Brevet FR3089011A1 — publié le 20200529

Description Titre de l'invention : Procédé et dispositif de mesure du statut du stress oxydant dans une matrice biologique [0001] La présente invention concerne le domaine des procédés et dispositifs de mesure du statut du stress oxydant à la surface ou dans une matrice biologique. [0002] Le stress oxydant correspond à une rupture de l'équilibre entre la production de radicaux libres, qui sont des espèces oxydantes, et la capacité des mécanismes protecteurs de l'organisme, représentés par les antioxydants, à neutraliser ces radicaux libres avant qu'ils n'occasionnent de dégâts sur la matrice. [0003] En ce qui concerne plus particulièrement les organismes vivants, et notamment l'espèce humaine, le stress oxydant est suspecté comme étant à l'origine du vieillissement cellulaire et de nombreuses pathologies, comme les maladies d'Alzheimer et de Parkinson notamment. [0004] De cc fait, certains industriels de secteurs variés, comme la cosmétique, l'agroalimentaire, le médical, cherchent à développer de nouvelles molécules ou de nouveaux composés aux propriétés antioxydantes, dans le but de réduire les effets du stress oxydant. Ces composés antioxydants sont également incorporés dans certains produits alimentaires, pharmaceutiques, nutraccutiques ou compositions cosmétiques, afin d'accroître leur temps de conservation tout en ayant un effet bénéfique sur la santé du consommateur. [0005] 11 peut donc s'avérer utile de pouvoir doser de manière fiable et reproductible les effets sur un organisme, de l'administration d'une substance antioxydants ou, au contraire, d'une substance oxydante Art antérieur 100061 On connait de l'art antérieur la demande de brevet W02017077237A1 qui présente un dispositif et un procédé de mesure de la capacité antioxydante et oxydante totale d'une matrice quelconque. Les mesures sont réalisées en faisant réagir un système médiateur comprenant un composé A et un composé B, différents, avec la matrice à tester, et en mesurant le potentiel électrochimique dudit système médiateur. Résumé de l'invention [0007] Les inventeurs ont mis au point un système médiateur particulièrement adapté aux matrices biologiques composé d'un unique composé AB disponible sous deux formes A et B. La forme A peut réagir et/ou former des complexes avec un antioxydant et la forme B peut réagir et/ou former des complexes avec un oxydant, mais les formes A et B n'interagissent pas entre elles. [0008] Avantages de l'invention 2 100091 Les composés AB selon l'invention présentent l'avantage d'être des molécule non toxique pour la peau, à l'inverse des composés utilisés dans l'art antérieur tel le sulfate d'ammonium ferrique, le cérium ou le monobromure d'iode. Ainsi, les composés AB s'avèrent particulièrement propice à une utilisation dans des systèmes permettant l'analyse de matrices biologiques telles que la peau. [0010] De plus, contrairement aux méthodes de l'art antérieur fonctionnant à pH 2 et tem- pératures supérieures à 50', les méthodes d'analyse de matrices selon l'invention utilisant un composé AB selon l'invention, permettent d'obtenir des analyses stables à pH et températures corporelles (pH entre 5 et 8, et T° entre 23 et 40°C), rendant particulièrement efficace l'utilisation de tels composés pour des analyses in vivo comme par exemple sur la peau, mais également d'effectuer des analyses stables sur des échantillons biologiques issus de prélèvements, sans risquer de dégrader l'échantillon au cours de l'analyse. [0011] Un composé AB selon l'invention présente l'avantage d'offrir une différence de potentiel proche de celle de la peau, qui soit à la fois suffisamment élevée pour être observable (au moins 20mV de différence de potentiel entre A et B), et pas trop élevée pour ne pas créer un danger pour la peau. Ainsi, le composé AB s'avère particulièrement adapté pour effectuer des analyses par électrochimie sur la peau. [0012] Un composé AB selon l'invention présente également l'avantage de provoquer un changement de couleur selon l'état d'oxydation de la matrice, et cela sans ajouter d'indicateurs colorés. Cela rend les composés AB particulièrement propices aux analyses par spectrophotométrie. De plus, comme il n'est pas nécessaire d'ajouter d'indicateur coloré, souvent toxique, les composés AB sont particulièrement adaptés à une analyse par spectrophotométrie dans des systèmes comportant des matrices biologiques. [0013] Un composé AB selon l'invention présente également l'avantage d'être visible en spectroscopie à fluorescence (fluorimétrie) sans avoir à ajouter un composé fluorescent. Cela rend les composés AB particulièrement propices aux analyses par fluorimétrie. Description des modes de réalisation [0014] L'invention concerne l'utilisation d'un composé AB choisi parmi le NADH, le NADPH, le Cyt C (Fe-) ou H2O,, pour mesurer le statut du stress oxydant dans une matrice biologique. Le composé AB étant disponible sous deux formes A et B n'interagissant pas entre elles, et aptes à interagir et/ou à former des complexes respectivement avec un antioxydant et un oxydant présents à la surface ou dans ladite matrice biologique. [0015] On entend par « composé AB » ou « médiateur AB » ou « médiateur » selon 3 l' invention, un composé choisi parmi le NADH, le NADPH .Cyt C (Fe2+) ou H202. [0016] Cc médiateur AB présente l'avantage de se dissocier sous deux formes : [0017] - d'une part la forme A , forme « oxydant » , va attirer des molécules antioxydantes, niais ne réagit pas avec la forme B, forme « antioxydant » du composé AB ; [0018] - d'autre part la forme B, forme « antioxydant », va attirer à elle les molécules oxydantes (appelées aussi radicaux libres) , mais ne réagit pas avec la forme A, forme « oxydant » du composé AB. [0019] Les composés AB selon l'invention se présentent sous les formes A et B telles que présentées dans le tableau 1. [0020] [Tall Icaux 1] Médiateur Médiateur NADH Médiateur NADPH Médiateur Cyt C(Fe2'-) Médiateur H202 Forme A « oxydant » NAD+ NADP Cyt C(Fe2+) HO- Forme B « antioxydant » NADH NADPH Cyt C(Fe2'-) H202 [0021] Ainsi, les deux états différents, A et B du composé AB ne s'équilibrent pas entre eux, ils s'équilibrent seulement au contact des molécules oxydantes et antioxydantes de la matrice, ceci garantit la justesse de la mesure réalisée, qui ne sera pas faussée par des interactions entre A et B. [0022] On entend par « matrice biologique » une matrice issue du domaine du vivant. Une telle matrice peut être issue d'un prélèvement (exemple : le sang, l'urine, la sueur, les cheveux, liquides séminal et folliculaire...), ou concerner une partie d'un organisme vivant (exemple : un tissu tel que la peau...). [0023] On entend par « statut du stress oxydant », la balance entre oxydants et antioxydants de la matrice à analyser. Ce statut indique si la matrice est majoritairement constituée de molécules oxydantes, majoritairement constituée de molécules antioxydantes, ou à l'équilibre entre antioxydants et oxydants. [0024] On entend par « mesure du statut du stress oxydant » la mesure du potentiel électro- chimique, de l'absorbante par spectrophotométrie ou de l'intensité de la fluorescence par lluorimétrie pour obtenir l'un des paramètres suivants : pouvoir antioxydant/ oxydant total, effet anti radicalaire, effet réducteur ou effet protecteur ; afin d'en déduire un statut général concernant l'état de stress oxydant de la matrice. [0025] Le statut du stress oxydant peut se présenter sous la forme d'une échelle de valeur numérique dont les valeurs : [0026] - Les plus faible correspond au cas où il n'y a pas ou peu de stress oxydant [0027] - Les valeurs intermédiaires correspondent au cas où le stress oxydant peut entrainer des risques pour les matrices biologiques. [0028] - Les valeurs élevées correspondent à un stress oxydant sévère. [0029] On entend par « pouvoir antioxydant/oxydant total » le ratio entre le pouvoir an- tioxydant total et le pouvoir oxydant total. Ainsi, pouvoir antioxydant/oxydant total peut aussi s'écrire pouvoir antioxydant total /pouvoir oxydant total ou encore ratio du pouvoir antioxydant/oxydant total. [0030] Le pouvoir antioxydant/oxydant total de la matrice est corrélé positivement avec le statut du stress oxydant de la matrice. [0031] Ainsi, un pouvoir antioxydant/oxydant total haut correspond à un déséquilibre de la balance antioxydant/oxydant au profit d'une présence accrue de molécules and-oxydantes et correspond donc à un statut du stress oxydant : « pas ou peu de stress oxydant ». [0032] A l'inverse, un pouvoir antioxydant/oxydant total bas correspond à un déséquilibre de la balance antioxydant/oxydant au profit d'une présence accrue de molécules oxydantes et correspond donc à un statut du stress oxydant : « stress oxydant sévère ». [0033] L'effet anti-radicalaire de la matrice est corrélé négativement avec le statut du stress oxydant de la matrice. [0034] Ainsi, un effet anti-radicalaire haut correspond à une présence accrue de molécules antioxydantes et correspond donc à un statut du stress oxydant : « pas ou peu de stress oxydant ». [0035] A l'inverse un effet anti-radicalaire bas correspond à un déséquilibre de la balance antioxydant/oxydant au profit d'une présence accrue de molécules oxydantes et correspond donc au statut du stress oxydant : « stress oxydant sévère ». [0036] L'effet réducteur de la matrice est corrélé négativement avec le statut du stress oxydant de la matrice. [0037] Ainsi, un effet réducteur haut correspond à un déséquilibre de la balance an- tioxydant/oxydant au profit de la présence accrue de molécules antioxydantes et correspond donc à un statut du stress oxydant : «pas ou peu de stress oxydant ». [0038] A l'inverse un effet réducteur bas correspond à un déséquilibre de la balance an- tioxydant/oxydant au profit d'une présence accrue de molécules oxydantes et correspond donc au statut du stress antioxydant/oxydant : « stress oxydant sévère ». [0039] L'effet protecteur de la matrice est corrélé négativement avec le statut du stress oxydant de la matrice. [0040] Ainsi, un effet protecteur haut correspond à un déséquilibre de la balance an- tioxydant/oxydant au profit de la présence accrue de molécules antioxydantes et correspond donc à un statut du stress oxydant: « pas ou peu de stress oxydant ». [0041] A l'inverse un effet protecteur bas correspond à un déséquilibre de la balance an- tioxydant/oxydant au profit d'une présence accrue de molécules oxydantes et correspond donc au statut du stress oxydant : « stress oxydant sévère ». [0042] Un second objet de l'invention concerne un dispositif de mesure du pouvoir an- tioxydant/oxydant total d'une matrice biologique comprenant un milieu de mesure dans lequel sont plongées une ou plusieurs électrodes de travail et une ou plusieurs électrodes de référence, caractérisé en ce que ledit milieu comprend un composé AB disponible sous deux formes A et B, aptes à interagir et/ou à former des complexes respectivement avec un antioxydant et un oxydant présents à la surface ou dans la matrice, et n'interagissant pas entre elles. [0043] On entend par « mesure du pouvoir antioxydant/oxydant total », la mesure du ratio entre le pouvoir antioxydant total et le pouvoir oxydant total. Cette mesure s'effectue principalement par mesure du potentiel électrochimique du milieu de mesure. [0044] La mesure du pouvoir antioxydant/oxydant total permet de suivre le stress oxydant afin de dépister et de prévenir d'éventuelles pathologies, cela permet également de surveiller l'efficacité et la sécurité d'un traitement et de ses ajustements en temps opportun, ainsi que d'optimiser la formulation et la fabrication des produits pharmaceutiques, cosmétiques, alimentaires et nutraccutiqucs. [0045] Le présent dispositif est caractérisé par le fait que ledit moyen de mesure du pouvoir antioxydant/oxydant consiste en un moyen de mesure du potentiel électrochimique du milieu de mesure, cc dernier incorporant au moins un composé AB présent sous deux formes A et B, aptes à réagir et/ou à former un complexe respectivement avec les espèces antioxydantcs et oxydantes présentes à la surface ou dans ladite matrice, de sorte de modifier le potentiel électrochimique dudit milieu de mesure. [0046] Un composé AB selon l'invention présente l'avantage d'offrir une différence de potentiel proche de celle de la peau, qui soit à la fois suffisamment élevée pour être observable (au moins 20 mV de différence de potentiel entre A et B), et pas trop élevée pour ne pas créer un danger pour la matrice biologique. Ainsi, le composé AB s'avère particulièrement propice aux analyses par électrochimie. [0047] On entend par « milieu de mesure », pouvant aussi être appelé système médiateur, tout milieu pouvant être utilisé pour effectuer une mesure du pouvoir antioxydant/ oxydant total de la matrice. [0048] Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le milieu de mesure est sous forme liquide ou gélifiée. [0049] Dans un mode de réalisation encore plus préféré, le milieu de mesure liquide ou gélifié est une solution composée de KC1. Une telle composition permet de stabiliser la mesure. [0050] Dans un mode de réalisation préféré, la solution de KC1 est à une concentration comprise entre 0,5 et 2,5mmol/L. [0051] La spécificité des milieux de mesure selon l'invention est qu'ils comportent toujours le composé AB selon l'invention, disponible sous deux formes A et B, n'interagissant 6 pas entres elles, mais aptes à interagir et/ou à former des complexes respectivement avec un antioxydant et un oxydant présents à la surface ou dans la matrice. [0052] Dans un mode de réalisation particulier, le milieu de mesure est sous forme liquide. Un milieu de mesure liquide est particulièrement utile pour mesurer le pouvoir antioxydant/oxydant total de matrices biologiques liquides comme le sang ou l'urine. [0053] Dans un autre mode de réalisation alternatif, le milieu de mesure est sous forme gélifiée. Un milieu de mesure gélifié est particulièrement utile pour mesurer le pouvoir antioxydant/oxydant total en surface de matrices biologiques comme la peau. [0054] Par « électrode » au sens de l'invention on entend un conducteur électronique, ou ionique captant des électrons. [0055] Le dispositif de mesure du pouvoir antioxydant/oxydant total de la matrice comporte deux sortes d'électrodes. D'une part la ou les électrodes dc référence, dont le potentiel ne varie pas pendant les mesures, et d'autre part la ou les électrodes de travail, dont on va mesurer la différence dc potentiel par rapport à l'électrode de référence. [0056] Dans un mode de réalisation préféré de l'invention les électrodes sont en métal. [0057] Dans un mode de réalisation préférentiel, les électrodes sont composées d'un mélange de métal. [0058] On entend par « mélange de métal soit une combinaison de métaux au sein d'une seule électrode, soit l'utilisation de différents métaux formant chacun une partie d'une électrode considérée dans sa globalité. [0059] Dans un mode de réalisation, l'électrode de référence est en Ag+/Ag (électrode au chlorure d'argent) [0060] Dans un mode autre mode de réalisation, l'électrode de travail est un mélange de tungstène, de platine et d'or. [0061] Dans un mode de réalisation préféré, l'électrode de référence est en Ag-F/Ag et l'électrode de travail est un mélange de tungstène, de platine et d'or. [0062] Un troisième objet de l'invention concerne un procédé de mesure du statut du stress oxydant d'une matrice biologique comportant les étapes de : [0063] - Mise en contact de ladite matrice et d'un milieu de mesure comprenant un composé AB disponible sous deux formes A et B, aptes à interagir et/ou à former des complexes respectivement avec un antioxydant et un oxydant présent à la surface ou dans ladite matrice, [0064] - Mesure du potentiel électrochimique entre une ou plusieurs électrodes de travail et une ou plusieurs électrodes de référence placées sur la matrice par électrochimie, ou de mesure d'une variation de l'absorbance par spectrophotométrie. [0065] On entend par « milieu de mesure », appelé aussi « système médiateur » ou « milieu médiateur », tout milieu pouvant être utilisé pour effectuer une mesure du statut du stress oxydant de la matrice. 7 [0066] Avantageusement, le milieu médiateur selon l'invention comporte le médiateur AB, et permet une mesure par électrochimie par spectrophotométrie ou par fluorimétric, sans avoir à ajouter de réactifs spécifiques à la méthode de mesure dans le milieu. [0067] Dans un mode de réalisation de l'invention, le milieu de mesure est sous forme liquide ou gélifiée. [0068] Dans un mode de réalisation préféré, le milieu de mesure liquide ou gélifié est composé notamment d'une solution de KCI. Une telle composition permet de stabiliser la mesure. [0069] Dans un mode de réalisation préféré, la solution de KCI est à une concentration comprise entre 0,5 et 2,5mmol/L [0070] La mise en contact de la matrice avec un milieu de mesure peut s'effectuer : [0071] - Dans le cas où la matrice à tester est solide, en appliquant un milieu de mesure gélifié à la surface de la matrice, cette méthode de mise en contact est notamment utile pour effectuer des analyses de type « in vivo » directement sur un tissu comme par exemple la peau. [0072] - Dans le cas où la matrice à tester est liquide, en mettant en solution la matrice dans un milieu médiateur liquide, cette méthode de mise en contact est notamment utile pour effectuer des analyses sur des échantillons biologiques comme le sang ou les urines. A titre d'exemple, pour un échantillon de sang, la mesure s'effectue en mettant 200Ft1 de sang dans un volume de 2,5m1 de système médiateur. [0073] On entend par « mesure du statut du stress oxydant » la mesure du potentiel électro- chimique, de l'absorbante par spectrophotométrie ou de l'intensité de la fluorescence par fluorimétrie, d'un des paramètres suivants : pouvoir antioxydant/oxydant total, effet anti-radicalaire, effet réducteur ou effet protecteur d'une matrice afin d'en déduire un statut général concernant l'état de stress oxydant de la matrice. [0074] Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le procédé est caractérisé par le fait que ledit moyen de mesure du statut du stress oxydant consiste en un moyen de mesure du pouvoir antioxydant/oxydant total de la matrice, basé sur l'analyse du potentiel électrochimique du milieu de mesure. Ce dernier incorporant au moins un composé AB présent sous deux formes A et B, aptes à réagir et/ou à former un complexe respectivement avec les espèces antioxydantes et oxydantes présentes à la surface ou dans ladite matrice, de sorte à modifier le potentiel électrochimique dudit milieu de mesure. [0075] L'utilisation d'un composé AB selon l'invention dans une mesure par électrochimie présente l'avantage d'offrir une différence de potentiel proche de celle de la peau, qui soit à la fois suffisamment élevée pour être observable (au moins 20 mV de différence de potentiel entre A et B), et pas trop élevée pour ne pas créer un danger pour la 8 matrice biologique. Ainsi, le composé AB s'avère particulièrement adapté pour effectuer des analyses par électrochimie. [0076] La mesure du potentiel électrochimique permet également l'analyse de l'effet d'un produit sur une matrice biologique, on effectue pour cela la différence entre la valeur de la différence de potentiel entre la ou les électrodes de travail et la ou les électrodes de référence prise à tO et la valeur de la différence de potentiel entre ces mêmes électrodes prise à un instant t à tester. L'instant tO correspondant à un moment avant la prise ou l'action du produit dont on veut vérifier l'effet sur la matrice biologique. On peut ainsi mesurer différents pouvoirs antioxydants/oxydants totaux correspondant à différents instants t, et réaliser la cinétique correspondante. [0077] Dans un mode de réalisation alternatif de l'invention, le procédé est caractérisé par le fait que ledit moyen de mesure du statut du stress oxydant consiste en un moyen de mesure de l'effet anti-radicalairc et de l'effet réducteur de la matrice, basé sur l'étude de rabsorbancc du milieu de mesure. Cc dernier incorporant au moins un composé AB présent sous deux formes A et B, aptes à réagir et/ou à former des complexes respectivement avec les espèces antioxydantes et oxydantes présentes à la surface ou dans ladite matrice, de sorte de modifier la valeur de l'absorbancc dudit milieu de mesure. [0078] L'utilisation d'un composé AB selon l'invention présente l'avantage de provoquer un changement de couleur du milieu selon l'état d'oxydation de la matrice mise en contact avec celui-ci, et cela sans ajouter d'indicateurs colorés. Cela rend les composés AB particulièrement propices aux analyses par spectrophotométrie. De plus, comme il n'est pas nécessaire d'ajouter d'indicateur coloré, souvent toxique, les composés AB sont particulièrement adaptés à une analyse par spectrophotométrie dans des systèmes comportant des matrices biologiques. [0079] La spectrophotométrie permet également l'analyse de l'effet d'un produit sur une matrice biologique, on effectue pour cela la différence entre la valeur de l'absorbance tO, et la valeur de l'absorbance à un instant t à tester. L'instant tO con-espondant à un moment avant la prise du produit dont on veut vérifier l'effet sur la matrice biologique. On peut ainsi mesurer différents effets anti-radicalaires et réducteurs, correspondant à différents instants t, et réaliser la cinétique correspondante. [0080] Dans un mode de réalisation alternatif de l'invention, le procédé est caractérisé par le fait que ledit moyen de mesure du statut du stress oxydant consiste en un moyen de mesure de la fluorescence du milieu de mesure, ce dernier incorporant une molécule au moins un composé AB présent sous deux formes A et B, aptes à réagir et/ou à former des complexes respectivement avec les espèces antioxydantes et oxydantes présentes à la surface ou dans ladite matrice, de sorte de modifier la valeur de la fluorescence dudit milieu de mesure. [0081] Dans un mode de réalisation avantageux, la mesure du statut du stress oxydant 9 permet également l'analyse de l'effet d'un produit sur une matrice biologique, on effectue pour cela la différence entre la valeur du statut du stress oxydant à tO et la valeur à un instant t à tester. L'instant tO correspondant à un moment avant la prise ou l'action du produit dont on veut vérifier l'effet sur la matrice biologique. On peut ainsi mesurer différents statut du stress oxydant correspondant à différents instants t, et réaliser la cinétique correspondante. [0082] L'étude de la cinétique du statut du stress oxydant est notamment utile pour dé- terminer l'effet d'un produit sur la balance antioxydant/oxydant de la matrice biologique au cours du temps. [0083] Un quatrième objet de l'invention concerne un procédé de détermination du score oxydant d'une matrice biologique qui comprend la combinaison des résultats d'au moins deux mesures choisies parmi : [0084] - Une mesure par électrochimie mesurant le pouvoir antioxydant/oxydant total de ladite matrice, [0085] - Une mesure par spectrophotométrie mesurant l'effet anti radicalaire et/ou l'effet réducteur de ladite matrice, [0086] - Une mesure par fluorimétrie mesurant l'effet protecteur de ladite matrice. [0087] On entend par « score oxydant », un indice donnant une information précise sur l'état antioxydant et oxydant de la matrice biologique. [0088] Un tel indice se différencie du statut du stress oxydant en ce qu'il se hase sur au moins deux paramètres informatifs concernant le stress oxydant de la matrice, obtenus par au moins deux méthodes de mesure différentes. Le fait d'utiliser deux méthodes de mesure différentes choisies parmi l'électrochimie, la spectrophotométrie ou la fluorimétrie, permet d'affiner la précision de l'indice. [0089] Comme énoncé précédemment, chaque méthode de mesure va permettre de mesurer un ou des paramètres différents. Les industriels ont souvent joué sur cette multiplicité des paramètres pour mettre en avant le paramètre les avantageant le plus aux yeux des clients. [0090] Le score oxydant permet d'éviter ce genre de biais, en combinant les résultats de différents paramètres issus de différentes mesures en un seul score, offrant ainsi un indice clair sur l'état oxydant de la matrice biologique, tout en offrant de meilleures garanties quant à la pertinence du résultat. [0091] Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le score oxydant est calculé en combinant la mesure du pouvoir antioxydant/oxydant total, de l'effet anti-radicalaire, de l'effet réducteur et de l'effet protecteur. Un tel score oxydant offre la mesure la plus précise de l'état oxydant de la matrice biologique car il combine un grand nombre de paramètres relatifs à l'état oxydant de la matrice biologique. [0092] Dans un mode de réalisation spécifique, la mesure du score oxydant permet également l'analyse de l'effet d'un produit. sur une matrice biologique, on effectue pour cela la différence entre la valeur du score oxydant prise à tO et la valeur prise à un instant t à tester. L'instant tO correspondant à un moment avant la prise ou l'action du produit dont. on veut vérifier l'effet sur la matrice biologique. On peut ainsi mesurer différents score oxydant correspondant. à différents instants t, et réaliser la cinétique correspondante. [0093] L'étude de la cinétique du score oxydant est notamment utile pour déterminer l'effet d'un produit sur l'état oxydant de la matrice biologique au cours du temps. Brève description des dessins [0094] [fig.11 La Figure 1 présente la courbe électrochimique obtenue après 10 minutes d'enregistrement grâce au système médiateur et aux microélectrodes appliquées sur la peau. EXEMPLES EXEMPLE 1 : Mesure du statut du stress oxydant. [0095] Le statut du stress oxydant est mesuré sur la peau (avant-bras) d'une femme âgée de 26 ans, à jeun 12 hem-es avant le début de la mesure, à une température et hygrométrie comprise respectivement (20°C