Brevet FR3108330A1 — publié le 20210924

COPOLYMERE LINEAIRE POUR LA TRANSFECTION DE GENES La présente invention concerne un copolymère de polyéthylèneimine linéaire comprenant des unités monomériques de formule (I) et des unités monomériques de formule (II) et son utilisation pour la transfection de gènes. Figure pour l'abrégé : Néant COPOLYMERE LINEAIRE POUR LA TRANSFECTION DE GENES La présente invention concerne des polymères à base de polyéthylènimine et leur utilisation dans le transfert de gènes en vue d’application thérapeutique. Dans certaines thérapies il est souhaitable de corriger les défauts génétiques dans des cellules cibles. Pour ce faire, il convient de transférer des gènes dans les cellules cibles. Le problème principal auquel se heurte le transfert de gènes in-vivo est de garantir l’efficacité du transfert dans les tissus ou cellules visés accompagnés d’un haut niveau d’expression du gène. La transfection utilise des complexes comprenant deux parties : un élément actif qui est généralement un acide nucléique, un plasmide, un fragment d’ADN, un fragment d’ARN et vecteur de transfert de gènes pouvant également comprendre des fonctions permettant d’aider à la localisation du complexe sur la cellule ou tissu cible. Les vecteurs de transfert de gènes sont typiquement des vecteurs viraux ou des vecteurs synthétiques. Parmi les vecteurs synthétiques on peut citer les lipides cationiques ou les vecteurs polymériques. Les polyélectrolytes positifs constituent un ensemble de vecteurs polymères particulièrement adapté au transfert de gènes, dans la mesure ou leur charge positive leur confère des propriétés de complexation de l’ADN et des plasmides, et d’interaction avec les surfaces cellulaires visées. Des polymères cationiques ont déjà été décrits dans WO2009/112402. Il existe cependant toujours un intérêt à proposer de nouveaux copolymères permettant notamment une transfection améliorée notamment des gènes. Ainsi, un objectif de la présente invention est de fournir un copolymère utile pour la transfection et permettant une transfection améliorée par rapport aux vecteurs existants. Un autre objectif de la présente invention est de fournir un tel copolymère qui présente une toxicité réduite. D’autres objectifs encore apparaîtront à la lumière de la description de l’invention qui suit. La présente invention concerne un copolymère de polyéthylèneimine linéaire (lPEI) comprenant des unités monomériques de formule (I) et des unités monomériques de formule (II) dans lesquels : R 1 et R 2 , identiques ou différents, représentent un atome d’hydrogène, un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, de préférence de 1 à 2 atomes de carbone, l’un au moins de R 1 ou R 2 représente H ; R est choisi parmi H ou un groupe protecteur d’amine, par exemple Boc (tert-butoxycarbonyle) ; n est un nombre compris entre 1 et 99% des monomères totaux ; et m est un nombre compris entre 1 et 99% des monomères totaux. Avantageusement, le copolymère de l’invention est un copolymère linéaire. De préférence, R 1 et R 2 représentent H. De préférence R représente H. De préférence R 1 , R 2 et R représentent H. De préférence, le copolymère de l’invention est un copolymère statistique. Le copolymère de l’invention peut répondre à l’une des formules suivantes : dans lesquels R, R1, R2, m et n sont tels que définis ci-dessus. De préférence, dans le copolymère de l’invention, m est inférieur ou égal à 70% des monomères totaux, de préférence m est compris entre 1 et 70%, plus préférentiellement entre 2 et 50%, de préférence entre 4 et 40%, par exemple entre 5 et 35%, notamment entre 10 et 30%, des monomères totaux. De préférence, dans le copolymère de l’invention, n est supérieur ou égale à 30%, de préférence n est compris entre 30 et 99%, plus préférentiellement entre 50 et 98%, de préférence entre 60 et 96%, par exemple entre 65 et 95%, notamment entre 70 et 90%, des monomères totaux. Le copolymère de l’invention peut en outre comprendre une unité monomère supplémentaire de formule III suivante : dans laquelle R 3 représente un groupe alkyle en C1-C6, de préférence un groupe méthyle ou éthyle ; r est un nombre compris entre 0 et 95% des monomères totaux, avantageusement entre 0 et 10% des monomères totaux. Cette unité monomère est également répartie de façon aléatoire dans le copolymère selon l’invention. Avantageusement m+n+r = 100%. Le copolymère statistique selon l’invention peut avoir la formule IX suivante : Dans laquelle m, n, r, R 1 , R 2 et R 3 sont tels que définis précédemment, ou la formule X suivante : Ou la formule XI suivante : Le copolymère de l’invention peut également comprendre des unités monomères comportant des résidus saccharidiques ou des résidus poly(oxyde d’éthylène) ou des unités peptidiques, avantageusement polylysine. Les résidus saccharidiques sont avantageusement choisis parmi les résidus de lactose, de tétraglucose et de mannose. Les résidus saccharidiques et/ou les résidus poly(oxyde d’éthylène) sont greffés sur l’atome d’azote du motif PEI de formue (I) avantageusement par l’intermédiaire d’un groupe CO. De façon avantageuse, la proportion de ces résidus est telle que le polyéthylènimine est toujours globalement de structure linéaire. Avantageusement, chacun de ces résidus est présent dans le copolymère en une proportion inférieure à 70% des monomères totaux, de façon avantageuse en une proportion inférieure à 50% des monomères totaux et de façon encore plus avantageuse en une proportion inférieure à 30% des monomères totaux, encore plus avantageusement en une proportion inférieure à 10% des monomères totaux. De façon avantageuse, chacun de ces unités est disposée aléatoirement dans le copolymère. De préférence, le copolymère présente une masse molaire comprise entre 1000 et 200000 Da, de préférence entre 3000 et 50000 Da. De façon avantageuse, le copolymère selon l’invention a la capacité d’être chargé positivement de par la fonction amine. La présente invention concerne également un procédé de préparation des copolymères de l’invention comprenant la réaction entre un composé polyéthylène imine de formule (I) et un composé de formule (IV) et la déprotection des fonctions amines dans lesquellesR1 est tel que défini ci-dessus et R’ représente un groupement protecteur d’une fonction amine, par exemple Boc (COOtBu), p étant supérieur à n et m+n, ou le cas échéant m+n+r, est égal à p. De préférence, le composé de formule (IV) est le composé suivant : Le procédé de l’invention peut de préférence correspondre à un greffage d’un composé de formule (IV) sur un composé de formule (I), de préférence la fonction ester activé (fonction succidinimyle). Le procédé de l’invention peut être mis en œuvre dans un solvant, le solvant doit permettre la solubilisation de la PEI, notamment méthanol, eau de préférence avec un contrôle du pH à pH neutre (environ 7), DMSO ou chloroforme, de préférence le DMSO. L’étape de déprotection, est optionnelle, elle peut être totale ou partielle, se fait de toute manière connue de l’homme du métier, notamment par l’action de l’acide trifluoroacétique (TFA). De préférence, le procédé de la présente invention est mis en œuvre à une température comprise entre 25 et 100°C, de préférence entre 50 et 80°C. Le produit obtenu peut être purifié par toute technique connue de l’homme du métier, notamment par extraction, par exemple au dichlorométhane puis dialyse des phases aqueuses récupérées. Le procédé de l’invention consiste donc en une réaction aléatoire d’un dérivé de l’histidine sur le polyéthylénimine. Le taux de modification de la polyéthylènimine et donc la valeur de m dans le copolymère selon l’invention dépend de la durée de l’étape de mise en contact du composé de formule (IV) avec la lPEI. Avantageusement, la durée de cette étape est d’au maximum 5 jours, de façon avantageuse au maximum de 4 jours, de façon plus avantageuse au maximum de 3 jours, plus avantageusement entre 12 heures et 2 jours de préférence entre 24 h et 2 jours. De préférence, la polyéthylènimine de départ présente une masse molaire comprise entre 500 et 200000 Da, de préférence entre 1000 et 100000 Da. De façon particulièrement avantageuse, le copolymère de l’invention peut être utilisé en tant que vecteur pharmaceutiquement acceptable notamment en tant que vecteur d’une substance active. Dans le cadre de la présente invention, on entend par substance active toute substance active pouvant être utilisée : en pharmacie. On peut notamment citer les antalgiques, antipyrétiques, aspirine et dérivés, antibiotiques, anti-inflammatoires, antiulcéreux, antihypertenseurs, neuroleptiques, antidépresseurs, oligonucléotides, peptides, protéines ; en cosmétique. On peut notamment citer les composés anti-UV, autobronzant ; ennitraceptique. On peut par exemple citer les protéines ; en alimentaire ; en agrochimie ; en vétérinaire. De façon avantageuse, la substance active est chargée ou susceptible d’être chargée négativement. Le copolymère selon l’invention, comme mentionné ci-dessus, est cationique ou potentiellement cationique, ainsi, une liaison de type électrostatique se crée entre le copolymère de l’invention (i) et la substance active (ii). De préférence, le copolymère selon l’invention peut être utilisé en tant que vecteur dans la transfection. Ainsi, la présente invention concerne également le copolymère selon l’invention en tant que vecteur de substance active. De préférence, la présente invention concerne le copolymère selon l’invention pour son utilisation pour la transfection de gènes. La présente invention concerne l’utilisation du copolymère selon l’invention en tant que vecteur pharmaceutiquement acceptable d’une substance active dans une composition pharmaceutique. La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant un copolymère selon l’invention, une substance active et éventuellement un excipient pharmaceutiquement acceptable. Ainsi, la présente invention concerne également la composition pharmaceutique selon l’invention pour son utilisation pour la transfection de gènes. La posologie peut varier dans des limites importantes en fonction de l’indication thérapeutique, et de la voie d’administration, ainsi que de l’âge et du poids du sujet. L’identification du patient qui a besoin est définie par l’homme du métier. On entend par patient un être humain ou un animal. Un médecin ou un vétérinaire peut identifier, par l’intermédiaire de tests cliniques, d’examen physique, de tests ou diagnostics biologiques et par l’historique familial et/ou médical, les sujets qui ont besoin d’un tel traitement. On entend par quantité suffisante, une quantité de composé selon la présente invention efficace pour prévenir ou traiter des conditions pathologiques. La quantité suffisante peut être déterminée par l’homme du métier, par l’intermédiaire de technique conventionnelle et par l’observation des résultats obtenus dans des circonstances analogues. Pour déterminer la quantité suffisante différents facteurs doivent être pris en compte par l’homme du métier, notamment et sans y être limité : le sujet, sa taille, son âge, son état de santé général, la maladie impliquée et son degré de sévérité ; la réponse du sujet, le type de composé, le mode d’administration, la biodisponibilité de la composition administrée, le dosage, l’utilisation concomitante d’autres médicaments, etc. Les compositions de l’invention sont destinées à une administrations par la voie orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, transdermique, locale ou rectale. On peut citer notamment les comprimés, les gélules, les poudres, les granules, les solutions ou suspensions orales, les formes d’administrations sublinguale et buccale, les formes d’administration sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, intranasale ou intraoculaire et les formes d’administration rectale. Parmi les excipients pharmaceutiquement acceptables on peut citer la gélatine, l’amidon, le lactose, le stéarate de magnésium, le talc, la gomme arabique ou analogues, un édulcorant, un antiseptique, un agent donnant du goût, un colorant, des agents de dispersion, un agent mouillant, un agent de mise en suspension ou un diluant. Les comprimés peuvent notamment être enrobés avec du saccharose ou toutes autres matières appropriées ou encore peuvent être traités de sorte à avoir une activité prolongée ou retardée et libérer de façon continue une quantité prédéterminée de la substance active et du copolymère selon l’invention. Pour une administration rectale, la composition peut être sous la forme de suppositoires préparés avec des liants fondant à la température rectale, par exemple beurre de cacao ou polyéthylèneglycols. Pour une composition pour administration parentérale, intranasale ou intraoculaire, on utilise des suspensions aqueuses, des solutions salines isotoniques ou des solutions stériles et injectables qui contiennent des agents de dispersion et/ou des agents mouillants pharmacologiquement compatibles. La présente invention concerne également un complexe comprenant : un copolymère selon l’invention ; au moins une substance active anionique ou potentiellement anionique. Le copolymère selon l’invention, comme mentionné ci-dessus, est cationique ou potentiellement cationique, ainsi, une liaison de type électrostatique se crée entre le copolymère de l’invention (i) et la substance active (ii). Dans le cadre de la présente invention, on entend par potentiellement cationique, une substance qui, après réaction avec un acide de bronsted ou un halogénure, produit un composé cationique. Dans le cadre de la présente invention, on entend par potentiellement anionique, une substance qui après réaction avec une base produit un composé anionique. De préférence, dans le cadre de l’invention, la substance active est un acide nucléique. L’acide nucléique peut être un acide désoxyribonucléique (ADN), un acide ribonucléique (ARN) ou des séquences hybrides (ADN/ARN). Il peut s’agir de séquences d’origine naturelle ou artificielle, et notamment d’ADN génomique, d’ADN complémentaire (ADNc), d’ARN messager (ARNm), d’ARN de transfert (ARNt), d’ARN ribosomique (ARNr), ou de séquences synthétiques ou semi-synthétiques. L’acide nucléique peut avoir une taille variable allant de l’oligonucléotide au chromosome. Ces acides nucléiques peuvent être d’origine humaine, animale, végétale, bactérienne, virale, etc. Ils peuvent être obtenus par toute technique connue de l’homme du métier, et notamment par criblage de banques, par synthèse chimique, ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage de banques. Ils peuvent notamment être obtenus par une modification chimique au niveau de la partie sucre de la partie nucléobase ou du squelette internucléotidique. Parmi les modifications avantageuses dans les parties sucres, on peut notamment citer les modifications intervenant en position 2’ du ribose, telles que les modiﬁcations 2’-deoxy, 2’-ﬁuoro, 2’-amino, 2’-thio, ou 2’-O-alkyl,en particulier 2’-O-methyle, au lieu du groupement 2’-OH normal sur les ribonucléotides, ou encore la présence d’un pont méthylène entre les positions 2’ et 4’ du ribose (LNA). Concernant les nucléobases, il est possible d’utiliser des bases modiﬁées, telles que notamment la 5-bromo-uridine, la 5-iodo-uridine, la N 3 -méthyl-uridine, une 2,6-diaminopurine (DAP), la 5-méthyl-2'-deoxyCytidine, la 5-(1-propynyl)-2'-deoxy-Uridine (pdU), la 5-(1-propynyl)-2'-deoxyCytidine (pdC), ou des bases conjuguées avec du cholestérol. Enﬁn, des modiﬁcations avantageuses du squelette internucléotidique comprennent le remplacement de groupements phosphodiesters de ce squelette par des groupements phosphorothioate, methylphosphonate, phosphorodiamidate, ou l’utilisation d’un squelette composé d’unités de N-(2-aminoéthyl)-glycine liées par des liaisons peptidiques (PNA, Peptide Nucleic Acid). Les différentes modiﬁcations (base, sucre, squelette) peuvent bien entendu être combinées pour donner des acides nucléiques modiﬁés de type morpholino (bases ﬁxées sur un cycle morpholine et liées par des groupes phosphorodiamidate) ou PNA (bases ﬁxées sur des unités de N-(2-aminoéthyl)-glycine liées par des liaisons peptidiques). Ils peuvent par ailleurs être incorporés dans des vecteurs, tels que des vecteurs plasmidiques. De préférence, l’acide nucléique est choisi dans le groupe constitué de l’ARN, de l’ADN complémentaire (ADNc), de l’ADN génomique, de l’ADN plasmidique, de l’ADN antisens, de l’ARN messager, de l’ARN antisens, de l’ARN interférant, des ribozymes, de l’ARN de transfert, de l’ARN ribosomique, ou de l’ADN codant ces types d’ARN. Concernant les acides désoxyribonucléiques, ils peuvent être simple ou double brin. Ces acides nucléiques peuvent comprendre une séquence de gènes choisis parmi a) des gènes marqueurs, b) des gènes à visée thérapeutique et c) des gènes à visée vaccinale, et les éléments permettant son expression. Au sens de l’invention, on entend par « gène à visée thérapeutique » notamment tout gène codant pour un produit protéique ayant un effet thérapeutique. Le produit protéique ainsi codé peut être une protéine, un peptide, etc. Ce produit protéique peut être homologue vis-à-vis de la cellule cible (c’est-à-dire un produit qui est normalement exprimé dans la cellule cible lorsque celle-ci ne présente aucune pathologie). Dans ce cas, l’expression d’une protéine permet par exemple de pallier à une expression insuffisante dans la cellule ou à l’expression d’une protéine inactive ou faiblement active en raison d’une modification, ou encore de surexprimer ladite protéine. Le gène thérapeutique peut aussi coder pour un mutant d’une protéine cellulaire, ayant une stabilité accrue, une activité modifiée, etc. Le produit protéique peut également être hétérologue vis-à-vis de la cellule cible. Dans ce cas, une protéine exprimée peut par exemple compléter ou apporter une activité déficiente dans la cellule, lui permettant de lutter contre une pathologie, ou stimuler une réponse immunitaire. Le gène thérapeutique peut également coder pour une protéine sécrétée dans l’organisme. Le gène thérapeutique peut également être un gène ou une séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la transcription d’ARN cellulaires. De telles séquences peuvent par exemple, être transcrites dans la cellule cible en ARN complémentaire d’ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine. Il peut s’agir aussi d’oligonucléotides synthétiques, éventuellement modifiés. Les antisens comprennent également les séquences codant pour des ribozymes, qui sont capables de détruire sélectivement des ARN cibles. Le gène thérapeutique peut également être un gène codant pour un siRNA ou un shRNA. Avantageusement, les gènes à visée thérapeutique sont choisis parmi les gènes codant : - la dystrophine et minidystrophine (myopathies) ; - la protéine CFTR cystic ﬁbrosis transmembrane conductance regulator Associée à la mucoviscidose ; - l’alpha1-antitrypsine ; - l’Erythropoïétine (EPO); - les cytokines telles que les interleukines et le TNF facteur de nécrose des tumeurs ; - les facteurs de croissance tels que le TGFbéta et le PDGF ; - les enzymes lysosomiques telles que la béta-glucosidase ; - l’adénosinedésaminase (ADA) ; - des ARN sens et antisens ; - des ARN interférant ; - des ribozymes ; - les récepteurs des lipoprotéines de faible densité, déficient dans le cas d’hypercholestérolemie ; - les facteurs de coagulation tels que les facteurs VII, VIII et IX ; - la phénylalanine-hydroxylase ; - la tyrosine hydroxylase ; - la thymidine kinase du Virus Herpes simplex ; - les protéines du complexe majeur d’histocompatibilité, avantageusement les HLA-B7 ; - la cytosine désaminase ; Comme indiqué plus haut, l'acide nucléique peut également comporter un ou plusieurs gènes à visée vaccinale capable de générer chez l'homme ou l'animal une réponse immunitaire. Dans ce mode particulier de mise en œuvre, l’invention permet donc la réalisation soit de vaccins soit de traitements immunothérapeutiques appliqués à l'homme ou à l'animal, notamment contre des microorganismes, des parasites, des bactéries, des virus ou des cancers. Il peut s'agir notamment de peptides antigéniques spéciﬁques du Virus d’Epstein Barr, du Virus HIV, du Virus de l'hépatite B, du Virus de la pseudo-rage, ou encore spéciﬁques de tumeurs. Ainsi, avantageusement les gènes à visée vaccinale sont choisis parmi les gènes codants pour: - des antigènes Viraux, avantageusement la nucléoprotéine du Virus de la grippe ou la protéine NEF ou GAG du Virus VIH ; - des antigènes associés aux tumeurs, avantageusement l’antigène MART1 des cancers à mélanome, les mucines ou l’antigène PSA des cancers de la prostate; - des antigènes bactériens ; - des antigènes parasitaires. Dans un autre mode de réalisation avantageux, le gène marqueur est choisi parmi les gènes de : - la luciférase de la luciole ; - la protéine verte de méduse Aequora Victoria ; - la beta-galactosidase d’E. Coli ; - la chloramphénicol acétyle transférase ; - résistance à un antibiotique, avantageusement de résistance à la néomycine ou à l’hygromycine. Pour obtenir un effet optimum des complexes de l'invention, les proportions respectives du copolymère selon l’invention et de l'acide nucléique sont de préférence déterminées de sorte que le rapport massique (µg/µg) entre le copolymère et l'acide nucléique soit compris entre 3 et 6. Ce rapport peut bien entendu être adapté par l'homme du métier en fonction du copolymère utilisé, de la présence éventuelle d'un adjuvant, de l'acide nucléique, de la cellule cible et du mode d'administration utilisé. Les complexes selon l’invention peuvent être préparés en mélangeant une solution de l’acide nucléique concerné et une solution du copolymère selon l’invention. Avantageusement ces solutions sont préparées à partir de sérum physiologique ou d’un tampon, tel que le tampon hepes, ou d’un milieu cytocompatible. La présente invention concerne en outre une composition pharmaceutique comprenant un complexe selon l’invention et éventuellement un excipient pharmaceutiquement acceptable. La composition pharmaceutique selon l'invention peut être utilisée telle quelle ou en association avec d'autres composés. Ainsi, dans un mode particulier de mise en œuvre, la composition selon la présente invention comprend en plus un adjuvant capable de s'associer au complexe copolymère/acide nucléique selon l’invention et d'améliorer le pouvoir transfectant. En effet, le pouvoir transfectant des compositions de l'invention peut être encore amélioré en présence de certains adjuvants (lipides, protéines, lipopolyamines, polymères synthétiques par exemple), capables de s'associer au complexe copolymère/acide nucléique selon l’invention. Avantageusement, les adjuvants utilisés dans les compositions selon l'invention sont des lipides cationiques (comportant une ou plusieurs charges cationiques dans leur partie polaire) ou des lipides neutres. Concernant les lipides cationiques, il peut s'agir plus particulièrement de lipopolyamine. D'autres adjuvants particulièrement avantageux pour la réalisation des compositions de l'invention sont représentés par les lipides neutres. L'utilisation de lipides neutres est particulièrement avantageuse lorsque le rapport de charges R (amines/phosphates) est faible. De manière particulièrement avantageuse, on utilise des lipides naturels ou synthétiques, zwitterioniques ou dépourvus de charge ionique dans les conditions physiologiques. Ces différents lipides peuvent être obtenus soit par synthèse, soit par extraction à partir d'organes (par exemple : le cerveau) ou d'œufs, par des techniques classiques bien connues de l'homme du métier. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, les compositions de la présente invention comprennent un élément de ciblage permettant d'orienter le transfert de l'acide nucléique. Cet élément de ciblage peut être un élément de ciblage extracellulaire, permettant d'orienter le transfert de l'acide nucléique vers certains types cellulaires ou certains tissus souhaites (cellules tumorales, cellules hépatiques, cellules hématopoïétiques, etc). Il peut également s'agir d'un élément de ciblage intracellulaire, permettant d'orienter le transfert de l'acide nucléique vers certains compartiments cellulaires privilégiés (mitochondries, noyau, etc). Parmi les éléments de ciblage utilisables dans le cadre de l'invention, on peut citer les sucres, les peptides, les oligonucléotides, les lipides ou les protéines. Avantageusement, il s'agit de sucres, de peptides ou de protéines tels que des anticorps ou fragments d'anticorps, des ligands de récepteurs cellulaires ou des fragments de ceux-ci, des récepteurs ou fragments de récepteurs, etc. En particulier, il peut s'agir de ligands de récepteurs de facteurs de croissance, de récepteurs de cytokines, de récepteurs de lectines cellulaires ou de récepteurs de protéines d'adhésion. On peut également citer le récepteur de la transferrine, des HDL et des LDL. L'élément de ciblage peut également être un sucre permettant de cibler les récepteurs asialoglycoprotéiques, ou encore un fragment Fab d'anticorps permettant de cibler le récepteur du fragment Fc des immunoglobulines. Les compositions selon l'invention peuvent être formulées en vue d'administrations par voie topique, cutanée, orale, rectale, vaginale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. De préférence, les compositions pharmaceutiques de l'invention contiennent un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe au niveau de l'organe désiré, ou pour une administration par voie topique (sur peau et/ou muqueuse). Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou décompositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. Les doses d'acide nucléique utilisées pour l'injection ainsi que le nombre d'administrations peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilise, de la pathologie concernée, du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. Les complexes et compositions selon l'invention peuvent être utilisées pour le transfert d'acides nucléiques dans les cellules in viv o , in vitro ou ex vivo . En particulier les copolymères selon l'invention peuvent être utilisés pour transférer de manière très efficace des acides nucléiques dans de nombreux types cellulaires, et en particulier dans certains types cellulaires habituellement difficiles à transfecter. La présente invention concerne donc également un procédé pour transfecter in vitr o ou ex vivo un acide nucléique dans des cellules, ledit procédé comprenant la mise en contact desdites cellules avec au moins un complexe selon la présente invention ou une composition pharmaceutique selon l’invention. Les cellules peuvent être d’origine procaryote ou eucaryote, en particulier animale, végétale ou humaine. Avantageusement, les cellules sont des cellules de mammifères, de façon avantageuse choisies parmi : - des cellules souches hématopoïétiques ; - des cellules du système immunitaire, telles que des cellules dendritiques, des macrophages et des lymphocytes ; - des cellules du foie ; - des cellules des muscles squelettiques ; - des cellules de la peau, telles que des ﬁbroblastes, des kératinocytes, des cellules dendritiques et des mélanocytes ; - des cellules des vaisseaux et microvaisseaux sanguins, telles que des cellules endothéliales et des cellules musculaires lisses ; - des cellules épithéliales des voies aériennes ; - des cellules du système nerveux central ; - des cellules cancéreuses ; - des cellules du tissu conjonctif, telles que des ténocytes. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, la méthode de transfection in vitro ou ex vivo , se caractérise en ce que l'on met en présence un complexe ou une composition pharmaceutique selon l’invention dans un milieu contenant des cellules à transfecter, dans des conditions telles qu'il y a: - passage du complexe à partir du milieu dans le cytoplasme des cellules, - relargage de l'acide nucléique implique dans le susdit complexe dans le cytosol et/ou le noyau des cellules, - transcription et expression de l'acide nucléique dans les cellules transfectées, - expression de la protéine correspondant au gène transfecté. La présente invention concerne de plus l’utilisation d’un copolymère selon l’invention pour la préparation d’une composition pharmaceutique destinée à la délivrance intracellulaire de molécules anioniques, avantageusement d’acide nucléique notamment tel que défini plus haut. Elle concerne en outre un complexe selon l’invention pour son utilisation en tant que médicament destiné à la délivrance intracellulaire d’acide nucléique, avantageusement destiné au traitement de tumeurs, plus avantageusement deléiomyomeutérin ou de tumeur maligne telle que le carcinome des ovaires, du sein ou de l’endomètre, pour la préparation d’un vaccin ou au traitement ou à la prévention de déﬁcience métabolique congénitale ou acquise ou de maladies associées avec une expression génétique déﬁciente, plus avantageusement au traitement de maladies liées aux troubles d’un gène unique telles que les syndromes de déﬁcit immunitaire combiné sévère, la mucoviscidose, l’hémophilie, la drépanocytose, la béta-thalassémie et la dystrophie musculaire. L’invention sera mieux comprise à la lecture des exemples de la présente invention qui suivent. Les exemples de la présente demande mettent en œuvre un dosage de viabilité cellulaire. Ce dosage MTT évalue la viabilité cellulaire dans un essai au bromure de 3-(4,5)-diméthylthiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazolium (MTT). Les cellules sont ensemencées à raison de 2,5x10 4 cellules par puits dans un milieu de culture(100 µL) dans une plaque à 96 puits. Le milieu de culture est le MEM (milieu essentiel minimum) supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal décomplémenté (FBS) contenant 100 U/ml de pénicilline, 100 mg/ml de streptomycine, 1% d'acide aminé non essentiel et 1 % de GlutaMAX. Les cellules sont ensemencées à raison de 2 x 10 4 cellules par mL et sont maintenues à 37 °C dans une étuve humide dans une atmosphère à 5% de CO2. Deux jours plus tard, le milieu de culture est enlevé et les polymères dont on veut évaluer la cytotoxicité sont ajoutés (100 µL de solution) dans chaque puits, et les cellules sont mises à incuber à 37°C. Après 4 heures, le milieu est enlevé et les cellules sont mises en culture 48 heures à 37°C dans le milieu de culture MEM. 48 heures plus tard, le MTT est ajouté (5 mg/mL dans du PBS) à raison de 10 µL dans chaque puits et le tout est mis à incuber pour 4 heures à 37°C. Le MTT est converti en colorant insoluble par les cellules vivantes et il est solubilisé à l'aide d'isopropanol acidifié. L'absorbance est mesurée à 570 nm. Le pourcentage de cytotoxicité est (A o – A)/A o x100 où A est l'absorbance des cellules traitées et A o celle des cellules témoin cultivées dans les mêmes conditions Exemple 1 : Préparation d’un copolymère selon l’invention 1 ère étape : synthèse de la lPEI Dans un tricol de 500 mL équipé d’un réfrigérant, 10g de poly(2-éthyle-2-oxazoline) de masse molaire de 25000 g.mol -1 (0,2 mmol) sont dissous dans 115 mL d’eau distillée. A ce mélange, est additionné l’acide chlorhydrique 12N (75 ml ; 2,44 mol), et l’hydrolyse est menée durant 48 heures, à reflux sous azote. Des pastilles d’hydroxyde de sodium (NaOH) sont alors introduites dans le milieu réactionnel pour augmenter le pH de la solution jusqu’à pH=12 (contrôle au papier pH) permettant la précipitation totale du polymère souhaité. Le milieu réactionnel est filtré sur un verre fritté de porosité 4, puis lavé avec de l’eau distillée jusqu’à ce que l’eau de lavage atteigne un pH=7. Le précipité blanc est récupéré et séché au lyophilisateur. Le polymère est ainsi obtenu sous la forme d’une poudre blanche. Sa structure est déterminée par RMN ( 1 H, 13 C), en solution dans D 2 O contenant 5 µL de TFA, et par chromatographie d’exclusion stérique (SEC). Rendement : 4,232 g (96,3%), RMN 1 H (300 MHz, à raison de 10 mg dans 0,7 ml D 2 O + 5µlTFA) : δ(ppm) = 3,50 (s, 4H, NHC H 2 C H 2 ). 13 C NMR (75 MHz, D 2 O + 5µlTAF): δ (ppm) = 48,97 (s, 2C, NH C H 2 C H 2 ); 0 (s,) 2 ème étape : synthèse du copolymère de la formule II. 50mg de lPEI 11kDa et 85mg de boc-his(1-boc)-OSu ont été solubilisés dans 2mL de DMSO. 150µL de diisopropylamine ont ensuite été additionnés. La réaction est chauffée 48h à 65°C. Après 48h, 9mL TFA 50% ont été ajoutés goutte à goutte à 0°C et la réaction est laissée agiter 24h à température ambiante. Après évaporation, le produit est, dans un premier temps, purifié en réalisant deux extractions liquide-liquide (H 2 O/DCM) puis dans un second temps, par dialyse durant au moins 48h en utilisant des boudins de 1000MWCo. Après lyophilisation, le produit est récupéré sous la forme d’une poudre blanche. Exemple 2 : Toxicité du copolymère de l’invention comparée à celle du polymère de polyéthylènimine linéaire Le polymère selon l’invention ou la lPEI a été placé en incubation à différentes concentrations avec des celules HeLa (2,5.10 4 cellules/mL) pendant 24 heures à 37°C. La viabilité cellulaire a ensuite été mesurée à l’aide du test MTT décrit ci-dessus. Les résultats sont reportés dans le tableau 1ci-dessous. Polymère Concentration (µg/mL Viabilité cellulaire *16 % hist, Mn = 16000 Da 13 µg/mL 90% *16 % hist, Mn= 16000 Da 24 µg/mL 95 % *16% hist, Mn = 16000 Da 50 µg/mL 90 % lPEI, 12000 Da 13 µg/mL 75 % lPEI, 12000 Da 24 µg/mL 55 % lPEI, 12000 Da 50 g/mL 17% * Polymère selon l’invention Quelle que soit la concentration du polymère (selon l’invention ou la lPEI), la cytotoxicité de la lPEI se révèle être toujours supérieure à celle du polymère selon l’invention, la viabilité cellulaire résultant de l’incubation de la lPEI étant plus faible. La cytotoxicité du copolymère selon l’invention et de la lPEI a été évaluée dans les cellules HeLa en incubant des teneurs croissantes des copolymères. Les essais ont été faits selon le protocole MTT décrit ci-dessus Les résultats d’IC50 sont donnés dans le tableau II ci-dessous, à la concentration de 27 µg/mL. IC50% (µg/ml) Lignées cellulaires Copolymère de l’exemple 1 Polyéthylènimine linéaire HeLa >100 27 Il est à remarquer que la toxicité pour tuer la moitié des cellules (IC50%) du polymère lPEI est importante. Avec la lPEI on a moins de virus complets qu’avec les copolymères de l’invention ce qui entraîne une efficacité moindre pour la thérapie génique. Exemple 3 : Préparation du complexe copolymère de l’exemple 1 avec pCMV-EGFP 112,5 µl du copolymère de l’exemple 1 ont été mélangés à 112,5 µl de tampon Hepes (10 mM) pH 7,4. Le mélange obtenu a été ajouté à 75µg de pCMV-EGPF dans 975 µl de tampon Hepes (10 mM) pH 7,4. La solution obtenue est agitée fortement pendant 4 secondes puis laissée 30 min à température ambiante. La solution a été complétée à 4 ml avec le milieu de culture suivant (OptiMEM) : Les cellules de carcinome épithélioïde du col de l'utérus humain (cellules HeLa; CRL1772, C2C12, Rockville, MD, États-Unis) sont cultivées dans du milieu MEM (Milieu Essentiel Minimum) supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal décomplémenté (FBS) contenant 100 U / ml de pénicilline, 100 mg / ml de streptomycine, 1% d'acide aminé non essentiel et 1 % de GlutaMAX. Les cellules sont ensemencées à raison de 2 x 10 4 cellules par mL et sont maintenues à 37 °C dans une étuve humide dans une atmosphère à 5% de CO2. Exemple 4 : Production de lentivirus 60 µl du copolymère de l’exemple 1 sont ajoutés dans 10 µl d’un tampon Hepes 10 mMphH 7,4 comprenant 5 µg de plasmide ADN. La solution est agitée vigoureusement pendant 5 seconde puis conservées 30 min à température ambiante (environ 20°C). La solution est ensuite complétée à 1,5 ml avec OptiMEM pour obtenir la solution de transfection. Le milieu GibcoOpti-MEM I réduit en serum est une modification du milieu essentiel minimum d’Eagle, tamponné avec de l’HEPES et du bicarbonate de sodium, et compété par de l’hypoxanthine, de la thymidine, du pyr=uvate de sodium, de la L-glutamine, des oilgo-éléments et des facteurs de croissance. La Tri-transfection (pTRIP-GFP, 8.81 et VSV-G) a été effectuée avec des quantités de plasmide dans le rapport massique 2-2-1 µg/puits respectivement (5µg/puits). Le milieu cellulaire est retiré et remplacé par la solution de transfection. L’incubation dure 16h, le milieu est ensuite changé and les cellules sont laissées à incuber dans l’OptiMEM sans agent de transfection. Le surnageant est collecté après 20, 24, 40, 44 et 48h (après le début de l’expérience soit 4h, 8h, 24h, 28h et 32 h après le retrait de l’agent de transfection) et le titre viral est mesuré. Les résultats sont mentionnés dans le tableau 3 ci-dessous. Le titre viral est dosé par une méthode qPCR bien connue de l’homme du métier. Le titre viral peut également être mesuré par un dosage protéique pour avoir la quantité de particules virales présentes, qui sont des assemblages de 3 protéines (VP1, VP2, VP3). Temps d’expérience 16 20 24 40 44 48 Titre viral (1.10 6 ) 1 1,5 3 3,5 6 5,5 Exemple 5 : Transfection de cellules HeLa Etude de la transfection de cellules HeLa du plasmide pCMV-EGFP à l’aide du copolymère de l’invention à la concentration relative massique 1/3 ADN/polymère.. La procédure utilisée est identique à celle de l’exemple 4. Copolymère, cellules HeLa Résultats RLU/mg Polymère de l’invention exemple1 Mn16000 Da 8.10 e 8 Autre polymère de l’invention, Mn = 20000 2.10 e 8 Ces résultats montrent que les polymères de l’invention ont une excellente efficacité de transfection. Copolymère de polyéthylèneimine linéaire comprenant des unités monomériques de formule (I) et des unités monomériques de formule (II) dans lesquels : R 1 et R 2 , identiques ou différents, représentent un atome d’hydrogène, un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 3 atomes de carbone, de préférence de 1 à 2 atomes de carbone, au moins l’un de R 1 ou R 2 est H ; R est choisi parmi H ou un groupe protecteur d’amine, par exemple Boc ; n est un nombre compris entre 1 et 99% des monomères totaux ; et m est un nombre compris entre 1 et 99% des monomères totaux. Copolymère selon la revendication 1 dans lequel R 1 et R 2 représentent H. Procédé de préparation des copolymères selon la revendication 1 ou 2 comprenant la réaction entre un composé polyéthylène imine de formule (I) et un composé de formule (IV) et optionnellement la déprotection partielle ou totale des fonctions amines dans laquelle R 1 est tel que défini à la revendication 1 et R’ est un groupe protecteur d’amine, par exemple Boc. Copolymère selon l’une la revendication 1 ou 2 en tant que vecteur de substance active. Composition pharmaceutique comprenant un copolymère selon l’une quelconque des revendications 1 ou 2, une substance active et éventuellement un excipient pharmaceutiquement acceptable. Complexe comprenant : - un copolymère selon l’une des revendications 1 ou 2 ; - au moins une substance active anionique ou potentiellement anionique. Complexe selon la revendication 6, dans lequel la substance active est un acide nucléique. Complexe selon la revendication 7, dans lequel l’acide nucléique est choisi dans le groupe constitué par de l’ARN, de l’ADNc, de l’ADN génomique, de l’ADN plasmidique, de l’ADN antisens, de l’ARN messager, de l’ARN antisens, de l’ARN interférant, des ribozymes, de l’ARN de transfert, de l’ARN ribosomique ou de l’ADN codant pour ces types d’ARN. Composition pharmaceutique comprenant au moins un complexe selon l’une des revendications 6 à 8. Complexe selon l’une des revendications 6 à 8 pour son utilisation pour la délivrance intracellulaire de substance active anionique ou potentiellement anionique.