Brevet FR3077823A1 — publié le 20190816

L'invention concerne un procédé de préparation d'un lysat plaquettaire irradié ainsi qu'un lysat plaquettaire irradié obtenu par un tel procédé et un procédé de culture de cellules utilisant un tel lysat plaquettaire irradié. L'invention s'applique au domaine des produits dérivés des plaquettes sanguines, et notamment au domaine de la culture cellulaire pour cultiver les cellules à usage thérapeutique, plus particulièrement les cellules souches mésenchymateuses. Pour cultiver des cellules animales in vitro, on utilise classiquement des milieux de base de type RPMI (Roswell Park Memorial Institute), MEM (Modified Eagle Medium) ou DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium) comprenant essentiellement des sels minéraux, du glucose, des acides aminés, des vitamines et des bases azotées. Ces milieux de base sont généralement complémentés extemporanément avec des antibiotiques pour prévenir la contamination bactérienne, de la L-glutamine - un acide aminé instable -, et entre 1,5 et 10% de sérum de veau foetal comme complément nutritif. Pour utiliser des produits plus performants et pour éviter l'utilisation de produits xénogènes dans les cultures de cellules à usage thérapeutique, il a été proposé de remplacer le sérum de veau foetal par du lysat plaquettaire humain. Ce dernier présente notamment l'avantage de comprendre une quantité importante de facteurs de croissance tels que par exemple le facteur de croissance transformant bêta1 (TGF-beta1, Transforming Growth Factor-beta1), le facteur de croissance épidermique (EGF, Epidermal Growth Factor), le facteur de croissance dérivé des plaquettes AB (PDGF-AB, Platelet-Derived Growth Factor-AB), le facteur de croissance dérivé des plaquettes BB (PDGF-AB, PlateletDerived Growth Factor-BB), le facteur de croissance 1 ressemblant à l'insuline (IGF-1, Insulin-like Growth Factor-1), le facteur de croissance de l'endothélium vasculaire (VEGF, Vascular Endothelial Growth Factor) et le facteur de croissance des fibroblastes 2 (FGF-2, Fibroblast Growth Factor 2), aussi appelé facteur de croissance des fibroblastes basique (bFGF, Basic Fibroblast Growth Factor). 2 Le lysat plaquettaire est typiquement préparé à partir d'une suspension de plaquettes dans du plasma ou dans un mélange plasma et solution additive pour plaquettes, à laquelle on fait subir un ou plusieurs cycles de 5 congélation/décongélation afin de libérer les facteurs de croissance contenues dans les plaquettes par lyse cellulaire. Un inconvénient d'un tel lysat plaquettaire est qu'il contient du fibrinogène, provenant du plasma, dans une quantité variant d'environ 0,5 à 3 mg/ml, de sorte 10 que l'addition d'un anticoagulant au milieu de base est nécessaire pour éviter une coagulation du milieu de base (Burnouf T, Strunk D, Koh MB, et al.: Human platelet lysate: replacing fetal bovine serum as a gold standard for human cell propagation? Biomaterials 2016; 76:371-387). 15 L'anticoagulant le plus utilisé est l'héparine. Mais les héparines disponibles dans le commerce sont généralement d'origine porcine, de sorte que le milieu de culture, bien que dépourvu de sérum de veau foetal, comprend encore un produit xénogène. 20 En outre, à certaines concentrations, l'héparine a un effet négatif sur la prolifération cellulaire (Viau, Sabrina, et al. "Pathogen reduction through additive-free short-wave UV light irradiation retains the optimal efficacy of human platelet lysate for the expansion of human bone marrow mesenchymal stem cells." PloS one 12.8 (2017): e0181406). 25 Plusieurs stratégies ont été proposées pour éliminer le pouvoir de coagulation d'un lysat plaquettaire : Une première méthode est décrite dans le document WO 2013/003356, qui 30 consiste à ajouter au lysat plaquettaire du chlorure de calcium, induisant la conversion du fibrinogène en fibrine et la formation d'un caillot. Le caillot est ensuite éliminé par centrifugation pour obtenir un lysat comprenant moins de 3 0,05 mg/mi de fibrinogène. Cette méthode entraîne cependant une perte en facteurs de croissance qui seraient piégés dans le caillot. Une méthode indirecte consiste à éliminer le plasma qui contient le fibrinogène 5 de la suspension de plaquettes de départ, par exemple en effectuant plusieurs cycles de lavage des plaquettes avant de préparer le lysat plaquettaire. Cette stratégie est par exemple décrite dans le document WO 2008/034803 et dans le document US 2012/0156306. L'élimination du plasma entraîne cependant de fait l'élimination d'autres protéines plasmatiques telles que l'albumine, nécessaires à 10 la prolifération cellulaire. Dans le document WO 2017/162830, il est proposé d'éliminer le plasma des suspensions de plaquettes de départ puis de chauffer le lysat plaquettaire entre 55 et 65°C pendant 20 à 40 minutes, de sorte à obtenir une quantité de 15 fibrinogène inférieure à 0,3 mg/ml. Cependant, ce procédé réduit également la quantité des autres protéines présentes dans le lysat plaquettaire d'au moins 70%, ce qui n'est pas souhaitable pour une utilisation en culture cellulaire. Laner-Plamberger et al. proposent une méthode originale consistant à ajouter le 20 lysat plaquettaire non défibrinogéné au milieu de base afin de former un gel de fibrine, puis de détruire et éliminer ce gel par agitation vigoureuse et centrifugation. Le milieu de base complémenté en lysat plaquettaire ainsi obtenu est dépourvu de fibrinogène, mais contient encore les autres protéines plasmatiques (J Transi Med (2015) 13:354). Cette méthode est cependant 25 complexe à mettre en place dans le cadre d'une production industrielle standardisée et de qualité contrôlée de lysats plaquettaires. Dans le document WO 2016/193591, le lysat plaquettaire subit une irradiation par un rayonnement ionisant afin d'être stérilisé. Suivant la dose d'irradiation 30 utilisée, le lysat plaquettaire irradié peut comprendre moins de 0,4 mg/mi de fibrinogène. Selon l'exemple décrit, un lysat plaquettaire a été préparé à partir de concentrés plaquettaires comprenant des plaquettes suspendues dans 30% de plasma et 70% d'une solution de conservation, puis irradié à une dose de 35 ou 4 45 kGy. Lorsque le lysat plaquettaire est ajouté dans une quantité de 8% dans le milieu de base, le milieu de base ne coagule pas. Des essais supplémentaires d'irradiation par rayonnement gamma réalisés par 5 le demandeur ont montré que le pouvoir de coagulation du lysat plaquettaire dépendait non seulement de la dose d'irradiation utilisée, mais aussi de la quantité de protéines dans le lysat plaquettaire et de la quantité de lysat plaquettaire ajouté au milieu de base. 10 Ainsi, un lysat plaquettaire préparé à partir de concentrés plaquettaires comprenant des plaquettes suspendues dans 30% plasma, comprenant entre 20 et 30 g/I de protéines totales, et irradié à environ 35 kGy selon la méthode décrite dans le document WO 2016/193591, coagule à 15% et plus dans un milieu de base MEM dépourvue d'héparine. Un lysat plaquettaire préparé à partir de 15 concentrés plaquettaires comprenant des plaquettes suspendues dans 100% plasma, comprenant entre 60 et 80 g/I de protéines totales, et irradié à 35 kGy selon la méthode décrite dans le document WO 2016/193591, coagule dès 5% dans un milieu de base MEM dépourvue d'héparine. 20 Pour réduire le pouvoir de coagulation d'un lysat plaquettaire, le demandeur a envisagé d'augmenter la dose d'irradiation utilisée jusqu'à 75 kGy pour obtenir un lysat plaquettaire stérilisé et non coagulable, même à forte concentration dans le milieu de base. Mais à très forte dose d'irradiation par rayonnement gamma, les protéines plasmatiques d'intérêt pour la croissance cellulaire sont dégradées. 25 Il reste donc un besoin d'obtenir un lysat plaquettaire avec un pouvoir réduit de coagulation en présence de calcium, même quand le lysat plaquettaire est ajouté à concentration élevée dans un milieu de base comprenant du calcium, tout en préservant les protéines plasmatiques. 30 En outre, le document WO 2013/042095 et l'article de S. Castiglia (Castiglia, Sara, et al. "Inactivated human platelet lysate with psoralen: a new perspective for mesenchymal stromal cell production in Good Manufacturing Practice 5 conditions." Cytotherapy 16.6 (2014): 750-763) divulguent un lysat plaquettaire obtenu à partir de concentrés de plaquettes issus de buffy coat qui ont subi une inactivation virale par un rayonnement ultraviolet en présence de psoralène, un agent chimique intercalant de l'ADN. Cette technique d'inactivation virale 5 présente cependant l'inconvénient de devoir utiliser un agent chimique qui doit ensuite être éliminé du produit traité. Une autre méthode d'obtention d'un lysat plaquettaire dépourvu de pathogènes est décrite dans l'article de S. Viau (Viau, Sabrina, et al. "Pathogen reduction 10 through additive-free short-wave UV light irradiation retains the optimal efficacy of human platelet lysate for the expansion of human bone marrow mesenchymal stem cells." PloS one 12.8 (2017): e0181406). Dans cet article, un lysat plaquettaire est obtenu à partir de concentrés plaquettaires qui ont subi une inactivation virale par rayonnement UVC, en l'absence d'agent chimique. 15 Dans ces derniers documents, le lysat plaquettaire préparé à partir de concentrés plaquettaires ayant subi une inactivation virale reste coagulable. L'invention propose un procédé de préparation d'un lysat plaquettaire avec un 20 pouvoir réduit de coagulation en présence de calcium, tout en conservant les protéines plasmatiques nécessaires notamment à la prolifération cellulaire. Ainsi, selon un premier aspect, l'invention propose un procédé de préparation d'un lysat plaquettaire irradié comprenant les étapes suivantes : 25 - la fourniture d'un lysat plaquettaire afin d'obtenir un lysat plaquettaire de départ, ledit lysat plaquettaire de départ comprenant d'une part des facteurs plaquettaires incluant des facteurs de croissance et d'autre part des protéines plasmatiques incluant des facteurs de coagulation et des protéines autres que les facteurs de coagulation, 30 - la double irradiation dudit lysat plaquettaire de départ, par un rayonnement UVC de longueur d'onde comprise entre 200 et 280 nm et par un rayonnement ionisant ayant une longueur d'onde inférieure ou égale à 100 nm, afin d'obtenir un lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC et par rayonnement ionisant, ladite 6 double irradiation par rayonnement UVC et par rayonnement ionisant étant agencée pour conserver au moins 75% de la concentration en protéines totales dudit lysat plaquettaire de départ tout en réduisant d'au moins 40% la concentration en au moins un desdits facteurs de coagulation incluant le 5 fibrinogène, le facteur II, le facteur VII, le facteur IX, le facteur X et le facteur XI du lysat plaquettaire de départ. Selon un deuxième aspect, l'invention concerne le lysat plaquettaire irradié obtenu par le procédé selon le premier aspect de l'invention. 10 Selon un troisième aspect, l'invention propose un procédé pour la culture de cellules, notamment de cellules souches mésenchymateuses, comprenant la mise en contact desdites cellules avec une composition nutritive comprenant un milieu de base et un lysat plaquettaire irradié selon le deuxième aspect de 15 l'invention. D'autres objets et avantages apparaîtront au cours de la description qui suit. Les figures 1 à 6 représentent, respectivement, les concentrations en facteurs de 20 1G F-1, TGF-bêta1, bFGF, PDGF-AB, EGF et VEGF dans trois lots de lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC, en fonction de la dose d'irradiation. Les figure 7 à 11 représentent, respectivement, les concentrations en facteurs de coagulation facteur II, facteur VII, facteur IX, facteur X et facteur XI, exprimées 25 en pourcentage par rapport à un plasma humain normal étalon, dans trois lots de lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC, en fonction de la dose d'irradiation. La figure 12 représente les facteurs d'amplification au rme jour de culture de 30 cellules souches mésenchymateuses cultivées en présence de lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC en fonction de la dose d'irradiation. 7 Les figures 13 à 16, montrent respectivement, les concentrations en facteur de croissance bFGF, PDGF-AB, PDGF-BB et TGF-bêta1, d'un lysat plaquettaire non irradié (LP), d'un lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC à une dose de 1 J/cm2 puis irradié par rayonnement gamma à une dose de 35 kGy 5 (LP-UVC-G35) et d'un lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC à une dose de 1 J/cm2 puis irradié par rayonnement gamma à une dose de 55 kGy (LP-UVCG55). Les figures 17 et 18 montrent, respectivement, les concentrations en protéines 10 totales et les concentrations en vitamine B12, d'un lysat plaquettaire non irradié (LP), d'un lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC à une dose de 1 J/cm2 puis irradié par rayonnement gamma à une dose de 35 kGy (LP-UVC-G35) et d'un lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC à une dose de 1 J/cm2 puis irradié par rayonnement gamma à une dose de 55 kGy (LP-UVC-G55). 15 La figure 19 représente les facteurs d'amplification au rme jour de culture de cellules souches mésenchymateuses cultivées en présence d'un lysat plaquettaire non irradié (LP), d'un lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC à une dose de 1 J/cm2 puis irradié par rayonnement gamma à une dose de 20 35 kGy (LP-UVC-G35) et d'un lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC à une dose de 1 J/cm2 puis irradié par rayonnement gamma à une dose de 55 kGy (LP-UVC-G55). L'invention concerne un procédé de préparation d'un lysat plaquettaire irradié en 25 vue notamment d'obtenir un lysat plaquettaire ayant un pouvoir de coagulation réduit. Par lysat plaquettaire, on désigne le produit de la lyse de plaquettes, c'est-à-dire le produit obtenu après désintégration de la membrane cellulaire des plaquettes 30 qui conduit à la libération des molécules (facteurs de croissance, cytokines) normalement contenues à l'intérieur des plaquettes. 8 La lyse des plaquettes est par exemple réalisée par un ou plusieurs cycles de congélation/décongélation, par l'utilisation d'ultra-sons ou par un traitement au solvant/détergent. 5 Le procédé selon l'invention comprend d'abord l'étape consistant en la fourniture d'un lysat plaquettaire afin d'obtenir un lysat plaquettaire de départ, ledit lysat plaquettaire de départ comprenant d'une part des facteurs plaquettaires incluant des facteurs de croissance et d'autre part des protéines plasmatiques incluant des facteurs de coagulation et des protéines autres que les facteurs de 10 coagulation. Le lysat plaquettaire est produit à partir de plaquettes en suspension dans un liquide comprenant du plasma. Une telle suspension de plaquettes est par exemple un concentré de plaquettes ou un mélange de concentrés de plaquettes, 15 une couche leucoplaquettaire, aussi appelée buffy coat, ou un mélange de couches leucoplaquettaires, un plasma riche en plaquettes ou un mélange de plasmas riche en plaquettes. Plus particulièrement, la suspension de plaquettes est un concentré plaquettaire 20 issu d'aphérèse ou préparé à partir d'un don de sang ou un mélange de concentrés plaquettaires issus d'aphérèse ou préparés à partir de dons de sang. Par exemple, le mélange comprend entre 4 et 50 concentrés plaquettaires, en particulier entre 5 et 30 concentrés plaquettaires. 25 La préparation d'un lysat plaquettaire à partir d'un mélange de plusieurs concentrés plaquettaires, notamment plus de quatre concentrés plaquettaires, est avantageuse car elle permet de standardiser le lysat plaquettaire, c'est-à-dire d'homogénéiser la concentration de ses différents composants, notamment la 30 concentration en facteurs de croissance (Viau S, Eap S, et al. A standardized and characterized clinical grade human platelet lysate for efficient expansion of human bone marrow mesenchymal stem cells. Cytotherapy. May 2017, Volume 19, Issue 5, Supplement, Page S195). 9 En effet, les concentrations en facteurs de croissance d'un lysat plaquettaire sont dépendantes du donneur de plaquettes initiales. 5 Les concentrés plaquettaires sont soit frais, c'est-à-dire qualifiés pour être transfusés à un patient, soit périmés, c'est-à-dire stockés pendant 5 jours ou plus après sa préparation et ne pouvant plus être transfusés à un patient. De tels concentrés plaquettaires comprennent des plaquettes en suspension 10 dans un milieu liquide contenant du plasma. Par exemple, le milieu liquide ne comprend que du plasma. Selon un autre exemple, le milieu liquide comprend en outre une solution de conservation des plaquettes, telle que la solution SSP+ (Maco Pharma) ou l'Intersol® (Fresenius 15 Kabi). Dans un exemple particulier, le milieu liquide comprend de 20% à 100%, notamment 30% de plasma et de 0% à 80%, notamment 70% de solution de conservation des plaquettes. 20 La lyse d'une suspension de plaquettes comprenant des plaquettes dans du plasma fournit un lysat plaquettaire de départ comprenant d'une part des facteurs plaquettaires normalement contenus à l'intérieur des plaquettes et d'autre part des constituants du plasma. 25 Le plasma est constitué d'eau à 90%, de sels tels que le sodium, le chlore et le calcium, de lipides tels que les triglycérides et le cholestérol, d'hormones, de vitamines telles que la vitamine B12 et la vitamine D et de protéines telles que l'albumine, les immunoglobulines, les facteurs de coagulation dont le fibrinogène, 30 l'antithrombine III impliquée dans la chaîne de coagulation, les globulines, les interleukines et les interférons. 10 Ainsi, le lysat plaquettaire de départ auquel est appliqué le procédé de l'invention comprend notamment d'une part des facteurs plaquettaires incluant des facteurs de croissance et d'autre part des protéines plasmatiques incluant des facteurs de coagulation et des protéines autres que les facteurs de coagulation. 5 Ces facteurs de croissance sont notamment le TGF-bêta1, EGF, PDGF-AB, 1G F-1, VEGF et bFGF. D'autres facteurs de croissance se trouvant dans le lysat plaquettaire sont notamment le facteur de croissance du tissu conjonctif (CTGF, Connective Tissue Growth Factor) et le facteur dérivé des cellules stromales de 10 type 1-alpha (SDF-1alpha, Stromal Cell-Derived Factor-1 alpha). Ces facteurs de croissance sont dits endogènes. Par substance endogène, on désigne toute substance produite par les plaquettes ou comprise dans la suspension de plaquettes initiales utilisées pour préparer le 15 lysat plaquettaire, par opposition à une substance exogène introduite dans le lysat plaquettaire ou dans la suspension de plaquettes initiales. Par exemple, un lysat plaquettaire produit par lyse par congélation/décongélation d'une suspension de plaquettes comprend les concentrations en facteurs de 20 croissance suivantes : Tableau 1 : bFGF 110 - 180 pg/ml PDGF-AB 20 000 - 45 000 pg/ml PDGF-BB 12 000 - 15 000 pg/ml IGF-1 25- 150 pg/ml VEGF 500 - 1 000 pg/ml EGF 1 600 - 3 000 pg/ml TGFbêta1 30 000 - 80 000 pg/ml Le lysat plaquettaire de départ comprend d'autre part des protéines plasmatiques 25 incluant des facteurs de coagulation et des protéines autres que les facteurs de coagulation. 11 Les facteurs de coagulation sont notamment le fibrinogène, le facteur Il, le facteur VII, le facteur IX, le facteur X et le facteur Xl. D'autres facteurs de coagulation sont le facteur V et le facteur VIII. 5 Les autres protéines du plasma autre que les facteurs de coagulation sont notamment l'albumine et l'antithrombine III, protéine impliquée dans la chaîne de coagulation. 10 La quantité de protéines totales du lysat plaquettaire de départ dépend donc du pourcentage de plasma dans la suspension de plaquettes initiale, avant lyse des plaquettes. Par exemple, un lysat plaquettaire de départ produit à partir de la lyse par 15 congélation/décongélation de concentrés plaquettaires comprenant des plaquettes suspendues dans 100% plasma comprend notamment les composants suivants : Tableau 2 : Protéines totales (mg/mi) 60-80 mg/m1 Fibrinogène (mg/mi) 0,5 -1, 5 mg/m1 Vitamine B12 250-300 pg/ml Dans un autre exemple, un lysat plaquettaire de départ produit à partir de la lyse par congélation/décongélation de concentrés plaquettaires comprenant des plaquettes suspendues dans 30% plasma et 70% d'une solution de conservation des plaquettes comprend notamment les composants suivants : 20 25 12 Tableau 3 : Protéines totales (mg/mi) 20-30 mg/mi Fibrinogène (mg/mi) 0,45 -0,5 mg/m1 Vitamine B12 150-170 pg/ml L'étape de fourniture d'un lysat plaquettaire s'entend comme la mise à disposition d'un lysat plaquettaire. C'est-à-dire que le procédé de l'invention est mis en 5 oeuvre sur un lysat plaquettaire préalablement produit par lyse des plaquettes d'une suspension de plaquettes. Après l'étape de fourniture d'un lysat plaquettaire de départ, le procédé selon l'invention comprend la double irradiation dudit lysat plaquettaire de départ par 10 un rayonnement UVC de longueur d'onde comprise entre 200 et 280 nm et par un rayonnement ionisant ayant une longueur d'onde inférieure ou égale à 100 nm d'autre part, afin d'obtenir un lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC et par rayonnement ionisant, ladite double irradiation par rayonnement UVC et par rayonnement gamma étant agencée pour conserver au moins 75% de la 15 concentration en protéines totales dudit lysat plaquettaire de départ tout en réduisant d'au moins 40% la concentration en au moins un desdits facteurs de coagulation incluant le fibrinogène, le facteur 11, le facteur VII, le facteur IX, le facteur X et le facteur XI du lysat plaquettaire de départ. 20 L'étape de double irradiation s'entend comme une première irradiation suivie d'une deuxième irradiation. Notamment, la première irradiation est une irradiation par rayonnement UVC et la deuxième irradiation est une irradiation par rayonnement ionisant. En alternative, la première irradiation est une irradiation par rayonnement ionisant et la deuxième irradiation est une irradiation par 25 rayonnement UVC. Les première et deuxième irradiations sont successives, c'est-à-dire réalisées l'une après l'autre. L'étape consistant en l'irradiation dudit lysat plaquettaire par un rayonnement UVC de longueur d'onde comprise entre 200 et 280 nm afin d'obtenir un lysat 30 plaquettaire irradié par rayonnement UVC est notamment agencée pour 13 conserver au moins 75% de la concentration en protéines totales du lysat plaquettaire de départ tout en réduisant d'au moins 20% la concentration en au moins un desdits facteurs de coagulation incluant le fibrinogène, le facteur 11, le facteur VII, le facteur IX, le facteur X et le facteur XI du lysat plaquettaire de 5 départ. Le rayonnement UVC désigne un rayonnement électromagnétique non ionisant, c'est-à-dire un rayonnement incapable de provoquer l'ionisation d'atomes ou de molécules. Le rayonnement UVC possède une longueur d'onde comprise entre 10 200 et 280 nm, en particulier 254 nm. En conservant plus de 75% des protéines totales du lysat plaquettaire de départ, le lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC peut être utilisé comme complément pour milieu de base pour culture cellulaire. Notamment, l'albumine 15 qui représente plus de 50% des protéines dans le plasma et qui est un nutriment particulièrement important dans la culture cellulaire, est conservée à au moins 80% par rapport au lysat plaquettaire de départ. En particulier, au moins 80%, et plus particulièrement au moins 90% de la 20 concentration en protéines totales dans le lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC est conservé par rapport au lysat plaquettaire de départ. Le lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC comprend une concentration en protéines totales allant de 20 à 80 mg/ml, selon la concentration en plasma 25 de la suspension de plaquettes initiales. Par exemple, un lysat plaquettaire produit à partir de la lyse par congélation/décongélation de concentrés plaquettaires comprenant des plaquettes suspendues dans 100% plasma puis irradié par rayonnement UVC 30 comprend une concentration en protéines totales allant d'environ 55 mg/m1 à environ 80 mg/ml. 14 Selon un autre exemple, un lysat plaquettaire produit à partir de la lyse par congélation/décongélation de concentrés plaquettaires comprenant des plaquettes suspendues dans 30% plasma puis irradié par rayonnement UVC comprend une concentration en protéines totales allant d'environ 18 mg/m1 à 5 environ 30 mg/ml. De plus, en réduisant d'au moins 20% la concentration de l'un desdits facteurs de coagulation incluant le fibrinogène, le facteur 11, le facteur VII, le facteur IX, le facteur X et le facteur XI, le pouvoir de coagulation du lysat plaquettaire irradié 10 par rayonnement UVC est réduit. C'est-à-dire qu'un milieu de base comprenant du calcium, par exemple environ 0,2 g/I de chlorure de calcium ne coagulera pas en présence de lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC ou coagulera à partir d'une concentration de lysat 15 plaquettaire irradié par rayonnement UVC dans le milieu de base plus élevée que celle d'un lysat plaquettaire de départ à partir de laquelle le milieu de base coagule. Par exemple, le milieu de base alphaMEM coagule en présence de 5% ou plus 20 de lysat plaquettaire de départ, alors que ce milieu coagule à partir de 10% ou plus de lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC. Notamment, le lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC est ajouté dans une plage allant de 2 à 25 %, en particulier dans la plage allant de 5 à 15%, et 25 encore plus particulièrement dans la plage allant de 8 à 10% dans un milieu de base. Le lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC ayant un pouvoir de coagulation réduit, son utilisation en tant que complément de milieu de base pour 30 culture cellulaire est possible, dans certaines concentrations, sans utiliser d'anticoagulant tel que l'héparine. 15 En particulier, l'irradiation par rayonnement UVC est agencée pour réduire d'au moins 20% la concentration de chacun des facteurs de coagulation incluant le fibrinogène, le facteur 11, le facteur VII, le facteur IX, le facteur X et le facteur XI du lysat plaquettaire de départ. Par exemple, un lysat plaquettaire produit à partir de la lyse par congélation/décongélation de concentrés plaquettaires comprenant des plaquettes suspendues dans 30% plasma puis irradié par rayonnement UVC comprend les constituants plasmatiques suivants. Tableau 4: Protéines totales (mg/mi) 14-30 mg/m1 Fibrinogène (mg/mi) REVENDICATIONS1. Procédé de préparation d'un lysat plaquettaire irradié comprenant les étapes suivantes : - la fourniture d'un lysat plaquettaire afin d'obtenir un lysat plaquettaire de départ, ledit lysat plaquettaire de départ comprenant d'une part des facteurs plaquettaires incluant des facteurs de croissance et d'autre part des protéines plasmatiques incluant des facteurs de coagulation et des protéines autres que les facteurs de coagulation, - la double irradiation dudit lysat plaquettaire de départ par un rayonnement UVC de longueur d'onde comprise entre 200 et 280 nm et par un rayonnement ionisant ayant une longueur d'onde inférieure ou égale à 100 nm d'autre part, afin d'obtenir un lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC et par rayonnement ionisant, ladite double irradiation par rayonnement UVC et par rayonnement ionisant étant agencée pour conserver au moins 75% de la concentration en protéines totales dudit lysat plaquettaire de départ tout en réduisant d'au moins 40% la concentration en au moins un desdits facteurs de coagulation incluant le fibrinogène, le facteur II, le facteur VII, le facteur IX, le facteur X et le facteur XI du lysat plaquettaire de départ. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la double irradiation par rayonnement ionisant et par rayonnement UVC est agencée pour réduire d'au moins 40% la concentration de chacun des facteurs de coagulation incluant le facteur II, le facteur VII, le facteur IX, le facteur X et facteur XI du lysat plaquettaire de départ. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'irradiation par rayonnement UVC est agencée pour conserver au moins 75% de la concentration en protéines totales dudit lysat plaquettaire de départ, tout en réduisant d'au moins 20% la concentration de l'un au moins, notamment chacun, des facteurs de coagulation incluant le fibrinogène, le facteur II, le facteur IX, le facteur X et le facteur XI du lysat plaquettaire de départ. 36 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le lysat plaquettaire de départ comprend au moins les facteurs de croissance endogènes TGF-bêta1, EGF, PDGF-AB, 1G F-1, VEGF et bFGF, et en ce que l'irradiation par rayonnement UVC est agencée pour conserver au moins 80% de la concentration de l'un au moins des facteurs de croissance incluant IGF-1, PDGF-AB, EGF et VEGF, et notamment au moins 80% de chacun des facteurs de croissance incluant IGF-1, PDGF-AB, EGF et VEGF dans le lysat plaquettaire de départ. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'irradiation par rayonnement UVC est réalisée à une dose comprise entre 0,01 à 2 J/cm2, particulièrement entre 0,5 J/cm2 et 1,5 J/cm2, et plus particulièrement à 1 J/cm2. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le lysat plaquettaire de départ est irradié par rayonnement UVC à l'état liquide. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend, préalablement à l'irradiation par rayonnement UVC, une étape de filtration dudit lysat plaquettaire de départ au travers d'un filtre de porosité 0,65 pm ou moins, particulièrement 0,45 pm ou moins. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend, postérieurement à l'irradiation par rayonnement UVC, une étape de filtration stérilisante dudit lysat plaquettaire irradié par rayonnement UVC au travers d'un filtre de porosité 0,45 pm ou moins, particulièrement 0,22 pm ou moins. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend, préalablement à l'étape d'irradiation par rayonnement ionisant, 37 une étape de congélation dudit lysat plaquettaire afin d'irradier par rayonnement ionisant le lysat plaquettaire à l'état congelé. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'irradiation par rayonnement ionisant est réalisée postérieurement à l'irradiation par rayonnement UVC. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le rayonnement ionisant est un rayonnement gamma ayant une longueur d'onde inférieure ou égale à 10 pm. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que l'irradiation par rayonnement ionisant est réalisée à une dose absorbée comprise dans la plage allant de 20 kGy à 75kGy, notamment de 35 kGy à 55 kGy. 13. Lysat plaquettaire irradié obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce qu'il comprend une concentration en protéines totales comprise entre 18 et 80 mg/ml, une concentration en fibrinogène inférieure à 0,4 mg/ml, et une concentration en facteur de croissance bFGF endogène inférieure à 90 pg/ml. 14. Lysat plaquettaire irradié selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il comprend une concentration en facteur de croissance endogène TGF-bêta1 inférieure à 70 000 pg/ml, une concentration en facteur de croissance endogène EGF inférieure à 2 800 pg/ml, et une concentration en facteur de croissance endogène PDGF-BB inférieure à 12 000 pg/ml. 15. Lysat plaquettaire selon l'une des revendications 13 ou 14, caractérisé en ce qu'il comprend une concentration en vitamine B12 comprise entre 120 et 140 pg/ml. 38 16. Procédé pour la culture de cellules, notamment de cellules souches mésenchymateuses, comprenant la mise en contact desdites cellules avec une composition nutritive comprenant un milieu de base et un lysat plaquettaire irradié selon l'une quelconque des revendications 13 à 15. 17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que la composition nutritive est sous forme liquide et exempte d'anticoagulant.