Brevet FR3095817A1 — publié le 20201113

Description Titre de l'invention : Bactérie génétiquement modifiée pour une production améliorée de lactate à partir de CO, DOMAINE DE L'INVENTION. [0001] L'invention a trait à une bactérie oxydant naturellement l'hydrogène et géné- tiquement modifiée pour produire du lactate à partir de CO2. L'invention a également trait à un procédé de production de lactate, ou d'acide lactique, à partir de CO, utilisant une telle bactérie génétiquement modifiée. ARRIERE PLAN DE L'INVENTION. [0002] L'acide lactique trouve des applications dans de nombreuses industries. Par exemple, l'acide lactique est utilisé comme précurseur de l'acide polylactique (PLA) qui est un polymère entièrement biodégradable, utilisé par exemple dans les emballages alimentaires. L'acide lactique peut également être utilisé comme additif, en tant qu'antioxydant, acidifiant ou exhausteur de goût par l'industrie agroalimentaire. En cosmétique, l'acide lactique est généralement utilisé comme bactériostatique ou comme agent de peeling. [0003] Actuellement, la production à l'échelle industrielle de l'acide lactique repose princi- palement sur la fermentation d'hydrate de carbone, et notamment de glucose, lactose, sucrose ou maltose. Si de nombreuses bactéries peuvent provoquer la transformation de ces sucres en acide lactique, seules les bactéries lactiques permettent de produire exclusivement de l'acide lactique, les autres bactéries produisant en général un mélange de plusieurs acides organiques. 100041 En outre, la production d'acide lactique à partir de sucres fermentescibles, tels que le glucose ou le lactose, pose la question de la concurrence entre l'alimentation et la production de produits de commodité comme l'acide lactique. 100051 En parallèle, les émissions de dioxyde de carbone (CO2) dans l'atmosphère ne cessent de croître. Des systèmes biologiques qui fixent le carbone par des processus métaboliques biochimiques naturels, telles que les algues, ont déjà été utilisés pour produire des molécules d'intérêt par réactions photosynthétiques. Cependant, les rendements de production restent insuffisants et limitent l'intérêt économique de ces systèmes. 100061 De même, des méthodes mettant en oeuvre des cellules bactériennes génétiquement modifiées ont été développées, pour transformer des sucres en molécules d'intérêt dans des systèmes de fermentation hétérotrophe. Angermayr et al., 2012 décrit la surexpression de la lactate déshydrogénase de Baeillus subtilis dans la cyanobactérie Synechoeystis. WO 2014/205146 et WO 2015/155790 décrivent des bactéries métha- 2 notrophcs dont la source d'énergie vient de leur substrat carboné. De tels systèmes présentent plusieurs inconvénients. En effet, les systèmes de fermentation hétérotrophe sont sensibles à la contamination, ce qui impactc considérablement les rendements de production. En outre, ces systèmes hétérotrophes ne résolvent pas les problèmes de concurrence avec l'alimentation, puisque des sucres fermentescibles restent nécessaires, ni d'impacts environnementaux négatifs. [0007] Il existe donc toujours un besoin en des procédés microbiologiques pour permettre la production de molécules, telles que l'acide lactique, en grandes quantités à partir de CO, comme seule source de carbone, afin de ne pas entrer en compétition avec l'alimentaire tout en réduisant les émissions de gaz à effet de serre. [0008] En travaillant sur cette problématique, les inventeurs ont découvert qu'il est possible de forcer des bactéries oxydant naturellement l'hydrogène, et capables de produire de la matière organique à partir de CO2, dans une voie de synthèse de lactate, au détriment éventuellement d'autres voies de synthèse. Notamment, les inventeurs ont découvert qu'il est possible de favoriser une voie de synthèse de lactate endogène, qui n'est pas ou peu exprimée naturellement dans la bactérie, en jouant sur l'expression du ou des gènes associés à cette voie de synthèse. Ainsi, les inventeurs ont découvert que les bactéries oxydant l'hydrogène peuvent être génétiquement modifiée de manière à sur-exprimer une lactate déshydrogénase endogène ou une hétérologue, et/ou de manière à réprimer l'expression de gènes intervenant dans une voie de synthèse de molécules venant en concurrence de la production de lactate, afin de produire du lactate à partir de CO2. Plus particulièrement, les inventeurs ont découvert que la bactérie Cupriavidus necator (également appelée Hydrogenornonas eutrophus, Alcaligenes eutropha, Ralstonia eutropha, ou Wautersia etttropha) peut être génétiquement modifiée de manière à surexprimer une lactate déshydrogénase endogène, en jouant sur le promoteur et/ou le nombre de copie du gène codant pour cette lactate déshydrogénase notamment, de manière à produire du lactate à partir de CO2. De manière alternative ou complémentaire, la production de lactate peut être améliorée en introduisant un ou plusieurs gènes exprimant une lactate déshydrogénase hétérologue et/ou en réprimant l'expression de gènes intervenant dans une voie de synthèse de molécules venant en concurrence de la production de lactate. [0009] Ces modifications bien qu'efficaces atteignent des limites lorsque l'on cherche à favoriser la production de lactate en prolongeant la culture dans le temps. Les inventeurs ont alors constaté après quelques heures de culture que les bactéries reconsommaient le lactate produit. Contrairement à ce qui est généralement attendu, les inventeurs ont constaté que la délétion des gènes codant pour les lactates ferricytochrome C reductases (11dD et 11dA) décrite dans la littérature comme permettant d'éviter la consommation de lactate notamment chez Escherichia cou i (Woo et al. 2014 3 ; Niu et al. 2014 ; Mazumbar et al. 2013 ; Wang et al. 2012 ; Chai et al. 2009) et chez Issatachenkia orientes (Suominen et al. 2012 ; Millet et al. 2012) ne permet pas de supprimer la re-consommation du lactate dans les bactéries oxydant naturellement l'hydrogène, et capables de produire de la matière organique à partir de CO2. Ils ont identifié dans ces bactéries les gènes (lutA, lutB et lutC) réunis en opéron codant pour les composants d'un complexe enzymatique utilisant le lactate dont l'inhibition permet de réduire de manière substantielle voire de supprimer totalement la re-consommation du lactate produit. BREVE DESCRIPTION DE L'INVENTION. [0010] L'invention a donc pour objet une bactérie oxydant naturellement l'hydrogène et gé- nétiquement modifiée pour produire du lactate à partir de COn, ladite bactérie étant génétiquement modifiée pour surexprimer au moins un gène codant pour une lactate déshydrogénase et pour inhiber l'expression d'un opéron appelé lut, ledit opéron comprenant des gènes lutA, lutB ou lutC codant pour les composants d'un complexe enzymatique utilisant le lactate. [0011] Selon l'invention, la bactérie peut être génétiquement modifiée pour surcxpri mer une lactate déshydrogénase endogène et/ou exogène. [0012] L'invention a également pour objet l'utilisation d'une bactérie selon l'invention pour la production de lactate à partir de CO2, préférentiellement pour la production exclusivement de L-lactate, ou pour la production exclusivement de D-lactate. [0013] L'invention porte également sur un procédé de production de lactate à partir de CO2, comprenant les étapes consistant à cultiver la bactérie avec du CO2 comme seule source de carbone, puis à récupérer le lactate. DESCRIPTION DES FIGURES [0014] La figure 1 [fig. 1] montre une bactérie oxydant naturellement l'hydrogène selon l'invention apte à produire du lactate à partir de CO2 et 1-12. [0015[ La figure 2 [fig.2] montre les différentes voies métaboliques présentes naturellement chez Cupriavidus necator, et notamment, la glycolyse et le cycle de Calvin. [0016[ La figure 3 [fig.3] montre les différentes modifications génétiques (surcxpression et/ ou inhibition de l'expression de gènes) qui peuvent être réalisées chez Cupriavidus necator pour favoriser la production de L-lactate à partir de CO2. [0017] La figure 4 [fig.4] montre les différentes modifications génétiques (surexpression et/ ou inhibition de l'expression de gènes) qui peuvent être réalisées chez Cupriavidus necator pour favoriser la production de D-lactate à partir de CO2. [0018] Les différentes abréviations utilisées dans la description et les figures 2, 3 et 4 sont donnés dans le Tableau 4. [0019] La figure 5 [fig.5] représente la production de lactate par la bactérie CN0002 à partir de fructose. [0020] La figure 6 [fig.6] représente la production de lactate par la bactérie oxydant natu- rellement l'hydrogène CN0002 et génétiquement modifiée pour produire du lactate à partir de CO2. [0021] La figure 7 [fig.7] représente la comparaison de la croissance cellulaire et de la consommation du lactate dans deux souches de Cupriavidus necator, CN0004 et CN0009, dont l'une comprend la délétion des gènes IldD et IldA (CN0009). [0022] La figure 8 [fig.8] représente la comparaison de la croissance cellulaire et de la consommation du lactate dans quatre souches de Cupriavidus nccator, avec ou sans délétion des opérons lutl et lut2. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION. [0023] L'invention a pour objet une bactérie oxydant naturellement l'hydrogène, géné- tiquement modifiée pour produire du lactate à partir de COn, ladite bactérie étant génétiquement modifiée pour surexpri mer au moins un gène codant pour une lactate déshydrogénase [0024] Dans le contexte de l'invention, une bactérie «oxydant naturellement l'hydrogène» désigne une bactérie capable, sans manipulation génétique préalable, d'utiliser l'hydrogène gazeux comme donneur d'électron et l'oxygène comme accepteur d'électron, et capable de fixer le dioxyde de carbone. Ces bactéries sont également appelées bactéries « knallgas Les bactéries oxydant naturellement l'hydrogène ont besoin de dioxyde de carbone comme source de carbone et d'hydrogène comme source d'énergie. [0025] Selon l'invention, la bactérie oxydant naturellement l'hydrogène est préféren- tiellement sélectionnée parmi Ralstonia sp, Cupriavidus sp., Hydrogenobacter sp., Rhodococcus sp., Hydrogenovibrio Rhodopseudornonas .sp., Rhodobacter sp., Aquifex sp., Corynebacterium sp., Nocardia sp., Rhodospirillum sp., Rhizobium sp., Thiocapsa sp., Pseudomonas sp., Hvdrogenomonas sp., Hydrogenobacter sp., Hydrogenophilus sp., Hydrogenautresmus sp., Helicobacter sp., Xanthobacter sp., Hydrogenophaga sp., Bradvrhizobium sp., Alcaligenes sp., Amvcolata sp.; Aquaspirillum sp., Arthrobacter sp., Azospirillum sp., Variovouax sp., Acidovouax sp., Bacillus sp., Calderobacterium sp., Derxia sp., Flavobacterium sp., Microcyclus sp., Mycobacterium sp., Paracoccus sp., Persephonella sp., Renobacter sp., Thermocrinis sp., Wautersia sp., et les cyanobactéries telles que Anabaena sp. [0026] Notamment, la bactérie est sélectionnée paimi Rhodococcus opacus,Rhodococcus jostii,Hydrogenovibrio marinus, Rhodopseudomonas capsulata, Rhodopseudomonas palustris, Rhodobacter sphaeroides,Aquifex pyrophilus,Aquifex aeolicus, Cupriavidus necator, Cupriavidus metallidurans, Conwebacterium autotrophicum, Nocardia autotrophica, Nocardia opaca, Rhodopseudomonas viridis, Rhodopseudomonas sul- foviridis, Rhodopseudomonas blastica, Rhodopseudomonas sphaero ides, Rhodopseudomonas acidophila, Rhodospirillutn rubrutn, Rhizobium japotzicum, Thiocapsa roseopersicina, Psetalonzonas facilis,Pseudomonasjlava,Pseuclomonas putida, Pseudotnotzas hydrogenovoua' Pseudomonas palleronii, Pseudonzonas pseudoflava, Pseudotnotzas saccharophila,Pseudotnonas thertnophila,Pseudonzonas hydrogenothermophila, Hydrogenomotzas pantotropha, Hydrogetzomonas eutropha, Hydrogenotnonas facilis, Hydrogenobacter thermophilus, Hydrogenobacter halophilus, Hydrogetzobacter hydrogenophilus, Hydrogetzophilus isleticus, Hydrogcnophilus thcrmolutcolus, Hydrogetzautrestnus marinus, Helicobacter pylori, Xamhobacter autotrophicus, Xanthobacter flavus, Hydrogenophaga Pava, Hydrogenophaga palleronii, Hydrogenophaga pseudollava, Bradyrhizobiutnjaponicum, Ralstonia eutropha, AIcaligenes etorophus, Alcaligenes facilis,Alcaligenes hydrogetzophilus,Alcciligetzes kaus,Alcaligetzes paradoxus,Alcaligenes ruhletii, Amycolata sp., Aquaspirillum autotrophicutn, Arthrobacter suai n 11/X, Azospirillutn lipoferum, Variovouax paradoxus, Acidovouax forais, Hydrogenobacillus schlegelii,Bacillus tusciae, Calderobacterium hydrogetzophilutn, Derxia gummosa, Flavobacterium autautresmophilum, Itificrocyclus aquaticus, Mycobacterium goudoniae, Paracoccus denitrificans, Persephonella marina, Persephotzella guaymasensis, Renobacter vacuolatum, Thermocritzis ruber, Wautersia sp., Anabaena oscillarioides, Anabaetza spiroides et Anabaena cylindrica. [0027] Les termes «bactérie recombinante» et «bactérie génétiquement modifiée» sont utilisés ici de manière interchangeable et désignent des bactéries qui ont été génétiquement modifiées pour exprimer ou pour surexprimer des séquences nucléotidiques endogènes, pour exprimer des séquences nucléotidiques hétérologues (exogènes), ou qui ont une altération de l'expression d'un gène endogène. Par «altération», on entend que l'expression du gène, ou niveau d'une molécule d'ARN ou molécules d'ARN équivalentes codant pour un ou plusieurs polypeptides ou sous-unités polypeptidiques, ou l'activité d'un ou plusieurs polypeptides ou sous-unités polypeptidiques est régulée, de sorte que l'expression, le niveau ou l'activité soit supérieur ou inférieur à celui observé en l'absence de cette modification. Il est entendu que les termes «bactérie recombinante» et «bactérie génétiquement modifiée» se réfèrent non seulement à la bactérie recombinante particulière, mais également à la descendance ou à la descendance potentielle d'une telle bactérie. Certaines modifications pouvant se produire dans les générations suivantes, du fait d'une mutation ou d'influences environnementales, cette progéniture peut ne pas être identique à la cellule mère, mais elle est encore comprise dans le cadre du terme tel qu'utilisé ici. [0028] Selon l'invention, on entend par « surexpression d'un gène » le fait que ledit gène est plus exprimé dans la bactérie considérée que dans une bactérie non génétiquement modifiée pour surexprimer ledit gène, conduisant à une production ou une production 6 plus importante de la protéine correspondante (et plus particulièrement de la lactate déshydrogénase) et notamment à une augmentation supérieure à 20%, plus préférentiellement 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%. Selon l'invention, une telle surcxpression s'entend de l'expression d'une lactate déshydrogénase endogène, qui n'est pas ou peu exprimée dans la bactérie non génétiquement modifiée, ou de l'expression d'une lactate déshydrogénase exogène. [0029] Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie est sélectionnée parmi les bactéries oxydant naturellement l'hydrogène possédant une lactate déshydrogénase endogène. [0030] Avantageusement, la bactérie est sélectionnée parmi Cupriatzidus sp., telle que Cu- pria vidus necauzr, Hydrogenobaczer sp., telle que Hydrogetzobamer dzermophdus, Rhodococcus sp., telle que Rhodococcusopacus, et Pseudomonas sp., telle que Pseudomonas hydrogetunhermophda. [0031] Les termes "endogène" ou "natif' désignent un gène qui est normalement ou natu- rellement présent dans le génome de la bactérie considérée. A l'inverse, les termes « exogène» ou « hétérologue » tels qu'utilisés ici en référence à un gène (séquence nucléotidique) désignent un gène qui n'est pas normalement ou naturellement présent dans le génome de la bactérie considérée. [0032] Dans le cas d'une bactérie possédant une lactate déshydrogénase endogène, il est possible de modifier génétiquement ladite bactérie, de manière à permettre une surexpression dudit gène. Notamment, il est possible de modifier la bactérie pour que au moins un gène codant pour une lactate déshydrogénase endogène soit sous le contrôle d'un promoteur permettant une telle surexpression. Un promoteur désigne la séquence à l'extrémité 5 'du gène structural considéré et qui dirige l'initiation de la transcription. D'une manière générale, selon l'invention, les promoteurs utilisables incluent des promoteurs constitutifs, à savoir des promoteurs qui sont actifs dans la plupart des états cellulaires et des conditions environnementales, ainsi que des promoteurs inductibles qui sont activés ou réprimés par des stimuli physiques ou chimiques exogènes, et qui induisent donc un niveau d'expression variable en fonction de la présence ou de l'absence de ces stimuli. De manière alternative ou complémentaire, il est possible de modifier génétiquement le promoteur endogène, par exemple pour lever de potentielles inhibitions de son induction. Il est également possible de surexprimer une lactate déshydrogénase endogène en multipliant le nombre de copies du gène dans le génome de la bactérie, par le biais de plasmides et/ou en introduisant des séquences nucléotidiques à d'autres loci sur le ou les chromosomes de la bactérie, etc. [0033] Dans un mode de réalisation, la bactérie selon l'invention est génétiquement modifiée pour surexprimer une lactate déshydrogénase endogène. Avantageusement, la bactérie est génétiquement modifiée pour surexprimer seulement la L-lactate déshy- 7 drogénasc endogène ou seulement la D-lactate déshydrogénase endogène. [0034] Les tableaux 1 et 2 ci-dessous répertorient, à titre d'exemples, des séquences codant pour des L-lactate déshydrogénase (Tableau 1 : Exemples de L-lactate déshydrogénase (EC 1.1.1.27)) et des D-lactate déshydrogénase (Tableau 2 : Exemples de D-lactate déshydrogénase (EC 1.1.1.28)) de différentes bactéries, ainsi que les séquences protéiques correspondantes. Selon l'invention, ces séquences peuvent être la cible de modifications génétiques, y compris de multiplication, pour conduire à une bactérie génétiquement modifiée apte à produire du lactate à partir de CO2.- un polyhydrogénosiloxane II de formule X(R)2Si0-((R),Si0),'-(RXSi0)11-Si(R)2X avec R tel que défini ci-dessus et X correspondant à H ou R, [0035] [Tableaux 1] Microorganisme Gène GenBank Séquence protéique Cupriavidus necator H16 Ldh CAJ91814.1 SEQ ID N°1 Pediococcus acidilactici ldhA 1082254718 SEQ ID N°2 Sfreptococcus equinus (Streplococcus ho vis) Ldh KEN85486.1 SEQ ID N°3 Bacillus coagulans Ldh AGU00860.1 SEQ ID N°4 Lactobacillus casei Ldh CAQ65818.1 SEQ ID N'5 Lactobacillus helveticus Ldh ABX26516.1 SEQ ID N°6 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Ldh KRN37463.1 SEQ ID N°7 Lactobacillus plantarum Ldh EFK28653.1 SEQ ID N°8 Lactobacillus pentosus Ldh EIW14906.1 SEQ ID N°9 Lactococcus lactis subsp. lactis Ldh BAL51029.1 SEQ ID N°10 [0036] [Tableaux2] Microorganisme Gène GenBank Séquence protéique Cupriavidus necator H16 ldhA1 CAJ92810.1 SEQ ID N°11 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ldhA CAI96942.1 SEQ ID N°12 Escherichia colt str. K-12 substr. MG1655 ldhA 16129341 SEQ ID N°13 Bacillus coagtdans ldhA ADV02473.1 SEQ ID N°14 8 [0037] Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie est une bactérie Cupriavidus necator, génétiquement modifiée au niveau du promoteur associé au(x) gène(s) codant pour la L-lactate déshydrogénase endogène et/ou la D-lactate déshydrogénase endogène, afin de favoriser l'expression de l'un et/ou de l'autre gène. En effet, les inventeurs ont découvert que Cupriavidus necator possède des gènes codant une L-lactate déshydrogénase (ldh) et une D-lactate déshydrogénase (ldhA 1) endogènes, dont l'expression dépend des conditions de culture et qui est généralement quasiment nulle en limitation de nutriments. Selon l'invention, cette bactérie peut avantageusement être génétiquement modifiée au niveau de la séquence nucléotidique codant pour ledit promoteur, afin de lever cette régulation négative et permettre l'expression des gènes correspondants, même en limitation de nutriments. Il est notamment possible de modifier Cupriavidus necator de manière à associer la ou les séquences codant pour la L-lactate déshydrogénase et/ou la D-lactate déshydrogénase endogènes à un promoteur constitutif ou à un promoteur inductible. [0038] Dans un mode de réalisation, les gènes codant pour la L-lactate déshydrogénase et/ou à la D-lactate déshydrogénase endogènes sont modifiés de manière à être sous contrôle d'un promoteur recombinant constitutif (non soumis à une régulation négative) ou inductible en présence d'une molécule particulière. A titre d'exemple, il est possible d'utiliser des promoteurs constitutifs tels que pLac, pTAC, pJ5 (Gruber et al., 2014), un promoteur inductible tel que le promoteur pBAD, inductible à l'arabinosc (Grousseau et al., 2014), le promoteur pPHAP inductible en limitation phosphate (Barnard et al. 2015), le promoteur pCBBL inductible en conditions autotrophes (Lutte et al., 2012) ou le promoteur pKRrha inductible au rhamnose (Sydow et al., 2017). [0039] Dans un mode (le réalisation particulier, la bactérie selon l'invention est géné- tiquement modifiée pour surexprimer un gène codant pour l'expression d'une protéine présentant au moins 50% d'homologie avec SEQ ID N°1 (séquence de la L-lactate déshydrogénase de Cupriavidus necator H16), préférentiellement au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%. Dans un autre mode de réalisation, la bactérie selon l'invention est génétiquement modifiée pour surexprimer un gène codant pour l'expression d'une protéine présentant au moins 50% d'homologie avec SEQ ID N°11 (séquence d'une D-lactate déshydrogénase de Cupriavidus necator H16), préférentiellement au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%. [0040] De manière alternative ou cumulative, la bactérie peut être génétiquement modifiée pour surexpiimer au moins un gène codant pour une lactate déshydrogénase exogène, ou hétérologue. [0041] Selon l'invention, le génome de la bactérie est alors modifié de manière à intégrer une séquence nucléique codant pour une telle lactate déshydrogénase exogène. Ladite séquence nucléique peut avoir été introduite dans le génome de la bactérie ou d'un de 9 ses ascendants, par le biais de toute méthode de clonage moléculaire adaptée. Dans le contexte de l'invention, le génome de la bactérie s'entend de l'ensemble du matériel génétique contenu dans ladite bactérie, y compris le matériel génétique extrachromosomique contenu par exemple dans des plasmides, épisomes, chromosomes synthétiques, etc. La séquence nucléique introduite peut être une séquence hétérologue, c'est-à-dire qui n'existe pas à l'état naturel dans ladite bactérie, ou une séquence homologue. Avantageusement, on introduit dans le génome de la bactérie une unité transcriptionnelle comportant la séquence nucléique d'intérêt, placée sous le contrôle d'un ou plusieurs promoteur(s) et d'un ou plusieurs sites de liaison au ribosome. Une telle unité transcriptionnelle comprend également, avantageusement, les séquences usuelles telles que des terminateurs transcriptionnels, et le cas échéant d'autres éléments de régulation de la transcription. [0042] Un gène codant pour une lactate déshydrogénase exogène peut par exemple être dérivé d'une bactérie, d'un champignon, d'une levure ou d'un mammifère. Préférentiellement, un tel gène est dérivé d'une bactérie et notamment de E. cou, Bacillus coagulons, Pediococcus acidilactici'Streplococcus bovis (Streptococcus equinus), d'une bactérie lactique, et notamment de Loctobacillus cruel, Lactobacillus helvelicus, Laclobacillus bulgoricus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus plan/arum ou Laclobacillus pentosus, Loclococcus lactis subsp. lactis. Les gènes listés dans les tableaux 1 et 2 peuvent également être utilisés pour modifier génétiquement une bactérie selon l'invention. [0043] Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de la lactate déshydrogénase hé- térologue utilisée pour modifier génétiquement la bactérie selon l'invention présente au moins 50% d'homologie avec la séquence de la L-lactate déshydrogénase de Pediococcus acidilactici (SEQ ID N°2), préférentiellement au moins 60%, 70%, 75%, 80, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%. [0044] Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de la lactate déshydrogénase hé- térologue utilisée pour modifier génétiquement la bactérie selon l'invention présente au moins 50% d'homologie avec la séquence de la L-lactate déshydrogénase de Streptococcus equintts (Streptococcus bovis) (SEQ ID N°3), préférentiellement au moins 60%, 70%, 75%, 80, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%. [0045] Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de la lactate déshydrogénase hé- térologue utilisée pour modifier génétiquement la bactérie selon l'invention présente au moins 50% d'homologie avec la séquence de la L-lactate déshydrogénase de Bacillus coagulons (SEQ ID N°4), préférentiellement au moins 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%. [0046] Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de la lactate déshydrogénase hé- térologue utilisée pour modifier génétiquement la bactérie selon l'invention présente au moins 50% d'homologie avec la séquence de la L-lactatc déshydrogénase de Lactoburinas casei (SEQ ID N°5), préférentiellement au moins 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%. [0047] Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de la lactate déshydrogénase hé- térologue utilisée pour modifier génétiquement la bactérie selon l'invention présente au moins 50% d'homologie avec la séquence de la D-lactate déshydrogénase de Lactoburinas delbrueckii subsp. bulgaricus (SEQ ID N°12), préférentiellement au moins 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%. [0048] Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de la lactate déshydrogénase hé- térologue utilisée pour modifier génétiquement la bactérie selon l'invention présente au moins 50% d'homologie avec la séquence de la D-lactate déshydrogénase de Escherichia cou i (SEQ ID N°13), préférentiellement au moins 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%. [0049] Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de la lactate déshydrogénase hé- térologue utilisée pour modifier génétiquement la bactérie selon l'invention présente au moins 50% d'homologie avec la séquence de la D-lactate déshydrogénase &teillas coagulons (SEQ ID N°14), préférentiellement au moins 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%. [0050] Dans un mode de réalisation, la bactérie est génétiquement modifiée pour sur- exprimer au moins un gène codant pour une L-lactatc déshydrogénase (endogène ou hétérologue), de manière à pouvoir produire du L-lactate. Dans le cas d'une bactérie possédant un gène codant pour une D-lactate déshydrogénase endogène, l'expression dudit gène est avantageusement au moins partiellement inhibée, de manière à favoriser la production de L-lactate seulement. [0051] De manière alternative, la bactérie peut être génétiquement modifiée pour sur- exprimer au moins un gène codant pour une D-lactate déshydrogénase (endogène ou hétérologue) de manière à pouvoir produire du D-lactate. Dans le cas d'une bactérie possédant un gène codant pour une L-lactate déshydrogénase endogène, l'expression dudit gène est avantageusement au moins partiellement inhibée, de manière à favoriser la production de D-lactate seulement. [0052] Selon l'invention, on entend par « inhibition de l'expression d'un gène » le fait que ledit gène n'est plus exprimé dans la bactérie considérée ou que son expression est réduite, comparativement à la bactérie sauvage (non génétiquement modifiée pour inhiber l'expression du gène), conduisant à l'absence de production de la protéine correspondante ou à une baisse significative de sa production, et notamment à une baisse supérieure à 20%, plus préférentiellement 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%. Dans un mode de réalisation, l'inhibition peut être totale, c'est-à-dire que la protéine codée par ledit gène n'est plus du tout produite. L'inhibition de l'expression d'un gène 11 peut notamment être obtenue par délétion, mutation, insertion et/ou substitution d'un ou plusieurs nucléotides dans le gène considéré. Préférentiellement, l'inhibition de l'expression du gène est obtenue par délétion totale de la séquence nucléotidique. Selon l'invention, toute méthode d'inhibition d'un gène, connue en soi par l'homme de l'art et applicable à une bactérie peut être utilisée. Par exemple, l'inhibition de l'expression d'un gène peut être obtenue par recombinaison homologue (Datscnko et al., 2000; Lodish et al., 2000) ; mutagenèse aléatoire ou dirigée pour modifier l'expression d'un gène et/ou l'activité de la protéine encodée (Thomas et al., 1987) ; modification d'une séquence promotrice du gène pour altérer son expression (Kaufmann et al., 2011) ; ciblagc induit des lésions locales dans les génomes (TILLING) ; conjugaison, etc. Une autre approche particulière est l'inactivation génique par insertion d'une séquence étrangère, par exemple par mutagenèse de transposon en utilisant des éléments génétiques mobiles, d'origine naturelle ou artificielle ou par exemple par insertion d'une cassette antibiotique. Selon un autre mode de réalisation préféré, l'inhibition de l'expression du gène est obtenue par des techniques knock-out. L'inhibition de l'expression du gène peut également être obtenue par extinction du gène en utilisant des ARN interférents, ribozymes ou antiscns (Dancholt, 2006. Nobel Prizc in Physiology or Medicine). Dans le contexte de la présente invention, le terme "ARN interférent" ou "ARNi" désigne toute molécule d'ARNi (par exemple ARN monocaténaire ou ARN bicatenaire) qui peut bloquer l'expression d'un gène cible et/ou faciliter la dégradation de l'ARNm correspondants. L'inhibition du gène peut également être obtenue par des méthodes d'édition génomique qui permettent de directement apporter des modifications génétiques à un génome donné, via l'utilisation de nucléases à doigts de zinc (Kim et aL, 1996), de nucléases effectrices de type activateur de transcription, dites « TALEN » (Ousterout et al. 2016), d'un système combinant des nucléases de type Cas9 avec des courtes répétitions palindromiques groupées et régulièrement espacées dites `CRISPR' (Mali et aL, 2013), ou encore de méganucléases (Daboussi et al., 2012). L'inhibition de l'expression du gène peut également être obtenue par inactivation de la protéine codée par ledit gène. L'inhibition de l'expression du gène peut également être obtenue par délétion, mutation, insertion et/ou substitution d'un ou plusieurs nucléotides dans le promoteur en amont du gène considéré. L'inhibition de l'expression du gène peut également être obtenue par délétion, mutation, insertion et/ou substitution d'un ou plusieurs nucléotides dans le site de liaison au ribosome en amont du gène considéré. [0053] En travaillant sur les modifications à apporter à une bactérie oxydant naturellement l'hydrogène génétiquement modifiée pour lui permettre de produire du lactate à partir de CO2, les inventeurs ont mis en évidence dans ces bactéries des gènes (lutA, lutB ou lutC) codant pour les composants d'un complexe enzymatique utilisant le lactate dont 12 l'inhibition permet de réduire de manière substantielle voire de supprimer totalement la re-consommation du lactate produit. Ces gènes sont réunis sur un opéron appelé lut. [0054] L'opéron lut jusqu'alors inconnu chez les bactéries oxydant naturellement l'hydrogène réunit des gènes qui ont moins de 50% d'identité avec les gènes de l'opéron lut de B. subtilis (Chai et al., 2009) connu pour permettre la croissance de cette bactérie sur le L-lactate comme source de carbone. Pour Cupriavidus neewor, les gènes réunis dans l'opéron lut ont moins de 44% d'identité avec ceux de B. subtilis. Pour Rhodococcusopacus les gènes réunis dans l'opéron lut ont moins de 40% d'identité avec ceux de B. subtilis. Pour Rhodococcusjosta les gènes réunis dans l'opéron lut ont moins de 40% d'identité avec ceux de B. subtilis. Pour Helicobacter pylori, les gènes réunis dans l'opéron lut ont moins de 37% d'identité avec ceux de B. subtilis. Pour Baeillus fascine, les gènes réunis dans l'opéron lut ont moins de 55% d'identité avec ceux de B. subtilis. Pour Pseuclonzonas plaida, les gènes réunis dans l'opéron lut ont moins de 43% d'identité avec ceux de B. subtilis. Pour Caprinvidas tnetalliduratzs, les gènes réunis dans l'opéron lut ont moins de 42% d'identité avec ceux de B. subtilis. Pour Paracoccus Jetait-dirons, les gènes réunis dans l'opéron lut ont moins de 42% d'identité avec ceux de B. subtilis. [0055] Le Tableau 3 ci-après identifie les gènes codant pour des protéines utilisant le lactate réunis dans plusieurs bactéries oxydant naturellement l'hydrogène. [0056] 13 [Tableaux3] Microorganisme Gène GenBank Séquence protéique Cupriavidus necator H16 lutA WP 011615044.1 SEQ ID N°15 Cupriavidus necator 1116 lutB WP 011615043.1 SEQ ID N'16 Cupriavidus necator H16 lutC WP 011615045.1 SEQ ID N°17 Cupriavidus tzecator H16 lutA WP 011616347.1 SEQ ID N°18 Cupriavidus necator H16 lutB WP 010814062.1 SEQ ID N°19 Cupriavidus necator H16 lutC WP 010814659.1 SEQ ID N°20 Rhodococcus opacus lutA ANS31563.1 SEQ ID N°21 Rhodococcus opacus lutB WP 105418126.1 SEQ ID N'22 Rhodococcus opacus lutC RKM74017.1 SEQ ID N°23 Rhodococcus jostii lutA WP 073359632.1 SEQ ID N'24 Rhodococcus fusai lutB WP 073359631.1 SEQ ID N°25 Rhodococcus.jostii lutC WP 073359630.1 SEQ ID N°26 Helicobacter pylori lutA WP 000867265.1 SEQ ID N°27 Helicobacter pylori lutB WP_033777014.1 SEQ ID N°28 Helicobacter pylori lutC WP 096411967.1 SEQ ID N°29 Bacillus tusciae lutA WP_013076354.1 SEQ ID N°30 Bacillus tusciae lutB WP 013076353.1 SEQ ID N'3 1 Bacillus tusciae lutC WP 013076352.1 SEQ ID N'32 Pseudomonas putida lutA WP 110966271.1 SEQ ID N'33 Pseudomonas pl da lutB WP 077182418.1 SEQ ID N°34 Pseudomonas plaida lutC WP 077182417.1 SEQ ID N°35 Cupriavidus metallidurans lutA WP 029308115.1 SEQ ID N°36 Cupriavidus metallidurans lutB WP_011518104. SEQ ID N°37 Cupriavidus metallidurans lutC WP_035836231.1 SEQ ID N°38 Paracoccus denanficans lutA WP 011749200.1 SEQ ID N'39 Paracoccus clenarificans lutB WP 011749199.1 SEQ ID N'40 Paracoccus denitrificans lutC WP 011749198.1 SEQ ID N°41 [0057] L'homme du métier saura identifier les gènes codant pour des protéines utilisant le 14 lactate réunis dans des opérons lut dans d'autres espèces de bactéries oxydant naturellement l'hydrogène à partir des informations contenues dans la présente demande. [0058] Dans la bactérie oxydant naturellement l'hydrogène et génétiquement modifiée pour produire du lactate à partir de CO, selon l'invention, inhiber l'expression de l'opéron lut comprend l'inhibition de l'expression d'au moins l'un des gènes lutA, lutB ou lutC, de préférence d'au moins deux gènes parmi les trois, plus préférentiellement l'inhibition de l'expression des trois gènes lutA, lutB et lutC. [0059] De manière préférée, l'inhibition de l'expression d'un gène de l'opéron lut consiste en la délétion partielle ou totale de la séquence codant pour le dit gène. L'inhibition de l'expression de l'opéron lut consiste de préférence en une délétion dudit opéron lut. [0060] Dans certaines bactéries oxydant naturellement l'hydrogène comme Cupriavidus necator on trouve plusieurs opérons lut. Dans Cupriavidus necator, le premier opéron lut réunissant les gènes SEQ ID N°15, SEQ ID N°16 et SEQ ID N°17, est nommé lutl . Dans Cupriavidus necator, le deuxième opéron lut réunissant les gènes SEQ ID N°18, SEQ ID N°19 et SEQ ID N°20, est nommé lut2. Selon un premier mode de réalisation de l'invention, dans les bactéries qui contiennent deux opérons lut ou plus, au moins l'un des gènes lutA, lutB ou lutC de l'un des opérons lut est inhibé. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, au moins l'un des gènes lutA, lutB ou lutC d'au moins deux des opérons lut est inhibée. Avantageusement, l'expression d'au moins l'un des gènes lutA, lutB ou lutC de chacun des opérons lut est inhibée. [0061] Selon un autre mode de réalisation de l'invention, l'expression d'au moins l'un des opérons lut est inhibé Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'expression d'au moins deux des opérons lut est inhibée. Avantageusement l'expression de chacun des opérons lut est inhibée C'est en particulier le cas pour Cupriavidus necator qui comprend deux opérons lutl et lut2 et où de préférence l'expression des deux opérons lutl et lut2 est inhibée. [0062] En plus des modifications décrites plus haut, en travaillant sur les modifications gé- nétiques à apporter à une bactérie oxydant naturellement l'hydrogène pour lui permettre de produire du lactate à partir de CO2, les inventeurs ont mis en évidence que, dans certaines bactéries, il est possible d'inhiber au moins partiellement une voie de dégradation du pyruvate compétitrice de la voie de synthèse du lactate, de manière à favoriser la production de lactate à partir dudit pyruvate. [0063] En effet, certaines bactéries oxydant naturellement l'hydrogène et susceptible d'être modifiées génétiquement selon l'invention, présentent une voie de synthèse du Polyhydroxybutyrate (PHB) à partir du pyruvate. C'est le cas notamment de Cupriavidus necator (figure 2). Une telle voie de biosynthèse peut entrer en compétition avec la voie de synthèse du lactate, en forçant la consommation du pyruvate dans cette voie. Aussi, dans un mode de réalisation, une telle bactérie est génétiquement modifiée pour inhiber au moins partiellement la voie de synthèse du PHB (figure 3). Plus particulièrement, il est possible d'inhiber au moins partiellement l'expression d'au moins un gène choisi parmi les gènes codant pour l'Acétyl-CoA acetyltransférase (EC : 2.3.1.9), r Acctoacétyl-CoA réductase (EC : 1.1.1.36) et la poly(3-hydroxybutyrate) synthasc (EC : 2.3.1.-), préférentiellement l'expression d'au moins deux desdits gènes, plus préférentiellement l'expression desdits trois gènes. [0064] Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie génétiquement modifiée est Cu- priavidus necator, dans laquelle l'expression d'au moins un et préférentiellement des trois gènes parmi les gènes codant pour une phaA (GenBank: CAJ91322.1), une phaB (GenBank: CAJ92574.1) et une phaC (GenBank: CAJ92572.1) est inhibée (figure 2). Les inventeurs ont découvert qu'une telle bactérie également génétiquement modifiée pour surexprimer une lactate déshydrogénase est capable de produire des quantités importantes de lactate en présence de CO, comme seule source de carbone, le pyruvate produit n'étant pas ou peu consommé par la voie de production du PHB. [0065] De manière alternative ou complémentaire, il est possible de modifier génétiquement la bactérie de manière à inhiber au moins partiellement l'expression d'un gène codant pour une phosphoenolpyruvate synthasc (EC : 2.7.9.2), qui convertit le pyruvate en phosphocnol pyruvate (PEP), et/ou une pyruvate carboxylase (EC : 6.4.1.1) et/ou un complexe pyruvate dehydrogenase (EC : 1.2.4.1) et/ou une fumaratc reductase (EC : 1.3.5.4). [0066] Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie génétiquement modifiée est Cu- priavidus necator, dans laquelle l'expression d'au moins un gène parmi les gènes codant pour une ppsa (GenBank: CAJ93138.1), une pyc (GenBank: CAJ92391.1), une pdhA (GenBank: CAJ92510.1) et une sdhABCD (GenBank: CAJ93711.1, CAJ93712.1, CAJ93713.1, CAJ93714.1) est inhibée (figure 2). Les inventeurs ont découvert qu'une telle bactérie également génétiquement modifiée pour surexprimer une lactate déshydrogénase est capable de produire des quantités importantes de lactate en présence de CO2 comme seule source de carbone, le pyruvate produit n'étant pas ou peu consommé par ces voies compétitrices. [0067] De manière alternative ou complémentaire, il est possible de modifier génétiquement la bactérie de manière à inhiber au moins partiellement la voie de conversion de l'Acetyl-CoA en acétate et/ou en Acétaldéhyde. Pour cela, il est possible d'inhiber au moins partiellement l'expression d'au moins un gène choisi parmi les gènes codant pour une acetyl-CoA hydrolase (EC: 3.1.2.1), une phosphate acétyltransférase (EC: 2.3.1.8), une Acétate kinase (EC : 2.7.2.1), une propionate CoA-transferase (EC: 2.8.3.1), une succinyl-CoA: acetate CoA-transferase (EC :2.8.3.18) et une Acétaldéhyde déhydrogénase (EC: 1.2.1.10). [0068] Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie génétiquement modifiée est Cu- 16 priavidus necator, dans laquelle l'expression d'au moins un gène parmi les gènes codant pour une Acetyl-CoA hydrolasc (GenBank: CAJ96157.1), une Phosphate acétyltransférasc (ptal, pta2) (GenBank: CA196416.1, GenBank: CA196653.1), une Acétate kinase (ackA, ackA2) (GenBank: CA191818.1, GenBank: CA196415.1), une Propionate CoA-transferase (GenBank: CA193797.1), une Succinyl-CoA :acetate CoA-transferase (GenBank: CA192496.1) et une Acétaldéhyde déhydrogénase (mhpf) (GenBank: CAJ92911.1) est inhibée (figure 2). Les inventeurs ont découvert qu'une telle bactérie également génétiquement modifiée pour surexprirner une lactate déshydrogénase et inhiber l'expression d'au moins un gène de l'opéron lut est capable de produire des quantités importantes de lactate en présence de CO, comme seule source de carbone, le pyruvatc produit n'étant pas ou peu consommé par ces voies compétitrices. [0069] Dans certains cas, les bactéries oxydant naturellement l'hydrogène possèdent un ou des gènes codant pour une Lactate ferricytochrorne C reductasc. C'est le cas notamment de Cupriavalus necator qui possèdent trois gènes IldD (EC : 1.1.2.3, GenBank: CA195257.1), IldA (EC : 1.1.2.3, GenBank: CA196599.1), dld (EC :1.1.2.4, GenBank: CA194166.1) codant pour une telle Lactate ferricytochrorne C reductasc. Une telle enzyme est également susceptible de diminuer le taux de lactate produit, en convertissant ledit lactate en pyruvatc. Aussi, selon l'invention, dans le cas où la bactérie possède une telle Lactate ferricytochrorne C reductase endogène, le gène codant pour ladite enzyme est avantageusement au moins partiellement inhibé. [0070] L'invention propose avantageusement d'utiliser une bactérie génétiquement modifiée selon l'invention pour produire du lactate à partir de Ca. Avantageusement, une bactérie génétiquement modifiée pour sin-exprimer une L-lactate déshydrogénase, et le cas échéant inhiber une D-lactate déshydrogénase est utilisée pour produire exclusivement (lu L-lactate. De manière similaire, une bactérie génétiquement modifiée pour surexprimer une D-lactate déshydrogénase, et le cas échéant inhiber une L-lactate déshydrogénase est utilisée pour produire exclusivement du D-lactate. [0071] L'invention propose plus particulièrement un procédé de production de lactate à partir de CO2, selon lequel on cultive, par exemple en batch, fed-batch ou en culture continue, une bactérie génétiquement modifiée selon l'invention en présence de CO2 et on récupère le lactate produit. [0072] Dans un mode de mise en oeuvre du procédé, une solution de base est ajoutée pendant la fermentation pour contrôler le pH. L'acide lactique se trouve alors dans le milieu de fermentation sous forme de sel (lactate de sodium, lactate de potassium, lactate de calcium ou lactate d'ammonium, seuls ou en mélange, en fonction de la base choisie pour réguler le pH du milieu de fermentation). [0073] Le bouillon de fermentation contenant les bactéries, les impuretés du milieu de fer- 17 mentation (protéines non consommées et sels inorganiques de natures diverses) et le sel de lactate, est alors traité afin de les séparer. Une telle étape de séparation peut notamment être mise en oeuvre en utilisant un séparateur de cellules tel qu'une centrifugeuse, un dispositif de microfiltration ou d'ultrafiltration. Après séparation, on obtient d'une part une biomasse cellulaire concentrée et d'autre part une solution de sel de lactate. [0074] Il est ensuite possible de procéder à une étape de conversion des sels de lactate en acide lactique sous forme libre. Cette étape de récupération de l'acide lactique à partir du milieu de fermentation peut notamment être réalisée via l'extraction de l'acide lactique en tant que tel du milieu de fermentation, ou par acidification du milieu à l'acide sulfurique. [0075] Une étape de purification par extraction, estérification, distillation ou hydrolyse peut ensuite être réalisée, afin d'obtenir un acide lactique à haut degré de pureté. [0076] Selon l'invention, la source de CO2peut être du CO2 pur ou du CO2 issu d'émissions des usines ayant des procédés industriels tels que les raffineries de pétrole, les cimenteries, les productions d'ammoniaque, les productions de méthanol, etc. Le CO2 peut également être un produit de fermentation, un gaz enrichi en CO2, un gaz CO2 au moins partiellement purifié, une solution de carbonate ou de bicarbonate, et / ou l'acide formique. La teneur du gaz total en CO2 peut être de 10% à 100%. Un tel gaz contenant du CO2 peut être injecté directement ou via une étape intermédiaire de capture ou purification du CO2. La purification du CO2 peut être réalisée par traitement chimique, par exemple en présence d'amines, ou par traitement enzymatique mettant par exemple en oeuvre une anhydrase carbonique. [0077] Selon l'invention, la source l'hydrogène peut être un produit du vaporeformage du méthane, de l'électrolyse de l'eau ou être un co-produit (hydrogène « fatal ») des procédés industriels tels que le procédé chlore-alcali lors de la préparation du dichlore ou l'incinération des déchets. [0078] Selon l'invention, il est possible de prévoir éventuellement une étape de croissance de la bactérie en amont, en présence notamment de sucres fermentescibles, tels que du glucose du fructose ou du glycérol. 11 est également possible de cultiver la bactérie en présence de CO2 et d'une autre source de carbone lors de l'étape de production de lactate. EXEMPLES. [0079] Exemple 1 - souche productrice de lactate EN0001 [0080] Souche et constructions génétiques. Pour la production de lactate, une souche Cu- priavidus necator H16 PHB-4 (DSM n°541) est utilisée Cette souche ne forme pas de poly-P-hydroxy-butyrate (PHB). La construction de la souche productrice de lactate CN0001 est réalisée selon le protocole suivant : 18 [0081] Un plasmide portant la L-lactate déhydrogénase de Cupriavidus necator (ldh, EC:1.1.1.27) sous promoteur inductiblc à l'arabinose est cloné en une étape in vitro via le protocole d'assemblage In-Fusion® (Clontech). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Gcnomics. [0082] Le gène ldh est amplifié par PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus neeator H16 PHB-4 à l'aide des oligonucléotides 1(5' GGATCCAAAC TCGAGTAAGG ATCTCC 3') et 2(5' ATGTATATCT CCTTCTTAAA AGATCTTTTG AATTCC 3') et de l'enzyme Phusion High-Fidelity PCRMaster Mix with CC Buffer (New England Biolabs, Evry, France). Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR cican-up (Macherey-Nagel). [0083] Le plasmide squelette p:1M3 (Müller et al., 2013) dérivé du plasmide pBBR1-MCS2 (Kovach et al, 1995), contenant un promoteur pBAD de Escherichia colt, est amplifié à l'aide des oligonucléotides 3 (5' GAAGGAGATA TACATATGAA GATCTCCCTC ACCAGCG 3') et 4(5' CTCGAGTTTG GATCCTCAGG CCGTGGGGAC GGC 3') et de l'enzyme Phusion High-Fidclity PCRMaster Mix (New England Biolabs, Evry, France).Le produit de PCR est digéré par l'enzyme Dpni (New England Biolabs, Evry, France) : lpl de DpnI est ajouté à 50pL de produit PCR, puis incubé 15-60min à 37°C, l'enzyme est ensuite inactivée 10min à 80°C. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel). [0084] Un assemblage in vitro par In-fusion est réalisé avec les deux fragments afin d'obtenir le plasmide pJM3-ldh. 5p1 du produit d'assemblage sont transformés dans des cellules Escherichia coli Stellar (Clontech) chimio-compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5g/L, NaC15g/L, Sigma-Aldrich, agar 20g/L) contenant 25pg/mL de kanamycine. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm). Après extraction des plasmides à l'aide du kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel), l'insertion correcte du gène ldh est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 5 (5' GACGCTTTTT ATCGCAACTC TCTACTG 3') et 6 (5' CGAACGCCCT AGGTATAAAC GCAG 3'). [0085] Le plasmide pBBAD-ldh est inséré dans la souche Cupriavidus necator H16 PHB-4 par électroporation (protocole adapté de Taghavi et al., 1994). Des cellules Cupriavidus necator sont mises en culture en milieu TSB contenant 27.5 g/L de bouillon de soja tryptique (TSB, Becton Dickinson Sparks, Maryland, USA, 3m1 dans des tubes 10m1) et incubées une nuit à 30°C sous agitation vigoureuse. Le lendemain, 1ml de la culture est transféré dans un erlenmeyer de 250mL contenant 25mL de milieu TSB et incubé à 30°C, 200 rpm jusqu'à atteindre une D0600',, de 0,5-0,6. Les cellules sont alors récoltées et lavées deux fois avec 25mL de tampon de lavage froid (10%glycerol, 19 90% eau [vol/vol]). Les cellules rendues par ce procédé électro-compétentes sont ensuite concentrées dans la solution de lavage afin d'obtenir une D0610 de 50 et aliquotées par 150 L. [0086] Un aliquot de cellules compétentes est transformée avec 2-5 !IL d'ADN plasmidique (100-15Ong/p1). Le mélange ADN/cellules contenu dans un tube 1.5 mL est agité par de légers tapotements (4-5 fois). Le mélange est placé 5 min sur la glace et transféré dans une cuvette d'électroporation froide (0.2 cm, 10573463. Fisher scicntific, Illkirch). L'électroporation est réalisée avec les réglages suivants : voltage 2.5 kV, capacité 25 pF, résistance externe 200 Q. Immédiatement après l'électroporation les cellules sont mélangées avec lmL de milieu SOC (tryptone 2 %, extrait de levure 0,5 %, NaC1 10 mM, KC1 2,5 mM, MgC12 10 mM, MgSO4 10 mM et glucose 20 mM), incubées 2h à 30°C puis étalées sur des boites de pétri maintenue à 30°C contenant du milieu TSB/Agar (20g/L) additionné de 10 pg/mL de gentamycine et 200 pg/mL de kanamycine). [0087] La souche Cupriavidus necator H16 PHB-4 pIN13-1dh est récupérée et nommée CN0001. Les modifications génétiques sont validées par séquençage. [0088] Milieux Pour les préculturcs, le milieu minimum A utilisé contient : NaH2PO4, 4,0 g/L ; Na2HPO4, 4,6 g/L ; K2SO4, 0,45 g/L ; Mg504 0,39 g/L, CaCl2, 0,062 g/L ; NH4C1 0.05 % (w/v), trace d'éléments, lml/L (FeSO4-7H20, 15 g/L ; MnSO4-H20, 2,4 g/L ; ZnSO4-7H20, 2.4 g/L; CuSO4-5H20, 0,48 g/L dans HCI 0,1M). [0089] Pour les cultures en bioréacteurs le milieu minimum B utilisé contient par litre : MgSO4,7H20, 0,75 g; phosphate (Na2HPO4,12H20, 1,5g; KH2PO4, 0,25 g); acide nitrilotriacetique, 0.285g; citrate d'ammonium de fer(III), 0,9 g; CaC12, 0,015 g; trace d'éléments (f131303, 0,45 mg; CoC12,6H20, 0,3 mg; ZnSO4 7H20, 0,15 mg; MnC12,4H2 0, 0,045 mg; Na2M004,2W0, 0,045 mg; NiC12,6I-L0, 0,03 mg; CuSO4, 0,015 mg); kanamycin, 0,1 g. [0090] Précultures Une colonie isolée de la souche CN0001 est utilisée pour ensemencer la première culture qui est cultivée pendant 24 h avec 10 mL de TSB contenant 10 pg/mL de gentamycine et 200 pg/mL de kanamycine, dans un erlenmeyer ballé (le 100 mL Deux autres étapes de propagation sont menées pendant 12 h chacune (25 mL et 300 mL de milieu minimum A, respectivement dans des flacons Erlenmeyer de 250 mL et 3 L). Chaque culture est cultivée à 30 °C et agitée à 100 tours par minute dans un incubateur. Cette préculture est utilisée pour inoculer l'étape de culture en bioréacteurs. [0091] Culture en bioréacteurs La culture de la souche CN0001 en fed-batch est réalisée en trois phases. La première phase consiste en une phase de croissance contrôlée sur fructose pour atteindre 0,9 g/L de biomasse à un taux de croissance spécifique de 0,16 h-'. Après la consommation du fructose, la deuxième phase est réalisée pour permettre l'adaptation du métabolisme cellulaire aux substrats gazeux. Il est démarré en par un flux de 0,22 L/min d'un mélange commercial H2/02/CO2/N2 (% molaire: 60:2:10:28, Air Liquide, Paris, France). La troisième phase consiste en une croissance limitée en azote sur des substrats gazeux couplée à la production de lactate. Cette phase est initiée par l'ajout de 1 g/L de L-arabinosc pour induire l'expression de la lactate déshydrogénase. L'azote est alimenté à partir d'une solution de 56 g/L de NH4, pour contrôler un taux de croissance spécifique résiduel de 0,02 h-1. Cette culture est menée dans des bioréacteurs de 1,4 L BDCU B.Braun. La température est régulée à 30 nC et le pH à 7,0 par l'addition d'une solution de KOH 2,5 M. [0092] Analyse du lactate et des métabolites Afin de déterminer les concentrations en acides organiques, en particulier celle en lactate, le surnageant de fermentation est analysé par chromatographie HPLC-UV-RI. Le moût de fermentation régulièrement prélevé (1 mL) est d'abord centrifugé pendant 10 min à 10 000 g. Puis, il est filtré sur 0,45 pm (Minicart RC4, Sartorius). Le système HPLC utilisé est un TI-Ici-En° Scicntific UltiMate 3000 HPLC, couplé à un réfractomètre et détecteur UV (210 nm). 10 FIL de chaque échantillon est injecté sur une colonne Amincx HPX-87H H+, 300 mm x 7,8 mm (B iorad). L'éluant est une solution aqueuse d'acide sulfurique 4 mM. Le débit est fixé à 0,5 ml/min. La température du four est de 45°C. Une élution isocratique est réalisée. La quantification est réalisée grâce à une gamme étalon appropriée. Si besoin, les échantillons sont dilués. [0093] Résultat La souche CN0001 produit dans ces conditions de culture de 5 à 100 mg/L de lactate. [0094] Exemple 2 : Construction d'une bactérie oxydant naturellement l'hydrogène, Cupriavidus necator et génétiquement modifiée pour surexprimer de manière plasmidique une lactate déshydrogénase endogène et pour produire du lactate à partir de CO 2 (CN0002). [0095] Souche et constructions génétiques Pour la production de lactate, une souche Cu- priavidus necator H16 PHB-4 (DSM n°541) est utilisée. Cette souche ne forme pas de poly-P-hydroxy-butyrate (PHB). [0096] La construction de la souche productrice de lactate CN0002 est réalisée selon le protocole suivant : [0097] Un plasmide portant la L-lactate déshydrogénase de Cupriavidus necator (ldh, EC:1.1.1.27) sous promoteur inductible à l'arabinose est cloné en une étape in vitro via le protocole d'assemblage In-Fusion® (Clontech). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genornics. [0098] Le gène ldh (GenBank: CAJ91814.1) est amplifié par PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 PHB-4 à l'aide des oligonucléotides oligonucléotides 7 (5' AAGGAGATAT ACATATGAAG ATCTCCCTCA CCAGCG 3') et 8 (5' ACTCGAGTTT GGATCCTCAG GCCGTGGGGA CGGC 3') et de l'enzyme 21 Phusion High-Fidclity PCRMaster Mix with OC Buffer (New England Biolabs, Evry, France). Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucicospin gel and PCR cleanup (Macherey-Nagel). [0099] Le plasmide squelette pBADTrfp (Bi et al., 2013) dérivé du plasmide pBBR1-MCS (Kovach et al., 1995), contenant un promoteur pBAD de Escherichia coli, est digéré par les enzymes de restrictions BamHI-HF et Ndei (New England Biolabs, Evry, France) afin d'éliminer la séquence codant pour la protéine RFP. Le fragment d'ADN de 5247 paires de bases contenant l'origine de réplication pBBR1, le gène de selection (kan) et le promoteur pBAD est purifié sur gel avec le kit Nucicospin gel and PCR cican-up (Macherey-Nagel). [0100] Un assemblage in vitro par In-fusion est réalisé avec les deux fragments afin d'obtenir le plasmide pBAD-Idh(cn). 5 pl du produit d'assemblage sont transformés dans des cellules Escherichia coli StcllarTM (Clontech) chimio-compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 25 pg/mL de kanamycinc (GibcoTm). La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Mastcr Mix (Thermo ScicntificTM) et des oligonucléotides 9 (5' CGAAGGTGAG CCAGTGTGAC TC 3') et 10(5' CCTGTCGATC CTGCCCAACT AC 3'). Après extraction des plasmides à l'aide du kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel), l'insertion correcte du gène 1.1dh est confirmée par séquençage (Eurofins Genomic) avec les oligonucléotides 9 et 11(5' CATTGATTAT TTGCACGGCG TCAC 3'). [0101] Le plasmide pBAD-1.1dh(cn) est inséré dans une souche électrocompétente Es- cherichia coli S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Pulser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000). [0102] La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm) et des oligonucléotides 9 et 10. Le clone d'intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaC1 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20g/L) contenant 25 pg/mL de kanamycine et incubé une nuit à 37°C. [0103] La conjugaison entre les cellules Escherichia cou i S17-1 et celles de la souche Cu- priavidus necator H16 PHB-4 (DSM n°541) est réalisée comme suit: [0104] Les cellules Cupriaviclus necator sont mises en culture dans 3 mL de milieu TSB contenant 27,5 g/L de bouillon de soja tryptique (TSB, Becton Dickinson, Sparks, Maryland, USA) et incubées 20 h à 30°C sous agitation vigoureuse. Les cellules Escherichia coli sont mises en culture dans 3 mL de milieu LB (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaC1 5 g/L, Sigma-Aldrich) contenant 25 pg/mL de kanamycine et incubées une nuit à 37°C sous agitation vigoureuse. Le lendemain, la densité optique (D06011111) est mesurée pour chaque culture et l'équivalent de 1 DO de cellules sont transférées en tube 1,5 ml et centrifugées (5 minutes, 3000 rpm). Le surnageant est éliminé et les cellules sont lavées dans lml de PBS (Sigma-Aldrich). Le lavage est répété une seconde fois. 50 FtL de la suspension cellulaire Cupriavidus necator et 50 FIL de la suspension cellulaire Escherichia cou sont prélevés et mélangés dans un tube 1,5 mL. Ce mélange est déposé sous forme d'une goutte sur un milieu non sélectif LB/ Agar contenant 2% de fructose et incubé 6h à 30°C. Les cellules sont ensuite grattées et resuspendues dans 1 ml de PBS. Cette suspension est diluée au 1 :1000ème et 100 FIL de cette dilution sont étalés sur milieu sélectif LB/Agar contenant 2% de fructose, 300 pg/mL de kanamycine et 10 pg/mL de gentamycine (Sigma-Aldrich). Les cellules sont mises à incuber 24h à 30°C. Des clones isolés sont prélevés, striés sur le même milieu sélectif et mis à incuber 24h à 30°C. La sélection des clones contenant le plasmide pBAD-Idh(cn) est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thertno ScientificTM) et des oligonucléotides 9 et 10. [0105] La souche Cupriavidus necator H16 PHB-4 pBAD-Idh(cn) est récupérée et nommée CN0002. Les modifications génétiques sont validées par séquençage. [0106] Exemple 3: Production de lactate à partir de Fructose par culture en Er- lenmeyer d'une bactérie oxydant naturellement l'hydrogène, Cupriavidus necator , génétiquement modifiée (CN0002) [0107] Souche Pour la production de lactate, la souche CN0002 (Cupriavidus necator H16 PHB-4 pBAD -ldh) est utilisée. Dans cette souche, la LDH (lactate déshydrogénase) de C. necator est surexprimée sur plasmide via un promoteur inductible à l'arabinose. Cette souche est naturellement résistante à la gentamycine et porte une résistance plasmidique à la kanamycine. [0108] $Milieux Le milieu riche était constitué de 27,5% (p/v) de bouillon trypticase (le soja (TSB, Becton Dickinson, Rance). Le milieu minimum utilisé pour les cultures en Erlenmeyers (milieu MMR) contenait : 4,0 g/L de NaH0PO4 21-120; 4,6 g/L de Na2HPO4 121-120; 0,45 de g/L K2SO4; 0,39 g/L de MgSO4 7H20; 0,062 g/L de Can, 2E1,0 et 1 mUL de solution de trace d'éléments. La solution de trace d'éléments contenait : 15 g/ L de FeSO4 71-120; 2,4 g/L MnSO4H20; 2,4 g/L de ZnSO4 7110 et 0,48 g/L de CuSO4 5H,0 dans 0,1 M de HC1. Le fructose (20 g/L) a été utilisé comme source de carbone. NH4C1 (0,5 g/L) a été utilisé comme source d'azote pour atteindre une concentration de biomasse d'environ 1 g/L. 0,04 g/L de NaOH ont été ajoutés. [0109] Chaîne d'inoculation Un clone de la souche CN0002 repiqué d'une plaque de culture a été tout d'abord cultivé durant 8 h dans 5 mL de milieu riche avec de la gentamycine (10 pg/mL) et de la kanamycine (200 pg/mL) (dépendant de la souche), dans des tubes de culture, à 30°C sous agitation (200 rpm). Cette première préculture a été 23 utilisée pour inoculer la deuxième preculture à une D0600 initiale de 0,05 dans 25 mL de milieu MMR dans des Erlenmeyer baffles de 250 mL qui ont été incubés durant 20 h à 30°C, 200 rpm. Cette seconde préculture a été utilisée pour inoculer la culture en Erlenmeyer dans 50 mL de milieu MMR en présence de gentamycine (10 pg/mL) et de kanamycine (200 pg/mL) (dépendant de la souche). La D0600 initiale visée a été de 0,05. [0110] Culture en Erlenmeyer La culture hétérotrophe a été réalisée dans un volume de MMR de 50 mL dans des Erlenmeyers baffles de 500 mL, à une température de 30°C et une agitation de 200 rpm. Une phase de croissance d'une durée de 20h a été réalisée jusqu'à l'obtention d'une biomasse de 1 g/L. Après cette première phase de croissance, une modification de l'aération est opérée (2% air soit 0,4% d'02), une induction du promoteur de la LDH est réalisée par l'ajout de 1 g/L d'arabinosc (dépendant de la souche) ce qui conduit à une phase de production de lactate d'une durée de 120 h. [0111] Protocole d'échantillonnage et d'analyse Des échantillons de lmL ont été prélevés régulièrement au cours de la culture. La croissance a été suivie par une mesure de la densité optique (DO) à 600 nm; convertie en poids sec de cellules bactériennes (gCDW/L) selon une courbe d'étalonnage. La production de lactate a été analysée par HPLC comme décrit dans l'exemple 1. Les échantillons ont été centrifugés pendant 5 min à 13 000 tr/min et les surnageants ont été filtrés avant d'être analysés par HPLC. L'étalonnage avarié de 0,1 à 5 g/L dans de l'eau. [0112] Résultats La croissance de la souche est représentée à la figure 5. Pendant la phase de croissance exponentielle, le taux de croissance spécifique de CN0002 en condition hétérotrophe atteint kti'',, 0,14 h '. Un maximum de lactate, c'est-à-dire 1,3 g/L, a été atteint après 139 h de culture comme représenté à la figure 5. Il est à noter que dans les mêmes conditions de culture, la souche Cupriavidus necator HIG PHB-4 sans surexpression de lactate déshydrogénase ne produit pas de lactate. [0113] Exemple 4 : Production de lactate à partir de CO 2 par fermentation d'une bactérie oxydant naturellement l'hydrogène, Cupriavidus necator , génétiquement modifiée (CN0092). [0114] Souche Pour la production de lactate, la souche CN0002 (Cupriavidus necator H16 PHB-4 pBAD -ldh) est utilisée. Dans cette souche, la LDH (lactate déshydrogénase) de C. necator est surexprimée sur plasmide via un promoteur inductible à l'arabinose. Cette souche est naturellement résistante à la gentamycine et porte une résistance plasrnidique à la kanamycine. [0115] Milieux Le milieu riche était constitué de 27,5% (p/v) de bouillon trypticase de soja (TSB, Becton Dickinson, France). Le milieu minimum utilisé pour les cultures en Erlenmeyers (milieu MMR) contenait : 4,0 g/L de NaH2PO4 2H20; 4,6 g/L de Na2HPO4 12H20; 0,45 de g/L K2SO4; 0,39 g/L de MgSO4 7H20; 0,062 g/L de CaC12 2H20 et 1 24 ml/L de solution de trace d'éléments. La solution de trace d'éléments contenait : 15 g/ L de FeSO4 7110; 2,4 g/L MnSO4 H20; 2,4 g/L de ZnSO4 7H20 et 0,48 g/L de CuSO4 5H20 dans 0,1 M de HCI. Le fructose (20 g/L) a été utilisé comme source de carbone. NH4C1 (0,5 g/L) a été utilisé comme source d'azote pour atteindre une concentration de biomasse d'environ 1 g/L. 0,04 g/L de NaOH ont été ajoutés. [0116] Le milieu minimum utilisé dans le bioréacteur pour les fermentations gaz (milieu FAME) était constitué de : 0,29 g/L d'acide NitriloTriAcetique; 0,09 g/L de citrate d'ammonium ferrique ; 0,75 g/L de MgSO4 7H20; 0,015 g/L de CaCI, 2H20 et 1,5 ml/ L de solution de trace élément. La composition de la solution de trace élément était : 0,3 g/L de H4B03; 0,2 g/L de CoCh 6H20; 0,1 g/L de ZnSO4 7H20; 0,03 g/L de MnC12 4E1,0; 0,03 g/L de Na2Mo04 2E1,0; 0,02 g/L de NiC1, 6E1,0; 0,01 g/L de CuSO4 5H,0. (NH4)2SO4 (1,6 g/L) a été utilisé comme source d'azote pour atteindre une concentration en biomasse d'environ 2,5 g/L. Le pH a été ajusté à 7 avec 2,5 M de KOH. Après autoclavage du milieu, une solution de phosphate stérile de Na2HPO4 12H 20 (concentration finale de 1,6 g/L) et de KH2PO4 (concentration finale de 2,9 g/L) a été ajoutée stérilement dans le bioréacteur (permettant de produire environ 10 g/L de biomasse) ainsi qu'une solution stérile de FeSO4 7H20 (10,7 g/L; concentration finale 0,032 g/L). [0117] Chaîne d'inoculation Un clone de la souche CN0002 repiqué d'une plaque de culture a été tout d'abord cultivé durant 24 h dans 5 mL de milieu TSB avec de la gentamycine (10 mg/L) et de la kanamycine (50 mg/L) (dépendant de la souche), dans des Erlenmeyers baftlés de 50 mL, à 30°c sous agitation (110 ipm). Le milieu de culture a été ensuite centrifugé durant 10 min à 1900 g. Les cellules ont été resuspendues dans 5 mL de milieu MMR, et ont été utilisées pour inoculer les 45 mL de milieu MMR avec 5,5 mg/mL de gentamycine et 100 pg/mL de kanamycine dans des Erlenmeyers bafflés de 500 mL qui ont été incubés durant 20-24 h à 30°C, 110 rpm. Le milieu de culture a été centrifugé durant 5 min à 4000 g et les cellules ont été resuspendues dans 30 int de milieu FAME, et ont été utilisées pour inoculer les 300 mL de milieu FAME avec 100 mg/L de kanamycine dans le bioréacteur gaz. La D0600 initiale visée a été de 0,2. [0118] Bioréacteur gaz La culture autotrophe a été réalisée dans un bioréacteur à gaz avec un volume de travail de 330 mL La température a été réglée à 30 ° C, le pH à 7. La pression et la vitesse d'agitation ont été définies en fonction des besoins de la culture. Les débits de gaz étaient contrôlés individuellement (CO2, F12, air). Un analyseur de gaz a été utilisé pour l'analyse des gaz de sortie (% 02 et COE) et un volumètre pour mesurer les débits de gaz de sortie totaux. Après 53 heures de croissance, environ 3 g/ L de biomasse ont été atteint, la concentration en oxygène dissous est tombée à 0 et 160 mg/L de lactate ont été produits. [0119] Protocole d'échantillonnage et d'analyse Des échantillons (environ 1 ml) ont été prélevés régulièrement (toutes les 2-3 heures) en prélevant au travers d'un septum avec une seringue et une aiguille. La croissance a été suivie par une mesure de la densité optique (DO) à 600 nm; convertis en poids sec de cellules bactériennes (gCDW/L) selon une courbe d'étalonnage. La production de lactate a été analysée par HPLC/ HPAIC comme décrit dans l'exemple 1. Les échantillons ont été centrifugés pendant 3 min à 13 000 tr/min et les surnageants ont été analysés. Pour l'analyse HPLC, les surnageants des échantillons ont été filtrés avant analyse. L'étalonnage a varié de 0,1 à 5 g/L dans de l'eau. [0120] Fermentation La production de lactate par la souche CN0002 a été caractérisée en bioréacteur en conditions autotrophes. La croissance de la souche est représentée à la figure 6. Pendant la phase de croissance exponentielle, le taux de croissance spécifique de CN0002 en condition autotrophe atteint = 0,14 h 1. Un maximum de lactate, c'est-à-dire 160 mg/L, a été atteint après 53 h de culture comme représenté à la figure 6. [0121] Exemple 5 : Construction et évaluation d'une souche de Cupriavidus necator gé- nétiquement modifiée dans laquelle une lactate déshydrogénase hétérologue de Streptococcus bois est surexprimée (CN0003). [0122] Souche et constructions génétiques. Pour la production de lactate, une souche Cu- priavidus necator H16 PHB-4 (DSM n°541) est utilisée. Cette souche ne forme pas de poly-p-hydroxy-butyrate (PHB). La construction de la souche productrice de lactate CN0003 est réalisée selon le protocole suivant : [0123] Un plasmide portant la L-lactate déshydrogénase (ldh, EC:1.1.1.27) de Streptococcus bovis (ATCC 33317) sous promoteur inductible à l'arabinose est cloné en une étape in vitrovia le protocole d'assemblage In-Fusion® (Clontech). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics. [0124] Le gène ldh (GenBank: KFN85486.1) est recodé selon le biais d'usage de codon décrit pour Cupriavidus necator H16 et synthétisé in vitro (GenScript(9). Il est amplifié par PCR à l'aide des oligonucléotides 12 (5' AAGGAGATAT ACATATGACC GCGACCAAGC AGCAC 3') et 13(5' ACTCGAGTTT GGATCCTCAG TTCTTGCAGG CCGACGCGA 3') et de l'enzyme Phusion High-Fidelity PCRMaster Mix with OC Buffer (New England Biolabs, Evry, France). Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel). [0125] Le plasmide squelette pBADTrfp (Bi et al., 2013) dérivé du plasmide pBBR1-MCS (Kovach et al., 1995), contenant un promoteur pBAD de Escherichia cou, est digéré par les enzymes de restrictions BamHI-HF et NdeI (New England Biolabs, Evry, France) afin d'éliminer la séquence codant pour la protéine RFP. Le fragment d'ADN de 5247 paires de bases contenant l'origine de réplication pBBR1, le gène de sélection (kan) et le promoteur pBAD est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR 26 cican-up (Macherey-Nagel). [0126] Un assemblage in vitro par In-fusion est réalisé avec les deux fragments afin d'obtenir le plasmide pBAD-Idh(sb). 5 pl du produit d'assemblage sont transformés dans des cellules Escherichia cdi StellarTm (Clontech) chimio-compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5g/L, Sigma-Aldrich, agar 20g/L) contenant 25 pg/mL de kanamycine (GibcoTm). La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Mastcr Mix (Thermo ScientificTM) et des oligonucléotides 9 et 14(5' GGAGCTGGGC ATCATCGAGA TC 3'). Après extraction des plasmides à l'aide du kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel), l'insertion correcte du gène Idh est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 9 et 11. [0127] Le plasmide pBAD-ldh(sb) est inséré dans une souche électrocompétente Es- cherichia (-nui S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Cone Pulser, BioRad (Datscnko and Wanncr, 2000). [0128] La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Therrno ScientificTM) et des oligonucléotides 9 et 14. Le clone d'intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures g/L. NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 25 pg/mL de kanamycine et incubé une nuit à 37°C. [0129] La conjugaison entre les cellules Escherichia cou i S17-1 et celles de la souche Cu- priavidus necator H16 PHB-4 (DSM n°541) est réalisé comme suit : [0130] Les cellules Cupriaviclus necator sont mises en culture dans 3 mL de milieu TSB contenant 27,5 g/L de bouillon de soja tryptique (TSB, Becton Dickinson, Sparks, Maryland, USA) et incubées 20h à 30°C sous agitation vigoureuse. Les cellules Escherichia cou i sont mises en culture dans 3 mL de milieu LB (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaC1 5 g/L, Sigma-Aldrich) contenant 25 pg/mL de kanamycine et incubées une nuit à 37°C sous agitation vigoureuse. Le lendemain, la densité optique (D0600,1,11) est mesurée pour chaque culture et l'équivalent de 1 DO de cellules est transféré en tube 1,5ml et centrifugé (5 minutes, 3000 rpm). Le surnageant est éliminé et les cellules sont lavées dans 1 ml de PBS (Sigma-Aldrich). Le lavage est répété une seconde fois. 50 ML de la suspension cellulaire Cupriaviclus necator et 50 ML de la suspension cellulaire Escherichia cou i sont prélevées et mélangées dans un tube 1,5 ml. Ce mélange est déposé sous forme d'une goutte sur un milieu non sélectif LB/Agar contenant 2% de fructose et incubé 6h à 30°C. Les cellules sont ensuite grattées et resuspendues dans 1 ml de PBS. Cette suspension est diluée au 1 :1000eme et 100 pl de cette dilution sont étalés sur milieu sélectif LB/Agar contenant 2% de fructose, 300 pg/ mL de kanamycine et 10 pg/mL de gentamycine (Sigma-Aldrich). Les cellules sont 27 mises à incuber 24h à 30°C. Des clones isolés sont prélevés, striés sur le même milieu sélectif et mis à incuber 24h à 30°C. La sélection des clones contenant le plasmide pBAD- Idh(sb) est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Mastcr Mix (Thermo ScientificTM) et des oligonucléotides 9 et 14. [0131] La souche Cupriavidus necator H16 PHB-4 pBAD-Idh(sb) est récupérée et nommée CNO003. [0132] Evaluation de la souche CN0003 en fructose La production de lactate sur fructose de la souche Cap riavidus necator H16 PHB-4 pBAD-Idh(sb) (CN0003) a été évaluée selon la méthode décrite dans l'exemple 3. Dans ces conditions de culture, la souche CN0003 produit 1 g/L de lactate après 140h de culture. [0133] Extrapolation production de lactate par la CN0003 à partir de CO 2 La production de lactate de la souche CN0003 n'a pas été réalisée à partir de CO,. Cependant, l'évaluation en fructose a montré que la souche CN0003 produisait 23% de lactate en moins que la souche CN0002 dans les mêmes conditions de culture. Nous pouvons extrapoler qu'à partir de CO2 tel que décrit dans l'exemple 4, la souche CN0003 produirait 23% de lactate en moins à partir de CO2 que la souche CN0002. [0134] Exemple 6 : Construction d'une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est délétée et dans laquelle une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée (CNO004). [0135] Souche Pour la production de lactate, la souche Cupriavidus necator H16 (ATCC 17699) est utilisée. La délétion de l'opéron de voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est inhibée par insertion d'une lactate déshydrogénase endogène. [0136] Constructions génétiques La construction de la souche productrice de lactate CN0004 est réalisée selon le protocole suivant : [0137] Un plasmide portant la L-lactate déshydrogénase de Cupriavidus necator (ldh, EC:1.1.1.27) sous promoteur inductible pLac ainsi que les séquences des zones d'homologie amont et aval de l'opéron phaCAB est cloné en une étape in vitro via le protocole d'assemblage NEBuildee HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics. [0138] Le gène ldh est amplifié par PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l'aide des oligonucléotides 15 (5' AGACAATCAA ATC/liACAC T7'- TATGCTTC CGGCTCGTAT GTTGTGTGGA ATMTGAGCG GATAACAATT TCACACAGGA AACAGCTATG AAGATCTCCC TCACCAGCGC CC 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 13 paires de bases avec l'extrémité 3' de la zone d'homologie amont de l'opéron phaCAB et la séquence du promoteur pLac provenant du pJQ200mpl8 (Quandt and Hynes, 1993) et 16 (5' CCAGGCCGGC 28 AGGTCAGGCC GTGGGGACGG CCA 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 13 paires de bases avec l'extrémité 5' de la zone d'homologie aval de l'opéron phaCAB et de l'enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel). [0139] La séquence de la zone d'homologie amont de l'opéron phaCAB est amplifiée par PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l'aide des ol igonucléotides 17 (5' GCATGCCTGC AGGTCGACTC TAGAGGGTCG CTTCTACTCC TATCG 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l'extrémité 3' du plasmide pIQ200mpTet et 18 (5' CATAAAGTGT AAAGATTTGA TTGTCTCTCT GCC 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 13 paires de bases avec l'extrémité 5' de la séquence du promoteur pLac et de l'enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel). [0140] La séquence de la zone d'homologie aval de l'opéron phaCAB est amplifiée par PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necwor H16 à l'aide des oligonucléotides 19 (5' CCCCACGGCC TGACCTGCCG GCCTGGTTCA ACC 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 13 paires de bases avec l'extrémité 3' de la séquence du gène Idh de la souche Cupriavidus rzecator H16 et 20 (5' TACGAATTCG AGCTCGGTAC CCGGGTTCTG GATGTCGATG AAGGCCTG 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l'extrémité 5' du plasmide pJQ200mpTet et de l'enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel). [0141] Le plasmide squelette pIQ200mpTet est un dérivé du plasmide pJQ200mpl8 (Quandt and Hynes, 1993) où le gène de résistance à la gentamycine a été remplacé par le gène de résistance à la tétracycline. Le plasmide squelette pIQ200mpTet est coupé par l'enzyme de restriction BamHI-HF (New England Biolabs, Evry, Rance). Le produit de digestion est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel). [0142] Un assemblage in vitro par NEBuildela HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les quatre fragments afin d'obtenir le plasmide pJQ200mp-AphaCABS2pLac L-ldh. 2 pl du produit d'assemblage sont transformés dans des cellules Escherichia cou i NEB 5-alpha competent (New England Biolabs, Evry, France), chimio-compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCl5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline. La sélection des clones positifs est réalisée 29 par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTM) et des oligonucléotides 22(5' CATGCAAAGT GCCGGCCAGG 3') et 23 (5' CTGCACGAAC ATGGTGCTGG CT 3'). Après extraction des plasmides à l'aide du kit NucleoSpinC) Plasmid (Macherey-Nagel), l'insertion correcte du gène ldh, de la séquence de la zone d'homologie amont et de la séquence de la zone d'homologie aval est confirmée par séquençage (Eurofins gcnomic) avec les oligonucléotides 21 (5' TGCAAGGCGA TTAAGTTG 3'), 22,23 et 24(5' CTGGCACGAC AGGTTTCCCG A 3'). [0143] Le plasmide 00200mp-AphaCABS2pLac L-Idh est inséré dans une souche électro- compétente Escherichia cou i S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gefle Pulser, BioRad (Datscnko and Wanncr, 2000). [0144] La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTM) et des oligonucléotides 22 et 23. Le clone d'intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptonc 10 g/L, extrait de levures g/L. NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37°C. [0145] La conjugaison entre les cellules Escherichia cou S17-1 et celles de la souche Cu- priavidus necator H16 (ATCC 17699) a été adaptée du protocole de Lenz et al., 1994. La méthode de sélection au saccharose (15% de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément l'opéron phaCAB et d'y insérer pLac L-Idh. Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm)Tm) et des oligonucleotides 22 et 23. Après la deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les clones sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme Kod Xtremew Hot Start DNA Polymerase (Novagen) (Krauf3e et al., 2009) et des oligonucleotides 76 (5' CTGCATGTTC ATGAACTGCG AC 3') et 77(5' CGACGCGTCA ACCATGTTCG 3'). [0146] La souche Cupriavidus necator H16 AphaCABS2pLac_L-1c1h est récupérée et nommée CN0004. Les modifications génétiques sont validées par séquençage à l'aide des oligonucléotides 78 (5' GTACCTTGCC GACATCTATG C 3'), 79 (5' GCTGCTTGCA TCACGGACTT G 3'), 10,77 et 76. [0147] Evaluation de la souche CN0004 en fructose La production de lactate sur fructose de la souche Cttpriavidtts necator H16 AphaCABS2pLac_L-ldh C.necator (CN0004) a été évaluée selon la méthode décrite dans l'exemple 3. Dans ces conditions de culture, la souche CN0004 produit 1,5 g/L de lactate après 140 h de culture. [0148] Extrapolation production de lactate de la CN0004 à partir de CO 2 La production de lactate de la souche CN0004 n'a pas été réalisée à partir de CO2. Cependant, l'évaluation en fructose a montré que la souche CN0004 produisait 25% de lactate en plus que la souche CN0002 dans les mêmes conditions de culture. Nous pouvons ex- trapoler qu'à partir de CO2 tel que décrit dans l'exemple 4, la souche CN0004 produirait 25% de lactate en plus à partir de CO, que la souche CN0002. [0149] Exemple 7 : Construction d'une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est délétée, une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée et dans laquelle une pyruvate carboxylase est délétée (CN0005) [0150] Souche et constructions génétiques La construction de la souche productrice de lactate CN0005 est réalisée selon le protocole suivant : [0151] Un plasmide portant les séquences des zones d'homologie amont et aval du gène codant pour la pyruvatc carboxylase (pyc) de Cupriavidus necator est cloné en une étape in vitro via le protocole d'assemblage NEBuilder© HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Gcnomics. [0152] La séquence de la zone d'homologie amont du gène codant pour pyc est amplifiée par PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l'aide des oligonucléotides 25 (5' AGATCCTTTA ATTCGAGCTC GGTACCGCAT GGCCAAGGTG GAAGAG 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l'extrémité 3' du plasmide pL03 (Lenz and Friedrich, 1998) et 26 (5' TGCCGGCCAA CGTCACATGG GATGCAGGGA AGCGAAC 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 15 paires de bases avec l'extrémité 5' de la zone d'homologie aval du gène codant pour pyc et de l'enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel). [0153] La séquence de la zone d'homologie aval du gène codant pour pyc est amplifiée par PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator HIG à l'aide des oligonucléotides 27 (5' TCCCTGCATC CCATGTGACG TTGGCCGGCA GGG 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 15 paires de bases avec l'extrémité 3' de la zone d'homologie amont du gène codant pour pyc et 28 (5' ACTTAATTAA GGATCCGGCG CGCCCCCCGG GCTGATAGTT CTTCAACACC AGCAGTC 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 31 paires de bases avec l'extrémité 5' du plasmide pL03 et de l'enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel). [0154] Le plasmide squelette pL03 (Lenz and Friedrich, 1998) est coupé par l'enzyme de restriction XmaI-HF (New England Biolabs, Evry, France). Le produit de digestion est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel). [0155] Un assemblage in vitro par NEBuilder° HiFi DNA Assembly Cloning (New England 31 Biolabs, Evry, Rance), est réalisé avec les trois fragments afin d'obtenir le plasmide pL03-Apyc. 2 pl du produit d'assemblage sont transformés dans des cellules Escherichia coté NEB 5-alpha competcnt (New England Biolabs, Evry, Rance), chimiocompétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptonc 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 Fig/mL de tétracycline. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thertno ScicntificTM) et des oligonucleotides 51 et 80(5' AATGGGACGT GCGAGTCCAT CC 3'). Après extraction des plasmides à l'aide du kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel), la délétion du gène pyc est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 29 (5' GCAAACAAAC CACCGCTGGT 3'), 30(5' CGCCATATCG GATGCCGTTC 3') et 31(5' TAGCAGCACG CCATAGTGAC TG 3'). [0156] Le plasmide pL03-Apyc est inséré dans une souche électrocompétente Escherichia coli S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Pulser, BioRad (Datsenko and Wanncr, 2000). [0157] La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thertno ScientificTM) et des oligonucléotides 51 et 80. Le clone d'intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptonc 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37°C. [0158] La conjugaison entre les cellules Escherichia cou i S17-1 et celles de la souche CN0004 a été adaptée du protocole de Lenz et al., 1994. La méthode de sélection au saccharose (15% de saccharose utilisé) avec SacB a pet:luis de déléter précisément le gène codant pour pyc. Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTM) et des oligonucléotides Si et 80. Après la deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les clones sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme Kod XtremeTM Hot Start DNA Polymerase (Novagen) et des oligonucléotides 81(5' CCATTTGCCC AATACGACTA GC 3') et 30. [0159] La souche Cupriavidus necator H16 Apyc AphaCABS2pLac_L-ldh C.necator est récupérée et nommée CN0005. Les modifications génétiques sont validées par séquençage. [0160] Evaluation de la souche EN0005 en fructose La production de lactate sur fructose de la souche Cupriavidus necator H16 Apyc AphaCABS2pLac_L-ldh C.necator (CN0005) a été évaluée selon la méthode décrite dans l'exemple 3. Dans ces conditions de culture, la souche CN0005 produit 21% de lactate de plus que la souche CN0004 après Si h de culture. 32 [0161] Extrapolation production de lactate de la CN0005 à partir de CO 2 La production de lactate de la souche CN0005 n'a pas été réalisée à partir de CO,. Cependant, l'évaluation en fructose a montré que la souche CN0005 produisait 21% de lactate en plus que la souche CN0004 dans les mêmes conditions de culture. Nous pouvons extrapoler qu'à partir de CO2 tel que décrit dans l'exemple 4, la souche CN0005 produirait 25% de lactate en plus à partir de CO, que la souche CN0004. [0162] Exemple 8 : Construction d'une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est délétée, une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée et dans laquelle une pyruvate déshydrogénase est délétée (CN0006) [0163] Souche et constructions génétiques La construction de la souche productrice de lactate CN0006 est réalisée selon le protocole suivant : [0164] Un plasmide portant les séquences des zones d'homologie amont et aval du gène codant pour le composant El de la pyruvatc deshydrogénase (pdhA2) de Cupriavidus necator est cloné en une étape in vitro via le protocole d'assemblage NEBuildela HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics. [0165] La séquence de la zone d'homologie amont du gène codant pour pdhA2 est amplifiée par PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator Hl 6 à l'aide des oligonucléotides 32(5' TCCTTTAATT CGAGCTCGGT ACCCGGGTGC GTAATCCACT TCCAG 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 22 paires de bases avec l'extrémité 3' du plasmide pL03 (Lenz and Friedrich, 1998) et 33 (5' CCCATCGTTC ACACGGCAAG TCTCCGTTAA GGAATTC 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 11 paires de bases avec l'extrémité 5' de la zone d'homologie aval du gène codant pour pdhA2 et de l'enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel). [0166] La séquence de la zone d'homologie aval du gène codant pour pdhA2 est amplifiée par PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l'aide des oligonucléotides 34(5' GACTTGCCGT GTGAACGATG GGCCATCGGG CA 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 11 paires de bases avec l'extrémité 3' de la zone d'homologie amont du gène codant pour pdhA2 et 35 (5' TAAGGATCCG GCGCGCCCCC GGGTTGAGCA GGATCACGTC GATCC 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 22 paires de bases avec l'extrémité 5' du plasmide pL03 et de l'enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel). [0167] Le plasmide squelette pL03 (Lenz and Friedrich, 1998) est coupé par l'enzyme de 33 restriction Xmai-Hf (New England Biolabs, Evry, France). Le produit de digestion est purifié sur gel avec le kit Nucicospin gel and PCR cican-up (Macherey-Nagel). [0168] Un assemblage in vitro par NEBuilder® HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les trois fragments afin d'obtenir le plasmide pL03-ApdhA2. 2 pl du produit d'assemblage sont transformés dans des cellules Escherichia (-oh NEB 5-alpha competent (New England Biolabs, Evry, France), chimiocompétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 Fig/mL de tétracycline. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTM) et des oligonucléotides 29 et 82(5' ATGTCCTGGA TTGCGCAGAT C 3'). Après extraction des plasmides à l'aide du kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel), la délétion du gène pdhA2 est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 36 (5' TAATCCACTT CCAGCGCGAT AAG 3'), 37 (5' CCTGAAGTCT CCGCGATAAC 3'), 38 (5' GTTCGAAGCC ACCGAGTATG AC 3') et 29. [0169] Le plasmide pL03-ApdhA2 est inséré dans une souche électrocompétente Es- cherichia (-oui S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Pulser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000). [0170] La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm) et des oligonucléotides 29 et 82. Le clone d'intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaC1 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37°C. [0171] La conjugaison entre les cellules Escherichia cou i S17-1 et celles de la souche CN0004 a été adaptée du protocole de Lenz et al_ 1994. La méthode de sélection au saccharose (15% de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément le gène codant pour pdhA2. Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTM) et des oligonucléotides 29 et 82. Après la deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les clones sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme Kod XtremeTM Hot Start DNA Polymerase (Novagen). [0172] La souche Cupriavidus necator H16 ApdhA2 AphaCABS2pLac_L-ldh c''a', est récupérée et nommée CN0006. Les modifications génétiques sont validées par séquençage. [0173] Evaluation de la souche EN0006 en fructose La production de lactate sur fructose de la souche Cupriavidus necator H16 ApdhA2 AphaCABS2pLac_L-ldh cmecator 34 (CN0006) a été évaluée selon la méthode décrite dans l'exemple 3. Dans ces conditions de culture, la souche CN0006 produit 13% de lactate de plus que la souche CN0004 après 51 h dc culture. [0174] Extrapolation production de lactate de la CN0006 à partir de CO 2 La production de lactate de la souche CN0006 n'a pas été réalisée à partir de CO,. Cependant, l'évaluation en fructose a montré que la souche CN0006 produisait 13% de lactate en plus que la souche CN0004 dans les mêmes conditions de culture. Nous pouvons extrapoler qu'à partir de CO2 tel que décrit dans l'exemple 4, la souche CN0006 produirait 13% de lactate en plus à partir de CO, que la souche CN0004. [0175] Exemple 9 : Construction d'une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est délétée, une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée et dans laquelle une phosphate acétyltransférasee et une acétate kinase phosphoenolpyruvate synthase sont délétées (CN0007) [0176] Souche et constructions génétiques [0177] La construction de la souche productrice dc lactate CN0007 est réalisée selon le protocole suivant : [0178] Un plasmide portant les séquences des zones d'homologie amont et aval de l'opéron codant pour les gènes acétate kinase (ackA) et phosphotransacétylase (ptal) ) de Cupriavidus necator est cloné en une étape in vitro via le protocole d'assemblage NEBuildee HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics. [0179] La séquence de la zone d'homologie amont du gène codant pour ptal est amplifiée par PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l'aide des oligonucléotides 39 (5' TCCTTTAATT CGAGCTCGGT ACGTGTCCAA TGAGATGACA GCACG 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 22 paires de bases avec l'extrémité 3' du plasmide pL03 (Lenz and Friedrich, 1998) et 40 (5' TGTAGCGGTG GTGCGTCAGG GTCGTCGGTG 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 11 paires de bases avec l'extrémité 5' de la zone d'homologie aval du gène codant pour ackA et de l'enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel). [0180] La séquence de la zone d'homologie aval du gène codant pour ackA est amplifiée par PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator HI6 à l'aide des oligonucléotides 41(5' ACCCTGACGC ACCACCGCTA CAGCCGACCA AG 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 11 paires de bases avec l'extrémité 3' de la zone d'homologie amont du gène codant pour ptal et 42 (5' TAAGGATCCG GCGCGCCCCC GGGCTGATAC GTTCACGCAT AGTGGTC 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 22 paires de bases avec l'extrémité 5' du plasmide pL03 et de l'enzyme KOD Hot Start DNA Polymcrase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucicospin gel and PCR cican-up (Macherey-Nagel). [0181] Le plasmide squelette pL03 (Lenz and Friedrich, 1998) est coupé par l'enzyme de restriction Xmai-HF (New England Biolabs, Evry, France). Le produit de digestion est purifié sur gel avec le kit Nucicospin gel and PCR cican-up (Macherey-Nagel). [0182] Un assemblage in vitro par NEBuilder® HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les trois fragments afin d'obtenir le plasmide pL03-Aptal -ackA. 2 pl du produit d'assemblage sont transformés dans des cellules Escherichia cati NEB 5-alpha competcnt (New England Biolabs, Evry, France), chimio-compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptonc 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo SeientifieTM) et des oligonucleotides 29 et 43 (5' GACTTCCGGC AGGTCATGC 3'). Après extraction des plasmides à l'aide du kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel), la délétion de l'opéron ackA-ptal est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 43, 44 (5' CAGTTGTTGC GCTGCAGTCA T 3'), 45 (5' GCCAAGCCGG AACGCGTC 3') et 46(5' GATGGTGGCA CGATGTTCAC 3'). [0183] Le plasmide pL03-Aptal-ackA est inséré dans une souche électrocompétente Es- cherichia cou i S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Pulser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000). [0184] La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm) et des oligonucléotides 29 et 43. Le clone d'intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaC1 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37°C. [0185] La conjugaison entre les cellules Escherichia cou i S17-1 et celles de la souche CN0004 a été adaptée du protocole de Lenz et al_ 1994. La méthode de sélection au saccharose (15% de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément l'opéron ptal-ackA. Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTM) et des oligonucléotides 29 et 43. Après la deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les clones sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme Kod XtremeTM Hot Start DNA Polymerase (Novagen) et des oligonucléotides 44 et 83 (5' CA- 36 GAACTGGC TGTTCTCGGA C 3'). [0186] La souche Cupriavidus necator H16 Aptal-ackA AphaCABS2pLac L-Idh C.necudor est récupérée et nommée CN0007. Les modifications génétiques sont validées par séquençage. [0187] Evaluation de la souche CN0007 en fructose La production de lactate sur fructose de la souche Cupriavidus necator H16 Aptal -ackA AphaCA135-2pLac L-Idh Cnecator (CN0007) a été évaluée selon la méthode décrite dans l'exemple 3. Dans ces conditions de culture, la souche CN0007 produit 11% de lactate de plus que la souche CN0004 après 51 h de culture. [0188] Extrapolation production de lactate de la CN0007 à partir de CO 2 La production de lactate de la souche CN0007 n'a pas été réalisée à partir de CO,. Cependant, l'évaluation en fructose a montré que la souche CN0007 produisait 11% de lactate en plus que la souche CN0004 dans les mêmes conditions de culture. Nous pouvons extrapoler qu'à partir de CO2 tel que décrit dans l'exemple 4, la souche CN0007 produirait 11% de lactate en plus à partir de CO2 que la souche CN0004. [0189] Exemple 10 : Construction d'une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est délétée, une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée et dans laquelle une lactate ferricytochrome C reductase est délétée (CN0008) [0190] Souche et constructions génétiques. La construction de la souche productrice de lactate CN0008 est réalisée selon le protocole suivant : [0191] Un plasmide portant les séquences des zones d'homologie amont et aval du site actif de la L-Lactate cytochrome c reductase (11dD, 1.1.2.3) de Cupriavidus necator est cloné en une étape in vitro via le protocole d'assemblage NEBuilder® HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics. [0192] La séquence de la zone d'homologie amont du gène codant pour 11dD est amplifiée par PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l'aide des oligonucléotides 47 (5' CCTGCAGGTC GACTCTAGAG AGCAATTGCT CCGCCATCAG C 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 20 paires de bases avec l'extrémité 3' du plasmide pJQ200mpTet et 48 (5' AGTCGATGGC CACTTGGCGG CGCAAGGTAC 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 10 paires de bases avec l'extrémité 5' de la zone d'homologie aval du gène codant pour 11dD et de l'enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR cleanup (Macherey-Nagel). [0193] La séquence de la zone d'homologie aval du gène codant pour 11dD est amplifiée par PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator HI6 à l'aide des oligo- 37 nucléotides 49 (5' CCGCCAAGTG GCCATCGACT TGTTGCAGGC 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 10 paires de bases avec l'extrémité 3' de la zone d'homologie amont du gène codant pour IldD et 50 (5' ATTCGAGCTC GGTACCCGGG CAAAGGCTGC GTCCAGCCAG 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 20 paires de hases avec l'extrémité 5' du plasmide p,1Q200mpTet et de l'enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagcn) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucicospin gel and PCR cican-up (Macherey-Nagel). [0194] Le plasmide squelette p1Q200mpTet est un dérivé du plasmide p,1Q200mpl8 (Quandt and Hyncs, 1993) où le gène de résistance à la gentamycine a été remplacé par le gène de résistance à la tétracycline. Le plasmide squelette p1Q200mpTet est coupé par l'enzyme de restriction BarnHI-HF (New England Biolabs, Evry, France). Le produit de digestion est purifié sur gel avec le kit Nucicospin gel and PCR cican-up (Macherey-Nagel). [0195] Un assemblage in vitro par NEBuildela HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les trois fragments afin d'obtenir le plasmide p,1Q200mpTet -AlIdD. 2 pl du produit d'assemblage sont transformés dans des cellules Escherichia cati NEB 5-alpha competcnt (New England Biolabs, Evry, France), chimio-compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptonc 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTM) et des oligonucléotides 24 et 86 (5' GACAACCTGA TGGTGCACAA GG 3'). Après extraction des plasmides à l'aide du kit NucleoSpin0 Plasmid (Macherey-Nagel), la délétion du gène 11dD est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 24, 51(5' TGCAAGGCGA TTAAGTTGGG TAACG 3') et 52(5' GAACAGCTGC ACGCCGAG 3'). [0196] Le plasmide pJQ200mpTet -AlldD est inséré dans une souche électrocompétente Es- cherichia cou i S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Pulser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000). [0197] La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm) et des oligonucléotides 24 et 86. Le clone d'intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaC1 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 mg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37°C. [0198] La conjugaison entre les cellules Escherichia cou i S17-1 et celles de la souche CN0004 a été adaptée du protocole de Lenz et al_ 1994. La méthode de sélection au saccharose (15% de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément le 38 gène codant pour IldD. Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTM) et des oligonucléotides 24 et 86. Après la deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les clones sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme Rad XtremeTM Hot Start DNA Polymerase (Novagcn) ) et des oligonucléotides 52 et 87 (5' CACATTGCGT CGCTGACATT G 3'). [0199] La souche Cupriavidus necator H16 AlIdD AphaCAM2pLac L-Idh ',','r est récupérée et nommée CN0008. Les modifications génétiques sont validées par séquençage à l'aide des oligonucléotides 88 (5' AGCTGTTGCA CACCAGGCGA C 3'), 89(5' CATTGCCATA TCGCGCGAGA TC 3'), 90 (5' CTATCGATCATGTCAGCTCTTCATG 3') et 91(5' CACTCCGTAC ACAATGACCA CG 3'). [0200] Evaluation de la souche CN0008 en fructose La production de lactate sur fructose de la souche Cupriavidus necator H16 AlIdD AphaCA135-2pLac L-Idh Cnecator (CN0008) a été évaluée selon la méthode décrite dans l'exemple 3. Dans ces conditions de culture, la souche CN0008 produit 1,4 g/L de lactate après 140 h de culture. [0201] Extrapolation production de lactate de la CN0008 à partir de CO 2 La production de lactate de la souche CN0008 n'a pas été réalisée à partir de COn. Cependant, l'évaluation en fructose a montré que la souche CN0008 produisait 7% de lactate en moins que la souche CN0004 dans les mêmes conditions de culture. Nous pouvons extrapoler qu'à partir de CO2 tel que décrit dans l'exemple 4, la souche CN0008 produirait 7% de lactate en moins à partir de CO2 que la souche CN0004. [0202] Exemple 11 : Construction d'une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est délétée, une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée et dans laquelle deux lactates ferricytochrome C reductases sont délétées (CN0009) [0203] Souche et constructions génétiques La construction de la souche productrice de lactate CN0009 est réalisée selon le protocole suivant : [0204] Un plasmide portant les séquences des zones d'homologie amont et aval du gène codant pour L-Lactate cytochrome reductase (11dA) de Cupriavidus necator est cloné en une étape in vitro via le protocole d'assemblage NEBuilder*HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics. [0205] La séquence de la zone d'homologie amont du gène codant pour 11dA est amplifiée par PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l'aide des oligonucléotides 53 (5' CCTGCAGGTC GACTCTAGAG GATCCGCAAG ACGGTTTATC TCTCGGTC 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 25 39 paires de bases avec l'extrémité 3' du plasmide pJQ200mpTet et 54 (5' GACGCTATCA CATGGGAACT CCCTTGAAAA AAACAAAAAG CTGC 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 10 paires de bases avec l'extrémité 5' de la zone d'homologie aval du gène codant pour IldA et de l'enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagcn) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucicospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel). [0206] La séquence de la zone d'homologie aval du gène codant pour IldA est amplifiée par PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l'aide des oligonucléotides 55 (5' AGTTCCCATG TGATAGCGTC TATGAGGCGT C 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 10 paires de bases avec l'extrémité 3' de la zone d'homologie amont du gène codant pour IldA et 56 (5' ATTCGAGCTC GGTACCCGGG GATCGAGGAA ATCGGCTGCG TAGG 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 24 paires de bases avec l'extrémité 5' du plasmide pJQ200mpTet et de l'enzyme KOD Hot Start DNA Polymerasc (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucicospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel). [0207] Le plasmide squelette pJQ200mpTet est un dérivé du plasmide 0Q200mpl8 (Quandt and Hyncs, 1993) où le gène de résistance à la gentamycinc a été remplacé par le gène de résistance à la tétracycline. Le plasmide squelette pJQ200mpTet est coupé par l'enzyme de restriction BamHI-HF (New England Biolabs, Evry, France). Le produit de digestion est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel). [0208] Un assemblage in vitro par NEBuildeta HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les trois fragments afin d'obtenir le plasmide pJQ200mpTet -AlldA. 2 pl du produit d'assemblage sont transformés dans des cellules Escherichia cou i NEB 5-alpha compétentes (New England Biolabs, Evry, France), chimio-compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaC15 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTM) et des oligonucléotides 92 (5' TGAGTCCAAC CCGGTAAGAC 3') et 57 (5' CCTCATAGAC GCTATCACAT GO 3'). Après extraction des plasmides à l'aide du kit NucleoSpin0 Plasmid (Macherey-Nagel), la délétion du gène 11dA est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 21, 57, 58 (5' CCATGTGATAGCGTCTATGAGG 3') et 24. [0209] Le plasmide pJQ200mpTet -AlldA est inséré dans une souche électrocompétente Es- cherichia cou i S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Pulser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000). [0210] La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thertno SeientificTM) et des oligonucléotides 92 et 57. Le clone d'intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptonc 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37°C. [0211] La conjugaison entre les cellules Escherichia cou S17-1 et celles de la souche CN0008 a été adaptée du protocole de Lenz et cd, 1994. La méthode de sélection au saccharose (15% de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément le gène codant pour IldA. Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR sur colonie à de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTM) et des oligonucléotides 92 et 57. Après la deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les clones sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme KM XtremeTM Hot Start DNA Polymerasc (Novagcn) et des oligonucléotides 93 (5 CTGGCTGAAC GTGAAGAATG C 3') et 94(5 GGAAGATAAA CCCGAGCAGA TC 3'). [0212] La souche Cupriavidus necator H16 AlIdA AlIdD AphaCA1352pLac L-Idh cnm,r est récupérée et nommée CN0009. Les modifications génétiques sont validées par séquençage à l'aide des oligonucléotides 57, 58, 95 (5' CAGGCTTATC GACAGAGAAA TTCG 3') et 96 (5' GTATTTCGCA TCGTGCCAGA C 3'). [0213] Evaluation de la souche CN0009 en fructose La production de lactate sur fructose de la souche Cupriavidus necator H16 AlldD AphaCABS2pLac_L-ldh C.necator (CN0009) a été évaluée selon la méthode décrite dans l'exemple 3. Dans ces conditions de culture, la souche CN0009 produit 1,4 g/L de lactate après 140 h de culture. [0214] Extrapolation production de lactate de la CN0009 à partir de CO 2 La production de lactate de la souche CN0009 n'a pas été réalisée à partir de Ca. Cependant, l'évaluation en fructose a montré que la souche CN0009 produisait 7% de lactate en moins que la souche CN0004 dans les mêmes conditions de culture. Nous pouvons extrapoler qu'à partir de CO2 tel que décrit dans l'exemple 4, la souche CN0009 produirait 7% de lactate en moins à partir de CO2 que la souche CN0004. [0215] Exemple 12 : Construction d'une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est délétée, une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée et dans laquelle une phosphoenolpyruvate synthase est délétée (CN0010) [0216] Souche et constructions génétiques. La construction de la souche productrice de lactate CNO010 est réalisée selon le protocole suivant : [0217] Un plasmide portant les séquences des zones d'homologie amont et aval du gène codant pour la phosphoenolpyruvate synthase (ppsA) de Cupriavidus necator est cloné 41 en une étape in vitro via le protocole d'assemblage NEBuildere HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics. [0218] La séquence de la zone d'homologie amont du gène codant pour ppsA est amplifiée par PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l'aide des oligonucléotides 59 (5' AGATCCTTTA ATTCGAGCTC GGTACCCGAA GATCTTCGGC TTGAACG 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l'extrémité 3' du plasmide pL03 et 60 (5' ACGTCAAATG CTTCACATGT CCGGTATGTT CTTGGAGTTC 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 15 paires de hases avec l'extrémité 5' de la zone d'homologie aval du gène codant pour ppsA et de l'enzyme KOD Hot Start DNA Polymerasc (Novagcn) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel). [0219] La séquence de la zone d'homologie aval du gène codant pour ppsA est amplifiée par PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l'aide des ol igonucléotides 61(5' AACATACCGG ACATGTGAAG CATTTGACGT CACAATAACG 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 15 paires de bases avec l'extrémité 3' de la zone d'homologie amont du gène codant pour ppsA et 62 (5' ACTTAATTAA GGATCCGGCG CGCCCCTTGA GCACGTGCT TGTAGG 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l'extrémité 5' du plasmide pL03 et de l'enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel). [0220] Le plasmide squelette pL03 (Lenz and Friedrich, 1998) est coupé par l'enzyme de restriction XmaI-HF (New England Biolabs, Evry, France). Le produit de digestion est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel). [0221] Un assemblage in vitro par NEBuildela HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les trois fragments afin d'obtenir le plasmide pL03-.AppsA. 21.11 du produit d'assemblage sont transformés dans des cellules Escherichia cou NEB 5-alpha competent (New England Biolabs, Evry, France), chimiocompétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaC15 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientificni). Après extraction des plasmides à l'aide du kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel), la délétion du gène ppsA est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 63 (5' ATGAACACCG GCACCTTCTA CC 3'), 64(5' CAGGATGGAG TGGCTGAACG 3') et 29. 4-> [0222] Le plasmide pL03-AppsA est inséré dans une souche électrocompétente Escherichia coté S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Pulser, BioRad (Datsenko and Wanncr, 2000). [0223] La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Therrno ScientificTm). Le clone d'intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaC1 S g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37°C. [0224] La conjugaison entre les cellules Escherichia cou S17-1 et celles de la souche CN0004 a été adaptée du protocole de Lenz et aL, 1994. La méthode de sélection au saccharose (15% de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément le gène codant pour ppsA. Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm). Après la deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les clones sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme Kod XtremeTM Hot Start DNA Polymerase (Novagcn). [0225] La souche Cupriavidus necator H16 AppsA AphaCABS2pLac L-Idh Cnecator est récupérée et nommée CNO010. Les modifications génétiques sont validées par séquençage. [0226] Exemple 13 : Evaluation de la consommation lactate par les souches CN0004 et CNO009 [0227] Souches Pour l'évaluation de la consommation de lactate, les souches CN0004 ( Cu- priavidus necator H16 AphaCABS2pLac_L-Mh c neraror) et CN0009 (Cupriavidus necator H16 AlldA AlldD AphaCABS2pLac_L-ldh (7,',''' ) sont utilisées. [0228] Milieux Le milieu riche était constitué de 27,5% (p/v) de bouillon trypticase de soja (TSB, Becton Dickinson, Rance). Le milieu minimum utilisé pour les précultures et les cultures en Erlenmeyers (milieu MMR) contenait : 4,0 g/L de Nati2PO4 2H20; 4,6 g/L de Na2HPO4 12H20; 0,45 de g/L K2SO4; 0,39 g/L de MgSO4 7H20; 0,062 g/L de CaC12 2110 et 1 ml/L de solution de trace d'éléments. La solution de trace d'éléments contenait : 15 g/L de FeSO4 7H-0; 2,4 g/L MnSO4 H20; 2,4 g/L de ZnSO4 7H20 et 0,48 g/L de CuSO4 5H,0 dans 0,1 M de HC1. NH4C1 (1 g/L) a été utilisé comme source d'azote pour atteindre une concentration de biomasse d'environ 2 g/L. 0,04 g/L de NaOH ont été ajoutés. Pour les précultures, le fructose (20 g/L) a été utilisé comme source de carbone. Pour les cultures, le lactate (6 g/L) a été utilisé comme source de carbone. [0229] Chaîne d'inoculation Un clone de la souche CN0004 et un clone de la souche CN0009 repiqués d'une plaque de culture ont été tout d'abord cultivés durant 8 h dans 5 int de milieu riche avec de la gentamycine (10 pg/mL), dans des tubes de culture, à 30°C sous agitation (200 rpm). Cette première préculture a été utilisée pour inoculer la 43 deuxième préculturc à une D0600 initiale de 0,05 dans 25 mL de milieu MMR + 20 g/L de fructose dans des Erlemneyer baffles de 250 mL qui ont été incubés durant 20 h à 30°C, 200 rpm. [0230] Culture en Erlenmeyer La seconde préculturc a été centrifugée, le culot cellulaire a été lavé deux fois avec du MMR sans source de carbone et utilisé pour inoculer la culture en Erlenmeyer de 500mL dans 50 mL de milieu MMR + 6g/L de lactate en présence de gentamycine (10 pg/mL). La DO',y, initiale visée a été de 0,2. La culture en présence de lactate comme seule source de carbone a été réalisée à une température de 30°C et une agitation dc 200 rpm. Une phase de croissance d'une durée de 8h a été réalisée jusqu'à la consommation totale du lactate. [0231] Protocole d'échantillonnage et d'analyse Des échantillons dc lmL ont été prélevés régulièrement au cours de la culture. La croissance a été suivie par une mesure dc la densité optique (DO) à 600 nm. La consommation de lactate a été analysée par HPLC comme décrit dans l'exemple 1. Les échantillons ont été centrifugés pendant 5 min à 13 000 tr/min et les surnageants ont été filtrés avant d'être analysés par HPLC. L'étalonnage a varié de 0,1 à 5 g/L dans dc Peau. [0232] Résultats La croissance des souches CN0004 et CN0009 avec le lactate comme seule source de carbone est représentée à la figure 7. Pendant la phase de croissance exponentielle, la vitesse de consommation du lactate pour la souche CN0004 est de 0,89 g/L/h et pour la souche CN0009 de 0,88 g/L/h. La délétion des deux lactates fcrricytochrome C reductases entraine moins de 1% de diminution de la consommation du lactate par Cupriavidus necator. Ces résultats démontrent que la délétion des gènes 11dD et 11dA usuellement décrite n'est pas suffisante pour inhiber de manière substantielle la consommation de lactate par Cupriavidus necator. [0233] Exemple 14 : Construction d'une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est délétée, une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée, deux lactates terri-cytochrome C reductases sont délétées et dans laquelle l'opéron lutl portant les gènes codant pour pour les composants d'un complexe enzymatique utilisant le lactate est délété (CNO011). [0234] Souche et constructions génétiques : [0235] La construction de la souche productrice de lactate CNO011 est réalisée selon le protocole suivant : [0236] Un plasmide portant les séquences des zones d'homologie amont et aval de l'opéron comprenant les gènes A1390, A1391 et A1392 du chromosome AM260479 de Cupriavidus necator est cloné en une étape in vitro via le protocole d'assemblage NEBuilder® HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics. 44 [0237] La séquence de la zone d'homologie amont du gène A1390 est amplifiée par PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l'aide des oligonucléotides 65(5' AGATCCTTTA ATTCGAGCTC GGTACTCATA GATGCCGGCG GCAATGC 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l'extrémité 3' du plasmide pL03 et 66(5' TTTACTGAAG CCTCACATTG TCGACTTCTC CAGACCCG 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 15 paires de bases avec l'extrémité 5' de la zone d'homologie aval du gène A1392 et de l'enzyme KOD Hot Start DNA Polymcrase (Novagcn) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucicospin gel and PCR cican-up (Macherey-Nagel). [0238] La séquence de la zone d'homologie aval du gène A1392 est amplifiée par PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necatorH16 à l'aide des oligonucléotides 67 (5' GAGAAGTCGA CAATGTGAGG CTTCAGTAAA GAACCAC 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 15 paires de bases avec l'extrémité 3' de la zone d'homologie amont du gène A1390 et 68 (5' ACTTAATTAA GGATCCGGCG CGCCCCCAAG CTGCTGTACG TGTC 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 25 paires de hases avec l'extrémité 5' du plasmide pL03 et de l'enzyme KOD Hot Start DNA Polymcrase (Novagcn) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucicospin gel and PCR cican-up (Macherey-Nagel). [0239] Le plasmide squelette pL03 (Lenz and Friedrich, 1998) est coupé par l'enzyme de restriction XmaI-HF (New England Biolabs, Evry, France). Le produit de digestion est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel). [0240] Un assemblage in vitro par NEBuildeta HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les trois fragments afin d'obtenir le plasmide pL03-Alutl 20 du produit d'assemblage sont transformés dans des cellules Escherichia cou i NEB 5-alpha competent (New England Biolabs, Evry, France), chimiocompétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10g/L, extrait de levures 5g/L, NaCl 5g/L, Sigma-Aldrich, agar 20g/L) contenant 15mg/mL de tétracycline. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTM) à l'aide des oligonucléotides 97 (5' AGGCATTGAC CTTGGTGCGT ATC 3') et 31. Après extraction des plasmides à l'aide du kit NucleoSpin0 Plasmid (Macherey-Nagel), la délétion de l'opéron lutl est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 69 (5' GTGACAGCTC TTTCAGGCTG AC 3'), 31 et 29. [0241] Le plasmide pL03-Alutl est inséré dans une souche électrocompétente Escherichia colt S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Pulser, BioRad (Datsenko and Wanncr, 2000). [0242] La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Therrno SeientifieTM) et des oligonucléotides 97 et 31. Le clone d'intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptonc 10g/L, extrait de levures 5g/L. NaCI 5g/L, Sigma-Aldrich, agar 20g/L) contenant 15pg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37°C. [0243] La conjugaison entre les cellules Escherichia cou S17-1 et celles de la souche CN0009 a été adaptée du protocole de Lenz el cd, 1994. La méthode de sélection au saccharose (15% de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément l'opéron lutl . Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Mastcr Mix (Thermo ScientificTm). Après la deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les clones sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonies à l'aide de l'enzyme Kod XtremeTM Hot Start DNA Polymerase (Novagcn) et des oligonucléotides 98 (5' GGTCGGAGAA GACCTGATCG 3') et 69. [0244] La souche Cupriavidus necator H16 Alutl AlldA AlIdD AphaCABQpLac L-Idh est récupérée et nommée CNO011. Les modifications génétiques sont validées par séquençage à l'aide des oligonucléotides 99(5' GCTTCGGTCA CGTAGCCCAT G 3'), 100 (5' CTGGAATTCG TGGATACGCT GAC 3'), 101 (5' TGTCCGCCAG CCTTAACATC AG 3'), et 102 (5' CTCACCGGAA GTGATGTGCA TTG 3'). [0245] Exemple 15 : Construction d'une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est délétée, une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée, deux lactates terri-cytochrome C reductases sont délétées et dans laquelle l'opéron lut2 portant les gènes codant pour pour les composants d'un complexe enzymatique utilisant le lactate est délété (CNO012). [0246] Souche et constructions génétiques : [0247] La construction de la souche productrice de lactate CNO012 est réalisée selon le protocole suivant : [0248] Un plasmide portant les séquences des zones d'homologie amont et aval de l'opéron lactate utilisation comprenant les gènes B0091, B0092. B0093 du chromosome AM260480 de Cupriavidus necator est cloné en une étape in vitro via le protocole d'assemblage NEBuilder® HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genornics. [0249] La séquence de la zone d'homologie amont du gène B0093 est amplifiée par PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l'aide des oligonucléotides 70(5' AGATCCTTTA ATTCGAGCTC GGTACGGCTG CGCACGAAGT 46 CGATATG 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l'extrémité 3' du plasmide pL03 et 71(5' CGTGATGACGGATTATCATGTCTCGCTCCGGACGTG 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 15 paires de bases avec l'extrémité 5' de la zone d'homologie aval du gène B0091 et de l'enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagcn) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucicospin gel and PCR cican-up (Macherey-Nagel). [0250] La séquence de la zone d'homologie aval du gène B0091 est amplifiée par PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l'aide des oligonucléotides 72(5' CGGAGCGAGA CATGATAATC CGTCATCACG GGCGCGAG 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 15 paires de bases avec l'extrémité 3' de la zone d'homologie amont du gène B0093 et 73 (5' ACTTAATTAA GGATCCGGCG CGCCCGCGGC TGCCATACCT TCAGGAAC 3') présentant en 5' une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l'extrémité 5' du plasmide pL03 et de l'enzyme KOD Hot Start DNA Polymcrase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucicospin gel and PCR cican-up (Macherey-Nagel). [0251] Le plasmide squelette pL03 (Lenz and Friedrich, 1998) est coupé par l'enzyme de restriction Xmai-HF (New England Biolabs, Evry, France). Le produit de digestion est purifié sur gel avec le kit Nucicospin gel and PCR cican-up (Macherey-Nagel). [0252] Un assemblage in vitro par NEBuildeia HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les trois fragments afin d'obtenir le plasmide pL03-Alut2 20 du produit d'assemblage sont transformés dans des cellules Escherichia cou i NEB 5-alpha competent (New England Biolabs, Evry, France), chimiocompétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10g/L, extrait de levures 5g/L, NaC1 5g/L, Sigma-Aldrich, agar 20g/L) contenant 15mg/mL de tétracycline. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTM) et des oligonucléotides 31 et 74 ((5' GTGGCCGATT GCATGGATCA TC 3'). Après extraction des plasmides à l'aide du kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel), la délétion de l'opéron lut2 est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 29, 74, 75 (5' TGTTGCGCGC CACCTCGTAT TOC 3') et 31. [0253] Le plasmide pL03-Alut2 est inséré dans une souche électrocompétente Escherichia coli S17-1 pal- électroporation en utilisant un électroporateur Gene Pulser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000). [0254] La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm) et des oligonucléotides 31 et 47 74. Le clone d'intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptonc 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37°C. [0255] La conjugaison entre les cellules Escherichia cou i S17-1 et celles de la souche CN0009 a été adaptée du protocole de Lenz et al., 1994. La méthode de sélection au saccharose (15% dc saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément l'opéron lut2. Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Mastcr Mix (Thermo ScientificTM) et des oligonucléotides 31 et 74. Après la deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les clones sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonies à l'aide de l'enzyme Kod XtremeTM Hot Start DNA Polymcrase (Novagen) et des oligonucléotides 103 (5' CGCGGAAGCG GGAATTATGC 3') et 104 (5' TCCTGCTTCG GTGGTGTTTC G 3'). [0256] La souche Cupriavidus necator H16 Alut2 AlldA AlIdD AphaCABQpLac L-Idh C.necator est récupérée et nommée CNO012. Les modifications génétiques sont validées par séquençage à l'aide des oligonucléotides 103, 104, 105 (5' CCTATCTTCT ATGCCTACCT GAAG 3') et 106 (5' TGTAGGGCGA AGCCTTGC 3'). [0257] Exemple 16 : Construction d'une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est délétée, une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée, deux lactates ferricytochrome C reductases sont délétées et dans laquelle les deux opérons lutlet lut2 portant les gènes codant pour les composants d'un complexe enzymatique utilisant le lactate sont délétés (CNO013). [0258] Souche et constructions génétiques. [0259] La construction de la souche productrice de lactate CNO013 est réalisée selon le protocole suivant : [0260] Un plasmide portant les séquences des zones d'homologie amont et aval de l'opéron lactate utilisation comprenant les gènes B0091, B0092. B0093 du chromosome AM260480 de Cupriavidus necator est cloné en une étape in vitro via le protocole d'assemblage NEBuilder® HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genornics. [0261] La séquence de la zone d'homologie amont du gène B0093 est amplifiée par PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l'aide des oligonucléotides 70 présentant en 5' une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l'extrémité 3' du plasmide pL03 et 71 présentant en 5' une zone de recouvrement de 15 paires de bases avec l'extrémité 5' de la zone d'homologie aval du gène B0091 et de l'enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est 48 purifié sur gel avec le kit Nucicospin gel and PCR cican-up (Macherey-Nagel). [0262] La séquence de la zone d'homologie aval du gène B0091 est amplifiée par PCR sur l'ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l'aide des oligonucléotides 72 présentant en 5' une zone de recouvrement dc 15 paires de bases avec l'extrémité 3' de la zone d'homologie amont du gène B0093 et 73 présentant en 5' une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l'extrémité 5' du plasmide pL03 et de l'enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagcn) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucicospin gel and PCR cican-up (Macherey-Nagel). [0263] Le plasmide squelette pL03 (Lenz and Friedrich, 1998) est coupé par l'enzyme de restriction Xmai-HF (New England Biolabs, Evry, France). Le produit de digestion est purifié sur gel avec le kit Nucicospin gel and PCR cican-up (Macherey-Nagel). [0264] Un assemblage in vitro par NEBuilder® HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les trois fragments afin d'obtenir le plasmide pL03-Alut2. 2p1 du produit d'assemblage sont transformés dans des cellules Escherichia cadi NEB 5-alpha competent (New England Biolabs, Evry, France), chi miocompétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptonc 10g/L, extrait de levures 5g/L. NaCI 5g/L, Sigma-Aldrich, agar 20g1) contenant 15pg/mL de tétracycline. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTM) et des oligonucléotides 31 et 74. Après extraction des plasmides à l'aide du kit NucleoSpin0 Plasmid (Macherey-Nagel), la délétion de l'opéron lut2 est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 29, 74, 75 et 31. [0265] Le plasmide pL03-Alut2 est inséré dans une souche électrocompétente Escherichia coli S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Pulser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000). [0266] La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTm) et des oligonucléotides 31 et 74. Le clone d'intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10g/L, extrait de levures 5g/L, NaC15g/L, Sigma-Aldrich, agar 20g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37°C. [0267] La conjugaison entre les cellules Escherichia coli S17-1 et celles de la souche CNO011 a été adaptée du protocole de Lenz et al., 1994. La méthode de sélection au saccharose (15% de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter pré- cisément l'opéron lut2. Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR sur colonie à l'aide de l'enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo ScientificTM) et des oligonucléotides 31 et 74. Après la deuxième recom- 49 binaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les clones sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonies à l'aide de l'enzyme Kod XtremeTM Hot Start DNA Polymerase (Novagen) et des oligonucléotides 103 (5' CGCGGAAGCG GGAATTATGC 3') et 104 (5' TCCTGCTTCG GTGGTGTTTC G 3'). [0268] La souche Cupriavidus necator H16 Alutl Alut2 AlIdA AlIdD AphaCABS2pLac L-Idh c;/'. est récupérée et nommée CNO013. Les modifications génétiques sont validées par séquençage à l'aide des oligonucléotides 103, 104, 105 (5' CCTATCTTCT ATGCCTACCT GAAG 3') et 106 (5' TGTAGGGCGA AGCCTTGC 3'). [0269] Exemple 17 : Evaluation de la consommation lactate par les souches CN0009, CNO011, CNO012 et CNO013 [0270] Souches : Pour l'évaluation de la consommation de lactate, les souches CN0009 ( Cupriavidus necwor H16 AlIdA AlldD AphaCABS2pLac L-Idh ,'',('' ), CNO011 ( Cupriavidus necator H16 Alutl AlldA AlIdD AphaCABS2pLac L-Idh c,''', ), CNO012 ( Cupriavidus necwor H16 Alut2 AlIdA AlIdD AphaCABQpLac L-Idh ), CNO013 (Cupriavidus necator H16 Alutl Alut2 AlIdA AlldD AphaCABS2pLac L-Idh cm''' ) sont utilisées. [0271] Milieux, conditions de culture et protocole d'échantillonnage et d'analyse Les milieux, les conditions de culture et le protocole d'échantillonnage et d'analyse utilisés sont les mêmes que ceux décrits dans l'exemple 13. [0272] Résultats La croissance des souches CN0009, CNO011, CNO012 et CNO013 avec le lactate comme seule source de carbone est représentée à la figure 8. Pendant la phase de croissance, la vitesse de consommation du lactate pour la souche CN0009 est de 0,89 g/L/h, pour la souche CNO011 de 0,72 g/L/h, pour la souche CNO012 de 0,05 g/ L/h et pour la souche CNO013 de 0 g/L/h. La délétion de l'opéron lutl entraine donc une diminution de la vitesse de consommation du lactate par Cupriavidus necator de 19%. La délétion de l'opéron lut2 entraine donc une diminution de la vitesse de consommation du lactate par Cupriavidus necator de 94%. La délétion concomitante des opérons lutl et lut2 entraine donc une diminution totale de la consommation du lactate par Cupriavidus necator. [0273] [Tableaux4] Abréviations Nom F6P Fructose 6 phosphate FI6BP Fructose 1,6 bisphosphate G3P Glyceraldehyde 3 Phosphate I 3BPG 1,3 bis Phospho Glycerate 3PG 3 PhosphoGlycerate 2PG 2 PhosphoGlycerate PEP Phospho Enol Pyruvate R-HB-CoA 3 hydroxybutyratc-CoA PHB PolyHydroxyButyrate Cit Citrate Isocit I soci trate AKG 2 oxoglutarate SucCoA Succinyl-CoA Succ Succinate Fum Fumarate Mal Malate OAA OxaloAcetate DHAP Dihydroxyacctonc Phosphate E4P Eryth rose 4 phosphate X5P Xylulose 5 phosphate R5P Ribose 5 Phosphate Ru5P Ribulose 5 Phosphate R15BP Ribose 1,5 Bis Phosphate G6P Glucose 6 phosphate 15PGL 1,5 Phospho-glucono-lactonc 6PGA 6 Phospho gluconate S7P Sedoheptulose 7 phosphate S I 7BP Sedoheptulose 1,7 biphosphate ibp Fructose 1,6 BisPhosphatase 51 cbbF2, cbbFp Fructose 1,6 BisPhosphatase, Sedoheptulose 1,7 bisphosphatase lba, ebbA2, cbbAp Fructose-bisphosphate aldolase class II fbaB Fructosc-bisphosphatc aldolase class I tpiA triose phosphate isomerasc gapA, cbbG2, cbbGp Glyccraldchydc 3-phosphate dehydrogenase pgk, cbbK2, cbbKp Phosphoglycerate kinase cbbS2, cbbL2, cbbSp, cbbLp rit& Ribulose bisphosphate carboxylase small chain Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxyeenase large sub unit Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxyeenase small subunit Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxyeenase large subunit cbbP2, cbbPp Phosphoribulokinase tktA, ebbT2 Transketolase rpe, cbbE2, cbbEp Ribulose-phosphate 3-epimerase pgaml, pgam2 phosphoglycerate mutase 1, phosphoglycerate mutase 2 eno cnolasc pykl, pyk2, pyk2 pyruvatc kinase pdhA I, pdhA2, ace, bkdA I, bkdA2 Pyruvate dehydrogenase phaA Acetyl-CoA acetyltransferase phaB Acetoacetyl-CoA reductase phaC Poly(3-hydroxybutyrate) syntha se PPsA Phosphoenolpyruvate synthase Idh L-lactate dehydrogenase ldbAl, ldhA2 D-lactate dchydrogenase IldD, IldA L-lactate dehydrogenase (cytochrome) dld D-lactate dehydrogenase (cytochrome) pyc Pyruvate carboxylase 52 mhpf Acetaldehyde dehydrogenase pta Phosphate acetyltransferase ackA Acetate kinase cisY Citrate synthase acnA, acnB Aconitate hydratase icdl, icd2, icd3 Isocitrate dehydrogenase odhA, odhB 2-0xoglutarate dehydrogenase sucC, sucD Succinyl-CoA synthetase sdhA,B,C,D Succinatc dehydrogenase fumA, fumC Fumarate hydratase mdh I Malate dehydrogenase lutA, lutB, lutC Complexe enzymatique utilisant le lactate Liste des documents cités 102741 Angermayr et al., 2012. Appl. Environ. Microbiol., 78, 19, 7098-7106 102751 Bi et al., 2013. Microb. Cell Fact. 12, 1-10. 102761 Chai, et al., 2009..1. of Bacteriology, 191, 8, 2423-2430 102771 Daboussi et al., Nucleic Acids Res. 2012. 40:6367-79 [0278] Dancholt. 2006. Nobel Prizc in Physiology or Medicine [0279] Datscnko et aL, 2000. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-5 [0280] Fukui T. et al., 2011. Applicd Microbiology and Biotcchnology, 89, 5, 1527-1536 [0281] Grousscau et aL, 2014. Applicd Microbiology and Biotcchnology, 98, 9, 4277-4290 [0282] Gruber et aL, 2014. Journal of Biotcchnology, 192, 3,410-418 [0283] Kaufmann et al., 2011. Methods in Molccular Biology, 765. 275-294 [0284] Kim et aL, 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93,3, 1156-1160 [0285] Kovach et al., 1995. Gcnc, 166, 175-176 [0286] KrauBe et al., 2009. J. of Mol. Microb. and Biotech.. 17, 3. 146-152 [0287] Lenz et al., 1994. Journal of bactcriology, 176, 14, 4385-93 [0288] Lenz et al., 1998. Proc. Natl. Acad. Sci. 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Bactérie selon l'une des revendications 1 à 3, caractéiisée en ce que lorsque la bactérie comprend plusieurs opérons lut, l'expression d'au moins un opéron est inhibée. Bactérie selon l'une des revendications 1 à 4, caractéiisée en ce qu'elle est génétiquement modifiée pour surexprimer au moins un gène codant une lactate déshydrogénase endogène. Bactérie selon la revendication 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle est génétiquement modifiée pour surexprimer au moins un gène codant une lactate déshydrogénase exogène, préférentiellement dérivé d'une bactérie, d'un champignon, d'une levure ou d'un mammifère, plus préférentiellement dérivé d'une bactérie. Bactérie selon l'une des revendications 1 à 6, caractéiisée en ce qu'elle est également génétiquement modifiée pour inhiber au moins partiellement au moins une voie de dégradation du pyruvate compétitrice de la voie de synthèse du lactate. Bactérie selon l'une des revendications 1 à 7, caractéiisée en ce que l'expression d'au moins un gène codant une lactate ferricytochrome C reductase est au moins partiellement inhibée. Bactérie selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi Cupriavidus sp., telle que Cupriavidus necator, Hydrogenobacter sp., telle que Hydrogenobacter thermophilus, Rhodococcus sp., telle que Rhodococcusopacus, et Pseudomonas sp., telle que Pseudomonas hydrogenothennophila. Bactérie selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce qu'elle est Cupriavidus necator. Utilisation d'une bactérie définie selon l'une des revendications 1 à 10, 55 [Revendication 12] pour la production de lactate à partir dc CO,. Procédé dc production de lactate à partir de CO,, comprenant les étapes consistant à cultiver la bactérie selon l'une des revendications 1 à 10 en présence de CO2 comme seule source dc carbone, puis à récupérer le lactate.