Brevet FR3092587A1 — publié le 20200814

Description Titre de l'invention : PROTEINES BIOLUMINESCENTES AUX PROPRIETES AMELIOREES [0001] L'invention se rapporte au domaine de la bioluminescence. Plus particulièrement, la présente invention concerne des protéines MaLuc modifiées dont la bioluminescence est augmentée. Domaine technique [0002] La bioluminescence est une réaction biocatalytique qui permet à certains organismes vivants de produire de la lumière, notamment des organismes marins, algues, méduses, calamars, poissons, ou encore crevettes. Ces organismes ont en commun de posséder un gène codant pour une enzyme, la luciférase, capable d'émettre une lumière colorée. [0003] Ce phénomène de bioluminescence a tout d'abord été analysé à des fins de recherche scientifique mais trouve aujourd'hui des applications industrielles. Il est ainsi possible d'utiliser cette source lumineuse pour réaliser des objets et équipements bioluminescents émettant pendant des durées relativement brèves de la lumière, de faible intensité à différentes fins telles que signaler ou éclairer dans le noir, intensifier les couleurs, augmenter l'éclat, marquer (pour des applications en recherche notamment)... Exposé de l'invention [0004] Les inventeurs ont développé des luciférases mutantes dont les propriétés biolumi- nescentes sont améliorées, en durée et/ou en intensité. Ces enzymes dérivent de la luciférase naturelle Metridia asvmmetrica (MaLucl) utilisant des molécules à noyaux imidazopyrazinone telles que la coelenterazine native comme substrat pour générer la bioluminescence. Description des modes de réalisation [0005] Un premier objet de l'invention concerne une enzyme luciférase MaLuc sans peptide signal de 17 acides aminés (GlowLuc) comprenant une séquence nucléotidique SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.5, SEQ ID NO.7, SEQ ID NO.9, SEQ ID NO.11 ou SEQ ID NO.13, ou une séquence présentant au moins 80 % d'homologie avec l'une de ces séquences dans la mesure où la fonction de l'enzyme n'est pas modifiée. [0006] Un second objet de l'invention concerne une enzyme luciférase MaLuc sans peptide signal de 17 acides aminés (GlowLuc) de séquence protéique SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.4. SEQ ID NO.6. SEQ ID NO.8, SEQ ID NO.10. SEQ ID NO.12 ou SEQ ID NO.14. ou une séquence présentant au moins 80 % d'homologie avec l'une de ces séquences dans la mesure où la fonction de l'enzyme n'est pas modifiée. [0007] Dans un mode de réalisation préféré. les séquences selon l'invention présentent au moins 85 % d'homologie, voire 90 % ou 95 % d'homologie avec l'une des séquences 2 citées précédemment. Dans un mode de réalisation particulier, elles présentent 100 % d'homologie ou correspondent à l'une des séquences citées précédemment. [0008] Les enzymes MaLuc modifiées selon l'invention, appelées « GlowLuc », ont pour caractéristique commune de ne pas posséder le peptide signal présent chez l'enzyme MaLuc native. L'enzyme MaLuc sans peptide signal est représentée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO.1 et la séquence peptidique SEQ ID NO.2 ; elle est appelée GlowLucl. [0009] Le fait de déléter le peptide signal permet d'améliorer l'activité de l'enzyme et donc d'augmenter l'intensité de la bioluminescence mais également d'élargir la spécificité de substrat en permettant l'utilisation de dérivés de coelenterazine, comme cela est illustré dans la partie expérimentale. [0010] Afin d'améliorer la hioluminescence de GlowLucl, d'autres mutants ont été générés par les inventeurs pour augmenter soit la durée de la hioluminescence, soit l'intensité de la bioluminescence. L'augmentation de la durée de la bioluminescence repose sur un temps de réaction qui soit le plus long possible, alors qu'augmenter l'intensité de la hioluminescence consiste à accroître le rendement de la réaction. [0011] Ainsi, les mutants GlowLuc2, GlowLuc3 et GlowLuc4 présentent une hiolumi- nescence plus intense que l'enzyme native MaLuc. [0012] Le mutant GlowLuc2 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO. 3 et la séquence peptidique SEQ ID NO.4. [0013] Le mutant GlowLuc3 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO.5 et la séquence peptidique SEQ ID NO.6. [0014] Le mutant GlowLuc4 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO.7 et la séquence peptidique SEQ ID NO.8. [0015] D'autre part, les mutants GlowLucS, GlowLuc6 et GlowLuc7 présentent une biolu- minescence dont la durée est augmentée par rapport à l'enzyme native MaLucl. [0016] Le mutant GlowLucS est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO.9 et la séquence peptidique SEQ ID NO.10. [0017] Le mutant GlowLuc6 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO.11 et la séquence peptidique SEQ ID NO.12. [0018] Le double mutant GlowLuc7 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO.13 et la séquence peptidique SEQ ID NO.14. [0019] Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, les enzymes GlowLuc sont modifiées de sorte à ce que à la fois la durée et/ou l'intensité de la bioluminescence soit augmentée. [0020] Ainsi, l'une des mutations associées à une amélioration de durée de la biolumi- nescence telles que celles existantes chez les mutants GlowLucS, GlowLuc6 ou GlowLuc7 peut être associée à l'une des mutations associées à une amélioration de 3 l'intensité de la bioluminescence telles que celles existantes chez les mutants GlowLuc2, GlowLuc3 ou GlowLuc4. [0021] Afin d'évaluer la bioluminescence des différents mutants, une comparaison est établie avec la bioluminescence de l'enzyme MaLucl native mais également par rapport à celle de l'enzyme Cyan NanoLantern Luciferase (CNL), une enzyme considérée comme produisant une bioluminescence intense. La CNL est une luciférase issue de Rendit' renifornzis ayant fait l'objet d'une mutation aléatoire puis fusionnée à la mtureise2 (protéine fluorescente pour la réalisation de BRET). [0022] L'enzyme CNL est représentée par la séquence nucléotidiquc SEQ ID NO.15 et la séquence protéique SEQ ID NO.16. [0023] Un troisième objet de l'invention concerne un microorganisme comprenant une cassette d'expression comprenant au moins une séquence codante pour une enzyme luciférase GlowLuc de séquence SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.4, SEQ ID NO.6, SEQ ID NO.8, SEQ ID NO.10, SEQ ID NO.12 ou SEQ ID NO.14, ou une séquence présentant au moins 80 % d'homologie avec l'une de ces séquences dans la mesure où la fonction de l'enzyme n'est pas modifiée. [0024] Les microorganismes d'intérêt peuvent être choisis parmi les cellules procaryotes ou eucaryotes. Toutes les souches procaryotes peuvent être envisagées sans limitation qu'elles soient acrohics, microacrophil ics, capnophili ics, facultatives, anaérobies, gram-négatives et gram-positives. On peut citer notamment E. col i, Bacillus substilis, Bacillus licheniformis, bacteroide fragilis, clostridia perfiingens, Clostridia difficile, Caulobacter crescentus, Lactococcus lattis, Methylobacterium extorquens, Neisseria meningirulls, Neisseria meningitidis, Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens et Salmonella typhimurim. Parmi les cellules eucaryotes, on peut citer (i) les levures telles que Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia angusta, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae et Yarrowia lipolytica, (ii) les cellules d'insectes et les cellules dérivées d'insectes telles que les cellules dérivées de Spodoptera frugiperda, Trichoplusia ni, Drosophila melanogaster et Manduca sexta et (iii) les cellules de mammifères et des lignées dérivées telles que les cellules dérivées de souris, rats, hamster, porcs, boeufs, chevaux, singe et homme. [0025] Un quatrième objet de l'invention concerne l'utilisation d'une enzyme luciférase GlowLuc telle que définie précédemment en tant qu'ingrédient, colorant ou élément biolurninescent. [0026] Un cinquième objet de l'invention concerne l'utilisation d'une enzyme luciférase mutante telle que définie précédemment pour signaler, éclairer, illuminer, augmenter la visibilité dans le noir, intensifier les couleurs, par exemple la couleur bleue ou décorer un objet ou un élément. [0027] Ainsi, les enzymes luciférases selon l'invention peuvent être utilisées en tant qu'ingrédient, colorant ou élément bioluminescent notamment dans le domaine de la signalétique (décorative ou pour la sécurité), de la cosmétique, de la papeterie, du textile, des accessoires, de l'agroalimentaire et de la recherche notamment pour marquer certains éléments d'intérêt comme des protéines ou des sondes. [0028] Ces enzymes bioluminescentes peuvent, par exemple, être utilisées pour illuminer des infrastructures intérieures ou extérieures comme des éléments d'un panneau décoratif, d'un panneau publicitaire, d'un bâtiment, et plus généralement du paysage urbain comme un mobilier urbain, un élément de signalétique... [0029] La présente invention sera mieux comprise à la lecture des exemples qui suivent, fournis à titre d'illustration et ne devant en aucun cas être considérés comme limitant la portée de la présente invention. Brève description des dessins [0030] [fig.1] Figure 1 : Comparaison des intensités maximales de bioluminescence (Imax) des luciférascs CNL, MaLuc, et GlowLuc 1. Conditions expérimentales : 0,2 pM de luciférase et 1 pM de nCTZ. [0031] [fig.2] Figure 2 : Intensité maximale de bioluminescence (Imax) de la luciférase de Metridia asymmctrica avec peptide signal (MaLuc) et sans peptide signal (GlowLucl). Conditions expérimentales mises en oeuvre : 0,2 pM de luciférase et 2 0/1 de nCTZ. [0032] [fig.3] Figure 3 : Cinétique de bioluminescence des différents mutants GlowLuc en comparaison avec la CNL montrant une amélioration de l'intensité de la bioluminescence chez les mutants. Conditions expérimentales mises en oeuvre : 0,2 pM de luciférase et 2 pM de nCTZ. [0033] [fig.4] Figure 4 : Histogramme des intensités maximales (Imax) des différentes GlowLuc en comparaison de la CNL. Conditions expérimentales mises en oeuvre: 0,2 de luciférase et 2 pM de nCTZ. [0034] W8.51 Figure 5 : Profil de l'accumulation de photons produits au cours du temps par les différentes GlowLuc. Conditions expérimentales mises en oeuvre : 0,2 pM de luciférase et 2 pM de nCTZ. [0035] [fig.6] Figure 6 : Cinétique de bioluminescence des mutants GlowLuc montrant une amélioration de la durée de bioluminescence. Conditions expérimentales mises en oeuvre : 1µM de luciférase et 20 gM de nCTZ. EXEMPLES EXEMPLE 1 : Préparation des mutants GlowLuc 100361 1.1 - Obtention de la luciférase GlowLucl 100371 La séquence codante pour MaLuc (n° accession : BAN91823.1) a été amplifiée à l'aide des olieonucléolides (oligos) suivants : 5'CATATGAAGGCAACCGAGAACAATGATGAC3' (oligo sens) (SEQ ID NO. 17 et 5'CATATGAGATCTATAATACCTCCTTAAGATTTGGTTGTTGG3' (oligo antisens) (SEQ ID NO.18) à partir du plasmide pSB1C3-MaLuc, contenant la séquence native de MaLuc ; ces oligos permettent d'amplifier la séquence codante de la luciférase sans peptide signal ; l'enzyme résultante sans peptide signal étant appelée GowLucl . Ces oligos permettent aussi l'insertion des sites de restriction enzymatique NdeI et BglII du côté N-terminal de la séquence de la luciférase. Les produits de PCR (Chain Polymerisation Rcaction), ont été digérés avec les enzymes Ndel et Pst!, puis purifiés sur gel avec un kit Macherey-Nagel et ligaturés par une T4 ligasc. [0038] 1.2 - Construction des mutants [0039] Toutes les mutations ont été réalisées à partir de GlowLucl et ont été obtenues par amplification en utilisant des oligonucléotides phosphorylés en 5'. Les produits de PCR ont été purifiés puis ligaturés avec une T4 I igase. [0040] Les plasmides circularisés ont été nommés pGlowLuc suivi d'un numéro d'identification (GlowLucl, GlowLuc2...) [0041] 1.3 - Changement de promoteur [0042] Pour améliorer le niveau d'expression protéique chez E.coli, le promoteur pBad a été changé par le promoteur pT7. De la même façon que précédemment, les produits digérés ont été purifiés puis ligaturés avec une T4 I igase. [0043] 1.4 - Expression des protéines mutantes [0044] Les cellules chimiquement compétentes E. coli BL 21 D3 (New England Biolabs, Ipswich, MA) ont été transformées avec la nouvelle librairie de mutants GlowLuc et étalées sur boîtes de Pétri contenant du chloramphénicol. Le jour suivant, plusieurs colonies (une dizaine) ont été sélectionnées et cultivées toute la nuit à 37 °C (agitation 140 rpm) dans 8 mL de milieu LB contenant 35 pg/mt de chloramphénicol (CMP). Puis, 3 mL de culture ont été ajoutés dans 60 mL de milieu LB contenant 35 pg/mL de CMP. Après 1h30 d'incubation à 37 °C sous agitation (140 rpm), 60 mL de la culture ont été prélevés pour ensemencer 1 L de milieu LB contenant 35 pg/mL de CMP. La culture a ainsi été incubée à 37 °C sous agitation (140 ipm) jusqu'à l'obtention d'une DO600,,,' comprise entre 0,5-0,6. La culture a été refroidie en la mettant 1 h sur glace puis l'induction a été initiée par l'ajout d'IPTG dans le milieu pour une concentration finale de 1 mM. L'induction a été réalisée pendant 4 h à 30 °C sous agitation (140 rpm). La récupération des cellules a été réalisée par centrifugation 20 min à 4000 g à 4 °C. Le culot obtenu a ensuite été solubilisé dans 40 mL de tampon d'équilibration (phosphate de sodium 50 mM, 300 mM NaC1, pH 7,4). La lyse cellulaire a été réalisée à l'aide d'un sonicateur (SonoPuls HD 2200, Bandelin, Berlin), par 3 cycles de 30 secondes à 35 % de la puissance totale en continu. Pendant et entre chaque cycle, les cellules sont incubées sur glace afin d'éviter tout effet de dénaturation thermique. Après sonication, le lysat cellulaire a été de nouveau centrifugé 20 minutes à 16000 g 6 sous 4 °C. Le surnageant contenant les protéines à purifier a ensuite été récupéré et filtré à l'aide d'un filtre 0,2 pm. [0045] 1.5 - Purification des protéines mutantes [0046] Le surnageant filtré a été passé au travers d'une membrane chélate° au nickel (colonne HisTrapTM HP 1 mL, Ge Healthcare, Chicago, Il) équilibrée avec un tampon d'équilibration (50 mM phosphate de sodium, 300 mM NaCI, pH 7,2). Après lavage de la colonne avec 50 mL du même tampon d'équilibration, les protéines absorbées ont été éludes contre un gradient linéaire d' imidazolc via un tampon d'élution (50 mM sodium phosphate, 300 nM NaCI, 500 mM imidazole, pH 7,8). Tout au long de l'élution, des fractions de 1 mL ont été collectées et stockées à 4 °C en attendant d'être analysées. [0047] Après avoir identifié les fractions d'élution contenant le maximum de protéine d'intérêt, ces dernières ont été réunies et dialysées contre un tampon Hepes 50 mM, pH 7,2 puis concentrées à l'aide de concentratcur Vivaspin Turbo 15 10 000 Dalton (Dutschcr, Brumath, France). Les solutions de protéines purifiées obtenues ont été stockées à - 20 °C jusqu'à utilisation. [0048] EXEMPLE 2 : Méthode d'analyse de la bioluminescence des protéines GlowLuc [0049] Préparation des fractions d'élution [0050] Les fractions d'élution ainsi que les solutions enzymatiques purifiées ont été analysées par électrophorèse SDS-Page. Ces analyses ont été faites à l'aide de gels de séparation à 15 % comme décrit par Laemmli (Laemmli 1970). Les concentrations protéiques des solutions purifiées ont quant à elles été déterminées par méthode colon-métrique via l'utilisation d'un kit commercial de dosage de l'acide bicinchoninique (PierceTM BCA Protein Assay, Then-noFisher, Massachusetts, USA). Une gamme étalon de sérum albumine bovine a également été réalisée. [0051] Sélection des fractions d'élution actives [0052] A l'issue de la purification, la détermination des activités de bioluminescence des fractions d'élution a été nécessaire afin de garantir un degré de pureté optimal. Pour ce faire, une solution de substrat a été réalisée dans un tampon phosphate de sodium de 50 mM pH 7,2 pour une concentration finale en ccelenterazine native de 1 pM Afin de préserver le maximum d'échantillon et de garantir la qualité analytique, les fractions d'élutions ont été diluées clans le même tampon phosphate de sodium 50 mM, pH 7,2. Les dilutions ont été réalisées de façon à garantir un signal de bioluminescence de l'ordre de 1.106coups/s. La bioluminescence a été mesurée à l'aide d'un luminomètre Spark (Tecan, Switzerland), équipé d'un système réfrigérant Tecool afin de réaliser les analyses à 25 °C. [0053] 100 pL de fractions diluées ont été ajoutés dans une rnicroplaque 96 puits noire à fond transparent (Coming, New York, USA). Les réactions ont été initiées par ajout de 7 100 !IL de solution de substrat à l'aide d'une pipette multicanaux. Les analyses ont été réalisées pendant 2 minutes avec 10 ms de temps d'intégration. [0054] Méthode de comparaison de l'intensité bioluminescente des mutants [0055] Afin de comparer les intensités maximales de hioluminescence des mutants GlowLuc, des tests de hioluminescence ont été réalisés sur les solutions d'enzymes purifiées. Ces tests ont permis de comparer les activités de chaque solution de luciférase purifiée pour les mêmes quantités d'enzymes et de substrat. [0056] Des solutions d'enzymes purifiées ont été préparées dans du tampon phosphates de sodium 50 mM, pH 7,2 pour une concentration finale de 0,21.1M. D'autre part, une solution de substrat a également été réalisée dans le même tampon phosphate pour une concentration finale de 2 el. 1001.1L de solution d'enzyme ont été ajoutés dans une microplaque 96 puits noire à fond transparent. Les réactions ont été initiées par ajout de 100 !IL de solution de substrat dans les puits. L'analyse a été réalisée pour une cinétique de 10 minutes avec un temps d'intégration de 10 ms. Afin de visualiser les spectres d'émission de chaque mutant, un spectre de bioluminescence a également été réalisé avec un temps d' intégration de 10 ms. [0057] Mesure de la bioluminescence [0058] La mesure de la bioluminescence est réalisée par un luminomètre de marque TECAN. Ce luminomètre permet de mesurer en temps réel la production de photons émis pour chaque mutant ainsi que les spectres d'émission de chaque réaction. Ce type de courbes permet d'une part d'avoir une idée sur l'efficacité de la luciférase en termes d'intensité mais également en termes de cinétique ou plus précisément de durée de réaction. [0059] EXEMPLE 3 :Amélioration de la bioluminescence des luciférases mutées [0060] 3.1- Amélioration de l'intensité de bioluminescence [0061] a. Retrait du peptide signal [0062] Après purification, MaLuc native a été clonée sans le signal peptide de 17 acides aminés. MaLuc sans peptide signal est alors nommée GlowLucl et permet l'obtention d'une réaction de bioluminescence plus intense d'un facteur 2,5 (Figure 1). Cette augmentation d'intensité initiale maximale (Imax) a pour conséquence de réduire l'écart de performance avec la CNL. En effet, la CNL permet l'obtention d'un Imax 16 fois plus intense que la MaLuc alors qu'il n'y a plus qu'un facteur 2,6 entre la CNL et GlowLuc 1. [0063] De plus, l'enzyme sans son peptide signal (GlowLucl) est moins spécifique de la coe- lenterazine native (nCTZ) puisqu'elle accepte également la CTZ-h et dans une moindre mesure la ccelenterazine hh (ou 400a selon les fournisseurs) (Figure 2). En effet, il existe différents analogues de la coelenterazine native, qui se distinguent par de meilleures propriétés de stabilité, d'efficacité ou de couleur d'émission de la biolumi- 8 nescence. Ainsi, l'élargissement de la spécificité de l'enzyme pour son substrat est un point positif dans le cadre de l'emploi des enzymes dans les futures applications industrielles. [0064] Tous les mutants décrits par la suite sont construits à partir de GlowLucl. [0065] a. Mutagenèse dirigée [0066] Les mutants GlowLuc2, GlowLuc3 et GloxLuc4 ont été préparés et testés. [0067] Les résultats sont présentés aux Figures 3, 4 et 5. [0068] A la Figure 3, on constate tout d'abord que la CNL, qui présente une intensité inté- ressante, est également une enzyme possédant une cinétique plus rapide que les autres luciférascs par le fait que la quantité de photons émis décroit très rapidement pour atteindre 0 vers 2min30. Cc premier point et très intéressant dans leur cadre des potentielles applications industrielles. [0069] En complément de la Figure 3, et dans un souci de clarté, les intensités maximales des réactions catalysées par les différentes luciférascs ont été regroupées sous forme d'histogramme et représentées à la Figure 4. Ces intensités maximales ou Tmax sont pris au plus tôt de la réaction enregistrée par l'appareil, puisque dans tous les cas, les réactions sont tellement rapides que les cinétiques ne sont pas visualisables avant la constatation de la diminution continue de photons. [0070] Il apparait plus clairement une amélioration de l'intensité de GlowLuc 2 par rapport à la GlowLuc 1. De plus, cette même mutation permet à la luciférase de catalyser une réaction d'intensité similaire à la CNL. Ces résultats suggèrent que le potentiel des différents mutants GlowLuc est prometteur d'autant plus dans la perspective de conjuguer les effets des mutations. [0071] De plus, en analysant la Figure 5, nous constatons que malgré la production d'une grande quantité de photons au tout début de la réaction, la cinétique de la CNL, plutôt apparentée à une cinétique rapide (« flash »), produit moins de photons totaux au cours du temps que n'importe laquelle des luciférases GlowLuc. Cette dernière figure illustre bien le potentiel des mutants GlowLuc tant en termes d'intensité qu'en termes de cinétique réactionnelle pouvant être qualifiée de « lueur longue durée » Glow »). [0072] 3.2 - Amélioration de la durée de la bioluminescence [0073] Mutagénèse dirigée [0074] Les mutants GlowLucS, GlowLuc6 et GlowLuc7 ont été préparés et testés. [0075] La détermination de l'amélioration de la durée de la réaction de bioluminescence est mesurée par la détermination du temps de demi-réaction (t1p). Le t112 est défini comme suit : il s'agit du temps au bout duquel la moitié de l'intensité maximale de bioluminescence est atteint. Ce tue peut donc être déterminé graphiquement sur les cinétiques enzymatiques mesurées par un lurninomètre ou mathématiquement selon le modèle cinétique des enzymes. Dans le cas présent, les t112 ont été déterminés graphiquement. 9 [0076] Les résultats sont présentés à la Figure 6. On constate que la durée de la biolumi- nescence du mutant GlowLuc6 est inférieure à celle du mutant GlowLucl alors que celle du mutant GlowLuc5 est supérieure à celle du mutant GlowLucl. De manière très intéressante, GlowLuc7 permet une réaction de bioluminescence plus importante que n'importe laquelle des autres luciférases. [Revendication 1] [Revendication 2] [Revendication 3] [Revendication 4] [Revendication 5] [Revendication 6] [Revendication 7] REVENDICATIONSEnzyme luciférase MaLuc sans peptide signal de 17 acides aminés de séquence nucléotidiquc SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.5, SEQ ID NO.7, SEQ ID NO.9, SEQ ID NO.1 1 ou SEQ ID NO.13, ou une séquence présentant au moins 80 % d'homologie avec l'une dc ces séquences dans la mesure où la fonction dc l'enzyme n'est pas modifiée. Enzyme luciférase MaLuc sans peptide signal de 17 acides aminés de séquence protéique SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.4, SEQ ID NO.6, SEQ ID NO.8, SEQ ID NO.10, SEQ ID NO.12 ou SEQ ID NO.14, ou une séquence présentant au moins 80 % d'homologie avec l'une de ces séquences dans la mesure où la fonction de l'enzyme n'est pas modifiée. Microorganisme comprenant une cassette d'expression comprenant au moins une séquence codante pour une enzyme luciférase telle que définie à la revendication 2. Utilisation d'une enzyme luciférase telle que définie à la revendication 2 en tant qu'ingrédient, colorant ou élément bioluminescent. Utilisation selon la revendication 4 pour signaler, éclairer, illuminer, augmenter la visibilité dans le noir, intensifier les couleurs ou décorer un objet ou un élément. Utilisation selon l'une des revendications 4 ou 5 dans le domaine de la cosmétique, de la signalétique, de la cosmétique, de la papeterie, du textile, des accessoires, de l'emballage, de l'agroalimentaire et de la recherche. Utilisation selon l'une des revendications 4 à 6 pour illuminer des infrastructures intérieures ou extérieures.