Brevet FR3100955A1 — publié le 20210326

L’invention a pour objet un procédé d’élicitation contrôlée de plantes en culture pour augmenter leur synthèse de métabolites secondaires. L’invention se caractérise en ce qu’il comprend les étapes suivantes selon lesquelles : - d’une part, lesdites plantes sont traitées par application d’une solution de peroxyde d’hydrogène (H 2 O 2 ) à une concentration comprise entre 1 mM et 800 mM, et - d’autre part, un déficit hydrique est généré par arrêt total de l’irrigation desdites plantes en culture, ledit traitement H 2 O 2 et ledit déficit hydrique étant réalisés, de manière concomitante ou séparée, entre 1 et 5 jours avant la récolte, et - on récolte des fruits issus des plantes ainsi traitées dans lesquels la synthèse de métabolites secondaires choisis parmi les capsaïcinoïdes, flavonoïdes, caroténoïdes, terpenoïdes, pris seuls ou en combinaison, a été augmentée. L’invention concerne également les plantes choisies parmi les Solanacées, susceptibles d’être obtenues par le procédé selon l’invention, ainsi que l’utilisation du procédé selon l’invention chez des plantes choisies parmi les Solanacées, pour obtenir des fruits dans lesquels la teneur de métabolites secondaires, préférentiellement de capsaïcinoïdes, synthétisés par lesdites plantes a été augmentée. Figure 1 PROCEDE D’ELICITATION CONTROLEE DE PLANTS DE PIMENT DURANT LEUR CULTURE POUR AUGMENTER LEUR SYNTHESE DE METABOLITES SECONDAIRES D’INTERET INDUSTRIEL La présente invention concerne un procédé d’induction d’un profil d’expression de gènes et de métabolites secondaires chez des plantes en culture par une élicitation contrôlée en utilisant notamment du peroxyde d’hydrogène, et les plantes ainsi obtenues. Pour éviter l’usage de pesticides, l’agriculture cherche à favoriser des pratiques plus durables et plus respectueuses de l’environnement. Pour répondre à ces nouvelles exigences, les agriculteurs doivent se tourner vers l’exploitation et la rentabilisation des ressources naturelles par le biais de pratiques agricoles combinant la performance et la protection des cultures à un moindre coût écologique. Dans ce contexte, le développement de molécules biologiques capables de stimuler les défenses naturelles des végétaux (SDN) est une stratégie qui attire de plus en plus l’attention. Une molécule SDN est un éliciteur susceptible de déclencher une série d’évènements biochimiques menant à l’expression de la résistance chez la plante. La perception du signal par des récepteurs membranaires spécifiques et sa transduction par diverses voies de signalisation conduisent à la synthèse et à l’accumulation synchronisée de molécules parmi lesquelles certaines vont jouer un rôle structural alors que d’autres vont exercer une fonction de résistance au stress. Les progrès remarquables accomplis ces dernières années en termes de compréhension des mécanismes impliqués dans la résistance induite chez les plantes se traduisent par la commercialisation d’un nombre de plus en plus important de SDN capables de stimuler le « système immunitaire » des plantes en mimant l’effet des agents pathogènes. On distingue plus particulièrement le stress abiotique et le stress biotique. En pratique, il n’est pas toujours évident de savoir si des symptômes sont liés à un « désordre physiologique » (par exemple une carence minérale), ou à l’action d’un agent pathogène. Par ailleurs, face à un certain nombre de stress abiotiques ou biotiques comme le déficit hydrique, carences en minéraux ou les attaques parasitaires, il existe des solutions culturales (irrigation, amendements, traitements phytosanitaires…) et des solutions génétiques (utilisation d’espèces appropriées aux conditions pédoclimatiques, amélioration variétale). Les physiologistes qui se sont penchés sur les mécanismes sous-jacents aux résistances ont pu identifier des mécanismes biochimiques impliqués dans les tolérances aux stress abiotiques, ainsi que d’autres, différents, et spécifiquement impliqués dans les résistances aux stress biotiques. Les mécanismes de résistance à ces deux familles de contraintes apparaissent être fondamentalement distincts. La question de la résistance ou de la tolérance aux stress rejoint le problème agricole concret de la stabilité des rendements. Du point de vue agronomique, la tolérance au stress va se mesurer par l’impact du stress sur le rendement (graines, parties végétatives, dépendamment des cultures) et/ou la qualité des produits. Le piment ( Capsicum spp. ) est l'une des principales cultures rentables de Solanacées cultivées pour son pouvoir piquant. Il est bien connu que le pouvoir piquant du piment est dû aux capsaïcinoïdes, qui sont majoritairement des capsaïcines et des dihydrocapsaïcines (Kaale, E. et al. , Determination of Capsaicinoids in topical cream by liquid-liquid extraction and liquid chromatography, J. Pharm Biomed 2002, Anal. 30: 1331). La capsaïcine procure une sensation chaude, épicée, piquante ainsi qu'un effet engourdissant, brûlant ou picotant lorsqu'elle est appliquée par voie orale ou topique. La capsaïcine est connue pour être utilisée dans les produits pharmaceutiques, les cosmétiques, les aliments et les boissons (Mathur, R. et al. , 2000, The hottest chilli variety in India, Curr.Sci. 79 (3): 287). A titre d’exemples, plusieurs études rapportent une grande variété d'activités biologiques des capsaïcinoïdes, telles que des effets antioxydants, analgésiques, anti-tumoraux, anti-obésité et anti-inflammatoires (Luo X-J et al. , 2011, Recent advances in the study on capsaicinoids and capsinoids. Eur J Pharmacol 650: 1–7). Un autre effet pharmacologique majeur de la capsaïcine est son effet antimicrobien contre une grande variété de microorganismes, notamment des bactéries, des champignons et des virus, montrant des effets bénéfiques possibles sur de nombreuses maladies (Reyes-Escogido ML et al. , 2011, Chemical and pharmacological aspectsof capsaicin. Molecules 16: 1253–1270; Veloso J et al. , 2013, Properties of capsaicinoids for the control of fungi and oomycetes pathogenic to pepper. Plant Biol 16: 177–185). Bien que la variabilité génétique en matière de pouvoir piquant soit grande et qu'un grand nombre de variétés et d'hybrides aient été divulgués par de nombreuses organisations, très peu d'efforts ont été déployés pour augmenter la teneur en capsaïcine du fruit du piment (Tewari VP., Development of high Capsaicin Chillies ( Capsicum annuum L. ) and their implications for the manufacture of export products, J. Plantation Cultures, 1990, 18(1):1). L'une des exigences de base pour augmenter la teneur en capsaïcine dans les cultivars de piment est d'identifier le matériel génétique à forte teneur en capsaïcine. La culture de cellules végétales est une technologie alternative pour la production de composés phytochimiques à valeur ajoutée. L'élicitation des métabolites secondaires en utilisant des champignons, des bactéries et des levures est connue (Dicosmo et Misawa, Elicitation of secondary metabolism in plant cultures Trend in Biotechnology 3: 318, 1985; Sudhakar Johnson T. et al. , . Elicitation of capsaicin production in freely suspended cells and immobilized cell cultures of Capsicum frutescens Mill. Food Biotechnol. 5: 197, 1993). De nombreux autres éliciteurs biotiques et/ou abiotiques sont également décrits pour augmenter la résistance aux stress des plantes de manière générale et la production de métabolites secondaires. On connait plus particulièrement la publication M. Vargas-Hernández et al. (2017, Influence of hydrogen peroxide foliar applications on in vitro antimicrobial activity in Capsicum chinense Jacq., Plant Biosystems - An International Journal Dealing with all Aspects of Plant Biology, 151:2, 269-275) dont le but est d'évaluer l'effet d’applications foliaires de peroxyde d'hydrogène sur l'activité antimicrobienne d’extraits méthanoliques de Capsicum chinense Jacq. . Pour cela, les graines ont été immergées dans une solution de nitrate de potassium (200 ppm) pendant 24 h puis ont été semées dans un substrat préalablement désinfecté, à savoir un mélange mousse-tourbe-vermiculite dans un rapport de 4:1. Après 2 semaines, les plantules ont été transplantées dans des conteneurs de 5 L avec le même substrat, puis transférées dans une serre (T = 26°C, HR = 60%, jour 16 h). Au cours du processus, les plantes ont été arrosées trois fois par semaine avec une solution nutritive Steiner (Stainer AA, 1984, The universal nutrient solution, Proceedings of IWOSC 1984 6th International Congress on Soilless Culture, 29 April–May 1984, Wageningen, The Netherlands). Des applications foliaires de peroxyde d’hydrogène (18 mM) ont été effectuées tous les 15 jours pendant 104 jours jusqu’à ce que la récolte soit obtenue, comme indiqué ailleurs (García-Mier L et al. , 2013, Agriculture and bioactives: achieving both crop yield and phytochemicals, Int J Mol Sci 14: 4203–4222). Les échantillons ont été stockés à -70°C jusqu'à l'analyse. Les effets de l'application de peroxyde d'hydrogène sur l'accumulation de métabolites de C. chinense var. Jaguar et var. Chichen Itza ont ainsi été évalués. Les teneurs totales en composés phénoliques, flavonoïdes et capsaïcinoïdes des deux variétés traitées au peroxyde d'hydrogène ont été significativement plus élevées que celles du témoin. Néanmoins, bien que le résultat du traitement au peroxyde d’hydrogène consiste en une augmentation de la teneur en composés phénoliques, flavonoïdes et capsaïcinoïdes, un tel traitement est utilisé pour augmenter l'activité antimicrobienne des plants de piment et non l’effet piquant du piment. En revanche, on connait le document WO2006038049 qui se rapporte à un procédé de préparation d'une formulation de pulvérisation utile pour améliorer les niveaux de piquant de Capsicum . La pulvérisation appliquée sur les végétaux Capsicum assure des niveaux de piquant accrus comparativement aux niveaux des capsaïcinoïdes de contrôle et améliore également les intermédiaires propres à la biosynthèse des capsaïcinoïdes. La composition de pulvérisation utilisée pour augmenter le pouvoir piquant du fait de la présence d’intermédiaires de capsaïcinoïdes ou de phénylpropanoïde ou d'une combinaison de ceux-ci dans les fruits de la famille des Solanacées, comprend 2,5 x 10 1 à 10 x 10 1 (0,25-2% en poids)/v) d’un éliciteur biotique choisi dans un groupe comprenant les extraits fongiques d’ Aspergillus niger, Aspergillus parasiticus et Rhizopus oligosporus et leur mélange, ainsi que 1 x 10 5 à 5 x 10 5 (1-5 M) d’un éliciteur abiotique choisi dans un groupe comprenant le méthyl-jasmonate et l’acide salicylique dans un véhicule approprié. Néanmoins, l’utilisation d’un éliciteur biotique, notamment fongique, nécessite des étapes de pré-cultures et de cultures du champignon (ou de la bactérie) et des manipulations en milieu stérile et contrôlé (contrôle de non-contamination de l’ inoculum afin d’obtenir un extrait pur provenant uniquement de la souche d’intérêt). L’extrait de champignon, de chimie complexe et variable en fonction des conditions de culture, devra de même être contrôlé et standardisé par des analyses chimiques. Cette étape reste donc coûteuse et consommatrice de temps. En outre, les souches utilisées dans ce procédé peuvent-être responsables, chez l’homme, de maladies pulmonaires (aspergillose) et requiert donc des précautions de manipulations. Problème technique Considérant ce qui précède, bien que les capsaïcinoïdes et d'autres composés provoquant le pouvoir piquant soient produits naturellement dans les fruits de Capsicum , un problème que se propose de résoudre la présente invention est de développer un nouveau procédé d’élicitation contrôlée, facile à mettre en œuvre notamment pour des cultures en champs, conférant un plus grand pouvoir piquant aux fruits de Capsicum . Solution technique La solution à ce problème posé a pour premier objet un procédé d’élicitation contrôlée de plantes en culture pour augmenter leur synthèse de métabolites secondaires comprenant les étapes suivantes selon lesquelles : - d’une part, lesdites plantes sont traitées par application d’une solution de peroxyde d’hydrogène (H 2 O 2 ) à une concentration comprise entre 1 mM et 800 mM, et - d’autre part, un déficit hydrique est généré par arrêt total de l’irrigation desdites plantes en culture, ledit traitement H 2 O 2 et ledit déficit hydrique étant réalisés, de manière concomitante ou séparée, entre 1 et 5 jours avant la récolte, et - on récolte des fruits issus des plantes ainsi traitées dans lesquels la synthèse de métabolites secondaires choisis parmi les capsaïcinoïdes, flavonoïdes, caroténoïdes, terpenoïdes, pris seuls ou en combinaison, a été augmentée. Elle a pour deuxième objet des plantes choisies parmi les Solanacées, préférentiellement des plants de piment ( Capsicum spp.), susceptibles d’être obtenues par le procédé selon l’invention dans lesquelles la teneur de métabolites secondaires choisis parmi les capsaïcinoïdes, flavonoïdes, caroténoïdes, terpenoïdes, pris seuls ou en combinaison, préférentiellement capsaïcinoïdes, synthétisés dans leurs fruits a été augmentée. Enfin, elle a pour troisième et dernier objet l’utilisation du procédé selon l’invention chez des plantes choisies parmi les Solanacées, préférentiellement des plants de piment ( Capsicum spp.), pour obtenir des fruits dans lesquels la teneur de métabolites secondaires choisis parmi les capsaïcinoïdes, flavonoïdes, caroténoïdes, terpenoïdes, pris seuls ou en combinaison, préférentiellement capsaïcinoïdes, synthétisés par lesdites plantes a été augmentée. Avantages apportés Le procédé développé selon l’invention est facile à mettre en œuvre et à reproduire dans le temps. Il permet d’augmenter significativement, de manière additive voire synergique, le rendement en métabolites secondaires d’intérêt tels que les capsaïcinoïdes, flavonoïdes, carotenoïdes, terpènes, en particulier en capsaïcinoïdes. L’invention et les avantages qui en découlent seront mieux compris à la lecture de la description et des modes de réalisation non limitatifs qui suivent, illustrés au regard des dessins annexés dans lesquels : Fig.1 représente le pourcentage de capsaïcinoïdes totaux (capsaïcine + dihydrocapsaïcine) chez des fruits de piment (C. chinense cv. Helios) traité avec du peroxyde d’hydrogène (H2O2, 400mM) et/ou ayant subi un déficit hydrique (arrêt total de l’irrigation) 3 jours avant récolte. Fig.2 représente l’expression de gènes de l’aminotransférase (pamt), keto acyl synthase (kas), capsaicin synthase (at3) et de la phenyl alanine ammonia lyase (pal) chez des fruits de piment (C. chinense cv. Helios) traité avec du peroxyde d’hydrogène (H2O2, 400 mM) et/ou ayant subi un déficit hydrique (arrêt de l’irrigation) 3 jours avant récolte. Procédé d’élicitation contrôlée de plantes en culture pour augmenter leur synthèse de métabolites secondaires comprenant les étapes suivantes selon lesquelles : - d’une part, lesdites plantes sont traitées par application d’une solution de peroxyde d’hydrogène (H 2 O 2 ) à une concentration comprise entre 1 mM et 800 mM, et - d’autre part, un déficit hydrique est généré par arrêt total de l’irrigation desdites plantes en culture, ledit traitement H 2 O 2 et ledit déficit hydrique étant réalisés, de manière concomitante ou séparée, entre 1 et 5 jours avant la récolte, et - on récolte des fruits issus des plantes ainsi traitées dans lesquels la synthèse de métabolites secondaires choisis parmi les capsaïcinoïdes, flavonoïdes, caroténoïdes, terpenoïdes, pris seuls ou en combinaison, a été augmentée. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les plantes sont des Solanacées. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les Solanacées sont des plants de piment ( Capsicum spp. ), préférentiellement des plants de piment choisis parmi C. chinense Bhut Jolokia, C. chinense cv. Helios (piment Habanero ) et C. annuum L. cv Don Benito (piment Jalapeño ). Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le traitement au H 2 O 2 est réalisé avec une solution aqueuse de H 2 O 2 à une concentration comprise entre 10 mM et 500 mM, préférentiellement entre 200 mM et 450 mM, plus préférentiellement de 400 mM et appliqué par spray au niveau des feuilles desdites plantes. Procédé selon l’une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le traitement au H 2 O 2 et le déficit hydrique sont réalisés de manière concomitante 3 jours avant la récolte. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le traitement au H 2 O 2 et le déficit hydrique sont réalisés de manière périodique toutes les deux semaines avant chaque récolte pendant la période de production de fruits par lesdites plantes, préférentiellement respectivement au moins 3 fois, plus préférentiellement respectivement au moins 8 fois. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les métabolites secondaires dont la synthèse est augmentée sont des capsaïcinoïdes. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que les métabolites secondaires dont la synthèse est augmentée sont des capsaïcinoïdes choisis parmi la capsaïcine, dihydrocapsaïcine (8-méthyl-N-vanillylnonamide), nordihydrocapsaïcine (7-méthyl-N-vanillyloctamide), homodihydrocapsaïcine (9-méthyl-N-vanillyldécamide), homocapsaïcine (trans-9-méthyl-N-vanillyl-7-décénamide), préférentiellement la capsaïcine et dihydrocapsaïcine. Utilisation du procédé selon l’une des revendications 1 à 8 chez des plantes choisies parmi les Solanacées, préférentiellement des plants de piment ( Capsicum spp. ), pour obtenir des fruits dans lesquels la teneur de métabolites secondaires choisis parmi les capsaïcinoïdes, flavonoïdes, caroténoïdes, terpenoïdes, pris seuls ou en combinaison, préférentiellement capsaïcinoïdes, synthétisés par lesdites plantes a été augmentée.