Brevet FR3078976A1 — publié le 20190920

Procédé séquentiel de fermentation par voie fongique de ressources ligneuses La présente invention se rapporte à la valorisation de coproduits de l'industrie sylvicole ; plus spécifiquement, elle a pour objet la mise au point d'un procédé améliorant la digestibilité du bois afin de le rendre propre à la consommation par des 5 mammifères. En raison de son importante teneur en lignine qui le rend indigeste (20 à 30%), le bois n'a quasiment pas de débouché alimentaire. La présente invention propose un procédé original constitué d'une séquence de fermentations par voie fongique permettant de rendre comestibles des ressources ligneuses. En pratique une première 10 fermentation à température ambiante avec un champignon comestible lignivore pendant quelques semaines permet d'obtenir un substrat riche en composés fongiques d'intérêt et appauvri en lignine. L'arrêt de cette fermentation au moment optimum par un procédé adapté permet d'obtenir un substrat apte à une seconde fermentation de quelques jours par un champignon comestible à haute valeur ajoutée. Le produit ainsi obtenu contient des 15 enzymes et des composés fongiques d'intérêt et peut être utilisé directement en tant que supplément alimentaire. La France possède la quatrième forêt d'Europe en superficie (17 millions d'hectares en métropole), derrière la Suède, la Finlande et l'Espagne, mais la récolte, depuis les années 80, ne dépasse pas la moitié de la production annuelle de bois 20 (Alexandre, 2017). Ce sont donc entre 30% et 40% des superficies françaises et européennes qui sont couvertes de forêts. En France, 70% des forêts sont constitués d'arbres à feuilles caduques et 30% à feuilles persistantes avec une prépondérance du chêne sur l'ensemble des essences représentées et un accroissement brut annuel de la forêt française de 85 millions de m3 en bois fort de tiges entre 2001 et 2009 (Agreste 2012) ; ce 25 chiffre est même porté à 120 Mm3 si on inclut les bois de branchaison. Environ 55 millions de m3 ont été récoltés chaque année durant la même période pour une utilisation répartie entre le bois d'énergie et le bois d'ceuvre et d'industrie (Agreste 2012). Les procédés de première transformation associés à cette exploitation génèrent des résidus ou coproduits en quantité massive. Le rendement industriel dans une 30 scierie qui fabrique des planches est d'environ 50% (Alexandre, 2017), l'autre moitié appelée connexes de bois (écorces, sciures, plaquettes, délignures,...) ne trouve que des débouchés à faible valeur ajoutée pour laquelle il serait utile de trouver de nouvelles voies de valorisation (Alexandre, 2017). 2 La lignine est le deuxième biopolymère renouvelable le plus abondant sur la Terre, et la seule source de carbone aromatique généré dans la Nature (en moyenne 20% chez les feuillus et 30% chez les résineux) (Howard, Abotsi, L, & Howard, 2003). Ses principales fonctions sont d'apporter de la rigidité, une imperméabilité à l'eau et une grande résistance à la décomposition. La lignine est un polymère amorphe tridimensionnel composé de structures phénylpropane méthoxylées et les lignines isolées ont généralement un poids moléculaire d'environ 2000 à 5000 Da (Wertz, 2010). Comme biopolymère, la lignine est inhabituelle en raison de son hétérogénéité et de son manque de structure primaire définie, elle constitue la « colle » qui maintient les parois cellulaires ensemble. Les polymères de lignine rendent la paroi cellulaire rigide et imperméable, permettant le transport de l'eau et des éléments nutritifs à travers le système vasculaire et protégeant les plantes de l'invasion microbienne. La lignine est extrêmement résistante à la dégradation et, en formant des liaisons à la fois avec la cellulose et les hémicelluloses, elle crée une barrière à toutes les solutions ou enzymes (Wertz, 2010), constituant ainsi un des obstacles majeurs à la conversion de la biomasse lignocellulosique en carburants et produits chimiques biobasés. Dans la nature, la dégradation efficace de la lignine au cours du phénomène de pourriture du bois est possible principalement par les champignons basidiomycètes de la pourriture blanche du bois (Plkido & Capareda, 2015), qui produisent des enzymes spécifiques telles que les laccases, Manganèse Peroxydase et lignine peroxydase. De nombreux champignons de la pourriture blanche attaquent simultanément la lignine, les hémicelluloses et la cellulose, tandis que d'autres champignons de la pourriture blanche attaquent la lignine de manière sélective. Contrairement aux champignons de la pourriture blanche, les champignons de la pourriture brune peuvent dégrader les polysaccharides du bois, mais pas la lignine oxydée. Les Ascomycètes sont avant tout capables de dégrader la cellulose et les hémicelluloses, mais leur capacité de dégrader la lignine est limitée (Wertz, 2010). La lignine a plusieurs applications de relativement basse valeur ajoutée telles que : - combustible, fournissant plus d'énergie une fois brûlée que la cellulose ; - additif dans le ciment, en particulier comme agent retardateur de prise du ciment ; - additif dans l'asphalte, en particulier pour ses caractéristiques anti-oxydantes ; - liant dans les aliments pour animaux pour plastifier et tenir ensemble les granulés ; - additif dans les granulés combustibles basés sur la biomasse (Wertz, 2010). 3 Les développements de procédés de traitement et de fermentation de composés lignocellulosiques connaissent un essor depuis plusieurs années notamment pour la production de biocarburants, d'enzymes, de pigments et de métabolites secondaires. (Guerriero et al. 2016) (Dashtban, Schraft, & Qin, 2009) (Soccol et al. 2017). La grande 5 majorité de ces développements est réalisée à partir de composés lignocellulosiques issus de l'agriculture tels que les pailles, les sons, tourteaux (Soccol et al., 2017) et très peu se basent sur l'utilisation de substrats issus de l'exploitation forestière (Thomas, Larroche, & Pandey, 2013) (Ferreira, Mahboubi, Lennartsson, & Taherzadeh, 2016). Pourtant, sur une planète avec des ressources finies et une population en 10 augmentation continue, la mise en place d'une économie circulaire avec une optimisation de l'utilisation des bioressources à des fins alimentaires doit être une priorité (FAO, 2016). Les terres agricoles ne sont pas indéfiniment extensibles au détriment de la forêt car sinon c'est le poumon de la planète qui serait mis à mal. La présente invention propose donc la mise au point d'un procédé qui 15 permettrait pour la première fois d'utiliser du bois à des fins alimentaires ; ce procédé est constitué d'une séquence de fermentations par voie fongique permettant de rendre comestibles des ressources ligneuses. En pratique, une première fermentation à température ambiante avec un champignon comestible lignivore pendant quelques semaines permet d'obtenir un substrat 20 riche en composés fongiques d'intérêt et appauvri en lignine (semblable au niveau de lignine retrouvé dans la paille). L'arrêt de cette fermentation permet d'obtenir un substrat apte à une seconde fermentation de quelques jours par un champignon comestible à haute valeur ajoutée. Cette première fermentation permet le développement d'un ascomycète tel que Aspergillus oryzae, dans le cadre d'une deuxième fermentation, sur des sciures de bois 25 fermentées dans des conditions où l'ajout d'éléments nutritifs azotés est nul. A l'issue de la seconde fermentation, une stabilisation du produit fermenté obtenu comprenant des enzymes sécrétées est effectuée par déshydratation à basse température. Ainsi, la présente invention se rapporte à un procédé de transformation de résidus de bois en produit alimentaire comestible pour un mammifère comprenant les 30 étapes de : 1) optionnellement, prétraitement des résidus de bois ; 2) première fermentation d'un substrat composé de résidus de bois et comprenant optionnellement de 1 à 5% en poids sec d'un complément minéral alcalinisant, par un champignon lignivore comestible pendant une durée adaptée correspondant à la 4 colonisation maximale du substrat avant fructification par ledit champignon ; cette durée varie selon la souche de champignon utilisée et la température mise en oeuvre ; à titre d'exemple, selon un mode de réalisation optimisé pour Pleurotus ostreatus, cette première fermentation est conduite pendant 30 à 40 jours à une température de 28°C; si une 5 température inférieure est mise en oeuvre, il conviendra de prolonger le temps de fermentation ; 3) arrêt de la première fermentation par inactivation thermique dudit champignon lignivore comestible et broyage du produit obtenu à l'issue de ladite première fermentation ; de préférence, le broyage est réalisé avant l'inactivation thermique ; 10 4) seconde fermentation du produit obtenu à l'étape 3) par un champignon du genre Aspergillus pendant une durée adaptée correspondant à la colonisation maximale du produit obtenu à l'étape 3) avant sporulation dudit champignon du genre Aspergillus ; à titre d'exemple, selon un mode de réalisation optimisé pour Aspergillus oryzae, cette seconde fermentation est conduite pendant 3 à 4 jours à une 15 température optimale de croissance à 30°C ; si une température inférieure est mise en oeuvre, il conviendra de prolonger le temps de fermentation ; 5) optionnellement, stabilisation du produit obtenu à l'issue de ladite seconde fermentation par déshydratation. Le substrat, ou matériau de départ, du procédé selon l'invention 20 comprend des résidus de bois tels que des copeaux (taille des résidus comprise entre 1 mm et 2 cm), de la sciure (taille des résidus comprise entre 1 mm et 2 cm), ou encore de la farine de bois (taille des résidus comprise entre 20 i.tm et 1 mm) ; selon la qualité du bois et sa digestibilité par le champignon lignivore, le substrat peut aussi comprendre des morceaux de bois plus grossiers (d'une taille supérieure à 2 cm). 25 Afin de mettre en oeuvre la première fermentation du procédé selon l'invention, il est toutefois préférable de disposer de résidus de bois dont la taille maximale est inférieure ou égale à 2 cm ; ainsi, si les résidus de bois disponibles ont une taille supérieure à 2 cm, un broyage préalable est réalisé. Toute technique de broyage permettant de réduire la taille des résidus de bois peut être utilisée. 30 Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, il est avantageux de mélanger des résidus de bois ayant des tailles différentes, par exemple, entre 40 et 80% en poids de sciure de bois et entre 20 et 60% en poids de farine de bois éventuellement en présence de morceaux plus gros ; cette différence de granulométrie favorise une aération 5 satisfaisante du substrat sans qu'il soit nécessaire de procéder à une agitation mécanique au cours de la première fermentation. Toute essence de bois peut être utilisée pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention qu'il s'agisse de bois d'arbres résineux ou de feuillus ; de préférence, il 5 s'agit d'essences exploitées industriellement. A titre d'exemple, les essences d'arbres résineux utilisables sont le sapin, l'épicéa, le pin maritime, le douglas ; celles d'arbres feuillus utilisables sont le chêne, le peuplier, le hêtre, l'acacia, le châtaigner. Selon l'essence de l'arbre dont provient le bois utilisé, il peut être préférable de réduire la teneur en tanins de son bois ; les tanins participent en effet au 10 système de défense que les plantes ont développé contre les champignons et limitent la digestibilité et l'absorption des protéines des rations alimentaires des animaux d'élevage (Gilani et al. 2017) (Sharma & Arora 2015). Pour cela, les résidus de bois sont mélangés à de l'eau et chauffés à une température comprise entre 50 et 120°C, de préférence à environ 90°C ; l'eau est ensuite éliminée par filtration, par exemple, sur filtre de cellulose jusqu'à 15 obtention d'un taux d'humidité compris entre 55 et 70% (Girmay et al. 2016) (Hoa & Wang n.d.). L'objectif de cette première fermentation est principalement la dégradation de la lignine présente dans les résidus de bois et la libération de nutriments qui seront consommés dans le cadre de la seconde fermentation. 20 Selon un mode de réalisation particulier, le substrat de la première fermentation du procédé selon l'invention est préparé par ajout, aux résidus de bois, d'un complément minéral alcalinisant en une quantité comprise entre 1 à 5% en poids sec, de préférence entre 2 à 3% en poids sec, encore préférentiellement d'environ 2,5% en poids sec par rapport au poids total de résidus de bois utilisés dans le substrat. 25 L'ajout du complément minéral alcalinisant s'avère avantageux en prétraitement des bois difficiles à digérer, par exemple, ceux utilisés pour leur caractère imputrescible. Ces bois sont généralement ceux des feuillus, par exemple, le chêne et l'acacia. Lorsqu'il est ajouté aux résidus de bois, le complément minéral alcalinisant est de préférence introduit avant un éventuel chauffage humide tel que décrit plus tôt pour 30 favoriser la déstructuration du substrat. Le complément minéral est alcalinisant, c'est-à-dire qu'il a un pH basique, plus particulièrement un pH supérieur ou égal à 8, de préférence, supérieur ou égal à 9, encore préférentiellement, supérieur ou égal à 10, avant mélange avec les résidus de bois et qu'il permet la préparation d'un substrat dont le pH vaut au moins 7, de 6 préférence 8 avant chauffage. Selon ce mode de réalisation particulier, le complément minéral alcalinisant comprend au moins un minéral alcalinisant qui peut être notamment choisi parmi la potasse, le carbonate de calcium, la soude, l'hydroxyde de calcium, l'hydroxyde de sodium ou l'hydroxyde de potassium. 5 Préférentiellement, le complément minéral alcalinisant est constitué de cendres issues de la combustion de coproduits de l'industrie du bois (cendres de chaufferies de bois) permettant ainsi d'optimiser leur recyclage. De préférence, le complément minéral alcalinisant représente un apport de : 10 - 170 à 330 kg/t de calcium (exprimé sous forme de CaO), - 20 à 60 kg/t de potassium (exprimé sous forme de K20), - 25 à 46 kg/t de magnésium (exprimé sous forme de MgO), - 10 à 61 kg/t de phosphore (exprimé sous forme de P205), - des métaux, dont le Mn, Fe, Cu, Zn qui sont des co-facteurs d'enzymes digestives 15 sécrétées par les champignons, en proportions variables, et présente un pH, avant mélange avec les résidus de bois, compris entre 10 et 13. De préférence, le substrat comprenant des résidus de bois et éventuellement un complément minéral alcalinisant est traité pour éliminer les éventuels microorganismes contaminants, voire renforcer ses propriétés alcalinisantes le cas 20 échéant ; selon un mode de réalisation particulier, le substrat est chauffé avant la mise en oeuvre de la première fermentation ; le moyen de chauffage est choisi par l'homme du métier notamment en fonction du volume de substrat à traiter. Le substrat présente un pourcentage d'humidité compris entre 50 et 70%, de préférence entre 60 et 70%. 25 Le substrat est inoculé par un champignon lignivore comestible dans sa forme de mycélium primaire qui peut être notamment choisi parmi Pleurotus ostreatus, Pleurotus pulmonarius, pleurote de l'orme (Hypsizygus ulmarius), ou encore Agaricus blasei et Agaricus braziliensis ; de préférence, il s'agit de Pleurotus ostreatus. Selon un mode de réalisation particulier et afin de faciliter le démarrage 30 de la première fermentation, le champignon lignivore comestible est pré-cultivé sur un milieu de culture approprié avant d'être ensemencé sur le substrat. Les conditions de mises en oeuvre de cette pré-culture sont connues de l'homme du métier ; la pré-culture pourra par exemple être effectuée sur du blé, du riz ou encore un mélange de riz, paille et/ou bois avec ajout de chaux ou de carbonate de calcium. 7 Le substrat est inoculé avec entre 10 et 20 % en poids sec, de préférence de l'ordre de 20% en poids sec de la préculture du champignon lignivore comestible et est ensuite maintenu à une température optimale de croissance pour le champignon lignivore comestible utilisé ; par exemple, la température de culture est comprise entre 20 et 30°C, 5 de préférence de l'ordre de 28°C pour les basidiomycètes Pleurotus ostreatus (Hoa et al. n.d.), Pleurotus pulmonarius (Belletini et al., 2017) et Hypsizygus ulmarius, ou entre 25 et 35°C, de préférence 30°C pour Agaricus blazei ou braziliensis (Colauto et al., 2008). La durée de la fermentation est conduite jusqu'à colonisation complète du substrat par le champignon lignivore comestible. 10 Selon un mode de réalisation particulier, la fermentation est arrêtée lorsque le maximum de sécrétion de xylanases, d'amylases et/ou de protéases est atteint. Selon un mode de réalisation particulier, le milieu de culture de la première fermentation (substrat et population de champignon lignivore comestible) est broyé et/ou mélangé au moins une fois au cours de la première fermentation pour 15 uniformiser le développement dudit champignon. De façon surprenante, le traitement de résidus de bois par la première fermentation selon l'invention permet la croissance et le développement d'un second champignon du genre Aspergillus sur un substrat sur lequel il ne peut normalement pas se développer. 20 L'arrêt de cette première fermentation intervient de préférence avant la fructification du champignon lignivore comestible de façon à ce que la première fermentation ne soit réalisée qu'avec le mycélium primaire du champignon lignivore comestible. A l'issue de cette première fermentation, l'ensemble de la culture est 25 rebroyée/homogénéisée pour de servir de base pour la seconde fermentation. Ledit champignon lignivore comestible est ensuite inactivé par traitement thermique. L'homme du métier saura choisir le traitement thermique le plus approprié ; à titre d'exemple, selon un mode de réalisation adapté à une mise en oeuvre industrielle du procédé de l'invention, le traitement thermique est conduit à environ au moins 70°C en 30 milieu humide (par exemple, dans un dispositif à contre-courant, par traitement à la vapeur d'eau ou encore par traitement à la chaleur vive) pendant environ 1 heure. Après broyage et inactivation, la culture issue de la première fermentation (substrat de la seconde fermentation) est optionnellement enrichie d'un second complément minéral pour satisfaire les besoins nutritionnels du champignon du 8 genre Aspergillus ; cet enrichissement est utile lorsque la première fermentation n'a pas permis une libération de minéraux en quantité suffisante pour la croissance du champignon Aspergillus. De façon pratique, ce second complément minéral comprend au moins un 5 sel de phosphate ; il peut également comprendre une source de magnésium, de sulfate et/ou de potassium ; il est ajouté au substrat de la seconde fermentation en une quantité comprise entre 1 à 5% en poids sec, de préférence entre 2 à 3% en poids sec, encore préférentiellement d'environ 2,5% en poids sec par rapport au poids total de substrat de la seconde fermentation. 10 Le substrat de la seconde fermentation est ensemencé avec une quantité de spores d'une espèce de champignon GRAS (« Generally Recognized As Safe ») et couramment utilisé dans la préparation de produits alimentaires, du genre Aspergillus comprise entre 5.105 et 2.106/g de substrat. L'espèce de champignon du genre Aspergillus est notamment choisie pour sa capacité à sécréter des enzymes du type hémicellulase. 15 Le taux d'humidité du substrat de la seconde fermentation ensemencé est ensuite, si nécessaire, ajusté à une valeur comprise entre 55 et 75%, de préférence entre 60 et 70%, encore préférentiellement à environ 65%. De préférence, l'espèce utilisée pour cette seconde fermentation est choisie parmi Aspergillus oryzae, Aspergillus figer, Aspergillus sojae ou encore 20 Aspergillus awanori ; encore préférentiellement, il s'agit d'Aspergillus oryzae. Selon un mode de réalisation préféré utilisant l'espèce Aspergillus oryzae, les spores d'Aspergillus oryzae ont été préalablement récoltées après culture par exemple sur milieu PDA contenant 0,6 M de KC1 afin de stimuler la sporulation (Song et al. 2001). 25 A titre d'exemple, lorsque la seconde fermentation est mise en oeuvre avec Aspergillus oryzae, elle est arrêtée après 2 à 3 jours, de préférence 3 jours, d'incubation à une température comprise entre 25 et 40°C, de préférence, entre 28 et 30°C. Le produit fermenté est alors récupéré. Le but de cette seconde fermentation est l'accroissement de la biomasse 30 fongique globale et la production d'enzymes d'intérêt pour l'alimentation animale (notamment xylanase, amylase, protéase, phytase). Le produit obtenu à l'issue de la seconde fermentation est stabilisé par déshydratation, cette méthode permet avantageusement une stabilisation des enzymes d'intérêt sur le produit fermenté qui sert de support d'immobilisation. Pour cela, il peut par 9 exemple être placé après homogénéisation par agitation mécanique dans une enceinte à environ 24°C jusqu'à obtention d'un taux d'humidité inférieur ou égal à 12%, de préférence compris entre 10 et 12% (correspondant à une activité de l'eau (aw) inférieure à 0,6 et prévenant la croissance de microorganismes), puis stocké au froid ou à température 5 ambiante. Toute autre méthode de séchage connue de l'homme du métier, comme par exemple la lyophilisation, pourrait aussi être mise en oeuvre. Le produit fermenté obtenu à l'issue du procédé selon l'invention peut être utilisé directement et dans sa globalité en tant que complément alimentaire de préférence pour l'alimentation animale ou humaine, de préférence pour l'alimentation 10 animale. La présente invention se rapporte également à un produit alimentaire fermenté susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention et à son utilisation, en particulier comme complément alimentaire pour les animaux d'élevage. Le produit alimentaire selon l'invention se caractérise par une 15 composition nutritionnelle particulièrement intéressante, notamment pour l'alimentation animale. En effet, les enzymes sécrétées par les champignons filamenteux en présence de substrats lignocellulosiques ou riches en amidon sont largement employées dans l'alimentation animale pour améliorer la digestibilité des aliments et augmenter les 20 performances de croissance principalement des animaux d'élevage monogastriques (Asmare 2014). Dans le cas présent, ce produit alimentaire selon l'invention comprend avantageusement les enzymes suivantes : - entre 5 et 10 U de xylanases/g de produit fermenté sec, - entre 5 et 10 U d'amylases/g de produit fermenté sec et 25 - entre 30 et 100 U de protéases/g de produit fermenté sec. Outre l'apport d'enzymes, le produit fermenté est naturellement riche en mycélium, structure filamentaire des champignons filamenteux entourée d'une paroi. Ces parois sont des structures complexes essentiellement composées de polysaccharides dont les plus abondants, les beta-glucanes (Bowman & Free, 2006), ont des propriétés immuno- 30 modulatrices reconnues (Volman, Ramakers, & Plat, 2008). Avantageusement, le produit alimentaire selon l'invention contient également des vitamines, en particulier de la vitamine B3 en une teneur comprise entre 20 et 40 mg/g de produit alimentaire. 10 Ce produit alimentaire présente également l'avantage de contenir des acides aminés essentiels à raison de, exprimé en mg/g de protéines totales : - entre 10 et 15 mg d'Histidine, - entre 30 et 45 mg d' Isoleucine, 5 - entre 40 et 65 mg de Leucine, - entre 20 et 30 mg de Lysine, - entre 10 et 15 mg de Méthionine, - entre 25 et 40 mg de Phénylalanine, - entre 12 et 19 mg de Tyrosine, 10 - entre 35 et 54 mg de Thréonine, - entre 25 et 40 mg de Valine et - entre 8 et 12,5 mg de Tryptophane, avec une teneur en protéines totales comprise entre 2,5 et 4,0% de préférence, d'environ 3,0% en poids par rapport au poids sec dudit produit. 15 Enfin, grâce à son procédé d'obtention, ce produit alimentaire présente une bonne digestibilité car ses teneurs en lignine, cellulose et hémicellulose sont réduites. La teneur en lignine du produit alimentaire selon l'invention dépend bien entendu de la teneur en lignine du produit de départ (résidus de bois) ; le procédé selon l'invention permet de réduire la teneur en lignine du produit de départ d'au moins 30%, de préférence 20 d'au moins 40% et encore préférentiellement d'au moins 50%. A titre de comparaison, la teneur en lignine du produit alimentaire selon l'invention est comparable à celle de la paille. La présente invention se rapporte donc à un produit alimentaire comprenant : 25 - entre 5 et 10 U de xylanases/g de produit alimentaire sec ; - entre 5 et 10 U d'amylases/g de produit alimentaire sec ; - entre 30 et 100 U de protéases/g de produit alimentaire sec ; - entre 20 et 40 mg de vitamine B3/g de produit alimentaire sec ; - un profil d'acides aminés comprenant entre 10 et 15 mg d'Histidine, 30 entre 30 et 45 mg d'Isoleucine, entre 40 et 65 mg de Leucine, entre 20 et 30 mg de Lysine, entre 10 et 15 mg de Méthionine, entre 25 et 40 mg de Phénylalanine, entre 12 et 19 mg de Tyrosine, entre 35 et 54 mg de Thréonine, entre 25 et 40 mg de Valine et entre 8 et 12,5 mg de Tryptophane / g de protéines totales dudit produit alimentaire ; 11 - une teneur en lignine inférieure à 18%, de préférence inférieure à 15%, encore préférentiellement inférieure à 12,5% et tout préférentiellement inférieure à 11% en poids. De préférence, ce produit comporte une teneur en protéines totales 5 comprise entre 2,5 et 4,0% de préférence, d'environ 3,0% en poids par rapport au poids sec dudit produit. La présente invention se rapporte également à l'utilisation du produit alimentaire comme complément alimentaire par ajout de 3 à 4 % en poids dans une ration alimentaire animale. 10 Ainsi, le procédé séquentiel de fermentation en phase solide selon la présente invention permet l'utilisation de ressources ligneuses comme substrat et l'incorporation du produit fermenté in toto dans l'alimentation et notamment l'alimentation animale. Le règlement n°68/2013 du 16 janvier 2013 de la commission européenne établit la liste des matières premières pour l'alimentation animale (RÈGLEMENT (UE) 15 N°68/2013 DE LA COMMISSION du 16 janvier 2013 relatif au catalogue des matières premières pour aliments des animaux, http://eur-lex.europa.eu/eli/reg/2013/68/oj) et y inclut la lignocellulose de bois, obtenue par transformation mécanique de bois brut naturel (partie C tableau et ligne 7.8.1), le bois mur ou fibre de bois (partie C tableau et ligne 7.14.1) et le charbon de bois végétal (partie C tableau et ligne 7.13.1). Néanmoins, la 20 nature lignocellulosique du bois, sa rigidité et sa teneur en lignine ne font pas du bois un candidat fréquemment sélectionné pour l'alimentation animale ainsi que pour la fermentation de composés lignocellulosiques. Le procédé selon l'invention corrige cet inconvénient. Un autre avantage majeur du procédé de fermentation séquentielle selon 25 l'invention repose sur l'utilisation du produit fermenté comme support d'immobilisation/adsorption des enzymes sécrétées. En effet, habituellement, l'incorporation du produit fermenté dans l'alimentation animale nécessite sa stabilisation microbiologique et enzymatique pour la conservation du produit. L'immobilisation des enzymes sur support insoluble d'origine organique et inorganique est décrite et des 30 substrats purs de nature glucidique tels que la cellulose, l'amidon, l'agar-agar, les alginates ont été utilisés (Krajewska 2014). Le procédé développé ici propose d'utiliser le produit de fermentation composé de lignocellulose résiduelle et du mycélium déshydratés comme support d'immobilisation se substituant aux supports traditionnels décrits ci-dessus. De 12 manière surprenante, l'activité enzymatique mesurée est très bien conservée et stable à température ambiante après déshydratation simple du produit fermenté. Figures Figure 1 : A. Première fermentation : croissance de Pleurotus ostreatus sur sciure de chêne 5 après 40 jours d'incubation à 28°C en absence ou en présence de complément minéral (CM). B. Seconde fermentation : croissance d'Aspergillus oryzae après 3 jours d'incubation à 30°C après différentes conditions de première fermentation. Figure 2: A. Croissance d'Aspergillus oryzae sur sciure de chêne non fermentée par Pleurotus ostreatus avec et sans combinaison avec un complément minéral et/ou un 10 complément azoté (sous forme de protéine dans le cas présent) (l'encart présente la croissance d'A. oryzae après fermentation séquentielle). B. Croissance d'Aspergillus oryzae sur un milieu de culture renfermant 1 ,5% de glucose, 0,6% de NaNO3, 0,15% KH2PO4, 0,05% Mg504, 0,05% KC1 et des minéraux sous forme de trace (Mn, Co, Zn et Fe) ajusté à différents pH. C. Croissance d'Aspergillus oryzae sur un milieu de culture 15 minimal (1,5% de glucose, 0,6% de NaNO3), complété tel indiqué sur la figure et ajusté à pH 6,1. Figure 3 : A. Croissance de Pleurotus ostreatus sur sciures de chêne après 40 jours d'incubation à 28°C après combinaison avec différents compléments alcalins et/ou minéraux. B. Développement d'Aspergillus oryzae à la suite de cette première 20 fermentation après 3 jours d'incubation à 30°C. Figure 4 : Comparaison des activités xylanases, amylases et protéases sécrétées par Pleurotus ostreatus (à l'issue de la première fermentation) (PO, gris clair) et par Aspergillus oryzae (à l'issue de la seconde fermentation) (P0/A0, noir) en fonction du pourcentage de complément minéral ajouté avant la première fermentation. Les activités 25 sont exprimées en Unité (p.mol de produit généré/min)/g de produit fermenté sec. Figure 5 : Comparaison des activités xylanases (A), amylases (B), protéases (C) sécrétées par Pleurotus ostreatus (PO, gris clair) et par Aspergillus oryzae (P0/A0, noir) après différents temps de culture de Pleurotus ostreatus sur sciure de chêne combinée à 2,5% de cendre. Les activités sont exprimées en Unité (p.mol de produit généré/min)/ g de produit 30 fermenté sec. Figure 6 : Effet de la déshydratation (A) et de la conservation (B et C) du produit fermenté sur les activités xylanases, amylases et protéases. (MC : moisture content / pourcentage d'humidité). EXEMPLES 13 Exemple 1 - Procédé séquentiel de fermentations de bois de chêne avec Pleurotus ostreatus puis Aspergillus oryzae selon l'invention 1. Matériels et méthodes 1.1. Procédé de fermentation séquentiel 5 Prétraitement du bois Les résidus de bois de chêne obtenus sous forme de sciures ont été broyés grossièrement à l'aide d'un broyeur à hélice pour obtenir une fraction mineure sous forme de farine (environ 20%). L'objectif est de réduire la taille (entre 50 !dm et 1 mm) et la cristallinité d'une fraction de la lignocellulose du bois dans le but d'augmenter sa surface 10 d'échange et ainsi faciliter la dégradation enzymatique (Saritha et al. 2012; Ravindran & Jaiswal 2015). Ils ont été ensuite soumis à un prétraitement par chauffage à 90°C en milieu aqueux afin d'extraire une partie des extractibles dont les tannins hydrosolubles. Après filtration sur filtre de cellulose jusqu'à obtention d'un pourcentage 15 d'humidité compris entre 55 et 70% (Girmay et al. 2016) (Hoa & Wang n.d.), un complément minéral alcalin (cendre) est éventuellement ajouté puis le substrat est autoclavé. Première fermentation Le substrat est alors inoculé par Pleurotus ostreatus précultivé sur riz. Le 20 substrat inoculé est ensuite placé à 28°C, température optimale de croissance (Hoa et al. n.d.) pour une période comprise entre 30 et 40 jours jusqu'à colonisation complète du substrat par Pleurotus ostreatus (Hoa & Wang n.d.). Seconde fermentation A l'issue de cette première fermentation, la culture est broyée à l'aide 25 d'un broyeur à hélice dans le but de la rendre homogène et de servir de base pour la seconde fermentation. Les pleurotes sont ensuite inactivées par chauffage (entre 70°C et 120°C), puis 2.106 spores d'Aspergillus oryzae sont ajoutées par gramme de produit fermenté sec avec ajustement de l'humidité entre 60 et 70%. Les spores d'Aspergillus oryzae ont été préalablement récoltées après 30 culture sur milieu PDA contenant 0,6 M de KC1 afin de stimuler la sporulation (Song et al. 2001). La culture est arrêtée après 3 jours d'incubation à 30°C, le produit fermenté est récupéré. Stabilisation 14 Le produit fermenté est stabilisé par déshydratation : il est placé après homogénéisation par agitation mécanique dans une enceinte à 24°C jusqu'à obtention d'un pourcentage d'humidité de 11-12%, correspondant à une activité de l'eau (aw) inférieure à 0,6 et prévenant la croissance de microorganisme (Assamoi et al. 2009), puis il est stocké à 5 4°C ou température ambiante. 1.2. Caractérisation du produit fermenté alimentaire obtenu 1.2.1 Mesure des activités enzymatiques Préparation de l'extrait brut enzymatique Les enzymes sécrétées par les champignons sont isolées du produit 10 fermenté directement après l'arrêt de la période d'incubation ou après stabilisation. L'équivalent de 0,1 g de produit fermenté sec est prélevé dans un tube eppendorf puis placé dans 2 ml de tampon acétate 50 mM pH 5,0 et mis à agiter (agitateur incubateur 150 rpm) 30 min à 30°C (Chancharoonpong et al. 2012). Le surnageant contenant les enzymes sécrétées est récolté après centrifugation 10 min à 10000 g (4°C). 15 Mesure des activités xylanase, amylase et protéase Les activités xylanase sont mesurées en utilisant comme substrat, le xylan de hêtre à 1% dans un tampon acétate 50 mM pH 5,0. Typiquement, 50 pl d'extrait enzymatique brut sont ajoutés à 150 pl de substrat puis incubés 50 min à 50°C (van den Brink et al. 2013). L'apparition d'extrémités réductrices après coupure enzymatique est 20 mesurée par dosage colorimétrique à 405 nm après réaction avec le p-4- hydroxybenzhydrazide (Szilagyi, et al., 2010). Les activités amylase sont mesurées en utilisant comme substrat, l'amidon à 0,2% dans un tampon acétate 50 mM pH 5,0. Typiquement, 50 pl d'extrait enzymatique brut sont ajoutés à 150 pl de substrat puis incubés 50 min à 50 °C (van den 25 Brink et al. 2013). Les activités protéase sont mesurées en utilisant l'azocaséine comme substrat comme décrit (Janser et al. 2014) avec quelques modifications : 200 pl d'extrait enzymatique sont ajoutés à 200 pl d'azocaséine à 0.5% dans un tampon acétate 50 mM pH5,0. L'incubation est réalisée pendant 1 heure à 55°C, puis les protéines sont précipitées 30 par addition de 400 pl d'acide trichloroacétique 10%. Après 10 min dans la glace, les tubes sont centrifugés à 10000g pendant 10 min. 100 pl de surnageant contenant les azopeptides et azo acides aminés sont transférés dans une microplaque contenant 100 pl de NaOH 5M. L'absorbance est mesurée à 428 nm pour déterminer l'activité protéasique de l'extrait brut. 15 1.2.2. Détermination des teneurs en lignine et béta-glucanes La détermination de la teneur en lignine a été réalisée par gravimétrie après hydrolyse acide : l'échantillon subit une succession d'attaques par différentes solutions (détergent neutre, puis détergent acide) dans un appareil de type Fibertec. 5 (Ébullition pendant 1 heure). A la fin de chaque attaque, l'échantillon est soigneusement rincé, séché et pesé. Une attaque avec un acide très concentré est alors réalisé, et l'échantillon contenant la fraction de lignine est séché puis pesé pour déterminer la teneur en lignine en comparaison avec le poids sec de départ. La détermination de la teneur en beta-glucanes est réalisée après 10 hydrolyse enzymatique spécifique. Les échantillons subissent des digestions enzymatiques successives. Le glucose, contenu dans les béta-glucanes 1.3- 1.6, est ainsi libéré et dosé par chromatographie ionique. 2. Résultats Le développement d'Aspergillus oryzae sur les résidus de bois est dépendant du 15 développement préalable de Pleurotus ostreatus. Le modèle choisi pour le développement du procédé s'est basé sur l'utilisation de sciures de chêne broyées grossièrement et soumises à une extraction aqueuse à chaud. Après ajustement de l'humidité par filtration et stérilisation, le substrat est inoculé par Pleurotus ostreatus et placé 40 jours à 28°C pour permettre le 20 développement du champignon. La croissance de Pleurotus ostreatus sur sciures de chêne a pu être optimisée par ajout d'un complément minéral alcalinisant naturel et facilement disponible (cendres). La figure lA présente différentes conditions de cultures réalisées en absence ou en présence du complément minéral. Après 40 jours de culture, Pleurotus ostreatus s'est faiblement développé 25 sur sciure de chêne en absence de complément minéral (CM 0%) alors que la croissance, visible par l'extension du mycélium blanc, augmente avec le pourcentage de complément minéral jusqu'à se stabiliser aux environs de 5% de CM. L'utilisation d'un broyeur permet alors d'homogénéiser le produit fermenté tandis que l'inactivation par chauffage permet d'empêcher un nouveau développement des pleurotes. Après ces conditions de traitement, 30 le substrat fermenté retrouve un aspect, une couleur brune caractéristique du bois (le mycélium n'est plus visible à l'oeil nu) (voir, figure lA colonne 3 et figure 1B, colonne 1) et la croissance est ineffective sans nouvelle inoculation (figure 1B, colonne 1). Des spores d'Aspergillus oryzae sont ajoutées aux sciures fermentées puis le taux d'humidité est amené à une valeur comprise entre 60 et 70% avant d'initier 16 une seconde fermentation pendant 3 jours à 30°C en chambre humide. La figure 1B montre la croissance d'Aspergillus oryzae à l'issue de cette seconde fermentation. Celle-ci est indétectable si les spores sont ajoutées sur des sciures n'ayant pas été soumises à une première fermentation (figure 1B, colonne 2) et son niveau est corrélé positivement au 5 niveau de croissance de Pleurotus ostreatus obtenu lors de la première fermentation (comparer la quantité de mycélium blanc sur la figure lA colonnes 1 à 4 et figure 1B colonnes 3 à 6). Ces résultats montrent donc que la croissance d'Aspergillus oryzae sur sciure de chêne seule est dépendante d'une première fermentation par Pleurotus ostreatus. 10 Un certain nombre de facteurs pourrait expliquer cette dépendance. D'une part, une diminution de la teneur en lignine est attendue compte-tenu du caractère lignivore de Pleurotus ostreatus, diminution et dégradation partielle facilitant l'accès de l'holocellulose aux enzymes sécrétées par Aspergillus oryzae. A ceci s'ajoute une dégradation partielle de l'holocellulose par Pleurotus ostreatus lui-même 15 conduisant à la libération de sucres réducteurs facilement assimilables par Aspergillus oryzae. La mesure des sucres réducteurs après la première fermentation a été évaluée à 20 mg/g de produit fermenté sec contre 2 mg/g de sciure sèche avant fermentation. Elle a été estimée à 10 mg/g de produit fermenté sec à l'issue de la seconde. Ces résultats montrent donc que la première fermentation permet la libération de sucres réducteurs qui 20 pourraient être en partie utilisés lors de la seconde fermentation pour la croissance d'Aspergillus oryzae. D'autre part, il est possible que certains composés sécrétés par le champignon servent de source de carbone supplémentaire (tels que les acides organiques) et source d'azote (protéines synthétisées par Pleurotus ostreatus). 25 Les conditions minimales de fermentation de sciure de chêne par Aspergillus oryzae sont présentées sur la figure 2 et permettent de souligner la pertinence du procédé séquentiel sur sciures de chêne. Les sciures de bois ont été soumises à un prétraitement similaire à celui opéré avant inoculation par Pleurotus ostreatus à savoir un broyage grossier puis une extraction en milieu aqueux à 90°C. Après stérilisation 30 (autoclavage), un nouveau broyage est réalisé avant inoculation par les spores d'Aspergillus oryzae et incubation 3 jours à 30°C. Comme le montre la figure 2A, aucune croissance n'est observable sur du bois prétraité seul (colonne 1), sur du bois prétraité combiné à 2,5% de complément minéral alcalinisant et 2,5% de complément minéral neutre (ici la cendre dont le pH a été ajusté à 7,5 par ajout d'HC1) (colonnes 2 et 3), sur du 17 bois prétraité combiné à 1,25% de potasse alcalinisante (colonne 4) et sur du bois prétraité combiné à 3% de complément azoté (colonne 5). Par contre, une croissance est observée sur du bois prétraité après addition de 2,5% de complément minéral alcalinisant ou neutre et 3% de complément azoté (protéines) (colonnes 6 et 7). Le niveau de croissance 5 observée est supérieur lorsque le complément minéral est alcalinisant en comparaison du complément minéral neutre mais inférieur à celui observé après une première fermentation par Pleurotus ostreatus (comparer l'encart et les colonnes 6 et 7). Ces résultats suggèrent donc qu'Aspergillus oryzae peut se développer sur sciures de chêne en présence d'un complément minéral et d'un complément azoté avec un développement préférentiel à pH 10 alcalin. La combinaison du complément azoté et de potasse alcalinisante ne permet pas de visualiser un développement d'Aspergillus oryzae sur sciure de chêne (colonne 8), confirmant une dépendance sur la présence des éléments minéraux, absents dans cette condition expérimentale. Les conditions optimales de croissance d'A. oryzae combinant les compléments azoté et minéral alcalinisant ne sont pas en adéquation avec les données 15 bibliographiques présentant un pH optimal de croissance de cet ascomycète compris entre 6 et 7,5 (Krijgsheld et al., 2013). La figure 2B confirme une diminution de croissance d'A. oryzae à pH alcalin (le pH du bois prétraité combiné à 2,5% de complément minéral alcalinisant est d'environ 8,0) et suggère donc que l'effet positif de l'alcalinisation observé sur la croissance d'Aspergillus résulterait d'un effet sur le bois (figure 2A colonne 7) qui 20 fragilise la lignocellulose du bois et faciliterait sa dégradation par les enzymes sécrétées par Aspergillus (Rabemanolontsoa & Saka, 2015). La dépendance d'Aspergillus oryzae vis-à-vis d'éléments minéraux présents dans le complément minéral ajouté sous forme de cendre est soulignée sur la figure 2C. En comparaison à un milieu complet et un milieu minimal contenant uniquement une source carbonée et azotée et pour lequel une croissance 25 très faible est observée, le retrait de phosphate limite tout développement significatif d'Aspergillus oryzae. Le retrait de magnésium et de sulfate n'est pas limitant pour la croissance du champignon mais entraine une sporulation suggérant un stress de l'ascomycète (résultat non présenté). Ces résultats montrent donc qu'Aspergillus oryzae est capable de se 30 développer sur des sciures de chêne à condition d'ajouter au substrat un complément minéral et azoté, la croissance est favorisée si le complément minéral est alcalinisant avec un effet pouvant être attribué à une fragilisation de la lignocellulose (lors du chauffage en présence du complément minéral). Néanmoins, l'efficacité de croissance est inférieure à celle observée lors du procédé de fermentation séquentielle. 18 Dans leur ensemble, ces résultats montrent que la croissance d'Aspergillus oryzae sur sciure de chêne (sans ajout) est dépendante d'une première fermentation par Pleurotus ostreatus et suggèrent que cette première fermentation, en fragilisant le bois et notamment la lignine, rend disponibles des éléments nutritifs 5 nécessaires à son développement dont très probablement une source d'azote accessible et indispensable à la croissance d'Aspergillus oryzae ainsi que les éléments minéraux indispensables à son développement en particulier le phosphate. Effet du complément minéral sur la conduite du procédé selon l'invention La pertinence du procédé séquentiel de fermentation peut être également 10 soulignée à travers l'analyse de l'impact du complément minéral alcalinisant sur la fermentation par Pleurotus ostreatus. La figure 3A présente le développement de Pleurotus ostreatus sur sciures de chêne combinée à 2,5% de complément minéral (colonne 1), à 2,5% de complément minéral dont le pH a été ajusté à 7,5 (colonne 2), à 1,25 % de potasse (colonne 3) et à 1,25% de carbonate de Calcium (colonne 4) (1,25% de KOH ont été 15 ajoutés car la cendre renferme environ 50% de CaO majoritairement responsable de l'alcalinité). Les résultats obtenus montrent que la potasse ou le carbonate de Calcium peuvent se substituer à la cendre (comparer les colonnes 1, 3 et 4). Par contre, l'ajustement du complément minéral à pH 7,5 entraine une diminution notable du développement de Pleurotus sur les sciures de chêne avec toutefois un développement des pleurotes bien 20 supérieur dans ces conditions à celui observé sans ajout de complément minéral (comparer avec la figure 1, colonne 1). Ainsi, ces résultats montrent que l'alcalinité des cendres a un effet plus déterminant sur la croissance des pleurotes que l'ajout de minéraux. Il est probable que l'effet alcalinisant intervienne ici aussi sur le bois et 25 non sur la croissance du champignon, elle-même. En effet, différentes études ont montré un pH optimum de croissance des pleurotes compris entre 5 et 7 lors de culture sur milieu synthétique ou paille (Romero-Arenas et al., 2012, Tripathi and Yadav, 1992, Belletini et al., 2016). Finalement, la figure 3B présente le développement d'Aspergillus oryzae 30 en seconde fermentation dans ces conditions expérimentales. De façon plus surprenante, ces résultats montrent que la présence d'éléments minéraux supplémentaires n'est pas indispensable à la croissance d'Aspergillus oryzae lors de la seconde fermentation puisque les cendres peuvent être substituées par la potasse ou le carbonate de calcium (comparer figure 3B, colonnes 1, 3 et 4) et renforcent l'importance de la qualité de la première 19 fermentation sur la seconde par la mise à disposition d'éléments nutritifs azotés et minéraux puisés dans le bois pour Aspergillus oryzae. La fermentation séquentielle permet la production de xylanases, amylases et protéases par Aspergillus oryzae. 5 Les enzymes sécrétées par les champignons filamenteux sont largement employées dans l'alimentation animale pour améliorer la digestibilité des aliments et augmenter les performances de croissance des animaux d'élevage (Asmare 2014). Aspergillus oryzae est employé dans l'alimentation humaine depuis plusieurs millénaires et décrit pour sa capacité à synthétiser et sécréter des enzymes impliquées dans la dégradation 10 de substrats riches en amidon mais aussi lignocellulosiques (Brink & Vries 2011; Kobayashi et al. 2007; Vries & Visser 2001). Les activités xylanases, protéases, amylases, glucanases et phytases sont les activités les plus recherchées pour l'alimentation animale (Shallom & Shoham 2003; Kuhad et al. 2011; Asmare 2014). Des dosages des activités xylanases, protéases et 15 amylases ont été mis au point afin d'évaluer le niveau de sécrétion de ces enzymes par Aspergillus oryzae tout en le comparant à celui de Pleurotus ostreatus. La figure 4 présente les activités xylanases, amylases et protéases sécrétées par Pleurotus ostreatus à l'issue de la première fermentation et Aspergillus oryzae à l'issue de la seconde. Trois conditions de culture ont été comparées, une réalisée 20 sans ajout de complément minéral et deux réalisées avec ajout de 1 et 5% de complément minéral, deux conditions stimulant le développement de Pleurotus ostreatus et en conséquence celui d'Aspergillus oryzae. Ainsi, si la fermentation réalisée par Pleurotus ostreatus est une condition sine qua non à la croissance d'Aspergillus oryzae, la seconde fermentation 25 amène au produit fermenté une valeur ajoutée notamment par la présence d'enzymes digestives. Il est important de noter que le niveau de sécrétion de ces enzymes par Pleurotus ostreatus reste largement inférieur à celui d'Aspergillus oryzae quelle que soit la durée de la première fermentation. La figure 5A et B montre une sécrétion de xylanases et d'amylases quasiment nulle après 20, 30, 40, 50 et 60 jours de fermentation par Pleurotus 30 ostreatus en présence de 2,5% de cendre. Les activités xylanases et amylases sécrétées par Aspergillus oryzae augmentent entre 20 et 30 jours de première fermentation (par Pleurotus ostreatus) pour se stabiliser ensuite (la durée d'incubation d'Aspergillus oryzae est restée constante à 3 jours). Les différences dans les niveaux de sécrétion des activités protéases sont moins prononcées entre Pleurotus ostreatus et Aspergillus oryzae quelle que 20 soit la durée de la première fermentation mais sont toujours en faveur d'Aspergillus oryzae dans les conditions où le complément minéral a été ajouté à hauteur de 2,5 % (voir figure 5C) et 5% (voir figure 4C). Dans leur ensemble, ces résultats montrent que le procédé de 5 fermentation séquentielle sur résidus de bois utilisant Pleurotus ostreatus puis Aspergillus oryzae permet la production d'enzymes, telles que les xylanases, amylases et protéases. La fermentation séquentielle permet la dégradation de la lignine. Un des freins à l'utilisation des composés lignocellulosiques et particulièrement du bois pour l'alimentation animale est sa rigidité due à sa teneur en 10 lignine d'environ 25% (Guerriero et al. 2016). La teneur en lignine du produit fermenté à l'issue de la fermentation séquentielle a été évaluée et représente 11% de lignine, valeur très inférieure à la teneur en lignine des résidus de bois (produit de départ). Les activités enzymatiques du produit fermenté peuvent être stabilisées sur le 15 substrat La sécrétion d'enzymes digestives lors de la seconde fermentation ouvrant des perspectives de valorisation des sciures de bois fermentées, il est apparu essentiel de développer un procédé de stabilisation et de conservation de ces enzymes simple et peu couteux. 20 Dans le procédé mis en oeuvre, à l'issue de la seconde fermentation, le produit fermenté dont le taux d'humidité avoisine les 60% est rendu homogène par agitation mécanique puis placé dans une enceinte à 24°C jusqu'à obtenir un pourcentage d'humidité de 12%, taux d'humidité stabilisant le produit d'un point de vue microbiologique et prévenant une reprise de croissance ou le développement d'autres types 25 de micro-organismes (Assamoi et al. 2009). La figure 6A présente les activités enzymatiques résiduelles après déshydratation à 12% et montre qu'une déshydratation réalisée dans ces conditions n'entraine aucune perte d'activités xylanases, amylases et protéases. La figure 6B présente ces mêmes activités résiduelles après conservation 30 à 4°C du produit fermenté et déshydraté durant une, deux, trois et quatre semaines. Aucune perte significative d'activité n'est observable quelles que soient les activités mesurées. La figure 6C présente les activités xylanases, amylases et protéases résiduelles après conservation à température ambiante du produit fermenté et déshydraté 21 durant une, deux, trois et quatre semaines. Comme précédemment, aucune perte significative d'activité n'est observable quelles que soient les activités mesurées. Ces résultats confirment donc la possibilité d'utiliser le substrat fermenté comme support de stabilisation/immobilisation des enzymes sécrétées. 5 La teneur en beta-glucanes (composés majoritaires de la paroi des champignons filamenteux) présents dans le produit fermenté final est évaluée à environ 8%. 3. Conclusion Les données expérimentales mettent en évidence la production d'un 10 produit fermenté de qualité alimentaire à partir de bois ; ce produit est complexe et composé de lignocellulose digérées résiduelle (dans une proportion similaire à celle de la paille), de mycélium et de composés sécrétés par les champignons comprenant des enzymes. Ces enzymes d'intérêt sont habituellement ajoutées à la ration alimentaire animale (Asmare 2014). Dans les procédés actuels, les enzymes purifiées doivent être 15 « diluées » par mélange à des farines ou matrices minérales avant d'être incorporées aux aliments. Les enzymes sécrétées et stabilisées sur le produit fermenté final selon l'invention sont déjà « diluées » par la présence du substrat résiduel et du mycélium, un « prémélange » avec une farine ou une matrice pourrait être évité facilitant la production et limitant le coût de production des aliments enrichis. 20 Références bibliographiques Agreste. (2012). Forests and and the the Forests sector sector Key data on : « Forested areas 2012 Edition, (May). Alexandre, S. (2017). Rapport de mission de la dellelguele interministelrielle a la fore t et 25 au bois. Asmare, B. (2014). Effect of common feed enzymes on nutrient utilization of monogastric animais, 5(July), 27-34. https://doi.org/10.5897/IJBMBR2014.0191 Assamoi, A. A., Destain, J., & Thonart, P. (2009). Aspects microbiologiques de la production par fermentation solide des endo- p -1 , 4-xylanases de moisissures : le cas 30 de Penicillium canescens, 13(2), 281-294. Bowman, S. M., & Free, S. J. (2006). 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Procédé de transformation de résidus de bois en produit alimentaire comestible pour un mammifère comprenant les étapes de : 1) optionnellement, prétraitement de résidus de bois ; 2) première fermentation d'un substrat composé de résidus de bois et comprenant optionnellement de 1 à 5% en poids sec d'un complément minéral alcalinisant, par un champignon lignivore comestible pendant une durée adaptée correspondant à la colonisation maximale du substrat avant fructification par ledit champignon ; 3) arrêt de la première fermentation par inactivation thermique dudit champignon lignivore comestible et broyage du produit obtenu à l'issue de ladite première fermentation ; 4) seconde fermentation du produit obtenu à l'étape 3) par un champignon du genre Aspergillus pendant une durée adaptée correspondant à la colonisation maximale du substrat avant sporulation par ledit champignon du genre Aspergillus ; 5) optionnellement, stabilisation du produit obtenu à l'issue de ladite seconde fermentation par déshydratation. 2. Procédé de transformation de résidus de bois en produit alimentaire comestible pour un mammifère selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape 1) de prétraitement comprend un broyage des résidus de bois de façon à obtenir une taille de résidus du bois inférieure ou égale à 2 cm et/ou un chauffage à une température d'au moins 70°C en milieu humide. 3. Procédé de transformation de résidus de bois en produit alimentaire comestible pour un mammifère selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que lesdits résidus de bois comprennent un mélange de entre 40 et 80% en poids de sciure de bois et entre 20 et 60% en poids de farine de bois. 4. Procédé de transformation de résidus de bois en produit alimentaire comestible pour un mammifère selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit complément minéral alcalinisant représente un apport de : - 170 à 330 kg/t de calcium (exprimé sous forme de CaO), 25 - 20 à 60 kg/t de potassium (exprimé sous forme de K20), - 25 à 46 kg/t de magnésium (exprimé sous forme de MgO), - 10 à 61 kg/t de phosphore (exprimé sous forme de P205), - des métaux, dont le Mn, Fe, Cu, Zn qui sont des co-facteurs d'enzymes digestives 5 sécrétées par les champignons, en proportions variables, et présente un pH, avant mélange avec les résidus de bois, compris entre 10 et 13. 5. Procédé de transformation de résidus de bois en produit alimentaire comestible pour un mammifère selon l'une quelconque des revendications précédentes, 10 caractérisé en ce que le champignon lignivore comestible est choisi parmi Pleurotus ostreatus, Pleurotus pulmonarius, pleurote de l'orme (Hypsizygus ulmarius), Agaricus blasei et Agaricus braziliensis. 6. Procédé de transformation de résidus de bois en produit alimentaire 15 comestible pour un mammifère selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit champignon du genre Aspergillus est choisi parmi Aspergillus oryzae, Aspegillus figer, Aspergillus sojae et Aspergillus awanori. 7. Produit alimentaire fermenté susceptible d'être obtenu par le procédé 20 selon l'une quelconque des revendications 1 à 6. 8. Produit alimentaire fermenté selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il a la composition suivante : - entre 5 et 10 U de xylanases/g de produit alimentaire sec ; 25 - entre 5 et 10 U d'amylases/g de produit alimentaire sec ; - entre 30 et 100 U de protéases/g de produit alimentaire sec ; - entre 20 et 40 mg de vitamine B3/g de produit alimentaire sec ; - un profil d'acides aminés composé de 10 et 15 mg d'Histidine, entre 30 et 45 mg d'Isoleucine, entre 40 et 65 mg de Leucine, entre 20 et 30 mg de Lysine, entre 10 30 et 15 mg de Methionine, entre 25 et 40 mg de Phenylalanine, entre 12 et 19 mg de Tyrosine, entre 35 et 54 mg de Thréonine, entre 25 et 40 mg de Valine et entre 8 et 12,5 mg de Tryptophane / g de protéines totales dudit produit alimentaire ; - une teneur en lignine inférieure à 18% en poids. 26 9. Utilisation du produit alimentaire selon la revendication 7 ou la revendication 8 comme complément alimentaire dans une ration alimentaire animale.