Brevet FR3101709A1 — publié le 20210409

Méthode de détection, localisation et quantification de protéines MDR Méthode in vitro de détection, de localisation et/ou de quantification de protéines de multirésistance aux médicaments (MDR) associées à des cellules, dans un échantillon contenant des cellules procaryotes ou eucaryotes exprimant ou susceptibles d’exprimer des protéines MDR. La méthode comprend : l’ajout à l’échantillon en milieu liquide ou comprenant une phase liquide d’un traceur MDR apte à se fixer aux protéines MDR, l’incubation de l’échantillon avec ce traceur MDR, ce grâce à quoi le traceur MDR se fixe aux protéines MDR lorsqu’elles sont présentes, l’élimination du traceur non fixé à des protéines MDR, la détection, la localisation et/ou la quantification du traceur fixé à des protéines MDR. Figure pour l'abrégé : néant Méthode de détection, localisation et quantification de protéines MDR La présente invention concerne une méthode in vitro de détection, localisation et/ou quantification de protéines MDR de multirésistance (« MultiDrug Resistance », MDR) exprimées par des cellules présentes dans un échantillon. L’invention concerne aussi des traceurs de MDR détectables, utilisables dans cette méthode. Arrière-plan technologique La classe des protéines « Multidrug Resistance » (MDR) appartient à la superfamille des transporteurs de type « ATP binding cassette » (ABC). Les protéines MDR sont des transporteurs membranaires d’efflux (pompes) de xénobiotiques (polluants, médicaments, et/ou toutes autres molécules étrangères à la cellule). Très ubiquitaires et extrêmement conservées au cours de l’évolution, elles sont exprimées au niveau des systèmes membranaires des cellules de tous les organismes, des procaryotes aux eucaryotes. Les principales protéines MDR comprennent les sous-familles du ABCB (ABCB1/MDR1/P-glycoprotéine), l'ABCC (ABCC1/MRP1, ABCC2/MRP2, ABCC10/MRP7 et également ABCC3-6, et ABCC11), et l’ABCG (ABCG2/MXR/BCRP) . Chez l'Homme/mammifères, plusieurs tissus sains expriment naturellement la P-gp codée par le gène MDR1 (ou ABCB1), comme la barrière hématoencéphalique du cerveau, la glande surrénale, le pancréas, le foie et le rein, les cellules hématopoïétiques et les cellules souches, entre autres. Chez les autres organismes, eucaryotes ou procaryotes (animal ou végétal), la présence d’abcb1/mdr1/P-glycoprotéine (P-gp), qui représente la protéine de référence, a plutôt été démontrée chez les bactéries et parasites , chez les protozoaires , chez les invertébrés aquatiques , chez la drosophile et chez les végétaux ( arabidobsis et maïs) . Chez le modèle poisson, l’expression génique d’abcb1 et également d’autres membres de transporteurs ABC comme abcc1-5, abcb3, abcb11 et abcg2 a également été mise en évidence . Les protéines MDR sont des pompes d’efflux à rôle détoxificateur. Elles reconnaissent une très large variété de substrats allant de molécules organiques aux propriétés physico-chimiques très variées (hydrophobe, amphipathiques, …) jusqu’aux métaux lourds. De part cette propriété, les protéines MDR jouent à l’échelle de la cellule un rôle de défense à l’encontre des xénobiotiques. Les protéines MDR sont exprimées naturellement sur les systèmes membranaires de quasiment tous les organismes vivants. Il s’agit de l’expression basale naturelle. En présence de xénobiotiques, le niveau d’expression de ces protéines peut augmenter d’une manière dose dépendante. Ce niveau d’expression basal ou induit est quantifiable in vitro à l’heure actuelle à l’aide d’anticorps spécifiques de chaque protéine par des approches d’immuno-cytologie ou immuno-histologie . Le différentiel d’expression entre le niveau basal et après induction (exposition à un xénobiotique) peut être exploité comme un biomarqueur de défense cellulaire. En effet, à titre d’exemple, les protéines MDR, notamment la P-gp, représentent un « biomarqueur de choix » pour la détection de la pollution de l’air et de l’eau . Les protéines MDR sont également surexprimées dans toutes les cellules tumorales . Elles sont responsables de la notion de « Multidrug Resistance (MDR) » ou la résistance croisée des cellules cancéreuses vis-à-vis des agents anticancéreux. En effet, certaines tumeurs montrent un profil de résistance inhérente lié à un niveau d’expression basal élevé de la P-gp et/ou d’autres MDR. Chez d'autres tumeurs, le niveau d’expression de la P-gp et/ou d’autres MDR augmente au cours du traitement (résistance au traitement). Dans les deux cas, l’efflux massif des chimiothérapeutiques rend le traitement inefficace . Par conséquent, la détection et la quantification des protéines MDR avant et en cours de traitement est pertinent. En effet, il permet une prédiction de l’efficacité du traitement, en préclinique lors du screening des anti-cancéreux par modélisation in vitro et en clinique sur les biopsies des patients, permettant l’amélioration du pronostic. La recherche du niveau d’expression des protéines MDR n’est pas utilisée sur des biopsies au cours du traitement. Composé de formule (I) L-[ABC]m-D (I) dans laquelle : m représente 0 ou 1 L représente un ligand susceptible de se lier aux protéines MDR, L est - un groupe de formule (II) : dans laquelle X représente un groupe –CH 2 - ou C(O) R 1 représente H ou un groupe choisi parmi –OH, O-alkyl, O-alcényl, O-aryl, O-hétéroaryl, O-cycloalkyl, O-hétérocycle, -alkyl-aryl, -alkyl-hétéroaryl, -alkyl-hétérocycle, -alkyl-cycloalkyl, alcényle-aryl, alcényle-hétéroaryl, alcényle-cycloalkyle, alcényle-hétérocycle, NH-alkyl-aryl, NH-alkyl-hétéroaryl, NH-alkyl-hétérocycle, NH-alkyl-cycloalkyl, NH-alcényle-aryl, NH-alcényle-hétéroaryl, NH-alcényle-hétérocycle, NH-alcényle-cycloalkyl, O-alkyl-aryl, O-alkyl-hétéroaryl, O-alkyl-hétérocycle, O-alkyl-cycloalkyl, O-alcényle-aryl, O-alcényle-hétéroaryl, O-alcényle-hétérocycle, O-alcényle-cycloalkyl, NH-alkyl, NH-alcényle, NH-aryl, NH-hétéroaryl, NH-hétérocycle, NH-cycloalkyle, NR 9 R 10 , ; R 2 représente H ou un groupe choisi parmi –OH, -NH 2 , O-Alkyl, O-alcényl, O-hétéroaryl, O-cycloalkyl, O-hétérocycle, O-Aryl, O-Alkyl-Aryl, O-alkyl-hétéroaryl, O-alkyl-hétérocycle, O-alkyl-cycloalkyl, O-alcényle-aryl, O-alcényle-hétéroaryl, O-alcényle-hétérocycle, O-alcényle-cycloalkyl, -Alkyl-Aryl, -alkyl-hétéroaryl, -alkyl-hétérocycle, -alkyl-cycloalkyl, alcényle-aryl, alcényle-hétéroaryl, alcényle-cycloalkyle, alcényle-hétérocycle, NH-Alkyl, NH-alcényle, NH-Aryl, NH-hétéroaryl, NH-hétérocycle, NH-cycloalkyle, NH-alkyl-aryl, N-alkyl-hétéroaryl, NH-alkyl-hétérocycle, NH-alkyl-cycloalkyl, NH-alcényle-aryl, NH-alcényle-hétéroaryl, NH-alcényle-hétérocycle, NH-alcényle-cycloalkyl, NR 9 R 10 , NHC(O)OAlkyl, NHC(O)OAlcényl, NHC(O)Ocycloalkyle, NHC(O)Ohétérocycle, NHC(O)Ohétéroaryl, NHC(O)OAryl, NHC(O)O-alkyl-aryl, NHC(O)O-alkyl-hétéroaryl, NHC(O)O-alkyl-hétérocycle, NHC(O)O-alkyl-cycloalkyl, NHC(O)O-alcényl-aryl, NHC(O)O-alcényl-hétéroaryl, NHC(O)O-alcényl-hétérocycle, NHC(O)O-alcényl-cycloalkyl, NHC(O)NHAlkyl, NHC(O)NHAlcényle, NHC(O)NHAryl, NHC(O)NHhétéroaryle, NHC(O)NHcycloalkyl, NHC(O)NHhétérocycle, ; R 3 représente H ou un groupe choisi parmi alkyl, alcényle, aryl, hétéroaryle, cycloalkyl, hétérocycle, alkyl-aryl, -alkyl-hétéroaryl, -alkyl-hétérocycle, -alkyl-cycloalkyl, alcényle-aryl, alcényle-hétéroaryl, alcényle-cycloalkyle, alcényle-hétérocycle, NH-alkyl-aryl, NH-alkyl-hétéroaryl, NH-alkyl-hétérocycle, NH-alkyl-cycloalkyl, NH-alcényle-aryl, NH-alcényle-hétéroaryl, NH-alcényle-hétérocycle, NH-alcényle-cycloalkyl, C(O)alkyl, C(O)aryl, C(O)alcényle, C(O)hétéroaryle, C(O)hétérocycle, C(O)cycloalkyle, C(O)Oalkyl, C(O)Oaryl, C(O)Oalcényle, C(O)Ocycloalkyl, C(O)Ohétéroaryl, C(O)Ohétérocycle, C(O)NHalkyl, C(O)NHaryl, C(O)NHhétéroaryl, C(O)NHhétérocycle, C(O)NHcycloalkyle, C(O)NHalcényle; R 4 représente H ou un groupe choisi parmi –SH, –OH, O-alkyl, O-aryl, O-alcényl, O-hétéroaryl, O-cycloalkyl, O-hétérocycle, -O-alkyl-aryl, O-alkyl-hétéroaryl, O-alkyl-hétérocycle, O-alkyl-cycloalkyl, O-alcényle-aryl, O-alcényle-hétéroaryl, O-alcényle-hétérocycle, O-alcényle-cycloalkyl, -alkyl-aryl, -alkyl-hétéroaryl, -alkyl-hétérocycle, -alkyl-cycloalkyl, alcényle-aryl, alcényle-hétéraryl, alcényle-cycloalkyle, alcényle-hétérocycle, -O-cycloalkyl, O-alkyl, O-alcényl, O-aryl, O-hétéroaryl, O-hétérocycle, –NH 2 , NH-Alkyl, NH-Aryl, NH-alcényle, NH-hétéroaryl, NH-hétérocycle, NH-cycloalkyle, NH-alkyl-aryl, NH-alkyl-hétéroaryl, NH-alkyl-hétérocycle, NH-alkyl-cycloalkyl, NH-alcényle-aryl, NH-alcényle-hétéroaryl, NH-alcényle-hétérocycle, NH-alcényle-cycloalkyl, NR 9 R 10 , R 4 pouvant occuper la position 3, 4 ou 5 de l’hétérocycle azoté, avantageusement la position 4 ; R 5 représente H ou un groupe alkyle ou aryle ; avec la condition qu’au moins un des R 1 , R 2 , R 3 , R 4 ou R 5 représente une liaison avec le groupe [ABC] lorsque m représente 1 ou avec D lorsque m représente 0 ; R 9 et R 10 , identiques ou différents, représentent un groupe alkyle, alcényle, hétérocycle, hétéroaryl, cycloalkyle, alkyl-aryl, alyl-hétéroaryl, alkyl-hétérocycle, alkyl-cycloalkyle, alcényle-aryl, alcényle-hétéroaryl, alcényle-hétérocycle, alcényle-cycloalkyle, - ou un groupe de formule (III) dans laquelle R 6 représente H ou un groupe choisi parmi –OH, -NH 2 , O-Alkyl, O-Aryl, O-alcényl, O-hétéroaryl, O-cycloalkyl, O-hétérocycle, O-alkyl-aryl, O-alkyl-hétéroaryl, O-alkyl-hétérocycle, O-alkyl-cycloalkyl, O-alcényle-aryl, O-alcényle-hétéroaryl, O-alcényle-hétérocycle, O-alcényle-cycloalkyl, NH-Alkyl, NH-Aryl, NH-alcényle, NH-hétéroaryl, NH-hétérocycle, NH-cycloalkyle, NH-alkyl-aryl, NH-alkyl-hétéroaryl, NH-alkyl-hétérocycle, NH-alkyl-cycloalkyl, NH-alcényle-aryl, NH-alcényle-hétéroaryl, NH-alcényle-hétérocycle, NH-alcényle-cycloalkyl, NRR’, NHC(O)OAlkyl, NHC(O)OAryl, NHC(O)OAlcényl, NHC(O)Ocycloalkyle, NHC(O)Ohétérocycle, NHC(O)Ohétéroaryl, NHC(O)O-alkyl-aryl, NHC(O)O-alkyl-hétéroaryl, NHC(O)O-alkyl-hétérocycle, NHC(O)O-alkyl-cycloalkyl, NHC(O)O-alcényl-hétéroaryl, NHC(O)O-alcényl-hétérocycle, NHC(O)O-alcényl-cycloalkyl, NHC(O)NHAlcényle, NHC(O)NHhétéroaryle, NHC(O)NHcycloalkyl, NHC(O)NHhétérocycle, NHC(O)NHAlkyl, NHC(O)NHAryl, NHC(O)CH(alyl-aryl) 2 R 7 représente H ou un groupe choisi parmi –OH, O-alkyl, O-aryl, O-alcényl, O-hétéroaryl, O-cycloalkyl, O-hétérocycle, O-alkyl-aryl, O-alkyl-hétéroaryl, O-alkyl-hétérocycle, O-alkyl-cycloalkyl, O-alcényle-aryl, O-alcényle-hétéroaryl, O-alcényle-hétérocycle, O-alcényle-cycloalkyl, NH2, NH-Alkyl, NH-Aryl, NH-alcényle, NH-hétéroaryl, NH-hétérocycle, NH-cycloalkyle, NH-alkyl-aryl, NH-alkyl-hétéroaryl, NH-alkyl-hétérocycle, NH-alkyl-cycloalkyl, NH-alcényle-aryl, NH-alcényle-hétéroaryl, NH-alcényle-hétérocycle, NH-alcényle-cycloalkyl, NR 9 R 10 , ; R 8 représente H ou un groupe choisi parmi Alkyl, Aryl, alcényle, hétéroaryle, hétérocycle, cycloalkyle, alkyl-aryl, -alkyl-hétéroaryl, -alkyl-hétérocycle, -alkyl-cycloalkyl, alcényle-aryl, alcényle-hétéraryl, alcényle-cycloalkyle, alcényle-hétérocycle, O-Alkyl, O-Aryl, O-hétéroaryl, O-alcényl, O-cycloalkyl, O-hétérocycle, C(O)Alkyl, C(O)Aryl, C(O)hétéroaryl, C(O)alcényle, C(O)hétérocycle, C(O)cycloalkyle, C(O)OAlkyl, C(O)OAryl, C(O)Oalcényle, C(O)Ohétérocycle, C(O)Ohétéroaryle, C(O)Ocycloalkyle, C(O)NHAlkyl, C(O)NHAlcényle, C(O)NHAryl, C(O)NHhétérocycle, C(O)NHhétéroaryle, C(O)NHcycloalkyle, notamment O-phényl, O-quinoléile avec la condition qu’au moins un des R 6 , R 7 , R 8 représente une liaison avec le groupe [ABC] lorsque m représente 1 ou avec D lorsque m représente 0 ; [ABC] représente un groupe de 1 à 500 atomes et peut être compris d’atomes ou groupes d’atomes tels que hydrogène et carbone, amino, amido, alkylamido, oxygène, polyéthylène glycol (PEG), peptide, peptoïde, soufre, sulfoxyde, sulfonyl, carbonyl, imine, [ABC] peut présenter des groupements saturés, insaturés et des systèmes cycliques aromatiques, les systèmes cycliques aromatiques peuvent être polycycliques et/ou hétéroaromatiques contenant 1 à 4 hétéroatomes comme par exemple N, S, O ; D est un agent détectable choisi parmi des petites molécules organiques, des nanoparticules, des radionucléides, des espèces fluorescentes, bioluminescentes, chimioluminescentes, magnétiques, D peut être un agent détectable en tant que tel ou bien rendu détectable après une réaction chimique telle qu’une activation biologique par exemple réaction enzymatique, les hétérocycles, hétéroaryle, cycloalkyle, aryle sont substitués ou non substitués, lorsque A et/ou C représentent -NH-C(O)-NH, -NH-CO-(CH 2 ) 5- NH-CO-CH 2 , NHC(O)(CH 2 ) 2 , ou -NH-C(O)-, alors R 3 et R 5 ne représentent pas une liaison avec le groupe [ABC] lorsque m représente 1 ou avec D lorsque m représente 0 leurs énantiomères, diastéréoisomères, sels pharmaceutiquement acceptables, solvates ou hydrates. Composé selon la revendication 1 dans laquelle A et C, identiques ou différents, représentent indépendamment un groupe choisi parmi une liaison, C(O), –(CH 2 ) n -, -NH-C(O)-NH, -NH-C(O)-, -O-C(O)-NH-, -O-C(O)-, , -C(O)-O-, -C(O)-NH-, , -NH-CO-(CH 2 ) 5- NH-CO-CH 2 , NHC(O)(CH 2 ) 2 , B représente –(CH 2 ) n -, , -(O-(CH2)2-O-(CH2)2)n- chacun des n, identiques ou différents, est un nombre entier compris entre 1 et 99. Composé selon la revendication 1 ou 2 dans laquelle D est choisi parmi les fluorochromes, par exemple BODIPY, cyanines, coumarines, sulfocyanimes, les radionucléides, les nanoparticules, de préférence D est choisi parmi : Les R, identiques ou différents, sont choisis parmi alkyl, alcényle, aryle, hétéroaryle, hétérocycle, hétéroaryle, alcényle, alcényl-aryl, alcényl-hétéroaryle, alcényl-hétérocycle, alcényl-cycloalkyl, alkyl-aryl, alkyl-hétéroaryle, alkyl-hétérocycle, alkyl-cycloalkyl, alkyl-COOH, alcényl-COOH, aryl-O-alkyl-COOH, alcenyl-aryl-O-alkyl-COOH ; les hétérocycles, hétéroaryle, cycloalkyle, aryle sont substitués ou non substitués, p est compris entre 0 et 3. Composé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel R 1 représente –O-alkyle-aryle, -O-alkyle, de préférence –OBn, –OtBu, -OEt, -OMe ; R 2 représente NHC(O)O-alkyle-aryle, NHC(O)Oalkyle, O-alkyle-aryle, O-alkyle, de préférence NHC(O)OBn, NHC(O)OtBu, -OBn, -OEt ; R 3 représente C(O)alkyle, alkyle-aryle, alkyle, de préférence C(O)tBu, Bn, Me, Et, Pr ; R 4 représente OH, O-alkyle-aryle, O-alkyle, O-cycloalkyle, de préférence –OH, –OBn, –OtBu, -OEt, -OMe, -OcHex, R 4 pouvant occuper la position 3, 4 ou 5 de l’hétérocycle azoté, avantageusement la position 4 ; R 5 représente H ou un groupe Alkyle ou aryle, les hétérocycles, hétéroaryle, cycloalkyle, aryle sont substitués ou non substitués. Composé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel, dans les composés de formule (I) R 6 représente NHC(O)CH(alyl-aryl) 2 notamment NHC(O)CH[(CH2)3Ph]2 ; R 7 représente –OH, O-alkyl, O-alkyl-aryl, notamment –OH, –OBn, –OtBu, -OEt, -OMe ; R 8 représente H ou un groupe choisi parmi O-Aryl, O-hétéroaryl, notamment O-phényl, O-quinoléile, les hétérocycles, hétéroaryle, cycloalkyle, aryle sont substitués ou non substitués. Méthode in vitro de détection, de localisation et/ou de quantification de protéines de multirésistance aux médicaments (MDR) associées à des cellules, dans un échantillon contenant des cellules procaryotes ou eucaryotes exprimant ou susceptibles d’exprimer des protéines MDR, la méthode comprenant : - l’ajout à l’échantillon en milieu liquide ou comprenant une phase liquide d’un traceur MDR apte à se fixer aux protéines MDR, - l’incubation de l’échantillon avec ce traceur MDR, ce grâce à quoi le traceur MDR se fixe aux protéines MDR lorsqu’elles sont présentes, - l’élimination du traceur non fixé à des protéines MDR, - la détection, la localisation et/ou la quantification du traceur fixé à des protéines MDR. dans laquelle le traceur MDR est un composé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 Méthode selon la revendication 6, dans laquelle la protéine MDR est la P-gp. Méthode selon l’une quelconque des revendications 6 ou 7, dans laquelle l’incubation de l’échantillon avec ledit traceur MDR a une durée qui est comprise entre 1 minute et 24 heures ; l’élimination du traceur MDR non fixé aux protéines MDR est réalisée par élimination du milieu liquide de l’échantillon et lavage des cellules contenues dans l’échantillon ; et/ou le traceur MDR est ajouté à l’échantillon en quantité de 1 nM à 100 mM, notamment de 100 nM à 10 µM pour de 1 cellule à 10 9 cellules . Méthode selon l’une quelconque des revendications 6 à 8, dans laquelle l’échantillon comprend un extrait cellulaire, une suspension de cellules, des cellules adhérentes à un support de culture, une culture cellulaire monocouche ou multicouches, une culture cellulaire en 3D, un sphéroïde, un tissu biologique, un organisme pluricellulaire. Méthode selon l’une quelconque des revendications 6 à 9, dans laquelle l’échantillon comprend des cellules cancéreuses de patient, une biopsie de cancer de patient, des cellules de lignée cancéreuse, une tumeur artificielle. Méthode selon l’une quelconque des revendications 6 à 10 , dans laquelle, à l’aide du traceur MDR : - l'on détecte la présence de protéines MDR dans l’échantillon, - l’on détecte la liaison du traceur MDR à une protéine MDR en intracellulaire - l’on localise la présence de protéines MDR dans l’échantillon, - l’on quantifie le niveau d’expression des protéines MDR dans l’échantillon, - l’on localise des niveaux d’expression des protéines MDR dans l’échantillon, ou - l’on compare le niveau d’expression des protéines MDR dans des prélèvements de cellules ou de tissus (biopsies) provenant du même patient à des moments différents, et l’on détermine la réponse du patient à un traitement, en particulier la réponse de la tumeur à un traitement anticancéreux ou l’apparition de résistance à un traitement médicamenteux.