les suspensions liposomales N° 2 et N° 8 ont été exposées pendant 1 heure à un pH 1. L’examen visuel des suspensions dans les flacons et au microscope n’a pas révélé d’effet notable de dégradation. Exemple 5: Inclusion de MTP-PE dans les liposomes La méthode a été préparée selon la méthode décrite dans l’exemple n° 1 et en utilisant les proportions de lipides de la solution N°8. Différentes proportions de MTP-PE ont été additionnées: 0,4%, 1%, 5% et 10%. L’observation des flacons et au microscope de ces suspensions a montré des suspensions liposomales similaires aux Figures 1 et 2-B. L’addition de MTP-PE jusqu’à une proportion de 10% n’entraine donc pas de désorganisation de la structure des liposomes. Exemple 6: Fabrication de MTP-PE liposomal sous forme de poudre sèche Les particules liposomales séchées ont été préparées en utilisant une méthode d’atomisation séchage connue comme « spray drying .» L’appareil utilisé était un Büchi mini spray dryer 290. Le processus d’atomisation séchage comporte quatre étapes: atomisation du produit dans une buse de pulvérisation, contact air-pulvérisation, séchage des gouttelettes de pulvérisation et collecte du produit solide. La méthode a été utilisée selon les proportions de la solution N°8. Les lipides et le mifamurtide ont été dissouts dans un mélange de chloroforme et de méthanol (5:1) à la concentration finale de 80 µM. La solution a été injectée à l'aide d'une buse de pulvérisation de 1 mm de diamètre et un flux de 20 ml/minutes. La température de la chambre de séchage était de 90°C. Les particules séchées par atomisation ont été collectées dans un réservoir attaché à un cyclone et stockées dans un réfrigérateur avant leur caractérisation. Les particules obtenues ont été mesurées par microscopie et avaient un diamètre moyen compris entre 1 et 5 µm. La poudre sèche ainsi obtenue a été dissoute dans une solution aqueuse saline (NaCl 0,9%). La suspension a été secouée manuellement pendant quelques minutes. L’observation au microscope a montré une suspension liposomale composée de particules d’une taille moyenne de 2 µm, démontrant ainsi que la poudres sèche ainsi obtenue est hydrodispersible. Exemple 7 : Fabrication de MTP-PE liposomal sous forme de poudre sèche Deux types de particules liposomales sèches ont été préparées en utilisant la méthode décrite dans l’exemple 5, soit en rajoutant du mannitol (35 mM) dans la solution de départ, soit sans en rajouter. La cristallinité de ces particules sèches préparées avec et sans mannitol a été déterminée par diffraction des rayons X, avec une source de cuivre (Philips, modèle XPERT). Les mesures ont été effectuées à température ambiante en utilisant quelques milligrammes de chaque échantillon et une vitesse de balayage de 2 degrés par minute. Les résultats montrent une plus grande cristallinité pour les suspensions préparées sans mannitol. Exemple 8 : Etude de l’administration orale de MTP-PE liposomal chez la souris Des suspensions de MTP-PE liposomal N° 1 et N°10 ont été préparées selon la méthode indiquée dans l’exemple 1. En outre, ces liposomes ont été préparées en incorporant 0,5% d’un marqueur fluorescent N-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazolephosphatidyléthanolamine. Un lot de 30 souris BALB/c a été divisé au hasard en deux Groupes A et B de 15 souris. Les souris du Groupe A ont reçu une administration de la suspension N°1 par gavage orale à la dose de 20 µg de MTP-PE et les souris du Groupe B ont reçu une administration de la suspension N°10 à la même dose de MTP-PE. Des échantillons de sang (environ 100 µL) ont été prélevés à à 1, 4 et 24 heures après l’administration orale (5 souris par Groupe et par temps de prélèvement). Des frottis ont été réalisés à partir de chaque prélèvement de sang. Les frottis ont été examinés avec un microscope à fluorescence (Zeiss fluorescence microscope) et le nombre de monocytes fluorescents a été compté pour chaque frottis. Le nombre de monocytes fluorescent est un marqueur du niveau d’absorption des liposomes, c’est-à-dire du transfert des liposomes intacts et non destructurés de la lumière du tractus intestinal vers la circulation sanguine. Après leur passage dans la circulation sanguine, les liposomes qui ont été absorbés sont rapidement phagocytés par les monocytes circulants. Le nombre moyen de monocytes fluorescents était 3, 7 et 5 fois plus élevé dans le Groupe B par comparaison au Groupe A, aux temps 1, 4 et 24 heures, respectivement. Composition liposomale utile pour une administration orale constituée ou comprenant : a) une ou plusieurs substance(s) amphiphile(s) d'intérêt biologique, de préférence un immunostimulant lipophile, encore plus de préférence de 0,1 à 10 % en poids du dérivé lipophile du Muramyl di ou tri peptide (MDP ou MTP), par rapport au poids total de la composition liposomale; b) un liposome constitué ou comprenant: i) de 25% à 35% en poids ou en mole d'au moins un phospholipide chargé négativement, de préférence 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, ou 35%, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, ii) de 30% à 50% en poids ou en mole d'au moins un phospholipide zwitterionique, de préférence 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, ou 50%, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, iii) de 20% à 30% en poids ou en mole d'au moins un stérol, de préférence 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, ou 30%, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, pourvu que le au moins un phospholipide zwitterionique ne soit ni la palmitoyl-oleoyl-phosphatidyl-choline (POPC), ni la 1 ,2-didecanoyl 1-sn- glycero-3-phosphocholine (DDPC). Composition liposomale selon la revendication 1, caractérisée en ce que le au moins un phospholipide chargé négativement est choisi dans le groupe comprenant le phosphatidylinositol (PI), la phosphatidylsérine (PS), le phosphatidylglycérol (PG), l'acide phosphaphatique (PA), le diphosphatidylglycérol (DPG) ou la cardiolipine (CL), leurs dérivés comprenant un ou plusieurs résidu(s) d’acide(s) gras, et leurs mélanges. Composition liposomale selon la revendication 2, caractérisée en ce que le au moins un phospholipide chargé négativement est choisi dans le groupe comprenant la phosphatidylsérine (PS), ou un dérivé de la phosphatidyl sérine choisi dans le groupe comprenant la palmitoyloléoyl-phosphatidylsérine (POPS), palmitoyl-linoléoyl phosphatidylsérine (PLPS), palmitoyl-arachidonoyl-phosphatidylsérine (PAPS), palmitoyl docosa-hexaénoyl phosphatidylsérine (PDPS), stéaroyl-oléoyl-phosphatidylsérine (OSPS), stéaroyl-linoléoyl-phosphatidylsérine (GPPS), stéaroyl- arachidonoyl-phosphatidylsérine (SAPS), stéaroyl docosa-hexaénoyl phosphatidylsérine (SDPS), di-capryl- phosphatidylsérine (C10PS), di-lauroyl-phosphatidylsérine (DLPS), di-myristoyl-phosphatidylsérine (DMPS), di-phytanoyl-phosphatidylsérine (DPhPS), di-heptadecanoyl phosphatidylsérine (PS 17:0/17:0), di-oléoyl-phosphatidylsérine (DOPS), di-palmitoyl-phosphatidylsérine (DPPS), di-stéaroyl phosphatidylsérine (DSPS), di-linoléoyl phosphatidylsérine (di18:3 PS) di-erucoyl phosphatidylsérine, di-docosahexaenoyl- phosphatidylsérine, et leurs mélanges, de préférence la di-oleoyl-phosphatidylsérine (DOPS). Composition liposomale selon la revendication 1, caractérisée en ce que le au moins un phospholipide zwitterionique est choisi dans le groupe comprenant la phosphatidylcholine, la phosphatidyléthanolamine, leurs dérivés comprenant un ou plusieurs résidu(s) d’acide(s) gras, la lécithine, la lysolécithine, la lysophatidyl-éthanolamine, les phosphoglycérides, et leurs mélanges, pourvu que le au moins un phospholipide zwitterionique ne soit pas la palmitoyl-oleoyl- phosphatidyl-choline (POPC). Composition liposomale selon la revendication 4, caractérisée en ce que le au moins un phospholipide zwitterionique est la phosphatidylcholine ou un dérivé de la phosphatidylcholine choisi dans le groupe comprenant la di-arachidonoyl-phosphatidyl-choline (DAPC), la di-élaidoyl-phosphatidyl-choline (DEPC), la dilauroyl-phosphatidyl-choline (DLaPC), la di-linoléoyl-phosphatidyl-choline (DLPC), la di-linolénoyl-phosphatidyl-choline (DLnPC), la di-myristoyl-phosphatidyl-choline (DMPC), la di-myristoleoyl phosphatidylcholine (DMoPC), la di-oléoyl phosphatidyl-choline (DOPC), la di-palmitoyl-phosphatidyl-choline (DPPC), la di-pentadécanoyl phosphatidyl-choline (DPePC), la di-palmitoléoyl-phosphatidyl-choline (DPoPC), la di-phytanoyl-phosphatidyl-choline (DPhPC), la di-petrosélénoyl-phosphatidyl-choline (DPsPC), la di-tridécanoyl phosphatidyl-choline (DTPC), la 1-hexadécyl-2-arachidonoyl phosphatidylcholine (HAPC), la palmitoyl-arachidonoyl-phosphatidyl-choline (PAPC), la 1,2-dihexadécanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC), et la 1,2-distéaroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) et leurs mélanges, de préférence la 1,2-distéaroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) et encore plus de préférence la di-myristoyl-phosphatidyl-choline (DMPC). Composition liposomale selon la revendication 1, caractérisée en ce que le au moins un stérol est choisi dans le groupe constitué par le cholestérol, les dérivés du cholestérol tels que le cholestérol-phosphocholine, le cholestérolpolyéthylèneglycol et le cholestérol-S04, les esters de cholestéryle, la vitamine D, les phytostérols, tels que le sitostérol, le campestérol et le stigmastérol et leurs mélanges, de préférence le cholestérol. Composition liposomale selon la revendication 1, caractérisée en ce que: a) l’immunostimulant lipophile est le MTP-PE (mifamurtide), de préférence à une concentration de 0,1 à 10 % en poids par rapport au poids de la composition liposomale, b) un liposome constitué ou qui comprend: i) de 25% à 35% en poids ou en mole de DOPS, de préférence 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, ou 35%, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale du liposome, ii) de 30% à 50% en poids ou en mole de DSPC, DPPC, DMPC, ou DLPC, de préférence 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, ou 50%, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale du liposome, iii) de 20% à 30% en poids ou en mole de cholestérol, de préférence 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, ou 30% par rapport au poids total ou à la masse molaire totale du liposome. Composition liposomale selon l’une quelconque des revendications précédentes, pour la préparation d’une composition pharmaceutique destinée à une administration par voie orale. Composition liposomale selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu’elle se présente sous la forme d’une poudre sèche, comprenant optionnellement un stabilisant, ou un autre excipient pharmaceutiquement acceptable. Composition liposomale selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, pour son utilisation pour le traitement ou la prévention d’un cancer, notamment l’ostéosarcome.