Brevet FR3082982A1 — publié le 20191227

Procédé de détermination de l'infiltration de cellules biolooiaues dans un objet biologique d'intérêt DOMAINE TECHNIQUE DE L'INVENTION ET ETAT DE LA TECHNIQUE L'invention appartient au champ technique du traitement informatique d'images biologiques, de manière préférée pour des applications en anatomo-pathologie. Le diagnostic de la malignité d'une tumeur, par exemple cancéreuse, et/ou de l'efficacité d'un traitement peut être réalisé par analyse d'images microscopiques d'un échantillon de tumeur. Des coupes sont réalisées dans l'échantillon prélevé, et ces coupes sont traitées avec des marqueurs pour faire ressortir certains types de cellules biologiques. Les images microscopiques des coupes, comprenant les cellules biologiques marquées, peuvent être exploitées par un anatomo-pathologiste pour établir la malignité de la tumeur, réaliser un pronostic vital du patient, évaluer l'efficacité d'un traitement, etc. Notamment, l'infiltration de cellules immunitaires au sein de la tumeur, par exemple l'infiltration lymphocytaire, après l'administration du traitement constitue un paramètre d'intérêt. Il est établi qu'une densité élevée de cellules immunitaires infiltrées au sein des tumeurs peut être corrélée à une réponse immune anti-tumorale importante et donc à un bon pronostic vital des patients. Une solution bien connue consiste à prélever par carottage biopsique un échantillon de tissu biologique à étudier, puis à réaliser des coupes fines dudit échantillon pour obtenir des préparations histologiques. Un praticien de santé peut ensuite analyser au microscope les préparations histologiques et réaliser un diagnostic histopathologique. Cette solution exige toutefois que le praticien dispose physiquement de l'échantillon, qui doit donc être transporté et manipulé. De plus, l'observation réalisée par le praticien est très peu répétable et reproductible. 2 Des procédés ont été proposés pour l'analyse de la densité d'infiltration de cellules immunitaires à partir d'échantillons dématérialisés. Par exemple, la demande internationale de brevet WO 2012/032173 Al décrit un procédé de traitement d'une lame virtuelle de 5 tumeur, comprenant une quantification de la densité de cellules dans une pluralité de zones de faible surface. Lesdites zones de quantification sont placées de sorte à chevaucher la frontière tumorale. La lame virtuelle de tumeur comprend éventuellement un marquage à l'aide de marqueurs spécifiques ou non aux cellules immunitaires. Ce document décrit un mode 10 de réalisation préféré dans lequel chacune des zones de quantification est un rectangle de faible largeur, dont la médiatrice dans le sens de la longueur est superposée avec la normale au front tumoral (voir par exemple Figure 7). La quantification de densité cellulaire au sein d'une zone est réalisée par comptage des cellules dans des tranches de largeur 15 prédéfinie du rectangle de quantification, à des distances différentes du front tumoral. Après avoir éventuellement calculé une moyenne de densité d'infiltration de cellules sur plusieurs rectangles de quantification, une courbe représentative de la densité de cellules en fonction de la distance au front tumoral est obtenue. Cette courbe peut être comparée à des 20 profils types d'infiltration cellulaire. Toutefois, le procédé de ce document ne produit pas une mesure globale qui caractérise l'infiltration des cellules immunitaires sur l'ensemble de la tumeur. Une analyse complète de la lésion n'est donc pas possible. La mesure permet seulement d'obtenir une tendance générale de l'infiltration 25 des cellules immunitaires. En outre, des logiciels connus mettant en oeuvre ce procédé ne sont pas adaptables à divers types et tailles de tumeurs, la taille des rectangles de quantification étant prédéterminée, ni à divers types de marqueurs (notamment des marqueurs immunohistochimiques). Cette solution est 30 notamment difficilement exploitable lors de la phase d'étude préclinique de l'efficacité d'un traitement anti-cancéreux sur des populations non humaines, en amont des essais cliniques. 3 PRESENTATION GENERALE DE L'INVENTION Il existe donc un besoin pour un procédé permettant d'obtenir un profil d'infiltration d'un type choisi de cellules biologiques (par exemple un profil d'infiltration lymphocytaire) dans un objet biologique d'intérêt, quels que 5 soient le type et la taille de l'objet biologique. Il existe notamment un besoin pour un procédé fournissant, de manière fiable et rapide, une mesure globale de l'infiltration des cellules biologiques à l'échelle de l'objet biologique entier. Un enjeu est d'obtenir une mesure répétable et reproductible, produisant des résultats objectifs 10 pour assister la prise de décision du praticien, sans se substituer au praticien. Un besoin additionnel existe pour un procédé qui serait utilisable à la fois en étude préclinique, sur des échantillons prélevés chez des animaux, et en phase clinique pour des patients humains. 15 On recherche par ailleurs, de manière préférentielle, un procédé qui produise des résultats satisfaisants pour différents types de marqueurs histologiques, et pour différentes couleurs de marqueurs. La présente invention répond à ce besoin en fournissant, selon un premier 20 aspect, un procédé de détermination d'un profil d'infiltration de cellules biologiques d'intérêt dans un objet biologique d'intérêt, à partir d'une image histopathologique numérique de tissus biologiques, une frontière de l'objet biologique ayant préalablement été déterminée dans l'image histopathologique, 25 un marqueur histologique ayant préalablement été appliqué aux tissus biologiques, le procédé, exécuté par une unité de traitement, comprenant les étapes suivantes : génération d'une image de détection de cellules biologiques comprenant 30 des pixels d'une couleur prédéterminée, lesdits pixels correspondant aux zones de l'image histopathologique marquées à l'aide du marqueur histologique, 4 détermination d'une carte de distance comprenant des iso-courbes, chaque iso-courbe comprenant l'ensemble des pixels de la région d'intérêt situés à une distance euclidienne à la frontière égale à une valeur de distance ; 5 à partir de la carte de distance, calcul d'une courbe représentative de la densité surfacique de cellules biologiques d'intérêt, le calcul comprenant un comptage, pour chaque valeur de distance à la frontière, de pixels étant à la fois de la couleur prédéterminée sur l'image de détection et situés entre l'iso-courbe associée à ladite valeur de distance et l'iso-courbe 10 consécutive. Un avantage du procédé de l'invention est de fournir une mesure globale de l'infiltration des cellules biologiques dans l'objet biologique. La séparation des pixels de l'image histopathologique correspondant au 15 marqueur, associée à la détermination d'une carte de distance à l'échelle de l'objet biologique, permet d'obtenir une courbe de densité surfacique de cellules biologiques d'intérêt à l'échelle de l'objet biologique entier. La mesure est fiable et reproductible. Un avantage additionnel est que les résultats obtenus par ce procédé ne 20 dépendent pas de la taille ou du type de l'objet biologique étudié. Un autre avantage est que ce procédé peut être mis en oeuvre de façon automatisée et rapide, par une unité de traitement. Un avantage additionnel est que la densité surfacique dans le cadre de la mise en oeuvre du procédé, est corrigée des artefacts de type trous, pliures ou nécroses, 25 ce qui rend la courbe plus robuste. Des caractéristiques optionnelles et non-limitatives d'un procédé de l'invention sont les suivantes, considérées seules ou dans l'une quelconque de leurs combinaisons techniquement possibles : 30 lors de l'étape de calcul, la densité surfacique de cellules biologiques d'intérêt est obtenue par la formule suivante : Ace= as8 Pei 5 où ci correspond au nombre de pixels qui sont à la fois de la couleur prédéterminée sur l'image de détection et situés entre l'iso-courbe associée à la valeur de distance d et l'iso-courbe consécutive, 5 correspond au nombre total de pixels entre l'iso-courbe associée à la 5 valeur de distance d et l'iso-courbe consécutive, 0 est un nombre moyen prédéterminé de pixels par cellule biologique, et 5 est un nombre prédéterminé de pixels par unité de surface ; - l'étape de génération de l'image de détection de cellules biologiques comprend les sous-étapes suivantes : 10 à partir de l'image histopathologique, séparation du marqueur histologique par rapport à d'autres marqueurs, par traitement d'image donnant une image intermédiaire ; binarisation d'Otsu de l'image intermédiaire, détection de cellules biologiques d'intérêt à partir de l'image intermédiaire 15 et d'une image résultant de la binarisation d'Otsu, par séparation d'une première classe formée de pixels correspondant au marqueur histologique par rapport à une deuxième classe formée des autres pixels ; - l'image histopathologique comprend, en complément du marqueur histologique, un marqueur non spécifique, par exemple à l'hématoxyline 20 ou à l'éosine ; - l'étape de séparation du marqueur histologique comprenant une déconvolution des couleurs de l'image histopathologique sur l'espace teinte/saturation/luminance ; - le marqueur histologique est le diamino-benzidine ou l'hématoxyline- 25 aminoéthylcarbazole ; - l'étape de détection des cellules biologiques d'intérêt comprend une classification k-means à l'aide d'un centroïde de la classe des cellules biologiques d'intérêt et d'un centroïde de la classe fibrose, le centroïde de la classe des cellules biologiques d'intérêt pouvant alors, 30 préférentiellement, être pris égal au niveau de gris minimal de l'image intermédiaire, et l'équation du centroïde de la classe fibrose pouvant être préférentiellement la suivante : 6 - le procédé comprend une étape préliminaire de détermination, manuelle ou automatisée, de la frontière au sein de l'image histopathologique ; - l'image histopathologique est une lame virtuelle constituée par tuilage 5 d'une pluralité d'images microscopiques des tissus biologiques ; - dans la carte de distance, les pixels de l'image situés hors de la frontière sont associés à une distance négative, et les pixels de l'image situés à l'intérieur de la frontière sont associés à une distance positive, la courbe de densité surfacique de cellules biologiques d'intérêt 10 comprenant les distances négatives sur une partie gauche et les distances positives sur une partie droite ; - le procédé comprend une étape supplémentaire de représentation graphique d'une carte d'infiltration des cellules d'intérêt sur laquelle les iso-courbes sont superposées à l'image histopathologique de la région 15 d'intérêt, la couleur d'une zone entre deux iso-courbes consécutives étant variable en fonction de la valeur de densité surfacique de cellules biologiques d'intérêt ; - le procédé comprend des étapes supplémentaires de détermination 20 d'une aire sous la courbe de densité surfacique) de cellules biologiques d'intérêt en fonction de la distance à la frontière, pour un intervalle donné de distance, et de comparaison de l'aire obtenue à une valeur seuil prédéterminée ; - l'objet biologique d'intérêt est une tumeur ou un ensemble de tumeurs, 25 et la frontière est une frontière tumorale ; - l'image histopathologique, sur laquelle la frontière a préalablement été déterminée, est téléchargée par l'unité de traitement auprès d'une base de données distante, de préférence par l'intermédiaire d'une connexion réseau et de manière encore plus préférée par l'intermédiaire d'une 30 connexion Internet ; 7 -les cellules biologiques d'intérêt sont par exemple et de manière non limitative des lymphocytes T, ou des lymphocytes B, ou des cellules NK. 5 La présente invention concerne, selon un deuxième aspect, une unité de traitement comprenant : une mémoire configurée pour enregistrer une image histopathologique, une première sous-unité configurée pour déterminer une carte de distance comprenant des iso-courbes, chaque iso-courbe étant associée à une 10 valeur de distance et comprenant l'ensemble des pixels de l'image situés à une distance euclidienne d'une frontière égale à ladite valeur de distance, une deuxième sous-unité configurée pour calculer une courbe représentative de la densité surfacique de cellules biologiques d'intérêt 15 dans l'image en fonction de la distance par rapport à la frontière, l'unité de traitement étant configurée pour mettre en oeuvre le procédé tel que défini ci-avant. Enfin, l'invention vise un produit programme d'ordinateur comprenant des 20 instructions de code qui, lorsqu'elles sont mises en oeuvre par une unité de traitement, permettent l'exécution d'un procédé tel que défini ci-avant. PRESENTATION GENERALE DES FIGURES D'autres caractéristiques, buts et avantages de l'invention ressortiront de 25 la description qui suit, qui est purement illustrative et non limitative, accompagnée des dessins annexés, parmi lesquels : La Figure 1 représente de façon schématique un système pour la mise en oeuvre d'un procédé de détermination d'un profil d'infiltration de cellules biologiques d'intérêt ; 30 La Figure 2 représente les étapes d'un procédé selon un mode de réalisation de l'invention, dans lequel l'objet biologique étudié est une tumeur ; 8 La Figure 3 est une première image issue d'une lame virtuelle d'une coupe de tissu biologique comprenant une tumeur ; La Figure 4a est une deuxième image issue d'une lame virtuelle d'une coupe de tissu biologique comprenant une tumeur, dans laquelle les 5 lymphocytes ont été marqués ; La Figure 4b est une image en niveau de gris issue de la séparation du marqueur DAB dans l'image de la Figure 4a ; La Figure 4c est une image en niveau de gris issue de la séparation du marqueur hématoxyline dans l'image de la Figure 4a ; 10 La Figure 5 est une image en niveau de gris issue de la séparation du marqueur immunohistochimique dans l'image de la Figure 3 ; La Figure 6 est une image issue de la binarisation d'Otsu de l'image à marqueurs séparés de la Figure 5 ; La Figure 7 est une image de détection de lymphocytes obtenue à partie 15 de l'image de la Figure 3, où les pixels correspondant à des lymphocytes sont en noir ; La Figure 8 est une image comportant, en superposition, l'image de la Figure 5 d'une part, et des iso-courbes d'une carte de distance à la frontière tumorale identifiée dans la Figure 7 d'autre part ; on a représenté 20 au bas de la Figure 7b une vue rapprochée d'une zone de cette image ; La Figure 9 est un schéma représentatif de la répartition d'un lymphocyte entre plusieurs valeurs de distance à la frontière tumorale ; La Figure 10 est un exemple de profil d'infiltration lymphocytaire obtenu selon le procédé de la Figure 2. 25 DESCRIPTION DETAILLEE Un procédé de détermination de profil d'infiltration et un système associé sont décrits ci-après, pour le cas particulier où les objets biologiques sont des tumeurs, par exemple des tumeurs cancéreuses. La frontière de 30 l'objet biologique est donc une frontière tumorale dans les exemples ci- après. On comprendra toutefois que l'invention peut être utilisée avec les mêmes avantages pour l'étude de l'infiltration de cellules biologiques dans des objets biologiques autres que des tumeurs. Le procédé ci-après peut 9 par exemple être appliqué pour déterminer des mesures d'infiltration de cellules immunitaires (comme des lymphocytes) dans une glande du corps humain ou animal, ou dans un organe greffé à un patient, pour constater s'il y a rejet de l'organe greffé. 5 Par la suite, on entend par « image histopathologique » une image permettant une étude microscopique de tissus biologiques, utilisable en histopathologie notamment pour effectuer le suivi d'une maladie. Les tissus biologiques visibles sur une telle image sont le plus souvent des biopsies ou des tissus prélevés lors d'une opération chirurgicale. Les 10 méthodes de préparation d'un échantillon en vue d'obtenir une image histopathologique de qualité satisfaisante sont bien connus de l'homme du métier, et ne seront pas décrits par la suite. Une image ou une pluralité d'images histopathologiques peut par exemple être utilisée pour établir un diagnostic d'un patient humain ou animal, ou évaluer l'efficacité d'un 15 traitement administré audit patient. Les images histopathologiques décrites par la suite comprennent au moins une partie d'une frontière tumorale, c'est-à-dire une ligne de démarcation identifiable sur l'image histopathologique entre du tissu tumoral et du tissu non tumoral. Cependant, dans certains cas, des cellules tumorales isolées peuvent être 20 présentes au-delà du front tumoral, notamment s'il se produit un phénomène de « bourgeonnement tumoral ». Système de détermination d'un profil d'infiltration de cellules biologiques 25 On a représenté en Figure 1 un système permettant, une fois prélevé un échantillon de tissu biologique comprenant un objet biologique d'intérêt tel une tumeur, la mise en oeuvre du procédé de détermination de profil d'infiltration lymphocytaire qui sera décrit ci-après. Le système comprend une unité de traitement 10 comprenant des moyens 30 de calcul, préférentiellement un processeur. L'unité de traitement 10 peut comprendre en outre une interface utilisateur pour permettre la saisie d'instructions par un utilisateur. L'unité de traitement 10 comprend une mémoire 11 configurée pour la sauvegarde d'images histopathologiques, éventuellement annotées pour indiquer une frontière tumorale, et pour la 10 sauvegarde des profils d'infiltration lymphocytaire déterminés à l'aide du procédé qui sera décrit ci-après. La mémoire 11 peut, de façon optionnelle, être également configurée pour sauvegarder les images intermédiaires générées lors de l'exécution du procédé. L'unité de 5 traitement est, de façon avantageuse, reliée avec ou sans fil à un écran 12 comprenant une interface graphique. L'écran 12 est notamment configuré pour afficher des images histopathologiques. Dans une variante possible, le système comprend une unité d'acquisition d'images histopathologiques 13, configurée pour générer des images 10 histopathologiques à partir de tissus biologiques réels, les images histopathologiques étant de préférence stockées sous forme de lames virtuelles. Par « lame virtuelle », on entend une image de tissus biologiques recomposée à partir de plusieurs images microscopiques, par exemple des images microscopiques à plusieurs résolutions différentes, 15 par exemple par tuilage. Les lames virtuelles peuvent notamment être des images de type WSI (pour « Whole Slide Image ») comprenant des vues à très haute résolution de biopsies de tissus. De préférence, l'unité d'acquisition d'images histopathologiques 13 est un scanner à lames complètes. En alternative, l'unité 13 peut être un 20 microscope optique équipé d'une caméra. Alternativement ou en combinaison, le système comprend une base de données distante 14 d'un serveur distant, la base de données 14 étant configurée pour enregistrer en mémoire des images histopathologiques, de préférence des lames virtuelles. La base de données 14 est apte à 25 communiquer avec l'unité de traitement 10 via un réseau de communication R, de préférence un réseau Internet, l'unité de traitement 10 étant configurée dans cette variante pour télécharger les images histopathologiques par l'intermédiaire du réseau R. De préférence, des lames virtuelles de tissus biologiques d'individus sont 30 partagées sur le réseau R sécurisé, avec préférentiellement un accès sécurisé aux données. Le praticien peut ainsi, en utilisant des logiciels connus de traitement d'images, obtenir une vue à une résolution plus ou moins élevée de différentes zones d'une région d'intérêt comprenant un 11 objet biologique à étudier. De telles lames virtuelles et des méthodes pour leur acquisition et leur partage sont bien connues de l'homme du métier. La lame virtuelle est constituée par une pluralité de tranches d'un échantillon tumoral, déposées sur des lames et traitées avec des 5 marqueurs histologiques. Selon un mode de réalisation préféré, la lame virtuelle est constituée d'une seule tranche. L'utilisation de lames virtuelles est très avantageuse, puisque ces lames peuvent très facilement être partagées et annotées sur des logiciels de traitement d'image connus, à distance et sans nécessité de manipuler un 10 échantillon physique des tissus biologiques à analyser. De plus, une telle lame virtuelle présente l'avantage, par rapport à un échantillon biologique, de ne pas se dégrader au cours du temps. Enfin, il est plus aisé pour un utilisateur d'exploiter une lame virtuelle d'un objet biologique, plutôt qu'une pluralité de vues différentes du même objet 15 biologique séparées entre elles. Procédé de détermination d'un profil d'infiltration lymphocytaire dans une tumeur 20 La Figure 2 représente les étapes d'un procédé de l'invention selon un mode de réalisation particulier, dans lequel l'objet biologique à étudier est une tumeur cancéreuse, la frontière dudit objet est une frontière tumorale (ou front tumoral) et les cellules biologiques d'intérêt dont on veut quantifier l'infiltration sont des lymphocytes tels que des lymphocytes T 25 ou des lymphocytes B. On notera que le procédé de la Figure 2 peut être appliqué avec les mêmes avantages pour quantifier l'infiltration d'autres types de cellules biologiques, notamment des cellules NK, des macrophages, des cellules dendritiques. 30 A titre purement illustratif, le procédé de la Figure 2 peut être utilisé pour évaluer, en étude préclinique d'un traitement du cancer colorectal (ou CCR), la réponse d'une tumeur à un traitement par radiofréquence suivi d'une injection d'un gel GMCF (pour « Gramulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor ») ayant pour rôle d'activer les cellules dendritiques responsables du déclenchement de la réponse immune. Le but d'un tel 12 traitement est de détruire les cellules tumorales pouvant récidiver après radiofréquence et de limiter l'apparition d'autres cellules tumorales à distance du site du traitement. La tumeur faisant l'objet de l'étude peut être une tumeur principale ou une métastase secondaire. 5 Le procédé de la Figure 2 permet d'obtenir un profil d'infiltration de lymphocytes dans la tumeur, c'est-à-dire une courbe de quantification de la densité de lymphocytes en fonction de la distance au front tumoral. Ce procédé peut notamment être mis en oeuvre par l'unité de traitement 10 du système représenté schématiquement en Figure 1. 10 Le procédé de la Figure 2 prend en entrée une image histopathologique I ou une pluralité d'images histopathologiques d'une tumeur, de préférence une lame virtuelle de tumeur. La tumeur a préalablement été marquée à l'aide d'au moins un type de 15 marqueur histologique. L'expression « marqueur histologique » se réfère à un marqueur chimique utilisé en histologie, permettant un marquage de tissus biologiques. On distingue les marqueurs non spécifiques, marquant toutes les cellules de tissus biologiques de la même manière, tels que l'hématoxyline qui colore en bleu-violet l'ADN contenu dans les noyaux ou 20 l'éosine qui colore en rose les protéines de cytoplasme, et les marqueurs spécifiques qui ne marquent que certaines cellules d'intérêt. Les marqueurs spécifiques peuvent notamment être des marqueurs immunohistochimiques (ou marqueurs IHC), fonctionnant sur le principe d'une réaction de liaison entre un anticorps (présent dans le marqueur) et 25 un antigène. Un tel marqueur est par exemple couplé à une enzyme qui produit une coloration spécifique. Les marquages IHC peuvent être de type direct ou indirect. Pour le marquage direct, un marqueur visuel (ou une enzyme) est couplé à un anticorps capable de se lier directement avec l'antigène que l'on souhaite 30 marquer. La méthode indirecte est réalisée en deux étapes. Premièrement, un anticorps primaire sans étiquette (sans marqueur visuel) est lié à l'antigène ciblé ; deuxièmement, après rinçage de l'excès, 13 un anticorps secondaire avec marqueur visuel (ou une enzyme) est ajouté et se lie à l'anticorps primaire. La diamino-benzidine (ou DAB, coloration marron) et l'hématoxylineaminoéthylcarbazole (ou H-AEC, coloration bleue pour le noyau et rouge- 5 marron pour le contour) sont des marqueurs immunohistochimiques connus. L'observation des images issues d'un marquage IHC donne généralement des auréoles teintées de la teinte du marqueur, sur la périphérie des cellules biologiques d'intérêt ciblées par le marquage, et des noyaux teintés de la teinte du contre-marqueur (bleue si le contre- 10 marqueur est l'hématoxyline). Dans l'exemple qui va suivre, l'image histopathologique est marquée avec de la diamino-benzidine (DAB ci-après) et de l'hématoxyline (en alternative ou en complément de l'hématoxyline, l'image peut comprendre un marquage à l'éosine). 15 De façon préliminaire, une image histopathologique de la tumeur, comprenant une indication de la frontière tumorale (ladite frontière étant de préférence visible à l'aide d'une annotation de l'image, réalisée par un praticien) est nécessaire. A ce titre, le procédé de la Figure 2 comprend, 20 de manière optionnelle, une étape 100 de détermination de la frontière tumorale F. La frontière F, qui délimite l'objet biologique d'intérêt constitué par la tumeur (ou éventuellement un ensemble de tumeurs), est ici une courbe fermée. Alternativement, la frontière F peut être une courbe ouverte. 25 L'étape 100 est mise en oeuvre soit de manière automatisée, par lecture automatique de l'image I marquée à l'aide d'un marqueur histologique, soit manuellement par un opérateur, de préférence un praticien de santé formé à l'histopathologie. Alternativement, l'image histopathologique I reçue par l'unité de 30 traitement mettant en oeuvre le procédé peut déjà comprendre une annotation de la frontière tumorale F. Par exemple, si l'image I est acquise par l'unité de traitement via Internet auprès d'une plateforme de partage, l'image I peut avoir été préalablement annotée par un praticien, à l'aide 14 d'un logiciel de traitement d'image, pour faire apparaître la frontière tumorale F. L'étape 100 permet de repérer la région d'intérêt comprenant l'objet biologique à étudier (ici une tumeur) pour les étapes suivantes. 5 L'annotation 100 de la frontière F remplace avantageusement une étape de segmentation automatique de la région d'intérêt comprenant la tumeur. On a représenté en Figure 3 une image histopathologique I issue d'une lame virtuelle d'une tumeur, et faisant figurer une annotation de la 10 frontière tumorale F. Dans cet exemple, l'objet biologique à étudier (c'est- à-dire la tumeur), situé à l'intérieur de la courbe fermée F, correspond à une surface ayant une luminosité plus faible par rapport au reste de l'image. La frontière tumorale F est indiquée à l'aide d'une courbe brisée en trait épais. L'image histopathologique I, stockée temporairement ou de 15 manière permanente par l'unité de traitement 10, est de préférence une image de grande taille, par exemple plus de 3 gigaoctets et une résolution de 150 000 x 100 000 pixels. Limage I est par exemple une image du type WSI (Whole Slide Image). Sur l'image I, la tumeur délimitée par la frontière F présente un diamètre d'environ 2 millimètres. 20 Le procédé de détermination du profil d'infiltration lymphocytaire se poursuit par une étape 200 de détection de pixels de l'image I correspondant à des lymphocytes. Il est rappelé que les tissus biologiques comprenant la tumeur ont été 25 marqués à l'aide d'un marqueur histologique, de préférence un marqueur immunohistochimique spécifique aux lymphocytes, avant l'acquisition de l'image I. La détection des lymphocytes exploite le marquage distinct des lymphocytes sur l'image I, par rapport au reste des éléments visibles sur l'image. 30 L'image histopathologique du présent exemple comprend la DAB comme marqueur spécifique aux lymphocytes et l'hématoxyline comme contre-marqueur. Dans un premier temps, une sous-étape 210 de séparation de ces deux marqueurs sur l'image est mise en oeuvre. 15 Une méthode connue en histologie pour la séparation des marqueurs se fonde sur une déconvolution des couleurs, en fonction de l'absorption de la lumière par les différents marqueurs (loi de Beer-Lambert, voir Ruifrok, Johnston et al. (2001), Quantification of histochemical staining by color 5 deconvolution, Analytical and quantitative cytology and histology, 23(4):291-299). Toutefois, les marqueurs d'immunohistochimie dispersent la lumière incidente, au lieu de l'absorber, et la loi de BeerLambert n'est donc pas applicable. Il a été constaté que la déconvolution des couleurs des pixels de l'image I 10 dans l'espace teinte-saturation-luminance ou « Hue-Saturation- Lightness » (espace HSL ci-après) permet de discriminer efficacement les différents marqueurs, notamment immunohistochimiques, sur une image. L'étape 210 prend en entrée une teinte, une saturation et une luminance de référence du marqueur immunohistochimique recherché, permettant 15 de placer un point de référence dudit marqueur dans l'espace HSL en trois dimensions. Lors de cette étape, une image intermédiaire Iint de séparation des marqueurs est générée, chaque pixel de l'image Iint ayant un niveau de gris qui correspond à la distance entre le pixel correspondant de l'image I et le point de référence dans l'espace HSL. Plus un pixel de 20 l'image I est proche du point de référence dans l'espace HSL, plus le pixel correspondant de l'image Iint est foncé. A titre d'exemple, si le point de référence a pour coordonnées (ho, so, lo) dans l'espace HSL, une équation de la distance I (fonction d'espace-couleur) d'un pixel p de coordonnées (h, s, I) dans l'espace HSL par 25 rapport audit point de référence est la suivante : 1 - d y (p) (1 d s ( (11) avec les valeurs suivantes de dH(p), ds(p) et dL(p) : dn (P) cos(h - ho) - ho) 1 ± ristep) I (p) et une valeur du paramètre E pouvant être fixée à 1/255. 5 A titre illustratif, on a représenté en Figure 4a une image histopathologique issue d'une lame virtuelle d'un autre échantillon de tumeur que celui représenté sur la Figure 3. De même que l'image de la Figure 3, la tumeur de la Figure 4a a été marquée à la DAB et à l'hématoxyline. La frontière tumorale est bien visible et n'est pas 10 représentée. La Figure 4b est une image obtenue en séparant les marqueurs selon le calcul de distance ci-avant, en considérant un point de référence associé à la DAB. Les pixels foncés de l'image de la Figure 4b correspondent donc à des lymphocytes sur l'image avant séparation des marqueurs. Cette 15 image présente un intérêt pour la quantification de l'infiltration lymphocytaire. L'image de la Figure 4c est obtenue en séparant les marqueurs selon la même méthode, en considérant un point de référence associé à l'hématoxyline. Les pixels foncés de l'image de la Figure 4c correspondent 20 à de l'ADN. On a représenté en Figure 5 l'image intermédiaire Iint de séparation des marqueurs issue de l'image histopathologique I (sans frontière F) de la Figure 3, avec séparation des marqueurs dans l'espace HSL. L'image Iint 25 utilisée pour la suite du procédé est obtenue avec un point de référence ayant une teinte, une saturation et une luminance prédéterminées correspondant au marqueur DAB. On a indiqué en pointillés sur la Figure 5 une zone Z, correspondant à une zone bleutée de l'image histopathologique I, résultant du marquage à l'hématoxyline ; on constate 16 17 que l'image de séparation des marqueurs Iint ne permet pas de distinguer cette zone bleutée par rapport à d'autres pixels blancs de l'image. En alternative, l'image intermédiaire Iint peut être générée à l'aide de la distance à un point de référence correspondant au marqueur dans l'espace 5 rouge-vert-bleu ou « Red Green Blue » (RGB). L'étape 200 du procédé comprend ensuite une détection automatisée des pixels correspondant à des lymphocytes sur l'image I. Dans le présent exemple, la détection des lymphocytes donne en résultat une image 10 binaire, où les pixels correspondant à des lymphocytes sont d'une couleur prédéterminée (en noir), et tous les autres pixels sont de la couleur du fond (en blanc). A partir de l'image Iint de séparation du marqueur spécifique aux lymphocytes, l'unité de traitement met d'abord en oeuvre une binarisation 15 220, par exemple une binarisation selon la méthode d'Otsu. La binarisation produit, à partir de l'image Tint en niveaux de gris, une image seuillée I'. Le seuil qui sépare la classe des pixels du premier plan (parmi lesquels les pixels à détecter) et la classe des pixels de l'arrière-plan est optimisé lors de la binarisation d'Otsu de sorte à obtenir une variance 20 intra-classe minimale. On a représenté en Figure 6 l'image seuillée I' obtenue après binarisation d'Otsu à partir de l'image intermédiaire de la Figure 5. Les pixels en noir de l'image de la Figure 6, détectés comme pixels du premier plan, comprennent à la fois des pixels associés à des lymphocytes 25 et des pixels associés à de la fibrose. L'étape 200 selon le présent exemple comprend une étape supplémentaire 230 de détection des lymphocytes, afin notamment de distinguer les lymphocytes de la fibrose. Un objectif est de séparer, sur l'image I, une 30 première classe formée de pixels correspondant au marqueur DAB, par rapport à une deuxième classe formée des autres pixels de l'image. L'étape 230 comprend à ce titre une classification « k-means » des pixels entre deux classes, autrement dit deux « clusters », à partir de l'image 18 intermédiaire Iint et de l'image seuillée I'. Pour l'application de l'algorithme k-means, le centroïde de la classe des lymphocytes est avantageusement initialisé au minimum des niveaux de gris détectés dans l'image intermédiaire Iint, et le centroïde de la classe fibrose est initialisé à une 5 valeur o. La valeur ci est avantageusement obtenue à l'aide de l'équation suivante : = où le sommage est effectué sur les pixels p de l'image intermédiaire Tint de séparation des marqueurs, et de l'image I' obtenue par binarisation. 10 L'étape 230 de détection des lymphocytes par classification k-means est avantageuse, car elle donne des résultats d'une bonne précision pour la détection des objets d'intérêt, ici les lymphocytes. Du fait que les images histopathologiques étudiées sont des images bidimensionnelles issues d'échantillons biologiques réels (tridimensionnels), il est en général peu 15 aisé de distinguer les lymphocytes par rapport à d'autres types de cellules de l'échantillons ; cependant, les résultats obtenus par classification kmeans donnent satisfaction. La Figure 7 représente l'image I* de détection de lymphocytes issue de la classification k-means appliquée à l'image binaire I'. L'image I*, qui est 20 une image binaire, comporte en noir les pixels correspondant aux lymphocytes visibles sur l'image I, et en blanc les autres pixels. L'image I* peut donc être utilisée pour le calcul de la densité de lymphocytes. On notera que, de façon alternative, l'étape 200 de détection de cellules biologiques d'intérêt peut être réalisée avant l'annotation 100 de la 25 frontière tumorale F, ou en parallèle de l'annotation. Il n'est pas nécessaire de disposer de la position de la frontière F pour détecter les cellules mises en valeur par le marqueur histologique. Le procédé de détermination de profil d'infiltration comprend ensuite, de 30 manière importante, la détermination 300 d'une carte de distance DM. 19 Un avantage de l'usage d'une carte de distance par rapport à la frontière tumorale est de permettre la quantification de l'infiltration des lymphocytes, en fonction de leur éloignement par rapport au bord de la tumeur. 5 Avantageusement, une détection d'une zone intérieure à la tumeur et d'une zone extérieure à la tumeur est mise en oeuvre, à l'aide du théorème de Jordan. Une région d'intérêt (ou ROI) peut avoir été préalablement repérée dans l'image I. Ensuite, à partir de l'image histopathologique I, la distance euclidienne de 10 chacun des pixels de la région d'intérêt par rapport à la frontière tumorale F, précédemment annotée ou détectée, est calculée. La distance d'un pixel, par rapport à la frontière F, est définie comme le minimum de l'ensemble formé par les distances euclidiennes entre ledit pixel et chacun des pixels de la frontière F. 15 Une fois lesdites distances calculées, des seuillages successifs des pixels de l'image I sont réalisés en fonction de leur distance à la frontière F, de sorte à obtenir un ensemble d'iso-courbes. Une iso-courbe DMd de la carte de distance DM est définie comme la courbe reliant l'ensemble des pixels situés à une distance de la frontière F égale à la valeur d. Une 20 représentation de la carte de distance DM peut être obtenue en superposant les iso-courbes DMd sur l'image histopathologique I. La Figure 8 représente la carte de distance DM obtenue à l'issue de l'étape 300, pour l'image I de la Figure 3. Par convention, les pixels à l'extérieur de la frontière F sont définis comme ayant une distance négative à la 25 frontière F, et les pixels à l'intérieur de la frontière sont définis come ayant une distance positive à la frontière. On a représenté les iso-courbes DMd correspondant à des distances positives. Un rectangle de l'image I a été représenté à une échelle plus importante au bas de la Figure 8. L'isocourbe DMci correspond aux pixels voisins de la frontière F. On a repéré 30 également l'iso-courbe DM5, reliant les pixels situés à une distance d = 5 pm de la frontière F. 20 Sur la Figure 8, la carte de distance est obtenue à l'échelle de toute la tumeur. La détermination de la carte de distance ne nécessite pas de placer des zones de quantification autour de la tumeur. On notera que l'étape 300 de détermination de la carte de distance DM 5 peut, de façon alternative, être mise en oeuvre préalablement à la détection des lymphocytes à l'étape 200, ou en parallèle de la détection des lymphocytes. Le calcul de la carte de distance DM prend en entrée l'image histopathologique I. 10 La carte distance DM d'une part, et l'image I* de détection des lymphocytes d'autre part, peuvent être utilisées conjointement pour regrouper les pixels détectés comme correspondant à des lymphocytes en fonction de leur distance au front tumoral. A ce titre, le procédé de la Figure 2 comprend une étape 400 de détermination du profil d'infiltration 15 des lymphocytes en fonction de leur distance à la frontière F. L'étape 400 prend en entrée la carte de distance DM, l'image histopathologique I et l'image binaire I* de détection des lymphocytes. Pour chaque valeur de distance d à la frontière F, est déterminée à l'étape 400 une densité f(d) de lymphocytes par unité de surface correspondant 20 à ladite distance. Un nombre ô de pixels par unité de surface est prédéterminé en fonction de la résolution de l'image I, ainsi qu'un nombre 0 moyen de pixels par lymphocyte. On raisonne ainsi avec une taille moyenne de lymphocyte, ce qui permet d'obtenir une tendance générale de l'infiltration lymphocytaire. Pour une résolution d'image de 0,329 25 micromètres par pixel, on a par exemple une valeur ô de 46193,2167 pixels par micromètre carré, et une valeur 0 de 315 pixels par lymphocyte en moyenne. En disposant de ces valeurs prédéterminées, la densité surfacique de lymphocytes s'obtient comme suit au cours d'une sous-étape 420 de calcul : 30 f (d) - + b) * B La valeur a correspond au nombre de pixels détectés comme marqués à la DAB, parmi les pixels se trouvant à une distance d de la frontière F, alors que la valeur b correspond à la différence du nombre total de pixels a * 8 21 situés à la distance d avec le nombre a de pixels marqués à la DAB. Le nombre (a+b) est donc le nombre total de pixels se trouvant à la distance d du front F. La valeur a est obtenue à une sous-étape 410 au cours de laquelle, pour la valeur d de distance, sont comptés les pixels étant à la 5 fois de couleur noire sur l'image I* (donc détectés comme marqués à la DAB sur l'image I) et situés entre l'iso-courbe DMd et l'iso-courbe consécutive DMd+1. On note que le comptage 410 est effectué seulement en fonction de la couleur noire ou blanche des pixels de l'image I*. Il n'est pas tenu compte 10 du nombre de lymphocytes croisant l'iso-courbe DMd. On a représenté en Figure 9 une vue en superposition, à une échelle plus importante que celle de la Figure 3, de l'image I et des iso-courbes DMd, sur laquelle on a repéré deux lymphocytes Li et L2 ; les pixels correspondant aux lymphocytes Li et L2 sont répartis, lors de l'étape 410, entre plusieurs 15 valeurs de distance, car ils chevauchent des iso-courbes. Par exemple, le lymphocyte Li s'étend entre les iso-courbes DMd et DMd+2; environ 40% des pixels correspondant à Li sont comptés comme étant à la distance d de la frontière tumorale, et environ 60')/0 des pixels correspondant à Li sont comptés comme étant à la distance d+1. 20 La mesure de densité de lymphocytes par unité de surface est ainsi obtenue à l'échelle de toute une tumeur. Cette mesure est répétable et reproductible, notamment parce qu'elle ne dépend pas d'un placement de zones de quantification ; cette mesure dépend principalement du repérage de la frontière F, et des valeurs des paramètres prédéterminés pour la 25 binarisation et pour le comptage des pixels correspondant à ds lymphocytes. De façon optionnelle, les valeurs de densité surfacique de lymphocytes obtenues à l'issue de l'étape 400 sont représentées sur une courbe telle qu'illustrée en Figure 10, faisant figurer en abscisse les valeurs de 30 distance à la frontière tumorale, et en ordonnée la densité surfacique de lymphocytes pour chacune de ces distances. Par convention, les distances négatives (extérieur de la frontière tumorale) sont représentées à gauche 22 et les distances positives (intérieur de la frontière tumorale) sont représentées à droite. La courbe ainsi obtenue fournit un profil d'infiltration lymphocytaire au sein de la tumeur visible sur l'image histopathologique I. 5 De façon optionnelle, l'observation du profil d'infiltration par un expert, par exemple un anatomo-pathologiste, permet la classification du profil dans une catégorie, parmi les quatre types d'infiltration lymphocytaire suivants, associés à des résultats cliniques différents (voir à ce titre Allard 10 et al. (2012), Linear quantification of lymphoid infiltration of the tumor margin: a reproducible method, developed with colorectal cancer tissues, for assessing highly variable prognostic factor, Diagnostic Pathology, 7(1):156, ainsi que Emile et al. (2017), Classification histologique et altérations moléculaires des histiocytosis, La Presse Médicale, 46(1) :46- 15 54) : - Type 1 : Pas d'infiltration lymphocytaire ; - Type 2 : Faible infiltration lymphocytaire du front tumoral ; - Type 3 : Forte infiltration lymphocytaire du front tumoral uniquement ; - Type 4 : Forte infiltration lymphocytaire du front tumoral et de l'intérieur 20 de la tumeur. En effet, un profil d'infiltration lymphocytaire obtenu à l'aide du procédé décrit ci-avant permet de faire la distinction entre le cas d'une infiltration du front tumoral uniquement (densité surfacique de lymphocytes élevée uniquement pour de faibles valeurs de distance à la frontière), et le cas 25 d'une infiltration lymphocytaire jusqu'au coeur de la tumeur (densité REVENDICATIONS1. Procédé de détermination d'un profil d'infiltration de cellules biologiques d'intérêt dans un objet biologique d'intérêt, à partir d'une image histopathologique (I) numérique de tissus biologiques, une frontière (F) de l'objet biologique ayant préalablement été déterminée au sein de l'image histopathologique, un marqueur histologique ayant préalablement été appliqué aux tissus biologiques, le procédé, exécuté par une unité de traitement, comprenant la génération (200) d'une image (1*) de détection de cellules biologiques (I') comprenant des pixels d'une couleur prédéterminée, les pixels de la couleur prédéterminée correspondant à des zones de l'image histopathologique (I) marquées à l'aide du marqueur histologique, le procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend en outre les étapes suivantes : - détermination (300) d'une carte de distance (DM) comprenant des iso-courbes (DMd), chaque iso-courbe comprenant l'ensemble des pixels (x,y) de la région d'intérêt situés à une distance euclidienne (D(x,y)) à la frontière (F) égale à une valeur de distance (d) ; - à partir de la carte de distance (DM), calcul (400) d'une courbe représentative de la densité surfacique (f(d)) de cellules biologiques d'intérêt, le calcul comprenant un comptage (410), pour chaque valeur de distance (d), de pixels étant à la fois de la couleur prédéterminée sur l'image de détection (I*) et situés entre l'iso-courbe (DMd) associée à ladite valeur de distance (d) et l'iso-courbe consécutive. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel lors de l'étape de calcul (400), la densité surfacique (f(d)) de cellules biologiques d'intérêt est obtenue par la formule suivante : f (d) = P-0' 24 où a correspond au nombre de pixels qui sont à la fois de la couleur prédéterminée sur l'image de détection (I*) et situés entre l'iso-courbe (DMd) associée à la valeur de distance d et l'iso-courbe consécutive, 13 correspond au nombre total de pixels entre l'iso-courbe (DMd) associée 5 à la valeur de distance d et l'iso-courbe consécutive, B est un nombre moyen prédéterminé de pixels par cellule biologique, et 5 est un nombre prédéterminé de pixels par unité de surface. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel l'étape (200) de 10 génération de l'image (I*) de détection de cellules biologiques comprend les sous-étapes suivantes : -à partir de l'image histopathologique (I), séparation (210) du marqueur histologique par rapport à d'autres marqueurs, par traitement d'image donnant une image intermédiaire (Iint) ; 15 - binarisation d'Otsu (220) de l'image intermédiaire (Lit), - détection (230) de cellules biologiques d'intérêt à partir de l'image intermédiaire (Iint) et d'une image résultant de la binarisation d'Otsu, par séparation d'une première classe formée de pixels correspondant au marqueur histologique par rapport à une deuxième classe formée des 20 autres pixels. 4. Procédé selon la revendication 3, dans lequel l'image histopathologique (I) comprend, en complément du marqueur histologique, un marqueur non spécifique, par exemple à l'hématoxyline ou à l'éosine, 25 l'étape de séparation (210) du marqueur histologique comprenant une déconvolution des couleurs de l'image histopathologique (I) sur l'espace teinte/saturation/luminance. 5. Procédé selon l'une des revendications 3 ou 4, dans lequel l'étape de 30 détection (230) des cellules biologiques d'intérêt comprend une classification k-means à l'aide d'un centroïde de la classe des cellules biologiques d'intérêt et d'un centroïde de la classe fibrose. 25 6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel le centroÏde de la classe des cellules biologiques d'intérêt est pris égal au niveau de gris minimal de l'image intermédiaire (Lnt), et dans lequel l'équation du centroide de la classe fibrose est la suivante : Ck 5 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, comprenant une étape préliminaire de détermination (100), manuelle ou automatisée, de la frontière (F) au sein de l'image histopathologique (I). 10 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, dans lequel l'image histopathologique (I) est une lame virtuelle constituée par tuilage d'une pluralité d'images microscopiques des tissus biologiques. 15 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, où dans la carte de distance (DM), les pixels de l'image situés hors de la frontière (F) sont associés à une distance (d) négative, et les pixels de l'image situés à l'intérieur de la frontière (F) sont associés à une distance (d) positive, la courbe de densité surfacique (f(d)) de cellules biologiques d'intérêt 20 comprenant les distances négatives sur une partie gauche et les distances positives sur une partie droite. 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, comprenant une étape supplémentaire de représentation graphique (500) d'une carte 25 d'infiltration des cellules d'intérêt (C) sur laquelle les iso-courbes (DMd) sont superposées à l'image histopathologique (I) de la région d'intérêt, la couleur d'une zone entre deux iso-courbes (DMd) consécutives étant variable en fonction de la valeur de densité surfacique (f(d)) de cellules biologiques d'intérêt. 30 26 11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, comprenant des étapes supplémentaires de détermination d'une aire sous la courbe de densité surfacique (f(d)) de cellules biologiques d'intérêt en fonction de la distance à la frontière (F), pour un intervalle donné de distance, et de comparaison 5 de l'aire obtenue à une valeur seuil prédéterminée. 12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, dans lequel l'objet biologique d'intérêt est une tumeur ou un ensemble de tumeurs, et la frontière (F) est une frontière tumorale. 10 13. Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, dans lequel l'image histopathologique (I), sur laquelle la frontière (F) a préalablement été déterminée, est téléchargée par l'unité de traitement auprès d'une base de données (12) distante, de préférence par l'intermédiaire d'une 15 connexion réseau. 14. Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, dans lequel les cellules biologiques d'intérêt sont des lymphocytes T, ou des lymphocytes B, ou des cellules NK. 20 15. Unité de traitement (10) comprenant : - une mémoire (11) configurée pour enregistrer une image histopathologique (I), - une première sous-unité configurée pour déterminer une carte de 25 distance (DM) comprenant des iso-courbes (DMd), chaque iso-courbe étant associée à une valeur de distance (d) et comprenant l'ensemble des pixels (x,y) de l'image histopathologique (I) situés à une distance euclidienne (D(x,y)) d'une frontière (F) égale à ladite valeur de distance (d), 30 - une deuxième sous-unité configurée pour calculer une courbe représentative de la densité surfacique de cellules biologiques d'intérêt dans l'image histopathologique (I) en fonction de la distance par rapport à la frontière (F), 27 l'unité de traitement étant configurée pour mettre en oeuvre le procédé selon l'une des revendications 1 à 14. 16. Produit programme d'ordinateur comprenant des instructions de code 5 qui, lorsqu'elles sont exécutées par une unité de traitement, permettent la mise en oeuvre du procédé de détermination de profil d'infiltration de l'une des revendications 1 à 14.