Brevet FR3091703A1 — publié le 20200717

Description Titre de l'invention : PROCÉDÉ D'EXTRACTION DE PHYCO- CYANINES [0001] DOMAINE DE L'INVENTION. [0002] La présente invention concerne un nouveau procédé d'extraction et de purification de phycocyanines produites par fermentation de microalgues, en particulier produites par Galdieria sulphuraria, par précipitation sélective. [0003] ARRIERE PLAN DE L'INVENTION. [0004] La purification de phycobiliprotéines extraites de Galdieria sulphuraria et de Spiruline par précipitation au sulfate d'ammonium a déjà été décrite dans la littérature (Moon et al., 2015 ; Cruz de Jestis et al., 2006) mais elle est très difficilement applicable à l'échelle industrielle car elle demande beaucoup de sulfate d'ammonium, ce qui pose de gros problèmes de retraitement du sulfate d'ammonium et du surnageant. [0005] Les autres méthodes de purification décrites permettant d'obtenir un taux de pureté élevé, telles que des méthodes de chromatographie mais sont très couteuses à mettre en oeuvre. [0006] La précipitation de la phycocyanine de Spiruline a été décrite avec l'ajout d'acide à la solution brute de phycocyanine (TN 2009000406). Toutefois compte tenu du point isoelectrique de la phycocyanine de Spiruline, autour de 4,5 et proche du point isoelectrique d'un grand nombre d'autres protéines, cette méthode ne permet pas de précipiter sélectivement la phycocyanine et donc ne permet pas de la purifier. Dc même, certains décrivent l'utilisation de l'acide salicylique pour précipiter la phycocyanine de Spiruline (WO 2016/030643). L'utilisation de cet acide génère une précipitation non sélective de la PC et le précipité obtenu est particulièrement difficile à resolubiliser. Un résultat identique a été obtenu avec la PC de Galdieria. [0007] Les procédés d'extraction des phycocyanines consistent généralement à faire précipiter les matières organiques autres que les phycocyanines présentes dans un extrait brut aqueux issu d'une fermentation de microalgues pour conserver les phycocyanines dans le surnageant qui sera filtré avant de faire précipiter les phycocyanines. Toutefois, certains composés organiques, notamment des polysaccharides complexes comme le glycogène, restent solubles dans les mêmes conditions que les phycocyanines. [0008] Dans un procédé industriel de purification de phycocyanine, on peut employer une étape par filtration (ultrafiltration) pour éliminer l'eau afin de concentrer la phycocyanine et éliminer des petites molécules (protéines, ions, acide organique, etc.) dont la taille est inférieure au seuil de coupure du filtre utilisé, pour obtenir une phy- 2 cocyaninc la plus pure possible. Toutefois, le seuil de coupure du filtre étant inférieur à la taille du glycogène celui-ci n'est pas éliminé et augmente la viscosité du rétentat, diminuant les débits de filtration. L'effet viscosant du glycogène en fonction de sa concentration a été démontré à partir de glycogène purifié de Galdieriasulphuraria (Martincz-Garcia et al., 2017). [0009] De plus les phycocyanines purifiées obtenues conservent des taux élevés de ces sucres qui peuvent altérer les qualités des phycocyanines, notamment leur pouvoir colorant, nécessitant la production et/ou l'utilisation de plus grandes quantités de phycocyanines pour un même effet. Ces polysaccharides résiduels se comportent comme une charge qui vient renchérir les coûts de fabrication de la phycocyaninc et peut limiter les usages commerciaux de la phycocyaninc obtenue, par exemple pour la préparation d'aliments qui ont une faible teneur en sucres. [0010] On cherche donc à améliorer les procédés d'extraction et de purification des phyco- cyanines extraites d'une biomasse, tant d'un point de vue qualitatif que d'un point de vue industriel et économique et notamment en diminuant la teneur résiduelle en sucres dans le produit final, en particulier la teneur résiduelle en glycogènes. [0011] BREVE DESCRIPTION DE L'INVENTION [0012] Le procédé selon l'invention consiste à effectuer une précipitation sélective des phy- cocyanines directement à partir de l'extrait brut qui les contiennent dans des conditions respectueuses de l'intégrité des phycohilliprotéines et qui permettent le maintien en solution des principales impuretés, en particulier les polysaccharides dont le glycogène. [0013] Cette précipitation sélective résulte d'une action combinée sur deux facteurs, simul- tanément ou en séquence dans un ordre indifférent, d'une part le pH de la solution et d'autre part la concentration en phycocyanine. [0014] Le procédé selon l'invention est particulièrement adapté pour la purification de phy- cocyanines résistantes aux pH acides produites par Galdieria sulphuraria. [0015] BREVE DESCRIPTION DES FIGURES. [0016] [fig.1] représente la masse du précipité obtenu à différentes concentrations en phy- cocyanine et différents pH dans la solution initiale. [0017] [fig.2] représente la concentration en phycocyanine dans le surnageant après récu- pération du précipité en fonction du pH pour différentes concentrations en phycocyanine. [0018] DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION. [0019] L'invention concerne un procédé d'extraction de phycocyanines à partir d'une solution comprenant la ou les phycocyanines, également appelée solution initiale de phycocyanine, comprenant une étape de précipitation sélective qui consiste d'une part à ajuster le pH de la solution initiale à une valeur choisie dans une plage de valeurs de 3 pH dans laquelle les phycocyanines sont moins solubles (également appelée plage d'instabilité) et d'autre part à concentrer les phycocyanines dans la solution pour favoriser leur précipitation, puis une étape de récupération de la phycocyanine précipitée. [0020] Les deux actions d'ajustement du pH et de concentration peuvent être mises en oeuvres simultanément ou en séquence, soit en ajustant le pH de la solution initiale avant de concentrer, soit en concentrant la solution initiale avant d'ajuster le pH. [0021] De manière surprenante, les conditions de concentration différentielle font que seules les phycocyanines précipitent, les autres produits que l'on peut qualifier d'impuretés, en particulier les polysaccharides, restent en solution. [0022] Ainsi il est possible de récupérer les phycocyanines précipitées en les séparant de la solution, et le cas échéant de les sécher pour obtenir une poudre de phycocyanines purifiées. [0023] Non seulement le procédé selon l'invention permet d'extraire les phycocyanines de la solution, niais permet en une même étape de les purifier, les phycocyanines obtenues étant particulièrement pures avec de faibles teneurs en sucres résiduels. [0024] Le procédé selon l'invention est particulièrement adapté pour la purification d'une solution de phycocyaninc extraite d'une culture de microorganisme producteur de phycocyanines qui produit également du glycogène, en particulier dans le cadre d'un procédé industriel de production de phycocyaninc qui comprend la culture des microorganismes, puis la récupération de la biomasse produite pour extraire la phycocyanine, et la récupération (le la phycocyanine à partir de cette biomasse. [0025] Le procédé est particulièrement adapté pour les phycocyanines produites par des mi- croorganismes qui produisent de fortes teneurs de glycogène, en particulier pour l'extraction et la purification des phycocyanines à partir d'une biomasse qui comprend plus de 10% de glycogène par rapport à la totalité de la matière sèche. [0026] Des microorganismes producteurs de phycocyanine sont bien connus, notamment les algues (ou microalgues) des ordres des Cyanidiales. L'ordre des Cyanidiales, englobe les familles des Cyanidiaceae ou des Galdieriaceae, elles-mêmes subdivisées en les genres Cyanidioschyzon, Cyanidium ou Galdieria, auxquelles appartiennent entre autres les espèces Cyanidioschyzon merolae 10D, Cyanidioschyzon tnerolae DBV201, Cyanidium caldarum, Cyanidium daedalmm, Cyanidium maximum, Cyanidium partitum, Cyanidium rumens, Galdieria daedala, Galdieria maxima, Galdieria partita ou encore Galdieria sulphuraria. On citera en particulier la souche Galdieria sulphuraria (aussi appelée Cyanidium caldarium (UTEX 2919). [0027] On citera aussi des producteurs connus de phycocyanines comme les cyanobactéries filamenteuses du genre Arthrospira, cultivées industriellement sous le nom commun de spiruline. [0028] Les microorganismes qui produisent de la phycocyaninc avec une teneur élevée en glycogènes sont plus particulièrement identifiés parmi les microorganismes cités précédemment, en particulier les espèces des genres Cyanidioschyzon, Cyanidium ou Galdicria, plus particulièrement Galdieria sulfuraria. [0029] Les procédés industriels de culture de microorganismes producteurs de phycocyanine sont bien connus de l'homme du métier. On citera en particulier les demandes de brevet WO 2017/093345, WO 2017/050917. [0030] La récupération de la phycocyanine à partir de la biomasse est également connue de l'homme du métier. On citera notamment la demande de brevet WO 2018/178334. Elle requiert généralement une étape de lyse cellulaire, mécanique ou enzymatique de manière à libérer la phycocyaninc produite dans les compartiments cellulaires des microorganismes. Cette lyse est avantageusement effectuée à un pH favorable à la solubilisation des phycocyanines. Cette lyse cellulaire va généralement générer une solution de phycocyaninc qui comprend des matières organiques en suspensions (appelée suspension brute) qui peuvent être séparées par des méthodes usuelles de filtration. On obtient alors une solution brute de phycocyanine qui peut faire l'objet d'une nouvelle purification de manière à éliminer des résidus organiques de faible poids moléculaire par des méthodes usuelles d'ultrafiltration pour obtenir une solution raffinée à partir de laquelle on obtiendra la phycocyaninc par des méthodes usuelles de précipitation et séchage. On citera notamment la filtration tangentielle sur membranes céramiques ou membranes organiques tel que les fibres creuses en polyéthersulfone. Les seuils de ces filtres peuvent être choisis pour séparer des molécules de poids moléculaire supérieur ou inférieur aux phycobiliprotéines ciblées. [0031] Le procédé selon l'invention est particulièrement adapté pour la purification de solution de phycocyanines résistantes à des pH acides, en particulier les phycocyanines décrites dans la demande WO 2017/050918. [0032] En particulier, le procédé selon l'invention est mis en oeuvre pour la purification de phycocyanines résistantes aux pH acides produites par Galdieria sulphuraria, plus particulièrement dans un procédé de production industrielle de ces phycocyanines par culture en fermenteur de Galdieria sulphuraria. [0033] Le procédé est avantageusement mis en oeuvre pour extraire la phycocyanine du jus brut obtenu à partir d'une biomasse de microorganismes producteurs de phycocyanine. [0034] Avantageusement, la solution initiale de phycocyanine, en particulier le jus brut, comprend de 0,1à 10 g/L de phycocyanine. [0035] La concentration consiste à éliminer l'eau de manière à obtenir une teneur en phy- cocyanine d'au moins 15 g/L, de préférence d'au moins 20 g/L, plus préférentiellement d'au moins 30 g/L, voire au moins 40 g/L. [0036] Cette concentration peut être définie en % de perte de volume en fonction de la teneur en phycocyanines dans la solution initiale. [0037] Dans un procédé industriel de production de phycocyanines, le jus brut comprendra avantageusement au moins 1 g/L de phycocyanines. Dans ce cas, la concentration consistera à éliminer au moins 93% de volume initial de liquide. [0038] La concentration se fait par toute méthode connue pour permettre l'élimination de l'eau dans des conditions qui préservent l'intégrité des phycocyanines. On peut citer les méthodes d'évaporation de l'eau, notamment sous pression réduite pour favoriser cette évaporation dans des conditions de température respectueuses de l'intégrité de phycocyanines, sans affecter leur pouvoir colorant. On peut également citer des méthodes qui permettent d'éliminer un liquide, comme la filtration tangentielle avec des tailles de pores qui permettent le passage de l'eau et des petites molécules en solution mais retiennent les protéines. [0039] Ces méthodes de filtration et les appareils qui permettent leur mise en oeuvre sont bien connues de l'homme du métier, notamment les systèmes « TFF Spectrum Lab » de Repligen. Pour les phycocyanines, on choisira avantageusement des filtres des pores de 50kD à 100kD, en particulier des filtres de polyéthersulfone ou de polysulfone. [0040] L'ajustement du pH consiste à ajouter un acide ou une hase à la solution initiale ou à la solution concentrée de manière à atteindre une valeur de pH dans la plage d'instabilité. La plage d'instabilité dépendra des phycocyanines à purifier, et notamment du microorganisme qui l'a produite. De manière générale, cette plage d'instabilité va de 4,5 à 5,5, en particulier pour des phycocyanines résistantes aux pH acides telles que décrites ci-dessus. [0041] Pour ces phycocyanines résistantes aux pH acides, la lyse cellulaire est faite à pH acide, de préférence inférieur à 4,5, généralement d'environ 4, voire jusqu'à 3. [0042] L'ajustement du pH consiste alors à ajouter une base pour atteindre le pH dans la plage d'instabilité. [0043] Selon un premier mode de réalisation de l'invention, le procédé consiste d'abord à concentrer le jus initial. Dans ce cas, la concentration est mise en oeuvre à un pH favorable à la solubilisation des phycocyanines, c'est à dire hors de la plage d'instabilité. Pour les phycocyanines résistantes aux pH acides décrite précédemment, ces pH favorables à la solubilisation des phycocyanines sera avantageusement inférieur à 4 ou supérieur à 5. [0044] Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, le procédé consiste d'abord à ajuster le pH à la plage d'instabilité puis à concentrer la solution jusqu'à la précipitation des phycocyanines. [0045] On peut alors décrire le procédé comme l'obtention d'une solution dite de pH instable à partir d'une solution initiale, puis de concentration de la solution de pH instable pour entrainer la précipitation des phycocyanines. Le pourcentage de réduction 6 de volume sera atteint dès lors que l'on observe la précipitation des phycocyanines. [0046] Cette étape de précipitation sélective est avantageusement mise en oeuvre à tem- pérature ambiante. Bien entendu, l'homme du métier pourra modifier la température de manière à favoriser la précipitation, par exemple en diminuant la température pour mettre en oeuvre la deuxième partie de l'étape (concentration ou ajustement du pH) au cours de laquelle la précipitation a lieu. [0047] Les polysaccharides en solution, en particulier le glycogène, pourront être ensuite récupérés par des méthodes usuelles de précipitation des polysaccharides, par exemple par ajout d'éthanol (Martinez-Garcia et al., 2016), ces polysaccharides pouvant également ensuite être purifiés. [0048] Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, les polysaccharides contenus dans la solution initiale avec les phycocyanines font l'objet d'une lyse enzymatique qui favorise leur maintien en solution. Les traces de ces polysaccharides susceptibles d'être entrainés avec la précipitation des phycocyanines, déjà faibles, sont encore plus réduites lorsque les polysaccharides sont lyses en polyosides de faibles poids moléculaires encore plus solubles. Au surplus, lorsque l'étape de concentration est réalisée par filtration tangentielle, les polyosides de faibles poids moléculaires sont éliminés avec les autres petites molécules en solution, ce qui favorise l'obtention de solution en phycocyanines à plus grande teneur encore. [0049] En particulier, la lyse enzymatique du glycogène est mise en oeuvre à un pH in- férieure ou égal à 5, de préférence d'environ 4,5, à température ambiante. [0050] Ces conditions de température et de pH sont particulièrement adaptées pour préserver la phycocyanine au cours de la réaction enzymatique. [0051] Les enzymes actives en conditions de pH acide et à température ambiante sont choisies parmi des enzymes connues pour une activité glucuronidase al-4 , glucosidase al-4 (ou alpha-glucosidase). On citera en particulier des pectinases connues pour dégrader la pectine et en particulier des pectinases extraites de champignons filamenteux comme Aspergillus, plus particulièrement de pectinases extraites d' Aspegillus aculeatus, comme les enzymes commercialisées sous la dénomination Pectinex® par la société Novozymes. [0052] La lyse enzymatique du glycogène pourra également être réalisée avec une glu- cosidase al-6 en plus de la glucuronidase a1-4 ou glucosidase a1-4. Des glucosidases al-6 actives dans les conditions de pH et de température exposées ci-dessus sont également connues de l'homme du métier. 11 s'agit en particulier des pullulanases connues pour hydrolyser les liaisons glucosidiques al-6 de la pullulane, notamment connues pour supprimer les ramifications de l'amidon. [0053] 11 s'agit généralement d'enzymes extraites de bactéries, notamment des genres Bacillus. US 6,074,854, US 5,817,498 et WO 2009/075682 décrivent de telles pul- 7 lulanases extraites de Bacillus deratnificans ou de Bacillus acidopullulyficus. On connaît aussi des pullulanascs disponibles dans le commerce, notamment sous les dénominations « Promozymc D2 » (Novozymes), « Novozym 26062 » (Novozymes) et « Optimax L 1000 » (DuPont-Genencor). [0054] On notera que des mélanges pullulanascs/alpha-amylases sont décrits dans l'état de la technique, mais en particulier pour produire du sirop de glucose à partir de l'amidon (US 2017/159090). [0055] L'homme du métier saura déterminer les conditions réactionnelles appropriés pour réduire au mieux les quantités de glycogène en fonction de la teneur initiale en glycogène dans la solution à traiter, la quantité d'enzymes employée et la pureté recherchée pour la phycocyanine produite. [0056] La récupération des phycocyanines précipitées solides se fait par toutes méthodes connues de l'homme du métier, comme la filtration ou la centrifugation. [0057] L'homme du métier pourra envisager toute méthode de récupération des solides de manière à diminuer le volume à traiter par filtration ou centrifugation. [0058] Cette récupération pourra se faire de manière discontinue, par lots, ou encore de manière continue, l'ajout de solution initiale venant compenser la récupération des phycocyanincs solides. [0059] Cette étape de récupération en continu sera avantageusement mise en oeuvre avec une concentration par filtration tangentielle sur une solution de pH instable, l'homme du métier pouvant ajuster les débits respectifs d'élimination d'eau et d'alimentation en solution de pH instable pour favoriser la précipitation des phycocyanines. [0060] Un tel procédé continu sera particulièrement adapté pour traiter des solutions initiales dans lesquelles les polysaccharides et en particulier le glycogène auront fait l'objet d'une lyse enzymatique qui favorise leur élimination par filtration tangentielle avec l'eau et les autres petites molécules solubles. [0061] L'invention concerne aussi un procédé de production de phycocyanines par fer- mentation de microorganismes, ledit procédé comprenant les étapes suivantes de (i) culture des microorganismes pour obtenir une biomasse riche en phycocyanine, (ii) récupération de la biomasse et lyse cellulaire pour solubiliser les phycocyanines libérées dans une suspension de particules cellulaires, (iii) clarification de la suspension préalablement obtenue pour obtenir une solution brute de phycocyanine et (iv) récupération de la phycocyanine à partir de la solution brute préalablement obtenue, caractérisé en ce que la récupération de la phycocyanine comprend une étape de précipitation sélective telle que définie précédemment. [0062] Le solide récupéré peut ensuite être séché par toute méthode appropriée, et le cas échéant broyé. [0063] Le solide récupéré comprenant la phycocyanine peut également faire l'objet d'une 8 purification par des méthodes connues de l'homme du métier, comme la diafiltration. [0064] Les méthodes de culture par fermentation, de récupération de la biomasse, de lyse et de clarification sont bien connues de l'homme du métier, notamment décrites dans les demandes de brevet WO 2017/050917, WO 2017/093345 et WO 2018/178334. [0065] La précipitation sélective mise en oeuvre selon l'invention permet de diminuer de manière globale l'énergie nécessaire à la production de phycocyaninc en poudre à partir d'une solution initiale, en particulier à partir d'un jus brut, tant sur la quantité de matière à manipuler que de l'énergie nécessaire au séchage de la phycocyanine solide et son broyage. [0066] La phycocyaninc obtenue par cc procédé a un indice de pureté d'au moins 2, de préférence d'au moins 3, voire supérieur à 4. [0067] Cet indice de pureté est mesuré par mesure d'ahsorhance avec la méthode décrite par Moon & al. (2014). [0068] De manière avantageuse, la phycocyanine obtenue est une phycocyanine qui a un rapport glycogène/phycocyanines (en poids sec) inférieur à 6, avantageusement inférieur à 4, de préférence inférieur à 3, plus préférentiellement inférieur à 2,5, encore plus préférentiellement inférieur à 1. [0069] L'invention concerne également l'utilisation des phycocyanines obtenues comme colorants, en particulier comme colorants alimentaires. Elle concerne aussi des aliments, solides ou liquides, en particulier des boissons qui comprennent une phycocyanine à faible teneur en glycogène selon l'invention. [0070] EXEMPLES [0071] Matériel et méthodes [0072] Souche : Galdieria sulphuraria (aussi appelée Cyanidim caldarium) UTEX#2919. [0073] Conditions de culture [0074] La biomasse est obtenue par fermentation en mode Fedbatch en utilisant les conditions décrites dans la demande de brevet WO 2017/050918. [0075] Conditions d'extraction [0076] Les cellules sont broyées mécaniquement, à l'aide d'un broyeur à billes de type DYN0e-MILL KD (Willy A. Bachofen AG Maschinenfabrik). La phycocyanine (PC) étant une molécule hydrophile, son extraction se fait à l'eau en ajustant le pH à la valeur souhaitée avec une base (NaOH, KOH, NH4OH...) ou un acide (H,SO4, acide citrique....). L'extrait brut de PC est récupéré après séparation des débris cellulaires par centrifugation à 10000g pendant 10 min à température ambiante. L'extrait brut est concentré par filtration tangentielle avec membrane céramique ou membrane organique avec un seuil de coupure permettant de retenir la phycocyanine. Les échantillons sont par la suite centrifugés afin de séparer le précipité du surnageant. La masse du culot est mesurée grâce à une balance de précision. Le culot est re-suspendu 9 dans une solution aqueuse de pH 7 permettant sa resoluhilisation, ceci afin de pouvoir quantifier la phycocyanine précipitée. [0077] Dosage de la PC [0078] L'estimation de la teneur en phycocyanine et de l'indice de pureté ont été réalisés par mesure d'absorbante grâce à la méthode décrite par Moon & al (Moon et al., Korcan J. Chcm. Eng., 2014, 1-6). [0079] Exemple 1 : Effet de la concentration et du pH sur la précipitation et la purification de la phycocyanine (PC) [0080] Une solution brute de phycocyanine de concentration initiale de 1 g/l de PC et de pureté initiale de 1,6 est concentrée par filtration tangentielle à pH 4 jusqu'à obtenir un rétentat d'une concentration de 20 g/1, puis 30 g/l puis 45 g/I. Au cours de la filtration une augmentation de la pureté du produit peut être observée, toutefois cette pureté ne dépasse pas la valeur de 2 malgré le degré de concentration du produit. Dans la figure 1 nous pouvons voir que pour une concentration de 20 g/1, la précipitation de la phycocyanine est faible à pH 4 et augmente légèrement en faisant évoluer le pH vers des valeurs plus élevées (Fig. 1). Parallèlement la mesure de la concentration en phycocyanine soluble dans le surnageant lors de cette remontée du pH montre une diminution relativement faible. Pour une concentration de PC à 30 g/l ce phénomène de précipitation par changement de pH est beaucoup plus marqué et parait être maximale pour les valeurs de 4,5 et 5,5 (Fig. 1 et Fig. 2). Sur la poursuite de la filtration et la concentration de la phycocyanine jusqu'à la valeur de 40g/L soluble, la formation d'un précipité important est observée durant la filtration avant même modification du pH (Fig. 1). Comme précédemment le changement de pH accroît le phénomène de précipitation de la phycocyanine. [0081] Plus on observe de précipitation par filtration tangentielle plus la mesure de pureté de phycocyanine dans le rétentat diminue et inversement concernant la pureté du précipité collecté et resolubilisé à pH7. On observe bien une précipitation préférentielle de la phycocyanine, qui peut être resolubilisable dans des conditions de pH plus favorable. [0082] Le Tableau 1 rapporte la mesure de la pureté de la phycocyanine après re- solubilisation du précipité de phycocyanine pour une précipitation à pH de 7,5. [0083] [Tableauxl] Concentration PC dans l'échantillon Pureté PC du surnageant Pureté PC du culot resuspendu à pH 7,5 20 g/L 1,96 2,18 30 g/L 1 2,27 45 g/L 0,31 2,88 100841 Exemple 2: Effet de la concentration et du pH sur la précipitation et la purification de la PC sur un échantillon digéré enzymatiquement. [0085] Dans cet exemple, la solution brute est soumise à une digestion enzymatique afin de dégrader le glycogène présent. La dégradation enzymatique est faite à température ambiante et pH = 4 avec les enzymes glucoronidase alpha 1-4 (« pectinex Ultra SPL ») et glucosidasc alpha 1-6 (« Novozyme 26062 »). [0086] Un enrichissement par filtration tangentielle est réalisé pour atteindre une concentration en phycocyanine de plusieurs dizaines de g/L puis un ajustement pH est réalisé, provoquant une précipitation. Des prélèvements de pH aux valeurs de 4.5 ; 5 et 5.5 sont réalisés avec une mesure de la phycocyanine soluble résiduelle et une mesure de la phycocyanine précipitée après collecte et resoluhilisation du culot avec une solution tampon à pH 7.5. [0087] De façon similaire à l'exemple précédent, la précipitation est importante pour une gamme de pH comprise entre 4,5 et 5,5, et le niveau de pureté atteint dans cc cas des valeurs supérieures à 3,8 lors de la resoluhilisation de la phycocyanine précipitée. La digestion enzymatique du glycogène n'affecte pas la purification par précipitation. Le Tableau 2 ci-après donne les valeurs d'indice de pureté de la phycocyanine après précipitation par ajustement aux pH d'instabilité mais aussi après re-solubilisation du précipité de phycocyanine. [0088] [Tahleaux2] Echantillon [PC] (g.L -' Pureté ) Surnageant pH 4,5 5,90 1,08 Surnageant pH 5 7,19 1,25 Surnageant pH 5,5 10,79 1,51 Culot pH 4,5 22,26 3,82 Culot pH 5 19,82 3,90 Culot pH 5,5 16,55 3,87 Liste des documents cités 100891 Cruz de lests et al., Int J Food Nutr Sci (2016) 3(3): 1-0 100901 Martinet-Garcia et al., Int .1 Biol Macromol. (2016) 89:12-8 100911 Martinet-Garcia et al., Carbohydrate Polymers (2017) 169: 75-82 100921 Moon et al., 2014 Korean J. Chem. Eng., 2014, 1-6 100931 TN 2009000406, US 6,074,854, US 5,817,498, US 2017/159090, WO 2009/075682, WO 2016/030643, WO 2017/050917, WO 2017/050918, WO 2017/093345, WO 11 2018/178334 12 [Revendication 1] [Revendication 2] [Revendication 3] [Revendication 4] [Revendication 5] [Revendication 6] [Revendication 7] [Revendication 8] [Revendication 9] [Revendication 10]