Brevet FR3125882A1 — publié le 20230203

La présente invention a pour objet un procédé in vitro de caractérisation d’une tumeur, fondé sur l’analyse quantitative de nucléosides modifiés et non modifiés issus de l’ARN cellulaire total, de l’ARN extracellulaire et/ou des nucléosides isolés, extraits d’un échantillon biologique. Plus particulièrement, l’invention a pour objet un procédé de prédiction du grade d’une tumeur gliale. La présente invention se situe donc dans les domaines de la cancérologie et de la biologie moléculaire plus particulièrement appliquée au diagnostic médical. Figure à publier avec l’abrégé : Fig. 1 PROCEDE DE CARACTERISATION D’UNE TUMEUR Domaine de l’invention La présente invention a pour objet un procédé in vitro de caractérisation d’une tumeur, fondé sur l’analyse quantitative de nucléosides modifiés et non modifiés isolés d’un échantillon biologique. Plus particulièrement, l’invention a pour objet un procédé de prédiction du grade d’une tumeur gliale. La présente invention se situe donc dans les domaines de la cancérologie et de la biologie moléculaire plus particulièrement appliquée au diagnostic médical. Etat de la technique La caractérisation d’une tumeur est une condition préalable essentielle au choix du traitement le plus approprié pour le patient. Par « caractérisation d’une tumeur », on entend la caractérisation du statut ou degré d’évolution d’une tumeur donnée, il peut s’agir notamment par exemple de l’évaluation du degré d’évolution d’une tumeur d’un tissu connu, de l’attribution à une tumeur d’un grade préalablement défini, ou de tout autre caractérisation telle que notamment la détermination du caractère initial ou métastatique d’une tumeur. Les gliomes, ou tumeurs gliales, sont les tumeurs les plus courantes du système nerveux central, elles sont caractérisées par une variabilité significative de l'âge d'apparition, du classement, des caractéristiques histologiques et de la capacité à progresser et éventuellement à métastaser. Les gliomes sont classés en fonction de leur morphologie et de leur degré de malignité. La classification consensuelle de l'Organisation mondiale de la santé (OMS) attribue un degré de malignité de I à IV aux gliomes, les glioblastomes, ou tumeurs de grade IV, étant la forme la plus agressive et la plus mortelle. L'une des principales limites de la prise en charge des gliomes et des glioblastomes est liée au manque actuel de stratégies de diagnostic efficaces. La sélection d'un traitement personnalisé nécessite une classification précise des tumeurs. Actuellement, les principales méthodes de diagnostic utilisées cliniquement pour la détection des gliomes reposent sur des tests neurologiques et des méthodes de neuro-imagerie, réalisés lorsque la maladie est déjà à un stade avancé. Le diagnostic de la tumeur nécessite une analyse des tissus du patient provenant d'une biopsie ou d'une résection chirurgicale. À partir de cet échantillon, plusieurs analyses moléculaires sont effectuées : test d'expression de gènes candidats, comptage du nombre de copies d'ADN, profil de méthylation, profilage de la voie phospho-protéique et séquençage génétique. Pourtant, les diagnostics basés sur la biopsie ont des limites concernant la détermination du grade des tumeurs et la stratification des patients. En effet, en ce qui concerne par exemple plus particulièrement les tumeurs gliales, les grades du gliome sont difficiles à distinguer, et plus particulièrement les grades II et III. L’établissement du grade requiert une analyse anatomo-pathologique délicate, souvent réalisée indépendamment par deux spécialistes. Le grade II désigne une tumeur bénigne tandis que le grade III représente une transition vers le glioblastome multiforme, qui est l'état le plus agressif. Les classifications purement histologiques sont difficilement reproductibles, elles sont basées sur une expertise visuelle, et exigent l’intervention de deux spécialistes. Le couplage anatomo-pathologique avec analyse des images par imagerie par résonnance magnétique (IRM) est coûteux et long, il dépend notamment du délai d’accès à l’IRM. A l’heure actuelle, aucun biomarqueur n’est suffisant à lui seul pour orienter les décisions thérapeutiques anti-cancéreuses. Il existe donc un besoin général d’un procédé in vitro de caractérisation d’une tumeur, ledit procédé étant objectif, précis, reproductible, aisé et réalisable à un stade si possible précoce de la maladie. Ledit procédé permettrait de renforcer le diagnostic et faciliter la stratification des patients. La publication de Janzer (« Neuropathologie et pathologie moléculaire des gliomes .” R-C Janzer, Rev. Med. Suisse , 5, 1501-4, 2009) décrit la classification des gliomes selon l’OMS, basée sur des critères histologiques et immuno-histochimiques, ainsi que sur des profils génétiques mettant en évidence l’altération de l’ADN des cellules : la détermination de l’hyperméthylation du promoteur du gène MGMT (pour les glioblastomes) et la détection de pertes des chromosomes 1p et 19q (pour les tumeurs oligodendrogliales). La publication de Relier et al (« FTO-mediated cytoplasmic m 6 A m demethylation adjusts stem-like properties in colorectal cancer cell .”, Nat. Commun 12, 1716, 2021) décrit la régulation dans le cytoplasme du niveau de la méthylation m 6 A m par la FTO (en anglais Fat mass and obesity associated protein ) dans des lignées de cellules souches cancéreuses. Les auteurs mettent en évidence la fonction biologique de la modification m 6 A m et ses effets secondaires potentiels pour le suivi du cancer colorectal. Ce document mentionne une étape d’analyse par spectrométrie de masse (LC-MS/MS) d’ARNm fragmenté. Seuls les nucléosides m 6 A, A, m 6 A m et A m sont détectés et quantifiés. La demande internationale WO 2007/008647 « Diagnostic et classement de gliomes à l’aide d’une approche protéomique » a pour objet un procédé de diagnostic et de classification des gliomes utilisant une approche protéomique. Dans ce procédé, un tissu tumoral est analysé par spectrométrie de masse et un profil des protéines exprimées est obtenu. Il existe donc un besoin particulier d’un procédé in vitro d’évaluation du degré de malignité d’une tumeur gliale, en particulier sa classification. Il existe en particulier un besoin d’un procédé objectif permettant distinguer entre le grade II et le grade III des tumeurs gliales, pour renforcer le diagnostic et faciliter la stratification des patients. Les inventeurs ont maintenant mis au point un procédé de caractérisation d’une tumeur qui exploite les données quantitatives de l’épitranscriptome. L’épitranscriptome englobe l’ensemble des modifications chimiques portées par les bases des acides ribonucléiques (ARN), ensemble que l’on dénomme aussi par les termes « épigénétique de l’ARN ». Un procédé selon l’invention comprend la fourniture d’un échantillon biologique d’un sujet atteint d’une tumeur et l’obtention des quantités de nucléosides modifiés et non modifiés issus dudit échantillon, lesdites quantités sont regroupées dans un vecteur (au sens mathématique du terme). Selon un aspect particulier, un procédé selon l’invention comporte l’analyse informatique subséquente dudit vecteur pour la caractérisation d’une tumeur. Ladite caractérisation d’une tumeur permet de prédire des informations cliniques et médicales sur la tumeur à partir de l’échantillon sujet à l’analyse. Plus particulièrement, un procédé selon l’invention comporte l’analyse informatique dudit vecteur pour la prédiction du grade de ladite tumeur. Par simplicité, pour un échantillon donné, on nommera « profil épitranscriptomique » ou tout simplement « profil », le vecteur qui regroupe les quantités de chaque nucléoside, modifié ou non modifié. Les nucléosides modifiés et non modifiés sont issus : i) de l’ARN total extrait de cellules d’un échantillon biologique d’un patient, ii) de l’ARN extracellulaire provenant d’un échantillon biologique d’un patient, et/ou iii) d’un extrait de métabolites d’un échantillon biologique isolé d’un patient. Les nucléosides issus de l’ARN total extrait de cellules d’un échantillon biologique d’un patient et/ou de l’ARN extracellulaire provenant d’un échantillon biologique d’un patient sont obtenus par la fragmentation de l’ARN en nucléotides puis leur déphosphorylation. Les nucléosides issus d’un extrait de métabolites d’un échantillon biologique isolé d’un patient sont obtenus par une extraction des métabolites d’un échantillon biologique puis la déphosphorylation desdits métabolites, selon des procédés appropriés bien connus de l’homme du métier. Lesdits métabolites sont notamment issus du catabolisme de l’ARN, les nucléosides présents sous forme monomérique peuvent également être désignés par l’expression de nucléosides dits « libres ». Plus particulièrement, les nucléosides modifiés et non modifiés sont les nucléosides présents dans l’ARN total extrait de cellules d’une biopsie de ladite tumeur. Par « nucléosides » on désigne les glycosamines constituées d’une base nucléique liée à l’atome de carbone anomérique d’un résidu de pentose par une liaison glycosidique depuis l’atome d’azote N1 d’une pyrimidine ou l’atome N9 d’une purine. Selon un aspect particulier d’un procédé selon l’invention, lorsque ledit pentose est le ribose, le terme « nucléosides » désigne dans ce cas les ribonucléosides. On désigne aussi les nucléosides modifiés des ARN par les termes de « marques épitranscriptomiques » ou de « modifications épitranscriptomiques ». Outre les nucléosides usuels des ARN (Tableau 1) utilisables pour la caractérisation des tumeurs, des nucléosides modifiés utilisables dans un procédé selon l’invention, en particulier dans l’analyse de gliomes, sont listés (Tableau 2). Selon les modes de réalisation d’un procédé selon l’invention, un profil épitranscriptomique peut inclure, selon les besoins de l’application, un nombre plus important de nucléosides modifiés, à déterminer parmi les nucléosides connus (Jonkhout et al , « The RNA modification landscape in human disease », RNA, Dec ;23 (12) :1754-1769, 2017). Une liste complète de tous les nucléosides modifiés, qui pourront, selon les besoins de l’analyse, être inclus dans les profils transcriptomiques est accessible publiquement. Le profil épitranscriptomique d’un échantillon caractérise ledit échantillon. Ledit profil épitranscriptomique peut être obtenu par toute technique connue de l’état de l’art, et notamment par spectrométrie de masse, notamment par spectrométrie de masse couplée à la chromatographie. Pour désigner les informations médicales à prédire, on parlera aussi de « variables cliniques » ou « caractéristiques cliniques ». Dans un procédé selon l’invention, l’étape d’analyse du profil épitranscriptomique à des fins de prédiction clinique est basé sur une méthode d’apprentissage automatique supervisé. L’apprentissage est effectué sur les profils issus d’une cohorte, c’est-à-dire des échantillons cellulaires pour lesquels on connaît au préalable la variable caractéristique clinique à prédire. Le « modèle informatique » ainsi créé par l’apprentissage peut être ensuite utilisé (en mode prédiction) afin de prédire la variable clinique pour tout nouvel échantillon. Les inventeurs ont également développé un procédé de normalisation des données quantitatives brutes permettant d’obtenir un profil épitranscriptomique contenant des quantités relatives comparables. Préalablement au procédé d’apprentissage, l’analyse exploratoire des profils des échantillons de la cohorte a révélé des variations des profils, lesdites variations étant corrélées au grade des tumeurs des sujets dont ont été extraits les échantillons. A partir des profils de la cohorte signature et au moyen d’un outil de prédiction par apprentissage automatique, un procédé selon l’invention permet de prédire le grade d’un gliome à partir d’un échantillon biologique d’un patient atteint de tumeur, en particulier à partir d’un échantillon comprenant des cellules tumorales. Plus particulièrement, un procédé selon l’invention permet de distinguer les grades II et III d’un gliome à partir d’un échantillon comprenant des cellules tumorales. Enfin, en combinant les profils épitranscriptomiques normalisés et les données de survie de patients, et au moyen d’un outil de prédiction par apprentissage automatique, un procédé selon l’invention permet de prédire la survie d’un patient à partir d’un échantillon biologique isolé dudit patient, en particulier à partir d’un échantillon tumoral. Procédé in vitro de caractérisation d’une tumeur d’un individu, à partir d’un échantillon biologique isolé de cet individu, comprenant les étapes de : isolement des nucléosides dudit échantillon biologique, par l’extraction : i) de l’ARN cellulaire total et sa fragmentation en nucléosides, ii) de l’ARN extracellulaire et sa fragmentation en nucléosides et/ou iii) des nucléosides issus des catabolites monomériques, isolement par chromatographie et détermination d’une quantité respective d’au moins 3, de préférence au moins 5, de préférence au moins 10 de préférence au moins 20, nucléosides différents issus de l’étape a), et établissement, pour ledit échantillon biologique, d’un profil de nucléosides à partir des quantités respectives de chacun des nucléosides obtenues lors de l’étape b), ledit profil étant caractéristique de ladite tumeur. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel ledit échantillon biologique est une biopsie ou un échantillon biologique liquide, ledit échantillon biologique liquide étant choisi parmi le sang, le sérum, le plasma et l’urine. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 ou 2, dans lequel lesdits nucléosides sont choisis parmi les suivants : les nucléosides non modifiés : adénosine (A), cytidine (C), guanosine (G), uridine (U), et les nucléosides modifiés : 2’-O-méthyladénosine (Am), 1-méthyladénosine (m1A), N6,N6-diméthyladénosine (m66A), N6,N6,2′-O-triméthyladénosine (m66Am), N6-méthyladénosine (m6A), N6,2′-O-diméthyladénosine (m6Am), N4-acetylcytidine (ac4C), 2′-O-méthylcytidine (Cm), 5-hydroxyméthylcytidine (hm5C), 3-méthylcytidine (m3C), 5-méthylcytidine (m5C), 2′-O-méthylguanosine (Gm), 1-méthylguanosine (m1G), N2,N2,7-triméthylguanosine (m227G), N2,7-diméthylguanosine (m27G), 7-méthylguanosine (m7G), 8-hydroxyguanosine (oxo8G), inosine (I), pseudouridine (Psi), queuosine (Q), 3,2′-O-diméthyluridine (m3Um), 5-méthoxycarbonylméthyl-2-thiouridine (mcm5s2U), 5- méthoxycarbonylméthyluridine (mcm5U), 5-carbamoylméthyluridine (ncm5U), 2′-O-méthyluridine (Um). Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite tumeur est une tumeur gliale et en ce qu’il comprend une étape de prédiction d’un grade de ladite tumeur gliale par un premier modèle de classification préalablement entraîné, à partir du profil établi lors de l’étape c). Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le premier modèle de classification comprend : un algorithme d’apprentissage automatique, un réseau neuronal à apprentissage supervisé, ou un algorithme de classification probabiliste multi-classes, préalablement entraîné avec un jeu de données d’apprentissage. Procédé selon l’une quelconque des revendications 4 ou 5, dans lequel la prédiction d’un grade d’une tumeur gliale est choisie parmi : la prédiction d’une tumeur gliale de grade II, la prédiction d’une tumeur gliale de grade III et la prédiction d’une tumeur gliale de grade IV. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’il comprend une étape de prédiction d’un état de survie dudit individu, par un deuxième modèle de classification préalablement entraîné, à partir du profil établi lors de l’étape c). Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le deuxième modèle de classification comprend : un algorithme d’apprentissage automatique, un réseau neuronal à apprentissage supervisé, ou un algorithme de classification probabiliste, préalablement entraîné avec un jeu de données d’apprentissage. Modèle de classification, préalablement entraîné sur un jeu de données d’apprentissage, pour prédire, dans un procédé selon l’une quelconque des revendications 4 à 8 : un grade d’une tumeur, et/ou un état de survie d’un individu, à partir du profil établi lors de l’étape c). Utilisation d’un modèle de classification selon la revendication 9, pour la prédiction d’un grade d’une tumeur et/ou pour la prédiction d’un état de survie d’un individu.