Brevet FR3125592A1 — publié le 20230127

L’invention concerne un procédé d’acquisition d’image en deux dimensions d’un échantillon biologique par microscopie à balayage, ledit échantillon étant situé dans une surface de référence définie par une pluralité de pixels. Le procédé comprend les étapes suivantes : a) pré-balayage de la surface de référence, au cours duquel seul une sous-surface des pixels de la surface de référence, dit ensemble initial des pixels sondés, est illuminé, b) détermination de pixels brillants parmi les pixels sondés, c) pré-sélection, au voisinage des pixels sondés brillants (P B ), d’un ensemble de pixels non sondés pouvant appartenir à une structure d’intérêt de l’échantillon, dit ensemble de pixels à estimer (P E ), d) estimation de l’intensité des pixels à estimer (P E ) f) sélection parmi les pixels à estimer (P E ), à l’aide de l’estimation de leur intensité lumineuse, de pixels considérés comme brillants par application d’un crtière prédéterminé, dits pixels à sonder (P S ), e) balayage de la surface de référence, au cours duquel seul l’ensemble de pixels à sonder (P S ) est illuminé. Figure pour l’abrégé : figure 5 Procédé d’acquisition d’image en deux dimensions d’un échantillon biologique à balayage ciblé L’invention concerne le domaine de l’imagerie destinée à l’observations d’échantillons biologiques, et plus particulièrement un procédé de balayage d’image en deux dimensions d’un échantillon biologique composés d’une pluralité de cellules. Lors de l’observation par microscopie d’échantillons biologiques, notamment par microscopie optique à fluorescence, un microscope traditionnel balaye tout le volume (cuboïde) englobant la structure d’intérêt. Ceci présente toutefois un inconvénient majeur, car les fluorophores ont des effets délétères sur les cellules de l’échantillon, dont les processus biologiques peuvent être compromis par une trop longue exposition : ce phénomène est notamment qualifié de phototoxicité. Il est donc désirable, afin d’éviter leur dégradation, de limiter autant que possible l’exposition des échantillons, tant au niveau spatial que temporel. Dans l’art antérieur, il est connu, pour tenter de limiter les effets de la phototoxicité, d’accélérer la vitesse d’imagerie en remplaçant des miroirs galvanométriques de balayage laser par des systèmes résonnants ou par des déflecteurs acousto-optiques. Toutefois ces approches ne permettent pas d’obtenir une qualité d’image aussi bonne que celles obtenues par balayage classique. De plus, elles ne résolvent pas entièrement le problème de la phototoxicité, car la même quantité de lumière incidente est délivrée à l’échantillon in fine , mais seulement plus rapidement. Une autre méthode pour tenter de limiter l’illumination subie par les cellules, dite d’illumination adaptative, consiste à contrôler l’instrument d’acquisition pour moduler l’intensité lumineuse et maintenir un rapport signal sur bruit constant dans l’image capturée. Ceci est notamment réalisé à l’aide d’un marquage des membranes cellulaires. Néanmoins, cette approche a tendance à illuminer davantage le centre des cellules, nécessairement plus sombre que leur contour, qui n’est pas une zone d’intérêt pour l’observateur, qui cherche au contraire à étudier le contour cellulaire. En outre, même si cette approche permet de réduire l’intensité lumineuse lors de l’illumination, elle nécessite tout de même d’illuminer chaque voxel de l’échantillon, y compris ceux qui ne seraient pas d’intérêt. L'invention a donc pour but de fournir un procédé d’acquisition d’échantillons biologiques qui surmonte ces inconvénients, c’est-à-dire en limitant autant que possible l'exposition lumineuse de l’échantillon tant au niveau spatial que temporel, tout en fournissant une image de bonne qualité. Pour ce faire, l’invention tire parti du fait que certains échantillons biologiques, tels que les tissus cellulaires, sont organisés dans l’espace et que l’expérimentateur possède une information préalable sur ladite organisation. Ainsi, par exemple, les tissus biologiques épithéliaux sont organisés en monocouches, c’est-à-dire que le marquage des jonctions cellulaires s’organise en un maillage (des contours cellulaires) réparti sur une surface. L’invention se propose de fournir une méthode qui illumine un volume restreint à l’objet d’intérêt, telle qu’une surface épithéliale. A cet effet l’invention a pour objet un procédé d’acquisition d’image d’un échantillon biologique par microscopie à balayage, ledit échantillon étant situé dans une surface de référence définie par une pluralité de pixels, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes suivantes : a) pré-balayage d’une surface de référence, au cours duquel seul un sous-ensemble des pixels de la surface de référence, dit ensemble initial des pixels sondés, est illuminée, b) détermination de pixels brillants parmi les pixels sondés, dit ensemble de pixels sondés brillants, c) pré-sélection, au voisinage des pixels sondés brillants, d’un ensemble de pixels non illuminés pouvant appartenir à une structure d’intérêt de l’échantillon, dit ensemble de pixels à estimer, d) estimation de l’intensité lumineuse des pixels à estimer, e) sélection, parmi l’ensemble de pixels à estimer, à l’aide de l’estimation de leur intensité lumineuse, de pixels considéré comme brillants par application d’un critère prédéterminé, dits pixels à sonder, f) balayage de la surface de référence, au cours duquel seul l’ensemble de pixels à sonder est illuminé. On entend par pixel au voisinage d’un pixel, un pixel contenu dans une zone de recherche définie par une distance, dite de propagation, prédéterminée. Par exemple, cette distance de propagation est comprise entre 1 et 3 pixels. Grâce au fait qu’à partir d’un pré-balayage illuminant un faible nombre de pixels, l’on détermine des pixels brillants, puis que l’on pré-sélectionne au voisinage de ces derniers des pixels susceptibles d’être eux-aussi brillants, et que l’on détermine un ensemble de pixels à balayer (sonder) lors d’une étape ultérieure dont la probabilité est grande qu’ils appartiennent à la même structure d’intérêt que les pixels brillants initiaux, on peut restreindre le balayage à ces pixels à sonder. De cette manière, on ne sonde pas de façon systématique toute la surface de référence, ce qui limite l’illumination de la surface de référence. En outre, les pixels à sonder ayant une grande probabilité d’appartenir la structure d’intérêt de l’échantillon on ne réduit pas la vitesse d’acquisition de l’image. En effet, le procédé selon l’invention permet de rapidement aboutir à une image précise des échantillons biologiques, en particulier de tissus cellulaires car elle tire parti du fait que les contours des cellules ont naturellement tendance à suivre des lignes. En d’autres termes, on cible avantageusement et efficacement la fraction de pixels à balayer qui permette d’obtenir rapidement une image de qualité sans trop illuminer l’échantillon. La pré-sélection, l’estimation et la sélection des pixels à sonder peut notamment s’appuyer sur les connaissances de l’expérimentateur sur l’organisation dans l’espace de l’échantillon. De préférence, le critère prédéterminé permettant de considérer un pixel comme étant brillant est que l’intensité lumineuse du pixel considéré est supérieure à un seul prédéterminé d’intensité lumineuse. Le critère de dépassement d’un certain seuil d’intensité lumineuse est un critère efficace pour déterminer si un pixel appartient à la surface d’intérêt de l’échantillon puisque la surface d’intérêt de l’échantillon sera plus brillante que le reste de la surface de référence. De préférence, l’image de la surface de référence étant inscrite dans un fond, le seuil d’intensité lumineuse est déterminé en fonction d’une estimation de l’intensité lumineuse des pixels appartenant au fond de l’image. Le critère de dépassement d’un certain seuil d’intensité lumineuse en fonction de l’estimation de l’intensité lumineuse des pixels appartenant au fond de l’image permet d’éviter de confondre un pixel lumineux appartenant à la surface d’intérêt de l’échantillon avec un pixel lumineux appartenant au fond de l’image. On entend par « fond » de l’image l’ensemble des pixels n’étant pas brillants car non peuplé en sources lumineuses. Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, le seuil d’intensité lumineuse est déterminé en fonction d’une analyse statistique de l’intensité lumineuse des pixels du fond, de préférence de sorte qu’un pixel ayant une intensité lumineuse supérieure au seuil d’intensité lumineuse ait plus de 99% de chances de ne pas appartenir à l’ensemble de pixels formant le fond de l’image. On s’assure ainsi d’une très faible chance de confondre un pixel lumineux appartenant à la surface d’intérêt de l’échantillon avec un pixel lumineux appartenant au fond de l’image. De préférence, on réitère les étapes b), c), d), e) et f) jusqu’à interruption volontaire par un opérateur ou jusqu’à détermination qu’aucun point brillant ne soit déterminé à l’étape b). Ainsi, l’on peut obtenir une image à haute résolution sans avoir à illuminer l’ensemble ou une grande partie de l’échantillon, et donc en réduisant significativement la phototoxicité de l’acquisition. Par exemple, grâce à l’invention, pour un tissu biologique épithélial, il est possible d’obtenir une image de qualité comparable à une acquisition traditionnelle en n’illuminant que moins de 10% de la surface de référence dans lequel se trouve l’échantillon. Selon une variante de l’invention, l’étape a) consiste à balayer tous les pixels de la surface de référence et n’illuminer que les pixels à sonder. Cette variante est bien adaptée aux cas d’utilisation d’un microscope à miroirs résonants, à miroirs galvanométriques, et à miroirs polygonaux. En revanche, elle nécessite la connaissance de la position de balayage en temps réel afin de moduler, également en temps réel, l’illumination pour éclairer les points voulus. Selon une autre variante de l’invention, l’étape a) consiste à ne balayer et illuminer que les pixels à sonder. L’avantage de cette variante est que l’acquisition d’image sera plus rapide du fait qu’un volume restreint est balayé, en plus de générer une illumination réduite. En contrepartie, dans le cas d’utilisation d’un microscope à miroirs galvanométriques, il doit être fait attention à ce que les sauts ne soient pas trop fréquents ou soient faits suffisamment lentement pour ne pas entraîner les miroirs dans un régime instable. Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, les pixels de l’ensemble initial de pixels sont répartis aléatoirement dans le volume de référence. Afin de limiter autant que possible l’illumination de l’échantillon, le sous-ensemble de pixels initialement sondés représente entre 0,01% et 0,2% des pixels de la surface de référence, de préférence entre 0,05% et 0,1% des pixels de la surface de référence. De préférence, l’étape d’estimation de l’intensité des pixels à estimer implique une estimation numérique de l’intensité lumineuse des pixels, par exemple par une interpolation au plus proche voisin, une inférence bayésienne ou utilise un réseau neuronal convolutif. Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, l’étape d’estimation de l’intensité des pixels à estimer impliquant une interpolation numérique au plus proche voisin, au cours de l’étape de sélection des pixels à sonder, on sélectionne un pixel à sonder par le fait que le pixel sondé le plus proche est brillant. L’invention concerne également un dispositif d’acquisition d’image en trois dimensions d’un échantillon biologique par microscopie à balayage, caractérisé en ce qu’il est configuré pour mettre en œuvre le procédé selon l’invention. Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, le balayage des échantillons est réalisé par un microscope confocal, un microscope non-linéaire, un microscope à scanner acousto-optique, ou un microscope à matrice d’illumination. De préférence, le dispositif d’acquisition d’image comprend un système d’illumination comprenant au moins un laser, une matrice de micro-miroirs et un relais optique. Brève description des figures L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui va suivre donnée uniquement à titre d'exemple et faite en se référant aux dessins annexés dans lesquels : la est une vue schématique d’un dispositif d’acquisition d’image selon un mode de réalisation particulier de l’invention. la est une vue schématique en perspective d’un volume de référence dans lequel se trouve un tissu épithélial. la est une diagramme schématique représentant le procédé d’acquisition d’image selon l’invention. la est vue schématique d’un détail du tissu cellulaire de la . la est vue schématique des pixels du détail V de la . Procédé d’acquisition d’image d’un échantillon biologique par microscopie à balayage, ledit échantillon étant situé dans une surface de référence (S) définie par une pluralité de pixels, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes suivantes : a) pré-balayage (100) de la surface de référence, au cours duquel seul un sous-ensemble de pixels de la surface de référence (S), dit ensemble initial des pixels sondés, est illuminée, b) détermination (200) de pixels brillants (P B ) parmi les pixels sondés, dit ensemble de pixels sondés brillants (P B ), c) pré-sélection (300), au voisinage des pixels sondés brillants (P B ), d’un ensemble de pixels non illuminés pouvant appartenir à une structure d’intérêt de l’échantillon, dit ensemble de pixels à estimer (P E ). d) estimation (350) de l’intensité lumineuse des pixels à estimer (P E ), e) sélection (400), parmi les pixels à estimer (P E ), à l’aide de l’estimation de leur intensité lumineuse, de pixels considérés comme brillants par application d’un critère prédéterminé, dits pixels à sonder (P S ), f) balayage (500) de la surface de référence, au cours duquel seul l’ensemble de pixels à sonder (P S ) est illuminé. Procédé d’acquisition d’image selon la revendication 1, dans lequel le critère prédéterminé permettant de considérer un pixel comme étant brillant est que l’intensité lumineuse du pixel considéré est supérieure à un seul prédéterminé. Procédé d’acquisition d’image selon la revendication 2, dans lequel l’image de la surface de référence (S) étant inscrite dans un fond (F), le seuil d’intensité lumineuse est déterminé en fonction d’une estimation de l’intensité lumineuse des pixels appartenant au fond (F) de l’image. Procédé d’acquisition d’image selon la revendication 3, dans lequel le seuil d’intensité lumineuse est déterminé en fonction d’une analyse statistique de l’intensité lumineuse des pixels du fond (F), de préférence de sorte qu’un pixel ayant une intensité lumineuse supérieure au seuil d’intensité lumineuse ait plus de 99% de chances de ne pas appartenir à l’ensemble de pixels formant le fond (F) de l’image. Procédé d’observation d’image selon la revendication 1 ou 2, dans lequel on réitère les étapes b), c) et d), e) et f) jusqu’à interruption volontaire (700) par un opérateur ou jusqu’à détermination (800) qu’aucun pixel brillant ne soit déterminé à l’étape b). Procédé d’observation d’image selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l’étape a) consiste à balayer tous les pixels de la surface de référence (S) et n’illuminer que les pixels à sonder (P S ). Procédé d’observation d’image selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel l’étape a) consiste à ne balayer et illuminer que les pixels à sonder. Procédé d’observation d’image selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les pixels de l’ensemble initial de pixels sont répartis aléatoirement dans la surface de référence (S). Procédé d’observation d’image selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l’étape d’estimation de l’intensité lumineuse des pixels à estimer (P E ) implique une interpolation numérique, par exemple une interpolation au plus proche voisin, une inférence bayésienne ou utilise un réseau neuronal convolutif. Procédé d’observation d’image selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel, l’étape d’estimation de l’intensité lumineuse des pixels à estimer (P E ) impliquant une interpolation numérique au plus proche voisin, au cours de l’étape de sélection des pixels à sonder (P S ), on sélectionne un pixel à sonder (P S ) par le fait que le pixel sondé le plus proche est brillant (P B ). Procédé d’observation d’image selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le sous-ensemble de la surface de référence représente entre 0,01% et 0,2% des pixels de la surface de référence, de préférence entre 0,05% et 0,1% des pixels de la surface de référence. Dispositif d’acquisition d’image en trois dimensions d’un échantillon biologique par microscopie à balayage, caractérisé en ce qu’il est configuré pour mettre en œuvre le procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes. Dispositif d’acquisition d’image selon la revendication 12, dans lequel le balayage des échantillons est réalisé par un microscope confocal, un microscope non-linéaire, un microscope à scanner acousto-optique, ou un microscope à matrice d’illumination. Dispositif d’acquisition d’image selon la revendication 12 ou 13, comprenant un système d’illumination comprenant au moins un laser, une matrice de micro-miroirs et un relais optique.