Brevet FR3082730A1 — publié le 20191227

La présente invention concerne une méthode de résolution de l'inflammation pro-tumorale à l'aide d'une préparation pharmaceutique. La réaction inflammatoire est un processus biologique impliqué dans des réactions naturelles de défense de l'organisme mais aussi associé à une multitude de réactions 5 pathologiques. L'inflammation évoque en particulier des maladies inflammatoires telles que les maladies inflammatoires de l'intestin comme la maladie de Crohn et la poly arthrite rhumatoïde, mais elle est également impliquée dans la pathogenèse de l'obésité, du diabète et des troubles neurologiques tels que la dépression. Les facteurs pro- f() inflammatoires comme les cytokines pro-inflammatoires participent et soutiennent Pinflanunation dans l'obésité, la tumorigenèse et au cours de la progression du cancer. En effet, l'inflammation chronique joue un rôle important dans la promotion de l'échappement de la tumeur au système immunitaire et au maintien du développement de la tumeur. L'inflammation reste un facteur de risque aigu pour le cancer. 15 L'inflammation chronique peut être apparentée à une résolution partielle ou non aboulie de la réaction inflammatoire, qui peut être favorisée par des facteurs génétiques, environnementaux ou infectieux. L'inflammation chronique est particulièrement impliquée dans la progression des cancers induits par infections virales, comme l'inflammation associée à l'infection au papilloma virus (VPH) qui augmente le risque de 20 cancer du cou, à celle associée au virus de l'hépatite B et C et l'apparition d'hépatocarcinome ou encore avec Helicobacter pylori et le développement d'adénocarcinome ou de lymphome. L'inflammation chronique dans les maladies auto-immunes telles que la maladie de Crohn ou la colite ulcéreuse est aussi associée à un risque plus élevé de développer un cancer colorectal. Enfin, l'inflammation induite par 25 une exposition aux irritants ou dans l'obésité favorise également une activité pro-tumorale. Ainsi, lors de l'agression de l'organisme provoquant une inflammation, il est important de provoquer la résolution de l'inflammation ; si la résolution de l'inflammation n'est pas complète, une inflammation chronique peut s'installer, 30 débouchant sur les pathologies précitées. Si les médiateurs inflammatoires sont essentiels à la surveillance anti-tumorale, notamment au cours de la phase d'immuno-édition cancéreuse permettant la mise en place de réponses immunitaires anti-tumorales adaptées, ces derniers peuvent jouer un rôle pro-tumoral, et en particulier le TNF (tumor necrosis factor). En effet, le microenvironnement 2 inflammatoire tumoral peut favoriser la croissance tumorale, l'angiogenèse, l'invasion et la formation de métastases. Le développement tumoral est une conséquence de l'invasion des cellules tumorales en raison d'une prolifération accrue des cellules cancéreuses, de leur résistance à la mort par apoptose et à une angiogenèse dans le microenvironnement tumoral. Par exemple, le TNF pourra favoriser l'attraction des lymphocytes T régulateurs (Tregs) dans la tumeur ainsi que celle des cellules myéloïdes suppressives (MDSCs), affaiblissant davantage la réponse anti-tumorale. Paradoxalement, alors que les thérapies cytotoxiques induisant une mort immunogène des cellules tumorales ont permis de 10 démontrer un rôle majeur du système immunitaire dans le choix des traitements anticancéreux conventionnels, ces mêmes approches sont maintenant décrites comme associant des effets secondaires pro-tumoraux à travers les cellules mortes tuées par ces thérapies qui stimuleraient la croissance tumorale. Dans les maladies inflammatoires chroniques, la dérégulation de la résolution de 15 l'inflammation reste également une piste thérapeutique de choix afin de réenclencher la résolution naturelle de l'inflammation, c'est-à-dire permettre l'arrêt de la réponse inflammatoire. Actuellement, les approches thérapeutiques ciblées neutralisant ou détruisant les facteurs inflammatoires ont montré leurs limites. De plus il semble illusoire de pourvoir contrôler une pathologie complexe comme la maladie de Crohn en 20 neutralisant uniquement un facteur inflammatoire, qui n'est qu'une conséquence de la pathologie. En revanche, résoudre l'inflammation en rétablissant une résolution efficace pourrait permettre de traiter le coeur de la réaction inflammatoire. Ainsi encourager la résolution de l'inflammation et améliorer l'élimination des cellules tumorales tuées par les traitements anticancéreux deviennent un enjeu majeur 25 dans la prise en charge du cancer. De la même manière cibler la résolution de l'inflammation pourrait permettre un contrôle à la racine de la pathologie inflammatoire. L'invention concerne notamment des méthodes de prévention du cancer utilisant l'administration d'un résolutome, c'est-à-dire un ensemble de facteurs pro-résolutifs, capables de déclencher la résolution de l'inflammation, en inhibant l'échappement de la 30 tumeur à la surveillance immunitaire et son développement, et en rétablissant une immunité anti-tumorale efficace. Le brevet EP 2 941 257 décrit une préparation pharmaceutique en vue de son utilisation dans la prévention ou le traitement d'une réponse immunitaire pathologique ; cette préparation pharmaceutique comprend un surnageant pouvant être obtenu à partir 3 de la coculture de phagocytes avec des cellules apoptotiques. Dans ce brevet, la préparation pharmaceutique est utilisée dans le traitement d'une pathologie telle qu'une maladie auto-immune, par exemple de la polyarthrite rhumatoïde (PR) ou des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI). Cette préparation pharmaceutique est 5 également utilisée pour traiter la maladie du greffon contre l'hôte (MGCH). La présente invention a une cible différente, à savoir une méthode de résolution de l'inflammation pro-tumorale à l'aide d'un surnageant obtenu par une coculture de macrophages et de leucocytes irradiés ; ce surnageant comporte de façon inattendue de nombreux avantages par rapport au surnageant décrit dans le brevet EP 2 941 257. En particulier, il offre une quantité en facteurs pro-résolutifs plus importante que dans le cas du surnageant du brevet précité (Figure 1 a) ; il présente également une supériorité biologique (Figure lb). L'utilisation de la préparation pharmaceutique selon l'invention se fait au moment d'une résolution défaillante afin de rétablir une résolution efficace et permettre un arrêt de la réaction inflammatoire. Les buts de l'invention sont donc en particulier de résoudre une inflammation chronique installée et résoudre une inflammation favorisant la croissance tumorale à l'aide de la préparation pharmaceutique précitée. La présente invention est d'abord basée sur la démonstration que de cibler la résolution de l'inflammation pro-tumorale permet de restaurer la réponse immunitaire anti-tumorale et d'arrêter la réaction inflammatoire chronique. Il est rappelé à ce stade que l'inflammation joue un rôle bénéfique au début de l'installation d'une tumeur puis négatif par la suite favorisant l'échappement, ce que tend à contrôler la présente invention. Une méthode selon la présente invention consiste à utiliser un surnageant obtenu 25 en générant des macrophages dérivés de monocytes à partir de leucocytes du sang, de les stocker avec des leucocytes du sang préalablement irradiés permettant ainsi leur coculture et de récolter les facteurs contenus dans le surnageant produits par les cellules. Le surnageant constituant la préparation pharmaceutique selon l'invention destinée à obtenir la résolution de l'inflammation, sera dénommé « Resolvix » (marque 30 déposée) dans la suite de la présente description. L'injection de ces facteurs permet de résoudre la réaction inflammatoire en cours dans plusieurs modèles expérimentaux (arthrite, inflammation des intestins - IBD, colite, encéphalomyélite auto-immune expérimentale), mais aussi de favoriser la réparation des 4 tissus. De façon intéressante, cette approche permet aussi la restauration de l'immunité anti-cancéreuse et ainsi de favoriser la régression tumorale. A titre d'exemple non limitatif, une méthode de production du surnageant selon l'invention (Resolvix) va maintenant être décrite. 5 Les leucocytes sont isolés à JO par gradient de densité à partir de sang total, lavés, re-suspendus dans un milieu de culture défini, comme par exemple celui connu sous le nom RPMI 1640, puis répartis à 60% dans une première poche et à 40% dans une seconde. La première poche reçoit alors un facteur de différenciation et est conservée dans des conditions préservant la viabilité cellulaire, par exemple à 37°C, 5% de CO2, pendant 10 plusieurs jours, préférentiellement 3, puis reçoit à nouveau du milieu de culture défini frais précité. Cette première poche est alors laissée en l'état, aboutissant à la production de macrophages après plusieurs jours de conservation, préférentiellement 4 jours, dans des conditions préservant la viabilité cellulaire, par exemple à 37°C, 5% de CO2. La seconde poche est quant à elle conservée à basse température, préférentiellement à une 15 température inférieure à +10°C, et encore plus préférentiellement inférieure à +5°C. Au 7ème jour, la seconde poche est irradiée, par exemple à l'aide de rayons X, puis la première et la seconde poche sont débarrassées de leur milieu La seconde poche est alors reprise dans un milieu de sécrétion, comme par exemple celui connu sous le nom MEM, et transférée dans la première pour un stockage dans des conditions préservant la viabilité 20 cellulaire, par exemple à 37°C, 5% de CO2. Lors de ce stockage la coculture a lieu aboutissant à la production d'un surnageant conditionné, ce qui peut prendre plusieurs jours, préférentiellement 2. Dans la présente description, on entend par « surnageant conditionné » un surnageant contenant des facteurs dérivés des cellules. A l'issue de cette période de coculture, le surnageant est collecté dans une nouvelle poche, filtré puis conservé à très basse température, préférentiellement aux environs de -80°C. Ce surnageant est alors avantageusement mélangé avec d'autres surnageants produits, selon la méthode précédemment décrite, à partir de couches leuco-plaquettaires issues d'autres donneurs de sang, puis ce mélange est réparti en doses unitaires, lyophilisées ou non, puis stockées. De façon plus précise, des modèles de croissance tumorale in vivo ont été utilisés. Les résultats obtenus sont repris dans les figures suivantes : Figure 1 : comparaison biologique et d'activité de la nouvelle méthode de production aboutissant au surnageant dénommé Resolvix. La nouvelle méthode de production permet l'obtention d'une quantité supérieure en facteurs pro-résolutifs comme 5 la cytokine anti-inflammatoire TGF-beta, quantifiée par test ELISA (a), et une supériorité biologique (b) évaluée par test biologique d'inhibition de production de TNF dans des monocytes stimulés par phytohaemagglutinin. Données issues de 35 échantillons ancienne méthode et 89 nouvelle méthode, exprimées en % d'inhibition de production de 5 TNF, représentés avec la moyenne +/- l'erreur standard sur la moyenne. ***- p REVENDICATIONS1. Préparation pharmaceutique utilisée en vue d'obtenir la résolution de l'inflammation pro-tumorale comportant un surnageant obtenu à partir d'une coculture entre des macrophages et des leucocytes irradiés. 2. Préparation pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée en ce que lesdits macrophages sont des leucocytes. 3. Préparation pharmaceutique selon les revendications 1 et 2 caractérisée en ce que lesdits leucocytes sont isolés de la couche leuco-plaquettaire issue de sang total. 4. Préparation pharmaceutique selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'une partie desdits leucocytes est lavée, re-suspendue dans un milieu de culture défini, puis placée dans une première poche recevant un facteur de différenciation et conservée dans des conditions préservant la viabilité cellulaire pendant plusieurs jours, préférentiellement 3, avant de recevoir à nouveau du milieu de culture défini frais, puis être laissée en l'état pendant à nouveau plusieurs jours, préférentiellement 4, aboutissant à la production de macrophages. 5. Préparation pharmaceutique selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'une autre partie desdits leucocytes est placée dans une seconde poche conservée à basse température, préférentiellement inférieure à +10°C, et encore plus préférentiellement inférieure à +5°C. 6. Préparation pharmaceutique selon la revendication 5, caractérisée en ce que ladite seconde poche après avoir été irradiée, est débarrassée de son milieu, puis reprise dans un milieu de sécrétion dans des conditions préservant la viabilité cellulaire. 7. Préparation pharmaceutique selon la revendication 6, caractérisée en ce que ladite seconde poche est transférée dans ladite première poche, préalablement débarrassée de son milieu, l'ensemble des deux poches étant stockées dans des conditions préservant la viabilité cellulaire en vue de la co-culture entre les leucocytes pendant une période aboutissant à la production d'un surnageant conditionné. 8. Préparation pharmaceutique selon la revendication 7, caractérisée en ce que le surnageant résultant de ladite co-culture est collecté dans une nouvelle poche, filtré 30 et conservé à très basse température. 9. Préparation pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée par son utilisation dans le traitement de cancers, seul ou en complément d'autres thérapies anti-cancéreuses. 8 10. Préparation pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée par son utilisation pour restaurer une immunité anti-tumorale. 11. Préparation pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée par son utilisation pour stopper une progression tumorale. 5 12. Préparation pharmaceutique pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisée en ce qu'elle est le résultat d'un mélange de surnageants obtenus selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 à partir de plusieurs sources leucocytaires.