Brevet FR3103900A1 — publié le 20210604

La présente invention concerne une méthode pour l’identification d’un microorganisme à identifier comprenant les étapes suivantes : - l’obtention d’une matrice Excitation-Emission EEM du microorganisme à identifier, - L’analyse en composantes principales de ladite matrice EEM avec au moins une matrice EEMr de référence, - la projection du résultat de l’analyse dans un plan défini par deux composantes principales, et - l’identification du microorganisme à identifier Figure de l’abrégé : figure 3 Méthode d'identification rapide de microorganismes par analyse de matrices excitation-émission Domaine technique et art antérieur L’invention relève du domaine des méthodes d’identification et de caractérisation de microorganismes. La présente invention repose sur l’analyse des matrices Excitation-Emission (ou matrices EEM dans la suite de l’exposé) et trouve son intérêt dans tous les domaines concernés par l’identification de microorganismes, notamment le secteur médical, par exemple dans des laboratoires de recherche, des laboratoires de microbiologie, bactériologie ou parasitologie-mycologie, des Centres Hospitaliers et des laboratoires d’analyses de biologie médicale. Les infections dues à des microorganismes tels que des bactéries, des levures, des champignons filamenteux, des parasites ou des micro-algues touchent des individus immunodéprimés comme des individus immunocompétents. Les individus immunodéprimés présentent cependant un risque plus élevé d’infections sévères. Les infections touchant les individus immunodéprimés sont souvent associées à des niveaux élevés de morbidité et de mortalité. Afin d’initier le traitement approprié, il est primordial d’identifier correctement et rapidement le microorganisme responsable de l’infection. La méthode de référence pour l’identification des microorganismes repose sur le séquençage d’une région particulière du génome dudit microorganisme. Cette méthode implique l’extraction de l’ADN et l’analyse de la séquence obtenue. Cette méthode est extrêmement fiable mais nécessite un équipement et des locaux appropriés. En l’absence d’automatisation, cette méthode est coûteuse et consommatrice de temps. Les limites de ces techniques moléculaires ont conduit au développement de méthodes alternatives, basées sur la spectrométrie de masse, notamment la spectrométrie de masse de type MALDI-TOF qui est de plus en plus largement utilisée dans les laboratoires de microbiologie, bactériologie, ou parasitologie-mycologie des centres hospitaliers comme dans les laboratoires d’analyses de biologie médicale pour l’identification des microorganismes. Le coût d'un spectromètre de masse de type MALDI-TOF est élevé. Cet équipement nécessite une maintenance annuelle qui immobilise l'équipement pendant 24 à 48 h, avec notamment comme possible conséquence pour les laboratoires accrédités le non-respect des engagements en termes de délai de rendu des résultats. Dans le cadre d’une méthode d’identification par spectrométrie de masse de type MALDI-TOF, le dépôt du microorganisme sur une cible détermine la qualité des empreintes spectrales, et le pouvoir résolutif. En effet, le dépôt doit être régulier et fin, c’est-à-dire en « couche mince ». Après séchage et dépôt d’une matrice, il faut qu’il soit possible d’extraire les protéines du microorganisme et de les ioniser afin d’obtenir après séparation dans la colonne du MALDI-TOF un spectre de masse permettant, par l’analyse des ions de faible masse moléculaire, de déterminer l’identité du microorganisme. Le profil des pics obtenu par spectrométrie de masse de type MALTI-DOF est ensuite comparé à une base de données constituée de spectres de référence établis pour chacun des microorganismes présents dans la base. La base est alimentée de spectres individuels obtenus pour différentes souches de microorganismes, parfois cultivées dans différentes conditions (milieux de culture, âge des cultures), à partir desquels peuvent être définis des superspectres caractéristiques d’espèce et indépendants des conditions de culture. Il existe cependant des différences, y compris dans les spectres de référence, en fonction des équipements MALTI-DOF utilisés. Les performances, en termes de pouvoir discriminant et de fiabilité de l'identification finale, sont fonction également des algorithmes utilisés. Ainsi, deux laboratoires ayant deux équipements différents peuvent parfois conclure à des identifications contraires d’un même microorganisme. La méthode d’identification par spectrométrie de masse de type MALTI-DOF présente ainsi plusieurs désavantages. L’équipement utilisé et sa maintenance annuelle en font une méthode onéreuse. Pour certains fournisseurs, l’équipement est encombrant. Il est donc difficilement envisageable pour un laboratoire de détenir plusieurs équipements de ce type, et cet équipement n’est pas transportable d’un service ou d’un laboratoire à un autre. Problème technique Les inventeurs ont mis en œuvre une méthode d’identification de microorganismes aussi fiable que les méthodes connues par l’homme du métier jusqu’à ce jour, ne présentant pas les désavantages relevés plus haut. La méthode d’identification qui améliore la situation actuelle repose sur une analyse en composantes principales d’une matrice Excitation Emission (EEM) caractéristique d’un microorganisme avec au moins une matrice de référence (EEMr), les matrices étant obtenues par exemple à l’aide d’un fluorimètre. Le microorganisme est éclairé avec une lumière caractérisée par sa longueur d’onde. Dans le cadre du présent exposé, il est entendu par lumière une onde électromagnétique visible ou invisible, de préférence une onde électromagnétique choisie de l’ultraviolet (UV) jusqu’aux infrarouges (IR) et passant par le domaine du visible. Le microorganisme ainsi éclairé passe alors d’un état dit fondamental à un état excité en absorbant des photons dits photons d’excitation. Le microorganisme excité recouvre ensuite son état fondamental en réémettant des photons dits photons d’émission. Selon la longueur d’onde d’excitation, c’est-à-dire la longueur d’onde des photons d’excitation, les longueurs d’onde d’émission, c’est-à-dire les longueurs d’onde des photons réémis, peuvent changer et ceci en fonction du microorganisme étudié. La méthode consiste alors à recueillir, pour chaque longueur d’onde d’excitation donnée, le spectre d’émission de l'échantillon. Le spectre d’émission représente les quantités de photons d’émission mesurées à différentes longueurs d’onde, la quantité de photons d’émission étant directement proportionnelle à une puissance ou une énergie lumineuse selon les lois classiques de la photonique et à l’interaction spécifique avec l’échantillon étudié. La méthode est rendue d’autant plus fiable que pour un même microorganisme, on utilise différentes longueurs d’ondes d’excitation et que pour chaque longueur d’onde d’excitation on recueille un spectre d’émission. L’identification d’un microorganisme consiste ainsi à mesurer et analyser les spectres d’émission émis par le microorganisme après avoir été éclairé successivement par des lumières de longueurs d’onde différentes. L’invention a ainsi pour objet une méthode pour l’identification d’un microorganisme à identifier comprenant les étapes suivantes : - l’obtention d’une matrice Excitation-Emission EEM du microorganisme à identifier, - l’analyse en composantes principales de ladite matrice EEM avec au moins une matrice Excitation-Emission de référence EEMr, - la projection du résultat de l’analyse dans un plan défini par deux composantes principales, et - l’identification du microorganisme à identifier. L’identification d’un microorganisme à l’aide de la méthode présentement exposée est rapide. Il est possible d’identifier un microorganisme et par exemple un microorganisme responsable d’une infection. Le procédé selon l’invention permet ainsi de ramener une analyse laborieuse de matrice EEM à une simple comparaison graphique dans un plan de points caractéristiques d’un microorganisme à identifier. Selon un autre aspect, il est proposé un programme informatique comportant des instructions pour la mise en œuvre de tout ou partie d’une méthode telle que définie dans la présente lorsque ce programme est exécuté par un processeur. Selon un autre aspect de l’invention, il est proposé un support d’enregistrement non transitoire, lisible par un ordinateur, sur lequel est enregistré un programme d’identification de microorganismes selon la présente invention. Selon un autre aspect de l’invention, il est proposé un support d’enregistrement non transitoire, lisible par un ordinateur, sur lequel sont enregistrées les matrices EEMr des microorganismes de référence. Obtention d’une matrice EEM Une première étape de la présente méthode comprend l’obtention d’une matrice Excitation-Emission (EEM) caractéristique d’un microorganisme à identifier. Le M icroorganisme à identifier Le microorganisme à identifier peut être une bactérie, une levure, un champignon filamenteux, une micro-algue ou un parasite. Ces souches sont la cause de la majorité des infections en secteur médical. La culture dudit microorganisme peut être réalisée en milieu liquide, par exemple en bouillon ou en milieu semi-solide, par exemple sur milieu gélosé un microorganisme mis en culture se présentant alors sous forme de colonies. Dans le cas où de nouvelles espèces de microorganismes étaient découvertes, la présente invention serait tout autant utilisable et efficace. Il suffirait simplement de caractériser un nouvel organisme de référence. Chacun des microorganismes est identifié par une espèce selon la classification connue des microorganismes, voire par son génotype. La présente invention permet ainsi d’identifier le genre du microorganisme, de préférence l’espèce ou le complexe d’espèce du microorganisme. Les microorganismes qui peuvent être identifiés par le procédé de l'invention sont tous types de micro-organismes, pathogènes ou non, rencontrés tant dans l'industrie qu’en clinique, qui peuvent connaître des phénomènes de résistance aux agents antimicrobiens. Ce peut être, de préférence, des bactéries, des moisissures, des levures, des micro-algues ou des parasites. A titre d'exemple de tels microorganismes, on peut citer les bactéries Gram-positives, Gram-négatives et les Mycobactéries. A titre d'exemple de bactéries Gram-négatives, on peut citer celles des genres : Pseudomonas, Escherichia, Salmonella, Shigella, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus, Acinetobacter, Citrobacter , Aeromonas , Stenotrophomonas , Morganella et Providencia , et notamment les espèces Escherichia coli, Enterobacter cloacae , Enterobacter aerogenes , Klebsiella pneumoniae , Klebsiella oxytoca , Pseudomonas aeruginosa , Providencia rettgeri , Pseudomonas putida , Stenotrophomonas maltophilia , Acinetobacter baumannii , Morganella morganii , Proteus mirabilis, Salmonella senftenberg , Serratia marcescens , Salmonella typhimurium etc... A titre d'exemple de bactéries Gram-positives, on peut citer celles des genres : Enterococcus, Streptococcus, Staphylococcus, Bacillus, Listeria et Clostridium . A titre d’exemple de levures, on peut citer celles des genres : Candida, Blastobotrys , Cryptococcus , Diutina , Kluyveromyces , Magnusiomyces , Meyerozyma , Pichia , Rhodotorula , Saccharomyces, Trichomonascus , Trichosporon , Wickerhamiella , Yarrowia , et notamment les espèces Candida albicans , Candida glabrata , Candida parapsilosis , Candida tropicalis , Blastobotrys adeninivorans , Cryptococcus neoformans , Diutina rugosa , Kluyveromyces marxianus , Magnusiomyces clavatus , Meyerozyma guilliermondii , Pichia kudriavzevii , Rhodotorula mucilaginosa , Saccharomyces cerevisiae, Trichomonascus ciferrii , Trichosporon cutaneum , Wickerhamiella pararugosa , Yarrowia lipolytica etc... A titre d’exemple de champignons filamenteux, on peut citer des dermatophytes, des moisissures, et des champignons dimorphiques. A titre d'exemple de dermatophytes, on peut citer ceux des genres : Arthroderma , Epidermophyton , Microsporum, Nannizzia , Paraphyton , et Trichophyton , et notamment les espèces Arthroderma uncinatum , Epidermophyton floccosum , Microsporum canis, Microsporum audouinii, Nannizzia gypsea , nannizzia persicolor , Paraphyton cookei , Trichophyton rubrum , Trichophyton interdigitale, Trichophyton tonsurans etc... A titre d’exemples de moisissures, on peut citer celles des genres : Alternaria , Arthrographis , Aspergillus, Bissochlamys , Cladosporium , Cunninghamella , Exophiala , Fusarium, Geotrichum , Lichtheimia , Lomentospora , Mucor, Neoscytalidium , Penicillium, Purpureocillium , Rasamsonia , Rhizomucor , Rhizopus , Sarocladium , Scedosporium , Scopulariopsis , Syncephalastrum , Trichoderma , Verruconis , et notamment Alternaria infectoria , Arthrographis kalrae , Aspergillus flavus , Aspergillus fumigatus , Aspergillus nidulans , Aspergillus niger , Aspergillus terreus , Aspergillus versicolor , Byssochlamys spectabilis , Cladosporium cladosporioides , Cunninghamella bertholletiae , Exophiala dermatitidis , Fusarium dimerum , Fusarium fujikuroi , Fusarium oxysporum , Fusarium solani , Geotrichum candidum , Lichtheimia corymbifera , Lomentospora prolificans , Mucor circinelloides , Neoscytalidium dimidiatum , Penicillium expansum , Purpureocillium lilacinum , Rasamsonia argillacea , Rhizomucor pusillus , Rhizopus oryzae , Sarocladium kiliense , Scedosporium apiospermum , Scopulariopsis brevicaulis , Syncephalastrum racemosum , Trichoderma harzianum , Verruconis gallopava , etc… Le microorganisme étudié peut être obtenu à partir d’un prélèvement de sang, d’un prélèvement de peau et phanères (ongles, poils, cheveux), de salive, de muqueuse, d’une expectoration, ou de tout autre prélèvement. Le prélèvement et la mise en culture du microorganisme à identifier sont effectués selon des méthodes connues de l’homme du métier et/ou de l’utilisateur. Le microorganisme en culture en milieu liquide ou en milieu semi-solide peut être conservé plusieurs jours en vue d’une analyse différée ou répétée dans le temps. Le microorganisme peut ainsi être transporté d’un laboratoire à un autre ou d’un hôpital à un autre. Dans le cas où le microorganisme est mis en culture en milieu semi-solide, tel un milieu gélosé, l’analyse du microorganisme peut être directement réalisée sur une colonie obtenue sur le milieu sur lequel le microorganisme a été cultivé. La présente invention rend ainsi possible une analyse directe de l’échantillon contrairement à diverses méthodes d’identification de l’art antérieur, par exemple la méthode par spectrométrie de masse MALTI-DOF qui nécessite une disposition préalable du microorganisme à identifier sur une cible. Dans le cas où le microorganisme est mis en culture en milieu liquide, tel un bouillon, l’analyse du microorganisme est réalisée après mise en forme dudit microorganisme sur un support solide. Le support solide peut être choisi de sorte que son émission intrinsèque dans les gammes de longueurs d’ondes d’étude n’interfère pas avec la mesure de l’émission de l’échantillon dans lesdites gammes d’étude (gamme de longueurs d’onde d’excitation et gamme de longueurs d’onde d’émission). Le support solide est choisi de préférence non fluorescent et/ou non luminescent dans la gamme de longueurs d’onde d’étude. Le support solide est par exemple un support en verre, en métal, en plastique, en composite ou en bois. De manière avantageuse, la méthode d’identification selon l’invention peut succéder à une première identification. La première identification peut être réalisée par simple identification visuelle du type du microorganisme, de préférence au microscope, par l’utilisateur. Puis une deuxième caractérisation selon la méthode de la présente invention est réalisée afin d’identifier le microorganisme, c’est-à-dire l’identification du genre, ou, de préférence, de l'espèce d'un microorganisme préalablement déposé sur un support solide ou cultivé sur un milieu semi-solide. Matrice d’Excitation Emission (EEM) Une matrice d’Excitation Emission EEM est une matrice comprenant N lignes et M colonnes. Chaque ligne de la matrice EEM correspond à un spectre d’émission mesuré à une longueur d’onde d’excitation donnée. Ainsi, une matrice de N lignes et M colonnes signifie que N spectres d’émission ont été mesurés pour N longueurs d’onde d’excitation différentes. Pour une longueur d’onde d’excitation donnée, le spectre d’émission mesuré comprend M valeurs d’intensité lumineuse mesurée pour M longueurs d’onde d’émission différentes. Dans le présent exposé, l’« intensité lumineuse » mesurée à une longueur d’onde d’émission peut être exprimée selon les grandeurs photométriques usuelles (par exemple la radiance, la luminance, l’énergie, la puissance, le nombre de photons), ou bien sans unité. Dans le cas où l’intensité lumineuse est exprimée sans unité, la valeur de la mesure est classiquement donnée par le spectromètre en un nombre compris entre 1 et 2 p , p étant le nombre de bits du convertisseur analogique-numérique. Pour chaque longueur d’onde d’excitation, une mesure du spectre d’émission est réalisée mettant en œuvre des dispositifs discutés ci-après. Dans la suite de l’exposé, il est considéré qu’une matrice EEM d’un microorganisme à identifier comprend N lignes et M colonnes telles que : N est un entier positif qui correspond au nombre de longueurs d’onde d’excitation ; N est préférentiellement compris entre 2 et 20000, de préférence 10 et 1500 ; M est un entier positif qui correspond au nombre de longueurs d’onde d’émission ; M est préférentiellement compris entre 10 et 50000, de préférence entre 350 et 1500. Dans le cadre de la présente invention, la matrice EEM est avantageusement obtenue pour - une gamme d’au moins 2 longueurs d’onde d’excitation, de préférence au moins 100 longueurs d’onde d’excitation, et encore de préférence au moins 500 longueurs d’onde d’excitation comprise entre 140 et 2000 nm, de préférence entre 250 et 900 nm, par pas de 0,1 à 20 nm, de préférence par pas de 0,1 à 10 nm, et encore de préférence par pas de 0,8 nm, et - une gamme d’au moins 10 longueurs d’onde d’émission, de préférence au moins 100 longueurs d’onde d’émission, et encore de préférence au moins 500 longueurs d’onde d’émission comprise entre 180 et 5500 nm, de préférence entre 200 et 900 nm et encore de préférence entre 220 et 750 nm, par pas compris entre 0,1 nm et 20 nm, de préférence par pas compris entre 0,1 et 10 nm et encore de préférence par pas de 1 nm. Les longueurs d’ondes d’excitation peuvent être choisies sur une gamme très large du spectre électromagnétique. Elles sont choisies de sorte à exciter l’échantillon. A titre illustratif, les longueurs d’ondes d’excitation peuvent être choisies parmi les gammes des rayons gamma, rayons X, les infra-rouges lointains, les micro-ondes et les ondes radio. Les longueurs d’ondes d’excitation sont de préférence choisies de l’ultraviolet à l’infrarouge. Les longueurs d’ondes d’émission peuvent être choisies sur une gamme très large du spectre électromagnétique. Elles sont choisies de sorte qu’un spectre d’émission quel que soit la gamme de mesure puisse être réalisé en fonction d’une longueur d’onde d’excitation. A titre illustratif, les longueurs d’ondes d’émission peuvent être choisies parmi les gammes des rayons gamma, rayons X, le visible, les infrarouges, les micro-ondes et les ondes radio. Les longueurs d’ondes d’émission sont de préférence choisies de l’ultraviolet à l’infrarouge. Obtention d’une matrice EEM L’obtention d’une matrice EEM d’un microorganisme à identifier peut être réalisée à l’aide d’un appareil de mesure, tel un fluorimètre, comprenant une source de lumière qui émet des longueurs d’onde d’excitation et une unité de mesure de spectre d’émission du microorganisme. La source de lumière peut être une source de lumière émettant un spectre continu ou discontinu. Une source de lumière émettant un spectre discontinu peut être choisie parmi une source de lumière réalisée à partir de plusieurs lasers ou plusieurs LEDs de longueurs d’onde différentes. Une source de lumière émettant un spectre continu peut être choisie par exemple parmi une lampe halogène, un tube fluorescent, un néon, une lampe au sodium, une lampe au xénon ou une lampe à incandescence. Dans le cas où la source de lumière est une source continue, ladite source est couplée à un monochromateur pour sélectionner une bande la plus étroite possible d’une longueur d’onde d’excitation (λ excitation ) à partir de la gamme plus large de longueurs d’onde de la source de lumière continue. Un monochromateur est par exemple un système dispersif à réseau, un prisme, un double monochromateur en mode soustractif ou additif. Le monochromateur permet d’obtenir des longueurs d’onde d’excitation comprises entre 140 et 2000 nm, de préférence entre 250 et 900 nm, par pas de 0,1 à 20 nm, de préférence par pas de 0,1 à 10 nm, et encore de préférence par pas de 0,8 nm. L’unité de mesure du spectre d’émission permet la mesure du spectre d’émission du microorganisme à identifier pour des longueurs d’onde d’émission (λ emission ) comprises entre 180 et 5500 nm, de préférence entre 200 et 900 nm et encore de préférence entre 220 et 750 nm, par pas compris entre 0,1 nm et 20 nm, de préférence par pas compris entre 0,1 et 10 nm et encore de préférence par pas de 1 nm. L’unité de mesure comprend un monochromateur et un capteur. Le monochromateur est par exemple un système dispersif à réseau, un prisme, une fente, un double monochromateur en mode soustractif ou additif. Le capteur peut être un capteur CMOS, CCD, une barrette CMOS, une barrette CCD. Un tel capteur permet une mesure rapide et fiable du spectre d’émission. L’appareil de mesure tel un fluorimètre peut être couplé à un microscope ou à une fibre. Dans le cas où l’appareil de mesure est couplé à une fibre, l’utilisateur peut avantageusement amener la fibre directement au-dessus d’un microorganisme en culture ou déposé sur un support solide afin de l’éclairer et analyser son spectre d’émission simplement et rapidement d’après la méthode de la présente invention. La fibre permet l’excitation de l’échantillon et la collection de la lumière émise par l’échantillon. La fibre optique peut être couplée à un objectif ou à une sonde de mesure, placée en bout de fibre optique, focalisant la lumière d’excitation sur le microorganisme et collectant la lumière d’émission dudit microorganisme. En fonction de l’objectif, la zone d’étude peut par exemple être une zone de diamètre moyen d’environ 50 µm 2 . La fibre optique peut être une fibre optique monomode, multimode ou à indice variable. Un tel appareil de mesure, par exemple un fluorimètre, un fluorimètre fibré ou un fluorimètre couplé à un microscope, est facile d’utilisation et limite l’encombrement du système. Il est transportable et peu onéreux. La méthode objet de la présente invention permet donc de manière avantageuse d’identifier avec précision un microorganisme à l’aide d’un équipement plus simple d’utilisation et moins encombrant que les équipements de l’art antérieur, par exemple un spectromètre MALDI-TOF. A nalyse d’une matrice EEM avec au moins une matrice EEMr de référence La comparaison de la matrice EEM du microorganisme à identifier avec au moins une autre matrice EEMr de référence comprend au moins les étapes suivantes : - le dépliement de la matrice EEM du microorganisme à identifier après l’obtention de ladite matrice en un unique vecteur caractéristique du microorganisme ; et - l’analyse en composantes principales d’une matrice de données, ladite matrice de données comprenant ledit vecteur obtenu à l’étape précédente avec au moins un autre vecteur (vr) issu du dépliement d’une matrice EEMr d’un microorganisme de référence, ladite matrice EEMr étant obtenue dans les mêmes conditions que la matrice EEM. Microorganisme de référence Une matrice EEMr de référence est une matrice Excitation-Emission obtenue selon la présente invention à partir d’un micro-organisme de référence, c’est-à-dire un microorganisme connu dont on connait de préférence au moins jusqu’à l’espèce. Un «microorganisme de référence» est par exemple une souche de microorganisme déposée dans une collection de cultures internationales (par exemple, IHEM en Belgique, CBS aux Pays-Bas, ATCC aux USA, …). Le microorganisme de référence est caractérisé par une matrice EEMr et/ou un vecteur de référence. Le vecteur de référence étant obtenu d’après la matrice EEMr. Les matrices EEMr et/ou les vecteurs caractéristiques des microorganismes de référence peuvent être conservés en mémoire sur un support électronique classique ou sur un serveur informatique. L’analyse de la matrice EEM du microorganisme à identifier est avantageusement réalisée avec un grand nombre de matrices EEMr de référence pour une grande fiabilité de l’identification du microorganisme. Dépliement de matrice Certaines méthodes connues de l’homme du métier consistent à analyser directement la matrice EEM obtenue pour le microorganisme étudié ; i.e. comparer ladite matrice EEM avec des matrices EEMr de microorganisme de référence. Cependant, ces méthodes classiques connues de l’homme du métier sont peu fiables. En effet, deux matrices EEM obtenues pour deux microorganismes différents peuvent être très proches, c’est-à-dire que les spectres d’émission obtenus pour chacun des microorganismes sont très voisins. Cette proximité peut conduire à une mauvaise identification ; ainsi, l’homme du métier mettant en œuvre une méthode connue telle que discutée plus haut peut considérer deux microorganismes identiques alors qu’ils sont en réalité différents. Afin d’éviter une telle erreur d’analyse, les inventeurs ont mis en œuvre une étape consistant à déplier la matrice EEM du microorganisme à identifier en un unique vecteur caractéristique dudit microorganisme. Dans le présent exposé, il est entendu par « vecteur » un vecteur de dimension (1,x), x étant un entier positif. Dans le présent exposé, il est entendu par « dépliement » l’opération algébrique consistant à transformer une matrice de dimension (N,M) en un vecteur de dimension (1,N*M). A l’issue de l’opération de dépliement, la valeur (i,j) de la matrice EEM devient la valeur (1,(i-1)*M+j) du vecteur ainsi obtenu, ou vecteur déplié dans la suite de l’exposé. Le vecteur déplié ainsi obtenu est caractéristique du microorganisme étudié. A chaque microorganisme étudié peut correspondre un vecteur déplié caractéristique. La matrice de données Le vecteur déplié caractéristique du microorganisme à identifier est analysé avec au moins un vecteur de référence issu du dépliement d’au moins une matrice EEMr d’un microorganisme de référence enregistrée avec les mêmes longueurs d’onde d’excitation et d’émission. Dans le cas où une matrice EEM d’un microorganisme à identifier ne comprend pas les mêmes longueurs d’onde d’étude (longueurs d’onde d’émission et d’excitation), tant en nombre qu’en termes de pas, qu’une matrice EEMr de référence, une série d’opérations mathématiques classiques permet de faire correspondre les longueurs d’étude de la matrice EEM avec les longueurs d’onde d’étude de la matrice EEMr de référence. La matrice de données normalisées comprend au moins deux lignes correspondant à un vecteur déplié du microorganisme à identifier et à un vecteur de référence. Les vecteurs dépliés composant la matrice de données sont avantageusement obtenus selon le même protocole suivant la même méthode du présent exposé. C’est-à-dire que chaque vecteur déplié caractéristique d’un microorganisme de référence ou d’un microorganisme à identifier présente les mêmes dimensions. Ainsi, dans le présent exposé, il est entendu par « matrice de données » une matrice qui comprend U lignes et V colonnes. U correspond au nombre de vecteurs dépliés composant la matrice de données normalisées, U étant un entier supérieur ou égal à 2. V correspond au nombre de colonnes des vecteurs dépliés. Dans le présent exposé, V vaut typiquement N*M. Dans le présent exposé, il est entendu par « matrice de données normalisées » une matrice de données dont toutes les valeurs sont divisées par la valeur maximale de ladite matrice de données. Cette normalisation permet d’identifier les microorganismes entre eux sans ajouter de biais de mesure. En effet, deux spectres de deux mesures d’un même microorganisme peuvent quand même présenter de légères différences en termes d’intensité (par exemple en fonction de la quantité de bactéries ou de cellules fongiques en présence). Normaliser ces spectres permet d’éviter ces biais de mesure et de concentrer l’analyse sur la forme caractéristique du spectre plutôt que sur les intensités mesurées. La matrice de données normalisées comprend U vecteurs dépliés ou individus dans la suite de l’exposé. A chaque individu est associé une succession de spectres d’émission, soit V variables quantitatives dans la suite de l’exposé. Les U individus correspondent donc aux U microorganismes étudiés, c’est-à-dire un vecteur déplié d’un microorganisme à identifier avec au moins un vecteur de référence issu du dépliement d’au moins une matrice EEM d’un microorganisme de référence. Les V variables quantitatives sont les V colonnes de la matrice de données normalisées. Une variable quantitative correspond à une mesure d’intensité lumineuse effectuée à une longueur d’onde d’émission particulière pour une longueur d’onde d’excitation donnée. Chaque individu peut être représenté par un point dans un espace réel positif R V à V dimensions. Une telle représentation est peu satisfaisante car elle rend l’identification du microorganisme très difficile. Analyse en composantes principales L'analyse en composantes principales (ACP ou PCA en anglais pour principal component analysis ), est une méthode d'analyse de données et plus généralement de statistique à plusieurs variables, qui consiste à transformer des variables liées entre elles (dites « variables corrélées » en statistique) en nouvelles variables décorrélées les unes des autres. Les nouvelles variables décorrélées entres elles obtenues à la suite de l’analyse en composantes principales sont nommées « composantes principales ». L’étape qui consiste à analyser en composantes principales la matrice de données normalisées est par exemple réalisée à l’aide d’un ordinateur ou de tout autre moyen technique permettant une analyse en composantes principales, par exemple une calculatrice ou un système de calcul embarqué. A la suite de l’analyse en composantes principales, une nouvelle matrice de données dite matrice ajustée est obtenue. La matrice ajustée comprend le même nombre de lignes et le même nombre de colonnes que la matrice de données normalisées. Les variables de la matrice ajustée sont les « composantes principales » de la matrice de données normalisées. Lesdites composantes principales sont des combinaisons linéaires des variables de la matrice de données normalisées. De façon classique, les composantes principales peuvent être classées selon la quantité d’informations qu’elles transportent. La composante principale qui transporte la plus grande quantité d’informations est la composante principale de plus grand poids. La projection des différentes observables selon cette composante principale présente la plus grande variance statistique des observables. Il s’agit donc de la variable de la matrice ajustée pour laquelle les individus présentent la plus forte décorrélation entre eux. A l’inverse, la composante principale de poids le plus faible est la variable de la matrice de données ajustée pour laquelle les individus sont le moins décorrélés. Dans le présent exposé, il est entendu par composantes principales classées des composantes principales triées selon leur poids, la composante principale de poids le plus fort est la composante principale 1 ou PC1 et la composante principale de poids le plus faible est la composante principale V ou PCV pour une matrice de donnée comprenant V variables. La première colonne de la matrice de données ajustée est la PC1, la deuxième colonne la PC2 et ainsi de suite jusqu’à la PCV. Projection du résultat de l’analyse en composantes principales Les individus de la matrice de données ajustée peuvent être projetés dans un nouveau plan R V à V dimensions dont les vecteurs directeurs sont les V composantes principales. Une telle projection est chronophage, laborieuse et nécessite des traitements mathématiques et/ou informatiques supplémentaires afin de mesurer par exemple les distances algébriques entre les différents points caractéristiques des différents individus composant la matrice de données normalisées. Les inventeurs ont mis en œuvre un procédé avantageux, simple et rapide d’utilisation comprenant une étape de projection des vecteurs de la matrice de données dans un plan défini par deux composantes principales de grands poids, avantageusement par les deux composantes principales de plus grands poids. Cette projection selon les deux composantes principales de plus grands poids permet à l’utilisateur de visualiser rapidement et sans difficultés les points caractéristiques des microorganismes, les points caractéristiques des microorganismes étant les projections des vecteurs dépliés dans un même plan. La projection peut être avantageusement réalisée par n’importe quel support permettant une visualisation du plan selon deux composantes principales différentes, de préférence les composantes principales de poids le plus fort ( i.e. PC1 et PC2). Un tel support est par exemple un écran de télévision, un écran d’ordinateur, une tablette ou un téléphone portable. Ledit support ne se trouve pas nécessairement relié ou dans la même pièce que l’appareil de mesure, c’est-à-dire le dispositif émettant les longueurs d’ondes d’excitation et mesurant le spectre d’émission. Ainsi, dans un mode de réalisation de la présente invention, l’utilisateur peut avoir un support de visualisation portable et indépendant de l’appareil de mesure mis en œuvre pour l’obtention de la matrice EEM du microorganisme à identifier. De façon avantageuse, le procédé de la présente invention peut permettre à un opérateur de réaliser les étapes de la méthode dans une même zone de travail, par exemple un laboratoire d’analyses ou de recherche, puis de recevoir les résultats de l’analyse via par exemple un téléphone portable, une tablette ou un ordinateur portable. L’opérateur peut alors continuer son travail sans devoir attendre les résultats dans le laboratoire d’analyses. Les différentes étapes de la méthode de l’invention peuvent être réalisées par des opérateurs différents et pouvant se situer dans des zones très éloignées tant que le résultat obtenu est partagé à un support de visualisation. La communication du résultat de l’identification peut être réalisée par n’importe quels moyens connus de l’homme du métier, par exemple via le réseau internet, un réseau Wi-Fi, un réseau Bluetooth ou une communication NFC. La projection des vecteurs de la matrice de données peut être réalisée dans un plan défini par deux composantes principales autres que les composantes principales de plus grands poids. Dans ce cas, l’utilisateur peut choisir les composantes principales qu’il souhaite et projeter les vecteurs de la matrice ajustée selon ces composantes principales. De même, la projection du vecteur du microorganisme à identifier et d’au moins un vecteur de référence de la matrice de données peut être réalisée dans un espace défini par au moins trois composantes principales autres que les composantes principales de plus grands poids. Dans ce cas, l’utilisateur peut choisir les composantes principales qu’il souhaite et projeter les vecteurs caractéristiques des souches de microorganismes selon ces composantes principales. Une projection mettant en jeu des couleurs ou une visualisation en trois dimensions peut permettre de visualiser facilement les projections des vecteurs dans un espace à plus de deux dimensions. La projection du résultat de l’analyse dans un plan défini par deux composantes principales, ou un espace défini par trois composantes principales peut comprendre en outre l’affichage d’une liste de distances entre les projections du microorganisme et du microorganisme de référence. Identification du microorganisme L’identification du microorganisme consiste à discriminer les points issus de la projection entres eux. Deux points proches sur la projection à deux dimensions sont caractéristiques de deux microorganismes identiques. Dans le présent exposé, deux vecteurs sont dits « proches » selon l’appréciation visuelle de l’opérateur. Dans ce cas, l’opérateur identifie directement les points issus de la projection des vecteurs caractéristiques des souches de microorganismes dans l’espace selon les composantes principales PC1 et PC2. C’est pourquoi il peut être préférable d’analyser une matrice EEM d’un microorganisme à identifier avec plusieurs matrices EEMr de référence par exemple avec au moins 5 matrices EEMr, de préférence au moins 100 matrices EEMr, et encore de préférence au moins 200 matrices EEMr. L’identification peut aussi être réalisée automatiquement par exemple par un ordinateur. Cette analyse consiste alors à calculer la distance algébrique entre deux points et à définir un scalaire en deçà duquel les points sont considérés proches. Le scalaire peut être ajusté au fil des mesures. La représentation issue de la méthode de la présente invention peut permettre la différenciation de plusieurs souches de microorganismes entre elles ou bien l’identification d’un microorganisme inconnu par comparaison avec un panel d’au moins un microorganisme de référence. Etapes optionnelles De façon optionnelle, la présente invention peut présenter des étapes intermédiaires de traitement de données. Un filtre peut être couplé à l’appareil de mesure pour couper certaine longueurs d’onde d’émission spécifiques. Un traitement numérique peut aussi être réalisé afin d’éliminer des réflexions dites parasites obtenues lors de la mesure du spectre d’émission, par exemple un traitement numérique peut être réalisé afin d’éliminer ou diminuer la diffusion Rayleigh, la rétrodiffusion, la diffusion intrinsèque à l’échantillon et non plus caractéristique du microorganisme à identifier. De préférence, l’obtention de la matrice EEM du microorganisme à identifier peut comprendre un filtrage physique (à l’aide de filtres) ou numérique du bruit lors de l’obtention de la matrice EEM. De préférence, l’obtention de la matrice EEM du microorganisme à identifier peut comprendre en outre un filtrage physique (à l’aide de filtres) ou numérique de la composante Rayleigh. Le processus d’acquisition des matrices EEM, le traitement d’image optionnel, la normalisation de la matrice de données peuvent avantageusement être automatisés. De préférence, aucun ajustement des paramètres ne sera demandé à l’opérateur. La présente invention ne nécessite que très peu de matériel biologique et de gestes techniques. La présente invention peut être rapidement implémentée dans des laboratoires d’analyses ou de recherche, mais des applications dans tous les domaines concernés par l’identification de microorganismes est possible, par exemple en microbiologie animale, en contrôle microbiologique dans l’environnement, dans l’industrie agro-alimentaire ou dans le domaine des productions végétales. D’autres caractéristiques, détails et avantages de l’invention apparaîtront à la lecture de la description détaillée ci-après, et à l’analyse des dessins annexés, sur lesquels : Fig. 1 montre un schéma illustrant un dépliement d’une matrice EEM en un vecteur caractéristique d’un microorganisme selon un mode de réalisation de l’invention ; Fig. 2 montre quatre matrices EEM obtenues pour deux souches différentes de microorganismes de référence, chacune étant analysée deux fois ; Fig. 3 montre un schéma d’un mode de réalisation de la présente invention ; Fig. 4 montre les projections de quatre matrices EEM obtenues pour deux souches différentes de microorganismes de référence, chacune étant analysée deux fois, selon des composantes principales obtenues après analyse en composantes principales des quatre matrices EEM correspondantes ; Fig. 5 montre un graphique selon PC1 et PC2 de quatre points issus de la projection de quatre vecteurs de référence. Les dessins et la description ci-après contiennent, pour l’essentiel, des éléments de caractère certain. Ils pourront donc non seulement servir à mieux faire comprendre la présente invention, mais aussi contribuer à sa définition, le cas échéant. La figure 1 illustre une opération de dépliement de matrice selon la méthode de la présente invention. La matrice EEM de la figure 1 présente un nombre entier i de lignes, i étant un entier positif compris entre 1 et N. La matrice EEM de la figure 1 présente un nombre entier j de colonnes, j étant un entier positif compris entre 1 et M. Le vecteur déplié est alors de dimension (1,N*M). L’élément (i,j) de la matrice EEM devenant l’élément (1,(i-1)*M+j) du vecteur déplié. La figure 2 illustre des matrices EEM dont l’intensité lumineuse est représentée selon une échelle de nuances de gris. Les matrices EEM sont deux matrices EEM indépendantes obtenues selon la même méthode à partir du microorganisme Candida p arapsipolis et deux matrices EEM indépendantes obtenues selon la méthode à partir du microorganisme Ca n dida t ropicalis . Les matrices EEM des microorganismes Candida p arapsipolis et Candida t ropicalis semblent identiques alors que les microorganismes étudiés sont bien différents. Il est maintenant fait référence à la figure 3. Un microorganisme étudié 20 est éclairé par une lumière de longueur d’onde d’excitation λ excitation . La source de lumière 10 est une source de lumière continue couplée à un double monochromateur en mode soustractif 11 . La source de lumière 10 est avantageusement reliée à une fibre optique 32 couplée à un objectif 31 . L’objectif 31 permet de sélectionner une zone plus ou moins grande sur le microorganisme en culture. Par exemple la zone de mesure est inférieure à 50 µm. L’objectif est choisi en fonction de la zone de mesure souhaitée. A chaque longueur d’onde d’excitation, le spectre d’émission de la souche 20 est mesuré à l’aide d’une unité de mesure 40 comprenant un double monochromateur en mode soustractif et un capteur CCD. La fibre optique couplée à l’objectif 31 refocalise la lumière excitatrice sur un point du microorganisme et la lumière réémise par le microorganisme est concentrée dans la fibre optique jusqu’à l’unité de mesure 40 . L’appareil de mesure permet ainsi d’obtenir le spectre d’émission de la souche pour une longueur d’onde d’excitation donnée. L’opération est répétée pour chacune des longueurs d’onde d’excitation d’étude. Grâce aux un ou deux monochromateurs fonctionnant en mode soustractif 11 , le changement de longueur d’onde d’excitation est très rapide et la mesure du spectre d’émission aussi. L’opération d’obtention de matrice EEM est ainsi rapide, de l’ordre de la minute. A l’issue de l’éclairage successif de la souche 20 par des longueurs d’onde d’excitation différentes, une matrice Excitation Emission EEM 100 comme illustré en figure 2 est obtenue, caractéristique du microorganisme étudié. Cette matrice EEM est dépliée selon le schéma de la figure 1 afin d’obtenir un unique vecteur caractéristique de l’échantillon. Cette opération est par exemple réalisée à l’aide d’un ordinateur 50 . Cet ordinateur comprend par exemple en mémoire 300 , un panel d’au moins un vecteur déplié de référence REF . L’au moins un vecteur de référence REF et le vecteur déplié caractéristique du microorganisme étudié sont insérés dans une matrice de données DON . La matrice de données DON est normalisée, puis analysée en composantes principales 200 pour donner une nouvelle matrice ajustée ACP . Les différents vecteurs de la matrice ACP sont alors projetés dans un plan selon PC1 et PC2 ( i.e. en générale les deux premières colonnes de la matrice ajustée) et affichés à l’aide d’un écran 60 . Exemples Candida p arapsilosis , Candida t ropicalis Il est maintenant fait référence à la figure 3. La figure 3 présente quatre matrices EEM obtenues selon un mode de réalisation de la présente invention. Les souches de microorganismes étudiées sont des souches de référence de Candida p arapsilosis et Candida tropicalis , chaque souche étant déposée en duplicate (dépôts 3 et 8 pour Candida p arapsiposis , 2 et 7 pour Candida t ropicalis ) . Les longueurs d’onde d’excitation sont choisies entre 325 et 600 nm par pas de 1 nm et les longueurs d’onde d’émission sont choisies entre 300 et 750 nm, par pas de 2 nm. Il est impossible de différencier rapidement et de façon fiable les deux souches de référence de l’exemple à partir de leur matrice EEM respectives illustrées à la figure 2. En effet, aucune différence ne semble émerger d’une telle représentation. Les matrices EEM de l’exemple sont ensuite analysées selon la méthode de la présente invention. Il est maintenant fait référence à la figure 4. Chaque ligne des matrices EEM correspond à un spectre d’émission obtenu pour une longueur d’onde d’excitation donnée. Ainsi, chaque ligne des matrices EEM peut être projetée dans un plan selon deux composantes principales préalablement calculées par analyse en composantes principales. La figure 4 présente pour chaque microorganisme étudié les projections des spectres d’émission obtenus pour chaque longueur d’onde d’excitation (numérotés dans la figure de 302 jusqu’à 450 par pas de 2). Les projections sont effectuées selon PC1 et P21, PC1 et PC3, PC1 et PC4, PC1 et PC5. Une telle représentation peut permettre de différencier les souches de Candida p arapsilosis et Candida t ropicalis . L’identification n’est pas aussi aisée et rapide qu’une identification à l’aide d’une projection des vecteurs du microorganisme à identifier et microorganisme de référence dans un plan selon PC1 et PC2. Il est maintenant fait référence à la figure 5. La figure 5 présente une projection obtenue à l’issue de la méthode de la présente invention. Les vecteurs caractéristiques des quatre microorganismes étudiés du présent exemple sont projetés dans un plan selon PC1 et PC2 illustrés à la figure 5. Le graphique de la figure 5 permet bien de différencier et d’identifier instantanément les quatre microorganismes de référence, Pichia kudriavzevii (anciennement Candida krusei ) , Candida parapsilosis , et Candida tropicalis , Candida Glabrata . Contrairement aux illustrations discutées plus haut, la figure 5 permet de séparer les quatre microorganismes d’espèces différentes en quatre points distincts dans un même plan. Les points obtenus pour les deux analyses indépendantes réalisées pour la souche de Candida parapsilosis , comme ceux obtenus pour la souche de Candida tropicalis , sont très proches, attestant de la reproductibilité de la méthode. L’identification de tels microorganismes se fait habituellement à l’aide d’un spectromètre MALDI-TOF présentant plusieurs inconvénients. La présente invention permet donc d’identifier rapidement et facilement de façon fiable des microorganismes. Une méthode pour l’identification d’un microorganisme à identifier comprenant les étapes suivantes : - l’obtention d’une matrice Excitation-Emission EEM du microorganisme à identifier, - l’analyse en composantes principales de ladite matrice EEM avec au moins une matrice EEMr de référence, - la projection du résultat de l’analyse dans un plan défini par deux composantes principales, et - l’identification du microorganisme à identifier. Méthode selon la revendication 1, où l’obtention de la matrice Excitation-Emission (EEM) du microorganisme à identifier est réalisée avec un fluorimètre. Méthode selon les revendications 1 à 2, dans laquelle la matrice EEM est obtenue pour - une gamme d’au moins 2 longueurs d’onde d’excitation, de préférence au moins 100 longueurs d’onde d’excitation, et encore de préférence au moins 500 longueurs d’onde d’excitation comprise entre 140 et 2000 nm, de préférence entre 250 et 900 nm, par pas de 0,1 à 20 nm, de préférence par pas de 0,1 à 10 nm, et encore de préférence par pas de 0,8 nm, et - une gamme d’au moins 10 longueurs d’onde d’émission, de préférence au moins 100 longueurs d’onde d’émission, et encore de préférence au moins 500 longueurs d’onde d’émission comprise entre 180 et 5500 nm, de préférence entre 200 et 900 nm et encore de préférence entre 220 et 750 nm, par pas compris entre 0,1 nm et 20 nm, de préférence par pas compris entre 1 et 10 nm et encore de préférence par pas de 1 nm. Méthode selon les revendications 1 à 3, où l’obtention de la matrice EEM à identifier est réalisée directement sur un milieu de culture sur lequel le microorganisme à identifier a été préalablement cultivé, de préférence un milieu de culture semi-solide tel un milieu gélosé. Méthode selon les revendications précédentes, dans laquelle le résultat de l’analyse en composantes principales est projeté dans un plan défini par deux composantes principales de plus grand poids. Méthode selon les revendications précédentes, dans laquelle la projection du résultat de l’analyse dans un plan défini par deux composantes principales comprend en outre l’affichage d’une liste de distances entre les projections du microorganisme et du microorganisme de référence. Support d’enregistrement non transitoire lisible par un ordinateur sur lequel est enregistré un programme pour la mise en œuvre de la méthode pour l’identification d’un microorganisme selon l’une des revendications 1 à 6 lorsque ce programme est exécuté par un processeur. Support d’enregistrement non transitoire selon la revendication 7, comprenant en outre un panel d’au moins 100 matrices EEMr de référence, de préférence au moins 200 matrices EEMr de référence, où une matrice EEMr de référence est une matrice Excitation-Emission obtenue selon la méthode pour l’identification d’un microorganisme à identifier selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, où le microorganisme à identifier est un microorganisme de référence, où le microorganisme de référence est un microorganisme dont on connait au moins jusqu’à son espèce.