Brevet FR3092994A1 — publié le 20200828

Description Titre de l'invention : Utilisation de peptides cycliques fongiques de type destruxine comme agents antibactériens actifs contre Clostridium perfringens mol] La présente invention concerne le domaine de la prévention ou du traitement des in- fections bactériennes, notamment par Clostridium petfringens. [0002] Clostridium petfringens est responsable d'infections intestinales chez l'Homme ainsi que chez l'animal. Chez l'Homme, Gostridium petfringens est responsable de toxi-infections alimentaires. Clostridium pedringens est ainsi l'une des causes les plus courantes d'intoxication alimentaire aux États-Unis et au Canada (Johnson, E. A., Surmiaanen, P., & Finegold, S. M. (2007). Clostridium. In P. R. Munay (Ed.), Manual of Clinical Microbiology (9th ed., pp. 889-910). Washington, D.C. : ASM Press). En France, Clostridiumperfringens occupe le 4e rang en nombre de foyers (2006- 2007) et le ler (2006) ou le 3e rang (2007) (Tableau 3) en nombre de cas parmi les causes identifiées dans le cadre de la déclaration obligatoire (DO) des toxi-infections alimentaires collectives (TIAC) (source ANSES, https://www.anses.far/system/files/MIC2010sa0235Fi.pdf). Chez les animaux d'élevage, Clostridium petfringens infecte principalement les porcs et les volailles avec des conséquences économiques (baisse de rendement, mortalité et coût du traitement) et sanitaires (transmission à l'Homme). Dans les élevages de volailles, il peut causer dans sa fornae clinique une mortalité très anormalement élevée (jusqu'à 50% de l'élevage) et dans sa forme sub-clinique une infection par Clostridium perfrin gens se traduit généralement par des pertes économiques importantes puisque les performances des animaux sont largement diminuées. [0003] Il est désirable de mettre au point des compositions permettant d'agir spécifiquement contre cette souche afin de ne pas entrainer de modifications de la flore intestinale. [0004] Les destruxines sont des peptides cycliques fongiques de type cyclohexadepsi- peptides produits par divers champignons principalement du genre Metarhizium anisopliae mais aussi des genres Metarhizium brunneum Beauveria feinta, Ophioconlyceps eoccidneola, Altemaria brassiee, Alternaria litticola et Aschersonis [0005] 11 existe diverses destruxines (35 molécules identifiées à ce jour) regroupées en 7 séries (séries A, B, C, D, E, F et G) (Pedras et al. Phytochemistry 2002, 59, 579-96). [0006] Elles sont formées de cinq acides aminés (de conformation spatiale S) et. d'un acide alpha-hydroxylé (de conformation spatiale R). Les destruxines des différentes séries diffèrent selon le type d'acides aminés, le type d'acide alpha-hydroxylé et/ou sur la présence ou non de N-méthylation des acides aminés. Ces molécules sont connues 2 pour avoir diverses activités biologiques (Wang et al., Molecules 2018, 23, 169; doi:10.3390) telles que des activités insecticides, cytotoxiques, immunosuppresive, antiproliférative, antivirale (Pcdras et al.. Phytochemistry, 2002, 59, 579-96 et Wang et al., Molecules 2018, 23, 169; doi:10.3390) et certaines demandes de brevet auraient allégué une activité contre l'ostéoporose (CN101433214B, CN106810601A, W02002064155A1). Néanmoins, leur effet antibactérien n'a jamais été rapporté (Wang et al., Molecules 2018, 23, 169; doi:10.3390). L'activité contre la bactérie Helicobacter pylori rapportée (Kao et al., Process. Biochem. 2015, 50, 134-139) ne correspond pas à une activité antibactérienne mais à une activité d'inhibition de la vacuolisation causée par H pylori dans les cellules gastriques. [0007] De façon inattendue, il a maintenant été démontré que les destruxines présentent une activité contre Clostridium perfringens. De plus, à l'inverse d'autres peptides cycliques fongiques (Enniatines A, Al, B, B1 et Bcauvericine notamment qui ont un spectre d'action large avec une activité antibactérienne sur plusieurs bactéries Gram-F), les destruxines ont montré une sélectivité d'action contre Closi ridiunz perfringens. Cette activité sélective des destruxines permet d'envisager leur utilisation pour le traitement et/ou la prévention des infections liées à Clostridium perfringens notamment les infections intestinales chez l'Homme et l'animal d'élevage, dont le poulet. [0008] Selon un premier objet, la présente invention concerne une composition comprenant au moins une destruxine pour traiter et/ou prévenir les infections par Clostridium per-fin gens. [0009] Selon un mode de réalisation, la destruxine est choisie parmi les destruxines des séries A, B, C, D, E, Fou G de champignon, ou leurs dérivés. [0010] On entend par « destruxines » des peptides cycliques de type cyclohexadepsipeptide, tels que ceux produits par les champignons du genre Metarhizium anisopliae, Metarhizium brunneum, Beauveria frima, Ophiocordvceps coccidiicola, Ahernaria brassice, Alternaria lin icola et Aschersonis sp. [0011] On peut notamment citer les destruxines des séries A, B, C, D, E, F et G décrites par Pedras et al. Phytochemistry, 2002, 59, 579-96, et notamment les destruxines : [0012] Série A : Dx A, AI, A2, A4, A4, A5, A4 chlorohydrin, desmethylDx A, dihydroDx A; Série B : B, BI, B2, desmethylDx B, Desmethyl Dx B2, homoDx, protoDx, hydroxyDx B, hydroxyhomoDx B. beta-D-Olucopyranosyl-hydroxyDx B ; Série C : C, C2, desmethylDx C; Série D : D, DI, D2 Série E : E, El, E2, E chlorhydrin, E2 chlorohydrin, E diol, El diol ; Série F : F; PseudoDx A PseudoDx B. 3 [0013] Selon un mode de réalisation particulier, on peut notamment citer les destruxines A, B, C. D, E. Fou G et leurs dérivés (dont les sources sont notamment indiquées dans Pedras et al, supra)notamment les destruxine A et B. Les destruxines A et B sont disponibles commercialement (Sigma-Aldrich ou A2S, pureté>98%). [0014] Une destruxine selon l'invention inclut les destruxines pré-citées, ainsi que leurs dérivés, notamment définis par la formule générale (1) ci-dessous. [0015] La destruxine pour l'application antibactérienne de l'invention est une destruxine fonctionnelle. [0016] Par "destruxine fonctionnelle" ou -destruxine à activité fonctionnelle", on entend une destruxine présentant une activité susceptible de prévenir et ou traiter une infection bactérienne. On peut déterminer si une protéine est fonctionnelle, par toute méthode connue, par exemple par un essai in vitro de détermination de l'activité antibactérienne (CMI, tel que décrit dans l'exemple 1). [0017] La destruxine selon l'invention peut être d'origine fongique ou de synthèse, de préférence d'origine fongique. [0018] L'expression "destruxine d'origine fongique" inclut la destruxine de champignon telle que celles définies ci-avant ou un dérivé de celle-ci. [0019] A titre de destruxine selon l'invention, on peut notamment citer les composés de formule (1) : [0020] [Chem.]] [0021] (1) [0022] Dans laquelle [0023] 'R représente un atome d'hydrogène, un groupe C1-C6 alkyle ou un groupe aralkylc ; [0024] 212, 3R, 4R identiques ou différents représentent indépendamment un atome d' hydrogène ou un groupe C1-C6 alkyle ; [0025] 512 représente un groupe choisi parmi les groupes C2-C6 alkènyle et Cl-C6 alkyle éventuellement substitués par un ou plusieurs substituants choisis parmi les atomes d'halogène, les groupes hydroxy (OH), carboxy (COOH), -glycosyle, et les groupes hétérocycliques de 3 à 6 membres comprenant un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, 0 et S ; [0026] Et plus particulièrement: [0027] 'R représente un atome d'hydrogène, un groupe méthyle ou un groupe benzyle ; [0028] 212, 312, 4R identiques ou différents représentent indépendamment un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle ; [0029] 512. représente un groupe choisi parmi -CH=CH2, -CHOHCH2C1, CH=CH2, -CHMe2, -COHMe2, -C(0-beta-D-glycosyl)Me2, -CHMeCH2OH, -CHMeCOOH, [Chern2] [0030] -CHOHCH2C1, -CHOHCH2OH, -CHOHMe, -CHMe,. o. [0031] Selon la présente invention, les radicaux Alkyle représentent des radicaux hydro- carbonés saturés, en chaîne droite ou ramifiée, de 1 à 6 atomes de carbone, tels que les radicaux méthyle, éthyle, propyle, butyle, pentyle, hexyle, isopropyle, tert-butyl, 2-méthylbutyle, 2-méthylpentyle, 1-méthylpentyle. [0032] Parmi les atomes d'Halogène, on cite plus particulièrement les atomes de fluor, de chlore, de brome et d'iode, de préférence le fluor. [0033] Les radicaux Alkényle représentent des radicaux hydrocarbonés de 2 à 6 atomes de carbone, en chaîne droite ou ramifiée, et comprenant une ou plusieurs insaturations éthyléniques. Parmi les radicaux Alkènyle, on peut notamment citer les radicaux allyle ou vinyle. [0034] Le terme aralkyle désigne les groupes AlkyleAryle où alkyle est défini comme ci- avant et aryle désigne un système aromatique hydrocarboné, mono ou bicyclique de 6 à 10 atomes de carbone. Parmi les radicaux -AlkyleAryle, on peut notamment citer le radical benzyle ou phénétyle. [0035] La composition de l'invention peut comprendre une destruxine sous forme pure en mélange, ou sous forme d'un champignon produisant une destruxine, ou un extrait de celui-ci, tel qu'un broyat ou un surnageant de culture de celui-ci, notamment un extrait comprenant une destruxine, ou leurs mélanges. [0036] Wang et al. (supra) décrit notamment différentes destruxines et les champignons les produisant (pages 14 et. 15). A titre de champignon produisant. une destruxine, on peut citer les espèces Metarrhizium, Beauveria, Ophiocordyceps, Alternaria et Aschersoni et notamment les genres Metarrhiziwn anisopliae, Metarhiziwn brunneum, Beauveria Mina, Ophiocortlyceps coccidiicola, Alternaria brassicae, Alternaria lin kola, Ophioconlyceps coecidiicola, Alternaria brassicae et Aschersonis sp ; notamment Beauveria Mina , Metarrhizium anisopliae,Metarhizium brunneum , Ophiocordyceps sp., AIternaria alternata, Alternaria brassicae, A Iternaria linicola ; et leurs mélanges, ou les extrait de ceux-ci, et/ou les surnageant de culture de ceux-ci. [0037] Certains de ces genres sont disponibles commercialement ou disponibles auprès d'organismes dc dépôt : Beauveria fèfina et Metarhizhen anisopliae sont notamment disponibles commercialement, chez DSMZ et ATCC, par exemple sous les références DSM 4678 et ATCC® 60335TM ou DSM 1490 [0038] Certains de ces genres sont disponibles commercialement ou disponibles auprès d'organismes dc dépôt. Ils sont notamment disponibles commercialement, chez DSMZ et ATCC, par exemple Beauveriafrlitza sous la référence DSM 4678 ; MeiarrhizMtn anisoplicie sous la référence ATCC® 60335-, DSM 1490 et DSM 21704 ; Illetarhizium brunneum sous la référence ATCC® 90448- ; Ophiocordyceps sp. sous la référence ATCC® 24400"; Alternaria alternata sous la référence ATCC® 13963, ATCC® 66981, DSM-12633, DSM-62006, DSM-62010 ou DSM-1102; Alternaria brassicae sous la référence ATCC® 58169, ATCC® 38713 ou ATCC® 34642 ; Altertzaria linieola sous la référence ATCC® 201065, ATCC® 11802 ou ATCC® 201658. [0039] On entend par « surnageant » de culture ou sécrétome, le milieu de culture dans lequel a été cultivé le champignon, après séparation dudit champignon. [0040] Selon la présente invention, les composés de formule (1) présentent une activité anti- bactérienne spécifique contre Clostridium perfrin gens. [0041] Les composés de formule (j) sont donc utiles dans le traitement et/ou la prévention des infections liées à Clostriditun perfringens. [0042] Les compositions selon l'invention peuvent être utilisées en thérapie humaine ou vé- térinaire afin de traiter une infection causée par Clostridiutn perfritzgens, ou à titre de complément alimentaire pour animaux afin de prévenir l'infection par Clostridium perfritzgens. [0043] De façon avantageuse et contrairement aux antibiotiques tel que le métronidazolc classiquement utilisé pour traiter les infections par Clostridiunz perfritzgetzs, l'administration de destruxine n'induit pas de sélection de bactéries résistantes (voir Figure 1). [0044] Clostridium perfringens comprend ou consiste en la séquence ATCC013124Tm déposée auprès de l'ATCC. Par exemple, Clostridium petfringens peut comprendre ou consister en une séquence présentant un degré d'identité d'au moins 80% à ladite séquence ATCCO13124Tm, disponible commercialement, notamment au moins 85% d'identité, de préférence au moins 90% d'identité, et plus particulièrement au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d'identité, étant entendu que ladite séquence de Clostridium perfrin gens est fonctionnelle. [0045] Selon un autre objet, la présente invention concerne donc une composition pharma- ceutique comprenant une destruxine selon l'invention avec un excipient pharmaceutiquement acceptable. [0046] De préférence, ladite composition contient une quantité efficace du composé selon l'invention. De préférence, ladite composition est administrée à un patient ou un animal qui en a besoin. [0047] La présente invention concerne également une destruxine selon l'invention pour le traitement et/ou la prévention d'infections bactériennes liées à Clostridium pertringens, telles que les infections intestinales, notamment les entérites nécrotiques. [0048] Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être présentées sous des formes destinées à l'administration par voie parentérale ou orale. 6 100491 Elles seront donc présentées sous forme de solutés ou de suspensions injectables ou flacons multi-doses, sous forme de comprimés nus ou enrobés, de dragées, de capsules, de gélules, de pilules, de cachets, de poudres, de suppositoires ou de capsules rectales, de solutions ou de suspensions. [0050] Les excipients qui conviennent pour de telles administrations sont les dérivés de la cellulose ou de la cellulose microcristallinc, les carbonates alcalino-terreux, le phosphate de magnésium, les amidons, les amidons modifiés, le lactose pour les formes solides. [0051] Pour l'usage parentéral, l'eau, les solutés aqueux, le sérum physiologique, les solutés isotoniques sont les véhicules les plus commodément utilisés. [0052] La posologie peut varier dans les limites importantes (0,5 mg à 1000 mg) en fonction de l'indication thérapeutique et de la voie d'administration, ainsi que de l'âge et du poids du sujet. [0053] Selon un autre objet, la présente invention concerne également les compositions ali- mentaires comprenant une destruxine selon l'invention. Lesdites compositions conviennent particulièrement à l'alimentation des animaux d'élevage tels que le porc ou les volailles ou tout autre animal d'élevage susceptible d'être infecté par Clostridium perfringens. [0054] Selon un autre objet, la présente invention concerne également l'utilisation d'une destruxine à titre d'additif alimentaire pour les animaux d'élevage dont le porc et les volailles pour le traitement et/ou la prévention des infections bactériennes par une infection par la souche Clostridium perfringens. [0055] Les exemples suivants illustrent l'invention, sans toutefois la limiter Les produits de départs utilisés sont des produits connus ou préparés selon des modes opératoires connus. FIGURES [0056] [fig.1] La Figure I illustre l'évaluation de l'induction de résistance chez Clostridium perfringens par les destruxincs A ou B et le métronidazolc. L'apparition de mutants résistants a été évaluée en présence de dcstruxines A ou B ou de métronidazolc comme indiqué dans le texte. [0057] [fig.2] La Figure 2 illustre l'évaluation de l'effet perméabilisant des destruxines sur Clostridium perfringens. Clostridium perfringens a été exposée pendant 2h aux destruxines A ou B, à la nisine, à l'enniatine Al ou au CTAB à une dose correspondant à 5 fois leur CMI. La perméabilisation de la membrane bactérienne a été mesurée à l'aide d'iodure de propidium comme expliqué dans le texte. La perméabilisation est exprimée en pourcentage, le CTAB servant de contrôle positif et donnant 100 % de pemaéabilisation. Les valeurs portées dans le graphique correspondent aux moyennes 7 +/- écart-type. [0058] [fig.3] La Figure 3 représente la détermination de la pression critique d'insertion des destruxines dans une monocouche formée de lipides extraits de Clostridium perfringens. Les pressions critiques d'insertion des destruxines A et B, de la nisinc, de l'enniatine Al et du CTAB ont été mesurées comme indiqué dans le texte à une dose correspondant à 5 fois leur CMI. [0059] [fig.4] La Figure 4 illustre la détermination de la capacité d'insertion des destruxines dans une monocouche formée de lipides extraits de Clostridium perfringens et présentant une pression initiale de surface correspondant à la membrane des bactéries. L'insertion des destruxines A et B, de la nisinc, de l'enniatine Al et du CTAB dans une monocouche lipidique mimant la membrane de Clostridium perfringens a été mesuré comme indiqué dans le texte à une dose correspondant à 5 fois leur CMI. Les valeurs portées dans le graphique correspondent à la moyenne +/- écart-type. [0060] [fig.5] La Figure 5 représente le phénotype morphologique de la bactérie Clostridium perfringens (ATCC 13124) incubée avec différents antibiotiques conventionnels de mécanisme d'action connu. Clostridium perfringens (ATCC 13124) a été exposé à divers antibiotiques conventionnels agissant sur la synthèse de macromolécules indiquée dans le graphique ou à la destruxine A (à une dose correspondant à 5 fois leur CMI). Après 2h d'exposition, les bactéries ont été marquées comme indiqué dans le texte avant observation au microscope à fluorescence des phénotypes obtenus. [0061] Exemples [0062] I- Exemple 1 : Evaluation de l'activité antibactérienne [0063] Matériels et Méthodes : [0064] L'activité antimicrobienne des destruxines A et B a été évalué sur divers souches de bactéries et champignons commerciales listées dans le Tableau 2 et obtenues chez ATCC, DSMZ ou l'institut Pasteur (CIP). L'activité anthnicrobienne a été mesurée par détermination de la Concentration Minimale Inhibitrice ou CMI suivant les instructions du National Committee of Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 1997) et tel que décrit dans les publications suivantes : Oyama et al., Nature Biofilms and Microbiomes, 2017, 3, 33; Benkhaled et al., Polym. Chem., 2018, 9, 3127-3141; 011eik et al., Eur J Med Chem, 2019, 165, 133-141. [0065] La détermination de la CMI se fait par exposition des bactéries ou champignons à des doses croissantes de destruxines A ou B ou d'antibiotiques de références obtenues par dilution en cascade au 1/2 de ces molécules dans le milieu de culture. [0066] Brièvement, chaque souche bactérienne ou fongique a été cultivée sur boite de Pétri contenant le milieu de culture spécifique de la souche étudiée. Une colonie a été prélevée et utilisée pour ensemencer 3 ml de milieu de culture. Après incubation à 37°C sous agitation (200 rotations par minutes (rpm)) durant 16h, la densité optique 8 (DO) a été lue à 600 nm afin d'estimer la densité bactérienne. La suspension bactérienne a alors été diluée au 1/100 dans 3 ml de milieu de culture avant incubation à 37°C sous agitation à 200 rpm pendant 2-3h jusqu'à obtenir une D06001110 de 0.6. [0067] Les bactéries ont alors été diluées afin d'atteindre une densité de 10E5 bactéries par millilitre (10L, bactéries/m1). Pour les souches fongiques, la densité utilisée a été de 10 L, cellules par ml pour Candida alhicatzs et 10L4conidies par mil pour les autres champignons. 100 pl de cette suspension bactérienne ont alors été ajoutés à des puits d'une plaque de 96 puits en polypropylène (Greincr BioOne) contenants déjà 100 pl de destruxines A ou B ou d'antibiotiques de référence dilués en cascade au 1/2 dans du milieu de culture. Les plaques 96 puits ont ensuite été incubées selon la souche testée dans les conditions de température et de temps indiquées dans le Tableau 2. [0068] Dans le cas des souches anaérobies (dont toutes les souches de Clasiridium), la CMI a été mesurée en utilisant une chambre anaérobie (Coy Laboratory Products, Grass Lake, MI). [0069] Pour les souches micro-anaérobies (H. pylori et E. faecalis) la CMI a été mesurée en utilisant les systèmes micro-anaérobiques BD GasPack. [0070] En fin d'incubation, la D0600,,,' a été lue à l'aide d'un lecteur de microplaque (Synergy Mx, Biotck), la CMI correspondant à la plus faible concentration de destruxines A ou B ou d'antibiotique de référence capable d'inhiber l'augmentation de causée par la croissance bactérienne ou fongique. Le test a été répété 3 fois de manière indépendante (n=3). [0071] La Concentration Minimale Bactéricide (CMB) correspondant à la plus faible concentration entraînant la mort de plus de 99.9 % des bactéries ou champignons a également été mesurée. La CMB a été mesurée en étalant sur boite de Pétri de 10 pl du contenu des puits des plaques 96 puits utilisées lors de la mesure de la CMI. Après incubation dans les conditions propres à chaque souche et listées dans le Tableau 2, le nombre de colonies bactériennes/fongiques a été déterminé. Les concentrations d'antibiotique donnant une seule colonie ou pas de colonie ont été considérées comme étant les CMB. [0072] L'induction de résistance a également été évaluée comme décrit dans les publications suivantes : Oyama et al., Nature Biofilms and Microbiomes, 2017, 3, 33; Benkhaled et al., Polym. Chem., 2018, 9, 3127-3141. Pour cela, la bactérie Clostridium perfringens (ATCC13124) a été exposée à la destruxine A, à la destruxine B ou au métronidazole durant 18 jours consécutifs. Chaque jour, la CMI a été mesurée comme indiqué précédemment. Le dernier puits où une croissance bactérienne a eu lieu (correspondant donc à la CMI divisée par deux) a été utilisé pour préparer l'inoculum permettant de mesurer la CMI le jour suivant. [0073] Table 2 : Souches testées et conditions de culture utilisées. 9 [0074] LB : milieu Luria-Bertoni ; MH : milieu Mueller-Hinton ; BHI : milieu Brain Hcart Infusion ; TS : milieu Tryptocasein Soja ; PD : Potato Dextrose ; RPMI : Roswell Park Mcmorial Institute medium ; Middlehrook 7H9 et 7H10: milieu sélectif des Mycobacterium. [0075] [Tableauxl] Souches Milieu de culture Milieu utilisé pour le test de CMI T° de la CMI Temps d' incu bation Gram(- ) Aérobie Acinetobacter baumannil (CIP LB MH 37 16-24 110431) Citrobacter farmeri (ATCC 51633) LB MH 37 16-24 Citrobacter rodentium (ATCC 51116) LB MH 37 16-24 Escherichia colt (ATCC 8739) LB MH 37 16-24 Klebsiella pneutnotziae (DSM 26371) LB M H 37 16-24 Klebsiella variicola (DSM 15968) LB MH 37 16-24 Psettdomonas ae- ruginosa (CIP 107398) LB MH 37 16-24 Salmonella enterica (CIP 80.39) LB MH 37 16-24 Shigellaflexneri (ATCC 12022) LB MH 37 16-24 Anaérobi e Bacteroides thetaioa- taomicron (DSM 2255) BHI BHI 37 16-24 Helicobacter pylori (ATCC 43504) BHI MH 37 24 11 Gram(+ ) Aérobie Arthrobacter gan- davetzsis (DSM 2447) LB MH 37 48 Bacillus subtffis (DSM LB MH 37 16-24 347) Bacillus cereus (DSM LB MH 37 16-24 31) Lactococcus lactis LB M H 37 16-24 (DSM 20481) Listeria rnonocylogetzes BHI BHI 37 16-24 (DSM 20600) Micrococcus luteus TS TSB 37 16-24 (DSM 20030) Staphylococcus aureus LB MH 37 16-24 MRSA USA300 (ATCC BAA-1717) Staphylococcus aureus LB MH 37 16-24 (ATCC 6538P) Anaérobi Clostridium botulinum BHI BHI 37 24 - e (DSM 1985) 48 Clostridium coccoides BHI BHI 37 24 - (DSM 935) 48 Clostridium difficile BHI BHI 37 24 - (DSM 1296) 48 Clostriditun nexile BHI BHI 37 24 - (DSM 1787) 48 Clostridium perfringens BHI LB 37 24 - (ATCC 13124) 48 Clostridium pro- B111 BHI 37 48 - pionicum (DSM 6251) 72 Enterococcus filerons LB M H 37 16-24 (DSM 13591) Lactobacillus aci- SHI BHI 37 24 - dophi/us (DSM 20079) 48 Propionibacterium BHI BHI 37 24 - 12 nettes (ATCC 6919) 48 Streptocoecus pyogenes BHI BHI 37 24 - (DSM 20565) 48 Strepto BHI BHI 37 24- 48 Coccus thernto philus (ATCC LMD-9 ) M ycob Aérobic Mycohacterium Middlcbrook Middlcbrook 37 48 - acteriu m smegmatis 7H10 7H9 72 (ATCC 700084) Champi Aérobic A .spergillus flavus PD RMPI RT 48 - gnons (DSM 1959) 72 Aspergillus figer PD RMPI RT 48 (ATCC 9142) A.spergillus oc/mai:eus PD RMPI RT 48 - (DSM 824) 72 Candida albicans (DSM PD RMPI 35 24 10697) Fusarium graminearum PD RNIPI RT 48 - (DSM 1095) 72 Fusarium oxysporum PD RMPI RT 48 - (DSM 62316) 72 Fusarium verticillioides PD RMPI RT 48 - (DSM 62264) 72 Penieillium verrueosum PD RNIPI RT 48 - (DSM 12639) 72 100761 Résultats : 100771 Les activités antimicrobiennes de la destruxine A, de la destruxine B et d'antibiotiques de références utilisés pour comparaison sont données dans les Tableaux 3 à 6. 100781 Tableau 3: Valeurs des CMI de la DesA, DesB, Bafilomycine Al et Bafilomycine B obtenues sur diverses souches bactériennes et fongiques testées. Les CMI sont 13 exprimées en micromolaire ou pM (micromole par litre). [0079] 14 [Tablcaux2] Souches CMI Des A CMI DesB CMI CMI Bafilo B Bafil o Al Gram (-) Aérobie Acinetobacter baumannil (CEP >100 >100 >100 >100 110431) Cil robacter fartneri (ATCC 51633) >100 >100 100 >100 Citrobacter rodentiutn (ATCC 51116) >100 >100 >100 >100 Escherichia cou i (ATCC 8739) >100 >100 25 >100 Klebsiella >100 >100 100 >100 pneutzzoniae (DSMZ 26371) Klebsiella variicola (DSM 15968) >100 >100 >100 >100 Pseudomonas ae- ruginosa (CIP 107398) >100 >100 >100 >100 Salmonella enterica (CIP 80.39) >100 >100 >100 >100 Shigella flexneri (ATCC 12022) >100 >100 >100 >100 Anaérobie Bacteroides thetaioa- taomicron (DSM 2255) >100 >100 >100 >100 Helicobacter pylori (ATCC 43504) >100 >100 >100 >100 Gram (+) Aérobie Arthrobacter gan- davensis (DSM 2447) >100 >100 3 3 Bacillus cereus (DSM 31) >100 >100 12.5 25 Bacillus subtilis (DSM 347) >100 >100 100 20 LaCIOCOCC US lad iS (DSM 20481) >100 >100 50 50 Listeria monocytogen es (DSM 20600) >100 >100 25 50 Micrococcus luteus (DSM 20030) >100 >100 25 25 Staphylococcus aureus M RS A USA300 (ATCC BAA-1717) >100 >100 >100 20 Staphylococcus aureus (ATCC 6538P) >100 >100 12.5 10 Anaérobie Clostridium botulinum (DSM 1985) >100 >100 6.25 30 Clostridium coccoides (DSM 935) >100 >100 >100 30 Clostridium difficile (DSM 1296) >100 >100 >100 >100 Clostridium nexile (DSM 1787) >100 >100 50 60 Clostridium per- fringens (ATCC 13124) 1.5 3 25 10 Clostridium pro- pionicum (DSM 6251) >100 >100 25 25 Enterococcus faecalis >100 >100 >100 40 16 Slreplococcus Ihertnophilus (ATCC LMD9) >100 (DSMZ 13591) Lactobacillus aci- clophilus (DSM 20079) >100 >100 33 10 Propionibacterium acnes (ATCC 6919) >100 >100 50 60 Si. reptococcus pyogenes (DSM 20565) >100 >100 66 20 >100 25 30 >100 >100 Mycobacteriu m Aérobie Mycobacterium smegmatis >100 >100 (ATCC 700084) Champignons Aérobie Aspergillus flavus (DSM 1959) >100 >100 3.25 3.25 Aspergillus rager (ATCC 9142) >100 >100 >100 100 Aspergillus ochraceus (DSM 824) >100 >100 >100 6.25 Candida albicans (DSM 10697) >100 >100 >100 100 Fusarium gra- minearum (DSM 1095) >100 >100 6.25 25 Fusarittm onsportun (DSM 62316) >100 >100 >100 50 Fusariunt verticillioid es (DSM 62264) >100 >100 50 50 Penicillium >100 >100 6.25 6.25 verrucosum (DSM 12639) 17 [0080] L'analyse des résultats du Tableau 3 montre que : [0081] - Parmi toutes les souches bactériennes et fongiques testées, seule la souche Clostridiurn perfringens (ATCC 13124) est sensible à la destruxine A et la destruxine B avec de très bonne valeur de CMI (respectivement 1.5 et 3 pmol/ I) démontrant la sélectivité des destruxines A et B contre la souche Clostridium perfringens (ATCC 13124). La bafilotnycine Al et la bafilomycine B, deux antibiotiques ayant la même cible moléculaire que les destruxines dans les cellules eucaryotes (la VATPase) ne sont pas sélectives de Clostridiurn perfringens et sont ainsi actives contre de nombreuses souches bactériennes et fongiques indiquées dans le Tableau 3. [0082] Tableau 4 : Valeurs des CMI de la DesA, DesB, Bafilomycine AI, Bi et du mé- tronidazole obtenues sur diverses souches bactériennes anaérobies. Les CM" sont exprimées en micromolaire ou pM (micromole par litre). [0083] 18 [Tablcaux3] Souche CMI DesA CMI DesB CMI Bafilo Al CMI Bafilo B CMI Métronidazole Bacteroides the- taioataotnicron (DSM 2255) >100 >100 >100 >100 2.34 Clostridium boudintun (DSM 1985) >100 >100 6.25 30 0.29 Clostridium coccoides (DSM 935) >100 >100 >100 30 0.29 Clostridium cliffidle (DSM 1296) >100 >100 >100 >100 1.17 Clostridium nexile (DSM 1787) >100 >100 50 60 2.34 Clostridium per- fin gens (ATCC 13124) 1.5 3 25 10 9.37 Clostridium pro- pionicum (DSM 6251) >100 >100 25 25 1.17 Enterococcus .faecalis (DSM 13591) >100 >100 >100 40 >1500 Helicobacter pylori (ATCC >100 >100 >100 >100 >1500 21031) Lactobacillus aci- dophilus (DSM 20079) >100 >100 33 10 >1500 Propionibacteriu m acnes (ATCC >100 >100 50 60 1500 19 6919) SI reptococcus pyogenes (DSM 20565) >100 >100 66 20 >1500 Streptococcus the rmophilus (ATCC LMD-9) >100 >100 25 30 1500 [0084] Les données du Tableau 4 confirment que : [0085] Parmi toutes les souches bactériennes anaérobies testées, seule la souche Clostridium perfringens (ATCC 13124) est sensible à la destruxine A et la destruxine B avec de très bonne valeur de CMI (respectivement 1.5 et 3 mmol/ 1) démontrant la sélectivité des destruxines A et B contre cette souche. De manière importante, toutes les autres souches de Clostridium testées (autre que Clostridium perfringens) sont insensibles aux destruxines A et B (CMI > 100 RM). Les données du Tableau 4 confirment que, contrairement aux destruxines, le métronidazole, un antibiotique conventionnel actif sur de nombreuses bactéries anaérobies Gram+ et Gram-, n'est pas sélectif de Clostridium perfringens et est actif sur toutes les souches de Clostridium testés dans le Tableau 4. 100861 Tableau 5 : Valeurs des CMI de divers antibiotiques conventionnels et des des- truxines A et B contre la souche Clostridium perfringens (ATCC-13-124). Les CMI sont exprimées en micromolaire ou gIVI (micromole par litre) et en mg/I (milligramme par litre). 100871 [Tablcaux4] Antibiotique CMI (el) CMI (mg/I) Bafilomycin Al 25 15.5 Bafilomycin BI 10 8.15 Chloramphénicole 12.5 4.03 Daptomycine 8 12.96 Destruxine A 1.5 0.86 Destruxine B 3 1.78 Enniatine Al 6.25 4.16 Fosfomycine 125 22.75 Métronidazole 9.37 1.60 Tétracyc I i ne 11.7 5.20 [0088] L'analyse des résultats du Tableau 5 montre que les CMI de la destruxine A et de la destruxine B obtenues sur la souche Clostridium perfringens (ATCC 13124) sont proches ou inférieures à celles d'antibiotiques conventionnels utilisés pour traiter les infections bactériennes. De manière importante, les CMI de la destruxine A (1.5 pM ou 0.86 mg/1) et de la destruxine B (3 iM ou 1.78 mg/1) sont nettement inférieures à celle du métronidazole (9.37 pM ou 1.6 mg/1), l'antibiotique conventionnel classiquement utilisé dans le traitement des infections intestinales causées par Clostrichurn per-fin gens. [0089] Tableau 6 : Comparaison des valeurs de CMI des destruxines A et B et de l'enniatine Al contre divers souches bactériennes et fongiques. Les CMI sont exprimées en micromolaire ou pM (micromole par litre). [0090] 21 [Tablcaux5] Destruxine A Destruxine B Enniatine Al Bacillus subtilis (DSM 347) >100 >100 25 Clostridium per- fringens (ATCC 13124) 1.5 3 6.25 Etzterococcus faecalis (DSM 13591) >100 >100 6.25 Escherichia cati (ATCC 8739) >100 >100 >100 Pseudomonas ae- rugitzosa (CIP 107398) >100 >100 >100 Staphylococcus aureus (ATCC 6538P) >100 >100 25 Candida albicans (DSM 10697) >100 >100 3.125 100911 Les données du Tableau 6 montrent que l'enniatine Al, un pept de cyclique fongique appartenant à la famille des depsipeptides comme les destruxines, ne présente pas la sélectivité étroite des destruxines contre le Clostridium peifringens puisque l'enniatine Al est active contre diverses souches Gram+ et la levure Candida albicans comme indiqué dans le Tableau 6. Ceci démontre que les propriétés antimicrobiennes des destruxines, particulièrement leur sélectivité contre Clostridiwn perfringens ne sont pas partagées par d'autres membres de la même famille de peptide, les depsipeptides fongiques. 100921 Tableau 7 : Valeurs des CMI de la destruxine A et de la destruxine B contre divers souches cliniques de Clostridium perflingens isolées de patients humains ou d'animaux. Les CMI sont exprimées en micromolaire ou pM (micromole par litre). 100931 [Tableaux6] Souche CMI DesA CMI DesB Humaine 779269 0.75 3 Humaine 779790 1.5 3 Humaine 779794 1.5 3 Humaine 779809 1.5 3 Humaine 664408 1.5 3 Humaine 256313 1.5 3 Humaine 597867 1.5 3 Humaine 22151 1.5 3 Humaine 366478 1.5 3 Humaine 96289 1.5 3 Animal 24 0.75 3 Animal 56 3 3 Animal 60 1.5 1.5 [0094] L'analyse des résultats du Tableau 7 montre que la destruxine A et la destruxine B possèdent des CMI sur souches cliniques de Clastridium perfringens (isolées de patients ou d'animaux infectés) proches ou inférieures à celles obtenues sur la souche Clostridium perfringens (ATCC 13124). Ainsi, les destruxines A et B ont la même activité, voir sont plus actives sur les souches isolées de patients ou d'animaux que sur la souche ATCC de référence, démontrant leur possible utilisation dans le traitement des humains et animaux infectés par Clostridium perfringens ou dans le traitement préventif des infections par Clostridium perfringens des animaux d'élevage dont le porc et les volailles. [0095] Les concentrations minimales bactéricides de la destruxine A et de b destruxine B ont été déterminées sur la souche Clostriditun perfringens (ATCC 13124) et sur les souches cliniques de Clastridium perfringens isolées de patients ou d'animaux. Dans tous les cas, les valeurs de CMB sont identiques aux valeurs de CMI obtenues, démontrant que les destruxines A et B ont une action bactériolytique sur Clostridhun perfringens. [0096] De manière très importante, l'évaluation de l'induction de résistance chez la bactérie Clostriurn perfringens (ATCC 13124) exposée aux destruxines A ou B ou au métronidazole durant 18 jours montre que (Figure 1): [0097] les CMI des destruxine A et B n'évoluent pas ou peu (avec un doublement de 23 la valeur de la CMI) durant les 18 jours consécutifs de contact A l'inverse, le métronidazole entraine rapidement l'apparition de résistance avec une augmentation importante de sa CMI : multiplication de la CMI par 10 après 7 jours de contact et multiplication par 50-100 après 9 jours de contact. [0098] Ceci démontre que, contrairement à un antibiotique conventionnel tel que le métro- nidazole, les destruxines A et B n'entraînent pas l'apparition et/ou la sélection de mutants de Clostridintn perfringetzs résistant à leur action. [0099] En conclusion des tests d'activité andmicrobienne des destruxines A et B. il apparait que : [0100] Contrairement aux antibiotiques conventionnels, dont le métronidazole, les destruxines A et B ont une action extrêmement sélective, ne présentant d'activité que contre les souches commerciales et cliniques de Clostridium perfringens avec une CMI / CMB très faible (0.75-3 pM). Cette sélectivité très étroite est un atout majeur des destruxines car, contrairement aux antibiotiques conventionnels qui perturbent fortement la flore commensale intestinale, l'utilisation des destruxines n'entrainera pas de dysbiose intestinale. Ceci pourrait également permettre un traitement préventif des animaux d'élevage dont le porc et les volailles par les destruxines pour prévenir l'infection par Clostridintn perfringens sans risquer de perturber la flore commensale bénéfique des animaux. La sélectivité des destruxines A et B contre Clostridium perfringens n'est pas présente chez d'autres membres de la famille de depsipeptides fongiques dont l'enniatine Al démontrant que tous les membres de la famille des depsipeptides n'ont pas les mêmes activités antimicrobiennes. Contrairement aux antibiotiques conventionnels, tel le métronidazole, l'exposition répétée aux destruxines A et B ne conduit pas à l'apparition de souches résistantes. De plus, ces résultats montrent que les destruxines sont actives contre la souche de Clostridittm perfringens (ATCC13124) rendue résistante au métronidazole. Ces deux observations renforcent l'intérêt thérapeutique et/ou préventif des destruxines dans le contexte actuel d'augmentation constante du nombre de souches bactériennes résistantes ou multi-résistantes aux antibiotiques conventionnels. [0101] II- Exemple 2 : Evaluation de l'innocuité et du passage transépithélial des des- truxines A et B à l'aide de cellules intestinales humaines et animales [0102] Matériels et Méthodes : [0103] L'innocuité des dextruxines a été d'abord mesurée par un test d'hémolyse réalisé sur globules rouges humains comme publié dans le papier Oyama et al., Nature Biofilms 24 and Microbiomes, 2017 3 33 Des globules rouges obtenus chez Divbioscicncc (Pays Bas) ont été lavés 3 fois dans du tampon phosphate (PBS, pH 7) puis dilués à 8 % (volume : volume) dans du PBS. 100 pl de cette suspension cellulaire ont été ajoutés dans des plaques 96 puits puis 100 pl de PBS contenant des doses croissantes de destruxines A ou B ont été ajoutés dans chaque puits. Après lh d'incubation à 37°C, les plaques ont été centrifugées à 800 g pendant 5 min. 100 pl de surnageant ont alors été transférés dans une nouvelle plaque 96 puits avant lecture de la densité optique à 405 nm. Le pourcentage d'hémolyse causé par les destruxines a été quantifié en utilisant le Triton-X100 (Sigma Aldrich) comme contrôle positif donnant 100% d'hémolyse. [0104] L'innocuité et l'absorption intestinale des destruxines ont également été évaluée à l'aide de cellules intestinales humaines mimant l'intestin grêle (cellules Caco-2 (ATCC HTB-37) ou le colon (cellules T84 (ATCC CCL-248) et de cellules d'intestin grêle de porc (DSM ACC701). Les cellules ont été cultivées en routine dans du milieu Dulbecco's Modificd Eagle Medium supplémenté avec 10% (volume : volume) de sérum de veau fétal. Les cellules ont été ensemencées en flasques de 25 cm2 et maintenues à 37°C dans un incubateur à CO2 avec changement de milieu tous les deux jours et passage lorsque les cellules atteignaient 80-90% de confluence. [0105] Pour les tests d'innocuité, les cellules les cellules Caco-2, T84 ou IPEC-J2 ont été trypsinisécs et ensemencées en plaques de 96 puits. Une fois con-fluentes, les cellules ont été exposées à des doses croissantes de destruxines A ou B ou d'autres molécules durant 48h. Après 48h d'incubation, la viabilité cellulaire a été mesurée à l'aide du kit de dosage de la toxicité de Sigma-Aldrich basé sur la résazurine (réf. TOX8-1KT). Après 4h d'incubation avec le réactif du kit, la viabilité cellulaire a été mesurée par lecture de la fluorescence des puits (excitation à 530 nm / émission à 590 nm). La concentration causant 50% de mortalité cellulaire (IC50) a été calculée graphiquement à l'aide du logiciel GraphPad® Prism 7 software. L'analyse statistique des données a été faite par le test-t et le test ANOVA du logiciel. [0106] Pour les tests d'absorption intestinale, les cellules Caco-2, T84 ou IPEC-J2 ont été ensemencées sur des inserts de culture Greiner de 1 cm2 de diamètre et de porosité 0.4 pm. Après 21 jours de culture, l'étanchéité de l'épithélium intestinal a été confirmée par mesure de la résistance électrique transépithéliale à l'aide d'un voltohmètre (EVOM de Millipore). Le passage transépithélial (apical vers basal) et l'accumulation intracellulaire des divers antibiotiques (destruxines A ou B, bafilomycine Al, métronidazole, enniatine Al) ont été mesurés après ajout dans le compartiment apical (correspondant à la lumière intestinale) de 100 pM de composé dilué dans du PBS contenant du calcium et du magnésium (PBS++). Après 4h d'incubation à 37°C, la résistance électrique transépithéliale a été mesurée à l'aide d'un voltohmètre (EVOM de Millipore) et les milieux apical, basal et intracellulaire ont été collectés et analysés par chromatographie HPLC afin de quantifier la teneur en antibiotique. [0107] Résultats : [0108] Le test d'hémolyse (Tableau 8) montre que les destruxines A et B (comme la bafi- lomycine Al et le métronidazole) n'induisent aucune hémolyse, même pour des doses de 100 pM (0% d'hémolyse à 100 pM). A l'inverse, en accord avec sa toxicité déjà connue et rapportée dans la littérature, l'enniatine Al qui appartient pourtant à la même famille de peptides cycliques fongiques (les depsipeptides) entraîne une hémolyse des globules rouges humains avec 51 % d'hémolyse observé à 100 pM d'enniatine Al. [0109] L'évaluation de la toxicité des destruxines A et B sur les cellules intestinales humaines (Caco-2 et T84) et de porc (TPEC-J2) (Tableau 9) montre que, comme le métronidazole, les destruxines ne sont pas toxiques même à 100 pM vis-à-vis de ces cellules. A l'inverse, comme rapporté dans la littérature, l'enniatine Al est toxique vis-à-vis de ces cellules intestinales. De la même façon, la bafilomycine Al est toxique contre toutes les cellules intestinales testées avec des 1050 comprises entre 1.8 et 11.8 [0110] Tableau 8 : Evaluation de l'effet hémolytique des destruxines A et B, de l'enniatine Al, de la bafilomycine AI ou du métronidazole vis-à-vis des globules rouges humains. Les valeurs portées dans le tableau indiquent le pourcentage d'hémolyse observée après lh de contact avec 100 pM d'antibiotique. [0111] [Tableaux?] Destruxine A Destruxine B Enniatine Al Bafilomycin e Al Métronidazol e Pourcentage d'hémolyse 0 +/- 0 0 +/- 0 51 +/- 12 0 +/- 0 0 +/- 0 10112] Tableau 9 : Evaluation de la toxicité des destruxines A et B, de l'enniatine Al, de la bafilomycine Al ou du métronidazole vis-à-vis des cellules intestinales humaines et porcines. Les valeurs portées dans le tableau correspondent aux IC50 exprimées en pmo1/1 (pM) (moyenne +/- écart-type) 10113] 26 [Tableaux8] Caco-2 (mimant l'intestin grêle humain) T84 (mimant le colon humain) IPEC-J2 (mimant l'intestin grêle de porc) Destruxine A >100 >100 >100 Destruxinc B >100 >100 >100 Enniatine Al 3.1 +/- 0.5 4.5 +/- 1.2 5.1 +/- 0.6 Bafilomycine Al 11.8 +/- 2.0 9.9 +/- 0.9 1.8 +/- 1.9 Métronidazol e >1500 >1500 >1500 10114] Sur la base des données de toxicité, on peu conclure que, comme le métronidazole (antibiotique conventionnel de référence utilisé pour traiter les infections intestinales causées par Clostridium perfritzgetts, les destruxines A et B ne sont pas hémolytiques et ne causent pas dc toxicité à l'encontre des cellules humaines et porcines aux doses actives contre Clostridium perfrin gens. Sur la base de la CMI et des IC50 de la destruxine A et B, le facteur de sécurité (calculé en divisant l'IC50 obtenue dans le test de toxicité par la CMI obtenue avec le Clostridium perfringens (ATCC 13124)) est d'au moins 66. A l'inverse, la bafilomycine Al et l'enniatine Al présentent une toxicité à faible dose contre les cellules humaines et porcines (de 1.8 à 11.8 pM pour la bafilomycine Al et de 3.1 à XX pM pour l'enniatine Al). Les CMI contre Clostridium perfritzgetzs (ATCC 13124) étant de 25 pM pour la bafilomycine Al et de 6.25 pM pour l'enniatine Al, à l'inverse des destruxines ou du métronidazole, ces molécules ne présentent pas de facteurs de sécurité (facteur de sécurité inférieur à 1 pour la bafilomycine Al et pour l'enniatine Al). [0115] L'absence de toxicité des destruxines A et B les distingue donc également de l'enniatine Al, un autre peptide cyclique fongique de type depsipeptides à action antibactérienne qui lui est très toxique. [0116] L'évaluation du transport transépithélial et de l'accumulation intracellulaire des des- truxines A et B à l'aide de cellules épithéliales humaines ou porcines (Tableau 10) montre que l'absorption intestinale des destruxines A et B même au bout de 4h d'incubation est faible et comprise entre 0.2 et 3.3 % de la dose initiale. De la même manière, l'accumulation intracellulaire des destruxines A et B au bout de 4h est faible et comprise entre 3.0 et 20.4 % de la dose initiale. Ceci diffère de l'enniatine Al et de 27 la bafilornycine Al qui s'accumulent dans les cellules intestinales (de 19.5 à 77.4 % de la dose initiale) en lien avec leur forte toxicité. [0117] Tableau 10 : Evaluation à l'aide de cellules épithéliales intestinales humaines et porcines du passage transépithélial et de l'accumulation intracellulaire des destruxines A et B, de l'enniatine Al, de la bafilomycine Al et du métronidazole. [0118] Les valeurs indiquées dans le tableau ont été mesurées par HPLC après 4h d'incubation avec les cellules et correspondent au pourcentage de la dose initialement ajoutée aux cellules dans le compartiment apical. [0119] [Tableaux9] Caco-2 (mimant l'intestin pèle humain) Destruxine A Destruxine B Enniatine Al Bafilomycin c Al Métronidazol c Fraction apicale 88.3 92.4 58.7 0.1 80.2 Fraction basale 2.3 2.5 1.95 22.5 12.9 Fraction in- tracellulaire 9.2 5.5 43.2 77.4 12.7 [0120] [Tableaux10] T84 (mimant le colon humain) Destruxine A Destruxine B Enniatine Al Bafilomycin e Al Métronidazol e Fraction apicale 87.6 81.6 80.5 2.5 71.3 Fraction basale 3.3 2.0 2.0 30.5 9.7 Fraction in- 15.1 20.4 19.5 68.0 19.0 tracellulaire [0121] 28 [Tableaux11] IPEC-J2 (mimant l'intestin grêle de porc) Destruxine A Destruxinc B Enniatine Al Bafilomycin c Al Métronidazol c Fraction apicale 88.6 95.5 45.7 0.1 84.0 Fraction basale 0.2 1.5 1.3 28.1 7.1 Fraction in- tracellul aire 11.1 3.0 53.0 71.8 8.9 [0122] L'intégrité tissulaire après 4h d'exposition aux destruxines A ou B a été évaluée par mesure de la résistance électrique transépithéliale des cellules intestinales humaines ou porcine cultivées sur inserts à l'aide d'un appareil de type EVOM (Tableau 11). Les données montrent que les destruxines, comme le métronidazolc, affectent peu ou pas la résistance électrique transépithéliale (diminution comprise entre 2 et 17 % pour les destruxines et entre 0 et 34 % pour le rnétronidazole) indiquant que ces molécules causent peu ou pas d'atteinte de l'intégrité intestinale. A l'inverse, l'enniatine Al et la bafilomycinc Al entrainent de fortes diminutions de la résistance électrique transépithéliale (diminution comprise entre 67 et 83 % pour l'enniatine Al et 61 et 75 % pour la bafilomycinc Al), indiquant une atteinte importante de l'intégrité tissulaire intestinale. [0123] Tableau Il: Evaluation à l'aide de cellules épithéliales intestinales humaines et porcines de l'atteinte tissulaire causée par les destruxines A et B, de l'enniatine Al, de la batilomycine Al et du métronidazole. [0124] Les cellules intestinales humaines et porcines cultivées sur inserts ont été exposées pendant 4h à 100 RM de chaque molécule ajoutée dans le compartiment apical des inserts. Après 4h, l'intégrité tissulaire a été évaluée par mesure de la résistance électrique transépithéliale. Les valeurs sont en ohm.cm2 (moyennes +/- écart-type). [0125] 29 [Tablcaux12] Contrôle Destruxine A Destruxinc B Enniatinc Al Bafilomycin c Al Métronidazol c Caca-2 293 +/- 281 +/- 282 +/- 95 +/- 112 +/- 16.5 252 +/- 13.7 7.5 13.3 15.0 20.6 T84 449 +/- 373 +/- 377 +/- 122 +/- 118+!- 10.4 293 -F1- 12.3 35.2 21.7 10.4 11.3 IPEC-.12 786 +/- 768 +/- 763 -F/- 128 +/- 191 +/- 62.2 875 -F/- 203 12.5 41.3 21.2 3.2 [0126] En conclusion, il apparait que : [0127] Les destruxines A et B sont non hémolytiques et peu ou pas toxiques vis-à-vis des cellules intestinales humaines et porcines testées L'accumulation intracellulaire et le passage transépithélial des destruxines A et B est faible, ce qui est une bonne chose. En effet, suite à leur ingestion les destruxines A et B resteront majoritairement dans la lumière intestinale ce qui est un avantage pour leur utilisation dans le traitement topique et/ou la prévention des infections intestinales causées par Clostridium perfrin gens. [0128] III- Exemple 3 : Identification du mécanisme d'action des destruxines A et B [0129] Matériels et Méthodes : [0130] Le mécanisme d'action des destruxines A et B a été étudié par divers techniques. La plupart des peptides antimicrobiens (PAM) rapportés dans la littérature sont connus pour s'insérer dans la membrane bactérienne formant des pores et causant une perméabilisation / lyse de la membrane bactérienne. La capacité des destruxines A et B à perméabiliser la membrane de Clostridium perfringens (ATCC 13124) a donc été évaluée. La nisine, un PAM connu pour perméabiliser la membrane bactérienne a été utilisé en contrôle positif de perméabilisation. La capacité de l'enniatine Al à former des pores a aussi été évaluée. L'évaluation de la perméabilisation se fait à l'aide de l'iodure de propidium, une molécule qui devient fluorescente une fois qu'elle rentre en contact avec de l'ADN (Oyama et al., Nature Biofilms and Microbiomes, 2017, 3, 33). La membrane bactérienne étant imperméable à l'iodure de propidium, celui ne peut rentrer en contact avec de l'ADN que si la membrane est perméabilisée. Le principe du test est le suivant. Une culture liquid de Clostridium perfringens (ATCC 13124) est centrifugée à 3000 rpm pendant 5 min Le culot bactérien est alors resuspendu dans du PBS à une concentration de 10E9 bactéries / mi De l'iodure de propidium (Sigma Aldrich) est ensuite ajouté à cette suspension bactérienne à une concentration finale de 60 pM. 100 pl de cette suspension sont ensuite ajoutés dans des puits d'une plaque 96 puits noire pour fluorescence (Greincr) contenant 100 pl de molécules à tester diluées dans du PBS à une concentration correspondant à 5 fois leur CMI. Après 120 min d'incubation à 37°C en condition anaérobie, la fluorescence des puits a été lue à l'aide d'un lecteur de rnicroplaques fluorescence (excitation à 530 nm et émission à 590 nm). La perméabilisation de la membrane bactérienne de Clostriditinz perfritzgetzs (ATCC 13124) a été exprimée en pourcentage, le CTAB servant de référence et donnant 100% de perméabilisation. [0131] La capacité des destruxines A et B à s'insérer dans les lipides membranaircs de Clostridium perfringens a également été étudiée par la technique des monocouchcs lipidiques ou balance de Langmuir (Oyama et al., Nature Biofilms and Microbiomes 2017, 3, 33) Les lipides membranaires totaux de Clostridiwn perfringens (ATCC 13124) ont été extrait selon la technique de Folch (Oyama et al., Nature Biofilms and Microbiomes, 2017 3 33). Ces lipides ont été déposés à l'aide d'une seringue Hamilton à la surface d'une goutte de PBS formant une monocouche lipidique à l'interface PBS-air. Durant le test, la température est maintenue à 20 +/- 0.2 'C. Le film lipidique formé comprime une sonde positionnée à la surface du PBS cntrainant une augmentation de la pression de surface mesurée à l'aide d'un tnicrotensiomètre de surface (pTROUGH SX, Kibron Inc). Les lipides sont ainsi ajoutés jusqu'à atteindre la pression de surface souhaitée nommée pression de surface initiale (Pi dont l'unité est mN/m). Une fois la pression de surface stabilisée, les antibiotiques à tester sont injectées dans la sous-phase de PBS à l'aide d'une autre seringue Hamilton. Si l'antibiotique injecté est capable de s'insérer dans le film lipidique, il s'ensuit une augmentation de la pression de surface jusqu'à atteindre une valeur maximale correspondant à la pression de surface maximale (Pmax en mN/m). La variation de surface causée par l'insertion de l'antibiotique testé (deltaP en mN/m) est calculée en soustrayant Pi à Pmax (DeltaP = Pmax - Pi). L'affinité d'un antibiotique pour le film lipidique est évaluée par mesure de la pression critique d'insertion (Pc). Pc correspond à la pression de surface initiale qui ne permet pas l'insertion de l'antibiotique. Ainsi, plus la valeur de Pc est élevée et plus l'antibiotique peut s'insérer dans le film lipidique. Pc est déterminée graphiquement en mesurant la DeltaP causée par l'insertion de l'antibiotique à différentes valeurs de Pi (approximativement 10, 15, 20, 25 et 30 mN/m). Après avoir rapporté les points obtenus dans un graphique de type DeltaP (portée sur l'axe des Y) en fonction de Pi (portée sur l'axe des X), Pc est déterminé à partir de l'équation de la droite obtenue quand Y (DeltaP) = 0. Dans certaines expériences, pour mimer la situation physiologique, la DeltaP causée par l'insertion de l'antibiotique dans le film lipidique est mesurée pour une pression de surface Pi fixée à 30+!- 0.5 mN/m, la pression de la membrane lipidique d'une bactérie entière étant théoriquement de cet ordre (Oyama et al., Nature Biofilms and 31 Microbiomes, 2017 3 33). [0132] Le mécanisme d'action des destruxines A et B sur Clostridiutn perfringens (ATCC 13124) a aussi été étudié par microscopie comme précédemment expliqué (Nonejuic et al., PNAS October 1, 2013 110 (40) 16169-16174). Une suspension bactérienne de Clostridiutn perfringens (ATCC 13124) a été diluée au 1/100 et cultivée à 37°C en condition anaérobie jusqu'à atteindre une densité optique à 600 nm de 0.2. Les bactéries ont ensuite été traitées pendant 2h avec les destruxines A ou B ou avec divers antibiotiques conventionnels dont on connait la cible moléculaire. La dose d'antibiotique utilisée correspond à 5 fois leur CMI. Après 2h d'incubation, la membrane bactérienne a été marquée 10 min dans la glace à l'aide de la molécule fluorescente rouge FM4-64FX (de ThermoFisher, utilisée à 12 pg/ml) et l'ADN bactérien avec la molécule fluorescente bleu DAPI (de Sigma Aldrich, utilisée à 2 pg/m1). Les bactéries ont ensuite été centrifugées à 7 500 rpm pendant 30 sec et lavées avec de PBS. Les bactéries sont ensuite fixées à l'aide d'une solution de paraformaldéhyde à 4% pendant 15 min dans la glace avant d'être une nouvelle fois centrifugées et lavées avec du PBS. Finalement, les bactéries sont reprises dans du liquide de montage Vectashield (Vector Laboratorics) et déposées entre lame et lamelle avant observation au microscope confocal à l'aide des filtres spécifiques à FM4-64FX et au DAPI (Olympus, Rungis, France). [0133] Résultats : [0134] L'effet perméabilisant sur Clostridium perfringens (ATCC 13124) des destruxines A et B a été évalué à l'aide de l'iodure de propidium et est illustré dans la Figure 2. Alors que la nisine et l'enniantine Al causent une perméabilisation de l'ordre de 50-60 % de Clostridiutn perfringens (ATCC 13124), les destruxines sont sans effet, ne causant aucune perméabilisation. [0135] La technique des monocouches lipidiques a ensuite été utilisée pour confirmer l'absence d'insertion des destruxines A et B dans la membrane de Clostridiutn perfringens (Figures 3 et 4). La détermination de la pression critique d'insertion (Pc) (Figure 3 et Tableau 12) montre que les destruxines A et B s'insèrent très faiblement dans une monocouche lipidiques formée à partir de lipides totaux extraits de Clostridiutn perfringens (ATCC 13124) avec une valeur de Pc 26.9 et 27.1 mN/m pour la destruxine A et la destruxine B. Ceci signifie que les destruxines A et B ne peuvent pas s'insérer dans la membrane de Clostridium perfringens dont la pression de surface théorique est de 30 mN/m, comme montré clans la Figure 4 et en accord avec les données de perméabilisation (Figure 2). A l'inverse, l'enniatine Al, la nisine et le CTAB présentent tous les trois des Pc supérieures à 30 mN/m (40.1, 36.9 et 46.8 inN/ m, respectivement) indiquant qu'ils peuvent donc s'insérer dans une monocouche lipidique formée de lipides de Clostridium perfringens à la pression initiale de 30 mN/ 31 m (Figure 4), en accord avec leur capacité à perméabiliser la bactérie (Figure 2). [0136] Tableau 12 : Détermination de la pression critique d'insertion des destruxines A et B, de l'enniatine Al, de la nisine et du CTAB. [0137] Les pressions critiques d'insertion (Pc) des différentes molécules injectées à 5 fois leur CMI ont été déterminées à partir de la Figure 3. [0138] [Tableaux13] Destruxine A Destruxine B Enniatine Al Nisine CTAB Pc (en mN/ m) 26.9 27.1 40.1 36.9 46.8 [0139] Les résultats de l'étude du mécanisme d'action des destruxines A et B sur Clostridium petfringens (ATCC 13124) sont portés dans la Figure 5. La microscopie montre que les destruxines agissent comme le chloramphénicol en provoquant une hypercondensation de l'ADN bactérien. Ceci suggère que, comme le chloramphénicol, les destruxines agissent en inhibant la synthèse protéique, un mécanisme d'action original pour un PAM. [0140] En conclusion : [0141] Ayant montré l'activité sélective des destruxines A et B sur Clostrium pmfringens, les raisons de cette sélectivité ont été investiguées. Classiquement, les peptides antimicrobiens (PAM) sont peu ou pas sélectifs, agissant soit sur toutes les bactéries Gram+ et Gram-, soit que sur les bactéries Gram+ ou Gram-, soit sur un ensemble de bactéries proches phylogénétiquement. Les destruxines A et B sont donc très originaux puisqu'ils n'agissent que sur Clostrium perfringens (souches cliniques et ATCC) sans agir sur des bactéries proches phylogénétiquement comme les autres souches de Clostridium testés dans les Tableaux 3 et 4. La sélectivité des destruxines A et B contre Clostrium petfringens provient de leur mécanisme d'action original. 101421 Ainsi, alors que la majorité des PAM déjà connus agissent en perméabilisant la membrane des bactéries, les destruxines A et B ne perméabilisent pas la membrane bactérienne de Clostriditun petfringens (Figure 2). De même, alors que la majorité des PAM sont capables de s'insérer dans les lipides bactériens (activité suivie par la technique des monocouches lipidiques), les destruxines A et B ne pénètrent pas un film de lipides bactériens (Figures 3 et 4). 101431 Des tests par microscopie ont permis de déterminer le mécanisme d'action de ces molécules expliquant leur action spécifique contre les bactéries du genre Clostritun petfringens. Il semble qu'une inhibition de la synthèse d'ADN et/ou de la paroi bactérienne (peptidoglycane) soit en cause (Figure 5). L'existence d'une cible spécifique restant à identifier et présente uniquement dans Clostrium petfritzgetzs explique cer- 33 tainemcnt la sélectivité des destruxines A et B contre Closiraun perfringens. De manière importante, l'absence de perméabilisation membranaire et d'insertion dans les lipides des destruxines A et B les distinguent des autres peptides cycliques fongiques à action antibactérienne testés tel que l'enniatinc Al qui est capable de s'insérer dans les lipides et de perméabiliser la membrane bactérienne (Figures 2, 3 et 4). Cette différence de mécanisme d'action entre les destruxines A et B et Penniatine Al explique la différence de sélectivité de ces molécules, une action de type perméabilisation membranairc n'étant pas ou peu sélective comme le montre l'action non sélective de l'enniatine Al qui est active contre Clawridium perfringetzs mais aussi contre d'autres bactéries Gram+ et contre Candida albicans comme illustrée dans le Tableau 6. [0144] IV- Exemple 4: Evaluation de l'activité antibactérienne et de l'innocuité de surnageant (sécrétomes) de champignons producteurs de destruxines. [0145] Matériels et Méthodes : [0146] Afin de tester les effets antimicrobicns d'extrait de champignons producteurs de des- truxines, la moisissure Beauveria felina (DSM 4678) a été utilisée. Les sécrétomes de cette moisissure ont été obtenu après inoculation de milieu de culture dextrose à la pomme de terre ou Potato Dextrose (PD) par le champignon et culture à 25cC pendant 2 semaines sous agitation (200 rpm). Les sécrétomes obtenus ont été centrifugés à 3000 rpm pendant 5 min puis stérilisés par filtration sur filtre de 0.2 p.m. Les sécrétomes stériles ont ensuite été utilisés pour réaliser des tests antimicrobiens comme détaillé dans l'exemple 1 par dilution au 1 / 2 à partir des sécrétomes purs. [0147] Résultats : [0148] L'activité antimicrobienne des sécrétomes de Beauveria felina (DSM 4678) a été évaluée sur certaines souches bactériennes Gram+ et Gram- comme illustrées dans le Tableau 13. [0149] Tableau 13 : Détermination de l'activité antimicrobienne du sécrétome obtenu à partir de la moisissure Beauveria lélina (DSM 4678). [0150] L'activité antimicrobienne des sécrétomes de Beauveria felina (DSM 4678) a été testée sur divers souches Gram-i- et Gram- par dilution en cascade. L'activité est exprimée en pourcentage de sécrétome dilué présentant une activité. [0151] 34 [Tableaux13] Souches bactériennes Pourcentage d'extrait le plus faible présentant une activité antimicrobienne contre la souche testée °m'iridium perfringens (ATCC 13124) 6.25 % Bacillus cereus (DSM 31) 6.25 % Szaphylococcus aureus (ATCC 6538P) 12.5 % Esche richia colt (ATCC 8739) >50 % Klebsiella pneumoniae (DSM 26371) >50 % Pseudomonas aeruginosa (CEP 107398) >50 % Salmonella enterica (CIP 80.39) >50 % 101521 Les données du Tableau 13 montrent que les sécrétomes de Beauveria felitza (DSM 4678) sont bien actifs contre Clostridium petfringens (ATCC 13124) mais également contre d'autres souches Gram+ pathogènes tel que Bacillus cereus (DSM 31) et Staphylococcus aureus (ATCC 6538P). Ceci suggère que les sécrétomes contiennent d'autres molécules, en plus des destruxines A et B, qui sont actives contre les bactéries Gram-F. Même si la perte de sélectivité contre Clostridium petfringens est préjudiciable, le fait que les sécrétomes de Beauveria felina (DSM 4678) soient actifs contre divers pathogènes Gram+ infectant les animaux et les humains est un point positif L'utilisation de fractions plus purifiées du sécrétome, enrichies en destruxines, devrait permettre de retrouver la sélectivité contre Clostridium perfringetzs. 101531 BILAN 101541 Les résultats ci-dessus démontrent donc une activité ultra sélective des destruxines A et B à l'encontre des bactéries du genre Clostrium perfringens responsable d'infections intestinales chez l'Homme et l'animal d'élevage dont le porc et les volailles. [0155] Du fait de l'absence de toxicité des destruxines A et B aux doses antibactériennes, l'utilisation des destruxines A et B est envisageable dans le traitement des infections humaines par Clostridium perfringens niais également dans le traitement de l'infection intestinale par Clostridiutn perfringens des animaux d'élevage, dont le porc et les volailles. [0156] Le fait que les sécrétomes de Beauveria felina (DSM 4678) soient actifs contre Clostridiutn perfringens permet de proposer également d'utiliser des extraits plus ou moins purifiés de cc champignon ou d'autres champignons producteurs de destruxines (tel que Metarrhizitun, Beau veria, Ophiocordyceps, Alternaria et Aschersoni et notamment les genres Itifetarrhizium anisopliae, Metarhizium brunneunz, Beauveria Ophincordyceps coccidiicola, Ahernaria brassicae, Ahernaria Aschersonis sp, Ophiocordyceps coccidiicola, Ahernaria brassice et Aschersonis .sp) afin de prévenir l'infection des animaux d'élevage (dont le porc et les volailles) par Clos! ldnon perfringens. [0157] 36 [Revendication 1] [Revendication 2] [Revendication 3]