Brevet FR3079846A1 — publié le 20191011

La présente invention est du domaine des extraits de microalgues marines, et concerne en particulier une fraction protéinique isolée à partir d'une microalgue rouge et son procédé d'obtention. Les phycobiliprotéines peuvent être obtenues en quantité importante à partir des algues ou des microalgues. Les phycobiliprotéines sont de quatre types : l'allophycocyanine, la phycocyanine, la phycoérythrine et la phycoérythrocyanine. De telles protéines sont récupérées après désintégration cellulaire et des étapes de séparation solide-liquide. Le surnageant obtenu qui contient la phycobiliprotéine peut être isolé et/ou purifié en utilisant une technique de capture (absorption) sur résine échangeuse d'ions, au moins une précipitation isoélectrique éventuellement couplée à des extractions liquide/liquide mettant en oeuvre des systèmes aqueux bi-phasiques, comme cela est décrit par exemple dans la demande US2010/0178674. Il est également connu d'isoler ce type de protéine grâce à des composés organiques tels que l'acide salicylique, comme cela est décrit dans la demande W02016030643. Cependant de telles techniques de précipitation et/ou d'absorption à l'échelle industrielle, demandent de manipuler des volumes en eau conséquents et des quantités de sels très importantes, ce qui requiert la mise en service d'installations complexes à contrôler et à maintenir en fonctionnement, et impacte fortement l'environnement. D'autres méthodes ont été développées pour l'extraction de telles protéines à partir des algues ou des microalgues. Une de ces méthodes alternatives consiste à isoler des protéines en mettant en oeuvre des systèmes aqueux à deux phases tels que l'ATPS (acronyme anglo-saxon pour le terme anglais : « aqueous two phase system »), lequel peut comprendre du PEG 6000 (polyéthylène glycol de masse molaire : 6000 g.mo1-1 ) et un tampon phosphate dans un milieu à pH 7. L'article Liu Y. et al., Food and Bioproducts Processing, voL90(2) Apr. page 111-117 décrit un tel système d'ATPS pour l'extraction de phycobiliprotéines à partir de la microalgue spiruline platensis par la méthode de distribution à contre-courant (connue sous l'acronyme anglo-saxon : CCD - « contercurrent distribution »). Une telle méthode dite CCD comporte de nombreuses étapes, notamment des extractions multi-étagées (dix niveaux de séparation), et les puretés des protéines obtenues restent médiocres. 2 Une autre technique employée pour la purification des protéines à partir d'une algue est la technique dite de chromatographie de partage centrifuge (CPC) qui est une chromatographie liquide-liquide sans support solide. La demande KR20110119071 décrit une telle méthode de CPC pour l'isolation de 5 fucoxanthine à partir d'un extrait d'algue. La présente invention vise à améliorer les techniques de l'art antérieures en vue d'extraire et de purifier des phycobiliprotéines avec un rendement supérieur à 70% et un haut degré de pureté, de manière simple, rapide et en 10 mettant en oeuvre un procédé qui s'inscrive dans une démarche de développement durable. La présente invention concerne à cet effet un procédé de purification d'au moins une protéine comprenant une étape de purification mettant en oeuvre une 15 colonne de chromatographie de partage centrifuge (colonne CPC) à partir d'un extrait de microalgue dispersé dans un mélange comprenant un système aqueux de solvants à deux phases (ATPS), lesdites deux phases constituant une phase mobile de la CPC et une phase stationnaire de la CPC. 20 Le terme « chromatographie de partage centrifuge » (CPC) désigne la technique de chromatographie sans support solide, basée sur le principe des coefficients de partage de différents solutés dans un milieu comprenant deux liquides non miscibles constituant un système bi-phasique liquide/liquide, et sur la mise en contact des deux liquides tout en les séparant un très grand nombre 25 de fois par une agitation et un déplacement d'une des phases provoquées par une force centrifuge. Une telle chromatographie CPC est décrite dans la demande FR 2 791 578. Le terme « ATPS » désigne un système aqueux de solvants à deux 30 phases, des exemples de tels systèmes sont décrit dans l'article de Arafat M. Goja et al. J Bioproces Biotechniq 2013, 4:1. Le système ATPS mis en oeuvre dans le cadre de l'invention est avantageusement un système comprenant du polyéthylène glycol (PEG), de préférence de masse molaire de 6000 g.mo1-1 et qualifié de PEG 6000. L'ATPS comprend en outre avantageusement un tampon 35 pour maintenir un pH=7, il s'agit de préférence du tampon phosphate de 3 potassium (K2HPO4/KH2PO4). Plus avantageusement, le procédé selon l'invention met en oeuvre l'utilisation du système ATPS contenant de 8 à 15% (w/w) de PEG 6000 et 10 à 17% (w/w) de K2HPO4/KH2PO4 (pH7). 5 Les inventeurs ont montré de manière inattendue que le système de solvant à deux phases ATPS utilisés en réalisant une chromatographie CPC permettait d'obtenir une protéine extraite d'une microalgue avec un rendement et un degré de pureté sans précédent. Une CPC réalisée dans de telles conditions s'est avérée particulièrement efficace et rapide à exécuter pour la purification 10 d'une phycobiliprotéine. Ce procédé permet d'avoir des cycles courts de purification à partir de l'extrait, tout en fonctionnant avec des volumes de liquides très réduit. Le rendement global en protéine extraite est supérieur à 70% et les protéines obtenues ne sont pas, ou très faiblement, dénaturées. 15 Avantageusement, le procédé selon l'invention met en oeuvre les étapes suivantes : a) une dispersion de l'extrait à purifier dans le système aqueux de solvants à deux phases dans un premier récipient ; b) une injection du mélange obtenu à l'étape a) dans la colonne CPC par 20 mise en route d'une première pompe adaptée pour faire transiter la phase à injecter contenue dans le premier récipient en contact avec la phase stationnaire dans un premier sens de migration ; c) un lavage pour éliminer les impuretés par mise en route d'une deuxième pompe adaptée pour faire transiter la phase mobile contenue dans un 25 deuxième récipient en contact sur la phase stationnaire dans le premier sens de migration; d) une extrusion par mise en route d'une troisième pompe adaptée pour faire transiter la phase mobile en contact sur la phase stationnaire dans le sens inverse au susdit premier sens de migration, qualifié de second 30 sens de migration. Le procédé décrit ci-dessus comprend une étape d. de pompage en configurant le pompage dans le sens inverse au susdit premier sens de migration, qualifié de deuxième sens de migration (mode ascendant (AM) versus 35 mode descendant (DM)). Ce mode de fonctionnement de la chromatographie 4 CPC est qualifié de mode double (« dual mode ») et permet d'alterner les phases stationnaire et mobile en cours de séparation. Il est ainsi possible de rendre mobile la phase stationnaire et inversement de rendre stationnaire la phase mobile. Cette étape permet la récupération par extrusion de la protéine d'intérêt, 5 et permet également le reconditionnement d'une partie de la colonne avec de la phase stationnaire recyclée injectée dans la colonne. Les inventeurs ont montré qu'un tel procédé permet de séparer finement des phycobiliprotéines d'autres molécules de structure et/ou de masse très 10 proches. Avantageusement, la colonne de CPC comprend des cellules de géométrie sensiblement sphériques. Cette configuration des cellules permet d'optimiser le rendement de purification des phycobiliprotéines. Le volume 15 interne de l'ensemble des cellules est avantageusement tel que la rétention en phase stationnaire soit comprise entre 50 et 80%, voire 65 et 70%. La rétention en phase stationnaire se défini comme suit : Sf = [Volume de phase stationnaire dans les cellules (en mL)] / [Volume des cellules (en mL)] x 100, c'est-à-dire : SF = \Vcell X 100). 20 Cette configuration des cellules permet de favoriser la décantation du système à deux phases (ATPS) et donc d'atteindre de meilleures rétentions en phase stationnaire que les systèmes fonctionnant avec des cellules ayant d'autres géométries, telles que les cellules dites « twin cells ». De préférence, le nombre de cellules est inférieur ou égal à 50. Les inventeurs ont montré que 25 l'utilisation de la CPC dans les conditions selon l'invention permettait d'utiliser des colonnes relativement courtes de moins de 50 cellules tout en restant efficace : ce qui facilite les manipulations et réduit les volumes d'éluant nécessaires. 30 Avantageusement, le procédé selon l'invention met en oeuvre deux colonnes de chromatographie CPC, une première colonne CPC et une deuxième colonne CPC, qui fonctionnent de manière séquentielle. Le fonctionnement séquentiel implique de monter deux colonnes, une première et une deuxième colonne, en parallèle. 5 Les séquences sont avantageusement calibrées afin de réaliser une purification en continue : - lorsque les étapes b) et d) sont réalisées dans la première colonne, permettant ainsi la récupération de la phase stationnaire enrichie en phycobiliprotéines (à 5 l'étape n-1 du procédé en continu) puis à la réalisation d'une nouvelle injection, l'étape c) est réalisée dans la seconde colonne en effectuant ainsi la purification de la protéine capturée : des impuretés pouvant être entrainées par la phase mobile (la durée des étapes b) et d) étant égale à celle de l'étape c)) ; et - les étapes d), puis b) sont réalisés dans la seconde colonne pendant que dans 10 la première colonne est réalisée l'étape c) ; et ainsi de suite... Grâce à ce fonctionnement séquentiel, une production en continue est réalisable. La préparation de volumes important en protéines purifiées à l'échelle industrielle est accessible, grâce à un tel procédé. 15 Le procédé selon l'invention en mode séquentiel met en oeuvre avantageusement les étapes suivantes : a) une dispersion de l'extrait à purifier dans le système aqueux de solvants à deux phases dans un premier récipient ; bl ) une injection d'un premier volume du mélange obtenu à l'étape al ) 20 dans une première colonne CPC par mise en route d'une première pompe adaptée pour faire transiter la phase à injecter contenue dans le premier récipient en contact avec la phase stationnaire dans un premier sens de migration ; cl ) un lavage pour éliminer les impuretés par mise en route d'une 25 deuxième pompe adaptée pour faire transiter la phase mobile contenue dans un deuxième récipient en contact sur la phase stationnaire dans le premier sens de migration ; dl ) une extrusion par mise en route d'une troisième pompe adaptée pour faire transiter la phase mobile en contact sur la phase stationnaire 30 dans le sens inverse au susdit premier sens de migration, qualifié de second sens de migration ; el ) une récupération de la phase stationnaire enrichie en substance d'intérêt ; b2) une injection d'un deuxième volume du mélange obtenu à l'étape a) 35 dans la seconde colonne CPC par mise en route de la première 6 pompe adaptée pour faire transiter la phase à injecter contenue dans le premier récipient en contact avec la phase stationnaire dans le premier sens de migration ; c2) un lavage pour éliminer les impuretés par mise en route de la 5 deuxième pompe adaptée pour faire transiter la phase mobile contenue dans le deuxième récipient en contact sur la phase stationnaire dans le premier sens de migration ; d2) une extrusion par mise en route de la troisième pompe adaptée pour faire transiter la phase mobile en contact sur la phase stationnaire 10 dans le second sens de migration ; e2) une récupération de la phase stationnaire enrichie en substance d'intérêt. Avantageusement, le procédé selon l'invention comprend au moins une 15 étape de filtration d'au moins une des deux phases choisies parmi la phase stationnaire (enrichie en BPE) et la phase mobile (à recycler), par filtration membranaire. Le procédé selon l'invention comprend plus avantageusement au moins trois étapes de filtration membranaire pour filtrer une fois la phase mobile et deux fois la phase stationnaire enrichie en BPE. Un tel processus de filtration 20 sur membrane, qualifié de procédé membranaire, permet de récupérer les protéines avec un degré de pureté amélioré, et de pouvoir recycler le système de solvant bi-phasique. De l'eau purifiée est ajoutée lors de cette étape pour la réalisation de la filtration et afin de récupérer le maximum de matière. L'eau purifiée est de préférence une eau déminéralisée par distillation, filtration et/ou 25 électrodialyse. Avantageusement, les filtres à membrane mis en oeuvre procédé selon l'invention sont configurés de la manière suivante : dans lequel un premier filtre membranaire filtre la phase stationnaire récupérée aux étapes el ) et e2) pour 30 améliorer la purification de la substance d'intérêt qui est isolée ; un deuxième filtre membranaire filtre la phase stationnaire éluée à partir du premier filtre membranaire en vue de son recyclage ; et un troisième filtre membranaire filtre la phase mobile récupérée en sortie de colonne en vue de son recyclage. Les membranes mise en oeuvre sont de préférence des membranes aptes à faire de 7 l'ultrafiltration ou de la nanofiltration, telle que la gamme commercialisée par la société NADIR®. Avantageusement, l'injection dans les deux colonnes CPC mise en oeuvre 5 selon le procédé de l'invention d'au moins un des liquides choisi parmi l'extrait de microalgue dispersé dans un mélange comprenant un système aqueux de solvants à deux phases, la phase mobile et la phase stationnaire, est contrôlé par des vannes trois voies, désignées première, deuxième et troisième vannes trois voies. 10 Avantageusement, les liquides choisis parmi l'extrait de microalgue dispersé dans un mélange comprenant un système aqueux de solvants à deux phases, la phase mobile et la phase stationnaire, débouchent dans une première vanne quatre voies en amont de la première colonne CPC et dans une deuxième 15 vanne quatre voies en amont de la deuxième colonne CPC. Les modes d'élution des phases mobile et stationnaire dans les colonnes CPC sont contrôlées séquentiellement par ces deux vannes quatre voies, désignée première et deuxième vannes quatre voies. La première et la deuxième vanne quatre voies débouchent respectivement sur les canalisations de collecte des première et 20 deuxième colonnes CPC. Avantageusement, les phases mobile et stationnaire en sortie de colonne CPC sont séparées séquentiellement par une vanne quatre voies et une quatrième vanne trois voies. 25 PARTIE EXPERIMENTALE : 30 I. Préparation de l'extrait contenant la protéine d'intérêt : une phycobiliprotéine, la B-phycoérythrine (BPE) - (figure 1) Un extrait de microalgue porphyridium cruentum concentré - conservé une nuit au frigo - est décongelé par centrifugation. 8 1g d'extrait de microalgue décongelée est repris dans 10 mL de la phase inférieur de l'ATPS (phase mobile dans la suite du procédé) contenant 11.6% (w/w) PEG6000 et 13% (w/w) K2HPO4/KH2PO4 (pH=7). 5 L'ensemble est inséré dans un flacon de 15 mL (un flacon plastique de 15 mL de la société Fisherbrande) et ensuite placé 15 minutes dans un bain ultrason connu sous le nom commercial VWR® Ultrasonic Cleaner. Ensuite le mélange issu de la sonication est centrifugé à 3900 rpm (tours par 10 minutes) pendant 20 mn dans une centrifugeuse de type Mikro 22RTM, de la société Hettich zentrifugenTM. L'acronyme « rpm » signifie « rotation per minute » en anglais, sa traduction française étant « tours par minute ». 15 Le surnageant est ensuite passé sur une colonne CPC dans les conditions détaillées au point II. de la présente partie expérimentale. 20 II. Principe de purification de la BPE sur colonne de chromatographie de partage centrifuge (CPC) selon l'invention La colonne utilisée contient 36 cellules sphériques et est montée sur un visual CPC. Le visual CPC est un outil permettant la visualisation de l'hydrodynamique 25 dans les cellules. Le processus se décompose en deux parties, une partie chromatographie et une partie visualisation. La partie chromatographie comporte tous les composants d'un appareil de chromatographie de partage centrifuge : - Une pompe AP100 commercialisé par la société Armen lnstrumentTM, 30 permettant la mise en mouvement des différentes phases du système. - Les connectiques utilisées sur cet appareil sont des connectiques 1/8è basse pression en PTFE commercialisé par la société UpChurche. - Une vanne rhéodhyne quatre voies permettant de sélectionner le mode d'élution ascendant ou descendant (c'est-à-dire AM ou DM). 9 - La colonne du visual étudiée est reliée au système par l'intermédiaire de deux joints tournants commercialisé par la société ArmenTM. - Le signal UV/visible est enregistré par un détecteur spectra 100 (Thermo séparation, San Jose, US). 5 La colonne est en polycarbonate et possède un volume de 48 mL (soit 1,3 mL par cellule). La colonne est pré-équilibrée à 65-70 (3/0 de rétention en éluant la phase saline 10 (qui comporte le système tampon phosphate) à 35 mL/mn et 1600 rpm (tours par minutes) à travers la phase comportant le PEG en mode descendant pendant 2 mn 30 à 3 mn. L'extrait à traiter est ensuite injecté en mode descendant à 20 mL/min et 1600 15 rpm. La capture est alors réalisée dans la colonne. La capture consiste au transfert de la (ou des) molécule(s) cible(s) vers la phase statonnaire pour laquelle ils ont une forte affinité (coefficient de partage KD > 5). Une élution de phase mobile fraiche est réalisée à 20 mL/min et 1600 rpm afin 20 d'enlever les molécules ayant moins d'affinités pour la phase stationnaire (KD REVENDICATIONS1. Procédé de purification d'au moins une protéine comprenant une étape de purification mettant en oeuvre une colonne de chromatographie de partage centrifuge, dite colonne CPC (1, 19), à partir d'un extrait de microalgue dispersé dans un mélange comprenant un système aqueux de solvants à deux phases, une phase mobile de la CPC et une phase stationnaire de la CPC. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le système aqueux de solvants à deux phases contient de 8 à 15% en masse de PEG 6000 et 10 à 17% en masse de K2HPO4/KH2PO4 à pH 7. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, dans lequel le procédé met en oeuvre les étapes suivantes : a) une dispersion de l'extrait à purifier dans le système aqueux de solvants à deux phases dans un premier récipient (2); b) une injection du mélange obtenu à l'étape a) dans la colonne CPC (1, 19) par mise en route d'une première pompe (3) adaptée pour faire transiter la phase à injecter contenue dans le premier récipient (2) en contact avec la phase stationnaire dans un premier sens de migration ; c) un lavage pour éliminer les impuretés par mise en route d'une deuxième pompe (7) adaptée pour faire transiter la phase mobile contenue dans un deuxième récipient (6) en contact sur la phase stationnaire dans le premier sens de migration; d) une extrusion par mise en route d'une troisième pompe (16) adaptée pour faire transiter la phase mobile en contact sur la phase stationnaire dans le sens inverse au susdit premier sens de migration, qualifié de second sens de migration. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel la colonne CPC (1, 19) comporte au plus 50 cellules sensiblement sphériques. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel ledit procédé met en oeuvre deux colonnes de chromatographie CPC (1 et 19), une première 14 colonne CPC (1) et une deuxième colonne CPC (19), qui fonctionnent de manière séquentielle. 6. Procédé selon la revendication 5, mettant en oeuvre les étapes suivantes : 5 a) une dispersion de l'extrait à purifier dans le système aqueux de solvants à deux phases dans un premier récipient (2) ; bl ) une injection d'un premier volume du mélange obtenu à l'étape a) dans la première colonne CPC (1) par mise en route d'une première pompe (3) adaptée pour faire transiter la phase à injecter contenue dans 10 le premier récipient (2) en contact avec la phase stationnaire dans un premier sens de migration ; cl ) un lavage pour éliminer les impuretés par mise en route d'une deuxième pompe (7) adaptée pour faire transiter la phase mobile contenue dans un deuxième récipient (6) en contact sur la phase 15 stationnaire dans le premier sens de migration ; dl ) une extrusion par mise en route d'une troisième pompe (16) adaptée pour faire transiter la phase mobile en contact sur la phase stationnaire dans le sens inverse au susdit premier sens de migration, qualifié de second sens de migration ; 20 el ) une récupération de la phase stationnaire enrichie en substance d'intérêt ; b2) une injection d'une deuxième volume du mélange obtenu à l'étape a) dans la seconde colonne CPC (19) par mise en route de la première pompe (3) adaptée pour faire transiter la phase à injecter contenue 25 dans le premier récipient (2) en contact avec la phase stationnaire dans le premier sens de migration ; c2) un lavage pour éliminer les impuretés par mise en route de la deuxième pompe (7) adaptée pour faire transiter la phase mobile contenue dans le deuxième récipient (6) en contact sur la phase 30 stationnaire dans le premier sens de migration ; d2) une extrusion par mise en route de la troisième pompe (16) adaptée pour faire transiter la phase mobile en contact sur la phase stationnaire dans le second sens de migration ; e2) une récupération de la phase stationnaire enrichie en substance d'intérêt. 15 7. 5 8. 10 9. 15 20 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, dans lequel ledit procédé comporte au moins une étape de filtration d'au moins une phase choisie parmi la phase stationnaire et la phase mobile par filtration membranaire. Procédé selon les revendications 6 et 7 prises ensembles, dans lequel un premier filtre membranaire (12) filtre la phase stationnaire récupérée à l'étape el ) et e2) pour améliorer la purification de la substance d'intérêt qui est isolée ; un deuxième filtre membranaire (14) filtre la phase stationnaire éluée à partir du premier filtre membranaire (12) en vue de son recyclage ; et un troisième filtre membranaire (18) filtre la phase mobile récupérée en sortie de colonne en vue de son recyclage. Procédé selon l'une des revendications 6 à 8, dans lequel l'injection dans les deux colonnes CPC (1 ,19) d'au moins un des liquides choisi parmi l'extrait de microalgue dispersé dans un mélange comprenant un système aqueux de solvants à deux phases, la phase mobile et la phase stationnaire, est contrôlé par des vannes trois voies, désignées première, troisième et quatrième vannes trois voies (4, 8, 17). Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, dans lequel les phases mobile et stationnaire en sortie de colonne CPC (1, 19) sont séparées séquentiellement par une vanne quatre voies (11 a) et une quatrième vanne trois voies (11 b).