Brevet FR3093642A1 — publié le 20200918

Description Titre de l'invention : Bactérie de la famille des Christensenellacées dans la prévention et/ou le traitement de maladies inflammatoires chroniques et/ou de cancers [000 L'invention concerne le traitement des maladies inflammatoires chroniques et des cancers avec des bactéries spécifiques du microbiote intestinal. [0002] L'inflammation est le processus normal de défense de l'organisme face à une agression. Elle permet de lutter et d'éliminer le ou les agents étrangers à l'origine de ladite agression. Cette inflammation, dite aiguë, est réversible et n'a qu'une durée limitée allant de quelques minutes à quelques jours. Toutefois, dans certains cas, le processus inflammatoire se dérègle et l'inflammation devient chronique. Au lieu de contribuer à la défense de l'organisme, les acteurs impliqués dans le processus inflammatoire deviennent dangereux et entraînent un état pathologique souvent grave et invalidant. Les maladies inflammatoires chroniques sont donc des maladies dont la physiopathologie est directement liée à une inflammation, ladite inflammation étant d'origine auto-immune et/ou auto-inflammatoire. [0003] Tous les organes peuvent être concernés par une inflammation chronique, comme par exemple le système digestif (maladie de Crohn, colite ulcéreuse, gastrite auto-immune, etc.), le foie (hépatite, NAFLD, stéatohépatite non alcoolique, etc.), le pancréas (pancréatite), les poumons (asthme), la peau (dermatite atopique comme le psoriasis), le système nerveux (scléroses en plaques), les articulations (polyarthrites). Par ailleurs, l'inflammation chronique est également présente dans d'autres situations où d'autres mécanismes sont en cause comme en particulier les cancers. [0004] L'inflammation chronique, et en particulier les maladies chroniques inflammatoires, touchent une large portion de la population, dans des proportions variées en fonction de la pathologie concernée. Les conséquences pour la santé sont majeures, car ces maladies, bien qu'à évolution lente, sont invalidantes, douloureuses et associées à un risque élevé de mortalité précoce. [0005] Actuellement, les traitements proposés pour ces maladies sont des anti-in- flammatoires, des immunomodulateurs et/ou immunosuppresseurs. On peut citer par exemple : - les médicaments anti-inflammatoires non stéroïdiens tels que ibuprofen, naproxen et aspirine qui sont dédiés à un usage de courte durée et qui sont inadaptés aux douleurs chroniques, - les modulateurs du métabolisme des purines qui sont des immunomodulateurs, tels que methotrexate et azathioprine, 2 - des médicaments biologiques tels que des anti-TNFalpha, des antagonistes des récepteurs à l'ILl et 1L6, ou encore - la sulfasalazine. [0006] Tous ces médicaments ont des taux de réponses très variables du fait de la dé- gradation des molécules lorsqu'elles sont administrées et présentent des effets secondaires importants. De plus, les immunomodulatcurs entravent la réponse immunitaire normale et saine face aux pathogènes, si bien que les patients traités sont susceptibles aux infections. Le méthotrexate quant à lui est spécifiquement connu pour ses effets indésirables sur la production de sperme et par conséquent sur la fertilité. [0007] Ainsi, il existe un besoin important pour un traitement efficace des maladies chroniques inflammatoires et des maladies induites par une inflammation chronique, qui soit facile à administrer et qui ne présente pas d'effets secondaires. [0008] C'est l'objectif de la présente invention, qui, pour y répondre, vise l'utilisation de bactéries particulières du microbiote intestinal humain, à savoir des bactéries de la famille des Christensenellacées. [0009] Des bactéries de la famille des Christensenellacées, notamment du genre Chris- tensenella, ont déjà été étudiées et décrites. C'est le cas en particulier de Christensenella minuta, Christensenella tnassilietzsis et Christensenella timonetzsis. Christensenella minuta en particulier a été décrite pour la première fois en 2012. En 2014, une étude a montré qu'il s'agissait du taxon le plus héritable dans une cohorte de jumeaux britanniques et que leur présence est associée à un indice de masse corporel faible. Cette corrélation entre Christensenella minuta et l'indice de masse corporel faible a ensuite été observée dans une dizaine d'études parues depuis 2014 dans des populations géographiquement diverses. [0010] De façon surprenante, et selon l'invention, les bactéries de la famille des Christense- nellacées, notamment du genre Christensenella, et notamment Christensenella minuta, lorsqu'elles sont administrées à l'homme ou à l'animal, sont capables d'agir sur les marqueurs de l'inflammation à l'origine des maladies chroniques inflammatoires et des cancers. [0011] C'est pourquoi, l'invention a pour objet une bactérie de la famille des Chrisiense- nellacées, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement de maladies inflammatoires chroniques et/ou de cancers chez l'être humain ou l'animal. [0012] Avantageusement, une telle bactérie, lorsqu'elle est administrée à un être humain ou un animal présentant une inflammation chronique, est capable d'agir sur les molécules produites en excès lors d'une inflammation chronique comme la kynurenine, l'interleukine 6, le TNFalpha, l'interleukine lb, les lipocalines ou la calprotectine fécale. [0013] L'invention a également pour objet les compositions comprenant au moins une 3 bactérie de la famille des Christensenellacées, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement de maladies inflammatoires chroniques et/ou de cancers chez l'être humain ou l'animal. [0014] D'autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description en détails de l'invention qui va suivre. DEFINTIONS [0015] Par « hyperproduction d'interleukine 6» au sens de l'invention, on entend une production excessive d'interleukine 6 par rapport à la production chez unc personne ou un animal sain sans inflammation. [0016] Par « maladie chronique inflammatoire » au sens de l'invention, on entend en par- ticulier toute maladie chronique dont la physiopathologie, à évolution lente et progressive, est en lien direct avec une inflammation d'origine auto-immune et/ou auto-inflammatoire. Description des modes de réalisation [0017] L'invention a donc pour objet l'utilisation dans la prévention et/ou le traitement (le maladies inflammatoires chroniques et/ou de cancers, en particulier de cancers à caractère inflammatoire, chez l'être humain ou l'animal, d'au moins une bactérie de la famille des Christensenellacées. 10018] L'invention vise donc une bactérie de la famille des Christensenellacées pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement de maladies inflammatoires chroniques et/ou de cancers chez l'être humain ou l'animal, en particulier chez des personnes ou des animaux présentant une maladie inflammatoire ou un cancer avec une hyperproduction d'interleukine 6. 10019] Selon l'invention, les bactéries de la famille des Christensenellacées, lorsqu'elles sont administrées à un être humain ou un animal présentant une inflammation chronique ou un cancer, sont capables d'agir sur les molécules produites en excès lors d'une inflammation chronique ou d'un cancer, en particulier sur l'interleukine 6 et la kynurenine, mais également sur le TNFalpha, l'interleukine lb, les lipocalines ou la calprotectine fécale. 10020] Dans les maladies inflammatoires et cancers qui présentent une augmentation de l'un de ces marqueurs (interleukine 6, kynurénine, TNFalpha, interleukine lb, lipocaline ou calprotectine), leur diminution est le signe de la réduction de la voie de signal pro-inflammatoire, c'est-à-dire que les cellules immunitaires à l'origine de cette production sont moins stimulées. Dès lors, la réaction immunitaire excessive en cause de l'inflammation est ralentie et le système retourne progressivement à la norme. [0021] La ou les bactéries utiles selon l'invention, sont administrées à des êtres humains ou des animaux dans unc quantité efficace pour unc action sur au moins un de ces marqueurs de l'inflammation, c'est-à-dire pour diminuer la production d'au moins une de ces molécules dans l'organisme. Selon un mode de réalisation adapté, la ou les bactéries peuvent être administrées à raison d'une dose de 109 à 1012 unités formant des colonies (CFU) par jour, quel que soit le poids de la personne ou de l'animal. Préférentiellement il s'agit d'une dose unique, c'est-à-dire administrée en une seule fois ou une dose avant chaque repas soit trois fois par jour. [0022] Préférentiellement, la bactérie de la famille des Christensetzellacées est utile dans le traitement d'au moins une maladie inflammatoire chronique choisie parmi les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, les maladies inflammatoires chroniques du foie, les maladies inflammatoires chroniques du pancréas, les polyarthrites, les dermatites atopiques, les maladies neuro-inflammatoires, de la bronchopncumopathie chronique obstructive. En particulier, elle présente un effet dans la prévention et/ou le traitement d'au moins une maladie choisie parmi la maladie de Crohn, la colite ulcéreuse, la maladie coeliaque, la gastrite auto-immune, les hépatites, la stéatohépatite non alcoolique, la cholangite sclérosante primitive, la pancréatite, la polyarthrite rhumatoïde, la polyarthrite psoriatique, le psoriasis, l'eczema. [0023] En outre, la bactérie de la famille des Christensetzellacées est utile dans le traitement d'une maladie proliférative choisie parmi les lymphomes, les glioblastomes, les myélomes, les leucémies, les cancers colorectaux, les cancers du sein, de la prostate, de l'ovaire, de l'utérus, du pancréas, des poumons, du foie, de la vésicule biliaire et des reins. [0024] La ou les bactéries utiles selon l'invention sont des bactéries de la famille des Chris- tensenellacées, préférentiellement du genre Christensenella. Il peut s'agir en particulier de Christensenella massiliensis, Christensenella timonensis et/ou Christensenella minuta. Selon une variante particulièrement adaptée, il s'agit de Christensenella minuta. [0025] Ces bactéries peuvent être isolées à partir de selles humaines par exemple selon les protocoles publiés par Morotomi et al. 2012 (Morotomi, M., Nagai, F. & Watanabe, Y. Description of Christensenella minuta gen. nov., sp. nov., isolated from human faeces, which forms a distinct branch in the order Clostridiales, and proposai of Christensenellaceae fam. nov. INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC AND EVOLUTIONARY MICROBIOLOGY 62, 144-149 (2012)) et NDongo et al. 2016 (Ndongo, S., Dubourg, G., Khelaifia, S., Fournier, P. E. & Raoult, D. Christensenella timonensis , a new bacterial species isolated from the human gut. New Microbes and New Infections 13, 32-33 (2016)). Ces documents décrivent également les méthodes de culture des bactéries utiles selon l'invention. [0026] La ou les bactéries utiles selon l'invention, pour leur utilisation précédemment décrite, sont préférentiellement administrées dans une composition. [0027] Ainsi, l'invention a également pour objet une composition comprenant au moins une bactérie de la famille des Christensenellacées dans la prévention et/ou le traitement de maladies inflammatoires chroniques et/ou de cancers, chez l'être humain ou l'animal, notamment chez des personnes ou des animaux présentant unc hyperproduction d'interleukine 6. La ou les bactéries sont présentes en unc quantité efficace dans la composition permettant un effet sur les maladies chroniques inflammatoires et/ou les cancers dont sont atteints les personnes ou les animaux traités. [0028] Préférentiellement, la composition utile selon l'invention comprend 106 à 1012 unités formant des colonies (CFU) dc bactéries de la famille des Christensenellacées par dose quotidienne à administrer de composition. Préférentiellement cela correspond à une dose quotidienne dc bactéries à administrer, quel que soit le poids de la personne ou de l'animal. De façon préférée, cette dose est administrée en une seule fois. [0029] La composition utile selon l'invention peut être sous forme liquide. Elle peut notamment comprendre des bactéries de la famille des Christensenellacées et un milieu de culture desdites bactéries qui permet de les conserver, comme par exemple préférentiellement le milieu Columbia agar anaérobique enrichi en sang de mouton, ou un milieu équivalent ne contenant pas de produit dérivé d'origine animale. [0030] Selon une variante, la composition utile selon l'invention peut se présenter sous forme solide. Dans ce cas les bactéries peuvent être présentes sous forme lyophilisée, et peuvent comprendre également des excipients tels que par exemple la cellulose microcrystalline, le lactose, le saccharose, le fructose, le lévulose, les amidons, le stachyose, le raffinose, l'amylum, le lactate de calcium, le sulfate de magnésium, le citrate de sodium, le calcium stearate, la polyvinylpyrrolidone, la maltodextrine, les galactooligosaccharides, les fructooligosaccharides, les pectines, les béta-glucans, les lactoglobulines, les isomaltooligosaccharides, les polydextroses, le sorbitol et/ou le glycérol. [0031] Les compositions utiles selon l'invention peuvent se présenter sous forme de poudre, de poudre microencapsulée, de gélule, de capsule, de comprimé, de pastille, de granulés, d'émulsion, de suspension ou de suppositoire. Selon un mode de réalisation particulièrement adapté, elles peuvent se présenter sous une forme gastro-résistante, telles qu'un comprimé enrobé contenant des bactéries microencapsulées. [0032] Les bactéries peuvent être utilisées vivantes ou inactivées par exemple par la chaleur, l'exposition à un pH approprié, aux rayons gamma ou à la mise sous haute pression. [0033] Elles peuvent être toutes vivantes ou toutes inactivées. [0034] Préférentiellement, au moins une partie des bactéries sont vivantes, en particulier au moins 50% (en nombre), encore plus préférentiellement au moins 90% (en nombre). [0035] Ainsi, selon un mode de réalisation adapté, les bactéries présentes dans la com- position utile selon l'invention sont pour au moins 50% des bactéries vivantes (en 6 nombre), préférentiellement pour au moins 90% des bactéries vivantes (en nombre), encore plus préférentiellement toutes vivantes. [0036] Les conditions de conservation selon l'invention se présentent pour des formulations liquides sous la forme d'un produit congelé maintenu à -20°C dans un sachet hermétique. Pour les formulations solides, les conditions de conservation selon l'invention comprennent une capsule ou un enrobage hermétique à la lumière et à l'oxygène maintenu à une température ambiante comprise entre 15°C et 40°C et un taux d'humidité compris entre 3% et 70%. [0037] Les bactéries utiles selon l'invention, et en particulier les compositions l'incluant, peuvent être administrées par voie orale, topique, inhalée ou rectale. [0038] Les compositions utiles selon l'invention, en plus des bactéries utiles selon l'invention peuvent comprendre d'autres composés, tels que : - au moins un probiotique, et/ou - au moins une bactérie produisant de l'acide lactique qui permet de créer un environnement anaérobique favorable aux Christensenellacées telle qu'au moins une bactérie choisie parmi les bactéries du genre Lactobacillus.spp., Bifitlobacterium spp., Streptococcus spp. et/ou au moins un autre organisme favorisant les conditions anaérebiques nécessaires à la survie des Christensenellacées telle qu'au moins une levure choisie parmi des Saccharomyces spp. ou des micro-organismes de la famille des Methanabacteriaceae et/ou - au moins une bactérie associée à l'écosystème des Christensenellacées car elles facilitent leur survie dans l'intestin telle qu'au moins une bactérie choisie parmi les bactéries du phylum Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Tenericutes, et Venucomicrobia, et/ou - au moins une bactérie choisie parmi les bactéries de l'ordre des Clostridales, des Verrucomicrobiales, des Aeromonadales, des Alteromonadales, ML615.1-28, RF32, YS2, de la famille des Clostridiacées, des Lachnospiracées, des Ruminococcacées, des Bacteroidncées, des Enterococcacées, des Rikenéllacées, des Dehalobactériacées, des Veillonellacées et/ou - au moins une bactérie choisie parmi les bactéries du genre Faecalibacterium, Akkermansia, Eubacterium et Oscillospira telle que par exemple Faecalibacteritun praus nitzii, Akkermansia muchilphila, Eubacterium halii, Oscillospiraguilliermondii., et/ou - au moins un prébiotique tel que par exemple au moins un prébiotique choisi parmi les galactooligosaccharides, les fructooligosaccharides, les inulines, les arabinoxylans, les béta-glucanes, les lactoglobulines et/ou les béta-caséines, et/ou - au moins un polyphénol tel que par exemple au moins un polyphénol choisi parmi la quercetin, le kaempferol, le resvératrol, les flavones (comme la lutéoline), les flavan3-ols (comme les catéchines), les flavanones (comme la narinénine), les isoflavones, 7 les anthocyanidines, les proanthocyanidines, et/ou - au moins un minéral et/ou au moins une vitamine et/ou au moins un agent nutritionnel, et/ou - au moins un principe actif pharmaceutique préférentiellement choisi parmi les anti-inflammatoires non stéroïdien, les anticorps dirigés contre des cibles pro-inflammatoires (anti-TNFalpha), les antirhumatismaux, les analgésiques, les antimicrobiens, les corticostéroïdes, les anaboliques stéroïdiens, les antidiabétiques, les agents thyroïdiens, les antidiarrhéiques, les antitussifs, les antiémétiques, les anti ulcères, les laxatifs, les anticoagulants, l'érythropoïétine, les immunoglobulines, les immunosuppresseurs, les hormones de croissance, les médicaments hormonaux, les modulateurs des récepteurs aux oestrogènes, les agents alkylant, les antimétabolites, les inhibiteurs mitotiques, les radiopharmaceutiques, les anti-dépresseurs, les antipsychotiques, les anxiolytiques, les hypnotiques, les sympathomimétiques, les stimulants, le donepezil, la tacrinc, les médicaments pour l'asthme, les bêta-agonistes, les stéroïdes inhalés, les inhibiteurs de leucotriène, les cromoglycates ou acides cromoglycidiques, l'épinéphrine, la dornasc alpha, les cytokines, les antagonistes de cytokines. [0039] L'invention est à présent illustrée par des exemples de bactéries utiles selon l'invention, de procédés de cultures de ces bactéries, des exemples de compositions les contenant et des résultats d'essais démontrant l'efficacité de l'invention. Exemples [0040] Exemple 1 : Christensenella minuta. Christensenella minuta peut-être cultivée selon le protocole opératoire décrit en suivant. 1/ Dissoudre un milieu RCM ("Reinforccd Clostridial Medium" milieu clostridiale renforcé) déshydraté dans de l'eau distillée 2/Ajouter 0,5 in L/L de solution de résazurinc-Na (0,1% p/v) 3/Porter à ébullition et refroidir à température ambiante tout en injectant un mélange gazeux à 80% de N2 et à 20% de CO2 4/Etaler le milieu sous la même atmosphère gazeuse dans des tubes de type Hungatc anoxiqucs ou dans des flacons de sérum puis autoclavcr 5/Avant utilisation, ajoutez 1,0 g de carbonate de sodium par litre à partir d'une solution mère anoxique stérile préparée avec un mélange gazeux à 80% de N2 et à 20% de CO2 6/ Vérifier le pH du milieu après autoclavage et ajuster le pH entre 7,3 et 7,5, en utilisant une solution mère anoxique stérile de bicarbonate de sodium (5% p / v) préparée dans une atmosphère gazeuse à 80% de N2 et à 20% de CO2. [0041] Exemple 2 : Christensenella inassiliensis 8 Christensenella massiliensis peut-être cultivée selon le protocole opératoire décrit en suivant. [0042] 1/Préparer un milieu carboxyméthylcellulose (N2 / CO) en suivant les instructions suivantes fournies par DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen). [0043] [Tableauxl] Casitone 30.0 g Extrait de levure 5.0 g K21-11304 5.0 g Na-resazurin solution (0.1% w/v) 0.5 ml L-Cysteine-HC1 x H2O 0.5 g D-Glucose 4.0 g Cellobiose 1.0 g Maltose 1.0 g Amidon (soluble) 1.0 g Na2CO3 1.5 g Filtrat de viande (voir Tableau 2) 1000m I [0044] 2/Dissoudre les différents constituants listés dans le tableau ci-dessus, sauf la cystéine, les carbohydrates et le carbonate. 3/Faire bouillir le milieu pendant 1 min, puis le laisser refroidir à la température ambiante sous une atmosphère gazeuse à 80% de N, et à 20% de CO,. 4/Ajouter 0,5 g/L de L-cystéine-HCl x H2O et le verser sous la même atmosphère gazeuse dans des tubes de type Hungate (pour les souches exigeant des particules de viande, introduire celles-ci en premier dans le tube, utiliser 1 partie de particules de viande pour 4 ou 5 parties de liquide). 5/ Autoclavage à 121°C pendant 20 min 6/ Après autoclavage, ajouter le glucose, le cellobiose, le maltose et l'amidon provenant de solutions mères anoxiques stériles préparées à 100% de gaz N, et de carbonate à partir d'une solution mère anoxique stérile préparée sous des mélanges gazeux à 80% de N, et 20% de CO,. 7/ Ajuster le pH du milieu à 7, si nécessaire. Préparation du Filtrat de viande : 100451 9 [Tablcaux2] Viande hachée (sans gras) 500.0 g NaOH 1 N 25.0 ml Eau distillée 1000m1 [0046] Utiliser du boeuf maigre ou de la viande de cheval. Enlever la graisse et le tissu conjonctif avant de hacher. Mélanger la viande, l'eau et NaOH, puis faire bouillir pendant 15 min sous agitation. Laisser refroidir à la température ambiante, retirer la graisse de la surface et filtrer, en retenant les particules de viande et le filtrat. Ajouter au filtrat de l'eau jusqu'à un volume final de 1000,0 ml. [0047] Les bactéries doivent être cultivées en condition anaérobie à 37°C. [0048] Exemple 3 : Christensenella tintonensis Christensenella timonensis peut-être cultivée selon le même protocole opératoire que celui décrit à l'exemple 2 pour Christensenella massiliensis. [0049] Exemple 4 : Composition utile selon l'invention sous forme liquide Un exemple de composition utile selon l'invention sous forme liquide est une composition comprenant Christensenellaminuta 109 CFU/mL dans le milieu de culture RCM anaérobie décrit ci-dessus modifié pour ne contenir aucun produit d'origine animale et enrichi en glycérol 5%. La composition de l'exemple 4 est obtenue à partir d'une RCB («research cell bank » banque de cellules de recherche) préparée à base de Christensenella minuta 1010 CFU/ mL puis conservée congelée à -20°C dans un sachet hermétique à l'oxygène. La composition congelée doit être réchauffée à température ambiante jusqu'à retrouver une forme liquide avant utilisation. [0050] Exemple 5 : Composition utile selon l'invention sous forme solide Un exemple de composition utile selon l'invention sous forme lyophilisée peut être obtenu par lyophilisation de la composition de l'exemple 4 à l'état congelé. [0051] RESULTATS D'ESSAIS DEMONTRANT L'EFFET DE L'INVENTION [0052] Démonstration de l'effet anti-inflammatoire in vitro [0053] L'objectif de cette étude est de démontrer l'effet anti-inflammatoire in vitro de bactéries selon l'invention. La démonstration a été réalisée sur un des marqueurs de l'inflammation : la kynurénine. [0054] Le protocole opératoire de l'étude est décrit en suivant. 1/ Protocole de fermentation à partir de féces d'origine humaine contenant du Christensenella .spp . : - Les donneurs ne devaient pas avoir pris d'antibiotiques durant les six mois précédents l'expérience et n'avoir aucun historique de désordres gastro-intestinaux. Les donneurs étaient âgés entre 18 et 60 ans. - La collecte des échantillons frais de leur fèces est obtenue dans des contenants stériles en plastique, conservés dans des flacons anaérobies contenant un sachet de 2,51 d'ÀnaeroGenTM d'OxoidTM (0)