Brevet FR3083248A1 — publié le 20200103

KIT DE DETECTION DE L'ALTERNARIOSE ET DE DISCRIMINATION ENTRE LES SOUCHES ALTERIVARIA DE LA SECTION ALTERNARIA ET CELLES DE LA SECTION PORRI Domaine de l'invention La présente invention a trait au domaine du diagnostic de terrain appliqué à la détection de pathogènes infectant les végétaux. Elle concerne plus spécifiquement une méthode de détection de l'alternariose, en particulier de l'alternariose de la pomme de terre, et un kit de diagnostic mettant en oeuvre cette méthode. La 10 méthode permet de détecter la présence d'un pathogène de genre Alternaria sp. responsable de l'alternariose de la pomme de terre mais permet également de discriminer entre deux groupes de souches, celles de la section Alternaria et celles de la section Porri. Elle est basée sur la technique d'amplification par recornbinase polymérase qui permet de réaliser un diagnostic rapide sur le terrain, c'est-à-dire à 15 proximité des champs de pomme de terre, et qui ne nécessite pas de formation du manipulateur spécifique aux techniques de laboratoire. Etat de la technique En France, la production de pommes de terre génère un chiffre d'affaire annuel de 20 12 milliards d'euros. Avec une production de 6,95 millions de tonnes par an et un niveau de qualité élevé, la France a un avantage compétitif lui conférant la place de 2ème exportateur mondial de pommes de terre. Cependant, depuis quelques années, la filière pomme de terre est de plus en plus touchée par l'alternariose deuxième maladie fongique en végétation après le mildiou - qui peut entraîner 25 jusqu'à 20% de perte de rendement. Cette maladie est causée par des champignons du genre A/tornade. Ce parasite ne touche pas que la pomme de terre, il infecte également la tomate, le piment, l'aubergine, le pétunia et la carotte. Ses spores entrainent des allergies chez les animaux et les humains. 30 Le genre Alternaria est composé de multiples espèces pathogènes et saprophytes. Actuellement, le genre est divisé en 26 sections taxonomiques basées sur la 2 phylogénie moléculaire. Ces sections incluraient 299 espèces (2008)' . Deux sections incluant des espèces d'Alternaria ont été identifiées comme saprophytes ou pathogènes de la pomme de terre - la section Alternaria contenant des espèces dites « à petites spores » (A. alternats, A. arborescens, A. tenuissima et A. durnosa); et - la section Pair! contenant des espèces dites « à larges spores » A. olani, A grandis, A. protenta, A. tinariae). L'alternariose de la pomme de terre est doublement difficile à diagnostiquer. D'une 10 part, ses symptômes se confondent avec de simples carences (rnacro ou oligoelements) et d'autre part, il est impossible de différencier à l'oeil entre les souches Alternaria de la section Alternaria et celles de la section Porri alors que leur pathogénicité diffère fortement. 15 En effet, les souches de la section Allemane ont peu d'impact sur les rendements alors que les souches de la section Pou/ présentent un réel danger pour les récoltes si la lutte fongicide n'est pas menée correctement, notamment si l'infection n'est pas traitée dés son apparition. De plus, les souches des deux sections présentent des résistances différentes aux fongicides. Il existe donc un réel besoin de disposer d'un outil de diagnostic permettant de détecter rapidement la présence d'alternariose et de discriminer une infection en fonction de la section des souches impliquées. Inconvénients de l'art antérieur 25 A l'heure actuelle, le diagnostic ne peut se faire qu'en laboratoire, ce qui implique un temps de réponse élevé et donc une prise en charge tardive. Face à un risque potentiel, des traitements fongicides sont appliqués en préventif. Ces traitements massifs entraînent des risques d'apparition de résistance aux fongicides et contribuent à la pollution des cultures et des sols. 30 Kirk PM, Cannon PF, Minter DW, Stalpers 1A, Dictionarryof the Fungt, Wailingforcl, CAB", 2008, 10e éd. (ISBN 0-851994326-7) p. 22 3 Avantages de l'invention La présente invention répond au besoin du monde agricole en proposant un test ADN duplex destiné à être utilisé sur le terrain pour une détection rapide permettant de discriminer les deux sections de pathogènes Allemane incriminés dans l'alternariose. Ce test s'appuie sur la méthode d'amplification par recombinase polymérise (ou RPA pour « Recombinase Polymerase Amplification »). La RPA est une alternative isotherme à la réaction en chaîne de la polymérase (PCR). En effet, fonctionnant de manière optimale à des températures basses de 37- 10 42°C, les réactions RPA ne requièrent pas l'utilisation d'un thermocycleur. La RPA est bien plus rapide qu'une PCR (20min contre 3h-4h avec révélation sur gel) et plus simple car tout les réactifs sont réunis dans un même tube lyophilisé donc conservable à T° ambiante. Cela fait de la RPA un excellent candidat pour la mise au point de tests moléculaires rapides et utilisables sur le terrain. Cette technique est 15 bien connue de l'homme du métier et décrite notamment dans l'article de Olaf Piepenburg et al. (PLOS Biology, July 2006, Volume 4, Issue 7, page 1115) ainsi que dans les documents US 7,666,598 132, US2009/0029421 et US2012/0129173. éthode selon l'invention a l'avantage de permettre la détection, grâce à un choix 20 de couples amorcesIsonde fonctionnant en duplex, de toutes les espèces de souches responsables de l'Alternariose de la pomme de terre, à savoir d'une part celles de la section Allemane (A. aitemata, A. arborescens, A. tenuissima et A. dumosa) et d'autre part celles de la section Porri (A. soient A. grandis, A. protente, A. linariae) tout en différenciant ces deux sections. Les souches identifiées sont les 25 souches pathogènes les plus répandues à travers le monde. Ainsi, la méthode et le kit selon l'invention sont adaptés à la détection de ces souches sur pomme de terre mais aussi sur d'autres espèces végétales de solanées chez lesquelles les espèces pathogènes pour la pomme de terre le sont également (ex : tomate, piment, carotte...). 30 Le test de diagnostic a été conçu pour permettre une utilisation par des personnes sans aucune expérience de laboratoire, sans équipement de protection particulier et sans risque pour l'environnement ou le manipulateur (sans composant toxique), Il 4 permet d'obtenir un résultat en moins d'une heure (environ 30 min) et ce résultat est simple à interpréter (sous fan ne de bandelettes). La differentiation des deux sections (Alternaria et Porn) apporte une information précieuse sur les espèces présentes permettant d'adapter les traitements fongicides. Si aucune espèce n'est présente, ou si la souche présente appartient à la section Alternaria, le test peut indiquer [inutilité d'appliquer un traitement. Avec un résultat en 30 min, l'utilisateur pourra rapidement réagir au diagnostic dès l'apparition des premiers symptômes et adapter le traitement si nécessaire. 10 Sur 300 échantillons symptomatiques identifiés par des professionnels et testés par inventeurs, la méthode selon l'invention a permis de révéler que moins de 30% de ces échantillons étaient en réalité porteurs de l'Altemariose. D'où la possibilité, grâce à la méthode selon l'invention, de limiter les traitements et surtout d'éviter les 15 traitements fongiques inutiles et potentiellement polluants. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION 20 Un premier objet de l'invention concerne une méthode de détection de l'alternariose de la pomme de terre comprenant : a) le prélèvement d'un échantillon de feuille de pomme de terre suspectée d'être infectée par un pathogène responsable de l'altemariose ; b) l'extraction de l'ADN dudit échantillon ; 25 c) l'amplification duplex d'une séquence d'ADN spécifique aux champignons entrainant l'Alternariose et le marquage des amplicons ainsi générés par la méthode d'amplification par recornbinase polymérise à l'aide des amorces de séquences SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.2, SEQ ID N0.3 et SEQ ID NO.4. et des sondes de séquences SEQ ID NO. 5 et SEQ ID NOM 30 d) la détermination de la présence d'un pathogène responsable de l'alternariose lorsqu'au moins une séquence amplifiée est détectée à l'aide de l'une des sondes de séquences SEQ ID NO. 5 et SEQ ID NOM. L'invention concerne, dans son acceptation la plus large, une méthode de détection de l'alternarlose, notamment de la pomme de terre, comprenant a) le prélèvement d'un échantillon de feuille suspectée d'être infectée par un pathogène responsable de l'Alternariose b) l'extraction de l'ADN à partir dudit échantillon c) l'amplification duplex dudit ADN par la méthode d'amplification par recombinase polymérase à l'aide des amorces de séquences SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3 et SEQ ID NO.4 et de l'une des sondes de séquences SEQ ID NO. 5 et SEQ ID NOM. d) la détermination de la présence d'un pathogène responsable de l'Alternariose lorsqu'au moins une séquence amplifiée est détectée à l'aide de l'une des sondes de séquences SEQ ID NO. 5 et SEQ ID NO.6. Pour la mise en oeuvre de la méthode RPA, dans chaque couple d'amorces, l'un des deux amorces est marquée, par exemple à la biotine, alors que la sonde est marqué à l'aide d'un autre marqueur de type FAfv1 ou diogoxigénine. La sonde peu en outre contenir un site abasique de type THF. Cette méthode permet de déterminer si le plant de pomme dee suspecté par l'agriculteur d'infection de type Alternariose l'est effectivement ou s'il s'agit d'une autre maladie ou d'un problème physiologique de la plante. En effet, les deux couples d'amorces et les sondes utilisées en duplex permettent d'amplifier dans une même réaction toutes les souches Alternaria pathogènes décrites à l'heure actuelle, qu'elles soient de la section Alternaria ou de la section Porri. Ainsi, cette méthode permet de poser un diagnostic complet sur la présence d'une infection de type Alternariose. Un second objet de l'invention concerne une méthode de discrimination appliquée à un plant de pomme de terre infecté par l'Alternariose, entre une infection causée par une souche Alternaria de la section Alternaria et une infection causée par une souche Alternaria de la section Porri consistant à mettre en oeuvre la méthode de détection telle que définie précédemment, en considérant que le plant de pomme de terre est infecté par une souche Alternaria de la section Alternaria lorsque la sonde de séquence SEQ ID NO. 5 reconnaît une séquence amplifiée ; le plant de pomme de terre est infecté par une souche Alternaria de la section 5 Porri lorsque la sonde de séquence SEQ ID NO. 6 reconnaît une séquence amplifiée ; le plant de pomme de terre est infecté par au moins une souche la section Alternaria et au moins une souche de la section Porri lorsque les sondes de SEQ ID NO. 5 et SEQ ID NO.6 reconnaissent chacune une séquence amplifiée. 10 L'invention concerne, dans son acceptation la plus large, une méthode de discrimination entre un plant végétal infecté par fAlternariose dont l'infection est causée par une souche Alternaria de la section Alternaria et dont l'infection est causée par une souche Alternaria de la section Porri consistant à mettre en oeuvre la 15 méthode de détection telle que définie précédemment en considérant que : le plant est infecté par une souche Alternaria de la section Alternaria lorsque la sonde de séquence SEQ ID NO. 5 reconnaît une séquence amplifiée le plant est infecté par une souche Allemane de la section Porri lorsque la sonde de séquence SEQ ID NO. 6 reconnaît une séquence amplifiée ; 20 le plant est infecté par au moins deux souches Alternaria, à savoir au moins une souche de la section Alternaria et au moins une souche de la section Porri lorsque les sondes de SEQ ID NO. 5 et SEQ ID NO.6 reconnaissent chacune une séquence amplifiée. 25 Pour concevoir une telle méthode de diagnostic, les inventeurs ont mis au point : d'une part des couples amorcesisonde permettant d'amplifier de façon spécifique une séquence caractéristique de chacune des sous-espèces Alternaria de la section Allemane puis de détecter avec une seule sonde les différents amplicons ; 30 d'autre part des couples amorces/sonde permettant d'amplifier de façon spécifique une séquence caractéristique de chacune des sous-espèces Alternaria de la section Porri puis de détecter avec une seule sonde les différents amplicons ; 7 Puis, ils ont mis au point des conditions de réaction permettant un duplexage de deux réactions d'amplification et détection en choisissant un couple d'amorces/sonde pour chacune des sections - les deux couples choisis devant être compatibles entre eux (pas de réaction/détection croisée) - et en définissant les conditions d'amplification et de détection appropriées pour les deux réactions. De plus, les sondes ont été marquées différemment de sorte à pouvoir les détecter après hybridation avec les séquences amplifiées. Dans un mode de réalisation préféré, les sondes sont marquées avec des étiquettes antigéniques, par exemple FAI'vt, digoxigénine... Ainsi, les sondes peuvent être révélées de manière différentielle grâce à des anticorps spécifiques, par exemple fixés suries membranes nitrocellulosique insérées dans les cassettes de révélation. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la détection est ciblée sur 15 l'Alternariose de la pomme de terre causée par un pathogène du genre Allemane de la section Alternaria. Cette méthode comprend : a) le prélèvement d'un échantillon de feuille de pomme de terre suspectée d'être infectée par un pathogène responsable de l'Alternariose ; b) l'extraction de l'ADN présent dans ledit échantillon ; 20 c) l'amplification d'une séquence d'ADN spécifique par la méthode d'amplification par recombinase polymérase à l'aide des amorces de séquences SEQ ID NO.1 et SEQ ID NO.2 et d'une sonde de séquence SEQ ID NO. 5; d) la détermination de la présence d'un pathogène responsable de l'Alternariose 25 lorsqu'une séquence amplifiée est détectée à l'aide d'une sonde de séquence SEQ ID NO. 5. Dans son acceptation la plus large, l'invention concerne aussi une méthode de détection de l'Altemariose causée par un pathogène du genre Alternaria de la 30 section Alternaria comprenant a) le prélèvement d'un échantillon de feuille suspectée d'être infectée par un pathogène responsable de l'Alternariose ; b) l'extraction de l'ADN à partir dudit échantillon ; c) l'amplification dudit ADN par la méthode d'amplification par recombinase polymérase à l'aide des amorces de séquences SEQ ID NO.1 et SEQ ID NO.2 et d'une sonde de séquence SEQ ID NO. 5 ; d) la détermination de la présence d'un pathogène responsable de l'Alternariose lorsqu'une séquence amplifiée est détectée à l'aide d'une sonde de séquenne SEQ ID NO, 5. Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, la détection est ciblée sur la détection de l'Alternariose de la pomme de terre causée par un pathogène du 10 genre Alternaria de la section Peut. Cette méthode comprend : a) le prélèvement d'un échantillon de feuille de pomme de terre suspectée d'être infectée par un pathogène responsable de l'Alternariose ; b) l'extraction de l'ADN à partir dudit échantillon ; c) l'amplification dudit ADN par la méthode d'amplification par recombinase 15 polymérase à l'aide des amorces de séquences SEQ ID N0,3 et SEQ ID N0,4 et d'une sonde de séquence SEQ ID NO. 6 d) la détermination de la présence d'un pathogène responsable de l'Alternariose lorsqu'une séquence amplifiée est détectée à l'aide d'une sonde de séquence SEQ ID NO. 6. 20 Dans son acceptation la plus large, l'invention concerne aussi une méthode de détection de l'Alternariose causée par un pathogène du genre Alternaria de la section Porri comprenant a) la mise à disposition d'un échantillon de feuille suspectée d'être infectée 25 par un pathogène responsable de l'Alternariose b) l'extraction de l'ADN à partir dudit échantillon c) l'amplification dudit ADN par la méthode d'amplification par recombinase polymérase à l'aide des amorces de séquences SEQ ID N0,3 et SEQ ID N0.4 et d'une sonde de séquence SEQ ID NO. 6 ; 30 d) la détermination de la présence d'un pathogène responsable de l'Alternariose lorsqu'une séquence amplifiée est détectée à l'aide d'une sonde de séquence SEQ ID NO. 6. 9 Un troisième objet de l'invention concerne un kit de détection de la présence d'une Alternariose chez un plant de pomme de terre et de discrimination entre une infection causée par souches Alternaria de la section Alternaria et une infection causée par une souche Alternaria de la section Porri utilisable avec la méthode RPA et 5 comprenant : Deux couples d'amorces pour amplification par RPA des séquences spécifiques des différentes souches d'Alternana appartenant aux sections Alternaria et Porri, ces deux couples d'amorces étant de séquences SEQ ID NO.1 et 2 et de séquences SEQ ID NO.3 et 4 respectivement ; 10 Deux sondes ADN de séquences SEQ ID NO. 5 et 6 spécifiques des séquences amplifiées grâce aux couples d'amorces de séquences SEQ ID NO.1 et 2 et SEQ ID NO. 3 et 4 respectivement, ces deux sondes portant chacune des étiquettes antigéniques particulières ; Des bandelettes nitrocellulosiques sur lesquelles sont fixés des d'anticorps 15 permettant la détection spécifique des étiquettes antigéniques présentes sur les sondes. Dans son acceptation la plus large, l'invention concerne aussi un kit de détection de la présence d'une Alternariose chez un plant végétal et de discrimination entre une 20 infection causée par souches Alternaria de la section Alternaria et une infection causée par une souche Alternaria de la section Porri utilisable avec la méthode RPA et comprenant : Deux couples d'amorces pour amplification par RPA des séquences spécifiques des différentes souches d'Aftemaria, ces deux couples d'amorces étant de 25 séquences SEQ ID NO.1 et 2 et SEQ ID NO.3 et 4 respectivement ; Deux sondes ADN de séquences SEQ ID NO. 5 et 6 spécifiques des séquences amplifiées grâce aux couples d'amorces de séquences SEQ ID NO.1 et 2 et SEQ ID NO, 3 et 4 respectivement, ces deux sondes portant chacune des étiquettes antigéniques particulières. 30 Des bandelettes sur lesquelles sont fixés des d'anticorps permettant la détection spécifique des étiquettes antigéniques présentes sur les sondes. 10 Dans un mode de réalisation particulier de [invention, le kit est destiné à la détection de la présence d'une Alternariose causée par souches Alternaria de la section Alternaria chez un plant de pomme de terre. Ce kit est utilisable avec la méthode RPA et comprenant notamment: 5 un couple d'amorces pour amplification par RPA des séquences spécifiques des différentes souches d'Attemaria, ce couple d'amorces étant de séquences SEQ ID NO.1 et 2; une sonde ADN de séquence SEQ ID NO. 5 spécifique des séquences amplifiées, cette sonde portant une étiquette antigénique particulière ; 10 des bandelettes sur lesquelles sont fixés des d'anticorps permettant la détection spécifique des étiquettes antigéniques présentes sur les sondes. Dans son acceptation la plus large, l'invention concerne aussi un kit de détection de la présence d'une Altemariose causée par souches Alternaria de la section Alternaria 15 chez un plant végétal utilisable avec la méthode RPA et comprenant : Un couple d'amorces pour amplification par RPA des séquences spécifiques des différentes souches ci' Attemaria, ce couple d'amorces étant de séquences SEQ ID NO.1 et 2; Une sonde ADN de séquence SEQ ID NO. 5 spécifique des séquences 20 amplifiées, cette sonde portant une étiquette antigénique particulière ; Des bandelettes sur lesquelles sont fixés des d'anticorps permettant la détection spécifique des étiquettes antigéniques présentes sur les sondes. Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le kit est destiné à la 25 détection de la présence d'une Alternariose causée par souches Alternaria de la section Petri chez un plant de pomme de terre. Ce kit est utilisable avec la méthode RPA et comprenant notamment : un couple d'amorces pour amplification par RPA des séquences spécifiques des différentes souches d'Altemaria, ce couple d'amorces étant de séquences SEQ 30 ID NO.3 et 4; une sonde ADN de séquence SEQ ID NO. 6 spécifique des séquences amplifiées, cette sonde portant une étiquette antigénique particulière ; des bandelettes sur lesquelles sont fixés des d'anticorps permettant la détection spécifique des étiquettes antigéniques présentes sur les sondes, 11 Dans son acceptation la plus large, l'invention concerne aussi un kit de détection de la présence d'une Alternariose causée par souches Alternaria de la section Pott chez un plant végétal utilisable avec la méthode RPA et comprenant Un couple d'amorces pour amplification par RPA des séquences spécifiques des différentes souches d'Alternaria, ce couple d'amorces étant de séquences SEQ ID NO.3 et 4; Une sonde ADN de séquence SEQ ID NO. 6 spécifique des séquences amplifiées, cette sonde portant une étiquette antigénique particulière ; 10 Des bandelettes sur lesquelles sont fixés des d'anticorps permettant la détection spécifique des étiquettes antigéniques présentes sur les sondes. Lorsque le kit révèle une infection de type Aiternahose causée par une souche Parti, il est important de mettre rapidement en place un protocole de traitement antifongique approprié. Les kits selon l'invention constituent donc des outils d'aide la décision (OAD) en vue d'un traitement antifongique â savoir (i) s'il faut ou non traiter le champ de pommes de terre et dans l'affirmative, (ii) quel type de traitement est approprié en fonction du type de souche identifié. Les souches responsables de l'Alternariose détectées par les méthodes et kits selon l'invention sont les souches de la section Alternaria de type A. alternata A. arborescens, A. tenuissirna et A. dumosa, et les souches de la section Porri de type A. salant, A. grandis, A. protenta, A. iinariae. PARTIE EXPERIMENTALE La présente invention peut être mise en oeuvre en proposant un kit de détection de terrain tel que le Flashdiag®ALT présenté dans cet exemple. L'amplification des séquences spécifiques des pathogènes responsables de l'Alternariose de la pomme de terre est réalisée par la méthode d'amplification par recombinase polymérise telle que décrite dans Piepenburg O. et al. (PLOS Biology, July 2006, Volume 4, Issue 7, page 1115). Les éléments spécifiques développés 25 30 12 dans le cadre de la présente invention sont les couples d'amorces et sondes décrites ci-après. L'une des amorces est liée à un marqueur biotine, 5 Pour l'amplicationi détection des souches de la section Alternaria: amorce sens ALLalti: [5'BiotinTEG] TGGTGTTGGGCGTCTTGTCTCTAGCT (SEQ ID NO.1) amorce anti-sens ALT_alt_R GTATCCCTACCTGATCCGAG (SEQ ID NO.2) sonde ALlinfo_alt 6-FAM] 10 CCAGTAGGCCGGCTGCCAA[THE]TACTTTAAGGCGAGT [C3 spacer) (SEQ ID NO.5) Pour ilamplication/ détection des souches de la section Porri: amorce sens AL Tipor F TTTCCTTICACACGGACTGC. (SEQ ID NO.3) 15 - amorce anti-sens ALT_por_R: [5'BiotinTEG] GTCGCCAGGGCATGATATCGCCAAC (SEQ ID NO.4) Digoxigenin] [C3 spacer] - sonde ALtrifq_por [5' CTTTCACACGGACTGCTGCAT[THF]CACCTGGTGCTTCCTC (SEQ ID NO.6) Le site THE correspond a un tétrahyfdrofurane utilisé pour créer un site abasique stable dans l'oligonucléotide. Le mix réactionnel pour une réaction dans lequel les séquences d'intérêt sont 25 amplifiés puis hybridées avec les sondes spécifiques en duplex est décrit dans le Tableau 1. 30 Tampon de 14,75 pl - réhydratation MgOAC (280mM) 125 pi ' 16,8 mivl ALT_alt_F(10pM) 1,26 pl 504 nM 504 riM ALT_aft_R (10pM) 1,26 pl ALT_nfo_alt (10pM) ; 0,36 pl 144 nM ALT_por F (10pM) 0,84 pl 336 nM ALT_por R (10pM) 0,84 pl 336 ntvl SOL_nfo_por (10pM) 0,24 pl 96 nM 15 Tableau 1 Mix réactionnel du_FlashdiaoeALT Le protocole final FlastidiageALT est composé des étapes suivantes : 1. Prélèvement d'un morceau de feuille présentant 1111 symptôme avec un 20 emporte-pièce 2. L'échantillon est placé dans un sachet d'extraction contenant 3m1 de tampon d'extraction d'ADN 3. L'échantillon est broyé jusqu'à obtenir un broyat homogène 4. Le broyat est prélevé à l'aide d'une pipette de transfert 25 5. Le broyat est transféré dans une seringue 5m1 équipée d'un filtre pour se débarrasser des débris végétaux 6. Le broyat filtré est recueilli dans un tube 7. Un tube contenant le culot lyophilisé contenant les sondes et les amorces telle que définies ci-dessus et une bille magnétique est réhydraté avec un mélange 30 de tampon de réhydratation et du MgOAc à l'aide d'une pipette à volume fixe équipée de cônes 200p1 afin d'obtenir un mix réactionnel tel que décrit au Tableau 1. 14 8. L'ADN précédemment extrait est ensuite transféré dans le mix de réaction nécessaire à la réaction d'amplification par recornbinase polymérase préparé à l'étape 7, à l'aide d'une oese et mélangé pendant environ 15 secondes. 9. Le tube est placé dans le bloc chauffant de type Twirla avec le programme suivant : -Température : 39°C -Durée : 2Omin -Temps d'agitation : 5 sec intervalle d'agitation : 5 min 1.0 10. Une fois la réaction terminée, le tube est placé dans une cassette de type U- Star (ref : 0001-05 vendu par TvvistDx) pour la révélation du résultat. Cette cassette comprend une bandelette de nitrocellulose sur laquelle sont fixés des anticorps capables de reconnaître les amplicons marqués à l'aide de FAM (sonde spécifique des amplicons de la section Alternaria), ou de la 15 digoxigénine (sonde spécifique des amplicons de la section Port-O. Le protocole complet dure donc environ 30-35min et fournit un ulta simple : - Bande contrôle : Apparition à chaque test - Bande-test supérieure : Présence d'une espèce de la Section Alternaria 20 - Bande-test inférieure : Présence d'une espèce de la Section Porri obtenu grâce au kit Flashdiag®ALT est représenté à la Figure 1. Le prototype Flashdiag®ALT permet donc de détecter et différencier correctement les espèces pathogènes d'Alternaria REVENDICATIONS1. Méthode de détection de l'alternariose, notamment de la pomme de terre, comprenant : a) le prélèvement d'un échantillon de feuille suspectée d'être infectée par un pathogène responsable de l'altemariose b) l'extraction de l'ADN à partir dudit échantillon c) l'amplification duplex dudit ADN par la méthode d'amplification par recombinase polymérase à l'aide des amorces de séquences SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3 et SEQ ID NO.4 et de l'une des sondes de séquences SEQ ID NO. 5 et SEQ ID NO.6. d) la détermination de la présence d'un pathogène responsable de l'Alternariose lorsqu'au moins une séquence amplifiée est détectée à l'aide de l'une des sondes de séquences SEQ ID NO. 5 et SEQ ID NO.6. 2. Méthode de discrimination entre un plant végétal infecté par l'altemariose dont l'infection est causée par une souche Altemaria de la section Alternaria et dont l'infection est causée par une souche Altemaria de la section Porri consistant à mettre en oeuvre la méthode de détection telle que définie à la revendication 1 en considérant 20 que : le plant est infecté par une souche Alternaria de la section Alternaria lorsque la sonde de séquence SEQ ID NO. 5 reconnaît une séquence amplifiée le plant est infecté par une souche Alternaria de la section Porri lorsque la sonde de séquence SEQ ID NO. 6 reconnaît une séquence amplifiée ; 25 - le plant est infecté par au moins deux souches Alternaria, à savoir au moins une souche de la section Alternaria et au moins une souche de la section Porri lorsque les sondes de SEQ ID NO. 5 et SEQ ID NO.6 reconnaissent chacune une séquence amplifiée. 30 3. Méthode de détection de l'alternariose causée par un pathogène du genre Alternaria de la section Alternaria comprenant : a) le prélèvement d'un échantillon de feuille suspectée d'être infectée par un pathogène responsable de l'Alternariose ; b) l'extraction de l'ADN à partir dudit échantillon ; 15 16 c) l'amplification dudit ADN par la méthode d'amplification par recombinase polymérase à l'aide des amorces de séquences SEQ ID NO.1 et SEQ ID NO.2 et d'une sonde de séquence SEQ ID NO. 5 ; d) la détermination de la présence d'un pathogène responsable de 5 l'Alternariose lorsqu'une séquence amplifiée est détectée à l'aide d'une sonde de séquence SEQ ID NO. 5. 4.Méthode de détection de l'altemariose causée par un pathogène du genre Alternaria de la section Porri comprenant : 10 a) la mise à disposition d'un échantillon de feuille suspectée d'être infectée par un pathogène responsable de l'alternariose b) l'extraction de l'ADN à partir dudit échantillon c) l'amplification dudit ADN par la méthode d'amplification par recombinase polymérase à l'aide des amorces de séquences SEQ ID NO.3 et SEQ ID 15 NO.4 et d'une sonde de séquence SEQ ID NO. 6 ; d) la détermination de la présence d'un pathogène responsable de l'alternariose lorsqu'une séquence amplifiée est détectée à l'aide d'une sonde de séquence SEQ ID NO. 6. 5. Kit de détection de la présence d'une alternariose chez un plant végétal et de discrimination entre une infection causée par souches Alternaria de la section Alternaria et une infection causée par une souche Alternaria de la section Porri utilisable avec la méthode RPA et comprenant : - Deux couples d'amorces pour amplification par RPA des séquences spécifiques des différentes souches d'Altemaria, ces deux couples d'amorces étant de séquences SEQ ID NO.1 et 2 et SEQ ID NO.3 et 4 respectivement ; - Deux sondes ADN de séquences SEQ ID NO. 5 et 6 spécifiques des séquences amplifiées grâce aux couples d'amorces de séquences SEQ ID NO.1 et 2 et SEQ ID NO. 3 et 4 respectivement, ces deux sondes portant chacune des étiquettes antigéniques particulières. - Des bandelettes sur lesquelles sont fixés des d'anticorps permettant la détection spécifique des étiquettes antigéniques présentes sur les sondes. 17 6. Kit de détection de la présence d'une alternariose causée par souches Alternaria de la section Alternaria chez un plant végétal utilisable avec la méthode RPA et comprenant : Un couple d'amorces pour amplification par RPA des séquences spécifiques des 5 différentes souches d'Alternaria, ce couple d'amorces étant de séquences SEQ ID NO.1 et 2; Une sonde ADN de séquence SEQ ID NO. 5 spécifique des séquences amplifiées, cette sonde portant une étiquette antigénique particulière ; Des bandelettes sur lesquelles sont fixés des d'anticorps permettant la détection 10 spécifique des étiquettes antigéniques présentes sur les sondes. 7. Kit de détection de la présence d'une alternariose causée par souches Alternaria de la section Porri chez un plant végétal utilisable avec la méthode RPA et comprenant : 15 Un couple d'amorces pour amplification par RPA des séquences spécifiques des différentes souches d'Altemaria, ce couple d'amorces étant de séquences SEQ ID NO.3 et 4; Une sonde ADN de séquence SEQ ID NO. 6 spécifique des séquences amplifiées, cette sonde portant une étiquette antigénique particulière ; 20 Des bandelettes sur lesquelles sont fixés des d'anticorps permettant la détection spécifique des étiquettes antigéniques présentes sur les sondes. 8. Méthode selon l'une des revendications 1 à 4 ou kit selon l'une des revendications 5 à 7 dans lesquels les souches responsables de l'Alternariose sont choisies parmi les 25 souches de la section Alternaria de type A. alternata, A. arborescens, A. tenuissima et A. dumosa, ou les souches de la section Porri de type A. solani, A. grandis, A. protenta, A. linariae. 30