Brevet FR3099182A1 — publié le 20210129

Description Titre de l'invention : Procédé de détection et de quantification d'une espèce biologique d'intérêt paranalyse métagénomique Domaine technique [0001] Le domaine technique de l'invention est l'identification d'une espèce biologique d'intérêt par analyse métagénomique. ART ANTERIEUR [0002] L'amplification des acides nucléiques par PCR (Polytnerase Chain Reaction) permet d'effectuer un diagnostic rapide et précoce quant à la présence de certains microorganismes dans un échantillon. La PCR est par exemple particulièrement adaptée pour détecter l'ADN (Acide Désoxyribonucléique) de bactéries difficilement cultivables, ou se développant lentement, telles que Mycobacterium tuberculosis. [0003] Cependant, la mise en oeuvre de la PCR nécessite l'utilisation d'amorces, ciblant spé- cifiquement un gène présent dans une espèce biologique cible. Ainsi, la PCR permet une analyse spécifique à une espèce biologique, ce qui en fait une méthode sélective, sensible, et pouvant être quantitative. Cependant elle suppose un a priori sur l'espèce biologique ciblée. Si plusieurs espèces biologiques sont recherchées, des PCR dites multiplex doivent être réalisées, ce qui rend le processus plus complexe. [0004] Il est également possible de cibler un gène, présent dans différentes espèces bio- logiques cibles. En ce qui concerne les bactéries, il s'agit par exemple du gène ARN 16S. L'analyse par PCR est alors dite à large spectre. En cas de test positif, un séquençage doit être réalisé afin d'identifier l'espèce biologique présente dans l'échantillon. Cependant, la PCR à large spectre est plus délicate à mettre en oeuvre, et suppose de disposer d'un a priori sur l'espèce biologique cible à identifier. [0005] A l'inverse des techniques précédemment dédites, la métagénomique permet de séquencer des génomes de plusieurs individus d'espèces biologiques différentes dans un milieu donné. On peut alors déterminer les espèces effectivement présentes dans l'échantillon, ainsi que leurs abondances relatives. La métagénomique séquence les génomes de plusieurs individus d'espèces différentes dans un milieu donné, et cela sans a priori sur les espèces biologiques dans l'échantillon, qu'elles soient bactériennes, virales ou humaines. On dispose alors d'une analyse des différents génomes des espèces biologiques d'un échantillon. On peut alors déterminer quelles espèces sont présentes, ainsi que leurs abondances relatives. [0006] Des progrès ont récemment été réalisés dans le domaine du séquençage, avec l'avènement des séquençages de deuxième ou de troisième génération, dits séquençage haut débit, également désignés par l'acronyme HTS (High Throughput Sequencing). 2 Les performances de la bioinformatique, permettant un traitement informatique rapide de l'information biologique issue du séquençage, se sont améliorées. Le séquençage haut débit permet à présent de générer suffisamment de séquences pour obtenir un inventaire représentatif des différentes espèces présentes dans l'échantillon. 11 s'agit d'une méthode d'analyse disponible commercialement, et dont l'utilisation devient relativement courante. Le document W02018/069430 décrit une application d'une analyse métagénomique pour l'identification d'agents pathogènes ainsi que des marqueurs de résistance à des antibiotiques. [0007] La publication Ruppé E "Cl inical metagenomics of None and joint infections : a proof of concept study", décrit également l'application de la métagénomique pour l'identification de bactéries. [0008] L'inventeur propose un procédé de détection, et éventuellement de quantification, d'une espèce biologique d'intérêt, voire de différentes espèces biologiques d'intérêt, dans un échantillon, en mettant en oeuvre une analyse métagénomique de l'échantillon. De plus, le procédé permet d'établir un indicateur relatif au bon déroulement des étapes biologiques ou hioinformatiques du processus métagénomique. Exposé de l'invention [0009] Un objet de l'invention est un procédé de détection d'une espèce biologique d'intérêt potentiellement présente dans un échantillon d'analyse, l'espèce biologique d'intérêt présentant un génome connu ou partiellement connu, l'échantillon d'analyse comportant un mélange de différentes espèces biologiques, le procédé comportant les étapes suivantes : [0010] a. extraction des acides nucléiques de l'échantillon d'analyse ; h. séquençage des séquences de nucléotides extraites lors de l'étape a) ; c. à partir du résultat du séquençage : [0011] i. assignation des séquences résultant de l'étape h) à partir d'une base de séquences de référence ; détermination d'une quantité de séquences assignées à l'espèce biologique d'intérêt; iii. prise en compte d'un seuil de détection associé à l'espèce biologique d'intérêt; iv. comparaison de la quantité résultant de la sous-étape ii) au seuil de détection pris en compte lors de l'étape iii) ; [0012] le procédé étant caractérisé en ce qu'il comporte, préalablement à l'étape a), l'ajout d'une espèce de contrôle, l'espèce de contrôle étant ajoutée selon une concentration connue, dans l'échantillon d'analyse, l'espèce de contrôle présentant un génome connu, et en ce que l'étape c) comporte : [0013] v) détermination d'une quantité de séquences assignées à l'espèce de contrôle; 3 [0014] vi) prise en compte d'un seuil de détection associé à l'espèce de contrôle; [0015] vii) comparaison de la quantité résultant de la sous-étape v) avec le seuil de détection pris en compte lors de la sous-étape vi) ; [0016] d) utilisation des comparaisons effectuées lors des sous-étapes iv) et vii) pour dé- terminer une présence de l'espèce biologique d'intérêt dans l'échantillon. [0017] Le procédé peut comporter une prise en compte d'un seuil de décision. L'étape d) peut alors comporter, en fonction des comparaisons effectuées lors des sous-étapes iv) et vii), une confirmation ou une non confirmation de la présence de l'espèce biologique d'intérêt en dessus ou en dessous du seuil de décision. [0018] Le seuil de décision est de préférence exprimé dans une unité correspondant à un nombre de séquences par unité de volume (ou de masse), par exemple en Génome Equivalent par mL. Le seuil de décision peut dépendre de l'espèce biologique considérée. [0019] De préférence, les quantités de séquences respectivement assignées à l'espèce biologique d'intérêt et à l'espèce biologique de contrôle sont normalisées par une quantité de référence. La quantité de référence peut par exemple être une quantité totale de séquences produites au cours du séquençage. [0020] Lors de l'étape d), [0021] lorsque la quantité de séquences assignées à l'espèce de contrôle est su- périeure au seuil de détection associé à l'espèce de contrôle ; et lorsque la quantité de séquences assignées à l'espèce biologique d'intérêt est supérieure au seuil de détection associé à l'espèce biologique d'intérêt ; [0022] l'étape d) peut comporter une confirmation de la présence de l'espèce biologique d'intérêt dans l'échantillon d'analyse. L'étape d) peut alors comporter ainsi une estimation d'une concentration de l'espèce biologique d'intérêt. [0023] Selon un mode de réalisation, le procédé comporte, de préférence préalablement à l'étape a), l'ajout d'un calibrateur, à une concentration connue, dans l'échantillon, le calibrateur présentant un génome connu. Lors de l'étape d), l'estimation de la concentration de l'espèce biologique d'intérêt comporte alors: [0024] - détermination d'un premier ratio, entre les quantités de séquences respec- tivement assignées à l'espèce biologique d'intérêt et au calibrateur ; détermination d'un deuxième ratio, entre les tailles de génome respectives du calibrateur et de l'espèce biologique d'intérêt ; prise en compte de la concentration du calibrateur ajoutée dans l'échantillon d'analyse. [0025] L'estimation de la concentration d'espèce biologique d'intérêt peut alors comporter un calcul d'un produit du premier ratio par le deuxième ratio et par la concentration du calibrateur ajouté dans l'échantillon d'analyse. [0026] L'espèce de contrôle peut faire office de calibrateur. Dans ce cas, lors de l'étape d), l'estimation de la concentration de l'espèce biologique d'intérêt peut comporter : [0027] détermination d'un ratio de quantités, entre les quantités de séquences respec- tivement assignées à l'espèce biologique d'intérêt et à l'espèce de contrôle ; détermination d'un ratio de tailles, entre les tailles de génome respectives de l'espèce de contrôle et de l'espèce biologique d'intérêt ; prise en compte de la concentration de l'espèce de contrôle ajoutée dans l'échantillon d'analyse. [0028] L'estimation de la concentration d'espèce biologique d'intérêt peut alors comporter un calcul d'un produit du premier ratio par le deuxième ratio et par la concentration de l'espèce de contrôle ajoutée dans l'échantillon d'analyse. [0029] Lors de l'étape d) : [0030] lorsque la quantité de séquences assignées à l'espèce de contrôle est su- périeure au seuil de détection associé à l'espèce de contrôle ; et lorsque la quantité de séquences assignées à l'espèce biologique d'intérêt est inférieure au seuil détection associé à l'espèce biologique d'intérêt ; [0031] l'étape d) peut comporter : [0032] estimation d'une concentration minimale détectable de l'espèce biologique d'intérêt ; comparaison de la concentration minimale détectable de l'espèce biologique d'intérêt avec le seuil de décision, de telle sorte que lorsque la concentration minimale détectable de l'espèce biologique d'intérêt est inférieure au seuil de décision, il est estimé que l'espèce biologique d'intérêt n'est pas présente dans l'échantillon d'analyse à une concentration supérieure au seuil de décision. [0033] L'estimation de la concentration minimale détectable de l'espèce biologique d'intérêt peut alors comporter: [0034] détermination d'un premier ratio, entre le seuil de détection de l'espèce biologique d'intérêt et de la quantité de séquences assignées à l'espèce de contrôle ; détermination d'un deuxième ratio de tailles, entre les tailles de génome respectives de l'espèce de contrôle et de l'espèce biologique d'intérêt ; prise en compte de la concentration de l'espèce de contrôle ajoutée dans l'échantillon d'analyse. [0035] Lors de l'étape d) : [0036] lorsque la quantité de séquences assignées à l'espèce de contrôle est inférieure au seuil de détection associé à l'espèce de contrôle ; et lorsque la quantité de séquences assignées à l'espèce biologique d'intérêt est supérieure au seuil de détection de l'espèce biologique d'intérêt ; [0037] l'étape d) peut comporter une comparaison de la concentration de l'espèce de contrôle ajoutée à l'échantillon d'analyse avec le seuil de décision, de telle sorte que : [0038] lorsque la concentration de l'espèce de contrôle ajoutée à l'échantillon d'analyse est supérieure au seuil de décision, confirmation de la présence de l'espèce hiologique d'intérêt dans l'échantillon d'analyse selon une concentration supérieure au seuil de décision ; lorsque la concentration de l'espèce de contrôle ajoutée à l'échantillon d'analyse est inférieure au seuil de décision, confirmation de la présence de l'espèce hiologique d'intérêt dans l'échantillon d'analyse. [0039] Lors de l'étape d) : [0040] - lorsque la quantité de séquences assignées à l'espèce de contrôle est inférieure au seuil de détection associé à l'espèce de contrôle ; et lorsque la quantité de séquences assignées à l'espèce biologique d'intérêt est inférieure au seuil de détection de l'espèce hiologique d'intérêt ; [0041] aucune confirmation quant à la présence de l'espèce biologique d'intérêt ne peut être donnée. Les étapes a) à c) peuvent alors être considérées comme non valides. [0042] Le procédé peut comporter une phase préalable de détermination du seuil de détection associé à l'espèce hiologique d'intérêt, en utilisant une pluralité de premiers échantillons d'entraînement, considérés comme ne comportant pas l'espèce hiologique d'intérêt, le procédé comportant, pour chaque premier échantillon d'entraînement : [0043] extraction de séquences de nucléotides ; séquençage des séquences de nucléotides ainsi extraites ; détermination d'une quantité de séquences d'intérêt, assignées à l'espèce biologique d'intérêt éventuellement normalisation des quantités de séquences d'intérêt assignées à l'espèce biologique d'intérêt ; [0044] le procédé comportant alors : [0045] calcul d'un indicateur de dispersion des quantités, ou des quantités nor- malisées, de séquences d'intérêt déterminées pour chaque premier échantillon entraînement; détermination du seuil de détection associé à l'espèce biologique d'intérêt en fonction de l'indicateur de dispersion ainsi calculé. [0046] Le procédé peut comporter un calcul d'une moyenne ou d'une médiane des quantités, éventuellement normalisées, de séquences d'intérêt déterminées pour chaque premier échantillon entraînement. Le seuil de détection associé à l'espèce biologique d'intérêt est alors également déterminé en fonction de la moyenne ou de la médiane. [0047] Le procédé peut comporter une phase préalable de détermination du seuil de détection associé à l'espèce de contrôle, en utilisant une pluralité de deuxièmes 6 échantillons entraînement, considérés comme ne comportant pas l'espèce de contrôle, le procédé comportant, pour chaque deuxième échantillon entraînement : [0048] extraction de séquences de nucléotides ; séquençage des séquences de nucléotides ainsi extraites ; détermination d'une quantité de séquences, assignées à l'espèce de contrôle ; éventuellement normalisation des quantités de séquences assignées à l'espèce de contrôle ; [0049] le procédé comportant alors : [0050] calcul d'un indicateur de dispersion des quantités, ou des quantités nor- malisées, de séquences assignées à l'espèce de contrôle, déterminées pour chaque deuxième échantillon d'entraînement ; détermination du seuil de détection associé à l'espèce de contrôle en fonction de l'indicateur de dispersion ainsi calculé. [0051] Le procédé peut comporter un calcul d'une moyenne ou d'une médiane des quantités, éventuellement normalisées, de séquences assignées à l'espèce de contrôle déterminées pour chaque deuxième échantillon entraînement. Le seuil de détection associé à l'espèce de contrôle est alors également déterminé en fonction de la moyenne ou de la médiane. [0052] Chaque deuxième échantillon d'entraînement peut être un échantillon d'analyse, sans ajout de l'espèce de contrôle. [0053] D'une façon générale, une quantité de séquence normalisée est obtenue en divisant une quantité de séquence résultant d'un séquençage, par une quantité de référence. La quantité de référence peut être un nombre total de séquences produites au cours du séquençage [0054] Selon un mode de réalisation, les étapes c) et d) sont effectuées parallèlement respec- tivement pour différentes espèces biologiques d'intérêt, chaque espèce biologique d'intérêt étant considérée comme potentiellement présente dans l'échantillon. Selon un tel mode de réalisation, pour chaque espèce biologique d'intérêt, on met en oeuvre les étapes c) et d) pour chaque espèce biologique d'intérêt. [0055] Selon un mode de réalisation, le procédé comporte, préalablement à l'étape a), un ajout de plusieurs espèces de contrôle, de telle sorte que pour une même espèce d'intérêt, les étapes c) et d) sont effectuées en prenant en compte plusieurs espèces de contrôle, les sous-étapes iv) à vi) étant mises en oeuvre, parallèlement, pour chaque espèce de contrôle. [0056] D'autres avantages et caractéristiques ressortiront plus clairement de la description qui va suivre de modes particuliers de réalisation de l'invention, donnés à titre d'exemples non limitatifs, et représentés sur les figures listées ci-dessous. 7 FIGURES [0057] [fie.1] La figure 1 schématise les principales étapes d'un procédé selon l'invention. [0058] [fig.2A] La figure 2A montre une comparaison de quantifications d'une espèce biologique d'intérêt, en l'occurrence S.aureus, respectivement en mettant en oeuvre les étapes décrites ci-après (axe des ordonnées) et une méthode de référence (axe des abscisses), par mise en culture. [0059] [fie.2B] La figure 2B montre une comparaison de quantifications d'une espèce biologique d'intérêt, en l'occurrence S.aureus, respectivement en mettant en oeuvre les étapes décrites ci-après (axe des ordonnées) et une méthode de référence (axe des abscisses), par PCR quantitative. [0060] [fig.3] La figure 3 montre une distribution statistique de la quantité normalisée de séquences, correspondant respectivement à différentes espèces biologiques d'intérêt, mesurées sur des échantillons de test considérés comme ne comportant pas lesdites espèces biologiques d'intérêt. [0061] [fig.4] La figure 4 est une figure représentant une comparaison entre des concen- trations d'espèces biologiques d'intérêt respectivement estimées par culture (axe des abscisses) et par analyse métagénomique (axe des ordonnées). EXPOSE DE MODES DE REALISATION PARTICULIERS 100621 L'objectif du procédé est de pouvoir détecter la présence d'une espèce biologique d'intérêt SOI dans un échantillon. L'acronyme SOI signifie "Species of Interest". En cas de détection, le procédé peut permettre une quantification absolue de l'espèce d'intérêt SOI, de façon à permettre une comparaison avec un seuil de décision SD. 100631 Par espèce biologique, il est entendu un microorganisme, par exemple une bactérie, ou un virus, un champignon, une archéobactérie, une amibe, un protiste, une microalgue. Une espèce biologique peut également être une cellule ou tout autre matériel ou entité comportant un acide nucléique séquençable. 100641 Lorsque l'échantillon est issu d'un organisme humain ou animal, l'espèce biologique d'intérêt peut être une espèce pathogène. Lorsque l'échantillon est issu d'un prélèvement dans un procédé industriel ou dans l'environnement, l'espèce biologique d'intérêt peut être une espèce considérée comme contaminante, ou une espèce d'intérêt ayant une importance dans un processus industriel ou dans [environnement, et dont on souhaite contrôler la présence ou la concentration. 100651 L'espèce d'intérêt présente un génome connu, ou partiellement connu. Le génome, ou sa portion connue, est constitué de séquences, dites séquences d'intérêt. 100661 Le procédé peut adresser simultanément plusieurs espèces d'intérêt. Aussi, le terme une espèce d'intérêt est à interpréter comme signifiant au moins unc espèce d'intérêt. [0067] Le seuil de décision SD est un seuil permettant de caractériser unc charge de l'espèce 8 biologique d'intérêt, par exemple d'un microorganisme, en fonction de l'application visée. Il est par exemple établi à partir d'une limite réglementaire, ou sanitaire ou industrielle. Par exemple, lorsque l'application est utilisée dans l'aide au diagnostic clinique, l'espèce biologique d'intérêt étant une bactérie, le seuil de décision peut être une concentration en deçà de laquelle la présence de la bactérie correspond à fune colonisation, c'est-à-dire un développement non pathologique, et au-delà de laquelle la présence de la bactérie est considérée comme pathologique, correspondant par exemple à une infection. Lorsque l'invention est appliquée dans un procédé industriel, le seuil de détection correspond à une valeur de conformité, de telle sorte qu'au-delà du seuil de détection, l'échantillon est considéré comme non conforme, et qu'en deçà du seuil de détection, l'échantillon est considéré comme conforme. Quelle que soit l'application, lorsque la concentration de l'espèce biologique d'intérêt est supérieure ou égale au seuil de décision, elle est définie comme étant critique. Dans certaines applications, par exemple dans la fabrication de produits subissant une fermentation, une concentration d'espèce biologique d'intérêt peut être considérée comme critique si elle est inférieure à un seuil de décision, ce dernier correspondant à une concentration minimale admissible de l'espèce biologique. [0068] L'échantillon est généralement un échantillon prélevé, dans l'environnement ou dans un organisme, mort ou vivant, ou encore dans un produit agroalimentaire ou manufacturé. L'échantillon peut également avoir été prélevé dans une installation industrielle à des fins de contrôle de procédé. Aussi, l'échantillon comporte différentes espèces biologiques, ne présentant pas le même génome. En particulier, lorsque l'échantillon résulte d'un prélèvement d'un organisme, par exemple un organisme humain ou animal, l'échantillon comporte une quantité significative, voire majoritaire, de cellules provenant de l'organisme prélevé. Les génomes des organismes humains ou animaux ont une taille 1000 à 100 000 fois plus importante que les génomes des organismes procaryotes. De plus, l'échantillon comporte généralement des espèces biologiques naturellement présentes dans l'échantillon, et non susceptibles d'entraîner une pathologie ou une contamination critique. Par exemple, lorsque l'échantillon est un prélèvement broncho-alvéolaire, il comporte une flore bactérienne naturellement présente dans les poumons. Lorsque l'échantillon est un prélèvement de selles, il comporte une flore bactérienne naturellement présente dans le tube digestif. En cela, lorsque l'espèce biologique d'intérêt est une bactérie ou un virus, les acides nucléiques provenant de l'espèce biologique d'intérêt peuvent être minoritaires dans l'échantillon. [0069] L'échantillon comporte des espèces dites "de matrice", endogènes dans l'échantillon, et susceptibles de masquer l'information métagénomique relative à l'espèce biologique d'intérêt. Par exemple, lorsque l'échantillon est prélevé dans un yaourt, dans une viande ou dans un vaccin, il comporte des espèces de matrice représentatives de ces milieux. 9 Dans le cas d'un prélèvement sur un organisme, la matrice comporte les cellules composant l'organisme. [0070] Un aspect important de l'invention est que l'échantillon subit une extraction d'acides nucléiques (ADN et/ou ARN), suivie par un processus de séquençage, selon les principes de l'analyse métagénomique. Le processus de séquençage peut être précédé d'un processus d'amplification. Le séquençage peut être un séquençage complet du génome, usuellement désigné par le terme "wholc gcnome sequencing" (WGS), notamment un séquençage complet de type shotgun. Un inventaire de séquences de gènes des différentes espèces constituant l'échantillon est ainsi obtenu. La totalité, ou la quasi-totalité, de l'acide nucléique des différentes espèces constituant l'échantillon est séquencée, par une méthode de séquençage haut débit. Des moyens bioinforrnatiques permettent alors d'identifier des séquences d'intérêt, associées à l'espèce biologique d'intérêt, et d'en déterminer une quantité, généralement une quantité normalisée, comme décrit par la suite. Les moyens informatiques sont basés sur une hase de données de séquences de référence, par exemple des génomes complets de référence dans le cadre d'un processus de type WGS précédemment évoqué. La hase de données comporte au moins les génomes, totaux ou partiels, des espèces biologiques d'intérêt potentiellement présentes dans l'échantillon. Elle comporte également le génome, total ou partiel, d'une espèce biologique dite de contrôle, cette dernière étant décrite par la suite. [0071] Ainsi, selon cette technique, on obtient, par séquençage, une description génomique des différentes espèces constituant l'échantillon. On identifie ensuite, parmi les séquences génomiques inventoriées, les séquences correspondant à l'espèce biologique d'intérêt et celles correspondant à l'espèce de contrôle. [0072] Le procédé comporte les étapes décrites ci-après, en lien avec la figure 1. [0073] Etape 10 : prélèvement de l'échantillon. [0074] Dans cet exemple, l'échantillon est prélevé dans un organisme humain vivant, à des fins d'aide au diagnostic. Cependant, l'invention ne se limite pas à une application dans le domaine du vivant. L'échantillon peut être prélevé dans un environnement industriel ou hospitalier, de façon à vérifier une conformité à l'égard d'un seuil de décision. [0075] Etape 20 : ajout d'une espèce de contrôle. [0076] Un des objectifs de l'invention est d'évaluer dans quelle mesure une analyse méta- génomique est exploitable. Il s'agit en particulier d'évaluer une conformité de l'ensemble des étapes depuis la préparation de l'échantillon, prélèvement exclu, jusqu'à l'analyse bioinformatique des données de séquençage. A cette fin, une espèce de contrôle, noté SPC, acronyme de Sample Processing Control, est ajoutée dans l'échantillon. Une fonction de l'espèce de contrôle est de permettre un contrôle du bon déroulement des étapes d'extraction d'acides nucléiques et de séquençage, décrites par la suite. L'espèce de contrôle SPC peut être une espèce biologique connue, dont le génome est également connu, de préférence en totalité. L'espèce de contrôle SPC peut être une espèce biologique naturelle. Il peut également s'agir d'une espèce artificielle, par exemple un ARN (acide ribonucléique) encapsidé. De préférence, l'espèce de contrôle SPC n'est pas initialement présente dans l'échantillon prélevé, ou selon une quantité négligeable. De préférence, la teneur en espèce de contrôle SPC initialement présente dans l'échantillon, c'est-à-dire présente avant l'ajout, et de préférence au moins 10 fois inférieure, ou de préférence au moins 100 ou 1000 fois inférieure à la concentration ajoutée Cspc de l'espèce de contrôle SPC dans l'échantillon. L'espèce de contrôle SPC peut par exemple être une bactérie. Il est important que la concentration de l'espèce de contrôle ajoutée soit maîtrisée. [0077] L'espèce de contrôle peut être choisie en tenant compte des aspects listés ci-dessous : [0078] a. L'espèce de contrôle doit de préférence se distinguer, des organismes natu- rellement présents dans l'échantillon, ou organismes endogènes, ainsi que de l'espèce d'intérêt recherchée : ainsi, l'outil bioinfortnatique peut identifier avec précision les séquences issues du séquençage du SPC. h. La quantité de séquences assignées à l'espèce de contrôle, au cours du sé- quençage, doit être suffisante pour pouvoir être détectée de façon correcte, sans pour autant masquer l'information utile, correspondant aux séquences de l'espèce biologique d'intérêt. En d'autres termes, l'espèce de contrôle est de préférence détectable par le séquençage haut débit, tout n'étant pas prépondérante dans l'échantillon. En particulier, lorsqu'on souhaite déterminer une positivité (concentration de l'espèce supérieure au seuil de décision) ou une négativité (concentration de l'espèce inférieure au seuil de décision), il est préférable que l'espèce de contrôle soit telle que : La taille de son génome est de préférence similaire, ou au moins comparable, à la taille du génome de l'espèce biologique d'intérêt. Plus particulièrement, la taille du génome de l'espèce de contrôle est comprise entre 0.1 fois à 10 fois la taille du génome de l'espèce biologique d'intérêt. La concentration Cspc de l'espèce de contrôle peut être déterminée en fonction du seuil de décision. La concentration Cspc de l'espèce de contrôle SPC ajoutée peut être par exemple comprise entre 0,001 fois et 1000 fois, et de préférence entre 0.01 et 100 fois le seuil de décision. Les acides nucléiques de l'espèce de contrôle SPC subissent un traitement similaire aux acides nucléiques de l'espèce d'intérêt lors des étapes de préparation de l'échantillon, de l'extraction et de sé- - 11 quençage, et de préférence : le pourcentage de hases GC (Guanine, Cytosine) est de préférence proche du pourcentage de hases GC de l'espèce biologique d'intérêt ; Par proche de, on entend compris entre 75% et 125%, et de préférence entre 80% et 120 %. l'espèce biologique de contrôle comporte de préférence, lorsque l'espèce biologique d'intérêt est une bactérie, une membrane ou une paroi cellulaire intègre ou, lorsque l'espèce biologique d'intérêt est un virus, une enveloppe protéique. Cette condition permet en outre un suivi des étapes de lyse ou de l'extraction des acides nucléiques de l'espèce biologique d'intérêt. c. Les séquences de nucléotides de l'espèce de contrôle ne contiennent pas, de préférence, de marqueurs génomiques, comme par exemple des marqueurs de résistance aux antibiotiques, des marqueurs de virulence, de façon à ne pas fausser des résultats d'un éventuel test de sensibilité aux antibiotiques par la présence de tels marqueurs dans le génome de l'espèce biologique d'intérêt. De préférence, les séquences de nucléotides de l'espèce de contrôle ne contiennent pas tout autre gène présentant un intérêt clinique ou industriel et dont la présence est susceptible d'être contrôlée. d. L'espèce de contrôle est de préférence aisément manipulable, en particulier : - en étant inoffensive pour l'homme ou l'environnement ; - et/ou en étant résistante à des traitements thermiques de type lyophilisation ou congélation, ce qui facilite le stockage. e. L'espèce de contrôle ne doit pas former des spores, ou de façon marginale. f. L'espèce de contrôle doit présenter une sensibilité à la lyse proche de celle de l'espèce biologique d'intérêt. g. L'espèce de contrôle est présente sous la forme de billes, chaque bille comportant une concentration calibrée d'espèce biologique de contrôle sous forme lyophilisée. [0079] Il est précisé qu'une unique espèce de contrôle SPC peut être utilisée, ou que plusieurs espèces de contrôle, de différents types, peuvent être utilisées. On peut utiliser différentes espèces biologiques de contrôle pour une même espèce biologique d'intérêt. Selon une possibilité, l'espèce de contrôle forme un calibrateur. Selon une autre variante, un calibrateur, différent de l'espèce de contrôle, est ajouté à l'échantillon. Le calibrateur permet une estimation de la concentration de l'espèce d'intérêt. Cette alternative, qui correspond à une variante de l'invention, est décrite après la description des étapes 61 à 64. Cf. paragraphe "Variante". 12 [0080] La concentration ajoutée Cspc de l'espèce de contrôle SPC est de préférence connue avec précision. En effet, elle peut permettre, sous réserve que certaines conditions soient remplies, de quantifier la concentration d'espèce biologique d'intérêt dans l'échantillon, l'espèce de contrôle formant alors un calibrateur. Le terme concentration ajoutée désigne la concentration de l'espèce de contrôle dans l'échantillon duc à l'ajout de l'espèce de contrôle. [0081] Dans la description des étapes 30 à 60, on se hase, à titre d'exemple avantageux, sur l'ajout d'un seul type d'espèce de contrôle dans l'échantillon. L'espèce de contrôle remplit alors la fonction de contrôle qualité des étapes de l'analyse métagénomique, ainsi que la fonction de calibrateur, permettant une quantification de la concentration de l'espèce biologique d'intérêt. [0082] A l'issue de l'étape 20, on dispose d'une concentration ajoutée Csi,c de l'espèce de contrôle dans l'échantillon. La concentration ajoutée Cspc peut être expri niée en GEq/ mL (génome équivalent par mL). [0083] Etape 30 : lyse et extraction des acides nucléiques. [0084] Au cours de cette étape, les cellules de l'échantillon, et notamment les cellules de l'espèce biologique d'intérêt et de l'espèce de contrôle, subissent une lyse, pour permettre une extraction de leur ADN. Différentes stratégies peuvent être envisagées : [0085] - la lyse peut être paramétrée pour cibler préférentiellement l'espèce biologique d'intérêt ; l'espèce de contrôle doit présenter une même sensibilité à la lyse que l'espèce biologique d'intérêt, ou une sensibilité à la lyse considérée comme équivalente. la lyse peut inclure une première lyse, destinée à lyser essentiellement des cellules autres que l'espèce d'intérêt. Une telle première lyse peut par exemple être envisagée lorsque l'espèce biologique d'intérêt est très minoritaire par rapport aux cellules d'une matrice composant l'échantillon. A la suite de la première lyse, les acides nucléiques libérés sont évacués, puis une deuxième lyse est réalisée, visant l'espèce biologique d'intérêt. Selon un tel scénario, l'espèce de contrôle est de préférence résistante à la première lyse, et non résistante à la deuxième lyse. [0086] Suite à la lyse, l'ADN est extrait de l'échantillon par exemple selon le procédé d'extraction décrit dans W02014/114896. [0087] L'ADN extrait de l'échantillon peut être composé essentiellement de l'ADN de la matrice, c'est-à-dire de l'environnement duquel a été prélevé l'échantillon. Dans ce cas, l'échantillon peut subir une capture et/ou une amplification sélective, ciblant principalement des séquences et/ou des modifications physico-chimiques spécifiques des génomes de l'espèce biologique d'intérêt. Dans ce cas, l'espèce de contrôle comporte 13 les séquences et/les modifications physico-chimiques ciblées par la capture ou l'amplification sélective. Inversement, l'échantillon peut subir une déplétion ciblant essentiellement l'ADN de la matrice. Dans ce cas, l'espèce de contrôle ne comporte pas de séquences ou de modifications physicochimiques pouvant être visées par la déplétion. [0088] Etape 40 : Amplification et séquençage. [0089] Suite à l'extraction d'ADN, les fragments d'ADN subissent optionnellement une am- plification qui peut être de type cihlée, par exemple par PCR (Polymerase Chain Rcaction), ou non cihlée, par exemple par WGA (Whole Genomc Amplification). L'ADN extrait de l'échantillon, le cas échéant amplifié, subit un séquençage, de préférence un séquençage de type WGS (Whole Gcnome Sequencing). Il existe de nombreuses techniques de séquençage, par exemple de type séquençage par synthèse (SBS), ou par nanopore, ou par hybridation. Quelle que soit la technique employée, le but du séquençage est de fournir des séquences numériques d'acides nucléiques, dites reads. Le séquençage comporte une préparation de banques de séquences (ou lihrary preparation), optionnellement suivie d'une étape d'amplification, puis d'une étape de séquençage proprement dite. La technique de séquençage d'acide nucléique étant bien connue, elle ne sera pas décrite dans le détail. L'amplification et le séquençage peut être mise en oeuvre par la plateforme MiSeq, commercialisée par la société Illumina. [0090] Lors de la préparation des banques de séquences, l'ADN peut être morcelé de manière aléatoire, de façon à obtenir des séquences d'acides nucléiques d'une longueur moyenne ciblée, généralement une longueur moyenne comprise entre 50 bases et 300 bases. On parle de séquençage aléatoire, ou séquençage "shotgun", ou de séquençage de type WGS (Whole Genome Sequencing). Avec ce type de technique, les acides nucléiques, quelle que soit leur origine, sont traités de manière identique lors de la préparation de la banque de séquences. [0091] A la suite de la préparation des banques de séquences, le séquençage haut débit est réalisé. Le séquenceur procède à la lecture des bases des fragments d'ADN séquencés, de manière à obtenir des séquences dites "reads", chaque "read" correspondant à une séquence décodée par le séquenceur. Les séquences issues du séquençage sont ensuite alignées par rapport à des génomes mémorisés dans une base de données, dont notamment le génome de l'espèce biologique d'intérêt recherchée et le génome de l'espèce de contrôle. Le séquençage est une opération connue de l'homme du métier. Des détails relatifs aux opérations de séquençage sont donnés par exemple dans les documents cités en lien avec l'art antérieur, en particulier W02018/069430 ou dans la publication Ruppé E précédemment citée. [0092] Le séquenceur transmet des fichiers, correspondant aux mesures effectuées comportant les "reads" à une unité de traitement de données. Cette dernière comporte 14 une mémoire, dans laquelle sont stockées des instructions permettant la mise en oeuvre d'algorithmes de séquençage. Les algorithmes de séquençage permettent d'identifier, pour chaque séquence, le génome comportant la séquence, parmi une pluralité de génomes mémorisés dans une hase de données. Ils permettent également d'établir la position de chaque séquence sur le génome auquel elle appartient, et de réaliser des assemblages entre les différentes séquences appartenant à un même génome. [0093] A l'issue de l'étape 40, on dispose de données de séquençage relatives aux différentes espèces biologiques de l'échantillon. Il s'agit en particulier d'une identification de chaque espèce et d'une quantité de séquences assignées à chaque espèce identifiée. On dispose en particulier d'un nombre de séquences Rso, assignées à l'espèce biologique d'intérêt et d'un nombre de séquences R5 assignées à l'espèce de contrôle. [0094] Etape 45 : Identification des espèces auxquelles appartiennent les rcads. [0095] Lors de cette étape, mise en oeuvre par l'unité de traitement de données, il est identifié, en termes d'espèce bactérienne, l'origine de chacun des rcads. Cette étape, généralement connue sous le nom de « hinning », dc « hinning taxonomique », ou d'« assignment », comprend la comparaison de chacun des rcads avec des séquences numériques d'acides nucléiques d'une hase de données de référence. Des logiciels dc hinning connus sont par exemple Krakcn, (Wood et Salzberg, "Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact al ignments", Gcnome Biology, 2014), ou "Wowpal Wabbit" (Vcrvicr et al., "Large-scale machine learning for mctagenomics sequence classification", Bioinformatics, 2015), ou "BWA-MEM" (Li, "Aligning sequence rends, clone sequences and assembly contigs with BWA-MEM", Genomics, 2013). De préférence, un rend est assigné à une espèce d'intérêt s'il est entièrement compris dans un génome représentatif de l'espèce d'intérêt mémorisé dans la base de données. [0096] Etape 50 : Normalisation [0097] Les quantités de données de séquençage résultant de l'étape 45 n'ont pas la même taille pour chacun des échantillons. En effet, le nombre de séquences générées par le séquençage dépend de la qualité et de la quantité d'ADN des différentes espèces biologiques composant l'échantillon. Il est donc préférable, voire nécessaire, de normaliser la quantité de séquences associées à une espèce par rapport à une quantité de référence. La normalisation dépend du type d'échantillon analysé et de l'analyse métagénomique appliquée. La quantité de référence peut par exemple être un nombre total de séquences produites pour l'échantillon analysé. La quantité normalisée de séquences associées à chaque espèce, divisée par la quantité de référence, est usuellement multipliée par F6 de façon à obtenir une quantité normalisée correspondant à une quantité par million de séquence (ou RPM, acronyme de Read Per Million) [0098] Selon d'autres variantes, la quantité de référence peut-être, à titre non exhaustif : [0099] - un nombre total de séquences associées à tous les microorganismes identifiés ; un nombre total de séquences associées à un organisme duquel est extrait l'échantillon : par exemple, lorsque l'organisme est un corps humain, on peut déterminer un nombre total de séquences associées au génome humain ; un nombre total de séquences associées à une espèce de référence. Par espèce de référence, il est entendu une espèce endogène ou exogène que l'on considère comme présente de façon constante dans différents échantillons prélevés. L'espèce de référence peut être l'espèce de contrôle. un nombre total de séquences associées à une espèce prédéterminée dans un échantillon ne présentant pas l'espèce biologique d'intérêt (échantillon négatif) ou dans un tampon ne comportant pas l'échantillon. [0100] L'étape 50 est effectuée pour l'espèce biologique d'intérêt (ou pour chaque espèce biologique d'intérêt), ainsi que pour l'espèce de contrôle (ou pour chaque espèce de contrôle SPC ou pour chaque cal ibrateur). On obtient ainsi une quantité normalisée RN so, pour l'espèce biologique d'intérêt SOI (ou pour chaque espèce biologique d'intérêt) et une quantité normalisée RNspc. pour l'espèce de contrôle SPC (ou pour chaque espèce de contrôle ou pour chaque calibratcur). Dans la notation RN, la lettre N désigne le fait que la quantité est normalisée. [0101] Par la suite, de façon non limitative, on considère qu'il n'y a qu'une seule espèce biologique d'intérêt et une seule espèce de contrôle. [0102] Dans la suite de la description, le terme quantité peut désigner une quantité normalisée. [0103] Etape 60 : Interprétation. [0104] Cette étape est une étape importante de l'invention. Il s'agit de savoir dans quelle mesure les résultats du séquençage sont interprétables. [0105] Cette étape utilise des seuils de détection DTso, et DTspc, respectivement associés à l'espèce biologique d'intérêt SOI et à l'espèce de contrôle SPC. Les seuils de détection peuvent être établis à partir de seuils de détection statistiques respectivement déterminés pour l'espèce biologique d'intérêt et l'espèce de contrôle. Les seuils de détection statistiques sont établis préalablement, au cours d'une étape 100 décrite ultérieurement. D'une façon générale, un seuil de détection statistique correspond à la plus basse valeur d'une concentration d'analyte mesurée par une méthode de détection, qui est statistiquement différente de celle mesurée, dans les mêmes conditions, lorsque l'analyte est absent de l'échantillon. Chaque seuil de détection peut être égal au seuil de détection statistique, ou être déterminé à partir du seuil de détection statistique, en étant notamment k fois égal au seuil de détection statistique, k étant un réel non nul. [0106] L'interprétation vise à comparer les quantités normalisées de séquences RNsol et RN spc, respectivement assignées à l'espèce biologique d'intérêt SOI et à l'espèce de 16 contrôle SPC, à leurs seuils de détection respectifs. En effet, l'espèce biologique d'intérêt peut être considérée comme détectée avec un niveau de confiance acceptable lorsque la quantité normalisée de séquences assignées à l'espèce biologique d'intérêt est supérieure ou égale au seuil de détection qui lui est associé. Il en est de même de l'espèce de contrôle. En fonction de la comparaison, quatre situations peuvent être distinguées : [0107] - RNso, DTso,et RNspc cf. étape 61 RNso, DTsoiet RNspc SD, la concentration d'espèce biologique d'intérêt ne peut pas être estimée, mais elle peut être considérée comme supérieure au seuil de décision, et donc critique. Sans pouvoir quantifier la concentration de l'espèce biologique d'intérêt, il est possible de conclure à un franchissement du seuil de décision. [0130] Etape 63 [0131] Lorsque RNscn SD, aucune information ne peut être apportée relativement à la présence de l'espèce biologique d'intérêt dans l'échantillon et sa concentration par rapport au seuil de décision. [0138] Etape 64 [0139] Lorsque RNso, 1E5 1.8E6 48 4418 2.2E6 SPC NA 4 1E5 3.1E5 1255 98109 1.9E6 3.0E5 5 1E2 2.0E4 398 2256 1.4E5 SPC NA 6 1E5 4.2E5 3605 129716 8.7E5 2.3E5 7 >1E5 9.6E4 116 1793 3.8E5 SPC NA 8 1E5 3.3E4 0 74 Invalid Invalid 9 1E5 2.9E4 1225 4956 9.8E4 1.6E4 10 1E5 1.5E5 1681 64201 93E5 5.6E4 11 1E4 8.8E5 706 40714 1.4E6 9.7E4 12 1E4 4.4E3 9302 2054 5.3E3 1.0E4 13 1E2 9.5E2 272 3 2.72 SOI NA [0182] Tableau 1 [0183] Les échantillons 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12 et 13 (soit 12 échantillons sur 13) cor- respondent à la configuration décrite en lien avec l'étape 61, dans laquelle une quantification de l'espèce d'intérêt est possible, par exemple selon l'expression (1) et l'expression (1'). [0184] L'échantillon 8 correspond à la configuration décrite en lien avec l'étape 64 : les résultats ne sont pas interprétables. Des investigations complémentaires ont montré, pour cet échantillon, un échec de l'étape de démultiplexage des séquences. Ce cas de figure est intéressant, car il montre que la prise en compte de l'espèce de contrôle 27 permet d'éviter la production d'un résultat "faux négatif". [0185] Pour les échantillons "quantifiables" (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12 et 13), on a estimé la concentration Cso, par l'équation (1'). Cependant, les séquences associées à l'espèce de contrôle SPC ou à l'espèce biologique d'intérêt SOI ne sont parfois pas as-semblables ; dans ce cas, l'espèce biologique d'intérêt n'est pas quantifiable selon ce protocole, alors qu'elle l'est en utilisant l'équation (1). C'est notamment le cas des échantillons 2 et 13, dans lesquels les quantités de séquences associées à l'espèce biologique d'intérêt ne sont pas suffisantes pour obtenir un assemblage et mesurer une profondeur de séquençage. Ainsi, la quantification basée sur l'équation (1') n'est envisageable que lorsque la quantité de séquences est suffisante. Une quantification basée sur l'équation (1) semble préférable. [0186] La figure 2A montre une comparaison de la quantification de S.aureus par culture (axe des abscisses) et par séquençage (axe des ordonnées). Le facteur de corrélation est faible = 0.2929). Cette faible valeur s'explique par un manque de précision de la méthode de culture, ainsi qu'une différence entre la quantité de cellules viables et cultivables, détectées par la culture, et la quantité totale de génomes, détectée par le séquençage. Certains patients sur lesquels les échantillons ont été prélevés sont soumis à une antibiothérapie, ce qui tend à diminuer la proportion de bactéries viables et cultivables par rapport à la totalité des bactéries. Ainsi, la culture ne permet de disposer que d'une information quantitative partielle. [0187] La figure 2B montre une corrélation entre les résultats de quantification par métasé- quençage (équation (1) - axe des ordonnées) et par PCR quantitative (axe des abscisses). Le facteur de corrélation est plus élevé : r2 = 0.9906, ce qui démontre la fiabilité de la quantification par métaséquençage. [0188] Exemple 3 [0189] Dans cet exemple, on a testé la détection des 20 espèces d'intérêt bactériennes pa- thogènes, citées en lien avec l'exemple 1, sur des échantillons issus de lavages broncho-alvéolaires (BAL) ou de mini- lavages broncho-alvéolaires (mini BAL). L'espèce de contrôle SPC (B. subtilis) est obtenue de façon identique à l'exemple 2, la concentration ajoutée à chaque échantillon étant de 1.7E4 CFU/mL. Le seuil de décision est de 1E4 CFU/mL pour les prélèvements BAL, et de 1E3 CFU/mL pour les prélèvements mini BAL. [0190] Deux cohortes d'échantillons ont été collectées : une cohorte d'apprentissage, comportant 46 échantillons (23 BAL et 23 mini-BAL) et une cohorte d'analyse, comportant 40 échantillons (33 BAL et 7 mini-BAL). [0191] Des mesures de référence, par culture, ont été effectuées pour chacune des espèces d'intérêt pour l'ensemble des échantillons composant les cohortes d'apprentissage et d'analyse. 28 [0192] L'échantillon a subi une double lyse, comme décrit en lien avec l'exemple 2. Le sé- quençage a été effectué comme décrit dans l'exemple 2. [0193] Pour chaque espèce d'intérêt, et pour l'espèce de contrôle, la quantité de séquences a été normalisée en rcads par million de rcads associés à des espèces bactériennes(RPMb), cf. étape 50. [0194] Pour chacune des espèces biologiques d'intérêt, on a déterminé le seuil de détection DTso, en ne considérant que les échantillons d'apprentissage pour lesquels l'espèce biologique d'intérêt est considérée comme non détectée. L'espèce d'intérêt est considérée comme non détectée dans un échantillon, lorsque le résultat de culture microhiologique de l'échantillon est négatif pour la détection du SOI considéré et négatif pour la détection de séquences marqueurs MetaPhlAn spécifiques du SOI considéré. La figure 3 représente les distributions statistiques de la quantité de séquence, normalisée, sur des échantillons d'apprentissage négatifs relativement à l'espèce d'intérêt. L'axe des abscisses correspond à chaque espèce d'intérêt, tandis que l'axe des ordonnées correspond à la quantité normalisée de séquences associées à l'espèce d'intérêt. Pour chaque espèce, on a déterminé la valeur médiane (trait inclus dans le rectangle), ainsi que les fractilcs à 25% et 75 % (limites du rectangle), ce qui permet une représentation sous la forme d'une boite à moustache (ou box plot). Les extrémités de chaque ligne verticale correspondent aux fractilcs à 1% et à 99%. On observe que les distributions sont très variables les unes des autres, ce qui justifie qu'un seuil de détection DTs0, soit établi pour chaque espèce biologique d'intérêt. Pour chacune des espèces d'intérêt, un seuil de détection DTso, a été déterminé, selon l'étape 100 précédemment décrite. Si pso, désigne la moyenne du nombre normalisé de séquences assignées à l'espèce d'intérêt, et aso, est leur écart type, le seuil de détection DTso, est obtenu "à 3 sigmas", selon l'expression : [0195] DTsoi = Psol + 3 asol (3) [0196] Le seuil de détection DTsp,-.. = DT 8..''b'isassocié à B. subtilis a été défini. On a pris en compte 7 échantillons d'apprentissage sans ajout de B. subtilis. On a déterminé la moyenne p 8..',1'il, du nombre normalisé de séquences assignées à B. subtilis, ainsi que leur écart-type ci . Le seuil de détection DT est tel que : [0197] DT R_subrius = µ R. s4btills + 3 a R. sib'ls (3) [0198] Un seuil de décision (SD), dit seuil métagénomique, a été défini pour distinguer la présence normale des bactéries d'intérêt et les infections des patients par ces bactéries d'intérêt. Pour cela les résultats des cultures microbiologiques obtenues sur les échantillons composants la cohorte d'apprentissage ont été séparés en 2 populations distinctes : [0199] la population « Infection » correspond aux 20 occurrences détectées par culture à des concentrations égales ou supérieures aux seuils cliniques, à 29 savoir 11±.3 CFU/mL pour les échantillons de miniBAL et Pi4 CFU/mL pour les échantillons de BAL. la population « Colonisation » correspond aux 900 occurrences non détectées par culture ou détectées par culture à des concentrations inférieures aux seuils cliniques, à savoir P'3 CFU/mL pour les échantillons de ininiBAL et P4 CFU/mL pour les échantillons de BAL. [0200] Dans les deux alinéas qui précèdent, les 920 occurrences correspondent aux analyses, par microculture, des 46 échantillons d'apprentissage en considérant respectivement les 20 espèces biologiques d'intérêt. [0201] La figure 4 représente, pour différents échantillons, des quantifications d'espèces bio- logiques réalisées par culture (axe des abscisses) et par analyse métagénomique (axe des ordonnées). Sur la figure 4, les ronds noirs correspondent à une espèce choisie parmi Acinetobacter baumannii, Citrobacter freutzdii, Citrobacter k.oseri, Enterobacter aerogetzes, Escherichia coli, Haemophilus iefluenzae, Haftzia alvei, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Legionella pneutnophila, Morganella morganii, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Providencia stuartii, Pseudomonas aeruginosa'Serratia marcescetzs, Stenotrophomonas tnaltophilia et Streptococcus pneumoniae. Les triangles clairs correspondent à Staphylococcus aureus. [0202] Bien qu'il ne soit parfois pas possible de corréler précisément la concentration obtenue en CFU/mL par culture et la concentration obtenue en GEq/mL par méta séquençage, comme montré dans l'exemple 2 figure 2A, la figure 4 montre que pour une espèce d'intérêt, ou pour un groupe d'espèces d'intérêt, les populations « Colonisation » et « Infection » peuvent également être différenciées à partir des résultats de quantification par séquençage en équivalent génome (GEq). Le seuil métagénomique (SD) est défini en prenant en compte le premier demi centile des concentrations mesurées sur la population « Infection », la valeur ainsi obtenue est 5,5E3 GEq/mL [0203] Ainsi, à partir des échantillons d'apprentissage, on peut définir, un seuil méta- génomique, formant un seuil de décision SD, permettant de séparer respectivement les échantillons dont la concentration en espèce biologique d'intérêt est située au deçà ou au-delà d'une valeur critique. La valeur critique peut notamment correspondre au seuil de décision SD précédemment décrit. La concentration d'une espèce d'intérêt, déterminée par séquençage, est ensuite comparée au seuil de décision lui étant associé. On remarque que le seuil de décision dépend généralement de l'espèce biologique considérée. On peut alors établir un seuil de décision pour une espèce biologique considérée ou pour un groupes d'espèces biologiques. Deux espèces biologiques différentes peuvent être associées à deux seuils de décision différents. [0204] Les 40 échantillons du set d'analyse ont été séquencés. Les tableaux 2A à 2C ras- semblent les résultats obtenus, chaque tableau rassemblant respectivement les résultats des échantillons 1 à 13, 14 à 27 et 28 à 40. La première ligne de chaque tableau comporte les références de chaque échantillon. La deuxième ligne représente la détection (+) ou la non détection (-) de l'espèce de contrôle SPC par rapport au seuil de détection DTs,,c qui lui est associé : cf. étape 60. [0205] Dans les échantillons 3, 7, 23 et 35, l'espèce de contrôle SPC n'a pas été détectée (RN sre DTsa-.). Lorsque l'espèce d'intérêt n'est pas détectée (RNso, DTspc), et que l'espèce biologique d'intérêt a été détectée (RNso, > DTs0,), le nombre de séquences associées à l'espèce biologique d'intérêt est utilisé comme calibrateur pour établir la 31 concentration Cso, de l'espèce biologique d'intérêt, en utilisant l'expression (1) décrite dans l'étape 61. Ces résultats correspondent, dans les tableaux 2A, 2B et 2C : [0210] - à TP (Truc Positive - Vrai Positif) lorsque l'espèce biologique d'intérêt est détectée au-dessus du seuil clinique par la culture rnicrobiologique ; à FP ou FP+ (False Positive-faux Positif) lorsque l'espèce biologique d'intérêt n'est pas détectée au-dessus du seuil clinique par la culture micro-biologique. [0211] 32 [Tahlcaux2A] Echantillon 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 SPC + + + + + + + + + + + A. bautnannil IN V IN V IN V C. freundii IN V IN V C. koseri IN V IN V IN V E. aerogens IN V IN V IN V IN V IN V E. cloacae IN V IN V IN V IN V IN V IN V IN V IN V IN V IN V IN V IN V INV E. coli IN V IN V IN V IN V IN V H. influenzae IN V IN V IN V IN V H. alvei IN V IN V K. oxytoca IN V IN V IN V K. pneumoniae IN V IN V IN V IN V IN V L IN V IN V pneutnophda M. morganii IN V IN V P. nilrabilis IN V IN V P. vulgaris IN V IN V IN V IN V IN V IN V INV P. stuartii IN V IN V 33 P. aeruginosa TP FP IN V S. marcescens IN V FP+ FP+ S. aureus IN V IN V IN V IN V IN V TP S. tnaltophilia IN V IN V IN V S. pnetunoniae TN V IN V TN V IN V IN V TP TP [0212] Tableau 2A [0213] 34 [Tah 'can x 2B] Echantillon 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 SPC + + + + + + + + + + + + A. bautnannil IN V IN V C. freundii IN V C. koseri IN V 1N V E. aerogens IN V IN V E. cloacae IN V IN V IN V IN V IN V IN V IN V IN V IN V IN V IN V IN V INV E. coli IN V IN V IN V H. influenzae IN V IN V H. alvei IN V K. oxyloca IN V IN V K. pneumoniae IN V IN V L 1 N V pneutnophda M. morganii IN V IN V P. nilrabilis IN V P. vulgaris IN V IN V IN V IN V P. stuartii IN V IN V P. aeruginosa TP IN V TP S. marcescens IN V S. aureus IN V IN V S. Inallophilia TP IN V S. pneumoniae FP IN V IN V [0214] Tableau 2B [0215] 36 [Tableaux 2C] 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 SPC + + + + + + + + + + + + + A.baurnanii IN V 1N V IN V 1N V C.freundii FP IN V C koseri IN V IN V 1N V E.aerogens IN V FP+ IN V IN V E.cloacae IN V IN V IN V IN V IN V IN V IN V IN V IN V IN V IN V IN V IN V E.coli IN V IN V IN V IN V IN V IN V H.influenwe IN V IN V TP IN V IN V H.alvei FP IN V K.arytoca FP FP IN V IN V K.pneumoniae FP+ IN V IN V IN V IN V L.pneumophil a IN V M. morganii IN V IN V IN V P.mirabilis IN V P.vulgaris IN V IN V IN V IN V IN V IN V P.suartii IN V IN V 37 P.aeruginosa IN V IN V TP TP FP S.marcescens FP FP FP IN V S.aureus IN V IN V FP+ IN V IN V IN V IN V IN V IN V S.maltophilia IN V IN V IN V IN V IN V FP IN V S.pneumoniae IN V IN V IN V IN V IN V IN V [0216] Tableau 2C [0217] L'analyse par culture microbiologique a permis la détection de 11 occurrences au- dessus du seuil de décision (1'4 CFU/mL pour les échantillons BAL et 1h3 CFU/mL pour les échantillons mini-BAL). L'analyse métagénomique a permis la détection de 10 de ces occurrences, ce qui correspond à la notation TP (True Positive - Vrai Positif) dans les tableaux 2A à 2C. L'occurrence non détectée par la métagénomique correspond à E. cloacae dans l'échantillon 27 et s'explique par l'importante quantité de séquences associée à E. cloacae dans les échantillons dans lesquels cette bactérie est absente, cf. figure 3, ce qui entraine une valeur de seuil de détection très élevée ce qui a pour conséquence une concentration minimale détectable Cmins°, fréquemment supérieure au seuil métagénomique (SM). Ce résultat a été considéré par le test métagénomique comme invalide, cf. INV dans le tableau 2C. [0218] L'analyse métagénomique a permis une détection de 19 occurrences supplémentaires, par rapport à la culture microbiologique. Ces occurrences sont désignées par FP (False Positive - Faux Positif) ou FP+ sur les tableaux 2A à 2C. Les 5 occurrences FP+ correspondent à des détections pour lesquels des marqueurs MetaPhlAn et des alignements BLAST (acronyme de Basic Local Alignment Search Tool) permettent de confirmer la présence de l'espèce d'intérêt dans l'échantillon, malgré sa non détection par culture. Ces occurrences complémentaires sont probablement dues à une meilleure sensibilité du test métagénomique par rapport à la détection par culture micro-biologique qui ne permet que la détection de la part viable et cultivable du microbiote. Les occurrences FP correspondent à des faux positifs pour lesquels le nombre de reads associes aux espèces d'intérêt sont trop faibles pour une confirmation par la recherche des marqueurs MetaPhlAn et les alignements BLAST. Ces occurrences complémentaires sont également probablement dues à une meilleure sensibilité du test métagénomique par rapport à la détection par culture microbiologique, cependant. l'absence 38 de confirmation ne permet pas d'exclure un défaut de spécificité du test métagénomique. [0219] Le test métagénomique a généré 185 résultats invalides, INV dans les tableaux 2A, 2B et 2C. Ces résultats correspondent à la non détection de l'espèce d'intérêt SOI mais dont l'interprétation n'est pas possible car la concentration minimale détectable Cmin so, est supérieure au seuil tnétagénotnique (SM). Cc résultat se distingue particulièrement des résultats de culture microbiologique qui produit généralement des résultats négatifs sans qu'aucun dispositif ne soit utilisé pour valider individuellement la sensibilité de la détection d'une espèce bactérienne dans l'échantillon testé. Le contrôle du test tnétagénotnique permet de limiter le risquer de faux négatifs, cette situation est clairement illustrée par la non détection d'E. cloacae dans l'échantillon 27. [0220] La comparaison des résultats de la détection des pathogènes d'intérêt infectant les patients auxquels sont prélevés les échantillons de BAL et mini-BAL, cf. tableau 3, montre clairement l'intérêt d'utiliser l'espèce de contrôle décrit dans cette invention. La détection de pathogènes au-dessus du seuil de décision clinique, directement à partir du nombre de reads normalisé assigné aux espèces d'intérêt produit près de 9 fois plus de résultats faux positifs. L'utilisation de l'espèce de contrôle de l'échantillon et du calibrateur présenté dans cette invention permet un gain significatif de spécificité du test métagénomique et une meilleure détection des infections sans perte de sensibilité. [0221] [Tableaux3] Vrai positif 10 Faux positif Non confirmable 14 Confirmé par MetaPhlAn et/ou BLAST 5 Infirmé par MetaPhlAn et/ou BLAST 0 Vrai négatif 586 Faux négatif 0 Valeur prédictive positive 34.5% Valeur prédictive négative 100.0% Sensibilité 100.0% Spécificité 96.9% [0222] Tableau 3 [0223] Il a été décrit une application particulière de l'invention aux séquences dit « shotgun ». L'invention s'applique également aux séquences ciblées, par exemple aux séquences dit 165. Dans ce cas, préalablement au séquençage, il est mis en oeuvre une 39 étape d'amplification des gènes ciblés afin de multiplier leurs copies dans l'échantillon. Les rcads utilisés par l'invention sont alors les rcads correspondant uniquement aux gènes ciblés. [0224] TI a été décrit l'utilisation de Bacillus subrnis en tant qu'espèce de contrôle lors d'une analyse métagénomique d'échantillons de type BAL ou mini-BAL. En variante, il peut être utilisé une autre espèce de contrôle, pour autant qu'elle satisfasse à tout ou partie des critères décrits en lien avec l'étape 20. Il peut par exemple s'agir d'une espèce choisie parmi : Acinetobacter haumannii, Gambader freunda, Gambader kose ri, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Haentophilus influenzae, Hafnia alvei, Klebsiella avytoca, Klebsiella pneumoniae, Legionella pneutnophila, Morganella morganii, Proteus mirabilis, Proteus' vulgaris, Providencia stuarai, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcesrens'Staphylococcus aureus'Stenotrophomonas mahophilia et Streptococcus pneutnoniae [0225] TI a été décrit une plusieurs espèces de contrôle sous la forme d'éléments comprenant des acides nucléiques compris ou encapsulés dans membranes (membrane bactérienne, capside, ...). Cette caractéristique est utilisée pour la fonction de contrôle de conformité de l'analyse rnétagénomique, en particulier pour savoir si le processus d'extraction des acides nucléiques a fonctionnée comme attendu. Evidemment, lorsqu'une espèce biologique est mise en oeuvre en tant que calibrateur seul, c'est-à-dire ne mettant pas en oeuvre la fonction de contrôle de conformité, niais uniquement la fonction de quantification, le calibrateur peut consister en des acides nucléiques libres ajoutés à l'échantillon ou dans l'extrait d'ADN en quantité connue. [0226] Il a été décrit l'ajout d'espèces de contrôle et de calibration en une seule fois, à savoir avant l'étape d'extraction des séquences nucléiques. Lorsque deux espèces biologiques différentes sont utilisées pour mettre en oeuvre de manière distincte les fonctions de contrôle de conformité et de quantification (calibrateur), les calibrateurs peuvent être ajoutées à une étape ultérieure, préférentiellement après l'étape de lyse de l'échantillon lorsqu'il s'agit d'acides nucléiques nus afin d'éviter la destruction de ces derniers. [0227] Le procédé selon l'invention permet notamment de doser les espèces biologiques d'intérêt dans un échantillon. De manière préférentielle, dans le cadre d'une application clinique, le procédé selon l'invention est complété d'une étape de détermination d'une antibiothérapie en fonction des espèces identifiées et dosées dans l'échantillon, et d'administration des antibiotiques déterminés au patient. [0228] Le procédé permet une aide au diagnostic d'une contamination d'un échantillon par une espèce d'intérêt, cette dernière pouvant être une bactérie ou un champignon. Cela permet une définition d'un traitement approprié (antibiotique dans le cas d'une bactérie, antifongique dans le cas d'une levure ou d'un champignon), sur la base de l'identité de l'espèce d'intérêt, mais également sur la base d'éventuels marques de résistance aux an- timicrobiens détectées dans le génome. [0229] D'une façon plus générale, en fonction de l'application visée, lorsque la concentration de l'espèce biologique est supérieure au seuil de décision, cela peut être considéré comme signifiant l'occurrence d'une anomalie. Un traitement de remédiation approprié est décidé, visant à remédier à l'anomalie. Par exemple, dans le domaine de l'agroalimentaire, l'espèce d'intérêt peut être une bactérie. Lorsque la concentration excède un certain seuil, le traitement de remédiation peut être un retrait ou une destruction de produits alimentaires destinés à être vendus, et/ou un nettoyage d'une installation de production. Il en est de même dans lorsque l'application concerne un contrôle sanitaire, par exemple un contrôle sanitaire d'une installation, par exemple d'une partie d'un hôpital, de façon à prévenir des infections nosocomiales. La présence avérée d'une espèce biologique indésirable entraîne un traitement de remédiation de type nettoyage ou décontamination. [0230] L'invention pourra être mise en oeuvre dans le domaine de la santé, en tant qu'aide au diagnostic, ou, plus généralement, dans le domaine de l'analyse d'échantillons prélevés dans l'environnement, ou dans des procédés industriels, par exemple l'industrie agroalimentaire, l'industrie, pharmaceutique ou l'industrie des cosmétiques. Elle peut également être mise en oeuvre dans le contrôle sanitaire. 41 [Revendication I] REVENDICATIONSProcédé de détection d'une espèce biologique d'intérêt (SOI) potentiellement présente dans un échantillon d'analyse, l'espèce biologique d'intérêt présentant un génome connu ou partiellement connu, l'échantillon d'analyse comportant un mélange de différentes espèces biologiques, le procédé comportant les étapes suivantes : a) extraction des acides nucléiques de l'échantillon d'analyse ; h) séquençage des séquences de nucléotides extraites lors de l'étape a) ; c) à partir du résultat du séquençage (i.) assignation des séquences résultant de l'étape b) à partir d'une base de séquences de référence ; (ii) détermination d'une quantité de séquences (R501. RNso,) assignées à l'espèce biologique d'intérêt; (iii) prise en compte d'un seuil de détection (DTs0,) associé à l'espèce biologique d'intérêt; (iv) comparaison de la quantité résultant de la sous-étape (ii) au seuil de détection pris en compte lors de la sous-étape (iii) ; le procédé étant caractérisé en cc qu'il comporte, préalablement à l'étape a), l'ajout d'une espèce de contrôle, l'espèce de contrôle étant ajoutée selon une concentration connue, dans l'échantillon d'analyse, l'espèce de contrôle présentant un génome connu, et en cc que l'étape c) comporte : (y) détermination d'une quantité de séquences (RSPC, RNSPC) assignées à l'espèce de contrôle; (vi) prise en compte d'un seuil de détection (DTSPC) associé à l'espèce de contrôle; (vii) comparaison de la quantité résultant de la sous-étape (y) avec le seuil de détection pris en compte lors de la sous-étape (vi) ; d) utilisation des comparaisons effectuées lors des sous-étapes (iv) et (vii) pour déterminer une présence de l'espèce biologique d'intérêt clans l'échantillon. 42 [Revendication 2] [Revendication 3] [Revendication 4] [Revendication 5] [Revendication 6] [Revendication 7] Procédé selon la revendication 1, dans lequel lors des sous- étapes (ii) et (y) les quantités de séquence respectivement assignées à l'espèce biologique d'intérêt et à l'espèce de contrôle sont normalisées par une quantité de référence. Procédé selon la revendication 1, comportant une prise en compte d'un seuil de décision (SD), et dans lequel l'étape d) comporte, en fonction des comparaisons effectuées lors des sous-étapes iv) et vii), une confirmation ou une non confirmation de la présence de l'espèce biologique d'intérêt en dessus ou en dessous du seuil de décision. Procédé selon la revendication 3, dans lequel la quantité de référence est le nombre total de séquences produites au cours du séquençage. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel lors de l'étape d) : lorsque la quantité de séquences (RNsi,c) assignées à l'espèce de contrôle est supérieure au seuil de détection (DTspc) associé à l'espèce de contrôle ; et lorsque la quantité de séquences (RNso,) assignées à l'espèce biologique d'intérôt est supérieure au seuil de détection (DTsol) associé à l'espèce biologique d'intérêt; l'étape d) comporte une confirmation de la présence de l'espèce biologique d'intérêt dans l'échantillon d'analyse. Procédé selon la revendication 5, dans lequel l'étape d) comporte également une estimation d'une concentration de l'espèce biologique d'intérêt. Procédé selon la revendication 6, comportant l'ajout d'un calibrateur, une concentration connue, dans l'échantillon, le calibrateur présentant un génome connu, et dans lequel l'estimation de la concentration de l'espèce biologique d'intérêt comporte: détermination d'une quantité de séquences assignées au calibrateur ; détermination d'un premier ratio, entre les quantités de séquences respectivement assignées à l'espèce biologique d'intérêt et au calibrateur ; détermination d'un deuxième ratio, entre les tailles de génome respectives du calibrateur et de l'espèce biologique d'intérêt ; prise en compte de la concentration du calibrateur ajoutée dans 43 [échantillon d'analyse. [Revendication 8] Procédé selon la revendication 7, dans lequel l'estimation de la concentration d'espèce biologique d'intérêt comporte un calcul d'un produit du premier ratio par le deuxième ratio et par la concentration du calibrateur ajouté dans l'échantillon d'analyse. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 ou 8, dans lequel l'espèce de contrôle (SPC) fait office de cal ihratcur. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 ou 4, dans lequel lors de l'étape d) : lorsque la quantité de séquences (RNspc) assignées à l'espèce de contrôle est supérieure au seuil de détection (DTspc) associé à l'espèce de contrôle ; et lorsque la quantité de séquences (RNsol) assignées à l'espèce biologique d'intérêt est inférieure au seuil détection (DTspc) associé à l'espèce biologique d'intérêt ; [Revendication 9] [Revendication 10] [Revendication 11] l'étape d) comporte : estimation d'une concentration minimale détectable (Cminso,) de l'espèce biologique d'intérêt ; comparaison de la concentration minimale de l'espèce biologique d'intérêt (Cminso,) avec le seuil de décision (SD), de telle sorte que lorsque la concentration minimale de l'espèce biologique d'intérêt est inférieure au seuil de décision, il est estimé que l'espèce biologique d'intérêt n'est pas présente dans l'échantillon d'analyse à une concentration supérieure au seuil de décision. Procédé selon la revendication 10, dans lequel l'estimation de la concentration minimale détectable (Cminscll) comporte : détermination d'un premier ratio, entre le seuil de détection de l'espèce biologique d'intérêt et de la quantité de séquences assignées à l'espèce de contrôle ; détermination d'un deuxième ratio de tailles, entre les tailles de 44 génome respectives de l'espèce de contrôle et de l'espèce biologique d'intérêt ; prise en compte de la concentration de l'espèce de contrôle ajoutée dans l'échantillon d'analyse. [Revendication 12] Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 ou 4, dans lequel lors de l'étape d) : lorsque la quantité de séquences (RNspc) assignées à l'espèce de contrôle est inférieure au seuil de détection (DTspc) associé à l'espèce de contrôle ; et lorsque la quantité de séquences (RNsol) assignées à l'espèce biologique d'intérêt est supérieure au seuil de détection (DTsol) associé à l'espèce biologique d'intérêt; [Revendication 13] l'étape d) comporte une comparaison de la concentration de l'espèce de contrôle ajoutée à l'échantillon d'analyse avec le seuil de décision, de telle sorte que : lorsque la concentration de l'espèce de contrôle (Cspc) ajoutée à l'échantillon d'analyse est supérieure au seuil de décision (SD), l'étape d) comporte une confirmation de la présence de l'espèce biologique d'intérêt dans l'échantillon d'analyse selon une concentration supérieure au seuil de décision ; lorsque la concentration de l'espèce de contrôle (Cspc) ajoutée à l'échantillon d'analyse est inférieure au seuil de décision (SD), confirmation de la présence de l'espèce biologique d'intérêt dans l'échantillon d'analyse. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel lors de l'étape d), lorsque la quantité de séquences (RNspc) assignées à l'espèce de contrôle est inférieure au seuil de détection (DTspc) associé à l'espèce de contrôle ; et lorsque la quantité de séquences (RNsoi) assignées à l'espèce biologique d'intérêt est inférieure au seuil de détection (DTsol) associé à l'espèce biologique d'intérêt; 45 [Revendication 14] aucune confirmation quant à la présence de l'espèce biologique d'intérêt ne peut être donnée. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comportant une phase préalable de détermination du seuil de détection (DTs0,) associé à l'espèce biologique d'intérêt, en utilisant une pluralité de premiers échantillons entraînement, considérés comme ne comportant pas l'espèce biologique d'intérêt (SOI), le procédé comportant, pour chaque premier échantillon de test : extraction de séquences de nucléotides ; séquençage des séquences de nucléotides ainsi extraites ; détermination d'une quantité de séquences d'intérêt, assignées à l'espèce biologique d'intérêt; éventuellement normalisation des quantités de séquences d'intérêt assignées à l'espèce biologique d'intérêt ; le procédé comportant alors : calcul d'un indicateur de dispersion des quantités, ou des quantités normalisées, dc séquences d'intérêt déterminées pour chaque premier échantillon entraînement ; détermination du seuil dc détection associé à l'espèce biologique d'intérêt en fonction de l'indicateur de dispersion ainsi calculé. [Revendication 15] Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comportant une phase préalable de détermination du seuil de détection (DTspc) associé à l'espèce de contrôle, en utilisant une pluralité de deuxièmes échantillons entraînement, considérés comme ne comportant pas l'espèce de contrôle, le procédé comportant, pour chaque deuxième échantillon de test : extraction de séquences de nucléotides ; séquençage des séquences de nucléotides ainsi extraites ; détermination d'une quantité de séquences, assignées à l'espèce de contrôle ; éventuellement normalisation des quantités de séquences assignées à l'espèce de contrôle ; 46 le procédé comportant alors : calcul d'un indicateur de dispersion des quantités, ou des quantités normalisées, de séquences assignées à l'espèce de contrôle, déterminées pour chaque deuxième échantillon entraînement; détermination du seuil de détection associé à l'espèce de contrôle en fonction de l'indicateur de dispersion ainsi calculé. [Revendication 16] [Revendication 17] [Revendication 18] Procédé selon la revendication 15, dans lequel un deuxième échantillon entraînement est un échantillon d'analyse, sans ajout de l'espèce de contrôle. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les étapes c) et d) sont effectuées parallèlement respectivement pour différentes espèces biologiques d'intérêt, chaque espèce biologique d'intérêt étant considérée comme potentiellement présente dans l'échantillon. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comportant, préalablement à l'étape a), un ajout de plusieurs espèces de contrôle, de telle sorte que pour une même espèce d'intérêt, les étapes c) et d) sont effectuées en prenant en compte plusieurs espèces de contrôle, les sous-étapes v) à vii) étant mises en oeuvre, parallèlement, pour chaque espèce de contrôle.