Brevet FR3116009A1 — publié le 20220513

Ce document décrit une technologie pour fabriquer des barrettes de puces filtrantes fonctionnalisées. Dans le descriptif qui suit, la presse peut être une machine plus ou moins automatisée ou un serrage identique à un étau comme cela a été fait dans notre laboratoire de Baldersheim. Les barrettes obtenues peuvent être utilisées pour détecter et quantifier des biomolécules complexes dans des matrices biologiques : sang, plasma, sérum, organes ou extrait d’organes, milieu réactionnel dans lequel sont produits des bio molécules complexes (anticorps, protéines). Figure pour l’abrégé : figure 1 Production de barrettes de puces filtrantes bio-fonctionnalisées Ce document décrit une technologie pour fabriquer des barrettes de puces filtrantes fonctionnalisées. Dans le descriptif qui suit, la presse peut être une machine plus ou moins automatisée ou un serrage identique à un étau comme cela a été fait dans notre laboratoire de Baldersheim. Les barrettes obtenues peuvent être utilisées pour détecter et quantifier des biomolécules complexes dans des matrices biologiques : sang, plasma, sérum, organes ou extrait d’organes, milieu réactionnel dans lequel sont produits des bio molécules complexes (anticorps, protéines). La détection se fait par une analyse immunologique de type ELISA : une fois le complexe molécule de capture / biomolécule d’intérêt formé sur les puits de la puce filtrante, un anticorps de révélation est ajouté qui se lie spécifiquement au complexe molécule de capture / biomolécule. La fluorescence qui apparait dans chaque puit, est mesurée à l’aide d’un photomultiplicateur ou d’une caméra type CMos couplé à un programme informatique qui réalise les calculs. Étape 3.1 La bande support a 20mm de large et 25 m de long par exemple. La largeur et la longueur peuvent être changées en fonction du type de barrettes à fabriquer. L’épaisseur de la bande support est de 0,06mm soit la moitié de l’épaisseur actuelle des membranes filtrante (Nitrocellulose). En laboratoire, nous utilisons une membrane filtrante carrée de 20mm de coté. La bande support peut être en métal ex : acier, cuivre, laiton ou alors en plastique ; pourvu que le support soit assez rigide pour permettre les différentes opérations qui vont suivre. Préalablement à la fabrication la bande support peut être traitée, par exemple par pulvérisation sur de ses faces un polymère cireux ayant une caractéristique de colle légère. Il s’agit de réaliser un outil emporte-pièces et la contre pièce correspondante afin de pouvoir perforer convenablement la bande support et ainsi réaliser les puits (spots) dans la bande support. Cet outil sera en acier (par exemple) afin que sa rigidité et sa tenue dans le temps soient garantis. Les dimensions seront adaptées aux types de membranes à réaliser. Dans notre cas présent, ce sont 25 trous de 500micromètres de diamètre espacés de 200micromètres, soit un carré de 6mm x 6mm placé au centre de notre membrane filtrante (20x20mm). Cet outil emporte-pièce aura 25 pitons d’un diamètre de 500 microns. Pour d’autres membranes les pitons pourront avoir des diamètres différents (200 à 600 microns). Cet ensemble « emporte-pièces et contre pièce » est fixé sous une presse. La bande support viendra se dérouler d’une manière automatique et ajustée au milieu de cet « emporte-pièces et contre pièce » afin de réaliser des puits automatiquement par simple mouvement de haut en bas à la place prévue. Il sera nécessaire que l’avance de la bande support soit calculée de telle façon à avoir en sortie de cet emboutissage toutes les membranes de la même dimension et que chaque membrane soit bien délimitée de la suivante. Cette bande perforée pourra être conservée (plusieurs mois à 20 °C +- 5 °C en atmosphère sèche.) en vue d’une utilisation ultérieure. Il est possible de réaliser tout cela en parallèle. Une deuxième bande sera exécutée de la même manière. 3.2. Étape 3.2 On utilise une double alimentation par bandes superposées pour amener dans une presse dédiée les deux bandes de matière préparées en Étape 3.1. Les bandes avec le traitement au polymère sont introduites de telle manière que le polymère sera entre les deux bandes de métal ou plastique. Une bande d’une membrane filtrante de même dimension, par exemple de la Nitrocellulose, est positionnée pour passer entre les deux bandes de métal ou plastique avant introduction dans une presse. La presse est abaissée lors du passage du système à trois bandes avec une pression de telle sorte que une fois la pression terminée on aura en sortie une membrane qui sera composée de trois parties parfaitement soudées. La Nitrocellulose est ainsi pressée entre les deux bandes en métal ou plastique remplissant les trous libres et étant chargée de colle aux endroits non perforés. Elle est d’une part, incorporée au polymère et d’autre part, elle est poussée dans les puits des deux bandes de métal ou plastique. L’alignement doit être parfait afin que les puits des deux bandes de métal (ou plastique) soient alignés à l’entrée dans la presse. Après pressage, le système de bandes est poussé pour sortir les barrettes ainsi formées et un nouveau pressage est réalisé pour former les barrettes suivantes; En sortie de machine, nous récupérons un rouleau d’une bande de matière (acier, cuivre, laiton ou plastique) sur laquelle sont reparties des puces de 300 à 600 microns de diamètre de manières régulière et espacée de limite des membranes terminées. Ce rouleau pourra être maintenu de la sorte ou coupé en portions horizontales de différentes longueurs pour être stocké a 20 degrés +/-5 °C au sec pendant 6 à 12 mois (Il s’agit d’un minimum. La shelf life doit être déterminée de manière précise). Le rouleau ou portions pourront être utilise pour réaliser la bio fonctionnalisation des puces avec une molécules de capture comme décrit en Section 4. Des barrettes contenant un nombre moindre de puces (par ex. 8, 12, 24 ou 20…puits) sur la même surface peuvent être fabriquées en utilisant les mêmes procédés et changeant le nombre d’emporte-pièces sur la plaque d’acier fixée à la presse de formation des puits. Il est possible de repartir plus de puits que les 25 testés dans les procédures utilisées. 4. Bio Fonctionnalisation La bio fonctionnalisation des puces consiste à fixer une molécule de capture (par exemple un anticorps pour détecter un antigène) ciblant la biomolécule complexe à détecter et quantifier dans le liquide biologique. Typiquement, le rouleau de barrettes de puces filtrantes est mis en place sur une machine de « spoting ». Il est déroulé pour faire défiler les barrettes de puces sur un plateau filtrant relié à une pompe à vide. La tête d’injection de la machine de « Spoting » va déposer en 2-3 injections 10 µL d’une solution contenant la molécule de capture, par exemple, à une concentration de 10 à 30 µg/mL. Le vide d’aspiration doit permettre une filtration lente sur un temps d’environ 20 secondes des 10 µL de solution. Les 25 puces de chaque barrette sont ainsi traitées de la même façon. Une deuxième application est ensuite réalisée dans les mêmes conditions mais avec une solution de BSA (Bovine Sérum Albumine) à une concentration 100 µg/mL. Cette solution permet de saturer les sites polaires de la puce filtrante pour éviter des liaisons non spécifiques entre la biomolécule qui sera détectée et la surface de nitrocellulose de la puce. Après incubation du rouleau de barrettes de puces filtrantes à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, les barrettes sont prêtes. Elles peuvent être séparées les unes des autres avec un outil de coupage qui permette d’obtenir des barrettes isolées de mêmes dimensions. La procédure Sandwich peut être réalisée en utilisant deux barrettes constituées par exemple, de 25 puits de 300 à 600 µm de diamètre, repartis sur un carré de ~0,5 X 0,5 cm, la barrette ayant une dimension de 2 x 2 cm. La membrane filtrante, par exemple de la nitrocellulose, est coupée pour avoir la même dimension que la barrette en métal ou plastique. Elle est pressée entre les deux barrettes métalliques à l’aide d’un étau durant 10 minutes. Les barrettes de puces filtrantes peuvent ainsi être préparées à l’unité. représente un exemple d’une feuille de nitrocellulose pressée de 25 spots (Exp : 17/04/2020).