Brevet FR3098814A1 — publié le 20210122

Description Titre de l'invention : PROCEDE D'AUTO-ASSEMBLAGE D'UNE PROTEINE SUR UN SUBSTRAT SELON UNE STRUCTURE TRIDIMENSIONNELLE EN NID D'ABEILLE Domaine technique 100011 La présente invention se rapporte au domaine général de la cristallisation de protéines. 100021 L'invention concerne un procédé d'auto-assemblage de protéines sur un substrat selon une structure tridimensionnelle en nid d'abeille. 100031 L'invention est particulièrement intéressante puisqu'elle permet d'obtenir un matériau nanostructuré, stable, dont les motifs présentent une très grande régularité. 100041 L'invention concerne également l'ensemble, formé du substrat et de la structure protéique, ainsi obtenu. 100051 L'invention concerne également une utilisation d'un tel ensemble. L'invention trouve des applications dans de nombreux domaines industriels, et notamment dans le domaine de la photolithographie, de la catalyse, de l'optique, ou encore pour la fabrication de membrane. 100061 L'invention concerne également un procédé pour fabriquer des nanopiliers à partir d'un tel ensemble. Technique antérieure [0007] Actuellement, pour générer l'auto-assemblage de protéines sur une surface, deux approches sont utilisées : l'approche de haut en bas (dite « top-down ») et l'approche de bas en haut (dite « bottom-up »). [0008] L'approche de type « top-clown » consiste à modifier localement la surface d'un substrat de manière à créer des sites de liaisons pouvant interagir avec des protéines. L'auto-assemblage des protéines est alors conditionné par leur attachement sur ces sites de liaison. Cependant, une telle approche nécessite de structurer le substrat à l'échelle nanométrique ou micrométrique, ce qui nécessite des étapes additionnelles et rend le procédé plus long et plus coûteux. [0009] L'approche de « type bottom-up » repose sur les propriétés intrinsèques des protéines à pouvoir interagir entre elles. Plusieurs types de procédés « bottom-up » ont été rapportés. On peut, notamment, citer : - les techniques d'émulsion inverse, basées sur l'évaporation d'une microémulsion de protéine sur une surface (« inverse emulsion brcath-figure »), - les techniques de Langmuir-Blodgett, reposant sur la fabrication d'un film protéique monocouchc induit par pression à la surface d'un liquide, puis au dépôt de ce 2 film sur une surface solide, et - les procédés de recristallisation 2D de protéines « S-layer ». [0010] Par exemple, dans l'article de Conon et al. (« Design of ordered two-ditnensiotzal arrays mediated by tzotzcovalent protein-protein interfaces », Science (2015), 348, 6241, 1365-1368), la conception d'interfaces protéiques, assistée par ordinateur, a permis de définir différentes architectures de réseaux 2D. Des cristaux protéiques allant jusqu'à 11.1m de long et 8nm d'épaisseur sont obtenus. [0011] Dans l'article de Sayou et al. (« A SAM oligomerization domain shapes the genomic bitzding landscape of the LEAFY transcription factor », Nature Communications (2016), 7, 11222), la structure cristalline du domaine d'oligomérisation de Ginkgo Nicha a été étudiée en solution. Les auteurs ont montré que Pol igomérisation tête queue des monomères conduit à la formation d'une hélice. [0012] Les différentes architectures obtenues sont des architectures 2D, formées de couches simples ou doubles. Cependant, ces architectures protéiques ne présentent pas une grande stabilité. Exposé de l'invention [0013] Un but de la présente invention est donc de proposer un procédé permettant de fabriquer un auto-assemblage de protéines stable dans le temps et/ou résistant aux solvants. [0014] Pour cela, la présente invention propose un procédé d'auto-assemblage d'une protéine selon une structure tridimensionnelle en nids d'abeille comprenant les étapes successives suivantes : - fournir une solution comprenant un solvant et une protéine, la protéine comprenant une séquence d'acides aminés correspondant à un domaine d'oligomérisation d'une protéine LEAFY, par exemple au domaine d'oligomérisation de Ginkgo biloba, en fusion avec une étiquette, telle qu'une étiquette histidine, - mettre la solution en contact avec un substrat, - faire évaporer le solvant pour cristalliser la protéine, le domaine d'oligomérisation cristallisant sous la forme d'une hélice primaire, chaque hélice primaire interagissant avec six autres hélices primaires, moyennant quoi on obtient une structure protéique tridimensionnelle en nid d'abeille, perpendiculaire au substrat, la structure protéique étant fixée au substrat par l'étiquette. [0015] L'invention se distingue fondamentalement de l'art antérieur par l'utilisation d'une étiquette permettant une croissance perpendiculairement à la surface du substrat (i.e. une croissance en hauteur et non pas le long du substrat) et donc à l'obtention d'une architecture tridimensionnelle. Les hélices primaires forment, au sein de la structure protéique, des alvéoles régulièrement espacées, pouvant être, avantageusement, fonc- 3 tionnalisées. Une telle architecture présente une très bonne stabilité. Un tel procédé est relativement simple à mettre en oeuvre puisque la structure protéique s'auto-assemble spontanément lors de l'évaporation du solvant. [0016] Avantageusement, le procédé comporte une étape additionnelle au cours de laquelle on ajoute sur la structure en nid d'abeille, déjà formée, une autre protéine correspondant au domaine d'oligomérisation de la protéine LEAFY sans étiquette, moyennant quoi on augmente la hauteur de la structure en nid d'abeille perpendiculairement au substrat. [0017] Avantageusement, le substrat est en un matériau choisi parmi un métal, un métalloïde ou un matériau carboné. Le choix du matériau du substrat et notamment ses propriétés hydrophiles/hydrophobes joue sur l'affinité substrat/étiquette. Ceci va influencer la surface de la structure auto-assemblée ainsi que le taux de recouvrement du substrat par cette structure. [0018] L'invention concerne également un ensemble obtenu par un tel procédé, l'ensemble comprenant un substrat recouvert par un auto-assemblage de protéine selon une structure tridimensionnelle en nid d'abeille, [0019] la protéine comprenant une séquence d'acides aminés correspondant à un domaine d'oligomérisation d'une protéine LEAFY, par exemple au domaine d'oligomérisation de Ginkgo biloba, en fusion avec une étiquette, de préférence une étiquette histidine, [0020] le domaine d'oligomérisation étant cristallisé sous la forme d'une hélice primaire, chaque hélice primaire interagissant avec six autres hélices primaires, la structure étant fixée perpendiculairement au substrat par l'étiquette. [0021] Avantageusement, le pas entre chaque hélice primaire est inférieur à 10nm. Par pas, on entend la distance entre le centre de la lumière de deux hélices primaires adjacentes. [0022] Avantageusement, le diamètre intérieur d'une hélice primaire va de 4nm à 6nm, par exemple 5nm. [0023] Avantageusement, l'auto-assemblage couvre une surface d'au moins 50mm2. [0024] Avantageusement, le substrat est poreux. Ce mode de réalisation est particulièrement avantageux, notamment pour fabriquer des membranes dont la taille des pores est définie par les alvéoles de la structure en nid d'abeille. [0025] Selon une première variante avantageuse, la protéine est fonctionnalisée avec un métal (nanoparticules métalliques), un sel métallique, un complexe inorganique ou une molécule organique. Ce mode de réalisation est particulièrement avantageux pour fabriquer des nanopiliers métalliques, des nanocatalyseurs ou des nanophosphores. [0026] Selon une autre variante avantageuse, la structure en nids d'abeille est métallisée, par exemple avec de l'or. Ce mode de réalisation est particulièrement avantageux pour former des anneaux métalliques de dimensions nanométriques régulièrement espacés, pour des applications optiques. 100271 Une telle structure présente de nombreux avantages : - la régularité des motifs de la structure déposée est très grande, voire supérieure aux technologies existantes (copolymères à blocs notamment), - il est possible de fonctionnaliser l'intérieur des puits avec des molécules organiques et/ ou inorganiques, - la structure peut être déposée sur de nombreux substrats plans ou courbes, - il est possible de contrôler le diamètre des alvéoles de la structure en nid d'abeille ainsi que le pas entre les alvéoles, en utilisant différentes architectures protéiques, - la structure protéique fixée au substrat est très stable, - il n'y a pas besoin de structurer préalablement le substrat pour fixer la structure protéique. [0028] L'invention concerne également une utilisation d'un ensemble tel que défini pré- cédemment, pour développer des applications en nanotechnologies, par exemple comme masque de photolithographie, comme amplificateur d'un signal d'un capteur optique, comme membrane, ou comme catalyseur. [0029] L'invention concerne également un procédé de fabrication de nano-piliers mé- talliques comprenant les étapes successives suivantes : [0030] - fournir un ensemble comprenant un substrat recouvert par un auto-assemblage de protéine selon une structure tridimensionnelle en nid d'abeille, la protéine comprenant une séquence d'acides aminés correspondant à un domaine d'oligomérisation d'une protéine LEAFY, par exemple au domaine d'oligomérisation de Ginkgo biloba, en fusion avec une étiquette, de préférence une étiquette histidine, et des acides aminés spécifiques, apte à être fonctionnalisés par un métal ou un sel métallique, tapissant les alvéoles du nid d'abeille, le domaine d'oligomérisation étant cristallisé sous la forme d'une hélice primaire, chaque hélice primaire interagissant avec six autres hélices primaires, la structure étant fixée perpendiculairement au substrat par l'étiquette, [0031] - greffer, sur les acides aminés spécifiques, un métal (par exemple sous la forme de nanoparticules métalliques), un complexe inorganique ou un sel métallique et le réduire, pour former des nano-piliers métalliques dans les alvéoles du nid d'abeille. [0032] D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront du complément de description qui suit. [0033] Il va de soi que ce complément de description n'est donné qu'à titre d'illustration de l'objet de l'invention et ne doit en aucun cas être interprété comme une limitation de cet objet. Brève description des dessins [0034] La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description d'exemples de réalisation donnés à titre purement indicatif et nullement limitatif en faisant référence aux dessins annexés sur lesquels : [0035] [fig.1A] représente, schématiquement, selon différentes vues, la structure de deux monomères du domaine d'oligomérisation d'une protéine LEAFY en interaction (code PDB 4UDE), selon un mode de réalisation particulier de l'invention ; pour plus de lisibilité l'étiquette histidine et la partie C-terminale désordonnée des monomères ne sont pas représentées. [0036] [fig.113] représente de manière schématique, selon différentes vues, la structure de l'hélice formée par l'oligomérisation tête queue des monomères du domaine d'oligomérisation d'une protéine LEAFY, selon un mode de réalisation particulier de l' invention. [0037] [fig.1C] représente de manière schématique, selon différentes vues, les détails de l'interaction de deux hélices primaires formées par oligomérisation du domaine d'oligomérisation d'une protéine LEAFY, selon un mode de réalisation particulier de l'invention ; pour plus de lisibilité, seuls les monomères d'une hélice sont différenciés. [0038] [fig.1D] représente de manière schématique une hélice primaire interagissant avec 6 autres hélices primaires pour former une structure protéique en nid d'abeille, selon un mode de réalisation particulier de l'invention. [0039] [fig.2] est un cliché obtenu par microscopie électronique (STEM), d'un auto- assemblage du domaine d'oligomérisation d'une protéine LEAFY dépourvue d'étiquette histidine selon une structure en nid d'abeille, parallèlement à la surface d'un substrat en carbone ; l'encart représente schématiquement l'orientation d'une hélice primaire dans la structure. [0040] [fig.3A] [0041] [fig.3B] sont des clichés obtenus par microscopie électronique (STEM), d'un auto- assemblage d'une protéine comprenant un domaine d'oligomérisation d'une protéine LEAFY munie d'une étiquette histidine, selon une structure en nid d'abeille, perpendiculaire à la surface d'un substrat en carbone, selon un mode de réalisation particulier de l'invention et selon différentes échelles ; l'encart de la figure 3B représente schématiquement l'orientation d'une hélice primaire dans la structure. [0042] [fig.4A] [0043] [fig.4B] sont des clichés obtenus par microscopie électronique (STEM) d'un auto- assemblage de protéine sur un substrat de carbone, à différentes échelles, selon un mode de réalisation particulier de l'invention. [0044] Les figures 2, 3A, 3B, 4A et 4B ont été obtenues en réalisant un marquage en noir, à l'acétate d'uranyle, des acides aminés qui tapissent la lumière des puits des hélices primaires. [0045] Les différentes parties représentées sur les figures ne le sont pas nécessairement selon une échelle uniforme, pour rendre les figures plus lisibles. 6 [0046] Les différentes possibilités (variantes et modes de réalisation) doivent être comprises comme n'étant pas exclusives les unes des autres et peuvent se combiner entre elles. [0047] En outre, dans la description ci-après, des ternies qui dépendent de l'orientation, tels que « dessus », « sur », «dessous », « sous », etc. d'une structure s'appliquent en considérant que la structure est orientée de la façon illustrée sur les figures. [0048] EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS [0049] -Ici et par la suite, le procédé d'auto-assemblage est décrit pour une protéine. Cependant, l'invention est transposahle aux peptides, polypeptides et d'une manière plus générale aux séquences d'acides aminés homologues à la séquence en acide aminés du domaine d'oligomérisation de la protéine LEAFY. [0050] Le procédé d'auto-assemblage pour obtenir une structure protéique tridimensionnelle en nid d'abeille comprend les étapes successives suivantes : a) fournir une solution contenant une protéine d'intérêt, h) mettre la solution en contact avec la surface d'un substrat, c) faire cristalliser la protéine, moyennant quoi on obtient un auto-assemblage tridimensionnel de la protéine selon une structure en nids d'abeille, perpendiculairement à la surface du substrat. [0051] Lors de l'étape a), la protéine d'intérêt utilisée pour former la structure protéique tri- dimensionnelle en nid d'abeille sur le substrat présente une séquence primaire en acides aminés comprenant : - une étiquette, de préférence une étiquette histidine (aussi appelée étiquette polyhistidine ou tag histidine), - un domaine d'oligomérisation d'une protéine LEAFY, - une partie destinée à tapisser les alvéoles du nid d'abeille. [0052] Par domaine d'oligomérisation, on entend une séquence d'acides aminés permettant aux protéines de s'assembler les unes à la suite des autres, en petites chaînes. [0053] Le domaine d'oligomérisation est celui de la protéine LEAFY. Le facteur de trans- cription LEAFY (aussi noté LFY) est impliqué dans des processus développementaux chez les plantes, en particulier la formation des fleurs. L'oligomérisation de la protéine LEAFY est une oligomérisation tête-queue (figures 1A, 1B, 1C). Une telle oligomérisation permet, contrairement à des interactions tête-tête, d'auto-assembler des monomères sous la forme d'une hélice primaire L'hélice primaire du domaine d'oligomérisation de la protéine forme un enroulement sensiblement hélicoïdal dont le diamètre interne forme une alvéole (aussi appelé puits ou lumière). Les parois de l'alvéole sont tapissées par l'extrémité C-terminale de chaque monomère. Le sillon d'une hélice primaire interagit parallèlement avec le sillon de 6 autres hélices primaires pour générer une organisation en nids d'abeille (figures 1D). Autrement dit, une hélice primaire est imbriquée avec six autres hélices primaire, selon une structure en nid 7 d'abeille (ou structure hexagonale). Les liaisons entre les hélices primaires sont des liaisons hydrogène et ionique. [0054] A titre illustratif et non limitatif, le domaine d'al igomerisation peut être celui de Ara- bidopsis. thalituza (AtLFY), de Ginkgo biloba (GhLFY), de Ceraiopieris richard (CrLFY) ou de Physcomitrella patens (PpLFY). [0055] Par exemple, le domaine d'oligomérisation de la protéine LEAFY du Ginkgo biloba est (ici et par la suite toutes les séquences d'acides aminés sont notées du N-terminal vers le C-terminal): MARKELSSLEELFRHYGVRYMTLTKMVEMOFTVNTLVNMTEQELDDVIRTL VDIYRVDLLVGEKYGIKSAVRAEKRRLDELERKKLDLEVDVDGKRKADENAL DTLSQ (SEQ ID NO: 1 dans le listage de séquences en annexe). [0056] L'orientation de l'auto-assemblage est déterminée par l'addition d'une étiquette. D'une manière générale, l'étiquette est une séquence courte d'acides aminés (typiquement ayant de 6 à 30 acides aminés) [0057] Par la suite, on décrira une étiquette histidine. Toute autre étiquette, notamment de taille équivalente, s'accrochant de manière aspécifique ou spécifique à un substrat, et permettant une croissance de la structure protéique perpendiculaire au substrat peut être utilisée. [0058] Plusieurs types d'étiquettes pourront-être utilisés comme par exemple : -des étiquettes composées d'acides aminés chargés positivement (lysine (K) ou arginine (R)) permettant de se fixer sur une surface chargée négativement, -des étiquettes composées d'acides aminés chargés négativement (glutamate (E) ou aspartate (D)) permettant de se fixer sur une surface chargée positivement, -des étiquettes composées d'acides aminés hydrophobes (leucine (L), valine (V), isoleucine (I), méthionine (M), phenylalanine (F), tryptophane (W), proline (P)) permettant de se fixer sur une surface hydrophobe, -des étiquettes composées d'acides aminés polaires (sérine (S), thréonine (T), tyrosine (Y)) permettant de se fixer sur une surface polaire, -des étiquettes composées d'acides aminés permettant de se lier à des métaux (cystéine (C), histidine (H), glutamate (E), aspartate (D)) permettant de se fixer sur des surfaces métalliques, -des étiquettes composées d'acides aminés spécifiques permettant une interaction de forte affinité de type récepteurnigand sur des surfaces fonctionnalisées comme par exemple une étiquette Strep (WSHPQFEK ; SEQ ID NO: 2 dans le listage de séquences en annexe) sur une surface fonctionnalisée avec de la biotine. [0059] En absence de cette étiquette, l'auto-assemblage croit parallèlement à la surface, c'est-à-dire dans le plan de la surface du substrat en contact avec la solution de protéine d'intérêt lors de l'étape b) (figure 2). En présence de l'étiquette d'histidine, 8 l'assemblage croit perpendiculairement à la surface du substrat, c'est-à-dire perpendiculairement au plan de la surface du substrat en contact avec la solution de protéine d'intérêt lors de l'étape h) (figures 3A et 3B). [0060] L'étiquette histidine de la protéine permet de fixer la structure protéique à la surface du substrat. [0061] L'étiquette histidine comprend au moins six acides aminés histidine. Elle peut comporter plus de six acides aminés histidine. Elle peut également comprendre d'autres acides aminés. A titre illustratif et non limitatif, on peut choisir la séquence suivante : MKHHHHHHPMSDYDIPTTENLYFQGA (SEQ ID NO: 3 dans le listage de séquences en annexe) [0062] La séquence d'acides aminés comprend également une partie destinée à tapisser les alvéoles du nid d'abeille. Par exemple, cette partie correspond à la séquence : KKLDLFVDVDGKRKADENALDTLSQ (SEQ ID NO: 4 dans le listage de séquences en annexe) [0063] Cette partie peut être modifiée par délétion, substitution, ou insertion. Les modi- fications sur cette partie n'affectent pas la capacité d'auto-assemblage de la protéine. Avantageusement, elle est modifiée par substitution ou insertion de manière à introduire un ou plusieurs acides aminés spécifiques apte à être fonctionnalisés par un ion métallique, un métal ou une molécule organique. Par exemple, on choisira comme acide aminé spécifique une cystéine (aussi appelé résidu de cystéine (C)) permettant de greffer spécifiquement des molécules portant un groupement maléimide ou iodoacétamide. La séquence de la partie tapissant les alvéoles modifiées par délétion peut être par exemple : CKLDLFVDVDGKRKADENALDTLSQ (SEQ ID NO: 5 dans le listage de séquences en annexe) [0064] La séquence primaire des acides aminés de la protéine comprend par exemple : MKHHHHHHPMSDYDIPTTENLYFQGAMARKELSSLEELERHYGVRYMTLT KMVEMGFTVNTLVNMTEQELDDVIRTLVDIYRVDLLVGEKYGIKSAVRAEKR RLDELERKKLDLFVDVDGKRKADENALDTLSQ (SEQ ID NO: 6 dans le listage de séquences en annexe) [0065] ou avec la délétion précédemment décrite : MKHHHHHHPMSDYDIPTTENLYFQGAMARKELSSLEELFRHYGVRYMTLT KMVEMGFTVNTLVNMTEQELDDVIRTLVDIYRVDLLVGEKYGIKSAVRAEKR RLDELERCKLDLFVDVDGKRKADENALDTLSQ (SEQ ID NO: 7 dans le listage de séquences en annexe) [0066] Selon une première alternative, la protéine d'intérêt peut être synthétisée par biologie de synthèse. [0067] Selon une seconde alternative préférée, la protéine d'intérêt est produite par une 9 bactérie. Pour cela, la protéine d'intérêt peut être exprimée dans une souche commerciale, avantageusement par une souche de bactéries E. coli. La protéine d'intérêt est ensuite purifiée à partir de l'extrait soluble des bactéries l'ayant produite. La purification consiste, par exemple, à recueillir les bactéries par centrifugation, à casser leur membrane par sonication puis à séparer les protéines solubles contenant la protéine d'intérêt par centrifugation. La protéine d'intérêt est ensuite purifiée une ou plusieurs fois. Il peut s'agir d'une purification par affinité sur une résine contenant du Nickel (par exemple de type Nickel-Sépharose) et/ou sur gel de perméation (par exemple de type Superdex 200, commercialisé par GE Hcalfcare). Seules les protéines munies de l'étiquette histidine sont retenues sur la résine contenant du nickel. [0068] La protéine est soluble dans un tampon aqueux, de préférence du Tris-HC1 (pH entre 7,0 et 9,0 à une concentration entre 10 et 100 mM) contenant un réducteur de fonction thiol (du DTT (Dithiothréitol) ou du TCEP (Tris(2-carhoxycthyl)phosphine hydrochloride) à une concentration de 1 mM), pour former une solution protéique. [0069] La solution protéique est avantageusement mélangée avec une solution de cristal- lisation (aussi appelée solution tampon de cristallisation). Il peut s'agir d'un mélange volumique 50/50. La solution de cristallisation comprend, par exemple, du Tris-HCI et du sulfate d'ammonium. D'une façon plus générale, on pourra également utiliser un tampon dit tampon de Good. [0070] La concentration de la protéine dans la solution utilisée lors de l'étape a) peut aller de 0,5 mg/mL à 5 mg/mL [0071] Lors de l'étape b), un volume VI de la solution contenant la protéine d'intérêt est mis en contact avec le substrat. Le substrat peut être de différentes natures. Par exemple, il peut être métallique, en un élément métalloïde ou encore en un matériau carboné. A titre illustratif, il peut s'agir de silicium ou de carbone. Par exemple, on pourra choisir une tranche (« wafer ») de silicium ou une grille de microscopie en silicium ou en carbone. Le substrat peut être transparent. Par transparent, on entend que le substrat a une transmittance supérieure à 50% dans le domaine visible, i.e. de 350nm à 750nm, et de préférence supérieure à 70% dans le domaine visible. [0072] Avantageusement, le substrat est hydrophile pour favoriser son recouvrement par la solution contenant la protéine d'intérêt et/ou les interactions avec l'étiquette histidine. [0073] La surface du substrat à fonctionnaliser peut être supérieure à 50pm2, voire su- périeure à lmm2. Elle peut être par exemple d'environ 7 mm2 [0074] Une goutte de solution contenant la protéine d'intérêt, ou un volume plus important de cette solution, peut être déposée sur la surface à traiter ou la surface à traiter peut être déposée sur la solution contenant la protéine d'intérêt. [0075] Lors de l'étape b), la solution de protéine peut recouvrir, avantageusement, lo- calement le substrat. Selon une variante de réalisation particulièrement avantageuse, on peut réaliser préalablement à l'étape h), une étape au cours de laquelle une couche dite couche de protection est formée localement sur le substrat, par exemple lors d'une étape de photolithographie à travers un masque. Le substrat comprend alors des parties recouvertes par la couche de protection et des parties non recouvertes par la couche de protection. Ceci permet de délimiter les zones du substrat à fonctionnaliser avec la structure de protéine. La solution de protéine est en contact avec la surface du substrat au niveau des parties non recouvertes par la couche de protection. Les parois de la couche de protection jouent le rôle de guide lors de la croissance de la structure protéique. [0076] Lors de l'étape c), la protéine est cristallisée pour former la structure protéique. La cristallisation consiste à faire passer la protéine d'un état soluble à un état solide et ordonné. On fait progressivement évaporer la solution contenant la protéine afin d'augmenter la concentration en protéine jusqu'à sa cristallisation. [0077] L'auto-assemblage de la protéine sur la surface du substrat est, avantageusement, réalisé dans une enceinte fermée, par exemple dans une chambre de cristallisation. [0078] L'enceinte contient, avantageusement, un réservoir de cristallisation de volume V2 contenant la solution tampon de cristallisation. On choisira un volume V, supérieur au volume VI. Le volume V, va, par exemple, de 500pL à SmL. Une fois l'enceinte rendue étanche, la diffusion de vapeur de la goutte vers le substrat est initiée. [0079] La cristallisation est, avantageusement, réalisée à température ambiante (i.e. de 20 à 25°C) et à pression ambiante (de l'ordre de lbar). [0080] La durée de l'étape c) dure, avantageusement, de 4h à 48 h. Cette durée dépend de la surface du substrat à fonctionnaliser ainsi que du volume de solution. L'auto-assemblage est visible à partir de 4 heures et atteint un optimal après 24 heures. [0081] A l'issue du procédé, on obtient un ensemble comprenant un substrat recouvert par la protéine cristallisée et auto-assemblée selon une structure tridimensionnelle en nid d'abeille perpendiculaire à la surface du substrat. Elle présente une hauteur maîtrisée correspondant à l'empilement des différents monomères. La hauteur de la structure protéique est en moyenne de 18nm avec la protéine contenant l'étiquette histidine mais peut-être plus élevée en utilisant une deuxième étape de croissance en présence de la protéine sans étiquette histidine. Le diamètre interne des alvéoles du nid d'abeille va, par exemple, de 4nm à 6nm. Le pas entre les hélices primaires est inférieur à 10 nm. Il va, par exemple, de 8 nm à 10 nm. [0082] A titre illustratif, l'architecture protéique obtenue avec le domaine d'oligomérisation de la protéine LEAFY du Ginkgo biloba présente les caractéristiques suivantes (figures 3A et 3B): - un tour d'hélice primaire correspond à 12 monomères, - la hauteur de la structure nidimensionnelle est d'environ 18 nm, correspondant à 11 l'empilement de 24 monomères, - le pas entre le centre des lumières de deux hélices primaires adjacentes est de 9,5 nm, - la largeur du sillon au sein d'une même hélice primaire va de 4 à 5nm, - le diamètre interne de l'hélice primaire est de 5 nm. [0083] Ces caractéristiques peuvent être mesurées par microscopie à force atomique (AFM) ou par microscopie électronique (STEM) à transmission, c.g. STEM, TEM après une étape de coloration standard des structures protéiques utilisant l'acétate d'uranyle. [0084] Les paramètres de la structure auto-assemblée de protéines, tel que le diamètre des puits et la hauteur des puits peuvent être facilement modifiés. [0085] Par exemple, en augmentant le nombre d'acides aminés tapissant la paroi des puits, le diamètre des puits peut être réduit. La variation du nombre d'acides aminés tapissant l'intérieur des puits permet également de moduler le nombre de molécules greffées dans les alvéoles de la structure protéique. [0086] La hauteur de la structure auto-assemblée peut être augmentée par addition du domaine d'oligomérisation, dépourvu de l'étiquette histidine, autrement dit par l'addition sur l'auto-assemblage de monomères du domaine d'oligomérisation de manière à faire croître les hélices primaires de la structure protéique. Cette modification permet, par exemple, d'augmenter le nombre de molécules greffées (inorganiques, organiques ou mixtes), d'avoir un masque de nano-lithographie ayant une plus forte épaisseur ou bien encore d'augmenter la hauteur des piliers pouvant croitre au sein de cet auto-assemblage. [0087] La surface de la structure auto-assemblée ainsi que le taux de recouvrement d'un substrat peuvent être augmentés, par exemple, en faisant varier l'affinité du substrat pour l'étiquette histidine. [0088] 11 est également possible de modifier la forme, le diamètre des puits ainsi que leur es- pacement, en choisissant des architectures protéiques différentes. L'identification de ces architectures protéiques ou domaines protéique capables de faire des interactions tête-queue peut être réalisée dans la « Protein Data Bank » (PDB) recueillant l'ensemble des structures protéiques connues. [0089] La structure tridimensionnelle en nid d'abeille auto-assemblée ainsi obtenue est un biomatériau qui peut être utilisé pour de nombreuses applications. [0090] Selon un mode de réalisation particulier, la structure peut être utilisée comme membrane, lorsque la structure auto-assemblée est formée sur une surface poreuse, le seuil de perméabilité est déterminé par le diamètre interne des hélices primaires. [0091] Selon un autre mode de réalisation, la structure auto-assemblée peut être recouverte, totalement, ou partiellement par une couche métallique, par exemple en or. Elle peut être métallisée par dépôt physique par phase vapeur, par dépôt chimique par phase vapeur, par dépôt chimique ou par dépôt électrochimique. Une telle structure peut 12 servir à influer le comportement d'une onde lumineuse à la surface d'un substrat. Ceci est particulièrement intéressant pour amplifier le signal d'un capteur optique, comme par exemple un capteur choisi parmi les capteurs basés sur la résonance plasmonique de surface (SPR), les capteurs de diffusion Raman exaltée de surface (SERS), ou encore pour la spectroscopie infrarouge exaltée de surface (SEIRAS). Il est, par exemple, possible de former des anneaux d'or régulièrement espacés en recouvrant la partie supérieure de la structure par de l'or. [0092] Selon un autre mode de réalisation, la structure auto-assemblée peut être utilisée comme masque de photolithographie : l'auto-assemblage générant des puits de diamètre et d'espacements réguliers (par exemple d'un diamètre de 5 nm et espacés de 9 nm), il peut être utilisé comme un masque de photolithographie pour graver un support au travers des alvéoles du nid d'abeille. La gravure pourra être, par exemple, de type chimique (HF) sur support silicium ou par ultra-violet (UV) sur surface photosensible. [0093] Selon un autre mode de réalisation, l'auto-assemblage peut servir de plateforme/ support de greffage de molécules inorganiques (ions métalliques, complexes inorganiques ou particules métalliques) et organiques. Pour cela, on choisira une protéine ayant une séquence comprenant un ou plusieurs acides aminés pouvant être fonctionnalisés par des sels métalliques pouvant être réduits en nanoparticules métalliques, des complexes inorganiques présentant une certaine activité catalytique et par des molécules organiques. A titre illustratif, sur la seule base d'un auto-assemblage de 18 nm de hauteur (soit un empilement de 24 monomères par puits) et d'environ 12 000 puits par pm2, on estime la fixation d'environ 300 000 molécules/ pm2 (soit 30 000 milliard/ cm2). Un tel auto-assemblage présente une surface élevée et donc permet de fixer une forte quantité de molécules. La position et la spécificité de greffage peut être contrôlée par la composition en acides aminés tapissant la lumière des puits et la réactivité des composés à greffer. [0094] Cette plate-forme de greffage peut être utilisée dans le domaine photovoltaïque ou pour la détection de molécules. Il est possible d'envisager la détection de molécules uniques. Il est possible de greffer des molécules jouant, par exemple, le rôle de catalyseurs. L'immobilisation des catalyseurs augmente leur stabilité. Il est ainsi possible de fabriquer des matériaux bio-hybrides, par exemple, pour la photo-catalyse. [0095] Ce confinement est également particulièrement intéressant par exemple pour la pho- tosynthèse artificielle ou pour réaliser des réactions d'oxydo-réduction. [0096] D'une manière particulièrement avantageuse, le greffage spécifique des métaux (ou d'ions métalliques qui sont par la suite réduits) à l'intérieur des puits pourra être utilisé pour la conception de nanopiliers métalliques dans les alvéoles de la structure protéique (puits), par exemple pour la nanoélectronique. Leurs longueurs et leurs 13 diamètres dépend de l'architecture protéique. Les nanopiliers sont orientés perpendiculairement à la surface du substrat et sont régulièrement espacés. On pourra réaliser, par exemple, des nanopiliers en or, via une fonction thiol, se fixant aux cystéines de la séquence d'acides aminés de la protéine. Pour fixer des sels métalliques, on choisira, par exemple, des histidines. [0097] Le procédé de fabrication des nano-piliers comprend, avantageusement, les étapes successives suivantes : - fonctionnaliser la partie de la séquence d'acides aminés de la protéine destinée à tapisser les puits du nid d'abeille, en introduisant un acide aminé réactif vis-à-vis des métaux, par exemple un acide aminé cystéine, -cristalliser la structure protéique tridimensionnelle sur un substrat, - ajouter un métal, par exemple sous la forme de nanoparticule métallique, le métal se liant à l'acide aminé réactif vis-à-vis des métaux, et jouant le rôle de germe métallique pour la croissance du nano-pilier, - faire croître le nano-pilier métallique, dans le puits, par agglomération de métaux autour du germe métallique. [0098] Selon ce mode de réalisation, on pourra réaliser, ultérieurement, une étape au cours de laquelle on retire la structure de protéines pour ne conserver que les nanopiliers à la surface du substrat. Cette étape peut être accomplie, en fonction de la nature du substrat, par plasma, ou encore par recuit thermique à une température supérieure à la température de décomposition de la protéine (typiquement à une température supérieure à 100°C). [0099] Exemples illustratifs et non limitatifs d'un mode de réalisation : [0100] Dans cet exemple, l'architecture auto-assemblée de protéines est obtenue en réalisant les étapes successives suivantes : 1) choisir et synthétiser une séquence capable d'oligomériser avec des interactions tête-queue pour pouvoir assurer une croissance en 3D de l'auto-assemblage ; les interactions tête-queue conduisant à la formation d'une hélice primaire possédant un sillon d'une largeur suffisante pour permettre l'imbrication des hélices entre elles (comme montré dans la figure 1C), 2) rajouter à cette séquence en N-terminal une étiquette histidine de manière à positionner l'auto-assemblage avec une croissance perpendiculaire à la surface. 3) utiliser cette construction ou des séquences dites mutants de manière à fonctionnaliser spécifiquement la lumière des nids d'abeille. 4) produire la protéine d'intérêt dans des bactéries. 5) purifier la protéine d'intérêt à partir de l'extrait soluble des bactéries l'ayant produite, en réalisant les étapes suivantes : - recueillir les bactéries par centrifugation, casser leur membrane par sonication puis 14 séparer l'ensemble des protéines solubles des bactéries (contenant la protéine d'intérêt) des autres éléments contenus dans les bactéries par centrifugation, - purifier l'ensemble par affinité sur une résine contenant du nickel (par exemple du type Nickel-Sépharose), de manière à sélectivement retenir la protéine d'intérêt, - éventuellement réaliser une seconde purification sur un gel de perméation (par exemple de type Superdcx 200, commercialisé chez GE hcalfcarc) dans un tampon Tris-HCI (pH entre 7 et 9.0) 20 mM, - concentrer la protéine pure entre 0,5 et 5 mg/ml ; la protéine peut être congelée à l'azote liquide puis conservée à -80°C avant utilisation. 6) un volume de x1.11_, de la solution de protéine d'intérêt (avec x allant par exemple de 5 à 50 pl) est mélangée avec le même volume d'une solution de cristallisation de manière à former une goutte de protéine qui est ensuite mise en contact avec une surface à traiter. La solution de cristallisation peut comprendre du Tris-HCI avec un pH de 7 à 9 et du sulfate d'ammonium à une concentration allant de 40 à 350 mM. La surface à traiter peut être rendue hydrophile par exemple par un traitement au plasma (« glow-discharge »). Un réservoir de cristallisation ayant un volume, allant par exemple de 500pL à 5mL) est rempli par la solution de cristallisation. Puis la chambre de cristallisation est rendue étanche pour initier la diffusion de vapeur de la goutte vers le réservoir. Après un temps allant de 4h à 48 h à température ambiante, la surface traitée est retirée de la chambre de cristallisation. [0101] A l'issue du procédé, le matériau obtenu peut ensuite être visualisé en microscopie électronique par transmission (STEM, TEM) lorsque le support est transparent aux électrons. Pour cela, le support est déposé sur une solution aqueuse contenant un colorant (par exemple de l'acétate d'uranyle à 2%) pendant 2min. L'acétate d'uranyle va marquer plus spécifiquement la lumière des nids d'abeille par interaction du métal avec les acides aminés négatifs (Glutamate et Aspartate) qui tapissent la lumière des puits. [0102] Les figures 4A et 4B sont des clichés obtenus au microscope électronique (STEM) d'une structure auto-assemblée de protéines sur un substrat en carbone de 7mnf La structure en nid d'abeille perpendiculaire à la surface du substrat est bien visible. Le taux de recouvrement est de 40%. [Revendication 1] [Revendication 2] [Revendication 3] [Revendication 4] [Revendication 5] [Revendication 6] REVENDICATIONSProcédé d'auto-assemblage d'une protéine selon une structure tridimensionnelle en nids d'abeille comprenant les étapes successives suivantes : - fournir une solution comprenant un solvant et une protéine, la protéine comprenant une séquence d'acides aminés correspondant à un domaine d'oligomérisation d'une protéine LEAFY en fusion avec une étiquette, de préférence une étiquette histidine, - mettre la solution en contact avec un substrat, - faire évaporer le solvant pour cristalliser la protéine, le domaine d'oligomérisation cristallisant sous la forme d'une hélice primaire, chaque hélice primaire interagissant avec six autres hélices primaires, moyennant quoi on obtient une structure protéique tridimensionnelle en nid d'abeille, perpendiculaire au substrat, la structure protéique étant fixée au substrat par l'étiquette. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le procédé comporte une étape additionnelle au cours de laquelle on ajoute sur la structure en nid d'abeille une autre protéine correspondant au domaine d'oligomérisation de la protéine LEAFY, sans étiquette, moyennant quoi on augmente la hauteur de la structure en nid d'abeille perpendiculairement au substrat. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le substrat est en un matériau choisi parmi un métal, un métalloïde ou un matériau carboné. Ensemble comprenant un substrat recouvert par un auto-assemblage de protéine selon une structure tridimensionnelle en nid d'abeille, la protéine comprenant une séquence d'acides aminés correspondant à un domaine d'oligomérisation d'une protéine LEAFY, en fusion avec une étiquette, de préférence une étiquette histidine, le domaine d'oligomérisation étant cristallisé sous la forme d'une hélice primaire, chaque hélice primaire interagissant avec six autres hélices primaires, la structure étant fixée perpendiculairement au substrat par l'étiquette. Ensemble selon la revendication 4, caractérisé en ce que le pas entre chaque hélice primaire est inférieur à lOnm et/ou en ce que le diamètre intérieur d'une hélice primaire va de 4nm à 6nm. Ensemble selon l'une des revendications 4 et 5, caractérisé en ce que l'auto-assemblage couvre une surface d'au moins 50!_trn2. 16 [Revendication 7] [Revendication 8] [Revendication 9] [Revendication 10] Ensemble selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisé en ce que le substrat est poreux. Ensemble selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, caractérisé en ce que la protéine est métallisée ou fonctionnalisée avec un métal, un sel métallique, un complexe inorganique ou une molécule organique. Utilisation d'un ensemble tel que défini dans l'une des revendications 4 à 8, comme masque de photolithographie, comme amplificateur d'un signal d'un capteur optique, comme membrane, ou comme catalyseur. Procédé de fabrication de nano-piliers comprenant les étapes successives suivantes : - fournir un ensemble comprenant un substrat recouvert par un auto-assemblage de protéine selon une structure tridimensionnelle en nid la protéine comprenant une séquence d'acides aminés correspondant à un domaine d'oligomérisation d'une protéine LEAFY, par exemple au domaine d'oligomérisation de Ginkgo biloha, en fusion avec une étiquette, de préférence une étiquette histidine, et des acides aminés spécifiques, apte à être fonctionnalisés par un métal ou un sel métallique, tapissant les alvéoles du nid d'abeille, le domaine d'oligomérisation étant cristallisé sous la forme d'une hélice primaire, chaque hélice primaire interagissant avec six autres hélices primaires, la structure étant fixée perpendiculairement au substrat par l'étiquette, - greffer un métal, un complexe inorganique ou un sel métallique sur les acides aminés spécifiques, et réduire le sel métallique, pour former des nano-piliers métalliques dans les alvéoles du nid d'abeille.