Brevet FR3110246A1 — publié le 20211119

Procédé de détection d’une forme agrégée en feuillets β d’une protéine formant des agrégats de type feuillets β L’invention concerne un procédé in vitro de détection dans un échantillon d’une forme agrégée en feuillets β d’une protéine formant des agrégats de type feuillets β (PAFβ) comprenant une étape qui consiste à ajuster le pH d’un échantillon susceptible de contenir une PAFβ à un pH allant de 9,7 à 13,2 pour désagréger tout ou partie de la PAFβ afin d’obtenir une forme non-agrégée en feuillets β de la protéine formant des agrégats de type feuillets β (PNAFβ) et la mesure de la teneur en PNAFβ avec une méthode immunologique appropriée à un pH allant de 6 à 9. FIGURES procédé de détection d’une forme agrégée en feuillets β d’une protéine formant des agrégats de type feuillets β L’invention concerne un procédé in vitro de détection dans un échantillon d’une forme agrégée en feuillets β d’une protéine formant des agrégats de type feuillets β (PAFβ) comprenant une étape de désagrégation d’une PAFβ afin d’obtenir une forme non-agrégée en feuillets β de la protéine formant des agrégats de type feuillets β (PNAFβ) et une étape de mesure de la teneur en PNAFβ. L’accumulation de protéines souvent mal repliées conduit à leur agrégation dans la cellule, entrainant des dérégulations cellulaires, caractéristiques de certaines pathologies neurodégénératives notamment. Les peptides amyloïdes β et plus particulièrement le peptide amyloïde β 1-42 ont été largement étudiés pour la formation de fibrilles contenant des feuillets β puis de plaques dans la maladie d’Alzheimer. Le processus d’agrégation des peptides amyloïdes β est bien caractérisé et ce processus dépend d’un certain nombre de facteurs notamment leur concentration, le pH et la température. De nombreuses autres protéines, telles que les protéines de liaison à l’ARN et à l’ADN, qui contiennent un domaine de type prion (« prion like-domain ») peuvent également former des agrégats du même type [1]. Les protéines contenant un domaine de type prion sont des protéines formant des agrégats de type feuillets β (PFβ). Les domaines de type prion contiennent des acides aminés hydrophobes favorisant la formation de fibrilles riches en feuillets β. Les formes agrégées en feuillets β d’une protéine formant des agrégats de type feuillets β (PAFβ) ne sont pas solubles dans l’eau à pH neutre. Le diagnostic actuel de ces maladies neurodégénératives induites par une PAFβ repose le plus souvent sur l’imagerie, qui complète l’examen clinique et neuropsychologique. C’est une procédure lourde et onéreuse qui requiert plusieurs étapes de diagnostic. Différentes techniques de diagnostic permettant de mettre en évidence ou de quantifier l’agrégation ou l’oligomérisation des PFβ dans un échantillon biologique ont également été décrites dans la littérature. Des techniques d’analyse structurale ont permis de mettre en évidence les différents niveaux d’agrégation de certaines PFβ, notamment les peptides amyloïdes β et les protéines Tau ou TDP-43 : microscopie électronique, microscopie de force atomique, Cryo EM, Dichroïsme Circulaire, Résonance Magnétique Nucléaire, diffraction aux rayons X. Néanmoins ces techniques permettent difficilement de mesurer la teneur, même de manière relative, en agrégats présents dans un échantillon. L’effet éventuel de composés sur le niveau d’agrégation (notamment l’inhibition de l’agrégation) d’une PFβ ne peut donc pas vraiment être étudié par ces techniques. Des techniques capables de séparer des protéines en fonction de leur poids moléculaires permettent de discriminer les PAFβ de haut poids moléculaire des PNAFβ de faible poids moléculaire. Certaines d’entre elles permettent aussi de discriminer des agrégats de différentes tailles. On peut citer par exemple l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE et SDS-PAGE) associé ou non à une détection par Western Blot. Les conditions expérimentales actuellement décrites dans ces techniques peuvent toutefois fausser la mesure du niveau d’agrégation. C’est notamment le cas pour le SDS-PAGE dans lequel l’utilisation combinée d’un détergent et d’un agent réducteur (DTT, beta-mercaptoethanol ou TCEP) peut dissocier tout ou partie des agrégats. Du fait de leurs contraintes expérimentales (temps de mise en œuvre, quantité importante d’échantillons, manque de sensibilité), ces techniques ne sont pas vraiment adaptées à la caractérisation de composés capables de moduler le niveau d’agrégation des PFβ. Des techniques basées sur de l’immuno-détection ont également été décrites : - Filtration combinée à de l’immuno-détection : dans cette méthode l’échantillon biologique est filtré sur une membrane capable de retenir les espèces de haut poids moléculaire et notamment les PAFβ. On applique ensuite sur la membrane un anticorps spécifique de la PAFβ marqué de manière directe ou indirecte avec un traceur colorimétrique ou fluorescent, voire luminescent. Le signal mesuré est directement proportionnel à la quantité de PAFβ. Cette méthode peut être adaptée à un format microplaque pour étudier les paramètres d’agrégation d’une protéine amyloïde ou bien l’effet d’un composé sur son niveau d’agrégation. Toutefois, l’automatisation et le débit de la méthode sont limités du fait des étapes de filtration et lavages que nécessite cette technique [2]. - ELISA : différentes stratégies de test ELISA ont été décrites afin de permettre la caractérisation de l’agrégation des PFβ. La première stratégie consiste à utiliser un même anticorps pour la capture des PAFβ sur la phase solide et comme traceur permettant leur détection. Cette méthode permet de détecter uniquement les PAFβ qui possèdent plusieurs épitopes de l’anticorps utilisé en capture et en détection. A l’inverse, l’anticorps de capture et l’anticorps de détection ne pourront donc pas se fixer simultanément sur une PNAFβ car celle-ci ne possède qu’un seul épitope reconnu par l’anticorps utilisé. Aucun signal ne sera donc généré en présence de PNAFβ [3]. La seconde stratégie consiste à associer dans un test ELISA un anticorps reconnaissant spécifiquement des PAFβ avec un anticorps reconnaissant toutes les formes de PFβ présentes dans l’échantillon (PAFβ et PNAFβ) [4]. Dans ce format, l’anticorps spécifique des PAFβ est généralement l’anticorps de capture mais un format utilisant celui-ci comme anticorps de détection a aussi été décrit [5]. Une troisième stratégie consiste à utiliser deux anticorps différents reconnaissants tous les deux la PAFβ d’intérêt. Cette dernière stratégie semble améliorer la spécificité de détection des agrégats [6]. Tous ces tests ELISA permettent de déterminer le niveau d’agrégation des PFβ d’intérêt et de déterminer l’effet d’un composé sur leur niveau d’agrégation Néanmoins, la détection seule de la PAFβ ne suffit pas car, à un signal donné, on ne peut pas se rendre compte du niveau d’agrégation par rapport à l’état initial, à moins de comparer les mesures à une gamme standard qui biaise forcément les mesures de l’échantillon biologique testé. - TR-FRET (Transfert d’énergie en temps résolu) : des kits basés sur cette méthode ont été développés et commercialisés afin de détecter l’agrégation de TAU et de l’alpha-synucléine dans des échantillons biologiques (voir site Web Cisbio, références commerciales 6FTAUPEG et 6FASYPEG). Ces tests utilisent un même anticorps marqué respectivement au donneur et à l’accepteur de fluorescence. En présence d’une PAFβ, du fait de l’agrégation, les deux anticorps marqués se lieront simultanément à la PAFβ induisant un transfert d’énergie entre le donneur et l’accepteur de fluorescence situés à proximité l’un de l’autre. L’anticorps accepteur émettra alors un signal de FRET spécifique qui sera mesuré en temps résolu. En revanche, seul un des deux anticorps pourra se lier sur la PNAFβ empêchant ainsi toute proximité entre le donneur et l’accepteur. Il sera alors impossible d’obtenir un signal de FRET sur la PNAFβ. Ces kits permettent de déterminer le niveau d’agrégation de la PFβ d’intérêt et de déterminer l’effet d’un composé sur son niveau d’agrégation dans des formats miniaturisés et à haut débit. Néanmoins, ces kits nécessitent l’utilisation d’anticorps capables de reconnaitre des épitopes de PFβ même si celles-ci sont agrégées, ce qui s’avère quelquefois limitant voire bloquant dans le développement des tests de détection, étant donné que les immunisations sont généralement réalisées avec des PNAFβ, ce qui peut rendre difficile l’obtention d’anticorps anti-PAFβ. Les méthodes décrites dans l’art antérieur visent donc à détecter directement une PAFβ dans un échantillon, notamment en utilisant un ou plusieurs ligands de la PAFβ. Néanmoins, détecter directement la PAFβ peut rendre ces techniques difficiles à mettre en œuvre, peu précises et/ou peu adaptées à une utilisation à grande échelle. De plus, la détection seule de la PAFβ ne suffit pas car, à un signal donné, on ne peut pas se rendre compte du niveau d’agrégation par rapport à l’état initial, à moins de comparer les mesures à une gamme standard qui biaise forcément les mesures de l’échantillon biologique testé. Un diagnostic des maladies liées à l’agrégation d’une PFβ plus aisé, plus rapide et plus fiable est donc nécessaire. La Demanderesse a mis au point un protocole simple et facile à mettre en œuvre qui permet de désagréger tout ou partie de la PAFβ présente dans un échantillon afin d’obtenir une PNAFβ. Ce protocole a permis à la Demanderesse de mettre au point un procédé de détection de la PAFβ réalisé au travers de la mesure de la teneur en PNAFβ, ce qui permet de s’affranchir de toutes les contraintes liées à la détection de la PAFβ. Selon un premier aspect, l’invention concerne un procédé in vitro de détection dans un échantillon d’une forme agrégée en feuillets β d’une protéine formant des agrégats de type feuillets β (PAFβ), comprenant les étapes suivantes : a) Dans un premier contenant : a1) introduire un échantillon susceptible de contenir une PAFβ, a2) ajuster le pH à un pH allant de 9,7 à 13,2 pour désagréger tout ou partie de la PAFβ afin d’obtenir une forme non-agrégée en feuillets β de la protéine formant des agrégats de type feuillets β (PNAFβ), a3) ajuster le pH à un pH allant de 6 à 9, b) Mesurer la teneur en PNAFβ dans le premier contenant avec une méthode immunologique appropriée ; c) Dans un deuxième contenant : c1) introduire un même échantillon qu’à l’étape a1), c2) ajuster le pH à un pH allant de 6 à 9 ; d) Mesurer la teneur en PNAFβ dans le deuxième contenant avec la même méthode qu’à l’étape b) ; e) Comparer les teneurs mesurées aux l’étapes b) et d), une diminution de la teneur mesurée à l’étape d) par rapport à la teneur mesurée à l’étape b) indiquant que l’échantillon contient une PAFβ. Selon un deuxième aspect, l’invention concerne un procédé in vitro de suivi de l’efficacité thérapeutique d’un traitement d’une maladie associée à une PAFβ, comprenant les étapes suivantes : A) Mettre en œuvre le procédé selon l’invention sur un premier échantillon dans lequel l’étape e) consiste à déterminer le ratio entre la teneur mesurée à l’étape b) et la teneur mesurée à l’étape d) (« Ratio b)/d) de l’échantillon 1 ») ; B) Mettre en œuvre un même procédé qu’à l’étape A) sur un second échantillon, pour déterminer le « Ratio b)/d) de l’échantillon 2 » ; C) Comparer les ratios déterminés aux étapes A) et B), dans lequel une efficacité thérapeutique est observée lorsque le ratio déterminé à l’étape B) est inférieur au ratio déterminé à l’étape A). Selon un troisième aspect, l’invention concerne un procédé in vitro de mesure de l’efficacité pharmacologique d’une molécule sur une maladie associée à une PAFβ, comprenant les étapes suivantes : A) Mettre en œuvre le procédé selon l’invention sur un premier échantillon dans lequel l’étape e) consiste à déterminer le ratio entre la teneur mesurée à l’étape b) et la teneur mesurée à l’étape d) (« Ratio b)/d) de l’échantillon 1 ») ; B) Mettre en œuvre un même procédé qu’à l’étape A) sur un second échantillon, pour déterminer le « Ratio b)/d) de l’échantillon 2 » ; C) Comparer les ratios déterminés aux étapes A) et B), dans lequel une efficacité pharmacologique est observée lorsque le ratio déterminé à l’étape B) est inférieur au ratio déterminé à l’étape A). Description détaillée Définitions L’expression « protéine formant des agrégats de type feuillets β » ou « PFβ » désigne une protéine capable de former des agrégats riches en feuillets β, c’est-à-dire une protéine capable de former une forme multimérique (ou une forme oligomérique) riche en feuillets β. Généralement, une forme non-agrégée de la PFβ est normale, mais une forme agrégée de celle-ci caractérise, en particulier, par une maladie neurodégénérative, telle que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Creutzfeldt-Jakob, la maladie de Parkinson ou la sclérose latérale amyotrophique (SLA). Il peut s’agir d’une protéine humaine ou animale, native ou recombinante. Dans le cadre de la présente invention, la forme non-agrégée d’une PFβ est désignée par l’expression « forme non-agrégée en feuillets β d’une protéine formant des agrégats de type feuillets β » ou « PNAFβ ». La forme agrégée d’une PFβ est désignée par l’expression « forme agrégée en feuillets β d’une protéine formant des agrégats de type feuillets β » ou « PAFβ ». La PFβ, qui peut être sous forme agrégée (PAFβ) ou sous forme non-agrégée (PNAFβ), peut être choisie parmi FUS (Fused in sarcoma), TAF15, EWSR1, DAZAP1, TIA-1, TTR (transthyrétine), cystatine C, β2-microglobuline, peptide amyloïde β (tel que peptide amyloïde β 1-40 ou peptide amyloïde β 1-42), TAU (Tubulin-Associated Unit), α-synucléine, β-synucléine, γ-synucléine, Huntingtine (HTT), SOD1 (superoxyde dismutase 1), prion, et TDP-43 (TAR DNA-binding protein 43). Par exemple, lorsque PFβ est TDP-43, on parlera de « TDP-43 NAFβ » pour la forme non-agrégée de TDP-43 et de « TDP-43 AFβ » pour la forme agrégée de TDP-43. Les PFβ listées ci-dessus sont notamment impliquées dans des maladies neuro-dégénératives. Par exemple, FUS impliqué dans la sclérose latérale amyotrophique, TAF15 impliqué dans la sclérose latérale amyotrophique, les peptides amyloïde β impliqués dans la maladie d'Alzheimer et l'angiopathie amyloïde cérébrale héréditaire, le prion impliqué dans la maladie de Creutzfeldt-Jakob et l’encéphalopathie spongiforme, l'α-synucléine impliquée dans la maladie de Parkinson, la protéine TAU impliquée dans la maladie d'Alzheimer, les démences frontotemporales, la transthyrétine impliquée dans l'amylose systémique sénile ou la polyneuropathie familiale amyloïde, la cystatine C impliquée dans l'angiopathie amyloïde cérébrale héréditaire, la β2-microglobuline impliquée dans l'amylose liée à l'hémodialyse, la Huntingtine impliquée dans la maladie de Huntington, la SOD1 impliquée dans la sclérose latérale amyotrophique, TDP-43 impliquée dans la sclérose latérale amyotrophique et les démences frontotemporales. De préférence, la PFβ est choisie parmi le peptide amyloïde β 1-42, le peptide amyloïde β 1-40, l’α-synucléine ou la TDP-43. L’échantillon dans lequel le procédé de l’invention est mis en œuvre peut être tout échantillon susceptible de contenir au moins une PAFβ. Il peut s’agir d’un échantillon biologique d’origine humaine ou animale, ou d’un échantillon de cellules ou de tissu cultivé in vitro . Le terme « procédé in vitro » signifie un procédé mis en œuvre en dehors du corps humain ou animal, par exemple sur micro-organismes, organes, tissus, cellules, sous-fractions cellulaires (ex. noyaux, mitochondries) ou des protéines (natives ou recombinantes). Le terme « in vitro » englobe ex vivo . L’échantillon peut par exemple provenir d’un individu, homme ou animal, ayant ou étant suspecté d’avoir une maladie associée à une PAFβ, par exemple une maladie neurodégénérative telle que décrite ci-dessus. Par exemple, l’échantillon peut être choisi parmi un échantillon de sang, un échantillon de plasma, un échantillon de sérum ou un échantillon de liquide céphalo-rachidien. L’échantillon peut également être préparé à partir d’un tissu ou de cellules provenant de l’individu, par exemple à partir de cerveau, de tissus du système nerveux central, d’organes tels que la rate et l’intestin. L’échantillon peut donc être un lysat cellulaire, un homogénat cellulaire, un lysat tissulaire ou un homogénat tissulaire, tel qu’un homogénat de cerveau. L’échantillon peut également comprendre des cellules (ex. une lignée cellulaire), des sous-fractions cellulaires (ex. noyaux, mitochondries) ou des protéines (natives ou recombinantes). L’échantillon peut également provenir de cellules ou d’un tissu cultivé(es) in vitro ou ex vivo , de préférence provenir d’un modèle cellulaire ou tissulaire d’une maladie associée à une PAFβ . Par exemple, l’échantillon peut être choisi parmi un lysat cellulaire, un homogénat cellulaire, un lysat tissulaire, un homogénat tissulaire, un surnageant de culture cellulaire ou un surnageant de culture tissulaire. De préférence, l’échantillon est un lysat cellulaire ou un homogénat cellulaire. Le terme « contenant » désigne un puits d’une plaque, un tube à essai ou tout autre contenant approprié au mélange d’un échantillon avec les réactifs nécessaires à la mise en œuvre du procédé selon l’invention. Au sens de l’invention, le terme « ligand » désigne une molécule capable de lier à une molécule cible. Dans le cadre de l’invention, la molécule cible est la PNAFβ. On parle alors de « ligand de la PNAFβ ». Le ligand peut être de nature protéique (ex. une protéine ou un peptide) ou de nature nucléotidique (ex. un ADN ou un ARN). Dans le cadre de l’invention, le ligand est avantageusement choisi parmi un anticorps, un fragment d’anticorps, un peptide ou un aptamère, de préférence un anticorps ou un fragment d’anticorps. Au sens de l’invention, le terme « ligand capable de se lier spécifiquement à la PNAFβ » ou « paire de ligands capable de se lier spécifiquement à la PNAFβ » désigne un ligand ou une paire de ligands qui se lie préférentiellement à la PNAFβ par rapport à la PAFβ, c’est-à-dire un ligand ou une paire de ligands capable de générer un signal (ex. un signal ELISA ou un signal de RET) vis-à-vis d’une PNAFβ au moins deux fois supérieur, par exemple au moins trois, au moins quatre, au moins cinq ou au moins six fois supérieur, au signal généré vis-à-vis de la PAFβ correspondante. Les exemples 1-4 et 25 de la présente demande décrivent des méthodes ELISA et FRET qui permettent de déterminer facilement si un ligand ou une paire de ligands est capable de se lier spécifiquement à la PNAFβ. Avantageusement, le « ligand capable de se lier spécifiquement à la PNAFβ » ou la « paire de ligands capable de se lier spécifiquement à la PNAFβ » est capable de se lier à une PNAFβ avec une affinité au moins 2 fois supérieure à l’affinité pour la PAFβ correspondante, par exemple une affinité au moins 2 fois supérieure, au moins 3 fois supérieure, au moins 4 fois supérieure, au moins 5 fois supérieure, au moins 6 fois supérieure, au moins 7 fois supérieure, au moins 8 fois supérieure, au moins 9 fois supérieure, au moins 10 fois supérieure à l’affinité pour la PAFβ correspondante. Lorsqu’il s’agit d’une paire de ligands capable de se lier spécifiquement à la PNAFβ, il n’est pas nécessaire que les deux ligands de la paire de ligands soient spécifiques de la PNAFβ pour que la paire de ligands soit spécifique de la PNAFβ. En effet, il suffit qu’au moins un des deux ligands de la paire de ligands soit un ligand spécifique de la PNAFβ pour que la paire de ligands soit spécifique de la PNAFβ. Néanmoins, les deux ligands de la paire de ligands peuvent être des ligands spécifiques de la PNAFβ. Le terme « affinité » fait référence à la force de l’ensemble des interactions non-covalentes entre un ligand et un antigène. L’affinité est généralement représentée par la constante de dissociation (Kd). Plus la valeur Kd est basse, plus l'affinité de liaison entre le ligand et sa cible est élevée. La constante de dissociation (Kd) peut être mesurée par des méthodes bien connues, par exemple en FRET, en ELISA ou en SPR. Les techniques décrites dans la littérature permettent donc de savoir aisément si un ligand ou une paire de ligands est spécifique de la PNAFβ. Le terme « anticorps », également appelé « immunoglobuline » désigne un hétérotétramère constitué de deux chaînes lourdes d'environ 50-70 kDa chacune (dites les chaînes H pour Heavy) et de deux chaînes légères d'environ 25 kDa chacune (dites les chaînes L pour Light), liées entre elles par des ponts disulfures intra et intercaténaires. Chaque chaîne est constituée, en position N-terminale, d'une région ou domaine variable, dit VL pour la chaîne légère, VH pour la chaîne lourde, et en position C-terminale, d'une région constante, constitué d'un seul domaine dit CL pour la chaîne légère et de trois ou quatre domaines nommés CH1, CH2, CH3, CH4, pour la chaîne lourde. Chaque domaine variable comprend généralement 4 « régions charnières » (appelées FR1, FR2, FR3, FR4) et 3 régions directement responsables de la liaison avec l’antigène, dites « CDR » (appelées CDR1, CDR2, CDR3). Un « anticorps » peut être d’origine mammifère (ex. humain ou de souris ou de rat ou de camélidé), humanisé, chimérique, recombinant. Il s’agit de préférence d’un anticorps monoclonal produit de manière recombinante par des cellules génétiquement modifiées selon des techniques largement connues de l’homme de l’art. L’anticorps peut être de n’importe quel isotype, par exemple IgG, IgM, IgA, IgD ou IgE, de préférence IgG. On entend par « fragment d'anticorps », toute partie d'une immunoglobuline obtenue par digestion enzymatique ou obtenue par bio-production comprenant au moins un pont disulfure et qui est capable de se lier à l’antigène reconnu par l’anticorps entier, par exemple Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, les diabodies, les anticorps linéaires (aussi appelés « Single Domain Antibodies » ou sdAb, ou nanobodies), les anticorps avec une seule chaine (ex. les scFv). La digestion enzymatique des immunoglobulines par la pepsine génère un fragment F(ab')2 et un fragment Fc scindé en plusieurs peptides. F(ab')2 est formé de deux fragments Fab' liés par des ponts disulfures intercaténaires. Les parties Fab sont constituées des régions variables et des domaines CH1 et CL. Le fragment Fab' est constitué de la région Fab et d'une région charnière. Fab'-SH fait référence à un fragment Fab' dans lequel le résidu cystéine de la région charnière porte un groupe thiol libre. On entend par « traceur » un agent chimique ou biologique capable d’émettre directement ou indirectement un signal qui pourra être détecté avec un appareil de détection approprié. Il peut s’agir d’un traceur fluorescent, luminescent, radioactif ou enzymatique. Dans un mode de réalisation particulier, le traceur est un membre d’un couple de partenaires de RET. Le terme « RET » (de l’anglais « Resonance Energy Transfer ») désigne les techniques de transfert d'énergie. Le RET peut être un FRET ou un BRET. Le terme « FRET » (de l’anglais « Fluorescence Resonance Energy Transfer ») désigne le transfert d'énergie entre deux molécules fluorescentes. Le FRET est défini comme un transfert d’énergie non radiatif résultant d’une interaction dipôle–dipôle entre un donneur et un accepteur d’énergie. Ce phénomène physique nécessite une compatibilité énergétique entre ces molécules. Cela signifie que le spectre d’émission du donneur doit recouvrir, au moins partiellement, le spectre d’absorption de l’accepteur. En accord avec la théorie de Förster, le FRET est un processus qui dépend de la distance séparant les deux molécules, donneur et accepteur : lorsque ces molécules sont à proximité l’une de l’autre, un signal de FRET sera émis. Le terme « BRET » (de l’anglais « Bioluminescence Resonance Energy Transfer ») désigne le transfert d'énergie entre une molécule bioluminescente et une molécule fluorescente. Le terme « couple de partenaires de RET » désigne un couple constitué d’un composé donneur d'énergie (ci-après « composé donneur ») et d’un composé accepteur d'énergie (ci-après « composé accepteur »); lorsqu’ils sont à proximité l’un de l’autre et lorsqu’ils sont excités à la longueur d’onde d’excitation du composé donneur, ces composés émettent un signal de RET. Il est connu que pour que deux composés soient partenaires de RET, le spectre d’émission du composé donneur doit recouvrir partiellement le spectre d’excitation du composé accepteur. Par exemple, on parle de « couples de partenaires de FRET » lorsqu’on utilise un composé fluorescent donneur et un composé accepteur ou de « couple de partenaires de BRET » lorsqu’on utilise un composé bioluminescent donneur et un composé accepteur. Le terme « signal de RET » désigne tout signal mesurable représentatif d’un RET entre un composé donneur et un composé accepteur. Par exemple, un signal de FRET peut donc être une variation de l’intensité ou de la durée de vie de luminescence du composé fluorescent donneur ou du composé accepteur lorsque ce dernier est fluorescent. Procédé de détection « 2 contenants » Selon un premier aspect, l’invention concerne un procédé in vitro de détection dans un échantillon d’une forme agrégée en feuillets β d’une protéine formant des agrégats de type feuillets β (PAFβ), comprenant les étapes suivantes: a) Dans un premier contenant : a1) introduire un échantillon susceptible de contenir une PAFβ, a2) ajuster le pH à un pH allant de 9,7 à 13,2 pour désagréger tout ou partie de la PAFβ afin d’obtenir une forme non-agrégée en feuillets β de la protéine formant des agrégats de type feuillets β (PNAFβ), a3) ajuster le pH à un pH allant de 6 à 9, b) Mesurer la teneur en PNAFβ dans le premier contenant avec une méthode immunologique appropriée ; c) Dans un deuxième contenant : c1) introduire un même échantillon qu’à l’étape a1), c2) ajuster le pH à un pH allant de 6 à 9 ; d) Mesurer la teneur en PNAFβ dans le deuxième contenant avec la même méthode qu’à l’étape b) ; e) Comparer les teneurs mesurées aux étapes b) et d), une diminution de la teneur mesurée à l’étape d) par rapport à la teneur mesurée à l’étape b) indiquant que l’échantillon contient une PAFβ. Le principe général du procédé selon l’invention est illustré à la Figure 1. Ci-après, le procédé est décrit en détail étape par étape. Etape a) L’étape a1) consiste à, dans un premier contenant, introduire un échantillon susceptible de contenir une PAFβ. L’échantillon peut être préalablement préparé pour pouvoir réaliser convenablement les étapes du procédé, notamment l’étape de mesure de la teneur en PNAFβ. Par exemple, lorsque l’échantillon est un tissu ou des cellules, il peut être préparé préalablement en le lysant, broyant, filtrant et/ou en le mettant en solution dans un solvant approprié tel que de l’eau. L’Homme du métier n’aura aucune difficulté à préparer l’échantillon. L’étape a2) consiste à ajuster le pH à un pH allant de 9,7 à 13,2 pour désagréger tout ou partie de la PAFβ afin d’obtenir une forme non-agrégée en feuillets β de la protéine formant des agrégats de type feuillets β (PNAFβ). La demanderesse s’est en effet aperçue qu’un pH allant de 9,7 à 13,2 permet de désagréger la PAFβ. Ce phénomène de désagrégation permet d’obtenir une PNAFβ à partir de la PAFβ. Ce phénomène de désagrégation à pH allant de 9,7 à 13,2 est tout à fait surprenant puisque les méthodes de désagrégation décrites dans l’art antérieur consistent plutôt à traiter les PNAFβ à pH acide, avec des détergents puissants et/ou par sonication. Par exemple, les travaux décrits dans [7] montrent différentes méthodes permettant d’obtenir des protéines amyloïdes relativement monomériques à partir de fibres amyloïdes. Dans une première approche, une préparation de fibres amyloïdes est traitée en combinant un acide, l’acide formique à 88%, avec un détergent de type tensioactif fort, le Sodium Dodecyl Sulfate (SDS). Une alternative consiste à combiner un agent chaotropique, une solution saturée de Guanidine Thiocyanate (6.8M) avec le SDS. Dans les 2 cas, les auteurs ont pu noter la disparition des fibres amyloïdes au profit de protéines amyloïdes relativement monomériques (mélange de monomères et de dimères). Une autre étude [8] décrit différentes méthodes de traitement d’échantillons biologiques pour désagréger des protéines amyloïdes (peptide amyloïde β 1-42) qu’ils contiennent avant de les doser via un test ELISA. Des extraits de cerveaux de souris ou des liquides céphalo-rachidiens de patients sont traités par une solution d’alcool fluoré (HFIP) ou d’acide (TFA) couplée à une sonication pendant 15 minutes pour désagréger les protéines amyloïdes. L’HFIP ou le TFA sont ensuite enlevés par séchage sous flux constant d’azote. Les échantillons à sec, contenant les protéines amyloïdes désagrégées, sont ensuite repris par une solution à 1% NH 4 OH avant d’être analysés. Les auteurs suggèrent que ces 2 types de traitement permettent de désagréger les agrégats de peptide amyloïde β142 et par la même d’améliorer leur quantification. Néanmoins la demanderesse a montré que les procédés de désagrégation décrits dans l’art antérieur ne permettent pas de mesurer la teneur en PNAFβ avec des méthodes immunologiques, qui nécessitent d’être mis en œuvre à un pH physiologique (cf. Exemples 5 à 17). Le procédé de l’invention ne nécessite pas de traitement à un pH acide pour désagréger la PAFβ. Au contraire, la Demanderesse a non seulement montré qu’une désagrégation était possible en traitant une PAFβ à un pH allant de 9,7 à 13,2, mais également que ce traitement était tout à fait compatible avec la mise en œuvre ultérieure d’une méthode immunologique visant à mesurer la teneur en PNAFβ. Avantageusement, l’étape a2) consiste à ajuster le pH à un pH allant de 10 à 13,2, par exemple un pH allant de 11 à 13,2, un pH allant de 11,5 à 13,2, un pH allant de 12 à 13,2, un pH allant de 12,5 à 13,2, un pH allant de 12,8 à 13,2, un pH allant de 10 à 13, un pH allant de 11 à 13, un pH allant de 12 à 13, par exemple environ 12,8. Le pH est ajusté avec une base, par exemple une base forte telle que KOH ou NaOH, de préférence NaOH. La durée de l’étape a2) pourra dépendre de différents paramètres tels que la base utilisée ou la PFβ testée. En particulier, l’étape a2) pourra durer au moins 30 secondes, par exemple au moins 1 minute, au moins 2 minutes, au moins 5 minutes, au moins 10 minutes, au moins 15 minutes, par exemple entre 30 secondes et 60 min ou entre 5 minutes et 30 minutes. L’Homme du métier n’aura aucune difficulté à adapter la durée de l’étape a2) pour arriver à désagréger tout ou partie de la PAFβ afin d’obtenir une PNAFβ. L’étape a3) consiste à ajuster le pH à un pH allant de 6 à 9. Cette étape est importante puisqu’elle permet de mettre en œuvre la méthode immunologique de l’étape b). Avantageusement, l’étape a3) consiste à ajuster le pH à un pH allant de 6,4 à 9, par exemple un pH allant de 6,4 à 8,4, un pH allant de 6 à 8,5, un pH allant de 7 à 8,5. Le pH est ajusté avec un acide, par exemple un acide fort, tel que HCl. Etape b) L’étape b) consiste à mesurer la teneur en PNAFβ dans le premier contenant avec une méthode immunologique appropriée (ou « immunoassay » approprié). Il est nécessaire que la méthode immunologique de l’étape b) permette d’obtenir des teneurs qui soient comparables entre elles. Néanmoins, il n’est pas nécessaire que la méthode immunologique de l’étape b) soit quantitative, bien qu’elle puisse l’être. La méthode immunologique de l’étape b) doit permettre a minima de mesurer une teneur relative pouvant être comparée à une autre teneur relative mesurée par une même méthode immunologique. Dans un mode de réalisation particulier la méthode immunologique mise en œuvre à l’étape b) utilise : (i) un ligand capable de se lier spécifiquement à la PNAFβ, ledit ligand étant marqué avec un traceur, ou (ii) une paire de ligands capable de se lier spécifiquement à la PNAFβ, au moins un ligand de ladite paire de ligands étant marqué avec un traceur. Le ligand (i) peut être choisi parmi un anticorps, un fragment d’anticorps, un peptide ou un aptamère, de préférence un anticorps. La paire de ligands (ii) peut être choisie parmi une paire d’anticorps, une paire de fragments d’anticorps, une paire de peptides ou une paire d’aptamères, de préférence une paire d’anticorps. L’Homme du métier n’aura aucune difficulté à obtenir et/ou sélectionner des anticorps ou des fragments d’anticorps ayant les propriétés recherchées, par exemple en immunisant une souris avec une PFβ, en faisant une hybridation lymphocytaire à partir des lymphocytes de la rate de la souris immunisée afin de générer des hybridomes et en testant les anticorps de chaque hybridome pour leurs capacités à se lier spécifiquement à la PNAFβ. Des exemples de protocole complet de génération d’anticorps anti-PNAFβ puis de sélection des anticorps spécifiques sont détaillés aux exemples 1-4 et 25. Il est donc très facile d’obtenir des anticorps ou des paires d’anticorps dirigés contre n’importe quelle PNAFβ pour la mise en œuvre du procédé selon l’invention, par exemple en mettant en œuvre les procédés décrits aux exemples 1-4 et 25. L’obtention des PNAFβ et des PAFβ est à la portée de l’Homme du métier. Par exemple, pour les protéines dites « prion-like », telles que TDP-43, FUS, TAF15 et EWSR1, la production de ces protéines fusionnées à la Gluthatione-S-Transférase (GST) (fusion N- ou C-terminale selon les protéines) permet d’obtenir des protéines en fusion GST dont l’analyse par turbidimétrie montre qu’elles sont sous forme non-agrégées [9][10][13]. Lorsqu’un site de clivage à la Tobacco etch Virus protéase (TEV) est inséré entre la PFβ d’intérêt et la GST, un traitement des protéines GST à la TEV suivie d’une étape de purification permet d’obtenir les protéines sans étiquette GST. Lorsque celles-ci sont laissées 1h30 à température ambiante sous agitation, l’analyse par turbidimétrie montre qu’elles sont sous forme agrégées [10][13]. Des PFβ fusionnées à GST sont également disponibles dans le commerce, par exemple chez Abnova : GST-TDP-43 (Réf. H00023435-P02), GST-FUS1 (Réf. H00002521-P01), GST-TAF15 (Réf. H00008148-P02) GST-EWSR1 (Réf. H00002130-Q01). Les peptides amyloïdes, notamment les formes β 1-40 et β 1-42, sont également disponibles auprès de nombreux fournisseurs sous forme de poudre. La solubilisation de ces poudres dans du HFIP ou de NH 4 OH permet d’obtenir des solutions stocks contenant plus de 90% de formes non-agrégées. L’utilisation extemporanée de ces solutions préalablement diluées dans des tampons présentant des pH physiologiques permet de disposer d’échantillons de formes non-agrégées. A l’inverse, une incubation de plusieurs heures à plusieurs jours, par exemple une incubation de plus de 24 h, de ces mêmes solutions stock dans un tampon physiologique à température ambiante permet d’obtenir un échantillon contenant de très fortes proportions de formes agrégées [11]. Des échantillons contenant des PNAFβ et des PAFβ peuvent également être obtenues auprès de la société StressMarq (www.stressmarq.com). C’est notamment le cas pour les alpha, beta et gamma synucléines, la protéine TAU, la protéine Cu/Zn superoxide dismutase 1 (SOD1) ou la Transthyretin (TTR). Avantageusement, la méthode immunologique mise en œuvre aux étapes b) est une méthode ELISA ou une méthode RET, telle qu’un FRET ou un BRET. Selon la méthode utilisée, la mesure de l’étape b) peut se faire directement dans le premier contenant en y rajoutant les réactifs appropriés ou dans un autre contenant avec tout ou partie du contenu du premier contenant. Par exemple, les réactifs d’une méthode RET peuvent être ajoutés directement dans le premier contenant. A l’inverse, la méthode ELISA se fera de préférence dans un autre contenant adapté à la mise en œuvre de la méthode ELISA, notamment dans un contenant au fond duquel a préalablement été immobilisé un ligand de la PNAFβ. Dans un mode de réalisation particulier, l’étape b) est réalisée par une méthode RET et consiste à : (b1) introduire dans le contenant un premier ligand de la PNAFβ marqué par un premier membre d’un couple de partenaires de RET et un second ligand de la PNAFβ marqué par un second membre du couple de partenaires de RET, la paire de ligands étant capable de se lier spécifiquement à la PNAFβ, et (b2) mesurer le signal de RET émis dans le contenant. Bien évidemment, pour la mise en œuvre de la méthode RET, le premier ligand et le second ligand ne doivent pas entrer en compétition pour la liaison à la PNAFβ, par exemple le premier ligand et le deuxième ligand ne doivent pas lier le même épitope sur la PNAFβ. Il est facile de sélectionner une paire de ligands appropriée en mettant en œuvre le procédé décrit aux exemples 1-4 et 25. Les ligands peuvent être marqués de manière directe ou indirecte. Le marquage direct du ligand par un membre d’un couple de partenaires de RET peut être effectué par les méthodes classiques connues de l’homme du métier, reposant sur la présence de groupes réactifs sur le ligand. Par exemple, lorsque le ligand est un anticorps ou un fragment d’anticorps, les groupes réactifs suivants peuvent être utilisés : le groupe amino terminal, les groupes carboxylates des acides aspartique et glutamique, les groupes amines des lysines, les groupes guanidines des arginines, les groupes thiols des cystéines, les groupes phénols des tyrosines, les cycles indoles des tryptophanes, les groupes thioéthers des méthionines, les groupes imidazoles des histidines. Les groupes réactifs peuvent former une liaison covalente avec un groupe réactif porté par un membre d’un couple de partenaires de RET. Les groupes réactifs appropriés, portés par le membre d’un couple de partenaires de RET, sont bien connus de l’homme du métier, par exemple un composé donneur ou un composé accepteur fonctionnalisé par un groupe maléimide sera par exemple capable de se lier de manière covalente avec les groupes thiols portés par les cystéines portées par une protéine ou un peptide, par exemple un anticorps ou un fragment d’anticorps. De même, un composé donneur/accepteur portant un ester de N-hydroxysuccinimide sera capable de se fixer de manière covalente à une amine présente sur une protéine ou un peptide. Le ligand peut également être marqué par un composé fluorescent ou bioluminescent de manière indirecte, par exemple en introduisant dans le milieu de mesure un anticorps ou un fragment d’anticorps, lui-même lié de manière covalente à un composé accepteur/donneur, ce deuxième anticorps ou fragment d’anticorps reconnaissant de manière spécifique le ligand. Un autre moyen de marquage indirect très classique consiste à fixer de la biotine sur le ligand à marquer, puis d’incuber ce ligand biotinylé en présence de streptavidine marquée par un composé accepteur/donneur. Des ligands biotinylés appropriés peuvent être préparés par des techniques bien connues de l’homme du métier ; la société Cisbio Bioassays commercialise par exemple de la streptavidine marquée avec un fluorophore dont la dénomination commerciale est « d2 » (réf. 610SADLA). Avantageusement, l’un des membres du couple de partenaires de RET est un composé fluorescent donneur ou luminescent donneur et l’autre membre du couple de partenaires de RET est un composé fluorescent accepteur ou un composé accepteur non fluorescent (quencher). Lorsque le RET est un FRET, le composé fluorescent donneur peut être un partenaire de FRET choisi parmi : un cryptate d’europium, un chélate d’europium, un chélate de terbium, un cryptate de terbium, un chélate de ruthénium, un quantum dot, les allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène et le nitrobenzoxadiazole. Lorsque le RET est un FRET, le composé fluorescent accepteur peut être un partenaire de FRET choisi parmi : les allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène, le nitrobenzoxadiazole, un quantum dot, la GFP, les variants GFP choisis parmi GFP10, GFP2 et eGFP, la YFP, les variants YFP choisis parmi eYFP, YFP topaz, YFP citrine, YFP venus et YPet, le mOrange, le DsRed. Lorsque le RET est un BRET, le composé luminescent donneur peut être un partenaire de BRET choisi parmi : la Luciférase (luc), Renilla Luciférase (Rluc), les variants de Rénilla Luciférase (Rluc8) et la Firefly Luciférase. Lorsque le RET est un BRET, le composé fluorescent accepteur est un partenaire de BRET choisi parmi : les allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène, le nitrobenzoxadiazole, un quantum dot, la GFP, les variants GFP choisis parmi GFP10, GFP2 et eGFP, la YFP, les variants YFP choisis parmi eYFP, YFP topaz, YFP citrine, YFP venus et YPet, le mOrange, le DsRed. Dans un mode de réalisation particulier, l’étape b) est réalisée par une méthode ELISA et consiste à : (b1) introduire tout ou partie de l’échantillon dans un contenant au fond duquel a été immobilisé un premier ligand de la PNAFβ, puis introduire un second ligand de la PNAFβ marqué avec un traceur, la paire de ligands étant capable de se lier spécifiquement à la PNAFβ, (b2) mesurer le signal ELISA émis dans le contenant. La méthode ELISA est largement décrite dans l’art antérieur et ne présente aucune difficulté de mise en œuvre pour l’Homme du métier. Etape c) L’étape c) consiste à, dans un premier contenant, c1) introduire un même échantillon qu’à l’étape a1). Contrairement à l’étape a), le pH n’est pas ajusté à un pH allant de 9,7 à 13,2 lors de l’étape c). Le pH est directement ajusté à un pH allant de 6 à 9 (étape c2)), de préférence au même pH que le pH de l’étape a3). Le pH à l’étape c2) peut être ajusté avec un mélange acide/base, par exemple un mélange acide fort/base forte. Il peut s’agir par exemple d’un mélange NaOH/HCl. De préférence, l’acide utilisé à l’étape c2) est le même que celui utilisé à l’étape a3) et la base utilisée à l’étape c2) est la même que la base utilisée à l’étape a2). Etape d) L’étape d) consiste à mesurer la teneur en PNAFβ dans le deuxième contenant avec la même méthode qu’à l’étape b). L’étape d) est mise en œuvre de la même manière que l’étape b) pour pouvoir comparer les mesures et mettre en œuvre l’étape e). Ainsi, lorsque l’étape b) est réalisée par une méthode RET, l’étape d) consiste à : (d1) introduire dans le contenant un premier ligand de la PNAFβ marqué par un premier membre d’un couple de partenaires de RET et un second ligand de la PNAFβ marqué par un second membre du couple de partenaires de RET, la paire de ligands étant capable de se lier spécifiquement à la PNAFβ, et (d2) mesurer le signal de RET émis dans le contenant. De la même manière, lorsque l’étape b) est réalisée par une méthode ELISA, l’étape d) consiste à : (d1) introduire tout ou partie de l’échantillon dans un contenant au fond duquel a été immobilisé un premier ligand de la PNAFβ, puis introduire un second ligand de la PNAFβ marqué avec un traceur, la paire de ligands étant capable de se lier spécifiquement à la PNAFβ, (d2) mesurer le signal ELISA émis dans le contenant. Etape e) L’étape e) consiste à comparer les teneurs mesurées à l’étape b) et à l’étape d), une diminution de la teneur mesurée à l’étape d) par rapport à la teneur mesurée à l’étape b) indiquant que l’échantillon contient une PAFβ. Bien évidemment, si on permute le premier et le deuxième contenant, l’étape e) consistera à comparer les teneurs mesurées à l’étape b) et à l’étape d), une augmentation de la teneur mesurée à l’étape d) par rapport à la teneur mesurée à l’étape b) indiquant que l’échantillon contient une PAFβ. L’homme du métier pourra facilement comparer les teneurs mesurées aux étapes b) et d) et définir un seuil lui permettant de qualifier l’augmentation ou la diminution. Par exemple un écart entre les teneurs mesurées supérieur à 5%, supérieur à 10%, supérieur à 15%, supérieur à 20%, supérieur à 25%. La détermination du seuil pourra dépendre de la variabilité inhérente à la méthode immunologique choisie. L’homme du métier pourra par exemple calculer le ratio entre les teneurs mesurées aux étapes b) et d). De manière générale, plus l’écart entre les teneurs mesurées est important, plus le ratio entre les teneurs mesurées sera important et plus la quantité de PAFβ dans l’échantillon sera importante. Lorsque la méthode immunologique est une méthode ELISA ou une méthode RET, on va comparer les signaux de RET ou les signaux ELISA mesurés aux étapes b) et d). Par conséquent, une diminution du signal de RET ou une diminution du signal ELISA indiquera que l’échantillon contient une PAFβ. Avantageusement on calculera un ratio entre le signal mesuré dans le premier contenant (étape b)) et le signal mesuré dans le deuxième contenant (étape d)). Le calcul du ratio pourra se faire manuellement ou automatiquement. De préférence, la durée entre l’étape a3) et l’étape b) et/ou entre l’étape c2) et l’étape d) sera adaptée pour éviter que la PNAFβ se ré-agrège en PAFβ. La durée sera de préférence inférieure à 24 heures, par exemple inférieure à 5 heures. Avantageusement, les étapes b) et d) sont réalisées dans la foulée des étapes a3) et c2) respectivement, c’est-à-dire moins de 30 minutes après les étapes a3) et c2). L’Homme du métier n’aura aucune difficulté à adapter la durée de l’étape a3) et/ou de l’étape c2) pour éviter que tout ou partie de la PNAFβ se ré-agrège en PAFβ avant l’étape c) et/ou l’étape d). La comparaison des teneurs dans les deux échantillons à l’étape e) permet de mesurer le niveau d’agrégation de façon très précise, notamment par rapport à la plupart des méthodes de l’art antérieur. Procédé de suivi de l’efficacité thérapeutique La présente invention concerne également un procédé in vitro de suivi de l’efficacité thérapeutique d’un traitement d’une maladie associée à une PAFβ, comprenant les étapes suivantes : A) Mettre en œuvre le procédé selon l’invention sur un premier échantillon, dans lequel l’étape e) consiste à déterminer le ratio entre la teneur mesurée à l’étape b) et la teneur mesurée à l’étape d) (« Ratio b)/d) de l’échantillon 1 ») ; B) Mettre en œuvre un même procédé qu’à l’étape A) sur un second échantillon, pour déterminer le « Ratio b)/d) de l’échantillon 2 » ; C) Comparer les ratios déterminés aux étapes A) et B), dans lequel une efficacité thérapeutique est observée lorsque le ratio déterminé à l’étape B) est inférieur au ratio déterminé à l’étape A). Le traitement peut être un traitement connu de la maladie associée à une PAFβ ou un traitement expérimental. L’échantillon provient, de préférence, d'un individu ayant une maladie associée à la PAFβ. Procédé de suivi de mesure de l’efficacité pharmacologique La présente invention concerne également un procédé in vitro de mesure de l’efficacité pharmacologique d’une molécule médicament ou d’un candidat médicament sur une maladie associée à une PAFβ, comprenant les étapes suivantes : A) Mettre en œuvre le procédé selon l’invention sur un premier échantillon dans lequel l’étape e) consiste à déterminer le ratio entre la teneur mesurée à l’étape b) et la teneur mesurée à l’étape d) (« Ratio b)/d) de l’échantillon 1 ») ; B) Mettre en œuvre un même procédé qu’à l’étape A) sur un second échantillon, pour déterminer le « Ratio b)/d) de l’échantillon 2 » ; C) Comparer les ratios déterminés aux étapes A) et B), dans lequel une efficacité pharmacologique est observée lorsque le ratio déterminé à l’étape B) est inférieur au ratio déterminé à l’étape A). La molécule peut être un médicament ou un candidat médicament. L’échantillon provient, de préférence, de cellules ou d’un tissu cultivé(es) in vitro . Par conséquent, la molécule médicament ou le candidat médicament est de préférence testé sur un modèle in vitro de maladie associée à une PAFβ. De tels modèles sont largement décrits dans la littérature. La présente invention sera maintenant illustrée par les exemples non limitatifs suivants. EXEMPLES Exemple 1 : Méthode permettant d’identifier des anticorps spécifiques d’une PNAFβ Génération d’anticorps anti-PNAFβ Immunisations des souris Des souris BALB/c sont immunisées par injection de la protéine PNAFβ préalablement diluée dans du tampon phosphate préparé en conditions physiologiques. L’absence de présence de multimères ou d’agrégats de la PNAFβ est vérifiée dans le tampon destiné à réaliser les injections afin de diriger la réponse immune des souris sur les formes non-agrégées. La primo-injection est suivie de trois rappels à intervalle d’un mois. Quinze jours après chaque injection, des ponctions sanguines sont réalisées sur les souris pour vérifier la présence d’une réponse immunitaire par titration des anticorps. Titration des immun-sérums en anticorps anti-PNAFb par tests ELISA Pour cela, des tests d’immuno-détection de type ELISA sont mis en place en fonction de la nature de la PFβ. Pour les PFβ de type amyloïde ou les peptides, de la PNAFβ est préalablement marquée sur ses lysines primaires avec de la biotine par l’utilisation d’un réactif composé de biotine, d’un linker carboné et d’un groupement réactif NHS (N-Hydroxysuccinimide). Pour les PFβ hors amyloïde ou non, de la PNAF β en fusion GST est directement immobilisée sur des plaques 96 puits via le tag GST par l’utilisation de microplaques ELISA fonctionnalisées avec un groupement glutahion. Les protéines marquées à la biotine sont immobilisées sur des plaques ELISA 96 puits via la biotine par l’utilisation de microplaques fonctionnalisées avec de la streptavidine. Pour cela, 100 µL de solution de PNAFβ en fusion GST et/ou biotinylées sont ajoutées dans chaque puits puis incubées pendant 2h à température ambiante. Les puits sont ensuite lavés trois fois en tampon PBS supplémenté de 0.05% de Tween-20. Après retrait de la solution de lavage, chaque puits est ensuite incubé pendant toute une nuit à 4°C avec 200 µL d’une solution de saturation composée de PBS, 5% BSA. Les dilutions sérielles d’un facteur 10 à 100 millions des ponctions sanguines (immun-sérums) sont ensuite ajoutées, en doublets, à hauteur de 100 µL par puit en tampon PBS + 0.1% BSA et incubées sous agitation pendant 2h. Les anticorps non spécifiques non fixés à la PNAFβ immobilisée sont éliminés par trois étapes de lavages de 200 µL en tampon PBS 1X, 0.05% Tween20. La présence éventuelle d’anticorps spécifiques est détectée à l’aide de 100 µL par puits d’anticorps secondaire anti-Fc de souris couplé à la HRP (horseradish peroxidase) (Sigma #A0168 diluée au 1/10 000 dans du PBS, BSA 0.1%). Après 1h d’incubation à température ambiante sous agitation puis trois lavages sous 200 µL en tampon PBS 1X, 0.05% Tween20, la révélation de la HRP est réalisée par dosage colorimétrique à 450 nm suite à l’incubation de son substrat TMB (3,3',5,5'-Tétraméthylbenzidine, Sigma #T0440) pendant 20 min à température ambiante et sous agitation. Cette solution de saturation est ensuite retirée par aspiration et les plaques sont stockées à 4°C en vue d’une utilisation future. Afin de s’assurer que les anticorps détectés par le test ELISA sont bien dirigés contre la protéine PNAFβ et non contre le tag GST ou la biotine, les mêmes ponctions sont testées sur le test ELISA après pré-incubation avec un excès d’une autre protéine orthogonale tagguée avec la GST ou la biotine. Ainsi, les anticorps anti-TAG se fixent sur la protéine orthogonale taguée et donc pas sur la protéine PNAFβ immobilisée au fond des puits ; auquel cas aucun signal HRP ou une diminution du signal HRP est détecté. Fusion & clonages Les souris présentant les meilleurs titres d’anticorps anti-PNAFβ (signal, c’est-à-dire densité optique à 450 nm élevée) et le moins de baisse de signal dans le cas contrôle anti-TAG sont sélectionnées pour l’étape suivante d’hybridation lymphocytaire, aussi appelée fusion. La rate des souris est extraite afin d’isoler un mélange des lymphocytes et plasmocytes. Cet échantillon pluri-cellulaire est fusionné in vitro avec une lignée cellulaire de myélome en présence d’un catalyseur de la fusion cellulaire du type polyéthylène glycol (PEG). Une lignée cellulaire de myélome mutante, déficiente pour l’enzyme HGPRT (Hypoxanthine Guanosin Phosphoribosyl Transferase) est utilisée pour permettre une sélection des cellules hybrides, appelées hybridomes. Ces cellules sont cultivées dans un milieu contenant de l’hypoxanthine, de l’aminopterine (methotrexate) et de la thyamine (milieu HAT), pour permettre l’élimination des cellules de myélome non fusionnées et ainsi sélectionner les hybridomes d’intérêt. Les cellules de rate non fusionnées quant à elle meurent puisqu’elles sont incapables de proliférer in vitro. Ainsi, seuls les hybridomes survivent à cette pression de sélection in vitro . Ces hybridomes sont cultivés dans des plaques de culture. Les surnageants de ces hybridomes sont testés pour évaluer leur capacité à produire des anticorps anti-PNAFβ. Pour cela, un test ELISA comme décrit ci-dessus est réalisé. Le seuil minimal retenu pour sélectionner un clone est de quatre fois celui du non spécifique. Les meilleurs hybridomes sont clonés avec une étape de dilution limite afin d’obtenir des clones stables d’hybridome. Les clones retenus sont mis en culture en vue de constituer une banque d’hybridomes, testés en viabilité cellulaire et stockés dans de l’azote liquide. A cette étape, les anticorps produits par les clones peuvent être facilement séquencés par des méthodes bien décrites dans l’art antérieur afin de pouvoir produire les anticorps, par exemple, dans des cellules productrices. Alternativement, les anticorps sont produits comme décrit ci-après. Production d’anticorps anti-PNAF β Les clones d’hybridomes d’intérêt sont remis en culture et l’inoculum cellulaire est ensuite injecté dans des souris BALB/c (injection intra-péritonéale, IP) afin de permettre la production des anticorps en grande quantité dans le liquide d’ascite. Après caractérisation du contenu des liquides d’ascites par diverses techniques visant à quantifier et à qualifier le contenu en anticorps, ceux-ci sont ensuite purifiés après précipitation éventuelle par des sels, via une chromatographie d’affinité sur des colonnes comportant des résines greffées avec la protéine A. Après lavage de la colonne pour éliminer les constituants en dehors des anticorps, le contenu en anticorps est élué par un choc à pH acide en tampon glycine. Après neutralisation du pH et dialyse contre un tampon à pH neutre, les anticorps anti-PNAFβ sont prêts pour stockage à 4°C ou congélation et utilisation/caractérisation ultérieures (isotypage, dosage, tests fonctionnels). Sélection d’une paire d’anticorps capable de se lier spécifiquement à une PNAFβ (méthode ELISA) Afin de sélectionner une paire d’anticorps reconnaissant préférentiellement une PNAFβ vis-à-vis d’une PAFβ, un test de type ELISA est mis en place. Pour se faire, un des anticorps de la paire testée est biotinylé en utilisant le kit Lightning-Link Rapid Biotin Type A (Expedeon, référence SKU 370-0005) selon les recommandations du fournisseur. Le deuxième anticorps de la paire testée, préalablement dilué en tampon PBS à des concentrations comprises entre 1 et 20 µg/mL, est adsorbé sur des plaques 96 puits de type ELISA « high binding ». Pour cela 100 µL d’anticorps sont ajoutés dans chaque puits puis incubés pendant 20h à 4°C suivi de trois lavages en tampon PBS 1X, 0.05% Tween20. Après retrait de la solution de lavage, chaque puits est ensuite incubé pendant toute une nuit à 4°C avec 200 µL d’une solution de saturation composée de PBS, 5% BSA. Cette solution de saturation est ensuite retirée par aspiration et les plaques sont stockées à 4°C en vue d’une utilisation future. Des dilutions sérielles d’un facteur 1 à 1/100ème d’échantillons contenant la même concentration initiale de PNAFβ ou de PAFβ sont ajoutées à hauteur de 100 µL/puit et incubées pendant 2h à température ambiante sous agitation. Les PNAFβ ou PAFβ non fixés à l’anticorps adsorbé sur les plaques sont éliminés par trois étapes de lavages en tampon PBS 1X, 0.05% Tween20. L’anticorps biotinylé, préalablement dilué en tampon PBS à une concentration comprise entre 10 et 200 ng/mL, est ajouté à hauteur de 100 µL/puits et incubé pendant 2h à température ambiante sous agitation. Les anticorps biotinylés non fixés aux PNAFβ ou PAFβ sont éliminés par trois étapes de lavages en tampon PBS 1X, 0.05% Tween20. La détection des anticorps fixés est réalisée à l’aide d’une streptavidine-HRP (R&D Systems, Réf. DY998) diluée au 1/10ème dans du PBS, BSA 0.1%. Après 30 minutes d’incubation à température ambiante sous agitation, puis trois lavages en tampon PBS 1X, 0,05% Tween20, la révélation de la HRP est réalisée par mesure de la densité optique à 450 nm (D.O. 450 nm) suite à l’incubation de son substrat TMB (3,3',5,5'-Tétraméthylbenzidine, Sigma #T0440) pendant 20 min à température ambiante sous agitation. Dans une première étape, la dilution de référence des échantillons de PNAFβ ou PAFβ est déterminée en analysant la D.O. 450 nm mesurée avec les différentes dilutions de PNAFβ. Comme indiqué dans la Figure 2, la dilution de référence est celle pour laquelle 80% de la D.O. 450nm maximale est obtenue. Dans une deuxième étape, la D.O. 450nm obtenue avec la dilution de référence de l’échantillon de PNAFβ est comparée avec la D.O. 450 nm mesurée avec une dilution identique de l’échantillon de PAFβ. Comme illustré dans la Figure 3, une paire d’anticorps capable de se lier spécifiquement à la PNAFβ donnera une D.O. 450nm 50% plus faible sur l’échantillon PAFβ par rapport à la D.O. 450 nm mesurée sur l’échantillon PNAFβ. Sélection d’une paire d’anticorps capable de se lier spécifiquement à une PNAFβ (méthode FRET) Afin de sélectionner une paire d’anticorps reconnaissant préférentiellement une PNAFβ vis-à-vis d’une PAFβ, un test de FRET est mis en place. Ce test est basé sur la Technologie HTRF® de Cisbio Bioassays. Le principe de cette technique repose sur un transfert d’énergie de fluorescence entre une molécule donneuse, un cryptate de Terbium (Donneur), et une molécule fluorescente acceptrice d’énergie le d2 (Accepteur). Ces deux molécules fluorescentes sont greffées par couplage covalent à des anticorps pour mettre en œuvre un dosage immunologique tel qu’illustré à la Figure 4. Pour se faire, un des anticorps de la paire testée est marqué avec le donneur Lumi4 Terbium en utilisant le kit Terbium Cryptate labeling kit (Cisbio Bioassays, référence 62TBSPEA) selon les recommandations du fabricant. Avant utilisation, l’anticorps marqué au donneur est dilué dans un tampon Hepes 20mM pH=7.4, BSA 0.1% à une concentration de 0.5 nM. Le deuxième anticorps de la paire testée est marqué avec l’accepteur d2 en utilisant le kit d2 labeling kit (Cisbio Bioassays référence 62D2DPEA) selon les recommandations du fournisseur. Avant utilisation, l’anticorps marqué au donneur est dilué dans un tampon Hepes 20mM pH=7.4, BSA 0.1% à une concentration de 5nM. Des dilutions sérielles d’un facteur 1 à 1/100ème d’échantillons contenant la même concentration initiale de PNAFβ ou de PAFβ sont distribuées dans une microplaque 384 à hauteur de 16µL/puits. 2µL de la solution à 0.5nM d’anticorps marqué au donneur et 2µL de la solution à 5 nM d’anticorps marqué à l’accepteur sont ensuite ajoutés dans chaque puits. La microplaque est incubée 20 h à température ambiante. La détection du signal de FRET dans les différentes plaques été réalisée sur un appareil PHERAstar FS Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF. Dans une première étape, la dilution de référence des échantillons de PNAFβ ou PAFβ est déterminée en analysant le signal HTRF mesuré avec les différentes dilutions de PNAFβ. Comme indiqué dans la Figure 5, la dilution de référence est celle pour laquelle 80% du signal HTRF maximum est obtenu, avant le plateau de saturation de l’immuno-essai. Dans une deuxième étape, le signal HTRF obtenu avec la dilution de référence de l’échantillon de PNAFβ est comparé avec le signal HTRF mesuré avec une dilution identique de l’échantillon de PAFβ. Comme illustré dans la Figure 6, une paire d’anticorps capable de se lier spécifiquement à la PNAFβ donnera un signal HTRF 50% plus faible sur l’échantillon PAFβ par rapport au signal HTRF mesuré sur l’échantillon PNAFβ. Exemple 2 : Méthode permettant d’identifier des couples d’anticorps capables de se lier spécifiquement à la TDP-43 NAFβ (Méthode FRET) Une méthode alternative d’obtention d’échantillons contenant des TDP-43 AFβ ou des TDP-43 NAFβ consiste à cultiver des cellules HeLa et à les traiter ou non pendant au moins 6h par de la staurosporine. L’analyse des lysats cellulaires réalisée par SDS-PAGE et Western-Blot montre que les lysats de cellules HeLa non traitées contiennent des TDP-43 NAFβ tandis que les lysats de HeLa traités à la staurosporine contiennent essentiellement des TDP-43 AFβ [12]. La méthode est basée sur la technologie FRET (Technologie HTRF® de Cisbio Bioassays) décrite dans l’exemple 1. Préparation des anticorps à tester Cinq anticorps dirigés contre TDP-43 ont été marqués respectivement avec le Donneur et avec l’Accepteur. Ces marquages ont été réalisés en utilisant les kits de marquage commercialisés par Cisbio Bioassays (Références commerciales 62EUSUEA et 62D2DPEA). Les taux de marquage obtenus (nombre de molécules fluorescentes par anticorps) étaient conformes aux attentes. Les taux de marquage au Donneur étaient compris entre 5.9 et 7.9. Les taux de marquages à l’Accepteur étaient compris entre 2.3 et 3.3. Le tableau ci-dessous donne les caractéristiques des anticorps qui ont été testés. Identification de l’anticorps Référence commerciale Fournisseur Ac1 SIG-39854 Biolegend Ac2 89789BF Cell Signaling Technology Ac3 MABN774 Merck Millipore Ac4 ab238443 Abcam Ac5 ab248546 Abcam Pour être testés, tous les anticorps ont été dilués dans un tampon pour obtenir des concentrations respectives de 3 nM pour les anticorps marqués au Donneur et de 30 nM pour ceux marqués à l’Accepteur. Préparation d’un échantillon de TDP-43 NAFβ (Monomères) Des cellules HeLa ont été ensemencées à 5 millions de cellules en flasque (175 cm²) en milieu de culture complet (MEM alpha medium + 2 mM Hepes + 10% sérum de veau fœtal décomplémenté + 1% d’antibiotiques, Pénicilline 5000 U/ml et Streptomycine 5000 µg/ml). Après 78 heures, le milieu de culture a été aspiré. Les cellules ont ensuite été lysées avec un tampon de lyse cellulaire. Le lysat obtenu (ci-après « échantillon Monomères »), contenant la TDP-43 NAFβ, a été congelé à -80°C en vue de son utilisation. Un contrôle de cet échantillon a été réalisé par western blot comme préconisé dans la littérature [12] afin de s’assurer que celui-ci contient essentiellement de la TDP43 non agrégée (TDP-43 NAFβ). Préparation d’un échantillon de TDP-43 AFβ (Agrégats) Des cellules HeLa ont été ensemencées à 5 millions de cellules en flasque (175 cm²) en milieu de culture complet (MEM alpha medium + 2 mM Hepes + 10% sérum de veau fœtal décomplémenté + 1% d’antibiotiques, Pénicilline 5000 U/ml et Streptomycine 5000 µg/ml). Après 72 heures, le milieu de culture a été aspiré. Une solution de staurosporine à 1 µM en milieu complet a été ajoutée sur les cellules en culture pendant 6h. Le traitement des cellules à la staurosporine permet d’agréger TDP-43 pour obtenir des TDP-43 AFβ. Le milieu de culture a ensuite été aspiré avant d’ajouter un tampon de lyse cellulaire. Le lysat obtenu (ci-après « échantillon Agrégats »), contenant la TDP-43 AFβ, a été congelé à -80°C en vue de son utilisation ultérieure. Un contrôle de cet échantillon a été réalisé par western blot comme préconisé dans la littérature [12] afin de s’assurer que celui-ci contient essentiellement de la TDP43 agrégée (TDP-43 AFβ). Criblage des paires d’anticorps sur les Monomères ou les Agrégats Le jour du test, les échantillons Monomères et Agrégats ont été décongelés avant distribution dans des microplaques 384 puits (Greiner référence 784075). Les réactifs suivants ont été ajoutés dans les microplaques selon l’ordre ci-dessous : - 16 µL d’échantillon Monomères ou d’échantillon Agrégats, - 2 µL d’anticorps Donneur - 2 µL d’anticorps Accepteur Les plaques ont ensuite été incubées une nuit à température ambiante. La détection du signal de FRET dans les différentes plaques a été réalisée sur un appareil PHERAstar FS Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF. Pour toutes les paires d’anticorps testés, les signaux obtenus en FRET sur l’échantillon Monomères et sur l’échantillon Agrégats ont été comparés en calculant un rapport des signaux de FRET (Monomères / Agrégats), tel qu’illustré dans la Figure 7 avec la paire Ac1-Donneur / Ac4-Accepteur. Le rapport des signaux de FRET (Monomères / Agrégats) a été calculé pour toutes les paires d’anticorps testés. Le tableau 2 ci-dessous récapitule les résultats obtenus. Toutes les paires d’anticorps présentant un rapport (Monomère / Agrégats) supérieur à 2 sont considérées sélectives de la TDP-43 NAFβ vis-à-vis de la TDP-43 AFβ. Donneur Ac1 Ac2 Ac3 Ac4 Ac5 Accepteur Ac1 5.5 1.0 1.1 4.2 Ac2 2.2 1.1 1.1 1.9 Ac3 1.1 0.9 1.1 1.0 Ac4 6.0 1.3 1.0 2.9 Ac5 3.9 3.0 1.0 1.1 7 paires d’anticorps ont permis de discriminer la TDP-43 NAFβ de la TDP-43 AFβ car elles présentent un rapport Monomère / Agrégats supérieur à 2. Elles sont listées dans le tableau 3. Donneur Accepteur Ac1 Ac2 Ac1 Ac4 Ac1 Ac5 Ac2 Ac1 Ac2 Ac5 Ac5 Ac1 Ac5 Ac4 Exemple 3 : Méthode permettant d’identifier des couples d’anticorps capable de se lier spécifiquement au peptide beta amyloïde 1-40 NAFβ (Méthode FRET) La méthode est basée sur la technologie FRET (Technologie HTRF® de Cisbio Bioassays), comme détaillé dans l’exemple 1. Paire d’anticorps testée Les anticorps dirigés contre le peptide beta amyloïde 1-40 marqués respectivement au Donneur et à l’Accepteur sont ceux contenus dans le kit Amyloid Beta 1-40 HTRF commercialisé par Cisbio Bioassays (référence 62B40PEG). Ils ont été dilués dans le diluant référence 62RB3FDG tel que préconisé par le manuel du kit Amyloid Beta 1-40 HTRF. Préparation de peptide beta amyloïde 1-40 NAFβ (Monomères) Le peptide amyloïde beta 1-40 humain lyophilisé (ERI275BAS, The ERI Amyloid Laboratory, LLC, Oxford) a été re-suspendu selon les recommandations du fournisseur puis dilué en tampon 10 mM Sodium Phosphate pH 7,4 à une concentration de 30 µM. La solution (ci-après « échantillon Monomères »), contenant le peptide amyloïde beta 1-40 NAFβ, a ensuite été congelée à -80°C. Un test à la Thioflavine T a été réalisé sur cette solution. Il indique que celle-ci contient plus de 90% de monomères de peptide beta amyloïde 1-40. Préparation de peptide beta amyloïde 1-40 AFβ (Agrégats) Le peptide amyloïde beta 1-40 humain lyophilisé (ERI275BAS, The ERI Amyloid Laboratory, LLC, Oxford) a été re-suspendu selon les recommandations du fournisseur puis dilué en tampon 10 mM Sodium Phosphate pH 7,4 à une concentration de 30µM. Cette solution est ensuite incubée 495 heures à 25°C, ce qui permet d’agréger le peptide beta amyloïde 1-40 pour obtenir le peptide beta amyloïde 1-40 AFβ. La solution (ci-après « échantillon Agrégats »), contenant le peptide beta amyloïde 1-40 AFβ, a ensuite été congelée à -80°C. Un test à la Thioflavine T a été réalisé sur cette solution. Il indique que celle-ci contient plus de 90% d’agrégats de peptide beta amyloïde 1-40. Test de la paire d’anticorps sur les Monomères ou les Agrégats Le jour du test, les échantillons Monomères et Agrégats ont été décongelés puis dilués en tampon 10 mM Sodium Phosphate pH 7,4 à une concentration de 20,3 ng/mL avant distribution dans une microplaque 384 puits (Greiner référence 784075). Les réactifs suivants ont été ajoutés dans les microplaques selon l’ordre ci-dessous : - 5 µL d’échantillon Monomère ou d’échantillon Agrégat - 5 µL de diluant (Réf. 62DL1DDD, Cisbio Bioassays) - 5 µL d’anticorps Donneur - 5 µL d’anticorps Accepteur Les plaques ont ensuite été incubées une nuit à une température comprise entre 2°C et 8°C. La détection du signal FRET dans les différentes plaques été réalisée sur un appareil PHERAstar FS Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF. Les signaux obtenus en FRET sur l’échantillon Monomères et sur l’échantillon Agrégats ont été comparés en calculant le rapport des signaux de FRET (Monomères / Agrégats) tel que montré à la Figure 8. Le rapport des signaux de FRET (Monomère / Agrégat) de la paire d’anticorps est supérieur à 2 (valeur de 3,1). Cela indique que cette paire d’anticorps discrimine le peptide beta amyloïde 1-40 NAFβ du peptide beta amyloïde 1-40 AFβ, c’est-à-dire que cette paire d’anticorps est spécifique du peptide beta amyloïde 1-40 NAFβ. Exemple 4 : Méthode permettant d’identifier des couples d’anticorps capable de se lier spécifiquement au peptide amyloïde beta 1-42 NAFβ (Méthode FRET) La méthode est basée sur la technologie FRET (Technologie HTRF® de Cisbio Bioassays), comme détaillé dans l’exemple 1. Paire d’anticorps testée Deux anticorps dirigés contre le peptide amyloïde beta 1-42 marqués respectivement au Donneur et à l’Accepteur ont été dilués à des concentrations respectives de 3 nM (Donneur) et 30 nM (Accepteur). Préparation de peptide beta amyloïde 1-42 NAFβ (Monomères) Le peptide amyloïde beta 1-42 humain lyophilisé (The ERI Amyloid Laboratory, LLC, Oxford) a été re-suspendu selon les recommandations du fournisseur puis dilué en tampon 10 mM Sodium Phosphate pH 7,4 à une concentration de 30 µM. La solution (ci-après « échantillon Monomères »), contenant le peptide beta amyloïde 1-42 NAFβ, a ensuite été congelée à -80°C. Un test à la Thioflavine T a été réalisé sur cette solution. Il indique que celle-ci contient plus de 90% de monomères de peptide beta amyloïde 1-42. Préparation de peptide beta amyloïde 1-42 AFβ (Agrégats) Le peptide amyloïde beta 1-42 humain lyophilisé (ERI275BAS, The ERI Amyloid Laboratory, LLC, Oxford) a été re-suspendu selon les recommandations du fournisseur puis dilué en tampon 10 mM Sodium Phosphate pH 7,4 à une concentration de 30 µM. Cette solution est ensuite incubée 188 heures à 25°C. La solution (ci-après « échantillon Agrégats »), contenant le peptide beta amyloïde 1-42 AFβ, a ensuite été congelée à -80°C. Un test à la Thioflavine T a été réalisé sur cette solution. Il indique que celle-ci contient plus de 90% d’agrégats de peptide beta amyloïde 1-42. Test de la paire d’anticorps sur les Monomères ou les Agrégats Le jour du test, les échantillons Monomère et Agrégat ont été décongelés puis dilués en tampon 10 mM Sodium Phosphate pH 7,4 à une concentration de 2,4 ng/mL avant distribution dans des microplaques 384 puits (Greiner référence 784075). Les réactifs suivants ont été ajoutés dans les microplaques selon l’ordre ci-dessous : - 16 µL d’échantillon Monomères ou d’échantillon Agrégats - 2 µL d’anticorps Donneur - 2 µL d’anticorps Accepteur Les plaques ont été incubées une nuit à température comprise entre 2°C et 8°C. La détection du signal FRET dans les différentes plaques été réalisée sur un appareil PHERAstar FS Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF. Le signal obtenu en FRET sur l’échantillon Monomères et sur l’échantillon Agrégats ont été comparés en calculant le rapport des signaux de FRET (Monomère / Agrégats) tel que montré à la Figure 9. Le rapport des signaux de FRET (Monomère / Agrégat) de la paire d’anticorps étudiée est supérieur à 2 (valeur de 4,5). Cela indique que cette paire d’anticorps discrimine la amyloïde beta 1-42 NAFβ de la amyloïde beta 1-42 AFβ, c’est-à-dire que cette paire d’anticorps est spécifique du peptide amyloïde beta 1 -42 NAFβ. Exemple 5 : Test de l’effet du Hexafluoroisopropanol (HFIP) sur la capacité de détection d’une méthode utilisant une paire d’anticorps capable de se lier spécifiquement au TDP-43 NAFβ Le HFIP a été utilisé pur (100%) ou dilué dans du tampon de lyse pour obtenir des solutions à 20%, 10% et 2%. Les réactifs suivants ont été distribués dans une plaque 384 puits dans l’ordre suivant: 1) 8 µL d’un échantillon de TDP-43 NAFβ préparé selon le protocole décrit à l’Exemple 2. 2) 8 µL des différentes solutions de HFIP à 100%, 20%, 10% et 2% ou de tampon de lyse supplémenté. 3) Ajout des réactifs de détection FRET : - 2 µL d’anticorps Ac1 Donneur préparé comme décrit à l’Exemple 2 - 2 µL d’anticorps Ac2 Accepteur préparé comme décrit à l’Exemple 2. Les plaques ont été incubées une nuit à température ambiante. La détection du signal HTRF dans les différentes plaques a été réalisée sur un appareil PHERAstar FS Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF. La Figure 10 donne les signaux obtenus avec les différentes concentrations de HFIP testées. Pour des concentrations supérieures à 2%, le HFIP diminue de plus de 75% le signal de détection du TDP-43 NAFβ. Son effet éventuel sur les agrégats sera donc évalué dans ce format avec une concentration de 2%. Exemple 6 : Test du HFIP comme agent désagrégeant deTDP-43 AFβ Le HFIP a été dilué dans du tampon de lyse pour obtenir une solution à 2%. Les réactifs suivants ont été distribués dans une plaque 384 puits dans l’ordre suivant: 1) 8 µL d’un échantillon de TDP-43 AFβ préparé selon le protocole décrit à l’exemple 2. 2) 8 µL d’une solution de HFIP à 2% ou de tampon de lyse. 3) Ajout des réactifs de détection FRET : - 2 µL d’anticorps Ac1 Donneur préparé comme décrit à l’Exemple 2 - 2 µL d’anticorps Ac2 Accepteur préparé comme décrit à l’Exemple 2. Les plaques ont été incubées une nuit à température ambiante. La détection du signal HTRF dans les différentes plaques a été réalisée sur un appareil PHERAstar FS Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF. Le Ratio des signaux obtenus a été calculé comme suit à partir des signaux FRET obtenus sur les échantillons : Ratio des signaux = (Signal échantillon traité avec le HFIP 2%) / (Signal échantillon traité avec tampon de lyse). La Figure 11 donne les résultats obtenus. Le ratio des signaux est inférieur ou égal à 1 (0.89) ce qui indique que le traitement au HFIP 2% n’augmente pas la détection du PNAFβ dans l’échantillon contenant TDP-43 AFβ. On peut en conclure que le traitement au HFIP 2% ne permet pas de désagréger, même partiellement, TDP-43 AFβ. Exemple 7 : Test de l’effet de l’Urée sur la capacité de détection d’une méthode utilisant une paire d’anticorps capable de se lier spécifiquement au TDP-43 NAFβ L’urée a été diluée dans du tampon de lyse pour obtenir des solutions à 7M, 3,5M, 1,75 M et 0,88 M. Les réactifs suivants ont été distribués dans une plaque 384 puits dans l’ordre suivant : 1) 8 µL d’un échantillon de TDP-43 NAFβ préparé selon le protocole décrit à l’Exemple 2. 2) 8 µL des différentes solutions d’Urée à 7M, 3,5M, 1,75M et 0,88M ou de tampon de lyse. 3) Ajout des réactifs de détection FRET : - 2 µL d’anticorps Ac1 Donneur préparé comme décrit à l’Exemple 2 - 2 µL d’anticorps Ac2 Accepteur préparé comme décrit à l’Exemple 2. Les plaques ont été incubées une nuit à température ambiante. La détection du signal HTRF dans les différentes plaques été réalisée sur un appareil PHERAstar FS Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF. La Figure 12 donne les signaux obtenus avec les différentes concentrations d’Urée testées. Pour des concentrations supérieures à 3,5M, l’Urée diminue de plus de 75% le signal de détection du TDP-43 NAFβ. Son effet éventuel sur les agrégats sera donc évalué dans ce format avec des concentrations inférieures ou égales à 3,5M. Exemple 8 : Test de l‘Urée comme agent désagrégeant de TDP-43 AFβ L’urée a été dilué dans du tampon de lyse supplémenté pour obtenir des solutions à 3,5 M, 1,75 M et 0,88 M. Les réactifs suivants ont été distribués dans une plaque 384 puits dans l’ordre suivant : 1) 8 µL d’un échantillon de TDP-43 AFβ préparé selon le protocole décrit à l’Exemple 2. 2) 8 µL d’une solution d’Urée aux différents concentrations (3,5 M, 1,75 M et 0,88 M) ou de tampon de lyse. 3) Ajout des réactifs de détection FRET : - 2 µL d’anticorps Ac1 Donneur préparé comme décrit à l’Exemple 2. - 2 µL d’anticorps Ac2 Accepteur préparé comme décrit à l’Exemple 2. Les plaques ont été incubées une nuit à température ambiante. La détection du signal HTRF dans les différentes plaques a été réalisée sur un appareil PHERAstar FS Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF. Le Ratio des signaux obtenus a été calculé comme suit à partir des signaux FRET obtenus sur les échantillons : Ratio des signaux = (Signal échantillon traité avec l’Urée 3,5M) / (Signal échantillon traité avec tampon de lyse supplémenté). La Figure 13 donne les résultats obtenus. Le ratio des signaux est inférieur ou égal à 1 pour toutes les concentrations d’Urée testées ce qui indique que ces traitements n’augmentent pas la détection de TDP-43 PNAFβ dans l’échantillon agrégat. On peut en conclure qu’un traitement avec des concentrations d’Urée inférieures ou égales à 3,5M ne permet pas de désagréger, même partiellement, TDP-43 AFβ. Exemple 9 : Test de l’effet du chlorure de Guanidinium sur la capacité de détection d’une méthode utilisant une paire d’anticorps capable de se lier spécifiquement au TDP-43 NAFβ Le Chlorure de Guanidinium a été dilué dans du tampon de lyse supplémenté pour obtenir des solutions à 6 M, 3 M et 1,5 M. Les réactifs suivants ont été distribués dans une plaque 384 puits dans l’ordre suivant : 1) 8 µL d’un échantillon de TDP-43 NAFβ préparé selon le protocole décrit à l’Exemple 2. 2) 8 µL des différentes solutions de Chlorure de Guanidinium à 6 M, 3 M et 1,5 M ou de tampon de lyse supplémenté. 3) Ajout des réactifs de détection FRET : - 2 µL d’anticorps Ac1 Donneur préparé comme décrit à l’Exemple 2 - 2 µL d’anticorps Ac2 Accepteur préparé comme décrit à l’Exemple 2. Les plaques ont été incubées une nuit à température ambiante. La détection du signal HTRF dans les différentes plaques a été réalisée sur un appareil PHERAstar FS Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF. La Figure 14 donne les signaux obtenus avec les différentes concentrations de Chlorure de Guanidinium testées. Quelle que soit sa concentration, le Chlorure de Guanidinium diminue de plus de 75% le signal de détection de TDP-43 NAFβ. Son effet éventuel sur les agrégats ne pourra donc pas être évalué dans ce format car ce composé empêche la détection de TDP-43 NAFβ. Exemple 10 : Test de l’effet l’Acide Formique (AF) et l’Acide Trifluoroacétique (TFA) sur la capacité de détection d’une méthode utilisant une paire d’anticorps capable de se lier spécifiquement au TDP-43 NAFβ L’AF et le TFA ont été dilués dans du tampon de lyse supplémenté pour obtenir des solutions à 20%, 10% et 2%. Les réactifs suivants ont été distribués dans une plaque 384 puits dans l’ordre suivant: 1) 8µL d’un TDP-43 NAFβ préparé selon le protocole décrit à l’Exemple 2. 2) 8µL des différentes solutions de d’AF ou de TFA à 20%, 10% et 2% ou de tampon de lyse supplémenté. 3) Ajout des réactifs de détection FRET : - 2 µL d’anticorps Ac1 Donneur préparé comme décrit à l’Exemple 2 - 2 µL d’anticorps Ac2 Accepteur préparé comme décrit à l’Exemple 2. Les plaques ont été incubées une nuit à température ambiante. La détection du signal HTRF dans les différentes plaques a été réalisée sur un appareil PHERAstar FS Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF. La Figure 15 donne les signaux obtenus avec les différentes concentrations d’AF ou de TFA testées. Quelle que soit leurs concentrations, ces réactifs diminuent de plus de 75% le signal de détection du TDP-43 NAFβ. Leur effet éventuel sur les agrégats ne pourra donc pas être évalué dans ce format car ils empêchent la détection de TDP-43 NAFβ. Exemple 11 : Test de l’effet de l’acide formique (AF) suivi d’une neutralisation au NaOH sur la capacité de détection d’une méthode utilisant une paire d’anticorps capable de se lier spécifiquement au TDP-43 NAFβ L’AF a été dilué dans du tampon de lyse supplémenté pour obtenir des solutions à 20%. Le NaOH a été dilué dans un tampon HEPES 450mM pour obtenir une solution 5N Les réactifs suivants ont été distribués dans une plaque 96 puits dans l’ordre suivant: 1) 60 µL d’un échantillon de TDP-43 NAFβ préparé selon le protocole décrit à l’Exemple 2. 2) 8 µL d’une solution d’AF à 20% ou de tampon de lyse supplémenté. Le mélange a été incubé 15 minutes à température ambiante. Le pH mesuré à cette étape est égal à 2,5. 3) 9 µL d’une solution de NaOH 5N ou de tampon de lyse supplémenté. Le pH mesuré après ces ajouts est égal à 7,6. Une partie du volume contenu dans les puits de la plaque 96 puits a été transféré dans une plaque 384 puits avant d’ajouter les réactifs de détection FRET avec : - 16 µL du mélange issu de la plaque 96 puits - 2 µL d’anticorps Ac1 Donneur préparé comme décrit à l’Exemple 2 - 2 µL d’anticorps Ac2 Accepteur préparé comme décrit à l’Exemple 2. Les plaques ont été incubées une nuit à température ambiante. La détection du signal HTRF dans les différentes plaques a été réalisée sur un appareil PHERAstar FS Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF. La Figure 16 compare le signal de détection de la PNAFβ obtenu avec le traitement AF puis NaOH avec celui obtenu en absence de traitement. Le traitement provoque une disparition quasi-totale du signal de détection de TDP-43 NAFβ. Leur effet éventuel sur la désagrégation de TDP-43 AFβ ne pourra donc pas être évalué. Exemple 12 : Test de l’effet de l’Acide Trifluoroacétique (TFA) suivi d’une neutralisation au NaOH sur la capacité de détection d’une méthode utilisant une paire d’anticorps capable de se lier spécifiquement au TDP-43 NAFβ Le TFA a été dilué dans du tampon de lyse supplémenté pour obtenir des solutions à 20%. Le NaOH a été dilué dans un tampon HEPES 450 mM pour obtenir une solution 5N. Les réactifs suivants ont été distribués dans une plaque 96 puits dans l’ordre suivant: 1) 60 µL d’un échantillon de TDP-43 NAFβ préparé selon le protocole décrit à l’Exemple 2. 2) 8 µL d’une solution de TFA à 20% ou de tampon de lyse supplémenté. Le mélange a été incubé 15 minutes à température ambiante. Le pH mesuré à cette étape est égal à 0,6. 3) 4,5 µL d’une solution de NaOH 5N ou de tampon de lyse supplémenté. Le pH mesuré après cet ajout est égal à 7,5. Une partie du volume contenu dans les puits de la plaque 96 puits a été transféré dans une plaque 384 puits avant d’ajouter les réactifs de détection FRET avec : - 16 µL du mélange issu de la plaque 96 puits - 2 µL d’anticorps Ac1 Donneur préparé comme décrit à l’Exemple 2 - 2 µL d’anticorps Ac2 Accepteur préparé comme décrit à l’Exemple 2. Les plaques ont été incubées une nuit à température ambiante. La détection du signal HTRF dans les différentes plaques a été réalisée sur un appareil PHERAstar FS Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF. La Figure 17 compare le signal de détection de la PNAFβ obtenu avec le traitement TFA puis NaOH avec celui obtenu en absence de traitement. Même si ce traitement affecte significativement le signal de détection de TDP-43 NAFβ (-62%), le signal restant permet de tester celui-ci sur la désagrégation de la TDP-43 AFβ. Exemple 13 : Test de l’effet de l’Acide Trifluoroacétique (TFA) suivi d’une neutralisation au NaOH comme agent désagrégeant de TDP-43 AFβ Le TFA a été dilué dans du tampon de lyse supplémenté pour obtenir des solutions à 20%. Le NaOH a été dilué dans un tampon HEPES 450 mM pour obtenir une solution 5 N. Les réactifs suivants ont été distribués dans une plaque 96 puits dans l’ordre suivant: 1) 60 µl d’un échantillon de TDP-43 AFβ préparé selon le protocole décrit à l’Exemple 2. 2) 8 µL d’une solution de TFA à 20% ou d’un mélange TFA/NaOH (obtenu en mélangeant 8 volumes d’une solution de TFA 20% avec 4.5 volumes d’une solution de NaOH 5N). Le mélange a été incubé 15 minutes à température ambiante. 3) 4,5 µL d’une solution de NaOH 5N ou d’un mélange TFA/NaOH. Le pH mesuré après cet ajout est égal à 7,5. Une partie du volume contenu dans les puits de la plaque 96 puits a été transféré dans une plaque 384 puits avant d’ajouter les réactifs de détection FRET avec : - 16 µL du mélange issu de la plaque 96 puits - 2 µL d’anticorps Ac1 Donneur préparé comme décrit à l’Exemple 2 - 2 µL d’anticorps Ac2 Accepteur préparé comme décrit à l’Exemple 2. Les plaques ont été incubées une nuit à température ambiante. La détection du signal HTRF dans les différentes plaques a été réalisée sur un appareil PHERAstar FS Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF. Le Ratio des signaux obtenus a été calculé comme suit à partir des signaux FRET obtenus sur les échantillons : Ratio des signaux = (Signal échantillon traité avec TFA 20% puis NaOH 5N) / (Signal échantillon traité avec le mélange TFA/NaOH). La Figure 18 donne les résultats obtenus. Le ratio des signaux est inférieur ou égal à 1 (0,56) ce qui indique que le traitement n’augmente pas la détection de TDP-43 NAFβ dans l’échantillon agrégat. On peut en conclure que le traitement au TFA 20% suivi d’une neutralisation au NaOH ne permet pas de désagréger, même partiellement, TDP-43 AFβ. Exemple 14 : Test de l’effet de l’acide formique (AF) suivi d’une neutralisation au NH 4 OH sur la capacité de détection d’une méthode utilisant une paire d’anticorps capable de se lier spécifiquement au TDP-43 NAFβ L’AF a été dilué dans du tampon de lyse supplémenté pour obtenir des solutions à 20%. Le NH 4 OH a été dilué dans un tampon HEPES 450mM pour obtenir une solution 5N. Les réactifs suivants ont été distribués dans une plaque 96 puits dans l’ordre suivant: 1) 60 µL d’un échantillon de TDP-43 NAFβ préparé selon le protocole décrit à l’Exemple 2. 2) 8 µL d’une solution d’AF à 20% ou de tampon de lyse supplémenté. Le mélange a été incubé 15 minutes à température ambiante. Le pH mesuré à cette étape est égal à 2,5. 3) 12 µL d’une solution de NH 4 OH 5N. Le pH mesuré après cet ajout est égal à 7,2. Une partie du volume contenu dans les puits de la plaque 96 puits a été transféré dans une plaque 384 puits avant d’ajouter les réactifs de détection FRET avec : - 16 µL du mélange issu de la plaque 96 puits - 2 µL d’anticorps Ac1 Donneur préparé comme décrit à l’Exemple 2 - 2 µL d’anticorps Ac2 Accepteur préparé comme décrit à l’Exemple 2. Les plaques ont été incubées une nuit à température ambiante. La détection du signal HTRF dans les différentes plaques a été réalisée sur un appareil PHERAstar FS Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF. La Figure 19 compare le signal de détection de TDP-43 NAFβ obtenu avec le traitement AF puis NH 4 OH avec celui obtenu en absence de traitement. Même si ce traitement affecte significativement le signal de détection de la TDP-43 NAFβ (-68%), le signal restant permet de tester celui-ci sur la désagrégation de TDP-43 AFβ. Exemple 15 : Test de l’effet de l’acide formique (AF) suivi d’une neutralisation au NH 4 OH comme agent désagrégeant de TDP-43 AFβ L’AF a été dilué dans du tampon de lyse supplémenté pour obtenir des solutions à 20%. Le NH 4 OH a été dilué dans un tampon HEPES 450mM pour obtenir une solution 5N Les réactifs suivants ont été distribués dans une plaque 96 puits dans l’ordre suivant: 1) 60 µL d’un échantillon de TDP-43 AFβ préparé selon le protocole décrit à l’Exemple 2 2) 8 µL d’une solution d’AF à 20% ou d’un mélange AF/ NH 4 OH (obtenu en mélangeant 8 volumes d’une solution de TFA 20% avec 12 volumes d’une solution de NH 4 OH 5N). Le mélange a été incubé 15 minutes à température ambiante. 3) 12 µL d’une solution de NH 4 OH 5N ou d’un mélange AF/ NH 4 OH. Le pH mesuré après cet ajout est égal à 7,2. Une partie du volume contenu dans les puits de la plaque 96 puits a été transféré dans une plaque 384 puits avant d’ajouter les réactifs de détection FRET avec : - 16 µL du mélange issu de la plaque 96 puits - 2 µL d’anticorps Ac1 Donneur préparé comme décrit à l’Exemple 2 - 2 µL d’anticorps Ac2 Accepteur préparé comme décrit à l’Exemple 2. Les plaques ont été incubées une nuit à température ambiante. La détection du signal HTRF dans les différentes plaques a été réalisée sur un appareil PHERAstar FS Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF. Le Ratio des signaux obtenus a été calculé comme suit à partir des signaux FRET obtenus sur les échantillons : Ratio des signaux = (Signal échantillon traité avec AF 20% puis NH 4 OH 5N) / (Signal échantillon traité avec le mélange AF/NH 4 OH). La Figure 20 donne les résultats obtenus. Le ratio des signaux est inférieur ou égal à 1 (0,78) ce qui indique que le traitement n’augmente pas la détection de TDP-43 NAFβ dans l’échantillon agrégat. On peut en conclure que le traitement à l’AF 20% suivi d’une neutralisation au NH 4 OH ne permet pas de désagréger, même partiellement, TDP-43 AFβ. Exemple 16 : Test de l’effet de l’acide trifluoroacétique (TFA) suivi d’une neutralisation au NH 4 OH sur la capacité de détection d’une méthode utilisant une paire d’anticorps capable de se lier spécifiquement au TDP-43 NAFβ Le TFA a été dilué dans du tampon de lyse supplémenté pour obtenir des solutions à 20%. Le NH 4 OH a été dilué dans un tampon HEPES 450mM pour obtenir une solution 5N. Les réactifs suivants ont été distribués dans une plaque 96 puits dans l’ordre suivant: 1) 60 µL d’un échantillon de TDP-43 NAFβ préparé selon le protocole décrit à l’Exemple 2. 2) 8 µL d’une solution de TFA à 20% ou de tampon de lyse supplémenté. Le mélange a été incubé 15 minutes à température ambiante. Le pH mesuré à cette étape est égal à 0,6. 3) 7 µL d’une solution de NH 4 OH 5N. Le pH mesuré après cet ajout est égal à 7,5. Une partie du volume contenu dans les puits de la plaque 96 puits a été transféré dans une plaque 384 puits avant d’ajouter les réactifs de détection FRET avec : - 16 µL du mélange issu de la plaque 96 puits - 2 µL d’anticorps Ac1 Donneur préparé comme décrit à l’Exemple 2 - 2 µL d’anticorps Ac2 Accepteur préparé comme décrit à l’Exemple 2. Les plaques ont été incubées une nuit à température ambiante. La détection du signal HTRF dans les différentes plaques a été réalisée sur un appareil PHERAstar FS Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF. La Figure 21 compare le signal de détection de la PNAFβ obtenu avec le traitement TFA puis NH 4 OH avec celui obtenu en absence de traitement. Même si ce traitement affecte significativement le signal de détection de TDP-43 NAFβ (-72%), le signal restant permet de tester celui-ci sur la désagrégation de TDP-43 AFβ. Exemple 17 : Test de l’effet de l’acide trifluoroacétique (TFA) suivi d’une neutralisation au NH 4 OH comme agent désagrégeant de TDP-43 AFβ Le TFA a été dilué dans du tampon de lyse supplémenté pour obtenir des solutions à 20%. Le NH 4 OH a été dilué dans un tampon HEPES 450mM pour obtenir une solution 5N. Les réactifs suivants ont été distribués dans une plaque 96 puits dans l’ordre suivant: 1) 60 µL d’un échantillon de TDP-43 AFβ préparé selon le protocole décrit à l’Exemple 2 2) 8 µL d’une solution de TFA à 20% ou d’un mélange TFA/NH 4 OH (obtenu en mélangeant 8 volumes d’une solution de TFA 20% avec 7 volumes d’une solution de NH 4 OH 5N). Le mélange a été incubé 15 minutes à température ambiante. 3) 7 µl d’une solution de NH 4 OH 5N ou d’un mélange TFA/ NH 4 OH. Le pH mesuré après cet ajout est égal à 7,5. Une partie du volume contenu dans les puits de la plaque 96 puits a été transféré dans une plaque 384 puits avant d’ajouter les réactifs de détection FRET avec : - 16 µL du mélange issu de la plaque 96 puits - 2 µL d’anticorps Ac1 Donneur préparé comme décrit à l’Exemple 2 - 2 µL d’anticorps Ac2 Accepteur préparé comme décrit à l’Exemple 2. Les plaques ont été incubées une nuit à température ambiante. La détection du signal HTRF dans les différentes plaques a été réalisée sur un appareil PHERAstar FS Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF. Le Ratio des signaux obtenus a été calculé comme suit à partir des signaux FRET obtenus sur les échantillons : Ratio des signaux = (Signal échantillon traité avec TFA 20% puis NH 4 OH 5N) / (Signal échantillon traité avec le mélange TFA/NH 4 OH). La Figure 22 donne les résultats obtenus. Le ratio des signaux est inférieur ou égal à 1 (0,42) ce qui indique que le traitement n’augmente pas la détection de TDP-43 NAFβ dans l’échantillon agrégat. On peut en conclure que le traitement au TFA 20% suivi d’une neutralisation au NH 4 OH ne permet pas de désagréger, même partiellement, TDP-43 AFβ. Exemple 18 : effet de solutions de NaOH donnant des pH compris entre 8,2 et 13,3 suivi d’une neutralisation au HCl sur la méthode utilisant les réactifs de détection de TDP-43 NAFβ Solutions de NaOH testées Condition Solution NaOH pH mesuré après ajout sur l’échantillon de TDP-43 NAFβ A 0,5N 8,2 B 0,6N 8,5 C 0,8N 9,6 D 1,2N 12,8 E 2,4N 13,2 F 5N 13,3 Solutions de HCl testées Condition Solution HCl A 0,34N B 0,34N C 0,5N D 1N E 2N F 5N Mélanges NaOH/HCl testés (obtenus en mélangeant un volume identique d’une solution de NaOH et d’une solution de HCl) Condition Solution NaOH Solution HCl pH mesuré après ajout sur l’échantillon de TDP-43 NAFβ A 0,5N 0,34N 7,6 B 0,6N 0,34N 7,4 C 0,8N 0,5N 7,4 D 1,2N 1N 7,2 E 2,4N 2N 7,4 F 5N 5N 7 Les réactifs suivants ont été distribués dans une plaque 96 puits: - 60 µL d’un échantillon de TDP-43 NAFβ préparé selon le protocole décrit à l’Exemple 2. - 10 µL des différentes solutions de NaOH (A, B, C, D, E ou F) ou de tampon. Le mélange a été incubé 15 minutes à température ambiante. - 10 µL des différentes solutions de HCl (A, B, C, D, E ou F) ou de tampon. Une partie du volume contenu dans les puits de la plaque 96 puits a été transféré dans une plaque 384 puits avant d’ajouter les réactifs de détection FRET avec : - 16 µL du mélange issu de la plaque 96 puits - 2 µL d’anticorps Ac1 Donneur préparé comme décrit à l’Exemple 2 - 2 µL d’anticorps Ac2 Accepteur préparé comme décrit à l’Exemple 2. Les plaques ont été incubées une nuit à température ambiante. La détection du signal HTRF dans les différentes plaques a été réalisée sur un appareil PHERAstar FS Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF. La Figure 23 montre les résultats obtenus avec les différentes modes de traitement. Le traitement avec une solution de NaOH aboutissant à un pH de 13.3 suivi d’une neutralisation à l’HCl ne permet pas de détecter TDP-43 NAFβ. Le pouvoir désagrégeant de toutes les autres solutions a pu être testé sur TDP-43 AFβ. Exemple 19 : détermination du pH minimum et maximum pour désagréger TDP-43 AFβ avec NaOH Solutions de NaOH testées Condition Solution NaOH pH mesuré après ajout sur l’échantillon de TDP-43 AFβ A 0,5N 8,2 B 0,6N 8,5 C 0,8N 9,6 D 1,2N 12,8 E 2,4N 13,2 Solutions de HCl testées Condition Solution HCl A 0,34N B 0,34N C 0,5N D 1N E 2N Mélanges NaOH/HCl testés (obtenus en mélangeant un volume identique d’une solution de NaOH et d’une solution de HCl) Condition Solution NaOH Solution HCl pH mesuré après ajout sur l’échantillon de TDP-43 AFβ A 0,5N 0,34N 7,6 B 0,6N 0,34N 7,4 C 0,8N 0,5N 7,4 D 1,2N 1N 7,2 E 2,4N 2N 7,4 Les réactifs suivants ont été distribués Dans une plaque 96 puits: - 60 µL d’un échantillon de TDP-43 AFβ préparé selon le protocole décrit à l’Exemple 2. - 10 µL des différentes solutions de NaOH (A, B, C, D ou E) ou des mélanges NaOH/HCl correspondants (A, B, C, D ou E). Le mélange a été incubé 15 minutes à température ambiante. - 10 µL des différentes solutions de HCl (A, B, C, D, E) ou des mélanges NaOH/HCl correspondants (A, B, C, D, E). Une partie du volume contenu dans les puits de la plaque 96 puits a été transféré dans une plaque 384 puits avant d’ajouter les réactifs de détection FRET avec : - 16 µL du mélange issu de la plaque 96 puits - 2 µL d’anticorps Ac1 Donneur préparé comme décrit à l’Exemple 2 - 2 µL d’anticorps Ac2 Accepteur préparé comme décrit à l’Exemple 2. Les plaques ont été incubées une nuit à température ambiante. La détection du signal HTRF dans les différentes plaques a été réalisée sur un appareil PHERAstar FS Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF. Le Ratio des signaux obtenus a été calculé comme suit à partir des signaux FRET obtenus sur les échantillons : Ratio des signaux = (Signal échantillon traité avec NaOH puis HCl) / (Signal échantillon traité avec mélange NaOH/HCl). La Figure 24 montre les résultats obtenus en fonction du pH induit par les différentes solutions de NaOH testées. La détection de TDP-43 NAFβ est possible lorsque le pH va de 8,5 à 13,2 durant l’étape de désagrégation. Toutefois, le pH permettant d’avoir une amplitude optimale de détection de TDP-43 NAFβ est d’environ pH 12,8. Exemple 20 : détermination du temps nécessaire pour désagréger TDP-43 AFβ à un pH de 12,8 Les réactifs suivants ont été distribués dans une plaque 96 puits dans l’ordre suivant: 1) 60 µL d’un échantillon de TDP-43 AFβ préparé selon le protocole décrit à l’exemple 2 2) 10 µL d’une solution de NaOH à 1,2N (pH de l’échantillon porté à 12,8) ou d’un mélange NaOH/HCl (obtenu en mélangeant un volume identique d’une solution de NaOH à 1,2N et d’une solution de HCl à 1N). Le mélange a été incubé entre 30 secondes et 1h à température ambiante selon les puits. 3) 10 µL d’une solution de HCl à 1N (pH de l’échantillon porté à 7,5) dans les puits traités avec NaOH à 1,2N ou 10 µL du mélange NaOH/HCl dans les puits traités avec le mélange NaOH/HCl. Une partie du volume contenu dans les puits de la plaque 96 puits a été transféré dans une plaque 384 puits avant d’ajouter les réactifs de détection FRET avec : - 16 µL du mélange issu de la plaque 96 puits - 2 µL d’anticorps Ac1 Donneur préparé comme décrit à l’Exemple 2 - 2 µL d’anticorps Ac2 Accepteur préparé comme décrit à l’Exemple 2. Les plaques ont été incubées une nuit à température ambiante. La détection du signal HTRF dans les différentes plaques a été réalisée sur un appareil PHERAstar FS Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF. Le Ratio des signaux obtenus a été calculé comme suit à partir des signaux FRET obtenus sur les échantillons : Ratio des signaux = (Signal échantillon traité avec NaOH à 1,2N puis HCl à 1N) / (Signal échantillon traité avec mélange NaOH/HCl). La Figure 25 donne les résultats obtenus en fonction du temps de contact avec NaOH à 1,2N. Les résultats montrent que le traitement au NaOH à 1,2N a permis de désagréger au moins partiellement TDP-43 AFβ indépendamment du temps de contact (ratio des signaux toujours supérieur à 1. Toutefois, la meilleure désagrégation a été obtenue pour des temps de contact allant de 5 minutes à 30 minutes. Exemple 21 : détermination du pH minimum et maximum lors de la mesure la détection de TDP-43 NAFβ Solutions de NaOH testées Solution de NaOH à 1,2N (permet de porter le pH de l’échantillon à 12,8) Solutions de HCl testées Condition Solution HCl A 1,4N B 1,3N C 1,2N D 1N E 0,7N F 0,6N G 0,5N H 0,4N I 0,3N Mélanges NaOH/HCl testés (obtenus en mélangeant un volume identique d’une solution de NaOH et d’une solution de HCl). Condition Solution NaOH Solution HCl pH mesuré après ajout sur l’échantillon de TDP-43 AFβ A 1,2N 1,4N 5,7 B 1,2N 1,3N 6 C 1,2N 1,2N 6,4 D 1,2N 1N 7,2 E 1,2N 0,7N 8 F 1,2N 0,6N 8,4 G 1,2N 0,5N 10,4 H 1,2N 0,4N 11,2 I 1,2N 0,3N 12,8 Les réactifs suivants ont été distribués Dans une plaque 96 puits: - 60 µL d’un échantillon de TDP-43 AFβ préparé selon le protocole décrit à l’Exemple 2. - 10 µL des différentes solutions de NaOH à 1,2N ou des mélanges NaOH/HCl correspondants (A, B, C, D, E, F, G, H ou I). Le mélange a été incubé 15 minutes à température ambiante. - 10 µL des différentes solutions de HCl (A, B, C, D, E, F, G, H ou I ) ou des mélanges NaOH/HCl correspondants (A, B, C, D, E, F, G, H ou I). Une partie du volume contenu dans les puits de la plaque 96 puits a été transféré dans une plaque 384 puits avant d’ajouter les réactifs de détection FRET avec : - 16 µL du mélange issu de la plaque 96 puits - 2 µL d’anticorps Ac1 Donneur préparé comme décrit à l’Exemple 2 - 2 µL d’anticorps Ac2 Accepteur préparé comme décrit à l’Exemple 2. Les plaques ont été incubées une nuit à température ambiante. La détection du signal HTRF dans les différentes plaques a été réalisée sur un appareil PHERAstar FS Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF. Le Ratio des signaux obtenus a été calculé comme suit à partir des signaux FRET obtenus sur les échantillons : Ratio des signaux = (Signal échantillon traité avec NaOH à 1,2N puis HCl) / (Signal échantillon traité avec mélange NaOH/HCl). La Figure 26 montre que la TDP-43 NAFβ peut être détecté après traitement à pH=12,8 lorsque le pH est ensuite ramené entre pH=6 et pH=10,5. La détection est optimale lorsque le pH est compris entre 6 et 8,5. Exemple 22 : mesure du niveau d’agrégation d’un peptide béta amyloïde 1-42 en utilisant le NaOH comme agent désagrégeant et l’HCl comme agent neutralisant La méthode décrite ci-dessous est basée sur la technologie HTRF (voir Exemple 1 pour principe). Les solutions de NaOH 1,2N et d’HCl 1N ont été préparées comme décrit dans les exemples précédents. Préparation d’échantillons contenant du peptide amyloïde beta 1-42 monomérique (1-42 NAFβ) ou agrégé (1-42 AFβ) : le peptide amyloïde beta 1-42 humain lyophilisé (ERI275BAS, The ERI Amyloid Laboratory, LLC, Oxford) a été re-suspendu selon les recommandations du fournisseur puis dilué en tampon 10 mM Sodium Phosphate pH 7,4 à une concentration de 30 µM (1-42 NAFβ). Une solution identique de peptide amyloïde beta 1-42 est incubée 188 heures à 25°C pour obtenir du 1-42 AFβ. Les 2 échantillons ont été congelés à -80°C avant utilisation future. Avant utilisation, le niveau d’agrégation des 2 échantillons a été contrôlé par la méthode à la Thioflavine T. Le jour du test, les échantillons 1-42 NAFβ et 1-42 AFβ ont été décongelés puis dilués en tampon 10 mM Sodium Phosphate pH 7,4 à une concentration de 2,4 ng/mL avant distribution dans la microplaque. Les réactifs suivants ont été distribués dans une plaque 384 puits dans l’ordre suivant: 1) 12 µL d’un échantillon de 1-42 AFβ ou d’un échantillon de 1-42 NAFβ. 2) 2 µL d’une solution de NaOH à 1,2N ou d’un mélange NaOH/HCl (obtenu en mélangeant un volume identique d’une solution de NaOH à 1,2N et d’une solution de HCl à 1N). Le mélange a été incubé 15 minutes à température ambiante. 3) 2 µL d’une solution de HCl à 1N ou d’un mélange NaOH/HCl. 4) Ajout des réactifs de détection FRET : - 2 µL d’anticorps Donneur préparé comme décrit à l’Exemple 4. - 2 µL d’anticorps Accepteur préparé comme décrit à l’Exemple 4. Les plaques ont été incubées une nuit à température comprise entre 2°C et 8°C. La détection du signal HTRF dans les différentes plaques a été réalisée sur un appareil PHERAstar FS Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF. Le Ratio d’Agrégation est calculé comme suit à partir des signaux HTRF obtenus sur les échantillons : Ratio des signaux = (Signal échantillon traité NaOH 1.2N puis HCl 1N) / (Signal échantillon traité avec le mélange NaOH/HCl). La Figure 27 montre les ratios de signaux obtenus avec les échantillons 1-42 NAFβ et 1-42 AFβ. Le ratio de signal obtenu sur l’échantillon 1-42 AFβ est très supérieur à celui obtenu sur l’échantillon 1-42 NAFβ. Ce résultat nous indique que la méthode est capable de mesurer le niveau d’agrégation du peptide amyloïde 1-42. Exemple 23 : Effet d’un traitement au NaOH, à l’hydroxyde de potassium (KOH) ou au NH 4 OH suivi d’une neutralisation à l‘HCl sur la capacité de détection d’une méthode utilisant une paire d’anticorps capable de se lier spécifiquement au TDP-43 NAFβ Préparation de solutions de NaOH, de KOH, de NH 4 OH et de HCl pour traiter des lysats de TDP43-AFβ Condition Solution de base pH mesuré après ajout sur l’échantillon de TDP-43 NAFβ A NaOH 1,2N 12,8 B KOH 1,2N 12,5 C NH 4 OH 10N 10,9 D NaOH 1,2N 9,6 E NH 4 OH 1,2N 9,6 Solutions de HCl testées Condition Solution HCl pH mesuré après ajout sur l’échantillon de TDP-43 NAFβ A 1N 7,2 B 0,67N 7,5 C 6,6N 7,4 D 0,5N 7,4 E 0,5N 7,6 Mélanges Bases/HCl testés (obtenus en mélangeant un volume identique d’une solution de NaOH et d’une solution de HCl). Condition Solution de base Solution HCl pH mesuré après ajout sur l’échantillon de TDP-43 NAFβ A NaOH 1,2N 1N 7,2 B KOH 1,2N 0,67N 7,5 C NH 4 OH 10N 6,6N 7,4 D NaOH 1,2N 0,5N 7,4 E NH 4 OH 1,2N 0,5N 7,6 Les réactifs suivants ont été distribués Dans une plaque 96 puits: - 60 µL d’un échantillon de TDP-43 NAFβ préparé selon le protocole décrit à l’exemple 2. - 10 µL des différentes solutions de Bases (A, B, C, D ou E) ou des mélanges Bases/HCl correspondants (A, B, C, D ou E). Le mélange a été incubé 15 minutes à température ambiante. - 10 µL des différentes solutions de HCl (A, B, C, D, E) ou des mélanges Bases/HCl correspondants (A, B, C, D, E). Une partie du volume contenu dans les puits de la plaque 96 puits a été transféré dans une plaque 384 puits avant d’ajouter les réactifs de détection FRET avec : - 16 µL du mélange issu de la plaque 96 puits - 2 µL d’anticorps Ac1 Donneur préparé comme décrit à l’Exemple 2 - 2 µL d’anticorps Ac2 Accepteur préparé comme décrit à l’Exemple 2. Les plaques ont été incubées une nuit à température ambiante. La détection du signal HTRF dans les différentes plaques a été réalisée sur un appareil PHERAstar FS Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF. La Figure 28 montre les signaux de détection de TDP-NAFβ obtenus avec les différents traitements. La détection de TDP-43 NAFβ est possible quelles que soient les bases utilisées lorsqu’une étape de neutralisation au HCl permettant d’avoir un pH compris entre 7 et 8 est réalisée. L’effet désagrégeant de ces bases sera donc testés sur TDP-43 AFβ. Exemple 24 : Effet d’un traitement au NaOH, à l’hydroxyde de potassium (KOH) ou au NH 4 OH suivi d’une neutralisation à l‘HCl sur la désagrégation de TDP-43 AFβ Préparation de solutions de NaOH, de KOH, de NH 4 OH et de HCl pour traiter des lysats de TDP43-AFβ Condition Solution de base pH mesuré après ajout sur l’échantillon de TDP-43 AFβ A NaOH 1,2N 12,8 B KOH 1,2N 12,5 C NH 4 OH 10N 10,9 D NaOH 1,2N 9,6 E NH 4 OH 1,2N 9,6 Solutions de HCl testées Condition Solution HCl pH mesuré après ajout sur l’échantillon de TDP-43 AFβ A 1N 7,2 B 0,67N 7,5 C 6,6N 7,4 D 0,5N 7,4 E 0,5N 7,6 Mélanges Bases/HCl testés (obtenus en mélangeant un volume identique d’une solution de NaOH et d’une solution de HCl) Condition Solution de base Solution HCl pH mesuré après ajout sur l’échantillon de TDP-43 AFβ A NaOH 1,2N 1N 7,2 B KOH 1,2N 0,67N 7,5 C NH 4 OH 10N 6,6N 7,4 D NaOH 1,2N 0,5N 7,4 E NH 4 OH 1,2N 0,5N 7,6 Les réactifs suivants ont été distribués Dans une plaque 96 puits: - 60 µL d’un échantillon de TDP-43 AFβ préparé selon le protocole décrit à l’Exemple 2. - 10 µL des différentes solutions de Bases (A, B, C, D ou E) ou des mélanges Bases/HCl correspondants (A, B, C, D ou E). Le mélange a été incubé 15 minutes à température ambiante. - 10 µL des différentes solutions de HCl (A, B, C, D, E) ou des mélanges Bases/HCl correspondants (A, B, C, D, E). Une partie du volume contenu dans les puits de la plaque 96 puits a été transféré dans une plaque 384 puits avant d’ajouter les réactifs de détection FRET avec : - 16 µL du mélange issu de la plaque 96 puits - 2 µL d’anticorps Ac1 Donneur préparé comme décrit à l’Exemple 2 - 2 µL d’anticorps Ac2 Accepteur préparé comme décrit à l’Exemple 2. Les plaques ont été incubées une nuit à température ambiante. La détection du signal HTRF dans les différentes plaques a été réalisée sur un appareil PHERAstar FS Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF. Le Ratio des signaux obtenus a été calculé comme suit à partir des signaux FRET obtenus sur les échantillons : Ratio des signaux = (Signal échantillon traité avec Base puis HCl) / (Signal échantillon traité avec mélange Base/HCl). La Figure 29 montre le ratio des signaux obtenus avec les différents traitements. Les deux conditions de traitement au NaOH (1,2N et 0.8N), donnant respectivement des pH de 12,8 et 9,6, permettent de détecter TDP43-NAFβ confirmant leur effet désagrégeant sur TDP-43 AFβ. Le traitement au KOH 1,2N (pH=12,5) permet une faible détection de TDP43-NAFβ montrant un faible effet désagrégeant de TDP-43 AFβ. Les 2 traitements au NH 4 OH (10N et 1,2N) qui donnent des pH similaires aux traitements au NaOH ne permettent pas de détecter TDP43-NAFβ. Ce résultat montre que le NH 4 OH n’a aucun effet désagrégeant de TDP-43 AFβ. Exemple 25 : Méthode permettant d’identifier des paires d’anticorps capables de se lier spécifiquement à l’Alpha-Synucléine NAFβ (Alpha-Syn NAFβ) La méthode est basée sur la technologie FRET (Technologie HTRF® de Cisbio Bioassays), comme détaillé à l’Exemple 1. Paire d’anticorps testée Une paire d’anticorps dirigée contre l’Alpha-Synucléine marquée respectivement au Donneur et à l’Accepteur est celle contenue dans le kit HTRF Total-Alpha-Synuclein commercialisée par Cisbio Bioassays (réf. 6FNSYPEG). Chaque anticorps a été dilué dans le diluant du kit tel que préconisé par le manuel d’utilisation. Préparation d’échantillons d’Alpha-Syn NAF β et d’Alpha-Syn NAF β L’Alpha-Syn NAFβ et l’Alpha-Syn AFβ ont été obtenues auprès de la société StressMarq (StressMarq Active Human recombinant A53T Mutant Alpha Synuclein Protein Monomer, ref SPR-325 et Active Human recombinant A53T Mutant Alpha Synuclein Protein Preformed Fibrils Type 1 réf. SPR-326). Elles ont été diluées à 15,6ng/mL dans le tampon de lyse du kit HTRF Total-A Synuclein. Test de la paire d’anticorps sur Alpha-Syn NAF β et Alpha-Syn AF β Les réactifs suivants ont été distribués dans une plaque 384 puits dans l’ordre suivant: 1) 12 µL d’Alpha-Syn NAFβ ou d’Alpha-Syn AFβ à 15,6ng/mL 2) 2 µL de tampon de lyse. Le mélange a été incubé 15 minutes à température ambiante. 3) 2 µL de tampon de lyse. 4) 2 µL d’anticorps Donneur. 5) 2 µL d’anticorps Accepteur. La détection du signal FRET dans les différentes plaques été réalisée sur un appareil PHERAstar FS Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF. Les signaux obtenus en FRET sur l’échantillon Alpha-Syn NAFβ (Monomères) et sur l’échantillon Alpha-Syn AFβ (Agrégats) ont été comparés en calculant le rapport des signaux de FRET (Monomères/Agrégats) tel que montré à la Figure 30. Le rapport des signaux de FRET (Monomère / Agrégat) de la paire d’anticorps est supérieur à 2 (valeur de 6,64). Cela indique que cette paire d’anticorps est capable de lier spécifiquement l’Alpha-Syn NAFβ par rapport à l’Alpha-Syn AFβ. Exemple 26 : effet d’une solution de NaOH 1.2N suivi d’une neutralisation au HCl 1N sur la capacité de détection d’une méthode utilisant une paire d’anticorps capable de se lier spécifiquement à l’Alpha-Syn NAFβ L’Alpha-Syn NAFβ (StressMarq, Active Human recombinant A53T Mutant Alpha Synuclein Protein Monomer, réf. SPR-326) a été dilué dans le tampon de lyse du kit HTRF Total-Alpha Synuclein (Cisbio Bioassays, réf. 6FNSYPEG) à 15,6ng/mL. Les anticorps donneur et accepteur du kit HTRF Total-A Synuclein ont été dilués comme recommandé par le fournisseur dans le manuel du kit. Les réactifs suivants ont été distribués dans une plaque 384 puits dans l’ordre suivant: 1) 12 µL d’Alpha-Syn NAFβ à 15,6 ng/mL 2) 2 µL d’une solution de NaOH à 1,2N (pH de l’échantillon porté à 12,8) ou d’un mélange NaOH/HCl (obtenu en mélangeant un volume identique d’une solution de NaOH à 1,2N et d’une solution de HCl à 1N). Le mélange a été incubé 15 minutes à température ambiante. 3) 2 µL d’une solution de HCl à 1N (pH de l’échantillon porté à 7,5) dans les puits traités avec NaOH à 1,2N ou 2µL du mélange NaOH/HCl dans les puits traités avec le mélange NaOH/HCl. 4) 2 µL d’anticorps Donneur préparé comme décrit dans l’exemple 25 5) 2 µL d’anticorps Accepteur préparé comme décrit dans l’exemple 25 Les plaques ont été incubées une nuit à température ambiante. La détection du signal HTRF dans les différentes plaques été réalisée sur un appareil PHERAstar FS Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF. La Figure 31 donne les résultats obtenus. Ils montrent que le traitement au NaOH à 1,2N suivi d’une neutralisation au HCl 1N affecte peu la détection de l’Alpha-Syn NAFβ par les anticorps. L’effet de ce traitement pour désagréger l’Alpha-Syn AFβ pourra donc être évalué. Exemple 27 : mesure du niveau d’agrégation de l’Alpha-Synucléine en utilisant le NaOH comme Agent Désagrégeant et l’HCl comme Agent Neutralisant La méthode est basée sur la technologie FRET (Technologie HTRF® de Cisbio Bioassays), comme détaillé à l’Exemple 1. Paire d’anticorps testée Les anticorps dirigés contre l’Alpha-Synucléine marqués respectivement au Donneur et à l’Accepteur sont ceux contenus dans le kit HTRF Total-Alpha-Synuclein commercialisé par Cisbio Bioassays (réf. 6FNSYPEG). Ils ont été dilués dans le diluant du kit tel que préconisé par le manuel d’utilisation. Préparation d’échantillons d’Alpha-Syn NAF β et d’Alpha-Syn NAF β L’Alpha-Syn NAFβ et l’Alpha-Syn AFβ ont été obtenues auprès de la société StressMarq (StressMarq Active Human recombinant A53T Mutant Alpha Synuclein Protein Monomer, ref SPR-325 et Active Human recombinant A53T Mutant Alpha Synuclein Protein Preformed Fibrils Type 1 ref SPR-326). Elles ont été diluées à 15.6 ng/mL dans le tampon de lyse du kit HTRF Total-Alpha Synuclein. Test de la paire d’anticorps sur Alpha-Syn NAF β et Alpha-Syn AF β Les réactifs suivants ont été distribués dans une plaque 384 puits dans l’ordre suivant: 1) 12 µL d’Alpha-Syn NAFβ ou d’Alpha-Syn AFβ à 15,6 ng/mL 2) 2 µL d’une solution de NaOH à 1,2N (pH de l’échantillon porté à 12,8) ou d’un mélange NaOH/HCl (obtenu en mélangeant un volume identique d’une solution de NaOH à 1,2N et d’une solution de HCl à 1N). Le mélange a été incubé 15 minutes à température ambiante. 3) 2 µL d’une solution de HCl à 1N (pH de l’échantillon porté à 7,5) dans les puits traités avec NaOH à 1,2N ou 2 µL du mélange NaOH/HCl dans les puits traités avec le mélange NaOH/HCl. 4) 2 µL d’anticorps Donneur. 5) 2 µL d’anticorps Accepteur. La détection du signal FRET dans les différentes plaques a été réalisée sur un appareil PHERAstar FS Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF. La Figure 32 montre les ratios de signaux obtenus avec les échantillons d’Alpha-Syn NAFβ et d’Alpha-Syn AFβ. Le ratio de signal obtenu sur l’échantillon d’Alpha-Syn AFβ est très supérieur à celui obtenu sur l’échantillon d’Alpha-Syn NAFβ. Ce résultat nous indique que la méthode selon l’invention permet de mesurer le niveau d’agrégation de l’Alpha-Synucléine. La Figure 1 illustre le principe général du procédé selon l’invention. La comparaison des teneurs en PNAFβ (Ratio des signaux) permet donc de savoir si l’échantillon testé comprend une PAFβ. Le ratio des signaux pour un échantillon ne comprenant pas de PAFβ sera égal à 1. Le ratio des signaux pour un échantillon comprenant des PAFβ sera supérieur à 1. La Figure 2 représente le signal ELISA (D.O.) obtenu pour différentes dilutions de PNAFβ. La valeur de D.O. correspondant à 80% du signal maximum permet de déterminer la dilution de référence à utiliser dans la suite de l’expérience. La Figure 3 représente les résultats obtenus dans un test ELISA visant à déterminer si une paire d’anticorps reconnait sélectivement ou non une PNAFβ. A) paire d’anticorps non sélective d’une PNAFβ. B) paire d’anticorps sélective d’une PNAFβ. La Figure 4 représente le principe d’un immunoessai HTRF. Ce type d’immunoessai permet de savoir si deux anticorps, respectivement marqués au Donneur et à l’Accepteur sont capables de créer une paire d’anticorps capables de reconnaitre simultanément un antigène d’intérêt. A) les 2 anticorps testés ne sont pas capables de créer une paire d’anticorps capable de reconnaitre l’antigène d’intérêt ; il n’y a pas de transfert d’énergie entre le Donneur et l’Accepteur et donc aucun signal de fluorescence émis par l’Accepteur. B) Les deux anticorps testés sont capables de reconnaitre simultanément l’antigène d’intérêt. Un transfert d’énergie se produit alors entre le Donneur et l’Accepteur. Il en résulte une émission de fluorescence spécifique à 665 nm qui est émise par l’accepteur. La Figure 5 représente le signal HTRF obtenu pour différentes dilutions de PNAFβ. La valeur de signal HTRF correspondant à 80% du signal maximum permet de déterminer la dilution de référence à utiliser dans la suite de l’expérience. La Figure 6 représente les résultats obtenus dans un test HTRF visant à déterminer si une paire d’anticorps reconnait sélectivement ou non une PNAFβ. A) paire d’anticorps non sélective d’une PNAFβ. B) paire d’anticorps sélective d’une PNAFβ. La Figure 7 représente le calcul du rapport des signaux entre un échantillon agrégat TDP-43 AFβ et un échantillon monomère TDP-43 NAFβ obtenu avec une paire d’anticorps dirigée contre la protéine TDP-43. Un rapport de signaux supérieur à 2 indique que la paire testée est sélective de TDP-43 NAFβ. La Figure 8 représente le calcul du rapport des signaux entre un échantillon agrégat de peptide amyloïde beta 1-40 et un échantillon monomère de ce même peptide obtenu avec une paire d’anticorps dirigée contre le peptide amyloïde beta 1-40. La valeur du rapport des signaux supérieure à 2 indique que la paire testée est sélective du peptide amyloïde 1-40 NAFβ (forme monomérique). La Figure 9 représente le calcul du rapport des signaux entre un échantillon agrégat de peptide amyloïde beta 1-42 et un échantillon monomère de ce même peptide obtenu avec une paire d’anticorps dirigée contre le peptide amyloïde beta 1-42. La valeur du rapport des signaux supérieure à 2 indique que la paire testée est sélective du peptide amyloïde 1-42 NAFβ (forme monomérique). La Figure 10 représente l’effet de l’Hexafluoroisopropanol (HFIP) sur la capacité de détection d’une méthode HTRF utilisant une paire d’anticorps capable de se lier spécifiquement au TDP-43 NAFβ. La Figure 11 représente l’absence d’effet désagrégeant de l’Hexafluoroisopropanol (HFIP) sur un échantillon de TDP-43 AFβ. La Figure 12 représente l’effet de l’Urée sur la capacité de détection d’une méthode HTRF utilisant une paire d’anticorps capable de se lier spécifiquement au TDP-43 NAFβ. La Figure 13 représente l’absence d’effet désagrégeant de l’Urée sur un échantillon de TDP-43 AFβ. La Figure 14 représente l’effet du Chlorure de Guanidinium sur la capacité de détection d’une méthode HTRF utilisant une paire d’anticorps capable de se lier spécifiquement au TDP-43 NAFβ. La Figure 15 représente l’effet de l’Acide Formique (A) ou du TFA (B) sur la capacité de détection d’une méthode HTRF utilisant une paire d’anticorps capable de se lier spécifiquement au TDP-43 NAFβ. La Figure 16 représente l’effet de l’Acide Formique suivi d’une neutralisation au NaOH sur la capacité de détection d’une méthode HTRF utilisant une paire d’anticorps capable de se lier spécifiquement au TDP-43 NAFβ. La Figure 17 représente l’effet du TFA suivi d’une neutralisation au NaOH sur la capacité de détection d’une méthode HTRF utilisant une paire d’anticorps capable de se lier spécifiquement au TDP-43 NAFβ. La Figure 18 représente l’absence d’effet désagrégeant du TFA suivi d’une neutralisation au NaOH sur un échantillon de TDP-43 AFβ. La Figure 19 représente l’effet de l’Acide Formique suivi d’une neutralisation au NH4OH sur la capacité de détection d’une méthode HTRF utilisant une paire d’anticorps capable de se lier spécifiquement au TDP-43 NAFβ. La Figure 20 représente l’absence d’effet désagrégeant de l’Acide Formique suivi d’une neutralisation au NH4OH sur un échantillon de TDP-43 AFβ. La Figure 21 représente l’effet du TFA suivi d’une neutralisation au NH4OH sur la capacité de détection d’une méthode HTRF utilisant une paire d’anticorps capable de se lier spécifiquement au TDP-43 NAFβ. La Figure 22 représente l’absence d’effet désagrégeant du TFA suivi d’une neutralisation au NH4OH sur un échantillon de TDP-43 AFβ. La Figure 23 représente l’effet de solutions de NaOH donnant des pH compris entre 8.2 et 13.3 suivi d’une neutralisation au HCl sur la capacité de détection d’une méthode HTRF utilisant une paire d’anticorps capable de se lier spécifiquement au TDP-43 NAFβ. La Figure 24 représente la détermination du pH minimum et maximum pour désagréger un échantillon de TDP-43 AFβ avec de solutions de NaOH. La Figure 25 représente la détermination du temps nécessaire pour désagréger un échantillon de TDP-43 AFβ avec une solution de NaOH à pH=12.8. La Figure 26 représente la détermination du pH minimum et maximum lors de la mesure de la détection de TDP-43 NAFβ. La Figure 27 représente la mesure du niveau d’agrégation d’un peptide béta amyloïde 1-42 en utilisant le NaOH comme agent désagrégeant suivi d’une neutralisation à l’HCl. La Figure 28 représente l’effet de solutions de NaOH, KOH et NH4OH suivi d’une neutralisation à l’HCl sur la capacité de détection d’une méthode HTRF utilisant une paire d’anticorps capable de se lier spécifiquement au TDP-43 NAFβ. La Figure 29 représente l’effet de solutions de NaOH, KOH et NH4OH suivi d’une neutralisation à l’HCl sur la désagrégation de TDP-43 NAFβ. La Figure 30 représente le calcul du rapport des signaux entre un échantillon agrégat d’Alpha-Synucléine (Alpha-Syn AFβ) et un échantillon monomère de cette même protéine (Alpha-Syn NAFβ) obtenu avec une paire d’anticorps dirigée contre l’Alpha-Synucléine. La valeur du rapport des signaux supérieure à 2 indique que la paire testée est sélective de l’Alpha-Syn NAFβ. La Figure 31 représente l’effet d’une solution de NaOH suivi d’une neutralisation à l’HCl sur la capacité de détection d’une méthode HTRF utilisant une paire d’anticorps capable de se lier spécifiquement à l’Alpha-Syn NAFβ. La Figure 32 représente la mesure du niveau d’agrégation de l’Alpha-Synucléine en utilisant le NaOH comme agent désagrégeant suivi d’une neutralisation à l’HCl. 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Procédé selon la revendication 1, dans lequel la protéine formant des agrégats de type feuillets β (PFβ) est choisie parmi FUS (Fused in sarcoma), TAF15, EWSR1, DAZAP1, TIA-1, TTR (transthyrétine), cystatine C, β2-microglobuline, peptide amyloïde beta (tel que peptide amyloïde β 1-40 ou peptide amyloïde β 1-42), TAU (Tubulin-Associated Unit), SOD1 (superoxyde dismutase 1), α-synucléine, γ-synucléine, Huntingtine (HTT), prion et TDP-43 (TAR DNA-binding protein). Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 ou 2, dans lequel la PFβ est choisie parmi amyloïde beta 1-42, α-synucléine et TDP-43. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel l’échantillon provient d'un individu ayant ou étant suspecté d’avoir une maladie associée à la PAFβ. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel l’échantillon provient de cellules ou d’un tissu cultivé(es) in vitro . Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel l’échantillon est choisi parmi un échantillon de sang, un échantillon de plasma, un échantillon de sérum, un échantillon de liquide céphalo-rachidien, un lysat cellulaire, un homogénat cellulaire, un lysat tissulaire ou un homogénat tissulaire, tel qu’un homogénat de cerveau. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 ou 5, dans lequel l’échantillon est choisi parmi un lysat cellulaire, un homogénat cellulaire, un lysat tissulaire, un homogénat tissulaire, un surnageant de culture cellulaire, un surnageant de culture tissulaire, des sous-fractions cellulaires ou des protéines (natives ou recombinantes). Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel le pH à l’étape a2) est ajusté avec une base, telle que NaOH. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel le pH à l’étape a3) est ajusté avec un acide, tel que HCl. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, dans lequel le pH est ajusté à l’étape c2) avec un mélange acide/base, tel qu’un mélange NaOH/HCl. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, dans lequel la méthode immunologique mise en œuvre aux étapes b) et d) utilise : (i) un ligand capable de se lier spécifiquement à la PNAFβ, ledit ligand étant marqué avec un traceur, ou (ii) une paire de ligands capable de se lier spécifiquement à la PNAFβ, au moins un ligand de ladite paire de ligands étant marqué avec un traceur. Procédé selon la revendication 11, dans lequel : - le ligand (i) est choisi parmi un anticorps, un fragment d’anticorps, un peptide ou un aptamère, ou - la paire de ligands (ii) est choisie parmi une paire d’anticorps, une paire de fragments d’anticorps, une paire de peptides ou une paire d’aptamères, de préférence une paire d’anticorps. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 12 dans lequel la méthode immunologique mise en œuvre aux étapes b) et d) est une méthode ELISA ou une méthode RET. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 13, dans lequel les étapes b) et d) sont réalisées par une méthode RET et consistent à : (b1)/(d1) introduire dans le contenant un premier ligand de la PNAFβ marqué par un premier membre d’un couple de partenaires de RET et un second ligand de la PNAFβ marqué par un second membre du couple de partenaires de RET, la paire de ligands étant capable de se lier spécifiquement à la PNAFβ, et (b2)/(d2) mesurer le signal de RET émis dans le contenant. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 13, dans lequel les étapes b) et d) sont réalisées par une méthode ELISA et consistent à : (b1)/(d1) introduire dans le contenant, au fond duquel a préalablement été immobilisé un premier ligand de la PNAFβ, un deuxième ligand de la PNAFβ marqué avec un traceur, la paire de ligands étant capable de se lier spécifiquement à la PNAFβ, (b2)/(d2) mesurer le signal ELISA émis dans le contenant.