Brevet FR3105911A1 — publié le 20210709

La présente invention concerne un procédé de congélation et de conservation d’une composition comprenant une population de cellules stromales néonatales (CSN) et un cryoprotecteur, caractérisé en ce qu’il comprend une étape de congélation de la composition à une température comprise entre -70°C et -140°C, puis une étape de conservation de la composition entre -10°C et -40°C. La présente invention concerne également une composition comprenant une population de CSN, et un cryoprotecteur caractérisée en ce qu’elle est conservée entre -10°C et -40°C, lesdites CSN étant en particulier des CSN placentaires. Pas de figure Procédé de congélation et de conservation de cellules stromales néonatales La présente invention porte sur un procédé de congélation et de conservation de cellules stromales néonatales (CSN). Les cellules stromales mésenchymateuses (CSM) représentent à l’heure actuelle une option de thérapie cellulaire dans le cadre des maladies dégénératives et/ou dis-immunitaires. En 2019, les CSM sont utilisées dans plus de 220 essais cliniques en cours de recrutement à l’échelle mondiale et génèrent un engouement certain d’un point de vue industriel et commercial. La capacité de conservation des CSM représente donc un levier technologique majeur afin d’assurer une efficacité thérapeutique du produit final. Les évolutions techniques de ces dernières années se sont principalement basées sur la composition chimique des solutions de cryoconservation et le procédé de congélation pour un stockage à ultrabasse température. Ces travaux ont permis d’aboutir à une congélation et un stockage à long terme maitrisé des CSM en condition de températures ultrabasses comprises entre -80°C et -195°C (Marquez-Curtis et al., 2015). Cette gamme de températures implique d’avoir recours à une gestion de l’azote pour une conservation en phase liquide ou gazeuse. Une alternative est d’avoir recours à des congélateurs hautes performances afin de maintenir de telles températures. Une telle conservation requiert donc un équipement couteux, de la logistique et l’accès à un site de stockage spécialisé. En 2012, Yingbo et al. (CN102487939 A) ont conservé à -20°C durant une période de 20 jours, une suspension de CSN de placenta humain dans du milieu de congélation composé de glucose, chlorure de sodium, albumine, sodium bicarbonate, propylène glycol et cholestérol. La méthode de congélation employée est une congélation à -20°C pour un stockage compris entre -20°C et -4°C. Les auteurs ont montré une viabilité à la décongélation de l’ordre de 85%. En 2015, l’équipe de Espina et al. ont congelé des CSM de moelle osseuse à -150°C et les ont soumises à des conditions de basses températures mimant des conditions de livraison. L’équipe a montré qu’il était difficile d’envisager une conservation des CSM de moelle osseuse à des températures de -20°C et ce pour une durée de 48h à 72h au maximum. Ces résultats montrent à minima une baisse de viabilité de l’ordre de 50% des cellules à la décongélation. Il existait donc un besoin pour conserver les CSM grâce à des dispositifs moins couteux et faciles à mettre en œuvre, par le médecin ou le vétérinaire par exemple. Il était également nécessaire de développer une méthode de conservation qui garantisse une viabilité acceptable des cellules après décongélation et le maintien d’une efficacité thérapeutique. Les inventeurs ont découvert de manière inattendue, qu’un procédé de congélation et de conservation d’une composition comprenant une population de cellules stromales néonatales (CSN) et un cryoprotecteur, comprenant une étape de congélation entre -70°C et -140°C suivi d’une étape de conservation entre -10°C et -40°C, permettait de conserver les CSN à une température entre -10°C et -40°C sur une longue durée (en particulier au moins 3 semaines, voire plusieurs mois), tout en garantissant une viabilité cellulaire, une activité métabolique et une capacité d’immunomodulation acceptables après décongélation. Ainsi, les inventeurs ont développé un procédé permettant la conservation des CSN grâce à des dispositifs de conservation à basses températures entre -10°C et -40°C, faciles à mettre en œuvre et peu onéreux, tels que des congélateurs standards à usage non industriel, et garantissant une bonne viabilité des cellules et leur efficacité thérapeutique après plusieurs mois de conservation. La présente invention concerne un procédé de congélation et de conservation d’une population de cellules stromales néonatales. Au sens de la présente invention, Par « population de cellules », on entend un ensemble de cellules comprenant un ou plusieurs types cellulaires différents, par exemple un mélange de cellules à différents stades de différenciation, comprenant des cellules ayant une même origine tissulaire ou issues de différentes origines tissulaires. D’un point de vue structural, les cellules stromales néonatales (CSN) peuvent être caractérisées par le fait que moins de 10% des cellules expriment un ou plusieurs des marqueurs de surface suivants : CD11b, CD14, CD31, CD34, CD45, ou, HLA-DR, dénommé également CMH-II. Les CSN peuvent également être caractérisées par l’expression au niveau transcriptionnel de facteurs de croissance, tels que le facteur croissance de l’endothélium vasculaire de (VEGF), le facteur de croissance (HGF), le facteur de croissance kératinocyte (KGF), le facteur de croissance transformant de type β (TGF-β). Les CSN selon l’invention peuvent également être caractérisées par leurs propriétés biologiques, telle que leur capacité de prolifération cellulaire. Ainsi, dans un mode de réalisation spécifique, la population de CSN est caractérisée en ce qu’au moins 80% des cellules de ladite population de CSN possèdent une capacité de doublement cellulaire consécutif supérieur à 20 doublements cumulés. Par « capacité de prolifération cellulaire », on entend qu’une population de CSN selon l’invention est capable de doubler en nombre, plus de 20 fois au total. Pour évaluer le nombre de doublements, à chaque passage cellulaire, les cellules sont détachées de leur support, centrifugées puis comptabilisées, par exemple par la technique d’exclusion au bleu trypan à l’aide d’un compteur électronique. Le nombre de doublement à chaque passage cellulaire est calculé selon la formule suivante : Nb de doublements = LOG (Nf/Ni)/LOG(2) (Nf : nombre de cellules finales et Ni : nombre de cellules initiales). Le nombre total de doublements cellulaires est égal à la somme du nombre de doublements cumulés à chaque passage cellulaire. La population de CSN peut également être caractérisée en ce qu’au moins 80% des cellules de ladite population de CSN possèdent : - une capacité d’adhérence sur support plastique ; et/ou - un potentiel de différenciation chondrogénique, et/ou - un potentiel immunomodulateur. Dans un mode de réalisation spécifique, la population de CSN est également caractérisée en ce qu’au moins 80% des cellules de ladite population de CSN présentent un potentiel de différenciation ostéogénique limité ou ne présentent pas de potentiel de différenciation ostéogénique. Par « capacité d’adhérence sur support plastique », on entend que la population de CSN est caractérisée par sa propriété d’adhérence sur support plastique. Par « potentiel de différenciation chondrogénique », on entend que les CSN ont la capacité de pouvoir se différencier en chondrocytes. Les expressions « différenciation chondrocytaire » et « différenciation en chondrocytes » peuvent également être utilisées de manière indifférente. Cette capacité de différenciation en chondrocytes peut être évaluée par l’étude protéique et/ou transcriptionnelle des marqueurs spécifiques du cartilage tels que le Collagène de type II( COL2A1 ), SOX-9 ( SOX9 ), l’aggrécane ( ACAN ), le cartilage Oligomeric Matrix Protein ( COMP ), le Collagène de type IX ( COL9A1 ), le collagène de type XI ( COL11A1 ), le collagène de type IIB ( COL2B ) après induction de la chondrogenèse. D’autre part, des propriétés visco-élastiques de la matrice extracellulaire, exprimée par les CSN différenciées, se rapprochent des propriétés visco-élastiques du cartilage. Ces propriétés visco-élastiques peuvent ainsi servir de caractéristique pour l’évaluation de la chondrogenèse. Dans un mode de culture privilégié, pour induire la chondrogénèse, les CSN sont détachées de leur support par trypsination et utilisées pour former des micromasses par gravitation dans une goutte de milieu d’amplification comme par exemple le DMEM (1g/L de glucose) supplémenté avec 10% de SVF (vol :vol), 2mM de glutamine et 0 à 20 ng/ml de facteur de croissance fibroblastique (FGF2-β). Une micromasse de CSN se forme alors après 24h d’incubation, à la base de la goutte. Cette micromasse est récupérée et mise en présence d’un milieu de différenciation chondrocytaire composé de DMEM avec 4.5 g/L de glucose et additionné de TGF- β3 ou d’une combinaison TGF-β1/BMP-2, pendant 7 à 28 jours. A l’issue, une extraction ARN ou protéique est réalisée afin d’analyser l’expression de marqueurs spécifiques du lignage chondrogénique tels que le collagène de type II, l’aggrécane, les COMP, SOX9. Par « potentiel immunomodulateur », on entend la capacité d’immunomodulation des CSN. Ce potentiel peut se caractériser par la capacité qu’ont les CSN à exprimer un ensemble de facteurs immunomodulateurs tels que PGE2, IL-6, IL-10, TGF-β, IDO, iNOS, HGF, KGF, CCL2 et/ou TSG-6. En effet, en présence d’un contexte inflammatoire, les CSN peuvent modifier leur phénotype. Le contexte inflammatoire peut être mimé in vitro par stimulation des cellules par le biais de cytokines et/ou facteurs de croissance tels que l’IFN-γ, IL-1, IL-6 et/ou TNF-α. Une modification du phénotype des CSN se traduit par la capacité des CSN à modifier l’expression transcriptionnelle et/ou protéique de marqueurs intervenant dans l’immunomodulation. Parmi ces marqueurs nous pouvons citer PGE2, IL-6, IL-10, TGF-β, IDO, iNOS, HGF, KGF, TSG-6, CCL2, CMH-I, CMH-II, HLA-E. Ainsi, le potentiel immunomodulateur peut par exemple être déterminé par une étude de l’expression de la prostaglandine (PGE2) sécrétée par les cellules en condition basale et après stimulation en contexte inflammatoire. Pour cela les cellules sont cultivées en milieu de prolifération (milieu avec sérum de veau fœtal) ou en milieu complémenté avec de l’interféron gamma, puis le PGE2 sécrété est mesuré par test Elisa. Le potentiel immunomodulateur des CSN peut également se caractériser par l’effet antiprolifératif des CSN sur des cellules mononuclées sanguines périphériques (PBMC) traitées avec un agent mitogène tel que la phytohémagglutinine, la concanavalin A et/ou au lipopolysaccharides. L’immunomodulation des CSN peut également être évaluée par la capacité des CSN à inhiber la prolifération, la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires et/ou la différenciation des lymphocytes T, NK, Lymphocytes B, des monocytes et/ou macrophages. Ainsi, le potentiel immunomodulateur des CSN peut également être déterminé par la capacité des CSN à inhiber la prolifération des lymphocytes in vitro. Pour cela des cellules mononuclées sanguines (PBMCs) préalablement incubées avec un colorant fluorescent, sont co-cultivées avec les CSN en proportion CSN/ PBMC 1 :10 en présence d’un agent mitogène comme la concanavalin A. Après 4 jours de culture à 37°C, les cellules non adhérentes sont récupérées et marquées par un anticorps anti-CD3 (spécifique des lymphocytes T) couplé à un fluorochrome, puis analysées en cytométrie en flux pour évaluer le signal du colorant fluorescent au sein de la population CD3 positive. La comparaison du marquage avec celui réalisé dans un contrôle correspondant aux PBMCs cultivées en présence d’agent mitogène mais sans CSN (PBMC-ctrl), permet de définir un indice de prolifération de la population lymphocytaire. Avec un ratio (CSN+ PBMC 1:10) / (PBMC-ctrl) inférieur ou égal à 0.5, les CSN sont considérées comme exerçant une activité antiproliférative significative (Figure 7 et Figure 8D). La population de CSN peut également être caractérisée en ce qu’au moins 80% des cellules de ladite population de CSN ne présentent pas de potentiel de différenciation ostéogénique. On parle également de faible potentiel de différenciation ostéogénique ou de faible potentiel d’ostéogenèse. Cette absence de potentiel de différenciation ostéogénique ou ce faible potentiel de différenciation ostéogénique peut être évalué par l’étude protéique et/ou transcriptionnelle des marqueurs spécifiques de l’os (ALPL, RUNX2…) ou par analyse des dépôts calciques après induction de l’ostéogenèse sous 7 à 15 jours. Cette induction ostéogénique peut être réalisée par culture des CSN en monocouche en présence d’un milieu de différenciation ostéogénique contenant un corticostéroïde, tel que le déxaméthasone (0.1-1 µM), un agent réducteur tel que l’acide ascorbique 2-phosphate (entre 0 et 200 µg/ml) et du β-glycérophosphate (0-50 mM). La BMP-2 peut par exemple remplacer la dexaméthasone. A l’issue du processus de différenciation, la présence de dépôts calciques dans la boite de culture est mise en évidence par coloration avec une solution de rouge Alizarine 1% (poids/volume) sous microscope. L’absence de dépôts révèle l’absence de potentiel de différenciation ostéogénique tandis que la présence de dépôts calciques colorés par un rouge intense montre la présence d’une différenciation ostéogénique. Alternativement ou en complément, une étude protéique et/ou transcriptionnelle des marqueurs spécifiques de l’os (ALPL, RUNX2) est réalisée. Cette caractéristique permet ainsi aux CSN d’être utilisées en thérapie cellulaire. En particulier, il s’agit de thérapie cellulaire pour le traitement d’arthropathie, dans la mesure où ces dernières limitent la génération de tissu ectopique calcifié au sein de l’articulation. Cette propriété est particulièrement importante pour les applications telles que l’arthrose, avec ou sans atteinte tissulaire. Selon un premier aspect la présente invention porte sur un procédé de congélation et de conservation d’une composition comprenant une population de CSN et un cryoprotecteur, caractérisé en ce que : 1) ladite composition est congelée à une température comprise entre -70°C et -140°C, en particulier entre -70°C et -100°C, plus particulièrement à -80°C ; puis 2) ladite composition est conservée entre -10°C et -40°C, en particulier entre -10°C et -35°C, plus particulièrement entre -15°C et -30°C, encore plus particulièrement entre -17°C et -20°C, encore plus particulièrement à -18°C. Les inventeurs ont découvert de manière surprenante qu’un tel procédé permettait de garantir une viabilité cellulaire et une activité métabolique acceptable ainsi qu’une activité immunomodulatrice des CSN, lorsqu’elles sont conservées à une température entre -10°C et -40°C. L’activité immunomodulatrice des CSN peut par exemple être appréciée au travers de leur activité immunosuppressive, en particulier de leur capacité à inhiber la prolifération des lymphocytes in vitro. En particulier, l’étape 1 est réalisée par exemple par une descente en température jusqu’à une température comprise entre -70°C et -140°C, en particulier entre -70°C et -100°C, plus particulièrement jusqu’à -80°C, à raison de -1°C/minute. Dans un mode de réalisation particulier, l’étape 1 est d’au moins 2h. Dans un mode plus particulier, les cellules sont conservées à une température comprise entre -70°C et -140°C, en particulier entre -70°C et -100°C, plus particulièrement à-80°C, à l’étape 1 entre 2 h et 36 mois, plus particulièrement entre 2 h et 24 mois. Optionnellement, une étape de stockage intermédiaire de la composition à une température inférieure à -70°C, en particulier entre -70°C et -196°C, entre l’étape 1 et l’étape 2, peut être effectué. En particulier, ce stockage intermédiaire est 1 jour à 24 mois, en particulier de 1 jour à 24 mois, par exemple de 2 semaines à 3 mois. L’étape 2, appelée étape de stockage, correspond à la conservation de la composition comprenant les CSN et un cryoprotecteur, à une température entre -10°C et -40°C, en particulier entre -10°C et -35°C, plus particulièrement entre -15°C et -30°C, encore plus particulièrement entre -17°C et -20°C, encore plus particulièrement à -18°C. Dans un mode de réalisation particulier, la conservation de la composition à l’étape 2 est de 1 jour à 5 mois, en particulier de 1 jour à 4 mois, plus particulièrement de 1 jour à 3 mois. Dans un mode de réalisation particulier, la conservation de la composition à l’étape 2 est d’au moins 21 jours, en particulier entre 21 jours et 5 mois, plus particulièrement entre 21 jours et 3 mois. A noter que ladite composition peut être conditionnée en doses unitaires afin de constituer des solutions injectables prêtes à l’emploi. Le nombre de CSN dans ces doses unitaires est défini plus loin dans la demande. Par « cryoprotecteur », on entend tous composés permettant d’assurer la fonction de cryoconservation ou de congélation. Un cryoprotecteur adéquat selon l’invention est capable de garantir l’intégrité et la formulation de la composition. Par « intégrité de la formulation de la composition pharmaceutique », on entend que les caractéristiques structurelles des CSN, les caractéristiques biologiques des CSN et la teneur en CSN de la composition pharmaceutique, ne sont pas perdues ou drastiquement modifiées. Plus particulièrement, les paramètres cités précédemment concernent la capacité d’adhésion des CSN, la capacité de prolifération des CSN, l’expression des marqueurs phénotypiques précédemment cités, la capacité de différenciation des CSN, la capacité d’immunomodulation des CSN, la concentration cellulaire de la composition pharmaceutique et/ou la viabilité cellulaire. Plus particulièrement, sont concernés, la capacité d’immunomodulation des CSN et plus largement de la composition pharmaceutique. Est considérée comme non drastiquement modifiée, une composition pharmaceutique dont 50% à 99% de CSN initialement utilisées pour la formulation de la composition, sont capables d’adhérer au plastique et de proliférer, plus particulièrement 70 à 99%, plus particulièrement 80% à 99%. Est considérée comme non drastiquement modifiées une composition pharmaceutique dont la concentration de CSN représente 50% à 99% de la concentration de CSN initiale utilisée pour la formulation de la composition, plus particulièrement 70 à 99%, plus particulièrement 80% à 99%. Est considérée comme non drastiquement modifiées une composition pharmaceutique dont la teneur en CSN viables est supérieure à 50% des cellules viables initialement présentes dans la composition pharmaceutique, plus particulièrement supérieure à 70% plus particulièrement supérieure à 80%. Est considérée comme non drastiquement modifiées une composition pharmaceutique dont les CSN expriment les marqueurs normalement exprimés par des CSN à des pourcentages d’expressions supérieurs 60%, plus particulièrement 70%, plis particulièrement 80% parmi la population totale de CSN. Est considérée comme non drastiquement modifiées une composition pharmaceutique comportant des CSN concevant une activité d’inhibition sur la prolifération des PBMC tels que décrite dans ladite invention, et ce pour un rapport en nombre de une CSN pour 10 PBMC. Cette activité d’inhibition se matérialise par une diminution supérieure à 20% de l’activité de prolifération des PBMC stimulés par un agent mitogène, plus particulièrement supérieure à 30%, plus particulièrement supérieure à 50%. Selon un mode de réalisation, ledit cryoprotecteur est choisi parmi le diméthylsulfoxyde (DMSO), le glycérol, le propylène glycol, les protéoglycanes, le tréhalose, la « Bovine serum albumin » (BSA), l’Albumine de synthèse ou d’extraction, du plasma plus ou moins enrichi en plaquettes ou contenu plaquettaire, la gélatine, du polyéthylène glycol (PEG), du polyacrylic-acide, du poly-L-lysine, de l’éthylène glycol ou une combinaison de plusieurs de ces cryoprotecteurs. Selon un mode de réalisation, ledit cryoprotecteur est choisi parmi le diméthylsulfoxyde (DMSO), le glycérol, le propylène glycol, les protéoglycanes, le tréhalose, la gélatine, du polyéthylène glycol (PEG), du polyacrylic-acide, du poly-L-lysine, de l’éthylène glycol ou une combinaison de plusieurs de ces cryoprotecteurs. Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition comprend entre de 0,5 à 30 %, en particulier de 0,5 à 20%, en particulier de 2 à 10%, plus particulièrement 5% de cryoprotecteur. Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition comprend du DMSO en tant que cryoprotecteur. Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition comprend de 0,5 à 30 % de DMSO, plus particulièrement de 2 à 10% de DMSO, encore plus particulièrement 5% de DMSO. Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition comprend du glycérol en tant que cryoprotecteur. Plus particulièrement, ladite composition comprend de 2 à 20% de glycérol. Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition comprend du propylène glycol ou de la poly-L-lysine en tant que cryoprotecteur. Des solutions commerciales comprenant un cryoprotecteur peuvent également être utilisées dans ladite composition, telles que des solutions STEMALPHA.CRYO3 (StemAlpha, France), CryoStor® CS2, CS5 ou CS10 (STEMCELL Technologies, France). Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition peut en outre comprendre entre 1 et 20% de sérum de veau fœtal (SVF), plus particulièrement entre 5 et 20%, encore plus particulièrement 10%. Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition comprend en outre du D-PBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline), du DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), ou du MEM (Minimum Essential Media). Dans un mode de réalisation particulier, la composition peut en outre comprendre du DMEM comprenant du SVF, en particulier de 5 à 20% de SVF et plus particulièrement 10%. Dans un mode de réalisation particulier, la composition peut en outre comprendre un ou plusieurs adjuvants comme du chlorure d’ammonium, de lactate de Ringer ou du BSA. Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition est exempte de produit d’origine animale. Selon un mode de réalisation, la population de CSN de la composition provient d’un échantillon tissulaire néonatal, en particulier d’un ou plusieurs placentas et/ou d’un ou plusieurs cordons ombilicaux, et/ou d’une ou plusieurs membranes amniotiques, ou d’un échantillon de fluide néonatal, en particulier le sang d’un ou plusieurs cordons ombilicaux, ou le liquide amniotique d’un ou plusieurs fluides amniotiques. L’avantage des tissus néonataux permet de disposer d’un grand nombre de CSN à partir d’un échantillon et de fournir certaines caractéristiques structurales. Pour cela, les annexes extra embryonnaires (placenta, cordon ombilical, membrane amniotique) sont généralement prélevées de manière aseptique lors de césariennes ou de mises bas par voie naturelle chez des femelles gestantes, de préférence à terme. Par exemple, dès que le nouveau-né est sorti du sac amniotique et mis en sécurité, le tissu extra embryonnaire est immédiatement transféré dans une boite de transport contenant par exemple une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco pour être acheminé en laboratoire. Le sang de cordon ombilical peut être quant à lui récupéré par ponction au niveau de la veine ombilicale, en particulier à l’aide d’une aiguille connectée à une poche de prélèvement sanguin ou un tube ou tout autre contenant. Dans un autre exemple, le liquide amniotique peut être récupéré par ponction au travers de la membrane amniotique, en particulier à l’aide d’une aiguille connectée à une poche de prélèvement sanguin ou un tube ou tout autre contenant. Dans un mode de réalisation particulier ladite composition comprend une population de CSN placentaires. Dans un mode de réalisation particulier, la population de CSN de la composition provient de tissus ou de fluides néonataux de mammifère, et en particulier du chien, du chat, du cheval ou de l’Homme. Dans un mode de réalisation plus particulier, les tissus ou les fluides néonataux proviennent du chien, cheval ou du chat. Dans un mode de réalisation encore plus particulier, la population de CSN de la composition est une population de CSN placentaires de chien. Dans un mode de réalisation particulier, la population de CSN de la composition comprend des CSN de phénotype CMH-I faible (CMH-I L ) et de phénotype CD90 fort (CD90 H ). En particulier, ladite population de CSN de la composition est caractérisée en ce qu’au moins 80% en nombre, en particulier au moins 85 %, plus particulièrement au moins 90% des cellules de ladite population sont CMH-I L et caractérisée en ce que au moins 80% en nombre, en particulier au moins de 85 %, plus particulièrement au moins 90% des cellules de ladite population sont CD90 H . Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition comprend une population de CSN de phénotype CMH-I L / CD90 H . Le CMH-I correspond au complexe majeur d’histocompatibilité de classe 1, exprimé de façon quasi ubiquitaire au sein de l’organisme. Le CMH-I également appelé HLA-I (« human leukocyte antigen class I ») chez l’homme, est issu de l’expression d’une famille de gènes appelés gènes HLA. Parmi ces gènes nous pouvons citer le HLA-A, le HLA-B et le HLA-C qui codent pour les formes classiques de HLA-I. Chez le chien, le CMH est également appelé DLA (Dog Leukocyte Antigen), chez le cheval, on parle de ELA (Equine Leukocyte Antigen), et chez le chat, on parle de FLA (Feline Leukocyte Antigen). Le CD90 correspond à la protéine membranaire « Thy-1 Cell Surface Antigen » et est exprimé par une large majorité des cellules du stroma. Par « phénotype CMH-I L », on entend que les CSN ont une très faible expression, ou une absence d’expression de CMH-I. Par « phénotype CD90 H », on entend que les CSN ont une expression forte de l’antigène de surface CD90. A l’inverse, par « phénotype CMH-I H », on entend que les CSN ont une très forte expression. Par « phénotype CD90 L », on entend que les CSN ont une expression faible de l’antigène de surface CD90. Les inventeurs ont identifié de manière inattendue que le phénotype CMH-I L /CD90 H des CSN était lié à la capacité de prolifération des cellules, permettant à celles-ci de doubler un plus grand nombre de fois in vitro que les CSN de phénotype CMH-I H /CD90 L . Les CSN de phénotype CMH-I L /CD90 H présente également une bonne capacité d’immunomodulation. En particulier, ladite population de CSN de la composition est caractérisée en ce que moins de 20% en nombre, en particulier moins 15 %, plus particulièrement moins 10% des cellules de ladite population sont CMH-I H et caractérisée en ce que au moins 20% en nombre, en particulier au moins de 15 %, plus particulièrement au moins 10% des cellules de ladite population sont CD90 L . Dans un mode de réalisation particulier, la population de CSN de la composition est exempte de CSN de phénotype CMH-I fort (CMH-I H ) et de phénotype CD90 faible (CD90 L ). La présente invention porte également sur une composition ou une solution injectable prête à l’emploi comprenant une population de cellules stromales néonatales (CSN), et un cryoprotecteur obtenue par le procédé de congélation et de conservation des CSN décrit ci-dessus, conservées entre -10°C et -40°C, en particulier entre -10°C et -35°C, plus particulièrement entre -15°C et -30°C, encore plus particulièrement entre -17°C et -20°C, encore plus particulièrement à -18°C. En particulier, cette composition ou solution injectable est conservée à ces températures pendant au moins 21 jours, plus particulièrement entre 21 jours et 5 mois, typiquement entre 21 jours et 3 mois. La présente invention porte également sur une composition ou une solution injectable prête à l’emploi comprenant une population de cellules stromales néonatales (CSN), et un cryoprotecteur caractérisée en ce qu’elle est conservée entre -10°C et -40°C, en particulier entre -10°C et -35°C, plus particulièrement entre -15°C et -30°C, encore plus particulièrement entre -17°C et -20°C, encore plus particulièrement à -18°C. En particulier, cette composition ou solution injectable est conservée à ces températures pendant au moins 21 jours, plus particulièrement entre 21 jours et 5 mois, typiquement entre 21 jours et 3 mois. Par « prête à l’emploi », on entend que la composition ou solution injectable comprenant une population de CSN est prête à être injectée à l’individu avec ou sans étape de transfert dans un dispositif d’administration (poche, soluté, seringue). La remise en culture des cellules avant utilisation chez l’individu n’est pas nécessaire et les cellules n’ont pas besoin d’être lavées ou remises en suspension dans un milieu physiologique, et ceci même lorsqu’elles sont formulées avec un cryoprotecteur comme décrit ci-dessous. L’expression « prête à l’emploi » signifie que seule une étape de décongélation est nécessaire lorsque la composition ou solution injectable est sous forme congelée, avant une injection chez le sujet. Cette composition pharmaceutique ou solution injectable pouvant être congelée, elle est ainsi mobilisable à tous moments. Cette dernière a l’avantage de rendre disponible dans les plus brefs délais le traitement tout en limitant l’intervention humaine nécessaire à son efficacité et en limitant le risque de contamination inhérent à chaque manipulation par un opérateur. Ainsi, il est possible de séparer le procédé d’obtention de la composition pharmaceutique de son utilisation clinique finale. Le cryoprotecteur peut être un cryoprotecteur tel que défini précédemment. De même, les quantités de cryoprotecteur dans la composition sont telles que décrites ci-dessus. Dans un mode de réalisation particulier, le cryoprotecteur est du DMSO. Selon un mode de réalisation, la population de CSN de la composition ou de la solution injectable prête à l’emploi provient d’un échantillon tissulaire néonatal, en particulier d’un ou plusieurs placentas et/ou d’un ou plusieurs cordons ombilicaux, et/ou d’une ou plusieurs membranes amniotiques, ou d’un échantillon de fluide néonatal, en particulier le sang d’un ou plusieurs cordons ombilicaux, ou le liquide amniotique d’un ou plusieurs fluides amniotiques. Dans un mode de réalisation particulier, les CSN sont des CSN placentaires. Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition ou solution injectable prête à l’emploi comprend une population de CSN, et un cryoprotecteur caractérisée en ce qu’elle est conservée entre -10°C et -40°C, en particulier entre -10°C et -35°C, plus particulièrement entre -15°C et -30°C, encore plus particulièrement entre -17°C et -20°C, encore plus particulièrement à -18°C, et en ce que lesdites CSN sont des CSN placentaires. Dans un mode de réalisation particulier, la population de CSN de la composition ou de la solution injectable prête à l’emploi provient de tissus ou de fluides néonataux de mammifère, et en particulier du chien, du chat, du cheval ou de l’Homme. Dans un mode de réalisation plus particulier, les tissus ou les fluides néonataux proviennent du chien, cheval ou du chat. Dans un mode de réalisation encore plus particulier, la population de CSN de la composition ou de la solution injectable prête à l’emploi est une population de CSN placentaires de chien. Dans un mode de réalisation particulier, la population de CSN de la composition ou de la solution injectable prête à l’emploi comprend des CSN de phénotype CMH-I faible (CMH-I L ) et de phénotype CD90 fort (CD90 H ). En particulier, ladite population de CSN de la composition ou de la solution injectable est caractérisée en ce qu’au moins 80% en nombre, en particulier au moins 85 %, plus particulièrement au moins 90% des cellules de ladite population sont CMH-I L et caractérisée en ce que au moins 80% en nombre, en particulier au moins de 85 %, plus particulièrement au moins 90% des cellules de ladite population sont CD90 H . Les cellules de phénotype CMH-I L / CD90 H peuvent être sélectionnées en cytométrie en flux par un marquage simultané (également dit double-marquage ou co-marquage immunophénotypique) du CMH-I et du CD90 au sein d’une même population de CSN. Ce double-marquage peut être réalisé en utilisant : - pour le marquage du CMH-I, un anticorps primaire de souris anti-CMH-I IgG2a, tel que l’anticorps primaire anti-CMH-I DG-BOV2001/DG-H58A IgG2a (Monoclonal Antibody Center Washington State University), révélé avec un anticorps secondaire de chèvre F(ab')2 anti-IgG secondaire de souris couplé à l’allophycocyanine (APC), et - pour le marquage du CD90, un anticorps monoclonal anti-CD90 couplé au phycoérythrine (PE), tel que l’anticorps monoclonal de rat anti-CD90/Thy1 Antibody YKIX337.217 (PE). Après marquage, la fluorescence des fluorochromes APC et PE est analysée. Afin de discerner les sous populations de CSN, une représentation 2D de la fluorescence APC et PE est réalisée. Les résultats sont comparés à ceux obtenus avec l’utilisation des isotypes couplés aux fluorochromes respectifs décrits précédemment. Une population ou sous population de CSN est qualifiée CMH-I L /CD90 H si le ratio des moyennes de d’intensité de fluorescence (MFI) entre le CMH-I et son isotype contrôle (également appelé MFI relative ou rMFI) est inférieur à un seuil de 20, plus particulièrement 15, plus particulièrement 10 et si le rMFI entre le marqueur CD90 et son isotype contrôle est supérieur à 15, plus particulièrement 20. Au contraire, une population ou sous population de CSN est qualifiée CMH-I H /CD90 L si le ratio des moyennes de d’intensité de fluorescence (MFI) entre le CMH-I et son isotype contrôle est supérieur à 20, plus particulièrement 15, plus particulièrement 10 et si le rMFI entre le marqueur CD90 et son isotype contrôle est inférieur à 15, plus particulièrement 20. Avec le double-marquage, la présence de différents profils de sous-population de CSN au regard de l’expression des marqueurs CMH-I/CD90 (CMH-I L , CMH-I H et CD90 H , CD90 L ) est mise en évidence, au sein d’une même population cellulaire provenant d’un même échantillon (Figure 12 et Figure 13). En particulier, la sélection par double marquage est réalisée après une étape d’amplification comprenant au moins 3 passages cellulaires successifs. De manière alternative, les cellules de phénotype CMH-I H / CD90 L peuvent être exclues par sélection négative c’est-à-dire en ne sélectionnant pas en cytométrie en flux, telle que décrite ci-dessus, les populations comprenant au moins 20% en nombre, en particulier au moins 15 %, plus particulièrement au moins 10% de cellules CMH-I H /CD90 L .Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention, ladite population de CSN de la composition ou de la solution injectable prête à l’emploi est caractérisée en ce qu’au moins 80% en nombre, en particulier au moins 85 %, plus particulièrement au moins 90% des cellules de ladite population sont CMH-I L et caractérisée en ce que au moins 80% en nombre, en particulier au moins de 85 %, plus particulièrement au moins 90% des cellules de ladite population sont CD90 H . Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention, ladite population de CSN de la composition ou de la solution injectable prête à l’emploi est caractérisée en ce que moins de 20% en nombre, en particulier moins 15 %, plus particulièrement moins 10% des cellules de ladite population sont CMH-I H et caractérisée en ce que au moins 20% en nombre, en particulier au moins de 15 %, plus particulièrement au moins 10% des cellules de ladite population sont CD90 L . Dans un mode de réalisation particulier, la population de CSN de la composition ou de la solution injectable prête à l’emploi est exempte de CSN de phénotype CMH-I fort (CMH-I H ) et de phénotype CD90 faible (CD90 L ). Typiquement, la composition pharmaceutique ou la solution injectable comporte une population de CSN de 1.10 6 à 1.10 8 cellules dans un volume de 0.1 ml à 15 ml, soit une concentration de 5.10 4 à 1.10 9 cellules/ml. En particulier, elle comprend de 1.10 6 à 5.10 7 cellules dans un volume de 0.1 ml à 15 ml, soit une concentration de 7.10 4 à 5.10 7 cellules/ml. En particulier, elle comprend de 2,5.10 6 à 1.10 7 cellules pour un volume de 0.1 ml à 15 ml de composition, soit une concentration de 1,5.10 5 et 1.10 8 cellules/ml. En particulier, elle comprend de 1.10 6 à 1.10 7 cellules dans 0.5 à 2 ml, soit une concentration de 5.10 5 à 2.10 7 cellules/ml. Typiquement, ladite composition ou solution injectable comprend entre 1.10 6 et 1.10 8 cellules, en particulier 1.10 7 cellules. Un autre aspect de la présente divulgation porte sur une composition ou une solution injectable telle que définie précédemment pour son utilisation thérapeutique . Typiquement, il s’agit d’une utilisation en thérapie cellulaire. Par « thérapie cellulaire », on entend un traitement thérapeutique comprenant l’administration de cellules susceptibles d’induire un effet thérapeutique bénéfique chez l’individu. Dans le cadre d’une approche de médecine régénérative, cette thérapie cellulaire est susceptible de favoriser directement (différenciation cellulaire) ou indirectement (sécrétion de facteurs biologiques, activation ou inhibition de cellules de l’environnement) la régénération in vivo d’un ou plusieurs tissus biologiques chez un individu en attente d’un tel traitement. De manière alternative, les cellules, en particulier CSN faisant l’objet de l’administration peuvent ou non avoir subi une modification de type génétique par le biais d’outils de recombinaison homologues ou de recombinaisons par nucléases programmables comme les systèmes CRISPR-Cas9 (« Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats »). En particulier, il s’agit d’une utilisation chez un même individu, ou chez un individu de la même espèce, ou chez un individu d’une espèce différente par rapport à l’espèce de provenance desdites CSN. Lorsque le sujet receveur est identique à l’individu dont proviennent les CSN, on parle d’une utilisation thérapeutique autologue. Lorsque le sujet receveur est un individu de la même espèce que l’espèce de provenance des CSN, on parle d’une utilisation thérapeutique hétérologue ou allogénique. Lorsque le sujet receveur est un individu d’une espèce différente par rapport à l’espèce de provenance des CSN, on parle d’une utilisation thérapeutique xénogénique. Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention porte sur une composition ou une solution injectable telle que définie précédemment pour son utilisation thérapeutique xénogénique. Dans un mode de réalisation particulier, la présente divulgation concerne ladite composition pharmaceutique ou solution injectable telle que définie précédemment pour son utilisation thérapeutique chez un mammifère. En particulier, ledit mammifère est le chien, le chat, le cheval, ou l’Homme. A titre d’exemple, l’utilisation thérapeutique peut être le traitement : - des atteintes tissulaires ou ostéo-articulaires, avec ou sans composante inflammatoire ; - des maladies dégénératives, notamment l’arthrose, les tendinopathies, les fibroses tissulaires, Alzheimer, Parkinson ; - des maladies auto-immunes, inflammatoires et/ou infectieuses, notamment les dermatites atopiques, les gingivostomatites, la thrombocytopénie, l’epidermolyse bulleuse, sepsis, les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) ; - du rejet de greffe, ou - des maladies tumorales. Par atteintes tissulaires , on entend lésions, perte de fonction normale et/ou dégradations induites par une sollicitation trop importante du tissu, une sollicitation normale d’un tissu pathologique ou tous tissus nécessitant une reconstruction/cicatrisation tissulaire : infarctus du myocarde, atteintes rénales, atteintes hépatiques, brulure, lésions cutanées, fractures, atteintes respiratoires, atteintes ostéo-articulaires telles que l’ostéochondrite disséquante. Par maladie dégénérative, on entend tous types de maladies où la balance homéostasique est dérégulée en faveur d’un catabolisme tissulaire exacerbé ou une induction trop importante de l’anabolisme tissulaire, comme par exemple : l’arthrose, les tendinopathies, les fibroses tissulaires, Alzheimer, Parkinson. La composition ou la solution injectable définies précédemment peuvent également être utilisées dans le traitement de maladies ou de dérèglements physiologiques liés à une réponse immunitaire non désirée, c’est-à-dire tous types de maladies où le système immunitaire interfère avec le fonctionnement normal/physiologique du tissu ou avec un traitement visant à traiter une maladie immunitaire et/ou résorber le fonctionnement normal/physiologique d’un tissu, comme par exemple les dermatites atopiques, les gingivostomatites. Elles peuvent être utilisées dans le traitement de maladies auto-immunes et inflammatoires telles que la réaction du greffon contre l’hôte (graft versus host disease ou GvHD), greffe tissulaire ou d’organe, maladies auto immunes comme la sclérose en plaques, inflammation tissulaire, allergie, asthme, bronchites allergiques, bronchites chroniques telles que la bronchopathie pulmonaire chronique obstructive (BPCO), maladie inflammatoire chronique des intestins, insuffisance rénale, thrombocytopénie, lupus érythémateux, polyarthrite rhumatoïde, l’epidermolyse bulleuse. Par « maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) », on entend les inflammations chroniques des muqueuses de l'intestin grêle, du colon et de la région ano-périnéale idiopathiques, telles que l’entérite duodénale chez le chien et le chat, et plus particulièrement les inflammations telles que la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique chez l’homme. Ces affections sont caractérisées par des troubles gastro-intestinaux et chroniques associés à une infiltration inflammatoire de la muqueuse. Elles sont diagnostiquées le plus souvent lors de vomissements et de diarrhée chronique chez l’animal et chez l’homme. Les MICI sont distinctes des entéropathies répondant à un changement alimentaire et des diarrhées répondant aux antibiotiques. Par définition, elles répondent aux agents immunosuppresseurs et non à une alimentation spécifique ou à des antibiotiques. Les signes cliniques tels que les vomissements, la diarrhée, la perte de poids, une perte d’appétit sont dus aux infiltrats cellulaires de la muqueuse, aux médiateurs de l’inflammation, à un dysfonctionnement des entérocytes associé à l’inflammation et à un trouble de la motilité de l’intestin. La composition ou la solution injectable définies précédemment peuvent également être utilisées dans le traitement de maladies dans lesquelles une inflammation chronique liée ou non à un dérèglement immunitaire entraine une dégénérescence tissulaire ou un dysfonctionnement de la fonction d’un organe ou d’un tissu telles que l’arthrose, les tendinites. D’autre part, la composition ou la solution injectable définies précédemment peuvent être utilisées dans le traitement de maladies infectieuses associées ou non aux composantes précédentes. Par maladies infectieuse nous entendons les maladies impliquant une contamination par des pathogènes tels que les micro-organismes comme les protozoaires, les bactéries, et/ou les virus. Ces maladies à composante infectieuse peuvent être de nature localisée ou systémique. L’utilisation des CSN peut notamment être prescrite dans le cadre particulier de résistance aux antibiotiques des pathogènes impliqués et dans le cadre d’une réponse inflammatoire généralisée associée à une infection grave, comme le sepsis. Le cadre thérapeutique peut s’étendre à des maladies ayant plusieurs versants pathologiques telles que l’arthrose avec un versant dégénératif et un versant inflammatoire. La composition ou la solution injectable définies précédemment peuvent aussi être utilisées dans le traitement de maladies de nature tumorale avec ou non une composante métastasique. Le cadre thérapeutique peut également s’étendre à l’utilisation des CSN de façon combinée avec d’autres types de thérapies comme par exemple : laser ; ondes de choc ; plasma riche en plaquettes (PRP) ; acide hyaluronique ; anti inflammatoire non stéroïdiens. Dans un mode de réalisation particulier, la présente divulgation concerne la composition ou la solution injectable définie précédemment pour son utilisation en ingénierie tissulaire. Par « ingénierie tissulaire », on entend l’ensemble des techniques de biotechnologie utilisant des cellules et des biomatériaux (d’origine biologique ou synthétique) pour générer des substituts tissulaires in vitro/ex vivo pour une implantation in vivo ou pour être utilisé comme modèle tissulaire en laboratoire (par exmple : reconstruction de la peau, osseuse ou cartilagineuse). Dans un mode de réalisation particulier, la présente divulgation concerne la composition ou la solution injectable définie précédemment pour son utilisation dans le traitement d’indications de l’appareil locomoteur telles que l’ arthrose chez le mammifère, plus particulièrement chez le chien, le chat ou le cheval, préférablement chez le chien. Dans un autre mode de réalisation particulier, la présente divulgation concerne la composition ou la solution injectable définie précédemment pour son utilisation dans le traitement de la thrombocytopénie chez le mammifère, plus particulièrement chez le chien, le chat ou le cheval, préférablement chez le chien. Dans un mode de réalisation particulier, la présente divulgation concerne la composition ou la solution injectable définies précédemment pour son utilisation dans le traitement de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, telles que l’entérite duodénale chez le mammifère, plus particulièrement chez le chien, le chat ou le cheval, préférablement chez le chien. Dans un mode de réalisation particulier, la présente divulgation concerne la composition ou la solution injectable définie précédemment pour son utilisation dans le traitement de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, telles que la maladie de Crohn chez l’homme. La composition ou la solution injectable telle que définie précédemment peut être administrée de façon topique externe, localement (i.e. par voie intra-articulaire, intra-musculaire, sous-cutanée ou intra-rachidienne) ou par voie intra-veineuse (IV), intra-artérielle ou de façon plus générale par voie parentérale. Typiquement, une administration locale peut être une administration par injection intra-articulaire, par exemple dans le cas du traitement d’indications de l’appareil locomoteur telles que l’arthrose, au niveau de chaque articulation à traiter. Par administration IV on entend une administration de la composition ou de la solution injectable directement dans le système veineux du sujet à l’aide d’un cathéter ou d’une aiguille ou par exemple via une poche de soluté de perfusion ou par exemple par la tubulure du perfuseur. Typiquement, une administration par voie intra-veineuse est réalisée dans le cas du traitement de la thrombocytopénie, de l’arthrose, ou du traitement d’une maladie inflammatoire chronique de l’intestin telle que l’entérite duodénale ou la maladie de Crohn. Dans un mode de réalisation particulier, une composition ou une solution injectable comprenant 1.10 6 à 1.10 8 CSN, en particulier 2,5.10 6 à 1.10 7 CSN, plus particulièrement 1.10 7 CSN, est administrée par voie intra-articulaire, au niveau de chaque articulation à traiter, pour le traitement d’indications de l’appareil locomoteur telles que l’arthrose. Dans un mode de réalisation particulier, une composition ou une solution injectable comprenant 1.10 6 à 10.10 8 CSN, en particulier 1.10 7 CSN, est administrée par voie intraveineuse pour le traitement de maladies inflammatoires à composante dysimmunitaire, telle que la thrombocytopénie. Dans un mode de réalisation particulier, 1.10 6 à 5.10 6 CSN/kg sont administrées par voie intraveineuse pour le traitement de maladies inflammatoires à composante dysimmunitaire, telle que la thrombocytopénie. Dans un mode de réalisation particulier, une composition ou une solution injectable comprenant 1.10 6 à 10.10 8 CSN, en particulier 1.10 7 CSN, est administrée par voie intraveineuse pour le traitement d’une maladie inflammatoire chronique de l’intestin. Le mode d’administration est évidemment adapté en fonction du sujet et de la pathologie à traiter. Le nombre exact de cellules à administrer dépend de différents facteurs, et notamment, l’âge, le poids, le sexe du sujet à traiter, la pathologie et l’étendue ou la sévérité de la pathologie à traiter. Dans un mode particulier, la composition ou la solution injectable peut être diluée ou combinée à un véhicule pharmaceutiquement acceptable avant une injection systémique par voie intra-veineuse (IV) ou de façon plus générale par voie parentérale comme par exemple un véhicule de type isotonique, le lactate de ringer associé ou non à de l’héparine ou le Chlorure de sodium 0,9 %. Dans un mode particulier, la composition ou la solution injectable peut être diluée ou combinée à une autre solution thérapeutique curative ou palliative connu par l’homme de l’art pour les mêmes indications thérapeutiques que celles concernées par la dite solution injectable. Par autre solution thérapeutique, on entend la combinaison avec l’administration d’un ou plusieurs traitements anti-inflammatoires, antalgiques, immunomodulateurs, anti-infectieux et/ou antiviral liés ou non à la stomatite. Dans un mode de réalisation particulier, la composition pharmaceutique ou la solution injectable telle que décrite précédemment est utilisée en combinaison avec un agent anti-inflammatoire. Cet agent anti-inflammatoire peut être un anti-inflammatoire de type stéroïdien ou non stéroïdien. En tant qu’anti-inflammatoire stéroïdien nous pouvons citer les glucocorticoïdes et corticostéroïdes. Comme anti-inflammatoire non stéroïdien nous pouvons citer la buprénorphine, l’aspirine, l’ibuprofène, le kétoprofène, l’acétate de méthylprednisolone. L’agent anti-inflammatoire peut également être une thérapie avec une action anti-inflammatoire, telle que la thérapie au laser. L’antalgique peut être à titre d’exemple les morphiniques et alpha2-agonistes. L’immunomodulateur peut être à titre d’exemple les cyclosporines et la rapamycine. Un anti-infectieux et/ou antiviral peuvent être à titre d’exemple les antibiotiques et interférons recombinants. La présente invention concerne également un procédé in vitro/ex vivo de fabrication et de conservation d’une composition comprenant une population de CSN à titre de principe actif et un cryoprotecteur, ledit procédé comprenant les étapes suivantes: a. la fourniture d’un ou plusieurs échantillons biologiques néonataux comprenant des CSN à partir d’un ou plusieurs individus, b. l’isolement de la population de CSN présentes dans le ou les échantillons biologiques, c. optionnellement, au moins une étape d’amplification ex vivo de la population de CSN obtenues à l’étape b., d. la formulation de la composition pharmaceutique à partir de de la population de CSN obtenues à l’étape b. ou c. et d’un cryoprotecteur, e. le conditionnement de la composition pharmaceutique en dose unitaire, f. la congélation à une température entre -70°C et -140°C de la composition pharmaceutique en doses unitaires obtenues à l’étape e., g. optionnellement, un stockage intermédiaire de la composition pharmaceutique à une température inférieure à -70°C, h. le stockage final de la composition pharmaceutique en doses unitaires entre -10°C et -40°C. Dans ce procédé, les échantillons biologiques néonataux à l’étape a) sont tels que définis précédemment dans la présente demande. Dans un mode de réalisation particulier, l’échantillon biologique néonatal est un placenta et la population de CSN est donc une population de CSN placentaires. Dans un mode de réalisation particulier, la population de CSN provient d’un échantillon biologique néonatal de mammifère, et plus particulièrement du chien, du chat, du cheval ou de l’Homme. Dans un mode de réalisation particulier, l’échantillon biologique néonatal est un échantillon provenant du chien. Par « isolement » à l’étape b), on entend l’opération consistant à extraire par un processus enzymatique et/ou mécanique, les cellules contenues dans un tissu et sa matrice extracellulaire. L’isolement des CSN est réalisé à partir d’un tissu néonatal, par exemple, par dissection et digestion enzymatique du tissu, puis par centrifugation et récupération du culot cellulaire contenant des CSN. Alternativement, il est réalisé à partir d’un échantillon de sang de cordon ombilical. Les cellules de sang peuvent alors être séparées sur un gradient de densité, en particulier en utilisant du Ficoll. L’anneau cellulaire formé à l’interphase entre le plasma dilué et le Ficoll est récupéré, et les cellules sont lavées et centrifugées, puis le culot cellulaire contenant des CSN est récupéré. Les cellules sont en général comptées et ensemencées à une densité comprise entre 10 5 et 5.10 5 cellules/cm2. Le nombre de cellules totales récupérées après centrifugation peut être compris par exemple entre 0,1.10 6 et 500.10 6 cellules, plus précisément chez le chien entre 0,1.10 6 et 10.10 6 , plus précisément chez le cheval 100.10 6 et 500.10 6 . Suite à l’isolement des cellules contenant une fraction de CSN, une étape d’amplification ex vivo des CSN peut être réalisée par adhésion au plastique. Afin d’obtenir des quantités plus importantes de CSN dans le but de réaliser différentes préparations pharmaceutiques, cette étape d’amplification des CSN peut être réalisée à différents étapes du procédé. Par « étape d’amplification », on entend toute étape permettant une prolifération des CSN sur support plastique ou polymère. Cette phase doit être capable de favoriser la présence des CSN au détriment d’autres types cellulaires ne répondant pas aux caractéristiques des CSN. Elle doit également assurer une prolifération optimale des cellules tout en limitant les phénomènes de dédifférenciation, de différenciation et/ou de sénescence. Cette étape implique des conditions en atmosphère contrôlée telles que l’homme de l’art est capable d’établir comme par exemple avec 90% d’humidité et comportant 5% de CO 2 . La température d’amplification doit être constante et comprise entre 35-40°C, plus précisément entre 37-39°C. Parmi les milieux de culture, de façon non exhaustive, il est possible de citer les milieux de type Alpha-MEM, DMEM, RPMI, IMDM, Opti-MEM, EGM, EGM-2, milieux synthétiques adaptés à la culture de CSM dépourvus d’endotoxine et/ou de sérum, milieux synthétiques adaptés aux bonnes pratiques de fabrication, complémentés ou non avec du sérum de veau fœtal (SVF) de 0,1% à 20%, du lysat plaquettaire, de l’insuline-transferine-sélénium, des compléments commerciaux définis et/ou autres facteurs de croissance et/ou molécules favorisant la prolifération des CSN tout en limitant leur sénescence comme le FGF, EGF, VEGF, dexamethasone et/ou A2P. Cette phase d’amplification peut être réalisée sur différents supports une fois que la population de CSN est obtenue suite à l’étape d’isolement. Ces différents supports peuvent être de nature 2D ou 3D. Par amplification sur support 2D, on entend toutes méthodes de culture cellulaire permettant une amplification des CSN sur support monocouche et correctement mis au point par l’homme de l’art. Dans des modes de réalisation particuliers les cellules peuvent être cultivées dans des boites de cultures en plastique traitées ou non pour favoriser l’adhésion cellulaire, de type flasque, à un ou plusieurs étages et/ou de type multicouches avec ou sans perfusion continue, avec ou sans optimisation du flux d’air. Le support 2D peut s’apparenter à une culture monocouche sur support non plans ou courbe comme un support cylindrique de type « Roller Bottles » (Corning, Etats-Unis). Par amplification sur support 3D, on entend toutes techniques connues par l’homme de l’art utilisant des biomatériaux, membranes artificielles poreuses, microporteurs et/ou polymères capables d’assurer une amplification des CSN en bioréacteur et correctement mise au point par l’homme de l’art. Dans des modes de réalisation particuliers, les CSN peuvent être amplifiés en bioréacteurs sous agitation, axiales et/ou pendulaire, sous agitation à vagues, sous agitation à lit tournant, en bioréacteurs statiques et/ou perfusés. Les biomatériaux et/ou microporteurs peuvent être de plusieurs natures et selon des modes de réalisation particuliers peuvent être de tailles comprises entre 100-500 µm de diamètre, ont une porosité de différente nature, présentent une surface traitée, chargée ou non négativement ou positivement, comportent des facteurs de croissance ou protéines recombinantes de type intégrines et/ou matrice extracellulaire ou toutes autres molécules biologiques/chimique favorisant l’adhésion cellulaires et/ou la prolifération cellulaire. Les CSN étant des cellules adhérentes, afin d’assurer l’étape d’amplification, un passage cellulaire des CSN peut être nécessaire et réalisé par une méthode correctement mise au point par l’homme de l’art. Un passage cellulaire (P) correspond au détachement des cellules de leur support lorsqu’elles arrivent à confluence (tapis cellulaire), pour les remettre en culture sur un nouveau support. Typiquement, le détachement des cellules peut être réalisé sous l’effet d’action mécanique, d’enzymes et/ou inhibiteurs comme, de façon non exhaustive, la trypsine, EDTA et/ou accutase recombinantes ou animales. Il est également possible de réaliser ces passages cellulaires par l’utilisation de biomatériaux/microporteurs dissolvables selon un procédé mis au point par l’Homme de l’art. Dans le cadre d’une culture en bioreacteur et de manière alternative, la phase d’amplification peut faire l’objet d’une augmentation progressive de support de culture (comme des microporteurs), de nutriments/milieux de culture et/ou de facteurs de croissance. Ce principe de « fed batch » permet d’optimiser la production de biomasse au sein même d’une phase d’amplification. Dans un mode de réalisation particulier, pour la phase d’amplification, les cellules sont par exemple traitées avec de la trypsine-EDTA, puis reprises dans un milieu d’amplification et centrifugées. Après reprise dans du milieu d’amplification, elles sont remises en culture à hauteur de 1500 à 5000 cellules/cm 2 ou équivalent 3D dans du milieu d’amplification avec ou sans suivi monitoré du microenvironnement et/ou atmosphère de culture. Dans un mode de réalisation particulier, l’étape d’amplification peut comprendre plusieurs passages cellulaires. Pendant cette étape d’amplification, les CSN se multiplient par doublement cellulaire. Ainsi, l’étape d’amplification peut également être définie en termes de doublement cellulaire. Dans un mode de réalisation particulier, ledit procédé comprend une étape d’amplification dans laquelle la population de CSN selon l’invention subi 2 à 25 doublements cellulaires, plus particulièrement 5 à 15 doublements cellulaires. De manière optionnelle, après l’étape b. d’isolement ou l’étape c. d’amplification, la population de CSN peut être soumise à une étape de cryoconservation à -70°C ou -196°C. Cela correspond à la création d’une masterbank de CSN. Par « cryoconservation », on entend l’étape de stockage des cellules congelées pour une durée allant de 1 jour à 5 ans et plus. La banque de cellules est conditionnée de façon à garantir l’intégrité et les propriétés biologiques des populations cellulaires. Dans un mode de réalisation particulier, cette étape de cryoconservation correspond à une descente progressive de la température de la suspension cellulaire (-1°C / minutes) pour atteindre la température allant de -70°C à -196°C. Dans un mode de réalisation alternatif, les cellules peuvent être cryoconservées à une vitesse de congélation comprise entre -0,3°C / minutes et -99°C / minutes. Un même protocole de congélation peut comprendre une ou plusieurs vitesses de congélation différentes comme dans le cas d’une montée graduelle de vitesse de congélation. Dans un mode de réalisation alternatif, les cellules sont directement congelées sans contrôle de température dans une enceinte de stockage dont la température est comprise entre -70°C et 196°C. Le stockage final peut être en phase liquide (de type azote liquide), phase gazeuse (de type azote en phase gazeuse) ou en condition de température contrôlé (de type enceinte -140°C, -100°C, -80°C). Cette étape n’affecte ni la viabilité des cellules, ni leurs propriétés thérapeutiques. Ces cellules pourront ensuite être décongelées pour subir une étape d’amplification telle que décrite à l’étape c. et/ou être formulées selon l’étape e. Optionnellement, une stimulation par effecteur physique, biologique et/ou chimique de la population de CSN obtenues à l’étape b., c., ou après l’étape optionnelle de cryoconservation ci-dessus, peut être réalisées. La population de CSN est ensuite formulée à l’étape d. en composition pharmaceutique. Pour cela, les cellules sont centrifugées puis reprises dans une solution comprenant un cryoprotecteur tel que décrit précédemment dans la présente demande. En particulier, ladite composition comprend entre 0.5 et 30% de DMSO, plus particulièrement entre 2 et 10%, encore plus particulièrement 5%. Alternativement, les cellules sont reprises dans la solution Cryostor® CS5, solution commerciale comprenant 5% de DMSO, ou toute autre solution commerciale ou préformulée contenant 5% de DMSO. Dans un mode particulier, ladite composition est du milieu DMEM enrichi avec 5-50% du SVF (vol : vol) et comprenant 5-10% (vol : vol) de DMSO ou est un milieu de cryoconservation commercial contenant ou non une fraction de DMSO. La composition est ensuite conditionnée en doses unitaires prêtes à l’emploi. Les doses unitaires prêtes à l’emploi peuvent aussi être appelées solutions injectables prêtes à l’emploi. En particulier, la dose unitaire comprend de 1.10 6 à 1.10 8 CSN, en particulier 1.10 7 CSN. Plus particulièrement, la dose unitaire comprend de 1.10 6 à 1.10 8 CSN dans un volume de 0.1 ml à 15 ml de composition. En particulier, elle comprend de 1.10 6 à 5.10 7 CSN dans un volume de 0.1 ml à 15 ml de composition. En particulier, elle comprend de 2,5.10 6 à 1.10 7 CSN pour un volume de 0.1 ml à 15 ml de composition. En particulier, elle comprend de 1.10 6 à 1.10 7 cellules dans 0.5 à 2 ml de composition. La composition, sous forme de doses unitaires, est ensuite congelée à une température comprise entre -70°C et -140°C, en particulier entre -70°C et -100°C, plus particulièrement à -80°C. Cette étape de congélation est par exemple réalisée en condition de descente en température contrôlée à raison de -1°C/min jusqu’à une température finale comprise entre -70°C et -140°C, en utilisant par exemple un container CoolCell® Cell Freezing Containers (BioCision) ou un congélateur programmable de type Digitcool (Cryobiosystem) ou encore un congélateur cryogénique programmable de type FREEZAL (Biofluide). Dans un mode de réalisation particulier, les cellules sont conservées à une température comprise entre -70°C et -140°C, en particulier entre -70°C et -100°C, plus particulièrement à -80°C, pendant au moins 2h, en particulier entre 2 h et 36 mois, plus particulièrement entre 2 h et 24 mois. La composition comprenant la population de CSN ainsi congelée sous forme de doses unitaires, peut optionnellement être soumise à une étape f. de stockage intermédiaire, où elle est conservée à des températures inférieures à -70°C, en particulier entre -70°C et -196°C pendant plusieurs mois, en particulier au moins un jour, plus particulièrement entre 1 jour et 24 mois, encore plus particulièrement entre 1 jour et 12 mois. A l’issue de l’étape f. ou de l’étape g., la composition est soumise à une étape h. dite de « stockage final ». Par « stockage final », on entend un stockage pour une durée allant de 1 jour à 5 mois, plus particulièrement de 1 jour à 3 mois, plus particulièrement de 1 jour à 1 mois de la dose unitaire, dans des conditions de températures bases. En particulier, ce stockage final est d’au moins 21 jours, en particulier entre 21 jours et 5 mois. Par conditions de températures bases, on entend que la température de conservation pour le stockage finale est comprise entre -10°C et -40°C, plus particulièrement -10°C et -35°C, plus particulièrement -15°C et -30°C, encore plus particulièrement -17°C à -20°C, typiquement de -18°C. A l’issue du stockage final, la composition est décongelée, et peut être directement utilisée en thérapie cellulaire. Cette étape de décongélation est réalisée de façon à passer du stade de cellules congelées au stade de cellules décongelées tout en limitant la mort cellulaire par dessiccation, lésion mécanique de la membrane plasmique, choc osmotique. Dans un mode de réalisation particulier, la composition est réchauffée par friction manuelle durant moins de 10 min. Dans un autre mode de réalisation particulier, la composition est placée au bain marie liquide ou sec, réglé à une température comprise entre 30 et 40°C pendant moins de 10 min, en particulier à 37°C pendant 3 à 5 min. Dans un autre mode de réalisation particulier, la composition est placée dans un appareil de décongélation automatique. Dans un autre mode de réalisation particulier, la composition est décongelée à température ambiante pendant moins de 10 min. Optionnellement, après décongélation et avant administration au patient, la composition peut être remise en suspension dans un milieu pharmaceutiquement acceptable pour une injection systémique ou intraveineuse comme le lactate Ringer ou autre solution ionique. Fig. 1 représente la procédure d’analyse par cytométrie en flux de la viabilité cellulaire. Une première fenêtre d’analysée (FSC-H/SSC-H) est tracée de manière à ne prendre en compte que les cellules (graphique de gauche). L’analyse de viabilité de ces cellules est réalisée par mesure de la fluorescence de l’iodure de propidium (IP) sur le canal FL-2 du cytomètre. Fig. 2 est un graphique représentant la viabilité cellulaire évaluée au bleu trypan (BT) et avec l’iodure de propidium (IP) après conservation des CSN à -80°C pendant 15 jours (J15), 1 mois (1M), 2 mois (2M), 3 mois (3M) et 5 mois (5M). Fig. 3 est un graphique représentant le pourcentage de cellules positives pour l’expression des marqueurs CD29, CD44, et CD90, mesurée en cytométrie en flux, après différents temps de conservation des CSN à -80°C (de 15 jours à 3 mois). Fig. 4 est un graphique représentant l’activité proliférative des CSN au travers du nombre de doublement de la population cellulaire en 7 jours, après une conservation de la population cellulaire à -80°C, ou à -18°C pendant 15 jours, 1 mois, 2 mois ou 3 mois. Fig. 5 est un graphique représentant l’activité proliférative des CSN au travers du temps de doublement de la population cellulaire pendant 7 jours, après une conservation de la population cellulaire à -80°C, ou à -18°C pendant 15 jours, 1 mois, 2 mois ou 3 mois. Fig. 6 est un graphique représentant l’activité proliférative des CSN après 24h, 48h, et 5 jours en culture mesurée à l’aide du kit colorimétrique CCK8, après une conservation des CSN à -80°C, ou à -18°C pendant 15 jours, 1 mois, 2 mois ou 3 mois. Fig. 7 est un graphique représentant l’activité inhibitrice des CSN sur la prolifération des lymphocytes (% d’inhibition), après une congélation des CSN à -80°C et une conservation à -18°C pendant 15 jours, 1 mois, 2 mois ou 3 mois. Les résultats sont comparés au contrôle lymphocytes stimulés à la concavanaline A (Con A). Fig. 8 est un graphique représentant l’activité inhibitrice des CSN sur la prolifération des lymphocytes (% d’inhibition), après une congélation des CSN à -80°C et une conservation à -18°C pendant 15 jours, 1 mois, 2 mois ou 3 mois. Les résultats sont comparés à l’activité inhibitrice de CSN congelées à -80°C et conservées à -80°C (-80°C) durant 2 mois. Fig. 9 est un graphique représentant la viabilité cellulaire des CSN mesurée par comptage au bleu de trypan, après un procédé selon l’invention (congélation des CSN à -80°C, puis conservation à -18°C pendant 1 semaine ou 3 mois) ou après un procédé comprenant une congélation des CSN à -18°C puis une conservation à -18°C pendant 1 semaine ou 3 mois. Fig. 10 est un graphique représentant l’activité inhibitrice des CSN sur la prolifération des lymphocytes (% d’inhibition), après une congélation à -18°C et une conservation à -18°C de la population cellulaire pendant 15 jours, 1 mois, 2 mois ou 3 mois, pour des co-cultures de ratio 1 :10 et 1 :20. Fig. 11 est un graphique représentant l’activité inhibitrice des CSN sur la prolifération des lymphocytes (% d’inhibition), après une congélation des CSN à -18°C et une conservation à -18°C pendant 3 mois, versus une congélation des CSN à -80°C et une conservation à -18°C pendant 3 mois. Fig. 12 représente des exemples représentatifs des différents profils cytométriques et leurs caractéristiques associées. Des CSN sont isolées de placenta canin et amplifiées sur plusieurs passages (2 à 5). Plusieurs échantillons de CSN sont analysés en cytométrie en flux pour évaluer l’expression du CD90 (FL2-PE) et du CMH-I (FL4-APC). En fonction du profil phénotypique CD90/CMH-I, les CSN peuvent être classées en plusieurs catégories suivant leurs caractéristiques biologiques et leur composition. Ici les cellules ne répondent pas aux critères d’expression du CD90/CMH-I, tels que décrits dans l’invention. Fig. 13 représente des exemples représentatifs des différents profils cytométriques et leurs caractéristiques associées. Des CSN sont isolées de placenta canin et amplifiées sur plusieurs passages (2 à 5). Plusieurs échantillons de CSN sont analysés en cytométrie en flux pour évaluer l’expression du CD90 (FL2-PE) et du CMH-I (FL4-APC). En fonction du profil phénotypique CD90/CMH-I, les CSN peuvent être classées en plusieurs catégories suivant leurs caractéristiques biologiques et leur composition. Ici les cellules répondent aux critères d’expression du CD90/CMH-I, tels que décrits dans l’invention. Exemples I. Isolement des CSN de placenta canin Les annexes extra embryonnaires canines (placenta, cordon ombilical) sont prélevées de manière aseptique lors de césariennes pratiquées chez des chiennes gestantes à terme. Dès que le chiot nouveau-né est sorti du sac amniotique et mis en sécurité, le tissu extra embryonnaire est immédiatement transféré dans une boite de transport contenant une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (D-PBS) pour être acheminé au laboratoire. Le traitement du tissu extra embryonnaire est réalisé au maximum dans les 48h suivant le prélèvement. L’ensemble des étapes de traitement du tissu est réalisé dans un environnement contrôlé, sous un poste de sécurité microbiologique (PSM). Le tissu est transféré dans une boite de Pétri de 100 cm2 et la membrane amniotique résiduelle est éliminée mécaniquement par dissection. Le placenta est placé face embryonnaire contre la surface plastique de la boite et l’utéroverdine présente sur la face d’origine maternelle est séparée du placenta par grattage du tissu. Le placenta est rincé 3 à 5 fois dans des bains successifs de D-PBS. Les vaisseaux sanguins et le cordon ombilical sont ensuite retirés mécaniquement du placenta. Le tissu placentaire est disséqué en fragments de 10-20 mm 2 environ puis soumis à une digestion enzymatique en incubant les fragments de tissu dans une solution composée de DMEM (milieu de Eagle modifié de Dulbecco) contenant 0,5-4 mg/ml de collagénase de type I, et plus spécifiquement une concentration de 1 mg/ml de collagénase de type I. La digestion enzymatique se déroule à 37°C durant 1h mais une digestion comprise entre 30 min et 16h peut être réalisée en diminuant la température d’incubation (température ambiante (18-22°C ou 4°C). Au terme de la digestion, l’activité enzymatique est arrêtée par dilution, en ajoutant du DMEM contenant au moins 10% de sérum de veau fœtal (SVF) en quantité équivalente à la solution de digestion enzymatique. La solution est alors filtrée sur tamis de 70-100 µm. Les cellules récupérées sont centrifugées à 800 g durant 10 min. Le culot cellulaire contenant les cellules stromales néonatales est rincé au DMEM et de nouveau centrifugé à 800 g durant 10 min. Le culot cellulaire est repris dans du milieu de culture constitué de DMEM, 10% de SVF, 2 mM glutamine et de 0 à 20 ng/ml de facteur de croissance fibroblast growth factor (FGF). Les cellules sont comptées et ensemencées dans des boites de culture à une densité comprise entre 10 4 et 2.10 4 cellules/cm 2 . Les cellules sont alors cultivées dans le milieu de culture décrit ci-dessus en atmosphère contrôlé à 37°C et contenant 5% de CO 2 . Le milieu est changé au bout de 48h puis tous les 2-3 jours. Les cellules sont passées lorsque la confluence atteint 70-80%. II. Passage cellulaire et amplification A sub-confluence, les cellules subissent un passage cellulaire et optionnellement, une procédure d’amplification. Les CSN sont rincées au D-PBS et traitées par 0,05% de trypsine-EDTA durant 2-5 min à 37°C. Cela permet de détacher les cellules et de former une population de cellules isolées. Les cellules sont ensuite reprises avec du milieu d’amplification constitué de DMEM, 10% de SVF, 2 mM glutamine et de 0 à 20 ng/ml de facteur de croissance fibroblaste (FGF) et centrifugées entre 300-500 g durant 5 à 10 min. Les CSN sont reprises dans du milieu d’amplification, et comptées par comptage manuel (bleu tryan et cellules de Malassez) ou à l’aide d’un cytomètre. Elles sont ensuite ensemencées à hauteur de 1500 à 5000 cellules/cm 2 et cultivées sur support plastique de culture cellulaire dans du milieu d’amplification et en atmosphère contrôlé à 37°C et contenant 5% de CO 2 . Au cours du processus d’amplification les cellules peuvent subir entre 0 et 15 passages cellulaires. III. Cryoconservation des CSN optionnelle- constitution d’une masterbank A l’issue du premier ou second passage cellulaire (P1-P2), les cellules peuvent être cryoconservées en unités cellulaires d’ensemencement (seed units). Pour ce faire, après comptage, les CSN sont centrifugées entre 300-500 g durant 5 à 10 min et le culot cellulaire est repris dans du milieu de congélation composé soit de milieu DMEM enrichi avec 5-20% de SVF et 5-10% (vol : vol) de DMSO ou dans un milieu de cryopréservation commercial, contenant ou non une fraction de DMSO. La concentration cellulaire est comprise entre 1.10 6 et 15.10 6 cellules par ml de milieu de congélation. La congélation des cellules est réalisée en condition de descente en température contrôlée, en utilisant par exemple un container CoolCell® Cell Freezing Containers (BioCision) et en suivant la procédure de congélation telle qu’elle est décrite par le fabricant. Les cellules sont alors transférées pour stockage en froid négatif à des températures comprises entre -70°C et -196°C. Les unités cellulaires d’ensemencement peuvent être utilisées pour générer des unités cellulaires à visée thérapeutique. Les unités cellulaires d’ensemencement sont décongelées à 37°C pendant 3-6 min et amplifiées in vitro. Les cellules sont ensemencées en milieu de culture à la densité de 1500-3000 cellules/cm2. Les cellules sont amplifiées par passage successif in vitro. Lorsqu’un nombre significatif de cellules est produit (par exemple >150.10 6 cellules), les cellules sont congelées selon le protocole décrit précédemment. Les cellules sont distribuées dans des flacons operculables scellés hermétiquement à raison de 1.10 6 -15.10 6 cellules/ml en milieu de congélation exempt en produit d’origine animale (comme par exemple le milieu de cryoconservation Recovery TM Cell culture freezing medium (Thermo Fisher), Cryostem TM freezing medium (Biological Industries). Les flacons sont descendus en température selon un protocole de descente en température contrôlée, à raison de -1°C/min jusqu’à -80°C. Les flacons sont ensuite transférés à -80°C pour stockage. Une fois obtenue, la population de CSN est caractérisée d’une part par ses caractéristiques structurales (présence/absence de marqueurs) et d’autre part par ses caractéristiques fonctionnelles (prolifération, différenciation etc.). IV. Préparation de la composition pharmaceutique et congélation des doses unitaires A l’issue de l’amplification de CSN correspondant à une phase de production des doses unitaires à vocation thérapeutique, les cellules peuvent être congelées sous forme de composition pharmaceutique et conditionnées en doses unitaires. Pour ce faire, après comptage, les CSN sont centrifugées entre 300-500 g durant 5 à 10 min et le culot cellulaire est repris dans du milieu de congélation exempt en produit d’origine animale composé de milieu Cryostor® CS5 (Stem cell technology) ou tout autre milieu commercial ou préformulé contenant 5% de DMSO. Les cellules sont distribuées dans des flacons operculables scellés hermétiquement à raison de 1.10 6 -15.10 6 cellules/ml. La congélation des cellules est réalisée en condition de descente en température contrôlée, en utilisant par exemple un congélateur cryogénique programmable de type FREEZAL (Biofluide) et programmé pour une descente en température de 1°C/min pour une température initiale comprise entre 10°C et 4°C et pour une température finale de -80°C. Les cellules sont alors transférées pour stockage en froid négatif à des températures comprises entre -70°C et -80°C ou directement stockées pour un stockage final à une température comprise entre -10°C et -40°C. V . Détails des échantillo ns testés : comparaison congélation/stockage -80°C/ - 18 °C vs -80°C /-80°C Trois lots de CSN issus de placentas canins de différentes phases d’amplifications sont utilisés dans cette étude. Des compositions comprenant 15.10 6 de CSN dans 1.5ml de milieu Cryostor® CS5 (Stem cell technology), milieu comprenant 5% de DMSO, ont été conditionnées en flacons et ont été cryoconservées à -80°C à raison d’une descente en température de -1°C/minute à l’aide du dispositif Coolcell. Trois flacons de chaque lot ont été stockés à -80°C pendant une période comprise entre 15 jours et 3 mois (Tableau 1), puis transférés au congélateur -18°C (condition -80°C/-18°C). En parallèle, des cellules stockées uniquement à -80°C, c’est-à-dire sans transfert à -20°C ont été utilisées comme contrôles (condition « ctrl-80°C »). Le jour des analyses, les flacons sont sortis du -18°C ou du -80°C, transférés au laboratoire dans un bac en polystyrène contenant un pack eutectique -20°C. Les flacons sont décongelés à T°C ambiante (18-20°C) pendant environ 5min. Les cellules sont aspirées des flacons à l’aide d’une seringue (aiguille 18G) et transférées dans un eppendorf stérile pour les analyses suivantes. V . 1. Viabilité au bleu de trypan et à l’iodure de propidium Pour chaque condition, un aliquote de la suspension initiale (50µl) est prélevé pour comptage au bleu trypan (BT) au compteur électronique Luna. Un autre aliquote de la suspension initiale (50µl) est prélevé pour un marquage au cytomètre de flux avec iodure de propidium (IP) (Sigma Aldrich). L’aliquote est maintenu au réfrigérateur jusqu’à analyse. La fenêtre d’analyse IP de l’analyse cytométrique (BD accury c6) est tracée selon la figure ci-dessous. Une fenêtre de « cellules » est tracée en FSC-H/SSC-H et est utilisée pour l’analyse IP. L’analyse IP est réalisée sur le canal FL-2 par une analyse en FL2-A/FSC-H (Figure 1). La viabilité cellulaire a été évaluée par BT et IP pour toutes les conditions testées (15 jours : J15 n=2 ; 1 mois : 1M n=3 ; 2 mois : 2M n=2 ; 3 mois : 3M n=1 ; 5 mois : 5M n=2) et comparée à la viabilité des cellules après décongélation des lots cellulaires stockés à -80°C (n=3) (Figure 2). Les résultats obtenus après le temps de stockage -80°C pour l’analyse de viabilité intermédiaire (Tableau 1) n’ont pas montrés de différences par rapport aux cellules congelées et conservées selon le protocole de la présente invention (congélation à -80°C puis conservation à -18°C) (Figure 2). Les résultats obtenus par BT ou IP sont concordants suggérant que les deux méthodes analytiques peuvent être utilisées pour vérifier le paramètre de viabilité. Les données mettent en évidence une viabilité >80% pour les échantillons conservés jusqu’à 2 mois à -18°C en BT et IP (plus grande variabilité à 1 mois en IP). L’analyse à 3 mois montre une viabilité de 72% (BT) et 79% en IP. Les analyses après 5 mois à -18°C montrent une viabilité moyenne de 40% (BT) et 42% (IP). Les résultats montrent que les CSN peuvent être conservées durant une période d’au moins 3 mois à -18°C sans affecter drastiquement leur viabilité à la décongélation. V . 2 . Analyse des marqueurs phénotypiques L’analyse cytométrique vise à déterminer la présence de marqueurs membranaires à la surface des CSN grâce à l’utilisation d’un panel d’anticorps spécifiques de chaque marqueur : CD29, CD44, CD90. Afin d’étudier l’impact du stockage à -18°C sur les cellules congelées, 5.10 5 cellules sont prélevées à partir des chaque condition précédemment citée pour l’analyse cytométrique. Chaque prélèvement de chaque condition est séparé en 4 échantillons transférés dans des eppendorfs de 1,5 ml afin de réaliser 4 marquages. Les cellules sont reprises dans 1 ml de tampon cytométrique composé de D-PBS et de 0,5-1% (v/v) d’albumine de sérum bovin (BSA) ou de 0.5-2% (v/v) de sérum de veau fœtal. Ces 4 échantillons sont centrifugés à 500 g pendant 5 min. Un second lavage est réalisé dans les mêmes conditions expérimentales. Après élimination du surnageant, les cellules des 4 tubes sont respectivement reprises dans 1 volume de 30-100 µl, en particulier 50 µl, de tampon cytométrique. Au total, 4 marquages sont réalisés par conditions de congélation et stockage : marquage isotipique (FITC et PE), marquage CD29, marquage CD44 et marquage CD90 selon le tableau 2. La concentration optimale d’anticorps utilisé pour le marquage doit être préalablement déterminée par un homme du métier. L’incubation nécessaire au marquage doit également être déterminée par l’homme du métier et comprise entre 15 min et 10h à 4°C à l’abri de la lumière. En particulier, les cellules sont incubées 20 min à 4°C à l’abri de la lumière. Des contrôles isotypiques (ici FITC et PE pour Isothiocyanate de fluorescéine et phycoérythrine) adaptés à chaque marquage doivent être utilisés comme contrôle négatif. Suite à l’incubation avec les anticorps, les cellules sont lavées en D-PBS, centrifugées 5-10 min à 500 g et reprise dans un volume de 100 à 250 µl de tampon de marquage pour analyse au cytomètre de flux (Accuri C6, BD Biosciences). Ainsi, l’expression des marqueurs CD29, CD44 et CD90 a été évaluée par cytométrie en flux. L’expression moyenne des marqueurs des cellules conservées à -80°C a des temps variables a été prise comme contrôle (CD29=91%±7% ; CD44 = 99.4%±0.3% ; CD90 =87.8±9%) (n=6). Les échantillons ont été analysées pour 15 jours : J15 n=2 ; 1 mois : 1M n=3 ; 2 mois : 2M n=2 ; 3 mois : 3M n=1. Pour les 3 marqueurs étudiés, un signal positif a été mise en évidence quelle que soit la condition testée (Figure 3). La Figure 3 représentant le pourcentage de cellules positives pour les marqueurs CD29, CD44, et CD90. Les résultats mettent en évidence une expression très similaire du CD44 pour toutes les conditions (>99% de positivité). Concernant le CD29, on observe >85% de positivité pour toutes les conditions (sauf un échantillon conservé à -18°C pendant 15jours). Le marqueur CD90 montre une plus grande variabilité avec 5 échantillons conservés à -18°C dont le signal positif est >95% et deux échantillons avec un signal positif d’environ 80%. Cette variabilité est également observée avec les échantillons conservés à -80°C (87.8±9%) et les échantillons en cours d’amplification. De ce fait, la conservation à -18°C n’affecte pas l’expression des marqueurs CD29, CD44 ou CD90. V . 3 . Activité proliférative et métabolique après mise en culture des cellules décongelées Après décongélation et comptage, les cellules sont diluées dans du milieu d’amplification (DMEM, 10% de SVF, 2 mM glutamine et de 0 à 20 ng/ml de FGF) pour obtenir une concentration d’environ 10 6 cellules/ml. Une boite de culture de 75 cm² est ensemencée avec 0,225.10 6 cellules pour l’analyse de prolifération pendant 1 semaine en milieu d’amplification. En parallèle, une plaque 96 puits est ensemencée à hauteur de de 10.000 cellules/puits pour un suivi cinétique du métabolisme des cellules à l’aide du Cell Counting Kit-8 (CCK8-Sigma-Aldrich) analysé par spectrophotométrie. L’activité proliférative des CSN est évaluée en calculant le nombre de doublement (ND) des cellules durant 7 jours de culture et calculant le temps de doublement (TD). Après 7 jours de culture, les cellules sont détachées de leur support de culture à l’aide de trypsine/EDTA 0.5% pendant 2 -3 minutes. Du milieu de culture est ajouté et les cellules sont centrifugées 5 min/300 g. Le culot cellulaire est repris dans un volume défini de milieu de culture et les cellules sont comptées par technique d’exclusion au bleu trypan à l’aide d’un compteur électronique. Le nombre de doublement (ND) est calculé selon la formule suivante : ND = LOG (Nf/Ni)/LOG(2) (Nf : nombre de cellules finales et Ni : nombre de cellules initiales). Le temps de doublement (TD) est calculé selon la formule suivante : TD = temps de culture (h)/ND. Les Figures 4 et 5 présentent l’activité proliférative des cellules en culture 7 jours. La Figure 4 présente le nombre de doublements de CSN cultivées 7 jours et la Figure 5, le temps de doublement moyen des cultures. Les données montrent un nombre de doublements (ND) cellulaire moyen = 4.6 lorsque les cellules sont issues du -80°C (n=12). Ce nombre est similaire pour les deux échantillons stockés à -18°C/15jours (ND =4.6). Après 1mois à -18°C, ND = 3.6±1.2 (n=3) ; après 2 mois à -18°C, ND = 3.9 (n=2) et après 3 mois à -18°C, ND = 4.1 (n=1). On observe une diminution importante du nombre de doublements après 5 mois à -18°C ; ND = 1.7 (n=2) (Figure 4). Concernant les temps de doublement (TD), ceux-ci sont similaires à -80°C et après 15 jours à -18°C ; respectivement 37.5h±5 (n=12) et 38.7h (n=2). A 1,2 et 3 mois à -18°C, on observe des temps de doublement respectifs de 48.5h±18 (n=3), 48.7h (n=2), et 41h (n=1). Après 5 mois à -18°C, les temps doublement augmentent sensiblement TD = 112h (n=2) (Figure 5). V . 4 . Activité métabolique Une seconde méthode analytique a été utilisée pour évaluer la prolifération des cellules post-décongélation en cinétique 24h, 48h ; 5 jours ainsi que pour vérifier la reprise métabolique des cellules au cours de la culture. Le test colorimétrique CCK8 a été utilisé et analysé en lecteur de plaque à 450nm. Les analyses ont été faites sur des cellules conservées à -18°C pendant 15j (n=2) ; 1mois (n=2) ; 2mois (n=2) ; 3mois (n=2) et 4 échantillons cryoconservés à -80° utilisés comme contrôles. La Figure 6 présente l’analyse de l’activité proliférative des cellules après 24h, 48h, et 5 jours en culture calculée à l’aide du kit colorimétrique CCK8. Une augmentation de la DO correspond à une augmentation de l’activité métabolique des cellules ou du nombre de cellules viables dans les puits. Les résultats montrent qu’à 24h post-ensemencement, les densités optiques (DO) à 450nm sont équivalentes pour l’ensemble des conditions (DO 450 =0.22). Cela est consistent avec les résultats de viabilités obtenus à la décongélation. A 48h, on observe une augmentation de la DO dans la condition -80°C (DO 450 =0.313±0.1) alors que les DO ne sont pas modifiées dans les tests -18°C (DO 450 (J15) =0.27 ; DO 450 (1M) = 0.27 ; DO 450 (2M) = 0.24 ; DO 450 (3M) = 0.26). V . 5 . Activité immunosuppressive in vitro des CSN L’activité immunomodulatrice des CSN est étudiée au travers de leur activité immunosuppressive, en particulier de leur capacité à inhiber la prolifération des lymphocytes in vitro. Cette activité inhibitrice est évaluée en co-cultivant les CSN de chaque condition de stockage avec des cellules mononuclées sanguines (PBMCs) en présence d’un agent mitogène. Pour cela, les PBMCs sont isolées à partir d’un prélèvement sanguin réalisé chez un chien donneur ou d’un cheval donneur sur un gradient de Ficoll. Les PBMCs sont ensuite incubés avec un colorant fluorescent (CellTrace CFSE, Thermo Fisher) qui permet de mesurer la prolifération cellulaire sur plusieurs générations. 0,2.10 6 PBMCs marqués au Celltrace sont ajoutés dans les puits d’une plaque 96 puits dans lesquels ont été ensemencées la veille les CSN de chaque condition de stockage à la concentration (2.10 4 CSN/puits) ; permettant ainsi d’obtenir un ratio CSN: PBMC équivalent à 1 :10. Les CSN sont traitées à la mitomycine (10 µg/ml pendant 1,5-2h à 37°C) et rincées 3 fois en milieu de culture avant l’ajout des PBMCs. Le milieu de prolifération des lymphocytes est ajouté (RPMI, 10% SVF, 2 mM glutamine, 10 mM hepes, 50 µM β-mercaptoethanol, 5 µg/ml concanavalin A). Les co-cultures PBMC/CSN et les cultures contrôle (PBMC sans CSN) sont incubées 4 jours en incubateur à 37°C. A l’issue de la culture, les PBMC non adhérents sont récupérées des puits, centrifugées et lavées au D-PBS. Les cellules sont ensuite marquées avec un anticorps anti-CD3 couplé à un fluorochrome FITC pendant 30 min à 4°C. Les cellules sont ensuite lavées au D-PBS avant analyse au cytomètre de flux (Accuri C6, BD Biosciences). L’analyse cytométrique consiste à évaluer le signal du Celltrace au sein de la population CD3+ viable. A l’issue de l’incubation, les lymphocytes-T spécifiquement marqués au CD3 sont analysés au cytomètre. Pour chaque test réalisé, les PBMC ont été isolés à partir de 2 ou 3 patients. Un indice de prolifération lymphocytaire est calculé pour chaque condition expérimentale en utilisant le logiciel d’analyse Modfit. L’indice de prolifération lymphocytaire en présence de CSN est normalisé par rapport à l’indice de prolifération lymphocytaire en condition contrôle, fixé à 1. Les analyses statistiques ont été réalisées par un t-test de comparaison à la valeur de référence (con A). Les conditions stockées à -18°C ont était comparées aux PBMC stimulés à la concavanaline A (con A) (Figure 7) ou aux résultats d’échantillons stockées à -80°C (-80) (Figure 8). Les données mettent en évidence une diminution de la prolifération lymphocytaire en présence de CSN stockées 15j, 1M, 2M, et 3M à -18°C. Cette différence est significative (p Les données obtenues dans cette étude sont comparées avec les résultats observés lorsque les PBMC sont co-cultivés avec des CSN stockés à -80°C (n=14) montrant une activité proliférative = 0.4±.13 (Figure 8). Les résultats mettent en évidence une différence significative de l’activité lympho-inhibitrice des CSN conservées à -18°C pendant 15 jours, 1 mois, 2 mois et 3 mois par rapport aux CSN conservées à -80°C (t-test). V I . Comparaison congélation/stockage : -80°C/- 18 °C vs - 18 °C/- 18 °C Afin d’évaluer si le mode de cryoconservation des CSN avec une étape à -80°C est nécessaire pour conserver les propriétés biologiques des cellules stockées temporairement à -18°C, l’étude suivante est réalisée en stockant des échantillons de CSN en milieu de cryoconservation directement dans un congélateur -18°C±5°C sans descente en température initiale à -80°C. 2 lots d’amplification de CSN ont été utilisés pour cette étude. Les cellules en P6 ont subi un passage cellulaire et sont comptées au comptage BT. Les résultats sont présentés dans le tableau 3 ci-après. Les CSN sont centrifugées entre 300-500 g durant 5 à 10 min et le culot cellulaire est repris dans du milieu de congélation composé soit de milieu DMEM enrichi avec 5-20% de SVF et 5-10% (vol : vol) de DMSO ou dans un milieu de cryopréservation commercial, contenant ou non une fraction de DMSO. La concentration cellulaire est comprise entre 5.10 6 et 10.10 6 cellules par ml de milieu de congélation. Deux doses unitaires sont réalisées pour chaque lot (condition -18/-18). Les résultats sont comparés à ceux obtenus avec la méthode de congélation et de stockage présentés dans la partie I. (condition -80/-18 : n=3). V I . 1. Comparaison congélation/stockage : Viabilité au bleu de trypan Les résultats en Figure 9 montrent que la viabilité cellulaire n’est que peu affectée par les deux conditions de congélations pour un stockage d’une semaine. On observe une diminution de 9,42% pour -80/-18 et 2,20% pour -18/-18 à 1 semaine en comparaison de leur viabilité respective à la congélation. Néanmoins, après un stockage de 2-3 mois, une diminution importante de la viabilité peut être observée pour le cas -18/-18 (diminution de 31,60% par rapport à T0) tandis que dans le cas -80/-18, on constate une stabilisation de la viabilité (diminution de 11,63% par rapport à T0). De ce fait, la stratégie de congélation décrite dans l’invention favorise un stockage à -18°C des CSN pour une durée de 2-3 mois. V I . 2. Effet immunomodulateur des CSN selon la méthode de congélation/stockage - 18 °C/- 18 °C L’activité immunomodulatrice des CSN a été étudiée au travers de leur activité immunosuppressive, en particulier de leur capacité à inhiber la prolifération des lymphocytes in vitro comme détaillée dans la partie IV.5. Les CSN congelées à -18 et stockées à -18°C durant 3 mois ont été décongelées et sont cultivées avec des PBMC marqués au CFSE. L’indice de prolifération lymphocytaire en présence de CSN est normalisé par rapport à l’indice de prolifération lymphocytaire en condition contrôle, fixé à 1. Les résultats en Figure 10 ont montré que pour des co-cultures de ratio 1 :10 ou 1 :20, aucun effet immunomodulateur n’a pu être observé indiquant une perte de cet effet suite à une congélation -18°C et un stockage -18°C. Ces résultats ont été comparés à la méthode de congélation jusqu’à -80°C et de stockage à -18°C décrite dans l’invention (Figure 11). La comparaison a montré que la méthode décrite dans l’invention permettait une conservation de l’activité lympho-inhibitrice des CSN par rapport à une congélation directe à -18°C (comparaisons des moyennes selon les deux techniques par Mann Whitney U p-valeur : 0,007). À toute fin utile, le(s) document(s) suivant(s) est (sont) cité(s) : - Marquez-Curtis, L.A., Janowska-Wieczorek, A., McGann, L.E., and Elliott, J.A.W. (2015). Mesenchymal stromal cells derived from various tissues: Biological, clinical and cryopreservation aspects. Cryobiology 71, 181–197. - Espina, M., Jülke, H., Brehm, W., Ribitsch, I., Winter, K., and Delling, U. (2016). Evaluation of transport conditions for autologous bone marrow-derived mesenchymal stromal cells for therapeutic application in horses. PeerJ 4, e1773. - Demande de brevet chinoise CN102487939 A, déposée par Shangai Angelife Biotechnology CO LTD, publiée le 13 Juin 2012. Inventeurs : Yingbo, C., Jiawei, Z., Limin, Y., et Yiqiang, J. Procédé de congélation et de conservation d’une composition comprenant une population de cellules stromales néonatales (CSN) et un cryoprotecteur, caractérisé en ce que : 1) ladite composition est congelée à une température comprise entre -70°C et -140°C, en particulier entre -70°C et -100°C, plus particulièrement à -80°C ; puis 2) ladite composition est conservée entre -10°C et -40°C, en particulier entre -10°C et -35°C, plus particulièrement entre -15°C et -30°C, plus particulièrement entre -17°C et -20°C, encore plus particulièrement -18°C. Procédé de congélation et de conservation selon la revendication 1, dans lequel la population de CSN est une population de CSN placentaires. Procédé de congélation et de conservation selon la revendication 1 ou 2, dans lequel l’étape 1 est d’au moins 2h. Procédé de congélation et de conservation selon l’une des revendications 1 à 3, dans lequel l’étape 2 est de 1 jour à 5 mois. Procédé de congélation et de conservation selon l’une des revendications 1 à 3, dans lequel l’étape 2 est d’au moins 21 jours. Procédé de congélation et de conservation selon l’une des revendications 1 à 5, dans lequel le cryoprotecteur est choisi parmi le glycérol, le diméthylsulfoxyde (DMSO), le propylène glycol, les protéoglycanes, le tréhalose, du polyéthylène glycol (PEG), du polyacrylic-acide, du poly-L-lysine, de l’éthylène glycol ou une combinaison de plusieurs de ces cryoprotecteurs. Procédé de congélation et de conservation selon l’une des revendications 1 à 6, dans lequel la composition comprend du DMSO en tant que cryoprotecteur. Procédé de congélation et de conservation selon l’une des revendications 1 à 7, ladite composition comprend une population de CSN de phénotype CMH-I L / CD90 H . Composition comprenant une population de CSN, et un cryoprotecteur caractérisée en ce qu’elle est conservée entre -10°C et -40°C, en particulier entre -10°C et -35°C, plus particulièrement entre -15°C et -30°C, encore plus particulièrement entre -17°C et -20°C, encore plus particulièrement à -18°C, et en ce que lesdites CSN sont des CSN placentaires. Composition selon la revendication 9, dans laquelle le cryoprotecteur est du DMSO.