Brevet FR3088200A1 — publié le 20200515

UTILISATION D'UN COMPOSE ORGANOMETALLIQUE EN TANT QU'AGENT DE DEMETHYLATION DE L'ADN DOMAINE TECHNIQUE AUQUEL SE RAPPORTE L'INVENTION La présente invention concerne de manière générale l'utilisation non-thérapeutique et l'utilisation thérapeutique de composés ayant un effet déméthylant de l'ADN. Elle concerne ainsi tout d'abord, l'utilisation non-thérapeutique en tant qu'agent de déméthylafion de l'ADN de complexes organométalliques à base de fer pour former par exemple des outils de biotechnologie, tels que des réactifs de séquençage. Puis, l'invention porte également sur l'utilisation thérapeutique de ces complexes organométalliques à base de fer en tant que médicament, par exemple pour le traitement de pathologies prolifératives, en particuliers de cancers. ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE Les cancers sont la seconde cause de décès après les maladies cardiovasculaires dans les pays industrialisés. Hormis des mutations directes de l'ADN de gènes essentiels, l'expansion d'une cellule cancéreuse est fréquemment associée à des modifications épigénétiques, c'est-à-dire non directement codés par la séquence de l'ADN. Le terme épigénétique regroupe en effet tout un ensemble de modifications responsables de la régulation de l'expression génique pouvant être transmises lors de la division cellulaire et qui n'impliquent aucun changement de la séquence d'ADN (Flintoft, 2017). Ce terme regroupe ainsi différents processus, tels que la méthylation de l'ADN, les modifications post-traductionnelles des histones et l'expression d'ARN non codant. La régulation de l'expression génique est un phénomène qui influence la plupart des aspects de la biologie cellulaire (l'embryogenèse, le développement, la différenciation cellulaire, ainsi que la mort cellulaire) dans les organismes multicellulaires. Une dérégulation des modifications épigénétiques, tant au niveau de leur maintien que dans leur coordination, est fréquemment observée pour diverses pathologies, telles que l'inflammation, l'obésité, les maladies neurodégénératives et cardiovasculaires, ainsi que les cancers. Par conséquent, la recherche de molécules capables de réguler ces processus présente un intérêt majeur. En particulier, la méthylation de l'ADN est un processus épigénétique. Elle est le résultat d'une méthylation de cytosines en 5-méthylcytosines dans les dimères C-G de l'ADN, en particulier dans les îlots CpG. Environ 80 % de ces régions sont méthylées dans le génome humain. Les enzymes DNA méthyltransférases (DNMTs) catalysent 2 l'addition d'un groupement méthyle provenant du donneur Sadénosylméthionine sur le carbone 5 d'une cytosine. Parmi les DNA méthyltransférases, la DNMT1 qui est une enzyme impliquée dans le maintien de l'information épigénétique (Leonhardt et al., 1992 ; Liu et al., 1998), prend comme modèle le brin d'ADN hémi-méthylé lors de la réplication 5 tandis que les enzymes DNMT3a et 3b peuvent agir sur un brin non méthylé et donc modifier l'information épigénétique (Okano et al., 1999). Par contre, la DNMT2 ne montre pas d'activité DNA méthyltransférase. La méthylation de l'ADN conduit à la répression de l'expression du gène (Bird, 2002). Il existe aussi une enzyme (peptidyl arginine deiminase 4) pouvant, en déiminant les résidus arginine de l'histone H3, interférer avec la 10 méthylation (Cuthbert et al., 2004). Jusqu'à ce jour, le développement d'agents déméthylant de l'ADN (également connus sous le terme anglais « DNA hypomethylating agent ») est basé sur des stratégies conduisant à une déméthylafion indirecte de l'ADN et ce notamment via l'inhibition des enzymes responsables de la méthylation de celui-ci, à savoir les DNMTs décrites ci- 15 dessus. Par exemple, pour de nombreux cancers, il a été démontré que certains gènes suppresseurs de tumeurs, comme par exemple p16, étaient hyperméthylés (Herman et al., 1995). La conséquence de cette hyperméthylation est l'inactivation de ce gène régulateur du cycle cellulaire. Il a été démontré que les inhibiteurs bloquant l'activité DNA 20 méthyltransférase provoquent l'hypométhylation de ces gènes suppresseurs de tumeurs et possèdent ainsi des propriétés anticancéreuses (Santini et al., 2001). A l'heure actuelle, les différents agents déméthylants de l'ADN peuvent être classés en fonction de leur mode d'action en cinq catégories différentes :1) les analogues nucléosidiques non méthylables (décitabine, azacyfidine), 2) les inhibiteurs de l'activité 25 catalytique (procaïnamide), 3) les inhibiteurs de la S-adénosylméthionine hydrolase (caldribine), 4) les inhibiteurs de l'expression des DNMTs (MG98) et 5) les inhibiteurs de l'interaction des DNMTSs avec leurs partenaires (UP peptide). 1) Les analogues nucléosidiques non méthylables, tels que la 5-azacytidine, la Décitabine (DAC ou 5-aza-2'-déoxycytidine), la Zébularine (dZTP), le 5-fluoro-2'- 30 deoxycytidine (FdCyd), le SGI-110 (Décitabine modifiée) et le CP-4200 (un dérivé de la 5- azacyfidine) permettent la capture des DNMTs sur de l'ADN ayant incorporé ces analogues conduisant ainsi à leur dégradation. Cependant, ces analogues nucléosidiques non méthylables, comme la 5-azacytidine, ou la 5-aza-2'-déoxycytidine, en plus de présenter d'importants effets secondaires, montrent généralement une forte toxicité et une 35 faible stabilité. La zébularine présente toutefois une meilleure stabilité (Zhou et al., 2002 ; Cheng et al., 2003) et une plus faible toxicité (Cheng et al., 2004). 2) Les inhibiteurs de l'activité enzymatique des DNMTs (tels que RG108, procaïne, nanaomycine et le procaïnamide) sont des composés synthétiques qui ont une 3 affinité pour les régions d'ADN riches en CpG bloquant ainsi l'activité des DNMT1. Ces molécules présentent plusieurs avantages par rapport aux analogues nucléotidiques car leur utilisation n'est pas limitée aux cellules hautement prolifératives puisqu'elles inhibent directement les DNMTs sans nécessiter leur incorporation au sein de l'ADN. 5 3) Les inhibiteurs de la S-adénosylhomocystéine hydrolase entraînent quant à eux une baisse de S-adénosylméthionine qui est le donneur de méthyl permettant aux methyltransférases de catalyser la méthylation des cytosines de l'ADN (Cladribine, Fludarabine et Clofarabine) (Bonate et al., 2006; Jeha et al., 2004). 4) Les inhibiteurs de la synthèse des DNMTs, tels que les oligonucléotides 10 antisens et les microARNs (MG98) (Amato, 2007; Winquist et al., 2006) reposent sur le fait qu'une hyperméthylation est très souvent associée à une augmentation de l'expression des DNMTs. Malgré un important engouement pour cette stratégie, à l'heure actuelle, les essais cliniques de phase I ou II ont révélé un manque d'efficacité de ces oligonucléotides. 15 5) Les inhibiteurs de l'interaction des DNMTSs avec leurs partenaires concernent des molécules peptidiques qui sont capables de perturber l'association des DNMTs avec certains de leurs partenaires protéiques nécessaires à leur fonctionnement. Comme les complexes protéiques formés avec les DNMTs peuvent varier en fonction des gènes cibles, cette approche permet donc d'éviter (par rapport aux 20 autres modes d'action cités précédemment) l'induction d'une hypométhylation globale qui peut être à l'origine d'importants effets secondaires. Il a par exemple été démontré que l'inhibition spécifique du complexe DNMT3A/ISGF3y permet de rétablir une sensibilité au témozolomide et ainsi réduire la croissance tumorale de glioblastomes (Cheray et al., 2013, 2014; Hervouet et al., 2010). 25 A ce jour, la recherche de molécules capables de moduler le niveau de méthylation de l'ADN est donc tournée uniquement vers les inhibiteurs des enzymes responsables de ce processus, à savoir les DNMTs. Dans ce contexte, il existe un besoin dans l'état de la technique de développer de nouveaux agents déméthylant de l'ADN à des fins thérapeutiques et non-30 thérapeutiques. Il existe en particulier un besoin dans l'état de la technique de développer des nouveaux agents déméthylant de l'ADN qui soient efficaces, qui possèdent de préférence des effets indésirables réduits ou moindres par rapport aux agents déméthylants de l'art antérieur (de préférence, faible cytotoxicité cellulaire), tout en étant faciles à mettre en 35 oeuvre et en ayant avantageusement un prix de revient modéré. Un but de la présente invention est ainsi de proposer de nouveaux composés qui évitent, tout ou en partie, des inconvénients susmentionnés. 4 OBJET DE L'INVENTION La Demanderesse s'est ainsi attachée au développement de nouveaux composés déméthylants capables d'interagir avec l'ADN. Elle a notamment mis au point une nouvelle classe d'agents déméthylants 5 aptes à entraîner une déméthylation directe de l'ADN par de simples réactions chimiques et ce dans des systèmes acellulaires et cellulaires. La Demanderesse a en effet démontré que certains composés organométalliques comprenant un atome de fer lié à deux groupes terpyridines permettaient une déméthylation directe de l'ADN. 10 Ces composés pouvaient notamment être utilisés que ce soit pour des applications non-thérapeutiques, par exemple, en tant que réactifs de réaction lorsque qu'une déméthylation de l'ADN est requise, soit pour des applications thérapeutiques. Dans ce cas, la Demanderesse a démontré que les composés selon l'invention présentaient une action antiproliférative notamment sur des cellules cancéreuses. En 15 outre, comme le montre les essais expérimentaux ci-dessous (en particulier les exemples 9 et 10), les composés selon l'invention sont non cytotoxiques et présentent ainsi un effet cytostatique. A cet effet, la présente invention a pour objet l'utilisation non-thérapeutique, en tant qu'agent de déméthylation de l'ADN, d'au moins un composé organométallique 20 comprenant un atome de fer lié à deux groupes terpyridines de formule générale (I) suivante : 25 (I) 2+ 30 2X dans laquelle : R1 à R6, identiques ou différents sont choisis parmi - un atome d'hydrogène ; une 35 chaîne alkyle linéaire ou ramifiée de formule C,,H2n.,1 avec n = 1 à 12 ; un groupe COOH ; un groupe 303H ; un groupe PO3H ; un cycle aromatique de formule (II) à (VI) ci-dessous: 5 5 R7 (Il) (III) (IV) (V) (VI) où Y sont chacun indépendemment des autres un groupe CH ou un atome 10 d'azote (les deux groupes Y peuvent être identiques ou différents); R7 est choisi parmi un groupe OCyN2y+1avec y = 1 à 10 ; 1 à 10; N(C,,H2,'+1)2 avec m= 1 à 6, COOH ; 303H ou PO2H3 ; Z désigne un atome d'oxygène, un atome de soufre ou un groupe NH ; la ligne en pointillée représente une liaison C-C au niveau du point de 15 rattachement du cycle aromatique de formule (II) à (VI) aux groupements terpyridines du composé organométallique de formule (I) ; X - est un contre-ion. La présente invention a également pour objet un composé organométallique comprenant un atome de fer lié à deux groupes terpyridines, ayant une formule générale 20 (I) définie ci-dessus pour son utilisation comme médicament. Enfin, la présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant, dans un support acceptable sur le plan pharmaceutique, au moins un composé organométallique tel que défini ci-dessus. Pour le reste de la description, à moins qu'il n'en soit spécifié autrement, 25 l'indication d'un intervalle de valeurs « de X à Y » ou entre « X à Y », dans la présente invention, s'entend comme incluant les valeurs X et Y. DESCRIPTION DETAILLEE D'UN EXEMPLE DE REALISATION 30 La description qui va suivre, donnée à titre d'exemples non limitatifs, fera bien comprendre en quoi consiste l'invention et comment elle peut être réalisée. I. Utilisation non-thérapeutique du ou des composés de formule générale (I) Tel que mentionné ci-dessus, la présente invention porte sur l'utilisation non- 35 thérapeutique, en tant qu'agent de déméthylation de l'ADN, d'au moins un composé organométallique comprenant un atome de fer lié à deux groupes terpyridines de formule générale (I) suivante : 6 5 (I) 2+ 2X- 10 dans laquelle : R1 à R6, identiques ou différents sont indépendemment choisis parmi : un atome d'hydrogène ; une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée de formule C,,H2'.1 avec n = 1 à 12 ; 15 un groupe COOH ; un groupe SO3H un groupe PO3H ; un cycle aromatique de formule (II) à (VI) ci-dessous: 20 R7 (III) (IV) où 25 Y sont chacun indépendemment des autres un groupe CH ou un atome d'azote, à savoir les deux groupes Y peuvent être identiques ou différents ; R7 est choisi parmi un groupe OCyHzy+i avec y = 1 à 10 ; 1 à 10; N(CmH2m+i)2 avec m = 1 à 6, COOH ; SO3H ; P021-13 ; Z désigne un atome d'oxygène, un atome de soufre ou un groupe NH ; 30 la ligne en pointillée représente une liaison C-C au niveau du point de rattachement du cycle aromatique de formule (II) à (VI) aux groupements terpyridines du composé organométallique de formule (I) ; X - est un contre-ion. Selon l'invention, les groupes terpyridine sont des ligands particulièrement 35 appropriés pour l'atome de fer qui permettent de former un composé organométallique relativement stable et qui serait, de ce fait, résistant même dans un environnement biologique. En outre, la configuration particulière des ligands terpyridine confère une rigidité remarquable au composé organométallique selon l'invention. 7 Les composés de l'invention peuvent être sous forme de sels, solvates et/ou de pro-drogues pharmaceutiquement acceptables. Les pro-drogues sont des variants des composés de l'invention qui peuvent être transformés in vivo en composés de formule générale (I) selon l'invention. 5 Selon l'invention, le terme « sels ou solvates pharmaceutiquement acceptables » se réfère à des sels ou des solvates qui conservent l'activité biologique désirée telle que décrite ci-dessus des composés organométalliques de l'invention et qui exposent à très peu, voire aucun effet toxicologique non désiré. Selon l'invention, le terme « alkyle » désigne un radical hydrocarboné linéaire 10 ou ramifié, saturé ou insaturé, ayant avantageusement de 1 à 12 atomes de carbone, tel que méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, isobutyle, tert-butyle, pentyle, néopentyle, n-hexyle, etc. Les groupes ayant de 1 à 6 atomes et en particulier de 1 à 4 atomes de carbone sont préférés. Selon un premier mode de réalisation préféré, RI à R6 peuvent correspondent à 15 un atome d'hydrogène. Selon ce mode, le composé organométallique de formule (I) peut répondre à la formule (IX) suivante : 2+ 2X- 20 (IX) 25 Ce composé de formule (IX) sera nommé ci-après AIM1. Selon un deuxième mode de réalisation préféré, RI, R3, R4, 66 peuvent être 30 identiques et correspondre à un atome d'hydrogène, et R2 et R5 peuvent être identiques et désigner un cycle aromatique de formule (II) tel que décrit ci-dessus avec Y=CH et correspondre ainsi à un benzène de formule (VII) suivante : 35 Selon ce mode, le composé organométallique de formule (I) peut répondre à la formule (X) suivante : 8 (X) 2+ 2X N N //-KI N // \-Ç / NN \/ 5 J Ce composé de formule (IX) sera nommé ci-après AIM2. 10 Selon un troisième mode de réalisation préféré, R1, R3, R4, R6 sont identiques et correspondent à un atome d'hydrogène, et R2 et R5 sont identiques et désignent un cycle aromatique de formule (II) où un des Y=CH et l'autre Y= N et correspondent à un radical pyridine de formule (VIII) suivante : 15 (VIII) où la ligne en pointillée représente une liaison C-C entre le carbone porté par le radical pyridine et le carbone porté par le groupe terpyridine du composé organométallique de formule (I). 20 Selon ce mode, le composé organométallique de formule (I) peut répondre à la formule (XI) suivante : 25 (XI) 5 ; ' , \ , , Nb /Fe\ 30 Ce composé de formule (IX) sera nommé ci-après AIM3. Les deux groupes terpyridines de ce composé AIM3 porte ainsi chacun un noyau pyridinique, l'atome d'azote permettant d'induire un effet nucléophile. De préférence, le contre-ion X est choisi parmi : Cl-, l'hexafluorophosphate de formule PF6-, de préférence le contre-ion est le PF5. 35 Avantageusement, le ou les composés organométalliques sont capables d'entraîner une déméthylation directe de l'ADN. Sans être lié par une quelconque théorie, il semblerait que la déméthylation de l'ADN serait due soit à une attaque nucléophile des 5-méthylcytosines (5mC) entraînant 9 ainsi leur déamination, et/ou soit à une oxydation médiée par le fer qui permettrait une conversion des 5mC en 5-hydroxymethylcytosine (5hmC). Ainsi, les composés organométalliques de formule (I) selon l'invention peuvent notamment être utilisés afin de former des outils de biotechnologie, par exemple en tant 5 que réactifs de séquençage où une déméthylation de l'ADN est requise. A titre d'exemple, le ou les composés de l'invention peuvent être utilisés en tant qu'outil de biotechnologies, comme par exemple en tant que réactif pour effectuer des expériences de déméthylation in vitro sur de cellules, généralement tumorales, issues d'un prélèvement effectué chez un animal. Ces expériences permettraient par exemple 10 de confirmer la présence ou non de phénomène de méthylation de l'ADN sur certains gènes, de bloquer la prolifération cellulaire de ces cellules et donc de les sensibiliser à des agents de chimiothérapie. « Par animal » selon l'invention, on entend les mammifères, les oiseaux, les poissons, les insectes, etc., ainsi que l'être humain. La synthèse du ou des composés organométalliques de formule (I) selon 15 l'invention et en particulier des composés AIM1 à AIM3 a précédemment été décrite dans des publications, telles que la publication de E. C. Constable, A. M. W. Cargill Thompson, Dalton Trans, 1992, 2947-2950 pour les composés AIM1 et AIM3 et la publication de H. Krass, E.A. Plummer, J.M. Haider, P.R. Barker, N.W. Alcock, Z. Pikramenou, M.J., Hannon, D.G. Kurth, Angew. Chem. Int. Ed. 40 (2001) 3862-3865 pour le composé AIM2. 20 En particulier, la synthèse du ou des composés selon l'invention peut s'effectuer selon le procédé décrit ci-dessous. Les ligands terpyridines requis pour la synthèse des composés organométalliques selon l'invention ont été préparés en utilisant la réaction de Krthnke entre la 2-acétylpyridine et un composé aryl aldéhyde approprié en présence d'ammoniac. 25 Par exemple, les complexes homoleptiques AIM1, AIM2 et AIM3 sont obtenus avec un rendement respectif de 90, 69 et 83% en faisant réagir le ligand terpyridine approprié (2 équivalents) avec du FeCl2 dans de l'acétonitrile (schéma 1). 30 R= H R FeCl2 CH3CN, r. 10 min 35 Schéma 1 En particulier, une solution comprenant FeCl2 (106 mg, 0,84 mmoles) et du méthanol (20 mL) est additionnée à une solution comprenant le ligand terpyridine approprié (1,68 mmoles) et du méthanol (20 mL). Le mélange est alors agité pendant 10 10 min. De l'éther éthylique (100 mL) est ensuite ajouté conduisant à un solide pourpre collecté par filtration, lavé à l'éther et séché sous vide. AIM1. Rendement: 90%. RMN 1H (200 MHz, CD3OD): b = 7.85 (d, J = 8.1 Hz, 4H), 7.49 (t, J = 8.2 Hz, 2H), 7.41 (d, J = 8.2 Hz, 4H), 6.68 (m, 4H), 5.90 (d, J = 3.8 Hz, 5 8H) ppm. HRMS (ESI) calcd pour C301-122FeN6C12 m/z = 261.0627 [M - 2 Cr. Trouvé: 261.0683. AIM2. Rendement: 69%. RMN 1H (200 MHz, DMSO-d6 ) 9.70 (s, 4H), 9.09 (d, J=8.5 Hz, 4H), 8.57 (d, J=7.4 Hz, 2H), 8.05 (t, J = 7.4 Hz, 4H), 7.85 (t, J=7.2 Hz, 4H), 7.78 (t, J=7.0 Hz, 2H,), 7.3 (d, J=5.1 Hz, 4H), 7.2 (t, J=6.3 Hz, 4H). HRMS (ESI) calcd pour 10 G42H3oFeN6C12 m/z = 337.0936 [M - 2 Cl]2*. Trouvé: 337.0902. AIM3. Rendement: 83%. RMN 1H (200 MHz, CD3CN): b = 9.27 (s, 2H), 9.08 (d, J = 5.8 Hz, 2H), 8.65 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 8.38 (d, J = 5.8 Hz, 2H), 7.97 (dt, J = 6.7 Hz,1.2 Hz, 2H), 7.22-7.10 (m, 4H) ppm. HRMS (ESI) calcd pour C40H28FeN8C12 m/z = 338.0888 [M - 2 Cl]2+. Trouvé: 338.0906. 15 Il. Utilisation thérapeutique du ou des composés de formule générale (I) Comme cela a déjà été mentionné précédemment, le ou les composés organométalliques de formule (I) selon l'invention présentant une action déméthylante de l'ADN peuvent aussi représenter une substance active à des fins thérapeutiques, comme 20 cela sera décrit ci-après. La présente invention porte ainsi sur un composé organométallique comprenant un atome de fer lié à deux groupes terpyridines, ayant une formule générale (I) telle que définie ci-dessus pour son utilisation comme médicament. Egalement, la présente invention porte sur une composition pharmaceutique 25 comprenant, dans un support acceptable sur le plan pharmaceutique, au moins un composé organométallique tel que défini ci-dessus. Bien sûr les caractéristiques décrites ci-dessus pour le ou les composés organométalliques de formule (I) à usage non-thérapeutique sont reprises ici pour l'usage thérapeutique (à savoir pour leur utilisation en tant que médicament). 30 De préférence, le ou les composés organométalliques selon l'invention peuvent être utilisés afin de traiter des maladies liées à une hyperprolifération cellulaire, en particulier des cancers. En particulier, le ou les composés organométalliques selon l'invention peuvent être utilisés pour traiter des glioblastomes, des leucémies promyélocytaires, des cancers 35 de la prostate, des ovaires, des poumons, des seins, des voies digestives, en particulier du foie, du pancréas, de la tête et du cou, du colon, des lymphomes non-Hodgkiniens ou des mélanomes, etc. 11 Les composés de l'invention présentent un effet antiprolifératif vis-à-vis de cellules tumorales et saines. Ces composés entraînent une accumulation des cellules en phase G2/M ou GO/G1. Une mort cellulaire peut être observée mais seulement après des traitements longs de minimum 96h. Ainsi ces composés peuvent être utilisés afin de 5 réduire la prolifération tumorale. En outre, le ou les composés organométalliques peuvent être utilisés pour traiter des tumeurs résistantes à d'autres agents anticancéreux. De par la capacité déméthylante de ces composés, la Demanderesse a également découvert que le ou les composés organométalliques selon l'invention 10 pouvaient être utilisés pour traiter d'autres maladies liées à une dérégulation des modifications épigénétiques, telles que pour traiter l'inflammation, l'obésité, les maladies neurodégénératives ou les maladies cardiovasculaires. Egalement, la présente invention porte sur une composition pharmaceutique comprenant, dans un support acceptable sur le plan pharmaceutique, au moins un 15 composé organométallique de formule (I) tel que défini ci-dessus. Bien sûr les caractéristiques décrites ci-dessus pour le ou les composés organométalliques de formule (I) à usage non-thérapeutique ou pour l'utilisation en tant que médicament sont reprises ici pour l'usage thérapeutique en tant que médicament. Dans le contexte de l'invention, le terme « support acceptable sur le plan 20 pharmaceutique » désigne des substances telles que les excipients, les véhicules, les adjuvants, les tampons qui sont classiquement utilisés, en combinaison avec un ou des principes actifs (ici, le ou les composés organométalliques selon l'invention), pour la préparation d'un médicament. Le choix de tels supports dépend essentiellement de la voie d'administration envisagée. 25 En générale, le support acceptable sur le plan pharmaceutique est un excipient, un véhicule et/ou un adjuvant choisi dans le groupe constitué par les excipients, les véhicules et/ou les adjuvants pharmaceutiquement acceptables. Des techniques de préparation de compositions pharmaceutiques peuvent être aisément retrouvées par l'homme du métier, par exemple dans l'ouvrage Remmington's 30 Pharmaceutical Sciences, Mid. Publis. Co, Easton, PA, USA. Des adjuvants, des véhicules et des excipients physiologiquement acceptables sont aussi décrits dans l'ouvrage intitulé "Handbook of Pharmaceutical Excipients, seconde édition, American Pharmaceutical Association, 1994". Pour formuler une composition pharmaceutique selon l'invention, l'homme du 35 métier pourra avantageusement se référer à la dernière édition de la Pharmacopée Européenne ou de la Pharmacopée des Etats-Unis d'Amérique (USP). 12 L'homme du métier pourra notamment avantageusement se référer à la quatrième édition 2002 de la Pharmacopée Européenne, ou encore à l'édition USP 25-NF 20 de la Pharmacopée Américaine (U.S. Pharmacopeia). Ainsi, la composition pharmaceutique selon l'invention peut comprendre un ou 5 plusieurs agents ou véhicules choisis parmi les dispersants, les solubilisants, les stabilisants, les conservateurs, etc. La composition pharmaceutique selon l'invention peut être une composition pharmaceutique humaine ou vétérinaire. La composition pharmaceutique selon l'invention peut se présenter sous une 10 forme liquide, ou, de manière préférentielle, sous une forme solide. Pour une administration orale, on préférera une composition pharmaceutique solide, par exemple sous la forme de comprimés, de capsules ou de gélules. Sous la forme liquide, on préférera une composition pharmaceutique sous la forme d'une suspension aqueuse. 15 Une composition pharmaceutique selon l'invention peut ainsi se présenter sous une forme pour l'administration orale, par inhalation, parentérale ou injection comme par exemple par voie intraveineuse, intra-musculaire, sous-cutanée, trans-dermique, intraartérielle, etc. Selon un premier aspect, les formes orales sont particulièrement préférées. 20 Selon un deuxième aspect, les voies, intraveineuse, intramusculaire, sous- cutanée, et par inhalation sont préférées. A titre d'exemple, pour les injections, les compositions sont généralement sous forme de suspensions liquides, qui peuvent être injectées au moyen de seringues ou de perfusions, par exemple. A cet égard, les composés sont généralement dissous dans un 25 support acceptable qui comprend des solutions salines, physiologiques, isotoniques, tamponnées, etc., compatibles avec un usage pharmaceutique et connues de l'homme du métier. Des agents ou véhicules utilisables dans des formulations liquides et/ou injectables sont notamment la méthylcellulose, l'hydroxyméthylcellulose, la carboxyméthylcellulose, le polysorbate 80, le mannitol, la gélatine, le lactose, des huiles 30 végétales, l'acacia, etc. Il est entendu que le débit d'injection et/ou la dose injectée peuvent être adaptés par l'homme du métier en fonction du patient, de la pathologie concernée, du mode d'administration, etc. Typiquement, le ou les composés organométalliques selon l'invention sont 35 administrés à des doses pouvant varier entre 0,1 pg et 100 mg/kg de poids corporel, plus généralement entre 0,01 et 10 mg/kg, typiquement entre 0,1 et 10 mg/kg. En outre, des injections répétées peuvent être réalisées. D'autre part, pour des traitements chroniques, des systèmes à libération prolongée et/ou retardée peuvent être avantageux. 13 A titre d'exemple, pour une administration par voie orale, des formes pharmaceutiques solides en tant que support pharmaceutique peuvent comprendre, en tant que véhicules, adjuvants ou excipients, au moins un agent diluant, un arôme, un agent solubilisant, un agent lubrifiant, un agent de suspension, un agent désintégrant et 5 un agent d'encapsulation, l'identité et la fonction de ces différents classiques étant documentés complètement dans la Pharmacopée Européenne ou dans la Pharmacopée des Etats-Unis d'Amérique, (USP). De tels composés sont par exemple le carbonate de magnésium, le stéarate de magnésium, le talc, le lactose, la pectine, la dextrine, l'amidon, la gélatine, des matériaux 10 cellulosiques, etc. Les compositions sous forme liquide peuvent comprendre également de l'eau, le cas échéant en mélange avec du propylèneglycol ou du polyéthylèneglycol, et éventuellement aussi des agents de coloration, des arômes, des stabilisants et des agents épaississants. Généralement, afin de traiter un patient d'une pathologie liée à une dérégulation 15 des modifications épigénétiques (telle que le cancer), la méthode comprend une étape au cours de laquelle on administre audit patient, une quantité thérapeutiquement efficace d'un extrait sec purifié du ou des composés organométalliques selon l'invention, ou encore de la composition pharmaceutique décrite ci-dessus. Dans le contexte de l'invention, le terme « traitement » désigne le traitement 20 préventif, curatif, palliatif, ainsi que la prise en charge des patients (réduction de la souffrance, amélioration de la durée de vie, ralentissement de la progression de la maladie, réduction de la croissance tumorale, etc.). Le traitement peut en outre être réalisé en combinaison avec d'autres agents ou traitements chimiques ou physiques (chimiothérapie, radiothérapie, thérapie génique, etc.). Les traitements et médicaments de 25 l'invention sont tout particulièrement destinés aux humains. Ainsi, selon un aspect de l'invention, le ou les composés organométalliques selon l'invention et/ou la composition pharmaceutique selon l'invention seront utilisés dans le traitement des cancers en combinaison avec un traitement anticancéreux mettant en oeuvre des rayonnements, tel que la radiothérapie. 30 Selon un autre aspect de l'invention, le ou les composés organométalliques selon l'invention et/ou la composition pharmaceutique selon l'invention seront utilisés dans le traitement des cancers en combinaison avec au moins un autre agent chimique anticancéreux, conditionné et administré de façon combinée, séparée ou séquentielle. Par exemple, il est possible de prévoir un pré-traitement avec un composé selon l'invention, 35 suivi d'un traitement avec un agent anticancéreux. L'autre agent chimique anticancéreux peut être par exemple le cisplatine, le carboplatine, le taxotère, le taxol, le tomoxifène, la doxorubicine ou encore le 5- 14 fluorouracile et est avantageusement le taxol, le 5-fluorouracile ou encore le tomoxifène ou la doxorubicine. La Demanderesse a en effet mis en évidence de manière surprenante que les composés selon l'invention permettaient de sensibiliser des cellules cancéreuses à des 5 agents anticancéreux, voire d'agir en synergie avec eux (exemples 11 et 12). La présente invention permet ainsi d'inhiber in vivo, in vitro ou ex vivo la prolifération de cellules tumorales, comprenant la mise en contact desdites cellules tumorales avec la composition pharmaceutique selon l'invention. Les cellules tumorales peuvent être notamment celles des pathologies spécifiées ci-dessus. 10 L'invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les figures annexées et les exemples suivants où : - la Figure 1 : représente le résultat d'une expérience de modélisation moléculaire de la capacité déméthylante du composé AIM3 selon l'invention ; - la Figure 2 : représente l'évaluation du pouvoir déméthylant des composés 15 AIM2 et AIM3 selon l'invention dans un système in vitro, (a) des tests ELISA ont été réalisés afin de mesurer le taux de cytosines méthylées présent sur un fragment d'ADN après action de la déméthylase TET2 ou des molécules AIM2 et AIM3 ; (b) l'activité déméthylante de AIM2 (2pM) et de la protéine his-tagged-TET2 (10pg) a été mesurée par un dosage de l'incorporation de groupements méthyle radiomarqués au niveau d'un ADN 20 double brin biotynilé et préalablement méthylé par l'enzyme MSsl ; - la Figure 3: représente l'évaluation du pouvoir déméthylant global des molécules AIM2 et AIM3 dans les cellules U251 : un test ELISA a été réalisé afin de mesurer le taux de cytosines méthylées présent au niveau de l'ADN de cellules U251 non traitées versus traitées pendant 1 ou 4h avec 2pM de 5aza-2-déoxycytidine, AIM2 ou 25 AIM3 ; - la Figure 4 : représente l'évaluation du pouvoir déméthylant global de la molécule AIM3 sur les cellules T98G et montre l'absence d'effet dose du pouvoir déméthylant de la molécule AIM3 suite à son incubation pendant 1h (p=0.2578) ; - la Figure 5 : représente l'évaluation du pouvoir déméthylant global des 30 molécules AIM2 et AIM3 selon l'invention sur les cellules MDA-MB231 : une quantification par densitométrie a permis d'obtenir une valeur quantitative de l'intensité des bandes présentent dans la partie encadrée du gel (le calcul du pourcentage de déméthylation a été calculé à l'aide de la formule indiquée) ; - la Figure 6 : représente l'influence de la molécule AIM2 selon l'invention sur la 35 prolifération des cellules épithéliales mammaires MCF-10A et tumorales mammaires MDA-MB231 et Hs578T : les cellules ont été ensemencées, après 24h de culture les cellules ont été traitées pendant 48h avec des concentrations variables de la molécule AIIM2 ; la détermination du nombre de cellules adhérentes a été réalisée par une 15 coloration au cristal violet et quantifiée par une mesure de l'absorbance à 595 nm ; les résultats correspondent à la moyenne de 4 expériences indépendantes, les erreurs standard à la moyenne (SEM) sont indiquées et la significativité des données a été calculée en comparant les cellules traitées vs non traitées (test de Student) ; 5 - la Figure 7 : représente l'influence de la molécule AIM3 selon l'invention sur la prolifération des cellules épithéliales mammaires MCF-10A et tumorales mammaires MDA-MB231 et Hs578T : les cellules ont été ensemencées, après 24h de culture les cellules ont été traitées pendant 48h avec des concentrations variables de la molécule AIIM3 ; la détermination du nombre de cellules adhérentes a été réalisée par une 10 coloration au cristal violet et quantifiée par une mesure de l'absorbance à 595 nm ; les résultats correspondent à la moyenne de 4 expériences indépendantes, les erreurs standard à la moyenne (SEM) sont indiquées- la significacité des données a été calculée en comparant les cellules traitées vs non traitées (test de Student) ; - la Figure 8 : est une analyse du cycle cellulaire des cellules MCF-10A traitées 15 ou non avec 0,5pM de AIM2 ou AIM3 ; les cellules ont été ensemencées et traitées avec 0,5pM d'AIM2 ou de AIM3 pendant 0, 16, 24, 48 et 72h ; après détachement les cellules sont fixées et perméabilisées dans une solution d'éthanol froid à 70% ; un marquage à l'iodure de propidium est ensuite réalisé afin de marquer l'ADN et la fluorescence est quantifiée par cytométrie en flux ; 20 - la Figure 9 : représente une analyse du nombre de cellules traitées ou non avec 2pM de AIM2 ou AIM3. Les cellules ont été ensemencées et traitées avec 2pM d'AIM2 ou de AIM3 pendant 0, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 et 192h. Après détachement les cellules sont dénombrées à l'aide d'une cellule de comptage de type Malassez. Le milieu des cellules NT ou AIM2 ou AIM3 est renouvelé toutes les 72h. Pour les cellules 25 AIM2(72)+NT ou AIM3(72)+NT le milieu de culture contient la molécule indiquée uniquement pendant 72h et après cela il est remplacé par un milieu sans molécule afin de tester la réversibilité de l'effet ; - la Figure 10 : correspond au plan expérimental de plaque de l'exemple 11 ; - la Figure 11 : est une représentation graphique de la viabilité cellulaire des 30 MDA-MB 231 traitées par différentes concentrations du composé AIM2 selon l'invention et/ou de tamoxifène ; - la Figure 12 : représente un ensemble de graphique montrant la sensibilité de différentes lignées de tumeurs mammaires face aux composés AIM2, AIM3, des agents de chimiothérapies classiques et leurs combinaisons. 35 16 III. EXEMPLES Afin de confirmer biologiquement ces données, une étude de l'influence des molécules AIM3 et AIM2 sur la méthylation de l'ADN a été réalisée dans des systèmes acellulaires et cellulaires. 5 EXEMPLE 1 : Solubilisation des composés AIM2 et AIM3 selon l'invention pour leur utilisation sur cellules Pour les différents essais décrits ci-dessous, les composés AIM2 et AIM3 selon 10 l'invention ont été préalablement solubilisés de la manière suivante (Tableau 1): Composé Dilution mère Dilutions filles AIM2 1mM dans PBS + 20% éthanol conservée à 4°C réalisées dans du PBS 1X et conservée à 4°C AIM3 5mM dans PBS + 20% éthanol conservée à 4°C réalisées dans du PBS 1X et conservée à 4°C Tableau I Pour le composé AIM2, les solutions filles peuvent précipiter à 4°C. Il est ainsi nécessaire de les incuber à 37°C pendant 10 min avant leur utilisation. 15 EXEMPLE 2 : Modélisation moléculaire de la capacité déméthylante du composé AIM3 selon l'invention Afin de démontrer l'action déméthylante des composés organométalliques selon l'invention, la Demanderesse a réalisé une modélisation moléculaire de la capacité 20 déméthylante du composé AIM3 selon l'invention. A cet effet, le profil d'énergie lié à la réaction de déméthylation a été réalisé à l'aide des calculs de chimie quantique. Notamment un système modèle comprenant une cytosine méthylée et AIM3 a été utilisé. Les géométries des réactifs et des produits ont été optimisées à l'aide de la théorie de la fonctionnelle de la densité « DFT » en utilisant 25 wB97XD comme fonctionnelle d'échange-corrélation et LANL2DZ comme base d'orbitales. Par la suite l'état de transition, c'est à dire la conformation d'énergie maximale, a été aussi optimisé ce qui a permis d'estimer la barrière énergétique qui doit être surmonté pour pouvoir compléter la réaction dans ce cas de déméthylation. Le profil 30 énergétique de la réaction dans l'espace reliant les réactifs et les produits via l'état de transition a aussi été estimé en analysant la variation d'énergie selon une coordonnée de réaction, c'est à dire la distance entre le méthyl et l'azote périphérique de AIM3. Les effets 17 du solvant, l'eau, ont été pris en compte à l'aide d'un modèle du continuum polarisable « PCM ». Tous les calculs de modélisation moléculaire ont été réalisés via le logiciel Gaussian 09 version DO1 et grâce aux techniques standards de modélisation moléculaire 5 notamment détaillées dans des nombreux ouvrages comme par exemple « Chris J. Cramer Essential of Computational Chemistry Wiley eds ». De plus l'homme de métier pourra se référer au manuel de Gaussian 09 pour une illustration détaillée des techniques d'optimisation de géométrie qui ont été utilisées. Comme le montre la FIG.1, les résultats obtenus ont révélé que le composé 10 AIM3 et les autres composés organométalliques de formule (I) pourraient entraîner une déméthylation directe de l'ADN via des réactions thermodynamiques favorables. EXEMPLE 3 : Mesure du taux de 5-méthylacytosine (5mC) par ELISA (Fig.2 (a)) 15 Test acellulaire : Les expériences acellulaires consistent à incuber de l'ADN méthylé (Qiagen, France) à 37°C pendant 1h avec soit 2pM de molécules AIM2 et AIM3, soit avec la protéine TET2 recombinante qui est une protéine connue pour son rôle déméthylant et servant de contrôle positif ou soit avec de l'eau (Ctrl). 20 En particulier, l'ADN méthylé (50Ong, ref#N4007 NEB, ADN génomique de cellule HeLa hyperméthylée in vitro par l'enzyme M.Sssl) est incubé pendant 1h at 37°C soit en présence d'eau (Ctrl), soit en présence de AIM2 (2 pM) ou AIM3 (2 pM), soit en présence de 10 pg de protéine his-tagged-TET2. L'ADN est ensuite utilisé pour réaliser un test 5mC-ELISA (Zymo Research) i.e. 25 permettant de mesurer le niveau de 5-méthylcytosines (voir ci-dessous). Test cellulaire : Les cellules de gliomes U251 ou de glioblastomes T98G ont été ensemencées à 2.106 respectivement. 24 h après l'ensemencement, les cellules ont été traitées pendant 1 ou 4h avec les molécules AIM2 ou AIM3 à raison de 0, 2, 5, 10 pM. Après le traitement 30 le milieu de culture est remplacé par un milieu sans molécule et les cellules sont maintenues 48h en culture. Les cellules sont ensuite détachées mécaniquement avec un grattoir afin de réaliser une extraction d'ADN total via l'utilisation de l'automate QiaCube (Qiagen) et du kit QlAamp DNA Mini QlAcube Kit (Qiagen), sans modification avec les instructions fournies par Qiagen. 35 5mC-ELISA (Zymo Research) L'ADN (10Ong) collecté comme indiqué ci-dessus est tout d'abord dénaturé à 98°C pendant 5min (utilisation du thermocycler MyCycler BioRad), avant d'être déposé dans les puits de la plaque : 96 puits prévus à cet effet (Kit 5mC-ELISA, Zymo) pour 1h 18 d'incubation à 37°C. Le surnageant est ensuite retiré et les puits sont lavés 3 fois avec 200 pL de tampon de lavage (fourni par le kit). Puis, 200 pL de tampon de lavage sont incubés dans chaque puits pour 30min à 37°C. L'étape de révélation/quantification des 5méthylcytosines est réalisée avec l'incubation (1h, 37°C) de l'anticorps anti-5mC fourni 5 par le kit (ref/A3001-30), dilué au 1/2000. Après 3 lavages (200 pL de tampon de lavage fourni par le kit), l'anticorps primaire est révélé suite à l'incubation (1h, 37°C) de l'anticorps secondaire couplé HRP (D5325-3-30). Enfin, après 3 lavages (200 pL de tampon de lavage fourni par le kit), la révélation de l'ELISA est réalisée par ajout de 100 pL de « HRP developer » (fourni par le kit). La lecture de la plaque ELISA est réalisée 10 à 405-450 nm (Victor plate reader, Perkin Elmer). En parallèle, une gamme étalon est réalisée avec de l'ADN méthylé dont le pourcentage de 5mC est connu (gamme : 0, 5, 10, 25, 50, 75, 100%). Comme le montre la Fig.2(a), la mesure du taux de méthylcytosines (test ELISA) présentes au niveau de la sonde d'ADN a permis de révéler une baisse 15 significative des méthylcytosines après un traitement avec les molécules AIM3 et AIM2. EXEMPLE 4 : Dosage des groupements méthyl radiomarqués (Fig. 2(b)) De plus, l'activité déméthylante de AIM2 (2pM) et de la protéine his-tagged- 20 TET2 (10pg) (témoin positif) a été mesurée par un dosage de l'incorporation de groupements méthyle radiomarqués au niveau d'un ADN double brin biotynilé et préalablement méthylé par l'enzyme M.SSsI. Protocole Cette expérience DMB est réalisée comme décrit par Yokochi and Robertson 25 (2004). Une plaque de 96 puits est préalablement pré-traitée avec 10 mg/ml de BSA (bovine serum albumin) pendant 30 min. Les billes magnétiques (10 mg/ml, Dynal) sont lavées trois fois avec le tampon TENT2M (20 mM Tris, pH 8.0, 2 mM EDTA, 0.01% Triton X-100, 2 M NaCI). La 30 concentration de ces billes est ajustée à 2,5 mg/ml avec le tampon TENT2M et 1/10 du volume avec la forme non radioactive de AdoMet (100 mg/mi ; Sigma). La réaction de méthylation (40 pl) contient 200 U de l'enzyme M.Sssl (NEB#M0226) 125 nM d'oligonucléotides d'ADN, 200ng d'ADN, and 900 nM tritiumlabeled AdoMet (Amersham Bioscience, 1 mCi/ml) dans le milieu réactionnel (50 mM Tris, 35 pH 8.0, 5 mM EDTA, 10% glycérol, 10 mM 2-mercaptoéthanol, 0,5 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle). Après une incubation de 30 min à 37 °C, les réactions sont stoppées par l'ajout d'un volume équivalent de billes magnétiques en suspension et une agitation douce 19 pendant 15 min à température ambiante. Les billes magnétiques sont séparées à l'aide d'un aimant et lavées successivement avec 300, 200, 150, and 100 pI TENT1M (10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA, 0.005% Triton X-100, 1 M NaCI). Les billes magnétiques sont resuspendues dans 25 pI de TENT1M en présence des "agents déméthylant putatifs " ou 5 avec 100 pg d'extrait nucléaire isolé à l'aide du kit, nuclear extract kit (Active Motif, # 40410). Après les incubations, les billes magnétiques sont séparées à l'aide d'un aimant et lavées successivement avec 300, 200, 150, and 100 pI de TENT1M (10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA, 0.005% Triton X-100, 1 M NaCI). Ensuite le taux de tritium incorporé est mesuré dans un compteur à scintillation. 10 Résultats (Fig.2(b)) Comme le montre la Fig.2(b), le composé AIM2 présente une action déméthylante de l'ADN. EXEMPLE 5 : Expérience sur des cellules du glioblastome U251 (Fig.3) 15 Parallèlement, dans le but de vérifier le pouvoir déméthylant de ces molécules organométalliques selon l'invention, des expériences sur des cellules de glioblastome U251 ont été réalisées. Protocole 20 L'expérience réalisée sur les cellules U251 a consisté à traiter ces dernières pendant 1 ou 4h avec 2pM d'AIM2, AIM3 ou de 5aza-2-déoxycyfidine qui est un agent déméthylant connu et couramment utilisé. A la suite des traitements, l'ADN a été extrait et soumis à un test ELISA afin de déterminer le taux de cytosines méthylées (protocole, voir EXEMPLE 3). 25 Résultats : Comme indiqué sur la Figure 3, les molécules AIM2 et AIM3 présentent un pouvoir déméthylant après 1 h et 4h d'incubation nettement supérieur à celui de la 5aza-2- déoxycyfidine qui est l'agent déméthylant connu et couramment utilisé, mais qui nécessite une incorporation au sein de l'ADN. 30 EXEMPLE 6 Expérience sur une autre ligne cellulaire de glioblastome T98G (Fig.4) Par ailleurs, l'action déméthylante de AIM3 a également été observée sur une autre lignée cellulaire de glioblastome, appelée T98G (Figure 4). 35 Protocole L'expérience réalisée sur les cellules T98G a consisté à traiter ces dernières pendant 1 h avec différentes concentrations du composé AIM3 selon l'invention, à savoir 0 ; 2 ; 5 et 10 pM. 20 A la suite des traitements, l'ADN a été extrait et soumis à un test ELISA afin de déterminer le taux de cytosines méthylées (protocole, voir EXEMPLE 3). Résultats : Comme indiqué sur la Figure 4, dans ces cellules le pouvoir déméthylant de la 5 molécule AIM3 est visible après 1h de traitement à une concentration de 2pM. Néanmoins, une augmentation de la concentration de cette molécule (de l'ordre de 5 à 10 pM) n'augmente pas son pouvoir déméthylant. En effet, une dose de 2pM de AIM3 présente un effet déméthylant qui est similaire à celui d'une dose de 10 pM de AIM3. 10 EXEMPLE 7 Expérience sur les cellules MDA-MB231 (Fig.5) Une expérience de digestion enzymatique a également été réalisée afin de déterminer le pourcentage de déméthylation global induit par les molécules AIM2 et AIM3 selon l'invention. 15 Protocole 1. Culture cellulaire 1.1. Conditions de culture et traitements Les cellules de la lignée cancéreuse mammaire MDA-MB 231 sont cultivées en milieu RPMI 1640 (Gibco) contenant 2mM de L-Glutamine (Sigma), 0,1mg/mL de 20 gentamicine (Sigma) et 10% de sérum de veau foetal (Sigma) décomplémenté 30 minutes à 56°C. Elles sont incubées à 37°C et à 5% de CO2. L'ensemencement s'effectue en boîtes de Pétri 6cm (4mL milieu/boîte) selon les conditions suivantes (tableau 2) : Non traitées 4.105cellules AIM2 2pM 1h 4h 16h 24h AIM3 2pM 1h 4h 16h 24h 5aza2déoxycytidine 5pM 72h 8.105 cellules Tableau 2 25 1.2. Conditions de reprise des molécules 5aza2déoxycytidine (Sigma A3656) La poudre est reprise à 100 mM dans du DMSO (Sigma). Cette solution stock est aliquotée (2pL) et stockée à -80°C. 21 Les dilutions intermédiaires s'effectuent dans le milieu de culture. AIM 2 La poudre (717,07 g/mol) est reprise à 1mM dans du PBS (Fisher) contenant 20% d'éthanol. Cette solution mère est stockée à 4°C. 5 Les dilutions intermédiaires s'effectuent dans du PBS. AIM 3 La poudre (719,06 g/mol) est reprise à 5mM dans du PBS contenant 20% d'éthanol. Cette solution mère est stockée à 4°C. Les dilutions intermédiaires s'effectuent dans du PBS 10 NB : Les solutions mères de AIM 2 et AIM3 précipitent à 4°C. Il suffit de les incuber 5 minutes à 37°C afin de les re-solubiliser. 1.3. Procédure de récolte des cellules Le tapis cellulaire est lavé avec 2mL de PBS, puis trypsiné avec 0,5mL de trypsine EDTA 1X (Sigma) pendant 5 minutes à 37°C. L'action de la trypsine est ensuite 15 inhibée par l'ajout de 4 mL de milieu de culture. La suspension cellulaire est enfin centrifugée à 200 G pendant 5 minutes et le culot conservé à -20°C. 1.4. Planning J1 J2 J3 J4 J5 ensemencement à X-5 h : récolte cellules boîtes 16 h A X-4h : Traitement AIM2/3 2 pm boîtes 4 h A X-1h : Traitement AIM2/3 2 dam boîtes 1 h àXh: àXh: àXh : A X h : Traitement Renouveler Renouveler Récolte cellules 5 aza 5 pM milieu 5 aza milieu 5 aza boîtes non traitées, 1h, 4h et 24h 20 Tableau 3 2. Lyse et extraction de l'ADN 2.1. Lyse cellulaire Chaque culot est repris dans 100pL de PBS, auxquels sont ajoutés dans l'ordre : Traitement AI M2/3 2 pM boîtes24 h àXh: Traitement 5 aza 5 pM 22 - 100 pL eau - 150 pL SDS 0,1% - 50 pL Protéinase K à 10mg/mL (Sigma) La lyse s'effectue à 37°C toute la nuit. 5 2.2. Extraction de l'ADN Ajouter au lysat 2 volumes de phénol/chloroforme 5 1 Vortexer 30 secondes Centrifuger à 16 000 G pendant 5 minutes à température ambiante 10 Récupérer la phase aqueuse (surnageant) Ajouter 1 volume de chloroforme/isoamylalcool 23 : 1 Centrifuger à 16 000 G pendant 5 minutes à température ambiante Récupérer la phase aqueuse (surnageant) Ajouter 1/10 du volume d'acétate de sodium 3M 15 Puis 1 volume d'éthanol absolu froid Vortexer 10 secondes Laisser précipiter une nuit à -20°C Centrifuger à 12 000 G pendant 15 minutes à 4°C Laver le culot avec 500 pL d'éthanol 70% 20 Centrifuger à 12 000 G pendant 5 minutes à 4°C Laisser sécher le culot (couvercle du tube ouvert) jusqu'à ce qu'il devienne translucide Dissoudre le culot dans de l'eau stérile (100 pL environ, volume à ajuster en fonction de la taille du culot obtenu) 25 Doser l'ADN à 260 nm Conserver l'ADN à -20°C 3. Digestions enzymatiques avec MSPI et Hpall (Fisher, ER0541 et ER0511) 1 pg d'ADN de chaque condition est digéré avec MSPI et Hpall selon le protocole suivant : 30 2 pL Buffer TANGO 10X 1 pg ADN Eau qsp 16 pL 2 pL Hpall ou Mspl (=20 U) Incuber à 37°C toute la nuit, puis 20 minutes à 80 °C (inactivation enzymes) 35 4. Migration de l'ADN digéré sur gel d'agarose Ajouter 4pL de bleu de dépôt 6X à chaque volume de digestion (20pL) (Bleu dépôt 6X : 10mM TrisHCl pH 7,6, 60mM EDTA, 60% glycérol, 0,03% bromophénol bleu, 0,03% xylène cyanol FF) 23 Faire migrer la totalité de chaque digestion sur un gel d'agarose 1% + 2pL BET 10mg/mL à 90V pendant 40 minutes. L'intensité de chaque bande est mesurée à l'aide du logiciel Quantity One. Calcul % de déméthylation de l'ADN : (Hpall - Mspl)uffité x 100 / (Hpall - Mspl )Non Traité Résultats : Les données présentées figure 5 confirment que, comme la 5-azacytidine, le traitement de cellules MDA-MB231 avec les molécules AIM2 et AIM3 permet de réduire le pourcentage globale de méthylation du génome. EXEMPLE 8 : Influence des composés AIM2 et AIM3 selon l'invention sur la prolifération des cellules épithéliales mammaires MCF-10A et tumorales mammaires MDA-MB231 et Hs578T (Fig.6 et Fig.7) 15 Protocole cristal violet Ensemencement en plaque 96 puits : Lignée cellulaire MDA MB 231 : 10 000 cellules / puits dans 100pL de milieu de culture Lignée cellulaire MCF10A : 2 000 cellules / puits dans 100pL de milieu de culture Lignée cellulaire Hs578T : 5 000 cellules / puits dans 100pL de milieu de culture 20 Tableau 4 Les cellules sont ensemencées selon les densités indiquées ci-dessus (Tableau 4). Après 24h de culture, le milieu de culture est remplacé par du milieu contenant ou non les molécules AIM2 ou AIM3 aux concentrations de 0,5 ; 1 ; 1,5 ; 2 et 2,5 pM en quatre exemplaires pendant 48h. Après ces 48h de traitement le milieu de culture est enlevé et 25 les cellules sont lavées avec une solution de PBS 1X. Elles sont ensuite fixées dans 100pL de milieu de culture contenant 4% de paraformaldéhyde et incubées 20 min à température ambiante. Les cellules sont ensuite rincées avec une solution de PBS lx. Puis elles sont colorées 30 min à l'aide de 100pL d'une solution de Cristal Violet 0,1% (dilution au 1/5 dans H2O de la solution stock : 0.5% cristal violet 2% ethanol). Les cellules 30 sont ensuite lavées 3 fois avec 100pL d'H20. L'étape suivante consiste à solubiliser le cristal violet afin d'obtenir une solution colorée qui pourra être dosée. Ainsi, 100pL d'une solution d'acide acétique à 10% est ajoutée, puis les plaques sont incubées sous agitation jusqu'à la solubilisation totale du Cristal Violet. Une lecture de l'absorbance est ensuite réalisée à 595 nm grâce à un 35 lecteur de plaque (VICTOR). Résultats : Au niveau biologique, il a été déterminé que les molécules AIM2 et AIM3 présentaient une action antiproliférative sur des cellules épithéliales mammaires normales (MCF-10A) et sur des cellules tumorales mammaires (MDA-MB231 et Hs578T) (Figure 6 5 10 24 et 7). Ces résultats permettent de définir la concentration médiane inhibitrice (IC50) des molécules AIM2 (Figure 6) et AIM3 (Figure 7). L'IC50 de la molécule AIM2 dans les cellules MCF-10A est comprise entre 0,5 et 1pM et dans les cellules MDA-MB231 entre 1 et 1,5pM ; l'IC50 de la molécule AIM3 dans les cellules MCF-10A est comprise entre 1 et 5 1,5pM et dans les cellules MDA-MB231 entre 1,5 et 2pM. EXEMPLE 9 : Influence des composés AIM2 et AIM3 selon l'invention sur la prolifération des cellules épithéliales mammaires MCF-10A par cytométrie en flux (Fig.8) : absence de toxicité cellulaire 10 Dans le but de définir cette action antiproliférative, une étude du cycle cellulaire des cellules épithéliales mammaires MCF-10A par cytométrie en flux a également été réalisée (Figure 8). Protocole : cycle cellulaire 15 1. Ensemencer les cellules dans des boîtes 60mm. La concentration des cellules est présentée dans le tableau en dessous. Lignée cellulaire Concentration (nombre/mL) MCF-10A (0h, 16h, 24h) 1,5x104 MCF-10A (48h, 72h) 5x104 MDA-MB231 1x105 Hs578T 5x104 Tableau 5 2. Traiter les cellules selon le temps de traitement. 3. Récupérer le milieu de chaque boite dans un tube de 15m1. 20 4. Laver les cellules avec 2mL de PBS. 5. Récupérer le PBS dans le tube. 6. Ajouter 1 mL de trypsine 1 x dans chaque boite et les incuber dans l'incubateur pendant 5 minutes pour les MDA-MB231 et les Hs578T, et 15 minutes pour les MCF-10A. 7. Inhiber la trypsine avec le milieu et récupérer les cellules dans le tube. 25 8. Bien re-suspendre les cellules et faire un comptage à l'aide d'un TC10Tm Automated Cell Counter (Bio-Rad). 9. Prendre 1x106 cellules dans un nouveau tube de 15m1, centrifuger à 500 G pendant 5 minutes. 10. Aspirer le surnageant et laver les cellules avec 2m1 de PBS. 30 11. Centrifuger à 500 G pendant 5 minutes. 12. Aspirer le surnageant, reprendre le culot dans 300p1 de PBS et bien séparer les cellules avec une pipette 200p1. 25 13. Ajouter 700p1 de l'éthanol absolu froide au goutte à goutte tout en vortexant dans le tube. 14. Mettre les cellules dans le frigo à -20°C au moins 30 minutes pour assurer une perméabilisation et une fixation correcte. 5 15. Prendre 500pL de cellules (5x105 cellules) de chaque suspension et centrifuger à 800G pendant 10 minutes. 16. Aspirer délicatement le surnageant. 17. Reprendre chaque culot dans 500 pl de DNA stainning solution contenant 10p1 de RNase A et 2p1 d'iodure de propidium(IP,50 pg/ml). Les culots non marqués sont repris 10 dans 500pL de PBS. 18. Incubation 10 minutes à l'obscurité. 19. Lecture au FACS. Résultats : 15 Comme le montre la Fig.8, les résultats obtenus indiquent qu'un traitement avec 0,5 pM d'AIM2 et AIM3 induit un blocage du cycle cellulaire en phase G1. L'absence de cellules en phase subG1 indique que ces molécules ne présentent pas de toxicité cellulaire dans ces conditions de traitement. 20 EXEMPLE 10: Influence sur la prolifération cellulaire (essai PARP clivée par Western Blot) (Fig.9) L'absence de mort cellulaire a été confirmée par des expériences au cours desquelles il a été vérifié l'absence de la protéine PARP clivée par western blot 25 L'effet de ces molécules sur la prolifération cellulaire a également été évalué en fonction du temps de traitement et non plus de la dose de molécule utilisée. La dose de 2pM, qui est celle capable d'entraîner une déméthylation de l'ADN, a été choisie. Protocole : Les cellules sont ensemencées dans des boîtes de 60mm à raison de 30 4 mL/boîte le 1er jour à la concentration indiquée dans le tableau ci-dessous. Lignée cellulaire Concentration (nombre/ml) MCF-10A 8x104 MDA-MB231 1x105 Hs578T 4,5x104 Tableau 6 6 heures après leur ensemencement, les complexes organométalliques Al M2 et AIM3 à 2pM ou le solvant (0.04% d'éthanol) pour les cellules non traitées sont ajoutés dans le milieu de culture. A l'issue du temps de traitement choisi, 24, 48, 72, 96, 120, 144 26 heures, les cellules traitées et non traitées sont détachées par action de la trypsine. Après inactivation de la trypsine avec du milieu de culture contenant 10% de sérum de veau foetal, les cellules sont lavées dans du PBS et comptées après coloration au Bleu Trypan afin de ne compter que les cellules vivantes (une fraction de 10p1 de la suspension est 5 mélangée avec 10p1 de bleu de Trypan à 0,4% (Thermo Scientific). Le comptage des cellules est effectué à l'aide d'une cellule de comptage Malassez (Marienfeld-Superior). a). Préalablement au traitement, les molécules AlMs sont préchauffées dans un bloc chauffant (Thermo Scientific) à 37°C sous agitation pendant 10 minutes afin de garantir une solubilisation totale. 10 b). Pour les traitements supérieurs à 72 heures, les milieux sont renouvelés toutes les 72 heures avec ou sans AIMs. c). Dans le test de réversibilité de la prolifération (courbes rouges sur la figure), le traitement est arrêté après 72 heures et les milieux sont renouvelés sans ajout de molécules AlMs. 15 Résultats : Ainsi, les molécules AIM2 et AIM3 présentent une action cytostatique dans les différentes lignées cellulaires utilisées (MCF-10A, MDA-M B231 et Hs578). Comme indiqué figure 9, un traitement avec une dose de 2 mM inhibe la prolifération des cellules épithéliales mammaires saines (MCF10A), mais également des 20 cellules cancéreuses mammaires (MDA-MB231 et HS578T) (cf. courbes points carré par rapport aux contrôles non traités rond). Par contre, dans le but de déterminer la réversibilité de ces traitements, il a également été réalisé un traitement de 72h avec 2mM de molécule, suivi par un changement de milieu sans rajout de molécule. Dans cette expérience, il apparaît que le changement de milieu permet aux cellules de proliférer de 25 nouveau et ce de manière beaucoup plus marquée concernant les cellules épithéliales mammaires saines (MCF10A). Ce résultat permet de conforter les observations précédentes démontrant la non-cytotoxicité de ces molécules et donc leur effet cytostatique. 30 EXEMPLE 11 : Effet sensibilisant des composés selon l'invention vis-à-vis de chimiothérapie dans des cellules tumorales mammaires (Fiq.10 et Fiq.11) Le cancer du sein regroupe en réalité différentes sous-catégories basées sur l'expression de 3 marqueurs moléculaire : le récepteur aux oestrogènes (ERa), le 35 récepteur à la progestérone (PR) et le récepteur transmembranaire appartenant à la famille des récepteurs à l'EGF (HER2). Certaines tumeurs sont ainsi nommées triples négatives, car elles n'expriment aucun des 3 marqueurs moléculaires. Ce type de tumeur pose de nombreux problèmes dans leur traitement du fait : 27 - de leur insensibilité aux agents de chimiothérapie couramment utilisés dans le traitement du cancer du sein - de l'absence de traitement ciblé pour ces tumeurs. Un des enjeux majeurs dans le traitement du cancer du sein consiste à tenter 5 de re-sensibiliser des tumeurs mammaires triples négatives aux agents de chimiothérapie. Un des buts visés consiste ainsi à restaurer la sensibilité de cellules cancéreuses mammaires triples négatives, les MDA-M B231, à un agent de chimiothérapie, le tamoxifène. D'un point de vue mécanistique, le tamoxifène est un modulateur sélectif des 10 récepteurs aux oestrogènes (ERa), c'est-à-dire qu'il se fixe spécifiquement sur les récepteurs aux oestrogènes, mais sans activer de voie de signalisation. La résistance des cellules MDA-MB231 face au tamoxifène a été montrée comme étant due à une absence d'expression d'ERG. En 2000, Yoshida et ses collaborateurs ont montré que l'hyperméthylation de 2 régions promotrices (promoteur A et B) en amont du gène codant 15 ERG est inversement corrélée à l'expression d'ERa dans les cellules M DA-M B231. De plus, un traitement à l'aide d'un agent déméthylant (la 5-azadésoxycytidine) a permis de ré-induire l'expression d'ERG dans les cellules MDA-MB231 (lien : the synergic inhibitory effect of 5-aza-2-deoxycytidine and tamoxifen on estrogen receptor alpha negative breast cancer cell lines in vitro). 20 Les résultats de l'utilisation sur cellules de la 5aza étant très prometteurs, des essais cliniques ont été réalisés pour le traitement de certaines leucémies associées à une hyperméthylation de gènes spécifiques. Bien que la survie globale des patients soit nettement améliorée, il n'en reste pas moins que l'utilisation de la 5-azadésoxycytidine soit associée à de lourds effets secondaires (neutropénie, thrombocytopénie, anémie, 25 pyrexie), du fait de l'absence de spécificité de l'action de cette molécule. Une partie des travaux menés en cancérologie est ainsi de générer et d'étudier de nouveaux agents déméthylants présentant une spécificité d'action améliorée. C'est dans ce contexte que les composés selon l'invention ont été développés dont le composé AIM2 qui présente comme le montre les essais ci-dessus une action 30 déméthylante, à la fois in vitro et in cellulo. Face à ce mode d'action, la Demanderesse a étudié si les composés selon l'invention permettaient de déméthyler le promoteur d'ERa dans les cellules MDA-MB231, afin de réinduire son expression, et de resensibiliser les cellules au tamoxifène. Dans un 1er temps, la synergie d'action entre notre molécule AIM2 et le 35 tamoxifène a été étudié. Des tests de Chou-Talalay ont été réalisés en déterminant le nombre de cellules attachées après traitements à l'aide du composé AIM2 et/ou à l'aide de tamoxifène. 28 Protocole : Expérience de synergisme AIM2/Tamoxiféne Chou Talalay Pour cela, des cellules MDA-MB231 ont été ensemencées en plaque 96 puits à une densité cellulaire de 8 000 cellules/puits dans un volume de 100pL/puits. Le plan expérimental de plaque est présenté sur la figure 10. 5 Le traitement à AIM2 se fait pendant 24h, suivi de 48h de traitement au tamoxifène. A la fin des traitements, un marquage au cristal violet est réalisé afin de dénombrer les cellules vivantes. Le protocole est le suivant : - aspirer les puits 10 - laver les puits avec 100pL de PBS - ajouter 50 pL de cristal violet 0,1% et laisser incuber 30 minutes à température ambiante - rincer 3 fois à l'eau distillée - ajouter 100 pL d'acide acétique 10% par puits et laisser incuber sous agitation 15 10 minutes - mesurer l'absorbance à 595 nm dans un VICTOR Multilabel Plate Reader (PerkinElmer). Les triplicats de plaque sont moyennés, et les résultats sont exprimés en fonction du contrôle non traité qui est fixé à 1 pour chaque condition. 20 Résultats : Les résultats montrent que les cellules MDA-MB231, qui sont ER négatives, sont insensibles au tamoxifène. Un traitement avec AIM2 induit une diminution de la viabilité cellulaire de l'ordre de 50% dès la dose la plus faible (2 000 nM). Un 25 prétraitement par AIM2 suivi d'un traitement au tamoxifène induit également une diminution de la viabilité cellulaire, qui semble plus importante qu'en présence de la molécule AIM2 uniquement. Afin de savoir si cette diminution de la viabilité cellulaire dans la condition AIM2+Tam s'explique par une synergie entre les 2 molécules, le Demanderesse a utilisé le logiciel CompuSync qui se base sur la méthode de Chou- 30 Talalay via le principe d'effet médian de la loi d'action de masse. L'équation sur laquelle se base le logiciel est la suivante fa/fu=K(D/Dm)]m où : fa et fu correspondent respectivement aux fractions de cellules affectées et non affectées par les traitements; 35 D et Dm correspondent respectivement à la dose employée et la dose médiane (IC50) m correspond à la forme de la courbe dose-réponse. Il suffit de rentrer dans le logiciel 3 jeux de données : 29 - les valeurs correspondant à l'effet de la molécule A à la dose donnée - les valeurs correspondant à l'effet de la molécule B à la dose donnée - les valeurs correspondant à l'effet de la molécule A et de la molécule B à la combinaison de doses données. 5 Le logiciel génère alors des indices de combinaison (Cl) : - si le Cl à une combinaison de dose donnée est inférieur à 1, alors il y a synergie d'action entre la molécule A et la molécule B - si le Cl à une combinaison de dose donnée est supérieur à 1, alors il y a antagonisme entre la molécule A et la molécule B. 10 Les résultats (exprimés sous la forme de combinaison index, ou Cl) sont présentés dans le tableau 7 ci-dessous : Dose de AIM2 Dose de TAM Combinaison de dose Combinaison index (Cl) 2 000 nM 100 nM 2 100 nM 0,48 5 000 Nm 250 nM 5 250 nM 0,42 10 000 nM 500 nM 10 500 nM 1,7 15 000 nM 750 nM 15 750 nM 0,63 20 000 nM 1000 nM 21 000 nM 0,41 Tableau 7 Comme les résultats le montrent, toutes les combinaisons de doses (sauf la combinaison 10 000 nM de AIM2 et 750 nM de TAM) permettent d'observer une synergie 15 (Cl REVENDICATIONS1. Utilisation non-thérapeutique, en tant qu'agent de il-alitai] de l'ADN, d'au moins un composé organométallique comprenant un atome de fer é à deux groupes terpyridines de forrnu e générale (I) suivante dans laquelle R1 à RI, identiques ou deerents sont choisi_ parmi un atome d'hydrogéna ; Une chaîne alkyle linéaire ou rarnffiée de formule C,H2n.,:t avec n r-t 1 à 12 ; un groupe COOH un groupe S03H ; un groupe PO3H ; un cycle aromatique de formule (II) à (VI) ci-dessous: (VI) Y sont dhacun :ndêpendernment des aritres un groupie CH ou un atome d'azote; est choisi pari-nt un groupe OCTI-l2y.H avec y ttt 1 à 10 ; avec w= 1 à 10: avec m= 1 à 6, 000H ; SOs1-1 POkla Z désigne un atome d'oxygéne, un atome de soufre ou un groupe. NH ; la ligne en pointillée représente UTIQ C-C au niveau du point le rattachement do cycle aromatique de formule (I1) à (VI) aux grbupernents terpyridines du composé organométallique de formule (I); X est un contre-ion, 2. LltlisatiOn non-thérapeutiqUe selon la revendication 1, dans laquelle co respondent à un atome d'hydrogène. 32 non thérapeutique selon là revendication 1 dans Ale RI, R5, R4, e sont identiques et correspondent è un atome d'hydrogène, et R2 et R5 sont identiques et désignent un benzène de formule MI) suivante; Utilisation non-thérapeutique selon le r veridicati n 1. dans laquelle R1, R3,. sont identiques et correspondent à un a orne ène. et Rz et R5 sont dentiques et désignent un radical pyridine da formuie vz nte (Vil) où la ligne en pointillée représente une i aison C-C entre le carbone porté par ie radical peic.line et le carbone porté par le groupe terpyridine du composé organométallique de farrYllile (3). non-thérapeutlque selon l'une quelconque des revendications. Mes, dans laquelle le contre-ion X est choisi parmi CI , Br ,ou I 20 6. Utilisation non-therapeufique selon l'une quelconque des revendications Précédentes, dans iagnelle ledit composé organométallique est capable. d'emtraîner une démethylation directe de 'ADN, 7. Composé organométallique comprenant un atome de fer lié à deux groupes terpyridines, ayant une formule générale (I) définie selon t' ro quelconque de revendications 1 A 6 pour son utilisation comme-MediCament. 8. Composé organométallique selon la revendication T, pour son utilisation dans. le tiaitemel t des maladies llées à une hyperprolifération 9. Composé- organométallique- selon la.fevendication 7 ou 8, pour Son utilisation dans le traitement de cancers. 30 10. Composé organométallique tune des revendications 7 à 9, pour sort utilisatior'. dans le traitement des glioblastorries, des 1eucemies pramyelocytaires, cancers de la prostate, des ovaires. des poumons, des' seins, des voies digestives, en partic.,ulier du foie, du pancréas, de la tête et du cou, du côlon, des lymphoines nonHodeiniens ou des mélanomes. 35 11. Composé orn:anornétall:que selon l'une des revendications 7 à 10, pour Son ion dans le traiternent des tu Meurs résistantes au cisplatine, le 5-fluorouracilé, le toMo, féne encore la doXorubicine ou à d'autres composés anticancéreux, CL) 12. Cornposé organométdilique selon la vendication 7 o pour son tion dans ie traitement de nlemma-don de l'obésité. de maladies neurodégénératives ou de maladies cardlovasculaires. 13. Composition pharrnatteutlque comprenant, dans un support acceptable sui ie plan pharmaceutique, amans un composé organométallique défini selon l'une quelconque desrevendications 7 à 12.