Brevet FR3075224A1 — publié le 20190621

Methode de diagnostic d'une vaginose bacterienne par detection de Methanobrevibacter smith// La presente invention concerne un diagnostic microbiologique monoplexe rapide de la vaginose bacterienne (ci-apres abrege en « VB ») c'est a dire par detection d'un seul micro-organisme et le cas echeant de fawn non quantitative. Plus particulierement, la presente invention concerne une methode de diagnostic de l'etat de la flore bacterienne vaginale au regard de la presence d'une vaginose bacterienne (VB), le cas echeant pour le suivi de l'etat de la flore bacterienne vaginale et de sa prise en charge therapeutique. Pendant longtemps, la VB qui est une infection frequente avec des consequences nefastes pour la grossesse et le foetus, a ete definie du point de vue microbiologique par une quasidisparition de la flore vaginale normale composee principalement de lactobacilles au profit d'autres bacteries, notamment Gardnere//a vagina/is, Mobiluncus spp. et mycoplasmes genitaux [Spiegel CA, CMR 1991 ; Thorsen P, AJGO 1998]. La VB est un motif frequent de consultation medicale, elle est notamment impliquee dans la susceptibilite aux infections sexuellement transmissibles comme le VIH, et pour les grossesses dans la prematurite et la naissance d'enfants de petit poids. Sa prevalence chez la femme, y compris durant la grossesse, se situe entre 8 et 23% [Guise JM, AJPM 2001] selon les methodes actuelles d'investigation. Actuellement, le diagnostic de la VB repose sur le score de Nugent et les criteres d'Amsel. Le score de Nugent est la methode la plus couramment rapportee dans la litterature, consideree par certains comme la technique de reference, merne si elle n'est pas realisee en routine dans les laboratoires de microbiologie clinique du fait du caractere fastidieux de sa mise en oeuvre [Fredricks DN, NEJM 2005 ; Thomason JL, AJOG 1992 ; Ison CA, STD 2002 ; Nugent RP, JCM 1991]. Le score de Nugent identifie la VB grace a une analyse morphologique semi-quantitative des bacteries apres coloration de Gram. C'est donc une technique subjective dont la reproductibilite a ete mise en cause [Sha BE, JCM 2005 ; 2 Schwebke JR, OG 1996]. Les criteres cliniques d'Amsel (pH vaginal superieur a 4,5 ; leucorrhees grisatres homogenes adherentes; odeur azotee apres adjonction de KOH a 10%; presence de clue-cells) representent la seconde approche diagnostique [Amsel R AJM 1983]. 5 Comme le score de Nugent, il est de determination delicate et non utilise en pratique clinique courante. Une des limites de ces methodes diagnostiques est ('absence d'identification de certains microorganismes impliques dans la VB. D'une part, la detection microscopique des microorganismes par la coloration de 10 Gram reposant sur la structure de leur paroi, les microorganismes sans paroi tels que des mycoplasmes ou de structure particuliere de paroi tels que les archaea, ces derniers microorganismes ne peuvent pas etre detectes par la coloration de Gram et donc leur presence n'est pas prise en compte par le score de Nugent. D'autre part, l'apport de la biologie 15 moleculaire a permis d'identifier de nouvelles bacteries pouvant etre impliquees dans la VB mais leur mise en evidence par les 2 methodes diagnostiques existantes est impossible. Atopobium vaginae est la principale nouvelle espece bacterienne caracterisee. Sa presence a ete correlee a la VB dans quelques articles sans toutefois qu'une appreciation 20 quantitative fiable de sa place relative par rapport aux autres microorganismes ait ete realisee [Bradshaw CS, JID 2006, Rodriguez JM, IJSB 1999 ; Ferris MJ, BMCID 2004 ; Ferris MJ, JCM 2004 ; Verhelst R, BMCM 2004]. Dans ('article publie en 2006 par Bradshaw et col. [Bradshaw CS, 25 JID 2006], il etait notamment decrit une relation entre la detection des bacteries A. vaginae et G. vagina/is et la VB, mais ces resultats etaient insuffisants pour realiser un diagnostic de VB et/ou un suivi de revolution d'une VB fiables. En effet, les donnees presentees dans ce travail permettaient le depistage desdites bacteries et non pas leur reelle 30 quantification. De plus, ce depistage a montre une bonne sensibilite, A. vaginae et G. vagina/is etant detectees respectivement chez 96% et 99% des patientes atteintes de VB. Cependant, sa specificite est mauvaise car A. vaginae est detectee chez 12% des patientes presentant une flore 3 normale et G. vagina/is chez 60%. Les auteurs ont alors tente une approche dite « semi-quantitative » en classant les charges bacteriennes comme faibles ou elevees par comparaison des CT (« Cycle Treshold ») medians de detection des microorganismes au sein de tous les 5 echantillons analyses. Ainsi, les auteurs ont estime une charge mediane de 4 x 105 copies pour G. vagina/is (mediane correspondant a 21 cycles) et 4 x 106 copies pour A. vaginae (mediane a 18 cycles). Les charges elevees de G. vagina/is (>4 x 105) et d'A. vaginae (>4 x 106) etaient significativement plus presentes chez les patientes presentant une VB par 10 rapport aux patientes avec une flore normale. Cependant, ces valeurs presentaient encore une mauvaise sensibilite, A. vaginae et G. vagina/is etant seulement detectees respectivement chez 49% et 71% des patientes atteintes d'une VB. De plus, 16 patientes (28%) avec une rechute de VB apres traitement presentaient une concentration en G. 15 vagina/is en dessous du seuil donne (Table 3). Quarante patientes (70%) avec une rechute de VB presentaient aussi une concentration en dessous du seuil en A. vaginae. L'approche « semi-quantitative » des auteurs n'est donc pas applicable en tant qu'outil diagnostique et de suivi immediat des patients. 20 En fait, les techniques utilisees pour obtenir ces resultats etaient insuffisantes sur plusieurs points. Tout d'abord, les techniques de PCR n'etaient pas suffisamment sensibles car les cibles moleculaires amplifiaient de trop longs fragments (fragment de I'ARN 165 ribosomique de 430 paires de base pour A. vaginae et de 291 paires de base pour G. 25 vagina/is). Avec une sequence ciblee aussi longue, Ia sensibilite lors d'une reaction de PCR est faible. En outre, les techniques de PCR en temps reel utilisaient pour Ia detection et quantification un marquage du produit d'amplification en SyberGreen, methode beaucoup moins specifique que celles qui utilisent des sondes d'hydrolyse marquees qui necessitent une 30 triple specificite (deux amorces plus Ia sonde, pour amplifier un fragment dont Ia taille n'excede pas 150 paires de bases). Enfin, deux des inventeurs de la presente invention ont mis en place un test diagnostic de VB multiplexe base sur la detection et la 4 quantification moleculaires d'au moins les deux bacteries Atopobium vaginae et Gardnere//a vagina/is dans les prelevements vaginaux [Bretelle F, Clin Infect Dis. 2015;60:860-7; Menard JP,. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2010;29:1547-52; labor. Obstet Gynecol. 2010;115:134-40;. Clin 5 Infect Dis. 2008;47:33-43 et WO 2008/062136] En conclusion, exceptee la methode decrite dans ces dernieres references et WO 2008/062136, les techniques actuelles de diagnostic de la VB, reposent sur des criteres qui sont peu fiables. Cependant, la mise en oeuvre de ce test diagnostique multiplexe et 10 quantitatif de WO 2008/062136 suppose un ensemble complexe d'operations de preparation des reactifs puis de realisation et d'interpretation. Plus particulierement, dans WO 2008/062136, on determine la presence d'une vaginose bacterienne ou l'echec du traitement 15 therapeutique en cours si les concentrations de fragments d'ADN des deux sequences specifiques des bacteries Atopobium vaginae et respectivement Gardnere//a vagina/is dans un echantillon de prelevement de secretions vaginales de patiente contenant au moins 104 cellules humaines/ml, sont telles que l'une au moins des 2 conditions a) et b) 20 suivantes est respectee : a) la concentration Ca en dit fragment d'ADN d'Atopobium vaginae est superieure ou egale a 108 copies/mL, et b) la concentration Cg en dit fragment d'ADN de Gardnere//a vagina/is est superieure ou egale a 109 copies/mL. 25 Une concentration de bacterie Atopobium vaginae superieure ou egale au seuil de 108 permet de detecter environ 90% des vaginoses. La quantification de la bacterie Gardnere//a vagina/is vient en complement dans le cas ou la concentration en Atopobium vaginae serait inferieure au seuil de 108 bacteries/ml, pour detecter une vaginose, car le seuil de 30 detection de G. vagina/is superieur ou egal a 109 bacteries/mL ne permettrait a lui seul de detecter qu'environ la moitie des vaginoses. 5 C'est pourquoi, selon cette methode, il est necessaire de quantifier les concentrations d'ADN pour les deux bacteries. D'autre part, on releve que le developpement d'une vaginose bacterienne est confirme si les concentrations Ca, Cg et CI d'au moins 5 trois fragments de sequences specifiques presents en une seule copie dans I'ADN des bacteries A. vaginae (Ca), G. vagina/is (Cg) et respectivement Lactobacillus sp. (CI) dans I'ADN extrait d'un echantillon de secretions vaginales de patiente sont telles que le rapport des concentrations CI/(Ca+Cg) diminue entre les 2 echantillons preleves 10 successivement dans le temps a intervalle de temps suffisant, de preference au moins 1 mois. On entend ici par « developpement d'une vaginose » une aggravation d'une vaginose déjà detectee ou, dans certains cas, un risque d'apparition d'une vaginose, c'est-à-dire d'un desequilibre ou une 15 anomalie de la flore vaginale risquant de devenir pathologique. De meme, l'echec du traitement en cours en fonction des concentrations des sequences specifiques presentes en une seule copie dans I'ADN des bacteries est confirme si le rapport des concentrations C1/(Ca+Cg) diminue ou n'augmente pas entre les 2 echantillons preleves 20 intervalle de temps suffisant, de preference au moins 1 mois. Plus particulierement, la concentration en bacteries du genre Lactobacillus sp. vient en complement ou confirmation dans le cas oia les conditions de concentrations en A. vaginae et G. vagina/is sont reunies. De preference, on determine une vaginose bacterienne si lesdites 25 concentrations sont telles que les 3 conditions suivantes sont respectees : a- concentration Ca en dit fragment d'ADN de sequence specifique d'Atopobium vaginae superieure ou egale a 108 copies/mL, b- concentration Cg en en dit fragment d'ADN de sequence 30 specifique de Gardnere//a vagina/is superieure ou egale a 109 copies/mL, 6 et c- concentration CI en dit fragment d'ADN de sequence specifique de Lactobacillus sp. inferieure ou egale a 107 copies/mL. Lesdites concentrations Ca, Cg ou CI sont determinees par 5 amplification enzymatique de type PCR en temps reel et quantification de I'ADN desdits fragments d'ADN de sequences specifiques des bacteries respectivement Atopobium vaginae, Gardnere//a vagina/is et le cas echeant Lactobacillus sp, ainsi que, de preference, d'un fragment d'ADN humain present dans tout prelevement biologique humain contenant des 10 cellules. Le but de la presente invention est de simplifier la mise en oeuvre du diagnostic de laboratoire de la VB en fournissant un test monoplexe (c'est a dire par detection d'un seul micro-organisme) et si possible nonquantitatif. 15 En continuant a investiguer les microorganismes associes specifiquement a Ia VB, les inventeurs ont decouvert de fagon surprenante qu'une archaea methanogene denommee Methanobrevibacter smithii et elle-seule testee parmi toutes les autres archaea methanogenes presentes chez l'homme (explicitees a l'exemple 2), etait detectee dans 20 100% des prelevements vaginaux obtenus chez les patientes diagnostiquees par ailleurs avec une VB et dans 0% des prelevements vaginaux obtenus chez des patientes sans VB selon Ia methode de reference par quantification de Atopobium vaginae, Gardnere//a vagina/is et le cas echeant Lactobacillus sp decrite dans WO 2008/062136. En 25 effet, aucune autre archaea methanogene n'a ete detectee par les techniques reposant sur ('amplification et le sequengage du gene ribosomal 16S ARN, techniques qui permettent Ia detection de toute espece d'archaea methanogene. Ce resultat etait inattendu car meme si la detection de cette 30 archaea methanogene avait ete rapporte en 1990 dans deux prelevements vaginaux collectes chez deux patientes presentant une VB, les 7 prelevements vaginaux collectes chez une autre patiente presentant une VB ne presentait pas toutefois d'archaea dans cette publication [Belay N, J Clin Microbiol. 1990;28:1666-8]. Ce travail etait non seulement limite dans le nombre d'echantillons etudies, mais etait aussi limite dans la methode 5 d'identification laquelle etait purement phenotypique par simple observation visuelle des colonies mise en oeuvre et ne donnant pas 100% de positivite d'association a la VB en termes de specificite, et ne permettait pas d'induire ('utilisation de la detection de M. smithll comme un test diagnostique de la VB. 10 Les inventeurs ont demontre selon la presente invention la possibilite d'un diagnostic microbiologique fiable, rapide et simplifie de la VB, notamment simple a mettre en oeuvre en routine dans les laboratoires d'analyse microbiologique clinique et dans les points-de-soins (« point-ofcare ») [Drancourt M, in Clinical Microbiology. Clin Microbiol Rev. 2016 15 Jul;29(3):429-47]. Pour ce faire, les inventeurs ont elargi les etudes precedentes de la flore microbienne de la VB, a ('etude des archaea methanogenes par des methodes de detection moleculaire et de detection par culture. Dans l'etat de l'art, les differentes archaea methanogenes detectees 20 chez l'homme l'ont ete dans les microbiotes du tube digestif et de la cavite buccale. Parmi ces 15 especes d'archaea methanogenes, seules 7 ont ete isolees et cultivees chez l'homme (tel qu'explicite au tableau A de l'exemple 2). Cette etude rapportee dans les exemples ci-apres, a montre de 25 fagon inattendue qu'une archaea methanogene Methanobrevibacter smithll pouvait etre presente dans des prelevements vaginaux et que seuls les prelevements vaginaux de patientes presentant une VB etaient porteurs d'une archaea methanogene Methanobrevibacter smithii, alors que l'archaea M, smithll n'etait jamais detectee dans les prelevements 30 vaginaux de femmes indemnes de VB ; et que la detection de sequence specifique de certains genes presents en une seule copie tels que les genes mcrA , rpoB et 16S ARN de Methanobrevibacter smithll pouvaient 8 constituer un test diagnostic monoplexe et non-quantitatif de la presence de M. smithii dans un prelevement de la cavite vaginale. Ainsi, selon la presente invention il a ete demontre que la presence de Methanobrevibacter smithii est associee a une VB de fawn tres specifique 5 et significativement et que toute detection de cette archaea rend le diagnostic facile et fiable. Plus precisement la presente invention fournit une methode de diagnostic in vitro de la presence d'une vaginose bacterienne chez une patiente, caracterisee en ce qu'on determine la presence d'une vaginose 10 bacterienne si I'on detecte la presence d'une archaea methanogene de l'espece Methanobrevibacter smithii dans un echantillon de prelevement de secretions vaginales de Ia dite patiente par detection de Ia presence d'au moins une sequence d'acide nucleique specifique de ladite archaea methanogene Methanobrevibacter smithii contenue dans I'ADN extrait 15 dudit echantillon de prelevement de secretion vaginale de Ia dite patiente. La presente invention permet donc le diagnostic et suivi in vitro de l'etat de la flore bacterienne vaginale au regard de la presence d'une vaginose bacterienne, et le cas echeant pour le suivi de son traitement 20 therapeutique, en detectant la presence de I'archaea methanogene Methanobrevibacter smithii. En particulier, on determine la presence de Methanobrevibacter smithii en detectant la presence d'au moins une sequence d'acide nucleique specifique de ladite archaea methanogene Methanobrevibacter 25 smithii presente en une seule copie dans la dite archaea Methanobrevibacter smithii contenue dans I'ADN extrait dudit echantillon de prelevement de secretions vaginales de la dite patiente, ladite sequence specifique de Methanobrevibacter smithii presentant une taille inferieure a 150 nucleotides. 30 Plus particulierement, on realise les etapes suivantes : 9 1) on effectue ('amplification enzymatique du type PCR d'au moins une dite sequence specifique de ladite archaea methanogene Methanobrevibacter smithll dans l'ADN extrait dudit echantillon de prelevement de secretion vaginale, 5 2) on effectue la detection de fragments amplifies de ladite sequence specifique de Methanobrevibacter smithii, de preference par sequengage, par electrophorese sur gel d'agarose ou a ('aide de sondes marquees specifiques de la dite sequence specifique de ladite archaea methanogene Methanobrevibacter smithll de sequences distinctes de 10 celles des dites amorces d'amplification, et 3) on determine la presence d'une vaginose bacterienne si la concentration de fragments d'ADN de la dite sequence specifique de Methanobrevibacter smithll dans ledit echantillon de prelevement de secretions vaginales est superieure ou egale a 101 copies/mL. Ce seuil de 15 10 copies a ete determine par des essais comparatifs avec une gamme de dilution comme explicite a l'exemple 1 ci-apres. Plus particulierement, on realise une methode dans laquelle : on realise un protocole specifique d'extraction de I'ADN total contenu dans le prelevement d'origine vaginale. Ce protocole d'extraction peut etre un 20 protocole simplifie incluant ('extraction de d'ADN de Methanobrevibacter smithll laquelle archaea est de paroi epaisse et difficile a en extraire I'ADN tel qu'expose dans l'exemple 1 ou bien un protocole standard anterieurement decrit tel qu'expose dans les exemples 2 et 3. Plus particulierement, on realise une methode d'extraction de I'ADN 25 total contenu dans le prelevement d'origine vaginale incluant ('extraction de d'ADN de Methanobrevibacter smithll dans laquelle on realise les seules etapes suivantes : 4) on effectue la sonication de ('echantillon de secretions vaginales, notamment par un sonicateur a ultrasons par exemple un 30 sonicateur Branson 2510 (Branson, Rungis, France) puissance 4 (c'est-a- 10 dire a puissance maximale), a 50 % du cycle actif (c'est-e-dire pendant 30 secondes), et 5) on effectue une lyse enzymatique du dit echantillon, notamment a l'aide d'un extracteur d'ADN tel que l'appareil Qiagen EZ1 5 XL et le kit Qiagen EZ1® DNA Tissue. De preference, ladite sequence specifique de ladite archaea methanogene Methanobrevibacter smithll presente une taille de 70 a 150 nucleotides de preference de 90 a 120 nucleotides. De preference encore, on realise des reactions d'amplification et 10 quantification par PCR en Temps Reel, en mettant en oeuvre des sondes d'hydrolyse specifiques respectivement de chacune desdites sequences specifiques de dites bacteries et sequence specifique d'un gene humain present dans tout prelevement biologique contenant des cellules humaines, dans rechantillon a tester. 15 La technique de PCR en temps reel, consiste en une PCR classique en utilisant des amorces de sequence directe et inverse, et comprend une detection du produit amplifie basee sur la mesure d'emission de fluorescence proportionnelle a la quantite de genes amplifies avec une sonde dite « d'hydrolyse ». Pour cela, ladite sonde est marquee par un 20 emetteur de fluorescence ou fluorophore en 5' et un agent bloquant remission de fluorescence en 3'. Cet agent bloquant absorbe la fluorescence emise lorsque le fluorophore et l'agent bloquant sont proches. Lorsque le fluorophore et l'agent bloquant sont separes, remission de fluorescence n'est plus absorbee par l'agent bloquant. Lors 25 de son passage, la Taq polymerase entraine une hydrolyse de la sonde et donc une liberation des nucleotides et du fluorophore en solution. L'emission de fluorescence sera donc proportionnelle au nombre d'amplifiat. Le principe de la PCR en temps reel repose sur la capacite de la Taq polymerase pendant retape d'elongation d'hydrolyser une sonde 30 hybridee sur I'ADN a copier, cette hydrolyse permettant remission de fluorescence, laquelle permet une quantification. Au cours de la meme reaction, on peut quantifier deux cibles differentes, en introduisant dans 11 le mélange reactionnel deux amorces et une sonde dirigees contre une premiere cible, et deux autres amorces et sonde dirigees contre l'autre cible. Les deux sondes etant marquees avec des fluorophores differents. On entend par "sequence specifique de ladite archaea", une 5 sequence du genome de ladite archaea qu'on ne retrouve dans aucun autre genome d'organisme vivant. On entend par "fragment d'ADN", un fragment d'ADN ou oligonucleotide dont les sequences sont &rites ci-apres dans le sens 5'->3'. 10 Plus particulierement, on realise des reactions d'amplification et de quantification d'une sequence specifique d'ADN humain dans l'echantillon a tester, de preference une sequence specifique de l'albumine humaine. Plus particulierement encore, ladite sequence specifique de ladite archaea methanogene Methanobrevibacter smithll comprend un des 15 fragments suivants : - le fragment des positions 334632 a 334687 du gene ARN 16S ribosomal de reference GenBank NC_009515.1. - le fragment des positions 1734995 a 1735069 du gene mcrA de la proteine methyl-coenzyme M reductase alpha subunit de 157 acides 20 amines et de 16,942 Da de reference GenBank AAW80308.1. - le fragment des positions 876305 a 876370 du gene rpoB de la proteine RNA polymerase subunit B de M. smithll de 186 acides amines et de 20,836 Da de reference GenBank ABYV02000000. Plus particulierement, ladite sequence specifique d'ADN humain 25 dans l'echantillon a tester comprend le fragment des positions 1628316423 de l'exon 12 du gene de l'albumine humaine de reference Genebank M12523.1. Plus particulierement, on met en oeuvre les etapes suivantes dans lesquelles : 12 a- on realise une extraction de I'ADN total contenu dans l'echantillon d'origine vaginal par une methode apte a ('extraction de I'ADN des archaea methanogenes, et b- on realise une reaction d'amplification enzymatique de type PCR 5 de I'ADN d'au moins une dite sequence specifique de ladite archaea methanogene Methanobrevibacter smithii, dans I'ADN extrait desdits echantillons a tester, a l'aide d'au moins un jeu d'amorces apte amplifier ladite sequence specifique de ladite archaea methanogene Methanobrevibacter smithii ; et 10 c- on verifie si les amplifiats eventuels de I'ADN extrait desdits echantillons a tester, comprennent une dite sequence specifique a l'aide d'une sonde d'hydrolyse comprenant une sequence specifique de ladite sequence specifique de Methanobrevibacter smithii et encadree par les sequences des dites amorces. 15 Plus particulierement, on realise des reactions de co-amplification et de quantification en mettant en oeuvre deux jeux d'amorces et sondes d'hydrolyse specifiques respectivement d'une part de ladite sequence specifique de l'archaea Methanobrevibacter smithii, et d'autre part d'une sequence specifique d'ADN humain dans l'echantillon a tester, de 20 preference une sequence specifique de l'albumine humaine, et ladite sequence specifique de l'albumine humaine comprenant une sequence de dite sonde encadree par des sequences aptes a servir comme de dites amorces dans une reaction d'amplification du type PCR de ladite sequence specifique de l'albumine humaine. 25 Plus particulierement encore, on determine la presence d'une vaginose bacterienne si, dans I'ADN extrait d'un echantillon de secretion vaginale de patiente, les 2 conditions a) et b) suivantes sont respectees : a) la concentration Ca en fragment d'ADN de l'albumine humaine est superieure ou egale a 101 copies/ml, et 30 b) la concentration Cm en dit fragment d'ADN specifique de Methanobrevibacter smithii est superieure ou egale a 101 copies/mL. 13 Plus particulierement, ladite sequence specifique de ladite archaea methanogene Methanobrevibacter smithll est choisie parmi les sequences suivantes incluant des sequences sondes (soulignees) encadrees par des sequences amorces (en gras) ou leurs sequences reverses et 5 complementaires pour les amorces anti-sens: - pour la sequence 16S ARNr: SEQ.ID. n°2 =5'-CCGGGTATCTAATCCGGTTCCCGTCAGAATCGTTCC AGTCAGCTCCCAGGGTAGAGGTGAAA-3' (cette sequence SEQ.ID. n°2 a ete decrite dans ('article de Dridi B,. PLoS One 4(9):e7063); 10 - pour la sequence du gene mcrA: SEQ.ID. n°3 = 5'- GCTCTACGACCAGATMTGGCTTGGARGCACCKAACAMCATGGACACWGTCCG TAGTACGTGAAGTCATCCAGCA -3' (cette sequence SEQ.ID. n°3 a ete 15 decrite dans ('article de Vianna Oral Microbiology and Immunology, 24(5), pp. 417-422). - pour la sequence rpoB : SEQ.ID. n°4 = 5'- AAGGGATTTGCACCCAACACATTTGGTAAGATTTGTCCGAATG 20 GACCACAGTTAGGACCCTCTGG-3' (cette sequence SEQ.ID. n°4 a ete decrite dans ('article de Dridi B, PLoS One 4:e7063). Dans l'ecriture de ces sequences, la specificite large de certaines enzymes ou encore la degenerescence du code genetique implique qu'on doit indiquer quelquefois dans les sequences des lettres correspondant 25 plusieurs bases azotees differentes pour le meme nucleotide present a une position. Dans le cas dans notre sequence mcrA : R correspond a une purine soit A soit G; K (keto) correspond a G ou T ; M correspond a A ou C et W (weak) correspond a A ou T. Avantageusement encore, on realise des reactions d'amplification et 30 de quantification en mettant en oeuvre des jeux d'amorces et des sondes d'hydrolyse specifiques de ladite archaea Methanobrevibacter smithii, et 14 le cas echeant d'une sequence specifique d'ADN humain dans l'echantillon a tester, telle que une sequence specifique de I'albumine humaine, et ladite sequence specifique comprend une sequence sonde encadree par des sequences aptes a servir comme amorce dans une reaction 5 d'amplification du type PCR desdites sequences specifiques. On entend ici par "sonde", un oligonucleotide, de preference encore de 20 a 30 nucleotides, s'hybridant specifiquement avec ladite sequence specifique et donc permettant de la detecter et de la quantifier de fawn specifique grace a la mesure de I'accroissement de la fluorescence Hee de 10 la reaction de PCR. La sonde permet de detecter I'ADN specifique amplifie et de le quantifier. On entend ici par "amorce", un oligonucleotide de preference de 15 a 25 nucleotides qui s'hybride de fawn specifique avec une des 2 15 extremites de la sequence que I'ADN polymerase amplifiera dans la reaction de PCR. Plus particulierement, ladite sequence de I'exon 12 du gene de I'albumine humaine specifique d'ADN humain dans l'echantillon a tester comprend la sequence du listage de sequence suivante ou la sequence 20 complementaire: SEQ.ID.n°1 = 5'-GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGTAATCATCGTTTAAGAG TAATATTGCAAAACCTGTCATGCCCACACAAATCTCTCCCTGGCATTGTTGTCTTT GCAGATGTCAGTGAAAGAGAACCAGCAGCTCCCATGAGTTT-3' Plus particulierement encore, on met en oeuvre les jeux d'amorces 25 et de sondes choisis le cas echeant parmi les sequences suivantes du listage de sequence annexe a la presente description, ou respectivement leurs sequences complementaires : - pour le gene 16S ARNr : Amorce 5': SEQ.ID.n°5 = 5'- CCGGGTATCTAATCCGGTTC -3' 15 Amorce 3': SEQ.ID.n°6 = 5'- CTCCCAGGGTAGAGGTGAAA -3' Sonde: SEQ.ID.n°7 = 5'- CCGTCAGAATCGTTCCAGTCAG -3' - pour le gene mcrA : Amorce 5': SEQ.ID. n°8 = 5'-GCTCTACGACCAGATMTGGCTTGG- 3' 5 Amorce 3': SEQ.ID. n°9 = 5'- CCGTAGTACGTGAAGTCATCCAGCA -3' Sonde: SEQ.ID. n°10 = 5'- ARGCACCKAACAMCATGGACACWGT-3' - pour le gene rpoB : Amorce 5': SEQ.ID.n°11 = 5'-AAGGGATTTGCACCCAACAC- 3' Amorce 3': SEQ.ID. n°12= 5'- GACCACAGTTAGGACCCTCTGG -3' 10 Sonde: SEQ.ID. n°13 = 5'- ATTTGGTAAGATTTGTCCGAATG-3' - pour l'albumine humaine : Amorce 5': SEQ.ID.n°14 = 5'-GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGT-3' Amorce 3': SEQ.ID.n°15 = 3'-AAACTCATGGGAGCTGCTGGTTC-3' Sonde: SEQ.ID. n°16 = 5'-CCTGTCATGCCCACACAAATCTCTCC-3' 15 La presente invention a egalement pour objet une trousse de diagnostic utile pour la mise en oeuvre d'une methode de diagnostic d'une vaginose selon ('invention, caracterisee en ce qu'elle comprend au moins - des reactifs permettant ('extraction de I'ADN total contenu dans 20 un echantillon d'origine vaginale, ainsi que - un jeu d'amorces specifiques d'au moins une sequence d'ADN specifique de ladite archaea methanogene Methanobrevibacter smithll et de preference, au moins une sonde specifique de la dite sequence specifique de ladite archaea methanogene Methanobrevibacter smithii, et 25 - des reactifs de mise en oeuvre d'une reaction d'amplification d'ADN de type PCR. Plus particulierement, une trousse de diagnostic selon ('invention comprend : 16 - au moins un jeu d'amorces et de sondes de sequences choisies parmi les 3 jeux de sequences SEQ.ID.n°5 a 7, SEQ.ID.n°8 a 10 et SEQ.ID. n°11 613, et - au moins un jeu d'amorces et de sonde de sequences SEQ.ID.n°14 5 a 16. Les sequences SEQ. ID. N°1 a 16 decrites ci-dessus sont specifiees dans le listage de sequences annexe a la presente description. A la position correspondant a un nucleotide K, M, R, W ou T dans les sequences SEQ. ID. N° 3, 8 et 10, on trouve, dans les sequences 10 cibles complementaires, des nucleotides variables comme defini ci-dessus. Les oligonucleotides de sequences SEQ. ID. N°3, 8 et 10, sont donc mis en oeuvre, en fait, sous forme de mélanges equimolaires d'oligonucleotides de sequences differentes, lesdits oligonucleotides de sequences differentes repondant pour chaque sequence SEQ. ID. N°3 8 et 15 10 aux diverses definitions possibles des sequences respectivement N°3 8 et 10, a savoir : - un mélange equimolaire de 32 sequences differentes pour SEQ. ID. N°3 pour lesquelles M (present deux fois) est A ou C a chaque fois, R est A ou G, K est G ou T et W est A ou T, 20 - un mélange equimolaire de 2 sequences differentes pour SEQ. ID. N°8 pour lesquelles M est A ou C, - un mélange equimolaire de 16 sequences differentes pour SEQ. ID. N°10 pour lesquelles M est A ou C, R est A ou G, K est G ou T et W est A ou T. 25 Ces mélanges equimolaires d'oligonucleotides sont obtenus en mettant en oeuvre, lors de la synthese oligonucleotidique, des mélanges equimolaires des differents nucleotides concernes. D'autres caracteristiques de la presente invention apparaltront a la lumiere de la description detaillee qui va suivre de l'exemple de 17 realisation en reference au listage de sequence et aux figures suivantes, dans lesquelles : - les figures 1A a 1C representent les detections par electrophorese sur gel d'agarose des produits d'amplification PCR du gene 165 ARNr de 5 Methanobrevibacter smithll (figures 1A et 1B) et du gene mcrA de Methanobrevibacter smithll (figure 1C) dans des echantillons vaginaux, en presence de temoins negatifs, selon un procede d'extraction simplifie de I'ADN selon la presente invention de l'exemple 1, et - les figures 2A et 2B, representent les detections par 10 electrophorese sur gel d'agarose des produits de PCR du gene 165 ARN ribosomal de Methanobrevibacter smithll (figure 2A) et du gene mcrA de Methanobrevibacter smithll (figure 2B) dans des echantillons vaginaux, en presence de temoins negatifs, selon un procede d'extraction standard de I'ADN selon la presente invention de l'exemple 2. 15 EXEMPLE 1. Extraction rapide de I'ADN de Methanobrevibacter smithii pour amplification PCR standard a partir de prelevements vaginaux. Dans cet exemple, ('extraction d'ADN a ete faite a partir d'une suspension de Methanobrevibacter smithll calibree a 102 unites formant 20 colonies (colony-forming-units,CFUs) suivant le protocole ci-dessous. Une premiere etape de sonication a ete faite pendant 30 minutes en utilisant le sonicateur a ultrason Branson 2510 (Branson, Rungis, France) puissance 4, a 50 % du cycle actif , suivi d'une deuxieme etape de lyse de la paroi de Methanobrevibacter smithll et de la purification d'ADN en 25 utilisant la carte V 1.066069118 Qiagen DNA bacteria contenue dans l'appareil Qiagen EZ1 XL et le kit Qiagen EZ1® DNA Tissue en suivant les instructions du fournisseur (Qiagen, Les Ulis, France). Dans cet exemple, une portion du gene ribosomal 165 de Methanobrevibacter smithll a ete amplifiee par PCR standard a partir de prelevements vaginaux en utilisant 30 une methode simplifiee d'extraction de I'ADN total, telle qu'explicite dans cet exemple. 18 Les reactions en chaine de Polymerase (PCR) ont ete realisees dans un thermocycleur automatique PTC-200 (MJ Research, Waltham, MA, USA) incluant 50 pL de MIX (mélange) de PCR comportant : 25 pL de reactif d'amplification « amplitaq gold » (Thermo Fisher Scientific, Villebon sur 5 Yvette, France) ; 17 pL d'eau distillee RNAse free (Sigma Aldrich, SaintQuentin-Fallavier, France) ; amorce sens ( amorce 5')20 pM 1,5 pL ; Amorce Reverse 20 pM 1,5 pL et 5 pL d'ADN extrait. Le programme PCR depend des amorces utilisees. Pour ('amplification du gene 16S RNA archaea le programme comprend : une Jere etape de 95° C pendant 15 10 minutes ; 3 etapes de 40 cycles 95°C pendant 30 secondes, 57°C pendant 45 secondes, 72°C pendant 1 minute ; et une derniere etape 72 °C pendant 5 minutes. Pour le gene mcrA archaea methanogenes, le programme comprend : une Jere etape de 95° C pendant 15 minutes ; 03 etapes de 40 cycles 95°C pendant 1 minute, 57°C pendant 45 secondes, 15 72°C pendant 1 minute ; et une derniere etape 72 °C PENDANT 5 minutes. Les produits de PCR sont par la suite migres sur un gel d'agarose 1,5 % (BIO-RAD, Marnes-la-Coquette, France) pendant 20 minutes a 135 volt. Pour confirmer qu'il s'agit bien de Methanobrevibacter smithii, un sequengage des amplifiats est realise comme suit : les 20 reactions de sequengage sont effectuees en utilisant le kit de sequengage « BigDye Terminator v1.1 « selon les instructions du fabricant (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Tous les produits PCR ont ete sequences dans les deux directions, en utilisant les memes amorces que celles utilisees pour les PCR, dans un thermocycleur automatique PTC-200 25 (MJ Research, Waltham, MA, USA) avec une etape initiale de denaturation de 1 min a 96°C suivie de 25 cycles de 10 secondes a 96°C, 5 secondes a 50°C et de 3 minutes a 60°C. Les produits sequences ont ete purifies a l'aide des plaques Millipore MultiScreen a 96 puits (Merck, Molsheim, France) contenant 5% de Sephadex G-50 (Sigma-Aldrich, L'Isle d'Abeau 30 Chesnes, France). Les sequences sont par la suite analysees sur un analyseur genetique ABI PRISM 31309 (Applied Biosystems, Foster City, USA). Apres que tous les produits de la PCR ont ete sequences a l'aide du logiciel ChromasPro (http://technelysium.com.au/wp/chromaspro/) les differents fragments sont assembles et compares aux sequences 19 disponibles dans la base de donnees GenBank en utilisant le programme BLAST en ligne du NCBI. Les resultats montrent que l'ADN ainsi extrait est de qualite suffisante pour permettre de detecter M. smithll par PCR. 5 La figure 1A presente une electrophorese sur gel d'agarose a 1,5% dans lequel on a fait migrer les produits d'amplification par PCR standard de cinq echantillons El a E5 positifs pour la presence de Methanobrevibacter smithll montrant une bande au poids moleculaire attendu de 700 paires de bases, en presence de temoin negatif qui est 10 reste negatif. La colonne de droite notee « M. taille » correspond au marqueur de poids moleculaire. Ensuite, pour mesurer la sensibilite de ce nouveau protocole d'extraction d'ADN, les inventeurs ont teste ce protocole sur differentes concentrations de Methanobrevibacter smithll (de 101 a 106CFU/mL. Les figures 1B et 1C presentent deux gels d'agarose 15 a 1,5% dans lesquels on a fait migrer les produits d'amplification de differentes concentrations de I'ADN de Methanobrevibacter smithll par PCR standard. Les amplifiats obtenus montrent une bande au poids moleculaire attendu de 700 paires de bases pour le produit d'amplification du gene ribosomal 16S ARN et une bande au poids moleculaire attendu de 20 560 paires de bases pour le produit d'amplification du gene mcrA, en presence de temoin negatif qui est reste negatif. La colonne de droite notee « M. taille » correspond au marqueur de poids moleculaire. Sur la Figure 1B, on montre la revelation des produits de PCR ciblant le gene ribosomal 16S ARN de Methanobrevibacter smithll par 25 electrophorese sur gel d'agarose 1,5 %. Les voies n° 1 a 6 correspondent a 101- 106 CFUs de Methanobrevibacter smithll ; T- : -remain negatif ; et MT : marqueur de taille. Sur la Figure 1C, on montre la revelation des produits de PCR ciblant le gene mcrA de Methanobrevibacter smithll par electrophorese 30 sur gel d'agarose 1,5 %. Les voies n° 1 a 6 correspondent a 101 - 106 CFUs de Methanobrevibacter smithll ; T- : -remain negatif ; et MT : marqueur de taille. 20 EXEMPLE 2. Detection de sequences specifiques de Methanobrevibacter smithii dans des prelevements vaginaux de patientes par amplification et sequencage. 5 Un total de 77 des femmes enceintes, suivies pour leur grossesse, ont ete recrutees a l'hopital de La Conception a Marseille. Un consentement eclaire est la condition necessaire a ('inclusion. Les prelevements ont ete realises au niveau du cul de sac vaginal posterieur sous speculum sterile non lubrifie et sans antiseptique. Quatre 10 prelevements sont realises pour chaque femme : deux prelevements par ecouvillon coton sur tube sec (Copan innovation®, Brescia, Italie) et deux prelevements par cytobrosse (Scrinet® 5,5 mm, laboratoire C.C.D. international, Paris, France). Un ecouvillon coton standard est utilise pour l'etat frais et la culture bacterienne. Un second est place dans un milieu 15 de transport specifique (R1 Uree-Arginine LYO 2, BioMerieux SA, Marcy l'Etoile, France) pour la recherche des Mycoplasmes genitaux (M. hominis et M. urealyticum). Une cytobrosse est utilisee pour l'etalement sur lame et coloration de Gram. Une seconde pour ('extraction de I'ADN aux fins d'amplification moleculaire est transportee dans 500 pL de milieu de 20 transport MEM (Minimum Essential Medium, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Elle est congelee a -80°C des son arrivee au laboratoire jusqu'a son utilisation. Apres analyses microbiologiques appropriees telles que precedemment decrites dans le brevet WO 2008/062136], 15 patientes ont ete diagnostiquees avec une vaginose 25 bacterienne selon les criteres rappeles dans ce brevet et 62 patientes ont ete diagnostiquees sans vaginose bacterienne. La detection moleculaire de sequences specifiques de l'archaea methanogene M. smith// a ete realisee par PCR standard apres une extraction de I'ADN selon un protocole standard. En pratique, le protocole 30 d'extraction d'ADN utilise le kit « NucleoSpin Tissue Mini Kit » (MachereyNagel, Hoerdt, France) modifie de la fagon suivante : 0,3g de poudre de verre (B106 mm, Sigma, Saint-Quentin Fallavier, France) sont ajoutes 250 pL d'echantillon suivi d'une lyse mecanique dans un appareil FastPrep 21 BIO 101 (Qbiogene, Strasbourg, France) pendant 2 min a vitesse 6,5. Ensuite, 200 pL de tampon de lyse et 20 pL de proteinase K (20 mg/mL) sont ajoutes aux echantillons qui sont par la suite incubes pendant 12 heures a 56°C. Apres 12 heures d'incubation, vient une autre lyse 5 mecanique a vitesse 6,5 pendant 2 minutes. Le lysat recupere est traite selon les recommandations du fabriquant. L'ADN est Blue dans 100 pL de tampon d'elution puis stocke a - 20°C. L'analyse des donnees de la litterature, et des sequences deposees dans le site « GenBank » 10 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/GenbankSearch.html) permet de prendre connaissance des sequences disponibles pour chacun des microorganismes cibles. La specificite des amorces, et des fragments des sequences cibles de chacun des microorganismes choisis sont testees pour leur specificite sur le site Internet NBCI 15 (http://WWW.ncbi.n1 m.nih.gov/BLAST/). Les inventeurs ont selectionne des cibles sur I'archaea methanogene Methanobrevibacter smithii. Les cibles retenues sont localisees sur Ia sequence du gene codant pour I'ARN ribosomal 16S, sur le gene mcrA et sur le gene rpoB. Une sequence situee dans I'exon 12 du 20 gene de I'albumine humaine est choisie afin d'attester de Ia presence et de Ia quantite d'ADN dans l'echantillon teste. Pour Methanobrevibacter smithii et I'albumine humaine une sonde, un couple amorce sens et anti-sens sont choisies sur les sequences cibles precedemment definies en utilisant le programme Primer 3® 25 (http://frodo.wi.mit edu/primer3/primer3_code .html). Les amorces sont decrites ci- apres. Chaque amorce est analysee sur le site Internet NBCI (http://WWW.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) pour s'assurer de leur specificite in silico. - Pour le gene 16S ARNr : 30 Amorce 5': SEQ.ID. n°5 = 5'- CCGGGTATCTAATCCGGTTC -3' Amorce 3': SEQ.ID. n°6 = 5'- CTCCCAGGGTAGAGGTGAAA -3' 22 - Pour le gene mcrA : Amorce 5':SEQ.ID. n°8 = 5'-GCTCTACGACCAGATMTGGCTTGG- 3' Amorce 3':SEQ.ID.n°9 =5'- CCGTAGTACGTGAAGTCATCCAGCA -3'. Pour le gene rpoB : 5 Amorce 5':SEQ.ID.n°11=5'-AAGGGATTTGCACCCAACAC- 3' Amorce 3': SEQ.ID.n°12= 5'- GACCACAGTTAGGACCCTCTGG -3' Pour l'albumine humaine : Amorce 5': SEQ.ID.n°14 = 5'-GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGT-3' Amorce 3':SEQ.ID.n°15 = 3'-AAACTCATGGGAGCTGCTGGTTC-3' 10 Afin de tester la specificite des amorces et du protocole de PCR, I'ADN extrait de souches bacteriennes de reference representatives de la flore de la cavite vaginale selon la liste suivante : Bacteroides nordii, Propionibacterium avidum,Clostridum irregular, Clostridum massilioamazoniensis, Clostridum butyricum, Clostridum beijerinckii, 15 Bacteroides thetaiotaomicron, Propionibacterium acnes, Finegoldia magna, Bacteroides fragilis, Staphylococcus aureus, Enterobacter aerogenes, Escherichia colt Klebsiella oxytoca, Streptococcus agalactiae, Serratia marcescens, Enterococcus faecalis, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus mitis, Staphylococcus 20 epidermidis, Morganella morganii, Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae, Bacillus circulars, Neisseria meninigitidis, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus hominis, Acinetobacter baumanii, Haemophilus influenzae a servi a faire des PCR pour confirmer la specificite des amorces utilisees. 25 Tous les temoins negatifs testes sort negatifs en PCR. Sur les 77 echantillons analyses, 62 echantillons qui correspondent a des prelevements a partir de flore vaginale normale sort negatifs en PCR et 15 echantillons qui correspondent a des prelevements de vaginose sort positifs en PCR. Les PCR sort suivies d'un sequengage des amplifiats. 30 L'analyse des sequences obtenues a montre une identite de 100% avec le fragment homologue du gene 16S ARN ribosomal de reference de Methanobrevibacter smithii strain NVD (accession NCBI: LT223565) 23 confirmant que seule cette archaea methanogene a ete retrouvee dans les echantillons vaginaux preleves chez des femmes enceintes diagnostiquees avec une vaginose bacterienne (Figure 2A, Figure 2B et Tableau 1). En effet, it y a actuellement 15 archaea methanogenes listees au tableau A 5 ci-apres detectees chez l'homme dont 7 especes (en gras dans le tableau A) sont cultivees. II etait donc necessaire d'utiliser une methode de sequengage permettant d'identifier sans ambiguite que, parmi ces 15 especes, seule l'archaea methanogene Methanobrevibacter smithii etait detectee. 10 Tableau A. Espece d'archaea methanogenes Techniques de detection Sources Methanobrevibacter smithii culture selles, cavite buccale methanobrevibacter oralis culture selles, cavite buccale Methanosphaera stadtmanae culture selles Methanomassilicoccus luminyensis culture selles Ca. Methanomassillicoccus intestinalis culture cavite buccale Ca.Methanomethylophilus alvus culture selles Methanobrevibacter arbophilus culture selles Methanosarcina mazei biologie moleculaire cavite buccale CO. Methanomethylophilus sp. biologie moleculaire cavite buccale Methanobacterium congolense biologie moleculaire selles Methanoculleus chikugoensis biologie moleculaire selles Methanobrevibacter millerae biologie moleculaire selles Methanobrevibacter massiliense biologie moleculaire cavite buccale Candidatus Nitrososphaera evergiadensis biologie moleculaire cavite buccale Methanoculleus bourgensis biologie moleculaire cavite buccale Sur la figure 2A, on montre la revelation des produits de PCR 165 ARN ribosomal archaea (echantillons de vaginose) par electrophorese sur gel d'agarose 1,5 %. Les voies E.V1 a E.V11 : echantillons de vaginose ; T- : -remain negatif ; et MT : marqueur de taille. 15 Sur la figure 2B, on montre la revelation des produits de PCR ciblant le gene mcrA methanogene (echantillons de vaginose) par electrophorese sur gel d'agarose 1,5 %. Les voies E.1 a E.12: echantillons de vaginose ; T- : -remain negatif ; et MT : marqueur de taille. 24 Tableau 1. Detection de la presence de M. smithii par PCR standard ciblant les genes 16S rARN et mcrA pour 77 echantillons. FN=Flore normale ; VB= Vaginose bacterienne. N° Nature des echantillons PCR 16S r M. smithii PCR mcrA echantillon 1 FN NEGATIVE NEGATIVE 2 FN NEGATIVE NEGATIVE 3 FN NEGATIVE NEGATIVE 4 FN NEGATIVE NEGATIVE 5 FN NEGATIVE NEGATIVE 6 FN NEGATIVE NEGATIVE 7 FN NEGATIVE NEGATIVE 8 FN NEGATIVE NEGATIVE 9 FN NEGATIVE NEGATIVE 10 FN NEGATIVE NEGATIVE 11 FN NEGATIVE NEGATIVE 12 FN NEGATIVE NEGATIVE 13 FN NEGATIVE NEGATIVE 14 FN NEGATIVE NEGATIVE 15 FN NEGATIVE NEGATIVE 16 FN NEGATIVE NEGATIVE 17 FN NEGATIVE NEGATIVE 18 FN NEGATIVE NEGATIVE 19 FN NEGATIVE NEGATIVE 20 FN NEGATIVE NEGATIVE 21 FN NEGATIVE NEGATIVE 25 22 FN NEGATIVE NEGATIVE 23 FN NEGATIVE NEGATIVE 24 FN NEGATIVE NEGATIVE 25 FN NEGATIVE NEGATIVE 26 FN NEGATIVE NEGATIVE 27 FN NEGATIVE NEGATIVE 28 FN NEGATIVE NEGATIVE 29 FN NEGATIVE NEGATIVE 30 FN NEGATIVE NEGATIVE 31 FN NEGATIVE NEGATIVE 32 FN NEGATIVE NEGATIVE 33 FN NEGATIVE NEGATIVE 34 ND NEGATIVE NEGATIVE FN NEGATIVE NEGATIVE 36 VB POSITIVE POSITIVE 37 VB POSITIVE POSITIVE 38 VB POSITIVE POSITIVE 39 VB POSITIVE POSITIVE VB POSITIVE POSITIVE 41 VB POSITIVE POSITIVE 42 VB POSITIVE POSITIVE 43 VB POSITIVE POSITIVE 44 VB POSITIVE POSITIVE VB POSITIVE POSITIVE 46 VB POSITIVE POSITIVE 26 47 VB POSITIVE POSITIVE 48 VB POSITIVE POSITIVE 49 VB POSITIVE POSITIVE VB POSITIVE POSITIVE 51 FN NEGATIVE NEGATIVE 52 FN NEGATIVE NEGATIVE 53 FN NEGATIVE NEGATIVE 54 FN NEGATIVE NEGATIVE FN NEGATIVE NEGATIVE 56 FN NEGATIVE NEGATIVE 57 FN NEGATIVE NEGATIVE 58 FN NEGATIVE NEGATIVE 59 FN NEGATIVE NEGATIVE FN NEGATIVE NEGATIVE 61 FN NEGATIVE NEGATIVE 62 FN NEGATIVE NEGATIVE 63 FN NEGATIVE NEGATIVE 64 FN NEGATIVE NEGATIVE FN NEGATIVE NEGATIVE 66 FN NEGATIVE NEGATIVE 67 FN NEGATIVE NEGATIVE 68 FN NEGATIVE NEGATIVE 69 FN NEGATIVE NEGATIVE FN NEGATIVE NEGATIVE 71 FN NEGATIVE NEGATIVE 27 72 FN NEGATIVE NEGATIVE 73 FN NEGATIVE NEGATIVE 74 FN NEGATIVE NEGATIVE FN NEGATIVE NEGATIVE 76 FN NEGATIVE NEGATIVE 77 FN NEGATIVE NEGATIVE EXEMPLE 3. Detection de Methanobrevibacter smithii dans des prelevements vaginaux de patientes par amplification et detection par sonde par PCR en temps-reel. 5 Dans cet exemple, la merne collection de prelevements vaginaux testes dans l'exemple 2, a ete testee pour la presence de Methanobrevibacter smithii par PCR temps-reel ciblant les genes 16S ARNr, mcrA et rpoB. La detection moleculaire de l'archaea methanogene 10 Methanobrevibacter smithii a ete realisee par PCR temps reel apres une extraction de I'ADN selon un protocole standard tel que decrit dans l'exemple 2 avec les amorces et sondes suivantes. Microorganismes Cibles Sequences nucleotidiques M. smithii ARNr 16s Amorce sens : SEQ.ID.n°5 : CCGGGTATCTAATCCGGTTC Amorce anti-sens : SEQ.ID.n°6 : CTCCCAGGGTAGAGGTGAAA Sonde : SEQ.ID.n°7 : FAM- CCGTCAGAATCGTTCCAGTCAG- TAMRA M.smithii Gene mcrA Amorce sens : SEQ.ID.n°8 : 28 GCTCTACGACCAGATMTGGCTTGG Amorce anti-sens: SEQ.ID.n°9: CCGTAGTACGTGAAGTCATCCAGCA Sonde : SEQ.ID.n°10: FAM-ARGCACCI REVENDICATIONS1. Methode de diagnostic in vitro de la presence d'une vaginose bacterienne chez une patiente, caracterisee en ce qu'on determine la presence d'une vaginose bacterienne si I'on detecte la presence d'une 5 archaea methanogene de l'espece Methanobrevibacter smithii dans un echantillon de prelevement de secretion vaginale de la dite patiente par detection de Ia presence d'au moins une sequence d'acide nucleique specifique de ladite archaea methanogene Methanobrevibacter smithii contenue dans l'ADN extrait dudit echantillon de prelevement de secretion 10 vaginale de la dite patiente. 2. Methode selon la revendication 1 caracterise en ce qu'on determine Ia presence de Methanobrevibacter smithii en detectant la presence d'au moins une sequence d'acide nucleique specifique de ladite archaea methanogene Methanobrevibacter smith,' presente en une seule 15 copie dans la dite archaea Methanobrevibacter smith'', ladite sequence specifique de Methanobrevibacter smithii presentant une taille inferieure a 150 nucleotides. 3. Methode selon la revendication 1 ou 2 caracterisee en ce qu'on realise les etapes suivantes : 20 a) on effectue ('amplification enzymatique du type PCR d'au moins une dite sequence specifique de ladite archaea methanogene Methanobrevibacter smithii dans I'ADN extrait dudit echantillon de prelevement de secretion vaginale, b) on effectue Ia detection de fragments amplifies de ladite 25 sequence specifique de Methanobrevibacter smithii de preference par sequencage, par electrophorese sur gel d'agarose ou a ('aide de sondes marquees specifiques de la dite sequence specifique de ladite archaea methanogene Methanobrevibacter smithii de sequences distinctes de celles des dites amorces d'amplification, et 39 c) on determine la presence d'une vaginose bacterienne si la concentration de fragments d'ADN de Ia dite sequence specifique de Methanobrevibacter smithfi dans ledit echantillon de prelevement de secretions vaginales est superieure ou egale a 101 copies/mL. 4. Methode selon la revendication 2 ou 3 caracterise en ce qu'on realise des reactions d'amplification et de quantification d'une sequence specifique d'ADN humain dans l'ADN extrait de l'echantillon a tester, de preference une sequence specifique de i'albumine humaine. 5. Methode selon ('une des revendications 2 a 4 caracterisee en ce 10 que ladite sequence specifique de ladite archaea methanogene Methanobrevibacter smithfi comprend ou est tiree d'un des fragments suivants : - le fragment des positions 334632 a 334687 du gene ARN 16S ribosomal de reference GenBank NC 009515.1 ; 15 - le fragment des positions 1734995 a 1735069 du gene mcrA de Ia proteine methyl-coenzyme M reductase alpha subunit de 157 acides amines et de 16,942 Da de reference GenBank AAW80308.1 ; - le fragment des positions 876305 a 876370 du gene rpoB de la proteine RNA polymerase subunit B de M. smithfi de 186 acides amines et 20 de 20,836 Da de reference GenBank ABYV02000000. 6. Methode selon la revendication 4, caracterisee en ce que ladite sequence specifique d'ADN humain dans l'echantillon a tester comprend le fragment des positions 16283-16423 de l'exon 12 du gene de l'albumine humaine de reference Genebank M12523.1. 25 7. Methode selon ('une des revendications 2 a 6 caracterise en ce qu'on met en oeuvre les etapes suivantes dans lesquelles : a) on realise une extraction de l'ADN total contenu dans l'echantillon de prelevement de secretion vaginale par une methode apte a ('extraction de l'ADN des archaea methanogenes, et 40 b) on realise une reaction d'amplification enzymatique de type PCR de I'ADN d'au moins une dite sequence specifique de ladite archaea methanogene Methanobrevibacter smithii, dans I'ADN extrait desdits echantillons a tester, a l'aide d'au moins un jeu d'amorces apte amplifier ladite sequence specifique de ladite archaea methanogene Methanobrevibacter smithii, e,t c) on verifie si les amplifiats eventuels de I'ADN extrait desdits echantillons a tester, comprennent une dite sequence specifique a l'aide d'une sonde d'hydrolyse comprenant une sequence specifique de ladite sequence specifique de Methanobrevibacter smithii et encadree par les sequences des dites amorces. 8. Methode selon la revendication 7 caracterise en ce qu'on realise des reactions de co-amplification et de quantification en mettant en oeuvre deux jeux d'amorces et sondes d'hydrolyse specifiques respectivement d'une part de ladite sequence specifique de l'archaea Methanobrevibacter smithii, et d'autre part d'une sequence specifique d'ADN humain dans l'echantillon a tester, de preference une sequence specifique de l'albumine humaine, et ladite sequence specifique de l'albumine humaine comprenant une sequence de dite sonde encadree par des sequences aptes a servir comme de dites amorces dans une reaction d'amplification du type PCR de ladite sequence specifique de l'albumine humaine. 9. Methode selon l'une des revendications 1 a 8, caracterise en ce qu'on determine la presence d'une vaginose bacterienne si, dans I'ADN 25 extrait d'un echantillon de secretion vaginale de patiente, les 2 conditions a) et b) suivantes sont respectees : a) Ia concentration Ca en fragment d'ADN de l'albumine humaine est superieure ou egale a 101 copies/ml, et b) Ia concentration Cm en dit fragment d'ADN specifique de 30 Methanobrevibacter smithii est superieure ou egale a 10' copies/mL. 41 10. Methode selon l'une des revendication 3 a 9 caracterise en ce qu'on realise une methode d'extraction de l'ADN total contenu dans le prelevennent de secretion vaginale incluant ('extraction de d'ADN de Methanobrevibacter smithll dans laquelle on realise les etapes suivantes : 5 1) on effectue Ia sonication de l'echantillon de secretion vaginale, et 2) on effectue une lyse enzymatique dans le dit echantillon. 11. Methode selon l'une des revendication 3 a 10 caracterise en ce que ladite sequence specifique de ladite archaea methanogene 10 Methanobrevibacter smithll est choisie parmi les sequences suivantes incluant des sequences sondes (soulignees) encadrees par des sequences amorces (en gras) ou leurs sequences reverses et complementaires pour les amorces anti-sens: - pour Ia sequence 16S ARNr ; SEQ.ID. n°2 = 15 5'CCGGGTATCTAATCCGGTTCCCGTCAGAATCGTTCC AGTCAGCTCCCAGGGTAGAGGTGAAA-3' ; - pour Ia sequence du gene mcrA ; SEQ.ID.n°3 = 5'- GCTCTACGACCAGATMTGGCTTGGARGCACCKAA CAMCATGGACACWGTCCGTAGTACGTGAAGTCATCCAGCA-3' ; et 20 - pour la sequence rpoB ; SEQ.ID. n°4 = 5'- AAGGGATTTGCACCCAACACATTTGGTAAGATTTGTCCGAATG GACCACAGTTAGGACCCTCTGG-3'. 12. Methode selon l'une des revendications 8 a 11 caracterise en ce que ladite sequence de I'exon 12 du gene de l'albumine humaine 25 specifique d'ADN humain dans l'echantillon a tester comprend la sequence du listage de sequence suivante ou la sequence complementaire: 42 SEQ.ID. n°1 = 5'-GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGTAATCATCGTTTAAGAG TAATATTGCAAAACCTGTCATGCCCACACAAATCTCTCCCTGGCATTGTTGTCTTT GCAGATGTCAGTGAAAGAGAACCAGCAGCTCCCATGAGTTT-3' 13. Methode selon rune des revendications 11 a 12 caracterise en 5 ce qu'on met en oeuvre les jeux d'amorces et de preference de sondes choisis le cas echeant parmi les sequences suivantes du listage de sequence annexe a Ia presente description, ou respectivement leurs sequences complementaires : - Pour le gene 16S ARNr : 10 Amorce 5': SEQ.ID. n°5 = 5'- CCGGGTATCTAATCCGGTTC -3' Amorce 3': SEQ.ID. n°6 = 5'- CTCCCAGGGTAGAGGTGAAA -3' Sonde: SEQ.ID. n°7 = 5'- CCGTCAGAATCGTTCCAGTCAG -3' - Pour le gene mcrA : Amorce 5':SEQ.ID. n°8 = 5'-GCTCTACGACCAGATMTGGCTTGG- 3' 15 Amorce 3':SEQ.ID.n°9 =5'- CCGTAGTACGTGAAGTCATCCAGCA -3' Sonde: SEQ.ID. n°10 = 5'- ARGCACCKAACAMCATGGACACWGT-3' - Pour le gene rpoB : Amorce 5':SEQ.ID.n°11=5'-AAGGGATTTGCACCCAACAC- 3' Amorce 3': SEQ.ID. n°12= 5'- GACCACAGTTAGGACCCTCTGG -3' 20 Sonde: SEQ.ID. n°13 = 5'- ATTTGGTAAGATTTGTCCGAATG-3' - Pour I'albumine humaine : Amorce 5': SEQ.ID. n°14 = 5'-GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGT-3' Amorce 3':SEQ.ID. n°15 = 3'-AAACTCATGGGAGCTGCTGGTTC-3' Sonde: SEQ.ID. n°16 = 5'-CCTGTCATGCCCACACAAATCTCTCC-3' 14. Trousse de diagnostic pour Ia mise en oeuvre d'une methode de diagnostic selon rune des revendications 1 a 13, caracterisee en ce qu'elle comprend au moins : 43 - des reactifs permettant ('extraction de l'ADN total contenu dans un echantillon de prelevement de secretion vaginale incluant l'ADN de Methanobrevibacter smithii, ainsi que - un jeu d'amorces specifiques d'au moins une sequence d'ADN 5 specifiques de ladite archaea methanogene Methanobrevibacter smithll et de preference, au moins une sonde specifique de la dite sequence specifiques de ladite archaea methanogene Methanobrevibacter smithii, et - des reactifs de mise en oeuvre d'une reaction d'amplification d'ADN de type PCR. 10 15. Trousse de diagnostic selon la revendication 14 comprenant : - au moins un jeu d'amorces et de sondes de sequences choisies parmi les 3 jeux de sequences SEQ.ID.n°5 a 7, SEQ.ID.n°8 a 10 et SEQ.ID. n°11 h13, et - au moins un jeu d'amorces et de sonde de sequences SEQ.ID.n°14 15 616.