Brevet FR3089232A1 — publié le 20200605

Description Titre de l'invention : Modèle tridimensionnel de culture cellulaire de la glande sudoripare humaine pour l'analyse des processus de sudation associés au stress [000 La présente invention concerne un procédé d'étude in vitro des processus de sudation dans lequel un équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares est mis à disposition, l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares est stimulé par voie adrénergique et la réaction de l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares est déterminée. [0002] Le lavage, le nettoyage et le soin de son propre corps constitue un besoin primaire de l'être humain et l'industrie moderne tente en permanence de satisfaire ces besoins de l'être humain de diverses manières. L'élimination continue, ou au moins la réduction, des odeurs corporelles et de l'humidité des aisselles est particulièrement importante pour l'hygiène quotidienne. Les clients souhaitent des anti-transpirants qui empêchent efficacement l'impact négatif de la sudation émotionnelle sur leur qualité de vie. La protection contre les odeurs corporelles et l'humidité des aisselles grâce aux produits cosmétiques est un élément important de l'hygiène quotidienne. Cela donne un sentiment de confiance à l'utilisateur, en particulier aux personnes qui subissent une forte transpiration en raison de la pression psychologique. [0003] L'humidité des aisselles et les odeurs corporelles sont causées par la sécrétion issue des glandes sudoripares eccrines et apocrines dans l'aisselle humaine. Tandis que les glandes eccrines servent principalement à la thermorégulation du corps et sont responsables de la formation de l'humidité des aisselles, les glandes apocrines sécrètent une sécrétion visqueuse en réponse au stress, ce qui génère une odeur corporelle désagréable due à la décomposition bactérienne. [0004] Les premiers travaux de recherche sur les glandes sudoripares eccrines et apocrines ont été menés dès le début du 20e siècle afin de classer ces annexes cutanées appartenant au groupe des glandes exocrines. Les glandes sudoripares peuvent ensuite être divisées en glandes sudoripares apocrines et eccrines et en une forme mixte de glandes sudoripares apocrines et eccrines (également appelées glandes sudoripares apoeccrines). Les formes susmentionnées peuvent être distinguées par des propriétés morphologiques et caractéristiques. [0005] Les glandes sudoripares eccrines, en particulier les glandes sudoripares eccrines humaines, appartiennent aux glandes tubulaires enroulées non ramifiées et peuvent se subdiviser en queue sécrétoire (également appelée spirale), en portion dermique (appelé aussi conduit) et. en portion épidermique (aussi appelée acrosyringium). Les cellules présentes dans ces sections glandulaires présentent différentes fonctions, telles 2 que, par exemple, la sécrétion dans la spirale, la réabsorption des ions dans le conduit et l'émission de la sécrétion, en particulier de la sueur, sur la peau environnante par r acrosyringium. Les glandes sudoripares eccrines sont stimulées par le neurotransmetteur acétylcholine (ACh). Afin d'éviter l'humidité des aisselles et/ou les odeurs corporelles, il est souhaitable de réduire ou d'empêcher la sécrétion des glandes sudoripares eccrines et/ou apocrines. Cela peut être réalisé, par exemple, par le blocage des portions des glandes sudoripares eccrines au moyen de bouchons. Des sels d'aluminium et/ou d'aluminium-zirconium antitranspirants sont utilisés à cette fin dans l'état actuel de la technique, ceux-ci sont toutefois considérés comme critiques par le consommateur. [0006] En outre, des agents antibactériens sont utilisés dans l'état actuel de la technique pour empêcher la dégradation bactérienne de la sueur. Cependant, ces agents peuvent affecter négativement la microflore naturelle de la peau sous les aisselles. Il est donc souhaitable de mettre à disposition des agents cosmétiques capables d'empêcher de manière fiable l'humidité des aisselles et/ou les odeurs corporelles, et qui ne contiennent ni les agents antibactériens ni les sels d'aluminium et/ou d'aluminium-zirconium utilisés dans l'état actuel de la technique. Des études uniques non confirmées relient ces composés d'aluminium à des maladies. Le consommateur incertain souhaite des produits « sans aluminium ». Bien qu'aucune preuve n'existe jusqu'à présent et que l'Office fédéral d'évaluation des risques (BfR) ne voit aucun risque pour l'utilisateur si le produit est utilisé correctement, l'attention des médias et du consommateur est grande. [0007] Une façon de mettre à disposition de tels agents consiste à utiliser des substances qui inhibent efficacement la stimulation des glandes sudoripares et réduisent ou empêchent ainsi la sécrétion de sueur. Afin de pouvoir identifier de telles substances, des tests in vivo associant des participants peuvent être menés. Cependant, ces tests sont coûteux et ne permettent pas les procédés de criblage à haut débit. D'autre part, des tests in vitro utilisant des modèles cellulaires de glandes sudoripares peuvent être utilisés pour étudier l'influence des substances de test sur la stimulation des glandes sudoripares. [0008] Pour que les résultats des tests obtenus in vitro soient bien transférables à la situation in vivo, le modèle cellulaire utilisé des glandes sudoripares doit reproduire la situation in vivo aussi précisément que possible. À cette fin, des modèles cellulaires tridimensionnels sont nécessaires car les modèles bidimensionnels connus dans l'état actuel de la technique n'ont pas d'approche physiologique suffisante concernant les glandes sudoripares natives et ne reproduisent donc que de manière insuffisante la situation in vivo. En outre, une clarification du mécanisme de la sécrétion de sueur est nécessaire. C'est seulement ainsi que peuvent être identifiées les cibles dites biologiques, en particulier les protéines produites par les cellules des glandes sudoripares, dont l'influence 3 par des substances de test conduit à une production de sueur moindre. Les cibles biologiques potentielles pouvant être associées à la production de sueur sont les canaux ioniques et/ou les canaux d'eau et/ou les récepteurs de la transduction de signal qui contrôlent la sécrétion de sueur. [0009] De plus, les modèles cellulaires de glandes sudoripares peuvent être utilisés pour étudier l'influence des substances de test sur la stimulation des glandes sudoripares. Ces modèles doivent simuler le plus fidèlement possible la situation in vivo, être normalisés et rentables, et permettre l'utilisation de procédés de criblage à haut débit. Un modèle de glande sudoripare tridimensionnel connu dans l'état actuel de la technique est par exemple décrit par Li (Li et al., « La matrice memhranairc basale de Matrigel amène les cellules des glandes sudoripares eccrines à reconstituer les structures analogues aux glandes sudoripares chez les souris sans poil » (« Matrigel hasement membrane matrix induccs eccrine swcat gland cens to rcconstitutc swcat gland-like structures in nudc micc ») ; recherche cellulaire expérimentale, 2015, 332, Pages 67 à 77). Pour produire cc modèle de glande sudoripare, les cellules primaires des glandes sudoripares sont d'abord cultivées avec des facteurs de croissance dans une substance semblable à un gel (Matrigel®), puis implantées dans le dos de souris vivantes. Après implantation, des structures sphéroïdales sont exprimées, celles-ci exprimant des protéines de marqueur spécifiques des glandes sudoripares. Étant donné que l'utilisation de souris est nécessaire pour former les structures différenciées, cc modèle ne peut pas être utilisé dans la recherche cosmétique et pharmaceutique où l'utilisation d'animaux de laboratoire est interdite. Enfin, l'utilisation de modèles à peau pleine, qui, en plus du derme et de l'épiderme, contient également des glandes sudoripares, est également connue. En prélevant des échantillons de peau humaine adulte, on obtient des modèles contenant toutes les annexes cutanées de cette partie de la peau, y compris les glandes sudoripares. Ces modèles sont également appelés modèles de peau complète ex vivo. [0010] 11 existe donc toujours un besoin de procédés in vitro pouvant être utilisés pour identifier et analyser les cibles biologiques responsables de la réduction accrue de la sueur. Après l'identification et l'analyse de telles cibles, il est préférable d'étudier l'influence de différentes substances de test sur ces cibles. Ces procédés in vitro doivent être normalisés, peu coûteux et rapides à mettre en oeuvre, afin de permettre la détermination de l'influence des substances de test sur les cibles biologiques dans les procédés de criblage à haut débit. [0011] Un objet de la présente invention est de mettre à disposition un procédé in vitro d'analyse de processus de sudation qui puisse être normalisé, soit peu coûteux et rapide à mettre en oeuvre, et dont les résultats puissent être transférés à la situation in vivo. En particulier, le procédé doit permettre d'identifier les substances qui représentent des antitranspirants potentiellement efficaces. [0012] Le problème est résolu par l'objet de la présente invention qui concerne un procédé d'étude in vitro des processus de sudation, dans lequel un équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares est mis à disposition, l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares est stimulé par voie adrénergique et la réaction de l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares est déterminée grâce à une mesure de la teneur en adénosine monophosphatc cyclique (AMPc). [0013] Il a été découvert qu'une étude in vitro des processus de sudation peut être réalisée par la détection de la réponse d'un équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares par la mesure de la teneur en adénosine monophosphatc cyclique. [0014] La première étape du procédé concerne la mise à disposition d'un équivalent tridi- mensionnel de glandes sudoripares. [0015] Selon l'invention, on entend par équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares un modèle cellulaire de cellules de glandes sudoripares qui s'étend dans les trois directions spatiales et dans lequel les cellules exercent une fonction similaire, en particulier une fonction identique, en tant que cellules d'une glande sudoripare native. La production d'équivalents tridimensionnels de glandes sudoripares est connue dans l'état actuel de la technique. Par l'incorporation d'équivalents tridimensionnels de glandes sudoripares dans un équivalent dermique et/ou épidermique d'un équivalent cutané, il est possible d'obtenir des modèles dans lesquels les interactions cellule-cellule entre les différents types de cellules correspondent à peu près à celles de la peau native. La production a lieu exclusivement par des procédés in vitro et permet une bonne normalisation ainsi qu'une production économique des équivalents cutanés. Par conséquent, ces équivalents cutanés sont particulièrement bien adaptés aux procédés de criblage à haut débit utilisés pour tester les substances antitranspirantes destinées aux cosmétiques et à la pharmacie. L'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares mis à disposition est stimulé de manière adrénergique dans une étape de procédé ultérieure. La stimulation est destinée à simuler le facteur de stress humain. En principe, tous les stimulants qui stimulent les récepteurs adrénergiques sont pris en compte. Maintenant, l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares peut être exposé à une substance active. [0016] Si l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares stimulé est exposé à une substance active, une réaction de l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares peut se produire. Une étape de procédé dans le procédé selon l'invention peut comprendre la mise en contact de l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares avec une substance active à étudier. Selon le type de substance active à étudier, il existe une inhibition souhaitable dans la voie adrénergique. Le degré d'inhibition de la voie de signalisation adrénergique permet de tirer des conclusions sur la mesure dans laquelle la substance active à étudier agit en tant qu'anti-transpirant. Le degré d'inhibition de la voie de signalisation adrénergique est déterminé selon l'invention par la mesure de la teneur en adénosine monophosphate cyclique (AMPc). L'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) est une molécule d'adénosine triphosphate (ATP) d'origine biochimique qui sert de « second messager » dans la transmission cellulaire des impulsions nerveuses. La teneur en AMPc sert finalement de mesure quantitative de l'activité anti-transpirante d'une substance active potentielle. Par conséquent, dans la dernière étape du procédé selon l'invention, on détermine la réaction de l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares qui exerce une substance active par la mesure de la teneur en AMPc. Plus les cellules sont actives dans la structure cellulaire, plus la valeur d'AMPc est élevée. En raison de la substance active à étudier, la teneur en AMPc doit être inférieure malgré la stimulation adrénergique. Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares comprend de 500 à 500 000 cellules de glandes sudoripares. L'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares présente de préférence un diamètre compris entre 100 et 6000 pm, de préférence entre 150 et 4000 pm, de manière davantage préférée entre 200 et 3000 pm. Le diamètre des équivalents de glandes sudoripares sphériques selon l'invention peut être réalisé, par exemple, au moyen d'une mesure microscopique à l'aide du logiciel « CellSens ». Des équivalents tridimensionnels de glandes sudoripares ayant les propriétés ci-dessus peuvent être préparés par un procédé décrit ci-dessous. Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares est préparé par un procédé comprenant les étapes suivantes : [0017] a) la mise à disposition de glandes sudoripares isolées, [0018] b) la mise à disposition d'une préparation cellulaire de cellules primaires de glandes sudoripares issue des glandes sudoripares isolées à l'étape de procédé a), [0019] c) l'application de la préparation cellulaire mise à disposition à l'étape de procédé b) sur un substrat, [0020] d) la culture de la préparation cellulaire appliquée à l'étape de procédé c), [0021] e) l'isolement de l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares obtenu à l'étape d). [0022] Par glandes sudoripares isolées utilisées à l'étape de procédé a), on entend des glandes sudoripares non cultivées pouvant être obtenues à partir de biopsies cutanées ou d'éléments analogues et qui ont été retirées de leur environnement naturel. Ces glandes sudoripares isolées sont ensuite préparées, cultivées et isolées pour obtenir une culture cellulaire. La préparation cellulaire utilisée à l'étape de procédé b) des cellules primaires de glandes sudoripares doit être comprise comme une suspension de cellules de glandes sudoripares de la glande sudoripare isolée et cultivée dans une solution, en 6 particulier dans un milieu nutritif À cet égard, il est préférable d'isoler les glandes sudoripares natives par digestion enzymatique de la peau humaine à l'aide d'un mélange de 2 à 3 mg/m1 de collagénase n et de 0,1 à 0,2 mg/ml de thermolysine pendant 3 à 6 heures à une température de 35 à 40 °C, en particulier de 37 °C. La peau humaine utilisée à cet effet est de préférence une biopsie de la peau obtenue par exemple en tant que déchet issu d'une opération de chirurgie esthétique. En outre, une préparation à l'état suspendu peut de préférence être prévue, ce qui doit être compris comme une préparation dans laquelle la préparation cellulaire de l'étape de procédé h) n'est pas située sur la surface d'une plaque de culture ou d'un flacon, mais est suspendue librement suspendue sous la forme d'une goutte d'une surface ou suspendue librement entre deux surfaces. [0023] À l'étape de procédé h) du procédé selon l'invention, une préparation cellulaire de cellules primaires de glandes sudoripares à partir des glandes sudoripares isolées, de préférence natives, est mise à disposition. Cette préparation cellulaire peut être effectuée, par exemple, après la préparation des glandes sudoripares isolées, de préférence natives, le détachement des cultures monocouchcs poussant à partir des glandes sudoripares et la préparation de ces cellules de glandes sudoripares primaires détachées par suspension dans un milieu approprié avec ajustement du nombre de cellules requis. Les modes de réalisation préférés selon l'invention sont donc caractérisés en ce que la préparation cellulaire de cellules de glandes sudoripares primaires à l'étape de procédé b) est réalisée par la préparation des glandes sudoripares isolées à l'étape de procédé a), le détachement de cellules de glandes sudoripares, en particulier par trypsinisation douce, la culture de ces cellules de glandes sudoripares séparées dans des cultures monocouches, la suspension des cellules de glandes sudoripares primaires cultivées dans un milieu nutritif ainsi qu'un ajustement du nombre de cellules sont fabriqués. [0024] Après une mise à disposition de la préparation cellulaire de cellules primaires de glandes sudoripares, la préparation cellulaire est appliquée sur un substrat conformément au mode de réalisation préféré. En d'autres termes, à l'étape de procédé c), la préparation cellulaire de cellules de glandes sudoripares primaires mise à disposition à l'étape de procédé b) est appliquée sur une surface, de préférence appliquée sur une surface de polymère. Afin de parvenir à une normalisation suffisante, un nombre déterminé de cellules doit être ajusté avant la culture de la préparation cellulaire de cellules primaires de glandes sudoripares à la surface du polymère Afin de permettre la formation de différentes caractéristiques ainsi que la différenciation des cellules primaires de glandes sudoripares en différentes fonctionnalités dans l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares, la préparation cellulaire appliquée à l'étape de procédé c) sur la surface, de préférence la surface du polymère, contient 7 des nombres déterminés de cellules primaires de glandes sudoripares. L'utilisation de nombres de cellules précisément définis permet également la normalisation des équivalents de glandes sudoripares, car tous les équivalents ont des nombres de cellules similaires, en particulier identiques, ce qui permet d'éviter des résultats divergents ou une normalisation coûteuse. Les modes de réalisation préférés de cet objet de l'invention sont donc caractérisés en ce que, à l'étape de procédé c), le nombre de cellules des cellules de glande sudoripare primaire dans la préparation cellulaire est compris entre 5 000 et 230 000 cellules par centimètre carré de surface du polymère, de préférence entre 5 000 et 200 000 cellules par centimètre carré dc surface du polymère, de préférence dc 5 000 à 170 000 cellules par centimètre carré dc surface du polymère, de préférence dc 5 000 à 140 000 cellules par centimètre carré dc surface du polymère, en particulier de 5 000 à 132 000 cellules par centimètre carré de surface du polymère. [0025] Par exemple, le nombre de cellules des cellules primaires de glandes sudoripares peut être déterminé à l'aide d'une chambre de comptage classique et du bleu dc trypan. À cette fin, la suspension de cellules primaires de glandes sudoripares en culture est ajoutée de manière non diluée avec une solution de bleu de trypan et le nombre de cellules dans les coins carrés correspondants est déterminé. À partir de ces valeurs, la moyenne arithmétique est formée. En tenant compte du volume de la chambre de comptage, du facteur de dilution et du facteur de chambre, on détermine le nombre de cellules par ml ou [11 à partir de cette valeur moyenne. Le nombre de cellules utilisé à l'étape de procédé c) du procédé fait ici référence au nombre de cellules vivantes (nombre de cellules vivantes). À l'aide d'un volume correspondant, le nombre de cellules revendiqué peut ensuite être appliqué à la surface du polymère. Dans le contexte de la présente invention, il est préférable que la préparation cellulaire de cellules primaires de glandes sudoripares utilisées à l'étape de procédé c) présente un volume déterminé. Cela facilite la culture de ladite préparation cellulaire sur le substrat. On préfère donc, conformément à l'invention, que, à l'étape de procédé c), la préparation cellulaire de cellules de glandes sudoripares primaires à appliquer sur la surface cellulaire présente un volume compris entre 400 et 4 000 !IL, de préférence entre 450 et 3 000 kiL, de préférence entre 480 et 2 500 [11, en particulier entre 490 et 2 100 mt. L'application des volumes susmentionnés sur le substrat, en particulier sur la surface du polymère, assure une croissance suffisante des cellules primaires de glandes sudoripares situées dans ladite préparation cellulaire. [0026] À l'étape de procédé d) du procédé selon l'invention, la culture de la préparation cellulaire des cellules primaires de glandes sudoripares est réalisée sur le substrat, en particulier sur la surface spéciale du polymère. [0027] La surface du polymère empêche l'adhésion des cellules sur cette surface et 8 contribue donc à la formation de l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares. [0028] Un mode de réalisation préféré de la présente invention est ainsi caractérisé en ce que la surface du polymère est formée d'au moins un polymère choisi dans le groupe des alcools polyvinyliques, des polyéthylèneglycols, des poly(2-hydroxyéthyl)tnéthacrylates, des dextranes, des carboxyméthylcellulloses, des agaroses, des amidons, des celluloses, des polyacrylamines, des esters d'acides alginiques et/ou des acides hyaluroniques et/ou des polyacrylates et/ou des pectines, ainsi que leurs mélanges. De telles surfaces de polymère sont disponibles dans le commerce, par exemple, auprès de la société Corning Incorporated en tant que produits de culture cellulaire Ultra Low Attachment avec des surfaces d'hydrogel liées par covalence. [0029] Il s'est avéré avantageux que la préparation cellulaire avec les cellules primaires de glandes sudoripares à l'étape de procédé d) soit cultivée dans des conditions déterminées sur le substrat, en particulier la surface du polymère, pendant une période de temps déterminée. Il est donc préférable de cultiver la préparation cellulaire à l'étape de procédé d) pendant une période de 1 à 25 jours, en particulier de 2 à 7 jours, à une température de 36 à 38 nC et à une teneur en CO2 de 5 % en poids, par rapport au poids total de l'atmosphère utilisée pour la culture. [0030] Dans le contexte de la présente invention, il peut en outre être prévu que, lors de la culture des cellules primaires de glandes sudoripares à l'étape de procédé d), le milieu nutritif utilisé pour l'application de la préparation cellulaire soit remplacé par un milieu nutritif frais. Par milieu nutritif frais, on entend un milieu nutritif qui ne contient pas de cellule. La fraction volumique désigne ici le volume total de la préparation cellulaire préparée à l'étape de procédé b). Il est donc avantageux selon l'invention que, pendant la période de culture à l'étape de procédé d), en particulier après 1 à 3 jours, le milieu nutritif de la préparation cellulaire soit remplacé par un milieu nutritif frais. [0031] Dans ce contexte, il est préférable d'utiliser un milieu nutritif déterminé en tant que milieu nutritif frais pour l'échange de volume. Dans le contexte de la présente invention, il est donc avantageux qu'un mélange de DMEM et de F12 de Ham dans un rapport pondéral de 3:1, contenant en outre 10 % en poids, par rapport au poids total du mélange, de sérum de veau foetal (SVF), soit utilisé en tant que milieu nutritif frais. À l'étape de procédé e) du procédé selon l'invention, l'isolement de l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares a lieu par élimination du milieu nutritif. Les modes de réalisation préférés de la présente invention sont donc caractérisés en ce que l'isolation de l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares à l'étape de procédé e) a lieu par élimination du milieu nutritif. [0032] De manière davantage préférée, l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares est un équivalent des glandes sudoripares humaines eccrines et/ou apocrines. Les 9 modes de réalisation préférés de la présente invention sont donc caractérisés en cc que l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares est un équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares des glandes sudoripares humaines eccrines et/ou apocrines. En particulier, il s'agit de glandes sudoripares eccrines à l'étape a) du procédé de production. [0033] Les équivalents de glandes sudoripares obtenus selon le procédé de production préféré sont particulièrement bien adaptés à l'identification de substances actives and-transpirantes à usage humain in vivo. [0034] Les équivalents tridimensionnels de glandes sudoripares selon l'invention présentent une normalisation et une disponibilité plus élevées que les glandes sudoripares isolées et sont plus proches de la situation in vivo que les modèles unidimensionnels et bidimensionnels de glandes sudoripares. De plus, ces équivalents représentent une autre solution rentable par rapport aux études humaines in vivo, ccs équivalents pouvant être utilisés pour étudier l'effet anti-transpirant de substances de test, par exemple par la comparaison de l'expression génique ou de l'expression d'une protéine dans le cas d'une stimulation par l'acétylcholine (ACh) en présence et en l'absence d'une substance de test déterminée. Les équivalents tridimensionnels de glandes sudoripares selon l'invention simulent la glande sudoripare in vivo, tant par leur structure que par leur composition histologique, de sorte que les informations obtenues avec ces équivalents sont facilement transférables à l'homme et peuvent également être comparées à des données de composés déjà testés in vivo. Selon un autre mode de réalisation préféré, l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares est présent dans un milieu aqueux ou est dispersé dans de l'eau. Cette caractéristique présente l'avantage de pouvoir étudier les substances actives hydrosolubles à étudier pouvant servir d'anti-transpirants, ainsi que leur potentiel anti-transpirant. [0035] Dans le contexte de la présente invention, il est préférable que les équivalents de glandes sudoripares prêts à l'emploi selon l'invention soient exempts de composés de matrice et/ou de supports. Par composés de matrice, on entend des composés capables de former des réseaux spatiaux. Cependant, cela n'inclut pas les substances produites et excrétées par les cellules elles-mêmes, lesquelles substances sont capables de former des réseaux spatiaux. De plus, les supports au sens de la présente invention s'entendent comme des substances auto-portantes pouvant servir de support ou de cadre aux cellules de glandes sudoripares. Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares est exempt de composés de matrice et/ou de supports, en particulier exempt de composés de matrice et de supports. [0036] Par « exempt de », on entend selon l'invention que les équivalents tridimensionnels de glandes sudoripares contiennent moins de 1% en poids, par rapport au poids total de l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares, de composés de matrice et/ou de supports. Il est donc avantageux que l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares contienne de 0 à 1 % en poids, de préférence de 0 à 0,5 % en poids, de manière préférée de 0 à 0,2 % en poids, en particulier 0 % en poids, par rapport au poids total de l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares, sur les composés de matrice et les supports. Dans ce contexte, il est particulièrement avantageux que les équivalents tridimensionnels de glandes sudoripares soient exempts de composés de matrice et de supports déterminés. Il est donc préférable que l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares ne contienne pas de composés de matrice et/ou de support choisis dans le groupe des collagènes, en particulier des collagènes de type I et/ou de type III et/ou de type IV, des scléroprotéines, des gélatines, des chitosanes, des glucosamines, des glucosaminoglucanes (GAG), des protéoglucanes de sulfate d'héparine, des protéines glycatécs sulfatées, des facteurs de croissance, des polysaccharides réticulés, des polypeptides réticulés ainsi que leurs mélanges. Selon un mode de réalisation préféré, les cellules primaires de glandes sudoripares mises à disposition à l'étape de procédé h) comprennent au moins un type de cellule choisi dans le groupe (i) des cellules en spirale, en particulier des cellules claires, des cellules sombres et des cellules rnyoépithéliales, (ii) des cellules canalaires ainsi que (iii) de leurs mélanges. Les cellules spéciales de la spirale sont tenues pour responsables de la formation de la sueur primaire. Les cellules sélectionnées de la spirale sont donc avantageuses comme base pour la production d'équivalents tridimensionnels de glandes sudoripares, lesquels doivent être utilisés dans un procédé d'étude des processus de sudation. Le conduit représente la sortie à la cellule sudoripare. Les cellules du conduit ont une fonction d'absorption des ions et ont donc une influence sur les processus de sudation et en particulier sur la formation d'odeurs, car les cellules ont une influence sur la teneur en sel. De plus, des récepteurs adrénergiques ont été trouvés dans les types de cellules préférés. [0037] Selon un mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention, l'équivalent tridi- mensionnel de glandes sudoripares est stimulé par l'ajout d'adrénaline, de préférence d'une solution aqueuse comprenant de l'adrénaline, à l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares. La stimulation représente la simulation du stress. En contactant l'adrénaline comme stimulant préféré, l'équivalent de glandes sudoripares doit être stimulé de la même manière que le stress stimule les glandes sudoripares naturelles dans le corps humain. À cette fin, l'adrénaline est mise en contact avec la suspension aqueuse comprenant l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares dans une solution aqueuse. [0038] La détection de la réaction de l'équivalent de glandes sudoripares est mesurée par la détection de l'AMPc, sa concentration étant mesurée. Concrètement, selon un mode de 11 réalisation préféré de la présente invention, la concentration en AMPc est mesurée de manière calorimétrique par une réaction de teinture. Plus les cellules sont actives dans la structure cellulaire, plus la valeur d'AMPc est élevée. Par la mise en contact de substances actives avec l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares, la teneur en AMPc doit être inférieure malgré la stimulation adrénergique. Plus le niveau d'AMPc est faible après la mise en contact, meilleure est la substance active à étudier. Selon un procédé préféré, on détermine la réaction de l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares qui exerce une substance active prévue pour la réduction du processus de sudation sur l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares. [0039] Selon un autre mode de réalisation préféré, on détermine la réaction de l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares que la substance active exerce par l'ajout de la substance active à l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares, et de préférence avant que l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares ne soit stimulé, ou simultanément avec l'étape de procédé dans laquelle l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares est stimulé, ou après que l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares est stimulé. Dans ces trois options, le mécanisme de la réaction de l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares peut être particulièrement bien étudié. Les compositions cosmétiques tout particulièrement préférées selon l'invention comprennent au moins l'un des modes de réalisation suivants A) à E) [0040] A) [0041] Procédé d'étude in vitro de processus de sudation, dans lequel [0042] - un équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares est mis à disposition, [0043] - l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares est stimulé par voie adr- énergique, [0044] - l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares est mis en contact avec une substance active à étudier, et [0045] - la réaction de l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares est déterminée par la mesure de la teneur en adénosine monophosphate cyclique (AMPc). [0046] B) [0047] Procédé d'étude in vitro de processus de sudation, dans lequel [0048] - un équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares est mis à disposition, [0049] - l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares est stimulé par voie adr- énergique, [0050] - l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares est mis en contact avec une substance active à étudier, et [0051] - la réaction de l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares est déterminée par la mesure de la teneur en adénosine monophosphate cyclique (AMPc). [0052] l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares étant préparé par un procédé 12 comprenant les étapes suivantes : [0053] a) la mise à disposition de glandes sudoripares isolées, [0054] h) la mise à disposition d'une préparation cellulaire de cellules primaires de glandes sudoripares issue des glandes sudoripares isolées à l'étape de procédé a), [0055] c) l'application de la préparation cellulaire mise à disposition à l'étape de procédé h) sur un substrat, [0056] d) la culture de la préparation cellulaire appliquée à l'étape de procédé c), [0057] c) l'isolement de l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares obtenu à l'étape de procédé d). [0058] C) [0059] Procédé d'étude in vitro de processus de sudation, dans lequel [0060] - un équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares est mis à disposition, [0061] - l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares est stimulé par voie adr- énergique, [0062] - l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares est mis en contact avec une substance active à étudier, et [0063] - la réaction de l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares est déterminée par la mesure de la teneur en adénosine monophosphatc cyclique (AMPc). [0064] l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares comprenant de 500 à 500 000 cellules de glandes sudoripares et/ou présentant un diamètre compris entre 100 et 6000 pm, de préférence entre 150 et 4000 de manière davantage préférée entre 200 et 3000 pm. [0065] D) [0066] Procédé d'étude in vitro de processus de sudation, dans lequel [0067] - un équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares est mis à disposition, [0068] - l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares est stimulé par voie adr- énergique, [0069] - l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares est mis en contact avec une substance active à étudier, et [0070] - la réaction de l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares est déterminée par la mesure colorimétrique de la teneur en adénosine monophosphate cyclique (AMPc). [0071] l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares comprenant de 500 à 500 000 cellules de glandes sudoripares et/ou présentant un diamètre compris entre 100 et 6000 pm, de préférence entre 150 et 4000 de manière davantage préférée entre 200 et 3000 pm. [0072] E) [0073] Procédé d'étude in vitro de processus de sudation, dans lequel 13 [0074] - un équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares est mis à disposition, [0075] - l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares est stimulé par voie adr- énergique, [0076] - l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares est mis en contact avec une substance active à étudier, et [0077] - la réaction de l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares est déterminée par la mesure colorimétrique de la teneur en adénosine monophosphate cyclique (AMPc). [0078] l'équivalent tridimensionnel de glandes sudoripares comprenant de préférence de 500 à 500 000 cellules de glandes sudoripares et/ou présentant un diamètre compris entre 100 et 6000 pm, de préférence entre 150 et 4000 pm, de manière davantage préférée entre 200 et 3000 pm, et les équivalents de cellules sudoripares étant produits à partir de glandes sudoripares eccrines. [0079] Les modes de réalisation A à E peuvent être combinés avec des propriétés des autres modes de réalisation préférés. À l'aide des modèles de glandes sudoripares 3D, il est possible d'identifier des substances actives à l'aide du procédé selon l'invention dans le cadre d'un criblage de substance active, lesquelles pourraient être utilisées comme antitranspirants, afin de permettre le remplacement des produits conventionnels contenant de l'aluminium. 14 [Revendication 1] [Revendication 2] [Revendication 3] [Revendication 4] [Revendication 5] [Revendication 6]