Brevet FR3084463A1 — publié le 20200131

PROCEDE D'ANALYSE DES PLAQUETTES D'UN ECHANTILLON SANGUIN DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne le domaine des procédés d'analyse sanguine in vitro et en particulier le domaine des procédés pour analyser des plaquettes présentes dans un échantillon sanguin. Plus particulièrement, le procédé selon l'invention permet de diagnostiquer in vitro une thrombopénie périphérique ou centrale chez un sujet. ARRIERE-PLAN TECHNIQUE Les plaquettes, sont des cellules sanguines dépourvues de noyau produites par fragmentation des mégacaryocytes de la moelle osseuse. Elles sont normalement présentes dans le sang à une concentration moyenne de 150 000 à 400 000 /pL chez l'homme et ont un rôle essentiel dans l'hémostase, un processus biologique regroupant l'ensemble des phénomènes qui permettent la prévention et l'arrêt de saignements. De nombreuses pathologies sont liées à des anomalies du nombre de plaquettes dans le sang. Il peut s'agir d'une augmentation de la concentration de plaquettes dans le sang, c'est-à-dire une thrombocytose, ou d'une diminution de la concentration de plaquettes dans le sang, c'est-à-dire une thrombopénie. Les thrombocytoses essentielles résultent d'atteintes graves de la moelle osseuse (syndromes myeloprolifératifs en particulier). Détecter ces types de thrombocytoses est primordial pour pouvoir adopter un traitement médical approprié. Une première analyse des plaquettes sanguines et du pourcentage de plaquettes jeunes constitue un geste simple qui permet d'orienter facilement les démarches exploratoires, qui peuvent inclure une analyse de biopsie de moelle, ce qui constitue un geste beaucoup plus invasif. On peut distinguer deux types de thrombopénies : La thrombopénie centrale, ou essentielle, qui résulte d'un défaut, en qualité et/ou en nombre, dans la formation des mégacaryocytes et qui se traduit par une faible production de plaquettes et par conséquent par une faible concentration de plaquettes dans le sang. La thrombopénie centrale peut avoir différentes causes qui peuvent être d'origine génétique, ou acquise comme une carence en vitamine B12, certains cancers, les myelodysplasies, des atteintes hépatiques, ou certains traitements comme la chimiothérapie ou la radiothérapie. Dans certains cas, la cause n'est pas identifiée. Certaines maladies sont connues pour être liées à une 2 thrombopénie centrale, par exemple le syndrome de Bernard-Soulier ou le syndrome de May-Hegglin (MYH9). La thrombopénie périphérique se caractérise par une diminution de la numération des plaquettes circulantes, par une augmentation compensatrice de la 5 mégacaryocytopoïèse et donc par une production plus importante des plaquettes. La thrombopénie périphérique est généralement provoquée par la destruction des plaquettes circulantes, par exemple sous l'action d'auto-anticorps ou d'anticorps qui se fixent sur les plaquettes en présence de certains médicaments (héparines, quinines par exemple). Une thrombopénie périphérique se caractérise donc par 10 une proportion plus importante de plaquettes jeunes (parfois dénommés plaquettes immatures). Le purpura thrombopénique idiopathique (PTI), d'origine auto-immune, est la cause la plus fréquente de thrombopénie périphérique. La thrombopénie périphérique peut également être expliquée par un état inflammatoire du patient qui peut entrainer une consommation des plaquettes 15 circulantes ou encore d'être d'origine allergique. La thrombopénie peut entrainer des hémorragies, visibles sous forme de pétéchies ou purpura, des saignements anormaux au niveau du nez et de la bouche, des règles abondantes, des hématomes peuvent également survenir. Le traitement de la thrombopénie dépend de sa cause. Il est donc essentiel de pouvoir 20 distinguer une thrombopénie centrale et une thrombopénie périphérique. La thrombopénie est identifiée en mesurant le nombre de plaquettes dans le sang, généralement au moyen d'un test sanguin, appelé « numération formule sanguine » ou « NFS » ou « hémogramme ». La thrombopénie est diagnostiquée si le nombre de plaquettes est inférieur à 150 x109/L de sang. Néanmoins, la mesure du nombre de 25 plaquettes uniquement ne permet pas de faire la différence entre une thrombopénie centrale et périphérique. La détermination de la quantité de plaquettes jeunes dans le sang, c'est-à-dire les plaquettes qui viennent d'être produites par la moelle osseuse, revêt donc un intérêt particulier pour distinguer une thrombopénie centrale d'une thrombopénie périphérique. 30 Les plaquettes jeunes se distinguent des autres plaquettes circulantes par un contenu riche en réticulum endoplasmique et en ARNm et par une taille un peu plus importante. Le thiazole orange (TO) ou ses analogues (ex. l'acridine orange), des colorants dont l'émission de fluorescence est multipliée par 1000 après liaison à l'ARN, sont utilisés pour 3 discriminer par cytométrie en flux les plaquettes jeunes. Cependant, l'utilisation du TO et de ses analogues pour l'analyse des plaquettes jeunes est délicate, notamment chez l'Homme où la population de plaquettes jeunes ne représente généralement que 1 à 2% de l'ensemble des plaquettes. En effet, une partie de la fluorescence du TO (ou de ses 5 analogues) dans les plaquettes est insensible à un traitement par la RNase qui cible les ARN cytosoliques, ce qui peut s'expliquer par une fluorescence après liaison aux acides nucléiques mitochondriaux ou aux nucléotides dans les granules denses. Ainsi, un marquage des plaquettes au TO (ou à un de ses analogues) révèle deux populations : une première dite « Tobright », dont la forte fluorescence est réduite de façon drastique par un 10 traitement avec de la RNase, avec donc un contenu en ARN plus important et qui correspond effectivement aux plaquettes jeunes, une seconde dite « TOdim », dont la fluorescence du TO (ou de ses analogues) est plus faible et est insensible à un traitement avec de la RNase, et qui ne contient donc peu ou pas d'ARN cytosolique et qui ne correspond pas aux plaquettes jeunes. 15 Malgré cette limite, le procédé utilisé à ce jour pour identifier la cause d'une thrombopénie (i.e. centrale ou périphérique) repose sur l'utilisation d'un analogue du TO pour déterminer la proportion de plaquettes jeunes, appelée « immature platelet fraction » ou « IPF », dans un échantillon de sang total. Il s'agit du procédé connu sous le nom de Sysmex®. Le procédé Sysmex® utilise un algorithme intégrant la taille des 20 plaquettes et leur fluorescence en présence d'un dérivé de l'acridine orange, une molécule qui possède des propriétés analogues à celles du TO vis-à-vis des ARN. Ce procédé est utilisé pour obtenir un pourcentage d'IPF qui peut être utilisé pour poser un diagnostic clinique face à une thrombopénie isolée. La mise en évidence d'un taux d'IPF élevé est considérée comme reflétant une thrombopénie périphérique alors qu'un taux d'IPF 25 classique mesuré par le procédé Sysmex (inférieur à 15%) peut refléter une thrombopénie centrale. Or, comme expliqué plus haut, une partie de l'acridine orange se lie aux acides nucléiques mitochondriaux ou aux nucléotides dans les granules denses, ces derniers étant insensibles au traitement à la RNase, ce qui peut générer des faux positifs. 30 Il existe donc un réel besoin de disposer d'un procédé facile à mettre en oeuvre qui peut s'affranchir de l'utilisation du thiazole orange (TO) ou d'un de ses analogues (ex. l'acridine orange) pour pouvoir analyser les plaquettes présentes dans un échantillon sanguin de manière fiable et reproductible, en particulier pour diagnostiquer in vitro une thrombopénie périphérique ou une thrombopénie centrale. 4 RESUME DE L'INVENTION Les inventeurs ont mis en évidence que la mesure par cytométrie en flux du niveau d'expression des molécules du Complexe Majeur d'Histocompatibilité de classe I (CMH I) au niveau de la membrane plasmique des plaquettes est corrélé avec l'âge des 5 plaquettes. Ainsi, les inventeurs ont mis au point un procédé permettant d'analyser les plaquettes d'un échantillon sanguin par cytométrie de flux, en utilisant un ligand antichaîne alpha du CMH-I couplé à un fluorochrome. Ce procédé d'analyse est particulièrement adapté pour distinguer une thrombopénie périphérique d'une thrombopénie centrale. 10 Un premier objet de l'invention concerne un procédé pour analyser les plaquettes présentes dans un échantillon sanguin, ledit procédé comprend les étapes de : a) ajouter audit échantillon un ligand qui se lie au CMH I couplé à un fluorochrome ; b) mesurer l'intensité de fluorescence moyenne des plaquettes (MFIplaquett') avec 15 un cytomètre en flux. Un second objet de l'invention concerne un procédé de diagnostic in vitro d'une thrombopénie périphérique ou centrale chez un sujet comprenant les étapes de : a) analyser les plaquettes présentes dans un échantillon sanguin d'un sujet en mettant en oeuvre le procédé d'analyse selon l'invention ; et 20 b) utiliser le résultat de l'étape a) dans le diagnostic de la thrombopénie périphérique ou centrale. Un troisième objet de l'invention concerne un procédé in vitro de suivi de l'efficacité thérapeutique d'un traitement de la thrombopénie centrale ou périphérique, comprenant 25 les étapes de : a) analyser les plaquettes présentes dans un échantillon sanguin d'un patient ayant subi un traitement de la thrombopénie centrale ou périphérique en mettant en oeuvre le procédé d'analyse selon l'invention ; b) utiliser le résultat de l'étape a) dans la détermination de l'efficacité 30 thérapeutique du traitement de la thrombopénie périphérique ou centrale. 5 Un quatrième objet de l'invention concerne un procédé in vitro pour pronostiquer le développement d'une maladie inflammatoire ou cardiovasculaire, comprenant les étapes de : a) analyser les plaquettes présentes dans un échantillon sanguin d'un sujet en 5 mettant en oeuvre le procédé d'analyse selon l'invention ; b) utiliser le résultat de l'étape a) dans le pronostic du développement de la maladie inflammatoire ou cardiovasculaire. Un cinquième objet de l'invention concerne un kit pour la mise en oeuvre d'un procédé de diagnostic, de suivi de l'efficacité thérapeutique d'un traitement ou de pronostic du 10 développement d'une maladie inflammatoire ou cardiovasculaire selon l'invention, comprenant : - un ligand qui se lie au CMH I couplé à un fluorochrome ; - un standard interne ; et - des instructions. 15 6 DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1. L'expression en surface des molécules du CMH I est plus importante sur les plaquettes murines jeunes A) Graphique d'une analyse FACS représentative 5 de l'expression du TO et du CMH I sur les plaquettes murines. Les plaquettes ont été marquées avec un anticorps anti-GPIb beta conjugué PE ou Alexa-647 et avec du thiazole orange (TO) (panneau de gauche). Les plaquettes GPIb beta+ ont été sélectionnées et l'expression du CMH I a été analysée grâce à un co-marquage avec un anticorps antiCMHI conjugué PE ou avec un anticorps anti-p2m révélé avec un anticorps secondaire 10 anti-souris de chèvre conjugué Alexa-647 (panneau de droite). Les plaquettes TObret sont mises en évidence en gris clair (panneaux gauche et droit) B) L'expression en surface des molécules du CMH I et de la GP1bp a été évaluée en calculant le rapport entre l'intensité moyenne de fluorescence (MFI) du CMH I ou la MFI de la GPIbp et la MFI du paramètre FSC sur les plaquettes TOdim ou TObright (* p 0.05 ; n=3). 15 Figure 2. L'expression en surface des molécules du CMH I diminue in vivo au cours du vieillissement des plaquettes. Des plaquettes de souris iDTR PF4 cre traitées par la toxine diphtérique (DT) ont été isolées, biotinylées et transfusées à des souris WT. Analyse par cytométrie en flux de A) 20 l'expression du CMH I B) expression de la GPIbp et C) du marquage TO sur plaquettes transfusées biotinylées (À) et sur plaquettes endogènes TOdim (^) ou Tobright (e) 5 min, 24h, 48h et 72h après transfusion. Résultats exprimés sous forme de ratios entre la MFI du marquage et la MFI du paramètre FSC (n=3, une expérience représentative de 3 expériences indépendantes). 25 Figure 3. Les molécules HLA I sont exprimées de préférence par des plaquettes humaines très fluorescentes pour le thiazole orange A) Graphiques FACS représentatifs de l'expression du TO et du CMH I sur les plaquettes humaines. Les plaquettes ont été marquées avec un anti-GPIb conjugué PE et avec le TO (panneau de 30 gauche). Les plaquettes GPIbP+ ont été sélectionnées et l'expression du CMH I a été analysée grâce à une coloration avec un anti-CMHI conjugué A647 et un anticorps anti132m conjugué PE-CY7 (panneau de droite). Les plaquettes TObright sont mises en évidence en gris clair (panneaux de gauche et de droite). B) L'expression à la surface cellulaire des molécules du CMH I et de la GP1bp a été évaluée en calculant le rapport entre la MFI du 7 CMH I (marquage anti-(32m ou anti-HLA I) ou la MFI de la GPIb(3 et la MFI du paramètre FSC sur les plaquettes TOd'n' ou TObright (* p .05 ; n=7). Figure 4. Les plaquettes humaines exprimant une densité élevée de molécules 5 du CMH I présentent des caractéristiques de jeunes plaquettes. Graphiques FACS représentatifs de l'expression des protéines ribosomales, du TO et de l'expression des molécules du CMH I sur les plaquettes humaines. Les plaquettes humaines ont été fixées, perméabilisées, co-marquées avec un anti-GPIb conjugué PE, un anticorps anti-protéine ribosomale P mAb, un anti-CMHI conjugué A647, un anticorps 10 anti-132m conjugué PE-CY7, et le TO puis analysées par FACS. A) Les plaquettes GPIbj3+ ont été sélectionnées. L'expression de la protéine ribosomale a été analysée en mettant en évidence les plaquettes TObright en gris foncé (panneaux du haut à droite). L'expression des molécules du CMH I a été analysée en mettant en évidences les plaquettes TObright ou P-ribosomal- high en gris foncé (panneaux du bas). B) Analyse de la distribution de la 15 protéine ribosomale P ou du marquage Teight dans les populations exprimant fortement ou faiblement les molécules HLA I. Figure 5. L'expression à la surface cellulaire du CMH I est un critère fiable pour déterminer la proportion de jeunes plaquettes chez les patients. A) Sur des échantillons de sang de donneurs sains les pourcentages de plaquettes TObright 20 et HLA Ihigh ont été déterminés par analyse FACS, et les pourcentages d'IPF avec l'automate Sysmex® (n=6) B) Des échantillons de sang de donneurs sains ou de patients déficients en MyH9 ont été analysés et la MFI du TO et de HLA I sur les plaquettes ont été déterminés par analyse FACS. Les résultats sont exprimés sous forme de ratios entre les MFI des marquages HLA I (W6/32 ou 132m) ou TO sur les MFI des FSC. C) Graphiques 25 de FACS du marquage TO sur les différents échantillons de sang avant et après le traitement à la RNase Les pourcentages de plaquettes TObright sont indiqués pour chaque condition. D) Les échantillons de sang citraté de donneur sain ont été activés par du TRAP 0.1, 0.5, 1, 10, 50 ou 100 pM avant que les pourcentages d'IPF soient estimés par le Sysmex®' (panneau du haut) ou que les ratios HLA I/FSC ou f32m/FSC soient analysés par 30 cytométrie en flux (panneau du bas) (n=3-5). 8 DESCRIPTION DETAILLEE Les Demandeurs ont mis au point un procédé permettant d'analyser les plaquettes présentes dans un échantillon sanguin de façon précise et reproductible. La mise en 5 oeuvre de ce procédé permet notamment de déterminer in vitro l'origine (centrale ou périphérique) d'une thrombopénie. Définitions Les « plaquettes » sont des cellules sanguines produites par fragmentation des mégacaryocytes de la moelle osseuse. Les plaquettes sont dépourvues de noyau chez les 10 mammifères et leur durée de vie chez l'homme est d'environ 7 à 10 jours avant d'être éliminées par les macrophages de la rate ou du foie. Les plaquettes sont des composants indispensables de l'hémostase primaire. Chez l'homme, les plaquettes ont un diamètre de 2 à 4 microns et leur concentration normale dans le sang est de 150 à 400x109 plaquettes par litre de sang. Leur nombre tend à diminuer avec l'âge. Les plaquettes expriment les 15 molécules du CMH de classe I (Complexe Majeur d'histocompatibilité) à leur surface. Lorsque la concentration en plaquettes est inférieure à 150 x109 plaquettes par litre de sang, le taux de plaquettes est considéré bas et on parle de « thrombopénie » ou de « thrombocytopénie », à laquelle le risque d'hémorragies est augmenté. Lorsque la concentration en plaquettes est supérieure à 400 x109 plaquettes par litre de 20 sang, le taux de plaquettes est considéré haut et on parle alors de « thrombocytose », à laquelle sont associés des risques de thrombose. On peut distinguer deux types de thrombopénies : La thrombopénie centrale, ou essentielle, qui résulte d'un défaut, en qualité et/ou en nombre, dans la formation des mégacaryocytes et qui se traduit par une faible 25 production de plaquettes (concentration en plaquettes dans le sang inférieure à 150 000 /pL de sang). La thrombopénie centrale peut avoir différentes causes qui peuvent être d'origine génétique, ou acquise comme une carence en vitamine B12, certains cancers, les myelodysplasies, des atteintes hépatiques, ou certains traitements comme la chimiothérapie ou la radiothérapie. Dans certains cas, la 30 cause n'est pas identifiée. Certaines maladies sont connues pour être liées à une thrombopénie centrale, par exemple le syndrome de Bernard-Soulier ou le syndrome de May-Hegglin (MYH9). 9 La thrombopénie périphérique se caractérise par une diminution de la numération des plaquettes circulantes, par une augmentation compensatrice de la mégacaryocytopoïèse et donc par une production plus importante des plaquettes. La thrombopénie périphérique est généralement provoquée par leur destruction, 5 par exemple sous l'action d'auto-anticorps ou d'anticorps qui se fixent sur les plaquettes en présence de certains médicaments (héparines, quinines par exemple). Une thrombopénie périphérique se caractérise donc par une proportion plus importante de plaquettes jeunes (parfois dénommés plaquettes immatures). Le purpura thrombopénique idiopathique (PTI), d'origine auto-immune, est une 10 cause fréquente de thrombopénie périphérique. La thrombopénie périphérique peut également être expliquée par un état inflammatoire du patient qui peut entrainer une consommation des plaquettes circulantes ou être d'origine immune. Les molécules du « Complexe Majeur d'Histocompatibilité » de classe I ou « CMH I » constituent le système de reconnaissance du non soi et présentent des antigènes 15 peptidiques aux lymphocytes T. Chez l'homme le CMH est appelé « HLA » pour « Human Leucocyte Antigen ». Ces molécules sont exprimées à la membrane plasmique de presque toutes les cellules nucléées et sur les plaquettes sanguines. Elles sont constituées de l'association non covalente d'une chaîne alpha (comprenant 3 domaines de type immunoglobuline : al, 02 et 03) et de la béta-2 microglobuline ([32m). Le CMH I exprimé 20 à la membrane plasmique est toujours associé à un peptide, lequel permet de stabiliser le CMH I. Le CMH I est notamment impliqué dans la présentation des antigènes du soi aux lymphocytes T CD8. Le terme « échantillon sanguin », tel qu'utilisé ici, comprend tout échantillon contenant des plaquettes. L'échantillon sanguin est par exemple obtenu à partir du sang d'un sujet. 25 De préférence, il s'agit d'un échantillon de sang total, avantageusement prélevé en présence d'anticoagulant selon les bonnes pratiques de l'Homme de l'art. L'anticoagulant peut être l'EDTA ou le citrate. Le terme « ligand » au sens de l'invention désigne une molécule qui se lie de façon spécifique à la cible. 30 Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le ligand n'est pas capable de se lier à la chaine 132m non associée à la chaine alpha, c'est-à-dire à la chaine p2m soluble. 10 Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le ligand est capable de se lier à la chaine p2m non associée à la chaine alpha. Dans ce mode de réalisation particulier, une concentration de ligand suffisamment élevée est avantageusement utilisée pour que la chaine 132m soluble présente dans le l'échantillon sanguin n'interfère pas avec 5 la liaison au CMH I lors de la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le ligand est capable de se lier à tous les isotypes de CMH I, c'est à dire les isotypes A (HLA A), B (HLA B) et C (HLA C). Le ligand peut être un anticorps, un fragment d'anticorps, un aptamère, une protéine, un peptide ou une petite molécule. Les ligands utilisables dans le cadre de l'invention 10 peuvent être obtenus facilement par l'Homme de l'art. On peut citer par exemple le procédé Selex pour les aptamères ou les procédés d'immunisation et de clonage pour les anticorps. Dans un mode de réalisation préféré, le ligand est un anticorps ou un fragment d'anticorps. Plusieurs anticorps utilisables dans le cadre de l'invention sont accessibles dans le commerce, par exemple l'anticorps W6/32, produit par l'hybridome ATCC HB-95 15 ou l'anticorps anti-p2m humaine déjà couplé au fluorophore PE/Cy7 disponible chez Biolegend (référence : 316318). Le terme « anticorps » est utilisé ici dans son sens le plus large et englobe diverses structures d'anticorps qui présentent l'activité de liaison à l'antigène souhaité, notamment les anticorps monoclonaux. Il peut s'agir d'anticorps humains, humanisés, chimériques ou 20 d'une espèce non-humaine, par exemple des anticorps murins. Dans le cadre de la présente invention, le ligand est couplé à un moyen permettant sa détection en cytométrie de flux, de préférence un fluorochrome (ou fluorophore). Le terme « fluorochrome » désigne une molécule capable d'émettre de la lumière de fluorescence après excitation. L'intensité de fluorescence (ou MFI) émise par le 25 fluorochrome peut être mesurée par tout moyen connu, par exemple avec un cytomètre de flux capable de détecter et de mesurer l'intensité de fluorescence du fluorochrome. La « cytométrie en flux » ou « cytométrie de flux » est une technique largement répandue qui permet de faire défiler des particules, molécules ou cellules à grande vitesse dans le faisceau d'un laser, en les comptant et en les caractérisant. La cytométrie de flux 30 est une technique particulièrement avantageuse car elle permet de mesurer individuellement l'intensité de fluorescence des particules, molécules ou cellules en les faisant défiler une par une devant un faisceau laser. 11 Le « standard interne » au sens de l'invention permet de normaliser les intensités de fluorescence (MFI) mesurées en cytométrie de flux. Dans le cadre de la présente invention, le standard interne est de préférence un élément qui se lie au ligand. Il peut notamment s'agir d'une microbille de polystyrène sur lequel peut s'adsorber le ligand. De 5 nombreux standards internes adaptés à différents types de ligands sont proposés dans le commerce, par exemple le standard « BD Compbead n°552843 » qui peut être utilisé lorsque le ligand est un anticorps qui lie la chaine kappa d'un anticorps de souris. Par « sujet » au sens de l'invention, il est fait référence à un mammifère, par exemple un chien, un chat, un ovin, un bovin ou l'Homme, de préférence le sujet est un Homme. Par 10 « sujet sain » au sens de l'invention, il est fait référence à un sujet qui ne présente aucune pathologie à l'origine d'une numération anormale des plaquettes dans le sang et qui n'est pas sous traitement médicamenteux. Le terme « diagnostic », est utilisé ici dans son sens le plus large, et est couramment utilisé et bien compris de l'Homme de l'art. Ce terme désigne par exemple la 15 détermination de la probabilité, du risque ou de la possibilité d'avoir une pathologie chez un sujet. Le terme « traitement » ou « traiter » ou « répondre au traitement » désigne au sens de l'invention une amélioration, une atténuation, une inversion ou une inhibition de la progression d'une pathologie. En particulier, le traitement de la pathologie peut consister 20 à rétablir une production normale de plaquettes par la moelle osseuse. Procédé pour analyser les plaquettes L'invention concerne un procédé pour analyser les plaquettes présentes dans un échantillon sanguin, ledit procédé comprend les étapes de : 25 a) ajouter audit échantillon un ligand qui se lie au CMH I couplé à un fluorochrome ; b) mesurer l'intensité de fluorescence moyenne des plaquettes (MFlpiaquettes) avec un cytomètre en flux. Les demandeurs se sont en effet aperçus que le niveau d'expression du CMH I à la 30 surface des plaquettes est corrélé avec leur âge. Ainsi, les plaquettes les plus jeunes expriment plus de CMH I au niveau de leur membrane plasmique que les plaquettes plus âgées. 12 Etape a) L'étape a) consiste à ajouter audit échantillon un ligand qui se lie au CMH I couplé à un fluorochrome. Cette étape est réalisée en ajoutant le ligand couplé à un fluorochrome dans un échantillon sanguin, par exemple sous agitation. L'agitation permet notamment 5 d'homogénéiser le mélange afin de faciliter le contact entre les ligands marqués et les plaquettes. Le temps d'incubation doit être suffisant pour mettre en contact le ligand marqué et les plaquettes. Généralement, le temps d'incubation utilisé par l'Homme du métier est de 20 à 30 min pour un anticorps, mais il pourrait être raccourci en fonction du ligand utilisé et 10 être alors inférieur à 5 min, par exemple inférieur à 4 min, inférieur à 3 min, inférieur à 2 min, inférieur à 1 minute, inférieur à 30 secondes. Le temps d'incubation peut également être supérieur à 5 min, supérieur à 10 min ou même supérieur à 15 min. Le procédé d'analyse selon l'invention est particulièrement facile à mettre en oeuvre puisqu'il peut être mis en oeuvre en utilisant un échantillon de sang total. Néanmoins, il 15 n'est pas limité à l'utilisation d'un échantillon sanguin spécifique. Par exemple, il peut s'agir de toute fraction du sang total comprenant des plaquettes, par exemple le plasma sanguin riche en plaquettes (PRP) ou des plaquettes isolées à partir de sang total. De préférence, l'échantillon sanguin est un échantillon de sang total. Dans un mode de réalisation particulier, l'échantillon sanguin peut contenir d'autres 20 composants que ceux naturellement présents dans l'échantillon sanguin, par exemple des tampons, qui permettent d'ajuster le pH, ou des agents anticoagulants adaptés tels que l'EDTA ou le citrate. Dans un mode de réalisation particulier, le ligand peut être choisi parmi un anticorps, un fragment d'anticorps, un aptamère, une protéine, un peptide ou une petite molécule. La 25 quantité de ligand appropriée peut être déterminée aisément par l'expérimentateur. Par exemple, si le ligand est un anticorps, il peut être ajouté à une concentration allant de 0,1 pg/mL à 10 pg/mL. Le ligand est ajouté à l'échantillon en condition saturante afin d'assurer un marquage approprié des plaquettes. Dans un mode de réalisation particulier, le ligand est un anticorps ou un fragment 30 d'anticorps, par exemple l'anticorps W6/32 produit par l'hybridome ATCC HB-95 ou un fragment qui a gardé sa capacité à se lier au CMH I. Il peut également s'agir d'un anticorps qui se lie à la 132m, dans ce cas il faut utiliser une concentration d'anticorps 13 suffisamment élevée pour que la B2m soluble présente dans le sang n'interfère pas lors de la mise en oeuvre de la méthode. Le ligand est couplé à un moyen permettant sa détection avec un cytomètre en flux, de préférence un fluorochrome (ou fluorophore). Le ligand peut être couplé à un 5 fluorochrome directement ou indirectement, de préférence directement. Des méthodes de couplage d'un ligand avec un fluorochrome sont largement décrites dans la littérature. Le couplage ne présente donc aucune difficulté technique particulière. Le procédé n'est pas limité à un fluorochrome particulier, à partir du moment où il peut être détecté avec un cytomètre en flux. Avantageusement, le fluorochrome est un 10 fluorochrome dont les longueurs d'onde d'excitation et d'émission n'interfèrent pas avec les réactifs permettant de détecter l'ARN. Des exemples, non limitatifs, de fluorophores sont cités ci-après et dans les exemples : FITC (fluorescein isothiocyanate), PE (Rphycoerythrin), APC (allophycocyanin), PerCP (peridinin chlorophyll protein), PE-CF594, peridinin chlorophyll protein (PerCP)-Cy5.5, PE-Texas Red, GFP (green fluorescent 15 protein), YFP (yellow fluorescent protein) ou CFP (cyan fluorescent protein). Etape L'étape b) consiste à mesurer l'intensité de fluorescence moyenne des plaquettes (MFIplaquettes) avec un cytomètre en flux. Bien entendu, le cytomètre en flux est capable de détecter et de mesurer la fluorescence du fluorochrome. La mesure est effectuée 20 automatiquement par le cytomètre en flux. Le paramétrage du cytomètre en flux ne présente aucune difficulté technique particulière. En particulier, l'Homme du métier saura paramétrer le cytomètre en flux en fonction du fluorochrome choisi. La mesure effectuée à l'étape b) permet d'identifier les plaquettes liées par le ligand marqué, et permet l'identification d'une ou de plusieurs population(s) de plaquette(s), en 25 particulier une population de plaquettes jeunes. Dans un mode de réalisation particulier, la mesure MFIplaquettes est normalisée avec l'intensité de fluorescence moyenne d'un standard interne (MFIstandard) afin d'obtenir une intensité de fluorescence moyenne des plaquettes normalisée (MFIplaquettes normalisée). Le standard interne est de préférence ajouté audit échantillon à l'étape a), soit avant le 30 ligand soit après le ligand, soit simultanément au ligand, de préférence avant le ligand. La quantité de standard interne appropriée peut être déterminée aisément par 14 l'expérimentateur, de préférence en le mettant en quantité d'un même ordre de grandeur que le nombre de plaquettes. La normalisation de la mesure MFIplaquett' avec un standard interne est particulièrement avantageuse puisqu'elle permet de palier la variabilité inter-expérience, inter-laboratoire 5 et/ou inter-expérimentateur. Dans un mode de réalisation particulier, le standard interne se lie au ligand couplé au fluorochrome, par exemple le ligand couplé au fluorochrome s'adsorbe sur le standard interne. Dans ce mode de réalisation particulier, MFIstandard correspond donc à l'intensité de fluorescence moyenne émise par le fluorochrome lié au standard et mesurée avec le 10 cytomètre en flux capable de détecter et de mesurer la fluorescence du fluorochrome. Le cytomètre en flux doit être réglé pour faire la distinction entre les plaquettes marquées et le standard interne marqué. En général, la distinction se fait par la taille. Il est donc essentiel que la taille du standard marqué soit choisie de façon à ce que le standard se démarque aisément des plaquettes. 15 Avantageusement, le standard interne est une microbille de polystyrène sur lequel s'adsorbe le ligand couplé au fluorochrome. Il peut s'agir, par exemple, d'une microbille de polystyrène recouverte d'anticorps qui se lient audit ligand couplé au fluorochrome. On peut citer par exemple le produit commercial « BD Compbead n°552843 » qui peut être utilisé lorsque le ligand est un anticorps qui comprend la chaine kappa d'un anticorps de 20 souris (ex. un anticorps chimérique). En plus de l'intensité de fluorescence, le cytomètre en flux peut mesurer d'autres paramètres tels que le « Forward Scatter » (FSC). La FSC permet notamment de donner une indication sur la taille des particules, par exemple sur la taille des plaquettes. Ainsi, dans un mode de réalisation préféré, le procédé de l'invention comprend en outre 25 une étape c) mesurer le paramètre de diffusion FSC moyen (FSC) avec ledit cytomètre en flux et déterminer le ratio MFIplag'ttes / FSC ou MFI -plaquettes normalisée / FSC. La détermination du ratio MFIplaq'u' / FSC ou MFIHaquettes normalisée / FSC est particulièrement avantageuse puisqu'elle permet d'analyser plus finement les plaquettes. Cela permet de différencier plus finement une ou plusieurs population(s) de plaquette(s), en particulier une 30 population de plaquettes jeunes. L'étape c) est effectuée automatiquement par le cytomètre en flux simultanément à l'étape b). 15 La description concerne également un procédé pour identifier une population de plaquettes présente dans un échantillon sanguin, ledit procédé comprend les étapes de : a) analyser les plaquettes présentes dans un échantillon sanguin par la mise en oeuvre du procédé selon l'invention ; et 5 b) utiliser le résultat de l'étape a) pour identifier une population de plaquettes. L'identification de la population de plaquettes est faite automatiquement par le cytomètre de flux en fonction des paramètres décrits précédemment. Procédé de diagnostic 10 L'invention concerne un procédé de diagnostic in vitro d'une thrombopénie périphérique ou centrale chez un sujet comprenant les étapes de : a) analyser les plaquettes présentes dans un échantillon sanguin d'un sujet en mettant en oeuvre le procédé d'analyse des plaquettes selon l'invention ; et b) utiliser le résultat de l'étape a) dans le diagnostic de la thrombopénie 15 périphérique ou centrale. Le résultat obtenu en analysant les plaquettes selon l'invention permet de poser un diagnostic de la thrombopénie périphérique chez un sujet. En particulier, un diagnostic positif pour la thrombopénie périphérique est donné par une augmentation chez ledit - ttes 20 sujet du/des paramètre(s) MFIplaquett', de MFIpiaque normalisée, du ratio MFIplaquettes FSC et/ou du ratio MFT -- -plaquettes normalisée/ FSC par rapport au(x) même(s) paramètre(s) mesuré(s) chez un sujet sain. Une augmentation du ou des paramètre(s) précité(s) chez le sujet considéré en comparaison avec ce ou ces même(s) paramètres(s) mesuré(s) chez un sujet sain, traduit 25 une augmentation de la quantité de plaquettes jeunes chez ledit sujet considéré et permet de mettre en évidence une activité accrue de la moelle osseuse et donc permet de poser le diagnostic d'une thrombopénie périphérique. Dans un mode de réalisation préféré, l'augmentation d'un ou de plusieurs des paramètres précités est de l'ordre d'un facteur supérieur à 1,5, par exemple supérieur à 2, supérieur à 30 2,5, supérieur à 3, ou encore supérieur à 3,5. 16 Le résultat obtenu en analysant les plaquettes selon l'invention permet de poser un diagnostic de la thrombopénie centrale chez un sujet. En particulier, un diagnostic positif pour la thrombopénie centrale est donné par un/des paramètre(s) MFIplaquettes/ MFIplaquettes normalisée/ ratio MFIplaquettes / FSC et/ou ratio MFIplaquettes normalisée FSC chez ledit sujet 5 similaire(s) ou identique(s) au(x) même(s) paramètre(s) mesuré(s) chez un sujet sain. Dans un mode de réalisation particulier, ledit sujet a préalablement été diagnostiqué comme présentant une thrombopénie ou comme étant susceptible de présenter une thrombopénie. Le procédé de diagnostic selon l'invention va alors permettre de connaitre l'origine (centrale ou périphérique) de la thrombopénie. 10 Procédé pour suivre l'efficacité thérapeutique d'un traitement L'invention concerne également un procédé in vitro de suivi de l'efficacité thérapeutique d'un traitement de la thrombopénie centrale ou périphérique, comprenant les étapes de : a) analyser les plaquettes présentes dans un échantillon sanguin d'un patient 15 ayant subi un traitement de la thrombopénie centrale ou périphérique en mettant en oeuvre le procédé d'analyse selon l'invention ; b) utiliser le résultat de l'étape a) dans la détermination de l'efficacité thérapeutique du traitement de la thrombopénie centrale ou périphérique. 20 Procédé de pronostic L'invention concerne également un procédé in vitro pour pronostiquer le développement d'une maladie inflammatoire ou cardiovasculaire, comprenant les étapes de : a) analyser les plaquettes présentes dans un échantillon sanguin d'un sujet en mettant en oeuvre le procédé d'analyse selon l'invention ; 25 b) utiliser le résultat de l'étape a) dans le pronostic du développement de la maladie inflammatoire ou cardiovasculaire. Dans un mode de réalisation particulier, la maladie inflammatoire est le sepsis. Dans un autre mode de réalisation particulier, la maladie cardiovasculaire est l'athérosclérose. 17 Kit de diagnostic L'invention concerne également un kit pour diagnostiquer une thrombopénie périphérique ou une thrombopénie centrale chez un sujet, pour suivre l'efficacité thérapeutique d'un traitement ou pour pronostiquer le développement d'une maladie inflammatoire ou 5 cardiovasculaire, comprenant : un ligand qui se lie au CMH I couplé à un fluorochrome ; un standard interne ; et des instructions pour la mise en oeuvre d'un procédé de diagnostic in vitro selon l'invention. 10 Méthode de traitement L'invention concerne également une méthode pour traiter une thrombopénie périphérique ou une thrombopénie centrale chez un sujet, comprenant : la mise en oeuvre d'un procédé de diagnostic in vitro selon l'invention ; et 15 - lorsque le diagnostic est positif, entamer un traitement approprié dudit sujet. Des traitements appropriés sont notamment décrits dans la référence [8], en particulier les parties « First-line therapy », « Second-line therapy », « Third-line therapy », « Other new agents » et le Tableau 2 en pages 18 et 19. 18 EXEMPLES Matériels et méthodes 5 Réactifs Les réactifs sont disponibles dans le commerce. Le thiazole orange (TO) provient de chez Sigma-Aldrich. La xylazine (Rompue)) et la ketamine (Imalgene 1,000®) sont de Bayer et de Merial, respectivement. La biotine est fournie par ThermoFischer et la toxine diphtérique (DT) par Santa Cruz. 10 Anticorps et cytométrie en flux L'anticorps monoclonal de rat dirigé contre le domaine extracellulaire de la glycoprotéine plaquettaire GPIb beta (Rami, [7]) a été produit et couplé à l'Alexa647 ou 488 dans notre laboratoire. Les anticorps de souris anti-HLAI (clone W6/32) couplé à l'allophycocyanin 15 (APC) (référence : 311410), anti-132m humaine couplé au PE-CY7 (référence : 316318) et anti-CD45 humain couplé à APC-cy7 (clone 2D1) (référence : 368516) proviennent de chez Biolegend. L'anti-H2 de souris (clone M1/42) couplé à la phycoérythrine (PE) (référence : 125506) et la streptavidine couple à l'APC-CY7 (référence : 405208) ont été achetés chez Biolegend. L'anticorps anti-b2 microglobuline (a2m) de souris (clone 20 519.8) (référence : 555299) provient de BD Pharmingen. L'anticorps anU-CD45 de souris couplé à la PE-cy7 (clone 30-Fil) (référence : 25-0451) a été fourni par Invitrogen. L'anticorps anti-protéine ribosomale P humaine a aimablement été fourni par le Prof. Sun, National Yang-Ming University, Taiwan [1]. Le sang total a été dilué dans 10 volumes de PBS contenant 1% de BSA et 6 mM EDTA. 25 Les récepteurs Fcy ont été bloqués par le réactif « FcR blocking » (Milteny Biotec) dilué au 1/200e avant le marquage avec le ou les anticorps. Après une étape de lavage, les cellules ont été contre-marquées avec du TO lpg/ml dans du PBS pendant 15 min. Les échantillons ont ensuite été dilués dans 20 volumes de paraformaldehyde 1°/0 et analysés par cytométrie de flux (LSRFortessaT" tell analyzer, BD Biosciences) dans les 45 30 minutes. Les données ont été analysées avec le logiciel BD FACSDiva. 19 Souris Les expériences ont été réalisées sur des souris C57BI6/3 âgées de 8 à 10 semaines achetées chez "Charles River Laboratories". Les souris positives à la fois pour les transgènes du récepteur à la toxine diphtérique et le PF4 - désignées dans le texte par 5 PF4-cre/iDTR - ont été générées comme décrit précédemment [2]. Transfusion plaquettaire Les souris PF4-cre/iDTR ont été rendues sévèrement thrombopéniques par injection de toxine diphtérique (DT) (100 ng/jour, i.p.) pendant 4 jours. 8 jours après la dernière 10 injection, le sang a été prélevé à l'aorte abdominale des souris anesthésiées sur citrate (3.8%) utilisé comme anticoagulant et les plaquettes ont été isolées comme décrit précédemment [3]. Les plaquettes réticulées lavées ont été biotinylées, resuspendues à 1.2.10 6 /pL et 150 pL de la suspension ont été injectées dans le sinus rétro-orbitaire des souris WT. Les échantillons de sang ont été collectés 5 minutes après la transfusion 15 (temps 0) puis 30min, 2h, 24, 48 et 72 h après. Déclaration éthique Les échantillons de sang humain ont été obtenus auprès de donneurs volontaires et non rémunérés, recrutés par l'Etablissement Français du Sang - Grand Est (EFS-Alsace), où la 20 recherche a été effectuée. À chaque collecte de sang, les donneurs ont signé un consentement éclairé indiquant que les échantillons pouvaient être utilisés à des fins de recherche. L'approbation éthique des expériences sur les animaux était conforme à la directive de l'Union européenne 2010/63/EU. L'étude a été approuvée par le Comité régional d'éthique pour l'expérimentation animale de Strasbourg, C.R.E.M.E.A.S. (CEEA 25 35). Analyses statistiques Les analyses statistiques ont été faites à l'aide du logiciel GraphPad (Prism 5.02). 20 Résultats Les plaquettes murines jeunes expriment plus de molécules du CMH I à leur surface Dans un premier temps, nous avons analysé si l'expression des molécules de 5 classe I à la surface des plaquettes de souris dépendait de leur âge. Chez la souris, le marquage au thiazole orange (TO) a permis de discriminer facilement deux populations plaquettaires, environ 10% d'entre elles présentent une fluorescence importante au TO (Tob,ight) (Figure 1A, gauche) et sont âgées de moins de 12 heures [2]. L'expression des molécules du CMH I à la surface des plaquettes a été estimée par cytométrie de flux 10 après un marquage avec un anticorps anti-p2m ou anti-CMH I (H2) suivi d'un marquage au TO. L'expression des molécules de classe I est apparue plus forte sur les plaquettes TObright que sur les plaquettes TOdim (Figure 1A, droite). Pour exclure le fait que les plaquettes jeunes puissent exprimer plus de molécules du CMHI de par leur taille plus grande, nous avons calculé le ratio de l'intensité moyenne de fluorescence (MFI) du 15 marquage de la p2m ou de la chaîne lourde (H2) sur la moyenne du paramètre FSC (un paramètre corrélé à la taille des cellules) dans les deux populations TOdim et TObright (Figure 1B). Le ratio était significativement plus élevé dans la population TObright que dans la population de plaquettes TOdim (ratio H2/FSC 14.55 +/- 0.46 dans TObright vs 8.35 +/0.14 dans TOdim; p REVENDICATIONSMODIFIEES 1. Procédé pour analyser les plaquettes présentes dans un échantillon sanguin, ledit procédé comprend les étapes de : a) ajouter audit échantillon un ligand qui se lie au CMH I couplé à un fluorochrome ; b) mesurer l'intensité de fluorescence moyenne des plaquettes I (ME - -plaquettes) avec un cytomètre en flux. 2. Procédé selon la revendication 1, ledit échantillon sanguin est un échantillon de sang total ou une fraction du sang total comprenant les plaquettes. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, ledit ligand est un anticorps ou un fragment d'anticorps. 4. Procédé selon la revendication 3, ledit anticorps est l'anticorps W6/32 produit par l'hybridome ATCC IIB-95 ou un dérivé qui a gardé sa capacité à lier le CMH L 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, ledit fluorochrome est un fluorochrome dont les longueurs d'onde d'excitation et d'émission n'interfèrent pas avec les réactifs permettant de détecter l'ARN. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, ladite mesure MFIplaquettes est normalisée avec l'intensité de fluorescence moyenne d'un standard interne (friFistandard) afin d'obtenir une intensité de fluorescence moyenne des plaquettes normalisée (MFIplaquettes normalisée)- 7. Procédé selon la revendication 6, ledit standard interne se lie audit ligand couplé au fluorochrome, par exemple le standard interne est une microbille de polystyrène qui se lie au ligand couplé au fluorochrome. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, ledit procédé comprend en outre une étape c) mesurer le paramètre « Forward Scatter » moyen (FSC) 27 avec ledit cytomètre en flux et déterminer le ratio MFIplaquettes FSC ou MFIplaquettes normalisée / FSC. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, le ligand se lie au moins 5 partiellement à la chaine alpha du CMH I. 10. Procédé de diagnostic in vitro d'une thrombopénie périphérique ou centrale chez un sujet comprenant les étapes de : a) analyser les plaquettes présents dans un échantillon sanguin d'un sujet en 10 mettant en oeuvre le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 8 ; et b) utiliser le résultat de l'étape a) dans le diagnostic de la thrombopénie périphérique ou centrale. 11. Procédé selon la revendication 10, dans lequel un diagnostic positif pour la 15 thrombopénie périphérique est donné par une augmentation chez ledit sujet du/des paramètre(s) MFIplaquettes, de MFIplaquettes normalisée, du ratio MFIplaquettes FSC et/ou du ratio MFIplaquettes normalisée / FSC par rapport au(x) même(s) paramètre(s) mesuré(s) chez un sujet sain. 20 12. Procédé selon la revendication 10, dans lequel un diagnostic positif pour la thrombopénie centrale est donné par un/des paramètre(s) MFIplaquettes, MFIplaquettes normalisée, ratio MFIplaquettes FSC et/ou ratio MFIplaquettes normalisée FSC chez ledit sujet similaire(s) ou identique(s) au(x) même(s) paramètre(s) mesuré(s) chez un sujet sain. 25 13. Procédé in vitro pour pronostiquer le développement d'une maladie inflammatoire ou cardiovasculaire, comprenant les étapes de : a) analyser les plaquettes présentes dans un échantillon sanguin d'un sujet en mettant en oeuvre le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 8 ; 30 b) utiliser le résultat de l'étape a) dans le pronostic du développement de la maladie inflammatoire ou cardiovasculaire. 14. Procédé in vitro de suivi de l'efficacité thérapeutique d'un traitement de la thrombopénie centrale ou périphérique, comprenant les étapes de : 28 a) analyser les plaquettes présentes dans un échantillon sanguin d'un patient ayant subi un traitement de la thrombopénie centrale ou périphérique en mettant en oeuvre le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 8 ; b) utiliser le résultat de l'étape a) dans la détermination de l'efficacité 5 thérapeutique du traitement de la thrombopénie centrale ou périphérique. 15. Kit pour la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 14, comprenant : un ligand qui se lie au CMH I couplé à un fluorochrome ; 10 un standard interne ; et des instructions.