Brevet FR3088324A1 — publié le 20200515

PROCEDE BIOCATALYTIQUE DE PRODUCTION DE 2H-HBO A PARTIR DE LGO UTILISANT UNE CYCLOHEXANONE MONOOXYGENASE L'invention se rapporte au domaine de la production de 4-hydroxyméthyl-ybutyrolactone (2H-HBO) à partir de lévoglucosénone (LGO). Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé éco-compatible de synthèse de 2H-HBO à partir de LGO ou de dihydroglucosénone (2H-LGO) par réaction biocatalytique mettent en oeuvre une cyclohexanone monooxygénase (CHMO). Introduction Afin de s'affranchir des problèmes de dépendance vis-à-vis des énergies fossiles, de nombreux procédés de production de composés chimiques d'intérêt ont été développés dans les dernières décennies à partir de biomasse. La biomasse lignocellulosique est l'une des sources vertes de composés carbonés la plus exploitée. La lévoglucosénone (LGO) est l'un des produits les plus intéressants pouvant ainsi être obtenus à partir de biomasse, notamment par une technologie de flash pyrolyse de cellulose. La LGO est couramment employée en tant que produit de départ pour la synthèse de divers composés chimiques d'intérêt, en particulier de 4- hydroxyméthyl-a,13-buténolide (HBO) et de 4-hydroxyméthyl-y-butyrolactone (2H- HBO). Ces composés constituent des intermédiaires chimiques asymétriques (chiraux) à forte valeur ajoutée ; ils sont en effet fréquemment mis en oeuvre dans l'industrie agroalimentaire, pour la production de fragrances et d'arômes, ou encore dans l'industrie pharmaceutique, pour la production de principes actifs de médicaments, tirant profit de leur noyau lactonique et de leur centre chiral. Dans la continuité de la démarche d'utilisation d'énergies renouvelables, il est souhaitable de développer des procédés industriels de transformation de LGO en HBO et 2H-HBO dont l'impact écologique soit le plus faible possible. Etat de la technique Des voies de valorisation classiques de la LGO en HBO et/ou 2H-HBO sont illustrées à la Figure 1. Ces voies utilisent d'une part des métaux, et d'autre part de l'eau 5 oxygénée, deux réactifs dont des effets indésirables sont bien connus, tant pour l'environnement que dans un contexte d'exploitation industrielle. Dans le but de proposer une nouvelle voie de production de la 2H-HBO plus écocompatible, les inventeurs ont cherché à réduire autant que possible l'utilisation de IO solvants organiques et de réactifs toxiques. Des travaux récents des inventeurs ont permis de proposer une nouvelle voie d'hydrogénation de la LGO en 2H-LGO et de la HBO en 2H-HBO n'utilisant pas de métaux mais une enzyme, l'alkène réductase OYE 2.6 (W02018/183706). 15 Toutefois, le procédé global de production de 2H-HBO, bien qu'exempt de l'utilisation de métaux, reste consommateur d'eau oxygénée (H202), molécule dont l'utilisation est délicate au niveau industriel (danger lors de la manipulation, pollution...). 20 Avantages de l'invention Les inventeurs ont développé un nouveau procédé de production de 2H-HBO à partir de 2H-LGO en utilisant une enzyme naturelle, à savoir une cyclohexanonemonooxygénase (CHMO), en particulier la CHMO issue d'Acinetobacter sp., en 25 remplacement de l'eau oxygénée. Ce procédé présente plusieurs avantages : - Il est éco-compatible, du fait de l'absence de solvant organique et de métaux ; - Il est industriellement viable ; - Il ne présente pas de risques d'exothermicité et/ou d'explosion contrairement à la voie de synthèse faisant intervenir H202 ; - Il peut être mis en oeuvre par biotransformation, notamment en utilisant des cellules qui expriment une cyclohexanone monooxygénase. 3 DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Les inventeurs proposent un procédé biocatalytique de production de 2H-HBO à partir de 2H-LGO utilisant une enzyme naturelle présentant une activité CHMO, en 5 particulier la CHMO d'Acinetobacter sp. En effet, afin de permettre la réalisation de la réaction de Baeyer-Villiger de la LGO par une CHMO, les inventeurs ont mis en évidence que la LGO doit être utilisée sous sa forme saturée (2H-LGO, aussi appelée Cyrène ®), condition indispensable à la réaction enzymatique. 10 Par « LGO sous une forme saturée », on désigne une molécule de lévoglucosénone dont les carbones en positons a et [3 de la fonction cétone sont saturés. Cette molécule est aussi appelée 2H-LGO ou Cyrène®. Ainsi, l'objet de l'invention concerne un procédé de synthèse de 2H-HBO à partir de 15 2H-LGO comprenant une réaction de biocatalyse utilisant une CHMO suivie d'une hydrolyse acide. Toute enzyme présentant une activité CHMO peut être mise en oeuvre dans ce procédé, notamment la CHMO issue d'Acinetobacter sp. ou toute enzyme présentant la même activité, notamment des variants de celle-ci. 20 La réaction de synthèse de la 2H-HBO selon l'invention comprend tout d'abord la conversion la 2H-LGO en un intermédiaire relativement instable, dit « criégée », qui donne lieu à un second intermédiaire, formylé celui-ci (2H-FBO). Une hydrolyse acide permet ensuite l'obtention de la 2H-HBO à partir de la 2H-FBO. Une telle 25 réaction est illustrée dans son ensemble à la Figure 2. L'étape d'hydrolyse acide peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple mettant en oeuvre de l'acide chlorhydrique, notamment en solution dans le méthanol, de l'acide acétique, de l'acide sulfurique, une résine de 30 type Amberlyst® ou encore tout zéolite acide. Dans un mode de réalisation particulier, le procédé selon l'invention comprend une étape préalable de transformation de la LGO en 2H-LGO. Cette étape de transformation peut être réalisée à l'aide de métaux lourds tels que le palladium, le 4 nickel ou le platine, et de dihydrogène. Dans un mode de réalisation préféré, cette étape est réalisée par une réaction d'hydrogénation n'utilisant pas de métaux lourds, ni de dihydrogène (H2) ; une telle réaction peut être réalisée en utilisant une enzyme alkène réductase telle que la OYE 2.6, comme cela est exposé dans la demande 5 W02018/183706, ou toute enzyme présentant la même activité, notamment des variants de celle-ci. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la transformation de la LGO en 2H-HBO est réalisée au sein d'un seul milieu réactionnel (réaction dite « one-pot »), 10 ce milieu réactionnel contenant les catalyseurs ou enzymes nécessaires à la transformation d'une part de la LGO en 2H-LGO, et d'autre part de 2H-LGO en 2HHBO. Ainsi, on peut obtenir de manière simplifiée de la 2H-HBO à partir de LGO en une seule étape. Cette réaction est représentée à la Figure 3. 15 Dans un mode de réalisation préféré de ce procédé one-pot, la transformation de la LGO en 2H-LGO est obtenue grâce à l'action d'une alkéne réductase, par exemple la OYE 2.6. Dans un autre mode de réalisation préféré, de ce procédé one-pot la transformation de la 2H-LGO en 2H-HBO est obtenue grâce à l'action d'une CHMO, en particulier 20 de la CHMO d'Acinetobacter sp. Dans un mode de réalisation tout à fait préféré de ce procédé one-pot, la transformation de la LGO en 2H-LGO est obtenue grâce à l'action d'une alkène réductase et la transformation de la 2H-LGO en 2H-HBO est obtenue grâce à l'action d'une CHMO. 25 Une telle réaction « one-pot » peut être réalisée en milieu synthétique ou en biotransformation en utilisant des cellules entières. Pour la biotransformation, les cellules utilisées peuvent être tout type de cellules appropriées à cet usage telles que des bactéries ou des cellules animales ou végétales. 30 Les différents modes de réalisation décrits précédemment se rapportent à une même réaction générale et leur combinaison est prévue dans le cadre de cette divulgation. 5 La présente invention sera mieux comprise à la lecture des exemples qui suivent, fournis à titre d'illustration et ne devant en aucun cas être considérés comme limitant la portée de la présente invention. DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1 : Voies classiques de valorisation de la LGO et/ou de la 2H-LGO en 2HHBO. Figure 2 : Procédé de synthèse de 2H-HBO à partir de LGO et/ou de 2H-LGO par une réaction de biocatalyse utilisant la CHMO. Figure 3: Procédé de synthèse « one-pot » de 2H-HBO à partir de LGO par une 15 réaction de biocatalyse utilisant la CHMO et l'alkène réductase OYE 2.6. EXEMPLES 20 EXEMPLE 1 : Production de 2H-HBO à partir de 2H-LGO en milieu synthétique Dans une solution contenant 20 mM Cyrène®, 50 mM Glucose, 0,5 mM NADP+, 0,25 mM FADH2 et 62,5 U Glucose dehydrogenase (GDH) dans un volume final de 25 mL de tampon phosphate 0.1 M pH 8,0 a été ajouté 150 pL de CHMO purifiée. La 25 solution a été magnétiquement agitée (200 rpm) sur une période de 12 heures à 37 °C. La consommation totale du Cyrène® a été vérifiée par chromatographie sur couche mince. L'analyse a révélé que le Cyrène® a été totalement transformé en un 30 intermédiaire n'étant ni 2H-FBO ni 2H-HBO (intermédiaire dit « Criégée »). La solution a ensuite été évaporée sous vide et le matériel brut analysé par RMN, confirmant les analyses par chromatographie sur couche mince. Une hydrolyse acide (HCI, 2 heures à 45 °C) permet de convertir cet intermédiaire en 2H-FBO puis 2H-HBO. 5 I() 6 Un contrôle négatif a été réalisé reprenant les mêmes conditions sans ajout de CHMO. Dans ces conditions, aucune transformation de Cyrène® n'a été observée (chromatographie sur couche mince), ce qui confirme la spécificité d'action de la CHMO sur la transformation du Cyrène®. 5 EXEMPLE 2: Bioproduction de 2H-HBO à partir de 2H-LGO en système cellulaire chez des bactéries exprimant la CHMO d'Acinetobacter sp. Des bactéries Escherichia colt BL2/(DE3) contenant un plasmide portant un gène de lu résistance à l'Ampicilline et codant l'enzyme CHMO d'Acinetobacter sp. ont été mises en culture dans 1 mL LB medium contenant de l'ampicilline à une concentration de 100 pg/L et incubés à 37 °C / 200 rpm sur une période de 12 heures. 500 pL de cette solution ont ensuite été transférés dans 50 mL LB medium contenant de l'ampicilline à une concentration de 100 pg/L, incubée à 37 °C sous 15 agitation jusqu'à atteindre une D0600 re. 0,9. La solution a ensuite été centrifugée à 4500 rpm à 4 °C sur une période de 15 minutes. Le surnageant a été éliminé et les cellules resuspendues dans 50 mL de milieu M9 minimal. IPTG et le Cyrène® ont ensuite été ajoutés à des concentrations finales de 0,15 mM et 10-40 mM respectivement. 20 La consommation totale du Cyrène® a été vérifiée par chromatographie sur couche mince (concentration maximale de 5,2 g/L) (NB : le système peut accepter jusqu'à 10 g/L mais à une telle concentration la conversion du Cyrène® n'est pas totale). L'analyse par chromatographie sur couche mince a révélé que le Cyrène® a été intégralement transformé en un intermédiaire dit « Criégée » différent de la 2H-FBO 25 et de la 2H-HBO alors qu'à 10 g/L nous avons un mélange contenant du Cyrène®, l'intermédiaire en question, 2H-FBO et 2H-HBO. Une hydrolyse acide (HCI, 2 heures à 45 °C) permet la transformation de l'intermédiaire dit « Criégée » en 2H-FBO puis en molécule d'intérêt, la 2H-HBO (validée