Brevet FR3084584A1 — publié le 20200207

SOLUTION INJECTABLE A PH 7 COMPRENANT DU GLUCAGON HUMAIN ET UN COMPOSE AMPHIPHILE PORTEUR DE RADICAUX HYDROPHOBES [0001] La présente invention concerne des composés amphiphiles porteurs de radicaux hydrophobes destinés à un usage thérapeutique et/ou prophylactique, notamment dans une formulation de glucagon pour le traitement du diabète ou pour le traitement d'urgence d'hypoglycémies sévères. [0002] Le glucagon humain est une hormone hyperglycémiante d'action brève qui permet d'augmenter la glycémie, corrigeant ainsi un niveau hypoglycémique pouvant résulter d'un excès d'insuline. Il permet la libération de glucose par stimulation de la glycogénolyse hépatique, et possède des propriétés antagonistes de l'insuline (hypoglycémiante). Le glucagon humain est normalement sécrété par les cellules alpha des ilots de Langerhans dans le pancréas lorsqu'une hypoglycémie est détectée. [0003] Le glucagon humain est utilisé à des fins thérapeutiques, comme le traitement d'urgence d'hypoglycémies sévères, encore appelé « rescue », mais également dans un cadre diagnostique lors de la réalisation d'examens médicaux, par exemple pour inhiber la motilité gastro-intestinale. D'autres applications sont également envisagées pour le glucagon humain, en particulier son utilisation dans un système de régulation bi-hormonal de la glycémie aussi appelé pancréas artificiel et dans l'hyperinsulinisme congénital qui est une maladie rare caractérisée par des niveaux très élevés d'insuline. [0004] L'utilisation clinique du glucagon humain a été limitée à cause de certaines de ses propriétés peu favorables pour développer un produit pharmaceutique stable à visée thérapeutique. En effet, le glucagon humain présente une très faible solubilité à pH physiologique, une forte instabilité physique, à cause de sa propension à former des fibrilles sur une large gamme de pH. C'est pour cette raison que les seuls produits commerciaux à base de glucagon humain (Glucagen®, NOVO NORDISK et Glucagon pour injection, ELI LILLY) sont des formes lyophilisées à reconstituer extemporanément. [0005] Les travaux d'Onoue et al. (Pharm. Res. 2004, 21(7), 1274-83) ont montré le caractère potentiellement dangereux de ces fibrilles le glucagon humain fibrillé étant cytotoxique dans des cellules de mammifères en culture. [0006] Outre son instabilité physique, le glucagon humain subit divers types de dégradation chimique. En solution aqueuse, il se dégrade rapidement pour former plusieurs produits de dégradation. Au moins 16 produits de dégradation du glucagon humain ont été identifiés par Kirsh et al. (International Journal of Pharmaceutics, 2000, 203, 115-125). La dégradation chimique de ce glucagon humain est donc rapide et complexe. 2 [0007] La mauvaise stabilité chimique et physique du glucagon humain en solution a conduit des sociétés pharmaceutiques comme NOVO NORDISK, ELI LILLY et plus récemment FRESENIUS KABI à commercialiser ce glucagon humain sous la forme d'un lyophilisat à reconstituer à pH acide (pH l'N -Prs g / ,. e, f Ç'. ij Il ' H H = 0,048, DP (m) = 21 Ri = H ou pyroglutamate = N° Bi B2 Exemple Bi: co-polyaminoacide Bl. - poly-L-glutamate de sodium modifié à 10 une de ses extrémités par la molécule Al. et ayant une masse molaire moyenne en nombre (Mn) de 3845 g/mol Co-potyarninoacide B1-1 poly-L-benzylglutamate modifié à l'une de ses extrémités par la molécule Al. [000517] Dans un ballon préalablement séché à l'étuve, du y-benzyl-L-glutamate N- 15 carboxyanhydride (39 g, 148,1 mmol) est solubilisé dans du DM[' anhydre (80 mL). Le mélange est refroidi à 4 °C, puis une solution de molécule Al (5,45 g, 6,73 mmol) dans le DMF (10 mL) est introduite rapidement. Le mélange est agité entre 4 °C et température ambiante pendant 18 h, puis chauffé à 65 °C pendant 2 h. Le milieu réactionnel est alors refroidi à température ambiante et versé goutte-à-goutte dans du dilsopropyléther OPE, 1350 mL) sous agitation. Le précipité blanc est récupéré par filtration, lavé avec de l'IPE (2 x 100 mL) puis séché sous pression réduite à 30 °C pour 5 donner un poly-L-benzylglutamate modifié à l'une de ses extrémités par la molécule Al. Co-polyaminoacide B1 [000518] À une solution de co-polyaminoacide 51-1 (36 g) dans du N,Ndiméthylacétamide (DMAc, 360 mL) est ajouté du Pd/A1203 (7,2 g) sous atmosphère 10 d'argon. Le mélange est placé sous pression d'hydrogène (10 bar) et agité à 60 °C pendant 24 h. Après refroidissement à température ambiante et filtration du catalyseur sur verre fritté puis sur membrane Omnipore 0,2 pm PTFE hydrophile, une solution d'eau à pH 2 (2160 ml) est coulée goutte-à-goutte sur la solution de DMAc sur une période de 45 min el sous agitation. Après 18 h sous agitation, le précipité blanc est 15 récupéré par filtration, lavé avec de l'eau (4 x 180 mL) puis séché sous pression réduite à 30 °C. Le solide (21,2 g) est suspendu dans du TFA (130 mL) et le mélange est agité pendant 24 h à température ambiante puis coulé goutte-à-goutte sur un mélange 1:1 (v/v) de IPE/eau sous agitation (280 mL). Après 3 h d'agitation, le précipité est récupéré par filtration, lavé avec de l'IPE (2 x 110 mL) puis séché sous pression réduite à 30 °C. 20 Le solide obtenu est solubilisé dans de l'eau (500 mL) en ajustant le pH à 7 par ajout d'une solution aqueuse de soude 1 N. Le pH est ensuite ajusté à pH 12 et la solution est maintenue sous agitation pendant 2 h. Après neutralisation à pH 7, la solution est filtrée sur 0,2 pm, diluée avec de l'éthanol afin d'obtenir une solution contenant 30 % massique d'éthanol, puis filtrée sur filtre de charbon actif (3M R53SLP). La solution obtenue est 25 filtrée sur 0,45 pm et purifiée par ultrafiltration contre une solution de NaCI 0,9 0/0 puis de l'eau jusqu'à ce que la conductimétrie du perméat soit inférieure à 50 p5/cm. La solution de co-polyaminoacide est ensuite concentrée à environ 30 g/L théorique et le pH est ajusté à 7. La solution aqueuse est filtrée sur 0,2 pm et conservée à 4 °C. Extrait sec : 26,0 mg/g 30 DP (estimé par RMN 1H) = 24 donc i = 0,042 La masse molaire moyenne calculée du co-polyaminoacide B1 est de 4119 g/mol HPLC-SEC aqueuse (calibrant PEG) : Mn = 3845 g/mol 66 Exemple 82; co-polyaminoacide 82 - poly-L-glutamate de sodium modifié à une de ses extrémités par la molécule Al et ayant une masse molaire moyenne en nombre (Mn) de 3236 g/mol 5 Co- uolvarninoacide B2-1 poly-L-benzylglutamate modifié à l'une de ses extrémités par la molécule A2. [000519] Par un procédé similaire à celui utilisé pour la préparation du co- polyaminoacide B1-1 appliqué à la molécule A2 (0,29 g, 0,19 mmol) et au y-benzyl-L- j glutamate N-carboxyanhydride (1,095 g, 4,16 mmol), le co-polyaminoacide B2-1 est 10 obtenu. Co-polyaminoacide 82 [000520] Le co-polyaminoacide B2-1 (1,08 g) est dilué dans du TFA (3,8 mL), puis la solution est refroidie à 4 °C. Une solution de HBr à 33 0/0 dans l'acide acétique (2,7 mL, 15 15 mrnol) est alors ajoutée goutte-à-goutte. Le mélange est agité à température ambiante pendant 3 h, puis coulé goutte-à-goutte sur un mélange 1:1 (v/v) d'IPE et d'eau sous agitation (60 mL). Après 2 h d'agitation, le précipité blanc est récupéré par filtration, lavé avec de l'IPE (2 x 5 mL) puis avec de l'eau (2 x 5 mL). Le solide obtenu est alors solubilisé dans de l'eau (20 mL) en ajustant le pl I à 7 par ajout d'une solution 20 aqueuse de soude 1 N. Le pH est ensuite ajusté à pH 12 et la solution est maintenue sous agitation pendant 30 min. Après neutralisation à pH 7, la concentration théorique est ajustée à 20 g/L théorique par addition d'eau (10 mL). La solution est filtrée sur filtre 0,45 pm et purifiée par ultrafiltration contre une solution de NaCI 0,9 0/0 puis de l'eau jusqu'à ce que la conductimétrie du perméat soit inférieure à 50 pS/cm. Le pH est 25 ajusté à 7. La solution aqueuse est filtrée sur 0,2 pm et conservée à 4 °C. Extrait sec : 8,8 mg/g DP (estimé par RMN 1H) = 21 donc i = 0,048 La masse molaire moyenne calculée du co-polyaminoacide B2 est de 3940 g/mol HPLC-SEC aqueuse (calibrant PEG) : Mn = 3236 g/mol 30 PARTIE C COMPOSITIONS Le glucagon utilisé est du glucagon humain issu d'un processus de synthèse 35 peptidique. provient de la société Bachem (référence 4074733). 67 Exemple Cl : Solution de glucagon à 2 mg/mL dans l'acide chlorhydrique contenant 2 mg/mL de L-méthionine [000521] Dans un tube Falcon de 50 mL est introduit 102 mg de glucagon DS en poudre suivi de 49 mL d'une solution d'acide chlorhydrique à 0,003 N contenant 2 mg/mL de L- 5 méthionine. La poudre de glucagon est mélangée par des inversions répétées du tube jusqu'à complète dissolution du glucagon. La solution de glucagon à 2 mg/mL est alors filtrée sur membrane (0,22 urn). Exemple C2 : Solution de glucagon à 2 mg/mL dans l'acide chlorhydrique E0 [000522] Dans un tube Falcon de 20 mL est introduit 23,4 mg de glucagon DS en poudre suivi de 11,3 mL d'une solution d'acide chlorhydrique à 0,003 N. La poudre de glucagon est mélangée par des inversions répétées du tube jusqu'à complète dissolution du glucagon. La solution de glucagon à 2 mg/ml_ est alors filtrée sur membrane (0,22 pm). 15 Exemple C3 : Solution de glucagon à 4 mg/mL dans l'acide chlorhydrique contenant 2 mg/mL de L-méthionine [00052]] Du glucagon (160 mg) en poudre est introduit dans un tube Falcon de 45 ml puis 40 mL de la solution aqueuse d'acide chlorhydrique à 0,006 N contenant 2 mg/mL de L-méthionine est ajoutée. La poudre de glucagon est mélangée par des inversions 20 répétées du tube jusqu'à complète dissolution du glucagon. La solution de glucagon à 4 mg/mi est alors filtrée sur membrane (0,22 pm). Exemple C4 : Solution de glucagon à 4 mg/mi dans l'acide chlorhydrique [000524] Du glucagon (160 mg) en poudre est introduit dans un tube Falcon de 45 rffi. 25 Une solution aqueuse d'acide chlorhydrique à 0,006 N (40 ml) est ajoutée. La poudre de glucagon est mélangée par des inversions répétées du tube jusqu'à complète dissolution du glucagon. La solution de glucagon à 4 mg/m1 est alors filtrée sur membrane (0,22 pm). 30 Exemple CS : Solution de glucagon à 6 mg/m1 dans l'acide chlorhydrique contenant 2 mg/mL de L-méthionine [000525] Du glucagon (240 mg) en poudre est introduit dans un tube Falcon de 45 ml. Une solution aqueuse d'acide chlorhydrique à 0,009 N (40 ml) contenant 2 mg/mL de L-méthionine est ajoutée. La poudre de glucagon est mélangée par des inversions 35 répétées du tube jusqu'à complète dissolution du glucagon. La solution de glucagon à 6 mg/m1 est alors filtrée sur membrane (0,22 pm). 68 Exemple C6 : Solution de glucagon à 6 mg/m1 dans l'acide chlorhydrique [000526] Du glucagon (240 mg) en poudre est introduit dans un tube Falcon de 45 ml. Une solution aqueuse d'acide chlorhydrique à 0,009 N (40 ml) est ajoutée, La poudre de glucagon est mélangée par des inversions répétées du tube jusqu'à complète 5 dissolution du glucagon. La solution de glucagon à 6 mg/mi est alors filtrée sur membrane (0,22 pm), Exemple C7 : Solution de glucagon à 10 mg/m1 dans l'acide chlorhydrique contenant 2 mg/mL de 1-méthionine 10 [000527] Du glucagon (400 mg) en poudre est introduit dans un tube Falcon de 45 ml. Une solution aqueuse d'acide chlorhydrique à 0,01 N (40 ml) contenant 2 mg/mL est ajoutée. La poudre de glucagon est mélangée par des inversions répétées du tube jusqu'à complète dissolution du glucagon. La solution de glucagon à 10 mg/mi est alors filtrée sur membrane (0,22 pro). 15 Exemple C8 : Solution de glucagon à 10 mg/mi dans l'acide chlorhydrique [000528] Du glucagon (400 mg) en poudre est introduit dans un tube Falcon de 45 ml. Une solution aqueuse d'acide chlorhydrique à 0,01 N (40 ml) est ajoutée. La poudre de glucagon est mélangée par des inversions répétées du tube jusqu'à complète dissolution 20 du glucagon, La solution de glucagon à 10 mg/m1 est alors filtrée sur membrane (0,22 Pm). Exemple C9 : Solution tampon de Tris à 500 mM pH 7.4 [000529] Dans une fiole de 50 mi, 3,0 g de Trizrria(t.:0 base (Sigma-Aldrich 04577) sont 25 pesés. De l'eau est ajoutée sans compléter au trait de jauge. Une fois la poudre solubilisée, Le pH de la solution est ajusté à pH 7,4 ± 0,1 par ajout de Na0H/HCI 1 N puis la solution est filtrée sur membrane (0,22 pm). Le volume d'eau est ajusté pour obtenir la solution concentrée de Tris. 30 Exemples CA : Préparation de solutions de glucagon à 1 mg/m1 contenant le co-polyaminoacide Bl, un tampon Tris (2 mM), de la glycérine et différentes concentrations de chlorure de sodium et chlorure de zinc à pH 7,2. [0005]0] Dans un flacon sont ajoutées successivement une solution concentrée de glycérol (afin d'obtenir 300 mOsmole/kg dans la formulation finale), une solution 35 concentrée de tampon Tris, préparée suivant le protocole décrit à l'exemple C9, et des additifs (NaCI, chlorhydrate d'arginine (Arg), chlorure de zinc (Zn), chlorure de calcium (Ca), chlorure de magnésium (Mg)) et le co-polyaminoacide B1 en solution ou sous forme de lyophilisat. La composition est agitée jusqu'à dissolution du co-polyaminoacide 69 131. Le pH de la solution est ajusté à pH 7,8 + 0,1 par ajout de Na0H/HCI 1 N puis la solution est filtrée sur membrane (0,22 pm). [000531] Le mélange équivolumique de cette solution est ajoutée à la solution de glucagon fraichement préparée, telle que décrite à l'exemple Cl et conduit aux 5 compositions finales CA1 à CA12 et CA13 à CA25 contenant 1 mg/mL de glucagon. Le pH de la solution est ajusté à pH 7,2 ± 0,1 par ajout de Na0H/HCI 1 N puis filtrée sur membrane (0,22pm). Le détail des compositions est récapitulé dans les tableaux 1 et 2. [000532] Une inspection visuelle est effectuée pour déterminer si l'on obtient ou non 10 une solution limpide (Par comparaison, la solution de glucagon à pH neutre n'est pas soluble au-delà de 0,2 mg/mL). L'inspection visuelle des échantillons est effectuée afin de détecter les particules visibles, ou une turbidité. Cette inspection est réalisée selon les recommandations de la Pharmacopée Européenne (EP 2.9.20) les échantillons sont soumis à un éclairage d'au moins 2000 Lux et sont observés face à un fond blanc et un 15 fond noir. Quand des particules sont visibles dans la moitié des échantillons la composition est estimée non limpide. Composi Concentr Ratio co- [NaCI] (Zn] Glycé roi Aspect tion ation de polyaminoaci (mM) (mM) visuel de co- de polyamin °acide Bl/glucagon (mM) mg/mL la solution CA1 9,5 8,0 0 limpide CA2 9,5 8,0 0 limpide CA3 9,5 8,0 50 0 189 limpide CA4 9,5 8,0 0 1,15 286 limpide CA5 9,5 8,0 25 1,15 236 limpide CAS 9,5 8,0 50 1,15 186 limpide CA7 106 9,0 0 0 289 limpide , CAS 10,6 9,0 25 0 239 limpide CA9 10,6 9,0 50 0 189 limpide CA10 146 9,0 0 | 1,29 285 limpide CAll 10,6 9,0 25 1,29 235 limpide CA12 10,6 | 9,0 50 1,29 185 limpide Tableau 1 : Compositions et aspect visuel des solutions de glucagon à 1 mg/mL contenant du tampon Tris (2 mM), 1 mg/mL L-méthionine en présence de différentes 20 concentrations en co-polyaminoacide 131 de chlorure de sodium et de chlorure de zinc à pH 7,2. Compo Concentrat Ratio co- Additif 1 [Zn] Glycér Aspect visuel sition o polyamin . (mM) ol de la solution in de coo - oacide/g1 0 (mM) PolYamin ucagon 285 acide (mq/mL) CA13 5,9 5 0 Limpide CA14 5,9 5 NaCI (25 235 Limpide mM CA15 5,9 5 NaCI (50 o Limpide rnM CA16 5,9 5 NaCI (100 mML NaCI (200 85 Limpide 0 0 277 CA17 5,9 5 0 Limpide 5 2,87 Limpide CA18 5,9 CA19 5,9 5 NaCI (25 2,87 227 Limpide mM) NaCI (50 2,87 177 Limpide mM) CA20 5,9 5 CA21 5,9 5 NaCI (100 2,87 77 Limpide mM) CA22 5,9 5 NaCI (100 , '''" 0 Limpide 5 mM) ' 0 . CA23 5,9 NaCI (200 2,87 Limpide mM) CA24 5,9 5 NaCI (300 2,87 , Limpide mM 0 CA25 5,9 5 Arg (100 7,87 Na Limpide mr1.) Tableau 2 : Compositions et aspect visuel des solutions de glucagon à 1 mg/mL à pH 7,2 contcnant du tampon Tris (2 mM), 1 mg/mL de L-méthionine et des concentrations variables en co-polyaminoacide Bi, de chlorure de sodium et de zinc. Exemples CB: Préparation de solutions de glucagon à 2 mg/mL contenant le co-polyaminoacide B1 à 11,8 mg/mL, un tampon Tris (2 mM), du glycérol, du chlorure de sodium et du chlorure de zinc à pH 7,2. 10 [000533] Des solutions de glucagon à 2 mg/mL avec le co-polyaminoacide 81 ont été préparées en suivant le protocole décrit dans l'exemple CA. Le détail des compositions est récapitulé dans le tableau 4. 71 Ratio co- I Aspect Composi polyaminoa glycérol visuel de tion cide/glucag [NaCI] (mM) [Zn] (mM) (mM) la on solution CB01 5 0 5,74 262 Limpide CB02 5 50 5,7 162 Limpide CB03 5 100 5,7 62 Limpide CB04 5 100 0 79 Limpide Tableau 4 : Compositions et aspect visuel des solutions de glucagon à 2 mg/mL contenant du tampon Tris (2 mM), 1 mg/mL de L-méthionine en présence de copolyaminoacide Bi, de chlorure de sodium et de chlorure de zinc à pH 7,2. 5 Exemples CD: Préparation de solutions de glucagon à 3 mg/mL contenant le co-polyaminoacide 61 à 17,7 mg/mL, un tampon Tris (2 mM), du glycérol, du chlorure de sodium et du chlorure de zinc â pH 7,2. [000534] Des solutions de glucagon à 3 mg/mL avec le co-polyaminoacide B1 ont été 10 préparées en suivant le protocole décrit dans l'exemple CA. Le détail des compositions est récapitulé dans le tableau 5 Composi Ratio co- [NaCI] (mM) [Zn] (mM) Glycérin Aspect tion polyaminoa e (mM) visuel de cide/glucag la on solution CD01 5 50 8,61 247 Limpide 5 CD02 8,61 147 Limpide CD03 5 100 8,61 47 Limpide CD04 5 100 0 72 Limpide Tableau 5 : Compositions et aspect visuel des solutions de glucagon à 3 mg/mL contenant du tampon Tris (2 mM), 1 mg/mL de L-mélhionine en présence de copolyaminoacide Bi, de chlorure de sodium et de chlorure de zinc à pH 7,2. 15 Exemples CE : Préparation de solutions de glucagon à 5 mg/mL contenant le co-polyaminoacide B1 à 29,55 mg/mL, un tampon Tris (2 mM), du glycérol, du chlorure de sodium et du chlorure de zinc à pH 7,2. [000535] Des solutions de glucagon à 5 mg/mL avec le co-polyaminoacide B1 ont été 20 préparées en suivant le protocole décrit dans l'exemple CA. Le détail des compositions est récapitulé dans le tableau 6. 72 Composi Ratio co- [NaCI] (mM) [Zn] (mM) glycérol Aspect tion polyaminoa 14,35 (mM) visuel de cide/glucag la on solution C[01 5 2 6 limpide CE02 5 50 14,35 116 Limpide CE° 3 100 14,35 16 Limpide 0 59 imp ide CE04 5 100 Tableau 6 : Compositions et aspect visuel des solutions de glucagon à 5 mg/mL contenant du tampon Tris (2 mM), 1 mg/mL de L-méthionine en présence de copolyaminoacide Bl, de chlorure de sodium et de chlorure de zinc à pH 7,2. 5 Suivi de la stabilité physique des compositions Stabilité physique de compositions co-polyaminoacide/glucagon [000536] Les compositions précédemment préparées ont été transférées dans des cartouches (easy-to-fill de OMPI de 3 ml - Ref P4084100.3250) à raison de 1 mL par 10 cartouche et placées en conditions statiques à 37 °C. [000537] L'inspection visuelle des échantillons placés en conditions statiques à 37 °C est effectuée chaque semaine à 37 °C afin de détecter l'apparition de particules visibles, de fibrilles ou d'une turbidité. Cette inspection est réalisée selon les recommandations 15 de la Pharmacopée Européenne (EP 2.9.20) les échantillons sont soumis à un éclairage d'au moins 2 000 Lu x et sont observés face à un fond blanc et un fond noir pour respecter les recommandations de la pharmacopée Européenne. Quand des particules sont visibles dans la moitié des échantillons la composition est estimée non stable. Stable signifie donc qu'au jour de l'inspection au moins la moitié des échantillons étaient 20 dépourvus de particules, de fibrilles ou d'une turbidité. Exemple DA1 Stablité physique en cartouche à 37"C de solutions de glucagon à 1 mg/mL en présence de différentes concentrations du co-polyaminoacide B1, de tampon Tris (2 mM), de chlorure de sodium et de chlorure de zinc à pH 25 7,2. [000538] L'étude des stabilités physiques des compositions des exemples CA1, CAS, CA6, CA7, CA11 à CA13 et CA21 à CA22 décrites dans le tableau ci-dessous a été menée sur des volumes de 1 ml de composition dans des cartouches de contenance de 3 ml 30 (OMPI - ref : P40134100.3250). Par comparaison, la solution de glucagon à pH acide à 1 mg/mL n'est stable que 2 jours à 37 °C. [000 539] Les résultats des inspections visuelles sont reportés dans le tableau suivant. 73 Tableau 7 : Résultats des stabilités physiques des solutions de glucagon à 1 mg/mL à pH 7,2 contenant du tampon Tris (2 mM), 1 mg/mL de L-méthionine et des concentrations variables en co-polyaminoacide, chlorure de sodium et chlorure de zinc. 5 [000540] L'addition de co-polyamioacide permet de solubiliser et de stabiliser le glucagon à pH neutre alors que le gliicagon en solution à pH acide n'est stable que 2 jours à 37 °C. Les solutions comprenant du NaCI et du zinc présentent une stabilité physique améliorée à 37 °C en conditions statiques en cartouche. 10 RESULTATS DES OBSERVATIONS VISUELLES AU MELANGE ET DES MESURES DE FIBRILLATION PAR THT Principe [000541] La formation de fibrilles amyloïdes (définies comme des structures 15 macromoléculaires ordonnées) par un peptide peut conduire à des problèmes de stabilité. Ces fibrilles peuvent conduire à la formation de gel. [000542] Le suivi de la fluorescence de la thioflavine T (ThT) est utilisé pour analyser la stabilité physique des solutions. La Thioflavine est une petite molécule sonde ayant une signature de fluorescence caractéristique lorsqu'elle se lie à des fibrilles de type 20 amyloïdes (Naiki et al. (1989) Anal. 8ioChem. 177, 244-249 ; LeVine (1999) Methods. Enzymol. 309, 274-284). [000543] Cette méthode permet de suivre la formation de fibrilles pour de faibles concentrations de ThT au sein de solutions non diluées. Ce suivi est réalisé dans des conditions de stabilité accélérées : sous agitation et à 37 °C. 25 Conditions expérimentales [000544] Les échantillons ont été préparés juste avant le début de la mesure. La préparation de chaque composition est décrite dans l'exemple associé. La Thioflavine T a été ajoutée dans la composition à partir d'une solution mère concentrée de manière à Concentration de co- [NaCI Composition polyaminoacide limM) (mg/mL) Temps de stabilité à 37 °C (semaines) [Zn] (mM) 9,5 0 0 CA5 9,5 25 1,15 CA6 9,5 5O 1,15 CA7 10,6 O 0 CAll 10,6 25 1,29 CA12 1U6 50 1,29 CA13 0 0 CA21 5,9 100 2.87 CA22 5,9 200 2.87 CAI 9 10 25 Ratio co- polyaminoacide/glu - - cagon [flaCI 0 100 [Zn] (mM) 0 2,87 Temps de fibrillation (h) 15 REVENDICATIONS1. Composition stable physiquement sous forme d'une solution aqueuse injectable, dont le pH est compris entre 6,0 et 8,0, comprenant au moins : du glucagon humain, et un composé amphiphile comprenant un squelette hydrophile HB, substitué par au moins un radical hydrophobe -Hy de formule I. 2. Composition sous forme d'une solution aqueuse injectable, selon la revendication précédente caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une insuline prandiale. 3. Composition sous forme d'une solution aqueuse injectable, selon L'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une hormone gastrointestinale. 4. Composition sous forme d'une solution aqueuse injectable, selon la revendication précédente caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un sel de cation au moins divalent. 5. Composition sous forme d'une solution aqueuse injectable, selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un anion, cation ou zwitterion choisi parmi les espèces ioniques différentes des cations au moins divalents. 6. Composition sous forme d'une solution aqueuse injectable, selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que l'insuline prandiale est de l'insuline humaine ou une insuline humaine recombinante. 7. Composition sous forme d'une solution aqueuse injectable, selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que l'insuline prandiale est choisie dans le groupe comprenant l'insuline lispro (Humalog0), l'insuline glulisine (Apidrae) et l'insuline aspart (NovoLoge). 8. Composition sous forme d'une solution aqueuse injectable, selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que l'hormones gastro-intestinale est choisie parmi les analogues ou dérivés de GLP-1 RA choisis dans le groupe constitué par l'exenatide ou Byetta®(ASTRA-ZENECA) , le liraglutide ou Victoze (NOVO NORDISK), le 77 lixisenatide ou Lyxumia (SANOFI), l'albiglutide ou Tanzeum® (GSK) ou le dulaglutide ou Trulicity® (ELI LILLY & CO), leurs analogues ou dérivés et leurs sels pharmaceutiquement acceptables 9. Composition sous forme d'une solution aqueuse injectable, selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que le radical hydrophobe -Hy est choisi parmi les radicaux de formule I: *-(GpR),-(GpI).-[(GpR)r,-(GpIn-GpC Formule I dans laquelle, - GpI est un radical divalent, ledit radical comprenant au moins un motif imidazole Im de formule III : lm Formule III H 0"), (r)p - GpR est un radical de formules II, II' ou II" : H H *-N-R -N-* Formule II, Formule II', ou Formule II" 0 *_11_- H R N * 0 0 *_U_R - GpC est un radical de formule IV 0 d Formule IV; les* indiquent les sites de rattachement du radical hydrophobe -Hy au squelette hydrophile HB ou les radicaux ci-dessus (I, II, II', II" III et IV) entre eux par des fonctions amides ; - cc, p et y sont des entiers identiques ou différents égaux à 0 ou à 1 ; b est un entier égal à 0 ou à 1 ; c est un entier égal à 0 ou à 1 ; 78 d est un entier égal à 0, à 1 ou à 2 ; et si c est égal à 0 alors d est égal à 1 ou à 2; e est un entier égal à 0 ou à 1 ; i et i' identiques ou différents sont des entiers inférieurs ou égaux à 6 et i+i' est supérieur ou égal à 1 et inférieur ou égal à 6, 1 5 i+i' 56, r et r' sont des entiers égaux à 0, 1, 2 ou 3 ; si r est égal à alors le radical hydrophobe de formule I est lié au squelette hydrophile HB via une liaison covalente entre un carbonyl du radical hydrophobe et un atome d'azote du squelette hydrophile HB, formant ainsi une fonction amide issue de la réaction d'une fonction amine du précurseur du squelette hydrophile HB et une fonction acide portée par le précurseur du radical hydrophobe, et si r est égal à 1, 2 ou 3 alors le radical hydrophobe -Hy de formule I est lié au squelette hydrophile HB : 0 via une liaison covalente entre un atome d'azote du radical hydrophobe et un carbonyl du squelette hydrophile HB, formant ainsi une fonction amide issue de la réaction d'une fonction amine du précurseur du radical hydrophobe et une fonction acide portée par le précurseur du squelette hydrophile HB ou 0 via une liaison covalente entre un carbonyl du radical hydrophobe et un atome d'azote du squelette hydrophile HB, formant ainsi une fonction amide issue de la réaction d'une fonction acide du précurseur du radical hydrophobe et une fonction amine du précurseur du squelette hydrophile HB; t est un entier égal à 0 ou à 1 ; B est un radical alkyle linéaire ou ramifié, éventuellement comprenant un noyau aromatique, comprenant de 1 à 9 atomes de carbone ou un radical éther ou polyether non substitué comprenant de 4 à 14 atomes de carbone et de 1 à 5 atomes d'oxygène ; Cx est un radical alkyl monovalent linéaire ou ramifié, éventuellement comprenant une partie cyclique, dans lequel x indique le nombre d'atomes de carbone et 11_5x_525 ; I', I" et I"', identiques ou différents, sont des radicaux divalents, choisis dans le groupe constitué par un radical alkyle, linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, I est un radical trivalent, choisi dans le groupe constitué par un radical alkyle, linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 12 atomes de carbone Im est un radical imidazolyl, R est un radical choisi dans le groupe constitué par un radical alkyle divalent, linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, un radical alkyle divalent, linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 12 atomes de carbone portant une 79 ou plusieurs fonctions -CONH2 ou un radical éther ou polyéther non substitué comprenant de 4 à 14 atomes de carbone et de 1 à 5 atomes d'oxygène, lorsque plusieurs radicaux hydrophobes sont portés par un squelette hydrophile HB alors ils sont identiques ou différents 10. Composition stable selon la revendication 10, caractérisée en ce que le radical hydrophobe -Hy est choisi parmi les radicaux de formule I dans laquelle le radical de formule III est choisi parmi les radicaux de formules Ma: Formule IIIa 11. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le précurseur du squelette hydrophile HB porteur d'au moins un radical hydrophobe est un polymère dont les unités de répétition sont choisies dans le groupe de la lysine, l'acide glutamique, l'acide aspartique, et les éthers, notamment l'éthylène glycol et le propylène glycol. 12. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le squelette hydrophile HB est un co-polyaminoacide porteur de charges carboxylates et de radicaux hydrophobes, ledit squelette hydrophile est choisi parmi les co-polyaminoacides de formule XXX suivante : Hy Formule XXX dans laquelle, - D représente, indépendamment, soit un groupe -CH2- (unité aspartique) soit un groupe -CH2-CH2- (unité glutamique), 80 - Ri est un radical hydrophobe choisi parmi les radicaux hydrophobes Hy, ou un radical choisi dans le groupe constitué par un H, un groupe acyle linéaire en C2 à GO, un groupe acyle ramifié en C3 à Cio, un benzyle, une unité « acide aminé » terminale et un pyroglutamate, - R2 est soit un radical hydrophobe choisi parmi les radicaux hydrophobes -Hy, soit un radical choisi dans le groupe constitué par un -OH, un groupe amine, une unité «acide aminé » terminale et un pyroglutamate, - ledit copolyaminoacide comprend au moins un radical hydrophobe -Hy tel que ci-dessus défini, - X représente une entité cationique choisie dans le groupe comprenant les cations alcalins; - si n 0 alors m 1 - si m = 0 alors n k 1 - n + m représente le degré de polymérisation DP du co-polyaminoacide, c'est-à-dire le nombre moyen d'unités monomériques par chaîne de co-polyaminoacide et 5 n + m 13. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le squelette hydrophile HB est une polylysine porteuse de radicaux hydrophobes et ledit squelette hydrophile est choisi parmi les polylysine de formule XXXX suivante : FORMULE XXXX dans laquelle, - Ri est un radical hydrophobe choisi parmi les radicaux hydrophobes Hy, ou un radical choisi dans le groupe constitué par un -H ou une unité « acide aminé » terminale, 81 - R2 est soit un radical hydrophobe choisi parmi les radicaux hydrophobes -Hy, soit un radical choisi dans le groupe constitué par un -OH, un groupe amine ou une unité« acide aminé » terminale, - ladite polylysine comprend au moins un radical hydrophobe -Hy tel que ci-dessus défini, - si n = 0 alors m 1 - si m = 0 alors n 1 - n + m représente le degré de polymérisation DP de la polylysine, c'est-à-dire le nombre moyen d'unités monomériques par chaîne de polylysine et 5 n + m 250. 14. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le squelette hydrophile HB est un polyéthylène glycol porteur de radicaux hydrophobes et ledit squelette hydrophile est choisi parmi les polyéthylèneglycol de formule XXXXX suivante dans laquelle, - R1 est un radical hydrophobe choisi parmi les radicaux hydrophobes Hy, ou un radical choisi dans le groupe constitué par un -H ou -OH, - R2 est soit un radical hydrophobe choisi parmi les radicaux hydrophobes -Hy, soit un radical choisi dans le groupe constitué par un -OH ou -H, - et au moins un parmi RI ou R2 est un radical hydrophobe -Hy - pn' est un entier compris entre 1 et 5, 1 5_ pn' 5 - pn représente le degré de polymérisation DP du polyalkylèneglycol, c'est-à-dire le nombre moyen d'unités monomériques par chaîne de polyalkylèneglycol et 5 5 n + m 250.