Brevet FR3125336A1 — publié le 20230120

Un procédé de quantification d'endotoxines d'un échantillon biologique avec un support d'analyse introduit dans le champ de vue d'un imageur, ledit support d'analyse comprenant au moins une chambre d'analyse et une pluralité de chambres de référence, comprenant, pour chacun d'une pluralité d'instants de mesure d'une durée de mesure : a) acquisition (S02) d'une image et détermination (S03) de valeurs d'intensité lumineuse des chambres de référence et d'analyse ; b) détermination (S04) d'une relation d'étalonnage liant valeur d'intensité lumineuse et concentration à cet instant de mesure ; c) détermination (S05) d'au moins une concentration d'endotoxines dans l'échantillon biologique à partir de ladite relation d'étalonnage et de la valeur d'intensité de la chambre d'analyse audit instant de mesure ; le procédé comprenant ensuite d) une détermination (S06) d'une évolution temporelle d'une concentration d'endotoxines dans l'échantillon biologique au cours de la durée de mesure à partir de concentration d'endotoxines pour plusieurs instants de mesure. Figure pour l'abrégé : figure 3 Procédé de quantification d'endotoxines d'un échantillon biologique La présente invention se rapporte au domaine de l'analyse d'échantillons biologiques, et plus précisément concerne un procédé de quantification d'endotoxines d'un échantillon biologique au moyen d'un instrument de mesure. Arrière-plan technologique Les endotoxines sont des toxines situées dans la membrane externe de certaines bactéries à Gram négatif, de nature lipopolysaccharidique (LPS) et thermostables. Ce sont des substances pyrogènes, c’est-à-dire pouvant provoquer de fortes fièvres. Les normes de la pharmacopée imposent l'absence de ce type de substances dans les produits pharmaceutiques qui entrent en contact avec la circulation sanguine ou le système nerveux central, comme les médicaments injectables ou les dispositifs médicaux. Il est également recommandé de quantifier les endotoxines dans les matières premières telles que l’eau ou les en-cours de production. La détection des endotoxines repose aujourd’hui essentiellement sur l’utilisation de réactifs élaborés à partir d’une fraction purifiée de sang de limules, une famille de crabes en voie de disparition en Asie et protégés aux États Unis et dont le sang a la propriété de coaguler en présence d’infimes quantités d'endotoxines bactériennes. Il a été développé une nouvelle approche basée sur des protéines recombinantes du Facteur C de limule (rFC), permettant de s’affranchir de l’utilisation de sang de limules et de détecter ainsi la présence d'endotoxines. Selon un procédé de détection typique d'endotoxine, plusieurs solutions d'endotoxines à des concentrations standardisées sont préparées, par exemple à 50 UE/mL, 5 EU/mL, 0,5 EU/mL. UE correspond à l'anglais "Endotoxin Unit" pour Unité Endotoxine, et est une mesure de l'activité des endotoxines, équivalente à l'unité internationale, ou IU pour "International Unit". Cette approche repose encore sur la détermination quantitative in vitro de l'endotoxine dans des échantillons pharmaceutiques, biologiques et environnementaux. Ces tests sont exigeants et requièrent beaucoup d’étapes de manipulation par l’opérateur, ils nécessitent la préparation de dilutions standard et de contrôles internes. Ces étapes manuelles de préparation sont longues et peuvent entraîner des résultats variables voire invalides. En outre, les procédés actuels se basent uniquement sur les résultats obtenus à l'issue d'une durée de mesure fixe, par exemple de 90 minutes, pendant laquelle l'échantillon biologique à analyser est placé à une température donnée, typiquement d'environ 37°C. Cette durée de mesure fixe est commune à toutes les mesures, et a été préalablement choisie afin d'être suffisamment longue pour permettre l'achèvement complet des diverses réactions susceptibles de se produire avec différentes dynamiques. Par conséquent, pour la plupart des mesures, cette durée de mesure est beaucoup plus longue que nécessaire, et malgré cela ce temps de mesure peut encore être trop court pour quelques mesures dans des cas particuliers. En outre, en cas de défaut de configuration de la mesure, par exemple une erreur de manipulation, un éventuel problème ne pourra être détecté qu'à la fin de la durée de mesure, lorsqu'il sera tenté d'exploiter les résultats erronés. Présentation de l'invention L'invention vise donc à permettre de suivre l'évolution temporelle d'une concentration d'endotoxines dans l'échantillon biologique au cours de la durée de mesure, de façon fiable à chaque instant de mesure. A cet effet, l'invention propose un procédé de quantification d'endotoxines d'un échantillon biologique par un instrument d'analyse comprenant un imageur définissant un champ de vue, un support d'analyse étant introduit dans le champ de vue de l'instrument d'analyse, ledit support d'analyse comprenant au moins une chambre d'analyse configurée pour recevoir ledit échantillon biologique et une pluralité de chambres de référence configurées pour recevoir un liquide de référence, le procédé comprenant d'abord une mise en place de l'échantillon biologique dans ladite chambre d'analyse et du liquide de référence dans la pluralité de chambres de référence, des chambres de référence étant pourvues de réactifs de référence et de différentes concentrations d'endotoxines, lesdits réactifs de référence étant aptes à causer une réaction de luminescence en présence du liquide de référence en fonction de la concentration d'endotoxines dans la chambre de référence correspondante, la chambre d'analyse étant pourvue de réactifs d'analyse aptes à causer une réaction de luminescence en présence d'endotoxines de l'échantillon biologique, le procédé comprenant, pour chaque instant de mesure d'une durée de mesure, l'acquisition audit instant de mesure d'une image du support d'analyse et la détermination, à partir de ladite image du support d'analyse, d'une valeur d'intensité lumineuse de chambre d'analyse pour ledit instant de mesure, le procédé comprenant en outre, pour une pluralité d'instants de mesure : - une détermination à partir de l'image du support d'analyse, de valeurs d'intensité lumineuse de chambres de référence pour ledit instants de mesure, - une détermination, à partir des valeurs d'intensité lumineuse de chambres de référence pour ledit instant de mesure, d'une relation d'étalonnage liant la valeur d'intensité lumineuse et concentration d'endotoxines à cet instant de mesure ; le procédé comprenant également, pour une pluralité d'instants de mesure: - une détermination d'au moins une mesure de concentration d'endotoxines dans l'échantillon biologique à cet instant de mesure à partir d'une relation d'étalonnage pour ledit instant de mesure et de la valeur d'intensité de chambre d'analyse audit instant de mesure ; et - une détermination d'une évolution temporelle de la mesure de concentration d'endotoxines dans l'échantillon biologique au cours de la durée de mesure à partir de mesures de concentration d'endotoxines pour plusieurs instants de mesure. L'invention est avantageusement complétée par les différentes caractéristiques suivantes prises seules ou selon leurs différentes combinaisons possibles : - le procédé comprend ensuite une mise en œuvre d'une action fonction de l'évolution temporelle de la mesure de concentration d'endotoxines ; - l'action mise en œuvre comprend l'arrêt du procédé ou une alerte en fonction d'une stabilité de ladite évolution temporelle de la mesure de concentration d'endotoxines ou d'une décroissance de la mesure de concentration d'endotoxines ; - une relation d'étalonnage est déterminée pour chaque instant de mesure de la durée de mesure ; - la relation d'étalonnage pour un instant de mesure est une relation d'étalonnage déterminée à partir des valeurs d'intensité lumineuse des chambres de référence d'un instant de mesure précédent ; - l'évolution temporelle d'une mesure de concentration d'endotoxines dans l'échantillon biologique est déterminée plusieurs fois au cours de la durée de mesure, à chaque fois à la suite d'un instant de mesure pris en compte dans ladite évolution temporelle - des réactifs d'analyse présents dans des chambres d'analyse et des réactifs de référence présents dans des chambres de référence comprennent un facteur C recombinant et un substrat fluorigène des chambres de référence comprenant des endotoxines à des concentrations prédéterminées ; - au moins une chambre de référence est dépourvue d'endotoxine ; - le support d'analyse comprend une pluralité de chambres d'analyse, et la détermination la détermination d'une valeur d'intensité lumineuse de chambre d'analyse pour ledit instant de mesure comprend la détermination d'une valeur statistiquement représentative de valeurs d'intensité lumineuse de plusieurs desdites chambres d'analyse. L'invention concerne également un instrument d'analyse comprenant un imageur définissant un champ de vue, l'instrument étant configuré pour recevoir un support d'analyse dans le champ de vue de l'imageur, ledit support d'analyse comprenant au moins une chambre d'analyse configurée pour recevoir un échantillon biologique, et une pluralité de chambres de référence configurées pour recevoir un liquide de référence, les chambres de référence étant pourvues de réactifs de référence et de concentrations de référence, les réactifs de référence étant aptes à causer une réaction de luminescence en présence du liquide de référence en fonction de la concentration d'endotoxines dans la chambre de référence correspondante, la chambre d'analyse étant pourvue de réactifs d'analyse aptes à causer une réaction de luminescence en présence d'endotoxines de l'échantillon biologique, le système étant configuré pour mettre en œuvre au moins les étapes du procédé selon l'invention. L'invention concerne également un système comprenant un instrument d'analyse et un support d'analyse selon l'invention. Présentation des figures D'autres caractéristiques, buts et avantages de l'invention ressortiront de la description qui suit, qui est purement illustrative et non limitative, et qui doit être lue en regard des dessins annexés sur lesquels : la illustre schématique un support d'analyse disposé dans le champ de vue d'un imageur de l'instrument de mesure, selon un mode de réalisation possible de l'invention ; la montre un exemple de support d'analyse comportant une pluralité de chambres, pouvant être utilisée pour la mise en place d'un échantillon biologique à analyser, selon un mode de réalisation possible de l'invention ; la est un diagramme montrant des étapes du procédé selon un mode de réalisation possible de l'invention ; la montre schématiquement des traitements appliqués à l'image d'une chambre selon un mode de réalisation possible ; la montre un exemple d'évolution temporelle de valeurs d’intensité lumineuses de chambres de référence selon un mode de réalisation possible de l'invention ; la montre des exemples de droites représentant des relations d'étalonnage liant valeur d'intensité lumineuse et concentration à cet instant de mesure, selon un mode de réalisation possible de l'invention ; la montre une courbe illustrant un exemple d'évolution temporelle d'une concentration en analyte dans l'échantillon biologique au cours de la durée de mesure, selon un mode de réalisation possible de l'invention. la montre une courbe illustrant un exemple d'évolution temporelle, au cours de la durée de mesure, du logarithme d'une moyenne de valeurs d'intensité lumineuse de chambres d'analyse accueillant l'échantillon biologique, selon un mode de réalisation possible de l'invention. Procédé de quantification d'endotoxines d'un échantillon biologique par un instrument d'analyse (10) comprenant un imageur (12) définissant un champ de vue (11), un support d'analyse (1) étant introduit dans le champ de vue (11) de l'instrument d'analyse (10), ledit support d'analyse (1) comprenant au moins une chambre d'analyse (2) configurée pour recevoir ledit échantillon biologique et une pluralité de chambres de référence (6) configurées pour recevoir un liquide de référence, le procédé comprenant d'abord une mise en place (S01) de l'échantillon biologique dans ladite chambre d'analyse (2) et du liquide de référence dans la pluralité de chambres de référence (6), des chambres de référence (6) étant pourvues de réactifs de référence et de différentes concentrations d'endotoxines, lesdits réactifs de référence étant aptes à causer une réaction de luminescence en présence du liquide de référence en fonction de la concentration d'endotoxines dans la chambre de référence (6) correspondante, la chambre d'analyse (2) étant pourvue de réactifs d'analyse aptes à causer une réaction de luminescence en présence d'endotoxines de l'échantillon biologique, le procédé comprenant, pour chaque instant de mesure d'une durée de mesure, l'acquisition (S02) audit instant de mesure d'une image du support d'analyse (1) et la détermination (S03), à partir de ladite image du support d'analyse (1), d'une valeur d'intensité lumineuse de chambre d'analyse pour ledit instant de mesure, le procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend en outre, pour une pluralité d'instants de mesure : - une détermination (S03) à partir de l'image du support d'analyse (1), de valeurs d'intensité lumineuse de chambres de référence (6) pour ledit instants de mesure, - une détermination (S04), à partir des valeurs d'intensité lumineuse de chambres de référence (6) pour ledit instant de mesure, d'une relation d'étalonnage liant la valeur d'intensité lumineuse et concentration d'endotoxines à cet instant de mesure ; le procédé comprenant également, pour une pluralité d'instants de mesure: - une détermination (S05) d'au moins une mesure de concentration d'endotoxines dans l'échantillon biologique à cet instant de mesure à partir d'une relation d'étalonnage pour ledit instant de mesure et de la valeur d'intensité de chambre d'analyse audit instant de mesure ; et - une détermination (S06) d'une évolution temporelle de la mesure de concentration d'endotoxines dans l'échantillon biologique au cours de la durée de mesure à partir de mesures de concentration d'endotoxines pour plusieurs instants de mesure. Procédé selon la revendication 1, comprenant ensuite une mise en œuvre d'une action fonction de l'évolution temporelle de la mesure de concentration d'endotoxines (S07). Procédé selon la revendication 2, dans lequel, l'action mise en œuvre comprend l'arrêt du procédé ou une alerte en fonction d'une stabilité de ladite évolution temporelle de la mesure de concentration d'endotoxines ou d'une décroissance de la mesure de concentration d'endotoxines. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel une relation d'étalonnage est déterminée pour chaque instant de mesure de la durée de mesure. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel la relation d'étalonnage pour un instant de mesure est une relation d'étalonnage déterminée à partir des valeurs d'intensité lumineuse des chambres de référence d'un instant de mesure précédent. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'évolution temporelle d'une mesure de concentration d'endotoxines dans l'échantillon biologique est déterminée plusieurs fois au cours de la durée de mesure, à chaque fois à la suite d'un instant de mesure pris en compte dans ladite évolution temporelle. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, des réactifs d'analyse présents dans des chambres d'analyse (2) et des réactifs de référence présents dans des chambres de référence (6) comprennent un facteur C recombinant et un substrat fluorigène des chambres de référence (6) comprenant des endotoxines à des concentrations prédéterminées. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel au moins une chambre de référence (6a) est dépourvue d'endotoxine. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le support d'analyse (1) comprend une pluralité de chambres d'analyse (2), et la détermination la détermination (S03) d'une valeur d'intensité lumineuse de chambre d'analyse pour ledit instant de mesure comprend la détermination d'une valeur statistiquement représentative de valeurs d'intensité lumineuse de plusieurs desdites chambres d'analyse (2). Instrument d'analyse (10) comprenant un imageur (12) définissant un champ de vue (11), l'instrument d'analyse étant configuré pour recevoir un support d'analyse (1) dans le champ de vue (11) de l'imageur (12), ledit support d'analyse (1) comprenant au moins une chambre d'analyse (2) configurée pour recevoir un échantillon biologique, et une pluralité de chambres de référence (6) configurées pour recevoir un liquide de référence, les chambres de référence (6) étant pourvues de réactifs de référence et de concentrations de référence, les réactifs de référence étant aptes à causer une réaction de luminescence en présence du liquide de référence en fonction de la concentration d'endotoxines dans la chambre de référence (6) correspondante, la chambre d'analyse (2) étant pourvue de réactifs d'analyse aptes à causer une réaction de luminescence en présence d'endotoxines de l'échantillon biologique, le système étant configuré pour mettre en œuvre au moins les étapes du procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes.