Brevet FR3112547A1 — publié le 20220121

L’invention concerne un composé de formule (I) : (I) dans laquelle X, A, Y et X 1 sont tels que définis dans la description. L’invention concerne également un conjugué entre une protéine comprenant au moins deux ponts disulfure et un composé de formule (I). Composés capables de se lier à des protéines et conjugués obtenus à partir de ces composés La présente invention concerne des composés capables de se lier à des protéines, et l’utilisation de ces composés pour préparer des conjugués avec des protéines, lesdits conjugués pouvant comprendre en outre un principe actif. Etat de la technique Le début des années 2000 a vu une intensification de la recherche sur des conjugués entre une protéine, notamment un anticorps, et une molécule d’intérêt, notamment un principe actif de médicament, ces conjugués représentant potentiellement une alternative ou un complément aux thérapies « classiques » pour délivrer de manière sélective un principe actif. En particulier, un conjugué anticorps-médicament (en anglais « Antibody Drug Conjugate » ou « ADC ») constitue un moyen de délivrance sélectif d'un médicament, notamment d’un médicament cytotoxique. Le conjugué anticorps-médicament permet donc de combiner la spécificité du ciblage par les anticorps avec de nouvelles fonctions effectrices puissantes par les agents qui leur sont conjugués. La structure d'un conjugué anticorps-médicament consiste typiquement en un anticorps lié au médicament par une molécule dont une partie va fixer l’anticorps et une autre partie va se coupler au médicament, généralement par l’intermédiaire d’un bras d’espacement (ou linker) de longueur et nature variables. Après fixation sur son antigène cible, l'anticorps est le plus souvent internalisé dans la cellule par endocytose médiée par des récepteurs. Les vésicules fusionnent avec des lysosomes où le médicament est libéré de l'anticorps via différents mécanismes. Le médicament actif agit ensuite directement sur la cellule en induisant sa mort et parfois sur les cellules cancéreuses voisines par transport ou diffusion dans l'environnement. L'anticorps est donc principalement utilisé comme vecteur et apporte le médicament dans la cellule ciblée. Dans le contexte de l’obtention d’ADC par bioconjugaison sur ponts disulfure, la stabilité des conjugués anticorps-médicament dépend notamment de la capacité de la molécule qui fixe l’anticorps à reconstruire les ponts disulfure réduits entre les chaînes lourdes et les chaînes légères de l’anticorps. Il est toutefois souhaitable de pouvoir limiter la toxicité des conjugués entre une protéine et une molécule d’intérêt telle qu’un principe actif de médicament, en particulier dans le contexte d’une utilisation thérapeutique de ces conjugués. Dans ce contexte, les inventeurs se sont attachés à mettre au point des composés (appelés également par la suite « têtes d’accroche ») qui, lorsqu’ils sont conjugués à des protéines, notamment des anticorps, permettent l’obtention d’une « structure » telle qu’en moyenne le nombre de tête d’accroche conjuguée par protéine (anticorps) est contrôlé : le conjugué majoritaire visé portant soit 1 molécule par anticorps soit 2 molécules par anticorps. Il existe également un besoin d’optimiser la reconstruction des anticorps, notamment dans la perspective de préparer des conjugués anticorps-médicament ayant une homogénéité et une stabilité améliorée du fait de la moindre présence d’espèces inégalement reconstruites. C’est avec ce « cahier des charges » à l’esprit que les inventeurs ont mis au point la présente invention. La présente invention concerne un composé de formule (I) : (I) dans laquelle X, A, Y et X 1 ont la signification donnée ci-après dans la description détaillée de l’invention. La présente invention concerne également un composé de formule (II) : (II) dans laquelle la tête d’accroche, le bras de liaison, l’espaceur et M ont la signification donnée ci-après dans la description détaillée de l’invention. La présente invention concerne également un conjugué susceptible d’être obtenu par conjugaison entre une protéine comprenant au moins deux ponts disulfure et un composé de formule (I) ou composé de formule (II). La présente invention concerne également une composition comprenant au moins un conjugué susmentionné. Description détaillée Selon un premier aspect, l’invention concerne un composé de formule (I) : (I) dans laquelle : - chaque A est le résidu d’un phényle ou d’un pyridyle ; - chaque X est un groupe partant ; - chaque Y est une liaison directe, -CH 2 -, -O-, -S-, -CO-, -NH- ou -C(=NR 1 )- ; - X 1 est choisi parmi : et ; - chaque Z est indépendamment une liaison directe, -CH 2 -, -O-, -S-, -CO-, -NH- ou -C(=NR 1 )- ; - W est -OR a , -COR 2 , -CONR 3 R 4 ou -NR 3 COR 4 ; - R a est -(C 1 -C 6 )alkyle, -(CH 2 CH 2 O) q R 5 , -(CR c R d ) r R 5 , -COR b , -(CR c R d ) r -NHCO-(CH 2 CH 2 O) q -R 5 , -(CR c R d ) r -CONH-(CH 2 CH 2 O) q -R 5 , -(CH 2 CH 2 O) q -(CH 2 ) r -NHCO-(CR c R d ) r -R 5 ou -(CH 2 CH 2 O) q -(CH 2 ) r -CONH-(CR c R d ) r -R 5 ; - R b est -(C 1 -C 6 )alkyle, -(C 1 -C 6 )alcoxy, -(CH 2 CH 2 O) q R 5 , -O(CH 2 CH 2 O) q R 5 , -(CR c R d ) r R 5 , -O(CR c R d ) r R 5 , -(CR c R d ) r -NHCO-(CH 2 CH 2 O) q -R 5 , -(CR c R d ) r -CONH-(CH 2 CH 2 O) q -R 5 , -(CH 2 CH 2 O) q -(CH 2 ) r -NHCO-(CR c R d ) r -R 5 ou -(CH 2 CH 2 O) q -(CH 2 ) r -CONH-(CR c R d ) r -R 5 ; - R 1 est -H, -OH ou -(C 1 -C 6 )alkyle ; - R 2 est -OH, -(C 1 -C 6 )alkyle, -(C 1 -C 6 )alcoxy, -(CH 2 CH 2 O) q R 5 , -(CR c R d ) r R 5 , -O(CH 2 CH 2 O) q R 5 , -O(CR c R d ) r R 5 , -O(CR c R d ) r -NHCO-(CH 2 CH 2 O) q -R 5 , -O(CR c R d ) r -CONH-(CH 2 CH 2 O) q -R 5 , -O(CH 2 CH 2 O) q -(CH 2 ) r -NHCO-(CR c R d ) r -R 5 ou -O(CH 2 CH 2 O) q -(CH 2 ) r -CONH-(CR c R d ) r -R 5 ; - R 3 est -H ou -(C 1 -C 6 )alkyle ; - R 4 est -H, -(C 1 -C 6 )alkyle, -(CH 2 CH 2 O) q R 5 , -(CR c R d ) r R 5 , -(CR c R d ) r -NHCO-(CH 2 CH 2 O) q -R 5 , -(CR c R d ) r -CONH-(CH 2 CH 2 O) q -R 5 , -(CH 2 CH 2 O) q -(CH 2 ) r -NHCO-(CR c R d ) r -R 5 ou -(CH 2 CH 2 O) q -(CH 2 ) r -CONH-(CR c R d ) r -R 5 ; - R 5 est -(CH 2 ) s R 6 ou -(CH 2 ) s R 7 ; - R 6 est -COOR 8 , -COSR 8 , -CONR 8 R 9 ou -NR 8 COR 9 ; - R 7 est choisi parmi : ; - R c est -H ; - chaque R d est -H ou -SO 3 H ; - R 8 est -H ou -(C 1 -C 6 )alkyle ; - R 9 est -H ou -(C 1 -C 6 )alkyle ; - est un (C 3 -C 6 )cycloalkyle, un (C 6 -C 10 )aryle ou un hétérocycle saturé, insaturé ou partiellement insaturé, ayant de 5 à 15 chaînons et comprenant de 1 à 4 hétéroatomes choisis parmi l'azote, l'oxygène et le soufre ; - m, n et p sont chacun indépendamment l’un de l’autre un entier allant de 0 à 8 ; - chaque q est un entier allant de 1 à 24 ; - chaque r est un entier allant de 1 à 8 ; - chaque s est un entier allant de 0 à 6. Définitions On entend par « aryle » un groupe phényle ou naphtyle. On entend par « hétérocycle saturé, insaturé ou partiellement insaturé, ayant de 5 à 15 chaînons, et comprenant de 1 à 4 hétéroatomes choisis parmi l'azote, l'oxygène et le soufre » un groupe monocyclique, bicyclique ou tricyclique, éventuellement fusionné, saturé, insaturé ou partiellement insaturé, comprenant de 1 à 4 hétéroatomes, de préférence de 1 à 3 hétéroatomes, et de préférence encore 1 ou 2 hétéroatomes, choisis parmi l'azote, l'oxygène et le soufre. A titre d’exemple de monocycle insaturé, on peut citer les groupes pyrrolyle, pyrazolyle, imidazolyle, oxazolyle, isoxazolyle, triazolyle, oxadiazolyle, furanyle, thiényle, thiazolyle, isothiazolyle, thiadiazolyle, pyridyle, pyridazinyle, pyrimidinyle, pyrazinyle, triazinyle, azépinyle, oxepinyle ou thiépinyle. A titre d’exemple de monocycle saturé, on peut citer les groupes pyrrolidinyle, tétrahydrofuryle, tétrahydrothiényle, pyrrolidinyle, imidazolidinyle, thiazolidinyle, isoxazolidinyle, pipéridinyle, pipérazinyle, morpholinyle, thiomorpholinyle, ou hexahydroazépinyle. A titre d’exemple de monocycle partiellement insaturé, on peut citer le groupe dihydro(is)oxazole. A titre d’exemple de bicycle ou tricycle, insaturé ou partiellement insaturé, éventuellement fusionné, on peut citer les groupes isoquinolyle, quinolyle, 1,4-dihydroquinolinyle, 2,4-dihydroquinolinyle, 1,2,3,4-tétrahydroquinolinyle, 1H-pyrrolo[3,2-b]pyridinyle, benzimidazolyle, benzopyrazinyle, indolyle, 2,3-dihydroindolyle, indolynyle, benzofuranyle, 2,3-dihydrobenzofuranyle, benzothiazolyle, benzothiadiazolyle, benzisoxazolyle, 3,4-dihydro-1,4-benzoxazinyle, 2,4-dihydro-1,4-benzoxazinyle, 1,3-benzodioxolyle, 2,3-dihydrobenzodioxinyle, imidazothiazolyle, benzoxazolyle, benzoxazinyle, 4,5-dihydro-1,5-benzoxazépinyle, 2,3-dihydropyrido[4,3-b][1,4]oxazinyle, 3,4-dihydropyrido[3,2-b][1,4]oxazinyle, spiro[benzoxazine-2,1'-cyclobutane]-yle, chromanyle, chroményle, spiro[chromane-2,1’-cyclobutane], spiro[chromène-2,1’-cyclobutane], spiro[cyclopentane-1,3'-indoline]-yle, spiro[indoline-3,3'-tétrahydrofurane]-yle, spiro[indoline-3,3'-tétrahydropyrane]-yle, dihydrocyclopropa[b]indol-2-yle, hexahydrocarbazolyle, tétrahydrocarbazolyle, dihydrocarbazolyle ou tétrahydrocyclopenta[b]indol-4-yle. Les modes de réalisation qui suivent peuvent le cas échéant être combinés entre eux et avec le mode de réalisation principal donné en relation avec le premier aspect de l’invention. Dans un mode de réalisation, chaque groupe partant X est un halogène, un tosylate ou un mésylate, de préférence chaque X est un halogène. De manière avantageuse, chaque X est Br. Dans un mode de réalisation, chaque A est le résidu d’un pyridyle. Dans un mode de réalisation, chaque Y est choisi parmi une liaison directe, -CO- et -NH-. Dans ce mode de réalisation, l’un des groupes Y et Z est avantageusement -CO- et l’autre est avantageusement -NH-. Dans un mode de réalisation, X 1 est , - W est -COR 2 ou -CONR 3 R 4 ; - Z est -CO- ou -NH- ; - R 2 est -OH ou -(C 1 -C 6 )alcoxy ; - R 4 est –H, -(C1-C6)alkyle, -(CH 2 CH 2 O) q -R 5 , ou -(CR c R d ) r R 5 ; - R 5 est -(CH 2 ) s R 6 ou -(CH 2 ) s R 7 ; - R 6 est -COOR 8 , -CONR 8 R 9 ou -NR 8 COR 9 ; - R 7 est choisi parmi : ; - R c , R d , R 3 , R 8 et R 9 sont tels que définis ci-dessus ; - m et n sont chacun indépendamment l’un de l’autre un entier allant de 0 à 3 ; - p est égal à 0, 1 ou 2 ; - chaque q est un entier allant de 1 à 12 ; - chaque r est un entier allant de 1 à 6 ; - chaque s est un entier allant de 0 à 4. Dans un mode de réalisation, X 1 est un groupe : choisi parmi : ; - W est -COR 2 ou -CONR 3 R 4 ; - Z est -CO- ou -NH- ; - R 2 est -OH ou -(C 1 -C 6 )alcoxy ; - R 3 est -H ou -(C 1 -C 6 )alkyle ; - R 4 est -H, -(C 1 -C 6 )alkyle, -(CR c R d ) r R 5 , ou -(CH 2 CH 2 O) q R 5 ; - R 5 est -(CH 2 ) s R 6 ou -(CH 2 ) s R 7 ; - R 6 est -COOR 8 , -CONR 8 R 9 ou -NR 8 COR 9 ; - R 7 est choisi parmi : ; - R c , R d , R 8 et R 9 sont tels que définis ci-dessus ; - chaque q est un entier allant de 1 à 12 ; - chaque r est un entier allant de 1 à 6 ; - chaque s est un entier allant de 0 à 4. Dans ce mode de réalisation, X 1 est avantageusement choisi parmi : . De préférence X 1 est : . Dans un mode de réalisation, le composé de formule (I) est un composé de formule (Ia), (Ib) ou (Ic) : (Ia) ; (Ib) ; (Ic) ; dans chacune de ces formules W est tel que défini ci-dessus. Avantageusement, W est -COR 2 ou -CONR 3 R 4 ; R 2 est -OH ou -(C 1 -C 6 )alcoxy ; R 3 est -H ou -(C 1 -C 6 )alkyle ; R 4 est -(CH 2 CH 2 O) q R 5 , ou -(CR c R d ) r R 5 ; R 5 est -(CH 2 ) s R 6 ou -(CH 2 ) s R 7 ; R 6 est -COOR 8 ; R 7 est choisi parmi : ; R 8 est -H ou -(C 1 -C 6 )alkyle ; R c est -H et chaque R d est -H ou -SO 3 H ; chaque q est un entier allant de 1 à 12 ; chaque r est un entier allant de 1 à 6 ; chaque s est un entier allant de 0 à 4. Les composés de formule (I) sont particulièrement adaptés pour la conjugaison homogène et la reconstruction de protéines comprenant au moins deux ponts disulfure, en particulier pour la reconstruction d’anticorps. Le terme « anticorps », également appelé « immunoglobuline » désigne un hétérotétramère constitué de deux chaînes lourdes d'environ 50-70 kDa chacune (dites les chaînes H pour Heavy) et de deux chaînes légères d'environ 25 kDa chacune (dites les chaînes L pour Light), liées entre elles par des ponts disulfure inter caténaires. Chaque chaîne est constituée, en position N-terminale, d'une région ou domaine variable, dit VL pour la chaîne légère, VH pour la chaîne lourde, et en position C-terminale, d'une région constante, constituée d'un seul domaine dit CL pour la chaîne légère et de trois ou quatre domaines nommés CH1, CH2, CH3, CH4, pour la chaîne lourde. On entend par « fragment d'anticorps », toute partie d'une immunoglobuline obtenue par digestion enzymatique, bioproduction ou ingénierie des protéines comprenant au moins deux ponts disulfure, par exemple, F(ab') 2 . La digestion enzymatique des immunoglobulines par la pepsine génère un fragment F(ab') 2 et un fragment Fc scindé en plusieurs peptides. F(ab') 2 est formé de deux fragments Fab' liés par des ponts disulfure intercaténaires. Les parties Fab sont constituées des régions variables et des domaines CH1 et CL. Le fragment Fab' est constitué de la région Fab et d'une région charnière. La capacité des composés de formule (I) à reconstruire des protéines comprenant au moins deux ponts disulfure permet d’envisager leur utilisation pour préparer des conjugués entre de telles protéines et une molécule d’intérêt, le cas échéant via un bras d’espacement. Ainsi, selon un autre aspect, la présente invention concerne un composé de formule (II) : (II) dans laquelle : - la tête d’accroche est un composé de formule (I) tel que défini ci-dessus ; - le bras de liaison est une liaison directe ; un résidu d’acide aminé ; un résidu de peptide ; un sucre ; un glucuronide ; un pont -S-S- ; -NHCH[CH 2 COR 10 ] 2 - ; ou un groupe de formule : ; dans laquelle R 10 est une liaison directe ou un résidu de peptide, de préférence un résidu de dipeptide ; - l’espaceur est une liaison directe ou un groupe de formule : ; - M est une molécule d’intérêt. La liaison entre chacune des différentes parties du composé de formule (II), à savoir tête d’accroche, bras de liaison, espaceur et molécule d’intérêt, est effectuée via une liaison de type amide, ester, éther, carbamate ou carbonate. L’homme du métier réalisera que la définition donnée pour la tête d’accroche dans la formule (II) n’est pas à proprement parler correcte et qu’en réalité il faut lire « résidu de composé de formule (I) », l’un des groupes réactifs porté par le composé de formule (I) ayant réagi pour former la liaison susmentionnée de type amide, ester, éther, carbamate ou carbonate. Par exemple, un groupe acide ou ester porté par le composé de formule (I) a réagi avec un groupe amino pour former une liaison de type amide entre la tête d’accroche et le bras de liaison (s’il est présent) ou l’espaceur (s’il est présent) ou la molécule d’intérêt. De la même manière, on comprend que l’expression « molécule d’intérêt » donnée dans la définition de la formule (II) doit en fait être comprise comme signifiant « résidu de molécule d’intérêt ». Dans un mode de réalisation, la partie de la formule (II) constituée par le bras de liaison et l’espaceur est représentée par l’une des formules (III) ou (IV) : (III) ; (IV). Dans un mode de réalisation, la molécule d’intérêt est un principe actif, un fluorophore ou une cage pour radioéléments. A titre de principe actif susceptible d’être utilisé dans le cadre de l’invention, on peut citer les principes actifs de médicaments déjà autorisés et les molécules en cours d’évaluation thérapeutique, en particulier : - les agents alkylants tels que : chlorambucile, chlornaphazine, cyclophosphamide, dacarbazine, estramustine, ifosfamide, méchloréthamine, chlorhydrate d’oxyde de méchloréthamine, mannomustine, mitobronitol, melphalan, mitolactol, pipobroman, novembichine, phénesterine, prednimustine, thiotépa, trofosfamide, moutarde à l’uracile, CC-1065 (y compris ses analogues synthétiques adozélésine, carzélésine et bizélésine), duocarmycine (y compris les analogues synthétiques KW-2189 et CBI-TMI), dimères de benzodiazépine (par exemple, dimères de pyrrolobenzodiazépine (PBD) ou tomaymycine, indolinobenzodiazépines, imidazobenzothiadiazépines, ou oxazolidino-benzodiazépines), nitro-urées (carmustine, lomustine, chlorozotocine, fotemustine, nimustine, ranimustine), alkylsulfonates (busulfan, tréosulfan, improsulfan et piposulfan), triazènes (dacarbazine), composés à base de platine (carboplatine, cisplatine, oxaliplatine), aziridines (benzodopa, carboquone, meturedopa, et uredopa), éthylène-imines et mélamines (incluant altrétamine, triéthylènemélamine, triéthylenephosphoramide, triéthylènethio-phosphaoramide et triméthylolomelamine) ; - les alcaloïdes végétaux tels que : alcaloïdes de Vinca (vincristine, vinblastine, vindésine, vinorelbine, navelbine), les taxoïdes (paclitaxel, docetaxol) et leurs analogues, les Maytansinoïdes (DM1, DM2, DM3, DM4, maytansine et ansamitocines) et leurs analogues, les cryptophycines (en particulier la cryptophycine 1 et la cryptophycine 8), les épothilones, eleuthérobine, discodermolide, bryostatines, dolastatines, auristatines, tubulysines, céphalostatines, pancratistatines, sarcodictyine, spongistatines ; - les inhibiteurs d’ADN topoisomérase tels que : épipodophylline (9-aminocamptothécine, camptothécine, crisnatol, daunomycine, étoposide, étoposide phosphate, irinotécan, mitoxantrone, novantrone, acides rétinoïques (rétinols), téniposide, topotecan, 9-nitrocamptothécine (RFS 2000), mitomycines (mitomycine C), bortezomib ; - les anti-métabolites tels que : les anti-folates (inhibiteurs DHFR (méthotrexate, trimétrexate, dénopterine, ptéroptérine, aminoptérine (acide 4-aminoptéroïque) et autres analogues de l’acide folique), les inhibiteurs de l’IMP déshydrogénase (acide mycophénolique, tiazofurine, ribavirine, EICAR), les inhibiteurs de ribonucléotide réductase (hydroxyurée, déferoxamine), les analogues de pyrimidine tels que : analogues d’uracile (ancitabine, azacitidine, 6-azauridine, capécitabine, carmofur, cytarabine, didésoxyuridine, doxifluridine, enocitabine, 5-fluorouracile, floxuridine, ratitrexed), analogues de cytosine (cytarabine, cytosine arabinoside, fludarabine), analogues de purine (azathioprine, fludarabine, mercaptopurine, thiamiprine, thioguanine), acide folinique ; - les agents hormonaux tels que : anti-estrogènes (mégestrol, raloxifène, tamoxifène), agonistes LHRH (goséréline, acétate de leuprolide), anti-androgènes (bicalutamide, flutamide, calustérone, propionate de dromostanolone, épitiostanol, goséréline, leuprolide, mépitiostane, nilutamide, testolactone, trilostane), analogues de la vitamine D3 (CB 1093, EB 1089, KH 1060, cholécalciférol, ergocalciférol), thérapies photodynamiques (verteporfine, phthalocyanine, photosensibilisateur Pc4), cytokines (interféron-alpha, interféron-gamma, facteur de nécrose tumorale (TNF), protéines humaines contenant un domaine TNF) ; - les inhibiteurs de kinase tels que : BIBW 2992, CYT387, E7080, axitinib, bafetinib, bosutinib, cabozantinib, dasatinib, erlotinib, gefitinib, imatinib, iniparib, ispinesib, lapatinib, masitinib, mubritinib, nilotinib, pazopanib, pegaptanib, ponatinib, ruxolitinib, sorafénib, sunitinib, tivozanib, vandetanib, vismodegib ; - les inhibiteurs de poly(ADP-ribose)polymérase (PARP) tels que : BGB-290, CEP 9722, E7016, 3-aminobenzamide, niraparib, olaparib, talazoparib, veliparib ; - les immunomodulateurs tels que : thalidomide, lénalidomide, pomalidomide. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le principe actif est choisi parmi la duocarmycine et ses analogues, les dolastatines, la combretastatine et ses analogues, la calichéamicine, la N-acétyl-y-calichéamycine (CMC), un dérivé de calichéamycine, la maytansine et ses analogues, tel qu’un dérivé de type maytansinoïde, par exemple le DM1 et le DM4, les auristatines et leurs dérivés, tels que l'auristatine E, l'auristatine EB (AEB), l'auristatine EFP (AEFP), la monométhyle auristatine E (MMAE), la monométhyle auristatine F (MMAF), la tubulysine, le disorazole, les épothilones, l'échinomycine, l'estramustine, la cémadotine, l'eleuthérobine, la méthoptérine, l'actinomycine, la mitomycine C, la camptothécine, un dérivé de la camptothécine, le SN38, le TK1, l'amanitine et ses analogues, une pyrrolobenzodiazépine, un dimère de pyrrolobenzodiazépine, une pyrrolopyridodiazépine, un dimère de pyrrolopyridodiazépine, un intercalant de l'ADN, un inhibiteur d'histone désacétylase, ou un inhibiteur de (tyrosine) kinase. Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le principe actif est sélectionné parmi l'exotoxine de pseudomonas (PE), la deBouganin, la Bouganin, la toxine diphtérique (DT) et la ricine. Dans un mode de réalisation particulier, le principe actif est choisi parmi le méthotrexate, un immunomodulateur, la duocarmycine, la combrétastatine, la calichéamicine, la monométhyle auristatine E (MMAE), la monométhyle auristatine F (MMAF), la maytansine, DM1, DM4, SN38, l’amanitine et ses analogues, la pyrrolobenzodiazépine, un dimère de pyrrolobenzodiazépine, la pyrrolopyridodiazépine, un dimère de pyrrolopyridodiazépine, un inhibiteur de l’histone désacétylase, un inhibiteur de (tyrosine) kinase, et la ricine, de préférence le principe actif est la MMAE, représentée par la formule suivante : . Selon un autre aspect, l’invention concerne un conjugué susceptible d’être obtenu : (c1) par conjugaison entre une protéine comprenant au moins deux ponts disulfure et un composé de formule (I) tel que défini précédemment, ou (c2) par conjugaison entre une protéine comprenant au moins deux ponts disulfure et un composé de formule (II) tel que défini précédemment, ou (c3) par réaction entre une protéine comprenant au moins deux ponts disulfure, un composé de formule (I) et un composé de formule (V) : (V) dans laquelle : - R 1 1 est R 7 -(CH 2 ) s -CO-, R 7 -(CH 2 ) s -CONHCH[CH 2 CO-] 2 , R 7 -(CH 2 ) s -(O-CH 2 -CH 2 ) q -CO-, R 7 -(CH 2 ) s -(O-CH 2 -CH 2 ) q -CONHCH[CH 2 CO-] 2 , ou un composé de formule : ; - R 7 est tel que défini ci-dessus ; - R 1 0 est une liaison directe ou un résidu de peptide, de préférence un résidu de dipeptide ; - chaque q est un entier allant de 1 à 12 ; - chaque s est un entier allant de 0 à 6 ; - t est 1 ou 2, de préférence t est 1 ; - le bras de liaison, l’espaceur et M sont tels que définis ci-dessus. Dans la réaction décrite dans l’alternative (c3), les composés de formule (I) et de formule (V) réagissent entre eux par mise en œuvre d’une réaction dite « click ». De manière plus précise la réaction click entre le composé de formule (I) et le composé de formule (V) s’effectue entre un diène (par exemple un azoture ou un diazo) et un diénophile (par exemple un alcène ou un alcyne), chacune de ces espèces étant respectivement apportée par R 7 d’une part dans le composé de formule (I), par R 11 , d’autre part dans le composé de formule (V). On comprend donc que la réaction click peut intervenir : - entre un diène porté par le R 7 provenant du composé de formule (I) et un diénophile porté par le R 11 provenant du composé de formule (V) ; ou - entre un diénophile porté par le R 7 provenant du composé de formule (I) et un diène porté par le R 11 provenant du composé de formule (V). Les réactions click sont bien connues de l’homme du métier, et incluent par exemple une réaction de cycloaddition entre un diénophile et un diène. Des exemples de réaction click sont représentés dans le schéma suivant : Dans ces exemples, un seul régio-isomère par réaction a été représenté, étant entendu que les réactions de cycloaddition peuvent générer plusieurs régio-isomères. Dans un mode de réalisation, la réaction click est effectué entre un composé de formule (I) et un composé de formule (V) dans laquelle R 11 est N 3 -(CH 2 ) 5 -CO-, t = 1 et le bras de liaison est représenté par la formule (VI) : (VI). Dans un mode de réalisation, la protéine comprenant au moins deux ponts disulfures est un anticorps ou un fragment d’anticorps tel que défini ci-dessus. Dans ce mode de réalisation, l’anticorps ou le fragment d’anticorps se lie à la tête d’accroche par substitution des groupes partants représentés par le substituant X dans la formule (I). Toujours dans ce mode de réalisation, les réactions (c1) à (c3) décrites ci-dessus entraînent la reconstruction de l’anticorps, après réduction des ponts disulfures intercaténaires. Dans le contexte de la présente invention la reconstruction d’un anticorps est définie comme l’obtention d’une majorité d’anticorps entier LHHL. La proportion d’anticorps entier LHHL et des autres espèces (LHH, HH, LH, H, L) est déterminée à l’aide de la densité optique mesurée par analyse sur gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes réductrices. Une bonne reconstruction est atteinte lorsque la proportion de LHHL dépasse 50%. Dans un mode de réalisation, les différentes réactions (c1) à (c3) permettent d’obtenir un « molecule-to-antibody ratio » (MAR) (ou ratio de molécules « accrochées » ou « conjuguées » par anticorps) compris dans la plage allant d’environ 0,50 à environ 2,50. Dans un mode de réalisation, l’anticorps ou le fragment d’anticorps est conjugué en moyenne à 1,00±0,50 (c’est-à-dire toute valeur allant de 0,50 à 1,50, par exemple 0,50 ; 0,51 ; ..... ; 1,49 ; 1,50) molécule, de préférence à 1,00±0,30 molécule. Dans un mode de réalisation, l’anticorps ou le fragment d’anticorps est conjugué en moyenne à 2,00±0,50 (c’est-à-dire toute valeur allant de 1,50 à 2,50, par exemple 1,50 ; 1,51 ; ….. ; 2,49 ; 2,50) molécule(s), de préférence à 2,00±0,30 molécule(s). Dans le contexte de la présente invention, il faut comprendre par « molécule » soit un composé de formule (I), soit un composé de formule (II), soit le produit de la réaction (click) entre un composé de formule (I) et un composé de formule (V). On peut représenter de manière schématique le conjugué formé à l’issue des réactions (c1), (c2) ou (c3) par la structure suivante : dans laquelle Ac est un anticorps ou un fragment d’anticorps ; la molécule est telle que définie ci-dessus (étant entendu que l’anticorps ou le fragment d’anticorps se lie à la tête d’accroche de la molécule par substitution des groupes partants X) ; et MAR représente le nombre moyen de molécule(s) fixée(s) sur l’anticorps ou le fragment d’anticorps. Le MAR est déterminé pour chaque espèce (LHHL, LH, L, H, HH, LHH) par analyse SMHR (Spectrométrie de Masse Haute Résolution) en conditions dénaturantes. Le MAR moyen est obtenu à partir du MAR par espèce pondéré par les proportions des espèces observées en analyse sur gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes non réductrices. Seules les espèces majoritaires LHHL et LH ont été considérées pour ce calcul, la somme des proportions des autres espèces (L, H, HH et LHH) étant inférieure à 18%. La somme des proportions des espèces LHHL et LH a donc été ramenée à 100% en ne tenant pas compte des autres espèces. L’espèce « demi-anticorps » LH est observée en conditions dénaturantes. En solution (en conditions natives) cette espèce n’est pas présente de façon isolée, les interactions faibles maintiennent les deux LH ensembles. C’est pourquoi le MAR de l’espèce LH-LH non reconstruite correspond à 2 fois le MAR observé sur l’espèce LH. Le MAR moyen a donc été calculé à l’aide de la formule suivante : Selon un autre aspect, l’invention concerne une composition comprenant un ou plusieurs conjugué(s) tel(s) que défini(s) ci-dessus. La composition peut être une composition pharmaceutique contenant un ou plusieurs excipients et/ou véhicules pharmaceutiquement acceptables. Les composés de formules (I), (II) et (V) peuvent être préparés selon des techniques décrites dans la littérature et/ou dans les exemples ci-après. La réaction de bioconjugaison (c1) ou (c2) peut être mise en œuvre par réaction de la protéine comprenant au moins deux ponts disulfure avec le composé de formule (I) ou (II) à conjuguer, en présence d’un réducteur. Dans un mode de réalisation la protéine est en solution dans un tampon. Dans un mode de réalisation, le réducteur est ajouté avant le composé à conjuguer. Dans un autre mode de réalisation, le réducteur et le composé à conjuguer sont ajoutés simultanément. La réaction (c3) peut être mise en œuvre par (i) réaction, en présence d’un réducteur, de la protéine comprenant au moins deux ponts disulfure avec le composé de formule (I) puis ajout du composé de formule (V) et réaction click ou par (ii) réaction, en présence d’un réducteur, de la protéine comprenant au moins deux ponts disulfures avec un composé issu d’une réaction click préalable entre les composés de formule (I) et (V). Dans un mode de réalisation la protéine est en solution dans un tampon. L’invention est illustrée par les exemples ci-après, donnés à titre purement illustratif. Dans ces exemples, on utilise les abréviations suivantes : AcOEt = acétate d’éthyle APS = persulfate d’ammonium ASB = albumine sérique bovine BnOH = alcool benzylique CHCl 3 = chloroforme DBCO = dibenzylcyclooctyne DCM= dichlorométhane DIPEA = N , N -diisopropyléthylamine DMF = N , N -diméthylformamide DMSO = diméthylsulfoxyde EEDQ = N -éthoxycarbonyl-2-éthoxy-1,2-dihydroquinoline EtOH = éthanol FmocCl = chlorure de fluorénylméthoxycarbonyle HATU = O -(7-azabenzotriazol-1-yl)- N , N , N’ , N’ -tétraméthyluronium hexafluorophosphate HCl = acide chlorhydrique LiOH = hydroxyde de lithium MeCN = acétonitrile MeOH = méthanol MgSO 4 = sulfate de magnésium NaCl = chlorure de sodium Na 2 CO 3 = carbonate de sodium NaHCO 3 = hydrogénocarbonate de sodium NaN 3 = azoture de sodium PBr 3 = tribromure de phosphore Pd/C = palladium sur charbon Pd(OH) 2 /C = hydroxyde de palladium sur charbon SiO 2 = silice SOCl 2 = chlorure de thionyle TA = température ambiante (20 °C sauf indication contraire) TBAF = fluorure de tétrabutylammonium TBDMSOTf = trifluorométhanesulfonate de tert -butyldiméthylsilyle TFA = acide trifluoroacétique THF = tétrahydrofurane Méthodes d’analyse Spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) Les spectres de résonance magnétique nucléaire (RMN) du proton 1 H, du carbone 13 C et du fluor 19 F ont été réalisés sur un appareil Bruker Ultrashield 300 (300 MHz ( 1 H), 75 MHz ( 13 C) et 282 MHz ( 19 F)). Les analyses ont été réalisées dans le chloroforme deutéré (CDCl 3 ), dans le diméthylsulfoxyde deutéré (DMSO- d 6 ), dans l’eau lourde (D 2 O) ou dans le méthanol deutéré (MD 3 OD). Les déplacements chimiques (δ) sont mesurés en parties par million (ppm) par rapport au signal résiduel du chloroforme deutéré (CDCl 3 ) (δ 1 H = 7,26 ppm, δ 13 C = 77,1 ppm), au signal résiduel du diméthylsulfoxyde deutéré (DMSO- d 6 ) (δ 1 H = 2,50 ppm, δ 13 C = 39,5 ppm), au signal résiduel de l’eau lourde (δ 1 H = 4,79 ppm), ou au signal résiduel du méthanol deutéré (δ 1 H = 3,31 ppm, δ 13 C = 49,0 ppm). Les constantes de couplage ( J ) sont exprimées en Hertz (Hz) et la multiplicité est décrite de la façon suivante : d = doublet, dd = doublet de doublet, dt = doublet de triplet, m = multiplet, p = pentuplet, s = singulet, t = triplet. Afin de clarifier la lecture des analyses RMN, la numérotation des atomes pour l’attribution des signaux a été fixée arbitrairement. Spectrométrie de masse à haute résolution (SMHR) La masse exacte des composés synthétisés a été déterminée par spectrométrie de masse haute résolution (SMHR) en mode positif ou négatif avec la technique d’ionisation par électronébulisation ESI, soit sur un spectromètre de masse Bruker maXis couplé à un système Dionex Ultimate 3000 RSLC de la plateforme « Fédération de Recherche » de l’ICOA/CBM (FR2708), soit sur un spectromètre de masse Waters Vion IMS QTof couplé à un système Waters Acquity UPLC H-Class du GICC (EA7501). Spectrométrie de masse à haute résolution (SMHR) dénaturante L’analyse des conjugués a été réalisée sur un échantillon préalablement déglycosylé ou non. Dans le cas d’un échantillon déglycosylé, il a été dilué à une concentration de 1 μg/μL puis de la N-glycosidase F (0,02 unité/μg d’échantillon) a été ajoutée et l’échantillon a été incubé à 37 °C pendant au moins 16h. L’analyse a été réalisée sur un spectromètre de masse Vion IMS Qtof couplé à un système Acquity UPLC H-Class de Waters (Wilmslow, UK). Avant l’analyse, les échantillons (800 ng) ont été injectés sur une colonne XBridge BEH300 C4 2,1 x 50 mm, 1,7 μm, soit sur une colonne XBridge BEH300 C4 2,1 x 30 mm, 5 µm chauffée à 90 °C. Une étape de dessalage a été réalisée avec un gradient isocratique 95% de solvant A (H 2 O + 0,1% acide formique) et 5% de solvant B (MeCN + 0,1% acide formique) pendant 1,5-2 min à 0,5 mL/min. Puis, l’élution de l’échantillon a été réalisée avec un gradient de 20% à 35% de solvant B sur 7 min, de 50% à 90% de solvant B sur 3 min, et un isocratique de 1 min à 90% de B, soit avec un gradient de 5% à 50% de solvant B sur 2,9 min, de 50% à 90% de solvant B sur 0,5 min, un isocratique de 0,5 min à 90% de B, avec un débit de 0,4 mL/min. Une vanne de dérivation a été programmée pour permettre au solvant d’entrer dans le spectromètre entre 3 et 7,5 min seulement. Les données de spectrométrie de masse ont été acquises en mode positif avec une source ESI sur une gamme m/z de 500 à 4000 à une fréquence de scan de 1 Hz et analysées en utilisant le logiciel UNIFI 1.9.4 et l’algorithme MaxEnt pour la déconvolution. Le MAR moyen par espèce (= nombre moyen de molécules conjuguées à l’anticorps utilisé pour la réaction de bioconjugaison) a été déterminé à l’aide de l’intensité des pics des espèces observés. Gel SDS-PAGE en conditions dénaturantes, non réductrices ou réductrices Les échantillons ont été analysés par gel d’acrylamide SDS-PAGE tris-HCl. Un gel de concentration à 4% d’acrylamide sur un gel de migration à 6-7% d’acrylamide ont été utilisés. Du tampon Laemmli 2X (bleu de bromophénol 0,3 mM ; glycérol 2 M, TrisBase 20 mM ; 0,04% de dodécylsulfate de sodium) a été ajouté dans les échantillons (1,6 μg). En conditions réductrices, les échantillons ont été réduits à l’aide d’une solution de dithiothréitol (DTT) à 10% dans de l’eau (10% v/v). Ensuite, les échantillons ont été incubés à 95 °C pendant 10 min. Un marqueur de poids de moléculaire de grande amplitude (Invitrogen SeeBlue® Plus2 Prestained Standard) et l’anticorps natif ont été utilisés pour estimer les poids moléculaires des protéines. Le gel a été mis à migrer à 100 V pendant 10 min puis à 140 V pendant 35 min, dans un tampon de migration NuPAGE (MOPS 50 mM ; TrisBase 50 mM ; 0,1% SDS (v/v) ; EDTA 1 mM, pH 7,3). Après un lavage à l’eau, le gel a été coloré avec du bleu de Coomassie (Thermo Scientific Imperial TM Protein Stain). L’analyse densitométrique a été réalisée à l’aide du logiciel ImageJ et un filtre Vanilla de Windows a été appliqué pour l’analyse en noir et blanc. En conditions dénaturantes non réductrices, la densité optique relative des espèces LHHL et LH a été utilisée pour déterminer le MAR moyen du conjugué. En conditions dénaturantes réductrices, la densité optique relative mesurée pour l’espèce LHHL a déterminé la reconstruction de l’anticorps (en %). Réactions de bioconjugaison Préparation des solutions Tampon de bioconjugaison 1 : Tampon phosphate 1X à un pH de 8,3, avec une concentration finale en NaCl de 180 mM et une concentration finale en EDTA de 1 mM. Tampon de bioconjugaison 2 : Tampon borate 1X à un pH de 8,3, avec une concentration finale en NaCl de 25 mM et une concentration finale en EDTA de 1 mM. Réducteur 1 : Solution de chlorhydrate de tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP.HCl) à une concentration de 1 mM dans le tampon de bioconjugaison. Réducteur 2 : Solution de dithiothréitol (DTT) à une concentration de 1 mM dans le tampon de bioconjugaison. Réaction de bioconjugaison 1 : La solution d’anticorps dans le tampon de bioconjugaison (1,0 éq) a été placée sous argon. Le réducteur (8,0-12,0 éq) a ensuite été ajouté et le milieu réactionnel a été incubé à 37 °C pendant 2h. Puis la solution de composé à conjuguer (5,0-12,0 éq) a été ajoutée sous argon et le milieu réactionnel a été agité à 37 °C pendant 2h30. Réaction de bioconjugaison 2 : La solution d’anticorps dans le tampon de bioconjugaison (1,0 éq) a été placée sous argon. Les solutions de composé à conjuguer (10 ,6-12,0 éq) puis de réducteur (7,0-12,0 éq) ont été ajoutées et le milieu réactionnel a été agité sous argon à 37 °C pendant 2h30. Réaction de bioconjugaison 3 : La solution d’anticorps dans le tampon de bioconjugaison (1,0 éq) a été placée sous argon. Les solutions du composé de formule (I) (10,6 éq) puis de réducteur (7,0 éq) ont été ajoutées et le milieu réactionnel a été agité sous argon à 37 °C pendant 2h30. La solution du composé de formule (V) (11,7 éq) a ensuite été ajoutée et le milieu réactionnel a été agité à 25 °C pendant 17h. Exemples Préparation 1 : isonicotinate de benzyle (1) (1) De l’acide isonicotinique (5,00 g ; 40,614 mmol ; 1,0 éq) a été solubilisé dans du SOCl 2 (15 mL ; 206,775 mmol ; 5,1 éq) et chauffé à reflux pendant 15h. Après retour à TA, l’excès de SOCl 2 a été éliminé par évaporation sous pression réduite, puis le résidu obtenu a été dissous dans du DCM anhydre (55 mL). BnOH a été additionné (4,2 mL ; 40,614 mmol ; 1,0 éq) et le mélange a été agité à reflux pendant 10h. Après retour à TA, le milieu réactionnel a été neutralisé avec une solution saturée de NaHCO 3 et extrait avec du DCM (3x100 mL). Les phases organiques ont été rassemblées, lavées avec une solution saturée de NaCl, séchées sur MgSO 4 et concentrées sous pression réduite. Le produit obtenu a été purifié par chromatographie flash (SiO 2 , cyclohexane/AcOEt 50:50) pour donner (1) (6,97 g ; 80%) sous la forme d’une huile incolore. RMN 1 H (300 MHz, DMSO) δ 8,80 (dd ; J = 6,1 ; 1,6 Hz ; 2H 1,5 ) ; 7,86 (dd ; J = 6,1 ; 1,6 Hz, 2H 2,4 ) ; 7,56 – 7,29 (m ; 5H 9-13 ) ; 5,39 (s ; 2H 7 ). RMN 13 C (75 MHz, DMSO) δ 165,0 (1C 6 ) ; 151,3 (2C 1,5 ) ; 137,2 (1C 3 ) ; 136,1 (1C 8 ) ; 129,0 (2C 10,12 ) ; 128,8 (1C 11 ) ; 128,6 (2C 9,13 ) ; 123,0 (2C 2,4 ) ; 67,4 (1C 7 ). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C 13 H 11 NO 2 [M] : 213,0790 ; observée 213,0796. Préparation 2 : 2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinate de benzyle (2) (2) L’isonicotinate de benzyle (1) (2,48 g ; 11,630 mmol ; 1,0 éq) a été solubilisé dans MeOH (43 mL), agité à 50 °C et H 2 SO 4 concentré (320 µL ; 6,016 mmol ; 0,5 éq) a été ajouté. Une solution de APS (26,500 g ; 116,126 mmol ; 10,0 éq) dans l’eau (43 mL) a été ajoutée en deux étapes : un premier ajout rapide de 30 gouttes, une suspension blanche se forme, puis en goutte à goutte rapide pendant 5 min. La réaction s’est emballée jusqu’à 75 °C, puis la solution jaune obtenue a été agitée à 50 °C pendant 1h supplémentaire. Après retour à TA, MeOH a été évaporé sous pression réduite. 50 mL d’AcOEt ont été ajoutés et le milieu a été neutralisé par ajout d’une solution saturée de NaHCO 3 . La phase aqueuse a été extraite avec de AcOEt (3x100 mL) et les phases organiques rassemblées ont été lavées par une solution saturée de NaCl, séchées sur MgSO 4 , puis concentrées sous pression réduite. Le brut a été purifié par chromatographie flash (SiO 2 , DCM/MeOH, 95:5) pour donner (2) (1,56 g ; 49%) sous la forme d’un solide beige. RMN 1 H (300 MHz, DMSO) δ 7,81 (s ; 2H 2,4 ) ; 7,55 – 7,32 (m ; 5H 9-13 ) ; 5,60 (t ; J = 5,9 Hz ; 2H 15,17 ) ; 5,40 (s ; 2H 7 ) ; 4,59 (d ; J = 5,9 Hz ; 4H 14,16 ). RMN 13 C (75 MHz, DMSO) δ 165,0 (1C 6 ) ; 162,8 (2C 1,5 ) ; 138,0 (1C 3 ) ; 135,7 (1C 8 ) ; 128,6 (2C 10,12 ) ; 128,4 (1C 11 ) ; 128,3 (2C 9,13 ) ; 117,0 (2C 2,4 ) ; 66,9 (1C 7 ) ; 63,9 (2C 14,16 ). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C 15 H 15 NO 4 [M] : 273,1001 ; observée 273,1001. Préparation 3 : 2,6-bis(((tert-butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)-isonicotinate de benzyle (3) (3) Le 2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinate de benzyle (2) (1,56 g ; 5,708 mmol ; 1,0 éq) a été dissous dans du DCM anhydre (12 mL), la 2,6-lutidine (3,6 mL ; 28,542 mmol ; 5,0 éq) a été ajoutée et la solution a été refroidie à 0 °C. TBDMSOTf (5,5 mL ; 23,974 mmol ; 4,2 éq) a été ajouté goutte à goutte en 10 min, puis le milieu réactionnel a été agité sous argon à TA pendant 19h. Le milieu a été refroidit à 0 °C puis neutralisé par ajout d’une solution saturée de NaHCO 3 . La phase aqueuse a été extraite avec du DCM (3x100 mL) et les phases organiques rassemblées ont été lavées par une solution saturée de NaCl, séchées sur MgSO 4 , filtrées, puis concentrées sous pression réduite. Le brut a été purifié par chromatographie flash (SiO 2 , cyclohexane/AcOEt, 90:10) pour donner (3) (2,50 g ; 87%) sous la forme d’un solide beige. RMN 1 H (300 MHz, CDCl 3 ) δ 7,97 (s ; 2H 2,4 ) ; 7,57 – 7,28 (m ; 5H 9-13 ) ; 5,39 (s ; 2H 7 ) ; 4,84 (s ; 4H 14,21 ) ; 0,95 (s ; 18H 18-20,25-27 ) ; 0,12 (s ; 12H 15,16,22,23 ). RMN 13 C (75 MHz, CDCl 3 ) δ 165,6 (1C 6 ) ; 161,8 (2C 1,5 ) ; 138,9 (1C 3 ) ; 135,6 (1C 8 ) ; 128,8 (2C 10,12 ) ; 128,5 (1C 11 ) ; 128,2 (2C 9,13 ) ; 117,8 (2C 2,4 ) ; 67,4 (1C 7 ) ; 65,9 (2C 14,21 ) ; 26,0 (6C 18-20,25-27 ) ; 18,5 (2C 17,24 ) ; -5,2 (4C 15,16,22,23 ). SMHR (ESI) : m/z calculée pour C 27 H 44 NO 4 Si 2 [M+H] + : 502,2803 ; observée 502,2801. Préparation 4 : acide 2,6-bis((( tert -butyldiméthylsilyl)-oxy)méthyl)isonicotinique (4) (4) Le 2,6-bis(((tert-butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)isonicotinate de benzyle (3) (2,50 g ; 4,982 mmol ; 1,0 éq) a été dissous dans 60 mL d’un mélange MeOH/AcOEt (5:1) et la solution a été dégazée avec de l’argon pendant 15 min. Du Pd/C à 10% en masse (250 mg ; 10% m/m) a été ajouté et le milieu réactionnel a été agité à TA sous atmosphère d’hydrogène pendant 5h. Le milieu réactionnel a été filtré sur Dicalite™ (rinçage MeOH). Le filtrat a été concentré sous pression réduite pour donner (4) (1,93 g ; 94%) sous la forme d’un solide blanc. RMN 1 H (300 MHz, CDCl 3 ) δ 8,01 (s ; 2H 2,4 ) ; 4,90 (s ; 4H 8,15 ) ; 0,97 (s ; 18H 12-14,19-21 ) ; 0,13 (s ; 12H 9,10,16,17 ). RMN 13 C (75 MHz, CDCl 3 ) δ 170,2 (1C 6 ) ; 161,8 (2C 1,5 ) ; 139,3 (1C 3 ) ; 118,4 (2C 2,4 ) ; 65,7 (2C 8,15 ) ; 26,1 (6C 12-14,19-21 ) ; 18,6 (2C 11,18 ) ; -5,2 (4C 9,10,16,17 ). SMHR(ESI) : masse neutre calculée pour C 20 H 37 NO 4 Si 2 [M] : 411,2261 ; observée 411,2257. Préparation 5 : acide 6-(Fmoc-amino)hexanoïque (5) (5) L’acide 6-aminohexanoïque (1,00 g ; 7,623 mmol ; 1,0 éq) a été dissous dans un mélange eau/1,4-dioxane (1:1 ; 38 mL) à 0 °C. Na 2 CO 3 (2,42 g ; 22,832 mmol ; 3,0 éq) a été ajouté et le milieu réactionnel a été agité à 0 °C pendant 10 min. FmocCl (1,97 g ; 7,623 mmol ; 1,0 éq) a été ajouté et le milieu réactionnel a été agité à TA pendant 5h. Le milieu a été acidifié par ajout d’une solution d’HCl à 1 M jusqu’à atteindre un pH de 6 et le précipité formé a été filtré et rincé à l’eau (3x20 mL). Le solide a été purifié par chromatographie flash (SiO 2 , DCM/MeOH, 95:5) pour donner (5) (2,32 g ; 86%) sous la forme d’un solide blanc. RMN 1 H (300 MHz ; DMSO) δ 7,89 (d ; J = 7,4 Hz ; 2H 16,19 ) ; 7,68 (d ; J = 7,4 Hz ; 2H 13,22 ) ; 7,48 – 7,38 (m ; 2H 15,20 ) ; 7,37 – 7,29 (m ; 2H 14,21 ) ; 7,26 (t ; J = 5,6 Hz ; 1H 8 ) ; 4,35 – 4,25 (m ; 2H 10 ) ; 4,25 – 4,13 (m ; 1H 11 ) ; 3,04 – 2,87 (m ; 2H 7 ) ; 2,18 (t ; J = 7,3 Hz ; 2H 3 ) ; 1,58 – 1,31 (m ; 4H 4,6 ) ; 1,31 – 1,18 (m ; 1H 5 ). RMN 13 C (75 MHz, DMSO) δ 174,5 (1C 2 ) ; 156,1 (1C 9 ) ; 144,0 (2C 12,23 ) ; 140,8 (2C 17,18 ) ; 127,6 (2C 15,20 ) ; 127,1 (2C 14,21 ) ; 125,2 (2C 13,22 ) ; 120,1 (2C 16,19 ) ; 65,2 (1C 10 ) ; 46,8 (1C 11 ) ; 39,7 sous le DMSO (1C 7 ) ; 33,7 (1C 3 ) ; 29,1 (1C 6 ) ; 25,8 (1C 5 ) ; 24,2 (1C 4 ). SMHR(ESI) : masse neutre calculée pour C 21 H 23 NO 4 [M] : 353,1627 ; observée 353,1633. Préparation 6 : 6-aminohexanamide-valine-citrulline- p -aminobenzoyle carbamate de MMAE, sel de TFA (6) (6) L’acide 6-(Fmoc-amino)hexanoïque (5) (11,8 mg ; 0,034 mmol ; 2,0 éq) a été dissous dans du DMF anhydre (300 μL), la solution a été refroidie à 0 °C, puis le HATU (25,5 mg ; 0,067 mmol ; 4,0 éq) et la 2,6-lutidine (5,8 μL ; 0,050 mmol ; 3,0 éq) ont été ajoutés. La solution d’activation a été agitée sous argon à 0 °C pendant 15 min. Une solution de sel d’acide trifluoroacétique de valine-citrulline- p -aminobenzoyle carbamate de MMAE (20,7 mg ; 0,017 mmol ; 1,0 éq), solubilisé dans du DMF anhydre (300 μL) en présence de 2,6-lutidine (5,8 μL ; 0,050 mmol ; 3,0 éq), a été ajoutée au milieu d’activation. Le milieu réactionnel obtenu a été agité sous argon à TA pendant 21h. La pipéridine (120 μL, 20% v/v) a été ajoutée et le milieu réactionnel a été agité sous argon à TA pendant 2h. Le mélange a été dilué par 2 avec du MeOH et purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (t R = 15,8 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 µm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l’eau (solvant A), et de l’acétonitrile (solvant B) ; gradient 20 à 100% de B sur 32 min puis 100% de B sur 6 min à 17,1 mL/min) pour donner (6) (17,2 mg ; 76%) sous la forme d’un lyophilisat blanc. RMN 1 H (300 MHz, DMSO) δ (ppm) 10,14 – 9,95 (m ; 1H) ; 8,41 – 8,26 (m ; 1H) ; 8,19 – 8,06 (m ; 1H) ; 7,91 (d ; J = 8,7 Hz ; 1H) ; 7,83 (d ; J = 8,7 Hz ; 1H) ; 7,76 – 7,53 (m ; 5H) ; 7,40 – 7,22 (m ; 5H) ; 7,21 – 7,12 (m ; 1H) ; 6,01 (s ; 1H) ; 5,43 (s ; 3H) ; 5,18 – 4,91 (m ; 3H) ; 4,82 – 4,56 (m ; 2H) ; 4,52 – 4,34 (m ; 3H) ; 4,32 – 4,15 (m ; 3H) ; 4,08 – 3,89 (m ; 4H) ; 3,35 – 3,27 (m ; 1H) ; 3,27 – 3,08 (m ; 8H) ; 3,08 – 2,92 (m ; 4H) ; 2,91 – 2,82 (m ; 3H) ; 2,82 – 2,71 (m ; 3H) ; 2,47 – 2,34 (m ; 3H) ; 2,33 – 2,22 (m ; 2H) ; 2,22 – 2,06 (m ; 4H) ; 2,05 – 1,87 (m ; 2H) ; 1,87 – 1,63 (m ; 4H) ; 1,62 – 1,42 (m ; 6H) ; 1,39 – 1,21 (m ; 4H) ; 1,08 – 0,94 (m ; 6H) ; 0,94 – 0,52 (m ; 21H). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C 64 H 105 N 11 O 13 [M] : 1235,7893 ; observée 1235,7889. Exemple 1 : 2,3-bis(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)propanoate de méthyle (11) Schéma réactionnel général (a) Bn 2 NH, EtOH, 1h30, 71 °C; (b) H 2 , Pd(OH) 2 /C, 1,1,2-trichloroéthane, MeOH, 64h, TA; (c) HATU, 2,6-lutidine, DIPEA, DMF, composé 4 , 22h20, TA; (d) TBAF, THF, 5h30, TA ; (e) PBr 3 , MeCN, 2h15, 45 °C. Etape 1 : 2,3-bis(dibenzylamino) propanoate de méthyle (7) (7) Le 2,3-dibromo propanoate de méthyle racémique (154,4 μL ; 1,22 mmol ; 1,0 éq) a été dissous dans 6 mL d’EtOH absolu. Puis Bn 2 NH (939 μL ; 4,88 mmol ; 4,0 éq) a été ajoutée lentement sous agitation, un précipité s’est formé après environ 1 min. Le milieu réactionnel a été agité sous argon au reflux (71 °C) pendant 1h30. Les sels d’amine ont été filtrés sur fritté. Puis le filtrat a été évaporé sous pression réduite. Le solide beige obtenu a été repris dans du DCM (20 mL) puis un lavage a été réalisé avec de l’eau (2x20 mL) et une solution de NaCl saturée (1x20 mL). La phase organique a ensuite été séchée sur MgSO 4 et concentrée sous pression réduite. Le produit a été purifié par chromatographie flash (SiO 2 , cyclohexane/AcOEt 80:20) pour donner (7) (471 mg ; 81%) sous la forme d’une huile incolore. RMN 1 H (300 MHz, CDCl 3 ) δ 7,38 – 7,14 (m ; 20H 7-11,14-18,21-25,28-32 ) ; 3,82 (d ; J = 14,0 Hz ; 2H 5,12,19,26 ) ; 3,73 (s ; 3H 4 ) ; 3,68 (dd ; J = 8,6, 5,3 Hz ; 1H 2 ) ; 3,55 – 3,37 (m ; 6H 5,12,19,26 ) ; 3,01 (dd ; J = 12,8 ; 8,6 Hz ; 1H 1 ) ; 2,72 (dd ; J = 12,8 ; 5,3 Hz ; 1H 1 ). RMN 13 C (75 MHz, CDCl 3 ) δ 172,7 (1C 3 ) ; 139,7(2C 6,13,20,27 ) ; 139,0 (2C 6,13,20,27 ) 129,1 (4C 7,11,14,18,21,25,28,32 ) ; 129,0 (4C 7,11,14,18,21,25,28,32 ) ; 128,3 (4C 8,10,15,17,22,24,29,31 ) ; 128,2 (4C 8,10,15,17,22,24,29,31 ) ; 127,1 (2C 9,16,23,30 ) ; 127,0 (2C 9,16,23,30 ) ; 60,1 (1C 2 ) ; 58,4 (4C 5,12,19,26 ) ; 55,1 (4C 5,12,19,26 ) ; 54,3 (1C 1 ) ; 51,2 (1C 4 ). SMHR (ESI) : m/z calculée pour C 32 H 35 N 2 O 2 [M+H] + : 479,2693 ; observée 479,2693 Etape 2 : chlorhydrate de 2,3-diaminopropanoate de méthyle (8) (8) Le 2,3-bis(dibenzylamino) propanoate de méthyle (7) (219,6 mg ; 0,459 mmol ; 1,0 éq) a été dissous dans du MeOH (3,5 mL). Du 1,1,2-trichloroéthane (119,6 μL ; 1,29 mmol, 2,8 éq) a été ajouté et la solution a été dégazée avec de l’argon pendant 15 min. Puis du Pd(OH) 2 /C 20% en masse (87,8 mg, 40% m/m) a été ajouté. Le milieu réactionnel a été agité sous atmosphère d’hydrogène à TA pendant 64h. Pd(OH) 2 /C a été filtré sur Dicalite™ puis le filtrat a été concentré sous pression réduite. Le produit (8) (89,8 mg, rendement quantitatif) a été obtenu sous forme d’une huile hétérogène jaune. RMN 1 H (300 MHz, D 2 O) δ 4,38 (dd ; J = 7,9 ; 5,5 Hz ; 1H 2 ) ; 3,75 (s ; 3H 4 ) ; 3,57 – 3,30 (m ; 2H 1 ). RMN 1 H (300 MHz, DMSO) δ 8,69 (s ; 5H 5,6 ) ; 4,40 (t ; J = 6,1 Hz ; 1H 2 ) ; 3,79 (s ; 3H 4 ) ; 3,34 – 3,25 (m, 2H 1 ; sous l’H 2 O du DMSO). RMN 13 C (75 MHz, D 2 O) δ 167,2 (1C 3 ) ; 54,2 (1C 4 ) ; 49,5 (1C 2 ) ; 37,8 (1C 1 ). SMHR (ESI) : m/z calculée pour C 4 H 11 N 2 O 2 [M+H] + : 119,0815 ; observée 119,0815. Etape 3 : 2,3-bis(2,6-bis((( tert -butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)isonicotinamido) propanoate de méthyle (9) (9) Le chlorhydrate de 2,3-diaminopropanoate de méthyle (8) (99,7 mg ; 0,645 mmol ; 1,0 éq) a été dissous dans du DMF anhydre (2,4 mL) et de la DIPEA (381,7 μL ; 2,19 mmol ; 3,4 éq) été ajoutée. Le milieu réactionnel a été agité sous argon à TA pendant 2h20. Puis le mélange d’acide 2,6-bis((( tert -butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)isonicotinique (4) (434,5 mg ; 1,06 mmol ; 1,6 éq) préalablement activé avec du HATU (603,4 mg ; 1,59 mmol ; 2,5 éq) et de la 2,6-lutidine (184,4 μL ; 1,59 mmol ; 2,5 éq) dans du DMF anhydre (4,8 mL) sous agitation et sous argon à TA pendant 2h20, a été ajouté au milieu réactionnel. Le milieu réactionnel a été agité sous argon à TA pendant 20 h. Le DMF a été évaporé sous pression réduite. Puis le produit a été purifié par chromatographie flash (SiO 2 , cyclohexane/acétone, 80:20) pour donner (9) (116,8 mg ; 20%) sous la forme d’une huile incolore. RMN 1 H (300 MHz, DMSO) δ 9,13 (d ; J = 7,3 Hz ; 1H 5 ) ; 8,96 (t ; J = 5,7 Hz ; 1H 26 ) ; 7,67 (s ; 2H 8,11,29,32 ) ; 7,59 (s ; 2H 8,11,29,32 ) ; 4,75 (s ; 4H 12,19,33,40 ) ; 4,74 (s ; 4H 12,19,33,40 ) ; 4,73 – 4,66 (m ; 1H 2 ) ; 3,85 – 3,69 (m ; 2H 1 ) ; 3,64 (s ; 3H 4 ) ; 0,87 (s ; 36H 15-17,23-25,37-39,43-45 ) ; 0,06 (s ; 24H 13,14,20,21,34,35,41,42 ). RMN 13 C (75 MHz, DMSO) δ 175,8 (1C 3 ) ; 171,8 (1C 6,27 ) ; 171,0 (1C 6,27 ) ; 166,1 (2C 9,10,30,31 ) ; 166,0 (2C 9,10,30,31 ) ; 148,6 (1C 7,28 ) ; 147,9 (1C 7,28 ) ; 121,6 (2C 8,11,29,32 ) ; 121,4 (2C 8,11,29,32 ) ; 71,0 (4C 12,19,33,40 ) ; 58,1 (1C 2 ) ; 57,5 (1C 4 ) ; 39,7 sous le DMSO (1C 1 ); 31,2 (12C 15-17,23-25,37-39,43-45 ) ; 23,4 (4C 18,22,36,46 ) ; 0,0 (8C 13,14,20,21,34,35,41,42 ). SMHR (ESI) : m/z calculée pour C 44 H 81 N 4 O 8 Si 4 [M+H] + : 905,5125 ; observée 905,5123 Etape 4 : 2,3-bis(2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinamido)propanoate de méthyle (10) (10) Le 2,3-bis(2,6-bis((( tert -butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)isonicotinamido)propanoate de méthyle (9) (26,5 mg ; 0,029 mmol ; 1,0 éq) a été dissous dans le THF (310 μL) et une solution de TBAF à 1 M dans du THF (164 μL ; 0,164 mmol ; 5,6 éq) a été ajoutée. Le milieu réactionnel a été agité sous argon à TA (23 °C) pendant 5h30. Le THF a été évaporé sous pression réduite. Le brut a été solubilisé dans un mélange de MeCN (1 mL), d’eau (0,1 mL), de DMF (0,1 mL) et de DMSO (0,1 mL) et purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (t R = 7,1 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe), ECOM TOYDAD600 (détecteur UV), SEDEX FP SAGA (détecteur DEDL)] détection UV à 254 nm à 25 °C et DEDL à 60 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 μm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% d’acide trifluoroacétique (en volume) dans l’eau (solvant A), et de l’acétonitrile (solvant B) ; gradient 5 à 60% de B sur 40 min puis de 60 à 100% de B sur 5 min puis 100% de B sur 5 min à 17,1 mL/min) pour donner (10) (10,7 mg ; 80%) sous la forme d’un solide blanc. RMN 1 H (300 MHz, CD 3 OD) δ 7,90 (s ; 2H 8,11,19,22 ) ; 7,86 (s ; 2H 8,11,19,22 ) ; 5,00 – 4,91 (m ; 1H 2 ) ; 4,81 (s ; 4H 12,14, 23,25 ) ; 4,79 (s ; 4H 12,14, 23,25 ) ; 4,09 – 3,85 (m ; 2H 1 ) ; 3,80 (s ; 3H 4 ). RMN 13 C (75 MHz, CD 3 OD) δ 171,57 (1C 3 ) ; 168,78 (1C 6, 17 ) ; 167,89 (1C 6, 17 ) ; 162,27 (2C 9,10,20,21 ) ; 162,23 (1C 9,10,20,21 ) ; 145,99 (1C 7,18 ) ; 145,65 (1C 7,18 ) ; 118,63 (2C 8,11,19,22 ) ; 118,53 (2C 8,11,19,22 ) ; 64,55 (2C 12,14, 23,25 ) ; 64,53 (2C 12,14, 23,25 ) ; 54,68 (1C 2 ) ; 53,20 (1C 4 ) ; 41,90 (1C 1 ). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C 20 H 24 N 4 O 8 [M] : 448,1594 ; observée 448,1589. Etape 5 : 2,3-bis(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido) propanoate de méthyle (11) (11) Le 2,3-bis(2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinamido) propanoate de méthyle (10) (5,8 mg ; 0,013 mmol ; 1,0 éq) a été dissous dans du MeCN anhydre (500 μL) puis du PBr 3 (12,1 μL ; 0,13 mmol ; 10,0 éq) a été ajouté lentement. Le milieu réactionnel a été agité à 45 °C pendant 2h15. La solution a été refroidie à 0 °C, neutralisée avec de l’eau (1 mL) et extraite à l’AcOEt (3x5 mL). Les phases organiques combinées ont été lavées avec une solution de NaCl saturée, séchées sur MgSO 4 et concentrées sous pression réduite. Le produit (11) (7,1 mg ; 79%) a été obtenu sous la forme d’un solide blanc. RMN 1 H (300 MHz, CD 3 OD) δ 7,82 (s ; 2H 8,11,17,20 ) ; 7,78 (s ; 2H 8,11,17,20 ) ; 4,93 (dd ; J = 7,7 ; 5,0 Hz ; 1H 2 ) ; 4,65 (s ; 4H 12,13,21,22 ) ; 4,63 (s ; 4H 12,13,21,22 ) ; 3,99 (dd ; J = 13,9 ; 5,0 Hz ; 1H 1 ) ; 3,90 (dd ; J = 13,9 ; 7,7 Hz ; 1H 1 ) ; 3,80 (s ; 3H 4 ). RMN 13 C (75 MHz, CD 3 OD) δ 171,54 (1C 3 ) ; 168,12 (1C 6, 15 ) ; 167,25 (1C 6, 15 ) ; 159,55 (2C 9,10,18,19 ) ; 159,52(2C 9,10,18,19 ) ; 145,57 (1C 7,16 ) ; 145,19 (1C 7,16 ) ; 121,98 (2C 8,11,17,20 ) ; 121,87 (2C 8,11,17,20 ) ; 54,57 (1C 2 ) ; 53,22 (1C 4 ) ; 41,89 (1C 1 ) ; 33,27 (2C 12,13,21,22 ) ; 33,26 (2C 12,13,21,22 ). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C 20 H 20 Br 4 N 4 O 4 [M] : 695,8218 ; observée 695,8194. Exemple 2 : conjugué trastuzumab – composé (11) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (8,0 éq), Composé (11) (12,0 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH. Méthode Réaction de bioconjugaison 1. Analyse SMHR dénaturante Les résultats sont présentés dans le Tableau 1 ci-dessous. LHHL LH Intensité (%) MM (Da) 1 écart de masse par rapport à l'attendu (Da) Intensité (%) MM (Da) 1 écart de masse par rapport à l'attendu (Da) MAR 0 n.o. 2 n.o. 2 MAR 1 n.o. 2 100 72956 -9 MAR 2 100 145916 -15 n.o. 2 MAR 3 n.o. 2 n.o. 2 MAR moyen 2,00 1,00 1 : masse moléculaire de l’espèce déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 2,00 pour l’espèce LHHL et un MAR moyen de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en condition dénaturante non réductrice et réductrice Les résultats sont présentés dans le Tableau 2 ci-dessous. Espèces DTT LHHL LHH HH LH H L Densité optique (%) - 54 n.o. 1 n.o. 1 46 n.o. 1 n.o. 1 + 55 n.o. 1 n.o. 1 45 n.o. 1 n.o. 1 1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 55% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 2,00. Exemple 3 : 3-(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)-2-((2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)méthyl)propanoate de méthyle (16) et acide 3-(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)-2-((2,6-bis(bromométhyl)-isonicotinamido)méthyl)propanoïque (17) Schéma réactionnel général (a) BnNH 2 , DIPEA, CHCl 3 , 16h25, 0 °C puis TA ; (b) H 2 , Pd(OH) 2 /C, 1,1,2-trichloroéthane, MeOH, 62h, TA; (c) HATU, 2,6-lutidine, DMF, composé 4 , 5h, TA ; (d) TBAF, THF, 7h30, TA ; (e) PBr 3 , MeCN, 2h30, 45 °C ; (f) LiOH, THF, H 2 O, 2h10, TA. Etape 1 : 3-(benzylamino)-2-((benzylamino)méthyl)propanoate de méthyle (12), sel double de TFA (12) Le 3-bromo-2-(bromométhyl)propanoate de méthyle (549 μL ; 3,85 mmol ; 1,0 éq) a été dissous dans du CHCl 3 anhydre (9,6 mL). Puis la benzylamine (1,68 mL ; 15,4 mmol ; 4,0 éq) a été ajoutée goutte à goutte sous agitation à 0 °C. Un précipité a été observé. Le milieu réactionnel a été agité sous argon à 0 °C pendant 25 min. Puis de la DIPEA (1,41 mL ; 8,1 mmol ; 2,1 éq) a été ajoutée au milieu réactionnel goutte à goutte, la disparition du précipité a été observée. Le milieu réactionnel a été agité sous argon à TA pendant 16h. Le CHCl 3 a été évaporé sous pression réduite. Le résidu a été repris dans de l’AcOEt (15 mL), puis un lavage a été réalisé avec de l’eau (5x15 mL) et une solution de NaCl saturée (1x20 mL). La phase organique a ensuite été séchée sur MgSO 4 et concentrée sous pression réduite. Le produit a ensuite été salifié en chlorhydrate : il a été solubilisé dans du MeOH (38 mL), puis une solution de HCl à 1,25 M dans EtOH (9,23 mL ; 11,5 mmol, 3,0 éq) a été ajoutée sous agitation à 0 °C. Le MeOH a été évaporé sous pression réduite. Le brut a été solubilisé dans un mélange de MeOH (9 mL) et de DMF (100 μL) et purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (t R = 14,5 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe), ECOM TOYDAD600 (détecteur UV), détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 μm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l’eau (solvant A), et de MeCN (solvant B) ; gradient 5 à 60% de B sur 40 min puis de 60 à 100% de B sur 5 min puis 100% de B sur 5 min à 17,1 mL/min) pour donner (12) (875 mg ; 42%) sous la forme d’une huile incolore. RMN 1 H (300 MHz, CDCl 3 ) δ 7,39 (s ; 10H 9-13,17-21 ) ; 4,13 (d ; J = 13,1 Hz ; 2H 7,15 ) ; 4,07 (d ; J = 13,0 Hz ; 2H 7,15 ) ; 3,64 (s ; 3H 4 ) ; 3,63 – 3,57 (m ; 1H 2 ) ; 3,41 – 3,22 (m ; 4H 1, 5 ) RMN 13 C (75 MHz, CDCl 3 ) δ 170,4 (1C 3 ) ; 130,1 (4C 9,10,12,13,17,18,20,21 ) ; 130,1 (2C 11,19 ) ; 129,6 (2C 8,16 ) ; 129,5 (4C 9,10,12,13,17,18, 20,21 ) ; 53,5 (1C 4 ) ; 52,5 (2C 7,15 ) ; 45,7 (2C 1,5 ) ; 40,0 (1C 2 ). RMN 19 F (282 MHz, CDCl 3 ) δ -75,75 (s, TFA). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C 19 H 24 N 2 O 2 [M] : 312,1838 ; observée : 312,1834. Etape 2 : 3-amino-2-(aminométhyl)propanoate de méthyle, sel double de TFA (0,6) et de HCl (1,4) (13) (13) Le 3-(benzylamino)-2-((benzylamino)méthyl)propanoate de méthyle (12) (814,5 mg ; 1,51 mmol ; 1,0 éq) a été dissous dans du MeOH (16 mL). Du 1,1,2-trichloroéthane (393 μL ; 4,23 mmol, 2,8 éq) a été ajouté et la solution a été dégazée avec de l’argon pendant 15 min. Puis du Pd(OH) 2 /C 20% en masse (327,2 mg, 40% m/m) a été ajouté. Le milieu réactionnel a été agité sous atmosphère d’hydrogène à TA pendant 62h. Le Pd(OH) 2 /C a été filtré sur Dicalite™ puis le filtrat a été concentré sous pression réduite. Le produit (13) (376,1 mg, 99%) salifié (1,4 HCl ; 0,6 TFA, dosage RMN) a été obtenu sous forme d’une huile hétérogène brune. RMN 1 H (300 MHz, D 2 O) δ 3,72 (s ; 3H 4 ) ; 3,35 – 3,09 (m ; 5H 1,2,5 ). RMN 1 H (300 MHz, DMSO) δ 8,16 (s ; 6H 6,7 ) ; 3,71 (s ; 3H 4 ) ; 3,16 (s ; 1H 2 ) ; 3,14 (s ; 4H 1, 5 ). RMN 19 F (282 MHz, D 2 O) δ -75,68 (s ; TFA). RMN 13 C (75 MHz, D 2 O) δ 171,64 (1C 3 ) ; 53,46 (1C 4 ) ; 40,25 (1C 2 ) ; 38,09 (2C 1,5 ). SMHR (ESI) : m/z calculée pour C 5 H 13 N 2 O 2 [M+H] + : 133,0972 ; observée 133,0973. Etape 3 : 3-(2,6-bis((( tert -butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)isonicotinamido)-2-((2,6-bis((( tert -butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)isonicotinamido)méthyl)-propanoate de méthyle (14) (14) L’acide 2,6-bis((( tert -butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)isonicotinique (4) (291,1 mg ; 0,707 mmol ; 2,5 éq) a été activé avec du HATU (323,6 mg ; 0,851 mmol ; 3,0 éq) et de la 2,6-lutidine (231 μL ; 1,98 mmol ; 7,0 éq) dans du DMF anhydre (2,7 mL) sous agitation et sous argon à TA (24 °C) pendant 1h15. Puis le 3-amino-2-(aminométhyl)propanoate de méthyle salifié (0,6 TFA ; 1,4 HCl) (71 mg, 0,282 mmol, 1,0 éq) solubilisé dans du DMF anhydre (0,8 mL) a été ajouté au milieu réactionnel. Le milieu réactionnel a été agité sous argon à TA pendant 3h45. Le DMF a été évaporé sous pression réduite. Puis le produit a été purifié par chromatographie flash (SiO 2 , cyclohexane/AcOEt, 70:30) pour donner (14) (112,9 mg ; 44%) sous la forme d’une laque incolore. RMN 1 H (300 MHz, DMSO) δ 8,89 (t ; J = 5,8 Hz, 2H 6,27 ) ; 7,61 (s ; 4H 9,12,30,33 ) ; 4,76 (s ; 8H 13,20,34,41 ) ; 3,58 (s ; 3H 4 ) ; 3,55 – 3,42 (m ; 4H 1,5 ) ; 3,03 (p ; J = 7,6 Hz ; 1H 2 ) ; 0,91 (s ; 36H 17-19,24-26,38-40,45-47 ) ; 0,09 (s ; 24H 14,15,21,22,35,36,42,43 ) RMN 13 C (75 MHz, DMSO) δ 172,5 (1C 3 ) ; 165,8 (2C 7,28 ) ; 160,6 (4C 10,11,31,32 ) ; 143,3 (2C 8, 29 ) ; 116,0 (4C 9,12,30,33 ) ; 65,5 (4C 13,20,34,41 ) ; 51,6 (1C 4 ) ; 44,7 (1C 2 ) ; 38,7 sous le DMSO (2C 1,5 ) ; 25,8 (12C 17-19,24-26,38-40,45-47 ) ; 18,0 (4C 16,23,37,44 ) ; -5,4 (8C 14,15,21, 22,36,35,42,43 ). SMHR (ESI) : m/z calculée pour C 45 H 82 N 4 O 8 Si 4 [M+H] + : 919,5282 ; observée 919,5288. Etape 4 : 3-(2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinamido)-2-((2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinamido)méthyl)propanoate de méthyle (15) (15) Le 3-(2,6-bis((( tert -butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)isonicotinamido)-2-((2,6-bis((( tert -butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)isonicotinamido)méthyl)propanoate de méthyle (14) (260,9 mg ; 0,284 mmol ; 1,0 éq) a été dissous dans le THF (2,0 mL) et une solution de TBAF à 1 M dans du THF (1,30 mL ; 1,31 mmol ; 4,6 éq) a été ajoutée. Le milieu réactionnel a été agité sous argon à TA (25 °C) pendant 7h30. Le THF a été évaporé sous pression réduite. Le brut a été solubilisé dans du MeOH (4 mL) et purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (t R = 9,1 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe), ECOM TOYDAD600 (détecteur UV), SEDEX FP SAGA (détecteur DEDL)] détection UV à 254 nm à 25 °C et DEDL à 60 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 μm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l’eau (solvant A), et du MeCN (solvant B) ; gradient 5 à 60% de B sur 40 min puis de 60 à 100% de B sur 5 min puis 100% de B sur 5 min à 17,1 mL/min) pour donner (15) (95,1 mg ; 72%) sous la forme d’un solide blanc. RMN 1 H (300 MHz, DMSO) δ 9,00 (t ; J = 5,7 Hz ; 2H 6,17 ) ; 7,77 (s ; 4H 9,12,20,23 ) ; 4,62 (s ; 8H 13,15,24,26 ) ; 3,60 (s ; 3H 4 ) ; 3,58 – 3,43 (m ; 4H 1,5 ) ; 3,06 (p ; J = 6,6 Hz ; 1H 2 ). RMN 13 C (75 MHz, DMSO) δ 172,6 (1C 3 ) ; 165,3 (2C 7,18 ) ; 161,4 (4C 10,11,21,22 ) ; 143,3 (2C 8,19 ) ; 116,4 (4C 9,12,23,20 ) ; 63,5 (4C 13,15,24,26 ) ; 51,8 (1C 4 ) ; 44,7 (1C 2 ) ; 39,2 sous le DMSO (2C 1,5 ). SMHR (ESI) : m/z calculée pour C 21 H 27 N 4 O 8 [M+H] + : 463,1823 ; observée 463,1819. Etape 5 : 3-(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)-2-((2,6-bis(bromométhyl)-isonicotinamido)méthyl)propanoate de méthyle (16) (16) Le 3-(2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinamido)-2-((2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinamido)-méthyl)propanoate de méthyle (15) (86,3 mg ; 0,187 mmol ; 1,0 éq) a été mis en suspension dans du MeCN anhydre (4,3 mL) puis du PBr 3 (105 μL ; 1,12 mmol ; 6,0 éq) a été ajouté goutte à goutte. Le milieu réactionnel a été agité à 45 °C pendant 2h30. La solution a été refroidie à 0 °C, neutralisée avec de l’eau (6 mL) et extraite à l’AcOEt (3x20 mL). Les phases organiques combinées ont été lavées avec une solution saturée de NaCl, séchées sur MgSO 4 et concentrées sous pression réduite. Le brut a été solubilisé dans un mélange de MeOH (2,9 mL) et de DMF (1,2 mL) et purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (t R = 30,26 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe), ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 μm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l’eau (solvant A), et du MeCN (solvant B) ; gradient 30 à 80% de B sur 49 min puis de 80 à 100% de B sur 2 min puis 100% de B sur 3 min à 17,1 mL/min) pour donner le produit (16) (64,7 mg ; 49%) a été obtenu sous la forme d’un solide légèrement bleuté. RMN 1 H (300 MHz, CD 3 OD) δ 8,93 (t ; J = 5,8 Hz ; 2H 6,15 ) ; 7,81 (s ; 4H 9,12,18,21 ) ; 4,65 (s ; 8H 13,14,22,23 ) ; 3,74 (s ; 3H 4 ) ; 3,73 – 3,67 (m ; 4H 1,5 ) ; 3,13 (p ; J = 6,7 Hz ; 1H 2 ). RMN 13 C (75 MHz, CD 3 OD) δ 159,5 (4C 11,10,19,20 ) ; 145,7 (2C 8,17 ) ; 121,8 (4C 9,12,18,21 ) ; 52,8 (1C 4 ) ; 46,3 (1C 2 ) ; 40,3 (2C 1,5 ) ; 33,2 (4C 13,14,22,23 ) ; C 3 , C 7 et C 16 non observés. SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C 21 H 22 N 4 O 4 Br 4 [M] : 709,8374 ; observée 709,8349. Etape 6 : acide 3-(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)-2-((2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)méthyl)propanoïque (17) (17) Le 3-(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)-2-((2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)-méthyl)propanoate de méthyle (16) (56,8 mg ; 0,080 mmol ; 1,0 éq) a été dissous dans le THF (4,4 mL) et une solution de LiOH hydraté (4,8 mg ; 0,199 mmol ; 2,5 éq) dans l’eau (1,99 mL) a été ajoutée doucement. Le milieu réactionnel a été agité à TA (25 °C) pendant 2h10. Le milieu réactionnel a été acidifié à 0 °C avec une solution aqueuse d’HCl 0,1N puis extrait avec de l’AcOEt (4x10 mL). Les phases organiques rassemblées ont été lavées avec une solution saturée de NaCl, séchées sur MgSO 4 et concentrées sous pression réduite. Le brut a été solubilisé dans un mélange de MeOH (1,7 mL) et de DMF (0,7 mL) et purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (t R = 31,13 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe), ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 μm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l’eau (solvant A), et du MeCN (solvant B) ; gradient 20 à 60% de B sur 33 min puis de 60 à 100% de B sur 2 min puis 100% de B sur 2 min à 17,1 mL/min) pour donner le produit (17) (33,6 mg ; 60%) a été obtenu sous la forme d’un lyophilisat blanc. RMN 1 H (300 MHz, CD 3 OD) δ 8,96 (t ; J = 5,7 Hz ; 2H 6,15 ) ; 7,83 (s ; 4H 9,12,18,21 ) ; 4,65 (s ; 8H 13,14,22,23 ) ; 3,82 – 3,61 (m ; 4H 1,5 ) ; 3,18 – 3,04 (m ; 1H 2 ). RMN 13 C (75 MHz, CD 3 OD) δ 175,6 (1C 3 ) ; 167,5 (1C 7,16 ) ; 159,5 (4C 11,10,19,20 ) ; 145,7 (2C 8,17 ) ; 121,9 (4C 9,12,18,21 ) ; 46,1 (1C 2 ) ; 40,4 (2C 1,5 ) ; 33,2 (4C 13,14,22,23 ). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C 21 H 22 N 4 O 4 Br 4 [M] : 695,8290 ; observée 695,8218. Exemple 4 : conjugué trastuzumab – composé (16) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 2 (8,0 éq), Composé (16) (12,0 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH. Méthode Réaction de bioconjugaison 1. Dans ce cas, le réducteur 2 a été éliminé par purification sur membrane (10 kDa) avant l’ajout du composé (16) . Analyse SMHR dénaturante Les résultats sont présentés dans le Tableau 3 ci-dessous. LHHL LH Intensité (%) MM (Da) 1 Intensité (%) MM (Da) 1 MAR 0 n.o. 2 n.o. 2 MAR 1 n.o. 2 96 72979 MAR 2 100 145958 4 73370 MAR 3 n.o. 2 n.o. 2 MAR moyen 2,00 1,06 1 : masse moléculaire de l’espèce déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 2,00 pour l’espèce LHHL et un MAR moyen de 1,06 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en condition dénaturante non réductrice et réductrice Les résultats sont présentés dans le Tableau 4 ci-dessous. Espèces LHHL LHH HH LH H L Densité optique (%) 75 n.o. 1 n.o. 1 25 n.o. 1 n.o. 1 1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions non réductrices un MAR moyen de 2,03. Exemple 5 : conjugué nivolumab – composé (16) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, nivolumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 2 (8,0 éq), Composé (16) (6,0 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH. Méthode Réaction de bioconjugaison 1. Dans ce cas, le réducteur 2 a été éliminé par purification sur membrane (10 kDa) avant l’ajout du composé (16) . Analyse SMHR dénaturante Les résultats sont présentés dans le Tableau 5 ci-dessous. LHHL LH L Intensité (%) MM (Da) 1 Intensité (%) MM (Da) 1 Intensité (%) MM (Da) MAR 0 n.o. 2 n.o. 2 100 23337 MAR 1 36 143735 99 72064 n.o. 2 MAR 2 64 144132 1 72455 n.o. 2 MAR 3 n.o. 2 n.o. 2 n.o. 2 MAR moyen 1,64 1,01 0,00 1 : masse moléculaire de l’espèce déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 1,64 pour l’espèce LHHL et un MAR moyen de 1,01 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH et H n’ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en condition dénaturante non réductrice et réductrice Les résultats sont présentés dans le Tableau 6 ci-dessous. Espèces DTT LHHL LHH HH LH H L Densité optique (%) - 70 n.o. 1 n.o. 1 30 n.o. 1 n.o. 1 + 79 n.o. 1 n.o. 1 21 n.o. 1 n.o. 1 1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 79% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 1,75. Exemple 6 : conjugué trastuzumab – composé (16) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 10 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (7,0 éq), Composé (16) (10,6 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH. Méthode Réaction de bioconjugaison 2. Analyse SMHR dénaturante Les résultats sont présentés dans le Tableau 7 ci-dessous. LHHL LH L Intensité (%) MM (Da) 1 Intensité (%) MM (Da) 1 Intensité (%) MM (Da) MAR 0 n.o. 2 n.o. 2 100 23439 MAR 1 71 145564 100 72979 n.o. 2 MAR 2 29 145957 n.o. 2 n.o. 2 MAR 3 n.o. 2 n.o. 2 n.o. 2 MAR moyen 1,29 1,00 0,00 1 : masse moléculaire de l’espèce déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 1,29 pour l’espèce LHHL et un MAR moyen de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH et H n’ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en condition dénaturante non réductrice et réductrice Les résultats sont présentés dans le Tableau 8 ci-dessous. Espèces DTT LHHL LHH HH LH H L Densité optique (%) - 100 n.o. 1 n.o. 1 n.o. 1 n.o. 1 n.o. 1 + 100 n.o. 1 n.o. 1 n.o. 1 n.o. 1 n.o. 1 1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 100% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 1,29. Exemple 7 : conjugué trastuzumab – composé (17) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (8,0 éq), Composé (17) (12,0 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH. Méthode Réaction de bioconjugaison 1. Analyse SMHR dénaturante Les résultats sont présentés dans le Tableau 9 ci-dessous. LHHL LH Intensité (%) MM (Da) 1 Intensité (%) MM (Da) 1 MAR 0 n.o. 2 n.o. 2 MAR 1 n.o. 2 96 72967 MAR 2 75 145934 4 73344 MAR 3 25 146315 n.o. 2 MAR moyen 2,25 1,04 1 : masse moléculaire de l’espèce déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 2,25 pour l’espèce LHHL et un MAR moyen de 1,04 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en condition dénaturante non réductrice Les résultats sont présentés dans le Tableau 10 ci-dessous. Espèces DTT LHHL LHH HH LH H L Densité optique (%) - 48 n.o. 1 n.o. 1 52 n.o. 1 n.o. 1 + 54 n.o. 1 n.o. 1 46 n.o. 1 n.o. 1 1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 54% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 2,16. Exemple 8 : N -(2-((((2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)carbonyl)amino)-méthyl)-19-(11,12-didéhydrodibenzo[ b , f ]azocin-5(6 H )-yl)-3,14,19-trioxo-7,10-dioxa-4,13-diazanonadec-1-yl)-2,6-bis(bromométhyl)pyridine-4-carboxamide (20) et 6-azidohexanamido- N -hexanamide-valine-citrulline- p -aminobenzoyle carbamate de MMAE (22) Schéma réactionnel général (a) NH 2 -PEG 2 -(CH 2 ) 2 NH 2 , HATU, 2,6-lutidine, DMF, 1h40, TA ; (b) TFA, DCM, 2h20, TA ; (c) composé (17) , EEDQ, DIPEA, DMF, MeCN, 2h, 25 °C ; (d) NaN 3 , DMF, 16h, 100 °C ; (e) TFA.NH 2 -val-cit-PABC-MMAE, HATU, 2,6-lutidine, DMF, 15h, 0 °C à TA. Etape 1 : tert -butyl (2-(2-(2-((6-(11,12-didéhydrodibenzo[ b , f ]azocin-5(6 H )-yl)-6-oxohexanoyl)amino)éthoxy)éthoxy)éthyl)carbamate (18) (18) L’acide 6-(11,12-didéhydrodibenzo[ b , f ]azocin-5(6 H )-yl)-6-oxohexanoïque (32,1 mg ; 0,104 mmol ; 1,2 éq) a été mis en suspension dans le DMF anhydre (750 μL). Puis le HATU (66,6 mg ; 0,175 mmol ; 2,0 éq) et la 2,6-lutidine (26,2 μL ; 0,225 mmol ; 2,6 éq) ont été ajoutés. La solution d’activation a été agitée sous argon à TA (19 °C) pendant 10 min. Puis du tert -butyl (2-(2-(2-aminoéthoxy)éthoxy)éthyl)carbamate (20,6 μL ; 0,087 mmol ; 1,0 éq) a été ajouté au milieu d’activation lentement. Le milieu réactionnel obtenu a été agité sous argon à TA pendant 1h30. Le DMF a été évaporé sous pression réduite. Puis le produit a été purifié par chromatographie flash (SiO 2 , DCM/MeOH, 95:5) pour donner (18) (55,6 mg ; conversion 100%, P RMN : 81%) sous la forme d’une huile jaune. RMN 1 H (300 MHz, CD 3 OD) δ 7,67 – 7,61 (m ; 1H ar ) ; 7,51 – 7,42 (m ; 4H ar ) ; 7,39 – 7,27 (m ; 2H ar ) ; 7,26 – 7,21 (m ; 1H ar ) ; 5,12 (d ; J = 13,9 Hz ; 1H 12 ) ; 3,68 (d ; J = 13,9 Hz ; 1H 12 ) ; 3,56 (s ; 4H 25,26 ) ; 3,51 – 3,43 (m ; 4H 24,27 ) ; 3,26 (t ; J = 4,7 Hz ; 2H 23 ) ; 3,19 (t ; J = 5,6 Hz ; 2H 28 ) ; 2,26 – 2,12 (m ; 1H 17,20 ) ; 2,01 – 1,88 (m ; 3H 17,20 ) ; 1,41 (s ; 9H 32-34 ) ; 1,36 – 1,19 (m ; 4H 18-19 ). RMN 13 C (75 MHz, CD 3 OD) δ 175,8 (1C 21 ) ; 175,3 (1C 16 ) ; 153,0 (1C 11,13,14,15 ) ; 149,5 (1C 11,13,14,15 ) ; 133,5 (1C ar ) ; 130,4 (1C ar ) ; 129,9 (1C ar ) ; 129,7 (1C 30 ) ; 129,6 (1C ar ) ; 129,2 (1C ar ) ; 128,9 (1C ar ) ; 128,1 (1C ar ) ; 126,5 (1C ar ) ; 124,3 (1C 11,13,14,15 ) ; 123,7 (1C 11,13,14,15 ) ; 115,8 (1C 5-6 ) ; 108,9 (1C 5-6 ) ; 71,3 (2C 25-26 ) ; 71,1(1C 31 ) ; 70,6 (2C 24-27 ) ; 56,6 (1C 12 ) ; 41,2 (1C 28 ) ; 40,3 (1C 23 ) ; 36,5 (1C 17-20 ) ; 35,6 (1C 17-20 ) ; 28,8 (3C 32-34 ) ; 26,2 (1C 18-19 ) ; 25,9 (1C 18-19 ). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C 32 H 41 N 3 O 6 [M] : 563,2995 ; observée 563,5991. Etape 2 : N -(2-(2-(2-aminoéthoxy)éthoxy)éthyl)-6-(11,12-didéhydro-dibenzo[ b , f ]azocin-5(6 H )-yl)-6-oxohexanamide, sel de TFA (19) (19) Le tert -butyl (2-(2-(2-((6-(11,12-didéhydrodibenzo[ b , f ]azocin-5(6 H )-yl)-6-oxohexanoyl)-amino)éthoxy)éthoxy)éthyl)carbamate (52,2 mg ; 0,093 mmol ; 1,0 éq) a été dissous du DCM (930 μL). Puis du TFA (93,0 μL ; 10% v/v) a été ajouté. Le milieu réactionnel obtenu a été agité à TA pendant 2h20. Le milieu réactionnel a été concentré sous pression réduite et purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (t R = 20,06 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 μm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l’eau (solvant A), et du MeCN (solvant B) ; gradient 20 à 60% de B sur 33 min puis 60 à 100% de B sur 2 min et 100% de B sur 2 min à 17,1 mL/min) pour donner (19) (21,3 mg ; 40%) sous la forme d’une huile légèrement rose. RMN 1 H (300 MHz, CD 3 OD) δ 7,69 – 7,63 (m ; 1H ar ) ; 7,54 – 7,43 (m ; 4H ar ) ; 7,41 – 7,30 (m ; 2H ar ) ; 7,28 – 7,23 (m ; 1H ar ) ; 5,13 (d ; J = 13,9 Hz ; 1H 12 ) ; 3,71 (d ; J = 13,9 Hz ; 1H 12 ) ; 3,68 – 3,62 (m ; 2H 27 ) ; 3,63 – 3,57 (m ; 4H 25,26 ) ; 3,49 (t ; J = 5,8 Hz ; 3H 24 ) ; 3,31 – 3,26 (m ; 2H 23 ) ; 3,08 (t ; 2H 28 ) ; 2,30 – 2,13 (m ; 1H 17,20 ) ; 1,98 (t ; J = 7,0 Hz ; 2H 17,20 ) ; 1,95 – 1,87 (m ; 1H 17,20 ) ; 1,45 – 1,20 (m ; 4H 18-19 ). RMN 13 C (75 MHz, CD 3 OD) δ 175,9 (1C 21 ) ; 175,3 (1C 16 ) ; 152,9 (1C 11,13,14,15 ) ; 149,5 (1C 11,13,14,15 ) ; 133,5 (1C ar ) ; 130,4 (1C ar ) ; 130,0 (1C ar ) ; 129,7 (1C ar ) ; 129,2 (1C ar ; 128,9 (1C ar ) ; 128,1 (1C ar ) ; 126,5 (1C ar ) ; 124,4 (1C 11,13,14,15 ) ; 123,7 (1C 11,13,14,15 ) ; 115,7 (1C 5-6 ) ; 108,8 (1C 5-6 ) ; 71,4 (1C 25-26 ) ; 71,3 (1C 25-26 ) ; 70,6 (1C 24 ) ; 67,9 (1C 27 ) ; 56,6 (1C 12 ) ; 40,7 (1C 28 ) ; 40,1 (1C 23 ) ; 36,5 (1C 17-20 ) ; 35,6 (1C 17-20 ) ; 26,2 (1C 18-19 ) ; 25,9 (1C 18-19 ). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C 29 H 34 N 3 O 6 [M] : 463,2471 ; observée 463,2466. Etape 3 : N -(2-((((2,6-bis(bromométhyl)pyridin-4-yl)carbonyl)amino)méthyl)-19-(11,12-didéhydrodibenzo[ b , f ]azocin-5(6 H )-yl)-3,14,19-trioxo-7,10-dioxa-4,13-diazanonadec-1-yl)-2,6-bis(bromométhyl)pyridine-4-carboxamide (20) (20) Sous atmosphère inerte, dans l’obscurité et en conditions anhydres, l’acide 3-(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)-2-((2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)méthyl)-propanoïque (17) (20,4 mg ; 0,029 mmol ; 1,7 éq) a été mis en suspension dans du MeCN anhydre (1,98 mL) puis la EEDQ (56,1 mg ; 0,23 mmol ; 13,0 éq) a été ajoutée. Le milieu d’activation a été agité sous argon à 25 °C pendant 30 min. Une solution de sel d’acide trifluoroacétique de N -(2-(2-(2-aminoéthoxy)éthoxy)éthyl)-6-(11,12-didéhydrodibenzo[ b , f ]azocin-5(6 H )-yl)-6-oxohexanamide (19) (10,1 mg ; 0,018 mmol ; 1,0 éq), solubilisé dans du DMF anhydre (1,68 mL) en présence de DIPEA (12,18 μL ; 0,070 mmol ; 4,0 éq), a été ajoutée au milieu d’activation. Puis de la DIPEA (12,18 μL ; 0,070 mmol ; 4,0 éq) a été ajouté au milieu réactionnel. Le milieu réactionnel a été agité sous argon dans l’obscurité et à 25 °C pendant 1h40. Le mélange a été dilué avec du DMF (800 μL) et purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (t R = 29,25 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 μm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l’eau (solvant A), et du MeCN (solvant B) ; gradient 20 à 100% de B sur 37 min puis 100% de B sur 6 min à 17,1 mL/min) pour donner (20) (17,2 mg ; 86%) sous la forme d’un solide blanc. RMN 1 H (300 MHz, CD 3 OD) δ 8,88 (t ; J = 5,9 Hz ; 2H 33,43 ) ; 8,19 (t ; J = 5,8 Hz ; 1H 22,29 ) ; 7,82 (s ; 4H 36,39,46,49 ) ; 7,82 (s ; 1H 22,29 ) ; 7,67 – 7,60 (m ; 1H ar DBCO ) ; 7,54 – 7,40 (m ; 4H ar DBCO ) ; 7,38 – 7,26 (m ; 2H ar DBCO ) ; 7,26 – 7,20 (m ; 1H ar DBCO ) ; 5,12 (d ; J = 13,9 Hz ; 1H 12 ) ; 4,63 (s ; 8H 40,41,50,51 ) ; 3,68 (d ; J = 14,0 Hz ; 1H 12 ) ; 3,64 – 3,56 (m ; 4H 32,42 ) ; 3,55 – 3,44 (m ; 6H 24,25,26,27 ) ; 3,44 – 3,36 (m ; 2H 24,25,26,27 ) ; 3,32 sous MeOH (2H 23 ) ; 3,23 (t ; J = 5,5 Hz ; 2H 28 ) ; 3,09 – 2,97 (m ; 1H 31 ) ; 2,26 – 2,13 (m ; 1H 17-20 ) ; 2,04 – 1,80 (m ; 3H 17-20 ) ; 1,45 – 1,15 (m ; 4H 18-19 ). RMN 13 C (75 MHz, CD 3 OD) δ 167,2 (2C 34,44 ); 159,5 (4C 37,38,47,48 ); 145,7 (2C 35,45 ) ; 133,5 (1C 1-4,7-10 ) ; 130,4 (1C 1-4,7-10 ) ; 130,0 (1C 1-4,7-10 ) ; 129,6 (1C 1-4,7-10 ) ; 129,2 (1C 1-4,7-10 ) ; 128,9 (1C 1-4,7-10 ) ; 128,1 (1C 1-4,7-10 ) ; 126,5 (1C 1-4,7-10 ) ; 121,9 (4C 36,39,46,49 ); 71,3 (1C 23,24,25,26,27,28 ); 71,0 (1C 23,24,25,26,27,28 ); 70,6 (1C 23,24,25,26,27,28 ); 70,5 (1C 23,24,25,26,27,28 ); 56,6 (1C 12 ); 47,3 (1C 31 ); 41,2 (2C 32,42 ); 40,2 (1C 23,24,25,26,27,28 ); 40,1 (1C 23,24,25,26,27,28 ), 36,5 (1C 17-20 ) ; 35,6 (1C 17-20 ) ; 33,3 (4C 40,41,50,51 ); 26,2 (1C 18-19 ); 26,0 (1C 18-19 ). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C 47 H 51 N 7 O 7 Br 4 [M] : 1141,0583 ; observée 1141,0540. Etape 4 : acide 6-azidohexanoïque (21) (21) L’acide 6-bromohexanoïque (100 mg ; 0,513 mmol ; 1,0 éq) a été dissous dans du DMF peptidique (5 mL) et du NaN 3 (167 mg ; 2,56 mmol ; 5,0 éq) a été ajouté. Le milieu réactionnel a été agité à 100 °C pendant 16h. Le DMF a été évaporé sous pression réduite. Le résidu a été repris dans du DCM (20 mL), puis un lavage a été réalisé avec 1x20 mL d’une solution aqueuse d’HCl 0,1 M puis 1x20 mL d’une solution de NaCl saturée. La phase organique a ensuite été séchée sur MgSO 4 et concentrée sous pression réduite. Le produit (21) (81 mg, 100%) a été obtenu sous forme d’une huile opaque blanche. RMN 1 H (300 MHz, CDCl 3 ) δ 8,75 (s ; 1H 7 ) ; 3,28 (t ; J = 6,8 Hz ; 2H 5 ) ; 2,36 (t ; J = 7,3 Hz ; 2H 1 ) ; 1,76 – 1,55 (m ; 4H 2,4 ) ; 1,52 – 1,34 (m ; 2H 3 ). RMN 13 C (75 MHz, CDCl 3 ) δ 179,1 (1C 6 ) ; 51,4 (1C 1 ) ; 34,1 (1C 5 ) ; 28,7 (1C 2 ) ; 26,3 (1C 3 ) ; 24,4(1C 4 ). SMHR (ESI) : m/z calculée pour C 6 H 10 N 3 O 2 [M-H] - : 156,0779 ; observée 156,0779. Etape 5 : 6-azidohexanamido- N -hexanamide-valine-citrulline- p -aminobenzoyle carbamate de MMAE (22) (22) L’acide 6-azidohexanoïque (21) (1,3 mg ; 0,008 mmol ; 2,0 éq) a été dissous dans le DMF anhydre (100 μL), la solution a été refroidie à 0 °C, puis le HATU (6,1 mg ; 0,016 mmol ; 4,0 éq) et la 2,6-lutidine (2,8 μL ; 0,024 mmol ; 6,0 éq) ont été ajoutés. La solution d’activation a été agitée sous argon à 0 °C pendant 15 min. Une solution de sel d’acide trifluoroacétique de valine-citrulline- p -aminobenzoyle carbamate de MMAE (5,0 mg ; 0,004 mmol ; 1,0 éq), solubilisé dans le DMF anhydre (100 μL), a été ajoutée au milieu d’activation. Le milieu réactionnel obtenu a été agité sous argon à TA pendant 15h. Le mélange a été dilué par 4 avec du DMF anhydre et purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (t R = 19,3 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 μm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l’eau (solvant A), et du MeCN (solvant B) ; gradient 20 à 100% de B sur 32 min puis 100% de B sur 6 min à 17,1 mL/min) pour donner (22) (3,8 mg ; 75%) sous la forme d’un solide blanc. RMN 1 H (300 MHz, DMSO) δ 9,99 (s ; 1H) ; 8,31 (s ; 1H) ; 8,09 (d ; J = 7,4 Hz ; 2H) ; 7,87 (dd ; J = 16,9 ; 8,7 Hz ; 2H) ; 7,61 (dd ; J = 15,3 ; 8,5 Hz ; 3H) ; 7,40 – 7,21 (m ; 7H) ; 7,22 – 7,10 (m ; 1H) ; 5,97 (s ; 1H) ; 5,41 (s ; 2H) ; 5,16 – 4,90 (m ; 2H) ; 4,73 (s ; 1H) ; 4,54 – 4,31 (m ; 3H) ; 4,30 – 4,13 (m ; 2H) ; 4,13 – 3,87 (m ; 2H) ; 3,78 (d ; J = 11,4 Hz ; 1H) ; 3,29 (t ; J = 6,9 Hz ; 1H) ; 3,23 (d ; J = 4,8 Hz ; 2H) ; 3,20 (s ; 1H) ; 3,17 (s ; 1H) ; 3,11 (s ; 1H) ; 2,97 (s ; 2H) ; 2,86 (d ; J = 11,1 Hz ; 2H) ; 2,27 (dd ; J = 10,3 ; 8,5 Hz ; 1H) ; 2,23 – 2,05 (m ; 3H) ; 2,05 – 1,89 (m ; 1H) ; 1,87 – 1,63 (m ; 3H) ; 1,53 (dd ; J = 14,1 ; 6,8 Hz ; 6H) ; 1,41 – 1,19 (m ; 4H) ; 1,11 – 0,94 (m ; 6H) ; 0,94 – 0,68 (m ; 26H). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C 64 H 103 N 13 O 13 [M] : 1261,7798 ; observée 1261,7758. Exemple 9 : conjugué trastuzumab – composé (20) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (7,0 éq), Composé (20) (10,6 éq) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH. Méthode Réaction de bioconjugaison 2. Le mélange réactionnel a été purifié sur PD-10 (GE Healthcare) avec du tampon PBS Gibco® pH 7,4. Analyse SMHR dénaturante Les résultats sont présentés dans le Tableau 11 ci-dessous. LHHL LH Intensité (%) MM (Da) 1 Intensité (%) MM (Da) 1 MAR 0 n.o. 2 n.o. 2 MAR 1 13 145996 100 73411 MAR 2 87 146822 n.o. 2 MAR 3 n.o. 2 n.o. 2 MAR moyen 1,87 1,00 1 : masse moléculaire de l’espèce déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 1,87 pour l’espèce LHHL et un MAR moyen de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en condition dénaturante non réductrice Les résultats sont présentés dans le Tableau 12 ci-dessous. Espèces DTT LHHL LHH HH LH H L Densité optique (%) - 92 n.o. 1 n.o. 1 8 n.o. 1 n.o. 1 + 96 n.o. 1 n.o. 1 4 n.o. 1 n.o. 1 1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 96% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 1,88. Exemple 10 : conjugué trastuzumab – composé (20) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (7,0 éq), Composé (20) (10,6 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH. Méthode Réaction de bioconjugaison 2. Analyse SMHR dénaturante Les résultats sont présentés dans le Tableau 13 ci-dessous. LHHL LH L Intensité (%) MM (Da) 1 Intensité (%) MM (Da) 1 Intensité (%) MM (Da) MAR 0 n.o. 2 n.o. 2 3 2343 9 MAR 1 81 145997 100 73411 97 24 261 MAR 2 19 1 46822 n.o. 2 n.o. 2 MAR 3 n.o. 2 n.o. 2 n.o. 2 MAR moyen 1, 19 1,00 0, 97 1 : masse moléculaire de l’espèce déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 1,19 pour l’espèce LHHL et un MAR moyen de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH et H n’ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en condition dénaturante non réductrice Les résultats sont présentés dans le Tableau 14 ci-dessous. Espèces DTT LHHL LHH HH LH H L Densité optique (%) - 94 n.o. 1 n.o. 1 3 n.o. 1 3 + 77 n.o. 1 3 6 7 6 1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 77% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 1,18. Exemple 11 : conjugué trastuzumab – composé (20) - composé (22) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1, composé (20) (1 er composé) à une concentration de 3 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH, composé (22) (2 ème composé) à une concentration de 10 mM dans du DMSO. Méthode Réaction de bioconjugaison 3. Le mélange réactionnel a été purifié sur PD-10 (GE Healthcare) avec du tampon PBS Gibco® pH 7,4. Analyse SMHR dénaturante Les résultats sont présentés dans le Tableau 15 ci-dessous. LHHL LH Intensité (%) MM (Da) 1 Intensité (%) MM (Da) 1 MAR 0 n.o. 2 n.o. 2 MAR 1 n.o. 2 100 74674 MAR 2 100 149347 n.o. 2 MAR 3 n.o. 2 n.o. 2 M AR moyen 2,00 1,00 1 : masse moléculaire de l’espèce déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 2,00 pour l’espèce LHHL et un MAR moyen de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observées. Aucun incrément de masse correspondant au composé (20) n’est observé : le conjugué trastuzumab-composé (20) a été entièrement converti. Analyse gel SDS-PAGE en condition dénaturante non réductrice Les résultats sont présentés dans le Tableau 16 ci-dessous. Espèces DTT LHHL LHH HH LH H L Densité optique (%) - 90 n.o. 1 n.o. 1 10 n.o. 1 n.o. 1 + 97 n.o. 1 n.o. 1 3 n.o. 1 n.o. 1 1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 97% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 2,00. Exemple 12 : conjugué trastuzumab – composé (20) – composé (22) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1, composé (20) (1 er composé) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH, composé (22) (2 ème composé) à une concentration de 10 mM dans du DMSO. Méthode Réaction de bioconjugaison 3. Analyse SMHR dénaturante Les résultats sont présentés dans le Tableau 17 ci-dessous. LHHL LH L Intensité (%) MM (Da) 1 Intensité (%) MM (Da) 1 Intensité (%) MM (Da) MAR 0 n.o. 2 14 72585 100 23439 MAR 1 83 14 7259 86 7 4674 n.o. 2 MAR 2 1 7 14 9352 n.o. 2 n.o. 2 MAR 3 n.o. 2 n.o. 2 n.o. 2 MAR moyen 1,1 7 1,00 0,00 1 : masse moléculaire de l’espèce déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 1,17 pour l’espèce LHHL et un MAR moyen de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observées. Aucun incrément de masse correspondant au composé (20) n’est observé : le conjugué trastuzumab-composé (20) a été entièrement converti. Analyse gel SDS-PAGE en condition dénaturante non réductrice Les résultats sont présentés dans le Tableau 18 ci-dessous. Espèces DTT LHHL LHH HH LH H L Densité optique (%) - 97 n.o. 1 n.o. 1 3 n.o. 1 n.o. 1 + 75 n.o. 1 n.o. 1 8 10 7 1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 75% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 1,19. Exemple 13 : 3-(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)-2-((2,6 bis(bromométhyl)isonicotinamido)méthyl)propamido- N -hexanamide-valine-citrulline- p -aminobenzoyle carbamate de MMAE (23) [Chem46] (23) Sous atmosphère inerte, dans l’obscurité et en conditions anhydres, l’acide 3-(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)-2-((2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)méthyl)-propanoïque (17) (12,0 mg ; 0,017 mmol ; 1,5 éq) a été mis en suspension dans du MeCN anhydre (1,3 mL) puis EEDQ (34,2 mg ; 0,138 mmol ; 12,0 éq) a été ajouté. Le milieu d’activation a été agité sous argon à 25 °C pendant 30 min. Une solution de sel d’acide trifluoroacétique de 6-aminohexanamide-valine-citrulline- p -aminobenzoyle carbamate de MMAE (6) (15,5 mg ; 0,012 mmol ; 1,0 éq), solubilisé dans du DMF anhydre (1,1 mL) en présence de DIPEA (8,0 μL ; 0,046 mmol ; 4,0 éq), a été ajoutée au milieu d’activation. Puis de la DIPEA (8,0 μL ; 0,046 mmol ; 4,0 éq),a été ajouté au milieu réactionnel. Le milieu réactionnel a été agité sous argon dans l’obscurité et à 25 °C pendant 1h30. Le mélange a été dilué avec du DMF (1 mL) et purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (t R = 27,35 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 μm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l’eau (solvant A), et du MeCN (solvant B) ; gradient 20 à 100% de B sur 37 min puis 100% de B sur 6 min à 17,1 mL/min) pour donner (23) (13,9 mg ; 63%) sous la forme d’un solide blanc. RMN 1 H (300 MHz, DMSO) δ 9,99 (s ; 1H) ; 8,91 (t ; J = 5,6 Hz ; 2H) ; 8,32 (s ; 1H) ; 8,10 (d ; J = 7,8 Hz ; 1H) ; 7,98 – 7,89 (m ; 2H) ; 7,87 – 7,82 (m ; 4H) ; 7,73 (d ; J = 8,3 Hz ; 1H) ; 7,67 – 7,51 (m ; 3H) ; 7,41 – 7,22 (m ; 6H) ; 7,18 (t ; J = 7,1 Hz ; 1H) ; 5,97 (t ; J = 5,0 Hz ; 1H) ; 5,42 (s ; 2H) ; 5,02 (dd ; J = 29,8 ; 10,6 Hz ; 1H) ; 4,79 (d ; J = 11,7 Hz ; 1H) ; 4,72 (s ; 8H) ; 4,67 – 4,57 (m ; 1H) ; 4,53 – 4,32 (m ; 2H) ; 4,32 – 4,14 (m ; 2H) ; 4,09 – 3,87 (m ; 2H) ; 3,78 (d ; J = 8,6 Hz ; 3H) ; 3,62 – 3,53 (m ; 2H) ; 3,21 (dd ; J = 14,9 ; 6,2 Hz ; 5H) ; 3,12 (s ; 1H) ; 3,08 – 2,93 (m ; 3H) ; 2,86 (d ; J = 10,4 Hz ; 3H) ; 2,18 – 2,02 (m ; 3H) ; 2,02 – 1,87 (m ; 2H) ; 1,86 – 1,62 (m ; 2H) ; 1,61 – 1,45 (m ; 2H) ; 1,43 – 1,26 (m ; 6H) ; 1,15 (dd ; J = 13,5 ; 7,3 Hz ; 1H) ; 1,01 (dt ; J = 15,2 ; 7,6 Hz ; 5H) ; 0,91 – 0,67 (m ; 25H). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C 84 H 123 N 15 O 16 Br 4 [M] : 1913,6006 ; observée 1913,6059. Exemple 14 : conjugué trastuzumab – composé (23) Réactifs Tampon de bioconjugaison 2, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 2 (8,0 éq), composé (23) (5,0 éq) à une concentration de 0,4 mM dans un mélange de 80% de DMF et 20% de MeOH. Méthode Réaction de bioconjugaison 1. Analyse SMHR dénaturante Les résultats sont présentés dans le Tableau 19 ci-dessous. LHHL LH Intensité (%) MM (Da) 1 Intensité (%) MM (Da) 1 M AR 0 n.o. 2 n.o. 2 M AR 1 n.o. 2 100 7 4184 M AR 2 100 148367 n.o. 2 M AR 3 n.o. 2 n.o. 2 M AR moyen 2,00 1,00 1 : masse moléculaire de l’espèce déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un DAR moyen de 2,00 pour l’espèce LHHL et un DAR moyen de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH, H et L n’ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en condition dénaturante non réductrice Les résultats sont présentés dans le Tableau 20 ci-dessous. Espèces DTT LHHL LHH HH LH H L Densité optique (%) - 68 n.o. 1 n.o. 1 32 n.o. 1 n.o. 1 + 61 n.o. 1 5 27 6 2 1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 61% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 2,00. Exemple 15 : 3,5-bis(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)benzoate de méthyle (26) Schéma réactionnel général (a) HATU, 2,6-lutidine, DMF, 20h, TA; (b) TBAF, THF, 21h, TA; (c) PBr 3 , MeCN, DMF, 7h, 45 °C. Etape 1 : 3,5-bis(2,6-bis((( tert -butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)-isonicotinamido)benzoate de méthyle (24) [Chem48] (24) L’acide 2,6-bis(((tert-butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)isonicotinique (4) (1,39 g ; 3,376 mmol ; 2,5 éq) a été mis en suspension dans le DMF peptidique (8,0 mL), puis le HATU (1,54 g ; 4,050 mmol ; 3,0 éq) et la 2,6-lutidine (0,63 mL ; 5,439 mmol ; 4,0 éq) ont été ajoutés. La solution d’activation a été agitée sous argon à TA (25 °C) pendant 45 min. Puis une solution de 3,5-diaminobenzoate de méthyle (225 mg ; 1,354 mmol ; 1,0 éq), solubilisé dans le DMF peptidique (1,0 mL) a été ajoutée. Le milieu réactionnel a été agité à TA (25 °C) pendant 20h. Le mélange réactionnel a été repris dans l’AcOEt et concentré sous pression réduite. Le brut a été purifié par chromatographie flash (cyclohexane/AcOEt, 85:15) pour donner (24) (778 mg ; 60%) sous la forme d’un solide blanc cassé. RMN 1 H (300 MHz, DMSO) δ 10,91 (s ; 2H 9,30 ) ; 8,66 (t ; J = 2,0 Hz ; 1H 6 ) ; 8,21 (d ; J = 2,0 Hz ; 2H 4,8 ) ; 7,80 (s ; 4H 12,15,33,36 ) ; 4,82 (s ; 8H 16,23,37,44 ) ; 3,90 (s ; 3H 1 ) ; 0,93 (s ; 36H 20-22,27-29,41-43,48-50 ) ; 0,12 (s ; 24H 17,18,24,25,38,39,45,46 ). RMN 13 C (75 MHz, CDCl 3 ) δ 166,4 (1C 2 ) ; 165,1 (2C 10,31 ) ; 162,1 (4C 13,14,34,35 ) ; 143,3 (2C 5,7 ) ; 138,7 (2C 11,32 ) ; 132,0 (1C 3 ) ; 117,5 (2C 4,8 ) ; 116,1 (1C 6 ) ; 115,5 (4C 12,15,33,36 ) ; 66,0 (4C 16,23,37,44 ) ; 52,6 (1C 1 ) ; 26,1 (12C 20-22,27-29,41-43,48-50 ) ; 18,6 (4C 19,26,40,47 ) ; -5,2 (8C 17,18,24,25,38,39,45,46 ). SMHR (ESI) : m/z calculée pour C 48 H 81 N 4 O 8 Si 4 [M+H] + : 953,5126 ; observée 953.5121. Etape 2 : 3,5-bis(2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinamido)benzoate de méthyle (25) [Chem49] (25) Le 3,5-bis(2,6-bis((( tert -butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)isonicotinamido)benzoate de méthyle (24) (119 mg ; 0,125 mmol ; 1,0 éq) a été dissous dans le THF anhydre (560 μL) et une solution de TBAF 1 M dans le THF (580 μL ; 0,580 mmol ; 4,6 éq) a été ajoutée. Le milieu réactionnel a été agité sous argon à TA pendant 21h. Le THF a été évaporé sous pression réduite et le résidu a été repris dans le DMSO (3,0 mL) et purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (t R = 10,6 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 μm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l’eau (solvant A), et du MeCN (solvant B) ; gradient 5 à 60% de B sur 34 min puis 100% de B sur 5 min à 17,1 mL/min) pour donner (25) (62 mg ; 100%) sous la forme d’un solide jaune pâle. RMN 1 H (300 MHz, DMSO) δ 10,89 (s ; 2H 9,20 ) ; 8,73 (t ; J = 2,0 Hz ; 1H 6 ) ; 8,22 (d ; J = 2,0 Hz ; 2H 4,8 ) ; 7,88 (s ; 4H 12,15,23,26 ) ; 4,64 (s ; 8H 16,18,27,29 ) ; 3,90 (s ; 3H 1 ). RMN 13 C (75 MHz, DMSO) δ 165,9 (1C 2 ) ; 164,8 (2C 10,21 ) ; 162,0 (4C 13,14,24,25 ) ; 143,0 (2C 5,7 ) ; 139,4 (2C 11,22 ) ; 130,3 (1C 3 ) ; 117,0 (3C 4,6,8 ) ; 116,3 (4Cc 12,15,23,26 ) ; 64,1 (4C 13,14,24,25 ) ; 52,4 (1C 1 ). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C 24 H 24 N 4 O 8 [M] : 496,1594 ; observée 496,1597. Etape 3 : 3,5-bis(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)benzoate de méthyle (26) [Chem50] (26) Le 3,5-bis(2,6-bis((( tert -butyldiméthylsilyl)oxy)méthyl)isonicotinamido)benzoate de méthyle (25) (64 mg ; 0,129 mmol ; 1,0 éq) a été mis en suspension dans du MeCN anhydre (5 mL) puis PBr 3 (74 μL ; 0,780 mmol ; 6,0 éq) a été ajouté goutte à goutte. La suspension a été agitée sous argon à 45 °C pendant 4h. Après retour à TA, 1 mL de DMF anhydre a été ajouté, puis la solution a été agitée sous argon à 45 °C pendant 3h. Le milieu réactionnel a été neutralisé avec de l’eau (10 mL) et extrait à l’AcOEt (3x30 mL). Les phases organiques combinées ont été lavées avec une solution saturée de NaCl, séchées sur MgSO 4 , filtrées et concentrées sous pression réduite. Le produit a été purifié par chromatographie flash (SiO 2 , DCM/AcOEt, 80:20) pour donner (26) (41 mg ; 43%) sous la forme d’un solide blanc. RMN 1 H (300 MHz, DMSO) δ 10,89 (s ; 2H 9,18 ) ; 8,72 (s ; 1H 6 ) ; 8,19 (s ; 2H 4,8 ) ; 8,00 (s ; 4H 12,15,21,24 ) ; 4,79 (s ; 8H 16,17,25,26 ) ; 3,90 (s ; 3H 1 ). RMN 13 C (75 MHz, DMSO) δ 165,8 (1C 2 ) ; 163,5 (2C 10,19 ) ; 157,6 (4C 13,14,22,23 ) ; 144,1 (2C 5,7 ) ; 139,2 (2C 11,20 ) ; 130,4 (1C 3 ) ; 121,2 (4C 12,15,21,24 ) ; 117,0 (2C 4,8 ) ; 116,6 (1C 6 ) ; 52,4 (1C 1 ) ; 34,0 (4C 16,17,25,26 ). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C 24 H 20 Br 4 N 4 O 4 [M] : 743,8218 ; observée 743,8207. Exemple 16 : conjugué trastuzumab – composé (26) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (8,0 éq), composé (26) (12,0 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH. Méthode Réaction de bioconjugaison 1. Analyse SMHR dénaturante Les résultats sont présentés dans le Tableau 21 ci-dessous. LHHL LH L Intensité (%) MM (Da) 1 Intensité (%) MM (Da) 1 Intensité (%) MM (Da) MAR 0 n.o. 2 n.o. 2 100 23424 MAR 1 n.o. 2 100 73014 n.o. 2 MAR 2 64 146027 n.o. 2 n.o. 2 MAR 3 36 146456 n.o. 2 n.o. 2 MAR moyen 2,36 1,00 0 1 : masse moléculaire de l’espèce déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 2,36 pour l’espèce LHHL et un MAR moyen de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH et H n’ont pas été observées Analyse gel SDS-PAGE en condition dénaturante non réductrice Les résultats sont présentés dans le Tableau 22 ci-dessous. Espèces DTT LHHL LHH HH LH H L Densité optique (%) - 83 n.o. 1 n.o. 1 16 1 n.o. 1 + 78 n.o. 1 n.o. 1 18 4 n.o. 1 1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 78% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 2,30. Exemple 17 : acide 3,5-bis(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)benzoïque (28) Schéma réactionnel général (a) LiOH, THF, H 2 O, 43h, TA; (b) PBr 3 , DMF, 3h30, 0 °C puis TA. Etape 1 : acide 3,5-bis(2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinamido)benzoïque (27) [Chem52] (27) Le 3,5-bis(2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinamido)benzoate de méthyle (25) (312 mg ; 0,628 mmol ; 1,0 éq) a été mis en suspension dans le THF (35 mL) et une solution de LiOH hydraté (42 mg ; 1,754 mmol ; 2,8 éq) dans l’eau (17,5 mL) a été ajoutée. Le milieu réactionnel a été agité à TA (25 °C) pendant 43h. Le milieu a été acidifié avec une solution aqueuse d’HCl 1N jusqu’à pH 1 et le THF a été évaporé sous pression réduite. Le résidu aqueux a été purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (t R = 10,9 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 μm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l’eau (solvant A), et du MeCN (solvant B) ; gradient 5 à 60% de B sur 40 min puis 100% de B sur 5 min à 17,1 mL/min) pour donner (27) (252 mg ; 83%) sous la forme d’un solide jaune pâle. RMN 1 H (300 MHz, DMSO) δ 10,83 (s ; 2H 9,20 ) ; 8,67 (t ; J = 1,7 Hz ; 1H 6 ) ; 8,18 (d ; J = 2,0 Hz ; 2H 4,8 ) ; 7,86 (s ; 4H 12,15,23,26 ) ; 5,56 (t ; J = 5,8 Hz ; 4H 17,19,28,30 ) ; 4,63 (d ; J = 5,7 Hz ; 8H 16,18,27,29 ). RMN 13 C (75 MHz, DMSO) δ 167,0 (1C 2 ) ; 164,8 (2C 10,21 ) ; 162,0 (4C 13,14,24,25 ) ; 143,0 (2C 5,7 ) ; 139,3 (2C 11,22 ) ; 131,5 (1C 3 ) ; 117,3 (2C 4,8 ) ; 116,7 (1C 6 ) ; 116,3 (4C 12,15,23,26 ) ; 64,1 (4C 16,18,27,29 ). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C 23 H 22 N 4 O 8 [M] : 482,1438 ; observée 482,1447. Etape 2 : acide 3,5-bis(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)benzoïque (28) [Chem53] (28) L’acide 3,5-bis(2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinamido)benzoïque (27) (20 mg ; 0,041 mmol ; 1,0 éq) a été mis en suspension dans le DMF anhydre (1,3 mL) à 0 °C puis le PBr 3 (32 μL ; 0,337 mmol ; 8,2 éq) a été ajouté goutte à goutte. La suspension a été agitée sous argon à TA (25 °C) pendant 3h30. Le milieu réactionnel a été neutralisé avec de l’eau (1,5 mL), le précipité blanc formé a été filtré, rincé à l’eau et au n -pentane pour donner (28) (24 mg ; 81%) sous la forme d’un solide blanc. RMN 1 H (300 MHz, CD 3 OD) δ 8,59 (t ; J = 2,1 Hz ; 1H 6 ) ; 8,21 (d ; J = 2,1 Hz ; 2H 4,8 ) ; 7,97 (s ; 4H 12,15,21,24 ) ; 4,69 (s ; 8H 16,17,25,26 ). RMN 13 C (75 MHz, CD 3 OD) δ 167,0 (1C 2 ) ; 165,8 (2C 10,19 ) ; 159,6 (4C 13,14,22,23 ) ; 146,3 (2C 5,7 ) ; 140,2 (2C 11,20 ) ; 133,3 (1C 3 ) ; 122,2 (4C 12,15,21,24 ) ; 119,6 (2C 4,8 ) ; 118,8 (1C 6 ) ; 33,3 (4C 16,17,25,26 ). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C 23 H 18 Br 4 N 4 O 4 [M] : 729,8062 ; observée 729,8069. Exemple 18 : conjugué trastuzumab – composé (28) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (12,0 éq), composé (28) (12,0 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH. Méthode Réaction de bioconjugaison 1. Analyse SMHR dénaturante Les résultats sont présentés dans le Tableau 23 ci-dessous. LHHL LH L Intensité (%) MM (Da) 1 Intensité (%) MM (Da) 1 Intensité (%) MM (Da) MAR 0 n.o. 2 n.o. 2 100 23405 MAR 1 n.o. 2 100 73001 n.o. 2 MAR 2 73 146001 n.o. 2 n.o. 2 MAR 3 27 146414 n.o. 2 n.o. 2 MAR moyen 2,27 1,00 0,00 1 : masse moléculaire de l’espèce déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 2,27 pour l’espèce LHHL et un MAR moyen de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH et H n’ont pas été observées Analyse gel SDS-PAGE en condition dénaturante non réductrice Les résultats sont présentés dans le Tableau 24 ci-dessous. Espèces DTT LHHL LHH HH LH H L Densité optique (%) - 58 n.o. 1 2 28 6 6 + 56 n.o. 1 3 33 4 4 1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 56% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 2,19. Exemple 19 : conjugué trastuzumab – composé (28) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (12,0 éq), composé (28) (12,0 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH. Méthode Réaction de bioconjugaison 2. Analyse SMHR dénaturante Les résultats sont présentés dans le Tableau 25 ci-dessous. LHHL LH L Intensité (%) MM (Da) 1 Intensité (%) MM (Da) 1 Intensité (%) MM (Da) MAR 0 n.o. 2 n.o. 2 100 23405 MAR 1 60 145586 100 73001 n.o. 2 MAR 2 40 145600 n.o. 2 n.o. 2 MAR 3 n.o. 2 n.o. 2 n.o. 2 MAR moyen 1,40 1,00 0,00 1 : masse moléculaire de l’espèce déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 1,40 pour l’espèce LHHL et un MAR moyen de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH et H n’ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en condition dénaturante non réductrice Les résultats sont présentés dans le Tableau 26 ci-dessous. Espèces DTT LHHL LHH HH LH H L Densité optique (%) - 82 n.o. 1 1 4 10 3 + 60 n.o. 1 2 12 14 12 1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 60% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 1,43. Exemple 20 : 6-(3,5-bis(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)benzamido)-hexanoate de méthyle (30) Schéma réactionnel général (a) NH 2 (CH 2 ) 5 CO 2 CH 3 .HCl, HATU, 2,6-lutidine, DMF, 25h, 0 °C puis TA; (b) PBr 3 , DMF, 2h, 45 °C. Etape 1 : 6-(3,5-bis(2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinamido)benzamido)-hexanoate de méthyle (29) [Chem55] (29) L’acide 3,5-bis(2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinamido)benzoïque (27) (98 mg ; 0,203 mmol ; 1,0 éq) a été mis en suspension dans le DMF anhydre (8,0 mL) sous argon à 0 °C, puis le HATU (116 mg ; 0,305 mmol ; 1,5 éq) et la 2,6-lutidine (110 μL ; 0,950 mmol ; 4,7 éq) ont été ajoutés. La solution d’activation a été agitée sous argon à 0 °C pendant 15 min. Puis le chlorhydrate de 6-aminohexanoate de méthyle (44 mg ; 0,242 mmol ; 1,2 éq) a été ajouté. Le milieu réactionnel a été agité sous argon à TA (25 °C) pendant 25h. Le mélange réactionnel a été concentré sous pression réduite et purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (t R = 16,4 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 μm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l’eau (solvant A), et du MeCN (solvant B) ; gradient 5 à 60% de B sur 40 min puis 100% de B sur 5 min à 17,1 mL/min) pour donner (29) (110 mg ; 89%) sous la forme d’un solide jaune pâle. RMN 1 H (300 MHz, DMSO) δ 10,80 (s ; 2H 9,20 ) ; 8,49 (t ; J = 1,8 Hz ; 1H 6 ) ; 8,48 – 8,41 (m ; 1H 1 ) ; 7,94 (d ; J = 1,9 Hz ; 2H 4,8 ) ; 7,87 (s ; 4H 12,15,23,26 ) ; 4,64 (s ; 8H 16,18,27,29 ) ; 3,58 (s ; 3H 37 ) ; 3,30 – 3,20 (m ; 2H 31 ) ; 2,32 (t ; J = 7,4 Hz ; 2H 35 ) ; 1,64 – 1,47 (m ; 4H 32,34 ) ; 1,40 – 1,26 (m ; 2H 33 ). RMN 13 C (75 MHz, DMSO) δ 173,4 (1C 36 ) ; 166,3 (1C 2 ) ; 164,4 (2C 10,21 ) ; 161,5 (4C 13,14,24,25 ) ; 143,9 (2C 5,7 ) ; 138,8 (2C 11,22 ) ; 136,2 (1C 3 ) ; 116,9 (4C 12,15,23,26 ) ; 115,9 (2C 4,8 ) ; 115,7 (1C 6 ) ; 63,5 (4C 16,18,27,29 ) ; 51,2 (1C 37 ) ; 38,9 sous le DMSO (1C 31 ) ; 33,3 (1C 35 ) ; 28,8 (1C 32 ) ; 26,0 (1C 33 ) ; 24,2 (1C 34 ). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C 30 H 35 N 5 O 9 [M] : 609,2435 ; observée 609,2429. Etape 2: 6-(3,5-bis(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)benzamido)-hexanoate de méthyle (30) [Chem56] (30) Le 6-(3,5-bis(2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinamido)benzamido)hexanoate de méthyle (29) (22 mg ; 0,036 mmol ; 1,0 éq) a été solubilisé dans le DMF anhydre (1,4 mL) puis le PBr 3 (21 μL ; 0,221 mmol ; 6,2 éq) a été ajouté goutte à goutte. La suspension a été agitée sous argon à 45 °C pendant 50 min. Le milieu réactionnel blanc crème visqueux a été mis en suspension par l’ajout de DMF anhydre (1,4 mL). La suspension blanche obtenue a été agitée à 45 °C pendant 1h10. Après retour à TA, le milieu réactionnel a été neutralisé avec de l’eau et extrait à l’AcOEt (3x30 mL). Les phases organiques combinées ont été lavées avec une solution saturée de NaCl, séchées sur MgSO 4 , filtrées et concentrées sous pression réduite. Le produit a été purifié par chromatographie flash (SiO 2 , dichlorométhane/acétate d’éthyle, 70:30) puis par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (t R = 24,3 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 μm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l’eau (solvant A), et du MeCN (solvant B) ; gradient 20 à 100% de B sur 32 min puis 100% de B sur 6 min à 17,1 mL/min) pour donner (30) (9 mg ; 29%) sous la forme d’un solide blanc. RMN 1 H (300 MHz, DMSO) δ 10,89 (s ; 2H 9,18 ) ; 8,95 (s ; 1H 1 ) ; 8,64 (t ; J = 1,8 Hz ; 1H 6 ) ; 7,98 (s ; 4H 12,15,21,24 ) ; 7,77 (d ; J = 2,0 Hz ; 2H 4,8 ) ; 4,79 (s ; 8H 16,17,25,26 ) ; 3,75 (t ; J = 7,2 Hz ; 2H 27 ) ; 3,57 (s ; 3H 33 ) ; 2,32 (t ; J = 7,4 Hz ; 2H 31 ) ; 1,63 – 1,51 (m ; 4H 28,30 ) ; 1,38 – 1,28 (m ; 2H 29 ). RMN 1 H (300 MHz, CDCl 3 ) δ 9,13 – 9,02 (m ; 2H 9,18 ) ; 8,94 (s ; 1H 1 ) ; 8,49 (t ; J = 1,9 Hz ; 1H 6 ) ; 7,82 (s ; 4H 12,15,21,24 ) ; 7,64 (d ; J = 1,6 Hz ; 2H 4,8 ) ; 4,57 (s ; 8H 16,17,25,26 ) ; 3,84 (t ; J = 6,4 Hz ; 2H 27 ) ; 3,56 (s ; 3H 33 ) ; 2,33 (t ; J = 7,1 Hz ; 2H 31 ) ; 1,72 – 1,54 (m ; 4H 28,30 ) ; 1,43 – 1,28 (m ; 2H 29 ). RMN 13 C (75 MHz, CDCl 3 ) δ 175,0 (1C 32 ) ; 171,7 (1C 2 ) ; 163,8 (2C 10,19 ) ; 158,3 (4C 13,14,22,23 ) ; 143,9 (2C 5,7 ) ; 139,0 (2C 11,20 ) ; 135,4 (1C 3 ) ; 120,6 (4C 12,15,21,24 ) ; 116,9 (2C 4,8 ) ; 115,6 (1C 6 ) ; 51,9 (1C 33 ) ; 40,6 (1C 27 ) ; 34,06 (1C 31 ) ; 32,9 (4C 16,17,25,26 ) ; 27,6 (1C 28 ) ; 26,3 (1C 29 ) ; 24,7 (1C 30 ). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C 30 H 31 Br 4 N 5 O 5 [M] : 856,9059 ; observée 856,9080. Exemple 21 : conjugué trastuzumab – composé (30) Réactifs Tampon de bioconjugaison 1, trastuzumab à 5 mg/mL dans le tampon de bioconjugaison, réducteur 1 (12,0 éq), composé (30) (12,0 éq) à une concentration de 1 mM dans un mélange de 20% de DMF et 80% de MeOH. Méthode Réaction de bioconjugaison 1. Analyse SMHR dénaturante Les résultats sont présentés dans le Tableau 27 ci-dessous. LHHL LH L Intensité (%) MM (Da) 1 Intensité (%) MM (Da) 1 Intensité (%) MM (Da) MAR 0 n.o. 2 n.o. 2 100 23439 MAR 1 n.o. 2 100 73128 n.o. 2 MAR 2 100 146255 n.o. 2 n.o. 2 MAR 3 n.o. 2 n.o. 2 n.o. 2 MAR moyen 2,00 1,00 0,00 1 : masse moléculaire de l’espèce déglycosylée 2 : non observé L’analyse SMHR a permis de déterminer un MAR moyen de 2,00 pour l’espèce LHHL et un MAR moyen de 1,00 pour l’espèce LH. Les espèces LHH, HH et H n’ont pas été observées. Analyse gel SDS-PAGE en condition dénaturante non réductrice Les résultats sont présentés dans le Tableau 28 ci-dessous. Espèces DTT LHHL LHH HH LH H L Densité optique (%) - 56 n.o. 1 2 27 5 10 + 54 n.o. 1 2 24 7 13 1 : non observé L’analyse sur gel SDS-PAGE a permis de déterminer en conditions réductrices une reconstruction de 54% et en conditions non réductrices un MAR moyen de 2,00. Exemple 22 : acide 6-(3,5-bis(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)-benzamido)hexanoïque (32) Schéma réactionnel général (a) LiOH, THF, H 2 O, 25h, TA; (b) PBr 3 , MeCN, 5h, 45 °C. Etape 1 : acide 6-(3,5-bis(2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinamido)benzamido)-hexanoïque (31) [Chem58] (31) Le 6-(3,5-bis(2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinamido)benzamido)hexanoate de méthyle (29) (110 mg ; 0,180 mmol ; 1,0 éq) a été mis en suspension dans le THF (9 mL) et une solution de LiOH 0,1 M (10,8 mg ; 0,451 mmol ; 2,5 éq) dans l’eau (4,5 mL) a été ajoutée. Le milieu réactionnel a été agité à TA (25 °C) pendant 25h. Le milieu a été acidifié avec une solution aqueuse d’HCl 1N jusqu’à pH 1 et le THF a été évaporé sous pression réduite. Le résidu aqueux a été purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (t R = 13,4 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 μm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l’eau (solvant A), et du MeCN (solvant B) ; gradient 5 à 60% de B sur 40 min puis 100% de B sur 5 min à 17,1 mL/min) pour donner (31) (84 mg ; 79%) sous la forme d’un solide jaune pâle. RMN 1 H (300 MHz, DMSO) δ 10,82 (s ; 2H 9,20 ) ; 8,53 – 8,48 (m ; 1H 6 ) ; 8,48 – 8,42 (m ; 1H 1 ) ; 7,93 (d ; J = 1,6 Hz ; 2H 4,8 ) ; 7,90 (s ; 4H 12,15,23,26 ) ; 4,66 (s ; 8H 16,18,27,29 ) ; 3,31 – 3,19 (m ; 2H 31 ) ; 2,22 (t ; J = 7,3 Hz ; 2H 35 ) ; 1,62 – 1,46 (m ; 4H 32,34 ) ; 1,40 – 1,26 (m ; 2H 33 ). RMN 13 C (75 MHz, DMSO) δ 174,5 (1C 36 ) ; 166,2 (1C 2 ) ; 164,5 (2C 10,21 ) ; 161,6 (4C 13,14,24,25 ) ; 143,5 (2C 5,7 ) ; 138,8 (2C 11,22 ) ; 136,1 (1C 3 ) ; 116,6 (4C 12,15,23,26 ) ; 115,8 (2C 4,8 ) ; 115,7 (1C 6 ) ; 63,7 (4C 16,18,27,29 ) ; 38,9 sous le DMSO (1C 31 ) ; 33,7 (1C 35 ) ; 28,8 (1C 32 ) ; 26,0 (1C 33 ) ; 24,3 (1C 34 ). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C 29 H 33 N 5 O 9 [M] : 595,2278 ; observée 595,2271. Etape 2 : acide 6-(3,5-bis(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)benzamido)-hexanoïque (32) [Chem59] (32) L’acide 6-(3,5-bis(2,6-bis(hydroxyméthyl)isonicotinamido)benzamido)hexanoïque (31) (48,7 mg ; 0,082 mmol ; 1,0 éq) a été mis en suspension dans du MeCN anhydre (4 mL) puis PBr 3 (47 μL ; 0,495 mmol ; 6,0 éq) a été ajouté goutte à goutte. La suspension a été agitée sous argon à 45 °C pendant 3h10. Après retour à TA, un ajout de PBr 3 (24 μL ; 0,253 mmol ; 3,1 éq) supplémentaire a été réalisé goutte à goutte et la suspension a été agitée sous argon à 45 °C pendant 1h45. Après refroidissement à 0 °C, le milieu réactionnel a été neutralisé avec de l’eau et concentré sous pression réduite. Le résidu aqueux (1 mL) a été dilué dans le DMF anhydre (3,5 mL) et le produit a été purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (t R = 19,9 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 μm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l’eau (solvant A), et du MeCN (solvant B) ; gradient 20 à 100% de B sur 32 min puis 100% de B sur 6 min à 17,1 mL/min) pour donner (32) (6,0 mg ; 9%) sous la forme d’un solide blanc. RMN 1 H (300 MHz, DMSO) δ 12,00 (s ; 1H 33 ) ; 10,84 (s ; 2H 9,18 ) ; 8,64 – 8,36 (m ; 2H 1,6 ) ; 8,03 (s ; 4H 12,15,21,24 ) ; 7,93 (d ; J = 1,8 Hz ; 2H 4,8 ) ; 4,90 (s ; 8H 16,17,25,26 ) ; 3,28 – 3,20 (m ; 2H 27 ) ; 2,21 (t ; J = 7,4 Hz ; 2H 31 ) ; 1,63 – 1,47 (m ; 4H 28,30 ) ; 1,43 – 1,26 (m ; 2H 29 ). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C 24 H 20 Br 4 N 4 O 4 [M] : 743,8218 ; observée 743.8207. Exemple 23 : 3,5-bis(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)benzamido- N -hexanamide-valine-citrulline- p -aminobenzoyle carbamate de MMAE (33) (33) Sous atmosphère inerte, dans l’obscurité et en conditions anhydres, l’acide 3,5-bis(2,6-bis(bromométhyl)isonicotinamido)benzoïque (28) (10,0 mg ; 0,0136 mmol ; 2,0 éq) a été mis en suspension dans du MeCN anhydre (536 μL) EEDQ (10,0 mg ; 0,0404 mmol ; 6,0 éq) a été ajouté. Le milieu d’activation a été agité sous argon à 25 °C pendant 1h30. Une solution de sel d’acide trifluoroacétique de 6-aminohexanamide-valine-citrulline- p -aminobenzoyle carbamate de MMAE (6) (9,0 mg ; 0,0067 mmol ; 1,0 éq), solubilisé dans du DMF anhydre (134 μL) en présence de DIPEA (4,7 μL ; 0,0270 mmol ; 4,0 éq), a été ajoutée au milieu d’activation. Le milieu réactionnel obtenu a été agité à 25 °C pendant 2h. Le mélange a été dilué par 2 avec du DMF et purifié par chromatographie liquide haute pression semi-préparative (t R = 22,6 min ; sur le système Gilson PLC 2050 [ARMEN V2 (pompe) et ECOM TOYDAD600 (détecteur UV)] détection UV à 254 nm à 25 °C ; colonne Waters XBridge™ C-18 ; 5 μm (250 mm x 19,00 mm) ; élution réalisée avec 0,1% de TFA (en volume) dans l’eau (solvant A), et du MeCN (solvant B) ; gradient 20 à 100% de B sur 32 min puis 100% de B sur 6 min à 17,1 mL/min) pour donner (33) (6,0 mg ; 46%) sous la forme d’un solide blanc. RMN 1 H (300 MHz, DMSO) δ 10,82 (s ; 2H) ; 10,06 – 9,91 (m ; 1H) ; 8,57 – 8,44 (m ; 2H) ; 8,18 – 8,03 (m ; ; 2H) ; 8,00 (s ; 4H) ; 7,93 (d ; J = 1,9 Hz ; 2H) ; 7,92 – 7,76 (m ; 2H) ; 7,70 – 7,53 (m ; 3H) ; 7,39 – 7,21 (m ; 7H) ; 7,21 – 7,10 (m ; 1H) ; 6,01 – 5,92 (m ; 1H); 5,61 – 5,22 (m ; 6H); 5,15 – 4,96 (m ; 3H); 4,79 (s ; 8H); 4,54 – 4,45 (m ; 2H); 4,45 – 4,33 (m ; 3H); 4,30 – 4,15 (m ; 3H); 4,12 – 3,89 (m ; 4H); 3,26 – 2,91 (m ; 9H); 2,91 – 2,80 (m ; 4H); 2,23 – 2,06 (m ; 1H); 2,05 – 1,88 (m ; 1H); 1,86 – 1,63 (m ; 2H); 1,53 (s ; 4H); 1,38 – 1,18 (m ; 3H); 1,08 – 0,93 (m ; 9H); 0,92 – 0,68 (m ; 27H). SMHR (ESI) : masse neutre calculée pour C 87 H 121 Br 4 N 15 O 16 [M] : 1947,5849 ; observée 1947,5891. Composé de formule (I) : (I) dans laquelle : - chaque A est le résidu d’un phényle ou d’un pyridyle ; - chaque X est un groupe partant ; - chaque Y est une liaison directe, -CH 2 -, -O-, -S-, -CO-, -NH- ou -C(=NR 1 )- ; - X 1 est choisi parmi : et ; - chaque Z est indépendamment une liaison directe, -CH 2 -, -O-, -S-, -CO-, -NH- ou -C(=NR 1 )- ; - W est -OR a , -COR 2 , -CONR 3 R 4 ou -NR 3 COR 4 ; - R a est -(C 1 -C 6 )alkyle, -(CH 2 CH 2 O) q R 5 , -(CR c R d ) r R 5 , -COR b , -(CR c R d ) r -NHCO-(CH 2 CH 2 O) q -R 5 , -(CR c R d ) r -CONH-(CH 2 CH 2 O) q -R 5 , -(CH 2 CH 2 O) q -(CH 2 ) r -NHCO-(CR c R d ) r -R 5 ou -(CH 2 CH 2 O) q -(CH 2 ) r -CONH-(CR c R d ) r -R 5 ; - R b est -(C 1 -C 6 )alkyle, -(C 1 -C 6 )alcoxy, -(CH 2 CH 2 O) q R 5 , -O(CH 2 CH 2 O) q R 5 , -(CR c R d ) r R 5 , -O(CR c R d ) r R 5 , -(CR c R d ) r -NHCO-(CH 2 CH 2 O) q -R 5 , -(CR c R d ) r -CONH-(CH 2 CH 2 O) q -R 5 , -(CH 2 CH 2 O) q -(CH 2 ) r -NHCO-(CR c R d ) r -R 5 ou -(CH 2 CH 2 O) q -(CH 2 ) r -CONH-(CR c R d ) r -R 5 ; - R 1 est -H, -OH ou -(C 1 -C 6 )alkyle ; - R 2 est -OH, -(C 1 -C 6 )alkyle, -(C 1 -C 6 )alcoxy, -(CH 2 CH 2 O) q R 5 , -(CR c R d ) r R 5 , -O(CH 2 CH 2 O) q R 5 , -O(CR c R d ) r R 5 , -O(CR c R d ) r -NHCO-(CH 2 CH 2 O) q -R 5 , -O(CR c R d ) r -CONH-(CH 2 CH 2 O) q -R 5 , -O(CH 2 CH 2 O) q -(CH 2 ) r -NHCO-(CR c R d ) r -R 5 ou -O(CH 2 CH 2 O) q -(CH 2 ) r -CONH-(CR c R d ) r -R 5 ; - R 3 est -H ou -(C 1 -C 6 )alkyle ; - R 4 est -H, -(C 1 -C 6 )alkyle, -(CH 2 CH 2 O) q R 5 , -(CR c R d ) r R 5 , -(CR c R d ) r -NHCO-(CH 2 CH 2 O) q -R 5 , -(CR c R d ) r -CONH-(CH 2 CH 2 O) q -R 5 , -(CH 2 CH 2 O) q -(CH 2 ) r -NHCO-(CR c R d ) r -R 5 ou -(CH 2 CH 2 O) q -(CH 2 ) r -CONH-(CR c R d ) r -R 5 ; - R 5 est -(CH 2 ) s R 6 ou -(CH 2 ) s R 7 ; - R 6 est -COOR 8 , -COSR 8 , -CONR 8 R 9 ou -NR 8 COR 9 ; - R 7 est choisi parmi : ; - R c est -H ; - chaque R d est -H ou -SO 3 H ; - R 8 est -H ou -(C 1 -C 6 )alkyle ; - R 9 est -H ou -(C 1 -C 6 )alkyle ; - est un -(C 3 -C 6 )cycloalkyle, un -(C 6 -C 10 )aryle ou un hétérocycle saturé, insaturé ou partiellement insaturé, ayant de 5 à 15 chaînons et comprenant de 1 à 4 hétéroatomes choisis parmi l'azote, l'oxygène et le soufre ; - m, n et p sont chacun indépendamment l’un de l’autre un entier allant de 0 à 8 ; - chaque q est un entier allant de 1 à 24 ; - chaque r est un entier allant de 1 à 8 ; - chaque s est un entier allant de 0 à 6. Composé selon la revendication 1, dans lequel chaque X est un halogène, un tosylate ou un mésylate, de préférence chaque X est un halogène. Composé selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans lequel chaque X est Br. Composé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel chaque A est le résidu d’un pyridyle. Composé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel chaque Y est choisi parmi une liaison directe, -CO- et -NH-. Composé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel l’un des groupes Y et Z est -CO- et l’autre est -NH-. Composé selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel X 1 est , - W est -COR 2 ou -CONR 3 R 4 ; - Z est -CO- ou -NH- ; - R 2 est -OH ou -(C 1 -C 6 )alcoxy ; - R 4 est –H, -(C 1 -C 6 )alkyle, -(CH 2 CH 2 O) q -R 5 , ou -(CR c R d ) r R 5 ; - R 5 est -(CH 2 ) s R 6 ou -(CH 2 ) s R 7 ; - R 6 est -COOR 8 , -CONR 8 R 9 ou -NR 8 COR 9 ; - R 7 est choisi parmi : ; - R c , R d , R 3 , R 8 et R 9 sont tels que définis à la revendication 1 ; - m et n sont chacun indépendamment l’un de l’autre un entier allant de 0 à 3 ; - p est égal à 0, 1 ou 2 ; - chaque q est un entier allant de 1 à 12 ; - chaque r est un entier allant de 1 à 6 ; - chaque s est un entier allant de 0 à 4. Composé selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel X 1 est un groupe : choisi parmi : ; - W est -COR 2 ou -CONR 3 R 4 ; - Z est -CO- ou -NH- ; - R 2 est -OH ou -(C 1 -C 6 )alcoxy ; - R 3 est -H ou -(C 1 -C 6 )alkyle ; - R 4 est -H, -(C 1 -C 6 )alkyle, -(CR c R d ) r R 5 , ou -(CH 2 CH 2 O) q R 5 ; - R 5 est -(CH 2 ) s R 6 ou -(CH 2 ) s R 7 ; - R 6 est -COOR 8 , -CONR 8 R 9 ou -NR 8 COR 9 ; - R 7 est choisi parmi : ; - R c , R d , R 8 et R 9 sont tels que définis à la revendication 1 ; - chaque q est un entier allant de 1 à 12 ; - chaque r est un entier allant de 1 à 6 ; - chaque s est un entier allant de 0 à 4. Composé selon la revendication 8, dans lequel X 1 est choisi parmi : . Composé selon la revendication 1, qui est un composé de formule (Ia), (Ib) ou (Ic) : (Ia) ; (Ib) ; (Ic) ; dans chacune de ces formules W est tel que défini à la revendication 1. Composé de formule (II) : (II) dans laquelle : - la tête d’accroche est un composé de formule (I) tel que défini dans l’une quelconque des revendications 1 à 10 ; - le bras de liaison est une liaison directe ; un résidu d’acide aminé ; un résidu de peptide ; un sucre ; un glucuronide ; un pont -S-S- ; -NHCH[CH 2 COR 10 ] 2 - ; ou un groupe de formule : ; dans laquelle R 10 est une liaison directe ou un résidu de peptide, de préférence un résidu de dipeptide ; - l’espaceur est une liaison directe ou un groupe de formule : ; - M est une molécule d’intérêt. Composé selon la revendication 11, dans lequel la partie de la formule (II) constituée par le bras de liaison et l’espaceur est représentée par l’une des formules (III) ou (IV) : (III) ; (IV). Composé selon l’une quelconque des revendications 11 à 12, dans lequel la molécule d’intérêt est un principe actif, un fluorophore ou une cage pour radioéléments. Composé selon la revendication 13, dans lequel le principe actif est choisi parmi : le méthotrexate, un immunomodulateur, la duocarmycine, la combrétastatine, la calichéamicine, la monométhylauristatine E (MMAE), la monométhylauristatine F (MMAF), la maytansine, le DM1, le DM4, le SN38, l’amanitine et ses analogues, la pyrrolobenzodiazépine, un dimère de pyrrolobenzodiazépine, la pyrrolopyridodiazépine, un dimère de pyrrolopyridodiazépine, un inhibiteur de l’histone désacétylase, un inhibiteur de tyrosine kinase, et la ricine, de préférence le principe actif est la MMAE. Conjugué susceptible d’être obtenu : (c1) par conjugaison entre une protéine comprenant au moins deux ponts disulfure et un composé de formule (I) tel que défini dans l’une quelconque des revendications 1 à 10, ou (c2) par conjugaison entre une protéine comprenant au moins deux ponts disulfure et un composé de formule (II) tel que défini dans l’une quelconque des revendications 11 et 12, ou (c3) par réaction entre une protéine comprenant au moins deux ponts disulfure, un composé de formule (I) tel que défini l’une quelconque des revendications 1 à 10, et un composé de formule (V) : (V) dans laquelle : - R 11 est R 7 -(CH 2 ) s -CO-, R 7 -(CH 2 ) s -CONHCH[CH 2 CO-] 2 , R 7 -(CH 2 ) s -(O-CH 2 -CH 2 ) q -CO-, R 7 -(CH 2 ) s -(O-CH 2 -CH 2 ) q -CONHCH[CH 2 CO-] 2 , ou un composé de formule : ; - R 7 est tel que défini à la revendication 1 ; - R 1 0 est une liaison directe ou un résidu de peptide, de préférence un résidu de dipeptide ; - chaque q est un entier allant de 1 à 12 ; - chaque s est un entier allant de 0 à 6 ; - t est 1 ou 2, de préférence t est 1 ; - le bras de liaison, l’espaceur et M sont tels que définis dans l’une quelconque des revendications 11 à 14. Conjugué selon la revendication 15, dans lequel la protéine comprenant au moins deux ponts disulfure est un anticorps ou un fragment d’anticorps. Conjugué selon la revendication 16, de structure suivante : dans laquelle : - Ac est un anticorps ou un fragment d’anticorps ; - la molécule est soit un composé de formule (I) tel que défini dans l’une quelconque des revendications 1 à 10, soit un composé de formule (II) tel que défini dans l’une quelconque des revendications 11 à 12, soit le produit de la réaction entre un composé de formule (I) et un composé de formule (V) tel que défini dans la revendication 15 ; - MAR, qui représente le nombre moyen de molécule(s) fixée(s) sur l’anticorps ou le fragment d’anticorps, est compris dans la gamme allant de 0,50 à 2,50. Conjugué selon la revendication 17, dans lequel MAR = 1,00±0,50. Conjugué selon la revendication 17, dans lequel MAR = 2,00±0,50. Composition comprenant un ou plusieurs conjugué(s) selon l’une quelconque des revendications 15 à 19.