Brevet FR3109818A1 — publié le 20211105

Kit pour la détection d’un agent pathogène, en particulier SARS-CoV-2, par spectroscopie Raman exaltée de surface (SERS) comprenant un tampon de lyse, des nanoparticules métalliques non magnétiques et un logiciel conçu pour détecter la présence dudit virus dans ledit échantillon et méthode de détection le mettant en œuvre. Méthode de détection de la présence d’un agent pathogène dans un liquide biologique La présente invention concerne un kit pour la détection de la présence d’un agent pathogène par spectroscopie Raman exaltée de surface (en anglais Surface Enhanced Raman Spectroscopy ou SERS), l’utilisation dudit kit associé à une méthode de détection de la présence d’un agent pathogène par SERS. Cette méthode rapide et reproductible présente une haute sensibilité et spécificité. Le domaine de l'invention est plus particulièrement celui de la détection de la présence d’un agent pathogène dans un liquide biologique. Etat de la technique antérieure Divers agents pathogènes dont les virus, sont responsables chaque année de nombreuses maladies humaines courantes, telles que les infections respiratoires hautes ( rhinites, pharyngites) , la grippe, les infections gastro-intestinales, les infections virales de la petite enfance telles que la varicelle, la rougeole et les oreillons. Certaines maladies virales ont un pouvoir de morbi ou mortalité important telles que les fièvres hémorragiques (virus EBOLA, Virus amaril), les encéphalites virales (Virus de la rage, Virus de la Dengue, Herpes simplex virus, le poliovirus), et le syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA). La rougeole et le cytomégalovirus peuvent provoquer de graves anomalies ou entrainer le décès chez les enfants à naître. Sur les 1 000 à 1 500 types de virus estimés, environ 250 provoquent des maladies chez l'homme. Plusieurs virus humains tels que le virus Epstein Barr, les papillomavirus et les virus des hépatites B et C ont également été associés au développement de cancers. Apparue en Chine fin 2019, la maladie Covid-19 est un syndrome respiratoire aigu sévère causé par le SARS-CoV-2, un virus appartenant à la famille des coronavirus. Ces derniers, très fréquents, peuvent aussi bien provoquer un simple rhume comme une infection respiratoire des voies basses de type pneumonie, à l’origine d’épidémies mortelles comme celles du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV en 2003), du Syndrome Respiratoire du Moyen-Orient (MERS-CoV en 2012), et maintenant du Covid-19 (SARS-CoV-2). Les méthodes de diagnostic viral actuelles viral implique (i) soit la recherche de la particule virale ou un de ses composants (antigènes viraux, génome viral ou bien une propriété enzymatique d’une protéine virale) et correspond au diagnostic direct ; cette recherche utilise des tests de détection rapides pour les antigènes ou des techniques de biologie moléculaire pour le génome (PCR ou RT-PCR selon la nature du génome ADN ou ARN) (ii) soit la recherche de la réponse de l’hôte vis-à-vis de virus correspondant à la détection d’anticorps spécifiques du virus recherché. Cetet recherche se fait principalement par des techniques d’immunochimie le plussouvent automatisées tels que l’ELISA (enzyme-linked-immuno-sorbent-assay). La recherche du génome viral qui est une technique sensible et spécifique largement déployée nécessite cependant un équipement lourd et couteux et est souvent chronophage. Actuellement, pour le SARS-CoV-2, seul un test de biologie moléculaire par RT-PCR sur un prélèvement naso-pharyngé permet de confirmer une infection au SARS-CoV-2. De nombreux tests sérologiques sont en cours de déploiement et de validation ciblant les protéines de surface Spike du virus permettant de mettre en évidence la présence ou non d’immunoglobulines IgG, IgM ou IgA selon les kits. La spectroscopie Raman est une méthode d’analyse chimique non invasive. C’est une spectroscopie vibrationnelle à l’instar de la spectroscopie infrarouge (IR) qui fournit une caractérisation simultanée de la composition chimique d'un matériau, de son environnement ou encore de son degré d'oxydation. C’est une technique peu sensible mais sa faible sensibilité a été compensée par l’introduction de la spectroscopie Raman exaltée de surface (en anglais Surface Enhanced Raman Spectroscopy ou SERS). Cette méthodologie repose sur l’utilisation de substrats présentant des nanostructurations ou bien décorés de nanoparticules d’or ou d’argent. Les électrons libres du métal oscillent dans ces nanostructures à la résonance plasmon (Localized Surface Plasmon Resonance: LSPR), donnant lieu à une forte amplification localisée du signal Raman de composés à proximité, jusqu’à 1012, permettant d'aller jusqu'à la détection de molécules uniques. Un problème majeur est la nature interfaciale intrinsèque du SERS, qui nécessite que les molécules s'adsorbent sur les surfaces métalliques rugueuses. Pour les molécules biologiques telles que les peptides, les protéines et les acides nucléiques, les données Raman améliorées en surface sont particulièrement difficiles à obtenir, difficiles à interpréter et presque impossibles à reproduire. Par conséquent, il existe un besoin de mettre à disposition une méthode de détection, fiable et rapide pour détecter des virus, notamment le SARS-Cov-2. Or les inventeurs ont montré que des nanoparticules métalliques non magnétiques en suspension permettaient d’obtenir facilement et rapidement des données Raman faciles à interpréter et reproductibles. Le but de la présente invention est donc de fournir un kit pour la détection d’un agent pathogène par spectroscopie Raman exaltée de surface (SERS), son utilisation et une méthode pour la détection d’un agent pathogène par spectroscopie Raman exaltée de surface (SERS). La présente invention a donc pour objet un kit pour la détection de la présence d’un agent pathogène dans un échantillon par spectroscopie Raman exaltée de surface (SERS), ledit kit comprenant un tampon de lyse, des nanoparticules métalliques non magnétiques ou un mélange de nanoparticules non magnétiques métalliques d’un premier métal et de nanoparticules non magnétiques d’un second métal, les nanoparticules du premier métal étant différentes des nanoparticules du second métal et un logiciel conçu pour détecter la présence dudit agent pathogène dans ledit échantillon. Conformément à l’invention le tampon de lyse peut être tout tampon connu de l’homme du métier apte à solubiliser les protéines des agents pathogènes telles que la capside pour les virus, les protéines membranaires ou d’enveloppe pour les bactéries ou les virus et à libérer l’ARN ou l’ADN de l’échantillon. Ce tampon doit être compatible avec la technique SERS. On peut citer à titre d’exemple des tampons de lyse à base de Tris, EDTA, d’HEPES ou de SDS. Conformément à l’invention l’échantillon peut-être choisi parmi le sang, le plasma, la salive, les larmes, le liquide naso-pharyngé, la sueur, les urines, la lymphe, le liquide céphalorachidien, du tissu humain ou animal ou des cellules humaines ou animales. L’échantillon peut être également tout liquide comme de l’eau du robinet ou de rivière ou ayant servi à rincer une surface susceptible d’être contaminée. Dans un mode de réalisation avantageux de l’invention, l’agent pathogène qui est détecté est choisi dans le groupe comprenant les virus, les prions, les bactéries, les parasites et les fragments de tous ces pathogènes. L’agent pathogène est en particulier le SARS-CoV-2. Parmi les virus, on peut citer à titre d’exemple les virus à ARN simple brin ou monocaténaire, les virus à ARN double brin ou bicaténaire, les rétrovirus, les virus à ADN simple brin, les virus à ADN double brin, tels qu’ils sont définis par le Comité International de taxonomie des virus (International Committee on Taxonomy of Viruses ou ICTV) que l’on trouve sur le lien suivant : https://talk.ictvonline.org/ictv-reports/ictv_online_report/ Parmi les prions, on peut citer à titre d’exemple les encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST) comme par exemple les différentes formes de la maladie de Creutzfeldt-Jakob, l’insomnie fatale familiale (IFF), le syndrome de Gerstmann-Sträussler-Scheinker (SGSS) et le Kuru chez l’homme et chez l’animal, la tremblante du mouton et de la chèvre ainsi que l’encéphalopathie spongiforme bovine. Parmi les parasites, on peut citer à titre d’exemple les parasites du genre Plasmodium, responsable du paludisme ou malaria, les Sarcocystes, les protozoaires tels que Toxoplasma gondii, responsable de la toxoplasmose. Parmi les bactéries, on peut citer à titre d’exemple, les bactéries pathogènes obligatoires comme Corynebacterium diphtheriae agent de la diphtérie, Mycobacterium tuberculosis qui provoque la tuberculose, Mycobacterium leprae responsable de la lèpre ; les bactéries pathogènes accidentelles comme Clostridium tetani responsable du tétanos et Vibrio cholerae qui provoque le choléra ; les bactéries pathogènes opportunistes comme Pseudomonas aeruginosa, ou les Staphylocoques de la flore cutanée. Dans un mode de réalisation avantageux de l’invention, les nanoparticules métalliques non magnétiques présentent un diamètre moyen compris entre 50 et 200 nm (incluant 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200 nm), avantageusement compris entre 100 et 200 nm (incluant 100, 150 et 200 nm), encore plus avantageusement compris entre 100 et 150 nm (incluant 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150 nm). Dans un autre mode de réalisation avantageux de l’invention, les nanoparticules métalliques non magnétiques sont des nanoparticules d’or, d’argent, de cuivre ou d’un alliage à base d’un de ces métaux. Dans le cas des mélanges de nanoparticules, les nanoparticules métalliques non magnétiques du premier métal sont des nanoparticules d’or et les nanoparticules métalliques non magnétiques du second métal sont des nanoparticules d’argent. Conformément à l’invention les nanoparticules comprennent substantiellement un métal unique mais peuvent aussi comprendre des alliages binaires du métal principal qui les constitue. Ces nanoparticules sont disponibles dans le commerce sous forme de solutions ou de suspension colloïdale. Conformément à l’invention dans le cas des mélanges, le rapport entre les deux types de nanoparticules est compris entre 5/95 et 95/5 et avantageusement compris entre 40/60 et 60/40, en particulier 50/50. Ainsi il peut y avoir dans le mélange de 5 % de particules d’or et 95 % de nanoparticules d’argent exprimés en masse par rapport à la masse totale de nanoparticules à 95 % de particules d’or et 5 % de nanoparticules d’argent exprimés en masse par rapport à la masse de nanoparticules. Dans un mode de réalisation avantageux de l’invention, le mélange contient 50 % en masse de nanoparticules d’or et 50 % en masse de nanoparticules d’argent exprimés en masse par rapport à la masse totale de nanoparticules. Dans le kit selon l’invention, la solution ou la suspension de tampon de lyse contenant les nanoparticules ou le mélange de nanoparticules non magnétiques d’un premier métal et de nanoparticules non magnétiques d’un second métal, les nanoparticules du premier métal étant différentes des nanoparticules du second métal, peut se présenter dans un récipient qui peut être par exemple un tube à essai muni d’un système de fermeture ou un flacon muni d’un système de fermeture, ou un tube conique muni d’un système de fermeture comme par exemple un tube de type Eppendorf®. La présente invention a également pour objet l’utilisation d’un kit selon l’invention comprenant un tampon de lyse et des nanoparticules métalliques non magnétiques ou un mélange de nanoparticules non magnétiques d’un premier métal et de nanoparticules non magnétiques d’un second métal, les nanoparticules du premier métal étant différentes des nanoparticules du second métal, et un logiciel conçu pour détecter la présence d’un agent pathogène dans un échantillon par spectroscopie Raman exaltée de surface (SERS). La présente demande a également pour objet une méthode de détection de la présence d’un agent pathogène dans un échantillon susceptible de le contenir par spectroscopie Raman exaltée de surface (SERS), ladite méthode comprenant a) la mise en contact dudit échantillon avec des nanoparticules métalliques non magnétiques ou avec un mélange de nanoparticules non magnétiques d’un premier métal et de nanoparticules non magnétiques d’un second métal, les nanoparticules du premier métal étant différentes des nanoparticules du second métal pour obtenir une solution ou une suspension et la solution de lyse ? b) le dépôt de ladite solution ou de ladite suspension sur un support et c) la détection des signaux SERS émis par ledit agent pathogène et ses constituants, les signaux indiquant la présence dudit agent pathogène dans l’échantillon. L’ensemble des étapes a) à c) se fait à température ambiante. Cette méthode de détection permet de détecter la présence d’une infection due à un pathogène et de distinguer dans une population les individus malades, porteurs du pathogène et appelés individus positifs des individus sains, non porteurs du pathogène et appelés individus négatifs. Lorsque l'individu a une infection mais ne présente pas de symptômes de maladie alors la détection de la présence du pathogène sera prédictive d’un risque de développer la maladie. La méthode selon l’invention peut être utilisée pour surveiller les progrès d'une thérapie antimicrobienne dans une infection active ou latente chez un individu. Une diminution de la quantité de pathogène et / ou une augmentation de cette quantité indique que la thérapie est efficace ou non. La méthode selon l’invention peut être utilisée pour évaluer l'efficacité de médicaments ou de vaccins anti-pathogènes connus ou pour tester l'efficacité de nouveaux médicaments ou vaccins anti-microbiens potentiels. Une diminution de la quantité de l’agent pathogène et / ou une augmentation du de cette quantité indique que la thérapie est efficace ou non. Dans un premier mode de réalisation de la méthode selon l’invention on ajoute un volume d’échantillon à tester d’environ 10 à 200 microlitres à environ 10 à 2000 microlitres d’un solution ou d’une suspension de tampon de lyse contenant des nanoparticules métalliques non magnétiques ou un mélange de nanoparticules non magnétiques d’un premier métal et de nanoparticules non magnétiques d’un second métal, les nanoparticules du premier métal étant différentes des nanoparticules du second métal. Après homogénéisation par agitation par pipetage successifs (pas besoin de vortex) , on réalise un dépôt sur un support en aluminium ou un matériau recouvert d’une feuille d’aluminium. Le support peut-être n’importe quel type de support couramment utilisée pour la SERS. Dans ce mode de réalisation, l’échantillon est mis simultanément en contact avec les nanoparticules métalliques non magnétiques et avec le tampon de lyse. Dans un autre mode de réalisation de la méthode selon l’invention, l’échantillon à tester est mis en contact avec le tampon de lyse puis mélangé à un culot de nanoparticules obtenu par centrifugation d’une suspension colloïdales de nanoparticules métalliques non magnétiques telles que définies précédemment. Après homogénéisation par agitation, on réalise un dépôt sur un support en aluminium ou sur un matériau recouvert d’une feuille d’aluminium. Le support peut-être n’importe quel type de support couramment utilisée pour la SERS. Pour obtenir le culot de nanoparticules le mélange de nanoparticules tel qu’il a été défini précédemment est centrifugé dans des conditions connues de l’homme du métier par exemple à une vitesse de centrifugation de 1500 à 18 000g pendant un temps compris entre 1 et 30 minutes. Conformément à l’invention dans les deux modes de réalisation décrits précédemment, le dépôt est séché dans des conditions classiques connues de l’homme du métier. Conformément à l’invention, tout système de spectromètre Raman approprié connu dans la technique et disponible dans le commerce. Les dispositifs de détection, tels que les détecteurs optiques, les sources de rayonnement et les systèmes informatiques, les microprocesseurs et les logiciels et algorithmes informatiques, peuvent être utilisés dans n'importe quelle combinaison pour mettre en pratique la méthode selon l’invention. En conséquence, dans certains modes de réalisation, un logiciel ou d'autres instructions lisibles par ordinateur peuvent être utilisés pour interpréter, analyser, compiler ou autrement analyser des données de sortie. Le logiciel ou un autre système informatique peut être utilisé pour afficher, stocker ou transmettre des données de sortie, que ce soit sous forme numérique ou autre, à un ou plusieurs utilisateurs. Pour un pathogène donné, la sélection des longueurs d’onde est réalisée par tout technique connue de l’homme du métier ou décrite dans la littérature, notamment par le biais d’un algorithme tel décrit par Marois M. et al. (J. Of Biomedical Optics, (2018), 23(7), 071202) ou par Chen Y. et al. (Molecules (2019) 24, 421) ou par Luke G.P. et al. (Photoacoustics, (2013), 1(2), 36-42). Cette méthode permet de mesurer les spectres SERS de différents pathogènes. Chaque pathogène peut être détecté parce qu’il possède un spectre SERS unique qui est sensiblement différent, et donc distinguable, des spectres SERS d'autres pathogènes. Ainsi les pathogènes, notamment les virus, ont une «empreinte» SERS unique qui permet de distinguer une biomolécule d'intérêt ou une combinaison de biomolécules particulières des autres biomolécules ou des milieux de base. Typiquement en présence de pathogène inactivé ou en l’absence de pathogène, on obtient une première signature spectroscopique Raman à surface augmentée et lorsque le pathogène est présent on obtient une seconde signature spectroscopique Raman à surface augmentée différente de la première. Les inventeurs ont trouvé que la présence du SARS-CoV-2 dans un échantillon pour des nanoparticules d’or est caractérisée par la présence d’un pic à 660nm, d’un pic entre 1250 et 1500 nm et d’un pic à 2100 nm. On dit alors que le patient chez lequel l’échantillon a été prélevé est positif SARS-CoV-2. En revanche en l’absence de virus dans un échantillon, seul un pic entre 1100 et 1250 nm est visible. Le patient est alors déclaré négatif au SARS-CoV-2. L’invention a également pour objet l’utilisation d’un kit selon la présente invention dans lequel le logiciel fournit en outre un diagnostic de la maladie liée à la présence dudit agent pathogène. Description des figures et modes de réalisation D’autres avantages et particularités de l’invention apparaîtront à la lecture de l’exemple 1 et des figures suivantes : illustre les résultats obtenus avec des prélèvements naso-pharyngés de 20 personnes différentes avec 3 échantillons pour chaque prélèvement. Les conditions expérimentales sont celles de l’exemple 1. donne les spectres obtenus dans les conditions de l’exemple 1 pour des patients positifs chez lesquels on a détecté la présence de Covid-19 (en noir) et chez des patients négatifs chez lesquels on n’a pas détecté la présence du Covid-19. (en gris) illustre la présence des pics chez des patients positifs (+) et chez des patients négatifs (x) lorsqu’on utilise des nanoparticules d’or. Exemple 1 : Détection de la présence du SARS-CoV-2 Matériel et méthode Des prélèvements nasopharyngés sont réalisés chez des personnes. Les prélèvements sont traités par un tampon de lyse et l’ARN est isolé par absorption sur une matrice de silice et lavage. Une solution contenant des particules d’or de diamètre moyen de 150 nm à une concentration de 0,15 mg/ml (AUNP-COL de Metrohm) est centrifugé à 18 000 g pendant 1 minute. 30 microlitres de l’échantillon contenant l’ARN purifié sont mis en contact avec le culot de nanoparticules puis l’ensemble est agité pour obtenir un milieu homogène. Des dépôts de 10 microlitres sont faits sur une lame recouverte de papier d’aluminium et les spectres sont réalisés avec un senseur ST-Ram de chez Metrohm d’une puissance d’environ 500 mW avec une longueur d’onde de 785 nm. Il est utilisé entre 10 et 100 % de sa puissance, avantageusement entre 50 et 100 % de sa puissance. Le temps d’intégration de la mesure est compris entre 15 et 60 secondes. 1.2. Résultats : Ils sont donnés dans la figure 1. La méthode selon la présente invention est sensible puisqu’elle permet une bonne classification des patients (voir la colonne sensibilité du tableau de la figure 1) donc elle donne peu de patients faux positifs ; elle est spécifique (voir la colonne spécificité du tableau de la figure 1) donc elle permet de distinguer les patients négatifs. Elle présente un index de Youden très élevé (Youden W.J. Index for rating diagnostic tests Cancer, 3, 32-35). Cet index est calculé selon la formule suivante (sensibilité + spécificité)-1. Les pics spécifiques du SARS-CoV-2 sont donnés dans les figures 2 et 3. La présence du SARS-CoV-2 dans un échantillon pour des nanoparticules d’or est caractérisée par la présence d’un pic à 660nm, d’un pic entre 1250 et 1500 nm et d’un pic à 2100 nm. On dit alors que le patient chez lequel l’échantillon a été prélevé est positif SARS-CoV-2. En revanche en l’absence de virus dans un échantillon, seul un pic entre 1100 et 1250 nm est visible. Le patient est alors déclaré négatif au SARS-CoV-2. Kit pour la détection de la présence d’un agent pathogène dans un échantillon par spectroscopie Raman exaltée de surface (SERS), ledit kit comprenant un tampon de lyse, des nanoparticules métalliques non magnétiques ou un mélange de nanoparticules non magnétiques d’un premier métal et de nanoparticules non magnétiques d’un second métal, les nanoparticules du premier métal étant différentes des nanoparticules du second métal et un logiciel conçu pour détecter la présence dudit agent pathogène dans ledit échantillon. Kit selon la revendication 1 caractérisé en ce que l’agent pathogène qui est détecté est choisi dans le groupe comprenant les virus, les prions, les parasites et les bactéries et est en particulier le SARS-CoV-2. Kit selon l’une quelconque des revendications précédentes dans lequel les nanoparticules métalliques non magnétiques présentent un diamètre moyen compris entre 50 et 200 nm, avantageusement compris entre 100 et 200 nm, encore plus avantageusement compris entre 100 et 150 nm. Kit selon l’une quelconque des revendications précédentes dans lequel les nanoparticules métalliques non magnétiques sont des particules d’or, d’argent, de cuivre ou d’un alliage à base d’un de ces métaux. Kit selon l’une quelconque des revendications précédentes dans lequel les nanoparticules métalliques non magnétiques du premier métal sont des nanoparticules d’or et les nanoparticules métalliques non magnétiques du second métal sont des nanoparticules d’argent. Utilisation d’un kit pour détecter la présence d’un agent pathogène dans un échantillon par spectroscopie Raman exaltée de surface, ledit kit comprenant un tampon de lyse et des nanoparticules métalliques non magnétiques ou un mélange de nanoparticules non magnétiques d’un premier métal et de nanoparticules non magnétiques d’un second métal, les nanoparticules du premier métal étant différentes des nanoparticules du second métal et un logiciel conçu pour détecter la présence d’un agent pathogène dans un échantillon par spectroscopie Raman exaltée de surface (SERS). Méthode de détection de la présence d’un agent pathogène dans un échantillon susceptible de le contenir par spectroscopie Raman exaltée de surface (SERS) , ladite méthode comprenant a) la mise en contact dudit échantillon avec des nanoparticules métalliques non magnétiques ou un mélange de nanoparticules non magnétiques d’un premier métal et de nanoparticules non magnétiques d’un second métal, les nanoparticules du premier métal étant différentes des nanoparticules du second métal pour obtenir une solution ou une suspension, b) le dépôt de ladite solution ou de ladite suspension sur un support et c) la détection des signaux SERS émis par ledit agent pathogène, les signaux indiquant la présence dudit agent pathogène. Méthode selon la revendication 7 caractérisée en ce que l’échantillon est mis en solution dans un tampon de lyse avant la mise en contact avec un culot de centrifugation contenant lesdites nanoparticules métalliques non magnétiques. Méthode selon la revendication 7 caractérisée en ce que l’échantillon est mis simultanément en contact avec lesdites nanoparticules métalliques non magnétiques et avec un tampon de lyse. Méthode selon l’une quelconque des revendications 7 à 9 caractérisée en ce que les nanoparticules métalliques non magnétiques présentent un diamètre compris entre 50 et 200 nm, avantageusement compris entre 100 et 200 nm, encore plus avantageusement compris entre 100 et 150 nm. Méthode selon l’une quelconque des revendications 7 à 10 caractérisée en ce que les nanoparticules métalliques non magnétiques du premier métal sont des particules d’or et les nanoparticules métalliques non magnétiques du second métal sont des nanoparticules d’argent. Méthode selon l’une quelconque des revendications 7 à 11 caractérisée en ce que l’agent pathogène qui est détecté est choisi dans le groupe comprenant les virus, les prions, les parasites et les bactéries et est en particulier le SARS-CoV-2. Utilisation selon la revendication 6 caractérisé en ce que ledit logiciel fournit en outre un diagnostic in vitro de la maladie liée à la présence dudit agent pathogène.