Brevet FR3103195A1 — publié le 20210521

L’invention relève du domaine de la fermentation bactérienne en particulier la fermentation bactérienne utilisant du bois comme source de carbone. Plus précisément, l’invention porte sur un procédé de fermentation d’une bactérie dans un milieu de fermentation comprenant du bois à l’état solide comme source de carbone principale, caractérisé en ce que ladite bactérie est choisie parmi les souches de Pseudomonas putida . Pas de figure Procédé de fermentation L’invention relève du domaine de la fermentation bactérienne en particulier la fermentation bactérienne dans un milieu solide ou immergé utilisant du bois comme source principale de carbone. La biomasse lignocellulosique comme le bois est un assemblage complexe de cellulose, d’hémicellulose et de lignine. Cette biomasse est très utilisée dans différents secteurs d’activités (meubles, papeterie, biocarburants…), générant la plupart du temps des déchets sous forme de copeaux ou poudre, peu ou mal utilisés. La cellulose est un assemblage de sucres, et la lignine, un hétéropolymère complexe de molécules aromatiques. La lignine, deuxième biopolymère le plus abondant sur terre après la cellulose est donc très intéressante d’un point de vue industriel. Plus généralement, le bois représente une vaste ressource renouvelable pour la production de molécules chimiques par biologie synthétique (Beckham et al., Current Opinion Biotech (2016), 42 : 40-53; Bugg et al., Current Opinion in Biotechnology (2011), 22 :394-400). La biomasse lignocellulosique est un composé récalcitrant : sa dépolymérisation, et donc la libération de différents sucres et molécules aromatiques, est difficile, et ne peut se faire pour le moment qu’avec des méthodes chimiques lourdes et consommatrices en énergie (dépolymérisation thermique, chimique ou enzymatiques). Dans la nature, de nombreux champignons et quelques genres bactériens sont capables de dégrader le bois et d’utiliser les molécules obtenues (sucres, molécules aromatiques…) comme sources de carbone et d’énergie. Certaines bactéries du genre Pseudomonas possèdent des enzymes capables de dégrader partiellement la lignine (de Gonzalo et al., Journal of Biotechnology 236 (2016) 110-119). Ces bactéries représentent potentiellement un fort intérêt pour l’utilisation de cette biomasse : quelques exemples existent démontrant la production de molécules d’intérêt à partir de lignine par des bactéries du genre Pseudomonas (Ravi et al., Appl Microbiol (2017) 101 :5059-5070; Linger et al., PNAS (2014) 111 : 12013-12018 ; Johnson and Beckham, MetabEng (2015) 28:240-247.; Salvachua et al., Green chemistry, (2015) 11). Problème technique Les microorganismes utilisés aujourd’hui en bioproduction utilisent généralement des sources de carbone comme le glucose ou le xylose, dont le coût est encore très élevé (50% en moyenne du prix de revient d’un composé) et les sucres biosourcés proviennent la plupart du temps de cultures de maïs ou de betteraves. Ces matières premières ne permettent donc pas d’avoir un prix de revient intéressant pour la bioproduction d’une molécule donnée, sans oublier l’impact environnemental qu’elles génèrent. L’utilisation de ressources renouvelables par un microorganisme en bioproduction représenterait une perspective prometteuse car abondante et peu chère. A ce titre, la biomasse lignocellulosique, constituant principal du bois et des plantes et également l’un des bio-polymères les plus abondants sur terre, pourrait ainsi représenter une matière première peu coûteuse et quasi inépuisable pour les microorganismes de bioproduction. Il est cependant nécessaire de mettre au point des procédés peu coûteux de dépolymérisation de cette biomasse par une bactérie facile à cultiver. Jusqu’ici, ce sont les champignons qui ont été les plus décrits pour la dépolymérisation biologique de lignine. Mais la culture en bioréacteur de ceux-ci est problématique (temps de croissance, homogénéisation, etc.). La substitution de champignons par des bactéries pouvant croitre plus rapidement et dans des bioréacteurs contrôlés, permettrait de lever ces verrous. A ce jour, les études montrent une croissance bactérienne essentiellement sur des substrats liquides enrichis en lignine comme la liqueur noire provenant des usines de papeterie, ou sur des molécules aromatiques pures. Dans ce cas la biomasse lignocellulosique est déjà partiellement dépolymérisée, mais par des procédés chers ou coûteux en énergie. Quelques essais de fermentation solide ont également été réalisés avec des bactéries du genre Pseudomonas : résidus de plante, Mahanta et al., Bioresour technol. 2008, 99(6): 1729-35; tourteaux de soja, El Bessoumy et al., 2004 J Biochem Mol Biol 2004 ; 37(4) : 387-93; tourteaux de plantes oléagineuses, Faisal et al., Advances in Enzyme research, 2014, 2, 125-133; graines de maïs, Rudakiya and Bande, International Journal of Science and Research, 2013, 2 (9) :2319-7064; bagasses de cannes à sucre, Narendrakumar et al., 2017 International Journal of Green Pharmacy, 2017, 11 ; son de blé, Ziayoddin et al., Research and reviews in Biosciences, 2016, 4(1); fumier de vache, Vijayaraghavan et al., 2014 Chinese Journal of Biology; pour revue, voir Koyani and Rajput, 2015 Journal of Bioprocessing & Biotechniques, 2015 5 :10). Mais aucun essai n’a jamais été réalisé sur du bois brut. Il existe donc un réel besoin d’un procédé de fermentation bactérienne effectuée directement sur une ressource végétale qui ne serait pas une ressource alimentaire. L’un des aspects de la présente invention porte sur un procédé de fermentation d’une bactérie dans un milieu de fermentation comprenant du bois à l’état solide comme source principale de carbone, par exemple des copeaux de bois, caractérisé en ce que ladite bactérie est choisie parmi des souches génétiquement modifiées de Pseudomonas putida . Un autre aspect porte sur un procédé de biosynthèse d’une molécule d’intérêt, comprenant (i) la fermentation d’une souche génétiquement modifiée de Pseudomonas putida , dans des conditions permettant la biosynthèse de ladite molécule d’intérêt, ladite souche génétiquement modifiée de Pseudomonas putida comprenant un ou plusieurs gènes recombinants impliqués dans la voie de biosynthèse de ladite molécule d’intérêt, et(ii) le cas échéant la purification de ladite molécule d’intérêt. L’invention porte également sur une souche de Pseudomonas putida génétiquement modifiée, comprenant un ou plusieurs gènes recombinants choisi parmi - les gènes exprimant les enzymes permettant la dégradation de la lignine, par exemple les laccases, les péroxidases, les oxydoréductases, les aryl-alcool oxidase et/ou les glyoxal oxidases, en particulier les gènes recombinants comprenant les séquences d’acides nucléiques SEQ ID NO :15, 17, 19, 21, et/ou 23 ; - les gènes exprimant les enzymes permettant la dégradation de la cellulose, par exemple les endoglucanases, les exoglucanases et les beta-glucosidases, notamment les endo-β1,4-glucanase, et/ou les endo-β-1,3 glucanases, en particulier les gène recombinants comprenant l’une des séquences d’acides nucléiques SEQ ID NO :1, 3 et 5 ; - les gènes exprimant les enzymes permettant la dégradation de l’hémicellulose, par exemple les endoxylanases, les endo-β1,4-xylanases, les β-xylosidases, et/ou les α-xylosidases, en particulier les gènes recombinant comprenant l’une des séquences d’acides nucléiques SEQ ID NO :7, 9 et/ou 11. L’invention porte enfin sur l’utilisation d’une souche de Pseudomonas putida dans un procédé de fermentation avec, comme source de carbone principale, le bois à l’état solide, par exemple du bois de feuillus, en particulier du bois de chêne ou de hêtre ou de bouleau. Fig. 1 présente la croissance de Pseudomonas putida avec lignosulfonate de hêtre. C représente le contrôle négatif : P. putida sur milieu minium sans source de carbone et Ca-LS ou Na-LS représente respectivement les essais avec des lignosulfonates de hêtre ou de résineux. Fig. 2 présente la croissance de Pseudomonas putida avec lignosulfonate de hêtre. C représente le contrôle négatif : P. putida sur milieu minium sans source de carbone et Ca-LS ou Na-LS représente respectivement les essais avec des lignosulfonates de hêtre ou de résineux. Fig. 3 présente la croissance de Pseudomonas putida KT2440 sur bois de chêne. Ppu fait référence à P. putida et Ecoli à E. coli. FI1 et FI2 représente deux essais de croissances différents. FI3 représente l’essai de croissance avec E. coli. NA représente un essai de croissance avec bois non autoclavé, c’est-à-dire, comprenant d’autres microorganismes présents sur le bois. A représente un essai autoclavé. Fig. 4 présente la croissance de P. putida sur milieu M9 comprenant des copeaux de bois (Figure 3A) et le dosage du glucose libre. Ppu désigne P. putida, A : bois autoclavé et NA : bois non autoclavé. Fig. 5 présente le protocole de conjugaison utilisable pour transformer P. putida. La présente invention concerne un procédé de fermentation d’une bactérie dans un milieu de fermentation comprenant du bois à l’état solide comme source principale de carbone, par exemple des copeaux de bois, caractérisé en ce que ladite bactérie est choisie parmi des souches génétiquement modifiées de Pseudomonas putida . Par « fermentation », on entend un procédé de culture d’un micro-organisme, dans un milieu de culture, en condition aérobie ou anaérobie, de préférence en milieu clos (bioréacteur). Le milieu de culture comprend en particulier une source d’apport en carbone et des éléments minéraux ou oligo-éléments. Dans un mode de réalisation, le procédé de fermentation est en milieu solide. On entend par fermentation en milieu solide, un procédé dans lequel il n’y pas d’eau libre. Dans un autre mode de réalisation, le procédé de fermentation est en milieu immergé. On entend par milieu immergé, un milieu dans lequel une partie des constituants est présent à l’état non-soluble dans un milieu liquide. On parle également de fermentation semi-liquide. Dans le procédé de l’invention, le milieu de culture comprend au moins du bois à l’état solide comme source de carbone principale. Ce bois peut être présent sous forme de copeaux, de granules, de poudres ou tout autre forme solide, mélangée ou non avec d’autres matières. Dans un autre un mode de réalisation, le bois peut être prétraité ou non par trempage dans l’eau ou dans le milieu de fermentation, par pasteurisation ou stérilisation ou étuvage à chaud. Dans un mode de réalisation, le bois est autoclavé ou non autoclavé avant son utilisation. De préférence, au moins 50% des apports en carbone fournis par le milieu de fermentation proviennent du bois. De manière plus préféré encore, 80%, voire 90% des apports en carbone proviennent du bois. En particulier, le bois présent dans le milieu de culture n’a pas été préalablement traité par des enzymes capables de dégrader la lignine ou la cellulose. Dans un mode préféré du procédé selon la présente invention, le bois est constitué essentiellement de bois de feuillus, par exemple, à titre non limitatif, les essences de chêne, hêtre, châtaigner, merisiers, charmes, tilleuls, érables, frênes, alisiers, trembles, ou aulnes, de préférence, du bois de chêne, de hêtre ou de bouleau. Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de fermentation selon l’invention est un procédé de fermentation en milieu immergé, ledit milieu étant composé de 10 à 45% de masse sèche de bois non préalablement traité par voie enzymatique, et respectivement 90 à 55% de masse de solution nutritive saline. La solution nutritive saline peut comprendre en particulier du potassium, du sodium, du phosphate, du sulfate, de l’ammonium, du calcium, et d’autres éléments traces, oligo-éléments, et/ou vitamines. Des procédés de fermentation en milieu solide ont été décrits avec Pseudomonas aeruginosa (Mahanta et al., Bioresour Technol 2008, 99, 1729-1735 ; El-Bessoumy et al. 2004, J. Biochem. Mol. Biol. 37, 387-393 ; Faisal et al. 2014, Adv. Enzyme Res. 02, 125 ; Narendrakumar G. 2017, Int. J. Green Pharm. IJGP 11) et avec Pseudomonas putida (Vijayaraghavan et al., 2014, Chinese Journal of Biology). L’homme du métier ajustera les conditions de fermentation, et notamment la température, le pH, l’aération, et la stérilité en fonction du type de fermentation (milieu solide ou immergé), du rendement souhaité, du type de bioréacteur utilisé, ou du milieu de culture (pour revue voir notamment Les Techniques de l’Ingénieur, Ref : BIO620 V2, 10 Juillet 2019, « Fermentation en milieu solide » ; Assamoi, Destain et Thonart, 2009, Aspects microbiologiques de la production par fermentation solide des endo-β-1,4-xylanases de moisissures : le cas de Penicillium canescens. BASE - volume 13 (2009) numéro 2). Typiquement, dans un procédé en milieu immergé comprenant du bois, on pourra inoculer entre 0,025 à 0,1 gramme de masse sèche de ladite souche génétiquement modifiée de Pseudomonas putida par gramme de milieu. La température est de préférence maintenue entre 30 et 35°C. Le pH est de préférence maintenu entre 6 et 7,5, par exemple par l’addition de solutions acides (par exemple acide phosphorique ou sultfurique) ou basiques (ammoniaque ou potasse). La souche génétiquement modifiée L’invention découle de la mise en évidence de capacités de croissance de souches de Pseudomonas dans un milieu immergé en présence de bois, notamment de bois de feuillus. Le procédé de fermentation selon la présente invention comprend donc l’inoculation dans le milieu de culture comprenant du bois à l’état solide, en particulier du bois non préalablement traité par voie enzymatique, d’une souche génétiquement modifiée de Pseudomonas putida , par exemple une souche génétiquement modifiée Pseudomonas putida KT2440. Les souches sauvages de P. putida KT2440 sont disponibles par exemple dans la Banque de souches NBRC (National Institute of Technology and Evaluation Biological Resource center https://www.nite.go.jp/en/nbrc/, NBRC100650). Au sens de la présente invention, on entend par « souche génétiquement modifiée », une souche qui comprend soit (i) au moins un acide nucléique recombinant, intégré de manière stable dans son génome, et/ou présent sur un vecteur, par exemple un vecteur plasmidique, soit (ii) une ou plusieurs mutations non naturelles par insertion, substitution ou délétion de nucléotides, lesdites mutations étant obtenues par des techniques de transformation ou par des techniques d’édition de gènes. Les techniques de modifications génétiques par transformation, mutagenèse ou édition de gènes sont bien connues de l’homme du métier et sont décrites par exemple dans « Strategies used for genetically modifying bacterial genome: site-directed mutagenesis, gene inactivation », Journal of Zhejiang Univ-Sci B (Biomed & Biotechnol) 2016 17(2):83-99., et dans Martinez-Garcia and de Lorenzo, « Pseudomonas putida in the quest of programmable chemistry », Current Opinion in Biotechnology, 59 :111-121, 2019. De préférence, pour l’intégration de gènes recombinants ou de mutation chez Pseudomonas putida , on utilisera la technique de mutagenèse décrite en exemple 5 ci-après. En particulier, une souche génétiquement modifiée peut comprendre un acide nucléique modifiant l’expression d’un ou plusieurs gènes naturellement exprimés chez Pseudomonas putida , notamment Pseudomonas putida KT2440. Dans un autre mode de réalisation particulier, une souche génétiquement modifiée peut comprendre un acide nucléique codant une ou plusieurs enzymes, non naturellement exprimée chez Pseudomonas putida , notamment Pseudomonas putida KT2440. Avantageusement, les souches de Pseudomonas putida utilisables dans le procédé selon l’invention peuvent être génétiquement modifiées pour permettre la dégradation des polymères du bois, et notamment, la lignine, la cellulose, l’hémicellulose ou une combinaison de ceux-ci. Des exemples de gènes codant pour des enzymes et impliqués dans la dégradation de la lignine sont décrits notamment par Kamimura et al 2017 (Kamimura et al 2017, Environmental Microbiology Reports 9(6), 679-705). Aussi, dans un mode spécifique de réalisation, la souche de Pseudomonas putida utilisable dans le procédé selon l’invention est une souche génétiquement modifiée comprenant plusieurs gènes recombinants exprimant les enzymes permettant la dégradation de la lignine. A titre d’exemples non limitant d’enzymes permettant la dégradation de la lignine, on citera en particulier : les laccases, les péroxidases, les oxydoréductases, les aryl-alcool oxidase et/ou les glyoxal oxidases. Pour une dégradation optimale de la lignine, la souche doit exprimer de préférence les 4 activités enzymatiques, laccase, péroxidase, oxydoréductase, aryl-alcool oxidase et/ou glyoxal oxidase. Dans un mode de réalisation particulier, la souche de Pseudomonas putida utilisable dans le procédé selon l’invention est une souche génétiquement modifiée avec les gènes recombinants comprenant (i) les acides nucléiques de séquences SEQ ID NO :15, 17, 19, 21 et/ou 23 ; ou, (ii) les acides nucléiques homologues codant pour les enzymes dégradant la lignine et ayant au moins 70%, 80%, 90%, voire 95% d’identité avec les séquences d’acide nucléique SEQ ID NO :15, 17, 19, 21 et/ou 23 respectivement. Au sens de la présente invention, le pourcentage d’identité fait référence au pourcentage de résidus identiques dans une séquence nucléotidique ou d’acides aminés sur un fragment donné après alignement et comparaison avec une séquence de référence. Pour la comparaison, on utilisera un algorithme d’alignement et les séquences à comparer sont entrées avec les paramètres correspondants de l’algorithme. On pourra utiliser les paramètres par défaut de l’algorithme. De préférence, pour une comparaison de séquence d’acide nucléique et la détermination d’un pourcentage d’identité, on utilisera l’algorithme blastn tel que décrit dans https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi avec les paramètres par défaut. De préférence, pour une comparaison de séquences d’acides aminés et la détermination d’un pourcentage d’identité, on utilisera l’algorithme blastp tel que décrit dans https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi avec les paramètres par défaut. Dans un autre mode spécifique de réalisation qui doit être combiné avec le précédent, la souche de Pseudomonas putida utilisable dans le procédé selon l’invention est une souche génétiquement modifiée comprenant les gènes recombinants exprimant les enzymes permettant la dégradation de la cellulose, ces enzymes étant choisies de préférence parmi les endoglucanases, les exoglucanases, les β-glucosidases, par exemple les endo-β1,4-glucanase, et/ou les endo-β1,3 endoglucanase. Pour une dégradation optimale de la cellulose, la souche doit exprimer de préférence les 3 activités enzymatiques, endoglucanase, exoglucanase et beta-glucosidase. Dans un mode de réalisation particulier la souche de Pseudomonas putida utilisable dans le procédé selon l’invention est une souche génétiquement modifiée avec les gènes recombinants comprenant (i) les acides nucléiques de séquences SEQ ID NO :1, 3 et 5 ; ou, (ii) les acides nucléiques homologues codant pour les enzymes dégradant la cellulose et ayant au moins 70%, 80%, 90%, voire 95% d’identité avec les séquences d’acide nucléique SEQ ID NO :1, 3 et 5 respectivement. Dans un autre mode spécifique de réalisation qui doit être combiné avec les modes précédents, la souche de Pseudomonas putida utilisable dans le procédé selon l’invention est une souche génétiquement modifiée comprenant les gènes recombinants exprimant les enzymes permettant la dégradation de l’hémicellulose, ces enzymes étant choisies de préférence parmi les endoxylanases, typiquement, les endo-β1,4-xylanases, les β-xylosidases, et/ou les α-xylosidases. Pour une dégradation optimale de l’hémicellulose, la souche doit exprimer de préférence les 2 activités enzymatiques, endoxylanase, et xylosidase. Dans un mode de réalisation particulier, la souche de Pseudomonas putida utilisable dans le procédé selon l’invention est une souche génétiquement modifiée comprenant au moins un gène recombinant comprenant (i) les acides nucléiques de séquences SEQ ID NO :7, 9 et/ou 11 ; ou, (ii) les acides nucléiques homologues codant pour les enzymes dégradant la l’hémicellulose, et ayant au moins 70%, 80%, 90%, voire 95% d’identité avec les séquences d’acide nucléique SEQ ID NO :7, 9 et/ou 11 respectivement. La présente invention porte sur une souche de Pseudomonas putida telle que modifiée génétiquement ci-dessus, et son utilisation notamment comme souche châssis pour construire des souches dérivées utilisables dans le procédé de fermentation selon l’invention. Dans ce cas, la souche dérivée comprend en outre un ou plusieurs gènes recombinants impliqués dans la voie de biosynthèse d’une molécule d’intérêt. Ainsi, les souches filles sont obtenues par transformation de la souche parentale avec un ou plusieurs gènes impliqués dans la voie de biosynthèse de ladite molécule d’intérêt. A titre d’exemple de molécules d’intérêt, on peut citer des molécules de la famille des phenylpropanoïdes, des muscs, des glycolipides, des lactones. En particulier, l’invention vise également le procédé de biosynthèse d’une molécule d’intérêt par fermentation d’une souche génétiquement modifiée de Pseudomonas putida comme décrit plus haut. Aussi l’invention vise plus particulièrement un procédé de biosynthèse d’une molécule d’intérêt, comprenant (i) la fermentation d’une souche génétiquement modifiée de Pseudomonas putida comme décrit plus haut, dans des conditions permettant la biosynthèse de ladite molécule d’intérêt, ladite souche génétiquement modifiée de Pseudomonas putida comprenant un ou plusieurs gènes recombinants impliqués dans la voie de biosynthèse de ladite molécule d’intérêt, et (ii) le cas échéant la purification de ladite molécule d’intérêt. Dans un mode de réalisation particulier, le procédé peut comprendre en outre l’introduction dans le milieu de culture d’un substrat de départ pour la biosynthèse de la molécule d’intérêt et/ou une ou plusieurs enzymes impliquées dans la voie de biosynthèse de ladite molécule d’intérêt. Dans un autre mode de réalisation particulier qui peut être combiné au mode précédent, le procédé de biosynthèse peut comprendre en outre, après l’étape de fermentation, une ou plusieurs étapes enzymatiques in vitro, nécessaires à la biosynthèse de la molécule d’intérêt, le cas échéant suivie de purification des produits intermédiaires. La présente invention sera mieux comprise à la lumière des exemples non limitatifs suivants, qui sont donnés à titre purement illustratif et n'ont pas pour but de limiter la portée de cette invention qui est définie par les revendications. Exemples Exemple 1 : Croissance Pseudomonas putida KT2440 sur différents extraits de lignine Les lignosulfonates sont des extraits de lignine. Les extraits sont réalisés à chaud avec des contre-ions comme le calcium (Ca-LS) ou le sodium (Na-LS). Deux lignosulfonates différentes ont été utilisés comme source de carbone pour la croissance de P. putida dans du milieu minimum M9. Lignosulfonate Hêtre : Roth ref 8208.1 Lignosulfonates résineux : CTP Grenoble Milieu M9 (Na2HPO4 47.7 mM ; KH2PO4 22 mM ; NaCl 8.56 mM ; NH4Cl 18.7 mM) Euromedex ref SD724-2520. 1 mM de MgSO4 et 0.3 mM de CaCl2 sont ajoutés également. Contrôle négatif : C- ( P. putida dans un milieu minimum M9 sans source de carbone) Deux essais de croissance avec lignosulfonates (Ca-LS ou Na-LS) à 2 g/l comme sources de carbone dans le M9 (Figure 1A et B) ont été menées. Les cultures sont réalisées à 30°C avec une agitation de 180 rpm. Comme le montre les Figures 1A et B, Pseudomonas putida a une croissance lente et atteint une biomasse faible en présence de Ca-lignosulfonates Hêtre (feuillus) comme source de carbone. Néanmoins, cette croissance est significative par rapport à l’utilisation de Na-lignosulfonates de résineux. Pseudomonas putida peut donc utiliser préférentiellement des extraits de bois d’arbres feuillus par rapport à des extraits de bois d’arbres résineux pour sa croissance. Exemple 2 : Croissance Pseudomonas putida KT2440 vs E. coli sur copeaux de bois de chêne Nous avons ensuite comparé la croissance de Pseudomonas putida sur copeaux de bois avec E. coli . Nous avons mis en culture des souches de P. putida (Ppu) ou E. coli dans un milieu comprenant 5 g de bois en copeaux dans 100 ml de M9 complet sans glucose. Les cultures sont réalisées à 30°C avec une agitation de 100 rpm. Les résultats sont présentés à la figure 2. Fl1 et Fl2 représentent deux essais de croissance différents de P. putida en présence de bois autoclavés, ou non autoclavés (donc comprenant des microorganismes du bois). Les résultats montrent que E. coli a une croissance lente et atteint une biomasse significativement plus faible que P. putida dans les mêmes conditions de culture. Exemple 3 : Consommation de substrat sur le bois de chêne Des dosages de glucose libre sont réalisés en même temps que la croissance de P. putida sur des copeaux de bois de chêne en milieu M9 (Figure 3). Le dosage a été réalisé à l’aide du kit Megazyme (ref L-MANGL 2/15). Lors de la culture Fl2 A vide, on voit la quantité de glucose libérée naturellement par le bois qui augmente. Cette libération est très certainement mécanique et/chimique, due à la chaleur et/ou à l’agitation et au trempage du milieu. On atteint en fin de culture 170 mg/l de glucose disponible. Le rendement maximum de conversion du glucose en biomasse d’après la littérature, pour Pseudomonas putida , est de 0.5 g de cellules sèches (ou Dry Cell Weigh_DCW)/g de glucose (Yx/s = 0,55 gDCW/gGlucose). Avec 0,170 g, la biomasse obtenue devrait donc être de 0.0935 g/l, ou 0.35 unité de DO (coefficient de conversion de la biomasse en unité de DO=0.27gDCW/l/UDO). Or la biomasse obtenue après 400h de culture est bien plus importante (plus de 1 unité de DO). Il est estimé que 1 uDO/ml équivaut à 1.10 8 cfu/ml. On en déduit que P. putida a la capacité de consommer les sucres libres comme le glucose libéré par le bois, mais également de consommer d’autres substrats provenant du bois. Pseudomonas putida constitue par conséquent une espèce préférentielle pour son utilisation comme châssis bactérien pour la biosynthèse de molécule d’intérêt par fermentation sur bois, de préférence sur bois de feuillus, et en particulier sur bois de chêne. Exemple 4 : Souche s de Pseudomonas putida génétiquement modifiées pour la croissance sur bois Afin d’améliorer la croissance de Pseudomonas putida sur le bois de chêne, plusieurs modifications génétiques de la bactérie sont réalisées. Pour cela, des gènes recombinants codant des enzymes permettant une dégradation efficace de la cellulose, de l’hémicellulose et de la lignine sont intégrés au chromosome de Pseudomonas putida selon le protocole suivant. Protocole de mutagenèse génétique de Pseudomonas putida : La mutagenèse génétique chez Pseudomonas putida s’effectue au moyen de plasmides suicides qui s’intègrent dans le chromosome et en ressortent en laissant la délétion ou l’insertion de gènes désirées. Le plasmide suicide utilisé est le pK18mobsacB (Schäfer A, Tauch A, Jäger W, Kalinowski J, Thierbach G, Pühler A. Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19 : selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum. Gene 1994 Jul 22 ; 145(1) :69-73). Ce plasmide porte une cassette de résistance à l’antibiotique Kanamycine et la cassette de contre-sélection sacB. Il comporte également une origine de réplication qui ne fonctionne que chez la bactérie E. coli, et une origine de transfert oriT qui lui permet d’être transféré par conjugaison d’E. coli à une autre souche bactérienne comme Pseudomonas putida . Les gènes à insérer sont clonés dans ce plasmide, ainsi que les zones d’homologie au lieu d’insertion choisi sur le chromosome bactérien. Ces zones d’homologie sont clonées de part et d’autre du gène à insérer, et doivent avoir une taille de 800 paires de bases minimum. Les clonages se font dans une souche d’Escherichia coli capable de conjuguer (en général la souche S17.1, Simon, R., Priefer, U. and A. Pülher, A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering : transposon mutagenesis in gram negative bacteria. Nature BioTechnology volume 1, pages784–791 (1983)). Le protocole de conjugaison est le suivant : Une goutte de culture de S17.1/plasmide suicide (souche donneuse) est déposée sur un milieu riche LB Agar (Luria-Miller, Roth, référence X968.2 contenants de l’agar à 1,5%), et une goutte de culture de la souche Pseudomonas putida (souche receveuse) est déposée sur la première goutte. La boîte de culture est incubée une nuit à 30°C. La goutte est ensuite diluée dans du MgSO4 10 mM et le protocole est réalisé comme décrit à la figure 4. Le plasmide de conjugaison pK18mobsacB est un plasmide intégratif apte à s’intégrer dans le génome de la souche bactérienne receveuse afin de produire des transconjugants. Le plasmide étant résistant à la Kanamycine, le milieu de sélection des transconjugants est du LB Agar contenant de l’Ampicilline 100 mg/ml ( Pseudomonas putida résiste naturellement à cet antibiotique), et de la Kanamycine à 50 mg/ml (Kanamycine, ROTH référence T832.4 ; Ampicilline, EUROMEDEX, référence EU0400-D). Ce milieu permet donc de sélectionner les bactéries Pseudomonas putida dans lesquelles un plasmide s’est intégré. La suite du protocole comprend les étapes suivantes : - Excision du plasmide suicide : prélever 8 clones Kn+AmpR et les mettre en culture dans 10ml de milieu LB+Amp 100 mg/ml (dilution 1/2000) à 30°C avec agitation. Incuber entre 12h et 24h. - Contre-sélection sacB sur Sucrose 25% : strier la culture du pool de clones sur YT agar et YT+Sucrose 25% agar. Incuber à 30°C jusqu’au lendemain matin. Repiquer 20-25 clones Sucrose+ sur YT agar, YT+Sucrose 25% agar et YT agar +Kn 50 mg/ml. Incuber à 30°C jusqu’au lendemain matin. YT : Yeast extract tryptone - Vérification par PCR de l’insertion du gène Des primers s’hybridant de part et d’autre de la zone chromosomique d’insertion permettent de vérifier les clones mutants en réalisant des PCR sur colonie pour les clones KnS et Sucrose+. Gènes à insérer dans Pseudomonas putida Un ou plusieurs des gènes listés ci-après sont insérés dans Pseudomonas putida afin d’améliorer la croissance de la bactérie sur bois. Ces gènes ont été choisis chez des microorganismes connus pour être très efficaces dans la dégradation du bois, notamment de nombreux champignons. Les gènes sont synthétisés et les codons sont optimisés pour une expression maximale chez Pseudomonas putida . Certains gènes sont endogènes à Pseudomonas putida , mais il est recommandé de tester l’activité des protéines pour lesquelles ils codent et si ces enzymes ne sont pas assez actives ou leur expression insuffisante, ces activités peut être optimisées. Gènes codant une enzyme permettant la dégradation de la cellulose : Endoglucanase/endo-β-1.4-glucanase/endo-β-1,3 glucanase : bcsZ ( P. putida KT2440) : >PP_2637 bcsZ (SEQ ID NO :1) codant la sous-unité cellulose synthase endo-1,4-D-glucanase (SEQ ID No :2) -Exoglucanase/exo-β-1,4-glucanase Exoglucanase (Paenibacillus xylanexedens) >BS614_09070 (SEQ ID NO :3) codant l’exoglucanase (SEQ ID NO :4) β-glucosidase bglX ( P. putida KT2440) >PP_1403 bglX (SEQ ID NO :5) codant la beta-D-glucoside glucohydrolase (SEQ ID NO :6) Gènes permettant la dégradation de l’hémicellulose Endoxylanase/Endo-β-1,4-xylanase Endoxylanase (Paenibacillus xylanexedens) >BS614_01545 (SEQ ID NO :7) codant la 1,4-beta-xylanase (SEQ ID NO :8) β-xylosidase β-xylosidase (Paenibacillus xylanexedens) >BS614_01615 (SEQ ID NO :9) codant la beta-xylosidase (SEQ ID NO : 10) α-xylosidase α-xylosidase (Paenibacillus xylanexedens) >BS614_14525 (SEQ ID NO :11) codant l’alpha-xylosidase (SEQ ID NO :12) acétyle-xylane estérase acétyle-xylane estérase (Paenibacillus xylanexedens) >BS614_18585 (SEQ ID NO :13) codant l’acétyle xylane estérase (SEQ ID NO :14) Gènes permettant la dégradation de la lignine Laccases= Multicopper oxydase= Multicopper phenyloxydase Laccase (Pleurotus eryngii) ADG01835.1 >Laccase (SEQ ID NO :15) codant la laccase (SEQ ID NO :16) Peroxidase PP_3248 (Pseudomonas putida KT2440) >PP_3248 (SEQ ID NO :17) codant la protéine de la famille des péroxidase de type Dyp (SEQ ID NO :18). >Oxydoreductase PP_3249 (Pseudomonas putida KT2440) >PP_3249 (SEQ ID NO :19) codant une oxidoreductase putative (SEQ ID NO :20) Aryl-alcool oxidase Aryl-alcool oxidase ( Pleurotus eryngii ) ADD14021.1>AAO (SEQ ID NO :21) codant l’aryl-alcohol oxidase (SEQ ID NO :22) Glyoxal oxidase glyoxal oxidase precursor ( Phanerochaete chrysosporium )> glx1 (SEQ ID NO :23) codant la GLOX_PHACH (SEQ ID NO :24) Exemple 5 : Procédé de fermentation immergé d’une souche modifiée de Pseudomonas putida sur bois Le milieu est composé de 10 à 45% de masse sèche de bois avec respectivement 90 à 55 % de masse de solution nutritive saline, composée de potassium, sodium, phosphate, sulfate, ammonium, calcium, éventuellement d’éléments traces et/ou de vitamines. La souche est inoculée à environ 0,025-0,1 gramme de masse sèche de biomasse par gramme de milieu (bois + solution saline). La température est maintenue entre 30 et 35°C Le pH est maintenu entre 6 et 7,5 par ajout de solutions acides (phosphorique ou sulfurique) ou basiques (ammoniaque ou potasse). La croissance est réalisée pendant 24 à 48h. Par la suite, la souche passe en phase stationnaire. La consommation du substrat est maintenue afin de permettre la production des molécules cibles. Dans la présente demande, il est fait référence au(x) listage(s) de séquence(s) dont le(s) identificateur(s) (ou « SEQ ID NO ») sont listés ci-après. Quelle que soit la forme sous laquelle les listages sont fournis, ces listages font partie de la présente demande. SEQ ID NO :1 : bcsZ (P. putida KT2440) : >PP_2637 bcsZ ATGCGCCAGATGCTGGTAGGGCTGGTCGCCTTAGGCCTGCCCGTTTTCGCCAATGCCGGGTCGGTTTGCCCATGGCCTGCCTGGGAGCGGTTCAAGGCCGGCTGGTGAGTGTGGATGGGCGGGTCATCGACCCGAGTGACGAGCGCCTGATCACCACCTCGGAAGGGCAGAGTTACGCGCTGTTCTTCGCCCTGGTAGGTAACGACCGGCAAACCTTCGCGCAGTTGCTGCGTTGGACCAGCAACAACCTCGCCGAGGGTGACCTGGCCCGGCATCTGCCTGCCTGGCTGTGGGGCCGTGACGGGCAGCAGCAGTGGCAGGTGCTGGACGCCAACAACGCCAGCGATGCCGATCTGTGGATCGCCTACAGCCTGCTGGAAGCAGGGCGGTTGTGGGACCAGCCGGCCTACACGCAACTGGGCCAGCACCTGCTGTGGCGTATCGCCGCGCAGACCGTGCGCAAGCTTCCAGGCCTTGGTGTGATGTTGCTGCCAGGTGACTACGGCTTCGAAGACGCCCAGGGTACCCGCCTGAACCCCAGCTACCTGCCGCTGCAGCTGCTCGACCGCTTCAGCGATGTGGACCCCTTGTGGGGTGAGCTGGCGGCCAACACGCGGCGTTTGTGGTTGGCATCGTCGCCAAAGGGTTTTGCCCCGGACTGGTTGCTGTGGACGCCGGCCGGAAAGCCAGCGGCAGACACGAAACATGGCAATGCCGGTGATTATGACGCCATTCGTGTGTACCTGTGGGTCGGCATGTTGGCCGAGGGGGCGGCGCAACGCCGCGAACTGGTGGCCCATTATGCGCCGATGGCGGCATTGACCCAGCGCCAGGGGCTACCTCCTGAGCACCTGGATGCACGCAGCGGTGAAGCCCGCGGCCATGGCCCGGCGGGTTTCTCTGCGGCCTTGCTGCCATTGCTTGCTGCCTCGCCAGAGCACGTGGCCGGCTTGGCGGCCCAGCGCCAGCGCTTGCGCGAACAGCCGGTCGAGGCCAAGGCGTATTACAGCCAGGTGCTGGCGCTGTTCGGCCAGGGCTTCGACGAGGCCCGTTACCGTTTTGACCCGCACGGCCGGCTGTTGCCGGCCTGGAGCGCGCCATGCAGCGAATGA SEQ ID NO :2 : > P. putida - cellulose synthase endo-1,4-D-glucanase subunit MRQMLVGLVALGLPVFANAGSVCPWPAWERFKAELVSVDGRVIDPSDERLITTSEGQSYALFFALVGNDRQTFAQLLRWTSNNLAEGDLARHLPAWLWGRDGQQQWQVLDANNASDADLWIAYSLLEAGRLWDQPAYTQLGQHLLWRIAAQTVRKLPGLGVMLLPGDYGFEDAQGTRLNPSYLPLQLLDRFSDVDPLWGELAANTRRLWLASSPKGFAPDWLLWTPAGKPAADTKHGNAGDYDAIRVYLWVGMLAEGAAQRRELVAHYAPMAALTQRQGLPPEHLDARSGEARGHGPAGFSAALLPLLAASPEHVAGLAAQRQRLREQPVEAKAYYSQVLALFGQGFDEARYRFDPHGRLLPAWSAPCSE SEQ ID NO :3 : > Paenibacillus xylanexedens Exoglucanase/exo-b-1,4-glucanase BS614_09070 CTGCGCAAAGGTGTAAAACAAATGCTGGCAGCAACGCTGCTCGCGGCGGGGATTTTCCCGGGGATGTCTCCAGGCCTGACTCAGGCGGCTGAGGCACATGTGGACAATCCATTTGTAGGGGCAACGGCTTATCTGAACCAAGATTACTCGGCTCTCGTGGATACGTCCATTGCGCTGACTAACGATGCATCGCTGAAGGCCAAGATGGAGACGGTCAAATCGTATCCAACCGCAGTATGGGTTGACCGGATTGCTGCAATCTATGGCGGCACGGACAACGCTGGTCGCAAAAGTGTAGAGCAACATCTTGATGCCGTTCTCGCCCAAAAGAAGCCTGGTACGCCAATAACGGCTTCGTTCGTTATCTATAACTTGCCTGGACGGGATTGTCATGCACTTGCATCGAATGGTGAACTTCCACTAACACAGGCGGCACTGCAGACATATAAAACGGATTATATTGATGTGCTCGCAGATATCTTCGCAGATCCGAAGTATCAGGATATTCGTATTATTGCCGTCATTGAACCGGACAGCCTGCCTAACCTTGTGACCAACCTGAGTACACCAGCTTGTGGTCAAGCCAGCTCAACAGGTATCTATGAGGCGGGTGTGAAGTATGCATTGGACAAGCTGCACGCCATTCCGAATGTGTACAACTATCTGGATATCGGCCACTCCGGCTGGCTTGGATGGGATAACAACCGTTCTGCAGCAGTCGCGCTGTATACAAGTGTTGTGCAAGGGACAGCCGCGGGTCTGAGCAGTGCAGATGGCTTCATTACGAATACTGCGAACACCACACCACTGGGGGAGCCGAACCTGTCTAATCCGGATCTCAATATCGGTGGACAACCGATTAAATCTGCCAAGTTTTATGAGTGGAATCCTTATTTTGACGAAACCGATTTCACCGCTGCGCTGTATGCCGATTTCGTACAAGCTGGCTGGCCAAGCAGCACAGGTTTCCTGATTGATACTAGCCGGAATGGGTGGGGCGGGGTAGACCGTCCAGCATCTGCTACGGGCAGCAACATCAACGATTATGTGAATTCTGGACGTGTAGATCGCCGGGAGCATCGGGGGAACTGGTGTAATGCCAGTGGCGCAGGTATTGGTGAAGCACCTAAGGCTGCACCAGGACCAGCGCATCTGGATGCTTATGTATGGGTGAAACCTCCGGGTGAATCCGATGGCTCCAGCTCCGAAATTCCGAATAACGAAGGCAAAGGTTTCGACCGGATGTGTGATCCAACCTTCACAACTCGGGATGGTGTATTAACAGGTGCGTTGCCTAATGCTCCGGTATCGGGTCACTGGTTCCATGATCAATTCGTGGCACTGGTGAAAAACGCATTCCCTGTACTGCCTGCCAGTAACGGTGGAGGCAATCCTCCCGGGGGAACAACAGCTCCGGCAGCACCAGCAGCATTGACGGCTTCTGCCGGTAACGCTCAAGTCTCCTTGACGTGGACTGCTTCTACAGGGGCTACAAGTTATAGTGTGAAGCGGGCACTGAGTGCATCAGGTCCATTCACAACAATTGCAGCTAACGTGAGTGGAACATCTTACAGCAACACCGGGCTGATCAATGGTACAACCTATTATTATGTGGTAACGGCAACAAATGCAGTAGGTGAAAGTGTTAACTCTGCAACAGCAACAGCTACACCTGTTGCAGGTGTAACGGCGCCAGCTGCACCGACTGCTCTCACAGCAACTGCAGGCAATGCGCAGGTGAGCCTGACGTGGACCGCTTCTACAGGTGCAACAAGTTATGATGTGAAACGCGCACTGAGTGCAACAGGTCCGTTCACCACAATCGCGGCGAATGTGAGCGGTACGTCATACACCAACACTTCCCTGACGAACGGCACGACGTATCATTATGTGGTAAGTGCAGTGAATACAGCAGGGCAAAGTGCCAATTCCGCTGTAGCTTCTGCGACACCTCAAAGTGTCGTTGTACCAACGAGTGATCTTGTCGTGCAATATCGTGCTGGAGATACCAATGCTCAAGATAGCCAGATCAAACCGTATTTCAACATCAAAAATCTGGGTAGTACTGCTGTGAATCTGAGTGATCTGAAGATCCGGTACTACTTCTCCAAAGAAGGCTCGGCTGCGATGGATTCTGCCATCGATTATGCTCAAGTTGGCGGAGCCAATATCCAGCGTACCTTCACAGACTCGTATGTGGAGTTGAGCTTCACATCTGGCGCTGGCAGCATTCAGGCTGGTGGACAGACTGGAGACATCCAGCTTCGCATGTACAAAACAGACTGGTCAAACTTTGACGAGACGAATGACTACTCTTTCGATCCAACGAAAACATCCTACCAGGATTGGAACAAGGTAACGCTCTACCAAGGTGGAAACCTGGTATGGGGCATTGAGCCTTAA SEQ ID NO :4 : > Paenibacillus xylanexedens Exoglucanase MRKGVKQMLAATLLAAGIFPGMSPGLTQAAEAHVDNPFVGATAYLNQDYSALVDTSIALTNDASLKAKMETVKSYPTAVWVDRIAAIYGGTDNAGRKSVEQHLDAVLAQKKPGTPITASFVIYNLPGRDCHALASNGELPLTQAALQTYKTDYIDVLADIFADPKYQDIRIIAVIEPDSLPNLVTNLSTPACGQASSTGIYEAGVKYALDKLHAIPNVYNYLDIGHSGWLGWDNNRSAAVALYTSVVQGTAAGLSSADGFITNTANTTPLGEPNLSNPDLNIGGQPIKSAKFYEWNPYFDETDFTAALYADFVQAGWPSSTGFLIDTSRNGWGGVDRPASATGSNINDYVNSGRVDRREHRGNWCNASGAGIGEAPKAAPGPAHLDAYVWVKPPGESDGSSSEIPNNEGKGFDRMCDPTFTTRDGVLTGALPNAPVSGHWFHDQFVALVKNAFPVLPASNGGGNPPGGTTAPAAPAALTASAGNAQVSLTWTASTGATSYSVKRALSASGPFTTIAANVSGTSYSNTGLINGTTYYYVVTATNAVGESVNSATATATPVAGVTAPAAPTALTATAGNAQVSLTWTASTGATSYDVKRALSATGPFTTIAANVSGTSYTNTSLTNGTTYHYVVSAVNTAGQSANSAVASATPQSVVVPTSDLVVQYRAGDTNAQDSQIKPYFNIKNLGSTAVNLSDLKIRYYFSKEGSAAMDSAIDYAQVGGANIQRTFTDSYVELSFTSGAGSIQAGGQTGDIQLRMYKTDWSNFDETNDYSFDPTKTSYQDWNKVTLYQGGNLVWGIEP SEQ ID NO : 5 : P. putida KT2440 >PP_1403 bglX ATGATGAAACTGTCTTTGCTGGGCCTGGCCATGGGCCTTGCCAGTCAGGCGGCCCTCGCCGCCCCCACCGCCCCGCCCCTACAGGACAAGCAGGCCTTTATCGAGCATCTGATCAGCCAGATGACCGAAGCCGAAAAAATCGGCCAGTTGCGCCTGATCAGCATCGGCCCGGAAATGCCCCGCGACAAGATCCGCGAGGAAATCGCCGCCGGCCGTATCGGTGGCACCTTCAACTCACGCACTGCCCCCGAAAACCGGCCGATGCAGGACGCGGCCATGCGCAGCCGCCTGAAGATCCCGATGTTCTTCGCCTACGACACCGTCCACGGCGAGCGCACCATCTTCCCGATCGGCCTGGGCATGGCCGCGACCTGGGACATGGAGGCCGTCGCCAAGGTCGGCCGCACCGCCGCGATCGAAGCCTCGGCCGACGCCCTGGACATGACGTTCGCGCCAATGGTGGATATCGCCCGTGACCCGCGCTGGGGCCGCACAAGCGAAGGTTTCGGCGAAGACACCTACCTGACTTCGAGAATCGGCCAGGTAATGGTGCGCTCGTTCCAGGGCAGCAGCCCGGCCAACCCCGACAGCATCATGGCCATCGTCAAGCATTTCGCCTTGTATGGCGCCGTGGAAGGCGGGCGCGACTACAACACGGTCGATATGAGCCTGCCGAAAATGTACAACGACTACCTGCCACCCTATCGCGCCGCGCTCGATGCGGGTGCCGGTGGCGTGATGGTGGCGCTGAACTCGATCAACGGCGTACCGGCCACCTCCAACACCTGGCTGATGAACGACCTGCTGCGCAAGGAGTGGGGCTTCAAGGGCGTGACCATCAGCGACCACGGTGCCATCCAGGAGCTGATTCGCCACGGCGTCGCCCGTGACGGCCGTGAAGCCGCCAAGCTGGCGATCAAGGCCGGCATCGACATGAGCATGAACGATACCCTGTACGGCGAAGAGCTGCCGGGCCTGCTGAAGTCCGGCGAGGTGACCCAGCGCGAGCTGGACCAGGCGGTGCGTGAAGTGCTGGGTGCCAAGTACGACATGGGCCTGTTCAAGGACCCGTACGTGCGCATCGGCAAGGCCGAAACCGATCTGAAGGACTACTACGGCAACGACCGCCTGCACCGCGAAGCTGCGCGCGACGTGGCACGCCGCAGCCTGGTGCTGCTGGAAAACCGCAACCAGACCCTGCCGCTGAAAAAGGCCGGCACCATTGCCTTGGTCGGCCCGCTGGCCGATGCTCCGATCGACATGATGGGCAGCTGGGCCGCCGACGGTAAACCCGTCCACTCGGTGACCGTGCGCGAAGGCTTGCGCCGCGCCGTGGAAGGCAAGGCCAAGCTGGTCTACGCCAAAGGCTCCAACGTCACGGGCGACAAGGCGATCTTCGATTACCTGAACTTCCTCAACTTCGATGCCCCGGAAATCGTCGACGACCCACGCCCGCCTGCGGTGCTGATCGATGAAGCAATCAAGGCAGCCAAGCAATCCGACGTCGTGGTCGCAGTGGTCGGCGAGTCCCGCGGCATGTCCCACGAGTCGTCGAGCCGCACCACCCTGGAGATCCCGGCCAGCCAGCGCGAGCTGATCAAGGCGCTCAAGGCCACCGGCAAACCGCTGGTGCTGGTGCTGATGAACGGCCGGCCGCTGTCGATCAGCTGGGAGCGCGAGCAGGCCGACGCCATCCTGGAAACCTGGTTCGCCGGCACCGAAGGCGGCAATGCCATCGCCGACGTGCTGTTTGGCGACTACAACCCCTCCGGCAAGCTGGCCATTACCTTCCCACGGTCGGTGGGGCAGATCCCGATGTACTACAACCACACCCGCATCGGCCGGCCGTTCACGCCGGGCAAGCCGGGCAACTACACCTCGCAATACTTCGAAGAACCCAACGGGCCGCTTTATCCGTTCGGCTATGGCTTGAGCTACAGCAGCTTCGAGCTGTCAGGCCTGAACCTGTCGAGCAAGGATCTCAAGCGCGGCGATACGCTGGATGCCAAGGTAACGGTCAAGAACACCGGCAAGGTTGCAGGCGAGACGGTGGTGCAGCTGTACCTGCAGGATGTGTCGGCGTCGATGAGCCGCCCAGTGAAAGAGCTGAAAAACTTCCAGAAGCTGATGCTTGAACCGGGTGAAACCCGCACGTTGACCTTCCGCATCAGCGAGGACGACCTGAAGTTCTACAATGGCCAGTTGCAGCGGGTTGCCGAACCAGGGGAGTTCAATGTCCAGGTAGGGCTGGATTCCCAGGCGGTGCAGCAGCAGAGCTTTGAATTGCTTTGA SEQ ID NO :6 : P. putida KT24>beta-D-glucoside glucohydrolase MMKLSLLGLAMGLASQAALAAPTAPPLQDKQAFIEHLISQMTEAEKIGQLRLISIGPEMPRDKIREEIAAGRIGGTFNSRTAPENRPMQDAAMRSRLKIPMFFAYDTVHGERTIFPIGLGMAATWDMEAVAKVGRTAAIEASADALDMTFAPMVDIARDPRWGRTSEGFGEDTYLTSRIGQVMVRSFQGSSPANPDSIMAIVKHFALYGAVEGGRDYNTVDMSLPKMYNDYLPPYRAALDAGAGGVMVALNSINGVPATSNTWLMNDLLRKEWGFKGVTISDHGAIQELIRHGVARDGREAAKLAIKAGIDMSMNDTLYGEELPGLLKSGEVTQRELDQAVREVLGAKYDMGLFKDPYVRIGKAETDLKDYYGNDRLHREAARDVARRSLVLLENRNQTLPLKKAGTIALVGPLADAPIDMMGSWAADGKPVHSVTVREGLRRAVEGKAKLVYAKGSNVTGDKAIFDYLNFLNFDAPEIVDDPRPPAVLIDEAIKAAKQSDVVVAVVGESRGMSHESSSRTTLEIPASQRELIKALKATGKPLVLVLMNGRPLSISWEREQADAILETWFAGTEGGNAIADVLFGDYNPSGKLAITFPRSVGQIPMYYNHTRIGRPFTPGKPGNYTSQYFEEPNGPLYPFGYGLSYSSFELSGLNLSSKDLKRGDTLDAKVTVKNTGKVAGETVVQLYLQDVSASMSRPVKELKNFQKLMLEPGETRTLTFRISEDDLKFYNGQLQRVAEPGEFNVQVGLDSQAVQQQSFELL SEQ ID NO :7 : Endoxylanase ( Paenibacillus xylanexedens ) >BS614_01545 ATGAAGTACATCAAGGGATTTACATTTGGCTGGATGAGTGGCAAGGGCGACTTCCGCAAGCCGGAAGCCAAAGAATCCTTGCGCCTGATGGCTGAACGTACAGGCAGTTCTCATGTCATTTTTGCACTGGCTGCACATCAGGATCATCCACAGGAGGTAGAGGTCAAGTATCGGGGTGAACATCTGGTGGAGGATGATGAACTGATCGACATGATTCGTTATGCCCGTACACTCGGGCTGCGTATCATTCTGAAACCAACCGTTAACTGCACCGACGGCACATGGCGTGCACACATTAACTTTTTTGATATCGATGTGCCTTGTGAGCCGAAGTGGAAGGATTGGTTCCGCAGTTACACGGCATTTCAGAAGCATTATGCAGGGATTGCAGAGCAGGAAAAGTGTGAGATGTTCATCGTAGGCTGTGAGATGGTGCAATCCGAGCGTCGGGATGAAGAGTGGCGCGAGGTGATCGCCGCTGTGCGTGAAGTGTACACGGGACTGGTGTCATACAACACGGACAAATATCAGGAAGGTCATGTGAAATGGTGGGATGCCGTGGATGTCATCTCTTCCAGTGGTTACTATCCCATCGGAGATTGGGAGGCGCAACTGGATCGTATTGAACAGGCGATTGATCCCTATGGTAAACCCTTTTTCTTCGCGGAAGCAGGCTGTCCCAGCCGTAGCGGATCAGCCCAGGTACCAAACGATTGGGGACTGGAAGGCGAAGTGAATGCGGAGGAACAAGAGCGTTTCTATGAGGCGATGTTCCGGCATGTCAGTCAGCGTGACTGGGTACGCGGATTCGGTCTGTGGGATTGGAGTGCAAATCTGCACACGGAGAAGGATGCGCTGACCGATGACGGATATGGAGTTTACGGTAAGCCAGCGGAGCAGGTGATTCGTCGGTTCTATGAGGGCATCGCTGTAGAAGTTTAA SEQ ID NO :8 : Paenibacillus xylanexedens >1,4-beta-xylanase MKYIKGFTFGWMSGKGDFRKPEAKESLRLMAERTGSSHVIFALAAHQDHPQEVEVKYRGEHLVEDDELIDMIRYARTLGLRIILKPTVNCTDGTWRAHINFFDIDVPCEPKWKDWFRSYTAFQKHYAGIAEQEKCEMFIVGCEMVQSERRDEEWREVIAAVREVYTGLVSYNTDKYQEGHVKWWDAVDVISSSGYYPIGDWEAQLDRIEQAIDPYGKPFFFAEAGCPSRSGSAQVPNDWGLEGEVNAEEQERFYEAMFRHVSQRDWVRGFGLWDWSANLHTEKDALTDDGYGVYGKPAEQVIRRFYEGIAVEV SEQ ID NO :9 : Paenibacillus xylanexedens β-xylosidase > BS614_01615 TTGGCGCTGCAATCCATAGGTATGCTGCTTGCACCCGGACCGAATGCTTCAGCTGCTCCACTTAGTGTAACGAACGGGATACAGTTCAAGGATACCAATGGCAATGTCGTTCATGCTCATGGGGGCGGGATGATTAAGGCAAATGGGTATTATTACTGGTTTGGAGAGAACCGCAATACGAATGGAACGTTCAAGGCAGTGTCCGTGTATCGTTCATCGGATCTGAAGAACTGGGAGTATCGTAATGATGTGCTGACCAGCAACTCGGCTACCGAGCTAAATATCTCTAACATTGAACGCCCAAAGGTCATCTACAACAGTGCTACCGGCAAATATGTGCTGTGGATGCACAAAGAGAATGGTCTGGATTATGGCGAGGCCCGAGTGGCGGTAGCTACTTCGAATACAGTTGATGGCAACTACACGTATGTGGGCAGTTATCGTCCACTTGGGTATGATTCCAGAGATATGACGGTGTACAACGATAACGGAACGGCTTATCTGATCTCCGCGACCCGAGTGAATGCAGATCTGAATATATATAAGCTGACCCCGGATTTCCTGGGTGTGGAATCCCTAGTCACAACGCTGTGGCCCGGACAATATCGTGAAGCACCAGCCCTATTCAAAAAAGACGGCGTCTACTTCCTGATCACCTCGGGTGCGACCGGCTGGAATCCGAATCAGGCCAAATATGCCACAGCCTCCAGCATTACAGGCACATGGAGCGGCCTCAGTAACTTCGGCGACAGCACAACGTATGGTTCTCAATCCACCTATGTTGTTCCAGTAGAAGGTTCACAGACCACATCTTATCTCTACATGGGTGATCGCTGGGCTGGTGCATGGAGCGGACCGGTGCAGGATTCCAAGTATGTCTGGCTGCCACTTTCATTCCCGAGTGCAACCAGTCTGGCGATGAACTGGGCCAGCAGTATTACGATTGATACAGCAACAGGGACTGTGACCGGAGTGAGTACACCGGATGTATGGGACCCGAATGCTTCATATCAGCTGATTAGTCGTAAGAGTAACAAATTGCTGAATGTCATTGGGGGTTCTTCCGTCAACGGTGCGGATCTGGAGCAGCGAGCAGATTGGGGAACAACCAGTCAACAGTGGCAAATTACCGATGCGGGTCAAATTACCGATGCGGGTGGCGGTTATGTCAAAATCATCAACCGTTCCAGTGGCAAGCTAATCGGTGTGGAGAATGGTGCCACGACGGATGGGGCTGTCATTGAACAGTGGAATGATGGTGGCTGGGCCAGCCAGCAATGGCAACTCGTCAGTGTAGGTGGTGGTTATTATAAACTGAAGAACCGCAGTACAGGCAAGGTATTGGATATCTCCAGTCAATCCCTGGCAGATGGGGCTGCGGCCATCCAGTGGACGGATAATGGCGGTACGAATCAGCATTTTCAGATTGTTAAGGTGCAGTAA SEQ ID NO :10 : Paenibacillus xylanexedens >beta-xylosidase MALQSIGMLLAPGPNASAAPLSVTNGIQFKDTNGNVVHAHGGGMIKANGYYYWFGENRNTNGTFKAVSVYRSSDLKNWEYRNDVLTSNSATELNISNIERPKVIYNSATGKYVLWMHKENGLDYGEARVAVATSNTVDGNYTYVGSYRPLGYDSRDMTVYNDNGTAYLISATRVNADLNIYKLTPDFLGVESLVTTLWPGQYREAPALFKKDGVYFLITSGATGWNPNQAKYATASSITGTWSGLSNFGDSTTYGSQSTYVVPVEGSQTTSYLYMGDRWAGAWSGPVQDSKYVWLPLSFPSATSLAMNWASSITIDTATGTVTGVSTPDVWDPNASYQLISRKSNKLLNVIGGSSVNGADLEQRADWGTTSQQWQITDAGQITDAGGGYVKIINRSSGKLIGVENGATTDGAVIEQWNDGGWASQQWQLVSVGGGYYKLKNRSTGKVLDISSQSLADGAAAIQWTDNGGTNQHFQIVKVQ SEQ ID NO : 11 : Paenibacillus xylanexedens α-xylosidase >BS614_14525 ATGAAATTTACTGATGGATTCTGGATGACTCGTGAAGGGTACCAAATTCAAAACCCGACTGACATTCGTGATATTGTGCAAAAAGACAATGCTGTGACCGTATATGCGGCAACTAAATATATTCGTACCAAAGGCGACACATTGAACGGTACATTGCTGAAAGCAACGTACAGCTCACCTATGCCTAACGTTATCCGTGTAACCTTGAATCATCATAAAGGCGGCGTGAAAAAAGGGCCTGTTTTTGAGCTTAACACGCAAGATGTAAACGTTGACATCTCAAAAAATGAACAAGGTGCTGTTTTGAAAAGCGGCAACCTGGAAGTTCAAATCGACAAAACAAACGGTTGGGACGTTAGCTTCCTATATGGAGGAAAACGCATTACAGGTAGCGGTCAAAGAGCGGCTGGTTATATTACAGGTCCAAGCAAGGAAGCGTACTTCCGCGAGCAGCTTGATCTCGGTATTGGTGAATACGTTTACGGACTCGGGGAGCGCTTCACACCGTTTGTTAAGAATGGCCAAATCGTCGATACCTGGAATGAGGACGGCGGTACAAGCAGTGAACAGTCCTATAAGAACATTCCATTCTACCTGTCCAATAAAGGATATGGTGTATTTGTAAACCATCCTGAACGCGTATCATACGAGATTGCATCTGAGAATGTATCAAAAGTGCAGTTCAGCGTAGAAGGAGAGACTCTGGAATACTTCATTATCGGCGGTGACAATCCTAAAGATGTACTTGATAATTATACGAAATTAACAGGTAAACCAGCGCTTCCACCGGCATGGACTTTTGGTCTGTGGCTGACAACTTCATTCACAACGGATTATGATGAAGCAACGGTTAACCATTTCGTAGATGGCATGGCTGAACGTGATCTTCCGCTGTCAGTATTCCATTTTGACTGCTTCTGGATGAAGGAATACCAATGGTCTGATTTCGTATGGGATGAAGCGATGTTCCCGGATCCGGAAGGCATGCTTGCACGTCTGAAAGAGAAGGGTCTTAAAATCTGTGCTTGGATCAATCCATATATTGCAGAAAAATCCTACTTATTCGATGAAGGTATGGAGAACGGTTATCTGGTGAAAACAGCCGATGGTAGCGTATGGCAATGGGATATGTGGCAAGCAGGTATGGCTCTGGTTGACTTCACGAATCCGGATGCTGTGAACTGGTATAAGAGCAAGCTGGAAGTCCTGCTGGATCAAGGTGTAGATTCCTTCAAGACCGACTTCGGCGAAAGAATTCCGACAGATGTTGTGTACTTCGATGGTTCTGATCCGGTTAAAATGCACAACTATTATACACAGCTCTATAACAAAGCTGTATTTGAATTGCTTGAAGAGAAAATTGGCAAAAACGAAGCTGCCCTGTTTGCACGCTCTGCAACAGCAGGTGGTCAACAGTTCCCTGTTCACTGGGGCGGTGACTGCTCTTCCACGTATGAATCCATGGCTGAATCACTTCGCGGTGGCCTCTCGCTCGGACTTTCCGGTTTCGGATTCTGGAGCCATGATATCAGTGGTTTTGAAAGCACAGCGAGCCCTGACGTCTACAAACGCTGGGTACAATTCGGACTGTTATCTTCACACAGTCGCCTGCACGGAAGCACTTCGTATCGTGTGCCTTGGTTGTTTGACGAGGAATCCGTGGACGTTGTTCGAGACTTTACCAAACTCAAAATCAGCCTGATGCCGTACCTGTACAATTCTGCGGTAGAGTCAACGGTAAAAGGTATTCCGATGATGCGCGCTATGCTGCTGGACTTCCCAGAGGACCCAACAACATACAGCTTGGATACGCAATATATGTTTGGTGACTCGATTCTGGTGGCTCCAATCTTCAACAAGGAAGGTGATGTGCGTTATTACCTGCCTGAAGGAACTTGGACGAACTATCTGACAGGAGCGAAAGTACAAGGTGGACGCTGGATCAGTGAAAACCATGACTTCAAAACACTGCCAATGATGATTAAGCCAAACAGTCTGATCGCTGTGGGTGCGGTGGATAGCAAACCGGATTACGACTTTGCAAATGATGTGTCCTTGCACTTGTTCGAACTGGCTGATGGTCAAACGGCTCAAGCTGTCGTTGTGAACCAAGCGGCTGAACAGGAGCTGACGGTTAACGTTACACGTAATGGATCAGTGCTGGACGTTCGTGCTGAAGGTGCAGGCAAACCATGGAACTTGGTGCTTCGCGGCATTGAGAGTGTATCCAGCGTTGAAGGTGGTTCCCAAGTGTCTGGTGCAAATGGTGTTGTTGTTACGGCAGCAACAGGCGCAAGCTCGCTTACAATCCAACTGTAA SEQ ID NO :12 Paenibacillus xylanexedens >alpha-xylosidase MKFTDGFWMTREGYQIQNPTDIRDIVQKDNAVTVYAATKYIRTKGDTLNGTLLKATYSSPMPNVIRVTLNHHKGGVKKGPVFELNTQDVNVDISKNEQGAVLKSGNLEVQIDKTNGWDVSFLYGGKRITGSGQRAAGYITGPSKEAYFREQLDLGIGEYVYGLGERFTPFVKNGQIVDTWNEDGGTSSEQSYKNIPFYLSNKGYGVFVNHPERVSYEIASENVSKVQFSVEGETLEYFIIGGDNPKDVLDNYTKLTGKPALPPAWTFGLWLTTSFTTDYDEATVNHFVDGMAERDLPLSVFHFDCFWMKEYQWSDFVWDEAMFPDPEGMLARLKEKGLKICAWINPYIAEKSYLFDEGMENGYLVKTADGSVWQWDMWQAGMALVDFTNPDAVNWYKSKLEVLLDQGVDSFKTDFGERIPTDVVYFDGSDPVKMHNYYTQLYNKAVFELLEEKIGKNEAALFARSATAGGQQFPVHWGGDCSSTYESMAESLRGGLSLGLSGFGFWSHDISGFESTASPDVYKRWVQFGLLSSHSRLHGSTSYRVPWLFDEESVDVVRDFTKLKISLMPYLYNSAVESTVKGIPMMRAMLLDFPEDPTTYSLDTQYMFGDSILVAPIFNKEGDVRYYLPEGTWTNYLTGAKVQGGRWISENHDFKTLPMMIKPNSLIAVGAVDSKPDYDFANDVSLHLFELADGQTAQAVVVNQAAEQELTVNVTRNGSVLDVRAEGAGKPWNLVLRGIESVSSVEGGSQVSGANGVVVTAATGASSLTIQL SEQ ID NO :13 Paenibacillus xylanexedens acetyl-xylane esterase >BS614_18585 ATGTATCCGAATCCGATTATTTGGGCCGATTACCCGGATCTTGACGTTATTCGTGTAGAGGACACATATTATATGGTCAGTACAACCATGCACATGATGCCGGGATGTGTCATCCTGCGTTCATATGACCTGATCCATTGGGAAGTAGCCACATATGTATACGACACATTGGACGATACGCCTGCACAACGGCTGGTGGATGGTCATCACGTTTATAGTAAAGGCATGTGGGCTGCATCACTCCGTTATCATCAAGGGATGTTCTATGTGATCTTTGTTGCGAATGATACTCGTAAGACATACTTGTATACGTCCCCCACCATCTCGGGAGTTTGGAAGAAGCAGATCGTGGAAGGGTTCTACCATGATTGCTCCTTATTTTTTGACGATGATGAACGAGCATATCTCGTGTACGGTAATACCGAGATCTATCTGACCGAATTAAACTCTGATCTGTCCGGGCCCAAACCTGGTGGAGTGCATCGCTTGATTGTAAAAGACGAGCAGCCTCATCACCTTGGTTATGAAGGAGCACATTTTTACAAGATCAATGGTAAATATATTGTGTTCCTGATTCATATCACGAAAGCTTCCGGACGGAGAACACAGGCTTTTTATATGGCAGACTCTCTGGAAGATGTCTTCACTGGTGGAGAAGTATTCAATGACGATATGGATTATTTCAATTCAGGTGTTGCTCAGGGTGGTATCGTGGATACGCCGGATGGAGACTGGTATGCAATGCTGTTTCAGGATCATGGGGCTGTTGGGCGGGTTCCTGTTTTGGTTCCGCTACACTTTGATCAAGGTAAACCGATCTTTGTAAACAAAGCGCCGAAACAGATTGATATCCCGAGCACGAGACCAGAGCACCGTTATAACCCGTTAGTGGGTAGCGACAGTTTCAATTATGAACCCGAGGAAGATGGAAGTATCCGCCTCCGTGATTTTTGGCAATGGAATCATACACCTAATCATGAGCTCTGGTCCGTTACAGAGAAATCGGGGGTGTATCGTGTTCGAACGGGACAGATCAGTCCAAATCTGACGTTCGCGGTAAATACTCTAACCCAGCGTTCAATGGGGCCCGCTTGCGAAGCAATAGTTACGCTTGACGGCAGTCGTCTGAATGATGGGGATTATGCCGGGTTGTGTTTTCTGATCGGTTCGTACGGTATGATCGCTCTCACGAAGCAGGATAGCAAGTTTTACTTGGTCATGCATGCCAGAGATAGTGAGGATTCAACCATATTTGGCAATCTGATCGACCAGAAGCCAGCCACTGAACATGAACGTATCCCGGTATCAGATCCAGTAGTTAAACTAAAAGCATTCGGAAATTTTGAGAACAATCTGGATGAGTGCTCTTTTGCCTATTTTGATGGGGTTGAATGGAGAGATATAGGGATTGTCCATAAAATGATATATAAACTGGATCATTTTATGGGTTGCCGAACGGGGTTGTTTGTATATTCAACTGAAATAGCTGGAGGAACAGCTGACTTTTCGAATTTCGAATATCGCGTAATTAATCCTGATGAGAAACAATGA SEQ ID NO : 14 Paenibacillus xylanexedens >acetyl xylan esterase MYPNPIIWADYPDLDVIRVEDTYYMVSTTMHMMPGCVILRSYDLIHWEVATYVYDTLDDTPAQRLVDGHHVYSKGMWAASLRYHQGMFYVIFVANDTRKTYLYTSPTISGVWKKQIVEGFYHDCSLFFDDDERAYLVYGNTEIYLTELNSDLSGPKPGGVHRLIVKDEQPHHLGYEGAHFYKINGKYIVFLIHITKASGRRTQAFYMADSLEDVFTGGEVFNDDMDYFNSGVAQGGIVDTPDGDWYAMLFQDHGAVGRVPVLVPLHFDQGKPIFVNKAPKQIDIPSTRPEHRYNPLVGSDSFNYEPEEDGSIRLRDFWQWNHTPNHELWSVTEKSGVYRVRTGQISPNLTFAVNTLTQRSMGPACEAIVTLDGSRLNDGDYAGLCFLIGSYGMIALTKQDSKFYLVMHARDSEDSTIFGNLIDQKPATEHERIPVSDPVVKLKAFGNFENNLDECSFAYFDGVEWRDIGIVHKMIYKLDHFMGCRTGLFVYSTEIAGGTADFSNFEYRVINPDEKQ SEQ ID NO :15 Pleurotus eryngii ADG01835.1 >Laccase ATGTTTCCAGGCGCACGGATTCTCGCTACGCTTACATTAGCTCTTCACCTTTTACATGGCACTCATGCTGCCATCGGGCCCATTGCCGACATGTACATCGTCAACGAGGACGTCTCTCCTGACGGCTTCGCTCGTTCGGCTGTCGTCGCTCGCTCTGTGCCGGCCACAGATCCGACGCCTGCGTCGGTATCGGTTCCTGGCGTCCTCGTGCAAGGAAACAAGGGCGATAACTTTCAGCTGAACGTTCGCAATCAACTGTCGGACTCGACTATGTTGAAGACTACTAGTATCCATTGGCATGGCTTCTTTCAATCCGGCTCTACGTGGGCAGATGGACCCGCGTTCGTGAATCAGTGCCCCATCGCCCCGGGGAATAGCTTCCTATATGACTTTAACGTTCCCGACCAAGCTGGCACGTTCTGGTACCATTCGCATCTTTCCACCCAGTATTGTGATGGTCTTAGAGGACCATTCGTAGTATACGATCCCTCCGATCCCCACCTGTCCTTATATGACGTTGACAACGCCGACACTGTCATTACACTTGAAGATTGGTACCACGTTGCGGCCCCTCAGGGTGCAGTGCTTCCTACTCCTGATAGCACGCTCATCAATGGTAAAGGTCGCTTCGCCGGGGGGCCGACTTCCCCTTTGGCTATCATCAACGTCGAAAGCAACAAGCGATATCGTTTCCGACTTATCTCGATGTCTTGCGACCCCAATTTCACGTTCTCAATCGACGGTCACTCTTTGCAGGTCATTGAAGCAGATGCTGTCAATATTGTGCCCATCGTCGTGGATAGTATTCAAATCTTCGCGGGCCAACGCTATTCTTTCGTCCTGAATGCCAATCAGGCTGTTGACAATTATTGGATTCGCGCAAATCCCAACTTGGGATCGACTGGCTTCGAAGGTGGCATTAATTCCGCTATCCTTCGGTATGCTGGTGCCACTGAAAATGACCCTGCCACGACTTCGTCGACGAGCACTCCCCTTCTGGAGACTAATCTTGTGCCACTCGAAAATCCTGGTGCTCCTGGTCCAGCTGTCCCTGGAGGCGCAGACATCAACATCAATCTTGCTATGGGCTTCGACTTTACTAACTTTGAAATGACCATCAACGGTTCCCCCTTCAAAGCACCAACCGCTCCTGTTCTGCTCCAGATTCTGTCAGGTGCTACGCCTGCCGCTTCGCTTCTTCCTTCAGGTAGTATATACGCGCTAGAAGCCAACAAAGTTGTCGAAATCTCCATGCCCGCCTTAGCTGTCGGAGGACCGCATCCTTTCCATCTTCACGGACACACGTTCGACGTCATCAGGAGTGCGGGCTCTACTACGTATAACTTCGACACCCCTGCGCAACGCGATGTTGTCAACACTGGAATTGACGCGAACGACAACGTTACCATCCGCTTTGTGACGGATAATCCAGGCCCATGGTTCCTCCACTGCCACATTGACTGGCACCTCGAAATCGGTCTCGCGGTCGTTTTCGCCGAAGATGTGGCGTCCATCAAGGCCCCGCCTGCCGCGTGGGACGACTTGTGTCCGATTTATGATGCTTTGAGCGATTCCGACAGAGGTGGCATAGCTTAG SEQ ID NO :16 Pleurotus eryngii >laccase Pleurotus eryngii MFPGARILATLTLALHLLHGTHAAIGPIADMYIVNEDVSPDGFARSAVVARSVPATDPTPASVSVPGVLVQGNKGDNFQLNVRNQLSDSTMLKTTSIHWHGFFQSGSTWADGPAFVNQCPIAPGNSFLYDFNVPDQAGTFWYHSHLSTQYCDGLRGPFVVYDPSDPHLSLYDVDNADTVITLEDWYHVAAPQGAVLPTPDSTLINGKGRFAGGPTSPLAIINVESNKRYRFRLISMSCDPNFTFSIDGHSLQVIEADAVNIVPIVVDSIQIFAGQRYSFVLNANQAVDNYWIRANPNLGSTGFEGGINSAILRYAGATENDPATTSSTSTPLLETNLVPLENPGAPGPAVPGGADININLAMGFDFTNFEMTINGSPFKAPTAPVLLQILSGATPAASLLPSGSIYALEANKVVEISMPALAVGGPHPFHLHGHTFDVIRSAGSTTYNFDTPAQRDVVNTGIDANDNVTIRFVTDNPGPWFLHCHIDWHLEIGLAVVFAEDVASIKAPPAAWDDLCPIYDALSDSDRGGIA SEQ ID NO :17 Pseudomonas putida KT2440 >PP_3248 ATGCCGTTCCAGCAAGGTCTGCTTGCCACCCCGGTGCCGGCCCACGCCCGTCACCTGTTCTTCACCCTGCAGTCGCCCGAGGCGTTGCCTGCCGCGCTGGATGCCTTGCTGCCGCAGGTCGATGGCAAACAGTTGCTGCTGGGCGTAGGCGCCCCCTTGGCCAAGGCCCTGGGCCGGGAAATACCAGGCCTGCGCCCGTTCCCGCTACTGGATGCCGCGGTTGAGAACCCCAGCACCCAACACGCCCTGTGGCTGTGGCTGCGTGGCGACGAACGTGGCGACCTGCTGCTGCGCACCCAGGCCCTGGAGCAGGCGCTGGCACCCGCCCTGAGCCTGGCCGACAGCGTTGATGGCTTCCTGCACCGGGGCGGCCATGACCTTACCGGTTATGAAGACGGCACCGAAAACCCGACAGACGAAGAGGCGGTGCAAGCGGCCATTGCCGCAGATGGCTCCAGCTTTGCCGCGTTCCAGCTGTGGAAGCACGACCTGCAATACTTCAAGTCGCTGCCCCAGGCAGACCAGGACAACATCATCGGCCGTCGCTTGAGCGATAACGAAGAACTCGACGACGCCCCCGCGTCCGCGCACGTCAAGCGCACCGCCCAGGAAAGCTTTGAACCCGAGGCGTTCATGGTCCGTCGCTCGGTATCCTGGGCCGACCAACGCGGCGCCGGCCTGGCTTTCGTCGCCCTGGGCAAGAGTTTCGAGGCATTCGAGGTGCAGCTGCGGCGCATGAGTGGCCTGGAAGACGGCATCATCGACGGGCTGTACCGCTTCAGCCGCCCGCTGACGGGGGGCTACTACTGGTGCCCGCCAATGAGCGAGACGGGTGTCGATCTAAGCCCCTTGCTGCGGGCCTGA SEQ ID NO :18 Pseudomonas putida KT2440 >Dyp-type peroxidase family protein MPFQQGLLATPVPAHARHLFFTLQSPEALPAALDALLPQVDGKQLLLGVGAPLAKALGREIPGLRPFPLLDAAVENPSTQHALWLWLRGDERGDLLLRTQALEQALAPALSLADSVDGFLHRGGHDLTGYEDGTENPTDEEAVQAAIAADGSSFAAFQLWKHDLQYFKSLPQADQDNIIGRRLSDNEELDDAPASAHVKRTAQESFEPEAFMVRRSVSWADQRGAGLAFVALGKSFEAFEVQLRRMSGLEDGIIDGLYRFSRPLTGGYYWCPPMSETGVDLSPLLRA SEQ ID NO :19 Pseudomonas putida KT2440 >PP_3249 ATGTACGCACGTCGTGAAGTCCTACGCGCAGGTGCAACATTGGGATTGCTGGCCGCCGCCAGCCCTTGGCTGCACGCTGCCGCGCCGGCGGGTTTGCTTGCGCGCAAAGTCCCGTCCACCGGTGAAGCGTTGCCGGTGATCGGTGCCGGTACTTCGGGCAGTTTCGAGGTAGAAAACGGTTCGCCCCAGTACCTTCAGCTCAAAACGGTGCTCAAGGCATTTTTCGAAGGCGGCGGCCGGGTGATCGACACCTCGCCCAACTACGGGGGCGCCGACAGCATTCTCGGCCAGTTGCTGGAAGAGGGCGGCTGGCACCGCCAGTGCTTCCTGGCCACCAAGATCGCCGCCAATAGCCGGGCTGAAGCCCAAGCGCAGTGGGCCGGCAGCCTCAAGAGCCTGCGCACCGACAAGGTCGACTTGCTGCAGATTCACAACCTGCGTGACTGGCAGACGCAGCTGCCTTATGCCCGCGAGCTGAAGCAGCAGGGCGGGACACGTTATGTCGGCATCACCCATTACCTGAACAGTGGCCACGACGAAGTCGCCCGTATCGTGCGCAGCGAGCCGCTGGACTTCATCCAGATCAACTACTCGGTCAATGCGCCGGACGCTGCCCGGGAACTGCTGCCGCTGTGCCAGGACAAGGGCGTTGCGGTGTTGATCAATCGGGCCTTCGACGATGGCCGGCTGTTCGCCCGGGTCAAAGGCCAGGCCTTGCCGGGCTGGGCCGCCGAAGCAGGCATCGGCAGCTGGGCACAGCTGTTTCTCAAGTTCGCCATCAGCCACCCGGCAGTGACCACGGTCATACCCGCTACCAGTCGGCCTGACCGCCAGCTCGATCAGCTCAAGGCCGGGCATGAGCCAATGCTCACCCAAGCGCAGCAACAGGCGCTGATCACA CAGTTTGCCTGA SEQ ID NO :20 Pseudomonas putida KT2440>putative oxidoreductase MYARREVLRAGATLGLLAAASPWLHAAAPAGLLARKVPSTGEALPVIGAGTSGSFEVENGSPQYLQLKTVLKAFFEGGGRVIDTSPNYGGADSILGQLLEEGGWHRQCFLATKIAANSRAEAQAQWAGSLKSLRTDKVDLLQIHNLRDWQTQLPYARELKQQGGTRYVGITHYLNSGHDEVARIVRSEPLDFIQINYSVNAPDAARELLPLCQDKGVAVLINRAFDDGRLFARVKGQALPGWAAEAGIGSWAQLFLKFAISHPAVTTVIPATSRPDRQLDQLKAGHEPMLTQAQQQALITQFA SEQ ID NO :21 Pleurotus eryngii ADD14021.1>AAO ATGTCGTTTGGTGCACTTCGTCAACTTCTTTTGATCGCTTGCTTGGCTCTGCCATCACTGGCGGCCACTAACCTCCCAACCGCCGATTTTGACTACGTTGTCGTCGGGGCGGGGAACGCGGGGAACGTTGTCGCTGCACGACTCACAGAGGATCCCGACGTGTCCGTCTTGGTCCTAGAGGCGGGTGTATCAGATGAGAATGTATTAGGGGCAGAGGCTCCACTCCTTGCGCCCGGGCTTGTTCCTAACTCTATCTTCGACTGGAATTACACGACAACAGCTCAAGCTGGGTATAATGGTCGGTCAATTGCGTATCCTCGCGGCCGTATGCTAGGGGGGTCTAGCTCTGTTCACTACATGGTCATGATGCGTGGATCAACAGAGGATTTCGATCGCTATGCGGCTGTCACTGGCGATGAAGGATGGAACTGGGACAATATCCAGCAGTTCGTCGGGAAGAACGAAATGGTCGTGCCTCCCGCTGACAACCATAATACCTCCGGCGAATTTATTCCAGCGGTACATGGGACTAATGGCTCCGTCTCCATTAGCTTGCCAGGCTTCCCTACCCCCCTTGATGATCGCGTCTTGGCCACGACGCAAGAGCAAAGCGAAGAGTTCTTCTTCAATCCCGACATGGGGACAGGTCATCCCCTCGGAATAAGTTGGTCAATCGCATCAGTCGGCAACGGCCAACGTAGCAGCTCTTCGACTGCCTACTTACGGCCTGCCCAGTCACGGCCCAATCTCAGCGTGTTGATTAATGCCCAAGTAACTAAGCTCGTCAACAGCGGCATAACAAATGGCCTACCTGCGTTCCGGTGTGTAGAGTACGCAGAGCAAGAAGGAGCACCAACAACGACTGTTTGTGCTAAGAAAGAAGTTGTTCTTTCGGCGGGATCCGTTGGCACCCCCATTCTCCTGCAACTATCAGGCATCGGCGACGAGAATGACCTATCATCTGTTGGTATCGATACCATCGTTAACAATCCTAGCGTAGGCCGAAACCTGTCCGACCATTTGCTCCTTCCTGCTGCCTTCTTCGTCAACAGCAACCAAACATTCGATAACATCTTCAGAAACTCGTCCGAGTTCAACGCTGATTTAGATCAGTGGACAAACACTAGAACCGGTCCTCTCACCGCGCTCATTGCTAACCACTTGGCCTGGCTGAGGTTGCCATCGAATTCAAGCATCTTCCAAACCTTCCCAGACCCAGCTGCGGGCCCCAACTCTGCTCATTGGGAGACCATCTTTTCCAACCAATGGTTCCACCCAGCTATCCCTCGCCCTGACACTGGCAGCTTTATGAGCGTTACAAACGCGTTGATTTCTCCTGTAGCTCGCGGAGACATCAAGCTTGCTACATCCAACCCATTCGACAAGCCGCTCATCAATCCGCAGTATCTCTCAACGGAATTCGACATCTTCACCATGATCCAAGCCGTCAAATCCAACCTTCGTTTCCTCTCTGGTCAAGCGTGGGCGGACTTCGTTATACGCCCATTTGATCCTCGTTTGAGAGACCCGACGAACGATGCTGCTATCGAGTCGTACATTAGAGACAACGCCAACACGATTTTCCACCCAGTTGGAACGGCCAGCATGTCCCCGCGCGGAGCTTCTTGGGGCGTCGTAGATCCCGATCTCAAAGTCAAAGGTGTGGATGGCCTCAGAATCGTCGATGGGTCTATTTTGCCCTTCGCGCCCAACGCACATACCCAAGGACCGATATACCTTGTAGGCGAGCGAGGAGCCGATCTTATCAAGGCTGATCAGTAG SEQ ID NO :22 : Pleurotus eryngii > aryl-alcohol oxidase MSFGALRQLLLIACLALPSLAATNLPTADFDYVVVGAGNAGNVVAARLTEDPDVSVLVLEAGVSDENVLGAEAPLLAPGLVPNSIFDWNYTTTAQAGYNGRSIAYPRGRMLGGSSSVHYMVMMRGSTEDFDRYAAVTGDEGWNWDNIQQFVGKNEMVVPPADNHNTSGEFIPAVHGTNGSVSISLPGFPTPLDDRVLATTQEQSEEFFFNPDMGTGHPLGISWSIASVGNGQRSSSSTAYLRPAQSRPNLSVLINAQVTKLVNSGITNGLPAFRCVEYAEQEGAPTTTVCAKKEVVLSAGSVGTPILLQLSGIGDENDLSSVGIDTIVNNPSVGRNLSDHLLLPAAFFVNSNQTFDNIFRNSSEFNADLDQWTNTRTGPLTALIANHLAWLRLPSNSSIFQTFPDPAAGPNSAHWETIFSNQWFHPAIPRPDTGSFMSVTNALISPVARGDIKLATSNPFDKPLINPQYLSTEFDIFTMIQAVKSNLRFLSGQAWADFVIRPFDPRLRDPTNDAAIESYIRDNANTIFHPVGTASMSPRGASWGVVDPDLKVKGVDGLRIVDGSILPFAPNAHTQGPIYLVGERGADLIKADQ SEQ ID NO :23 : Phanerochaete chrysosporium - glyoxal oxidase precursor > glx1 ATGTTGTCGCTGCTAGCCGTAGTCTCACTCGCCGCCGCCACACTCGCTGCTCCAGCTGCCAGCGATGCACCAGGCGGCGGTTCGACCTGAAGCCCAACCTTTCCGGGATCGTGGCTCTCGAGGCGATCGTCGTGAACAGCTCACTGGTGGCATATTCGACCGCGCCACCGGCGATCAGCCTCTCAAGATCAACGGCGAATCGACCTGGGGTGCGCTCTGGGATCTGATACGAGCACTGTCCGCCCGCTTTCGGTCCTGACGGACTCCTTCTGCGCCAGCGGTGCGCTGCTCAGCAATGGCACTATGGTCAGCATGGGAGGAACCCCTGGCGGTACTGGAGGGGATGTTGCTGCTCCTCCTGGCAACCAGGCGATCCGGATCTTCGAGCCCTGCGCCTCGCCTTCGGGAGATGGCTGCACGCTCTTCGAAGACCCTGCGACTGTTCATCTCCTTGAGGAGCGGTGGTACCCATCGTCCGTGCGCATTTTCGATGGCAGTCTCATGATCATTGGTGGTTCGCATGTCCTCACACCGTTCTACAACGTCGATCCAGCCAACTCCTTCGAGTTCTTCCCAAGCAAGGAGCAGACGCCCAGGCCTTCAGCCTTCTTGGAACGCTCGCTGCCAGCGAATCTTTTCCCACGGGCTTTCGCCTTGCCAGACGGAACCGTCTTTATCGTCGCTAATAACCAGTCTATCATCTACGATATCGAGAAGAATACTGAGACCATCCTCCCGGATATCCCCAACGGTGTTCGTGTCACGAACCCCATCGATGGAAGCGCCATCCTTCTCCCGTTGTCGCCCCCTGACTTCATTCCCGAGGTTCTCGTCTGTGGAGGCTCGACTGCGGACACCTCGCTCCCGTCCACCAGCTTGTCCTCCCAACATCCCGCTACCAGCCAATGCAGCCGGATCAAGCTCACCCCCGAAGGTATCAAGGCCGGCTGGCAGGTCGAACATATGCTTGAGGCGCGCATGATGCCTGAGCTCGTGCACGTCCCGAACGGCCAGATCCTCATCACCAACGGCGCTGGTACAGGCTTTGCCGCACTGTCTGCCGTCGCGGACCCCGTCGGCAACTCGAACGCGGACCACCCCGTGCTCACACCTTCGCTCTACACGCCCGACGCACCTCTTGGAAAGCGCATCAGCAACGCGGGCATGCCGACGACGACGATTCCGCGCATGTACCACTCGACCGTGACGCTCACGCAGCAGGGCAACTTCTTCATCGGGGGCAACAACCCGAACATGAACTTCACGCCGCCTGGCACACCCGGGATCAAGTTCCCCAGCGAGCTGCGCATCGAGACCCTCGACCCGCCGTTCATGTTCAGGAGCCGCCCCGCGCTTCTCACGATGCCTGAGAAGCTCAAGTTCGGCCAGAAGGTGACCGTGCCTATCACGATCCCGAGCGACCTGAAGGCGAGCAAGGTCCAAGTCGCCCTGATGGACCTCGGCTTTTCGAGCCACGCCTTCCACTCCAGTGCGCGCCTCGTCTTCATGGAGTCGTCCATCTCGGCGGACCGCAAGTCGCTCACCTTCACGGCTCCGCCCAACGGACGCGTCTTCCCACCGGGCCCGGCTGTCGTTTTCCTCACGATTGACGACGTGACAAGTCCGGGAGAGAGAGTCATGATGGGCAGTGGCAACCCTCCGCCGACCCTGGAGTAA SEQ ID NO :24 > GLOX_PHACH MLSLLAVVSLAAATLAAPAASDAPGWRFDLKPNLSGIVALEAIVVNSSLVVIFDRATGDQPLKINGESTWGALWDLDTSTVRPLSVLTDSFCASGALLSNGTMVSMGGTPGGTGGDVAAPPGNQAIRIFEPCASPSGDGCTLFEDPATVHLLEERWYPSSVRIFDGSLMIIGGSHVLTPFYNVDPANSFEFFPSKEQTPRPSAFLERSLPANLFPRAFALPDGTVFIVANNQSIIYDIEKNTETILPDIPNGVRVTNPIDGSAILLPLSPPDFIPEVLVCGGSTADTSLPSTSLSSQHPATSQCSRIKLTPEGIKAGWQVEHMLEARMMPELVHVPNGQILITNGAGTGFAALSAVADPVGNSNADHPVLTPSLYTPDAPLGKRISNAGMPTTTIPRMYHSTVTLTQQGNFFIGGNNPNMNFTPPGTPGIKFPSELRIETLDPPFMFRSRPALLTMPEKLKFGQKVTVPITIPSDLKASKVQVALMDLGFSSHAFHSSARLVFMESSISADRKSLTFTAPPNGRVFPPGPAVVFLTIDDVTSPGERVMMGSGNPPPTLE À toute fin utile, le(s) élément(s) non-brevet(s) suivant(s) est (sont) cité(s) : - nplcit1 : Beckham, G. T., Johnson, C. W., Karp, E. M., Salvachúa, D. & Vardon, D. R. Opportunities and challenges in biological lignin valorization. Current Opinion in Biotechnology 42 , 40–53 (2016). - nplcit2 : Bugg, T. D. H., Ahmad, M., Hardiman, E. M. & Singh, R. The emerging role for bacteria in lignin degradation and bio-product formation. Curr . Opin . Biotechnol . 22 , 394–400 (2011). - nplcit3 : de Gonzalo, G., Colpa, D. I., Habib, M. H. M. & Fraaije, M. W. Bacterial enzymes involved in lignin degradation. J. Biotechnol . 236 , 110–119 (2016). - nplcit4 : Ravi, K., García-Hidalgo, J., Gorwa-Grauslund, M. F. & Lidén, G. Conversion of lignin model compounds by Pseudomonas putida KT2440 and isolates from compost. Appl Microbiol Biotechnol 101 , 5059–5070 (2017). - nplcit5 : Linger, J. G. et al. Lignin valorization through integrated biological funneling and chemical catalysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 , 12013–12018 (2014). - nplcit6 : Johnson, C. W. & Beckham, G. T. Aromatic catabolic pathway selection for optimal production of pyruvate and lactate from lignin. Metabolic Engineering 28 , 240–247 (2015). - nplcit7 : Salvachúa, D., Karp, E. M., Nimlos, C. T., Vardon, D. R. & Beckham, G. T. Towards lignin consolidated bioprocessing: simultaneous lignin depolymerization and product generation by bacteria. Green Chem. 17 , 4951–4967 (2015). - nplcit8 : Mahanta, N., Gupta, A. & Khare, S. K. Production of protease and lipase by solvent tolerant Pseudomonas aeruginosa PseA in solid-state fermentation using Jatropha curcas seed cake as substrate. Bioresour . Technol. 99 , 1729–1735 (2008). - nplcit9 : El-Bessoumy, A. A., Sarhan, M. & Mansour, J. Production, isolation, and purification of L-asparaginase from Pseudomonas aeruginosa 50071 using solid-state fermentation. J. Biochem . Mol. Biol. 37 , 387–393 (2004). - nplcit10 : Faisal, P. A. et al. Optimization of Parameters for the Production of Lipase from Pseudomonas sp. BUP6 by Solid State Fermentation. Advances in Enzyme Research 02 , 125 (2014). - nplcit11 : Rudakiya, D. & Bande, P. Comparative Production of Different Amino Acids by Pseudomonas Boreopolis MD-4 . 2 , (2013). - nplcit12 : Narendrakumar, G. Production, characterization, and optimization of rhamnolipids produced by Pseudomonas aeruginosa by solid-state fermentation. International Journal of Green Pharmacy (IJGP) 11 , (2017). - nplcit13 : Ziayoddin. Agarase Production by Pseudomonas aeruginosa ZSL-2 in Solid-State Fermentation. Research & Reviews in BioSciences 4 , (2016). - nplcit14 : Vijayaraghavan, P., Saranya, S. & Prakash Vincent, S. G. Cow Dung Substrate for the Potential Production of Alkaline Proteases by Pseudomonas putida Strain AT in Solid-State Fermentation. Chinese Journal of Biology (2014). doi:10.1155/2014/217434 - nplcit15 : Koyani, R. D. & Rajput, K. S. Solid State Fermentation: Comprehensive Tool for Utilization of Lignocellulosic through Biotechnology. Journal of Bioprocessing & Biotechniques 5 , (2015). Souche de Pseudomonas putida génétiquement modifiée, comprenant plusieurs gènes recombinants choisis parmi - les gènes exprimant les enzymes permettant la dégradation de la lignine, par exemple les laccases, les péroxidases, les oxydoréductases, les aryl-alcool oxidase et/ou les glyoxal oxidases, ; - les gènes exprimant les enzymes permettant la dégradation de la cellulose, par exemple les endoglucanases, les exoglucanases et/ou les β-glucosidases, ; - les gènes exprimant les enzymes permettant la dégradation de l’hémicellulose, par exemple les endoxylanases, les endo-β1,4-xylanases, les β-xylosidases, et/ou les α-xylosidases. Souche de Pseudomonas putida génétiquement modifiée selon la revendication 1, comprenant les gènes recombinants exprimant les enzymes permettant la dégradation de la lignine, ces enzymes étant choisies de préférence parmi les laccases, les péroxidases, les oxydoréductases, les aryl-alcool oxidase et/ou les glyoxal oxidases, en particulier les gènes recombinants comprenant les séquences d’acides nucléiques SEQ ID NO :15, 17, 19, 21, et/ou 23. Souche de Pseudomonas putida génétiquement modifiée selon la revendication 1 ou 2, comprenant les gènes recombinants exprimant les enzymes permettant la dégradation de la cellulose, ces enzymes étant choisies de préférence parmi les endoglucanases, les exoglucanases et les β-glucosidases, en particulier les gènes recombinants comprenant les séquences d’acides nucléiques SEQ ID NO :1, 3 et 5. Souche de Pseudomonas putida génétiquement modifiée comprenant les gènes recombinants exprimant les enzymes permettant la dégradation de l’hémicellulose, ces enzymes étant choisies de préférence parmi les endoxylanases, les endo-β1,4-xylanases, les β-xylosidases, et/ou les α-xylosidases, en particulier les gènes recombinants comprenant les séquences d’acides nucléiques SEQ ID NO :7, 9 et/ou 11. Utilisation d’une souche de Pseudomonas putida selon l’une des revendications 1 à 4, dans un procédé de fermentation avec comme source de carbone principale le bois à l’état solide, par exemple du bois de feuillus, en particulier du bois de chêne ou de hêtre. Procédé de fermentation d’une bactérie comprenant une étape de culture d’une bactérie dans un milieu de fermentation comprenant du bois à l’état solide comme source de carbone principale, par exemple des copeaux de bois, caractérisé en ce que ladite bactérie est choisie parmi des souches génétiquement modifiées de Pseudomonas putida telles que définies à l’une des revendications 1 à 4. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le bois est choisi parmi le bois de feuillus, par exemple le bois de chêne ou de hêtre. Procédé selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce que le bois est autoclavé ou non-autoclavé avant son utilisation. Procédé de biosynthèse d’une molécule d’intérêt, comprenant (i) la fermentation d’une souche génétiquement modifiée de Pseudomonas putida comme décrit à l’une des revendications 1 à 4, dans des conditions permettant la biosynthèse de ladite molécule d’intérêt, ladite souche génétiquement modifiée de Pseudomonas putida comprenant un ou plusieurs gènes recombinants impliqués dans la voie de biosynthèse de ladite molécule d’intérêt, et (ii) le cas échéant la purification de ladite molécule d’intérêt.