Brevet FR3081712A1 — publié le 20191206

MATRICE POUR LA PREPARATION D'UNE COMPOSITION DE REGENERATION CELLULAIRE, TISSULAIRE ET/OU OSSEUSE La présente invention a pour objet une matrice pour la préparation d'une composition de régénération cellulaire, tissulaire et/ou osseuse, utilisable pour de la réparation ou de la prévention, pathologique ou traumatique. Il s'agit d'un biomatériau pouvant servir de support pour l'ingénierie tissulaire. La matrice est destinée à être ensemencée ou non avec des cellules, avec ou sans ajout de facteurs de croissance, de manière à obtenir ladite composition de régénération. La composition peut être utilisée en général pour la reconstitution des tissus lésés et en particulier pour la réparation d'un tissu dur, comme le tissu osseux ou le cartilage, au niveau d'une zone endommagée du tissu. Lors d'une lésion, qu'elle soit traumatique, pathologique ou induite, des mécanismes physiologiques complexes se mettent en place pour la réparation tissulaire et la cicatrisation. Ces mécanismes font appel à de nombreuses phases et sont le fruit d'interactions complexes entre des cellules ou entre des cellules et une matrice extracellulaire impliquant ou non des facteurs de croissance, le microenvironnement et l'activation de voies de signalisation cellulaire spécifiques. Ces interactions peuvent être augmentées, accélérées, ou inhibées par divers éléments tels que des agents hémostatiques, des drogues ou encore des facteurs de croissance. Aujourd'hui, des chirurgiens, que ce soit en ophtalmologie, en stomatologie, en orthopédie, en chirurgie cardiovasculaire, en urologie, en néphrologie, ou encore en chirurgie esthétique, utilisent des biomatériaux dans leurs stratégies thérapeutiques. La médecine régénérative prend toute son importance pour répondre aux besoins grandissants dans tous ces domaines. 2 La médecine régénérative est définie comme une approche multidisciplinaire qui implique non seulement l'ingénierie tissulaire, mais aussi la chimie, la science du biomatériau, la biomécanique et les biothérapies avec la découverte des cellules souches. Elle offre de 5 nombreuses perspectives d'avenir dans le remplacement de tissus lésés et dans la prévention de certaines pathologies. Le principe de l'ingénierie tissulaire consiste à utiliser un biomatériau, à l'ensemencer avec des cellules appropriées, à y ajouter ou non des molécules biologiquement actives permettant de créer un 10 environnement tridimensionnel nécessaire et adapté à la survie, la prolifération, la différenciation et l'organisation cellulaire vers le tissu à régénérer. De nombreux travaux ont ainsi été mis en oeuvre pour réaliser des biomatériaux capables de supporter la formation de ces nouveaux tissus. 15 Si cet objectif paraît assez simple, sa mise en oeuvre est particulièrement complexe et représente un défi qui fait appel à de nombreux domaines scientifiques et technologiques. Cela suppose notamment de choisir le biomatériau idéal présentant une structure de soutien compatible avec tissu et élément de la matrice extracellulaire, de 20 manière à ce que les cellules puissent s'organiser et former un tissu valide. Le biomatériau doit de plus permettre les interactions cellules-cellules entre les cellules cultivées et les cellules de l'hôte, et fournir un microenvironnement physiologique et physique particulier permettant de contrôler les fonctions cellulaires et de maîtriser le cycle cellulaire 25 (prolifération, différenciation et fonctionnalisation). Il est possible d'y ajouter ou non des molécules capables de favoriser leur croissance, leur différenciation et d'intégrer les contraintes mécaniques auxquelles doit se plier le nouveau tissu. Le biomatériau, la matrice, est donc un support agissant comme un 30 tissu biologique qui permet l'adhésion des cellules, leur migration, leur prolifération et leur différenciation. 3 Un biomatériau utilisé en médecine régénérative doit donc répondre à de nombreuses caractéristiques. Il doit : - être biocompatible et donc ne pas dégrader le milieu biologique 5 dans lequel il se trouve ni interférer avec lui ; - être bioactif pour permettre le développement cellulaire ; - présenter des caractéristiques physico-chimiques définies : par exemple il doit être poreux pour favoriser la croissance cellulaire, permettre le passage des nutriments et l'élimination des déchets produits; 10 - mimer le microenvironnement cellulaire spécifique à chaque tissu ; - être capable de résister aux contraintes mécaniques spécifiques du tissu lésé. Il existe deux grandes classes de biomatériaux : les biomatériaux naturels et les biomatériaux synthétiques. 15 Certains biomatériaux naturels comme le collagène, le fibrinogène, l'acide hyaluronique, ont la propriété d'être des composants de la matrice extracellulaire native, leur principale qualité étant leur excellente biocompatibilité. Les biomatériaux synthétiques présentent divers avantages, 20 notamment de pouvoir être produits à grande échelle, avec un procédé de fabrication contrôlé, et sont donc moins onéreux. D'autre part, ces biomatériaux sont généralement facilement manipulables. Cependant, l'utilisation de ces produits peut générer des réactions inflammatoires car ces produits sont reconnus comme corps étranger par le système 25 immunitaire du receveur. Des études précliniques et quelques rares essais cliniques démontrent la capacité de « matrices », constituées d'un support biorésorbable composé de dérivés naturels ou de matériaux synthétiques et d'une ou plusieurs populations cellulaires, à aider au processus de 30 réparation tissulaire avec la synthèse, par exemple de cartilage ou d'os, une fois ces matrices implantées au sein d'une lésion. Il reste cependant à 4 améliorer l'interface entre les matériaux et les milieux biologiques, notamment en contrôlant la macrostructure du matériau (taille des porosités, morphologie, distribution), afin de permettre la bioactivité et la biofonctionnalité. 5 Différents types cellulaires, seuls ou en association, ont déjà été testés dans le cadre de la régénération tissulaire : des cellules souches embryonnaires (CSE), d'origine foetale (sang de cordon, cordon ombilical ou placenta) ou isolées de cellules souches adultes (CSA), des cellules souches pluripotentes induites (iPS) ou des cellules somatiques. Quels que 10 soient l'origine et le type de cellules utilisées, les mécanismes de régénération des tissus font appel aux effets paracrines et/ou à une intégration - participation directe de ces cellules implantées à la formation du tissu lésé. Les cellules souches embryonnaires issues de l'embryon à un stade 15 très précoce de son développement sont douées de deux capacités importantes : celle de se multiplier à l'infini, par simple division (autorenouvèlement), et celle de donner naissance à tous les types de cellules de l'organisme (pluripotence). Les cellules souches pluripotentes induites appelées iPS (pour 20 "induced pluripotent stem cells" en langue anglaise) sont obtenues après prélèvement de pratiquement n'importe quel type cellulaire adulte et reprogrammation génétique pour restaurer cette capacité de pluripotence. Les iPS sont ainsi capables de se multiplier à l'infini et de se différencier en types de cellules qui composent un organisme adulte, exactement comme 25 une cellule souche embryonnaire. Compte tenu des questions éthiques et des contraintes de sécurité, les CSE et les iPS ont été plutôt utilisées pour étudier la formation des tissus ou les mécanismes fondamentaux du développement et constituent d'excellents modèles pour comprendre les phénomènes pathologiques. 30 Les cellules souches multipotentes ont la capacité de se différencier en plusieurs types cellulaires. Parmi ces cellules, les cellules souches 5 mésenchymateuses (CSM), isolées de tissus foetaux ou adultes, sont les plus utilisées pour l'ingénierie tissulaire et peuvent se différencier en ostéoblastes, chondrocytes, adipocytes et myocytes in vitro. Le nombre de patients devant bénéficier d'une reconstruction 5 osseuse chirurgicale ne cesse d'augmenter et les chirurgiens orthopédistes ou maxillo-faciaux sont à la recherche de techniques et de matériaux simples et garantissant une parfaite biosécurité pour le patient. Environ 2,2 millions de greffes osseuses sont réalisées chaque année dans le monde. L'os est un organe dont la composition cellulaire est complexe. Il est 10 fortement vascularisé et est sujet à de constants remodelages. La matrice minéralisée de l'os est composée d'une phase organique (représentant 35% du poids sec de la matrice) principalement composée de collagène responsable de sa rigidité, sa viscoélasticité et sa solidité, et d'autres protéines qui forment le microenvironnement nécessaire aux fonctions 15 cellulaires, et d'une phase minérale de carbonate d'apatite (représentant 65% du poids sec de la matrice) pour le renfort structural, sa rigidité et l'homéostasie minérale. L'os possède des capacités intrinsèques de consolidation spontanée après une blessure. Cependant, en cas de lésions trop importantes, il faut intervenir et la greffe de tissus et les auto- 20 transplantations restent encore les stratégies les plus utilisées. Mais la morbidité du site donneur (douleur, inflammation, infections) et la quantité d'os disponible constituent les limites de ces approches thérapeutiques. Aujourd'hui, il n'existe pas de substitut osseux de référence malgré les études précliniques et cliniques démontrant la capacité de ces matrices 25 à aider au processus de synthèse de tissus osseux. Le choix du chirurgien se fait donc en fonction de ses connaissances et des convictions du patient qui pourra préférer des substituts d'origine naturelle et non d'origine animale. La matrice idéale sera un support agissant comme un tissu 30 biologique (tissu de soutien et matrice extracellulaire) qui répondra à 6 l'ensemble des critères cités ci-dessus et qui permettra dans ce cas précis l'ostéoconduction et l'ostéoinduction. La présente invention vise à remédier aux inconvénients mentionnés ci-dessus, en proposant une matrice pour la préparation d'une composition 5 de régénération cellulaire, tissulaire et/ou osseuse, la matrice étant notamment biocompatible et permettant une bonne viabilité des cellules hôtes et/ou des cellules ensemencées. L'invention a ainsi pour objet une matrice pour la préparation d'une composition de régénération cellulaire, tissulaire et/ou osseuse. 10 La matrice selon l'invention comprend : - une couche fibreuse poreuse comprenant des fibres d'alginate de calcium hydratées, ladite couche fibreuse étant apte à être ensemencée par des cellules, et - une couche barrière gélifiée comprenant de l'alginate, apte à 15 maintenir les cellules dans la couche fibreuse. Ainsi, la couche fibreuse permet la culture cellulaire, tandis que la couche barrière, adjacente à la couche fibreuse, sert de support à la culture cellulaire sans risque de dissémination et donc de perte des cellules dans le milieu au moment de la préparation. 20 L'acide alginique et ses dérivés (base conjuguée, sels et esters) les alginates sont des polysaccharides principalement obtenus à partir d'une famille d'algues brunes : les laminaires ou les fucus. L'alginate est le nom commun pour une famille de polymères formés de deux monomères liés ensemble : le mannuronate ou acide 25 mannuronique et le guluronate ou acide guluronique. La formule générale de l'alginate est la suivante : 7 La proportion et la distribution de ces deux monomères sont déterminantes pour une large expansion des propriétés physiques et chimiques de l'alginate, on parle ainsi de rapport mannuronique gluronique ou encore de rapport M/G. La composition chimique de l'alginate varie 5 selon les diverses espèces d'algues, les différentes parties de la même plante et est sujette aux changements saisonniers. Néanmoins, par sélection de matières premières aux différentes propriétés, il est possible de fabriquer une variété d'alginate aux caractéristiques constantes. La couche fibreuse peut comprendre des fibres d'alginate de calcium 10 et de sodium, et la couche barrière peut comprendre de l'alginate de sodium et de calcium. Le taux de calcium complexé à l'alginate dans la couche fibreuse est de préférence supérieur au taux de calcium complexé à l'alginate dans la couche barrière. 15 Le taux de sodium complexé à l'alginate dans la couche fibreuse est de préférence inférieur au taux de sodium complexé à l'alginate dans la couche barrière. Les fibres d'alginate de calcium hydratées peuvent être obtenues par imprégnation de fibres d'alginate de calcium avec une solution (aqueuse) 20 de sel de sodium. La couche barrière peut être obtenue par mélange de la couche fibreuse avec un sel d'alginate ou un sel de sodium. Les fibres d'alginate de calcium hydratées étant obtenues par hydratation de fibres d'alginate de calcium à l'état sec, la masse surfacique 25 des fibres d'alginate de calcium à l'état sec est avantageusement inférieure ou égale à 170 g/m2, de préférence comprise entre 120 et 170 g/m2. Une masse surfacique supérieure ou égale à 120 g/m2 permet de rendre la matrice moins fragile et de la manipuler plus facilement, tandis qu'une masse surfacique inférieure ou égale à 170 g/m2 permet l'obtention d'une 30 matrice moins dense, avec une pénétration optimale des cellules. 8 Les fibres d'alginate de calcium peuvent être choisies parmi les fibres d'alginate de calcium, d'alginate de calcium/manganèse, d'alginate de calcium/argent, et d'alginate de calcium/chitosane. La couche barrière gélifiée peut comprendre de l'alginate de sodium 5 ou un dérivé d'alginate. La couche barrière gélifiée peut comprendre en outre un dérivé d'alginate, un dérivé de cellulose, un poloxamère ou un de ses dérivés, du collagène, de la gélatine, du chitosane ou un de ses dérivés. La matrice peut être obtenue par hydratation d'une composition 10 lyophilisée ou séchée de fibres d'alginate de calcium hydratées. L'hydratation peut être réalisée avec une solution d'alginate de sodium. L'invention a également pour objet une composition de régénération cellulaire, tissulaire, et/ou osseuse. La composition selon l'invention comprend une matrice décrite ci- 15 dessus et des cellules. L'invention a également pour objet une composition décrite ci-dessus pour une utilisation pour la régénération cellulaire, tissulaire, et/ou osseuse. L'invention a également pour objet un procédé d'obtention d'une 20 matrice décrite ci-dessus. Le procédé comprend les étapes suivantes : - imprégnation de fibres d'alginate de calcium avec une solution (aqueuse) de sel de sodium, de manière à obtenir des fibres d'alginate de calcium hydratées, et 25 - mise en contact des fibres hydratées avec une solution d'alginate de sodium. Le procédé peut comprendre en outre une étape d'ensemencement de la matrice obtenue avec des cellules. L'invention sera mieux comprise et d'autres détails, caractéristiques 30 et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description 9 suivante faite à titre d'exemple non limitatif et en référence aux dessins annexés dans lesquels : - la figure 1 illustre schématiquement les différentes étapes d'un procédé d'obtention d'une matrice selon l'invention, et 5 - la figure 2 illustre schématiquement une matrice selon l'invention ensemencée avec des cellules. La matrice selon l'invention est un hydrogel structuré en bicouche, les deux couches étant distinctes et cohésives. Elle est ainsi avantageusement composée d'une couche de fibres d'alginate de calcium 10 et de sodium hydratées, dite couche fibreuse, et d'une couche d'alginate de sodium et de calcium dense et non poreuse, dite couche gélifiée. Cette matrice présente le même type d'environnement chimique : deux couches contenant toutes les deux de l'alginate sous forme calcique ou sodique mais avec des proportions ioniques différentes. Dans la couche fibreuse, le 15 taux de calcium complexé à l'alginate est supérieur à celui de la couche gel. Inversement, le taux de sodium est supérieur dans la couche gel par rapport à la couche fibreuse. La couche gélifiée contient nécessairement de l'alginate mais peut comprendre en outre un ou plusieurs polymères, comme un dérivé 20 d'alginate, un dérivé de cellulose, un poloxamère ou un de ses dérivés, du collagène, de la gélatine, du chitosane ou un de ses dérivés, afin d'améliorer par exemple les propriétés mécaniques de cette couche. La face composée de fibres d'alginate partiellement gélifiées (la couche fibreuse) est de densité contrôlée et présente des pores. Le 25 contrôle de la densité se fait lors du procédé de fabrication par le choix des éléments constitutifs de la couche fibreuse. Cette couche fibreuse présente une architecture et un environnement propices à la culture ou la coculture de différents types cellulaires (avec ou sans facteurs de croissance), à leur survie, prolifération, leur différenciation et leur organisation 30 tridimensionnelle in vivo. 10 La couche gélifiée est quant à elle avantageusement très dense et non poreuse, les cellules ne peuvent pas s'intégrer et la traverser. Ainsi, les cellules vont donc venir coloniser uniquement la couche fibreuse de la matrice, la couche gélifiée servant de support à la couche 5 fibreuse limitant la perte de cellules dans le milieu in vitro de dissémination et donc la perte des cellules lors de l'ensemencement. Cette matrice bicouche peut également contenir des protéines, des facteurs de croissance, des hormones, des vésicules, dans le but d'améliorer la viabilité, la prolifération et la différenciation cellulaire selon le 10 type cellulaire utilisé. La matrice bicouche peut être ensemencée avec des cellules, avec ou sans facteurs de croisssance. Cet ensemencement doit être réalisé sur la couche fibreuse et donc présentant la porosité la plus élevée. Les cellules sont alors capables de 15 pénétrer au coeur de la matrice. Elles seront retenues par la seconde couche, dense, qui joue le rôle de barrière. Les matrices ainsi ensemencées sont cultivées dans un milieu de culture adapté et spécifique des cellules choisies, contenant ou non des facteurs de croissance, et permettant la viabilité et la prolifération des cellules au sein de la couche 20 fibreuse. La couche gélifiée retient les cellules sur la partie fibreuse ou à l'interface. La continuité chimique assure une bonne survie cellulaire dans la matrice. La matrice bicouche d'alginate peut être ensemencée avec différents 25 types cellulaires, avec ou sans facteurs de croissance, selon le tissu à régénérer : - les cellules somatiques (adultes et différenciées) utilisées pour leur libération de facteurs de croissance ou de molécules impliquées dans le maintien du microenvironnement, dans la différenciation, dans la réponse 30 inflammatoire ou la migration d'autres types cellulaires ; 11 - les cellules souches adultes dont la capacité de différenciation en un type cellulaire est intéressante selon le tissu à régénérer (progéniteurs endothéliaux circulants (PEC), cellules souches musculaires...) ; - les cellules souches multipotentes capables de se différencier en 5 plusieurs types cellulaires de plusieurs feuillets embryonnaires. Parmi ces cellules, et compte tenu de leurs capacités de prolifération et de différenciation, les cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont largement utilisées. Présentes dans la moelle osseuse et dans différents tissus, elles sont facilement isolables et ont une grande capacité de 10 prolifération et de différenciation. De plus, il est maintenant démontré la participation de ces cellules, intégrées dans une matrice, à la morphogenèse des tissus osseux ou leur rôle dans la stimulation et le recrutement des cellules du microenvironnement par action paracrine ; - les cellules souches embryonnaires ou cellules iPS pluripotentes 15 capables de se diviser à l'infini et de se différencier en tous les tissus du corps humain. Les cellules peuvent être des cellules souches, de préférence des cellules souches choisies dans le groupe constitué des cellules souches embryonnaires, des cellules souches pluripotentes et des cellules souches 20 adultes, plus préférablement des cellules souches pluripotentes induites (iPS) ou/et des cellules souches adultes (OSA). Les cellules souches embryonnaires ne sont pas des cellules souches embryonnaires humaines. Les cellules ne sont pas des cellules souches embryonnaires humaines obtenues via la destruction de novo d'embryons humains ou qui 25 utilisent des lignées de cellules souches embryonnaires humaines publiquement disponibles qui proviennent initialement d'un procédé entraînant la destruction des embryons humains. Des combinaisons et cocultures peuvent être mises en place dans cette matrice. 12 Par exemple, les cellules souches mésenchymateuses pourront être mises en coculture avec d'autres types cellulaires comme des cellules endothéliales (CE) ou des cellules mononuclées (CMN) contenant, entre autres, des précurseurs des CE. De nombreuses publications démontrent 5 en effet le bénéfice fonctionnel de l'intégration de plusieurs types cellulaires dans les matrices et leur effet paracrine. De plus, le milieu de culture pourra être supplémenté avec différents facteurs de croissance (VEGF, IL1 par exemple). Un procédé de préparation de la matrice va maintenant être décrit, 10 en liaison avec les figures 1 et 2. Le matériau de base est avantageusement des fibres d'alginate de calcium 1 entremêlées (non tissé), présentant un certain grammage. Dans une première étape, et tel qu'illustré à la figure 1, ces fibres 1 sont imprégnées dans un réservoir 3 avec un certain volume de solution 15 saline de concentration connue, par exemple sodique. Après un certain temps de contact, sous l'action des sels 2, l'alginate de calcium va se gélifier partiellement par échange ionique. Il est ainsi obtenu des fibres d'alginate pluri-ionique 4, par exemple d'alginate de calcium-sodium, et du calcium libre. Suivant le grammage initial, on obtiendra à la fin de cette 20 étape une porosité plus ou moins élevée : plus le grammage initial sera élevé, plus la porosité finale sera faible et inversement. Dans une deuxième étape, les fibres partiellement gélifiées 4 vont ensuite être mises en contact avec un volume connu d'un ou plusieurs polymères ioniques 5 de concentration déterminée. Au cours de cette 25 étape, suite à des échanges ioniques entre le calcium libre présent dans les fibres hydratées 4 et les ions contenus dans la solution 5, il y a réticulation ionique faible de l'alginate, formant ainsi in situ la couche gélifiée 6 et l'hydrogel bicouche va se développer créant la matrice 7. Il est obtenu finalement, après égouttage, une matrice 7 composée 30 d'une couche 4 de fibres partiellement gélifiées présentant une certaine porosité et d'une couche 6 de gel d'alginate dense, présentant une très 13 faible porosité, les deux couches 4 et 6 étant adjacentes et solidaires l'une de l'autre. Cette matrice 7 pourra ainsi être fournie pour ensemencement ou non de cellules 8 et utilisée chez le patient ou à des fins de recherche (figure 2). 5 La partie fibreuse est obtenue par solubilisation partielle de fibres d'alginate de calcium entremêlées. Le grammage initial a un impact direct sur la porosité finale de cette couche. En effet, plus le grammage initial sera élevé, plus la porosité finale sera faible et inversement. Le grammage est de préférence inférieur ou égal à 170 g/m2. La porosité de la matrice 10 peut donc être contrôlée et modifiée pour obtenir une porosité idéale selon le type cellulaire à ensemencer. Le contrôle de la porosité via le grammage initial des fibres d'alginate entremêlées permet la production d'une matrice bicouche stable et homogène entre différents lots de matrices. Il est également possible de lyophiliser ou de sécher les fibres 15 d'alginate de calcium hydratées avec la solution saline, à la fin de la première étape. Une fois lyophilisées ou séchées, ces fibres pourront être stérilisées par irradiation, par exemple par rayonnement bêta. Les fibres seront fournies au futur utilisateur. Celui-ci devra les réhydrater avec une solution de polymères ioniques pour obtenir une matrice bicouche. 20 Le fait de lyophiliser ou de sécher la matrice permet de pouvoir la stériliser, et donc d'avoir un produit exempt de biocharge, qui ne risque pas de se dégrader dans le temps et de perdre ses caractéristiques physico-chimiques. Cette matrice lyophilisée ou séchée présente donc l'avantage d'avoir une date de péremption plus tardive. 25 L'utilisateur aura ainsi à sa disposition soit une matrice fraîchement fabriquée, utilisable directement, soit un kit composé d'une matrice déshydratée et d'une solution d'un ou plusieurs polymères. Les cellules sont ensuite ensemencées à la surface de la matrice bicouche, sur la face composée de fibres d'alginate hydratées et donc 30 présentant la porosité la plus élevée. Les cellules vont alors pénétrer au coeur de la matrice et être retenues par la seconde couche gélifiée 14 présentant une porosité très faible. Les matrices ainsi ensemencées sont mises en contact avec du milieu de culture adapté, complémenté en facteurs de croissance, permettant la viabilité et la prolifération des cellules. Une fois la matrice colonisée par les cellules, le chirurgien pourra 5 l'implanter chez le patient dans la zone des tissus endommagés. Selon le type de blessure et l'avis du chirurgien, soit la matrice complète, avec la couche gélifiée et la couche fibreuse, sera implantée, soit les deux couches de la matrice seront séparées et seule la couche fibreuse, contenant les cellules, sera conservée pour être implantée. Le chirurgien aura également 10 la possibilité d'implanter chez le patient la matrice seule, avec ou sans molécules biologiquement actives, sans ensemencement préalable de cellules. L'invention est illustrée de manière non limitative par l'exemple qui suit. 15 Exemple : préparation d'une composition de régénération osseuse et tissulaire Une matrice bicouche est découpée en échantillons de 0,5 x 0,5 cm. 20 Chaque échantillon est doublement rincé pendant 3 à 4 h à une température de 37°C dans du milieu de culture EGM2®, milieu de culture spécifique des cellules endothéliales, commercialisé par la société Lonza. Les échantillons sont déposés dans des puits de culture, face fibreuse sur le dessus. 25 Les cellules utilisées dans le cas de la régénération osseuse peuvent être: - les cellules souches mésenchymateuses (CSM) présentes dans la moelle osseuse, les tissus adipeux, le sang de cordon ou dans la gelée de cordon ombilical. Leurs caractéristiques in vitro sont : l'adhérence au 30 support plastique, l'expression des marqueurs de surface CD73, CD90 et CD105 et l'absence d'expression des marqueurs CD34, CD45, CD19 et 15 HLA-DR. Elles ont la capacité à se différencier en ostéoblastes, adipocytes et chondrocytes in vitro ; - les cellules endothéliales (CE) issues des progéniteurs du sang de cordon. Ces cellules constituent la paroi des vaisseaux, contrôlent le tonus 5 vasculaire et jouent un rôle dans la néoangiogénèse. Elles sont mobilisées à partir de la moelle osseuse, issues des progéniteurs endothéliaux circulants. Ces cellules ont démontré leur capacité à se différencier en plusieurs types de cellules endothéliales et synthétisent des facteurs essentiels pour l'hémostase et autres processus cellulaires. 10 En coculture, ces deux types cellulaires coopèrent. En effet les cellules endothéliales augmentent, in vitro et in vivo, la différenciation ostéogénique des cellules souches mésenchymateuses et les cellules souches mésenchymateuses stimulent la survie et la croissance des cellules endothéliales par action paracrine. Une étude a démontré que le 15 ratio entre les cellules souches mésenchymateuses et les cellules endothéliales était important pour la survie et la prolifération cellulaire. Pour ce cas de régénération osseuse, plusieurs ensemencements ont été testés : - les CSM humaines seules (1 million de cellules sur 0,25 cm2) ; 20 - les CE humaines seules (1 million de cellules sur 0,25 cm2) ; - une coculture 50/50 CSM/CE d'origine humaine (500 000 cellules de chaque type cellulaire sur 0,25 cm2). Les matrices sont cultivées dans chaque puits dans du milieu de culture EGM2® (milieu de culture spécifique aux cellules endothéliales, 25 riche en facteurs de croissance, EGF, IGF, VEGF, bFGF...). Ce milieu de culture peut être additionné de facteurs de croissance (VEGF par exemple) pour permettre une meilleure prolifération des cellules. Les cellules sont ainsi laissées en culture durant 24 à 96 heures à une température de 37°C et avec 5% de CO2. 16 Les cellules colonisent l'ensemble de la couche fibreuse de la matrice : la couche gélifiée retient de manière efficace et durable les cellules dans la couche fibreuse sans perte cellulaire. Avant la mise en culture les membranes des cellules ont été 5 marquées avec des colorants de type PKH (des initiales de leur créateur, Paul Karl Horan), tels que ceux décrits dans la publication Duttenhoefer F et al, 2013, European Cells and Material, pour permettre le suivi de la viabilité cellulaire. Au bout de 24 h, on estime la viabilité des CSM à au moins 95% et à 10 60% pour les CE. Au bout de 96 h, les CSM et les CE sont viables. La viabilité cellulaire est plus importante lorsque les cellules CSM et CE sont cocultivées dans la matrice. Pour une matrice fabriquée à partir d'un non tissé d'alginate de calcium présentant un grammage trop élevé (supérieur à 170 g/m2), on 15 constate que la matrice devient moins poreuse et les cellules ensemencées pénètrent plus difficilement dans la matrice. Les cellules forment alors un tapis sur la surface de la matrice. Implantation de la matrice : test in vivo 20 Une fois la matrice colonisée par les cellules, après 24h, les deux couches de la matrice sont séparées. Seule la couche fibreuse, contenant les cellules, est conservée et est implantée en sous-cutané sur le flanc de souris nude immunodéprimées. Les souris sont suivies pendant deux mois, 25 et pesées deux fois par semaine. La prise de poids des souris au cours du temps est restée régulière, et aucun comportement anormal particulier des souris dans la cage n'a été observé. De plus, après implantation de la couche fibreuse, aucun phénomène inflammatoire ou infectieux n'a été observé, les matrices ayant été très bien tolérées. Aucune souris n'est 30 décédée. Au bout de deux mois les souris sont sacrifiées, les implants prélevés et les cellules présentes identifiées. 17 Des marquages spécifiques des cellules humaines et murines ont montré que : - deux mois après implantation, des cellules CE et CSM humaines initialement incluses sont retrouvées dans la matrice ; 5 - les matrices sont colonisées par des CSM de souris (pas de cellules endothéliales retrouvées) ; - une synthèse de matrice de collagène, sans différence significative entre les conditions, est observée ; - les CE humaines ont formé un vaisseau démontrant la prolifération 10 et l'organisation des cellules entre elles au sein de la matrice après deux mois d'implantation. Ces résultats démontrent que cette matrice est un support adéquat permettant la viabilité, la prolifération et la fonctionnalité des cellules ainsi que la colonisation par les cellules du receveur avec une interaction entre 15 cellules ensemencées et cellules de l'hôte. REVENDICATIONS1. Matrice (7) pour la préparation d'une composition de régénération cellulaire, tissulaire et/ou osseuse, caractérisée en ce qu'elle comprend : - une couche fibreuse (4) poreuse comprenant des fibres d'alginate de calcium hydratées, ladite couche fibreuse (4) étant apte à être ensemencée par des cellules (8), et - une couche barrière (6) gélifiée comprenant de l'alginate, apte à maintenir les cellules (8) dans la couche fibreuse (4). 2. Matrice (7) selon la revendication 1, caractérisée en ce que la couche fibreuse (4) comprend des fibres d'alginate de calcium et de sodium, et en ce que la couche barrière (6) comprend de l'alginate de sodium et de calcium. 3. Matrice (7) selon la revendication 2, caractérisée en ce que le taux de calcium complexé à l'alginate dans la couche fibreuse (4) est supérieur au taux de calcium complexé à l'alginate dans la couche barrière (6). 4. Matrice (7) selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que le taux de sodium complexé à l'alginate dans la couche fibreuse (4) est inférieur au taux de sodium complexé à l'alginate dans la couche barrière (6). 5. Matrice (7) selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que les fibres d'alginate de calcium hydratées sont obtenues par imprégnation de fibres d'alginate de calcium (1) avec une solution de sel de sodium (2). 6. Matrice (7) selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la couche barrière (6) est obtenue par mélange de la couche fibreuse (4) avec un sel de sodium. 7. Matrice (7) selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que les fibres d'alginate de calcium hydratées étant obtenues par hydratation de fibres d'alginate de calcium à l'état sec, la masse 19 surfacique des fibres d'alginate de calcium à l'état sec est inférieure ou égale à 170 g/m2. 8. Matrice (7) selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que les fibres d'alginate de calcium (1) sont choisies parmi les fibres 5 d'alginate de calcium, d'alginate de calcium/manganèse, d'alginate de calcium/argent, et d'alginate de calcium/chitosane. 9. Matrice (7) selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que la couche barrière (6) gélifiée comprend de l'alginate de sodium ou un dérivé d'alginate. 10 10. Matrice (7) selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par hydratation d'une composition lyophilisée ou séchée de fibres d'alginate de calcium hydratées. 11. Composition de régénération cellulaire, tissulaire et/ou osseuse, caractérisée en ce qu'elle comprend une matrice (7) selon l'une des 15 revendications 1 à 10 et des cellules, lesdites cellules n'étant pas des cellules souches embryonnaires humaines. 12. Composition selon la revendication 11 pour une utilisation pour la régénération cellulaire, tissulaire, et/ou osseuse. 13. Procédé d'obtention d'une matrice (7) selon l'une des revendications 20 1 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - imprégnation de fibres d'alginate de calcium (1) avec une solution de sel de sodium (2), de manière à obtenir des fibres d'alginate de calcium hydratées (4), et - mise en contact des fibres hydratées avec une solution d'alginate de 25 sodium (5). 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape d'ensemencement de la matrice (7) obtenue avec des cellules (8), lesdites cellules n'étant pas des cellules souches embryonnaires humaines.