Brevet FR3076713A1 — publié le 20190719

Utilisation d'hémoglobine d'Annélides comme bactéricide, notamment pour prévenir et/ou traiter une maladie parodontale La présente invention concerne l'utilisation d'une molécule choisie parmi une globine, un protomère de globine ou une hémoglobine extracellulaire d'Annélides, comme agent bactéricide. La présente invention concerne également l'utilisation d'une molécule choisie parmi une globine, un protomère de globine ou une hémoglobine extracellulaire d'Annélides, pour prévenir et/ou traiter une maladie parodontale. Les maladies parodontales sont des maladies d'origine infectieuse (bactéries), qui touchent et détruisent les tissus de soutien des dents formant le parodonte. Le parodonte est constitué de quatre tissus : la gencive, l'os alvéolaire, le ligament alvéolo-dentaire et le cément. Lorsque la maladie parodontale se limite à la gencive, on parle de gingivite. Lorsqu'elle touche l'ensemble du parodonte, on parle de parodontite. Les maladies parodontales sont assez lentes et évoluent sur plusieurs dizaines d'années. Elles sont essentiellement dues à la plaque dentaire (i.e. accumulation de débris alimentaires et de bactéries) qui adhère à la surface de la dent située sous le rebord de la gencive. Le tartre est la calcification de cette plaque dentaire. Il est colonisé par des bactéries pathogènes. La stagnation des bactéries dans la plaque dentaire est à l'origine d'une réaction inflammatoire sur les gencives et l'os, induisant au fur et à mesure des mois et des années leur destruction. Comme indiqué précédemment, la formation d'un biofilm est une étape essentielle dans l'apparition des maladies parodontales. Elle se fait de manière hiérarchique, avec d'abord la colonisation des surfaces buccales par des colonisateurs primaires grâce à des ligands et des éléments nutritifs présents dans l'environnement, puis par des colonisateurs secondaires ou tardifs comme Porphymonas gingivalis (P. gingivalis) et Treponema denticola (T denticola) dont l'installation dans le biofilm est favorisée par les colonisateurs primaires. Certaines espèces parodontopathogènes ont été identifiées comme étant principalement associées aux maladies parodontales, et forment ce que l'on appelle le « complexe rouge » : il s'agit de P. gingivalis, T denticola et T.forsythia. Parmi les colonisateurs primaires, on retrouve Streptococcus gordonii. Cette bactérie fait partie des bactéries commensales de l'environnement buccal. C'est un coque à Gram positif appartenant au phylum des Firmicutes, aérobie-anaérobie facultatif. 2 P. gingivalis appartient au phylum Bacteroidetes ; c'est un coccobacille à Gram-négatif, anaérobie strict, aérotolérant, protéolytique, et encapsulé. P. gingivalis est principalement retrouvé dans l'environnement buccal au niveau des sites sous-gingivaux, mais peut être isolé en faible nombre dans la salive et sur les muqueuses buccales. 5 T denticola, au même titre que P. gingivalis, est une bactérie appartenant au « complexe rouge » et de ce fait, responsable de parodontites. Elle appartient au phylum Spirochaetaceae ; c'est un spirochète à Gram négatif, anaérobie strict, motile. Une coopération métabolique entre P. gingivalis et T denticola a également été démontrée (Meuric et al., 2013; Yamada et al., 2005) mettant en jeu des protéases qui 10 permettent la libération par une espèce de substrats utilisables par l'autre espèce. Les traitements des maladies parodontales sont distincts et plus ou moins complexes selon le stade de la maladie : en cas de gingivite, un détartrage et une bonne hygiène dentaire, éventuellement complétés par une antibiothérapie, généralement suffisent. 15 En revanche, quand la maladie parodontale évolue vers la parodontite, l'accumulation de la plaque dentaire entre la gencive et la dent entraîne une perte d'attache de la gencive et une résorption de l'os qui entoure la dent. Ce phénomène est à l'origine de la formation de poches parodontales entre la gencive, la dent et l'os. On observe un début de destruction de l'os sous-jacent. En outre, la formation de ces poches favorise 20 l'accumulation de la plaque dentaire qui aggrave la résorption de l'os. On entre alors dans un cercle vicieux. Le traitement consiste dans ce cas à effectuer un surfaçage radiculaire (au besoin sous anesthésie locale) qui vise à éliminer la plaque dentaire et le tartre situés sous la gencive. L'objectif de ce traitement est de provoquer une ré-attache entre la gencive et les surfaces des racines précédemment exposées. Des chirurgies 25 parodontales peuvent également être envisagées. La gingivite peut régresser complètement. La parodontite pourra être stabilisée. Mais seule une hygiène dentaire rigoureuse permettra d'éviter la récidive. Il existe donc un besoin pour un traitement efficace des maladies bactériennes, et 30 notamment parodontales, et notamment des parodontites. Les inventeurs ont maintenant découvert que, de façon surprenante, l'hémoglobine extracellulaire d'Annélides, en particulier d'Arenicola marina, a une activité anti-biofilm. En effet, comme démontré en exemple, il apparaît que l'hémoglobine extracellulaire d'Arenicola marina a un effet bactéricide sur des cultures planctoniques de P. gingivalis et T denticola. En outre, S. gordonii est capable d'inhiber de manière plus importante la 3 croissance de P. gingivalis en présence de cette hémoglobine. Enfin, dans un modèle in vitro de biofilm buccal composé de S. gordonii (colonisateur primaire), P. gingivalis et T denticola (parodontopathogènes), cette hémoglobine semble favoriser le détachement des cellules de P. gingivalis et T denticola. En conclusion, l'hémoglobine extracellulaire 5 d'Annélides, en particulier d' Arenicola marina, semble présenter une activité bactéricide vis-à-vis de bactéries à Gram négatif et pathogènes notamment pour l'homme. La présente invention concerne ainsi l'utilisation d'une molécule choisie parmi une globine, un protomère de globine ou une hémoglobine extracellulaire d'Annélides, comme 10 agent bactéricide vis-à-vis de bactéries à Gram négatif et pathogènes pour l'homme. Les bactéries pathogènes sont des bactéries responsables d'une maladie même chez le sujet sain. Les bactéries à Gram négatif sont identifiées d'après la technique de coloration de Gram : les bactéries à paroi épaisses sont colorées en violet et dites "à Gram positif", alors que 15 les bactéries à paroi fine sont colorées en rouge et dites "à Gram négatif". La molécule choisie parmi une globine, un protomère de globine ou une hémoglobine extracellulaire d'Annélides, selon l'invention, peut ainsi être utilisée comme un antibiotique vis-à-vis de bactéries à Gram négatif et pathogènes pour l'homme. Les bactéries à Gram négatif sont notamment choisies parmi P. gingivalis, T denticola, 20 T forsythia, G.meningitidis, E. col), H.influenzae, P.aeruginosa, B.pertussis, L.pneumoniae et H.pylori. Une telle molécule peut en outre être utilisée pour traiter différents désordres induits par de telles bactéries. 25 En particulier, elle peut être utilisée pour prévenir et/ou traiter la mauvaise haleine (ou halitose), et/ou pour blanchir les dents. La présente invention concerne également l'utilisation d'une molécule choisie parmi une globine, un protomère de globine ou une hémoglobine extracellulaire d'Annélides, pour 30 prévenir et/ou traiter une maladie parodontale. La présente invention concerne ainsi également l'utilisation d'une molécule choisie parmi une globine, un protomère de globine ou une hémoglobine extracellulaire d'Annélides, pour prévenir et/ou traiter l'halitose. 35 4 La présente invention concerne également l'utilisation d'une molécule choisie parmi une globine, un protomère de globine ou une hémoglobine extracellulaire d'Annélides, pour blanchir les dents. 5 La présente invention concerne également l'utilisation d'une molécule choisie parmi une globine, un protomère de globine ou une hémoglobine extracellulaire d'Annélides, pour traiter des plaies causées par des bactéries à Gram négatif et pathogènes pour l'homme. De préférence, la maladie parodontale est choisie parmi les gingivites, les parodontites, 10 les récessions parodontales et l'abcès parodontal. L'hémoglobine extracellulaire d'Annélides est présente chez les trois classes d'Annélides : les Polychètes, les Oligochètes et les Achètes. On parle d'hémoglobine extracellulaire car elle est naturellement non contenue dans une cellule, et peut donc circuler librement dans 15 le système sanguin sans modification chimique pour la stabiliser ou la rendre fonctionnelle. L'hémoglobine extracellulaire d'Annélides est un biopolymère géant de poids moléculaire compris entre 2000 et 4000 kDa, constitué d'environ 200 chaînes polypeptidiques comprises entre 4 et 12 types différents que l'on regroupe généralement en deux 20 catégories. La première catégorie, comptant 144 à 192 éléments, regroupe les chaînes polypeptidiques dites "fonctionnelles" qui portent un site actif de type hème, et sont capables de lier réversiblement l'oxygène ; ce sont des chaînes de type globine (huit types au total pour l'hémoglobine d'Arenicola marina: ai, a2, bl , b2, b3, c, dl et d2), dont 25 les masses sont comprises entre 15 et 18 kDa. Elles sont très similaires aux chaînes de type a et [3 de vertébrés. La deuxième catégorie, comptant 36 à 42 éléments, regroupe les chaînes polypeptidiques dites de « structure » ou « linkers » possédant peu ou pas de site actif mais permettant l'assemblage des sous-unités appelées douzièmes ou protomères. On compte deux types 30 de linkers, Li et L2. Chaque molécule d'hémoglobine est constituée de deux hexagones superposés que l'on a nommés bicouche hexagonale (hexagonal bilayer) et chaque hexagone est lui-même formé par l'assemblage de six sous-unités (dodécamère ou protomère) en forme de goutte d'eau. La molécule native est formée de douze de ces sous-unités (dodécamère ou 35 protomère). Chaque sous-unité a une masse moléculaire d'environ 250 kDa, et constitue l'unité fonctionnelle de la molécule native. 5 De préférence, l'hémoglobine extracellulaire d'Annélides est choisie parmi les hémoglobines extracellulaires d'Annélides Polychètes et les hémoglobines extracellulaires d'Annélides Oligochètes. De préférence, l'hémoglobine extracellulaire d'Annélides est 5 choisie parmi les hémoglobines extracellulaires de la famille des Lumbricidae, les hémoglobines extracellulaires de la famille des Arenicolidae et les hémoglobines extracellulaires de la famille des Nereididae. Encore plus préférentiellement, l'hémoglobine extracellulaire d'Annélides est choisie parmi l'hémoglobine extracellulaire de Lumbricus terrestris, l'hémoglobine extracellulaire d'Arenicola sp et l'hémoglobine 10 extracellulaire de Nereis sp, plus préférentiellement l'hémoglobine extracellulaire d'Arenicola marina ou de Nereis virens. L'arénicole Arenicola marina est un ver annélide polychète vivant essentiellement dans le sable. Selon l'invention, le protomère de globine de l'hémoglobine extracellulaire d'Annélides 15 constitue l'unité fonctionnelle de l'hémoglobine native, comme indiqué ci-dessus. Enfin, la chaîne de globine de l'hémoglobine extracellulaire d'Annélides peut notamment être choisie parmi les chaînes de globine de type Ax et/ou Bx d'hémoglobine extracellulaire d'Annélides. 20 L'hémoglobine extracellulaire d'Annélides, ses protomères de globine et/ou ses globines ne nécessitent pas de cofacteur pour fonctionner, contrairement à l'hémoglobine de mammifère, notamment humaine. Enfin, l'hémoglobine extracellulaire d'Annélides, ses protomères de globine et/ou ses globines ne possédant pas de typage sanguin, ils permettent d'éviter tout problème de réaction immunologique. L'hémoglobine 25 extracellulaire d'Annélides, ses protomères de globine et/ou ses globines présentent une activité superoxide dismutase (SOD) intrinsèque. Par conséquent, cette activité antioxydante intrinsèque ne nécessite aucun antioxydant pour fonctionner, contrairement à l'utilisation d'une hémoglobine de mammifères pour laquelle les molécules antioxydantes sont contenues à l'intérieur du globule rouge et ne sont pas liées à l'hémoglobine. Cette 30 activité SOD rend la molécule particulièrement efficace dans le traitement de l'halitose. L'hémoglobine extracellulaire d'Annélides, ses protomères de globine et/ou ses globines peuvent être natifs ou recombinants. Selon l'invention, de préférence, la globine, le protomère de globine ou l'hémoglobine 35 extracellulaire d'Annélides est présente dans une composition comprenant une solution tampon. Selon l'invention, de préférence et comme indiqué dans les exemples, la globine, 6 le protomère de globine ou l'hémoglobine extracellulaire d'Annélides est présente dans une composition dépourvue d'hydrocolloïde, de préférence dans une composition liquide dépourvue d'hydrcolloïde (solution tampon dépourvue d'hydrocolloïde). De préférence, une telle composition consiste uniquement une globine, un protomère de globine ou une 5 hémoglobine extracellulaire d'Annélides et une solution tampon. La formulation de la globine, du protomère de globine ou de l'hémoglobine extracellulaire d'Annélides sous forme liquide présente en effet l'avantage d'être plus facilement administrée. 10 Ladite solution tampon créée un environnement salin adéquat pour l'hémoglobine, ses protomères et ses globines, et permet ainsi le maintien de la structure quaternaire, et donc de la fonctionnalité de cette molécule. Grâce à la solution tampon, l'hémoglobine, ses protomères et ses globines sont capables d'assurer leur fonction d'oxygénation. 15 La solution tampon selon l'invention est de préférence une solution aqueuse comprenant des sels, de préférence des ions chlorure, sodium, calcium, magnésium et potassium, et confère à la composition selon l'invention un pH compris entre 6.5 et 7.6; sa formulation est similaire à celle d'un liquide physiologiquement injectable. Dans ces conditions, l'hémoglobine extracellulaire d'Annélides, ses protomères de globine et ses globines 20 restent fonctionnels. Dans la présente description, le pH s'entend à température ambiante (25°C), sauf mention contraire. De préférence, la solution tampon est une solution aqueuse comprenant du chlorure de 25 sodium, du chlorure de calcium, du chlorure de magnésium, du chlorure de potassium, ainsi que du sodium gluconate et du sodium acétate, et a un pH compris entre 6.5 et 7.6, de préférence égal à 7,1 ± 0,5, de préférence d'environ 7.35. Plus préférentiellement, la solution tampon est une solution aqueuse comprenant 90 mM de NaCI, 23 Mm de Nagluconate, 2,5 mM de CaCl2, 27 mM de Na-acétate, 1,5 mM de MgC12, 5 mM de KCI, et a 30 un pH de 7,1 ± 0,5, pouvant contenir entre 0 et 100 mM d'antioxydant de type acide ascorbique et/ou glutathion réduit. De préférence, la composition est administrée au sujet par voie parentérale, de préférence par injection ou perfusion ; ou bien par voie topique sur les gencives et/ou les 35 dents. 7 La composition peut être administrée au sujet sous forme de gel. Ce gel peut par exemple être présent dans une gouttière qui sera appliquée sur l'ensemble des dents de la mâchoire supérieure ou de la mâchoire inférieure. Il peut également être appliqué tel quel sur les dents et/ou les gencives. Un tel gel comprend ainsi au moins une globine, un 5 protomère de globine ou une hémoglobine extracellulaire d'Annélides, et une matrice hydrophile. La matrice hydrophile comprend notamment au moins un agent gélifiant. Un tel gel comprend de préférence au moins une globine, un protomère de globine ou une hémoglobine extracellulaire d'Annélides, une solution tampon et un agent gélifiant qui n'est pas un hydrocolloïde. De préférence l'agent gélifiant est choisi parmi la gomme 10 xanthane, la gomme de guar et ses dérivés (hydroxypropylguar par exemple). Enfin, il peut être appliqué par le biais d'une seringue, par exemple dans le cas de poches parodontales. 15 De préférence, la composition comprenant l'hémoglobine, ses protomères ou ses globines, et la solution tampon est administrée en tant que telle. En effet, dans ce cas, l'hémoglobine, ses protomères ou ses globines, est présente dans une composition comprenant une solution tampon, de préférence une solution aqueuse comprenant des sels, et conférant à la composition un pH compris entre 6.5 et 7.6. De préférence, la 20 composition contient uniquement l'hémoglobine, ses protomères ou ses globines, et une solution tampon consistant en une solution aqueuse comprenant des sels, et conférant à la composition un pH compris entre 6.5 et 7.6. La galénique d'administration est donc assez simple et efficace. 25 L'invention est décrite plus en détail dans les exemples suivants. Ces exemples sont fournis à des fins d'illustration uniquement, et ne sont pas limitatifs. Exemples 30 Matériels et méthodes 1) Souches bactériennes et conditions de culture Les souches utilisées lors de cette étude sont la souche de Porphyromonas gingivalis TDC60 (JCM19600) provenant du RIKEN BioResource Center, Japon, la souche de 35 Treponema denticola ATCC® 35405 et la souche Streptococcus gordonii Challis CH1 ATCCO35105 (Lunsford and London, 1996). Les souches de T. denticola et de P. 8 gingivalis ont été cultivées dans du milieu liquide défini pour leur croissance, le milieu MMBC-S, dont la composition est présentée dans le Tableau 1. Tableau 1 Composition du milieu défini pour la croissance de Porphyromonas gin givalis 5 et Treponema denticola (MMBC-S) La souche de S. gordonii a été cultivée dans du milieu liquide défini pour sa croissance, le milieu MMBC-4, composés de tous les éléments du milieu MMBC-S présentés dans le 10 Tableau 1 et des différents ajouts présentés dans le Tableau 2. Tableau 2 Ajouts pour le milieu MMBC-4 défini pour la croissance de Streptococcus gordonii V L .acitics Elements Concentration Amok ( -11; mL) mM - Sérique? I Conct n1 g ,1 [mn finale 1m. Toutes les souches utilisées lors de l'étude ont été cultivées en conditions anaérobies dans une enceinte thermostatée à 37°C (Modular Atmcsphere Controlled System 5000, 5 Don Whitley Scientific, Shipley, UK) contenant un mélange gazeux de 10% d'hydrogène, 10% de dioxyde de carbone et 80% d'azote, ou bien dans des conteneurs hermétiques contenant des sachets générateurs d'atmosphère anaérobie (Anaerogen Oxoid). L'hémoglobine d'Arenicola marina (HbAm) est fournie à une concentration de 24 g/L et 10 diluée dans un tampon de stabilisation dont la composition est présentée en Tableau 3. Tableau 3 Composition du tampon de stabilisation de HbAm Elements Concentrations finales NaCl 90 mN1 1,1.nate 15 2) Evaluation de l'effet de HbAm sur la survie bactérienne L'expérience a été réalisée en anaérobie dans des fioles serties d'un bouchon permettant l'injection de HbAm via une seringue à travers un septum étanche, ceci afin de maintenir les bactéries en anaérobie dans l'enceinte thermostatée, tout en conservant au maximum l'oxygénation de l'HbAm à l'intérieur de la seringue préparée en condition aérobie. La 20 solution contenant la molécule a été injectée directement dans la culture bactérienne. Les milieux MMBC-S ou MMBC-4 sont inoculés à une D0600nm initiale de 0.1 dans un volume final de 2 mL. Les cultures ont été préalablement incubées en anaérobie pendant 1h30 ou 24h respectivement pour P. gingivalis ou T. denticola, afin qu'elles soient dans des conditions optimales pour la suite du test de survie. Par la suite, 2 g/L dHbAm Elements 9 ConcerL1tIo.[s Finales D-Biotin 10 (chargée en oxygène) dilués dans le tampon de stabilisation ont été injectées à travers le septum des fioles ; un volume équivalent de tampon de stabilisation (tsHbAm) ou de milieu MMBC-S/MMBC-4 non réduit (gardé en condition aérobie) a été utilisé pour les contrôles. Les expériences ont été réalisées en triplicate. Plusieurs méthodes ont été 5 utilisées pour quantifier les cellules viables : a) Dénombrement sur gélose Columbia au sang (S. gordonii et P. gingivalis) Après différentes durées de culture à 37°C en anaérobie (0 minutes, 30 minutes, 2 heures et 4 heures après injection d'Hbam), le dénombrement des UFC a été effectué par dépôt 10 de gouttes d'échantillon dilué sur gélose Columbia au sang (2 dilutions en séries par échantillon, trois dépôts par dilution), et comptage des colonies au niveau des dépôts après 24h d'incubation à 37°C en anaérobie. Trois eqôériences indépendantes ont été réalisées. 15 b) Marquage LIVE/DEAD et analyse par fluorimétrie (P. gingivalis et T denticola) Afin de vérifier l'effet d'HbAm sur la survie des bactéries, des expériences de marquage LIVE/DEAD permettant de déterminer la viabilité cellulaire ont été réalisées après 4h d'incubation en anaérobie des cultures bactériennes traitées ou non avec HbAm. Ce test est basé sur les caractéristiques suivantes : le marqueur fluorescent Syto 40 (5 1..1M) 20 marque la totalité des cellules, tandis que l'iodure de propidium (301.1M) marque uniquement les cellules mortes. Ce marquage a été réalisé dans les échantillons après élimination du milieu de culture par centrifugation à 7000 g pendant 10 minutes à 20°C, puis lavage des bactéries dans du PBS. Des témoins de bactéries 100% vivantes (sans injection de traitement) ou 100% mortes (par utilisation d'un traitement à l'éthanol 70%) 25 ont été effectués en parallèle des échantillons afin de réaliser des gammes d'étalonnage du pourcentage de cellules vivantes. Les fluorescences des deux différents marqueurs ont été mesurées en spectrofluorométrie aux longueurs d'onde d'excitation et d'émission de 380 nm et de 440 nm respectivement pour le Syto 40 et aux longueurs d'onde d'excitation et d'émission de 480 nm et 650 nm respectivement pour l'iodure de propidium 30 à l'aide du lecteur de plaques POLARstar OMEGA (BMG LABTECH). Les ratios des intensités de fluorescence du Syto 40 sur celles de l'iodure de propidium ont été ensuite calculés afin d'analyser la survie bactérienne en présence d'HbAm. 3) Etude de l'expression de spxB chez S. oordonii 35 a) Culture bactérienne 11 Des cultures de S. gordonii ont été prélevées en phase exponentielle de croissance et diluées au tiers dans un agent stabilisateur d'ARN (RNA protect Bacteria Reagent, Quiagen), incubées 5 minutes à température ambiante puis centrifugées pendant 10 minutes à 5000 g avant congélation des culots à -80°C. 5 b) Extraction d'ADN Les culots bactériens ont été resuspendus dans du tampon TE (Tris-HCI 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8) contenant 20 mg/mL de lysozyme et 2 mg/mL de protéinase K afin de procéder à leur lyse enzymatique. Après une incubation de 30 minutes à 37°C, les 10 mélanges ont été déposés sur des billes de verre traitées à l'acide (Sigma-Aldrich) et soumis à 3 cycles de 45 secondes à vitesse 6,5 m/s (Fastprep® FP120 Oeil Disrupter, BIO 101 ThermoSavant) afin de procéder à une lyse mécanique des cellules bactériennes. Une centrifugation de 10 secondes à 13000 g a ensuite été réalisée et les surnageants ont été récoltés. Les ARN bactériens ont été extraits des lysats obtenus à 15 l'aide du kit NucleoSpin® RNA (Macherey-Nagel) selon les recommandations du fournisseur. L'ADN a été éliminé des échantillons par digestion à l'aide de la DNase RQ1 (Promega) en suivant les recommandations du fournisseur. L'ARN a ensuite été purifié sur colonne par le kit RNA Clean & ConcentratorTm (Zymo Research) selon les recommandations du fournisseur et a été dosé par spectrophotométrie à 260 nm 20 (Nanodrop MD-1000® ThermoScientific). Afin de vérifier l'absence d'ADN dans les extraits purifiés, une PCR (cf ci-dessous) a été réalisée en utilisant des amorces spécifiques de l'ADN 16S de chaque espèce bactérienne (Tableau 4). c) Amplification par Polymerase Chain Reaction (PCR) 25 Les réactions de PCR ont été réalisées en suivant le protocole du fournisseur de la polymérase One-Taq® 25 U/i..11_ (NEB) avec un thermocycleur 01000 (BioRad). La réaction a été réalisée sur un volume final de 25 1..11_, chaque tube contenant 12,5 !IL du Mix One-Taq 2X, 0,5 !IL de chacune des amorces R et L (Tableau 4) concentrées à 51.1M, ainsi que de 0,5 1..1L de l'échantillon à analyser, le tout complété à 25 !IL par de l'eau 30 stérile RNase free. La PCR a été réalisée comme suit : Etape initiale de dénaturation : 30 s à 94°C, pub 30 cycles de trois étapes successives de dénaturation de 30 s à 94°C, d'hybridation de 30 s à 55°C et d'élongation de 12s à 68°C, puis 35 Elongation finale de 5 minutes à 68°C. 12 Les produits de PCR ont ensuite été mis en évidence sur gel d'agarose 2% (p/v) (Eurobio) réalisée avec du tampon de migration TAE buffer 50X (Biosolve) en présence d'un intercalant à l'ADN, le DNA Dye NonTox (AppliChem). Des marqueurs de taille, DNA ladder 2I0g (New England Biolabs), de 1 kB à 50 pb, ont été utilisés pour vérifier la taille 5 de la séquence amplifiée. La révélation et la photographie des gels ont été réalisées après exposition aux UV (365 nm) sur un transilluminateur UVIDOC (UVITEC Cambridge). d) Reverse transcription (RT) 10 L'ARN a été transformé en ADNc par transcription inverse avec le kit ProtoScriptTM II Reverse Transcriptase (New England Biolabs) suivant le protocole du fournisseur. La réaction a été réalisée avec une matrice d'ARN de concentration supérieure à 40 ng, dans un mélange de 20 !IL contenant 1 1..1L de dNTP concentrés à 10 mM, 2 1..1L d'amorces Random Primer Mix (New England Biolabs) concentrées à 60 1..1M, 2 1..1L de 1,4- 15 Dithiothreitol concentré à 0,1 M, 4 !IL de tampon concentré 5 fois, 1 il d'inhibiteur de RNase (murine RNAse inhibitor 40 U/pL), 11..1L de reverse transcriptase (200 U/pL), le tout complété à 20 !IL par de l'eau stérile RNA free (Ambion). Le mélange réactionnel a été incubé dans un thermocycleur 01000 (BioRad) suivant un programme composé d'une étape initiale de 5 minutes à 25°C, puis 1h à 42 °C,puis inactivation des enzymes à 80°C 20 pendant 5 minutes. e) Quantification de l'ADN par qPCR La liste des amorces utilisées lors de cette étude est présentée dans le Tableau 4. Les qPCR ont été réalisées avec le kit SYBR GREEN/ROX (Eurogentec), selon les 25 recommandations du fournisseur dans un volume final de 12,51.11_, chaque tube contenant 6,25 1..1L du Mix SYBR GREEN 2X, 1 1..1L de chacune des amorces R et L concentrées à 5 1..1M, ainsi que de 1 !IL de l'échantillon à analyser compris entre 0.001 ng/i..11_ et 10 ng/pL, le tout complété à 6.25 1..1L par de l'eau stérile RNase free. Les réactions d'amplification ont été réalisées sur un appareil StepOne Plus (Applied Biosystems), suivant le programme 30 suivant : 2 minutes à 50 °C, 10 minutes à 95 °C, 40cycles composés d'une étape de dénaturation de 15s à 95°C, une étape d'hybridaticn et d'élongation de 60 s à 60°C. Une courbe de fusion a été réalisée après chaque amplification (15 secondes à 95°C, une minute à 60°C suivie d'un gradient de température cb 60 à 95°C et de 15 secondes à 95°C). Les efficacités des amorces RTSgo etspxB ont été déterminées par qPCR sur une 35 gamme d'étalonnage d'ADN 16S de Sg à l'aide de la formule 10-1/Pente-1. Les différences d'expression du gène étudié, spxB (amorces spxB, Zheng et al., 2011) ont été calculées 13 de façon relative par la méthode 2-°°Q en normalisant avec l'expression du gène de ménage de S. gordonii, rpoB, gène codant la sous-unité béta de l'ARN polymérase (amorces RTSgo, Park S. N. & Kook, J. K, 2013). 5 Tableau 4 Amorces utilisées Noms Séquence 5' => 3' RTSgo F RTSgo R TGTACCCCGTATCGTTCCTGTG (SEQ ID NO :1) AAAGACTGGAGTTGCAATGTGAATA (SEQ ID NO :2) spxB F spxB R GGATGCTTTGGCTGAAGAC (SEQ ID NO :3) GGACCACCTGAACCTACTG (SEQ ID NO :4) ADN 16S Sg L ADN 16S Sg R AGCGTTGTCCGGATTTATTG (SEQ ID NO :5) CATTTCACCGCTACACATGG (SEQ ID NO :6) ADN 16S Pg L ADN 16S Pg R TGGGTTTAAAGGGTGCGTAG (SEQ ID NO :7) CAATCGGAGTTCCTCGTGAT (SEQ ID NO :8) ADN 16S Id L ADN 16S Id R GGGCTACACACGTGCTACAA (SEQ ID NO :9) CGTGCTGATGTGCGATTACT (SEQ ID NO :10) 4) Evaluation de l'effet d'HbAm sur l'inhibition de la croissance de P. clinclivalis par S. clordonii L'évaluation de l'inhibition de la croissance de P. gingivalis par S. gordonii, a été réalisée 10 sur milieu solide d'parès une adaptation de la méthode de Herrero et al., (2016). Le milieu riche BHI a été remplacé par le milieu MMBC-4, milieu contrôlé défini pour la croissance de S. gordonii, afin que les éléments présents dans le milieu riche n'interfèrent pas avec l'expérience. Ce test est réalisé par inoculation de 7 1..1L de S. gordonii concentré à 109 UFC/mL sur 15 milieu gélose et son incubation en anaérobie pendant 24 h, suivies d'une inoculation de 7 1..1L de P. gingivalis concentré à 109 UFC/mL à 5 mm du bord du dépôt de S. gordonii. Les géloses ont été incubées en anaérobie pendant 3 jours avant observation. L'évaluation de l'inhibition est effectuée par la mesure de la distance entre le bord du dépôt formé par les bactéries inhibitrices (S. gordonii) et le bord du dépôt formé par les bactéries cibles (P. 20 gingivalis). Cette expérience a été effectuée de deux manières différentes. Pour la première expérience, S. gordonii a été inoculé sur 3 types de milieu gélose, le milieu MMBC-4 seul, le milieu MMBC-4 en présence de 2 g/L d'HbAm et le milieu MMBC-4 en présence d'une quatité équivalente de tampon de stabilisation tsHbAm. Pour la deuxième expérience, S. 25 gordonii a été incubé en milieu liquide MMBC-4 seul, MMBC-4 contenant 2 g/L d'HbAm 14 ou MMBC-4 contenant une quantité équivalente de tsHbAm avant inoculation sur milieu gélosé MMBC-4 comme décrit précédemment. 5) Evaluation de l'effet d'HbAm sur des biofilms de S. aordonii, P. aincivalis et T. 5 denticola a) Formation des biofilms statiques La formation de biofilms statiques a été réalisée dans des chambres de culture montées sur lamelle pSlide, ibiTreat: #1.5 polymer coverslip (lbidi). De la salive stérile (provenant de plusieurs volontaires sains), traitée avec 2,5 mM de dithiothréitol, centrifugée pendant 10 5 minutes à 2500 rpm à température ambiante, puis filtrée sur membrane 0,22 lm et diluée au 1/4, a été appliquée dans les chambres de culture pendant 30 minutes. Après ces 30 minutes, le surplus a été éliminé afin de retirer les éléments de la salive non adsorbés à la surface de la chambre. Un mélange bactérien composé de cultures de S. gordonii (D0600nm = 0,05), de P. 15 gingivalis (D0600nm = 0,1) et de T. denticola (D0600nm = 0,1) en milieu MMBC-4, a ensuite été inoculé dans les chambres de cultures et incubé pendant 24h en anaérobie à 37°C. Un traitement d'HbAm à 2 g/L de 1h ou son éciLivalent en tsHbAm ont ensuite été appliqués sur les biofilms par injection des solutions à l'aide d'une seringue afin de conserver l'oxygénation de la molécule au sein de l'enceinte anaérobie. 20 b) Marquage et observation Les surnageants de culture des biofilms ont été retirés et les biofilms ont été lavés au PBS. Le marquage a enseuite été fait à l'aide d'une solution composée d'un mélange de Syto 40 (5 pM) et d'iodure de propidium (40 pM). L'observation des biofilms a été réalisée 25 après 24h de croissance sur la plateforme « microscopie photonique » du centre « Microscopy Rennes Imaging Center » (SFR BIOSIT, Rennes) au moyen d'un microscope confocal Leica TCS-SP8 (Leica Microsystems, Wezlar, Germany). Un objectif à immersion 63x a été utilisé pour la capture d'image et un zoom de 1.5 a été appliqué. La détection de la fluorescence émise par le marqueur Syto 40 de la totalité des cellules a 30 été réalisée par excitation à 405 nm et recueil de la fluorescence émise entre 420 et 475 nm. Une excitation à 514 nm permet la détection du marquage à l'iodure de propidium des cellules mortes entre 620 et 650 nm. Les images du biofilm ont été acquises à des intervalles de 0.5 lm et ont été scannées à une fréquence de 400 Hz. Le logiciel Leica (LAS AF V.2.2.1) a été utilisé pour le pilotage du microscope et l'acquisition des images. 35 L'analyse qualitative des images a été réalisée grâce au logiciel ImageJ V1 .43m, 15 COMSTAT2 (Heydorn et al., 2000). La biomasse a été déterminée par somme des biomasses évaluée par marquage au Syto 40 et par marquage à l'iodure de propidium. C) Quantification par qPCR 5 Les bactéries de l'inoculum de départ et les bactéries détachées du biofilm ont été centrifugées à 7000g, 20°C pendant 10 minutes avec resuspension du culot bactérien dans du PBS afin d'éliminer le milieu MMBC-4 et les traitements. Les bactéries sessiles composant le biofilm ont été resuspendues dans du PBS. Les bactéries ont ensuite été chauffées à 95°C puis quantifiées par qPCR à l'aide d'amorces 16S spécifiques de 10 chaque espèce, comme décrit ci-dessus. Résultats et Discussion 1) Evaluation de l'effet de HbAm sur la survie de S. gordonii, P. qingivalis et T. denticola 15 en cultures planctoniques a) Effet de HbAm sur la survie de S. gordonii Afin d'évaluer l'effet d'HbAm sur la croissance et la survie de S. gordonii, des cultures de cette bactérie ont été incubées pendant 4h en conditions anaérobie, après injection ou 20 non de HbAm au temps 0. A chaque temps les colonies formées sur gélose Columbia au sang, provenant des différentes conditions de test, ont été dénombrées. Les résultats montrent qu'il n'y a pas de différence significative de survie ou croissance de S. gordonii en présence ou absence de 2 g/L d'HbAm de 0 minute à 4h. En effet, les courbes de log de concentrations bactériennes en fonction du temps d'exposition sont 25 équivalentes entre les conditions de culture en milieu MMBC-4 seul, en présence de tampon de stabilisation tsHbAm et en présence d'HbAm. Les comparaisons relatives de la survie de S. gordonii en présence d'HbAm par rapport à l'exposition en tsHbAm le confirment. De ce fait, la croissance et la survie de S. gordonii en culture planctonique ne semblent 30 pas être affectées par HbAm ni par tsHbAm. b) Effet de HbAm sur la survie de P. gin givalis Afin d'évaluer l'effet d'HbAm sur la survie de P. gingivalis, des cultures de cette bactérie ont été exposées à la molécule pendant 4h en conditions anaérobies. A chaque temps les 35 colonies formées sur gélose Columbia au sang, provenant des différentes conditions de test, ont été dénombrées. 16 Les résultats montrent que le tampon de stabilisation de la molécule HbAm n'affecte pas significativement la croissance et la survie de P. gingivalis. En effet, les dénombrements exprimés en log(UFC/mL) sont similaires avec ou sans tampon de stabilisation, de 109 UFC/mL au début de l'expérimentation à 4.109 UFC/mL après 2h d'exposition. Il n'y a pas 5 de différence significative après 4h d'exposition avec 6,3.109 UFC/mL en milieu MMBC-S seul et 5.109 UFC/mL en présence de tsHbAm. Le tampon de stabilisation a donc été utilisé comme seul contrôle négatif dans les trois expériences réalisées ensuite. Une diminution de la concentration en UFC a été observée dès 2h d'exposition pour les bactéries exposées à HbAm à 2 g/L (2,5.109 UFC/mL) par rapport aux échantillons 10 témoins contenant uniquement le tampon de stabilisation tsHbAm (4.109 UFC/mL), soit 35% de mortalité avec HbAm. L'effet est amplifié après 4h post-exposition avec 49% de mortalité dans la condition d'exposition avec HbAm. La molécule HbAm a donc un effet sur la survie ou la division des bactéries à partir de 2h et cet effet est augmenté avec le temps d'incubation. 15 Afin de confirmer l'effet d'HbAm sur la viabilité de P. gingivalis, une méthode complémentaire a été utilisée, basée sur l'utilisation de fluorophores (kit « LIVE/DEAD ») capables (Syto 40) ou non (iodure de propidium) de pénétrer à travers la membrane cytoplasmique polarisée (cellules vivantes) pour se fixer sur l'ADN. La fluorescence spécifique liée au Syto 40 et à l'iodure de propidium des cellules de P. gingivalis, traitées 20 ou non avec la molécule HbAm a été mesurée par spectrofluorimétrie après incubation en présence des fluorophores. Les résultats montrent que l'injection dans la culture anaérobie de milieu MMBC-S non réduit ou de tampon de stabilisation ne semble pas affecter significativement la survie de P. gingivalis (MMBC-S : 96 (3/0 de cellules vivantes ; MMBC-S plus tsHbAm : 93,9 (3/0 de 25 cellules vivantes). Cependant, HbAm semble avoir un effet sur la viabilité cellulaire de P. gingivalis puisque 4h après l'injection de la molécule le taux de cellules vivantes est de seulement 60%. Ces résultats confirment les données obtenues par dénombrement des colonies. HbAm a donc un effet bactéricide sur P. gingivalis. 30 C) Effet de HbAm sur la survie de T denticola L'obtention de colonies de T. denticola est fastidieuse, non reproductible et demande l'utilisation de milieux complexes. De ce fait, la méthode de dénombrement n'est pas adaptée pour évaluer la survie de T. denticola en présence d'HbAm. 17 La méthode de dénombrement de colonie et la méthode fluorimétrique avec les sondes LIVE/DEAD permettent l'obtention de résultats concordants pour P. gingivalis. La méthode LIVE/DEAD a donc été utilisée pour T. denticola. Ni le tampon de stabilisation (92 (3/0 de cellules vivantes), ni le milieu MMBC-S non réduit 5 (94 (3/0 de cellules vivantes) ne semblent affecter la viabilité de T. denticola. Par contre, la molécule HbAm diminue significativement le taux de cellules vivantes à 70 (3/0 dans les cultures 4 h après injection de la molécule. HbAm a donc un effet bactéricide sur T. denticola. 10 2) Evaluation de l'effet de HbAm sur la production d'H202 par S. gordonii a) Effet de HbAm sur l'inhibition de la croissance de P. gingivalis par S. gordonii S. gordonii est connue pour produire de l'H202 par la pyruvate oxydase SpxB en présence d'oxygène et de pyuvate. Par ailleurs H202 est toxique pour P. gingivalis. Afin 15 de déterminer si l'apport oxygène par HbAm permet une augmentation des propriétés inhibitrices de S. gordonii, des expériences d'inhibition sur milieu gélosé ont été réalisées. Les résultats montrent qu'en milieux gélosés MMBC-4 seul ou contenant 2 g/L d'HbAm ou avec un volume équivalent de tampon de stabilisation tsHbAm, les inocula de P. gingivalis incubés à proximité de S. gordonii semblent avoir une densité cellulaire plus faible que les 20 inocula de P. gingivalis incubés seuls pour les mêmes milieux. De plus, l'ajout de 2 g/L d'HbAm dans les géloses amplifie l'effet inhibiteur de S. gordonii sur P. gingivalis puisqu'aucune colonie de P. gingivalis n'est observable dans cette condition. Les mêmes observations peuvent être faites pour l'expérience réalisée sur milieu gélosé MMBC-4 non supplémenté, mais avec addition ou non de HbAm ou tsHbAm dans la culture de S. 25 gordonii avant dépôt sur la gélose. S. gordonii semble donc produire des inhibiteurs de la croissance de P. gingivalis en plus grande quantité lorsqu'exposée à HbAm concentrée à 2 g/L. b) Effet de HbAm sur l'expression du gène spxB chez S. gordonii 30 Le gène codant la pyruvate oxydase est spxB. Afin de vérifier si l'apport en oxygène par HbAm est suffisant pour permettre une augmentation de l'expression du gène, une quantification de l'expression relative de ce gène par rapport au gène de ménage rpoB a été effectuée grâce à une RT-qPCR. L'efficacité des amorces utilisées pour rpoB était faible (89%). 35 Cependant, la différence d'expression de spxB avec ou sans HbAm était supérieure à 10 fois et donc probablement significative. 18 Selon les premiers résultats, la valeur de 2-°°Q est de 14,2 en moyenne, signifiant une expression de spxB 14 fois supérieure avec HbAm. HbAm apporterait donc une quantité d'oxygène suffisante pour permettre d'augmenter significativement l'expression de spxB chez S. gordonii cultivé en condition anaérobie. 5 Ces résultats, couplés à ceux présentés sur la production d'inhibiteurs de croissance de P. gingivalis, suggèrent qu'HbAm pourrait augmenter la production de H202 au sein d'une culture préalablement incubée en condition anaérobie. 3) Evaluation de l'effet de HbAm sur un biofilm mixte composé de S. gordonii, de P. 10 gingivalis et de T. denticola Afin d'évaluer le potentiel inhibiteur d'HbAm sur un biofilm mixte déjà établi, comprenant S. gordonii, P. gingivalis et T. denticola, des biofilms de 24 h ont été incubés pendant 1h dans du milieu MMBC-4 seul, ou en présence de tampon de stabilisation ou d'HbAm, avant d'être analysés : 15 - par microscopie confocale permettant d'étudier l'épaisseur du film, la biomasse et la proportion en cellules mortes, - par qPCR pour quantifier les espèces bactériennes dans les biofilms. Afin d'évaluer l'effet d'HbAm sur le détachement des cellules du biofilm, la quantification bactérienne par qPCR a également été réalisée sur les surnageants obtenus après un temps d'exposition 20 de lh à Hbam ou au tampon de stabilisation tsHbAm, ou bien après traitement à l'éthanol 70%. D'après les premiers résultats, les superpositions de LIVE/DEAD établies en microscopie confocale montrent une plus forte coloration rouge des bactéries en milieu MMBC-4 exposées à HbAm (1% vivantes / 99% mortes) que pour les bactéries exposées 25 seulement au tampon de stabilisation tsHbAm (8% vivantes / 92% mortes) ce qui laisserait penser que les cellules du biofilm exposées à HbAm auraient subi des dommages au niveau de leur membrane laissant pénétrer l'iodure de propidium dans leur cytoplasme. Néanmoins, il faut noter que le pourcentage de cellules mortes sans HbAm est élevé. 30 Dans nos conditions expérimentales, le test de LIVE/DEAD ne permet donc pas d'établir de conclusion définitive quant à la mortalité cellulaire des bactéries du biofilm spécifiquement due à HbAm. D'après l'analyse des images obtenues en microscopie confocale, la biomasse ainsi que l'épaisseur moyenne du biofilm est plus faible après traitement du biofilm par HbAm que 35 pour les traitements avec le tampon de solubilisation seul (tsHbAm) ou bien avec éthanol 70%. 19 De plus, la proportion de cellules détachées du biofilm après traitement est plus élevée après traitement avec HbAm (44%) par rapport à tsHbAm seul (2%). Le traitement à l'éthanol 70% induit également un détachement important des bactéries avec 51% de cellules détachées dans cette condition. Par ailleurs, les quantifications bactériennes 5 montrent qu'avec tsHbAm et surtout HbAm, les espèces retrouvées dans les cellules détachées du biofilm sont majoritairement T. denticola et P. gingivalis alors que pour les biofilms traités avec éthanol 70% c'est S. gordonii qui est retrouvé en pourcentage élevé dans les cellules détachées. HbAm provoquerait donc le détachement des cellules du biofilm, et aurait un effet principalement sur P. gingivalis et T. denticola. Ces résultats sont 10 à confirmer. En ce qui concerne la composition bactérienne des différents biofilms, dans les conditions étudiées, une proportion élevée de S. gordonii est retrouvée par rapport à P. gingivalis et T. denticola, que ce soit en présence de tampon de stabilisation tsHbAm (98.5%), d'HbAm (99.8%) ou bien d'éthanol 70% (81.7%). Les espèces bactériennes de l'inoculum 15 de départ ont été quantifiées par qPCR : 9,26.107 UFC/mL de S. gordonii (42,9 %), 5,11.107 UFC/mL de P. gingivalis (23,2%) et 7,34.107 UFC/mL de T. denticola (33,9 (3/0). S. gordonii est majoritaire dans le biofilm malgré un innoculum composé à plus de 60% de P. gingivalis et T. denticola. En outre, il peut être noté qu'en présence d'HbAm, une concentration plus faible en T. 20 denticola et en P. gingivalis est retrouvée au sein du biofilm par rapport au contrôle exposé au tsHbAm ainsi qu'à l'éthanol 70%. En effet, une réduction de 10 UFC/mL REVENDICATIONS1. Molécule choisie parmi une globine, un protomère de globine ou une hémoglobine extracellulaire d'Annélides, pour son utilisation comme agent bactéricide vis-à-vis de bactéries à Gram négatif et pathogènes pour l'homme. 2. Molécule pour son utilisation selon la revendication 1, pour prévenir et/ou traiter une maladie parodontale. 3. Molécule pour son utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que la maladie parodontale est choisie parmi les gingivites, les parodontites, les récessions parodontales et l'abcès parodontal. 4. Molécule pour son utilisation selon la revendication 1, pour prévenir et/ou traiter l'halitose. 5. Molécule pour son utilisation selon la revendication 1, pour blanchir les dents. 6. Molécule pour son utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'hémoglobine extracellulaire d'Annélides est choisie parmi les hémoglobines extracellulaires d'Annélides Polychètes. 7. Molécule pour son utilisation selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que l'hémoglobine extracellulaire d'Annélides est choisie parmi les hémoglobines extracellulaires de la famille des Lumbricidae, les hémoglobines extracellulaires de la famille des Arenicolidae et les hémoglobines extracellulaires de la famille des Nereididae. 8. Molécule pour son utilisation selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que l'hémoglobine extracellulaire d'Annélides est choisie parmi l'hémoglobine extracellulaire de Lumbricus terrestris, l'hémoglobine extracellulaire d'Arenicola sp et l'hémoglobine extracellulaire de Nereis sp. 9. Molécule pour son utilisation selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que l'hémoglobine extracellulaire d'Annélides est choisie parmi l'hémoglobine extracellulaire d'Arenicola marina et l'hémoglobine extracellulaire de Nereis virens. 21 10. Molécule pour son utilisation selon I une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que la globine, le protomère de globine ou l'hémoglobine est présent dans une composition comprenant une solution tampon et dépourvue d'hydrocolloïde, de préférence dans une solution aqueuse comprenant des sels, et conférant à la composition 5 un pH compris entre 6.5 et 7.6, ou dans une composition sous forme de gel.