Brevet FR3113494A1 — publié le 20220225

L’invention concerne une méthode de production de Welan comprenant la culture en bioréacteur agité d’une souche de Sphingomonas sp dans un milieu de culture en conditions aérobies sous pression partielle en oxygène supérieure à 30% de la saturation à l’air, par fermentation d’au moins un sucre en C5/C6, la synthèse étant conduite sous un volume d’air injecté par volume de milieu et par minute (VVM) compris entre 0,5 et 2, sous agitation comprise entre 500 et 1800 rotations par minutes (RPM), pendant une durée comprise entre 40 et 140 heures afin d’obtenir un biopolymère constitué de Welan. L’invention concerne également le biopolymère de haute viscosité produit, ainsi que son utilisation pour la récupération assistée de pétrole, notamment en conditions de haute température et haute salinité. Figure à publier : Figure 9 Procédé de production de Welan de haute viscosité par Sphingomonas sp. L’invention concerne le domaine des biopolymères, notamment pour les procédés de récupération assistée de pétrole (EOR : Enhanced Oil Recovery) pour les réservoirs chauds et salins (dits HT, HS pour Haute Température, Haute Salinité). Pour l’exploration et l’exploitation d’une formation souterraine, notamment lorsqu’un champ pétrolifère devient mature, il est courant d’injecter un fluide dans la formation souterraine afin d’augmenter l’efficacité des procédés (Han D. K. & al, Recent Development of Enhanced oil Recovery in China, J. Petrol. Sci. Eng. 22(1-3) : 181-188 ; 1999). Il existe plusieurs méthodes de récupération assistée de pétrole. Lorsque le fluide injecté, aussi appelé fluide de balayage, est additionné de composés, on parle de récupération assistée tertiaire. Ces composés chimiques sont des polymères, tensioactifs, des composés alcalins, ou des mélanges de ces composés. Cette opération est connue sous le nom d’EOR chimique. En effet, pour optimiser ces procédés, il est d’usage d’inclure au moins une formulation de molécules organiques, telles que des polymères (P), des copolymères et/ou des tensioactifs (S), des alcalins (A), etc. Par rapport à une simple injection d'eau ou de saumure, l'intérêt de la présence d'un polymère est d'augmenter la viscosité du fluide de balayage et par conséquent d'améliorer le rapport de mobilité entre le fluide injecté et les hydrocarbures en place dans la formation souterraine. La production pétrolière par un procédé EOR chimique peut être notamment appliquée pour maintenir ou améliorer la production d’un réservoir. Parmi les familles de polymères utilisés en EOR on trouve les polymères hydrosolubles de hautes masses molaires tels que les polyacrylamides (PAM), les polyacrylamides partiellement hydrolysés (HPAM), ou certains polysaccharides (xanthanes, guars…). Ces polymères viscosifient la phase aqueuse dans le réservoir et permettent ainsi d’augmenter notablement le taux de récupération du pétrole présent dans les pores de la roche. Le choix des polymères pour les applications EOR, notamment dans des conditions de haute température et haute salinité doit tenir compte de nombreux paramètres : pouvoir viscosifiant, stabilité thermique et mécanique, filtrabilité, biodégradabilité, compatibilité avec les surfactants, tolérance aux sels…(Rellegadla, S., Prajapat, G. & Agrawal, A. Polymers for enhanced oil recovery: fundamentals and selection criteria. Appl Microbiol Biotechnol 101, 4387–4402 (2017)) Pour les procédés de type P, seuls quatre grands types de polymères semblent répondre aujourd’hui aux besoins de l’EOR : -des polyacrylamides partiellement hydrolysés (HPAMs), -des gommes xanthane, -des celluloses modifiées (CMC, PAC - Carboxy Methyl Cellulose et PolyAnionic Cellulose), -des copolymères de polyacrylate. Pratiquement, seuls les HPAM et le xanthane sont commercialisés pour les applications sur champs, auxquels on peut ajouter le scléroglucane pour les applications spécifiques aux boues de forage à l’eau. L’instabilité des HPAMs à température élevée en présence d’ions divalents et leur sensibilité au stress mécanique sont des inconvénients majeurs lors de leur utilisation en EOR. Les bio-polymères comme le xanthane présentent l’inconvénient d’être plus instables à haute température, plus coûteux, plus sensibles à la biodégradation et conduisent à des pertes d’injectivité de par la présence de résidus cellulaires. Un des inconvénients majeurs des polymères microbiens est leur biodégradabilité qui conduit à l’addition massive de biocides (formol, polyéther sulfones) responsables d’interactions au sein des fluides. Aujourd’hui, l'EOR chimique utilise des tonnages importants de polymères hydrosolubles de hauts poids moléculaires à la fois comme agent de balayage viscosifiant et comme réducteur de mobilité. Les propriétés physico-chimiques attendues concernent avant tout une stabilité accrue en conditions de réservoirs (température pouvant aller jusqu’à 120°C, salinité pouvant aller jusqu’à 150g/l de sels), un meilleur maintien des propriétés viscosifiantes et une (bio)traitabilité favorisant leur élimination à la fin du procédé EOR. Il est donc important de trouver une alternative à l’utilisation des polymères de type HPAM en conditions de réservoirs chauds et salins (HT/HS), tout en résolvant les inconvénients liés à l’emploi de biopolymères comme le xanthane. La demande de brevet US2014315765 AA décrit une méthode de traitement d’une formation souterraine au moyen d’une composition comprenant un exopolysaccharide EPS formé par : -soumission d’un micro-organisme extrémophile ou extrémotolérant à des conditions telles que l’EPS se forme. - soumission d’un micro-organisme extrémophile ou extrémotolérant génétiquement modifié à des conditions telles que l’EPS se forme. Le micro-organisme permettant d’obtenir peut être choisi parmi Acetobacter xylinum , Acinetobacter calcoaceticus , Aeropyrum pernix , Agrobacterium radiobacter , Alcaligenes faecalis var. myxogenes, Alcaligenes viscosus , Alteromonas hispanica , Alteromonas infernus , Alteromonas macleodii subsp. Fijiensis , Aquifex aeolicus , Archaeoglobus fulgidus , Aureomonas elodea , Azotobacter vinelandii , Bacillus licheniformis , Bacillus megaterium , Bacillus subtilis , Bacillus thermodenitrificans , Beijerinckia indica , Chromohalobacter beijerinckii , Colwellia psychrerythraea , Escherichia coli, Exiguobacterium acetylicum , Exiguobacterium aestuarii , Exiguobacterium antarticum , Exiguobacterium artmeiae , Exiguobacterium aurantiacum , Exiguobacterium marinum , Exiguobacterium mexicanum , Exiguobacterium oxidotolerans , Exiguobacterium profumsum , Exiguobacterium sibiricum , Exiguobacterium undae , Geobacillus tepidamans , Geothermobacterium ferrireducens , Hahella chejuensis , Haloarcula hispanica , Haloarcula japonica , Haloarcula marismortui , Halobacterium noricense , Halobiforma haloterrestris , Halococcus dombrowskii , Halococcus salifodinae , Haloferax denitrificans , Haloferax gibbonsii , Haloferax mediterranei , Haloferax volcanii , Halomonas alkaliantarctica , Halomonas eurihalina , Halomonas maura , Halomonas salaria, Halopiger aswanensis , Haloterrigena hispanica , Lactobacillus hilgardii , Lentinus elodes , Leuconostoc dextranicum , Leuconostoc mesenteroides , Methanococcus jannaschii , Natronobacterium gregoryi , Palleronia marisminoris , Pantoea stewartii subsp. Stewartii , Phoma herbarum , Pseudoalteromonas antarctica , Pseudomonas aeruginosa , Pseudomonas marginalis , Pyrococcus furiosus , Pyrolobus fumarii , Salipiger mucosus , Sclerotium delfinii , Sclerotium glucanicum , Sclerotium rolfsii , Sinorhizobium meliloti , Sphingomonas paucimobilis , Staphylococcus epidermidis , Streptococcus equi , Sulfolobus solfataricus , Tetragenococcus halophilus , Thermococcus litoralis , Thermotoga maritima , Thermus aquaticus , Vibrio Diabolicus , Xanthomonas campestris , and Zymomonas mobilis Ce document décrit notamment de manière plus particulière Xanthomonas Campestris pour produire la gomme xanthane. Afin de trouver une alternative aux polymères connus de type HPAM, la Demanderesse s’est intéressée à d’autres biopolymères que le Xanthane, notamment le Welan. La synthèse de Welan se fait habituellement à partir de Sphingomonas sp . selon le protocole et notamment le milieu préconisé par l’American Type Culture Collection (ATCC) en fioles de Fernbach. De manière surprenante, la Demanderesse a découvert un nouveau procédé de synthèse d’un polymère à partir de Sphingomonas sp . permettant d’obtenir avec une productivité améliorée un biopolymère à base de Welan ayant des propriétés viscosifiantes et un comportement rhéofluidifiant proches des polymères de type HPAM, et présentant à la fois un maintien de la viscosité à haute température et une bonne stabilité aux sels. L’invention concerne une méthode de production de Welan comprenant la culture en bioréacteur agité d’une souche de Sphingomonas sp dans un milieu de culture en conditions aérobies sous pression partielle en oxygène supérieure à 30% de la saturation à l’air, par fermentation d’au moins un sucre en C5/C6, la synthèse étant conduite sous un volume d’air injecté par volume de milieu et par minute (VVM) compris entre 0,5 et 2, sous agitation comprise entre 500 et 1800 rotations par minutes (RPM), pendant une durée comprise entre 40 et 140 heures de préférence entre 48 et 120 heures, de manière très préférée entre 60 et 96 heures, de manière encore plus préférée entre 68 et 76 heures, afin d’obtenir un biopolymère constitué de Welan. Dans un mode de réalisation, la fermentation comprend une phase de croissance de la souche et une phase de production dudit biopolymère, dans laquelle l’agitation est fixée à une valeur de RPM V1 pendant la phase de croissance et est fixée à une valeur de RPM V2 pendant la phase de production, V1 étant supérieure à V2. Dans un autre mode de réalisation, l’agitation est montée progressivement à une valeur V1 qui reste ensuite constante pendant toute la durée de la fermentation. L’agitation dans ledit bioréacteur peut être effectuée au moyen d’une turbine à écoulement radial de type Rushton et/ou d’une turbine centripète de type Rayneri . L’agitation dans ledit bioréacteur peut être effectuée au moyen d’un arbre d’agitation muni dans sa partie haute d’une turbine de type Rushton et dans sa partie basse d’une roue à pales inclinées. L’agitation dans ledit bioréacteur peut également être effectuée au moyen d’un arbre d’agitation muni d’une turbine centripète de type Rayneri, l’axe de l’arbre d’agitation étant excentré par rapport à l’axe dudit bioréacteur. Le biopolymère constitué de Welan peut être isolé du milieu de culture par : a)précipitation dans un solvant organique introduit en excès volumique b)centrifugation, c)élimination du surnageant, ces trois étapes pouvant être répétées une ou plusieurs fois, et d) séchage à une température comprise entre 30 et 120°C jusqu’à poids constant. Ledit solvant organique peut être choisi parmi l’isopropanol et l’éthanol, de préférence l’isopropanol. Dans la méthode selon l’invention, ladite souche peut produire au moins 8 grammes de welan par kg de milieu de culture. Le milieu de culture peut contenir des sucres naturels ou synthétiques en C5/C6, de préférence du glucose, de manière très préférée un mélange de glucose et de xylose. De préférence, le milieu de culture est majoritairement composé d’hydrolysats de biomasse lignocellulosique riches en sucres C5/C6. Le milieu de culture peut comprendre également au moins un composé surfactant choisi parmi l e glycérol, les solvants polaires tels que le diméthylsulfoxyde (DMSO) et les esters de sorbitane éthoxylés, de préférence le glycérol. L’invention concerne également un biopolymère à base de welan produit selon la méthode selon l’invention, de viscosité supérieure à 10 cP. L’invention concerne également l’utilisation du biopolymère à base de Welan produit selon la méthode selon l’invention ou dudit biopolymère à base de Welan de viscosité supérieure à 10 cP pour la récupération assistée de pétrole. L’utilisation du biopolymère à base de Welan peut concerner la récupération assistée de pétrole dans des réservoirs à haute température et haute salinité, la température étant comprise entre 70 et 120°C et la concentration en sels étant comprise entre 100 et 150 g/l. Liste des figures [Fig 1] La représente une photographie d’une turbine à écoulement radial de type Rushton. [Fig 2] La représente une photographie d’un arbre d’agitation muni d’une turbine centripète de type Rayneri. [Fig 3] La représente une photographie d’un arbre d’agitation muni en partie haute d’une turbine de type Rushton et en partie basse d’un module à pales inclinées de type pitch blade. [Fig 4] La représente les bioréacteurs agités en cours de synthèse de biopolymère selon les protocoles expérimentaux des exemples 1, 2, 3 et 4, moûts de fermentation W09 à W12. [Fig 5] La représente le suivi de la demande en oxygène au cours du temps dans les bioréacteurs pour les moûts de fermentation W09 à W12 des exemples 1 à 4. [Fig 6] La représente les rhéogrammes (viscosité en mPa.s en fonction de la température en °C) comparés pour les moûts de fermentation cultivés en bioréacteur agité (W09/W10/W12) et en fiole de Fernbach (exemple 5). [Fig 7] La représente le rhéogramme à quatre températures différentes du Welan préparé selon l’invention à 2g/kg dans une solution de NaCl à 100 g/kg (viscosité en Pa.s en fonction du taux de cisaillement, exemple 7). [Fig 8] La représente le rhéogramme à trois températures différentes du Welan préparé selon l’invention à 2g/kg dans une solution de NaCl à 150 g/kg (viscosité en Pa.s en fonction du taux de cisaillement, exemple 7). [Fig 9] La représente les rhéogrammes comparés à 70°C d’un polymère de type HPAM, de Xanthane et de Welan préparé selon l’invention, à 2g/kg dans une solution de NaCl à 25 ou 50 g/kg (viscosité en Pa.s en fonction du taux de cisaillement, exemple 8). D'autres caractéristiques et avantages de la méthode de production de Welan selon l'invention, apparaîtront à la lecture de la description ci-après d'exemples non limitatifs de réalisations, en se référant aux figures annexées et décrites ci-après. L'invention consiste en une amélioration des conditions de synthèse d’un biopolymère à base de Welan par la bactérie Sphingomonas sp .. L’injection d’une quantité d’oxygène plus importante ainsi qu’une meilleure agitation conduisent notamment à une productivité améliorée, et à une viscosité plus importante du biopolymère obtenu. Un protocole de purification n’ayant pas d’impact sur le comportement rhéologique du polymère est par ailleurs mis en œuvre afin de séparer avec précision la biomasse cellulaire synthétisée. La souche bactérienne permettant la synthèse est Sphingomonas sp . ATCC 31555 (Autre dénomination : Alcaligenes sp . S130) productrice de Welan. La production de polymère se fait de façon exocellulaire (on parle d’ExoPolySaccharide : EPS). Le nouveau procédé de synthèse selon l’invention permet de jouer sur la productivité et la viscosité du polymère obtenu. En effet, l’incidence de l’oxygène dissout et la mise en œuvre des synthèses dans un bioréacteur dont la géométrie est mieux adaptée à ces polymères de hautes masses molaires, avec un module d’agitation efficace en terme de transfert d’oxygène, peu cisaillant vis-à-vis du produit formé et qui génère moins de stress microbien. Les propriétés rhéologiques du biopolymère purifié sont en effet améliorées par le procédé de synthèse selon l’invention. La mise en œuvre du procédé de production de Welan par Sphingomonas Sp selon l’invention permet de synthétiser du biopolymère dont l’étude rhéologique montre des propriétés viscosifiantes réelles, proches de celles du HPAM. Par exemple, la cible de viscosité fixée à 10 mPa.s est notamment atteinte pour des solutions de Welan à 2g/kg, caractérisées à 90°C et en présence de 100 g de sels par kg. Par ailleurs, le comportement rhéofluidifiant du Welan obtenu montre que la viscosité est en grande partie préservée en conditions HT/HS (conditions pouvant aller jusqu’à une température de 120°C et une concentration de 150 g/l de sels). A même concentration et à 70°C, le Welan développe la même viscosité que l’HPAM. La production en bioréacteur agité, notamment en bioréacteur agité équipé d’un arbre d’agitation muni d’au moins une turbine, améliore fortement la productivité, notamment lorsque la production est conduite sans limitation en O 2 dissout et avec un mélange de sucres naturels ou synthétiques assimilables par Sphingomonas sp . Ces nouvelles conditions permettent de sensiblement doubler la concentration finale en Welan (±18g/Kg de moût). Un protocole de purification ayant peu d’impact sur le comportement rhéologique du Welan a été développé et validé sur le xanthane déjà connu. Par ce traitement, il est désormais possible de mieux séparer biomasse et polymère, d’évaluer plus précisément la biomasse cellulaire synthétisée ainsi que la quantité de biopolymère dans les moûts de fermentation. La production de Welan par Sphingomonas Sp , peut se faire à partir de sucres en C5/C6, par exemple le xylose et le glusoce, seuls ou en mélange, mais également à partir d’hydrolysats de biomasse lignocellulosique (paille de blé) riches en sucres C5/C6. Cette synthèse est envisageable car Sphingomonas Sp assimile de nombreux sucres (xylose, glucose, arabinose, fructose, galactose, lactose, maltose, mannose, raffinose, rhamnose, sucrose, mannitol et xylitol). Les hydrolysats de biomasse lignocellulosique contiennent généralement un rapport 75%/25% en glucose et xylose. La synthèse de Welan avec ces hydrolysats présente donc l’avantage de produire un polymère d’intérêt pour la récupération assistée de pétrole tout en utilisant des sucres moins coûteux que les sucres synthétiques qui sont ainsi valorisés pour la biosynthèse de Welan. Un paramètre important de la méthode selon l’invention est le maintien durant la phase de synthèse, d’une saturation en oxygène dissout supérieure ou égale à 30%, permettant notamment d’ assurer les propriétés viscosifiantes du Welan. Le maintien de cette saturation en oxygène peut être contrôlée par la géométrie du bioréacteur utilisé et notamment de ses modules d’agitation, associée à un contrôle des paramètres de fermentation (contrôle de la pression partielle en O2 dissout, mais également quantité de sucres en C5/C6 disponibles pour la fermentation, également appelé fed-batch en C5/C6) influant sur la productivité et sur les propriétés rhéologiques du biopolymère. La production de Welan dans la méthode selon l’invention est effectuée en bioréacteur, notamment en bioréacteur agité équipé de turbines, ce qui améliore fortement la productivité. Le bioréacteur utilisé pour la synthèse peut être équipé de tout type de module d’agitation connu de l’homme du métier permettant d’assurer une oxygénation efficace sans cisailler trop fortement le biopolymère. De préférence, le module d’agitation peut comprendre une turbine à écoulement radial de type Rushton et/ou une turbine centripète de type Rayneri. La turbine Rushton est une turbine à écoulement radial utilisée pour de nombreuses applications de mélange. La conception est basée sur un disque plat avec des lames verticales plates montées verticalement (perpendiculairement au disque plat). Les innovations récentes incluent l'utilisation de lames concaves ou semi-circulaires ( ). La turbine Rayneri est un agitateur centripète utilisé pour des applications de mélange ( ) Une roue "pitched blade" ou « pitch blade » est une roue à pales inclinées qui génère un flux divergent, mais généralement axial, utilisée pour des applications de mélange. Dans un mode de réalisation, l’arbre d’agitation du bioréacteur peut comprendre une turbine Rushton en partie haute et une roue à pales inclinées de type « pitch blade » en partie basse ( ). Dans un autre mode de réalisation, afin d’aérer le milieu de production sans cisailler le biopolymère avec les pales d’agitation (notamment pour des vitesses de rotation comprises entre 1200 et 1800 t/min), il est possible d’utiliser une géométrie de réacteur F2P conçu par IFPEN, équipé de turbine Rayneri excentrée, c’est à dire muni d’un agitateur centripète de type Rayneri et dont l’axe de l’arbre d’agitation n’est pas centré, ce qui conduit à la création de turbulences et donc à un mélange plus efficace. Ces modules sont recommandés pour leur capacité à transférer de l’oxygène dissout au sein de solutions visqueuses, sans pour autant cisailler les polymères en solution . Ce type de réacteur a notamment été utilisé pour la culture de Trichoderma reesei durant la thèse de M. Nicolas Hardy « Identification des critères d’extrapolation du procédé de production de cellulases par Trichoderma reesei en utilisant l’approche « scale-down » ». Dans un mode de réalisation, la synthèse de Welan par culture de Sphingomonas sp peut se faire en présence de composés surfactants susceptibles de favoriser la synthèse de Welan. Par exemple, différents types de molécules peuvent être envisagées : Le glycérol, des solvants polaires tels que le diméthylsulfoxyde (DMSO) et les esters de sorbitane éthoxylés (par exemple le produit commercial tween 40). De préférence le composé ajouté est le glycérol. Sphingomonas sp est une bactérie « aérobie », c’est-à-dire qu’elle a besoin d’oxygène à la fois pour se reproduire mais aussi pour synthétiser le Welan. Les bactéries vivent et fonctionnent dans la phase liquide des bioréacteurs ; l’oxygène est apportée à la cellule bactérienne via l’oxygène dissout qui est présent en phase aqueuse. La solubilité de l’O 2 dans l’eau étant limitée (environ 8 mg/l) , le procédé de synthèse selon l’invention permet de le renouveler au fur et à mesure de sa consommation par les bactéries, une biosynthèse de welan durant généralement plusieurs jours, par exemple de 3 à 5 jours. La capacité d’un bioréacteur à transférer et dissoudre de l’oxygène dans l’eau est liée à sa géométrie (forme et taille du réacteur et de l’arbre d’agitation équipé de ses modules), mais aussi aux conditions d’aération ( exprimée en V olume d’air injecté par V olume de M ilieu et par minute – ou VVM ) et d’agitation (exprimée en R otation P ar M inute – ou RPM ) qui sont imposées. Les conditions d’aération et d’agitation sont donc des paramètres influant sur l’oxygène dissout. A cet effet, la synthèse est conduite sous un volume d’air injecté par volume de milieu et par minute (VVM) compris entre 0,5 et 2, sous agitation comprise entre 500 et 1800 rotations par minutes (RPM), pendant une durée comprise entre 40 et 140 heures de préférence entre 48 et 120 heures, de manière très préférée entre 60 et 96 heures, de manière encore plus préférée entre 68 et 76 heures, afin d’obtenir un biopolymère constitué de Welan. Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, un apport conséquent en O 2 joue : -Dans un premier temps sur la vitesse de reproduction des cellules bactériennes. Le fait de favoriser très tôt le transfert d’O 2 va doper la croissance cellulaire. -Dans un second temps sur la productivité en Welan ; il apparaît que les synthèses effectuées en bioréacteur agité tel que décrit précédemment (et non en fioles) permettent de passer de moins de 8 g/kg à environ 18 g/kg (g de Welan par kg de milieu réactionnel). En imposant des VVM et RPM fortes au sein des bioréacteurs (par exemple des valeurs de VVM autour de 1 et des vitesses d’agitation RPM de l’ordre de 1000 rpm ou rotations/min ou tours/min), on favorise la synthèse de Welan. -Dans un dernier temps sur les propriétés rhéologiques du Welan, notamment sa viscosité. De manière non attendue, des conditions d’aération plus performantes ont conduit à un welan plus visqueux. Purification du biopolymère obtenu par précipitation au solvant La récupération de polymère par une méthode de précipitation par addition de solvants organiques est décrite dans la littérature (Ramen Urbam & David A Brant 1989). De même, l’utilisation de propionate et l’augmentation de pH sont préconisées dans la littérature pour une meilleure accessibilité du polymère (Kaur & al, 2014). Un protocole de purification n’ayant pas d’impact sur le comportement rhéologique du polymère a été développé afin de séparer le biopolymère obtenu et de déterminer avec précision la biomasse cellulaire synthétisée. Dans la méthode de production selon l’invention, le biopolymère obtenu peut ainsi être isolé du milieu de culture à l’issue de la fermentation par : a)précipitation dans un solvant organique introduit en excès volumique, de préférence deux ou trois fois en volume b)centrifugation, de préférence à une vitesse supérieure à 1000 rpm, c)élimination du surnageant, ces trois étapes pouvant être répétées une ou plusieurs fois, et d) séchage jusqu’à poids constant, à une température comprise entre 30 et 120°C. Le protocole de purification conduit à une dissociation du Welan sous forme d’une masse blanche floconneuse, et de la biomasse visible au fond du pot de centrifugation. Pour la détermination de la teneur en polymère, le protocole préféré est le suivant : -Dans le moût, ajout d’une quantité comprise entre 0,1 et 0,5%, par exemple une quantité égale à 0,2% de propionate de calcium ; -Ajustement du pH à une valeur comprise entre 10 et 11,5, de préférence pH 11 avec de la potasse 3N ; -Pesée du moût dans un flacon à centrifuger de 250ML ;; -Addition de 2,5 à 3,5 volumes d’isopropanol, de préférence 3 volumes d'isopropanol -Centrifugation à une vitesse comprise entre 1000 et 2000 rpm, de préférence à une vitesse de 1400rpm (soit 30000g) pendant 1 heure à 20°C ; -Elimination du surnageant ; -Procéder 3 fois ainsi (ajout d’isopropanol, centrifugation, élimination du surnageant) ; -Séchage à 55°C jusqu’à poids constant, de préférence pendant une durée égale à 4 heures ; -Pesée ; -La poudre obtenue est cassée grossièrement à la spatule et conservée dans un flacon à l’abri de l’humidité. Ce protocole de purification permet notamment de maintenir la viscosité du biopolymère obtenu et d’éviter la présence de débris cellulaires de biomasse dans le biopolymère (ce qui permet par ailleurs d’éviter les problèmes d’injectivité en tête de puits dans le cas d’une application en récupération assistée de pétrole). Détermination des propriétés rhéologiques des moûts de fermentation et des biopolymères obtenus Les propriétés rhéologiques (viscosité, comportement au cisaillement) peuvent être évaluées par toute technique de l’homme du métier. De manière préférée, deux types d’équipements rhéologiques peuvent être utilisés : -un rhéomètre de type DHR3 équipé soit d’un module « plan/plan rugueux » de 40mm soit d’un double entrefer de type Couette pour les échantillons les moins visqueux, -un rhéomètre de type AR2000 équipé d’une géométrie à hélice pour les échantillons les plus visqueux et hétérogènes (notamment pour les moûts de fermentation cultivés en fermenteur). Applications Le biopolymère à base de Welan obtenu selon l’invention peut être utilisé dans tout type d’application industrielle, par exemple dans le domaine alimentaire, cosmétique, pharmaceutique ou pétrolier. Plus particulièrement, les propriétés démontrées par le biopolymère obtenu selon l’invention, notamment une stabilité accrue en conditions de réservoirs (température pouvant aller jusqu’à 120°C, salinité pouvant aller jusqu’à 150g/l de sels), un meilleur maintien des propriétés viscosifiantes et une (bio)traitabilité favorisant leur élimination à la fin du procédé EOR permettent d’envisager l’utilisation du welan obtenu selon le procédé de l’invention comme une alternative à l’utilisation des polymères de type HPAM dans les procédés de récupération assistée de pétrole, notamment dans les réservoirs chauds et salins. Exemples Exemple A (comparatif) : synthèse en fioles de Fernbach Dans l’exemple A, la synthèse de biopolymère est menée en fioles de Fernbach selon l’art antérieur avec pour objectif de produire et de purifier une quantité suffisante de Welan pour évaluer ses propriétés rhéologiques et sa stabilité. Pour cela, on réalise une production avec le milieu préconisé pour Sphingomonas sp par l’American Type Culture Collection (ATCC). Trois fioles de Fernbach contenant chacune 500mL de milieu de culture ont été préparées avec la composition suivante : Composition du milieu de culture Glucose : 20g/L Extrait de levure : 3g/L Peptone : 2g/L K 2 HPO 4 , 3H 2 O: 2g/L MgSO 4 : 0,1g/L Le protocole est le suivant : -Ajustement du pH à 7,2-7,4 avant stérilisation à 120°C pendant 15 minutes. -Ensemencement de chaque Fiole de Fernbach avec un cryotube de Sphingomonas sp conservé à -80°C - Puis incubation pendant 72 heures à 30°C, sous agitation orbitale en Infors à 220 rpm. La concentration en polymère produite au bout de 72 heures est de 5,4 g/kg. Exemples 1 à 4 : synthèse en bioréacteurs Les conditions d’inoculation et le milieu de préculture sont identiques à ceux décrits à l’exemple A. Les productions de Welan sont effectuées en bioréacteur pour une durée de 72h, pour évaluer les propriétés rhéologiques et la stabilité du biopolymère obtenu. Les exemples 1 à 4 permettent également d’évaluer l’influence des paramètres de synthèse. Les bioréacteurs sont équipés d’une sonde qui enregistre en continu la teneur en O 2 dissout en phase liquide. Le système d’agitation comprend un arbre d’agitation équipé en partie haute d’un module d’agitation composé d’une turbine de type Rushton et en partie basse d’une roue de type pitch-blade (pitched blade Rushton). La teneur en oxygène dissout est fixée initialement à 30% en volume. Les conditions de synthèse sont listées dans le tableau 1 ci-dessous. La composition du milieu salin est la même pour l’ensemble des exemples : Extrait levure : 3,7 g/L K 2 HPO 4 , 3H 2 O : 6,2 g/L MgSO 4 : 0,5g/L CaCl 2 : 0,6g/L FeSO4: 1,2 mg/l Réf . Souche Condition conservation de la souche Type de Fermenteur pH Point de consigne pO 2 Mobile Agitation T°C Nature du batch W09 Sphingomonas sp . Glycérol Bioréacteur agité 7 30% Rushton / Pitch Blade 30°C Glucose 30g/L / Xylose 10g/L W10 Sphingomonas sp . Glycérol Bioréacteur agité 7 30% Rushton / Pitch Blade 30°C Glucose 30g/L / Xylose 10g/L W11 (comparatif) Sphingomonas sp . Glycérol Bioréacteur agité 7 30% Rushton / Pitch Blade 30°C Glucose 30g/L / Xylose 10g/L W12 Sphingomonas sp . Glycérol Bioréacteur agité 7 30% Rushton / Pitch Blade 30°C Glucose 60g/L / Xylose 20g/L A l’issue de la synthèse, le welan peut être isolé du milieu de culture par le protocole de purification suivant : -Dans le moût, ajout de 0,2% de propionate de calcium -Ajustement du pH à 11 avec de la potasse 3N -Pesée du moût dans un flacon à centrifuger de 250Ml -Addition de 3 volumes d'isopropanol -Centrifugation à 1400rpm (soit 30000g) pendant 1 heure à 20°C -Elimination du surnageant -Procéder 3 fois ainsi (ajout d’isopropanol, centrifugation, élimination du surnageant) -Séchage 4 heures à 55°C -Pesée -La poudre obtenue est cassée grossièrement à la spatule et conservée dans un flacon à l’abri de l’humidité. Exemple 1 (comparatif, limitation en O2) : W11 : L’objectif de cet essai est d’évaluer la production avec le glucose et le xylose synthétiques en mélange 75%/25% avec des conditions d’aérations non conformes (limitation en oxygène dissout O 2 , agitation non conforme). L’agitation est maintenue à 200 rpm pendant tout l’essai. Le système d’agitation comprend un arbre d’agitation équipé en partie haute d’un module d’agitation composé d’une turbine de type Rushton et en partie basse d’un module de type pitch-blade (pitched blade Rushton). (module d’agitation de type pitch blade et rushton, voir ). Température=30°C, pH=7, pO 2 =30%, 800 mL milieu salin 100 mL Glucose à 300g/L et xylose à 100g/L soit un batch à 40g/L 100 mL d’inoculum introduit au moment de l’ensemencement Régulation du pH à 7 par une solution de soude à 3M On obtient le moût de fermentation W11. Exemple 2 (selon l’invention) W09 : L’objectif de cet essai est d’évaluer la production avec le glucose et le xylose synthétiques en mélange 75/25% dans des conditions conformes à l’invention. Les conditions opératoires et la composition du milieu sont identiques à celles de l’exemple 1, sauf l’agitation qui est effectuée par une montée progressive jusqu’à 1200 rpm pendant toute la durée de l’essai. On monte progressivement l’agitation jusqu’à 1200 rpm. Les conditions opératoires sont les suivantes : température=30°C, pH=7, pO 2 =30%, module d’agitation de type pitch blade et Rushton 800 mL milieu salin 100 mL glucose à 300g/L et xylose à 100g/L soit un batch à 40g/L 100 mL d’inoculum introduit au moment de l’ensemencement Régulation du pH à 7 par une solution de soude à 3M. On obtient le moût de fermentation W09. Exemple 3 (selon l’invention) : W10 : L’objectif de cet essai est d’évaluer la production avec le glucose et le xylose synthétiques en mélange 75/25% dans des conditions conformes à l’invention. Les conditions opératoires et la composition du milieu sont identiques à celles de l’exemple 2, sauf l’agitation qui est effectuée en deux modes successifs : 1200 rpm pendant la croissance, 600 rpm pendant la production. Ainsi, on oxygène très fort (1200 rpm) pendant la phase initiale de croissance (forte consommatrice en oxygène) puis moins fort (600 rpm) pendant la phase de synthèse du biopolymère L’agitation est effectuée à 1200rpm pendant la croissance puis à 600rpm pendant la production Température=30°C, pH=7, pO 2 =30%, module d’agitation de type Pitch blade et Rushton 800 mL milieu salin 100 mL glucose à 300g/L et xylose à 100g/L soit un batch à 40g/L 100 mL d’inoculum introduit au moment de l’ensemencement Régulation du pH à 7 par une solution de soude à 3M On obtient le moût de fermentation W10. Exemple 4 (selon l’invention) : W12 : L’objectif de cet essai est d’évaluer la production avec le glucose et le xylose synthétiques en mélange 75/25% dans des conditions conformes à l’invention, en doublant la teneur en sucres assimilables disponibles. Les conditions opératoires et la composition du milieu sont identiques à celles de l’exemple 2, sauf la concentration en sucres qui est doublée (80 g/l). On monte progressivement l’agitation jusqu’à 1200 rpm. Température=30°C, pH=7, pO2=30%, module d’agitation de type Pitch blade et Rushton 800 mL milieu salin 100 mL glucose à 600g/L et xylose à 200g/L soit un batch à 80 g/L 100 mL du Fernbach Régulation du pH à 7 par une solution de soude à 3M On obtient le moût de fermentation W12. Le suivi de la teneur en oxygène dans les moûts de fermentation W09, W10, W11 et W12 est donné sur la . Exemple 5 : Résultats en termes de productivité (g de Welan/kg de milieu de culture) Pour le moût de fermentation W11 (exemple 1), la montre que l’O2 dissout tombe à zéro dès 5h de culture, l’essai étant effectué en conditions d’oxygène limitant (agitation non conforme) ; les conditions opératoires de VVM et RPM ne permettent pas de maintenir l’oxygène dissout à 30% qui est le point de consigne fixé initialement. L’aspect du moût de fermentation reste complètement liquide :aucune synthèse de Welan n’a pu être obtenue. Pour les moûts de fermentation obtenus en fiole de Fernbach (exemple A) et en bioréacteur agité W09, W10 et W12 (exemples 2, 3, 4), les résultats en termes de productivité du biopolymère (teneurs en welan dans les moûts de fermentation en g/kg de milieu de culture, estimées par la méthode de précipitation aux solvants) sont donnés dans le tableau 2 ci-dessous. Référence du moût de fermentation Fiole de Fernbach ou bioréacteur agité Exemple A (comparatif, fiole de Fernbach) Exemple 2 (selon l’invention, bioréacteur agité,W09) Exemple 3 (selon l’invention, bioréacteur agité, W10) Exemple 4( selon l’invention, bioréacteur agité, W12) Polymère estimé (g/kg) 5,4 8 8,1 18,8 On observe qu’une agitation permettant de maintenir une teneur en oxygène dissout supérieure à 30% pendant au moins la phase de croissance du biopolymère permet d’obtenir des productivités supérieures ou égales à 8g/kg de milieu de culture. Une synthèse de Welan en bioréacteur agité conduite dès l’inoculation sans limitation en oxygène dissout, conduit en effet à des productions bien plus importantes qu’en fioles de Fernbach. La teneur en biopolymères dans le moût W12 est deux fois plus élevée que dans les synthèses : W09 et W10, ce qui montre que la quantité initiale de sucres assimilables par Sphingomonas sp . Influe également sur la quantité de biopolymère produit. Exemple 6 : Résultats en termes de propriétés rhéologiques des biopolymères obtenus La référence est constituée par le biopolymère obtenu par la synthèse en fiole de l’exemple A afin de montrer l’incidence de l’apport d’oxygène sur la viscosité du biopolymère. Dans cet essai, des mesures rhéologiques de moûts de fermentation cultivés en fermenteur (W09/W10/W12) et en fiole (exemple A) sont effectuées ( ). La procédure de mesure utilisée est une rampe décroissante de vitesses de cisaillement de 200s -1 à 0.01s -1 pour garantir l’homogénéisation du milieu et une bonne répétabilité des mesures. Pour chaque échantillon, on observe un comportement rhéofluidifiant, soit une diminution de la viscosité lorsque la vitesse de cisaillement augmente. Ces mesures ont pour objectif de vérifier la répétabilité de la rhéologie du biopolymère synthétisé selon l’invention, mais également d’évaluer le gain en viscosité du biopolymère obtenu par rapport à la culture en fiole. Avec la culture en bioréacteur (fermenteur), on constate que la viscosité du milieu est multipliée par 10. Ce gain est imputable : -à la concentration finale de Welan qui est plus forte : on passe globalement de 9 à 18g/l concernant les valeurs estimées ; -et à la masse molaire du Welan potentiellement plus élevée. Il semblerait en effet que des productions conduites avec une pression partielle en oxygène supérieure ou égale à 30% de la saturation à l’air, donnent des polymères de masses sensiblement plus élevées. Cet exemple montre que le biopolymère synthétisé selon l’invention présente, pour une même vitesse de cisaillement, une viscosité beaucoup plus importante que le biopolymère à base de Welan obtenu par une synthèse de l’art antérieur de type fiole de Fernbach. Les moûts peuvent être classés selon la viscosité croissante suivante : W09, W10, W12, l’écart entre l’échantillon W09 et W10 étant pertinent, car supérieur à 10% (erreur de la mesure sur cette gamme). Ces résultats sont cohérents avec les valeurs de concentrations en Welan, estimées dans les synthèses selon l’invention par la méthode de précipitation aux solvants. Le tableau 2 montre en effet que la teneur en biopolymères dans le moût W12 est deux fois plus élevée que dans les synthèses : W09 et W10. On peut aussi noter que la synthèse en fermenteur W12, conduite dès l’inoculation sans limitation en oxygène dissout, permet des productions bien plus importantes qu’en fioles. Exemple 7 : Evaluation des propriétés du biopolymère de type Welan obtenu Le Welan obtenu selon l’exemple 4 (W12) et purifié selon le protocole de précipitation au solvant décrit ci-dessus est préparé à une concentration de 2g/kg de solution dans une solution de NaCl à 100g/kg de solution. La présente les rhéogrammes (viscosité en fonction du taux de cisaillement) à quatre températures (30, 50, 70 et 90°C du Welan traité et préparé à 2g/kg dans une solution de NaCl à 100 g/kg). A 10 s -1 , la perte de viscosité à 100 g/kg de sels est de 18% entre 30 et 90°C La présente les rhéogrammes à trois températures (30, 50 et 70°C) du Welan traité et préparé à 2g/kg dans une solution de NaCl à 150 g/kg. A 10 s -1 , la perte de viscosité à 150 g/kg de sels est de 10% entre 30 et 70°C Les différences de viscosités des échantillons entre 30 et 90°C n’excèdent jamais 40%. Quel que soit l'échantillon de Welan, la température ne semble pas impacter fortement sa viscosité aux différents cisaillements testés. Il semble aussi que la température ait moins d’effets aux fortes salinités, ce qui est une propriété attendue pour l’utilisation de ce biopolymère en conditions HT/HS. Pour résumer, aux faibles taux de cisaillement (conditions de balayage du réservoir) et aux fortes salinités, le Welan préparé à 2g/kg développe entre 70 et 90°C, une viscosité comprise entre 10 et 30 mPa.s. Il apparaît donc que le Welan ainsi préparé est peu sensible aux sels, on observe entre 10 et 20% de perte de viscosité pour les salinités testées, l’attente pour des applications en récupération assistée de pétrole en réservoirs chauds et salins étant de ne pas chuter de plus de 30% en viscosité. Exemple 8 : Comparaison des propriétés rhéologiques du Welan obtenu selon le procédé selon l’invention avec un polymère EOR de type HPAM et un polymère EOR de type Xanthane Les trois polymères sont préparés à 2g/kg dans une solution saline ayant une concentration de 25 et 50 g/kg de sels (NaCl). Entre 1 et 10 s-1, valeurs de cisaillement cohérentes avec les conditions de balayage au sein des réservoirs, la viscosité développée à 30°C par le Welan est 3 à 4 fois plus forte que celle du HPAM 3630S, mais 10 fois plus faible que celle du xanthane de référence. Les essais menés à des températures de 50°C et 70°C donnent les mêmes résultats (voir la qui présente le rhéogramme à 70°C). On note aussi un caractère rhéofluidifiant plus marqué pour le xanthane que pour le Welan. La présente les rhéogrammes à 70°C des différents polymères (Xanthane, Welan et HPAM3630S) préparés à 2g/kg entre 25 et 50 g/kg de sels. Cet exemple montre que pour des températures de 30°C, 50°C et 70°C : - la viscosité développée par le Welan est au niveau de celle du HPAM (même meilleure pour des cisaillements faibles et inférieurs à 10sec-1). -le Welan présente un comportement rhéofluidifiant plus marqué que celui du HPAM - Le xanthane est plus sensible au cisaillement que le Welan obtenu selon l’invention et l'HPAM, bien qu’il développe une plus grande viscosité à faibles taux de cisaillement. Le comportement du Welan se rapproche donc de celui du HPAM avec une faible variation de viscosité en fonction du taux de cisaillement. Si le comportement du HPAM est pris en référence vu son utilisation très fréquente en EOR, le Welan se positionne bien avec notamment une viscosité plus élevée à un faible taux de cisaillement. Les exemples 6 à 8 relatifs aux propriétés rhéologiques du biopolymère Welan purifié selon la méthode de précipitation aux solvants montrent que le Welan obtenu selon le procédé de l’invention a des propriétés viscosifiantes et un comportement rhéofluidifiant proches de ceux d’un polymère de type HPAM quand il est soumis à différentes vitesses de cisaillement (1 à 500 sec -1 ). A 90°C et en présence de 100 g/kg de sels, la cible en viscosité fixée à 10 Cp est atteinte pour des solutions aqueuses de Welan, préparées à 2g/kg. Les résultats montrent par ailleurs un maintien de la viscosité du Welan à de hautes températures et une bonne stabilité aux sels. Méthode de production de Welan comprenant la culture en bioréacteur agité d’une souche de Sphingomonas sp dans un milieu de culture en conditions aérobies sous pression partielle en oxygène supérieure à 30% de la saturation à l’air, par fermentation d’au moins un sucre en C5/C6, la synthèse étant conduite sous un v olume d’air injecté par v olume de m ilieu et par minute (VVM) compris entre 0,5 et 2, sous agitation comprise entre 500 et 1800 rotations par minutes (RPM), pendant une durée comprise entre 40 et 140 heures de préférence entre 48 et 120 heures, de manière très préférée entre 60 et 96 heures, de manière encore plus préférée entre 68 et 76 heures afin d’obtenir un biopolymère constitué de Welan. Méthode de production de Welan selon la revendication 1 dans laquelle la fermentation comprend une phase de croissance de la souche et une phase de production dudit biopolymère, dans laquelle l’agitation est fixée à une valeur de RPM V1 pendant la phase de croissance et est fixée à une valeur de RPM V2 pendant la phase de production, V1 étant supérieure à V2. Méthode de production de Welan selon la revendication 1 dans laquelle l’agitation est montée progressivement à une valeur V1 qui reste ensuite constante pendant toute la durée de la fermentation. Méthode de production de Welan selon l’une des revendications précédentes dans laquelle l’agitation dans ledit bioréacteur est effectuée au moyen d’une turbine à écoulement radial de type Rushton et/ou d’une turbine centripète de type Rayneri . Méthode de production de Welan selon la revendication 4 dans laquelle l’agitation dans ledit bioréacteur est effectuée au moyen d’un arbre d’agitation muni dans sa partie haute d’une turbine de type Rushton et dans sa partie basse d’une roue à pales inclinées. Méthode de production de Welan selon la revendication 4 dans laquelle l’agitation dans ledit bioréacteur est effectuée au moyen d’un arbre d’agitation muni d’une turbine centripète de type Rayneri, l’axe de l’arbre d’agitation étant excentré par rapport à l’axe dudit bioréacteur. 7. Méthode selon l’une des revendications 1 à 6 dans laquelle le biopolymère constitué de Welan est isolé du milieu de culture par : a)précipitation dans un solvant organique introduit en excès volumique b)centrifugation, c)élimination du surnageant, ces trois étapes pouvant être répétées une ou plusieurs fois, et d) séchage à une température comprise entre 30 et 120°C jusqu’à poids constant. 8. Méthode selon la revendication 7 dans laquelle ledit solvant organique est choisi parmi l’isopropanol et l’éthanol, de préférence l’isopropanol. 9. Méthode selon la revendication 1 à 8 où ladite souche est capable de produire au moins 8 grammes de welan par kg de milieu de culture. 10. Méthode selon l’une des revendications 1 à 9 dans laquelle le milieu de culture contient des sucres naturels ou synthétiques en C5/C6, de préférence du glucose, de manière très préférée un mélange de glucose et de xylose. 1Méthode selon la revendication 10 dans laquelle le milieu de culture est majoritairement composé d’hydrolysats de biomasse lignocellulosique riches en sucres C5/C6. 12. Méthode selon l’une des revendications 1 à 11 dans lequel le milieu de culture comprend au moins un composé surfactant choisi parmi l e glycérol, les solvants polaires tels que le diméthylsulfoxyde (DMSO) et les esters de sorbitane éthoxylés, de préférence le glycérol. 3Biopolymère à base de welan produit selon la méthode selon l’une des revendications précédentes de viscosité supérieure à 10 cP. 14. Utilisation du biopolymère à base de Welan produit selon la méthode selon l’une des revendications 1 à 12 ou du biopolymère à base de Welan selon la revendication 13 pour la récupération assistée de pétrole. 15. Utilisation du biopolymère à base de Welan selon la revendication 14 pour la récupération assistée de pétrole dans des réservoirs à haute température et haute salinité, la température étant comprise entre 70 et 120°C et la concentration en sels étant comprise entre 100 et 150 g/l.