Brevet FR3110048A1 — publié le 20211119

L’invention concerne un procédé de traitement préventif et/ou curatif des maladies cryptogamiques du bois de la vigne. Ce procédé comprend l’application sur le bois de vigne d’une composition phytosanitaire contenant du chlorhydrate de chitosane en tant qu’agent actif, dans un véhicule adapté à une utilisation phytosanitaire. PROCÉDÉ DE TRAITEMENT DES MALADIES DU BOIS DE LA VIGNE La présente invention s’inscrit dans le domaine du traitement des maladies des végétaux, en particulier de la vigne. Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé de traitement des maladies cryptogamiques du bois de la vigne, du type mettant en œuvre un ingrédient actif d’origine naturelle, le chlorhydrate de chitosane. L’invention concerne également l’utilisation du chlorhydrate de chitosane, ou d’une composition phytosanitaire le contenant, pour le traitement des maladies cryptogamiques du bois de la vigne, ainsi qu’une composition phytosanitaire destinée à une telle utilisation, contenant, en tant qu’agent actif, du chlorhydrate de chitosane. Les maladies cryptogamiques du bois de la vigne provoquent de graves problèmes dans les vignobles de la plupart des régions viticoles du monde. Ces maladies sont causées par des champignons pathogènes lignicoles, dont la porte d’entrée dans les ceps est les blessures infligées à ces derniers lors de la taille ou du curetage de la vigne, ces blessures étant couramment nommées plaies de taille ou de curetage, ou lors de la réalisation d’une greffe. Les plaies de taille sont généralement localisées, sur les ceps, au niveau des troncs et des bras. Elles proviennent le plus souvent de la coupe de sarments, c’est-à-dire de jeunes tiges âgées d’un an, mais elles peuvent aussi concerner le bois plus âgé, et prennent alors la forme de larges blessures. Le curetage consiste à supprimer les tissus nécrosés du tronc et des bras d’un cep, pour le soulager en particulier du bois amadou, qui constitue le siège de l’un des champignons causant la maladie, ce qui génère des plaies profondes et larges sur le bois. Les maladies du bois de la vigne les plus courantes, sévissant en particulier chez les plantes adultes, sont l'eutypiose, causée par le champignon de l’espèce Eutypa lata , l'esca, causée par les champignons des espèces Phaeomoniella chlamydospora , Phaeoacremonium minimum et Fomitiporia mediterranea , et le dépérissement à Botryosphaeria (également appelé par le passé BDA, pour l’anglais black dead arm), causé principalement en France par les espèces Diplodia seriata et Neofusicoccum parvum . Parmi ces champignons pathogènes lignicoles pouvant infecter les plaies de tailles ou de curetage sur le bois de vigne, les champignons des espèces Eutypa lata et Phaeomoniella chlamydospora sont parmi les plus susceptibles d’être disséminés dans l’air, et donc d’être largement répandus dans les vignobles. Ils sont par ailleurs les plus utilisés en tant que modèles d’étude. Afin de protéger les blessures du bois de la vigne de la contamination par les champignons pathogènes responsables des maladies du bois de la vigne, il a été proposé par l’art antérieur d’enduire ces blessures par des fongicides chimiques. Un exemple de tel fongicide est le thiophanate-méthyl, ingrédient actif de la spécialité commercialisée sous la dénomination Phytopast®-V. D’autres exemples de fongicides proposés par l’art antérieur sont le mancozèbe, le diféconazole, la pyraclostrobine et le tébuconazole (Rusin et al., 2016, BIO Web of Conferences 7, 01044, DOI: 10.1051/bioconf/20160701044). Cependant, au cours des dernières décennies, l'utilisation de fongicides chimiques a soulevé des inquiétudes quant à leur impact environnemental et au risque potentiel pour la santé qui est associé à leur utilisation. Dans ce contexte, il s’est avéré nécessaire de développer une alternative aux fongicides chimiques conventionnels, et l’art antérieur s’est donc intéressé à la possibilité d’utiliser des produits antifongiques d’origine naturelle. Quelques travaux de l’art antérieur ont notamment porté sur l'utilisation d’une substance active naturelle particulière, le chitosane, pour lutter contre les champignons pathogènes lignicoles responsables des maladies du bois de la vigne. Le chitosane est issu de la désacétylation alcaline thermochimique de la chitine (polymère de β1,4-N-acétyl-D-glucosamine), l'un des polymères naturels les plus abondants après la cellulose. La chitine est communément trouvée dans les exosquelettes ou cuticules de nombreux invertébrés et dans les parois cellulaires de la plupart des champignons et de certaines algues. Lorsque, après désacétylation, le degré de N-acétylation (DA) de la chitine est inférieur ou égal à 40%, de manière conventionnelle le produit obtenu est appelé chitosane. Il a été proposé par l’art antérieur, illustré notamment par la publication de Cobos et al., 2015, Applied and Environmental Microbiology, 81: 6474-6483, d’utiliser le chitosane pour contrôler l’infection par les pathogènes responsables de la maladie du bois de la vigne. Des chitosanes de différents poids moléculaires ont été testés à cet effet, ces chitosanes présentant plus précisément un poids moléculaire très faible, inférieur à 3 kDa (on parle alors d’oligochitosane ou oligosaccharide de chitosane), faible, moyen ou élevé. Les travaux présentés dans cette publication concluent que l’efficacité est inversement proportionnelle au poids moléculaire, l’oligosaccharide de chitosane, de très bas poids moléculaire, s’avérant le plus efficace parmi les chitosanes testés. Cette efficacité reste cependant discutable, les résultats obtenus étant peu reproductibles d’un essai à l’autre. Ainsi, il subsiste un besoin pour un procédé de traitement des maladies cryptogamiques du bois de la vigne qui soit efficace, tout en utilisant un agent actif naturel. La présente invention vise à proposer un tel procédé. Des objectifs supplémentaires de l’invention sont que ce procédé soit simple à mettre en œuvre, et qu’il soit respectueux de l’environnement. Les présents inventeurs ont maintenant découvert que l’utilisation d’un dérivé particulier du chitosane, le chlorhydrate de chitosane (en anglais chitosan hydrochloride), permet d’atteindre ces objectifs. Le chlorhydrate de chitosane est classiquement produit par solubilisation du chitosane dans une solution d’acide chlorhydrique, suivie d'une re-précipitation. Ce polymère est notamment utilisé à l’heure actuelle pour l’enrobage de semis. Il est également indiqué comme pouvant être utilisé pour lutter contre les champignons aériens responsables du mildiou et de la pourriture grise, tels que Plasmopara viticola et Botrytis cinerea , en pulvérisation foliaire. Son effet vis-à-vis de l’infection par les champignons pathogènes lignicoles de la vigne n’a cependant jamais été décrit ni suggéré par l’art antérieur. Cherchant des composés naturels actifs contre les champignons responsables des maladies du bois de la vigne, les présents inventeurs ont maintenant découvert que, alors que dans des essais réalisés in vitro , le chlorhydrate de chitosane est moins efficace vis-à-vis de la plupart de ces champignons que les chitosanes de très faible poids moléculaire (oligochitosanes) et les chitosanes de poids moléculaire faible ou moyen, de manière tout à fait surprenante, in vivo , dans des conditions de traitement usuelles des plaies de taille des ceps de vigne, le chlorhydrate de chitosane s’avère globalement bien plus performant que les chitosanes de très faible, faible ou moyen poids moléculaire. Cette supériorité de l’effet antifongique du chlorhydrate de chitosane in vivo s’exerce notamment de manière particulièrement forte vis-à-vis du champignon de l’espèce Phaeomoniella chlamydospora , l’un des champignons majeurs associés à l’esca. Le chlorhydrate de chitosane est également particulièrement efficace, in vivo , pour la lutte contre le champignon de l’espèce Eutypa lata . Vis-à-vis de ces champignons pathogènes, in vivo , le chlorhydrate de chitosane s’avère bien plus efficace que l’oligochitosane, ce dernier étant pourtant présenté par l’art antérieur comme le plus performant pour lutter contre les maladies du bois de la vigne. Ainsi, il est proposé selon la présente invention un procédé de traitement préventif et/ou curatif d’une maladie cryptogamique du bois de la vigne. Ce procédé comprend l’application sur le bois de vigne d’une composition phytosanitaire qui contient, en tant qu’agent actif, du chlorhydrate de chitosan, dans un véhicule adapté à une utilisation phytosanitaire. Dans le terme traitement, on englobe selon la présente invention le traitement préventif, réalisé sur le bois sain, pour empêcher ou limiter les infections du bois de la vigne par les champignons pathogènes lignicoles, et le traitement curatif, réalisé sur le bois déjà infecté, pour réduire ou faire disparaitre totalement l’infection déjà développée ou en cours de développement. Selon l’invention, l’application de la composition sur le bois de vigne est préférentiellement réalisée au niveau d’une blessure du bois de vigne. On englobe ici, dans le terme blessure, aussi bien les plaies de taille que les plaies de curetage infligées au bois de vigne lors de la taille ou du curetage, ainsi, de manière plus générale, que tous les types de blessures pouvant être infligées au bois de vigne, du jeune plant au cep adulte, par exemple les blessures résultant de la réalisation d’une greffe sur le bois de vigne. Préférentiellement, bien entendu, l’application est réalisée sur chacune des blessures d’un même cep. L’application de la composition est en outre de préférence réalisée, pour chaque blessure concernée, de sorte à recouvrir intégralement, ou quasiment intégralement, la surface de cette blessure par la composition. On entend, par quasi-intégralement, le fait qu’au moins 90 % de la surface de la blessure est recouverte par la composition. Ainsi, l’application de la composition phytosanitaire sur la blessure est de préférence réalisée de sorte à recouvrir au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, de préférence encore au moins 98 %, et préférentiellement 100 %, c’est-à-dire la totalité, de la surface de ladite blessure par ladite composition. Préférentiellement, l’application de la composition phytosanitaire est réalisée sans emprisonner de bulles d’air entre le bois de vigne et la composition. Dans des modes de mise en œuvre particulièrement préférés de l’invention, pour chaque blessure concernée, l’application de la composition est réalisée de manière ciblée sur ladite blessure. On entend par là que l’application de la composition est réalisée exclusivement sur le bois de vigne, de manière localisée au niveau de la blessure, de préférence de chaque blessure sur le cep, et préférentiellement sans beaucoup déborder sur les parties de bois autour de la blessure. Préférentiellement, l’application de la composition sur le bois de vigne, en particulier sur les blessures, est réalisée par badigeonnage. L’application par badigeonnage peut être réalisée par tout moyen applicateur classique en lui-même pour l’homme du métier, par exemple au pinceau. Tout autre moyen d’application ciblée et entièrement recouvrante de la composition utilisée selon l’invention sur le bois de vigne, équivalent au badigeonnage, peut autrement être mis en œuvre selon l’invention. L’application de la composition peut ainsi par exemple également être réalisée par pulvérisation ciblée sur le bois de la vigne, en particulier sur les blessures portées par le bois, la pulvérisation étant notamment réalisée à faible distance de la zone visée. Le procédé selon l’invention peut en outre répondre à l’une ou plusieurs des caractéristiques décrites ci-après, mises en œuvre isolément ou en chacune de leurs combinaisons techniquement opérantes. Le chlorhydrate de chitosane mis en œuvre selon l’invention peut avoir été obtenu à partir de chitosane de toute origine. Il peut notamment être d’origine fongique, ou issu d’insecte ou de crustacé. A partir de chitosane, quelle que soit l’origine de ce dernier, le chlorhydrate de chitosane peut avoir été obtenu par toute méthode classique en elle-même, en particulier par la méthode mentionnée ci-dessus de solubilisation du chitosane avec de l’acide chlorhydrique, suivie d'une re-précipitation. Le chlorhydrate de chitosane peut autrement par exemple avoir été obtenu par dissolution de chitosane dans une solution aqueuse d'acide acétique à 1 % en poids, par exemple dans une quantité d’environ 1 g de chitosane dans 100 ml de cette solution, suivie d’une filtration, d’une dialyse au moyen d’une solution aqueuse contenant un sel de chlore, notamment du chlorure de sodium, par exemple à une concentration de 0,2 mol/l, et d’une lyophilisation, selon le procédé détaillé dans l’article de Signini et Campana Filho, 1999. Polymer Bulletin 42, 159-166. Préférentiellement, le poids moléculaire du chlorhydrate de chitosane est compris entre 3 et 130 kDa, de préférence entre 30 et 130 kDa, notamment entre 60 et 130 kDa et par exemple entre 60 et 120 kDa ou même entre 60 et 100 kDa. Le chitosane sous forme de chlorhydrate utilisé dans le procédé selon l’invention peut présenter tout degré d’acétylation, de faibles degrés d’acétylation étant toutefois préférés dans le cadre de l’invention. Ainsi, préférentiellement, le degré d’acétylation du chlorhydrate de chitosane est compris entre 5 et 35 %, de préférence compris entre 5 et 30 %, plus particulièrement compris entre 10 et 30 %, de préférence encore compris entre 10 et 25 %, notamment compris entre 10 et 16 % et par exemple compris entre 14 et 15 %. La composition phytosanitaire mise en œuvre selon l’invention contient le chlorhydrate de chitosane dans un véhicule compatible avec une utilisation phytosanitaire, plus particulièrement compatible avec une utilisation en viticulture. Ce véhicule est préférentiellement choisi parmi les véhicules de type aqueux, les acides organiques et l’un quelconque de leurs mélanges. Le véhicule mis en œuvre selon l’invention est notamment l’eau, l’acide acétique ou une solution aqueuse d’acide acétique. Préférentiellement, la composition mise en œuvre selon l’invention est une solution aqueuse de chlorhydrate de chitosane. La composition mise en œuvre selon l’invention peut en outre comporter un ou plusieurs excipients, classiques en eux-mêmes pour le traitement des végétaux destinés à l’alimentation en général, et de la vigne en particulier, tels que des conservateurs, colorants, épaississants, modificateurs de rhéologie, tensioactifs, dispersants, mouillants, pénétrants, rétenteurs, acidifiants, adhérents, plastifiants, tels qu’un polyol, etc. La composition mise en œuvre selon l’invention peut en outre contenir un ou plusieurs autres agents phytosanitaires actifs utilisables dans le domaine de la viticulture, notamment fongicides, insecticides, biostimulants, etc., et/ou des microorganismes bénéfiques pour la vigne, de tels microorganismes étant de préférence introduits extemporanément dans la composition phytosanitaire, juste avant son application sur le bois de vigne. Dans des modes de mise en œuvre particuliers de l’invention, le chlorhydrate de chitosane est le seul agent actif à propriétés antifongiques, et le cas échéant le seul agent actif en général, présent dans la composition phytosanitaire. La composition mise en œuvre selon l’invention peut présenter toute consistance, notamment adaptée à une application par badigeonnage / étalement. Elle peut en particulier se présenter sous forme liquide ou semi-liquide, en particulier sous forme de gel, ou sous forme semi-solide telle qu’une pâte. Dans des modes de mise en œuvre particuliers de l’invention, la concentration en chlorhydrate de chitosan dans la composition est comprise entre 1 et 15 % en poids, de préférence comprise entre 1,5 et 15 % en poids, de préférence encore comprise entre 5 et 15 % en poids, préférentiellement comprise entre 5 et 12 % en poids, et préférentiellement encore entre 5 et 11 % en poids, par rapport au volume total de la composition. Une concentration en chlorhydrate de chitosane comprise entre 1,5 et 5 % en poids, par rapport au volume total de la composition, s’avère particulièrement adaptée au mode d’application par pulvérisation. Une concentration en chlorhydrate de chitosane comprise entre 5 et 15 % en poids, notamment entre 5 et 12 % en poids et en particulier entre 5 et 11 % en poids, par rapport au volume total de la composition, s’avère quant à elle particulièrement adaptée au mode d’application par badigeonnage. Le procédé selon l’invention peut en outre comporter une ou plusieurs étapes préalables de : - dissolution ou mise en suspension de chlorhydrate de chitosane, initialement sous forme de poudre, dans le véhicule, en particulier dans l’eau et/ou dans un acide organique ; - et/ou dilution dans le véhicule, en particulier dans l’eau et/ou dans un acide organique, d’une préparation mère, en particulier liquide, très concentrée en chlorhydrate de chitosane, ceci pour obtenir la composition phytosanitaire de concentration souhaitée en chlorhydrate de chitosane, notamment de concentration comprise entre 1 et 15 % en poids, de préférence entre 1,5 et 12 % en poids, de chlorhydrate de chitosane, par rapport au volume total de la composition. Dans des modes de mise en œuvre particuliers de l’invention, la maladie cryptogamique du bois de la vigne est l’esca, l’eutypiose ou le dépérissement à Botryosphaeria . Bien entendu, le procédé selon l’invention permet de prévenir, en même temps, l’ensemble de ces maladies. Le procédé selon l’invention est notamment particulièrement efficace pour lutter in vivo , de manière tant préventive que curative, contre les maladies cryptogamiques du bois de la vigne causées par le champignon pathogène de l’espèce Eutypa lata et/ou par le champignon pathogène de l’espèce Phaeomoniella chlamydospora et/ou par le champignon pathogène de l’espèce Phaeoacremonium minimum et/ou par le champignon pathogène de l’espèce Fomitiporia mediterranea et/ou par les champignons pathogènes de l’espèce Botryosphaeria spp . Dans des modes de mise en œuvre particuliers de l’invention, l’application de la composition à base de chlorhydrate de chitosane sur le bois de vigne, notamment sur une blessure dudit bois de vigne, est réalisée à une seule reprise. Préférentiellement, l’application de la composition est réalisée dans les trois jours, de préférence dans les deux jours, suivant l’infliction d’une blessure au bois de vigne, et préférentiellement dans les 24 heures suivant une telle infliction. L’application peut autrement être réalisée à plusieurs reprises, à plusieurs semaines d’intervalles ; et/ou sur des blessures anciennes. L’application de la composition phytosanitaire mise en œuvre selon l’invention sur le bois de vigne est de préférence réalisée dans des conditions atmosphériques reconnues classiquement favorables pour ce type de traitement, c’est-à-dire notamment par temps dégagé, non pluvieux, en évitant les périodes de gel d’hiver. Préférentiellement, l’application est réalisée dans des conditions d’absence de pleurs de la vigne. A chaque application, il est appliqué une quantité efficace de la composition phytosanitaire, et plus particulièrement du chlorhydrate de chitosane qu’elle contient. Une quantité de la composition phytosanitaire comprise entre 30 et 250 μl/cm 2 de bois est de préférence appliquée sur le bois de vigne. Cette quantité est de préférence comprise entre environ 30 et 50 μl/cm 2 lorsque la composition se trouve sous forme liquide, apte à être appliquée par pulvérisation ciblée sur le bois de vigne. Elle est de préférence comprise entre 50 et 250 μl/cm 2 , préférentiellement comprise entre 100 et 200 μl/cm 2 , par exemple d’environ 150 μl/cm 2 , lorsque la composition se trouve sous forme semi-liquide ou semi-solide, en particulier sous forme de gel, particulièrement adaptée à une application par badigeonnage. Par exemple, lorsque la composition phytosanitaire contient 10 % en poids de chlorhydrate de chitosane, par rapport au volume total de la composition, l’application de la composition sur le bois de vigne, en particulier sur une blessure ayant été infligée au bois de vigne, peut être réalisée de sorte à appliquer 5 à 25 mg de chlorhydrate de chitosane par cm 2 de bois traité, de préférence comprise entre 10 et 25 mg de chlorhydrate de chitosane par cm 2 de bois traité. Un autre aspect de l’invention concerne l’utilisation de chlorhydrate de chitosane, ou d’une composition phytosanitaire contenant du chlorhydrate de chitosane en tant qu’agent actif dans un véhicule adapté à une utilisation phytosanitaire, pour le traitement préventif et/ou curatif d’une maladie cryptogamique du bois de la vigne. Cette utilisation peut répondre à l’une ou plusieurs des caractéristiques décrites ci-avant en référence au procédé de traitement selon l’invention. L’invention concerne également l’utilisation de chlorhydrate de chitosane pour la fabrication d’une composition phytosanitaire destinée au, et donc adaptée au, traitement préventif et/ou curatif d’une maladie cryptogamique du bois de la vigne. La fabrication de cette composition phytosanitaire comprend la dissolution ou la mise en suspension de chlorhydrate de chitosane sous forme de poudre, en quantité adéquate, dans un véhicule adapté à une utilisation phytosanitaire, en particulier dans le domaine de la viticulture, par exemple dans l’eau et/ou dans un acide organique tel que l’acide acétique ; ou la dilution d’une préparation mère de chlorhydrate de chitosane dans le véhicule, par exemple dans l’eau et/ou dans un acide organique tel que l’acide acétique, pour obtenir la concentration souhaitée en chlorhydrate de chitosane. Un autre objet de l’invention est une composition phytosanitaire pour le traitement préventif et/ou curatif d’une maladie cryptogamique du bois de la vigne. Cette composition contient du chlorhydrate de chitosane en tant qu’agent actif, dans un véhicule adapté à une utilisation phytosanitaire. La concentration de chlorhydrate de chitosane dans cette composition est comprise entre 5 et 15 % en poids par rapport au volume total de la composition. Cette concentration peut notamment être comprise entre 5 et 12 % en poids, par exemple entre 5 et 11 % en poids, par rapport au volume total de la composition. La composition phytosanitaire selon l’invention peut répondre à l’une ou plusieurs des caractéristiques décrites ci-avant en référence au procédé de traitement selon l’invention, pour ce qui concerne le chlorhydrate de chitosane et la composition. Les caractéristiques et avantages de l’invention apparaîtront plus clairement à la lumière des exemples de mise en œuvre ci-après, fournis à simple titre illustratif et nullement limitatifs de l’invention. Exemple 1 – essais in vitro Dans cet exemple, il est réalisé l’étude in vitro de l’effet de différents produits sur la croissance mycélienne des principaux champignons pathogènes lignicoles de la vigne. Le principe de cet essai, mené en préventif, consiste à déposer les produits testés à la surface d’un milieu gélosé quelques heures avant le dépôt d’un implant mycélien pathogène (face mycélienne en contact avec le produit) à la surface du produit asséché. L’effet est évalué sur les six champignons pathogènes majeurs responsables des maladies du bois de la vigne, dont les caractéristiques sont indiquées dans le tableau 1 ci-dessous. Les vignobles à partir desquels ces champignons ont été isolés, où la maladie associée était présente, sont précisés dans ce tableau. Champignon Origine Maladie Eutypa lata Entre-Deux-Mers, 33, Sud-Ouest Eutypiose Phaeomoniella chlamydospora Labastide d’Armagnac, 40, Sud-Ouest Esca Phaeoacremonium minimum Julienne, 16, Cognac Esca Fomitiporia mediterranea Saint Preuil, Cognac Esca et dégradation terminale du bois ("pourriture blanche" ou carie) Neofusicoccum parvum Domaine de Couhins, 33, Sud-Ouest, isolé sur Cabernet sauvignon Dépérissement à Botryosphaeria Diplodia seriata Perpignan, 66, Sud-Est Dépérissement à Botryosphaeria Le milieu de base Malt-Agar (MA) est constitué de 15 g de malt et de 20 g d’agar pour 1 l d’eau permutée. Ce milieu est stérilisé à 120°C pendant 20 min et refroidi à 55°C environ avant d’être coulé dans des boîtes de Petri. Les produits testés et leurs caractéristiques sont indiqués dans le tableau 2 ci-dessous. Code Produit testé Origine Poids moléculaire (PM) (kDa) Fournisseur, référence OCe Oligochitosane Crustacé 3 Glentham Life Sciences, GU0761 Ca50 Chitosane PM moyen Crustacé 50 Glentham Life Sciences, GC9009 S Chitosane haut PM Crustacé 674 Sigma-Aldrich OF Oligochitosane Champignon 3 Glentham Life Sciences, GU3511 LF Chitosane PM moyen Champignon 43 Laffort, France F Chitosane haut PM Champignon 329 Nutra-Science Industries, Chine H Chlorhydrate de chitosane Champignon 90 Glentham Life Sciences, GP0962 Parmi les chitosanes testés, certains sont issus de la chitine de champignon (codes LF, F et OF), d’autres de crustacé (codes Ca50, S et OCe). Les différents chitosanes testés se différencient également par leurs poids moléculaires, qui sont faibles, c’est-à-dire inférieur ou égal à 5 kDa, pour les oligosaccharides (oligochitosane) (codes OCe, OF), moyens, entre 40 et 50 kDa, pour certains chitosanes dits « PM moyen » (codes Ca50, LF) et élevé, supérieur à 300 kDa, pour d’autres chitosanes dits « haut PM » (codes S, F). Le chlorhydrate de chitosane, de poids moléculaire de 90 kDa et à faible degré d’acétylation (14,5 %) est également testé (code H). Les sept produits testés ont été conservés à température ambiante et à l’abri de la lumière avant leur utilisation. Un produit chimique disponible dans le commerce, homologué en pulvérisation sur la vigne, a été testé en référence, à la dose de 1.6 g/L (soit 0.16 %). Il s’agit du Topsin® 70WG, à base de thiophanate-méthyl (substance active également présente dans le Phytopast®-V, mastic homologué sur vigne en traitement des parties aériennes contre l’eutypiose), comprenant 70,4 % de matière active. Pour chaque produit, les doses testées (0,2 et 1 %) sont indiquées en pourcentage : 1 % correspond à 1 g de produit testé dilué dans 100 mL d’eau stérile. Le test in vitro est réalisé de la façon suivante. A l’aide d’une pipette à embout stérile, 300 µL de chacune des compositions contenant le produit à tester sont déposés à la surface et au centre d’un milieu gélosé en boite de Petri. Il est réalisé un assèchement complet des solutions sous une hotte à flux laminaire. Une fois les solutions asséchées, le même jour ou le lendemain, il est réalisé l’ensemencement des champignons sous la forme de pastilles de mycélium. Pour ce faire, des implants de 5 mm de diamètre, découpés à l'aide d'un emporte-pièce dans la zone de croissance d'une culture-mère du champignon pathogène testé, sont disposés en conditions stériles au centre de chaque boîte, la face mycélienne étant en contact avec la composition contenant le produit à tester. Deux essais et quatre répétitions sont effectués. Un témoin est réalisé, pour lequel 300 μl d’eau seule sont déposés sur le milieu (« milieu témoin »). Les boîtes de Petri ensemencées sont mises à incuber en chambre de culture à une température de +/- 23°C et à photopériode alternée (12h/12h). La durée d’incubation correspond au temps nécessaire pour que le champignon testé se développe sur le milieu malt-agar : elle est de quelques jours pour les champignons à croissance rapide ( E. lata , D. seriata et N. parvum ) ou de quelques semaines pour les champignons à croissance lente ( F. mediterranea , P. chlamydospora et P. minimum ). Les mesures de croissance mycélienne sont réalisées quatre à vingt jours après l’ensemencement. La croissance mycélienne est calculée en faisant la moyenne (en cm) des mesures de deux diamètres perpendiculaires de la colonie (le diamètre de l’implant de 0,5 cm étant soustrait). Le pourcentage d’efficacité des produits est calculé selon la formule suivante : Les résultats obtenus sont présentés ci-après, dans le tableau 3 pour les doses de 0,2 % de produit testé et dans le tableau 4 pour les doses de 1 % de produit testé. Les résultats sont présentés en termes d’efficacité moyenne, obtenue lors d’au moins deux essais. Dose 0,2% Efficacité (%) Code E. lata F. mediterranea P. chlamydospora P. minimum D. seriata N. parvum OCe 67 7 11 5 55 23 Ca50 15 3 9 19 21 17 S 0 1 0 0 5 0 OF 34 3 6 1 13 14 LF 40 5 10 0 26 7 F 0 1 6 0 5 1 H 24 1 5 9 21 31 Topsin® 70WG 100 33 98 100 100 87 Dose 1% Efficacité (%) Code E. lata P. chlamydospora D. seriata OCe 100 66 95 Ca50 85 78 71 S 0 0 12 OF 100 58 90 LF 90 82 76 F 3 0 13 H 86 45 87 Topsin® 70WG 100 98 100 Pour tous les pathogènes, le produit chimique commercial Topsin® 70WG présente la meilleure efficacité. Aux deux doses testées, les oligochitosanes présentent les meilleurs taux d’efficacité sur l’ensemble des pathogènes, suivis par les chitosanes de poids moléculaire moyen, compris entre 40 et 50 kDa. Le chlorhydrate de chitosane est moins performant pour la grande majorité des pathogènes, en particulier vis-à-vis d’ E. lata , de P. chlamydospora et de D. seriata . Exemple 2 – expérience in vivo Dans cet exemple, il est évalué l’aptitude préventive des produits décrits dans l’Exemple 1, désignés par les codes OCe, LF et H (chlorhydrate de chitosane), à empêcher la germination (c’est-à-dire le développement de mycéliums issus de spores) d’une quantité connue d’ascospores d’ Eutypa lata ou de conidies de Phaeomoniella chlamydospora ( P. ch ), par application sur des plaies de taille de vigne. Compte-tenu de la durée très longue d’incubation des champignons avant le développement d’une nécrose significative ou l’expression de symptômes foliaires (5 à 8 ans), l’efficacité est jugée sur la base de la fréquence de ré-isolement des champignons pathogènes dans les tissus sous-jacents aux plaies de taille. Les isolements sont réalisés après un temps d’incubation d’une durée minimum de huit mois, temps jugé nécessaire et suffisant pour le développement d’une nécrose. Cette expérience est réalisée selon la méthode CEB 155. Pour Phaeomoniella chlamydospora , la souche utilisée est la souche décrite dans l’Exemple 1. En ce qui concerne Eutypa lata , on utilise des ascospores, contenues dans des périthèces récoltés quelques semaines avant dans les vignobles girondins où la maladie (l’eutypiose) est présente à partir de bois morts (des souches ou des bras) porteurs de périthèces, structures sexuées renfermant des asques (les conidies asexuées de ce champignon obtenues sur milieu gélosé ne germent pas et ne sont pas viables). Les essais ont été mis en place en Février (taille, traitement et inoculation) de 2016 à 2019, dans une parcelle expérimentale de l’INRAE à Villenave d’Ornon ou de Bordeaux Sciences Agro au Château Luchey-Halde à Mérignac. Le cépage choisi est le Cabernet sauvignon pour sa sensibilité aux maladies du bois. Les doses indiquées ci-dessous sont exprimée en poids / volume, les composés testés étant en solution dans de l’eau stérile (1 % indiquant une quantité de 1 g de composé dans 100 ml d’eau). Cette étude est réalisée sur les modalités suivantes : - chitosane LF pulvérisé aux doses de 5 % (Mérignac, 2016, E. lata ) et 15 % (Mérignac, 2017, E. lata et P. Chlamydospora ; 1610 μL pulvérisés par plaie de taille) ; - oligochitosane OCe pulvérisé aux doses de 5 % (Mérignac, 2018, E. lata et P. Chlamydospora ; 1430 μL pulvérisés par plaie de taille), 10 % (Villenave d’Ornon, 2019, E. lata et P. Chlamydospora ; 2300 μL pulvérisés par plaie de taille) et 15 % (Villenave d’Ornon, 2019, E. lata et P. Chlamydospora ; 2300 μL pulvérisés par plaie de taille) ; - chlorhydrate de chitosane H badigeonné à la dose de 10 % (Villenave d’Ornon, 2019, E. lata et P. Chlamydospora ; 200 à 250 µL badigeonnés par plaie de taille) ; - le produit Phytopast®G (mastic souple, polyvalent, appliqué par badigeon) : témoin non inoculé servant à contrôler la présence interne de P. chlamydospora – ce qui a bien été le cas pour toutes les expériences réalisées ; - un témoin inoculé et non traité ; - un témoin naturel (non inoculé, non traité). Chaque modalité est représentée par 39 sarments (30 sarments de base + 9 en secours) repérés par des étiquettes de couleur à raison d’un sarment par cep choisi de façon aléatoire (dispositif en randomisation, seul l’état sanitaire des sarments et l’aspect général du cep sont contrôlés). Les sarments ont été taillés d’environ 1 cm pour E. lata et 0,5 cm pour P. chlamydospora au-dessus d'un œil au repos. Les lames du sécateur ont été régulièrement désinfectées à l'alcool. Les dilutions dans l’eau stérile des produits OCe, LF et H ont été préparées peu avant leur application sur les plaies de taille. Les traitements ont été réalisés à l’aide d’un pulvérisateur manuel ou d’un pinceau, permettant une application directe sur les plaies de taille. Les conditions climatiques au moment de l’inoculation (plaies souvent humides à cause des pleurs mais rarement dégoulinantes, vent léger et pas de pluie, temps ensoleillé mais frais) ont été très favorables au développement des mycéliums. Selon la méthode CEB 155, la contamination artificielle des plaies par E. lata ou par P. chlamydospora a été réalisée par dépôt d’une suspension de spores au centre des plaies à l’aide d’une micropipette. Les modalités ont été inoculées par les champignons pathogènes un à deux jours après l’application des compositions contenant les chitosanes testés. Les suspensions de spores ont été systématiquement préparées le matin même de l’inoculation, quelques heures avant leur utilisation. Pour E. lata , des périthèces, contenant les asques à l’intérieur desquels se trouvent les ascospores, ont été collectés avec un scalpel et immergés dans de l’eau distillée stérile pendant environ une heure. Pour P. chlamydospora , de l’eau stérile (1 à 2 mL) a été déposée à la surface du mycélium d’une culture en croissance et une légère agitation a permis de mettre en suspension les conidies du pathogène. Les concentrations en ascospores et conidies des suspensions mères et filles ont été évaluées par comptage sur une cellule de Malassez. La viabilité des spores inoculées a été vérifiée par un test de germination. Pour cela, on réalise un étalement de 200 µL de la suspension de spores sur des boîtes de Petri contenant du milieu malt-agar. Après 24 h en étuve à 22°C, on effectue un comptage du nombre de spores germées en observant au microscope les colonies mycéliennes à la surface de la gélose. Le tableau 5 ci-dessous décrit l’inoculum préparé en termes de volume déposé sur les plaies de taille, de concentration en spores et de quantités de spores totales , puis de spores supposées aptes à germer déposées par plaies estimées après évaluation du pourcentage de germination des spores des pathogènes. 2016 2017 2018 2019 E. lata E. lata P. ch E. lata P. ch E. lata P. ch Nombre souhaité de spores 200 500 3000 300 1500 300 1800 Volume déposé (µL) 35 24 27 27 27 25 20 Nombre de spores par µL 6 22 113 13 70 15 100 Nombre total de spores déposées 210 528 3051 351 1890 375 2000 % de germination 88,5 52 95 61,5 94,8 94,8 98 Nombre de spores vivantes déposées 186 274 2898 215 1786 355 1960 Pour l’analyse microbiologique, le prélèvement des échantillons est réalisé huit mois après l’inoculation. Ce temps permet aux champignons de former une nécrose suffisamment développée à partir de laquelle l'isolement des champignons est relativement plus facile et surtout plus fiable. Avant l’analyse, l’état sanitaire des sarments et des bourgeons sous-jacents aux plaies de taille est observé : présence d’une nécrose longitudinale, sarment mort ou asséché, auquel cas celui-ci sera préférentiellement écarté de l’analyse. De plus, une notation est effectuée lorsque le bourgeon ne s’est pas développé ou si son développement est chétif. Avant la mise en culture des tissus nécrosés sous-jacents aux plaies de taille, les extrémités de sarments sont rapidement désinfectées en surface avec un coton imbibé d’alcool pour limiter la présence de micro-organismes (champignons, bactéries et levures) qui risque de gêner la croissance des mycéliums d’ E. lata ou de P. chlamydospora . Puis ces extrémités de sarments sont écorcées sur quelques centimètres à l’aide d’un scalpel stérilisé et passé à la flamme. A ce stade, le protocole diffère selon le pathogène étudié. Pour E. lata , à l’aide d’un sécateur, on élimine le premier millimètre nécrosé et on découpe l’extrémité des sarments en 25 à 30 petites bûchettes cubiques de 2 à 5 mm de côté en prenant soin de découper 5-10 bûchettes dans la zone nécrosée du bois (celle sous-jacente à la plaie de taille) et 15-20 dans le bois sain. Pour P. chlamydospora , à l’aide d’un sécateur, on élimine la presque totalité de la zone nécrosée ainsi que la moëlle et on découpe la zone frontière et la zone saine sous-jacente en 25 à 30 petites bûchettes cubiques de 2 à 5 mm de côté. Ensuite, les bûchettes sont immergées dans de l’hypochlorite de calcium à 3% pendant quinze secondes puis rincées à l’eau stérile. Sous une hotte à flux laminaire, on dépose ces petits morceaux de bois dans des boîtes de Petri à raison de cinq par boîte. Le milieu de culture utilisé est un milieu gélosé simple et complet nommé MAC. Il est composé de malt (15 g/L) et d’Agar (20 g/L). Un antibiotique (chloramphénicol à 50 mg/L) est ajouté après autoclavage. La notation des résultats est réalisée comme suit. L’observation des boîtes de Petri et la première notation des résultats sont réalisées après environ 1 semaine d’incubation à 22°C. Cette notation est vérifiée et ajustée si nécessaire au cours des semaines suivantes et ce jusqu’à un mois et demi après l’isolement. Pour l’expression des résultats, on note la présence ou l’absence de développement d’ E. lata et de P. chlamydospora au niveau de chacune des bûchettes. L’observation des champignons analysés à partir d’une seule bûchette suffit à déclarer le sarment infecté. Le diagnostic est réalisé en comparant le mycélium observé à un mycélium témoin. Les résultats sont d'abord exprimés en nombre de sarments infectés par les champignons testés par rapport au nombre de sarments analysés puis traduits en pourcentage d'infection. Enfin, l'efficacité est jugée prioritairement en fonction du taux d'infection de la modalité témoin inoculée et calculée selon la formule suivante : Pour l’exploitation statistique des résultats, les pourcentages d’infection obtenus au sein de chaque bloc de dix sarments sont comparés et utilisés pour une analyse de variance à un facteur au moyen du logiciel Statbox Pro. Au préalable, les pourcentages d’infection peuvent être transformés en données arc sinus exprimées en radians puis converties en degrés. Si le facteur étudié a un effet significatif, l’analyse de variance (Anova) est suivie d’un test de comparaison des moyennes (Newman-Keuls). La méthode précédente juge l’efficacité des traitements en fonction du pourcentage de sarments infectés par modalité. Un sarment est déclaré « infecté » dès qu’il permet l’isolement du champignon pathogène à partir d’une seule bûchette de bois. Pour mieux comprendre la relation entre l’inoculation et l’aptitude des produits à limiter le développement des champignons inoculés, il est en outre réalisé une analyse en fonction du nombre de bûchettes infectées par rapport au nombre total de bûchettes analysées (25 bûchettes de bois analysées par sarment). Ce type de variable ne permet pas d’analyse de variance : une répartition en classes selon un nombre croissant de bûchettes infectées est donc réalisée. Les résultats sont ensuite analysés deux à deux selon un test X 2 de comparaison des distributions 2 à 2. Les résultats obtenus, concernant l’aptitude de l’oligochitosane OCe, du chitosane LF et du chlorhydrate de chitosane H, à protéger les plaies de taille vis-à-vis de l’agent responsable de la maladie de l’eutypiose ( Eutypa lata ) et de l’un des principaux pathogènes impliqués dans la maladie de l’esca ( Phaeomoniella chlamydospora ), sont montrés sur le tableau 6 ci-dessous. Dans ce tableau, a indique les valeurs ayant montré une différence significative par rapport au témoin ( P = 0.05) selon le test de Newman-Keuls ; b indique les valeurs ayant montré une différence significative par rapport au témoin ( P = 0.05) selon le test du X 2 . E. lata P. chlamydospora Modalité Efficacité (%) (sarments analysés) Efficacité (%) (bûchettes analysées) Efficacité (%) (sarments analysés) Efficacité (%) (bûchettes analysées) OCe 5% 25 41 10 20 OCe 10% 0 0 3 6 OCe 15% 0 0 7 12 b LF 5% 19 27 - - LF 15% 69 a 89 b 10 0 H 10% 60 a 58 b 67 a 82 b Ces résultats montrent que les infections causées par E. lata et P. chlamydospora au travers des plaies de taille peuvent être réduites de manière significative en appliquant du chlorhydrate de chitosane à brève échéance après la taille. L’efficacité du chlorhydrate de chitosan est, de manière particulièrement inattendue étant donné les résultats du test in vitro de l’Exemple 1 sur le pathogène P. chlamydospora , bien plus importante que celle de l’oligochitosane OCe ou du chitosane de poids moléculaire moyen LF vis-à-vis de ce pathogène ; elle est, également de manière inattendue, bien supérieure à celle de l’oligochitosane OCe, et comparable à celle du chitosane de poids moléculaire moyen LF, vis-à-vis de E. lata . Ces résultats sont obtenus avec un haut degré de reproductibilité. Ces résultats démontrent que le chlorhydrate de chitosane est un agent actif particulièrement performant pour la lutte contre les maladies cryptogamiques du bois de la vigne. Procédé de traitement préventif et/ou curatif d’une maladie cryptogamique du bois de la vigne, caractérisé en ce qu’il comprend l’application sur le bois de vigne d’une composition phytosanitaire contenant du chlorhydrate de chitosane en tant qu’agent actif, dans un véhicule adapté à une utilisation phytosanitaire. Procédé selon la revendication 1, selon lequel l’application de ladite composition est réalisée sur une blessure dudit bois de vigne, de sorte à recouvrir au moins 90 %, de préférence la totalité, de la surface de ladite blessure par ladite composition. Procédé selon la revendication 2, selon lequel l’application de ladite composition est réalisée de manière ciblée sur ladite blessure. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, selon lequel l’application de ladite composition sur ledit bois de vigne est réalisée par badigeonnage. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, selon lequel le poids moléculaire dudit chlorhydrate de chitosane est compris entre 3 et 130 kDa, de préférence entre 30 et 130 kDa. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, selon lequel le degré d’acétylation dudit chlorhydrate de chitosane est compris entre 5 et 35 %. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, selon lequel ledit véhicule est choisi parmi les véhicules aqueux, les acides organiques et l’un quelconque de leurs mélanges. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, selon lequel la concentration en chlorhydrate de chitosane dans ladite composition est comprise entre 1 et 15 % en poids, de préférence entre 5 et 12 % en poids, par rapport au volume total de la composition. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, selon lequel ladite maladie cryptogamique du bois de la vigne est l’esca, l’eutypiose ou le dépérissement à Botryosphaeri a . Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, selon lequel ladite maladie cryptogamique du bois de la vigne est causée par un champignon pathogène de l’espèce Eutypa lata , de l’espèce Phaeomoniella chlamydospora , de l’espèce Phaeoacremonium minimum, de l’espèce Fomitiporia mediterranea ou de l’espèce Botryosphaeria spp . Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, selon lequel l’application de ladite composition phytosanitaire sur le bois de vigne est réalisée dans les trois jours suivant l’infliction d’une blessure audit bois de vigne, de préférence dans les 24 heures suivant une telle infliction. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 11, selon lequel l’application de ladite composition phytosanitaire sur le bois de vigne est réalisée à raison de 30 à 250 μl/cm 2 . Utilisation de chlorhydrate de chitosane, ou d’une composition phytosanitaire contenant du chlorhydrate de chitosane en tant qu’agent actif dans un véhicule adapté à une utilisation phytosanitaire, pour le traitement préventif et/ou curatif d’une maladie cryptogamique du bois de la vigne. Composition phytosanitaire pour le traitement préventif et/ou curatif d’une maladie cryptogamique du bois de la vigne, caractérisée en ce qu’elle contient 5 à 15 % en poids, par rapport au volume total de ladite composition phytosanitaire, de chlorhydrate de chitosane en tant qu’agent actif, dans un véhicule adapté à une utilisation phytosanitaire.