Brevet FR3100716A1 — publié le 20210319

La présente invention concerne l’utilisation cosmétique du collagène de Rhizostoma pulmo en tant qu’agent anti-âge, ainsi que son utilisation en tant qu’agent restructurant, régénérant, revitalisant, hydratant, antirides et/ou renforçant la fermeté, l’élasticité et/ou l’effet barrière de la peau. L’invention concerne également une composition cosmétique comprenant ce collagène, ainsi qu’un procédé de soin cosmétique anti-âge consistant en l’application de la composition selon l’invention sur une zone de la peau. Utilisation cosmétique de collagène de méduse. La présente invention concerne l’utilisation cosmétique du collagène de Rhizostoma pulmo en tant qu’agent anti-âge, ainsi que son utilisation en tant qu’agent restructurant, régénérant, revitalisant, hydratant, antirides et/ou renforçant la fermeté, l’élasticité et/ou l’effet barrière de la peau. L’invention concerne également une composition cosmétique comprenant ce collagène, ainsi qu’un procédé de soin cosmétique anti-âge consistant en l’application de la composition selon l’invention sur une zone de la peau. Le vieillissement cutané est un phénomène complexe qui est dû à de nombreux facteurs intrinsèques (facteurs génétiques) et extrinsèques (tels que le soleil, l'alimentation, l'exposition à la fumée de cigarette). Cliniquement, on observe l'apparition de rides et de ridules, une perte de l'élasticité cutanée, un relâchement des tissus cutanés et sous cutanés ainsi qu'une moins bonne cicatrisation. De nombreuses voies de recherches sont proposées pour lutter contre le vieillissement cutané, parmi lesquelles la protection contre l'environnement (soleil, pollutions...), l'activation de la régénération cellulaire, le renforcement de la matrice extracellulaire (collagène et élastine). Récemment, des études ont montré l'importance de l'adhérence des cellules entre elles d'une part, et de l'adhérence entre les cellules et la matrice extracellulaire d'autre part, dans le processus du vieillissement cutané et donc de la nécessité à les renforcer pour prévenir voire traiter le relâchement de la peau. Les interactions entre les cellules et la matrice extracellulaire (MEC) jouant en effet un rôle important dans le contrôle du comportement cellulaire. Ce contrôle s'effectue par des interactions spécifiques entre les molécules matricielles et les cellules au niveau de récepteurs transmembranaires, principalement de la famille des intégrines, dont le domaine intracellulaire est relié aux constituants du cytosquelette. Ceci permet à la matrice d'assurer la transmission de signaux intracellulaires modulant selon les cas l'adhérence, la migration, la prolifération, la différentiation ou l'apoptose des cellules du derme. Ce contrôle du comportement cellulaire est crucial au cours du développement mais également lors des remaniements tissulaires. Le collagène est la principale protéine de la matrice extracellulaire (MEC) et la plus abondante chez les animaux, représentant 25% du contenu protéique total et entre 70 à 80% de celui de la peau (en matière sèche). La caractéristique centrale de toutes les molécules de collagène est leur structure hélicoïdale rigide à trois brins. Les types I et III sont les principaux types de collagène trouvés dans le tissu conjonctif et constituent 90% de tout le collagène du corps. Le collagène est fabriqué par plusieurs types de cellules spécialisées, notamment par les fibroblastes, et est assemblé dans les tissus conjonctifs. Les fibroblastes sécrètent du collagène, de l’élastine, des facteurs de croissance, mais également des enzymes pour dégrader la matrice extracellulaire, la renouveler et la réorganiser. La perte de collagène liée au vieillissement est souvent concomitante à une perte d'élastine et d'acide hyaluronique. Dans l’ensemble, ces phénomènes entrainent une réduction de l'hydratation, de la souplesse et de l'élasticité de la peau et provoquent un amincissement du visage. L'industrie cosmétique est dans l'attente permanente de nouvelles composition capable d'augmenter efficacement l'adhérence des cellules à la matrice extracellulaire et/ou l'adhérence des cellules entre elles, et donc d’avoir une action anti-âge, restructurante, régénérante, revitalisante, hydratante, antirides et/ou renforçant la fermeté, l’élasticité et/ou l’effet barrière de la peau. La demanderesse a identifié, de façon surprenante et inattendue, que le collagène provenant de la méduse R. Pulmo avait des propriétés anti-âge, restructurante, régénérante, revitalisante, hydratante, antirides et/ou renforçant la fermeté, l’élasticité et/ou l’effet barrière de la peau. Selon un premier aspect, l’invention concerne l’utilisation cosmétique du collagène de Rhizostoma pulmo en tant qu’agent anti-âge. Le collagène est l'une des protéines les plus abondantes dans la matrice extracellulaire des corps animaux. La caractéristique centrale de toutes les molécules de collagène est leur structure hélicoïdale rigide à triple brin. Les types I et III sont les principaux types de collagène présents dans le tissu conjonctif et constituent 90 % de tout le collagène. Outre son rôle dans la résistance mécanique, le collagène fonctionne comme molécule de signalisation, régulant la migration cellulaire (Greenberg, et al., 1981), la différenciation (Bosnakovski, et al., 2005) et la prolifération (Pozzi, et al., 1998), et fonctionne en hémostase (Farndale, et al., 2004). " Rhizostoma pulmo " est une scyphoméduse de la famille des Rhizostomatidae . On la trouve dans le nord-est et le sud de l'Atlantique, dans l'Adriatique, la Méditerranée, la mer Noire et la mer d'Azov. Elle est bleue et mesure généralement jusqu'à 40 cm de diamètre, son ombrelle peut mesurer jusqu'à un mètre. Elle compte quatre bras qui sont divisés en huit bras soudés au manubrium, et ne compte pas de tentacules autour de son ombrelle. Les petits poissons, comme les bogues, les sérioles et les Chinchards, s'abritent sous son ombrelle ou entre ses bras. Les extrémités de ses huit bras contiennent des algues symbiotiques : les zooxanthelles, qui en échange de logements et de lumière produisent de la nourriture dont l'excès inutilisé est consommé par les méduses. Le collagène de R. pulmo se compose de deux chaînes 1 et 2 et contient un site de liaison à l'héparine qui ne serait pas situé dans la triple hélice mais plutôt dans la portion linéaire de la protéine. Par agent anti-âge est entendu selon l’invention un agent ayant une action de prévention et/ou de retard et/ou de limitation des signes du vieillissement cutané, notamment du vieillissement accéléré (exogène) provoqué par le stress environnemental ou par les facteurs de stress environnementaux, par exemple les ultraviolets (stress photo-induit), ou du vieillissement chronologique (stress endogène). Cette action anti-âge peut passer par une action de régénération de la peau et/ou de diminution du relâchement de la peau ou de la perte de fermeté de la peau ou une perte d'élasticité de la peau, notamment une prévention et/ou un retard et/ou une limitation du relâchement, et/ou une action de raffermissement et/ou une amélioration des qualités biomécaniques de la peau. Avantageusement, elle peut favoriser un raffermissement des structures de la peau et/ou une diminution de la formation des rides de la peau, de ses annexes ou des muqueuses. On entend par « améliorer l'aspect de la peau », au sens de la présente invention, tout effet permettant d'obtenir un avantage sur l'aspect de la peau par rapport à l'aspect de la peau avant l’utilisation du collagène selon l’invention. On entend par « régénération de la peau », au sens de la présente invention, la stimulation métabolique des cellules cutanées épidermiques ou dermiques, dont le renouvellement est directement ou indirectement lié ou cible du vieillissement intrinsèque ou extrinsèque. On entend par « diminution du relâchement/ de la perte de fermeté/ de la perte d'élasticité » au sens de la présente invention, une action d'inhibition des métalloprotéases (ou métalloprotéinases) matricielles (MMP, par exemple MMP3) qui dégradent le collagène et/ou l’élastine de la peau, de ses annexes et/ou des muqueuses. Il peut s'agir d'une action de protection, et/ou de maintien, et/ou de renforcement des fibres existantes dans le derme (collagène et/ou d'élastine) produites par les cellules dermiques. Avantageusement, cette action peut permettre de protéger, de faire perdurer et/ou d'améliorer les qualités biomécaniques du derme, notamment la fermeté, le volume, la densité et la résistance du tissu. L'utilisation cosmétique de l'invention peut avantageusement permettre d'améliorer les qualités de surface, donc esthétiques, de l'épiderme, comme de lisser la peau et/ou adoucir la peau. On entend par « lisser la surface de la peau », au sens de la présente invention, la diminution qualitative et quantitative des microreliefs de la peau, notamment de leur profondeur. Il peut s'agir par exemple de la diminution de la profondeur des rides et/ou des ridules. On entend par « adoucir la peau », au sens de la présente invention, l'obtention d'un effet plus soyeux de la peau au toucher après utilisation de l'extrait, et/ou une diminution de l'effet de rugosité de la peau au toucher. De manière préférée, l’utilisation cosmétique du collagène de Rhizostoma pulmo est en tant qu’agent anti-âge préventif et/ou curatif. De manière préférée, ledit collagène de Rhizostoma pulmo est destiné à être utilisé pour : a. promouvoir la synthèse de la matrice extracellulaire, l'organisation et la structuration des fibres de collagène par activation des gènes COL3A1, FBN1, FBN2, SPARC, MMP3 et LUM ; b. favoriser une meilleure cohésion dermique et une meilleure structuration de la couche basale des cellules par l'activation des gènes COL7A1, LAMA5 et CDC42 ; c. soutenir le renouvellement et la protection du derme par l'activation du facteur de croissance épithélial (EGF), SIRT4 et SIRT6 ; d. soutenir l'amélioration de la structure de la jonction cellulaire dermique par l'activation des gènes EPPK et LOR ; et/ou e. réduire l'inflammation par une réduction de l’expression d’IL-8, IL6, IL10, et IL-18, sur la peau sensible. Selon un deuxième aspect, l’invention concerne l’utilisation cosmétique du collagène de Rhizostoma pulmo en tant qu’agent restructurant, régénérant, revitalisant, hydratant, antirides et/ou renforçant la fermeté, l’élasticité et/ou l’effet barrière de la peau. Par agent restructurant est entendu selon l’invention un composé permettant de structurer les différentes couches de la peau et ses éléments, par exemple en améliorant la connexion entre le collagène et l’élastine dans le derme, en améliorant l’organisation des fibres de collagène dans le derme ou la lame basale, et/ou en renforçant l’adhérence des cellules entre elles et avec les protéines de l’épiderme et du derme. Ceci peut être réalisé en améliorant notamment la synthèse de gènes tels que les gènes codant pour les collagènes, ou les fibrillines. Par agent régénérant est entendu selon l’invention un composé permettant la stimulation métabolique des cellules cutanées épidermiques ou dermiques, dont le renouvellement est directement ou indirectement lié ou cible du vieillissement intrinsèque ou extrinsèque. Par agent revitalisant est entendu selon l’invention un composé permettant de stimuler le métabolisme cellulaire, aboutissant à une amélioration de l’aspect de la peau, dont l’éclat et la brillance. Par agent hydratant est entendu selon l’invention un agent qui permet de maintenir ou d’augmenter la teneur en eau des différentes couches de la peau, en particulier les couches superficielles, et de retenir cette eau dans la peau. Par agent antirides est entendu selon l’invention un composé permettant l'augmentation de la synthèse et/ou de l'activité de certaines protéines (par exemple les fibrillines ou le collagène), lorsqu'il est mis en contact avec une zone de peau ridée, cet effet ayant pour conséquence de réduire l'apparence des rides et/ou ridules. Cet agent peut également avoir un effet tenseur et/ou lissant pour la peau. Par agent renforçant la fermeté de la peau est entendu selon l’invention un composé permettant l’augmentation de la synthèse des protéines impliquées dans la fermeté de la peau, telle que l’élastine. Par agent renforçant l’élasticité de la peau est entendu selon l’invention un composé permettant l’augmentation de la synthèse des protéines impliquées dans l’élasticité de la peau, telle que l’élastine. Par agent renforçant l’effet barrière de la peau est entendu selon l’invention un composé permettant d’agir notamment sur le stratum corneum ou couche cornée, par exemple en réduisant la perte insensible en eau, ou en activant des gènes codant pour des protéines impliquées dans la formation de cette couche de la peau. Parmi les gènes impliqués, on peut notamment nommer le gène de la Loricrine (LOR). Selon un troisième aspect, l’invention concerne une composition cosmétique anti-âge comprenant du collagène de Rhizostoma pulmo . De manière préférée, ledit collagène est sous forme d’hydrolysat. De manière encore plus préférée, ledit hydrolysat est en milieu acide. Par hydrolysat est entendu selon l’invention un produit résultant de toute réaction chimique dans laquelle une molécule d'eau rompt une ou plusieurs liaisons chimiques. Ce terme couvre les réactions de substitution, d'élimination et de fragmentation dans lesquelles l'eau est le nucléophile. De manière préférée, ledit hydrolysat est sous forme de solution, d’hydrogel ou lyophilisée. Par hydrogel est entendu selon l'invention un réseau de fibres de collagène solubles qui sont empêchées de se dissocier par enchevêtrement de polymères et/ou réticulation covalente. Ils peuvent également être formés à partir de suspensions colloïdales. Les propriétés physiques des hydrogels peuvent être ajustées en fonction de la voie de fabrication. Par lyophilisé est entendu selon l’invention que l'eau a été retirée du collagène selon l'invention, par une étape de congélation suivie d'une étape de mise sous vide. De manière préférée, ledit collagène est présent d’environ 0,01% à environ 5%, de préférence d’environ 0,1% à 1%, de manière encore plus préférée d’environ 0,4% à 0,6%, en poids de la composition. De manière préférée, ladite composition comprend au moins un autre agent cosmétiquement acceptable, de préférence choisi parmi les agents apaisants, les agents restructurant, les agents régénérants, les agents revitalisants, les filtres solaires, les agents antirides, les agents hydratants, les agents anti-âges, les agents tensioactifs, les corps gras, les solvants organiques, les agents solubilisant, les agents épaississants et gélifiants, les lissants, les agents renforçant la fermeté, l’élasticité et/ou l’effet barrière de la peau, les antioxydants, les opacifiants, les agents stabilisants, les agents moussants, les parfums, les émulsionnants ioniques ou non, les charges, les séquestrants et les chélateurs, les parfums, les filtres, les huiles essentielles, les matières colorantes, les pigments, les actifs hydrophiles ou lipophiles, les vésicules lipidiques encapsulant un ou plusieurs actifs et/ou les conservateurs. De manière préférée selon l’invention, ladite composition cosmétique se présente sous forme de crème, d'une pommade, d’un onguent, d’un masque, d'un lait, d'une lotion, d'un sérum, d'une pâte, d'une mousse, d'un aérosol, d’un stick, d’un shampooings, d’un d’après-shampooings, de patchs, d'une solution aqueuse hydroalcoolique ou huileuse, d'une émulsion huile-dans-eau ou eau-dans-huile ou multiple, d'un gel aqueux ou huileux, d'un produit anhydre liquide, pâteux ou solide, et/ou d'une dispersion d'huile dans une phase aqueuse à l'aide de sphérules, ces sphérules pouvant être des nanoparticules polymériques telles que les nanosphères et les nanocapsules ou des vésicules lipidiques de type ionique et/ou non-ionique. La composition de l'invention peut contenir également les adjuvants habituels dans les domaines cosmétique et dermatologique, tels que les gélifiants hydrophiles ou lipophiles, les actifs hydrophiles ou lipophiles, les conservateurs, les antioxydants, les solvants, les parfums, les charges, les filtres, les pigments, les absorbeurs d'odeur et les matières colorantes. Les quantités de ces différents adjuvants sont celles classiquement utilisées dans les domaines considérés, et par exemple de 0,01 à 20 % du poids total de la composition. Ces adjuvants, selon leur nature, peuvent être introduits dans la phase grasse, dans la phase aqueuse, dans les vésicules lipidiques et/ou dans les nanoparticules. Selon un quatrième aspect, l’invention concerne un procédé de soin cosmétique anti-âge consistant en l’application sur une zone de la peau d’une composition selon l’invention. De manière préférée, une quantité d’environ 0,1 à 50 mg/cm2, de préférence environ 0,25 à 2,5 mg/cm2, de composition cosmétique selon l’invention est appliqué sur la zone de la peau, de manière encore plus préférée d’environ 0,5 à 1 mg/cm2. De manière préférée, la composition cosmétique selon l’invention est appliquée une à deux fois par jour, de préférence 2 fois par jour, pendant au moins 7 jours, de préférence au moins 15 jours, de manière encore préférée au moins un mois, de manière particulièrement préférée au moins 1 mois, et de manière plus particulièrement préférée au moins 2 mois. De manière tout particulièrement préférée, la composition cosmétique est appliquée dans le procédé selon l’invention 2 fois par jour pendant au moins 1 mois. De manière préférée selon l’invention, ladite zone de la peau est le visage. Selon un cinquième aspect, l’invention concerne un procédé de fabrication du collagène hydrolysé de R. Pulmo selon l’invention, comprenant les étapes de : a. Chauffage du Collagène soluble de R. Pulmo entre environ 40°C à environ 100°C pendant 10 minutes à 60 minutes, de préférence entre environ 60°C à environ 80°C pendant 45 minutes à 60 minutes ; b. Récupération dudit hydrolysat. Selon un mode de réalisation ; - L’étape a. comprend l’addition d’une protéase ; et - Le procédé comprend une étape a’ de purification de la composition obtenue à la fin de l’étape a. Les protéases, ou peptidases, sont des enzymes qui catalysent l'hydrolyse des liaisons peptidiques présentes dans les protéines et les polypeptides. Les protéases sont divisées en deux groupes : les exopeptidases et les endopeptidases, en fonction du site d'action sur les chaînes polypeptidiques. Les exopeptidases agissent sur les extrémités des chaînes polypeptidiques et les endopeptidases agissent de façon aléatoire dans les régions internes des chaînes polypeptidiques (Raveendran et al. 2018). De préférence, les protéases selon l'invention sont capables d'hydrolyser le collagène invertébré marin, par exemple la pepsine, la métallopeptidase matricielle, la papaïne et/ou la procollagène peptidase. Plus préférentiellement, ladite protéase est la pepsine ou un homologue de la pepsine. D’autres caractéristiques, buts et avantages de l’invention ressortiront de la description qui suit, qui est purement illustrative et non limitative, et qui doit être lue en regard des dessins annexés sur lesquels : La figure 1 montre les résultats de l'immunomarquage pour la Morphologie générale. A indique le résultat du contrôle à T0 ; B indique le lot témoin au jour 8 (J8) ; C indique le lot avec P1 à J8 ; D indique le lot P2 au jour 8 ; E indique le lot P3 au jour 8 (J8). La figure 2 montre les résultats de l'immunomarquage pour le collagène total. A indique le résultat du contrôle à T0 ; B indique le lot témoin au jour 8 (J8) ; C indique le lot avec P1 à J8 ; D indique le lot P2 au jour 8 ; E indique le lot P3 au jour 8 (J8). La figure 3 montre les résultats de l'immunomarquage pour l’élastine. A indique le résultat du Témoin négatif sans anticorps anti-élastine ; B indique le lot témoin au jour 8 (J8) ; C indique le lot témoin à J8 ; D indique le lot P1 au jour 8 ; E indique le lot P2 au jour 8 (J8), F indique le lot P3 au jour 8 (J8). La figure 4 montre les résultats de l'immunomarquage pour la Loricrine. A indique le résultat du contrôle négatif sans anticorps primaire ; B indique le lot témoin au jour 0 (J0) ; C indique le lot témoin au jour 8 (J8) ; D indique le lot P1 au jour 8 (J8) ; E indique le lot P2 au jour 8 (J8). La figure 5 montre les résultats de l'immunomarquage de SIRT-4. A indique le résultat du contrôle négatif sans anticorps primaire ; B indique le lot témoin au jour 0 (J0) ; C indique le lot témoin au jour 8 (J8) ; D indique le lot P1 au jour 8 (J8) ; E indique le lot P2 au jour 8 (J8). La figure 6 montre les résultats de l'immunomarquage du SIRT-6. A indique le résultat du contrôle négatif sans anticorps primaire ; B indique le lot témoin au jour 0 (J0) ; C indique le lot témoin au jour 8 (J8) ; D indique le lot P1 au jour 8 (J8) ; E indique le lot P2 au jour 8 (J8). La figure 7 montre les résultats de l'immunomarquage du collagène VII. A indique le résultat du contrôle négatif sans anticorps primaire ; B indique le lot témoin au jour 0 (J0) ; C indique le lot témoin au jour 8 (J8) ; D indique le lot P1 au jour 8 (J8) ; E indique le lot P2 au jour 8 (J8). La figure 8 montre les résultats de l'immunomarquage du collagène III. A indique le résultat du contrôle négatif sans anticorps primaire ; B indique le lot témoin au jour 0 (J0) ; C indique le lot témoin au jour 8 (J8) ; D indique le lot P1 au jour 8 (J8) ; E indique le lot P2 au jour 8 (J8). La figure 9 montre les résultats de l'immunomarquage du collagène V. A montre le résultat du contrôle négatif sans l'anticorps primaire ; B montre le lot témoin au jour 0 (J0) ; C montre le lot témoin au jour 8 (J8) ; D montre le lot P1 au jour 8 (J8) ; E montre le lot P2 au jour 8 (J8). La figure 10 présente les résultats comparatifs de l’étude de la synthèse de collagène par des fibroblastes humains dans les conditions de l’exemple 3 (application de collagène selon l’invention), en gris clair pour 1, 5, 10, 100 et 500μg/ml, référence ID-16/11341, et de l’exemple 4 (application Peptan® SR Marine), en gris foncé pour 10 et 100μg/ml référence ID-16/09538. Un contrôle positif au TGF-β à 10 μg/ml est également indiqué. La figure 11 présente les résultats d'un immunoessai évaluant la production IL-8 dans des cellules de macrophages humains dTHP-1 en présence et en l'absence de collagène de R. Pulmo hydrolysé selon l'invention et activé avec LPS (endotoxine) en présence ou non de collagène d'invertébrés marins selon l'invention. CRPH signifie collagène de R. Pulmo hydrolysé. La figure 12 présente les résultats d'un immunoessai évaluant la production IL-1 Beta dans des cellules de macrophages humains dTHP-1 en présence et en l'absence de collagène de R. Pulmo hydrolysé selon l'invention et activé avec LPS (endotoxine) en présence ou non de collagène d'invertébrés marins selon l'invention. CRPH signifie collagène de R. Pulmo hydrolysé. La figure 13 présente les résultats d'un immunoessai évaluant la production IL-18 dans des cellules de macrophages humains dTHP-1 en présence et en l'absence de collagène de R. Pulmo hydrolysé selon l'invention et activé avec LPS (endotoxine) en présence ou non de collagène d'invertébrés marins selon l'invention. CRPH signifie collagène de R. Pulmo hydrolysé. La figure 14 présente les résultats de l’analyse SDS PAGE des collagènes de R. pulmo selon l’invention. 1A : La voie 1 est le marqueur de poids moléculaire (de haut en bas : 250, 150, 100, 75, 50, 37 kD) ; les voies 2-4 sont 1, 5 et 10 μg des protéines de méduses respectivement). Veuillez noter que les poids moléculaires sont approximatifs. 1B :SDS PAGE du collagène extrait de R. Pulmo montrant les bandes de collagène présentes dans la solution. Allées 1 et 2 : Échelle de référence pour les protéines de poids moléculaire élevé. Ruelles 3-6 : protéines non collagéniques retirées de la solution avant le test. Voies 7-10 : Solution de collagène contenant 1, 2, 1 et γ chaînes de collagène. Exemples : Exemple 1 : Évaluation de l’activité anti-âge par immunomarquage Matériel et méthode : Le but est d’évaluer l’activité anti-âge d’une solution à base de collagène de Rhizostoma pulmo hydrolysé à partir d’explants de peau ex vivo. L’activité est évaluée par : - Un contrôle de la viabilité cellulaire après une coloration au trichrome de Masson - L’observation du collagène total après une coloration au picro-Sirius - Un immunomarquage de l’élastine Concentrations et dénomination des produits testés : Produit Concentrations P1 0,1 mg/mL P2 1 mg/mL P3 8,25 mg/mL Les produits ont été conservés à 4°C pendant et après la durée de l’étude. 1. Préparation des explants : 15 explants d’environ 1cm de diamètre, ont été préparés à partir d’une plastie abdominale d’une femme avec peau foncée âgée de 51 ans. Les explants ont été mis en survie en milieu BEM (BIO-EC’s Explants Medium) à 37°C en atmosphère humide, enrichie de 5 % de CO2. Répartition des explants en 5 lots, comme suit : Lots Désignation Concentration Nb d’explants Arrêt T0 Contrôle plastie / 3 J0 T Contrôle non traité / 3 J8 P1 Produit 1 0,1 mg/mL 3 J8 P2 Produit 2 1 mg/mL 3 J8 P3 Produit 3 8,25 mg/mL 3 J8 2. Application des produits : A J0, J1, J5 et J7, les explants ont été traités par application topique des produits P1 à P3, à raison de 2 mg par explant étalé à l’aide d’une spatule. Les lots non traités n’ont reçu aucun traitement, excepté le renouvellement du milieu pour moitié (1ml par puits) à J1, J5 et J7. Les jours de traitements et de prélèvements ont été modifiés pour adapter le planning de l’étude en fonction des jours ouvrés. 3. Prélèvements : Au jour J0, 3 explants des lots T0 ont été prélevés et coupés en deux. Une partie a été fixée dans une solution de formol tamponnée l’autre a été conservée à –80°C. A J8, 3 explants de chaque lot ont été prélevés et traités de la même manière. 4. Traitements histologiques : Après 24h dans le formol tamponné, les prélèvements ont été déshydratés et imprégnés en paraffine à l’aide d’un automate de déshydratation Leica PEARL. Ils ont été mis en bloc à l’aide d’une station d’enrobage Leica EG 1160. Des coupes de 5 μm ont été réalisées à l’aide d’un microtome type Minot, Leica RM2125 et montées sur des lames de verre histologiques Superfrost®. Les observations microscopiques ont été réalisées en microscopie optique, à l’aide d’un microscope Leica type DMLB ou Olympus BX43. Les prises de vue ont été réalisées avec une caméra Olympus DP72 et le logiciel Cell^D. a. Examen de la morphologie générale (contrôle de la viabilité) La morphologie générale a été examinée sur des coupes en paraffine colorées au trichrome de Masson variante de Goldner, afin d’évaluer la viabilité des structures dermiques et épidermiques. La morphologie générale a été évaluée par un examen microscopique. b. Coloration au picro-Sirius La coloration du collagène total a été réalisée sur coupes paraffine avec une solution de picro-Sirius La coloration a été évaluée par une observation microscopique et par une analyse d’images. c. Immunomarquage de l’élastine L’élastine a été marquée sur coupes paraffine formolées avec un anticorps polyclonal anti- élastine (Novotec, ref. 25011), dilué au 1/400ème dans du PBS- BSA 0.3%-Tween 20 à 0.05% pendant 1 h à température ambiante, et révélé en AlexaFluor 488 (Lifetechnologies, ref. A11008). Le marquage a été réalisé à l’aide d’un automate d’immunomarquage (Autostainer, Dako). Le marquage a été évalué par un examen microscopique. Résultats : 1. Morphologie générale (viabilité cellulaire) Les résultats sont présentés en Figure 1. Morphologie générale : Lots Viabilité́ cellulaire Commentaires Épiderme Derme papillaire T0 B B / TJ8 B B 3 à 4 assises cellulaires P1J8 B B 6 à 7 assises cellulaires - Acanthose hyperplasique et hypertrophique assez nette P2J8 B B 4 à 5 assises cellulaires - Légère acanthose hyperplasique et hypertrophique P3J8 B B 4 à 5 assises cellulaires - Légère acanthose hyperplasique et hypertrophique Légende Morpho: B= bonne, AB= assez bonne, TLA= très légèrement altérée, LA=légèrement altérée, MA= modérément altérée, ANA= assez nettement altérée, NA= nettement altérée, TNA=très nettement altérée A J0, la viabilité des cellules de l’épiderme et du derme papillaire est bonne. A J8, sur le lot témoin TJ8, la viabilité des cellules de l’épiderme et du derme papillaire est bonne. Effet des produits sur la viabilité cellulaire comparé au lot témoin TJ8 : - Le produit P1 n’induit pas d’altérations de la viabilité cellulaire, mais induit une assez nette augmentation du nombre de cellules (acanthose hyperplasique) et de la taille des cellules de l’épiderme (acanthose hypertrophique). - Le produit P2 n’induit pas d’altérations de la viabilité cellulaire, mais induit une légère augmentation du nombre de cellules (acanthose hyperplasique) et de la taille des cellules de l’épiderme (acanthose hypertrophique). - Le produit P3 n’induit pas d’altérations de la viabilité cellulaire, mais induit une légère augmentation du nombre de cellules (acanthose hyperplasique) et de la taille des cellules de l’épiderme (acanthose hypertrophique). 2. Collagène total (Sirius) Les résultats sont présentés en Figure 2. A J0, la coloration du collagène total représente 91.78% de la surface du derme. Effet sur le collagène total Collagène Total (sirius) T0 TJ8 P1J8 P2J8 P3J8 Moyenne 91,78 94,27 92,43 95,57 94,28 Ecart-type 2,08 2,20 1,23 0,77 1,06 A J8, sur le lot témoin TJ8, la synthèse de collagène est augmentée significativement de 3% (p Effet des produits sur la synthèse de collagène comparé au lot témoin TJ8 : - Le produit P1 induit une diminution significative de 2%* (p - Le produit P2 induit une augmentation non significative de 1%. - Le produit P3 n’induit pas de variation. 3. Elastine Les résultats sont présentés en Figure 3. A J0, sur le lot témoin T0, le marquage de l’élastine est d’assez net à net dans le derme papillaire. A J8, sur le lot témoin TJ8, l’expression de l’élastine est assez nettement diminuée comparé au lot T0. Effet des produits sur l’expression de l’élastine comparé au lot témoin TJ8 : - Le produit P1 induit une augmentation nette - Le produit P2 induit une augmentation très nette - Le produit P3 induit une augmentation forte Conclusions : Conclusions dans les conditions opératoires témoins ci-dessus et comparé au lot témoin T à J8 (TJ8) : Variation vs TJ8 Collagène Méduse Concentration = 0,1 mg/mL (P1) Collagène Méduse Concentration = 1 mg/mL (P2) Collagène Méduse Concentration = 8,25 mg/mL (P3) Morphologie générale (contrôle de viabilité) Augmentation assez nette de l’Épaisseur de l’Épiderme Augmentation légère de l’Épaisseur de l’Épiderme Augmentation légère de l’Épaisseur de l’Épiderme Collagène total (picro-sirius) -2% (significatif avec p 1% (non significatif) Élastine Augmentation nette de l’expression de l’élastine Augmentation très nette de l’expression de l’élastine Augmentation forte de l’expression de l’élastine Echelle = Diminution Forte Ainsi, le collagène de méduse hydrolysé selon l’invention induit l’expression de l’élastine, de manière dose dépendante, avec la plus forte activité à 8,25 mg/mL (P3). Il ne semble pas d’après cette étude y avoir d’activité significative sur la synthèse du collagène total. Ce produit induit aussi une augmentation de l’épaisseur de l’épiderme, avec la plus forte activité à 0.1 mg/ml. Exemple 2 : Évaluation par immunomarquage de la synthèse de la loricrine, des sirtuine-4 et 6, et des collagènes III, VII et V. Cette étude est la continuité de l’Exemple 1, et a pour but de réaliser les immunomarquages suivants : - Immunomarquage de la loricrine - Immunomarquage de la sirtuine-4 - Immunomarquage de la sirtuine-6 - Immunomarquage du collagène VII - Immunomarquage du collagène III - Immunomarquage du collagène V. Les produits P1 (0,1 mg/mL) et P2 (1 mg/mL) de l’exemple 1 sont étudiés dans cet exemple, sur les mêmes explants que ceux utilisés dans l’exemple 1, et également pendant 8 jours, contre un contrôle plastie (T0), et un contrôle (T) non traité. 1. Traitements histologiques Des coupes de 5 μm ont été réalisées à l’aide d’un microtome type Minot, Leica RM2125 et montées sur des lames de verre histologiques Superfrost®. Des coupes de 7 μm ont été réalisées à l’aide d’un cryostat Leica CM 3050 et montées sur des lames de verre histologique silanisées Superfrost® Plus. Les observations microscopiques ont été réalisées en microscopie optique, à l’aide d’un microscope Leica type DMLB ou Olympus BX43. Les prises de vue ont été réalisées avec une caméra Olympus DP72 et le logiciel Cell^D. a. Immunomarquage de la loricrine La loricrine a été marquée sur coupes paraffine formolées avec un anticorps polyclonal anti- loricrine (Covance, ref. PRB-14P), dilué au 1/1600ème dans du PBS-BSA 0.3%-Tween 20 à 0.05% pendant 1 h à température ambiante, avec un système amplificateur biotine/streptavidine, révélé en VIP, un substrat violet de peroxydase (Vector, réf. SK 4600). Le marquage a été réalisé à l’aide d’un automate d’immunomarquage (Autostainer, Dako) et il a été évalué par un examen microscopique. b. Immunomarquage de la sirtuine-4 (SIRT-4) La sirtuine-4 a été marquée sur coupes paraffine formolées avec un anticorps polyclonal anti- sirtuine-4 (GeneTex, réf. GTX51798), dilué au 1/100ème dans du PBS-BSA 0.3%-Tween 20 à 0.05% pendant 1 h à température ambiante, avec un système amplificateur biotine/streptavidine, révélé en VIP, un substrat violet de peroxydase (Vector, réf. SK 4600). Le marquage a été réalisé à l’aide d’un automate d’immunomarquage (Autostainer, Dako) et il a été évalué par un examen microscopique. Lots concernés : T0, TJ8, P1J8 et P2J8. c. Immunomarquage de la sirtuine-6 (SIRT-6) La sirtuine-6 a été marquée sur coupes paraffine formolées avec un anticorps polyclonal anti- sirtuine-6 (Novus Biologicals, réf. NB100-2522), dilué au 1/100ème dans du PBS-BSA 0.3%-Tween 20 à 0.05% pendant 1 h à température ambiante, avec un système amplificateur biotine/streptavidine, révélé en VIP, un substrat violet de peroxydase (Vector, réf. SK 4600). Le marquage a été réalisé à l’aide d’un automate d’immunomarquage (Autostainer, Dako) et il a été évalué par un examen microscopique. Lots concernés : T0, TJ8, P1J8 et P2J8. d. Immunomarquage du collagène VII Le collagène VII a été marquée sur coupes congelées avec un anticorps monoclonal anti- collagène VII (Santa Cruz, réf. sc-53226, clone LH 7.2), dilué au 1/100ème dans du PBS-BSA 0.3%-Tween 20 à 0.05% pendant 1 h à température ambiante, et révélé en AlexaFluor 488 (Lifetechnologies, réf. A11008). Le marquage a été réalisé à l’aide d’un automate d’immunomarquage (Autostainer, Dako) et il a été évalué par un examen microscopique. Lots concernés : T0, TJ8, P1J8 et P2J8. e. Immunomarquage du collagène III Le collagène III a été marquée sur coupes congelées avec un anticorps polyclonal anti- collagène III (SBA, réf. 1330-01), dilué au 1/100ème dans du PBS-BSA 0.3%-Tween 20 à 0.05% pendant 1 h à température ambiante, avec un système amplificateur biotine/streptavidine, révélé en VIP, un substrat violet de peroxydase (Vector, réf. SK 4600). Le marquage a été réalisé manuellement et il a été évalué par un examen microscopique. Lots concernés : T0, TJ8, P1J8 et P2J8. f. Immunomarquage du collagène V Le collagène V a été marquée sur coupes paraffine formolées avec un anticorps polyclonal anti- collagène V (Novotec, réf. 20511), dilué au 1/100ème dans du PBS-BSA 0.3%-Tween 20 à 0.05% pendant 1 h à température ambiante, avec un système amplificateur biotine/streptavidine, révélé en VIP, un substrat violet de peroxydase (Vector, réf. SK 4600). Le marquage a été réalisé à l’aide d’un automate d’immunomarquage (Autostainer, Dako) et il a été évalué par un examen microscopique. Lots concernés : T0, TJ8, P1J8 et P2J8. Résultats et Conclusions : Les résultats pour la loricrine sont présentés à la figure 4. A J0, sur le lot témoin T0, le marquage de la loricrine est assez net à net dans la couche granuleuse. A J8 : Sur le lot témoin TJ8, l’expression de la loricrine est modérée dans la couche granuleuse. Effet des produits sur l’expression de la loricrine, comparé au lot témoin TJ8 : - Le produit P1 induit une augmentation légère - Le produit P2 induit une diminution légère. Les résultats pour SIRT-4 sont présentés à la figure 5. A J0, sur le lot témoin T0, le marquage de la sirtuine-4 est assez net dans l’épiderme. A J8, Sur le lot témoin TJ8, l’expression de la sirtuine-4 est assez nette à nette dans l’épiderme. Effet des produits sur l’expression de la sirtuine-4, comparé au lot témoin TJ8 : - Le produit P1 induit une diminution légère - Le produit P2 induit une diminution modérée Les résultats pour SIRT-6 sont présentés à la figure 6. A J0, sur le lot témoin T0, le marquage de la sirtuine-6 est assez net à net dans l’épiderme. A J8, Sur le lot témoin TJ8, l’expression de la sirtuine-6 est nette dans l’épiderme. Effet des produits sur l’expression de la sirtuine-6, comparé au lot témoin TJ8 : - Le produit P1 induit une diminution légère - Le produit P2 n’induit aucune variation. Les résultats pour le collagène VII sont présentés à la figure 7. A J0, sur le lot témoin T0, le marquage du collagène VII est faible le long de la jonction dermo-épidermique. A J8, Sur le lot témoin TJ8, l’expression du collagène VII est faible à modérée le long de la jonction dermo-épidermique. Effet des produits sur l’expression du collagène VII, comparé au lot témoin TJ8 : - Le produit P1 induit une augmentation modérée - Le produit P2 induit une augmentation modérée. Les résultats pour le collagène III sont présentés à la figure 8. A J0, sur le lot témoin T0, le marquage du collagène III est assez net dans le derme papillaire. A J8, Sur le lot témoin TJ8, l’expression du collagène III est faible nette dans le derme papillaire. Effet des produits sur l’expression du collagène III, comparé au lot témoin TJ8 : - Le produit P1 n’induit aucune variation - Le produit P2 n’induit aucune variation. Les résultats pour le collagène V sont présentés à la figure 9. A J0, sur le lot témoin T0, le marquage du collagène V est net à très net dans le derme papillaire. A J8, Sur le lot témoin TJ8, l’expression du collagène V est nette dans le derme papillaire. Effet des produits sur l’expression du collagène V, comparé au lot témoin TJ8 : - Le produit P1 induit une diminution modérée - Le produit P2 induit une diminution assez nette Un résumé des résultats de ces immunomarquages est présenté au tableau 6. Résultats des immunomarquages pour les produits P1 et P2 : Variation vs TJ8 P1 P2 Loricrine Augmentation légère Diminution légère Sirtuine-4 Diminution légère Diminution Modérée Sirtuine-6 Diminution légère Pas de variation Collagène VII Augmentation modérée Augmentation modérée Collagène III Pas de variation Pas de variation Collagène V Diminution Modérée Diminution assez nette Echelle = Diminution Forte En conclusion, le collagène hydrolysé selon l’invention montre quelle que soit sa concentration un effet d’augmentation modérée de la synthèse du collagène VII, et une augmentation légère de la synthèse de loricrine à 0,1 mg/mL. Exemple 3 : Étude in vitro de l’effet du collagène selon l’invention sur une culture primaire de fibroblaste humain. A près application du collagène selon l’invention sur les cellules pendant 24 heures, le collagène intracellulaire et extracellulaire est quantifié avec le colorant rouge Sirius (Direct red 80) qui présente une affinité particulière pour la structure triple hélice (Gly-X-Y) n du collagène natif (collagène de type I à V). L’absorbance du complexe colorant-collagène est mesurée à 540 nm. La fraction protéique totale est évaluée, après sonication, par la méthode de Bradford (Bradford et al., 1976). Système d’essai : Cellules : fibroblastes humains primaires préparés conformément à l’instruction de travail IL 14 en vigueur. Les cellules sont cultivées en milieu DMEM 4,5 g/l glucose, 2 mM de L-glutamine ou glutamine stabilisées, 10 % de sérum de veau fœtal (SVF) inactivé à chaleur, 50 UI/ml de pénicilline, 50 μg/ml de streptomycine. Les cellules sont maintenues sous atmosphère humide (37°C, 5 % de CO2). Les cellules sont exemptes de mycoplasmes. Le test de détection des mycoplasmes a été réalisé selon l’instruction de travail IL 07 en vigueur. Les cellules ont été utilisées au passage 6. Éléments de référence : Contrôle négatif : milieu de culture à 1 % de SVF. Contrôle positif : Transforming growth factor β1 (TGFβ) à 10 ng/ml dans du milieu de culture à 1 % de SVF Définition des séries : 5 concentrations du collagène selon l’invention ont été testées. La concentration initiale de collagène hydrolysée (8,25 mg/ml) a été ramenée à 500, 100, 10, 5 and 1 μg/ml. Chaque condition du collagène selon l’invention et des éléments de référence a été testée sur trois puits de culture. Protocole de test : Ensemencement des cellules : Les cellules ont été ensemencées à 50000 cellules/cm2 en plaques de culture de 24 puits puis ont été incubées pendant une nuit (37°C, 5 % de CO2). Contact entre les cellules et l’élément d’essai ou les éléments de référence : Les dilutions de l’élément d’essai ou des éléments de référence ont été réalisées en milieu de culture à 1 % de SVF. Le milieu de culture a été aspiré et remplacé par 500 μl des différentes concentrations de l’élément d’essai ou des éléments de référence. Les plaques ont été incubées pendant 24 heures ± 1 heure (37° C, 5 % de CO2). Évaluation de la synthèse de collagène et la densité cellulaire : Le milieu de culture de chaque puis a été prélevé et la couche de cellules a été rincé avec 500 μl de cocktail inhibiteur de protéase concentré 2 fois. L'ensemble, milieu de culture et inhibiteur, a été mis en commun dans le même tube. La couche cellulaire de chaque puits a été récupérée par grattage dans 500 μl de cocktail inhibiteur de protéase concentré 1 fois et les puits ont été rincés une nouvelle fois avec 500 μl de cocktail 1 fois. Les deux volumes, qui constituent la matrice extracellulaire, ont été rassemblés au sein d’un même tube et traités par sonde ultrason pendant 40 secondes. Le collagène de chaque fraction a été complexé avec le colorant rouge Sirius et, après centrifugation et lavage à l'HCl 0,1M, le culot a été solubilisé dans du NaOH 0,5M. L’absorbance du complexe colorant-collagène a été mesurée à 540 nm. Une gamme d’étalonnage a été établie dans les mêmes conditions entre 0 et 10 μg par tube de collagène. La quantité de protéines totales a été évaluée à l’aide de la méthode de Bradford (Bradford et al. Anal Biochem 1976 ; 72:248-54) contre une gamme d'étalonnage établie à partir d'une solution de BSA à 400 μg/ml dans du PBS. 30 μl de chaque échantillon ont été mélangés avec 280 μl de réactif de Bradford dans une plaque à 96 puits. La plaque a été incubée environ 15 minutes à température ambiante à l'obscurité. Les absorbances ont été mesurées à 620 nm contre un blanc réactif constitué par le réactif de Bradford. Résultats : Stimulation de la synthèse du collagène par l'hydrolysat de collagène de Rhisostoma pulmo Concentration Protéique Collagène matrice cellulaire Collagène milieu de culture Concentration μg protéine / puits/ Moyenne Ecart-type μg collagène / puits/ % stimulation / Contrôle négatif Moyenne Ecart-type μg collagène / puits/ % stimulation / Contrôle négatif Collagène selon l’invention 500 μg/ml 54,78 3,8 0,256 0,015 2,60 73 0,233 0,023 2,37 0 100 μg/ml 64,64 9, 0,251 0,042 2,55 70 0,250 0,040 2,54 7 10 μg/ml 62,17 3,5 0,272 0,022 2,77 84 0,252 0,050 2,56 0 5 μg/ml 56,81 3,9 0,205 0,020 2,09 39 0,226 0,028 2,30 0 1 μg/ml 50,58 7,0 0,195 0,043 1,99 32 0,225 0,032 2,29 0 Contrôle positif TGF-β 10ng/ml 65,87 2,8 0,210 0,031 2,14 42 0,217 0,029 2,20 0 Contrôle négatif 50,14 4,1 0,148 0,029 1,50 Concernant l’effet du collagène selon l’invention, on peut remarquer une augmentation significative de la synthèse de collagène dans la matrice cellulaire avec un maximum à 84 % pour la concentration à 10 μg/ml de produit (Figure 10 en gris clair pour 1, 5, 10, 100 et 500μg/ml, référence ID-16/11341). Exemple 4 : Données comparatives par rapport à du collagène de poisson hydrolysé (Peptan SR Marine). Les mêmes expérimentations que celles réalisées dans l’Exemple 3 ont été réalisées pour du collagène de poisson hydrolysé (Peptan ® SR Marine, commercialisé par Rousselot) à 500, 100 et 10 μg/ml. Les résultats sont les suivants : Stimulation de la synthèse du collagène par le collagène de poisson hydrolysé. Concentration Protéique Collagène matrice cellulaire Collagène milieu de culture Concentration μg protéine / puits/ Moyenne Ecart-type μg collagène / puits/ % stimulation / Contrôle négatif Moyenne Ecart-type μg collagène / puits/ % stimulation / Contrôle négatif 500 μg/ml 54,78 3,8 0,256 0,015 2,60 73 0,233 0,023 2,37 0 100 μg/ml 64,64 9, 0,251 0,042 2,55 70 0,250 0,040 2,54 7 10 μg/ml 62,17 3,5 0,272 0,022 2,77 84 0,252 0,050 2,56 0 5 μg/ml 56,81 3,9 0,205 0,020 2,09 39 0,226 0,028 2,30 0 1 μg/ml 50,58 7,0 0,195 0,043 1,99 32 0,225 0,032 2,29 0 Collagène de poisson hydrolysé 500 μg/ml 95,22 1,2 0,144 0,019 1,47 0 0,254 0,021 2,58 9 100 μg/ml 66,09 0,6 0,214 0,030 2,18 45 0,212 0,015 2,15 0 10 μg/ml 50,87 6,1 0,249 0,012 2,53 68 0,222 0,031 2,26 0 Contrôle positif TGF-β 10ng/ml 65,87 2,8 0,210 0,031 2,14 42 0,217 0,029 2,20 0 Contrôle négatif 50,14 4,1 0,148 0,029 1,50 Ainsi, le collagène de poisson hydrolysé présente un effet maximum à 68 % à la concentration 10 μg/ml. La réponse semble inversement proportionnelle à la concentration, et reste inférieure aux valeurs obtenues avec le collagène selon l’invention (Figure 10). Exemple 5 : Activation inflammatoire des macrophages par le collagène hydrolysé selon l'invention Des macrophages humains, les cellules dTHP-1, ont été cultivés en présence et en l'absence de collagène hydrolysé de R. Pulmo selon l'invention et activé avec du LPS (endotoxine) - de nouveau en présence ou en l'absence de collagène d'invertébrés marins selon l'invention. Ces cellules sont d'origine humaine et constituent un modèle cellulaire très apprécié et validé utilisé à grande échelle dans l'étude des maladies inflammatoires. L'interleukine-1Bêta, l'IL6, l'IL8 et l'IL18 ont tous été déterminés par immunoessais standard et l'IL10 par RT-PCR. La figure 11 montre que l'hydrolysat de collagène de R. Pulmo induit une réduction de la sécrétion d’IL-8, seul ou en présence de LPS. Aucune sécrétion d'IL6 ou d'IL10 n'a été mise en évidence avec les cellules marines traitées par hydrolysat de collagène invertébré. Ces résultats confirment que ce collagène n'a pas d'action pro-inflammatoire sur les cytokines inflammatoires ou régulatrices à médiation NF-kB. Compte tenu de ces résultats, deux autres cytokines activées par la voie inflammasomique NLRP3 plutôt que NF-kB, IL1-Beta et IL18, ont été examinées. Cette voie est une alternative à la voie NF-kB et suscite un intérêt croissant pour la pathologie de nombreuses maladies. La figure 12 montre que l’hydrolysat de collagène de R. Pulmo selon l’invention n’induit pas une augmentation significative de la sécrétion d’IL-1 Beta, en présence de LPS. La figure 13 montre que l'hydrolysat de collagène de R. Pulmo selon l'invention induit une réduction de la sécrétion d’IL-18, en présence de LPS. Ces résultats confirment que l'hydrolysat de collagène de R. Pulmo selon l'invention n'agit pas de manière pro-inflammatoire en présence de macrophages. De plus, ces données ne se limitent pas à une seule voie inflammatoire mais sont liées aux voies inflammatoires NF-kB et NLRP3. Exemple 6 : Evaluation du collagène selon l’invention sur l’expression de gènes au sein d’explants de peau humain, par RT-qPCR microfluidique, à une concentration inférieure et comparée à du collagène de poisson. Modèle biologique L’explant de peau NativeSkin® est utilisé, qui est une biopsie de peau humaine baignée dans une matrice solide et nourrissante et dont la surface épidermique est conservée en contact avec l'air pour permettre une application topique. Les explants sont issus d’une abdominoplastie de femme de 32 ans correspondant à une pigmentation de 3 sur l’échelle de Fitzpatrick. Les collagènes hydrolysés utilisés dans cet exemple étaient concentrés à 100 μg/ml. Évaluation des produits L’expérience a été menée en triplicata dans les conditions suivantes : - Explant de peau (témoin) non traité (n=3) - Explant de peau + collagène hydrolysé selon l’invention (n=3) - Explant de peau + collagène hydrolysé de poisson (n=3) Les explants ont été traités avec le produit durant 2 jours : une application le matin et une application le soir. NB : Le collagène de poisson hydrolysé semble affaiblir l'épiderme. En effet, après traitement, les explants ont été préparés pour l'extraction de l'ARN en les perforant pour enlever la peau non exposée au produit. On remarque que l'épiderme était légèrement détaché du derme. A l’issue de la phase de culture, les explants ont été retirés de leurs inserts et la RT-qPCR microfluidique a été utilisée pour caractériser l’expression génique des explants de peau. Résultats / Conclusions Analyse des données La spécificité de chaque paire d'amorces est vérifiée pour toutes les conditions par analyse de la courbe de dissociation et les points problématiques à double pics sont éliminés de l'analyse. Chaque CT est ensuite normalisé par les gènes de référence et la condition de contrôle pour calculer le ΔΔCT et l'expression relative est calculée en fonction du ΔΔCT par la formule 2-∆∆CT. Pour chaque condition, l'erreur type par rapport à la moyenne (MEB) est calculée et les points ayant un MEB trop important (> 40 % de différence entre le MEB et la moyenne des 3 valeurs) sont éliminés de l'analyse. Les résultats sont exprimés en pourcentage de surexpression ou de sous-expression par rapport à la condition de référence. Les résultats sont présentés ici en les échelonnant en 4 catégories, au vu de l’expression génique pour chacune de ces indications : - Activité bénéfique : AB - Activité globalement positive temporisée par des activités négatives : AGP - Activité globalement négative, temporisée par des activités bénéfiques : AGN - Activité négative : AN Effets du collagène hydrolysé selon l’invention, et de collagène de poisson hydrolysé. Produits testés Concentration Anti-âge curatif (AAC) Anti-âge préventif (AAP) AAC + AAP Synthèse et Organisation MEC Cohésion et Lame basale Protection MEC et Lame basale Hydratation Survie, Croissance Renouvellement Protection Antioxydante Protection (Anti-infl) Différenciation (Barriere, Protection Physique) Collagène selon l’invention hydrolysé 100 μg/ml AGP AB AGN / AGP AGP AGN AB Collagène de poisson hydrolysé 100 μg/ml AGN AGP AGN AN AGP AGP AN AGN Ces résultats montrent donc un effet du collagène selon l’invention hydrolysé en anti-âge curatif sur les aspects Synthèse et Organisation de la membrane extracellulaire (MEC) et cohésion et lame basale, en préventif dans la survie, la croissance et le renouvellement cellulaire et protection antioxydantes, ainsi qu’un effet conjoint dans la différenciation. Parmi les gènes retrouvés pour être influencés positivement par le collagène selon l’invention, on retrouve : Effet du collagène hydrolysé selon l’invention sur l’expression génique d’explants de peau humains. Gènes % d’augmentation ou de diminution d’expression COL3A1 +60% COL5A1 +110% DCN +140% FBN1 +80% FBN2 +490% LOX +80% LUM +270% SPARC +100% CDC42 +60% COL7A1 +170% LAMA5 +70% EGF +130% SIRT4 +340% SIRT6 +60% MGST1 +230% EPPK1 +100% EVPL +80% FLG +60% LOR +130% MMP3 -80% Effet du collagène de poisson hydrolysé sur l’expression génique d’explants de peau humains. Gènes % d’augmentation ou de diminution d’expression LOXL1 +180% P4HA1 +120% COL1A1 - 90% COL5A1 -60% DCN -70% SPARC -70% CD44 +60% CDC42 +80% COL4A1 +120% CTNNA1 +90% ITGA2 +170% LAMC2 +430% PXN +200% SDC4 +440% COL17A1 -70% COL7A1 -90% FN1 -60% LAMA5 -90% SDC1 -60% MMP9 -80% PI3 +3230% TIMP1 +130% MMP1 +2390% MMP3 +180% AQP1 -60% AQP3 -60% HBEGF +1000% SIRT6 +140% TINF2 +70% IGFBP6 +140% GLRX +70% SIRT3 +80% SOD2 +570% CAT -70% MSRB2 -90% COX2 +240% IL1A +4350% IL6 +380% IL8 +9280% S100A7 +790% TNFA +1150% IVL +540% TGM1 +520% EVPL -60% FLG -90% LOR -60% POMC +90% DKK1 +200% Le collagène selon l'invention est capable d'augmenter la synthèse de LOXL1, P4HA1, CD44, CDC42, COL4A1, CTNNA1, ITGA2, LAMC2, PXN, SDC4, PI3, TIMP1, MMP1, MMP3, HBEGF, SIRT6, TINF2, IGFBP6, GLRX, SIRT3, SOD2, COX2,IL1A,IL6,IL8, S100A7, TNFA, IVL, TGM1, POMC, DKK1, et diminuer la synthèse des COL1A1, COL5A1, DCN, SPARC, COL17A1, COL7A1, FN1, LAMA5, SDC1, MMP9, AQP1, AQP3, CAT, MSRB2, EVPL, FLG, LOR. L’augmentation de l’expression des gènes EPPK1, EVPL, FLG, LOR a un effet sur la fonction barrière. En effet, ces gènes codent pour des protéines impliquées dans la formation de la couche cornée et favorise ainsi la fonction barrière de l'épiderme, première défense de la peau contre les agressions extérieures et assure le maintien de l'hydratation cutanée. La fonction barrière permet à la fois un effet préventif mais aussi un effet restructurant et hydratant. Le collagène selon l’invention favorise l’équilibre hydrique de la peau. L’augmentation de l’expression des gènes COL3A1, COL5A1, DCN, FBN1, FBN2, LOX, LUM et SPARC caractérise un effet sur la néosynthèse et la structuration de la matrice dermique concernant tous ses composants : Fibres de collagène, fibres élastiques et protéoglycanes. L’activité de structuration dermique est également très forte puisque LOX, impliquée dans l'assemblage des fibres, est stimulée. Les deux protéines structurales Fibrilline 1 (FBN1) et 2 (FBN2) sont également activées. L'activation du gène SPARC qui code l'ostéonectine est également observée. L’augmentation de l’expression des gènes CDC42, COL7A1 et LAMA5 caractérise un effet sur la restructuration de la lame basale qui constitue la jonction dermo-épidermique et le renforcement de l'ancrage des cellules à cette lame basale. Ceci relance les interactions derme/épiderme qui diminuent avec l'âge. La réduction de l’expression du gène MMP3 promeut la protection de la matrice extracellulaire et de la lame masale, puisque ce gène code pour une enzyme capable de dégrader de nombreux composants de la matrice extracellulaire : fibronectine, laminine, collagènes et protéoglycanes. L’augmentation de l’expression des gènes EGF, SIRT4 et SIRT6 a un effet sur la longévité cellulaire. Les sirtuines sont des protéines qui protègent globalement les cellules. Le collagène hydrolysé de poisson augmente et diminue l’expression de gènes différents, et a de fait des propriétés différentes. Les propriétés du collagène selon l’invention, et du collagène de poisson hydrolysés peuvent être résumés dans le tableau 12 suivant : Récapitulatif de l’effet du collagène selon l’invention et du collagène de poisson hydrolysé. Régénération du derme – anti rides Restructurant / affermissant Régénérateur / revitalisant Anti-âge préventif Fonction barrière Collagène de R. Pulmo hydrolysé +++ ++ ++ / ++ Collagène de poisson hydrolysé / ++ + Exemple 7 : Collagène de méduse selon l’invention. Le collagène selon l’invention est produit à partir de collagène soluble de R. Pulmo, par chauffage de celui-ci entre environ 40°C à environ 100°C pendant 10 minutes à 60 minutes, de préférence entre environ 60°C à environ 80°C pendant 45 minutes à 60 minutes, suivie par une étape de récupération dudit hydrolysat. Les caractéristiques physico-chimiques des collagènes de R. pulmo (hydrolysé ou non) sont données dans le tableau 13. Caractéristiques physico-chimiques des collagènes de R. pulmo Caractéristiques Collagène (JCOL) Collagène hydrolysé (HJCOL) Aspect Liquide Liquide Couleur Incolore à jaune pâle Incolore à jaune pâle Solvant Acide acétique 0,1 M Acide acétique 0,5 M Concentration 3-6 mg.mL -1 3-10 mg.mL -1 (8,25 mg.mL -1 ) Turbidité Clair à légèrement trouble Clair à légèrement trouble Taux de protéines > 80% > 80% pH 2,8-3,2 2,8-3,5 Des analyses SDS-PAGE de ces collagènes ont été réalisées (figure 14). Elles montrent des bandes bien distinctes des différentes chaînes du collagène, ce qui nous permet de suggérer que le collagène n’est pas dégradé lors de son extraction. Le collagène de méduse a également fait l’objet d’un test de cytotoxicité. La biocompatibilité du collagène de méduse (3,7 mg.mL -1 ) a été évaluée par une mesure de la cytotoxicité sur une culture cellulaire (fibroblastes murins L929), selon la méthode ISO 10993-5 2009 par Contact Indirect. Les résultats n’indiquent qu’aucun des échantillons testés n’a produit de cytotoxicité dans les conditions d’essai utilisées. Cela indique que le collagène de méduse n’est pas toxique vis-à-vis de cette culture cellulaire. Exemple 8 : Évaluation in vivo de l’effet de l’application de la composition C selon l’invention. La composition selon l’invention sous forme de sérum comprend entre environ 0,4 et 0,6% en poids de la composition de collagène hydrolysé de R. Pulmo. Un placebo sous forme de sérum est préparé comprenant la même composition sans le collagène hydrolysé provenant de R. Pulmo. 28 volontaires féminins, d’âge moyen 55 ans [40 à 75 ans], avec un teint hétérogène, appliquent deux fois par jour pendant 1 mois la composition ci-dessus en hémi-visage et sur un avant-bras contre placebo. Étude en simple aveugle : Évaluation par des juges experts (4) : - Fermeté - Élasticité de la peau - Éclat et brillance de la peau - Aspect des rides - Lissage de la peau - Aspect hydraté de la peau - Aspect anti-âge général Après 1 mois d’application, 4 juges experts remplissent un questionnaire sur 5 critères. Pour chaque critère, une note entre 0 et 7 est attribuée. Après 1 mois d’application de cette composition, une amélioration sur l’ensemble des critères présentés est observée par rapport à T0 et au placebo. Les juges experts constatent des résultats visibles sur tous ces critères. Fermeté de la peau : Après 1 mois, selon les juges experts, la composition selon l’invention améliore la fermeté de la peau. Élasticité de la peau : Après 1 mois, selon les juges experts, la peau semble avoir retrouvé une meilleure élasticité. Éclat et brillance de la peau Après 1 mois d’application de la composition selon l’invention, selon les juges experts, la peau a un éclat amélioré et est plus brillante. Aspect des rides : Selon les juges experts, la composition selon l’invention améliore l’aspect des rides, qui sont moins prononcées, après seulement 1 mois d’application. Lissage de la peau Après 1 mois, selon les juges experts, la composition selon l’invention permet à la peau de paraître plus lisse, et de diminuer ses microreliefs. Aspect hydraté de la peau Après 1 mois d’application de la composition selon l’invention, selon les juges experts, la peau paraît plus hydratée. Aspect anti-âge général Selon les juges experts, après 1 mois d’application, la composition selon l’invention améliore l’aspect anti-âge général de la peau. Utilisation cosmétique du collagène de Rhizostoma pulmo en tant qu’agent anti-âge. Utilisation cosmétique du collagène de Rhizostoma pulmo en tant qu’agent restructurant, régénérant, revitalisant, hydratant, antirides et/ou renforçant la fermeté, l’élasticité et/ou l’effet barrière de la peau. Composition cosmétique anti-âge comprenant du collagène de Rhizostoma pulmo . Composition cosmétique selon la revendication précédente, caractérisée en ce que ledit collagène est sous forme d’hydrolysat. Composition cosmétique selon la revendication précédente, caractérisée en ce que ledit hydrolysat est sous forme de solution, d’hydrogel ou lyophilisée. Composition cosmétique selon les revendications 3 à 5, caractérisée en ce que ledit collagène est présent d’environ 0,01% à environ 5%, de préférence d’environ 0,1% à 1%, de manière encore plus préférée d’environ 0,4% à 0,6%, en poids de la composition. Composition cosmétique selon les revendications 3 à 6, caractérisée en ce qu’elle comprend au moins un autre agent cosmétiquement acceptable, de préférence choisi parmi les agents apaisants, les agents restructurant, les agents régénérants, les agents revitalisants, les filtres solaires, les agents antirides, les agents hydratants, les agents anti-âges, les agents tensioactifs, les corps gras, les solvants organiques, les agents solubilisant, les agents épaississants et gélifiants, les lissants, les agents renforçant la fermeté, l’élasticité et/ou l’effet barrière de la peau, les antioxydants, les opacifiants, les agents stabilisants, les agents moussants, les parfums, les émulsionnants ioniques ou non, les charges, les séquestrants et les chélateurs, les parfums, les filtres, les huiles essentielles, les matières colorantes, les pigments, les actifs hydrophiles ou lipophiles, les vésicules lipidiques encapsulant un ou plusieurs actifs et/ou les conservateurs. Composition cosmétique selon les revendications 3 à 7, se présentant sous forme de crème, d'une pommade, d’un onguent, d’un masque, d'un lait, d'une lotion, d'un sérum, d'une pâte, d'une mousse, d'un aérosol, d’un stick, d’un shampooing, d’un après-shampooing, de patchs, d'une solution aqueuse hydroalcoolique ou huileuse, d'une émulsion huile-dans-eau ou eau-dans-huile ou multiple, d'un gel aqueux ou huileux, d'un produit anhydre liquide, pâteux ou solide, et/ou d'une dispersion d'huile dans une phase aqueuse à l'aide de sphérules, ces sphérules pouvant être des nanoparticules polymériques telles que les nanosphères et les nanocapsules ou des vésicules lipidiques de type ionique et/ou non-ionique. Procédé de soin cosmétique anti-âge consistant en l’application sur une zone de la peau d’une composition selon les revendications 3 à 8. Procédé de soin cosmétique anti-âge selon la revendication précédente, caractérisé en ce que ladite zone de la peau est le visage.