Brevet FR3099179A1 — publié le 20210129

Description Titre de l'invention : METHODE POUR DETERMINER L'EFFET D'UNE MUTATION SUR L'EXPRESSION D'UN GENE D'INTERET Domaine technique 100011 L'invention concerne une méthode pour déterminer l'effet d'une mutation, en par- ticulier une mutation synonyme sur l'expression d'un gène d'intérêt comprenant l'expression dans une cellule d'un vecteur comprenant un gène d'intérêt sauvage fusionné à un premier gène rapporteur et un gène d'intérêt comprenant ladite mutation fusionnée à un deuxième gène rapporteur, lesdits gènes étant sous le contrôle d'un promoteur bidirectionnel. Cette méthode est particulièrement adaptée pour déterminer l'effet d'une mutation préalablement détectée dans un échantillon de patient. L'invention concerne également le vecteur utilisé dans la méthode et les cellules exprimant ledit vecteur. Technique antérieure [0002] Le code génétique permettant de traduire les informations contenues dans le génome des cellules vivantes et de synthétiser les protéines est redondant. Ainsi, la plupart des acides aminés sont codés par plus d'un codon. Les codons codant pour le même acide aminé sont dits synonymes. Dès lors, une mutation génétique qui transforme un codon en un autre codon synonyme est sans incidence sur la séquence de la protéine synthétisée. [0003] Les mutations synonymes ont longtemps été considérées comme n'ayant aucune conséquence sur le profil d'expression et la fonction de la protéine. Les mutations synonymes ont été largement. négligées en pathologie humaine, dans la mesure où ces modifications n'ont aucun impact attendu sur la séquence protéique. Pourtant, très récemment, de nombreuses mutations synonymes ont. été associées à des maladies graves chez l'humain, notamment grâce à des études de criblage génétique. [0004] Les mutations synonymes peuvent entrainer des perturbations moléculaires, cel- lulaires et physiologiques et jouent un rôle dans l'épissage de l'ARNm (Cartegni L, Chew SL, Kraincr AR. Nat Rev Genet. 2002 ; 3 : 285-298), sa stabilité (Nackley AG, Shabalina SA, Tchivileva 1E, et al. Science 2006), sa structure (Shen LX, Basil ion JP, Stanton VP. Proc Nad Acad Sci USA 1999 ; 96 : 7871-7876) mais également dans la traduction et la structure tertiaire des protéines (Kimchi-Sarfaty C, Oh .IM, Kim 1W, et al. Science 2007). [0005] L'étude des mutations, notamment des mutations synonymes et de leurs effets sur l'expression et la fonction de la protéine est nécessaire pour comprendre les causes des 2 maladies associées à ces mutations. [0006] Actuellement, les mutations, en particulier les mutations synonymes sont étudiées en exprimant de manière ectopique des versions sauvages et mutées d'un gène d'intérêt dans des cellules distinctes, puis en mesurant la quantité de protéines produites par immunofluorescence ou immunoblot, lorsque les anticorps correspondants existent. Dans ce système, l'utilisation de cellules distinctes conduit à une variabilité de l'expression des gènes sauvages et mutés. Une comparaison précise des profils d'expression des gènes sauvage et muté, notamment du niveau d'expression et de la localisation subcellulaire des protéines codées par ces gènes n'est donc pas possible. [0007] Il reste ainsi un besoin de développer une méthode plus sensible permettant de comparer précisément les profils d'expression du gène sauvage et muté permettant notamment de mettre en évidence de faibles différences d'expression. Exposé de l'invention [0008] Les inventeurs ont développé un système expérimental reposant sur l'expression si- multanée d'un gène d'intérêt sauvage et portant une mutation sous le contrôle d'un même promoteur bidirectionnel. Chaque version du gène est fusionnée en phase à un gène rapporteur différent pour déterminer le profil d'expression de chacun des gènes. Ce système est particulièrement adapté pour étudier l'effet des mutations synonymes. [0009] La présente invention concerne ainsi une méthode pour déterminer l'effet d'une mutation, de préférence une mutation synonyme sur l'expression d'un gène d'intérêt dans une cellule, ladite méthode comprenant les étapes suivantes de : i) expression dans une cellule d'un vecteur comprenant un gène d'intérêt sauvage fusionné à un premier gène rapporteur codant pour une première protéine de fusion et un gène d'intérêt comprenant au moins une mutation, de préférence une mutation synonyme fusionnée à un deuxième gène rapporteur codant pour une deuxième protéine de fusion, lesdits gènes étant sous le contrôle transcriptionncl d'un promoteur bidirectionnel ; ii) détection de l'expression de la première et de la deuxième protéine de fusion ; iii) comparaison des profils d'expression de la première et de la deuxième protéine de fusion. La détection de l'expression de la première et de la deuxième protéine de fusion en ii) peut comprendre la détermination de la localisation subcellulaire de la première et de la deuxième protéine de fusion. La dite étape ii) peut également comprendre la mesure du niveau d'expression de la première et de la deuxième protéine de fusion et dans ce cas l'étape iii) peut comprendre la comparaison du niveau d'expression de la première et de la deuxième protéine de fusion, de préférence en mesurant le ratio du niveau d'expression de la deuxième protéine de fusion sur le niveau d'expression de la première protéine de fusion. [0010] Dans un mode particulier, le vecteur utilisé dans la méthode selon l'invention peut 3 comprendre un promoteur bidirectionnel inductible, de préférence inductible par de la tétracycline ou un de ses analogues. Dans un autre mode particulier, le vecteur utilisé dans ladite méthode peut comprendre des gènes rapporteurs codant pour des protéines fluorescentes différentes, de préférence la mCherry et la mEGFP. Dans ce cas-là, la dite méthode comprend une étape ii) de détection de l'expression de la première et de la deuxième protéine de fusion par microscopie en fluorescence ou par cytométrie en flux. [0011] La dite méthode selon l'invention peut comprendre en outre les étapes de norma- lisation suivantes : iv) expression dans une autre cellule d'un vecteur comprenant un gène d'intérêt sauvage fusionné audit premier gène rapporteur codant pour une troisième protéine de fusion et une deuxième copie du gène d'intérêt sauvage fusionné audit deuxième gène rapporteur codant pour une quatrième protéine de fusion, lesdits gènes étant sous le contrôle transcriptionnel dudit promoteur bidirectionnel ; v) mesure du niveau d'expression de la troisième et de la quatrième protéine de fusion ; vi) calcul du ratio du niveau d'expression de la quatrième protéine de fusion sur le niveau d'expression de la troisième protéine de fusion ; vii) normalisation du ratio des niveaux d'expression des protéines de fusion obtenu en iii) par le ratio des niveaux d'expression des protéines de fusion obtenu en vi). [0012] Dans un mode particulier, la méthode selon l'invention est caractérisée en ce que la mutation du gène d'intérêt est préalablement détectée dans un échantillon d'un sujet, de préférence d'un sujet malade. [0013] La présente invention concerne également un vecteur comprenant deux gènes rap- porteurs sous le contrôle transcriptionnel d'un promoteur bidirectionnel, comprenant de préférence des sites de restrictions permettant le clonage en phase de gènes d'intérêt avec des gènes rapporteurs de sorte à coder pour des protéines de fusion. De préférence, ledit vecteur comprend en outre un gène d'intérêt sauvage fusionné au premier gène rapporteur et un gène d'intérêt comprenant une mutation fusionné au deuxième gène rapporteur. Dans un autre aspect, l'invention concerne une cellule exprimant le vecteur selon l'invention. Brève description des dessins Fig. 1 100141 Ifig.l I Exemples de vecteurs utilisés dans la méthode selon l'invention ; Fig. 2 100151 I fie.21 Corrélation des niveaux d'expression par cellule de SHH-mEGFP et SHH- mChen-y via la méthode de l'invention. A. Vues microscopiques de cellules HeLa humaines exprimant SHH-mEGFP et SHH-mCherry à partir du vecteur de l'invention. B. Représentation graphique des intensités de chaque fluorophore par cellule. Le bruit de fond est soustrait du signal. La relation linéaire entre les signaux mCherry et mEGFP reflète leur lien de proportionnalité ; Fig. 3 100161 Ifig.31 Robustesse de la méthode selon l'invention, variabilité inter-expériences. Trois expériences indépendantes ont été menées, et. les ratios normalisés correspondants calculés et présentés sous forme de graphique. L'absence d'effet de la mutation c.C522T de SHH est conservée entre expériences (pvalues=0,1429 ; 0,0035 ; 0,0735 ; test t non paramétrique de Wilcoxon) ; Fig. 4 [0017] [fig.41 Colocalisation (le SHHwt-mEGFP et SHHwt-mCherry. A. Vues micro- scopiques de cellules HcLa humaines exprimant SHH-mEGFP et SI-11-1-mCherry à partir du vecteur ibis. B. Intensité par pixel le long de la ligne blanche en A). C. Superposition des deux courbes SI-1H-EnEGFP et SHH-mCherry ; Fig. 5 [0018] 1fig.51 Mise en évidence l'effet de la mutation c.G552C de SHH sur la quantité de protéine produite. La mutation c.G552C de SHH, au contraire de la mutation c.C522T, entraîne une réduction de la quantité de la protéine correspondante SHH par rapport à la version wt, avec des valeurs de p inférieure à 10-15 et égale à 7,7x10-2, respectivement (test t non paramétrique de Wilcoxon); Fig. 6 100191 I fie.6I Mise en évidence l'effet de la mutation c.C1206T de SHH sur la localisation de SHH. A. Vues microscopiques de cellules HeLa humaines exprimant c.C1206T SHH-mEGFP et WT SHH-mCherry à partir du vecteur ibis. B. Intensité par pixel le long de la ligne blanche en A). C. Superposition des deux courbes SHH-mEGFP et SHH-mCherry. La mutation c.C1206T de SHH (SHH-mEGFP) entraîne une superposition imparfaite avec la version sauvage de SHH (SHH-mCherry) en comparaison de la situation wt/wt présentée en Figure 2. Description des modes de réalisation [0020] Les inventeurs ont développé un nouveau vecteur comprenant un gène d'intérêt sauvage fusionné à un premier gène rapporteur codant pour une première protéine de fusion et un gène d'intérêt muté fusionnée à un deuxième gène rapporteur codant pour une deuxième protéine de fusion, lesdits gènes étant sous le contrôle d'un promoteur bidirectionnel. L'expression des protéines de fusion dans une cellule à partir de ce vecteur ainsi que leur détection et la comparaison de leurs profils d'expression permettent de déterminer l'effet d'une mutation sur l'expression d'un gène d'intérêt. Par profil d'expression, on entend notamment les niveaux d'expression et/ou la localisation subcellulaire des protéines de fusion. [0021] L'invention concerne ainsi un vecteur comprenant un gène d'intérêt sauvage fusionné à un premier gène rapporteur et un gène d'intérêt comprenant une mutation fusionnée à un deuxième gène rapporteur, lesdits gènes étant sous le contrôle d'un promoteur bidirectionnel. [0022] Par « gène », on entend une molécule d'acide nucléique codant pour un polypeptide. Le terme gène d'intérêt utilisé dans la présente demande se réfère préférentiellement à l'ADN complémentaire également appelé ADNc codant pour le produit d'un gène d'intérêt. Le produit d'un gène peut être un peptide ou une protéine. [0023] Les termes « acide nucléique » ou « séquence nucléotidique » peuvent être utilisés de manière interchangeable pour se référer à toute molécule composée de ou comprenant des monomères nucléotidiques. Un acide nucléique peut être un oligonucléotide ou un polynucléotide. Une séquence nucléotidique peut être un ADN ou un ARN. Une séquence nucléotidique peut être modifiée chimiquement ou artificiellement. Les séquences nucléotidiques peuvent comprendre les acides nucléiques, peptidiques, les morpholinos, les acides nucléiques bloqués ainsi que les acides nucléiques à glycols et les acides nucléiques à thréose. Chacune de ces séquences diffère de l'ADN ou ARN naturel par la nature du squelette. Les nucléotides phosphorothioate peuvent être utilisés. D'autres analogues d'acides nucléiques tels que les méthylphosphonates, phosphoramidates, phosphorodithioatesn N3'P5'-phosphoramidates et les oligorihonucléotide phosphorothioates et les analogues 2'-0-ally1 et 2'-0-methylribonucléotide methylphosphonates peuvent être utilisés dans le cadre de l'invention. [0024] Le gène sauvage correspond à la séquence nucléotidique, de préférence l'ADNc du gène d'intérêt sauvage. Par gène sauvage, on entend le gène fonctionnel possédé originellement par l'espèce ou la forme fonctionnelle la plus répandue qui sert de référence. [0025] La mutation se réfère à une modification de la séquence nucléotidique de la version sauvage d'un gène d'intérêt. La mutation peut conduire à la délétion, l'insertion, la substitution d'un ou plusieurs acides aminés de la séquence peptidique codée par le gène d'intérêt. [0026] De préférence, la mutation est une mutation synonyme. La mutation synonyme se réfère à une mutation de la séquence nucléotidique présente dans la région codante d'un gène d'intérêt, par exemple dans un exon dudit gène, et qui ne modifie pas la séquence d'acides aminés traduite. [0027] Dans le cadre de la présente demande, le gène comprenant une mutation est appelé gène muté. [0028] On entend ici par "vecteur", une molécule d'ADN qui est indifféremment sous la forme de simple brin ou de double brin. [0029] Un vecteur recombinant selon l'invention est de préférence un vecteur plasmidique ou un vecteur d'intégration. Dans certains modes de réalisation de l'invention, le 6 vecteur est un plasmide. On entend ici par "plasmide" une molécule d'ADN circulaire double brin qui possède une origine de réplication afin qu'il puisse se répliquer de manière autonome dans la cellule et un gène de sélection pour qu'il ne soit pas perdu par l'organisme au fil des multiplications cellulaires. De nombreux vecteurs sont connus en eux-mêmes ; le choix d'un vecteur approprié dépend de l'utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple réplication de la séquence d'intérêt, expression de cette séquence, maintien de cette séquence sous forme extrachromosomique, ou bien intégration dans le matériel chromosomique de l'hôte), ainsi que de la nature de la cellule hôte. [0030] De préférence, ledit vecteur est un vecteur d'expression comprenant tous les éléments nécessaires à l'expression dcs gènes d'intérêt tels que définis ci-dessus. Par exemple, ledit vecteur comprend une cassette d'expression incluant au moins un gène d'intérêt tel que défini ci-dessus, sous le contrôle de séquences régulatrices de la transcription et éventuellement de la traduction appropriées (promoteur, activateur, intron, codon d'initiation (ATG), codon stop, signal de polyadénylation, site d'épissage). [0031] De préférence, le vecteur est un vecteur épisomal capable de sc répliquer de manière autonome. [0032] En plus de la région codante, le gène d'intérêt peut comprendre ou être associé avec un ou plusieurs éléments qui facilitent ou augmentent l'expression dudit gène, tel que des séquences activatrices, des éléments de réponses, des insulateurs, des signaux de polyadénylation et/ou tout autre élément fonctionnel. [0033] Les gènes d'intérêt peuvent être insérés dans un vecteur d'expression, sous le contrôle transcriptionnel d'un promoteur bidirectionnel, pour permettre l'expression simultanée des deux gènes d'intérêt, en particulier les gènes d'intérêt sauvage et muté. [0034] Par « promoteur », on entend tout polynucléotide capable de réguler positivement l'expression, dans une cellule, d'une séquence nucléotidique à laquelle il est lié de façon opérationnelle. Un promoteur ou une séquence promotrice est une région de l'ADN située à proximité d'un gène et indispensable à la transcription de l'ADN en ARN. Les séquences promotrices sont en général situées en amont du site de démarrage de la transcription. Les séquences promotrices correspondent à la région sur laquelle se fixe initialement l'ARN polymérase avant de démarrer la synthèse de l'ARN. [0035] Par « promoteur bidirectionnel », on entend des régions régulatrices pouvant poten- tiellement induire l'expression de deux gènes contigus situés en orientations opposées. De préférence, le promoteur bidirectionnel comprend deux promoteurs identiques disposés dos à dos. Le fait d'utiliser un promoteur bidirectionnel pour les deux gènes d'intérêt sauvage et muté permet une expression transcriptionnelle identique des deux gènes d'intérêt et donc des deux gènes rapporteurs auxquels ils sont fusionnés. 7 [0036] Le promoteur bidirectionnel peut être un promoteur naturellement exprimé chez l'homme ou un promoteur synthétique. Les promoteurs pouvant être utilisés dans la méthode de l'invention incluent mais ne sont pas limités au promoteur du gène de la thymidine kinase (TK) du virus de l'herpès, le promoteur du CMV, le promoteur PGK. De préférence le promoteur est un promoteur du CMV. [0037] Dans un mode préféré, le promoteur bidirectionnel tel qu'utilisé dans la méthode de l'invention est un promoteur bidirectionnel inductible. Le promoteur inductihle est activé en réponse à la présence d'un composé externe particulier, appelé inducteur tel que les antibiotiques, les hormones ou d'une condition externe telle que l'augmentation de la température. L'utilisation d'un promoteur bidirectionnel inductihle permet d'exprimer simultanément les deux gènes d'intérêt. [0038] Dans un mode préféré, le promoteur inductible est un promoteur inductible à la té- tracycline ou un de ses dérivés. Ce promoteur inductible comprend un promoteur minimal opérationnellement lié à un ou plusieurs opérateur(s) de la tétracycline. De préférence, le promoteur bidirectionnel a une séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1. [0039] Il existe deux versions de protéines transactivatrices capables de se lier à la séquence opérateur tet et donc d'activer la transcription du gène en aval, l'une pouvant être activée par la tétracycline ou ses dérivés et l'autre inactivée par ces mêmes molécules (Gossen M. et Bujard H., Proc Natl Acad Sci U S A, 89 (1992) 5547-5551; Gossen M. et coll., Science, 268 (1995) 1766-1769). La protéine activatrice de transcription comprend deux polypeptides, un premier qui se lie aux séquences tet opérateurs et un deuxième qui active la transcription. La liaison aux séquences opérateurs de la tétracycline d'une protéine activatrice de transcription en présence (système tet on) ou en absence (système tet off) de tétracycline ou un de ses analogues permet l'activation du promoteur et la transcription du gène associé. [0040] Par analogues de la tétracycline, on entend par exemple la doxycycline, la chloroté- tracycline et l'anhydrotétracycline. [0041] La séquence nucléotidique codant pour la protéine transactivatrice capable de se lier à la séquence opérateur tet peut être située sur le même vecteur comprenant la séquence opérateur tet ou peut être située sur un vecteur distinct. [0042] Parmi les autres systèmes inductibles, on peut citer les fusions de VP16 ou Ga14 avec des séquences protéiques de contrôle comme certains récepteurs aux hormones nucléaires, plus ou moins modifiées pour répondre de façon spécifique à la présence d'analogues d'hormones. [0043] Pour pouvoir détecter distinctement l'expression du gène d'intérêt sauvage et du gène d'intérêt muté, chacun des gènes est fusionné à des gènes rapporteurs différents. [0044] Par fusion de deux ou plusieurs gènes, on entend l'association de deux ou plusieurs gènes qui codent pour des protéines ou des fragments de protéines différentes, la 8 traduction des deux gènes fusionnés donnant un seul polypeptide fonctionnel. Dans le cadre de l'invention, le gène d'intérêt est fusionné en phase de lecture avec le gène rapporteur pour donner une protéine de fusion qui permet de détecter la protéine d'intérêt. [0045] De préférence, le gène d'intérêt est fusionné au gène rapporteur par l'intermédiaire d'un « linker », de préférence une séquence nucléotidiquc qui code pour une séquence pcptidiquc qui permet de lier les différentes protéines ou fragment de protéines de telle sorte que la protéine adopte une meilleure conformation pour l'activité des protéines. En particulier, la séquence nucléotidiquc code pour une séquence pcptidiquc de 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40 ou 50 acides aminés. Dans un mode préféré, le linker code pour une séquence pcptidiquc consistant en cinq glycines. [0046] Le terme "gène rapporteur" désigne un gène dont le produit (une protéine) possède une caractéristique lui permettant d'être observé ou quantifié, par exemple par détection d'une bioluminescence (par exemple fluorescence) ou d'une activité enzymatique. Ainsi, un gène rapporteur utile dans la mise en oeuvre de la présente invention peut être choisi parmi les gènes rapporteurs codant pour une protéine fluorescente, et les gènes rapporteurs codant pour une enzyme dont l'action provoque l'apparition d'un produit coloré ou d'un phénotype facilement caractérisahle ou toute autre protéine ayant toute autre activité quantifiable. [0047] Dans certains modes de réalisation, un gène rapporteur selon l'invention est choisi parmi les gènes rapporteurs codant pour une enzyme, comme par exemple le gène de la luciférase de Vibrio (Lux), le gène de la bêta-galactosidase (LacZ) ou d'une hydrolase (3-glucoronidase, phosphatase- alcaline), le gène de la chloramphénicol acétyltransférase (CAT) et le gène de la bêta-lactamase (TEM-1). [0048] Dans un mode particulier, un gène rapporteur selon l'invention est un gène rapporteur codant pour une protéine fluorescente. [0049] De préférence, le premier gène rapporteur code pour une première protéine fluo- rescente, le deuxième gène rapporteur code pour une deuxième protéine fluorescente, et les première et deuxième protéines fluorescentes sont différentes. Chacune de ces protéines fluorescentes doit être adaptée à l'exploration cellulaire. Par "protéines fluorescentes différentes", on entend des protéines qui fluorescent dans des régions différentes du spectre optique, ou plus spécifiquement des protéines qui émettent une fluorescence à des longueurs d'onde suffisamment différentes pour qu'elles puissent être distinguées en utilisant une méthode classique de détection ou de mesure de fluorescence. Ainsi, la première protéine fluorescente peut émettre dans le rouge (longueur d'onde d'émission comprise entre environ 605 nm et 780 nm) et la deuxième protéine fluorescente peut émettre dans le vert (longueur d'onde d'émission comprise entre environ 510 nm et 570 nm). Alternativement, la première protéine fluorescente peut 9 émettre dans le bleu (longueur d'onde comprise entre environ 460 nm et 480 nm) et la deuxième protéine fluorescente peut émettre dans l'orangé (longueurs d'onde d'émission comprise entre environ 585 nm et 605 nm). L'homme du métier sait sélectionner deux protéines fluorescentes différentes pour développer un système rapporteur selon l'invention. [0050] Le gène rapporteur qui peut être utilisé dans le contexte de la présente invention est un gène codant pour une protéine fluorescente appartenant à la catégorie des BFPs (comme par exemple les protéines Sirius, EBFP, SBFP2, EBFP2, Azurite, mKalamal, TagBFP et mBlueberry2), des CFPs (comme par exemple SCFP3A, mTurquoise, mseCFP, Cerulean, ECFP, CyPet, TagCFP, [1-ITEM, Midori-ishi Cyan, et mUKG), des GFPs (comme par exemple TurboGFP, AceGFP, Azami Green, ZsGreen, TagGFP2, EGFP, mEGFP, mWasabi, Emcrald, Superfolder GFP, Sapphirc, T-Sapphire, et SGFP2), des YFPs (comme par exemple TagYFP, mAmetrine, EYFP, Topaz, SYFP2, Venus, mCitrine, Ypet, PhiYFP, et ZsYellowl), des OFPs (comme par exemple mBanana, mOrange, Kusabira Orange2, mOrange2, OFP, et TurboRFP), des RFPs (comme par exemple tdTomato, DsRed2, DsRed, DsRed-Express, TagRFP, TagRFPT, mTangerine, DsRed-Express2, DsRed-Max, AsRed2, mApple, mStrawherry, mRuby, mREPI, tdRFP611 et mCherry), ou des FRFPs (comme par exemple eqFP611, tdKeima, mKeima, mRaspberry, tdRFP639, tdKatushka2, mKate, mKate2, mPlum, mNeptune et AQ143). [0051] De préférence, le vecteur comprend un premier gène rapporteur codant pour la mEGFP et un deuxième gène rapporteur codant pour la mCherry. [0052] Dans certains modes de réalisation, le vecteur comprend en outre des sites de res- triction permettant la modification ou le remplacement du gène sauvage et/ou muté, mais éventuellement également du promoteur, du premier gène rapporteur, du deuxième gène rapporteur. Le terme "site de restriction" désigne une séquence particulière de nucléotides qui est reconnue par une enzyme de restriction comme un site de coupure dans la molécule d'ADN. Ces sites de restriction peuvent, par exemple, être reconnus par des enzymes choisis parmi BamHI, HindIII, Kpnl, Ndel, Apal, Xbal, BglII, et EcoRI. Préférablement, les sites de restriction des éléments modifiables ou remplaçables tels que les gènes d'intérêt sauvage et muté, promoteur, premier gène rapporteur, deuxième gène rapporteur sont tous uniques et différents les uns des autres pour que ces éléments puissent être modifiés ou remplacés spécifiquement et indépendamment les uns des autres. De préférence, le vecteur comprend au moins un site de restriction permettant le clonage d'un gène d'intérêt en phase de lecture avec le gène rapporteur de sorte à coder pour une protéine de fusion. [0053] Selon un mode de réalisation particulier, le vecteur peut également comprendre un marqueur de sélection qui permet de sélectionner les cellules exprimant ce vecteur. Par exemple, les marqueurs de sélection peuvent être des gènes conférant une résistance aux antibiotiques. Un gène de résistance aux antibiotiques est un gène qui produit une protéine qui permet de rendre la cellule résistante aux antibiotiques. Préférablement, le gène de résistance à l'antibiotique permet de réaliser une sélection dans les cellules procaryotes et est sélectionné, sans être limité, parmi le groupe constitué du : gène de résistance à l'ampicilline, à r actinomycinc, la kanamycine, la néomycine, la puromycine, la gentamycine. Dans une autre mode particulier, le vecteur de l'invention peut également comprendre un gène de résistance permettant de réaliser une sélection dans les cellules eucaryotes, tel que par exemple le gène de résistance à l'hygromycinc, la blastidicinc, la généticine, la zéocine, la puromycine. [0054] Le vecteur selon l'invention est un vecteur comprenant un premier gène rapporteur et un deuxième gène rapporteur sous le contrôle transcriptionnel d'un promoteur bidirectionnel, de préférence inductible. Dans un mode particulier, le vecteur comprend un gène d'intérêt sauvage fusionné à un premier gène rapporteur et un gène d'intérêt muté, de préférence un gène d'intérêt comprenant une mutation synonyme fusionné à un deuxième gène rapporteur sous le contrôle transcriptionnel d'un promoteur bidirectionnel, de préférence inductible. De préférence, le vecteur comprend des sites de restriction permettant le clonage en phase de lecture des gènes d'intérêt en amont des gènes rapporteurs de sorte à coder pour des protéines de fusion. Dc préférence, le vecteur selon l'invention a une séquence nucléotidiquc SEQ ID NO : 4 ou 5, en fonction de s'il comprend ou non le système transactivateur tet. [0055] Un vecteur selon l'invention peut être préparé par n'importe quelle méthode ap- propriée, la méthode d'obtention du vecteur n'étant pas un élément critique ou limitant de l'invention. [0056] Des méthodes de préparation de telles constructions d'acide nucléique sont connues dans l'art et ont, par exemple, été décrites dans plusieurs ouvrages de référence comme Sambrook, Fritsch et Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, et Silhavy, Berman, et Enquist, "Experiments with Gene Fusions", 1984, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor; F.M. Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", 1989, John Wiley & Sons: New York. [0057] L'invention concerne également une cellule exprimant le dit vecteur de l'invention. [0058] Par « cellule » on entend, une cellule eucaryote, de préférence animale. L'invention peut être réalisée dans n'importe quelle cellule, en particulier des cellules de mammifères. Les cellules peuvent être des cellules de primates, dont les cellules humaines, les cellules de singes, chimpanzés, macaques ou babouins. Les cellules peuvent également être des cellules de bovins, de caprins, d'ovins, de porcins, d'équidés, de lapin. Les cellules peuvent également être des cellules de rongeurs, 11 notamment de souris, de rat, de hamster, de cobaye. Des exemples de cellules de mammifères comprennent donc les fibroblastes, les cellules endothéliales, les cellules épithéliales, les cellules hématopoïétiques. De préférence, les cellules sont des lignées cellulaires qui représentent une population homogène de cellules, stables après des mitoses successives. De préférence, les lignées cellulaires sont issues de cellules prélevées chez un patient immortalisées. On citera à titre d'exemples non limitatifs les cellules 3T3, les cellules HeLa, les cellules U2OS, les cellules RPE, les cellules HCT1 16, les cellules HEK293, les cellules HEK293T, les cellules CHO ou les fibroblastes primaires. [0059] Le vecteur est exprimé dans la cellule en introduisant ledit vecteur dans la cellule. Le vecteur peut être introduit dans la cellule par n'importe quelle méthode connue de l'homme du métier. [0060] Le vecteur peut être introduit dans la cellule par électroporation, conjugaison, transfection, transduction, ou toute autre technique connue de l'homme du métier. Le vecteur peut être associé à une substance lui permettant de franchir la membrane des cellules hôtes, telle qu'un transporteur comme un nanotransportcur ou une préparation de liposomes, ou de polymères cationiques, ou bien l'introduire dans ladite cellule hôte en utilisant des méthodes physiques telles que l'électroporation ou la microinjection. [0061] Les cellules transformées par le vecteur peuvent également être utilisées pour produire des animaux transgéniques. Dans un autre aspect, l'invention concerne des animaux transgéniques non-humains comprenant une cellule exprimant le vecteur tel que décrit ci-dessus. Les procédés de modification de l'identité génétique des animaux tel que décrits dans la présente demande ne sont pas de nature à provoquer des souffrances sans utilité médicale substantielle pour l'homme ou l'animal. [0062] Par animal transgénique, on entend désigner un animal non humain, de préférence un mammifère choisi dans le groupe des rongeurs et notamment de la souris, du rat, du hamster, du cobaye. Alternativement, l'animal transgénique peut être choisi parmi les animaux d'élevage et notamment les porcins, ovins, caprins, bovins, équidés, notamment le cheval, les lagomorphes, notamment le lapin. L'animal transgénique selon l'invention peut également être choisi parmi les primates, notamment les singes, tels le macaque, le chimpanzé ou le babouin. [0063] Pour réaliser des animaux transgéniques, après transformation, les cellules sont en- semencées sur une couche nourricière et/ou dans un milieu approprié. Les cellules contenant la construction peuvent être détectées en utilisant un milieu sélectif. Pour réaliser le criblage des cellules exprimant le vecteur, des gènes de sélection, tel que des gènes de résistance aux antibiotiques peuvent être insérés dans le vecteur. Les colonies positives, c'est-à-dire contenant des cellules exprimant le vecteur sont identifiées par une analyse par southern blot et/ou par des techniques de PCR. Les cellules positives 12 peuvent ensuite être utilisées pour réaliser les manipulations sur l'embryon et notamment l'injection des cellules exprimant le vecteur dans les blastocystcs. Pour cc qui concerne la souris, les blastocystes sont obtenus à partir de femelles superovulées de 4 à 6 semaines. Les cellules sont trypsinées et les cellules modifiées sont injectées dans le blastocèle d'un blastocystc. Après l'injection, les blastocystes sont introduits dans la corne utérine de femelles pseudo-gestantes. On laisse ensuite les femelles aller jusqu'à leur ternie et les portées résultantes sont analysées pour déterminer la présence de cellules possédant le vecteur. [0064] Le vecteur de l'invention est utilisé pour déterminer l'effet d'une mutation, de préférence une mutation synonyme sur l'expression d'un gène d'intérêt. Ainsi, l'invention concerne également une méthode pour déterminer l'effet d'une mutation, de préférence une mutation synonyme sur l'expression d'un gène d'intérêt dans laquelle le vecteur selon l'invention est exprimé dans une cellule. L'expression des deux protéines de fusion, notamment le niveau d'expression et/ou la localisation subcellulaire des deux protéines de fusion est ensuite détectée puis les profils d'expression sont comparés. L'expression du vecteur dans la cellule peut être réalisée en introduisant dans la cellule ledit vecteur. Le vecteur peut être introduit dans la cellule par n'importe quelle méthode connue de l'homme du métier. [0065] L'étape de détection de l'expression des protéines de fusion peut correspondre à une étape de détection de la localisation subcellulaire et/ou de mesure du niveau d'expression des protéines de fusion codées par les gènes d'intérêt fusionnés aux gènes rapporteurs de la construction génétique. [0066] Dans un mode particulier, l'étape de détection consiste à mesurer le niveau d'expression de la première et de la deuxième protéine de fusion. La détection de l'expression des protéines de fusion peut se faire par détection ou mesure du signal qui peut correspondre par exemple à l'activité enzymatique ou la fluorescence des protéines de fusion. [0067] Dans certains modes de réalisation, le premier gène rapporteur code pour une première protéine fluorescente et le deuxième gène rapporteur code pour une deuxième protéine fluorescente. L'étape de détection du niveau d'expression des protéines de fusion comprend alors la mesure de l'intensité de fluorescence émise par la première protéine de fusion et la mesure de l'intensité de fluorescence émise par la deuxième protéine de fusion. La quantification ou mesure de l'intensité de fluorescence peut être effectuée par n'importe quelles techniques de fluorescence connues de l'homme du métier, telles que la microscopie en fluorescence, spectroscopie de fluorescence, cytométrie en flux etc. Ainsi, par exemple, les mesures de fluorescence peuvent être réalisées par microscopie en fluorescence par observation entre lame et lamelle des cellules. Après acquisition des images, la détermination de fluorescence peut être 13 réalisée par le traitement d'information en utilisant des logiciels tels que PCI ou TmageJ (Ramadoss et al, P.N.A.S USA, 2016, 110: 10282-10287). De préférence, pour chaque cellule, on supprime le bruit de fond de la mesure de l'intensité de fluorescence. [0068] Dans un autre mode particulier, l'étape de détection consiste à déterminer la loca- lisation suhcellulaire des protéines de fusion codées par les gènes rapporteurs fusionnés aux gènes d'intérêt sauvage et muté, afin de mettre en évidence un éventuel défaut de localisation cellulaire dû à la mutation dans le gène d'intérêt. En particulier, les gènes rapporteurs sont des gènes codant pour des protéines fluorescentes différentes. La détection de la fluorescence dans la cellule peut être effectuée par n'importe quelles techniques de fluorescence connues de l'homme du métier, en particulier par microscopie en fluorescence. Les différents organites cellulaires peuvent être détectés par des marqueurs connus de l'homme du métier. A titre d'exemple, le noyau peut être marqué par un marquage de l'ADN en utilisant par exemple le DAPI. [0069] Après avoir détecté l'expression des deux protéines de fusion, les profils d'expression sont comparés. Par comparaison des profils d'expression des deux protéines de fusion, on entend notamment la comparaison des niveaux d'expression des protéines de fusion et/ou la comparaison de la localisation suhcellulaire des protéines de fusion. La mise en évidence de différences de profils d'expression des protéines de fusion codées par des gènes rapporteurs fusionnés soit au gène muté, soit au gène sauvage, permet ainsi de caractériser l'effet de la mutation. [0070] Dans le mode particulier où le niveau d'expression des protéines de fusion est mesuré, les profils d'expressions peuvent être comparés en mesurant le ratio entre les niveaux d'expression des protéines de fusion. En particulier, le ratio Ra entre le niveau d'expression de la deuxième protéine de fusion codée par le gène d'intérêt muté fusionné au deuxième gène rapporteur et le niveau d'expression de la première protéine de fusion codée par le gène d'intérêt sauvage fusionné au premier gène rapporteur est mesuré. Dans le cas particulier où le gène rapporteur code pour une protéine fluorescente, le ratio Ra correspond au ratio entre l'intensité de fluorescence de la deuxième protéine de fusion codée par le gène d'intérêt muté fusionné au deuxième gène rapporteur et l'intensité de fluorescence de la première protéine de fusion codée par le gène d'intérêt sauvage fusionné au premier gène rapporteur. [0071] Pour la mesure de l'expression des deux gènes rapporteurs fusionnés au gène d'intérêt sauvage et muté, la méthode selon l'invention peut comprendre en outre des étapes de normalisation. En particulier, la normalisation comprend l'expression dans une deuxième cellule dudit vecteur tel que décrit ci-dessus comprenant non pas un gène sauvage et un gène muté mais deux gènes d'intérêt sauvages fusionnés chacun auxdits gènes rapporteurs. Les niveaux d'expression des protéines de fusion sont mesurés puis comparés. La comparaison des niveaux d'expression des protéines de 14 fusion codées par les deux gènes rapporteurs fusionnés aux deux copies du gène d'intérêt sauvage permet ainsi de normaliser les niveaux d'expression des protéines codées par les mêmes gènes rapporteurs fusionnés aux gènes d'intérêt sauvage et muté. En particulier, le ratio-R.2,0R,, entre le niveau d'expression de la protéine de fusion codée par le gène d'intérêt sauvage fusionné audit deuxième gène rapporteur et le niveau d'expression de la protéine de fusion codée par le gène d'intérêt sauvage fusionné au premier gène rapporteur est mesuré. Dans le cas particulier où le gène rapporteur code pour une protéine fluorescente, le niveau d'expression correspond à l'intensité de fluorescence. La normalisation est réalisée en divisant le ratio Ra par le ratio Rmino'. [0072] Les anomalies de profil d'expression ducs aux mutations sont responsables de nombreuses maladies. Plus d'une cinquantaine de maladies ont été caractérisées comme étant associées à une mutation synonyme. Des exemples de maladies associées aux mutations synonymes sont : le syndrome d'insensibilité aux androgènes, l'ataxie, la maladie de stockage des esters du cholestérol, granulomatose chronique, la polypose recto-colique familiale, le cancer colorectal héréditaire sans polypose, les mélanomes, le syndrome de Treacher-Collins, l'atrophie spino-musculaire liée à l'X de l'enfant, la fibrose cystique, la maladie de Hirschsprung, le syndrome de Marfan, la maladie de McArdle, Phenylcétonurie, le syndrome de Seckel, l'hydrocéphalie liée à l'X et r holoprosencephalic. [0073] Ainsi, la méthode selon l'invention peut être utilisée pour déterminer l'effet d'une mutation, de préférence une mutation synonyme dans un gène d'intérêt chez un sujet. La méthode selon l'invention est ainsi particulièrement adaptée pour identifier chez un sujet malade l'effet d'une mutation, de préférence synonyme associée à une maladie. L'identification de la mutation responsable de la maladie peut ainsi permettre d'adapter le traitement au sujet. Par sujet, on entend un mammifère, de préférence un humain. [0074] Ainsi, l'invention concerne également une méthode telle que décrit ci-dessus dans laquelle la mutation est préalablement détectée dans un échantillon d'un sujet, de préférence d'un sujet malade. [0075] L'échantillon utilisé peut être du sang ou tout autre fluide corporel ou tissu obtenu d'un individu. L'ADN peut être extrait en utilisant toute méthode connue de l'état de la technique, telles que les méthodes décrites dans Sambrook et al. (1989). L'ARN peut également être isolé, par exemple à partir de tissus obtenus lors d'une biopsie, en utilisant des méthodes standard bien connues de l'homme du métier, telles que l'extraction par phénol-chloroforme. [0076] Après les étapes d'extraction et de purification de l'acide nucléique, l'amplification PCR au moyen des amorces peut être utilisée pour améliorer la détection du signal. Par exemple, l'ARN isolé peut être soumis à une transcription-réverse puis une amplification, telle qu'une réaction RT-PCR en utilisant les oligonucléotides spécifiques du site muté ou qui permettent l'amplification de la région contenant la mutation. [0077] Dans un mode de réalisation, la mutation peut être détectée par analyse de la molécule d'acide nucléique du gène d'intérêt. La présence ou l'absence de la mutation peut être détectée par séquençage, amplification et/ou hybridation avec une sonde et des amorces spécifiques. [0078] Les méthodes pour la détection de la mutation sont décrites par exemple dans Molecular Cloning - A Laboratory Manual" Fourth Edition, M.R. Green, J. Sambrook, (Cold Spring Harbor Laboratory, 2012) et Laboratory Protocols for Mutation Detection, Ed. hy U. Landcgren, Oxford University Press, 1996 et PCR, 2ème édition par Newton & Graham, BIOS Scientific Publishers Limitcd, 1997. [0079] Les exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. Exemples [0080] 1. Construction du vecteur ibis [0081] Lc vecteur ibis (induccd bitluorescence system) permet l'expression inductible et si- multanée de deux versions sauvage et mutée de gènes d'intérêt fusionnées à deux fluorophores distinguables l'un de l'autre par leur spectre d'émission de fluorescence (mEGFP et mCherry). [0082] Les séquences codant les fluorophores mEGFP et mCherry sont placées en orientation divergente et sous le contrôle d'un même promoteur bidirectionnel inductiblc par de la doxycyclinc. Des sites de restriction uniques sont présents en 5' des séquences mCherry (Xho) et mEGFP (Swal) et permettent l'insertion des cDNA d'intérêt en phase avec les séquences mCherry et mEGFP. En outre, une séquence codant 5 résidus glycine est insérée en amont des séquences des fluorophores. Cet élément très flexible de 5 glycines minimise grandement le risque d'une perturbation du repliement et du comportement des protéines d' intérêt par les fluorophores. [0083] Les éléments permettant l'inductibilité par la doxycycline ont déjà été décrits (Bornkamm GW et al, NAR, 2005, 33(16) : e137) et sont portés soit sur la même construction plasmidiquc dans la version du vecteur utilisé dans les exemples suivants (Figure 1A, Version 1 ; SEQ ID NO : 4), soit sur un vecteur distinct. [0084] Dans la version du vecteur utilisé dans les exemples suivants (Version 1), les éléments ibis (entre les sites PacI et NotI, Figure 1) et d'inductibilité à la doxycycline (entre les sites NotI et AscI) sont portés sur le plasmide épisomal initialement décrit par Bornkamm et al. Ce vecteur a été modifié en éliminant la séquence codant la protéine mEGFP. La séquence codant la protéine mEGFP a été insérée d'un côté du promoteur dont elle est séparée par un site de restriction SwaI et une séquence codant 5 16 glycines. La séquence codant la luciférase a été éliminée. La séquence codant la protéine mCherry a été insérée du côté du promoteur opposé à celui de la séquence mEGFP. La séquence codant la protéine mCherry est séparée du promoteur par un site de restriction XhoT et une séquence codant 5 glycines. Des séquences permettant la sélection des bactéries (ampicilline) et des cellules de vertébrés (hygromycine) sont également présentes. [0085] Dans une deuxième version envisagée (Figure 1B, Version 2, SEQ ID NO : 5), les éléments permettant l'inductibilité par la doxycycline sont situés sur un plasmide distinct. Dans cette deuxième version, le plasmide ibis est obtenu à partir de la version 1 en retirant les éléments d' inductibilité à la doxycycline par digestion enzymatique (PacT/Notl). La simple fermeture par ligation du plasmide linéarisé résultant permet l'obtention du plasmide épisomal portant ibis. Des séquences permettant la sélection des bactéries (ampicilline) et des cellules de vertébrés (hygromycine) sont également présentes. [0086] Les éléments d'inductibilité à la doxycyclinc obtenus à l'étape précédente sont insérés dans un plasmide tel que pCDNA3.1. Des séquences permettant la sélection des bactéries (kanamycinc) et des cellules de vertébrés (0418, généticine) sont également présentes. Cette construction est appelé doxycyclinc induction clement, ou DIE. [0087] La séquence sauvage SHH est insérée en phase avec le gène rapporteur mCherry (site XhoT) dans toutes les versions d'ibis. La séquence portant les mutations d'intérêt ou la séquence sauvage est insérée en phase avec le gène rapporteur mEGFP (site SwaI) pour la version ibis à tester ou la version normalisatrice, respectivement. Pour chaque gène d'intérêt, il y a donc une version d'ibis gène (l'intérêt wt-wt et autant de versions mut-wt que de mutations à tester. Ces constructions plasmidiques s'obtiennent par techniques classiques de clonage d'ADN. [0088] 2. Préparation des lignées cellulaires et analyse de l'intensité de fluorescence [0089] Des lignées de cellules humaines sont établies pour chaque version d'ibis. Les cellules humaines HeLa sont transfectées par les vecteurs ibis par lipofection. Les cellules transfectées sont ensuite cultivées et sélectionnées en présence d'hygromycine (100pg/mL) Les cellules sont ensuite cultivées pour être amplifiées dans un milieu de culture en présence de 25 pg/mL d'hygromycine. [0090] Les cellules sont ensemencées et cultivées sur lamelles de verre et l'expression induite par traitement à la doxycycline (1-5 pg/ml, 20h à 72h) puis lavées, fixées (foimaldéhyde 4%), colorées au DAPI (ADN), montées entre lame et lamelles puis scellées. Les cellules fixées sont ensuite observées et photographiées à l'aide d'un microscope à fluorescence. [0091] Pour chaque cellule, les intensités de fluorescence mEGFP (vert, IEGFp) et mCherry (rouge ; IrnCh ) sont mesurées, diminuées (lu bruit de fond (IEGFPBGD. ItnCherryBGD) et 17 exprimées sont forme de ratio : [0092] Ra= (IaLG', - Ia EGI-PBCD)/ (ianiCherry- TainClat. BGD) [0093] Les différentes mesures obtenues par condition (lignée cellulaire) sont exprimées sous forme de moyenne et valeur de dispersion. Ainsi on obtient pour deux mutations 1 et 2 des moyennes de ratio Rwt-moy, Rmutl -moy et Rmut2-moy. Ces moyennes peuvent être normalisées par rapport à la condition contrôle wt-wt (ic, divisée par Rwtmoy). [0094] Un test statistique approprié (par exemple des variantes du test de Student, non appariées, bilatérales et non paramétriques) permet ensuite de déterminer la significativité des différences observées. [0095] 3. Efficacité de la méthode [0096] L'efficacité de la méthode selon l'invention permettant de déterminer l'effet de mutations notamment synonymes dépend d'une part d'une forte corrélation de l'expression des gènes rapporteurs codant pour les protéines EGFP et mCherry dans chaque cellule, et d'autre part de la reproductibilité des résultats obtenus entre expériences. Ces deux aspects ont été traités en utilisant la protéine SonicHedgeHog (SHH) humaine. [0097] 3.1. Détermination du niveau de corrélation entre SHH-EGFP et SHH-mcherry [0098] Des cellules humaines HeLa ont été transfectées avec un vecteur ibis comprenant deux copies du gène SHH sauvage fusionnés à l'EGFP et la mCherry. L'intensité de fluorescence de la EGFP et de la mCherry a été analysée en microscopie par fluorescence. [0099] La détermination du niveau de corrélation entre SHH-EGFP et SHH-mCherry est présentée en Figure 2. L'analyse par cellule des signaux de SHH-mCherry et SHHmEGFP (Figure 2B) révèle une très forte corrélation (R= 0,91 ; R2=0,82 ; pvalue REVENDICATIONS[Revendication 1] Méthode pour déterminer l'effet d'une mutation sur l'expression d'un gène d'intérêt dans une cellule, la dite méthode comprenant les étapes suivantes de : i) expression dans une cellule d'un vecteur comprenant un gène d'intérêt sauvage fusionné à un premier gène rapporteur codant pour une première protéine de fusion et un gène d'intérêt comprenant au moins une mutation fusionnée à un deuxième gène rapporteur codant pour une deuxième protéine de fusion, lesdits gènes étant sous le contrôle transcriptionnel d'un promoteur bidirectionnel, ii) détection de l'expression de la première et de la deuxième protéine de fusion, iii) comparaison des profils d'expression de la première et de la deuxième protéine de fusion. [Revendication 2] Méthode selon la revendication 1 caractérisée en ce que la mutation est une mutation synonyme. [Revendication 3] Méthode selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce que l'étape ii) comprend la détermination de la localisation subcellulaire de la première et de la deuxième protéine de fusion. [Revendication 4] Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que l'étape ii) comprend la mesure du niveau d'expression de la première et de la deuxième protéine de fusion et l'étape iii) comprend la comparaison du niveau d'expression de la première et de la deuxième protéine de fusion, de préférence par mesure du ratio du niveau d'expression de la deuxième protéine de fusion sur le niveau d'expression de la première protéine de fusion. [Revendication 5] Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 dans laquelle le promoteur bidirectionnel est un promoteur inductible, de préférence inductible par de la tétracycline ou un de ses analogues. [Revendication 6] Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 dans laquelle les gènes rapporteurs codent pour des protéines fluorescentes différentes, de préférence la mCherry et la mEGFP et de préférence dans laquelle la dite expression de la première et de la deuxième protéine de fusion est. détectée par microscopie en fluorescence ou cytométrie en flux. [Revendication 7] Méthode selon l'une quelconque des revendications 4 à 6 comprenant en outre les étapes de : 21 [Revendication 8] [Revendication 9] [Revendication 10] iv) expression dans une autre cellule d'un vecteur comprenant un gène d'intérêt sauvage fusionné audit premier gène rapporteur codant pour une troisième protéine de fusion et une deuxième copie du gène d'intérêt sauvage fusionné audit deuxième gène rapporteur codant pour une quatrième protéine de fusion, lesdits gènes étant sous le contrôle transcriptionnel dudit promoteur bidirectionnel, v) mesure du niveau d'expression de la troisième et de la quatrième protéine de fusion, vi) calcul du ratio du niveau d'expression de la quatrième protéine de fusion sur le niveau d'expression de la troisième protéine de fusion, vii) normalisation du ratio des niveaux d'expression des protéines de fusion obtenu en iii) par le ratio des niveaux d'expression des protéines de fusion obtenu en vi). Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisée en ce que la mutation du gène d'intérêt est préalablement détectée dans un échantillon d'un sujet, de préférence d'un sujet malade. Vecteur comprenant deux gènes rapporteurs sous le contrôle transcriptionnel d'un promoteur bidirectionnel, comprenant de préférence des sites de restrictions permettant le clonage en phase de lecture de gènes d'intérêt avec des gènes rapporteurs de sorte à coder pour des protéines de fusion, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un gène d'intérêt sauvage fusionné au premier gène rapporteur et un gène d'intérêt comprenant une mutation fusionné au deuxième gène rapporteur. Cellule exprimant le vecteur selon la revendication 9.