Brevet FR3078261A1 — publié le 20190830

HYDROGEL POUR STIMULER LA NEUROTISATION, L'OSTEOGENESE ET L'ANGIOGENESE La présente invention concerne un hydrogel utile pour favoriser la neurotisation, l'ostéogenèse et l'angiogenèse. ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE Dans le domaine de la médecine régénérative et de l'ingénierie tissulaire, le système nerveux périphérique reste, encore à ce jour, peu considéré dans un contexte de régénération du tissu osseux. Or, des données biologiques, expérimentales et cliniques démontrent des interactions entre les principaux évènements de la reconstruction osseuse, à savoir sa néovascularisation, son innervation et la néoformation osseuse. Des données biologiques récentes obtenues par l'équipe des inventeurs (Silva et al, Cell Death and Disease, 2017 Dec 13;8(12):3209) ont démontré, à l'aide de modèles de co-cultures en deux dimensions de neurones sensoriels et de cellules mésenchymateuses, l'impact de la communication entre ces deux types cellulaires sur l'ostéogénèse. Il n'existe toutefois pas à l'heure actuelle de matériaux ou de matrices tridimensionnelles permettant de mettre ces observations en pratique, tant sur le plan expérimental que thérapeutique, en vue du développement d'un nouveau matériau innovant dédié à la régénération osseuse. C'est dans ce contexte que les inventeurs ont développé un nouvel hydrogel, capable de recruter des neurones, notamment sensoriels, et d'héberger d'autres types cellulaires, et plus particulièrement des cellules ostéoformatrices et endothéliales. RESUME DE L'INVENTION Un premier aspect de l'invention concerne un hydrogel comprenant - i) un polypeptide de type élastine comprenant au moins un résidu alcénylé; et ii) un peptide capable de recruter des cellules neuronales et/ou endothéliales, notamment un peptide IKVAV. Selon un mode particulier de réalisation, l'hydrogel selon l'invention comprend : i) un polypeptide de type élastine comprenant au moins un résidu alcénylé, notamment une méthionine alcénylé; 2 ii) un peptide capable de recruter des cellules neuronales et/ou endothéliales, notamment un peptide IKVAV; et iii) un polymère de réticulation à terminaisons thiols. 5 Selon un mode particulier de réalisation, le polypeptide de type élastine est un polypeptide comprenant au moins une occurrence de la séquence VPGMG. De manière non-limitative, le peptide de type élastine peut notamment être le polypeptide MGTELAAASEFTHMW[VPGMG120 (ELP20), le polypeptide MW[VPGVGVPGMG(VPGVG)215 (ELPM20) ou le polypeptide MW[VPGVGVPGMG(VPGVG)2110 (ELPM40). 10 Selon un mode particulier de réalisation, le peptide est un peptide IKVAV, notamment un peptide IKVAV de formule Cys-{Beta-Ala}-Ile-Lys-Val-Ala-Val-{Beta-Ala}-Cys. Dans une autre variante, le polymère de réticulation à terminaisons thiols est un polymère multi-branché. 15 Plus particulièrement, le polymère de réticulation peut être un poly(éthylène glycol) à 4 branches à terminaisons thiols, notamment un poly(éthylène glycol) PEG à 4 branches à terminaisons thiols de masse moléculaire moyenne comprise entre 10 et 30 kDa. Le poly(éthylène glycol) à 4 branches à terminaisons thiols peut notamment avoir une masse moléculaire moyenne de 20 kDa. 20 Dans un mode particulier de réalisation, le polymère de réticulation à terminaisons thiols, le polypeptide type élastine comprenant un résidu méthionine alcénylé, et le peptide IKVAV sont présents dans l'hydrogel en un ratio thiol / alcène équimolaire. Selon un autre mode particulier de réalisation, la concentration de l'hydrogel est comprise entre 5 et 15% 25 en masse volumique (p/v), en particulier entre 7 et 8% (p/v). Dans un autre mode de réalisation, le module de conservation G' de l'hydrogel est compris entre 1 et 5, de préférence entre 1 et 1,5 kPa. 30 L'hydrogel selon l'invention peut en outre comprendre au moins un agent actif sur le plan biologique, notamment au moins un facteur de croissance. Un autre aspect de l'invention concerne l'hydrogel décrit dans la présente demande, pour son utilisation en tant que médicament. 35 Selon un autre aspect l'invention concerne l'hydrogel décrit dans la présente demande, pour son utilisation dans une méthode de régénération osseuse. 3 Par ailleurs, l'invention concerne également une méthode de culture cellulaire in vitro, comprenant la mise en culture de cellules dans un hydrogel tel que défini dans la présente demande. 5 DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1. A) représentation schématique des composants de l'hydrogel et de la méthode de production ; B) photographie montrant un hydrogel ELPM40 + PEG. Barre = 1 mm. 10 Figure 2. caractérisation rhéologique des hydrogels ELPM40 + PEG à différentes concentrations finales à 37 °C. Les modules élastiques (G') pour chaque concentration sont indiqués dans la figure. Figure 3. microscopie électronique à balayage de (A) ELPM40 + PEG, (B) ELPM40 + 25 % IKVAV, (C) ELPM40 +25 % VKAIV, (D) ELPM40 +50 % IKVAV, (E) ELPM40 +50 % VKAIV montrant la 15 structure poreuse de ces hydrogels. F) Quantification de la taille des pores : les compositions 25 % de peptide d'adhésion peptide ont des pores plus petits que les autres compositions. Figure 4. analyse in vitro de la dégradation des hydrogels par détermination des amines libres en solution après incubation avec de la protéinase K (0,5 U/mL) pendant 7 h. 20 Figure 5. activité métabolique des cellules endothéliales (ECs), des cellules stromales mésenchymateuses de la moelle osseuse (BMSCs) et des neurones sensoriels (SNs). Toutes les compositions d'hydrogels ont permis l'attachement et la culture des trois types cellulaires. 25 Figure 6. Morphologie des cellules endothéliales 7 jours après leur culture dans (A) ELPM40 + PEG, (B) ELPM40 + 25 % IKVAV, (C) ELPM40 + 25 % VKAIV, (D) ELPM40 + 50 % IKVAV et (E) ELPM40 + 50 % VKAIV. Dans toutes les compositions, les cellules ont pu entrer et migrer à l'intérieur des hydrogels et former différentes structures. 30 Figure 7. cellules BMSC associées à (A) ELPM40 + PEG, (B) ELPM40 +25 % IKVAV, (C) ELPM40 + 25 % VKAIV, (D) ELPM40 + 50 % IKVAV et (E) ELPM40 + 50 % VKAIV. Les cellules présentent une morphologie sphéroïde avec toutes les compositions d'hydrogels. (F) Détail de cellules plongées dans un hydrogel ELPM40 + 50 % IKVAV montrant deux noyaux connectés (indiqués par la flèche blanche), suggérant que les cellules peuvent proliférer à l'intérieur du gel. 35 Figure 8. Morphologie et diffusion de neurones sensoriels cultivés dans (A) ELPM40 + PEG, (B) ELPM40 +25 % IKVAV, (C) ELPM40 +25 % VKAIV, (D) ELPM40 +50 % IKVAV et (E) ELPM40 4 + 50 % VKAIV. Barres 100 um. (F) Longueur moyenne des neurites mesurée pour toutes les compositions d'hydrogels. Figure 9. Expression de gène dans des cellules BMSC cultivées dans un milieu ostéogénique pendant 5 7 jours, en association avec différents hydrogels. L'expression est représentée par rapport à la composition ELPM40 + PEG, utilisée comme contrôle. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION 10 La présente invention vise un hydrogel biocompatible capable de favoriser la neurotisation, l'ostéogenèse et l'angiogenèse. Cet hydrogel est caractérisé en ce qu'il comprend un polypeptide de type élastine comprenant au moins un résidu méthionine alcénylé, et un peptide capable de recruter des cellules neuronales et/ou endothéliales, notamment un peptide IKVAV. Plus particulièrement, l'hydrogel selon la présente invention est caractérisé en ce qu'il comprend i) un polypeptide de type 15 élastine comprenant au moins un résidu méthionine alcénylé, et ii) un peptide capable de recruter des cellules neuronales et/ou endothéliales, notamment un peptide IKVAV et iii) un polymère de réticulation à terminaisons thiols. L'hydrogel selon l'invention peut notamment être formé au moyen d'un polymère de réticulation à 20 terminaisons thiols. Ledit polymère est choisi parmi les polymères permettant la formation d'un hydrogel biocompatible, en ce sens qu'il n'est pas toxique pour les cellules. Il permet également avantageusement la diffusion d'oxygène et de nutriments, ainsi que celle de dioxyde de carbone et de déchets métaboliques pour alimenter les cellules et permettre leur survie. Les polymères de la solution d'hydrogel peuvent être d'origine naturelle, comme les protéines de matrice extracellulaire, ou 25 synthétique comme le poly(éthylène glycol) (PEG), le poly(oxazoline) (P0x) ou la poly(sarcosine) (PSar). Selon un mode de réalisation, le polymère de réticulation est plus particulièrement un polymère multi-branché, notamment un polymère linéaire ou un polymère multi-branché ayant au moins trois branches, plus particulièrement au moins quatre branches, ledit polymère linéaire multi-branché comprenant un groupement thiol à chacune de ses extrémités. Selon un mode particulier de réalisation, 30 le polymère multi-branché est un polymère à quatre branches comprenant un groupement thiol à l'extrémité de chacun de ses branches. Peuvent notamment être cités les polymères de type poly(éthylène glycol) (ou PEG) linéaires ou à trois ou quatre branches, ou plus de quatre branches, plus particulièrement quatre branches, chaque extrémité des PEG linéaires comprenant un groupement thiol, ou chaque branches des PEG multi-branché comprenant à leurs extrémités un groupement thiol. Dans 35 un mode de réalisation, l'hydrogel comprend un PEG à quatre branches comprenant chacun à son extrémité un groupement thiol, la masse moléculaire moyenne dudit PEG étant comprise entre 1 et 100 5 kDa, plus particulièrement entre 10 et 30 kDa, le PEG ayant de manière encore plus particulière une masse moléculaire moyenne de 20 kDa. Le second composant de l'hydrogel selon l'invention est un polypeptide de type élastine (ou ELP pour 5 Elastin-Like Polypeptide en anglais) comprenant au moins un résidu méthionine alcénylé. Ce type de polypeptides, leur procédé de fabrication par génie génétique, et leur purification sont connus de l'homme du métier qui peut notamment se référer à la demande internationale W02017021334 et aux articles Petitdemange et al. (Biomacromolecules. 2017 Feb 13;18(2):544-550) et Petitdemange et al. (Bioconjug Chem. 2017 May 17;28(5):1403-1412). Dans le cadre de la présente invention, le terme 10 "résidu méthionine alcénylé" signifie que la chaîne latérale du résidu méthionine est liée de manière covalente à un groupement comprenant un groupe alcène, c'est-à-dire comprenant au moins une double liaison entre deux atomes de carbone. De manière préférée, le terme "groupe alcène" se réfère à la présence d'un groupe -CH=CH2 dans le groupement lié au résidu méthionine. Selon un mode particulier de réalisation, le groupement méthionine est lié au groupement de formule (I): 15 Selon un mode de réalisation, la synthèse d'un ELP alcénylé au moyen du groupement de formule (I) peut été obtenue par thioalkylation chimiosélective au niveau de chaînes latérales méthionines en utilisant un éther d'allyle et glycidyle selon la procédure décrite dans Petitdemange et al. (Bioconjug 20 Chem. 2017 May 17;28(5):1403-1412). Selon un mode de réalisation, l'ELP alcénylé mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention comprend au moins une occurrence de la séquence d'acides aminés VPGMG dans laquelle le résidu méthionine est alcénylé. Dans un mode de réalisation, l'ELP alcénylé a une structure de formule (II) 25 Z4VPGXG111-0H (II) dans laquelle: Z est un peptide comprenant entre 1 et 20 acides aminés; X représente un résidu glycine ou un résidu méthionine alcénylé, notamment un résidu méthionine alcénylé de formule (III): 6 ..11.111V' n est un nombre entier compris entre 1 et 200, plus particulièrement entre 10 et 200, de manière encore plus particulière entre 15 et 50, notamment entre 20 et 40; et dans laquelle le rapport entre le ratio molaire valine / méthionine alcénylée en position X est 5 compris entre 0:1 et 10:1, plus particulièrement entre 1:1 et 5:1, ledit ratio étant plus particulièrement de 3:1. Selon un mode de réalisation, n est un nombre entier compris entre 30 et 50, en particulier entre 35 et 45, n étant plus particulièrement égal à 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45. Plus particulièrement, n est égal à 40. 10 Selon un mode particulier de réalisation, Z ne comprend pas la séquence d'acides aminés IKVAV. Selon un autre mode de réalisation, les acides aminés compris dans Z immédiatement en amont du motif [VPGXG111 correspondent au dipeptide MW. Z peut notamment être constitué du dipeptide MW ou comprendre ce dipeptide. A titre illustratif, le peptide ELP20 décrit ci-dessous comprend une séquence Z dans laquelle le dipeptide MW se trouve à son extrémité C-terminale dans la séquence 15 MGTELAAASEFTHMW. Selon un mode de réalisation, l'ELP employé est un peptide de formule Z-IVPGXG111 dans laquelle X est une méthionine alcénylée. Selon un autre mode de réalisation l'ELP employé est un peptide de formule Z-IVPGXG111 dans laquelle le rapport entre le ratio molaire valine / méthionine alcénylée en position X est compris entre 0:1 et 10:1, 20 plus particulièrement entre 1:1 et 5:1, ledit ratio étant plus particulièrement de 3:1. Selon un autre mode de réalisation l'ELP employé est un peptide de formule Z[VPGVGVPGMG(VPGVG)21x, en particulier MW[VPGVGVPGMG(VPGVG)21x dans laquelle x est un nombre entier compris entre 2 et 15, plus particulièrement entre 5 et 10. Selon un mode de réalisation, l'ELP employé est dérivé d'un peptide choisi parmi le peptide 25 MGTELAAASEFTHMW[VPGMG1 20 (ELP20), le peptide MW[VPGVGVPGMG(VPGVG)215 (ELPM20) ou le peptide MW[VPGVGVPGMG(VPGVG)2110 (ELPM40) décrits dans W02017021334, ledit peptide comprenant au moins un résidu méthionine alcénylé. Selon un mode particulier de réalisation, l'ELP a la structure suivante: 7 R= '"'s's." / "w(3:1) , r... s plus particulièrement la structure MW[VPGVGVPGMaG(VPGVG)2110 (ELP-M(alcène)-40), où Ma représente le résidu méthionine alcénylé de formule (III) ci-dessus. 5 Le composant iii) de l'hydrogel est un peptide capable de recruter des cellules neuronales et/ou endothéliales. On peut notamment citer à titre de peptides capables de recruter des cellules endothéliales les peptides REDV, RGD et GRGDSP dérivés de la fibronectine, IKLLI, IKVAV, PDSGR et YIGSR, dérivés de la laminine, et le peptide DGEA dérivé du collagène de type I. A titre de peptides capables de recruter des cellules neuronales, nous pouvons citer, notamment, les peptides YIGSR, RNIAEIIKDI 10 et IKVAV dérivés de la laminine. Selon un mode particulier de réalisation, le peptide capable de recruter des cellules neuronales et/ou endothéliales et un peptide IKVAV, c'est-à-dire un peptide comprenant la séquence d'acides aminés IKVAV dérivée de la laminine A. Dans un mode particulier de réalisation, le peptide capable de recruter des cellules neuronales et/ou endothéliales inclus dans l'hydrogel de l'invention est un peptide, notamment un peptide comprenant la séquence IKVAV, comprenant des 15 résidus cystéine à chacune de ses extrémités. Les résidus cystéines peuvent être liés de manière covalente directement à la séquence d'acides aminés IKVAV, ou par l'intermédiaire d'espaceurs. Selon un mode particulier de réalisation, les résidus cystéine sont liés au peptide capable de recruter des cellules neuronales et/ou endothéliales, notamment à un peptide IKVAV, par l'intermédiaire d'un espaceur, notamment un espaceur peptidique ou pseudopeptidique. L'espaceur peut notamment être un acide 20 aminé ou une séquence d'acide aminés (notamment un di- ou tripeptide), notamment un acide aminé bêta, plus particulièrement un acide aminé bêta-Ala. Ainsi, selon un mode particulier de réalisation, le peptide capable de recruter des cellules neuronales et/ou endothéliales est un peptide IKVAV de formule Cys-{espaceur} -Ile-Lys-Val-Ala-Val-{espaceur} -Cys, notamment le peptide de formule Cys-{BetaAla} -Ile-Lys-Val-Ala-Val- {Beta-Ala} -Cys. 25 La quantité des composants de l'hydrogel peut varier dans une large mesure, pour autant que l'hydrogel résultant favorise la neurotisation, l'ostéogenèse et/ou l'angiogenèse. Selon un mode particulier de réalisation, les différents composants sont en une quantité respectant un ratio molaire thiol / alcène 8 compris entre 10:1 et 1:10, notamment entre 5:1 et 1:5, en particulier entre 2:1 et 1:2. Selon un mode particulier de réalisation, le ratio thiol / alcène est équimolaire (i.e. il correspond à un ratio molaire 1:1). Il est entendu que les groupements thiols sont présents sur le polymère de réticulation et/ou sur le peptide capable de recruter des cellules neuronales et/ou endothéliales, notamment un peptide IKVAV tel que 5 décrit ci-dessus. Ainsi, l'hydrogel peut comprendre des quantités variables de chacun de ses composants, tout en respectant les ratios définis ci-avant. Par exemple, les groupes thiols portés par le peptide IKVAV peuvent représenter entre 10 et 75 % en moles de l'ensemble des groupes thiols apportés par le peptide IKVAV et le polymère de réticulation, plus particulièrement entre 20 et 60 % en moles, en particulier entre 25 et 50 % en moles de l'ensemble des groupes thiols apportés par le peptide IKVAV et le polymère 10 de réticulation. Les proportions des composants de l'hydrogel sont également choisies de manière à obtenir un hydrogel présentant des propriétés rhéologiques adaptées au développement de cellules, notamment de cellules neuronales, osseuses ou endothéliales, en particulier de cellules neuronales. L'invention permet ainsi 15 d'adapter de manière très fine la structure de l'hydrogel au(x) type(s) cellulaire(s) dont le développement doit être favorisé. Selon un mode de réalisation, la rigidité de l'hydrogel répond au paramètre de module de conservation G' compris dans l'intervalle suivant: 1 kPa REVENDICATIONS1. Hydrogel comprenant - i) un polypeptide de type élastine comprenant au moins un résidu alcénylé, et ii) un peptide capable de recruter des cellules neuronales et/ou endothéliales. 2. Hydrogel selon la revendication 1, comprenant en outre : iii) un polymère de réticulation à terminaisons thiols. 3. Hydrogel selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le peptide ii) est un peptide IKVAV, notamment un peptide de formule Cys-{Beta-Ala}-Ile-Lys-Val-Ala-Val-{Beta-Ala}-Cys 4. Hydrogel selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le polypeptide de type élastine est un polypeptide comprenant au moins une occurrence de la séquence VPGMG. 5. Hydrogel selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le polypeptide de type élastine est le polypeptide MGTELAAASEFTHMW[VPGMG120 (ELP20), le polypeptide MW[VPGVGVPGMG(VPGVG)215 (ELPM20) ou le polypeptide MW[VPGVGVPGMG(VPGVG)2110 (ELPM40). 6. Hydrogel selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que polymère de réticulation à terminaisons thiols est un polymère multibranches. 7. Hydrogel selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le polymère de 25 réticulation est un poly(éthylène glycol) à 4 branches à terminaisons thiols, ayant notamment une masse moléculaire moyenne comprise entre 10 et 30 kDa, notamment une masse moléculaire moyenne de 20 kDa. 8. Hydrogel selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le polymère de 30 réticulation à terminaisons thiols, le polypeptide type élastine comprenant un résidu méthionine alkénylé, et le peptide IKVAV sont présents en un ratio thiol / alkène équimolaire. 9. Hydrogel selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la concentration de l'hydrogel est comprise entre 5 et 15% en masse volumique (p/v), en particulier entre 7 et 8% (p/v). 35 20 10. Hydrogel selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le module de conservation G' de l'hydrogel est compris entre 1 et 1,5 kPa. 19 11. Hydrogel selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, comprenant en outre au moins un agent actif sur le plan biologique, notamment au moins un facteur de croissance. 5 12. Support tridimensionnel capable d'héberger des cellules d'intérêt, caractérisé en ce qu'il comprend un hydrogel selon l'une quelconque des revendications 1 à 11. 13. Hydrogel selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 ou support selon la revendication 12, pour son utilisation en tant que médicament. 10 13. Hydrogel selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 ou support selon la revendication 12, pour son utilisation dans une méthode de régénération osseuse. 14. Méthode in vitro de culture cellulaire, comprenant la mise en culture de cellules dans un hydrogel 15 tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 11 ou dans un support selon la revendication 12.