Brevet FR3095520A1 — publié le 20201030

Description Titre de l'invention : Méthode de stabilisation d'un peptide [0001] L'invention concerne une méthode de stabilisation d'un peptide. [0002] La maladie d'Alzheimer est une maladie neurodégénérative incurable du tissu cérébral qui entraîne la pelle progressive et irréversible des fonctions mentales et notamment de la mémoire. C'est la cause la plus fréquente de démence chez l'homme. [0003] Deux types de lésions du tissu nerveux caractérisent la maladie d'AlzheimerA>: les plaques séniles (ou dépôts amyloïdes) et la dégénérescence neurofibrillaire. Les plaques séniles sont formées par une accumulation extracellulaire de peptides amyloïdes de 40 à 42 acides aminés, résultant de cieux clivages de la protéine précurseur de l'amyloïde. [0004] Le diagnostic de la maladie d'Alzheimer repose actuellement sur une combinaison de tests incluant des tests cognitifs, des tests par imagerie et des tests d'immun-dosage par ELISA (de l'anglais « enzyme-linked immunosorbent assay »). Ces tests permettent de doser actuellement trois biomarqueurs qui sont présents dans le liquide céphalorachidien (LCR) des patients : la protéine Tau totale ; la protéine Tau phosphorylée ; et le peptide amyloïde A(31-42 (42 acides aminés). [0005] Le dosage du peptide amyloïde A(31-42 est le test le plus utilisé au niveau clinique. Toutefois, ce dosage est très compliqué car (i) d'une part ce peptide est très instable et tend à s'agréger, conduisant à sa dégradation rapide, et (ii) d'autre part il s'adsorbe facilement sur les parois des tubes utilisés dans les tests. Ces deux inconvénients aboutissent à des résultats inconstants lors des dosages en test ELISA et une faible fiabilité du diagnostic. [0006] Par ailleurs, les tests ELISA réalisés par différents laboratoires ou provenant de différents kits commerciaux peinent à donner des résultats identiques pour un même échantillon. [0007] Récemment, pour surmonter ces problèmes, la Commission Européenne a publié un document de procédure (Blennow K. et al., 2018) afin de calibrer les concentrations exactes des étalons dans les kits ELISA de diagnostic de la maladie d'Alzheimer grâce à des étalons certifiés. [0008] Cette procédure est basée sur un matériel de référence certifié « Certified Reference Material » (CRM) qui est en fait un ensemble d'échantillons dc LCR humains ayant une concentration connue en pcptidc amyloïde Ap1-42. Le CRM est soumis aux mêmes contraintes de stockage que le LCR (-70°C ± 10°C dans de la neige carbonique). Cette procédure nécessite en outre l'utilisation d'une méthode dc référence par spectrométrie de masse de type suivi de réactions utilisant un radio-isotope du pcptidc amyloïde Api -42 afin de quantifier précisément la concentration du 2 peptide amyloïde Ap -42 dans le CRM. [0009] Aussi, cette méthode est-elle extrêmement couteusc, requiert la participation de plusieurs laboratoires afin d'établir une validation croisée et doit être répétée fréquemment. En outre, il apparait des modifications continues de la forme et de la quantité du peptide amyloïde Ap1-42 pendant le stockage du CRM qui conduisent à des erreurs de calibrage. [0010] Il existe donc actuellement un grand besoin de standardiser plus facilement et de manière moins onéreuse les tests ELISA dans le cadre du diagnostic de la maladie d'Alzheimer. [0011] L'invention a notamment pour objectif de pallier ces inconvénients de l'art antérieur. [0012] Plus particulièrement, l'invention a pour objectif de fournir des peptides stables et une méthode utilisant ces peptides comme un étalon. [0013] A cet effet l'invention a pour objet une méthode de stabilisation d'un peptide amyloïde A(31-42 naturel de séquence SEQ ID NO :1, comprenant les étapes suivantes : a) la solubilisation dudit peptide amyloïde Api -42 naturel dans i. du diméthylsulfoxyde ou ii. une solution d'hydroxyde d'ammonium suivi d'une étape de lyophilisation, pour obtenir un premier mélange, h) la congélation dudit premier mélange à une température appropriée pour que ledit mélange soit sous forme solide, c) la dissolution dudit premier mélange obtenu à l'étape b) dans un tampon de borate de sodium dans lequel a été préalablement dissous un fluorochrome, permettant d'obtenir un peptide amyloïde A131-42 dérivé avec au moins un fluorochrome. [0014] Les inventeurs ont découvert de manière inattendue qu'il était possible de stabiliser le peptide amyloïde Ar31-42 naturel en dérivant ce dernier avec au moins un fluorochrome. Un tel peptide amyloïde A3I-42 dérivé présente une très bonne stabilité aussi bien à -80°C. à -20°C, à 4°C qu'à température ambiante. Ainsi la dégradation du peptide dérivé au cours du temps est fortement atténuée en comparaison avec le peptide amyloïde A131-42 naturel. [0015] En outre, et contre toute attente, les inventeurs ont découvert que le peptide amyloïde Ar31-42 dérivé conserve ses propriétés d'immuno-reconnaissance par les anticorps provenant des kits ELISA actuellement commercialisés pour le diagnostic de la maladie d'Alzheimer. Le peptide amyloïde A131-42 dérivé peut donc se substituer aux étalons utilisés dans ces kits. [0016] Par « peptide », on entend dans l'invention une chaîne d'acides aminés comprenant au moins 2 acides aminés. Les peptides peuvent être obtenus par les technologies de l'ADN recombinant ou par synthèse chimique 3 [0017] Par « peptide amyloïde A(31 -42 naturel », on entend un peptide de séquence SEQ ID NO :1 qui n'a pas subi de modifications post-traductionnelles, ni n'a subi aucune dérivation avec un quelconque composé. [0018] L'étape a) de soluhilisation du peptide amyloïde Mil -42 naturel permet d'amener ledit peptide à l'état de solution pour obtenir un premier mélange. En effet, le peptide amyloïde A131-42 naturel est généralement fourni sous la forme d'une poudre qu'il est nécessaire de solubiliser. Cette étape peut également être nommée « reconstitution ». Pour la suite de l'exposé, les termes « soluhilisation » et « reconstitution » seront considérés comme synonyme. Aussi, il sera employé de manière équivalente que le peptide amyloïde A131-42 naturel est solubilisé ou reconstitué. [0019] La soluhilisation du peptide amyloïde A131-42 naturel peut se faire soit dans une solution de diméthylsulfoxyde (DMSO), soit alternativement dans une solution d'hydroxyde d'ammonium. [0020] Dans le cas où la reconstitution peptide amyloïde A(31-42 naturel est réalisée dans une solution de d'hydroxyde d'ammonium, l'étape a) est avantageusement réalisée à température ambiante. [0021] Dans l'ensemble de la demande, il est entendu par « température ambiante », une température de 17°C à 37 °C, c'est-à-dire 17°C, 18°C, 19°C, 20°C, 21°C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, 30°C, 31°C 32°C, 33°C, 34°C 35°C, 36°C et 37°C. [0022] La reconstitution dans de l'hydroxide d'ammonium est nécessairement suivie par une étape de lyophilisation. En effet, une telle étape de lyophilisation permet de retirer toute trace d'ammonium dans le premier mélange, qui d'une part de par sa forte volatilité peut impacter la concentration finale du peptide et d'autre part peut altérer la réaction de dérivation. [0023] Cette étape de lyophilisation comprend une première sous-étape de congélation rapide à -110°C pour que ledit mélange soit sous forme solide suivie par deuxième sous-étape de déshydratation du peptide amyloïde A131-42 naturel reconstitué par sublimation de l'eau sous forme de glace. L'étape de sublimation est avantageusement réalisée à température ambiante et à une pression de 1 à 30 mbar. [0024] Dans le cas où la reconstitution peptide amyloïde A131-42 naturel est réalisée dans une solution de DMSO, l'étape a) est avantageusement réalisée à température ambiante. [0025] Dans tous les cas, l'étape a) est avantageusement réalisée à l'abri de la lumière. En effet le peptide amyloïde A131-42 naturel est sensible à la lumière et son exposition entraine sa dégradation. [0026] Suite à l'étape de lyophilisation, ou directement suite à l'étape de reconstitution dans le cas de l'utilisation d'une solution de DMSO, le premier mélange contenant le pcptidc amyloïde A(il -42 naturel reconstitué est congelé dans une étape h) à une température appropriée pour que ledit mélange soit sous forme solide. Cette étape h) permet de limiter la dégradation du peptide amyloïde A(31-42 naturel reconstitué avant l'étape c). [0027] Avantageusement, l'étape h) est réalisée immédiatement après l'étape a). Le peptide reconstitué n'est alors pas conditionné d'une autre manière suite à l'étape a). [0028] Avantageusement, suite à l'étape h), le premier mélange n'est décongelé que pour réaliser l'étape c). Aussi, ledit mélange n'est pas décongelé puis recongelé dans une étape ultérieure précédant l'étape c). En effet, une telle rccongélation conduit à une dégradation rapide du pcptidc amyloïde A131-42 naturel lors de sa décongélation ultérieure. [0029] Le pcptidc amyloïde A(31-42 naturel est ensuite dérivé lors de l'étape c) par la dis- solution du premier mélange dans un tampon de borate de sodium dans lequel a été préalablement dissous un fluorochrome, permettant d'obtenir un peptide amyloïde M31-42 dérivé avec au moins un fluorochrome. [0030] Avantageusement, l'étape c) est réalisée pendant au moins 30 secondes, et ty- piquement 1 minute, 2 minutes, 3 minutes, 4 minutes, 5 minutes, 6 minutes, 7 minutes, 8 minutes, 9 minutes ou 10 minutes. [0031] Avantageusement, l'étape c) est réalisée à température ambiante, plus avanta- geusement à une température de 17 à 25°C. [0032] Le peptide amyloïde Apt-42 dérivé correspond au peptide amyloïde Apt-42 naturel dont la séquence peptidique présente un ou plusieurs acides aminés auxquels est greffé un fluorochrome. [0033] Un fluorochrome, ou fluorophore, est un composé chimique capable d'émettre une lumière fluorescente à une certaine longueur d'oncle après avoir été excité à une autre longueur d'onde. Les fluorochromes sont couramment utilisés pour marquer des molécules biologiques telles que des peptides. [0034] Dans le cadre de l'invention, le fluorochrome présente une fonction chimique libre qui lui permet de se greffer à un acide aminé de la séquence du peptide amyloïde AP1-42 naturel, c'est-à-dire de créer une liaison covalente soit avec la chaire latérale de cet acide aminé, soit sur la fonction amine N-terminale libre ou la fonction acide carboxylique C-terminal libre commune à tous les acides aminés. Avantageusement, ledit fluorochrome se greffe sur les acides aminés présentant une fonction amine, plus particulièrement une fonction amine primaire, ou acide carboxylique sur leur chaîne latérale. Cette greffe est généralement réalisée par une réaction nucléophile, par exemple en formant une liaison de type NH-C=O. [0035] Dans le cas des fluorochromes se fixant aux fonctions amines, on pourra citer les fluorophores suivants : Alexa FluorTM 488 NHS Ester (Succinimidyl Ester), DLightTM 488 NHS Ester, FluoProbes0 488, CF0488A, et ChromeoTM 488 NHS-ester. [0036] La dérivation du peptide amyloïde Ap1-42 naturel de séquence SEQ ID NO : 1 par de tels fluorochromes peut se faire sur 3 acides aminés, ou sites, possibles de sa séquence peptidique : les lysines en positions 16 et 28, et l'acide aspartique en position N-terminal. [0037] Dans le cas des fluorochromes se fixant aux fonctions acides carboxyliques, on pourra citer les fluorochromcs suivants : 5-FAM Cadavcrinc, 5-FITC Cadavcrine et Alcxa FluorTM 488 Cadavcrinc. [0038] La dérivation du peptide amyloïde Ap1-42 naturel par de tels fluorochromes peut se faire sur 7 sites possibles de sa séquence peptidique : les acides glutamiques en positions 3, 11 et 22, les asparagines en positions 1, 7 et 23, et l'alanine en position C-terminal. [0039] Avant d'être solubilisé dans la solution de borate de sodium, ledit fluorophore est préalablement reconstitué dans une solution de DMSO. Avantageusement, la solution de DMSO utilisée présente une pureté supérieure ou égale à 99,9%. Avantageusement encore, la solution de DMSO n'a pas été au préalable au contact avec l'oxygène de l'air ambiant. De telles conditions permettent d'éviter une dégradation du fluorochrome. La concentration du fluorochrome dans la solution de DMSO est de 5 à 20 mg/ml, avantageusement de 10mg/rnl. Par de 5 à 20 mg/ml, il est entendu 5ng/ml, 6mg/ml, 7mghnl, 8mg/ml, 9mg/ml, 10mg/ml, 11 mg/ml, 12mg/ml, 13mg/ml, 14mg/ml, 15mg/ml, 16mg/ml, 17mg/ml, 18mg/ml, 19mg/m1 et 20mg/ml. [0040] Avantageusement, lors de l'étape c), ledit peptide amyloïde API-42 naturel est dérivé avec deux fluorophores, chacun étant lié sur un acide aminé différent du peptide amyloïde AP1-42 naturel de SEQ ID NO :1. [0041] Plus avantageusement, dans le cas d'un fluorochrome se liant aux fonctions amines, un des fluorochromes est lié à la lysine en position 28 du peptidique et l'autre à la fonction amine libre de l'acide aspartique en position N-terminal de la séquence peptidique. [0042] Dans le cadre de l'utilisation d'un tel fluorochrome, le ratio molaire entre le fluo- rochrome et le peptide amyloïde Api-42 naturel est avantageusement de 150: 1 à 250 : 1, notamment de 200 : 1. L'utilisation d'un ratio dans cet intervalle permet d'obtenir une très grande majorité, voire la quasi-totalité, de peptides amyloïdes AP1-42 dérivés par deux fluorochromes, dont un fluorochrome est lié à la lysine en position 28 de la séquence peptidique et l'autre à l'acide aspartique en position N-terminal de la séquence peptidique. [0043] Avantageusement, l'invention concerne également une méthode de stabilisation telle que décrite précédemment, dans laquelle la solution de DMSO utilisée à l'étape a) présente une pureté supérieure ou égale à 99,9%. 6 [0044] De telles conditions permettent à la fois d'éviter une dégradation du peptide amyloïde A(31-42 naturel et à la fois d'obtenir de meilleurs rendements lors de l'étape c) de dérivation. En outre, et pour les mêmes raisons, la solution de DMSO n'a avantageusement pas été au préalable au contact avec l'oxygène de l'air ambiant. [0045] L'invention concerne avantageusement la méthode de stabilisation susmentionnée, dans laquelle la solubilisation dudit peptide amyloïde A(31-42 naturel dans l'étape a) est réalisée dans une solution de DMSO et l'étape h) de congélation est réalisée à une température inférieure ou égale à -30°C. Plus avantageusement, la température est de 32°C. [0046] L'invention concerne avantageusement une méthode de stabilisation telle qu'énoncée précédemment, dans laquelle la solubilisation dudit peptide amyloïde MM -42 naturel dans l'étape a) est réalisée dans une solution d'hydroxyde d'ammonium de 0,10 à 0,20% m/v. [0047] Une telle condition permet d'assurer une solubilisation optimale du peptide dans la solution d'hydroxyde d'ammonium. Par de 0,10 à 0,20% m/v, il est entendu 0,10% m/ v, 0,11% m/v, 0,12% m/v, 0,13% m/v, 0,14% m/v, 0,15% m/v, 0,16% m/v, 0,17% m/v, 0,18% m/v, 0,19% m/v et 0,20% m/v, [0048] L'invention concerne avantageusement une méthode de stabilisation telle qu'énoncée précédemment, dans laquelle la solubilisation dudit peptide amyloïde MM -42 naturel dans l'étape a) est réalisée dans une solution d'hydroxyde d'ammonium et l'étape de congélation est réalisée à une température inférieure ou égale à -18°C. [0049] L'invention concerne avantageusement une méthode de stabilisation telle qu'énoncée précédemment, dans laquelle le tampon de borate de sodium utilisé à l'étape c) présente une force ionique de 30 nM à 50 nM et un pH de 10 à 11,5. [0050] De telles conditions permettent d'optimiser la dérivation du peptide et donc sa stabilité. En effet, des conditions de pH inférieur à 10 conduit à une dérivation partielle/incomplète du peptide, et des conditions de pH >11,5 dégrade le fluorophore et présente de forts risques de dégrader le peptide. [0051] La force ionique mesure la concentration d'ions en solution. Elle s'exprime en mo1.1' ou molaire (M). [0052] Par de 30 nM à 50 nM, il est entendu 30 nM, 31 nM, 32 nM, 33 nM, 34 nM, 35 nM, 36 nM, 37 nM, 38 nM, 39 nM, 40 nM, 41 nM, 42 nM, 43 nM, 44 nM, 45 nM, 46 nM, 47 nM, 48 nM, 49 nM et 50 nM. [0053] Par de 10 à 11,5, il est entendu 10, 10,1, 10,2, 10,3, 10,4, 10,5, 10,6, 10,7, 10,8, 10,9, 11, 11,1, 11,2, 11,3, 11,4 et 11,5. [0054] L'invention concerne avantageusement une méthode de stabilisation telle qu'énoncée précédemment, l'étape c) résultant en l'obtention d'un second mélange comprenant le peptide amyloïde AP1-42 dérivé, ladite méthode comprend en outre l'étape suivante : 7 d) au moins une filtration du second mélange au travers d'au moins une membrane poreuse présentant un poids moléculaire nominal limite de 1 à 4 kDa permettant l'isolement dudit peptide amyloïde A(31-42 dérivé. [0055] L'étape d) permet avantageusement de filtrer les impuretés liées à l'étape de dé- rivation c), principalement l'excès de fluorophore. [0056] Par de 1 à 4 kDa, il est entendu 1 kDa, 1,1 kDa, 1,2 kDa, 1,3 kDa, 1,4 kDa, 1,5 kDa, 1,6 kDa, 1,7 kDa, 1,8 kDa, 1,9 kDa, 2 kDa, 2,1 kDa, 2,2 kDa, 2,3 kDa, 2,4 kDa, 2,5 kDa, 2,6 kDa, 2,7 kDa, 2,8 kDa, 2,9 kDa, 3 kDa, 3,1 kDa, 3,2 kDa, 3,3 kDa, 3,4 kDa, 3,5 kDa, 3,6 kDa, 3,7 kDa, 3,8 kDa, 3,9 kDa, 4 kDa. [0057] La filtration d'une solution à travers une membrane poreuse est bien connue de l'art antérieur. De manière courante, une telle filtration est réalisée par le passage d'un liquide, en l'occurrence le second mélange, au travers d'une membrane présentant des pores d'une taille déterminée, contraint par l'effet d'une pression hydrostatique. [0058] La taille des pores est définie par le poids moléculaire nominal limite de la molécule qui peut passer à travers. En d'autres termes, toute molécule d'un poids moléculaire nominal supérieur ne peut pas passer à travers la membrane, n'est pas filtrée et reste donc piégée dans la solution à filtrer (rétentat). L'unité du poids moléculaire nominal limite est le Dalton (Da), 1 kDa étant égale à 1000 Da. Un dalton correspond à 1/12 de la masse d'un atonie de carbone 12, qui est approximativement de 1,660538921 x 10-27 kg. [0059] Dans le cadre de l'invention, la taille des pores permet aux fluorochromes en solution de passer au travers de la membrane, mais retient le peptide amyloïde Ar31-42 dérivé. Ainsi, le peptide amyloïde A(31-42 dérivé est récupéré dans le rétentat et non dans le filtrat. [0060] Suite à l'étape d), le rétentat se trouve au contact de la membrane. Avantageusement, ladite au moins une membrane est en polypropylène, permettant d'éviter une interaction du peptide amyloïde AP1-42 dérivé avec la membrane et son absorption sur cette membrane. En effet, le polypropylène interagit peu, voire pas, avec le peptide amyloïde AI31-42 dérivé. [0061] De manière générale, les membranes poreuses font partie d'un système de filtration comprenant une entrée et une sortie. Chaque système de filtration comprend une membrane ou plusieurs membranes empilées les unes sur les autres, et disposées entre l'entrée et la sortie. [0062] Le système de filtration est généralement placé dans un microtube. Le microtube comprenant le système de filtration et la solution à filtrer est ensuite disposé dans une centrifugeuse. La pression hydrostatique est ainsi appliquée sur la solution à filtrer par centrifugation. [0063] Avantageusement, les parois du microtube sont en polypropylène, pour les mêmes 8 raisons qu'expliquées plus haut. A cette fin, on peut notamment utiliser un microtube Eppcndorf®. [0064] Lorsque la membrane, ou dans le cadre d'une pluralité de membrane aucune des membranes, n'est accolée à l'entrée du système de filtration, il existe ce que l'on appelle un « volume mort », généralement de l'échelle du microlitrc. De par la présence d'un tel volume mort, la totalité de la solution à filtrer n'est pas filtrée au travers de la membrane poreuse. [0065] Ainsi avantageusement, le volume mort de la ou des membranes est de 0 à 49 pl. Par de « 0 à 49 pl, il est entendu 0 pl, 0,5 pl, 1 pi, 1,5 pl, 2 pl, 2,5 pl, 3 pl, 3,5 pl, 4 pl, 4,5 pl, 5 pl, 5,5 pl, 6 pl, 6,5 pl, 7 pl, 7,5 pl, 8 pl, 8,5 pl, 9 pl, 9,5 pl, 10 pl, 11 il, 12 pl, 13 pl, 14 pl, 15 pl, 16 pl, 17 pl, 18 pl, 19 pl, 20 pl, 21 pl, 22 pl, 23 pl, 24 25 pl, 26 pl, 27 pl, 28 pl, 29 pl, 30 31 pl, 32 pl, 33 pl, 34 pi, 35 36 pl, 37 pl, 38 pl, 39 pi, 40 pl, 41 pl, 42 pl, 43 pl, 44 pl, 45 pi, 46 pl, 47 pl, 48 pl et 49 pl. [0066] Ainsi, avantageusement, au moins 91% du volume du second mélange est filtré lors de l'étape d). Par au moins 91% il est entendu 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ct 100%. [0067] Avantageusement, l'étape d) comprend au moins deux filtrations. Ces deux ou plus filtrations peuvent être réalisée à travers la ou les mêmes membranes, ou bien à travers d'autres membranes. Ces autres membranes présentent avantageusement les mêmes caractéristiques que les premières. Avantageusement encore, la ou les filtrations suivantes sont réalisées au travers d'au moins une autre membrane. Entre deux filtrations, le rétentat est avantageusement récupéré par solubilisation dans une solution choisie parmi du DMSO, un tampon phosphate sodium présentant une force ionique de 10 nM à 30 nM et un pH de 6,5 à 7,5, de l'eau, notamment de l'eau distillé ou de l'eau ultra pure, ou du liquide céphalo-rachidien. Alternativement, ce rétentat peut être récupéré par une étape de centrifugation intermédiaire dans laquelle la membrane précédemment utilisée est retournée, puis ce rétentat est solubilisé dans une solution choisie parmi du DMSO, un tampon phosphate sodium présentant une force ionique de 10 nM à 30 nM et un pH de 6,5 à 7,5, de l'eau, notamment de l'eau distillé ou de l'eau ultra pure, ou du liquide céphalo-rachidien. [0068] Par analogie, ces filtrations peuvent ainsi être réalisées à travers un même système de filtration, ou bien à travers plusieurs systèmes de filtration. [0069] Alternativement ou de manière complémentaire, la ou au moins une des filtrations peut être réalisée au travers d'un gel. Le matériau formant ce gel peut être choisi dans le groupe comprenant du dextran, de l'acrylamide, de l'agarose, du sépharose, un polymère de vinyle, ou un mélange de ces derniers. [0070] Alternativement encore ou de manière complémentaire, la ou au moins une des fil- trations est réalisée par séparation sur colonne de chromatographie préparative. 9 [0071] De manière générale, lors de la séparation sur colonne de chromatographie pré- parative la solution à filtrer (notamment le second mélange) est exposée à deux phases : une phase stationnaire et une phase mobile, la phase stationnaire se trouvant à l'intérieur d'une colonne. La phase mobile se déplace au travers de la phase stationnaire de façon contrôlée en entraînant les éléments qui y sont solubles. On récupère ensuite à la sortie de la colonne les éléments en solution dans la phase mobile. La phase mobile est donc choisie pour que le peptide amyloïde dérivé y soit soluble. Avantageusement, des composants de la solution à filtrer, seul le peptide amyloïde dérivé est soluble dans la phase mobile. [0072] Avantageusement, ladite au moins une des filtrations réalisée à l'étape d) comprend une centrifugation pendant une durée d'au moins 4 minutes avec une force centrifuge relative de 12000 à 16000 g. Plus avantageusement, la force relative centrifuge est de 14000 g. [0073] L'invention concerne avantageusement une méthode de stabilisation telle qu'énoncée précédemment, dans laquelle la ou au moins une des filtrations est réalisée par centrifugation pendant une durée d'au moins 10 minutes, de préférence l'étape d) de filtration est réalisée par deux filtrations de 12 minutes chacune. [0074] Le peptide amyloïde dérivé est avantageusement stable dans différentes solutions couramment utilisées pour la solubilisation de molécule biologique. Ainsi, la méthode de stabilisation telle qu'énoncée précédemment comprend en outre l'étape suivante : e) la dissolution du rétentat comprenant le peptide amyloïde A3I-42 dérivé tel qu'obtenu à l'étape d) dans une solution choisie parmi du DMSO, un tampon phosphate sodium présentant une force ionique de 10 nM à 30 nM et un pH de 6,5 à 7,5, de l'eau, notamment de l'eau distillé ou de l'eau ultra pure, ou du liquide céphalorachidien amenant à l'obtention d'une troisième solution. [0075] L'eau ultra-pure ne contient par définition que des molécules HnO, et des ions H+ et OH en équilibre. [0076] Dans le cas où à l'étape d) au moins deux filtrations ont lieu et qu'entre deux fil- trations le rétentat est repris dans une solution, la solution utilisée à l'étape e) est la même que celle utilisée dans l'étape d). [0077] L'invention concerne également un kit d'immuno-dosage d'un peptide amyloïde AP1-42 naturel de séquence SEQ ID NO :1 comprenant un étalon correspondant audit peptide amyloïde AP1-42 dérivé par au moins un fluorophore obtenu selon la méthode de stabilisation telle qu'énoncée précédemment. [0078] Du fait de la grande stabilité du peptide amyloïde AP1-42 dérivé, la concentration de ce peptide en tant qu"étalon du kit reste constante au cours du temps. Il n'est alors pas nécessaire de vérifier sa concentration fréquemment au contraire de ce qui est réalisé actuellement dans les kits commerciaux. [00791 Avantageusement, le kit de l'invention est un kit de dosage d'immunoadsorption par enzyme liée (ELISA). [0080] Par ailleurs, et comme il a été mentionné ci-dessus, le kit peut avantageusement comprendre des anticorps dirigés contre le peptide amyloïde Ap1-42, notamment ceux actuellement utilisés dans les kits commerciaux. Ainsi, en dépit de sa dérivation le pcptidc peut être reconnu par les anticorps reconnaissant le pcptidc naturel. [0081] L'invention concerne enfin un pcptidc amyloïde Apl -42 dérivé par au moins un fluorophore obtenu selon la méthode de stabilisation telle qu'énoncée précédemment pour son utilisation comme étalon dans une méthode de dosage d'un peptide amyloïde M3l-42 naturel de séquence SEQ ID NO :1. [0082] De manière générale, les méthodes de dosage d'un peptide amyloïde Ap1-42 naturel se rapportent aux méthodes de diagnostic dc la maladie d'Alzheimer. [0083] L'invention concerne également l'utilisation du peptide amyloïde A(31 -42 dérivé par au moins un fluorophore obtenu selon la méthode de stabilisation telle qu'énoncée précédemment comme étalon dans une méthode dc dosage d'un pcptidc amyloïde Ap1-42 naturel de séquence SEQ ID NO :1. [0084] L'invention sera mieux comprise à la lumière des figures et des exemples suivants. Brève description des figures [0085] La [fig.1] est un graphique représentant l'évolution de la fluorescence du peptide amyloïde Ap1-42 naturel par spectrofluoriniétrie à la ThT. L'axe des x représente le temps en minutes. L'axe des y représente l'intensité de fluorescence obtenue avec une excitation à 488nm (unité arbitraire). La [fig.] est un électrophérogrammc représentant la quantité dc fluorescence (unité arbitraire) obtenue par électrophorèse du rétentat d'une solution comprenant le pcptidc amyloïde Ap1-42 dérivé filtrée au travers dc différentes membranes, en fonction du temps (en minutes). La courbe grise correspond au résultat obtenu après filtration au travers d'une membrane en polypropylène avec un volume mort de moins de 1 pl. La courbe noire correspond au résultat obtenu après filtration au travers d'une membrane en fibre de cellulose régénérée avec un volume mort dc 50 La courbe noire a été décalée en ordonnée à l'unité 2 et la courbe grise à l'unité 1 afin de pouvoir distinguer sur un même graphique ces deux courbes. La valeur de quantité de fluorescence réelle au temps 0 pour ces deux courbes est de 0. La [fig.3] est un graphique représentant un spectre de masse de déconvolution obtenu suite à une spectrométrie de masse en tandem Q-TOF effectuée sur un peptide amyloïde 1-42 modifié. Le spectre de masse de déconvolution donne les masses exactes des molécules sans les états de charges. L'axe des x représente le rapport masse sur charge (m/z) des ions chargés. L'axe des y représente le nombre d'ions 11 chargé compté. La Ifig.41 est un histogramme représentant le pourcentage de l'air du pic obtenu par électrophorèse capillaire en fonction du temps (en heures) pour le peptide amyloïde Ar31-42 dérivé (rectangle noir), et pour le peptide amyloïde A131-42 naturel (rectangle gris) après conservation à température ambiante dans de l'eau. La Ifig.51 est un histogramme représentant le pourcentage de l'air du pic obtenu par électrophorèse capillaire en fonction du temps (en jours) pour le peptide amyloïde Ap1-42 dérivé (rectangle noir), et pour le peptide amyloïde Ap1-42 naturel (rectangle gris) après conservation à 4°C dans de l'eau. La [fig.6] est un histogramme représentant le pourcentage de l'air du pic obtenu par électrophorèse capillaire en fonction du temps (en mois) pour le peptide amyloïde Ap1-42 dérivé (rectangle noir), et pour le peptide amyloïde Ap1-42 naturel (rectangle gris) après conservation à -20°C dans de l'eau. La [fig.7] est un histogramme représentant le pourcentage de l'air du pic obtenu par électrophorèse capillaire en fonction du temps (en heures) pour le peptide amyloïde Ap1-42 dérivé (rectangle noir), et pour le peptide amyloïde Ap1-42 naturel (rectangle gris) après conservation à température ambiante dans un tampon phosphate (20 mM et de pH 7,1). La [fig.8] est un histogramme représentant le pourcentage de l'air du pic obtenu par électrophorèse capillaire en fonction du temps (en jours) pour le peptide amyloïde Ap1-42 dérivé (rectangle noir), et pour le peptide amyloïde Ap1-42 naturel (rectangle gris) après conservation à 4°C dans un tampon phosphate (20 mM et de pH 7,1). La [fig.9] est un histogramme représentant le pourcentage de l'air du pic obtenu par électrophorèse capillaire en fonction du temps (en mois) pour le peptide amyloïde Ap1-42 dérivé (rectangle noir), et pour le peptide amyloïde Ap1-42 naturel (rectangle gris) après conservation à -20°C dans un tampon phosphate (20 mM et de pH 7,1). La [fig.10a] est un graphique représentant la corrélation entre la concentration du peptide amyloïde A131-42 naturel obtenu avec un kit ELISA R&D Système complet (axe des x) et avec ce même kit dont l'étalon a été remplacé par le peptide amyloïde Ar31-42 dérivé (axe des y). La [fig.l0b] est un graphique représentant la corrélation entre la concentration du peptide amyloïde A131-42 naturel obtenu avec un kit ELISA Fujirebio complet (axe des x) et avec ce même dont l'étalon a été remplacé par le peptide amyloïde A131-42 dérivé (axe des y). Exemples [0086] Exemple 1 : Obtention d'un peptide amyloïde stabilisé [0087] Des lots du peptide amyloïde Api-42 naturel (fournisseur : AnaSpec) ont été testés à réception par la technique de spectrophotométrie de fluorescence (spectrotlurométrie) 12 à la Thioflavin T (ThT) afin de vérifier leur état d'agrégation/oligomérisation, à l'aide du protocole publié par Brinct et al. (en 2014). Les résultats obtenus sont représentés en figure 1 (courbe noire). Cette courbe noire montre un « lag timc » (un temps de latence avant la montée de la fluorescence) supérieur à 5 min, cc qui correspond à un faible état d'agrégation/oligomérisation. Sur la même figure, on peut voir le cas d'un fort état d'agglomération/oligomérisation présentant un lag time extrêmement court (courbe grise). [0088] Suite à cette étape de vérification, l'ensemble des peptides d'un même lot ont été re- constitués dans une solution de DMSO pure à 99,9% afin d'obtenir une concentration de 2 mg.ml-'. La solution obtenue a été aliquote° en volumes de 5µL dans des tubes à parois à faible absorption (Low hinding tubes Eppendorf0) qui ont été immédiatement stockés à -32 °C. [0089] Suite à cette étape, le peptide a été décongelé puis dérivé par un fluorochromc (Fluoprobc 488 NHS Ester) dans un tampon de borate de sodium présentant une force ionique de 40 nM et un pH de 10,6, avec un ratio molaire entre le fluorochrome et le peptide amyloïde AI31-42 naturel de 200. Cc fluorochrome se greffe aux fonctions amines primaires des chaînes latérales des acides aminés. [0090] Le produit de la réaction a ensuite été filtré deux fois sur deux membranes différentes en polypropylène (Nanosep) de 3 kDa présentant un volume mort de moins de 1 pl, à 14 000 g pendant 4 min et à température ambiante pour isoler le peptide amyloïde dérivé et éliminer les impuretés liées à la dérivation. [0091] Le rétentat est ensuite récupéré dans une solution d'eau. La concentration du peptide dans la solution finale était de 100 nM. [0092] La figure 2 montre un électrophérogramme d'une électrophorèse capillaire réalisée à partir de cette solution (ligne grise). Les conditions de l'électrophorèse capillaire sont les mêmes que celles mentionnées à l'Exemple 3. Comme on peut le constater, cet électrophérogramme présente 2 pics, le premier pic correspondant au DMSO présent dans la solution et le deuxième pic correspondant au peptide amyloïde AP1-42 dérivé. [0093] Afin de mettre en évidence l'impact du volume mort de la membrane de filtration utilisée, la même expérience a été réalisée avec une filtration au travers d'une membrane en fibres de cellulose régénérée (Amicon) de 3 kDa présentant un volume mort de 50 pl. Comme on peut le voir sur la figure 2 (courbe noire), l'électrophérogranurie d'une électrophorèse capillaire réalisée à partir de la solution obtenue montre une courbe presque rectiligne, sans aucun pic caractéristique du peptide amyloïde Al3l-42 dérivé. Ce résultat montre que le rétentat de l'étape de filtration ne comprenait aucun peptide amyloïde AP1-42 dérivé. Les inventeurs émettent l'hypothèse que le peptide amyloïde Al3l-42 dérivé, du fait du grand volume mort de la membrane, a été absorbé par cette dernière. 13 [0094] Exemple 2 : Caractérisation du peptide amyloïde Ap1-42 dérivé [0095] Par la suite, les inventeurs ont caractérisé le peptide tel qu'obtenu à l'exemple 1 d'un point de vue structural. En utilisant un spectromètre de masse en tandem quadripôle/ temps de vol (Q-TOF) (Agilent 6540), les inventeurs ont pu identifier que le peptide amyloïde Ap1-42 était dérivé par deux fluorochromes. Sur le spectre de masse de dé-convolution de la figure 3, on peut voir que la masse moléculaire obtenue pour le peptide amyloïde Api -42 dérivé correspond à la celle du peptide amyloïde Ap1-42 naturel (4329,15) auquel il est ajoutée 2 fois 573, correspondant à deux groupements de fluorophore. [0096] Par ailleurs, en effectuant une digestion enzymatique par la pronase E, les inventeurs ont pu identifier que les deux sites dérivés étaient l'acide aspartique en N-terminal et la lysine en position 28 de la séquence peptidique (voir tableau 1). [0097] [Tableauxl] Séquence d'acides aminés obtenues après digestion par la pronase E m/z observées m/z théoriques des fragments non dérivés Incrément de masse (A) AA (1-2) 777.07462 204.06 +573 AA (27-29) 890.16992 307.08 +573 [0098] Ainsi ce tableau montre que les deux fluorophores sont portés chacun par un fragment (incrément de masse de 573) et donc qu'une molécule de fluorophore est lié à l'acide aspartique en N-terminal et l'autre à la lysine en position 28 de la séquence peptidique. [0099] Par une analyse en spectrométrie de masse en tandem, les inventeurs ont comparé l'énergie de collision nécessaire pour fragmenter le peptide amyloïde A131-42 naturel et le peptide amyloïde API-42 dérivé. Les résultats montrent qu'un peptide amyloïde AP1-42 naturel a besoin d'une énergie de collision de 23 eV pour se fragmenter totalement, alors que le peptide amyloïde AP1-42 dérivé nécessite une énergie supérieure à 50 eV. Ces résultats montrent une grande stabilité chimique du peptide. [0100] Exemple 3 : Stabilité du peptide amyloïde AP1-42 dérivé [0101] Les inventeurs ont testé la stabilité du peptide amyloïde API-42 dérivé par analyse par électrophorèse capillaire au cours du temps en utilisant un système SCIEX (PA800, PA800-F, MDQ-P/ACE) avec un capillaire de silice de 60 cm. Pour ces analyses, il est utilisé un tampon phosphate de séparation à une concentration de 60mM et de pH 7,4, une tension de 30kV, et une injection hydrodynamique de 1% du volume du capillaire. 14 La détection des fluorochromes est réalisée par UV à une longueur d'onde d'excitation de 214nm. [0102] Ces expériences ont été répétées dans différentes conditions de températures (température ambiante, 4°C et -18 °C), et dans deux milieux (tampon de phosphate de sodium de force ionique 20 mM, pH 7,1, et de l'eau ultrapure. L'eau ultra pure a été obtenue grâce à un système Mill iQ+ (Millipore). [0103] Les préparations ont été conservées à l'abri de la lumière. [0104] La Figure 4 montre l'évolution du pourcentage de l'aire du pic du peptide au cours du temps lorsque le peptide amyloïde Ap1-42 dérivé est préparé dans de l'eau et stocké à température ambiante, conditions jugées très difficiles. [0105] Les résultats montrent que le peptide amyloïde Ap1-42 dérivé est stable au moins 2 jours contrairement au peptide amyloïde A(31-42 naturel qui commence à se dégrader très rapidement dès le ler jour. Le peptide amyloïde Ap1-42 dérivé commence à se dégrader seulement après une semaine, ce qui est remarquable pour un peptide conservé dans de telles conditions. [0106] La Figure 5 montre l'évolution du pourcentage de l'aire du pic du peptide au cours du temps lorsque le peptide amyloïde Ap1-42 dérivé est préparé dans de l'eau et stocké à 4°C. La même tendance est observée qu'à température ambiante. Le peptide amyloïde Ap1-42 dérivé reste bien plus stable au cours du temps et peut être utilisé comme étalon même après 6 mois de stockage à 4°C contrairement au peptide amyloïde AP1-42 naturel qui se dégrade significativement au bout de seulement deux jours. [0107] La Figure 6 montre l'évolution du pourcentage de l'aire du pic du peptide au cours du temps lorsque le peptide amyloïde API-42 dérivé est préparé dans de l'eau et stocké à -18 °C. Les mêmes tendances sont observées mais cette fois-ci sur plusieurs mois. Le peptide amyloïde AP1-42 dérivé est stable plus d'un an (figure 6). Une conservation de plus de deux ans du peptide amyloïde AP1-42 dérivé a été observée. Au contraire, comme le montre la figure 6, le peptide amyloïde AP1-42 naturel se dégrade significativement au bout d'un an. [0108] Des expériences complémentaires réalisées avec un peptide amyloïde Api-42 dérivé conservé dans la solution de phosphate de sodium conduit aux mêmes tendances à température ambiante, 4°C et -18°C (Figures 7, 8 et 9). [0109] L'ensemble de ces résultats montrent la grande stabilité au cours du temps du peptide amyloïde AP1-42 dérivé et ce à différentes températures de conservation et dans plusieurs milieux de conservation du peptide. [0110] Exemple 4 : Utilisation du peptide amyloïde AP1-42 dérivé comme étalon dans des kits ELISA [0111] Dans cet exemple, des tests d'immun-dosage ont été réalisés en utilisant deux kits ELISA commerciaux (R&D System et Fujirehio) sur 4 solutions de peptide amyloïde Mil -42 naturel de concentrations croissantes (de 40 à 250 pg/ml). Il est à noter que ces concentrations du peptide amyloïde A131-42 naturel sont très faibles et correspondent à celles obtenues dans les fluides biologiques. [0112] Ces deux kits commerciaux sont utilisés pour r immuno-dosage du peptide amyloïde Mil -42 naturel, notamment dans le cadre du diagnostic de la maladie d'Alzheimer. Ces kits sont composés chacun d'anticorps monoclonaux de capture et d'anticorps monoclonaux de détection dirigés contre le peptide amyloïde Ap1-42 naturel, et un étalon appelé « calibrator ». [0113] La concentration des 4 solutions a été testée en utilisant d'une part ces kits com- merciaux complet ou en remplaçant leur étalon par le peptide amyloïde A(31-42 dérivé tel qu'obtenu à l'exemple 1. Le peptide amyloïde A(31-42 dérivé a été conservé avant utilisation à -20°C dans de l'eau. [0114] Les figures 10a et 10h montrent la corrélation entre les résultats obtenus avec l'étalon des kits commerciaux et ceux obtenus avec le peptide amyloïde Ap1-42 dérivé. La corrélation est excellente dans les deux cas, R2=0,9978 (R&D System) et R2=0,9904 (Fujirehio). [0115] Ces résultats indiquent que les propriétés d'immuno-reconnaissance du peptide amyloïde Ap1-42 dérivé par les anticorps monoclonaux des kits commerciaux sont équivalentes à celle des étalons utilisés dans ces kits, et permettent ainsi de détecter des concentrations du peptide amyloïde A131-42 naturel équivalentes à celles obtenues dans les fluides biologiques. [0116] Par ailleurs, les inventeurs ont testé le dosage d'un peptide amyloïde A131-42 naturel d'un échantillon de liquide céphalo rachidien obtenu en utilisant soit le kit ELISA de Fujirebio susmentionné complet, soit en remplaçant l'étalon de ce kit par le peptide amyloïde A131-42 dérivé. Les résultats obtenus, présentés au tableau 1, sont très similaires (330 pg/ml vs 346 pg/ml respectivement). [0117] [Tableaux2] Absorbance Mesurée (UA) Concentration du peptide amyloïde A131-42 naturel (pg/ml) Etalon kit de Fujirebio Peptide amyloïde API-42 dérivé Échantillon LCR 1,2141 330 346 [0118] UA signifie unité arbitraire. [0119] L'ensemble de ces résultats montrent que les propriétés d' immuno-affinité du peptide amyloïde API -42 dérivé correspondent à celles des étalons des kits ELISA com- 16 merciaux, vis-à-vis de l'anticorps de capture mais aussi de l'anticorps de détection de ces kits. Ainsi, le peptide amyloïde Mil -42 dérivé peut avantageusement remplacer dans les kits commerciaux les étalons actuels «calibrator» dont les conditions de conservation, de milieu de dissolution et de stabilité à la conservation sont très contraignantes et limitantes. Notamment ces kits présentent dés flacons en verre, nécessitent que les calibrators soient conservées de 2 à 4°C, que la reconstitution de ces derniers soit faite dans une solution spéciale (composition inconnue), et qu'après reconstitution les calibrators soient immédiatement utilisés sans pouvoir être réutilisés a posteriori. 17 [Revendication 1] [Revendication 2] [Revendication 3] [Revendication 4] [Revendication 5] [Revendication 6] [Revendication 7] REVENDICATIONSMéthode de stabilisation d'un peptide amyloïde ,m31-42 naturel de séquence SEQ ID NO :1, comprenant les étapes suivantes : a) la solubilisation dudit peptide amyloïde Ap1-42 naturel dans i. du DMSO ou ii. une solution d'hydroxyde d'ammonium suivi d'une étape de lyophilisation, pour obtenir un premier mélange, b) la congélation dudit premier mélange à une température appropriée pour que ledit mélange soit sous forme solide, c) la dissolution dudit premier mélange obtenu à l'étape b) dans un tampon de borate de sodium dans lequel a été préalablement dissous un fluorochrome, permettant d'obtenir un peptide amyloïde A[31-42 dérivé avec au moins un fluorochrome. Méthode de stabilisation selon la revendication 1, dans laquelle la solution de DMSO utilisée à l'étape a) présente une pureté supérieure ou égale à 99,9%. Méthode de stabilisation selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle la solubilisation dudit peptide amyloïde A[31-42 naturel dans l'étape a) est réalisée dans une solution de DMSO et l'étape b) de congélation est réalisée à une température inférieure ou égale à -30°C. Méthode de stabilisation selon la revendication 1, dans laquelle la solubilisation dudit peptide amyloïde A[31-42 dans l'étape a) est réalisée dans une solution d'hydroxyde d'ammonium de 0,10 à 0,20% m/v. Méthode de stabilisation selon la revendication 1 ou 4, dans laquelle la solubilisation dudit peptide amyloïde A[31-42 naturel dans l'étape a) est réalisée dans une solution d'hydroxyde d'ammonium et l'étape b) de congélation est réalisée à une température inférieure ou égale à -18°C. Méthode de stabilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle le tampon de borate de sodium utilisé à l'étape c) présente une force ionique de 30 nM à 50 nM et un pH de 10 à 11,5. Méthode de stabilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, l'étape c) résultant en l'obtention d'un second mélange comprenant le peptide amyloïde A131-42 dérivé, ladite méthode comprend en outre l'étape suivante : d) au moins une filtration du second mélange au travers d'au moins une membrane poreuse présentant un poids moléculaire nominal limite de 1 18 à 4 kDa permettant l'isolement dudit peptide amyloïde A(31-42 dérivé. [Revendication 8] Méthode de stabilisation selon la revendication 7, dans laquelle la ou au moins une des filtrations est réalisée par centrifugation pendant une durée d'au moins 10 minutes, de préférence l'étape d) de filtration est réalisée par deux filtrations de 12 minutes chacune. [Revendication 9] Kit d' immuno-dosage d'un peptide amyloïde M31-42 naturel de séquence SEQ ID NO :1 comprenant un étalon correspondant audit peptide amyloïde ,m31-42 dérivé par au moins un fluorophore obtenu selon l'une quelconque des revendications 1 à 8. [Revendication 10] Peptide amyloïde A(31-42 dérivé par au moins un fluorophore obtenu selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 pour son utilisation comme étalon dans une méthode de dosage d'un peptide amyloïde M31-42 naturel de séquence SEQ ID NO :1.