Brevet FR3101356A1 — publié le 20210402

L’invention concerne un procédé in vitro ou ex vivo de conservation d’un tissu ovarien germinal ou de cellules ovariennes germinales, ou de folliculogénèse à partir dudit tissu ou cellules ovariennes germinales, comprenant la culture du tissu ovarien germinal ou des cellules ovariennes germinales dans un bioréacteur dont les parois sont composées d’un biomatériau sous forme d’un hydrogel. Procédés in vitro de culture de tissu ovarien L’invention concerne des procédés in vitro de culture de tissu ovarien, qui permettent une conservation du tissu et une folliculogénèse . Arrière-plan technologique Les ovaires sont les glandes sexuelles féminines qui mesurent en moyenne 3 x 1,8 cm 2 chez la femme. Ces glandes ont un rôle de sécrétion des stéroïdes sexuels (œstrogènes, progestérone et androgènes) et ont également un rôle de reproduction par la folliculogenèse et la maturation ovocytaire. Ces fonctions sont exercées lors de la puberté de manière cyclique, jusqu’à la ménopause. L’ovaire est composé principalement du cortex qui contient les follicules et qui est le siège de la folliculogenèse, et de la médullaire où se situent les vaisseaux et les tissus de soutien. Le stock de follicules primordiaux est constitué durant la vie intra-utérine. Il atteint son maximum au 7 ème mois de vie intra-utérine. Puis le nombre de follicules contenu dans le cortex ovarien diminue avec l’âge. A la naissance, chaque ovaire contient en moyenne 500 000 follicules, soit au total un million de follicules, mais cette estimation est variable selon les individus. Ce nombre chute à 100 000 à 20 ans, 10 000 à 40 ans et 100 à 45 ans. La folliculogenèse est le développement du follicule du stade primordial jusqu’au stade tertiaire dans le cortex ovarien. Elle ne peut s’effectuer complètement qu’à partir de la puberté. Le follicule primordial se transforme en follicule primaire, secondaire puis tertiaire. Moins de 0,1% des follicules primordiaux atteignent le stade de follicule tertiaire. La figure 15 montre les différents stades de développement des follicules (voir aussi Yilmaz Guzel et Ozgur Oktem, Mol Reprod Dev.2017;84:544–559). Chez la femme, environ 450 ovocytes sont ovulés au cours d’une vie. Cependant certains traitements thérapeutiques à effet gonadotoxique tels qu’une chimiothérapie ou radiothérapie, peuvent conduire à une atteinte du potentiel reproductif féminin. Pour parer à cette insuffisance ovarienne prématurée, des techniques de préservation existent. La congélation des ovaires, qui est une des méthodes de préservation de fertilité, est la seule méthode pouvant être proposée aux jeunes filles prépubères et aux femmes nécessitant un traitement en urgence. Elle consiste à prélever chirurgicalement un ovaire puis à congeler le cortex jusqu’à la demande d’utilisation par la patiente pour un projet parental. Le cortex ovarien est alors décongelé et greffé. Cependant les protocoles d’autoconservation puis de greffe du tissu ovarien chez la femme restent à améliorer. De plus, chez les patientes souffrant de pathologies malignes, l’inconvénient majeur de l’utilisation de ce tissu ovarien cryopréservé est le risque de réintroduction de cellules malignes lié à l’autogreffe. Une technique alternative à l’autogreffe est la technique de folliculogenèse in vitro . Cependant aujourd’hui cette technique n’est pas encore au point, et à l’heure actuelle aucune équipe n’a réussi à obtenir des ovocytes matures fécondables. Une folliculogénèse complète in vitro nécessite en effet un temps de culture long, d’environ trois mois pour débuter au stade de follicule primordial et s’achever au stade de follicule mûr contenant un ovocyte mûr fécondable. Il existe donc toujours un besoin en une technique de conservation in vitro et de folliculogénèse in vitro qui permettrait d’une part de préserver le tissu ovarien in vitro sans congélation, et d’autre part d’obtenir des ovocytes matures, notamment à partir des follicules de réserve. Procédé in vitro ou ex vivo de conservation d’un tissu ovarien germinal ou de cellules ovariennes germinales, comprenant la culture du tissu ovarien germinal ou des cellules ovariennes germinales dans un bioréacteur dont les parois sont composées d’un biomatériau sous forme d’un hydrogel qui permet des échanges d’au moins de nutriments et des échanges gazeux avec le milieu de culture dans lequel le bioréacteur est placé, la culture du tissu ovarien étant conduite de préférence de 1 mois à 6 mois. Procédé selon la revendication 1, le milieu de culture dans lequel le bioréacteur est placé comprenant un ou plusieurs composants parmi facteurs de croissance, hormones, vitamines, acides aminés, antibiotiques, antifongiques, protéines telles qu’albumine, alpha-globuline, beta-globuline, métabolites. Procédé in vitro ou ex vivo de folliculogenèse à partir d’un tissu ovarien germinal ou de cellules ovariennes germinales, comprenant la maturation du tissu ovarien germinal ou des cellules ovariennes germinales dans un bioréacteur dont les parois sont composées d’un biomatériau sous forme d’un hydrogel qui permet des échanges d’au moins de nutriments et des échanges gazeux avec le milieu de culture dans lequel le bioréacteur est placé. Procédé selon la revendication 3, le milieu de culture dans lequel le bioréacteur est placé comprenant au moins un activateur de la folliculogénèse, de préférence de l’activine A. Procédé selon l’une des revendications 1 à 4, dans lequel le bioréacteur est fermé ou au moins partiellement fermé. Procédé selon l’une des revendications 1 à 5, dans lequel le tissu ovarien est i) un fragment d’ovaire comprenant de la corticale et de la médullaire, ii) un ovaire entier, ou iii) un filtrat tissulaire comprenant des follicules primordiaux associés à des cellules de la médullaire ovarienne, pouvant être obtenu par dissociation et filtration d’un tissu ovarien. Procédé selon l’une des revendications 1 à 6, dans lequel le bioréacteur a une forme de tube creux, de préférence ligaturé ou obstrué, au moins partiellement, à ses extrémités, de préférence d’un diamètre extérieur d’environ 1,5 mm à 3 cm, de préférence 6mm à 2cm, ou une forme sphérique ou hémisphérique, de préférence d’un diamètre extérieur d’environ 2 mm à 10 cm, de préférence 6 mm à 2 cm. Procédé selon l’une des revendications 1 à 7, dans lequel les parois du bioréacteur sont d’une épaisseur de 0,1 à 10mm, de préférence 0,5 à 2mm. Procédé selon l’une des revendications 1 à 8, dans lequel le biomatériau sous forme d’hydrogel comprend un polysaccharide, un mélange de polysaccharides, ou une protéine ou un mélange de protéines, de préférence du collagène, ou encore un mélange de polysaccharide(s) et de protéine(s). Procédé selon la revendication 9, dans lequel le polysaccharide est un chitosane, de l’acide hyaluronique, un alginate, une pectine ou un polysaccharide modifié tel que la carboxyméthylcellulose (CMC), seul ou en mélange. Procédé selon la revendication 10, dans lequel le biomatériau est un hydrogel comprenant de 1,5 à 6% de chitosane et de 94 à 98,5% d’eau. Procédé selon la revendication 9 ou 10, dans lequel le biomatériau est un hydrogel de chitosane ayant un degré d’acétylation inférieur ou égal à 30%, de préférence inférieur ou égal à 15%, ou de préférence encore inférieur ou égal à 5%, et une masse molaire supérieure à 300 000 g/mol, de préférence de l’ordre de 300 000 à 600 000 g/mol. Procédé selon l’une des revendications 1 à 12, comprenant au moins une étape de transfert du tissu ovarien ou des cellules ovariennes en culture, vers un bioréacteur de plus grande taille, permettant la croissance du tissu ovarien et/ou du ou des follicules.