Brevet FR3078075A1 — publié le 20190823

DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne une méthode pour l'évaluation du caractère toxique d'un effluent aqueux, un kit pour la mise en oeuvre de ladite méthode et son utilisation dans le domaine de l'épuration des eaux domestiques, agricoles 5 ou industrielles et du suivi environnemental. ART ANTERIEUR L'évaluation de la toxicité d'un échantillon aqueux (effluent industriel ou eaux usées urbaines par exemple) consiste à mettre en contact cet échantillon avec 10 un organisme donné dans des conditions expérimentales déterminées afin d'observer les effets sur l'activité dudit organisme. Ce paramètre est toutefois directement dépendant de l'organisme mis en oeuvre. De nombreux tests d'évaluation ont vu le jour commercialement, chacun étant 15 basé sur un organisme propre. V.Kokkali et al. ont publié en 2014 (Trends in Analytical Chemistry 61, 133-155) une revue des tests commerciaux dédiés à la mesure de la toxicité d'échantillons aqueux. Dans 95% des cas, les tests s'appuient sur des approches mono-paramétriques mettant en oeuvre un organisme unique. La principale limite de ces tests réside dans la 20 représentativité des informations recueillies. En effet, chaque organisme renseigne quant à l'effet d'un échantillon sur un aspect de son métabolisme propre (activité respiratoire, mortalité cellulaire, taux de croissance, ...). Par conséquent, la représentativité de l'information recueillie est limitée. 25 Afin de palier à cette limitation, la société NCIMB (UK) propose deux méthodes similaires (MARA et LumiMARA) pour l'évaluation de la toxicité d'un composé chimique, reposant sur un panel de microorganismes contrôlés. Dans le cas du test MARA (Microbial Assay for Risk Assessment), dix souches bactériennes et une souche de levure constituent le panel biologique. Ce test vise à mesurer 30 l'effet toxique dudit composé à différents gradients de concentration sur la croissance cellulaire et à comparer la réponse obtenue à des profils préalablement établis pour des composés chimiques connus (voir aussi le 2 brevet EP1283899B1). La limite de l'interprétation de ce test MARA réside dans l'analyse des données multivariées recueillies, qui ne prend pas en considération la robustesse des souches mises en oeuvre. Une souche très sensible ayant le même poids dans l'analyse des données qu'une souche plus robuste. Par conséquent, un échantillon induisant une toxicité sur la souche la plus robuste sera considérée comme ayant une toxicité semblable à un échantillon induisant un effet sur la souche très sensible. Dans le cas du test LumiMARA, il s'agit uniquement de souches bactériennes bioluminescentes, le test se focalisant sur l'inhibition de la bioluminescence afin d'estimer l'effet toxique. Ce test présente les mêmes inconvénients que le test MARA. De plus, la plupart de ces souches bactériennes bioluminescentes sont d'origine marine, ce qui nécessite une préparation spécifique des échantillons à tester de plus faible salinité que l'eau de mer (notamment ajustement de la salinité). Les méthodes de mesure actuelles manquent pour la plupart de représentativité vis-à-vis du paramètre de toxicité globale d'un échantillon aqueux. BUTS DE L'INVENTION Un premier but de l'invention est donc de proposer une méthode permettant d'évaluer la toxicité globale d'un échantillon aqueux et permettant en particulier de pouvoir comparer des échantillons entre eux. Un autre but de l'invention est de proposer une méthode d'évaluation de la toxicité d'un échantillon aqueux qui soit précise, reproductible et rapide (de préférence moins de deux heures), permettant par exemple de répercuter l'information sur des conditions de traitement ou d'épuration de l'effluent testé. 25 30 Un autre but de l'invention est de proposer une méthode permettant d'évaluer la toxicité globale, sans nécessiter de dilution de l'échantillon. 3 Un autre but de l'invention est de proposer une méthode aisée à mettre en oeuvre et pouvant être automatisée. 5 DESCRIPTION DE L'INVENTION A cet effet, la présente invention concerne une méthode d'estimation de la toxicité d'un échantillon aqueux comprenant les étapes successives suivantes : - répartition de différentes fractions de l'échantillon aqueux d'un milieu à tester dans au moins huit cellules de mesure, de préférence au moins dix cellules de 10 mesure, renfermant chacune une souche microbienne unique, non pathogène, lesdites souches microbiennes appartenant à un panel de différentes souches microbiennes présentant des profils de résistance toxicologique décroissants, chaque souche microbienne étant préalablement affectée d'un coefficient dénommé indice de robustesse ou indice de résistance toxicologique (Ind-Rob) 15 vis-à-vis de molécules ou de conditions fréquemment rencontrées dans ledit milieu à tester; - placement des cellules de mesure dans une enceinte thermostatée ; - suivi de l'inhibition de l'activité respiratoire microbienne de chaque fraction d'échantillon pendant une durée donnée, d'au moins 15 minutes, de préférence 20 au moins une heure, le résultat final et/ou les résultats cinétiques relatifs à chaque fraction, fournissant des informations sur l'activité respiratoire des microorganismes, - détermination d'un indice de toxicité globale (Ind-TOX) de l'échantillon aqueux en présence de chaque souche microbienne, en tenant compte des 25 indices de robustesse de chacune des souches. Il s'avère que cette méthode permet d'obtenir une estimation très rapide, en moins de deux heures, voire dès 15 minutes, de la toxicité globale d'un échantillon, ce qui permet par exemple un suivi (quasi en temps réel) de la 30 qualité d'épuration d'un traitement appliqué à cet effluent. 4 L'estimation de la réponse de chaque souche microbienne est prise individuellement dans un premier temps, chaque réponse individuelle est ensuite pondérée de l'indice de robustesse de la souche microbienne considérée pour obtenir une valeur de l'indice de toxicité globale. 5 Par "suivi", on entend par exemple une mesure à intervalles réguliers de l'effet toxique de l'échantillon analysé sur l'activité biologique des microorganismes. Le résultat final donne une information sur la capacité d'inhibition de la croissance microbienne de l'échantillon et la pente de la courbe une 10 information sur la vitesse de cette inhibition avec la souche microbienne en présence. Selon un premier mode de réalisation de l'invention, le suivi de l'activité métabolique des microorganismes est effectué au moyen d'un capteur 15 d'oxygène, redox ou de pH présent dans la cellule de mesure. Selon un second mode de réalisation de l'invention, un marqueur de l'activité métabolique des bactéries, tel qu'un marqueur fluorescent et/ou coloré de l'activité respiratoire des dits microorganismes est ajouté dans chaque cellule 20 de mesure, le suivi de l'activité respiratoire desdits microorganismes étant effectué par spectrophotométrie. Le marqueur de l'activité métabolique des bactéries est avantageusement la résazurine. En effet, la molécule de résazurine est réduite en résorufine de couleur rose en présence d'une activité métabolique cellulaire, cette réaction étant quantitativement corrélée à la respiration microbienne de l'échantillon considéré. Avec ce marqueur, le suivi de l'activité métabolique peut être réalisé par colorimétrie (pic d'absorbance de la résazurine : 601 nm / pic d'absorbance de la résorufine : 571 nm) et/ou par spectrophotométrie de fluorescence effectué à une longueur d'onde d'excitation de 540 nanomètres et une longueur d'onde d'émission de 610 nanomètres environ. 5 La méthode selon l'invention permet ainsi d'observer la cinétique de croissance microbienne, sans nécessiter de dilution de l'échantillon. Cette méthode peut aisément être automatisée. 5 Des cellules de mesure témoins peuvent être prévues : - Témoin "échantillon" (échantillon seul + marqueur). Ce témoin permet de mesurer le comportement de l'échantillon sur le marqueur sans l'action des microorganismes. Ce témoin devra être déduit du signal biologique mesuré 10 (microorganismes + échantillon + marqueur : ESSAI) : ESSAI - Témoin "échantillon" = ESSAI réel - Témoin "microorganismes" (microorganismes + marqueur) est utilisé comme référence biologique mesurant l'activité de chacune des souches de 15 microorganismes en condition normale (pas de toxicité). Ce témoin sert de référence pour calculer le taux d'inhibition (Tx Inh) : Tx Inh = (Témoin "microorganismes" - ESSAI réel)/Témoin "microorganismes" De manière préférée, chaque cellule de mesure est préparée selon les étapes 20 successives suivantes : - isolement et culture de la souche microbienne sélectionnée, et mise en place de celle-ci dans ladite cellule, - conditionnement dans ladite cellule avec ajout d'un agent protecteur de la souche microbienne vis-à-vis de la lyophilisation, 25 - puis lyophilisation de la souche microbienne et conservation. Les étapes de culture de la souche microbienne permettent notamment de placer les microorganismes en phase exponentielle de croissance avec une population homogène. 30 L'agent protecteur est avantageusement un diholoside tel que le saccharose ou un triholoside tel que le raffinose. 6 L'étape de lyophilisation est de préférence précédée d'une phase de congélation dans une gamme de température allant de -20°C à -80°C, la lyophilisation ayant lieu à une température inférieure à -40°C sous une 5 pression inférieure à 0,10 mbar (par exemple d'environ 0,05 mbar). A titre d'exemple, les différentes souches microbiennes sélectionnées, notamment pour une évaluation de toxicité d'un échantillon d'effluent d'eaux usées urbaines ou industrielles ou d'eaux naturelles, font partie d'un panel de 10 souches bactériennes choisies parmi : Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Enterobacter helveticus, Proteus mira buis, Budvicia aquatica, Zoo gloea resiniphila, Rhizobium radiobacter, Thauera linaloolentis, Bosea vertrisii, Comamonas testosteroni, Comamonas denitrificans, Arthrobacter aurescens, Staphylococcus sp, Acinetobacter 15 towneri, Rhodococcus rhodochrous, Corynebacterium pseudodiphtheriticum, Variovorax paradoxus, Staphylococcus auricularis, Sphingobium yanoikuyae, Cupriavidus necator, Paracoccus denitrificans, Bacillus subtilis subtilis, Paracoccus pantotrophus, Bacillus funiculus, Bacillus mycoides, classées par ordre décroissant de résistance à la toxicité. 20 Les résultats individuels des mesures d'activité métabolique tels que les cinétiques d'activité respiratoire de chacune des souches, par rapport à un témoin, sont exprimés en taux d'inhibition (Tx_inh) de ladite souche, et lesdits résultats individuels sont regroupés en donnant une empreinte toxicologique 25 de l'échantillon. Ensuite, chaque souche microbienne étant initialement affectée d'un coefficient dénommé indice de robustesse ou indice de résistance toxicologique (allant de 0 à 1), un indice toxicologique global de l'échantillon est calculé selon la 30 formule (I) suivante : Iii (i_TOX = r,"_1(Inci_Rohn) D_1(Inc1 Roi), xTx_Inh ) (I) 7 avec X: nombre de souches microbiennes testées Ind TOX: Indice de toxicité globale Ind Robn: Indice de robustesse de la souche n 5 Tx_Inhn: Taux d'inhibition de la souche n L'indice de robustesse ou indice de résistance toxicologique est préalablement déterminé pour chaque souche microbienne, vis-à-vis de conditions particulières (par exemple pH, salinité) ou en présence de composés toxiques 10 (tels que oxydants, désinfectants, antibiotiques, métaux lourds...) susceptibles d'être rencontrés dans les eaux de surface, les effluents de station d'épuration ou dans un effluent industriel particulier à tester. Cet indice permet de pondérer la réponse obtenue avec chacune des souches 15 microbiennes. En effet, parmi les microorganismes sélectionnés, certains présentent une tolérance particulièrement forte vis à vis des effluents à tester alors que d'autres, au contraire, sont immédiatement impactés par les composés présents dans les effluents testés. L'indice de toxicité globale tient ainsi compte des comportements et sensibilités de chacune des souches. 20 Ainsi au moyen de la méthode selon la présente invention, les microorganismes sélectionnés fournissent non seulement une empreinte spécifique de la toxicité de l'échantillon testé, mais aussi un indice global de toxicité après pondération des réponses en fonction de la sensibilité propre des 25 microorganismes. La présente invention concerne également un kit pour réaliser l'évaluation de la toxicité d'un échantillon aqueux, ledit kit comprenant : - au moins huit cellules de mesure, de préférence dix cellules de mesure, 30 chacune renfermant une souche microbienne unique, non pathogène, et lyophilisée en présence d'un agent de protection, 8 - de préférence une cellule de mesure témoin pour l'échantillon et une cellule de mesure témoin par souche microbienne, - un éventuel marqueur d'activité métabolique desdites bactéries, tel qu'un marqueur fluorescent et/ou coloré, et 5 - une notice détaillée de mise en oeuvre de la méthode telle que décrite ci-dessus. Les cellules de mesure sont avantageusement des flacons en verre, fermés, de préférence sous la forme de tubes, tubes individuels ou agencés en 10 microplaques. La présente invention concerne également l'utilisation de la méthode d'estimation décrite ci-dessus, pour l'estimation de la toxicité d'un effluent d'eaux usées urbaines, d'effluent de l'agro-alimentaire ou de l'industrie, d'eaux 15 pluviales, d'eaux de ruissellement, d'eaux de surface ou souterraine, ou d'eaux marines. La méthode selon l'invention trouve une utilisation particulièrement avantageuse pour le suivi de filières de traitement ou d'épuration, ou une 20 surveillance environnementale. BREVE DESCRIPTION DES DESSINS L'invention sera bien comprise à la lecture de la description suivante d'exemples de réalisation, en référence aux dessins annexés dans lesquels : 25 La figure 1 est un schéma présentant la résistance toxicologique de différentes souches bactériennes. La figure 2 présente des exemples de cinétiques d'activité respiratoire de 30 microorganismes en fonction du temps selon l'intensité de la toxicité. La figure 3 montre un exemple de suivi de traitement de différents échantillons 9 d'effluents (A à E) avec leurs taux d'inhibition de respiration bactérienne vis à vis de différentes souches, avant traitement et après traitement dans une station d'épuration (effluent F). 5 La figure 4 présente les indices de toxicité globale calculés pour les échantillons de la figure 3. EXEMPLES Les différentes étapes de préparation des souches microbiennes avant leur 10 introduction dans les cellules de mesure sont présentées ci-après : Etape 1 : Culture des souches avant lyophilisation La souche microbienne sélectionnée est isolée sur boite de pétri (milieu LB gélose: 5g/L NaCI, 5g/L Tryptone, 0,5g/L Extrait de levure, 12g/L d'agar) à 15 30°C pendant 24 à 48 heures. Elle est ensuite inoculée et incubée en milieu LB (5g/L NaCI, 5g/L Tryptone et 0,5g/L Extrait de levure) à 30°C, sous agitation à 250 tours/min pendant 16 à 20 heures. La culture est suivie par densité optique (indicateur de densité cellulaire) à 620 nm, jusqu'à obtenir une culture homogène de bactéries en phase exponentielle de croissance. 20 Etape 2: récupération et lavage des souches Après centrifugation (6400 tours par min/ 4min/ 4°C), le culot est récupéré et éventuellement lavé plusieurs fois par une solution de Mg504 10-2 M, puis conditionné dans une solution de lyophilisation renfermant un agent de 25 protection et un substrat carboné. L'agent de protection est ici le raffinose. Le substrat carboné peut être : - une source de carbone spécifique (glucose, acétate de sodium, pyruvate,...) - un mélange connu permettant aux cellules d'avoir une activité biologique significative (eaux usées standardisées selon la norme OCDE 209). 30 Etape 3: Lyophilisation des souches La solution de lyophilisation renfermant lesdites bactéries en suspension sont 10 réparties de manière égale dans différents tubes, qui sont ensuite soumis à une congélation à -80°C pendant au moins 3 heures, puis à une étape de lyophilisation à -50°C sous 0,05 mbar pendant 36 heures. L'ensemble peut alors être conservé pendant plusieurs mois à -20 °C. 5 Etape 4: Préparation de l'analyse Les bactéries lyophilisées peuvent être réhydratées pendant une durée de 0 à 30 min par ajout d'eau distillée. Chaque tube renfermant une souche microbienne unique est alors prêt pour 10 l'analyse proprement dite. Etape 5 : Analyse L'échantillon aqueux à tester est ajouté soit directement à la suspension microbienne lyophilisée, soit à la suspension microbienne réhydratée. Puis, 15 l'indicateur d'activité métabolique, ici la résazurine, est introduit dans la cellule de mesure dans les proportions suivantes : 10% de marqueur (résazurine), 23,3 % de suspension microbienne et 66,7 % d'échantillon à tester. Le suivi de la respiration microbienne est alors suivi par fluorescence (longueur d'onde d'excitation de 540 nm et longueur d'onde d'émission de 610 nm). Les 20 résultats pour chaque souche tiennent compte des témoins réalisés simultanément (un témoin par souche bactérienne testée = "souche bactérienne + marqueur" et un témoin = "échantillon + marqueur") comme indiqué précédemment dans la description de l'invention. 25 Chaque souche microbienne sélectionnée donne une information partielle. Cependant pour obtenir une estimation plus globale de la teneur en matière organique biodégradable d'un échantillon, il est nécessaire de combiner les informations provenant de plusieurs souches microbiennes. 30 Sélection des souches microbiennes A cet effet, les inventeurs ont sélectionné 28 souches bactériennes (voir tableau 1 et figure 1) issues du milieu naturel (et fréquemment rencontrées 11 dans les eaux usées urbaines) et les ont confrontées à différentes molécules (telles que antibiotiques, métaux lourds, désinfectants...) ou différentes conditions (pH, salinité ...) pouvant affecter leur croissance (c'est-à-dire potentiellement toxiques pour ces bactéries). Au moins 21 tests différents ont 5 été réalisés pour chacune des souches bactériennes. Souches Collection Acinetobacter towneri DSM 14962 Arthrobacter aurescens DSM 20116 Bacillus funiculus DSM 15141 Bacillus mycoides DSM 299 Bacillus subtilis subsp. subtilis DSM 10 Bosea vestrisii DSM 21229 Budvicia aquatica DSM 5075 Comamonas denitrificans DSM 17887 Comamonas testosteroni DSM 38 Corynebacterium pseudodiphtheriticum CIP A 105 Cupriavidus necator DSM 428 Enterobacter helveticus DSM 18396 Escherichia coli ATCC 700926 Paracoccus denitrificans DSM 1404 Souches Collection Paracoccus pantotrophus DSM 65 Proteus mirabilis CIP A235 Pseudomonas aeruginosa DSM 11634 Pseudomonas aeruginosa DSM 6279 Pseudomonas putida DSM 1868 Pseudomonas putida DSM 84 Rhizobium radiobacter DSM 7215 Rhodococcus rhodochrous DSM 6427 Sphingobium yanoikuyae DSM 6900 Staphylococcus auricularis DSM 20609 Staphylococcus sp. DSM 1057 Thauera linaloolentis DSM 12138 Variovorax paradoxus DSM 645 Zoogloea resiniphila DSM 14766 DSM: Collection Allemande de microorganismes ATCC: American Type Culture Collection CIP: Collection de l'Institut Pasteur 10 Tableau 1 A partir de l'ensemble des résultats obtenus, un indice de résistance toxicologique dénommé aussi indice de robustesse (Ind_Rob) a été attribué à 15 chacune des souches bactériennes testées et ces souches ont été classées par ordre décroissant de résistance à la toxicité (voir figure 1). Pour les tests de toxicité d'échantillons aqueux un panel de huit ou dix souches bactériennes présentant des indices de résistance variés (s'échelonnant entre les valeurs 1,00 pour E. coli et 0,13 pour B. mycoïdes) peut ainsi être choisi. 20 A titre d'exemple Le panel utilisé était constitué des huit souches bactériennes suivantes (avec leur indice de résistance toxicologique) : 12 Escherichia cou (1,00) Pseudomonas putida (0,88) Pseudomonas aeruginosa (0,81) Rhizobium radiobacter (0,63) 5 Comamonas denitrificans (0,53) Staphylococcus auricularis (0,38) Bacillus subtifis subtifis (0,34) Bacillus mycoides (0,13). 10 Les taux d'inhibition de différents échantillons d'eaux usées à traiter (notées A, B, C, D et E sur les figures 3 et 4) entrant dans une station d'épuration ont été mesurés après suivi de la cinétique respiratoire de chacune des huit souches individuellement pendant 1h15 à 30°C. L'effluent (F) de sortie de la station d'épuration, après traitement (physico15 chimique), a également été testé en présence de chacune des huit souches bactériennes individuellement. Les résultats regroupés sur la figure 3 montrent pour chaque échantillon une empreinte de toxicité spécifique et propre à l'échantillon testé. On note que les 20 empreintes diffèrent significativement entre les échantillons démontrant une toxicité induite par des composés chimiques différents. Plus le taux d'inhibition est élevé, plus l'effet toxique est important vis-à-vis d'une souche bactérienne. Le traitement appliqué « abat » significativement la toxicité de l'effluent vis-à25 vis de la quasi-totalité des souches. A delà de l'empreinte toxicologique qui apporte des informations vis-à-vis de chacune des souches, l'indice de toxicité global a été déterminé au moyen de la formule (I) suivante : Ind_TOX = -1(ind_Rob, x Tx_inhn) 30 i(Incl_Robt,) 13 qui, appliquée à l'exemple particulier de l'échantillon A: (1 x 0% + 0,88 X 0% + 0,8 + 0,63 x 6% + 0:33 X 0% + 0,38 x 0% + 0,34 x 0% + 0,13 x 99%) (1 0,88 0.81 0,( 3 a38 + 0,34 + 0,13) Ind_TOX = donne un indice de toxicité global Ind_TOX = 0,04 5 Les indices de toxicité calculés pour chacun des échantillons sont présentés sur la figure 4. Cet indice global peut ainsi donner une indication rapide à l'opérateur d'une REVENDICATIONS1. Méthode d'estimation de la toxicité d'un échantillon aqueux comprenant les 5 étapes successives suivantes : - répartition de différentes fractions de l'échantillon aqueux d'un milieu à tester dans au moins huit cellules de mesure, de préférence au moins dix cellules de mesure, renfermant chacune une souche microbienne unique, non pathogène, lesdites souches microbiennes appartenant à un panel de différentes souches 10 microbiennes présentant des profils de résistance toxicologique décroissants, chaque souche microbienne étant préalablement affectée d'un coefficient dénommé indice de robustesse ou indice de résistance toxicologique (Ind-Rob) vis-à-vis de molécules ou de conditions fréquemment rencontrées dans ledit milieu à tester; 15 - placement des cellules de mesure dans une enceinte thermostatée ; - suivi de l'inhibition de l'activité respiratoire microbienne de chaque fraction d'échantillon pendant une durée donnée, d'au moins 15 minutes, de préférence au moins une heure, le résultat final et/ou les résultats cinétiques relatifs à chaque fraction, fournissant des informations sur l'activité respiratoire des 20 microorganismes, - détermination d'un indice de toxicité globale (Ind-TOX) de l'échantillon aqueux en présence de chaque souche microbienne, en tenant compte des indices de robustesse de chacune des souches. 25 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que chaque cellule de mesure est préparée selon les étapes successives suivantes : - isolement et culture de la souche microbienne sélectionnée, et mise en place de celle-ci dans ladite cellule, - conditionnement dans ladite cellule avec ajout d'un agent protecteur de la 30 souche microbienne vis-à-vis de la lyophilisation, - puis lyophilisation de la souche microbienne et conservation. 15 3. Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que la phase de lyophilisation est précédée d'une phase de congélation dans une gamme de température allant de -20°C à -80°C, la lyophilisation ayant lieu à une température inférieure à -40°C sous une pression inférieure à 0,10 mbar. 4. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le suivi de l'activité métabolique des microorganismes est effectué au moyen d'un capteur d'oxygène, redox ou de pH présent dans la cellule de mesure. 5. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'un marqueur de l'activité métabolique des bactéries, tel qu'un marqueur fluorescent et/ou coloré de l'activité respiratoire des dits microorganismes est ajouté dans chaque cellule de mesure, le suivi de l'activité respiratoire desdits microorganismes étant effectué par spectrophotométrie. 6. Méthode selon la revendication 5, caractérisée en ce que le marqueur de l'activité métabolique des bactéries est la résazurine. 7. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les différentes souches microbiennes sélectionnées, notamment pour une évaluation de toxicité d'un échantillon d'effluent d'eaux usées urbaines ou industrielles ou d'eaux naturelles, font partie d'un panel de souches bactériennes choisies parmi : Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Enterobacter helveticus, Proteus mira buis, Budvicia aquatica, Zoo gloea resiniphila, Rhizobium radiobacter, Thauera linaloolentis, Bosea vertrisii, Comamonas testosteroni, Comamonas denitrificans, Arthrobacter aurescens, Staphylococcus sp, Acinetobacter towneri, Rhodococcus rhodochrous, Corynebacterium pseudodiphtheriticum, Variovorax paradoxus, Staphylococcus auricularis, Sphingobium yanoikuyae, Cupriavidus necator, Paracoccus denitrificans, Bacillus subtilis subtilis, Paracoccus pantotrophus, Bacillus funiculus, Bacillus 16 mycoides, classées par ordre décroissant de résistance à la toxicité. 8. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les résultats individuels des mesures d'activité 5 métabolique tels que les cinétiques d'activité respiratoire de chacune des souches, par rapport à un témoin, sont exprimés en taux d'inhibition (Tx_Inh) de ladite souche, et lesdits résultats individuels sont regroupés en donnant une empreinte toxicologique de l'échantillon. 10 9. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que chaque souche microbienne étant initialement affectée d'un coefficient dénommé indice de robustesse ou indice de résistance toxicologique (allant de 0 à 1), un indice toxicologique global de l'échantillon est calculé selon la formule (I) suivante : r1(Ind Rob, xTx_Inh ) IndTOX = 15 ri_i(Ind_Rohn) (I) avec X: nombre de souches microbiennes testées Ind TOX: Indice de toxicité globale Ind Robn: Indice de robustesse de la souche n 20 Tx_Inhn: Taux d'inhibition de la souche n 10. Kit pour réaliser l'évaluation de la toxicité d'un échantillon aqueux, ledit kit comprenant : - au moins huit cellules de mesure, de préférence dix cellules de mesure, 25 chacune renfermant une souche microbienne unique, non pathogène, et lyophilisée en présence d'un agent de protection, - de préférence une cellule de mesure témoin pour l'échantillon et une cellule de mesure témoin par souche microbienne, - un marqueur d'activité métabolique desdites bactéries, tel qu'un marqueur 30 fluorescent et/ou coloré, et 17 - une notice détaillée de mise en oeuvre de la méthode conforme à l'une des revendications précédentes. 11. Kit selon la revendication 10, caractérisé en ce que les cellules de mesure 5 sont des flacons en verre, fermés, de préférence sous la forme de tubes individuels ou agencés en microplaques. 12. Utilisation de la méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, pour l'estimation de la toxicité d'un effluent d'eaux usées urbaines, d'effluent de 10 l'agro-alimentaire ou de l'industrie, d'eaux pluviales, d'eaux de ruissellement, d'eaux de surface ou souterraine, ou d'eaux marines. 13. Utilisation selon la revendication 12, pour le suivi de filières de traitement ou d'épuration, ou une surveillance environnementale. 15