Brevet FR3087650A1 — publié le 20200501

DOMAINE TECHNIQUE DE L'INVENTION L'invention concerne la Flavine Adénine Dinucléotide (FAD) pour son utilisation pour la prévention et/ou le traitement du cancer et une composition pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement du cancer comprenant de la FAD associée à un vecteur. L'invention appartient au domaine pharmaceutique et plus spécifiquement l'oncologie ou la cancérologie. ÉTAT DE LA TECHNIQUE to Le cancer est une maladie caractérisée par une prolifération cellulaire anormalement importante au sein d'un tissu normal de l'organisme, de telle manière que la survie de ce dernier est menacée. Ces cellules dérivent toutes d'un même clone, cellule initiatrice du cancer qui a acquis certaines caractéristiques lui permettant de se diviser indéfiniment. Au cours de 15 l'évolution de la maladie, certaines cellules peuvent migrer de leur lieu de production et former des métastases. « Cancer » est un terme général désignant une maladie pour laquelle certaines cellules du corps humain se divisent d'une manière incontrôlée et sont considérées comme ayant perdu leur capacité à se différencier. Les nouvelles 20 cellules résultantes peuvent former une tumeur maligne (un néoplasme) et/ou se propager à travers le corps. Le vieillissement de la population et l'amélioration des diagnostics laissent apparaitre une augmentation de l'incidence des cancers. Le traitement du cancer est ainsi devenu un enjeu de santé publique. Ce traitement se doit d'être 25 efficace à l'encontre des cellules cancéreuses tout en préservant au mieux les cellules saines de l'organisme. Or, la majorité des traitements disponibles actuellement sont de plus en plus efficaces en étant très agressifs envers les cellules cancéreuses, mais aussi envers les cellules saines conduisant à des effets indésirables pouvant être particulièrement invalidants. 30 Un objet de la présente invention est de proposer un nouveau traitement anticancéreux qui soit à la fois efficace sur les cellules cancéreuses tout en étant le plus ciblé et le moins toxique possible. RÉSUMÉ DE L'INVENTION Pour atteindre cet objectif, selon un mode de réalisation, la présente invention concerne la Flavine Adénine Dinucléotide (FAD) pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement du cancer. De manière surprenante, le demandeur a pu identifier que la FAD présente des propriétés intéressantes pour être utilisée dans la prévention et/ou le traitement des cancers. La présence de deux bases nucléiques dans sa structure moléculaire, l'adénine et l'alloxazine, lui confère une capacité de liaison double avec l'ADN td et le pouvoir d'interférer avec les mécanismes de contrôle de l'expression des gènes et de la différenciation cellulaire. Il a pu être mis en évidence une augmentation de concentration de la FAD dans des cellules cancéreuses. Sans être lié à une théorie, cette concentration peut être interprétée comme une tentative précoce de réparation cellulaire. 15 Par ailleurs, la FAD est sans toxicité pour les monocytes sanguins normaux PBM cells (GI 50 > 100 pM). De manière avantageuse, la FAD est utilisée comme principe actif principal ou comme adjuvant ou néo adjuvant dans un traitement anticancéreux. 20 Selon un autre aspect, la présente invention concerne une composition, avantageusement pharmaceutique pour son utilisation pour la prévention et/ou le traitement du cancer comprenant une quantité thérapeutiquement efficace de FAD et un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Selon un autre aspect, l'invention concerne une composition pour son 25 utilisation pour la prévention et/ou le traitement du cancer comprenant une particule comprenant un vecteur et de la FAD au moins partiellement encapsulée par le vecteur. Avantageusement, le vecteur présente un rôle de protection de la FAD limitant sa dégradation par des enzymes. La particule permet d'améliorer l'absorption et la distribution de la FAD 30 dans l'organisme tout en limitant sa dégradation notamment par des hydrolases sanguines. 3 BRÈVE DESCRIPTION DES FIGURES La figure 1 illustre le procédé de synthèse d'une particule or-FAD-PEG par la méthode IN. La figure 2 illustre le relargage de FAD à partir d'une particule or-FADPEG obtenue par méthode IN à pH 5 sur des spectres UV-Visible. La figure 3 illustre la protection de la FAD par différents vecteurs face à la FAD libre sur un graphe représentant la concentration de FAD en fonction du temps. La figure 4 illustre la variation de température des cellules exposées à des Io particules de l'invention par photothermie. La figure 5 illustre un spectre UV-Visible avant et après encapsulation de FAD en micelle par le PEG. La figure 6 illustre la stabilité de particule de FAD-PEG à pH 4 sur des spectres UV-Visible. 15 La figure 7 illustre l'hydrolyse de particule de FAD-PEG en fonction du temps. DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION Avant d'entamer une revue détaillée de modes de réalisation de 20 l'invention, sont énoncées ci-après des caractéristiques optionnelles qui peuvent éventuellement être utilisées en association ou alternativement : - Avantageusement, l'invention concerne la FAD pour son en tant qu'anticancéreux. utilisation - Avantageusement, l'invention concerne la FAD pour son utilisation 25 en tant que principe actif principal. utilisation - Avantageusement, l'invention concerne la FAD pour son en tant qu'adjuvant ou néoadjuvant d'un traitement anticancéreux. - Avantageusement, le cancer est choisi parmi le groupe constitué du cancer du sein, de la prostate, du poumon, des voies aériennes, des 30 voies digestives hautes et/ou basses, des organes de la digestion, du rein, des voies urinaires, des organes génitaux, de la peau, de la sphère ORL et des organes lymphatiques. - Avantageusement, l'invention concerne une composition pour son utilisation pour la prévention et/ou le traitement du cancer comprenant une particule comprenant un vecteur et de la FAD au moins partiellement encapsulée par le vecteur, - Avantageusement, le vecteur est choisi parmi l'un au moins parmi des nanoparticules de métal dont des nanoparticules d'or, des biopolymères dont le Poly Ethyléne Glycol (PEG), le chitosane, le collagène, le glucose, - Avantageusement, la particule est une nanoparticule ou une microparticule, - Avantageusement, la FAD est liée à au moins à un biopolymère et à au moins une nanoparticule d'or, - Avantageusement, la FAD est liée par liaison covalente à du PEG encapsulant au moins une nanoparticule d'or, - Avantageusement, la FAD est liée à des nanoparticules d'or par liaison de coordination et liée avec le PEG par liaison covalente. Avantageusement, la FAD est au moins partiellement encapsulée par au moins un biopolymère préférentiellement choisi parmi le PEG, le chitosane, le glucose, préférentiellement par une micelle de PEG, - Avantageusement, la particule comprend à sa surface au moins un agent de ciblage, Les agents de ciblage visent à rendre plus spécifique la pénétration de la particule dans les cellules cancéreuses. - Avantageusement, la composition comprend une quantité thérapeutiquement efficace de FAD, avantageusement en tant que principe actif principal, ou adjuvant ou néo adjuvant d'un traitement anticancéreux, et un véhicule pharmaceutiquement acceptable - Avantageusement, la quantité thérapeutiquement efficace de FAD comprend une quantité de FAD libre et une quantité de FAD associée à un vecteur, La FAD libre s'entend comme de la FAD non associée à un vecteur. Cette association de deux formes de FAD permet d'assurer une efficacité immédiate dès l'administration et une efficacité prolongée 5 par la FAD associée au vecteur qui présentent ainsi une biodisponibilité sur une durée plus longue. - Avantageusement, la composition est sous forme adaptée à une administration parentérale incluant intraveineuse, intramusculaire et sous-cutanée, à une administration vaginale ou rectale. Selon un autre aspect, la présente invention concerne un procédé de synthèse de nanoparticules, par complexation et/ou par encapsulation avec des excipients pharmacologiquement acceptables. Peuvent ainsi être réalisées des 10 capsules comportant des polyéthylènes glycols (PEG) et des agents de ciblage, ou encore des liposomes. Les agents de ciblage visent à rendre plus spécifique la pénétration de la particule dans les cellules cancéreuses. La Flavine Adénine Dinucléotide (FAD) est un cofacteur d'oxydoréduction 15 fabriqué à partir de la Flavine Mono nucléotide (FMN). Elle est associée aux enzymes oxydoréductases. C'est une molécule organique non protéique hydrosoluble. La FAD est une molécule de formule I ci-dessous : 20 H3C HaC OH OH Formule I f) Elle est commercialisée notamment par Alfa Aesar et porte le numéro CAS 146-14-5. La FAD est synthétisée naturellement par l'organisme, et elle est composée d'une molécule de type vitaminique B2 d'une part, et d'une base nucléique adénine anciennement appelée vitamine B4 d'autre part, toutes deux d'une parfaite innocuité. La FAD se distingue de la vitamine B2, d'un point de vue structurel par la présence de la base nucléique adénine, et du point de vue de leurs fonctions et répartitions dans le corps humain. La FAD est un co-facteur dans les réactions d'oxydoréduction. Elle représente 70 à 90% de la riboflavine totale (RT) de l'organisme répartie dans les tissus cellulaires. Alors que la vitamine B2 ne représente que 0,5 à 2% de la riboflavine totale et intervient essentiellement comme constituant de la FMN (5 à 30% de la RT). Elle est présente dans 15 l'urine. La biodisponibilité de la FAD est cependant limitée, car la molécule est dégradée dans le sang sous la forme circulante de FMN (Flavine Mono nucléotide). 20 La FAD joue un rôle de coenzyme dans de nombreuses réactions biologiques dans l'organisme. Toutefois, à la connaissance du demandeur la FAD n'a jamais été utilisée pour le traitement et/ou la prévention de cancer. Selon l'invention, la FAD est utilisée pour traiter des cancers. Sans être lié à une théorie, il a été constaté que la FAD réduit la viabilité des cellules 25 cancéreuses. La FAD selon l'invention est avantageusement utilisée pour prévenir des cancers, c'est-à-dire que la FAD joue un rôle préventif. Le traitement préventif du cancer repose sur l'absence de toxicité de la FAD et sa capacité à inhiber précocement la croissance des cellules cancéreuses par exemple soit en les 30 dirigeant vers l'apoptose, soit en les différenciant c'est-à-dire en orientant leur maturation cellulaire vers leur organe de prédestination. 7 Selon un mode de réalisation de l'invention, la FAD est utilisée en tant que principe actif avantageusement seule. La FAD selon l'invention n'est pas utilisée uniquement comme potentialisateur biologique d'un autre principe actif anticancéreux ou non. Selon une possibilité de l'invention, la FAD est utilisée en tant que néoadjuvant. En tant que néoadjuvant elle prépare un traitement principal de chirurgie d'exérèse tumorale. On entend par néoadjuvant un traitement destiné à réduire la taille de la tumeur ou la stabiliser avant de pratiquer une opération chirurgicale ou une radiothérapie qu'il rend ainsi plus faciles. io Selon une possibilité de l'invention, la FAD est utilisée en tant qu'adjuvant, elle complète les traitements de chirurgie, de chimiothérapie ou radiothérapie, en prévenant le risque de récidives locales ou de métastases. En maintenant une pression inhibitrice sur la croissance des cellules cancéreuses, la FAD consolide les acquis de la chimiothérapie dans l'intervalle entre deux 15 séquences du traitement. Et elle en réduit les effets secondaires par son action métabolique sur les cellules saines. A titre préféré, la FAD est utilisée pour la prévention et/ou le traitement de cancers choisis parmi les tumeurs solides et les lymphomes. Avantageusement, 20 le cancer est choisi parmi le groupe constitué du cancer du sein, de la prostate, du poumon, des voies aériennes, des voies digestives hautes et/ou basses, des organes de la digestion tels que l'estomac, le foie, le pancréas, du rein, des voies urinaires, des organes génitaux, de la peau, de la sphère ORL et des organes lymphatiques. Elle est également utilisée dans le traitement des 25 leucémies. Selon un mode de réalisation préféré, la FAD est au moins partiellement encapsulée dans une particule de sorte notamment à améliorer son absorption, sa biodisponibilité et/ou sa distribution avantageusement tout en limitant sa 30 destruction notamment par des pyrophosphatases et/ou hydrolases sanguines. La formulation encapsulée permet d'augmenter la demi-vie de la FAD. Avantageusement, l'invention concerne une composition comprenant une particule comprenant un vecteur et de la FAD au moins partiellement encapsulée, préférentiellement entièrement encapsulée. 5 On parle d'une particule, mais il est entendu que la composition comprend une pluralité de particules. La particule selon l'invention est une microparticule ou une nanoparticule. On entend au sens de l'invention que les nanoparticules sont de tailles inférieures à 100nm et préférentiellement, les nanoparticules selon l'invention Io sont de diamètre inférieur à 50 nm. On entend au sens de l'invention que les microparticules sont de tailles comprises entre 1 et 1000pm et préférentiellement, les microparticules selon l'invention sont de diamètre inférieur 100 pm. Les particules peuvent être des capsules, des micelles, des liposomes 15 dans lesquelles la FAD est au moins partiellement, préférentiellement totalement entourée d'au moins un vecteur, ou des sphères dans lesquelles le vecteur forme une matrice dans laquelle la FAD est dispersée. Selon l'invention, le vecteur comprend un biopolymère ou un mélange de 20 biopolymères seul ou associé(s) à au moins un métal, préférentiellement sous forme de nanoparticule. Un biopolymère est un polymère biocompatible choisi parmi le groupe comprenant le chitosane, l'élastine, l'acide hyaluronique, l'alginate, la gélatine, le collagène, la cellulose, le glucose et le polyéthylène glycol (PEG). 25 Le métal est préférentiellement de l'or. Avantageusement, la FAD est au moins partiellement encapsulée c'est-à-dire qu'au moins une partie de la FAD est associée au vecteur pour former la particule. 30 Selon une première variante, la FAD est au moins partiellement encapsulée dans une particule dont le vecteur est un biopolymère ou un mélange de biopolymères. Préférentiellement, le vecteur est du PEG. A titre 9 alternatif, le vecteur est du chitosane associé ou non à du glucose. La particule est une micelle pouvant être de taille micrométrique préférentiellement nanométrique. La micelle assure l'encapsulation de la FAD en son coeur. Avantageusement, selon cette première variante, la particule est formée par un procédé de fabrication tel que la formation d'une émulsion par agitation des deux composés ou par brassage dans un fluide supercritique Selon une deuxième variante, la FAD est au moins partiellement encapsulée dans une particule dont le vecteur est un biopolymère ou un io mélange de biopolymères et un métal. Préférentiellement, le métal est une nanoparticule préférentiellement d'or. En plus de l'action anticancéreuse propre de la FAD, les complexes de FAD avec l'or ont la propriété de réagir à une irradiation infrarouge pour provoquer une hyperthermie intracellulaire exploitable en thérapeutique. L'effet 15 photothermique commence au-delà d'une élévation thermique supérieure à 4°C. C'est le cas comme illustré à l'exemple 11 et à la figure 4. Il est ainsi possible de détruire les cellules cancéreuses, ayant absorbé une particule selon l'invention comprenant de la FAD encapsulée et au moins une nanoparticule d'or et un biopolymère comme vecteur, par sonde thermique laser à 20 rayonnement infrarouge. L'effet d'hyperthermie s'ajoute à l'effet inhibiteur de la FAD. La sélection de ces nanoparticules d'or permet d'assurer des nanoparticules stables, faciles à réaliser et très reproductibles et présentant une biocompatibilité avec les biomolécules qu'on veut greffer à leur surface ou 25 encapsuler. Avantageusement, le vecteur comprend du PEG et au moins un atome d'or, préférentiellement une nanoparticule d'or. La particule est formée par la FAD qui est liée par liaison covalente telle 30 qu'une liaison carbodiimide (EDC/NHS) au PEG, le PEG étant complexé avec au moins une nanoparticule d'or. 10 Selon un premier mode de réalisation, le PEG est complexé avec au moins une nanoparticule d'or et la FAD est liée par liaison covalente au PEG partiellement à la surface de la particule. La particule selon ce premier mode de réalisation est avantageusement obtenue par un procédé de fabrication dit méthode ON comprenant une première étape de synthèse de particule, préférentiellement de nanoparticule d'or et PEG puis une deuxième étape de couplage de la FAD, notamment par chimie carboiimide sur le PEG. Avantageusement, la première étape de synthèse comprend le mélange d'un sel d'or sous forme HAuCla avec le PEG. 10 Selon un deuxième mode de réalisation, la FAD est complexée par réaction de coordination avec au moins un atome d'or, préférentiellement une nanoparticule d'or, et liée par liaison covalente au PEG. La particule selon ce deuxième mode de réalisation est avantageusement obtenue par un procédé 15 de fabrication dit méthode IN comprenant une première étape de complexation de la FAD avec au moins un atome d'or puis une deuxième étape de couplage du complexe or-FAD avec le PEG. Avantageusement, la première étape comprend le mélange d'un sel d'or sous forme HAuCla avec la FAD pour former le complexe or-FAD. La FAD étant liée par liaison de coordination avec l'atome 20 d'or. Avantageusement, la deuxième étape comprend le mélange du complexe or-FAD avec du PEG. Le PEG formant un réseau polymérique encapsulant le complexe or-FAD. Une étape ultérieure de réduction permet de réduire les sels d'or en atome d'or neutre par l'ajout par exemple de NaBH4. 25 Selon un mode de réalisation, la particule comprend au moins un type d'agents de ciblage. Les agents de ciblage visent à rendre plus spécifique la pénétration de la particule dans les cellules cancéreuses. A titre d'exemple les agents de ciblage sont choisis parmi des peptides, des anticorps monoclonaux, des aptamères, en particulier la protéine TAT-1 du H IV est un agent de ciblage 30 avantageusement utilisé dans l'invention. La particule est avantageusement formée d'atomes d'or, de molécules de FAD et de Polyéthylène glycol (PEG), avec ou sans incorporation d'agent de ciblage. 11 Suivant un aspect, l'invention concerne une composition, avantageusement thérapeutique, pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention de cancers comprenant la FAD, avantageusement en quantité thérapeutiquement efficace, et un véhicule thérapeutiquement adapté. La composition est destinée à être utilisée en tant que principe actif principal ou adjuvant ou néo-adjuvant d'un traitement anticancéreux. Cette composition thérapeutique peut comporter un mélange, en proportions variables, de FAD libre et de FAD au moins partiellement 10 encapsulée sous forme de particule. La composition comprend de la FAD libre et des particules telles que décrites ci-dessus comprenant un vecteur et de la FAD au moins partiellement encapsulée par le vecteur. La FAD est dite libre, car elle n'est pas liée à une particule. Cette association de deux formes de FAD d'apporter une première 15 quantité de FAD très rapidement grâce à la forme libre puis la FAD encapsulée relargue au cours du temps la FAD assurant une administration à durée prolongée. La composition est avantageusement formulée pour être adaptée à une administration parentérale incluant intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée 20 et/ou à une administration vaginale ou rectale selon la localisation des lésions cancéreuses à atteindre. La composition est avantageusement formulée pour être adaptée sous la forme de solution pour l'injection, de solution buvable et/ou de gel. 25 Selon un aspect, l'invention concerne une nanoformulation de FAD. Avantageusement, la nanoformulation comprend de la FAD au moins préférentiellement encapsulée dans ou avec une particule comprenant un vecteur et de la FAD. Préférentiellement, la nanoparticule présente un diamètre inférieur à 50nm. 30 À titre d'exemple préféré, la concentration plasmatique efficace de FAD est comprise entre 1 et 10 pM/L. En effet, la concentration inhibitrice (C150) qui 12 réduit la croissance des cellules cancéreuses en cultures de 50%, a pu être constatée dans une gamme de 0.5 à 5 pM/L Pour les exemples ci-après la molécule FAD, a été achetée chez Alfa 5 Aesar. Les mesures ont été faites sur un spectromètre UV-visible Uvikon 941 Kontron instruments pilotés par le logiciel Thermalys Uvikon 900. Les solutions ont été placées dans des cuves en quartz de 1 cm de trajet optique. Les spectres d'absorption des nanoparticules d'or, ont été enregistrés dans la io gamme spectrale allant de 200nm à 900nm. Les expériences de Spectrométrie Raman /SERS ont été réalisées avec le spectromètre Xplora développé par Horiba Jobin Yvon. Ce spectromètre utilise une source laser monochromatique, qui est focalisée sur l'échantillon. Le signal Raman diffusé par l'échantillon est collecté avec le même objectif (configuration 15 en rétrodiffusion). Le signal Raman est ensuite dirigé vers un réseau de diffraction dont l'image est collectée par une caméra CCD, ce qui donne un spectre. L'étude des particules a été réalisée en utilisant les paramètres suivants : - Longueur d'onde d'excitation : 660 nm 20 - Trou confocal de collection : 300pm - Réseau de diffraction : 600 traits/mm, donnant accès à une résolution spectrale de l'ordre de 3cm-1. - Temps d'acquisition : 120 secondes répétées 2 fois 25 Exemple 1 : Procédé de synthèse de particules or-FAD-PEG par une méthode IN. Le complexe est principalement préparé avec des sels d'or, typiquement l'acide chloraurique (HAuC14, Aldrich) de concentration à 1mM. Après 30 dissolution du sel d'or, la solution est agitée vigoureusement et la solution de FAD est ajoutée (5m1 à une concentration de 40pM), après quelques instants on ajoute 250p1 de PEG et 600pL de NaBH4. La liaison chimique s'effectuera par coordination au niveau des groupements phosphates du motif du ribose ou 13 de la cétone du motif de la flavine du PEG. La FAD est encapsulée au coeur de la particule par le PEG. Le procédé de synthèse est illustré en Figure 1. La purification de la particule se fait par ultra centrifugation à 9000rpm. La solution est centrifugée à 9000rpm, le surnageant est supprimé, le culot est resuspendu dans l'eau, ces trois étapes sont reproduites 3 fois d'affilées. Exemple 2 : 10 Procédé de synthèse de particules or-FAD-PEG par une méthode ON. Des solutions d'or colloïdal, sont préparées par réduction de sels d'or, typiquement l'acide chloraurique (HAuC14, Aldrich) de concentration à 1 mM. Après dissolution du sel d'or, la solution est agitée vigoureusement et l'agent réducteur NaBH4 (Sodium tétrahydridoborate, Sigma Aldrich) est ajouté, 15 réduisant les ions Au3+ en atomes d'or neutres (Au0). Au cours de la réaction, de plus en plus d'atomes d'or sont produits, la solution devient sursaturée et les atomes d'or commencent à précipiter sous la forme de particules subnanométriques. Afin d'éviter que les particules s'agrègent entre elles, un agent stabilisant est avantageusement ajouté, PEG-COOH (Poly-Éthylène- 20 Glycol di carboxylique, Sigma Aldrich), à température ambiante. Les molécules de PEG, grâce à leur double nature hydrophobe et hydrophile peuvent interagir avec un cluster d'AuCI- et produire, grâce à un procédé de réduction, des nanoparticules d'or bien dispersées et de taille d'environ 1 Onm. La biomolécule FAD est greffée par liaisons Carbodiimides en utilisant le 25 couple activateur EDC/NHS (pour 1 -Ethy1-3-(3-dimethylaminopropy1)- carbodiimide / N-hydroxysuccinimide) (40mg/10mg). Le couple activateur va activer le groupement COOH du PEG, et le groupement NH2 du FAD, ce qui crée une liaison covalente Carbodiimide. La FAD est ajoutée dans une quantité de 500pL à cette solution à 45004 30 de nanoparticules d'or, ce qui fait une concentration de 40pM de FAD dans la solution. La purification de la particule est réalisée de manière identique à ce qui est décrit dans l'exemple 1. 14 La FAD est complexée avec une nanoparticule d'or. La FAD est liée par liaison carbodiimide au PEG. La FAD est agencée à la surface de la nanoparticule d'or-PEG. Exemple 3 : Caractérisation de particules or-FAD-PEG synthétisées par une méthode IN. Les particules obtenues selon l'exemple 1 sont caractérisées par la mesure d'absorbance UV-visible permettent de voir le couplage des particules fo avec la FAD. Les résultats montrent des spectres UV-visible des étapes de formation des particules de tailles nanométriques soit des nanoparticules: - un premier spectre correspond aux complexes sels d'or-FAD, on peut juste observer la signature du FAD, ce qui correspond à la 15 complexation du FAD aux sels d'or, - un deuxième spectre correspond aux sels d'or - FAD - PEG, on peut constater qu'il n'y a pas eu formation de nanoparticules, les sels d'or ne sont pas réduits, il n'y a pas de bande plasmon, - un spectre correspond à la particule Or- FAD- PEG - agent réducteur 20 NaBH4, on peut observer l'apparition d'une bande plasmon à 560nm, ce qui correspond à la formation de nanoparticules. On obtient une solution colloïdale stabilisée par la présence du PEG. Les échantillons sont passés au MET (Microscopie Électronique 25 Transmission) ce qui permet de confirmer la formation de nanoparticules Les particules obtenues selon l'exemple 1 sont caractérisées par SERS permettant de voir le couplage des nanoparticules avec la FAD. Les résultats non représentés montrent un premier spectre représentant la 30 formation des particules laissant apparaitre des pics correspondant à la poudre de FAD (deuxième spectre) permettant de constater la formation de particules. 15 Exemple 4 : Caractérisation de particules or-FAD-PEG synthétisées par une méthode ON. Les particules or-PEG-FAD obtenues selon l'exemple 2 sont caractérisées par la mesure d'absorbance UV-visible permettant de voir le couplage des nanoparticules avec la FAD. La particule seule, avant et après fonctionnalisation par FAD sont comparées avec le contrôle négatif qui est de la FAD seule à l'état de poudre. Sur le spectre après fonctionnalisation par la FAD, on constate que la bande plasmon s'élargit, se décale vers le rouge à 530 nm et devient 10 asymétrique. Cette asymétrie semble correspondre à l'accrochage du FAD à la surface des nanoparticules. Les échantillons sont passés au MET (Microscopie Électronique Transmission) ce qui permet de confirmer la formation de nanoparticules 15 Les particules obtenues selon l'exemple 2 sont caractérisées par SERS permettant de voir le couplage des nanoparticules avec la FAD Trois spectres SERS non représentés sont obtenus: celui des nanoparticules d'or seules, celui des nanoparticules d'or après greffage 20 covalent de FAD et celui de la molécule FAD sous forme de poudre. Dans tous les cas, on observe une bande à 1640 cm-1 qui correspond à l'eau, solvant des nanoparticules. De plus, on observe des bandes Raman qui correspondent à la signature du PEG-COOH qui enrobe les nanoparticules : bandes à 1137 cm-1 dues à la vibration du groupement COC, à 1270 cm-1 qui 25 correspond à la vibration du groupement COH, et à 1455 cm-1 correspondant à la vibration du groupement CO. Le spectre de FAD greffé par liaison covalente présente toujours les pics du PEG-COOH, mais on constate également l'apparition d'un nouveau pic à 1349 cm-1 pour l'adénine, et à 1462 cm-1 pour le groupement C-0. Sur le 30 spectre représentant FAD en poudre, plusieurs pics à 1349 cm-1 et 1462 cm-1, correspondent à la FAD. On prendra ce spectre de la FAD comme référence pour voir la signature de FAD. 16 Exemple 5 : Caractérisation du relargage de FAD par des particules or-FAD-PEG synthétisées par une méthode IN. Les particules obtenues à l'exemple 1 sont centrifugées à 13000 rpm, pendant 30min à 4°C, le culot est récupéré et resug)endu dans d'autres milieux comprenant du PBS pH 7 et 5. Les échantillons sont incubés à 37°C pour différents durées de 1h, 5h, 24h, 48h et 72h pour suivre l'évolution du relargage par spectroscopie fo d'extinction (UV-visible) et par spectroscopie vibrationnelle (SERS). Les résultats des spectres UV-visible (figure 2) montrent le relargage de FAD, en fonction du temps à pH 5. Il est de plus de 90% à 24 H 15 Sur le spectre par SERS avant le relargage (non représenté) on observe des bandes Raman qui correspondent à la signature de la FAD greffée à l'intérieur du complexe. Après avoir changé le milieu des nanoparticules (PBS pH 5 et 7), on observe de façon concordante la disparition des pics qui signent la présence de FAD. Cela correspond au relargage de FAD avec le temps. 20 Exemple 6: Protection de la FAD dans différentes particules. La protection de la FAD dans des particules en comparaison avec la FAD 25 libre est étudiée. Les résultats sont illustrés en figure 3. Différentes particules comprenant de la FAD sont comparées à la FAD libre: - La FAD encapsulée avec une particule d'or-FAD-PEG ON est obtenue par la méthode ON décrite à l'exemple 2. 30 la FAD encapsulée avec une particule d'or-FAD-PEG IN obtenue par la méthode IN obtenue à l'exemple 1. 17 Les différentes particules et la FAD libre sont respectivement mises dans une solution d'enzyme NucléoPyroPhosphatase à 25 °C. La concentration de la FAD est suivie dans le temps par dosage HPLC. Il ressort que la FAD libre est hydrolysée en totalité en 15 minutes quand la concentration en FAD encapsulée par la méthode IN est inchangée après 400 minutes. La en FAD encapsulée par la méthode ON présente une hydrolyse de près de 50% de la FAD à 400 minutes. io Exemple 7 : Synthèse de particules de PEG-FAD, caractérisation et stabilité. 5m1 de FAD à 80pM est mélangé avec 500p1 de PEG, sous agitation continue magnétique pendant environ 4h. Des particules de PEG-FAD sont obtenues. Une étape de purification des particules est réalisée telle que décrit 15 dans l'exemple 1. La caractérisation de la particule par UV-visible (spectroscopie d'extinction) et par spectroscopie Raman est réalisée permettant d'identifier la formation de micelle de PEG encapsulant la FAD. La figure 5 illustre les 20 résultats de l'analyse par UV-Visible de la FAD seule, du PEG seul et la particule PEG-FAD. La spectroscopie Raman, confirme la signature du PEG dans le complexe PEG-FAD. Le suivi de stabilité de la particule a été faite par spectroscopie UV-visible 25 et Raman dans du PBS à pH 4 et 7 à 37°C. Les résultats à pH 4 en UV-visible sont illustrés en figure 6 En spectroscopie UV, on peut observer une superposition des courbes à pH 7 et un changement non significatif à pH 4. On peut en conclure que le complexe est stable dans les deux milieux et au cours du temps. 30 Ces résultats sont confirmés par la spectroscopie Raman. 18 Exemple 8 : Effets des différentes particules sur la prolifération des cellules HELA. Les tests sont réalisés sur des cellules HeLa (métastase de cancer de l'utérus) sur des plaques 24 puits ensemencés à moyenne / haute densité 5 (20000 cellules / puits) dans du milieu de culture cellulaire DMEM complet (Dulbecco's Modified Eagle Medium avec sérum) Après 24H de stabilisation, les cellules sont incubées pendant 48 H dans du DMEM complet avec différentes concentrations des produits à tester. Chaque traitement est réalisé en triplicat et fournit une moyenne de croissance fo pour chaque dose considérée. La viabilité des cellules est évaluée par test MTT : coloration des cellules vivantes par un sel de tetrazolium et détection par absorbance. Elle est exprimée en pourcentage de croissance par rapport à un témoin de culture ne comportant que du milieu. 15 Les résultats montrent qu'on a un meilleur effet avec les particules Or- FAD-PEG IN obtenues par la méthode IN avec un pourcentage de prolifération de 71%. Par détection d'absorbance par test MTT, les inhibitions de croissance 20 G150 sont respectivement de 0,3 et 0,5 pM pour les particules or-PEG-FAD-IN couplés à un agent de ciblage HIV-TAT-1 et les particules or-PEG-FAD-IN couplés à du chitosane. Ces résultats corroborent le fait que la synthèse de particule par méthode 25 IN a un effet dans l'inhibition de la prolifération des cellules HeLa. Exemple 9 : Effets des différentes nanoparticules sur la prolifération des cellules MCF7. 30 L'inhibition de croissance des cellules cancéreuses MCF7 (cancer du sein) est testée sur des cellules MCF7 en culture pendant 48H au contact de la particule or-FAD-PEG avec ou sans agent de ciblage obtenue par la méthode IN. Elle est comparée à l'activité d'un produit anticancéreux de référence, la 19 staurosporine, par lecture d'absorbance du test colorimétrique basé sur la réduction du composé tetrazilium MTS permettant la quantification des cellules viables. (Promega - Cell Titer Proliferation Assay) Il est constaté que l'inhibition de croissance G150 est supérieure à celle de la staurosporine avec 0,45 pM/L pour or-FAD-PEG, 0,70 pM/L pour or-FADPEG-agent de ciblage étant HIV-TAT-1 et environ 4 pM/L pour la staurosporine Exemple 10 : io Effets des différentes particules sur la prolifération des cellules HT22. Des tests sur des cellules HT22 (tumeur cérébrale murine) sont réalisés avec la particule or-FAD-PEG obtenue par la méthode IN. L'inhibition de croissance des cellules cancéreuses par la particule or-FAD-PEG obtenue par la méthode IN est comparée à l'activité de la staurosporine après 48 H 15 d'incubation et détection d'absorbance par test MTS. Les résultats montrent une inhibition de croissance de 50% (GI 50) de 1,6 pM/L pour la particule or-FAD-PEG obtenue par la méthode IN et 2,7 pM/L pour la staurosporine, soit un meilleur effet pour la particule testée que pour le témoin positif. 20 Exemple 11 : Photothermie des différentes nanoparticules. L'effet photothermique de la FAD selon l'invention est mesuré par contrôle 25 de l'augmentation de température de cellules mélangées avec des particules obtenues avec la méthode IN conformément à l'exemple 1. Les cellules sont ensuite irradiées par rayonnement infrarouge par sonde thermique laser. Les résultats sont illustrés en figure 4. On constate que seules les particules d'or-FAD-PEG et or-FAD-PEG30 agent de ciblage étant HIV-TAT-1 présentent une élévation thermique supérieure à 4°C. 20 Exemple 12 : Essai in vitro de viabilité des cellules MIA Paca-2. Les cellules MIA Paca-2 sont des cellules humaines de cancer du pancréas [American Tissue Cell Culture (ATCC, Manassas, VA, USA)] cultivées en milieu DMEM. Le test de viabilité MTT est réalisé à une densité cellulaire de 0.1x10*6 cellules/mL. Les produits testés sont mis en incubation pendant 2H à la concentration de 120pM/L et en triplicat, avec témoin de culture (ref: Blank) (100%) et témoin positif au DMSO (5%). Dans ces conditions, la viabilité cellulaire est de 34% en présence de FAD seule, 6% avec FAD-PEG. 10 Les résultats montrent une très bonne efficacité de la particule de FADPEG. 15 Exemple 13 : Résistance à l'hydrolyse dans le sérum en fonction du temps. Un test comparatif d'hydrolyse de la FAD libre et de la FAD-PEG de taille micrométrique obtenue à l'exemple 7 est réalisé dans le sérum pour tester la résistance aux enzymes. Il montre la stabilité de la particule FAD-PEG jusqu'à 20 20 H, REVENDICATIONS1. Flavine Adénine Dinucléotide (FAD) pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement de cancer. 2. FAD pour son utilisation selon la revendication 1 en tant que principe actif principal. 3. FAD pour son utilisation selon la revendication 1 en tant qu'adjuvant ou néoadjuvant d'un traitement anticancéreux. 4. FAD pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications fo précédentes dans laquelle le cancer est choisi parmi le groupe constitué du cancer du sein, de la prostate, du poumon, des voies aériennes, des voies digestives hautes et/ou basses, des organes de la digestion, du rein, des voies urinaires, des organes génitaux, de la peau, de la sphère ORL et des organes lymphatiques. 15 5. Composition comprenant de la FAD selon l'une quelconque des revendications précédente dans une quantité thérapeutiquement efficace et un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 6. Composition selon la revendication précédente pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement de cancer comprenant une particule 20 comprenant un vecteur et de la FAD au moins partiellement encapsulée par le vecteur. 7. Composition pour son utilisation selon la revendication précédente dans laquelle le vecteur est choisi parmi l'un au moins parmi des nanoparticules de métal dont des nanoparticules d'or, des biopolymères dont le Poly Ethyléne 25 Glycol (PEG), le chitosane, le collagène, le glucose. 8. Composition pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 5 à 7 dans laquelle la particule est une nanoparticule ou une microparticule. 9. Composition pour son utilisation selon l'une quelconque des 30 revendications 5 à 8 dans laquelle la FAD est liée à un biopolymère et à une nanoparticule d'or. 22 10. Composition pour son utilisation selon la revendication précédente dans laquelle la FAD est liée par liaison covalente à du PEG encapsulant au moins un atome d'or. 11. Composition pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 5 à 9 dans laquelle la FAD est liée à des atomes d'or par liaison de coordination et liée avec le PEG par liaison covalente. 12. Composition selon l'une quelconque des revendications 5 à 8 dans laquelle la FAD est au moins partiellement encapsulée par au moins un biopolymère préférentiellement choisi parmi le PEG, le chitosane, le glucose. io 13. Composition selon l'une quelconque des revendications 5 à 12 dans laquelle la quantité thérapeutiquement efficace de FAD comprend une quantité de FAD libre et une quantité de FAD associée à un vecteur. 14. Composition selon l'une quelconque des revendications 5 à 13 sous une forme adaptée à une administration parentérale incluant intraveineuse, 15 intramusculaire et sous-cutanée, à une administration vaginale ou rectale.