Brevet FR3098223A1 — publié le 20210108

Description Titre de l'invention : PROCEDE DE PRODUCTION IN VITRO DE NEURONES DE MAMMIFERES Domaine technique [0001] L'invention a trait à un procédé de production in vitro de neurones de mammifères. Plus particulièrement, le procédé selon l'invention permet de produire des neurones exprimant les 6 isoformes de la protéine Tau (2N4R, 1N4R, ON4R, 2N3R, 1N3R, ON3R). L'invention trouve des applications en lien avec les maladies neurodégénératives, notamment dans le domaine du diagnostic et de la thérapie cellulaire, ainsi que pour l'identification et le développement de nouveaux traitements thérapeutiques. ARRIERE PLAN TECHNOLOGIQUE [0002] Tau est une protéine multifonctionnelle, identifiée à l'origine comme une protéine cy- toplasmique associée aux microtubules. Six isoformes de Tau sont exprimées dans le cerveau humain adulte, résultant de l'épis sage alternatif du gène MAPT. L'épissage de Tau est régulé au cours du développement de telle sorte que seule l'isotonie la plus courte de Tau est exprimée dans le cerveau foetal, contrairement au cerveau adulte qui exprime les 6 isoformes. [0003] L'accumulation de dépôts intracellulaires pathologiques de la protéine Tau est la marque de nombreuses maladies neurodégénératives appelées tauopathies (Sergeant et al., 2008). Il est important de noter que la composition protéique (identité des isoformes de Tau présentes), la morphologie et la distribution anatomique des dépôts intracellulaires de Tau permettent de distinguer les différentes tauopathies. Dans la maladie d'Alzheimer (MA), les 6 isotonies Tau sont anormalement phosphorylées et agrégées. Dans la maladie de Pick, les isoformes de Tau 3R prédominent, tandis que des formes agrégées de Tau 4R prévalent dans la dégénérescence corticobasale et la paralysie supranucléaire progressive. D'autre part, plus de 50 mutations délétères ont été identifiées au sein du gène MAPT chez des patients atteints de démence lobaire frontotemporale liés au chromosome 17 (FTDP-17). Les mutations identifiées conduisent soit à une capacité réduite des protéines Tau à interagir avec les microtubules ou d'autres partenaires, soit à une surproduction d'isoformes 4R, ce qui entraîne un changement dans le rapport entre les isoformes 3R et 4R dans la cellule. 100041 Au cours de la dernière décennie, la technologie des cellules souches pluripotentes induites humaines (iPSC) a ouvert de nouvelles perspectives dans la modélisation des maladies humaines. Plusieurs groupes ont déjà démontré que les neurones dérivés d'iPSC peuvent être un outil précieux pour étudier les tauopathies. Cependant, l'immaturité relative des neurones issus d'iPSC constitue un défi majeur pour la récapi- 2 tulation in vitro de la pathologie Tau. De nombreuses études ont montré que les neurones corticaux dérivés d'iPSC de type « sauvage » expriment principalement l'isoforme Tau embryonnaire ON3R (Biswas et al, 2016 ; Hallmann et al, 2017 ; lmamura et al, 2016 ; lovino et al, 2015 ; Sato et al, 2018 ; Silva et al, 2016; Verheyen et al, 2018, 2015). Même si la plupart de ces études ont décrit une transition de l'isoforme ON3R unique vers la production mixte d'isoformes Tau 3R et 4R au cours de la procédure de différenciation, fisoforme Tau ON3R reste largement majoritaire. L'allongement du temps de culture jusqu'à 365 jours a permis la détection des isoformes protéiques ON3R, ON4R, 1N3R et 1N4R de Tau dans les neurones dérivés d'iPSC (Lovino et al., 2015 ; Sposito et al., 2015), mais toujours avec une prédominance du ON3R. La présence d'isoformes de Tau adultes a également été décrite au niveau ARN dans les neurones corticaux dérivés d'iPSC (Ehrlich et al., 2015). Cependant, les isoformes protéiques correspondantes n'ont pas pu être détectées. Seule l'isoforme foetale Tau ON3R était présente dans ces neurones corticaux dérivés d'iPSC. [0005] Tl existe donc un besoin en modèle de neurones adultes, c'est-à-dire exprimant les 6 isoformes de la protéine T, afin de pouvoir étudier les tauopathies, notamment les tauopathies liées à Tau 4R. Résumé de l'invention [0006] En travaillant sur la différenciation des neurones et l'expression des différentes isoformes de la protéine Tau chez l'adulte, les inventeurs ont découvert qu'il est possible de produire in vitro des neurones exprimant les 6 isoformes en cultivant des cellules souches dans des microcompartiments cellulaires creux à base d'alginate, permettant une culture en 3D, dans un milieu de culture permettant la différenciation neuronale. Avantageusement, cette étape est conduite au sein d'un bioréacteur dans lequel les microcompartiments sont maintenus en suspension dans ledit milieu de différenciation neuronale. Les inventeurs ont également mis en évidence qu'en utilisant un milieu de différenciation neuronale particulier comprenant du chlorure de sodium, un sel inorganique ncuroactif, de la glycine, de la L-alanine et de la L-scrinc, il est possible d'obtenir des cellules neuronales post-mitotiques comprenant les 6 isoformes de la protéine Tau dans des temps relativement courts, compris entre 5 et 50 semaines. Les inventeurs ont ainsi mis au point des procédés de culture permettant d'obtenir de tels neurones après seulement quelques semaines. [0007] L'invention a donc pour objet un procédé de production in vitro de neurones de mammifère exprimant les 6 isoformes de la protéine Tau (2N4R, 1N4R, ON4R, 2N3R, 1N3R, ON3R), comprenant une étape de différentiation neuronale, selon laquelle on cultive des microcompartiments cellulaires comprenant chacun une capsule creuse en hydrogel entourant des cellules neuronales post-mitotiques et une matrice ex- 3 tracellulaire, ladite étape de différentiation neuronale étant réalisée dans un bioréacteur, les microcompartiments cellulaires étant maintenus en suspension dans une enceinte dudit bioréacteur contenant un milieu de différenciation neuronale pendant une période comprise entre 5 semaines et 100 semaines. [0008] L'invention a également pour objet un procédé de production in vitro de neurones de mammifère exprimant les 6 isoformes de la protéine Tau (2N4R, 1N4R, ON4R, 2N3R, 1N3R, ON3R), comprenant une étape de dc différentiation neuronale selon laquelle on cultive pendant une période comprise entre 5 semaines et 100 semaines, préférentiellement entre Set 50 semaines, plus préférentiellement entre 10 et 50 semaines, encore plus préférentiellement entre 20 et 25 semaines, des microcompartiments cellulaires comprenant chacun une capsule creuse en hydrogel entourant des cellules neuronales post-mitotiques et une matrice extracellulaire dans un milieu de différenciation neuronale comprenant au moins un sel inorganique neuroactif, de la glycine, de la L-alaninc et de la L-serine. Lesdits composés sont chacun présents à une concentration qui maintient la survie et la fonctionnalité neurale d'une cellule neuronale. [0009] L'invention a également pour objet des cellules neuronales post-mitotiques non na- turelles, susceptibles d'être obtenues par le procédé selon l'invention, dans lesquelles les 6 isoformes de la protéine tau sont exprimées. [0010] Avantageusement, de telles cellules neuronales post-mitotiques présentent un ratio d'expression des isoformes de 3R et 4R compris entre 1/3 et 3, plus préférentiellement compris entre 1/2 et 2, encore plus préférentiellement compris entre 34 et 4/3, idéalement à 10% d'un ratio équimolaire. Les isoformes 2N, IN et ON représentent avantageusement, respectivement, plus de 3%, plus de 17% et moins de 90% des isoformes totales, préférentiellement respectivement plus de 5%, plus de 26% et moins de 50%, encore plus préférentiellement respectivement plus de 8%, plus de 45% et moins de 45%, idéalement respectivement 9%, 54%, and 37%. Brève description des dessins [0011] [fig.1] montre une caractérisation moléculaire des iPSC, des NSC et des neurones dérivés d' iPSC. Analyse par RT-PCR à 15, 20 et 25 semaines (15s, 20s, 25s), des iPSCs (A), NSCs (B) et neurones différenciés à différents points de différenciation (C-F), en utilisant le marqueur de pluripotence POU5F1 (A), le marqueur des NSC OTX-1 (B), deux marqueurs spécifiques des neurones de la couche supérieure du cortex : CALB1 (C) et RELN (D), GFAP comme marqueur d'astrocyte (E) et le marqueur spécifique des oligodendrocytes CLDN11 (F). Les cellules ont été différenciées pendant 15, 20 ou 25 semaines (w), en milieu DMEM/F12 - Neurobasal (D/N) ou BrainPhys. [0012] [fig.2] montre la détection des 6 isotonies adultes d'ARNm de MAPT dans des extraits de cerveau. (A) Représentation schématique des différentes isoformcs de MAPT analysées. Les tailles attendues pour chaque produit de PCR ont été calculées en fonction de l'emplacement des amorces couvrant les cxons 1 et 11. (B) Chaque pic correspond à une isoforme MAPT différente. L'axe Y affiche la fluorescence en unités arbitraires et l'axe X indique la taille en pli. [0013] [fig.3] montre l'expression des isotonies d'ARNm et de protéines MAPT adultes dans les neurones dérivés d'iPSC (A) Représentation de l'expression relative des 6 isoformcs de MAPT dans les neurones induits à partir d'iPSC après 15, 20 et 25 semaines de maturation par analyse RT-qPCR. Les cellules ont été différenciées pendant 15,20 ou 25 semaines (s), en milieu DMEM/E12 - Neurobasal (D/N) ou BrainPhys. (B) L'analyse par Western Blot de protéines extraites de capsules neuronales de 25 semaines maintenues en BrainPhys. Le traitement avec la Lambda phosphatase révèle la présence de 4 isoformcs de Tau, correspondant à 1N4R, 1N3R, ON4R et ON3R. Les isoformes 2N ne sont pas détectables. [0014] [fig.4] représente la quantification de l'expression relative des 6 isotonies adultes d'ARNm de MAPT. Les isoformes d'ARNm de MAPT ont été quantifiées soit individuellement (A), soit regroupées en fonction de l'inclusion de l'exon 10 (B), soit dc des cxons 2 et 3 (C). (A) Les données représentent l'écart type moyen (SD) d'au moins deux expériences indépendantes. [0015] [fig.5] montre la détection et quantification des isoformes adultes d'ARNm de MAPT. Analyses spécifiques de la proportion relative des isoformes ON, IN et 2N (A), ou des isofomies 3R et 4R (B) dans les NSC ou dans les neurones dérivés des iPSC par RT-qPCR. Les cellules neuronales ont été différenciées pendant 15, 20 ou 25 semaines (w), en milieu DMEM/F12 - Neurobasal (D/N) ou BrainPhys. Pour chaque analyse (A, B), une représentation schématique des différentes isoformes d'ARNm de MAPT analysées, la taille attendue du produit de PCR calculée en fonction de l'emplacement des amorces et un électrophérogramme représentatif sont présentés. L'axe Y affiche la fluorescence en unités arbitraires et l'axe X indique la taille en ph. (C) Les valeurs quantitatives sont indiquées dans les tableaux. Les données représentent l'écart type moyen (SD) d'au moins deux expériences indépendantes. [0016] [fig.6] montre la détection et quantification des isoformes adultes d'ARNm de MAPT après exclusion des transcrits ON3R Analyses spécifiques des transcrits 1N3R, 1N4R, 2N3R et 2N4R (A) ou des isofoimes 4R-Tau (B) dans des extraits de cerveau ou dans des capsules neuronales de 25 semaines maintenues en BrainPhys par RT-qPCR. (A) L'utilisation des amorces ex2 et exil a permis d'amplifier uniquement les isoformes IN et 2N. (B) L'utilisation des amorces exl et ex10 a permis l'amplification spécifique des isoformes 4R. Pour chaque analyse (A, B), une représentation schématique des dif- férentes isoformes de MAPT analysées et la taille attendue du produit de PCR calculée en fonction de l'emplacement des amorces sont présentées. Les valeurs quantitatives correspondantes sont indiquées dans les tableaux de gauche (A: amplification ex2/ex11, B : amplification exl/ex10). Les tableaux de droite (A, B : exl/ex11) présentent les données obtenues lorsque les 6 isoformes d'ARNm de MAPT ont été simultanément amplifiées à l'aide de l'exl-exll (Fig. 4A) et l'expression relative des isoformes 1N3R, 1N4R, 2N3R et 2N4R calculée sans inclure les isoformes ON (A) ou l'expression relative des isoformes ON4R, 1N4R et 2N4R calculée sans inclure les isoformes 3R (B). Description des modes de réalisation [0017] La présente invention concerne un procédé de culture et de production de cellules neuronales post-mitotiques exprimant les 6 isoformes 2N4R, 1N4R, ON4R, 2N3R, 1N3R, ON3R de la protéine Tau. Ce profil d'expression est caractéristique des neurones adultes, et ne se retrouve pas notamment au niveau embryonnaire. Jusqu'à présent, les procédés de production in vitro de cellules neuronales n'avaient pas abouti à la production de cellules neuronales exprimant ces 6 isoformes. Les inventeurs ont eu le mérite de découvrir et montrer qu'il est possible de produire in vitro de tels neurones, à haut débit et dans des délais raisonnables (de l'ordre de quelques dizaines de semaines), en combinant une culture de cellules en 3D à un milieu de différenciation. [0018] L'utilisation de microcompartiments cellulaires comprenant une enveloppe externe creuse d'hydrogel encapsulant les cellules et de la matrice extracellulaire est particulièrement avantageuse et permet, dans le cadre de la présente invention, de favoriser la différentiation cellulaire et la maturation des neurones jusqu'au stade post-mitotique caractéristique des neurones adultes. [0019] Microcomparti ment cellulaire [0020] Le procédé selon l'invention met en oeuvre des microcompartiments cellulaires renfermant des cellules. Chaque microcompartimcnt cellulaire comprend une capsule creuse en hydrogel réticulé, dans laquelle sont logées des cellules, noyées dans une matrice extracellulaire. [0021] Dans un mode de réalisation, la capsule d'hydrogel renferme un unique ensemble de cellules. Par unique, on entend que la capsule ne contient qu'un groupe de cellules, qui peut être plus ou moins cohésif. Notamment, un ensemble de cellules unique s'entend d'une structure cellulaire tridimensionnelle dans laquelle chaque cellule dudit ensemble est en contact physique avec au moins une autre cellule dudit ensemble. [0022] Avantageusement, les cellules sont autoorganisées en un ensemble de cellules posi- tionnées de manière particulière les unes par rapport aux autres pour créer des in- 6 tcractions et communications cellulaires et former une microstructure tridimensionnelle d'intérêt. Chaque microcompartiment comprend ainsi une couche externe d'hydrogel, ou capsule d'hydrogel, renfermant un ensemble de cellules autoorganisécs. Les cellules peuvent se multiplier, s'organiser et/ou se différencier au sein de la capsule d'hydrogel. [0023] Dans le contexte de « la couche externe d'hydrogel », ou « coque d'hydrogel », désigne une structure tridimensionnelle formée à partir d'une matrice de chaînes de polymères gonflée par un liquide, et préférentiellement de l'eau. Une telle couche externe d'hydrogel est obtenue par réticulation d'une solution d'hydrogel. Avantageusement, le ou les polymères de la solution d'hydrogel sont des polymères réticulables lorsque soumis à un stimulus, tel qu'une température, un pH, des ions, etc. Avantageusement, la solution d'hydrogel utilisée est biocompatible, en ce sens qu'elle n'est pas toxique pour les cellules. La couche d'hydrogel permet avantageusement la diffusion de gaz dissous (et notamment d'oxygène et/ou de dioxyde de carbone), de nutriments, et de déchets métaboliques pour permettre la survie, la prolifération, la différenciation, la maturation des cellules et/ou la production de molécules ou d'assemblages moléculaires d'intérêt et/ou la récapitulation de comportements cellulaires d'intérêt. Les polymères de la solution d'hydrogel peuvent être d'origine naturelle ou synthétique. Par exemple, la solution d'hydrogel contient un ou plusieurs polymères parmi les polymères à base de sulfonate, tel que le polystyrène sulfonate de sodium, les polymères à base d'acrylate, tel que le polyacrylate de sodium, le polyéthylène glycol diacrylate, le composé gélatine méthacrylate, les polysaccharides, et notamment les polysaccharides d'origine bactérienne, telle que la gomme gellane, ou d'origine végétale, telles que la pectine ou l'alginate. Dans un mode de réalisation, la solution d'hydrogel comprend au moins de l'alginate. Préférentiellement, la solution d'hydrogel ne comprend que de l'alginate. Dans le contexte de l'invention, on entend par « alginate » des polysaccharides linéaires formés à partir de P-D-mannuronate (M) et a-L-guluronate (G), des sels et dérivés de ceux-ci. Avantageusement, l'alginate est un alginate de sodium, composé à plus de 80% de G et moins de 20% de M, avec une masse moléculaire moyenne de 100 à 400 kDa (par exemple : PRONOVAO SLG100) et une concentration totale comprise entre 0.5% et 5% en masse volumique (poids/volume). [0024] Préférentiellement le microcompartiment cellulaire est clos. C'est la couche externe en hydrogel qui confère sa taille et sa forme au microcompartiment cellulaire. Le microcompartiment peut avoir n'importe quelle forme compatible avec l'encapsulation de cellules. [0025] Préférentiellement, la couche de matrice extracellulaire forme un gel. La couche de matrice extracellulaire comprend un mélange de protéines et de composés extracel- 7 lulaires nécessaires à la culture cellulaire, par exemple dc cellules pluripotentes. Préférentiellement, la matrice extracellulaire comprend des protéines structurelles, telles que de la laminine 521, 511 ou 421, de l'entactine, de la vitronectine, des laminines, du collagène, ainsi que des facteurs de croissance, tels que du TGF-béta et/ou de l'EGF. Dans un mode de réalisation, la couche de matrice extracellulaire consiste en, ou contient du Matrigel® et/ou de la Geltrex®. [0026] Selon l'invention, le microcompartiment peut contenir, à la place de la matrice ex- tracellulaire, un substitut de matrice extra-cellulaire. Un substitut de matrice extracellulaire s'entend d'un composé capable de favoriser l'attachement et/ou la survie des cellules en interagissant avec les protéines de membrane et/ou les voies dc transduction du signal extracellulaire. Par exemple, un tel substitut comprend les polymères biologiques et leurs fragments notamment les protéines (laminincs, vitronectines, fibronectines et collagènes), les glycosaminoglycancs non sulfatés (acide hyaluronique) ou sulfatés (chondroiline sulfate, dermatanc sulfate, kératanc sulfate, héparane sulfate), et polymères synthétiques contenant des motifs issus des polymères biologiques ou reproduisant leurs propriétés (motif RGD) et les petites molécules mimant l'attachement à un substrat (inhibiteurs dc Rho-A kinase tel que Y-27632 ou thiazovivin). [0027] Toute méthode de production de microcompartitnents cellulaires contenant à l'intérieur d'une capsule d'hydrogel dc la matrice extracellulaire et des cellules peut être utilisée pour la mise en oeuvre du procédé de préparation selon l'invention. Notamment, il est possible de préparer des microcompartiments en adaptant la méthode et le dispositif microtluidique décrits dans Alessandri et al., 2016 (« A 3D printed microtluidic device for production of functionalized hydrogel microcapsules for culture and differentiation of human Neuronal Stem Cells (hNSC) », Lab on a Chip, 2016, vol. 16,110. 9, p. 1593-1604). [0028] Avantageusement, les dimensions du microcompartiment cellulaire sont contrôlées. Dans un mode de réalisation, le microcompartiment cellulaire selon l'invention a une forme sphérique. Préférentiellement, le diamètre d'un tel microcompartiment est compris entre 10 pm et 1 mm, plus préférentiellement entre 75 et 750 pm, plus préférentiellement compris entre 100 et 500 pm, encore plus préférentiellement entre 150 et 300 pm, +/- 10%. Dans un autre mode de réalisation, le microcompartiment cellulaire selon l'invention a une forme allongée. Notamment, le microcompartiment peut avoir une forme ovoïde ou tubulaire Avantageusement, la plus petite dimension d'un tel microcompartiment ovoïde ou tubulaire est comprise entre 10 pm et 1 mm plus préférentiellement entre 75 et 750 pm, plus préférentiellement compris entre 100 et 500 pm, encore plus préférentiellement entre 150 et 300 pm, +/- 10%. Par « plus petite dimension », on entend le double de la distance minimale entre un point situé sur la 8 surface externe de la couche en hydrogel et le centre du microcompartiment. [0029] Dans un mode de réalisation particulier, l'épaisseur de la couche externe en hydrogel représente 5 à 40% du rayon du microcomparti ment. L'épaisseur de la couche de matrice extracellulaire représente 5 à 80 % du rayon du microcomparti ment et est avantageusement accrochée sur la face interne de la coque en hydrogel. Cette couche de matrice peut combler l'espace entre les cellules et la coque en hydrogel. Dans le contexte de « l'épaisseur » d'une couche est la dimension de ladite couche s'étendant radialcment par rapport au centre du microcompartiment. [0030] Milieu de différenciation neuronale [0031] Selon l'invention, des cellules neuronales post-mitotiques exprimant les 6 isoforrnes sont obtenues dans un délai de production relativement court, et notamment inférieur à 100 semaines, et plus préférentiellement inférieur à 50 semaines. Pour cela, les micro-compartiments sont maintenus dans un milieu de différenciation neuronal. [0032] De tels milieux sont connus de l'homme de l'art. Il est notamment possible d'utiliser du milieu dit N2B27 (500 ML DMEM/F12, 500mL Neurobasal, 5mL N2 medium complement, 10 mL B27 medium complet-rient). Avantageusement, un tel milieu est complémenté dans une première phase (10 à 15 premiers jours, phase d'induction neurale) par des molécules bloquant les voies de signalisation liées à BMP2 (telles que le LDN-193189 ou la protéine Noggin) et la voie de signalisation TGF-beta (telles que le SB-431542), et/ou dans une seconde phase optionnelle par des molécules activant les voies de signalisation liées à EGF-1 et FGF-2 (phase d'amplification de cellules souches neurales), et/ou complémenté dans une phase de différenciation terminale par des molécules activant les voies de signalisation neurotrophiques (par exemple la voie de transduction BDNF) et des molécules bloquant les voies de transduction du signal Notch (par exemple le compound E ou un autre inhibiteur de gamma-secretase) [0033] Dans un mode de réalisation particulier, les microcompartiments cellulaires, contenant des cellules souches, éventuellement déjà différentiées en cellules neuronales post-mitotiques, sont mis en culture dans un milieu de différenciation neuronale particulier, comprenant au moins un sel inorganique neuroactif, de la glycine, de la L-alanine et de la L-serine lesdits composés étant chacun présents à une concentration qui maintient la survie et la fonctionnalité neurale d'une cellule neuronale. L'homme du métier est à même d'adapter les concentrations pour maintenir la survie et la fonctionnalité desdites cellules. [0034] Dans le contexte de l'invention, on entend par composé « neuroactif » un composé, tel qu'un sel inorganique, qui affecte de manière significative l'activité neurale d'une cellule (par exemple une activité électrophysiologique). Une telle activité neurale peut être sensiblement identique à l'activité neurale d'une cellule neuronale sauvage dans son milieu naturel (in vivo). 9 [0035] Dans un mode de réalisation, le au moins un sel inorganique ncuroactif est choisi dans le groupe constitué par le chlorure de sodium (NaCI), le chlorure de potassium (KCI), le chlorure de calcium (CaCl2), le sulfate de magnésium (MgSO4), le chlorure de magnésium (MgCL2), le nitrate ferrique (FeNO3), le sulfate de zinc (ZnSO4), le sulfate cuivrique (CuSO4), le sulfate ferrique (FeSO4) et des combinaisons de ceux-ci. Dans un mode de réalisation, le milieu de différenciation neuronale comprend du chlorure de sodium et au moins un autre sel inorganique neuroactif. [0036] Dans certains modes de réalisation, la concentration en chlorure de sodium est comprise entre 20 et 200 mM, préférentiellement entre 70 et 150 mM, notamment à 120 mM +/- 10%. [0037] La concentration en les autres sels inorganiques ncuroactifs est préférentiellement comprise entre 0,000001 et 10 mM, 0,000005 et 8 mM, 0,00001 et 6 mM, 0,00005 et 4 mM, 0,00005 et 2 mM, 0,0001 et 1 mM, 0,0005 et 0.5 mM, 0,001 et 0,05 mM. 0.01 et 0,05 mM. [0038] La concentration en glycine comme la concentration en L-alanine sont avanta- geusement comprises entre 0,0001 et 0,05 mM. La concentration en L-serine est avantageusement comprise entre 0,001 et 0,03 mM. [0039] Dans un mode de réalisation, le milieu de culture comprend en outre [0040] de l'acide L-aspartique, préférentiellement à une concentration comprise entre 0,00001 et 0,003 mM, et/ou [0041] de l'acide L-glutamique, préférentiellement à une concentration comprise entre 0,00001 et 0,02 mM, et/ou [0042] un agent de modulation du pH, tel qu'un sel inorganique. [0043] Par exemple, l'agent de modulation est un sel inorganique choisi parmi le phosphate de sodium dibasique, le phosphate de sodium monobasique et des combinaisons de ceux-ci, ledit agent étant avantageusement à une concentration comprise entre 0,001 et 1 mM. Alternativement, l'agent de modulation est le bicarbonate de sodium, avantageusement à une concentration comprise entre 1 et 35 mM. [0044] De manière alternative ou complémentaire, le milieu de culture peut comprendre au moins un des composés suivants : un ou plusieurs acides aminés, chaque acide aminé étant avantageusement à une concentration comprise entre 0,001 et 1 rnIVI; une ou plusieurs vitamines, chaque vitamine étant avantageusement à une concentration comprise entre 0,00001 et 1 mM; un agent supplémentaire choisi dans le groupe consistant en une protéine, un facteur neurotrophique, un stéroïde, une hormone, un acide gras, un lipide, une vitamine, un sulfate minéral, un composé chimique organique, un monosaccharide, un nucléotide et des combinaisons de ceux-ci; un substrat énergétique, tel que le sucre, le pyruvate de sodium et des combinaisons ceux-ci, préférentiellement à une concentration comprise entre 0,1 et 5 mM; et un agent pho- tosensible, notamment la riboflavine (B2) à une concentration comprise entre 0,0001 et 0,0006 mM; et/ou l'HEPES à une concentration comprise entre 1 et 10 mM. [0045] Par exemple, le ou les acides aminés sont alors avantageusement choisi parmi la L- alanyl-L-glutamine, le chlorhydrate de L-argininc, la L-asparagine-H20, le chlorhydrate de cysteine-H20, la L- Cystinc 2HC1, le chlorhydrate de Lhistidine-H20, la L-isolcucinc, la L-leucine, le chlorhydrate de L-lysine, la Lmethionine, la L-phenylalanine, la L-prolinc, la L-threonine, le L tryptophane, le dihydratc de sel disodique de L-tyrosine, la L- Valine et des combinaisons de ceux-ci. [0046] Par exemple, la ou les vitamines sont choisies dans le groupe constitue par le chlorure de choline, le pantothenate de D-calcium (B5), l'acide folique (B9), le iInositol, la niacinamidc (B3), le chlorhydrate de pyridoxine, le chlorhydrate de thiamine, la vitamine B12 (cyanocobalaminc), la riboflavine (B2) et des combinaisons de ceux-ci. [0047] Dans un mode de réalisation, le milieu de culture ne comprend pas de sérum. De manière alternative ou complémentaire, l'osmolarité du milieu est comprise entre 280 et 330 Osm/mL. [0048] Des exemples de composition de milieu de différenciation neuronale pouvant être utilisés pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention sont décrits dans la demande W02014/172580. Le milieu BrainPhysTM Neuronal Medium commercialisé par la société STEMCELL Technologies est particulièrement adapté pour être utilisé comme milieu de différenciation neuronale dans le procédé de l'invention. [0049] Etapes de culture [0050] Selon l'invention, les microcompartiments sont mis en culture dans le milieu de dif- férenciation cellulaire pendant une période comprise entre 5 semaines et 100 semaines. De manière avantageuse, l'étape de culture dans le milieu de différenciation est conduite pendant une période comprise entre 5 et 50 semaines, préférentiellement entre 10 et 50 semaines, plus préférentiellement entre 20 et 25 semaines, encore plus préférentiellement pendant 25 semaines +/- 1 semaine. En effet, les inventeurs ont découvert qu'après ces laps de temps, tout ou partie des microcompartiments contient des neurones exprimant les 6 isofonnes de la protéine Tau (2N4R. 1N4R, 0N4R, 2N3R, 1N3R, 0N3R). [0051] Selon l'invention, les microcompartiments comprenant les cellules neuronales post- mitotiques peuvent être obtenus lors d'une étape de préculture de microcompartiments cellulaires comprenant chacun une capsule creuse en hydrogel entourant un unique amas de cellules souches et de la matrice extracellulaire dans un milieu de culture apte à induire la différenciation cellulaire au sein desdits microcompartiments cellulaires. Les cellules étant avantageusement organisées en cyste à l'intérieure des capsules d'hydrogel à l'issu de ladite étape de préculture. 11 [0052] Dans le contexte de l'invention, on désigne par cystc au moins une couche de cellules pluripotentes organisées autour d'une lumière centrale. Selon l'invention, un tel microcomparti ment comprend donc successivement, autour d'une lumière centrale, ladite couche de cellules pluripotentes, une couche de matrice extracellulaire, ou d'un substitut de matrice extra-cellulaire, et la couche externe en hydrogel. La lumière est générée, au moment de la formation du cystc, par les cellules qui se multiplient et se développent en couches sur la couche de matrice extracellulaire. Avantageusement, la lumière contient un liquide et plus particulièrement du milieu de culture. [0053] Les cellules souches utilisées pour la préparation des microcompartiments sont avan- tageusement des cellules souches pluripotentes de mammifère, humain ou non humain. Une cellule souche pluripotente, ou cellule pluripotente, s'entend d'une cellule qui a la capacité de former tous les tissus présents dans l'organisme d'origine entier, sans pour autant pouvoir former un organisme entier en tant que tel. Notamment, les cellules souches sont choisies parmi les cellules souches pluripotentes induites (IPS), les cellules souches embryonnaires (ES), les cellules transdifférenciées et des mélanges de ceux-ci. Les cellules transdifférenciées s'entendent de cellules pour lesquelles une différenciation en cellules d'intérêt est obtenue sans passer par une étape de pluripotence. Les cellules passent de leur état initial (par exemple fibroblaste ou cellule mononucléée sanguine périphérique) à un état terminal de neurone mâture en forçant l'expression d'un ensemble de gènes de l'état terminal sans jamais transitionncr par le phénotype pluripotent. [0054] Un procédé de préparation de cystes est démit dans la demande W02018/096277, ainsi que des milieux de culture favorables à l'organisation des cellules en cystes au sein des microcompartiments. [0055] Dans un autre mode de réalisation, des progéniteurs neuraux sont encapsulés dans une coque en hydrogel, lesdits progéniteurs étant avantageusement aptes à d'organiser sous forme de cystes. [0056] D'une manière générale, une fois que les microcompartiments cellulaires renferment majoritairement des cellules neuronales post-mitotiques, lesdits compartiments sont placés dans le milieu de différenciation neuronal. Par « majoritairement », on entend que le rnicrocompartiment comprend plus de 50% en nombre de cellules neuronales post-mitotiques, préférentiellement, plus de 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%. [0057] Avantageusement, l'étape de différenciation neuronale est conduite dans un bio- réacteur, les microcompartiments cellulaires étant maintenus en suspension dans une enceinte dudit bioréacteur contenant le milieu de différenciation. [0058] Les cellules étant protégées des contraintes pouvant exister au sein du réacteur par la coque d'hydrogel, le flux au travers du bioréacteur peut être aussi fort que la coque d'hydrogel peut le soutenir. En outre, la coque d'hydrogel des microcompartiments 12 cellulaires préserve les cellules des contraintes mécaniques liées aux collisions et prévient les fusions des éléments multicellulaires (agrégats, micro-carriers). Les micro-compartiments sont en suspension dans le bioréacteur, ce qui permet un accès au milieu de culture et une diffusion dans les microcompartiments homogènes, ainsi qu'une bonne convection. [0059] L'utilisation de microcompartiments cellulaires permet de cultiver les cellules dans n'importe quel type de bioréacteur, muni d'une enceinte close, et notamment dans un bioréacteur en mode d'alimentation par « batch », en mode d'alimentation par « fed batch » ou en mode d'alimentation continu (perfusion). L'utilisation de ces microcompartiments est particulièrement avantageuse dans le cas de culture en mode d'alimentation continu. En effet, les cellules étant protégées par la coque d'hydrogel, il est possible de les soumettre à des flux continus, sans risque de les fragiliser. [0060] Dans un mode de réalisation, le bioréacteur comprend une enceinte pouvant être fermée hermétiquement. Cela permet de contrôler l'atmosphère à l'intérieur du bioréacteur, et par exemple de cultiver les microcompartiments sous atmosphère inerte. [0061] Le bioréacteur peut comporter une enceinte ayant un volume compris entre 1 mL et 10 000L, préférentiellement entre 5 mL et 10.000 L, entre 10 rrIL et 10.000 L, entre 100 mL et 10.000 L, entre 200 mL et 10.000 L, entre 500 mL et 10.000 L. Dans un mode de réalisation, l'enceinte a un volume d'au moins 1 mL. Dans un mode de réalisation, l'enceinte a un volume d'au moins 10 mL. Dans un mode de réalisation, l'enceinte a un volume d'au moins 100 mL Dans un mode de réalisation, l'enceinte a un volume d'au moins 500 mL Dans un mode de réalisation, l'enceinte a un volume d'au moins 1 L. Dans un mode de réalisation, l'enceinte a un volume d'au moins 10 L. Dans un mode de réalisation, l'enceinte a un volume de 100 L, ou plus. [0062] L'homme du métier saura adapter le nombre de microcompartiments et le volume du bioréacteur en fonction des besoins. [0063] Préférentiellement, l'étape de différenciation neurale est conduite dans des conditions stériles afin d'éviter toute contamination par des microorganismes. Par exemple, l'enceinte du bioréacteur est close de manière à empêcher les contaminations, mais permet les échanges gazeux avec l'extérieur. [0064] D'une manière générale, l'utilisation d'une enceinte close permet un contrôle fin de l'environnement de culture, sans risque de perturbation par l'environnement extérieur. Il est par ailleurs aisé d'obtenir des produits stériles. Cela permet également un meilleur rendement volumétrique. [0065] A l'issu de l'étape de différenciation neuronale il est possible de récupérer tout ou partie des microcompartiments cellulaires, afin de récupérer des neurones post-mitotiques exprimant les 6 isofonnes de la protéine Tau contenus dans lesdits micro-compartiments. Les cellules peuvent être récupérées aisément, par simple hydrolyse et/ 13 ou dissolution de la couche externe en hydrogel. [0066] Cellules neuronales et applications [0067] Le procédé selon l'invention permet d'obtenir des cellules neuronales post-mi- totiques dans lesquelles les 6 isoformes 2N4R, 1N4R, ON4R, 2N3R, 1N3R, ON3R de la protéine Tau sont exprimées. [0068] Avantageusement, les 6 isoformes sont des proportions sensiblement identiques aux proportions présentent dans des cellules neuronales adultes sauvages. [0069] Dans un mode de réalisation, les cellules neuronales post-mitotiques récupérées dans les tnicrocompartitnents cellulaires à l'issue de l'étape de différenciation présentent un ratio d'expression des isoformes 3R et 4R compris entre 1/3 et 3, plus préférentiellement compris entre 1/2 et 2, encore plus préférentiellement compris entre 3/4 et 4/3, idéalement à 10% d'un ratio équimolaire. Les isoformes 2N, 1N et ON représentent avantageusement, respectivement, plus de 3%, plus de 17% et moins de 90% des isoformes totales, préférentiellement respectivement plus de 5%, plus de 26% et moins de 50%, encore plus préférentiellement respectivement plus de 8%, plus de 45% et moins de 45%, idéalement respectivement 9%, 54%, and 37%. [0070] Dans un mode de réalisation, les cellules neuronales post-mitotiques récupérées dans les tnicrocompartitnents cellulaires à l'issue de l'étape de différenciation comprennent les 6 isoformes dans les proportions ci-dessous rapport au nombre total des 6 isoformes : entre 0,1 et 0,9 % de l'isoforme 2N4R, notamment 0,16% ou 0,9%, entre 0,5 et 1% de l'isoforme 2N3R, notamment 0,69% ou 1%, entre 2 et 18% de l'isofonne 1N4R, notamment 2,19% ou 17,6%, entre 8 et 23% de l'isoforme ON4R, notamment 9,4% ou 22,4%, entre 8 et 23% de l'isoforme 1N3R, notamment 9,4% ou 27,5%, et entre 30 et 80% de l'isoforme ON3R, notamment 78,16% ou 30,6%. [0071] De telles cellules neuronales post-mitotiques peuvent être utilisées aussi bien à des fins de recherche que de diagnostic ou de traitement. Ces cellules, présentant un profil d'expression de la protéine Tau sensiblement identique à celui des cellules neuronales adultes sauvages, sont particulièrement adaptées pour le criblage de molécules thérapeutiques ciblant des maladies neurodégénératives et/ou modifiant la physiopathologie des neurones, notamment chez l'humain. Exemples [0072] Matériel et méthodes [0073] 1. Lignée iPSC et encapsulation [0074] La lignée BC-1 (WT XY, passages 15-25, MTI-Globalstem, Gaithersburg, MD) a été maintenue en absence de cellules nourricières. Les plaques de culture ont été recouvertes d'une matrice Matrigel pendant 2 heures à 37°C (Corning, NY, 1/100, dilué dans un milieu DMEM). Les colonies BC-1 ont été dissociées en utilisant du ReLeSR 14 (STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada) puis cultivées dans du mTESR1 (technologies STEMCELL) complémenté avec 1% de pénicilline/streptomycine (Invitrogen, Carlbstad, CA ). Les cultures ont été nourries quotidiennement et passées tous les 5 à 7 jours. [0075] La procédure d'encapsulation utilisée est celle décrite dans Alessandri et al, 2016. [0076] 2. Production de neurones corticaux matures [0077] L'induction neurale a été réalisée dans un mélange 1:1 de DMEM/F12 et de Neurobasal complémenté avec B27 et N2 (Thermo Fischer Scientific Inc., Waltharn, MA), litM LDN-193189 (Sigma Aldrich, St-Louis, MO, ) et lOpM SB431542 (Tocris Biosciences, Bristol, UK). Le milieu a été changé tous les jours pendant 8 jours. Ensuite, la différenciation des cellules souches neurales a été réalisée en utilisant le mélange DMEM/E12:Neurobasal (1:1) complémenté avec B27 et N2, ou le milieu BrainPhysTM complémenté avec N2-A et SM1 (STEMCELL Technologies). Les deux milieux ont été supplémentés par 10 ng/mL de BDNE et GDNE (Cell Guidance Systems Ltd., Cambridge, Royaume-Uni), 10 nM de Compound E (Abcam, Cambridge, Royaume-Uni) et 10 nM de trichostatinc A (Abcam). La moitié du milieu a été changée tous les jours jusqu'à la période de maturation spécifiée. [0078] 3. Extraction d'ARN [0079] Les microcompartimcnts (sphères) sédimentés ont été rincés une fois en PBS 1X (Thermo Fischer Scientific Inc.) puis incubés avec du Gentle Cell Dissociation Reagent (STEMCELL Technologies) pendant 5 minutes pour désintégrer la capsule d'alginate. Après deux lavages PBS IX, l'ARN total des cellules a été extrait à l'aide du kit Nucleospin RNA XS (Macherey-Nagel GmbH and Co KG, Dili-en, Allemagne). Des expériences de validation ont été effectuées sur l'ARN total extrait de cortex cérébral humain adulte normal (BioChain Institute Inc., Newark, CA). [0080] 4. Analyse de la maturation neuronale par RT-PCR [0081] Un total de 250 ng d'ARN a été retro-transcrit à l'aide du kit de transcription inverse RETROscript (Thermo Fischer Scientific Inc.) avec des amorces oligo(dT), conformément aux instructions du fabricant pour la procédure RT-PCR en deux étapes. Les réactions de PCR ont été réalisées en utilisant 1 pL d'ADNc et les amorces appropriées (figure 7). Les produits PCR ont été séparés par électrophorèse sur un gel d'agarose à 1,5 %. [0082] 5. Analyse des isofonnes MAPT adultes par RT-PCR fluorescente [0083] La rétrotranscription a été effectuée sur 70 ng d'ARN, à l'aide du kit d'ADNc Verso (Thermo Fischer Scientific Inc.) et des amorces oligo(dT). Les amorces utilisées dans cette étude sont énumérées dans le tableau 1 ci-dessous. La proportion relative des isoformes de MAPT a ensuite été analysée par PCR fluorescente, à l'aide d'une amorce sens non marquée et d'une amorce anti-sens marquée 6-FAM. Les produits de PCR ont été analysés sur un séquenceur automatique Genetic Analyzer 3500 (Applied Biosystems), et les électrophérogrammes analysés avec le logiciel GeneMapper Software 5. [0084] [Tall 'eaux 1] Gènes et olizenuciéeetides 1.11',F I F (SEO /) NO U 7 POUSF R .(SEQ ID NO:2) : TTGOEGCTçcApAAGGAIG SEQ ID NO3: s'-C AAAGGGACCGAGGAGTA _. OTX .CS.E4Q ID NO 4) : F-CAAGACTCGCTAC,CCTGA S-ACTACia&GAGG.A.G G:6W 3 CALB 1F (SEO ID NO 5' : CALB 1 R, (S.E.Q ID NE:6 : 5'-TGG CTCACGTATTACCCACA -3 ' -.? GATCCGTTCGGTACAGCIT ±3" RELNF (SEQID NO :7) . RELNR (S1Q ID NOEi),GFAP F (SEQ ID NO:9) : GFAP R (SEQ ID NO 1G) : 111TTTCCTCC7AGCOCT.GTT-31 5'.TAATCGCGCCACACTOTTC-31 -AGAAGCTCCAGGATGAAACC-31 54-AGCGACCAATOTTCCTCTC-3' CIDIN11 F (SEQ ID NO 11) : CLDNI1 R (SE Q ID NO 12): Tau .exan 1 (SEQ ID NO:13), Ta abri 2 (SEO ID NO:1 ' Ta none .-45 {ISEO ID NO:15), Tau non 9 (SEQ ID NO:16), Ta non IO (SEQ ID NOE17): Tau cran 11 (SEQ ID NO:18) : 517CTOGIGGACAToeTCATCCT3c 51-CCAGCAGAATGAG CAAAACA -3' 5 -GC CA GGAGTTCGA.AGTGA,TO -.3` 5' -GAGGACGGATCTCT.A.GGAA CC-31 5'-CATGCGACiCTTGGGT CAC-31 5' -CCCAAGTCGCCGTCTTCC-3' 5'-ACTTGGACTGGACGTTGCTA -3 5' -TCrGITTATGATGGATGTTGCCT-3' 100851 6. Extraction et déphosphorylation des protéines 100861 Les sphères ont été rincées dans du PBS IX (Thermo Fischer Scientific Inc.) puis incubées avec le Gentle Cell Dissociation Reagent (STEMCELL Technologies) pendant 5 minutes pour désintégrer la capsule d'alginate. Après deux lavages en PBS IX, les sphères ont été homogénéisées dans un tampon Pierce® RIPA (Thermo Fisher Scientific Inc.) additionnés d'un cocktail d'inhibiteurs de protéase (Sigma-Aldrich), en utilisant le TissueLyserLT (Qiagen, Hilden, Allemagne) (agitation rapide (50 Hz, 2 min) microtubes de 1,5 ml contenant deux billes en acier inox de 2 mm) Les échantillons ont ensuite été centrifugés et les lysats collectés. Après 30 min sur glace et centrifugation (11 300 X g, 20 min, 4°C), le surnageant contenant les protéines solubles a été recueilli. Trente pg de protéines totales ont ensuite été traitées avec 80 unités de protéine phosphatasc lambda (New England Biolabs, Ipswich, MA) pendant 3 h à 37°C dans un volume final de 50pL. [0087] 7. Western Blotting [0088] Les protéines ont été analysées grâce à la technique de Western blet comme décrit précédemment (Pons et al., 2017). Brièvement, les protéines des échantillons déphosphorylés ont été séparées par électrophorèse sur gel SDS-PAGE 10%, en parallèle de 1pL d'un échantillon de référence contenant les 6 isoformes protéiques de Tau produites in vitro (Sigma Aldrich), puis transférées sur une membrane de nitro- 16 cellulose. Les membranes ont été incubées avec l'anticorps primaire : Polyclonal Antihuman Tau (Dako Denmark AIS, Glostrup, Danemark) (1:50 000) puis révélées à l'aide de réactifs chemiluminescents (ECL Clarity, Bio-Rad Laboratories). Résultats 100891 1. Développement de neurones corticaux et des lignages gliaux sur matrieel à partir d'iPSC dans des capsules d'alginate [0090] Dans cette étude, des iPSC provenant de donneurs sains ont été utilisés. Après dis- sociation, les cellules iPSCs ont été encapsulées à l'intérieur de capsules d'alginate tapissées de Matrigel comme décrit précédemment pour les cellules souches neurales (NSC) dans Alessandri et al, 2016. Les capsules ont d'abord été maintenues dans un milieu EnTESR pour permettre aux colonies d'émerger à l'intérieur des capsules. Ensuite, l'induction neurale des iPSCs a été réalisée par la double inhibition de SMAD jusqu'à cc que les NSCs atteignent 100% de confluence dans les capsules (Feyeux et al., 2012). L'efficacité de l'induction neurale a été confirmée par l'évaluation de l'expression des ARNm POU5F I et 07'X- I par RT-PCR. Comme attendu, le gène de pluripotcnce POU5F1 était fortement exprimé dans les iPSC et presque non détecté dans les NSC (Fig. 1A). D'autre part, le marqueur OTX-1 des NSCs était spécifiquement surexprimé dans les NSCs par rapport aux iPSCs non induits (Fig. 1B). Une fois que les NSCs ont atteint la confluence, ils ont ensuite été différenciés en neurones corticaux. Deux milieux de culture cellulaire ont été testés : un milieu couramment utilisé (DMEM/F12 - Ncurobasal 1:1, D/N) ainsi que le milieu BrainPhysTM qui a été conçu pour favoriser la maturation et la fonction synaptique des neurones dérivés d'iPSC (Bardy et al., 2015). Parce que des études antérieures ont montré que la neurogenèse corticale à partir d'iPSC suit le même ordre temporel in vitro que le développement cortical des mammifères et s'étend au moins jusqu'au jour 90 en culture (Espuny-Cainacho et al., 2013 ; Kh-wan et al., 2015 ; Shi et al., 2012), il a été arbitrairement décidé de caractériser l'identité des neurones corticaux humains dérivés des iPSC dans la procédure expérimentale après 15, 20 ou 25 semaines de culture. L'expression de CALB1 (Calbindin 1) et RELN (Reelin), deux marqueurs spécifiques des neurones corticaux de la couche supérieure, a été évaluée. Les neurones corticaux de la couche supérieure sont générés aux derniers stades de la neurogenèse corticale. CALB1 est exprimé dans les couches corticales II et III du cortex cérébral humain et RELN dans la couche corticale I. Comme le montrent les figures 1C et ID, l'expression des ARNm CALB1 et RELN a été détectée dans les neurones dérivés d'iPSC dès 15 semaines de culture quel que soit le milieu utilisé. L'expression des deux gènes a été maintenue jusqu'à 25 semaines. Comme attendu, CALB1 et RELN n'ont pas été détectés à un niveau significatif dans les iPSC et les NSC. [0091] La présence d'astrocytes et d'oligodendrocytes myélinisants dans les cultures a 17 également été étudiée, en évaluant respectivement l'expression des ARNm GFAP (Glial fibrillary acidic protcin) et CLDN11 (Claudin11). L'expression de GFAP a été détectée des 15 semaines de culture dans les deux conditions expérimentales (Fig. 1E). Par contre, si l'expression de CLDN11 a été facilement détectée dans des capsules cultivées dans le milieu BrainPhysTM des la 15eme semaine de culture, son expression est demeurée absente dans celles cultivés dans le milieu standard, même au bout de 25 semaines de différenciation (Fig. 1F). Encore une fois, comme attendu, aucun de ces gènes n'est exprimé aux stades iPSC et NSC. Dans l'ensemble, ces résultats indiquent que les neurones issus d'iPSC à l'intérieur des capsules d'alginate tapissées de Matrigel ont pu se différencier en neurones corticaux, y compris les neurones corticaux de la couche supérieure qui sont générés aux derniers stades de la neurogenese corticale. Il est important de noter la présence d'oligodendrocytes spécifiquement dans les cultures maintenues en BrainPhysTM, soulignant que le milieu neuronal BrainPhysTm a amélioré la maturation neuronale par rapport au milieu D/N couramment utilisé. [0092] 2. Développement d'une méthode quantitative pour mesurer les 6 isoformes d'ARNm adultes de MAPT : validation dans le cortex cérébral humain [0093] Actuellement, les analyses de l'expression des isoformes d'ARNm de MAPT adultes sont principalement basées sur la seule quantification de l'inclusion de l'exon 10, pour déterminer le rapport 3R/4R, ou l'inclusion des exons 2 et 3, pour évaluer la proportion des isoformes ON, 1N ou 2N. Dans la présente étude, une méthode permettant l'analyse simultanée des 6 isoformes ARNm de MAPT adultes individuellement dans une seule réaction PCR pour examiner leur proportion relative pendant la maturation neuronale a été mise au point. À cette fin, un nouveau test a été mis au point, basé sur l'amplification des transcrits MAPT à l'aide d'amorces marquées par fluorescence. Un ensemble d'amorces couvrant les exons 1 et 11 (Fig. 2A), qui devrait permettre l'amplification des 6 isoformes MAPT, a été identifié. Pour valider ce test, des expériences de RT-PCR sur des ARNm extraits de cortex cérébral humain adulte ont été réalisées. L'analyse des électrophérogrammes correspondant aux produits amplifiés par PCR a révélé un profil en 6 pics correspondant aux tailles attendues pour les 6 isoformes d'ARNm adultes de MAPT (Fig. 2B). La proportion relative des différentes isoformes a ensuite été calculée à partir de la hauteur du pic. Les isoformes ON3R et 1N3R étaient les plus exprimées (30,6 et 27,5 %), suivies des isoformes ON4R et 1N4R (22,4 et 17,6 %), tandis que les isoformes 2N3R et 2N4R ne représentaient que 1 et 0,9 % de toutes les isofonnes. [0094] Ces données ont également permis de déterminer la proportion relative des isoformes ON (53 %), IN (45,1 %) et 2N (1,9 %) et des isoformes 3R (59,1 %) et 4R (40,9 %). Il est important de noter que des données quantitatives similaires ont été obtenues lors de l'analyse indépendante de l'inclusion des exons 2/3 et de l'inclusion de l'exon 10 (Fig. 5 18 A, B) : les isoformes ON et 1N se sont avérées les plus exprimées (52,9% et 45% respectivement), alors que les isoformes 2N ne représentaient que 2 %. En cc qui concerne l'épissage de l'exon 10, la quantification relative des pics indique que le rapport est légèrement en faveur des isoformes 3R, avec 59,9% de 3R-Tau contre 40,1% de 4R-Tau. Ces données sont parfaitement cohérentes avec les études publiées précédemment et valident donc ce nouvel essai. [0095] 3. Le BrainPhysTM favorise l'expression des 6 isoformes ARNm adultes de MAPT dans les neurones issus d'iPSC et cultivés à l'intérieur de capsules d'alginate tapissées de Matrigel [0096] Après avoir validé l'essai sur des extraits de cerveau adulte, la méthode a été utilisée pour évaluer l'expression des isoformes adultes MAPT dans des cultures neuronales dérivées d' iPSC maintenues en D/N ou dans un milieu BrainPhysTM, sur une période de maturation de 25 semaines. Conformément aux études antérieures, l'analyse des NSCs a révélé un pic unique, correspondant à la taille prévue de l'isoforme ON3R dc MAPT (Fig. 3A et Fig. 4A). Dès 15 semaines de maturation, des isoformes contenant l'exon 2 (les isoformes 1N3R et 1N4R) et l'exon 10 (les isoformes 0N4R et 1N4R) ont été détectées. Il est intéressant de noter que les cultures maintenues en BrainPhysTM présentaient des niveaux d'expression plus élevés des isoformes 1N3R, ON4R et 1N4R que les cultures D/N. Après 20 semaines de maturation, une augmentation significative de la quantité de ces espèces a été observée, avec l'apparition de faibles niveaux d'expression de l'isoforme 2N3R dans les deux conditions expérimentales. Au dernier point de l'étude (25 semaines), les niveaux d'expression de ces isoformes ARNm de MAPT adultes ont continué à augmenter. Plus important encore, l'isoforme 2N4R était maintenant détectable dans les cultures maintenues en BrainPhysTM. L'analyse quantitative des proportions relatives des isoformes ARNm de MAPT dans des cultures maintenues par BraiiiPhysTM pendant 25 semaines a révélé que les isoformes ON4R et 1N3R représentaient chacune 9,4 % de toutes les isoformes présentes, tandis que l'isoforme 1N4R représentait 2,19 %. Les isoformes 2N3R et 2N4R correspondaient respectivement à 0,69% et 0,16%. Les isoformes 4R-Tau constituaient donc 11,75 % des transcrits MAPT (Fig. 4B), tandis que les isoformes IN et 2N représentaient respectivement 11,63 % et 0,85 % (Fig. 4C). Comme pour les extraits de cerveau, ces résultats ont été validés par des évaluations indépendantes de l'épissage de l'exon 10 ou des exons 2/3 (Fig. 5C). [0097] La procédure expérimentale a permis le développement de neurones exprimant les 6 transcrits d'ARNm de MAPT adultes, mais l'isoforme ON3R est restée principalement exprimée après 25 semaines de maturation (-78%) Afin d'exclure que les isoformes ON3R puissent "piéger" les amorces et donc diminuer l'efficacité de la PCR par rapport aux transcrits moins bien exprimés, l'expression des isoformes de MAPT a été analysée 19 indépendamment des transcrits ON3R. Pour ce faire, deux jeux d'amorces (Fie. 6) ont été réalisés : la première couvrant les exons 2 et 11 pour analyser précisément les transcriptions 1N3R, 1N4R, 2N3R et 2N4R, et la seconde couvrant les exons 1 et 10 pour amplifier spécifiquement les isoformes 4R-Tau. L'analyse d'extraits cérébraux ainsi que des cultures maintenues en BrainPhysTm pendant 25 semaines ont confirmé les proportions relatives des différentes isoformes MAPT, validant ainsi le test. [0098] Dans l'ensemble, ces résultats ont montré que les neurones maintenus en BrainPhysTM exprimaient les 6 transcrits MAPT adultes après 25 semaines de maturation, incluant les isoformes 2N3R et 2N4R. Tl est important de noter que lorsque les cultures dérivées d'iPSC ont été conservées dans le milieu D/N, seules 5 isoformes été exprimées. L'isoformc 2N4R était indétectable. De plus, à chaque point d'étude, les niveaux d'ARNm pour chaque isoforme étaient systématiquement inférieurs à ceux observés avec le milieu BrainPh ysTM. Ces données sont parfaitement cohérentes avec le rôle bénéfique du milieu BrainPhysTM sur l'état de maturation des neurones. Fait intéressant, conformément à ce qui a été démontré lors du développement du cerveau humain (Hcfti et al., 2018), un changement dans l'expression des exon 2 et exon 10 a d'abord été détecté. L'inclusion de l'exon 3 est plus tardive. [0099] Afin de valider l'efficacité de la traduction des transcrits MAPT adultes dans le modèle expérimental, la production d'isoformes protéiques Tau a ensuite été évaluée par Western Blot dans des sphères maintenues en BrainPhysTM pendant 25 semaines. Les protéines ont été déphosphorylées ou non à l'aide de lambda phosphatase et séparées par éléctrophorèse à côté d'une échelle de protéines Tau recombinante contenant les 6 isoformes. Comme le montre la figure 3B, les protéines Tau migrent sous formes de multiples bandes entre 40 et 60 kDa, en raison G) de la présence d'isoformes multiples et (ii) de l'état de phosphorylation des protéines. Le traitement à la phosphatase a entraîné un déplacement des protéines Tau vers des poids moléculaires plus faibles. En accord avec l'analyse en ARNm, il a été constaté que l'isoforme ON3R-Tau était majoritairement détectée dans les capsules de 25 semaines. Cependant, des quantités significatives d'isoformes ON4R, 1N3R et 1N4R ont également été détectées. En revanche, nous n'avons pas pu observer les isoformes 2N de Tau. Ces isoformes représentant moins de 1 % de toutes les espèces de Tau présentes en ARNm, il est possible que leurs concentrations soient inférieures à la limite de détection dans l'analyse. CONCLUSIONS [0100] Ces résultats montrent que les neurones dérivés d'iPSC, cultivés à l'intérieur de capsules d'alginate revêtues de Matrigel présentaient des spécifications de cultures de cellules corticales matures. Plus importun encore, à l'aide d'un nouveau test qui permet l'analyse qualitative et quantitative de toutes les isoformes d'ARNm MAPT adultes in- dividuellement, il a été démontré que les neurones maintenus en BrainPhysTM exprimaient les 6 transcrits d'ARNm MAPT adultes après 25 semaines de maturation, rendant ce modèle très approprié pour la modélisation des pathologies Tau et à des fins thérapeutiques. 21 [Revendication 1] [Revendication 2] [Revendication 3] [Revendication 4] [Revendication 5] [Revendication 6] REVENDICATIONSProcédé de production in vitro dc neurones de mammifère exprimant les 6 isoformes de la protéine Tau (2N4R, 1N4R, ON4R, 2N3R, I N3R, ON3R), comprenant une étape de différentiation neuronale, selon laquelle on cultive pendant une période comprise entre 5 semaines et 100 semaines des microcompartimcnts cellulaires comprenant chacun une capsule creuse en hydrogel entourant des cellules neuronales post-mitotiques et une matrice extracellul ai re, ladite étape de différentiation neuronale étant réalisée dans un bioréacteur, les microcompartiments cellulaires étant maintenus en suspension dans une enceinte dudit bioréacteur contenant un milieu de différenciation neuronale. Procédé de production in vitro de neurones de mammifère selon la revendication 1, dans lequel, le milieu de différenciation neuronale comprenant au moins un sel inorganique neuroactif, de la glycine, de la L-alanine et de la L-serine. Procédé de production in vitro de neurones de mammifères selon la revendication 2, selon lequel le sel inorganique neuroactif est choisi dans le groupe constitué par le chlorure de sodium, le chlorure de potassium, le chlorure de calcium, le sulfate de magnésium, le chlorure de magnésium, le nitrate ferrique, le sulfate de zinc, le sulfate cuivrique, le sulfate ferrique et des combinaisons de ceux-ci. Procédé de production in vitro de neurones de mammifère selon l'une des revendications précédentes, dans lequel l'étape de différentiation neuronale est conduite pendant une période comprise entre 5 et 50 semaines, préférentiellement entre 10 et 50 semaines, plus préférentiellement entre 20 et 25 semaines, encore plus préférentiellement pendant 25 semaines +/- 1 semaine. Procédé de production in vitro de neurones de mammifères selon l'une des revendications précédentes, dans lequel l'étape de différenciation neurale est conduite dans des conditions stériles, l'enceinte du bioréacteur étant avantageusement une enceinte close. Procédé de production in vitro de neurones de mammifère selon l'une des revendications précédentes, comprenant une étape de préculture selon laquelle les microcompartiments de cellules neuronales post-mitotiques sont obtenus en cultivant des microcompartiments cellulaires comprenant chacun une capsule creuse en hydrogel entourant un unique amas de cellules souches, à l'exclusion des cellules souches cm- [Revendication 7] [Revendication 8] [Revendication 9] [Revendication 10] [Revendication 11] bryonnaires humaines, et de la matrice extracellulaire dans un milieu de culture apte à induire la différenciation cellulaire au sein desdits micro-compartiments cellulaire, les cellules étant avantageusement organisées en cyste à l'intérieure des capsules d'hydrogel à l'issu de ladite étape de préculturc. Procédé de production in vitro de neurones de mammifère selon la revendication 6, dans lequel les cellules souches sont des cellules souches pluripotcntes choisies parmi les cellules souches pluripotentes induites (IFS), les cellules souches embryonnaires (ES), à l'exclusion des cellules souches embryonnaires humaines, les cellules transdifférenciées et des mélanges de ceux-ci. Procédé de production in vitro de neurones de mammifères selon l'une des revendications précédentes, comprenant une étape ultérieure selon laquelle à l'issu de l'étape de différentiation neuronale on récupère des neurones post-mitotiques exprimant les 6 isoformes de la protéine Tau à partir des microcompartiments cellulaires. Procédé de production in vitro de neurones de mammifères selon l'une des revendications précédentes, dans lequel les nticrocompartiments cellulaires ont un diamètre compris entre 10 m et lmm, préférentiellement compris entre 75 et 750 pm, plus préférentiellement compris entre 100 et 500 pm, encore plus préférentiellement entre 150 et 300 Mm, +/- 10%. Cellules neuronales post-mitotiques non naturelles, susceptibles d'être obtenues par le procédé selon l'une des revendications 1 à 8, dans lesquelles les 6 isoformes de la protéine tau sont exprimées. Cellules neuronales post-mitotiques non naturelles selon la revendication 10, lesdites cellules présentant un ratio d'expression des isoformes de 3R et 4R compris entre 1/3 et 3, plus préférentiellement compris entre '1/2 et 2, encore plus préférentiellement compris entre 3/4 et 4/3, idéalement à 10% d'un ratio équimolaire, les isoformes 2N, IN et ON représentant avantageusement, respectivement, plus de 3%, plus de 17% et moins de 90% des isoformes totales, préférentiellement respectivement plus de 5%, plus de 26% et moins de 50%, encore plus préférentiellement respectivement plus de 8%, plus de 45% et moins de 45%, idéalement respectivement 9%, 54%, and 37%.