Brevet FR3101885A1 — publié le 20210416

L’invention concerne un système pour la libération de plaquettes à partir d’un fluide comprenant notamment des cellules mégacaryocytaires comportant des extensions cytoplasmiques. Le système permet de reproduire le processus de pipetage effectué manuellement au moyen d’une pipette ce qui autorise une libération continue et automatique des plaquettes. Ceci s’effectue à grande échelle car la géométrie du système selon l’invention permet de traiter des volumes importants de fluide avec un débit élevé (de l’ordre de plusieurs litres par heure), ce qui le rend particulièrement adapté à une utilisation à l’échelle industrielle. L’invention concerne en outre un procédé de libération de plaquettes à partir d’un fluide comprenant notamment des cellules mégacaryocytaires comprenant des extensions cytoplasmiques, ledit procédé étant mis en œuvre au moyen du système précité. Figure pour l’abrégé : Fig. 1a SYSTEME POUR LA LIBERATION DE PLAQUETTES ET PROCEDE DE LIBERATION DE PLAQUETTES Domaine technique de l’invention L’invention concerne un système pour la libération de plaquettes à partir d’un fluide comprenant notamment des progéniteurs de mégacaryocytes, cellules mégacaryocytaires comportant des extensions cytoplasmiques. L’invention concerne également un ensemble muni d’une pluralité de systèmes tel que celui-ci. Enfin, l’invention concerne un procédé de libération continue de plaquettes au moyen d’un tel système. L’invention est plus particulière adaptée à la production in vitro de plaquettes sanguines à une échelle industrielle. Arrière-plan technique La production in vitro de plaquettes sanguines répond à des besoins croissants dans diverses applications médicales. Actuellement, il existe essentiellement deux catégories de systèmes destinés à cet usage spécifique: les systèmes microfluidiques et les systèmes « à réservoir » . Ces catégories de systèmes destinés à libérer les plaquettes sont issues d’observations réalisées in situ qui montrent le besoin d’un flux. Un exemple de système à réservoir est décrit dans le document WO201909364 A1. Le système est muni de moyens d’agitation du fluide à traiter. Il comprend un réservoir pour le fluide comportant notamment les cellules mégacaryocytaires et au moins un moyen pour agiter le fluide, l’agitation étant à l’origine de la libération des plaquettes. Cette agitation est générée à l’intérieur du réservoir lui-même, par exemple, au moyen d’une pâle en va et vient vertical. L’inconvénient principal d’un tel système est qu’il n’est pas apte à fonctionner dans des conditions garantissant la qualité des plaquettes ainsi obtenues puisqu’il n’est pas isolé de l’environnement extérieur et des sources de contamination présentes dans cet environnement, ce qui le rend impropre à une utilisation médicale. Les systèmes microfluidiques comme leur nom l’indique sont généralement des systèmes de dimensions micrométriques (quelques dizaines de microns à quelques centaines de microns tout au plus) comprenant un réseau de réservoirs et de canaux interconnectés selon un agencement particulier en vue de remplir différentes fonctions. Ils comprennent, de manière classique, un site dédié à la culture de cellules mégacaryocytaires ou mégacaryocytes, et éventuellement à la libération des plaquettes, le site étant relié à un réseau de canaux configurés pour extraire/récupérer les plaquettes. Ces systèmes, pour la plupart biomimétiques, cherchent à reproduire l’environnement physiologique afin d’accroître la production de plaquettes. Du fait de leur petite taille, ces systèmes microfluidiques présentent deux limites intrinsèques. La première étant le faible débit de plaquettes pouvant être atteint par de tels systèmes, généralement de quelques centaines de microlitres par heure (µL/h). À titre d’exemple, un système ayant un débit de 200 µL/h nécessiterai 50 000 heures, soit 5,7 ans pour traiter 10 L de fluide. Il est alors nécessaire de connecter plusieurs systèmes en parallèle pour obtenir un débit total comparable. Cela étant, dans l’exemple ci-dessus le nombre de systèmes requis serait très élevé, i.e. 50 000, et la complexité du système serait encore plus accrue. Au mieux de tels systèmes ne peuvent donc convenir que pour des volumes limités d’échantillons de fluide. En outre, les dispositifs microfluidiques décrits dans la littérature mettent tous en œuvre un mécanisme/procédé qui "fixe" les mégacaryocytes puis en extrait les plaquettes. Cette phase de fixation est souvent basée sur l'utilisation d'une drogue ou d'un composé chimique de revêtement, ce qui constitue un inconvénient. Plus récemment, un nouveau procédé de libération des plaquettes à partir de cellules mégacaryocytaires en ayant recours au pipetage a été développé. Un tel procédé est décrit dans le document Strassel et al . « Aryl hydrocarbon receptor-dependent enrichment of a high potential to produce propalets », Blood, 5 Mai 2016, vol. 127, n° 18. Dans un tel procédé, le processus de libération des plaquettes résulte directement du pipetage. Le pipetage dont il s’agit est similaire à un pipetage classique puisqu’il consiste à prélever un échantillon d’un milieu comprenant des cellules mégacaryocytaires au moyen d’une pipette à ceci près que l’action de pipeter est répétée autant de fois que nécessaire afin de créer l’agitation nécessaire à la libération des plaquettes. À l’issu de ce procédé, des plaquettes ont été détectées dans le fluide traité, validant ainsi la capacité du pipetage pour la libération des plaquettes, qui plus est avec une grande simplicité de mise en œuvre. Cependant, ce procédé n’est pas adapté à une exploitation à grande échelle puisque le pipetage est par nature manuel et qu’en conséquent il n’a vocation qu’à traiter des volumes limités de fluide. Brève description des figures D’autres objets et caractéristiques de l’invention apparaîtront plus clairement dans la description qui suit, faite en référence aux figures annexées, dans lesquelles : La figue 1a est une représentation schématique d’un système selon un premier mode de réalisation de l’invention, un réservoir pour le fluide étant illustré en section selon une vue de côté ; La figue 1b est une représentation schématique d’une variante de réalisation du système de la figure 1a; La figure 1c est une vue rapprochée d’un réservoir équipant le système illustré à la figure 1b ; La figure 2a est une représentation schématique d’un système selon un deuxième mode de réalisation de l’invention comprenant une pluralité de dispositifs montés en série ; La figure 2b représente une vue éclatée d’un système selon l’invention comprenant cinq dispositifs montés en série ; La figure 2c représente un ensemble tel qu’illustré aux figures 2a et 2b, l’ensemble est ici connecté à un réservoir source et un réservoir de réception du fluide ; La figure 2d est une représentation schématique d’un ensemble selon un troisième mode de réalisation de l’invention, comprenant une pluralité de dispositifs montés en parallèle ; La figure 3a est une représentation schématique d’un procédé selon l’invention ; La figure 3b est une représentation schématique du procédé de la figure 3a dans laquelle sont illustrées les sous-étapes de réalisation du procédé ; La figure 4a illustre une cellule mégacaryocytaire proplaquettaire ; La figure 4b illustre des plaquettes obtenues après le procédé de libération de plaquettes selon l’invention ; La figure 5a est une figure comparative illustrant le rendement de libération de plaquettes obtenu en utilisant une pipette et en utilisant un système selon l’invention en fonction du vide relatif au sein dudit système ; La figure 5b est une analyse de la fonctionnalité des plaquettes obtenues à une pression de -30 kPa pour des plaquettes natives (barres creuses) et des plaquettes de culture (barres pleines). Système (1) pour la libération de plaquettes à partir d’un fluide (F) comprenant notamment des cellules mégacaryocytaires (Mk) comportant des extensions cytoplasmiques (Ck), ledit système (1) comprenant : un dispositif (2) comprenant : un réservoir (10) de libération de plaquettes comprenant une première ouverture (16) et une deuxième ouverture (18), un premier élément (20) de raccordement fluidique fixé au niveau de ladite première ouverture (16) et adapté pour injecter ledit fluide (F) à l’intérieur dudit réservoir (10), ledit premier élément (20) de raccordement comprenant un orifice (22) d’injection du fluide dans le réservoir (10) de libération de plaquettes et une portion (24) étrécie en direction dudit orifice (22), un deuxième élément (30) de raccordement fluidique fixé au niveau de ladite deuxième ouverture (18), ledit deuxième élément (30) de raccordement comprenant un orifice (32) de refoulement du fluide, un dispositif de pompage (60) du fluide (F) en communication fluidique avec le réservoir (10) par l’intermédiaire du deuxième élément (30) de raccordement fluidique, un module d’alimentation électrique (62) du dispositif de pompage (60), un système de programmation (70) configuré pour contrôler le module d’alimentation électrique (62) du dispositif de pompage (60), afin de mettre en œuvre une ou plusieurs séquences de libération de plaquettes réalisées de sorte à générer un écoulement continu du fluide (F) entre ledit orifice (22) d’injection et ledit orifice (32) de refoulement ainsi que des perturbations tourbillonnaires au sein du réservoir (10) provoquant la fragmentation des extensions cytoplasmiques (Ck) des cellules mégacaryocytaires (Mk). Système (1) selon la revendication 1, dans lequel la portion (24) étrécie est conique. Système (1) selon la revendication 1, dans lequel le premier élément (20) de raccordement comprend un axe longitudinal (X1) et le deuxième élément (30) de raccordement comprend un axe longitudinal (X2), lesdits axes longitudinaux (X1, X2) étant soit sécants soit parallèles et alors séparés d’une distance, d, non nulle. Système (1) selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l’orifice (22) d’injection présente un diamètre d’ouverture inférieur à 1 mm. Système (1) selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l’orifice (32) de refoulement présente un diamètre d’ouverture inférieur à 1 mm. Système (1) selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le réservoir (10) présente une forme sphérique. Système (1) selon l’une quelconque des revendications précédentes, comprenant : un réservoir (40) source pour le stockage du fluide (F), connecté au premier élément (20) de raccordement fluidique pour alimenter le réservoir (10) et un réservoir (50) de réception du fluide (F) connecté au deuxième élément (30) de raccordement fluidique pour collecter ledit fluide destiné à être aspiré du réservoir (10). Système (1) selon la revendication 7, dans lequel le dispositif de pompage (60) est situé dans le réservoir (50) de réception. Système (1) selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit deuxième élément (30) de raccordement comprend en outre une portion (34) évasée depuis ledit orifice (32) de refoulement du fluide en direction du dispositif de pompage (60). Système (1) selon l’une des revendications précédentes comprenant au moins un autre dispositif (2’’) comportant: - un réservoir (10’’) de libération de plaquettes comprenant une première ouverture (16’’) et une deuxième ouverture (18’’), - un premier élément (20’’) de raccordement fluidique fixé au niveau de ladite première ouverture (16’’) et adapté pour injecter ledit fluide (F) à l’intérieur dudit réservoir (10’’), ledit premier élément (20’’) de raccordement comprenant un orifice (22’’) d’injection du fluide et une première portion (24’’) étrécie de sorte à pouvoir accélérer le fluide (F), ladite première portion (24’’) étrécie débouchant sur ledit orifice (22’’) d’injection, - un deuxième élément (30’’) de raccordement fluidique fixé au niveau de ladite deuxième ouverture (18’’), ledit deuxième élément (30’’) de raccordement comprenant un orifice (32’’) de refoulement du fluide, ledit autre dispositif (2’’) étant agencé parallèlement au premier dispositif (2) et connecté au dispositif de pompage par l’intermédiaire du deuxième élément (30’) dudit autre dispositif. Système (1) selon l’une des revendications 1 à 9 comprenant au moins un autre dispositif (2’) comportant: - un réservoir (10’) de libération de plaquettes comprenant une première ouverture (16’) et une deuxième ouverture (18’), - un premier élément (20’) de raccordement fluidique fixé au niveau de ladite première ouverture (16’) et adapté pour injecter ledit fluide (F) à l’intérieur dudit réservoir (10’), ledit premier élément (20’) de raccordement comprenant un orifice (22’) d’injection du fluide et une première portion (24’) étrécie de sorte à pouvoir accélérer le fluide (F), ladite première portion (24’) étrécie débouchant sur ledit orifice (22’) d’injection, - un deuxième élément (30’) de raccordement fluidique fixé au niveau de ladite deuxième ouverture (18’), ledit deuxième élément (30’) de raccordement comprenant un orifice (32’) de refoulement du fluide, ledit autre dispositif étant agencé en série avec le premier dispositif (2), ledit deuxième élément (30’) de raccordement dudit autre dispositif (2’) étant en communication fluidique avec ledit premier élément (20) de raccordement fluidique dudit premier dispositif (2). Procédé (5) de libération de plaquettes (P) à partir d’un fluide (F) comprenant notamment des cellules mégacaryocytaires (Mk) comprenant des extensions cytoplasmiques (Ck), ledit procédé comprenant les étapes suivantes, mises en œuvre au moyen d’un système (1) selon l’une des revendications 1 à 11 : (100) fournir un fluide (F) comprenant des cellules mégacaryocytaires (Mk) en suspension dans ledit fluide (F), lesdites cellules mégacaryocytaires (Mk) comprenant des extensions cytoplasmiques (Ck), (200) alimenter électriquement le dispositif de pompage (60), (300) commander le système de programmation (70) afin de lancer une ou plusieurs séquences de libération de plaquettes, la ou chaque séquence de libération de plaquettes étant réalisée de sorte à générer un écoulement continu du fluide (F) entre ledit orifice (22) d’injection et ledit orifice (32) de refoulement ainsi que des perturbations tourbillonnaires au sein du réservoir (10) provoquant la fragmentation des extensions cytoplasmiques (Ck) des cellules mégacaryocytaires (Mk). Procédé (5) selon la revendication 12, dans lequel, lors de l’étape (200), un vide relatif compris entre -10 kPa et -50 kPa est généré dans le dispositif (2, 2’, 2’’).