Brevet FR3112284A1 — publié le 20220114

L’invention se rapporte au domaine de la préparation extemporanée de composition vaccinale à partir d’antigènes lyophilisés. Plus particulièrement, l’invention concerne l’utilisation de nanoparticules cationiques pour solubiliser des antigènes lyophilisés sans ajout d’adjuvant de lyophilisation en vue d’une utilisation extemporanée pour l’administration d’une composition vaccinale. Dans un mode de réalisation particulier, il permet de préparer une formulation vaccinale ou d’ajouter une ou plusieurs valences à une composition vaccinale préalablement formulée. PROCEDE DE PREPARATION D’UNE COMPOSITION VACCINALE A PARTIR D’ANTIGENES LYOPHILISES L’invention se rapporte au domaine de la préparation extemporanée de composition vaccinale à partir d’antigènes lyophilisés. Plus particulièrement, l’invention concerne l’utilisation de nanoparticules cationiques pour solubiliser des antigènes lyophilisés sans ajout d’adjuvant de lyophilisation en vue d’une utilisation extemporanée pour l’administration d’une composition vaccinale. Dans un mode de réalisation particulier, il permet de préparer une formulation vaccinale ou d’ajouter une ou plusieurs valences à une composition vaccinale préalablement formulée. Etat de la technique L’albumine est classiquement utilisée pour solubiliser de petites molécules lipophiles. A ce titre, on peut citer la demande FR3005858 qui décrit la préparation de compositions antipaludéennes solubles comprenant des nanoparticules. Dans cette composition, l’albumine est utilisée en tant qu’agent de solubilisation de la molécule antipaludéenne, et les auteurs montrent que les propriétés thérapeutiques ne sont pas perdues. D’autres adjuvants de lyophilisation comme l’arginine et l’histidine ont également été décrits comme facilitant la solubilisation de protéines lyophilisées. La demande EP 0638091 décrit la préparation d'une composition complexe de Facteur VIII lyophilisé laquelle, au contact de l'eau, se reconstitue en moins d'une minute à température ambiante. Cette préparation comprend (i) l’ajout d’un agent solubilisant comprenant de l'arginine, en une quantité suffisante pour accroître la solubilité du facteur VIII, et d'histidine à la solution aqueuse pour former ainsi une solution de Facteur VIII/arginine/histidine dans laquelle l'histidine est présente dans la solution de facteur VIII/arginine/histidine à une concentration de 0,025M et (ii) la lyophilisation de la solution Facteur VIII/arginine/histidine pour donner ainsi une composition complexe de Facteur VIII avec une solubilité accrue. La demande EP 2458990 propose également d’utiliser de l’arginine et de l’histidine, mais aussi du saccharose et du mannitol. Or ces adjuvants de lyophilisation peuvent avoir des effets indésirables, notamment si la composition extemporanée reconstituée à partir de protéines lyophilisées est destinée à un usage vaccinal. Dans le cadre de la formulation de compositions vaccinales, la solubilisation de protéines lyophilisées pose problème en raison de l’hétérogénéité des caractéristiques des antigènes, ou de la présence d’adjuvants associés à ces protéines. A ce jour, on ne dispose pas de méthode adaptée à la solubilisation des protéines lyophilisées qui ne nécessite pas l’ajout d’adjuvant compatible avec une administration en tant que composition vaccinale. Les inventeurs ont mis au point un procédé permettant de préparer de manière simple et rapide une composition vaccinale à partir d’antigènes lyophilisés ; ce procédé repose sur l’utilisation de nanoparticules cationiques solubilisées dans un milieu aqueux. Contrairement aux procédés classiques de solubilisation, ce procédé ne nécessite pas d’ajout d’adjuvant de lyophilisation. Ainsi, l’invention concerne un procédé de préparation d’une composition vaccinale à partir d’un antigène lyophilisé comprenant les étapes de : Fournir une solution aqueuse comprenant une nanoparticule cationique constituée d’un noyau de polysaccharide cationique et associée ou non à des protéines antigéniques Solubiliser ledit antigène lyophilisé dans ladite solution aqueuse Incuber la composition ainsi obtenue à température ambiante. Avantages de l’invention Le procédé de solubilisation est simple et rapide ; en effet, il suffit de remettre en suspension les antigènes lyophilisés dans la solution de nanoparticules, de les mélanger et de laisser incuber à température ambiante. Une composition extemporanée est ainsi obtenue en moins de 30 minutes. La composition ne contient aucun agent de solubilisation (autre que les nanoparticules elles-mêmes), ce qui évite les effets indésirables associés à ce type de molécule. Lorsque la composition vaccinale ne contient que des antigènes lyophilisés, elle ne contient pas non plus d’adjuvant vaccinal. Ceci est avantageux puisque les adjuvants minéraux (à savoir des sels minéraux tels que sels d’aluminium) restent très longtemps dans le corps (plusieurs dizaines d’années). Les antigènes s’associent aux nanoparticules en solution et sont délivrés au niveau des cellules immunitaires après administration, alors que les nanoparticules sont éliminées rapidement (en moins de 72h après administration nasale). Les nanoparticules jouent donc un quadruple rôle : agent de solubilisation, agent de stabilisation et vecteur de transport des antigènes, et adjuvant vaccinal. Par la mise en œuvre de la présente invention, la solubilisation des protéines hydrophobes ou hydrophiles est obtenue grâce aux nanoparticules, quelle que soit la taille des protéines. Les protéines de petite taille sont absorbées par les nanoparticules. Les protéines de grosse taille sont quant à elles entourées par les nanoparticules, ce qui évite qu’elles s’agrègent entre elles. Dans le cas d’une composition vaccinale, cela permet d’administrer des antigènes de tailles différentes, par exemple un mélange d’antigènes obtenu par broyage du pathogène entier. Ainsi, la présentation antigénique est de large spectre et les chances du succès de la vaccination augmentées par rapport aux approches classiques basées sur le choix d’un antigène, ou mélange d’antigènes déterminés ou mal présentés. Grâce aux nanoparticules, on s’affranchit du besoin d’utiliser des adjuvants de solubilisation, qui ne sont pas compatibles avec une préparation à usage vaccinal. Ainsi, la présente invention représente une avancée technologique dans le domaine des vaccins. En effet, les préparations d’antigènes en solution utilisées aujourd’hui ne sont pas stables plus de quelques mois et doivent donc être produites régulièrement, avec destruction des stocks d’antigènes non utilisés. La présente invention permet d’apporter une solution à ce problème en permettant de solubiliser des antigènes conservés pendant des mois ou des années sous forme lyophilisée. Il est donc possible grâce à l’utilisation des nanoparticules cationiques de (re)solubiliser à façon et de manière extemporanée, toute préparation antigénique conservée sous forme lyophilisée. Ainsi, la gestion des stocks de préparation d’antigènes est améliorée, permettant une diminution des coûts et plus de souplesse dans la préparation des vaccins. Le fait de pouvoir solubiliser des antigènes lyophilisés permet de combiner différents antigènes ou préparations antigéniques pour produire des vaccins dont les cibles sont modulables : préparation de vaccins combinés, mais aussi de vaccins dont la valence est adaptée en fonction de la répartition géographique des souches pathogènes. Un autre avantage de l’invention est qu’elle permet d’ajouter des antigènes à des vaccins existants pour en augmenter la valence. Pour cela, les antigènes à ajouter, disponibles sous forme lyophilisée, sont ajoutés à la composition vaccinale existante dans laquelle des nanoparticules cationiques ont préalablement été ajoutées. DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION L’invention concerne un procédé de préparation d’une composition vaccinale à partir d’au moins un antigène lyophilisé comprenant les étapes de : Fournir une solution aqueuse comprenant une nanoparticule cationique constituée d’un noyau de polysaccharide cationique, ladite nanoparticule étant associée ou non à des protéines antigéniques Ajouter ledit antigène lyophilisé dans ladite solution aqueuse Incuber la composition ainsi obtenue à température ambiante. La solution aqueuse comprend les nanoparticules nécessaires à la solubilisation des antigènes lyophilisés. L’ajout de la solution aqueuse et l’incubation permettent la solubilisation de l’antigène lyophilisé. Dans un mode de réalisation, le procédé selon l’invention permet d’augmenter la valence d’une composition vaccinale monovalente ou multivalente. Par « valence », on entend la partie d’un vaccin correspondant à la protection contre un germe unique. Un vaccin multivalent peut protéger contre plusieurs germes occasionnant une même maladie (comme le vaccin 13-valent contre le pneumocoque) ou contre différentes maladies (comme le vaccin rougeole-oreillons-rubéole). Dans un tel mode de réalisation, ladite solution aqueuse comprend au moins une protéine antigénique. Dans ce cas, la protéine antigénique (de la composition vaccinale initiale) est associée aux nanoparticules avant ajout de l’antigène lyophilisé. Il est possible d’ajouter un ou plusieurs antigènes lyophilisés à la composition vaccinale initiale. Par « nanoparticule cationique constituée d’un noyau de polysaccharide cationique », on entend une nanoparticule (NP) solide comprenant un noyau de polysaccharide cationique. La NP peut être réticulée ou non. Son noyau peut être chargé ou non d’un phospholipide anionique. Cette NP n’est entourée d’aucune couche phospholipidique. Dans un premier mode de réalisation particulier, le polysaccharide cationique formant le noyau de la NP est un polymère non réticulé obtenu par la réaction entre un polysaccharide choisi parmi l’amidon, le dextrane, la dextrine, et la maltodextrine, des poly-fructoses (inuline), poly-mannoses, poly-galactoses, poly-galacto-mannanes (gomme de guar) et au moins un ligand cationique choisi entre une amine primaire, secondaire, tertiaire ou des ammoniums quaternaires. Le noyau n’est pas chargé en lipides. Dans un deuxième mode de réalisation particulier, le polysaccharide cationique formant le noyau de la NP est un polymère réticulé obtenu par la réaction entre un polysaccharide choisi parmi l’amidon, le dextrane, la dextrine, et la maltodextrine, des poly-fructoses (inuline), poly-mannoses, poly-galactoses, poly-galacto-mannanes (gomme de guar) et au moins un ligand cationique choisi parmi une amine primaire, secondaire, tertiaire ou des ammoniums quaternaires, puis l’ajout d’un agent de réticulation. L’agent de réticulation est choisi parmi l’épichloridrine, un diacide carboxylique ou un chlorure d’acide, tel que l’acide sébacique. Le noyau n’est pas chargé en lipides. Dans un mode de réalisation préféré, le polysaccharide cationique est obtenu par la réaction entre la maltodextrine et le glycidyltriméthylammonium, que la NP soit réticulée ou non. Dans un troisième mode de réalisation particulier, le polysaccharide cationique formant le noyau de la NP est chargé d’un phospholipide anionique. Ce phospholipide anionique peut être choisi parmi le glycérol de diacylphosphatidyle, la sérine de diacylphosphatidyle ou l’inositol de diacylphosphatidyle. Dans un autre mode de réalisation préféré, le phospholipide anionique est du dipalmitoylphosphatidylglycérol (DPPG). Le polysaccharide cationique formant le noyau de la NP n’est pas réticulé. Dans un mode de réalisation tout à fait préféré, la NP est une nanoparticule de maltodextrine chargée en DPPG. Dans un quatrième mode de réalisation particulier, le polysaccharide cationique formant le noyau de la NP n’est pas chargé en lipides et n’est pas réticulé. Les modes de réalisation selon lesquelles les NP sont réticulées ou non, et chargées en lipides ou non, sont combinables pour donner quatre types de NP : NP réticulée non chargée en lipides (NP+) NP réticulée chargée en lipides (NPL) NP non réticulée non chargée en lipides (NP+ NR) NP non réticulée chargée en lipides (NPL NR) Ces quatre types de NP sont utilisables dans le procédé selon l’invention. Dans un mode de réalisation préféré, on utilise les NP en solution pour solubiliser une formulation antigénique lyophilisée. Une telle formulation peut être prête à l’emploi ou composée à façon à partir de différents antigènes lyophilisés. Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, le procédé de préparation d’une composition selon l’invention permet d’ajouter une ou plusieurs valences à une composition vaccinale existante, déjà formulée. Dans ce cas, la solution aqueuse dans laquelle est resuspendu ledit antigène lyophilisé est une composition vaccinale comprenant au moins un autre antigène déjà en solution associé à ladite nanoparticule cationique. Les étapes de ce procédé consistent à : - Fournir une composition vaccinale - Ajouter des NP constituées d’un noyau de polysaccharide cationique telle que définie précédemment - Remettre en suspension au moins un antigène additionnel lyophilisé dans ladite composition vaccinale contenant les NP - Incuber la composition obtenue à température ambiante. Dans ce mode de réalisation, l’invention concerne un procédé d’ajout d’une nouvelle valence à une composition vaccinale elle peut se définir par les étapes de : Fournir une composition vaccinale aqueuse d’une nanoparticule constituée d’un noyau de polysaccharide cationique contenant des antigènes associés Remettre en suspension au moins un antigène additionnel lyophilisé dans ladite composition vaccinale aqueuse Incuber la composition obtenue à température ambiante Ce procédé est particulièrement avantageux pour préparer des vaccins multivalents à partir de vaccins déjà formulés, ce qui n’était jusqu’alors pas possible. Par « antigène lyophilisé » au sens de l’invention, on entend une protéine antigénique, un mélange de protéines antigéniques, ou un extrait partiel ou total de pathogène. L’extrait de pathogène peut contenir des protéines, des polysaccharides et des lipides. La protéine peut être hydrophile ou lipophile. Les antigènes peuvent être purifiés, seuls ou en combinaison. Les protéines antigéniques peuvent être lipophiles ou hydrophiles. Dans un mode de réalisation préféré, le mélange de protéines antigéniques est composé d’un ou de plusieurs antigènes purifiés ou d’un extrait de pathogène. L’extrait de pathogène peut être un extrait total ou un extrait partiel. Dans un mode de réalisation préféré, l’antigène est un extrait complexe de protéines obtenu à partir d’un pathogène entier. Le pathogène peut être un parasite, un virus, une bactérie, une mycobactérie et un champignon. Parmi les pathogènes d’intérêt on peut citer les exemples suivants : un virus choisi parmi le virus herpès simplex 1 et 2, le papillomavirus humain, le cytomégalovirus, le mycobacterium tuberculosis, la dengue, le VIH, le virus respiratoire syncytial (VRS), le virus de l’hépatite A, le virus de l’hépatite B et le virus de l’hépatite C, un coronavirus tel que le SARS-Cov2, le virus de la rage, ou un virus vétérinaire tel que le Virus de la peste équine, Virus de la peste porcine africaine, Virus Andes, Virus de l'influenza aviaire, Virus de la grippe équine, Virus de la fièvre catarrhale ovine, Virus Chapare, Virus Chikungunya, Virus Choclo, Virus de la fièvre hémorragique de Crimée-Congo, Virus de la dengue, Virus Dobrava-Belgrade, Virus de l'encéphalite équine de l'Est, Virus Ebola, Virus de la fièvre aphteuse, Virus de la variole caprine, Virus Guanarito, Virus d'Hantaan, Virus Hendra (morbillivirus équin), Herpesvirus porcin (virus de la maladie d'Aujeszky), Herpesvirus equine, Virus de la peste porcine classique, Virus de l'encéphalite japonaise, Virus de Junin, Virus de la maladie de la forêt de Kyasanur, Virus Laguna negra, Virus de la fièvre de Lassa, Virus de l'encéphalomyélite ovine, Virus Lujo, Virus de la dermatose nodulaire contagieuse, Virus de la chorioméningite lymphocytaire, Virus Machupo, Virus de Marbourg, Virus de la variole du singe, Virus de l'encéphalite de Murray Valley, Virus de la maladie de Newcastle, Virus Nipah, Virus de la fièvre hémorragique d'Omsk, Virus Oropouche, Virus de la peste des petits ruminants, Entérovirus porcin type 9 (virus de la maladie vésiculeuse du porc), Virus de l'encéphalite Powassan, Virus de la rage et autres membres du genre Lyssavirus, Virus de la vallée du Rift, Virus de la peste bovine, Virus Rocio, Virus Sabia, Virus de Séoul, Virus de la variole ovine, Virus Sin Nombre, Virus de l'encéphalite de Saint-Louis, Virus de la maladie de Teschen (encéphalomyélite à entérovirus), Virus du Syndrome dysgénésique et respiratoire du porc, Virus de l'encéphalite à tiques (virus de l'encéphalite verno-estivale russe), Virus de la variole, Virus de l'encéphalite équine du Venezuela, Virus de la stomatite vésiculeuse, Virus de l'encéphalite équine de l'Ouest, Virus de la fièvre jaune, Virus leucémogène félin un parasite intracellulaire choisi parmi , Acanthamoeba spp., Babesia spp., Balantidium coli, Blastocytis, Dientamoebafragilis, Entamoebahistolytica, Giardia lemblia, Isospora belli, Leishmania spp., Naegleriafowleri, Rhinosporidiumseeberi, Trichomonasvaginalis, Trypanosomabrucei et Trypanosomacruzi, Toxoplasma gondii, Eimeria spp, Neospora caninum, Sarcocystis spp, Plasmodium spp (Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae, Plasmodium knowlesi for instance,) and Cryptosporidium spp. It may also be chosen among Acanthamoeba spp., Babesia spp., Balantidium coli, Blastocysts, Dientamoebafragilis, Entamoebahistolytica, Giardia lamblia, Isospora belli, Leishmania spp., Naegleriafowleri, Rhinosporidiumseeberi, Trichomonasvaginalis, Trypanosomabrucei, et Trypanosomacruzi. (iii) une bactérie choisie parmi les souches Aeromonas hydrophila, Afipia felis, Actinomyces israelii, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Achromobacter xylosoxidans, Acinetobacter baumannii, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bartonella henselae, Bartonella clarridgeiae, Bordetella pertussis (bacille de Bordet et Gengou), Bordetella parapertussis, Bordetella bronchiseptica, Borrelia burgdorferi, Borrelia recurrentis, Brucella, Burkholderia cepacian, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei (bacille de Whitmore), Campylobacter coli, Campylobacter fetus, Campylobacter jejuni, Cardiobacterium hominis, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, Coxiella burnetiid, Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia equi, Eikenella corrodens, Entérocoques : Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarum, Enterococcus flavescens, Enterococcus casseliflavus, Erysipelothrix rhusiopathiae, Escherichia coli, Entérobactéries, Francisella tularensis, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Kingella kingae, Klebsiella granulomatis, Klebsiella oxytoca, Klebsiella ozenae, Klebsiella planticola, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella rhinoscleromatis, Legionella pneumophila, Legionella longbeachae, Legionella micdadei, Leptospira interrogans, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae (bacille de Hansen), Mycobacterium tuberculosis (bacille de Koch), Mycobacterium bovis, Mycobactéries atypiques (M. avium, M. bovis, M. intracellulare…), Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Neisseria gonorrhoeae (gonocoque), Neisseria meningitidis (méningocoque), Nocardia, Pantoea agglomerans, Pasteurella multocida, Plesiomonas shigelloides, Pneumocoque (nom habituel de Streptococcus pneumoniae), Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Providencia stuartii, Pseudomonas aeruginosa, bacille pyocyanique, voir Pseudomonades, Porphyromonas gingivalis, Rickettsia, Salmonella enterica (ou salmonelle), Serratia marcescens, Serratia proteamaculans, Shigella dysenteriae (ou shigelle), Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Spirillum minus, Staphylocoques (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus), Streptococcus pyogenes ou Streptocoques du groupe A, Streptococcus pneumoniae (ou pneumocoque), Treponema pallidum, Ureaplasma urealyticum, Vibrio cholerae (variétés cholerae et el tor), Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis (v) un champignon choisi parmi Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus clavatus, Blastomyces dermatitidis, Candida albicans, Candida auris, Coccidioides immitis, Cryptococcus neoformans, Cryptococcus gattii, Histoplasma capsulatum, Mucormycosis, Paracoccidioides brasiliensis, Pneumocystis jirovecii, Pneumocystis Pneumonia, Sporothrix schenckii, Stachybotrys chartarum, Talaromycosis Les NP utilisées pour la préparation des compostions vaccinales forment des structures poreuses ayant la capacité d’absorber les antigènes libres ou de les recouvrir de sorte à permettre leur solubilisation dans une solution aqueuse. De plus, les protéines ainsi solubilisées sont stabilisées. Le procédé selon l’invention permet donc de solubiliser des antigènes lyophilisés dans une solution aqueuse sans utiliser d’adjuvant de solubilisation. La solution dans laquelle est solubilisé l’antigène lyophilisé est par exemple une solution aqueuse ou une solution tamponnée, apte à être utilisée dans le cadre d’une utilisation vaccinale. Lorsque l’antigène est solubilisé dans une composition vaccinale, il est entendu que cette composition peut contenir des adjuvants vaccinaux, voire de solubilisation, sans que cela ne remette en cause la mise en œuvre du procédé selon l’invention, lorsqu’un antigène est ajouté dans ladite composition vaccinale. Par « adjuvant de solubilisation » aussi appelé « adjuvant de lyophilisation», on entend au sens de l’invention, un agent permettant la solubilisation des protéines ainsi que la stabilisation des protéines. Comme exemple des surfactants comme le tween, empigen, triton, des saccharides comme le saccharose, des polyols comme le mannitol, inositol, des polymères comme le Polyvinylpyrrolidone (PVP), … Par « adjuvant vaccinal » au sens de l’invention, on entend un agent immuno-modulateur. De tels adjuvants peuvent être hydrophiles tels que des oligodésoxynucléotides (CpG), ou lipophiles tels que le squalène, MPL, QS-21… Pour éviter toute confusion, il est expressément entendu que, dans le cadre de cette invention, les NP ne sont pas considérées comme des adjuvants mais comme agent de solubilisation et de délivrance d’antigènes. Pour la remise en suspension de l’antigène lyophilisé, le ratio protéine/nanoparticule (poids/poids) est compris entre 1/10 et 1/1. Dans un mode de réalisation préféré, le ratio de protéine/nanoparticule est compris entre 1/1 et 1/4, notamment de 1/3. Après l’ajout des antigènes lyophilisés, la solution aqueuse est incubée à température ambiante. Le temps d’incubation peut être typiquement compris entre 3 minutes et 1 heure, de préférence entre 5 min et 30 minutes ; il peut être prolongé pendant 1 an sans que cela n’affecte le procédé. Après incubation, la composition obtenue peut être soit utilisée directement en tant que composition vaccinale, soit être utilisée pour solubiliser d’autres protéines lyophilisées. Ainsi, dans un mode de réalisation particulier de l’invention, au moins deux extraits protéiques lyophilisés différents sont solubilisés dans la solution aqueuse contenant les nanoparticules. Ces extraits protéiques différents peuvent provenir de pathogènes différents ou contenir des antigènes provenant de souches différentes d’un même pathogène. Les compositions obtenues selon l’invention peuvent être utilisées en tant que vaccin dans le domaine vétérinaire ou en santé humaine. La présente invention sera mieux comprise à la lecture des exemples qui suivent, fournis à titre d’illustration et ne devant en aucun cas être considérés comme limitant la portée de la présente invention. DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1 : PAGE en conditions natives de compositions comprenant de la BSA ou un extrait total d’E.Coli (ET) et des NPL ainsi que l’ajout de BSA/NPL dans une composition comprenant ET. Figure 2 : PAGE en conditions natives de compositions comprenant de la BSA ou un extrait total d’E.Coli (ET) et des NPL ainsi que l’ajout de ET/NPL dans une composition comprenant BSA. Figure 3 : PAGE en conditions natives de compositions comprenant de la BSA ou un extrait total d’E.Coli (ET) et des NPL NR ainsi que l’ajout de BSA/NPL NR dans une composition comprenant ET. Figure 4 : PAGE en conditions natives de compositions comprenant de la BSA ou un extrait total d’E.Coli (ET) et des NPL NR ainsi que l’ajout de ET/NPL NR dans une composition comprenant BSA. Figure 5 : PAGE en conditions natives de compositions comprenant de la BSA ou un extrait total d’E.Coli (ET) et des NP+ ainsi que l’ajout de BSA/NP+ dans une composition comprenant ET. Figure 6 : PAGE en conditions natives de compositions comprenant de la BSA ou un extrait total d’E.Coli (ET) et des NP+ ainsi que l’ajout de ET/NP+ dans une composition comprenant BSA. Figure 7 : PAGE en conditions natives de compositions comprenant de la BSA ou un extrait total d’E.Coli (ET) et des NP+ NR ainsi que l’ajout de BSA/NP NR dans une composition comprenant ET. Figure 8 : PAGE en conditions natives de compositions comprenant de la BSA ou un extrait total d’E.Coli (ET) et des NP+ NR ainsi que l’ajout de ET/NP+ NR dans une composition comprenant BSA. EXEMPLES EXEMPLE 1 : Préparation d’une composition aqueuse de protéines hydrophiles à partir de protéines lyophilisées Préparation des nanoparticules lipidées (NPL) Les NPL sont préparées comme précédemment décrit dans le brevet EP2708237 (A1) – 2014/03/19. 100 g de maltodextrine est dissous à température ambiante dans de l'hydroxyde de sodium 2N sous agitation magnétique. Le mélange est réticulé par ajout d’épichlorhydrine puis cationisé pendant une nuit par ajout de GTMA pour obtenir un hydrogel. L’hydrogel obtenu est ensuite neutralisé avec de l'acide acétique et broyé en utilisant un homogénéisateur à haute pression. La taille des particules ainsi obtenues est déterminée par analyse de la diffusion dynamique de la lumière (DLS). Les particules sont ensuite purifiées par ultrafiltration à flux tangentiel sur une membrane de 750 kDa. L'absence de sels et de fragments de maltodextrine sont contrôlées respectivement par dosage du nitrate d'argent et par DLS. Les nanoparticules de maltodextrine cationiques poreuses (nommées NP+) résultantes sont ensuite chargées par des phospholipides anioniques par injection d’une solution de dipalmitoyl-phosphatidylglycérol (DPPG) préparée dans du solutol pour obtenir les nanoparticules nommées « NPL ». Des nanoparticules de maltodextrine cationiques non réticulées sont préparées de la même manière que les NP+ et NPL respectivement, seule l’étape de réticulation par ajout de l’épichlorhydrine est shuntée. Les nanoparticules non réticulées résultantes sont nommées « NPL NR » et « NP+ NR » en fonction du fait qu’elles sont respectivement chargées en phospholipides ou non. Préparation des antigènes Cas d’un antigène purifié La sérum albumine bovine (BSA) lyophilisée et purifiée à 98% provient de chez Sigma Aldrich (ref. A9647)et est utilisée comme modèle d’antigène purifié. Cas d’un mélange d’antigènes à partir de l’extrait total (ET) d’E.coli La souche E.coli NC 9001, issue de la banque « Public Health England », est cultivée en erlen sous agitation pendant 24h à 37°C en milieu LB. Les bactéries sont centrifugées pendant 15 min à 11000 x g puis le culot est lavé par 4 rinçages successifs dans de l’eau stérile. Le culot bactérien est ensuite repris dans de l’isopropanol 70% et incubé dans la glace pendant 45 min pour inactiver les bactéries. Après centrifugation pendant 15 min à 11000 x g, le culot est lavé en eau stérile puis placés dans un bain à ultrason pendant 10 min. Après centrifugation pendant 15 min à 11000 x g, le culot est séché sous PSM pendant 30 minutes avant congélation puis lyophilisation. 10mg du lyophilisât sont remis en suspension pour déterminer le ratio poids sec/poids protéique par la méthode µBCA. Préparation d’une composition extemporanée L’association des antigènes aux nanoparticules (NP+, NPL, NP+ NR et NPL NR) à température ambiante (20-25°C) est testée à différents temps de maturation : 5min, 30min, 1h et 24h. Pour chaque condition testée, 1mg protéique d’antigène (BSA ou ET E.coli) est repris dans 2ml de NPL à 1.5mg/ml avant d’être vortexé pendant 30 sec pour obtenir une formulation en ratio 1/3 (antigènes/NPL). Après 30 min d’incubation, un échantillon dosé à 1mg protéique (BSA ou ET E.coli ) est ajouté à une solution aqueuse pour préparer la composition vaccinale. Méthodes d’analyse de l’association des antigènes avec les NPL L’association des antigènes aux NPL est analysée par : DLS (Dynamic Light Scattering ou diffraction de la lumière polarisée) et Potentiel Zeta : mesure de la taille (nm) et de la charge de surface (mV) (antigènes libres anioniques vs NPL cationiques) Electrophorèse en condition non dénaturante (Native PAGE) : Les NPL ont une masse moléculaire trop importante pour diffuser dans le gel. Ainsi, contrairement aux protéines antigéniques libres, les protéines associées dans les NPL ne diffusent pas dans le gel. Le profil protéique des antigènes formulés dans les NPL est contrôlé par électrophorèse en conditions dénaturantes (SDS-PAGE). EXEMPLE 2 : Analyse de l’association d’un antigène (BSA) et/ ou d’un extrait total d’E. Coli aux différentes nanoparticules Association aux NPL L’association de la BSA aux NPL est complète à partir de 5 min de maturation à température ambiante. Le potentiel Zeta des formulations BSA/NPL est positif et la taille est supérieure à 20nm (Tableau 1). Tableau 1 : DLS et potentiel Zeta des formulations BSA/NPL Le paramètre Z-av représente la taille moyenne des NPL. Ainsi, on observe que la BSA s’associe aux NPL est très effective en moins de 5 min. La paramètre « number » correspond au plus grand nombre de particules d’une taille donnée. Le PDI correspond à l’Indice de polydispersité ; il est admis que les particules sont monodispersées lorsque cet indice est inférieur à 0,3. Le potentiel Zeta représente la charge de surface des nanoparticules. Celui-ci est positif lorsque les antigènes (chargés négativement) sont absorbés à l’intérieur de la nanoparticule, ou lorsque les antigènes de grosse taille sont recouverts par les nanoparticules. De plus, on constate que l’ajout d’une seconde protéine à une formulation peut être réalisé en 5 min. L’association de la BSA aux NPL puis de l’extrait protéique total d’E.coli est totale après 5 min. Le potentiel Zeta des formulations est positif et confirme l’association de la BSA et de l’ET E.coli aux NPL (tableau 1). L’analyse par électrophorèse en conditions natives confirme l’association totale de la BSA aux NPL après 24h de maturation. De plus, cette analyse montre une association de l’extrait total d’E.Coli de 95% dès 5 min de maturation avec la BSA/NPL (Figure 1) ; une associtaion rapide et forte est aussi observée lorsque l’on associe la BSA à un extrait total d’E.Coli/ NPL (Figure 2). Association aux NPL NR Les résultats d’association sont présentés au Tableau 2 Tableau 2 : DLS & Potentiel Zeta des formulations NPL non réticulées (NPL NR) L‘association des NPL NR à la BSA ou à l’ET d’E. Coli est observée à 24h d’incubation. De plus, l’ajout d’une seconde protéine à une formulation NPL NR est possible même si l’association de la BSA et de L’ET E.coli aux NPL NR est moins bonne que pour les NPL réticulées. Le potentiel Zeta des formulations est positif et confirme l’association de la BSA et de l’ET E.coli aux NPL (Tableau 2). L’analyse par électrophorèse en conditions natives confirme ces résultats (Figures 3 et 4). Association aux NP+ Les résultats d’association sont présentés au Tableau 3. Tableau 3 . DLS & Potentiel Zeta des formulations NP+ L‘association des NPL NR à la BSA ou à l’ET d’E. Coli est observée à 24h d’incubation. De plus, l’ajout d’une seconde protéine à une formulation NP+ est est réalisable en 5 min avec une association de la BSA et de L’ET E.coli aux NPL NR presque totale. Le potentiel Zeta des formulations est positif et confirme l’association de la BSA et de l’ET E.coli aux NP+ (Tableau 3). L’analyse par électrophorèse en conditions natives confirme ces résultats (Figures 5 et 6). Association aux NP+ NR Les résultats d’association sont présentés au Tableau 4. Tableau 4 . DLS & Potentiel Zeta des formulations NP+NR L‘association des NP+ NR à la BSA ou à l’ET d’E. Coli est observée à 24h d’incubation. De plus, l’ajout d’une seconde protéine à une formulation NP+ NR est réalisable en 5 min avec une association de la BSA et de L’ET E.coli aux NP+ NR presque totale. Le potentiel Zeta des formulations est positif et confirme l’association de la BSA et de l’ET E.coli aux NP+ (Tableau 3). L’analyse par électrophorèse en conditions natives confirme ces résultats (Figures 7 et 8). Conclusion Les formulations extemporanées d’antigènes lyophilisées avec les 4 types de nanoparticules étudiées sont réalisées en moins de 30 min. Ces résultats montrent : D’une part la capacité à formuler un antigène lyophilisé dans une solution aqueuse (solubilisation) pour préparer une composition vaccinale prête-à-l’emploi D’autre part que l’on peut ajouter un ou plusieurs antigènes (une ou plusieurs valences) à une composition vaccinale qui comprend déjà un ou plusieurs antigènes formulés ; ce ou ces antigènes additionnels sont solubilisés dans une composition vaccinale pré-existante à laquelle des nanoparticules ont été préalablement ajoutées. Procédé de préparation d’une composition vaccinale à partir d’au moins un antigène lyophilisé comprenant les étapes de : Fournir une solution aqueuse comprenant une nanoparticule cationique constituée d’un noyau de polysaccharide cationique Ajouter ledit antigène lyophilisé dans ladite solution aqueuse Incuber la composition ainsi obtenue à température ambiante. Procédé selon la revendication 1 permettant d’augmenter la valence d’une composition vaccinale dans lequel ladite solution aqueuse comprend au moins une protéine antigénique. Procédé selon l’une des revendications 1 ou 2 dans lequel ledit noyau de polysaccharide cationique poreux est non réticulé et est obtenu par la réaction entre un polysaccharide choisi parmi l’amidon, le dextrane, la dextrine, et la maltodextrine, des poly-fructoses (inuline), poly-mannoses, poly-galactoses, poly-galacto-mannanes (gomme de guar) et au moins un ligand cationique choisi dans une amine primaire, secondaire ou tertiaire et des ammoniums quaternaires. Procédé selon l’une des revendications 1 ou 2 dans lequel ledit noyau de polysaccharide cationique poreux est réticulé et est obtenu par la réaction entre un polysaccharide choisi parmi l’amidon, le dextrane, la dextrine, et la maltodextrine, des poly-fructoses (inuline), poly-mannoses, poly-galactoses, poly-galacto-mannanes (gomme de guar) et au moins un ligand cationique choisi dans une amine primaire, secondaire ou tertiaire et des ammoniums quaternaires puis l’ajout d’un agent de réticulation. Procédé selon la revendication 4 dans lequel ledit agent de réticulation est choisi parmi l’épichloridrine, un diacide carboxylique ou un chlorure d’acide. Procédé selon l’une des revendications 3 ou 4 dans lequel ledit noyau de polysaccharide cationique est obtenu par réaction entre une maltodextrine et un glycidyltriméthylammonium. Procédé selon l’une des revendications précédentes dans lequel ledit noyau de polysaccharide cationique poreux est chargé d’un phospholipide anionique. Procédé selon la revendication 7 dans lequel ledit phospholipide anionique est choisi parmi le glycérol de diacylphosphatidyle, la sérine de diacylphosphatidyle ou l’inositol de diacylphosphatidyle. Procédé selon la revendication 8 dans lequel ledit phospholipide anionique est le dipalmitoylphosphatidylglycérol. Procédé selon l’une des revendications 1 à 6 dans lequel ledit noyau de polysaccharide cationique poreux n’est pas chargé en lipides. Procédé selon l’une des revendications précédentes dans lequel l’antigène lyophilisé est une protéine antigénique ou un mélange de protéines antigéniques. Procédé selon la revendication 11 dans lequel ledit mélange de protéines antigéniques est composé d’un ou de plusieurs antigènes purifiés ou d’un extrait de pathogène. Procédé selon la revendication 12 dans lequel ledit pathogène est choisi parmi un parasite, un virus, une bactérie, une mycobactérie et un champignon. Procédé selon la revendication 13 dans lequel ledit pathogène est : un virus choisi parmi le virus herpès simplex 1 et 2, le papillomavirus humain, le cytomégalovirus, le mycobacterium tuberculosis, la dengue, le VIH, le virus respiratoire syncytial (VRS), le virus de l’hépatite A, le virus de l’hépatite B et le virus de l’hépatite C, un coronavirus tel que le SARS-Cov2, le virus de la rage, ou un virus vétérinaire tel que le Virus de la peste équine, Virus de la peste porcine africaine, Virus Andes, Virus de l'influenza aviaire, Virus de la grippe équine, Virus de la fièvre catarrhale ovine, Virus Chapare, Virus Chikungunya, Virus Choclo, Virus de la fièvre hémorragique de Crimée-Congo, Virus de la dengue, Virus Dobrava-Belgrade, Virus de l'encéphalite équine de l'Est, Virus Ebola, Virus de la fièvre aphteuse, Virus de la variole caprine, Virus Guanarito, Virus d'Hantaan, Virus Hendra (morbillivirus équin), Herpesvirus porcin (virus de la maladie d'Aujeszky), Herpesvirus equine, Virus de la peste porcine classique, Virus de l'encéphalite japonaise, Virus de Junin, Virus de la maladie de la forêt de Kyasanur, Virus Laguna negra, Virus de la fièvre de Lassa, Virus de l'encéphalomyélite ovine, Virus Lujo, Virus de la dermatose nodulaire contagieuse, Virus de la chorioméningite lymphocytaire, Virus Machupo, Virus de Marbourg, Virus de la variole du singe, Virus de l'encéphalite de Murray Valley, Virus de la maladie de Newcastle, Virus Nipah, Virus de la fièvre hémorragique d'Omsk, Virus Oropouche, Virus de la peste des petits ruminants, Entérovirus porcin type 9 (virus de la maladie vésiculeuse du porc), Virus de l'encéphalite Powassan, Virus de la rage et autres membres du genre Lyssavirus, Virus de la vallée du Rift, Virus de la peste bovine, Virus Rocio, Virus Sabia, Virus de Séoul, Virus de la variole ovine, Virus Sin Nombre, Virus de l'encéphalite de Saint-Louis, Virus de la maladie de Teschen (encéphalomyélite à entérovirus), Virus du Syndrome dysgénésique et respiratoire du porc, Virus de l'encéphalite à tiques (virus de l'encéphalite verno-estivale russe), Virus de la variole, Virus de l'encéphalite équine du Venezuela, Virus de la stomatite vésiculeuse, Virus de l'encéphalite équine de l'Ouest, Virus de la fièvre jaune, Virus leucémogène félin, ou un parasite intracellulaire choisi parmi , Acanthamoeba spp., Babesia spp., Balantidium coli, Blastocytis, Dientamoebafragilis, Entamoebahistolytica, Giardia lemblia, Isospora belli, Leishmania spp., Naegleriafowleri, Rhinosporidiumseeberi, Trichomonasvaginalis, Trypanosomabrucei et Trypanosomacruzi, Toxoplasma gondii, Eimeria spp, Neospora caninum, Sarcocystis spp, Plasmodium spp (Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae, Plasmodium knowlesi for instance,) and Cryptosporidium spp. It may also be chosen among Acanthamoeba spp., Babesia spp., Balantidium coli, Blastocysts, Dientamoebafragilis, Entamoebahistolytica, Giardia lamblia, Isospora belli, Leishmania spp., Naegleriafowleri, Rhinosporidiumseeberi, Trichomonasvaginalis, Trypanosomabrucei, et Trypanosomacruzi, ou une bactérie choisie parmi les souches Aeromonas hydrophila, Afipia felis, Actinomyces israelii, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Achromobacter xylosoxidans, Acinetobacter baumannii, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bartonella henselae, Bartonella clarridgeiae, Bordetella pertussis (bacille de Bordet et Gengou), Bordetella parapertussis, Bordetella bronchiseptica, Borrelia burgdorferi, Borrelia recurrentis, Brucella, Burkholderia cepacian, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei (bacille de Whitmore), Campylobacter coli, Campylobacter fetus, Campylobacter jejuni, Cardiobacterium hominis, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, Coxiella burnetiid, Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia equi, Eikenella corrodens, Entérocoques : Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarum, Enterococcus flavescens, Enterococcus casseliflavus, Erysipelothrix rhusiopathiae, Escherichia coli, Entérobactéries, Francisella tularensis, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Kingella kingae, Klebsiella granulomatis, Klebsiella oxytoca, Klebsiella ozenae, Klebsiella planticola, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella rhinoscleromatis, Legionella pneumophila, Legionella longbeachae, Legionella micdadei, Leptospira interrogans, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae (bacille de Hansen), Mycobacterium tuberculosis (bacille de Koch), Mycobacterium bovis, Mycobactéries atypiques (M. avium, M. bovis, M. intracellulare…), Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Neisseria gonorrhoeae (gonocoque), Neisseria meningitidis (méningocoque), Nocardia, Pantoea agglomerans, Pasteurella multocida, Plesiomonas shigelloides, Pneumocoque (nom habituel de Streptococcus pneumoniae), Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Providencia stuartii, Pseudomonas aeruginosa, bacille pyocyanique, voir Pseudomonades, Porphyromonas gingivalis, Rickettsia, Salmonella enterica (ou salmonelle), Serratia marcescens, Serratia proteamaculans, Shigella dysenteriae (ou shigelle), Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Spirillum minus, Staphylocoques (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus), Streptococcus pyogenes ou Streptocoques du groupe A, Streptococcus pneumoniae (ou pneumocoque), Treponema pallidum, Ureaplasma urealyticum, Vibrio cholerae (variétés cholerae et el tor), Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis, ou un champignon choisi parmi Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus clavatus, Blastomyces dermatitidis, Candida albicans, Candida auris, Coccidioides immitis, Cryptococcus neoformans, Cryptococcus gattii, Histoplasma capsulatum, Mucormycosis, Paracoccidioides brasiliensis, Pneumocystis jirovecii, Pneumocystis Pneumonia, Sporothrix schenckii, Stachybotrys chartarum, Talaromycosis.