Brevet FR3091295A1 — publié le 20200703

Description Titre de l'invention : SYSTEME FLUIDIQUE DE PRODUCTION DE VESICULES EXTRACELLULAIRES ET PROCéDé ASSOCIé Domaine technique [0001] L'invention concerne de manière générale la production de vésicules extracellulaires L'invention se rapporte plus précisément à un système de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension, un procédé de production et de récupération de telles vésicules et des vésicules produites par un tel système, les vésicules extracellulaires peuvent par exemple être d'intérêt comme vecteurs d'agent thérapeutiques ou d'imagerie, comme alternative à la thérapie cellulaire et dans la médecine régénérative. Technique antérieure [0002] Les cellules sont connues pour libérer des vésicules extracellulaires dans leur envi- ronnement, par exemple, in vivo, dans les fluides biologiques d'un organisme. Les vésicules extracellulaires ont été identifiées comme des moyens efficaces pour délivrer des médicaments, de manière personnalisée ou ciblée, dans le corps humain. Elles présentent d'abord une biocompatibilité native et une tolérance immunitaire. Elles peuvent également intemaliser des nanoparticules théranostiques, permettant à la fois d'imager certaines parties du corps et de délivrer des principes actifs ayant des fonctions thérapeutiques. Les vésicules extracellulaires ont également une fonction de communication intercellulaire : elles permettent, par exemple, de transporter des lipides, des protéines membranaires et cytoplasmiques et/ou des nucléotides du cytoplasme cellulaire, tels que des ARNm, des microARN ou des ARN longs non-codants, entre différentes cellules. [0003] En particulier, l'utilisation de vésicules extracellulaires peut permettre de résoudre des problèmes connus lors de l'utilisation thérapeutique de cellules, tels que la réplication cellulaire, la différentiation, les occlusions vasculaires, les risques de rejet et les difficultés de stockage et congélation. Il existe en conséquent un besoin industriel pour la production de vésicules cellulaires en quantités suffisantes pour une utilisation thérapeutique, notamment en remplacement ou en complément de thérapies cellulaires. [0004] A cet effet, Piffoux et al. (Piffoux, M., Silva, A. K., Lugagne, J. B., Hersen, P., Wilhelm, C., & Gazeau, F., 2017, Extracellular Vesicle Production Loaded with NaT10- particles and Drugs in a Trade-o between Loading, Yield and Purity: Toi/yards a Personalized Drug Delivery System, Advanced Biosystems) décrivent la comparaison de différentes méthodes de production de vésicules extracellulaires [0005] Une première méthode consiste à produire des vésicules extracellulaires à partir de 2 cellules endothéliales de la veine du cordon ombilical (HUVEC), en soumettant ces cellules à des contraintes hydrodynamiques mimant les contraintes exercées dans des conditions physiologiques au sein des capillaires sanguins ou dans des conditions pathologiques lors de sténose des vaisseaux sanguins. Ces contraintes sont entraînées par le passage des cellules productrices dans des canaux rnicrofluidiques. Une puce micro-fluidique comprend deux cents canaux dans lesquels les cellules sont transportées dans un écoulement laminaire, pour produire des vésicules de manière parallélisée. [0006] Toutefois, cette méthode présente des problèmes de dimensionnement : les quantités de vésicules produites par une puce rnicrofluidique ne sont pas adaptées aux quantités requises pour les applications susmentionnées. De plus, le rendement de vésicules extracellulaires produites par cellule introduite dans une telle puce (environ 2.104 vésicules par cellule) est très inférieur au rendement théorique maximum de vésicules produites par une cellule, par exemple de l'ordre de 3,5.106 vésicules par cellule pour une cellule de type MSC (acronyme de cellule souche mésenchymateuse en anglais). Enfin, cette méthode nécessite une conformité aux normes dite G.M.P. (acronyme anglais de Bonnes Pratiques de Fabrication), nécessaires à la fabrication de médicaments. [0007] Une deuxième méthode couramment utilisée dans la littérature et décrite par Peaux et al. consiste à cultiver des HUVEC dans un milieu de culture de type DMEM (acronyme anglais de Dulbecco's Modified Eagle's Medium) sans sérum, pendant trois jours (technique dite de starvation en anglais, ou carence en sérum). L'absence de sérum entraîne un stress cellulaire déclenchant une libération de vésicules par les cellules productrices. Cette méthode présente un rendement plus élevé et permet de produire une plus grande quantité de vésicules que la méthode utilisant une puce microtluidique (environ 4.104 vésicules par cellule productrice). Toutefois, le rendement calculé correspond à une durée de production beaucoup plus longue que la durée de production de la méthode précédente. Cette méthode ne permet pas de produire une quantité de vésicules extracellulaires suffisante pour les applications susmentionnées. Enfin, cette méthode ne permet pas de produire des vésicules de manière continue car elle induit la mort des cellules. [0008] Watson et al. (Watson, D. C., Bayik, D., Srivatsan, A., Bergamaschi, C., Valentin, A., Niu, G., & Jones, J. C., 2016, Efficient production and enhanced tumor deliverv of engineered extracellular vesicles, Biomaterials, 105, 195-205) décrivent une méthode de production (les vésicules permettant d'augmenter la quantité de vésicules produites. Cette méthode consiste à cultiver des cellules adhérentes de type HEK293 dans des flasques de culture, puis dans des membranes à fibres creuses (Hollow Fiber Membrane en anglais). Le passage central des fibres creuses permet d'acheminer le milieu de culture aux cellules productrices. Les cellules productrices sont au préalable 3 ensemencées autour de ce passage, où elles produisent des vésicules dans un espace inter-fibre. Le milieu liquide compris dans l'espace inter-fibre est collecté trois fois par semaine, permettant de produire environ 3.1012 vésicules en plusieurs semaines, pour des quantités de cellules ensemencées très grandes, par exemple de l'ordre de 5.108 cellules, entraînant un rendement d'environ 6000 vésicules extracellulaires par cellule et un ratio de pureté très bas (par exemple 1,09.109 particules par microgramme de protéines). Cette production n'est toutefois pas assez élevée et trop lente au regard des applications susmentionnées. De plus, cette méthode est décrite en utilisant des cellules productrices correspondant à une lignée cellulaire particulièrement résistante à la culture en milieu dépourvu en sérum : cette méthode peut ne pas être transposable une production de vésicules par des cellules productrices telles que des cellules souches, par exemple humaines, moins résistantes et particulièrement appropriées aux applications thérapeutiques visées. [0009] Il est également bien connu dc l'homme du métier que la culture de cellules en suspension en 3 dimensions (3D) nécessite d'utiliser une méthode à faible agitation afin de ne pas induire la mort des cellules qu'on cherche à cultiver. Il est notamment connu de l'homme du métier que la longueur dc Kolmogorov est un critère qui permet d'évaluer la turbulence crée par l'action de mélange et de déterminer quand la turbulence est excessive pour une culture 3D. Résumé de l'invention [0010] De façon surprenante et inattendue et contrairement aux idées communément acceptées dans le domaine de la culture de cellules à 3D, les inventeurs ont découvert que la génération d'un écoulement turbulent dans le milieu de culture permet d'obtenir une production rapide dc vésicules en grande quantité et d'obtenir leur chargement. [0011] Ainsi, un but de l'invention est dc proposer une solution pour produire rapidement des vésicules extracellulaires en grande quantité à partir de cellules productrices, plus rapidement qu'avec les méthodes connues, dans des conditions conformes aux normes G.M.P. Un autre but der invention est de proposer une solution permettant d'augmenter le rendement du système de production dc vésicules, c'est-à-dire le rapport entre le nombre de vésicules produites et le nombre de cellules productrices introduites dans le système de production. Un autre but de l'invention est de proposer un système adapté à produire des vésicules extracellulaires à partir d'une large gamine de cellules productrices en suspension, quelle que soit la résistance du type de cellule introduite dans le système de production et résistante ou non à une carence en sérum. Selon un autre aspect de l'invention, les cellules productrices en suspension sont d'origine humaine, animale, végétale ou provenant des bactéries ou d'autres microorganismes. Un autre but de l'invention est de proposer une solution pour produire et récupérer des vésicules extracellulaires en continu ou en discontinu. Enfin, un autre but de l'invention est de simplifier la structure du système fluidique pour la production de vésicules et de réduire son coût de fabrication. [0012] Alternativement, un autre but de l'invention est de proposer une solution pour charger les vésicules extracellulaires produites par le système fluidique d'un agent thérapeutique et/ou agent d'imagerie. [0013] En particulier, un objet de l'invention est un système fluidique de production de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices en suspension , comprenant au moins un récipient, un milieu liquide contenu par le récipient , des cellules productrices en suspension, un agitateur de milieu liquide, des moyens de commande de la vitesse de l'agitateur adaptés pour la croissance des cellules productrices en suspension, caractérisé en ce qu'il comprend également des moyens de commande de la vitesse de l'agitateur et un agitateur dont la forme et les dimensions du récipient sont adaptés à la génération d'un écoulement turbulent du milieu liquide dans le récipient pour exercer des contraintes de cisaillement sur les cellules productrices afin de réaliser la production de vésicules extracellulaires (EV), la longueur de Kolmogorov de l'écoulement étant inférieure ou égale à 50 pm, préférentiellement inférieure ou égale à 40 pm ; plus préférentiellement inférieure ou égale à 35 pm. [0014] On comprend qu'avec un tel système, il est possible de produire des vésicules en grande quantité, et dans un système adapté aux normes G.M.P. On comprend également qu'un tel système est plus simple et moins couteux à fabriquer que les systèmes connus pour produire des vésicules extracellulaires. [0015] L'invention est avantageusement complétée par les caractéristiques suivantes, prises individuellement ou en l'une quelconque de leurs combinaisons techniquement possibles : l'agitateur du milieu liquide et les dimensions du récipient sont adaptés à commander un écoulement du milieu liquide, la longueur de Kolmogorov de l'écoulement étant inférieure ou égale 50 pm, et préférentiellement inférieure ou égale à 40 pm ; plus préférentiellement inférieure ou égale à 35 pm. le système fluidique comprend une sortie et une connectique reliée à la sortie, la connectique étant susceptible de comprendre du milieu liquide et des vésicules extracellulaires ; l'agitateur est préférentiellement un agitateur rotatif ou orbital dont la ou les vitesses de rotation, la forme, la taille sont adaptées, avec la forme et les dimensions du récipient, à la génération d'un écoulement turbulent du milieu liquide dans le récipient ; le récipient est utilisé en mode discontinu, c'est-à-dire que le liquide contenu dans le récipient est extrait après que les cellules productrices ont produit des vésicules extracellulaires pendant un temps donné. le système fluidique comprend un séparateur de vésicules extracellulaires. Le séparateur est positionné à l'intérieur ou à l'extérieur du récipient, le liquide peut être contenu dans le récipient et appauvri en vésicules grâce à un séparateur interne au récipient, tandis que les cellules sont maintenues dans le récipient ou le liquide peut être contenu dans le récipient et appauvri en vésicules grâce à un séparateur extérieur au récipient. l'entrée du séparateur étant reliée fluidiquernent au récipient, la sortie du séparateur étant reliée fluidiquement au récipient de manière à être susceptible d'être réintroduit dans le récipient sous la forme d'un milieu liquide appauvri en vésicules. [0016] Un autre objet de l'invention est un procédé de production ex vivo de vésicules ex- tracellulaires (EV) à partir de cellules productrices en suspension, comprenant : - un moyen de commande de la vitesse d'un agitateur adaptés pour la croissance des cellules productrices en suspension, et dont la forme et les dimensions du récipient sont adaptés à la génération d'un écoulement turbulent du milieu liquide dans le récipient pour exercer des contraintes de cisaillement sur les cellules productrices afin de réaliser la production de vésicules extracellulaires (EV), la longueur de Kolmogorov de l'écoulement étant inférieure ou égale à 50 p.m, préférentiellement inférieure ou égale à 40 p.m dans un récipient (4), le récipient comprenant une sortie, le milieu liquide comprenant des cellules productrices en suspension, et - une collecte du milieu liquide comprenant des vésicules extracellulaires (EV) en sortie du récipient. [0017] Le procédé est avantageusement complété par les caractéristiques suivantes, prises individuellement ou en l'une quelconque de leurs combinaisons techniquement possibles : on agite le milieu liquide pendant au moins vingt minutes ; on commande l'agitateur pour entraîner un écoulement du milieu liquide constant ou intermittent, d'intensité croissante ou décroissante, la longueur de Kolmogorov de l'écoulement étant inférieure ou égale à 40 pm ; un séparateur appauvrit une partie du milieu liquide collecté en sortie du récipient en vésicules extracellulaires, et on réintroduit la partie du milieu liquide dans le récipient. [0018] Le procédé est alternativement complété par les caractéristiques suivantes, prises in- dividuellement ou en l'une quelconque de leurs combinaisons techniquement possibles : le procédé comprend une étape préalable de chargement d'un agent thérapeutique ou d'imagerie présent dans le milieu liquide. 6 l'écoulement du milieu liquide permet de simultanément charger l'agent thérapeutique ou d'imagerie à l'intérieur des cellules productrices et produire les vésicules extracellulaires (EV) dans un récipient.. [0019] Selon un objet similaire, l'invention est un procédé de chargement d'un agent théra- peutique ou d'imagerie à l'intérieur de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices, comprenant les étapes suivantes : ajouter dans un récipient un milieu liquide comprenant des cellules productrices et un agent thérapeutique ou d'imagerie, actionner une commande d'un agitateur entraînant un écoulement turbulent d'un milieu liquide, la longueur de Kolmogorov de l'écoulement étant inférieure ou égale à 50 pm, préférentiellement inférieure ou égale à 40 pm, ledit écoulement permettant de simultanément charger l'agent thérapeutique et produire les vésicules extracellulaires (EV) dans un récipient, le récipient comprenant une sortie, collecter le milieu liquide comprenant des vésicules extracellulaires (EV) en sortie du récipient. [0020] Le procédé est alternativement complété par les caractéristiques suivantes, prises in- dividuellement ou en l'une quelconque de leurs combinaisons techniquement possibles : on commande l'agitateur pour entraîner un écoulement du milieu liquide, la longueur de Kolmogorov de l'écoulement étant inférieure ou égale à 40 pm ; les vésicules extracellulaires (EV) en sortie du récipient comprennent un mélange de vésicules extracellulaires chargées d'un agent thérapeutique et/ou d'imagerie ou des vésicules extracellulaires non chargées. DEFINITIONS [0021] Le terme « vésicule extracellulaire » désigne de manière générale une vésicule libérée de manière endogène par une cellule productrice, dont le diamètre est compris entre 30 nm et 5000 nm. Une vésicule extracellulaire correspond en particulier à un exosome et/ou une microvésicule et/ou un corps apoptotique cellulaire. [0022] Le terme « cellule productrice en suspension » désigne de manière générale une cellule qui n'est pas adhérente sur un milieu et peut se diviser et se multiplier. Selon un autre aspect de l'invention, le terme « cellules productrices en suspension » désigne des cellules humaines, d'origine animale ou végétale, des bactéries ou autres microorganismes capables de sécréter des vésicules extracellulaires. Selon un autre aspect de l'invention, le terme « cellules productrices en suspension » désigne des cellules adhérentes détachées de leur support de culture et mises en suspension. Un mélange doux créé par l'agitateur permet aux cellules productrices en suspension telles que définies de rester en suspension dans le milieu liquide de culture. Selon un autre aspect de 7 l'invention, le terme « cellules productrices en suspension » désigne des agrégats cellulaires. Le terme « agrégats cellulaires » désigne un assemblage de plusieurs cellules productrices en suspension qui adhèrent entre elles. Un mélange doux créé par l'agitateur permet aux cellules productrices en suspension telles que définies de rester en suspension dans le milieu liquide de culture. [0023] Le terme « agent thérapeutique » ou « agent d'imagerie » désigne de manière générale tout agent, molécule ou particule, composé d'intérêt pouvant être chargé, inséré dans les vésicules extracellulaires. Ces agents peuvent être des agents thérapeutiques molécules ou particules pour traiter les maladies infectieuses, inflammatoires, métaboliques, dégénératives, traumatiques, post-chirurgicales, génétiques, malignes (tumeurs), orphelines, du système vasculaire, lymphatique, locomoteur, digestif, nerveux, reproducteur, excréteur et/ou des agents (molécules ou particules) d'imagerie nucléaire, magnétique, optiques, acoustiques, etc. [0024] Le terme « agitateur » doit être compris selon un sens extrêmement général, qui est celui d'un moyen ou d'une combinaison de moyens permettant par action sur le liquide de générer au moins un écoulement, de favoriser le mélange du liquide ou de générer de la turbulence dans ce liquide. Brève description des dessins [0025] D'autres caractéristiques et avantages ressortiront encore de la description qui suit, laquelle est purement illustrative et non limitative, et doit être lue en regard des figures annexées, parmi lesquelles : [0026] [fig.1] illustre schématiquement un système fluidique pour la production de vésicules extracellulaires ; [0027] [fig.2j illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules THPI dans un système fluidique après 20 minutes d'agitation pour différentes intensités d'agitations ; [0028] [fig.3j illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules THP1 dans un système fluidique après 20 minutes d'agitation pour différentes longueurs de Kolmogorov ; [0029] [fig.4] illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules THP1 dans un système fluidique pour les agitations 200 RPM et 300 RPM en fonction du temps ; [0030] [fig.5] illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules C3H/10T1/2 dans un système fluidique après 20 minutes d'agitation pour différentes longueurs de Kolmogorov ; [0031] [fig.6] illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules C3H/10T1/2 adhérentes sur microcarTiers (3D) ou sur flasques (2D) en carence de 8 sérum pour différents temps ; Description des modes de réalisation [0032] Déments théoriques [0033] La longueur de Kolmogorov (ou dimension de Kolmogorov ou longueur d'eddy) est la longueur à partir de laquelle la viscosité d'un fluide permet de dissiper l'énergie cinétique d'un écoulement de ce fluide. En pratique, la longueur de Kolmogorov correspond à la taille des plus petits tourbillons dans un écoulement turbulent. Cette longueur LK est calculée dans la publication de Kolmogorov (Kolmogorov, A. N., 1941, January, The local structure of turbulence in incompressible yiscous fluidlor very large Reynolds numbers, In Dokl. Akad. Nauk, SSSR, Vol. 30, No. 4, pp. 301-305) et décrite par la formule (I) suivante : [0034] [Math I] L = [0035] dans laquelle y est la viscosité cinématique du milieu liquide en écoulement et s est le taux moyen de dissipation d'énergie dans le fluide par unité de masse (ou taux d'injection d'énergie dans le fluide). [0036] Zhou et al. (Zhou, G., Kresta, S. M., 1996, Impact of tank geometry on the maximum turbulence energy dissipation rate fbr impellers, AIChE journal, 42(9), 2476-2490) décrivent la relation entre c moyen et la géométrie d'un récipient dans lequel un milieu liquide est agité par agitateur de type roue à aubes. Cette relation est donnée par la formule (2) suivante : [0037] [Math 21 ND 5 .N3 (2) P E- 100381 dans laquelle Np est le nombre de puissance (ou nombre de Newton) adimensionné de l'agitateur dans le milieu liquide, D est le diamètre de l'agitateur (en mètre), N est la vitesse de rotation (en nombre de tours par seconde) et V est le volume de milieu liquide (en mètre cube). Cette relation est utilisée pour le calcul de c moyen correspondant à la géométrie d'un récipient et d'un agitateur utilisés pour la mise en oeuvre de l'invention. Le nombre de puissance Np est donné de manière connue par la formule (3) : [0039] [Math 3] NT P (3) p 3 N D p [0040] dans laquelle P est la puissance apportée par l'agitateur, et p est la densité du milieu liquide. La formule (3) peut être ajustée comme décrit dans Nienow et al. (Nienow, A. W., & Miles, D., 1971, Impeller power numbers in closed vessels, Industrial & Engineering Chemistry Process Design and Development, 10(1), 41-43) ou Zhou et al. (Zhou, G., Kresta, S. M., 1996, Impact of tank geometry on the maximum turbulence energy dissipation rate ,for itnpellers, AIChE journal, 42(9), 2476-2490) en fonction du 9 nombre de Reynolds de l'écoulement du milieu liquide. Il est également possible de calculer le nombre de Reynolds du système par la formule (4) suivante : Re W D2 (4) - - v [0042] Alternativement, l'homme du métier de par ses connaissances générales et avec des modes de calcul alternatifs peut calculer la longueur de Kolmogorov par unité de volume. En tout état, le calcul présenté ci-dessus n'est qu'une façon parmi tant d'autres connues de l'homme du métier de calculer la longueur de Kolmogorov. [0043] Architecture générale du système fluidique [0044] La figure 1 illustre schématiquement un système fluidique 1 pour la production de vésicules extracellulaires EV. Le système fluidique 1 de production de vésicules extracellulaires EV vise à la production en grande quantité de vésicules extracellulaires EV dans un récipient 4. Toutefois, l'invention n'est pas limitée à ce mode de réalisation et peut comprendre une série de récipients 4 reliés fluidiquernent en parallèle ou en série. 100451 Le récipient 4 contient un milieu liquide 5. Le récipient 4 peut être une cuve, une flasque, par exemple en verre ou en matière plastique, ou tout autre récipient adapté à contenir un milieu liquide 5. Le récipient peut être souple, ou contenir des parties souples. Le volume du récipient 4 est l'un des facteurs permettant de produire des vésicules extracellulaires EV en grande quantité : ce volume peut être compris entre 50 mL et 500 L, préférentiellement entre 100 mL et 100 L, et préférentiellement entre 300 mL et 40 L. Le volume du récipient 4 illustré schématiquement dans la figure 1 est de 1 L. Le récipient 4 comprend typiquement une ou plusieurs entrées gazeuses et une ou plusieurs sorties gazeuses, par lesquelles peut s'écouler une atmosphère comprenant des concentrations en air, 02, N2 et en CO2 adaptées à la culture cellulaire, par exemple comprenant 5% de CO2. Cette atmosphère peut provenir d'un injecteur/mélangeur de gaz adapté ou d'une étuve à atmosphère contrôlée en CO,. Une deuxième pompe 17 permet de commander cet écoulement gazeux dans le récipient 4. Le récipient 4 comprend également une sortie 9 susceptible de comprendre du milieu liquide 5 et des vésicules extracellulaires EV. Cette sortie peut être complétée d'un moyen de séparation et/ou de filtration des cellules en suspension permettant de ne pas récupérer des cellules en suspension en dehors du récipient 4. Cette sortie 9 permet d'extraire hors du récipient 4 les vésicules extracellulaires EV produites. Le récipient 4 peut également comprendre au moins une entrée 8 adaptée à introduire le milieu liquide 5 dans le récipient 4. [0046] Le milieu liquide 5 peut être de manière générale une solution saline, par exemple isotonique. Préférentiellement, le milieu liquide 5 est un milieu liquide de culture avec ou adjonction de composés permettant la culture des cellules d'intérêt, ou un milieu [0041] [Math 4] complémenté en sérum ou lysat plaquettaire préalablement purifié des vésicules extracellulaires ou un milieu sans sérum, permettant de ne pas contaminer les vésicules extracellulaires EV produites par le système fluidique 1 par des protéines ou d'autres vésicules provenant d'un sérum ou lysat plaquettairc. Un milieu liquide 5 de type DMEM sans sérum peut être utilisé. Le volume maximum de milieu liquide 5 est déterminé en partie par le récipient 4. Ce volume maximum peut également être compris entre 50 mL et 500 L, préférentiellement entre 100 mL et 100 L, et plus préférentiellement entre 300 mL et 40 L. Le volume minimum de milieu liquide 5 contenu par le récipient 4 est en partie déterminé par le choix de l'agitateur 7 permettant d'agiter le milieu liquide 5. [0047] Le système fluidique 1 comprend également des cellules productrices en suspension 6. Les vésicules extracellulaires EV sont produites par le système fluidique 1 à partir de ces cellules productrices en suspension 6. Les cellules productrices en suspension 6 peuvent être cultivées, avant la production de vésicules extracellulaires EV par le système fluidique 1 dans un milieu de culture cellulaire adapté. Ainsi, aucun transfert de cellules n'est nécessaire entre la culture des cellules productrices en suspension 6 et la production des vésicules extracellulaires EV, ce qui permet d'éviter toute contamination et de simplifier le procédé dans son ensemble. La majorité des cellules productrices en suspension 6 est en suspension de manière homogène dans le milieu, même si une proportion minoritaire de cellules productrices en suspension 6 peut être sédimentée au fond du récipient 4 ou collée sur la paroi du récipient 4, par exemple par l'agitation du milieu liquide 5. Préférentiellement, le système fluidique 1 est adapté de manière à générer une agitation douce permettant d'homogénéiser les cellules productrices 6 dans le milieu liquide 5 au sein du récipient 4, préférentiellement avant la production des vésicules extracellulaires. De manière générale, tout type de cellules productrices 6 peut être utilisé, de préférence des cellules productrices 6 en suspension non adhérentes. [0048] Le récipient 4 comprend également un agitateur? permettant d'agiter le milieu liquide 5. L'agitateur 7 peut être une roue à aubes, dont les aubes sont au moins en partie plongées dans le milieu liquide 5, et mise en mouvement par une transmission de forces magnétiques ou mécaniques. L'agitateur? peut également être un système de perfusion de milieu liquide 5 à un débit suffisant pour agiter le milieu liquide 5 contenu par le récipient, ou un système à murs rotatifs (par exemple agencés sur des rouleaux). L'agitateur 7 peut alternativement être du type rouleur à bouteilles ou rollers à bouteilles, agitateur orbital pour Erlenmeyers, avec ou sans baffles (shaken flask), agitateur à bascule (wave), biorécipient avec agitation pneumatique (air-lift) ou un agitateur rotatif à pales tel qu'un agitateur de type hélice marine, turbine de Rushton, ancres d'agitation, agitateur barrière, hélice rubans hélicoïdaux. Un agitateur rotatif 11 préféré est une turbine à pales verticales. Enfin, des structures statiques peuvent être présentes dans le récipient, par exemple des baffles, ou encore des structures formant barrières partielles au mouvement liquide, telles celles utilisées dans un mélangeur statique, peuvent naturellement aussi être utilisées. L'agitateur 7 et les dimensions du récipient 4 sont adaptés à commander un écoulement turbulent du milieu liquide 5 dans le récipient 4. L'homme du métier de par ses connaissances générales sait calculer la longueur de Kolmogorov adaptée pour chaque type d'agitateur 7 en fonction des dimensions du récipient 4, de la géométrie de l'agitateur 7 et de l'intensité de l'agitation. Par écoulement turbulent, on entend un écoulement dont le nombre de Reynolds est supérieur à 2000. Le nombre de Reynolds peut par exemple être calculé par la formule (4). Préférentiellement, le nombre de Reynolds Re de l'écoulement de milieu liquide 5 est supérieur à 7 000, préférentiellement à 10 000 et préférentiellement à 12 000. [0049] D'autres agitateurs 7 permettant de commander un écoulement turbulent selon la présente invention sont des agitateurs bien connus de l'homme du métier et susceptibles d'être implanté dans le système selon la présente invention. [0050] L'agitateur 7 utilisé dans les exemples de réalisation de l'invention comprend une roue à aube agencée dans un récipient 4 et mise en mouvement par un système de transmission de forces magnétiques ou mécaniques. La vitesse de la roue à aube dans le milieu liquide 5 entraine un écoulement du milieu liquide 5. L'agitateur est adapté à commander un écoulement, qui, compte-tenu des dimensions du récipient 4, est turbulent. Dans le cas de l'agitateur 7 illustré en figure 1, plusieurs paramètres permettent de calculer une valeur représentative de la turbulence du milieu liquide 5, en particulier la viscosité cinématique y du milieu liquide 5, les dimensions du récipient 4 et en particulier le volume V de milieu liquide 5 contenu dans le récipient 4, le nombre de puissance N, correspondant à la partie immergée de la roue à aube, le diamètre D de l'agitateur et en particulier de la roue, la vitesse N de rotation de la roue. L'utilisateur peut ainsi calculer, en fonction de ces paramètres, des valeurs représentatives de la turbulence de l'écoulement, et en particulier la longueur de Kolmogorov LK, telle que donnée par les équations (1), (2) et (3). En particulier, l'agitateur 7 est adapté à commander un écoulement dans lequel la longueur LK est inférieure ou égale à 50 pm et préférentiellement à 40 pm. [0051] Dans un exemple de réalisation du système fluidique 1, la vitesse de rotation de l'agitateur 7 est susceptible d'être commandée à 500 rpm (rotations par minute) par exemple, le diamètre d'une roue à aube est de 10,8 cm et le volume de milieu liquide contenu par le récipient 4 est de 400 int Le nombre de puissance Np mesuré de la roue à aube dans le milieu liquide 5, par la formule (3), est sensiblement égal à 3,2. L'énergie dissipée par unité de masse E, calculée, par la formule (2), est égale à 6,80.10 J.kg-'. La longueur de Kolmogorov LK calculée par la formule (1) est ainsi égale à 12 11,0 pm. [0052] Aspect chargement d'agent thérapeutique ou d'imagerie [0053] Le système fluidique 1 pour la production de vésicules extracellulaires EV vise à la production en grande quantité de vésicules extracellulaires EV dans un récipient 4. Toutefois, l'invention n'est pas limitée à ce mode de réalisation et permet également de charger en grande quantité des agents thérapeutiques ou agents d'imagerie dans les vésicules extracellulaires EV produites selon l'invention. Ainsi, les cellules en suspension 6 et l'agent thérapeutique ou d'imagerie sont simultanément en suspension dans le milieu liquide 5 et mélangés dans le récipient 4. Alternativement, les cellules en suspension 6 peuvent être ajoutées dans le milieu liquide 5 avant ou après l'ajout des agents thérapeutiques et/ou agents d'imagerie dans ledit milieu liquide 5. De manière générale, tout type d'agent thérapeutique ou d'imagerie peut être utilisé, de préférence des agents thérapeutiques molécules ou particules pour traiter les maladies infectieuses, inflammatoires, métaboliques, dégénératives, traumatiques, post-chirurgicales, génétiques, malignes (tumeurs), orphelines, du système vasculaire, lymphatique, locomoteur, digestif, nerveux, reproducteur, excréteur et/ou des agents (molécules ou particules) d'imagerie nucléaire, magnétique, optiques, acoustiques. Le récipient 4 comprend également un agitateur 7 tel que décrit précédemment et permettant d'agiter le milieu liquide 5 comprenant les cellules productrices en suspension 6 et l'agent thérapeutique ou d'imagerie. Préférentiellement, le système fluidique 1 est adapté de manière à générer une agitation douce permettant d'homogénéiser les cellules productrices 6 dans le milieu liquide 5 au sein du récipient 4 et ce afin de charger efficacement les agents d'intérêt dans les cellules productrices 6 et par conséquent dans les vésicules extracellulaires. [0054] Selon un autre objet, l'invention est un procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices, comprenant : une commande d'un agitateur? entraînant un écoulement turbulent d'un milieu liquide 5, la longueur de Kolmogorov de l'écoulement étant inférieure ou égale à 50 pm, préférentiellement inférieure ou égale à 40 pm dans un récipient 4, le récipient comprenant une sortie 9, le milieu liquide 5 comprenant des cellules productrices 6 en suspension et l'agent thérapeutique ou d'imagerie, et une collecte du milieu liquide 5 comprenant des vésicules extracellulaires (EV) en sortie 9 du récipient 4. [0055] Préférentiellement, le procédé selon l'invention comprend une étape de chargement d'un agent thérapeutique ou d'imagerie. Plus préférentiellement, l'étape de chargement dudit agent thérapeutique ou d'imagerie est simultanée à l'étape de production de vésicules extracellulaires. Bien entendu, cette étape peut également être avant l'étape 13 de production de vésicules extracellulaires. Alternativement, l'étape de chargement peut être après l'étape de production de vésicules extracellulaires. Ce mode de réalisation peut être d'intérêt dans le cas où l'on souhaite obtenir une lèm production de vésicules non chargées suivie d'une 2ème production de vésicules extracellulaire chargées dudit agent thérapeutique ou d'imagerie, et cc dans le cadre de la mise en place d'un système fluidique avec une collecte du milieu liquide 5 en continu. De manière surprenante, l'écoulement qui permet aux cellules productrices en suspension 6 de produire des vésicules extracellulaires permet également et simultanément de charger l'agent thérapeutique ou d'imagerie dans les cellules productrices en suspension 6 et par conséquent produire lesdites vésicules extracellulaires (EV) dans un récipient 4 chargé de l'agent thérapeutique ou d'imagerie. [0056] De manière préféré, l'invention est un procédé de chargement d'un agent théra- peutique à l'intérieur de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices 6, comprenant les étapes suivantes : ajouter dans un récipient 4, un milieu liquide 5 comprenant des cellules pro- ductrices 6 et au moins un agent thérapeutique ou d'imagerie, actionner une commande d'un agitateur 7 entraînant un écoulement turbulent d'un milieu liquide 5, la longueur de Kolmogorov de l'écoulement étant inférieure ou égale à 50 p.m, préférentiellement inférieure ou égale à 40 p.m, ledit écoulement permettant de simultanément charger l'agent thérapeutique et produire les vésicules extracellulaires (EV) dans un récipient 4, le récipient comprenant une sortie 9, collecter le milieu liquide 5 comprenant des vésicules extracellulaires (EV) en sortie 9 du récipient 4. [0057] Préférentiellement les vésicules extracellulaires (EV) en sortie 9 du récipient 4 com- prennent un mélange de vésicules extracellulaires chargées d'un agent thérapeutique ou d'imagerie et de vésicules extracellulaires non chargées d'un agent thérapeutique ou d'imagerie. [0058] Préparation du milieu de culture, des agents thérapeutiques ou agents d'imagerie et des cellules productrices [0059] Le récipient 4 peut être à usage unique ou bien stérilisé avant toute introduction de milieu liquide 5, de cellules productrices 6 et de l'agent thérapeutique ou agent d'imagerie. L'agent thérapeutique ou agent d'imagerie est incubé dans le milieu de culture des cellules productrices 6, comprenant du sérum, dans le récipient 4. [0060] Les cellules productrices 6, avant d'être introduites dans le système fluidique 1, sont mises en suspension au moyen d'un milieu comprenant de la trypsine. Elles peuvent être ensuite centrifugées à 300 G pendant cinq minutes pour être concentrées dans le culot d'un tube, de manière à remplacer le milieu comprenant de la trypsine par un 14 milieu DMEM. Les cellules productrices 6 ensuite sont introduites dans le récipient 4, comprenant du milieu de culture et selon un mode de réalisation alternatif l'agent thérapeutique ou agent d'imagerie. Les cellules productrices 6 et les agents thérapeutique ou agents d'imagerie sont ensuite agités de manière à mettre en contact les agents thérapeutiques ou agents d'imagerie et les cellules productrices 6, et favoriser le chargement des agents thérapeutiques ou agents d'imagerie dans les cellules productrices 6. L'agitation peut reprendre périodiquement, de manière à favoriser l'homogénéité des cellules productrices 6 et des agents thérapeutiques ou agents d'imagerie dans le milieu liquide 5. Par exemple, l'homogénéisation des éléments présents dans le milieu de culture 5 est réalisée avec une faible agitation du milieu de culture (par exemple la rotation d'une roue à aube à une vitesse de 20 rpm), ainsi qu'un remplacement régulier du milieu de culture (par exemple un remplacement de 5% à 40% du milieu de culture chaque jour). [0061] Exemple de production des vésicules extracellulaires EV sans chargement (l'agent thérapeutique ou agent d'imagerie [0062] Les vésicules extracellulaires EV sont produites dans un récipient 4 contenant un milieu liquide 5, par exemple sans sérum, des cellules productrices 6 en suspension. Le milieu utilisé avant la production pour la culture des cellules productrices 6 comprenant du sérum, on lave trois à quatre fois le récipient 4 avec du milieu liquide 5 DMEM sans sérum, chaque lavage correspondant par exemple à un volume d'environ 400 mL On commande ensuite l'agitation du milieu liquide 5 par l'agitateur 7 de manière à entraîner un écoulement turbulent dans le récipient 4. L'agitation est préférentiellement réglée de manière à commander un écoulement du milieu liquide 5 dans lequel la longueur de Kolmogorov LK est inférieure ou égale à 50 pm et préférentiellement à 40 pm. L'agitation du milieu liquide 5 est commandée au moins pendant vingt minutes, préférentiellement pendant plus d'une heure, et préférentiellement pendant plus de deux heures. La production de vésicules extracellulaires EV peut être mesurée pendant la production. A cet effet, l'agitation peut être continue, intermittente, croissante ou décroissante. On laisse sédimenter les cellules productrices 6 au fond du récipient 4, puis on prélève un échantillon de milieu liquide 5 comprenant des vésicules extracellulaires EV. On réalise une centrifugation de l'échantillon à 2000 G pendant 10 minutes, de manière à éliminer les débris cellulaires. Le surnageant est analysé par une méthode de suivi individuel de particules (ou NTA, acronyme anglais de Nanoparticle Tracking Analysis) de manière à compter le nombre de vésicules extracellulaires EV et d'en déduire la concentration en vésicules extracellulaires EV des échantillons. On peut vérifier que la concentration en vésicules extracellulaires EV au début de l'agitation est proche de zéro ou négligeable. [0063] Les vésicules extracellulaires EV produites peuvent également être observées et/ou comptées par cryo-microscopie électronique à transmission. A cet effet, une goutte de 2,7 pL de solution comprenant des vésicules extracellulaires EV est déposée sur une grille adaptée à la cryo-microscopie, puis plongée dans l'éthane liquide, entraînant une congélation quasi-instantanée de ladite goutte, évitant la formation de cristaux de glace. La grille supportant les vésicules extracellulaires EV est introduite dans le microscope et les vésicules extracellulaires EV sont observées à une température de l'ordre de -170°C. [0064] Séparation des vésicules extracellulaires [0065] Les vésicules extracellulaires EV produites dans le récipient 4 sont susceptibles d'être extraites du récipient 4 par la sortie 9 du récipient 4, suspendues dans du milieu liquide 5. Un filtre 18 peut être agencé à la sortie 9 de manière à filtrer les cellules productrices 6 en suspension et les débris cellulaires lors de l'extraction de vésicules extracellulaires EV du récipient 4. Une connectique 13 est fluidiquement reliée à la sortie 9, permettant le transport du milieu liquide 5 comprenant les vésicules extracellulaires EV produites. [0066] Le système fluidique 1 peut comprendre un séparateur 15 de vésicules extracel- lulaires EV. Le séparateur 15 comprend une entrée du séparateur 10, dans laquelle le milieu liquide 5 comprenant des vésicules extracellulaires EV issu du récipient 4 peut être acheminé de manière directe ou indirecte. Le séparateur 15 peut également comprendre une première sortie 11 du séparateur, par laquelle le milieu liquide 5 est susceptible de sortir du séparateur 15 avec une concentration en vésicules extracellulaires EV plus petite qu'en entrée 10 du séparateur 15, voire sensiblement nulle. Le séparateur 15 peut également comprendre une deuxième sortie 12 du séparateur 15, par laquelle le milieu liquide 5 est susceptible de sortir du séparateur 15 avec une concentration en vésicules extracellulaires EV plus élevée qu'en entrée 10 du séparateur 15. [0067] De manière générale, le séparateur 15 de vésicules extracellulaires EV peut être relié fluidiquement au récipient 4 de manière à être susceptible de réintroduire un milieu liquide 5 appauvri en vésicules EV clans le récipient 4, par exemple par l'entrée 8 du récipient 4. Ainsi, la production et/ou l'extraction de vésicules extracellulaires EV peu(ven)t être réalisée(s) de manière continue, à volume de milieu liquide 5 sensiblement constant dans le récipient 4. Selon un mode de réalisation alternatif, le système fluidique ne comprend pas de séparateur 15 de vésicules extracellulaires EV ou le système fluidique comprend un séparateur 15 de vésicules extracellulaires EV pouvant être relié fluidiquement ou non, par exemple par l'intermédiaire d'un moyen de fermeture dudit séparateur 15, au récipient 4. Ainsi, la production et/ou l'extraction de vésicules extracellulaires EV peu(ven)t être réalisée(s) de manière discontinue ou continu en fonction de l'ouverture ou fermeture du moyen de fermeture disposé en 16 amont du séparateur 15. [0068] Dans le cas d'un fonctionnement en discontinu, le récipient contenant les cellules productrices est agité et la durée de production est choisie de préférence pour un temps (Tv) supérieur à 20 minutes. [0069] Le liquide peut ensuite être extrait du récipient, et peut être soumis à une ou plusieurs étapes de purification ultérieures, pour notamment séparer les vésicules des cellules productrices. Cette séparation peut être réalisée au moyen de techniques connues de l'homme de l'art, par exemple et pris de façon non limitative, par des techniques acoustiques, des méthodes de filtration telle la séparation par filtration tangentielle, l'utilisation de filtres rotatifs ou des combinaisons quelconques de moyens de séparation. [0070] Dans le cas d'un fonctionnement en continu et selon un mode de réalisation préféré, le système de séparation est interne au récipient, les vésicules sont séparées progressivement dans un sous-compartiment du récipient. Divers moyens techniques sont connus de l'homme de l'art pour réaliser ce type de séparation, par exemple et de façon non limitative, l'utilisation de filtres rotatifs, ou encore de moyens acoustiques, ou des combinaisons quelconques de moyens de séparation. Selon un autre mode de réalisation, le système de séparation entre cellules et vésicules peut faire intervenir un circuit fluidique conçu pour faire circuler le milieu avec les cellules productrices et les vésicules entre le récipient d'une part et un système de séparation extérieur au récipient d'autre part. Ce système de séparation extérieur au récipient peut faire intervenir des techniques connues de l'homme de l'art, par exemple, et de façon non-limitative, de la filtration tangentielle, ou de la séparation acoustique, ou encore des combinaisons quelconques de moyens de séparation connus. A la sortie du système (le séparation, le liquide appauvri en vésicules est réinjecté dans le récipient, de façon à ce que la production de vésicules par les cellules productrices puisse continuer dans le récipient. [0071] Dans l'exemple de réalisation d'un système fluidique 1 illustré dans la figure 1, le milieu liquide 5 peut être extrait du récipient 4 par une première pompe 16, via une connectique 13, de manière à transporter le milieu liquide 5 dans un collecteur 19. Une autre première pompe 16 peimet d'acheminer le milieu liquide 5 contenu dans le collecteur 19 à l'entrée 10 du séparateur 15, via une autre connectique. La première sortie 11 du séparateur 15 est reliée au récipient 4 via une connectique, de manière à réintroduire du milieu liquide 5 appauvri en vésicules extracellulaires EV dans le récipient 4. La deuxième sortie 12 du séparateur 15 est reliée au collecteur 19 via une connectique, de manière à enrichir le milieu liquide 5 contenu dans le collecteur 19 en vésicules extracellulaires EV. Dans une variante, l'entrée 10 du séparateur 15 peut être directement reliée à la sortie 9 du récipient 4 (ou par l'intermédiaire d'une première pompe 16). La première sortie 11 du séparateur 15 est reliée au récipient 4 et la 17 deuxième sortie 12 du séparateur 15 est reliée au collecteur 19. Plusieurs séparateurs peuvent également être disposés en série pour faire varier le degré de séparation en vésicules extracellulaires EV dans le milieu liquide 5, et/ou en parallèle pour adapter le débit de milieu liquide 5 dans chaque séparateur 15 au débit d'une première pompe 16. [0072] Influence de l'agitation sur la production des vésicules extracellulaires EV [0073] La figure 2 illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules THP1 dans un système fluidique 1 pour différentes agitations commandées par l'agitateur 7. L'ordonnée correspond aux nombres de vésicules extracellulaires EV produites par cellule dans le récipient 4. Chaque colonne correspond à une production de vésicules extracellulaires EV pour différentes vitesses de rotation de l'agitateur 7 dans le récipient 4. Les vésicules extracellulaires EV sont produites à partir de cellules productrices 6 de type T'IR' dans le récipient 4 en utilisant une concentration de 100 000 000 de cellules en suspension 6 dans 400 mL de milieu liquide 5 dans une flasque à agitation (spinnerflask en anglais) de 1000 ml. Une production significativement élevée de vésicules extracellulaires EV est observable en commandant un écoulement de milieu liquide 5 dans lequel la production correspond à la colonne 300 RPM soit une longueur LK égale ou inférieure à 17 pm par rapport à la production en vésicules extracellulaires EV dans des conditions d'agitation plus faible dans lequel la vitesse d'agitation est de 200 RPM soit une longueur LK égale à 23 p.m. [0074] La figure 3 illustre le nombre de vésicules extracellulaires EV produites dans un système fluidique 1 pour différentes longueurs de Kolmogorov commandées par l'agitateur?. Les vésicules extracellulaires EV sont produites à partir de cellules productrices 6 de type THP1 dans le récipient 4 en utilisant une concentration de 100 000 000 de cellules en suspension 6 dans 400 mL de milieu liquide 5 dans une spinnerflask de 1000 ml. L'abscisse correspond à la longueur LK entraînée par l'agitateur 7 pendant la production de vésicules extracellulaires EV, calculée par les formules (1), (2) et (3). Une production significativement élevée de vésicules extracellulaires EV est observable en commandant un écoulement de milieu liquide 5 dans lequel la longueur LK est inférieure à 17 pm par rapport à la production en vésicules extracellulaires EV dans des conditions d'agitation plus faible. [0075] La figure 4 illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par cellule en fonction du temps, par (les cellules productrices 6 de type THP-1 humaines dans un système fluidique en commandant l'écoulement du milieu liquide 5 à des agitations 200 RPM et 300 RPM. Les conditions utilisées sont 100 000 000 de cellules dans 400 mL dans une spinner tlask de 1000 mL, avec une pale de diamètre 10,8 cm. Les longueurs Lk calculées par les formules (1), (2) et (3) sont respectivement de 23 pm (pour 300 RPM) et 17 pm (pour 400 RPM). Le nombre de vésicules extracellulaires EV produites est bien supérieur pour un écoulement caractérisé par une longueur Lk de 18 17 pm que par une longueur LI, de 23 pm. [0076] La figure 5 illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules productrices C3H/10T1/2 (cellules souches mésenchymateuses issues de souris) dans un système fluidique pour différentes longueurs de Kolmogorov commandées par l'agitateur 7. Une concentration de 100 000 000 cellules productrices 6 dans 400 mL de milieu liquide 5 dans une .spinnerflask de 1000 mL a été utilisée. L'abscisse correspond à la longueur L}, entraînée par l'agitateur 7 pendant la production de vésicules extracellulaires EV, calculée par les formules (1), (2) et (3). La production de vésicules par cellule augmente de façon importante en commandant un écoulement de milieu liquide 5 dans lequel la longueur Li, est de 17 pm par rapport à la production en vésicules extracellulaires EV dans des conditions d'agitation plus faible. [0077] La figure 6 illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules THP-1 humaines en flasques classiques dans le milieu liquide 5 sans agitation pendant 72 h (appelé carence 2D 72h), et dans un système fluidique en commandant un écoulement du milieu liquide 5 dans lequel la longueur LK cst supérieure à 200 pm (appelé carence 3D). Ces conditions sont les conditions classiques de production de vésicules extracellulaires EV. La production de vésicules extracellulaires EV par cellules dans ces différentes conditions est significativement inférieure à la production dans un écoulement où la longueur LI, est inférieure à 17 pm. 19 [Revendication 1] [Revendication 2] [Revendication 3] [Revendication 4] [Revendication 5]