Brevet FR3123427A1 — publié le 20221202

La présente description concerne un système d’imagerie tridimensionnelle (100) comprenant une source lumineuse (110) configurée pour l’émission d’un faisceau de lumière incohérente spatialement, de longueur centrale donnée, configuré pour illuminer un échantillon biologique (10) en transmission; un système d’imagerie optique (120) comprenant un objectif de microscope (121) avec un plan focal objet (125) donné au voisinage duquel l’échantillon (10) est positionné; des moyens de déplacement axial dudit objectif de microscope par rapport audit échantillon; un dispositif d’acquisition bidimensionnelle (140) comprenant une pluralité de détecteurs élémentaires agencés dans un plan de détection (141) conjugué optiquement avec ledit plan focal objet et une unité de traitement (150). Pour chaque section d’un objet biologique de l’échantillon, une pluralité de signaux interférométriques bidimensionnels résultant d’interférences optiques entre le faisceau d’illumination et un faisceau diffusé par un champ objet de ladite section sont acquis et au moins une première image est calculée à partir de ladite pluralité de signaux interférométriques bidimensionnels. Figure pour l’abrégé : FIG. 1A Procédés et systèmes d’imagerie tridimensionnelle d’un objet biologique transparent dans un échantillon biologique par tomographie optique plein champ La présente description concerne des procédés et systèmes d’imagerie tridimensionnelle d’un objet biologique transparent dans un échantillon biologique par tomographie optique plein champ. Elle est applicable notamment à l’imagerie cellulaire et intracellulaire. Etat de la technique Les objets biologiques tels que notamment les cellules ou amas de cellules peuvent être étudiés à l'échelle submicronique en utilisant la microscopie optique, mais la plupart des études biologiques utilisent la microscopie à fluorescence qui nécessite de modifier l'échantillon génétiquement ou chimiquement. Dans les cas où la conservation des échantillons est essentielle, quelques alternatives reposant sur les propriétés optiques intrinsèques des objets biologiques ont été développées. Parmi eux, la microscopie à contraste de phase (voir par exemple Lacey, A [Réf 1]), la microscopie à contraste d'interférence différentielle (voir par exemple Pluta, M [Réf 2]) ou l'holographie numérique (voir par exemple Amos, W. B. et al. [Réf 3]) permettent de visualiser des cellules dans des environnements 2D et 3D. Les techniques d’imagerie par tomographie optique permettent de générer des images en coupe en profondeur d’objets biologiques. On connait notamment parmi ces techniques la tomographie par cohérence optique (ou « OCT » selon l’abréviation anglosaxonne « Optical Coherence Tomography ») basée sur la microscopie à interférence lumineuse à large bande spectrale et la microscopie confocale qui utilise un filtrage géométrique. Les deux techniques nécessitent un balayage bidimensionnel de l’échantillon pour générer une image en face de l’échantillon. Plus récemment a été développée la technique d’acquisition d’image par microscopie interférentielle plein champ en lumière incohérente, connue sous le nom d’OCT plein champ (ou « FF-OCT » pour « Full-Field OCT »). La technique d’imagerie OCT plein champ est par exemple décrite dans le chapitre « Time Domain Full Field Optical Coherence Tomography Microscopy Time Domain » de Harms, F. et al . [Réf. 4] de l’ouvrage « Optical Coherence Tomography ” Wolfgang Drexler, ainsi que dans le brevet français FR2817030 [Réf. 5]. La technique d’imagerie OCT plein champ est basée sur l’exploitation de la lumière rétrodiffusée par un échantillon lorsqu’il est éclairé par une source lumineuse à faible longueur de cohérence temporelle, et en particulier l’exploitation de la lumière rétrodiffusée par les structures microscopiques cellulaires et tissulaires dans le cas d’un échantillon biologique. Cette technique exploite la faible cohérence temporelle et spatiale d’une source lumineuse pour isoler la lumière rétrodiffusée par une tranche virtuelle en profondeur dans l’échantillon. L’emploi d’un interféromètre permet de générer, par un phénomène d’interférence, un signal d’interférence représentatif de la lumière provenant sélectivement d’une tranche donnée de l’échantillon, et d’éliminer la lumière provenant du reste de l’échantillon. La technique d’imagerie OCT plein champ permet d’obtenir des images en trois dimensions avec une résolution typique de l’ordre de 1µm, ce qui est supérieur aux résolutions de l’ordre de 10µm susceptibles d’être obtenues avec d’autres techniques OCT conventionnelles telles que l’OCT dans le domaine spectral (connue sous l’acronyme « Fourier-Domain OCT » ou « spectral domain OCT »). Avec une telle résolution, on peut visualiser notamment la majorité des structures tissulaires de vaisseaux sanguins, de leurs parois, le collagène, les adipocytes, etc. De plus cette technique se montre particulièrement rapide : il est ainsi possible de générer à l’aide d’un microscope à OCT plein champ une image représentative d’une tranche en profondeur dont la surface est de plusieurs cm² en quelques minutes seulement. En plus d'obtenir une carte structurelle d’un échantillon biologique, un autre défi pour l'imagerie optique endogène consiste à extraire des informations spécifiques pour déduire des propriétés biochimiques au niveau cellulaire. Le brevet français FR 3034858 [Réf. 6] décrit un procédé d’imagerie par microscopie interférentielle plein champ nommé DC-FFOCT (pour « Dynamic Contrast FFOCT ») permettant d’accéder à des informations non perceptibles au moyen des images obtenues selon les techniques d’OCT plein champ classiques, comme par exemple les structures internes de cellules (membrane, noyau, cytoplasme notamment). Ce procédé d’imagerie est basé sur l’analyse des variations temporelles d’intensité entre des signaux interférométriques induites par les variations de différence de marche associées aux mouvements par exemples des vésicules, des mitochondries, organites cellulaires. Une telle analyse dynamique permet d’obtenir des images tomographiques plein champ dans un tissu frais, dans lequel les cellules sont toujours vivantes, avec un excellent contraste et ainsi de visualiser des structures d’objets biologiques jusqu’ici non perceptibles en OCT car les cellules rétrodiffusent très peu de lumière par rapport aux structures du tissu comme le collagène. Cependant, les techniques FF-OCT et DC-FFOCT décrites ci-dessus travaillent en réflexion et ne sont pas adaptées à des objets biologiques hautement transparents déposés sur un substrat transparent comme par exemple une boîte de Pétri à fond transparent en verre ou en plastique ou une lame de verre. En effet, le signal réfléchi par le substrat est typiquement trois à cinq ordres de grandeur supérieur aux signaux rétrodiffusés par des objets biologiques, par exemple des cellules, ce qui rend difficile l'élimination de ce signal. La présente description concerne un nouveau procédé d’imagerie tridimensionnelle d’un échantillon biologique par tomographie optique plein champ, adapté à l’imagerie tridimensionnelles d’objets biologiques transparents comme les cultures cellulaires ou les structures minces hautement transparentes, avec un excellent contraste et une grande facilité de mise en œuvre. Dans la présente description, le terme « comprendre » signifie la même chose que « inclure », « contenir », et est inclusif ou ouvert et n’exclut pas d’autres éléments non décrits ou représentés. En outre, dans la présente description, le terme « environ » ou « sensiblement » est synonyme de (signifie la même chose que) une marge inférieure et/ou supérieure de 20%, par exemple 10%, de la valeur respective. La présente description concerne, selon un premier aspect, un procédé d’imagerie tridimensionnelle par tomographie optique plein champ d’un objet biologique transparent dans un échantillon biologique, le procédé d’imagerie tridimensionnelle comprenant : - le positionnement de l’échantillon au voisinage d’un plan focal objet d’un objectif de microscope, ledit objectif de microscope comprenant un axe optique donné ; - l’illumination de l’échantillon en transmission au moyen d’un faisceau d’illumination de lumière incohérente spatialement et de longueur d’onde centrale donnée; - le déplacement relatif dudit objectif de microscope par rapport audit échantillon, selon une direction axiale parallèle à l’axe optique de l’objectif de microscope, pour définir une pluralité de positions de l’échantillon par rapport au plan focal objet de l’objectif de microscope, chaque position correspondant à une section dudit objet biologique transparent centrée sur le plan focal objet de l’objectif de microscope; et - pour chaque position de l’échantillon, la production d’au moins une première image d’un champ objet de ladite section comprenant : - l’acquisition, au moyen d’un dispositif d’acquisition bidimensionnel comprenant une pluralité de détecteurs élémentaires agencés dans un plan de détection, d’une pluralité de signaux interférométriques bidimensionnels résultant d’interférences optiques entre le faisceau d’illumination incident sur ledit champ objet et un faisceau diffusé par ledit champ objet, dans lequel ledit plan de détection est conjugué optiquement avec le plan focal objet de l’objectif de microscope par un système optique d’imagerie comprenant ledit objectif de microscope; - le calcul, au moyen d’une unité de traitement, de ladite au moins une première image, à partir de ladite pluralité de signaux interférométriques bidimensionnels. Par objet biologique transparent, on comprend dans la présente description tout objet biologique faiblement diffusant (typiquement moins d’environ 5% de la lumière incidente diffusée par l’objet), susceptible d’être traversé par la lumière du faisceau d’illumination, par exemple : une cellule ou une pluralité de cellules, par exemple un amas de cellules, un échafaudage cellulaire (ou « scaffold »), un tapis cellulaire, ou un biofilm, une tranche mince de tissu telle que celle préparée en anatomopathologie, etc. Typiquement, les objets biologiques transparents dont on cherche à former des images (au moins partielles) grâce au procédé selon la présente description ont des dimensions microscopiques (entre environ 1 μm et environ 2 mm). Lorsqu’il s’agit plus précisément d’une cellule ou pluralité de cellule, de tels objets biologiques transparents ont des dimensions comprises entre environ 2 microns et environ 50 microns. Selon la présente description, l’objet biologique transparent fait partie d’un échantillon biologique, c’est à dire un substrat dans lequel se trouve ledit objet biologique transparent. L’échantillon biologique est par exemple et de façon non limitative une culture de cellules 2D ou 3D dans un polymère transparent, ou le produit d’une biopsie à l’aiguille fine (BAF) ou « cytoponction », c’est-à-dire le produit d’un prélèvement de cellules et de tissu à l'aide d'une aiguille fine et d’une seringue. Dans le procédé d’imagerie tridimensionnelle objet de la présente description, on utilise la variation de phase du faisceau diffusé au voisinage du plan focal objet de l’objectif de microscope, dite phase de Gouy, pour introduire des déphasages entre les signaux interférométriques bidimensionnels de la pluralité de signaux interférométriques bidimensionnels acquis pour former ladite au moins une première image. Au-delà d’une certaine distance du plan focal objet de l’objectif de microscope, on peut montrer qu’il n’y a plus de déphasage entre les signaux interférométriques. Il est donc possible, par déplacement du plan focal objet de l’objectif de microscope dans une tranche d’épaisseur donnée de l’objet biologique à imager, ou grâce au mouvement intrinsèque de structures internes de l’objet biologique dans cette même tranche d’épaisseur donnée, d’acquérir des signaux interférométriques bidimensionnels avec des déphasages différents, à partir desquels une image pourra être calculée. L’image de l’objet biologique formée grâce au procédé d’imagerie selon la présente description est donc l’image d’un champ objet d’une tranche d’épaisseur donnée appelée « section » ou « section optique » dans la présente description, d’où le terme de tomographie optique. Les déposants ont montré que l’épaisseur de cette tranche est de l’ordre de la profondeur de champ de l’objectif de microscope et dépend donc de l’ouverture numérique de l’objectif de microscope et de la longueur d’onde centrale du faisceau d’illumination. Dans le procédé selon la présente description, le champ objet de la section de l’objet biologique dont on forme une image peut ainsi être défini par un volume dudit objet biologique constitué d’un ensemble de volumes élémentaires ou « voxels », chaque voxel pouvant être assimilé à un volume cylindrique de longueur égale à la profondeur de champ de l’objectif de microscope et de section définie par la tâche de diffraction de l’objectif de microscope. Les dimensions latérales du champ objet (dans un plan perpendiculaire à l’axe optique de l’objectif de microscope) sont égales aux dimensions latérales d’un champ image défini par une surface de détection effective du plan de détection, divisées par une valeur de grandissement du système optique d’imagerie comprenant ledit objectif de microscope. Dans des exemples de réalisation, la surface de détection effective comprend l’ensemble de la surface de détection sur laquelle sont agencés les détecteurs élémentaires ou « pixels » du dispositif d’acquisition bidimensionnel. Dans d’autres exemples de réalisation, la surface de détection effective peut être limitée à une région de ladite surface de détection, par exemple au moyen d’un diaphragme de champ. En pratique, un voxel, ou volume élémentaire du champ objet de la section dans l’espace objet de l’objectif de microscope, pourra correspondre dans l’espace image (plan de détection) à une pluralité de détecteurs élémentaires du dispositif d’acquisition bidimensionnel, autrement appelés « pixels » dans la présente description, afin de respecter les critères d’échantillonnage. Selon un ou plusieurs exemples de réalisation, en travaillant avec des longueurs d’onde centrales du faisceau d’illumination dans le visible (400 nm – 700 nm), l’épaisseur d’une section d’un objet dont on forme une image au moyen du procédé selon la présente description, est comprise entre environ 200 nm et environ 10 microns pour des ouvertures numériques de l’objectif microscope comprises entre 1,25 et 0,3. En pratique, pour une ouverture numérique donnée de l’objectif de microscope, on pourra travailler avec des longueurs d’onde plus courte pour imager des sections plus fines de l’objet. La résolution de l’image d’un champ objet d’une section est définie par une dimension latérale maximale d’un voxel. Dans le visible et pour des ouvertures numériques de l’objectif microscope comprises entre 1,25 et 0,3, la résolution est comprise entre environ 0.25 microns et environ 1 micron. Le déplacement relatif de l’objectif de microscope par rapport audit échantillon, selon une direction axiale parallèle à l’axe optique de l’objectif de microscope, permet ensuite de produire des images d’une pluralité de sections de l’objet biologique transparent pour produire une image tridimensionnelle dudit objet. Le procédé d’imagerie tridimensionnelle ainsi décrit permet une imagerie tomographique, y compris d’objets biologiques transparents, grâce à un arrangement optique original dans lequel l’échantillon est éclairé en transmission. Selon un ou plusieurs exemples de réalisation, ladite pluralité de signaux interférométriques bidimensionnels sont acquis pour différentes positions du plan focal objet dans l’épaisseur de ladite section, résultant en une pluralité de déphasages prédéterminés entre ledit faisceau d’illumination et ledit faisceau diffusé comprises entre – π/2 et π/2. Dans le premier mode de réalisation décrit ci-dessus, le procédé comprend donc pour la production d’une image d’un champ objet d’une section de l’objet biologique, le déplacement relatif dudit objectif de microscope par rapport à l’échantillon, selon une direction axiale parallèle à l’axe optique de l’objectif de microscope, les signaux interférométriques bidimensionnels utilisés pour calculer l’image du champ objet de la section étant acquis pour différentes positions du plan focal objet de l’objectif de microscope au sein de ladite section, permettant ainsi l’acquisition des signaux interférométriques bidimensionnels avec des déphasages prédéterminés. Selon un ou plusieurs exemples de réalisation, ledit calcul de ladite au moins une première image comprend une combinaison linéaire des signaux interférométriques bidimensionnels de ladite pluralité de signaux interférométriques bidimensionnels d’une pluralité de signaux, par exemple la soustraction de deux desdits signaux interférométriques bidimensionnels. En pratique, le calcul de ladite au moins une première image comprend, pour chaque détecteur élémentaire du dispositif d’acquisition bidimensionnel, le calcul d’une valeur de pixel fonction d’une combinaison linéaire des intensités desdits signaux interférométriques bidimensionnels acquis par ledit détecteur élémentaire. Par « valeur de pixel », on comprend dans la présente description la valeur du signal mesuré par le pixel, ou détecteur élémentaire, correspondant. Selon un ou plusieurs exemples de réalisation, le calcul d’une valeur de pixel est fonction d’une combinaison linéaire des intensités de signaux interférométriques bidimensionnels acquis en faisant varier la distance entre l’objectif de microscope et l’échantillon d’une distance comprise entre environ 1/10 de la profondeur de champ et la profondeur de champ, avantageusement entre environ 1/10 et environ 1/2 de la profondeur de champ. Selon un ou plusieurs exemples de réalisation, le déplacement relatif dudit objectif de microscope par rapport audit échantillon suit une fonction périodique d’amplitude maximale λ/4, où λ est la longueur d’onde centrale du faisceau d’illumination, par exemple une fonction périodique continue, par exemple une fonction sinusoïdale, ou une rampe périodique. La fonction périodique comprend une période déterminée en fonction d’une cadence d’acquisition du détecteur bidimensionnel pour permettre un échantillonnage temporel adapté au calcul de l’image, par exemple 2, 3 ou 4 acquisitions pour une période. Selon un ou plusieurs exemples de réalisation du procédé d’imagerie tridimensionnelle selon le premier aspect : - les signaux interférométriques bidimensionnels de ladite pluralité de signaux interférométriques bidimensionnels sont acquis pour une position fixe de l’objectif de microscope par rapport audit échantillon, et le calcul de ladite au moins une première image du champ objet de ladite section comprend : - le calcul, pour chaque détecteur élémentaire du dispositif d’acquisition bidimensionnel, d’au moins une valeur de pixel en fonction d’une valeur d’un paramètre représentatif des variations temporelles d’intensité desdits signaux interférométriques bidimensionnels acquis par ledit détecteur élémentaire. Dans ce deuxième mode de réalisation, une image du champ objet d’une section de l’objet biologique transparent est produite sans déplacement de l’objectif de microscope par rapport à l’échantillon. L’image est différente de celle calculée dans le premier mode de réalisation car elle est caractéristique des mouvements des structures intrinsèques de l’objet biologique et donc de l’environnement. Dans des exemples de réalisations, on pourra produire des images de l’objet biologique à la fois avec le premier mode de réalisation et avec le deuxième mode de réalisation car ces images apportent des informations complémentaires. Selon un ou plusieurs exemples de réalisation, ledit paramètre est représentatif de la dispersion temporelle des intensités desdits signaux interférométriques. Selon un ou plusieurs exemples de réalisation, le calcul, pour chaque détecteur élémentaire du dispositif d’acquisition bidimensionnel, d’au moins une valeur de pixel, comprend le calcul d’une transformée de Fourier desdits signaux interférométriques acquis par ledit détecteur élémentaire en fonction du temps. La présente description concerne, selon un deuxième aspect, un système d’imagerie tridimensionnelle par tomographie optique plein champ d’au moins un objet biologique transparent dans un échantillon biologique, le système d’imagerie comprenant : - une source lumineuse configurée pour l’émission d’un faisceau d’illumination de lumière incohérente spatialement, de longueur centrale donnée, ledit faisceau d’illumination étant configuré pour illuminer l’échantillon en transmission; - un système d’imagerie optique comprenant un objectif de microscope avec un axe optique donné et un plan focal objet donné au voisinage duquel, en fonctionnement, l’échantillon est positionné; - des moyens de déplacement relatif dudit objectif de microscope par rapport audit échantillon, selon une direction axiale parallèle à l’axe optique de l’objectif de microscope ; - un dispositif d’acquisition bidimensionnelle comprenant un plan de détection, ledit plan de détection étant conjugué optiquement avec le plan focal objet de l’objectif de microscope par ledit système optique d’imagerie; et - une unité de traitement; dans lequel, pour chaque section d’une pluralité de sections dudit objet biologique : - ledit système d’imagerie tridimensionnelle est configuré pour l’acquisition, au moyen dudit dispositif d’acquisition bidimensionnelle, d’une pluralité de signaux interférométriques bidimensionnels résultant d’interférences optiques entre ledit faisceau d’illumination et un faisceau diffusé par ladite section; - ladite unité de traitement est configurée pour calculer à partir de ladite pluralité de signaux interférométriques bidimensionnels au moins une première image d’un champ objet de ladite section. Un tel agencement original du système d’imagerie permet une imagerie par tomographie optique d’un objet biologique transparent, des images de sections ou « tranches » de l’objet biologique pouvant être produites afin de produire une image tridimensionnelle. Selon un ou plusieurs exemples de réalisation, les signaux interférométriques bidimensionnels de ladite pluralité de signaux interférométriques bidimensionnels sont acquis pour différentes positions du plan focal objet dans l’épaisseur de ladite section, résultant en une pluralité de déphasages prédéterminés entre ledit faisceau d’illumination et ledit faisceau diffusé comprises entre – π/2 et π/2. Dans ce premier mode de réalisation du système d’imagerie selon la présente description, les moyens de déplacement relatif dudit objectif de microscope par rapport audit échantillon sont configurés pour non seulement déplacer le plan focal objet de l’objectif de microscope au sein d’une section de l’objet biologique afin de produire une image de ladite section, mais également déplacer le plan focal objet le long de l’axe optique dans l’échantillon pour produire des images d’une pluralité de sections dudit objet biologique afin de produire une image tridimensionnelle. Selon un ou plusieurs exemples de réalisation, le calcul de ladite au moins une première image comprend une combinaison linéaire des signaux interférométriques bidimensionnels de ladite pluralité de signaux interférométriques bidimensionnels. Selon un ou plusieurs exemples de réalisation, les signaux interférométriques bidimensionnels ladite pluralité de signaux interférométriques bidimensionnels sont acquis pour une position fixe de l’objectif de microscope par rapport audit échantillon, et le calcul de ladite au moins une première image de ladite section comprend : - le calcul, pour chaque détecteur élémentaire du dispositif d’acquisition bidimensionnel, d’au moins une valeur de pixel en fonction d’une valeur d’un paramètre représentatif des variations temporelles d’intensité desdits signaux interférométriques bidimensionnels acquis par ledit détecteur élémentaire. Dans ce deuxième mode de réalisation du système d’imagerie selon la présente description, les moyens de déplacement relatif dudit objectif de microscope par rapport audit échantillon peuvent n’être configurés que pour déplacer le plan focal objet le long de l’axe optique dans l’objet biologique à imager pour produire des images d’une pluralité de sections dudit objet biologique afin de produire une image tridimensionnelle. Le premier et le deuxième mode de réalisation peuvent être mis en œuvre dans un même système d’imagerie selon la présente description afin d’obtenir une pluralité de premières images et une pluralité de deuxièmes images de sections de l’objet biologique transparent que l’on cherche à imager. Brève description des figures D’autres avantages et caractéristiques de la technique d’imagerie présentée ci-dessus apparaîtront à la lecture de la description détaillée ci-dessous, faite par référence aux figures dans lesquelles : représente un schéma d’un exemple de système d’imagerie tridimensionnelle selon la présente description. représente plus précisément et de façon schématique un plan focal objet de l’objectif de microscope dans un exemple de système d’imagerie tridimensionnelle selon la présente description. illustre de façon schématique, dans un exemple de mise en œuvre d’un procédé d’imagerie tridimensionnelle selon un premier mode de réalisation, deux positions du plan focal objet de l’objectif de microscope au sein d’une section d’un objet biologique transparent pour faire une image d’un champ objet de ladite section. illustre de façon schématique, dans un exemple de mise en œuvre d’un procédé d’imagerie tridimensionnelle selon le premier mode de réalisation, une pluralité de positions du plan focal objet de l’objectif de microscope, le plan focal objet étant centré sur différentes sections d’un objet biologique transparent pour faire une image tridimensionnelle dudit objet. montre, à titre d’illustration, l’intensité théorique calculée au centre du champ image pour un signal interférométrique bidimensionnel résultant de l’interférence d’un faisceau d’illumination et d’un faisceau diffusé par une particule diffusante comme le serait par exemple un organite cellulaire de dimension nanométrique, en fonction de la position relative du plan focal objet de l’objectif de microscope par rapport à la position de ladite particule. montre, à titre d’illustration, l’intensité théorique calculée et représentée sur la , à laquelle on a retranché un fond continu correspondant à une valeur moyenne du signal interférométrique en z. montre, à titre d’illustration, dans un exemple de de mise en œuvre d’un procédé d’imagerie tridimensionnelle selon le premier mode de réalisation, la différence entre des intensités théoriques calculées au centre du champ respectivement pour deux signaux interférométriques bidimensionnels résultant de l’interférence d’un faisceau d’illumination et d’un faisceau diffusé par la particule, pour deux positions de la particule séparées d’une distance égale à un dixième de la profondeur de champ donnée, en fonction de la position relative du plan focal objet de l’objectif de microscope par rapport à la position de ladite particule. montre, à titre d’illustration, l’intensité théorique calculée et représentée sur la , à laquelle superpose une courbe illustrant un déplacement relatif du plan focal objet de l’objectif de microscope par rapport à l’échantillon selon une fonction sinusoïdale. illustre, de façon schématique, dans la mise en œuvre d’un procédé d’imagerie tridimensionnelle selon un deuxième mode de réalisation, la position du plan focal objet de l’objectif de microscope par rapport à une section d’un objet biologique pour faire une image d’un champ objet de ladite section. montre, à titre d’illustration, l’intensité théorique calculée et représentée sur la , à laquelle superpose une courbe illustrant un déplacement aléatoire d’une structure intrinsèque de l’objet biologique par rapport au plan focal objet de l’objectif de microscope. montre des images expérimentales obtenus sur deux cellules HeLa voisines selon deux plans de coupes différents à 4 microns de distance, avec deux modes de réalisation d’un procédé selon la présente description. Procédé d’imagerie tridimensionnelle par tomographie optique plein champ d’un objet biologique transparent dans un échantillon biologique (10), le procédé d’imagerie tridimensionnelle comprenant : - le positionnement de l’échantillon au voisinage d’un plan focal objet (125) d’un objectif de microscope (121), ledit objectif de microscope comprenant un axe optique (Δ) donné ; - l’illumination de l’échantillon en transmission au moyen d’un faisceau d’illumination de lumière incohérente spatialement et de longueur d’onde centrale (λ) donnée; - le déplacement relatif dudit objectif de microscope par rapport audit échantillon, selon une direction axiale parallèle à l’axe optique de l’objectif de microscope, pour définir une pluralité de positions de l’échantillon, chaque position correspondant à une section (101) dudit objet biologique centrée sur le plan focal objet de l’objectif de microscope; et - pour chaque position de l’échantillon, la production d’au moins une première image d’un champ objet de ladite section comprenant : - l’acquisition, au moyen d’un dispositif d’acquisition bidimensionnel (140) comprenant une pluralité de détecteurs élémentaires agencés dans un plan de détection (141), d’une pluralité de signaux interférométriques bidimensionnels résultant d’interférences optiques entre le faisceau d’illumination incident sur le champ objet et un faisceau diffusé par ledit champ objet, dans lequel ledit plan de détection est conjugué optiquement avec le plan focal objet de l’objectif de microscope par un système optique d’imagerie comprenant ledit objectif de microscope; - le calcul, au moyen d’une unité de traitement (150), de ladite au moins une première image, à partir de ladite pluralité de signaux interférométriques bidimensionnels. Procédé d’imagerie selon la revendication 1, dans lequel les signaux interférométriques bidimensionnels de ladite pluralité de signaux interférométriques bidimensionnels sont acquis pour différentes positions du plan focal objet dans l’épaisseur de ladite section, résultant en une pluralité de déphasages prédéterminés entre ledit faisceau d’illumination et ledit faisceau diffusé comprises entre – π/2 et π/2. Procédé d’imagerie selon la revendication 2, dans lequel : - le calcul de ladite au moins une première image comprend une combinaison linéaire des signaux interférométriques bidimensionnels de ladite pluralité de signaux interférométriques bidimensionnels. Procédé d’imagerie selon l’une quelconque des revendications 2 ou 3, dans lequel le déplacement relatif dudit objectif de microscope par rapport audit échantillon suit une fonction périodique d’amplitude maximale λ/4, où λ est la longueur d’onde centrale du faisceau d’illumination. Procédé d’imagerie selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel : - les signaux interférométriques bidimensionnels de ladite pluralité de signaux interférométriques bidimensionnels sont acquis pour une position fixe de l’objectif de microscope par rapport audit échantillon, et - le calcul de ladite au moins une première image du champ objet de ladite section comprend le calcul, pour chaque détecteur élémentaire du dispositif d’acquisition bidimensionnel, d’au moins une valeur de pixel en fonction d’une valeur d’un paramètre représentatif des variations temporelles d’intensité desdits signaux interférométriques bidimensionnels acquis par ledit détecteur élémentaire. Procédé d’imagerie selon la revendication 5, dans lequel ledit paramètre est représentatif de la dispersion temporelle des intensités desdits signaux interférométriques. Système d’imagerie tridimensionnelle (100) par tomographie optique plein champ d’un objet biologique transparent dans un échantillon biologique (10), le système d’imagerie comprenant : - une source lumineuse (110) configurée pour l’émission d’un faisceau d’illumination de lumière incohérente spatialement, de longueur centrale donnée, ledit faisceau d’illumination étant configuré pour illuminer l’échantillon en transmission; - un système d’imagerie optique (120) comprenant un objectif de microscope (121) avec un axe optique (Δ) donné et un plan focal objet (125) donné au voisinage duquel, en fonctionnement, l’échantillon (10) est positionné; - des moyens de déplacement relatif (131, 132, 135) dudit objectif de microscope par rapport audit échantillon, selon une direction axiale parallèle à l’axe optique de l’objectif de microscope ; - un dispositif d’acquisition bidimensionnelle (140) comprenant une pluralité de détecteurs élémentaires agencés dans un plan de détection (141), ledit plan de détection étant conjugué optiquement avec le plan focal objet de l’objectif de microscope par ledit système optique d’imagerie; et - une unité de traitement (150); et dans lequel, pour chaque section d’une pluralité de sections dudit objet biologique : - ledit système d’imagerie tridimensionnelle est configuré pour l’acquisition, au moyen dudit dispositif d’acquisition bidimensionnelle (140), d’une pluralité de signaux interférométriques bidimensionnels résultant d’interférences optiques entre ledit faisceau d’illumination et un faisceau diffusé par un champ objet de ladite section; - ladite unité de traitement (150) est configurée pour calculer à partir de ladite pluralité de signaux interférométriques bidimensionnels au moins une première image dudit champ objet de ladite section. Système d’imagerie selon la revendication 7, dans lequel les signaux interférométriques bidimensionnels de ladite pluralité de signaux interférométriques bidimensionnels sont acquis pour différentes positions du plan focal objet dans l’épaisseur de ladite section, résultant en une pluralité de déphasages prédéterminés entre ledit faisceau d’illumination et ledit faisceau diffusé comprises entre – π/2 et π/2. Système d’imagerie selon la revendication 8, dans lequel le calcul de ladite au moins une première image comprend une combinaison linéaire des signaux interférométriques bidimensionnels de ladite pluralité de signaux interférométriques bidimensionnels. Système d’imagerie selon l’une quelconque des revendications 7 à 9, dans lequel les signaux interférométriques bidimensionnels ladite pluralité de signaux interférométriques bidimensionnels sont acquis pour une position fixe de l’objectif de microscope par rapport audit échantillon, et le calcul de ladite au moins une première image du champ objet de ladite section comprend : - le calcul, pour chaque détecteur élémentaire du dispositif d’acquisition bidimensionnel, d’au moins une valeur de pixel en fonction d’une valeur d’un paramètre représentatif des variations temporelles d’intensité desdits signaux interférométriques bidimensionnels acquis par ledit détecteur élémentaire. Système d’imagerie selon la revendication 10, dans lequel ledit paramètre est représentatif de la dispersion temporelle des intensités desdits signaux interférométriques bidimensionnels.