Brevet FR3088194A1 — publié le 20200515

Résumé de l'invention Les présents inventeurs ont identifié un miRNA capable de fortement moduler la réponse inflammatoire induite par Clostridium difficile. Ils proposent donc d'incorporer ce miRNA dans une composition pharmaceutique pour prévenir ou diminuer les effets délétères de cette infection sur les intestins des patients infectés. Ce microRNA est le miR-27a-Sp. De manière avantageuse, ce miRNA peut ëtre associé à une matrice, incorporé dans des particules, ou véhiculé par un vecteur. Il peut être administré à des sujets infectés à des fins thérapeutiques. Description de l'art antérieur Clostridium difficile est la principale bactérie entéropathogène responsable d'infections post-antibiotiques dans les pays industrialisés [1, 2]. L'exposition aux antibiotiques, l'hospitalisation et l'âge avancé sont les principaux facteurs de risque associés à l'infection à C. difficile (ICD) [1]. L'ICD peut aller d'une diarrhée légère à une colite pseudomembraneuse grave menaçant le pronostic vital. L'augmentation de l'incidence et de la sévérité des ICDs ces dernières années coïncide avec l'émergence de clones épidémiques, en particulier des souches de ribotype 027. Cette augmentation a été accompagnée d'une augmentation des coûts des soins [3, 4]. Selon les estimations, le coût des traitements associés aux ICDs aux Etats-Unis s'élève à 3 milliards de dollars par an avec des projections similaires pour le Canada [5-8]. Aux États-Unis, le fardeau économique annuel des ICDs sur le système de santé est estimé à près de 4,8 milliards de 1 dollars par an en coûts excédentaires dans les établissements de soins aigus [3]. La plupart de ces coûts ont été attribués à des épisodes primaires d'ICD, avec un coût de 12 607 $ par cas [9]. En Europe, les coûts de prise en charge des ICD estimés par le Centre européen de prévention et contrôle des maladies (CEPCM) atteignent près de 4,4 milliards de dollars par 5 an [10]. En douze ans, les surcoûts des ICDs peuvent avoir augmenté de 27 à 93 % selon les pays [11 ; 39]. En France, les estimations de surcoûts peuvent varier de 1 666 à 5 867 E par cas d'ICD [12]. Ces coûts élevés sont en grande partie liés à la nécessité d'isolement des patients et à la prolongation des durées de séjours hospitaliers. Cependant, la charge totale de l'ICD est 10 susceptible d'être largement sous-estimée, puisque les coûts de récurrences, les événements indésirables causés par l'ICD (complications), le coût des soins dans les établissements de soins de longue durée et les coûts sociaux doivent encore être définis. C'est le cas également pour les ICD communautaires (hors hôpital). Les toxines cytolytiques de C. difficile A et B (respectivement connues sous le nom de TcdA 15 et TcdB) contribuent directement à la pathologie associée aux ICD [13, 14], mais d'autres facteurs jouent un rôle dans la colonisation et la pathogénicité de la bactérie. Parmi ces facteurs, les flagelles conférant la mobilité et le chimiotactisme à la bactérie [15], joueraient un rôle dans la réponse inflammatoire intestinale par l'activation des voies de signalisation des MAPKs (Mitogen-activated Protein Kinases) et de NF-icB, via l'interaction avec le 20 récepteur cellulaire de la réponse immunitaire innée TLR5 (pour Toll-like receptor 5) [16]. Dans cette réponse pro-inflammatoire, la voie de NEKB semble être la voie prédominante. Par ailleurs, in vivo dans un modèle murin d'ICD, les toxines agiraient en coopération avec les flagelles de C. difficile pour induire une réponse inflammatoire, suggérant le rôle synergique 2 des toxines et des flagelles dans la réponse inflammatoire intestinale [17]. La sévérité de l'inflammation intestinale est corrélée à la gravité des présentations cliniques des ICD. Différents mécanismes de régulation des voies de signalisation des récepteurs cellulaires de la réponse immunitaire innée, les TLRs (Toll-Like Receptors), ont été décrits. Parmi ces 5 mécanismes, les microRNA (miRNA), des séquences d'ARN non-codant de 21 à 24 nucléotides, responsables de la régulation post-transcriptionnelle de gènes par leur action spécifique sur les ARNm [18], jouent un rôle d'immunomodulateurs de la réponse innée par la régulation des voies dépendantes des TLRs. Les miRNAs, dont l'expression serait induite par l'activation des TLRs, modulent la réponse inflammatoire par l'inhibition d'effecteurs des 10 cascades de signalisation. Ils agiraient sur l'expression des cibles effectrices, des facteurs de transcription des voies de l'inflammation et des récepteurs TLR eux-mêmes [19, 20]. A ce jour, il n'a jamais été démontré ni suggéré qu'il était possible de diminuer efficacement la réponse inflammatoire intestinale induite par Clostridium difficile, en utilisant un miRNA modulant la voie de signalisation des TLR, par exemple la voie NF-KB. 15 Or les miRNAs sont des molécules connues pour leur absence d'effets délétères sur les tissus normaux. Ils sont aujourd'hui considérés comme des candidats médicament efficaces de nouvelle génération, notamment pour traiter les cancers ([40]). Dans ce contexte, il serait très avantageux d'identifier un miRNA capable de fortement moduler la réponse inflammatoire induite par Clostridium difficile, par exemple en inhibant 20 de façon suffisamment forte la voie NF-icB suractivée lors de cette infection. L'incorporation d'un tel miRNA dans une composition pharmaceutique permettrait d'obtenir un médicament capable de prévenir ou diminuer les effets délétères de cette bactérie sur les intestins des patients infectés. 3 Description détaillée de l'invention Dans cette logique, les présents inventeurs ont étudié l'expression d'un panel de miRNAs potentiellement impliqués dans la voie de signalisation TLR5-NF-KB in vitro et in vivo, dans le modèle de cellules épithéliales intestinales humaines Caco-2 et dans un modèle murin d'ICD. 5 Le miRNA connu dans la littérature sous le nom de « miR-27a-5p » est apparu comme étant significativement surexprimé au cours du temps dans des cellules Caco-2 stimulées par les flagelles de C. difficile ou infectées par la bactérie entière (Figure 1). Ces résultats montrent que ce miRNA joue un rôle dans la réponse induite par les flagelles de C. difficile. Par ailleurs, l'analyse de l'expression in vivo des miR-27a-5p dans le caecum de souris à microbiote 10 conventionnel ou des souris KO pour le TLR5 (tIr.51-) infectées par C. difficile ou un mutant non flagellé, a révélé que ce miRNA est également surexprimé dans le caecum de souris infectées par la bactérie sauvage, alors qu'aucune variation dans l'expression de ce mi RNA n'a été observée dans le caecum des souris infectées par un mutant non flagellé ni dans le caecum des souris KO tir51- infectées par la souche sauvage (figure 4). Enfin, un mimique de 15 ce miRNA (« miR-27a-5p-mimic ») a été administré par voie intraveineuse dans un modèle murin d'ICD dans le but d'étudier la réponse de l'hôte, responsable des lésions tissulaires et des manifestations cliniques sévères. Les résultats de cette expérience montrent que le mimique du miR-27a-5p réduit considérablement les manifestations cliniques et anatomopathologiques provoquées par la bactérie lors de l'infection dans ce modèle murin 20 (figures 5 et 6). Ce résultat apporte la preuve du concept du rôle important de ce miR-27a- 5p dans la modulation de la réponse inflammatoire au cours de l'ICD. Plus précisément, l'ensemble des résultats présentés ci-dessous démontrent que les flagelles de C difficile provoquent une surexpression du miR-27a-5p qui diminue le degré de la 4 réponse inflammatoire et réduit en conséquence les manifestations cliniques observées durant l'infection intestinale par C. difficile. Ces travaux mettent en lumière le rôle capital du miR-27a-Sp pour diminuer la réponse inflammatoire induite par les toxines et les flagelles de C. difficile et prévenir (ou diminuer) 5 les lésions muqueuses causées par cette inflammation. Ce miRNA impacte donc la présentation clinique ainsi que le pronostic de l'ICD. Pour diminuer les effets délétères sévères de l'infection par cette bactérie, les présents inventeurs proposent d'utiliser ce miRNA en tant que principe actif dans une composition thérapeutique. 10 Dans un premier aspect, la présente invention vise une composition pharmaceutique contenant un mimique du miR-27a-5p, pour son utilisation pour prévenir ou diminuer les lésions intestinales chez un sujet souffrant d'une infection à Clostridium difficile. Dans le cadre de la présente demande, le terme « miRNA » est utilisé pour désigner indifféremment un micro-ARN (ou miARN) ou un « micro-RNA ». Il s'agit de courts ARN non- 15 codants possédant entre 20 et 25 nucléotides, se liant à des ARNm cibles et inhibant ainsi leur traduction. Ces miRNAs peuvent être sous forme double-brin (précurseur ou duplex) ou simple-brin (forme mature, prête à se lier à l'ARNm cible). Le mi RNA connu sous la dénomination « mi R-27a-5p » est un ARN double-brin ayant chez la souris et l'homme la même séquence SEQ ID NO :1 (AGGGCUUAGCUGCUUGUGAGCA). Il a 20 été identifié en 2001 ([41]) et a été impliqué dans la voie NF-KB dans des cellules aortiques ([42]), et dans le cancer ([43]). Il a également été identifié dans les cellules interstitielles de la valve mitrale ([46]). 5 Les mécanismes cellulaires mis en jeu dans ces différentes études sont totalement décorrélés des résultats observés par les présents inventeurs : dans les deux articles [42] et [46], les récepteurs TLRs ne sont pas impliqués. Dans l'article [46], la voie de N F-icb n'est pas activée, c'est la voie de JNK et Wnt/B-caténine qui est impliquée. 5 En outre, il est bien connu dans l'art qu'un mëme miRNA peut avoir un rôle donné dans des conditions et dans un type cellulaire donnés et un rôle complétement opposé dans un autre type de cellule. Par exemple, le miR-27a lui-même peut avoir un rôle oncogénique dans le cancer du sein, mais suppresseur de tumeur dans les cancers de la prostate ([47] ; [48]). A l'inverse des présents inventeurs, certaines équipes ont même suggéré que le miR-27a 10 augmentait la réponse inflammatoire médiée par IL-10, dans des macrophages activés ([49]). Il est également connu que le miR-146a a des effets opposés selon les cellules considérées (effet pro-inflammatoire dans les cellules endothéliales stimulées par des surnageants de monocytes activés au LPS [50] ou effet anti-inflammatoire dans les cellules endothéliales vasculaires stimulées au LPS, [51]). 15 Par « mimique du miR-27a-5p », on entend ici toute molécule synthétique d'ARN double-brin qui a la même séquence ou une séquence similaire à celle de miR-27a-5p permettant de moduler la même cible génétique. De préférence, cette molécule synthétique diffère des miRNAs naturels en ce qu'elle a subi des modifications chimiques visant à augmenter sa stabilité vis-à-vis notamment des RNases et des protéines du complexe RISC (« RNA-induced 20 silencing complex »). Lesdites modifications chimiques sont par exemple la méthylation, l'addition de groupes phosphorothioates (remplacement de l'oxygène non-liant du groupe phosphate par un 6 atome de soufre), l'ajout de groupements méthyles (par exemple 2'-O-methyl ou 2'-0- methoxyethyl) à différents endroits de la structure ([44])). Par « séquence similaire », on entend ici une séquence d'acide nucléique ayant un pourcentage d'identité supérieur ou égal à 70 %, de préférence supérieure ou égale à 80 %, 5 de manière encore plus préférée supérieure ou égale à 90 %, avec la séquence du miR-27a- 5p naturelle connue (par exemple SEQ ID NO :1). Par « pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acide nucléique, on entend désigner un pourcentage de nucléotides identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement (alignement optimal), ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux 10 séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Ce pourcentage d'identité peut être calculé par toute méthode d'analyse de séquences bien connue de l'homme du métier. Le pourcentage d'identité peut être déterminé après alignement global des séquences à comparer prises dans leur intégralité. Outre manuellement, il est possible de le déterminer au moyen de l'algorithme de Needleman et 15 Wunsch (1970). Pour les séquences nucléotidiques, la comparaison des séquences peut être effectuée à l'aide de tout logiciel bien connu de l'homme du métier, comme par exemple le logiciel Needle. Les paramètres utilisés peuvent notamment être les suivants : « Gap Open » égal à 10,0, « Gap Extend » égal à 0,5 et la matrice EDNAFULL (Version EMBOSS du NCBI NUC4.4). Ce pourcentage peut également être déterminé après alignement local des 20 séquences à comparer. Outre manuellement, il est possible d'utiliser l'algorithme de Smith et Waterman (1981) pour déterminer ce pourcentage. De préférence, le pourcentage d'identité défini dans le cadre de la présente invention est déterminé au moyen d'un alignement global des séquences à comparer sur toute leur longueur. 7 De préférence, le « mimique du miR-27a-5p » est une molécule synthétique d'ARN double-brin qui contient au moins 5 ou 6 nucléotides consécutifs de miR-27a-5p [partie qui se lie au mRNA cible]. Le reste de sa séquence oligonucléotidique a alors de préférence un pourcentage d'identité avec l'autre partie du miRNA de 70 % au moins. 5 De manière encore plus préférée, ledit « mimique du miR-27a-5p » est l'ARN double-brin ayant pour séquence SEQ ID NO :2 (5'-AGGGCUUAGCUGCUUGUGACCCCC-3') et ayant pour séquence accompagnante SEQ ID NO :3 (5'-GGGGGUCACAAGCAGCUAAGCCCU-3') (ou son complémentaire), commercialisée par RIBOXX sous le numéro M-00303-0200 Mimétique CONmiR® in vivo. 10 Dans la composition pharmaceutique de l'invention, le miARN mimique peut être nu. Il peut également être complexé avec des molécules chimiques ou des nanoparticules (i.e., des particules ayant un diamètre inférieur à 1 p.m) chargées positivement, ou encore être enveloppé dans des matériaux protecteurs, par exemple des capsules, des liposomes, etc. de sorte à favoriser sa stabilité et sa transfectabilité (entrée dans les cellules cibles). 15 Tout moyen de stabilisation connu pour favoriser le transport et le ciblage des siRNAs pourra être utilisé pour faciliter l'administration du mimique de l'invention, car ces molécules ont la même structure. Ces moyens sont, par exemple, ceux décrits dans [40] et [45]. Dans un mode de réalisation préféré, ledit mimique du miR-27a-5p est donc associé à (ou inclus dans) un vecteur, une matrice ou des particules favorisant sa stabilité et sa 20 transfectabilité. 8 S'il est véhiculé par un vecteur, ledit vecteur est de préférence un virus recombinant choisi parmi : les adénovirus, les rétrovirus, les lentivirus, les virus adéno-associé (AAV), les virus de l'herpès, les cytomégalovirus (CMV), les virus de la vaccine, etc. De manière avantageuse, ledit virus recombinant est un virus défectif, par exemple un AAV 5 défectif. Le terme « virus défectif » désigne ici un virus incapable de se répliquer dans une cellule cible. Généralement, le génome des virus défectifs est dénué d'au moins une des séquences nécessaires pour la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit éliminées, soit rendues non fonctionnelles ou encore substituées par d'autres séquences 10 et en particulier par l'acide nucléique qui code le peptide d'intérêt. Néanmoins, de préférence, le virus défectif conserve malgré tout les séquences de son génome qui sont nécessaires pour l'encapsulation des particules virales. Ce vecteur peut également être un bactériophage, ceux-ci ayant été déjà utilisés avec succès pour véhiculer des siRNA. Les bactériophages tels que MS2, Phi29, etc. peuvent être utilisés 15 dans le cadre de la présente invention. Si ledit mimique du miR-27a-Sp est associé à des particules, celles-ci peuvent être celles déjà proposées pour le transport des siRNAs. Il peut s'agir par exemple de liposomes (DOPC), de nanoparticules lipidiques, de nanocellules (type EnGeneIC EDV), de nanoparticules de silice, d'exosomes, etc. 20 Plus précisément, ces particules peuvent être des nanoparticules de poly(alkylcyanoacrylate), de préférence recouvertes de chitosan. Le miRNA mimique de 9 l'invention pourra y être aisément adsorbé par formation d'une paire d'ion, comme démontré précédemment pour les siRNA [38]. Si ledit mimique du miR-27a-5p est inclus dans une matrice, ladite matrice peut être une émulsion lipidique neutre (NLE), du polyethylenimine (PEI), du poly(lactide-co-glycolide) 5 (PLGA), etc. Plus précisément, ledit mimique du miR-27a-5p peut être complexé dans un polymère cationique tel que le « in vivo-jet PEI ® », bien connu pour transporter efficacement tout type d'acides nucléiques in vivo dans différents organes, sans susciter de réponse inflammatoire. Il est également possible d'administrer le mimique de l'invention conjugué avec une protéine 10 ou une molécule chimique d'intérêt, par exemple choisie parmi : les lipides, le cholesterol, le PEG, la cyclodextrine, le chitosan, les dendrimères (de poly(amidoamine) ou de poly(propylenimine), le N-acetyl-D-galactosamine (GaINAc), etc. La présente invention vise également des méthodes pour traiter des sujets souffrant d'une infection à Clostridium difficile. Ces méthodes contiennent une étape d'administration de la 15 composition pharmaceutique de l'invention à des patients ayant été infectés par Clostridium difficile. La présente invention concerne enfin l'utilisation du mimique de l'invention, tel que défini ci-dessus, pour fabriquer un médicament destiné à traiter des patients ayant été infectés par Clostridium difficile. 20 Le diagnostic de l'ICD se fait classiquement par i) la suspicion devant un tableau clinique de diarrhée, de colite avec présence de mucus et du sang dans les selles, le développement de complications comme le mégacôlon, la colite pseudomembraneuse, la perforation 10 intestinale, ou ii) la mise en évidence dans les selles des toxines ou de la bactérie elle-même (culture microbiologique, PCR, test GDH). Un test de cytotoxicité permet de détecter la présence de toxines libres, tandis qu'une culture toxigénique permet de mettre en évidence la présence de bactéries. Des méthodes 5 standardisées (tests immuno-enzymatiques, PCR, amplifications isothermiques) sont aujourd'hui disponibles pour détecter cette infection rapidement en cas de symptômes (diarrhée). Dans un mode de réalisation particulier, les sujets bénéficiant du traitement de l'invention sont les sujets présentant une des formes modérées à sévères d'ICD. Par exemple, il s'agit 10 des sujets présentant des diarrhées importantes et persistantes (plus de 3 jours) avec déshydratation, des formes dysentériformes (avec des douleurs abdominales et la présence de sang et de mucus dans les selles), des formes compliquées par des dilatations du côlon (mégacôlon) et des colites pseudomembraneuses (souvent détectée par endoscopie). Il peut également s'agir de patients présentant des comorbidités (maladies cardiaques, diabète, 15 pathologies hépato-digestives, pathologies chirurgicales, etc.) où l'ICD se manifeste souvent sous des formes sévères. Ces sujets peuvent être des animaux (domestiques ou non, par exemple le chat, le chien, les équidés) ou des êtres humains. De préférence, ces sujets ne sont pas des enfants en bas âge. Par « traitement », on entend ici un traitement à titre curatif (visant à au moins soulager ou 20 stopper le développement des lésions intestinales induites par les bactéries) ou prophylactique (visant à réduire le risque d'apparition de ces lésions). 11 La composition pharmaceutique utilisée dans l'invention contient, en tant que principe actif, l'acide nucléique décrit ci-dessus (éventuellement associé ou protégé par des particules, vecteurs, lipides, etc.). Elle contient également, de préférence, un excipient pharmaceutiquement acceptable. 5 Dans la présente description, on entend désigner par « excipient pharmaceutiquement acceptable », un composé (ou une combinaison de composés) entrant dans une composition pharmaceutique, mais ne provoquant pas de réactions secondaires et qui permet par exemple la facilitation de l'administration du ou des composés actifs, l'augmentation de sa durée de vie et/ou de son efficacité dans l'organisme, l'augmentation de sa solubilité en 10 solution ou encore l'amélioration de sa conservation. Ces excipients pharmaceutiquement acceptables sont bien connus et seront adaptés par l'homme de l'art en fonction de la nature et du mode d'administration du ou des composés actifs choisis. De préférence, les mimiques de l'invention seront administrés par voie systémique, en particulier par voie intraveineuse, par voie intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale 15 ou sous-cutanée, ou par voie orale. De manière plus préférée, ils seront administrés à plusieurs reprises, de manière étalée dans le temps. Leurs modes d'administration, posologies et formes galéniques optimaux peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement adapté à un patient comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la 20 gravité de son état général, la tolérance au traitement et les effets secondaires constatés. Les principes actifs peuvent être formulés également sous forme de microcapsules, éventuellement avec un ou plusieurs supports additifs. Pour la préparation de ces microcapsules, les principes actifs sont en général combinés à des diluants appropriés, des 12 stabilisants appropriés, des agents favorisant la libération prolongée des substances actives ou tout autre type d'additif pour la formation d'un noyau central qui est ensuite revêtu d'un polymère approprié (par exemple une résine hydrosoluble ou une résine insoluble dans l'eau). Les techniques connues de l'homme du métier seront utilisées à cet effet. Les 5 microcapsules ainsi obtenues sont ensuite éventuellement formulées dans des unités de dosage appropriées. Les mimiques de l'invention peuvent également être formulés dans des liposomes. Les liposomes sont formés à partir de phospholipides qui sont dispersés dans un milieu aqueux et forment spontanément des vésicules bicouches concentriques multilamellaires. Ces 10 vésicules ont généralement un diamètre de 25 nm à 4 pm et peuvent être soniquées, conduisant à la formation de vésicules plus petites unilamellaires, de diamètre de 200 à 500 Â, contenant une solution aqueuse en leur coeur. Les liposomes seront particulièrement avantageux pour administrer le médicament à une cible cellulaire ou tissulaire précise. Pour cela, les lipides pourront être couplés chimiquement à des molécules de ciblage, tels que des 15 peptides de ciblage (par exemple hormones), ou des anticorps. La posologie dépend naturellement du vecteur / complexe considéré, du mode d'administration, du stade de l'infection, de l'âge du patient et de son état. Certains auteurs ont utilisé des doses de miRNAs de 10 mg/kg par voie intraveineuse. Des doses moins importantes peuvent également être utilisées (par exemple, entre 3 et 5 mg/kg par jour). 20 Lorsque le mimique de l'invention est associé à un polymère cationique ou à un autre vecteur, il est possible d'utiliser des doses plus fortes (25mg/kg), en une prise, ou en plusieurs fois, en répétant les injections. 13 Légende des figures Figure 1. Cinétique d'expression du miR-27a-5p par les cellules Caco-2 incubées avec la flagelline FliC ou C. difficile. (A) Cinétique d'expression du miR-27a-5p par les cellules Caco- 2 incubées avec FliC durant 12 h. (B) Les cellules ont été incubées avec FliC ou infectées par 5 la souche sauvage R20291 (WT) ou son mutant non flagellé (Flic-) pendant 1 h. L'expression du miR-27a-5p a été mesurée par qRT-PCR avec l'oligonucléotide du Tableau 1. Les barres sur chaque point correspondent aux écart-types des moyennes d'au moins 3 expériences indépendantes. Figure 2. Inhibition de la surexpression du miR-27a-5p par des inhibiteurs chimiques 10 spécifiques de NF-kB et des MAPKs dans les cellules Caco-2 incubées avec la flagelline FliC ou la souche R20291 de C. difficile. Les voies NF-KB et MAPKs ont été inhibées 1 h avant la stimulation ou l'infection des cellules, par 20 p.M BMS 345541 (inhibiteur IKKa), 20 p.M U0126 (inhibiteur MEK1/2), 20 ltM PD98059 (inhibiteur MEK1), 20 ti.M SP600125 (inhibiteur JNK) ou 3 ti.M SB203580 (inhibiteur p38) aux monocouches cellulaires. L'expression du miR-27a-5p a 15 été analysée après incubation des cellules avec FliC (A) ou infection par la souche sauvage R20291 (WT) (B) pendant 1 h. L'expression des miRNAs a été mesurée par qRT-PCR avec l'oligonucléotide du Tableau 1. Les barres sur chaque point correspondent aux écart-types des moyennes d'au moins 3 expériences indépendantes. Figure 3. Effet inhibiteur du miR-27a-5p sur la voie de NF-xB dans les cellules Caco-2 20 incubées avec la flagelline. Les cellules Caco-2 ont été transfectées par les respectifs miR- 27a-mimic, miR-27a inhibitor, ainsi que par les respectifs oligonucléotides mimic et inhibitor contrôles. L'expression du miR-27a-5p a été mesurée par qRT-PCR avec l'oligonucléotide 5'- AGGGCTTAGCTGCTTGTGAG-3' (SEQ ID NO :4). (A). La dégradation de l'effecteur IKB-ct 14 signant l'activation de la voie NE-KB a été mesurée par Western-blot (B). (C) L'expression des ARNm des cytokines pro-inflammatoires TNFa et IL-8 (oligonucléotides Tableau 2), ainsi que (D) la production d'IL-8 dans le surnageant de culture cellulaire par ELISA a été également mesurée. Les barres sur chaque point correspondent aux moyennes ± écart-types, pour au 5 moins 3 expériences indépendantes (* p 3x 4 Score 3 avec expansion sous-muqueuse diffuse 2. Infiltrat cellulaire (400x) 0 Absence d'inflammation (0-5 cellules) 1 Infiltrat inflammatoire neutrophile multifocal minime (6-20 cellules) 2 Infiltrat inflammatoire neutrophile multifocal modéré (atteinte sous-muqueuse) (21-60 cellules) 3 Infiltrat inflammatoire neutrophile multifocal sévère (atteinte sous-muqueuse importante pouvant impliquer toute la paroi (61-100 cellules) 4 Score 3 avec des abcès lésion murale importante (>100 cellules) 3. Lésion épithéliale 0 Absence de lésion épithéliale 1 Lésion épithéliale multifocale superficielle minime. Desquamation épithéliale 2 Lésion épithéliale multifocale superficielle modérée. Erosion muqueuse (maintien de l'architecture ou perte de 1-10 cellules). 3 Lésion épithéliale multifocale superficielle sévère +/- pseudomembranes. Ulcération muqueuse (destruction de la lamina propria ou perte de >10 cellules). 4 Score 3 avec importantes pseudomembranes ou ulcération épithéliale (perte focale complète de l'épithélium) 4. Perte de cellules caliciformes (cellules à mucus) (400x) 0 >28 1 11-28 2 1-10 3 Par ailleurs, l'analyse de l'expression de l'ARNm du gène de la cytokine KC chez la souris, équivalent de le l'IL-8 humaine, révèle une parfaite corrélation avec l'expression accrue du miR-27a-5p comme l'indique la Fig. 4B. 5 V. Un mimique du miR-27a-Sp réduit la sévérité de l'inflammation in vivo dans le modèle muris d'ICD. Compte tenu des effets anti-inflammatoires induits par le miR-27a-5p dans les cellules Caco2, l'effet in vivo d'un oligonucléotide mimique de ce miRNA (miR-27a-5p-mimic) a été analysé. Cet oligonucléotide a été administré par voie intraveineuse (IV) dans le modèle 10 murin d'ICD (Fig. 5). Trois groupes de souris femelles âgées de 4 à 5 semaines C57BL/6 à microbiote conventionnel (n = 9-10 pour chaque groupe) ont été testés. Après le traitement antibiotique induisant la dysbiose, un groupe d'animaux non infectés a été traité par la suspension miR-27a-5p mimic / in vivo-jetPEl® à raison de 3 doses de 50 pg (soit 25 mg/kg), au moment de l'infection, 8 h et 24 h après l'infection, par voie intra-veineuse (150 pl_ injectés 15 en rétro-orbital). Un deuxième groupe d'animaux a été infecté par la souche sauvage R20291 et non traité par le miR-mimic et un troisième groupe a été également infecté par cette souche de C. difficile mais traité par la suspension miR-27a-Sp mimic / in vivo-jetPEl® comme pour le premier groupe. À la suite de l'infection, comme attendu dans ce modèle d'ICD, les souris infectées et non 20 traitées par le miR-27a-mimic, ont développé de signes cliniques d'ICD : diarrhée, poil hérissé et diminution de l'activité à .11 et J2 post-infection (Tableau 4). Seuls 3 animaux sur 10 du groupe infecté et traité par le miR27-a-mimic ont développé une diarrhée, et ce à J2 post-infection. Il est à noter que le taux de colonisation intestinal des animaux infectés quantifié 36 par le dénombrement bactérien dans le contenu caecal (unités formatrices de colonies - UFC/g) à J2 post-infection est tout à fait équivalent entre les groupes de souris infectées (WT non traité et WT + miR-27a-mimic) excluant la possibilité que la différence des manifestations cliniques entre ces deux groupes soit le résultat d'une faible colonisation intestinale des 5 souris. Tableau 4. Manifestations cliniques des animaux infectés et/ou traités par le miR-27a-mimic à il et J2 post-infection. A J2 post-infection, l'analyse anatomo-pathologique du caecum des animaux infectés par la 10 souche sauvage et non traités, a montré un aspect hyperémique inflammatoire avec des zones hémorragiques et un contenu caecal muqueux comparé au caecum normal des souris non infectées (contrôle négatif) comme montré dans la Fig. 6A et C. L'aspect inflammatoire du caecum a été largement atténué dans le groupe des souris infectées et traités par le miR27a-mimic (Fig. 6E). En ce qui concerne l'étude histologique des coupes de caecums, comme 15 attendu, un oedème important de la muqueuse, avec un infiltrat inflammatoire, une érosion épithéliale et une perte de cellules de gobelet sont retrouvés dans le caecum des souris infectées par la souche sauvage et non traitées par le miR-27a-mimic, avec un score Diarrhée Poil hérissé .11 J2 J3 12 11 0/9 0/9 0/9 0/9 0/9 9/9 9/9 3/9 3/9 3/9 0/10 3/10 0/10 Activité réduite 1,8 109 UFC/g WT+ miR-27a- mimic (n = 10) 3,7 x 109 UFC/g Groupe d'animaux Contrôle négatif + miR-27a-mimic (n = 9) 37 d'inflammation (Tableau 3) allant de 6 à 9, comparé à un score 0 pour les souris non infectées (Fig. 6G). En revanche, dans le groupe d'animaux infectés et traités par le miR-27-a-mimic, 6 souris sur 10 ont présenté un caecum indemne ou avec peu de signes d'inflammation et un contenu caecal normal et sans mucus (Fig. 6E). Le score histologique d'inflammation était 5 inférieur à 6 pour ces animaux qui présentaient principalement un infiltrat cellulaire et un oedème léger à modéré (Fig. 6F et G). Les 3 souris de ce groupe « infectées et traités par le mimic » ayant présenté une diarrhée à J2 post-infection (Tableau 4) ont obtenu un score d'inflammation élevé et comparable aux souris infectées et non traités (Fig 6G), ce qui ramène le taux d'efficacité du miR-27a-5p à 70 % sur ce modèle murin d'infection. 10 L'analyse de l'activation de la voie NF-KB dans le tissu caecal à J2 post-infection, a révélé une forte dégradation d'hcB-a dans le caecum des souris infectées et non traitées, comparé aux souris non infectées, ce qui correspond, comme pour les manifestations cliniques, aux observations habituelles sur ce modèle d'ICD [17]. En revanche, aucune activation d'IKB-a n'a été détectée dans le caecum des souris infectées et traitées par le miR-27a-mimic (Fig. 15 6H) ce qui renforce les observations précédentes quant à la réduction des manifestations cliniques et des phénomènes inflammatoires intestinaux associés à l'infection par la bactérie sur ce modèle murin. 20 25 38 CONCLUSION En conclusion, les présents travaux mettent en lumière le rôle capital d'un miRNA, le miR27a-5p pour diminuer la réponse inflammatoire induite par les toxines et les flagelles des 5 bactéries C. difficile et ainsi prévenir ou diminuer les lésions muqueuses causées par cette inflammation. En inhibant la voie de signalisation NF-KB activée par l'interaction flagellesTLR5 au cours de l'infection intestinale par C. difficile, ce miRNA impacte la présentation clinique ainsi que le pronostic de l'ICD. L'effet in vivo d'un miR-27a-5p-mimic spécifique ciblant la voie de signalisation pro- 10 inflammatoire TLR5-NF-KI3 induite par C. difficile a été démontré dans un modèle murin d'ICD. Cette molécule est capable de réduire la réponse délétère des souris infectées par C. difficile, en diminuant la réponse inflammatoire intestinale chez ces souris. Ces résultats prouvent qu'il est possible de diminuer les effets délétères sévères dus à l'infection par cette bactérie, en utilisant ce miRNA en tant que principe actif dans une composition 15 thérapeutique. 39 Références bibliographiques 1. Cloud, J. and C.P. Kelly, Update on Clostridium difficile associated disease. Curr Opin Gastroenterol, 2007. 23(1): p. 4-9. 2. Heinlen, L. and J.D. Ballard, Clostridium difficile infection. Am J Med Sci, 2010. 340(3): 5 p. 247-52. 3. Dubberke, E.R. and M.A. Olsen, Burden of Clostridium difficile on the healthcare system. Clin Infect Dis, 2012. 55 Suppl 2: p. 588-92. 4. Miller, M.A., et al., Morbidity, mortality, and healthcare burden of nosocomial Clostridium difficile-associated diarrhea in Canadian hospitals. Infect Control Hosp 10 Epidemiol, 2002. 23(3): p. 137-40. 5. Carrico, R.M., Silent menace. C. difficile and its threat to heaith core facilities. Health Facil Manage, 2011. 24(6): p. 43-5. 6. Dubberke, E.R. and A.I. Wertheimer, Review of current literature on the economic burden of Clostridium difficile infection. Infect Control Hosp Epidemiol, 2009. 30(1): 15 p. 57-66. 7. O'Brien, J.A., et al., The emerging infectious challenge of clostridium diffrcileassociated disease in Massachusetts hospitals: clinical and economic consequences. Infect Control Hosp Epidemiol, 2007. 28(11): p. 1219-27. 8. Rebmann, T. and R. M. Carrico, Preventing Clostridium difficile infections: an executive 20 summary of the Association for Professionals in Infection Control and Epidemiology's elimination guide. Am J Infect Control, 2011. 39(3): p. 239-42. 9. McGlone, S.M., et al., The economic burden of Clostridium difficile. Clin Microbiol Infect, 2012. 18(3): p. 282-9. 10. Kuijper, E.J., B. Coignard, and P. Tull, Emergence of Clostridium difficile-associated 25 disease in North America and Europe. Clin Microbiol Infect, 2006. 12 Suppl 6: p. 2-18. 11. Wiegand, P.N., et al., Clinical and economic burden of Clostridium difficile infection in Europe: a systematic review of healthcare-facility-acquired infection. J Hosp Infect, 2012. 81(1): p. 1-14. 12. Eckert, C. and F. Barbut, [Clostridium-difficile-associated infections]. Med Sci (Paris), 30 2010. 26(2): p. 153-8. 13. Kuehne, S.A., et al., The role of toxin A and toxin B in Clostridium difficile infection. Nature, 2010. 467(7316): p. 711-3. 14. Lyras, D., et al., Toxin Bis essentiel for virulence of Clostridium difficile. Nature, 2009. 458(7242): p. 1176-9. 35 15. Tasteyre, A., et al., Role of FliC and FIiD flagellar proteins of Clostridium difficile in adherence and gut colonization. Infect Immun, 2001. 69(12): p. 7937-40. 16. Batah, J., et al., Clostridium difficile flagella predominantly activate TLRS-linked NFkappaB pathway in epithelial cells. Anaerobe, 2016. 38: p. 116-24. 17. Batah, J., et al., Clostridium difficile flagella induce a pro-inflammatory response in intestinal epithelium of mice in cooperation with toxins. Sci Rep, 2017. 7(1): p. 3256. 40 18. Bentwich, I., et al., Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs. Nat Genet, 2005. 37(7): p. 766-70. 19. He, X., Z. Jing, and G. Cheng, MicroRNAs: new regulators of Toll-like receptor signalling pathways. Biomed Res Int, 2014. 2014: p. 945169. 5 20. Taganov, K.D., et al., NE-kappaR-dependent induction of microRNA miR-146, an inhibitor targeted to signaling proteins of innate immune responses. Proc Natl Acad Sci USA, 2006.103(33): p. 12481-6. 21. Bader, A.G., et al., Developing therapeutic microRNAs for cancer. Gene Ther, 2011. 18(12): p. 1121-6. 10 22. Minton, N., et al., The development of Clostridium difficile genetic systems. Anaerobe, 2004. 10(2): p. 75-84. 23. Hâsler R, et al. 2012. Microbial pattern recognition causes distinct functional micro-RNA signatures in primary human monocytes. PIoS One 7:e31151. 24. Norman E Buroker X-HN. 2013. Medical Diagnostic Methods Circulating miRNAs from 15 Dried Blood Spots are Associated with High Altitude Sickness. 25. Romay MC, et al. 2015. Regulation of NF-KB signaling by oxidized glycerophospholipid and IL-113 induced miRs-21-3p and -27a-5p in human aortic endothelial relis. J Lipid Res 56:38-50. 26. Nahid MA, et al. 2013. Regulation of TLR2-mediated tolerance and cross-tolerance 20 through IRAK4 modulation by miR-132 and miR-212. J Immunol Baltim Md 1950 190:1250-1263. 27. Liu G, et al. 2009. miR-147, a microRNA that is induced upon Toll-like receptor stimulation, regulates murine macrophage inflammatory responses. Proc Natl Acad Sci U S A 106:15819-15824. 25 28. Ceppi M, et al. 2009. MicroRNA-155 modulates the interleukin-1 signaling pathway in activated human monocyte-derived dendritic cells. Proc Nat/ Acad Sci U S A 106:2735-2740. 29. Lu Z, et al. 2011. miR-301a as an NF-KB activator in pancreatic cancer cells. EMBO J 30:57-67. 30 30. Wang B, et al. 2011. Systematic Evaluation of Three microRNA Profiling Platforms: Microarray, Beads Array, and Quantitative Real-Time PCR Array. PLoS ONE 6:e17167. 31. Hâsler R, et al. 2012. Microbial pattern recognition causes distinct functional micro-RNA signatures in primary human monocytes. PIoS One 7:e31151. 32. Norman E Buroker X-HN. 2013. Medical Diagnostic Methods Circulating miRNAs from 35 Dried Blood Spots are Associated with High Altitude Sickness. 33. Nahid MA, et al. 2013. Regulation of TLR2-mediated tolerance and cross-tolerance through IRAK4 modulation by miR-132 and miR-212. J Immunol Baltim Md 1950 190:1250-1263. 34. Liu G, et al. 2009. miR-147, a microRNA that is induced upon Toll-like receptor 40 stimulation, regulates murine macrophage inflammatory responses. Proc Natl Acad Sci U S A 106:15819-15824. 41 35. Ceppi M, et al. 2009. MicroRNA-155 modulates the interleukin-1 signaling pathway in activated human monocyte-derived dendritic cells. Proc Natl Acad Sci U S A 106:2735-2740. 36. Lu Z, et al. 2011. miR-301a as an NF-KB activator in pancreatic cancer cells. EMBO J 5 30:57-67. 37. Wang B, et al. 2011. Systematic Evaluation of Three microRNA Profiling Platforms: Microarray, Beads Array, and Quantitative Real-Time PCR Array. PLoS ONE 6:e17167. 38. Martimprey H et al, 2010. New Core-Shell nanoparticules for the intravenous delivery of siRNA to experimental thyroid papillary carcinoma, Pharmaceutical Research, 10 2010. 39. Reigadas Ramirez E, Bouza ES. Economic Burden of Clostridium difficile Infection in European Countries. Adv Exp Med Biol. 2018;1050:1-12 40. Rupaimoole R. & Slack F.J., MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nat Rev Drug Discov. 2017 15 Mar;16(3):203-222. 41. Lagos-Quintana M, Rauhut R, Lendeckel W, Tuschl T. Identification of nove) genes coding for small expressed RNAs. Science. 2001 Oct 26;294(5543):853-8. 42. Romay et al Regulation of NF-KB signaling by oxidized glycerophospholipid and IL-1(3 induced miRs-21-3p and -27a-5p in human aortic endothelial cells. J Lipid Res. 2015 20 Jan;56(1):38-50 43. Wu et al Coordinated Targeting of the EGFR Signaling Axis by MicroRNA- 27a* Oncotarget. 2013 Sep;4(9):1388-98 44. Geary RS, Pharmacokinetic properties of 2'-0-(2-methoxyethemodified oligonucleotide analogs in rats. 1 Pharmacol Exp Ther. 2001 Mar;296(3):890-7. 25 45. Baumann V. and Winckler J. miRNA-based therapies: strategies and delivery platforms for oligonucleotide and non-oligonucleotide agents. Future Med Chem. 2014;6(17):1967-84 46. Chen H. miR-27a protects human mitral valve interstitial cell from TNF-ct-induced inflammatory injury via up-regulation of NELL-1. Braz J Med Biol Res. 2018; 51(6) 30 47. Arros-Silva D, Costa-Pinheiro P, Duarte H, Sousa EJ, Evangelista AF, Graça I, et al. MicroRNA-27a-5p regulation by promoter methylation and MYC signaling in prostate carcinogenesis. Cell Death Dis. 7 févr 2018;9(2):167 48. Mertens-Talcott SU, Chintharlapalli S, Li X, Safe S. The oncogenic microRNA-27a targets genes that regulate specificity protein transcription factors and the G2-M 35 checkpoint in MDA-MB-231 breast cancer cells. Cancer Res. 15 nov 2007;67(22) :11001-11. 49. Xie N. et al, miR-27a regulates inflammatory response of macrophages by targeting IL-10. J Immunol. 2014 Jul 1; 193(1): 327-334. 50. Pfeiffer D. et al. miR-146a, rniR-146b, and miR-155 increase expression of IL-6 and IL- 40 8 and support HSP1O in an ln vitro sepsis model. PLOS ONE lune 29,2017 42 51. Gao et al, MicroRNA-146 regulates the inflammatory cytokines expression in vascular endothelial cells during sepsis. Die Pharmazie - An International Journal of Pharmaceutical Sciences, Volume 72, Number 11, November 2017, pp. 700-704(5) REVENDICATIONS1. Composition pharmaceutique contenant un mimique du miR-27a-5p pour son utilisation pour prévenir ou diminuer les lésions intestinales chez un sujet souffrant d'une infection à Clostridium 2. Composition pharmaceutique pour son utilisation selon la revendication 1, dans laquelle ledit mimique du miR-27a-5p a une séquence nucléotidique similaire à plus de 70% à SEQ ID NO :1. 3. Composition pharmaceutique pour son utilisation selon la revendication 1, dans laquelle ledit mimique du miR-27a-5p a la séquence nucléotidique SEQ ID NO :1. 4. Composition pharmaceutique pour son utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, comprenant en outre un excipient pharmaceutiquement acceptable. 5. Composition pharmaceutique pour son utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, dans laquelle ledit mimique du miR-27a-5p est associé à ou inclus dans un vecteur, une matrice ou des particules favorisant sa stabilité et/ou sa transfection. 6. Composition pharmaceutique pour son utilisation selon la revendication 5, dans lequel ledit vecteur est choisi parmi : les adénovirus, les rétrovirus, les lentivirus, les virus adénoassocié (AAV), les virus de l'herpès, les cytomégalovirus (CMV), et les virus de la vaccine. 7. Composition pharmaceutique pour son utilisation selon la revendication 5, dans lequel lesdites particules sont choisies parmi : les liposomes (DOPC), les nanoparticules lipidiques, les nanocellules, les nanoparticules de silice, les exosomes. 44 8. Composition pharmaceutique pour son utilisation selon la revendication 5, dans lequel ladite matrice est choisie parmi l'émulsion lipidique neutre (NLE), le polyethylenimine (PEI), le poly(lactide-co-glycolide) (PLGA). 9. Composition pharmaceutique pour son utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, 5 dans lequel ledit mimique du miR-27a-5p est conjugué à une molécule chimique choisie parmi : les lipides, le cholesterol, le PEG, la cyclodextrine, le chitosan, les dendrimères (de poly(amidoamine) ou de poly(propylenimine), le N-acetyl-D-galactosamine (GaINAc). 45