Brevet FR3094013A1 — publié le 20200925

Description Titre de l'invention : NOUVELLES SOUCHES DE BACTERIES LACTIQUES FAVORISANT L'ABSORPTION DU CALCIUM - PEPTIDES ET PRODUITS ASSOCIES pool j La présente invention concerne de nouvelles souches dc bactéries lactiques ainsi que des peptides isolés et des mélanges de peptides issus dc la [3-caséine et produits par ces souches. Ces peptides sont actifs, soit en tant qu'inhibiteurs de l'ACE, soit comme agent favorisant l'absorption du calcium. [0002] La présente concerne également une composition alimentaire ou pharmaceutique ainsi que des produits associés. [0003] Le document WO 2007/096498 Al décrit une nouvelle souche de bactérie lactique, plus précisément de Lactobacillus helveticus capable de produire par fermentation du lait deux tripeptides ayant des propriétés d'inhibition de l'enzyme de conversion de l'angiotensine (ACE). Ces deux peptides de séquences IPP et VPP sont connus pour inhiber l'ACE et permettent donc de réduire la pression sanguine et de lutter ainsi contre l'hypertension et les pathologies qui en découlent. [0004] D'autre part, la publication intitulée « Bioactive peptide : production and func- tionality » de H. Korhonen et al et publiée dans International Dairy Journal vol 16, page 945 à 960 en 2006 passe en revue les peptides obtenus par hydrolyse des protéines laitières par des bactéries lactiques, et possédant une activité biologique ; cette publication décrit plusieurs peptides différents des peptides IPP et VPP, mais également connus en tant qu'inhibiteurs de l'ACE. [0005] Par ailleurs, il est connu qu'outre son rôle dans la régulation de la pression sanguine, l'ACE est également impliquée dans les mécanismes de résorption/formation osseuse. En effet, l'article intitulé « Inhibition of angiotensin-converting enzyme exerts beneficial effects on trabecular bone in orchidectimozed mice » de X-F Chen, publié dans la revue Pharmacological reports 70, page 705-711 en 2018, indique qu'un inhibiteur de l'ACE, à savoir le captopril présente une activité de préservation osseuse. [0006] S'agissant de l'absorption du calcium, la publication précitée de H. Korhonen cite des caseino-phospho-peptides connus pour améliorer l'absorption du calcium et du zinc. Elle cite notamment le produit de marque CapolacC) qui contient un caseinophospho-peptide (CPP) connu pour améliorer l'absorption des minéraux S'agissant du mécanisme d'action, il semble que ces phospho-peptides sont connus pour se lier au calcium, le rendant ainsi biodisponible. [0007] Le document JP H0641191A décrit une souche de Lacwbacillus helveticus qui produit des peptides, lesquels augmentent la solubilité du calcium. En revanche, ce 2 document ne décrit aucune activité biologique des peptides pour l'absorption du calcium sur cultures cellulaires intestinales. [0008] Par ailleurs, la publication « Recent advanccs in microbial fermentation for dairy and hcalth » de D. Hill et al, publiée le 26 mai 2017 dans la revue in F 1000 Research fait également état de bactéries capables de produire par protéolyse des peptides bioactifs en tant qu'inhibiteur d'ACE. Elle indique de plus qu'un fructo-oligosaccharide peut être utilisé à titre préventif contre l'ostéoporose. Le mécanisme d'action de cc fructooligosaccharide est le suivant : dans le ventre du sujet, le fructo-oligosaccharide génère par fermentation des petites molécules d'acide, lesquelles diminuent le pH in vivo et entraînent la dissolution de phosphates de calcium qui seraient ainsi l'indisponibles. [0009] Une absorption insuffisante du calcium (hypocalcémie) peut conduire à différents symptômes ou pathologies telles que l'ostéoporose, l'hypertension artérielle ou le syndrome métabolique. En effet, le calcium est impliqué quel que soit l'âge du patient, dans la formation des os, la solidification du squelette, la rigidité des dents, la contraction musculaire et donc la contraction cardiaque, la transmission de l'influx nerveux au niveau des synapses, l'apprentissage et la mémorisation, la sécrétion salivaire, la croissance et la prolifération cellulaire. Le calcium permet d'activer de nombreuses enzymes, de libérer plusieurs hormones, de coaguler le sang et participe à l'équilibre du poids corporel. L'hypocalcémie est également liée à diverses pathologies rares telles que les hypoparathyroïdies auto-immunes, le rachitisme hypocalcémique vitamine-D dépendant, l'hétéroplasie osseuse progressive, les hypoparathyroïdies isolées, les hypoparathyroïdies synclromiques, les pseudo hypoparathyroïdies et les rachitismes hypo-carentiels et plus généralement les maladies causées par une anomalie de la régulation de la calcémie due au dysfonctionnement de la parathormone, de l'absorption de la vitamine D ou du fonctionnement du récepteur du calcium. [0010] A ce jour, l'ostéoporose n'est pas traitée de manière efficace. Ainsi, les bispho- phonates qui sont le traitement le plus utilisé, s'avèrent peu efficaces dans le cas de patientes qui présentent un faible risque de fracture. La prévention à travers la pratique régulière d'une activité physique, une alimentation équilibrée et la limitation du tabac et de l'alcool s'avère être plus efficace. [0011] Un but de la présente invention est de proposer une souche de bactérie lactique ré- sistante à la digestion gastro-intestinale et susceptible d'agir dans l'intestin en acidifiant le milieu, rendant ainsi le calcium soluble, afin de faciliter son absorption et son passage à travers la paroi intestinale. [0012] Un autre but de la présente invention est de proposer une souche de bactérie lactique résistante à la digestion gastro-intestinale et susceptible de stimuler l'absorption du calcium par les cellules intestinales, en agissant directement ou indirectement sur celles-ci. 3 100131 Un autre but de la présente invention est de fournir une souche de bactérie lactique qui a une croissance plus importante que certaines bactéries lactiques connues et/ou qui permet une acidification plus importante du milieu de fermentation, notamment du lait. [0014] Un autre but de la présente invention est de proposer une souche de bactérie lactique susceptible de produire de nouveaux peptides phosphorylés susceptibles de favoriser l'absorption du calcium au niveau intestinal. [0015] Un autre but de la présente invention est de proposer une souche de bactérie lactique susceptible de produire de nouveaux peptides ayant une activité inhibitrice de l'ACE. [0016] Un autre but de la présente invention est de proposer au moins un peptide, voire un mélange de peptides qui présente une activité inhibitrice de l'ACE et/ou favorise l'absorption intestinale du calcium et qui de préférence, soit non toxique pour les cellules intestinales. [0017] Un autre but de la présente invention est de proposer au moins un peptide, voire un mélange de peptides qui présente une activité inhibitrice de l'ACE qui soit supérieure à l'activité des peptidesIPP et VPP. [0018] Un autre but de la présente invention est de proposer une composition pharma- ceutique ou alimentaire apte à traiter l'hypocalcémie et donc les pathologies qui en découlent. Premier aspect [0019] Selon un premier aspect, l'invention concerne une souche de Lactobacillus helveticus présentant les gènes pr1H2 et pal13 et capable de réduire par fermentation anaérobie le pH du lait, notamment de vache et notamment le lait de vache écrémé à une valeur sensiblement égale ou inférieure à 3,36, notamment égale à 3,32 au bout de 48 heures de fermentation à 37°C. En réduisant le pH, la souche permet la dissolution des composés contenant du calcium, rendant ce dernier absorbable par la paroi intestinale. [0020] Selon ce premier aspect, la présente invention concerne également la souche de Lac- tobacillus helveticus VF45A déposée à la CNCM sous le numéro d'ordre CNCMI-5300, ses mutants et variants présentant au moins 80% d'identité, de préférence au moins 90% d'identité, de préférence au moins 95% d'identité avec le génome de ladite souche VF45A et capables de produire au moins un peptide correspondant aux séquences SEQ ID 1 à SEQ ID NO 43 et/ou capables de réduire par fermentation anaérobie le pH du lait, notamment de vache et notamment le lait de vache écrémé à une valeur sensiblement égale ou inférieure à 3,36, notamment égale à 3,32 au bout de 48 heures de fermentation à 37°C. [0021] Selon ce premier aspect, l'invention concerne également les souches précitées en référence au premier aspect pour leur utilisation en tant que médicament et notamment en tant que médicament pour le traitement de l'hypocalcémie ou dans le traitement d'une pathologie causée par une déficience d'absorption du calcium et notamment choisie parmi l'hypertension artérielle, le syndrome métabolique, l'ostéoporose ou dans le traitement de l'hypocalcémie induite par une pathologie choisie parmi les hypoparathyroklies auto-immunes, le rachitisme hypocalcémique vitamine-D dépendant, r hétéroplasic osseuse progressive, les hypoparathyroïdies isolées, les hypoparathyroïdies syndromiques, les pscudo hypoparathyroklies et les rachitismes hypocarentiels, les maladies causées par une anomalie de la régulation de la calcémie duc au dysfonctionnement de la parathormone, de l'absorption de la vitamine D ou du fonctionnement du récepteur du calcium chez un sujet, notamment un mammifère et particulièrement un humain ayant un tel besoin. [0022] Selon cc premier aspect, la présente invention concerne également un peptide isolé pouvant être obtenu par fermentation du lait, notamment de vache par au moins une souche selon le premier aspect de l'invention et choisi parmi les peptides correspondant aux séquences SEQ ID 1 à SEQ ID NO 43, les peptides présentant au moins 80% d'identité, notamment au moins 90% d'identité, en particulier au moins 95% d'identité avec lesdits peptides correspondant aux séquences SEQ ID 1 à SEQ ID NO 19 et capables d'inhiber l'ACE et les peptides présentant au moins 80% d'identité, notamment au moins 90% d'identité, en particulier au moins 95% d'identité avec lesdits peptides correspondant aux séquences SEQ ID 20 à SEQ ID NO 43 et capables d'augmenter l'absorption intestinale du calcium. La Demanderesse a en effet mis en évidence soit l'activité inhibitrice de l'ACE des peptides précités- laquelle activité est également liée à la bonne santé osseuse- soit l'activité d'amélioration de l'absorption du calcium à travers la paroi intestinale due à certains des peptides précités. Ainsi, les peptides de l'invention agissent sur la santé osseuse via l'absorption du calcium à travers la paroi intestinale, et/ou via l'inhibition de l'ACE. [0023] Selon ce premier aspect, la présente invention concerne également un mélange de peptides choisi parmi les mélanges comprenant ou constitués de tous les peptides de séquence SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 43, les mélanges comprenant ou constitués desdits peptides de séquence SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 5, les mélanges comprenant ou constitués des 5 peptides de séquence SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 5 et d'au moins un peptide choisi parmi les peptides correspondant aux séquences SEQ ID 20 à SEQ ID NO 43, de préférence les mélanges contenant ou constitués des 5 peptides de séquence SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 5 et des peptides de séquences SEQ ID 20 à SEQ ID NO 43 et les mélanges comprenant ou constitués des peptides de séquence SEQ ID 20 à SEQ ID 43. [0024] Ces mélanges s'avèrent être actifs sur l'inhibition de l'ACE et/ou pour l'amélioration de l'absorption intestinale du calcium. [0025] La présente invention concerne également les peptides isolés précités et les mélanges précités pour leur utilisation en tant que médicament et notamment en tant que mé- dicament dans le traitement de l'hypocalcémie ou dans le traitement d'une pathologie causée par une déficience d'absorption du calcium et notamment choisie parmi l'hypertension artérielle, le syndrome métabolique, l'ostéoporose ou dans le traitement de l'hypocalcémie induite par une pathologie choisie parmi les hypoparathyroïdies auto-immunes, le rachitisme hypocalcémique vitamine-D dépendant, rhétéroplasic osseuse progressive, les hypoparathyroïdies isolées, les hypoparathyroïdies syndromiques, les pseudo hypoparathyroïdies et les rachitismes hypo-carentiels, les maladies causées par une anomalie de la régulation de la calcémie duc au dysfonctionnement de la parathormone, de l'absorption de la vitamine D ou du fonctionnement du récepteur du calcium, chez un sujet, notamment un mammifère et particulièrement un humain ayant un tel besoin. [0026] Selon cc premier aspect, la présente invention concerne également une composition alimentaire ou pharmaceutique qui contient au moins un excipient pharmaccuticalment acceptable ou un milieu apte à être ingéré et en tant qu'ingrédient actif au moins un peptide choisi parmi les peptides isolés précités en référence au premier aspect et/ou un mélange de peptides tel que précité en référence au premier aspect et/ ou une souche selon le premier aspect de l'invention et notamment la souche VF45A. [0027] Avantageusement, selon un premier mode de réalisation du premier aspect, la com- position alimentaire ou pharmaceutique comprend, au moins ou seulement en tant que peptides actifs, les 5 peptides correspondant aux séquences SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 5. Ces peptides sont les plus actifs entant qu'inhibiteurs de l'ACE. Ils sont plus actifs que les tripeptides VPP et IPP de l'art antérieur. [0028] Selon ce premier aspect et selon un second mode de réalisation, la composition ali- mentaire ou pharmaceutique selon le premier aspect de l'invention contient en tant qu'ingrédient actif ou est constituée du feimentat obtenu par fermentation anaérobie du lait de vache éventuellement écrémé au moyen d'une souche selon le premier aspect de l'invention, ledit fermentat ayant éventuellement subi une ultrafiltration à un seuil de coupure de 10kDa ou elle contient ou est constituée du fermentat obtenu par fermentation anaérobie et éventuellement après une ultrafiltration à un seuil de coupure de 10kDa d'un substrat protéique choisi parmi les substrats protéiques d'origine végétale provenant d'au moins une céréale et/ou d'au moins un pois et/ou d'au moins un champignon et/ou d'au moins un fruit à coque, les mélanges d'au moins deux substrats protéiques d'origine végétale, les laits d'origine animale éventuellement stérilisés thermiquement, et/ou au moins partiellement écrémés, en particulier le lait de vache, de chèvre ou de brebis à l'exception du lait de yak pour le fermentat non ultrafiltré à un seuil de coupure de 10kDa, les mélanges d'au moins deux laits d'origine animale et les mélanges d'au moins un substrat protéique d'origine végétale et d'au moins un lait d'origine animale. 6 [0029] Le fermentat tel que précité obtenu par fermentation anaérobie et ultrafiltration à un seuil de coupure de 10kDa fait partie des fermentats selon le premier aspect de l'invention, y compris le fermentat ultrafiltre obtenu à partir du lait de yak. [0030] S'agissant du fermentat obtenu à partir du lait de vache, il est avantageusement obtenu selon les conditions de température et de durée indiquées dans la partie relative aux résultats expérimentaux. [0031] Dans toute la présente demande, le substrat protéique d'origine végétale peut être choisi parmi les laits végétaux tels que le lait d'avoine, le lait d'amande, le lait de riz, le lait de soja, le lait d'épeautre, le lait de noisette et les mélanges de ces laits. Quel que soit le lait, il peut être stérilisé thermiquemcnt avant fermentation par la bactérie selon l' invention. [0032] Selon un mode de réalisation particulier, ledit fermentat est obtenu par fermentation de la souche précitée en référence au premier aspect, dans du lait, notamment de vache, éventuellement écrémé et/ou stérilisé thermiquement, à une température de 40°C à pH=6 pendant 72h, ledit fermentat étant éventuellement également soumis à une ultrafiltration à un seuil de coupure de 10kDa à l'issue de la fermentation. Le fermentat ultrafiltre ou non s'avère actif pour l'inhibition de l'ACE et/ou pour l'absorption du calcium. [0033] Dans tous les aspects de l'invention, la composition alimentaire ou pharmaceutique contient en tant qu'ingrédient actif, le ou les peptides et/ou la souche. Elle peut également comprendre, avantageusement également du calcium et/ou de la vitamine D. [0034] Dans tous les aspects de l'invention, le fait d'effectuer une ultrafiltration sur le fermentat permet de séparer les peptides produits par la souche des protéines. Le fermentat ultrafiltré ne contient donc plus de protéines. Lorsque le fermentat ultrafiltré est soumis à une digestion gastro-intestinale, il n'y a pas génération d'autres peptides, du fait de l'absence de protéines. Le filtrat obtenu par ultrafiltration du fermentat s'avère plus actif lorsqu'il est ingéré et digéré du fait de l'absence d'interférences par les peptides issus de la digestion des protéines. [0035] Selon un mode de réalisation particulier de la composition alimentaire ou pharma- ceutique selon le premier aspect de l'invention, elle contient une concentration d'au moins une desdites souches et de préférence d'une desdites souches, notamment la souche Lactobacillus helveticus VF45A égale ou supérieure à 10 CFU par gramme et/ ou une concentration en peptides lesquels sont identiques ou différents et choisis parmi les peptides de séquence SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 43, supérieure ou égale à 18 mg par gramme. De préférence, les peptides sont les peptides contenus dans le fermentat précité en référence au premier aspect et notamment les peptides des séquences SEQ ID NO 1 à SEQ ID N° 41 [0036] Selon ce premier aspect, la présente invention concerne également un produit choisi 7 notamment parmi les produits alimentaires, notamment les laits fermentés, les jus de fruit(s) et/ou de légume(s) éventuellement fermentés, les légumes et/ou fruits fermentés, les champignons fermentés, la charcuterie, les préparations alimentaires à base de poisson(s) et. les produits laitiers obtenus à partir de lait éventuellement écrémé, en particulier de vache, de chèvre, de brebis et à l'exception du lait de yak, ou d'un mélange de laits. Selon le premier aspect de l'invention, ce produit contient au moins une souche selon le premier aspect et/ou au moins un peptide selon le premier aspect et/ou au moins un mélange de peptides selon le premier aspect de l'invention et/ ou une composition alimentaire ou pharmaceutique selon le premier aspect de l' invention. [0037] Selon cc premier aspect, l'invention concerne également un complément alimentaire adapté à un sujet, notamment un humain ou un animal en particulier choisi parmi le chat, le chien, les volailles, les ovins, les caprins, les bovins, les reptiles, notamment l'iguane, lequel de manière caractéristique comprend au moins une souche selon le premier aspect et/ou au moins un peptide selon le premier aspect et/ou au moins un mélange de peptides selon le premier aspect et/ou une composition alimentaire ou pharmaceutique selon le premier aspect. [0038] Quel que soit l'aspect de l'invention, la composition al imentaire/pharmaccutique ou le complément alimentaire peut être sous la forme d'une poudre, d'une solution notamment aqueuse, d'un comprimé, d'une gélule contenant la souche sous forme lyophilisée et/ou le peptide ou le mélange de peptides sous forme de poudre ou de solution. La gélule peut comporter une coque externe apte à résister à la digestion gastro-intestinale de manière à délivrer son contenu dans l'intestin du patient. La souche peut également être, par exemple, microencapsulée par un enrobage lipidique et se présenter sous la forme d'une poudre ingérable. [0039] Dans le cas d'un complément alimentaire selon le premier aspect, le comprimé, la gélule ou tout autre forme unitaire de dosage journalier contient de préférence, au moins 0,6 g de peptides actifs et/ou 107 CFU de souche selon le premier aspect, éventuellement en mélange. [0040] La composition pharmaceutique peut être de préférence adaptée à une administration par voie orale. [0041] Dans toute la demande, le produit laitier n'est pas limité selon l'invention. II peut s'agir d'une boisson lactée, d'un lait fermenté, de kéfir, d'un yaourt, d'un produit à base de lait coagulé par ajout d'acide ou d'un fromage frais ou à pâte levée, par exemple. Deuxième aspect [0042] Selon un deuxième aspect, la présente invention concerne une souche de Lacto- bacillus helveticus présentant le gène prtH1 et capable de réduire par fermentation 8 anaérobie le pH du lait, notamment de vache à une valeur sensiblement égale ou inférieure à 3,45 et notamment égale à 3,43 au bout de 48 heures à 37°C et présentant une hydrophobicité pariétale de 40 % et résistante à l'acidité et/ou capable d'augmenter l'absorption du calcium par les cellules intestinales. [0043] Selon cc deuxième aspect, la présente invention concerne la souche de Lactohceeillus helvelie us VFH049 déposée à la CNCM sous le numéro d'ordre CNCM-I-5403 et ses mutants et variants présentant au moins 80% d'identité, de préférence au moins 90% d'identité, de préférence au moins 95% d'identité avec le génome de ladite souche VFH049 et capable de produire au moins un peptide correspondant aux séquences SEQ ID 44 à SEQ ID NO 86 et/ou capable de réduire par fermentation anaérobie le pH du lait, notamment de vache à une valeur sensiblement égale ou inférieure à 3,45 et notamment égale à 3,43 au bout de 48 heures à 37°C et/ou capables d'augmenter l'absorption du calcium par les cellules intestinales. [0044] Cette souche s'est avérée capable de former des acides qui sont susceptibles de rendre soluble le calcium dans l'intestin d'un hôte/patient. Elle est également capable de produire, par protéolyse de la ri-caséine, des peptides actifs en tant qu'inhibiteur de l'ACE ou permettant une meilleure absorption intestinale du calcium. La souche elle-même résiste à la digestion et permet lorsqu'elle est en contact avec les cellules intestinales une meilleure absorption du calcium par ces dernières. [0045] Selon cc deuxième aspect, la présente invention concerne également les souches citées en référence au deuxième aspect et notamment la souche VFH049 ou ses mutants ou variants pour son utilisation en tant que médicament et notamment en tant que médicament dans le traitement de l'hypocalcémie ou dans le traitement d'une pathologie causée par une déficience d'absorption du calcium et notamment choisie parmi l'hypertension artérielle, le syndrome métabolique, l'ostéoporose ou dans le traitement de l'hypocalcémie induite par une pathologie choisie parmi les hypoparathyroïdies auto-immunes, le rachitisme hypocalcémique vitamine-D dépendant, l'hétéroplasie osseuse progressive, les hypoparathyroïdies isolées, les hypoparathyroïdies syndromiques, les pseudo hypoparathyroïdies et les rachitismes hypocarentiels, les maladies causées par une anomalie de la régulation de la calcémie due au dysfonctionnement de la parathormone, de l'absorption de la vitamine D ou du fonctionnement du récepteur du calcium, chez un sujet, notamment un mammifère et particulièrement un humain ayant un tel besoin. [0046] Selon ce deuxième aspect, la présente invention concerne également un peptide isolé pouvant être obtenu par fermentation du lait, notamment du lait de vache, par au moins une souche selon le deuxième aspect de l'invention et choisi parmi les peptides correspondant aux séquences SEQ ID 44 à SEQ ID NO 86, les peptides présentant au moins 80% d'identité, notamment au moins 90% d'identité, en particulier au moins 9 95% d'identité avec lesdits peptides correspondant aux séquences SEQ ID 44 à SEQ ID NO 74 et capables d'inhiber l'ACE et les peptides présentant au moins 80% d'identité, notamment au moins 90% d'identité, en particulier au moins 95% d'identité avec lesdits peptides correspondant aux séquences SEQ ID 75 à SEQ ID NO 86 et capables d'augmenter l'absorption intestinale du calcium. [0047] Selon cc deuxième aspect, l'invention concerne également un mélange de peptides choisi parmi les mélanges de peptides contenant ou constitués de tous les peptides de séquence SEQ ID 44 à SEQ ID 86, les mélanges comprenant ou constitués des peptides de séquence SEQ ID NO 44 à SEQ ID NO 58, les mélanges constitués des peptides de séquence SEQ ID NO 44 à SEQ ID NO 58 et d'au moins un des peptides de séquence SEQ ID NO 75 à SEQ ID NO 86, les mélanges comprenant ou constitués des peptides de séquence SEQ ID NO 44 à SEQ ID NO 58 et des peptides de séquence SEQ ID NO 75 à SEQ ID NO 86 et les mélanges contenant ou constitués des peptides de séquence SEQ ID NO 75 à SEQ ID NO 86. Les peptides de séquence SEQ ID NO 44 à SEQ ID NO 58 sont les plus actifs en tant qu'inhibiteur de l'ACE. [0048] Selon cc deuxième aspect, l'invention concerne également un peptide isolé du deuxième aspect ou le mélange selon le deuxième aspect pour son utilisation en tant que médicament et notamment en tant que médicament dans le traitement de l'hypocalcémie ou d'une pathologie causée par une déficience d'absorption du calcium et notamment choisie parmi l'hypertension artérielle, le syndrome métabolique, l'ostéoporose ou pour le traitement de l'hypocalcémie induite par une pathologie choisie parmi les hypoparathyroïdies auto-immunes, le rachitisme hypocalcémique vitamine-D dépendant, l'hétéroplasie osseuse progressive, les hypoparathyroïdies isolées, les hypoparathyroïdies synclromiques, les pseudo hypoparathyroïdies et les rachitismes hypo-carentiels, les maladies causées par une anomalie de la régulation de la calcémie due au dysfonctionnement de la parathormone, de l'absorption de la vitamine D ou du fonctionnement du récepteur du calcium, chez un sujet, notamment un mammifère, en particulier un humain ayant un tel besoin. [0049] Selon ce deuxième aspect, la présente invention concerne également une composition alimentaire ou pharmaceutique qui contient au moins un excipient phannaceuticalement acceptable ou au moins un milieu apte à être ingéré et en tant qu'ingrédient actif, au moins un peptide correspondant aux peptides isolés selon le deuxième aspect de l'invention, et/ou un mélange de peptides selon le deuxième aspect de l'invention, et/ou une souche selon le deuxième aspect de l'invention, en particulier la souche VFH049. De préférence, la composition alimentaire ou pharmaceutique contient un mélange contenant tous les peptides de séquences SEQ ID NO 44 à SEQ ID NO 86 ou un mélange contenant au moins ou seulement les peptides correspondant aux séquences SEQ ID NO 44 à SEQ ID NO 58 et éventuellement les peptides de séquence SEQ ID NO 75 à SEQ ID NO 86. [0050] Selon cc deuxième aspect, la composition alimentaire ou pharmaceutique contient ou est constituée du fermentat obtenu par fermentation anaérobie du lait de vache éventuellement écrémé au moyen d'une souche selon le deuxième aspect de l'invention, ledit fermentat ayant éventuellement subi une ultrafiltration à un seuil de coupure de 10kDa ou contient ou est constituée du fermentat obtenu par fermentation anaérobie et éventuellement après une ultrafiltration à un seuil de coupure de 10kDa d'un substrat protéique choisi parmi les substrats protéiques d'origine végétale provenant d'au moins une céréale et/ou d'au moins un pois et/ou d'au moins un champignon et/ou d'au moins un fruit à coque dont l'amande, les mélanges d'au moins deux substrats protéiques d'origine végétale, les laits d'origine animale éventuellement stérilisés thermiquement et/ou au moins partiellement écrémés, notamment le lait de vache, de chèvre ou de brebis à l'exception du lait de jument pour le fermentat non ultrafiltre à un seuil de coupure de 10kDa, les mélanges d'au moins deux laits et les mélanges d'au moins un substrat d'origine végétale et d'au moins un lait d'origine animale. [0051] Selon un mode de réalisation particulier du deuxième aspect de l'invention, la com- position alimentaire ou pharmaceutique contient ou est constituée du fermentat obtenu par fermentation anaérobie de la souche VFH049 ou d'une souche telle que précitée, dans du lait, notamment de vache, éventuellement écrémé, à une température de 40nC à 01=6 pendant 72h, ledit fermentat étant éventuellement soumis à une ultrafiltration à un seuil de coupure de 10kDa. Ce fermentat contient tous les peptides du deuxième aspect de l'invention ; il est donc actif pour favoriser la santé osseuse, à la fois en tant qu'inhibiteur de l'ACE et en tant qu'agent favorisant l'absorption intestinale du calcium. [0052] Quel que soit le mode de réalisation, le fermentat lui-même, ultrafiltré ou non peut être considéré comme une composition pharmaceutique ou alimentaire. [0053] Selon ce deuxième aspect, la composition alimentaire ou pharmaceutique précitée contient, de préférence une concentration d'au moins une desdites souches et de préférence d'une desdites souches, notamment la souche Lactobacillus helveticus VEH049 égale ou supérieure à 107 CFU par gramme et/ou une concentration en peptides lesquels sont identiques ou différents et choisis parmi les peptides de séquence SEQ ID NO 44 à SEQ ID NO 86, supérieure ou égale à 6 mg par gramme. [0054] Selon ce deuxième aspect, l'invention concerne également un produit choisi notamment parmi les produits alimentaires, notamment les laits fermentés, les jus de fruit(s) et/ou de légume(s) éventuellement fermentés, les légumes et/ou fruits fermentés, les champignons fermentés, la charcuterie, les préparations alimentaires à base de poisson(s) et les produits laitiers obtenus à partir de lait éventuellement écrémé, à l'exception du lait de jument, en particulier à partir de lait de vache, de 11 chèvre, de brebis ou d'un mélange de laits, qui contient au moins une souche selon le deuxième aspect de l'invention et/ou au moins un peptide selon le deuxième aspect de l'invention et/ou au moins un mélange de peptides selon le deuxième aspect de l'invention et/ou une composition alimentaire ou pharmaceutique selon le deuxième aspect de l'invention. [0055] Selon cc deuxième aspect, l'invention concerne également un complément ali- mentaire adapté à un sujet, notamment un humain ou un animal en particulier choisi parmi le chat, le chien, les volailles, les ovins, les caprins, les bovins, les reptiles, notamment l'iguane qui de manière caractéristique comprend au moins une souche selon le deuxième aspect de l'invention et/ou au moins un peptide selon le deuxième aspect de l'invention et/ou au moins un mélange de peptides selon le deuxième aspect de l'invention et/ou une composition alimentaire ou pharmaceutique selon le deuxième aspect de l'invention. [0056] A titre d'exemple, selon le deuxième aspect de l'invention, la composition pharma- ceutique ou alimentaire se présente sous la forme d'un liquide, notamment du fermentat de lait de vache précité. Un volume de 30 mL de cette solution contenant 0,2 g du mélange de peptides de l'invention est administré quotidiennement, par voie orale. Troisième aspect [0057] Selon un troisième aspect, la présente invention concerne une souche de Lucia- bacillus delbrueckil .sp. bulgaricus présentant le gène prtB et capable de réduire par fermentation anaérobie le pH du lait, notamment de vache à une valeur sensiblement égale ou inférieure à 4,55 et notamment égale à 4,51 au bout dc 48 heures à 37°C et présentant une hydrophobicité pariétale d'au moins 35% et/ou capable d'augmenter l'absorption du calcium. Une telle souche s'est avérée être active dans l'intestin et résistante à la digestion gastro-intestinale. Elle est capable d'augmenter le passage du calcium à travers la paroi intestinale. Les acides qu'elle produit permettent également de solubiliser le calcium. [0058] Selon ce troisième aspect, l'invention concerne la souche de Lactobacillus del- brueckii ssp. bulgaricus VF50b déposée à la CNCM sous le numéro d'ordre CNCM1-5316 et ses mutants et variants présentant au moins 80% d'identité, de préférence au moins 90% d'identité, de préférence au moins 95% d'identité avec le génome de ladite souche VF50b et capables de produire au moins un peptide correspondant aux séquences SEQ ID 87 à SEQ ID NO 199 et/ou capables de réduire par fermentation anaérobie le pH du lait, notamment de vache à une valeur sensiblement égale ou inférieure à 4,55 et notamment égale à 4,51 au bout de 48 heures à 37°C et/ou capable d'augmenter l'absorption intestinale du calcium. [0059] Le troisième aspect concerne également chacune des souches les telles que précitées 12 pour son utilisation en tant que médicament, et notamment en tant que médicament dans le traitement de l'hypocalcémie ou dans le traitement d'une pathologie causée par une déficience d'absorption du calcium et notamment choisie parmi l'hypertension artérielle, le syndrome métabolique, l'ostéoporose ou dans le traitement de l'hypocalcémie induite par une pathologie choisie parmi les hypoparathyroïdies auto-immunes, le rachitisme hypocalcémique vitamine-D dépendant, l'hétéroplasic osseuse progressive, les hypoparathyroïdies isolées, les hypoparathyroïdies syndromiques, les pseudo hypoparathyroïdies et les rachitismes hypo-carentiels, les maladies causées par une anomalie de la régulation de la calcémie duc au dysfonctionnement de la parathormone, de l'absorption de la vitamine D ou du fonctionnement du récepteur du calcium, chez un sujet, notamment un mammifère et particulièrement un humain ayant un tel besoin. [0060] Selon cc troisième aspect, la présente invention concerne un peptide isolé choisi parmi les peptides correspondant aux séquences SEQ ID 87 à SEQ ID NO 199, les peptides présentant au moins 80% d'identité, notamment au moins 90% d'identité, en particulier au moins 95% d'identité avec lesdits peptides correspondant aux séquences SEQ ID 87 à SEQ ID NO 161 et capables d'inhiber l'ACE et les peptides présentant au moins 80% d'identité, notamment au moins 90% d'identité, en particulier au moins 95% d'identité avec lesdits peptides correspondant aux séquences SEQ ID 162 à SEQ ID NO 199 et capables d'augmenter l'absorption intestinale du calcium. [0061] Selon ce troisième aspect, l'invention concerne également un mélange de peptides choisi parmi les mélanges contenant ou constitués de tous les peptides de séquence SEQ ID NO 87 à SEQ ID 199, les mélanges contenant ou constitués des peptides de séquence SEQ ID 87 à SEQ ID 112, les mélanges contenant ou constitués des peptides de séquence SEQ ID 87 à SEQ ID 112 et d'au moins un des peptides de séquence SEQ ID NO 162 à SEQ ID NO 199 et les mélanges contenant ou constitués des peptides de séquence SEQ ID NO 162 à SEQ ID NO 199. [0062] Selon le troisième aspect, l'invention concerne également un peptide isolé cité en référence au troisième aspect ou un mélange précité en référence au troisième aspect pour son utilisation en tant que médicament et notamment dans le traitement dans le traitement de l'hypocalcémie ou d'une pathologie causée par une déficience d'absorption du calcium et notamment choisie parmi l'hypertension artérielle, le syndrome métabolique, l'ostéoporose ou pour le traitement de l'hypocalcémie induite par une pathologie choisie parmi les hypoparathyroïdies auto-immunes, le rachitisme hypocalcérnique vitamine-D dépendant, l'hétéroplasie osseuse progressive, les hypoparathyroïdies isolées, les hypoparathyroïdies syndromiques, les pseudo hypoparathyroïdies et les rachitismes hypo-carentiels, les maladies causées par une anomalie de la régulation de la calcémie due au dysfonctionnement de la parathormone, de 13 l'absorption de la vitamine D ou du fonctionnement du récepteur du calcium, chez un sujet, notamment un mammifère, en particulier un humain ayant un tel besoin. [0063] Selon cc troisième aspect, l'invention concerne également une composition ali- mentaire ou pharmaceutique qui contient au moins un excipient pharmaceuticalement acceptable ou au moins un milieu apte à être ingéré et en tant qu'ingrédient actif, au moins un peptide isolé selon le troisième aspect de l'invention et/ou un mélange de peptides selon le troisième aspect. [0064] De préférence, la composition contient un mélange contenant au moins ou seulement en tant que peptides, les peptides correspondant aux séquences SEQ ID NO 87 à SEQ ID NO 161, ou un mélange contenant de préférence tous les peptides correspondant aux séquences SEQ ID 87 à SEQ ID NO 199 et/ou une souche selon le troisième aspect. [0065] Selon un mode de réalisation préféré de la composition pharmaceutique ou ali- mentaire selon le troisième aspect de l'invention, elle comprend ou est constituée par le fermentat obtenu par fermentation anaérobie du lait de vache éventuellement écrémé au moyen d'une souche selon le troisième aspect de l'invention, ledit fermentat ayant éventuellement subi une ultrafiltration à un seuil de coupure de 10kDa ou elle contient ou est constitué du fermentat obtenu par fermentation anaérobie et éventuellement après une ultrafiltration à un seuil de coupure de 10kDa d'un substrat protéique choisi parmi les substrats protéiques d'origine végétale provenant d'au moins une céréale ctl ou d'au moins un pois et/ou d'au moins un champignon et/ou d'au moins un fruit à coque, les mélanges d'au moins deux substrats protéiques d'origine végétale, les laits éventuellement stérilisés thermiquement et/ou au moins partiellement écrémés, notamment le lait de vache, de chèvre ou de brebis, à l'exception du lait de yak pour ledit fermentat non ultrafiltré à un seuil de coupure de 10kDa, les mélanges d'au moins deux laits et les mélanges d'au moins un substrat protéique d'origine végétale et d'au moins un lait d'origine animale [0066] Le fermentat obtenu par fermentation anaérobie du lait de yak par une souche selon le premier ou le troisième aspect de l'invention et ultrafiltré à un seuil de coupure de 10kDa fait partie respectivement des fermentats selon le premier et le troisième aspect de l'invention. Le fermentat obtenu par fermentation anaérobie du lait de jument et ultrafiltré à un seuil de coupure de 10kDa fait partie des fermentats selon le deuxième aspect de l'invention. [0067] Avantageusement, ladite composition alimentaire ou pharmaceutique selon le troisième aspect de l'invention contient une concentration d'au moins une desdites souches et de préférence d'une seule desdites souches, notamment la souche Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus VF50b égale ou supérieure à 10' CFU par gramme et/ou une concentration en peptides lesquels sont identiques ou différents et choisis 14 parmi les peptides de séquence SEQ ID NO 87 à SEQ ID NO 199, supérieure ou égale à 4 me par gramme. [0068] La composition alimentaire ou pharmaceutique comprend dc préférence, le fermentat obtenu par fermentation anaérobie de la souche selon le troisième aspect de l'invention, dans du lait, notamment de vache, éventuellement écrémé, à une température de 40cC à pli=6 pendant 72h, ledit fermentat étant éventuellement soumis à une ultrafiltration à un seuil de coupure de 10kDa. [0069] Selon cc troisième aspect, la présente invention concerne également un produit choisi notamment parmi les produits alimentaires, notamment les laits fermentés, les jus de fruit(s) ct/ou de légume(s) éventuellement fermentés, les légumes et/ou fruits fermentés, les champignons fermentés, la charcuterie, les préparations alimentaires à base de poisson(s) et les produits laitiers obtenus à partir de lait éventuellement écrémé, notamment de vache, de chèvre, de brebis à l'exception du lait de yak, ou d'un mélange de laits, lequel de manière caractéristique contient au moins une souche selon le troisième aspect de l'invention et/ou au moins un peptide selon le troisième aspect et/ou au moins un mélange de peptides selon le troisième aspect et/ou une composition alimentaire ou pharmaceutique selon le troisième aspect de l'invention. [0070] Selon cc troisième aspect, la présente invention concerne également un complément alimentaire adapté à un sujet, notamment un humain ou un animal en particulier choisi parmi le chat, le chien, les volailles, les ovins, les caprins, les bovins, les reptiles, notamment l'iguane, lequel comprend de manière caractéristique au moins une souche selon le troisième aspect et/ou au moins un peptide selon le troisième aspect et/ou au moins un mélange de peptides selon le troisième aspect et/ou une composition alimentaire ou pharmaceutique selon le troisième aspect de l'invention. [0071] Selon ce troisième aspect, par exemple, la composition alimentaire ou pharma- ceutique se présente sous la forme d'un liquide. Un volume de 30 mL de cette composition contenant 0,2 g de peptides sont administrés quotidiennement, par voie orale. Quatrième aspect [0072] Selon un quatrième aspect de l'invention, la présente invention concerne un mélange d'au moins deux souches choisies parmi les souches de Lactobacillus helveticus présentant les gènes prtH2 et prtH3 et capables de réduire par fermentation anaérobie le pH du lait, notamment de vache et notamment le lait de vache écrémé à une valeur sensiblement égale ou inférieure à 3,36, notamment égale à 3,32 au bout de 48 heures de fermentation à 37°C et notamment la souche de Lactobacillus helveticus VF45A déposée à la CNCM sous le numéro d'ordre CNCM-I-5300, les souches de Lactobacillus helveticus présentant le gène prtH1 , notamment la souche de Lactobacillus helveticus VFH049 déposée à la CNCM sous le numéro d'ordre CNCM-I-5403, capables de réduire par fermentation anaérobie le pH du lait, notamment de vache à une valeur sensiblement égale ou inférieure à 3,45 et notamment égale à 3,43 au bout de 48 heures à 37°C et présentant une hydrophobicité pariétale de 40% et résistante à l'acidité et/ou capable d'augmenter l'absorption du calcium et les souches de Laciobardais delbriteckd ssp. bulgaricus présentant le gène pria, notamment la souche de Lat-lobai-Mus delbrueckii ssp. bulgaricits VF50b déposée à la CNCM sous le numéro d'ordre CNCM-I-5316, capables de réduire par fermentation anaérobie le pH du lait, notamment de vache à une valeur sensiblement égale ou inférieure à 4,55 et notamment égale à 4,51 au bout de 48 heures à 37°C et présentant une hydrophobicité pariétale d'au moins 35% et/ou capable d'augmenter l'absorption du calcium par les cellules intestinales et notamment les mélanges des trois souches VF45A, VFH049 et VF50b. [0073] Selon cc quatrième aspect, l'invention concerne un mélange de peptides choisi parmi les mélanges comprenant les peptides de séquences SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 199, les mélanges contenant les peptides de séquence SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 5, les peptides de séquence SEQ ID NO 44 à SEQ ID NO 86 et les peptides de séquence SEQ ID NO 87 à SEQ ID NO 112. [0074] Selon cc quatrième aspect, l'invention concerne également un peptide isolé choisi parmi les peptides de séquences SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 199 ou un mélange selon la quatrième aspect de l'invention pour son utilisation en tant que médicament et notamment dans le traitement de l'hypocalcémie ou dans le traitement d'une pathologie causée par une déficience d'absorption du calcium et notamment choisie parmi l'hypertension artérielle, le syndrome métabolique, l'ostéoporose ou dans le traitement de l'hypocalcémie induite par une pathologie choisie parmi les hypoparathyroïdies auto-immunes, le rachitisme hypocalcémique vitamine-D dépendant, l'hétéroplasie osseuse progressive, les hypoparathyroïdies isolées, les hypoparathyroïdies syndromiques, les pseudo hypoparathyroïdies et les rachitismes hypocarentiels, les maladies causées par une anomalie de la régulation de la calcémie due au dysfonctionnement de la parathormone, de l'absorption de la vitamine D ou du fonctionnement du récepteur du calcium. [0075] Selon ce quatrième aspect, l'invention concerne une composition alimentaire ou pharmaceutique qui comprend au moins un excipient phannaceuticalement acceptable ou au moins un milieu apte à être ingéré et au moins un mélange de souches selon le quatrième aspect de l'invention et/ou au moins un mélange de peptides selon le quatrième aspect de l'invention et/ou au moins le fen-nentat obtenu par fermentation du mélange de souches selon le quatrième aspect de l'invention, dans du lait, notamment de vache, éventuellement écrémé, à une température de 40°C à pH=6 pendant 72h, ledit fermentat étant éventuellement soumis à une ultrafiltration à un seuil de coupure de 10kDa. 16 100761 Selon ce quatrième aspect, l'invention concerne une composition alimentaire ou pharmaceutique qui contient un excipient pharmaceuticalement acceptable ou un milieu apte à être ingéré et au moins un peptide tel que précité ou un mélange de peptides selon le quatrième aspect de l'invention et/ou un mélange de souches selon le quatrième aspect de l'invention. [0077] Selon cc quatrième aspect, l'invention concerne également un produit choisi parmi les produits alimentaires, notamment les laits fermentés, les jus de fruit(s) et/ou de légume(s) éventuellement fermentés, les légumes et/ou fruits fermentés, les champignons fermentés, la charcuterie, les préparations alimentaires à base de poisson(s) et les produits laitiers obtenus à partir de lait éventuellement écrémé, de vache, de chèvre, de brebis ou d'un mélange de laits qui contient un mélange de souches selon le quatrième aspect de l'invention et/ou au moins un mélange de peptides selon le quatrième aspect de l'invention et/ou une composition alimentaire ou pharmaceutique selon le quatrième aspect de l'invention. [0078] Avantageusement, la composition alimentaire ou pharmaceutique contient une concentration desdites souches égale ou supérieure à 107 CFU par gramme de produit et/ou une concentration en peptides lesquels sont identiques ou différents supérieure ou égale à 4 mg par gramme. Définitions [0079] Le ternie « lait », en l'absence de précision fait référence à du lait de vache. [0080] Le terme « yaourt » fait référence à un produit laitier élaboré par fermentation par ajout de bactéries lactiques Streptococcus thertnophilus et Lactobacillas delbrueckii subsp. bulgaricus. [0081] Le ternie « lait fermenté » fait référence à un produit laitier obtenu par coagulation des caséines suite à l'ajout d'un ferment lactique dans le lait. [0082] Le terme « fermentat » désigne le surnageant obtenu à la fin de la fermentation. [0083] Les termes « augmenter l'absorption du calcium » et autres termes relatifs font référence à la capacité de la souche ou des peptides à augmenter le passage global du calcium à travers la paroi intestinale d'un mammifère (entre les cellules de cette dernière du fait de l'augmentation de l'expression du gène cld-2, par exemple), ou à augmenter la fluorescence dans des cellules Caco-2 comme indiqué dans la partie expérimentale (passage plus important du calcium à travers les cellules de la paroi intestinale) ou à augmenter l'expression d'au moins un gène choisi parmi trpv6, et vdr chez les cellules intestinales comme indiqué dans la partie expérimentale de la présente demande (meilleure absorption par les cellules elles-mêmes). [0084] Les termes « résistante à l'acidité » font référence à la classe 3 indiquée dans la partie expérimentale de la présente demande en référence à la résistance à l'acidité. [0085] Le terme « probiotique » fait référence à un microorganisme susceptible de survivre 17 dans l'intestin d'un hôte, notamment un humain et d'interagir avec les cellules de la paroi intestinale et/ou d'interagir avec les autres microorganismes vivant dans l'intestin de l'hôte et d'exercer un effet bénéfique pour la santé de l'hôte. [0086] Le terme « hypocalcémie » désigne une concentration en calcium dans le sang, corrigée avec le taux d'albumine inférieure à 2,20 mmol/L. [0087] Le terme « ingrédient actif » signifie que l'ingrédient considéré (peptide, mélange de peptides et/ou souche) est contenu dans une quantité/concentration permettant d'obtenir un effet technique au moins in vitro sur r inhibition de l'ACE et/ou sur l'absorption du calcium. [0088] Le terme « sujet » fait référence à un humain ou un animal, notamment un mammifère (en particulier, le chien, le chat, une volaille, un ovin, un bovin, un caprin ou un reptile). [0089] Le terme « traitement » englobe à la fois le traitement préventif (prophylactique) et le traitement permettant d'obtenir une amélioration d'au moins un symptôme de la pathologie considérée. [0090] Le pourcentage d'identité fait référence au pourcentage de résidus d'acides aminés identiques entre la séquence à comparer et la séquence de référence, en alignant la totalité de la séquence comparée à la séquence de référence. La séquence protéique qui présente un % d'identité avec la séquence de référence peut ainsi comprendre des insertions ou des délétions. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles un résidu d'acide aminé identique, est observé pour les deux séquences comparées, puis en divisant le nombre de positions pour lesquelles il y a identité entre les deux bases nucléiques, ou entre les deux résidus d'acides aminés, par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par cent afin d'obtenir le pourcentage d'identité en nucléotides ou en acides aminés des deux séquences entre elles. [0091] Les peptides définis par leur % d'identité peuvent ainsi comprendre une ou plusieurs délétion et/ou une ou plusieurs substitutions, l'insertion ou la substitution par un acide aminé dextrogyre, le remplacement du groupe terminal acide carboxylique et/ou du groupe terminal amine par un groupement protecteur, par exemple, l'introduction d'une liaison de type rétro (c'est-à-dire une liaison peptide -NH-00- issue de la réaction entre la fonction amine du premier acide aminé dans la séquence avec la fonction acide carboxylique de l'acide aminé suivant dans la même séquence) ou l'introduction d'une liaison de type rétro-inverso (c'est-à-dire l'introduction (l'une liaison peptidique de type rétro précité avec un acide aminé dans la configuration inverse que celle de l'acide aminé de la séquence de référence) ou comprendre une plus longue chaîne d'acides aminés. [0092] Quel que soit l'aspect de l'invention, les peptides peuvent être phosphorylés ou non. 18 100931 Une composition pharmaceutique est définie comme étant une composition contenant un ingrédient actif et un excipient pharmaceuticalement acceptable et notamment choisi parmi l'eau, les huiles, les alcools, notamment l'alcool éthylique, les huiles végétales, les cyclodextrines, l'amidon, la maltodextrine, le lactose, saccharose, le propylène glycol et le sérum physiologique. [0094] Le terme « constitué » quand il est utilisé en référence à un ou des peptides indique que le mélange ou la composition contient en tant que peptide(s) uniquement les peptides cités à l'exception d'autres peptides mais d'autres composés ou constituants tels que des solvants, vitamines, protéines ou autres peuvent être présents. [0095] Un « milieu apte à être ingéré » désigne tout mélange ou tout substance quelle que soit sa phase physique qui peut être ingéré et digéré sans causer de problème au tractus digestif Les excipients pharmacenticalement acceptables et notamment les exemples cités dans la présent demande sont des milieux aptes à être ingérés. [0096] Dans toute la présente demande, les séquences sont indiquées classiquement dans le sens de leur extrémité N terminale vers leur extrémité C-terminale. [0097] Dans toute la présente demande, la souche VFH049 peut également être dénommée VF49d. [0098] Dans toute l'invention, le terme « souche » fait référence sans distinction à la souche vivante, c'est-à-dire capable de se développer dans un milieu nutritif adapté et à la souche inactivée, c'est-à-dire morte et donc incapable de se développer dans un milieu adapté à son développement. Figures [0099] Jig.lj : la Fig. I représente des photographies au microscope électronique de chacune des trois souches de l'invention ; la photographie la plus à gauche représente la souche VF45A, celle du milieu la souche VFH049 et celle de droite la souche VF50b. [0100] Uig.2j : la Fig. 2 représente la carte obtenue par ACP qui évalue les corrélations entre l'activité protéolytique sur gélose-lait, la croissance lors d'une fermentation en milieu liquide (lait), le pH à la fin de la fermentation, la quantité de peptides produits et 5 autres critères liés à l'analyse des profils chromatographiques des peptides produits par les souches (répartition en poids moléculaires apparents) ; [0101] [fig.3] : la Fig. 3 représente les 1050 en mg/mL pour l'activité inhibitrice de l'ACE du contrôle et des fermentats bruts obtenus par fermentations des souches VF45A et VFH049 ; [0102] [fig.4] : la Fig. 4 représente les 1050 en mg/mL pour l'activité inhibitrice de l'ACE du contrôle et des fermentats obtenus par fermentations des souches VF45A et VFH049 et ayant subi une ultrafiltration ; 19 101031 Ifie.51 : la Fig. 5 représente le taux d'absorption du calcium (ratio d'émission de lluorescence/émission basale) du contrôle et des fermentais bruts obtenus par fermentations des souches VF45A et VFH049 ; [0104] [fig-6] : la Fig. 6 représente le taux d'absorption du calcium (ratio d'émission de fluorescence/émission basale) du contrôle et des fermentats obtenus par fermentations des souches VF45A et VFH049 et ayant subi une ultrafiltration ; [0105] [fig.7] : la Fig. 7 représente le taux d'ARNm du gène trpv6 par rapport à celui de la condition PBS des fertnentats bruts obtenus par fermentations des souches VF45A et VFH049 ; [0106] [fig.8] : la Fig. 8 représente le taux d'ARNm du gène trpv6 par rapport à celui de la condition PBS des fertnentats obtenus par fermentations des souches VF45A et VFH049 et ayant subi une ultrafiltration ; [0107] [fig.9] : La Fig. 9 représente les pourcentages d'hydrophobie pariétale obtenus pour les souches testées en fonction de leur classe de tolérance à l'acidité. [0108] [fig.10] : La Fig. 10 représente le taux d'ARNm par rapport au contrôle des gènes vdr, trpv6 et cld-2 obtenu après 24 heures de mise en contact avec la souche VFH049 et la souche VF50b avec des cellules HT-29 MTX. Partie expérimentale Isolation et caractérisation des souches [0109] Les trois souches de l'invention ont été extraites de produits laitiers différents. [0110] Les échantillons de chaque produit laitier sont collectés dans des tubes stériles, gardés à 4°C pendant maximum deux jours avant l'analyse. Les échantillons sont soumis à une série de dilutions dans un tampon salin (solution 0,85% NaC1), puis étalés sur plaques MRS-agar (De Man, Rogosa and Sharpc). Les plaques sont incubées pendant 48 heures à 37°C en milieu anaérobie. Les colonies morphologiquement distinctes sont séparées, repiquées sur des plaques du même milieu pour purification. Afin de s'assurer dc la pureté des isolats, le ré-étalement sur plaque est répété au moins trois fois. [0111] Le Tableau 1 ci-dessous indique les produits laitiers d'où ont été extraites les souches. Tous ces produits laitiers proviennent de Mongolie et ont été préparés à l'automne. [0112] Des observations au microscope optique sont effectuées afin de déterminer la forme des bactéries. Ces observations sont visibles sur la Fig. 1. Le Gram de chaque souche est déterminé de manière classique par la technique de coloration de Gram et observation au microscope. La recherche de la catalase est effectuée pour chaque souche de manière classique par prélèvement de chaque souche sur un milieu gélosé et mise en contact avec de l'eau oxygénée. 101131 Les résultats sont rassemblés dans le Tableau ici-dessous. [0114] [Tableaux I ] Produit laitier source souche catalase Gram forme Espèce Yaourt (lait de yack) VF45A négatif + bacille L. helveticus Lait fermenté de jument VF49d négatif + bacille L. helveticus Yaourt (lait de yack) VF50b négatif + Bacille incurvé L. delhruecku ss hulgaricus Dépôt des souches [0115] La souche Lactobacillus helveticus VF45A a été déposée par la Demanderesse, le 29 mars 2018 auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), cis au 25 rue du Docteur ROUX 75724 Paris Cedex 15 sous le numéro d'ordre CNCM-I-5300 (dépôt selon le traité de Budapest). [0116] La souche Lactobacillus helveticus VFH049 a été déposée par la Demanderesse, le 19 février 2019 auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), cis au 25 rue du Docteur ROUX 75724 Paris Cedex 15 sous le numéro d'ordre CNCM-I-5403 (dépôt selon le traité de Budapest). Dans la suite de la demande, cette souche est également dénommée VF49d. [0117] La souche Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus VF50b a été déposée par la De- manderesse, le 20 avril 2018 auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), cis au 25 rue du Docteur ROUX 75724 Paris Cedex 15 sous le numéro d'ordre CNCM-I-5316 (dépôt selon le traité de Budapest). [0118] Se uence du 'énome codant our l'ARN ribosomi ue 16S [0119] La détermination de la séquence codant pour l'ARN ribosomique 168 des souches a confirmé que les souches VF45A et VFH049 sont bien des souches de l'espèce Lactobacillus helveticus. [0120] De même, l'analyse du génome à confirmer que la souche VF50b est bien une souche de l'espèce Lactobacillus. delbrueckii ssp. bulgaricus. [0121] Détection par PCR des gènes codant pour les protéases pariétales [0122] L'identification des prote-uses pariétales présentes chez les souches sélectionnées est réalisée par détection PCR des gènes codant pour ces enzymes. Les cellules bactériennes sont récupérées des cultures en lait écrémé, l'ADN bactérien est ensuite isolé par utilisation d'un kit wizard genomic DNA purification (Promega, Madison, Etats- 21 Unis). La souche CNRZ32 CIRM-BIA 103 de Lactobacillus helveticus (fournie par le Centre International de Ressources Microbiennes - Bactéries d'Intérêts Alimentaires, CIRM-BIA, INRA, Rennes, France) a été utilisée comme contrôle pour les gènes de Lactobacillus helveticus. Cette souche (CNRZ32), est connue pour posséder les 4 gènes pi-EH (prtH1 à prtH4). [0123] Chaque souche est testée pour 5 couples d'amorces correspondant à 5 gènes différents à savoir,prtB.prifil.prtf-12.prtH3 et prtH4. Les amorces décrites par Hou et al., 2015 sont utilisées pour la détection de prtB chez Lactobacillus delbrueckii. Concernant les souches de Lactobacillus helveticus, les amorces décrites par Gcnay et al., 2009 sont utilisées pour la détection des gènes prtH1 ct prtH2 et enfin celles décrites par Broadbent et al., 2011 pour la détection de prtH3 et prtH4. [0124] Les réactions PCR sont conduites dans un volume final de 25 FIL comprenant 12,5 FIL de PCR Master Mix (2x) (ThermoFisher Scientific, Waltham, Etats-Unis), 2 FIL de chaque amorce (12,5 pM), 2 FAL d'ADN bactérien extrait (environ 200 ng.pL-') et 6,5 FIL d'Hf/ Les cycles PCR sont réalisés dans un thermocycler labcycler (SensoQuest, Gtittingen, Allemagne). Après une première dénaturation à 95°C pendant 5 min, 30 cycles de PCR sont répétés successivement, un cycle se compose d'une dénaturation à 95°C pendant 30 sec, d'une hybridation pendant 1 min à la température d'hybridation requise pour chaque amorce et d'une élongation à 72°C pendant 30 sec (4 min pour le gène prtH4). Une dernière élongation à 72°C pendant 10 min a lieu après les 30 cycles PCR. Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose à 1 % (m/v) préparé dans un tampon TBE (Tris, Borate, EDTA). La révélation des fragments d'ADN est réalisée par l'ajout dans le gel de 0,008 % (v/v) de GelRec10 (10.000x) (Biotium, Fremont, Etats-Unis). Dix pL de produits PCR sont mélangés avec 4 pL de tampon de charge (6x) (ThermoFisher Scientific, Waltham, Etats-Unis) avant d'être déposé sur le gel d'agarose. Le mélange O'GeneRuler DNA Ladder Mix (ThermoFisher Scientific, Waltham, Etats-Unis) est utilisé comme marqueur de taille. La migration a lieu pendant 45 min à un voltage constant de 100 V. Les produits d'amplification sont révélés au Gel D0cTM (Bio-Rad, Hercules, Etats-Unis). [0125] Les résultats sont présentés dans le Tableau 2 ci-dessous. Le gène prtB est détecté pour la souche VF50b de Lactobacillus delbrueckii mais pas chez les souches VF45A et VFH049 de Lactobacillus helveticus. Le gène prtH1 est détecté pour la souche VFH049 de Lactobacillus helveticus et dans le contrôle. De manière intéressante, d'autres souches (non représentées) ont été testées et il s'avère que toutes les souches de Lactobacillus helveticus présentant le gène prtH1 ont été isolées à partir de lait de jument fermenté. Les gènes prtH2 et prtH3 sont détectés chez la souche VF45A de Lactobacillus helveticus et dans le contrôle. Le gène prtH4 est détecté dans le contrôle, mais pas dans les souches testées. [0126] [Tableaux2] $pughe prtelo prtH21 prt ".3i prtHe rni VF5Obe I... Li Li Li +e Lait-de'yake akerni CNR232 12, tmeec +0 +0 +0 t CR t N - VF49du tele .s4 -fr. Li Laittle,jumentu VF45Az L.. +n tu r u Lait-de'yaku Sie [0127] Détermination de l'activité protéolytique et fermentaire des souches [0128] Les tests utilisés couvrent à la fois la capacité fermentaire (rapidité de croissance, acidification) et l'activité protéolytique (capacité à hydrolyser les protéines). En fait., les deux aspects sont largement liés, la capacité des bactéries à croître dépend en effet de leur capacité à hydrolyser les protéines (puisqu'elles ont besoin des acides aminés libérés lors de l'hydrolyse pour assurer leur croissance). Il est aussi déjà connu qu'acidification du milieu et hydrolyse des protéines sont corrélées. [0129] 1. Echelle du laboratoire - fermentation sans contrôle de pH [0130] Détermination de l'activité protéolytique selon la méthode des géloses au lait [0131] Chaque souche est cultivée dans des puits de gélose-lait ; l'apparition d'un halo autour du puits témoigne d'une protéolyse. La mesure du diamètre du halo permet d'évaluer les capacités protéolytiques de la souche. La gélose-lait est préparée en mélangeant dans l'eau une poudre de lait écrémé (Sigma-Aldrich, St Louis, Etats-Unis) à une concentration de 5 % (m/v) supplémenté d'agar à 1,5 % (m/v). Après stérilisation à 110°C pendant 10 min, le lait est coulé dans des boites de Pétri. Des puits de 4 mm de diamètre sont ensuite formés dans la gélose. La souche est cultivée en milieu MRS (Gélose de Man, Rogosa, Sharpe) liquide pendant 48 h à 37°C en condition anaérobie. Les cellules bactériennes sont ensuite lavées deux fois dans du milieu MRS puis finalement re suspendues dans un volume de milieu MRS permettant d'obtenir une DO 600 égale à 1 (spectrophotomètre Prim, Secomam, Groupe Aqualabo, Champigny, France). Un volume de 20 pL de la suspension bactérienne est déposé dans les puits de gélose-lait. Les plaques inoculées sont ensuite incubées pendant 72h à 37°C en conditions anaérobies. L'activité protéolytique des souches est quantifiée en mesurant le diamètre (exprimé en mm) des halos apparus autour des puits après incubation. 23 Cultures en lait écrémé : croissance, pH 101321 A partir d'une culture bactérienne en milieu MRS liquide, une pré-culture de 5 mL est réalisée dans un milieu composé à 100 % de lait écrémé UHT (Cora, Paris, France), pendant 72h à 37°C, en condition anaérobie. La souche est ensuite inoculée dans un volume final de 30 mL du même milieu, avec une DO600 initiale de 0,3. Les cultures ont lieu pendant 48h à 37°C en condition anaérobie. En tant que contrôle, le même milieu lait non inoculé (Lait NI) est incubé dans les mêmes conditions. A la fin de la fermentation, l'acidité du milieu est évaluée en mesurant le pH par un pH mètre (Mettler Toledo, Greifensee, Suisse). Pour l'évaluation de la croissance bactérienne, une mesure directe de la DO ne peut être réalisée à cause de l'opacité du milieu. Le phénomène de coagulation des caséines après fermentation est également un problème, les caséines précipitant dès que le pH est inférieur à 4,6. Un protocole préalable de récupération des cellules bactériennes à partir de la culture lait est donc réalisé. Un volume de 1 mL de culture est dilué (1/10) dans une solution d'EDTA 2% (m/v) à pH 12, ceci afin de rc suspendre complètement les caséines précipitées. Les cellules sont ensuite récupérées par centrifugation à 13.400 rpm pendant 10 min. Cc protocole est répété une seconde fois et le culot bactérien obtenu est re suspendu dans 1 mL de tampon PBS. La mesure de D0600 est réalisée à partir de cette suspension, le blanc est obtenu en réalisant le même protocole avec du lait non inoculé. [0133] La croissance cellulaire et le pH ont été mesurés après 48h d'incubation en lait écrémé. Les souches de Lactobacillus helveticus présentent une croissance très rapide, atteignant une OD600moyenne de 2.7 alors que les souches de Lactobacillus delbrueckii atteignent seulement 0.85 en moyenne. [0134] L'acidification du lait inoculé a été comparée à celle du contrôle (Lait NI). Le pH initial du lait non inoculé était de 6.5, il a atteint 6.45 après 48h d'incubation. Dans presque tous les cas les souches de Lactobacillus helveticus ont conduit à une diminution du pH de 3 unités, atteignant une moyenne de 3.68, alors que le pH des échantillons inoculés avec la souche de Lactobacillus delbrueca a diminué de 2 unités pH au maximum, atteignant une moyenne de 4.57. Dans tous les cas, la fermentation a abouti à la coagulation du lait car les caséines précipitent lorsque le pH descend en dessous de 4,6. [0135] Mesure des quantités de peptides produits et de leur répartition en poids mo- léculaire [0136] Les peptides produits au cours de la fermentation des souches sont analysés par deux méthodes. Les concentrations en peptides sont évaluées d'abord par dosage au réactif de Folin-Ciocalteu (FC) ; les peptides sont également analysés en fonction de leur répartition en poids moléculaire apparent par chromatographie d'exclusion stérique (SEC). 24 [0137] Extraction et purification des peptides produits [0138] A partir des cultures en lait écrémé, un prélèvement de 4 mL est réalisé puis mélangé à un volume de 400 pL d'une solution d'acide trichloroacétique (TCA) à une concentration de 10% (m/v) pour atteindre une concentration finale en TCA de 1 %. L'ajout d'une telle concentration de TCA permet la précipitation des protéines de haut poids moléculaire. Après une centrifugation à 10.000 rpm pendant 10 min, le surnageant contenant les peptides est récupéré. [0139] Les peptides sont ensuite purifiés à partir du surnageant afin d'éliminer le TCA, les sucres, et les sels. La purification est réalisée par une extraction en phase solide (SPE), le principe de cette méthode est une séparation des composés d'un mélange par adsorption sélective sur une phase solide. Des micro-colonnes Bond Elut C18 (1000 mg) (Agilent Technologies, Santa Clara, Etats-Unis) sont utilisées. ; il s'agit de colonnes composées d'une phase solide de silice greffée avec des groupements CI, permettant la rétention de composés hydrophobes. Les colonnes sont équilibrées en passant un volume minimum de 10 [1-IL d'une solution d'acétonitrile (ACN) 100% supplémenté de 0,1 % d'acide trifluoroacétique (TFA) (v/v). Après un rinçage de la colonne par une solution d'FLO contenant 0,1 % de TFA (v/v), un volume de 4 mL de surnageant contenant les peptides extraits est ensuite chargé sur la colonne. Un nouveau rinçage à supplémenté de 0,1 % de TFA permet d'élucr tous les composés non retenus par la colonne. Les peptides retenus sont finalement élues dans un volume de 2 [1-IL d'une solution d'ACN à 80 % (v/v), 20 % d'H20 (v/v) et contenant 0,1 % de TFA. Les échantillons sont ensuite stockés à -20°C jusqu'à analyse. [0140] Dosage au réactif de Folin-Ciocalteu [0141] Les peptides extraits sont quantifiés par un dosage au réactif de Folin-Ciocalteu (FC). Il s'agit d'une solution de tungstate et molybdate de sodium préparés dans les acides phosphorique et chlorhydrique. Le complexe d'acide phosphotungstique et d'acide phosphomolybdique de couleur jaune est réduit par des résidus de tyrosine, tryptophane, cystéine ou encore par des liaisons peptidiques en milieu alcalin pour donner une couleur bleue. L'apparition de la couleur bleue, proportionnelle à la concentration en peptides, est suivie par spectrophotométrie. Pour le dosage, la réaction est réalisée dans un volume final de 800 pL comprenant 200 pL de peptides extraits, 500 pL d'une solution de carbonate de sodium (NaHCO,) à 500 mM et 100 pL de réactif de Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, St Louis, Etats-Unis). La réaction est incubée à 37°C à l'obscurité pendant 30 mm, puis la DO à 750 nm du mélange est mesurée par un spectrophotomètre Prim (Secomam, Groupe Aqualabo, Champigny, France). Le blanc est réalisé à partir de la solution servant à éluer les peptides des colonnes SPE (80 % ACN, 20 % FLO, 0,1 % TFA). La concentration dans les échantillons est déterminée par une gamme étalon d'une solution commerciale de peptides (peptide digest assay standard, ThermoFisher Scientific, Waltham, Etats-Unis). [0142] Analyse par chrotnato2raphie d'exclusion stérique [0143] Le but de la chromatographie d'exclusion stérique (SEC) est la séparation des composés d'un mélange en fonction de leurs tailles ou volumes hydrodynamiques. Dans cette étude, la SEC permet d'analyser la répartition en poids moléculaire apparent des peptides extraits après fermentation. La colonne utilisée pour la séparation des peptides est une Superdex Peptide 10/300 GL (10 x 300-310 mm, 13 prn, GE Healthcarc, Little Chalfont, Royaume-Uni) branchée sur un système de purification AKTA Protein (GE Healthcare, Little Chalfont, Royaume-Uni). Un volume de 25 pL, d'échantillon est élué en condition isocratique dans un solvant composé de 30 % d'ACN (v/v), 70 % d'Hf) (v/v) et 0,1 % de TFA (v/v), à un débit de 0,5 mL/min pendant 60 min. Un détecteur UV à 214 nm permet la détection des liaisons pcptidiques. La quantité de peptides dans les échantillons est analysée par intégration des profils obtenus par SEC. Deux gammes de poids moléculaires ont été choisies pour les intégrations, la première concerne les peptides de poids moléculaire apparent supérieurs à 1.700 Da (appelée PHPM, peptides de haut poids moléculaire) et la deuxième les peptides de poids moléculaire apparent inférieurs à 1.700 Da (appelée PBPM, peptides de bas poids moléculaire). La quantité de peptides appartenant à chaque classe de taille est exprimée soit en pourcentage de l'aire totale du chromatogramme (% PHPM et % PBPM), soit en pourcentage de l'aire du chromatogramme obtenu pour la condition contrôle lait non inoculé (% PHPM/Lait NI et % PBPM/Lait NI). [0144] Les mesures de concentration à l'aide du réactif PC ont montré une augmentation de la quantité de peptides après 48 h, avec des concentrations supérieures à 4 g/L dans tous les cas, contre 2/06 g/L dans l'échantillon non inoculé. [0145] La souche Lactobacillus helveticus VF45A est l'une des souches les plus efficaces avec une concentration finale en peptides supérieure à 6 g/L (voir Tableau 3 ci-dessous). [0146] Le poids moléculaire des peptides générés a été analysé par SEC comme précité. La quantité de peptides appartenant à chaque classe de taille (inférieure ou supérieure à 1.700 Da) est exprimée soit en pourcentage de aire totale du chromatogramme (% PHPM et % PBPM), soit en pourcentage de l'aire du chromatogramme obtenu pour la condition contrôle lait non inoculé (% PHPM/Lait NI et % PBPM/Lait NI). L'inoculation et la fermentation conduisent à une augmentation des peptides de bas poids moléculaire par rapport au contrôle (1.5 fois en moyenne pour les souches de Lactobacillus elelbrueckii, 4.2 fois en moyenne pour les Lactobacillus helveticus). [0147] Les résultats obtenus pour chaque souche sont regroupés dans le tableau 3 ci- 26 dessous. [0148] [Tablcaux3] , e CroiSsa ! (pH) o %PBP /Cura %PHIVIP%PBPIV1 1 ace- ! /Cura gélose' (0D)o Aire' ' gélose- Dosage Aire, ; ouche lait- ation- réactif' totale- ! I Munie FC19/1.) Offlic ! 6,45± xe 2,06* 347.5 85,62±- 2,72e 14:39* 2,72e 40,90.; 4,26e 60,1* 377e 100e 100=5 140,377 .±.28,22r 514,7* 8667= ! O,O5 0,973-.±- 0,62e ±-42,8 6,22a 21,12* 1,81a ! NiSIVie x 4,51,±(0 0,199e 4,89* 11 40* 37,35,±- 11,95e ! 3,32* 3:57-±. 0,3a ±.i25tj 3,74 ! 0,04a 0,12a _ 289:95, ! 1,32e ±-52e 1 VE50be 3 ±-1,5 ! ! ! ! VE45 32-±,4e ! ! . ! ! VF49(IL ,3` 2,72* 4,46* 225,08, 58,56-± 14,51e 42,19±- 14,63e 43,87* 29,24a 263,68, ! 3,4 O,0i 0,05a 0,46e 1±-118,31 3 ±-77,95= [0149] Les analyses en composantes principales (ACP) sont réalisces avec le logiciel R (R core tcam, 2016, Vienne, Autriche), sur le package R Commander et son plug-in FactorMineR. [0150] Une analyse ACP a pris en compte 9 paramètres quantitatifs : l'activité protéolytique sur gélose-lait, la croissance lors d'une fermentation en milieu liquide (lait), le pH à la fin de la fermentation, la quantité de peptides produits, et 5 autres critères liés à l'analyse des profils chromatographiqucs des peptides (répartition en poids moléculaires apparents. La Fig. 2 montre la carte obtenue. Les composantes principales Diml et Ditn2 représentent 60.82% et 23.56% de la variance totale, respectivement. Une corrélation positive est observée entre la valeur du pH et les peptides de haut poids moléculaire. De plus, la croissance est corrélée à une série de variables liées à la production de peptides (quantification par réactif FC, %PBPM, %PBPM/Lait NI) et au diamètre du halo de protéolyse. La valeur du pH et les peptides de haut poids moléculaire sont corrélés négativement avec des variables comme la croissance, la proportion de PBPM et le halo de protéolyse. [0151] 1. Production des peptides à pH contrôlé, ultrafiltration, identification des peptides Fermentation en bioréacteur [0152] Chaque souche est cultivée en bioréacteur de 500 mL (MiniBio 500, my-Control, Applikon Biotechnology, Delft, Pays-Bas). Le milieu est constitué de lait écrémé (10 g/L (voir paragraphe précédent), autoclave 30 min à 110°C. La souche est inoculée à une D0600 égale à 0,3. La fermentation est conduite pendant 72h à une température constante de 40°C avec une agitation de 300 rpm dans un volume final de 330 mL La 27 condition anaérobie est obtenue par injection de N, dans le bioréacteur à un débit de 20 mL/min. Tout au long de l'expérience, le pH est maintenu à 6 grâce à des solutions d'HCI (1 M) et de NaOH (3 M), l'approvisionnement est réalisé au moyen de deux pompes péristaltiques localisées sur l'unité de contrôle du bioréacteur. Des prélèvements d'environ 5 mL sont réalisés en condition d'asepsie à 0,2, 17, 24, 41, 48,65 et 72h de fermentation pour analyse de la croissance des souches bactériennes ainsi que de l'évolution de la concentration en peptides. Cette dernière est évaluée par un dosage au réactif FC après une précipitation au TCA. Un volume de 1 mL de fermentât est dilué (1/10) dans une solution d'EDTA 2 % (m/v) à pH 12 puis centrifugé à 13.400 rpm pendant 10 min, et 25 pL, de surnageant sont analysés par SEC. Le culot bactérien est re suspendu dans 1 mL de tampon PBS pour mesure de la DO,(') afin d'évaluer la croissance bactérienne. Après 72h de fermentation, l'intégralité du fermentat est récupérée puis centrifugée à 10.000 rpm pendant 10 min, le surnageant est ensuite stocké à -20°C jusqu'à analyse. La concentration en matière sèche dans les fcrmentats est mesurée au dessiccateur (XM60, Precisa, Poissy, France) et est toujours égale à 100 g/L. Afin de pouvoir confirmer l'impact de la fermentation bactérienne sur les propriétés du produit final, un contrôle est réalisé (CTLF). Il s'agit du milieu de fermentation incubé dans les mêmes conditions mais non inoculé. Après 72h d'incubation, ce milieu est centrifugé et stocké comme les autres fermentations. [0153] Identification des peptides produits lors de la fermentation à pH contrôlé [0154] Afin d'éliminer les protéines non hydrolysées, une partie du fennentat brut est fractionnée au moyen d'une membrane d'ultrafiltration. La membrane est une cassette Hydrosart0 (Sartocon® Slice Hydrosart0 Cassette, Sartorius, Giittingen, Allemagne) de 0,1 m2 avec un seuil de coupure de 10 kDa branchée sur un système Sartocon0 Slice 200 Holder (Sartorius, Gôttingen, Allemagne). L'alimentation du fermentat est réalisée par une pompe péristaltique et la pression du rétentat est maintenue à environ 1 bar pendant la filtration. Ainsi, le pet-méat d'ultrafiltration (UFP) contenant les molécules inférieures à 10 kDa est séparé du rétentat (UFR). Les deux sous-fractions sont ensuite conservées à -20°C jusqu'à analyse. Les pet-méats d'ultrafiltration sont séchés jusqu'à 10 % du volume initial par évaporation centrifuge (miVac, Gene Vac, Ipswich, Royaume-Uni) pendant 15h à 40°C. La concentration en matière sèche dans les produits (fermentat et fermentat ultrafiltre) est ensuite mesurée au dessiccateur (XM60, Precisa, Poissy, France). [0155] Les peptides purifiés par SPE à partir des surnageants de culture (non ultrafiltrés) sont séchés par évaporation centrifuge (miVac, Gene Vac, Ipswich, Royaume-Uni) pendant 2h à 40°C puis re suspendus dans 100 pL d'EL() contenant 0,1 % de TFA (v/v) et centrifugés pendant 10 min à 8.000 rpm. Dix microlitres d'échantillon sont injectés sur une colonne Cig-Kinetex (150 x 4,6 mm 26 pm, 100 À. Phenomenex, Torrance, 28 Etats-Unis), branchée sur un système chromatographique d'Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) Acquity (Waters, Manchester, Royaume-Uni). Un gradient linéaire d'ACN contenant 0,1 % d'acide formique (AF) (v/v) est utilisé (de 5 à 15 % d'ACN pendant 30 min, puis de 15 à 30 % d'ACN pendant 60 min, de 30 à 50% d'ACN pendant 10 min et enfin de 50 à 95 % d'ACN pendant 10 min) avec un débit de 500 L.min-,. Les éluants d'UPLC sont directement pulvérisés par électrospray à un voltage de 3 kV, la désolvatation est réalisée par utilisation de diazotc (N,) à un débit de 600 L.h-I à une température de 300°C. Le système chromatographiquc est couplé à un spectromètre de masse Synapt-G2-Si (Waters, Manchester, Royaume-Uni). Les mesures MS sont faites en mode data dependent (data &pendent analysis, DDA) et les datas sont récupérées dans une gamme de masse allant de 100 à 2000 m/z. Un maximum de 15 ions précurseurs avec un seuil d'intensité de 10.000 sont sélectionnés pour fragmentation par la méthode de dissociation induite par collision (CID) à une puissance de 8 à 9 V pour les faibles masses et une puissance de 40 à 90V pour les niasses élevées. Les spectres MS/MS sont récupérés dans une gamme de masse allant de 100 à 2000 m/z. Les spectres sont traités par le logiciel Mass Lynx (version 4.1.) (Waters, Manchester, Royaume-Uni). L'analyse de l'échantillon contrôle (CTLF) a permis de définir l'hétérogénéité de base. 596 peptides provenant de 22 protéines de lait (asi-caséine, ri-caséine, (1v-caséine, GLYCAM1, 1c-caséine, BTN1A1, lactoglobuline, FGFBP, lactoperoxidase, ostéopontinc, péril ipinc, collagène a2, TRIP& NPT2B, acylCoA désaturase, dysferline, C008, B4GT1, PSME4, DHX9, RALYL et apolipoprotéine A2) ont été identifiés dans cet échantillon. 32% d'entre eux proviennent de la 13-caséine. Par comparaison, entre 150 et 722 peptides ont été identifiés dans les échantillons fermentés par les différentes souches testées. Dans ces échantillons, les peptides de 13-caséine représentent 44 à 67% de toutes les séquences identifiées. En raison de la prépondérance des peptides de 13-caséine parmi les peptides identifiés, et de l'abondance naturelle de la 13-caséine dans le lait, seuls les peptides issus de la 13-caséine seront étudiés. Les peptides produits par les souches de l'invention sont donc tous issus de la protéolyse de la 13-caséine du lait de vache. La recherche en banque de données est réalisée via le logiciel Peaks Studio (version 7.0.) (Bioinfonnatics Solutions, Waterloo, Canada) en utilisant la base de données UniProt (le 15 Mai 2017) restreinte au protéome complet de l'espèce Bos tains. Les seuils de tolérance des masses des ions précurseurs et fragments sont définis à 35 ppm et 0,2 Da. Les séquences peptidiques identifiées par le logiciel sont filtrées selon un taux de faux positif (false discovery rate) strictement inférieur à 1%. [0156] Pour toutes les souches, les peptides identifiés proviennent du fennentat qui n'a pas subi d'ultrafiltration. Ces mêmes peptides devraient également se retrouver au vu de leur masse dans le fermentat ultrafiltré. 29 [0157] Il est à noter que lors de l'identification des peptides, les peptides pouvant provenir de la levure ont été considérés. Après analyse par spectrométrie de masse, la Demanderesse a constaté en utilisant les hases de données, qu'aucun peptide provenant de la levure n'était présent dans le fermentat ultrafiltre ou non. [0158] Le tableau 4 regroupe les peptides non phosphorylés et considérés comme nouveaux qui sont produits par la souche VF45A selon la méthode de fermentation indiquée ci-dessus à pH 6. [0159] Le tableau 5 regroupe les peptides phosphorylés et considérés comme nouveaux qui sont produits par la souche VF45A selon la méthode de fermentation indiquée ci- dessus à pH 6. [0160] [Tableaux4] [0161] VI,PVPQKAVPYPQ DrePiQAF DE LQD K1H PF EDELQ0KUIPF EEQQQTEDELQDKf HPF EQQQTEDELQDMHPF MHPF QTEDELQDKiNPF QQTEDELQDKIHPF EDELQ0Kf HPF TED ......... TE D KM [Tablcaux5] [0162] Le tableau 6 ci-dessous regroupe les peptides non phosphorylés et considérés comme nouveaux qui sont produits par la souche VFH049 selon la méthode de fermentation indiquée ci-dessus à pH 6. [0163] Le tableau 7 regroupe les peptides phosphorylés et considérés comme nouveaux qui sont produits par la souche VFH049 selon la méthode de fermentation indiquée ci-dessus à pH 6. [0164] 11 est connu que les peptides phosphorylés peuvent être actifs dans l'absorption du calcium (confère la publication intitulée « Casein phosphopeptide promotion of calcium uptake in HT-29 cells - Relationship between biological activity and supramolecular structure » de Gravaghi, C., et al. publié en 2007, FEBS J. 274, 4999-5011. 43 QAMEDWZNIE -1\TIE-61K-Q- NsTEA-E- ESTEDQAME STEDQAME ' EQQ AMED1KQM 26 GSESTEDQAME.DIKQME 27 HNSLPQ 23igGSESTEDQAMEDIKQM 29 tGSESTEDQAMEDIKQM SESTEDQAMEDiKOM F QAMEMK SESTEUQAMEWKQM AMED1KQME MCWIEAE Eln/PN ANIEDWQM AMEDÏKQME Di KeMEAE 40 SESTEDOANIEDIK 411SESTEDOAMED/KOM 31 doi:10.1111/j.1742-4658.2007.06015.x. [0165] [Tablcaux6] SEafliwO petide 44 SLVYPFPGPIH S PQN 45 SIMYPFPGPIPIMSLPQN ILEIIIPN 46 KYKVPQLEtVP61 SIWYPFPGPIPIN 47 48 49 PtrfPVEPFFESQ .........______________,...._,...._....._....._....._....._..., PKIWEPFTESQ 51 MPFPKYPVEPFTESQ 52 S3 HKEMPFPKWVEPFTESQ EMPFPKIIPVEPFTEQ 54 11.110VEN 55 Y/PR:ISM« SE SLVYIPFPGPILIN LVVPFPGP111$ 57 59 TPINVPPFLQPIEVAEGVSKVICEAMAP LPIPTIQ 60 PPM:1 61 Nipprret 61 k. 63 KAVPYPQ 120114511142 65 66 LVYPFPGPIIINSIPQ 67 SWYMPEPHEINSIPQ 68 TOM/En 69 TEDELOOKIHPF 70 SIMIPPIF 71 ELQDK1HPF 72 NIPPLIQTPINVPPF HKEMÏPFPKYPVEPF 73 74 DELQ1311114PÉ [0166] 32 [Tableaux7] [0167] Le tableau 8 ci-dessous regroupe les peptides non phosphorylés et considérés comme nouveaux qui sont produits par la souche VF50b selon la méthode de fermentation indiquée ci-dessus à pH 6. [0168] Le tableau 9 regroupe les peptides phosphorylés et considérés comme nouveaux qui sont produits par la souche VF50b selon la méthode de fermentation indiquée ci-dessus à pH 6. [0169] ASPEVIE EASPEVIESPPEINTVQ 75 76 KDIGSEST Itf-QSEE .T 79 MEM-Rif SEEQQQfEDELQ SEEQQQT EDELQDKIHPF T I. [ASPE TL EASPEVIESPPEINTVQ TEE VI ESPPEINTVQ 86 VPQEE IVP6ISAEERI., 84 33 [Tablcaux8] SEQ ID NO pptîde : SEQ te P40 8?SLWPFN5PPN5IPQN 125 WMUQPØQPIPPLVMFPFQ SE SITLIDVENIIILPIP1.11-4599 09 OVENUIEPIPLIQ5W 126 MHCWIIQPLPNVMFPPQ 127 11QPI4QPI,PVIVIIAIPPQ us 5111515Q5KVEPVPQ 129 KV KAVINPQ 54) VENtIFIPIPLICISW 91 NURPEP11125W IFIFFIPUMSW 130 k.ttflaJk41J2stÛa 93 141PIPLI.Q5W 131 S1SQSKVLINPQ 94 AQTQStVYPIP6PIPN 95. 5111YPFPGPIPN 132 LSQSKVLPVPQXAVPYPQ 133 1.5I/SKYLPVPQ NSXVKEAPAAPXHKEMPFPKYPVEPFTESQ tiVSKYKEAMAPKUKFRAPEPKYPVIP/FESQ ! 134 SQKVtPVPQIÇAVflPC1 13.S SCISICVIF'VPI1 98 KVK1AMAflHtEMPFPKYPvFP1-1ESQ 1.36 SKVI PVPQLAVPYPQ INIAN9 Mine E 1 / 13 VIPVPQIUMPYPQ 100 APK PAPIP IN IFSQ 138 KAVPVPQ fil MAPXHVEMPIPI(YPWPFIfSQ 139 II1VENI 107 APKUKLMPFPkYWLN-FESQ 140 WÉi5C,rVLPVPQtAVPYPQRUMPtON 103 KIIKEMPIPKYF'VIPFIEUQ 141 51-9QSXVIINPQKAVPIPQRDMPRME 104 K PF K -PFTEIQ 142&XVUMQKMVYPC1IWMPIQAF 105 KEMPFPKYPVEPFEESQ 143 StVIIVVQKAVPYPQRDMNQAF 106 PAPE a/ 144 107 PFPILYPVEME-3Q 145 KAVPPQR0MP4QAF 108PtYPVEPFOESQ 146 VPYPQRDMPIQAF 109 PFTENt/ 147 EQQQÏEDELQMÇ1HPF 110 5V1.515/1 148 QQQTEOELQDKIHPF 1111.321-RT0vEN 1 1.49 ()E1Q013HPF liffla QTEDELCID 150 IXUWPF MEM "IDE g- QD 114 NIPPLIQTPVVVPP 1 152 NIPPITCHINVVPPE 115 DELQDKIMP1MET 1 153 IPPLICHPVVVPPF 111/ QTEDFLQL>MHPFAQIQ 154 1,wsi. IIIIIIgnl oticenatirrActm US etauurrAQm 156 MAPKIIKEMPF PVIPI IIIIIMM QUMHPF Q APKBKEMPTflÇYPYtPE 120 OIUHPLAQIQ 158 IIKEMPIPKYPVEPF IIIIIEEII NIFILP1P11 I F IV PQ 159 KIMPIPKYPVIPI Mina E IXWMIfQPUWU'VIVMFPPQ 1.60 EMPÎPtYWIPF 111.11521 LQSWMHQPUQPLPVIVMFIWQ 124 SVVMUQP11QPIPPTVMIPPQ 161 MPFPKYPVEPF 34 1Tableaux91 [0171 j Activités biologiques des fermentats et des peptides 10172] Les fermentats (avant et après ultrafiltration) ont été testés pour deux activités bio- logiques, à savoir l'inhibition dc l'ACE et la capacité à moduler l'absorption du calcium. Par ailleurs, la toxicité des hydrolysats a été évaluée. Pour les analyses, les différents échantillons sont dilués dans l'1-1,0 à une concentration de 15 g/L de matière sèche. Test de cytotoxicité 10173] Le but de cette expérience est de tester l'éventuelle toxicité des fermentats envers les cellules intestinales. La viabilité cellulaire est mesurée par l'utilisation du réactif CCK8 (Cell Counting Kit-8), cette méthode est basée sur la réduction d'un sel de tétrazolium par des déshydrogénases cellulaires produisant du formazan dont la formation est suivie à 450 nm. Les cellules Caco-2 sont ensemencées en plaque 96 puits à une densité de 8.000 cellules par puits dans un volume de 200 pL de milieu DMEM complet, et cultivées pendant 7 jours à 37°C, 5 % de CO2. Les fermentats sont dilués dans du milieu DMEM complet à une concentration de Set 10 g/L. Un tampon PBS également dilué dans du milieu DMEM (même facteur de dilution que les échantillons) est utilisé en tant que contrôle. Un volume de 150 pL d'échantillon est déposé dans chaque puits, suivi d'une incubation pendant 7 ou 24h à 37°C, 5 % de CO2 Après incubation, les cellules Caco-2 sont lavées deux fois par du tampon PBS puis un volume de 150 pL de milieu DMEM complet supplémenté avec 5 % (v/v) de réactif CCK-8 (Sigma-Aldrich, St Louis, Etats-Unis) est ajouté dans chaque puits. La plaque est ensuite incubée pendant 2h à 37°C, 5 % de CO2 à l'obscurité, puis lue à 450 nm au SOUCHE le sue ER1.115MKEGni 168 DIFSKECtivni in DIGSESFE ISKRZIVIR 191 SK KOIGSFSIF iSFSTEDEZAIK MISTLWTEK 166 SAFERIPSAII 186 167 DIESESTE 162 SVEQKHK1 wi,svEnetwe 16Eq WIESTEMFIK NREQLSÏSUP&5KK SUI P4 169 ErFeSEE GKEKVNE1SKO sAnat lIS SAFFRI.115/AK SAFERIHSSAKEG i9 SKDIGSFSTEDQAME SK[08/18 1 1745 morean /95 SISEENSTUOVO lii KKIEKRISE 196 SVIentil 178:KKILKIa i 197 SV1Q10182 179 r.------------, KYKREIVPUSAEERtli SVE 1 19SQKHKIKE 199 WCZLE/VPNSAEERLII 175 173 KDIGSESTE 17414KEC1SEEQQQTED KneFECKEOTED41. 1.44 STIR/FTK 1814LtSK VÏR spectrofluorimètre Xcnius XC (Safas Monaco, Monaco, France). La viabilité cellulaire est calculée par rapport à l'absorbance obtenue pour les puits contrôles (correspondant à 100 % de cellules viables). A une concentration de 5 g/L, les fermentats bruts (non filtrés) de chacune des souches de l'invention ne présentent aucune toxicité envers les cellules Caco-2 même après 24h de contact. La même observation est faite pour une concentration de 10 g/L de matière sèche. Les fermentats ultrafiltres de chacune des souches ne présentent pas non plus de cytotoxicité. [0174] Inhibition de l'enzyme de conversion de l'angiotensine [0175] Le but est d'étudier le potentiel inhibiteur des fermentats envers l'ACE. Il repose sur l'utilisation d'un substrat fluorescent, le o-aminobenzoyl-Gly-p-nitro-L-Phe-Pro (Abz-Gly-Phe(NO2)-Pro). L'hydrolyse de cc substrat par l'ACE génère le groupement fluorophore Abz-Gly pouvant être suivi par des longueurs d'onde d'excitation et d'émission de 355-375 nm et de 400-430 nm respectivement. Les échantillons, l'enzyme et le substrat sont préparés et dilués dans un tampon Tris-HCI (150 mM) à pH 8,3 aux concentrations désirées. La réaction d'hydrolyse est conduite en plaque 96 puits dans un volume final de 3001.1L comprenant 501.1L d'échantillon ou de tampon Tris-HCI (pour le témoin négatif d'inhibition), 50 FIL d'une solution d'ACE (0,05 U/ mL) (Sigma-Aldrich, St Louis, Etats-Unis) et 200 pL de substrat Abz-Gly-Phe(NO2 )-Pro (0,45 mM) (Bachcm, Bubcndorf, Suisse). Un témoin ne contenant pas d'enzyme (remplacée par du tampon Tris-HCI) est également réalisé. La plaque est ensuite incubée à 37°C pendant 1h, une mesure de la fluorescence a lieu toutes les 2 min avec des longueurs d'onde d'excitation et d'émission de 365 et 415 nm respectivement par un spectrotluorimètre Xenius XC (Safas Monaco, Monaco, France) équipé d'un bain-marie à 37°C. Les pourcentages d'inhibition et les IC50 des différents échantillons testés sont calculés en fonction du témoin négatif d'inhibition. [0176] Pour l'analyse des activités biologiques (de toutes les activités biologiques testées dans la présente demande), la significativité des résultats est évaluée par une analyse de la variance (ANOVA) à un facteur suivi d'un test de Tukey pour la comparaison multiple des moyennes. La différence entre les moyennes est considérée comme significative pour une p value Modulation de l'absorption du calcium 101871 La majorité du calcium consommé est absorbée au niveau intestinal, deux voies de transport du calcium ont été identifiées dans l'intestin, la voie paracellulaire et la voie transcellulaire. Le transport paracellulaire du calcium est une diffusion passive de cet élément du lumen à la muqueuse intestinale, selon le gradient formé entre ces deux compartiments. Deux protéines sont impliquées dans ce transport, les claudines 2 et 12 (CLD-2 -12) qui font partie des jonctions serrées entre les cellules et agissant comme des canaux calciques (Fujita et al., 2008). Le transport transcellulaire du calcium est un transport actif impliquant l'incorporation du calcium au sein des cellules intestinales par un transporteur appelé TRPV6. Le calcium est par la suite transporté et excrété au pôle basal de la cellule dans la muqueuse intestinale. Ces deux voies de transport du calcium sont régulées par la vitamine D, une hormone qui, une fois fixée à son récepteur nucléaire le VDR (Vitamin D Receptor) agit comme un facteur de transcription contrôlant les gènes des CLD-2 -12 et de TRPV6. [0188] Sur cellules Caco-2, mesure de l'incorporation du calcium [0189] La capacité des fermentats à moduler l'absorption du calcium a été évaluée en utilisant les cellules Caco-2. Le test consiste à mettre en contact les fermentats (concentration de 10 g/L) avec les cellules Caco-2 pendant 7h. Après contact, l'incorporation du calcium par les cellules est évaluée par utilisation d'une sonde intracellulaire capable d'émettre une fluorescence en présence de calcium. Après rinçage des cellules Caco-2, la sonde FluoForte® est ajoutée en suivant les instructions du kit FluoForte® calcium assay (Enzo Life Sciences, Farmingdalc, Etats-Unis), la plaque est ensuite incubée à température ambiante pendant lh, temps de pénétration de la sonde. L'émission de fluorescence est ensuite suivie par un spectrofluori mètre Xcnius XC (Safas Monaco, Monaco, France) avec une longueur d'onde d'excitation à 490 nm pour une émission suivie à 525 nm. L'émission est mesurée pendant 30 sec avec une injection de 25 'IL d'une solution de CaCt, à 250 mM entre 9 et 10 sec de cinétique au moyen d'un module d'injecteurs couplé au spectrotluorimètre. Cette injection provoque une entrée brutale de calcium au sein des cellules intestinales ce qui conduit à une augmentation de l'émission de fluorescence. La capacité des souches bactériennes à moduler l'incorporation du calcium dans les cellules est déterminée par cette augmentation de fluorescence après injection du calcium. Les résultats sont ainsi exprimés pour chaque puits par rapport à la moyenne de fluorescence mesurée entre 0 et 9 sec de cinétique, considérée comme la fluorescence basale d'un puits. Un ratio d'augmentation de fluorescence, pour les différentes conditions de contact, est donc obtenu. [0190] L'effet des fermentats obtenus avec les souches VF45A et VFH049 est comparé avec celui du tampon PBS et celui du fermentat contrôle. Les résultats montrent que les 41 fermentats bruts obtenus avec ces deux souches sont capables de moduler positivement l'incorporation du calcium par rapport au tampon PBS et au contrôle (Fig. 5). Ainsi, le ratio d'émission de fluorescence sur l'émission basale est de 1,08 pour le PBS, de 1,23 pour le fermentat contrôle, de 1,3 pour le fermentat produit par la souche VF45A et de 1,31 pour le fermentat produit par la souche VFH049. Lorsque les fermentats ultrafiltres sont testés, l'effet est cependant moins prononcé pour la souche VF45a que pour la VF49d (Fig. 6). Néanmoins, une tendance à l'augmentation de l'absorption est observée pour les deux souches. [0191] Modulation de l'expression du gène trpv6 chez les cellules Caco-2 [0192] L'objectif de cette partie est d'évaluer la capacité des fermentats à moduler l'expression du gène trpv6 par les cellules intestinales. Une approche par RT-qPCR est conduite en utilisant les cellules Caco-2 comme modèle. Les cellules Caco-2 sont ensemencées en plaque 24 puits à une densité de 40.000 cellules par puits dans un volume final de 500 pL de milieu DMEM complet et incubées pendant 15 jours à 37°C, 5 % de CO, avec un changement du milieu tous les deux jours après 7 jours de culture. Les fermentats sont dilués en milieu DMEM complet à une concentration de 10 g/L de matière sèche. Le tampon PBS dilué dans le milieu DMEM (même facteur de dilution que pour les échantillons) est utilisé en tant que contrôle. Après incubation, les cellules sont lavées deux fois par du tampon PBS, puis un volume de 300 pL de chaque échantillon est déposé dans les puits. La plaque est ensuite incubée pendant 7h à 37°C, 5 % de CO,. Après contact entre les cellules Caco-2 et les échantillons, les puits sont rincés deux fois avec du tampon PBS puis une extraction des ARN par le réactif TRIzolni est réalisée. Les échantillons d'ARN sont d'abord traités à la DNase pour éliminer les éventuels fragments d'ADN co-extrait et/ou restant suite à l'extraction. Un volume de 8 pL contenant 1.000 ng d'ARN est mélangé avec 1 pl.' de DNase, et 1 Rt, de tampon DNase (ThennoScientific. Waltham, Etats-Unis). La réaction a lieu à 37°C pendant 30 min elle est stoppée par l'ajout d'I pL de solution d'EDTA à 50 mM (ThennoScientific, Waltham. Etats-Unis) suivi d'une incubation à 65°C pendant 10 min. Par la suite, les échantillons ont été rétro-transcrits en ADNc en utilisant le kit RevertAid H minus first strand cDNA synthesis (ThennoScientific, Waltham, Etats-Unis), selon les instructions fournies. Pour la réaction de qPCR, les échantillons d'ADNc sont dilués (1/16) dans l'H20. Pour un volume de 2 i..tL d'échantillon, 18 pL de mélange qPCR sont ajoutés contenant 10 pL de Power SYBRC) Green PCR Master Mix (2x) (Applied Biosystems, Life Technologies, Poster City, Etats-Unis). 0.6 pL de chaque amorce (10 pM) et 6.8 1iL d'ELO. La fluorescence est suivie pendant la réaction dans un thermocycler CFX Connect Real Time Detection System (Bio-Rad, Hercules, Etats-Unis). Après une étape de dénaturation à 95°C pendant 10 min, 40 cycles de PCR sont réalisés successivement, un cycle comprend 4-> une dénaturation à 95°C pendant 15 sec, une hybridation de 58 ou 60°C en fonction du couple d'amorces utilisé pendant 30 sec et une élongation à 72°C pendant 30 sec. La réalisation d'une courbe de fusion (meltine curve) termine la réaction. [0193] Le gène étudié est le gène codant pour le transporteur du calcium (transient receptor potential selective for calcium) (trpv6) également appelé CaT1 (calcium transporter 1). L'expression de ce gène est normalisée par rapport à celle du gène codant pour la peptidylproly1 isomerase À (ppiA). Les couples d'amorces utilisés, ainsi que leurs températures d'hybridation, sont présentés ci-dessous dans le tableau 13 ci-dessous : [0194] [Tableaux13] Taille-de-ramplicon- ffibbi Gêner( Amorces-(5'-3')sE T °C)n trpv6n sens.:.TGATGCGGCTCATCAGTGCCAGC. 251t= p (SECHD.N0-200)-f 136u antisens:- TAGAAGTGGCCTAGCTCCTCG (SEQ-ED-NO.201)iu sens-:-TGCTGACTGTGGACAACTCG-(SEO 1D-NO.202)11 antisens-:-TGCAGCGAGib,GCACAMGAT (SEQ-111N0.203)m [0195] Les échantillons de fermentai ont été mis en contact avec les cellules Caco-2 et les variations de l'expression du gène trpv6 ont ensuite été étudiées par qPCR. [0196] Les fermentais obtenus avec les souches VF45A et VFH049 sont capables de moduler positivement l'expression du gène. Plus particulièrement, le fermentat produit par la souche VFH049 entraîne une surexpression du gène 20 fois supérieure au contrôle (Fig. 7). L'effet des fermentais ultrafiltrés est moins prononcé, non significatif même si une tendance à l'induction du gène est clairement visible pour les deux souches (Fig. 8).Les fermentats produits par les deux souches sont donc capables de moduler à la fois l'incorporation du calcium et l'expression de trpv6 par rapport au lait non fermenté. Etude des caractères probiotiques [0197] La significativité des résultats est évaluée par une analyse de la variance (ANOVA) à un facteur suivi d'un test de Tukey pour la comparaison multiple des moyennes. Concernant l'expérience de transport du calcium au travers d'une membrane de cellules Caco-2, le test post-ANOVA est un test de Dunn aboutissant à une comparaison à la moyenne de la condition contrôle. La différence entre les moyennes est considérée comme significative pour une p value