Brevet FR3106414A1 — publié le 20210723

La présente invention concerne un procédé d’identification et de caractérisation d’au moins une population microbienne présente dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes : a) isolement des microorganismes puis scission des protéines microbiennes en un « mélange peptidique » contenant une pluralité de peptides; b) détection au sein de ce mélange peptidique d’au moins un peptide dit « nœud », cette étape de détection numérotée (i) étant mise en œuvre par spectrométrie de masse ciblée, réalisée sur un spectromètre de masse, combinée à une étape de séparation des peptides, i étant un nombre entier supérieur ou égal à 1, c) détection au sein de ce mélange peptidique d’au moins un autre peptide lors d’une étape de détection (i+1), cette étape étant mise en œuvre avec le même spectromètre de masse que celui utilisé à l’étape (i); lesdits peptides étant spécifiques d’un genre et/ou d’une espèce microbienne, ou d’un mécanisme de résistance aux antibiotiques et/ou d’un mécanisme de virulence et/ou d’un niveau de virulence, et lesdits peptides étant classifiés comme faisant partie d’un ou de groupes de peptides prédéfinis, chaque groupe prédéfini comprenant un ou des peptides dit « nœud(s) » et/ou un ou des peptides dits « rapporteur(s) », ledit procédé étant caractérisé en ce que, lors d’une étape de détection (i), l’identification d’au moins un peptide nœud membre du groupe prédéfini (i) oriente la sélection du ou des groupe(s) prédéfini(s) (i+1) comprenant les peptides qui seront recherchés lors de l’étape de détection (i+1). Figure pour l’abrégé : Fig. 7 Procédé d’identification et de caractérisation d’une population microbienne par spectrométrie de masse DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne le domaine de la microbiologie. Plus précisément, l’invention concerne un procédé d’identification et de caractérisation d’au moins une population microbienne issue d’un échantillon biologique, mettant en oeuvre la technologie de spectrométrie de masse ciblée et une méthode d’acquisition de données en arbre décisionnel. L’identification et la caractérisation des microorganismes est fondamentale tant dans le domaine clinique que le domaine industriel. Dans le domaine industriel, il est nécessaire de tester les denrées consommables comme les aliments, boissons ou produits d’hygiène, pour détecter la présence éventuelle d’une contamination par des microorganismes. Dans le domaine clinique, il est notamment important d’identifier avec rapidité et précision les pathogènes microbiens présents dans un échantillon biologique, et également de déterminer leur profil de résistance aux antibiotiques et leur niveau de virulence. D'origine communautaire ou nosocomiale, les infections du système sanguin (ISB) résultant de bactériémies ou de fongémies (respectivement 98 % et 2 %) totalisent près de 2 millions de cas en Europe et en Amérique du Nord, soit une estimation de 200 000 à 350 000 décès par an (taux de mortalité à court terme entre 13 et 20%). L'administration tardive d'agents antimicrobiens actifs à des patients en état de choc septique est étroitement associée à une diminution de la survie : une diminution de 7,5 % de survie par heure tardive a été estimée en moyenne. Pour guider le choix du traitement par les médecins, l'identification précise et opportune, le profilage de la résistance aux antibiotiques du ou des pathogènes et, idéalement, le niveau de virulence, sont des données essentielles qui doivent être connues dans les meilleurs délais. ETAT DE LA TECHNIQUE Dès qu’une infection du système sanguin est suspectée, les professionnels de santé cherchent à obtenir, dans les meilleurs délais, des données sur (i) l’identification de la ou des souches microbiennes présentes dans un échantillon biologique ; et (ii) les propriétés de résistance aux antibiotiques et/ou la virulence du/des microorganisme(s) pathogène(s) impliqué(s). Ces deux aspects peuvent être traités séparément, ou par des techniques combinées. Identification d’une souche microbienne La spectrométrie de masse de type MALDI-TOF (acronyme de l’anglais Matrix Assisted Laser Desorption Ionization – Time Of Flight) permet d’identifier différentes espèces microbiennes de manière bien plus rapide qu’avec les tests biochimiques traditionnels. Cette méthode dite « d’empreintes massiques » associe l’acquisition d’un spectre de masse à partir d’une colonie de microorganismes traitée avec une solution saturée d’acide alpha cyano hydroxycinnamique (HCCA) en solvant organique, et l’interprétation donnée par un logiciel expert, par comparaison du spectre obtenu avec des spectres contenus dans une base de données. L’utilisation de cette technologie est toutefois limitée aux échantillons de complexité modérée, présentant un nombre limité de souches microbiennes. Une autre technologie d’identification dite « bottom-up » permet d’identifier des bactéries à partir de spectres de fragmentation de peptides, et de l’utilisation de bases de données ; une autre technologie, plus anecdotique, est dite « top down » et est basée sur l’analyse de spectres de fragmentation de protéines entières. Caractérisation des propriétés de résistance et/ou de virulence A ce jour, le choix de l'antibiothérapie reste encore largement déterminé par les tests de sensibilité aux antimicrobiens (AST), basés sur des méthodes de diffusion sur disque ou de microdilution, ajoutant donc un délai moyen de 24 heures après l'identification de la souche microbienne pour connaitre ces propriétés. Dans les situations critiques, il existe d’autres solutions pour une détermination plus rapide des déterminants de résistance. Celles-ci sont basées soit sur l’utilisation d’une biopuce ADN (Verigene), sur l'amplification des acides nucléiques (FilmArray/bioMérieux ; Xpert/Cepheid ; BDMax/Becton Dickinson ; Eazyplex/Amplex Diagnostics), sur les techniques combinées PCR et hybridation (Sepsis Flow Chip/Master Diagnostica) ou encore sur les tests colorimétriques et immunochromatographiques (Resist 4/Coris, NG Biotech Carba 5), ces dernières méthodes étant limitées à la détection des mécanismes de type carbapénemases, CTX-M et MCR-1. Toutefois, pour des raisons de coût, il est impensable d’utiliser ces techniques de biologie moléculaire très coûteuses pour une détection au-delà de 100 cibles. Par ailleurs, les caractérisations à partir d’ADN microbien sont susceptibles de générer des « faux positifs » liés à la détection de l’ADN de microorganismes résiduels, non actifs. D’autres approches basées sur la recherche de protéines ou peptides associés à des mécanismes de résistance aux antibiotiques ont été développées. Ces technologies sont classifiées en type « bottom-up » c’est-à-dire non ciblé (mode DDA), ou de type ciblé (mode MRM/PRM). Les méthodes non ciblées (DDA) présentent des inconvénients majeurs : instruments coûteux, échantillonnage stochastique qui ne garantit pas une détection exhaustive des molécules d’intérêt, processus de traitement des données complexes, gamme dynamique de détection faible sur des temps courts d’analyse ne permettant pas dans ce cas de détecter les molécules plus faiblement concentrées, instruments avec un vide poussé qui requiert un temps d’immobilisation important après maintenance. Parmi les méthodes de type ciblé (MRM, PRM), on peut citer notamment les demandes de brevet suivantes qui s’y rapportent : - La demande de brevet FR 2 951 548 déposée par BIOMERIEUX décrit un procédé de caractérisation d’un microorganisme, comprenant la détermination des propriétés de typage, des résistances potentielles à des antimicrobiens et du facteur de virulence, par spectrométrie de masse de type MS/MS, en utilisant des protéines ou peptides comme marqueurs desdites propriétés. Ces trois caractéristiques sont déterminées lors d’une même étape, dans le même appareil. Différents peptides spécifiques de propriétés de typage, de virulence ou d’identification sont décrits. - Cette demande FR 2951548 présente d’autres peptides, utiles pour la détection par spectrométrie de masse d’une résistance à la céphalosporine. La demande EP 2 702 407 décrit des peptides permettant de caractériser des microorganismes résistants au carbapénème. La demande FR 12 57489 décrit des peptides permettant de caractériser des microorganismes résistants aux glycopeptides. La demande FR 2 982 367 décrit un procédé d’identification de différents facteurs de virulence de Staphylococcus aureus . Ces documents sont uniquement relatifs à des méthodes de caractérisation (typage/résistance aux antimicrobiens/virulence) des populations microbiennes, et n’abordent pas la question de l’identification de ces microorganismes, qui doit donc être préalablement réalisée par des techniques classiques. Identification et caractérisation combinées Récemment, ACCELERATE DIAGNOSTICS a décrit une technique combinant au sein d’un unique automate une identification microbienne en 90 minutes, et une détermination de l'AST phénotypique en environ 7 heures, à partir de cultures sanguines positives avec son dispositif PhenoTest unique, basé sur des techniques de biologie moléculaire et d’observation de la croissance bactérienne. Les comparaisons publiées entre le PhenoTest et les technologies conventionnelles confirment sans équivoque un raccourcissement significatif du délai d'exécution pour le diagnostic des infections de la circulation sanguine, même si certaines divergences apparaissent concernant les AST des Enterobacteriaceae et P. aeruginosa , et le diagnostic des échantillons polymicrobiens. Néanmoins, bien que des améliorations soient encore attendues, le système PhenoTest présente deux limites intrinsèques majeures qui nuisent fortement à son adoption comme approche de routine pour le traitement des échantillons biologiques positifs : le coût élevé du test individuel, et le fait qu'un dispositif est monopolisé pendant 7 heures pour un unique patient. Ainsi, des méthodes combinées pour, à la fois, identifier des microorganismes et caractériser leurs propriétés spécifiques, sont activement recherchées, lesdites méthodes devant être à la fois rapides et peu coûteuses. La spectrométrie de masse ciblée de type MS/MS, basée sur la détection de protéines ou peptides comme marqueurs, répond à ces critères de rapidité et de faible coût. Les méthodes ciblées présentent en effet l’avantage d’être mises en oeuvre sur des instruments relativement peu onéreux, robustes, opérant à des vides peu poussés, présentant une gamme dynamique de détection étendue, et générant des données sous forme de chromatogrammes, facilement et rapidement analysables. L’inconvénient est que leur capacité de multiplexage (détection de 300 à 400 peptides au mieux) ne permet pas de couvrir l’ensemble des peptides qu’il faudrait théoriquement cibler pour simultanément identifier les microorganismes pathogènes susceptibles d’être retrouvées dans le sang d’un patient (notamment en cas de sepsis), ou tout autre prélèvement biologique, ainsi que les mécanismes de résistance aux antibiotiques, voire idéalement les facteurs de virulence qui participent au caractère pathogène du microorganisme. Les capacités de multiplexage pourraient, en théorie, être étendues en utilisant des fenêtres de détection programmées en temps de rétention. L’inconvénient majeur est alors que toute modification du temps de rétention peut induire l’absence de détection du composé du fait de son absence dans sa fenêtre de détection, ce qui induit alors un faux négatif. Ainsi, en l’état actuel des connaissances, la question se pose de savoir comment la spectrométrie de masse ciblée pourrait cribler les quelques milliers de peptides nécessaires à la détermination simultanée de l’identité et des propriétés de résistance et de virulence d’une souche microbienne, alors que ce nombre dépasse largement la capacité de multiplexage de tous les instruments existants. La spectrométrie de masse ciblée en tandem est une technologie adaptée à l'analyse sensible, spécifique et robuste de listes finies de protéines ou peptides. La capacité de cette technologie à caractériser les phénotypes de résistance aux antimicrobiens au niveau protéomique a ainsi été récemment documentée, comme cela est présenté ci-dessus. La présente invention concerne un procédé permettant à la fois d’identifier et de caractériser une population microbienne issue d’un échantillon biologique, par la détection de peptides spécifiques d’un genre et/ou d’une espèce microbienne, et/ou d’un mécanisme de résistance aux antibiotiques, et/ou d’un niveau de virulence microbienne, par spectrométrie de masse ciblé suivie d’une séparation chromatographique. Ce procédé consiste à mettre en œuvre en temps réel une acquisition adaptative, de type arbre décisionnel, afin de réaliser dès le début de l’analyse un filtrage qui va réduire le nombre de peptides à cibler, tant du point de vue du processus d’identification du microorganisme que de la caractérisation de l’antibiorésistance et de la virulence La figure 1 présente de manière schématique le principe du procédé selon l’invention. Lors de la première étape (i=1), la détection du signal d’un peptide nœud parmi un groupe de peptides prédéfini déclenche le monitoring d’un second groupe de peptides prédéfini (i=2) dans lequel est positionné un autre peptide nœud, dont la détection éventuelle déclenchera une recherche dans un nouveau groupe de peptides (i=3), et ainsi de suite jusqu’à couvrir l’ensemble des peptides d’intérêt nécessaires à l’identification du genre et de l’espèce microbienne, du mécanisme et du niveau de virulence dudit microorganisme, et à la caractérisation des mécanismes de résistance aux antibiotiques du microorganisme pathogène. Dans ce procédé, les peptides spécifiques d’une famille de microorganismes (par exemple les entérobactéries), d’un genre (par exemple les staphylocoques), et/ou d’une espèce (par exemple le staphylocoque doré), c’est-à-dire les peptides nécessaires à l’identification de la ou des souches microbiennes, sont membres du premier groupe prédéfini de peptides, et ont été choisis de manière à être élués dans les toutes premières minutes de la séparation chromatographique des peptides. Ainsi, la présente invention concerne un procédé d’identification et de caractérisation d’au moins une population microbienne présente dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes : a) isolement des microorganismes puis scission des protéines microbiennes en un « mélange peptidique » contenant une pluralité de peptides; b) détection au sein de ce mélange peptidique d’au moins un peptide dit « nœud », cette étape de détection numérotée (i) étant mise en œuvre par spectrométrie de masse ciblée, réalisée sur un spectromètre de masse, combinée à une étape de séparation des peptides, i étant un nombre entier de 1 à 10, c) détection au sein de ce mélange peptidique d’au moins un autre peptide lors d’une étape de détection (i+1), cette étape étant mise en œuvre avec le même spectromètre de masse que celui utilisé à l’étape (i); lesdits peptides étant spécifiques d’un genre et/ou d’une espèce microbienne, ou d’un mécanisme de résistance aux antibiotiques et/ou d’un mécanisme de virulence et/ou d’un niveau de virulence, et lesdits peptides étant classifiés comme faisant partie d’un ou de groupes de peptides prédéfinis, chaque groupe prédéfini comprenant un ou des peptides nœuds et/ou un ou des peptides dits « rapporteurs », ledit procédé étant caractérisé en ce que, lors d’une étape de détection (i), l’identification d’au moins un peptide noeud membre du groupe prédéfini (i) oriente la sélection du ou des groupe(s) prédéfini(s) (i+1) comprenant les peptides qui seront recherchés lors de l’étape de détection (i+1). La présente invention concerne également un spectromètre de masse, de préférence à triple quadrupôle, comprenant des moyens de traitement adaptés pour recevoir une donnée concernant le au moins un peptide nœud détecté à l’étape (i), et pour sélectionner, en fonction de ladite donnée, le ou les groupes de peptides prédéfini(s) (i+1) comprenant les peptides qui seront recherchés lors de la mise en œuvre de l’étape de détection (i+1). Avantageusement, le procédé de l’invention permet de déterminer l’identité et les propriétés de résistance aux antibiotiques et de virulence d’une population microbienne en un temps record d’une heure après réception d’un échantillon biologique positif (c’est-à-dire comprenant au moins une population microbienne). Un autre intérêt de cette technologie est le fait que tous les laboratoires hospitaliers sont déjà équipés d’un spectromètre de masse à triple quadrupôle, et seraient donc capables de mettre en œuvre le procédé de l’invention directement, sans nécessité d’acquérir des équipements supplémentaires. Ces équipements sont robustes et peuvent être utilisés sans avoir à recourir à des conditions particulières ; en particulier, les conditions de sous-pression nécessaires au fonctionnement de la technologie de spectrométrie de masse ciblée en tandem couplée à une chromatographie en phase liquide (LC-MS-MS) ne sont pas extrêmes. DESCRIPTION DES FIGURES La figure 1 représente schématiquement le principe de l’acquisition adaptative du procédé, où les peptides noeuds servent d'identificateurs précoces permettant de caractériser l'espèce ou la famille microbienne de la population de microorganismes présente dans l’échantillon (étape i=1), puis déclenchent la surveillance de certains peptides contenus dans des groupes prédéfinis de peptides (étapes i>1), pour préciser ou confirmer l'identité du microorganisme pathogène, ainsi que pour établir le profil des mécanismes de résistance antimicrobienne et la virulence dudit microorganisme. Le premier graphe en haut représente la séparation des peptides à l’étape i=1. Lors de cette étape, les peptides nœuds sont de préférence issus de protéines ribosomiques, et servent à identifier la population microbienne. Le deuxième graphe représente la séparation des peptides du groupe prédéfini N°2 à l’étape i=2. Le troisième graphe représente la séparation des peptides du groupe prédéfini N°3 à l’étape i=3. Lors des étapes numérotées 2 et 3, les peptides rapporteurs identifiés permettent de caractériser la population microbienne, en termes de résistance aux antibiotiques et virulence. La figure 2A représente le temps de rétention (exprimé en minutes) des peptides testés pour l’identification des Enterobacteriaceae : plus il est court, plus le peptide est élué rapidement lors de la chromatographie liquide. Les deux peptides élués en premier, vers 6 minutes, ont été choisis (marqués d’une étoile) pour être des peptides noeuds. La figure 2B représente le temps de rétention (exprimé en minutes) des peptides testés pour l’identification de l’espèce Staphylococcus aureus : plus il est court, plus le peptide est élué rapidement lors de la chromatographie liquide. Les deux peptides élués en premier, autour de 5 minutes, ont été choisis (marqués d’une étoile) pour être des peptides noeuds. La figure 2C représente le temps de rétention (exprimé en minutes) des peptides testés pour l’identification de l’espèce Pseudomonas aeruginosa : plus il est court, plus le peptide est élué rapidement lors de la chromatographie liquide. Les deux peptides élués en premier, entre 5 et 6 minutes, ont été choisis (marqués d’une étoile) pour être des peptides noeuds. La figure 2D représente le temps de rétention (exprimé en minutes) des peptides testés pour l’identification de l’espèce Acinetobacter baumannii : plus il est court, plus le peptide est élué rapidement lors de la chromatographie liquide. Les deux peptides élués en premier, entre 6 et 7 minutes, ont été choisis (marqués d’une étoile) pour être des peptides noeuds. La figure 2E représente le temps de rétention (exprimé en minutes) des peptides testés pour l’identification du genre Enterococcus : plus il est court, plus le peptide est élué rapidement lors de la chromatographie liquide. Les deux peptides élués en premier, entre 6 et 7 minutes, ont été choisis (marqués d’une étoile) pour être des peptides noeuds. Schéma de la temporalité des étapes du procédé : - préparation du culot de microorganismes à partir d’un échantillon d’hémoculture positive, - digestion enzymatique des protéines, - analyse par spectrométrie de masse ciblée pour permettre (1) l’identification et (2) la caractérisation de la résistance aux antibiotiques et de la virulence dudit microorganisme. Chromatogramme au cours du temps d’une population microbienne de A . baumannii , exprimant la protéine de résistance aux antibiotiques OXA23. Les peptides nœuds marqués d’une étoile sont élués lors de l’étape de chromatographie liquide en premier, puis les peptides de confirmation d’identification et enfin les peptides spécifiques des mécanismes de résistance. Chromatogramme au cours du temps d’une population microbienne de K. pneumoniae , exprimant la protéine de résistance aux antibiotiques NDM. Les peptides nœuds marqués d’une étoile sont élués en premier lors de l’étape de chromatographie liquide, puis les peptides de confirmation d’identification et enfin les peptides spécifiques des mécanismes de résistance. Chromatogramme au cours du temps d’une population microbienne de Citrobacter , exprimant la protéine de résistance aux antibiotiques OXA48. Les peptides nœuds marqués d’une étoile, les peptides de confirmation d’identification et les peptides spécifiques des mécanismes de résistance sont élués au fur et à mesure de l’étape de chromatographie liquide. Schéma de l’arbre décisionnel illustratif du procédé selon l’invention, sur la base des peptides listés dans les tableaux 1 à 12. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION La présente invention concerne un procédé d’identification et de caractérisation d’au moins une population microbienne issue d’un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes : a) isolement des microorganismes puis scission des protéines microbiennes en un « mélange peptidique » contenant une pluralité de peptides; b) détection au sein de ce mélange peptidique d’au moins un peptide dit « noeud », cette étape de détection numérotée (i) étant mise en œuvre par spectrométrie de masse ciblée, réalisée sur un spectromètre de masse, combinée à une étape de séparation des peptides, i étant un nombre entier de 1 à 10 c) détection au sein de ce mélange peptidique d’au moins un autre peptide lors d’une étape de détection (i+1), cette étape étant mise en œuvre avec le même spectromètre de masse que celui utilisé à l’étape (i); lesdits peptides étant spécifiques d’un genre et/ou d’une espèce microbienne, ou d’un mécanisme de résistance aux antibiotiques et/ou d’un mécanisme de virulence et/ou d’un niveau de virulence, et lesdits peptides étant classifiés comme faisant partie d’un ou de groupes de peptides prédéfinis, chaque groupe prédéfini comprenant un ou des peptides nœuds et/ou un ou des peptides dits « rapporteurs », ledit procédé étant caractérisé en ce que, lors d’une étape de détection (i), l’identification d’au moins un peptide noeud membre du groupe prédéfini (i) oriente la sélection du ou des groupe(s) prédéfini(s) (i+1) comprenant les peptides qui seront recherchés lors de l’étape de détection (i+1). Au sens de la présente invention, on entend par « population microbienne » une population de microorganismes unicellulaires tels que notamment des bactéries, des levures des champignons et des protozoaires. Selon une mise en œuvre du procédé, la population microbienne de l’échantillon biologique comprend des bactéries et/ou des levures et/ou des champignons et/ou des protozoaires. Il est entendu que dans l’échantillon biologique, pourront être présentes une ou plusieurs populations microbiennes différentes, le procédé permettant d’identifier les populations majoritaires dans l’échantillon. Les populations microbiennes identifiées pourront en particulier être des populations bactériennes des espèces suivantes : Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Klebsiella aerogenes, Raoultella ornithinolytica, Citrobacter freundii, Citrobacter koseri, Citrobacter braakii, Citrobacter youngae, Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium et Pseudomonas aeruginosa. Les différentes étapes du procédé sont présentées en détails ci-après. L’étape (a) consiste en un isolement des microorganismes de l’échantillon biologique, par exemple par centrifugation, puis par une étape de scission des protéines microbiennes, également désignée étape de fragmentation. Les protéines sont découpées en peptides, par tout procédé connu de l’Homme du métier. Il pourra s’agir d’un procédé enzymatique, chimique ou mécanique permettant d’obtenir un mélange peptidique à partir des protéines microbiennes. Selon une mise en œuvre préférée de l’invention, la scission des protéines sera effectuée par hydrolyse / digestion enzymatique, par exemple grâce à une protéase, et en particulier avec de la trypsine. De préférence, la digestion enzymatique aura lieu de préférence à une température comprise d’au moins 40°C, notamment à une température comprise entre 45°C et 55°C, et préférentiellement à une température de 50°C. L’étape (b) correspond à une étape de détection d’au moins un peptide dit « noeud », cette étape de détection étant mise en œuvre par spectrométrie de masse ciblée et étant donc réalisée sur un spectromètre de masse. La spectrométrie de masse est une technologie physique d'analyse permettant de détecter et d'identifier des molécules d’intérêt. Elle est également connue sous le nom de single reaction monitoring , ou multiple reaction monitoring , ou parellel reaction monitoring . Son principe réside dans la séparation en phase gazeuse de molécules chargées (ions) en fonction de leur rapport masse/charge (m/z). La spectrométrie de masse ciblée est une variante dans laquelle les molécules d’intérêt recherchées par cette technique d’analyse sont préalablement connues, et l’analyse sert à identifier leur présence ou non dans un échantillon. Les spectromètres de masse comportent : i) une source d'ionisation destinée à ioniser les molécules à analyser, c'est-à-dire à conférer une charge positive ou négative à ces molécules; ii) un analyseur de masse destiné à séparer les molécules ionisées en fonction de leur ratio masse sur charge (m /z) ; iii) un détecteur destiné à mesurer le signal produit soit directement par les ions moléculaires, soit par des ions produits à partir des ions moléculaires, comme détaillés ci-après. L'étape d'ionisation nécessaire pour la mise en œuvre d'une spectrométrie de masse peut être mise en œuvre par tout procédé connu de l'homme du métier. La source d'ionisation permet d'amener les molécules à doser sous un état gazeux et ionisé. Une source d'ionisation peut être utilisée soit en mode positif pour étudier les ions positifs, soit en mode négatif pour étudier les ions négatifs. Plusieurs types de sources existent et seront utilisés en fonction du résultat recherché et des molécules analysées. L'analyseur de masse dans lequel est mis en œuvre l'étape de séparation des marqueurs ionisés en fonction de leur rapport masse/charge (m/z) est tout analyseur de masse connu de l'homme du métier. On peut citer les analyseurs basse résolution, du type quadripôle ou quadrupôle (Q), piège à ions 3D (IT) ou linéaire (LIT), également appelés trappe ionique, et les analyseurs haute résolution, permettant de mesurer la masse exacte des analytes et qui utilisent notamment le secteur magnétique couplé à un secteur électrique, le temps de vol (TOF), l’orbitrap. La séparation des ions moléculaires en fonction de leur ratio m/z peut être mise en oeuvre une seule fois (spectrométrie de masse simple ou MS), ou bien plusieurs séparations MS successives peuvent être menées. Lorsque deux séparations MS successives sont réalisées, l'analyse est appelée MS/MS ou MS 2 . Lorsque trois séparations MS successives sont réalisées, l'analyse est appelée MS/MS/MS ou MS 3 . Parmi les techniques mettant en œuvre plusieurs séparations successives, les modes SRM (Selected Reaction Monitoring) en cas de détection ou dosage d'une seule molécule cible, ou bien MRM (Multiple Reaction Monitoring) en cas de détection ou dosage de plusieurs molécules cibles, sont des utilisations particulières de séparation MS 2 . De même le mode MRM 3 est une utilisation particulière de séparation en MS/MS/MS. On parle alors de spectrométrie de masse ciblée, qui est la technologie utilisée pour la mise en œuvre du procédé selon l’invention. Le principe du mode SRM, ou encore du mode MRM, est de sélectionner spécifiquement un ion précurseur, de le fragmenter, puis de sélectionner spécifiquement l'un de ses ions fragments. Pour de telles applications, des dispositifs du type triple quadripôle ou des hybrides triple quadripôle à trappe ionique sont généralement utilisés. Selon une mise en œuvre préférée du procédé selon l’invention, la méthode d’analyse utilisée est une spectrométrie ciblée de type Multiple Reaction Monitoring (MRM) déployée sur un spectromètre de masse à triple quadrupôle (TQMS), combinée à une chromatographie en phase liquide à haut débit. En effet, ce dispositif combiné est aujourd'hui largement disponible dans les hôpitaux, car déjà utilisé pour le dosage de médicaments immunosuppresseurs ou le diagnostic néonatal. De plus, un TQMS fonctionne dans une plage de vide plus faible que celle des instruments à haute résolution (10 -5 contre 10 -8 à 10 -10 Torr), ce qui permet de réduire les coûts de fabrication et, surtout, de raccourcir le temps d'arrêt après maintenance (5 heures au lieu de 18-24 heures pour un QTof d'instrument Orbitrap). L’étape de détection d’au moins un peptide comprend également une étape de séparation des peptides détectés, comme cela est illustré dans les chromatogrammes des figures 1, 4, 5 et 6. La séparation des peptides peut être réalisée par toute technique connue de l’Homme du métier, et en particulier peut être réalisée par chromatographie liquide en phase inverse, par chromatographie liquide en phase normale, par chromatographie liquide en phase hydrophile, ou par électrophorèse capillaire. De manière préférée, la séparation des peptides est réalisée par chromatographie liquide en phase inverse. Cette étape de détection d’au moins un peptide parmi un mélange peptidique, comprenant une spectrométrie de masse ciblée et une séparation des peptides, classiquement par chromatographie, est numérotée i, i étant un nombre entier égal ou supérieur à 1, de préférence compris entre 1 et 15, ou entre 1 à 10, les bornes des intervalles cités étant incluses dans lesdits intervalles. Le procédé selon l’invention est un procédé itératif qui comprend au moins deux étapes successives (i) et (i+1) de détection de peptide(s) par spectrométrie de masse ciblée combinée à une séparation des peptides, ces au moins deux étapes étant réalisées sur le même spectromètre de masse. Ainsi, l’étape (c) du procédé correspond à cette étape numéroté (i+1), réalisée sur le même spectromètre de masse que l’étape (i)/(b), avec la même technologie de séparation des peptides. Peptides rapporteurs et peptides noeuds Dans la présente invention, on distingue les peptides « dénommés « peptides nœuds» » et les peptides dénommés « peptides rapporteurs ». Au sens de la présente invention : Les peptides rapporteurs désignent des peptides détectés par spectrométrie de masse ciblée, qui sont spécifiques d’un genre ou d’une espèce microbienne, ou d’un mécanisme de résistance, et/ou d’un mécanisme de virulence, et/ou encore d’un niveau de virulence. La présence de l’un de ces peptides dans l’échantillon testé par le procédé de l’invention donne des informations sur la population microbienne présente au sein dudit échantillon. Toutefois, la détection de l’un de ces peptides rapporteurs n’oriente pas la sélection d’un ou des groupes prédéfinis de peptides qui seront recherchée à l’étape d’analyse suivante (i+1). Les peptides rapporteurs spécifiques d’un genre ou d’une espèce microbienne sont également désignés par l’appellation « peptides de confirmation d’identification », et leur désignation est indiquée en caractères italiques dans les tableaux 1 à 12. Certains groupes prédéfinis de peptides ne comprennent que des peptide rapporteurs : lors d’une étape de détection (i), aucun peptide nœud n’étant identifié, le procédé s’arrête et il n’y a pas d’étape (i+1). Les peptides nœuds désignent des peptides détectés par spectrométrie de masse ciblée, qui sont spécifiques d’un genre ou d’une espèce microbienne. L’identification d’un tel peptide nœud, dans une étape d’analyse (i), oriente la sélection du ou des groupes prédéfinis de peptides comprenant les peptides qui seront recherchés par spectrométrie de masse ciblée lors de l’étape (i+1). Dans la présente demande, l’expression « groupe prédéfini de peptides (i) » désigne le groupe prédéfini de peptides qui sont recherchés lors de l’étape (i). Le premier groupe de peptides, lors de l’étape i=1, comprend des peptides nœuds ainsi que des peptides rapporteurs qui, bien qu’apportant des informations sur la souche microbienne présente dans l’échantillon, ne permettent pas d’orienter les étapes ultérieures du procédé. Les peptides nœuds compris dans le groupe de peptides prédéfini de l’étape (i=1) sont spécifiques d’un genre et/ou d’une espèce microbienne, et apparaissent dans les premières minutes de la séparation des peptides. Comme cela est montré en figure 7, la détection de l’un de ces peptides nœuds permet de sélectionner le groupe prédéfini de peptides qui seront recherchés, par spectrométrie de masse ciblés, lors de l’étape i=2. Lors de l’étape où i=1, les peptides nœuds de l’unique groupe prédéfini (i=1) sont avantageusement choisis parmi des peptides issus de protéines ribosomales. En effet, les protéines ribosomales sont abondantes dans la cellule. Elles ont un niveau d’expression élevé, une concentration proportionnelle au nombre de cellules microbiennes qui en fait des normalisateurs internes pour la mesure de l’expression relative des autres protéines, et présentent des fréquences de mutation faible hormis certains points « chauds ». Parmi ces peptides ribosomaux, ont été retenus ceux qui présentent un rendement d’ionisation élevé, et qui sont séparés dans les premières minutes de l’étape de séparation des peptides (dans le cas d’une séparation par chromatographie, les peptides sont élués dans les premières minutes de la chromatographie). De préférence, les peptides nœuds du groupe prédéfini i=1 sont séparés dans les 20 premières minutes de l’étape de séparation, ou dans les 10 premières minutes, ou dans les 8 premières minutes, ou dans les 6 premières minutes, ou dans les 4 premières minutes, ou encore dans les 2 premières minutes de la séparation. En fonction de la technique de séparation peptidique choisie, les peptides nœuds du groupe prédéfini i=1 seront identifiés par l’Homme du métier parmi ceux étant séparés en premier lieu. Selon une mise en œuvre préférée de l’invention, les peptides nœuds du groupe de peptides prédéfini (i=1) sont recherchés dans le groupe prédéfini de peptides comprenant les peptides listés dans le tableau 1 suivant : Désignation Séquence peptidique Numéro de séquence OXA24. EGMSGSIR SEQ ID NO. 1 vanA. SGSSFGVK SEQ ID NO. 2 VIM. SVSTHFHDDR SEQ ID NO. 3 VIM. AVSTHFHDDR SEQ ID NO. 4 OXA10. NEHQVFK SEQ ID NO. 5 oprJ. NADIGAAR SEQ ID NO. 6 VEB. LIGGTDSVQK SEQ ID NO. 7 oprN. GQQPGVTEDR SEQ ID NO. 8 OprD. YVVQSGPAK SEQ ID NO. 9 OprM. DTLGTYQK SEQ ID NO. 10 mexD. VVIQAEQGNR SEQ ID NO. 11 oprJ. ALANSSNEALK SEQ ID NO. 12 OXA48. LHVSER SEQ ID NO. 13 SHV. QIGDNVTR SEQ ID NO. 14 KPC. AVTESLQK SEQ ID NO. 15 SHV. LSESQLSGR SEQ ID NO. 16 spa. LNESQAPK SEQ ID NO. 17 OXA51. ATTTEVFK SEQ ID NO. 18 OXA58. AGDDIALR SEQ ID NO. 19 OXA24. ATTNEIFK SEQ ID NO. 20 Chp. NSAQFEK SEQ ID NO. 21 citrobacter. AAITAEVR SEQ ID NO. 22 Noeud1-Enterococcus GYNSFK SEQ ID NO. 23 Noeud1'-Enterococcus. VSFDDEK SEQ ID NO. 24 Noeud1-Enterobacteriaceae VVMTADAVK SEQ ID NO. 25 Noeud1'-Enterobacteriaceae AQLQEIAQTK SEQ ID NO. 26 Noeud1-S aureus. VIDQSAEK SEQ ID NO. 27 Noeud1'-S. aureus IETTEAR SEQ ID NO. 28 Noeud-P. aeruginosa YNDAVIR SEQ ID NO. 29 Noeud-P. aeruginosa NMQAPEAVAAK SEQ ID NO. 30 Noeud1-A. baumannii TGEELQIK SEQ ID NO. 31 Noeud1'-A. baumannii LEEAGATVTLK SEQ ID NO. 32 Les peptides rapporteurs contenus dans ce groupe sont ceux présentant une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO. 1 à SEQ ID NO.22. Selon une mise en œuvre particulière du procédé de l’invention, les peptides nœuds du groupe de peptides prédéfini (i=1) sont choisis parmi les peptides présentant les séquences SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 26, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 28, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO. 31 et SEQ ID NO. 32. Selon une première mise en oeuvre, le groupe de peptides prédéfini (i=1) comprend au moins un peptide parmi les peptides présentant les séquences SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 26, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 28, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO. 31 et SEQ ID NO. 32. Selon une deuxième mise en oeuvre, le groupe de peptides prédéfini (i=1) comprend tous les peptides présentant les séquences SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 26, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 28, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO. 31 et SEQ ID NO. 32. Selon une troisième mise en oeuvre, le groupe de peptides prédéfini (i=1) comprend tous les peptides présentant les séquences SEQ ID NO. 1 à SEQ ID NO. 32, soit tous les peptides du tableau 1. Selon une quatrième mise en oeuvre, le groupe de peptides prédéfini (i=1) consiste en tous les peptides présentant les séquences SEQ ID NO. 1 à SEQ ID NO. 32, soit tous les peptides du tableau 1. Lors de la mise en place de cette première étape i=1, le but est d’identifier la ou les populations bactériennes présentes dans l’échantillon biologique. Lors des étapes i>1, le but est de confirmer l’identification et de caractériser la ou les population(s) microbienne(s) de l’échantillon. Les groupes de peptides prédéfinis utilisés aux étapes où i>1 sont constitués d’une combinaison de peptides rapporteurs, spécifiques d’un genre et/ou d’une espèce microbienne, d’un mécanisme de résistance aux antibiotiques et/ou d’un mécanisme de virulence et/ou d’un niveau de virulence, et optionnellement de peptides nœuds qui, s’ils sont détectés, orienteront la sélection des peptides recherchés lors de l’étape de détection suivante. Il est entendu que, lorsqu’un groupe prédéfini de peptides (i>1) ne comprend aucun peptide nœud, c’est-à-dire uniquement des peptides rapporteurs, alors le procédé s’arrête après la détection des peptides de ce groupe lors de l’étape (i), il n’y a donc pas dans ce cas d’étape (i+1). Les mécanismes de résistance aux antibiotiques sont bien connus de l’Homme du métier, et sont par exemple décrits dans les revues (Munita & Arias, 2016) et (Peterson & Kaur, 2018). On peut citer notamment les mécanismes de résistance liés à la présence de carbapénémases, de carbapénèmes, de beta-lactamases, de pompes d’efflux, de porines ou encore de MecA. Les tableaux ci-dessous présentent des groupes de peptides prédéfinis d’une étape (i>1), contenant des exemples de peptides nœuds qui permettent d’orienter la sélection du ou des groupes prédéfinis (i+1) dans lesquels d’autres peptides nœuds seront recherchés, lors d’une étape (i+1). Chaque groupe de peptide pour une étape où (i>1) est constitué d’une combinaison de peptides rapporteurs et optionnellement de peptides nœuds, tous ces peptides étant spécifiques uniquement du genre ou de l’espèce microbienne préalablement déterminée lors de l’étape i=1. Les tableaux 2 à 12 ci-dessous présentent des exemples de groupes prédéfinis de peptides pour les étapes de détection où i>1. L’enchainement des étapes du procédé est présenté de manière schématique en figure 7. Par exemple, lorsque à l’étape i=1 une souche microbienne du genre P. aeruginosa est identifiée grâce à la présence de deux peptides nœuds de séquence SEQ ID NO. 29 et 30, l’étape i=2 consistera en la recherche de peptides compris dans le tableau n°5 (groupe prédéfini de peptides); si au moins un peptide nœud de séquence SEQ ID NO. 127 ou 128 est détecté, alors une étape i=3 aura lieu, consistant en la détection de peptides compris dans le tableau n°8 ; si au moins un peptide nœud de séquence SEQ ID NO. 207 ou 208 est détecté, alors une étape i=4 aura lieu, consistant en la détection de peptides rapporteurs compris dans le tableau n°10. Groupe 1/1' – Enterococcus Protéine / Espèce Peptides Numéro de séquence vanA SLTYIVAK SEQ ID NO.33 vanA MMAAAGIALPELIDR SEQ ID NO.34 vanA LIVLALK SEQ ID NO.35 E.faecium GLTVDEVTR SEQ ID NO.36 E.faecium LFNDIAPR SEQ ID NO.37 E.faecium VLVVLEK SEQ ID NO.38 E.faecalis EVTPSLVEK SEQ ID NO.39 E.faecalis LAYEMNGFR SEQ ID NO.40 E.faecalis TVDVTVK SEQ ID NO.41 Groupe 1/1' - A.baumannii Protéine / espèce Peptides Numéro de séquence OXA23 ANTEYVPASTFK SEQ ID NO.42 OXA23 DMTLGEAMK SEQ ID NO.43 OXA23 INLYGNALSR SEQ ID NO.44 OXA23 LSAVPVYQELAR SEQ ID NO.45 OXA23 MLNALIGLENQK SEQ ID NO.46 OXA23 NMLLLEESNGYK SEQ ID NO.47 OXA23 NTSGVLVIQTDK SEQ ID NO.48 OXA23 TDINEIFK SEQ ID NO.49 OXA24 ATTNEIFK SEQ ID NO.50 OXA24 IPFSLNLEMK SEQ ID NO.51 OXA24 ITPVQEVNFADDLAHNR SEQ ID NO.52 OXA24 MLNALIGLENHK SEQ ID NO.53 OXA24 NLSTYGNALAR SEQ ID NO.54 OXA24 TGLELMQK SEQ ID NO.55 OXA51 ASAIQVYQDLAR SEQ ID NO.56 OXA51 ASAISVYQDLAR SEQ ID NO.57 OXA51 ASTEYVPASTFK SEQ ID NO.58 OXA51 IGLELMSK SEQ ID NO.59 OXA51 IGLELMSNEVK SEQ ID NO.60 OXA51 ITPQQEAQFAYK SEQ ID NO.61 OXA51 MLNALIGLEHHK SEQ ID NO.62 OXA51 SFTAWEK SEQ ID NO.63 OXA51 TLPFSPK SEQ ID NO.64 OXA51 VQDEVQSMLFIEEK SEQ ID NO.65 OXA58 IANALIGLENHK SEQ ID NO.66 OXA58 TAYIPASTFK SEQ ID NO.67 A.baumannii ELDDAQLDAIR SEQ ID NO.68 A.baumannii LGTILGPR SEQ ID NO.69 A.baumannii TTDVTGAIQLK SEQ ID NO.70 Groupe 1/1' - S.aureus Protéine / Espèce Peptides Numéro de séquence Chp NSAQFEK SEQ ID NO.71 Chp NSGLPTTLGK SEQ ID NO.72 Chp SSYVINGPGK SEQ ID NO.73 ESXA FEEQFQQLSPK SEQ ID NO.74 ESXA QILSDLTR SEQ ID NO.75 ESXA SQSYGQGSDQIR SEQ ID NO.76 fib LIQAQNLVR SEQ ID NO.77 fib THTVSAHR SEQ ID NO.78 HLA TGDLVTYDK SEQ ID NO.79 HLA TGTTDIGSNTTVK SEQ ID NO.80 HLA TILESPTDK SEQ ID NO.81 MECA IYNSLGVK SEQ ID NO.82 MECA SYANLIGK SEQ ID NO.83 MECA VALELGSK SEQ ID NO.84 MECA YEVVNGNIDLK SEQ ID NO.85 NUC AIDGDTVK SEQ ID NO.86 NUC GLAYIYADGK SEQ ID NO.87 NUC YGPEASAFTK SEQ ID NO.88 Scn LANELK SEQ ID NO.89 Scn YQLQK SEQ ID NO.90 spa DDPSQSANVLGEAQK SEQ ID NO.91 spa LNESQAPK SEQ ID NO.92 spa NGFIQSLK SEQ ID NO.93 TSST HQLTQIHGLYR SEQ ID NO.94 S.aureus IYPGENVGR SEQ ID NO.95 Noeud2-S.aureus SLGSNTPINMVR SEQ ID NO.96 Noeud2'-S.aureus TPPAPVLLK SEQ ID NO.97 Groupe 1/1' - P.aeruginosa Protéine / Espèce peptides Numéro de séquence AmpC LPAPQALEGQR SEQ ID NO.98 AmpC TSAADLLR SEQ ID NO.99 ArnB SGWITTGPK SEQ ID NO.100 GES DYAVAVYTTAPK SEQ ID NO.101 MexA ELASGQLER SEQ ID NO.102 MexA VLSPISGR SEQ ID NO.103 mexB GQQLNATIIGK SEQ ID NO.104 mexB LATGANALDTAK SEQ ID NO.105 MexC VAGIVVR SEQ ID NO.106 MexE AAVAATQAQLDAAR SEQ ID NO.107 MexE ASNAISAELADAR SEQ ID NO.108 MexF LEPEQIGQLK SEQ ID NO.109 MexF LGITVDK SEQ ID NO.110 MexX AALDISR SEQ ID NO.111 MexX AVNPQAITVPR SEQ ID NO.112 MexX QALAQIASAK SEQ ID NO.113 mexY ATLDELSR SEQ ID NO.114 mexY LGIDDIGR SEQ ID NO.115 OprD GELYATYAGETAK SEQ ID NO.116 OprF DVLVNEYGVEGGR SEQ ID NO.117 OprF VQLDVK SEQ ID NO.118 OprM GTFTEQLQAQR SEQ ID NO.119 oprN IALSNLENQK SEQ ID NO.120 OXA10 EYLPASTFK SEQ ID NO.121 PER GLLPAGTVVAHK SEQ ID NO.122 PER WMVETTTGPER SEQ ID NO.123 VIM VGGADVLR SEQ ID NO.124 VIM VGGVDVLR SEQ ID NO.125 P.aeruginosa AVVDGAPGVVK SEQ ID NO.126 Noeud2-P.aeruginosa TVTVLIER SEQ ID NO.127 Noeud2'-P.aeruginosa MYAVIVTGGK SEQ ID NO.128 Groupe 1/1' – Enterobacteriaceae Protéine / Espèce peptides Numéro de séquence GES DYAVAVYTTAPK SEQ ID NO.129 IMI ETYQTWLK SEQ ID NO.130 IMI IGVYALDTGSGK SEQ ID NO.131 KPC AAVPADWAVGDK SEQ ID NO.132 KPC LTLGSALAAPQR SEQ ID NO.133 KPC SIGDTTFR SEQ ID NO.134 KPC SQQQAGLLDTPIR SEQ ID NO.135 mcr YTDFVIGEMIAK SEQ ID NO.136 NDM AFGAAFPK SEQ ID NO.137 NDM ASMIVMSHSAPDSR SEQ ID NO.138 OXA48 QQGFTNNLK SEQ ID NO.139 PER EQIESIVIGK SEQ ID NO.140 PER GLLPAGTVVAHK SEQ ID NO.141 PER LDLNQTVIVNR SEQ ID NO.142 PER WMVETTTGPER SEQ ID NO.143 TEM GIIAALGPDGKPSR SEQ ID NO.144 TEM IHYSQNDLVEYSPVTEK SEQ ID NO.145 tolc NDLDNAVEGLR SEQ ID NO.146 tolc NLSLLQAR SEQ ID NO.147 VEB LIGGTDSVQK SEQ ID NO.148 VEB LLIDTYNNK SEQ ID NO.149 VIM VGGADVLR SEQ ID NO.150 VIM VGGVDVLR SEQ ID NO.151 Enterobacteriaceae DLVESAPAALK SEQ ID NO.152 Enterobacteriaceae VGTVTPNVAEAVK SEQ ID NO.153 citrobacter IAHWVGQGATISDR SEQ ID NO.154 E.cloacae VAVTMPSAK SEQ ID NO.155 E.cloacae YSAAITGAEGTIHR SEQ ID NO.156 E.coli VFQTHSPVVDSISVK SEQ ID NO.157 K.pneumoniae AMITAEIR SEQ ID NO.158 K.pneumoniae YTGAITAAAGTIHR SEQ ID NO.159 Noeud2-Enterobacteriaceae VVGQLGQVLGPR SEQ ID NO.160 Noeud2'-Enterobacteriaceae LQLVGVGYR SEQ ID NO.161 Groupe 2/2' - S.aureus Protéine / Espèce Peptides Numéro de séquence CoA ALIDELVEK SEQ ID NO.162 CoA LTSIQTLEDVK SEQ ID NO.163 CoA TAIIFPGQGAQK SEQ ID NO.164 fib AVNLVSFEYK SEQ ID NO.165 gapA FTGEVEVVDGGFR SEQ ID NO.166 gapA TLAYLAELSK SEQ ID NO.167 gapA VPVATGSLTELTVVLEK SEQ ID NO.168 HLA IGGLIGANVSIGHTLK SEQ ID NO.169 HLA VQLQLPDNEVAQISDYYPR SEQ ID NO.170 HLD MAQDIISTIGDLVK SEQ ID NO.171 HLD WIIDTVNK SEQ ID NO.172 hlgA DSNVDLINYLPK SEQ ID NO.173 hlgB SNFNPEFLSVLSHR SEQ ID NO.174 hlgC YVSLINYLPK SEQ ID NO.175 psm1 SLIEQFTGK SEQ ID NO.176 psm4 AIIDIFAK SEQ ID NO.177 psm4 MAIVGTIIK SEQ ID NO.178 Scn IYNEIDEALK SEQ ID NO.179 TSST HQLTQIHGLYR SEQ ID NO.180 TSST LPTPIELPLK SEQ ID NO.181 TSST QLAISTLDFEIR SEQ ID NO.182 S.aureus EMSVLELNDLVK SEQ ID NO.183 S.aureus ALQSAGLEVTAIR SEQ ID NO.184 Groupe 2/2' - P.aeruginosa Protéine / Espèce Peptides Numéro de séquence ArnB DAFMEALK SEQ ID NO.185 GES EIGGPAAMTQYFR SEQ ID NO.186 GES WLIGNQTGDATLR SEQ ID NO.187 MexA LEFSEVSVDEGTGSVTIR SEQ ID NO.188 MexC TPQGIDNQAILVPQR SEQ ID NO.189 MexC VIVGGLAAVQPGVK SEQ ID NO.190 MexE LDFLDNQVNPR SEQ ID NO.191 MexF NLTATDVVNAIR SEQ ID NO.192 mexY LGIDDIGR SEQ ID NO.193 mexY VVEEAVTAIIER SEQ ID NO.194 OprF NLADFMK SEQ ID NO.195 OprM VAALNVEAFR SEQ ID NO.196 oprN DAGVGAELDVLR SEQ ID NO.197 OXA10 EALVTEAPEYLVHSK SEQ ID NO.198 OXA10 FWLEGQLR SEQ ID NO.199 OXA10 EALVTEAAPEYLVHSK SEQ ID NO.200 OXA10 FWLEDQLR SEQ ID NO.201 PER EQIESIVIGK SEQ ID NO.202 PER LDLNQTVIVNR SEQ ID NO.203 PER VLQNTWAPIMK SEQ ID NO.204 VIM NTAALLAEIEK SEQ ID NO.205 P.aeruginosa LSDYGLQLR SEQ ID NO.206 Noeud3-P.aeruginosa LLSISLPR SEQ ID NO.207 Noeud3'-P.aeruginosa AVLEVAGVQNVLAK SEQ ID NO.208 Groupe 2 /2'- Enterobacteriaceae Protéine / Espèce peptides Numéro de séquence GES EIGGPAAMTQYFR SEQ ID NO.209 GES WLIGNQTGDATLR SEQ ID NO.210 IMI APLIISVYTTK SEQ ID NO.211 IMI GFLAAAVLK SEQ ID NO.212 KPC APIVLAVYTR SEQ ID NO.213 KPC SQQQAGLLDTPIR SEQ ID NO.214 mcr LGVGILWR SEQ ID NO.215 mcr NSEGLLDVLQK SEQ ID NO.216 mcr VPNIEIEPK SEQ ID NO.217 mcr YQENVLDTLDR SEQ ID NO.218 NDM FGDLVFR SEQ ID NO.219 OXA48 ANQAFLPASTFK SEQ ID NO.220 OXA48 SQGVVALWNENK SEQ ID NO.221 OXA48 SQGVVVLWNENK SEQ ID NO.222 OXA48 TQGVVVLWNENK SEQ ID NO.223 OXA48 YSVVPVYQEFAR SEQ ID NO.224 PER VLQNTWAPIMK SEQ ID NO.225 SHV GIVALLGPNNK SEQ ID NO.226 SHV VGMIEMDLASGR SEQ ID NO.227 TEM FPMMSTFK SEQ ID NO.228 TEM LDHWEPELNEAIPNDER SEQ ID NO.229 TEM VGYIELDLNSGK SEQ ID NO.230 VEB FLNANHFTDISIK SEQ ID NO.231 VEB IGVAIFNSNEK SEQ ID NO.232 VIM NTAALLAEIEK SEQ ID NO.233 E.coli LIDQATAEIVETAK SEQ ID NO.234 Noeud3-Enterobacteriaceae AAAFEGELIPASQIDR SEQ ID NO.235 Noeud3'-Enterobacteriaceae DQLLENLQEGMEVK SEQ ID NO.236 Groupe 3/3' - P.aeruginosa Protéine / Espèce Peptides Numéro de séquence AmpC ANDIPGLAVAISLK SEQ ID NO.237 AmpC IAYAILSGLEQQAK SEQ ID NO.238 AmpC IAYAILSGLEQQGK SEQ ID NO.239 ArnB LAGLPLAPLGLPAHK SEQ ID NO.240 GES EIGGPAAMTQYFR SEQ ID NO.241 GES LSYGPDMIVEWSPATER SEQ ID NO.242 mexB LQTAEQFENILLK SEQ ID NO.243 mexD LVGFGLSIDDVSNAIR SEQ ID NO.244 mexD VLVDSVTSVLEESLNGAK SEQ ID NO.245 MexF LVTEEEFENIIIR SEQ ID NO.246 OprD GFIEDSSLDLLLR SEQ ID NO.247 OprD GFIEDSSLNLLLR SEQ ID NO.248 OXA10 FWLEDQLR SEQ ID NO.249 OXA10 GAIQVSAVPVFQQIAR SEQ ID NO.250 OXA10 IPNAIIGLETGVIK SEQ ID NO.251 OXA10 IPSAIIGLETGVIK SEQ ID NO.252 OXA10 ISAVNQVEFLESLFLNK SEQ ID NO.253 OXA10 ISAVNQVEFLESLYLNK SEQ ID NO.254 VIM DADELLLIDTAWGAK SEQ ID NO.255 VIM DGDELLLIDTAWGAK SEQ ID NO.256 VIM DGDELLLIDTAWGTK SEQ ID NO.257 VIM NTVALLAEIEK SEQ ID NO.258 P.aeruginosa GIEAVLADLR SEQ ID NO.259 Groupe 3 – Enterobacteriaceae Protéine / Espèce Peptides Numéro de séquence AmpC IAYAILSGLEQQGK SEQ ID NO.260 GES LSYGPDMIVEWSPATER SEQ ID NO.261 IMI WELDLNTAIPGDER SEQ ID NO.262 KPC GFLAAAVLAR SEQ ID NO.263 mcr LGVSILWR SEQ ID NO.264 mcr LVVFVVGETAR SEQ ID NO.265 OXA48-like IPNSLIALDLGVVK SEQ ID NO.266 SHV QLLQWMVDDR SEQ ID NO.267 SHV VGMIEMDLASGR SEQ ID NO.268 TEM WEPELNEAIPNDER SEQ ID NO.269 TEM EPELNEAIPNDER SEQ ID NO.270 tolc FNVGLVAITDVQNAR SEQ ID NO.271 tolc YNYLINELNIK SEQ ID NO.272 VEB IEITPQDLLPK SEQ ID NO.273 VIM DGDELLLIDTAWGTK SEQ ID NO.274 VIM NTVALLAEIEK SEQ ID NO.275 VIM DGDELLLIDTAWGAK SEQ ID NO.276 VIM DADELLLIDTAWGAK SEQ ID NO.277 K.pneumoniae ISELSEEQIDILR SEQ ID NO.278 Enterobacteriaceae ALLAAFDFPFR SEQ ID NO.279 Groupe 3' – Enterobacteriaceae Protéines Peptides Numéro de séquence AmpC IAYAILSGLEQQGK SEQ ID NO.260 GES EIGGPAAMTQYFR SEQ ID NO.209 GES LSYGPDMIVEWSPATER SEQ ID NO.261 IMI APLIISVYTTK SEQ ID NO.211 IMI GFLAAAVLK SEQ ID NO.212 IMI WELDLNTAIPGDER SEQ ID NO.262 KPC APIVLAVYTR SEQ ID NO.213 KPC GFLAAAVLAR SEQ ID NO.263 mcr LGVSILWR SEQ ID NO.264 mcr LVVFVVGETAR SEQ ID NO.265 mcr NSEGLLDVLQK SEQ ID NO.216 NDM FGDLVFR SEQ ID NO.219 OXA48 IPNSLIALDLGVVK SEQ ID NO.266 OXA48 YSVVPVYQEFAR SEQ ID NO.224 PER VLQNTWAPIMK SEQ ID NO.225 SHV QLLQWMVDDR SEQ ID NO.267 SHV VGMIEMDLASGR SEQ ID NO.227 TEM EPELNEAIPNDER SEQ ID NO.270 TEM FPMMSTFK SEQ ID NO.228 TEM WEPELNEAIPNDER SEQ ID NO.269 tolc FNVGLVAITDVQNAR SEQ ID NO.271 tolc YNYLINELNIK SEQ ID NO.272 VEB IEITPQDLLPK SEQ ID NO.273 VIM DADELLLIDTAWGAK SEQ ID NO.277 VIM DGDELLLIDTAWGAK SEQ ID NO.276 VIM DGDELLLIDTAWGTK SEQ ID NO.274 VIM NTAALLAEIEK SEQ ID NO.233 VIM NTVALLAEIEK SEQ ID NO.275 Enterobacteriaceae ALLAAFDFPFR SEQ ID NO.279 K.pneumoniae ISELSEEQIDILR SEQ ID NO.278 Selon une mise en œuvre de l’invention, les groupes de peptides prédéfinis des étapes (i>1) sont sélectionnés parmi les groupes de peptides présentés dans les tableaux 2 à 12. Selon une autre mise en œuvre de l’invention, les groupes de peptides prédéfinis des étapes (i>1) sont choisis parmi des groupes de peptides comprenant au moins un peptide listé dans les tableaux 2 à 12. Selon une autre mise en œuvre de l’invention, les groupes de peptides prédéfinis des étapes (i>1) sont choisis parmi des groupes de peptides comprenant au moins un peptide nœud tel qu’indiqué dans les tableaux 2 à 12, c’est-à-dire comprenant au moins un peptide choisi parmi ceux de séquence SEQ ID NO. 96, 97, 127, 128, 160, 161, 207, 208, 235 et 236. Que ce soit pour l’étape (i=1) ou lors des étapes (i>1), il peut être avantageux qu’un groupe de peptides comprenne au moins deux peptides nœuds étant spécifiques d’un même genre et/ou d’une même espèce microbienne. Selon une autre mise en œuvre de l’invention, les groupes de peptides prédéfinis des étapes (i>1) sont choisis parmi des groupes de peptides comprenant au moins un peptide parmi les peptides de séquence SEQ ID NO. 33 à SEQ ID NO. 279. Echantillon biologique Le procédé selon l’invention permet l’identification et la caractérisation d’au moins une population microbienne présente dans un échantillon biologique. Ledit échantillon biologique pourra être de plusieurs natures, et notamment : - être issu d’un mammifère ; - être un échantillon issu d’une culture microbienne ; ou encore - être un isolat de bactéries, de levures ou de champignons. Selon une première mise en oeuvre, cet échantillon pourra avoir été préalablement prélevé sur un organisme vivant, et notamment sur un mammifère. Lorsque l’échantillon biologique est issu d’un mammifère, il pourra être choisi notamment parmi les types d’échantillons biologiques suivants : du sang, du sérum, de la lymphe, du mucus issu des voies respiratoires, de la salive, du liquide céphalo rachidien ou de l’urine. Selon une deuxième mise en œuvre, l’échantillon biologique soumis au procédé d’identification et de caractérisation d’au moins une population microbienne présente dans ledit échantillon pourra avoir été prélevé sur d’autres matrices, par exemple sur un produit alimentaire (boisson, plat préparé, crème dessert, glace, …). Cet échantillon biologique pourra être testé selon le procédé de l’invention avec ou sans étape de culture préalable. Il est entendu qu’avant la mise en œuvre du procédé, ledit échantillon pourra être traité comme cela est bien connu par l’Homme du métier, afin d’enrichir ledit échantillon en microorganismes. En particulier, une étape de culture permettant aux microorganismes présents dans l’échantillon de se multiplier pourra être mise en oeuvre. Un tel échantillon sera par exemple mis en culture dans un milieu adapté à la reproduction d’une population microbienne, bien connu de l’Homme du métier. Après culture dans des conditions adaptées en termes de température et d’agitation, un échantillon de ladite culture microbienne sera soumis au procédé selon l’invention. Selon une troisième mise en œuvre, l’échantillon biologique soumis au procédé d’identification et de caractérisation d’au moins une population microbienne présente dans ledit échantillon est issu d’un isolat de bactéries. Selon une quatrième mise en œuvre, l’échantillon biologique soumis au procédé d’identification et de caractérisation d’au moins une population microbienne présente dans ledit échantillon est issu d’un isolat de levures. Selon une cinquième mise en œuvre, l’échantillon biologique soumis au procédé d’identification et de caractérisation d’au moins une population microbienne présente dans ledit échantillon est issu d’un isolat de champignons. Mise en œuvre par ordinateur Le procédé selon l’invention peut avantageusement être mis en œuvre par ordinateur. Il est précisé que dans la présente demande, par ordinateur, il est entendu, une machine algorithmique composée d'un assemblage de matériels correspondant à des fonctions spécifiques, capable de recevoir de l'information, dotée de mémoires et de moyens de traitement, pouvant restituer tout ou partie des éléments traités, ayant la possibilité de résoudre des problèmes mathématiques et logiques, et nécessitant pour son fonctionnement la mise en œuvre et l'exploitation automatique d'un ou plusieurs programmes enregistrés. Ainsi, selon une mise en œuvre du procédé de l’invention, celui-ci est caractérisé en ce que le choix du groupe de peptides prédéfini (i+1) est mis en œuvre par des moyens de traitement de données adaptés pour recevoir une donnée concernant le au moins un peptide nœud détecté à l’étape (i), et pour sélectionner en fonction de ladite donnée le groupe de peptides (i+1) comprenant les peptides (peptides rapporteurs et optionnellement peptides nœuds) qui seront recherchés lors de la mise en œuvre de l’étape de détection (i+1). Spectromètre de masse Le procédé selon l’invention est mis en œuvre sur un dispositif du type spectromètre de masse à fragmentation de peptides. Ce spectromètre de masse pour la mise en œuvre du procédé selon l’invention est avantageusement un spectromètre à triple quadrupôle. Le spectromètre de masse pour la mise en œuvre du procédé selon l’invention comprend des moyens de traitement adaptés pour recevoir une donnée concernant le au moins un peptide nœud détecté à l’étape (i), et pour sélectionner, en fonction de ladite donnée, le ou les groupes de peptides prédéfini(s) (i+1) comprenant les peptides qui seront recherchés lors de la mise en œuvre de l’étape de détection (i+1). Un tel spectromètre de masse comprenant des moyens de traitement adaptés, peut avantageusement être caractérisé en ce qu’il s’agit d’un spectromètre intégrant une étape de fragmentation des peptides, de type spectromètre à triple quadrupôle, ou hybride quadrupôle/piège à ion, ou hybride quadrupôle/analyseur haute résolution, ou encore piège à ion seul. EXEMPLES Exemple 1. Préparation des échantillons biologiques contenant au moins une population microbienne La figure 3 représente schématiquement le traitement des échantillons biologiques avant l’analyse par LC-MS-MS (chromatographie liquide après MS-MS). Le protocole détaillé est présenté ci-dessous. Produits chimiques et réactifs Le méthanol (MeOH), l'isopropanol (IPA), l'eau et l'acétonitrile (ACN) (qualité LC-MS) ont été achetés à Fisher Scientific (Illkirch, France). L'acide formique (FA) (qualité LC-MS), les billes de verre - lavées à l'acide (150-212 μm) et la trypsine du pancréas porcin (type IX-S) ont été obtenus à Sigma-Aldrich (St Quentin-Fallavier, France). Purification hémoculture 5 mL du contenu du flacon d’hémoculture est transféré dans un tube Eppendorf de 15 mL. Les tubes sont ensuite centrifugés pendant 5 minutes à 5000 RPM. Le surnageant est alors éliminé, et le culot est solubilisé avec 5 mL d’un mélange de NH 4 Cl (40 g/L), KHCO 3 (5 g/L), EDTA (100 mg/L). La solution est alors homogénéisée et laissé reposer 10 minutes. Les tubes sont centrifugés pendant 5 minutes à 5000 RPM. Le culot est alors lavé avec 5 mL de sérum physiologique, alors que le surnageant a été préalablement éliminé. Une nouvelle centrifugation et élimination du surnageant est alors réalisé (5 minutes à 5000 RPM). Le culot est ensuite resolubilisé dans un volume souhaité en fonction de l’application voulue. Dans un cas classique on reprendra dans 1mL d’eau physiologique. Les tubes peuvent être directement utilisés pour la prochaine étape de l’analyse ou conservé a -20 °C avant utilisation. Lyse microbienne et digestion 200 μL de suspensions microbiennes sont transférées dans des tubes Eppendorf Low biding protein de 1,5 ml, contenant un mélange de billes de verre (150-212 μm) et 50 μL de trypsine (1 mg/mL) préparés dans 150 mM NH4HCO3. Les tubes sont placés dans un bain à ultrasons thermostaté à 50 °C (Diagenode Bioruptor® plus, Diagenode s.a. Belgique), soniqués à basse puissance (cycle de sonication : 30s on/30s off) pendant 10 minutes. La digestion trypsique est arrêtée en acidifiant les échantillons avec 3 μL d'acide formique. Les tubes sont centrifugés à 8 000 RPM pendant 3 minutes avec un minispin® (Eppendorf). Le surnageant (150 µL) est alors transféré dans des inserts en verre, eux-mêmes dans des flacons en verre ambré pour être analysé. Exemple 2. Identification des peptides ribosomaux sentinelles, adaptés pour la détermination de l’identité des populations microbiennes présentes dans un échantillon biologique Afin d’identifier les peptides ribosomaux candidats à intégrer ce premier groupe, des expériences classiques de protéomique dites en mode Dada Dependant Acquisition ont été conduites sur les espèces bactériennes Staphylococcus aureus , Pseudomonas aeruginosa Acinetobcater baumannii et sur les genres Enterobacteriaceae et Enterococcus . Ces expériences ont permis pour chacune des espèces : i) de positionner de manière relative sur le chromatogramme les peptides ribosomaux identifiés et ii) d’identifier ceux qui présentent le rapport signal sur bruit le plus intense (voir les 3 exemples ci-dessous). Le procédé selon l’invention a été mis au point en intégrant dans le premier groupe de peptides les 10 peptides marqués d’une étoile, indiqués dans les figures 2A à 2E : - 2 peptides spécifiques du genre Enterobacteriacae (fig. 2A) : SEQ ID NO. 25 et NO. 26 - 2 peptides ont été intégrés pour les espèces S. aureus (fig 2B) : SEQ ID NO. 27 et NO. 28, - 2 peptides spécifiques de P. aeruginosa (fig. 2C) : SEQ ID NO. 29 et NO. 30, - 2 peptides spécifiques de Acinetobacter baumannii (fig. 2D) : SEQ ID NO. 31 et NO. 32, et - 2 peptides spécifiques du genre Enterococcus (fig. 2E) : SEQ ID NO. 23 et NO. 24. L’utilisation de deux peptides nœuds permet de prendre en compte une éventuelle mutation sur l’un des deux peptides ribosomaux. Ainsi, même si le premier peptide ribosomal d’un microorganisme présent est muté et donc non détecté, le fait de monitorer un second peptide noeud assure de ne pas aboutir à une détection faussement négative. Exemple 3. Identification des peptides nœuds des deuxièmes groupes, adaptés pour la confirmation ou l’affinage de l’identité des populations microbiennes présentes dans un échantillon biologique, ou encore pour la détermination des mécanismes de résistance aux antibiotiques, ou encore pour évaluer le niveau de virulence Dans chacun des deuxièmes groupes de peptides, dont le monitoring est dépendant de la détection d’un ou deux peptides noeuds ribosomaux positionnés dans le premier groupe, sont positionnés de nouveaux peptides ribosomaux qui vont : - soit confirmer l’identification de la bactérie, à savoir Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii - soit affiner l’identité de la bactérie dans le groupe des Enterobacteriaceae et Enterococcus La combinaison présence/absence de certains peptides permet de discriminer entre elles les différentes espèces des genres Enterobacteriacae et Enterococcus. Ces peptides ont eux-mêmes été identifiés lors des expériences en mode DDA précédemment citées et leur spécificité vis à vis du genre et de l’espèce vérifiée par analyse sur de vrais échantillons cliniques. Dans ces groupes de peptides sont également positionnés des peptides spécifiques des protéines associées à des mécanismes de résistance aux antibiotiques ou de virulence. Pour cette preuve de concept, ont été positionnés dans ces groupes de peptides des peptides rapporteurs de la présence de carbapénémases, protéines induisant une résistance à la classe des carbapénèmes ( KPC, NDM, OXA-48, VIM ), des peptides rapporteurs des pompes d’efflux et des porines de P. aeruginosa , et de MecA pour S. aureus. Cette stratégie peut être étendue en intégrant dans la méthode des peptides ribosomaux spécifiques d’autres agents pathogènes et d’autres mécanismes de résistance aux antibiotiques et/ou de virulence. De la même manière, l’identification du genre et de l’espèce du pathogène pourrait être conduite par la détection d’autres peptides rapporteurs de la présence de séquences spécifiques de protéines abondantes du pathogène. Par ailleurs, même s’il est montré ici l’utilisation du procédé pour caractériser un échantillon sanguin contaminé par une seule espèce microbienne, la détection de peptides ribosomaux spécifiques de deux espèces et genres distincts entrainent dans ce cas le monitoring des deux groupes de peptides spécifiques de ces deux pathogènes. La figure 7 illustre schématiquement l’application du procédé de l’invention à des échantillons d’hémocultures positives ayant suivi le protocole de préparation d’échantillon détaillé dans la figure 3. Au total, le processus d’analyse de la préparation d’échantillon au rendu des résultats (identification + caractérisation des mécanismes de résistance aux antibiotiques) est réalisé en moins d’une heure. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES FR 2 951 548 EP 2 702 407 FR 12 57489 FR 2 982 367 Munita JM, Arias CA. Mechanisms of Antibiotic Resistance. Microbiol Spectr. 2016 Apr;4(2). doi: 10.1128/microbiolspec.VMBF-0016-2015. Review. Peterson E, Kaur P. Antibiotic Resistance Mechanisms in Bacteria: Relationships Between Resistance Determinants of Antibiotic Producers, Environmental Bacteria, and Clinical Pathogens. Front Microbiol. 2018 Nov 30;9:2928. doi: 10.3389/fmicb.2018.02928. eCollection 2018. Review. Procédé d’identification et de caractérisation d’au moins une population microbienne présente dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes : a) isolement des microorganismes puis scission des protéines microbiennes en un « mélange peptidique » contenant une pluralité de peptides; b) détection au sein de ce mélange peptidique d’au moins un peptide dit « nœud », cette étape de détection numérotée (i) étant mise en œuvre par spectrométrie de masse ciblée, réalisée sur un spectromètre de masse, combinée à une étape de séparation des peptides, i étant un nombre entier supérieur ou égal à 1, c) détection au sein de ce mélange peptidique d’au moins un autre peptide lors d’une étape de détection (i+1), cette étape étant mise en œuvre avec le même spectromètre de masse que celui utilisé à l’étape (i); lesdits peptides étant spécifiques d’un genre et/ou d’une espèce microbienne, ou d’un mécanisme de résistance aux antibiotiques et/ou d’un mécanisme de virulence et/ou d’un niveau de virulence, et lesdits peptides étant classifiés comme faisant partie d’un ou de groupes de peptides prédéfinis, chaque groupe prédéfini comprenant un ou des peptides dit « nœud(s) » et/ou un ou des peptides dits « rapporteur(s) », ledit procédé étant caractérisé en ce que, lors d’une étape de détection (i), l’identification d’au moins un peptide nœud membre du groupe prédéfini (i) oriente la sélection du ou des groupe(s) prédéfini(s) (i+1) comprenant les peptides qui seront recherchés lors de l’étape de détection (i+1). Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le choix du groupe prédéfini (i+1) est mis en œuvre par des moyens de traitement de données adaptés pour recevoir une donnée concernant le au moins un peptide nœud détecté à l’étape (i), et pour sélectionner en fonction de ladite donnée le groupe de peptides (i+1) comprenant les peptides qui seront recherchés lors de la mise en œuvre de l’étape de détection (i+1). Procédé selon l’une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la séparation des peptides est réalisée par chromatographie liquide en phase inverse, par chromatographie liquide en phase normale, par chromatographie liquide en phase hydrophile, ou par électrophorèse capillaire. Procédé selon l’une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les peptides nœuds compris dans le groupe de peptides prédéfini de l’étape (i=1) sont spécifiques d’un genre et/ou d’une espèce microbienne, et apparaissent dans les premières minutes de la séparation des peptides. Procédé selon l’une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les peptides nœuds compris dans le groupe de peptides prédéfini (i=1) sont issus de protéines ribosomales. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les peptides nœuds du groupe de peptides prédéfini (i=1) sont choisis parmi les peptides présentant les séquences SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 26, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 28, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO. 31 et SEQ ID NO. 32. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les groupes de peptides prédéfinis des étapes (i>1) sont sélectionnés parmi les groupes de peptides présentés dans les tableaux 2 à 12. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel un groupe de peptides prédéfini comprend au moins deux peptides nœuds étant spécifiques d’un même genre et/ou d’une même espèce microbienne. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la population microbienne comprend des bactéries et/ou des levures et/ou des champignons et/ou des protozoaires. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l’échantillon biologique est issu d’un mammifère, d’une culture microbienne ou d’un isolat de bactéries, de levures, de champignons ou de protozoaires. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l’échantillon biologique est issu d’un mammifère, et est choisi parmi les types d’échantillons biologiques suivants : du sang, du sérum, de la lymphe, du mucus issu des voies respiratoires, de la salive, du liquide céphalo rachidien ou de l’urine. Procédé selon l’une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que lors de l’étape (a), la scission des protéines est réalisée par hydrolyse enzymatique, notamment en présence de trypsine, à une température d’au moins 40°C, préférentiellement à une température de 50°C. Spectromètre de masse pour la mise en œuvre du procédé selon l’une des revendications 1 à 12, comprenant des moyens de traitement adaptés pour recevoir une donnée concernant le au moins un peptide nœud détecté à l’étape (i), et pour sélectionner, en fonction de ladite donnée, le ou les groupes de peptides prédéfini(s) (i+1) comprenant les peptides qui seront recherchés lors de la mise en œuvre de l’étape de détection (i+1). Spectromètre de masse selon la revendication 13, caractérisé en ce qu’il s’agit d’un spectromètre intégrant une étape de fragmentation des peptides, de type spectromètre à triple quadrupôle, ou hybride quadrupôle/piège à ion, ou hybride quadrupôle/analyseur haute résolution, ou encore piège à ion seul.