Brevet FR3096460A1 — publié le 20201127

Description Titre de l'invention : Procédé de quantification de la teneur totale en saponines dans un échantillon en particulier dans un échantillon complexe Domaine technique 100011 La présente invention concerne le domaine du dosage des saponines, plus particu- lièrement elle porte sur un procédé de détermination de la teneur totale en saponines triterpéniques et/ou stéroïdiques dans un échantillon par spectrophotométrie et éventuellement un procédé de détermination de la teneur en saponines triterpéniques d'une part et stéroïdiques d'autre part dans ledit échantillon. Le procédé selon l'invention est avantageusement mis en oeuvre dans les domaines de l'industrie agro-alimentaire, de la pharmacie et de la cosmétique en particulier dans l'industrie de la nutrition humaine et animale pour la détermination de la teneur totale en saponines dans un échantillon complexe. Etat de la technique [0002] Les saponines sont des hétérosides largement répandus dans le monde végétal et retrouvés dans certains organismes marins. Il s'agit de molécules complexes constituées d'un squelette carboné polycyclique à caractère lipophile appelé sapogénine associée à une ou plusieurs chaines osidiques à caractère hydrophile. Les saponines possèdent diverses propriétés telles que des propriétés édulcorantes et d'amertume (Grenby, 1991) (Kitagawa, 2002) (Heng et al., 2006), des propriétés moussantes et émulsifiantes (Martin et Briones, 1999), des propriétés pharmacologiques et médicinales (Attele, Wu, et. Yuan, 1999), des propriétés hémolytiques (Oda et al., 2005) ainsi que des activités insecticides, molluscicides et antimicrobiens (Sparg, Light, et van Staden, 2004). Ces différentes propriétés physicochimiques et biologiques sont employées dans de nombreux secteurs de l'industrie tels que l'alimentation, la cosmétique, l'agriculture et la pharmacie (Giiçlti-Üstünda et Mazza, 2007). Il existe deux grandes familles de saponines, les saponines stéroïdiques constituées de 27 atomes de carbone retrouvées dans un nombre minoritaire de plante et les saponines triterpéniques constitués de de 30 atonies de carbone retrouvées dans la majorité des plantes à saponines. Afin de s'assurer de la qualité des extraits et des matières premières utilisées dans l'industrie il est nécessaire de développer des méthodes analytiques rapides, précises, permettant de quantifier la teneur totale en saponines. [0003] De nombreuses méthodes ont été développées pour détecter et mesurer les saponines présentes dans les matières végétales ; les méthodes classiques font appel à la gra- 2 vimétrie (Tenon et al., 2017) et l'indice de mousse (Ross et Miles, 1941). Cependant la gravimétrie qui consiste à extraire les saponines avec du butanol a tendance à surestimer la quantité présente du fait de l'affinité d'autres composés (polyphénols) avec ce même solvant. De même, l'indice de mousse qui mesure la hauteur de mousse est principalement utilisé comme élément de caractérisation. [0004] Il existe des méthodes quantitatives faisant appel à la chromatographie telles que la chromatographie liquide couplées avec différents détecteurs comme l'ultra-violet (UV), la spectrométrie de niasse (SM), ou encore l'évaporateur à diffusion de lumière (DEDL) permettant de mesurer la teneur en saponines. Ces bancs chromatographiques comprenant ces détecteurs sont cependant onéreux et ne sont pas adaptés à l'ensemble des saponines. Par ailleurs ces méthodes chromatographiques couplées nécessitent l'usage de standards de saponines pouvant ne pas être disponibles, faute de commercialisation. [0005] Une autre méthode quantitative faisant appel à la chromatographie est la chroma- tographie sur couche mince (CCM) couplée à un densitomètre. Ces méthodes nécessitent cependant des étapes automatisées pour assurer la robustesse de la quantification, il est alors nécessaire de s'équiper de modules également très couteux. A cet inconvénient s'ajoute celui de la chromatographie qui est dépendante des échantillons à analyser. [0006] La quantification des saponines par spectrophotométrie est devenue populaire du fait de sa simplicité, de sa rapidité et de son coût relativement faible au regard des méthodes chromatographiques. Elle consiste à révéler les saponines à l'aide d'un agent chromogène en présence d'acide et de doser le chromophore ainsi formé grâce à un spectromètre UV-visible par étalonnage. [0007] La méthode usuellement employée est celle présentée par Hiai et ses collaborateurs (Hiai et al., 1975). La méthode utilise une solution de vanilline sulfurique permettant de quantifier initialement les saponines triterpéniques du Panax ginseng à une longueur d'onde de 544 nm portée par les aglycones. L'acide sulfurique utilisée provoque la formation d'interférences proches des longueurs d'onde de quantification, par exemple le sorbose génère un interférent absorbant à 520 nm (Hiai et al., 1975 ; Nakajima, 1976). Ces interférants provenants de l'échantillon végétal ou bien des glycosides présents sur les saponines elles-mêmes, il est alors nécessaire de réaliser une purification des saponines avant d'effectuer la quantification. De nombreux brevets utilisent une étape de purification pour quantifier les saponines avec de la vanilline sulfurique. Par exemple, le brevet CN106404685A qui relate une méthode de dosage des saponines triterpéniques retrouvées dans des liqueurs, utilise l'acide chlorhydrique pour hydrolyser les saponines avant de quantifier les sapogénines triterpéniques. Dans un autre exemple, le brevet CN106483084A qui relate une méthode de dosage des 3 saponines triterpéniques de Panacis quinqucfolis utilise comme prétraitement une extraction en phase solide (SPE) avant de quantifier les saponines à 560 nm. De même, le brevet CN106596426A qui relate une méthode de dosage des saponines triterpéniques de Gynostemrna pentaphyllurn utilise comme prétraitement une résine macroporcuse avant de quantifier les saponines à 555 nm. Ces prétraitements augmentent le temps, le coût d'analyse et le développement. De plus, les SPE et résines macroporeuses nécessitent des conditions d'élution particulières pour éliminer les interférents caractéristiques de l'échantillon. De ce fait, les méthodes avec prétraitement sont difficilement transposables à d'autres échantillons dont la composition diffère réduisant considérablement le champ d'application desdites méthodes. [0008] Il existe une autre méthode spectrophotométrique usuellement employée et dé- veloppée initialement par l'équipe de Baccou et ses collaborateurs (Baccou, Lambert, et Sauvai rc, 1977). Elle utilise du p-anisaldéhyde sulfurique permettant de révéler spécifiquement les sapogénincs stérdidiques à 430 nm. Des tests réalisés sur différents standards de sapogénincs et saponines stéroïdiques ont montré que le chromophore était spécifique des sapogénines. Contrairement aux réactions chromogènes utilisant de la vanilline, la concentration en acide sulfurique est de 1 2,5 % (volume/volume), permettant ainsi d'éviter de former des interférences aux longueurs d'ondes de quantification. Elle possède l'avantage de pouvoir doser directement les saponines stéroïdiques dans un échantillon végétal complexe sans réaliser de prétraitement. Cependant, les conditions utilisées ne permettent pas de révéler les saponines triterpéniques, réduisant considérablement le champ d'application de ladite méthode. Le brevet JPS60219556A (Attele et al., 1985) utilise du p-anisaldehyde sulfurique pour quantifier les saponines triterpéniques de Gynostemma pentaphyllum. Afin de pouvoir révéler les saponines triterpéniques, les auteurs utilisent une proportion en acide sulfurique de 62,5 % (volume/volume) dans le milieu réactionnel. Les saponines triterpéniques peuvent alors être quantifiées à une longueur d'onde de 530 nm. Comme indiqué par les auteurs du brevet, la méthode s'accompagne d'interférences provenant de l'échantillon à analyser tels que les glycosides. Un prétraitement est donc réalisé sur SPE avec un greffage C-18 avant quantification. Comme énoncé précédemment, les prétraitements SPE sont le plus souvent dépendant de l'échantillon à analyser diminuant le champ de ladite méthode et augmentant le temps et le coût d'analyse de la méthode. [0009] Malgré les différentes technologies et inventions développées au cours des dernières décennies, il n'existe pas de méthodes de quantification relativement simples, rapides et peu onéreuses, permettant de quantifier avec précision des saponines triterpéniques et/ou stéroidiques présentes dans un échantillon complexe. Aucune méthode ne permet en outre de doser aisément en une seule analyse les saponines totale d'un mélange des deux types de saponines contenu dans un échantillon complexe donné. [0010] Il subsiste donc clairement un besoin pour un procédé simple, rapide et peu coûteux, permettant de quantifier avec précision la teneur totale en saponines contenues dans un échantillon complexe, qu'elles soient triterpéniques, stéroïdiques, ou que l'échantillon complexe contienne un mélange des deux types de saponines. Exposé de l'invention [0011] Les inventeurs ont mis au point un procédé permettant de résoudre tout ou partie des problèmes évoqués ci-dessus. [0012] La présente invention a pour objet un procédé de détermination de la teneur totale en saponines d'un échantillon, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes, dans cet ordre : (1) réaliser une réaction en ajoutant audit échantillon solubilisé dans au moins un solvant, du p-anisaldéhyde et dc l'acide sulfurique en une quantité allant de 25 % à 60 %, de préférence de 30 % à 55 %, en volume par rapport au volume total du mélange réactionnel ; (2) chauffer le mélange réactionnel à une température allant dc 45°C à 80°C, de préférence égale à 60°C, pour obtenir un chromophorc en solution ; (3) mesurer l'absorbance de la solution du chromophorc obtenu à une longueur d'onde allant de 580 à 630 nm, de préférence de 590 à 620 nm et de manière préférée 600 nm ; (4) réaliser une gamme de solutions étalon de saponines, dans les conditions dc réaction des étapes (1) et (2), dont les absorbances après réaction chromogène à la longueur d'onde définie à l'étape (3) vont de 0 à 1,5 UA, dc préférence de 0 à 1 UA ; (5) quantifier la teneur en saponines de l'échantillon en comparant l'absorbance dc la solution du chromophorc mesurée à l'étape (3) à la gamme d'absorbances des solutions étalon réalisées à l'étape (4). [0013] Un avantage du procédé selon la présente invention est qu'il permet de quantifier de façon spécifique les saponines présentes dans un échantillon, en particulier dans un échantillon complexe. [0014] Un autre avantage du procédé selon la présente invention est qu'il permet de quantifier simultanément la totalité des saponines stéroïdiques et triterpéniques dans des échantillons, en particulier dans des échantillons complexes. Le procédé selon la présente invention permet d'obtenir des niveaux de réponse similaires pour des saponines triterpéniques et stéroïdiques à la même longueur d'onde de quantification, permettant ainsi de quantifier ces deux groupes de saponines en mélange dans tous types d'échantillons et en particulier dans un échantillon complexe. Bien entendu, lorsqu'un seul groupe de saponines (triterpéniques ou stéroïdiques) est présent dans l'échantillon, le procédé selon l'invention permet de quantifier cc groupe de saponines. [0015] Avantageusement, le procédé de détermination de la teneur totale en saponines d'un échantillon selon l'invention est tel qu'un procédé de détermination de la teneur en saponines stéroïdiques dudit échantillon est mis en oeuvre avant, après ou simultanément aux étapes (1) à (5), ledit procédé de détermination de la teneur en saponines stéroïdiques comprenant au moins les étapes suivantes, dans cet ordre : (i) réaliser une réaction en ajoutant audit échantillon solubilisé dans au moins un solvant, du p-anisaldéhyde et de l'acide sulfurique en une quantité allant de 5 % à 25 %, de manière préférée de 10 % à 15 % et préférentiellement de 12,5 % en volume par rapport au volume total du mélange réactionnel ; (ii) chauffer le mélange réactionnel à une température allant de 45°C à 80°C, de manière préférée égale à 60°C, pour obtenir un chromophorc en solution ; (iii) mesurer l'absorbance de la solution du chromophore obtenu à une longueur d'onde allant de 400 à 450 nm, de manière préférée 425 nm ; (iv) réaliser une gamme de solutions étalon de saponines stéroïdiques, dans les conditions de réaction des étapes (i) et (ii), dont les absorbances des chromophores à la longueur d'onde définie à l'étape (iii) vont de 0 à 1,5 UA, de préférence de 0 à 1 UA ; (y) quantifier la teneur en saponines stéroïdiques de l'échantillon en comparant r absorhance de la solution du chromophore mesurée à l'étape (iii) à la gamme d'absorbances des solutions étalon réalisées à l'étape (iv). [0016] La mise en oeuvre, sur un échantillon comprenant à la fois des saponines stéroïdiques et triterpéniques, du procédé de détermination de la teneur totale en saponines selon l'invention couplé avec le procédé de détermination de la teneur en saponines stéroïdiques permet de quantifier dans ledit échantillon la teneur totale en saponines d'une part, la teneur en saponines stéroïdiques d'autre part, puis par différence, la teneur en saponines triterpéniques. [0017] Dans le procédé de détermination de la teneur totale en saponines d'un échantillon, les saponines sont choisies dans le groupe consistant en les saponines triterpéniques, les saponines stéroidiques et leurs mélanges. [0018] Ainsi lorsque l'échantillon contient des saponines stéroïdiques et des saponines triter- péniques, le procédé de détermination de la teneur totale en saponines d'un échantillon selon l'invention se caractérise en ce que la teneur en saponines triterpéniques est déterminée par différence entre la teneur totale en saponines déterminée selon l'invention et la teneur en saponines stéroïdiques déterminée selon l'invention. [0019] Avantageusement, le procédé de détermination de la teneur totale en saponines selon l'invention comprend une étape préliminaire comprenant au moins une extraction des saponines de l'échantillon effectuée avant l'étape (1) et, si présente, avant l'étape (i) ; ladite au moins une extraction des saponines de l'échantillon étant choisie de 6 préférence dans le groupe consistant en les extractions sous pression, les extractions par macération, les extractions par micro-ondes, les extractions par ultrasons, les extractions par reflux, de manière préférée ladite étape préliminaire est une extraction des saponines de l'échantillon par ultrasons. [0020] Le solvant est de préférence choisi dans le groupe consistant en les solvants aqueux, ioniques, organiques et leurs mélanges, de préférence dans le groupe consistant en l'eau, le méthanol, l'éthanol, l'acétonitrile, l'acétate d'éthyle et leurs mélanges, de manière préférée le méthanol. [0021] Procédé de détermination de la teneur totale en saponines [0022] Réaction chromogène [0023] Le procédé de détermination de la teneur totale en saponines selon la présente invention met en oeuvre une réaction chromogène lors de laquelle les saponines contenues dans l'échantillon à quantifier réagissent avec un agent dit « agent chromogène » pour former un chromophore. [0024] Le procédé de détermination de la teneur totale en saponines dudit échantillon est mis en oeuvre, en particulier selon les étapes (1) à (5). [0025] L'agent chromogène utilisé à l'étape (1) est le p-anisaldéhydc, qui réagit en présence d'acide sulfurique. [0026] La réaction chromogène comprend donc la réaction d'un échantillon solubilisé dans au moins un solvant avec du p-anisaldéhyde et de l'acide sulfurique puis le chauffage dudit mélange réactionnel, le chromophore étant révélé lors de l'étape de chauffage. [0027] De préférence, l'échantillon utilisé à l'étape (1) est solubilisé dans un solvant choisi dans le groupe consistant en l'eau, les alcools en Cl-C4 et leurs mélanges, de préférence le méthanol ou l'éthanol et de manière préférée le méthanol. [0028] Généralement, le p-anisaldéhyde utilisé est solubilisé dans un solvant en particulier un alcool en CI-C4 de manière préférée le méthanol, et l'acide sulfurique est utilisé sous la forme d'une solution aqueuse. [0029] Au sens de la présente invention le « mélange réactionnel » est défini comme comprenant l'ensemble des réactifs, en particulier l'échantillon solubilisé, le panisaldéhyde et l'acide sulfurique dans au moins un solvant. [0030] De préférence, le mélange réactionnel est formé par l'ajout de l'échantillon solubilisé avec le p-anisaldéhyde puis de l'acide sulfurique, de préférence ledit acide sulfurique étant solubilisé dans l'eau. [0031] Le mélange réactionnel de l'étape (1) comprend généralement un solvant choisi parini l'eau, les alcools en C1-C4 et leurs mélanges, de préférence choisi parmi le méthanol et l'éthanol et de manière préférée le méthanol. [0032] Par « mélange » on entend un mélange de plusieurs alcools, un mélange d'un alcool avec de l'eau ou un mélange de plusieurs alcools avec de l'eau. Ces mélanges peuvent 7 être effectués en toutes proportions. [0033] La quantité de p-anisaldéhyde ajoutée dans le mélange réactionnel de l'étape (1) dépend de la quantité de l'échantillon à quantifier. Il relève des compétences de l'homme du métier de déterminer cette quantité afin que le p-anisaldéhyde ne devienne pas un réactif limitant et qu'il ne précipite pas [0034] Généralement la quantité de p-anisaldéhyde utilisée à l'étape (1) va de 0,1 % à 10%. de préférence de 2 % à 5 % et de manière préférée 3 % en volume par rapport au volume total du mélange réactionnel. [0035] L'acide sulfurique, de préférence en solution aqueuse, est ajouté en une quantité allant de 25 % à 60 % et préférentiellement de 30 % à 55 % en volume par rapport au volume total du mélange réactionnel [0036] Conformément à l'étape (2), le mélange réactionnel est ensuite porté à une tem- pérature allant de 45 °C à 80 °C, de préférence égale à 60 °C pour permettre la formation du chromophore. [0037] Le temps nécessaire à la formation du chromophore dépend de différents paramètres tels que les quantités d'acide sulfurique, de saponines, la température.II relève des compétences de l'homme du métier de déterminer la durée de la réaction chromogène. Généralement la durée de la réaction chromogène va de 1 à 60 minutes, de préférence de 10 à30 minutes. [0038] Généralement, le mélange réactionnel contenant le chromophore est refroidi ou laissé refroidir avant de réaliser la quantification dudit chromophore. [0039] Mesure-Quantification [0040] L'étape de mesure-quantification du procédé de détermination de la teneur totale en saponines selon l'invention est effectuée par spectrophotométrie. [0041] On entend par « spectrophotométrie », toute analyse effectuée au moyen d'un détecteur optique permettant de mesurer l'intensité du signal (densité optique) lié à la présence de saponines. A titre de détecteur, on peut citer le spectrophotomètre evolution 60S commercialisé par la société Thema° Fisher Scientific. [0042] L'analyse-quantification par spectrophotométrie est possible parce que la réaction chimique des saponines avec le p-anisaldéhyde selon la présente invention conduit à un produit coloré, encore appelé « chromophore », et que l'intensité de la coloration est proportionnelle à la concentration du chromophore à quantifier. [0043] En outre la quantité de chromophore formée est proportionnelle à la quantité de saponines présentes dans la solution. [0044] Cette étape de quantification est basée sur la loi de Beer-Lambert selon laquelle 1' absorbance A est proportionnelle à la concentration C suivant la formule : [0045] [Math. I] A -ExixC 8 Avec : A : l'absorbance de la solution, théoriquement sans unité, r absorhance est souvent notée en unités d'absorbance (AU) ; : le coefficient d'absorption pondérale en Lx g-1 x cm-1 ; L : la longueur de cuve traversée par la lumière en cm ; C : la concentration massique en g.L-1. [0046] La mesure de l'absorbance au moyen d'un spectrophotomètre va permettre de dé- terminer la concentration massique en chromophore dans la composition en comparaison avec une gamme d'étalonnage c'est-à-dire une gamme de solutions étalon dudit chromophore réalisée dans les mêmes conditions que la réaction chromogène de l'échantillon à quantifier à savoir avec les mêmes quantités de p-anisaldéhyde et d'acide sulfurique. [0047] Ainsi le procédé selon la présente invention comprend une étape de mesure de r absorhance de la solution du chromophore obtenu Le. de l'échantillon à quantifier, puis une étape de quantification de la teneur en saponines dans l'échantillon à quantifier par comparaison de l'absorbance mesurée pour l'échantillon avec une gamme d'absorbances correspondant à différentes concentrations du même chromophore obtenu avec des solutions étalons de saponines de concentrations différentes. [0048] La mesure-quantification correspond aux étapes (3) à (5) du procédé de de déter- mination de la teneur totale en saponines. [0049] Conformément à l'étape (3) du procédé selon l'invention, l'absorbance de la solution du chromophore obtenu (à partir de l'échantillon à quantifier) est mesurée à une longueur d'onde allant de 580 à 630 nm, de préférence de 590 à 620 nm et de manière préférée 600 nm. [0050] Conformément à l'étape (4) du procédé selon l'invention, une gamme de solutions étalon de saponines est réalisée avec un standard de saponines. Plus particulièrement, les chromophores des solutions étalons sont obtenus dans les mêmes conditions que l'échantillon, c'est-à-dire avec le même solvant et les mêmes quantités de panisaldéhyde et d'acide sulfurique, à partir de solutions d'un standard de saponine à différentes concentrations. [0051] On entend par « standard de saponine » une saponine purifiée ou fraction de saponines purifiées provenant du groupe triterpénique et/ou stéroïdique dont la pureté a été déterminée. [0052] A titre d'exemple on peut citer l'escin IB à titre de standard préféré pour quantifier les saponines triterpéniques et la protodioscine à titre de standard préféré pour quantifier les saponines stéroïdiques. Cependant l'escin IB et la protodioscine, comme tout standard de saponine, peuvent être utilisés pour quantifier un échantillon 9 comprenant uniquement des saponines triterpéniques, uniquement des saponines stérokliques ou des mélanges de saponines triterpéniques et stéroïdiques. [0053] Les chrornophores des solutions étalon présentent des absorbances allant de 0 à 1,5 UA, de préférence de 0 à 1 UA à la longueur d'onde définie à l'étape (3) c'est-à-dire la longueur d'onde de mesure de l'échantillon à quantifier. Les solutions étalon sont définies de manière à couvrir une gamme d'absorbances selon des intervalles réguliers. [0054] Avantageusement les valeurs d'absorbances des chromophorcs sont reportées sur une courbe étalon afin d'établir une droite de cal ibration en standard de saponines. [0055] Généralement, la gamme de solutions étalon correspond à plusieurs solutions, géné- ralement entre Set 10 solutions de concentration allant généralement de 25 x g/I à 250 x 10-3g/1 (25 !Ighil à 250 pg/m1) dans le volume réactionnel. [0056] Puis, conformément à l'étape (5), la teneur en saponines de l'échantillon est quantifiée en comparant l'absorbance de la solution du chromophore obtenue à partir de l'échantillon à quantifier Le. mesurée à l'étape (3) avec la gamme d'absorbanccs des solutions étalon réalisées à la même longueur d'onde selon l'étape (4). [0057] Lorsque la teneur en saponines de l'échantillon à quantifier est supérieure ou in- férieure à la gamme des teneurs des solutions étalon, alors l'absorbance de la solution obtenue à partir de l'échantillon à quantifier n'est pas comprise dans la gamme allant de 0 à 1,5 UA. Dans ce cas, une étape de dilution ou de concentration de l'échantillon permettra l'obtention d'un échantillon d'absorbance dans la gamme allant de 0 à 1,5 UA. [0058] Il relève des compétences de l'homme du métier d'adapter la concentration de l'échantillon lorsque l'absorbance de la solution obtenue à partir de l'échantillon à quantifier n'est pas comprise dans la gamme allant de 0 à 1,5 UA. [0059] La détermination de la teneur totale en saponines de l'échantillon est calculée à partir de la concentration en chromophore de ladite solution. Si l'échantillon a subi un ou plusieurs traitements préalables tels qu'une ou plusieurs extractions, le rendement d'extraction est à prendre en considération dans le calcul de la teneur totale en saponines. [0060] Le procédé selon l'invention permet de déterminer la teneur totale en saponines dans des échantillons contenant de 0,1 et 100% en poids de saponines par- rapport au poids total de l'échantillon. [0061] Extraction [0062] L'étape de réaction chromogène du procédé selon l'invention peut être précédée d'une ou plusieurs étapes d'extraction des saponines de l'échantillon. Tous les procédés classiques d'extraction des saponines peuvent être mis en oeuvre pour réaliser cette étape. [0063] En particulier, il est préférable que l'échantillon à quantifier ne comprenne ni stérols libres, ni triterpènes libres car ces composés peuvent conduire à la formation d'interférents absorbant également à une longueur d'onde proche de 600 nm et proche de 425 nm. [0064] Or les stérols et triterpènes libres sont des composés apolaires qui peuvent être aisément extraits de l'échantillon en mettant en oeuvre une étape dite de délipidation. L'étape de délipidation peut être effectuée par tout moyen apte à éliminer les composés apolaires. [0065] Selon une première variante de l'invention, l'étape de réaction chromogène est précédée d'une délipidation comprenant au moins une extraction des composés apolaires au moyen d'un solvant apolairc notamment choisi dans le groupe consistant en le dichlorométhanc, l'hexanc, l'éther de pétrole, l'éther diéthylique ; ladite extraction étant éventuellement réalisée en présence d'ultrasons. De préférence la délipidation comprend une étape d'extraction au moyen de dichlorotnéthane en présence ultrasons. [0066] Selon une deuxième variante de l'invention, en particulier lorsque l'échantillon est solide, par exemple lorsqu'il s'agit d'un matériel végétal séché, une extraction alcoolique ou hydroalcool igue est avantageusement effectuée. [0067] Avantageusement, une étape préliminaire comprenant au moins une extraction de l'échantillon est effectuée avant l'étape (1) ladite au moins une extraction des saponines de l'échantillon étant choisie de préférence dans le groupe consistant en les extractions sous pression, les extractions par macération, les extractions par micro-ondes, les extractions par ultrasons, les extractions par reflux, de manière préférée ladite étape préliminaire est une extraction des saponines de l'échantillon par ultrasons. Avantageusement l'extraction est répétée plusieurs fois, de préférence 2, 3, 4 ou 5 fois et de manière préférée 3 fois. [0068] Ladite extraction est effectuée au moyen d'un solvant possédant des affinités avec les saponines, ledit solvant est choisi dans le groupe consistant en les solvants liquides, subcritiques ou supercritiques. [0069] Le solvant est de préférence choisi dans le groupe consistant en les solvants aqueux, ioniques, organiques et leurs mélanges, de préférence dans le groupe consistant en l'eau, le méthanol, l'éthanol, l'acétonitrile, l'acétate d'éthyle et leurs mélanges, de manière préférée le méthanol. [0070] Bien entendu, la mise en oeuvre d'une étape d'extraction et le choix du ou des procédés d'extraction dépendront de l'échantillon à quantifier et en particulier de la présence dans ledit échantillon de composés susceptibles de créer des interférences à une longueur d'onde dans la gamme 580- 630 nm et dans la gamme 400-450 nm. Ces choix relèvent des compétences de l'homme du métier. [0071] Plus particulièrement, ledit procédé d'extraction comprend au moins les étapes 11 suivantes : - placer l'échantillon dans au moins un solvant, - procéder à au moins une extraction dudit échantillon, - procéder à la filtration de la solution provenant de l'étape précédente pour séparer le retcntât et le filtrat liquide, - récupérer le filtrat obtenu à l'étape précédente comprenant au moins un solvant et au moins une saponine, - évaporer la totalité du solvant pour obtenir un extrait séché, - solubiliser l'extrait séché provenant de l'étape précédente dans un volume connu d'un deuxième solvant, - Centrifuger ledit extrait re-soubilisé et collecter le surnageant. [0072] Ledit au moins un premier solvant posséde des affinités avec les saponines, il est de préférence choisi parmi les solvants aqueux, ioniques, organiques et leurs mélanges, et de manière préférée parmi l'eau, le méthanol, l'éthanol, l'acétonitrile, l'acétate d'éthyle, de préférence le méthanol et leurs mélanges. [0073] Selon un mode de réalisation particulier du procédé de l'invention, le deuxième solvant, utilisé pourre-solubiliser l'extrait sec, est un solvant choisi parmi l'eau, le méthanol, l'éthanol et leurs mélanges. [0074] On entend par « échantillon » ou « échantillon à quantifier », un échantillon contenant de 0,1 % à 100 % poids de saponines par rapport au poids total dudit échantillon à quantifier. [0075] On entend par « saponine », toutes saponines c'est à dire des saponines triterpéniques ou stéroïdiques. [0076] Par « échantillon complexe », on entend un échantillon comprenant essentiellement un échantillon végétal notamment au moins une plante, une partie de plante, un échantillon comprenant essentiellement un organisme marin, ou encore un aliment complet pour bétail, de préférence il s'agit d'un échantillon végétal. [0077] En particulier l'échantillon peut être choisi dans le groupe formé par une partie ou un mélange de parties d'une ou de plusieurs plante(s) et/ou organisme(s) marin(s), un extrait d'une plante ou d'un organisme marin, un mélange d'extraits d'une ou de plusieurs plante(s) et/ou d'organisme(s) marin(s), un prémélange d'un ou plusieurs extrait(s) d'une ou plusieurs plante(s) et/ou d'un ou plusieurs organisme(s) marin(s), un mélange d'une ou plusieurs partie d'une ou plusieurs plante(s) et/ou d'un ou plusieurs organisme(s) marin(s) avec un ou plusieurs extrait(s) d'une ou plusieurs plante(s) et/ou un ou plusieurs organisme(s) marin(s). [0078] Avantageusement l'échantillon comprend au moins une partie d'au moins une plante à saponines. [0079] Par « plante à saponines », on entend une plante comprenant au moins une saponine, 12 de préférence au moins une saponine stérdidique ou triterpénique. De préférence, ladite plante à saponines est choisie dans le groupe constitué par les Theaceae, les Chen& podiaceae, les Fabaceae, les Agavaceae et leurs mélanges et en particulier Camellia olefeira, Chenopodium quinoa, Trigonella foenum graecum, Yucca schidigera et leurs mélanges. [0080] Avantageusement l'échantillon comprend au moins une partie d'au moins un organisme marin. De préférence, l'organisme marin est choisi dans le groupe formé par les Echinodermata et les Porifera et leurs mélanges, en particulier les concombres de nier, les étoiles de mer et les éponges de mer et leurs mélanges. [0081] En fonction de la nature de l'échantillon, celui-ci peut subir un traitement préalable avant la mise en oeuvre de l'invention. Avantageusement l'échantillon est solubilisé dans un solvant choisi parmi l'eau, les alcools en en C1-C4 et leurs mélanges, de préférence choisi parmi le méthanol et l'éthanol et de manière préférée le méthanol. [0082] Procédé de détermination de la teneur en saponines stéroïdiques [0083] Comme déjà mentionné, un procédé de détermination de la teneur en saponines sté- roïdiques dudit échantillon peut être mis en oeuvre avant, après ou simultanément audit procédé de détermination de la teneur totale en saponines, en particulier avant, après ou simultanément aux étapes (1) à (5). [0084] Avantageusement, ce procédé est mis en oeuvre à partir du même échantillon que le procédé de détermination de la teneur totale en saponines. [0085] De préférence, ledit procédé de détermination de la teneur totale en saponines d'un échantillon selon l'invention comprend, avant, après ou simultanément aux étapes (1) à (5), la mise en oeuvre du procédé de détermination de la teneur en saponines stéroïdiques dudit échantillon selon l'invention. Dans ce cas, ledit échantillon utilisé aux étapes (1) et (i) est identique. [0086] En outre, les mêmes traitements d'extraction préalables sont mis en oeuvre sur l'échantillon avant la mise en oeuvre du procédé de détermination de la teneur totale en saponines et du procédé de détermination de la teneur en saponines stéroïdiques. En particulier, avantageusement une étape préliminaire comprenant au moins une extraction des saponines de l'échantillon est effectuée avant l'étape (1) et/ou avant l'étape (i), de préférence avant les étapes (1) et (i). [0087] Réaction chromogène [0088] Le procédé de détermination de la teneur en saponines stéroïdiques selon la présente invention met également en oeuvre une réaction chromogène et une étape de mesure-quantification par spectrophotométrie. [0089] Le procédé de détermination de la teneur en saponines stéroïdiques dudit échantillon est mis en oeuvre selon les étapes CO à (y). [0090] L'agent chromogène utilisé à l'étape (i) est le p-anisaldéhyde, qui réagit en présence 13 d'acide sulfurique. [0091] La réaction chromogène comprend donc la réaction d'un échantillon solubilisé dans au moins un solvant, avec du p-anisaldéhyde et de l'acide sulfurique puis le chauffage dudit mélange réactionnel, le chromophore étant révélé lors de l'étape de chauffage. [0092] De préférence, l'échantillon utilisé à l'étape (i) est solubilisé dans un solvant choisi dans le groupe consistant en l'eau, les alcools en CI-C4ct leurs mélanges, de préférence l'éthanol ou le méthanol, de manière préférée l'éthanol. [0093] Généralement le p-anisaldéhyde utilisé est solubilisé dans un solvant en particulier un alcool en en C1-C4 de manière préférée l'éthanol, et l'acide sulfurique est utilisé sous la forme d'une solution éthanol igue. [0094] Au sens de la présente invention le « mélange réactionnel » est défini comme comprenant l'ensemble des réactifs, en particulier l'échantillon solubilisé, le panisaldehyde et l'acide sulfurique dans au moins un solvant. [0095] Le mélange réactionnel de l'étape (i) comprend généralement un solvant choisi parmi l'eau, les alcools en en C1-C4et leurs mélanges, de préférence choisi parmi le méthanol et l'éthanol et de manière préférée l'éthanol. [0096] La quantité de p-anisaldéhyde ajoutée dans le mélange réactionnel de l'étape (i) dépend de la quantité de l'échantillon à quantifier. Il relève des compétences de l'homme du métier de déterminer cette quantité afin que le p-anisaldéhyde ne devienne pas un réactif limitant et qu'il ne précipite pas. [0097] Généralement la quantité de p-anisaldéhyde utilisée à l'étape (i) va de 0,1 % à 2 %, et de manière préférée 0,5% en volume par rapport au volume total du mélange réactionnel. [0098] L'acide sulfurique, de préférence en solution éthanolique, est ajouté en une quantité allant de 5 % à 25 %, de manière préférée de 10 % à 15 % et préférentiellement de 12,5 % en volume par rapport au volume total du mélange réactionnel. [0099] Conformément à l'étape (ii), le mélange réactionnel est ensuite porté à une tem- pérature allant de 45°C à 80°C, de préférence égal à 60°C pour permettre la formation du chromophore. [0100] Le temps nécessaire à la formation du chromophore dépend de différents paramètres tels que les quantités d'acide sulfurique, de saponines, la température. Il relève des compétences de l'homme du métier de déterminer la durée de la réaction chromogène. Généralement la durée de la réaction chromogène va de 1 à 60 minutes, de préférence de 10 à 30 minutes. [0101] Généralement, le mélange réactionnel contenant le chromophore est refroidi ou laissé refroidir avant de réaliser la quantification dudit chromophore. [0102] Mesure-Quantification [0103] Le procédé selon la présente invention comprend une étape de mesure de 14 l'absorbance de la solution du chromophore obtenu puis une étape de quantification des saponines dans l'échantillon. [0104] La mesure-quantification correspond aux étapes (iii) à (v) du procédé de déter- mination de la teneur en saponines stéroïdiques. [0105] Conformément à l'étape (iii) du procédé selon l'invention,l'absorbance de la solution du chromophore obtenu est mesurée à une longueur d'onde allant de 400 à 450 nm, et de manière préférée 425 nm. [0106] Conformément à l'étape (iv) du procédé selon l'invention, une gamme de solutions étalon de saponines stéroïdiques est réalisée avec un standard de saponines. [0107] Les chrornophores des solutions étalons présentent des absorbances allant de 0 à 1,5 UA, de préférence de 0 à 1 UA à la longueur d'onde définie à l'étape (iii) c'est-à-dire la longueur d'onde de mesure de l'échantillon à quantifier. Les solutions étalon sont définies de manière à couvrir une gamme d'absorbances selon des intervalles réguliers. [0108] Puis, conformément à l'étape (v), la teneur en saponines stéroïdiques de l'échantillon est quantifiée en comparant l'absorbancc de la solution du chromophore obtenue à partir de l'échantillon à quantifier i.e. mesurée à l'étape (iii) avec la gamme d'absorbances des solutions étalon réalisées à la même longueur d'onde selon l'étape (iv). [0109] La quantification de la teneur en saponines stéroïdiques est effectuée selon le même protocole que la quantification de la teneur totale en saponines en référence à une gamme de solutions étalon, de préférence au moyen d'un standard de saponine stéroïdique. [0110] De préférence la quantification de la teneur en saponines stéroïdiques est effectuée avec le même standard de saponine que la quantification de la teneur totale en saponines. [0111] En conséquence lorsqu'un procédé de détermination des saponines stéoridïques est mis en oeuvre, le procédé de détermination de la teneur totale en saponines selon l'invention est de préférence effectué avec un standard de saponines stéoridïques. [0112] Avantageusement, lorsque les saponines de l'échantillon consistent en des saponines stéroïdiques et triterpéniques, ledit procédé de détermination de la teneur totale en saponines d'un échantillon selon l'invention comprend la détermination de la teneur en saponines triterpéniques dudit échantillon par différence (calcul de la différence) entre la teneur totale en saponines dudit échantillon déterminée à l'issue de l'étape (5) et la teneur en saponines stéroïdiques dudit échantillon déterminée à l'issue de l'étape (v). [0113] Les exemples qui suivent illustrent l'invention sans en limiter la portée. Exemples [0114] Exemple 1 : Détermination de la teneur totale en saponines dans un échantillon de Camellia oleifera [0115] Il est connu que le Catnellia oleifera comprend essentiellement des saponines triter- péniques. Dans cet exemple, l'escin IB est utilisée à titre de standard de saponines. [0116] Etablissement d'une courbe étalon avec une saponine de référence [0117] 5 solutions étalon sont préparées en introduisant dans 5 tubes à essai un volume dc 100 pl d'une solution étalon d'escin IB dans du méthanol, les concentrations desdites solutions étalon étant respectivement de 1 mg.m1-1, 2 mg.m1-1, 3 mg.m1-1, 4 mg.m1-1 et 5 mg.m1-1. On ajoute à chacune de ces 5 solutions étalon 100 pl d'une solution de panisaldéhyde solubilisée à 50 % dans du méthanol (volume/volume), puis 2 ml d'une solution d'acide sulfurique aqueuse à 50 % (volume/volume). Les 5 tubes à essai sont bouchés et incubés dans un bain-marie à 60°C pendant 20 minutes puis placés dans un bain d'eau glacée pendant 10 minutes. On obtient ainsi 5 solutions dont les concentrations d'escin IB dans le mélange réactionnel sont comprises entre 25 x 10-3 g/I et 250 x 10-3 g/I (25 pg.m1-1 à 250 pg.rn1-1). L'absorbance spécifique de chaque étalon est mesurée à 600 nm contre un blanc réalisé dans les mêmes conditions. On obtient ainsi pour chaque concentration d'escin IB une absorbance que l'on reporte en fonction de la concentration pour obtenir la courbe étalon présentée en [fig.1]. [0118] [fig.1] correspond à la droite de calibration de l'escin IB : cette droite correspond à r absorhance en fonction de la concentration (en 10-3 g.1-1), l'équation de cette droite est : y = 0,0057x + 0,0359 avec R2 = 0,9994. [0119] Détermination de la teneur totale en saponines dans un échantillon de Carnellia Oleifera [0120] Un échantillon de Catnellia oletfera est solubilisé dans du dichlorométhane afin d'obtenir une solution à 20 mg.m1 ' puis extrait aux ultrasons pendant 5 minutes à une température de 50 °C. La solution est ensuite filtrée sous vide sur un entonnoir contenant un disque fritté en verre de porosité 3. [0121] Le résidu est solubilisé avec 25 ml de méthanol puis extrait aux ultrasons pendant 5 minutes à une température de 50 °C. La solution est filtrée sous vide sur un entonnoir contenant un disque fritté en verre de porosité 3. Cette étape d'extraction est réalisée 3 fois et les filtrats réunis sont mis à sec par un évaporateur rotatif sous pression réduite. Le rendement d'extraction obtenu est de 18 %. [0122] Une quantité d'extrait est solubilisée dans du méthanol pour réaliser une solution à 10 mg.m1 '. La solution est centrifugée à 10 000 g pendant 10 minutes. Un volume de 100 pl du surnageant est ajouté dans un tube à essai avec 100 pl d'une solution de panisaldéhyde solubilisée à 50 % dans du méthanol (volume/volume). Un volume de 2 ml d'une solution d'acide sulfurique aqueuse à 50 % (volume/volume) est ajouté au tube à essai. Le tube à essai bouché est incubé dans un bain-marie à 60°C pendant 20 minutes puis placé dans un bain d'eau glacée pendant 10 minutes. L'absorbance 16 spécifique des saponines est mesurée à 600 nm contre un blanc réalisé dans les mêmes conditions. La valeur obtenue reportée sur la droite d'étalonnage d'escin IB permet de calculer une concentration de 0,31 mg.m1-1 soit 31 % (masse/masse) d'escin IB dans l'extrait méthanolique et 5,6 % (masse/masse) équivalent escin 1B dans l'échantillon de Corneille niellera. [0123] Elements de validation de la méthode [0124] Le coefficient de variation en répétabilité (CVr) réalisé sur 6 mesures est de 2% et en fidélité intermédiaire (CVR) réalisé sur 12 mesures est dc 3 %. La justesse de la méthode est évaluée par calcul de recouvrement par dopage. Le dopage est réalisé à 150 % sur l'extrait méthanolique de Corneille niellera. Le taux de recouvrement ainsi mesuré est de 100 ± 2% avec : [Math.2] Taux de recouvrement - teneur dopée x 100 teneur non dopée - teneur ajout Où: Teneur non dopée : quantité de saponines totales mesurée dans l'extrait initial Teneur ajout : quantité de saponine de référence ajoutée dans l'extrait initial (50% de la valeur initiale) Teneur dopée : quantité de saponines totales mesurée dans l'extrait dopé (à 150%) [0125] Elément de comparaison [0126] Le procédé selon l'invention a été comparée avec une méthode développée en interne sur CLHP-DEDL ainsi que par la méthode gravimétrique (Budan et al., 2013). Dans l'échantillon de Camellia oleifera, la teneur totale en saponines est de 5,6 % (masse/masse) contre 5,4 % (masse/masse) équivalent escin IB en CLHP-DEDL. La méthode gravimétrique, qui a tendance à surestimer la quantité de saponines permet. d'obtenir une valeur de 10,4 % (masse/masse) dans l'échantillon. [0127] Le [Table 1] regroupe les données majeures obtenues pour la mesure de la teneur totale en saponines dans l'échantillon de Camellie oleifera. [Tableauxl] Réalisée par le procédé selon l'invention Teneur (eq. escin 1B) Taux de re- couvrement sur extrait Teneur (eq. escin 1B) par CLHP- DEDL Teneur par gravimétrie 5,6% 100 ± 2 % 5,4% 10,4% [0128] Exemple 2 : Détermination de la teneur totale en saponines dans un échantillon de Chenopodium quinoa [0129] Il est connu que le Cherzopodiunt quinoa comprend essentiellement des saponines tri- 17 terpéniques. Dans cet exemple, l'escin IB est utilisée à titre de standard de saponines. [0130] Etablissement d'une courbe étalon avec une saponine de référence [0131] La courbe étalon est réalisée conformément à celle de l'exemple 1. [0132] Détermination de la teneur totale en saponines dans un échantillon de Chenopodium anima [0133] Un échantillon de Chenopodium quinoa est solubilisé dans du dichlorométhane afin d'obtenir une solution à 20 mg.m1 puis extrait aux ultrasons pendant 5 minutes à une température de 50 'C. La solution est ensuite filtrée sous vide sur un entonnoir contenant un disque fritté en verre de porosité 3. [0134] Le résidu est solubilisé avec 25 ml de méthanol puis extrait aux ultrasons pendant 5 minutes à une température de 50 'C. La solution est filtrée sous vide sur un entonnoir contenant un disque fritté en verre de porosité 3. Cette étape d'extraction est réalisée 3 fois et les filtrats réunis sont mis à sec par un évaporateur rotatif sous pression réduite. Le rendement d'extraction obtenu est de 45 %. [0135] Une quantité d'extrait est solubilisée dans du méthanol pour réaliser une solution à 10 mg.m1 'La solution est centrifugée à 10 000 g pendant 10 minutes. Un volume de 100 pl du surnageant est ajouté dans un tube à essai avec 100 pl d'une solution de panisaldéhyde solubilisée à 50% dans du méthanol (volume/volume). Un volume de 2 ml d'une solution d'acide sulfurique aqueuse à 50 % (volume/volume) est ajouté au tube à essai. Le tube à essai bouché est incubé dans un bain-marie à 60°C pendant 20 minutes puis placé dans un bain d'eau glacée pendant 10 minutes. L'absorbance spécifique des saponines est mesurée à 600 nm contre un blanc réalisé dans les mêmes conditions. La valeur obtenue reportée sur la droite d'étalonnage d'escin IB permet de calculer une concentration de 0,095 mg.m1' soit 9,5 % (masse/masse) d'escin IB dans l'extrait méthanolique et 4,3 % (masse/masse) équivalent escin TB dans l'échantillon de Chenopodium quinoa. [0136] Eléments de validation de la méthode [0137] Le coefficient de variation en répétabilité (CVr) réalisé sur 3 mesures est de 1 %. Un dopage réalisé à 125 % sur l'extrait méthanolique de Chenopodium quinoa permet d'obtenir un taux de recouvrement 105 ± 3% avec : [Math.2] teneur dopée x 100 Taux de recouvremeni - leneur non dopée + teneur ajout Où: Teneur non dopée : quantité de saponines totales mesurée dans l'extrait initial Teneur ajout : quantité de saponine de référence ajoutée dans l'extrait initial (25% dc la valeur initiale) Teneur dopée : quantité de saponines totales mesurée dans l'extrait dopé (à 125%) 18 [0138] Elément de comparaison [0139] Le procédé selon l'invention a été comparé avec une méthode développée en interne sur CLHP-DEDL. Dans l'échantillon de Chenopodium quinoa, la teneur totale en saponines est de 4,3 % (masse/masse), il est également de 4,3 % (masse/masse) équivalent cscin TB en CLHP-DEDL. [0140] Le [Table 2] regroupe les données majeures obtenues pour la mesure de la teneur totale en saponines dans l'échantillon de Chenopodium quinoa. [Tableaux2] Réalisée par le procéde selon l'invention Teneur (cg. cscin TB) Taux dc rc- couvrement sur extrait Teneur (cg. cscin IB) par CLHP-DEDL 4,3% 105 ± 3 % 4,3% [0141] Exemple 3 : Détermination de la teneur totale en saponines dans un échantillon de Trigonella foenum graecum [0142] Il est connu que le Trigonell a .fnenum graecurn comprend essentiellement des saponines stéroïdiques. Dans cet exemple, la protodioscine est utilisée à titre de standard de saponines. [0143] Etablissement d'une courbe étalon avec une saponine de référence [0144] 5 solutions étalon sont préparées en introduisant dans 5 tubes à essai un volume de 100 pl d'une solution étalon de protodioscine dans du méthanol, les concentrations desdites solutions étalon étant respectivement les concentrations desdites solutions étalon étant respectivement de 1 mg.m1-1, 2 me.m1-1, 3 mg.m1-1, 4 me.m1-1 et 5 me.m1-1. On ajoute à chacune de ces 5 solutions étalon 100 pl d'une solution de panisaldéhyde solubilisée à 50 % dans du méthanol (volume/volume), puis 2 ml d'une solution d'acide sulfurique aqueuse à 50 % (volume/volume). Les 5 tubes à essai sont bouchés et incubés dans un bain-marie à 60 °C pendant 20 minutes puis placés dans un bain d'eau glacé pendant 10 minutes. On obtient ainsi 5 solutions dont les concentrations d'escin TB dans le mélange réactionnel sont comprises entre 25 x 10-3 g/let 250 x 10-3 e/1 (25 pe.m1-1 à 250 pe.m1-1). L'absorbance spécifique de chaque étalon est mesurée à 600 nm contre un blanc réalisé dans les mêmes conditions. On obtient ainsi pour chaque concentration de protodioscine une absorbance que l'on reporte en fonction de la concentration pour obtenir la courbe étalon présentée en [fig.21. [0145] [fig.21 correspond à la droite de cal ibration de la protodioscine : cette droite correspond à l'absorbance en fonction de la concentration (en 10-3 g.1-1), cette droite a pour équation y = 0,0071x - 0,0509 avec R2= 0,9986. 19 [0146] Détermination de la teneur totale en saponines dans un échantillon de Trigonella foetzum graecum [0147] Un échantillon de Trigotzella foenwn graecurn est solubilisé dans du dichlorométhane afin d'obtenir une solution à 20 mg.m1-1 puis extrait aux ultrasons pendant 5 minutes à une température de 50 'C. La solution est ensuite filtrée sous vide sur un entonnoir contenant un disque fritté en verre de porosité 3. [0148] Le résidu est solubilisé avec 25 ml de méthanol puis extrait aux ultrasons pendant 5 minutes à une température de 50 'C. La solution est filtrée sous vide sur un entonnoir contenant un disque fritté en verre de porosité 3. Cette étape d'extraction est réalisée 3 fois et les filtrats réunis sont mis à sec par un évaporateur rotatif sous pression réduite. Le rendement d'extraction obtenu est de 22 %. [0149] Une quantité d'extrait est solubilisée dans du méthanol pour réaliser une solution à 10 mg.m11. La solution est centrifugée à 10 000 g pendant 10 minutes Un volume de 100 pl du surnageant est ajouté dans un tube à essai avec 100 pl d'une solution de panisaldéhyde solubilisée à 50 % dans du méthanol (volume/volume). Un volume de 2 ml d'une solution d'acide sulfurique aqueuse à 50 % (volume/volume) est ajouté au tube à essai. Le tube à essai bouché est incubé dans un bain-marie à 60°C pendant 20 minutes puis placé dans un bain d'eau glacée pendant 10 minutes. L'absorbance spécifique des saponines est mesurée à 600 nm contre un blanc réalisé dans les mêmes conditions. La valeur obtenue reportée sur la droite d'étalonnage de protodioscine permet de calculer une concentration de 0,29 mgml ' soit 29 % (masse/masse) dans l'extrait méthanolique et 6,4 % (masse/masse) équivalent protodioscine dans l'échantillon de Trigonella foenum graecum. [0150] Eléments de validation de la méthode [0151] Le coefficient de variation en répétabilité (CVr) réalisé sur 6 mesures est de 2% et en fidélité intermédiaire (CVR) réalisé sur 12 mesures est de 3%. Un dopage réalisé à 150% sur l'extrait méthanolique de Trigonella frenurn graecum permet d'obtenir un taux de recouvrement 102 ± 2% avec : [Math.2] teneur dopée Taux de recouvrement teneur non dopée + teneur ajout Où: Teneur non dopée : quantité de saponines totales mesurée dans l'extrait initial Teneur ajout : quantité de saponine de référence ajoutée dans l'extrait initial (50% de la valeur initiale) Teneur dopée : quantité de saponines totales mesurée dans l'extrait dopé (à 150%) [0152] Bernent de comparaison Le procédé selon l'invention a été comparé avec une méthode développée en interne 100 sur CLHP-DEDL ainsi que par la méthode gravimétrique (Budan et al., 2013). Dans l'échantillon de Trigonelle' foenunz graecum, la teneur totale en saponines est de 6,4 % (masse/masse) contre 6,2 % (masse/masse) équivalent protodioscine en CLHP-DEDL. La méthode gravimétrique, qui a tendance à surestimer la quantité de saponines permet d'obtenir une valeur de 11,2 % (masse/masse) dans l'échantillon. Le [Table 3] regroupe les données majeures obtenues pour la mesure de la teneur totale en saponines dans l'échantillon de Trigmzella foemun graecum. [Tableaux3] Réalisée par le procédé selon l'invention Teneur (cq. proto- dioscine) Taux dc re- couvrement sur extrait Teneur (eq. proto- dioscinc) par CLHP- DEDL Teneur par gravimétrie 6,4% 102 ± 2 % 6,2% 11,2% [0153] Exemple 4 : Détermination de la teneur totale en saponines dans un échantillon de Yucca schidigera [0154] 11 est connu que le Yucca schidigera comprend des saponines stéroïdiques. Dans cet exemple, la protodioscine est utilisée à titre de standard de saponines. [0155] Etablissement d'une courbe étalon avec une saponine de référence [0156] La courbe étalon est réalisée conformément à celle de l'exemple 3. [0157] Détermination de la teneur totale en saponines dans un échantillon de Yucca schidigera [0158] Un échantillon de Yucca schidigera est solubilisé dans du dichlorométhane afin d'obtenir une solution à 20 mg.m1-1 puis extrait aux ultrasons pendant 5 minutes à une température de 50 °C. La solution est ensuite filtrée sous vide sur un entonnoir contenant un disque fritté en verre de porosité 3. [0159] Le résidu est solubilisé avec 25 ml de méthanol puis extrait aux ultrasons pendant 5 minutes à une température de 50 °C. La solution est filtrée sous vide sur un entonnoir contenant un disque fritté en verre de porosité 3. Cette étape d'extraction est réalisée 3 fois et les filtrats réunis sont mis à sec par un évaporateur rotatif sous pression réduite. Le rendement d'extraction obtenu est de 28 %. [0160] Une quantité d'extrait est solubilisée dans du méthanol pour réaliser une solution à 10 me.m1-1. La solution est centrifugée à 10 000 g pendant 10 minutes. Un volume de 100 pl du surnageant est ajouté dans un tube à essai avec 100 pl d'une solution de panisaldéhyde solubilisée à 50 % dans du méthanol (volume/volume). Un volume de 2 ml d'une solution d'acide sulfurique aqueuse à 50 % (volume/volume) est ajouté au tube à essai. Le tube à essai bouché est incubé dans un bain-marie à 60°C pendant 20 21 minutes puis placé dans un bain d'eau glacée pendant 10 minutes. L'absorbance spécifique des saponines est mesurée à 600 nm contre un blanc réalisé dans les mêmes conditions. La valeur obtenue reportée sur la droite d'étalonnage de protodioscine permet de calculer une concentration de 0,28 mg.mH soit 28 % (masse/niasse) de protodioscinc dans l'extrait tnethanolique et 7,8 % (masse/masse) équivalent protodioscine dans l'échantillon de Yucca schidigera. [0161] Elements de validation de la méthode [0162] Le coefficient de variation en répétabilité (CVr) réalisé sur 3 mesures est de 2 %. Un dopage réalisé à 125 % sur l'extrait méthanolique de Yucca schidigera permet d'obtenir un taux de recouvrement 100 ± 2% avec : [Math.2] teneur dopée Taux de recouvrement = x 100 teneur non dopée + teneur ajout : Teneur non dopée : quantité de saponines totales mesurée dans l'extrait initial Teneur ajout : quantité de saponine de référence ajoutée dans l'extrait initial (25% de la valeur initiale) Teneur dopée : quantité de saponines totales mesurée dans l'extrait dopé (à 125%) [0163] Elément de comparaison [0164] Le procédé selon l'invention a été comparé avec une méthode développée en interne sur CLIIP-DEDL. Dans l'échantillon de Yucca schidigera, la teneur totale en saponines est de 7,8 % (masse/masse) contre 8,4 % (masse/masse) équivalent protodioscine en CLHP-DEDL. [0165] Le [Table 4] regroupe les données majeures obtenues pour la mesure de la teneur totale en saponines dans l'échantillon de Yucca schidigera. [Tableaux4] Réalisée par le procédé selon l'invention Teneur (eq. proto- dioscine) Taux de re- couvrement sur extrait Teneur (eq. protodioscine) par CLHPDEDL 7,8% 100 ± 2 % 8,4% [0166] Les exemples 1 à 4 mettent en évidence que le procédé selon l'inve ition donne une valeur en saponines très proche de la valeur développée en interne sur CLHP-DEDL. La mise en oeuvre du procédé selon l'invention est en outre beaucoup plus simple et met en oeuvre des moyens moins onéreux que la méthode sur CLHP-DEDL 101671 Exemple 5 : Détermination de la teneur totale en saponines dans un mélange contenant des saponines stéroïdiques et triterpéniques. [0168] Le procédé selon l'invention a été mis en oeuvre sur des échantillons comprenant un mélange d'un extrait de Cornent° niellera contenant des saponines triterpéniques et d'un extrait de Trignnella fnenum graecum contenant des saponines stérokliques. [0169] Estimation « théorique » de la teneur totale en saponines [0170] On entend par « estimation théorique » la teneur en saponines obtenue en addi- tionnant les teneurs en saponines de l'extrait de Camellia niellera et de l'extrait de Trigotzella foenum graecum obtenues séparément. [0171] La teneur en saponines (triterpéniques) de l'extrait de Cannet' oleifera d'une part et la teneur en saponines (stéroïdiques) de l'extrait de Trigonella foenum graecum d'autre part, ont été déterminée conformément au protocole présenté dans l'exemple 3 en utilisant la protodioscinc à titre de standard de saponines. Les teneurs en saponines obtenues sont de 26 % dans l'extrait de Camellia niellera et de 29 % dans l'extrait de Trigonella foenum graecum. [0172] Le [Table 5] présente la détermination des teneurs totales en saponines en fonction des pourcentages de chacun des extraits introduits dans trois échantillons dc mélanges. [Tableaux5] Proportion extrait &al-teilla oleifera / Tigonella foenum graecum (%m/m) Saponines de Camellia oleifera (m/m) eq. proto- dioscine Saponines de Tigonella foenum graecum (m/m) eq. protodioscine Teneur « théorique » totale en saponines du mélange (m/m) eq. protodioscine 80/20 20,9 % 5,9 % 26,8 % 50/50 13,1 % 14,7 % 27,8 % 20/80 5,2 % 23,5 % 28,7 % [0173] Détermination expérimentale de la teneur totale en saponines [0174] La teneur totale en saponines a été déterminée par le procédé selon la présente invention pour des mélanges d'extraits correspondant aux proportions suivantes : 80/20 ; 50/50 et 20/80 de Camellia oleifera I Trignnelia.foenum graecum (%m/m). [0175] Etablissement d'une courbe étalon avec une saponine de référence [0176] La teneur totale en saponines des échantillons contenant à la fois des saponines triter- péniques et stéroïdiques, peut être exprimée par tout standard de saponines provenant du groupe stéroïdique ou bien triterpénique. Dans cet exemple, la protodioscine est utilisée à titre de standard de saponines pour estimer la teneur totale en saponines des différents échantillons de mélanges. [0177] La courbe étalon est réalisée conformément à celle de l'exemple 3 [0178] Détermination de la teneur totale en saponines dans les différents échantillons de mélanges 23 [0179] Pour les différents échantillons (contenant des extraits de Caznellia oleifera et de Trigonella foenum graecurn), une quantité est solubilisée dans du méthanol pour réaliser une solution à 10 mg.mI-I. La solution est centrifugée à 10 000 g pendant 10 minutes. Un volume de 100 pl du surnageant est ajouté dans un tube à essai avec 100 pl d'une solution de p-anisaldéhyde solubilisée à 50 % dans du méthanol (volume/volume). Un volume de 2 ml d'une solution d'acide sulfurique aqueuse à 50 % (volume/volume) est ajouté au tube à essai. Le tube à essai bouché est incubé dans un bain-marie à 60 °C pendant 20 minutes puis placé dans un bain d'eau glacée pendant 10 minutes. L'absorbance spécifique des saponines est mesurée à 600 mn contre un blanc réalisé dans les mêmes conditions. La valeur obtenue reportée sur la droite d'étalonnage de protodioscine permet d'estimer la teneur totale en saponines dans les différents mélanges. [0180] Le [Table 6] présente les valeurs dites « expérimentales » c'est-à-dire obtenues pour les différents échantillons contenant des mélanges d'extraits de Canzellia oleifera et de Trigonella foenum graecurn ainsi que les valeurs dites « théoriques » définies ci-dessus (c.f. [Table 5] ci-dessus). [Tableaux6] Proportion extrait Cainellia oleifera / Tigonella foenum graecum (%m/m) Teneur totale expé- rimentale (m/m) eq. protodioscine Teneur totale théorique (m/m) eq. protodiosicine Biais relatif 80/20 27,1 % 26,8 % 1,1 % 50/50 26,9 % 27,8 % -3,2 % 20/80 28,0 % 28,7 % -2,4 % [0181] Avec : [Math.3] Biais relatif= Teneur expérimentale - teneur théorique teneur théorique 100 Où: - Teneur expérimentale : quantité totale en saponines déterminée expérimentalement dans les échantillons de mélanges - Teneur théorique : quantité totale en saponines calculée en additionnant les teneurs en saponines des extraits de Camellia oleifèra et de Trigoizella fiJezzum graenen. [0182] Le procédé selon l'invention permet de déterminer la teneur totale en saponines des trois mélanges d'extraits de Camellia oleifera et de Trigonella foenunz gamelan. Les valeurs obtenues en appliquant le procédé selon l'invention à un mélange d'extraits ne sont éloignées que d'un biais relatif de 3 % des valeurs obtenues en appliquant le 24 procédé selon l'invention à chaque extrait constituant ledit mélange. [0183] Exemple 6 : Détermination des teneurs respectives en saponines triterpéniquess et en saponines stéroïdiques dans un échantillon contenant des saponines triterpénioues et stéroïdiaues [0184] Le procédé selon l'invention a été a été appliqué à des échantillons de mélanges d'extrait de Ccunellia niellera et d'extrait de Tri gonella fnenum graectinz afin de déterminer la teneur totale en saponines ainsi que les teneurs respectives en saponines tri-terpéniques et en saponines stéroïdiques dans ces échantillons de mélanges. Ces déterminations sont réalisées en trois étapes. [0185] La première étape correspond à la détermination de la teneur totale en saponines dans un mélange contenant des saponines stéroïdiques et triterpéniques, cette étape est décrite dans l'exemple 5 ci-dessus. Elle met notamment en oeuvre une étape de mesure de l'absorbance à 600 nm du produit obtenu à l'issue d'une réaction chromogène sur l'échantillon. [0186] La seconde étape correspond à la détermination de la teneur totale en saponines sté- roïdiques dans un mélange contenant des saponines stéroïdiques et triterpéniques. Elle met notamment en oeuvre une étape de mesure de l'absorbance à 425 nm du produit obtenu à l'issue d'une réaction chromogène sur l'échantillon. [0187] La troisième étape permet, par différence, de déterminer la teneur totale en saponines triterpéniques dans un mélange contenant des saponines stéroïdiques et triterpéniques. [0188] Première étape : Détermination de la teneur totale en saponines [0189] Comme déjà mentionné, la première étape correspond à l'exemple 5 ci-dessus, les valeurs obtenues pour les différents échantillons sont présentées dans le [Table 6] ci-dessus. [0190] Seconde étape : Détermination de la teneur en saponines stéroïdiques [0191] Pour la seconde étape, on utilise un standard de saponines stéroïdiques. Par le procédé selon l'invention, la teneur en saponines stéroïdiques a été déterminée pour des échantillons de mélanges correspondant aux proportions suivantes : 80/20 ; 50/50 et 20/80 de Catnellia oletfera I Trigonella foentun graecum (%m/m). [0192] Etablissement d'une courbe étalon avec une saponine de référence [0193] La teneur en saponines stéroïdique est exprimée avec un standard appartenant aux groupes des saponines stéroïdiques. Dans cet exemple, la protodioscine est utilisée à titre de standard des saponines. [0194] 5 solutions étalon sont préparées en introduisant dans 5 tubes à essais un volume de 100 pl d'une solution étalon de protodioscine dans du méthanol, les concentrations desdites solutions étalon étant comprises entre 0,2 et 1 mg.m1-1 On ajoute à chacune de ces solutions étalon 100 pl d'une solution de p-anisaldéhyde solubilisée à 10 % dans de l'éthanol (volume/volume), puis 2 ml d'une solution d'acide sulfurique éthanolique à 12,5 % (volume/volume). Les tubes à essai sont bouchés et incubés dans un bain-marie à 60°C pendant 20 minutes puis placés dans un bain d'eau glacée pendant 10 minutes. On obtient ainsi 5 solutions dont les concentrations de protodioscine dans le mélange réactionnel sont comprises entre 4 x 10-3 g.I-1 et 40 x 10-3 g.1-1 (4 pg.m1-1 à 40 p.g.m1-1). L'absorbance spécifique de chaque étalon stéroïdique est mesurée à 425 nm contre un blanc réalisé dans les mêmes conditions. On obtient ainsi pour chaque concentration de protodioscine une absorbancc que l'on reporte en fonction de la concentration pour obtenir une courbe étalon présentée en [fig.3]. [0195] [fig.3]L'équation de la droite représentée en est y = 0,0309x + 0,0175 avec R2 = 0,9994 [0196] Détermination de la teneur en saponines stéroïdiques dans les différents échantillons de mélanges [0197] Pour chaque échantillon de mélanges, une quantité est solubilisée dans du méthanol pour réaliser une solution à 10 mg.m1-1. La solution est centrifugée à 10 000 g pendant 10 minutes. Un volume de 100 pl du surnageant est ajouté dans un tube à essai avec 100 pl d'une solution de p-anisaldéhyde solubilisée à 10 % dans de l'éthanol (volume/volume). Un volume de 2 ml d'une solution d'acide sulfurique éthanolique à 12,5 % (volume/volume) est ajouté au tube à essai. Le tube à essai bouché est incubé dans un bain-marie à 60°C pendant 20 minutes puis placé dans un bain d'eau glacée pendant 10 minutes. L'absorbance spécifique des saponines stéroïdiques est mesurée à 425 nm contre un blanc réalisé dans les mêmes conditions. La valeur obtenue reportée sur la droite d'étalonnage de protodioscine permet d'estimer la teneur en saponines stéroïdiques dans les différents échantillons de mélanges. [0198] Le [Table 7] présente les valeurs dites « expérimentales » en saponines stéroïdiques obtenues pour les différents échantillons de mélanges ainsi que les valeurs dites « théoriques » qui correspondent aux valeurs de saponines stéroïdiques présentées dans le [Table 5]. [Tableaux7] Proportion extrait Camellia oleifera / Tigonella foenum graecum (%m/m) Teneur totale expé- rimentale en saponines sté- roïdiques (m/m) eq. protodioscine Teneur théorique en saponines stéroïdiques (m/m) eq. protodiosicine Biais relatif 80/20 5,9% 5.9% 0% 50/50 14,8 % 14,7 % 0,68 % 20/80 23,2 % 23,5 % -1,28 % 26 [0199] Avec : [Math.3] Teneur expérimentale - teneur théorique Bais rel tif - .100 teneur théorique Où: - Teneur expérimentale : quantité de saponines stéroïdiques déterminée expérimentalement dans les échantillons de mélanges - Teneur théorique : quantité de saponines stéroïdiques déterminée sur la base de l'extrait contenant essentiellement des saponines stéroïdiques. [0200] Troisième étape : détermination de la teneur en saponines tritérpéniques [0201] La teneur en saponines triterpéniques présentes dans les échantillons de mélanges contenant à la fois des saponines triterpéniques et stéroïdiques est déterminée de la façon suivante : [Math.5] Teneur saponines tri e én/. es - Teneur totale en saponines-teneur er saponities stéroïdiques Où: - Teneur totale en saponines correspond à la teneur totale en saponines déterminée à la première étape ci-dessus en mg/g - Teneur en saponines stéroïdiques correspond à la teneur en saponines stéroïdiques déterminée à la seconde étape ci-dessus en mg/g [0202] Le [Table 8] présente les teneurs en saponines triterpéniques calculées par différence entre les données expérimentales obtenues à la première étape ([Table 6]) et les données expérimentales obtenues à la seconde étape ([Table 7]) puis comparées aux valeurs théoriques établies au [Table 5], Pt colonne en mg/g. [Tableaux8] Proportion extrait Camellia oleifera / Tigonella foenum graecum (%m/m) Teneur totale expé- rimentale en saponines tiller- péniques (mg/g) eq. protodioscine Teneur théorique en saponines triterpéniques (mg/g) eq. protodiosicine Biais relatif 80/20 212 209 1,4 % (271-59) 50/50 121 131 -7,6% (269-59) 20/80 48 52 -7,7 % (280-232) 102031 Avec : 27 [Math.3] Teneur expérimentale -teneur théorique Biais relatif - 100 teneur théorique : - Teneur expérimentale : quantité de saponines triterpéniques déterminée expérimentalement dans les échantillons de mélanges en mg/g - Teneur théorique : quantité de saponines triterpéniques déterminée sur la base de l'extrait contenant essentiellement des saponines triterpéniques en mg/g. [0204] Les valeurs des teneurs en saponines stéroïdiques d'une part et. en saponines triter- péniques d'autre part obtenues en appliquant le procédé selon l'invention à un mélange d'extraits ne sont éloignées respectivement que d'un biais relatif de 1 % et 8 % des valeurs obtenues en appliquant le procédé selon l'invention à chaque extrait constituant ledit mélange. 102051 Exemple 7 : Détermination de la teneur totale en saponines dans un échantillon liquide de Yucca schidigera 102061 La détermination de la teneur totale en saponines est effectuée directement sans étape d'extraction préalable. 102071 Etablissement d'une courbe étalon avec une saponine de référence 102081 Dans cet exemple, la protodioscine est utilisée à titre de standard de saponines. 102091 La courbe étalon est réalisée conformément à celle de l'exemple 3. 102101 Détermination de la teneur totale en saponines dans un échantillon liquide de Yucca schidigera 102111 Un échantillon liquide de Yucca schidigera est introduit dans du méthanol pour réaliser une solution à 10 mgml I. La solution est centrifugée à 10 000 g pendant 10 minutes. Un volume de 100 utl du surnageant est ajouté dans un tube à essai avec 100 d'une solution de p-anisaldéhyde solubilisée à 50 % dans du méthanol (volume/volume). Un volume de 2 ml d'une solution d'acide sulfurique aqueuse à 50 % (volume/volume) est ajouté au tube à essai. Le tube à essai bouché est incubé dans un bain-marie à 60°C pendant 20 minutes puis placé dans un bain d'eau glacée pendant 10 minutes. L'absorbancc spécifique des saponines est mesurée à 600 nm contre un blanc réalisé dans les mêmes conditions. La valeur obtenue reportée sur la droite d'étalonnage de protodioscinc permet de calculer une concentration de 0,081 mg.m1' soit 8,1 % (Masse/masse) équivalent protodioscinc dans l'échantillon liquide de Yucca schidigera. [0212] Elements de validation de la méthode [0213] Le coefficient de variation en répétabilité (CVr) réalisé sur 3 mesures cst de 1 %. Un dopage réalisé à 125 % sur l'échantillon de Yucca schidigera permet d'obtenir un taux de recouvrement 97 ± 2% avec : 28 IMath.21 teneur dopée Taux de recouvrement - 100 teneur non dopée + teneur ajout \ : - Teneur non dopée : quantité de saponines totales mesurée dans l'échantillon initial, - Teneur ajout : quantité de saponine de référence ajoutée dans l'échantillon initial (25% de la valeur initiale) - Teneur dopée : quantité de saponines totales mesurée dans l'échantillon dopé (à 125%). [0214] Elément de comparaison [0215] La présente méthode a été comparée avec une méthode développée en interne sur CLHP-DEDL. Dans l'échantillon de Yucca schidigera, la teneur totale en saponines est de 8,1 % (masse/masse) contre 7,2 % (masse/masse) équivalent protodioscine en CLHP-DEDL. [0216] Le [Table 9] regroupe les données majeures obtenues pour la teneur totale en saponines dans l'échantillon de Yucca schidigera. [Tableaux9] Réalisée par le procédc selon l'invention Teneur (eq. proto- dioscine) Taux de re- couvrement sur extrait Teneur (eq. protodioscine) par CLHPDEDL 8,1% 97 ± 2 % 7,2% [0217] Le procédé selon l'invention donne une valeur en saponines très proche de la valeur développée en interne sur CLHP-DEDL. La mise en oeuvre du procédé selon l'invention est en outre beaucoup plus simple et met en oeuvre des moyens moins onéreux que la méthode sur CLHP-DEDL. Références [0218] Arihara S., Haji K., Miyashita Y., Shobu H., Takcmoto T., Taniguchi S. Quantitative determination of saponin of gynostemma pentaphyllum. JPS60219556A. 1985. [0219] Attelc A. S., Wu J. A., Yuan C. S. « Ginseng pharmacology: multiple constituents and multiple actions ». Biochcm. Pharmacol. 1999. Vol. 58, n°11, p. 1685-1693. [0220] Baccou J. C., Lambert F., Sauvaire Y. « Spectrophotometric method for the &ter- mination of total stcroidal sapogcnin ». The Analyst. 1977. Vol. 102, n°1215, p. 458. 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[0236] CN106404685A: Method for deteimination of total saponin content in health wine. 30 REVENDICATIONS[Revendication I] Procédé de détermination de la teneur totale en saponines d'un échantillon, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes, dans cet ordre : (1) réaliser une réaction en ajoutant audit échantillon solubilisé dans au moins un solvant, du p-anisaldéhyde et de l'acide sulfurique en une quantité allant de 25 % à 60 %, de préférence de 30 % à 55 %, en volume par rapport au volume total du mélange réactionnel ; (2) chauffer le mélange réactionnel à une température allant de 45°C à 80°C, de préférence égale à 60°C, pour obtenir un chromophore en solution ; (3) mesurer l'absorbance de la solution du chromophore obtenu à une longueur d'onde allant de 580 à 630 nm, de préférence de 590 à 620 nm et de manière préférée 600 nm ; (4) réaliser une gamme de solutions étalon de saponines, dans les conditions de réaction des étapes (1) et (2), dont les absorbances après réaction chromogène à la longueur d'onde définie à l'étape (3) vont de 0 à 1,5 UA, de préférence de 0 à 1 UA; (5) quantifier la teneur en saponines de l'échantillon en comparant l'absorbance de la solution du chromophore mesurée à l'étape (3) à la gamme d'absorbances des solutions étalon réalisées à l'étape (4). [Revendication 2] Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'échantillon utilisé à l'étape (1) est solubilisé dans un solvant choisi dans le groupe consistant en l'eau, les alcools en CI-C4 et leurs mélanges, de préférence le méthanol ou l'éthanol et de manière préférée le méthanol. [Revendication 3] Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la quantité de p-anisaldéhyde ajouté à l'étape (1) va de 0.1 % à 10 %, de préférence de 2 % à 5 % et de manière préférée 3 % en volume par rapport au volume total du mélange réactionnel. [Revendication 4] Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, ca- ractérisé en ce que le temps de chauffage du mélange réactionnel va de 1 à 60 minutes, de préférence de 10 à 30 minutes. [Revendication 5] Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes ca- ractérisé en ce que l'échantillon comprend au moins une partie d'au moins une plante à saponines, de préférence choisie dans le groupe constitué par les Theaceae, les Chenopodiaceae, les Fabaceae, les Agavaceae et. leurs mélanges et en particulier Gamelin.' olefeira, Che- 31 [Revendication 6] [Revendication 7] [Revendication 8] [Revendication 9] napadium quinoa. Trigonella foenuni graecunt, Yucca schuligera et leurs mélanges. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que l'échantillon comprend au moins une partie d'au moins un organisme marin, de préférence choisi dans le groupe formé par les Echinadennaw et les Pontera et leurs mélanges, en particulier les concombres de mer, les étoiles de mer et les éponges de mer et leurs mélanges. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les saponines sont choisies dans le groupe consistant en les saponines triterpéniques, les saponines stéroidiques et leurs mélanges. Procédé de détermination de la teneur totale en saponines d'un échantillon selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce qu'un procédé de détermination de la teneur en saponines stéroïdiques dudit échantillon est mis en oeuvre avant, après ou simultanément aux étapes (I) à (5), ledit procédé de détermination de la teneur en saponines stéroïdiques comprenant au moins les étapes suivantes, dans cet ordre : (i) réaliser une réaction en ajoutant audit échantillon solubilisé dans au moins un solvant, du p-anisaldéhyde et de l'acide sulfurique en une quantité allant de 5 % à 25 %, de manière préférée de 10 % à 15 % et préférentiellement de 12,5 % en volume pal- rapport au volume total du mélange réactionnel ; (ii) chauffer le mélange réactionnel à une température allant de 45°C à 80°C, de manière préférée égale à 60°C, pour obtenir un chromophore en solution ; (iii) mesurer l'absorbance de la solution du chromophore obtenu à une longueur d'onde allant de 400 à 450 nm, de manière préférée 425 nm ; (iv) réaliser une gamme de solutions étalon de saponines stéroïdiques, dans les conditions de réaction des étapes (1) et (ii), dont les absorbances après réaction chromogène à la longueur d'onde définie à l'étape (iii) vont de 0 à 1,5 UA, de préférence de 0 à 1 UA ; (y) quantifier la teneur en saponines stéroïdiques de l'échantillon en comparant l'absorbance de la solution du chromophore mesurée à l'étape (iii) à la gamme d'absorbances des solutions étalon réalisées à l'étape (iv). Procédé de détermination de la teneur totale en saponines selon la re- 31 [Revendication 10] [Revendication 11] [Revendication 12] [Revendication 13] [Revendication 14] vendication 8 caractérisé en cc que l'échantillon de l'étape (i) est solubilisé dans un solvant choisi dans le groupe consistant en l'eau, les alcools en C1-C4 et leurs mélanges, de préférence l'éthanol ou le méthanol, de manière préférée l'éthanol. Procédé de détermination de la teneur totale en saponines selon la revendication 8 ou 9 caractérisé en cc que la quantité de p-anisaldéhyde à l'étape (i) va de 0,1 % à 2%, de manière préférée 0,5 %, en volume par rapport au volume total du mélange réactionnel. Procédé de détermination de la teneur totale en saponines selon l'une quelconque des revendications 8 à 10 caractérisé en ce que le temps de chauffage du mélange réactionnel selon l'étape (ii) va de 1 à 60 minutes, de préférence de 10 à 30 minutes. Procédé de détermination de la teneur totale en saponines selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce qu'une étape préliminaire comprenant au moins une extraction des saponines de l'échantillon est effectuée avant l'étape (1) et, si présente, avant l'étape (i) ; ladite au moins une extraction des saponines de l'échantillon étant choisie de préférence dans le groupe consistant en les extractions sous pression, les extractions par macération, les extractions par micro-ondes, les extractions par ultrasons, les extractions par reflux, de manière préférée ladite étape préliminaire est une extraction des saponines de l'échantillon par ultrasons. Procédé selon la revendication précédente caractérisé en ce que ladite au moins une extraction est effectuée en présence d'un solvant choisi dans le groupe consistant en les solvants aqueux, ioniques, organiques et leurs mélanges, de préférence dans le groupe consistant en l'eau, le méthanol, l'éthanol, l'acétonitrile, l'acétate d'éthyle et leurs mélanges, de manière préférée le méthanol. Procédé de détermination de la teneur totale en saponines d'un échantillon selon l'une quelconque des revendications 8 à 13 caractérisé en ce que ledit échantillon comprend des saponines stéroïdiques et des saponines triterpéniques et que la teneur en saponines triterpéniques dudit échantillon est déterminée par différence entre la teneur totale en saponines dudit échantillon déterminée à l'issue de l'étape (5) et la teneur en saponines stéroïdiques déterminée à l'issue de l'étape (y).