Brevet FR3109525A1 — publié le 20211029

Nanoparticules à libération pH dépendante pour l’incorporation de principes actifs, leur procédé de préparation et leurs utilisations thérapeutiques La présente invention concerne de nouvelles nanoparticules encapsulant un ou plusieurs principes actifs, tels que des antibiotiques, au sein d’une matrice polymérique biodégradable, présentant une charge en principe(s) actif(s) élevée et une libération du ou des principe(s) actif(s) pH dépendante. Figure pour l'abrégé : Aucune Nanoparticules à libération pH dépendante pour l’incorporation de principes actifs, leur procédé de préparation et leurs utilisations thérapeutiques La présente demande concerne le domaine de l’administration de principes actifs, et notamment leur libération. Le développement de nombreux principes actifs est limité de par la biodisponibilité des molécules dans le corps. De plus, il est désirable d’améliorer le ciblage du principe actif au site d’action désiré. Ainsi, on cherche à déclencher la libération du principe actif en fonction d’un stimulus correspondant au site d’action désiré. Un exemple de ces problématiques est notamment illustré par les anti-infectieux et notamment la vancomycine (VCM). La VCM est un antibiotique de la famille des glycopeptides, inhibitrice de la synthèse des peptidoglycanes de la paroi bactérienne. Efficace contre les bactéries Gram positifs, elle reste le traitement de choix pour les infections liées au Staphylocoque doré ( S aureus ). Cependant, la VCM présente une très faible biodisponibilité par voie orale : de fait, son administration par voie intraveineuse (iv) s’impose dans toutes les indications. S aureus possède de plus des mécanismes de virulence lui permettant d’envahir même les cellules immunitaires de l’organisme. Ainsi, S aureus est capable de survivre et de se multiplier dans une variété de cellules comme les cellules épithéliales, les ostéoblastes, les macrophages et les neutrophiles. Ces infections intracellulaires sont particulièrement difficiles à traiter. En effet, la VCM ne pénètre pas dans les cellules en raison de son caractère hydrophile marqué et de sa grande taille. Cette molécule est par ailleurs onéreuse et une limitation des doses administrées est particulièrement désirable pour limiter les effets secondaires, tout en réduisant les couts de traitement. A l’heure actuelle, les nanoparticules (NPs) à base de polymères biodégradables chargées en VCM ne permettent pas d’incorporer des quantités satisfaisantes de cet antibiotique. D’autre part, les NPs multicomposantes (par exemple en PLGA (poly(acide lactique-co-glycolique), copolymère poly(éthylène glycol) (PEG)-PLGA (PEG-PLGA), chitosane et eudragit) impliquent une préparation complexe (Pei et al. J. Controlled Release; 2017; 267; 133–143 ). De fait, les charges obtenues à présent restent insatisfaisantes, avec des préparations complexes. Il est donc nécessaire de mettre à disposition un système d’administration permettant de véhiculer efficacement les principes actifs, et de déclencher leur libération de façon ciblée. Il a ainsi été découvert et c’est l’un des objets de la présente invention un système d’encapsulation efficace, de type « cage » avec une inclusion aqueuse permettant d’accueillir les principes actifs, notamment hydrophiles, et permettant de libérer les principes actifs en fonction du pH, notamment en fonction d’un pH acide correspondant aux compartiments intracellulaires et/ou à l’environnement plus acide qui peut survenir au site d’infection ou autres site malade. Selon un premier objet, la présente invention concerne des NPs pour la libération contrôlée de principes actifs dépendant du pH, lesdites NPs comprenant un ou plusieurs principes actifs encapsulés au sein d’une matrice polymérique, telles que : ladite matrice comprend un ou plusieurs (co)polymères biodégradables, le(s)dit(s) principe(s) actif(s) sont chargés et les groupes terminaux des chaines de polymère présentent une charge opposée à pH donné, établissant ainsi des interactions électrostatiques entre la matrice et le(s) principe(s) actif(s); les NPs ont un diamètre moyen en nombre inférieur à 500 nm, lesdites NPs étant caractérisées en ce que ladite matrice présente une ou plusieurs inclusions comprenant le ou les principes actifs et de l’eau. Les interactions électrostatiques sont favorables à une encapsulation efficace du ou des principe(s) actif(s). De plus, selon l’invention, le principe actif tel que la VCM notamment peut former des dimères et oligomères selon le pH et la concentration (Williams et al. PNAS; 1993; 90(4); 1172–1178), (Williams et al. Science; 1998; 280; 711–714), (McPhail et al. J. Chem. Soc., Faraday Trans.; 1997; 93(13); 2283-2289), permettant d’améliorer l’encapsulation des principes actifs. Tel qu’utilisé ci-avant et ci-après : Par « nanoparticule », on entend généralement une particule de forme sphérique, de diamètre moyen en nombre compris entre 1 nm et 1µm. Dans le cadre de l’invention, lesdites NPs ont typiquement un diamètre moyen inférieur à 500 nm, notamment inférieur à 400 nm, avec un indice de polydispersité inférieur à 0.25. Le diamètre moyen en nombre et la polydispersité peuvent être mesurés par diffusion dynamique de la lumière (DLS: dynamic light scattering). Le terme « matrice » désigne le matériau formant la structure des NPs et au sein de laquelle sont présentes des inclusions. Le terme « inclusion » fait ici référence aux cavités présentes dans la matrice polymérique, étant entendu que ladite matrice peut contenir une ou plusieurs cavités, de formes variées, généralement sphériques, de diamètre identique ou différent. Typiquement, la matrice polymérique comprend une ou plusieurs inclusions de diamètre moyen compris entre 5 et 100 nm. Ces inclusions sont typiquement de type hydrophile, en ce qu’elles comprennent le ou les principe(s) actif(s), et l’eau, étant entendu que le(s) principe(s) actif(s) peut être dissous ou précipités. Le terme « encapsulé » indique que les molécules de principe actif sont incluses au sein des NPs. Selon un mode de réalisation, les NPs permettent une libération pH dépendante, notamment à pH acide, particulièrement à pH compris entre 5 et 6. Ainsi, les molécules de principes actifs sont administrées et véhiculées dans l’organisme au sein de la matrice, puis libérées lorsque le milieu biologique est compris entre 5 et 6. Ce pH est notamment observé dans les sites d’infections bactériennes et/ou au niveau des tumeurs. Ce pH correspond également à certains compartiments intracellulaires comme les endosomes. Les NPs selon l’invention permettent en effet de libérer les principes actifs à pH acide, notamment à pH 5-6, correspondant au pH du microenvironnement intracellulaire et des sites infectieux notamment, tout en limitant la libération à pH 7.4, correspondant au pH du milieu physiologique. L’expression « libération contrôlée de principes actifs dépendant du pH » désigne une libération préférentielle à pH acide, comparativement au pH physiologique (7.4). Ainsi, selon l’invention, la libération à pH physiologique est typiquement inférieure à 20%, notamment inférieure à 10%. Typiquement, à pH inférieur ou égal à 6, au moins 30%, notamment au moins 40%, de préférence au moins 50% de(s) principe(s) actif(s) sont libéré(s) selon les NPs selon l’invention. L’adjectif « biodégradable » illustre la capacité de la matrice polymérique à se décomposer dans le milieu physiologique en éléments dépourvus d’effet dommageable sur l’organisme. Selon un mode de réalisation, le ou les polymères biodégradables sont choisis parmi PLGA, PLA, et les copolymères à base de blocs de PLGA, tels que les copolymères PEG-PLGA. Selon un mode de réalisation, le(s) (co)polymère(s) possèdent un ratio molaire des unités acide lactique/acide glycolique (L/G) compris entre 50/50 et 100. Selon un mode de réalisation, les le(s)dit(s) copolymère(s) présentent des unités terminales de type acide (-COOH) ou ester (-COOAlkyle). Selon un mode de réalisation, la masse molaire moyenne en masse du ou des (co)polymère(s) est comprise entre 5 000 et 30 000 g/mol. Selon un mode de réalisation, le(s) principe(s) actif(s) présente(nt) un groupe terminal qui a tendance à se localiser à l’interface de la cavité de la matrice polymérique, au sein de(s) inclusion(s). Selon un autre mode de réalisation, les molécules de principes actifs sont dissoutes dans l’eau. De préférence, au sein de(s) inclusion(s), le(s) principe(s) actif(s) présente(nt) des charges opposées à celles des groupements terminaux des polymères, localisés à l’interface de la cavité de la matrice polymérique Selon l’invention, le(s)dit(s) principe(s) actif(s) sont chargés et les groupes terminaux des chaines de polymère présentent une charge opposée, à pH donné, ceci signifiant qu’il existe des interactions de type électrostatique entre les extrémités terminales du ou des polymère(s) et le principe actif encapsulé. Il a été démontré que des interactions favorables entre le polymère et le principe actif conduisent à des NPs de structure poreuse avec des inclusions aqueuses dans lesquelles se loge le principe actif. Ce pH est par exemple le pH physiologique 7.4, pour lequel les interactions vont être de type attracteur. Typiquement, à pH 7.4, les extrémités terminales du polymère sont chargées négativement et le principe actif est chargé positivement. Selon l’invention, la nature et l’intensité de l’interaction électrostatique peuvent varier avec le pH. Ainsi, il est entendu qu’à un autre pH, les charges du polymère et du principe actif vont être modifiées, de sorte que les interactions polymère/principe actif vont varier. Ainsi, il a été démontré que lorsque les interactions sont faibles, aucune inclusion n’est formée au sein des NPs qui ne retiennent pas le principe actif lors de la fabrication. Ainsi, à pH acide, tel que discuté ci-avant, l’attraction polymère/principe actif va s’affaiblir (les groupements terminaux du polymère étant plus protonés et la charge du principe actif étant moindre), de sorte que le principe actif pourra être libéré de la matrice polymérique. Aussi, lorsqu’un polymère sans groupement terminal acide est utilisé, ces interactions électrostatiques ne peuvent pas avoir lieur et l’incorporation du principe actif est très réduite. Selon un mode de réalisation, les interactions électrostatiques pouvant exister entre les polymères et les groupes terminaux du/des principe(s) actif(s) orientent le positionnement des molécules de principe(s) actif(s), de sorte que les groupes terminaux soient localisés à l’interface de la cavité avec la matrice polymérique. Selon un mode de réalisation, la charge totale principe actif incorporé est comprise supérieure à 10%, typiquement entre 10 et 50%, notamment entre 4 et 25% (en poids) lorsque au moins deux principes actifs sont présents. Selon un mode de réalisation, les NPs contiennent au moins un agent antibiotique, anticancéreux, antiseptique, catécholamine, anti-asthénique, ou acide aminé, à titre de principe actif. Typiquement, le principe actif est un antibiotique, tel que la VCM ou l’amikacine. Le principe actif est avantageusement choisi parmi les principes actifs pouvant porter une ou plusieurs charges positives. Le principe actif peut être présent sous forme d’hydrate et/ou de sel pharmaceutiquement acceptable. En effet, le principe actif peut posséder une fonction suffisamment acide ou une fonction suffisamment basique ou les deux, et peut donc être présent sous forme de sels correspondants d’acide organique ou minéral ou de base organique ou minérale pharmaceutiquement acceptables. Selon un mode de réalisation, la VCM se présente sous la forme de chlorhydrate. L’expression « sels pharmaceutiquement acceptables » fait référence aux sels d’addition acide relativement non toxiques, inorganiques et organiques, et les sels d’addition de base, des composés de la présente invention. Ces sels peuvent être préparés in situ pendant l’isolement final et la purification des composés. En particulier, les sels d’addition acide peuvent être préparés en faisant réagir séparément le composé purifié sous sa forme épurée avec un acide organique ou inorganique et en isolant le sel ainsi formé. Parmi les exemples de sels d’addition acide on trouve les sels bromhydrate, chlorhydrate, sulfate, bisulfate, phosphate, nitrate, acétate, oxalate, valerate, oléate, palmitate, stéarate, laurate, borate, benzoate, lactate, phosphate, tosylate, citrate, maléate, fumarate, succinate, tartrate, naphthylate, mésylate, glucoheptanate, lactobionate, sulfamates, malonates, salicylates, propionates, méthylènebis-b-hydroxynaphtoates, acide gentisique, iséthionates, di-p-toluoyltartrates, methanesulfonates, éthanesulfonates, benzenesulfonates, p-toluenesulfonates, cyclohexyl sulfamates et quinateslaurylsulfonate, et analogues. (Voir par exemple S.M. Berge et al. « Pharmaceutical Salts » J. Pharm. Sci , 66 : p.1-19 (1977)). Les sels d’addition acide peuvent également être préparés en faisant réagir séparément le composé purifié sous sa forme acide avec une base organique ou inorganique et en isolant le sel ainsi formé. Les sels d’addition acide comprennent les sels aminés et métalliques. Les sels métalliques adaptés comprennent les sels de sodium, potassium, calcium, baryum, zinc, magnésium et aluminium. Les sels de sodium et de potassium sont préférés. Les sels d’addition inorganiques de base adaptés sont préparés à partir de bases métalliques qui comprennent hydrure de sodium, hydroxyde de sodium, hydroxyde de potassium, hydroxyde de calcium, hydroxyde d’aluminium, hydroxyde de lithium, hydroxyde de magnésium, hydroxyde de zinc. Les sels d’addition aminés de base adaptés sont préparés à partir d’amines qui ont une alcalinité suffisante pour former un sel stable, et de préférence comprennent les amines qui sont souvent utilisées en chimie médicinale en raison de leur faible toxicité et de leur acceptabilité pour l’usage médical : ammoniac, éthylènediamine, N-méthyl-glucamine, lysine, arginine, ornithine, choline, N,N’-dibenzylethylenediamine, chloroprocaïne, diéthanolamine, procaïne, N-benzyl-phénéthylamine, diéthylamine, pipérazine, tris(hydroxymethyl)-aminomethane, hydroxyde de tétraméthylammonium, triéthylamine, dibenzylamine, éphénamine, dehydroabietylamine, N-ethylpiperidine, benzylamine, tétra-méthylammonium, tétraéthylammonium, méthylamine, diméthylamine, triméthyl-amine, éthylamine, acides aminés de base, par exemple lysine et arginine, et dicyclohexylamine, et analogues. Notamment, les NPs peuvent contenir typiquement au moins deux principes actifs ayant par exemple une action complémentaire, potentialisée ou synergique. Généralement, les principes actifs sont présents au sein des inclusions de la matrice polymérique. Avantageusement, elles peuvent également contenir un principe actif choisi parmi les agents antibiotiques et une NP métallique, présentant typiquement un diamètre inférieur à 40 nm. A titre de particule métallique, on peut notamment citer les NPs d’argent, ou de cuivre, ou bimétallique (argent/cuivre). Selon un autre objet, la présente invention concerne également une suspension aqueuse ou poudre lyophilisée comprenant des NPs selon l’invention. La suspension présente typiquement une concentration en NPs comprises entre 1 et 15 mg/mL. La poudre peut être obtenue par sédimentation, extraction et lyophilisation de la suspension de NPs. Selon un autre objet, la présente invention concerne aussi un procédé de préparation de NPs selon l’invention, comprenant les étapes de : Dissolution du ou des principe(s) actif(s) dans de l’eau Ajout du ou des (co)polymère(s) éventuellement en mélange dans un solvant organique Emulsification Ajout d’eau et éventuellement un ou plusieurs tensioactif(s) Emulsification Ce procédé est schématiquement représenté dans la figure 1A. La concentration du principe actif dans la solution aqueuse peut être comprise entre 10 et 200 mg/mL. Le solvant organique peut être choisi en fonction de la solubilité des polymères. Typiquement, le dichlorométhane peut être utilisé à titre de solvant organique. L’émulsification peut être réalisée par sonication. A tire de tensioactif ou d’agent stabilisant, on peut notamment mentionner le PVA (alcool polyvinylique). Avantageusement, les NPs peuvent associer des particules d’argent ou de cuivre/argent au PVA selon un procédé de radiolyse. Il est entendu que d’autres types de particules métalliques peuvent être synthétisées et associées au polymère par ce même procédé. Selon un autre objet, la présente invention concerne encore un médicament comprenant des NPs selon l’invention, et un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables, pour la libération contrôlée dépendant du pH de principe actif. De préférence, ledit médicament contient une quantité efficace du composé selon l’invention. De préférence, ledit médicament est administré à un patient qui en a besoin. Les compositions pharmaceutiques selon l’invention peuvent être présentées sous des formes destinées à l’administration par voie parentérale telle que iv, orale, topique (transmuqueuse ou cutanée), intratumorale. Elles seront donc présentées sous forme de solutés ou de suspensions injectables ou flacons multi-doses, sous forme de comprimés nus ou enrobés, de dragées, de capsules, de gélules, de pilules, de cachets, de poudres, de solutions ou de suspensions. Les excipients qui conviennent pour de telles administrations sont les dérivés de la cellulose ou de la cellulose microcristalline, les carbonates alcalino-terreux, le phosphate de magnésium, les amidons, les amidons modifiés, le lactose pour les formes solides. Pour l’usage parentéral, l’eau, les solutés aqueux, le sérum physiologique, les solutés isotoniques sont les véhicules les plus commodément utilisés. La posologie peut varier dans les limites importantes (0,5 mg à 1000 mg) en fonction de l’indication thérapeutique et de la voie d’administration, ainsi que de l’âge et du poids du sujet. Selon un autre objet, la présente invention concerne les utilisations thérapeutiques desdites NPs, notamment pour leur utilisation pour le traitement des infections bactériennes ou du cancer. Ainsi, dans le cadre des utilisations pour le traitement des infections antibactériennes, on peut notamment citer à titre de principe actif les agents antibiotiques tels que la VCM, l’amikacine ou la gentamicine. Ainsi, dans le cadre des utilisations pour le traitement des infections anticancéreuses, on peut notamment citer à titre de principe actif les agents anticancéreux tels que le cyclophosphamide, le cisplatine ou l’oxaliplatine. On peut également envisager, à titre de principe actif des agents antiseptiques tel que le chlorure de benzalkonium, ou de type catécholamine tel que l’adrénaline, les acides aminés, les anti-asthéniques à base d’acides aminés. Figures : La Figure 1a) est une représentation schématique de la préparation de NPs de PLGA (EXPANSORB® 10P019) chargées en VCM, au moyen d’une double émulsion par la méthode d’évaporation de solvant (w1/o/w2). La Figure 1b) est une image de microscopie électronique à balayage (MEB, ou Scanning Electron Microscopy SEM) de NPs de PLGA (EXPANSORB® 10P019) charges en VCM. La Figure 2 représente a) Cliché TEM de NP de PLGA (EXPANSORB® 10P019) chargées en VCM. b) Images par cryo-microscopie électronique à transmission (CryoTEM) de NPs en PLGA (EXPANSORB® 10P019) chargées en VCM, c) Images CryoTEM de NPs en PLA (EXPANSORB® 10P006) chargées en VCM, d) Images CryoTEM de NPs en PLGA (EXPANSORB® 10P019) chargées en VCM, après 48h d’incubation dans du PBS pH 5.5, e) Images CryoTEM de NPs en PLGA (EXPANSORB® 10P019) chargées en VCM, après 48h d’incubation dans l’eau et f) Images CryoTEM de NPs vides en PLGA (EXPANSORB® 10P019). La Figure 3a représente les profils de libération de la VCM à partir de NPs en PLGA (EXPANSORB® 10P019), dans du tampon phosphate (PB) dans 100 mM à 37°C et à pH=5,3 (sphère), pH=6,3 (triangle), pH=7,4 (diamant) et dans du milieu de culture cellulaire complet (carré). La figure 3b représente les profils de libération de la VCM à partir de NPs en PLGA (EXPANSORB® 10P019), dans le milieu de culture cellulaire complet. Après 1 heure, le pH du milieu de libération a été fixé à 5,3 entrainant la libération immédiate de la VCM. Ceci montre le caractère pH-répondant des NPs chargées en VCM. La Figure 4 illustre la libération de VCM par les NPs en PLGA (EXPANSORB® 10P019) co-incorporant la VCM (12±4%) et l'amikacine (Ami) (4±2%) dans du PB 100 mM à pH 5 (sphère), pH 6 (carré) et pH 7 (ligne pointillée). Les études ont été conduites à 37°C, sous agitation. La Figure 5 représente les spectres d'absorbance UV-vis. a) NPs d’argent (AgNPs) et b) NPs bimétalliques argent-cuivre (AgCuNPs). La Figure 6 représente a) Image TEM des AgNPs. b) Histogramme de la distribution des diamètres obtenue par ImageJ (d = 20 ± 2 nm). c) Image TEM des AgCuNPs. d) Histogramme de la distribution des diamètres obtenue par ImageJ (d = 27 ± 7 nm). N(dc) se réfère aux comptages totaux et la barre d'échelle correspond à 50 nm. La Figure 7 représente des images TEM de NPs en PLGA (EXPANSORB® 10P019) décorées de NPs métalliques. a) PLGA-VCM-AgNPs. b) PLGA-VCM-AgCuNPs. c) PLGA-VCM-AgNPs/AgCuNPs après libération de la VCM. Les exemples suivants illustrent l'invention, sans toutefois la limiter. EXEMPLES Matériaux et méthodes Produits chimiques Une série de polymères PLGA et PLA avec différents groupements terminaux, ratios molaires L:G et masses molaires moyennes en masse (MW) a été utilisée : PLGA 50:50 groupement terminal acide (MW: 40-64 KDa, EXPANSORB® 10P001), PLGA 75:25 groupement terminal acide (MW: 36-77 KDa, EXPANSORB® 10P002), PLGA 75:25 groupement terminal acide (MW: 70-125 KDa, EXPANSORB® 10P003), PLGA 50:50 groupement terminal acide (MW: 80-130 KDa, EXPANSORB® 10P012), PLGA 75:25 groupement terminal acide (MW: 4-16 KDa, EXPANSORB® 10P015),PLGA 50:50 groupement terminal ester (MW: 72-91 KDa, EXPANSORB® 10P016), PLGA 50:50 groupement terminal acide (MW: 20-40 KDa, EXPANSORB® 10P017), PLGA 50:50 groupement terminal acide (MW: 10–20 KDa, EXPANSORB® 10P019), PLGA 50:50 groupement terminal ester (MW: 10-20 KDa, EXPANSORB® 10P024), PLGA 45:55 groupement terminal acide (MW: 15-30 KDa, EXPANSORB® 10P032), PLGA 75:25 groupement terminal ester (MW: 32-63 KDa, EXPANSORB® 10P035), PLA groupement terminal acide (MW: 10-27 KDa, EXPANSORB® 10P005) et PLA groupement terminal acide (MW: 5-15 KDa, EXPANSORB® 10P006) Tous ces (co)polymères ont été fournis par Seqens (Expansorb, Aramon, France). VCM hydrochloride a été acheté chez Sigma-Aldrich. D’autres composés, incluant l’amikacine sulfate (Ami), l’alcool polyvinylique (PVA) (30000-70000 g/mol, 88% hydrolysé), le cholate de sodium, le dichlorométhane (DCM), l’acide trifluoracétique (TFA), l’acide hydrochlorique (HCl), le chlorure de sodium (NaCl), le chlorure de potassium (KCl), le phosphate dibasique de sodium (Na 2 HPO 4 ), et le phosphate de potassium monobasique (KH 2 PO 4 ) ont tous été obtenus de Sigma-Aldrich. Les solvants étaient de qualité analytique. Le milieu de culture cellulaire complet a été préparé avec du DMEM (LifeTechnologies,France) complété par 10 % v/v de sérum fœtal bovin (FBS) (Life Technologies, France) et 1 % de pénicilline/ streptomycine (Life Technologies, France). Préparation de nanoparticules de PLA ou PLGA. Des NPs chargées en VCM ont été préparées à partir d’émulsions de type eau/huile/eau, selon une méthode d’émulsification-évaporation de solvant en utilisant le PVA comme agent tensioactif. Le procédé de fabrication des NPs chargées en antibiotique(s) est illustré de manière schématique dans la Figure 1 (A). La préparation comprend deux étapes et conduit à l’obtention d’ émulsions de type eau-dans-huile-dans-eau (w1/o/w2). La VCM est ainsi incorporée dans des gouttelettes d'eau à l'intérieur de de goutelettes huileuses contenant le polymère biodégradable. En bref, 0.2 mL de solution aqueuse de VCM (150 mg/mL) ont été dispersés dans 1 mL de DCM contenant le PLGA ou le PLA (75 mg). Le mélange a été vortexé puis soumis à une sonication à l'aide d'une sonde (Sonopuls HD 2070, BANDELIN electronic GmbH & Co, Berlin, Germany) pendant 15 s. Pour créer les doubles-émulsions eau/huile/eau, 5 mL de solution de PVA (0.5% p/v) (ou sodium cholate) contenant ou non 1% w/v NaCl ont été versés, suivi d’une nouvelle sonication de 30 secondes dans un bain de glace pour éviter la surchauffe. Cette émulsion a été maintenue sous agitation magnétique douce à température ambiante pendant une nuit pour permettre l’évaporation du solvant organique. Comme contrôle, des NP vides (sans VCM) ont été préparées dans les mêmes conditions. Toutes les formulations ont été préparées en triplicata. Pour la co-incorporation du VCM et de l'Ami, la même procédure a été suivie en modifiant uniquement la composition de la phase aqueuse interne de 0,2 mL. Dans la co-incorporation, cette phase contient à la fois du VCM et de l'Ami (les concentrations et les volumes utilisés sont indiqués dans la section des résultats). Préparation de nanoparticules d’argent et de nanoparticules bimétalliques d’argent et cuivre Les ions Ag + ont été réduits par radiolyse afin de produire des NPs. Le précurseur Ag 2 SO 4 (à une concentration en argent ionique de 2×10 −3 M) a été solubilisé dans une solution aqueuse contenant 0.5% p/v PVA (avec 0,1 M de propanol-2, utilisé comme capteur de radicaux HO . générés par radiolyse de l'eau) (Remita et al Recent Trends in Radiation Chemistry; World Scientific, 2010; pp 347−383 et Remita et al Radiat . Phys. Chem., 72, 575-586, (2005).). La solution a été dégazée à l'azote, puis irradiée avec une source gamma panoramique 60 Co (débit de dose = 4,27 kGy h -1 ) pendant 57 minutes (dose totale de 4 kGy). La dose appliquée est suffisante pour réduire tous les ions métalliques à leur valence zéro. Les NPs d'AgCu ont été synthétisées selon la même procédure que celle décrite ci-dessus en utilisant un mélange de précurseurs Ag 2 SO 4 et CuSO 4 (les concentrations d'argent et de cuivre ioniques étant de 1×10 -3 M). Préparation de NPs PLA/PLGA contenant à la fois la VCM et les NPs d’argent ou les NP d’argent et cuivre. Les NPs de PLGA ou PLA contenant à la fois de VCM et des NP d'Ag ont été préparées selon la même procédure que celle décrite en section 2 ci-dessus, en remplaçant les 5 mL de solution de PVA à 0,5 % p/v utilisée pour créer l'émulsion eau/huile/eau par 5 mL de solution de PVA à 0,5 % p/v où les NP d'Ag ou les NPs d’AgCu étaient précédemment synthétisées (comme expliqué en section 3). Détermination de la quantité de VCM encapsulée L'encapsulation du médicament a été déterminée en quantifiant à la fois : i) la quantité de médicament non encapsulé présente dans le surnageant obtenu après centrifugation à 17 000 x g pendant 15 minutes à température ambiante (TA) et ii) le médicament extrait des NPs par dissolution dans du DMSO. Tous les échantillons ont été dosés par chromatographie liquide en phase inverse, en utilisant un système HPLC (Agilent 1100, USA) connecté à une colonne C18 (Kinetex 5u C18, 100 A, Phenomenex), et à un détecteur UV-vis (la longueur d'onde fixée à λ = 254 nm pour la VCM) et un détecteur universel ELSD pour l’Ami. La phase mobile A était composée d'eau et la phase mobile B était composée d'acétonitrile, les deux contenant 0,1 % de TFA (Tableau 1). La séparation chromatographique du VCM et de l'Ami a été effectuée à température ambiante avec un débit de phase mobile de 1 mL/min en mode gradient (tableau 1). Le volume d'injection était de 10 µL. Les paramètres du détecteur ELSD ont été optimisés afin d'obtenir une séparation optimale. Les conditions ELSD étaient les suivantes : pression de gaz du nébuliseur de 1,5 SLM, température du nébuliseur de 50 °C. Tableau 1 programme HPLC : gradients des deux phases A et B. Time (min) A (%) B (%) 0 90 10 6 55 45 10 90 10 La charge de médicament (DL) est définie comme la fraction massique de médicament incorporée dans les NPs et a été calculée selon l'équation 1. Le rendement d’incorporation (EE) est défini comme la fraction de médicament effectivement encapsulée dans les NP comparativement à la quantité utilisée pour préparer les NPs, selon l'équation 2. [Math 1] DL (%) = [Math 2] EE (%) = Quantification de la quantité de PVA entrant dans la composition des nanoparticules Le PVA résiduel entrant dans la composition des NPs en PLGA ou PLA a été quantifié par un dosage colorimétrique, basé sur la d'un complexe bleu entre le PVA et l’iode en présence d'acide borique, selon le protocole décrit par Zambaux et al . (Journal of Controlled Release, 1998; 50(1-3); 31-40). Etudes de libération du médicament Des études de libération de VCM à partir des formulations de NPs ont été effectuées après dilutions (x 10) dans du PB 100 mM à trois pH différents (5,3, 6,4 et 7,4) et aussi avec du milieu de culture cellulaire complet au pH physiologique et au pH 5 (acidifié avec du HCl 1N). Après incubation à 37ºC sous agitation pendant des durées de temps bien définies (0h, 1h, 3h, 6h et 24h), les suspensions ont été centrifugées à 17.000 x g pendant 15 min à TA. La libération a ensuite été déterminée par la méthode HPLC-UV-vis-ELSD comme décrit ci-dessus en se référant à la DL initiale de la formulation. Toutes les formulations ont été préparées en triplicata. Caractérisation des nanoparticules Mesures de diamètre hydrodynamique et potentiel Zeta Le diamètre hydrodynamique moyen des NPs a été déterminé par diffusion quasi-élastique de la lumière (DLS) à 25 °C avec un temps d'équilibrage de 60 s en utilisant un Zetasizer® de Malvern (Nano ZS90, Malvern 278 Instruments S.A., Worcestershire, UK). Toutes les formulations ont été mesurées au moins en triplicatas. Les diamètres moyens ont été rapportés comme Z Moyenne (nm) ± SE (Erreur type) avec l'indice de polydispersité (PDI). Les diamètres moyens des NPs ont été contrôlés jusqu'à trois mois de stockage à 25 °C. Le potentiel zêta des NPs a été mesuré dans une solution de KCl 1 mM avec le même appareil (Nano ZS90). 8.2. Microscopie électronique à transmission (TEM) Des images TEM ont été acquises à l’aide d’un microscope électronique JEOL (JEM 100 CX II, fonctionnant à 120 kV). Pour cela, 5uL d'échantillons ont été déposés sur une grille en cuivre pendant 1min, puis l'excès de liquide a été retiré. Des images Cryo-TEM ont été acquises à l'aide d'un microscope électronique à émission de champ (20 eV) à filtre énergétique JEOL 2200FS fonctionnant à 200 kV. 5 μL de suspensions de NPs ont été déposées sur une grille de cuivre et surgelées dans de l'éthane liquide refroidi à l'azote liquide. Incorporation de la VCM dans les NPs La précipitation rapide du polymère lors de l’évaporation du solvant organique entraine la solidification des NPs. Celles-ci présentent une forme sphérique d’après les clichés obtenus par SEM (figure 1 (B)). La polydispersité obtenue par DLS (égale ou inférieure à 0,25) démontre une bonne homogénéité des échantillons (Tableau 2). Le potentiel zêta de chaque formulation était proche de 0, ce qui peut être attribué à la présence de PVA (agent tensioactif non ionique) à la surface des NPs. Le PVA a été utilisé comme agent stabilisant lors de l’élaboration des doubles émulsions. La quantité d PVA résiduel avoisine les 6±2 % en poids pour toutes les formulations. Malgré des nombreuses étapes de lavage à l’eau, le PVA résiduel ne peut pas être décroché de la surface des NPs. Des tentatives de substitution du PVA par un autre agent tensioactif ont été entreprises. L'utilisation du cholate de sodium, un surfactant présentant une charge négative due à la présence de carboxylates, n'a pas pu conduire à la formation de NPs. Une séparation de phase a eu lieu lors des étapes d’émulsification. Tableau 2. Incorporation de la VCM dans des NPs élaborées à partir de différents (co)polymères. Effet sur DL, EE, diamètre moyen (d), PDI et potentiel Zeta. *Les écarts type (SD) pour les mesures de d sont de ± 25 nm pour toutes les formulations. Le rapport des unités acide lactique (L) et acide glycolique (G) varie entre 50/50 et 100/1. Les masses molaires moyennes en masse (M w ) sont comprises entre 4 et 130 KDa. Polymers (Reference EXPANSORB®) Nom Rapport molaire L/G Groupement terminal Viscosité (dL/g) M w (kDa) DL (%wt + SD) EE (%wt + SD) d (nm)* PDI Potentiel Zeta (mV + SD) 10P005 PLA 100 COOH 0.15-0.30 10 - 27 322 0.25±0.07 -1.7±0.1 10P006 PLA 100 COOH 0.05-0.20 5 - 15 7±2 16±5 319 0.18±0.05 -1.6±0.1 10P003 PLGA 75/25 COOH 0.70-0.90 70 - 125 352 0.14±0.01 -1.3±0.3 10P002 PLGA 75/25 COOH 0.38-0.64 36 - 77 350 0.16±0.03 -1.4±0.1 10P015 PLGA 75/25 COOH 0.08-0.21 4 - 16 5±1 11±2 312 0.13±0.01 -1.9±0.1 10P012 PLGA 50/50 COOH 0.65-0.90 80 - 130 367 0.17±0.03 -1.4±0.1 10P001 PLGA 50/50 COOH 0.40-0.55 40 - 64 324 0.14±0.01 -1.4±0.3 10P017 PLGA 50/50 COOH 0.25-0.40 20 - 40 8±1 18±2 326 0.21±0.03 -0.7±0.3 10P019 PLGA 50/50 COOH 0.15-0.25 10 - 20 14±4 36±2 325 0.19±0.02 -1.9±0.1 10P032 PLGA 45/55 COOH 0.15-0.30 15 - 30 9±1 24±1 323 0.18±0.03 -1.3±0.1 10P035 PLGA 75/25 ESTER 0.30-0.50 32 - 63 5±1 11±3 338 0.16±0.02 -1.4±0.3 10P016 PLGA 50/50 ESTER 0.60-0.70 72 - 91 344 0.15±0.04 -1.4±0.2 10P024 PLGA 50/50 ESTER 0.15-0.25 10 - 20 323 0.26±0.04 -0.9±0.1 Le Tableau 2 montre que le diamètre moyen des NPs varie peu avec la nature du (co)polymère utilisé. Par exemple, les matériaux EXPANSORB® 10P019, 10P002 et 10P012 conduisent à la formation de NPs de diamètre moyen de 325±25, 350±25 et 367±25 nm, respectivement. Il est à noter que l’utilisation de sel (NaCl, 0,5 %) dans la phase dispersante augmente le DL en favorisant la précipitation plus rapide des (co)polymères. Par exemple, dans le cas du PLGA (EXPANSORB® 10P019), le DL est de 14±4 % (pds) avec sel et 10±3 % sans sel. Bien que toutes les formulations présentent des propriétés similaires (d, PDI, potentiel zêta), elles possèdent des différences significatives en ce qui concerne le DL et l’EE qui sont liées à la nature des (co)polymères utilisés (groupements terminaux acide ou ester, masses molaires moyennes en masse M w , composition chimique L/G) (Tableau 2). Plus précisément, les NPs préparées avec le copolymère EXPANSORB® 10P019, ayant une faible M w , un rapport L/G de 50/50 et un groupement terminal carboxylate ont la meilleure capacité d’incorporation de la VCM (DL de 14±4 % en poids et EE de 36±2 %) tandis que d’autres matériaux n’incorporent pas la VCM (DL la présence de groupements terminaux COOH favorise les interactions avec la VCM conduisant à une bonne incorporation. Les polymères avec des groupements terminaux ester n’incorporent pas la VCM ; la masse molaire est importante : plus celle-ci est réduite, meilleure est l’incorporation de la VCM l’hydrophilie du copolymère PLGA joue aussi un rôle : plus le copolymère est hydrophile (teneur en acide glycolique importante) plus les DL et EE sont est élevés En effet, les propriétés physico-chimiques du VCM permettent les interactions électrostatiques avec le polymère lors de la formation de la première émulsion (Fig 1). Au pH légèrement acide de la première émulsion, le VCM présente une charge positive globale dans la solution (Johnson et al AAPS Pharmscitech; 2006; 7(1); E33–E37) tandis que les groupements carboxyle terminaux (pKa=3.85) des (co)polymères sont déprotonés (Yoo et al. PNAS; 107(25); 11205-10). Ceci explique les DL plus élevés obtenus avec les (co)polymères à terminaisons COOH par rapport à ceux à groupements terminaux ESTER (Tableau 1) (Giammarco et al. Journal of Colloid and Interface Science 468; 2016; 253–261) Il est à noter que la VCM est connue pour s'auto-associer facilement en solution via la formation de liaisons hydrogène amide-amide intermoléculaires et la formation spontanée de dimères et d'oligomères du VCM a été signalée. (Williams et al. PNAS; 1993; 90(4); 1172–1178) (Williams et al. Science; 1998; 280; 711–714). La formation d’agrégats de VCM dans la phase aqueuse interne devrait diminuer les possibilités de diffusion de la molécule active vers le milieu dispersant, donc conduire à une augmentation de la charge en VCM. En modifiant le pH de la solution, il est possible de modifier les interactions électrostatiques entre le polymère et le VCM ainsi que le profil de dimérisation/ oligomérisation du VCM (McPhail et al. J. Chem. Soc., Faraday Trans.; 1997; 93(13); 2283-2289). En rappelant nos observations expérimentales, lorsque le pH de la solution aqueuse de VCM (150 mg/mL) a été fixé à 7,4, nous avons obtenu une solution très visqueuse, ce qui conforte l’hypothèse de l'oligomérisation de la VCM. En effet, lorsque l'encapsulation de la VCM a été effectuée à pH interne de 7.4 et non de 4, des valeurs beaucoup plus élevées de DL et de LE ont été obtenues (22±1 % et 47±2 % respectivement à pH 7.4 par rapport à 14±4 et 36±2% respectivement à pH 4). Ce phénomène a été associé à l'oligomérisation de la VCM à un pH de 7,4, ce qui a permis d'éviter les fuites lors de la préparation des NPs, sans que cela ait une influence sur leur taille finale. Caractérisation des NPs chargées en VCM Les structures représentées schématiquement dans la Fig. 1 ont pu être révélées par une analyse TEM avant et après congélation des suspensions de NPs (cryoTEM) (Fig 2). Toutes les NPs sont sphériques. Les compartiments aqueux internes contenant la VCM apparaissent en clair sur un fond plus foncé correspondant à la matrice en (co)polymère. Ces compartiments sont délimités par des fines couches en polymère. Au contraire, les NPs non chargées (préparées en suivant la même procédure, en utilisant de l'eau sans VCM dans la première émulsion) apparaissent comme des structures pleines sans inclusions (Figure 2 (F)) ce qui est en accord avec le mécanisme d’incorporation de la VCM proposé. Libération de la VCM Le profil de libération des formulations de NPs a été évalué à pH 7,4, 6,3 et 5,3 dans du PB (100mM) à 37°C. Comme le montre la figure 3A, seulement 10 % du VCM est libéré après 24 heures à un pH de 7,4, alors que la majeure partie du VCM (70-75 %) est libéré en 1 heure à pH 5,3. A ce même pH la libération est totale après 24 heures. A pH 6,3, la libération de VCM montre un profil intermédiaire entre ceux à pH 7.4 et 5.3, montrant que la libération de l’antibiotique est pH-dépendante. Une tendance similaire a été observée lors de la libération dans un milieu de culture cellulaire complet (Fig 3B). Pendant 24 heures, 35% de la quantité initiale de VCM ont été libérés. Dans une étude parallèle, les NPs ont été incubées pendant 1 heure dans un milieu de culture cellulaire complet, puis le pH du milieu a été fixé à 5,3 (correspondant à un pH légèrement acide mimant des cellules infectées) et une libération immédiate de VCM a été observée (autour de 45%), suivie d'une libération plus progressive jusqu'à environ 94% après 24h (Fig 3B). Comme indiqué précédemment, le phénomène de dimérisation/ oligomérisation de la VCM survient à un pH de 7,4 et ce processus est réversible (Phillips-Jones et al. Sci. Rep.; 2017; 7; 12697). Nos observations expérimentales sont en accord avec ces travaux dans la littérature, mettant en évidence une diminution de la viscosité des solutions de VCM lorsque le pH diminue de 7,4 à 6,3 puis 5,3. La charge négative du polymère-COOH diminue elle aussi avec la diminution du pH de 7,4 à 6,3 puis 5,3, réduisant les interactions avec la VCM qui elle, garde une charge pratiquement constante entre pH 6,3 et 5,3. Cela pourrait expliquer la libération rapide de la VCM à partir des compartiments internes aqueux lorsque le pH est aux alentours de 5. Cette propriété pourrait être exploitée pour une libération pH-dépendante dans des compartiments intracellulaires acides (endosomes) ou au niveau d’un site infecté. La forme sphérique des NPs est préservée après 24h quel que soit le milieu de libération (Figures 2 (D) et (E)). Dans des conditions physiologiques, la libération est inférieure à 10% et dans un milieu de culture cellulaire complet, seulement 30% du VCM a été libéré après 24h. Par ailleurs, lors d’une conservation des NPs chargées en VCM sous la forme de suspensions, moins de 1 % de la molécule active est libérée, ce qui démontre la stabilité des formulations. 10. Co-incorporation de la VCM et de l’Ami dans des NPs en PLGA La préparation des solutions VCM-Ami nécessite une attention particulière en raison de la possible formation de solutions gélifiées en fonction des concentrations et du pH utilisé. Les solutions VCM-Ami numérotées 1-6 dans le Tableau 3 ont été utilisées immédiatement après le mélange. La solution 7 a été obtenue en préparant d’abord une solution de VCM à 150 mg/mL, suivi du rajout de l’Ami sous forme de poudre. Immédiatement après dissolution de l’Ami, la solution VCM-Ami a été utilisée pour la préparation de NPs, afin d’éviter une gélification observée au cours du temps. Table 3. Préparation et caractérisation de NPs contenant VCM-Ami. Les volumes V VCM et V Ami rajoutés pour former la première émulsion ont été variés entre 50 et 300 µL, et les concentrations c des deux molécules actives entre 0 et 300mg/mL. *Les écarts type (SD) pour les mesures de d sont de ± 25 nm pour toutes les formulations. No. VCM Ami DL (%pds) d (nm)* C VCM (mg/mL) V VCM (µL) C Ami (mg/mL) V Ami (µL) DL VCM (%) DL Ami (%) 1 150 200 50 0 15±4 0 324 2 150 150 50 50 10±2 3±2 314 3 150 100 50 100 6±2 4±2 318 4 150 50 50 150 3±1 4±2 297 5 150 0 50 200 0 6±2 284 6 0 0 300 200 0 21v2 287 7 200 µl de l'eau contenant à la fois VCM (150 mg/mL) et Ami (50 mg/mL) 12±4 4±2 294 8 200 µl de 100 mM PB (pH=4.5) contenant à la fois du VCM (150 mg/mL) et de l'Ami (300 mg/mL) conduit à la formation immédiate de gel Le DL du VCM atteint 15±4 % lorsque 200 µL de solution de VCM à 150 mg/mL ont été utilisés. Le remplacement du VCM par l’Ami entraîne une diminution du DL de VCM et une augmentation du DL de l’Ami. La meilleure co-incorporation (DL de 12±4 % pour le VCM et 4±2 % pour l'Ami) a été obtenue lorsque la poudre d'Ami a été ajoutée à la solution de VCM pour atteindre une concentration finale de 150 mg/mL et 50 mg/mL pour le VCM et l'Ami, respectivement. Par ailleurs, la solubilité de l'Ami a augmenté de façon significative jusqu'à 300 mg/mL en milieu acide (pH=4,5), ce qui a permis la préparation de NPs en PLGA (EXPANSORB® 10P019) avec un DL de l'Ami de 21±2%. Ceci montre qu’un autre antibiotique (l’Ami) peut être incorporé par le même procédé d’émulsification (Fig. 1). La co-incorporation de la VCM et de l’Ami conduit à des NPs composites présentant une libération réduite ( 11. Préparation de NPs contenant la VCM et des NPs métalliques- 11.1 Préparation et caractérisation de AgNPs et AgCuNPs Les NPs à base d’Ag ou Ag et Cu (AgNPs et AgCuNPs) ont été synthétisées comme décrit dans la section expérimentale. Elles présentent pour les AgNPs une bande plasmonique (Fig. 5) centrée à environ 405nm (avec une largeur à mi-hauteur (FWHM) de 60 nm) et, pour les AgCuNPs, deux bandes plasmon une centrée à 408 nm (avec une largeur à mi-hauteur de 70 nm) caractéristique de l’argent et une plus faible avec un maximum autour de 580 nm caractéristique du cuivre. Les clichés TEM montrent que ces NPs sont sphériques et ont une taille homogène (Fig. 6). Les diamètres moyens des AgNPs et AgCuNPs sont de 20 ± 2 nm et de 27 ± 7 nm, respectivement. 11.2 NPs de PLGA-VCM-AgNPs/AgCuNPs. Des NPs en PLGA (EXPANSORB® 10P019) contenant la VCM ont été préparées en utilisant une solution de PVA dans laquelle les NPs métalliques ont été synthétisées par radiolyse. L'utilisation de cette solution contenant AgNPs/AgCu NPs n'affecte pas le DL (12±3 % en poids) ni la taille mesurée par DLS (325±25 nm). Après avoir effectué la préparation des PLGA-VCM-AgNPs/AgCuNPs comme expliqué ci-dessus, il a été observé que les AgNPs et AgCuNPs décorent la surface des particules PLGA-VCM (Figure 7). De plus, il est possible de retrouver des NPs encore accrochées à la surface après la libération du VCM (Fig. 7c). Le PVA est enchevêtré avec les chaines de PLGA (Zambaux et al. J. Control Release; 1998; 50(1-3); 31-40), ce qui pourrait expliquer l’association des NPs métalliques à celles de PLGA. En effet, le test colorimétrique permettant le dosage du PVA (Zambaux et al. J. Control Release; 1998; 50(1-3); 31-40) indique la présence de 2,8±0,2 et 3,6±0,7 % pds PVA dans les PLGA-VCM-AgNPs/AgCuNPs, respectivement. 11.3 NPs de PLGA-PVA-AgNPs Il a été également possible de synthétiser les NPs d’Ag directement dans la couche en PVA recouvrant les NPs en PLGA (EXPANSORB® 10P019). Pour cela, les NPs ont été lavées du PVA résiduel après leur préparation, le précurseur Ag 2 SO 4 a été rajouté, la suspension a été dégazée à l’azote comme précédemment puis irradiée avec la source 60 Co. Nanoparticules pour la libération contrôlée de principe actif dépendant du pH, lesdites nanoparticules comprenant un ou plusieurs principes actifs encapsulés au sein d’une matrice polymérique, telles que : ladite matrice comprend un ou plusieurs (co)polymères biodégradables, le(s)dit(s) principe(s) actif(s) sont chargés et les groupes terminaux des chaines de polymère présentent une charge opposée à pH donné, établissant ainsi des interactions électrostatiques entre la matrice et le(s) principe(s) actif(s), les NPs ont un diamètre moyen en nombre inférieur à 500 nm, lesdites NPs étant caractérisées en ce que ladite matrice présente une ou plusieurs inclusions comprenant le ou les principes actifs et de l’eau. Nanoparticules selon la revendication 1 telles que le ou les polymères biodégradables sont choisis parmi PLGA (poly(acide lactique-co-glycolique), PLA (acide polylactique), et les copolymères de PLGA. Nanoparticules selon l’une quelconque des revendications précédentes telles que la masse molaire moyenne en masse du ou des (co)polymère(s) est comprise entre 5 000 et 30 000 g/mol. Nanoparticules selon l’une quelconque des revendications précédentes telles que le(s) (co)polymère(s) possèdent un ratio des unités lactique : glycolique compris entre 50 :50 et 100. Nanoparticules selon l’une quelconque des revendications précédentes telles que le(s)dit(s) copolymère(s) présentent des unités terminales de type acide (COOH) ou ester (COOAlkyle). Nanoparticules selon l’une quelconque des revendications précédentes telles que la charge en chaque principe actif incorporé est comprise entre 4 et 25% (en poids). Nanoparticules selon l’une quelconque des revendications précédentes, telles qu’elles contiennent au moins un agent antibiotique, anticancéreux, antiseptique, catécholamine, anti-asthénique, ou acide aminé, à titre de principe actif. Nanoparticules selon l’une quelconque des revendications précédentes, telles qu’elles contiennent deux principes actifs, ou un principe actif choisi parmi les agents antibiotiques et des nanoparticules métalliques, notamment de diamètre inférieur à 40 nm. Suspension aqueuse ou poudre lyophilisée comprenant des nanoparticules selon l’une quelconque des revendications précédentes. Procédé de préparation de nanoparticules selon l’une quelconque des revendications précédentes comprenant les étapes de : Dissolution du ou des principe(s) actif(s) dans de l’eau Ajout du ou des (co)polymère(s) éventuellement en mélange dans un solvant organique Emulsification Ajout d’eau et éventuellement un ou plusieurs tensioactif(s) Emulsification Médicament comprenant des nanoparticules selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, et un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables, pour la libération contrôlée dépendant du pH de principe actif. Nanoparticules selon l’une quelconque des revendications précédentes pour leur utilisation pour le traitement des infections bactériennes ou du cancer. Nanoparticules pour leur utilisation selon la revendication 12 comprenant la vancomycine.