Brevet FR3075798A1 — publié le 20190628

Procédé d'extraction de molécules hydrosolubles intracellulaires essentiellement non-destructif de microalgues unicellulaires 1. Domaine de l'invention Le domaine de l'invention est celui des procédés d'extraction de molécules hydrosolubles intracellulaires de microalgues unicellulaires. Plus précisément, l'invention concerne les procédés d'extraction comprenant l'application d'un champ électrique pulsé. 2. Art antérieur Les cellules des microalgues sont dotées de chloroplaste(s). Le chloroplaste est essentiellement connu pour sa capacité à réaliser la photosynthèse. Une autre caractéristique du chloroplaste est de posséder de l'acide désoxyribonucléique (ADN), modifiable à façon à l'aide des méthodes de biologie moléculaire en vue de produire des protéines d'intérêt. Il a donc été envisagé de faire produire aux chloroplastes des plantes terrestres et des microalgues des protéines d'intérêt économique afin de remplacer les méthodes actuelles de production. A ce jour, la microalgue verte Chlamydomonas reinhardtii a notamment été utilisée pour produire des protéines d'intérêt thérapeutique. Les microalgues présentent donc un potentiel biotechnologique important car elles produisent des molécules intéressantes, notamment des protéines d'intérêt, pour différents secteurs industriels : alimentaire, santé, parapharmacie, énergétique, cosmétiques, etc. Les procédés biotechnologiques actuels d'extraction de molécules d'intérêt de microalgues présentent généralement les étapes successives suivantes : (1) Obtenir de la biomasse de microalgues ; (2) Induire la production et l'accumulation de molécules d'intérêt dans les microalgues ; (3) Récolter la biomasse ; et (4) Extraire et purifier des molécules d'intérêt. L'un des freins ralentissant le développement à l'échelle industrielle de ces procédés est notamment relié au coût élevé du processus post-culture et de la remise en culture des microalgues. Des méthodes innovantes sont donc recherchées pour diminuer les coûts de production/extraction de molécules d'intérêt, notamment des protéines d'intérêt, issues de microalgues afin que ces dernières soient compétitives avec les méthodes actuelles de production de protéines animales et/ou végétales. 2 Le phénomène d'électroporation, ou électro-perméabilisation, a été observé pour la première fois en 1754 par Nollet : il correspond à une augmentation de la perméabilité membranaire de cellules lorsque ces dernières sont soumises à un champ électrique. Mais il 5 a fallu attendre les années 1980 pour que les premières applications de procédés par champs électriques pulsés (CEP) soient développées. Les procédés par CEP ont tout d'abord été utilisés dans le domaine de la médecine afin de transférer de l'ADN dans des cellules. Ils ont ensuite pris leur essor dans le domaine des biotechnologies grâce à de nombreuses autres applications. Parmi celles-ci peuvent être citées la transformation génétique et 10 l'inactivation de micro-organismes ainsi que l'extraction de biomolécules. Plusieurs études récentes portent sur l'extraction de composés hydrosolubles de microalgues grâce à un procédé impliquant un traitement impliquant des champs électriques pulsés (traitement CEP). Ces études sont basées soit sur l'application seule d'un traitement CEP, soit sur une succession de procédés d'extraction différents incluant 15 l'application d'un traitement CEP. Parmi les méthodes constituées d'une succession de procédés, on trouve notamment une combinaison d'un traitement CEP avec un échauffement des suspensions de microalgues ou encore des procédés comprenant une un traitement CEP suivi d'une extraction par solvant. Aucune des méthodes d'extraction utilisées dans les études mentionnées ci-dessus ne s'est révélée complètement satisfaisante. 20 Elles ont toutes pour désavantage d'être destructrices de la biomasse à extraire. Elles produisent donc des déchets biologiques voire organiques dans le cas d'utilisation de solvants d'extraction. De plus la culture de nouvelle biomasse est extrêmement coûteuse et chronophage. Certaines méthodes cumulent en outre d'autres désavantages comme par exemple 25 une non-sélectivité des molécules extraites et donc la nécessité d'étapes de purification post-extraction, un faible rendement d'extraction protéique (ne dépassant que dans de très rares cas 10% du contenu protéique cellulaire total), une mauvaise efficacité énergétique (surconsommation électrique), ou encore une mauvaise efficacité de production (temps nécessaire à l'extraction anormalement long). 30 3. Objectifs de l'invention L'invention a pour objectif de pallier au moins certains inconvénients de l'art antérieur. 3 L'invention a notamment pour objectif de proposer un procédé d'extraction de molécules hydrosolubles intracellulaires de microalgues unicellulaires permettant de préserver la viabilité de l'essentiel de la biomasse extraite. Un autre objectif de l'invention est, au moins selon certains modes de réalisations 5 avantageux, de proposer un procédé permettant l'extraction de molécules hydrosolubles intracellulaires de microalgues, notamment de protéines, issues essentiellement de chloroplastes. Un autre objectif de l'invention est, au moins selon certains modes de réalisations avantageux, de proposer un procédé permettant l'extraction de molécules hydrosolubles 10 intracellulaires de microalgues, notamment de protéines, avec de bons rendements. Un autre objectif de l'invention est, au moins selon certains modes de réalisations avantageux, de proposer un procédé simple, rapide, efficace énergétiquement et ayant un faible coût de revient. Un autre objectif de l'invention est, au moins selon certains modes de réalisations, de 15 proposer un procédé permettant d'obtenir des protéines à un coût comparable ou moindre que les protéines animales et végétales actuellement disponibles sur le marché. 4. Exposé de l'invention La présente invention concerne un procédé d'extraction de molécules hydrosolubles 20 intracellulaires essentiellement non-destructif de microalgues unicellulaires. Le procédé comprend : - une étape de fourniture de microalgues unicellulaires, les microalgues étant dépourvues de paroi cellulaire secondaire ou ayant une paroi cellulaire secondaire d'épaisseur inférieure ou égale à 0.5 ,i,m; 25 - une étape de placement des microalgues dans un milieu de faible conductivité électrolytique pour former une suspension de microalgues, la conductivité électrolytique totale de la suspension de microalgues ayant une valeur allant de 15 à 40 ,I,S.crri-1 à 25°C; - une étape d'application d'un champ électrique pulsé sur la suspension de microalgues afin d'obtenir une suspension de microalgues temporairement perméabilisées, le champ 30 électrique pulsé ayant une force électrique allant de 0,5 à 1 kV.cm-1; et, - une étape d'incubation de la suspension de microalgues temporairement perméabilisées, afin d'obtenir des microalgues appauvries en molécules hydrosolubles intracellulaires en 4 suspension dans un milieu enrichi en molécules hydrosolubles extraites, l'étape d'incubation permettant la diffusion de molécules hydrosolubles intracellulaires des microalgues au moins temporairement perméabilisées dans le milieu de faible conductivité électrolytique. Au sens de la présente invention, on entend par « essentiellement non destructif », le 5 fait que le procédé permette de garder viables autant que possible les cellules de microalgues soumises au champ électrique pulsé. Le procédé selon la présente invention permet notamment de garder viables au moins 40%, préférentiellement au moins 60%, et très préférentiellement au moins 80% des cellules de microalgues. On entend par « molécules hydrosolubles intracellulaires », notamment des protéines, des 10 glucides ou encore des ions se trouvant à l'intérieur des cellules avant extraction. Les inventeurs de la présente invention ont pu démontrer expérimentalement qu'il est possible d'extraire de manière efficace des molécules hydrosolubles intracellulaires de microalgues tout en préservant au mieux la viabilité de ces dernières, permettant ainsi de les réutiliser ultérieurement pour une nouvelle extraction selon le procédé d'extraction de 15 l'invention. En particulier, les inventeurs ont mis en évidence qu'à un champ électrique pulsé de force électrique allant de 0,5 kV.cm-1 à 1 kV.cm-1, il est possible de perméabiliser de manière réversible et suffisante (pour une extraction non négligeable de molécules hydrosolubles) la membrane plasmique et le cas échéant les différentes parois la surplombant, en particulier la paroi cellulaire primaire et/ou la paroi cellulaire secondaire, 20 de microalgues unicellulaires dépourvues de paroi cellulaire secondaire ou ayant une paroi cellulaire secondaire d'épaisseur inférieure ou égale à 0,5 iim. A contrario, un champ électrique pulsé de force électrique strictement inférieure à 0,5 kV.cm-1 est trop faible pour perméabiliser de manière suffisante la membrane plasmique et le cas échéant les différentes parois surplombant la microalgue et ne permet pas l'extraction en quantité non- 25 négligeable de molécules hydrosolubles intracellulaires. Par ailleurs, un champ électrique pulsé de force électrique strictement supérieure à 1 kV.cm-1 entraîne une perméabilisation irréversible de la membrane plasmique et le cas échéant des parois cellulaires la surplombant pour une partie voire la totalité des microalgues, sans gain supplémentaire sur le rendement en extraction des molécules hydrosolubles intracellulaire. Une 30 perméabilisation irréversible de la membrane plasmique et le cas échéant des parois cellulaires la surplombant implique in fine la destruction des cellules soumises au champ électrique pulsé, ce qui n'est pas souhaité dans la présente invention. Le placement des 5 microalgues dans un milieu de faible conductivité électrolytique, la conductivité électrolytique totale du milieu de faible conductivité électrolytique comprenant les microalgues ayant une valeur allant de 15 à 40 I.J.S.cm-1 à 25°C, permet de garantir que les microalgues de la suspension de microalgues s'échauffent peu, voire très peu lors de 5 l'application du champ électrique pulsé. En effet, plus la conductivité du milieu de suspension des microalgues est importante, plus ce dernier est apte à emmagasiner de la chaleur lors de l'application du champ électrique pulsé. Or des températures trop hautes entraînent la dénaturation des molécules extraites et la destruction des cellules de m icroa Igues. 10 La première étape du procédé selon l'invention est une étape de fourniture de microalgues unicellulaires, c'est à dire d'algues microscopiques formées par une seule cellule. La membrane plasmique des microalgues unicellulaires sépare le milieu intracellulaire du milieu extracellulaire. Selon les différents stades de développement de la 15 microalgue unicellulaire, une paroi primaire peut recouvrir la membrane plasmique et une paroi secondaire peut recouvrir la paroi primaire. La paroi cellulaire secondaire est moins flexible que la paroi primaire cellulaire. Les microalgues utilisées dans le procédé selon l'invention sont dépourvues de paroi secondaire ou alternativement ont une paroi cellulaire secondaire d'épaisseur inférieure ou 20 égale à 0,5 micromètres (i.J.m). Préférentiellement, les microalgues utilisées dans le procédé selon l'invention ont un diamètre moyen compris entre 15 et 30 iim. En particulier, les microalgues unicellulaires peuvent appartenir à l'ordre des Chlamydomonadales, de la classe des Chlorophyceae, du phylum Chlorophyta. Les 25 microalgues de cet ordre sont des microalgues vertes possédant à un stade végétatif deux flagelles. Leur cytoplasme comprend au moins un chloroplaste. Comme indiqué précédemment, grâce au génie génétique, les chloroplastes peuvent être avantageusement utilisés pour produire des molécules hydrosolubles d'intérêt. De manière spécifique, les microalgues unicellulaires peuvent appartenir à la famille 30 Haematococcaceae. De manière encore plus spécifique, les microalgues unicellulaires peuvent appartenir au genre Haematococcus. 6 En particulier, les microalgues unicellulaires peuvent appartenir à l'espèce Haematococcus pluvialis, telle la souche de micro-organismes déposée au Culture Collection of Algae and Protozoa (CCAP), Scottish Marine Institute, Royaume-Uni ayant comme numéro d'ordre : CCAP 34/19 Haematococcus pluvialis. 5 La microalgue de l'espèce Haematococcus pluvialis peut être trouvée dans les flaques, les gouttières et autres points d'eau peu profonds. Sa capacité à survivre dans ces milieux pouvant être considérés comme hostiles est liée à son cycle de vie, à la fois très complexe et flexible. Cette microalgue présente trois principaux stades de développement: macrozoïde, palmella et kyste. Les stades macrozoïde et palmella sont observables au cours 10 de la phase de croissance végétative (croissance par mitose) alors que le stade kyste n'apparaît qu'après arrêt des divisions cellulaires. Les microalgues Haematococcus pluvialis au stade macrozoïde sont des cellules ovoïdes mobiles dont le diamètre peut varier entre 8 et 50 iim, le diamètre moyen étant généralement compris entre 20 et 25 iim. Elles possèdent deux flagelles de longueur égale 15 et sont entourées d'une matrice glycoprotéique multicouche traversée de prolongements cytoplasmiques. A ce stade les cellules se multiplient par simple mitose : une cellule mère donne deux cellules filles qui ensuite se sépareront, s'entoureront de leur propre gangue et deviendront ainsi indépendantes. Le second stade observable durant la phase végétative est le stade palmella. Les 20 palmellas ont également généralement un diamètre moyen compris entre 20 et 25 iim A la différence des macrozoïdes, les palmellas ne possèdent pas de flagelles et ont une forme sphérique. La matrice glycoprotéique entourant la cellule est moins épaisse que chez les macrozoïdes et une paroi primaire se met en place entre cette matrice et la membrane plasmique. La division des cellules à ce stade de développement peut mener à la formation 25 soit de nouvelles palmellas ou bien de nouveaux macrozoïdes. Le stade palmella est observable lorsque les conditions environnementales sont favorables aux microalgues. Cependant, il peut aussi apparaître quand ces conditions commencent à se dégrader et que les cellules doivent se préparer à entrer dans une phase de repos au cours de laquelle elles seront au stade de kystes. 30 L'apparition de cellules au stade kystes est précédée d'un accroissement de la taille des microalgues, dont le diamètre peut dépasser les 50 iim. En raison d'une accumulation importante d'astaxanthine (jusqu'à 99 % des caroténoïdes totaux des cellules et 5 % du 7 poids sec de la biomasse), la composition pigmentaire des cellules subit elle aussi d'importantes variations. La phase d'enkystement s'accompagne également de modifications à la fois structurales et compositionnelles de la paroi extracellulaire, conduisant à un épaississement progressif de cette dernière. En effet, les différentes 5 couches de la matrice glycoprotéique caractérisant le stade macrozoïde se désintègrent les unes après les autres au cours de l'enkystement et plusieurs nouvelles structures sont progressivement mises en place pour les remplacer. La première structure mise en place est la paroi primaire, composée en grande partie de cellulose (la paroi primaire, présente au stade palmella, est transitoire puisqu'elle disparaît au cours de la maturation des kystes). La 10 deuxième structure, également mise en place est une gaine trilaminaire. Elle est composée d'algaenan, un biopolymère non hydrolysable. La troisième et dernière structure mise en place correspond à la paroi secondaire. Son constituant majeur est le mannane (terme regroupant les polysaccharides essentiellement composés de mannose), et plus particulièrement le mannane I granuleux non fibrillaire. L'épaisseur maximale atteinte par la 15 paroi secondaire des kystes est d'environ 2,5 iim. Avantageusement, la microalgue de l'espèce Haematococcus pluvialis utilisée dans le procédé selon la présente invention est à un stade végétatif, macrozoïde et/ou palmella. En effet, il est connu que la microalgue de l'espèce Haematococcus pluvialis à un stade végétatif comprend de 25% à 30% en poids de matière sèche de protéines. De plus, de 20 récentes études ont mis en évidence que les protéines hydrosolubles produites à ce stade du cycle cellulaire d'Haematococcus pluvialis avaient de bonnes propriétés émulsifiantes, présentant un intérêt réel dans les domaines de la cosmétologie, et de l'alimentation (Ba. et al., 2016). La microalgue de l'espèce Haematococcus pluvialis utilisée pour le procédé de la 25 présente invention peut également être au début d'une phase d'enkystement, transition entre un stade macrozoïde et/ou palmella et un stade kyste, quand la paroi cellulaire secondaire a une épaisseur inférieure ou égale à 0,5 iim. La deuxième étape du procédé selon l'invention est l'étape de placement des microalgues dans un milieu de faible conductivité électrolytique. Le milieu de faible 30 conductivité électrolytique doit être biocompatible pour ne pas endommager les microalgues. La conductivité électrolytique totale du milieu de faible conductivité électrolytique comprenant les microalgues a une valeur allant de 15 à 40 micro-siemens par 8 centimètre (g.cm-1) à 25°C (température de référence de la mesure de conductivité). Le milieu de faible conductivité électrolytique permet de garantir que les microalgues de la suspension de microalgues s'échauffent peu, voire très peu lors de l'étape d'application du champ électrique pulsé. Avantageusement, la suspension de microalgues s'échauffe de 5 moins de 1°C lors de l'étape d'application du champ électrique pulsé. Selon un mode de réalisation particulier, le milieu de faible conductivité électrolytique est de l'eau, notamment de l'eau distillée. Préférentiellement, la densité des microalgues dans la suspension de microalgues est inférieure ou égale à 106 cellules/mL de milieu de faible conductivité électrolytique. Ceci a 10 pour avantage de garantir que le champ électrique ressenti par chaque cellule est essentiellement uniforme lors de l'étape d'application du champ électrique pulsé. A contrario pour des densités de microalgues strictement supérieure à 106 cellules/mL, un effet d'écran, d'autant plus important que la densité de microalgues est importante, implique que certaines microalgues ressentent un champ électrique plus important que 15 d'autres lors de l'étape d'application du champ électrique pulsé. De manière davantage préférée, la densité de microalgues dans la suspension de microalgues est de l'ordre de 105 cellules/mL de milieu de faible conductivité électrolytique. Préférentiellement, la suspension de microalgues est maintenue à un pH allant de 6,5 à 8. 20 La troisième étape du procédé selon l'invention est l'étape d'application d'un champ électrique pulsé sur la suspension de microalgues afin d'obtenir une suspension de microalgues temporairement perméabilisées. L'application d'un champ électrique pulsé permet la formation spontanée de pores dans la membrane plasmique et le cas échéant dans la paroi cellulaire primaire et la paroi cellulaire secondaire. Ceci est à l'origine d'une 25 perméabilisation. De plus, durant l'application du champ électrique, un transport électrophorétique rapide se met en place, entrainant les molécules chargées et les ions intracellulaires. Un champ électrique pulsé est un champ électrique formé grâce à des impulsions électriques. Selon l'amplitude des impulsions électriques, différentes forces électriques de 30 champ électrique pulsé peuvent être obtenues. La force électrique est exprimée ici en kilovolt par centimètre (kV.cm-1) 9 La force électrique du champ électrique pulsé va de 0,5 à 1 kV.cm-1. Du fait que la force électrique est inférieure ou égale à 1 kV.cm-1, la perméabilisation est rendue essentiellement temporaire, ou autrement dit, essentiellement réversible. C'est ce qui permet de préserver au mieux la viabilité des microalgues. A contrario, pour des forces 5 électriques de champ plus élevées, une partie plus importante des microalgues voire la totalité des microalgues sont perméabilisées de manière irréversible, sans qu'un gain significatif sur le rendement d'extraction en molécules hydrosolubles extraites ne soit observé. En outre, il semble que des forces électriques de champ supérieures ou égales à 0,5 kV.cm-1 soient nécessaires pour assurer une ouverture suffisante des pores. 10 Il n'est pas nécessaire d'appliquer un grand nombre d'impulsions pour obtenir la perméabilisation temporaire des microalgues. Le nombre d'impulsions est supérieur ou égal à un. Le nombre d'impulsions peut notamment être supérieur ou égal à 2. Dans ce cas, le champ électrique pulsé est préférentiellement périodique. Le champ électrique pulsé peut par exemple avoir une fréquence ayant une valeur allant de 0,1 à 19 Hz, notamment une 15 valeur de 9,62 Hz. Dans le cas où le nombre d'impulsions est supérieur ou égal à 2, les impulsions peuvent être alternativement de signe positif et de signe négatif. Le champ électrique pulsé est alors qualifié de bipolaire. Un champ électrique bipolaire permet d'empêcher l'oxydation des électrodes et d'augmenter la durée de vie de ces dernières. Par ailleurs, il réduit la formation d'espèces réactives à l'oxygène. 20 Le nombre d'impulsions peut aussi être supérieur ou égal à 5. Selon un mode de réalisation, le nombre d'impulsions est égal à 5. Les impulsions du champ électrique pulsé peuvent avoir une durée comprise entre 1 microseconde (us) et 10 millisecondes (ms). Cette gamme de valeurs a pour avantage de permettre la perméabilisation de la membrane plasmique et le cas échéant les différentes 25 parois surplombant la microalgue tout en ayant un impact limité sur le cytosquelette, le noyau et l'ADN de la microalgue nécessaires à sa viabilité. Il est à noter que plus la durée des impulsions est longue, plus les pores formés sont grands. De préférence, les impulsions ont une durée comprise entre 0,1 ms et 5 ms. Ceci permet également de cibler la perméabilisation des chloroplastes. Dans cette même perspective, la durée des impulsions 30 est avantageusement choisie entre 1 ms et 3 ms. 10 La quatrième étape du procédé selon l'invention est une étape d'incubation de ladite suspension de microalgues temporairement perméabilisées, afin d'obtenir des microalgues appauvries en molécules hydrosolubles intracellulaires en suspension dans un milieu enrichi en molécules hydrosolubles extraites. Les pores formés lors de l'étape d'application du 5 champ électrique pulsé étant temporairement ouverts, une diffusion de molécules hydrosolubles intracellulaires des microalgues temporairement perméabilisées a lieu dans le milieu de faible conductivité électrolytique. Même si le transport électrophorétique, ayant lieu lors de l'application d'un champ électrique pulsé, est plus efficace que la diffusion en quantité de molécules extraites par unité de temps, il dure beaucoup moins longtemps. En 10 effet, la période pendant laquelle la membrane plasmique est perméabilisée suite à l'application des CEP peut s'étendre sur plusieurs minutes, voire sur quelques dizaines de minutes, alors que la durée d'une impulsion ne dépasse pas 10 ms. La durée de diffusion est donc environ 10 000 fois supérieure à celle des impulsions. La majorité des molécules hydrosolubles extraites passe donc du milieu intracellulaire au milieu extracellulaire via le 15 phénomène de diffusion pendant l'étape d'incubation de la suspension de microalgues temporairement perméabilisées. L'étape d'incubation peut avoir une durée allant de 3 à 45 minutes. Préférentiellement, elle a une durée allant de 5 à 10 minutes. Parmi les molécules hydrosolubles intracellulaires, le procédé selon l'invention permet notamment d'extraire des protéines. 20 Ces protéines peuvent notamment avoir un poids moléculaire allant jusqu'à 120 kilo-Daltons (kDa - 1 Dalton étant défini comme étant 1/12 de la masse d'un atome du nucléide 12C). Selon des modes avantageux de réalisation de l'invention, où une forte perméabilisation (essentiellement réversible) est obtenue, le poids moléculaire des protéines extraites peut aller jusqu'à 150 kDa sur gel d'électrophorèse (notamment gel de polyacrylamide) et aller 25 jusqu'à 265 kDa (environ) par spectrométrie de masse. Les protéines peuvent être issues du cytoplasme, des chloroplastes, de l'appareil de Golgi, du réticulum endoplasmique ou des mitochondries. Les protéines peuvent notamment être issues, au moins en partie, des chloroplastes des microalgues. Selon certains modes de réalisation, au moins 50% des protéines extraites est issu des 30 chloroplastes des microalgues. Ceci peut notamment être le cas quand la durée des impulsions du champ électrique pulsé pendant l'étape d'application d'un champ électrique pulsé est comprise entre 1 ms et 3 ms. 11 Le procédé d'extraction selon l'invention peut en outre comprendre une étape de séparation après l'étape d'incubation de la suspension de microalgues temporairement perméabilisées. L'étape de séparation permet de séparer les microalgues appauvries en molécules hydrosolubles extraites et le milieu enrichi en molécules hydrosolubles extraites. 5 Elle est mise en oeuvre par des méthodes usuelles, comme notamment la centrifugation. Les molécules hydrosolubles extraites, notamment les protéines, peuvent ensuite être isolées de leur milieu par des méthodes usuelles, notamment par chromatographie et/ou électrophorèse. Le procédé d'extraction selon l'invention peut en outre comprendre une étape de 10 récupération/régénération des microalgues appauvries en molécules hydrosolubles extraites après l'étape de séparation. L'étape de récupération/régénération consiste en une incubation des microalgues appauvries en molécules hydrosolubles extraites, dans un milieu nutritif adapté à la culture des microalgues. Cette étape permet notamment de rétablir le bon fonctionnement de la machinerie photosynthétique (récupération) des cellules 15 appauvries en molécules hydrosolubles extraites après que ces dernières ont recommencé à synthétiser de novo les molécules électro-extraites. Ceci permet également aux cellules de se multiplier de nouveau (régénération). Un milieu nutritif adapté à la culture des microalgues peut notamment être un milieu de croissance pour micro-organismes comprenant de l'azote, du phosphore et une source de 20 carbone organique. En particulier, le milieu nutritif adapté à la culture des microalgues peut être du médium tri-acétate-phosphate (TAP). Le milieu dit TAP, est bien connu de l'Homme du Métier pour la culture de microalgues, notamment pour la très étudiée microalgue Chlamydomonas reinhardtii. Le milieu TAP est constitué de Trishydroxyméthylaminométhane (tampon, connu sous le nom TRIS), d'ions acétate, d'une 25 solution de phosphate, des sels de Beijerinck (NH4C1+Mg504+CaC12) et des oligo-éléments sous forme de traces. L'étape de récupération/régénération a, le cas échéant, une durée supérieure ou égale à un jour, de préférence une durée supérieure ou égale à deux jours et, de manière très préférentielle, une durée supérieure à trois jours. En particulier, il est estimé qu'après 30 trois jours de récupération/régénération, les cellules de microalgues ont récupéré un état physiologique similaire à celui de cellules non traitées. 12 Le procédé comprenant une étape finale de récupération/régénération permet notamment de garder viables au moins 85%, préférentiellement au moins 95%, très préférentiellement au moins 99% des cellules de microalgues. 5. Liste des figures 5 La Figure 1 représente un profil typique d'impulsions bipolaires (abscisses : Temps en millisecondes (ms) - ordonnées : Tension en millivolts (mV)). La Figure 2 représente la concentration en protéines hydrosolubles extraites (dans le milieu extracellulaire) en fonction de la force électrique du champ électrique pulsé appliqué (nombre d'impulsions 5 ou 9). 10 La Figure 3 représente l'échauffement des suspensions en fonction de la force électrique du champ électrique pulsé appliqué (température de référence : 21,1°C). La Figure 4 représente le pourcentage de cellules mobiles en fonction de la force électrique du champ électrique pulsé appliqué. La Figure 5 représente le pourcentage de cellules perméabilisées en fonction de la 15 force électrique du champ électrique pulsé appliqué. La Figure 6 représente l'activité photosynthétique brute (« APb »)/le taux de respiration (« R ») en fonction de la force électrique du champ électrique pulsé appliqué. La Figure 7 représente le rendement quantique maximum de la PS Il (04 en fonction de la force électrique du champ électrique pulsé appliqué. 20 La Figure 8 représente le pourcentage de cellules mobiles en fonction du temps de récupération/régénération. La Figure 9 représente le pourcentage de cellules perméabilisées en fonction du temps de récupération/régénération. La Figure 10 représente la densité cellulaire en fonction du temps de 25 récupération/régénération. La Figure 11 représente l'activité photosynthétique brute en fonction du temps de récupération/régénération. La Figure 12 représente le rendement quantique maximum de la PS Il (04 en fonction du temps de récupération/régénération. 30 La Figure 13 représente le taux de respiration en fonction du temps de récupération/régénération. 13 6. Description détaillée d'un mode de réalisation 6.1- Obtention d'une souche axénisée de Haematococcus pluvialis Une souche a été prélevée en milieu naturel dans un bassin de rétention des eaux pluviales. Elle a tout d'abord été isolée puis axénisée grâce à un traitement à l'hypochlorite 5 de sodium. La nouvelle souche isolée et axénisée a été identifiée sur la base de critères morphologiques comme appartenant à l'espèce Haematococcus pluvialis. Afin de compléter l'identification morphologique de la nouvelle souche, une analyse phylogénétique a été réalisée. Le positionnement taxonomique de la nouvelle souche a été précisé suite à la 10 création d'un arbre phylogénétique basé sur un jeu de données regroupant la séquence du gène codant l'ARNr 18S de plusieurs espèces appartenant à l'ordre taxonomique des Chlamydomonadales, dont celle de la nouvelle souche isolée. Les résultats obtenus montrent que notre nouvelle souche appartient au même clade que les espèces Haematococcus pluvialis et Haematococcus lacustris (ces deux dénominations étant des 15 synonymes taxonomiques). La souche isolée et axénisée a été déposée le 11 décembre 2017 au Culture Collection of Algae and Protozoa (CCAP), Scottish Marine Institute, au Royaume-Uni et a comme numéro d'ordre : CCAP 34/19 Haematococcus pluvialis 6.2 - Obtention de cellules végétatives vertes (stades macrozoïde et palmella) 20 Les microalgues de la souche isolée et axénisée, ci-après appelées « les microalgues », ont été cultivées en conditions stériles dans des erlenmeyers de 250 ou 500 mL contenant le quart de leur capacité volumique en milieu de culture. La densité cellulaire initiale de chaque culture a été fixée à 104 cellules.mL-1, l'inoculum étant composé de cellules provenant d'une culture mère âgée d'environ 3 à 4 semaines. La température de la 25 chambre de culture a été maintenue à 19 °C. Les meilleurs paramètres de culture ont été obtenus dans un milieu TAP en conditions mixotrophes (exposées à un éclairement de 35 !moles de photons.m-2.s-1 avec une photopériode de 14 h). Avec ces paramètres de culture, il n'est pas observé de microalgues au stade kyste. 30 La phase d'enkystement pourrait néanmoins être provoquée par carence en azote (conditions de stress). 14 Les paramètres de culture pour d'autres espèces de l'ordre Chia mydomonadales peuvent être aménagés raisonnablement sans représenter une charge excessive pour l'Homme du Métier. Les paramètres à adapter sont notamment la température de culture et/ou les conditions autotrophe, mixotrophe ou hétérotrophe. 5 6.3 - Préparation d'une suspension de microalgues Les microalgues cultivées (voir section 6.2) ont été collectées par centrifugation (5 min à 400 g, 19°C) avant d'être transférées en conditions stériles dans de l'eau distillée pour obtenir une suspension de microalgues ayant une densité de 105cellules/mL. La suspension a une conductivité d'environ 20 u.S.cm-1. 10 6.4 - Application de champs électriques pulsés et incubation de la suspension temporairement perméabilisée - étude expérimentale Un banc d'électro-perméabilisation a été utilisé pour l'application de champs électriques pulsés. Les principaux appareillages composant le banc d'électroperméabilisation utilisé dans cette étude ont été les suivants : 15 - deux générateurs d'impulsions interconnectés (DEEX-Bio, Btech, France) permettant l'application d'impulsions bipolaires aux suspensions cellulaires, - deux chambres d'électroporation (CNRS). En fonction de la force électrique de champ désirée, l'une ou l'autre des deux chambres disponibles a été sélectionnée. En effet, la distance entre les deux électrodes situées à l'intérieur de chaque chambre étant de 6 ou 3 20 mm, la force électrique maximale des impulsions pouvant être délivrées entre ces deux électrodes est respectivement de 3 ou 6 kV.cm-1. Un train d'impulsions bipolaires a été délivré à chaque suspension cellulaire traversant la chambre d'électroporation grâce à l'action d'une pompe péristaltique (Fisher ScientificTM Variable-Flow Peristaltic Pump, Fisher Scientific, Pittsburgh, USA). Le débit devant 25 être appliqué par cette pompe (Q en mL.s-1) a été calculé grâce à l'équation suivante : Q= (F x V) / N où N est le nombre moyen d'impulsions délivrées à chaque microalgue au cours de son passage dans la chambre, F est la fréquence de répétition des impulsions (F = 9,62 Hz) et V est la capacité volumique de la chambre d'électroporation (0,54 ou 0,27 mL pour la chambre 30 de 6 ou 3 mm, respectivement). Un profil typique des impulsions bipolaires délivrées par les deux générateurs est représenté Figure 1. 15 Pour chaque valeur de nombre d'impulsions sélectionnée (N = 5 ou 9), cinq forces de champ différentes ont été testées (0,5, 1, 2, 3 et 6 kV.cm-1). Les forces de champ égales à respectivement 0,5 et 1 kV.cm-1 correspondent aux forces électriques de champ selon 5 l'invention. Les forces de champ égales à 2, 3 et 6 kV.cm-1 ne correspondent pas aux forces électriques de champ selon l'invention. La durée de chaque impulsion a été fixée à 2 ms. La condition "0 kV.cm4" a été utilisée comme condition témoin : le protocole de traitement a été identique à celui utilisé dans le cas des autres forces excepté qu'aucune impulsion n'a été délivrée lors du passage 10 de la suspension dans la chambre. Par ailleurs, afin d'évaluer l'échauffement par effet Joule des suspensions de microalgues dû au traitement par CEP, la température de chacune d'elles a été mesurée juste avant et immédiatement après l'application des impulsions électriques à l'aide d'une sonde thermométrique. La même procédure a été utilisée pour évaluer l'impact des CEP sur la conductivité des suspensions. 15 Suite à ces mesures, les suspensions cellulaires ont été incubées pendant 45 min à température ambiante afin de laisser suffisamment de temps aux composés intracellulaires pour diffuser hors des cellules. Après une étape de centrifugation (5 min à 400 g, 19°C), les surnageants ont été collectés afin de doser les protéines hydrosolubles extraites ayant diffusé à travers la membrane plasmique des microalgues traitées. 20 6.4-A. Influence de la force et du nombre des impulsions sur le rendement d'extraction des protéines 6.4-A.i) Impact de l'incubation des cellules dans de l'eau distillée sur la diffusion des protéines hydrosolubles Trois contrôles différents ont été préparés : 25 - une condition témoin "0 kV.cm4" pour laquelle le même protocole de traitement que celui utilisé dans le cas des autres forces a été appliqué, excepté qu'aucune impulsion électrique n'a été délivrée lors du passage de la suspension dans la chambre d'électroporation. - un contrôle négatif pour lequel les cellules ont été incubées pendant 45 min (durée identique à celle de la période d'incubation post-traitement) dans de l'eau distillée, tout 30 comme les cellules traitées, sans qu'aucun autre traitement ne leur soit appliqué. Ce contrôle a été réalisé afin de déterminer la quantité de protéines diffusant hors des cellules placées dans un milieu hypotonique pendant une durée déterminée (45 min). 16 - un contrôle positif pour lequel les microalgues ont été broyées à l'aide de microbilles de verre afin d'en extraire toutes les protéines hydrosolubles. Selon la Figure 2, aucune différence significative en terme de concentration en protéines extraites n'a pu être décelée entre le contrôle négatif et la condition témoin 5 "0 kV.cm4". Cette observation suggère donc que les forces mécaniques appliquées sur les cellules en raison de l'utilisation de la pompe péristaltique ne conduisent pas à une diffusion supplémentaire (par rapport au contrôle négatif) des protéines vers le milieu extracellulaire. 6.4-A.ii) Influence de la force de champ sur la diffusion des protéines hydrosolubles Les différents traitements CEP entraînent une augmentation significative de la 10 concentration en protéines extraites par rapport au contrôle négatif et à la condition témoin (Figure 2). Cependant, l'efficacité d'extraction des protéines n'est pas proportionnelle à la force du champ : elle augmente de manière constante et significative (au maximum d'un facteur 5, comparé à la condition témoin) avec des forces de champ inférieures ou égales à 1 kV.cm-1, puis elle tend à se stabiliser lorsque des forces de champ supérieures sont utilisées. 15 La perméabilisation membranaire induite par le traitement CEP (1 kV.cm-1) est telle qu'après 45 min d'incubation post-traitement, environ 50 % des protéines hydrosolubles extraites par broyage avec des microbilles de verre (contrôle positif) peuvent être collectés (Figure 2). 6.4-A.iii) Influence du nombre d'impulsions sur la diffusion des protéines hydrosolubles L'évolution de la concentration en protéines dans le milieu extracellulaire en fonction 20 de la force du champ suit toujours la même tendance, que ce soit avec l'un ou l'autre des deux nombres d'impulsions (N = 5 ou 9; Figure 2). De plus, une augmentation de la valeur de ce paramètre (de 5 à 9) n'influence pas significativement la concentration en protéines électro-extraites dosée dans le surnageant (Figure 2). Ces résultats permettent donc de conclure que le nombre d'impulsions n'a pas d'effet synergique avec la force du champ 25 électrique sur le rendement d'extraction des protéines hydrosolubles, et donc potentiellement sur le degré de perméabilisation de la membrane plasmique. Par conséquent, le nombre d'impulsions est fixé à une valeur de 5 pour la suite des expériences. 6.4-B. Influence de la force des impulsions sur l'état physiologique des cellules traitées 30 L'impact de l'intensité des champs électriques sur l'état physiologique des microalgues a été évalué par la mesure des cinq paramètres suivants : la mobilité cellulaire, la perméabilisation de la membrane plasmique, l'activité photosynthétique, le rendement 17 quantique maximal de la photochimie des PS Il (1)p0) et le taux de respiration. Ces mesures ont été réalisées après une période de récupération de 30 min au cours de laquelle les microalgues ont été replacées dans les conditions de culture mixotrophes définies précédemment (milieu TAP, éclairement de 35 p.moles de photons.m-2.s-1). 5 L'intérêt de cette période de récupération est de laisser du temps aux cellules transférées dans du milieu TAP pour se remettre (au moins en partie) du stress induit par leur séjour dans l'eau distillée, et ainsi pouvoir principalement étudier l'impact des CEP sur leur viabilité. 6.4-B.i) L'échauffement par effet Joule des suspensions Selon la Figure 3, l'échauffement pour des champs électriques pulsés dont la force - 10 électrique est égale à 0,5 ou 1 kV.cm1. est inférieur à 1°C. L'échauffement maximum observé est de 7,1°C pour le champ électrique pulsé dont la force électrique est égale à 6 kV.cm-1. 6.4-B.ii) La mobilité des microalgues La mobilité cellulaire a été analysée afin d'évaluer la capacité des CEP à affecter l'appareil locomoteur (composé de deux flagelles) de la microalgue H. pluvialis au stade 15 macrozoïde. Les résultats obtenus indiquent que seules 40 % des cellules totales de la condition témoin sont mobiles (voir Figure 4). La proportion plus importante de microalgues au stade palmella qu'au stade macrozoïde au sein de la culture mère explique cette observation, qui n'est d'ailleurs pas singulière puisqu'elle coïncide avec les résultats obtenus sur des cellules cultivées pendant 8 jours en conditions mixotrophes. En effet, la proportion 20 de cellules mobiles calculée dans ces conditions est de 52 ± 1,8 %, ce qui n'est pas biologiquement différent de la valeur mesurée pour la condition témoin (40 ± 8 %). Quelque soit la force du champ électrique, le traitement CEP entraîne une diminution du pourcentage de cellules mobiles (comparé à la condition témoin). La perte de mobilité entre les cellules de la condition témoin et celles de la condition "0,5 kV.cm4" est de 50 %. L'augmentation 25 subséquente de la force des impulsions (de 0,5 à 2 kV.cm-1) entraîne une diminution proportionnelle du pourcentage de cellules mobiles. Pour les plus fortes intensités de CEP (3 et 6 kV.cm-1), la valeur de ce pourcentage reste proche de 4 %. L'absence de mobilité n'implique pas nécessairement la mort des cellules sans mobilité. En effet, l'appareil locomoteur peut être affecté par le traitement CEP sans impliquer nécessairement la mort 30 des cellules. A contrario, la présence de mobilité cellulaire indique la viabilité des cellules. 6.4-B.iii) La perméabilisation de la membrane plasmique L'impact des différents traitements CEP sur la membrane plasmique a été étudié à 18 l'aide du bleu Evans. Il s'agit d'un marqueur de perméabilité capable de traverser la membrane plasmique lorsque cette dernière est perméabilisée. Les cellules ayant incorporé le marqueur sont colorées en bleu alors que les microalgues dont la membrane plasmique est intacte restent vertes. La principale limitation de ce marqueur est qu'il ne permet pas de 5 différencier les cellules perméabilisées de manière transitoire (et donc toujours viables) des cellules irréversiblement perméabilisées qui sont déjà mortes ou qui vont le devenir. Néanmoins, d'après le protocole de coloration utilisé, les mesures de perméabilité ont été réalisées 75 min après la fin du traitement (45 min d'incubation post-traitement + 30 min de récupération en milieu TAP (similaire à l'étape de récupération/régénération présentée en 10 section 8), ce qui est suffisant pour qu'une majorité de cellules perméabilisées de manière transitoire reviennent à leur conformation d'origine (de l'ordre de quelques minutes à une dizaine de minutes lorsque la durée des impulsions est de l'ordre de la ms). Les résultats liés à l'utilisation du bleu Evans qui seront discutés dans la suite donnent une indication, mais ne permettent pas de conclure de manière quantitative, sur la capacité 15 des CEP à tuer les microalgues via une perméabilisation irréversible de leur membrane plasmique. Seul l'aspect qualitatif des résultats (voir section 8 pour plus de détails sur la pertinence de cette méthode au niveau quantitatif), incorporation, respectivement non-incorporation, du colorant est à considérer et indique que les cellules sont perméabilisées (irréversiblement mais aussi dans une certaine mesure réversiblement), respectivement les 20 cellules sont non-perméabilisées. Les résultats obtenus pour la condition témoin (0 kV.cm-1) indiquent que 24,2 % des cellules non exposées aux CEP sont perméabilisées (voir Figure 5). Cela signifie que 24,2% des cellules ne seraient pas viables dès l'origine dans la culture témoin. La concentration en protéines dosée dans le surnageant pour la condition témoin et la condition "0,5 kV.cm4" 25 (Figure 2) est en faveur d'une surestimation de la proportion de cellules perméabilisées pour la condition témoin. En effet, la concentration en protéines dosée suite à l'application de CEP de 0,5kV.cm-1 est en moyenne trois fois supérieure à celle enregistrée pour la condition témoin. Or, si la proportion de cellules perméabilisées pour la condition témoin est en réalité comprise entre 8 et 10 %, alors qu'elle est trois fois plus faible que la proportion 30 calculée pour la condition "0,5 kV.cm4", ce qui lève l'incohérence entre les données d'extraction et celles de perméabilisation. Les résultats présentés dans la figure 5 vont donc être décrits et discutés sur la base d'une proportion de cellules perméabilisées pour la 19 condition témoin de 9 %. Quelle que soit la force des impulsions délivrées, la proportion de cellules perméabilisées augmente par rapport à la condition témoin (Figure 5). Cependant, cette augmentation n'est pas constante : avec des CEP de 0,5 et 1 kV.cm-1, la proportion de 5 cellules colorées par le bleu Evans est multipliée respectivement par un facteur 3 (27% de cellules perméabilisées) et 6 (54% de cellules perméabilisées) comparé à la condition témoin, alors qu'avec les forces de champ électrique les plus fortes (de 2 à 6 kV.cm-1), la proportion de cellules perméabilisées se stabilise à une valeur d'en moyenne 67 %. 6.4-B. iv) Les paramètres photosynthétiques 10 Afin d'étudier l'impact des CEP sur le fonctionnement de l'appareil photosynthétique des microalgues, deux paramètres ont été mesurés : l'activité photosynthétique brute (APb) et le rendement quantique maximum de la photochimie des PS II (1)Po). L'activité photosynthétique brute renseigne sur la capacité réelle des cellules à réaliser la photosynthèse puisqu'elle correspond à la quantité d'02 produite à la lumière lors de la 15 réaction d'oxydation de l'eau. Le paramètre C1)0 traduit quant à lui l'efficacité photochimique maximale des PS II. Ce paramètre repose sur le principe selon lequel la lumière captée par les antennes collectrices des PS II peut être utilisée pour réaliser la photochimie, ou bien être réémise dans l'environnement sous forme de chaleur et/ou de fluorescence. Le paramètre C1)0 est proportionnel au rendement quantique maximum de la 20 photochimie. La valeur optimale de Opo varie entre 0,78 et 0, 85. L'impact des CEP sur le fonctionnement de l'appareil photosynthétique dépend de la force des impulsions. Comme il peut être vu sur les figures 6 et 7, les valeurs de l'activité photosynthétique (Figure 6) et du paramètre Opo(Figure 7) ne sont significativement différentes de celles de la condition témoin qu'avec les forces de champs supérieures ou égales à 1 kV.cm-1. 25 Le fait que les CEP entraînent une baisse de la valeur de ces deux paramètres implique que de longues impulsions 1 us), telles que celles utilisées dans la présente étude, associées à une force de champ suffisamment intense peuvent impacter les chloroplastes ainsi que les thylakoïdes, et donc le bon fonctionnement des processus qui s'y déroulent. 6.4-B.v) La respiration cellulaire 30 L'impact de la force du champ électrique sur le taux de respiration cellulaire est similaire à celui observé sur l'activité photosynthétique (voir Figure 6). 20 En conclusion des sections 6.4-A et 6.4-B, les résultats indiquent que le meilleur compromis entre le rendement d'extraction des protéines et la survie des microalgues est atteint pour un champ électrique pulsé dont la force électrique va de 0,5 à 1kV.cm-1. 7) Identification des protéines électro-extraites 5 Les extraits protéiques obtenus avec 0,5 et 1 kV.cm 1 ont été séparés par électrophorèse 1D. Les strips ont été recueillis pour procéder à l'identification de toutes les protéines présentes sur ceux-ci. Grâce aux analyses par Nano-LC ESI MS-MS, 52 protéines ont été caractérisées et identifiées (au moins en partie). Parmi celles-ci, 36 protéines n'ont été électro-extraites qu'avec des CEP de 1kV.cm-1. Les 16 autres protéines ont été électro- 10 extraites avec les deux conditions CEP. L'augmentation du nombre de "peptides matches" pour la condition "1 kV.cm-1" (comparé à la condition "0,5 kV.cm-1") suggère qu'en plus de la variété des protéines, la quantité électro-extraite d'une même protéine augmente avec la force des impulsions. Les protéines électro-extraites avec les deux forces de champ ont également été 15 séparées par électrophorèse 2D. Les profils électrophorétiques ont permis d'étudier l'impact de la force des impulsions sur le nombre et l'intensité des spots. L'augmentation du nombre (nouveaux spots) et de l'intensité des spots (pour ceux déjà présents avec 0,5 kV.cm-1) visibles pour la condition "1 kV.cm-1" confirme que l'électro-perméabilisation membranaire et l'électro-extraction des protéines dépendent de la force des impulsions. Néanmoins, la 20 coloration à l'argent ayant été utilisée pour visualiser les spots, seules les protéines présentes pour la condition "1 kV.cm-1" mais absentes pour la condition "0,5 kV.cm-1" ont été recueillies afin d'être analysées par spectrométrie de masse (microséquençage). Seules 3 ont pu être caractérisées (numéros « 88 », « 186 », « 205 »). Par ailleurs, quatre spots (A, B, C et D) plus intenses pour 1 kV.cm-1 que pour 0,5 kV.cm-1 ont été sélectionnés de manière 25 aléatoire afin d'être analysés par spectrométrie de masse. Les résultats obtenus sont regroupés dans le tableau 1 ci-dessous. Les trois premières protéines (n° 88, 186 et 205) correspondent aux spots, prélevés à partir des gels d'électrophorèses 2D, qui ne sont visibles que pour la condition "1 kV.cm4". Les quatre protéines suivantes (n° A, B, C et D) correspondent aux spots, prélevés à partir des mêmes 30 gels, qui sont plus intenses pour la condition "1 kV.cm4" que pour la condition "0,5 kV.cm4". Les 52 protéines suivantes (n° 1 à 52) proviennent des strips recueillis après les électrophorèses 1D SDS-PAGE. Les protéines 1 à 16 ont été électro-extraites avec 21 des CEP de 0,5 et 1 kV.crn-1 alors que 36 autres (n° 17 à 52) n'ont été électro-extraites qu'avec des CEP de 1kV.crn-1. Numéro UniProt Nom Rôle Localisation Poids Numéro intracellulaire Moléculaire d'accession (Da) 88 A8J6Y8_CHLRE Ferredoxin-NADP Oxydoréduction Chloroplaste 38267 reductase OS=Chlamydomonas reinhardtii GN=FNR1 PE=3 SV=1 186 ARF1_CHLRE ADP-ribosylation factor 1 Protéine de fixation Appareil de 20703 OS=Chlamydomonas au GTP impliquée Golgi reinhardtii dans le trafic des GN=ARF1 PE=2 SV=2 protéines 205 Q1WLV1_CHLIN Chloroplast oxygen- Complexe Membrane 21948 evolving protein 3 d'oxydation de l'eau thylakoïdale OS=Chlamydomonas du photosystème II (chloroplaste) incerta GN=Psb3 PE=2 SV=1 A D8U298_VOLCA Putative uncharacterized Repliement des Cytoplasme 21648 protein protéines OS= Volvox carteri f. nagariensis GN=VOLCADRAFT_105670 PE=4 SV=1 B Q1WLV1_CHLIN Chloroplast oxygen- Complexe Membrane 21948 evolving protein 3 d'oxydation de l'eau thylakoïdale OS=Chlamydomonas du photosystème II (chloroplaste) incerta GN=Psb3 PE=2 SV=1 C A5X458_HAEPL Superoxide dismutase Activité superoxyde Chloroplaste 23629 OS=Haematococcus dismutase (enzyme Mitochondrie pluvialis antioxydante) GN=SOD2 PE=2 SV=1 D A5X458_HAEPL Superoxide dismutase Activité superoxyde Chloroplaste 23629 OS=Haematococcus dismutase Mitochondrie pluvialis GN=SOD2 PE=2 SV=1 1 A0A097KLQ1_9CHLO Photosystem II CP43 Protéine qui se lie à Membrane 52030 reaction center protein la chlorophylle et thylakoïdale 05=Ettlia participe à la catalyse (chloroplaste) pseudoalveolaris des processus GN=psbC PE=3 SV=1 photochimiques primaires induits par la capture de l'énergie lumineuse au niveau du photosystème II 2 A0A0H5B1H2 9CHLO Ribulose bisphosphate Activité catalytique Chloroplaste 41955 carboxylase large chain (carboxylation du 22 (Fragment) ribulose 1,5- 05=Pascherina tetras bisphosphate) GN=rbcL PE=3 SV=1 3 A0A051VVL8_9CHLO DEAD box RNA helicase Fixation à l'ATP, Noyau 48031 C1RH4 (Fragment) activité hélicase, Cytoplasme OS=Chlamydomonas sp. fixation aux acides ICE-L nucléiques PE=2 SV=1 4 A0A0521DA4_9CHLO Ribulose-1,5- Activité catalytique Chloroplaste 52564 bisphosphate (carboxylation du carboxylase/oxygenase ribulose 1,5- large subunit bisphosphate ou OS=Haematocoecus oxygénation du lacustris ribulose 1,5- GN=rbcL PE=3 SV=1 bisphosphate au cours de la photorespiration) 5 A0A052IDE6_9CHLO ATP synthase subunit Activité catalytique Chloroplaste 54596 alpha, chloroplastic OS=Haematocoecus lacustris GN=atpA PE=3 SV=1 6 A0A0521DH6_9CHLO ATP synthase subunit Activité catalytique Chloroplaste 52210 beta, chloroplastic OS=Haematocoecus lacustris GN=atpB PE=3 SV=1 7 A0A0521DP1_9CHLO 305 ribosomal protein 52, Composant Chloroplaste 164875 chloroplastic structural du OS=Haematocoecus ribosome 705 lacustris GN=rps2 PE=3 SV=1 8 A0A0521EF9_9CHLO Elongation factor Tu, Favorise la liaison GTP-dépendante de ' Chloroplaste 45660 chloroplastic lARNt-aminoacyle au OS=Haematocoecus site A des ribosomes lacustris au cours de la GN=tufA PE=3 SV=1 synthèse protéique 9 A8HTYO_CHLRE Plastid ribosomal protein Composant structural du ribosome 705, Chloroplaste 13841 L7/L12 traduction OS=Chlamydomonas reinhardtii GN=PRPL7/L12 PE=3 SV=1 10 D8TY33VOLCA Putative uncharacterized ' - 47212 _ 05=Volvproteinox carter/ Fixation à lATP, GN=VOLCADRAFT_120953 PE=3 SV=1 activité hélicase 11 D8U1R3_VOLCA Putative uncharacterized Chaperonne, fixation - 100901 protein à l'ATP, métabolisme 05=Volvox earteri des protéines GN=VOLCADRAFT_75431 PE=3 SV=1 12 E5G3Q8_9CHLO Beta-tubulin (Fragment) Activité GTPase, Microtubule 30055 OS=Chlamydomonas sp. fixation au GTP, ICE-L composant structural 23 PE=2 SV=1 des microtubules 13 F8WLT0_9CHLO ATP synthase subunit beta Activité catalytique, Périphérie de la 40832 (Fragment) production d'ATP à membrane OS=Voivox oves partir d'ADP en thylakoïdale GN=atpB PE=4 SV=1 présence d'un (chloroplaste) gradient de proton à travers la membrane 14 G9B655_HAEPL Acyl carrier protein Protéine porteuse de Intracellulaire 12350 OS=Haematococcus la chaîne d'acides pluvialis gras en cours PE=2 SV=1 d'élongation durant la biosynthèse des acides gras 15 H2DQ69_HAEPL Heat shock protein 70 Hydrolase, réponse Intracellulaire 71093 OS=Haematococcus au stress pluvialis PE=2 SV=1 16 Q8HDD9_9CHLO ATP synthase subunit beta Activité catalytique, Périphérie de la 40778 (Fragment) production d'ATP à membrane OS=Dunaliella parva partir d'ADP en thylakoïdale GN=atpB PE=4 SV=1 présence d'un (chloroplaste) gradient de proton à travers la membrane 17 A0A052ICK1_9CHLO Ribulose-1,5- Activité catalytique Chloroplaste 52445 bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit OS=Chloromonas radiata GN=rbcL PE=3 SV=1 18 A0A0521CY2_9CHLO 305 ribosomal protein 53, Traduction Chloroplaste 104742 chloroplastic OS=Haematococcus lacustris GN=rps3 PE=3 SV=1 19 A0A052LNT6_9CHLO Elongation factor Tu, Favorise la liaison Chloroplaste 45783 chloroplastic GTP-dépendante de OS=Oogamochlamys l'ARNt-aminoacyle au gigantea site A des ribosomes GN=tufA PE=3 SV=1 au cours de la synthèse protéique 20 A0A0U4MVM8 9CHLO ATP synthase beta- Activité catalytique, Périphérie de la 43807 subunit (Fragment) production d'ATP à membrane OS=Pyrobotrys squarrosa partir d'ADP en thylakoïdale GN=atpB PE=4 SV=1 présence d'un (chloroplaste) gradient de proton à travers la membrane 21 A1E8X4_9CHLO Ribulose bisphosphate carboxylase large chain (Fragment) OS=Stephanosphaera sp. UTEX-LB 2409 GN=rbcL Activité catalytique Chloroplaste 40675 PE=3 SV=1 22 A8HW56_CHLRE Flagellar associated Activité ATPase, Flagelle 90231 protein hydrolase OS=Chlamydomonas reinhardtii 24 GN=CDC48 PE=3 SV=1 23 A8HX38_CHLRE Eukaryotic translation Elongation de la Intracellulaire 50825 elongation factor 1 alpha traduction, activité 1 GTPase, fixation au OS=Chlamydomonas GTP reinhardtii GN=EEF1 PE=4 SV=1 24 A8HYV3_CHLRE Heat shock protein 70B Repliement des Intracellulaire 71955 OS=Chlamydomonas protéines, fixation à reinhardtii l'ATP, réponse au GN=1-15P7OB PE=3 SV=1 stress 25 A8ITH8_CHLRE Chaperonin 6082 Repliement des Cytoplasme 61738 OS=Chlamydomonas protéines, fixation à reinhardtii l'ATP GN=CPN60B2 PE=3 SV=1 26 A8IXZO_CHLRE Beta tubulin 1 Activité GTPase, Microtubule 49619 OS=Chlamydomonas fixation au GTP, reinhardtii composant structural GN=TUB1 PE=3 SV=1 des microtubules 27 A8IYP4_CHLRE Phosphoribulokinase Activité Apoplaste, 41892 OS=Chlamydomonas phosphoribulokinase, chloroplaste, reinhardtii activité uridine cytoplasme GN=PRK1 PE=3 SV=1 kinase, métabolisme des glucides, métabolisme des bases pyrimidiques, réponse à la cytokinine 28 A8J0E4_CHLRE Oxygen-evolving Liaison à l'ion Périphérie de la 30579 enhancer protein 1 of calcium, membrane photosystem II photosynthèse thylakoïdale OS=Chlamydomonas (chloroplaste) reinhardtii GN=P5130 PE=4 SV=1 29 A8JBX6_CHLRE Nascent polypeptide- Régulation de la Noyau 17193 associated complex transcription, Plaste subunit beta modèle d'ADN OS=Chlamydomonas reinhardtii GN=CHLREDRAFT_193614 PE=3 SV=1 30 A8JDV2_CHLRE Predicted protein - - 18085 (Fragment) OS=Chlamydomonas reinhardtii GN=CHLREDRAFT_122124 PE=4 SV=1 31 ARF1_CHLRE ADP-ribosylation factor 1 Protéine de fixation Appareil de 20703 OS=Chlamydomonas au GTP impliquée Golgi reinhardtii dans le trafic des GN=ARF1 PE=2 SV=2 protéines, modulation du bourgeonnement et déca psidation des vésicules dans l'appareil de Golgi 25 32 B1PL92_DUNSA Glyceraldehyde-3- Activité Intracellulaire 40269 phosphate oxydoréductase, dehydrogenase action sur le OS=Dunaliella sauna groupement GN=GAPDH PE=2 SV=1 aldéhyde ou oxo des donneurs, fixation au NAD ou au NADP, métabolisme du glucose 33 D2YZF3_9CHLO Ribulose bisphosphate Activité catalytique Chloroplaste 41797 carboxylase large chain (Fragment) OS=Gloeomonas kupfferi GN=rbcL PE=3 SV=1 34 D8TI13_VOLCA Putative uncharacterized Activité Intracellulaire 62128 protein phosphotransférase, OS=Volvox earteri métabolisme des GN=VOLCADRAFT 78928 glucides PE=3 SV=1 D8TLBO_VOLCA Uncharacterized protein Repliement des Intracellulaire 80502 OS=Volvox earteri protéines, fixation à GN=VOLCADRAFT 73112 l'ATP PE=3 SV=1 36 D8TLE3_VOLCA Heat-shock inducible Fixation à l'ATP, Intracellulaire 71055 Hsp70 activité hélicase, OS=Volvox earteri fixation aux acides GN=hsp70A PE=3 SV=1 nucléiques 37 D8TT41_VOLCA Luminal binding protein Repliement des Intracellulaire 71752 Bip1 protéines, fixation à OS=Volvox earteri l'ATP GN=bip1 PE=3 SV=1 38 D8TV86_VOLCA Argininosuccinate Activité Intracellulaire 48662 synthase argininosuccinate OS=Volvox earteri synthase, fixation à GN=ags1 PE=3 SV=1 l'ATP, biosynthèse de l'arginine 39 D8TZZ8_VOLCA Putative uncharacterized Chaperonne, fixation Membrane 57284 protein à l'ATP, repliement thylakoïdale OS=Volvox earteri des protéines (chloroplaste) GN=VOLCADRAFT_105311 PE=3 SV=1 D8U1H9_VOLCA Putative uncharacterized Synthèse du Intracellulaire 31375 protein phosphate de OS=Volvox earteri pyridoxal, synthèse GN=VOLCADRAFT 109832 de la vitamine B6 PE=3 SV=1 41 D8U9J4_VOLCA Glyceraldehyde-3- Activité Intracellulaire 40337 phosphate oxydoréductase, dehydrogenase action sur le OS=Volvox earteri groupement GN=VOLCADRAFT 76662 aldéhyde ou oxo des PE=3 SV=1 donneurs, fixation au NAD ou au NADP, métabolisme du glucose 42 D9CIY7_VOLCA 5-adenosylmethionine Catalyse de la Intracellulaire 42566 26 synthase formation de 5- 05=Volvox carteri f. adénosylméthionine nagariensis à partir de GN=METM1f PE=3 SV=1 méthionine et ATP 43 METK_CHLRE 5-adenosylmethionine Catalyse de la Intracellulaire 42584 synthase formation de S- OS=Chlamydomonas adénosylméthionine reinhardtii à partir de GN=METM PE=3 SV=1 méthionine et ATP 44 022660_9CH LO Alpha-tubulin Activité GTPase, Microtubule 49533 05=Chloromonas sp. fixation au GTP, ANT1 composant structural GN=tuba PE=3 SV=1 des microtubules 098765_9CHLO Ribulose-1,5- Activité catalytique Chloroplaste 52530 bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit 05=Chloromonas sp. ANT3 PE=3 SV=1 46 Q1WLZ5_CHLIN 14-3-3-like protein- Régulation cellulaire, Intracellulaire 29530 related protein chaperonne OS=Chlamydomonas incerta PE=2 SV=1 47 Q3L2Z3_HAEPL Superoxide dismutase Activité superoxyde Cytoplasme 23730 OS=Haematococcus dismutase Mitochondrie pluvialis GN=sod1 PE=2 SV=1 48 Q4JJJ6_DUNSA Beta-tubulin (Fragment) Activité GTPase, Microtubule 39100 OS=Dunaliella salina fixation au GTP PE=2 SV=1 binding, composant structural du cytosquelette 49 Q52R84_HAEPL 14-3-3 protein Chaperonne Intracellulaire 27630 OS=Haematococcus Cytoplasme pluvialis PE=2 SV=1 Q56D00_DUNSA 14-3-3 protein Chaperonne Intracellulaire 29284 OS=Dunaliella sauna Cytoplasme PE=2 SV=2 51 Q8VY41_DUNSA Heat shock protein 70B Repliement des Intracellulaire 71752 OS=Dunaliella sauna protéines, fixation à Cytoplasme GN=hsp7OB PE=2 SV=1 l'ATP, réponse au stress 52 Q94IK4_SCH DU Luminal binding protein, Fixation à l'ATP Réticulum 73021 BiP (Fragment) endoplasmique 05=Scherffelia dubia GN=bip PE=2 SV=1 Tableau 1 La caractérisation des protéines électro-extraites et l'analyse des spots visibles sur les profils électrophorétiques correspondant aux conditions "0,5 kV.crn-1" et "1 kV.crn-1" ont 27 montré que l'efficacité des CEP en matière de variété de protéines et, pour une même protéine, de quantité de matière électro-extraite dépend de la force des impulsions. L'identification des protéines électro-extraites avec des CEP de 1 kV.cm-1 nous a permis de déterminer la localisation intracellulaire initiale de celles-ci et donc les compartiments 5 affectés par les CEP. D'après les résultats obtenus, le cytoplasme, le chloroplaste, l'appareil de Golgi, le réticulum endoplasmique et, potentiellement, la mitochondrie en font partie. Des CEP de 1 kV.cm-1 sont donc suffisamment forts pour entraîner la perméabilisation de la/des membrane(s) des organites et affecter les processus qui s'y déroulent. En revanche, aucune protéine de la paroi cellulaire n'a été identifiée parmi les protéines extraites. De 10 plus, près de la moitié des protéines identifiées sont localisées (avant extraction) dans le chloroplaste. 8) Récupération/Régénération des microalgues Les culots cellulaires obtenus après l'étape de centrifugation sont placés dans du milieu de culture TAP. La densité cellulaire des nouvelles suspensions ainsi obtenues a été 15 fixée à 5.104 cellules.mL-1. Afin d'étudier la capacité de récupération/régénération des microalgues, différents paramètres traduisant leur état physiologique ont été mesurés pendant les trois jours suivant leur exposition à des CEP de 1 kV.cm-1 (N = 5) : la mobilité, la perméabilisation de la membrane plasmique, la multiplication cellulaire, l'activité photosynthétique, le rendement 20 quantique maximum de la photochimie des PS Il et la respiration. Les valeurs obtenues ont été comparées à celle d'une condition témoin (0 kV.cm-1) pour laquelle le même protocole de traitement a été utilisé excepté qu'aucune impulsion n'a été délivrée lors du passage des cellules dans la chambre d'électroporation. Dans les deux conditions (0 et 1 kV.cm-1), le pourcentage de cellules mobiles 25 augmente dès le premier jour de la période de récupération et continue d'augmenter durant les deux jours suivants pour finalement atteindre 85 % du nombre total de microalgues dans les deux populations (voir Figure 8). Pour expliquer ce résultat, l'hypothèse suivante peut être formulée : l'augmentation de la mobilité est le résultat de l'apparition de nouvelles cellules flagellées (stade macrozoïde) grâce à la reprise des divisions cellulaires. 30 L'augmentation proportionnelle de la densité cellulaire (voir Figure 10) et du pourcentage de cellules mobiles dans les deux conditions (0 et 1 kV.cm-1) renforce la validité de cette hypothèse. Dans le cas de la condition "1 kV.cm-1", la proportion de cellules mobiles 28 augmente plus fortement que pour la condition témoin. Une seconde hypothèse (valable uniquement pour les cellules de la condition "1 kV.cm-1") peut donc être envisagée : au cours de la période de récupération, la machinerie flagellaire des cellules traitées par CEP se remet à fonctionner normalement (réparation des dommages, augmentation de la synthèse 5 d'ATP). Le pourcentage de cellules perméabilisées (Figure 9) au sein des suspensions traitées par des CEP de 1 kV.cm-1 est significativement plus fort (55 % en moyenne du nombre total de cellules) que celui calculé pour la condition témoin durant les premières 24 h de la période de récupération. Il retourne à un niveau basal au cours des 24 h suivantes. Dans le 10 cas de la condition témoin (0 kV.cm-1), la proportion de cellules perméabilisées reste stable et inférieure à 10 % (en moyenne) de la population totale tout au long de la période de suivi. Or une membrane plasmique perméabilisée de manière transitoire suite à l'application d'impulsions électriques de l'ordre de la ms retrouve sa conformation initiale en seulement quelques minutes (au maximum). La première mesure de perméabilisation étant réalisée 75 15 min après la fin du traitement, le pourcentage de cellules perméabilisées au jour 0 (57,5 %) devrait donc correspondre à la proportion de cellules irréversiblement perméabilisées. Ces microalgues ne devraient par conséquent plus être viables. La diminution de la proportion de cellules perméabilisées observée entre les jours 1 et 2 serait donc a priori due à la multiplication des cellules restées viables suite au traitement (c'est-à-dire les 42,5 % de 20 cellules non perméabilisées). Néanmoins, la comparaison de l'évolution de la proportion de cellules (irréversiblement) perméabilisées par rapport à celle de la densité cellulaire révèle une incohérence au jour 1. En effet, la densité cellulaire des cultures traitées avec des CEP de 1 kV.cm-1 augmente continuellement au cours de la période de suivi et (presque) à la même vitesse que celle des cultures de la condition témoin (Figure 10). Le nombre de 25 cellules ayant doublé entre le jour 0 et le jour 1, la proportion de cellules ayant été exposées aux CEP au sein de la population totale est donc réduite de moitié. Or, la proportion de cellules perméabilisées ne varie pas significativement au cours des premières 24 h, ce qui indiquerait qu'une partie des cellules issues des divisions ayant eu lieu après le traitement serait perméabilisée alors que ces cellules "filles" n'ont pas été exposées aux impulsions 30 électriques. De part leur capacité à se diviser, les cellules incorporant le bleu Evans sont donc visiblement toujours viables. Ce résultat remet en cause la pertinence du choix du bleu Evans comme marqueur quantitatif de perméabilisation réversible/irréversible, et donc de 29 viabilité/mortalité. La densité cellulaire des cultures traitées par CEP augmente dès le début de la période de récupération. Les premières divisions post-traitement ont donc lieu au cours des 24 h suivant le transfert des cellules dans du milieu TAP frais. Les microalgues se divisent 5 cependant un peu plus lentement (0,5 versus 0,63 j-1) que les cellules non traitées (Figure 10) même si la différence de densité cellulaire entre les deux conditions n'est pas significative (p value > 0,05) durant les trois jours de suivi. L'augmentation rapide de la densité cellulaire des cultures traitées indique que les microalgues produisent très vite suffisamment d'énergie sous forme d'ATP pour se 10 multiplier. Deux processus sont responsables de la synthèse d'ATP : la respiration et la photophosphorylation (photosynthèse). Au cours des deux premiers jours de la période de récupération, le taux de respiration des cellules traitées augmente (Figure 13), ce qui pourrait indiquer une augmentation de la production d'ATP. Néanmoins, l'augmentation parallèle du taux de respiration des cellules de la condition témoin suggère une 15 contamination bactérienne des cultures (traitées et non traitées) significative dès le début de la période de suivi. Par conséquent, il est probable que des bactéries soient responsables de l'augmentation du taux de respiration mesurée pour les deux conditions. Dans le même temps, les valeurs de l'activité photosynthétique (Figure 11) et du rendement quantique maximal de la photochimie des PS Il (Figure 12) des cellules traitées 20 restent significativement inférieures à celles des cellules de la condition témoin (0 kV.cm-1). L'énergie fournie par la photophosphorylation est donc réduite pendant cette période. L'ATP (manquant) n'étant pas produit par une respiration plus intense, la capacité des cellules traitées à réaliser la photochimie semble par conséquent être suffisamment grande pour fournir l'énergie indispensable à la multiplication des microalgues. 25 A partir du 2ème jour de récupération, les valeurs de l'activité photosynthétique et du paramètre C1)0 des cellules traitées par CEP augmentent pour atteindre des valeurs qui ne sont plus significativement inférieures à celles des cellules non traitées (Figures 11 et 12). La densité cellulaire des cultures traitées augmentant dès le début de la période de suivi, la proportion de cellules ayant été exposées aux CEP dans ces cultures diminue au cours du 30 temps. Cependant, comme les valeurs des paramètres photosynthétiques n'augmentent que plus tardivement, les dommages causés par les CEP à la machinerie photosynthétique semblent se "transmettre" aux cellules issues des 30 divisions post-traitement. Les résultats présentés précédemment suggèrent fortement que le traitement CEP conduit à la perméabilisation des enveloppes chloroplastiques et des membranes thylacoïdales, permettant ainsi la diffusion des protéines et éventuellement de molécules de chlorophylles et de caroténoïdes. L'hypothèse que la récupération lente (72h) 5 de la machinerie photosynthétique suite au traitement CEP est liée au temps nécessaire (1) à la synthèse de novo des molécules électro-extraites et (2) à la chaine de transport des électrons photosynthétique pour fonctionner à nouveau normalement peut donc être émise. 10 Les résultats présentés dans cette section permettent de conclure que les cellules traitées avec des CEP de 1 kV.cm-1 (N = 5) sont capables de retrouver un état physiologique similaire à celui de cellules non traitées dans un délai de 3 jours suivant l'application du traitement. 9) Optimisation de l'étape d'incubation 15 L'objectif a été d'améliorer l'état physiologique des cellules traitées sans que le rendement d'extraction des protéines hydrosolubles soit réduit. L'eau distillée n'étant pas un milieu optimal pour la culture d'H. pluvialis, l'impact de la durée de la période d'incubation post-traitement des cellules dans l'eau distillée a été étudié. Les paramètres de CEP définis précédemment (1 kV.cm-1 et N = 5) n'ont quant à eux pas été modifiés. 20 Les résultats montrent qu'une période d'incubation réduite à 5 min, constitue un bon compromis entre le rendement d'extraction REVENDICATIONS1. Procédé d'extraction de molécules hydrosolubles intracellulaires essentiellement non-destructif de microalgues unicellulaires, ledit procédé comprenant : - une étape de fourniture de microalgues unicellulaires, lesdites microalgues étant dépourvues de paroi cellulaire secondaire ou ayant une paroi cellulaire secondaire d'épaisseur inférieure ou égale à 0.5 ,i,m ; - une étape de placement desdites microalgues dans un milieu de faible conductivité électrolytique pour former une suspension de microalgues, la conductivité électrolytique totale de ladite suspension de microalgues ayant une valeur allant de 15 et 40 ,I,S.crn-1 à 25°C; - une étape d'application d'un champ électrique pulsé sur ladite suspension de microalgues afin d'obtenir une suspension de microalgues temporairement perméabilisées, ledit champ électrique pulsé ayant une force électrique allant de 0,5 à 1 kV.cm-1; et, - une étape d'incubation de ladite suspension de microalgues temporairement perméabilisées, afin d'obtenir des microalgues appauvries en molécules hydrosolubles intracellulaire en suspension dans un milieu enrichi en molécules hydrosolubles extraites, ladite étape d'incubation permettant la diffusion de molécules hydrosolubles intracellulaires desdites microalgues au moins temporairement perméabilisées dans le milieu de faible conductivité électrolytique. 2. Procédé d'extraction selon la revendication 1, dans lequel lesdites microalgues sont des microalgues unicellulaires de l'ordre des Chlamydomonadales, préférentiellement de la famille Haematococcaceae et de manière davantage préférée du genre Haematococcus. 3. Procédé d'extraction selon la revendication 2, dans lequel lesdites microalgues étant des microalgues unicellulaires de l'espèce Haematococcus pluvialis, telle la souche déposée au Culture Collection of Algae and Protozoa, Scottish Marine Institute, au Royaume-Uni et ayant comme numéro d'ordre : CCAP 34/19 Haematococcus pluvialis. 30 4. Procédé d'extraction selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la densité desdites microalgues dans ladite suspension de microalgues est inférieure ou 32 égale à 106 cellules/mL de milieu de faible conductivité électrolytique ; et, de préférence de l'ordre de 105 cellules/mL de milieu de faible conductivité électrolytique. 5. Procédé d'extraction selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel 5 ledit champ électrique pulsé a des impulsions de durée comprise entre 14,us et 10 ms ; de préférence a des impulsions de durée comprise entre 0,1 ms et 5 ms ; et, de manière très préférentielle a des impulsions de durée comprise entre 1 ms et 3 ms. 6. Procédé d'extraction selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel 10 ladite étape d'incubation a une durée allant de 3 à 45 minutes; de préférence a une durée allant de 5 à 10 minutes. 7. Procédé d'extraction selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel lesdites molécules hydrosolubles sont des protéines. 15 8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel lesdites protéines ont un poids moléculaire allant jusqu'à 120 kDa et préférentiellement un poids moléculaire allant jusqu'à 150 kDa sur gel d'électrophorèse et allant jusqu'à 165 kDa par spectrométrie de masse. 20 9. Procédé d'extraction selon l'une 7 ou 8, dans lequel au moins 50% desdites protéines extraites est issu des chloroplastes desdites microalgues. 10. Procédé d'extraction selon l'une quelconque des revendications précédentes, ledit procédé comprenant une étape de séparation des microalgues appauvries en molécules 25 hydrosolubles extraites et du milieu enrichi en lesdites molécules hydrosolubles extraites. 11. Procédé d'extraction selon la revendication 10, ledit procédé comprenant une étape de récupération/régénération desdites microalgues appauvries en molécules hydrosolubles extraites après ladite étape de séparation, ladite étape de récupération/régénération consistant en une incubation desdites microalgues appauvries en molécules hydrosolubles dans un milieu nutritif adapté à la culture desdites microalgues.