Brevet FR3103827A1 — publié le 20210604

L’invention se rapporte au domaine des lyophilisats de matières biologiques. Plus particulièrement, l’invention concerne un nouveau procédé de préparation d’un lyophilisat de cellules comprenant une étape de cryogénie. Dans un mode de réalisation préféré, ce procédé est appliqué à des bactéries lactiques. PROCEDE DE LYOPHILISATION D’UNE COMPOSITION CELLULAIRE CRYOGENISEE ET CONTENANT DU GAZ DISSOUS L’invention se rapporte au domaine des lyophilisats de matières biologiques. Plus particulièrement, l’invention concerne un nouveau procédé de préparation d’un lyophilisat de cellules comprenant une étape de cryogénie. Dans un mode de réalisation préféré, ce procédé est appliqué à des bactéries lactiques. Etat de la technique La conservation des cellules sous forme congelée est connue de longue date. Cette méthode requiert peu d’équipement. Le principe est simple : la congélation induit une baisse de température qui ralentit puis arrête toutes les réactions biochimiques de la cellule. Ces dernières sont susceptibles d’être réactivées après décongélation. On constate cependant, quelle que soit la méthode utilisée, une perte significative de viabilité à la décongélation causée notamment par la formation de cristaux intracellulaires, et d’autant plus que la durée de congélation est longue. Alternativement, les cellules peuvent être lyophilisées. La lyophilisation est un procédé de dessiccation d’un produit préalablement congelé, par sublimation. Par ce procédé on obtient donc un produit sec qui peut être conservé à 4°C ou à température ambiante. Cependant, ce procédé est long, coûteux et très consommateur d’énergie. Classiquement, un procédé de lyophilisation de cellules comprend les étapes de préparation d’un échantillon comprenant les cellules, centrifugation de l’échantillon et reprise du culot cellulaire dans un milieu cryoprotecteur et permettant la déshydratation, congélation de l’échantillon puis lyophilisation. L’étape de congélation est généralement réalisée à des températures comprises entre -20°C (congélation lente) et -80°C (congélation rapide) ; une congélation rapide est moins délétère pour les cellules mais plus difficile à mettre en œuvre à l’échelle industrielle. Des tentatives de congélation des cellules par cryogénie, seule ou en vue d’une lyophilisation, ont été effectuées mais les résultats se sont révélés peu probants du fait d’une détérioration importante des cellules. Cette détérioration résulte probablement du fait que les procédés de l’art antérieur ne permettent pas de contrôler les quantités d‘eau et d’oxygène présentes dans le produit lors des étapes de congélation et de lyophilisation. Or, l’eau et l’oxygène sont deux facteurs qui altèrent la qualité des cellules et leur viabilité à long terme. Ainsi, aucune des solutions de cryogénie proposées à ce jour n’ont permis d’améliorer de façon significative les propriétés des produits lyophilisés. En particulier la plupart des solutions proposées s’appuient sur une dépression appliquée lors de la phase de congélation. Au contraire, la demande WO2018/138461 décrit un procédé de refroidissement de matière biologique par cryogénie sous haute pression, à savoir à une pression comprise entre 10 et 1000 bars. Ce procédé permet une amélioration du taux de survie d’une souche de Lactobacillus bulgaricus d’un facteur de presque 400. Parmi les nombreux inconvénients associés aux procédés disponibles à ce jour, il est regrettable de ne pouvoir obtenir des préparations de bactéries lactiques d’intérêt probiotique qui soient stables à long terme à température ambiante. Plus généralement, il existe un besoin de disposer d’une méthode de conservation à long terme des cellules de tout type, notamment des cellules vivantes. Les inventeurs ont montré que la qualité et la viabilité à long terme des cellules lyophilisées, notamment des souches bactériennes probiotiques, peut être significativement améliorée lorsque l’étape de congélation est réalisée via une cryogénie sous pression, permettant la dissolution de gaz au sein de la matrice à congeler avant lyophilisation. Ainsi, l’invention concerne un procédé de lyophilisation d’une composition cellulaire caractérisée en ce que l’étape de congélation est couplée à une dissolution importante de gaz dans le produit, intervenant juste avant ladite congélation. La dissolution est réalisée soit par réalisation de la congélation dans une enceinte sous pression, soit par soumission du produit à une très forte densité de molécules de gaz sans pour autant qu’une surpression ne soit forcément observée. Ces deux modes de réalisations sont équivalents en termes de résultat dans le sens où la matrice traverse une zone dense en molécules de gaz (étape de dissolution de gaz dans la matrice) avant d’être congelée par cryogénie. Avantages de l’invention Les inventeurs ont montré l’intérêt de la cryogénie sous pression en tant que méthode de congélation des matières biologiques, notamment des bactéries telles que les bactéries lactiques. En effet, cette méthode permet une meilleure préservation des cellules lors des étapes de congélation et de lyophilisation et donc une amélioration des rendements de production de préparations cellulaires congelées. On constate tout d’abord que la cryogénie sous pression est à elle seule avantageuse par rapport aux autres méthodes de congélation pour la préservation de l’intégrité et/ou viabilité des cellules. D’autre part, il est très avantageux de combiner une étape de congélation par cryogénie sous pression avec une lyophilisation et ce pour plusieurs raisons : Le rendement de production est meilleur, on récupère une composition lyophilisée plus riche en cellules à l’issue du procédé. Par conséquent, on améliore la concentration cellulaire du lyophilisat ; Les cellules sont moins abimées, leur intégrité membranaire est maintenue ; ceci est avantageux pour préserver la viabilité des cellules mais également dans le cas de cellules abimées ou mortes dont la membrane ou paroi est endommagée. En effet, il a été montré depuis plusieurs années, que des bactéries non-viables peuvent conserver certaines activités probiotiques (adhésion, stimulation du système immunitaire…). La viabilité des cellules est augmentée à l’issue de l’étape de lyophilisation par comparaison avec des produits obtenus par les procédés classiques de lyophilisation. La stabilité des lyophilisats de cellules est également observée sur le long terme, à savoir pendant plusieurs mois, à 4°C comme à température ambiante. Les avantages associés à ce procédé sont observés lorsque la composition cellulaire de départ contient des cryoprotectants. De manière tout à fait intéressante, ils sont observés également en absence de cryoprotectants ; en s’affranchissant de l’utilisation de cryoprotectant, on limite l’ajout d’additifs qui sont de plus en plus décriés. D’autre part, ce procédé permet de traiter des matrices dont la taille des billes formées peut atteindre 7 à 8 mm ainsi que des agrégats ; le paramètre de taille n’influe pas sur l’efficacité du procédé, ni sur la qualité de produit lyophilisés obtenus. A l’issue de ce procédé, il est proposé de conditionner les lyophilisats sous atmosphère protectrice, en particulier pour éviter l’altération causée par l’oxydation. Afin de limiter autant que possible le contact avec l’oxygène, il est avantageux de réaliser un balayage du lyophilisat avec un gaz inerte avant scellage du conditionnement, de sorte à augmenter encore la stabilité des lyophilisats dans le temps. En procédant ainsi, il est attendu une stabilité accrue pouvant atteindre plus d’une année. Ainsi, grâce à l’incorporation de gaz couplée à un refroidissement très rapide permettant de maintenir le gaz dissous et au maintien de l’anaérobiose pendant tout le procédé, la qualité des cellules lyophilisées est fortement améliorée. Le procédé selon l’invention permet de maitriser les trois paramètres critiques liés à la qualité d’une préparation de cellules lyophilisées : la concentration cellulaire, l’oxydation et la quantité d’eau libre (la présence d’eau étant délétère vis-à-vis de la stabilité des cellules lyophilisées à température ambiante et à 4°C), et permet ainsi la préparation de lyophilisat de bactéries d’intérêt probiotique dont les propriétés sont conservées à long terme. En fonction du produit, la conservation à 4°C est plus ou moins adaptée. Dans le cas des préparations de bactéries d’intérêt probiotique, une conservation à température ambiante rend l’usage plus facile (transport, stockage, utilisation). Il est donc avantageux de disposer de préparation de bactéries d’intérêt probiotique pouvant être conservées à température ambiante. Ce procédé peut être appliqué à de nombreux types cellulaires : bactéries d’intérêt probiotiques et agroalimentaires (utilisées pour la fabrication de fromages notamment), levures, cellules végétales, micro-algues, microorganismes issus du microbiote intestinal ou fécal (pour la transplantation de microbiote fécal dans le traitement des infections à Clostridium difficile ), cellules reproductrices (ovocytes et spermatozoïdes) pour la reproduction animale et humaine, des cellules sanguines et des cellules souches. Sans être liés par cette théorie, les inventeurs considèrent que les bénéfices du procédé selon l’invention pour la préparation de cellules congelées et/ou lyophilisées repose sur le fait que la cryogénie sous pression permet d’obtenir des produits surgelés non poreux contenant une grande quantité de gaz parfaitement dissout. Ce gaz n’étant pas de l’oxygène, les réactions d’oxydation sont évitées. De plus, la lyophilisation de tels produits permet d’éliminer la majeure partie de l’eau contenue dans le produit. Il en résulte que les conditions mises en œuvre dans ce procédé sont dans l’ensemble plus douces, moins agressives et moins destructurantes pour les cellules. Du point de vue du procédé de lyophilisation en tant que tel et de son industrialisation, l’étape de cryogénie sous pression permet également des améliorations conséquentes. Le temps de préparation est tout d’abord beaucoup plus rapide. La cryogénie est un procédé quasi-instantané, permettant de produire en continu et à des cadences élevées (plusieurs centaines de kg par heure avec des équipements standards) des billes de produit initialement fluide. Le gain de temps est considérable par rapport à de la congélation en chambre froide, y compris si celles-ci fonctionnent à des températures très basses (-40°C à -80°C en général). Les billes cryogénisées sont extraites à des températures généralement comprises entre -80°C et -120°C, ce qui permet de démarrer directement la lyophilisation, avec des produits dont la température avoisine -60°C, sans étape préalable de refroidissement. Le temps de lyophilisation lui-même est très fortement réduit (au moins d’un facteur 2). Enfin, ce procédé permet de traiter de plus grandes quantités de matières premières en réduisant le temps de traitement. Ce dernier avantage permet d’obtenir des produits de qualité même en l’absence de cryoprotectant. Ce procédé ouvre de nouvelles perspectives pour la conservation de cellules sous forme de lyophilisat dont les propriétés sont préservées pendant le procédé de lyophilisation et restaurées après remise en solution, tant au niveau des molécules actives qu’au niveau de la viabilité de cellules entières. DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION Un premier objet de l’invention concerne un procédé de lyophilisation d’une composition cellulaire caractérisée en ce que l’étape de congélation est réalisée par cryogénie et qui comprend les étapes de: a) disposer d’une composition cellulaire comprenant des cellules dans un milieu aqueux ; b) dissoudre un gaz dans ladite composition par passage dans une zone dense en molécules de gaz, une telle densité étant obtenue (i) soit grâce au flux de gaz généré par l’évaporation d’un fluide cryogénique, (ii) soit par une élévation de la pression ; c) cryogéniser ladite matrice riche en gaz obtenue à l’étape b) à une pression permettant de maintenir ledit gaz dissout dans ladite matrice pour obtention de granules, de particules ou de billes surgelées ; d) lyophilisation desdites granules, de particules ou de billes surgelées pour obtenir une préparation cellulaire lyophilisée. Ce procédé est donc caractérisé par le fait de congeler la matrice constituée d’une composition cellulaire par cryogénie au contact d’un gaz de sorte à dissoudre du gaz dans la matrice. La dissolution est obtenue par passage de la matrice dans une zone dense en molécules de gaz. La zone riche en molécules de gaz au sein de l’enceinte contenant le gaz cryogénique peut être obtenue de deux manières : i) soit grâce au flux de gaz généré par l’évaporation d’un fluide cryogénique, (ii) soit par une élévation de la pression. Lorsque la zone dense en molécules est obtenue grâce à un flux de gaz généré par l’évaporation d’un fluide cryogénique, la quantité de gaz dissoute dans la matrice est typiquement équivalente, lorsqu’aucune pression n’est appliquée, à celle que l’on obtiendrait par l’application de pressions relatives comprises entre 0,001 bars et 2 bars. Lorsque la zone dense en molécules est obtenue par une élévation de la pression, cette pression est supérieure à la pression atmosphérique, et peut notamment être supérieure à 0,1 bar, 0,5 bar, 1 bar, 2 bars, 5 bars, 10 bars, 15 bars, 20 bars, 25 bars, 30 bars, 50 bars ou 100 bars. Par les termes « sous pression » au sens de l’invention, on entend des conditions qui permettent la dissolution d’un gaz dans une matrice et/ou le maintien du gaz dissout dans ladite matrice pendant la surgélation. La mise sous pression peut être obtenue soit par une élévation de la pression, soit par la mise en contact de la matrice avec un fluide cryogénique, l’évaporation de ce gaz créant une densité de molécule de gaz équivalente à une mise sous pression de sorte que les molécules de gaz se dissolvent dans la matrice. De plus, la mise « sous pression » correspond à l’application de pressions relatives, c’est-à-dire que l’on considère la pression atmosphérique comme une pression de 0 bar. Toutes les pressions exprimées dans le présent document sont des pressions relatives. Dans un mode de réalisation préféré de l’invention, le procédé n’est pas mis en œuvre sous vide partiel. Ainsi, l’étape b) s’opère à une pression relative suffisante pour permettre la dissolution de gaz dans la matrice et une pression équivalente est maintenue à l’étape c) pour conserver le gaz dissout à l’intérieur de la matrice lors de la cryogénisation. Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, la pression appliquée à l’étape c) est supérieure ou égale à la pression atmosphérique. Le gaz peut être un gaz inerte. Le gaz peut être de l'azote, du protoxyde d'azote, du dioxyde de carbone, un gaz rare comme l'argon ou un mélange de ces gaz. Dans un mode de réalisation préféré, le gaz utilisé est de l’azote, et le fluide cryogénique de l’azote liquide. Concernant la mise en œuvre du procédé dans sa globalité, il est possible d’enchainer les étapes du procédé à la suite les unes des autres et notamment de réaliser l’étape de lyophilisation immédiatement après l’étape de cryogénie. De plus, le procédé peut être mené en continu. Il est également possible de conserver le produit sous forme surgelée à l’issue de l’étape c) et de réaliser la lyophilisation ultérieurement, après un temps de stockage en froid négatif pour conserver les produits à l’état solide (par exemple à -40°C). Dans les deux cas, les avantages du procédé sont conservés. Les conditions du procédé peuvent être adaptées en fonction du produit à déshydrater, notamment la pression lors de l’étape de cryogénie, et les paramètres de lyophilisation. L’homme du métier saura réaliser de telles adaptations. Par « cellule » au sens de l’invention, on entend une cellule procaryote ou eucaryote. Parmi les cellules procaryotes, on peut citer les bactéries lactiques, les bactéries d’intérêt probiotique, les bactéries constitutives du microbiote (intestinal, fécal…). Parmi les cellules eucaryotes, on peut citer les levures, cellules reproductrices, les cellules sanguines et les cellules souches, les cellules végétales et les micro-algues. Les cellules traitées selon les procédés décrits dans le présent document peuvent être vivantes, ou non. Il peut s’agir en particulier de bactéries tyndallisées, c’est-à-dire préalablement tuées par la chaleur. Les cellules peuvent être isolées les unes des autres ou être organisées sous forme de tissus. Dans un mode de réalisation préféré, la composition cellulaire est constituée de bactéries d’intérêt probiotique pour l’Homme et l’animal. Dans un autre mode de réalisation préféré, la composition cellulaire est constituée d’un échantillon de microbiote fécal. Par « milieu aqueux », on entend de l’eau, un milieu de culture, un extrait aqueux de plantes. Ce milieu aqueux peut contenir des cryoprotectants ou ne pas en contenir. Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, la composition cellulaire ne contient pas de cryoprotectant. Un deuxième objet de l’invention concerne un procédé de préparation d’une composition de cellules congelées par cryogénie sous pression comprenant les étapes : a) disposer d’une composition cellulaire comprenant des cellules dans un milieu aqueux sous forme d’une matrice ; b) dissoudre un gaz dans ladite matrice par passage dans une zone dense en molécules de gaz, une telle densité étant obtenue (i) soit grâce au flux de gaz généré par l’évaporation d’un fluide cryogénique, (ii) soit par une élévation de la pression jusqu’à 10 bars ; c) cryogéniser ladite matrice riche en gaz obtenue à l’étape b) à une pression permettant de maintenir ledit gaz dissout dans ladite matrice pour obtention de granules, de particules ou de billes surgelées. Ce procédé permet d’obtenir des cellules congelées dont la survie est augmentée par rapport aux procédés de congélation décrits antérieurement. La pression appliquée à l’étape b) est inférieure à 10 bars, mais peut dans certains modes de réalisation être inférieure à 5 bars, voire à 2 bars. Dans un mode de réalisation préféré, la pression permettant de maintenir ledit gaz dissout dans ladite matrice est supérieure ou égale à la pression atmosphérique. Un troisième objet de l’invention concerne une composition cellulaire lyophilisée obtenue par le procédé de lyophilisation tel que défini précédemment. Dans un mode de réalisation particulier, la composition comprend un lyophilisat et des maltodextrines surséchées. Dans un mode de réalisation particulier, la composition cellulaire lyophilisée comprend de bactéries d’intérêt probiotiques lyophilisées et stabilisées obtenues par le procédé tel que défini précédemment et des maltodextrines surséchées. Dans un mode de réalisation préféré, une telle composition comprend 20-25% de lyophilisat et 75-80% de maltodextrines surséchées. La présente invention sera mieux comprise à la lecture des exemples qui suivent, fournis à titre d’illustration et ne devant en aucun cas être considérés comme limitant la portée de la présente invention. DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1 : Viabilité d’une souche L. plantarum SD5209 après congélation par cryogénie à différentes pressions. Figure 2 : Concentrations en UFC et CI des lyophilisats d’une souche Lactobacillus plantarum. Figure 3 : Perte de viabilité en conditions de vieillissement accéléré des lyophilisats d’une souche Bifidobacterium animalis ssp lactis. Figure 4 : Rendement en cellules totales après 3 mois de stockage en conditions de vieillissement accéléré des lyophilisats d’une souche Bifidobacterium animalis ssp lactis. EXEMPLES EXEMPLE 1 : Impact de la méthode de congélation sur les propriétés d’une composition de bactéries lactiques congelée A - Préparation des compositions de bactéries lactiques congelées Un échantillon bactérien est cultivé pendant 24h dans 500mL de milieu de culture de type MRS Végétal (Ref BK176HA de Biokar Diagnostics. Le milieu de culture est ensuite centrifugé pendant 10 min à une vitesse de 3400 g. Le culot, contenant les microorganismes étudiés, est repris dans un milieu de culture frais de telle sorte que la concentration en cellules intactes soit ajustée à 5.10 9 cellules/mL. La préparation est alors séparée en 4 fractions permettant de tester les 4 méthodes de congélation différentes : - Les échantillons « témoin procédé standard » sont réalisés en aliquotant la préparation en flacons de 30mL et en plaçant ces derniers dans une enceinte à -80°C pendant au moins 48h de manière à garantir que l’ensemble du produit soit congelé et ait atteint la température de -80°C ; - Les échantillons « témoin billes azote » sont réalisés en produisant manuellement un goutte à goutte, à l’aide d’une seringue, au-dessus d’un récipient ouvert, tel qu’un bol ou un saladier, contenant de l’azote liquide, à pression atmosphérique et température ambiante ; - Les échantillons « cryogénie 5 bars » sont obtenus grâce à un équipement permettant de mettre en œuvre le procédé tel que décrit dans le brevet EP07858410, sous une pression relative de 5 bars dans l’enceinte de cryogénie ; de même les échantillons « cryogénie 10 bars », « cryogénie 15 bars » ainsi que les échantillons préparés en appliquant d’autres pression pendant l’étape de cryogénie sont obtenus en appliquant le même procédé et en modifiant la pression à l’intérieur de l’enceinte. - Les échantillons « cryozéro » sont obtenus grâce à un équipement permettant de mettre en œuvre une étape de cryogénie sous une pression relative de 0 bars, de telle sorte que la saturation en azote dissous obtenue soit environ 3 fois supérieure à celle qui serait obtenue à cette même pression avec un procédé standard (condition « témoin billes azote »). A l’issue de l’étape de congélation, tous les échantillons sont conservés dans une enceinte à -80°C avant d’être analysés. B - Analyse des échantillons congelés Les résultats obtenus sont présentés à la Figure 1. Les résultats de la Figure 1 ont été obtenus à partir d’une souche commerciale de L. plantarum SD5209 (ATCC). Les bactéries ont été solubilisées dans un milieu MRS Végétal sans sucre + saccharose 1 % + maltodextrines 5% (cryoprotectants). Le témoin -80°C correspond à la congélation de 40 mL à -80°C pendant un minimum de 48h. Le témoin -20°C correspond à la congélation de 40 mL à -20°C pendant un minimum de 48h. Les échantillons ont ensuite été décongelés (1h à 37°C) et la viabilité a été mesurée. Pour les souches congelées par cryogénie, différentes pressions ont été testées. On observe que la perte de viabilité du témoin congelé à -20°C est bien plus importante que pour les différents échantillons congelés par cryogénie, notamment à 8 bars. Ce résultat est tout à fait significatif et montre un réel apport de la cryogénie. Ce résultat est d’autant plus intéressant que les souches testées n’ont pas été fermentées avant congélation, mais juste solubilisées à partir d’un échantillon lyophilisé. La première lyophilisation subie par les bactéries a déjà éliminé les souches les moins résistantes et celles qui sont contenues dans l’échantillon ont donc déjà été « pré-sélectionnées » vis-à-vis de leur capacité de résistance à la déshydratation dans des conditions industrielles. Dans ce contexte, on peut s’attendre à ce que l’amélioration soit supérieure en congelant par cryogénie des souches fraichement fermentées. EXEMPLE 2 : Impact de la méthode de congélation sur les propriétés d’une composition de bactéries lyophilisée Les échantillons sont préparés dans les mêmes conditions que celles décrites dans l’exemple 1 a). Les échantillons congelés selon les 4 méthodes sont de plus lyophilisés, dans un lyophilisateur Drywinner CT60 (Heto Holten) pour une durée de 48h à 72h. Les échantillons sont broyés précautionneusement à l’aide d’un mortier et d’un pilon afin de les mettre sous forme de poudre. Ces dernières sont ensuite conservées dans un pot stérile à -20°C avant d’être analysées. Pour les analyses, les échantillons en poudre sont préalablement dispersés dans une eau peptonée tamponnée additionnée de Tween 80 à 1% (p/v) et homogénéisés à l’aide d’un Stomacher. Les quantités d’UFC et de CI sont obtenues par dénombrement en gélose MRS et par analyse cytométrique (protocole B de la norme ISO 19344 IDF 232 v2015). Les résultats obtenus sont présentés sur la Figure 2. Ce graphe montre les résultats obtenus selon 2 paramètres : - la concentration de cellules vivantes du lyophilisat, en UFC (test de viabilité consistant à tester la capacité des bactéries à former des colonies sur un milieu gélosé) et - l’intégrité membranaire en cellules intactes (CI, mesurée par cytométrie) des cellules du lyophilisat. Les résultats montrent que l’utilisation d’une vitesse de refroidissement plus forte (cryogénie : Témoin billes azote) permet de doubler et tripler les concentrations en UFC et CI du lyophilisat par rapport au témoin -80°C. La condition « Cryozéro » permet d’augmenter encore ces concentrations, puisqu’on atteint le triple et le quadruple des concentrations en UFC et CI du Témoin procédé standard (-80°C). Enfin, la condition « Cryogénie 5 bars » permet d’atteindre les concentrations les plus élevées en UFC et CI, 4 et 6 fois plus élevées que celles du procédé standard. EXEMPLE 3 : Impact du procédé de lyophilisation sur l’intégrité cellulaire d’une composition de bactéries lyophilisée (poudre sèche) Les échantillons sont préparés dans les mêmes conditions que celles décrites dans l’Exemple 2. Les échantillons sous forme de poudre sont conservés 3 mois, après dilution dans des maltodextrines de maïs surséchées, dans des sachets tricouches papier/alu/PE et placés dans différentes conditions de température et d’hygrométrie (4°C / HR non contrôlée, 20°C / HR non contrôlée, 25°C / 60% HR et 30°C / 65% HR) avant d’être analysés. Pour les analyses, les échantillons en poudre sont préalablement dispersés comme indiqué dans l’Exemple 2. Les quantités d’UFC sont obtenues par dénombrement en gélose MRS, à t=0 juste après la production des échantillons, puis après respectivement 1,5 mois et 3 mois de stockage. La perte de viabilité est calculée par différence entre la quantité d’UFC à un temps t et celle correspondante à t=0. Les expériences ont été réalisées en utilisant des bactéries B. lactis spp animalis. Les résultats obtenus sont présentés à la Figure 3. On observe que la perte de viabilité est très importante dans les conditions standards puisque cette perte est proche de la moitié des UFC présentes initialement. A contrario, la perte observée pour l’échantillon issu de la cryogénie sous 5 bars est très faible et proche de 0. Les résultats obtenus pour le témoin billes azote (Témoin N2) et pour les conditions cryozéro sont comparables et intermédiaires, ce qui montre également l’impact positif de la cryogénie selon le procédé proposé pour la conservation de souches sous forme lyophilisée. EXEMPLE 4 : Impact du procédé de lyophilisation sur la lyse cellulaire d’une composition de bactéries lyophilisée (poudre sèche) Les échantillons sont préparés dans les mêmes conditions que celles décrites dans l’Exemple 2. Les échantillons sous forme de poudres obtenus sont conservés 3 mois dans des sachets tricouches papier/alu/PE et placés dans différentes conditions de température et d’hygrométrie (4°C / HR non contrôlée, 20°C / HR non contrôlée, 25°C / 60% HR et 30°C / 65% HR) avant d’être analysés. Pour les analyses, les échantillons en poudre sont préalablement dispersés comme indiqué dans l’exemple 2. Les quantités de cellules totales (CT) sont obtenues par analyse cytométrique. Les rendements sont obtenus en rapportant les valeurs obtenues au nombre de CT dénombrées dans la préparation avant l’étape de congélation. Les expériences ont été réalisées en utilisant des bactéries Bifidobacterium animalis ssp lactis . Les résultats obtenus sont présentés dans la Figure 4. On observe que le pourcentage de cellules lysées est plus important avec l’utilisation du procédé standard alors que le nombre de cellules préservées augmente avec l’augmentation de la quantité de gaz dissous dans la préparation lors de l’étape de congélation dans l’azote liquide. L’utilisation de la cryogénie sous 5 bars de pression permet ainsi d’augmenter de 12% environ le rendement en cellules comparativement au procédé standard et ce alors même que la souche mise en œuvre présente déjà une résistance élevée aux processus de congélation et de lyophilisation. Le procédé proposé présente donc un intérêt également pour le traitement de souches peu sensibles aux contraintes actuelles, en permettant d’augmenter les rendements de production. Conclusion : Le procédé de lyophilisation d’une composition cellulaire comprenant une étape congélation réalisée par cryogénie sous pression permet une amélioration tant qualitative que quantitative de la production de lyophilisats de cellules. Procédé de lyophilisation d’une composition cellulaire caractérisée en ce que l’étape congélation est réalisée par cryogénie sous pression, ledit procédé comprenant les étapes de : a) disposer d’une composition cellulaire comprenant des cellules dans un milieu aqueux ; b) dissoudre un gaz dans ladite composition par passage dans une zone dense en molécules de gaz, une telle densité étant obtenue (i) soit grâce au flux de gaz généré par l’évaporation d’un fluide cryogénique, (ii) soit par une élévation de la pression ; c) cryogéniser la matrice constituée de ladite composition cellulaire riche en gaz obtenue à l’étape b) à une pression permettant de maintenir ledit gaz dissout dans ladite matrice pour obtention de granules, de particules ou de billes surgelées ; d) lyophilisation desdites granules, de particules ou de billes surgelées pour obtenir une préparation cellulaire lyophilisée. Procédé de préparation d’une composition de cellules congelées par cryogénie sous pression comprenant les étapes : a) disposer d’une composition cellulaire comprenant des cellules dans un milieu aqueux sous forme d’une matrice ; b) dissoudre un gaz dans ladite matrice par passage dans une zone dense en molécules de gaz, une telle densité étant obtenue (i) soit grâce au flux de gaz généré par l’évaporation d’un fluide cryogénique, (ii) soit par une élévation de la pression inférieure à 10 bars; c) cryogéniser ladite matrice riche en gaz obtenue à l’étape b) à une pression permettant de maintenir ledit gaz dissout dans ladite matrice pour obtention de granules, de particules ou de billes surgelées. Procédé selon l’une des revendications précédentes dans lequel ledit gaz est de l’azote. Procédé selon l’une des revendications précédentes dans lequel ladite composition cellulaire comprend des bactéries lactiques et d’intérêt probiotique, des bactéries formant le microbiote, des levures, des cellules végétales, des micro-algues, des cellules reproductrices, des cellules sanguines, des cellules souches. Procédé selon la revendication 4 dans lequel ladite composition cellulaire comprend des bactéries d’intérêt probiotique pour l’homme et l’animal. Procédé selon l’une des revendications 1 à 5 dans lequel la composition cellulaire ne contient pas de cryoprotectant. Procédé selon la revendication 4 dans lequel ladite composition cellulaire est un échantillon de microbiote fécal. Composition cellulaire lyophilisée obtenue par le procédé tel que défini à l’une des revendications 1, 3 à 7. Composition selon la revendication 8 comprenant en outre des maltodextrines surséchées. Composition selon l’une des revendications 8 ou 9 dans laquelle la composition cellulaire comprend des bactéries d’intérêt probiotique.