Brevet FR3089974A1 — publié le 20200619

Description Titre de l'invention : Nouveaux composés dépigmentants extraits de Eryngium maritimum [0001] La présente invention a pour objet de nouveaux composés dépienentants extraits de la plante Eryngium maritinunn, ainsi que l'utilisation de ces composés et des extraits d' Eryngium maritinunn contenant au moins un de ces composés pour dépigmenter la peau, notamment à éclaircir le teint ou à améliorer l'homogénéité de la coloration de la peau, ou encore à corriger ou atténuer les taches pigmentaires de peau ou les zones de peau hyperpigmentées. La présente invention se rapporte encore à des compositions cosmétiques comprenant au moins un de ces composés ou extraits et leur utilisation. [0002] La pigmentation cutanée est liée à la présence dans la peau dc cellules spécialisées, les mélanocytes. Ces derniers représentent environ 5% des cellules de la couche basale de l'épiderme. Ils possèdent des prolongations dendritiques leur permettant d'entrer en contact avec plusieurs kératinocytes à la fois, les protégeant ainsi des radiations ultraviolettes (UV) par la mélanine qu'ils synthétisent. En effet, les mélanocytes ont une fonction principale, la synthèse de mélanine ou mélanogenèse. [0003] La mélanogenèse est principalement stimulée par les radiations UVA et UVB du spectre solaire [I]. Il en résulte une augmentation de la synthèse des pigments mélaniques, de la dendricité et du nombre de mélanocytes [2]. Les UV qui pénètrent jusqu'à la couche basale de l'épiderme peuvent agir directement sur les mélanocytes ou indirectement en stimulant la production d'agents mélanogéniques par les kératinocytes (comme l'endothéline-1 ou le monoxyde d'azote) [3]. [0004] Le récepteur membranaire mélanocytairc appelé « melanocortin I receptor » (MCI R) joue un rôle essentiel dans la pigmentation. En effet, quand il fixe l'agoniste « alpha-melanocytes-stimulating-hormone » (alpha-MSH), il active l'adénylate cyclasc et augmente les niveaux intracellulaires de l'AM P cyclique (AMPc) qui active en retour la protéine kinase A (PKA) permettant ainsi l'augmentation de la transcription du facteur irans « microphtalmia-associated transcription factor » (MITE). Fun des plus importants régulateurs de la pigmentation, ce qui a pour conséquence d'augmenter la synthèse de l'enzyme tyrosinase, entre autres, et in fine permettre la synthèse de mélanine [4] [5] [6]. En plus de son rôle dans la pigmentation, MC1R régule bien d'autres fonctions du mélanocyte, parmi lesquelles l'activation de la réparation de l'ADN et autres activités anti-photocarcinogéniques qui sont importantes pour la protection contre les effets délétères des UVs [7]. [0005] La mélanine est synthétisée et stockée dans des vésicules spécialisées, appelés mé- lanosomes. Les mélanosomes sont acheminés du centre de la cellule mélanocytaire 2 vers l'extrémité des dendrites où ils pourront être transférés aux kératinocytes. Le relargage des mélanosomes par les mélanocytes et la phagocytose par les kératinocytes sont induits par les UV et modulés par de nombreux facteurs [3]. [0006] La formation de mélanine se fait généralement de façon continue et harmonieuse dans la peau et les cheveux. Lors du vieillissement cutané apparaissent des signes visibles tels que les rides, la peau papyracéc, la perte de fermeté, mais aussi des désordres du système pigmentaire tels que l'apparition de taches brunes appelées lentigo sénile [2]. Ces taches, apparaissant généralement après 40 ans, se retrouvent le plus souvent sur les mains, avant-bras et visage. L'incidence de ces lésions augmente avec l'âge et est corrélée avec le degré de vieillissement de la peau et la présence d'élastose solaire. L'exposition chronique à la lumière solaire est un facteur ethnologique important dans le développement du lentigo sénile. [0007] D'autres types de taches peuvent apparaître et s'intensifier lors des expositions solaires comme les éphélides qui sont de petites taches jaunâtres, rousses ou brunes. De la même manière, les taches de rousseur se trouvent préférentiellement sur les parties exposées de l'épiderme (visage, épaule, mains, etc.). [0008] Plusieurs mécanismes peuvent être à l'origine de ces dérèglements de la pig- mentation, les deux principaux étant l'activité accrue des mélanocytes ou la prolifération mélanocytaire. Une hyperactivité mélanocytairc est à l'origine des éphélides et du chloasma aussi appelé masque de grossesse. La prolifération mélanocytairc est à l'origine du lentigo sénile. Histologiquement le lentigo sénile présente une hyperpigmentation de la couche basale de l'épiderme avec augmentation du nombre de mélanosomes. [0009] Ces taches liées à l'âge peuvent être mal supportées et de nombreuses personnes sont tentées de les faire disparaître. On a proposé dans l'art antérieur plusieurs compositions cosmétiques dépigmentantes agissant par exemple sur le transfert des mélanosomes, telles que des compositions comprenant un extrait d' Alchemilla vulgaris (voir la demande de brevet FR 2 903 902). Il existe aussi certaines molécules aux propriétés dépigmentantes mais dont les effets secondaires sont trop toxiques pour être utilisés en cosmétologie. [0010] Les produits dépigmentants étant prisés notamment par les personnes âgées d'une part et par les femmes asiatiques pour qui la blancheur de la peau est essentielle d'autre part, l'utilisation d'une composition dépigmentante à la fois efficace et sans effets secondaires montre tout son intérêt. [0011] Dans le cadre de ses recherches de nouveaux actifs, la Demanderesse a identifié deux nouvelles molécules de type sesquiterpènes montrant des propriétés dépigmentantes marquées. Ces molécules ont été isolées à partir d'extrait d'Eryngium maritimum et caractérisées chimiquement. 3 [0012] Eryngium maritimum, communément appelé panicaut des mers, est une plante vivace très épineuse de couleur glauque bleuâtre et de hauteur 30-60 cm. Ses feuilles sont coriaces et épineuses avec des nervures très marquées. Les tiges glabres sont rameuses et dressées. Eryngium maraimum a la particularité d'avoir une tige souterraine importante d'environ 1 cm de diamètre. Il possède également des rhizomes latéraux qui se forment à partir des tiges enfouies [8]. Ses racines sont persistantes, épaisses et longues, elles pénètrent profondément dans le sol, ce qui permet à la plante de se maintenir dans les dunes. L'inflorescence se présente en ombelle sous forme de fleurs bleues en capitules arrondis. L'involucre est composé de 4 à 6 bractées chacune présentant 5 dents terminées par une fine épine. A maturité, les 5 dents sont étalées en étoile autour du fruit qui est de forme ovale et revêtu d'écailles [9]. [0013] L'espèce Eryngium marannum se retrouve en Europe, Asie occidentale et Afrique septentrionale. En Europe, elle est particulièrement localisée sur les côtes. En France, elle est plus particulièrement localisée dans les sables maritimes du côté de la Manche, de l'Océan Atlantique et de la Méditerranée ainsi qu'en Corse. [0014] Elle est utilisée en médecine traditionnelle pour ses effets diurétique, anti- inflammatoire, antinociceptif, aphrodisiaque ainsi antipyrétique. Il a également été démontré qu'elle présente une activité antimicrobiennes, anti-oxydante, anti-fibrotique, hépatoprotective et anti-inflammatoire [10, 11]. [0015] Il existe des extraits végétaux de Eryngium maritimum commerciaux, comme le produit Celtosome® de BiotechMarine, il s'agit cependant d'extraits obtenus à partir de cellules dédifférenciées de Eryngium maritimum qui ne contiennent pas les molécules nouvellement mises en évidence par la Demanderesse. [0016] La présente invention se rapporte au composé 3,7,9,10-Tétrahydroxy-6,11-cyclofames-1-ène ; elle se rapporte également au composé 9.10-Dihydroxy-6,11-cyclofarnes-L6-diène-3-0-glucoside. L'exemple IV ci-après présente l'activité dépigmentante de chacun de ces composés dans un test d'inhibition de la tyrosinase. La présente invention se rapporte encore à l'association des composés 3,7,9,10-Tétrahydroxy-6,11-cyclofames-1-ène et 9.10-Dihydroxy-6,11-cyclofarnes-L6-diène-3-0-glucoside. [0017] La présente invention se rapporte également à un extrait de Eryngium maritimum comprenant le composé 3,7,9,10-Tétrahydroxy-6,11-cyclofames-1-ène ; elle se rapporte aussi à un extrait de Eryngitun maritimurn comprenant le composé 9.10-Dihydroxy-6.11-cyclofarnes-L6-diène-3-0-glucoside. Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, elle se rapporte encore à un extrait d' Eryngium maritimum comprenant le composé 3,7,9,10-Tétrahydroxy-6,11-cyclofames-1-ène et le composé 9.10-Dihydroxy-6,11-cyclofarnes-L6-diène-3-0-glucoside. [0018] L'extrait de Eryngiunz marnimum selon l'invention est préférentiellement un extrait obtenu à partir des parties aériennes de la plante (c'est-à-dire tout ou partie des tiges, feuilles et fleurs). [0019] Il peut être obtenu par séchage de façon appropriée et/ou broyage des parties aériennes (feuilles, tiges, sommités fleuries) de la plante, suivie par la mise en contact avec un solvant d'extraction ; cette mise en contact est réalisée avec des proportions pondérales matériel végétal/solvant et/ou mélange de solvants de 1/4 à 1/15 pour des solvants liquides organiques ou aqueux, l'extraction peut également être conduite avec des solvants supercritiques. De plus, afin d'optimiser les cinétiques d'extraction, les rendements ou la qualité de l'extrait, il peut être effectué une extraction unitaire ou multiple, pendant des durées plus ou moins longues, soit par macération statique ou agitée, à température ambiante ; cette extraction peut être accélérée par chauffage sous agitation ou chauffage à reflux, assistée par ultrasons, par microondcs ou par une combinaison ultrasons/microondes en fonction des besoins. [0020] L'extrait alors obtenu peut être utilisé directement ou utilisé après un traitement tel que la filtration, la concentration, ou une décoloration sur support solide. [0021] En outre, il est possible d'utiliser l'extrait en éliminant le solvant d'extraction, suivie par la re-dissolution dans un solvant différent. [0022] Il est également possible d'utiliser l'extrait après une étape de purification sur du charbon actif, des résines macroporeuses ou sur colonne chromatographique. [0023] Le solvant d'extraction utilisé pour la préparation de l'extrait selon la présente invention peut être tout solvant couramment utilisé dans l'extraction, en particulier un alcool tel que l'éthanol, le 1,3-butanediol, le propylène glycol, le butylène glycol et le pentylène glycol ; un solvant aqueux, notamment de l'eau, ou un mélange hychoalcoolique (un mélange hydro-alcoolique désigne un solvant comprenant tout ratio d'eau et d'alcool, tel que ceux précités : éthanol, 1,3-butanediol, propylène glycol, butylène glycol et pentylène glycol, et pouvant être constitué exclusivement d'eau ou d'alcool, la proportion (l'eau et d'alcool dans ce mélange peut être ajustée par l'homme du métier) ; un solvant organique tel que l'acétone, l'acétate d'éthyle seul ou en combinaison, ainsi que les solvants supercritiques, en particulier le dioxyde de carbone supercritique éventuellement additionné d'un co-solvant alcoolique, en particulier l'éthanol. De préférence, on utilisera, à titre de solvant, l'eau, l'éthanol en mélange hydro-alcoolique ou le 1,3-butanediol. [0024] Préférentiellement, l'extrait selon l'invention est obtenu par une extraction hydro- alcoolique donnant un extrait ci-après nommé extrait de Eryngium maritimum hydroalcoolique ou par une extraction par dioxyde de carbone supercritique, additionné ou non d'un co-solvant alcoolique, on obtient alors un extrait ci-après nommé extrait de Eryngium maritimum COS. [0025] L'extrait de Eryngium maritimum comprenant le composé 3,7,9,10-Tétrahydroxy-6,11-cyclofarnes-1-ene est notamment l'extrait de Eryngium marli imum COS obtenu par extraction à l'aide d'un solvant dioxyde de carbone à l'état supercritique additionné d'un co-solvant, l'éthanol ; un exemple d'extrait de Eryngium marli imum COS est l'extrait ErmCOS dont la préparation est décrite dans la partie expérimentale ci-après. Le liquide obtenu est limpide et incolore à jaune pâle. [0026] L'extrait Eryngium mar-annum COS selon l'invention peut être obtenu selon un procédé comprenant au moins les étapes suivantes : [0027] - séchage et broyage des parties aériennes de la plante (MP) ; [0028] - mise en contact de la MP avec du CO, supercritique, à une température allant de 10 à 120°C, préférentiellement entre 40 et 50°C, et sous une pression allant de 10 à 600 bars, préférentiellement entre 200 et 400 bars, éventuellement en présence d'un cosolvant tel que l'éthanol, de préférence entre 1,5 à 8% en g de co-solvant par rapport au débit de CO2 exprimé en g/minutes ; [0029] - récupération de l'extrait de Eryngium marannum entrainé par le CO, supercritique, sous la forme d'un mélange liquide. [0030] L'extrait de Eryngium maritimum COS ainsi obtenu est un liquide verdâtre à jaune pâle, d'odeur caractéristique de la plante. Il présente les caractéristiques analytiques suivantes : pH (dilution à 1% v/v dans l'eau) = 4,5 -6,0. [0031] L'extrait d'Erytzgiwn maritimuzn comprenant le composé 9,10-Dihydroxy-6,11-cyclofarnes-1,6-diène-3-0-glucoside et/ou le composé 3,7,9,10-Tétrahydroxy-6,11-cyclofarnes-1-ène est de préférence un extrait de Ezyngium maritimum hydro-alcoolique obtenu par extraction à reflux à l'aide d'un mélange hydro-alcoolique constitué de 15 à 100% d'eau et de 0 à 85% (l'éthanol (pourcentages exprimés en volume/volume) ; on utilisera de préférence un solvant hydro-alcoolique constitué d'eau ou d'un mélange de 20% d'eau et 80% d'éthanol. Des exemples d'extraits de Enngium maritimum hydro-alcooliques, ErmR2 et ErmR3, sont décrits dans la partie expérimentale qui suit. [0032] 11 peut être obtenu selon un procédé comprenant au moins les étapes suivantes : [0033] - séchage et broyage des parties aériennes de la plante ; [0034] - ajout du solvant hydro-alcoolique avec un ratio plante sèche / solvant (masse/masse) de 1/7 à 1/15, de préférence 1/10; [0035] - extraction à reflux pendant 1 à 6h ou par micro-ondes pendant 15 minutes à lh ou par ultrasons pendant 1 à 2,5h ou par micro-ondes et ultrason pendant 15 à 45 minutes ; [0036] - séparation solide-liquide par filtrations sous vide successives, par exemple avec des membranes ayant un seuil de coupure compris entre 10 et 250 pm, clarification par filtration par exemple avec des membranes ayant un seuil de coupure compris entre 6 0,45 et 50 pm ; [0037] - élimination du solvant d'extraction suivie d'une rc-dissolution dans un solvant glycolé ou alcoolique ou un mélange glycolé et alcoolique, par exemple, le butylène-glycol, le propylène glycol, pentylene glycol, l'éthanol aqueux, le 1,3-butanediol, le propylène, ou mélanges de ceux-ci ; [0038] - centrifugation et filtration sur 0,2 p.m pour clarification finale et stabilisation micro- biologique. [0039] L'extrait de Eryngium maritimum hydro-alcoolique ainsi obtenu est un liquide plus ou moins visqueux, de couleur jaune-verdâtre assez clair à orangée. Il présente les caractéristiques analytiques suivantes : [0040] - Rendement massique (extrait sec/matière première sèche) (m/m) compris entre 6,5 et 8,5% lorsque le solvant est un mélange eau/éthanol à 20/80 en volume et entre 12 et 16% avec un solvant 100% aqueux ; [0041] - Rendement d'extraction (extrait/plante), 115/20 (m/rn) ; [0042] - pH (dilution v/v à 1% dans l'eau), 4.2-6. [0043] La présente invention se rapporte encore à une composition cosmétique comprenant à titre d'agent actif : [0044] - le composé 3,7,9,10-Tétrahydroxy-6,11-cyclofarnes-1-ène ; ou [0045] - le composé 9,10-Dihydroxy-6,11-cyclofarnes-1,6-diène-3-0-glucoside ; ou [0046] - les composés 3,7,9,10-Tétrahydroxy-6,11-cyclofarnes-1-ene et 9,10-Dihydroxy-6,11-cyclofarnes-1,6-diène-3-0-glucoside ; ou [0047] - un extrait de Eryngium maritimum comprenant le composé 3,7,9,10-Tétrahydroxy-6,11-cyclofarnes-1-ène ; ou [0048] - un extrait de Eryngium maritimum comprenant le composé 9,10-Dihydroxy-6,11-cyclofarnes-1,6-diène-3-0-glucoside ; ou [0049] - un extrait de Eryngium maritimum comprenant les composés 3,7,9,10-Tétrahydroxy-6,11-cyclofarnes-1-ène et 9,10-Dihydroxy-6,11-cyclofarnes-1,6-diène-3-0-glucoside ; [0050] et un véhicule cosmétiquement acceptable. [0051] Ladite composition comprend une quantité efficace de composé ou d'extrait selon l'invention pour obtenir l'effet recherché. [0052] L'extrait de Eryngium maritimurn selon l'invention est avantageusement présent à titre d'agent actif dans la composition selon une teneur comprise entre 0,001 et 5% en poids de la composition, préférentiellement de 0,1 à 2% en poids de la composition ; il est à la portée de l'homme du métier d'ajuster cette teneur en extrait dans la composition s'il le juge nécessaire ; il en est de même pour ce qui concerne la teneur en composé 3,7,9,10-Tétrahych-oxy-6,11-cyclofarnes-1-ène et en composé 9.10-Dihydroxy-6,11-cyclofarnes-1,6-diène-3-0-glucoside dans la composition, à titre 7 indicatif cette teneur pour chacun de ces composés peut être comprise entre 0,001 et 0,5% en poids de la composition. [0053] La composition selon l'invention est avantageusement destinée à une application topique et peut être par exemple un sérum, une lotion, un spray, une mousse, une solution, une poudre, une pommade, un lait, une émulsion, une crème teintée ou bien encore un hydrogel, de préférence un masque, ou se présenter sous la forme d'un stick, ou encore d'un patch. [0054] La composition cosmétique selon l'invention peut comprendre un ou plusieurs agents de formulation ou additifs d'usage connu et classique dans les compositions cosmétiques tels que, à titre d'exemples et de façon non limitative, des adoucissants, des colorants, des actifs filmogènes, des tensioactifs, des parfums, des conservateurs, des émulsionnants, des huiles, des glycols, des vitamines comme la vitamine E, des filtres UV, etc. Grâce à ses connaissances en matière de cosmétique, l'homme du métier saura quels agents de formulation ajouter aux compositions de l'invention et en quelles quantités en fonction des propriétés recherchées. [0055] La composition selon l'invention peut également comprendre au moins un autre agent actif, qui est avantageusement cosmétiquement acceptable. [0056] Ce ou ces autres agents actifs peuvent être choisis parmi les substances ayant une activité dépigmentante ou une activité éclaircissante de la peau ; les substances ayant une activité amincissante ; les substances ayant une activité hydratante ; les substances ayant une activité calmante, apaisante ou relaxante ; les substances ayant une activité stimulant la microcirculation cutanée pour améliorer l'éclat du teint, en particulier du visage ; les substances ayant une activité séborégulatrice pour le soin des peaux grasses ; les substances destinées à nettoyer ou purifier la peau ; les substances ayant une activité anti-radicalaire ; les substances destinées à atténuer ou retarder les effets du vieillissement de la peau, en particulier la formation de rides, par une activité visant à favoriser le maintien de la structure de la peau et/ou à limiter la dégradation de la matrice extracellulaire des couches superficielles du derme et de l'épiderme et/ou à obtenir un effet protecteur, correcteur ou restructurant de la peau ; les substances ayant une activité anti-inflammatoire. [0057] La présente invention concerne également l'utilisation cosmétique : [0058] - du composé 3,7,9,10-Tétrahydroxy-6,11-cyclofarnes-1-ène ; ou [0059] - du composé 9,10-Dihydroxy-6,11-cyclofames-1,6-diène-3-0-glucoside ou [0060] - des composés 3,7,9,10-Tétrahydroxy-6,11-cyclofarnes-1-ène et 9,10-Dihydroxy-6,11-cyclofarnes-1,6-diène-3-0-glucoside ; ou [0061] - d'un extrait de Eryngiurn maritimurn comprenant le composé 3,7,9,10-Tétrahydroxy-6,11-cyclofarnes-1-ène ; ou [0062] - d'un extrait de Eryngiurn maritimurn comprenant le composé 8 9,10-Dihydroxy-6,11-cyclofarnes-1,6-diène-3-0-glucoside ; ou [0063] - d'un extrait de Eryngium maritimum comprenant les composés 3,7,9,10-Tétrahydroxy-6,11-cyclofarnes-1-ène et 9,10-Dihydroxy-6,11-cyclofarnes-1,6-diène-3-0-glucoside ; ou [0064] - d'une composition contenant l'un et/ou l'autre des composés qui précèdent ou un extrait ; [0065] comme agent dépigmentant la peau. [0066] En particulier, cette utilisation peut être destinée à éclaircir le teint ou à améliorer l'homogénéité de la coloration de la peau, ou encore à corriger ou atténuer les taches pigmentaires de peau ou les zones de peau hyperpigmentées ; à corriger ou atténuer les taches pigmentaires cutanées, en particulier celles consistant en diverses dyschromies cutanées, notamment le lentigo sénile (tâches de vieillesse), le mélasma, ou encore le lentigo solaire. [0067] L'utilisation selon l'invention est particulièrement adaptée à une application à une peau saine ; dans le cadre de la présente invention, on désigne par peau saine une peau qui ne présente pas de pathologie cutanée. [0068] Un autre objet de la présente invention est un procédé de soin cosmétique de la peau pour corriger et/ou atténuer les taches pigmentaires cutanées et/ou la coloration d'une zone hyperpigmentée et/ou atténuer le pourtour de zones dépigmentées et/ou uniformiser la pigmentation de ladite zone de peau et/ou en éclaircir le teint, comprenant l'application sur au moins une zone hyperpigmentée de la peau du corps ou du visage, d'une quantité efficace d'une composition comprenant : [0069] - le composé 3,7,9,10-Tétrahydroxy-6,11-cyclofames-1-ène ; ou [0070] - le composé 9,10-Dihydroxy-6,11-cyclofames-1,6-diène-3-0-glucoside ; ou [0071] - les composés 3,7,9,10-Tétrahydroxy-6,11-cyclofames-1-ène et 9,10-Dihydroxy-6,11-cyclofarnes-1,6-diène-3-0-glucoside ; ou [0072] - un extrait de Eryngium maritimum comprenant le composé 3,7,9,10-Tétrahydroxy-6,11-cyclofames-1-ène ; ou [0073] - un extrait de Eryngium maritimum comprenant le composé 9.10-Dihydroxy-6,11-cyclofarnes-1,6-diène-3-0-glucoside ; ou [0074] - un extrait de Eryngium maritimum comprenant les composés 3,7,9,10-Tétrahydroxy-6,11-cyclofames-1-ène et 9,10-Dihydroxy-6,11-cyclofarnes-1,6-diène-3-0-glucoside. Figures [0075] [fig.1] graphe représentant la diminution de la synthèse de mélanine induite par l'extrait Eryngium maritimum ErmR3. EXEMPLES 9 100761 Dans ce qui suit, il est utilisé les codifications suivantes : [0077] 80: 3,7,9,10-Tétrahydroxy-6,11-cyclofarnes-1-ene ; 83 : 9,10-Dihydroxy-6,11-cyclofarnes-1,6-diene-3-0-glucoside ; ErmR3 et ErmR2 : Les deux extraits de Eryngium maritimum hydro-alcool igues décrits ; ErmCOS : L'extrait de Eryngium marilimum COS, obtenu par CO2 supercritique. [0078] I. Caractérisation des molécules isolées à partir d'extraits de Eryngium Maritimum [0079] L L 3,7,9, I 0-1 étra hydroxv-6, I I tcyclofarnes- I -ène [0080] [Chem.]] Aspect : huileux. SM : (ESI+) mh 295,19 [M+Na1+ [0081] RMN 1H (400 MHz, CDCl 3 ) et RMN '1 C (400 MHz, CDCl 3): [0082] [Tableaux 1] Numéro d'atome 'H ô (PPm) '3C ô (pp m) 1 5.24 (1H, dd, J=1 Hz, J =17 Hz) 112,2 5.09 (1H, dd, J=1 Hz, J =10 Hz) 2 5.89 (IH, dd, J=10 Hz, J =17 Hz) 145,1 3 74,4 4 1,71 (2H, d, J=7 Hz) 44,1 5 1,52 (2H, m) 19,4 6 1,38 (1H, t, J=5 Hz) 56,2 7 74,1 8 2.09 (1H, dd, J=4 Hz, J =12 Hz) 48,5 1.56 (1H, dd, J=4 Hz, J =12 Hz) 9 3.54 (1H, td. J=4 Hz, J =4 Hz, J=9 Hz) 69,3 10 3.09 (IH, d, J=9 Hz) 83,1 11 39,7 12 0.77 (3H, s) 15,88 13 1,05 (3H, s) 28,5 14 1,28 (3H, s) 24,8 1,22(3H, s) 29,1 100831 L2. 9. 10-dihydroxy-6,1 1 -cyclofames-1,6-diène-3 -0- g lue oside 100841 11 IChem.21 HO C2tl46Os 416,2 "mol Aspect : huileux. SM : (ESI+) m/z 439,23[M+Na]+ [0085] RMN H (400 MHz, CD 3 OD) et RMN 13 C (400 MHz, CD 3 OD) : [0086] 12 [Tableaux2] Numéro d'atome 'H é) (ppm) 'C e) (pp in) 1 5,25 (2H, dd, J=11 Hz, J=17 Hz) 114,5 2 5,97 (111, dd, J=11 I-17., J=17 Hz) 142,8 3 80,1 4 1,67 (2H, dd, J=6 HI, J=11 Hz) 41,3 5 1,99 (1H, m) + 2,15 (1H, m) 22,4 6 136,5 7 123,1 8 2,01 (1H, m) + 2,28 (1H, dd, J=6 Hz, J =16 Hz) 39,6 9 3,68 (1H, ddd, J=4 Hz, J=10 Hz, J=16 Hz) 67,0 10 3,16 (1H, m) 79,4 11 41,7 12 0,43 (3H, s) 20,4 13 1,13 (3H, s) 24,5 14 1,60 (3H, s) 18,2 15 1,41 (3H, s) 21,2 1' 4,35 (1H, d, J=8 Hz) 98,0 2' 3,18 (1H,m) 73,7 3' 3,33 (1H,m) 76,8 4' 3,28 (1H, dd, J=9 H7 J=18 Hz)) 70,2 5' 3,19 (1H, m) 76,1 6' 3,65 (1H, dd, J=6 Hz, J=12 Hz) + 3,82 (1 H, dd, J=2 Hz, J=12 Hz) 61,2 [0087] II. Préparation des extraits de Eryneum maritimum [0088] Dans cet exemple, les plants d'Eryngium maritimum utilisés proviennent de Tunisie. [0089] IL I . Extra ii ErtnR2 [0090] Cet extrait est obtenu par extraction d'un mélange hydro-alcoolique de parties aériennes de Erytzgiurn marli imum. [0091] - Séchage et broyage à 10000 ipm pendant 20 secondes ; 13 [0092] - ajout de 80% Et0H et 20% 1120, Ratio matière première végétaldsolvant de 1/10 (m/m) ; [0093] - extraction à reflux, 4h ; [0094] - filtration solide/liquide (filtration 50pm) ; [0095] - clarification par centrifugation 30 min à 4000 rpm ; [0096] - filtration sous vide à 12 pm puis 2 pm ; [0097] - détermination de la matière sèche extrait brut (EB) (1-2%) ; [0098] - stabilisation : ajout de 100% de butanc-1,3-diol à l'EB à la même niasse de EB et concentration par évaporation de la fraction eau ; [0099] - centrifugation à 4000 rpm pendant 30 min ; [0100] - filtration stérilisante sous vide à 0,2 pm ; [0101] - obtention de l'extrait final ErrnR2, stabilisé sur support 100% de butanc-1,3-diol. [0102] TL2. Extra ii ErtnR3 [0103] Cet extrait est obtenu par extraction aqueuse de parties aériennes de Eryngiutn maritimum. [0104] - Séchage et broyage à 10000 rpm / 20 secondes ; [0105] - ajout de 100% WO, Ratio matière première végétale /solvant de 1/10 (m/m) ; [0106] - extraction à reflux, 4h ; [0107] - filtration solide/liquide (Filtration 50itm) ; [0108] - clarification par centrifugation 30 min à 4000 rpm ; [0109] - filtration sous vide à 12 pm puis 2 pm ; [0110] - détermination de la matière sèche extrait brut (EB) (1-2%) ; [0111] - stabilisation : ajout de 100% de butane-1,3-diol à l'EB à la même masse de EB et concentration par évaporation de la fraction eau ; [0112] - centrifugation à 4000 rpm pendant 30 min ; [0113] - filtration stérilisante sous vide à 0,2 pm [0114] - obtention de l'extrait final EnnR3 stabilisé sur support 100% de butane 1,3-diol. [0115] 1L3. Extrait EnnCOS [0116] Cet extrait est obtenu par extraction au CO2 supercritique de parties aériennes de Eryngium [0117] - Séchage et broyage à 10000 rpm /20 secondes ; [0118] - extraction au CO2 supercritique en présence de 4%Et0H ; [0119] - filtration sous vide à 12pm puis 2 pm ; [0120] - détermination matière sèche extrait brut (EB) (1-2%) ; [0121] - stabilisation : ajout de 100% de Propylène glycol 1,3 à l'EB à la même masse de EB et concentration par évaporation de la fraction eau ; [0122] - centrifugation à 4000rpm / 30 min ; [0123] - filtration stérilisante, sous vide à 0.2pm ; 14 [0124] - obtention de l'extrait final ErtnCOS, stabilisé sur support 100% de Propylène glycol [0125] III. Dosages des nouvelles molécules dans les différents extraits réalisés [0126] HL I. Préparation des extraits [0127] Les extraits ErmR2, ErmR3 sont dilués dans du méthanol et ErtnCOS est dilué dans de l'éthanol à 1 mg/m1 avant analyse. [0128] 01.2. Préparation des molécules pures [0129] Les nouvelles molécules isolées lors sont les suivantes : [0130] 3,7,9,10-tétrahydroxy-6,11-cyclofarnes-1-ene et 9,10-dihydroxy-6,11-cyclofarnes-1,6-diène-3-0-glucoside. [0131] Afin d'établir les gammes étalons, chaque molécule est préparée diluée dans du méthanol à différentes concentrations :0,01 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,5 mg/m1 et 1 mg/ml. [0132] BIS. Dosages des molécules dans les extraits par LC-MS [0133] La chromatographie liquide à ultra haute performance (UHPLC) couplée à un spec- tromètre de masse de haute résolution (HR-MS) est réalisée avec un XEVO-G2 XS QTOF (mode EST) de Waters. Une colonne C18 CORTECS de la marque Waters (2,1x100 mm, 1,6 urn) est utilisée. Les composés sont détectés soit en ESI-MSE ou ESI-MS ou ESI-MS2 en mode positif ou négatif avec les paramètres suivants : un scan total entre 50 et 1500 rn/z, une température d'évaporation de 120nC, une température de désolvatation de 600°C, un voltage capillaire de 3,0 kV en mode positif et de 2,5 kV en mode négatif, un cône d'échantillonnage de 40 V, un débit de gaz de 50 L/h et un débit de gaz de désolvatation de 1000 L/h. [0134] Pour évaluer la composition chimique des extraits, chaque extrait et préparation de molécules est injecté à 1 Ft1 avec la méthode suivante : [0135] [Tableaux3] Temps (min) Débit (ml/min) %H20 %Me0H 0,5 0,4 95 5 17 0,4 45 55 0,4 2 98 28 0,4 2 98 35 0,4 95 5 [0136] Le logiciel « MassLynx » de Waters permet d'analyser les différents TIC (Total Ion Clu-omatography) obtenu et d'étudier les spectres de masse associés. [0137] La quantification des trois composés est réalisée par LC-MS su le même appareil que les analyses d'extraits et avec les mêmes conditions. Chaque composé a été injecté 15 à différentes concentrations (0,01 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,5 mg/ml, 1 mg/mi) en triplicat afin d'obtenir une gamme étalon. Les extraits sont injectés à 1 mg/m1 en triplicat. Les extraits ainsi que les composés sont analysés en mode SIM (Single Ion Monitoring) afin de ne cibler que les composés à doser. Les aires sont ainsi relevées puis un graphique aire=f(concentration) est tracé afin d'obtenir une courbe d'étalonnage avec l'équation associée. Pour établir ce graphique, la gamme étalon est choisie de façon à ce que les aires obtenus pour chacun des extraits analysés entre dans cette courbe. [0138] HIA. Résultats obtenus [0139] Les résultats obtenus, teneurs rapportées à la plante sèche sont les suivants : [0140] [Tableaux4] Extraits 3,7,9,10-tétrahydroxy-6,11-cyclofarn es-1-ène 9,10-dihydroxy-6,11-cyclofarnes1,6-diène-3-0-glucoside ErmC0 S 0,10 ± 0,01 % Non détecté ErmR2 0,20 ± 0,03 % 0,89 ± 0,07 % ErmR3 0,33 ± 0,08 % 0,07 ± 0,05 % [0141] On peut noter la présence du 3,7,9,10-tétrahydroxy-6,11-cyclofarnes-1-ène dans les trois extrtits et 9,10-dihydroxy-6,11-cyclofames-1,6-diène-3-0-glucoside dans les deux extnits par reflux (ErmR2 et EimR3). [0142] IV. Evaluation de l'activité déeementante des molécules selon l'invention [0143] Les molécules testées sont le 3,7,9,10-Tétrahydroxy-6,11-cyclofames-1-ène et le 9,10-Dihydroxy-6,11-cyclofames-1,6-diène-3-0-glucoside. [0144] 1V.1. Principe et protocole [0145] L'activité dépigmentante des extraits est déterminée par la mesure de l'inhibition de la tyrosinase. La tyrosinase de champignon et la L-dopa sont utilisées respectivement en tant qu'enzyme et substrat. La tyrosinase catalyse la transformation de la L-dopa en dopachrome, un composé coloré facilement quantifié par spectrophotométrie. Ce dosage mesure l'activité dépigmentante. La tyrosinase de champignon et la L-dopa sont utilisées respectivement en tant qu'enzyme et substrat. Les extraits sont dilués dans de l'eau, du méthanol et du DMSO à 1 me/ml. Sur une microplaque de 96 puits, 100 pl d'extrait à 1 mg/m1 accompagné de 100 pl de tampon phosphate salin (0,1 M, pH 6,8) et de 30 pl de tyrosinase (1000 LI/m1) sont ajoutés dans un puit puis le tout est incubé 10 min à température ambiante. Le contrôle est réalisé en remplaçant l'extrait par de l'eau et le témoin positif en remplaçant l'extrait par une solution d'acide kojique à 50 mg/mi (T+). Pour chaque extrait et contrôles, des blancs sont réalisés. Après 16 l'incubation, 90 pl de L-dopa (2 mM) sont ajoutés et le tout est incubé 5 min avant la mesure de l'absorbance à 475 mn avec un TECAN SPARL 10M. [0146] L'activité dépigmentante est calculée de la manière suivante : [0147] [Math .1] %inhibition de la tyros as (Ar,nitroip -A ) (Apt-h rift-Jr-ANUM( cl, ) 100 [0148] IV.2. Résultats [0149] [Tableaux5] tyrosinase moyenne Ecart-type Activité dépigmentante T+ 87% 1% 80 90% 1% 83 90% 2% [0150] Les résultats obtenus dans les deux cas, montrent une activité inhibitrice de la synthèse de mélanine, de l'ordre du témoin positif (T+) acide kojique testé à 0,1%. [0151] Les tests sur lignées cellulaires ici sur mélanine, sont robustes et répétables, l'activité obtenue est avérée. [0152] V. Evaluation de l'activité biologique de l'extrait ErmR3 [0153] V.1. Matériels et méthodes [0154] L'objectif de l'étude est d'évaluer l'activité dépigmentante de l'Extrait. Eryngium maritimum ErmR3 en présence d'aMSH (activateur (l'une des enzymes clef de la mélanoeenèse : la tyrosinase), par un dosage de mélanine. [0155] - MODÈLE BIOLOGIQUE [0156] Type cellulaire : Lignée de mélanocytes (cellules tumorales murines B16) Conditions de culture : 37°C, 5% CO, Milieu de culture : DMEM blanc (« Dulbelco' s Minimum Essential Medium » - Thermo Fisher) complémenté avec 10% de sérum de veau foetal (SVF - Dominique Dutscher) + Pénicilline / Streptomycine (Sigma) Milieu de traitement : DMEM blanc (« Dulbelco' s Minimum Essential Medium » - Thermo Fisher) complémenté avec 2% de sérum de veau foetal (SVF - Dominique Dutscher) + Pénicilline / Streptomycine (Sigma) Extrait et doses à tester : Extrait Eryneium maritimum ErmR3 aux doses 0,05% - 0,01% - 0,005% Référence positive (validation de l'expérimentation) : Acide kojique à la dose 0,1% 17 [0157] - CULTURE ET TRAITEMENTS [0158] Les mélanocytes sont ensemencés dans une plaque 24 puits à raison de 50 000 cellules par puits en milieu de culture. [0159] Après 24 heures d'incubation, les cellules sont traitées ou non (contrôle) par l'Extrait Eryngium maritimum ErmR3 ou l'acide kojique, en milieu de traitement, ainsi que par une solution d'aMSH à 100nM. Les cellules sont incubées à l'étuve pendant 72 heures à 37°C, 5% de CO,. Chaque condition a été réalisée en n=2. [0160] - DOSAGE DE LA NIELANINE [0161] Après prélèvement des surnageants, une mesure de la DO à k=470 nm est réalisée sur le Tccan M200 Pro afin de doser la quantité de mélanine dans les échantillons. [0162] Les tapis cellulaires sont rincés au PBS, puis les cellules sont lysécs et la quantité totale de protéines est déterminée à l'aide d'un dosage biochimique (Interchim), afin de normaliser les résultats du dosage de la mélanine. [0163] V.2. Résultats et conclusion [0164] Le Tableau ci-après présente les résultats du dosage de la mélanine dans les sur- nageants de culture, traités ou non par l'Extrait Eryngium maritirnum ErmR3 ou la référence positive acide kojique. Le tableau comprend les données normalisées (DO mélanine rapportée au dosage protéique) et les pourcentages d'inhibition de la synthèse de mélanine. La Figure [fig.1] représente les données du Tableau sous forme d'histogramme. [0165] La référence positive acide kojique à 0,1% a induit une inhibition de la synthèse de mélanine de 72%. Cette réponse des cellules permet de valider le modèle. [0166] L'Extrait Eryngium maritimtun ErmR3 a induit une inhibition de la synthèse de mélanine avec 19% et 32% d'inhibition aux doses respectives de 0,05% et 0,01%. [0167] 18 [Tableaux6] Diminution de la Mélanine Mélanine/ Noms Protéines Moyenne SE) synthèse de (DO) protéines mélanine (56) nmon 485,24 1,24E-03 Contrôle 1,20E-03 3,54E-05 0,630 540,41 1,17r-03 Acide kojoque 0,080 , 222,04 3,60E-04 3,32E-04 2,82E-OS 12,4 0,100 329,10 3,04E-04 0,15' ait Eryngium timum ErmR3 0,600 693,05 8,66E-04 0.4556 9,71E-134 1.06E-04 19,1 0;630 585,05 1,08E-03 0,590 668,04 8,83E-04 n 01% 8,11E-114 7,27E-05 32,5 0,620 840,31 7,38E-04 0,600 478,00 1,26E-03 0,005% 1,28E-133 2,66E-05 -6,7 0,630 481,50 1,31E-03 10168] Résultats présentant les données normalisées et les dotztrees d'inhibition de la yvnthèse de mélanine en %. 101691 Cette étude démontre que l'extrait Eryngium maritbnum ErmR3 a un effet dé- pigmentant aux doses 0,05% et 0,01%. La dose optimale est 0,01%. 101701 Références bibliographiques 101711 III Yamaguchi Y., Brenner M. and Hearing J. J. Biot Chem. 2007, 282, 27557 - 2756 [0172] [2] Bastonini E., Kovacs D. and Picard() M. Ann. 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