Brevet FR3100451A1 — publié le 20210312

Méthode de diagnostic de peaux sèches La présente invention concerne une méthode de diagnostic d’une peau sèche chez un sujet, comprenant une étape (a) de mesure, dans un échantillon de peau du sujet, du niveau d’au moins un N-glycane choisi dans le groupe constitué du glycane de type riche en mannose M6, du glycane de type riche en mannose M8, du glycane de type riche en mannose M9 et du glycane de type complexe A1GalNAc1 Figure pour l'abrégé : néant Méthode de diagnostic de peaux sèches La présente invention concerne une méthode de diagnostic de peaux sèches. Il est connu qu'une augmentation de la sécheresse cutanée est souvent observée avec l'âge, toutefois de tels états de sécheresse cutanée peuvent également se manifester chez les sujets jeunes. En effet, l'état de sécheresse cutanée est un état physiologique qui peut être présent chez des sujets jeunes, sans aucune cause pathologique, du moins apparente. L'origine de cette sécheresse peut être constitutionnelle ou acquise. Ainsi, de nombreux facteurs extérieurs peuvent entrainer l'assèchement de la peau ou aggraver l'état d'une peau déjà sèche. Parmi ces facteurs, on peut citer les conditions climatiques difficiles, les rayons solaires, l'exposition à certains agents chimiques ou thérapeutiques. Sur le plan physiologique, la peau sèche est souvent associée à une baisse du taux d'hydratation cutanée et à une altération de la fonction barrière, mesurée par la perte insensible en eau. Sur le plan sensoriel, elle est notamment caractérisée par une sensation de tiraillement et/ou de tension cutanée. Pour des raisons évidentes, ces manifestations sont sources d'inconfort, voire de douleurs. Or, l'expérience montre que les consommateurs ne choisissent pas toujours de manière optimale les produits de soins de la peau, parce qu'ils ne connaissent pas précisément leur type de peau et ses besoins spécifiques. Il existe par conséquent un besoin pour permettre la détermination du type d'une peau, par exemple savoir diagnostiquer si la peau est sèche, afin notamment de guider le formulateur dans la préparation de produits ciblés, voire personnalisés. La présente invention vise à répondre à ce besoin. La glycosylation correspond à l’ajout d’une chaine oligo- ou polysaccharide à une protéine, un lipide ou toute autre molécule organique, et est une modification post-traductionnelle clé dans toutes les fonctions biologiques. Il s’agit de la modification post-traductionnelle la plus commune et est trouvée sur plus de 60% des protéines eucaryotes. Elle peut influencer de nombreux aspects de la structure et de la fonction de la protéine : son activité biologique, son immunogénicité, sa solubilité, son agrégation, sa demi-vie. Les glycoprotéines jouent un rôle clé dans une multitude de fonctions biologiques dans tous les tissus, telles que la signalisation cellulaire, la reconnaissance des récepteurs, l’inflammation, l’adhésion cellulaire, la migration et la différenciation. Dans la mesure où la synthèse de glycanes n’est pas menée par un modèle, contrairement à la synthèse d’ADN ou de protéine, il a été difficile d’étudier en détail les changements de structures des glycanes dans les tissus maladies ou âgés du fait du manque d’outils moléculaires suffisamment sensibles. Cependant, le développement récent d’outils glycomiques qualitatifs et quantitatifs, basé sur la disponibilité de glycosidases spécifiques, et de méthodes de chromatographie et de spectrométrie de masse sensibles, a permis aux glycobiologistes de caractériser en détail le glycome des tissus. L’importance de la glycosylation dans l’hémostasie de la peau a ainsi été soulignée dans des troubles congénitaux de la glycosylation. Les patients nouveaux-nés souffrant de ces maladies présentent des mutations dans les gènes codant les enzymes impliquées dans la voie de glycosylation, ce qui entraine plusieurs anomalies de la peau, telles qu’une peau ridée et affaissée, une peau d’orange, une peau sèche et une ichtyose (Kouwenberg et al. (2014) Pediatr . Dermatol . 31 :e1-5). Peu d’études glycomiques ont été conduites sur la peau, mais Uematsu et al. (2009) Mol. Cell . Proteomics 8 :232-244 a montré que les N-glycomes dans l’épiderme humain et murin étaient très similaires. L’épiderme est caractérisé par une abondance d’oligosaccharides riches en mannose avec une présence plus faible d’espèces sialylées et fucosylées. Un profil réciproque a été identifié dans le derme. Néanmoins, à la connaissance des inventeurs, aucune étude n’a mis en évidence de marqueurs de la peau sèche dans le N-glycome de la peau. La présente invention résulte de la découverte inattendue par les inventeurs que seuls 3 glycanes de type riches en mannose, les glycanes M6, M8 et M9, et un glycane de type complexe, le glycane A1GalNAc1, parmi tous les N-glycanes présents dans le stratum corneum de la peau, étaient exprimés différentiellement dans une peau sèche par rapport à une peau normale. Ils ont en effet montré une diminution des niveaux des N-glycanes M6, M8 et M9, et une augmentation du niveau du N-glycane A1GalNAC1, dans des échantillons de peau sèche par rapport aux peaux normales. La présente invention concerne ainsi une méthode de diagnostic d’une peau sèche chez un sujet, comprenant une étape (a) de mesure, dans un échantillon de peau du sujet, du niveau d’au moins un N-glycane choisi dans le groupe constitué du glycane de type riche en mannose M6, du glycane de type riche en mannose M8, du glycane de type riche en mannose M9 et du glycane de type complexe A1GalNAc1. La présente invention a également pour objet une méthode d’évaluation de l’efficacité d’un traitement cosmétique contre la peau sèche chez un sujet, ladite méthode comprenant, après une étape (pré-a) d’application du traitement cosmétique contre la peau sèche, une étape (a) de mesure du niveau d’au moins un N-glycane choisi dans le groupe constitué du glycane de type riche en mannose M6, du glycane de type riche en mannose M8, du glycane de type riche en mannose M9 et du glycane de type complexe A1GalNAc1 dans un échantillon de peau dudit sujet. La présente invention concerne aussi une méthode de criblage de composés actifs pour traiter la peau sèche, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : mettre en contact le composé actif candidat avec un échantillon de peau, mesurer le niveau d’au moins un N-glycane choisi dans le groupe constitué du glycane de type riche en mannose M6, du glycane de type riche en mannose M8, du glycane de type riche en mannose M9 et du glycane de type complexe A1GalNAc1, dans ledit échantillon de peau, comparer le niveau dudit au moins un N-glycane mesuré à l‘étape (B) avec un contrôle, et sélectionner le composé actif candidat comme étant un composé actif pour traiter le peau sèche lorsque le niveau du glycane de type riche en mannose M6 mesuré à l’étape (a) est supérieur au niveau du contrôle, le niveau du glycane de type riche en mannose M8 mesuré à l’étape (a) est supérieur au niveau du contrôle, le niveau du glycane de type riche en mannose M9 mesuré à l’étape (a) est supérieur au niveau du contrôle, et/ou le niveau du glycane de type complexe A1GalNAc1 mesuré à l’étape (a) est inférieur au niveau du contrôle. Brève description des figures La Figure 1 représente les trois types de N-glycanes : (1) de type riche en mannose, (2) de type complexe et (3) de type hybride. Exemple Cet exemple montre que les N-glycanes M6, M8, M9 et A1GalNAc1 permettent de diagnostiquer une peau sèche. Matériel et méthodes Echantillons de stratum corneum L’analyse glycomique initiale a été réalisée sur un stratum corneum (SC) plantaire (SCP) obtenu à partir de râpages de pieds, de D-squame ou de strippings vernis . Les échantillons de SC étudiés ont été pris à partir de la jambe intérieure ou extérieure, dans une cohorte de 10 femmes en bonne santé avec soit une peau sèche (score visuel de dermatologiste > 2-3, profil d’âge 21-68 ans, moyenne 40 ans), soit une peau normale (score visuel 0-1, profil d’âge 27-68 ans, moyenne 53 ans). Analyse des N- glycanes Préparation des N- glycanes marqués Les glycoprotéines ont été extraites des échantillons SC dans une plaque multi-puits dans un tampon 25mM NaHCO 3 pH 8,5 / 50 mM DTT / 0,1% SDS, pendant 10 min à 70°C. Les glycoprotéines ont ensuite été alkylées en présence de 50 mM d’isoacétamide pendant 30 min à température ambiante. Les échantillons ont ensuite été clarifiés par filtrations successives à travers des membranes de 1 µm et 0,22 µm. Les surnageants ont ensuite été concentrés sur une cartouche d’ultrafiltration (seuil de 10 kDa). Le concentrât a ensuite été incubé avec de la PNGase F pendant 1 h à 40°C pour libérer spécifiquement les N-glycanes, et ceux-ci ont été récupérés par centrifugation en utilisant des cartouches de filtration de 0,22 µm (seuil de 10 kDa). 10 µl de N-glycanes libérés et purifiés ont ensuite été marqués par fluorescence avec de l’aminoquinoline N-hydroxysuccinimidylcarbamate (AQC) ou de la 2-aminobenzamide (2AB) pendant 5 min à température ambiante. Les marqueurs libres ont été éliminés par extraction en phase solide. Analyse UPLC Les N-glycanes libérés ont été séparés par chromatographie UPLC/HILIC en utilisant un gradient linéaire de 12-88% MeCN sur une colonne hybride à pont d’éthylène ( ethylene bridge hybrid , BEH) glycane 150 x 2.1, i.d., 1,7 µM. Des runs de 40 min ont été réalisés et les pics de glycanes s’éluant ont été détectés en utilisant un détecteur de fluorescence à λ ex de 245 nm et λ em de 395 nm respectivement. Le système a été calibré en utilisant un standard externe d’oligomères de glucose hydrolysés et marqués au 2-AB ou au AQC, à partir duquel les temps de rétention pour les glycanes individuels ont été convertis en unités de glucose (GU). Des digestions par exoglycosidase, et des analyses échange d’anion faible – HPLC et LC-MS/MS ont été réalisées pour déterminer la structure de chaque glycane. L’annotation structurelle est pics chromatographiques en résultant a été réalisée en comparant les données de temps de rétention exprimées en unité de glucose (GU) avec une base de données de glycanes établie au NIBRT, la Glycobase 3.1. La nomenclature des N-glycanes d’Oxford et la représentation symbolique ont été utilisées. Analyse statistique L’aire de chaque pic intégré dans le chromatogramme a été calculée et les quantités de N-glycanes présents dans chaque aire ont été exprimées en pourcentage relatif du chromatogramme intégré total (quantité totale de N-glycanes dans l’échantillon). Les aires de pic pour les échantillons dupliqués ont été comparées ( i.e. écart-type et coefficient de variance %CV) et les aires moyennes ont été utilisées pour l’analyse statistique. Les données ont été exportées à partir d’Empower vers Excel pour une analyse en utilisant le package de logiciels statistiques R. Un script développé au NIBRT (basé sur le test de Tukey) a été utilisé pour analyser les données. Le script rapporte les p-values et génère des diagrammes en boite pour chaque pic dans le profil de glycanes. Résultats Les analyses comparées de N-glycanes présents dans le SC de femmes à peau sèche par rapport aux femmes à peau normale ont montré qu’il y avait une diminution significative des N-glycanes de type riche en mannose M9, M8 et M6 et une augmentation du N-glycane de type complexe A1GalNAc1 dans les peaux sèches par rapport aux peaux normales. Les résultats sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous. N- glycane Peau normale Aire de pic relative (en %) moyenne Peau sèche Aire de pic relative (en %) moyenne p-value M9 3,65 2,45 6,1×10 -6 M8 5,38 4,63 3,55×10 -2 M6 9,33 8,54 3,1×10 -3 A1GalNAc1 2,31 3,01 5,89×10 -7 Tableau 1 : N-glycanes d’échantillons SC de peau normale ou sèche. Les données d’air de pic relative % moyenne ont été analysées dans R en utilisant le test de Tukey montrant des diminutions significatives pour les N-glycanes M9, M8 et M6, et une augmentation significative pour le N-glycane A1GalNAc1. Les inventeurs n’ont pas identifié de différence pour les autres N-glycanes détectés dans les échantillons SC entre les peaux normales et les peaux sèches. Méthode de diagnostic d’une peau sèche chez un sujet, comprenant une étape (a) de mesure, dans un échantillon de peau du sujet, du niveau d’au moins un N-glycane choisi dans le groupe constitué du glycane de type riche en mannose M6, du glycane de type riche en mannose M8, du glycane de type riche en mannose M9 et du glycane de type complexe A1GalNAc1. Méthode de diagnostic selon la revendication 1, dans laquelle le niveau dudit au moins un N-glycane est mesuré par chromatographie liquide à interaction hydrophile (HILIC), HPLC/UPLC ou spectrométrie de masse, et éventuellement digestions par exoglycosidases spécifiques. Méthode de diagnostic selon la revendication 1 ou 2, la méthode comprenant en outre les étapes consistant à : (b) comparer le niveau dudit au moins un N-glycane mesuré à l’étape (a) avec un contrôle, et (c) sur la base de la comparaison à l’étape (b), déterminer si la peau dudit sujet est une peau sèche. Méthode de diagnostic selon la revendication 3, dans laquelle ledit contrôle est la valeur moyenne du niveau dudit N-glycane chez une population de sujets ayant une peau normale. Méthode de diagnostic selon la revendication 4, dans laquelle la peau dudit sujet est diagnostiquée comme étant une peau sèche lorsque : le niveau du glycane de type riche en mannose M6 mesuré à l’étape (a) dans l’échantillon de peau du sujet est inférieur au niveau du contrôle, le niveau du glycane de type riche en mannose M8 mesuré à l’étape (a) dans l’échantillon de peau du sujet est inférieur au niveau du contrôle, le niveau du glycane de type riche en mannose M9 mesuré à l’étape (a) dans l’échantillon de peau du sujet est inférieur au niveau du contrôle, et/ou le niveau du glycane de type complexe A1GalNAc1 mesuré à l’étape (a) dans l’échantillon de peau du sujet est supérieur au niveau du contrôle. Méthode de diagnostic selon l’une des revendications 1 à 5, dans laquelle l’échantillon de peau est prélevé en frottant la surface de la peau. Méthode d’évaluation de l’efficacité d’un traitement cosmétique contre la peau sèche chez un sujet, ladite méthode comprenant, après une étape (pré-a) d’application du traitement cosmétique contre la peau sèche, une étape (a) de mesure du niveau d’au moins un N-glycane choisi dans le groupe constitué du glycane de type riche en mannose M6, du glycane de type riche en mannose M8, du glycane de type riche en mannose M9 et du glycane de type complexe A1GalNAc1 dans un échantillon de peau dudit sujet. Méthode d’évaluation selon la revendication 7, comprenant en outre les étapes consistant à : (b) comparer le niveau dudit au moins un N-glycane mesuré à l’étape (a) avec un contrôle, et (c) sur la base de la comparaison à l’étape (b), déterminer si ledit traitement cosmétique contre la peau sèche est efficace chez ledit sujet. Méthode d’évaluation selon la revendication 8, dans laquelle le contrôle est le niveau dudit au moins N-glycane dans un échantillon de peau dudit sujet avant l’application dudit traitement cosmétique. Méthode de criblage de composés actifs pour traiter la peau sèche, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : mettre en contact le composé actif candidat avec un échantillon de peau, mesurer le niveau d’au moins un N-glycane choisi dans le groupe constitué du glycane de type riche en mannose M6, du glycane de type riche en mannose M8, du glycane de type riche en mannose M9 et du glycane de type complexe A1GalNAc1, dans ledit échantillon de peau, comparer le niveau dudit au moins un N-glycane mesuré à l‘étape (B) avec un contrôle, et sélectionner le composé actif candidat comme étant un composé actif pour traiter le peau sèche lorsque le niveau du glycane de type riche en mannose M6 mesuré à l’étape (a) est supérieur au niveau contrôle, le niveau du glycane de type riche en mannose M8 mesuré à l’étape (a) est supérieur au niveau contrôle, le niveau du glycane de type riche en mannose M9 mesuré à l’étape (a) est supérieur au niveau contrôle, et/ou le niveau du glycane de type complexe A1GalNAc1 mesuré à l’étape (a) est inférieur au niveau contrôle.