Brevet FR3121058A1 — publié le 20220930

L’invention se rapporte au domaine des nanoparticules métalliques préparées à partir d’extrait de plantes. Plus particulièrement, l’invention concerne un procédé écologique de synthèse de nanoparticules d’argent biocompatibles et stables à partir d’un extrait de Hubertia ambavilla . L’invention concerne également la nanoparticule d’argent obtenue et ses utilisations en tant qu’agent antioxydant, antimicrobien et anticancéreux. PROCEDE ECOLOGIQUE DE PREPARATION DE NANOPARTICULES D’ARGENT A PARTIR D’UN EXTRAIT DE HUBERTIA AMBAVILLA ET LEURS UTILISATIONS L’invention se rapporte au domaine des nanoparticules métalliques préparées à partir d’extrait de plantes. Plus particulièrement, l’invention concerne un procédé écologique de synthèse de nanoparticules d’argent biocompatibles et stables à partir d’un extrait de Hubertia ambavilla . L’invention concerne également la nanoparticule d’argent obtenue et ses utilisations en tant qu’agent antioxydant, antimicrobien et anticancéreux. Domaine de l’invention Les nanoparticules (NPs) de métaux nobles comme l'argent, l'or, le fer et le cuivre suscitent un grand intérêt de la part de la communauté scientifique en raison de leur petite taille et de leur grande surface, qui leur confèrent des propriétés physiques et chimiques distinctes. Par conséquent, les nanoparticules ont diverses applications allant de l'électronique, des capteurs, de la catalyse et de la biotechnologie à la médecine. Parmi ces diverses nanoparticules de métaux nobles, les nanoparticules d'argent (AgNPs) montrent des applications potentielles dans divers domaines tels que le biomédical, la catalyse, l'optique et l'électronique en raison de leur bonne conductivité électrique, de leur stabilité, de leurs propriétés optiques et de leur activité antimicrobienne. Depuis l'Antiquité, l'argent est le principal métal utilisé comme agent antibactérien en médecine, notamment pour réduire les infections lors du traitement des brûlures et pour empêcher la colonisation des bactéries sur les matériaux dentaires. L'argent présente une activité potentielle contre les organismes résistants aux antibiotiques, ce qui constitue l'une des principales préoccupations en matière de santé publique. Actuellement, l'argent métallique a été remplacé par des nanoparticules d'argent (AgNPs) et fait partie des nanomatériaux les plus commercialisés. Les AgNPs ont été largement intégrées dans de nombreux produits tels que les filtres à eau domestiques, les vêtements, les cosmétiques, les sprays et détergents antibactériens, les planches à découper, les chaussettes, les chaussures, les téléphones portables, les claviers d'ordinateurs portables et les jouets pour enfants. En outre, plusieurs études réalisées au cours des dernières années ont prouvé le potentiel des AgNPs en tant qu'agent antimicrobien important, permettant de combattre diverses maladies infectieuses et pouvant être utilisé comme une nouvelle nanomédecine. Les applications des AgNPs ont également été étendues au traitement du cancer. Plusieurs études in vitro utilisant des AgNPs ont démontré leur potentiel en tant qu'agents anticancéreux efficaces vis-à-vis de différents types de cellules cancéreuses. Les performances et l'applicabilité des AgNPs dépendent essentiellement de leur taille, de leur forme, de leur composition et de leur chimie de surface. Diverses techniques chimiques et physiques ont été rapportées pour la synthèse des AgNPs : réduction au borohydrure de sodium, rayonnement γ, irradiation UV, réduction photochimique, irradiation par micro-ondes, réduction électrochimique, etc. La réduction chimique est la méthode la plus populaire pour synthétiser des NP métalliques bien définies. Bien que cette méthode offre des avantages significatifs en termes d'équipement simple et d'opération pratique, elle implique l'utilisation de produits chimiques toxiques et dangereux, qui peuvent présenter des risques environnementaux et biologiques potentiels. La synthèse verte est une approche alternative pour synthétiser des nanoparticules (NPs) en utilisant des ressources naturelles telles que des micro-organismes et des plantes médicinales comme agents réducteurs. La synthèse de nanoparticules à l'aide d'extraits de plantes brutes pourrait être une stratégie attrayante dans le domaine de la nanotechnologie, car elle offre plusieurs avantages tels que la rentabilité, l'écologie, la synthèse rapide avec un rendement élevé, une toxicité moindre et une utilisation sûre pour diverses applications thérapeutiques. Toutefois, le développement de nouvelles méthodes écologiques pour la production de nanoparticules bien caractérisées avec des bioactivités potentielles reste encore un défi scientifique. Les inventeurs ont mis au point un nouveau procédé de synthèse écologique de nanoparticules d’argent biocompatibles et stables aux propriétés intéressantes. Ainsi l’invention concerne un procédé de synthèse de nanoparticules d’argent stables comprenant le mélange d’une solution aqueuse d’au moins un sel d’argent et d’un extrait de H. ambavilla riche en flavonoïdes dans un ratio massique compris entre 0,5 et 10%. L’invention concerne également les nanoparticules d’argent comprenant un extrait H. ambavilla . Enfin, l’invention concerne l’utilisation de ces nanoparticules d’argent en tant qu’agent antioxydant, antimicrobien et anticancéreux applicable dans le domaine médical, cosmétique, agroalimentaire, et de la formulation en général. Avantages de l’invention Le procédé de synthèse objet de l’invention est tout d’abord avantageux du fait de sa simplicité de mise en œuvre. Il repose sur un mélange de sel d’argent avec un extrait riche ne flavonoïdes de H. ambavilla dans l’eau, sans ajout de solvant toxique. Il peut être réalisé à température ambiante. Il est rapide puisque les NPAg sont obtenues en moins de 3h. Il répond aux critères de la chimie verte et est de fait écologique. Ce procédé constitue une alternative aux méthodes de réduction chimique conventionnelles. En particulier, les inventeurs ont déterminé le ratio massique entre l’extrait de plante et le sel d’argent permettait d’obtenir des NPAg aux propriétés intéressantes. Elles sont notamment stables et biocompatibles. Les NPAg obtenues présentent, en effet, des propriétés antioxydantes, antimicrobiennes et anticancéreuses très intéressantes. Elles ont été caractérisées en utilisant la spectroscopie UV-Visible, TEM, EDX, XRD, et FTIR. Leurs propriétés sont liées à la fois à la nature de la NP (argent) et aux propriétés conférées par l’extrait de Hubertia ambavilla. Cette plante est traditionnellement utilisée dans l'Océan Indien comme tisane pour ses vertus médicinales pour renforcer la circulation, traiter le diabète, l'eczéma, les plaies, le lichen tropique, les rhumatismes, les démangeaisons, l'asthme et les ulcères. Les études phytochimiques ont révélé la présence de flavonoïdes, de tanins, de leucoanthocyanes, de phénols, etc. L'extrait méthanolique des feuilles et des tiges a montré des activités antioxydantes et de piégeage des radicaux. Grâce au procédé selon l’invention, les NPAg permettent de valoriser certaines de ces propriétés. DESCRIPTION DES FIGURES : Spectres d'absorption UV-Vis des nanoparticules d'argent formées après un temps de réaction allant de 10 min à 24h. En insert le spectre d'absorption UV-vis de l'extrait de H. ambavilla . : Suivi cinétique et colorimétrique de la formation des AgNPs pendant 24 h en mesurant l’absorbance à la longueur d’onde 439 nm. : (A, B) Images de microscopie électronique à transmission à différents grossissements (C) Distribution de la taille des particules d'AgNPs après centrifugation déterminée par TEM et (D) Spectre EDS et composition chimique (tableau) des AgNPs synthétisées. : Diffusion dynamique de la lumière (DLS) (A) et mesure du potentiel zêta (B) des AgNPs. : Diffractogramme DRX des AgNPs synthétisées à partir de l'extrait aqueux de H. ambavilla . : Spectre infrarouge à transformée de Fourier des AgNPs biosynthétisées (a) et de l'extrait de Hubertia ambavilla (b). : Effet des AgNPs sur la morphologie et la viabilité des cellules MDA-MB-231 et MIA PaCa-2. (A) Examen au microscope optique des cellules après traitement avec 0, 35µg/mL d'extrait de Hubertia ambavilla ou 20 µg/mL d'AgNPs pendant 24h. Les photographies présentées sont représentatives d'au moins trois champs de vision par échantillon, et de trois échantillons indépendants. Les cellules ont été traitées avec différentes concentrations d'extrait de Hubertia ambavilla (B) ou d'AgNPs (C) pendant 24 h, puis la viabilité cellulaire a été déterminée par le test MTT. Les données sont indiquées en tant que moyenne ± SD de trois expériences indépendantes (P : (A) Antibiogrammes des AgNPs contre E. coli et S. salivarius en présence de différentes concentrations de nanoparticules d'argent : 0,02, 0,04, 0,07, 0,15, 0,3, 0,6, 1,2, 2,4 mg/mL, p/s est pénicilline/streptomycine et W est l'eau. (B) Culture de nuit de 1. 106 bactéries de E.coli et S. salivarius avec ou sans pénicilline/streptomycine, extrait de H. ambavilla ou AgNPs montrant le changement de turbidité. (C) Culture de nuit sur une plaque d'agar de la culture précédente montrée dans (B) afin de compter les CFUs. Toutes les images de cette figure sont représentatives de 3 expériences différentes. : Pourcentage d'inhibition des radicaux (DPPH et ABTS) en présence de différentes concentrations de tous les échantillons (n=3). EXEMPLES EXEMPLE 1 : Matériels et méthodes pour la préparation et la caractérisation des NP d’argent Matériaux : Tous les produits chimiques utilisés dans l'étude, y compris les solvants, sont de qualité analytique. Nitrate d'argent (AgNO3), 1,1-diphényl-2-picryl-hydrazyl (DPPH), bromure de [3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium] (MTT), 2,4,6-Tris(2-pyridyl)-s-triazine (TPTZ), chlorure de fer(III) hexahydraté (FeCl3.6H2O), le peroxodisulfate de potassium (K2S2O8), le sel de diammonium de l'acide 2,2′-Azino-bis(3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique) (ABTS) et le Trolox (acide 6-hydroxy-2, 5, 7, 8-tétraméthylchroman-2-carboxylique) ont été achetés chez Sigma-Aldrich Chemicals. Le nitrate d’argent (AgNO 3 ) sous forme solide provient de Sigma-Aldrich (numéro CAS 7761-88-8) qualifié de réactif A.C.S et de pourcentage de pureté ≥99%. Les plantes séchées Hubertia ambavilla ont été achetées au CAHEB, Ile de la Réunion. La partie aérienne séchée à l'air a été extraite avec de l'eau ultrapure (H 2 O MilliQ) en utilisant un extracteur de solvant accéléré de type ASE 300. La souche Escherichia coli DH5a a été achetée chez Invitrogen (18265-017) et la souche Streptococcus salivarius a été aimablement donnée par le Dr Bergsten. Le milieu Dulbecco's modified eagle (DMEM) et le sérum bovin fœtal (FBS) ont été obtenus auprès de Gibco. L'eau utilisée dans les expériences a été purifiée par un système Thermo Scientific Easypure II (18,2 MΩcm ; Thermo Scientific Corp., Logan, UT, USA). Synthèse des nanoparticules d'argent : La synthèse des nanoparticules d'argent a été réalisée en mélangeant 20 mL de AgNO3 2 mM avec 5 mL d'extrait aqueux de H. ambavilla (34 mg) sous agitation dans l'obscurité à température ambiante. La couleur de la solution est passée du jaune clair à l'orange en 10 min, indiquant la formation de AgNPs. Après une incubation de 24 h dans l'obscurité pour éviter toute autre réaction de photooxydation, le mélange réactionnel a été centrifugé à 9 000 rpm pendant 15 min à l'aide d'une centrifugeuse à grande vitesse. Le surnageant a été jeté, et le culot a été lavé trois fois avec de l'eau ultra-purifiée pour éliminer tout extrait végétal indésirable et non fixé. Caractérisation des nanoparticules d'argent : La bioréduction des ions Ag+ a été suivie par échantillonnage périodique en mesurant les spectres d'absorption de la solution réactionnelle à l'aide d'un spectrophotomètre UV-VIS (Perkin Elmer Lambda UV/Vis 950). Les mesures ont été effectuées dans la gamme spectrale 300-800 nm. La couleur de la solution réactionnelle a également été enregistrée à intervalle de temps régulier. La morphologie des AgNPs a été caractérisée par des images de microscopie électronique à transmission (MET) acquises sur un microscope FEI Technai Osiris FEI équipé d'un dispositif EDX à 200 kV. Pour réaliser l'analyse MET, une goutte de 3µl de solution d'AgNPs préalablement traitée pendant 5 min dans un bain à ultrasons a été déposée sur une grille de cuivre recouverte de carbone. L'échantillon a été laissé sécher pendant 30 minutes à l'air ambiant. Le logiciel ImageJ a été utilisé pour déterminer le rendement des nanoparticules. La distribution de taille des particules hydrodynamiques et le potentiel zêta ont été mesurés sur un Zetasizer NanoZSP (Malvern Instruments). Les mesures ont été réalisées à 25°C. L'analyse par diffraction des rayons X (DRX) a été réalisée dans des capillaires avec le diffractomètre à rayons X Rigaku MM007HF utilisant une anode tournante en molybdène (λ = 0,70926 Å) à 17,5 KeV et un détecteur à plaque d'imagerie RAXIS4++ . Le balayage a été effectué dans la région de 10º-40º. La présence du revêtement des particules à la surface a été vérifiée par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (IRTF) à l'aide d'un Thermo Scientific Nicolet 380 FTIR. Les échantillons ont été analysés sous forme de pastilles de KBr. Stabilité de la suspension d'AgNP : La stabilité de la suspension d'AgNP stockée à 4°C pendant plus de trois mois a été évaluée sur la base des changements dans les spectres d'absorption de la solution d'AgNP. Une diminution significative de l'absorbance reflète l'instabilité des nanoparticules. Évaluation de la cytotoxicité des AgNPs synthétisés Origine de la lignée cellulaire tumorale - Culture cellulaire Deux lignées cellulaires ont été utilisées : La lignée cellulaire MIA PaCa-2 dérivée de l'explant chirurgical d'un carcinome du pancréas provenant d'un homme caucasien de 65 ans et la lignée cellulaire de cancer du sein MDA-MB-231 dérivée de l'explant chirurgical d'un mélanome malin provenant d'une femme caucasienne de 51 ans. Les lignées cellulaires ont été achetées auprès de l'ATCC (ATCC® CRL-1420TM et HTB-72TM) et cultivées dans du DMEM complété par 10 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur, 2 mM L-glutamine, 20 mM pyruvate de sodium, 50 U/mL de pénicilline et 50 µg/mL de streptomycine. Les lignées cellulaires ont été maintenues à 37°C dans une atmosphère humidifiée à 5% de CO2 et 95% d'air. Cytotoxicité L'activité anticancéreuse a été évaluée par un test colorimétrique au MTT (bromure de 3-[4, 5-diméthylthiazole-2-y]-2,5-diphényltétrazolium). Les cellules ont été ensemencées dans 96 plaques à puits à fond plat à une densité de 1 × 104. Après avoir été traitées avec différentes concentrations (436,5 - 13,7 μg mL -1 ) d'AgNPs, les cellules ont été incubées pendant 24 h à 37 °C avec 5 % de CO 2 . Ensuite, les cellules ont été lavées deux fois avec du DMEM pour éliminer les cellules mortes. Ensuite, 200 μL de MTT (5 mg mL -1 ) ont été ajoutés aux cellules incubées et les cellules ont encore été incubées pendant 4 h supplémentaires dans les mêmes conditions. Enfin, les cristaux de formazan ont été dissous dans 200 μL de DMSO et l'absorbance a été mesurée à 570 nm. L'absorbance des cellules non traitées a été utilisée comme contrôle et toute l'expérience a été réalisée en triplicatas. L'interférence des particules a été corrigée en soustrayant l'absorbance des particules à 570 nm. La viabilité cellulaire a été calculée à l'aide de l'équation suivante : Viabilité (%) = [(As - Ap)/Ac] ×100. Dans laquelle As est l'absorbance de l'échantillon, Ap est l'absorbance des nanoparticules, et Ac est la valeur d'absorbance du contrôle. Activité antimicrobienne des AgNPs : L'activité antibactérienne des AgNPs a été évaluée par la technique de diffusion des disques de Kirby-Bauer contre deux souches bactériennes différentes, à savoir Escherichia coli et Streptococcus salivarius . Des disques de papier filtre Whatman stériles de 6 mm de diamètre ont été chargés avec 15µL de l'échantillon et placés sur des plaques de gélose nutritive inoculées avec des cultures bactériennes. Les plaques ont ensuite été incubées à 37°C pendant 24 h et la zone d'inhibition a été mesurée. L'antibiotique streptomycine/pénicilline a été utilisé comme contrôle positif dans ce test. Les solutions de nanoparticules d'argent ont été utilisées sous la forme dans laquelle elles avaient été préparées. La concentration minimale inhibitrice (CMI) et la concentration minimale bactéricide (CMB) des AgNPs ont été évaluées en suivant un protocole standard : 1.10 6 bactéries ont été cultivées pendant la nuit dans 1mL de milieu avec différentes concentrations d'AgNPs. Ensuite, les bactéries ont été placées sur une plaque de gélose pour une incubation d'une nuit à 37°C afin de compter les unités formatrices de colonies (UFC). La pénicilline/streptomycine a été utilisée comme contrôle. Activité antioxydante des AgNPs Essai de piégeage du radical libre DPPH Le pourcentage de l'activité antioxydante a été évalué par le test des radicaux libres DPPH. Un aliquot de 20 µL des différentes concentrations de l'extrait aqueux de H. ambavilla et des AgNPs (500, 250, 125, 62,5, 31,25 et 15,62 µg/mL) dans l'eau a été ajouté à 180 µL de 0,254 mM DPPH dans une solution de méthanol et maintenue dans l'obscurité pendant 30 min à température ambiante. L'absorbance a été mesurée à 517 nm contre un blanc de 20 µL de DPPH dans 180 µL de méthanol. Chaque mesure a été effectuée en triplicata et l'activité de piégeage des radicaux libres DPPH a été calculée à l'aide de l'équation suivante. Effet de piégeage du DPPH (%) = [(A0 - At)/A0] × 100, A0 est l'absorbance du contrôle et At est l'absorbance de l'échantillon. Test de piégeage de l'ABTS La procédure suivie pour le dosage de l'ABTS est la méthode de Payet et al. avec quelques modifications. Une solution d'ABTS dissoute dans de l'eau désionisée à une concentration de 7 mM a été ajoutée en quantités égales à une solution de persulfate de potassium dissoute à une concentration finale de 2,45 mM. La solution de travail a été conservée dans l'obscurité à température ambiante pendant 12 à 16 h. La solution a ensuite été diluée en mélangeant 1 mL de solution d'ABTS avec 45 mL de méthanol pour obtenir une absorbance de 0,7 ± 0,02 unité à 734 nm à l'aide d'un spectrophotomètre TECAN. Une aliquote de 20 µL de différentes concentrations d'extrait aqueux de plantes et de AgNPs (15,62 à 500 µg/mL) a été laissée réagir avec 280 µL de la solution ABTS et l'absorbance a été mesurée à 734 nm après 5 minutes d'incubation à 30 °C. L'activité de piégeage de l'ABTS a été comparée à celle de Trolox et le pourcentage d'inhibition a été calculé comme suit : IP (%) = (1- Abs sample /Abs control )x 100, où Abs sample est l'absorbance de la solution de radicaux ABTS mélangée à l'extrait d'échantillon/AgNPs/standard ; Abs control est l'absorbance du radical ABTS dans le méthanol. Toutes les déterminations ont été effectuées en triplicata. Pouvoir antioxydant réducteur ferrique (FRAP) : Le test FRAP a été réalisé selon la méthode de Benzie et Strain. Une solution tampon (3,1 g d'acétate de sodium trihydraté et 16 mL d'acide acétique sont dilués dans un litre d'eau purifiée), une solution 10 mM de TPTZ dans 40 mM d'acide chlorhydrique, et une solution à 20 mM de fer III (FeCl 3 . 6H 2 O) ont été mélangées selon les rapports respectifs 10 : 1 : 1. Cette solution de réactif FRAP (solution de travail) a été incubée à 37°C avant utilisation. 10 μL de solution à tester ou de solvant ont été placés dans chaque puits, puis un volume de 290 μL de solution FRAP préchauffée à 37 ° C a été ajouté à cela. Le mélange réactionnel a été incubé à 37°C dans le lecteur de microplaques pendant 4 min. La lecture de l'absorbance a été effectuée à 593 nm. La courbe standard était linéaire (y = 0,5202x + 0,164 ; R2= 0,9956) entre 0,225 et 3,597 mM de solution de Fe (II). Les résultats ont été exprimés en équivalent millimolaire de Fe (II) par milligramme d'extrait (mM Fe (II) /mg d'extrait). Toutes les déterminations ont été effectuées en triplicata (n=3). Préparation des nanoparticules d’or creuses : La synthèse des nanoparticules d'or creuses (HAuNP) est basée sur une réaction de remplacement galvanique. Cette méthode polyvalente consiste à utiliser des nanoparticules métalliques comme gabarits sacrificiels. Cela se produit spontanément en solution lorsqu'un ion métallique rencontre une nanoparticule composée d'un atome de métal zérovalent ayant un potentiel redox inférieur, ce qui entraîne un échange d'électrons. Les atomes métalliques sont oxydés et dissous en solution tandis que les ions métalliques sont réduits à la surface du gabarit. De cette façon, le potentiel standard de AuCl - 4 /Au (0,99 V) étant supérieur à celui du couple Ag+/Ag (0,80 V), les nanoparticules d'argent en solution peuvent être oxydées par le sel l'or chlorourique selon la réaction suivante : 3 Ag(s)+ AuCl - 4 (aq)→ Au(s)+3 Ag + (aq)+4 Cl - (aq) L'or métallique formé est confiné près de la surface du gabarit et se dépose à la surface des nanoparticules d'argent. Une fine couche d'or incomplète se forme alors, et par conséquent, le trou reste le seul site de réaction et de diffusion des espèces formées. À mesure que le HAuCl4 se réduit, l'intérieur de la particule se vide progressivement, ce qui forme les HAuNPs. EXEMPLE 2 : Synthèse et caractérisation des nanoparticules d'argent Des nanoparticules d'argent ont été préparées par la réduction de Ag + en Ag 0 via les molécules actives présentes dans l'extrait aqueux de H. ambavilla . La synthèse de nanoparticules d'argent consiste en une réaction d'oxydoréduction de sels d'argent par l'utilisation d'agents bioréducteurs comme cela a été étudié dans d'autres synthèses de nanoparticules métalliques. Elle est généralement favorisée par la présence d'hydrates de carbone, de protéines ou de flavonoïdes dans les extraits de plantes ou même produite par des enzymes et des coenzymes dans les bactéries ou les champignons. Cette ressource biologique permet l'électro-donation entre l' Ag + et l'agent bioréducteur : déshydrogénation à partir de fonctions organiques telles que l'acide carboxylique, l'hydroxyle, ou par la conversion cétonique en énol. La couleur du mélange réactionnel a commencé à changer en orange jaunâtre au bout de 10 minutes et en brun rougeâtre après 1 heure, indiquant la génération de nanoparticules d'argent. Cette couleur est attribuée à la résonance plasmonique de surface dans les nanoparticules métalliques due à la vibration combinée des électrons libres en résonance avec l'onde lumineuse, induisant un spectre d'absorption optique. Après confirmation visuelle en détectant un changement de couleur dans les AgNPs de synthèse, les échantillons ont été exposés à l'analyse spectrale. Les spectres UV-VIS du mélange réactionnel ont été enregistrés pendant 24 h à différents intervalles de temps. Comme le montre la , une bande SPR caractéristique et bien définie pour les nanoparticules d'argent a été obtenue à environ 439 nm. Les transitions électroniques de l'Ag (0) métallique apparaissent à environ 330 nm. L'échantillon contrôlé H. ambavilla seul n'a pas une couleur brun rougeâtre et n'a montré aucun pic à cette longueur d'onde ( ). Les résultats ont montré que les étapes de réduction étaient corrélées avec l'apparition de la bande à 439 nm. L'intensité de la couleur brune était directement proportionnelle au temps d'incubation du mélange réactionnel ( ). Le taux de réduction des ions argent a été lent pendant la première heure, comme l'indiquent les faibles valeurs d'absorbance à la longueur d'onde. La synthèse verte de nanoparticules d'argent par des extraits végétaux a été précédemment réalisée en quelques minutes à température ambiante, selon la nature de l'extrait végétal. Nous avons procédé à d'autres étapes séquentielles de centrifugation pour réduire la concentration de la matrice organique libre et obtenir des nanoparticules individuelles. Les spectres UV-Vis des AgNPs après la centrifugation montrent une grande diminution de l'intensité de la bande de l'extrait végétal à 330 nm, ce qui révèle que le processus de centrifugation est efficace pour séparer les NPs de la matrice organique sans les déstabiliser (données non montrées). Le DLS et la MET ont été utilisés pour évaluer la taille des particules et la morphologie de surface des AgNPs. L'image MET de la montre que les particules étaient monodispersées et principalement sphériques et la couche de recouvrement organique autour d'elles est clairement distincte. La -B montre la morphologie des nanoparticules et l'épaisseur de la couche organique bien définie. Comme on peut l'observer, la nanoparticule a une structure cristalline avec de multiples face des plans (111) caractéristiques de la structure cubique à faces centrées (CFC) de l'argent avec une distance d'espacement d d'environ 0,24 nm, ce qui est en bon accord avec la référence de la structure CFC de la carte n° 04-0783 du Joint Committee of Powder Diffraction Standard (JCPDS). Pour obtenir les distributions de taille des nanoparticules d'argent, environ 100 particules ont été comptées puis converties en histogrammes. La courbe de distribution de taille ( -C) montre que les particules se situent dans la gamme 10-20 nm avec un diamètre moyen de 15 nm. La taille moyenne des particules a été confirmée par la méthode DLS, et elle s'est avérée être de 73,4 nm comme le révèle le graphique de distribution de taille ( ). Le PDI a été trouvé à 0,249, ce qui est inférieur à 0,7, indiquant des particules monodispersées en taille [50]. La différence de taille des particules observée par DLS par rapport à MET est due au fait que la taille mesurée inclut également les composés bio-organiques et une couche de solvant attachée à la surface de la particule lorsqu'elle se déplace sous l'influence du mouvement brownien. Cette synthèse verte de nanoparticules d'argent repose principalement sur une réaction d’oxydoréduction chimique impliquant un oxydant et un agent bioréducteur, comme cela a été étudié dans la synthèse verte de nanoparticules d'or. Les constituants élémentaires des AgNPs ont été examinés par spectroscopie de rayons X à dispersion d'énergie (EDS). Comme le montre la -D, la présence d'argent élémentaire dans les nanoparticules a été prouvée par un fort pic d'absorption situé à 3 keV. La présence de C et de O suggère que les AgNPs ont été recouvertes avec succès par des molécules organiques provenant de phytocomposés. Une partie du signal fort du carbone et du cuivre provient de la grille de cuivre recouverte de carbone utilisée pour la préparation de l'échantillon. La montre que le diffractogramme DRX révèle la présence de pics intenses à des valeurs 2q de 17,27°, 19,96°, 28,41°, 33,41° et 34,94° représentant respectivement les angles de diffraction des plans (111), (200), (220), (311) et (220) de la structure de réseau cubique à faces centrées de l'argent. Ces angles de diffraction et les valeurs des distances inter-réticulaires (d) des pics ont été comparés avec la carte de diffraction des poudres standard du Joint Committee on Powder Diffraction Standards (JCPDS) File No. : 04-0783 correspondant à l'argent et semblent cohérentes ; voir les données du Tableau 1 ci-dessous. P.No h k l AgNPs synthétisées à partir de l'extrait aqueux de H. ambavilla Standard JCPDS Argent : 04-0783 Angle de diffraction expérimental distance interréticulaire d (Ȧ) distance interréticulaire d (Ȧ) 1 111 17,27 2,3625 2,3590 2 200 19,96 2,0463 2,0440 3 220 28,41 1,4450 1,4450 4 311 33,41 1,2339 1,2310 5 222 34,94 1,1814 1,1796 Tableau 1 . Comparaison des distances interréticulaires à partir des données de diffraction de l'argent standard (JCPDS file no. 04-0783) avec les valeurs calculées et observées expérimentalement à partir du diffractogramme DRX. Le potentiel zêta des nanoparticules est utilisé pour caractériser la charge de surface des nanoparticules. Le potentiel zêta des AgNPs synthétisées a été trouvé comme un pic net à -33.1 mV ( -B). Ce potentiel zêta négatif reflète la charge de surface des AgNPs chargées négativement après avoir été fonctionnalisées avec les composés de l'extrait appartient à la répulsion entre les particules et prouve qu'elles sont très stables en raison de la couverture des constituants polyphénoliques présents dans l'extrait de la plante. De plus, la nature complexe des extraits de plantes est attribuée à l'énorme variété de composés chimiques, mais seuls certains composés phytochimiques sont impliqués dans cette réduction. Chaque plante possède un spectre unique de composés phytochimiques qui agissent comme agents réducteurs. Le mécanisme exact impliqué dans chaque plante varie en fonction de la substance phytochimique impliquée. Les spectres IR aident à prédire la présence de biomolécules possibles qui sont impliquées dans la réduction et la stabilisation des AgNPs. L'identification des groupes fonctionnels liés à la surface illustre les agents de stabilisation et de réduction impliqués dans la synthèse des AgNPs. Le spectre des AgNPs de la est similaire aux pics IR des extraits de plantes utilisés pour leur synthèse. Ceci est une preuve solide que les composés présents dans les extraits ont non seulement participé à la réduction des ions argent, mais ont également été adsorbés sur la surface des nanoparticules produites. Les bandes à 3420 cm -1 dans les spectres étaient responsables des vibrations d'étirement O-H indiquant la présence d'alcool et de phénol. Les bandes à 2922 et 2852 cm -1 pourraient être attribuées aux vibrations d'étirement des groupes fonctionnels -CH 2 et -CH 3 . La bande à 1738 cm -1 (décalée à 1727 cm -1 dans les AgNPs) a été attribuée à la vibration d'étirement C-C et la bande C=O à 1669 cm -1 , provenant de l'acide carboxylique. La bande à 1626 cm -1 dans l'extrait végétal correspond à l'étirement C-N et C-C des vibrations de l'amide I et cette bande a été décalée à 1622 cm -1 dans les AgNPs à cause des protéines qui se sont probablement liées aux AgNPs par les groupes amines. La bande à 1515 cm -1 correspond aux vibrations d'étirement C=C des cycles aromatiques, tous provenant de métabolites végétaux. La bande à 1274 cm -1 correspond à l'étirement C-N des amines présentes dans l'extrait et déplacées à 1267 cm -1 dans les AgNPs. Les bandes à 1027 cm -1 et 1070 cm -1 sont associées à l'étirement C-O de l'alcool, de l'acide carboxylique, de l'ester et de l'éther, tous dus aux groupes fonctionnels des protéines et des métabolites recouvrant les nanoparticules d'argent. Les résultats de l'IRTF ont confirmé la présence des groupes -NH, -OH, C=C, et -CH, ce qui confirme que l'extrait végétal contient des flavonoïdes substitués par des groupes hydroxyle et amine. Cette étude spectroscopique corrobore que les groupes hydroxyle (-OH), et amine (N-H) présents dans l'extrait sont principalement impliqués dans la réduction et la stabilisation des AgNPs. EXEMPLE 3 : Activité cytotoxique in vitro La cytotoxicité des AgNPs synthétisées a été évaluée contre deux lignées cellulaires cancéreuses humaines (MDA-MB-231 et MIA PaCa-2). Les images microscopiques ( -A) démontrent l'effet cytotoxique et les dommages cellulaires causés par les AgNPs en raison de la perte de l'intégrité de la membrane cellulaire et de l'apoptose par rapport à celle du contrôle. La viabilité cellulaire (%) des lignées cellulaires MDA-MB-231 et MIA PaCa-2 après traitement avec les NP d'argent biosynthétisées a provoqué une réduction de la viabilité cellulaire en fonction de la concentration, avec une perte d'environ 92 % de la viabilité cellulaire à 436 µg/mL selon le test MTT ( -C). Les résultats ont été présentés sous forme de valeurs de concentration inhibitrice de croissance (IC50), qui représentent les concentrations de composés nécessaires pour produire une inhibition de 50 % de la croissance cellulaire par rapport aux témoins non traités. Pour l'extrait de H. ambavilla , les valeurs IC50 ont été déterminées à 714 et 608 µg/mL pour MDA-MB-231 et MIAPaCa-2 respectivement ( -B). Les nanoparticules d'argent ont montré une activité anticancéreuse plus élevée avec une IC50 de 15,8 et 3,8 µg/mL pour les AgNPs contre les lignées cellulaires MDA-MB-231 et MIA PaCa-2 respectivement ( -C). Ce résultat est compatible avec les études précédentes qui ont examiné l'activité anticancéreuse des AgNPs synthétisés par chimie. En outre, les AgNPs de petite taille se sont avérées plus toxiques que celles de grande taille. De nombreuses études ont été documentées pour élucider le mécanisme d'action de la cytotoxicité des nanoparticules. Les propriétés cytotoxiques des nanoparticules d'argent peuvent être dues à la libération de cations Ag + qui interagissent avec les macromolécules intracellulaires, provoquant un stress oxydatif qui entraîne des dommages partiels ou permanents de l'intégrité des protéines et une augmentation de la perméabilité de la membrane mitochondriale. D'autres études ont suggéré que l'internalisation cellulaire des nanoparticules d'argent augmentait la production et l'accumulation d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) intercellulaires et perturbait la synthèse de l'adénosine triphosphate (ATP), entraînant ainsi des dommages aux acides nucléiques. EXEMPLE 4 : Activité antibactérienne des AgNPs L'activité antibactérienne des AgNPs a été analysée contre une bactérie Gram- ( E. coli ) et une bactérie Gram+ ( S. Salivarius ) par la méthode de diffusion de disque. La présence d'une zone claire autour des disques imbibés de différentes concentrations d'AgNPs suggère que les AgNPs possèdent une activité bactéricide qui est capable d'inhiber la croissance des bactéries ( -A). La zone d'inhibition complète causée par les AgNPs a été trouvée à 16mm et 13mm contre E. coli et S. salivarius respectivement. Les AgNPs ont montré une activité antibactérienne modérée à une concentration aussi faible que 20 µg/mL. De plus, pour comparer l'effet des AgNPs avec l'extrait de H. ambavilla , un test de contrôle a été appliqué en utilisant une solution d'extrait végétal. Après une nuit d'incubation à 37ºC, une turbidité a été remarquée dans tous les tubes à essai contenant l'extrait de H. ambavilla à la concentration de 0,2 mg/mL, indiquant la croissance des bactéries, alors qu'avec les nanoparticules d'argent, une diminution de la turbidité indiquant l'inhibition de la croissance bactérienne a été remarquée à partir de 70 µg/ml, ( -B). Pour une évaluation plus approfondie de l'activité antibactérienne des AgNPs, les valeurs de la concentration minimale inhibitrice (CMI) et de la concentration minimale bactéricide (CMB) ont été évaluées. La CMI a été définie comme la plus faible concentration de l'agent antibactérien pour inhiber la croissance des bactéries par dilution en série et la CMB est la plus faible concentration de l'agent antibactérien pour tuer les bactéries. Les CMI des AgNPs contre E. coli et S. salivarius sont de 20 µg/mL et 150 µg/mL respectivement et les MBC sont de 20 µg/mL et 0,6 mg/mL respectivement ( -C). Les AgNPs sont plus efficaces contre les bactéries Gram- (E. coli) que Gram+ (S. salivarius). Ces résultats sont cohérents avec les études précédentes qui ont examiné l'activité antibactérienne des nanoparticules d'argent, alors que certains travaux ont montré que les AgNPs synthétisées à l'aide d'un extrait végétal étaient plus toxiques contre les bactéries positives que négatives. Cela peut être associé à la nécessité d'interagir avec la membrane cellulaire des bactéries, qui est plus facile à atteindre chez les bactéries Gram- que chez les bactéries Gram+, dont la membrane cellulaire est protégée par une épaisse couche de peptidoglycane. Leur efficacité est due non seulement à leur taille nanométrique, mais aussi au rapport important entre leur surface et leur volume. Ainsi, elles peuvent pénétrer les parois cellulaires des bactéries en interagissant avec les protéines des composés contenant du soufre et du phosphore, modifiant la structure des membranes cellulaires et entraînant même la mort des cellules. De plus, les AgNPs peuvent décharger de l' Ag + et interagir avec la surface de charge négative des bactéries en dissociant les groupes carboxyliques des protéines, ce qui renforce les effets bactéricides. Une autre possibilité suggère qu'elles augmentent la perméabilité des membranes cellulaires, produisent des espèces réactives de l'oxygène et interrompent la réplication de l'acide désoxyribonucléique en libérant des ions argent. EXEMPLE 5 : Activité antioxydante L'activité antioxydante de l'extrait aqueux de H. ambavilla et des AgNPs a été évaluée par trois méthodes différentes : Piégeage des radicaux DPPH et ABTS et test FRAP. Le DPPH et l'ABTS sont des composés stables qui peuvent être réduits en acceptant de l'hydrogène ou des électrons et ils ont été largement utilisés pour évaluer l'activité antioxydante. Échantillons DPPH IC50 (µg/ mL ) ABTS IC50 (µg/ mL ) FRAP mmol Fe (II)/g d'extrait Extrait de Hubertia ambavilla 93,36 ± 1,18 71,73 ± 2,88 1,33 ± 0,11 AgNPs 215,50 ± 5,85 130,38 ± 21,48 2,35 ± 0,12 Trolox 84,46 ± 3,98 49,92 ± 1,23 7,69 ± 0,49 Les résultats sont représentés par des moyennes ± l'écart-type, n = 3. Tableau 2 . Activités de piégeage des radicaux DPPH, ABTS et test FRAP de l'extrait aqueux de Hubertia ambavilla, AgNPs et Trolox (contrôle positif). La représente le pourcentage d'inhibition de l'activité antioxydante des radicaux libres DPPH et ABTS de tous les échantillons (extrait de Hubertia ambavilla , AgNPs et Trolox) à différentes concentrations. Les résultats montrent que l'extrait aqueux et les AgNPs sont des piégeurs de radicaux libres. À la même concentration de 500 μg/mL, les nanoparticules d'AgNPs ont montré une plus grande activité de piégeage du DPPH (84,39 %) et de l'ABTS (84,54 %) que l'extrait aqueux avec des pourcentages d'inhibition de 77,93 % pour le DPPH et de 82,09 % pour l'ABTS. L'activité antioxydante était inférieure à celle du standard Trolox (88 %, DPPH) et (95 %, ABTS). Il a été constaté que les activités DPPH et ABTS de l'extrait d'eau de Hubertia ambavilla et des AgNPs augmentaient de manière dose-dépendante. A une concentration entre 62,5-500 µg/mL, la capacité de piégeage des AgNPs pour le DPPH est entre 8% à 84%, et celle pour l'ABTS est de 25% à 84% avec des valeurs moyennes d'IC50 de 215,50 ± 5,85 µg/ml et 130,38 ± 21,48 µg/mL pour le DPPH et l'ABTS respectivement (Tableau 2). En effet, une valeur IC50 plus faible indique que l'échantillon a une forte capacité à piéger les radicaux libres, et une valeur IC50 plus élevée indique que son effet de piégeage est également plus faible. Dans le test FRAP, la capacité de l'extrait de H. ambavilla et des nanoparticules d'argent (AgNPs) à réduire Fe 3+ en Fe 2+ était de 1,33 ± 0,11 et 2,35 ± 0,12 mmol Fe(II)/g d'extrait, respectivement. Ces deux échantillons ont montré un pouvoir réducteur significatif, qui était plus élevé que celui du témoin positif Trolox (7,69 ± 0,49 mmol Fe (II)/g d'extrait). Cela peut être dû à la concentration plus élevée de phénol dans l'extrait aqueux de la plante. Selon les rapports, les composés phénoliques et les flavonoïdes sont les produits phytochimiques les plus importants avec un pouvoir antioxydant. Dans cette étude, les nanoparticules d'argent synthétisées en utilisant l'extrait aqueux de Hubertia ambavilla ont une capacité antioxydante grâce aux composés phénoliques entourant la nanoparticule. Le groupe phénolique favorise la conversion du nitrate d'argent en AgNPs grâce à sa capacité à donner des électrons. CONCLUSION La présente étude décrit la synthèse verte de nanoparticules d'argent stables via un protocole simple en utilisant l'extrait aqueux de H. ambavilla qui fournit un agent à la fois réducteur et stabilisateur pour la biosynthèse des nanoparticules. Cela prouve le potentiel de l'utilisation d'extraits de plantes pour la synthèse de nanoparticules d'argent, en adoptant les principes de la chimie verte. Un autre avantage important des méthodes de synthèse verte réside dans leur rapport coût- efficacité et dans l'abondance des matières premières. Les nanoparticules obtenues ont été caractérisées à l'aide de diverses techniques pour déterminer les caractéristiques telles que la forme, la taille, la distribution de la taille et la composition de la surface, ce qui est crucial pour comprendre le mécanisme de base de chaque propriété. Les AgNPs biosynthétisées montrent un effet antimicrobien significatif contre E. coli et S. salivarius à de faibles concentrations. Les mécanismes d'action des AgNPs sont différents des traitements classiques, avec l'avantage d'être actifs contre des bactéries qui ont déjà développé une résistance aux antibiotiques. L'activité antioxydante élevée des AgNPs obtenus recommande également leur application comme antioxydants pour la préservation de la santé contre les différents stress oxydatifs associés aux maladies dégénératives. Les résultats ont également montré qu'ils présentaient une activité cytotoxique supérieure contre la lignée de cellules mammaires humaines (MDA-MB-231) et le cancer pancréatique humain (MIA PaCa-2) de manière dose-dépendante. Dans l'ensemble, les résultats soulignent l'efficacité et les applications prometteuses des AgNPs, notamment dans les domaines de la médecine, des cosmétiques et de l'industrie pharmaceutique. Procédé de synthèse de nanoparticules d’argent stables comprenant le mélange d’une solution aqueuse d’au moins un sel d’argent et d’un extrait de H. ambavilla riche en flavonoïdes dans un ratio massique compris entre 0,5 et 10%. Procédé selon la revendication 1 dans lequel ledit sel d’argent est choisi parmi le nitrate d’argent, l’acétate d’argent, le carbonate d’argent, ou leurs mélanges dans un rapport approprié. Procédé selon l’une des revendications 1 ou2 dans lequel ledit extrait est un extrait total ou un totum de flavonoïdes. Procédé selon la revendication 3 dans lequel ledit extrait est un extrait total. Procédé selon la revendication 4 dans lequel le ratio massique sel d’argent sur plante est compris entre 3 et 8%. Nanoparticule d’argent comprenant un extrait de H. ambavilla. Nanoparticule selon la revendication 6 obtenue par le procédé défini à l’une des revendications 1 à 5. Nanoparticule selon la revendication 7 obtenue à partir d’un extrait total de plante caractérisée par une forme sphérique. Nanoparticule selon l’une des revendications 6 à 8 dont le diamètre est compris entre 1 et 100 nm mesuré par la méthode MET. Nanoparticule selon la revendication 9 dont le diamètre est compris entre 10 et 20 nm mesuré par la méthode MET. Nanoparticule selon l’une des revendications 6 à 10 fonctionnalisée à l’aide d’une molécule de ciblage, d’une molécule de marquage, d’une molécule thérapeutique ou de toute autre type de molécule d’intérêt. Utilisation d’une nanoparticule telle que définie à l’une des revendications 6 à 11 en tant qu’agent antioxydant dans le domaine cosmétique, pour le traitement de surface et en tant que conservateur. Nanoparticule telle que définie à l’une des revendications 6 à 11 pour son utilisation en tant qu’agent antioxydant dans le domaine médical. Utilisation d’une nanoparticule telle que définie à l’une des revendications 6 à 11 en tant qu’agent antibactérien en tant que conservateur, notamment dans le domaine cosmétique. Nanoparticule telle que définie à l’une des revendications 6 à 11 pour son utilisation en tant qu’agent antibactérien dans le domaine médical. Nanoparticule selon la revendication 14 pour son utilisation telle que définie à la revendication 14 dans le traitement des infections bactériennes résistantes aux antibiotiques. Nanoparticule telle que définie à l’une des revendications 6 à 11 pour son utilisation dans le traitement du cancer. Nanoparticule selon la revendication 16 pour son utilisation selon la revendication 16 dans le traitement du cancer du pancréas ou du cancer du sein. Procédé de synthèse d’une nanoparticule d’or creuse comprenant les étapes suivantes : Formation d’une nanoparticule d’argent par mélange d’un sel d’argent et d’un extrait de H. ambavilla riche en flavonoïdes dans un ratio massique compris entre 0,5 et 10% ; Ajout d’une solution aqueuse de sel d’or dans un rapport molaire 1 : 3 par rapport à la quantité d’argent Incubation Purification