Brevet FR3093944A1 — publié le 20200925

Description Titre de l'invention : CARTOUCHE POUR BIOIMPRESSION Domaine de l'invention [0001] La présente invention concerne le domaine de l'impression additive tridimen- sionnelle, notamment assistée par laser et plus particulièrement, niais non limitativement, la bioimpression, technique d'organisation spatiale de cellules vivantes et d'autres produits biologiques en les assemblant et en utilisant une méthode de dépôt couche par couche assistée par ordinateur pour développer des tissus vivants et des organes pour l'ingénierie tissulaire, la médecine régénérative, la pharmacocinétique et plus généralement la recherche en biologie. L'impression additive tridimensionnelle assistée par laser consiste à transférer des éléments vers une cible ou « récepteur », à partir d'une lame supportant une encre contenant les éléments transférables par un jet produit par exemple par la vaporisation locale d'un substrat par une impulsion laser, apportant une énergie cinétique transférée directement à l'encre qui entraîne localement dans sa course une partie du liquide, une particule transférable ou un agrégat de particules contenues dans l'encre. [0002] Les particules transférables ou inhomogénéités contenues dans l'encre peuvent être de différentes natures. On entend par « inhomogénéité » au sens de la présente invention une zone d'intérêt de l'encre ou plus communément appelée bio-encre de composition organique, minérale ou vivante, en particulier : [0003] - des particules nanoscopiques telles que des exosomes ou autres vésicules produites par les cellules ou des nanoparticules de biomatériaux (hydroxyapatite) ou encore des nano-capsules de biomolécules (facteurs de croissance), [0004] - des particules microscopiques telles que des cellules vivantes (cellules eucaryotes, cellules souches, globules,...), des micro-particules de biomatériaux, des micro-capsules de biomolécules (facteurs de croissance), [0005] - des particules mésoscopiques telles que des sphéroïdes constitués par des amas de cellules, des microcarriers dont la surface est revêtue de cellules et/ou de biomatériaux. [0006] - des amas de particules dont la cohésivité est assurée au sein d'une capsule ou par un liquide ou gel visqueux. [0007] De préférence, dans le contexte de la bio-impression, on entend par particules, des objets ayant des propriétés biologiques, comme par exemple, des cellules vivantes, des exosomes ou encore des biomolécules (par exemple des macromolécules, des protéines, des peptides). [0008] Mais toutefois, cet équipement et le procédé correspondant ne s'arrêtent pas à cette définition selon l'invention. En effet, les particules peuvent également être non bio- logiques (c'est à dire inertes) et constituées par exemple d'un ou plusieurs bio- 2 matériaux, leur nature dépendant de l'application visée. [0009] L'ingénierie tissulaire vise à concevoir et développer des solutions de substitution biologiquement aptes à remplacer, restaurer ou maintenir les fonctions d'un tissu natif (épiderme, cornée, cartilage, épicarde, endocarde, ...), voire d'un organe. Un exemple est décrit dans l'article Griffith, L. G., & Naughton, G. (2002). Tissue engineering-- current challenges and expanding opportunitics. Science, 295(5557), 1009-1014. [0010] Pour pallier ces inconvénients, l'impression d'éléments biologiques, plus com- munément appelée bio-impression, a commencé à être imaginée, comme exposé dans les articles de : [0011] Klebe, R. (1988). Cytoscribing : A Mcthod for Micropositioning Cells and the Construction of Two- and Threc-Dimensional Synthctic Tissues. Expérimental Cell Research, 179 (2): 362-373. [0012] Et Klebe, R., Thomas, C, Grant, G., Grant, A. et Gosh, P. (1994). Cytoscription : Computer controlled rnicropositioning of cet] adhésion proteins and cells. Methods in Cell Science, 16(3): 189-192. [0013] L'invention concerne plus particulièrement la technique d'impression dite «LIFT - Laser-Induced Forward Transfer », autrement appelée LAB (Laser Assisted Bioprinting ou BioLP (Bic) laser printing)), avec un faisceau laser dirigé vers le haut, le récepteur étant situé au-dessus du support de l'encre. [0014] Le support sur lequel repose l'encre peut être revêtu d'une couche absorbante sacri- ficielle, par exemple une couche d'or pour aider au processus de génération de jet en augmentant l'absorption de l'énergie laser. Dans ce cas, l'impulsion laser est absorbée à l'interface du donneur. [0015] Alternativement, l'impression par laser peut être réalisée avec un support d'encre dépourvu de couche absorbante. Dans ce cas, les caractéristiques du laser et des moyens de focalisation associés doivent être optimisés pour pouvoir générer le jet, comme par exemple outrepasser le seuil d'ablation du liquide (l'encre) faiblement absorbant à la radiation laser afin de générer le plasma nécessaire à la création du jet d'impression ou encore générer la bulle de cavitation directement par onde de choc ou par effet thermique. [0016] L'encre est généralement déposée sur le support par un opérateur utilisant une micro- pipette pour former sur ledit support un film d'encre, ou par la circulation sur une lame d'une encre entre un canal d'entrée et un canal de sortie. État de la technique [0017] Le principe général d'impression d'une encre biologique par un laser impulsionnel dirigé vers le haut est décrit dans le brevet français FR3030361. [0018] La demande de brevet internationale W02018167402 de la demanderesse décrit un 3 équipement et un procédé d'impression additive comportant un moyen d'excitation énergétique orientable pour produire une interaction ponctuelle avec un fluide recouvrant une lame, afin de provoquer un jet orienté en direction d'une cible. Le fluide est constitué par un vecteur liquide contenant des inhomogénéités et forme un film liquide d'une épaisseur inférieure à 500 iirn, sur une lame présentant au moins une zone permettant l'interaction avec le laser dans laquelle débouche au moins une entrée. Cette zone d'interaction débouche dans au moins une sortie. L'équipement comporte des moyens de circulation du fluide cntrc ladite entrée et ladite sortie. [0019] On connaît aussi dans l'état de la technique le brevet W02016097619 décrivant un procédé d'impression d'au moins une encre, ledit procédé comprenant une étape de focalisation d'un faisceau laser de manière à générer une cavité dans un film d'encre, une étape de formation d'au moins une gouttelette d'encre à partir d'une surface libre du film d'encre et une étape de dépôt de ladite gouttelette sur une surface de dépose d'un substrat receveur positionnée à une distance donnée (L) du film, caractérisé en ce que le faisceau laser est orienté à contresens par rapport à la force gravitationnelle (G), la surface libre du film étant orientée vers le haut en direction de la surface de dépose placée au-dessus du film d'encre. [0020] La demande de brevet W02014061024A1 décrit un système pour effectuer un transfert vers l'avant induit par laser (LIFT) sans substrat et/ou à donneur local, lequel système comprend un réservoir comprenant au moins une ouverture ; et une source d'énergie configurée de façon à délivrer de l'énergie à un matériau donneur à l'intérieur dudit réservoir. Dans des modes de réalisation préférés de l'invention, la source d'énergie est un laser pulsé. Ce système permet la déposition de matériau par transfert vers l'avant induit par laser sans aucun besoin d'un substrat donneur. L'invention porte également sur des procédés de transfert vers l'avant induit par laser sans substrat et à donneur local. [0021] La demande de brevet internationale W02018193446A1 décrit également des procédés et systèmes de transfert direct induit par laser dans lesquels une puce micro-fluidique est utilisée comme tête d'impression. La tête comprend une région supérieure transparente, une région centrale comprenant un canal de couche intermédiaire et un canal d'encre en communication fluidique avec ledit canal de couche intermédiaire et une couche inférieure ayant un orifice en contact fluidique avec le canal d'encre. Lorsque le matériau dans le canal de couche intermédiaire est exposé à une source d'énergie (habituellement un laser pulsé) au niveau d'un point opposé à l'orifice, le matériau s'évapore partiellement, créant une bulle de cavitation qui crée une augmentation de pression transitoire lorsqu'elle éclate, forçant ainsi l'encre à sortir de l'orifice vers un substrat de réception. Inconvénients de l'art antérieur 100221 Dans les solutions de fart antérieur, la lame revêtue par un fluide contenant les particules à transférer, nécessite le remplacement de la lame après chaque séquence (évaporation du film par phénomènes de séchage, évolution des particules vivantes comme l'agrégation cellulaire, modification du film après les multiples tirs lasers, caractère sacrificiel de la couche métallique lorsqu'il y en a une...), ce qui ne permet pas une bonne maîtrise des caractéristiques du film contenant les éléments transférables, notamment le volume du fluide, l'homogénéité de l'épaisseur et son évolution dans le temps,... Ainsi, l'inconvénient principal des solutions de l'art antérieur concerne à la fois un manque dc reproductibilité des impressions et la nécessité d'un recours fréquent à des manipulations, réduisant la productivité. [0023] Dans les solutions prévoyant une cuve ou un réservoir contenant un fluide, les problèmes qui se posent concernent la maîtrise de la génération du jet à l'interface air-liquide, car les matériaux à transférer ont tendance à sédimenter. Ces solutions ne permettent pas de ce fait de transférer dans des conditions reproductibles les particules contenues dans un fluide. TI s'agit d'un inconvénient générique connu également pour les solutions de bio extrusion ou de jet d'encre. [0024] La solution consistant à faire circuler une encre, par exemple une bioencre chargée en particules dans une cartouche comportant un canal d'entrée et un canal de sortie présente l'inconvénient d'un étalement imparfait de l'encre sur la surface de tir (surface d'interaction avec le laser impulsionnel) et d'une répartition inhomogène des éléments transférables sur la surface de tir. Par ailleurs, pour des ouvertures importantes de la zone où seront focalisés les tirs laser, les encres sèchent rapidement, ce qui nécessite le retrait de la cartouche pour assurer son nettoyage. [0025] Enfin, le passage d'un type d'encre à un autre type d'encre, pour des impressions de tissus comprenant par exemple différents types cellulaires, nécessite un cycle de nettoyage long et impose des volumes morts importants clans les canaux d'apport en encre. Solution apportée par l'invention [0026] Afin de remédier à ces inconvénients, l'invention concerne selon son acception la plus générale un procédé d'impression mettant en oeuvre un équipement comportant un moyen d'excitation énergétique orientable pour produire une interaction ponctuelle avec au moins une encre pouvant être homogène ou pouvant contenir des particules, notamment un fluide chargé, déposé sur un support d'impression présentant une fenêtre d'interaction, afin de provoquer le transfert d'une partie ciblée de ladite ou lesdites encres vers un récepteur disposé au-dessus dudit support, caractérisé en ce qu'il comporte une étape de génération d'un film de mouillage recouvrant au moins partiellement ladite fenêtre d'interaction, suivie d'une étape de dépôt d'une encre sur la surface dudit film de fluide de mouillage et d'étapes de transfert par l'application d'excitation énergétique. [0027] On entendra par encre au sens du présent brevet un fluide homogène ou un fluide contenant des particules ou des inhomogénéités ou une bio-encre transférable sous l'effet d'une impulsion laser. [0028] Généralement, le procédé comporte des étapes de transfert par l'application de tirs laser impulsionnels et une étape postérieure de régénération d'un film de mouillage (par retrait ou réorganisation dudit fluide) recouvrant ladite fenêtre d'interaction. Les tirs laser sont de préférence dirigés vers le haut. [0029] On entend par « inhomogénéité » de l'encre au sens de la présente invention toute zone d'intérêt de l'encre de composition organique, minérale ou vivante, en particulier [0030] - des particules nanoscopiqucs telles que des exosomcs ou autres vésicules produites par les cellules ou des nanoparticules de biomatériaux (hydroxyapatitc) ou encore des nano-capsules de biomolécules (facteurs de croissance), [0031] - des particules microscopiques telles que des cellules vivantes (cellules eucaryotes, cellules souches, globules,...), des micro-particules de biomatériaux, des micro-capsules de biomolécules (facteurs de croissance), [0032] - des particules mésoscopiques telles que des sphéroïdes constitués par des amas de cellules, des microcarricrs (potentiellement biodégradables) dont la surface est revêtue de cellules ou de biomatériaux. [0033] - des amas de particules dont la cohésivité est assuré au sein d'une capsule ou par un liquide ou gel visqueux [0034] De préférence, dans le contexte de la bio-impression, on entend par particules, des objets ayant des propriétés biologiques, comme par exemple, des cellules vivantes, des exosomes ou encore des biomolécules (macromolécules, protéines, peptides, facteur de croissance, ARN messager, microARN, ADN... [0035] Les particules peuvent également être non biologiques (c'est à dire inertes) et constituées par exemple d'un ou plusieurs biomatériaux, leur nature dépendant de l'application visée. [0036] Avantageusement, ladite étape de formation d'un film de fluide de mouillage est réalisée par l'injection dudit liquide de mouillage à la périphérie d'un espace cylindrique dont le fond est constitué par ladite fenêtre d'interaction. [0037] Selon des variantes particulières de mise en oeuvre de l'invention: ledit film de liquide de mouillage ne vient que partiellement en contact avec le bord périphérique dudit espace cylindrique pendant l'étape de transfert par applications successives d'excitation énergétique orientable. le film de mouillage peut être modifié par une étape de traitement intermédiaire comprenant la photo-polymérisation, le changement de température ou la gélification, afin de conférer audit fluide des propriétés spécifiques autres que de mouillabilité, par exemple pour faire office de couche sacrificielle ou encore pour faire du photopatterning du film pour texturcr la lame et faire des rnicropuits afin de contrôler la distribution spatiale des particules dans le film de bioencre. Cette étape peut être réalisée avant ou pendant l'interaction avec les moyens énergétiques d'impression de l'encre. ladite étape de retrait du fluide est effectuée par aspiration depuis la périphérie dudit espace cylindrique. ladite étape de retrait du fluide est effectuée par aspiration depuis le haut via un aspirateur externe. la section dudit film de fluide de mouillage est supérieure à la longueur capillaire dudit fluide de mouillage. une étape postérieure de retrait du fluide recouvrant ladite fenêtre d'interaction a lieu après les étapes d'impression. ladite étape de formation d'un film de fluide de mouillage est réalisée par l'alimentation de la surface d'interaction par au moins un canal recevant un volume de fluide de mouillage sous pression. ladite étape de formation d'un film de fluide de mouillage est réalisée par enduction, par électromouillage ou par centrifugation. ladite étape de formation d'un film de fluide de mouillage est réalisée par un flux d'air permettant l'étalement sans contact. ladite étape de retrait d'un film de liquide est réalisée par la mise en relation de la surface d'interaction par au moins un canal relié à une source de pression inférieure à la pression atmosphérique. ladite étape de retrait d'un film de liquide est réalisée par la mise en relation de la surface d'interaction par au moins un canal relié à une source travaillant en débit via un pousse seringue et/ou une pompe péristaltique ou encore via des systèmes MEMS pour la microfluidique. ladite étape de retrait d'un film de liquide est réalisé par la mise en surpression de l'ouverture cylindrique par rapport a la pression atmosphérique. ladite étape de dépôt d'une encre est réalisée depuis la surface supérieure dudit film de fluide de mouillage. ladite étape de dépôt d'une encre est réalisée depuis la partie basse de l'équipement à travers un orifice débouchant sur la zone cylindrique centrale d'interaction. Le procédé comporte des étapes de mesure de l'évolution d'au moins une grandeur physique comprenant la température, le pH, la viscosité ou la position et orientation d'un assemblage. 7 Ledit assemblage est positionné avec une orientation spécifique par rapport à l'axe de propagation du faisceau laser par un système de servomoteurs et boucles de rétroaction. L'assemblage est relié directement à une plateforme. Cette liaison permet d'établir les connexions fluidiques de façon rapide sans avoir à les intégrer sur ledit support d'impression. l'encre biologique de nature inhomogène est stockée dans un tube dont les dimensions du diamètre intérieur sont préférentiellement entre 100 et 300 prn mais peuvent aller de 30 prn a 1 mm. L'invention concerne aussi un support d'impression d'une encre en interaction avec un moyen d'excitation énergétique orientable pour produire une interaction ponctuelle, pour la mise en oeuvre des procédés susvisés, ledit support présentant une fenêtre d'interaction entourée par une bordure pour former un espace cylindrique caractérisé en ce qu'il présente une pluralité de canaux débouchant dans ladite bordure de l'espace cylindrique pour l'injection d'un fluide de mouillage de ladite fenêtre d'interaction, et un ou plusieurs canaux d'aspiration débouchant dans ladite bordure de l'espace cylindrique. Avantageusement, ledit canal d'aspiration débouche dans ladite bordure de l'espace cylindrique par l'intermédiaire d'une zone évasée. [0038] Selon des variantes, Plusieurs liquides techniques sont utilisés, en particulier un type de liquide technique favorable au mouillage initialement, ledit liquide pouvant avoir d'autres propriétés utiles au procédé d'impression (température, gélification, absorption, etc.), et un liquide technique favorable au nettoyage après l'interaction avec la source énergétique. l'encre est acheminée sur l'espace d'interaction central à travers les canaux latéraux le film de mouillage est formé par un procédé comprenant la condensation de vapeur, le mouillage capillaire et l'électro-mouillage. [0039] Description détaillée de mises en oeuvre de différents équipements selon l'invention [0040] La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui suit, se référant aux figures annexées illustrant des exemples non limitatifs de réalisation, où: [Fig. 1] La figure 1 représente une vue éclatée d'un support selon l'invention [Fig. 2] La figure 2 représente une vue schématique du circuit fluidique [Fig. 3] La figure 3 représente une vue de dessus de la zone de transfert Support de transfert 8 [0041] La figure 1 représente une vue éclatée d'un exemple de réalisation d'un support de transfert. Il est constitué par un assemblage de trois lames découpées (10, 20, 30) accolées pour former un bloc présentant une zone d'interaction avec le faisceau laser ainsi que des canaux d'alimentation avec un fluide de mouillage et d'aspiration pour le retrait du liquide présent sur la zone d'interaction. [0042] Ces lames (10, 20, 30) sont typiquement en verre ou silicium et/ou en polymère (stérilisable ou non stérilisable), par exemple du COC, PMMÀ, PolyEtherEtherKetone PEEK. Alternativement, la lame inférieure (30) est constituée d'un matériau transparent à 1030 nm (longueur d'onde du laser utilisé), les autres lames (10,20) pouvant être transparentes ou opaques. [0043] La lame supérieure (10) est une pièce rectangulaire présentant une épaisseur comprise par exemple entre 100 micromètres et plusieurs millimètres. Elle présente une découpe (11) ronde correspondant à une découpe (21) prévue au même emplacement que la découpe sur la lame intermédiaire (20). Cette lame intermédiaire (20) présente également une épaisseur comprise entre 100 micromètres et plusieurs millimètres. L'ouverture (11) de la lame (10) peut présenter une géométrie différente de celle de l'ouverture (20). En particulier, elle peut être circulaire et présenter un rayon plus grand ou plus petit. [0044] Elle présente en sus de la découpe ronde (21) trois découpes (22, 23, 24) s'étendant radialemcnt par rapport à la découpe ronde (21) et aboutissant à l'extrémité opposée des renflements circulaires respectivement (25. 26. 27). Ces découpes renflées forment des canaux dont l'un est orienté selon Faxe longitudinal de la lame (20), est les autres sont disposés de part et d'autre du canal médian, l'axe des découpes (22, 24) des canaux extérieurs formant avec l'axe de la découpe (23) du canal médian un angle d'environ 45°, pour définir dans la paroi cylindrique de la découpe (21) un arc d'alimentation d'environ 90°. Ces valeurs sont relatives à l'exemple illustré en figure 1, d'autres configurations (nombre de canaux, positionnement des canaux, épaisseur des lames, etc.) sont envisageables pour répondre au besoin. [0045] La section des découpes (11) et (21) est déterminée en fonction de la longueur ca- pillaire du fluide de mouillage. Elle est légèrement supérieure à la longueur capillaire L du fluide de mouillage, pour limiter les effets capillaires et ainsi faciliter un étalement optimal du fluide de mouillage. La limite supérieure est déterminée par la surface balayée par le laser impulsionnel orientable. [0046] La longueur capillaire L est déterminée comme suit : [0047] [MATH]] L = M1.7.g [0048] : TS désigne la tension superficielle du fluide de mouillage 9 MV désigne la masse volumique du fluide de mouillage g désigne l'accélération gravitationnelle valant 9,806 m.s 2 [0049] Dans le cas d'un liquide de mouillage constitué par de Peau pure à 20', cette longueur capillaire L est égale à 2,7 millimètres pour une tension superficielle de 70.10 N.m-I. [0050] Du côté opposé aux découpes (22 à 24), la lame (20) présente une autre découpe (28) prolongée par un renflement (29), orienté radialement selon l'axe longitudinal de la lame (20). Cette découpe (28) est raccordée au bord de la découpe ronde (21) par une zone évasée (8) pour former un entonnoir facilitant l'aspiration du liquide déposé dans l'espace cylindrique défini par la découpe (21). Là encore, l'exemple illustré ici n'est qu'un exemple de réalisation, d'autres configurations (nombre de canaux de sortie, positionnement des canaux de sortie, géométrie,...) sont envisageables pour répondre au besoin. [0051] La lame inférieure (30) ne présente pas de découpe centrale et forme le fond de l'espace cylindrique défini par les découpes (11, 21). Elle est par exemple réalisée en un matériau transparent dans la longueur d'onde du faisceau laser impulsionnel. [0052] Elle présente trois trous (35, 36, 37) positionnés conformément aux renflements res- pectivement (25, 26, 27) de la lame intermédiaire (20) pour former des canaux verticaux d'alimentation des découpes respectivement (22, 23, 24). [0053] Un quatrième trou (39) est positionné conformément au renflement (29) de la lame intermédiaire (20), pour définir un canal vertical d'aspiration débouchant dans le conduit formé par la découpe (28). [0054] Les lames sont associées par collage par exemple (le matériau des lames (20) pouvant agir lui-même comme polymère thermo-activable ou thermo-collable), les découpes (22, 23, 24, 28 et 8) de la lame intermédiaire (20) étant fermées à leurs surfaces supérieures et inférieures par les lames respectivement supérieure (10) et inférieure (30) pour former des canaux débouchant dans la paroi annulaire entourant la découpe ronde (21) de la lame intermédiaire (20). [0055] Cet ensemble est complété par un bloc d'alimentation (40) et un bloc d'aspiration (50). [0056] Le bloc d'alimentation (40) présente un canal transversal (41) dans lequel débouche des canaux perpendiculaires (45, 46, 47) positionnés pour déboucher dans les trous (35, 36, 37) de la lame inférieure (30). [0057] Le bloc d'aspiration (50) présente un canal vertical (59) dont la position est dé- terminée pour déboucher dans le renflement (39) de la plaque inférieure (30). L'autre extrémité de ce canal (59) débouche dans deux canaux (51, 52) perpendiculaires, l'un servant à l'aspiration du liquide contenu dans l'espace cylindrique défini par la découpe (21) de la lame intermédiaire (20), l'autre servant à l'injection optionnelle d'un liquide de nettoyage. Le bloc d'aspiration (50) pourrait donc aussi jouer le rôle de bloc d'alimentation (40) pour certaines configurations. Autour de l'extrémité du canal (59) il existe un renfoncement permettant d'accueillir un éventuel trop plein de colle. Système d'alimentation 100581 Le système fluidique illustré figure 2 est constitué par un sous-ensemble d'alimentation (100) et un sous-ensemble d'aspiration (200). Différentes solutions sont envisageables, notamment une solution péristaltique. [0059] Le système d'alimentation (100) en fluide mouillant comporte un flacon (110), ty- piquement un flacon en polystyrène stérile relié à une pompe (120) alimentée par un réservoir (130) de fluide mouillant, par exemple de l'eau stérile ou une solution tampon biologique telle que le PBS ou l'HEPES permettant d'éviter le choc osmotique pour les cellules. [0060] Une première électrovanne (140) normalement fermée commande l'alimentation du flacon (110) par la pompe. [0061] Une deuxième électrovanne (150) normalement ouverte est placée entre une prise d'air (151) et un connecteur (152) ouvert sur le volume intérieur du flacon (110). [0062] Au repos, l'électrovanne (140) est fermée et l'électrovanne (150) ouverte, ainsi le volume du flacon est soumis à la pression atmosphérique. [0063] Lorsqu'on veut transférer du fluide depuis le flacon (1 10) sur la zone d'interaction (15), on commande l'ouverture de la première électrovanne (140) pour appliquer dans le flacon (110) une pression supérieure à la pression atmosphérique et on commande l'alimentation en fermant dc manière contrôlée la deuxième électrovanne (150), pour former à la surface de la zone d'interaction (15) un film (16) de mouillage. [0064] Le circuit d'aspiration (200) comprend un deuxième flacon (210) relié à la sortie du support. Ce deuxième flacon (210) peut être mis en dépression par une pompe (220) ou un réservoir de vide. Une électrovanne (240) normalement ouverte débouchant sur un évent (241) assure la mise à pression atmosphérique du flacon (210) au repos. Lorsqu'il est nécessaire d'aspirer le liquide (16) déposé sur la zone d'interaction (15), on commande la fermeture de l'électrovanne (240) et on récupère le liquide aspiré dans le flacon (210). [0065] Comme illustré en figure 3, le liquide de mouillage forme d'abord un film reliant (23) et (28) puis ensuite il est modifié (diminué) en aspirant du liquide sur la zone d'interaction en laissant un espace semi-annulaire (255) entre le bord de l'espace cylindrique défini par les découpes (11, 21) et le bord du film (250) appelé film de pré-mouillage. De ce fait, le ménisque (250) déposé sur la zone d'interaction peut ne pas communiquer avec le fluide contenu dans les canaux d'alimentations (22 à 24) ce qui évite les retours de liquide vers le circuit d'alimentation. Une version avec une communication entre (250) et (22 à 24) est aussi envisageable, surtout avec un système de 11 poussée et d'aspiration avec pompes péristaltiques. [0066] L'écoulement du fluide de mouillage présente un nombre de Reynolds relativement élevé, supérieur à 2000 sur certaines zones. Ce paramètre permet de décrire l'évolution de la couche limite pour créer un écoulement turbulent sur la zone d'interaction. [0067] Le film de pré-mouillage (250) résiduel (après aspiration) est d'une épaisseur plus faible, que l'épaisseur du film d'encre qui sera déposé par-dessus. Par ailleurs, la nature du liquide de pré-mouillage doit assurer une totale innocuité vis à vis des cellules de la bio-encre, c'est pourquoi il est constitué d'éléments bio-compatibles et / ou stériles. Le liquide de pré-mouillage peut être structuré avant ou après le dépôt de l'encre, par exemple à l'aide d'un flash lumineux qui génère par photopolytnérisation une structure en nid d'abeille permettant de créer des micropuits définis sur la cartouche. [0068] La génération de la surface mouillante pourrait être également obtenue par des procédés de greffage biochimique, de dépôt de couches minces ou de traitement des matériaux sans recours à un fluide de pré-mouillage. [0069] Lorsque le film de pré-mouillage (250) est formé, on dépose une goutte (310) d'encre biologique sur la surface du fluide (250) à l'aide d'une pipette (300) ou un système avec pousse seringue par exemple. [0070] L'encre biologique se répand sur la surface mouillante obtenue par l'intermédiaire du fluide de mouillage (250). [0071] On peut alors procéder aux tirs d'impulsions laser. [0072] Après la séquence de tirs, on aspire le liquide avec le circuit d'aspiration et/ou on le pousse par le circuit de poussée, et on peut injecter un liquide de nettoyage avant le démarrage d'une nouvelle séquence. 12