Brevet FR3075401A1 — publié le 20190621

MICROSCOPIE 3D SPECTRALE EN CHAMP LARGE DOMAINE TECHNIQUE [0001] L'invention concerne le domaine de la microscopie optique de fluorescence en champ large et notamment la microscopie spectrale de fluorescence en champ large, dans laquelle une image d'un objet fluorescent est enregistree pour plusieurs longueurs d'onde sur un detecteur lineaire ou matriciel d'une camera. Tout particulierement, ('invention est applicable a la microscopie de fluorescence en champ large en trois dimensions (3D) spectrale (ou multi-couleurs ou en pseudo-couleurs). [0002] La microscopie de fluorescence ou en fluorescence connait au moins deux types de microscopes, les microscopes a ou en champ large et les microscopes confocaux. Dans les microscopes a champ large, le champ est determine par un diaphragme de champ a deux dimensions (2D). Dans les microscopes confocaux, le diaphragme de champ est reduit a une dimension (fente) ou a zero dimension (diaphragme en forme de trou). [0003] II est particulierement simple d'utiliser un element dispersif ou un spectrometre de tout type avec un microscope confocal, pour en faire un imageur spectral. II suffit, en effet, d'utiliser un detecteur monochromatique ayant une dimension de plus que le diaphragme de champ et de disperser les composantes du spectre de la lumiere selon cette dimension avec un element dispersif connu de l'art anterieur (prisme, reseau, spectrometre de Michelson, ...). Par exemple, avec un microscope confocal muni d'un trou, il est possible d'utiliser une barrette lineaire pour recueillir le spectre disperse par un prisme eclaire par le trou. Selon un autre exemple, avec un microscope confocal muni d'une fente, il est possible d'utiliser une barrette matricielle ou a deux dimensions, pour recueillir le spectre disperse par un prisme eclaire par la fente disposee non parallelement a la direction de la dispersion du prisme. [0004] Par contre, il est impossible, dans l'art anterieur, d'utiliser un element dispersif avec un microscope a champ large, sans diminuer severement la resolution des images enregistrees, aucune dimension d'un detecteur matriciel ou a deux dimensions (2D) ou camera, n'etant disponible pour enregistrer les composantes spectrales de l'image, le plein champ 2D du detecteur pouvant etre occupe par l'image. [0005] En pratique, dans l'art anterieur, la transformation d'un microscope a champ large associe a un detecteur matriciel monochromatique, en microscope sensible ou donnant acces au contenu spectral de la lumiere de fluorescence emise par un objet dans tout le champ du microscope est donc un probleme difficile. [0006] La microscopie spectrale en champ large qui permet a priori d'enregistrer en parallele les points d'une image a une cadence superieure aux microscopes confocaux, sequentiels, serait pourtant une technique souhaitable pour enregistrer des objets dynamiques, tout particulierement en trois dimensions. 2 DEFINITIONS [0007] Dans toute la demande, qui concerne le domaine de I'optique, les mots « disposes entre » pour des elements d'un dispositif optique, designent une disposition spatiale de ces elements adaptee a leur permettre d'accomplir une fonction optique, notamment de conjugaison, de 5 transmission, de deviation, de dispersion ou de reflexion optiques. [0008] Dans Ia presente demande, on entendra par : Couleur ou pseudo-couleur : une mesure par une camera de Ia repartition spectrale d'une lumiere de fluorescence. On comprendra que des fluorophores de natures differentes auront des couleurs differentes. 10 [0009] Separateur : une lame optique ou un miroir dichroIque traite(e) pour reflechir partiellement et transmettre partiellement une lumiere incidente, avec des caracteristiques spectrales differentes pour Ia lumiere transmise et reflechie. Dans une utilisation pour Ia microscopie par fluorescence, un tel separateur sera par exemple optimise pour reflechir avec peu de pertes (i.e. le moins possible) un spectre d'excitation ou d'illumination et transmettre avec 15 peu de pertes un spectre de fluorescence. Un separateur ou une lame separatrice dichroIque, vis- a-vis d'une lumiere d'illumination et d'une lumiere de fluorescence, place devant une camera sera en pratique, un empilement de couches minces optiques servant a isoler Ia camera de Ia lumiere d'illumination pour permettre de detecter Ia lumiere de fluorescence d'intensite de plusieurs ordres de grandeur plus faible sans saturer Ia camera. 20 [0010] Camera ou camera monochromatique : dispositif optique muni d'un detecteur matriciel (i.e. a deux dimensions ou 2D) compose de pixels de camera ou « pixels camera », ne permettant pas de distinguer Ia couleur au niveau d'un pixel camera ou enregistre par Ia camera, l'image etant enregistree en niveaux d'energie integres (aussi appeles niveaux de gris) sur tout le spectre recu et pour lequel le detecteur materialisant le pixel camera a un rendement quantique aussi 25 eleve que possible. [0011] Prisme : un element optique en diedre dispersant Ia lumiere dans un plan perpendiculaire a l'arete du diedre en raison de Ia variation de son indice optique avec Ia longueur d'onde ou Ia couleur de Ia lumiere qu'il transmet. [0012] Modulateur spatial : un element optique capable d'appliquer des differences d'energie 30 variables spatialement a une lumiere transmise ou reflechie par ('element. Un tel element permet de disposer a partir d'une source large, d'un motif de pixels arbitrairement choisis (un pixel etant Ia plus petite dimension ou periode de modulation de ('element). Des exemples de modulateurs spatiaux sont notamment un disque perfore tournant (en anglais, «spinning disk») ou une matrice a deux dimensions de micro-miroirs (DMD) ou encore un modulateur a cristaux liquides (SLM). Un 35 modulateur peut notamment selectionner un point ou pixel unique mais aussi un objet discret ou motif discret ou objet module discret ou motif module discret, constitue d'un ensemble de points ou pixels *pares spatialement et repartis regulierement, qui se prete a Ia suppression d'un fond continu dans l'image de ('objet. Le DMD permet ainsi une illumination parallele d'un ensemble de 3 points choisis, sans deplacement de l'objet. [0013] Grille : un objet discret (ou ses differentes images), compose d'un ensemble de pixels repartis sur une matrice a deux dimensions, coIncidant avec les nceuds d'un reseau de points, en general dispose dans un plan. 5 ARRIERE PLAN [0014] L'art anterieur connait des dispositifs d'imagerie comprenant un microscope, utilisant une matrice de micro-miroirs de reflexion, disposee sur un chemin optique d'illumination ou d'excitation du microscope. Le microscope possede aussi un chemin d'imagerie pour collecter par exemple une lumiere de fluorescence induite par l'illumination, sur une matrice de capteurs ou 10 pixels d'une camera (CMOS, CCD, etc.). La lumiere de fluorescence est de bande spectrale variable ou de couleur differente en fonction de la nature des differentes molecules soumises a l'illumination et de la composition spectrale de la ou les sources lumineuses d'excitation. [0015] Une condition importante pour la qualite d'un systeme de microscopie spectrale utilisant la fluorescence, est d'assurer non seulement la formation des images d'un meme point objet dans 15 differentes bandes spectrales mais aussi d'assurer le maintien de la superposition spatiale de ces images du point de l'objet a la precision d'un pixel de la camera, c'est-a-dire le maintien de la reference spatiale pour chaque point de l'objet. [0016] L'utilisation d'une camera monochromatique pour realiser un systeme spectral necessite dans l'art anterieur d'enregistrer les images spectrales en sequence, a l'aide de filtres 20 interferentiels, puis a superposer ces images dans un systeme de visualisation pour recreer une image simultanee de toutes les bandes spectrales en les referengant les unes aux autres. II est alors connu que pour ne pas degrader la resolution de ces systemes a filtres interferentiels, ces filtres doivent etre d'un parallelisme quasi parfait, de l'ordre de quelques secondes d'arc. Ces filtres sont dits a decalage de pixels nul (« zero shift ») parce que leur angle au sommet est 25 quasiment nul induisant un decalage nul ou inferieur a un pixel de camera lorsqu'ils sont introduits sur le faisceau. [0017] En consequence, dans l'art anterieur, ('introduction d'un element non parfaitement parallele sur le chemin optique d'imagerie d'un systeme de microscopie a resolution limitee par la camera et utilisant la fluorescence est considers comme nefaste. Plus generalement, pour faire de 30 l'imagerie de fluorescence avec une camera monochromatique, les elements qui peuvent etre introduits sur le chemin optique, pour selectionner une bande spectrale, sont presumes dans l'art anterieur comme devant etre a decalage de pixels nul sur la camera (« zero shift »). Cette condition fait presumer que les elements pouvant etre introduits sur le chemin optique doivent etre a deviation nulle et a dispersion de la deviation nulle en fonction de la longueur d'onde, a 35 ('image des filtres interferentiels a decalage de pixels nul ( comme par exemple les filtres de la societe « Semrock » aux USA ) dont le parallelisme est a zero pixel, ou en pratique inferieur a quelques secondes d'arc ( 1/60ierne de milliradian). Une telle propriete est obtenue en pratique par un tri sur des filtres une fois realises, car elle est hors de portee de la precision de fabrication 4 possible industriellement pour des lames a faces planes et paralleles. [0018] L'art anterieur connait aussi les prismes et d'autres elements dispersifs (reseaux, etc.) mais ceux-ci ne sont pas, dans l'art anterieur, a la tolerance de parallelisme requise pour les systemes a decalage de pixel nul ou zero pixel. Tout particulierement, le prisme qui est a la fois 5 deviateur de faisceau sur un grand angle et dispersif en longueur d'onde semble particulierement inadapte aux systemes a decalage de pixel nul. [0019] Enfin, les filtres interferentiels devant etre introduits en sequence sur le chemin optique, it en resulte une limitation importante de la cadence d'acquisition, limitee par la vitesse d'escamotage des filtres. Cette limitation ralentit aussi, en pratique, de tels systemes pour la 10 microscopie 3D, dans laquelle les points de mesure sont pris dans des plans paralleles a un plan objet, le long de l'axe optique du microscope ou « axe Z », perpendiculaire au plan objet. PRESENTATION GENERALE [0020] Dans ce contexte, ('invention concerne un microscope de fluorescence a champ large pour ('observation d'un plan objet dans un milieu objet tridimensionnel apte a emettre une lumiere de 15 fluorescence en reponse a une lumiere d'illumination, qui comprend une premiere voie optique pour la lumiere d'illumination, une deuxieme voie optique pour la lumiere d'illumination et la lumiere de fluorescence et une troisieme voie optique pour la lumiere de fluorescence, dans lequel la premiere voie comprend un modulateur spatial limitant le champ du microscope a champ large, dans lequel la deuxieme voie s'etend entre le plan objet et un separateur, 20 dichroIque vis-a-vis de la lumiere d'illumination et de la lumiere de fluorescence, dans lequel la troisieme voie s'etend entre la deuxieme voie et une camera apte a detecter la lumiere de fluorescence, dans lequel le microscope comprend un moyen optique pour conjuguer le modulateur spatial avec le plan objet pour la lumiere d'illumination et pour conjuguer le plan objet avec la camera pour la lumiere de fluorescence et dans lequel la troisieme voie comprend 25 un element optique dispersif pour la lumiere de fluorescence. [0021] Dans des variantes: le moyen optique comprend un objectif de microscope dispose sur la deuxieme voie. le moyen optique comprend un premier objectif de microscope dispose sur la premiere voie et un second objectif de microscope dispose sur la deuxieme voie. 30 ('element optique dispersif est un prisme. le modulateur spatial est une matrice de micro-miroirs (DMD). le modulateur spatial est un disque tournant. [0022] L'invention concerne aussi un procede pour la calibration a une premiere longueur d'onde du microscope a champ large, comprenant les etapes suivantes: 35 disposer dans un voisinage du plan objet un milieu objet apte a emettre de la lumiere de fluorescence dans une premiere bande spectrale contenant la premiere longueur d'onde, en reponse a une premiere lumiere d'illumination, disposer sur la troisieme voie un premier filtre interferentiel apte a selectionner 5 spectralement un voisinage de la premiere longueur d'onde, illuminer sequentiellement par la premiere lumiere d'illumination, chaque point du champ large du microscope dans le plan objet, au moyen du modulateur spatial, enregistrer une premiere image de chaque point du champ large du microscope, sur la 5 camera, enlever le premier filtre interferentiel de Ia troisieme voie. [0023] Dans une variante du procede, l'invention concerne aussi un procede pour Ia calibration a une deuxieme longueur d'onde du microscope a champ large, consistant a repeter les etapes de Ia calibration a Ia premiere longueur d'onde, avec un deuxieme filtre interferentiel, apte a 10 selectionner spectralement un voisinage de Ia deuxieme longueur d'onde, pour obtenir une deuxieme image de chaque point du champ large du microscope, enregistree avec le deuxieme filtre interferentiel, sur Ia camera. [0024] L'invention concerne aussi un procede d'utilisation du microscope a champ large calibre a Ia premiere longueur d'onde et a Ia deuxieme longueur d'onde, comprenant les etapes suivantes : 15 disposer au voisinage du plan objet, un echantillon apte a emettre une lumiere de fluorescence dans un spectre de longueurs d'onde comprenant le voisinage de Ia premiere longueur d'onde et le voisinage de la seconde longueur d'onde, en reponse d'illumination, illuminer le champ large du microscope selon une grille de points, 20 modulateur spatial, enregistrer l'image de chaque point de la grille pour le spectre de longueurs d'onde, sur la camera, repeter les deux etapes ci-dessus en appliquant des translations a la grille dans le champ large du microscope, au moyen du modulateur spatial, jusqu'a avoir enregistre une image pour le 25 spectre de longueurs d'onde de chaque point du champ large du microscope sur la camera, deduire par traitement d'image, une premiere image d'un point de rechantillon a la premiere longueur d'onde, a partir de la premiere image de ce point a la premiere longueur d'onde, obtenue par le procede de calibration et de l'image de ce point pour le spectre de longueurs d'onde, 30 deduire par traitement d'image, une deuxieme image du point de rechantillon a la deuxieme longueur d'onde, a partir de l'image de ce point a la deuxieme longueur d'onde, obtenue par le procede de calibration et de l'image de ce point pour le spectre de longueurs d'onde. [0025] Dans une variante, l'invention concerne un procede pour obtenir une image spectrale 35 d'un echantillon, sectionnee le long d'un axe optique du microscope a champ large, dans lequel le traitement d'image comprend l'etape suivante: supprimer le fond continu dans les images enregistrees par la camera. a une lumiere au moyen du 6 BREVE DESCRIPTION DES DESSINS [0026] L'invention sera mieux comprise en lien avec les dessins annexes, les numeros de reference renvoyant a ces dessins. Les dessins annexes sont schematiques et ne sont pas a l'echelle, ils visent avant tout a illustrer les principes de ('invention. 5 [0027] La figure 1 represente un exemple de systeme de microscopie par fluorescence. DESCRIPTION DETAILLEE D'EXEMPLE(S) [0028] L'exemple de systeme de microscopie par fluorescence de la figure 1 comprend un modulateur spatial 1 conjugue du plan focal objet d'un objectif de microscope 2 formant une image de son plan focal objet, sur une camera 4 via un separateur de faisceau ou separateur 3 et 10 comprenant un element dispersif qui est, sur cette figure 1, un prisme 5 dispose entre le separateur de faisceau 3 et la camera 4. [0029] Le modulateur spatial 1 est conjugue optiquement du plan focal objet de l'objectif de microscope 2, via une lentille 6 (au foyer de laquelle le modulateur spatial 1 est dispose), via le separateur 3 operant par reflexion sur cette voie dite d'illumination, et via l'objectif de 15 microscope 2. Le separateur 3, opere par reflexion pour une lumiere d'illumination reflechie par le modulateur spatial 1, ici un DMD ou matrice de micro-miroirs. La lumiere d'illumination est fournie au modulateur spatial 1 par une source de lumiere non representee sur la figure 1. [0030] Le separateur 3, opere aussi par transmission pour une lumiere de fluorescence, emise par un objet fluorescent exposé a la lumiere d'illumination et dispose dans le plan focal objet. 20 [0031] La lumiere d'illumination et la lumiere de fluorescence, sont transmises en sens inverse entre le separateur 3 et le plan focal objet de l'objectif de microscope 2, notamment a travers l'objectif de microscope 2. [0032] Un moyen optique connu, non represente, comme un filtre a encoche (« Notch filter ») permet, si necessaire, de s'assurer qu'aucune lumiere d'illumination n'est detectable sur la 25 camera 4. [0033] La figure 1 represente un exemple de dispositif optique pour la microscopie optique de fluorescence comprenant un modulateur spatial 1, un objectif de microscope 2, un separateur 3 et une camera 4, dans lequel le separateur 3 est dispose entre le modulateur spatial 1 et l'objectif de microscope 2, dans lequel le separateur 3 est dispose entre la camera 4 et l'objectif de 30 microscope 2, et dans lequel un prisme 5 servant d'element dispersif est dispose entre le separateur 3 et la camera 4. [0034] Le modulateur spatial 1 est dispose sur une voie ou chemin optique d'illumination aboutissant a une premiere face ou d'un cote du separateur dichroIque 3. II existe une voie optique ou chemin optique d'illumination et de fluorescence entre cette premiere face du 35 separateur 3 et le plan objet, ici plan focal objet de l'objectif de microscope 2, et it existe entre la deuxieme face ou le deuxieme cote du separateur 3 jusqu'a la camera 4, une troisieme voie optique ou chemin optique de fluorescence. Dans un fonctionnement optique normal, seule la lumiere d'illumination parcourt la premiere voie optique, seule la lumiere de fluorescence 7 parcourt la troisieme vole et les deux lumieres parcourent la deuxieme vole, ici selon des sens opposes. De fagon equivalente, it serait possible plutot que de collecter la lumiere de fluorescence par l'objectif de microscope 2, de la collecter de l'autre cote du plan focal objet par un autre objectif de microscope et une autre camera, via un autre separateur dichroIque pour la lumiere 5 d'illumination, autre separateur dichroIque pouvant ici fonctionner en incidence inclinee mais aussi normale, afin de ne conserver de la meme fagon que la lumiere de fluorescence sur l'autre camera. [0035] Un premier mode de realisation, en reference a la figure 1, concerne un systeme de microscopie par fluorescence comprenant le modulateur spatial 1, qui est un DMD ou matrice de 10 micro-miroirs, conjugue du plan focal objet de l'objectif de microscope 2, via la lentille 6 et le separateur 3. Un modulateur a cristaux liquides ou tout modulateur d'amplitude par reflexion ou par transmission serait adapts au present mode. [0036] Le DMD est eclairs par un faisceau lumineux adapts a ('excitation de fluorophores et de longueur d'onde comprise couramment entre 350 nm et 800 nm. II est conjugue du plan focal 15 objet du microscope et donc de l'objet, qu'il permet d'eclairer de fagon selective par differents motifs de points espaces a deux dimensions. [0037] Ce faisceau permet d'exciter la fluorescence d'un objet dans le plan focal objet pour les points selectionnes par une electronique connue, associee au DMD. Communement, le faisceau d'illumination est constitue de plusieurs lasers regroupes sur un meme chemin optique, pour 20 pouvoir exciter chacun un fluorophore lorsque celui-ci est present dans l'objet. Une source composee de plusieurs raies peut egalement etre adaptee si la puissance de cette source est suffisante. [0038] Cette vole dite d'illumination pour le microscope permet donc de vehiculer une lumiere d'excitation, jusqu'au plan focal objet de l'objectif de microscope 2. Sur ce chemin, la lame semi- 25 reflechissante ou lame separatrice ou separateur de faisceau de retour ou separateur 3, reflechit sans dispersion le faisceau d'illumination. [0039] De fagon connue de l'art anterieur, le separateur transmet sans dispersion significative la lumiere de fluorescence. [0040] Le separateur de faisceau est typiquement un miroir dichroIque associe a un filtre 30 interferentiel dispose entre le miroir dichroIque et la source qui peut etre une lampe a vapeur de mercure, une source composee d'une ou plusieurs LED collimatees ou un faisceau rectiligne issu du mélange de plusieurs lasers. [0041] L'objectif 2 forme ainsi apres excitation de la fluorescence de l'objet, non-represents, une image sur une camera 4 d'une section de cet objet au plan focal objet pour les longueurs d'onde 35 du spectre de fluorescence, le microscope dispose a cette fin d'une lentille dite de tube qui forme l'image sur la matrice ccd ou cmos de la camera. Couramment, ce spectre est le spectre visible, et l'image est formee sur la camera 4 via le separateur de faisceau 3, qui joue le role de miroir selectif en longueur d'onde entre le spectre d'excitation et le spectre de fluorescence. Par 8 exemple, le separateur de faisceau peut etre dispose a 45° d'angle par rapport a I'axe optique ce qui reflechit le faisceau reflechi a 90° ou angle droit. Toute autre valeur d'inclinaison de Ia normale au plan du separateur qui permet d'illuminer Ia camera 4 avec le spectre de fluorescence, c'est-a-dire de *parer ('illumination et le faisceau emis par un objet dans le plan 5 focal de l'objectif 2, du faisceau d'excitation, est egalement adaptee. [0042] L'introduction du prisme 5 sur Ia voie d'imagerie separee du faisceau d'illumination par le separateur de faisceau 3 provoque une deviation de l'image, une dispersion en longueur d'onde dans l'image et Ia formation d'une image polychromatique sur plusieurs pixels de Ia camera 4, sous forme d'un ensemble d'image decalees en longueur d'onde pour un meme point de l'objet. 10 Toute reference spatiale et spectrale est donc perdue, pour les images considerees, et les images de pixels contigus sont melangees et brouillees. [0043] Deux difficultes sont donc a surmonter, determiner le decalage lateral entre les images, reparable par leur angle autour de l'arete du prisme ou droite d'intersection des plans de ses faces et etre capable d'enregistrer selectivement chaque image a une longueur d'onde donnee en 15 provenance d'un meme pixel. [0044] On decrit ainsi d'abord ci-dessous une utilisation particuliere du DMD pour enregistrer selectivement les images a differentes longueurs d'onde (separees angulairement par le prisme, puis separees spatialement sur le detecteur de Ia camera par focalisation via un objectif de Ia camera) d'un meme pixel et les superposer. Puis, on decrira un procede de calibration permettant 20 de retrouver une reference spectrale absolue par Ia localisation d'une couleur, puis une reference spectrale relative par Ia localisation d'une deuxieme couleur. Un tel procede pouvant se generaliser a un nombre quelconque de couleurs, sous reserve de *parer ou distinguer sur Ia camera les differentes images (monochromes ou en niveaux de gris revues). [0045] Pour enregistrer selectivement les images a differentes longueurs d'onde d'un meme 25 pixel et les superposer, Ia dispersion du prisme intervenant classiquement selon une seule direction, dans un plan perpendiculaire a son arete, on utilise des images du DMD, ou points eclaires dans l'objet par le DMD, qui sont des points, des peignes (pixels separes entre eux et repartis sur une droite) ou des grilles de pixels, spatialement separes. II est possible ainsi de disposer l'image dispersee entre les points eclaires dans l'image, dont la distance donne 30 l'intervalle spectral libre pour ajuster la dispersion du prisme. Le meilleur resultat est obtenu pour des images sur le DMD qui sont des grilles, sans perte de generalite, puisqu'il est possible en translatant une grille de paver une image, c'est-a-dire de recouvrir la totalite des points du modulateur a l'aide des grilles translatees. On considerera ainsi ci-dessous des images ou motifs sur le DMD qui sont des grilles. 35 [0046] II est alors possible soit d'aligner commodement une direction d'un cote d'une grille carree ou rectangulaire avec la direction de dispersion du prisme, ou bien la direction d'une diagonale afin de maximiser l'intervalle spectral libre entre deux points de la grille. On peut aussi utiliser des images de grilles de points espaces sur un motif ou reseau hexagonal pour une 9 distance maximum entre deux points de la grille et donc un plus grand intervalle spectral libre. [0047] Ce type d'eclairage par points espaces permet d'eviter le brouillage au niveau spectral, le segment image d'un point de l'objet a differentes longueurs d'onde, obtenu par dispersion par le prisme, trouvant sa place entre les differents points espaces eclaires dans l'objet au moyen du 5 DMD, conjugue optiquement de cet objet et dispose sur la voie d'excitation ou d'illumination. [0048] De preference, la resolution minimum nest pas limitee par le DMD, plusieurs pixels de la camera pouvant recouvrir un seul pixel du DMD dans l'image. De cette fawn, it est possible d'utiliser la dynamique des pixels de la camera pour interpoler la position spectrale de l'image d'un point et ameliorer la resolution finale. Par exemple, on peut regler le grandissement pour 10 que l'image d'un pixel du DMD s'etende sur un carre de quatre pixels de la camera (soit un carre de 2 pixels par 2 pixels). [0049] Toutefois, pour ces images, la reference spatiale des longueurs d'onde entre elles est necessaire et on decrit ci-dessous un procede permettant de retrouver cette calibration ou referencement spatial ou spectral, chaque longueur d'onde etant codee par sa position sur la 15 camera grace au prisme qui est dispersif, c'est-a-dire qui *pare les rayons lumineux a differentes longueurs d'onde angulairement. [0050] Dans ce procede, on intercale un filtre de fluorescence ou filtre colore, centre sur une longueur d'onde donnee et de type passe-bande optique etroit autour de cette longueur d'onde, entre le separateur de faisceau et la camera, i.e. sur la voie d'imagerie du microscope et on 20 genere un seul pixel a l'aide du DMD, ou un peigne de points ou une grille de points, ou un objet espace ou discret connu en termes de pixels du DMD. [0051] Le ou les filtres choisis sont a decalage de pixel nul (« zero shift »), i.e. ils sont chacun d'un parallelisme tels entre leur faces que leur introduction sur le chemin optique ne devie pas l'image d'un point de l'objet de plus de la moitie de la resolution du systeme d'imagerie. De tels filtres 25 sont connus de l'art anterieur et commercialises par la societe « Semrock » aux USA. II est a noter que pour des lames a faces planes et paralleles, la dispersion en longueur d'onde est proportionnelle a l'angle du prisme et donc potentiellement negligeable, ce qui permet d'assurer qu'une deviation nulle entraine une dispersion nulle et donc un fonctionnement adapte aux systemes a tres haute resolution ou a decalage de pixel nul sur la camera utilisee. 30 [0052] Dans le plan objet du microscope conjugue du modulateur, qui est le plan focal objet pour les microscopes actuels, on peut disposer une solution de deux fluorophores ou fluorochromes, assurant que pour ('illumination du microscope, un spectre de fluorescence soit obtenu a une premiere couleur et une seconde couleur quel que soit le point unique selectionne sur le DMD et donc eclaire dans le plan objet. 35 [0053] On peut alors utiliser la source d'illumination du microscope qui permet d'exciter la fluorescence pour un objet inconnu contenant les memes fluorophores que la solution de calibration et obtenir des images pour chaque couleur en chaque point de l'objet inconnu. [0054] Par exemple, on peut illuminer un point unique d'un pixel du DMD et enregistrer l'image 10 d'un tel objet ou reponse spectrale du systeme pour ce point, reponse codee ou reperee spatialement sur la camera monochromatique, pour un premier filtre colore donne, connu, intercale sur la voie d'imagerie, i.e. entre le separateur de faisceau et la camera. [0055] De cette fawn, it est possible de determiner une premiere image d'un point du DMD a 5 travers ('ensemble de I'optique, sur la camera pour la longueur d'onde centrale du premier filtre colore adapte a Ia fluorescence a une premiere couleur, definie par ce filtre. On obtient ainsi une reference spatiale absolue associee sur Ia camera a Ia premiere couleur. [0056] On obtient ainsi Ia position de l'image d'un pixel du DMD sur Ia camera a une premiere longueur d'onde, qui est Ia longueur d'onde centrale du premier filtre. 10 [0057] Pour une echelle des couleurs ou longueurs d'onde, sur Ia camera, deux solutions sont praticables : Soit on extrapole a partir de Ia premiere longueur d'onde Ia position spectrale des images, par calcul, a partir des parametres du prisme et Ia dispersion en longueur d'onde avec son signe du prisme. La connaissance de l'indice du prisme et son angle au sommet permet de fawn connue 15 une telle prediction de Ia dispersion en longueur d'onde de Ia position des images a une deuxieme couleur ou a d'autres. Soit on interpole entre deux longueurs d'onde en effectuant une seconde mesure ou enregistrement d'une deuxieme image, a une deuxieme longueur d'onde avec un deuxieme filtre colore adapte a Ia fluorescence du deuxieme fluorophore. 20 [0058] Apres ces operations, it est donc possible d'obtenir une image d'un point objet qui est deviee spatialement en presence du prisme par rapport a l'image du point sans prisme, mais pour laquelle les images dans differentes bandes spectrales du point de l'objet sont superposees a moins d'un pixel de decalage entre elles sur Ia camera. II existe donc un decalage relatif de zero pixel entre les images spectrales d'un meme point. La reference spectrale peut etre une longueur 25 d'onde arbitraire. La reference spatiale de l'art anterieur qui etait l'image sans prisme est donc remplacee dans ce mode par une reference spectrale d'une des images de l'objet dans une des bandes spectrales, sur laquelle les autres images spectrales ou colorees sont superposees. [0059] Pour obtenir la reponse spectrale en tout point du DMD, chacun de ses points peut etre illumine en sequence. Cette operation etant faite une seule fois, elle peut etre effectuee dans un 30 laps de temps non contraint et pour chaque point. En pratique, on constate qu'il est suffisant d'enregistrer cette reponse tous les 10 pixels ou plus et de proceder a une interpolation entre les points calibres pour les autres points, la reponse spectrale etant lentement variable entre les points pour des composants optiques de qualite et bien regles. [0060] On peut aussi faire cette determination pour plusieurs longueurs d'onde en un point 35 donne. Chaque enregistrement en plus du premier permet de determiner une translation spectrale par rapport a la premiere longueur d'onde enregistree en chaque point de l'image. Pour cela on peut utiliser plusieurs filtres colores, centres chacun a une longueur d'onde de transmission d'un fluorophore. De tels filtres sont usuellement disponibles pour un microscope de 11 fluorescence. [0061] Apres la phase de calibration toutes les positions absolues des points images (en niveaux de gris) de tous les objets de 1 pixel du DMD obtenues par les filtres colores sont connues ou calculables en fonction de la longueur d'onde. Elles sont commodement enregistrees dans une 5 memoire informatique. Si l'une des longueurs d'onde est prise pour reference, alors toutes les positions relatives des points colores peuvent aussi etre stockees. [0062] II est ainsi possible par cartographie, d'associer a un pixel du modulateur un ensemble de positions de ses images en fonction de la longueur d'onde. Inversement l'enregistrement des positions des images d'un pixel sur la camera permet de leur associer une couleur pour un pixel 10 dans un systeme de traitement d'image en couleur et d'obtenir une image en couleurs du pixel, pour peu que l'image de chaque couleur soit separable des autres images en couleur des autres pixels images (en niveaux de gris) a un instant donne sur la camera. [0063] En pratique la dispersion depend de la position dans le champ (a cause des aberrations geometriques des lentilles). On ne peut donc pas generalement proceder par bande de pixels 15 contigus. II faut donc generalement utiliser des objets ou motifs a points espaces sur le DMD pour la calibration : un point, un peigne ou une matrice ou grille de points et determiner la dispersion spectrale pour chaque position du champ soit reellement par interpolation entre plusieurs mesures a des couleurs differentes, soit par calcul et extrapolation. Toute connaissance a priori de la reponse impulsionnelle optique des elements peut etre utilisee pour diminuer le nombre de 20 points de calibration utilises sur le DMD et la duree de cette operation. [0064] On peut notamment effectuer la calibration pour plus de deux fluorophores pour obtenir un instrument ayant des capacites d'imagerie pour plus de deux couleurs et notamment pour chaque filtre colore disponible sur un microscope particulier ou pour chaque fluorophore d'un echantillon donne. 25 [0065] Pour ('acquisition des images, on peut former des grilles lumineuses de 1 pixel separees par exemple par 4 a 5 taches de diffraction du microscope, notamment sur une matrice carree ou sur une matrice hexagonale. Une fois choisi le pas de la grille en fonction de la resolution du systeme optique, on choisit ('angle du prisme pour que tous les points colores images d'un spectre de fluorescence d'un point soient contenus dans la grille choisie sans recouvrement d'un 30 point de la grille a une autre longueur d'onde, lorsqu'ils sont disperses par le prisme. De cette fagon, on peut enregistrer tous les points de la grille en couleur en une seule fois, a la cadence de la camera. [0066] En pratique, pour la microscopie 3D, c'est la necessite de *parer les points sources du fond de fluorescence hors plan focal, qui impose, de fagon connue, la distance entre les points de 35 la grille. [0067] Pour enregistrer une image carree ou rectangulaire ou d'une forme quelconque, on peut translater une grille dans des directions non-colineaires jusqu'a avoir enregistre les images en couleur de tous les points de l'image carree ou rectangulaire ou d'une autre forme, donnee par la 12 forme du capteur de la camera. [0068] Si plusieurs pixels de la camera recouvrent un pixel du DMD dans (image, on peut utiliser l'intensite sur ces pixels de Ia camera pour ameliorer Ia resolution spatiale au-dela de celle du DMD, grace a Ia camera. 5 [0069] II est ainsi possible, sans aucun masque colore ni pieces mobiles, et connaissant par une calibration unique les translations ou positions associees a chaque longueur d'onde sur la camera a un pixel donne, de choisir une longueur d'onde de reference, la premiere longueur d'onde calibree, et de superposer les images colorees dont les places sont connues relativement a l'une d'entre elles, prise pour reference, en les translatant sur ('image de reference dans un systeme de 10 traitement d'image. II est possible de faire des sequences d'image ou images video multicouleurs et hyperspectrales en 3D avec le dispositif. [0070] II est a noter que les filtres a utiliser pour la calibration, centres sur les bandes d'emission des principaux fluorophores, en nombre limite, sont generalement presents sur un systeme d'imagerie par fluorescence dans un microscope et que la calibration est d'autant plus applicable 15 a un grand nombre de dispositifs existants, a titre d'accessoire permettant l'imagerie ou la video en couleur a la frequence maximum d'acquisition de la camera. [0071] II est a noter que la calibration spectrale du systeme optique incluant le filtre peut etre faite prealablement a toute utilisation et une seule fois, par le fabricant ou l'utilisateur d'un microscope utilisant l'imagerie par fluorescence avec un meme objet de calibration. II est possible 20 d'utiliser chez un fabricant une calibration avec un jeu de filtres etalons dont le parallelisme est le plus parfait possible et la transmission spectrale representative de tous les filtres produits. II est possible chez un utilisateur de calibrer avec les filtres fournis avec le microscope en acceptant leur parallelisme. [0072] Dans tous les cas, la calibration peut etre faite de fagon asynchrone avec les mesures et 25 les mesures peuvent etre faites sans aucun filtre colore, en utilisant la dispersion du prisme pour distinguer les spectres de fluorescence ou couleurs ou les longueurs d'onde centrales revues par chaque pixel de camera et les images de reference enregistrees. En pratique, a nouveau, un filtre et un miroir dichroIque, permettant de supprimer la ou les longueurs d'onde d'excitation, sont generalement necessaires. 30 [0073] L'invention obtient donc avec une camera monochromatique, une capacite d'imagerie en couleur, a une cadence fonction de la vitesse de la camera. [0074] Pour realiser une image 2D it faut ainsi enregistrer toutes les positions de la grille d'illumination. Dans un cas typique it faut environ 200 images camera pour obtenir une image 2D. Donc la cadence d'imagerie reelle est 1/200 vitesse camera, cette cadence d'imagerie est obtenue 35 en imposant un synchronisme de la camera avec le modulateur de fagon electronique. En pratique, la camera est donc synchronisee avec le DMD. [0075] De fagon remarquable, pour des motifs discrets, les images spectrales ou multicolores obtenues en 2D sont confocales (c'est a dire sectionnees ou sectionnables en z ou selon la 13 direction de l'axe optique ou en profondeur) et adaptees a la microscopie 3D. Pour une grille, par exemple, les images etant necessairement de motifs de points espaces pour les raisons ci-dessus d'intervalle spectral libre, elles sont en effet naturellement adaptees a un filtrage des frequences spatiales discretes de Ia grille d'eclairage par rapport au fond continu de Ia fluorescence hors- 5 plan, issue de plans differents du plan objet et perpendiculaires a l'axe optique. II est donc possible de deplacer le microscope par rapport a l'objet ou l'objet par rapport au microscope, par des moyens connus, pour obtenir apres filtrage, des images 3D en couleur d'un objet fluorescent. [0076] En pratique le sectionnement est d'autant meilleur que moins de points sont eclaires en meme temps dans l'image par le DMD mais la cadence d'acquisition en est d'autant plus lente, le 10 DMD ou la camera limitant celle-ci. II est possible par de simples operations d'execution d'ajuster pour un sectionnement en z donne la periode de la grille et d'observer la cadence d'acquisition qui en resulte ou de fixer la cadence et d'operer avec le sectionnement en z qui en decoule. [0077] On comprend que la separabilite des images issues de differentes couleurs de l'objet, separees d'abord angulairement par le prisme, puis spatialement sur la camera, ou separees en z 15 (sectionnees) le long de l'axe optique du microscope, peut etre variable. Ce critere peut etre apprecie dans les memes termes que la limite de resolution dans les images optiques afin de verifier si un motif choisi sur un modulateur spatial est adapte a la mise en oeuvre de l'invention pour un prisme donne et des caracteristiques optiques donnees, de fawn a donner toute son extension a l'invention. L'adaptation du motif peut etre determine a la calibration grace a ce 20 critere prealablement aux mesures sur les objets a imager par le microscope. [0078] L'invention est susceptible d'application industrielle dans le domaine des microscopes 3D pour ('observation en couleur de la fluorescence. [0079] II est entendu dans la presente demande que les mots « source de lumiere » s'entendent aussi comme plusieurs sources de lumiere (coaxiales) dont le spectre d'emission comprend une 25 premiere bande spectrale et une seconde bande spectrale, pour obtenir ('excitation de la fluorescence du premier fluorophore a la premiere couleur et du deuxieme fluorophore a la seconde couleur. [0080] II est entendu, au sens de la presente demande, qu'une « source de lumiere dont le spectre d'emission comprend une premiere bande spectrale et une seconde bande spectrale » 30 peut etre obtenue par la superposition d'un premier faisceau lumineux d'une premiere source de lumiere emettant dans la premiere bande spectrale et d'un second faisceau lumineux d'une deuxieme source de lumiere emettant dans la seconde bande spectrale, sans sortir de l'enseignement de la presente demande. Notamment, une source de lumiere, au sens de la presente demande, peut etre obtenue par plusieurs sources lasers de longueurs d'onde 35 differentes et rendues coaxiales. [0081] II est entendu, au sens de la presente demande, que lorsqu'un prisme est introduit sur un faisceau lumineux, issu d'un point objet, et ayant traverse un microscope, it rest preferentiellement a une position pour laquelle des rayons lumineux du faisceau, incidents sur le 14 prisme, sont paralleles entre eux, au moins dans ('approximation de I'optique paraxiale, dans la mesure necessaire a minimiser les defauts optiques ou aberrations geometriques ou chromatiques introduites par le prisme sur le faisceau lumineux qu'il transmet. [0082] On entend par perte de reference spatiale sur une camera munie d'un detecteur 5 matriciel, un deplacement de ('image d'un point de ('objet par rapport au referentiel forme par Ia grille du detecteur matriciel de Ia camera, superieur a Ia moitie de Ia limite de resolution du systeme d'imagerie concert* dans I'espace objet. II est connu qu'un tel deplacement peut etre induit par I'ajout et/ou le retrait d'un element optique dans le montage. [0083] Pour une image subissant une dispersion en longueur d'onde en plusieurs images colorees 10 au sens d'associees chacune sur un detecteur monochromatique a une longueur d'onde inconnue ou a un intervalle en longueur d'onde faible autour dune longueur d'onde inconnue, le probleme de la perte de reference spatiale se caracterise par le fait qu'aucune image coloree a une longueur d'onde connue ou dans un intervalle en longueur d'onde faible autour dune longueur d'onde connue, ne reste fixe ou ne se deplace de moins de la moitie de la limite de resolution du systeme 15 d'imagerie concert* dans l'espace objet. [0084] Le probleme de la perte de la reference spatiale dans les systemes d'imagerie ne semble pas avoir ete identifie dans fart anterieur. Le procede de calibration propose dans la presente demande qui consiste a isoler une longueur d'onde connue ou un spectre connu par un filtre interferentiel dont le parallelisme et les conditions d'eclairage n'entrainent pas une perte de 20 reference spatiale pour cette longueur d'onde ou ce spectre connu, apparait donc comme un moyen de recuperer la reference spatiale pour cette longueur d'onde connue ou ce spectre connu. Ce procede se generalise a autant de longueurs d'onde connues ou de spectres connus pour lesquels il est necessaire d'avoir une reference spatiale, par exemple a autant de spectres de fluorophores pour un systeme de microscopie par fluorescence associant une couleur arbitraire 25 (rouge, vert, bleu, ...) d'un systeme colorimetrique a un spectre de fluorophore pour representer en fausses couleurs une image obtenue avec un systeme monochromatique avec la meme resolution que le systeme d'imagerie utilise sans dispersion en longueur d'onde de ('image. [0085] De ce point de vue, on comprend de la presente demande que ('utilisation de tout element dispersif en remplacement d'un prisme simple, comme une association de prismes 30 (notamment prisme d'Amici) ou comme un reseau, est aussi dans l'enseignement de la presente demande, dans la mesure 00 il provoque une perte de reference spatiale a une longueur d'onde ou pour un spectre d'interet pour le systeme d'imagerie en couleurs. II en serait notamment ainsi pour un element ne deviant pas la lumiere mais la dispersant comme un interferometre de Michelson des ('instant que ses defauts de parallelisme ou ses aberrations chromatiques 35 entrainent une perte de la reference spatiale pour le spectre ou la longueur d'onde consideres. [0086] Le concept inventif general du procede de la presente demande apparait finalement comme ('utilisation d'un filtre spectral preservant la reference spatiale sur une camera monochromatique, pour calibrer spatialement et spectralement un systeme d'imagerie integrant 15 un element dispersif spatialement et en longueur d'onde, c'est a dire l'etablissement de la position spatiale de chaque longueur d'onde ou de la forme de chaque spectre d'interet sur le detecteur matriciel de la camera monochromatique, avec une erreur de positionnement egale ou inferieure a la resolution spatiale ( ou la moitie de la resolution en fonction du critere choisi) du 5 systeme d'imagerie utilise pour former l'image sur la camera. [0087] On comprend de la presente demande, que le procede peut etre mis en oeuvre de fawn equivalente soit par insertion dans le chemin optique d'imagerie d'un element preservant la reference spatiale, soit par insertion dans le chemin optique d'un element calibre, i.e. mesure quant a son changement de la reference spatiale avec une precision qui permet d'avoir un 10 deplacement connu de la reference spatiale avec une erreur inferieure a la resolution du systeme d'imagerie et que Ion peut donc soustraire pour annuler la perturbation du composant ou element introduit. [0088] Par exemple, pour utiliser un filtre interferentiel a lames a faces planes et paralleles pour Ia calibration selon le procede de l'invention, on peut de fawn equivalente, soit imposer que ses 15 tolerances de parallelisme entre ses deux faces et de planeite sur chaque face soient suffisamment basses pour que cette preservation soit acquise, soit evaluer Ia perturbation de reference spatiale au spectre d'interet d'apres ses defauts de parallelisme ou Ia prevoir partiellement par le calcul par une mesure d'indice et dangle entre faces du filtre interferentiel. [0089] II est aussi a noter que Ia transmission spectrale d'un filtre interferentiel utilise pour Ia 20 calibration, sera preferentiellement etroite et centree sur le spectre d'emission du fluorophore qui sera utilise pour l'imagerie, et ce, pour obtenir une calibration la plus fidele possible pour le fluorophore considers. De tels filtres sont connus de fart anterieur. [0090] Le procede de l'invention apparait encore comme un moyen de minimiser faction d'un element optique produisant une deviation geometrique variable en fonction de la longueur 25 d'onde, introduit sur un chemin optique, par l'ajout et le retrait sur le chemin optique d'un filtre spectral produisant une deviation geometrique nulle en fonction de la longueur d'onde, ce qui parait particulierement paradoxal. [0091] En consideration des elements ci-dessus, un prisme au sens de l'invention est tout element provoquant une dispersion chromatique relative des images d'un point de l'objet qui est 30 superieure a un pixel sur la camera ou a la resolution optique dans l'objet. [0092] En consideration des elements ci-dessus, un filtre ou filtre interferentiel ou filtre optique au sens de l'invention est tout element optique de transmission variable en fonction de la longueur d'onde, dont la deviation geometrique sur un systeme d'imagerie, est, en fonction de la longueur d'onde, nulle ou inferieure a la moitie de la resolution spatiale du systeme d'imagerie. 35 [0093] Le procede de l'invention est susceptible d'application industrielle ou utile pour la calibration spectrale des systemes d'imagerie monochrome, possedant un element dispersif en longueur d'onde sur leur chemin optique. 16 [0094] Aux fins de la presente demande, dans le dispositif optique de l'invention le mot « entre » dans ('expression « dispose entre » signifie pour un composant optique C dispose « entre » un composant optique A et un composant optique B, que dans un fonctionnement normal du dispositif de l'invention, Ia lumiere cheminant de A a B, par un chemin optique, rencontre d'abord 5 C avant B ou que Ia lumiere cheminant de B a A sur le chemin optique, par application du principe de retour inverse de Ia lumiere, rencontre d'abord C avant A. De ce point de vue, C se trouve bien ainsi sur le chemin optique prevu pour Ia lumiere entre A et B, ou entre B et A. Notamment, le systeme ou dispositif de l'invention est un systeme dit « non de-scanne », dans lequel un separateur est entre un modulateur et un objectif de microscope par opposition a un systeme dit 10 « de-scanne» dans lequel le modulateur est entre le separateur et l'objectif de microscope. Cette distinction est essentielle car pour un systeme de-scanne, le probleme technique de Ia perte de Ia reference spatiale lors de ('introduction d'un element dispersif, ne se pose pas de fagon aigue, le modulateur fournissant une reference spatiale. [0095] Dans les systemes de l'invention, le DMD ou le modulateur est conjugue d'un plan objet 15 pour Ia lumiere d'illumination (sur Ia figure 1, via Ia lentille 6 au plan foyer objet de laquelle le DMD 1 est dispose et via ('objectif de microscope 2) alors que le plan objet est conjugue du plan du detecteur de Ia camera pour Ia lumiere de fluorescence de l'objet. Autrement dit, dans une utilisation normale de tous les systemes de l'invention, le modulateur est eclaire seulement par une lumiere d'illumination, issue d'une source, le plan objet est eclaire seulement par Ia lumiere 20 d'illumination, et Ia camera est eclairee seulement par Ia lumiere de fluorescence, sous illumination, d'un objet fluorescent, dispose dans le plan objet; aucune image du modulateur sur Ia camera, qui pourrait servir de reference spatiale dans ('image de l'objet sur Ia camera, n'est ainsi formee par les systemes de l'invention. L'invention est applicable comme decrit ci-dessus, a tout systeme de microscopie en fluorescence ou de fluorescence, utilisant un modulateur et une 25 camera conjugues chacun d'un meme plan objet, par un moyen optique qui ne forme pas d'image du modulateur sur Ia camera. On comprend toutefois de Ia demande que Ia separatrice fonctionnant en reflexion pour Ia voie d'illumination et en transmission pour Ia voie de fluorescence (ou ('inverse) et associee a un objectif de microscope unique conjuguant le modulateur et Ia camera avec un meme cote du plan objet, pourraient etre aussi bien remplaces, 30 de fagon equivalente, par un premier objectif de microscope conjuguant le modulateur avec un cote du plan objet pour ('illumination et par un second objectif de microscope conjuguant l'autre cote du plan objet avec Ia camera via une separatrice, eliminant Ia lumiere d'illumination pour ne conserver que Ia lumiere de fluorescence sur Ia camera, de Ia meme fagon que decrit dans Ia demande pour un objectif de microscope unique. 35 [0096] On comprend de Ia presente demande que tout element optique dispersif (prisme, reseau, ...) peut etre utilise de fagon equivalente au prisme decrit ci-dessus, sans sortir de l'enseignement REVENDICATIONS1. Microscope de fluorescence a champ large pour ('observation d'un plan objet dans un milieu objet tridimensionnel apte a emettre une lumiere de fluorescence en reponse a une lumiere d'illumination, caracterise en ce qu'il comprend une premiere voie optique pour la lumiere d'illumination, une deuxieme voie optique pour la lumiere d'illumination et la lumiere de fluorescence et une troisieme voie optique pour la lumiere de fluorescence, dans lequel la premiere voie comprend un modulateur spatial (1) limitant le champ du microscope a champ large, dans lequel la deuxieme voie s'etend entre le plan objet et un separateur (3), dichroique vis-a-vis de la lumiere d'illumination et de la lumiere de fluorescence, dans lequel la troisieme voie s'etend entre la deuxieme voie et une camera (4) apte a detecter la lumiere de fluorescence, dans lequel le microscope comprend un moyen optique pour conjuguer le modulateur spatial (1) avec le plan objet pour la lumiere d'illumination et pour conjuguer le plan objet avec la camera (4) pour la lumiere de fluorescence et dans lequel la troisieme voie comprend un element optique dispersif pour la lumiere de fluorescence. 2. Microscope a champ large selon la revendication 1, dans lequel le moyen optique comprend un objectif de microscope (2) dispose sur la deuxieme voie. 3. Microscope a champ large selon la revendication 1, dans lequel le moyen optique comprend un premier objectif de microscope dispose sur la premiere voie et un second objectif de microscope dispose sur la deuxieme voie. 4. Microscope a champ large selon la revendication 1, dans lequel ('element optique dispersif est un prisme (5). 5. Dispositif selon la revendication 1, dans lequel le modulateur spatial (1) est une matrice de micro-miroirs (DMD). 6. Dispositif selon la revendication 1 dans lequel le modulateur spatial (1) est un disque tournant. 7. Procede pour la calibration a une premiere longueur d'onde du microscope a champ large selon la revendication 1, comprenant les etapes suivantes: - disposer dans un voisinage du plan objet un milieu objet apte a emettre de la lumiere de fluorescence dans une premiere bande spectrale contenant la premiere longueur d'onde, en reponse a une premiere lumiere d'illumination, - disposer sur la troisieme voie un premier filtre interferentiel apte a selectionner spectralement un voisinage de la premiere longueur d'onde, 18 - illuminer sequentiellement par la premiere lumiere d'illumination, chaque point du champ large du microscope dans le plan objet, au moyen du modulateur spatial (1), - enregistrer une premiere image de chaque point du champ large du microscope, sur la camera (4), 5 - enlever le premier filtre interferentiel de la troisieme voie. 8. Procede selon la revendication 7 pour la calibration a une deuxieme longueur d'onde du microscope a champ large selon la revendication 1, consistant a repeter les etapes de la revendication 7 avec un deuxieme filtre interferentiel, apte a selectionner spectralement un 10 voisinage de la deuxieme longueur d'onde, pour obtenir une deuxieme image de chaque point du champ large du microscope, enregistree avec le deuxieme filtre interferentiel sur la camera (4). 9. Procede d'utilisation du microscope a champ large selon la revendication 1, calibre selon le procede de la revendication 8, comprenant les etapes suivantes: 15 - disposer au voisinage du plan objet, un echantillon apte a emettre une lumiere de fluorescence dans un spectre de longueurs d'onde comprenant le voisinage de la premiere longueur d'onde et le voisinage de la seconde longueur d'onde, en reponse a une lumiere d'illumination, - illuminer le champ large du microscope selon une grille de points, au moyen du modulateur spatial (1), 20 - enregistrer l'image de chaque point de la grille pour le spectre de longueurs d'onde, sur la camera (4), - repeter les deux etapes ci-dessus en appliquant des translations a la grille dans le champ large du microscope, au moyen du modulateur spatial (1), jusqu'a avoir enregistre une image pour le spectre de longueurs d'onde de chaque point du champ large du microscope sur la camera (4), 25 - deduire par traitement d'image, une premiere image d'un point de rechantillon a la premiere longueur d'onde, a partir de la premiere image de ce point a la premiere longueur d'onde, obtenue par le procede de calibration et de l'image de ce point pour le spectre de longueurs d'onde, - deduire par traitement d'image, une deuxieme image du point de l'echantillon a la deuxieme 30 longueur d'onde, a partir de l'image de ce point a la deuxieme longueur d'onde, obtenue par le procede de calibration et de l'image de ce point pour le spectre de longueurs d'onde. 10. Procede selon la revendication 9 pour obtenir une image spectrale d'un echantillon, sectionnee le long d'un axe optique du microscope a champ large, dans lequel le traitement 35 d'image comprend l'etape suivante: - supprimer le fond continu dans les images enregistrees par la camera (4).