Brevet FR3088195A1 — publié le 20200515

EXTRAIT D'ALGUES ROUGES POUR SON UTILISATION POUR LA PREVENTION OU LE TRAITEMENT D'UN TROUBLE INTESTINAL La présente invention concerne un extrait d'algues rouges du genre Solieria pour son utilisation en tant que complément alimentaire ou pour la prévention et/ou le traitement d'un trouble intestinal, par son effet bénéfique sur la fonction et/ou l'intégrité de la barrière épithéliale intestinale. Les troubles intestinaux sont de plus en plus répandus de nos jours et regroupent de nombreuses affections touchant aussi bien les personnes jeunes, âgées, les hommes ou les femmes. Le stress, le surmenage, les mauvaises habitudes alimentaires, le vieillissement expliquent en partie l'augmentation de ces troubles. Les désordres intestinaux sont également très répandus en élevage animal, en particulier en élevage intensif, où, par exemple, les aliments concentrés et hyper- protéiniques qui sont donnés peuvent causer des problèmes digestifs. Le tube digestif, système complexe, est un organe vital. Il permet à la fois la digestion et l'absorption de nutriments alimentaires mais constitue également la barrière majeure entre l'intérieur de l'organisme et le milieu extérieur. La structure de la barrière intestinale représente une ligne de défense immunologique, physiologique et physique pour l'organisme. Le stress, le vieillissement, les maladies chroniques sont autant de causes qui fragilisent les fonctions de la barrière intestinale. Son bon fonctionnement permet de maintenir en bonne santé un sujet, d'augmenter sa résistance au stress et de prévenir certaines pathologies chroniques ou infectieuses. Par conséquent, le renforcement de la réponse de l'organisme et en particulier du tube digestif à ce stress représente un enjeu majeur dans le maintien de la santé et pour la prévention ou le ralentissement de l'apparition de pathologies chroniques. Les algues rouges contiennent des constituants spécifiques (protéines, peptides et polysaccharides, notamment carraghénanes) auxquels ont été associés des effets prébiotiques et de régulation des cellules épithéliales intestinales. Les carraghénanes, et leurs produits de dégradation sont cependant aussi impliqués dans l'induction d'inflammation intestinale, conduisant à des recommandations de limiter l'usage des carraghénanes de poids moléculaire de moins de 50 kDa dans l'alimentation (Cian et al. Marine Drugs, 2015, 13, 5358-5383). Les inventeurs ont mis en évidence qu'un extrait d'algues rouges du genre Solieria, et notamment deux fractions distinctes de cet extrait, réduisait ou prévenait 2 l'augmentation de la perméabilité intestinale et du temps de transit intestinal, notamment en situation de stress. Résumé de l'invention 5 L'invention concerne un procédé de préparation d'un extrait d'algues rouges du genre Solieria comprenant : a) le lavage et dessablage des algues; b) le broyage des algues lavées et dessablées ; c) l'hydrolyse thermique du broyat obtenu; 10 d) la séparation de la phase solide du broyat de sa phase liquide ; et e) la clarification de ladite phase liquide. Selon un mode de réalisation le procédé de préparation comprend, après l'étape e) : 15 f) l'ultrafiltration du jus de filtration obtenu à l'étape e) sur une membrane ayant un seuil de coupure de 300 kDa; et g) la récolte et le séchage du rétentat d'ultrafiltration obtenu à l'étape f). Selon un mode de réalisation le procédé de préparation comprend, après l'étape 20 e) : f) l'ultrafiltration du jus de filtration obtenu à l'étape e) sur une membrane ayant un seuil de coupure de 300 kDa; et g) la récolte et le séchage du perméat d'ultrafiltration obtenu à l'étape f). 25 L'invention concerne également un extrait d'algues rouges du genre Solieria susceptible d'être obtenu par le procédé de préparation selon l'invention. L'invention concerne également un extrait d'algues rouges du genre Solieria caractérisé en ce que l'extrait d'algues rouges comprend (en poids sur le poids total de 30 l'extrait) : Matière sèche : 92-99% ; Matière minérale : 5-37% ; Sucres : 10-48% ; Protéines : 10-30% ; 35 Sulfates : 10-20%. 3 L'extrait d'algues rouges du genre Solieria est en particulier caractérisé en ce que les monosaccharides constitutifs des polysaccharides de l'extrait d'algues rouges comprennent : Galactose : 50-75%, 5 Glucose : 5-40% ; et Xylose : 1-7%, les pourcentages étant exprimés en ratio molaire des monosaccharides constitutifs des polysaccharides. L'extrait d'algues rouges du genre Solieria est en particulier caractérisé en ce que 10 au moins 40% de la matière organique de l'extrait d'algues rouges présente un poids moléculaire supérieur ou égal à 50 kDa, et de préférence au moins 40% de la matière organique de l'extrait d'algues rouges présente un poids moléculaire moyen supérieur ou égal à 250 kDa. Cet extrait d'algues rouges du genre Solieria est en particulier susceptible d'être 15 obtenu par un procédé selon l'invention dans lequel le rétentat est récolté. L'invention concerne également un extrait d'algues rouges du genre Solieria caractérisé en ce que l'extrait d'algues rouges comprend (en poids sur le poids total de l'extrait) : 20 Matière sèche : 95-99% ; Matière minérale : 5-65%; Sucres : 5-37%; Protéines : 5-29%; Sulfates : 1-9%. 25 L'extrait d'algues rouges du genre Solieria est en particulier caractérisé en ce que les monosaccharides constitutifs des polysaccharides de l'extrait d'algues rouges comprennent : Galactose : 60-85%, Glucose : 10-25% ; et 30 Xylose : 1-5%, les pourcentages étant exprimés en ratio molaire des monosaccharides constitutifs des polysaccharides. L'extrait d'algues rouges du genre Solieria est en particulier caractérisé en ce que au moins au moins 70% de la matière organique de l'extrait d'algues rouges présente un 35 poids moléculaire inférieur ou égal à 150 kDa, et de préférence au moins 70% de la 4 matière organique de l'extrait d'algues rouges présente un poids moléculaire moyen inférieur ou égal à 50 kDa. Cet extrait d'algues rouges du genre Solieria est en particulier susceptible d'être obtenu par un procédé selon l'invention dans lequel le perméat est récolté. 5 L'invention concerne en outre l'extrait d'algues rouges du genre Solieria pour son utilisation pour la prévention ou le traitement d'un trouble intestinal. Selon un autre aspect, l'invention concerne l'extrait d'algues rouges du genre 10 Solieria pour son utilisation non thérapeutique en tant que complément alimentaire. L'invention concerne aussi un complément alimentaire, une composition pharmaceutique ou un médicament comprenant un extrait d'algues rouges du genre Solieria selon l'invention. 15 Description détaillée Extrait d'algues rouges L'extrait d'algues rouges est un extrait d'algues du genre Solieria, et plus spécifiquement de l'espèce Solieria chordes. 20 Un dalton (Da) est une unité massique définie comme étant égal à un douzième de la masse d'un atome de carbone 12, masse qui s'avérera ensuite estimée à partir d'un mélange de plusieurs isotopes (principalement carbone 12 et carbone 13, possédant respectivement 6 et 7 neutrons en plus des 6 protons de tout atome de 25 carbone). Un dalton est, avec une assez bonne précision, la masse d'un atome d'hydrogène, la valeur exacte étant 1,00794 uma (unité de masse atomique). Le kilodalton (kDa) est égal à 1000 Da. Dans le cadre de la présente invention, les poids moléculaires mentionnés en kDa sont déterminés par toute méthode usuellement employée par l'homme du métier, en particulier les poids moléculaires des constituants des extraits 30 d'algues pourront être discriminés par ultrafiltration sur des membranes laissant uniquement filtrer des molécules de tailles prédéterminées. La distribution de poids moléculaires des constituants d'un extrait d'algues peut être déterminée par chromatographie d'exclusion stérique, par exemple sur 2 colonnes Shodex OHpak SB-806M placées en série. L'éluant utilisé est par exemple du nitrate de 35 sodium à 0,1M, additionné d'azide de sodium à 0,2%, à un débit de 0,5 ml/min. La détection peut être réalisée à l'aide d'un réfractomètre Wyatt et d'un détecteur à diffusion 5 de la lumière 3 angles Wyatt. Dans ces conditions, les valeurs de l'incrément d'indice de réfraction dn/dc seront définies comme égales à 0,142 mL/g. Selon un mode de réalisation, l'extrait d'algues rouges est caractérisé par les 5 teneurs suivantes (« extrait OSE ») : Matière sèche : 92-99%, de préférence environ 94-99% (en poids sur le poids total de l'extrait) ; Matière minérale : 20-37%, de préférence 25-32% (en poids sur le poids total de l'extrait) ; 10 Sucres : 10-38%, de préférences 15-33% (en poids sur le poids total de l'extrait) ; Protéines : 10-26%, de préférence 13-23% (en poids sur le poids total de l'extrait) ; Sulfates : 10-15%, de préférence environ 13% (en poids sur le poids total de l'extrait). L'analyse élémentaire de l'extrait OSE indique que l'extrait est de préférence 15 constitué de : C : 25-30%, de préférence environ 28% ; H : 3-5% ; 0 : 38-42%, de préférence environ 40% ; N : 1-5%, de préférence environ 3% ; S : 4-8%, de préférence 57%. La composition osidique de la fraction de matière organique de l'extrait OSE (autrement dit, l'extrait déminéralisé) a été déterminée après hydrolyse des 20 polysaccharides par méthanolyse puis triméthylsylilation. Les monosaccharides constitutifs des polysaccharides de l'extrait OSE comprennent ainsi (les pourcentages étant exprimés en ratio molaire des monosaccharides constitutifs des polysaccharides de l'extrait OSE) : Galactose : 50-75%, de préférence 60-70%; 25 Glucose : 5-40% ; et Xylose : 1-7%. Selon un mode de réalisation, au moins 40%, de préférence au moins 45%, de la matière organique de l'extrait OSE présente un poids moléculaire supérieur ou égal à 50 kDa. 30 De préférence, au moins 40%, de préférence au moins 45%, de la matière organique de l'extrait OSE présente un poids moléculaire moyen supérieur ou égal à 250 kDa. La matière organique d'un extrait d'algues inclut tous les éléments constitutifs de l'extrait, à l'exclusion de la matière minérale, et inclut donc les saccharides 35 (polysaccharides, oligosaccharides) mais également les protéines qui sont associées aux polysaccharides. 6 Selon un mode de réalisation, l'extrait d'algues rouges est caractérisé par les teneurs suivantes (« extrait OSF ») : Matière sèche : 95-99%, de préférence 97-98% (en poids sur le poids total de 5 l'extrait) ; Matière minérale : 55-65%, de préférence 58-62% (en poids sur le poids total de l'extrait) ; Sucres : 5-15%, de préférences 7-10% (en poids sur le poids total de l'extrait) ; Protéines : 5-15%, de préférence 8-10% (en poids sur le poids total de l'extrait) ; 10 Sulfates : 1-5%, de préférence environ 3% (en poids sur le poids total de l'extrait). La composition osidique de la fraction de matière organique de l'extrait OSF (autrement dit, l'extrait déminéralisé) a été déterminée après hydrolyse des polysaccharides par méthanolyse puis triméthylsylilation. Les monosaccharides constitutifs des polysaccharides de l'extrait OSF comprennent ainsi (ratio molaire des 15 monosaccharides constitutifs des polysaccharides de l'extrait OSF) : Galactose : 60-85%, de préférence 70-80%; Glucose : 10-25% ; et Xylose : 1-5%. Selon un mode de réalisation, au moins 70%, de préférence au moins 80% de la 20 matière organique de l'extrait OSF présente un poids moléculaire inférieur ou égal à 150 kDa. De préférence au moins 70%, de préférence au moins 80%, de la matière organique de l'extrait OSF présente un poids moléculaire moyen inférieur ou égal à 50 kDa, 25 L'extrait d'algues rouges est en particulier susceptible d'être obtenu par un procédé de préparation tel que décrit ci-après. De préférence, l'extrait d'algues rouges réduit ou prévient l'augmentation de la 30 perméabilité intestinale, notamment en situation de stress, et/ou réduit ou prévient l'augmentation du temps de transit intestinal, en particulier induit par le stress. De préférence, l'extrait d'algues rouges induit in vitro l'expression de mucines (notamment MUC2 et/ou MUC4) et de protéines de jonction serrées (notamment ZO-1, ZO-2 et/ou claudin-2) dans des cellules intestinales, en particulier des cellules de colon telles que 35 Caco-2 (ATCC® HTB-37). 7 Selon un mode de réalisation, la perméabilité intestinale est évaluée en mesurant la perméabilité paracellulaire intestinale, par exemple par mesure du passage sanguin d'un marqueur (par exemple acide sulfonique-FITC). Selon un mode de réalisation, le temps de transit intestinal est évalué par mesure 5 du temps écoulé entre l'ingestion d'un bolus marqué (par exemple avec un colorant) et l'émission de la première fèces contenant le marqueur. Procédé d'extraction Un procédé de préparation de l'extrait d'algues rouges du genre Solieria 10 comprend: a) le lavage et dessablage d'algues rouges; b) le broyage des algues lavées et dessablées; c) l'hydrolyse thermique du broyat obtenu; d) la séparation de la phase solide du broyat de sa phase liquide ; 15 e) la clarification de ladite phase liquide; Le procédé de préparation peut en outre comprendre, après l'étape e) : f) l'ultrafiltration du jus de filtration obtenu à l'étape e) sur une membrane ayant un seuil de coupure de 300 kDa (et/ou une taille de pores de 0,50 pm) ; et 20 g) la récolte et le séchage du rétentat d'ultrafiltration obtenu à l'étape f) (« OSE ») ; ou, f) l'ultrafiltration du jus de filtration obtenu à l'étape e) sur une membrane ayant un seuil de coupure de 300 kDa (et/ou une taille de pores de 0,50 pm) ; et 25 g) la récolte et le séchage du perméat d'ultrafiltration obtenu à l'étape f) (« OSF »). Selon un mode de réalisation du procédé, les algues sont lavées à l'eau douce. Elles peuvent être dessablées par tout moyen connu de l'homme du métier. 30 Les dites algues sont ensuite broyées, notamment au moyen d'un broyeur, comme par exemple un affineur ou un cutteur. Le broyage conduit de préférence à l'obtention de particules dont la taille est comprise entre 0,1 et 10 mm. Le broyat est ensuite réhydraté avec de l'eau douce (par exemple avec un ratio en poids broyat : eau de 3 :1 à 1 :1, notamment 2:1) puis chauffé sous agitation, par 35 exemple pendant 1 à 3h, de préférence pendant environ 2h, à une température de 70 à 85°C, de préférence de 75 à 80°C. 8 Par la suite, la phase solide du broyat, le marc, est séparée de sa phase liquide, le jus, par pressage du broyat, par exemple à l'aide d'une presse à bande ou à plateaux, ou par centrifugation. Par « jus », on entend le jus cytoplasmique qui inclut la structure pariétale des 5 cellules des algues. La phase liquide obtenue est ensuite clarifiée, par exemple avec un clarificateur à assiettes, ou par centrifugation, décantation ou filtration (par exemple à poche ou à plaque). De préférence, le jus obtenu est ensuite ultrafiltré, après dilution à l'eau douce. 10 Selon un mode de réalisation du procédé, l'ultrafiltration est réalisée sur une membrane de taille de pores de moins de 1 pm, notamment sur une membrane de taille de pores de 0,8 pm ou de taille de pores de 0,5 pm. De manière préférée, la membrane est une membrane de taille de pores de 0,5 pm. La membrane peut être, par exemple, une membrane de céramique ou une membrane organique. Plus particulièrement, la 15 membrane est une membrane de céramique avec un seuil de coupure placé à 300 kDa, permettant de séparer les polysaccharides de longue chaine (degré de polymérisation > 100) des polysaccharides de plus petite chaine (degré de polymérisation 0.05) (Figure 2). Après 10 jours de gavage, la perméabilité paracellulaire in vivo restait identique entre les souris OSF (n=12) et les souris témoins (n=24) (T test, Mann et Whitnez test, p > 0.05) (Figure 2). 20 ii. En situation de stress Le modèle de stress (Water Avoidance Stress (WAS)) induisait une augmentation de perméabilité paracellulaire. Les souris témoins WAS (témoins et OSF WAS) avaient une perméabilité plus élevée que les souris non stressées (n=9) gavées à l'eau (Témoin / OSF WAS, T test, Mann et Whitney test, p = 0.0949 ; Témoin / Témoin WAS, T test, Mann 25 et Whitney test, p = 0.0021 a) (Figure 3). La perméabilité paracellulaire in vivo avait tendance à être réduite chez les souris OSF WAS (n=12) par rapport aux souris témoin WAS (n=10) (T test, Mann et Whitney, p = 0.0602) (Figure 3). 30 Effet de l'extrait d'algue OSF sur la motricité digestive En situation basale Le temps de transit total était identique chez les souris OSF et les souris témoins, en situation basale, du jour 0 au jour 10 (Figure 4). Au jour 0 et après 10 jours de gavage, le transit colique était identique chez les 35 souris du groupe OSF (n=12) par rapport aux souris du groupe témoin (n=24) (T test, Mann et Whitney test, p > 0.05) (Figure 4). 28 ii. En situation de stress Le transit colique était identique chez les souris OSF WAS (n=13) par rapport aux souris témoin WAS (n=12) (T test, Mann et Whitney test, p>0.05) (Figure 5). 5 Le transit colique était significativement augmenté chez les souris témoins WAS et OSF WAS par rapport aux souris témoins (n=12) (T test, Mann et Whitney test ; Témoin/Témoin WAS, p = 0.0019a ; témoin/OSF WAS, p = 0.0005v) (Figure 5). Effet de l'extrait d'algue OSF sur la morphométrie/anatomie 10 i. Poids des animaux Chez les souris témoins (n=6), le poids augmentait significativement au cours du temps (One way anova, Friedman test, p = 0.0001"). Chez les souris traitées avec l'extrait d'algue OSF (n=6), le poids augmentait significativement au cours du temps (One way anova, Friedman test, p = 0.0001 *). Chez les souris témoins WAS (n=6), le poids 15 augmentait significativement au cours du temps (One way anova, Friedman test, p=0.0017*) (Figure 6). Chez les souris témoin (n=6), le poids augmentait significativement au cours du temps (One way anova, Friedman test, p =0.0001"). Chez les souris traitées avec l'extrait d'algue OSF (n=7), le poids augmentait significativement au cours du temps (One way 20 anova, Friedman test, p 0.05). iii. Poids du cerveau 30 Le poids du cerveau avait tendance à être augmenté chez les souris OSF (n=13) par rapport aux souris témoin (n=24) (T test, Mann et Whitney test, p = 0.0579). Récapitulatif des données et données comparatives L'impact de six extraits d'algues a été évalué sur les fonctions clefs du tube 35 digestif : la perméabilité et la motricité intestinale, dans un modèle murin in vivo. Cette étude était réalisée en comparant les réponses induites par ces 6 différents extraits à un 29 groupe contrôle gavé par l'excipient, dans des conditions de base et dans des conditions de stress d'évitement de l'eau (WAS ; Water Avoidance Stress). Le Tableau 4 ci-dessous récapitule les données obtenues pour chacun des extraits. 5 Tableau 4 : Synthèse de l'effet de six extraits d'algues sur la perméabilité et la motricité intestinale, dans un modèle murin Extrait Perméabilité Temps Transit colique in vivo poids des Longueur poids du paracellulaire in vivo transit animaux intestin cerveau total /côlon Basal stress basal basal stress OSA JO = /après stress JO = JO = 1' "= ou 1. " pas d'effet pas d'effet J101 J10= J10= que témoin OSB JO = /après stress JO = JO = 1' que témoin pas d'effet t J10,I, J10= J10= OSC J1J0 O /. /après stress J0j, JO t "= " témoin pas d'effet pas d'effet = J10 = = J10/ OSD JO = /après stress JO = JO = t j, que témoin pas d'effet pas d'effet J10 Î J 10 = J10 = OSE JO = "= " sans stress JO = JO = J10 = "= " sans stress "= " témoin pas d'effet pas d'effet J10 = J10 = OSF JO = "= " sans stress JO = JO = .1' "= " témoin pas d'effet 1' (tendance) J10 = J10 = J10 = Les extraits d'algues OSE et OSF selon l'invention se distinguent des quatre 10 autres extraits d'algues testés. Cette étude, a montré que le complément OSF avait une forte tendance à diminuer la perméabilité en condition de stress (Water Avoidance Stress). Cet extrait n'induisait pas de modifications morpho-anatomiques, aucune différence n'était observée concernant l'évolution du poids des animaux, la longueur totale de l'intestin et le poids des 15 cerveaux. Les taux de corticostérone, dans le sang, étaient identiques entre les souris témoin WAS et les souris gavées avec l'extrait d'algue OSF WAS. Exemple 4: Etude des effets de l'extrait d'algues OSE sur la motricité et la perméabilité intestinale 20 Cette étude est la synthèse de deux études indépendantes de caractérisation des effets de l'extrait OSE (l'oligosaccharide « E ») sur les fonctions digestives in vivo (perméabilité, motricité), et ex vivo sur la fonction de barrière intestinale en chambre d'Ussing. La capacité d'OSE à modifier ces fonctions digestives à la fois à leur état de base et lors d'un modèle de stress (Stress d'évitement de l'eau - ST), connu pour les 25 modifier, a été évaluée. A la fin de cette phase de stress, l'impact d'OSE sur la réponse 30 au stress était également évalué en mesurant le taux sanguin de corticostérone (hormone du stress). Le protocole général de l'étude ainsi que les détails de chaque série d'expériences sont montrées en figures 8 et 9. 5 MATERIELS ET METHODES Modèle animal Le modèle animal utilisé était la souris saine C57 black 6Rj mâle âgée de 8 semaines. Après 10 jours d'acclimatation, les souris ont été gavées quotidiennement 10 (week-ends exclus) durant 14 jours avec l'oligosaccharide E (OSE) ou bien un placebo (eau). A partir du 11 ême jour de traitement, les souris étaient placées durant 1 heure sur un plot entouré d'eau durant 4 jours consécutifs jusqu'au 1 eme jour de traitement. Les souris étaient hébergées dans des cages sur portoir ventilé. Au total 64 souris ont été utilisées avec 4 groupes expérimentaux distincts : un groupe de 28 souris contrôle 15 gavées à l'eau, sans stress (groupe CT) ; un groupe de 28 souris contrôles gavées à l'eau, avec stress (groupe ST) ; un groupe de 16 souris gavées avec OSE (groupe OSE), un groupe de 28 souris gavées avec OSE, avec stress (OSE+ST). L'ensemble de l'étude s'est déroulée sur 6 séries d'expériences réalisées à des temps différents. Chaque série d'expériences était composée des quatre groupes (CT, ST, OSE et OSE+ST). 20 A. Evaluation des effets d'OSE sur la perméabilité paracellulaire et transcellulaire in vivo et ex vivo. Evaluation de la perméabilité intestinale in vivo Les perméabilités paracellulaire et transcellulaire étaient évaluées in vivo avant le 25 début des gavages (JO) puis après 10 jours (J10) et 14 jours (J14) de gavages en mesurant le passage sanguin d'acide sulfonique conjugué au FITC (ASF - marqueur de faible poids moléculaire, 400 Da) et de la protéine Horse Radish Peroxydase (HRP marqueur de haut poids moléculaire, 44kDa), respectivement. Les souris étaient gavées avec une solution de carboxy-méthyl-cellulose 0.5% 30 (p/v) contenant l'ASF (10 mg/ml) et la HRP (10 mg/mL). Le sang était collecté 120 min après le gavage puis le plasma était obtenu après une centrifugation à 3000g/5min. L'intensité de fluorescence du plasma était mesurée à l'aide d'un lecteur de plaque fluorimètre. La perméabilité à l'ASF est exprimée en pourcentage par rapport la moyenne de l'intensité de fluorescence du groupe CT. La perméabilité à l'HRP est évaluée en 35 mesurant son activité enzymatique dans le plasma à l'aide d'un dosage enzymatique 31 colorimétrique. La perméabilité à l'HRP est exprimée en pourcentage par rapport la moyenne des activités enzymatiques du groupe CT. Evaluation de la perméabilité intestinale ex vivo Les perméabilités paracellulaire et transcellulaire étaient évaluées ex vivo à J14 5 sur le jéjunum, l'iléon, le colon proximal et le colon distal. Brièvement, les segments d'intestin étaient ouverts le long de l'insertion du mésentère et montés dans les chambres d'Ussing. Après une période d'équilibration de 30 min, ASF (1 mg/ml) et l'HRP (3.75 mg/ml) étaient ajoutés au pôle apical du tissu. La perméabilité à l'ASF était évaluée en mesurant la fluorescence d'échantillons de milieu prélevés toutes les 30 min au pôle 10 basolatéral sur une période de 150 min. la quantification de fluorescence au cours du temps permet de réaliser une régression linéaire donc la pente définit le flux d'ASF au travers du tissu. La perméabilité à l'HRP était évaluée en mesurant son activité enzymatique dans des échantillons de milieu prélevés toutes les 30 min au pôle basolatéral sur une période de 150 min (dosage enzymatique colorimétrique). 15 B. Evaluation des effets d'OSE sur la motricité intestinale in vivo. Evaluation du temps de transit total : Le temps de transit total a été évalué à JO et J10. La solution utilisée pour évaluer la perméabilité in vivo contenait également du rouge carmin (60mg/m1) qui n'était pas 20 absorbé et était utilisé pour caractériser le temps de transit intestinal oro-anal (Tasselli et al, 2013). Le temps de transit total était déterminé en mesurant le temps écoulé entre le gavage et l'émission de la première fèces de couleur rouge. Evaluation du transit colique Le transit colique a été évalué à JO, J10, J14 en dénombrant le nombre de fèces 25 émises durant 2 heures (Tasselli et al, 2013). Chaque souris était placée en cage individuelle et les fèces ont été comptées et collectées pendant 2h. Les fèces ont été pesées (poids frais) puis séchées 48 heures à 56°C et de nouveau repesées pour déterminer le pourcentage d'humidité (JO et J10). Le temps de transit total et le transit colique sont présentés en % par rapport à la 30 moyenne des contrôles (% / moy. CT) C. Prélèvement et stockage d'échantillons Au sacrifice (J14), des segments de jéjunum, d'iléon, de colon proximal et de colon distal ont été prélevés et congelés (-80°C) dans des tubes secs, et d'autre part, fixés au 35 PBS/paraformaldéhyde 4%. Le cerveau était également prélevé, la moitié était congelée à -80°C et l'autre fixée. Ces échantillons pourront are utilisés pour d'éventuelles analyses 32 transcriptomiques (tubes secs) et histologiques (tissus fixés). Des fèces étaient également prélevées à JO et J10 puis congelées à -80°C. D. Etude de l'impact d'OSE sur la réponse au stress. 5 L'impact d'OSE sur le stress éprouvé par l'animal était évalué en mesurant le taux de corticostérone sanguin lors du stress d'évitement de l'eau. La concentration sanguine en corticostérone était déterminée par dosage ELISA et exprimée en ng/ml de plasma. Graphiques et Analyses statistiques 10 Tous les graphiques et les évaluations statistiques étaient réalisés avec GraphPad Prism Software (GraphPad Software, Inc., La Jolla, California, United States). L'effet du traitement avec OSE au cours du temps était évalué avec une anova à 2 voies à mesure répétée suivi d'un post test de Bonferroni. Les effets d'OSE et du stress étaient évalués avec une anova à 2 voies à mesure répétée suivi d'un post test de Bonferroni 15 (symbole :*). Le test de Mann et Whitney (symbole : ()était utilisé pour comparer les données non appariées et déterminer la valeur exacte de p. Les valeurs de p 0,05 étaient considérées comme statistiquement significatives. Enfin, quand la probabilité (p) entre deux groupes donnés était comprise entre 0,07 0,05 , cette tendance était symbolisée par n . 20 RESULTATS Effet d'OSE sur les paramètres anatomiques L'impact de 10 jours et 14 jours d'administration d'OSE était évalué sur plusieurs paramètres anatomiques tels que le poids et la longueur de l'intestin. 25 i. Effet sur le poids des souris Entre JO et J14, le poids des souris augmentait significativement dans les différents groupes (one way anova RM ; Friedman test p 0.0004 ; post test de Dunn's p 0,01 ; n 28 CT ; 15 OSE ; 28 ST 27 OSE+ST). Apres 10 jours de traitement le poids des souris était semblable entre les groupes, cependant à J14 le poids des souris OSE-kST 30 est significativement plus faible que celui du groupe CT (Anova à 2 voies à mesure répétée ; p = 0,13 ; n = 24 / groupe ; Figure 10). iL Effet sur la longueur totale de l'intestin Les longueurs totales des intestins étaient similaires entre les groupes (Anova à 2 ; effet traitement p = 0,43 ; effet du stress p = 0,5 ; n = 28CT ; 15 OSE ; 28 ST et 27 35 OSE+ST) (données non montrées). 33 Effet sur la longueur de l'intestin grêle La longueur de l'intestin grêle n'étais pas modifiée par le stress et / ou le traitement avec OSE (Anova à 2 voies ; effet traitement p = 0,51 ; effet du stress p = 0,1 ; n = 28 CT ; 15 OSE ; 28 ST et 27 OSE+ST) (données non montrées). 5 iv. Effet sur la longueur du colon La longueur colon n'étais pas modifiée par le stress et / ou le traitement avec OSE (Anova à 2 voies ; effet traitement p = 0,057; effet du stress p = 0,084 ; n = 28 CT ; 15 OSE ; 28 ST et 27 OSE+ST) (données non montrées). v. Effet sur le poids du cerveau 10 Le stress induisait des modifications significatives du poids des cerveaux (Anova à deux voies, traitement p = 0.85 ; stress p = 0,0039 ; n = 28 CT, 13 OSE, 26 ST, 22 OSE+ST). Le stress induisait une augmentation significative du poids des cerveaux du groupe OSE+ST par rapport aux groupes OSE (post test de Bonferroni p REVENDICATIONS1.- Extrait d'algues rouges du genre Solieria pour son utilisation pour la prévention ou le traitement d'un trouble intestinal. 2.- Extrait d'algues rouges du genre Solieria pour l'utilisation selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'extrait d'algues rouges protège et/ou améliore la fonction ou l'intégrité de la barrière épithéliale intestinale. 3.- Extrait d'algues rouges du genre Solieria pour l'utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le trouble intestinal est une diarrhée, une constipation, un syndrôme du côlon irritable, ou une maladie inflammatoire chronique de l'intestin. 4.- Extrait d'algues rouges du genre Solieria pour l'utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le trouble intestinal est un trouble induit par un stress. 5.- Extrait d'algues rouges du genre Solieria pour son utilisation non thérapeutique en tant que complément alimentaire. 6.- Extrait d'algues rouges du genre Solieria pour l'utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les algues rouges sont des algues Solieria chordalis. 7.- Extrait d'algues rouges du genre Solieria pour l'utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'extrait d'algues rouges est obtenu par un procédé de préparation comprenant : a) le lavage et dessablage des algues; b) le broyage des algues lavées et dessablées ; c) l'hydrolyse thermique du broyat obtenu; d) la séparation de la phase solide du broyat de sa phase liquide ; et e) la clarification de ladite phase liquide. 8.- Extrait d'algues rouges du genre Solieria pour l'utilisation selon la revendication 7; caractérisé en ce que le procédé de préparation comprend, après l'étape e) : f) l'ultrafiltration du jus de filtration obtenu à l'étape e) sur une membrane ayant un seuil de coupure de 300 kDa; et g) la récolte et le séchage du rétentat d'ultrafiltration obtenu à l'étape f). 5 9.- Extrait d'algues rouges du genre Solieria pour l'utilisation selon la revendication 7; caractérisé en ce que le procédé de préparation comprend, après l'étape e) : f) l'ultrafiltration du jus de filtration obtenu à l'étape e) sur une membrane ayant un seuil de coupure de 300 kDa; et g) la récolte et le séchage du perméat d'ultrafiltration obtenu à l'étape f). 10 10.- Extrait d'algues rouges du genre Solieria pour l'utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'extrait d'algues rouges comprend (en poids sur le poids total de l'extrait) : Matière sèche : 92-99% ; 15 Matière minérale : 5-37% ; Sucres : 10-48%; Protéines : 10-30% ; Sulfates : 10-20%. 20 11.- Extrait d'algues rouges du genre Solieria pour l'utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 et 10, caractérisé en ce que les monosaccharides constitutifs des polysaccharides de l'extrait d'algues rouges comprennent : Galactose : 50-75%, Glucose : 5-40% ; et 25 Xylose : 1-7%, les pourcentages étant exprimés en ratio molaire des monosaccharides constitutifs des polysaccharides. 12.- Extrait d'algues rouges du genre Solieria pour l'utilisation selon l'une 30 quelconque des revendications 1 à 8 et 10-11, caractérisé en ce que au moins 40% de la matière organique de l'extrait d'algues rouges présente un poids moléculaire supérieur ou égal à 50 kDa, et de préférence au moins 40% de la matière organique de l'extrait d'algues rouges présente un poids moléculaire moyen supérieur ou égal à 250 kDa. 41 13.- Extrait d'algues rouges du genre Solieria pour l'utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 et 9, caractérisé en ce que l'extrait d'algues rouges comprend (en poids sur le poids total de l'extrait) : Matière sèche : 95-99% ; 5 Matière minérale : 5-65%; Sucres : 5-37% ; Protéines : 5-29% ; Sulfates : 1-9%. 10 14.- Extrait d'algues rouges du genre Solieria pour l'utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, 9 et 13, caractérisé en ce que les monosaccharides constitutifs des polysaccharides de l'extrait d'algues rouges comprennent : Galactose : 60-85%, Glucose : 10-25% ; et 15 Xylose : 1-5%, les pourcentages étant exprimés en ratio molaire des monosaccharides constitutifs des polysaccharides. 15.- Extrait d'algues rouges du genre Solieria pour l'utilisation selon l'une 20 quelconque des revendications 1 à 7, 9 et 13-14, caractérisé en ce que au moins au moins 70% de la matière organique de l'extrait d'algues rouges présente un poids moléculaire inférieur ou égal à 150 kDa, et de préférence au moins 70% de la matière organique de l'extrait d'algues rouges présente un poids moléculaire moyen inférieur ou égal à 50 kDa. 25 16.- Extrait d'algues rouges du genre Solieria susceptible d'être obtenu par un procédé de préparation comprenant : a) le lavage et dessablage des algues ; b) le broyage des algues lavées et dessablées ; 30 c) l'hydrolyse thermique du broyat obtenu ; d) la séparation de la phase solide du broyat de sa phase liquide ; et e) la clarification de ladite phase liquide. 17.- Extrait d'algues rouges du genre Solieria selon la revendication 16; 35 caractérisé en ce que le procédé de préparation comprend, après l'étape e) : 42 f) l'ultrafiltration du jus de filtration obtenu à l'étape e) sur une membrane ayant un seuil de coupure de 300 kDa; et g) la récolte et le séchage du rétentat d'ultrafiltration obtenu à l'étape f). 5 18.- Extrait d'algues rouges du genre Solieria selon la revendication 16, caractérisé en ce que le procédé de préparation comprend, après l'étape e) : f) l'ultrafiltration du jus de filtration obtenu à l'étape e) sur une membrane ayant un seuil de coupure de 300 kDa; et g) la récolte et le séchage du perméat d'ultrafiltration obtenu à l'étape f). 10 19.- Extrait d'algues rouges du genre Solieria selon la revendication 16 ou 17, l'extrait d'algues rouges étant tel que défini dans l'une quelconque des revendications 10 à 12. 15 20.- Extrait d'algues rouges du genre Solieria selon la revendication 16 ou 18, l'extrait d'algues rouges étant tel que défini dans l'une quelconque des revendications 13 à 15. 21.- Extrait d'algues rouges du genre Solieria tel que défini dans l'une quelconque 20 des revendications 10 à 15. 22.- Complément alimentaire, composition pharmaceutique ou un médicament comprenant un extrait d'algues rouges du genre Solieria tel que défini dans l'une quelconque des revendications 10 à 20. 25 23.- Procédé de préparation d'un extrait d'algues rouges du genre Solieria comprenant : a) le lavage et dessablage des algues; b) le broyage des algues lavées et dessablées ; 30 c) l'hydrolyse thermique du broyat obtenu; d) la séparation de la phase solide du broyat de sa phase liquide ; et e) la clarification de ladite phase liquide.