Brevet FR3097326A1 — publié le 20201218

Description Titre de l'invention : Dispositif et procédé d'observation d'un échantillon fluorescent Domaine technique [0001] Le domaine technique de l'invention est un dispositif et un procédé d'observation d'un échantillon fluorescent, présentant une sensibilité élevée. L'échantillon peut notamment être un échantillon biologique. Technique antérieure [0002] L'application de la microscopie à des échantillons fluorescents est une technique très courante d'observation, en particulier dans le domaine de la biologie ou du diagnostic médical. Selon cette technique, l'échantillon est disposé dans un plan objet d'un objectif, optiquement couplé à un capteur d'image. On illumine l'échantillon selon une longueur d'onde d'excitation, induisant une fluorescence de l'échantillon, de façon à former une image de fluorescence. [0003] Une des difficultés associées à l'imagerie de fluorescence est la sensibilité. En effet, le rendement de fluorescence, c'est-à-dire l'intensité de la lumière de fluorescence émise normalisée par l'intensité de la lumière d'excitation, est généralement faible. Le recours à des objectifs présentant des grandissements élevés est une solution pour améliorer la collecte de la lumière de fluorescence. Cependant, plus le grandissement est élevé, plus le champ d'observation est faible. Lorsqu'un échantillon de plusieurs dizaines de mm2 doit être analysé, il est nécessaire de procéder à un balayage de l'échantillon, ce qui prend du temps et nécessite une instrumentation adaptée. [0004] On sait que l'imagerie sans lentille permet de former une image d'un échantillon selon des champs d'observation élevés. Selon une telle configuration, aucune optique de formation d'image n'est interposée entre l'échantillon et le capteur d'image. Lorsque l'échantillon est rapproché du capteur d'image, le champ observé est légèrement inférieur à la surface du capteur d'image. Ainsi, on peut obtenir un champ d'observation atteignant plusieurs dizaines de mm2 Cependant, l'absence d'optique de grossissement entre le capteur d'image et l'échantillon rend la technique d'imagerie sans lentille difficile à envisager clans les applications liées à l'imagerie de fluorescence, du fait d'une sensibilité peu satisfaisante. [0005] Les inventeurs ont conçu un dispositif et un procédé d'observation d'un échantillon fluorescent, permettant l'obtention d'une image représentative de la fluorescence d'un échantillon, et cela avec une sensibilité élevée. Exposé de l'invention [0006] Un premier objet de l'invention est un procédé d'observation d'un échantillon 2 fluorescent, l'échantillon comportant un agent fluorescent émettant une lumière de fluorescence, dans une bande spectrale de fluorescence lorsqu'il est illuminé par une lumière d'excitation, dans une bande spectrale d'excitation, le procédé comportant les étapes suivantes : a. disposition de l'échantillon contre un support, et de préférence au contact du support ; h. illumination de l'échantillon, par une source de lumière, dans la bande spectrale d'excitation, la lumière émise par la source de lumière se propageant selon un axe de propagation; c. détection d'une lumière de fluorescence, dans la bande spectrale de fluo- rescence, par un capteur d'image; [0007] le procédé étant tel que le support comporte une couche mince formée d'un premier matériau, d'un premier indice de réfraction, la couche mince s'étendant selon un plan de support perpendiculaire à l'axe de propagation, le plan de support s'étendant selon un axe longitudinal, la couche mince comportant : des premières inclusions formées d'un deuxième matériau, d'un deuxième indice de réfraction, différent du premier indice de réfraction, les premières inclusions définissant un premier motif périodique, les premières inclusions étant réparties selon une première période, parallèlement à l'axe longitudinal, les premières inclusions formant un premier cristal photonique résonant dans la bande spectrale d'excitation; des deuxièmes inclusions, formées d'un troisième matériau, d'un troisième indice de réfraction, différent du premier indice de réfraction, et formant un deuxième motif périodique, les deuxièmes inclusions étant réparties selon une deuxième période, parallèlement à l'axe longitudinal, la deuxième période étant strictement supérieure à la première période, les deuxièmes inclusions formant un deuxième cristal photonique résonant dans la bande spectrale de fluorescence; au moins deux deuxièmes cristaux photoniques étant disposés de part et d'autre d'un premier cristal photonique; [0008] de telle sorte que : une partie de la lumière émise par la source de lumière, à la longueur d'onde d'excitation, est confinée dans la couche mince, sous l'effet du premier cristal photonique, résultant en une amplification d'une onde lumineuse se propageant au niveau d'une interface entre la couche mince et l'échantillon; la lumière de fluorescence se propage dans la couche mince, à travers un premier cristal photonique, en étant réfléchie par les deuxièmes cristaux photoniques disposés de part et d'autre du premier cristal photonique, résultant en 3 une amplification de la lumière de fluorescence. [0009] Ainsi, selon l'axe longitudinal, au moins un premier cristal photonique est délimité par deux deuxièmes cristaux photoniques, s'étendant respectivement de part et d'autre du premier cristal photonique, ou de part et d'autre de chaque premier cristal photonique. [0010] L'image formée par le capteur d'image permet de localiser des parties fluorescentes de l'échantillon dans un plan de détection défini par le capteur d'image. Elle comporte des zones intenses, correspondant aux parties fluorescentes de l'échantillon. [0011] De préférence, l'échantillon est disposé au contact de la couche mince, ou à une distance de cette dernière inférieure à 1 mm. [0012] Selon un mode de réalisation, le premier cristal photonique est monodimensionnel, les premières inclusions s'étendant parallèlement à un axe latéral perpendiculaire à l'axe longitudinal ; et/ou le deuxième cristal photonique est rnonodimensionnel, les deuxièmes inclusions s'étendant parallèlement l'axe latéral. [0013] Selon un mode de réalisation, le premier cristal photonique est bidimensionnel, les premières inclusions étant espacées les unes des autres, selon un axe latéral perpendiculaire à l'axe longitudinal ; et/ou le deuxième cristal photonique est bidimensionnel, les deuxièmes in- clusions étant espacées les unes des autres, selon l'axe latéral. [0014] La première période, parallèlement à l'axe longitudinal, peut être comprise entre 100 nm et 300 nm, ou entre 200 nm et 300 nm. La deuxième période, parallèlement à l'axe longitudinal, peut être comprise entre 200 nm et 400 nm, ou entre 300 nm et 400 nm. L'épaisseur de la couche mince selon l'axe de propagation, peut être comprise entre 100 nm et 300 nm. [0015] Le support est de préférence disposé entre l'échantillon et le capteur d'image. [0016] Selon un mode de réalisation, aucune optique de formation d'image, par exemple de type lentille ou objectif, n'est disposée entre le capteur d'image et le support. Selon un autre mode de réalisation, un système optique, de type lentille ou objectif, permet une conjugaison de la couche mince avec le capteur d'image. [0017] Le troisième matériau, formant les deuxièmes inclusions peut être identique au deuxième matériau, formant les premières inclusions. [0018] Un deuxième objet de l'invention est un dispositif d'observation d'un échantillon fluorescent, l'échantillon comportant un agent fluorescent émettant une lumière de fluorescence, dans une bande spectrale de fluorescence lorsqu'il est illuminé par une lumière d'excitation, dans une bande spectrale d'excitation, le dispositif comportant : une source de lumière, configurée pour émettre une onde lumineuse d'illumination dans la bande spectrale d'excitation, la lumière se propageant, vers l'échantillon, selon un axe de propagation; un support d'échantillon, configure pour recevoir l'échantillon; un capteur d'image, configure pour détecter une lumière de fluorescence, émise par l'échantillon, dans la bande spectrale de fluorescence ; le dispositif étant caractérisé en cc que : [0019] le support comporte une couche mince formée d'un premier matériau, d'un premier indice de réfraction, la couche mince s'étendant selon un plan de support perpendiculaire à l'axe de propagation, le plan de support s'étendant selon un axe longitudinal, la couche mince comportant : des premières inclusions formées d'un deuxième matériau, d'un deuxième indice de réfraction, différent du premier indice de réfraction, les premières inclusions définissant un premier motif périodique, les premières inclusions étant reparties selon une première période, parallèlement à l'axe longitudinal, les premières inclusions formant un premier cristal photonique résonant dans la bande spectrale d'excitation, le premier cristal photonique étant configure pour confiner une partie de l'onde lumineuse d'illumination dans la couche mince ; des deuxièmes inclusions, formées d'un troisième matériau, d'un troisième indice de réfraction, différent du premier indice de réfraction, et formant un deuxième motif périodique, les deuxièmes inclusions étant réparties selon une deuxième période, parallèlement à l'axe longitudinal, la deuxième période étant strictement supérieure à la première période, les deuxièmes inclusions formant un deuxième cristal photonique résonant dans la bande spectrale de fluorescence; au moins deux deuxièmes cristaux photoniques étant disposés de part et d'autre d'un premier cristal photonique. [0020] Selon un mode de réalisation, le premier cristal photonique est monodimensionnel, les premières inclusions s'étendant parallèlement à un axe latéral perpendiculaire à l'axe longitudinal; et/ou le deuxième cristal photonique est monodimensionnel, les deuxièmes inclusions s'étendant parallèlement l'axe latéral. [0021] Selon un mode de réalisation, le premier cristal photonique est bidimensionnel, les premières inclusions étant espacées les unes des autres, selon un axe latéral perpendiculaire à l'axe longitudinal; et/ou le deuxième cristal photonique est bidimensionnel, les deuxièmes in- clusions étant espacées les unes des autres, selon l'axe latéral. 100221 La première période, parallèlement à faxe loneitudinal, peut être comprise entre 100 nm et 300 nm, et de préférence entre 200 nm et 300 nm. La deuxième période peut être comprise entre 200 nm et 400 nm, et de préférence entre 300 nm et 400 nm. L'épaisseur de la couche mince, selon faxe de propagation, peut être comprise entre 100 nm et 300 nm. [0023] Le support peut être délimité par une face supérieure, adjacente de la couche mince, et une face inférieure, opposée à la face supérieure. Le capteur d'image peut alors être disposé face au support, plus proche de la face inférieure que de la face supérieure. [0024] Selon un mode de réalisation, aucune optique de formation d'image, par exemple de type lentille ou objectif, ne s'étend entre le support et le capteur d'image. Selon un autre mode de réalisation, un système optique, de type lentille ou objectif, permet une conjugaison de la couche mince avec le capteur d'image. [0025] Selon un mode de réalisation, le troisième matériau, formant les deuxièmes in- clusions est identique au deuxième matériau, formant les premières inclusions. [0026] Selon un mode de réalisation, le support et le capteur d'image sont solidaires l'un de l'autre. Ils peuvent former un même composant. [0027] Le premier objet de l'invention peut comporter des caractéristiques décrites en lien avec le deuxième objet de l'invention et réciproquement. [0028] L'invention sera mieux comprise à la lecture de l'exposé des exemples de réalisation présentés, dans la suite de la description, en lien avec les figures listées ci-dessous. Brève description des dessins [0029] [fig. 1A] La figure 1A représente un mode de réalisation de dispositif selon l'invention. [0030] [fig. 113] [003 1 ] [fig.IC]Les figures 1B et 1C représentent un support d'échantillon faisant partie du dispositif. [0032] [fig. ID] [0033] [fig.1E] Les figures ID et 1E schématisent des autres modes dc réalisation de dispositif selon l'invention. [0034] [fig.2A] La figure 2A illustre un mode de réalisation selon lequel le support d'échantillon comporte une couche mince formée de cristaux photoniques monodimensionnels. [0035] [fig.2B] [0036] [fig.2C] Les figures 2B et 2C illustrent des modes de réalisation selon lesquels le support d'échantillon comporte une couche mince formée de cristaux photoniques bidimensionnels. [0037] [fig.3A] 6 100381 La figure 3A montre une configuration modélisée, clans laquelle le support d'échantillon comporte une couche mince formée d'un premier cristal photonique [0039] [fig.313] [0040] [fig.3C] Les figures 3B et 3C sont les résultats de modélisations de la propagation d'un champ électromagnétique dans la configuration représentée sur la figure 3A, respectivement selon deux longueurs d'onde différentes. [0041] [fig.4A] La figure 4A montre une configuration modélisée, représentative de l'invention. [0042] [fig.413] [0043] [fig.4C] Les figures 4B et 4C sont les résultats de modélisations de la propagation d'un champ électromagnétique dans la configuration représentée sur la figure 4A, respectivement selon deux longueurs d'onde différentes. [0044] [fig..5A] La figure SA illustre une propagation d'un champ électromagnétique lorsqu'une particule est disposée sur un support uniforme constitué dc silice. [0045] [fig..513] La figure 5B illustre une propagation d'un champ électromagnétique, à une longueur d'onde de fluorescence, lorsqu'une particule est disposée sur un support tel que représenté sur la figure 3A. [0046] [fig.5C] La figure SC illustre une propagation d'un champ électromagnétique, à une longueur d'onde de fluorescence, lorsqu'une particule est disposée sur un support tel que représenté sur la figure 4A. [0047] [fig.6] La figure 6 montre des profils d'intensité d'images respectivement formées avec un support de silice, selon l'art antérieur, et un support selon l'invention. [0048] [fig.7A] [0049] [fig.7B] [0050] [fig.7C] [0051] [fig.7D] [0052] [fig.7E] [0053] [fig.7F] [0054] [fig.70] [0055] [fig.7H] Les figures 7A à 7H schématisent les principales étapes de fabrication d'un support pouvant être utilisé dans un dispositif ou un procédé selon l'invention. EXPOSE DE MODES DE REALISATION PARTICULIERS [0056] La figure lA représente un dispositif 1 formant un premier mode de réalisation de l'invention. Une source de lumière 10 produit une onde lumineuse incidente 12 en direction d'un support 20, ce dernier étant disposé entre la source de lumière 10 et un capteur d'image 40. [0057] L'échantillon 2 à analyser est placé contre un support 20. Le support 20 est délimité par une face supérieure 2Q, disposée face à la source de lumière 10, et une face in- 7 féricure 20,, disposée en vis-à-vis du capteur d'image 40. Le capteur d'image est plus proche de la face inférieure 20, que de la face supérieure 20,. [0058] Dans cet exemple, l'échantillon 2 est un échantillon liquide, comportant des particules 2 fluorescentes. Le liquide peut notamment comprendre un liquide biologique, de type sang, lymphe, sperme ou autre. Chaque particule fluorescente Z émet une lumière de fluorescence 16, dans une bande spectrale de fluorescence Akr, lorsqu'elle est illuminée dans une bande spectrale d'excitation Ak. L'onde lumineuse incidente 12, émise par la source de lumière, s'étend dans une bande spectrale Ak correspondant à tout ou partie de la bande spectrale d'excitation KA.e. De préférence, la bande spectrale d'illumination Ak ne s'étend pas dans la bande spectrale de fluorescence SKI., ou de façon marginale. Par de façon marginale, on entend qu'au maximum 5%, voire 1%, voire 0.1%, de l'intensité de l'onde lumineuse incidente est émise dans la bande spectrale de fluorescence Ak,-. [0059] Quel que soit le mode de réalisation, la bande spectrale d'illumination A?,. de la source de lumière 10 est de préférence ajustée à une première longueur d'onde de résonance d'un premier cristal photonique 31 formé dans le support 20, comme décrit par la suite. La bande spectrale d'illumination Ak peut se situer dans le domaine visible, proche UV (> 200 nm), proche infra-rouge ( n, et n, > no. [0075] Chaque première inclusion 22 peut également prendre la forme d'un cône ou un tronc conique, de base circulaire ou polygonale, ou avoir une forme hémisphérique. Quelle que soit la forme retenue, la dimension de chaque première inclusion 22 est micrométrique, c'est-à-dire que selon le plan du support Ro, la plus grande dimension de chaque première inclusion 22 est inférieure à la longueur d'onde de la bande spectrale d'illumination. On parle de dimension « sub-longueur d'onde ». Les premières inclusions 22 définissent, dans la couche mince 21, un premier un cristal photonique 31. Elles sont agencées selon un premier motif, qui est répété périodiquement sur la couche mince 21. [0076] Le plan du support Pno est défini par un axe longitudinal X perpendiculaire à un axe latéral Y. Les premières inclusions 22 peuvent s'étendre parallèlement à l'axe latéral Y, auquel cas le premier cristal photonique 31 est rnonodimensionnel. Les premières inclusions peuvent être réparties périodiquement selon faxe longitudinal X et selon l'axe latéral Y auquel cas le premier cristal photonique 31 est bidimensionnel. Le premier cristal photonique est paramétré par les indices respectifs du premier matériau et du deuxième matériau, ainsi que par la dimension des premières inclusions 22. 11 est également paramétré par une première période PI, selon l'axe X. Lorsque le cristal photonique est bidimensionnel, il est également paramétré par une première période P y selon l'axe Y. Par période, il est entendu l'espacement, centre à centre, entre deux inclusions adjacentes selon l'axe X ou selon l'axe Y. [0077] Le premier cristal photonique 31 présente une première longueur d'onde de résonance Xi', à laquelle les propriétés de transmission et de réflexion de la lumière peuvent être déterminées à l'aide de simulations effectuées par des codes de calcul. En effet, les propriétés de propagation de la lumière dans les réseaux de diffraction découlent de leur arrangement périodique spécifique et sont aisément modélisées, par l'homme du métier, sur la base des équations spatio-temporelles de Maxwell. Dans la suite de cette description, les modélisations sont réalisées à l'aide du logiciel RSOFTFullwave, mettant en oeuvre une méthode de type FDTD "Finite difference time domain method". [0078] Par cristal photonique, on entend une structure, et, par exemple, une structure di- électrique, dont l'indice varie périodiquement à l'échelle de la longueur d'onde, dans une ou plusieurs directions. L'invention tire alors profit du développement de techniques de micro structuration des matériaux diélectriques, permettant un contrôle de l'interaction des ondes électromagnétiques dans des structures tridimensionnelles 11 basées sur l'agencement de matériaux de différents indices. Grâce à la précision nanométrique des procédés de microfabrication, on peut à présent réaliser des cristaux photoniques correspondant à une échelle de structuration de la matière voisine du quart ou de la demi-longueur d'onde, ce qui les rend compatibles avec des applications en optique. [0079] Dans le cas présent, à la première longueur d'onde de résonance 741, le premier cristal photonique 31 ne transmet pas la lumière. À la première longueur d'onde de résonance le premier cristal photonique permet un confinement, dans la couche mince 21, d'une partie de l'onde incidente 12, parvenant à la couche mince 21 selon une incidence normale, formant alors un faisceau de lumière confiné 12. Le faisceau de lumière confiné 12 se propage ainsi le long de la couche mince 21, à l'interface entre le support 20 et l'échantillon 2. [0080] La première longueur d'onde de résonance 741 est comprise dans la bande spectrale d'illumination Ak de l'onde lumineuse incidente 12. Elle est donc comprise dans la bande spectrale d'excitation A?' de la particule fluorescente 2. [0081] Le taux de couplage F des photons de l'onde incidente 12 dans la couche mince 21 peut atteindre par exemple 10%. Par taux de couplage, on entend un ratio entre un nombre de photons couplés et un nombre de photons incidents. Dans ce cas, 10% du flux incident est couplé au réseau résonant. Le taux de découplage de la couche mince 21, où taux de fuite, a la même valeur que le taux de couplage F. en l'occurrence 10%. Lors de l'illumination du support 20 par la source 10, à la première longueur d'onde de résonance Xi', l'intensité du faisceau lumineux 12' confiné dans la couche mince 21, par le premier cristal photonique augmente quasi-instantanément, jusqu'à dépasser 10 fois l'intensité de l'onde lumineuse incidente. Les photons couplés par le premier cristal photonique 31 compensent les pertes issues du découplage. Ces pertes forment une onde 13 se propageant vers la source de lumière, et d'une onde 15 se propageant vers le capteur d'image 40, les ondes 13 et 15 se propageant parallèlement à l'axe de propagation Z. [0082] L'intensité de l'onde 13 réfléchie par le support 20 dans un sens opposé au sens de propagation Z est équivalente à l'intensité de l'onde lumineuse incidente 12. Par ailleurs, l'onde 15 formée par les pertes du réseau selon le sens de propagation Z est en opposition de phase avec une onde 14 transmise par le support, cette dernière étant formée par la partie de l'onde lumineuse incidente 12 non couplée par le premier cristal photonique. Par transmise par le support, on entend se propageant à travers le support, puis au-delà de ce dernier, dans le même sens que l'onde lumineuse incidente 12. Il se forme alors des interférences destructives, bloquant l'exposition du capteur d'image 40. Ces interférences destructives sont symbolisées, sur la figure 1B, par le symbole X. 12 [0083] Par conséquent, à la première longueur d'onde de résonance, ki.' le premier cristal photonique 31 agit comme un miroir résonant, avec un coefficient de réflexion proche de 1. On parle de réflexion résonante. Dans ces conditions, le capteur d'image 40 se trouve dans une configuration dite en fond noir, car il n'est pas exposé à une lumière provenant du support 20. En réalité, compte tenu d'imperfections, le capteur d'image 40 est exposé à un fond sombre, de faible niveau de gris et pouvant être considéré comme homogène. [0084] Du fait du confinement de la lumière incidente 12, dans la bande spectrale d'illumination, par couche mince 21, chaque particule fluorescente 2r est soumise à un faisceau d'excitation intense. Cela contribue à augmenter la quantité de lumière de fluorescence 16 émise par chaque particule fluorescente. En effet, la quantité de lumière de fluorescence est généralement considérée comme une fonction croissante, et généralement linéaire, de la quantité de lumière d'excitation. L'apparition du faisceau confiné 12' dans la couche mince 21, permet une amplification de l'intensité de l'onde lumineuse parvenant à chaque particule fluorescente, dans la longueur d'onde d'excitation. Il en résulte une augmentation significative de l'intensité de la lumière de fluorescence 16 émise par chacune d'entre elle. [0085] Comme on peut le voir sur la figure 1B, plusieurs premiers cristaux photoniques 31, séparés les uns des autres, sont répartis dans la couche mince 21. Entre deux premiers cristaux photoniques 31 adjacents, la couche mince 21 comporte des deuxièmes inclusions 23, réalisées selon un troisième matériau, transparent à tout ou partie de la bande spectrale de fluorescence AXf. Le troisième matériau présente un troisième indice de réfraction n. L'écart entre le premier indice n1 du premier matériau, formant la couche mince 21, et le troisième indice n3est de préférence supérieur à 0,1 voire 0,25. Le troisième indice a.. est supérieur au premier indice [0086] Les deuxièmes inclusions 23 présentent des caractéristiques géométriques telles que celles décrites en lien avec les premières inclusions 22. Les deuxièmes inclusions 23 forment, avec le premier matériau de la couche mince 21, un deuxième cristal photonique 32, ce dernier étant configuré pour présenter une deuxième longueur d'onde de résonance Xr2. La deuxième longueur d'onde de résonance Xro est différente de la première longueur d'onde de résonance Xr, des premiers cristaux photoniques. La deuxième longueur d'onde de résonance Xr2 est comprise dans la bande spectrale de fluorescence Mf. [0087] A l'instar du premier cristal photonique 31, le deuxième cristal photonique 32 est défini selon une deuxième période P,x selon l'axe longitudinal X et, lorsque le cristal est bidimensionnel, une deuxième période Ply selon l'axe latéral Y. La longueur d'onde de fluorescence étant supérieure à la longueur d'onde d'excitation, selon chaque direction, la deuxième période est supérieure à la première période. Ainsi, P2>> Pix et 13 P2Y > PlY- [0088] Le troisième matériau, formant les deuxièmes inclusions 23 peut être différent ou similaire au deuxième matériau, formant les premières inclusions 22. 11 peut s'agir par exemple de Si3N4 (SiN). [0089] Sous l'effet de l'onde lumineuse d'illumination 12 et du faisceau confiné 12' se propageant à l'interface entre le support 20 et l'échantillon 2, chaque particule fluorescente 2, située au contact de la couche mince ou à une distance suffisamment faible de cette dernière, émet une lumière de fluorescence 16, selon un angle solide de 43f. L'effet d'amplification de la lumière de fluorescence par le faisceau confiné n'est obtenu qu'au contact de la couche mince, ou à une distance sub-longueur d'onde de cette dernière. Il s'agit d'un effet dit de champ proche. [0090] Une partie de la lumière de fluorescence 16 se propage à travers la couche mince 21, et plus précisément à travers un premier cristal photonique 31, formant un faisceau de fluorescence confiné 16'. La couche mince 21 comporte plusieurs premiers cristaux photoniques 31 séparés les uns des autres par un deuxième cristal photonique 32. Le faisceau de fluorescence confiné 16' se forme dans le cristal photonique, ou dans les cristaux photoniques, les plus proches de la particule fluorescente 2. [0091] Chaque premier cristal photonique 31 n'est pas résonant à l'égard des longueurs d'onde de la bande spectrale de fluorescence Akf. Du fait de la présence des premières inclusions nl, chaque premier cristal photonique présente un indice de réfraction effectif ncff qui est supérieur à l'indice no du matériau de base formant le support 20. Cette différence d'indice entre chaque premier cristal photonique 31 et la partie inférieure du support 25 explique la formation du faisceau de fluorescence confiné 16'. Par indice effectif ncff, on entend une moyenne de l'indice n, du premier matériau, formant la couche mince 21, et de l'indice n2 du deuxième matériau, formant les premières inclusions 22, la moyenne étant pondérée par les volumes respectifs du premier matériau et du deuxième matériau dans la couche mince 21. Ainsi, le cristal premier cristal photonique, ou les premiers cristaux photoniques, les plus proches du lieu d'émission de la fluorescence, se comportent comme des guides d'onde d'indice ncff [0092] Une partie du faisceau de fluorescence confiné 16' se découple, et se propage vers le capteur d'image 40. [0093] Chaque deuxième cristal photonique 32 est configuré pour former un réflecteur dans la bande spectrale de fluorescence Ainsi, comme représenté sur la figure 1C, le faisceau de fluorescence confiné 16', se propageant à travers un premier cristal photonique 31, est réfléchi par les deuxièmes cristaux photoniques 32 adjacents du premier cristal photonique. On obtient ainsi un mode guidé, se propageant à travers un premier cristal photonique 31, et successivement réfléchi par les cristaux photoniques 14 32 s'étendant de part et d'autre du premier cristal photonique 31. De la même manière qu'une cavité de Fabry Pcrot, il en résulte une amplification du signal de fluorescence à l'intérieur de la couche mince. [0094] La largeur L,H parallèlement à l'axe longitudinal X, selon laquelle s'étend le premier cristal photonique 31, est de préférence telle que: [0095] 2 rr A nef/x 2L31 + 29 2rr (1) [0096] où g-t, correspond au déphasage produit par chaque réflexion induite par un deuxième cristal photonique 32. Il peut être déterminé par modélisation numérique. in est un entier naturel non nul. t est une longueur d'onde de fluorescence. [0097] avec [0098] nt, ft, yff n 2 ± (1-ff) x (2) [0099] oùff correspond à la fraction volumique de la couche mince 21 occupée par les premières inclusions 22 dans un même premier cristal photonique 31. [0100] On obtient : [0101] À TOT - L31 = 27rn,t7 (3) [0102] Ainsi, pour obtenir une amplification importante de la lumière de fluorescence, la dimension Ln, selon l'axe longitudinal X, du premier cristal photonique satisfait à l'équation (3). [0103] Chaque faisceau de fluorescence confiné ne se propage qu'à travers un seul premier cristal photonique 31, en étant réfléchi de part et d'autre de ce dernier, par les deuxièmes cristaux photoniques 32 adjacents du premier cristal photonique. Il s'agit donc d'un effet de confinement localisé. Ainsi, l'image formée sur le capteur d'image 40 permet de localiser les zones de l'échantillon dans lesquelles une fluorescence est émise Elle peut permettre d'évaluer leur étendue, dans le plan de support, ou de les dénombrer. Elle peut également permettre de comparer les intensités de fluorescence relative de différentes zones fluorescentes de l'échantillons. [0104] Un premier exemple de dimensionnement de premiers cristaux photoniques et de deuxièmes cristaux photoniques monodimensionnels, tels que représentés sur la figure 2A est : matériau du support : Si02, épaisseur 725 nm ; premier matériau (couche mince) : SiO2; épaisseur F; de la couche mince 21 : 160 nm deuxième matériau (premières inclusions 22) : Si3N4 (SiN - Nitrure de Silicium) ; facteur de remplissage du premier cristal photonique : 50 % ; diamètre des premières inclusions : 130 nm ; première période P, du premier cristal photonique : 260 nm ; longueur d'onde de résonance du premier cristal photonique : 405 nm ; troisième matériau (deuxièmes inclusions 23) : Si3N4 (SiN - Nitrure de Silicium) ; facteur de remplissage du deuxième cristal photonique : 50 % ; deuxième période P,x du deuxième cristal photonique : 330 nm ; diamètre des deuxièmes inclusions : 165 nm ; longueur d'onde de résonance du deuxième cristal photonique : 550 nm. [0105] Les figures 2B et 2C montrent des exemples de cristaux photoniques bidimen- sionnels. Sur la figure 2B, les premier et deuxième cristaux photoniques sont entourés par un cadre en tirets. Pour un même cristal photonique, la période de répétition du motif selon l'axe longitudinal (P, ou P2,) peut être identique ou différente de la période de répétition du motif selon l'axe latéral (Ply ou P2Y). [0106] On a réalisé des simulations de l'intensité du champ électrique de différents supports, comportant des cristaux photoniques rnonodimensionnels, similaires à celui décrit en lien avec la figure 2A. [0107] Les figures 3A à 3C montrent les résultats d'une première modélisation. Sur la figure 3A, on a représenté la structure modélisée : Il s'agit d'un support 20 de 5i02 présentant, à l'interface avec l'air 3, une couche mince 21 présentant un premier cristal photonique, tel que paramétré dans le premier exemple préalablement décrit. La couche mince 21 est uniquement formée d'inclusions 22 de SiN dans du Si02 selon une période de 260 nm et un facteur de remplissage de 50%. [0108] Les figures 3B et 3C représentent l'intensité du champ électrique lorsque le support est illuminé par une onde lumineuse incidente 12 respectivement : à la longueur d'onde de 405 nm, qui correspond à la longueur d'onde de résonance du premier cristal photonique 31 ; et à la longueur d'onde de 550 nm, qui correspond à la longueur d'onde de fluorescence modélisée. [0109] On observe qu'à la longueur d'onde de résonance (figure 3B), le premier cristal photonique se comporte comme un miroir A la longueur d'onde de fluorescence (figure 3C), le premier cristal photonique transmet la lumière, cette dernière se propageant à travers le support 20. [0110] Les figures 4A à 4C montrent les résultats d'une deuxième modélisation. Sur la figure 4A, on a représenté la structure modélisée : Il s'agit d'un support 20 de SiO, présentant, 16 à l'interface avec l'air 3, une couche mince 21 présentant un premier cristal photonique 31 ainsi qu'un deuxième cristal photonique 32, tel que paramétrés dans le premier exemple préalablement décrit. Le premier cristal photonique 31 s'étend, parallèlement à l'axe X, selon une longueur L1 vérifiant l'équation (3). [0111] Les figures 4B et 4C représentent l'intensité du champ électrique lorsque le support est illuminé par une onde lumineuse incidente 12 respectivement : à la longueur d'onde dc 405 nm, qui correspond à la longueur d'onde de résonance du premier cristal photonique 31 ; et à la longueur d'onde de 550 nm, qui correspond à la longueur d'onde de fluorescence modélisée. [0112] On observe, à la longueur d'onde de résonance (figure 4B), un gain d'intensité de l'onde lumineuse se propageant à la surface du support 20 (ou intensité du champ proche), le gain étant estimé à un facteur 10 par rapport à une configuration selon laquelle le support 20 est uniquement constitué de SiO2. Lorsque la longueur d'onde dc résonance correspond à la longueur d'onde d'excitation dc la fluorescence, cela conduit à une forte augmentation du champ d'excitation de fluorescence au niveau dc la face supérieure 20, du support. [0113] A la longueur d'onde de fluorescence (figure 4C), on observe un gain d'intensité de l'onde lumineuse se propageant à travers le support 20, le gain étant estimé à un facteur 7 par rapport à une configuration selon laquelle le support 20 est uniquement constitué de SiO2. [0114] Ainsi, l'invention permet d'augmenter l'intensité de l'onde lumineuse d'illumination se propageant à la surface de la couche mince 21, et permettant l'excitation de la fluorescence, d'un facteur 10. Elle permet également d'augmenter l'intensité de l'onde lumineuse de fluorescence se propageant à travers le support 20, d'un facteur 7. Les deux gains pouvant se multiplier, les modélisations schématisées sur les figures 4A à 4C permettent d'estimer un gain d'un facteur 70 de l'intensité de fluorescence détectée par un capteur d'image disposé face au support 20, comme décrit en lien avec la figure 1A. [0115] Les figures 5A à .5C montrent les résultats d'autres modélisations. Sur les figures 5A, 5B et 5C, on a modélisé l'intensité du champ électrique en illuminant un dipôle électrique à la longueur d'onde de 550 nm, le dipôle étant : disposé sur un simple support en Si02 : figure .5A ; disposé sur une couche mince 21 comportant un premier cristal photonique, telle que représenté sur la figure 3A : figure 5B ; disposé sur une couche mince 21 selon l'invention, telle que représenté sur la figure 4A : figure 5C. [0116] On observe à nouveau un gain d'un facteur 7 entre la configuration de l'art antérieur 17 (figure 5A) et la configuration selon l'invention (figure 5C). [0117] La comparaison entre la figure 5B et la figure SC montre que l'intensité du champ électromagnétique se propageant à travers le support 20 est bien supérieure avec la configuration selon l'invention. En effet, le premier cristal photonique 31 n'est pas résonant à la longueur d'onde de 550 nm. La figure 5B permet d'observer un confinement de l'onde lumineuse dans la couche mince 21, sous l'effet de l'indice effectif de cette dernière, qui est supérieur à l'indice du support 20 (en l'occurrence l'indice de la couche inférieure 25) et à l'indice de l'air. [0118] Par ailleurs, sur la figure 5C, on observe que la lumière de fluorescence se propage, à partir de la couche mince 21, selon un angle (1) compris entre 0° et 45', autour de l'axe de propagation Z. [0119] La figure 6 montre les résultats d'une simulation d'un profil d'une image de fluo- rescence obtenue en disposant une particule fluorescente modélisée par un dipôle électrique, sur un simple support de verre (courbe a) et sur un support selon l'invention (courbe h). On observe l'augmentation du signal collecté en mettant en oeuvre un support selon l'invention. On observe également que la lumière de fluorescence se propage, à partir de la couche mince 21, en formant un cône de lumière dont le demi-angle est d'environ 50', ce qui corrobore les observations formulées en lien avec la figure SC. [0120] Ainsi, la fluorescence atteint le capteur d'image 40 en formant un cône divergent à partir de la couche mince, selon un demi-angle relativement élevé. Afin d'obtenir une résolution spatiale con-ecte de l'image de fluorescence, il est préférable de disposer le capteur d'image au plus près du support 20, et par exemple au contact de ce dernier. La configuration d'imagerie sans lentille est donc particulièrement adaptée au support 20. [0121] Les figures 7A à 7H décrivent les étapes de fabrication d'un support tel que pré- cédemment décrit. [0122] Sur la figure 7A, on a représenté un support 20 formé de Si02. Une couche de SiN d'épaisseur 160 nm est déposée : cf. figure 7B. Une résine R de photolithographie est ensuite appliquée (figure 7C). Une photolithographie de la résine est effectuée (figure 7D), suivie d'une gravure RIE (Reactive Ion Etching) : cf. figure 7E. La résine est ensuite retirée (figure 7F). On procède ensuite à un dépôt conforme de Sit), (figure 7G). La figure 7H montre une étape de polissage par CMP. (Chernical Mechanical Planarization). [0123] Bien que décrite selon une configuration sans lentille, selon laquelle aucune optique de formation d'image n'est disposée entre le support et le capteur d'image, selon une variante, un système optique, de type lentille ou objectif, peut être disposé entre le support et le capteur d'image. [0124] Par ailleurs, bien que dans les exemples décrits, chaque cristal photonique est obtenu 18 à partir d'inclusions de nitrure de silicium dans une couche mince de silice, ce couple de matériaux n'est nullement limitatif et l'invention pourra mettre en oeuvre d'autres matériaux, sous réserve d'une différence d'indice suffisante, en particulier supérieure à 0,25. 19 [Revendication 1] REVENDICATIONSProcédé d'observation d'un échantillon fluorescent (2), l'échantillon comportant un agent fluorescent émettant une lumière de fluorescence, dans une bande spectrale de fluorescence (kr) lorsqu'il est illuminé par une lumière d'excitation, dans une bande spectrale d'excitation (Xe), le procédé comportant les étapes suivantes : a. disposition de l'échantillon contre un support (20); h. illumination de l'échantillon, par une source de lumière (10), dans la bande spectrale d'excitation 03, la lumière (12) émise par la source de lumière se propageant selon un axe de propagation (Z); c. détection d'une lumière de fluorescence (16), dans la bande spectrale de fluorescence, par un capteur d'image (40); le procédé étant tel que le support comporte une couche mince (21) formée d'un premier matériau, d'un premier indice de réfraction (n1), la couche mince s'étendant selon un plan de support (P20) perpendiculaire à l'axe de propagation (Z), le plan de support s'étendant selon un axe longitudinal (X), la couche mince comportant : des premières inclusions (22) formées d'un deuxième matériau, d'un deuxième indice de réfraction (n,), différent du premier indice de réfraction (n1), les premières inclusions définissant un premier motif périodique, les premières inclusions étant réparties selon une première période (P1,), parallèlement à faxe longitudinal (X), les premières inclusions formant un premier cristal photonique (31) résonant dans la bande spectrale d'excitation (Xe) ; des deuxièmes inclusions (23), formées d'un troisième matériau, d'un troisième indice de réfraction (n3), différent du premier indice de réfraction, et formant un deuxième motif périodique, les deuxièmes inclusions étant réparties selon une deuxième période (P2x), parallèlement à l'axe longitudinal, la deuxième période étant strictement supérieure à la première période, les deuxièmes inclusions formant un deuxième cristal photonique (32) résonant dans la bande spectrale de fluorescence (Xf); 20 au moins deux deuxièmes cristaux photoniques (32) étant disposés de part et d'autre d'un premier cristal photonique (31); de telle sorte que : une partie de la lumière émise par la source de lumière (10), à b longueur d'onde d'excitation, est confinée dans la couche mince (21), sous l'effet du premier cristal photonique, résultant en une amplification d'unc onde lumineuse se propageant au niveau d'une interface entre la couche mince (21) et l'échantillon (2); la lumière de fluorescence (16) se propage dans la couche mince (21), à travers un premier cristal photonique (31), en étant réfléchie par les deuxièmes cristaux photoniques (32) disposés de part et d'autre du premier cristal photonique, résultant en une amplification de la lumière de fluorescence. [Revendication 2] Procédé selon la revendication 1, dans lequel [échantillon est disposé au contact de la couche mince, ou à une distance de cette dernière inférieure à 1 mm. [Revendication 3] Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le premier cristal photonique (31) est monodimensionnel, les premières inclusions (22) s'étendant parallèlement à un axe latéral (Y) perpendiculaire à faxe longitudinal ; et/ou le deuxième cristal photonique (32) est monodimensionnel, les deuxièmes inclusions (23) s'étendant parallèlement l'axe latéral. [Revendication 4] Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, dans lequel le premier cristal photonique (31) est bidimensionnel, les premières inclusions (22) étant également espacées les unes des autres, selon un axe latéral (Y) perpendiculaire à faxe longitudinal ; et/ou le deuxième cristal photonique est bidimensionnel (32), les deuxièmes inclusions (23) étant également espacées les unes des autres, selon l'axe latéral. 21 [Revendication 5] Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel : b première période (131),), parallèlement à l'axe longitudinal, est comprise entre 100 nm et 300 nm ; et/ou la deuxième période (P2),), parallèlement à Faxe longitudinal, est comprise entre 200 nm et 400 nm. [Revendication 6] Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'épaisseur (c) de la couche mince (21), selon l'axe de propagation, est comprise entre 100 nm et 300 nm. [Revendication 7] Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le support (20) est disposé entre l'échantillon (2) et le capteur d'image (40). [Revendication 8] Procédé selon la revendication 7, dans lequel aucune optique de formation d'image n'est disposée entre le capteur d'image (40) et le support (20). [Revendication 9] Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le troisième matériau, formant les deuxièmes inclusions (23) est identique au deuxième matériau, formant les premières inclusions (22). [Revendication 10] Dispositif (1) d'observation d'un échantillon fluorescent (2), l'échantillon comportant un agent fluorescent émettant une lumière de fluorescence, dans une bande spectrale de fluorescence (2,r) lorsqu'il est illuminé par une lumière d'excitation, dans une bande spectrale d'excitation (Xe), le dispositif comportant : une source de lumière (10), configurée pour émettre une onde lumineuse d'illumination (12) dans la bande spectrale d'excitation, la lumière se propageant, vers l'échantillon, selon un axe de propagation (g); un support d'échantillon (20), configuré pour recevoir l'échantillon ; un capteur d'image (40), confieuré pour détecter une lumière de fluorescence (16), émise par l'échantillon, dans la bande spectrale de fluorescence ; le dispositif étant caractérisé en ce que : le support comporte une couche mince (21) formée d'un premier matériau, d'un premier indice de réfraction (n1), la couche mince s'étendant selon un plan de support (1:120)' perpendiculaire à l'axe de propagation (Z), le plan du support s'étendant selon un axe longitudinal (X), la couche mince comportant : des premières inclusions (22) formées d'un deuxième matériau, d'un deuxième indice de réfraction (n,,), différent du premier indice de réfraction (n1), les premières inclusions définissant un premier motif périodique, les premières inclusions étant réparties selon une première période (Plx), parallèlement à l'axe longitudinal (X), les premières inclusions formant un premier cristal photonique (31) résonant dans la bande spectrale d'excitation (?'), le premier cristal photonique étant configure pour confiner une partie de l'onde lumineuse d'illumination (12) dans la couche mince (21) des deuxièmes inclusions (23), formées d'un troisième matériau, d'un troisième indice de réfraction (n1), différent du premier indice de réfraction, et formant un deuxième motif périodique, les deuxièmes inclusions étant réparties selon une deuxième période (P,x), parallèlement à l'axe longitudinal, la deuxième période étant strictement supérieure à la première période, les deuxièmes inclusions formant un deuxième cristal photonique (32) résonant dans la bande spectrale de fluorescence (X0); au moins deux deuxièmes cristaux photoniques (32) étant disposés de part et d'autre d'un premier cristal photonique (31). [Revendication 11] Dispositif selon la revendication 10, dans lequel : le premier cristal photonique (31) est monodimensionnel, les premières inclusions (22) s'étendant parallèlement à un axe latéral (Y) perpendiculaire à l'axe longitudinal (X) ; et/ou le deuxième cristal photonique (32) est monodimensionnel, les deuxièmes inclusions (23) s'étendant parallèlement l'axe latéral (Y). [Revendication 12] Dispositif selon la revendication 10, dans lequel : 23 le premier cristal photonique (31) est bidimensionnel, les premières inclusions (22) étant espacées les unes des autres, selon un axe latéral (Y) perpendiculaire à l'axe longitudinal (X); et/ou le deuxième cristal photonique (32) est bidimensionnel, les deuxièmes inclusions (23) étant espacées les unes des autres, selon l'axe latéral (Y). [Revendication 13] Dispositif selon rune quelconque des revendications 10 à 12, dans lequel : la première période (P1,), parallèlement à l'axe longitudinal, est comprise entre 100 nm et 300 nm ; et/ou la deuxième période (P2,) est comprise entre 200 nm et 400 nm. [Revendication 14] [Revendication 15] [Revendication 16] [Revendication 17] [Revendication 18] Dispositif selon rune quelconque des revendications 10 à 13, dans lequel l'épaisseur (e) de la couche mince 21, selon faxe de propagation, est comprise entre 100 nm et 300 nm. Dispositif selon rune quelconque des revendications 10 à 14 dans lequel le support est délimité par une face supérieure (2071 adjacente de la couche mince (21), et une face inférieure (20), opposée à la face supérieure, le capteur d'image étant disposé face au support, plus proche de la face inférieure que de la face supérieure. Dispositif selon rune quelconque des revendications 10 à 15, dans lequel aucune optique de formation d'image ne s'étend entre le support (20) et le capteur d'image (40). Dispositif selon la revendication 16, dans lequel le support (20) et le capteur d'image (40) forment un même composant. Dispositif selon rune quelconque des revendications 10 à 16, dans lequel le troisième matériau, formant les deuxièmes inclusions (23) est identique au deuxième matériau, formant les premières inclusions (22).