Brevet FR3098813A1 — publié le 20210122

Description Titre de l'invention : Complexe hybride htiARN / nanoparticule et son utilisation pour traitement d'une maladie du système digestif [0001] La présente invention concerne un complexe de molécules hybrides ADN/ARN, appelée « hybrides htiARN », et de nanoparticules et son utilisation thérapeutique, notamment pour traitement d'une maladie du système digestif. [0002] Les siARN sont de plus en plus utilisées comme candidats médicaments. Les siARN comprennent deux brins d'ARN généralement d'une longueur de 21 à 23 nucléotides chacun, dont : [0003] - un brin antisens, qui peut s'apparier par complémentarité avec l'ARN messager d'un gène cible, et [0004] - un brin sens ou passager, complémentaire au brin antisens. [0005] En se fixant sur l'ARN messager d'un gène cible, le brin antisens d'un siARN va provoquer l'inhibition fonctionnelle de l'expression de ce gène cible via le mécanisme d'ARN interférence, le brin sens n'étant pas utilisé au cours de ce processus. Cc mécanisme d'ARN interférence peut ainsi servir à moduler l'expression du gène cible dans un but thérapeutique. [0006] La barrière la plus importante à l'utilisation des siARN comme médicament est leur très faible biodisponibilité. Pour améliorer les propriétés pharmacocinétiques et assurer la biodisponibilité intracellulaire d'une molécule active hydrophile telle qu'un siARN, il est possible de l'associer à une nanoparticule lipidique (LNP), qui va protéger le siARN, permettre son transport et ainsi d'atteindre sa cible. En particulier, la fixation d'un siARN, qui est une molécule anionique (charge nette négative), est possible sur une nanoparticule lipidique cationique (charge nette positive) par interaction électrostatique. [0007] Les nanoparticulcs lipidiques peuvent être sous forme isolée ou être les gouttelettes d'une émulsion dans laquelle la phase dispersée est lipidique. [0008] La demande FR 2 994 849 décrit une nanoémulsion, comprenant une phase aqueuse continue et une phase dispersée sous forme de gouttelettes comprenant notamment un tensioactif cationique. Ce tensioactif cationique permet la complexation de siARN sur les LNP de la phase dispersée. [0009] L'efficacité du transport d'un siARN par une nanoparticule dépend principalement de la stabilité du complexe siARN - nanoparticule dans un fluide biologique. Les inventeurs de la présente demande ont observé que le complexe siARN - LNP décrit dans la demande FR 2 994 849 est stable dans un milieu artificiel qui n'est pas physiologique (milieu de culture cellulaire), mais qu'une dissociation du siARN et des 2 LNP se produit dans un milieu complexe reproduisant les conditions physiologiques, en particulier celles du colon distal. [0010] Il existe donc un besoin de fournir un véhicule de siRNA qui soit plus stable en milieu physiologique que les véhicules de l'art antérieur tout en permettant de maintenir l'efficacité biologique, afin de permettre une administration orale, topique, intra rectale ou ophtalmologique. En particulier, une formulation permettant une administration orale est recherchée, cc qui requiert que le véhicule de siRNA puisse franchir les différents milieux intestinaux, avec conditions extrêmes (pH, sels biliaires, enzymes...) pour permettre au siARN d'atteindre sa cible. [0011] A cet effet, selon un premier objet, l'invention concerne une molécule hybride ADN/ ARN, appelée htiARN, comprenant : [0012] - deux brins d'ARN antisens de séquences identiques et étant susceptibles de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférence, chacun comprenant un nombre nÀRN de nucléotides de 18 à 30, et ayant une extrémité 5' phosphoryléc, [0013] - un premier brin d'ADN dont la séquence nucléotidique comprend unc séquence nu- cléotidique Si liée par son extrémité 3' à l'extrémité 5' d'un bras cspaccur nucléotidique Ll lié par son extrémité 3' à l'extrémité 5' d'une séquence nucléotidique SCI, et [0014] - un deuxième brin d'ADN dont la séquence nucléotidique comprend une séquence nucléotidique S2 liée par son extrémité 3' à l'extrémité 5' d'un bras cspaccur nucléotidique L2 lié par son extrémité 3' à l'extrémité 5' d'une séquence nucléotidique SC2, [0015] où : [0016] - la séquence nucléotidique SCI comprend un nombre nsc, nucléotides avec nsc., de (nARN - 3) à (nARN-F 3), et présente au moins 40 % d'identité de séquence, déterminé par une méthode d'alignement globale, avec la séquence complémentaire de TARN antisens, de sorte que la séquence nucléotidique SCI est hybridée par complémentarité à un premier des deux brins d'ARN antisens, [0017] - la séquence nucléotidique SC2 comprend un nombre nsc2 nucléotides avec nsc., de (nARN - 3) à (nARN-F 3), et présente au moins 40 % d'identité de séquence, déterminé par une méthode d'alignement globale, avec la séquence complémentaire de TARN antisens, de sorte que la séquence nucléotidique SC2 est hybridée par complémentarité au deuxième des deux brins d'ARN antisens, [0018] - la séquence nucléotidique SI du premier brin d'ADN est complémentaire de la séquence nucléotidique S2 du deuxième brin d'ADN, de sorte que la séquence nucléotidique Si du premier brin d'ADN est hybridée par complémentarité à la séquence nucléotidique S2 du deuxième brin d'ADN, [0019] - les deux séquences nucléotidiques SI et S2 ont un même nombre nsi s2 de nu- 3 cléotides, ns1s2étant un nombre de 16 à 30, [0020] - le bras cspaccur nucléotidique Ll du premier brin d'ADN comprend un nombre nu de nucléotides et le bras espaccur nucléotidique L2 du deuxième brin d'ADN comprend un nombre nu, de nucléotides, nu et nu, représentant indépendamment un nombre de 1 à 15, [0021] - les deux brins d'ARN antisens, le premier brin d'ADN et/ou le deuxième brin d'ADN sont éventuellement porteurs d'un ou plusieurs groupes lipidiques. [0022] L'invention repose sur la découverte que l'hybride htiARN défini ci-dessus est capable de former avec une nanoparticule un complexe plus stable en milieu physiologique que celui obtenu par complexation de la même nanoparticulc avec l'ARN antiscns qu'il comprend, tout en conservant une capacité à moduler les mécanismes endogènes d'ARN interférence. En l'occurrence, le complexe hybride htiARN / nanoparticule permet un bon compromis entre stabilité du complexe, ce qui permet d'éviter une décomplexation dans les milieux physiologiques, et efficacité de la modulation des mécanismes endogènes d'ARN interférence. Un tel compromis est difficile à obtenir, car si le complexe est trop stable, l'ARN antisens n'est pas libéré et il ne peut pas moduler les mécanismes endogènes d'ARN interférence, mais si le complexe n'est pas assez stable, l'ARN antiscns est libéré prématurément et ne peut pas atteindre sa cible. [0023] Des modifications apportées à la structure d'un siARN ont été décrites dans la lit- térature, comme l'allongement du brin sens ARN ou son remplacement par de l'ADN. Un allongement de la taille du siARN au-delà de 30 paires de bases entraine une réponse inflammatoire, si bien qu'on évite d'allonger les siARN. De plus, à la connaissance des inventeurs, aucune de ces modifications n'a été utilisée pour réaliser un hybride htiARN tel que défini ci-dessus, ou bien pour stabiliser la complexation d'un médicament ARN sur une nanoparticule. [0024] Sans vouloir être liés à une théorie particulière, les inventeurs supposent que cette stabilisation améliorée du complexe hybride htiARN / nanoparticule pourrait s'expliquer par l'augmentation de la longueur de la molécule d'acide nucléique (nsc, + + nsi + nARN) par rapport à celle de l'ARN antisens (nARN, de 21 à 23 nucléotides lorsqu'il est monobrin, ou 42 à 46 bases lorsqu'il est double brin), ce qui induirait une charge nette totale plus importante de l'hybride htiARN par rapport à celle de l'ARN antisens, et donc une meilleure affinité de l'hybride htiARN avec la nanoparticule grâce à des forces électrostatiques plus importantes. Cette meilleure affinité expliquerait la meilleure stabilité du complexe hybride htiARN / nanoparticule dans les fluides physiologiques complexes, en prévenant ou limitant sa séparation par compétition avec les différents électrolytes et macromolécules chargées présentes dans un milieu biologique complexe. Cette stabilité renforcée permet ainsi d'augmenter l'efficacité de délivrance d'un siARN dont la séquence antisens est incluse dans la structure du htiARN. [0025] La structure du htiARN est représentée à la [fig.1] figure 1. [0026] L'hybride htiARN est un hybride d'ARN et d'ADN. L'hybride htiARN comprend quatre brins : deux brins d'ARN et deux brins d'ADN. L'hybride htiARN est un dimère de deux unités monomériques illustrées sur la [fig.2] figure 2, où chaque unité monomérique comprend : [0027] - un brin d'ARN antisens (qui est identique entre les deux unités monomériques) et [0028] - un brin d'ADN (soit le premier brin, soit le deuxième brin définis ci-dessus) qui comprend : [0029] - une séquence nucléotidique SC1 ou SC2 au moins partiellement complémentaire à l'ARN antisens, et [0030] - une séquence nucléotidique Si ou S2 complémentaire de celle de l'autre unité mo- nomérique (S1 complémentaire de S2 et vice versa). [0031] L'hybride htiARN contient deux ARN antisens, cc qui maximise le nombre de siARN, en comparant par exemple à une structure dans laquelle seul de l'ADN inerte serait ajouté au siARN. Chacun des deux brins d'ARN antiscns comprend un nombre n ARN de nucléotides de 18 à 30, notamment de 19 à 27, par exemple de 20 à 25, de préférence de 21 à 23. [0032] Chacune des séquences nucléotidiques SC1 et SC2 peut indépendamment avoir jusque trois nucléotides en moins ou en plus par rapport à la séquence de l'ARN antisens. De plus, les séquences nucléotidiques SC1 et SC2 doivent comporter au moins (40 % d'identité, de préférence au moins 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% d'identité, déterminé par une méthode d'alignement globale, avec la séquence complémentaire de la séquence de l'ARN antisens. Cette complémentarité, partielle ou totale, permet que la séquence SC1 du premier brin d'ADN soit hybridée à un premier ARN antisens et que la séquence SC2 du deuxième brin d'ADN soit hybridée au deuxième ARN antisens. De préférence, SC1 et SC2 sont identiques, ce qui facilite la préparation de l'hybride htiARN. [0033] Un pourcentage d'identité peut être déterminé par une méthode d'alignement globale en utilisant, par exemple, le programme Clustal Omega (Sievers F et al. (2011). Molecular Systems Biology 7:539 doi:10.1038/msb.2011.75 ; Sievers F, Higgins DG (2018). Protein Sci 27:135-145). [0034] La séquence nucléotidique Si du premier brin d'ADN et la séquence nucléotidique S2 du deuxième brin d'ADN sont complémentaires l'une de l'autre et permettent l'association par hybridation des deux unités monomériques sous la forme d'un tandem inversé, comme illustré à la [fig.2] figure 2. [0035] De préférence, la séquence nucléotidique SI-L1 du premier brin d'ADN et/ou la séquence nucléotidique S2-L2 du deuxième brin d'ADN a(ont) moins de 80%, notamment 60%, notamment moins de 50%, typiquement moins de 40%, notamment moins de 30%, de préférence moins de 20%, d'identité avec une séquence ARN du transcriptome (de préférence le transcriptome humain), déterminé par une méthode d'alignement locale. En effet, les séquences nucléotidiques S1 et 52 n'ont de préférence pas de rôle biologique pour éviter un effet indésirable. Le rôle des séquences nucléotidiques 51-L1 et 52-L2 est d'augmenter la charge nette totale de l'hybride htiARN et ainsi d'améliorer la stabilité du complexe hybride htiARN / nanoparticule. [0036] Un pourcentage d'identité peut être déterminé par une méthode d'alignement locale en utilisant, par exemple, le programme Nucleotide BLAST du NCBT (National Center for Biotechnology Information). [0037] Comme transcriptome de référence, il est fait référence en particulier au trans- criptome humain généré par le Genome Reference Consortium, en particulier la version GRCh38.p1 2 du 21 décembre 2017. [0038] Les séquences nucléotidiques 51 et S2 étant complémentaires, elles ont le même nombre ns, s2 de nucléotides. ns, sa est un nombre entier de 16 à 30. Plus nsi 52 est élevé, plus l'hybridation entre les deux unités monomériques de l'hybride htiARN est forte et plus la charge nette totale de l'hybride htiARN augmente, donc plus sa capacité à stabiliser un complexe hybride htiARN / nanoparticulc augmente, mais plus le risque que 51 ou S2 ait un effet biologique non désiré augmente. C'est pourquoi nsi 52est inférieur ou égal à 30. Lorsque ns, s2 est inférieur à 16, les deux unités monomériques s'hybrident moins bien. Un ns, 52 entre 18 et 22 est optimal pour qu'il y ait une bonne hybridation entre les deux unités monomériques de l'hybride htiARN tout en minimisant le risque d'effet biologique non désiré. [0039] Les deux brins d'ARN antisens sont identiques et chacun comprend de 21 à 23 nu- cléotides. Leur extrémité 5' est phosphorylée afin de permettre la liaison avec le complexe protéique impliqué dans le processus d'ARN interférence (complexe RISC). L'ARN antisens est susceptible de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférence, et donc susceptible de bloquer l'expression d'un gène cible par le processus d'ARN interférence. [0040] Le bras espaceur nucléotidique LI sert à relier la séquence nucléotidique SI et la séquence nucléotidique SC1 du premier brin d'ADN. Le bras espaceur nucléotidique L2 sert à relier la séquence nucléotidique S2 et la séquence nucléotidique SC2 du deuxième brin d'ADN. Les cieux bras espaceur peuvent comprendre un nombre de nucléotides nu et ni_.2 identiques ou différents. Lorsque nu et nu sont égaux, les séquences des bras espaceurs nucléotidiques LI et L2 peuvent être identiques ou différentes. nu et nu sont indépendamment un nombre entier de 1 à 15, notamment de 2 à 10, par exemple de 5. Plus nu ou nu est élevé, plus le risque que bras espaceur nu- 6 cléotidique LI ou L2 ait un effet biologique non désiré augmente. C'est pourquoi n, et n, sont inférieurs ou égaux à 15, et sont de préférence le plus faibles possibles. [0041] Un ou les deux brins d'ARN antisens, le premier brin d'ADN et/ou le deuxième brin d'ADN peuvent être éventuellement porteurs d'un ou plusieurs groupes lipidiques. Ce(s) groupe(s) lipidique(s) permet avantageusement de rendre l'hybride htiARN plus lipophile, et de faciliter son passage à travers les membranes plasmiques ou encore renforcer son affinité pour une nanoparticule lipidique. Un groupe cholestérol peut être utilisé comme groupe lipidique. De préférence, le groupe lipidique est greffé sur le premier et/ou deuxième brin d'ADN, par exemple sur leur extrémité 3'. [0042] La [fig.3] figure 3 fournit un exemple d'hybride htiARN, nommé « htiGFP » car l'ARN antisens qu'il contient est un ARN interférent ciblant l'ARN messager du gène codant pour la « Green Fluorescent Protein » (GFP). Le ler brin d'ADN a la séquence SEQ ID NO:1. Le 2ème brin d'ADN a la séquence SEQ ID NO:2. Chacun des deux brins d'ARN antisens comprend la séquence SEQ ID NO:3. Chacun contient nARN = 22 nucléotides. Les séquences nucléotidiques SC1 du premier brin d'ADN et SC2 du deuxième brin d'ADN sont identiques et chacune consiste en la séquence SEQ ID NO:4. Les séquences nucléotidiques SC1 et SC2 contiennent chacune nSCI = nSC2 = 22 nucléotides, dont 20 nucléotides consécutifs sont complémentaires de 20 nucléotides consécutifs de SEQ ID NO:3. Les deux nucléotides AT de SEQ ID NO:4 représentent une extrémité débordante en 3' de SC1 et SC2, ces deux nucléotides n'ayant pas de nucléotides complémentaires dans l'ARN antisens. De même, deux nucléotides CG de SEQ ID NO:3 représentent une extrémité débordante en 3' de l'ARN antisens. Le bras espaceur LI et le bras espaceur L2 sont identiques et consistent chacun en la séquence AACAG. Les bras espaceur LI et L2 contiennent chacun nLI = nL2 = 5 nucléotides. La séquence nucléotidique Si du premier brin d'ADN consiste en la séquence SEQ ID NO:5. La séquence nucléotidique S2 du deuxième brin d'ADN consiste en la séquence SEQ ID NO:6. Les séquences nucléotidiques Si et S2 sont complémentaires. Le nombre de nucléotides de chaque séquence nucléotidique Si et S2 est nSI-S2 = 20. [0043] De préférence, la somme nsci+ + nsi+ nARN et/ou la somme nsc2 + n12+ nS2 nARN est(sont) supérieure(s) ou égale(s) à 60 pour une stabilisation optimale du complexe hybride htiARN / nanoparticule. [0044] L'hybride htiARN peut être préparé par hybridation dans un tampon d'hybridation de deux équivalents molaire d'ARN antisens, d'un équivalent molaire de premier brin d'ADN et d'un équivalent molaire de deuxième brin d'ADN. [0045] Selon un deuxième objet, l'invention concerne un complexe d'au moins une nano- particule et d'au moins un hybride htiARN tel que défini ci-dessus. Ce complexe est également appelé « complexe hybride htiARN / nanoparticule ». Généralement, une 7 nanoparticulc est complexée avec plusieurs hybrides htiARN. [0046] La nanoparticulc peut être une nanoparticule neutre, anionique ou cationique, de préférence cationique, ce qui favorise les interactions électrostatiques avec l'hybride htiARN. [0047] La nanoparticulc est de préférence synthétique. L'utilisation d'une nanoparticule syn- thétique permet d'effectuer des manipulations peu contraignantes, par rapport à des manipulations mettant en oeuvre des microorganismes ou des virus. [0048] Dans certains modes de réalisation, ladite nanoparticulc est une nanoparticulc in- organique, comme par exemple une nanoparticulc d'or, une nanoparticule magnétique (nanoparticule d'oxyde de fer), ou un nanocristal de matériau semi-conducteur (« quantum dot » en anglais). [0049] Dans certains modes de réalisation, ladite nanoparticulc est une nanoparticulc organique. Des exemples de nanoparticulcs utilisables sont notamment décrits dans Morille et al., 2008, Biomatcrials, 29 :3477-3496 ; Bruno, 2011, Advanced Drug Delivery Reviews, 63 :1210-1226 ; Zhang et al., 2012, Bioorganic Chemistry, 40:10-18. [0050] Dans certains modes de réalisation, ladite nanoparticulc est une nanoparticulc hybride organique/inorganique, typiquement une nanoparticulc comportant un coeur inorganique recouvert d'une couche organique, notamment une couche polymérique. [0051] Dans un mode de réalisation, la nanoparticule est une nanoparticulc organique comprenant au moins un polymère. Des exemples de polymères sont le Polyéthylèneimine (PEI), la poly(L-lysine) (PLL), le poly(a-[4-amino-butyl]-L-glycolique acide), le chitosan, tel que le chitosan galactosylé, le chitosangraft-poly(vinylpyrrolidone) (PVP) galactosylé, des oligomères de chitosan trimétylés, le chitosan N-dodécylé, le déoxycholique acide chitosan modifié, la polyamidoamine (PAMAM), le poly(acide lactique) (PLA pour Poly(lactic acid) en anglais), le poly(acide lactique-co-glycolique) (PLGA pour poly(lactic-co-glycolic acid) en anglais), le polyalkylcyanoacrylate (PACA), les dérivés de cyanoacrylate, tels que le polybutylcyanoacrylate (PBCA), le polyisobutylcyanoacrylate (PIBCA), le polyisohexylcyanoacrylate (PIHCA), le polyhexylcyanoacrylate (PHCA), ou l'isobutylcyanoacrylate (IBCA). Optionnellement, ladite nanoparticule peut en outre comprendre au moins un poly(ethylène-glycol) (PEG). [0052] Dans un mode de réalisation, la nanoparticule est une nanoparticule organique ca- tionique comprenant au moins un lipide. Par exemple, la nanoparticule organique cationique comprenant au moins un lipide est un liposome, ou une gouttelette d'une nanoémulsion comprenant une phase aqueuse continue et au moins une phase lipidique dispersée. [0053] De préférence, ledit liposome comprend ou consiste en au moins un lipide ali- 8 phatique monovalent, tel que le 1,2-dioley1-3-trimethylamonium-propane (DOTAP), le N[1-(2,3-dioléyloxy) propyl]-N,N,N-triméthylamrnonium (DOTMA), ou le N(2-hydroxyethyl)-N,N-dimethy1-2,3-bis(tetradecyloxy-1-propananium) (DMRIE), un lipide aliphatique multivalcnt, tel que le dioctadecylamidoglycylspermine (DOLS), ou un dérivé cationique du cholestérol, tel que le 313-[N-(N',Vdiméthyl-aminoéthanc)-carbamoyl]cholestérol (DC-Chol) ou le bisguanidium-tren-cholestérol (BGTC). Optionnellement, ledit liposome peut comprendre en outre un lipide fusogène, qui est susceptible de faciliter la libération cytosolique par déstabilisation de la membrane endosomale, dit lipide « beim », tel que le dioléylphosphatidyléthanolamine (DOPE) ou le cholestérol. Ledit liposome peut comprendre au moins 2, 3, 4, 5 lipides tels que décrits ci-dessus. A titre d'exemples non limitatifs, ledit liposome peut donc être un liposome DOTMA/DOPE ou DOTAP/cholestérol. Optionnellement, ledit liposome peut en outre comprendre au moins un polyethylène-glycol (PEG). Des exemples de liposomes comprenant en outre au moins un PEG sont des liposomes constitués de N,N-diolcyl-N,N-dimethylammonium chloride, de DOPE et de céramides conjugués un PEG, des liposomes constitués de 3-N - [methoxypoly(ethyleneglycol)2000)carbamoy1]-1,2dimyristoyloxy-propylamine (PEG-C-DMA),1,2-dilinolcylloxy-N-N-dimethym-3-aminopropane (DLinDMA), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) et de cholestérol à un rapport 2:40:10:48 pour cent molaires, des liposomes constitués de pL-arginy1-2,3-L-diaminopropionic acid-N-palmityl-N-oleyl-amide trihydrochloride, 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DphyPE et le lipide PEGylé N(carbonyl methyxypolyethyleneglycol2000)-1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phospho-ethanolamine sodium (DSPE-PEG), des liposomes constitués de phosphatidyl choline hydrogénée de soja, de cholestérol, de DSPE-PEG2000 et de DOTAP. [0054] De préférence, ladite gouttelette d'une nanoémulsion, comprenant une phase aqueuse continue et au moins une phase dispersée, est telle que définie dans la demande FR 2 994 849. Ce mode de réalisation est particulièrement préféré et est détaillé ci-après. [0055] Le complexe hybride htiARN / nanoparticule est alors sous forme d'une na- noémulsion comprenant une phase aqueuse continue et au moins une phase dispersée qui comprend : [0056] a) au moins 5% molaire de lipide amphiphile, [0057] b) de 15 à 70% molaire d'au moins un tensioactif cationique comprenant : [0058] i) au moins un groupe lipophile choisi parmi : [0059] - un groupe R ou R-(C=0)-, où R représente une chaîne hydrocarbonée linéaire comprenant de 11 à 23 atomes de carbone, [0060] - un ester ou un amide d'acides gras comprenant de 12 à 24 atomes de carbone et de 9 phosphatidyléthanolarninc, et [0061] un poly(oxyde de propylène), et [0062] ii) au moins un groupe hydrophile comprenant au moins un groupe cationique choisi parmi : [0063] un groupe alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 12 atomes de carbone et interrompu et/ou substitué par au moins un groupe cationique, et un groupe polymérique hydrophile comprenant au moins un groupe cationique, et [0064] c) de 10% à 55% molaire d'un co-tensioactif comprenant au moins une chaîne poly(oxyde d'éthylène) comprenant au moins 25 unités d'oxyde d'éthylène, [0065] d) un lipide solubilisant comprenant au moins un glycéride d'acides gras, [0066] c) éventuellement un lipide fusogène, [0067] f) un hybride htiARN tel que défini ci-dessus, [0068] où les pourcentages molaires de lipide amphiphilc, de tensioactif cationique et de co- tensioactif sont par rapport à l'ensemble (lipide amphiphile / tensioactif cationique / co-tensioactif / éventuel lipide fusogenc). [0069] Comme expliqué ci-après, les : lipide arnphiphilc / tensioactif cationique / co- tensioactif / éventuel lipide fusogène / hybride htiARN sont les principaux composants de la couronne des gouttelettes de la nanoémulsion. [0070] La nanoémulsion est donc une émulsion de type huile dans l'eau. Elle peut être simple ou multiple, notamment en comportant dans la phase dispersée une seconde phase aqueuse. De préférence, elle est simple. [0071] Un ou plusieurs hybrides htiARN (généralement plusieurs) est(sont) complexé(s) à la surface des gouttelettes de ladite nanoémulsion. [0072] Tensioactif cationique [0073] La nanoémulsion utilisée comprend un tensioactif cationique comprenant : [0074] a) au moins un groupe lipophile choisi parmi : [0075] i) un groupe R représentant une chaîne hydrocarbonée linéaire comprenant de 11 23 atomes de carbone, [0076] ii) un ester ou un amide d'acides gras comprenant de 12 à 24 atomes de carbone et de phosphatidyléthanolamine, tel que le distéaryl phosphatidyléthanolamine (DSPE), et [0077] iii) un poly(oxyde de propylène), et [0078] b) au moins un groupe hydrophile comprenant au moins un groupe cationique choisi parmi : [0079] i. un groupe alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 12 atomes de carbone et interrompu et/ou substitué par au moins un groupe cationique, et [0080] ii) un groupe polymérique hydrophile comprenant au moins un groupe cationique, ledit groupe polymérique étant notamment choisi parmi : [0081] - un poly(oxyde d'éthylène) comprenant typiquement de 3 à 500 unités oxyde d'éthylène, de préférence de 20 à 200 unités oxyde d'éthylène, et comprenant au moins un groupe cationique. un polysaccharide, tel que du dextrane, de la cellulose ou du chitosan, ayant notamment des masses moléculaires comprises entre 0,5 et 20 kDa, par exemple entre 1 et 12 kDa, [0082] - un polyamine, tel qu'un chitosan ou une polylysinc, ayant notamment des masses moléculaires comprises entre 0,5 et 20 kDa, par exemple entre 1 et 12 kDa. [0083] Par «ester ou amide d'acides gras comprenant de 12 à 24 atomes de carbone et de phosphatidyléthanolamine», on entend un groupe de formule : [0084] [Che m.1] [0085] dans laquelle [0086] - R3 et R4 représentent indépendamment une chaîne hydrocarbonée linéaire comprenant de 11 à 23 atomes de carbone, [0087] - A3 et A4 représentent O ou NH, et [0088] - M représente H ou un cation. [0089] Les groupes cationiques du tensioactif cationique sont typiquement : [0090] - des oniums choisis parmi les groupes ammonium, imidazolium, pyridinium, pyno- lidinium, pipéridinium, phosphonium ou sulfonium, ou [0091] - des complexes métalliques entre un radical d'un groupe organique chélatant mono- ou multi-dentate, par exemple la phénantroline, la pyridine, l'acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA), l'acide diéthylène triamine pentes acétique (DTPA), les porphyrines, les phtalocyanines, les chrines, les bactériochlorines complexé avec un cation inorganique, tel que Ca2+, A13+, Ni+, Zn2+, Fe2', Fes+ ou Cu2+, [0092] les groupes ammonium, notamment -+NMe3, -+NHMe2, -+NH,Me et -+NH3, en par- ticulier *NH3, étant particulièrement préféré. [0093] Bien sûr, des anions peuvent être associés au(x) groupe(s) cationique(s) pour que la nanoémulsion soit électriquement neutre. La nature des anions n'est pas limitée A titre N- I I H 11 illustratif, on peut citer les halogénures, notamment le chlorure ou le bromure, ou le trifluoroacétate. [0094] Dans le tensioactif cationique, la nature du groupe de liaison liant lc(s) groupe(s) lipophile(s) au(x) groupe(s) hydrophile(s) comprenant au moins un groupe cationique n'est pas limitée. Des exemples de groupes de liaison sont fournis ci-dessous (groupe L). [0095] Le tensioactif cationique peut avoir la formule (A) suivante : [0096] [(Lipo)I-L-(Hydro),,p-k, (n/m) [A]°i- (A) [0097] dans laquelle: [0098] - I et h représentent des nombres entiers indépendamment compris entre 1 et 4, [0099] - n est un nombre entier supérieur ou égal à 1, généralement compris entre 1 et 50, [0100] - Lipo représente un groupe lipophile tel que défini ci-dessus, [0101] - Hydro représente un groupe hydrophile tel que défini ci-dessus comprenant au moins un groupe cationique, [0102] - L représente un groupe de [0103] - A représente un anion, [0104] - m est un nombre entier représentant la charge de l'anion, [0105] - n est un nombre entier représentant la charge du cation [(Lipo),-L-(Hydro)b]. [0106] Dans la formule (A) susmentionnée, de préférence L est tel que : [0107] a) lorsque 1 et h représentent 1, L est un groupe de liaison divalent choisi parmi : [0108] - une liaison simple, [0109] - un groupe Z choisi parmi -0-, -NH-, -0(0C)-, -(CO)O-, -(CO)NH-, -NH(CO)-, - 0-(C0)-0-, -NH-(C0)-0-, -O-(CO)-NH- et-NH-(CO)-NH, -O-PO(OH)-O- ou un radical divalent cyclique de 5 à 6 atomes, [0110] - un groupe Alk étant un alkylène comprenant de 1 à 6 atomes de carbone, et [0111] - un groupe Z-Alk, Alk-Z, Alk-Z-Alk ou Z-Alk-Z où Alk et Z sont tels que définis ci- dessus et où les deux groupes Z du groupe Z-Alk-Z sont identiques ou différents, [0112] b) lorsque l'un des groupes 1 ou h représente 1, et l'autre représente 2, L est un groupe trivalent choisi parmi un groupe phosphate OP-(0-)3, un groupe dérivé du glycérol de formule -0-CH2-CH-(0-)CH2-0- et un radical trivalent cyclique de 5 à 6 atomes, [0113] - pour les autres valeurs del et h, L est un radical multivalent cyclique de 5 à 6 atomes. [0114] De manière particulièrement préférée, L est tel que [0115] a) lorsque 1 et h représentent 1, L est un groupe de liaison divalent choisi parmi : [0116] - une liaison simple, [0117] - un groupe Z choisi parmi -0-, -NH-, -0(0C)-, -(CO)O-, -(CO)NH-, -NH(CO)-, - 0-(C0)-0-, -NH-(C0)-0-, -O-(CO)-NH- et-NH-(CO)-NH ou -0-P0(OH)-0-, 12 [0118] h) lorsque l'un des groupes I ou h représente 1, et l'autre représente 2, L est un groupe trivalent choisi parmi un groupe phosphate OP-(O-)3 et un groupe dérivé du glycérol de formule -0-CH,-CH-(0-)CH2-0-. [0119] Dans la formule (A) susmentionnée, I et h représentent de préférence indé- pendamment 1 ou 2. [0120] Selon une première alternative, le groupe hydrophile du tensioactif cationique est un groupe alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 12 atomes de carbone et interrompu et/ou substitué par au moins un groupe cationique. Comme exemple de tels tensioactifs cationiques, on peut citer: [0121] 1) (Lipo)-(CFL)',i-NR3uR3iR, où Lipo est un groupe lipophile tel que défini ci- dessus, ml représente 1 ou 2 et Rio, R31 et R/2 représentent indépendamment H. Mc ou [0122] 2) [Chem 2] [0123] 33 101241 où chaque Lipo est indépendamment un groupe lipophile tel que défini ci-dessus et R33 représente FI, Me ou -CH2-CH2-0H, 101251 3) ]Chem 3] 10126] R4 [0127] où Lipo est un groupe lipophile tel que défini ci-dessus. et R34, R35, R36, R37, R38, R3y, R40, R41, R42 et R43 représentent indépendamment H, Mc ou -CFL-CH,-OH. [0128] De préférence, le tensioactif cationique est choisi parmi : [0129] - le N[1-(2,3-dioleyloxy) propyl]-N,N,N-triméthylammonium (DOTMA), N, 13 [0130] - le 1,2-dioley1-3-trimethylamonium-propane (DOTAP), [0131] - le N-(2-hydroxyethyl)-N,N-di methy1-2,3-bis(tetradecyloxy- 1 -propananium) (DMRIE), [0132] - le 1[2-(olcoyloxy)ethy11-2-oley1-3-(2-hydroxyethypimidazoliniurn (DOTIM), et [0133] - le dioctadecylamidoglycylspermine (DOGS) (sous forme protonéc), [0134] et est de préférence le 1,2-dioley1-3-trimethylamonium-propane (DOTAP). [0135] Selon une deuxième alternative, le groupe hydrophile du tensioactif cationique est un groupe polymérique hydrophile comprenant au moins un groupe cationique. [0136] Lorsque le groupe hydrophile du tensioactif cationique est polymérique, le(s) groupe(s) cationique(s) peu(ven)t être un(des) groupe(s) terminal(aux) ou pendant(s). Par exemple : [0137] - lorsque groupe polymérique hydrophile est un poly(oxyde d'éthylène), le(s) groupe(s) cationique(s) est(sont) généralement situé(s) sur un groupe terminal à l'extrémité de la chaîne poly(oxyde d'éthylène). [0138] - lorsque le groupe polymériquc hydrophile est du dextrane ou de la cellulose, le(s) groupe(s) cationiques est(sont) généralement situé(s) sur un groupe terminal à l'extrémité de la chaîne polysaccharidique. [0139] - lorsque le groupe polymériquc hydrophile est du chitosan, le(s) groupe(s) ca- tioniques est(sont) généralement un(des) groupe(s) pendant(s), en particulier des groupes -N1-11+ présents en milieu acide sur le chitosan. [0140] Dans un mode de réalisation, le(s) groupe(s) cationique(s) est(sont) un(des) groupe(s) terminal(aux). En effet, les groupes pendants de tensioactifs anioniques adjacents en surface des gouttelettes de la phase dispersée se repoussent par interactions électrostatiques et, par conséquent, les nanoémulsions comprenant des tensioactifs cationiques dont le groupe Hydro comprend des groupes pendants sont généralement moins stables. [0141] Dans un autre mode de réalisation, le(s) groupe(s) cationique(s) est(sont) un(des) groupe(s) pendant(s). Il est avantageusement possible d'utiliser un tensioactif cationique dont le groupe hydrophile comprend plusieurs groupes cationiques pendants, et donc d'obtenir une nanoémulsion plus chargée positivement, et donc dans laquelle l'hybride htiARN est complexé plus fortement aux gouttelettes. [0142] Le groupe polymérique hydrophile préféré est un radical d'un poly(oxyde d'éthylène) comprenant typiquement de 3 à 500 unités oxyde d'éthylène, de préférence de 20 à 200 unités oxyde d'éthylène, et comprenant au moins un groupe cationique. [0143] Ainsi, dans un mode de réalisation, le tensioactif cationique a l'une des formules suivantes : [0144] 14 [Chem.4] [0145] dans lesquelles : [0146] - RI, R2, R3 et R4 représentent indépendamment une chaîne hydrocarbonée linéaire comprenant de 11 à 23 atomes de carbone, [0147] - AI, A2, A3 et A4 représentent O ou NH, [0148] - m, n, o et p représentent indépendamment des nombres entiers de 3 à 500, de préférence 20 à 200, et [0149] - a représente un nombre entier de 20 à 120, [0150] - M représente H ou un cation, [0151] - Arp, A11, Al2 et A13 représentent indépendamment un groupe -+NR,012,1R,2, dans lequel R20, R,1 et R,, représentent indépendamment H, Me ou -CH2-CH,-OH [0152] Dans un mode de réalisation, dans la formule (A11), A11 représente -*NH3 et le ten- sioactif cationique a la formule suivante : [0153] IChem.51 [0154] dans laquelle An, R2 et n sont tels que définis ci-dessus. De préférence, dans la formule (AIl), R, représente C171135. [0155] Sans vouloir être liés à une théorie particulière, la présence du groupe polymérique hydrophile permettrait : [0156] - de stabiliser la nanoémulsion, et [0157] - de protéger le htiARN, localisé à la surface des gouttelettes, des protéines du milieu dans lequel la nanoémulsion est administrée/utilisée, et donc la dégradation de l'hybride htiARN et de l'ARN antiscns qu'il contient, par ces protéines. [0158] Selon une troisième alternative, la nanoémulsion comprend au moins deux ten- sioactifs cationiques, dont : [0159] a) l'un est choisi parmi : [0160] - le N[1-(2,3-dioléyloxy) propyl]-N,N,N-triméthylammonium (DOTMA), [0161] - le 1,2-dioley1-3-trimethylamonium-propane (DOTAP), [0162] - le N-(2-hydroxyethyl)-N,N-di methy1-2,3-bis(tetradecyloxy- 1 -propananium) (DMRIE), [0163] - le 1-[2-(oleoyloxy)ethyl]-2-olcyl-3-(2-hydroxycthyl)imidazolinium chloridc (DOTTIVI), et [0164] - le dioctadecylamidoglycylspermine (DOGS), [0165] et est de préférence le 1,2-dioley1-3-trimethylamonium-propane (DOTAP), et [0166] h) l'autre est un tensioactif cationique comprenant : [0167] i) au moins un groupe lipophile choisi parmi : [0168] - un groupe R ou R-(C=0)-, où R représente une chaîne hydrocarbonée linéaire comprenant de 11 à 23 atomes de carbone, [0169] - un ester ou un amide d'acides gras comprenant de 12 à 24 atomes de carbone et de phosphatidyléthanolamine, tel que le distéaryl phosphatidyléthanolamine (DSPE), et [0170] - un poly(oxyde de propylène), et [0171] ii) un groupe polymérique hydrophile comprenant au moins un groupe cationique, ledit groupe polymérique étant choisi parmi : [0172] - un poly(oxyde d'éthylène) comprenant typiquement de 3 à 500 unités oxyde d'éthylène, de préférence de 20 à 200 unités oxyde d'éthylène, et comprenant au moins un groupe cationique, [0173] - un polysaccharide, tel que du dextrane, de la cellulose ou du chitosan, [0174] - un polyamine, tel qu'un chitosan ou une polylysine, [0175] et est de préférence un poly(oxyde d'éthylène) comprenant au moins un groupe ca- tionique. [0176] Dans un mode de réalisation, la nanoémulsion comprend, à titre de tensioactifs ca- tioniques : [0177] a) du 1,2-dioley1-3-trimethylamonium-propane, et [0178] b) un tensioactif cationique comprenant : [0179] i) au moins un groupe lipophile choisi parmi : 16 [0180] - un groupe R ou R-(C=0)-, où R représente une chaîne hydrocarbonée linéaire comprenant de 11 à 23 atomes dc carbone, [0181] - un ester ou un amide d'acides gras comprenant de 12 à 24 atomes de carbone et de phosphatidyléthanolarnine, tel que le distéaryl phosphatidyléthanolaminc (DSPE), et [0182] ii) un poly(oxyde d'éthylène) comprenant typiquement de 3 à 500 unités oxyde d'éthylène, de préférence de 20 à 200 unités oxyde d'éthylène, et comprenant au moins un groupe cationique. [0183] Dans un mode de réalisation, la nanoémulsion comprend, à titre dc tensioactifs ca- tioniques : [0184] - du 1,2-dioley1-3-trimethylamonium-propanc, et [0185] - un composé de formule (AIT) telle que définie ci-dessus, notamment dc formule (AV). [0186] Le tensioactif cationique se situe dans la couronne des gouttelettes de la na- noémulsion. Il se lie par interactions électrostatiques à l'hybride htiARN et permet de le maintenir à la surface des gouttelettes. Cc sont ces interactions électrostatiques qui permettent la formation et la stabilité du complexe hybride htiARN / gouttelettes de la nanoémulsion. [0187] La nanoémulsion comprend de 15 à 70% molaire d'au moins un tensioactif ca- tionique par rapport à l'ensemble (lipide amphiphilc / tensioactif cationique / cotensioactif / éventuel lipide fusogène). En dessous de 15%, la nanoémulsion ne comprend pas assez de charges positives et la complexation des gouttelettes avec l'hybride htiARN est insuffisante. Au-delà de 70%, les nanoémulsions ne sont pas stables, et ne peuvent généralement même pas être formulées (la formation de la nanoémulsion n'est pas possible car les gouttelettes coalescent pour former deux phases), et les gouttelettes deviennent généralement toxiques pour les cellules. [0188] Ces proportions sont particulièrement adaptées pour obtenir une complexation efficace de l'hybride htiARN à la surface des gouttelettes, et donc une bonne délivrance et/ou transfection. [0189] Lipide ,fusogène (« helper lipid » en anglais) [0190] La nanoémulsion peut comprendre un lipide fusogène, qui est susceptible de faciliter la libération cytosolique par déstabilisation de la membrane endosomale, dit lipide helper ». De préférence, ce lipide est le dioléylphosphatidyléthanolamine (DOPE). [0191] Le lipide fusogène permet de favoriser l'échappement endosomal des gouttelettes de la nanoémulsion, et donc des hybrides htiARN, qu'elles contiennent, et améliore généralement leur efficacité. Ainsi, le lipide fusogène améliore l'efficacité d'extinction génique de l'hybride htiARN. [0192] Le lipide susceptible de faciliter la libération cytosolique par déstabilisation de la membrane endosomale se situe dans la couronne des gouttelettes de la nanoémulsion. 17 [0193] Lipide amphiphile [0194] La nanoémulsion comprend au moins un lipide amphiphile, qui se situe dans la couronne des gouttelettes de la nanoémulsi on. [0195] Afin de former une nanoémulsion stable, il est nécessaire d'inclure dans la com- position au moins un lipide amphiphile à titre de tensioactif. La nature amphiphile du tensioactif assure la stabilisation des gouttelettes d'huile au sein de la phase continue aqueuse. En dessous de 5% molaire de lipide amphiphilc par rapport à l'ensemble (lipide amphiphilc / tensioactif cationique / co-tensioactif / éventuel lipide fusogène), les nanoémulsions ne sont pas stables, et ne peuvent généralement même pas être formulées (la formation de la nanoémulsion n'est pas possible car les gouttelettes coalescent pour former deux phases). [0196] Généralement, la nanoémulsion comprend de 5 à 85% molaire, de préférence de 5 à 75% molaire, en particulier de 5 à 50% molaire et tout particulièrement de 8 à 30% molaire de lipide amphiphile par rapport à l'ensemble (lipide amphiphilc / tensioactif cationique / co-tensioactif / éventuel lipide fusogène). [0197] La quantité de lipide amphiphilc contribue avantageusement à contrôler la taille de la phase dispersée de la nanoémulsion. [0198] Les lipides amphiphilcs comportent une partie hydrophile et une partie lipophile. Ils sont généralement choisis parmi les composés dont la partie lipophile comprend une chaîne saturée ou insaturée, linéaire ou ramifiée, ayant de 8 à 30 atomes de carbone. Ils peuvent être choisis parmi les phospholipides, les cholestérols, les lysolipides, les sphingomyélines, les tocophérols, les glucolipides, stéarylamines, les cardiolipines d'origine naturelle ou synthétique ; les molécules composées d'un acide gras couplé à un groupement hydrophile par une fonction éther ou ester tels que les esters de sorbitan comme par exemple les monooléate et monolaurate de sorbitan vendus sous les dénominations Span® par la société Sigma; les lipides polymérisés ; les lipides conjugués à de courtes chaînes d'oxyde de polyéthylène (PEG) tels que les tensioactifs non-ioniques vendus sous les dénominations commerciales Tween® par la société ICI Americas, Inc. et Triton® par la société Union Carbide Corp.; les esters de sucre tels que les mono- et di-laurate, mono- et di-palmitate, mono- et distéarate de saccharose; lesdits tensioactifs pouvant être utilisés seuls ou en mélanges. [0199] Les phospholipides sont les lipides amphiphiles préférés. [0200] La lécithine est le lipide amphiphile particulièrement préféré. [0201] Lipide solubilisant [0202] La nanoémulsion comprend par ailleurs un lipide solubilisant comprenant au moins un glycéride d'acides gras, qui se situe dans la phase dispersée de la nanoémulsion, plus précisément dans le coeur des gouttelettes. Ce composé a pour mission principale de solubiliser le lipide amphiphile, peu soluble, dans la phase dispersée de la na- 18 noémulsion. [0203] Le lipide solubilisant est un lipide présentant une affinité avec le lipide amphiphile suffisante pour permettre sa solubilisation. De préférence, le lipide solubilisant est solide à température ambiante (250°C). [0204] Dans le cas où le lipide amphiphile est un phospholipide, il peut s'agir notamment : [0205] - d'esters d'acides gras et d'alcool gras, comme le cétylpalmitate, ou [0206] - de dérivés du glycérol, et en particulier de glycérides obtenues par estérification de glycérol avec des acides gras. [0207] Le lipide solubilisant utilisé est avantageusement choisi en fonction du lipide am- phiphile utilisé. Il présentera généralement une structure chimique proche, afin d'assurer la solubilisation recherchée. Il peut s'agir d'une huile ou d'une cire. De préférence, le lipide solubilisant est solide à température ambiante (20°C), mais liquide à la température du corps (37°C). [0208] Les lipides solubilisants préférés, en particulier pour les phospholipides, sont les esters d'acides gras et d'alcool gras, comme le cétylpalmitatc, ou les glycérides d'acides gras, notamment d'acides gras saturés, et en particulier les glycérides d'acides gras saturés comportant 8 à 18 atomes de carbone, encore préféré 12 à 18 atomes de carbone. Avantageusement, le lipide solubilisant est un mélange de différents glycérides. [0209] De préférence, le lipide solubilisant est un mélange s'agit de glycérides d'acides gras saturés comportant au moins 10% en poids d'acides gras en C12, au moins 5% en poids d'acides gras en C14, au moins 5% en poids d'acides gras en C16 et au moins 5% en poids d'acides gras en C18. [0210] De préférence, le lipide solubilisant est un mélange de glycérides d'acides gras saturés comportant 0% à 20% en poids d'acides gras en C8, 0% à 20% en poids d'acides gras en C10, 10% à 70% en poids d'acides gras en C12, 5% à 30% en poids d'acides gras en C14, 5% à 30% en poids d'acides gras en C16 et 5% à 30% en poids d'acides gras en C18. [0211] Particulièrement préférés sont les mélanges de glycérides semi-synthétiques solides à température ambiante (25°C) vendus sous la dénomination commerciale Suppocire® NC par la société Gattefossé et approuvé pour l'injection chez l'homme. Les Suppocire ® de type N sont obtenues par estérification directe d'acides gras et de glycérol. Il s'agit de glycérides hérni-synthétiques d'acides gras saturés de C8 à C18, dont la composition quali-quantitative est indiquée dans le tableau 1 ci-dessous. [0212] Les lipides solubilisants précités permettent d'obtenir une nanoémulsion avanta- geusement stable. Sans vouloir être lié à une théorie particulière, il est supposé que les lipides solubilisants précités permettent d'obtenir des gouttelettes dans la nanoémulsion présentant un coeur amorphe. Le coeur ainsi obtenu présente une viscosité 19 interne élevée sans pour autant présenter de cristallinité. Or, la cristallisation est néfaste pour la stabilité de la nanoémulsion car elle conduit généralement à une agrégation des gouttelettes et/ou à une expulsion des molécules encapsulécs à l'extérieur des gouttelettes. Ces propriétés physiques favorisent la stabilité physique de la nanoémulsion. [0213] La quantité de lipide solubilisant peut varier largement en fonction de la nature et de la quantité de lipide amphiphilc présent dans la phase dispersée. Généralement, le coeur des gouttelettes (comprenant le lipide solubilisant, l'éventuelle huile, l'éventuel agent d'imagerie, l'éventuel agent thérapeutique s'il est lipophile) comprend de 1 à 100% en poids, de préférence de 5 à 80% en poids et tout particulièrement de 40 à 75% en poids de lipide solubilisant. [0214] [Tableauxl] Longueur de chaînes [% en poids] C8 0,1 à 0,9 C10 0,1 à 0,9 C12 25 à 50 C14 10 à 24,9 C16 10 à 24,9 C18 10 à 24,9 [0215] Tableau 1 : Composition en acides gras du Suppocire® NC de Gattefossé [0216] Huile [021 7 ] La phase dispersée de la nanoémulsion peut comporter par ailleurs une ou plusieurs autres huiles, qui se situe(nt) dans le coeur des gouttelettes. [0218] Les huiles utilisées présentent de préférence une balance hydrophile-lipophile (1-1LB) inférieure à 8 et encore plus préférentiellement comprise entre 3 et 6. Avantageusement, les huiles sont utilisées sans modification chimique ou physique préalablement à la formation de l'émulsion. [0219] Les huiles sont généralement choisies parmi les huiles hiocompatibles, et en par- ticulier parmi les huiles d'origine naturelle (végétale ou animale) ou synthétique. Parmi de telles huiles, on peut notamment citer les huiles d'origine naturelle végétale parmi lesquelles figurent notamment les huiles de soja, de lin, de palme, d'arachide, d'olives, de pépin de raisins et de tournesol ; les huiles synthétiques parmi lesquelles figurent notamment les triglycérides, di glycérides et les mono glycérides. Ces huiles peuvent être de premières expressions, raffinées ou inter-estérifiées. [0220] Les huiles préférées sont l'huile de soja et l'huile de lin. [0221] Généralement, si présente, l'huile sera contenue dans le coeur des gouttelettes (comprenant le lipide solubilisant, l'éventuelle huile, l'éventuel agent d'imagerie, l'éventuel agent thérapeutique s'il est lipophile) dans une proportion allant de 1 à 80% en poids, de préférence entre 5 et 50 % en poids et tout particulièrement 10 à 30% en poids. [0222] La phase dispersée peut contenir en outre d'autres additifs tels que des colorants, sta- bilisants, conservateurs ou d'autres principes actifs, en quantité appropriée. [0223] Co-tensioactif [0224] La nanoémulsion comprend un co-tensioactif, qui permet de la stabiliser. [0225] Les co-tensioactifs sont généralement des tensioactifs hydrosolubles. Ils comprennent au moins une chaîne poly(oxyde d'éthylène) comprenant au moins 25, notamment au moins 30, de préférence au moins 35, unités d'oxyde d'éthylène. Le nombre d'unités d'oxyde d'éthylène est généralement inférieur à 500. [0226] Des nanoémulsions comprenant un co-tensioactif comprenant une chaîne poly(oxyde d'éthylène) comprenant moins de 25 unités d'oxyde d'éthylène ne sont en effet pas stables. Généralement, il n'est même pas possible de préparer la nanoémulsion. [0227] Ces nombres d'unités sont en effet particulièrement adaptés pour éviter la fuite de l'hybride htiARN hors des gouttelettes. [0228] En effet, les inventeurs ont observé qu'une nanoémulsion ne comprenant pas un co- tensioactif n'est pas suffisamment stable. [0229] De plus, sans vouloir être liés à une théorie particulière, la présence de la chaîne composée de motifs d'oxyde d'éthylène du co-tensioactif permettrait de protéger les hybrides htiARN, localisés à la surface des gouttelettes des protéines du milieu dans lequel la nanoémulsion est administrée/utilisée, et donc la dégradation desdits hybrides htiARN par ces protéines. [0230] A titre d'exemple de co-tensioactifs, on peut en particulier citer les composés conjugués polyéthylèneglycol/phosphatidyl-éthanolamine (PEG-PE), Ies éthers d'acide gras et de polyéthylèneglycol tels que les produits vendus sous les dénominations commerciales Brij® (par exemple Brij® 35, 58, 78 ou 98) par la société ICI Americas Inc., les esters d'acide gras et de polyéthylèneglycol tels que les produits vendus sous les dénominations commerciales Myrj® par la société ICI Americas Inc. (par exemple Myrj® 45, 52, 53 ou 59) et les copolymères blocs d'oxyde d'éthylène et d'oxyde de propylène tels que les produits vendus sous les dénominations commerciales Pluronic® par la société BASF AG (par exemple Pluronic® F68, F127, L64, L61, 10R4, 17R2, 17R4, 25R2 ou 25R4 ) ou les produits vendus sous la dénomination commerciale Synperonic ® par la société Unichema Chemie BV (par exemple Synperonic® PE/F68, PE/L61 ou PE/L64). [0231] Ainsi, le co-tensioactif se situe à la fois dans la phase aqueuse continue et dans la 21 phase dispersée. En effet, la partie hydrophobe du co-tensioactif s'insère dans les gouttelettes de la phase dispersée, alors que les chaînes polyalcoxylécs sont dans la phase aqueuse continue. Dans la présente demande, les pourcentages massiques de phase dispersée décrits sont calculés en considérant que le co-tensioactif appartient à la phase dispersée. [0232] La nanoémulsion comprend de 10% à 55% molaire de co-tensioactif par rapport à l'ensemble (lipide amphiphile / tensioactif cationique / co-tensioactif / éventuel lipide fusogène). En dessous de 10%, les nanoémulsions ne sont pas stables, et ne peuvent généralement même pas être formulées (la formation de la nanoémulsion n'est pas possible car les gouttelettes coalescent pour former deux phases). Au-delà de 55%, la complexation des hybrides htiARN sur les gouttelettes de la nanoémulsion n'a pas lieu, probablement car les charges positives du tensioactif cationique sont masquées par les chaînes poly(oxyde d'éthylène) du co-tcnsioactif, et donc plus accessibles pour se lier par liaison électrostatique aux hybrides htiARN. [0233] Agent d'imagerie [0234] La nanoméulsion peut comprendre un agent d'imagerie, qui permet avantageusement de visualiser la distribution des gouttelettes dans les cellules ou le corps du patient, et donc la distribution des hybrides htiARN. [0235] L'agent d'imagerie peut notamment être utilisé dans les imageries de type : [0236] - tomographie à émission de positons (Positron Emission Tomography (PET) en anglais) (l'agent d'imagerie pouvant être un composé comprenant un radionucléide, tel que isF, "C, un chélate de cations métalliques "Ga, mCu), [0237] - tomographie d'émission monophotonique (TEMP) (Single photon ernission computed tomography (SPECT) en anglais) (l'agent d'imagerie pouvant être un composé comprenant un radionucléide par exemple 'nt ou un chélate de 99mTc ou " [0238] - imagerie par résonance magnétique (IRM) (l'agent d'imagerie pouvant être un chélate de gadolinium ou un nanocristal magnétique tel qu'un nanocristal d'oxyde de fer, d'oxyde de manganèse ou de fer-platine FePt), [0239] - imagerie optique ou imagerie aux rayons X (l'agent d'imagerie pouvant être un fluorophore lipophile ou un agent de contraste, par exemple une molécule iodée telle que l'iopamidol, l'amidotrizoate, ou des nanoparticules d'or). [0240] De préférence, l'agent d'imagerie est un fluorophore lipophile permettant de réaliser de l'imagerie optique. [0241] La nature du ou des fluorophores lipophiles utilisables n'est pas critique à partir du moment où ils sont compatibles avec l'imagerie in vivo (c'est à dire qu'ils sont biocompatibles et non toxiques). De préférence, les fluorophores utilisés comme agent d'imagerie absorbent et émettent dans le visible ou le proche infrarouge. Pour l'imagerie non invasive dans un tissu ou un organisme vivant (animal, homme) les fluorophores préférés absorbent et émettent dans le proche infrarouge. En effet, pour que la lumière d'excitation et la lumière émise par le fluorophorc puissent mieux traverser les tissus, il convient d'utiliser des fluorophores absorbant et émettant dans le proche infrarouge, c'est-à-dire à une longueur d'onde comprise entre 640 et 900 nm. [0242] A titre de fluorophorc lipophile on peut par exemple citer les composés décrits dans le chapitre 13 ("Probes for Lipids and Membranes") du catalogue InVitrogen. De façon plus précise, on peut notamment citer, à titre de fluorophore, le vert d'indocyaninc (ICG), les analogues d'acides gras et les phospholipides fonctionnalisés par un groupement fluorescent tels que les produits fluorescents vendus sous les dénominations commerciales Bodipy (R) tels que le Bodipy (R) 665/676 (Ex/Em.) ; les dérivés lipophiles de carbocyanines telles que le perchlorate de 1,1'-dioctadécyl-3,3,3',3'-tétraméthylindodicarbocyanine (DiD), par exemple vendu sous la référence D-307, le perchlorate de 3,3'-dihexadecyloxacarbocyanine (Di0), par exemple vendu sous la référence D1125, le perchlorate de 1,1'-dihexadecy1-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine (Dii), par exemple vendu sous la référence D384; les sondes fluorescentes dérivées de sphingolipidcs, de stéroïdes ou de lipopolysaccharides tels que les produits vendus sous les dénominations commerciales BODIPY O TR céramides, BODIPY ® FL C5-lactosylcéramide, BODIPY FL C5-ganglioside, BODIPY O FL cérébrosides ; les dérivés amphiphilcs de cyanines, de rhodamines, de fluorescéines ou de coumarines tels que l'octadécyl rhodamine B, l'octadécyl ester de fluorescéine et la 4-heptadécyl-7- hydroxycoumarine ; et le diphénylhexalliène (DPH) et ses dérivés ; l'ensemble de ces produits étant vendus par la société Invitrogen. [0243] Selon une forme de réalisation préférée de l'Invention, le fluorophore est le vert d'indocyanine, le perchlorate de 1,F"--dioctadécy1-3,3,3',3'-tétraméthylindodicarbocyanine, le perchlorate de 3,3'-dihexadecyloxacarbocyanine, ou le perchlorate de 1,1i-dihexadecy1-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine. [0244] Agent thérapeutique [0245] La nanoémulsion peut comporter un agent thérapeutique. [0246] Les agents thérapeutiques susceptibles d'être encapsulés dans la nanoémulsion com- prennent en particulier les principes actifs agissant par voie chimique, biologique ou physique. Ainsi, il peut s'agir de principes actifs pharmaceutiques ou d'agents biologiques tels que de l'ADN, des protéines, peptides ou anticorps ou encore des agents utiles pour des thérapies physiques tels que des composés utiles pour la thennothérapie, les composés relarguant de l'oxygène singulet lorsqu'ils sont excités par une lumière utiles pour la photothérapie et des agents radioactifs. De préférence, il s'agit de 23 principes actifs administrés de façon parentérale. [0247] Selon son affinité lipophile ou amphiphile, l'agent thérapeutique sera encapsulé par la phase dispersée ou se situera à l'interface des deux phases. [0248] La nature des agents thérapeutiques encapsulés dans la nanoémulsion n'est pas parti- culièrement limitée. Cependant, la nanoémulsion est particulièrement intéressante pour des composés peu solubles, qui sont difficiles à formuler dans les systèmes d'administration classiques et pour les principes actifs utiles pour la photothérapie, dont le rendement quantique peut être préservé. [0249] Du fait des conditions douces du procédé de préparation, la nanoémulsion décrite est particulièrement intéressante pour l'encapsulation d'agents thérapeutiques qui se dégradent à température élevée. [0250] Parmi les principes actifs pharmaceutiques intéressants comme agents théra- peutiques, on peut citer en particulier les agents utilisés dans le traitement du SIDA, les agents utilisés dans le traitement des maladies cardiaques, les analgésiques, les anesthésiques, les anorexigènes, les anthelmintiqucs, les antiallergiques, les antiangincux, les antiarythmisants, les anticholinergiques, les anticoagulants, les antidépresseurs, les antidiabétiques, les antidiurétiques, les antiémétiques, les anticonvulsivants, les antifongiques, les antihistaminiques, les antihypertenseurs, les anti-inflammatoires, les anti-migraineux, les antimuscariniques, les antimycobactériens, les anticancéreux y compris les antiparkinsonicns, les antithyroïdiens, les antiviraux, les astringents, les agents bloquants, les produits sanguins, les substituts sanguins, les agents inotropes cardiaques, les agents cardiovasculaires, les agents du système nerveux central, les chélateurs, les agents de chimiothérapie, les facteurs de croissance hématopoïétiques, les corticostéroïdes, les antitussifs, les agents dermatologiques, les diurétiques, les dopaminergiques, les inhibiteurs de l'élastase, les agents endocrines, les alkaloïdes de l'ergot, les expectorants, les agents gastro-intestinaux, les agents génito-urinaires, le facteur de déclenchement de l'hormone de croissance, les hormones de croissance, les agents hématologiques, les agents hématopoïétiques, les hemostatiques, les hormones, les immunosuppresseurs, les interleukines, les analogues d'interleukines, les agents de régulation des lipides, la gonadolibérine, les myorelaxants, les antagonistes narcotiques, les nutriments, les agents nutritifs, les thérapies oncologiques, les nitrates organiques, les vagomimétiques, les prostaglandines, les antibiotiques, les agents rénaux, les agents respiratoires, les sédatifs, les hormones sexuelles, les stimulants, les sympathomimétiques, les anti-infectieux systémiques, le tacrolimus, les agents thrombolytiques, les agents thyroïdiens, les traitements pour les troubles de l'attention, les vasodilatateurs, les xanthines, les agents diminuant le cholestérol. Particulièrement visés sont les anticancéreux tels que le taxol (paclitaxel), la doxorubicine et le cisplatine. [0251] Parmi les agents physiques ou chimiques, on peut citer notamment les isotopes ra- 24 dioactifs et les photo-sensibilisateurs. [0252] Parmi les photo-sensibilisateurs, on peut citer notamment ceux appartenant à la classe des tétrapyrroles comme les porphyrines, les bactériochlorines, les phtalocyanines, les chlorines, les purpurines, les porphycènes, les phéophorbides, ou encore ceux appartenant à la classe des texaphyrines ou dcs hypericines. Parmi les photo-sensibilisateurs de première génération, on peut mentionner l'hémato-porphyrine et un mélange de dérivés d' hémato-porphyrine (HpD) (vendu sous la marque commerciale Photcyfrin® par Axcan Pharma). Parmi les photo-sensibilisateurs de seconde génération, on peut mentionner le méta-tetra-hydroxyphenyl chlorine (mTHPC ; nom commercial Foscan®, Biolitec AG) et le dérivé monoacide du cycle A de la henzoporphyrine (BPD-MA vendu sous la marque commerciale Visudyne® par QLT et Novartis Opthalmics). Les formulations des photo-sensibilisateurs de seconde génération qui associent à ces photo-sensibilisateurs une molécule (lipide, peptide, sucre etc..) qualifiée de transporteur qui permet leur acheminement sélectif au niveau du tissu tumoral sont appelées photo-sensibilisateurs de troisième génération. [0253] Parmi les agents biologiques, on peut mentionner les oligonucléotides, de l'ADN, de r ARN, des siARN, les peptides et les protéines et les saccharides. [0254] Bien entendu, l'agent thérapeutique peut être formulé directement sous sa forme active ou sous forme d'une pro-drogue. Par ailleurs, il est envisagé que plusieurs agents thérapeutiques puissent être formulés en association dans la nanoémulsion. [0255] La quantité d'agent thérapeutique dépend de l'application visée ainsi que de la nature de l'agent. Toutefois, on cherchera généralement à formuler la nanoémulsion avec une concentration maximale en agent thérapeutique, notamment lorsqu'il s'agit d'agents thérapeutiques peu solubles, afin de limiter le volume et/ou la durée d'administration au patient. [0256] Or il a été constaté que la présence du lipide solubilisant dans la phase dispersée permet d'incorporer une quantité importante de composés mêmes hydrophobes ou amphiphiles. [0257] Proportion de coeur dans les gouttelettes [0258] Généralement, la proportion molaire des composants du coeur des gouttelettes par rapport aux composants des gouttelettes est de 10 à 80%, notamment de 25 à 75%, de préférence de 33,35 à 73,99% (ces pourcentages étant calculés sans prendre en compte l'hybride htiARN). Autrement dit, la proportion molaire (mol/mol) de l'ensemble (lipide solubilisant / éventuelle huile / éventuel agent d'imagerie / éventuel agent thérapeutique lipophile) par rapport à la phase dispersée (c'est-à-dire à tous les composants de la phase dispersée) est généralement de 10 à 80%, notamment de 25 à 75%, de préférence de 33,35 à 73,99%. [0259] Généralement, la proportion massique (wt/wt) des composants du coeur des gout- telettes par rapport aux composants des gouttelettes est de 10 à 60%, notamment de 20 à 60%, de préférence de 23,53 à 59,51% (ces pourcentages étant calculés sans prendre en compte l'hybride htiARN). Autrement dit, la proportion massique de l'ensemble (lipide solubilisant / éventuelle huile / éventuel agent d'imagerie / éventuel agent thérapeutique lipophile) par rapport à la phase dispersée (c'est-à-dire à tous les composants de la phase dispersée) est généralement de 10 à 60%, notamment de 20 à 60%, de préférence de 23,53 à 59,51%. [0260] Ces proportions molaires et/ou massiques sont particulièrement adaptées pour que la nanoémulsion avant complexation avec le htiARN soit stable au stockage, notamment qu'elle soit stable en étant stockée plus de 28 jours à 40°C, voire plus de 300 jours à 40°C. La stabilité peut notamment être mesurée en suivant la taille des gouttelettes, leur index de polydispersité et/ou leur potentiel zéta (par exemple par diffusion quasi-élastique de la lumière par un appareil de type ZetaSizer, Malvern). [0261] Phase aqueuse [0262] La phase aqueuse de la nanoémulsion est de préférence constituée d'eau et/ou d'un tampon tel qu'un tampon phosphate comme par exemple du PBS ("Phosphate Buffcr Saline") ou d'une solution saline, notamment de chlorure de sodium. [0263] La phase aqueuse continue peut également comporter un agent épaississant tel que du glycérol, un saccharide, oligosaccharidc ou polysaccharide, une gomme ou encore une protéine, de préférence du glycérol. En effet, l'utilisation d'une phase continue de viscosité plus élevée facilite l'émulsification et permet de ce fait de réduire le temps de sonication. [0264] La phase aqueuse comporte avantageusement de 0 à 50% en poids, de préférence de 1 à 30% en poids et tout particulièrement de 5 à 20% en poids d'agent épaississant. [0265] Bien entendu, la phase aqueuse peut contenir en outre d'autres additifs tels que des colorants, stabilisants et conservateurs en quantité appropriée. [0266] La proportion de phase dispersée et de phase aqueuse est très variable. Cependant, le plus souvent, les nanoémulsions seront préparées avec 1 à 50%, de préférence 5 à 40% et tout particulièrement 10 à 30% en poids de phase dispersée et 50 à 99%, de préférence 60 à 95% et tout particulièrement 70 à 90 % en poids de phase aqueuse. [0267] Taille des gouttelettes [0268] Les gouttelettes de la nanoémulsion avant complexation avec l'(les) hybride(s) htiARN (gouttelettes nues) ont généralement un diamètre compris entre 20 et 200 nm. Ce diamètre peut notamment être mesuré par diffusion quasi-élastique de la lumière sur un appareil ZetaSizer, Malvern. [0269] 11 est possible d'obtenir des gouttelettes de taille plus spécifique en adaptant les pour- centages des composants de la nanoémulsion. [0270] Pour une nanoémulsion comprenant des gouttelettes non complexées à un hybride 26 htiARN de taille comprise entre 20 et 40 nm, on préfèrera utiliser une nanoémulsion comprenant au moins 5% molaire de lipide amphiphile et : [0271] - de 25 à 45% molaire de co-tensioactif (en dessous de 25% molaire, la na- noémulsion peut présenter des problèmes de stabilité), et/ou [0272] - de 15 à 50% molaire de tensioactif cationique. [0273] Pour une nanoémulsion comprenant des gouttelettes non complexées à un hybride htiARN de taille comprise entre 40 et 100 nm, on préfèrera utiliser une nanoémulsion comprenant au moins 5% molaire de lipide amphiphile et : [0274] - de 45 à 50% molaire de co-tensioactif (en dessous de 45% molaire, la na- noémulsion peut présenter des problèmes de stabilité. Au-delà de 50%, l'efficacité en transfection de la nanoémulsion est moindre), et/ou [0275] - de 30 à 40% molaire de tensioactif cationique. (en dessous de 30% molaire, l'efficacité en transfection de la nanoémulsion est moindre. Au-delà de 40%, la nanoémulsion peut présenter des problèmes de stabilité). [0276] Pour une nanoémulsion comprenant des gouttelettes non complexées à un hybride htiARN de taille comprise entre 130 et 175 nm, on préfèrera utiliser une nanoémulsion comprenant au moins 5% molaire de lipide amphiphile et de 15 à 70% molaire d'au moins un tensioactif cationique et : [0277] - de 10 à 25% molaire, notamment de 10 à 15% de co-tensioactif. [0278] Les pourcentages molaires de lipide amphiphile, de tensioactif cationique et de co- tensioactif sont par rapport à l'ensemble (lipide amphiphile / tensioactif cationique / co-tensioactif / éventuel lipide fusogène). [0279] Les gouttelettes du complexe hybride htiARN / gouttelettes (gouttelettes complexées à un hybride htiARN) ont généralement un diamètre compris entre 20 et 250 nm, typiquement entre 40 et 200 nm. Ce diamètre peut notamment être mesuré par diffusion quasi-élastique de la lumière sur un appareil ZetaSizer, Malvern. [0280] Localisation des composants dans le complexe [0281] Les gouttelettes du complexe htiARN / gouttelette sous forme de nanoémulsion définie ci-dessus s'organisent sous forme de coeur - couronne, où : [0282] - le coeur comprend : [0283] - le lipide solubilisant, [0284] - l'éventuelle huile, [0285] - l'éventuel agent d'imagerie, [0286] - l'éventuel agent thérapeutique lipophile, [0287] - la couronne comprend : [0288] - le lipide amphiphile, [0289] - le tensioactif cationique, [0290] - le co-tensioactif (éventuellement greffé avec une molécule d'intérêt), 27 [0291] - l'hybride htiARN, [0292] l'éventuel lipide fusogène, l'éventuel agent thérapeutique s'il est amphiphilc. [0293] Procédé de préparation du cotnplexehyhride htiARN / tzanoparticule [0294] Le complexe htiARN / nanoparticule sous forme de nanoémulsion définie ci-dessus peut être préparé en suivant le procédé de préparation décrit dans la demande FR 2 994 849, en utilisant le htiARN en tant que séquence nucléotidique susceptible de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférence. [0295] Selon un troisième objet, l'invention concerne l'utilisation d'un hybride htiARN tel que défini ci-dessus pour stabiliser un complexe entre une nanoparticule et ledit ARN antisens. [0296] L'invention concerne également une méthode de stabilisation d'un complexe d'un ARN antisens et d'une nanoparticule comprenant les étapes consistant à : [0297] - fournir un ARN antisens, un premier brin d'ADN et un deuxième brin d'ADN tels que définis ci-dessus, et une nanoparticule, notamment telle que définie ci-dessus, [0298] - hybrider dans un tampon d'hybridation deux équivalents molaire d'ARN antiscns, un équivalent molaire de premier brin d'ADN et d'un équivalent molaire de deuxième brin d'ADN, ce par quoi un hybride htiARN tel que défini ci-dessus est obtenu, [0299] - complexer l'hybride htiARN avec la nanoparticule. [0300] Selon un quatrième objet, l'invention concerne une méthode d'introduction d'ARN antisens susceptible de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférence dans une cellule eucaryote, comprenant la mise en contact de la cellule eucaryote avec le complexe selon l'invention. Cette méthode est une méthode de transfection. [0301] La méthode d'introduction peut être réalisée in vitro. Dans ce cas, généralement, la mise en contact de la cellule eucaryote avec le complexe selon l'invention a lieu dans une solution tampon, par exemple un milieu OptiMEMC). La mise en contact dure gé-néralement entre 8 et 96 heures, typiquement de l'ordre de 72 heures, à une température de l'ordre de 37°C. [0302] Généralement, après l'étape de mise en contact, les cellules sont récupérées. [0303] Selon un cinquième objet, l'invention concerne le complexe défini ci-dessus pour son utilisation pour la prévention ou le traitement d'une maladie, en particulier une maladie du système digestif, telle qu'une maladie chronique inflammatoire de l'intestin, notamment la maladie de Crohn ou la rectocolite hémorragique. [0304] L'invention concerne également une méthode de prévention ou de traitement d'une maladie, en particulier d'une maladie du système digestif, telle qu'une maladie chronique inflammatoire de l'intestin, notamment la maladie de Crohn ou la rectocolite hémorragique comprenant l'administration à un mammifère en ayant besoin, de préférence un humain en ayant besoin, d'une quantité efficace du complexe défini ci- 28 dessus. [0305] Le complexe hybride htiARN / nanoparticulc sous forme de nanoémulsion peut comprendre un agent thérapeutique permettant de traiter la maladie, cc qui permet de bénéficier d'un double effet thérapeutique : celui induit par l'hybride htiARN qui permet de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférence et celui induit par l'agent thérapeutique. [0306] L'administration peut être parentérale, intraveineuse, orale, topique, intra rectale ou ophtalmologique, et est de préférence orale, ce qui est possible grâce à la stabilité du complexe selon l'invention aux fluides physiologiques complexes et notamment aux milieux intestinaux. [0307] L'invention est illustrée au vu des figures et exemples qui suivent. Figures [0308] [fig.1] Figure 1 : Structure de l'hybride htiARN [0309] [fig.2] Figure 2 : Structure des deux unités monomériques de l'hybride htiARN vu comme un dimère [0310] [fig.3] Figure 3 : Structure d'un exemple d'hybride htiARN (« htiGFP ») selon l' invention [0311] [fig.4] Figure 4 : Structure d'une unité monomériquc de l'hybride htiGFP (comparatif). [0312] [fig.5] Figure 5 : Structure d'un dimère premier brin d'ADN / deuxième brin d'ADN de d'hybride htiGFP, les deux brins étant hybridés par SI et S2 (comparatif). [0313] [fig.6] Figure 6 : Structure d'un hybride htiARN contrôle (« htiCTRL »), dont l'ARN antisens de séquence SEQ ID NO:7 n'est pas susceptible de moduler les mécanismes endogènes d'ARN interférence (contrôle). [0314] [fig.7] : Structure d'une unité monomérique de l'hybride htiCTRL Exemples Exemple 1 : Hybride htiGFP 103151 1.1. Préparation de l'hybride htiGFP 10316] L'hybridation des deux unités monomériques en un dimère (Ifig.2I figure 2) a été effectuée par chauffage, à l'aide du protocole indiqué au tableau 2, afin de former l'hybride htiGFP de structure détaillée à1Fig 311a figure 3. Un ARN interférant ciblant l'ARN messager du gène codant pour la GFP a été utilisé comme ARN antisens. 10317] 29 [Tableaux2] Oligonucléotide séquence fournisseur Equivalent molaire Tampon d'hybridation Protocole ARN antisens SEQ ID IDT DNA 2 100mM KC1 1mM MgC12 30mM Chauffer : NO:3 HEPES 1) 5 minutes à 90°C pH7,3 2) 5 minutes à 80°C 3) 20 minutes à 70°C Laisser refroidir lentement jusqu'à 25°C le i brin d'ADN SEQ ID IDT DNA 1 NO:1 2ème brin d'ADN SEQ ID IDT DNA 1 NO:2 [0318] Tableau 2 : Protocole de préparation d'une structure hybride ADN-ARN « htiGFP « susceptible de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférence [0319] L'hybridation effective des deux unités monomériques en un dimère hybride htiGFP a été contrôlée par une électrophorèse sur gel d' agarose (E-gel EX 4% Agarose Syhr Gold, Invitrogen). Le temps de migration était de 15 minutes. Un témoin de poids moléculaire (GeneRuler 50 hp DNA Ladder, Thcrmo Scicntific) a été utilisé pour démontrer que la taille de la structure obtenue se situe entre les marqueurs 100 paires de bases (100 pb) et 50 paires de bases (50 pb). La structure de l'hybride htiGFP est de 69 paires de bases + nsi + nARN = nsc2 nl» ns2 nARN = 69). [0320] 1.2. Préparation de structures comparatives [0321] Par ailleurs, pour la réalisation d'exemples comparatifs ont été préparés : [0322] - une unité monomérique de l'hybride htiGFP ([fig.4] figure 4). [0323] - un dimère constitué du premier brin d'ADN et du deuxième brin d'ADN, les deux brins étant hybridés par Si et S2 (dimère exempt d'ARN antisens) ([fig.5] figure 5). [0324] - un autre hybride htiCTRL contrôle, dont l'ARN antisens n'est pas susceptible de moduler les mécanismes endogènes d'ARN interférence ([fig.6] figure 6). Cet ARN antisens non ciblé de séquence SEQ ID NO:7 (Kim et al., 2005) n'a pas de cible spécifique sur le génome humain et est utilisé pour contrôle. Le premier brin d'ADN de l'hybride htiCTRL a la séquence SEQ ID NO:8 et le deuxième brin a la séquence SEQ ID NO:9. Les ARN antisens et SC1 et SC2 diffèrent entre htiGFP et htiCTRL. Par contre, les bras espaceurs Li et L2 et les séquences nucléotidiques S1 et S2 de l'hybride htiCTRL sont identiques à ceux de l'hybride htiGFP. [0325] 1.3. Activité fonctionnelle de l'hybride htiGFP [0326] Une lignée de cellules tumorales de cancer de la prostate surexprimant le gène codant pour la Green Fluorescent Protein (PC3-GFP) a été utilisée pour valider l'activité fonctionnelle d'ARN interférence des différentes structures décrites en 1.1 et 1.2. [0327] Chaque ARN interférent a été transfccté dans la lignée cellulaire PC3-GFP à une concentration finale de 5 à 20 nM à l'aide du réactif Lipofectamine RNAimax, suivant les recommandations du fabricant. [0328] La fluorescence à 510 nm (longueur d'onde d'émission de la GFP) de chaque cellule a été quantifiée par microscopie confocalc (>300 cellules par conditions). Chaque condition a été reproduite à N = 3 expériences indépendantes, +/- écart-type standard. Les résultats sont fournis au tableau 3. [0329] 31 [Tableaux3] Intensité de fluorescence de la GFP par cellule (Unité Arbitraire, ± écart-type standard, N=3 expériences indépendantes) concentration 5nM lOnM 20nM Non traité 441,23 ± 41,46 474,68 ± 103,75 462,71 ± 57,27 ARN antisens non ciblé siAllStar (Qiagen et son brin complémentaire) (comp.) 479,02 ± 26,48 529,92 ± 86,86 561,02 ± 31,85 ARN antisens GFP siGFP (SEQ ID NO:3 et son brin complémentaire) (comp.) 147,38 ± 13,94 141,95 ± 21,24 117,33 ± 27,66 unité monomérique de l'hybride htiCTRL ([Fig 7] figure 7) (comp.) 456,09 ± 24,14 458,12 ± 48,42 540,6 ± 84,28 unité monomérique de l'hybride htiGFP ([Fig 4] figure 4) (comp.) 256,43 ± 20,37 245,89 ± 16,42 149,55 ± 29,65 dimère ler brin d'ADN / 2sile brin d'ADN de d'hybride htiGFP ([Fig 5] fleure 5) (comp.) 523,38 ± 69,67 567,72 ± 57,99 519,98 ± 67,82 htiCTRL ([Fig 6] figure 6) (comp.) 502,53 ± 38,22 519,1 ± 67,32 528,58 ± 46,05 htiGFP ([Fig 3] fleure 3) (invention) 311,79 ± 11,7 309,41 ± 75,99 237,15 ± 15,5 [0330] Tableau 3 : Intensité de fluorescence de la GFP par la cellule en fonction de la 32 structure utilisée [0331] L'activité de l'hybride htiGFP, conserve une activité similaire d'ARN interférence comparé à un siARN dont la séquence antiscns SEQ ID NO:3 est identique. En effet, d'après le tableau 3, le siARN ciblant le gène codant pour la GFP (siGFP) diminue fortement l'expression de son gène cible, visualisé par une diminution de l'intensité de la GFP par cellule, lorsque les cellules PC3-GFP sont transfectées par ce siARN. Après l'intégration de la même séquence d'ARN antiscns au sein d'une structure hybride ADN/ARN en tandem inversé (htiGFP), tout comme sa sous-unité monomérique (unité monomérique de l'hybride htiGFP) on observe toujours une activité similaire d'ARN interférence (tableau 3). Cette activité est cependant un peu moins importante qu'avec un siARN composé uniquement d'ARN (siGFP). [0332] Exemple 2 : Préparation d'un complexe nanoparticule lipidique / hybride htiARN [0333] 2.1. Préparation de nanoparticules lipidiques [0334] Les nanoparticules lipidiques (LNP) sont préparées par mélange des phases or- ganiques et aqueuses par un procédé ultrasonique, permettant de générer des nanogouttelettes. Après homogénéisation à 55°C, les deux phases sont mélangées et des cycles de sonication sont réalisés à 55°C pendant 5 minutes (alternant 10 secondes de sonication et 30 secondes de repos). Un sonicateur à sonde conique de 3 mm est utilisé (AV505 Ultrasonic processor, Sonics), réglé sur une puissance de 45%. [0335] Les composants non-cncapsulés sont séparés des LNPs par dialyse dans un volume de tampon PBS (Phosphate-Buffered Saline) équivalent à 200 fois le volume des LNPs. Le tampon PBS est changé deux fois au cours de la dialyse, d'une durée totale de 24h. Après caractérisation, les LNPs sont filtrées sur une membrane cellulose d'une porosité de 0.22 pm. [0336] Le diamètre hydrodynamique, l'index de polydispersité (PDI) et le potentiel zeta des nanoparticules lipidiques sont mesurés à l'aide d'un instrument Zeta Sizer Nano (NanoZS, Malvern). Le diamètre hydrodynamique et l'index de polydispersité sont mesurés à une concentration de LNP de 0.6 mg/mL dans un tampon PBS à 25°C. Le potentiel zeta est mesuré à une concentration de 0.4 mg/mL dans un tampon 1 mM NaC1, pH 7,4 à 25°C. [0337] 33 [Tahleaux4] Phase organique Phase aqueuse LIP OID S PC- 3 DO TAP DO PE SUPER REFINEDC) SOYBEAN USP EP- LQ-(MH) SUPPOCIRE STANDARD MYRJ TM S40-P W-(M PB S Glyc érol V) CL % (Phase solide) 3,43 30,4 3,6 1 18,24 6,11 38,24 40 mg 3,7 32,8 3,9 19,7 6,6 41,3 14 800 80 CL % (Phase solide) 1,47 10,0 44,88 14,95 28,77 80 1 mg 2,2 15 67,1 22,4 43,1 14 800 80 103381 Tableau 4: Composition des émulsions comprenant les nanoparticules CL40 et CL80 [0339] [Tablcaux5] Nom commercial Fournis scur No CAS: Description SUPPOCIRE STANDARD Gattcfo 85665-3 Glyccridcs, C10-18; Tri- ssé 3-4 glyccridcs C10-C18 MYRJTM S40-PW-(MV) CROD 9004-99 Polyoxycthylcnc fatty acid ester A -3 SUPER REFINED® SOYBEAN CROD 232-274 Soybcan oil USP EP-LQ-(MH) A -4 LIPOID S PC-3 Lipoid 97281-4 Phosphatidylcholine hy- 8-6 drogenated (phospholipids) DOTAP MERC 132172- 1,2-dioleoy1-3-trimethylammoniu K 61-3 m-propane DOPE Avanti 4004-05 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3- Polar -1 phosphoethanolamine Phosphate Buffered Saline Sigma Tampon à pH neutre Glycérol Sigma 56-81-5 34 [0340] Tableau 5 : Listes des produits utilisés [0341] 2.2. Préparation d'un complexe nanoparticulc lipidique / hybride htiARN [0342] L'hybride htiARN de l'exemple 1 a été complexé aux nanoparticulcs préparées à l'exemple 3.1. [0343] Les complexes ont été formés entre les différents acides nucléiques et les nano- particules lipidiques pendant 20 minutes dans un tampon de réaction (154 mM NaCI, 10 mM HEPES, pH 7.2). Les quantités de nanoparticules lipidiques sont ajustées pour maintenir un ratio N/P constant avec N/P = 36 (N : groupement amine DOTAP/DOPE, P : groupement phosphate de l'acide nucléique correspondant). Une quantité de milieu artificiel SHIME (Prodigest) est ajoutée pour une concentration finale allant de 0 à 90% de milieu SHIME (% V/V). Les résultats sont fournis au tableau 6. [0344] [Tableaux6] Volume LNP (pL) Volume siAllStar 20pM (pL) Volume htiGFP 20pM (pL) Tampon 154 mM NaC1, 10 mM Hepes, pH7.2 (µL) Milieu Volume total (pL) Ratio N/P % Milieu SHIM E % de Stabilité (Ratio du contrôle SHIME + ARN in-terférent) SHIM E (pL) 1 0 1 39,0 0 40,00 36 0,0% 2 0 1 19,0 20 40,00 36 50,0% 3 0,7 1 38,3 0 40,00 36 0,0% 92,85 4 0,7 1 18,3 20 40,00 36 50,0% 46,11 5 0,7 1 14,3 24 40,00 36 60,0% 20,48 6 0,7 1 10,3 28 40,00 36 70,0% 2,093 7 0,7 1 6,3 32 40,00 36 80,0% 5,114 8 0,7 1 2,3 36 40,00 36 90,0% 3,368 9 0 1 39,0 0 40,00 36 0,0% 10 0 1 19,0 20 40,00 36 50,0% 11 2 1 37,0 0 40,00 36 0,0% 96.78 12 2 1 17,0 20 40,00 36 50,0% 95,62 13 2 1 13,0 24 40,00 36 60,0% 95,82 14 2 1 9,0 28 40,00 36 70,0% 94,51 15 2 1 5,0 32 40,00 36 80,0% 93,13 16 2 1 1,0 36 40,00 36 90,0% 92,89 [0345] Tableau 6 Stabilité selon la proportion de milieu SHIME [0346] 2.3. Augmentation de la stabilité du complexe nanoparticule / htiGFP par rapport à 36 un complexe nanoparticulc / siGFP dans un fluide biologique complexe [0347] La stabilité : [0348] du complexe nanoparticulc / siARN contrôle (siAllstar, Qiagen, 21 paires de bases,) ou du complexe nanoparticulc / htiGFP [0349] a été suivie par électrophorèse sur gel d'agarose (E-gel 2% Agarose Bromure d'Ethidium, Invitrogen, temps de migration 10 minutes) après exposition des complexes à des concentrations croissantes de milieu artificiel SHTME (Prodigest) pour reproduire les conditions physiologiques au niveau du colon distal (100% SHTME). [0350] Lorsque l'on augmente la concentration en milieu SHTME, une décomplexation des complexes nanoparticulc / siAllStar à partir d'une concentration de 50% en milieu SHTME est observable car une migration du siAllStar est observée sur gel d'agarosc. En revanche, grâce à une interaction électrostatique plus importante, le complexe nanoparticulc / htiGFP reste stable dans ce fluide biologique comme l'indique l'absence de migration du htiGFP sur gel d'agarose. 37 [Revendication I] REVENDICATIONSMolécule hybride ADN/ARN, appelée hybride htiARN, comprenant : - deux brins d'ARN antisens de séquences identiques et étant susceptibles de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférence, chacun comprenant un nombre n,,,, de nucléotides de 18 à 30, et ayant une extrémité 5' phosphorylée, - un premier brin d'ADN dont la séquence nucléotidique comprend une séquence nucléotidique SI liée par son extrémité 3' à l'extrémité 5' d'un bras espaceur nucléotidique LI lié par son extrémité 3' à l'extrémité 5' d'une séquence nucléotidique SC1, et - un deuxième brin d'ADN dont la séquence nucléotidique comprend une séquence nucléotidique S2 liée par son extrémité 3' à l'extrémité 5' d'un bras espaceur nucléotidique L2 lié par son extrémité 3' à l'extrémité 5' d'une séquence nucléotidique SC2, où : - la séquence nucléotidique SC1 comprend un nombre nsci nucléotides avec nsci de (nARN - 3) à (nA,,, + 3), et présente au moins 40 % d'identité de séquence, déterminé par une méthode d'alignement globale, avec la séquence complémentaire de l'ARN antisens, de sorte que la séquence nucléotidique SC1 est hybridée par complémentarité à un premier des deux brins d'ARN antisens, - la séquence nucléotidique SC2 comprend un nombre nsc2 nucléotides avec nsc2 de (nARN - 3) à (nA,,, + 3), et présente au moins 40 % d'identité de séquence, déterminé par une méthode d'alignement globale, avec la séquence complémentaire de l'ARN antisens, de sorte que la séquence nucléotidique SC2 est hybridée par complémentarité au deuxième des deux brins d'ARN antisens, - la séquence nucléotidique 51 du premier brin d'ADN est complémentaire de la séquence nucléotidique S2 du deuxième brin d'ADN, de sorte que la séquence nucléotidique Si du premier brin d'ADN est hybridée par complémentarité à la séquence nucléotidique S2 du deuxième brin d'ADN, - les deux séquences nucléotidiques Si et S2 ont un même nombre nsus, de nucléotides, nsus, étant un nombre de 16 à 30, - le bras espaceur nucléotidique LI du premier brin d'ADN comprend un nombre nu de nucléotides et le bras espaceur nucléotidique L2 du deuxième brin d'ADN comprend un nombre nu de nucléotides, nu et n 38 [Revendication 2] [Revendication 3] [Revendication 4] [Revendication 5] [Revendication 6] [Revendication 7] représentant indépendamment un nombre de 1 à 15, - les deux brins d'ARN antisens, le premier brin d'ADN et/ou le deuxième brin d'ADN sont éventuellement porteurs d'un ou plusieurs groupes lipidiques. Hybride htiARN selon la revendication 1 dans lequel : - ns, s, est un nombre entier de 18 à 22, et/ou - nn et n,, sont indépendamment un nombre entier de 1 à 15, notamment de 2 à 10, et/ou - la somme nsn + nn+ nsi+ nA,' et/ou la somme nsc, + nw+ ns, + nA,' est(sont) supéricure(s) ou égale(s) à 60. Complexe d'au moins une nanoparticulc et d'au moins un hybride htiARN selon la revendication 1 ou 2. Complexe selon la revendication 3, dans lequel la nanoparticulc est cationique. Complexe selon la revendication 3 ou 4, dans lequel la nanoparticule est une nanoparticulc inorganique, organique ou hybride organique/inorganique. Complexe selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, dans lequel la nanoparticule est une nanoparticulc organique cationique comprenant au moins un lipide, telle qu'un liposome ou une gouttelette d'une nanoémulsion comprenant une phase aqueuse continue et au moins une phase lipidique dispersée. Complexe selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, sous forme d'une nanoémulsion comprenant une phase aqueuse continue et au moins une phase dispersée qui comprend : a) au moins 5% molaire de lipide amphiphile, b) de 15 à 70% molaire d'au moins un tensioactif cationique comprenant : i) au moins un groupe lipophile choisi parmi : - un groupe R ou R-(C=0)-, où R représente une chaîne hydrocarbonée linéaire comprenant de 11 à 23 atomes de carbone, - un ester ou un amide d'acides gras comprenant de 12 à 24 atomes de carbone et de phosphatidyléthanolamine, et un poly(oxyde de propylène), et ii) au moins un groupe hydrophile comprenant au moins un groupe cationique choisi parmi : 39 un groupe alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 12 atomes de carbone et interrompu et/ou substitué par au moins un groupe cationique, et un groupe polymérique hydrophile comprenant au moins un groupe cationique, et c) de 10% à 55% molaire d'un co-tensioactif comprenant au moins une chaîne poly(oxyde d'éthylène) comprenant au moins 25 unités d'oxyde d'éthylène, d) un lipide solubilisant comprenant au moins un glycéride d'acides gras, e) éventuellement un lipide fusogène, f) un hybride htiARN selon la revendication 1 ou 2, où les pourcentages molaires de lipide amphiphile, de tensioactif cationique et de co-tensioactif sont par rapport à l'ensemble (lipide amphiphile / tensioactif cationique / co-tensioactif / éventuel lipide fusogène). [Revendication 8] Utilisation d'un hybride htiARN selon la revendication 1 ou 2 pour stabiliser un complexe entre ledit ARN antisens et une nanoparticule. [Revendication 9] Méthode d'introduction in vitro d'un ARN antisens susceptible de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférence dans une cellule eucaryote, comprenant la mise en contact de la cellule eucaryote avec le complexe selon l'une quelconque des revendications 3 à 7. [Revendication 10] Complexe selon l'une quelconque des revendications 3 à 7 pour son uti- lisation pour la prévention ou le traitement d'une maladie, en particulier une maladie du système digestif, telle qu'une maladie chronique inflammatoire de l'intestin, notamment la maladie de Crohn ou la rectocolite hémorragique.