Brevet FR3113812A1 — publié le 20220311

L’invention a trait au domaine de la bioprotection des fruits et légumes crus par application ou mélange d’une composition conservatrice. Plus particulièrement, elle concerne une composition de bioprotection comprenant au moins une souche de Leuconostoc pseudomesentero i des , plus spécifiquement la souche FLOR4G 55 déposée auprès de la CNCM sous le numéro I-5557. L’invention concerne également de nouvelles souches bactériennes de L . pseudomesentero i des , Le u conostoc citreum et Lactobacillus paraplantarum présentant des propriétés d’inhibition de la croissance de la flore altérante des fruits et légumes crus ou sous forme de jus ou de purée, ainsi qu’une méthode de préparation d’une composition de bioprotection et une méthode de sélection de bactéries lactiques capables d’inhiber une flore altérante. COMPOSITION DE BIOPROTECTION DE FRUITS OU LEGUMES CRUS, DE JUS ET PUREES L’invention a trait au domaine de la bioprotection des fruits et légumes crus par application ou mélange d’une composition conservatrice. Plus particulièrement, elle concerne une composition de bioprotection comprenant au moins une souche de Leuconostoc pseudomesentero i des , plus spécifiquement la souche FLOR4G 55 déposée auprès de la CNCM sous le numéro I-5557. L’invention concerne également de nouvelles souches bactériennes de L . pseudomesentero i des , Le u conostoc citreum et Lactobacillus paraplantarum présentant des propriétés d’inhibition de la croissance de la flore altérante des fruits et légumes crus ou sous forme de jus ou de purée, ainsi qu’une méthode de préparation d’une composition de bioprotection et une méthode de sélection de bactéries lactiques capables d’inhiber une flore altérante. Domaine de l’invention La conservation de fruits et légumes crus sous une forme prêt-à-l’emploi c’est-à-dire par exemple coupés non épluchés, épluchés et coupés dits « de 4ème gamme », ou sous forme de jus ou de purée, pose problème. En effet, les bactéries et levures naturellement présentes à la surface des fruits et légumes ou qui contaminent l’aliment lors de sa préparation, se développent au cours du temps avec pour conséquence une modification de l’aspect, de la texture et du goût des fruits et légumes rendant l’aliment impropre à la consommation ; ces microorganismes constituent ce que l’on appelle la « flore altérante ». Pour ralentir cet effet, et sans préjuger de l’absence de danger microbien, ces produits alimentaires fragiles doivent être conservés en conditions réfrigérées et consommés dans les quelques jours qui suivent leur préparation. Différentes solutions ont été proposées afin d’augmenter la durée de conservation des produits végétaux crus prêts à l’emploi. Un traitement thermique permet d’inactiver les microorganismes présents à la surface des fruits et légumes et responsables de leur détérioration. Ce traitement doit être de très courte durée (quelques secondes) à une température maitrisée jusqu’à 80°C environ. Il produit toutefois un effet de cuisson qui dénature la fraicheur des produits les plus fragiles et affecte leur texture. Il n’est pas adapté aux fruits tels que la fraise, le melon ou la mangue par exemple. Les fruits et légumes crus préparés peuvent être protégés par conditionnement dans un emballage sous atmosphère modifiée. Ce type de technique est couramment utilisé en industrie. S’il permet de limiter les phénomènes d’oxydation dus notamment au métabolisme endogène des végétaux, ce type de conditionnement est insuffisamment efficace pour éviter le développement de la flore pathogène et altérante ( ). Des traitements de type athermiques comme une exposition aux UV-C, à la lumière pulsée ou à de hautes pressions (HP) ont également été proposés. L’application de ces méthodes à un niveau industriel nécessite des équipements assez lourds, coûteux à l’acquisition, et associés à une consommation énergétique récurrente. D’autres solutions dont la mise en œuvre semble plus simple sont à l’étude. La possibilité d’ajout de conservateurs se trouve limitée à la fois par un cadre règlementaire de plus en plus strict et un rejet grandissant de la part des consommateurs pour les produits issus de la chimie. La piste des enrobages comestibles est émergeante mais encore incertaine à la fois pour des raisons de coût et de règlementation. L’état de la technique fait état de compositions bioprotectrices à base de bactéries lactiques. Ainsi, le document US2018/0000101 décrit une composition bioconservatrice basée sur des consortiums de lactobactéries hétérofermentaires facultatives, comprenant au moins une des lactobactéries non altérantes et non pathogènes du genre Lactobacillus générant des bactériocines, des acides organiques et des oxydants, pour prévenir et contrôler la détérioration des produits de viande fraîche et / ou cuite. Cette composition est utilisée pour inhiber la croissance de la bactérie pathogène List e ria . Le document EP1173064 décrit un procédé de conservation d'un produit alimentaire comprenant : (a) l'inoculation dans le produit alimentaire d'une quantité de micro-organismes secs, non toxiques, ayant une teneur d'eau inférieure à 15 % en poids ; puis (b) la pasteurisation du produit alimentaire, tout en veillant à ce qu'au moins une partie des micro-organismes non toxiques reste à l'état sec avec une teneur d'eau inférieure à 15 % en poids après la pasteurisation ; de façon que ; si le produit alimentaire est ultérieurement stocké dans des conditions réfrigérées, au moins une partie des micro-organismes restera sec avec une teneur en eau inférieure à 15 % en poids mais si le produit alimentaire est soumis plus tard à une température excessive, au moins une partie des micro-organismes non toxiques s'hydratera et sera par conséquent efficace pour inhiber au moins partiellement la croissance de micro-organismes toxiques à l'intérieur du produit alimentaire. Les micro-organismes utilisés dans ce procédé comprennent des bactéries choisies dans le groupe constitué de Pediococcus acidilactici , Lactobacillus bulgaricus , Lactobacillus plantarum , Lactobacillus acidophilus , Lactobacillus helveticus , Lactobacillus salivarius , Leuconostoc citrovorum , Streptococcus cremoris ( renommée Lactococcus lactis cremoris ) , Streptococcus diacetylactis ( renommée Lactococcus lactis diacetylactis ) , et Streptococcus lactis ( renommée Lactococcus lactis lactis ) . Les inventeurs ont identifié, à partir de fruits et légumes cultivées à l’île de La Réunion, des souches de bactéries lactiques, en particulier des souches Leuconostoc pseudomesentero i des présentant une activité antagoniste aux flores altérantes, notamment les levures et moisissures de carotte et de mangue. Ils ont montré que l’application d’une composition comprenant de telles bactéries lactiques sur les produits alimentaires comprenant des fruits et légumes (4ème gamme, purée et jus) permet de prolonger de plusieurs jours leur durée de conservation ( ). Les inventeurs proposent également une nouvelle méthode de sélection de bactéries lactiques capables d’inhiber une flore altérante en recherchant ces bactéries directement dans la flore microbienne provenant de la même niche écologique que celle du fruit ou légume duquel on souhaite augmenter la durée de conservation. Ainsi, l’invention concerne une composition de bioprotection caractérisée en ce qu’elle comprend au moins une souche de L. pseudomesenteroides , en particulier la souche FLOR4G 55. Une telle composition peut également contenir au moins une autre souche de L. pseudomesenteroides choisie parmi les souches FLOR4G 50, 61, 66 ou 87 ou la souche Leuconostoc citreum FLOR4G 76 ou la souche Lactobacillus paraplantarum FLOR4G 74 . Elle concerne également les nouvelles souches de bactéries lactiques décrites précédemment. Elle concerne aussi un procédé de bioprotection d’un produit alimentaire comprenant au moins un fruit et/ou légume de 4ème gamme, ou d’un jus frais ou d’une purée fraîche de fruits et/ou légumes comprenant l’addition d’une composition de bioprotection selon l’invention audit produit alimentaire pour prolonger sa durée de conservation. Elle concerne un procédé de sélection de bactéries lactiques capables d’inhiber la flore altérante d’un produit alimentaire frais comprenant au moins un fruit et/ou légume de 4ème gamme, ou une purée ou un jus, ces bactéries étant obtenues à partir d’une flore microbienne provenant de la même niche écologique que celle dudit fruit et/ou légume. Elle concerne enfin un procédé de préparation d’une composition de bioprotection d’un produit alimentaire comprenant au moins un fruit et/ou légume de 4ème gamme, ou une purée ou un jus obtenu à partir d’au moins un fruit et/ou légume frais, consistant à sélectionner des bactéries lactiques provenant de la flore microbienne issue de la même niche écologique dudit fruit et/ou légume et capables d’inhiber le développement de la flore altérante, et de les combiner dans une même composition destinée à prolonger la durée de conservation dudit produit alimentaire. Avantages de l’invention La présente invention met à disposition de nouvelles bactéries lactiques capable d’inhiber le développement de la flore altérante, en particulier de la flore altérante fongique. En particulier, ces compositions sont efficaces sur les mangues et les carottes, deux produits alimentaires couramment utilisés dans les aliments de 4 ème gamme, purées et jus. Les compositions de bioprotection selon l’invention permettent d’allonger la durée de conservation des fruits et légumes de 4 ème gamme, jus et purées, en limitant le développement des flores microbiennes d’altération. Elles contiennent uniquement des bactéries présentes naturellement sur les fruits et légumes et dont l’innocuité est avérée. Le principe est de modifier l’équilibre microbien naturel en inhibant le développement des levures, moisissures et bactéries altérantes de la matrice fruit ou légume par une présence accrue de certaines bactéries lactiques non altérantes pour la matrice. On cherche à éviter la survenue d’un déséquilibre de la flore microbienne naturelle au profit des microorganismes constitutifs de la flore altérante et responsables de la dégradation des produits frais. Cette méthode a l’avantage d’être peu consommatrice d’énergie, d’eau et sans intrant chimique. Notamment, les compositions de bioprotection ne contiennent aucun conservateur chimique. Elle ne nécessite pas d’installation ou d’équipement lourd. Pour augmenter encore la durée de conservation ou maximiser l’effet bioprotecteur, les compositions bioprotectrices selon l’invention pourraient être associées à un traitement physique tel que le conditionnement sous atmosphère modifiée, l’application de lumière pulsée ou une pasteurisation douce. Les compositions selon l’invention comprenant la nouvelle souche L . pseudomesentero i des FLOR4G 55 sont efficaces pour la bioprotection des mangues et des carottes. Il est vraisemblable qu’elles le soient également sur d’autres fruits et légumes. Cette invention ouvre donc la voie à de nouvelles compositions efficaces pour la bioprotection de produits assemblés tels que des salades de fruits ou salades composées. Enfin, la méthode de bioprotection proposée est simple à mettre en œuvre puisque l’application des compositions est réalisée après préparation des fruits ou légumes (lavage, épluchage, parage, pré-traitements éventuels) par bain ou pulvérisation pour les morceaux ou mélange pour les liquides. L’invention propose également une nouvelle approche pour la sélection de bactéries lactiques inhibitrices de la flore altérante. Celle-ci consiste à sélectionner ces bactéries directement dans la flore microbienne provenant de la même niche écologique que celle du fruit ou légume que l’on souhaite protéger de la dégradation. Ainsi, la composition de bioprotection n’apporte que des bactéries présentes naturellement sur les végétaux de sorte à inhiber le développement de la flore altérante. Les bactéries sélectionnées sont des bactéries lactiques avec un statut « safe use » dans les aliments : statuts GRAS et QPS. Elles font aussi partie de la liste IDF (International Dairy Federation) 2018 qui répertorie les bactéries utilisables comme ferments dans les aliments. DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION Un premier objet de l’invention concerne une composition de bioprotection caractérisée en ce qu’elle comprend au moins une souche de L . pseudomesentero i des . Par « bioprotection », on entend la capacité à protéger un produit alimentaire, généralement cru, en particulier des fruits et légumes de 4 ème gamme, ou des purées et jus de fruits et légumes frais contre l’altération causée par le développement d’une flore altérante. Des termes équivalents sont biocontrôle, biopréservation ou bioconservation. Les bactéries lactiques du genre L . pseudomesentero i des n’ont jamais été utilisées pour lutter contre le développement de la flore altérante. Ici, les inventeurs montrent que les souches FLOR4G 55, 50, 61, 66 et 87 présentent de telles propriétés. Ainsi, dans un mode de réalisation préféré de l’invention, une composition de bioprotection selon l’invention comprend au moins la souche FLOR4G 55 déposée auprès de la CNCM sous le numéro I-5557. Dans un autre mode de réalisation, elle comprend en outre au moins une autre souche de L . pseudomesentero i des choisie parmi la souche FLOR4G 50 déposée auprès de la CNCM sous le numéro I- 5556, la souche FLOR4G 61 déposée auprès de la CNCM sous le numéro I-5558, la souche FLOR4G 66 déposée auprès de la CNCM sous le numéro I-5559 et la souche FLOR4G 87 déposée auprès de la CNCM sous le numéro I-5560. Dans un mode de réalisation particulier, la composition comprend les souches FLOR4G 55, FLOR4G 50, FLOR4G 66 et FLOR4G 87. Cette composition dite « composition 1 » est particulièrement appropriée à la bioprotection de la mangue (Voir Exemple 1). Dans un autre mode de réalisation, la composition comprend en plus d’une ou plusieurs souches de L . pseudomesentero i des telles que définies précédemment, la souche L . citreum FLOR4G 76 déposée auprès de la CNCM sous le numéro I-5555 et/ou la souche L . paraplantarum FLOR4G 74 déposée auprès de la CNCM sous le numéro I-5554. Dans un mode de réalisation particulier, la composition comprend les souches FLOR4G 55, FLOR4G 61, FLOR4G 74 et FLOR4G 76. Cette composition dite « composition 2 » est particulièrement appropriée à la bioprotection de la carotte (Voir Exemple 2). Un deuxième objet de l’invention concerne de nouvelles souches de bactéries lactiques présentant des propriétés de bioprotection ainsi que leur utilisation pour la bioprotection de fruits et légumes de 4 ème gamme, de purées et jus. Ces nouvelles souches sont les suivantes : la souche L. pseudomesenteroides FLOR4G 55 déposée auprès de la CNCM sous le numéro I-5557 ; la souche L. pseudomesenteroides FLOR4G 50 déposée auprès de la CNCM sous le numéro I- 5556 ; la souche L. pseudomesenteroides FLOR4G 61 déposée auprès de la CNCM sous le numéro I- 5558 ; la souche L. pseudomesenteroides FLOR4G 66 déposée auprès de la CNCM sous le numéro I-5559 ; la souche L. pseudomesenteroides FLOR4G 87 déposée auprès de la CNCM sous le numéro I-5560 ; la souche L. citreum FLOR4G 76 déposée auprès de la CNCM sous le numéro I-5555 ; la souche L. paraplantarum FLOR4G 74 déposée auprès de la CNCM sous le numéro I-5554. Ces souches sont de préférence utilisées en combinaison dans des compositions. Ainsi, l’invention concerne l’utilisation d’une composition comprenant la souche L. pseudomesenteroides FLOR4G 55 et au moins une autre souche choisie parmi (i) les souches L. pseudomesenteroides FLOR4G 50 déposée auprès de la CNCM sous le numéro I- 5556, FLOR4G 61 déposée auprès de la CNCM sous le numéro I-5558, FLOR4G 66 déposée auprès de la CNCM sous le numéro I-5559, FLOR4G 87 déposée auprès de la CNCM sous le numéro I-5560, (ii) la souche L. citreum FLOR4G 76 déposée auprès de la CNCM sous le numéro I-5555 et (iii) la souche L. paraplantarum FLOR4G 74 déposée auprès de la CNCM sous le numéro I-5554, pour la bioprotection d’un produit alimentaire frais comprenant au moins un fruit et/ou légume de 4ème gamme, ou d’un jus frais ou d’une purée fraîche de fruits et/ou légumes. Dans un mode de réalisation particulier, l’invention concerne l’utilisation d’une composition comprenant les souches FLOR4G 55, FLOR4G 50, FLOR4G 66 et FLOR4G 87 (composition 1) pour la bioprotection d’un produit alimentaire frais comprenant au moins un fruit et/ou légume de 4ème gamme, ou d’un jus frais ou d’une purée fraîche de fruits et/ou légumes, en particulier pour la bioprotection de la mangue. Dans un autre mode de réalisation particulier, l’invention concerne l’utilisation d’une composition comprenant les souches FLOR4G 55, FLOR4G 61, FLOR4G 74 et FLOR4G 76 (composition 2) pour la bioprotection d’un produit alimentaire frais comprenant au moins un fruit et/ou légume de 4ème gamme, ou d’un jus frais ou d’une purée fraîche de fruits et/ou légumes, pour la bioprotection de la carotte. Un troisième objet de l’invention concerne un procédé de bioprotection d’un produit alimentaire comprenant au moins un fruit et/ou légume de 4ème gamme, ou d’un jus frais ou d’une purée fraîche de fruits et/ou légumes comprenant : - la préparation dudit produit alimentaire frais par découpage et/ou épluchage, mixage ou écrasement d’au moins un fruit et/ou légume ; - l’addition d’une composition de bioprotection telle que définie précédemment audit produit alimentaire pour prolonger sa durée de conservation. Par « produit de 4ème gamme », on entend les légumes et fruits frais (fraîchement récoltés), crus, lavés, épluchés et/ou coupés. La composition peut être ajoutée sur le fruit ou légume par tout moyen : pulvérisation, trempage, application au pinceau, brumisation… ou par mélange s’il s’agit de jus ou de purée. A titre indicatif, l’inoculation d’un jus est généralement réalisée en ajoutant entre 10 5 à 10 9 bactéries lactiques par mL. De manière préférée, l’inoculation est réalisée avec entre 10 6 à 10 8 de bactéries lactiques par mL. L’homme du métier saura ajuster la quantité de bactéries en fonction de la préparation de fruits et/ou légumes de 4 ème gamme, de la purée ou du jus concernés. Un quatrième objet de l’invention concerne un procédé de sélection de bactéries lactiques capables d’inhiber la flore altérante d’un produit alimentaire frais comprenant au moins un fruit et/ou légume de 4ème gamme, ou une purée ou un jus, lesdites bactéries lactiques obtenues à partir de la flore microbienne provenant de la même niche écologique que celle dudit fruit et/ou légume comprenant les étapes de : a) Culture d’une flore microbienne provenant de la même niche écologique que celle dudit au moins un fruit et/ou légume b) Isolement de différents isolats de bactéries lactiques parmi la flore microbienne cultivée à l’étape a), de préférence au moins 2 ou plus, c) Identification des différents isolats de bactéries lactiques isolés à l’étape b) d) Culture d’une flore microbienne provenant dudit au moins un fruit et/ou légume e) Identification de différents isolats fongiques parmi ladite flore microbienne cultivée à l’étape d), de préférence au moins 2 ou plus f) Culture desdits isolats fongiques sur un milieu représentatif dudit fruit et/ou légume et sélection des isolats altérants dudit milieu afin de préparer un cocktail altérant g) Mise en contact, sur milieu gélosé comprenant un extrait (jus, purée, nectar) dudit fruit et/ou légume, du cocktail altérant avec chacun des isolats bactériens identifiés et incubation 7 jours à 10°C h) Sélection d’au moins une bactérie lactique capable d’inhiber le développement du cocktail altérant. Par « niche écologique » (ou biotope) on entend un ensemble de conditions (pH, gamme de températures, hygrométrie, composition en sucres, composés phytochimiques…) représentatives du milieu naturel des bactéries, ici des végétaux. La niche écologique des fruits et légumes comprend une flore microbienne qui est différente, au niveau souches, de celle des produits laitiers (composition en sucres, protéines…) ou celle trouvée en milieu médical, pour une même espèce. La différence s’exprime par des phénotypes différents, résultant d’une divergence des génomes. La notion de niche écologique est documentée dans la littérature au travers de la domestication des bactéries versus les souches « environnementales » par exemple pour les lactocoques retrouvés dans les produits laitiers ou les bactéries lactiques Oenococcus impliquées dans les fermentations de cidre ou vin : Cavanagh, D., Fitzgerald, G.F., McAuliffe, O., 2015. From field to fermentation: The origins of Lactococcus lactis and its domestication to the dairy environment. Food Microbiology 47, 45–61. Laroute, V., Tormo, H., Couderc, C., Mercier-Bonin, M., Le Bourgeois, P., Cocaign-Bousquet, M., Daveran-Mingot, M.-L., 2017. From genome to phenotype: an integrative approach to evaluate the biodiversity of Lactococcus lactis . Microorganisms 5. Campbell-Sills, H., El Khoury, M., Favier, M., Romano, A., Biasioli, F., Spano, G., Sherman, D.J., Bouchez, O., Coton, E., Coton, M., Okada, S., Tanaka, N., Dols-Lafargue, M., Lucas, P.M., 2015. Phylogenomic analysis of Oenococcus oeni reveals specific domestication of strains to cider and wines. Genome biology and evolution 7, 1506–18. La flore microbienne cultivée pour identifier les isolats fongiques constitutifs de la flore altérante provient d’un fruit ou légume altéré, de préférence visiblement ou olfactivement altéré. Les procédés de l’état de la technique proposent de tester des bactéries lactiques connues afin d’identifier des propriétés d’antagonisme vis-à-vis de microorganismes altérants ou dangereux pour la santé du consommateur. Il s’agit donc de rechercher des microorganismes d’intérêt dans des biobanques établies. D’autre part, le criblage de ces microorganismes est généralement réalisé sur des microorganismes cibles isolés, tels que Listeria monocytogenes . Le procédé de sélection selon l’invention est original et innovant à deux égards. D’une part parce qu’il propose de sélectionner des bactéries capables d’inhiber la croissance d’une flore altérante parmi une flore microbienne naturelle, sans sélection préalable. Ce choix permet l’identification de nouvelles souches intéressantes. D’autre part l’étape de sélection des bactéries lactiques est réalisée dans un écosystème très proche du fruit ou légume constituant un produit alimentaire. En effet, la sélection a lieu sur un milieu de composition issu du fruit ou légume à biopréserver et comprenant un ensemble d’isolats fongiques représentatifs de la flore altérante cultivés sur le fruit ou légumes pour lequel on souhaite préparer une composition bioprotectrice. Ce procédé permet d’obtenir des compositions dont l’efficacité bioprotectrice est particulièrement élevée. Enfin, un cinquième objet de l’invention concerne un procédé de préparation d’une composition de bioprotection d’un produit alimentaire comprenant au moins un fruit et/ou légume de 4ème gamme, ou une purée ou un jus obtenu à partir d’au moins un fruit et/ou légume frais consistant à sélectionner des bactéries lactiques provenant de la flore microbienne dudit fruit et/ou légume ou du même écosystème et capables d’inhiber le développement de la flore altérante conformément au procédé défini précédemment, et de les combiner dans une même composition destinée à prolonger la durée de conservation dudit produit alimentaire. DESCRIPTION DES FIGURES : Schéma représentatif des objectifs de biopréservation à l’aide de flores microbiennes pour la conservation des produits végétaux. La flore bioprotectrice peut permettre de contrôler le développement de la flore pathogène et de la flore d’altération, mais pas le métabolisme du végétal, pour lequel un autre moyen de contrôle est à prévoir, par exemple une atmosphère modifiée. : Evaluation de l’inhibition de la flore altérante par les bactéries de la souche FLOR4G 55 sur jus de mangue. : Evolution des populations fongiques pendant la conservation réfrigérée de purée de mangue, avec ou sans biopréservation. Une lettre identique dans une série de données indique l’absence de différence. : Evaluation de l’inhibition de la flore altérante par les bactéries de la souche FLOR4G 55 sur jus de carotte. : Evolution des populations fongiques pendant la conservation réfrigérée de jus de carotte, avec ou sans biopréservation. Une lettre identique dans une série de données indique l’absence de différence. EXEMPLES EXEMPLE 1 : Identification de souches bactériennes inhibitrices de la flore altérante de la mangue L’expérience a été réalisée sur un 8 lots de mangues récoltées sur 2 saisons de sorte à avoir un échantillonnage représentatif de la diversité des produits et de la flore altérante présente sur les mangues. - Préparation et analyse de la flore microbienne de la mangue Des préparations de 4 ème gamme de mangues ont été réalisées et conservées en conditions réfrigérées. Un suivi de la dynamique microbienne et des évolutions physicochimiques a été mis en place durant 14 jours, en utilisant différentes méthodes : méthodes PCR-DGGE, metabarcoding, dénombrements (levures-moisissures, entérobactéries, flore psychrotrophe et bactéries lactiques), couleur, texture, acidité (pH, acidité titrable, teneur en sucres solubles). La couleur des mangues de 4 e gamme évolue pendant la conservation. Elle devient significativement différente dès 3 jours de conservation (valeur de 6,9) et augmente jusqu’à 12 au bout de 14 jours. Le pH, initialement à 4,4 en moyenne, reste stable. La population microbienne augmente et cette augmentation est significative dès 3 jours de conservation pour les bactéries psychrotrophes, les levures et moisissures (flore fongique), les entérobactéries et les bactéries lactiques. Le seuil de 10 6 UFC/g est atteint pour chacune de ces flores à 14 jours de conservation. D’après les critères sensoriels, le produit n’est plus acceptable à 14 jours de conservation. La durée de vie du produit (DLC) est estimée à 10 jours. Des isolats fongiques et bactériens ont été collectés et identifiés à partir des échantillons de mangue pendant la conservation. - Recherche d’isolats fongiques représentatifs de la flore altérante de la mangue Au total, 20 isolats fongiques ont été collectés à partir de la flore microbienne de la mangue. Chaque isolat fongique a été cultivé indépendamment sur un nectar de mangue appertisé commercial avec une incubation à 4°C et à 10°C, en appliquant deux niveaux d’inoculation. La capacité d’altération de chaque isolat a été étudiée par mesure du pH, observation de l’aspect du jus, mesure de la production de gaz, dénombrement de la culture, détermination de couleur. Cette étape a permis de sélectionner un « cocktail » altérant constitué de 4 isolats fongiques (isolats 9 Cryptococcus sp., 14 Hanseniaspora uvarum , 22 Yarrowia lipolytica et 2 Debaryomyces hansenii ) choisis en fonction des modifications telles que décrites au Tableau 1 et en appliquant des critères de diversité (ne pas sélectionner des isolats de la même souche par exemple). Isolat Modification texture Production de gaz Acidification 9 oui non pH ≤ 4 8 oui non pH ≤ 4,2 7, 14 , 41, V, W non oui pH ≤ 4 2 , 11, 15, 21, 22 , 27, 42 non non pH ≤ 4 1, 10, 23, 24, P, Q non non pH ≤ 4,4 Tableau 1 : Modifications de jus de mangue (conservation 4 ou 10°C) en présence d’isolats fongiques issus de mangues 4 e gamme Cogshall ou José - Recherche d’isolats de bactéries lactiques qui n’altèrent pas les caractéristiques du nectar de mangue Des isolats de bactéries lactiques ont été obtenus à partir de la flore microbienne provenant de la niche écologique de fruits et légumes, puis identifiés. Ces isolements de flores ont été réalisés sur différents milieux à partir de fruits et légumes locaux cultivés sur l’ile de La Réunion, y compris de mangues 4 e gamme. Une collection de 35 isolats a été utilisée, 17 provenant de chou, 9 de papaye et 9 de mangue. Chaque isolat bactérien a été cultivé indépendamment sur nectar de mangue afin de détecter une éventuelle altération, déterminée par une modification de texture ou une acidification. Cette étape a permis de sélectionner 18 isolats de bactéries lactiques dont 11 correspondent à des bactéries lactiques peu acidifiantes et capables de croitre à moins de 10°C isolées de chou ou papaye, l’autre partie étant les isolats de mangue de ce projet. - Détermination de la capacité d’antagonisme des bactéries lactiques sélectionnées sur le développement de la flore altérante Cette expérience a été réalisée en conditions modélisant le fruit : une microplaque contenant un mélange (en proportion 1:1) de nectar de mangue (du commerce) et de l’agar. Des flores lactiques ont été incluses dans l’agar et le tout a été incubé pendant 7 jours 10°C. Puis une goutte du cocktail altérant a été déposé à la surface de l’agar et le tout a été incubé au moins 7 jours à 4°C. L’évaluation de la capacité d’antagonisme de chaque isolat bactérien repose sur la détermination de la taille de la colonie altérante sur le témoin (agar sans bactéries lactiques) versus chaque isolat ( ). Cette étape a permis de sélectionner les bactéries inhibant la croissance du cocktail altérant sur nectar de mangue : isolats 50, 55, 66, 87 qui sont identifiées comme des L . pseudomesenteroides . - Validation de l’efficacité des bactéries lactiques sélectionnées sur purée de mangue Des essais ont été réalisés sur des purées de mangues avec leur contamination naturelle (pas d’ajout de cocktail altérant). Ces essais consistent à inoculer des purées de mangues avec une composition comprenant les bactéries lactiques FLOR4G 55, 50, 66 et 87 préalablement sélectionnées (composition 1), avec deux niveaux d’inoculation différents (bas et haut : 6 et 8 log UFC/g respectivement) en comparaison avec un témoin (non inoculé). L’évaluation porte sur la durée de conservation à l’aide de critères physicochimiques et microbiologiques. Après 7 jours de conservation, les populations en bactéries psychrotrophes, flore fongique et entérobactéries du témoin ont significativement augmenté par rapport au jour de la préparation et sont comprises entre 3,6 et 4,9 log UFC/g ( ). La couleur est significativement modifiée (différence avec le premier jour de 3,5). Pour les deux essais biopréservés, les populations à 7 jours sont significativement plus faibles que celle du témoin pour les levures et moisissures et les entérobactéries. La population en bactéries psychrotrophes est moindre uniquement pour le niveau d’inoculation bas. La différence de couleur par rapport au jour de préparation n’est pas différente entre les trois modalités. Après 10 jours de conservation, les populations sur le témoin sont passées à 4,0 log UFC/g pour les bactéries psychrotrophes, 5,7 log UFC/g pour les levures et moisissures et 5,4 log UFC/g pour les entérobactéries. La couleur n’a pas plus évolué qu’après 7 jours et le pH est identique au pH initial (4,0). Les populations en bactéries psychrotrophes et en levures et moisissures sont significativement plus faibles pour les deux essais de biopréservation, avec des valeurs de 3,5 et 3,6 log UFC/g pour les psychrotrophes et 4,3 et 4,1 log UFC/g pour les fongiques, respectivement pour le bas et le haut niveau d’inoculation en bactéries de biopréservation. La couleur est modifiée pour les essais en comparaison du témoin, par sa composante jaune qui est plus marquée. Pour l’essai à bas niveau d’inoculation, après 17 jours de conservation, la population en bactéries psychrotrophes atteint 3,9 log UFC/g et 5,3 log UFC/g pour les levures et moisissures, ce qui est du même ordre que le témoin après 10 jours. Le renforcement de la couleur jaune a augmenté. Cette durée de conservation apparait correspondre à la DLC. A 17 jours de conservation, pour l’essai à haut niveau d’inoculation, les observations sont similaires à celles de l’essai à bas niveau. Cette modalité conduit à la même durée de vie du produit. EXEMPLE 2 : Identification de souches bactériennes inhibitrices de la flore altérante de la carotte L’expérience a été réalisée sur un 10 lots de carottes récoltées entre décembre 2017 et mai 2019 de sorte à avoir un échantillonnage représentatif de la diversité des produits et du type de flore altérante présent sur les carottes. - Préparation et analyse de la flore microbienne de la carotte Des préparations de 4ème gamme de carottes ont été réalisées et conservées en conditions réfrigérées. Un suivi de la dynamique microbienne et des paramètres physicochimiques a été mis en place durant 14 jours, en utilisant différentes méthodes : méthodes PCR-DGGE, metabarcoding, dénombrements levures-moisissures, entérobactéries, flore psychrotrophe et bactéries lactiques), couleur, texture, acidité (pH, acidité titrable, teneur en sucres solubles). La couleur évolue au cours de la conservation et la modification devient significative après 3 jours de conservation (différence de 5,6). Une diminution de la composante rouge de la couleur est observée. En moyenne pour les 10 lots observés, il apparait que la population en levures et moisissures et en entérobactéries devient significativement différente du témoin (échantillons du jour de la préparation) après 7 jours de stockage à 4°C. La flore psychrotrophe atteint des populations significativement différentes du témoin après 10 jours de stockage. Ces trois flores dépassent le seuil de 10 6 UFC/g après 7 jours pour les entérobactéries et les levures et moisissures et 10 jours pour les bactéries psychrotrophes. En revanche, la population en bactéries lactiques ne devient différente du témoin qu’après 14 jours et la population est passée de 10 3,9 à 10 5,2 UFC/g. Ces observations moyennes masquent une variabilité élevée selon les lots. Par exemple, le seuil de 10 6 UFC/g en levures et moisissures est atteint en 3 à 10 jours selon le lot. Des isolats à la fois fongiques et bactériens ont été collectés et identifiés à partir de cette flore microbienne. - Recherche d’isolats fongiques représentatifs de la flore altérante de la carotte Un panel de 24 isolats fongiques a été collecté à partir de la flore microbienne de la carotte préparée en 4 e gamme et conservée à 4°C, de 0 à 7 jours. Pour évaluer la capacité d’altération de ces isolats, chaque isolat fongique a été cultivé indépendamment sur un jus de carotte appertisé commercial avec une incubation à 4°C et à 10°C, en appliquant deux niveaux d’inoculation. La capacité d’altération de chaque isolat a été étudiée par mesure du pH, observation de l’aspect du jus, mesure de la production de gaz, dénombrement de la culture, détermination de couleur (Tableau 2). Cette étape a permis de sélectionner un « cocktail » altérant constitué de 3 isolats fongiques (isolats 36 Meyerozyma guilliermondii , 37 Penicillium sp. et 39 Pichia fermentans ) choisis en fonction des modifications telles que décrites au Tableau 1 et en appliquant des critères de diversité (ne pas sélectionner des isolats de la même souche par exemple). isolat Modification texture Production de gaz Acidification 36 oui non ≥ 0,3 u. pH 29, 31, 35, 39 non oui ≥ 0,3 u. pH 6, 30, 32, 33, 37 non non ≥ 0,3 u. pH 4, 5, 25, 28, 32, 34, 40, U non non ≥ 0,2 u. pH 13, 26 non non ≤ 0,2 u. pH Tableau 2 : Modifications de jus de carotte (conservation 4 ou 10°C) en présence d’isolats fongiques issus de carottes râpées 4 e gamme - Recherche d’isolats de bactéries lactiques qui n’altèrent pas le jus de carotte Des isolats de bactéries lactiques ont été obtenus à partir de la flore microbienne épiphyte de fruits et légumes. Ces isolements ont été réalisés sur milieu de culture MRS (gélose de Man, Rogosa, Sharpe) à partir de fruits et légumes locaux cultivés sur l’ile de La Réunion, y compris de carottes 4 e gamme. Au total 37 bactéries lactiques, dont 10 isolées de carotte, 9 de papaye et 18 de chou, ont été cultivées indépendamment sur jus de carottes afin de détecter une éventuelle altération, détectée par l’acidification ou par le changement de texture. Cette étape a permis de sélectionner 36 isolats de bactéries lactiques dont une partie correspond à des bactéries lactiques peu acidifiantes et capables de croitre à moins de 10°C, l’autre partie étant les isolats de carotte de ce projet. Ces bactéries appartiennent aux espèces L . citreum , L . mesenteroides , L . pseudomesenteroides ou L . paraplantarum . Détermination de la capacité d’antagonisme des bactéries lactiques sélectionnées sur le développement de la flore altérante Cette expérience a été réalisée en conditions modélisant le fruit : une microplaque contenant un mélange (en proportion 1:1) du jus de carotte (pur jus du commerce) et de l’agar. Des flores lactiques ont été incluses dans l’agar et le tout a été incubé pendant 7 jours 10°C. Puis une goutte du cocktail altérant (chaque isolat du cocktail préparé indépendamment, centrifugé, lavé avec de l’eau physiologique et mélangé volume à volume) a été déposée à la surface de l’agar et le tout a été incubé au moins 7 jours à 4°C. L’évaluation de la capacité d’antagonisme de chaque isolat bactérien repose sur la détermination de la taille de la colonie altérante sur le témoin (agar sans bactéries lactiques) versus chaque isolat. La montre l’efficacité de la souche FLOR4G 55 sur l’inhibition de la croissance de la flore altérante sur un jus de carotte. Cette étape a permis de sélectionner les bactéries inhibant la croissance du cocktail altérant sur jus de carotte : les isolats 55 et 61 qui correspondent à des L . pseudomesenteroides , l’isolat 74 qui est un L . paraplantarum et l’isolat 76 qui est un L . citreum . Validation de l’efficacité des bactéries lactiques sélectionnées sur jus de carotte Des essais ont été réalisés en triplicats indépendants sur du jus de carotte (préparé à partir de carottes râpées cultivées localement) avec leur contamination naturelle (pas d’ajout de cocktail altérant). Ces essais consistent à inoculer des jus de carottes avec une composition comprenant les bactéries lactiques FLOR4G 55, 76 et 74 préalablement sélectionnées (composition 2), avec deux niveaux d’inoculation différents (bas et haut) en comparaison avec un témoin (non inoculé). L’évaluation porte sur la durée de conservation à l’aide de critères physicochimiques, microbiologiques et sensoriels. Pour ces essais, une population de 10 6 (niveau bas) ou 10 8 (niveau haut) bactéries lactiques a été inoculée par mL de jus. Le jus de carotte (témoin, essai niveau bas et essai niveau haut) a été ensuite conservé à 4°C jusqu’à 17 jours. Les populations en bactéries lactiques après inoculation étaient respectivement de 10 3,4 , 10 7 et 10 8,7 UFC/mL respectivement pour le témoin, l’essai à niveau bas et l’essai à niveau haut. Le jus témoin a montré après 3 jours un déphasage et une variation de couleur significative (différence de 10,8). La population en levures et moisissures et en bactéries psychrotrophes était significativement plus élevée après 3 jours de conservation. L’essai inoculé à bas niveau de bactéries lactiques a montré aussi un déphasage après 3 jours de conservation. Toutefois, la couleur était mieux préservée (différence de 3,2). Les populations microbiennes ont augmenté en 3 jours, comme pour le témoin. L’essai inoculé à haut niveau a montré un profil différent. Aucun déphasage n’a été observé. La couleur a évolué mais moins rapidement que pour le témoin (différence à 3 jours de 4,3 et à 7 jours de 5,8). La population en entérobactéries n’évolue pas de façon significative pendant les 17 jours de suivi. La population en levures et moisissures et en bactéries psychrotrophes devient différente du témoin (jour 0) après 7 jours et le seuil à 10 6 UFC/mL est atteint respectivement après 10 et 14 jours pour les bactéries psychrotrophes et les levures et moisissures ( ). Il est à noter que contrairement aux autres modalités, l’essai inoculé à haut niveau de bactéries lactiques montre une diminution de pH significative (diminution de 6,5 à 5,0 après 3 jours). Les analyses sensorielles pratiquées après 7 jours de conservation avec un jury entrainé ont permis de comparer les trois modalités. Le jus témoin est jugé plus « acétique » alors que le jus inoculé à haut niveau conduit au choix des descripteurs « carotte » et « sucré ». D’après ces données, l’inoculation de bactéries lactiques à haut niveau permet de conserver le jus de carotte de 7 à 10 jours en comparaison du jus témoin qui se conserve moins de 3 jours. 1. Composition de bioprotection caractérisée en ce qu’elle comprend au moins une souche de L . pseudomesenteroides . Composition selon la revendication 1 caractérisée en ce que ladite souche de L. pseudomesenteroides est la souche FLOR4G 55 déposée auprès de la CNCM sous le numéro I-5557. Composition selon la revendication 2 caractérisée en qu’elle comprend en outre au moins une autre souche de L. pseudomesenteroides choisie parmi la souche FLOR4G 50 déposée auprès de la CNCM sous le numéro I-5556, la souche FLOR4G 61 déposée auprès de la CNCM sous le numéro I-5558, la souche FLOR4G 66 déposée auprès de la CNCM sous le numéro I-5559 et la souche FLOR4G 87 déposée auprès de la CNCM sous le numéro I-5560. Composition selon l’une des revendications 2 ou 3 comprenant en outre au moins une souche choisie parmi la souche L. citreum FLOR4G 76 déposée auprès de la CNCM sous le numéro I-5555 et la souche L. paraplantarum FLOR4G 74 déposée auprès de la CNCM sous le numéro I-5554. Souche de bactérie lactique bioprotectrice choisie parmi l’une des souches suivantes : la souche L. pseudomesenteroides FLOR4G 55 déposée auprès de la CNCM sous le numéro I-5557 ; la souche L. pseudomesenteroides FLOR4G 50 déposée auprès de la CNCM sous le numéro I- 5556 ; la souche L. pseudomesenteroides FLOR4G 61 déposée auprès de la CNCM sous le numéro I- 5558 ; la souche L. pseudomesenteroides FLOR4G 66 déposée auprès de la CNCM sous le numéro I-5559 ; la souche L. pseudomesenteroides FLOR4G 87 déposée auprès de la CNCM sous le numéro I-5560 ; Utilisation d’au moins une souche de bactérie lactique telle que définie à la revendication 5 pour la bioprotection d’un produit alimentaire frais comprenant au moins un fruit et/ou légume de 4ème gamme, ou d’un jus frais ou d’une purée fraîche de fruits et/ou légumes. Utilisation d’une composition choisie parmi l’une des compositions suivantes : composition comprenant les souches FLOR4G 55, FLOR4G 50, FLOR4G 66 et FLOR4G 87 telles que définies selon l’une des revendication 1 à 6 ; composition comprenant les souches FLOR4G 55, FLOR4G 61, FLOR4G 74 et FLOR4G 76 telles que définies selon l’une des revendication 1 à 6 pour la bioprotection d’un produit alimentaire frais comprenant au moins un fruit et/ou légume de 4ème gamme, ou d’un jus frais ou d’une purée fraîche de fruits et/ou légumes. Procédé de bioprotection d’un produit alimentaire frais comprenant au moins un fruit et/ou légume de 4ème gamme, ou d’un jus frais ou d’une purée fraîche de fruits et/ou légumes comprenant : - la préparation dudit produit alimentaire frais par découpage et/ou épluchage, mixage ou écrasement d’au moins un fruit et/ou légume ; - l’addition d’une composition de bioprotection telle que définie à l’une des revendications 1 à 4 audit produit alimentaire pour prolonger sa durée de conservation. Procédé de sélection de bactéries lactiques capables d’inhiber la flore altérante d’un produit alimentaire fraiscomprenant au moins un fruit et/ou légume de 4ème gamme, ou une purée ou un jus, lesdites bactéries lactiques obtenues à partir de la flore microbienne provenant de la même niche écologique que celle dudit fruit et/ou légume comprenant les étapes de : a) culture d’une flore microbienne provenant de la même niche écologique que celle dudit au moins un fruit et/ou légume b) Isolement de différents isolats de bactéries lactiques parmi la flore microbienne cultivée à l’étape a), de préférence au moins 2 ou plus, c) Identification des différents isolats de bactéries lactiques isolés à l’étape b), d) Culture d’une flore microbienne provenant dudit au moins un fruit et/ou légume e) Identification de différents isolats fongiques parmi ladite flore microbienne cultivée à l’étape d), de préférence au moins 2 ou plus, f) Culture desdits isolats fongiques sur un milieu représentatif dudit fruit et/ou légume et sélection des isolats altérants dudit milieu afin de préparer un cocktail altérant. g) Mise en contact, sur milieu gélosé comprenant un extrait (jus, purée, nectar) dudit fruit et/ou légume, du cocktail altérant avec chacun des isolats bactériens identifiés et incubation 7 jours à 10°C h) Sélection d’au moins une bactérie lactique capable d’inhiber le développement du cocktail altérant.