Brevet FR3089233A1 — publié le 20200605

Description Titre de l'invention : PROCEDE DE TRAITEMENT D'UNE BIOMASSE COMPRENANT DES MACRO-ALGUES CELLU- LOSIQUES Domaine technique 100011 L'invention s'intéresse aux procédés de traitement de biomasse comprenant des algues, et plus particulièrement des macro-algues cellulosiques. Les algues constituent un groupe unique et très diversifié d'organismes, mais, surtout, ce sont des producteurs naturels d'amidon et de cellulose non-lignifiée. Elles présentent beaucoup d'intérêt en tant que ressource alternative et renouvelable pour la production de matériaux, de produits chimiques ou de combustibles. Ce sont des organismes à croissance rapide qui peuvent être utilisés de façon durable, venir en complément de ressources de biomasses lignocellulosiques non alimentaires terrestres comme le bois, la paille de blé ou de cultures dédiées, pour la production de jus sucrés dits de seconde génération (2G). Ces jus sucrés peuvent être utilisés et valorisés tels quels, ou être transformés pour produire d'autres produits par voie chimique ou voie biochimique/fermentaire (par exemple, des alcools comme l'éthanol, le butanol) ou d'autres molécules, par exemple des solvants tels que l'acétone et d'autres molécules biosourcées valorisables. [0002] Le procédé de production des jus sucrés à partir de biomasse lignocellulosique comprend généralement, schématiquement, deux étapes successives : une étape de pré-traitement, éventuellement précédée d'une étape d'imprégnation, suivie d'une étape d'hydrolyse enzymatique. Le prétraitement permet de modifier les propriétés physico-chimiques de la biomasse lignocellulosique afin de rendre la cellulose accessible aux enzymes et d'atteindre une bonne réactivité en hydrolyse enzymatique. L'hydrolyse enzymatique vient hydrolyser les chaînes de cellulose en glucose sous l'action d'enzymes appropriées. Deux autres étapes peuvent suivre pour transformer les jus sucrés en molécules valorisables, comme du bioéthanol : une fermentation, qui convertit le glucose en alcool, comme l'éthanol sous l'action de micro-organismes de type levures, puis une distillation, qui permet de séparer et récupérer l'alcool d'intérêt. [0003] Technique antérieure La biomasse lignocellulosique est composée de trois principaux polymères : la cellulose (35 à 50%), les hémicelluloses (20 à 32%) qui sont des polysaccharides essentiellement constitués de pentoses et d'hexoses, et la lignine, (15 à 25%) qui est un polymère de structure complexe et de haut poids moléculaire provenant de la copolymérisation d'alcools phénylpropénoïques. Ces différentes molécules sont responsables des propriétés intrinsèques de la paroi végétale et s'organisent en un enchevêtrement 2 complexe. [0004] Le principe du procédé de conversion de la biomasse lignocellulosique en molécules valorisables/biocarburant utilise une étape d'hydrolyse enzymatique de la cellulose et/ ou des hémicelluloses contenues dans les matières végétales pour produire du glucose et autres sucres. [0005] Cependant, la cellulose contenue dans la biomasse lignocellulosique est particu- lièrement réfractaire à l'hydrolyse enzymatique, notamment car la cellulose n'est pas directement accessible aux enzymes. Pour s'affranchir de ce caractère réfractaire, une étape de prétraitement en amont de l'hydrolyse enzymatique est nécessaire. Il existe de nombreuses méthodes de traitement (chimique, mécanique, enzymatique, micro-biologique, ...) des matériaux riches en cellulose pour améliorer l'étape ultérieure d'hydrolyse enzymatique. [0006] L'efficacité du prétraitement se mesure à la fois par le bilan matière à l'issue du pré- traitement (taux de récupération des sucres sous forme monomère ou oligomère solubles ou polymère solide) et également par la réactivité des résidus cellulosiques et hémicellulosiques à l'hydrolyse enzymatique. [0007] Les algues sont des organismes poussant en milieu aqueux, eau douce, eau de mer ou eaux saumâtres. Les microalgucs lipidiques sont beaucoup étudiées comme nouvelle ressource, notamment pour la valorisation des lipides qu'elles peuvent contenir. Le terme "macro-algues" couvre quant à lui une grande variété d'espèces, avec des adaptations au milieu environnant. Les macro-algues sont des végétaux eucaryotes photosynthétiques incorporant des chlorophylles associées à différents pigments. Ces variations de pigmentation permettent de classer les macro-algues en groupes différenciés par leur couleur (verte, rouge ou brune). [0008] Comme la biomasse terrestre, la biomasse marine couvre une grande variété d'espèces et de larges gammes de composition. De par leur environnement de croissance aqueux, les algues n'ont, au contraire des ressources terrestres, pas besoin de polymères structuraux comme la lignine. De fait, les algues contiennent peu ou pas de lignine et peuvent, selon l'espèce et les conditions de croissance, contenir de fortes teneurs en sucres issus de la cellulose, des hémicelluloses et/ou de l'amidon, ce qui en fait un substrat de choix pour les procédés de conversion par voie dite biochimique, qui font intervenir une étape d'hydrolyse enzymatique des polymères de sucres (cellulose et hémicelluloses). [0009] Différentes études ont récemment porté sur la production de jus sucrés à partir d'algues, en partant des travaux existants sur la biomasse terrestre : ces études ont notamment porté sur les conditions opératoires du prétraitement d'algues contenant de la cellulose en vue de rendre cette cellulose plus accessible aux enzymes. [0010] NJ. KIM et al. (Nag-Jong KIM, Hui LI, Kwonsu JUNG, Ho Nam CHANG, Pyung 3 Chcon LEE : « Ethanol production from marine algal hydrolysates using Escherichia coté K011 », Bioresource Technology 102 (2011) 7466-7469) ont, par exemple, travaillé sur deux types d'algues brunes, un type d'algue rouge et un type d'algue verte. Les prétraitements des algues proposés consistent en une cuisson réalisée sur des algues broyées, soit en présence d'acide, comme HCI ou II,SO4, soit en présence d'une hase, comme Ca(OH),. Les algues ainsi traitées par cuisson ont ensuite été hydrolysées en présence d'enzymes appartenant soit à la famille des cellulases, soit à celles des amylases. [0011] On définit par cellulases, les enzymes qui catalysent l'hydrolyse de la cellulose et de ses dérivés (notamment endo-glucanases, cxo-glucanases et 8-glucosidases). On définit par amylases, les enzymes qui dégradent l'amidon et ses dérivés (notamment a-amylases et glucoamylases, ces dernières pouvant aussi être appelées amyloglucosidases). [0012] Après hydrolyse des algues, les sucres sont fermentés en milieu anaérobie par une bactérie du type E.Coli pour être finalement convertis en éthanol. [0013] Ces travaux sont intéressants. Cependant les résultats, notamment en termes de rendement de production de jus sucrés à l'issue de l'hydrolyse enzymatique, sont susceptibles d'amélioration. [0014] L'invention a alors pour but la mise au point d'un traitement de biomasse de type algues visant à en extraire des composés d'intérêt, procédé qui soit amélioré en termes de rendement, et, notamment, de faisabilité industrielle. [0015] Résumé de l'invention L'invention a tout d'abord pour objet un procédé de traitement d'une biomasse comprenant des macro-algues cellulosiques, tel que le procédé comprend : - une étape de prétraitement par cuisson, - une étape d'hydrolyse enzymatique des macro-algues prétraitées avec un cocktail enzymatique comprenant des cellulases et des amylases. [0016] Ce procédé permet d'obtenir des jus sucrés à partir d'algues avec de bons rendements : il s'est en effet avéré que, d'une part, un prétraitement par cuisson était un premier point-clé pour obtenir de bons résultats lors de l'hydrolyse enzymatique, qui ne pouvait pas faire l'économie de cette étape préalable. Il s'est ensuite avéré qu'un deuxième point-clé de l'invention est que l'hydrolyse enzymatique n'était vraiment efficace qu'en associant dans le cocktail enzymatique à la fois des cellulases et des amylases : ce n'est qu'avec cette combinaison d'enzymes que l'on parvient à pousser suffisamment loin l'hydrolyse des algues, et, notamment, de la cellulose et l'amidon qui les composent. [0017] De préférence, le cocktail de l'invention comprend deux types différents d'amylases, et tout particulièrement associe des a-amylases et des glucoamylases. Il s'est en effet avéré que cette combinaison d'amylases permettait un rendement d'hydrolyse le plus élevé. [0018] Il est à noter que l'invention s'intéresse au traitement de hiomasse de type algues, niais qu'elle inclut également le traitement de hiomasse non exclusivement constituée d'algues, niais aussi, éventuellement, de hiomasse de type terrestre. [0019] L'étape de prétraitement peut optionnellemcnt être précédée (et/ou suivie) d'une étape de préparation des macro-algues, comportant une opération de séparation liquide/solide et/ou une opération de séchage. [0020] Selon un mode de réalisation, l'étape de prétraitement par cuisson s'opère en milieu aqueux à une température d'au plus 180°C, notamment d'au plus 160°C, 140°C ou 130°C, et de préférence d'au moins 60°C, de préférence d'au moins 80°C, notamment à une température comprise entre 90°C et 140°C, notamment à une température d'environ 100°C ou 120°C. Il s'agit donc d'une cuisson en conditions thermiques relativement « douces », qui n'impose pas de cuisson avec explosion à la vapeur. [0021] Selon un autre mode de réalisation, l'étape de prétraitement peut comporter une cuisson avec explosion à la vapeur, généralement, alors, avec une durée de cuisson un peu plus courte et une température de cuisson qui peut être un peu plus élevée que dans le cas précédent, mais qui peut rester dans des températures d'au plus 180°C comme dans le cas précédent. [0022] Il est apparu cependant préférable, que la cuisson soit opérée avec ou sans explosion à la vapeur, de choisir une température de cuisson d'au plus 180°C, notamment d'au plus 160°C par exemple. [0023] De préférence encore, l'étape de prétraitement par cuisson s'opère sans ajout de ca- talyseur acide, basique ou oxydant, elle s'opère notamment à un pH d'environ 6 à 7, par exemple d'environ 6,3 à 6,5. C'est un point très avantageux de pouvoir ainsi éviter d'ajouter des catalyseurs tout en obtenant l'effet voulu de déstructuration des algues avant hydrolyse, sans perte de rendement sur la production des jus sucrés : on fait ainsi une économie de catalyseur, on simplifie la mise en oeuvre du prétraitement (plus de besoin de régulation du pH par exemple par introduction contrôlée du catalyseur). [0024] Supprimer ainsi le catalyseur lors du prétraitement n'allait pas de soi, et allait même à l'encontre de toutes les préconisations. Il a été montré, de façon surprenante, dans le cadre de l'invention, que non seulement les catalyseurs n'étaient pas nécessaires pour que le prétraitement se fasse correctement, mais que leur ajout pouvait même, selon le type d'algues, s'avérer contre-productif, en provoquant la solubilisation d'au moins une partie de l'amidon, qui, de fait, était ensuite perdue pour l'étape suivante d'hydrolyse enzymatique s'opérant plutôt sur la phase solide obtenue en fin de pré-traitement. [0025] Alternativement, cependant, pour certains types d'algues, il peut être choisi d'opérer l'étape de prétraitemcnt par cuisson en milieu acide, notamment à un pH d'au plus 6, avec ajout d'un catalyseur acide donc, minéral ou organique. [0026] Avantageusement, l'étape de prétraitement par cuisson a une durée d'au moins 3 minutes, de préférence d'au plus 45 minutes, et notamment comprise entre 5 et 30 minutes : c'est une durée suffisante pour obtenir l'effet voulu, et suffisamment courte pour être compatible avec une production à l'échelle industrielle. Comme évoqué plus haut, une cuisson avec explosion à la vapeur peut permettre de viser dans cette gamme des valeurs de durée plus courtes, généralement, qu'avec une cuisson sans explosion à la vapeur. [0027] De préférence, entre l'étape de prétraitemcnt et l'étape d'hydrolyse enzymatique, on prévoit de séparer les algues prétraitécs d'au moins une partie du milieu aqueux dans lequel l'étape de prétraitemcnt a été opérée. [0028] Avantageusement, l'étape d'hydrolyse enzymatique est réalisée à pH acide, notamment à un pH compris entre 4 et 6. [0029] Avantageusement encore, on réalise l'étape d'hydrolyse enzymatique avec un cocktail enzymatique dans une quantité correspondant à 0,1 à 2% en poids, notamment d'environ 0,15 à 1%, en poids par rapport à la quantité d'algues prétraitécs exprimée en teneur en matière sèche MS. [0030] Avantageusement encore, on réalise l'étape d'hydrolyse enzymatique à une tem- pérature d'au plus 70°C, notamment comprise entre 30 et 60', notamment à environ 50°C. C'est en effet dans des conditions thermiques « douces », vers 50°C, et à pH acide, que les enzymes sont les plus efficaces. [0031] L'hydrolyse enzymatique s'opère selon l'invention soit en mode batch, soit en mode fed-batch. L'avantage du mode fed-batch est qu'il autorise le traitement d'une concentration plus importante en algues prétraitées, notamment quand on atteint et dépasse une teneur de 5% en poids de matière sèche MS dans le milieu (aqueux) dans lequel est opérée l'hydrolyse enzymatique. [0032] 11 s'avère que l'étape de prétraitement et/ou d'hydrolyse enzymatique peut être réalisée en milieu aqueux salin, sans dégrader significativement les performances du procédé : c'est un atout, car les algues peuvent être cultivées/pousser en milieu salin ou saumâtre, et un reste de salinité peut subsister lors de l'une ou l'autre de ces étapes. El n'est donc pas nécessaire de faire un rinçage extrêmement poussé des algues après récolte, ou des algues entre le prétraitement et l'hydrolyse enzymatique. [0033] Avantageusement, le procédé selon l'invention comprend également, après l'étape d'hydrolyse enzymatique, une étape de fermentation alcoolique du moût d'hydrolyse enzymatique. A partir des jus sucrés obtenus après hydrolyse enzymatique, on obtient alors des alcools valorisables, comme du biocarburant (bioéthanol) ou des molécules utilisables en chimie 6 100341 Le procédé selon l'invention traite préférentiellement des algues de type macro- algues vertes, et notamment des algues de la famille des Cludophoraceae, et de type Chaetomoipha ou de type Cladophora, telles que Rhizoclonium, Ulothrix, Acrosiphonia, Spongomotpha, Chaetomorpha et Cladophora. [0035] L'invention a également pour objet l'utilisation du procédé décrit plus haut pour la production de sucres, de biocarburants ou de molécules hiosourcées à partir de macroalgues cellulosiques. Liste des figures [0036] La figure 1 représente un mode de réalisation du procédé selon l'invention, sous forme d'un schéma bloc. [0037] La figure 2 représente un graphe du rendement en glucose de l'hydrolyse en- zymatique en fonction de la durée de différents exemples de réalisation. Description des modes de réalisation [0038] Le procédé selon la présente invention va maintenant être décrit plus en détails, dans des modes de réalisation non limitatifs, à l'aide de la figure I. 100391 C'est donc un procédé de production d'une solution contenant des sucres à partir d'algues, comprenant au moins une étape de prétraitement et une étape d'hydrolyse enzymatique des algues. 100401 L'étape de prétraitement des algues comprend au moins une étape de cuisson (en milieu aqueux), avec une température de cuisson comprise entre 60°C et 180°C, par exemple entre 80°C et 140°C, notamment vers 100°C ou 120°C. 100411 L'étape d'hydrolyse enzymatique met en oeuvre des enzymes, de type cellulases et de type amylases (a-amylases et glucoamylases) et est conduite à une température entre 25°C et 60°C. 100421 L'étape de prétraitement peut être mise en oeuvre soit en mode par lot (« batch » en anglais), soit en mode par lot alimenté (« fed-hatch » en anglais) comme il est connu dans ce domaine technique. Généralement, la durée du prétraitement est comprise entre 30 secondes et 60 minutes, préférentiellement d'au moins 3 minutes et d'au plus de 45 minutes et est notamment de moins de 30 minutes. 100431 Dans le cadre de l'invention, on peut réaliser le prétraitement avec une seule étape de cuisson, ou avec plusieurs étapes de cuisson successives à des conditions opératoires différentes, par exemple. Il s'est avéré qu'une seule cuisson est généralement suffisante. Contrairement à la cuisson de biomasses lignoce11ulosiques entièrement terrestres, il n'est pas nécessaire de réduire la taille de particules des algues au préalable, par un broyage par exemple. On peut cependant prévoir une étape préalable de séparation liquide/solide par des moyens mécaniques (par l'utilisation d'une vis sans fin convoyeuse à tête conique connue aussi sous l'appellation anglo-saxonne 7 « plug scrcw » par exemple), ou un séchage par des moyens de chauffage appropriés. [0044] La concentration d'algues mise en oeuvre dans l'étape de cuisson est comprise entre 2% et 60 % poids MS, préférentiellement entre 4 % et 45 % poids MS, et encore plus préférentiellement entre 5 % et 35 % poids MS. [0045] On rappelle que l'on désigne sous l'abréviation "MS" les matières sèches (solides et solubles) présentes dans un milieu. Le taux de matières sèches (ou "Total Solids") est déterminé selon la méthode ASTM E1756-01, qui consiste en une perte de masse à 105°C jusqu'à poids sec constant. [0046] Selon la MS de l'algue humide récoltée, une étape optionnelle d'augmentation de la MS de l'algue en amont du prétraitement peut être mise en oeuvre, comme évoqué plus haut. Cette augmentation de la MS peut être réalisée par toutes les techniques connues de l'homme de l'art comme une séparation solide/liquide ou un séchage. De manière préférée, l'augmentation de la MS, lorsqu'elle est nécessaire, a lieu par séparation solide/liquide. Cette séparation peut faire appel par exemple à un écoulement gravitaire, à l'application d'une pression mécanique de type compression, à l'application d'une pression de compactage, comme dans le cas de l'utilisation d'un filtre-presse, ou à un soutirage sous vide du liquide comme par exemple avec un filtre à bande sous vide, à l'application d'une force centrifuge, etc... [0047] Selon la présente invention, le prétraitement peut être opéré en présence ou en absence d'un catalyseur acide. Lorsqu'un catalyseur acide est présent, sa concentration dans la phase liquide du milieu de cuisson est d'au plus 4% poids, préférentiellement d'au plus 2% poids, et encore plus préférentiellement d'au plus 1% poids. L'acide mis en oeuvre peut être un acide minéral, de type H2SO4, ou un acide organique comme l'acide acétique, l'acide formique, l'acide oxalique ou tout autre acide approprié. De manière préférée dans le cadre de la présente invention, l'acide choisi est H2SO4, mais il s'est avéré qu'il pouvait être préférable, selon l'algue considérée, de ne pas ajouter d'acide du tout (ni de base ou d'agent oxydant). [0048] La mise en contact du catalyseur acide, quand il est utilisé, avec la biomasse peut être réalisée par une imprégnation préalable de la biomasse à l'acide et/ou une injection de l'acide dans le réacteur de cuisson, par toutes les techniques connues de l'homme de l'art. [0049] On peut prévoir optionnellement une étape de traitement mécanique, par exemple de type broyage ou défibrage, avant ou après l'étape de prétraitement par cuisson, avant l'étape d'hydrolyse enzymatique. De manière préférée, il n'y a pas besoin d'un tel traitement mécanique de broyage avant l'étape de cuisson (ou après), c'est tout l'avantage d'utiliser une biomasse de type algues par rapport à une biomasse entièrement terrestre contenant un squelette de lignine conférant beaucoup plus de rigidité à la biomasse lignocellulosique. 8 [0050] La cuisson peut être couplée à une étape de détente explosive (connue aussi sous le nom d'explosion à la vapeur, ou « steam explosion » selon la terminologie anglo-saxonne), mais il s'est avéré qu'une cuisson en conditions douces (pH proche d'un pH neutre, température de cuisson modérée, pas d'injection de vapeur sous pression) donnait déjà de très bons résultats. [0051] Les paramètres du prétraitement sont notamment la température, la pression, la durée, la présence d'acide (type et concentration) ou son absence. Ces paramètres agissent ensemble sur la réactivité résultante du substrat produit. Dans une certaine mesure, l'effet combiné de certains paramètres du prétraitement est variable : par exemple, une durée plus longue peut compenser une température moins élevée. D'après la littérature [Chortzet et al., Phetzotnenological Kinetics and Reaction Engineering Aspects of Steam/Aqueous Trecuments. Proceedings of the International Workshop on Steam Explosion Technique : Fundatnentals and Industrial Applications, 21-58, 1988], la sévérité du traitement thermique de cuisson peut être déterminée par un facteur de sévérité, ci-après dénommé FS, combinant les effets de température et de temps. La littérature propose aussi un facteur de sévérité corrigé, ci-après dénommé FSAC, pour prendre en compte la présence d'acide [Chien et al., PretreamzentCatalyst Effects and the Combined Severity Parcuneter, Applied Blochernistry and Riotechnology, Vol. 24/25, 1990 et Pedersetz et al., Lignocellulose pretrecament severity - relating pH to bannatrix opening, New Biotechnology, Volume 27, Number 6, December 2010]. [0052] Ces facteurs sont calculés comme suit : [0053] FS = d * exp( (T-100) / 14,75)) [0054] où d est la durée de la réaction (minutes) et T est la température de la réaction (°C) [0055] FSAC est calculé par : log (FSAC) = log (FS) - pH [0056] où pH est le pH de la solution acide avant mise en contact avec la biomasse, ou, le cas échéant, le pH calculé sur la base de l'eau présente dans la biomasse et de l'ajout d'acide réalisé directement en entrée du réacteur selon une variante du procédé. [0057] De manière préférée, le procédé selon la présente invention est réalisé à un FS de 1 à 120, de manière préférée entre 5 et 90. [0058] Lorsque le prétraitement est réalisé sans présence de catalyseur acide, le FS est de manière préférée compris entre 15 et 120, et préférentiellement entre 20 et 90. [0059] Lorsque le prétraitement est réalisé en présence d'un catalyseur acide, le FS est de préférence compris entre 1 et 60, et de manière préférée entre 5 et 30. [0060] De manière préférée, dans le cadre de la présente invention, lorsqu'un acide est utilisé, le procédé selon la présente invention a de plus un FSAC inférieur ou égal à 3, plus préférentiellement inférieur ou égal à 2,5. Le FSAC est de préférence également d'au moins 0,5 ou 1,notamment d'au moins 1,5. Selon un exemple préféré, le FSAC 9 est choisi égal à ou proche de 2. [0061] Le substrat prétraité produit par le procédé de l'invention présente une très bonne ré- activité à l'hydrolyse enzymatique par des cocktails d'enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques et d'amylases. De plus, la mise en oeuvre de conditions douces de cuisson permet de limiter la dégradation des sucres présents dans des polymères autres que la cellulose comme, par exemple, les sucres des hémicelluloscs et le glucose de l'amidon. [0062] Le substrat prétraité selon la présente invention subit ensuite une étape d'hydrolyse enzymatique. L'hydrolyse enzymatique est réalisée en mettant en contact, dans un réacteur, des enzymes avec le substrat prétraité. [0063] Les enzymes qui hydrolysent la cellulose sont produites par un microorganisme, par exemple des champignons appartenant aux genres Trichoderma, Aspergillus, Humicola, Fusarium, Penicillium ou Schizophyllum, ou des bactéries telles que Thermomonaspora, Bacillus, Cellulomonas et Streptomyces ou appartenant, par exemple, au genre Clostridium. Les enzymes sécrétées par ces microorganismes possèdent trois types d'activités utiles dans la conversion de la cellulose en glucose, et se divisent en trois groupes : les endoglucanases, qui attaquent les fibres de celluloses aléatoirement en interne, les exoglucanascs qui vont attaquer les extrémités des fibres en libérant du cellobiosc, et les B-glucosidascs qui vont hydrolyser ce cellobiose en glucose. [0064] L'hydrolyse enzymatique est préférentiellement réalisée à pH compris entre 4 et 6 et à une température comprise entre 25 et 60°C, de manière préférée comprise entre 40 et 60°C, et préférentiellement entre 45 et 55°C. [0065] Les conditions de l'hydrolyse enzymatique sont principalement, outre le pH et la tem- pérature, le taux de matière sèche du mélange à hydrolyser, la quantité d'enzymes utilisée et la durée de mise en contact. [0066] De manière préférée, le taux de matière sèche mise en oeuvre dans l'étape d'hydrolyse enzymatique est compris entre 1% et 35% poids, encore plus préférentiellement entre 5% et 25% poids. La quantité d'enzymes utilisée exprimée en milligramme de protéines par g de MS du substrat est comprise entre 2 et 70, encore plus préférentiellement entre 4 et 40. [0067] La durée de l'hydrolyse enzymatique est comprise entre 6 heures et 180 heures, et de préférence, entre 24 et 144 hem-es. [0068] L'hydrolyse enzymatique selon l'invention met en oeuvre des enzymes de type cellulase qui comportent des proportions équilibrées de cellulases ayant des activités enzymatiques diverses, entre autres, mais non exclusivement, du type exoglucanases, endoglucanases, xylanases et 13-glucosidases. Ces cellulases présentent de préférence 30 à 70% d'exoglucanases, 10 à 20% d'endoglucanases, de zéro à quelques pourcents d'hémicellulases, et environ 5 à 30% de B-glucosidascs. [0069] Des amylases viennent en complément de ces enzymes cellulases. Les enzymes amylases comprennent des a-amylases produites par des microorganismes du genre &teillas, Aspergillus ou Rhizopus, et des glucoamylascs produites par des microorganismes du genre Candida, Saccharomyces ou Aspergillus, deux types d'amylases dont les actions se complètent pour hydrolyser l'amidon contenu dans les algues. [0070] Une étape optionnelle de séparation solide/liquide peut être effectuée sur tout ou partie du substrat prétraité, en amont de l'étape d'hydrolyse enzymatique, qui traite alors la fraction solide issue de cette séparation. [0071] On comprend par « amont » et « aval » des indications relatives à la direction générale de déplacement de la biomasse d'une étape de traitement à la suivante. [0072] L'hydrolysat issu de l'hydrolyse enzymatique peut être utilisé dans un procédé de conversion biotechnologique. On appelle procédé biotechnologique tout procédé de conversion de sucres utilisant un microorganisme vivant ou un agent issu d'un microorganisme vivant pour la conversion de ces sucres en produits d'intérêt, et par exemple : [0073] - fermentation en éthanol des sucres en C6 par une levure, par exemple une levure appartenant au genre Saccharomyces (S. cerevisiae, S. carl.sbergetzsis'S. bayatzus'S. uvarutn)'Schizosaccharonzyces (S. ponzbe) ou encore Kluyverotnyces (K. fragilis); [0074] - fermentation en solvants tels qu'acétone, hutanol ou iso-propanol par une bactérie, telle que par exemple celle du genre Clostridium; - fermentation en éthanol des sucres en C6 et C5 par une levure telle que par exemple Pichia stipitis, Candida sheatae ou Pachysolen tannophilus; - production de champignons filamenteux, par exemple Trichoderma reseei. [0075] Le ou les microorganismes mis en oeuvre dans la conversion biotechnologique peuvent être des microorganismes natifs et/ou génétiquement modifiés. [0076] Selon une variante, l'hydrolyse enzymatique et la fermentation peuvent être réalisées de manière concomitante. [0077] La figure 1 reprend le schéma bloc d'un mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention. Les références dans la figure ont la signification ci-dessous : [0078] 1 : Algues 2 : Réacteur de cuisson 3 : Entrée d'eau ou vapeur et d'acide 4 : Algues prétraitées 5 : Réacteur d'hydrolyse enzymatique 6 : Cocktail d'enzymes 7 : Optionnel : entrée d'eau / de réactifs pour ajuster le Ph 8 : Jus sucré avec résidus d'hydrolyse 11 9 : Etape optionnelle de séparation solide/liquide avec lavage 10 : Eau de lavage (optionnel) 11 : Jus sucré 12 : Résidus solides d'hydrolyse [0079] La biomasse 1 constituée essentiellement de macro-algues vertes est introduite dans un réacteur 2 de cuisson par une entrée dédiée pour y subir un prétraitement (en milieu aqueux, avec éventuellement des restes de salinité provenant du milieu dans lequel ont poussé les algues en question). Le réacteur 2 peut comporter une autre entrée de fluide 3, qui peut être de l'eau, de l'eau contenant de l'acide ou de la vapeur d'eau. Les algues prétraitécs 4 sont extraites du réacteur 2 et introduites dans un réacteur 5 d'hydrolyse enzymatique, qui est muni d'une entrée 6 pour le cocktail enzymatique en solution. Le réacteur 5 peut également comporter, de façon optionnelle, une entrée 7 d'eau ou de réactifs liquides, notamment pour ajuster le pH du milieu réactionnel dans le réacteur 5. Est extrait du réacteur 5 un flux 8 de jus sucré contenant des résidus d'hydrolyse. [0080] Optionnellemcnt, ce jus sucré 8 est introduit dans une enceinte 9 pour une séparation liquide/solide, avec éventuellement un lavage à l'eau par une entrée d'eau 10, pour obtenir, en fin de séparation, un jus sucré 11 d'une part et un extrait 12 de résidus solides d'hydrolyse. [0081] Cc jus sucré peut ensuite subir une fermentation pour transformer les sucres en alcool ou autres molécules biosourcées valorisables, selon des techniques connues de l'homme de l'art, ou être valorisé tel quel. [0082] On peut aussi prévoir une autre séparation liquide/solide optionnelle (non re- présentée), cette fois en amont de l'hydrolyse enzymatique (avant la cuisson et/ou entre la cuisson et l'hydrolyse enzymatique) Exemples [0083] Les enzymes utilisées pour composer le cocktail enzymatique pour l'hydrolyse en- zymatique sont choisies parmi : [0084] - d'une part des cellulases : [0085] - des cellulases Cl produites avec la souche CL847 de Trichodertnci longibrachiaturn (selon la publication de European Food Safety Authority : the EFSA Journal (2007) 520,1-8) - une enzyme de dénomination commerciale Cellic'° CTec2 de la société Novozymes. [0086] - d'autre part des amylases : [0087] - la Liquozymee SC4X est une cc-amylase commerciale de la société Novozymes. [0088] - la Spirizymee Excel est une glucoamylase (qu'on peut aussi appeler amyloglu- cosidase) commercialisée par la société Novozymes. Cette enzyme est utilisée diluée 12 au 1 /1 Oème. avant utilisation. [0089] Exemple 1 : avec une algue de type Cladophora rupestris [0090] L'algue Cladophora rupestris est une espèce d'algue verte de la famille des Clado- phoraceae. Elle est constituée de 17,7 g/100g MS de cellulose équivalent. Après avoir été récoltée en pleine mer, elle a subi un prétraitement par cuisson avec 1% poids d'acide dans un réacteur de 1 litre à 100°C pendant 21 minutes à 5% poids MS avec une agitation à 300 tours par minute. Elle est ensuite lavée, ajustée à pH 5 avec de la soude, puis pressée et centrifugée. La matière sèche MS est de 23% poids, et le pourcentage de glucose potentiel obtenu par hydrolyse acide est de 19% poids (correspondant à une teneur en cellulose équivalent de 50,2 g/100 g MS). [0091] Le substrat prétraité est ensuite mis en présence d'une composition enzymatique Cellic® CTec2 de manière à produire un hydrolysat contenant du glucose à un taux de 11 mg de protéines/g de cellulose. [0092] Les essais sont effectués dans des flacons de 100 mL pour un mélange total de 70g contenant : [0093] - l'équivalent de 1 g de cellulose de macro-algues lavées, pressées et centrifugées; - le complément de milieu réactionnel d'hydrolyse composé de tampon acétate 50 mM au pH à 4,65 ajusté à 4,8 avec ajout de NaOH 2N, et un bactériostatique, l'azide de sodium (1.103 mg/g de milieu réactionnel); - une quantité suffisante de composition enzymatique de Cell ice° CTec2 en fonction de leur taux de protéines, diluées ou pas, pour un taux à 11 mg protéines /g cellulose. [0094] Les hydrolyses enzymatiques sont réalisées à 50°C sous agitation mécanique à 1200 rotations par minute dans un bain-marie à sec. [0095] Tous les essais sont effectués en double avec des temps de prélèvement fixés à 1,5, 3, 6, 24, 48, 72 et 144 heures. [0096] A chaque temps de prélèvement, les échantillons sont dilués dans de l'eau puis ébouillantés 5 minutes. Ces tubes sont ensuite refroidis et centrifugés. Le dosage du glucose est effectué Le dosage du glucose est effectué par réaction enzymatique avec la glucose oxydase qui oxyde le glucose en gluconolactone et peroxyde d'hydrogène . [0097] Le rendement d'hydrolyse après 72 heures est de 45% poids et de 52% poids après 144 heures. Il n'est que de 33% poids pour l'algue sans prétraitement à 72 heures, et 43% poids à 144 heures. [0098] Cet exemple démontre que l'étape de prétraitement est préconisée si on veut obtenir un rendement d'hydrolyse enzymatique dépassant 45% poids en 72 heures ou 50% poids en 144 heures. [0099] Exemples 2 à 7: à partir d'une algue de type Chaetomorpha linum [0100] L'algue Chaetomorpha Hum est une espèce d'algue verte autotrophe de la famille des Cladophoraceae. Appelée également « algue spaghetti », c'est une algue fila- 13 menteuse constituée de longs filaments enchevêtrés non ramifiés qui prolifèrent très rapidement. Pour tous les exemples 2 à 7 suivants, après avoir été cueillie sur le littoral, cette macro-algue a été cultivée en salinité réduite pour l'enrichir en cellulose et amidon. Elle contient 37% en poids de glucose potentiel. [0101] On comprend par « glucose potentiel » dans l'ensemble du présent texte le total du glucose présent, que cc soit sous forme d'un polymère de cellulose, d'un polymère d'amidon ou dans les hémicclluloses. Le glucose potentiel est déterminé expérimentalement comme le glucose maximum généré suite à une hydrolyse acide en deux étapes selon la méthode ASTM E1758-01. [0102] Exemple 2 Le substrat utilisé est une algue du genre Chaetornorpha ayant subi un prétraitement par cuisson sans acide dans un réacteur de 1 litre à 120°C pendant 20 minutes à 5% poids MS à 300 tours par minute. Elle est ensuite lavée, ajustée à pH 5 avec de la soude 5N, puis pressée et centrifugée. La matière sèche est de 24% poids et le pourcentage de glucose potentiel obtenu par hydrolyse acide est de 71,4% poids. [0103] Les hydrolyses ont été réalisées à 5% poids de matière sèche.. Le taux de protéines des cellulases Cl est fixé à 10 mg/g MS. Ces enzymes cellulases sont supplémentées en a-amylase Liquozyme SC4X et en glucoamylasc Spirizyme Excel diluée au 1/10ème à hauteur de 10 mg/g MS chacune (ou 1% poids MS). [0104] Les essais sont effectués en tubes Eppendorf de 2 mL utile (1,5 g réactionnel) contenant : [0105] - 0.075 ± 0.001 g de matière sèche de macro-algues lavées, pressées et centrifugées; - un volume intermédiaire de solution tampon acétate 50 mM pour un pH 5; - un volume suffisant d'un antibiotique, le chloramphénicol, pour 0,1 mg/g de milieu réactionnel final; - un volume de base ou d'acide pour un ajustement du pH, si nécessaire; - une quantité suffisante de compositions enzymatiques en fonction de leur taux de protéines, diluées ou pas, pour un taux à 10 mg/g MS; - un volume complémentaire de solution tampon acétate 50 mM pour 1.5 g de milieu réactionnel final. [0106] Les hydrolyses enzymatiques sont réalisées à 50 ± 2 °C sous agitation type vortex à 900 rotations par minute dans un Then-nomixer Comfort Eppendorf. [0107] Tous les essais sont effectués en double avec des temps de prélèvement fixés à 24, 48, 72 et 96 heures avec pour certains essais, des prélèvements à 168 hem-es. [0108] A chaque temps de prélèvement, les hydrolysats sont ébouillantés 5 minutes dans les tubes Eppendorf sacrifiés. Ces tubes sont ensuite refroidis et centrifugés. Le dosage du glucose est effectué par HPLC. Parallèlement les résidus solides de chaque tube Eppendorf sont lavés et centrifugés 3 fois avant d'être séchés à 105°C pendant 24 14 heures minimum jusqu'à poids constant de façon à évaluer les résidus solides insolubles dans l'eau (ou W1S). Le calcul du rendement d'hydrolyse est effectué en tenant compte de la quantité de WIS restant clans les milieux réactionnels en fin d'hydrolyse. [0109] Les quantités de produits solubles constituant ces macro-algues prétraitées sont obtenues après une analyse chromatographique des surnageants de suspensions préparés dans ces conditions d'hydrolyse enzymatique sans les enzymes à 5 % poids MS (tampon acétate 50 mM, pH 5,0, 96 heures, 50 °C). L'acide acétique apporté par le tampon acétate étant soustrait des dosages, seul du glucose a été détecté dans le surnageant. Exemple 3 : [0110] L'exemple 2 a été reproduit, mais avec un cocktail enzymatique différent pour l'étape d'hydrolyse enzymatique : le cocktail ne contient ici que des cellulases Cl. Exemple 4 : [0111] L'exemple 2 a été reproduit, mais avec un cocktail enzymatique différent pour l'étape d'hydrolyse enzymatique : le cocktail contient uniquement un mélange d'amylases Liquozymes SC4X et Spirizymc Excel. Exemple 5 : 10112] L'exemple 2 a été reproduit, mais avec un cocktail enzymatique différent pour l'étape d'hydrolyse enzymatique : le cocktail ne contient ici que des cellulases Cellic® CTec2. 10113] La figure 2 représente un graphe avec, en abscisse, la durée de l'hydrolyse en- zymatique en heures, et en ordonnées le rendement glucose en % poids pour chacun des exemples 2 à 5, calcifié comme suit : 10114] Rendement glucose (% poids) = (m GlucosehnGlucose poren',)x100 10115] où mcd,', est la masse de glucose libérée dans le milieu réactionnel pendant l'hydrolyse enzymatique et mcd,,co'potentiei la masse de glucose apportée dans la réaction par les algues via la cellulose et l'amidon. 10116] La courbe avec des ronds correspond à l'exemple 2, la courbe avec les triangles correspond à l'exemple 3, la courbe avec des losanges correspond à l'exemple 4, et la courbe avec les carrés correspond à l'exemple 5. 10117] Les données de rendement glucose sont également regroupées dans le tableau 1 ci- dessous à deux durées d'hydrolyse définies, 96 et 168 heures : 10118] [Tableauxl] Rendement glucose (% poids) 96 heures 168 heures Exemple 2 84,2 ± 3 % 87,9 ± 0,1 % Exemple 3 38,6 ± 1.2% 40 ± 1,5 % Exemple 4 53,2 ± 1,8 % 58,6 ± 1,6 % Exemples 55 ± 0,3 % 60±2% [0119] L'exemple 2, dont le cocktail enzymatique combine à la fois des cellulases et deux types d'amylases, donne, de loin, les meilleurs résultats en termes de rendement glucose. [0120] On voit sur le graphe de la figure 2 que, dès 72 heures, on est proche d'un rendement de 80 % poids, rendement qui augmente jusqu'à plus de 84 % poids après 96 heures d'hydrolyse pour l'exemple 2, alors que tous les autres exemples donnent des rendements de moins de /d'au plus 60 % poids pour la même durée, et cela même en prolongeant l'hydrolyse jusqu'à une durée de 168 heures, comme on peut le vérifier du tableau 1 ci-dessus : [0121] Les exemples n'utilisant que des enzymes de type cellulases, à savoir les exemples 3 et 5, donnent des résultats peu satisfaisants avec, au mieux, un rendement de 60 % poids après 168 heures : le moins bon résultat est obtenu avec l'exemple 3 utilisant les cellulases produites par la souche Cl seule, puisqu'il plafonne à 40% poids au bout de 168 heures, avec une pente de progression après 24 heures qui est faible, et un plateau atteint à 96 heures. [0122] De ces comparaisons, on conclut que combiner des cellulases et des amylases (exemple 2) permet d'augmenter la vitesse de l'hydrolyse par rapport à l'utilisation d'un seul type de cellulases (exemples 3 et 5). On conclut également qu'utiliser plusieurs types d'amylases (exemple 4) donne des résultats supérieurs à ceux où l'on utilise les cellulases Cl seules (exemple 3). [0123] 11 en ressort que la combinaison de cellulases et d'amylases (exemple 2), et de préférence en associant deux types différents d'amylase, est la seule solution pour atteindre des rendements suffisants pour envisager une production industrielle. Cette solution n'allait pas de soi, elle tient à la structure et à la composition chimique des algues, qui ne permettait pas de simplement transposer des procédés (de prétraitement et) d'hydrolyse enzymatique connus pour de la biomasse terrestre. C'est cette combinaison d'enzymes qui permet d'hydrolyser la cellulose, les hémicelluloses mais aussi l'amidon, contenu dans les algues prétraitées, et d'atteindre de bons rendements d'hydrolyse. 16 [0124] Par ailleurs, des tests ont été refaits, en changeant les conditions opératoires du pré- traitement décrits pour les exemples 2 à 5, en termes de température et de pH, notamment en jouant sur une augmentation de température et l'ajout d'un catalyseur acide de type acide sulfurique. Il en est ressorti que des températures trop élevées, notamment dépassant 150 à 160°C, et/ou des ajouts de catalyseur acide en teneur significative (par exemple dépassant 1% en poids) n'étaient pas favorables. La conjonction d'une température supérieure à 160°C et d'un ajout de catalyseur d'au moins 1% en poids est la configuration la moins bonne en termes de rendement global en glucose. Il a été montré, en effet, qu'une température excessive lors du prétraitement pouvait provoquer la formation de produits inhibiteurs de l'activité enzymatique pendant l'hydrolyse enzymatique, et/ou l'activité d'autres micro-organismes pendant une fermentation alcoolique ultérieure, du type acide formique, acide lévulinique, 5-HMF, furfural et polyphénols notamment des qu'elle dépasse 150°C, avec ou sans ajout d'acide. [0125] De plus, la présence d'acide, pourtant bien connue et utile pour les prétraitements de biomasse terrestre, parait peu favorable, voire inutile ou néfaste, d'autant plus quand l'ajout est combiné à une température supérieure à 150°C ou 160°C. C'est probablement dû au fait que, sous l'action d'acide, une partie de l'amidon des algues s'hydrolyse prématurément en se solubilisant dans le milieu réactionnel aqueux, et n'est donc plus présent dans la matière solide obtenue par pressage en fin de pré-traitement qui va subir l'hydrolyse enzymatique. [0126] 11 en a été déduit qu'il était préférable que le prétraitement se fasse en conditions re- lativement douces (sans exclure un prétraitement par explosion à la vapeur), à savoir une température d'au plus 160°C, et de préférence d'au plus 150°C, et l'absence d'ajout de catalyseur, notamment acide, ou un ajout en faible teneur (au plus 1%, notamment au plus 0,5 % en poids), le choix de l'ajout ou non d'acide pouvant prendre en compte la nature de l'algue à traiter. [0127] 11 a par ailleurs été vérifié que les résultats en termes de rendement ne sont pas signi- ficativement meilleurs si on interpose entre le prétraitement et l'hydrolyse enzymatique un lavage à l'eau destiné à retirer les traces de salinité présentes dans les algues provenant d'eau de mer ou d'eau saumâtre, ce lavage initialement prévu a donc été finalement supprimé. [0128] En conclusion, l'invention est la combinaison entre un prétraitement des algues en conditions relativement « douces », suivi d'une hydrolyse enzymatique avec un cocktail enzymatique associant cellulases et amylases, combinaison permettant seule d'atteindre des rendements de conversion en glucose raisonnables pour ce type très particulier de biomasse. 17