Brevet FR3087793A1 — publié le 20200501

UTILISATION D'UN OEUF GREFFE AVEC DES CELLULES TUMORALES POUR ETUDIER L'EFFICACITE ANTI-CANCEREUSE D'IMMUNOTHERAPIES, EN L'ABSENCE DE CELLULES EFFECTRICES IMMUNITAIRES AUTRES QUE CELLES DE L'OEUF GREFFE. DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne le domaine de l'immuno-oncologie et en particulier de la médecine personnalisée afin de prescrire aux patients atteints de cancers l'immunothérapie la plus prometteuse en termes d'efficacité. ART ANTERIEUR En dépit des solutions thérapeutiques déjà existantes dans le traitement du cancer (chirurgie, irradiation, chimiothérapies, et thérapies ciblées), certaines tumeurs malignes restaient incurables jusqu'à la découverte des mécanismes par lesquels le système immunitaire peut agir sur la tumeur. Ces avancées dans le domaine ont permis de mettre en place une nouvelle voie thérapeutique qu'est l'immunothérapie, qui cherche à réactiver ou stimuler le système immunitaire pour que celui-ci attaque spécifiquement les cellules tumorales. zo Un des intérêts de l'immunothérapie est en effet de développer des traitements non pas dépendants d'un type de cancer donné, mais du profil génétique et de la présence de biomarqueurs spécifiques dans la tumeur (type PDL-1). Ces traitements tiennent ainsi compte du profil du patient et de sa tumeur, un premier pas vers une médecine personnalisée. zs Différentes voies d'action sont envisagées et ont donné des résultats prometteurs depuis 2010 : - l'utilisation d'anticorps monoclonaux, associés ou non à des molécules cytotoxiques, - l'utilisation d'inhibiteurs de points de contrôle immunitaire ou immune 30 checkpoints (points de contrôle de voies spécifiquement activées ou inhibées dans les mécanismes du cancer) pour activer ou inhiber certains mécanismes 2 impliquant le système immunitaire dans le développement, tels que l'utilisation d'un inhibiteur de CTLA-4 (ipilimumab), - stimuler le système immunitaire pour que celui-ci lutte plus efficacement contre les cellules tumorales, notamment à l'aide d'immunothérapies non ciblées, de 5 vaccins anti cancer, préventifs ou curatifs, - l'utilisation du système thérapie cellulaire adoptive tels que par exemple les CAR-TCell (Chimeric Antigen Receptor T cells), qui vise à modifier in vitro les cellules de patients qui sont ensuite ré-injectées chez le patient pour lutter contre la tumeur, aux résultats prometteurs. io La plupart des immunothérapies nécessitent la présence de cellules immunitaires pour être efficaces, ce qui limite les possibilités de tests in vitro sur ce genre de molécules. Les phases de développement passent ainsi rapidement sur des modèles animaux, principalement chez la souris. Les modèles murins développant de manière spontanée des tumeurs ne 15 présentent pas la complexité génétique qu'il existe dans les tumeurs chez les patients, ce qui peut inhiber tout effet de traitement ou à l'inverse l'amplifier. Il est alors difficile d'extrapoler les résultats chez l'homme. Les premiers modèles in vivo utilisés pour les xénogreffes ont été des souris immunodéficientes, ce qui facilite le développement de la tumeur qui n'est pas attaquée par le système immunitaire de l'hôte. Ces modèles de souris ont ensuite été « humanisés » en réalisant des modèles transgéniques par expression de gènes humains (knock-in), ou par greffe de cellules hématopoïétiques humaines chez des souris immunodéficientes. Néanmoins, ces modèles présentent plusieurs inconvénients, tels que le temps de développement du modèle qui prend plusieurs mois avant de pouvoir obtenir le début d'un résultat, ou encore la vitesse de développement de la tumeur, qui est plus rapide que chez l'homme, ce développement ne s'accompagnant pas d'une inflammation chronique dans l'environnement tumorale comme cela existe chez l'homme. Au vu de ces difficultés, des coûts afférents et du temps de réalisation que nécessitent des études sur un modèle de souris humanisées, il existe donc un besoin de développer d'autres modèles plus simples, rapides et fiables, afin de développer et de valider l'efficacité de nouvelles immunothérapies. 3 RESUME DE L'INVENTION La présente invention concerne l'utilisation d'un modèle d'ceuf embryonné d'oiseau greffé, en particulier au niveau de la membrane chorioallantoïque (CAM), avec des cellules tumorales pour évaluer l'activité anti-cancéreuse d'une ou 5 plusieurs molécule(s) immunothérapeutique(s), dans laquelle ledit modèle exclu la présence de cellules effectrices immunitaires autres que celles de liceuf greffé. En particulier, et lorsque les cellules tumorales sont issues d'un échantillon de patient atteint de cancer, le fait de tester plusieurs molécules immunothérapeutiques permet de pouvoir déterminer celle qui sera la plus 10 prometteuse en termes d'efficacité de traitement du cancer chez ce patient. Dans le cadre de l'utilisation de cet veuf embryonné, il est également possible de déterminer, voire de quantifier, la toxicité de la ou des molécules immunothérapeutiques testées, à la fois sur les tumeurs qui se sont développées à partir des cellules tumorales greffées et sur l'embryon dans son ensemble. 15 La présente invention concerne également un procédé d'évaluation de l'activité anti-cancéreuse d'une ou plusieurs molécule(s) immunothérapeutique(s), caractérisé en ce qu'il comprend : - la greffe de cellules tumorales au niveau de la membrane chorioallantoïque (CAM) d'un veuf embryonné d'oiseau préalablement incubé jusqu'à un stade de 20 développement correspondant à la formation de la CAM et équivalent à au moins 8 jours de développement chez l'embryon de poulet, - l'administration de la ou des molécules immunothérapeutiques dans l'oeuf embryonné au moins 12h après la greffe, - l'étude de l'effet de la ou des molécules immunothérapeutiques ainsi 25 administrée(s) sur la tumorigenèse des tumeurs qui se sont développées dans rceuf embryonné greffé, et qu'il est mis en oeuvre en l'absence et sans ajout de cellules immunitaires effectrices autres que celles de l'oeuf greffé. 4 La présente invention est aussi relative à un procédé de criblage de molécules immunothérapeutiques ayant une activité anti-cancéreuse, comprenant les étapes suivantes : - la greffe de cellules tumorales au niveau de la membrane chorioallantoïque 5 (CAM) d'un oeuf embryonné d'oiseau préalablement incubé jusqu'à un stade de développement correspondant à la formation de la CAM, et équivalent à moins 8 jours de développement chez le poulet, - l'administration de la ou des molécules immunothérapeutiques candidates dans l'oeuf embryonné au moins 12 heures après la greffe, 10 - l'étude de l'effet de la ou des molécules immunothérapeutiques ainsi administrée(s) sur la tumorigenèse des tumeurs qui se sont développées dans l'oeuf embryonné greffé, ledit procédé étant mis en oeuvre en l'absence et sans ajout de cellules immunitaires effectrices autres que celles de l'oeuf greffé. 15 La présente invention se rapporte enfin à un procédé de suivi d'un patient ou d'un animal atteint de cancer, comprenant : - la préparation d'un premier oeuf embryonné d'oiseau comme décrit ci-dessus avec des cellules tumorales issues dudit patient ou animal à un instant T1, et l'étude de la tumorigenèse des tumeurs qui se développent dans ce premier oeuf 20 embryonné, - la préparation d'un second oeuf embryonné d'oiseau comme décrit ci-dessus avec des CTC issues du même patient ou animal à un instant T2, et l'étude de la tumorigenèse des tumeurs qui se développent dans ce second oeuf embryonné, - la comparaison de la tumorigenèse des tumeurs qui se sont développées dans le 25 premier et dans le second oeuf embryonné, ledit procédé étant mis en oeuvre en l'absence et sans ajout de cellules immunitaires effectrices autres que celles des oeufs greffés. 5 La présente invention exclut la présence de cellules immunitaires effectrices autres que celles de l'oeuf embryonné d'oiseau dans lequel les cellules tumorales sont greffées. A aucun moment, les utilisations et les procédés selon la présente invention ne 5 peuvent inclure la présence ni l'ajout de cellules immunitaires effectrices autres que celles de l'oeuf embryonné dans lequel les cellules tumorales sont greffées. LEGENDES DE FIGURES La Figure 1 représente un modèle d'oeuf embryonné avec la zone de dépôt des 10 cellules tumorales et les principaux tissus présents. La Figure 2 représente un exemple de chronologie de l'étude de la greffe des cellules à la collecte des échantillons. La Figure 3 représente l'effet du traitement avec le Tecentriq sur les tumeurs initiées à partir de cellules MDA-MB-231. 15 La Figure 4 représente l'effet du traitement avec le Keytruda sur les tumeurs initiées à partir (A) de cellules MDA-MB-231 ou (B) de cellules SU-DHL-4. La Figure 5 représente l'effet du traitement avec le RMP1-14 sur les tumeurs initiées à partir de cellules SU-DHL-4. La Figure 6 représente l'effet d'un traitement avec le Keytruda sur les métastases 20 dans la CAM inférieure après greffe de cellules MDA-MB-231. La Figure 7 représente la quantité relative (par rapport au groupe contrôle négatif) de l'expression de CD3 (A) et CD45 (B), dans des tumeurs obtenues à partir de cellules SU-DHL-4 avec ou sans traitement Keytruda (anti-PD-1). La Figure 8 représente la quantité relative (par rapport au groupe contrôle négatif) 25 de l'expression de CD3 (A) et CD4 (B), dans des tumeurs obtenues à partir de cellules SU-DHL-4 avec ou sans traitement Tecentriq (anti-PD-L1). DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION La présente invention concerne l'utilisation d'un oeuf embryonné d'oiseau greffé, 30 en particulier au niveau de la CAM, avec des cellules tumorales pour évaluer 6 l'activité anti-cancéreuse d'une ou plusieurs molécule(s) immunothérapeutique(s), dans laquelle ledit modèle exclu la présence de cellules effectrices immunitaires autres que celles de l'oeuf greffé. Le modèle d'ceuf embryonné, en particulier de poulet, avec greffe de tumeur au 5 niveau de la membrane chorio-allantoidienne (CAM) est déjà largement utilisé pour les tests d'efficacité et de toxicité de nombreux types de traitement anti cancéreux, tels que des chimiothérapies, des peptides ou encore des nanoparticules. Les inventeurs ont démontré, de manière surprenante, que ce modèle peut être utilisé de la même manière pour tester l'efficacité de molécules immunothérapeutiques en utilisant uniquement le système immunitaire de l'oeuf greffé, bien qu'il soit très différent de celui de l'homme. L'utilisation de ce modèle selon l'invention est donc mise en oeuvre en l'absence et sans ajout de cellules effectrices immunitaires autres que celles de l'oeuf embryonné greffé. Cette mise 15 en oeuvre fait donc appel uniquement au système immunitaire de l'oeuf greffé. Une telle mise en oeuvre de ce modèle présente plusieurs avantages par rapport aux modèles existants, tels que - le coût (de l'oeuf comparé à une souris et à son entretien en animalerie pendant plusieurs semaines ou mois); 20 - la présence d'un système immunitaire complet, qui ne nécessite donc ni la présence ni l'ajout de cellules immunitaires effectrices autres que celles de l'oeuf embryonné greffé. De plus, ce modèle étant un modèle embryonnaire, le système immunitaire est encore en développement. Celui-ci n'est pas encore totalement mature au 25 moment de la greffe des cellules ; ce qui facilite la prise de greffe et limite le risque de rejet des tumeurs. La maturation de ce système immunitaire est néanmoins suffisante quelques heures après la greffe pour pouvoir être activé par des composés immuns thérapeutiques et ainsi valider l'efficacité de ceux-ci. 7 De préférence, l'oeuf embryonné selon l'invention est un veuf d'oiseau de l'ordre des Galliformes ou des Struthioniformes. En particulier, il est particulièrement préféré que l'oeuf soit un veuf de gallinacés, et notamment de poulet, caille, dinde, faisan, paon, pintade ou d'autres oiseaux de basse-cour. Il peut également être un 5 oeuf d'autruche. Avantageusement, l'oeuf embryonné selon la présente invention est un oeuf de poulet (Gallus gallus). Dans le cadre de la présente invention, le terme « oeuf embryonné » désigne un oeuf d'oiseau fécondé dans lequel l'embryon peut se développer dans des conditions appropriées, en particulier dans un incubateur à une température de 10 37°C à 38°C. Dans ces conditions, le temps d'incubation nécessaire pour aboutir à l'éclosion de l'oeuf est de 21 jours pour le poulet. Les stades de développement renseignés ici sont définis en fonction du temps d'incubation post-fécondation des oeufs, en particulier du temps d'incubation dans les conditions appropriées telles que définies ci-dessus. 15 Par « greffe au niveau de la CAM », on entend désigner l'administration par apposition ou injection sur la CAM, que ce soit la CAM supérieure (upper CAM) ou inférieure (lower CAM). Le modèle d'oeuf embryonnè qui est utilisé selon l'invention possède des cellules issues de deux organismes différents ou xénogreffes : les cellules de l'oiseau 20 « hôte » ou « receveur » et les CTC greffées dans l'oeuf qui sont issues d'un organisme humain ou animal d'une espèce différente de celle de l'oiseau « receveur ». De manière particulièrement préférée, les CTC greffées dans l'oeuf embryonné d'oiseau sont des cellules humaines. Ces cellules CTC greffées vont ensuite se développer dans l'embryon en formant une ou plusieurs tumeurs 25 solides et/ou en se déplaçant dans l'oeuf. Selon l'invention, la greffe des cellules tumorales est réalisée en l'absence de cellules effectrices immunitaires autres que celles de l'oeuf embryonnè et l'utilisation dudit oeuf une fois greffé exclus la présence et l'ajout de cellules effectrices immunitaires autres que celles de l'oeuf greffé. 8 Par définition, la « greffe au niveau de la CAM » a lieu une fois la CAM formée et à un stade équivalent à au moins 8 jours de développement chez le poulet dans des conditions de croissances normales et standard. Si l'oiseau utilisé est le poulet, ce stade correspond à au moins 8 jours de développement. Le nombre de jours de 5 développement pouvant varier d'une espèce à l'autre, la greffe peut intervenir à des jours de développement qui varient. Par exemple, un stade de développement d'au moins 8 jours chez le poulet correspond à un stade de développement d'au moins 6,5 jours chez la caille. Il est entendu que l'embryon greffé qui est utilisé selon la présente invention n'a 10 pas vocation à éclore et n'est par conséquent pas destiné à créer un organisme adulte. Il s'agit uniquement de l'utilisation d'un modèle animal le temps de l'étude des effets de molécule(s) immunothérapeutique(s), n'allant pas jusqu'à l'éclosion, qui correspond à 21 jours de développement chez le poulet. En tout état de cause, l'embryon d'oiseau qui est utilisé selon l'invention sera sacrifié, selon les règles 15 d'éthique en vigueur, après que les cellules tumorales greffées auront conduit au développement d'une ou plusieurs tumeurs dans l'oeuf et avant l'éclosion. Les cellules tumorales greffées peuvent être des lignées cellulaires tumorales de différents types de cancers, mais également être issues d'un échantillon de tumeur d'un patient atteint de cancer, comme par exemple d'une biopsie de la 20 tumeur de ce patient ou tout autre échantillon biologique qui contient des cellules tumorales issues de ce patient, dès lors que les cellules immunitaires effectrices auront été éliminées c'est-à-dire que seules les cellules tumorales auront été isolées à partir de cet échantillon biologique. Dans le cadre de la présente invention, que ce soit lors de la greffe de lignées 25 cellulaires tumorales ou d'un échantillon biologique issu d'un patient atteint de cancer dont les cellules immunitaires effectrices ont été éliminées, aucun ajout de cellules immunitaires effectrices ne sera effectué lors de l'utilisation du modèle d'oeuf embryonné ou de la mise en oeuvre des procédés selon l'invention. De préférence, ledit patient est un individu humain. Dans ce cas, l'échantillon est 30 une xénogreffe dérivée de la tumeur dudit patient ou PDX (patient-derived xenograft). 9 Les cellules tumorales greffées dans l'oeuf embryonné peuvent provenir en particulier de cancer du poumon, de cancer de la prostate, de cancer du sein, de mélanomes, de cancer du rein et tout autre cancer pouvant bénéficier d'un traitement par immunothérapie. 5 Avantageusement, le modèle d'oeuf embryonné utilisé selon l'invention est un oeuf de poulet dans lequel des cellules tumorales, de préférence humaines, ont été greffées au niveau de la CAM. De manière préféré, l'utilisation du modèle d'oeuf de poulet greffé exclu la présence de cellules effectrices immunitaires humaines. Par « cellules immunitaires effectrices », on entend les lymphocytes, en particulier io les lymphocytes T, B et NK, les macrophages et les cellules dendritiques. Dans le cadre de la présente invention, on utilise indifféremment, et avec la même signification, les termes tumeur et cancer, pour définir une prolifération de cellules malignes. Il en va de même avec l'utilisation des termes antitumoral et anticancéreux. 15 Par « molécule immunothérapeutique » on entend désigner tout composé ou produit capable d'activer une réponse immunitaire ou de rétablir l'action développée par le système immunitaire du patient contre sa tumeur. Ces molécules immunothérapeutiques ciblent les fonctions de contrôle du système immunitaire qui ont été bloquées par la tumeur. De tels composés peuvent être 20 des anticorps, notamment des anticorps monoclonaux, des adjuvants, des molécules chimiques etc. Dans l'oeuf embryonné utilisé selon l'invention, les molécules immunothérapeutiques sont en l'occurrence capables de stimuler la réponse immunitaire de l'oiseau « hôte » ou « receveur » contre le cancer qui se développe à partir des cellules tumorales greffées. Parmi les molécules 25 immunothérapeutiques, on peut notamment citer les thérapies cellulaires adoptives telles que les CAR-T, les vaccins, les anticorps bi spécifiques, les inhibiteurs de point de contrôle immunitaires tels que des anticorps anti-PD1, ou anti-PDL1, ou anti CTLA-4. En particulier, et lorsque les cellules tumorales sont issues d'un échantillon de 30 patient atteint de cancer, le fait de tester plusieurs molécules immunothérapeutiques permet de pouvoir sélectionner la molécule 10 immunothérapeutique qui est la plus prometteuse pour le traitement de la tumeur chez ce patient. C'est ainsi que selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, l'oeuf embryonné d'oiseau greffé avec des cellules tumorales est utilisé pour déterminer celle qui présente la meilleure activité anti-cancéreuse 5 parmi les différentes molécules immunothérapeutiques testées. L'ceuf embryonné d'oiseau greffé avec les cellules tumorales peut également être utilisé selon la présente invention pour tester l'efficacité anti-cancéreuse de combinaisons de molécules immunothérapeutiques par rapport à l'effet obtenu avec chacune des molécules testées indépendamment. Dans le cadre de l'utilisation de cet oeuf embryonné, il est aussi possible de déterminer, voire quantifier, la toxicité de la ou des molécules immunothérapeutiques testées, à la fois sur les tumeurs qui se sont développées à partir des cellules tumorales greffées et sur l'embryon dans son ensemble. Par conséquent, un autre objet de la présente invention concerne l'utilisation d'un oeuf 15 embryonné d'oiseau greffé avec des cellules tumorales pour quantifier la toxicité d'une ou plusieurs molécule(s) immunothérapeutique(s) sur la tumeur et/ou sur l'embryon dans son ensemble. Selon un mode de réalisation préféré, les utilisations selon la présente invention qui sont décrites ci-dessus sont réalisées avec un oeuf embryonné d'oiseau greffé 20 qui a été préalablement incubé jusqu'à un stade de développement correspondant à la formation de la CAM et équivalent à au moins 9 ou de manière encore plus préférée 9,5 jours de développement chez le poulet. La présente invention concerne également un procédé d'évaluation de l'activité anti-cancéreuse d'une ou plusieurs molécule(s) immunothérapeutique(s), 25 caractérisé en ce qu'il comprend : - la greffe de cellules tumorales au niveau de la membrane chorioallantoïque (CAM) d'un veuf embryonné d'oiseau préalablement incubé jusqu'à un stade de développement correspondant à la formation de la CAM et équivalent à au moins 8 jours chez le poulet au moment de la greffe ; 11 - l'administration de la ou des molécules immunothérapeutiques dans l'oeuf embryonné au moins 12h après la greffe, - l'étude de l'effet de la ou des molécules immunothérapeutiques ainsi administrée(s) sur la tumorigenèse des tumeurs qui se sont développées dans 5 l'oeuf embryonné greffé, et qu'il est mis en oeuvre en l'absence et sans ajout de cellules immunitaires effectrices autres que celles de l'oeuf greffé. L'homme du métier saura déterminer le moment pour réaliser la greffe des cellules tumorales en fonction de l'espèce d'oiseau utilisée, c'est-à-dire le nombre de jours 10 d'incubation ou de développement minimum de l'oeuf embryonné pour arriver à formation de la CAM, et à un stade de développement équivalent à au moins 8 jours de développement chez le poulet. Par exemple, chez le poulet, la greffe pourra intervenir à partir de 8 jours de développement, et chez la caille à partir de 6,5 jours de développement. 15 Selon un mode de réalisation préféré, l'oeuf embryonné a été, préalablement à la greffe, incubé jusqu'à un stade de développement correspondant à la formation de la CAM, et équivalant à au moins 9 ou de manière encore plus préférée 9,5 jours de développement chez le poulet. Les incubations sont réalisées dans des conditions appropriées, c'est-à-dire des 20 conditions qui permettent le développement normal de l'ceuf embryonné, notamment à une température comprise entre 37°C et 39°C, et de préférence 38°C, voire 38,5°C. La greffe des cellules tumorales peut être réalisée à n'importe quel endroit de la CAM, supérieure ou inférieure, de préférence au niveau de la CAM supérieure. 25 Toute méthode bien connue de l'homme du métier pourra être utilisée pour cette greffe, et en particulier, il est possible d'utiliser la technique de greffe référencée par Crespo P. & Casar B., 2016. Selon un mode de réalisation particulier, la quantité de cellules tumorales greffées va d'environ 10 cellules à environ 5.106cellules. 30 Selon un mode de réalisation préféré, les cellules tumorales utilisées ont été congelées avant la greffe dans l'oeuf embryonné, que ce soit pour des lignées 12 cellulaires ou pour des cellules tumorales obtenues à partir d'un échantillon de patient ou d'animal atteint de cancer. Selon un mode de réalisation de l'invention les cellules tumorales obtenues à partir d'un échantillon de patient ou d'animal atteint de cancer sont purifiées 5 préalablement à la greffe dans l'ceuf embryonné. Cette purification peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier, et notamment par celles décrites en 2013 par Han Wei Hou et al. ou encore en 2017 par Laget S et al. lorsqu'il s'agit de Cellules Tumorales Circulantes (CTC), celle décrite en 2013 par Petit Vincent et al. lorsqu'il s'agit de cellules tumorales isolées à partir de 10 xénogreffes dérivées de cellules de patients (Patient Derived Xenograft ou PDX) et enfin celles décrites par DeBord Logan C et al. en 2018. En particulier, lorsque les cellules tumorales greffées sont issues d'un échantillon de patient ou d'animal atteint de cancer, le fait de tester plusieurs molécules immunothérapeutiques permet de pouvoir sélectionner celle qui est la plus 15 prometteuse pour le traitement de la tumeur chez ce patient ou cet animal. C'est ainsi que selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, le procédé d'évaluation de l'activité anti-cancéreuse d'une ou plusieurs molécule(s) immunothérapeutique(s) permet de déterminer la molécule immunothérapeutique qui présente la meilleure activité anti-cancéreuse parmi les différentes testées. 20 Le procédé d'évaluation de l'activité anti-cancéreuse d'une ou plusieurs molécule(s) immunothérapeutique(s) selon la présente invention permet également de tester l'efficacité anti-cancéreuse de combinaisons de molécule(s) immunothérapeutique(s) par rapport à l'effet obtenu avec chacun des molécule(s) immunothérapeutique(s) testées indépendamment. 25 L'étape d'administration de la ou des molécules immunothérapeutiques dans l'ceuf embryonné peut être réalisée de différentes manières par des techniques bien connues de l'homme du métier. L'administration peut notamment être réalisée par apposition ou injection au niveau de la CAM, par injection intra-tumorale, par injection dans les structures embryonnaires ou extra-embryonnaires de l'ceuf. 30 L'administration de la ou des molécules immunothérapeutiques est réalisée au moins 12h après la greffe des cellules tumorales, de préférence au moins 24h ou de manière encore préférée au moins 48h après la greffe, c'est-à-dire 1 à 2 jours 13 après la greffe. La ou les molécules immunothérapeutiques peuvent être administrées selon différents schémas en termes de durée, mais également de nombre d'administrations, comme par exemple tous les deux jours, ou tous les jours, ou deux fois par jour, ou une injection unique, et ce jusqu'au dernier jour 5 d'incubation de l'ceuf. Ces choix seront déterminés en fonction de la molécule immunothérapeutique administrée. Selon un mode de réalisation préféré, le procédé d'évaluation de l'activité anticancéreuse d'une ou plusieurs molécule(s) immunothérapeutique(s) selon l'invention, comprend en outre l'incubation de l'oeuf embryonné une fois greffé pendant au moins 1 heure, après administration de la ou des molécules immunothérapeutiques dans l'ceuf embryonné greffé, avant d'étudier l'effet sur la tumorigenèse. Avantageusement, l'incubation est réalisée pendant au moins 4 jours et au maximum 12 jours, pour correspondre à un stade de développement de l'embryon de 21 jours maximum, avantageusement 18 jours de 15 développement. Selon un mode de réalisation particulier, le procédé pour évaluer l'activité anticancéreuse d'une ou plusieurs molécule(s) immunothérapeutique(s) selon l'invention comprend en outre le prélèvement des tumeurs qui se développent à partir des cellules tumorales greffées au terme de l'incubation dudit ceuf 20 embryonné après administration de la ou des molécules immunothérapeutiques qui ont été administrées, et notamment par microdissection. L'étude de l'effet de la ou des molécules immunothérapeutiques ainsi administrée(s) sur la tumorigenèse peut revêtir plusieurs approches complémentaires, en particulier après prélèvement des tumeurs qui se sont 25 développées dans l'ceuf embryonné greffé. Elle peut notamment comprendre l'analyse de paramètres tels que la croissance tumorale, l'invasion métastatique, l'angiogenèse, la néo-angiogenèse, l'inflammation et/ou l'infiltration immunitaire tumorale, la toxicité sur la tumeur. Les tumeurs peuvent ainsi être soumises à des analyses pour mesurer et/ou 30 analyser ces différents paramètres, telles que le poids et/ou le volume tumoral pour étudier la croissance tumorale, l'expression de différents marqueurs spécifiques pour étudier l'invasion métastatique tels que l'amplification de 14 séquence Alu par PCR quantitative pour les métastase humaines, le nombre de vaisseaux à la tumeur pour l'angiogenèse et la néo-angiogenèse, la quantification des interleukines pour l'inflammation et/ou la quantification, notamment par rtQPCR, de marqueurs tels que CD3, CD8, CD4, CD45 et CD56 pour apprécier 5 l'infiltration immunitaire tumorale, le poids, et des analyses histologiques pour évaluer la toxicité sur la tumeur. L'étude de l'invasion métastatique peut être réalisée sur la CAM inférieure, facilement accessible, mais elle peut aussi être réalisée dans n'importe quel organe cible au sein de l'embryon, notamment en fonction du type de cancer et des données connues sur le phénomène de métastases associé. L'inflammation et/ou l'infiltration immunitaire tumorales peut notamment être étudiée par l'analyse de l'expression de différents marqueurs, tels que CD3 (marqueur membranaire des lymphocytes T), CD4 (marqueur membranaire des lymphocytes T régulateurs, monocytes et macrophages), CD8 (marqueur des 15 lymphocytes T cytotoxiques), CD45 (marqueur membranaire des leucocytes), CD56 (marqueur de cellules NK), etc. Des couples d'oligonucléotides spécifiques de ces marqueurs pourront être développés, afin d'éviter le croisement inter-espèces. Par extension, il est également possible de suivre l'inflammation et l'infiltration de 20 cellules du système immunitaire dans les sites de métastases. L'analyse combinée de tous ces facteurs, bien connus de l'homme du métier, permet de déterminer l'efficacité anti-cancéreuse de la ou des molécules immunothérapeutiques administrés dans l'embryon. Ces paramètres font notamment partie intégrante de l'arbre décisionnel utilisé par les cliniciens pour 25 décider de la prise en charge thérapeutique à adopter chez les patients atteints de cancers. Dans le cadre de tous les procédés selon l'invention qui comprennent l'étude de l'effet de la ou des molécules immunothérapeutiques sur la tumorigenèse, l'activité anti-cancéreuse est préférentiellement évaluée par comparaison de la 30 tumorigenèse des tumeurs prélevées après administration de la ou des molécules immunothérapeutiques dans l'ceuf embryonné une fois greffé à celle des tumeurs 15 prélevées dans un autre ceuf embryonné du même oiseau préalablement greffé selon le même procédé avec les mêmes cellules tumorales mais dans lequel aucune molécule immunothérapeutique n'a été administrée. De même, lorsque l'effet de plusieurs molécules immunothérapeutiques est étudié, l'activité anti5 cancéreuse sera préférentiellement évaluée par comparaison de la tumorigenèse des tumeurs prélevées après administration de la combinaison de molécules immunothérapeutiques dans l'ceuf embryonné une fois greffé à celle des tumeurs prélevées dans un ou plusieurs autre(s) ceuf(s) embryonné(s) du même oiseau préalablement greffé(s) selon le même procédé avec les mêmes cellules 10 tumorales mais dans le(s)quel(s) chacune des molécules immunothérapeutiques a été administrée individuellement. Avantageusement, c'est l'activité anti-cancéreuse d'un ou de plusieurs inhibiteurs de point de contrôle immunitaire qui est évaluée dans le cadre du procédé d'évaluation de l'activité anti-cancéreuse selon l'invention, et de préférence 15 l'activité anti-cancéreuse d'anticorps anti-PD1 ou d'anticorps anti-PDL1. La présente invention est aussi relative à un procédé de criblage de molécules immunothérapeutiques destinées au traitement du cancer in vivo. C'est ainsi que selon un autre aspect, l'invention concerne un procédé de criblage de molécules immunothérapeutiques ayant une activité anti-cancéreuse, comprenant les étapes 20 suivantes : - la greffe de cellules tumorales au niveau de la membrane chorioallantoïque (CAM) d'un oeuf embryonné d'oiseau préalablement incubé jusqu'à un stade de développement correspondant à la formation de la CAM et équivalent à au moins 8 jour de développement chez le poulet, 25 - l'administration de la ou des molécules immunothérapeutiques candidates dans l'oeuf embryonné au moins 12 heures après la greffe, - l'étude de l'effet de la ou des molécules immunothérapeutiques ainsi administrée(s) sur la tumorigenèse des tumeurs qui se sont développées dans l'oeuf embryonné greffé, 16 ledit procédé étant mis en oeuvre en l'absence et sans ajout de cellules immunitaires effectrices autres que celles de l'oeuf greffé. Par « molécules immunothérapeutiques candidates », on entend une molécule immunothérapeutique chimique ou biologique telle que définie ci-dessus et 5 susceptible d'avoir une activité antitumorale/anti-cancéreuse, et en particulier potentiellement efficace pour traiter le type de cancer qui s'est développé à partir des cellules tumorales greffées dans l'oeuf embryonné. Le procédé de criblage selon la présente invention permet de déterminer si un agent thérapeutique candidat présente ou non une activité anti-cancéreuse, et s'il possède une activité anti-métastase. Selon un autre aspect, l'invention se rapporte également à un procédé de suivi d'un patient ou d'un animal atteint de cancer, comprenant : - la préparation d'un premier veuf embryonné d'oiseau comme décrit ci-dessus avec des cellules tumorales issues dudit patient ou animal à un instant Ti, et 15 l'étude de la tumorigenèse des tumeurs qui se développent dans ce premier oeuf embryonné, - la préparation d'un second veuf embryonné d'oiseau comme décrit ci-dessus avec des CTC issues du même patient ou animal à un instant T2, et l'étude de la tumorigenèse des tumeurs qui se développent dans ce second oeuf embryonné, 20 - la comparaison de la tumorigenèse des tumeurs qui se sont développées dans le premier et dans le second veuf embryonné ledit procédé étant mis en oeuvre en l'absence et sans ajout de cellules immunitaires effectrices autres que celles des oeufs greffés. Toutes les préférences et précisions mentionnées ci-dessus pour le procédé zs d'évaluation de l'activité anti-cancéreuse de molécules immunothérapeutiques s'appliquent mutatis mutandis aux procédés de suivi et de criblage selon la présente invention. 17 EXEMPLES L'invention est illustrée ci-après par l'utilisation de l'ceuf de poule embryonné avec une tumeur d'origine humaine développée sur la membrane chorioallantoidienne (CAM) pour valider l'efficacité de différentes molécules immunothérapeutiques en 5 oncologie, et en particulier d'anticorps dirigés contre deux protéines mem branaires ayant un rôle majeur dans l'interaction du système immunitaire avec la tumeur : PD-1 et PDL-1 PD-1 (ou PDC1 pour Programmed Cell Death 1) est une protéine membranaire exprimée à la surface des lymphocytes T activés. Sa liaison avec son ligand, PDL- 10 (Programmed Cell Death-Ligand 1), présent en surface des cellules tumorales entraine une inactivation des lymphocytes T vis-à-vis des cellules tumorales (inhibition de prolifération et de sécrétion de cytokines). Les inhibiteurs de checkpoint immunitaires sont développés dans le but de lever les freins qui bloquent les lymphocytes et les empêchent de s'attaquer aux 15 tumeurs. Ainsi les anticorps anti-PD1 ou anti-PD-L1 doivent permettre de réactiver l'attaque de la tumeur par le système immunitaire. Matériels & Méthodes Embryons, conditions d'incubation et greffe 20 L'ouverture de l'oeuf embryonné et la greffe de cellules tumorales par apposition sur la membrane chorio-allantoidienne (CAM) est déjà connu et largement documenté depuis de nombreuses années (Crespo P. & Casar B., 2016). Un schéma d'ceuf embryonné avec le site de greffe des cellules tumorales sur la CAM supérieure est représenté sur la Figure 1. 25 Ne sont décrites ici que les conditions spécifiques utilisées pour les études de validation : - les oeufs de poules fécondés ont été incubés en position couchée pendant 9,5 jours à 37°C et 40% d'humidité. 18 - A E9,5 de développement, les oeufs ont été ouverts en préservant l'intégrité de la CAM. Les cellules ont été greffées sur celle-ci après ouverture puis les oeufs ré-incubés 24h à 37°C et 40% d'humidité. - Pour chaque groupe (contrôle et traités) les résultats sont donnés sur au 5 moins 9 oeufs (oeufs survivants à E18). Lignées cellulaires Des lignées cellulaires standards de lymphome (SU-DHL-4), d'adénocarcinome de sein (MDA-MB-231), ou de glioblastome (U87) ont été greffées dans les quantités et conditions décrites dans le TABLEAU 1. lignée Référence ATCC Conditions de greffe cellulaire Milieu de greffe Quantité de cellules MDA-MB-231 HTB-26 DMEM + 50% matrice extracellulaire commerciale 1.106 (Matrigel; Corning . Ref. 354230) cellules/oeuf SU-DHL-4 CRL-2957 RPM l-1640 + 50% matrice extracellulaire 1.106 commerciale (Matrigel; Corning . Ref. 354230 cellules/oeuf U87-MG HTB-1 EMEM + 50% matrice extracellulaire commerciale 1.106 (Matrigel; Corning . Ref. 354230 cellules/oeuf io TABLEAU 1 Molécules immunothérapeutiques Après greffe, les tumeurs in ovo ont été traitées avec un anticorps anti-PD1 ou anti-PDL1 humain à quatre reprises (E10,5 ; E12,5 ; E14,5 ; E16,5) avec 100 pl d'anticorps (anti-PD1 ou anti-PDL1) à différentes concentrations (détaillées sur les 15 figures par la suite). Les anticorps anti-PD1 testés sont présentés dans le TABLEAU 2. TABLEAU 2 Nom commerical Anticorps Cible Espèce Tecentriq (Roche) atezolizumab PDL-1 humain Keytruda (Merck) Pembrolizumab PD-1 humain NIA (BioXcell) Clone RMP1-14 PD-1 souris 19 Le Tecentriq et le Keytruda sont deux anticorps monoclonaux déjà prescrits chez l'homme. Le Tecentriq est le premier anti-PDL-1 homologué chez l'homme (FDA). Il est utilisé contre le cancer du poumon non à petites cellules métastatique. Il est aussi 5 utilisé contre le cancer urothélial. Le Keytruda est un anti-PD-1 prescrit contre de nombreux cancers (mélanome, poumon, lymphome de Hodgkin, prostate, vessie, sein,..). Prélèvement des tumeurs et analyses 10 A E18, les oeufs ont été ouverts, les tumeurs collectées, fixées dans du Paraformaldehyde 4% en tampon phosphate salin (PBS) nettoyées pour éliminer les morceaux de CAM autour de la tumeur, puis pesées sur une balance de précision. Pour l'analyse des métastases, un morceau de la CAM inférieure (à l'opposé du site de greffe) peut être collecté et congelé. Il sera utilisé pour une 15 extraction d'ADN génomique total. La mise en évidence des cellules humaines dans ces échantillons est réalisée par qPCR à l'aide amorces spécifiques pour les séquences Alu humaines (séquences en multi copies bien conservées chez l'homme)(Zijlstra, A. et al., 2012). La Figure 2 représente la chronologie de l'étude de la greffe des cellules à la 20 collecte des échantillons. Les résultats ont été obtenus sur différents modèles de cancer, démontrant le potentiel de ce type de traitement sur de nombreux modèles. Résultats 1. EFFICACITE DE TROIS IMMUNOTHERAPIES SUR LA CROISSANCE TUMORALE 5 Efficacité du Tecentriq (anti-PDL-1) sur les cellules MDA-MB-231 Après la greffe des cellules, les tumeurs ont été traitées 4 fois (E10,5 ; E12,5 ; E14,5 ; E16,5) avec 100 pl de Tecentriq (anti-PDL-1) à une dose de 4 tag/kg pour chaque ceuf. Les résultats des analyses de mesure du poids des tumeurs initiées à partir de cellules MDA-MB-231, après administration du Tecentriq sont regroupés dans le tableau 3 (DS : déviation standard ; ETM : écart-type de la moyenne) et la Figure 3 annexée. n Poids tumeur (mg) DS ETM % de regression tumorale Valeur P vs. Ctrl Neg Ctrl Neg 17 59,98 11,602 2,814 N/A N/A Tecentriq (4 µg/kg) 13 50,30 11,523 3,196 16,13 0,03107 TABLEAU 3 15 Efficacité du Keytruda (anti-PD-1) sur les cellules MDA-MB-231 et les cellules SU-DHL-4 Après la greffe des cellules, les tumeurs ont été traitées 4 fois (E10,5 ; E12,5 ; E14,5 ; E16,5) avec 100 pl de Keytruda (anti-PD-1). 20 20 Les résultats des analyses de mesure du poids des tumeurs initiées à partir de cellules MDA-MB-231, après administration du Keytruda sont regroupés dans les 21 TABLEAUX 4 et 5 (DS : déviation standard ; ETM : écart-type de la moyenne) ainsi que sur la Figure 4 annexée. n Poids DS ETM % de regression Valeur P vs. tumoral tumorale Ctrl Neg (mg) Ctrl Neg 21 66,08 11,289 2,463 N/A / Keytruda 24 48,31 12,312 2,513 26,89 0,00001 (17.5 µg/kg) TABLEAU 4 n Poids DS ETM % de regression Valeur P tumoral tumorale value vs. Ctrl (mg) Neg Ctrl Neg 13 98.92 42.037 11.659 NIA / Keytruda 9 48.77 27.238 9.079 50.70 0.00516 (16.7 µg/kg) 5 TABLEAU 5 Efficacité de l'anti-PD-1 RMP1-14 sur les cellules SU-DHL-4 Après la greffe des cellules, les tumeurs ont été traitées 4 fois (E10,5 ; E12,5 ; E14,5 ; E16,5) avec 100 pl de RMP1-14 (anti-PDL-1) à une concentration de 166 10 dag/kg pour chaque ceuf. Les résultats des analyses de mesure du poids des tumeurs initiées à partir de cellules SU-DHL-4, après administration du RMP1-14 sont regroupés dans le TABLEAU 6 (DS : déviation standard ; ETM : écart-type de la moyenne) ainsi que sur la Figure 5 annexée. 22 n Poids DS ETM % de regression Valeur P vs. tumoral tumorale Ctrl Neg (mg) Ctrl Neg 13 98,918 42,037 11,659 N/A / Anti PD1 9 48,767 27,238 9,079 50,70014 0,00516 (166 µg/kg) TABLEAU 6 2. SUIVI DE L'INVASION METASTATIQUE Outre le poids des tumeurs, il est possible de suivre l'invasion métastatique au 5 sein de l'ceuf embryonné, après administration d'une immunothérapie. Cette analyse est classiquement réalisée sur l'ADN génomique extrait (kit MagJET Genomic DNA ; ThermoScientific ; Ref.K2721) de tout tissu de l'embryon ou de la CAM inféireure par qPCR (Bio-Rad ; SsoAdvanced Univ SYBR Green Supermix Ref. 1725274) avec des oligonucléotides spécifiques pour les séquences Alu humaines (séquences en multicopie dans le génome humain) (Zijlstra, A. et al., 2012). Après la greffe de cellules MDA-MB-231, puis administration du Keytruda comme décrit ci-dessus, l'analyse a ici été réalisée sur l'ADN génomique extrait d'un morceau de la CAM inférieure, tissu facilement accessible. 15 Les résultats sont regroupés sur la Figure 6 annexée. 3. ANALYSE DE L'INFILTRATION DE LA TUMEUR PAR LES CELLULES DU SYSTEME IMMUNITAIRE Outre l'efficacité observée sur le poids tumoral, il est possible d'analyser l'action 20 des immunothérapies en mesurant l'infiltration des cellules immunitaires de l'embryon dans le tissu tumoral en présence ou en absence d'immunothérapies. 23 L'expression de la forme aviaire des marqueurs CD3 (marqueur membranaire des lymphocytes T), CD4 (marqueur membranaire des lymphocytes T régulateurs, monocytes et macrophages) et CD45 (marqueur membranaire des leucocytes) ont été analysées par qPCR dans les tumeurs initiées à partir de cellules SU-DHL-4, 5 après administration ou non de l'anti PD-1 Keytruda ou de l'anti-PD-L1 Tecentriq, comme décrit ci-dessus. Les tissus ont été prélevées, les ARN totaux extraits (kit MagJET RNA ; ThermoScientific ; Ref. K2731). A partir des ARN totaux, les ADNc sont synthétisés (iScript Explore RT and PreAmp Kit ; Bio-Rad ; Ref. 12004856) avec 10 une pré amplification spécifique pour chaque biomarqueur recherché (PrimePCR, Pre-Amp Assay, Probe Chicken ; Bio-Rad ; Ref. 10041596). Une PCR quantitative est ensuite réalisée avec les oligonucléotides spécifiques pour chacun des biomarqueurs (PrimePCR Assay FAM, Chicken ; Bio-Rad ; Ref. 12001961). Les résultats sont regroupés sur les figures 7 et 8 respectivement et montrent 15 l'infiltration des cellules immunitaires de poulet porteurs de CD3, CD4 et CD45, avec ou sans traitement par immunothérapie, que ce soit par Keytruda ou Tecentriq. 20 24 REFERENCES Crespo P. & Casar B.; Bio-protocol, Vol. 6, lss 20, Oct 20, 2016; Chick Embryo Chorioallantoic Membrane as an in vivo Model to Study Metastasis 5 Han Wei Hou et al. Scientific Reports 3, Article number: 1259 (2013) Laget Set al.. PIoS one, 2017 Jan 6,12(1),e0169427. Petit Vincent et al. Lab Invest. 2013 May;93(5):611-21. DeBord Logan C et al. Am J Cancer Res. 2018 Aug 1;8(8):1642-1660. Zijlstra, A. et al. A Quantitative Analysis of Rate-limiting Steps in the Metastatic 10 Cascade Using Human-specific Real-Time Polymerase Chain Reaction. Cancer Res. 62, 7083-7092 (2012) REVENDICATIONS1. Utilisation d'un modèle d'oeuf embryonné d'oiseau greffé, en particulier au niveau de la membrane chorioallantoïque (CAM), avec des cellules tumorales pour évaluer l'activité anti-cancéreuse d'une ou plusieurs molécule(s) immunothérapeutique(s), dans laquelle ledit modèle exclu la présence de cellules effectrices immunitaires autres que celles de l'oeuf greffé. 2. Utilisation selon la revendication 1 pour sélectionner la molécule immunothérapeutique dont l'activité anti-cancéreuse est la plus prometteuse pour le traitement de la tumeur développée à partir des cellules tumorales greffées dans l'oeuf embryonné parmi les différentes molécules immunothérapeutiques testées. 3. Utilisation d'un modèle d'oeuf embryonné d'oiseau greffé, en particulier au niveau de la membrane chorioallantoïque (CAM), avec des cellules tumorales pour déterminer, voire quantifier, la toxicité d'une ou plusieurs molécule(s) immunothérapeutique(s) sur les tumeurs qui se sont développées à partir des cellules tumorales greffées et/ou sur l'embryon dans son ensemble, dans laquelle ledit modèle exclu la présence de toute cellule effectrice immunitaire autre que celles de l'oeuf greffé. 4. Procédé d'évaluation de l'activité anti-cancéreuse d'une ou plusieurs molécule(s) immunothérapeutique(s), caractérisé en ce qu'il comprend : - la greffe de cellules tumorales au niveau de la membrane chorioallantoïque (CAM) d'un veuf embryonné d'oiseau préalablement incubé jusqu'à un stade de développement correspondant à la formation de la CAM et équivalent à au moins 8 jours de développement chez l'embryon de poulet, - l'administration de la ou des molécules immunothérapeutiques dans l'oeuf embryonné au moins 12h après la greffe, - l'étude de l'effet de la ou des molécules immunothérapeutiques ainsi administrée(s) sur la tumorigenèse des tumeurs qui se sont développées dans l'oeuf embryonné greffé, 26 et qu'il est mis en oeuvre en l'absence et sans ajout de cellules immunitaires effectrices autres que celles de l'oeuf greffé. 5. Procédé d'évaluation de l'activité anti-cancéreuse d'une ou plusieurs s molécule(s) immunothérapeutique(s) selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'incubation de l'oeuf embryonné une fois greffé pendant au moins 1 heure, après administration de la ou des molécules immunothérapeutiques dans l'oeuf embryonné greffé avant d'étudier l'effet sur la tumorigenèse. 10 6. Procédé d'évaluation de l'activité anti-cancéreuse d'une ou plusieurs molécule(s) immunothérapeutique(s) selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comprend en outre le prélèvement des tumeurs qui se développent à partir des cellules tumorales greffées au terme de l'incubation dudit oeuf embryonné après administration de la ou des molécules immunothérapeutiques. 15 7. Procédé d'évaluation de l'activité anti-cancéreuse d'une ou plusieurs molécule(s) immunothérapeutique(s) selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisé en ce que l'étude de la tumorigenèse comprend la mesure de différents paramètres tels que la croissance tumorale, l'invasion métastatique l'angiogenèse, la néo-angiogenèse, l'inflammation et/ou l'infiltration immunitaire 20 tumorale, la toxicité sur la tumeur. 8. Procédé d'évaluation de l'activité anti-cancéreuse d'une ou plusieurs molécule(s) immunothérapeutique(s) selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, caractérisé en ce que l'activité anti-cancéreuse est évaluée par comparaison de la tumorigenèse des tumeurs prélevées après l'administration de la ou des 25 molécules immunothérapeutiques dans l'oeuf embryonné une fois greffé à celle des tumeurs collectées dans un oeuf embryonné du même oiseau préalablement greffé selon le même procédé avec les mêmes cellules tumorales dans lequel aucune molécule immunothérapeutique n'a été administrée. 27 9. Procédé d'évaluation de l'activité anti-cancéreuse d'une ou plusieurs molécule(s) immunothérapeutique(s) selon l'une quelconque des revendications 4 à 8, caractérisé en ce que la molécule immunothérapeutique est une thérapie cellulaire adoptive telle que les CAR-T, un vaccin, un anticorps bi spécifique, un 5 inhibiteur de point de contrôle immunitaire tel qu'un anticorps anti-PD1, ou anti- PDL1, ou anti CTLA-4. 10. Procédé de criblage de molécules immunothérapeutiques ayant une activité anti-cancéreuse, comprenant les étapes suivantes : - la greffe de cellules tumorales au niveau de la membrane chorioallantoïque 10 (CAM) d'un veuf embryonné d'oiseau préalablement incubé jusqu'à un stade de développement correspondant à la formation de la CAM et équivalent à au moins 8 jours de développement chez le poulet, - l'administration de la ou des molécules immunothérapeutiques candidates dans l'oeuf embryonné au moins 12 heures après la greffe, 15 - l'étude de l'effet de la ou des molécules immunothérapeutiques ainsi administrée(s) sur la tumorigenèse des tumeurs qui se sont développées dans l'oeuf embryonné greffé ; ledit procédé étant mis en oeuvre en l'absence et sans ajout de cellules immunitaires effectrices autres que celles de l'oeuf greffé. 20 11. Procédé de criblage selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'incubation de l'oeuf embryonné une fois greffé pendant au moins 1 heure, après administration de la ou des molécules immunothérapeutiques dans l'oeuf embryonné greffé avant d'étudier l'effet sur la tumorigenèse. 25 12. Procédé de criblage selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend en outre le prélèvement des tumeurs qui se développent à partir des cellules tumorales greffées au terme de l'incubation dudit oeuf embryonné après administration de la ou des molécules immunothérapeutiques. 28 13. Procédé de criblage selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, caractérisé en ce que l'activité anti-cancéreuse de la ou des molécules immunothérapeutiques candidates est évaluée par comparaison de la tumorigenèse des tumeurs prélevées après l'administration de la ou des 5 molécules immunothérapeutiques dans l'oeuf embryonné une fois greffé à celle des tumeurs prélevées dans un oeuf embryonné du même oiseau préalablement greffé selon le même procédé avec les mêmes cellules tumorales dans lequel aucune molécule immunothérapeutique n'a été administrée. 14. Procédé d'évaluation de l'activité anti-cancéreuse d'une ou plusieurs io molécule(s) immunothérapeutique(s) selon l'une quelconque des revendications 4 à 9 ou procédé de criblage de molécules immunothérapeutiques ayant une activité anti-cancéreuse selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, caractérisé en ce que lesdites cellules tumorales greffées dans l'ceuf embryonné d'oiseau sont issues d'un échantillon de patient ou d'animal atteint d'un cancer. 15 15. Procédé de suivi d'un patient ou d'un animal atteint de cancer, comprenant : - la préparation d'un premier oeuf embryonné d'oiseau par la greffe au niveau de la membrane chorioallantoïque (CAM) de cellules tumorales issues dudit patient ou animal à un instant T1, préalablement incubé jusqu'à un stade de développement correspondant à la formation de la CAM et équivalent à au moins 8 jours de 20 développement chez le poulet, et l'étude de la tumorigenèse des tumeurs qui se développent dans ce premier veuf embryonné, - la préparation d'un second oeuf embryonné d'oiseau par la greffe au niveau de la membrane chorioallantoïque (CAM) de cellules tumorales issues dudit patient ou animal à un instant T2, préalablement incubé jusqu'à un stade de développement 25 correspondant à la formation de la CAM et équivalent à au moins 8 jours de développement chez le poulet., et l'étude de la tumorigenèse des tumeurs qui se développent dans ce second veuf embryonné, - la comparaison de la tumorigenèse des tumeurs qui se sont développées dans le premier et dans le second oeuf embryonné ; 29 ledit procédé étant mis en oeuvre en l'absence et sans ajout de cellules immunitaires effectrices autres que celles des oeufs greffés.