Brevet FR3089115A1 — publié le 20200605

Description Titre de l'invention : HYDROGEL BIOCOMPATIBLE, PROCEDE DE PREPARATION ET UTILISATION DANS UN SYSTEME DE VISCO-SUPPLEMENTATION MECANIQUE Domaine technique de l'invention 100011 La présente invention concerne un hydrogel hiocompatible. Elle concerne en outre un procédé de préparation d'un tel hydrogel, une utilisation de l'hydrogel et un kit. Art antérieur [0002] L'usage médical d'hydrogels contenant de la polyacrylamide uniquement a tout d'abord été divulgué dans le document brevet publié sous le numéro EP0742022A, publié le 13/11/1996. [0003] D'autres documents brevets publiés ultérieurement ont concerné l'usage d'hydrogels biocompatibles en polyacrylamide, en santé humaine, comme agent de comblement, prothèses ou visco-supplément (US7678146B, EP3088011A). [0004] Pour certaines formulations d'hydrogels, des publications cliniques mentionnent une biocompatibilité durable de ces hydrogels et leur propension à former des structures réticulées viscoélastiques intéressantes pour les tissus mous pour un usage externe, par exemple (soins des plaies, Knapp et al, Clinical experiences with a new gel-like wound dressing aller skin transplantation, Aktuelle Traumatologie, décembre 1984, pp. 275-281) ou articulaire. [0005] Des recherches in vitro ont mis en avant la possible capacité des hydrogels réticulés à base de polyacrylamide à former des réservoirs pour un relargage contrôlé et différé de biomolécules (Ferreira et al, Design of a Drug-Delivery System Based On Polyacrylamide Hydrogels, Evaluation of Structural Properties, Laboratories and Demonstrations, octobre 2000). [0006] L'utilisation des hydrogels précités présente différents inconvénients. Notamment, la catalyse de la polymérisation de l'acrylamide est effectuée à l'aide de tétra-méthyle éthylène diamine (TEMED) qui est un produit dangereux. [0007] De nombreuses études ont montré les bénéfices d'une supplémentation de bio- molécules véhiculées dans des microcapsules, microsphères ou vecteurs, contenus dans des hydrogels et cc, au sein d'articulations par exemple, avec des microsphères de chitosan. Janssen et. al, Drugs and Polymers for Defivery Systems in OA Joints: Clinical Needs and Opportunities, Polymers 2014, 6, pp. 799-819. Unc difficulté à résoudre est de réussir à fixer, protéger et retenir in-situ des microcapsules biocompatibles en évitant les agrégats et ainsi les relargages excessifs initiaux pouvant déclencher de possibles inflammations. 2 100081 Le chitosan est un biopolymère, biocompatible et biodégradable qui présente de multiples usages biomédicaux notamment sous forme réticulé en trois dimensions comme biomatériau (Croisier et al, Chitosan-based biomaterials for tissue engineering, European Polymer Journal, Volume 49, Issue 4, avril 2013). Les produits de sa dégradation (glucosamine) sont biocompatibles, mais la durabilité du réseau est variable, notamment suivant les contraintes mécaniques et chimiques appliquées. [0009] Dans ce contexte, il existe un besoin grandissant de concevoir un système de soutien mécanique à usage médical qui puisse répondre aux enjeux de biocompatibilité, biodégradabilité, visco-supplémentation et capacité d'emport in-situ. Résumé de l'invention [0010] Compte tenu de ce qui précède, un problème technique que se propose de résoudre l'invention est de réaliser un nouvel hydrogel qui présente des propriétés améliorées par rapport aux hydrogels de chitosan ou de polyacrylamidc de l'art antérieur, formant des systèmes performants de soutien à usage médical, présentant une capacité d'emport in situ, et susceptibles dc permettre la libération d'un agent diffusant. [0011] La solution de l'invention à ce problème a pour premier objet un hydrogel comprenant, d'une part, entre 0,3% et 30% en poids de matière sèche d'un copolymère formé au moins d'acrylamide, de chitosan et de N,N'-méthylènebisacrylamide et, d'autre part, un agent diffusant. [0012] Ainsi, l'hydrogel présente une structure matricielle viscoélastique qui permet une hy- dratation ou visco-supplémentation mécanique prolongée dc l'agent diffusant qui est localisé, fixé, protégé et relargué par l'hydrogel au cours de sa dégradation in situ. L'hydrogel permet d'éviter les agrégats d'agents diffusants et, par voie de conséquence, les relargages excessifs initiaux. [0013] Avantageusement, - l'agent diffusant est choisi parmi des ingrédients inertes ayant des propriétés biomécaniques intéressantes ou des actifs, préférentiellement des substances d'origine végétale telles que les extraits de genépi, des substances d'origine marine telles que les moules vertes de Nouvelle Zélande (Pcrna canal iculus), de l'acide ortho-silicique, des vitamines telles que les vitamines A, D3, E ou C, des métaux tels que l'or ou l'argent, des analgésiques tels que la lidocaïne, xylazine, détomidine, des anti-inflammatoires non stéroïdiens, tels que flunixine, kétoprofène, aspirine, des corticostéroïdes tels que la prednisolone, triamcinolone, de l'acide hyaluronique, des glycosaminoglycanes, de la chondroïtine sulfate, du méthylsulfonylméthane, de la bromélaïne, de l'arnica, du collagène, des antioxydants, des acides gras - l'agent diffusant est compris dans un cargo choisi parmi des microcapsules, des micro-particules et des véhicules polymériques, de préférence des nano ou microcapsules biodégradables; - l'hydrogel est substantiellement exempt d'agents pyrogènes ; - le 3 rapport massique entre l'acrylamide et le chitosan est compris entre 1/1 et 1/8 ; - le rapport massique entre le N,N'-méthylènebisacrylamide et l'acrylamide est compris entre 1/50 et 1/1000, de préférence compris entre 1/100 et 1/500 ; et - le rapport suivant des constituants en % en poids du poids total de l'hydrogel : acrylamide compris entre 0,3% et 20%; chitosan compris entre 0,0375% et 10%; N,N'-rnéthylènebisacrylamide compris entre 0,004% et 0,4% ; agent diffusant 0,001% et 30%; et H,0 jusqu'à 100%. [0014] L'invention a pour second objet, un procédé de fabrication d'un hydrogel tel que défini ci-dessus, comprenant les étapes suivantes : copolymérisation d'acrylamide et de chitosan, en présence de N,N'-méthylenchisacrylamide et d'un initiateur radicalaire, dans un milieu aqueux pour obtenir un copolymère ; lavage du copolymère à l'eau pour obtenir un copolymère lavé ; et ajout d'un agent diffusant pour obtenir l'hydrogel. [0015] Avantageusement, le procédé comprend les étapes suivantes : copolymérisation d'acrylamide et de chitosan introduits avec un rapport massique compris entre 1/1 et 1/8, à une température comprise entre 20 et 60°C, de préférence entre 40 et 60°C, en présence de N,N'-méthylènebisacrylamide introduit avec un rapport massique par rapport à l'acrylamide compris entre 1/50 et 1/1000, de préférence compris entre 1/100 et 1/500, et d'un initiateur radicalaire avec un rapport massique par rapport à l'acrylamide entre 1/100 et 1/10 choisi parmi le persulfate de potassium ou le persulfatc d'ammonium, éventuellement en association avec la tétraméthyléthylènediamine avec un rapport massique par rapport à l'acrylamide entre 1/2000 et 1/20, dans un milieu aqueux pour obtenir un copolymère ; lavage du copolymère à l'eau pour obtenir un copolymère lavé ; et ajout de l'agent diffusant entre 0,001% et 30% en % en poids du poids total de l'hydrogel, l'agent diffusant étant choisi parmi des ingrédients inertes ayant des propriétés biomécaniques intéressantes ou des actifs, ces agents étant préférentiellement des substances d'origine végétale telles que les extraits de genépi, des substances d'origine marine telles que les moules vertes de Nouvelle Zélande (Perna canaliculus), de l'acide ortho-silicique, des vitamines telles que les vitamines A, D3, E ou C, des métaux tels que l'or ou l'argent, des analgésiques tels que la lidocaïne, xylazine, détomidine, des anti-inflammatoires non stéroïdiens, tels que flunixine, kétoprofène, aspirine, des corticostéroïdes tels que la prednisolone, triamcinolone, de l'acide hyaluronique, des glycosaminoglycanes, de la chondroïtine sulfate, du méthylsulfonylméthane, de la bromélaïne, de l'arnica, du collagène, des antioxydants, des acides gras, éventuellement compris dans un cargo choisi parmi des microcapsules, des microparticules ou des véhicules polymériques, de préférence des microcapsules biodégradables, pour obtenir l'hydrogel. [0016] L'invention a pour troisième objet une utilisation d'un hydrogel tel que défini ci- dessus, dans un système de visco-supplémentation mécanique, en usage externe ou interne. [0017] Avantageusement, - le système de visco-supplémentation est un lubrifiant; - le système de visco-supplémentation est une matrice réticulée avec capacité d'emport ou stockage; - le système de visco-supplémentation est un hydratant ; - l'agent diffusant commence à diffuser entre le Terne et le 30ème jour après l'administration, de préférence entre le 10ème et le 20ème jour, en particulier à compter du 15ètne jour ; et - l'agent diffusant est libéré sur une période comprise entre 2 semaines et 12 mois, de préférence entre 1 mois et 6 mois. [0018] L'invention a pour quatrième objet, un kit de visco-supplémentation mécanique externe ou interne comprenant un copolymère d'acrylamide et de chitosan réticulé avec du N,N'-méthylènebisacrylamide, et un agent diffusant en phase solide ou en suspension, ledit copolymère et ledit agent diffusant étant préalablement mélangés lors de la fabrication sous la forme d'un hydrogel ou mélangés extemporanément pour former un hydrogel final. Brève description des figures [0019] L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description non limitative qui suit, rédigée au regard des dessins annexés, dans lesquels : [0020] [fig.1] - la figure I schématise la réaction de greffage du chitosan sur la poly- acrylamide par intervention d'une réaction radicalaire (création de radicaux libres à l'aide d'un initiateur de radicaux, noté I), et la réticulation du copolymère sous l'action du N,N'-méthylènebisacrylamide, selon l'invention ; [0021] [fig.2A] - Apres séchage des hydrogels (50°C pendant plus de 12 heures, réalisation de la pesée de matière sèche, en % du volume d'hydrogel. L'astérisque signifie que la viscosité n'a pas permis de valider la méthode. L'hydrogel V14 est le copolymère de l'invention (3.75% de mat.seche), l'hydrogel VS est la polyacrylamide pure et V20 est le copolymère avec l'agent diffusant. [0022] [fig.213[ - la figure 2B représente une comparaison des spectres infrarouge à transformée de Fourier (FT-IR), détaillés dans l'exemple 2, du copolymère chitosanpolyacrylamide-MBA (V 14) (MBA pour N,1\l'-méthylènebisacrylamide) présent dans l'hydrogel de l'invention sans agent diffusant, puis le V20 avec agent diffusant, d'un gel de polyacrylamide « pure » (V5) et du chitosan « pur » (Chitosan) ; [0023] [fig.2C] -la figure 2C représente une comparaison des spectres infrarouge à transformée de Fourier (FT-IR), détaillés dans l'exemple 2, du copolymère chitosanpolyacrylamide-MBA (V14) (MBA pour N,N1-méthylènebisacrylanaide) présent dans l'hydrogel de l'invention, d'un gel de polyacrylamide « pure » (V5) et du chitosan « pur » (Chitostui) ; [0024] [fig.2D] - le tableau de la figure 2D liste les pics majoritaires de FT-IR du co- polymère chitosan-polyacrylamide-MBA ; [0025] [fig.3A] - la figure 3A montre un essai de dissolution du copolymère présent dans l'hydrogel de l'invention, dans l'acide acétique, tel que décrit dans l'exemple 2 ; [0026] [fig.3B] - la figure 3B illustre l'absence de dissolution du copolymère dans l'acide acétique par la filtration de l'hydrogel après l'essai de dissolution décrit dans l'exemple 2 ; [0027] [fig.4] - le tableau 4 montre les tangentes de pertes suite aux mesures de visco- élasticité, dans les différents cas étudiés pour le copolymère de l'invention ; et [0028] [fig.5] - le tableau 5 montre les températures de transitions vitreuses en degrés Celsius, pour le chitosan (1), l'hydrogel pur de polyacrylamide (2) et le copolymère de l'invention (3). Description détaillée de l'invention [0029] Selon la présente invention, les termes « compris entre... et... » utilisés pour définir des intervalles de valeurs doivent être compris comme intégrant les bornes inférieure et supérieure de ces intervalles. Les termes « % en poids » doivent être compris comme « % en poids par rapport au poids total de l'hydrogel ». [0030] Selon un premier objet, l'invention concerne d'une part un hydrogel comprenant entre 0,3% et 30% en poids de matière sèche d'un copolymère formé au moins d'acrylamidc, de chitosan et de N,N'-méthylènebisacrylamide, et d'autre part un agent diffusant. [0031] Un « hydrogel » est un gel, c'est-à-dire un réseau tridimensionnel de solides dilué dans un fluide, dont le fluide est de l'eau (généralement 80% ou plus en poids du poids total de l'hydrogel). Le réseau tridimensionnel de solides est généralement un réseau de polymères. Ces derniers sont insolubles dans Veau, mais sont capables de gonfler substantiellement en présence d'une grande quantité d'eau. [0032] En référence à la figure I, l'hydrogel de l'invention comprend ou est constitué par un réseau moléculaire tridimensionnel piégeant des molécules d'eau et embarquant un agent diffusant. Lc réseau moléculaire tridimensionnel est formé par un copolymère chitosan-polyacrylamide-MBA. L'eau est présente, dans l'hydrogel, à raison de 70 à 99,7% en poids, préférentiellement à raison de 90 à 95% en poids d'eau, hors agent diffusant. [0033] L'hydrogel de l'invention est « biocompatible », c'est-à-dire qu'il ne dégrade pas le milieu biologique dans lequel il est utilisé Cette biocompatibilité provient de la grande quantité d'eau absorbée par l'hydrogel et de la structure tridimensionnelle non-toxique formée par un copolymère de chitosan et de polyacrylamide réticulé par du N,N'-méthylènebisacrylamide. [0034] L'hydrogel de l'invention est « biodégradable » en ce sens qu'il se dégrade en 6 formant des entités non dommageables pour l'environnement dans lequel il se trouve. En particulier, l'un des produits de dégradation de l'hydrogel de l'invention par exemple contenant de l'acide ortho-silicique, est la glucosamine qui est par ailleurs produite naturellement par l'organisme à partir du glucose et de la glutamine. La glucosamine joue un rôle prépondérant dans le maintien de l'intégrité du cartilage de l'ensemble des articulations. Elle permet de d'accompagner la dégradation des cartilages et soutient l'action lubrifiante du liquide synovial, un lubrifiant naturel des articulations. [0035] L'hydrogel de l'invention est un hydrogel de chitosan-polyacrylamide-MBA comprenant un agent diffusant. Cet hydrogel comprend donc un copolymère chitosanpolyacrylamide-MBA formé au moins d'acrylamide, de chitosan et de N,N'-rnéthylènebisacrylamide. [0036] L'acrylamide est un monomère d'origine synthétique. Lors de la polymérisation, les monomères se rassemblent en une macromolécule qui perd sa toxicité. Aussi, il est très important de construire le mieux possible le réseau tridimensionnel et de laver l'hydrogel après réticulation de manière à extraire la totalité des monomères potentiels résiduels. [0037] Le chitosan est un matériau d'origine naturelle et renouvelable. Ce matériau bio- compatible et biodégradable, ne présente aucune toxicité, est soluble dans l'acide acétique et est capable de se greffer chimiquement à d'autres molécules. [0038] Les différents types de molécules réagissant sur le chitosan sont nombreux. On peut notamment citer le polyéthylène glycol, l'alcool polyvinylique, l'acide polyacrylique, l'hydroxy-cellulose, des polyacrylates, des polyacryliques, et le polyacrylamide. [0039] Le chitosan est un polyoside composé de la distribution aléatoire de D-glucosamine liée en I3-(1-4) (unité désacétylée) et de N-acétyle-D-glucosamine (unité acétylée). Il est produit par désacétylation chimique (en milieu alcalin) ou enzymatique de la chitine, le composant de l'exosquelette des arthropodes (crustacés) ou de l'endosquelette des céphalopodes (calmars...), parfois aussi d'origine végétale (parois des champignons) ou d'origine synthétique. Cette matière première est déminéralisée par traitement à l'acide chlorhydrique, puis déprotéinée en présence de soude ou de potasse et enfin décolorée grâce à un agent oxydant. Le degré d'acétylation (DA) est le pourcentage d'unités acétylées par rapport au nombre d'unités totales, il peut être déterminé par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (1R-TF) ou par un titrage par une base forte. La frontière entre chitosan et chitine correspond à un DA de 50 % : en deçà le composé est nommé chitosan, au-delà, chitine. Le chitosan est soluble en milieu acide contrairement à la chitine qui est insoluble. Il est important de faire la distinction entre le degré d'acétylation (DA) et le degré de désacétylation (DD). L'un étant le complémentaire de l'autre c'est-à-dire que du chitosan ayant un DD de 85 7 %, possède 15 % de groupements acétyles et 85 % de groupements amines sur ses chaînes. [0040] Le chitosan est une macromolécule dont la masse molaire est comprise entre 50 000 Daltons et 400 000 Daltons (g/mole) qui peut être également visualisée par un nombre de motifs de quelques centaines à 2 ou 3 milliers. [0041] Le N,N'-méthylènehisacrylamide est un agent de réticulation. Dans la présente invention, le N,N'-méthylènebisacrylamide permet d'obtenir une structure tridimensionnelle, en particulier par la formation de liaisons covalentes entre les chaînes de chitosan-polyacrylamidc. [0042] Un polymère est formé d'une succession de motifs de répétition, nommés monomères, liés entre eux par des liaisons covalentes. Il est entendu par « copolymère », au sens de la présente invention, un polymère issu de la copolymérisation d'au moins deux types de monomères, chimiquement différents. Au sens de l'invention, le copolymère est un matériau homogène à enchaînement aléatoire, alterné et statistique des différents monomères le constituant. [0043] Dans un mode de réalisation, l'hydrogel de l'invention comprend entre 0,3% et 30% en poids, du poids total de l'hydrogel, de matière sèche en copolymère. En dessous de 0,3% en poids du poids total de l'hydrogel de matière sèche en copolymère, l'hydrogel risque de se former plus difficilement ou de ne pas se former de tout, c'est-à-dire que le mélange reste liquide. Au-delà de 30%, en poids du poids total de l'hydrogel de matière sèche en copolymère, l'hydrogel risque progressivement de devenir trop dur et de ne plus être applicable ou implantable ou injectable. Avantageusement, la proportion en poids de matière sèche du copolymère est égale ou supérieure à 2% en poids, ou encore 4%. Avantageusement, la proportion en poids de matière sèche du copolymère est inférieure ou égale à 15%, ou encore 10%. [0044] Dans un mode de réalisation, l'hydrogel de l'invention est substantiellement exempt de pyrogène. Au sens de l'invention, il est entendu par les termes « substantiellement exempt de pyrogène » une exemption substantielle de substances induisant une élévation de la température. Différentes méthodes existent pour identifier la présence de pyrogènes et sont bien connues de l'homme du métier. En particulier, une méthode permettant d'identifier la présence de pyrogène consiste à injecter à un lapin 10 mL de solution par kg de poids corporel et à mesurer sa température. Si la température corporelle du lapin augmente de 0,6°C, ou si l'augmentation totale est de plus de 1,4°C sur trois lapins, la solution n'est pas substantiellement exempte de pyrogènes. Une autre méthode permettant d'identifier la présence de pyrogène consiste à utiliser un test MAT ("Monocyte Activation Test" - "Test d'Activation des Monocytes") commercialisé, par exemple, par MerckTM sous les dénominations PyroDetectTM et/ou PyroMATTM introduit dans la Pharmacopée européenne en 2010. Ce 8 test a été développé comme alternative aux méthodes utilisant des animaux et vise à offrir la possibilité de réaliser les tests des pyrogènes chez l'humain dans un système in vitro. Au sens de l'invention, une eau substantiellement exempte de pyrogène est dite apyrogène. [0045] Dans un mode de réalisation, l'hydrogel selon l'invention comprend également un agent diffusant et/ou un autre agent ou ingrédient. [0046] Au sens de la présente invention, il est entendu par « agent diffusant » un ingrédient ou un actif capable de diffuser en dehors de l'hydrogel. L'agent diffusant peut être choisi parmi des ingrédients inertes ayant des propriétés biomécaniques intéressantes ou actifs. Ces agents peuvent être des substances d'origine végétale telles que les extraits de genépi, des substances d'origine marine telles que les moules vertes de Nouvelle Zélande (Perna canal iculus), de ortho-silicique, des vitamines telles que les vitamines A, D3, E ou C, des métaux tels que l'or ou l'argent, des analgésiques tels que la lidocaïnc, xylazinc, détomidine, des anti-inflammatoires non stéroïdiens, tels que flunixinc, kétoprofène, aspirine, des corticostéroïdes tels que la prednisolone, triamcinolone, de l'acide hyaluronique, des glycosaminoglycanes, de la chondroïtine sulfate, du méthylsulfonylméthanc, de la bromélaïne, de l'arnica, du collagène, des antioxydants, des acides gras. [0047] Dans un mode de réalisation, l'agent diffusant de l'invention peut également être compris dans un cargo. Ce cargo est défini comme une matrice capable d'embarquer l'agent diffusant, dans l'hydrogel. Selon l'invention, différentes techniques de cargo peuvent permettre d'embarquer l'agent diffusant, telles que l'encapsulation ou la vectorisation, la technologie dite d'égouttage (dripping technology en langue anglaise), la création d'émulsions ou de revêtements spécifiques, le greffage polymérique. En particulier, le cargo peut être choisi parmi des microcapsules, des microparticules ou encore des véhicules polymériques. La taille des particules utilisées est par exemple comprise entre 200 nm et 20 000 nm, ce qui fait d'elles des particules de taille supérieure à celles des nanopai-ticules dont la norme européenne décrit une taille inférieure à 100 nm pour plus de 50 % d'entre elles. [0048] L'agent diffusant, compris ou non dans un cargo, est retenu dans l'hydrogel, soit par piégeage physique, soit par interactions moléculaires, covalentes ou non, des exemples d'interactions non covalentes étant des interactions ioniques, liaison hydrogène ou complexation, soit par toute combinaison de ces modes de rétention. Notamment, la taille des pores, définie par la structure matricielle tridimensionnelle du copolymère de l'hydrogel, peut empêcher l'agent diffusant d'être libéré jusqu'à ce que l'hydrogel subisse une dégradation par un ou plusieurs mécanismes. L'agent diffusant peut ainsi être libéré soit par un changement de pH ou de température, soit sous une action mécanique. 9 [0049] Dans un mode de réalisation, l'hydrogel final de l'invention comprend entre 0,0001% et 30 % en niasse d'agent diffusant, sur la masse totale. De façon préférentielle, l'agent diffusant comprend environ 1% et 25 % en masse, par rapport à la niasse totale de l'hydrogel final. [0050] Dans un mode de réalisation particulier, l'agent diffusant de l'invention est un acide ortho-sil ic igue . [0051] Dans un mode de réalisation particulier, l'agent diffusant est sous la forme de micro- particules dont la taille est comprise entre 200 nm et 20 000nm. Ces microparticules sont donc de taille supérieure à celles des nanoparticules dont la norme européenne décrit une taille inférieure à 100 nm pour plus de 50 % d'entre elles. [0052] Dans un mode de réalisation, le rapport massique entre l'acrylamide et le chitosan est compris entre 1/1 et 1/8. Préférentiellement, il est compris entre 1/2 et 1/6. [0053] Dans un mode de réalisation, le rapport massique entre le N,N'-rnéthylènebisacrylamide et l'acrylamide est compris entre 1/50 et 1/1000. De préférence, le rapport massique entre le N,N'-méthylènebisacrylamide et l'acrylamide est compris entre 1/100 et 1/500. [0054] Dans un mode de réalisation particulier, l'hydrogel de l'invention comprend le co- polymère formé au moins par l'acrylamide, le chitosan et le N,N'-rnéthylènebisacrylamide, et l'agent diffusant, selon le rapport suivant en % en poids du poids total de l'hydrogel final : [0055] Acrylamide 0,3% et 20% [0056] Chitosan 0,0375% et 10% [0057] N,N'-rnéthylènebisacrylarnide 0,004% et 0,4% [0058] agent diffusant 0,001% et 30% [0059] H20 jusqu'à 100 [0060] Selon un second objet, l'invention concerne un procédé de fabrication d'un hydrogel tel que défini ci-dessus, comprenant les étapes suivantes : copolymérisation d'acrylarnide et de chitosan, en présence de N,N'-méthylènebisacrylamide et d'un initiateur radicalaire, dans un milieu aqueux, pour obtenir un copolymère ; lavage du copolymère à l'eau pour obtenir un copolymère lavé ; et ajout de l'agent diffusant pour obtenir l'hydrogel. [0061] Au cours du procédé de fabrication, le chitosan copolymérise avec la polyacrylamide en se liant sur elle de façon covalente. Sous l'action du N,N'-méthylènebisacrylamide (MBA), le système réticule selon un réseau tridimensionnel. Le MBA permet de lier de manière covalente différentes chaînes de chitosan-polyacrylamide pour former un réseau tridimensionnel. [0062] Le chitosan est ajouté en solution aqueuse acide, c'est-à-dire une solution aqueuse dont le pH est inférieur à 6. De préférence la solution aqueuse acide comprend un acide organique, notamment un acide organique dont le pKa est compris entre 4 et 6, tel qu'un acide carboxylique. En particulier la solution aqueuse acide comprend de l'acide acétique. [0063] La concentration du chitosan dans la solution aqueuse acide est de 1 à 5% en poids du poids total de la solution. [0064] La solution aqueuse acide de chitosan est mélangée à l'acrylamidc à une température comprise entre 20 et 60°C. De préférence la température est comprise entre 40 et 60°C. [0065] Le rapport massique entre l'acrylamide et le chitosan est compris entre 1/1 et 1/8. [0066] Le rapport massique entre le N,N'-méthylènehisacrylamide et l'acrylamide est compris entre 1/50 et 1/1000. De préférence, le rapport massique entre le N,N'-méthylènebisacrylamide et l'acrylamide est compris entre 1/100 et 1/500. [0067] La réaction de copolymérisation est initiée par un initiateur radicalaire. En par- ticulier, l'initiateur radicalaire est choisi parmi le persulfate de potassium ou le persulfate d'ammonium. Le rapport massique entre l'initiateur radicalaire et l'acrylamide est compris entre 1/100 et 1/10. L'initiateur radicalaire peut éventuellement être utilisé en association avec de la tétraméthyléthylènediamine (TEMED). Le TEMED est facultatif lors de la copolymérisation. Ainsi, le rapport massique entre la TEMED et l'acrylamide est compris entre 1/2000 et 1/20. L'absence de TEMED, catalyseur toxique, permet la formation d'un hydrogel à hase de matériaux en partie naturels et biocompatibles, et ainsi permet une hio-conception plus responsable. [0068] Le lavage du copolymère à l'eau permet l'élimination de contaminants et d'assurer une absence de tels contaminants au sein de l'hydrogel. Les contaminants du copolymère peuvent être des monomères résiduels, des résidus d'initiateurs radicalaires, des acides organiques. En particulier, des lavages répétés à l'eau et une analyse de l'eau de lavage, notamment par FT-IR, permet de mesurer le taux de monomères résiduels n'ayant pas participé à la réaction de copolymérisation et/ou de réticulation et permet également d'assurer l'absence de ces monomères résiduels dans l'hydrogel. En particulier, l'hydrogel de l'invention comprend moins de 1,5 mg/dispositif en acrylamide et moins de 20 UE/dispositif en endotoxines. [0069] L'agent diffusant, éventuellement compris dans un cargo, peut être ajouté à l'état solide ou en suspension dans l'eau. En particulier, l'agent diffusant peut être ajouté en suspension dans de l'eau apyrogène. [0070] Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de l'invention comprend les étapes suivantes : copolymérisation d' acrylamide et de chitosan introduits avec un rapport massique compris entre 1/1 et 1/8, à une température comprise entre 20 et 60°C, de préférence entre 40 et 60°C, en présence de N,N'-méthylènebisacrylamide introduit avec un rapport massique par rapport à l'acrylamide compris entre 1/50 et 1/1000, de préférence compris entre 1/100 et 1/500, et d'un initiateur radicalaire choisi 11 parmi le persulfatc de potassium ou le persulfate d'ammonium, éventuellement en association avec la tétrarnéthyléthylènediamine, dans un milieu aqueux pour obtenir un copolymère ; lavage du copolymère à l'eau sur 3 à 5 lavages pendant 48-96 heures pour obtenir un copolymère lavé ; et ajout de l'agent diffusant entre 0.001% et 30%, pour obtenir l'hydrogel final. [0071] Selon un troisième objet, l'invention concerne l'utilisation d'un hydrogel dans un système de visco-supplémentation mécanique, en usage externe ou interne. [0072] La visco-supplémentation mécanique selon l'invention permet d'embarquer phy- siquement l'agent diffusant in situ, pour un soutien des conditions physiologiques et rhéologiques normales de plaies, d'articulations ou en cas d'ulcères gastriques, notamment chez le cheval. [0073] Dans un mode de réalisation, l'hydrogel de l'invention est utilisé en usage interne dans un système de visco-supplémentation mécanique implantable pour le soutien des tissus mous des mammifères, voir des os et cartilage selon l'agent diffusant. Les tissus mous sont des éléments du corps, tels que les tissus adipeux, tissus conjonctifs, membrane synoviale de la capsule articulaire muscles, tendons, derme ou épiderme. [0074] La visco-supplémentation mécanique en usage interne consiste à implanter lo- calement l'hydrogel qui agit comme un agent de soutien de la membrane synoviale, du liquide synovial ou de l'os et cartilage selon les cas. L'hydrogel permet ainsi à l'articulation de soutenir sa mobilité par une action biomécanique. [0075] Avantageusement, le système de visco-supplémentation mécanique en usage interne est un lubrifiant. [0076] Dans un autre mode de réalisation, l'hydrogel de l'invention est utilisé en usage externe dans un système de visco-supplémentation mécanique. En usage externe, la visco-supplémentation mécanique consiste à appliquer localement l'hydrogel qui agit comme un agent d'accompagnement à la cicatrisation. Cet accompagnement à la cicatrisation se traduit par le maintien d'une humidité de la plaie lors de la cicatrisation grâce à la grande quantité d'eau présente dans l'hydrogel. [0077] Avantageusement, le système de visco-supplémentation mécanique en usage externe est un hydratant. [0078] L'utilisation de l'hydrogel selon l'invention permet un effet différé de l'agent diffusant compris dans l'hydrogel. En particulier, l'agent diffusant commence à diffuser entre le 2ème et le 30ème jour après l'administration, de préférence entre le 10ème et le 20ème jour, en particulier à compter du 15ème jour. [0079] L'utilisation de l'hydrogel selon l'invention permet également un effet prolongé de l'agent diffusant compris dans l'hydrogel. De préférence, l'agent diffusant est libéré sur une période comprise entre 2 semaines et 12 mois, de préférence entre 1 mois et 6 mois. 12 100801 Ainsi, les systèmes de visco-supplémentation mécanique de l'invention nécessitent moins d'applications et l'effet se manifeste pendant une période prolongée, d'au moins deux semailles. Cette visco-supplémentation mécanique prolongée de l'agent diffusant qui est localisé, fixé, protégé puis libéré par l'hydrogel est rendue possible grâce à la structure matricielle viscoélastique de l'hydrogel. Les effets de l'hydrogel viscoélastique, dont la libération différée et prolongée de l'agent diffusant, perdurent de manière significative. Dans ces conditions, l'hydrogel diffuse petit à petit au bout de quelques semaines après l'usage et ce pendant plusieurs semaines, comme s'il en résultait un usage de manière continue dans les plaies ou l'articulation, pendant un tel laps de temps. 11 en résulte par exemple une simplification sensible de l'accompagnement des articulations en apportant une visco-supplémentation durable et réduisant d'une manière importante le nombre d'applications ou implantations. [0081] Selon un quatrième objet, l'invention concerne un kit de visco-supplémentation externe ou interne comprenant un copolymère d'acrylamide et de chitosan réticulé avec du N,N'-méthylènebisacrylamide, et un agent diffusant en phase solide ou en suspension, ledit copolymère et ledit agent diffusant étant préalablement mélangés sous la forme d'un hydrogel ou mélangés extemporanément pour former un hydrogel. [0082] Ce kit comprend un copolymère formé au moins d'acrylamide et de chitosan et réticulé avec du N,N'-méthylènehisacrylamide, et un agent diffusant en phase solide ou en suspension. Le copolymère et l'agent diffusant sont soit préalablement mélangés sous la forme d'un hydrogel, soit mélangés extemporanément pour former un hydrogel. Exemples [0083] Exemple 1. Préparation du Go-polymère [0084] a) Produits intervenants dans le mélange [0085] - Solution d'acrylamide à 40 % dans l'eau, Sigma Aldrich riq (Grade biologie mo- léculaire/transfert embryonnairc/pharma) [0086] - Solution N, N' méthylène bis acrylamidc à 2% dans l'eau, Sigma Aldrich' hl- (Grade biologie moléculaire/transfert embryonnaire/pharrna) [0087] - Solution de Chitosan à 1% dans l'acide acétique 0,1 M, Sigma Aldric&M (350 Kda > 75 % désacétylation, Grade biologie moléculaire/transfert embryonnaire/pharma) [0088] - Persulfate de Potassium (KPS) (> 99 %) en poudre, Sigma AldrichTM (Grade biologie moléculaire/transfert embryonnaire/phalma) [0089] - Eau pour préparations injectables (eau ppi) [0090] b) Equipement [0091] - Ballon en verre de 1 L [0092] - Agitateur magnétique (de marque Fischer Bioblock ScienticTM), rotation 500 tours/ 13 n [0093] - Température de 40 °C (régulation par thermocouple HeidolphTM EKT 3001) [0094] c) Protocole général [0095] 1. Etape 1 [0096] Verser la solution de Chitosan dans le ballon préchauffé à 40 °C, conserver cette température et maintenir l'agitation à 500 tours/mn [0097] 2. Etape 2 [0098] Mélanger la solution d'acrylamide à la solution de N, N'-méthylènebisacrylamide. Verser le mélange dans le ballon 1 minute après le chitosan [0099] 3. Etape 3 [0100] Dissoudre I'APS (persulfate d'ammonium) ou KPS dans une partie de l'eau complé- mentaire, en remuant jusqu'à dissolution complète. [0101] Verser progressivement cette solution, 1 minute après avoir versé la solution (acrylamide et N, N', méthylène bis acrylamide) [0102] 4. Etape 4 [0103] Verser l'eau ppi jusqu'au volume total désiré [0104] 5. Etape 5 [0105] Conserver l'agitation magnétique et la température pendant une durée de 45 mn pour une copolymérisation du Chitosan sur la polyacrylamide et pour une réticulation avec la N,N' méthylène bis acrylamide [0106] 6. Etape 6 [0107] Laisser reposer 24 heures pour laisser complètement se former le gel [0108] 7. Etape 7 [0109] Procéder à plusieurs (3 à 5) rinçages dans de l'eau ppi pendant 96 heures puis égoutter le gel et le conserver à température ambiante. [0110] d) Différentes formulations testées [0111] 14 [Tableaux1] Constituants (e TFe2 Ac: -a.- - à 4 0 % 4:1 - r 75 r. 0 , 75 1,4 rfa :` - ,3 06 T.' 9.à.- d; n .,::z a dc 'Pr MED 3. ri_ FPS _ - - - , , ç Total e- tL 1 a nr - ej, .z ...: -. [0112] Exemple 2. Caractérisation du copolymère [0113] a) Caractérisation par infra-rouge à transformée de Fourier (FTIR) du copolymère présent dans l'hydrogel [0114] Des mesures FTIR, sur de la matière sèche, ont été menées pour comparer les spectres du copolymère chitosan-polyacrylamide-MBA présent dans l'hydrogel de copolymère de l'invention à 3,75%, sans agent diffusant (V14), à 3,75% avec agent diffusant (V20) versus du polyacrylamide « pure » à plus de 3,5 % sans chitosan (V5) et du chitosan « pur » (Chitosan). Les pesées des matières sèches sont contenues dans la figure 2A. [0115] Les spectres sont représentés sur les figures 2B et 2C Une analyse plus précise des spectres s'est poilée sur entre l'hydrogel sans agent diffusant (V14) versus hydrogel pur polyacrylamide (V5) et du chitosan. Les liaisons spécifiques sont reportées sur la figure 2D. [0116] Les conclusions expérimentales confirment la littérature publiée sur les greffages de type de copolymères. [0117] 1. Les pics du V14 a 1450 cm-' et 3182cm-' sont les caractéristiques uniques d'une copolymérisation entre chitosan et polyacrylamide. [0118] 2. Le pic à 3350cm-' (N-H) observé sur le chitosan et moins sur le copolymère est ca- ractéristique de la consommation de cette liaison pour le greffage selon la bibliographie. [0119] 3. Les pics à 1375cm-' (C-H) et 1113cm-' (C-0) observés sur le chitosan mais qui disparaissent sur le copolymère et le gel pur de polyacrylamide : la littérature attribue cela au greffage chitosan avec la polyacrylamide. [0120] Six pics spécifiques et distinctifs du copolymère chitosan-polyacrylamide-MBA sont identifiés dans les mesures FTIR, ce qui confirme la copolymérisation. [0121] Cette analyse FTTR verdie bien que le chitosan et le polyacrylamide se sont liés de manière covalente donnant naissance à un seul copolymère. [0122] h) Test de dissolution du copolymère dans l'acide acétique à 1% [0123] Essai de dissolution du chitosan dans l'acide acétique dilué à 1/100: [0124] On pèse 49,5 d'eau, 0,5 g d'acide acétique pur, 0,5 g de chitosan. [0125] On mélange dans un pécher et on laisse agir, tel que représenté sur la figure 3A. [0126] Au bout de 30 mn, sous agitation mécanique à la main, le chitosan est dissout. [0127] Essai de dissolution du copolymère chitosan-polyacrylamidc-MBA dans l'acide acétique dilué à 1/100: [0128] On pèse 49,5 d'eau, 0,5 g d'acide acétique pur, 20 g de chitosan-poly- acrylamide-MBA. [0129] On mélange dans un gobelet et on laisse agir, tel que représenté sur la figure 3A. [0130] Au bout de 60mn, sous agitation mécanique à la main, on utilise un filtre, comme illustré par la figure 3B. [0131] On recueille un gel que l'on pèse et on retrouve le poids de 20,00 g. [0132] Tl est possible de conclure que le copolymère est bien réticulé puisque insoluble dans l'acide acétique. [0133] c) Caractérisation de la viscoélasticité dynamique du copolymère [0134] La viscoélasticité dynamique du copolymère obtenu après lavages est mesurée et comparée à la viscoélasticité dynamique du copolymère obtenu avant lavages, à celle du copolymère obtenu après ajout d'acide acétique. [0135] Comme le rappelle les conclusions des essais figure 4, cette mesure de viscoélasticité révèle des valeurs significatives du module élastique caractéristique de la réticulation. Ainsi, elle prouve l'existence d'un réseau tridimensionnel dans le cas de l'hydrogel de copolymère chitosan-greffé-polyacrylamide, comme dans le cas de l'hydrogel de polyacrylamide pure. En parallèle aux valeurs de modules de cisaillement obtenues, les valeurs de tangente de pertes montrent une présence marquée de l'élasticité vis-à-vis de la viscosité, caractéristique d'un système réticulé. [0136] De, plus cette étude montre également que la réticulation du système copolymérisé est effective, car le gel formé n'est pas dissout dans l'acide acétique, contrairement aux molécules linéaires de chitosan. [0137] Cet état de réticulation subsiste aux différentes opérations (lavage, cisaillement par l'entrée et sortie de la seringue). [0138] d) Caractérisation de la calorimétrie différentielle à balayage (DSC) & Dynamic me- chanical analysis (Analyse Mécanique Dynamique - DMA) 16 [0139] Une analyse par DSC est réalisée sur la matière sèche du copolymère chitosan- polyacrylamide-MBA et comparée à l'analyse par DSC de la matière sèche de chitosan (+DMA) d'une part et de polyacrylamidc d'autre part. [0140] D'après la figure 5, ces résultats montrent une valeur unique de transition vitreuse pour chacun des matériaux étudiés. [0141] Si les polymères chitosan, d'une part et polyacrylamidc d'autre part, n'avaient pas formé de copolymères, on aurait pu s'attendre à l'existence de deux températures de transition vitreuse. 17