Brevet FR3080621A1 — publié le 20191101

NOUVELLE CLASSE D'IMMUNOGLOBULINE RECOMBINANTE DE TYPE G : IgG5, CODÉE PAR LE PSEUDO-GÈNE GAMMA HUMAIN DE CHAÎNE LOURDE DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne le domaine de la médecine, en. particulier une nouvelle structure d'immunoglobuline humaine codée par un gène considéré 10 auparavant comme étant un. pseudo-gène non exprimé : le pseudo-gêne gamma. Quatre classes d'immunoglobulines G, à savoir IgGl, IgG2, IgG3 et IgG4 sont connues (Vidarsson, G., Dekkers, G. & Rispens, T. Sous-classes et allotypes d'igG - de la structure aux fonctions 15 effectrices. Front. Immunol. 5, 520 (2014)). L'invention démontre l'expression non conventionnelle du pseudo-gène gamma, et montre que des produits codés par ce pseudo-gène peuvent fournir un nouvel outil pour une immunothérapie chez l'homme, définissant une classe supplémentaire d'Ig de 20 type G : l'IgGS ARRIÈRE-PLAN DE L'INVENTION L'immunothérapie est un domaine très actif comportant de multiples développement en termes à la fois 25 de thérapie anti--cancéreuse, maladies infectieuses et types de tumeurs, entraînant une rémission à long 30 finalement transformant des maladies mortelles antigènes spécifiques de immuns ont. complètement maladies inflammatoires, anticorps ciblant des Les tumeur changé ou des points de contrôle le pronostic de nombreux terme et en maladies chroniques presque sous contrôle du système immunitaire. Le traitement de troubles auto-immuns par des anticorps 2 monoclonaux a également mplètement changé le pronostic de ces troubles. Tandis que les molécules d'anticorps sont ainsi devenues des outils majeurs contre le cancer et d'autres maladies humaines, la diversité des molécules disponibles est actuellement restreinte à IgM et les quatre classes d'IgG humaines connues (IgGl, I G2, IgG3 et IgG4), chacune ayant des propriétés fonctionnelles uniques (Vidarsson, G., Dekkers, G. & Rispens, T. ous-classes et a lotypes d'IgG 10 de la structure aux fonctions effectrices. Front. Immunol. 5, 520 (2014)). Même si diverses mutations pourraient être introduites dans la structure des chaînes lourdes d'IgG de façon à moduler leur fonction, le spectre de modifications possibles est limité intrinsèquement par le risque de créer 15 de nouveaux épitoges immunogènes. Seuls quatre gènes fonctionnels codant pour les chaînes lourdes d'IgG humaines sont présents dans le génome humain, alors qu'un cinquième gène homologue a été qualifié de « pseudo-gamma » avec pour explication une absence 20 d'expression en raison de l'absence d'une région flanquante de « commutation » (région « Switch ») adéquate, apte à supporter une recombinaison adéquate permettant l'expression du gène (Lefranc, M. P., Lefranc, G. & Rabbitts, T. H. Délétion héréditaire de gènes de région 25 constante de chaîne lourde d'immunoglobuline chez des individus humains normaux. Nature 300, 760-762 (1982) ; et Bensmana, M., Huck, S., Lefranc, G. & Lefranc, M. P. Le pseudo-gène gamma IGHGP d' immunoglobuline humaine ne présente pas de défaut structural majeur. Nucleic Acids 30 Res. 16, 3108 (1.988)). RÉSUMÉ DE L'INVENTION Selon un premier aspect, la présente invention. concerne une molécule d'acide nucléique recombinante 5 comprenant : une séquence codant pour une région variable de chaîne lourde (VO d'immunoglobuline; une séquence codant pour une région variable de chaîne légère (VT) d'immunoglobuline; 10 une séquence codant pour une région constante de chaîne légère une séquence codant pour une région constante de chaîne lourde (CO d'immunoglobuline correspondant aux domaines protéiques CH1, région charnière, CH2 et CH3 codés 15 par le pseudo-gène gamma humain (111!). De préférence, la séquence codant pour une région constante de chaîne lourde d'immunoglobuline code pour trois ou quatre domaines constants de chaîne lourde 20 d'immunoglobuline. La séquence codant pour une région constante de chaîne lourde d' immunoglobuline peut coder pour uniquement une partie du domaine constant de chaîne lourde pseudogamma. 25 La molécule d'acide nucléique recombinante peut en outre comprendre des polynucléotides supplémentaires pour diriger l'intégration de la molécule d'acide nucléique par recombinaison homologue à un emplacement précis à l'intérieur d'un génome d'une cellule hôte. 30 Également, la molécule d'acide nucléique recombinante peut en outre comprendre des polynucléotides supplémentaires pour l'expression en tant qu'anticorps à chaîne unique ou en tant, qu'anticorps hybride intégrant 4 certains domaines constants homologues aux classes d'IqG humaines IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4 classiques. Par exemple, la molécule d'acide nucléique recombinante peut comprendre des lieurs peptidiques qui peuvent fusionner des chaînes lourdes et légères d'anticorps en une molécule d'anticorps à chaîne unique. Selon un autre aspect, la présente invention concerne une cassette d'expression comprenant une molécule d'acide nucléique recombinante de l'invention liée de manière 10 fonctionnelle à une ou plusieurs séquences de contrôle qui dirigent l'expression dudit acide nucléique dans une cellule hôte appropriée dans des conditions compatibles avec les séquences de contrôle. En particulier, la molécule d'acide nucléique 15 recombinante peut être liée de manière fonctionnelle à un promoteur VH d'immunoglobuline. Selon un autre aspect, la présente invention concerne un vecteur comprenant une cassette d'expression de l'invention. 20 Le vecteur est, de préférence, un vecteur viral, de manière davantage préférée un vecteur rétroviral, et de manière encore davantage préférée un vecteur lentiviral. Dans des modes de réalisation préférés, ledit vecteur est un vecteur viral adéno-associé (AAV), de préférence le 25 vecteur AAV6. Selon un autre aspect, la présente invention concerne une particule virale comprenant un vecteur de l'invention. Selon un autre aspect, la présente invention 30 concerne une cellule isolée comprenant une molécule d'acide nucléique recombinante, une cassette d'expression, un vecteur ou une particule virale de l'invention. Dans des modes de réalisation préférés, la cellule isolée est une cellule souche embryonnaire de souris. Dans d'autres modes de réalisation préférés, la 5 cellule isolée est un lymphocyte B, de préférence un lymphocyte B humain. Selon un autre aspect, la présente invention concerne un organisme transgénique animal non humain, comprenant au moins une cellule de l'invention, de 10 préférence ledit organisme transgénique étant une souris. Selon un autre aspect, la présente invention concerne un anticorps comprenant - une région variable de chaîne lourde (VH) d'immunoglobuline ; 15 - une région variable de chaîne légère (VL) d'immunoglobuline une région constante de chaîne légère (CL) d'immunoglobuline - une région constante de chaîne lourde (CH) 20 d'immunoglobuline comprenant l'ensemble ou une partie des peptides codés par le pseudo-gène gamma d'immunoglobuline humaine. L'anticorps de l'invention peut comprendre une région variable de chaîne lourde 25 (VH) d'immunoglobuline; - une région variable de chaîne légère (VL) d'immunoglobuline; - une région constante de chaîne légère (CL) d'immunoglobuline; 30 - une région constante de chaîne lourde (CH) d'immunoglobuline homologue au pseudo-gène gamma humain constant d'immunoglobuline, et des séquences codant pour 6 des heurs peptidiques, les séquences de chaînes lourdes et légères étant fusionnées en un seul peptide. La présente invention. concerne également un procédé de production d'un anticorps de l'invention, comprenant : fournir une cellule ou un organisme transgénique de l'invention, ladite cellule ou ledit organisme exprimant ledit anticorps, mettre en culture ladite cellule hôte ou permettre audit organisme de croître, et récupérer ledit anticorps à partir de la culture cellulaire ou à partir d'un échantillon dudit organisme Selon un autre aspect, la présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant une molécule d'acide nucléique recombinante, une cassette d'expression, un vecteur, une particule virale, une cellule de l'invention ou un anticorps de l'invention, et un excipient pharmaceutiquement acceptable. BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS 20 Figure 1 Représentation schématique d'une classe G]. d'immunoglobuline (gauche, état antérieur de la technique) et d'un type IgG5 de l'invention (droite). Par comparaison avec les classes d" G connues, les domaines constants 25 d'igG5 sont codés par le pseudo-gène gamma de chaîne lourde d'immunoglobuline humaine. Structurellement, parmi un certain nombre de différences, la région. charnière de l'igG5 diffère de la région charnière de l'igG1 et est légèrement plus longue que celle-ci. 30 B - Alignement, des séquences protéiques des 5 classes d'IgG (CH1, Po, Des exemples de composés actifs supplémentaires comprennent, mais sans y être limités, un médicament chimiothérapeutique, des antibiotiques, des agents antiparasitaires, des agents antifongiques ou des agents 5 antiviraux. Tous les modes de réalisation de la molécule d'acide nucléique recombinante, de la cassette d'expression, du vecteur, de la particule virale, de la cellule hôte et de l'anticorps de l'invention sont 10 également envisagés dans cet aspect. La présente invention concerne en outre une molécule d'acide nucléique recombinante, une cassette d'expression, un vecteur, une particule virale, une cellule 15 hôte, un anticorps ou une composition pharmaceutique de l'invention destinés à être utilisés dans la prévention ou le traitement d'une maladie. La présente invention concerne l'utilisation d'une molécule d'acide nucléique recombinante, d'une 20 cassette d'expression, d'un vecteur, d'une particule virale, d'une cellule hôte, d'un anticorps ou d'une composition pharmaceutique de l'invention comme médicament pour le traitement d'une maladie. L'invention concerne également l'utilisation d'une molécule d'acide nucléique 25 recombinante, d'une cassette d'expression, d'un vecteur, d'une particule virale, d'une cellule hôte ou d'un anticorps de l'invention pour la fabrication ou la préparation d'un médicament. En particulier, la présente invention. concerne 30 une méthode de traitement d'une maladie chez un sujet, comprenant : administrer audit sujet une quantité efficace d'une molécule d'acide nucléique recombinante, d'une cassette d'expression, d'un vecteur, d'une particule 41 virale, d'une cellule hôte, d'un anticorps ou d'une composition. pharmaceutique de l'invention. Tel qu'utilisé dans la présente invention, le terme « sujet » ou « patient » fait référence à un 5 mammifère, de préférence un être humain. La maladie peut être n'importe quelle maladie qui peut être traitée, prévenue ou soulagée par l'intermédiaire de l'action d'un anticorps, en particulier un anticorps de l'invention. Des exemples de telles maladies comprennent, 10 mais sans y être limités, le cancer, les maladies infectieuses, les maladies auto--immunes et les maladies inflammatoires Tous les modes de réalisation de la molécule d'acide nucléique recombinante, de la cassette 15 d'expression, du vecteur, de la particule virale, de la cellule hôte, de l'anticorps et de la composition pharmaceutique de l'invention sont également envisagés dans cet aspect. 20 La présente invention concerne en outre une molécule d'acide nucléique recombinante, une cassette d'expression, un vecteur, une particule virale, une cellule hôte, un anticorps ou une composition pharmaceutique de l'invention, de préférence un anticorps de l'invention, 25 destinés à être utilisés dans une méthode de diagnostic ou de détection d'une maladie. La maladie à diagnostiquer ou détecter dépend de l'anticorps. La méthode peut comprendre : mettre en contact 30 l'échantillon biologique avec un anticorps de l'invention dans des conditions permissives pour la liaison de l'anticorps à son antigène, si présent dans l'échantillon, et détecter si un complexe est ou non formé entre 42 l'anticorps et son antigène. Une telle méthode peut être une méthode in vitro ou in vivo. Le terme « détecter » tel qu'utilisé dans la présente invention englobe une détection quantitative ou qualitative. 5 Dans des modes de réalisation préférés, l'anticorps de l'invention utilisé dans des méthodes de diagnostic est marqué. Les marqueurs comprennent, mais sans y être limités, des marqueurs ou des fractions qui sont détectés(ées) directement (tels que des marqueurs 10 fluorescents, chromophores, denses en électrons, chimiluminescents et radioactifs), ainsi que des fractions, telles que des enzymes ou des ligands, qui sont détectées indirectement, par exemple, par l'intermédiaire d'une réaction enzymatique ou d'une interaction moléculaire. 15 Tel qu'utilisé dans cette description, le terme environ » fait référence à une plage de valeurs ± 10 % de la valeur spécifiée, de manière davantage préférée à une plage de valeurs ± 5 % de la valeur spécifiée. Par exemple, 20 « environ 1 » signifie de 0,9 à 1,1 lorsque 10 % est pris en considération et de 0,95 à 1,05 lorsque 5 % est pris en considération. Tel qu'utilisé dans la présente invention, le verbe « comprendre » est utilisé dans son sens non limitatif pour signifier que les éléments suivant le mot sont inclus, mais les éléments non spécifiquement mentionnés ne sont pas exclus. En outre, la. référence à un élément par l'article indéfini « un » ou « une » n'exclut pas la possibilité que plus d'un exemplaire de l'élément 30 soit présent, à moins que le contexte exige clairement qu'il y ait un et un seul des éléments. L'article indéfini « un » ou « une » signifie ainsi habituellement « au moins un ». 43 Les exemples suivants sont donnés à titre illustratif et non limitatif. EXEMPLES 5 Matériel et méthode Construction d'une IgG5 anti-CD20 Une réaction de synthèse de gène a été utilisée pour créer une cassette entièrement. synthétique codant pour une IgG5 anti-CD20 (avec des séquences constantes provenant 10 du pseudo-gène gamma). Les domaines variables étaient basés sur la séquence du rituximab. De façon à obtenir un anticorps issu de la classe IgGS, nous avons conçu une stratégie originale au moyen de laquelle V11,DjH de pleine longueur a été reliée aux exons 15 assemblés CH1, CH2 et CH3 déterminés à partir du pseudo-gène gamma, prétendument non exprimé chez un être humain. Cette séquence était ensuite suivie par un site de polyadénylation. la séquence V'J, du rituximab était suivie par Ck. 20 Cette séquence était ensuite suivie par un site de polyadénylation. Enfin, les constructions ont été clonées dans le vecteur pCDNA3.1(+), qui contient un gène de résistance à 25 la néomycine pour la sélection, au niveau des sites HindIII et EcoRI. Production Des cellules CHO-S ont, été transfectées avec les 30 vecteurs plasmidiques, et sélectionnées avec un milieu complété par 0,5 à 1 mg/mL de G418 le jour après la transfection. Après 3-4 semaines, les surnageants ont été criblés pour l'expression par un dosage immuno-enzymatique. 44 Les surnageants des cellules CHO-S ont été purifiés par chromatographie par affinité en utilisant une colonne couplée à la protéine /G. L'IgG5 purifiée a été quantifiée par absorption de lumière ultraviolette et a été utilisée à 10 pg/ml pour réaliser des expériences de cytométrie. Caractérisation Pour la méthode ELISA, l'IgGS a été capturée par 10 des anticorps anti-humains polyclonaux spécifiques de Fc, et détectée par des anticorps IgG (H+L) anti-humains HRPconjugués (tous issus de Sigma Aldrich). Pour la cytométrie de flux, 100 000 cellules exprimant l'antigène de membrane hCD20 (ou des cellules 15 témoin négatif) ont été incubées avec l'IgG5 purifiée à :1.0 pg/m1 pendant 1 heure à 2-8 °C. Après plusieurs lavages, un anticorps PE fluorescent polyclonal de chèvre anti-hIgG spécifique de Fc a été incubé pendant 30 min à 2-8 °C. Les cellules ont été fixées avec du PFA à 1 % pendant 15 20 minutes et lavées avant une analyse par cytométrie en flux sur un cytomètre FORTESSA. Résultats 25 Figure la : Diagrammes schématiques de l'igG1 et de l'IgG montrant que la région charnière de l'IgG5 diffère de la région charnière de l'T G1 et est légèrement plus longue que celle-ci. Figure lb : Alignement des séquences protéiques des 5 30 classes d'I G (CH1, région charnière, CH2 et CH3). Les cadres gris mettent en évidence les différences entre l'IgG5 et l'igGl. Figures 2a et 2b : Carte du plasmide construit pour l'expression. de l'IgG5 anti-hCD20. (a) La construction pour la séquence VDLI du pseudo-gène gamma du rituximab a été insérée au niveau des sites XbaI et EcoRV dans un vecteur 5 pCDNA3.4 (+). (b) La construction pour la séquence Vkappa du rituximab a été insérée au niveau. des sites XbaI et EcoRV dans un vecteur pCDNA3.4 (+). Figure 3 : Détection d'immunoglobulines dans un surnageant de cellules CHO-S par la méthode ELISA. Le surnageant 10 provenant de cellules transfectées a. été collecté et analysé par ELISA. Les anticorps monoclonaux (mAb) IgGi et IgM recombinants ont été utilisés respectivement comme témoins positif et négatif. L'IgG5 a été détectée avec succès dans un surnageant de la lignée cellulaire CHO-S 15 transfectée. Figure 4 : Le marquage de cellules cibles avec une IgG5 purifiée permet de montrer que l'IgG5 anti-hCD20 a été déctectée sur une lignée cellulaire hCD20 positive (EL4- hCD20), non pas dans les cellules témoin, négatif. Ce 20 résultat montre que les cellules CHO-S transformées avec un acide nucléique codant pour l'IgG5 de l'invention ont pu produire l'anticorps recombinant (IgG5 anti-hCD20) et que celui-ci s'est REVENDICATIONS1 - Molécule d'acide nucléique recombinante comprenant une séquence codant pour une région variable de chaîne lourde (VH) d'immunoglobuline; - une séquence codant pour la région constante du 10 pseudo-gène gamma de chaîne lourde (YyCH) d'immunoglobuline; une séquence codant pour une région variable de chaîne légère (V1') d'immunoglobuline; - une séquence codant pour une région constante de 15 chaîne légère (CL). 2 - Molécule d'acide nucléique recombinante selon la revendication 1, dans laquelle la séquence codant pour une région constante de chaîne lourde 20 d'immunoglobuline code uniquement pour une partie des domaines constants de chaîne lourde pseudo-gamma. 3 Molécule d'acide nucléique recombinante selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, dans 25 laquelle la molécule d'acide nucléique comprend des polynucléotides supplémentaires pour diriger l'intégration de ladite molécule d'acide nucléique par recombinaison homologue à un emplacement précis à l'intérieur d'un génome d'une cellule hôte. 30 4 Molécule d'acide nucléique recombinante selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle des lieurs peptidiques fusionnent les chaînes 47 lourdes et légères d'un anticorps en une molécule d'anticorps à chaîne unique. - Cassette d'expression comprenant une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 liée de manière fonctionnelle à une ou plusieurs séquences de contrôle qui dirigent l'expression dudit acide nucléique dans une cellule hôte appropriée dans des conditions compatibles avec les séquences de contrôle. 6 Cassette d'expression selon la revendication 5, dans laquelle la molécule d'acide nucléique recombinante est liée de manière fonctionnelle à un promoteur VH d'immunoglobuline. 7 Vecteur comprenant une cassette d'expression selon l'une des revendications 5 ou 6. 8 - Vecteur selon la revendication 7, dans lequel le vecteur est un vecteur viral, de préférence un vecteur rétroviral, de manière davantage préférée un vecteur lentiviral. 9 - Vecteur selon l'une des revendications 7 ou 25 8, dans lequel ledit vecteur est un vecteur viral adéno- associé (AAV), de préférence le vecteur AAV6. 10 - Particule virale comprenant un vecteur selon l'une quelconque des revendications 7 à. 9. 30 11 Cellule isolée comprenant une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, une cassette d'expression selon l'une des 48 revendications 5 ou 6, un vecteur selon l'une quelconque des revendications 7 à 9 ou une particule virale selon la revendication. 10. 5 12 Cellule selon la revendication 11, dans laquelle ladite cellule est une cellule souche embryonnaire de souris. 13 - Cellule selon la revendication 11, dans 10 laquelle ladite cellule est un lymphocyte B, de préférence un lymphocyte B humain. 14 - Organisme transgénique animal non. humain, comprenant au moins une cellule telle que définie dans 15 l'une quelconque des revendications 11 à 13, de préférence ledit organisme transgénique étant une souris. 15 - Anticorps comprenant : - une région d'immunoglobui - une région d'immunoglobul une région variable de chaîne lourde (VH) variable de chaîne légère 01,J me; constante de chaîne légère (CL) ine; constante de chaîne lourde (CH) ensemble ou une partie le pseudo-gène gamma 20 d'immunoglobuline; d'immunoglobuline comprenant l' des peptides codés par une région d' immunoglobuline humaine. 16 -- Procédé de production d'un anticorps selon la revendication 15, comprenant : fournir une cellule telle Que définie dans l'une quelconque des revendications 11 à 13 ou un organisme transgénique selon la revendication 14, 49 ladite cellule ou ledit organisme exprimant ledit anticorps, mettre en culture ladite cellule ou permettre audit organisme de croître, et récupérer ledit anticorps à partir de la culture cellulaire ou à partir d'un échantillon dudit organisme. 17 - Composition pharmaceutique comprenant une molécule d'acide nucléique recombinante selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, une cassette 10 d'expression selon l'une des revendications 5 ou 6, un vecteur selon l'une quelconque des revendications 7 ou 8, une particule virale selon. la revendication 10, une cellule selon l'une quelconque des revendications 11 à 13 ou un. anticorps selon la revendication 15, et un excipient 15 pharmaceutiquement acceptable.