Brevet FR3100820A1 — publié le 20210319

L’invention a trait à un procédé de génotypage permettant de traiter simultanément un grand nombre d’échantillons d’ADN. Plus particulièrement, elle concerne un procédé de génotypage comportant une première étape d’amplification par PCR indexée puis une seconde étape de séquençage à haut débit, ce procédé étant simple, rapide et peu coûteux. Procédé de génotypage adapté au traitement d’un grand nombre d’échantillons, notamment en cas de polymorphisme élevé L’invention a trait à un procédé de génotypage permettant de traiter simultanément un grand nombre d’échantillons d’ADN. Plus particulièrement, elle concerne un procédé de génotypage comportant une première étape d’amplification par PCR indexée en système microfluidique puis une seconde étape de séquençage à haut débit, ce procédé est simple, rapide et moins coûteux que les procédés de l’état de la technique. Le séquençage à haut débit (aussi appelé NGS pour Next Generation Sequencing) permet d’opérer en parallèle un très grand nombre de séquences courtes. Le principe de cette technique est le suivant : Les séquences à analyser sont tout d’abord préparées par ajout de séquences adaptatrices aux extrémités. Elles sont ensuite fixées sur un support solide via ces séquences adaptatrices et chaque fragment est enrichi pour former des « clusters » clonaux qui seront séquencés par la suite. À chaque cycle, l'ajout d'un nucléotide se traduit par un signal fluorescent associé à chacun des quatre nucléotides de l'ADN. Ces signaux sont ensuite analysés par un logiciel de traitement de données qui restitue le résultat de la lecture des séquences. Cette méthode est rapide et précise. Afin de permettre un multiplexage élevé et dans ce contexte assurer la stabilité des duplex d’ADN hydridés lorsque la température de demi-dénaturation (Tm) est élevée, des bases LNA™(Locked Nucleic Acid) sont ajoutées, notamment dans la méthode NGS développée par la société Fluidigm. Ces bases sont des oligonucléotides modifiés qui obéissent aux règles d'appariement des bases de Watson-Crick et forment des duplex, lesquels sont significativement plus stables que des duplex similaires formés par des oligonucléotides non modifiés. Ainsi, la sensibilité de discrimination entre des allèles ne présentant que des différences mineures, voire un seul nucléotide différent, est possible. Cette technique est particulièrement adaptée lorsque le polymorphisme est très élevé. Cette technologie NGS est largement utilisée en recherche, comme en diagnostic. Elle permet de séquencer des génomes entiers. Elle constitue ainsi un outil très performant et représente une aide au diagnostic de maladies génétiques et oncologiques par exemple. Afin de permettre la lecture de séquences cibles, comme ceci est le cas pour le diagnostic, une librairie de séquences est préparée en amont du séquençage afin d’enrichir la librairie en séquences d’intérêt. Cette amplification de séquences est réalisée par réaction de polymérase en chaîne (PCR). Comme le séquençage NGS permet de lire un grand nombre de séquences simultanément, il est intéressant de mélanger des échantillons provenant de patients différents. Afin d’identifier les séquences provenant d’un même échantillon, celles-ci peuvent être étiquetées lors de l’étape d’amplification par l’ajout de séquences étiquettes ou « index ». La méthode de PCR indexée est connue de l’homme du métier et décrite par exemple dans l’article de Stahlberg A. et al. (Nucleic Acid Research, 2016, vol.44, No.11) Le document EP 2599877 décrit une méthode de séquençage comprenant une première étape de PCR pendant laquelle les séquences sont marquées à l’aide d’un index puis une seconde étape de séquençage de deuxième génération. Lors du séquençage, une stratégie de cisaillement incomplet de l’ADN est mise en œuvre pour augmenter l’amplitude de lecture des séquences. Le séquençage NGS bien que très puissant en termes de capacité de séquençage présente des inconvénients. Le principal obstacle est la durée de réalisation d’un génotypage depuis la préparation de l’échantillon jusqu’à l’obtention du résultat qui s’étale sur plusieurs jours. Il existe un besoin de disposer d’une méthode de séquençage précise et rapide à coût raisonnable. La présente invention concerne une méthode de génotypage à partir d’échantillons d’ADN comprenant : une étape d’amplification de l’ADN par une réaction de polymérisation en chaîne (PCR) indexée en condition de multiplexage faible réalisée en système microfluidique, dans laquelle les amorces spécifiques comprennent en 3’ une séquence stabilisatrice comprenant entre 8 et 12 nucléotides parmi lesquels 45% à 65% sont des G ou C ; une étape de séquençage à haut débit de type NGS dans laquelle les amorces de séquençage ne contiennent pas de base LNA™ mais une séquence complémentaire de ladite séquence stabilisatrice. Pour stabiliser les duplex lors du séquençage, les inventeurs ont introduit des séquences d’une dizaine de nucléotides aux extrémités des amorces. Cet ajout permet de se passer des bases modifiées tout en conservant une grande fiabilité de lecture lors du séquençage. La présente invention concerne également un kit de génotypage pour la mise en œuvre successive d’une PCR indexée en système microfluidique et d’un séquençage à haut débit de type NGS, ainsi qu’un mélange réactionnel pour séquençage NGS sans utilisation de bases LNA™. Avantages de l’invention La méthode de génotypage selon l’invention présente plusieurs avantages : elle est simple, rapide et peu coûteuse et permet de traiter, en simultané, une grande série d’échantillons. Elle combine une PCR indexée réalisée dans un système microfluidique (gain de temps et de matériel) avec un système de séquençage NGS (précision, rapidité). Cette méthode est simple car 100% automatisée. Elle est proposée sous la forme d’un kit prêt à l’emploi. Ce format limite les manipulations par l’expérimentateur et donc les risques d’erreur. Il permet aussi de gagner du temps en diminuant le nombre de gestes à effectuer. Cette méthode est rapide puisque le résultat est obtenu en moins de 48 heures. En effet, il faut compter 6h15 pour la préparation de la banque, 32h pour le séquençage et 3h30 environ pour l’analyse, et ceci quel que soit le nombre de patients diagnostiqués. Elle est peu coûteuse et permet de proposer une solution de génotypage efficace et très fiable, accessible au plus grand nombre. Elle a vocation à être déployée dans tous les laboratoires où un génotypage est pratiqué, par exemple dans les centres de recherches, dans les centres hospitaliers, les banques de sang et les centres de transfusion sanguine où elle s’inscrit dans une démarche de maitrise des coûts de santé publique et de productivité. Elle permet le traitement d’un grand nombre d’échantillons en même temps, ce qui est rentable à la fois en termes de temps et de coût. Dans la version actuelle du kit, il est possible de génotyper en même temps 48 patients. BREVE DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1 : Représentation schématique des amorces utilisées selon un mode de réalisation particulier de la présente invention. (A) amorces spécifiques, (B) séquences universelles et stabilisatrices, (C) Adaptateurs P5-P7 et Index, (D) amorce de séquençage Sens, (E) amorce de séquençage Anti sens, (E) amorce de lecture d’index. Figure 2 : Représentation d’une séquence amplifiée en tant que descriptif d’un mode de réalisation particulier. EXEMPLE EXEMPLE 1 : Principe de la méthode de génotypage NGS sans base LNA ™ 1. Amplification des séquences d’intérêt par PCR indexée A partir de variants alléliques ou de mutations connus dans un système biologique défini, des séquences d’intérêt sont identifiées en vue du génotypage. Des couples d’amorces spécifiques des séquences alléliques ou mutants à amplifier sont conçus et validés. Ces amorces permettront l’amplification des séquences d’intérêt. Les réactions d’amplification étant réalisées en multiplexage, des mélanges réactionnels combinant plusieurs couples d’amorces sont préparés. Les échantillons biologiques à analyser sont préparés en vue de la PCR, l’ADN est extrait et purifié. Cette étape de préparation est bien connue de l’homme du métier et aboutit à des échantillons présentant des concentrations en ADN normalisées. La réaction d’amplification proprement dite est réalisée dans une plaque microfluidique de type IFC de Fluidigm. Les mélanges réactionnels contenant les amorces spécifiques sont déposées dans une première zone de 48 puits et les amorces destinées à l’indexation ainsi que le Master Mix sont déposés dans une seconde zone de 48 puits. La réaction d’amplification se déroule en conditions standard, dans un automate de type Juno de la société Fuidigm par exemple. Une fois amplifiées, les séquences sont récupérées, purifiées et quantifiées pour être séquencées. 2. Séquençage NGS Le séquençage est réalisé dans un séquenceur NGS de la société Illumina. Le séquençage est réalisé à l’aide du couple d’amorces de séquençage pour amplifier les séquences à analyser et de l’amorce de lecture d’index pour identifier le patient auquel se rapporte la séquence. Tableau 1 : Récapitulatif des séquences décrites Descriptif de le séquence SEQ ID N o . Séquence 5’-3’ Séquence stabilisatrice 1 1 GCAGACTCAG Séquence stabilisatrice 2 2 TGTTGACTCC Séquence universelle 1 3 ACACTCACGACATGGTTCTACA Séquence universelle 2 4 TACCGTAGCAGAGACTTGGTCT Index 1 5 CGCGACTTGT Index 2 6 GGTTGGAGTT Index 3 7 GAGCACGGAA Adaptateur de séquençage P5 (Illumina®) 8 AATGATACGGCGACCACCGAGATCT Adaptateur de séquençage P7 (Illumina®) 9 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT Amorce de séquençage sens 10 ACACTCACGACATGGTTCTACAGCAGACTCAG Amorce de séquençage antisens 11 TACCGTAGCAGAGACTTGGTCTTGTTGACTCC Amorce de lecture d’index 12 GGAGTCAACAAGACCAAGTCTCTGCTACGGTA Méthode de génotypage à partir d’échantillons d’ADN comprenant : a . une étape d’amplification de l’ADN par une réaction de polymérisation en chaîne indexée en condition de faible multiplexage réalisée dans un système microfluidique, dans laquelle les couples amorces spécifiques comprennent en 3’ une séquence stabilisatrice comprenant de 8 à 12 nucléotides parmi lesquels 45% à 65% sont des G ou C ; b . une étape de séquençage à haut débit de type NGS dans laquelle les amorces de séquençage ne contiennent pas de base LNA™ mais une séquence complémentaire de ladite séquence stabilisatrice. Méthode selon la revendication 1 dans laquelle ladite séquence stabilisatrice comprend 10 nucléotides dont 5 à 6 nucléotides sont des G ou C. Méthode selon la revendication 2 dans laquelle ladite séquence stabilisatrice est choisie parmi les séquences SEQ ID NO. 1 et SEQ ID NO.2 Méthode selon l’une des revendications 1 à 3 dans laquelle lesdites amorces spécifiques comprennent en outre une séquence universelle située en 3’ de ladite séquence stabilisatrice. Méthode selon la revendication 4 dans laquelle ladite étape d’amplification d’ADN met en outre en œuvre des couples d’amorces destinés à l’indexation et au séquençage des séquences amplifiées comprenant : au moins une première partie capable de s’hybrider avec les séquences universelles amplifiées grâce aux amorces spécifiques et au moins une seconde partie comprenant une séquence pour un adaptateur nécessaire au séquençage, l’une des amorces sens ou antisens comprenant en outre un index positionné entre ces deux parties. Méthode selon l’une des revendications précédentes dans laquelle l’étape de séquençage est réalisée à l’aide des amorces suivantes : un couple d’amorces de séquençage s’hybridant aux séquences universelles et comprenant une séquence stabilisatrice positionnée à l’extrémité 5’ ; une amorce de lecture d’index s’hybridant à la séquence universelle juxtaposant l’index et comprenant une séquence stabilisatrice. Kit de génotypage pour la mise en œuvre successive d’une PCR indexée et d’un séquençage à haut débit de type NGS sans utilisation de base LNA™ comprenant : une plaque PCR comprenant des amorces destinées à l’indexation pré-aliquotées mélangées au Master mix ; une plaque PCR comprenant des amorces spécifiques ; des couples d’amorces spécifiques des séquences à amplifier, ces amorces comprenant en 3’ une séquence stabilisatrice comprenant de 8 à 12 nucléotides parmi lesquels au moins 45% à 65% sont des G ou C, précédée d’une séquence universelle ; des couples d’amorces permettant l’indexation et le séquençage des séquences amplifiées, ces amorces comprenant au moins une première partie capable de s’hybrider aux séquences universelles et au moins une seconde partie comprenant une séquence pour un adaptateur nécessaire au séquençage, l’une des amorces sens ou antisens comprenant en outre un index positionné entre ces deux parties ; d’un mélange réactionnel pour séquençage NGS sans base LNA™ comprenant un couple d’amorce pour le séquençage s’hybridant aux séquences universelles et une amorce pour la lecture de l’index, chacune de ces amorces comprenant une séquence stabilisatrice. Kit selon la revendication 7 dans lequel lesdites plaques dans lesquelles sont déposées les amorces, sont disposées sur une plaque microfluidique pour la mise en œuvre de la PCR indexée, ladite plaque microfluidique comportant deux zones de 48 puits pour dépôt d’une part des amorces spécifiques et d’autre part des amorces permettant l’indexation et des micro-chambres réactionnelles. Mélange réactionnel pour séquençage NGS sans utilisation de base LNA™ comprenant les amorces suivantes : une amorce de séquençage sens s’hybridant à la séquence universelle située en 5’ de la séquence à analyser et comprenant une séquence stabilisatrice à son extrémité 5’ ; une amorce de séquençage antisens s’hybridant à la séquence universelle située en 3’ de la séquence à analyser et comprenant une séquence stabilisatrice à son extrémité 5’ ; une amorce de lecture d’index s’hybridant à la séquence universelle juxtaposant l’index et comprenant une séquence stabilisatrice positionnée à l’une de ses extrémités 3’. Mélange selon la revendication 9 dans lequel : ladite amorce de séquençage sens est de séquence SEQ ID No.10 ; ladite amorce de séquençage antisens est de séquence SEQ ID No.11; et ladite amorce de lecture d’index est de séquence SEQ ID No.12.