Brevet FR3106834A1 — publié le 20210806

L’invention concerne un procédé pour amplifier au moins deux séquences d’acides nucléiques distinctes présentes dans un échantillon à partir d’un couple d’amorces 1 et d’un couple d’amorces 2. En particulier, le 1 er oligonucléotide du couple d’amorces 2 comprend en outre en 5’ la séquence du 1 er oligonucléotide du couple d’amorces 1, et le 2 ème oligonucléotide du couple d’amorces 2 comprend en outre en 5’ la séquence du 2 ème oligonucléotide du couple d’amorces 1. L’invention concerne également un kit et un kit de détection apte à mettre en œuvre ledit procédé et ses utilisations. Nouveau procédé de PCR multiplexe et utilisation L’invention se rapporte au domaine de la détection et amplification d’un acide nucléique d’intérêt, en particulier dans le diagnostic infectieux. L’invention concerne ainsi un procédé pour amplifier au moins deux séquences d’acides nucléiques distinctes présentes dans un échantillon à partir d’un couple d’amorces 1 reconnaissant un 1 e r acide nucléique (A) et un couple d’amorces 2 reconnaissant un 2 ème acide nucléique. En particulier, le 1 er oligonucléotide tel qu’un oligonucléotide sens du couple d’amorces 2 comprend en outre en 5’ la séquence du 1 er oligonucléotide du couple d’amorces 1, et le 2 ème oligonucléotide du couple d’amorces 2 comprend en outre en 5’ la séquence du 2 ème oligonucléotide du couple d’amorces 1. L’invention concerne également les amorces, un kit de détection apte à mettre en œuvre ledit procédé et ses utilisations. Ces dernières années, le diagnostic infectieux a fortement évolué, notamment par l’utilisation des méthodes de biologie moléculaire telles que l’amplification génomique ou Polymerase Chain Reaction (PCR). La PCR remplace de plus en plus les méthodes sérologiques et microbiologiques classiques, telles que la mise en culture des bactéries ou le test ELISA. Les avantages de la PCR sont nombreux, le test est rapide, sensible et spécifique. Malgré un coût encore assez important et donc réservé aux analyses difficiles ou à certains laboratoires d’analyse, la spécificité et sensibilité du diagnostic remplacera à terme les analyses classiques et mis en œuvre en 1 ère intention. La PCR permet d’analyser une quantité très importante d’échantillons en peu de temps grâce à la technologie multiplexe. Il est ainsi possible d’amplifier plusieurs cibles d’acide nucléique d’un même échantillon lors d’un unique cycle de PCR. La PCR multiplexe est une PCR permettant d’amplifier simultanément plusieurs séquences d'acides nucléiques différentes. Elle permet d’effectuer plusieurs réactions de PCR séparées, ensembles, dans une seule et même réaction. Ce procédé permet d'amplifier l’acide nucléique dans des échantillons en utilisant de multiples amorces et une polymérase dans un thermocycleur. La PCR multiplexe est donc particulièrement adaptée pour le diagnostic infectieux. Lors du diagnostic infectieux, des amorces différentes permettant de cibler plusieurs bactéries, virus ou levures sont mises en présence de l’échantillon cible. Toutefois, les amorces nécessitent d’être fortement optimisées afin que toutes les amorces puissent travailler à la même température pendant la PCR, permettant notamment d’éviter le phénomène de cross-réactions. Par exemple, la PCR multiplexe est capable de révéler au moins un pathogène lors de pneumonie communautaire chez 77 % des patients hospitalisés, par rapport à 39 % par culture (NJ Gadsby CD Russell MP McHugh Comprehensive molecular testing for respiratory pathogens in community-acquired pneumonia. Clin Infect Dis 2016). Lors de diarrhées, elle permet de détecter jusqu’à trois fois plus de pathogènes dans les selles que les méthodes traditionnelles (CR Stensvold HV Nielsen Comparison of microscopy and PCR for detection of intestinal parasites in Danish patients supports an incentive for molecular screening platforms. J Clin Microbiol 2012). Ainsi, un seul test peut mettre en évidence plusieurs agents infectieux en moins de deux heures. Aujourd’hui, des panels sont déjà proposés au clinicien pour la méningite, les infections sexuellement transmissibles, les infections respiratoires et l’entérocolite infectieuse. La PCR multiplex est également limitée à la détection d’une quantité de pathogènes prédéfinie, dont les amorces sont incluses dans le panel. Afin d’étendre le panel de détection, le kit de détection peut comprendre un nombre très important d’amorces permettant donc de détecter une grande quantité de microorganismes. Plus on souhaite augmenter le nombre de pathogènes détectés, plus on aura tendance à augmenter le nombre d’amorces. De manière générale, un pathogène est détecté par un couple d’amorce. Or, une forte concentration d’amorces différentes dans un unique test engendre un effet délétère contradictoire. L’apparition d’un phénomène de compétition entre les amorces ayant pour conséquence une inhibition des amorces et des amplifications aspécifiques. Par conséquent, des multiplexages trop élevés induisent une très mauvaise sensibilité de détection. Il est également connu par les travaux d’I. Afonina et al. en 2007 (Primers with 5′ flaps improve real-time PCR) que l’ajout en 5’ d’une séquence non complémentaire de la cible de l’amorce améliore l’efficacité d’amplifications PCR. Cependant ces ajouts de séquence ne règlent pas le problème d’amplification aspécifique ou de perte de sensibilité liées aux fortes concentrations d’amorces utilisées classiquement lors de PCR multiplexes. L’invention vise à résoudre les problématiques et inconvénients de l’art antérieur et notamment supprimer ou limiter la présence du phénomène de compétition entre les amorces lorsqu’elles sont présentes dans un seul et même test en trop grande quantités ainsi que supprimer ou limiter les amplifications aspécifiques. Ainsi selon un premier aspect, l’invention concerne un procédé pour amplifier au moins deux séquences d’acides nucléiques distinctes présentes dans un échantillon à partir d’un couple d’amorces 1 apte à amplifier une 1 ère séquence d’acides nucléiques (A) et un couple d’amorces 2 apte à amplifier une 2 ème séquence d’acides nucléiques (B), ledit procédé comprenant les étapes suivantes : la mise en contact de l’échantillon avec le couple d’amorces 1 apte à amplifier la 1 ère séquence d’acides nucléiques (A) et le couple d’amorces 2 apte à amplifier la 2 ème séquence d’acides nucléiques (B), le couple d’amorces 1 étant constitué d’un 1 er oligonucléotide et d’un 2 ème oligonucléotide apte à amplifier un acide nucléique correspondant à la 1 ère séquence (A), le couple d’amorces 2 étant constitué d’un 1 er oligonucléotide et d’un 2 ème oligonucléotide apte à amplifier un acide nucléique correspondant à la 2 ème séquence (B), l’ajout de réactifs sélectionnés et de conditions permettant une amplification PCR, et l’amplification de la 1 ère et 2 ème séquence d’acide nucléique, en réalisant une réaction d’amplification basée sur une transcription spécifique de la séquence d’acides nucléiques (A) et de la séquence d’acides nucléiques (B) présent dans l’échantillon, caractérisé en ce que, la séquence du 1 er oligonucléotide du couple d’amorces 2 comprend en outre en 5’ la séquence du 1 er oligonucléotide du couple d’amorce 1 et la séquence du 2 ème oligonucléotide du couple d’amorces 2 comprend en outre en 5’ la séquence du 2 ème oligonucléotide du couple d’amorces 1. Préférentiellement, la concentration du couple d’amorces 2 est inférieure ou égale à celle du couple d’amorces 1. Le procédé selon l’invention peut également comprendre un couple d’amorces 3, un couple d’amorces 4 etc., comprenant chacun un 1 e r oligonucléotide dont la séquence comprend en outre en 5’ la séquence du 1 er oligonucléotide du couple d’amorces 1 et un 2 ème oligonucléotide dont la séquence comprend en outre en 5’ la séquence du 2 ème oligonucléotide du couple d’amorces 1. Par exemple, le 1 er oligonucléotide du couple d’amorces 1, 2, 3 ou 4 peut être une amorce sens et le 2 ème oligonucléotide du couple d’amorces 1, 2, 3 ou 4 peut être une amorce antisens. Préférentiellement, le procédé selon l’invention est une PCR multiplexe et permet de réaliser des amplifications quantitatives différentielles. Ladite PCR selon l’invention est également dénommée PCR Relais dans la suite de la description. La PCR selon l’invention permet notamment de détecter et identifier des microorganismes tels que des bactéries, virus, levures impliquées dans des maladies infectieuses. Selon un second aspect, l’invention concerne également les amorces et kits comprenant des amorces spécifiques, un kit de détection apte à mettre en œuvre le procédé de l’invention et son utilisation pour détecter les microorganismes présents lors de maladies infectieuses. L’invention est à présent décrite en détails en regard des figures décrites ci-après. Les figures ne sont qu’illustratives de certains modes de réalisation de l’invention et ne sont pas limitatives. Figures représente le principe de la PCR Relais selon l’invention. représente un essai de PCR Duplex standard avec un couple d’amorces 1 ciblant Staphyloccocus aureus et un couple d’amorces 2 ciblant Escherichia coli. En noir : courbes d’amplification ciblant un gène spécifique de Escherichia coli. En gris : courbes d’amplification ciblant un gène spécifique de Staphyloccocus aureus. représente un essai de PCR Relais selon l’invention comprenant un couple d’amorces 1 ciblant Staphyloccocus aureus et un couple d’amorces 2 ciblant Escherichia coli. Le ratio couple d’amorces 1:couple d’amorces 2 est égal à 10:1. En noir : courbes d’amplification ciblant un gène spécifique de Escherichia coli. En gris : courbes d’amplification ciblant un gène spécifique de Staphyloccocus aureus. représente un essai de PCR Relais selon l’invention comprenant un couple d’amorces 1 ciblant Staphyloccocus aureus et un couple d’amorces 2 ciblant Escherichia coli. Le ratio couple d’amorces 1:couple d’amorces 2 est égal à 1:1. En noir : courbes d’amplification ciblant un gène spécifique de Escherichia coli. En gris : courbes d’amplification ciblant un gène spécifique de Staphyloccocus aureus. représente un essai de PCR Duplex standard avec un couple d’amorces 1 ciblant Klebsiella pneumoniae et un couple d’amorces 2 ciblant Staphyloccocus aureus. En noir : courbes d’amplification ciblant un gène spécifique de Klebsiella pneumoniae. En gris : courbes d’amplification ciblant un gène spécifique de Staphyloccocus aureus. représente un essai de PCR Relais selon l’invention comprenant un couple d’amorces 1 ciblant Klebsiella pneumoniae et un couple d’amorces 2 ciblant Staphyloccocus aureus. Le ratio couple d’amorces 1:couple d’amorces 2 est égal à 10:1. En noir : courbes d’amplification ciblant un gène spécifique de Klebsiella pneumoniae. En gris : courbes d’amplification ciblant un gène spécifique de Staphyloccocus aureus. représente un essai de PCR Relais selon l’invention comprenant un couple d’amorces 1 ciblant Klebsiella pneumoniae et un couple d’amorces 2 ciblant Staphyloccocus aureus. Le ratio couple d’amorces 1:couple d’amorces 2 est égal à 1:1. En noir : courbes d’amplification ciblant un gène spécifique de Klebsiella pneumoniae. En gris : courbes d’amplification ciblant un gène spécifique de Staphyloccocus aureus. Définitions Par patient, on entend au sens de l’invention un sujet qui peut être un être humain ou un animal, de préférence un être humain ou un mammifère. De préférence, le sujet est un patient humain, quel que soit son âge ou son sexe. Les nouveau-nés, les nourrissons et les enfants sont également inclus. Par diagnostic, on entend au sens de l’invention un test qui vise à détecter et identifier une ou des pathologie(s), en particulier la détection et l’identification de maladies infectieuses afin d’être en mesure d’administrer au patient un traitement correspondant à la pathologie. Par couple d’amorces ou couple d’oligonucléotides ou primers pair, on entend au sens de l’invention deux oligonucléotides permettant d’amplifier une séquence cible dans le cadre d’une PCR. Par amorce ou oligonucléotide ou primer, on entend au sens de l’invention un court segment d'acides nucléiques de quelques dizaines de nucléotides. Lesdites amorces sont aptes à s’hybrider avec une séquence complémentaire. Dans le cadre de l’invention, ils sont aptes à s’hybrider avec la séquence cible. La séquence cible peut être une séquence d’acides nucléiques (ADN ou ARN). Par amplification, on entend au sens de l’invention, l’amplification de la séquence cible lors d’une réaction PCR et donc l’augmentation du nombre de copies de la séquence cible. Les amorces s’hybrident avec la séquence complémentaire préalablement dénaturée, suivi de l’élongation des brins par l’action de la polymérase. La réaction se poursuit avec plusieurs cycles successifs permettant d’augmenter le nombre de copies de l’amplicon. Par amplicon, on entend au sens de l’invention, un fragment d’acide nucléique correspondant à la séquence amplifiée lors de la PCR et délimité par les deux amorces utilisées. L’amplicon est donc une copie de la séquence cible. Par amorce hybride, on entend au sens de l’invention une amorce comprenant une séquence d’acides nucléiques apte à s’hybrider avec un brin complémentaire de la séquence cible et en 5’ une séquence d’acides nucléiques correspondant à la séquence d’une amorce appartenant à un autre couple d’amorce. Dans le cadre de l’invention, le couple d’amorces 2, 3 et 4 est constitué d’amorces hybrides. Par exemple, le 1 er oligonucléotide du couple d’amorces 2 comprend une séquence apte à s’hybrider avec une séquence d’acides nucléiques spécifique (cible B) et en 5’ une séquence d’acides nucléiques correspondant à la séquence du 1 er oligonucléotide du couple d’amorces 1 apte à s’hybrider avec une autre séquence d’acides nucléiques spécifique (cible A). Par ratio de concentration, on entend au sens de l’invention, le rapport de concentration du couple d’amorces 1 par rapport à un 2 ème couple d’amorces tel que le couple d’amorces 2. Par exemple, un ratio de 1:1 correspond à une concentration identique du 1 er couple et du 2 ème couple et un ratio de 10:1 correspond à une concentration 10 fois plus importante du 1 er couple par rapport au 2 ème . Description détaillée de l’invention L’invention a donc pour objet un nouveau procédé qui vise à mettre en œuvre une PCR dite multiplexe sans augmenter significativement le nombre d’amorces différentes présentes dans le mélange réactionnel. Il est connu des PCR multiplexes permettant d’identifier un très grand nombre de séquences cibles. De tels PCR nécessitent la présence d’une forte concentration d’un couple d’amorces pour une séquence cible, multiplié par le nombre de séquence cible. A partir d’au moins 4, 5 couples d’amorces différents, les conditions de réaction sont très complexifiées. En outre, l’apparition d’un phénomène de compétition entre les amorces a pour conséquence une inhibition des amorces et des amplifications aspécifiques et par conséquent il en résulte une très mauvaise sensibilité de détection. Par ailleurs, le séquençage est une technologie de biologie moléculaire quantitative, c’est-à-dire qui va conserver la proportionnalité des acides nucléiques qu’elle séquence. Grâce à l’invention, il est possible d’amplifier les acides nucléiques en en favorisant certains. En particulier les acides nucléiques de la cible A, par rapport aux autres. Ces acides nucléiques seront ainsi présents en plus grande quantité et seront donc séquencés plus rapidement. En diagnostic, privilégier certains acides nucléiques est lié au fait que ces acides nucléiques sont plus informatifs que les autres. Grâce à l’invention ils seront analysés en priorité et permettront un diagnostic plus rapide. Ainsi, l’invention concerne un procédé pour amplifier au moins deux séquences d’acides nucléiques distinctes présentes dans un échantillon à partir d’un couple d’amorces 1 apte à amplifier une 1 ère séquence d’acides nucléiques (A) et un couple d’amorces 2 apte à amplifier une 2 ème séquence d’acides nucléiques (B), ledit procédé comprenant les étapes suivantes : la mise en contact de l’échantillon avec le couple d’amorces 1 apte à amplifier la séquence d’acides nucléiques (A) et le couple d’amorces 2 apte à amplifier la 2 ème séquence d’acides nucléiques (B), le couple d’amorces 1 étant constitué d’une 1 è r e amorce et d’une 2 ème amorce apte à amplifier un acide nucléique correspondant à la 1 ère séquence (A), le couple d’amorces 2 étant constitué d’une 1 è r e amorce et d’une 2 ème amorce apte à amplifier un acide nucléique correspondant à la 2 ème séquence (B), l’ajout de réactifs sélectionnés et de conditions permettant une amplification PCR, et l’amplification de la 1 ère et 2 ème séquence d’acides nucléiques (A et B), en réalisant une réaction d’amplification basée sur une transcription spécifique de la séquence d’acides nucléiques (A) et de la séquence d’acides nucléiques (B) présente dans l’échantillon, caractérisé en ce que, la séquence de la 1 er amorce du couple d’amorces 2 comprend en outre en 5’ la séquence de la 1 ère amorce du couple d’amorces 1 et la séquence de la 2 ème amorce du couple d’amorces 2 comprend en outre en 5’ la séquence de la 2 ème amorce du couple d’amorces 1. Lors d’une PCR Duplex-Relais, la réaction de PCR s’opère dans un mélange comprenant un couple d’amorces 1 apte à s’hybrider et amplifier une 1 ère séquence d’acides nucléiques (A) et un couple d’amorces 2 apte à s’hybrider et amplifier une 2 ème séquence d’acides nucléiques (B) comme cela est le cas pour une PCR Duplex standard. Toutefois, la PCR Duplex-Relais se distingue de la PCR Duplex standard par le fait d’utiliser des amorces hybrides pour le 2 ème couple d’amorces. La PCR Duplex-Relais comprend notamment la mise en contact de l’échantillon avec le mélange réactionnel comprenant le couple d’amorces 1 apte à amplifier la séquence d’acides nucléiques (A) et le couple d’amorces 2 apte à amplifier la 2 ème séquence d’acides nucléiques (B). Le couple d’amorces 1 est constitué d’une 1 ère amorce et d’une 2 ème amorce capable de s’hybrider chacune à la séquence complémentaire d’un des brins de l’acide nucléique (A) et à amplifier la séquence correspondant à la séquence du brin complémentaire entre les deux amorces. Ladite séquence complémentaire étant la séquence cible (A). Le couple d’amorces 2 est constitué d’une 1 ère amorce et d’une 2 ème amorce capable de s’hybrider chacune à la séquence complémentaire d’un des brins de l’acide nucléique (B) et à amplifier la séquence correspondant à la séquence du brin complémentaire entre les deux amorces. Ladite séquence complémentaire étant la séquence cible (B). En outre, le mélange réactionnel comprend l’ensemble des réactifs et conditions nécessaires pour réaliser une amplification PCR. Lesdits réactifs pouvant être initialement présents dans le mélange réactionnel ou ajoutés après la mise en contact de l’échantillon. Les réactifs nécessaires comprennent notamment des dNTPs et la polymérase que l’homme du métier sera en mesure de choisir en fonction de la PCR et des conditions de la réaction. Préférentiellement la polymérase est la polymérase de Thermophilus aquaticus ou le fragment dit Klenow de cette polymérase. Une fois l’ensemble des constituants présent dans le mélange réactionnel, l’amplification peut débuter. Il est connu de l’homme du métier les différentes étapes d’une réaction PCR. Un cycle de PCR comprend une étape de dénaturation qui vise à séparer le double brin afin d’obtenir deux simples brins suivie de l’étape d’hybridation. Lors de cette étape, les amorces vont reconnaître la séquence complémentaire présente sur un des simples brins préalablement dénaturé et vont alors s’hybrider. S’ensuit une étape d’élongation qui permet aux polymérases de synthétiser le brin complémentaire du simple brin. Ce brin est synthétisé à partir des dNTPs libres présents dans le milieu réactionnel. La durée de cette étape dépend de la longueur de la séquence à amplifier. La réaction PCR se poursuit avec un 2 ème cycle, 3 ème etc. qui comprennent chacun les mêmes étapes. A la fin de la PCR, on obtient ainsi une amplification de la séquence comprise entre les amorces. Ladite séquence correspondant à l’amplicon. Ainsi, l’amplification de la 1 ère et 2 ème séquence d’acides nucléiques est basée sur une transcription spécifique de la séquence d’acides nucléiques cible (A) et de la séquence d’acides nucléiques cible (B) présent dans l’échantillon. Le procédé selon l’invention est caractérisé en ce que la 1 ère amorce du couple d’amorces 2 comprend en outre en 5’ la séquence de la 1 ère amorce du couple d’amorces 1, et la 2 ème amorce du couple d’amorces 2 comprend en outre en 5’ la séquence de la 2 ème amorce du couple d’amorces 1. Préférentiellement, la 1 ère amorce du couple d’amorces 2 comprend une séquence d’acides nucléiques apte à s’hybrider avec la séquence complémentaire de la séquence à amplifier, telle que la séquence cible (B) et en outre en 5’ la séquence de la 1 ère amorce du couple d’amorces 1, et la 2 ème amorce du couple d’amorces 2 comprend une séquence d’acides nucléiques apte à s’hybrider avec la séquence complémentaire de la séquence à amplifier, telle que la séquence cible (B) et en outre en 5’ la séquence de la 2 ème amorce du couple d’amorces 1. La séquence d’acides nucléiques apte à s’hybrider avec la séquence complémentaire à amplifier, telle que la séquence cible (B) étant distincte pour l’amorce 1 et l’amorce 2. En particulier l’amorce 1 peut être une amorce sens et l’amorce 2 une amorce antisens. Préférentiellement, le 1 er couple d’amorces est apte à amplifier la 1 ère séquence (A) et la 2 ème séquence (B) à partir du 2 ème cycle de PCR. En effet lors du 1 er cycle de PCR, le 1 er couple d’amorces est apte à amplifier la 1 ère séquence (A) et le 2 ème couple d’amorces est apte à amplifier la 2 ème séquence (B). A la fin du 1 er cycle de PCR, il est généré des séquences d’acides nucléiques comprenant la séquence de la 1 ère amorce du 1 er couple et la séquence complémentaire de la séquence (A), des séquences d’acides nucléiques comprenant la séquence de la 2 ème amorce du 1 er couple et la séquence complémentaire de la séquence (A), des séquences d’acides nucléiques comprenant la séquence de la 1 ère amorce du 2 ème couple et la séquence complémentaire de la séquence (B), et des séquences d’acides nucléiques comprenant la séquence de la 2 ème amorce du 2 ème couple et la séquence complémentaire de la séquence (B). Or, la 1 ère amorce du 2 ème couple comprend la séquence de la 1 ère amorce du 1 er couple et d’une séquence apte à s’hybrider à la séquence (B) et la 2 ème amorce du 2 ème couple comprend la séquence de la 2 ème amorce du 1 er couple et d’une séquence apte à s’hybrider à la séquence (B). Ainsi, lors du 2 ème cycle, le couple d’amorces 1 est apte à amplifier les séquences d’acides nucléiques générées lors du 1 er cycle. Selon un mode de réalisation, la séquence de la 1 ère amorce du 1 er couple est choisie parmi la SEQ ID NO :1, SEQ ID NO :3 ou SEQ ID NO :5, la séquence de la 2 ème amorce du 1 er couple est choisie parmi la SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :4 ou SEQ ID NO :6, la séquence de la 1 ère amorce du 2 ème couple est choisie parmi la SEQ ID NO :7 ou la SEQ ID NO :9, la séquence de la 2 ème amorce du 2 ème couple est choisie parmi la SEQ ID NO :8 ou la SEQ ID NO :10. Lesdites séquences étant listées dans le tableau 1 ci-dessous. 1 er couple 1 ère amorce CGGAAGCAACGCGTAAACTC SEQ ID NO :1 2 ème amorce TGAGCGTCGCAGAACATTACA SEQ ID NO :2 1 er couple 1 ère amorce TCGAAATTAAATGTTGTCGTGTCTTC SEQ ID NO :3 2 ème amorce CAATATTTTCATTTTTGACATGGAGAGAAACATC SEQ ID NO :4 1 er couple 1 ère amorce GACGGGATATCTGACCAGTCGG SEQ ID NO :5 2 ème amorce CCGGGTTTTGCGTAATGATCTG SEQ ID NO :6 2 ème couple 1 ère amorce TCGAAATTAAATGTTGTCGTGTCTTCCGGAAGCAACGCGTAAACTC SEQ ID NO :7 2 ème amorce CAATATTTTCATTTTTGACATGGAGAGAAACATCTGAGCGTCGCAGAACATTACA SEQ ID NO :8 2 ème couple 1 ère amorce GACGGGATATCTGACCAGTCGGTCGAAATTAAATGTTGTCGTGTCTTC SEQ ID NO :9 2 ème amorce CCGGGTTTTGCGTAATGATCTGCAATATTTTCATTTTTGACATGGAGAGAAACATC SEQ ID NO :10 Lors du procédé selon l’invention, la concentration du couple d’amorces 2 peut être inférieure, supérieure ou égale à celle du couple d’amorces 1. Il est ainsi possible de favoriser ou non un couple d’amorces par rapport à un autre et donc l’amplification d’une séquence d’intérêt. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré de l’invention, la concentration du couple d’amorces 2 est inférieure ou égale à celle du couple d’amorces 1. Lorsque, la concentration du couple d’amorces 2 est inférieure à celle du couple d’amorces 1, le couple d’amorces 2 est défavorisé par rapport au 1 er couple. Les amplicons générés par le couple d’amorces 1 vont ainsi être présents en plus grande quantité. Lorsqu’un séquençage est ensuite réalisé, les amplicons de la cible A seront surreprésentés et seront donc séquencés de façon préférentielle. L’obtention de leur séquence en sera alors plus rapide. Le procédé selon l’invention permet de générer une quantité d’amplicons par le couple d’amorces 1 au moins 4 fois plus importante que les amplicons générés par le couple d’amorces 2. Les amplicons générés par le 2 ème couple seront donc présents en plus faible quantité et sortiront moins vite lors du séquençage. Préférentiellement, le ratio de concentration entre le couple d’amorces 1 et le couple d’amorces 2 est compris entre 1:1 et 1000:1, encore plus préférentiellement entre 1:1 et 100:1. Selon un mode particulièrement avantageux, le ratio de concentration entre le couple d’amorces 1 et le couple d’amorces 2 est égal à 10:1. Un tel ratio peut par exemple correspondre à une concentration du couple d’amorces 1 égale à 1mM et une concentration du couple d’amorces 2 égale à 0,1mM. Selon un autre mode de réalisation, le procédé selon l’invention peut comprendre en outre la mise en contact de l’échantillon avec un 3 ème couple d’amorces apte à amplifier une 3 ème séquence d’acides nucléiques (C). La 1 ère amorce du couple d’amorces 3 comprend une séquence d’acides nucléiques capable de s’hybrider avec la séquence complémentaire (C) et en outre en 5’ la séquence correspondant à la séquence de la 1 ère amorce du couple d’amorces 1. La 2 ème amorce du couple d’amorces 3 comprend une séquence d’acides nucléiques capable de s’hybrider avec la séquence complémentaire (C) et en outre en 5’ la séquence correspondant à la séquence de la 2 ème amorce du couple d’amorces 1. Le procédé selon l’invention comprend ainsi 3 couples d’amorces différents permettant d’amplifier 3 séquences d’acides nucléiques cibles différentes notamment une séquence A, une séquence B et une séquence C. Ledit procédé est une PCR dites Triplex-Relais. Lors du procédé, la concentration du couple d’amorce 3 est inférieure ou supérieure ou égale à celle du couple d’amorces 1 et/ou la concentration du couple d’amorces 2 est inférieure ou supérieure ou égale à celle du couple d’amorces 1. Il est ainsi possible de favoriser ou non un couple d’amorces par rapport à un autre. Préférentiellement, la concentration du couple d’amorces 1 est supérieure à celle du 2 ème et du 3 ème couple d’amorces et la concentration du couple d’amorces 2 est égale à celle du couple d’amorces 3. Selon un mode de réalisation, la concentration du couple d’amorces 1 est supérieure à celle du 2 ème et 3 ème couple d’amorces et la concentration du couple d’amorces 2 est supérieure à celle du couple d’amorces 3. Ainsi, le 1 er couple est favorisé par rapport au 2 ème et le 2 ème est également favorisé par rapport au 3 ème . Selon un autre mode de réalisation, le procédé selon l’invention peut comprendre en outre la mise en contact de l’échantillon avec un 4 ème couple d’amorces apte à amplifier une 4 ème séquence d’acides nucléiques (D). La 1 ère amorce du couple d’amorces 4 comprend une séquence d’acides nucléiques capable de s’hybrider avec la séquence complémentaire (D) et en outre en 5’ la séquence correspondant à la séquence de la 1 ère amorce du couple d’amorces 1. La 2 ème amorce du couple d’amorces 4 comprend une séquence d’acides nucléiques capable de s’hybrider avec la séquence complémentaire (D) et en outre en 5’ la séquence correspondant à la séquence de la 2 ème amorce du couple d’amorces 1. Préférentiellement, la concentration du 4 ème couple d’amorces est inférieure ou égale à la concentration du couple d’amorces 1 et la concentration du 2 ème , du 3 ème et du 4 ème couple est identique. Selon un autre mode de réalisation, le procédé selon l’invention peut comprendre en outre la mise en contact de l’échantillon avec un n iè me couple d’amorces apte à amplifier une n iè me séquence d’acides nucléiques. La 1 ère amorce du couple d’amorces n comprend une séquence d’acides nucléiques capable de s’hybrider avec la séquence complémentaire cible et en outre en 5’ la séquence correspondant à la séquence de la 1 ère amorce du couple d’amorces 1. La 2 ème amorce du couple d’amorces n comprend une séquence d’acides nucléiques capable de s’hybrider avec la séquence complémentaire cible et en outre en 5’ la séquence correspondant à la séquence de la 2 ème amorce du couple d’amorces 1. Préférentiellement, la concentration du n iè me couple d’amorces est inférieure ou égale à la concentration du couple d’amorces 1 et la concentration du 2 ème , du 3 ème , du 4 ème couple et du n ième couple est identique. Par « n », on entend au sens de l’invention un entier naturel qui est un nombre positif permettant de dénombrer des objets comptant chacun pour un. Ainsi, un nombre entier a un successeur unique, c'est-à-dire un entier qui lui est immédiatement supérieur, et la liste des entiers naturels est infinie. En outre, le milieu réactionnel permettant de mettre en œuvre le procédé selon l’invention peut comprendre une ou plusieurs sonde(s) spécifique(s) couplée(s) à un fluorophore dont le spectre d’émission est différent des autres. Ainsi, chaque produit de la réaction PCR est mesuré en temps réel par la ou lesdites sonde(s) spécifique(s). Ainsi, selon un mode de réalisation, le procédé selon l’invention comprend en outre une étape de quantification des amplicons par l’utilisation de sondes couplées à un fluorophore, préférentiellement des sondes dites TaqMan. De telles sondes selon l’invention sont listées dans le tableau 2 ci-dessous. Sonde 1 (EC) CGCGTCCGATCACCTGCGTC SEQ ID NO:11 Sonde 2 (KP) GTTGAGGTCAACAGTGCTGCGG SEQ ID NO:12 Sonde 3 (SA) TCGCGACATTCATTATGCCCA SEQ ID NO:13 Selon un autre mode de réalisation, le procédé selon l’invention comprend une étape de détection des amplicons par sondes fluorescentes, marquage fluorescent, courbe de fusion, PCR nichée ou par séquençage d’ADN. Lorsque la détection des amplicons est faite par séquençage, le procédé comprend en outre une étape de séquençage des acides nucléiques amplifiés ou amplicons. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, le procédé selon l’invention permet de détecter et identifier des microorganismes (bactéries, levures, virus etc.) impliqués lors de maladies infectieuses, préférentiellement des bactéries. Le procédé selon l’invention peut aussi être utilisé pour le diagnostic des maladies génétiques, en oncologie et de façon générale en biologie moléculaire. Selon un autre aspect, l’invention concerne un kit comprenant un couple d’amorces 1 comprenant la SEQ ID N°1 et la SEQ ID N°2 ou la SEQ ID N°3 et la SEQ ID N°4 ou la SEQ ID N°5 et la SEQ ID N°6 et un couple d’amorces 2 comprenant la SEQ ID N°7 et la SEQ ID N°8 ou la SEQ ID N°9 et la SEQ ID N°10. Préférentiellement, le kit selon l’invention est apte à mettre en œuvre le procédé selon l’invention. L’invention concerne également l’utilisation du kit selon l’invention pour détecter les microorganismes présents lors de maladies infectieuses, tels des bactéries, des virus ou des levures. Préférentiellement, l’invention concerne l’utilisation du kit pour diagnostiquer une maladie infectieuse. L’invention concerne également l’utilisation du kit selon l’invention pour détecter au moins une maladie génétique ou au moins un cancer. Matériels et méthode Les réactions de PCR-Relais ont été effectuées de la manière suivante : 0,2mM de dNTP, 4mM de MgCl2, 0,05 unité de FastStart polymérase (Roche) et le tampon selon les conditions du fournisseur. Les sondes TaqMan pour le couple d’amorces 1 étaient à 0,25mM alors que celles pour le couple d’amorces 2 à 0,1mM. Les couples d’amorces étaient mis à différentes concentrations : 1mM pour les Duplex standard, 1mM pour le couple d’amorces 1 dans les Duplex-Relais et 0,1mM ou 1mM pour le couple d’amorces 2 dans les Duplex-Relais. Les cyclages étaient les suivants : une dénaturation à 95°C 10min puis 55 cycles à 95°C 15sec/55°C 15sec/68°C 15sec. Environ 100 copies génomes équivalents de chacune des bactéries testées étaient ajoutées aux mix pour réaliser les amplifications. Résultats Exemple 1 du p rocédé selon l’invention pour l’amplification de deux séquences d’un gène spécifique de Staphyloccocus aureus et d’ Escherichia coli . L’amplification des deux séquences d’intérêt a été réalisée par une PCR standard en duplex, par PCR Relais selon l’invention avec un ratio couple d’amorces 1:couple d’amorces 2 égale à 10:1 et par PCR Relais selon l’invention avec un ratio couple d’amorces 1:couple d’amorces 2 égale à 1:1. Dans le cadre de la PCR Duplex standard, les deux couples d’amorces ont été mis en forte concentration. Le couple d’amorces permettant d’amplifier la séquence spécifique du gène Staphyloccocus aureus est constitué des amorces de séquence SEQ ID NO :3 et SEQ ID NO :4 et le couple permettant d’amplifier Escherichia coli est constitué des amorces de séquence SEQ ID NO :1 et SEQ ID NO :2. Les résultats sont représentés dans la et le Tableau 3. Les inventeurs ont ainsi observé une superposition des Cq (nombre de cycles initiant une détection du signal de fluorescence) signifiant qu’une quantité identique de génome bactérien à bien été ajoutée au mix PCR. De plus, autant de quantité d’amplicons Escherichia coli et Staphyloccocus aureus ont été générés. Lors de la PCR Duplex-Relais avec un ratio 10:1, le couple d’amorces 1 est constitué des amorces de séquences SEQ ID NO:2 et SEQ ID NO:3 et le couple d’amorces 2 constitué des amorces de séquences SEQ ID NO:7 et SEQ ID NO:8. Le 1er couple d’amorces permet d’amplifier la séquence spécifique du gène Staphyloccocus aureus et le 2ème couple d’amorces hybride permet d’amplifier la séquence spécifique du gène d’Escherichia coli. Les résultats sont représentés dans la et le Tableau 3. Les inventeurs ont ainsi observé un décalage de Cq des courbes entre les amplications Staphyloccocus aureus et Escherichia coli. Ce retard engendré par la PCR Duplex-Relais était de 2,09 cycles (35.27-33.18) pour un ratio d’amorce 10:1 soit environ un facteur 4 (2^1.99). Il conduit à un différentiel de quantité d’environ 4 fois moins d’amplicons relatifs au gène d’Escherichia coli par rapport aux amplicons de Staphyloccocus aureus. Lors de la PCR Relais avec un ratio 1:1, les couples d’amorces utilisés sont identiques à ceux utilisés dans la PCR Relais (ratio 10:1). Les résultats sont présentés dans la et le Tableau 3. Les inventeurs ont également observé un décalage de Cq des courbes entre les amplications Staphyloccocus aureus et Escherichia coli. Ce retard engendré par la PCR Duplex-Relais était de 1,79 cycles (35.68-33.89), soit environ un facteur 3,5 (2^1,79). La quantité différentielle d’amplicons était là encore observée pour des facteurs similaires. Cq SA M. Cq SA SD. Cq SA Cq EC M. EC SD. EC PCR Duplex 32,61 32,95 0,31 32,99 32,90 0,11 33,04 32,93 33,2 32,78 PCR Relais 10:1 33,06 33,18 0,20 35,37 35,27 0,10 33,41 35,28 33,08 35,17 PCR Relais 1:1 34,42 33,89 0,51 35,77 35,68 0,08 33,85 35,62 33,4 35,65 M. Cq= moyenne des Cq. SD. Cq= deviation stantard de Cq. SA : valeurs pour Staphyloccocus aureus EC : valeurs pour Escherichia coli . Exemple 2 du procédé selon l’invention pour l’amplification de deux séquences d’un gène spécifique de Klebsiella pneumoniae et de Staphyloccocus aureus . L’amplification des deux séquences d’intérêt a été réalisée par une PCR Duplex standard, et par PCR Duplex-Relais selon l’invention avec un ratio couple d’amorces 1: couple d’amorces 2 égale à 10:1 et par PCR Duplex-Relais selon l’invention avec un ratio couple d’amorces 1: couple d’amorces 2 égale à 1:1. Dans le cadre de la PCR Duplex standard, les deux couples d’amorces ont été mis en forte concentration. Le couple d’amorces permettant d’amplifier la séquence spécifique du gène Klebsiella pneumoniae est constitué des amorces de séquence SEQ ID NO :5 et SEQ ID NO :6 et le couple permettant d’amplifier Staphyloccocus aureus est constitué des amorces de séquences SEQ ID NO :3 et SEQ ID NO :4. Les résultats sont représentés dans la et le Tableau 4. Les inventeurs ont ainsi observé une superposition des Cq (nombre de cycles initiant une détection du signal de fluorescence) signifiant qu’une quantité identique de génome bactérien a bien été ajoutée au mix PCR De plus, autant de quantité d’amplicons Klebsiella pneumoniae et Staphyloccocus aureus ont été générés. Lors de la PCR Relais avec un ratio 10:1, le couple d’amorces 1 est constitué des amorces de séquences SEQ ID NO :5 et SEQ ID NO :6 et le couple d’amorces 2 constitué des amorces de séquences SEQ ID NO :9 et SEQ ID NO :10. Le 1er couple d’amorces permet d’amplifier la séquence spécifique du gène Klebsiella pneumoniae et le 2ème couple d’amorces hybride permet d’amplifier la séquence spécifique du gène Staphyloccocus aureus. Les résultats sont représentés dans la et le Tableau 4. Les inventeurs ont ainsi observé un décalage de Cq des courbes entre les amplications Klebsiella pneumoniae et Staphyloccocus aureus. Le retard engendré par la PCR Duplex-Relais était de 1,99 cycles (35.35-33.36) pour le ratio d’amorce 10:1 soit environ un facteur 4 (2^1.99). Il conduit à un différentiel de quantité d’environ 4 fois moins d’amplicons relatifs au gène Staphyloccocus aureus par rapport aux amplicons de Klebsiella pneumoniae. Lors de la PCR Relais avec un ratio 1:1, les couples d’amorces utilisés sont identiques à ceux utilisés dans la PCR Relais (ratio 10:1). Les résultats sont présentés dans la et le Tableau 4. Les inventeurs ont également observé un décalage de Cq des courbes entre les amplications Klebsiella pneumoniae et Staphyloccocus aureus. Le retard engendré par la PCR Duplex-Relais était de 2,59 cycles (36.43-33.84), soit environ un facteur 6 (2^2,59). Il conduit à un différentiel de quantité d’environ 6 fois moins d’amplicons relatifs au gène Staphyloccocus aureus par rapport aux amplicons de Klebsiella pneumoniae. Cq KP M. Cq KP SD. Cq KP Cq SA M. SA SD. SA PCR Duplex 33,9 33,85 0,10 33,51 33,44 0,08 33,91 33,47 33,73 33,35 PCR Relais 10:1 33,5 33,36 0,15 35,09 35,35 0,27 33,37 35,63 33,2 35,32 PCR Relais 1:1 33,31 33,84 0,51 36,27 36,43 0,15 33,89 36,45 34,33 36,56 M. Cq= moyenne des Cq. SD. Cq= deviation stantard de Cq. KP : valeurs pour Klebsiella pneumoniae SA : valeurs pour Staphyloccocus aureus Procédé pour amplifier au moins deux séquences d’acides nucléiques distinctes d’intérêt présentes dans un échantillon à partir d’un couple d’amorces 1 apte à amplifier une 1 ère séquence d’acides nucléiques d’intérêt (A) et un couple d’amorces 2 apte à amplifier une 2 ème séquence d’acides nucléiques d’intérêt (B), ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a. la mise en contact de l’échantillon avec le couple d’amorces 1 apte à amplifier la séquence d’acides nucléiques (A) et le couple d’amorces 2 apte à amplifier la 2 ème séquence d’acides nucléiques (B), i. le couple d’amorces 1 étant constitué d’une 1 ère amorce et d’une 2 ème amorce aptes à amplifier un acide nucléique correspondant à la 1 ère séquence (A), ii. le couple d’amorces 2 étant constitué d’une 1 ère amorce et d’une 2 ème amorce aptes à amplifier un acide nucléique correspondant à la 2 ème séquence (B), b. l’ajout de réactifs sélectionnés et de conditions permettant une amplification PCR, et c. l’amplification de la 1 ère et 2 ème séquence d’acides nucléiques, en réalisant une réaction d’amplification basée sur une transcription spécifique de la séquence d’acides nucléiques (A) et de la séquence d’acides nucléiques (B) présent dans l’échantillon, caractérisé en ce que, la séquence de la 1 è r e amorce du couple d’amorces 2 comprend en outre en 5’ la séquence de la 1 ère amorce du couple d’amorces 1 et la séquence de la 2 ème amorce du couple d’amorces 2 comprend en outre en 5’ la séquence de la 2 ème amorce du couple d’amorces 1. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que la concentration du couple d’amorces 2 est inférieure ou égale à celle du couple d’amorces 1. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que le ratio de concentration entre le couple d’amorces 1 et le couple d’amorces 2 est compris entre 1:1 et 1000:1. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que le ratio de concentration entre le couple d’amorces 1 et le couple d’amorces 2 est compris entre 1:1 et 100:1, préférentiellement 10:1. Procédé selon l’une des revendications précédentes, comprenant en outre la mise en contact de l’échantillon avec un couple d’amorces 3 apte à amplifier un acide nucléique correspondant à la 3 ème séquence d’acides nucléiques (C), caractérisé en ce que, la séquence de la 1 è r e amorce du couple d’amorces 3 comprend en outre en 5’ la séquence de la 1 ère amorce du couple d’amorces 1 et la séquence de la 2 ème amorce du couple d’amorces 3 comprend en outre en 5’ la séquence de la 2 ème amorce du couple d’amorces 1. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel la concentration du couple d’amorces 3 est inférieure ou égale à la concentration du couple d’amorces 1. Procédé selon l’une des revendications précédentes, dans lequel les séquences d’intérêt correspondent à des séquences conservées d’un gène unique ou d’au moins deux gènes distincts. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel la concentration du couple d’amorces 1 est supérieure ou égale à la concentration du 2 ème et/ou 3 ème couple. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel la concentration du couple d’amorces 2 est égale à celle du couple d’amorces 3. Procédé selon l’une des revendications 7 à 9, comprenant en outre la mise en contact de l’échantillon avec un couple d’amorces 4 apte à amplifier une 4 ème séquence d’acides nucléiques (D), caractérisé en ce que, la séquence de la 1 è r e amorce du couple d’amorces 4 comprend en outre en 5’ la séquence de la 1 ère amorce du couple d’amorces 1 et la séquence de la 2 ème amorce du couple d’amorces 4 comprend en outre en 5’ la séquence de la 2 ème amorce du couple d’amorces 1. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel la concentration du couple d’amorces 4 est inférieure ou égale à la concentration du couple d’amorces 1. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel la concentration du couple d’amorces 2, du couple d’amorces 3 et du couple d’amorces 4 est identique. Procédé selon l’une des revendications précédentes, dans lequel la PCR est une PCR multiplexe. Procédé selon l’une des revendications précédentes, comprenant en outre une étape de séquençage des acides nucléiques amplifiés. Procédé selon l’une des revendications précédentes, dans lequel l’amplification des séquences d’acide nucléique d’intérêt permet de détecter et identifier au moins un microorganisme impliqué dans au moins une maladie infectieuse. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que les bactéries sont identifiées par sondes fluorescentes, marquage fluorescent, courbe de fusion, PCR nichée ou par séquençage d’ADN. Kit comprenant un couple d’amorces 1 comprenant la SEQ ID NO :1 et la SEQ ID NO :2 et un couple d’amorces 2 comprenant la SEQ ID NO :3 et la SEQ ID NO :4. Utilisation d’un kit selon la revendication précédente pour mettre en œuvre le procédé selon l’une des revendications 1 à 16 et détecter au moins un microorganisme présent lors d’au moins une maladie infectieuse. Utilisation d’un kit selon la revendication 17 pour détecter au moins une maladie génétique ou au moins un cancer.