Brevet FR3121039A1 — publié le 20220930

L’invention concerne des Oligonucléotides antisens ayant la capacité de diminuer le niveau d’expression de la protéine huntingtine dans des cellules de gliomes, pour leur utilisation dans la sensibilisation desdites cellules à un traitement anticancéreux. Figure pour l’abrégé : Fig. 7 Oligonucléotides anti-sens pour leur utilisation dans un traitement anticancéreux Domaine technique de l’invention L’invention relève d’oligonucléotides antisens pour leur utilisation dans un traitement anticancéreux. Elle s’inscrit dans le domaine des applications thérapeutiques et concerne plus particulièrement l’utilisation d’oligonucléotides antisens pour sensibiliser les cellules de gliomes à des traitements anticancéreux. Le glioblastome multiforme (GBM) ou astrocytome de type IV, est une tumeur cérébrale rare (4 cas pour 100 000 habitants en France chaque année), à croissance rapide et dont le pronostic vital est mauvais puisque seulement 2 % des patients survivent au-delà de 2 ans après le diagnostic. Les tumeurs ont une origine gliale, elles sont donc appelées gliomes. Il a été montré plus récemment que des cellules souches de la zone sous-ventriculaire dérégulées pourraient être à l’origine des GBM ( « Human glioblastoma arises from subventricular zone cells with low-level driver mutations » Lee et al. 2018). Les facteurs environnementaux et moléculaires à l’origine de ces dérégulations restent à déterminer. Les tumeurs sont constituées de multiples types cellulaires plus ou moins différenciés. Parmi ces cellules, les rares cellules souches cancéreuses sont responsables de la résistance aux traitements anticancéreux et à la récurrence tumorale. La première phase du traitement consiste en une exérèse chirurgicale. Cependant, les cellules de GBM prolifèrent rapidement et envahissent le parenchyme cérébral et il est donc impossible d’enlever toute la tumeur et notamment les cellules souches. Des cycles répétés de radiothérapie et de chimiothérapie par prise orale de témozolomide (TMZ) pendant 7 jours tous les 28 jours permettent de ralentir la repousse tumorale. Le TMZ est un agent alkylant de l’ADN qui ajoute un groupement méthyl en position N-7 ou O-6 de la guanine et en position N-3 de l’adénine. Bien que la présence de méthyl-O6 guanine ne représente que moins de 10% du total de l’alkylation due au TMZ, c’est principalement par cette modification que le TMZ induit l’apoptose. Au cours de la réplication, la guanine modifiée s’apparie de façon erronée à la thymine. Ce mésappariement est reconnu par les enzymes du système de réparation des mésappariements de l’ADN (MMR pour « mismatch repair » en terminologie anglo-saxonne). Ces enzymes tentent en boucle de réparer ces mésappariements sans succès. Il en résulte des cassures du double brin d’ADN, un arrêt du cycle cellulaire en G2 et l’induction de l’apoptose. Cependant, les tumeurs récurrentes expriment l’enzyme O6-methylguanine DNA méthyltransférase (MGMT), une enzyme qui ôte le groupement alkyl présent sur la guanine après traitement au TMZ. Le TMZ devient donc inefficace et il n’existe pas d’alternative de traitement au TMZ. Toute avancée permettant d’identifier des cibles moléculaires et cellulaires visant à réduire la capacité des cellules tumorales à résister au TMZ sera donc bénéfique pour les patients souffrant de gliomes. Présentation de l'invention A cet effet, la présente invention a pour objectif de palier les inconvénients précités en proposant un oligonucléotide antisens ayant la capacité de diminuer le niveau d’expression de la protéine huntingtine dans des cellules de gliomes, pour son utilisation dans la sensibilisation desdites cellules à un traitement anticancéreux. La présente invention vise en outre un oligonucléotide antisens ayant la capacité de diminuer le niveau d’expression de la protéine huntingtine et de la protéine 6-O-méthylguanine ADN méthyltransférase (MGMT) dans des cellules de gliomes, pour son utilisation dans la sensibilisation desdites cellules à un traitement anticancéreux. La protéine huntingtine (HTT) est une protéine pléiotropique de 350 kDa. Cette protéine est majoritairement étudiée sous sa forme mutante, c’est à dire présentant une expansion de plus de 36 triplets de CAG dans l’exon 1 de sa séquence génique car le gène muté (gène huntingtine avec l’expansion anormale de triplets CAG) codant la protéine HTT entraine la maladie de Huntington, une maladie neurodégénérative létale. La HTT sauvage permet le maintien de l’état souche des cellules. En effet, la diminution des niveaux de HTT dans des cellules souches/progénitrices de différentes origines conduit à une déplétion du réservoir de ces cellules qui auront tendance à se différencier de façon précoce (Godin et al. 2010, Elias et al. 2014, Lopes et al. 2016). Il a également été montré que la HTT participait à la transition épithélio-mésenchymateuse, et en son absence, les cellules cancéreuses mammaires sont plus métastatiques et les cellules non cancéreuses perdent leur polarité (Elias et al. 2015, Thion et al. 2015). Les oligonucléotides antisens aussi appelés ASO venant de la terminologie anglo-saxonne « Antisense Oligonucleotides » , sont des séquences courtes d’ADN de synthèse (environs 20 bases) qui ciblent l’ARN messager (ARNm) d’intérêt selon le principe de Crick et Watson d’appariement des bases azotées. L’ARNm est alors dégradé par la RNAse H et n’est donc pas traduit en protéine. Les ASO présentent des liaisons phosphothiorates et des modifications des bases azotées avec notamment ajout de groupements 2’-O-méthoxyéthyl (MOE) sur les nucléotides des extrémités 3’ et 5’ les rendant résistants aux nucléases et solubles dans l’eau. Les inventeurs ont découvert que, de manière tout à fait surprenante, les ASO ayant la capacité de diminuer le niveau d’expression de la protéine HTT dans des cellules de gliomes par ciblage de leur ARNm et les ASO ayant la capacité de diminuer le niveau d’expression de la protéine HTT et de la protéine MGMT (rendant les cellules qui l’expriment particulièrement résistantes aux traitements anticancéreux) dans des cellules de gliomes, lorsqu’ils sont transfectés auxdites cellules, permettent de sensibiliser ces dernières à un traitement anticancéreux auquel elles développent habituellement une résistance dans le temps. Les séquences d’oligonucléotides antisens utilisées dans la présente invention pour diminuer les niveaux de HTT dans les cellules de gliomes sont des séquences disponibles dans la littérature (Kordasiewicz et al. 2012, « In Vivo Evaluation of Candidate Allele-specific Mutant Huntingtin Gene Silencing Antisense Oligonucleotides » Southwell et al. 2014). Dans le cadre de la maladie de Huntington, des essais cliniques ont été réalisés avec l’ASO de séquence SEQ ID NO : 1 également appelé dans la description de la présente demande oligonucléotides antisens RG6042. Après 4 injections intrathécales de l’ASO RG6042, les niveaux de HTT sont diminués dans le liquide cérébrospinal des patients atteints de la maladie de Huntington (Tabrizi et al. 2019). La protéine 6-O-méthylguanine ADN méthyltransférase (MGMT) est une enzyme de la réparation de l’ADN. On la retrouve exprimée dans différents tissus de l’organisme (spécificité tissulaire faible). Dans le cerveau, elle est exprimée par les cellules endothéliales et les cellules gliales mais pas par les neurones. Les niveaux de MGMT sont bas dans le cerveau et normalement corrélés à la méthylation du promoteur du gène voire du corps du gène (mécanismes de « silencing » en terminologie anglo-saxonne). Dans les tumeurs cérébrales, suite aux cycles répétés de radio/chimiothérapies, certaines cellules ré-exprimant la MGMT émergent, « prennent le dessus » sur les autres cellules de la masse tumorale qui pour partie, sont éliminées par le traitement. Ces cellules résistantes sont à l’origine de la récurrence tumorale. L’utilisation des oligonucléotides antisens ayant la capacité de diminuer le niveau d’expression de la protéine huntingtine et de la protéine 6-O-méthylguanine ADN méthyltransférase (MGMT) dans des cellules de gliomes selon l’invention est donc particulièrement avantageuse afin d’éviter le phénomène de récurrence tumorale. Dans des modes particuliers de réalisation, l’invention répond en outre aux caractéristiques suivantes, mises en œuvre séparément ou en chacune de leurs combinaisons techniquement opérantes. Dans des modes particuliers de réalisation de l’invention, l’oligonucléotide antisens comprend entre 12 et 35 bases nucléiques. Dans des modes particuliers de réalisation de l’invention, l’oligonucléotide antisens est choisi parmi les oligonucléotides antisens de séquence SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3 et SEQ ID NO : 4. Dans des modes particuliers de réalisation de l’invention, l’oligonucléotide antisens est choisi parmi les oligonucléotides antisens ayant une séquence identique à au moins 50%, de préférence au moins 60%, encore de préférence au moins 70%, de manière préférentielle au moins 80%, préférentiellement au moins 90%, de préférence au moins 92%, encore de préférence au moins 95%, de préférence au moins 96%, de préférence au moins 97%, de préférence au moins 98%, de préférence au moins 99%, avec une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3 et SEQ ID NO : 4. Dans des modes particuliers de réalisation de l’invention, le traitement anticancéreux auquel sont sensibilisées les cellules de gliome est un traitement qui provoque des dommages à l’ADN desdites cellules. Dans des modes particuliers de réalisation de l’invention, le traitement anticancéreux auquel sont sensibilisées les cellules de gliome est un traitement avec un agent alkylant de l’ADN. L’agent alkylant est de préférence choisi parmi le témozolomide (TMZ), la lomustine (CCNU), la carmustine (BCNU), la procarbazine et la carboplatine. Dans les modes particuliers de réalisation de l’invention dans lesquels le traitement anticancéreux auquel sont sensibilisées les cellules de gliome est un traitement au témozolomide (TMZ), les cellules de gliomes sont de préférence sensibilisées de sorte que la dose létale 50 (DL50) au TMZ est diminuée d’au moins 30% mais de préférence d’au moins 40%. La dose létale 50 (DL50) désigne la concentration de TMZ pour laquelle la viabilité cellulaire est réduite de 50 % par rapport à la condition de contrôle (sans utilisation d’oligonucléotides antisens objet de la présente invention). Dans des modes particuliers de réalisation de l’invention, le traitement anticancéreux auquel sont sensibilisées les cellules de gliome est un traitement utilisant des radiations. Selon un autre aspect, l’invention vise une composition pharmaceutique comprenant au moins un oligonucléotide antisens objet de la présente invention, ou comprenant un sel, un ester, un sel d’un tel ester ou un promédicament pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, et un support ou diluant pharmaceutiquement acceptable, pour son utilisation dans la sensibilisation desdites cellules à un traitement anticancéreux. Dans le présent document, une "composition pharmaceutique comprenant un oligonucléotide antisens" désigne une composition comprenant un oligonucléotide antisens ciblant la huntingtine dans un diluant pharmaceutiquement acceptable. Les diluants pharmaceutiquement acceptables sont bien connus des spécialistes de cet art. La sélection d'un diluant ou d'un véhicule pharmaceutiquement acceptable est basée sur un certain nombre de facteurs, y compris, mais sans s'y limiter, la solubilité du composé et la voie d'administration. Ces considérations sont bien comprises par l’homme de l’art. Un "support pharmaceutique" ou excipient peut être un solvant pharmaceutiquement acceptable, un agent de suspension ou tout autre véhicule pharmacologiquement inerte pour délivrer un ou plusieurs acides nucléiques à un animal et sont connus dans le domaine technique. L'excipient peut être liquide ou solide et est choisi, en tenant compte du mode d'administration prévu, de manière à obtenir le volume, la consistance, etc. souhaités lorsqu'il est combiné avec un acide nucléique et les autres composants d'une composition pharmaceutique donnée. Le terme "sel pharmaceutiquement acceptable" désigne les sels physiologiquement et pharmaceutiquement acceptables des composés de l'invention : c'est-à-dire les sels qui conservent l'activité biologique souhaitée du composé parent et ne lui confèrent pas d'effets toxicologiques indésirables. Les sels de sodium des oligonucléotides antisens sont utiles et sont bien acceptés pour l'administration thérapeutique à l'homme. Le terme "promédicament" désigne dans la présente demande un agent thérapeutique qui est préparé sous une forme inactive ou moins active qui est convertie en une forme active (c'est-à-dire un médicament) dans le corps ou les cellules de celui-ci par l'action d'enzymes endogènes ou d'autres substances chimiques et/ou conditions. Selon un autre aspect, la présente invention vise l’oligonucléotide antisens ou la composition comprenant au moins un oligonucléotide antisens selon la présente invention pour son utilisation dans le traitement d’une tumeur cérébrale. Selon un autre aspect, la présente invention vise l’oligonucléotide antisens ou la composition comprenant au moins un oligonucléotide antisens selon la présente invention pour son utilisation dans le traitement d’un glioblastome multiforme ou astrocytome de type IV. Brève description des figures L’invention sera mieux comprise à la lecture de la description suivante, donnée à titre d’exemple nullement limitatif, et faite en se référant aux figures qui représentent : La illustre en A les résultats du western blot réalisé à partir de cellules de la lignée cellulaire U251 ayant été transfectées avec l’oligonucléotide antisens (ASO) RG6042 (SEQ ID NO : 1), avec l’ASO Scr (pour « scramble » en terminologie anglo-saxonne et « brouillage » en terminologie française) ou traitées à la lipofectamine seule (Ctrl pour contrôle), et, en B , la quantification des niveaux protéiques de HTT obtenus en western blot après 4 répétitions de l’expérience présentée en ( A ) ; La illustre en A le résultat du western blot réalisé à partir de cellules de la lignée cellulaire U87 ayant été transfectées avec l’ASO RG6042, avec l’ASO Scr ou traitées à la lipofectamine seule (Ctrl), et, en B , la quantification des niveaux protéiques de HTT obtenus en western blot après au moins 3 répétitions de l’expérience présentée en ( A ) ; La illustre en A le résultat du western blot réalisé à partir de cellules de la lignée cellulaire T98G ayant été transfectées avec l’ASO RG6042, avec l’ASO Scr ou traitées à la lipofectamine seule (Ctrl), et, en B , la quantification des niveaux protéiques de HTT obtenus en western blot après 5 répétitions de l’expérience présentée en ( A ) ; La illustre en A le résultat du western blot réalisé à partir de cellules de la lignée cellulaire T98G ayant été transfectées avec l’ASO RG6042, avec l’ASO Scr ou traitées à la lipofectamine seule (Ctrl), et, en B , la quantification des niveaux protéiques de MGMT obtenus en western blot après 4 répétitions de l’expérience présentée en ( A ) ; La illustre en A une courbe montrant le pourcentage de cellules vivantes de lignée U251 transfectées avec l’ASO RG6042 ou traitées avec la lipofectamine seule (Ctrl) en fonction de la dose de TMZ reçue et, en B , la concentration de TMZ mesurée à la DL50 pour les cellules de lignée U251 transfectées avec l’ASO RG6042 ou traitées avec la lipofectamine seule (Ctrl) ; La illustre en A une courbe montrant le pourcentage de cellules vivantes de lignée U87 transfectées avec l’ASO RG6042 ou traitées avec la lipofectamine seule (Ctrl) en fonction de la dose de TMZ reçue et, en B , la concentration de TMZ mesurée à la DL50 pour les cellules de lignée U87 transfectées avec l’ASO RG6042 ou traitées avec la lipofectamine seule (Ctrl) ; La illustre en A une courbe montrant le pourcentage de cellules vivantes de lignée T98G transfectées avec l’ASO RG6042 ou traitées avec la lipofectamine seule (Ctrl) en fonction de la dose de TMZ reçue et, en B , la concentration de TMZ mesurée à la DL50 pour les cellules de lignée T98G transfectées avec l’ASO RG6042 ou traitées avec la lipofectamine seule (Ctrl). Oligonucléotide antisens ayant la capacité de diminuer le niveau d’expression de la protéine huntingtine dans des cellules de gliomes, pour son utilisation dans la sensibilisation desdites cellules à un traitement anticancéreux, ledit oligonucléotide antisens étant choisi parmi les oligonucléotides antisens de séquence SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3 et SEQ ID NO : 4 et les oligonucléotides antisens ayant une séquence identique à au moins 50%, de préférence au moins 60%, encore de préférence au moins 70%, de manière préférentielle au moins 80%, préférentiellement au moins 90%, de préférence au moins 92%, encore de préférence au moins 95%, de préférence au moins 96%, de préférence au moins 97%, de préférence au moins 98%, de préférence au moins 99%, avec une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3 et SEQ ID NO : 4. Oligonucléotide antisens pour son utilisation selon la revendication 1, ledit oligonucléotide antisens ayant en outre la capacité de diminuer le niveau d’expression de la protéine 6-O-méthylguanine ADN méthyltransférase (MGMT) dans des cellules de gliomes. Oligonucléotide antisens pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 et 2, ledit oligonucléotide antisens comprenant entre 12 et 35 bases nucléiques. Oligonucléotide antisens pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle le traitement anticancéreux auquel sont sensibilisées les cellules de gliome est un traitement qui provoque des dommages à l’ADN desdites cellules. Oligonucléotide antisens pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle le traitement anticancéreux auquel sont sensibilisées les cellules de gliome est un traitement avec un agent alkylant de l’ADN. Oligonucléotide antisens pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle le traitement anticancéreux auquel sont sensibilisées les cellules de gliome est un traitement avec un ou une combinaison de plusieurs des agents alkylants choisis parmi le témozolomide (TMZ), la lomustine (CCNU), la carmustine (BCNU), la procarbazine et la carboplatine. Oligonucléotide antisens pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle le traitement anticancéreux auquel sont sensibilisées les cellules de gliome est un traitement du témozolomide (TMZ) et les cellules de gliomes sont sensibilisées de sorte que la dose létale 50 (DL50) au TMZ est diminuée d’au moins 30%, de préférence d’au moins 40%. Oligonucléotide antisens pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle le traitement anticancéreux auquel sont sensibilisées les cellules de gliome est un traitement utilisant des radiations. Composition pharmaceutique comprenant au moins un oligonucléotide antisens pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, ou comprenant un sel, un ester, un sel d’un tel ester ou un promédicament pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, et un support ou diluant pharmaceutiquement acceptable. Oligonucléotide antisens selon l’une quelconque des revendications 1 à 8 ou composition selon la revendication 9, pour son utilisation dans le traitement d’une tumeur cérébrale. Oligonucléotide antisens selon l’une quelconque des revendications 1 à 8 ou composition selon la revendication 9, pour son utilisation dans le traitement d’un glioblastome multiforme ou astrocytome de type IV.