Brevet FR3080918A1 — publié le 20191108

PROCÉDÉ DE CONSTRUCTION D'UNE IMAGE TRIDIMENSIONNELLE D'UN ÉCHANTILLON DE PEAU Domaine technique La présente invention appartient au domaine de l'histologie, plus particulièrement à l'étude de la structure de la peau. L'invention se rapporte ainsi à un procédé de construction d'une image tridimensionnelle de l'épiderme et du derme papillaire sur un échantillon de peau (expiant de peau ou peau reconstruite) ainsi qu'à une méthode in vitro d'identification d'un effet cosmétique et/ou dermatologique d'un actif ou d'une formulation mettant en oeuvre le procédé de l'invention. Dans la description ci-dessous, les références entre crochets (E]) renvoient à la liste des références présentée à la fin des exemples. État de la technique La couche externe de la peau, l'épiderme, a une organisation complexe. Il s'agit d'un épithélium stratifié très dense. C'est un épithélium dynamique vivant car il se renouvelle constamment grâce aux cellules basales parmi lesquelles se trouvent des cellules souches [1]. Les cellules souches sont divisées en trois classes [2] et sont localisées à la couche basale dans des microenvironnements distincts [3,4]. L'épiderme est constitué de différentes cellules. Les kératinocytes, qui sont les plus nombreux, proviennent de la couche basale proliférative et migrent vers le haut à travers l'épiderme jusqu'à la surface. Au cours de l'ascension, également appelée différenciation, les kératinocytes subissent un changement de forme qui donne naissance à des structures multicouches avec une caractéristique morphologique distinctive. On peut distinguer la couche basale, le stratum spinosum et le stratum granulosum dont la différenciation produit la couche supérieure : le stratum corneum (SC). Contrairement à d'autres couches, le SC est constitué de cellules 2 anucléées, aplaties (cornéocytes) qui forment en partie la barrière protectrice de la peau. Ces cellules seront ensuite éliminées en surface et remplacées par de nouvelles cellules provenant de la couche granuleuse. La surface de l'épiderme possède un microrelief caractérisé par 5 des motifs typiques de lignes entrecroisées qui forment des formes polygonales. Ce microrelief, composé de plateaux et de sillons, visible à la surface de la couche cornée, est dû à un réseau de fibres dans le compartiment dermique [5,6]. En effet, l'épiderme repose sur une fine couche de protéines de la matrice extracellulaire, la membrane basale. 10 Cette jonction entre l'épiderme et le derme ondule en raison de fibres orientées constituées de fibres de collagène et d'élastine dans le derme papillaire. Ces projections en forme de doigts connues sous le nom de papilles dermiques sont entourées par des projections similaires de l'épiderme (projection en direction du derme) appelées « rete ridge ». Ces 15 structures augmentent la surface de contact entre les couches. Le derme est vascularisé et un réseau capillaire étendu et abondant est présent en particulier dans les papilles dermiques [7]. L'organisation complexe de l'épiderme concerne également les cellules. En effet, d'autres types de cellules présentes dans l'épiderme comme les mélanocytes, les cellules de 20 Langerhans sont qualifiées de cellules dendritiques. Par exemple, les mélanocytes résident dans la couche basale. Ils synthétisent la mélanine à l'intérieur des organites appelés mélanosomes. Les mélanosomes sont transférés aux kératinocytes voisins en raison de plusieurs prolongations cellulaires qui s'étendent dans de nombreuses directions [8]. 25 L'épiderme comprend également différents appendices, tels que les follicules pileux, les glandes sébacées et les glandes sudoripares. Enfin, les interactions avec l'environnement, la pathologie et le vieillissement réorganisent cette architecture. 30 Bien que la peau ait été étudiée depuis longtemps, de nombreuses questions restent non résolues à ce jour. L'identification et la localisation 3 des cellules souches épidermiques [9] par exemple et leur rôle dans la différenciation et la stratification ou encore leur rôle dans les interactions cellulaire [8] sont autant de questions concernant le compartiment épidermique qui restent sans réponse. Ces sujets sont nécessairement 5 associés à l'imagerie de la peau. Compte tenu de la complexité de l'épiderme, les investigations 2D telles que les coupes histologiques conventionnelles ne suffisent pas. La caractérisation tridimensionnelle afin de déterminer l'architecture spatiale de l'épiderme est importante pour contribuer à l'amélioration des connaissances actuelles limitées [10,1 1 ] . 10 La visualisation tridimensionnelle de la peau a déjà été étudiée par plusieurs méthodes in vivo et in vitro, comme la microtomographie aux rayons X [13], la tomographie par cohérence optique [14], ou encore via les microscopies de fluorescence comme la microscopie épiscopique [1 2] , 15 la microscopie confocale à balayage Laser [15] ou encore la microscopie biphotonique [16]. Ces équipements apparaissent très intéressants pour caractériser principalement les composants dermiques. Les appendices cutanés, les vaisseaux sanguins, les nerfs, les faisceaux de collagène peuvent être suivis et reconstruits. Cependant le manque de résolution 20 spatiale et/ou l'absence de marqueurs spécifiques à l'épiderme ne permettent pas de caractériser les sous-structures 3D de l'épiderme. L'épiderme et le derme superficiel peuvent être visualisés par microscopie confocale in vivo par réflectance [17] ou par microscopie multiphotonique [18]. Des images peuvent être générées par contraste en 25 fonction respectivement de la réflectivité des microstructures à l'intérieur et entre les cellules ou des propriétés intrinsèques de fluorescence et de la génération de second harmonique. Malgré une bonne résolution latérale, le manque d'information structurelle ne permet pas d'obtenir une reconstruction 3D [19,20]. L'une des approches 3D sur l'épiderme de la 30 peau a été réalisée en microscopie électronique sur des coupes sériées 4 [21]. Cette technique présente l'avantage d'une très haute résolution mais seulement sur un petit volume de peau. Il est possible également d'utiliser la microscopie à feuille de lumière. Cette méthode est plutôt employée pour imager des échantillons 5 volumineux fixés, voire, vivants cela au détriment de la résolution par comparaison au microscope confocal, par exemple. Récemment, Abadie et al. [22] ont utilisé une technique de transparisation (BABB) sur explants de peau. Ils ont caractérisé les molécules et les régions autofluorescentes dans la peau à savoir notamment les fibres de collagène et d'élastine pour 10 le derme et le stratum corneum pour l'épiderme et ce au moyen de la microscopie à feuille de lumière. Néanmoins, ils n'ont pas pu investiguer l'organisation tridimensionnelle de l'épiderme. L'investigation 2D avec des coupes histologiques prend beaucoup 15 de temps et ne permet pas suffisamment d'apprécier un tissu complexe tel que l'épiderme. De même, bien qu'il soit possible de pénétrer le tissu cutané au moyen de microscopes tels que le confocal, le biphoton ou bien la feuille de lumière, ces derniers ne sont toujours pas en mesure de collecter 20 suffisamment d'informations structurelles pour reproduire une image 3D du tissu épidermique. L'association de ces mêmes équipements aux techniques de transparisation ne permet notamment pas de collecter davantage d'informations sur la structure de l'épiderme. 25 Il existe donc un réel besoin d'un procédé de construction d'une image tridimensionnelle d'un échantillon de peau, traité ou non traité par un actif ou d'une formulation cosmétique et/ou dermatologique, palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l'art antérieur, en particulier d'un procédé permettant de cartographier avec précision la partie supérieure de 30 la peau comprenant l'épiderme et le derme papillaire, sur des échantillons de grande taille, avec une résolution satisfaisante. 5 Exposé de l'invention Il est du mérite de la demanderesse d'avoir mis au point un nouveau procédé permettant de cartographier avec précision la partie 5 supérieure de la peau, à savoir l'épiderme et le derme papillaire. Il a ainsi été possible au moyen d'une technique de microscopie de fluorescence, de générer une collection d'images d'épiderme et de derme papillaire longitudinales et/ou transversales à partir d'une biopsie cutanée sans sectionnement. 10 Il a ainsi été possible, après marquage (ou coloration) avec un marqueur fluorescent (tel que par exemple la rhodamine B) suivi d'une étape de transparisation, de générer une collection d'images (par exemple avec un microscope confocal à balayage LASER) d'épiderme et de derme papillaire, longitudinales et/ou transversales à partir d'un échantillon de 15 peau (par exemple une biopsie cutanée) sans sectionnement. Des images haute résolution de l'épiderme et du derme papillaire dans leur intégralité et au niveau cellulaire ont ainsi pu être générées. Le procédé selon l'invention permet en outre la visualisation de l'architecture 20 interne de l'épiderme et du derme papillaire. Ces sections virtuelles associées à des outils de rendu de volume permettent de collecter de nouvelles images sur l'organisation de l'épiderme et du derme papillaire humain ou animal. La segmentation permet d'analyser le patron du microrelief du stratum corneum et l'organisation complexe de la jonction 25 dermo-épidermique. Plusieurs piles d'images peuvent être assemblées pour étudier une plus grande surface (à la manière d'une mosaïque). La caractérisation du tissu à l'échelle cellulaire en microscopie de fluorescence nécessite l'emploi d'un objectif à fort grossissement. Cet objectif réduit la surface et donc le volume caractérisé. Néanmoins, 30 l'acquisition de multiples zones juxtaposées entre elles, suivi de leur 6 assemblage (à la manière d'une mosaïque) permettent d'analyser des surfaces de peau importante. A la connaissance de la demanderesse, aucune étude en 5 microscopie photonique concernant la micromorphologie de l'épiderme dans son intégralité n'a à ce jour été rapportée. Le procédé selon l'invention est peu coûteux, rapide et évolutif (la technique étant compatible avec l'immunomarquage). Ainsi, la possibilité de cibler des protéines spécifiques et de 10 visualiser leur localisation dans la troisième dimension tissulaire offre une nouvelle opportunité. Ce travail peut également être mené sur une peau normale, pathologique ou sur différents modèles de peau reconstruite. Ces nouvelles techniques apparaissent comme un outil complémentaire pour 15 les études in vitro et peuvent être dédiées dans différents domaines d'activité pour comprendre, comparer ou évaluer l'efficacité d'un traitement par un actif ou une formulation cosmétique et/ou dermatologique. L'invention se rapporte ainsi à un procédé de construction d'une image tridimensionnelle (image 3D) d'un échantillon de peau comprenant 20 les étapes suivantes : (a) marquage in vitro d'au moins un des éléments constitutifs de l'échantillon de peau au moyen d'un marqueur détectable par microscopie de fluorescence ; (b) transparisation in vitro de l'échantillon de peau marqué à l'étape 25 (a) ; et (c) construction de l'image tridimensionnelle de l'échantillon de peau transparisé à l'étape (b) à partir d'images successives obtenues par une technique de microscopie de fluorescence. 30 7 Définitions On entend par « échantillon de peau », un fragment de peau d'origine humaine ou animale, naturel ou synthétique. Selon l'invention, un échantillon de peau peut être un expiant de peau (d'origine naturelle) ou de 5 la peau reconstruite (d'origine synthétique). On entend par « expiant de peau », un fragment de peau issu d'une biopsie d'origine humaine ou animale, naturel (par exemple NativeSkinC)).0n entend par « peau reconstruite », un échantillon de peau d'origine « synthétique », par exemple obtenu par impression 3D ou par 10 culture cellulaire. Il peut s'agir d'épidermes reconstruits (Episkin®, EpiDerm®, epiCS®, EpiSkin, EpiSkin / SkinEthic RHE, SkinEthic RHPE (un épiderme pigmenté) ou encore des peaux complètes reconstruites (épiderme + derme / Full-Thickness Skin Model) : T-Skin, Phenion®, OSREp (Open Source Reconstructed Epidermis) ou encore LabcyteTM 15 [23,24]. Ainsi, dans le cadre de l'invention, on utilisera « échantillon de peau » pour définir soit un expiant de peau naturel, soit un échantillon de peau reconstruite, et donc synthétique. 20 Avantageusement, l'échantillon de peau a une épaisseur correspondant à celle de l'épiderme et du derme papillaire de la peau, soit une épaisseur moyenne de 100 pm qui peut varier en fonction de la localisation sur le corps du sujet (par exemple, allant de 50 pm au niveau des paupières jusqu'à 200 pm ou 500 pm, voire même jusqu'à 1 mm sur la 25 paumes des mains ou la plante des pieds), selon l'origine de l'échantillon. La topologie de la surface de l'épiderme pouvant être irrégulière, l'épaisseur de l'échantillon peut ne pas être homogène sur toute la surface de l'échantillon. Selon le procédé de l'invention, il n'y a pas de limite maximale du diamètre de l'échantillon de peau pouvant être analysé par le 30 procédé selon l'invention. L'échantillon de peau peut avoir un diamètre allant par exemple de 1,5 à 50 mm, de préférence de 1,5 à 20 mm, et de 8 manière encore plus préférée de 2 à 5 mm. Lorsque cela est nécessaire, l'échantillon de peau peut être découpé à la taille requise, et les couches non désirées, tel que par exemple le derme ou l'hypoderme, peuvent être excisés. 5 Avantageusement, l'échantillon de peau peut être traité ou non traité par un actif ou une formulation cosmétique et/ou dermatologique. L'échantillon de peau traité par l'actif cosmétique et/ou dermatologique peut être préparé selon le protocole décrit de manière classique dans l'état de la technique, tel que par exemple la méthode décrite dans Sakata et al. 10 [24] ou bien encore Sidgwick et al. [25]. L'échantillon de peau peut être traité par l'actif, avant ou après son prélèvement et avant sa fixation. L'actif peut par exemple être appliqué de manière topique sur l'échantillon de peau ou bien par injection sous-cutanée (SC) avant ou après son prélèvement. 15 Dans le cadre de l'invention, on entend par « actif », une substance active, pouvant être comprise dans un produit (ou formulation) cosmétique et/ou dermatologique, qui assure l'efficacité dudit produit. On entend par « actif cosmétique » un actif pouvant avoir un effet anti-âge, hydratant, nourrissant, séborégulateur, apaisant, pigmentant, 20 dépigmentant, et/ou antiperspirant. Par « anti-âge », on entend un effet lissant, raffermissant, anti-ride, restructurant ou plus particulièrement un effet sur les molécules de la matrice extracellulaire dermique, un effet sur la jonction dermoépidermique et/ou un effet sur les molécules impliquées dans la 25 différenciation kératinocytaire. Par « effet hydratant », on entend un effet de rétention ou de captation des molécules d'eau et plus précisément par exemple un effet sur les protéoglycanes dermiques ou épidermiques, un effet sur les molécules impliquées dans la différenciation des kératinocytes et/ou un 30 effet sur les molécules impliquées dans l'angiogenèse. 9 Par « effet nourrissant », on entend un effet d'apport lipidique en surface de l'épiderme avec par exemple un effet sur les céramides et/ou les structures lipidiques produites par les kératinocytes. Par « effet séboregulateur », on entend un effet sur l'activité 5 métabolique des sébocytes avec par exemple un effet sur la 5-alpha réductase, un effet sur la transformation de la testostérone et/ou un effet sur toute molécule produite par les sébocytes. Par « effet apaisant », on entend une limitation des effets induits par les stress environnementaux (par exemple UV, température, pollution) 10 avec plus particulièrement un effet sur les molécules pro-inflammatoires ou anti-inflammatoires produites par les kératinocytes. Par « effet pigmentant » et « effet dépigmentant », on entend un effet sur la pigmentation de la peau avec plus précisément un effet stimulant ou inhibiteur de la synthèse de mélanine par les mélanocytes 15 et/ou un effet inhibiteur dans le transfert des mélanomes au kératinocytes. Par « effet antiperspirant », on entend un effet inhibiteur de la production de la sueur par les glandes sudoripares et plus précisément sur les molécules produites par les cellules et/ou un rétrécissement du canal sudoripare. 20 On entend par « actif dermatologique » un actif pouvant avoir un effet choisi parmi un effet sur un mécanisme biologique lié à la dermatite atopique, l'eczéma, l'ichthyose, la rosacée, la couperose, le psoriasis, les pemphigoïdes, l'acné, le lentigo et/ou l'albinisme. L'actif peut dans certains cas cumuler des effets cosmétique(s) et 25 dermatologique(s). Avantageusement, l'actif peut être compris dans un produit (ou une formulation) cosmétique et/ou dermatologique. Le produit (ou la formulation) cosmétique et/ou dermatologique peut comprendre en outre de l'actif, un ou plusieurs excipients et/ou additifs, tels que par exemple 30 des adjuvants (parfum, agent moussant), conservateurs, colorants, antioxydants, émulsifiants, stabilisateurs de pH, tensioactifs ou encore 10 agents de contrôle de la viscosité. L'actif, le produit ou la formulation cosmétique et/ou dermatologique peut être sous la forme de crème, émulsion, lait, lotion, gel et huile pour la peau, masque de beauté, fond de teint tels que des liquides, pâtes ou poudres, poudres pour maquillage, 5 poudres à appliquer après le bain, poudres pour l'hygiène corporelle, préparations pour bains et douches tels que sels, mousses, huiles ou gels, produits solaires, produits de bronzage sans soleil, produits permettant de blanchir la peau, produits antirides, produits pour le rasage tels que savons, mousses ou lotions, produits de maquillage et démaquillage, 10 produits destinés à être appliqués sur les lèvres, produits capillaires tels que colorants capillaires, produits pour l'ondulation, le défrisage ou la fixation des cheveux, produits de mise en plis, produits de nettoyage pour cheveux tels que lotions, poudres ou shampooings, produits d'entretien pour la chevelure tels que lotions, crèmes ou huiles et produits de coiffage 15 tels que lotions, laques, brillantines, parfums, eaux de toilette et eaux de Cologne, dépilatoires produits pour les soins et le maquillage des ongles. Avantageusement, le procédé selon l'invention comprend une étape de fixation de l'échantillon de peau. Dans le cadre de l'invention, on entend par « fixation d'un échantillon » ou « échantillon fixé », un 20 traitement qui permet de conserver l'échantillon dans un état le plus proche possible de l'état in vivo. Deux moyens de conservation sont classiquement utilisés : la congélation ou la fixation par un produit chimique. Dans le cadre de l'invention, la fixation peut être réalisée par un produit chimique simple comme par exemple le formol (formaldéhyde ou 25 méthanal), l'éthanol absolu ou un mélange de fixateurs tel que le Carnoy, le Baker ou l'alcool-formol. Le fixateur qui permet de stabiliser les structures cellulaires et tissulaires avec pour effet de polymériser les protéines et, dans certains cas, les lipides présents dans l'échantillon. L'échantillon de peau peut être fixé au moyen d'un ou plusieurs solvant(s) 30 organique(s), par exemple le formaldéhyde ou un mélange d'acide picrique 11 (75% v/v), d'une solution de formaldéhyde à 37% (20% v/v) et d'acide acétique glacial (5% v/v). Toute méthode de fixation d'échantillon de peau compatible avec la transparisation et l'observation subséquente par microscopie de 5 fluorescence, peut être utilisée dans le cadre d'invention. Avantageusement, le procédé selon l'invention comprend une étape de lavage de l'échantillon de peau après fixation. L'échantillon de peau peut être lavé avec de l'eau et/ou un solvant organique ou un 10 mélange de solvants organiques. Le ou les solvant(s) organique(s) peu(ven)t être choisi(s) dans le groupe comprenant le tétrahydrofurane et le dichlorométhane. Avantageusement, le procédé selon l'invention comprend une 15 étape de marquage de l'échantillon de peau. L'échantillon de peau est de préférence marqué au moyen d'un marqueur colorant fluorescent (ou marqueur tissulaire, marqueur) ayant la capacité d'émettre dans la longueur d'onde détectable par les microscopes de fluorescence. Le marqueur peut cibler un ou plusieurs éléments constitutifs de la peau se 20 situant dans l'épiderme et/ou le derme papillaire. Le marqueur a de préférence une affinité particulière avec l'un desdits éléments constitutifs de la peau. Lesdits éléments constitutifs de la peau peuvent par exemple être les kératinocytes, les mélanocytes, les cellules de langerhans, les cellules de merkel, les fibroblastes, les cellules endothéliales, les cellules 25 souches ou bien tout type de cellules comprises dans l'épiderme ou le derme papillaire, ou les molécules produites par les cellules précitées. Le marqueur peut ainsi être présent à concentrations variables dans les différents éléments constitutifs de l'échantillon de peau marquée. Ceci permet d'enregistrer des intensités de fluorescence variables en fonction 30 des parties de l'échantillon représentées sur les images 2D et 3D obtenues par le procédé de l'invention. 12 Avantageusement, le marqueur peut être choisi dans des classes de colorants incluant tout type de molécules organiques fluorescentes comprenant au moins un groupe ou noyau aromatique, tels que les molécules comprenant un groupe benzène et/ou un hétérocycle 5 aromatique. Le marqueur peut par exemple être un composé appartenant à la famille de composés organiques hétérotricycliques fluorescents, tel que par exemple les dérivés de xanthène (CAS: 92-83-1) ou de fluorone (CAS : 494-41-7). On entend par dérivés de xanthène ou de fluorone, des composés organiques fluorescents comprenant dans leur structure ou 10 plusieurs groupes xanthène ou fluorone. Il peut s'agir par exemple de composés tels que les fluorescéines, les éosines ou bien encore les rhodamines. Par exemple, le marqueur peut être une molécule de la famille des rhodamines. Les rhodamines sont des dérivés de la fluorone. De préférence, le marqueur est une rhodamine choisie dans le groupe 15 comprenant la rhodamine B (CAS: 81-88-9), la rhodamine 6G (CAS: 989- 38-8) et la rhodamine 123 (62669-70-9). Avantageusement, le marqueur et le fixateur peuvent être identiques ou différents. Par exemple, le glutaraldéhyde qui ne possède pas intrinsèquement de propriété de fluorescence, peut jouer le rôle de 20 marqueur selon l'invention. Dans certains cas, l'étape de fixation entraine la formation de liaisons, par exemple covalentes, entre le solvant de fixation et les protéines du tissu. Le fixateur devient ainsi capable de générer une fluorescence caractérisable au moyen de microscopes de fluorescence. 25 Avantageusement, le procédé selon l'invention comprend en outre une étape de lavage de l'échantillon de peau marqué. Cette étape permet, lorsque cela est nécessaire, d'éliminer l'excédent de marqueur. L'échantillon de peau peut être lavé avec de l'eau et/ou un solvant 30 organique ou un mélange de solvants organiques. Le ou les solvant(s) organique(s) peu(ven)t être choisi(s) dans le groupe comprenant le 13 tétrahydrofurane et le dichlorométhane, ou tout autre solvant dans lequel le marqueur est soluble, le- ou lesdit(s) solvant(s) ne dénaturant pas l'échantillon de peau. Par exemple, la rhodamine B étant solubilisée dans l'eau, il peut être utile de laver à l'eau après marquage. Des lavages avec 5 des mélanges solvant organique/eau (par exemple THF/eau) contribuent également à éliminer le marqueur non fixé durablement. Avantageusement, l'échantillon de peau est soumis à une étape dite de transparisation. Dans le cadre de l'invention, on entend par 10 « transparisation », un traitement de l'échantillon de peau permettant de le rendre transparent ou translucide. Il existe de nombreuses méthodes de transparisation connues, telles que par exemple la méthode 3DISCO décrite par Erturk et al [27], ou bien encore la méthode uDISCO [28]. La transparisation peut être réalisée à l'aide d'un ou plusieurs solvant(s) 15 organique(s) choisi(s) ou mélange(s) solvant(s) organique(s)/eau, ledit solvant organique étant dans le groupe comprenant le dichlorométhane (DCM), le tétrahydrofurane (THF), le dibenzyléther (DBE), l'alcool benzylique, l'ester benzylique de l'acide benzoïque et leurs mélanges (par exemple alcool benzylique et ester benzylique de l'acide benzoïque ou 20 BABB). L'échantillon de peau peut être immergé successivement dans un ou plusieurs solvant(s) organique(s). A la fin de l'étape de transparisation, l'échantillon de peau n'est plus opaque. Il peut être translucide ou transparent. L'étape de transparisation peut induire un rétrécissement de l'échantillon de peau. Ce rétrécissement peut être dû à la déshydratation 25 des tissus ou bien à la nature des tissues. Dans certain cas, un aspect brun peut subsister dû à la pigmentation de la peau. L'intensité de cette coloration peut être liée au marqueur utilisé préalablement à l'étape de transparisation. Dans certains cas également, une coloration rose peut être visible et est présente principalement dans l'épiderme. Suite à l'étape de 30 transparisation, la fluorescence de l'échantillon marqué et transparisé peut être conservée pendant une durée allant jusqu'à une semaine. 14 Avantageusement, l'image tridimensionnelle de l'échantillon de peau est obtenue à partir d'images successives obtenues par des équipements microscopiques de fluorescence comme le confocal à balayage LASER (MCBL, CLSM en anglais) le biphoton, la feuille de 5 lumière, l'imagerie par microscope confocal à disque rotatif (ou disque de Nipkov). Le marqueur fluorescent peut ainsi être excité au moyen d'un LASER, tel que par exemple un LASER argon-ion (longueurs d'onde : 457 nm, 488 nm, 514 nm) ou hélium-néon (longueurs d'onde : 543 nm, 633 nm), et les émissions de fluorescence sont collectées. Le type de LASER 10 utilisé peut être adapté en fonction du spectre d'excitation du marqueur utilisé. Par exemple, Les rhodamines possèdent un spectre d'excitation compris entre environ 480 et 580 nm (Lambda max 540 nm). Ces valeurs oscillent selon le milieu dans lequel le spectre de la rhodamine est effectué. Toutes les raies LASER comprises dans cet intervalle seront 15 susceptibles d'exciter la molécule. Avantageusement, on obtient ainsi une pluralité d'images en deux dimensions (images 2D) longitudinales et/ou transversales de l'échantillon de peau. Ces images 2D sont assemblées et compilées pour obtenir une l'image tridimensionnelle (image 3D) de l'échantillon de peau. 20 Le procédé de l'invention permet aussi de réaliser des constructions d'images tridimensionnelles d'échantillon de peau de grande taille. Il est ainsi possible de cartographier des échantillons de peau de grande taille, dont la surface est supérieure à la surface qu'il est possible d'enregistrer avec le microscope (par exemple à imagerie confocale) en 25 une prise unique. Il est ainsi possible, en répétant le procédé sur différentes zones de l'échantillon (à la manière d'une mosaïque) d'obtenir des images 2D, après assemblage, de l'échantillon dans son intégralité, à la profondeur désirée. Les images 2D prises à des profondeurs différentes peuvent ensuite être compilées pour former l'image 3D d'une partie ou de 30 la totalité de l'échantillon de peau. 15 Un avantage du procédé selon l'invention est qu'il est possible d'obtenir rapidement des informations sur la structure de la peau, en particulier de l'épiderme et du derme papillaire. Le procédé de l'invention étant applicable à un échantillon de peau traité ou non traité par un actif ou 5 une formulation cosmétique et/ou dermatologique, il est ainsi possible de cribler les effets d'un actif cosmétique et/ou dermatologique sur la peau. L'invention se rapporte ainsi également à une méthode in vitro d'identification d'un effet cosmétique et/ou dermatologique d'un actif ou d'une formulation comprenant les étapes suivantes : 10 (i) Mise en oeuvre in vitro du procédé selon l'invention sur un premier échantillon de peau non traité par l'actif ou la formulation cosmétique et/ou dermatologique ; (ii) Mise en oeuvre in vitro du procédé selon l'invention sur un deuxième échantillon de peau traité par l'actif ou la formulation 15 cosmétique et/ou dermatologique ; et (iii) Comparaison des images tridimensionnelles obtenues aux étapes (i) et (ii) et identification de l'effet de l'actif ou de la formulation dans la peau. 20 Avantageusement, dans la méthode selon l'invention, le premier échantillon de peau et le deuxième échantillon de peau sont des échantillons d'origine naturelle ou synthétique, humaine ou animale, pouvant provenir : - soit d'un même échantillon de peau, préalablement sectionné 25 en deux, - soit d'une même zone de peau. Avantageusement, dans la méthode selon l'invention, l'actif ou la formulation dont l'effet est identifié, est un actif ou une formulation ayant un 30 effet cosmétique et/ou dermatologique tel que défini ci-dessus. La méthode selon l'invention permet d'observer les effets d'un actif seul ou bien d'un 16 ensemble de composés formant un produit ou une formulation. La formulation peut être par exemple une formulation topique ou nutraceutique. L'échantillon de peau peut ainsi être traité directement par l'actif ou la formulation cosmétique et/ou dermatologique par une 5 application topique directement sur la peau du sujet, ou indirectement de par l'ingestion d'un actif ou d'une formulation nutraceutique. Dans la méthode selon l'invention, le premier échantillon de peau tient le rôle d'échantillon témoin. Avantageusement, l'actif ou la formulation cible un constituant de 10 l'épiderme et/ou du derme papillaire (ou possède un effet biologique directe ou indirecte sur un constituant de l'épiderme et/ou du derme papillaire). La méthode peut aussi mettre en évidence un effet secondaire d'un actif ou d'un produit (ou formulation) qui est ou n'est pas destiné à être en contact avec la peau. La méthode selon l'invention permet ainsi en 15 outre de mesurer une tolérance à un actif ou une formulation cosmétique et/ou dermatologique. Les différences observées entre images tridimensionnelles obtenues des premier et deuxième échantillons de peau permettent d'obtenir des informations, de manière quasi immédiate, sur l'effet de l'actif 20 ou de la formulation cosmétique et/ou dermatologique. La méthode selon l'invention ne nécessite pas d'analyse complexe et/ou coûteuse afin d'observer un potentiel effet de l'actif ou de la formulation dans l'épiderme ou le derme papillaire de la peau. 25 D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif et non limitatif. Brève description des figures 30 - La figure 1 représente des images confocales d'une biopsie cutanée abdominale après marquage à la rhodamine B et transparisation selon la 17 méthode 3DISCO, dans la même zone et à des profondeurs progressives. La microarchitecture de l'épiderme peut être visualisée à partir du stratum corneum jusqu'au derme papillaire. (a) surface de Stratum corneum, (b) stratum granulosum, (c & d) stratum spinosum, (d) sommet d'une papille, 5 (g, h, i) couche basale à différentes profondeurs. La flèche blanche montre une boucle capillaire. Echelle 20 pm. - La figure 2 représente des images confocales d'une biopsie cutanée abdominale après marquage à la rhodamine B et transparisation selon la méthode 3DISCO, dans la même zone et à des profondeurs progressives. 10 (a-d) sont des images recadrées extraites de la figure 1, montrant un gros plan des kératinocytes à différentes profondeurs : (a) stratum granulosum, (b) stratum spinosum, (c) sommet d'une papille, (d) coupe dans une papille. Echelle 10 pm. (e & f) sont des images montrant une section optique au milieu des papilles : (e) canal de fluorescence. b) image 15 montrant des kératinocytes basaux pigmentés. Echelle 50 pm. - La figure 3 représente une sélection de coupes transversales montrant l'ensemble de l'épiderme au même endroit mais à des profondeurs différentes. Chaque image (a-i) est séparée par une distance de 3,5 pm afin d'apprécier l'évolution de la jonction dermo-épidermique (JED ou DEJ). 20 La forte interaction entre le bas des cellules basales et le derme peut être mis en évidence. Echelle 20 pm. - La figure 4 représente plusieurs vue (a-e) d'une construction de l'image tridimensionnelle à partir d'images 2D confocales de l'épiderme, selon le procédé de l'invention. Echelle 30 pm (a, c-e) et 20 pm (b). 25 EXEMPLES Exemple 1: De la peau abdominale humaine a été obtenue par chirurgie 30 esthétique. Des biopsies cutanées (explants de peau) ont été prélevées avec des pinces à biopsie (Punch Biopsy) d'un diamètre de 3 mm. 18 Fixation et marquage de l'expiant de peau L'excès de derme a été enlevé avec une lame de rasoir sous stéréomicroscope. Les explants ont ensuite été fixés avec 2% de 5 paraformaldéhyde (PFA, EMS 15710) dans du tampon phosphate salin (PBS) pendant une nuit à 4 °C. Les explants fixés ont ensuite été lavés avec du PBS pendant 1h, à deux reprises, puis marqués par une solution de rhodamine B à 0,5 Yo(w/w) dans l'eau (Sigma R6626) pendant une journée. Après 10 plusieurs lavages dans l'eau pour éliminer l'excès de rhodamine B, les explants ont été incubés pendant la nuit dans 20 ml d'un mélange THF:eau (50/50 v/v) (VWR 28551.321). Transparisation 15 Les explants ont ensuite été incubés pendant 1h dans 20 ml d'un mélange THF:eau (80/20 v/v) puis deux fois de plus dans du THF pur puis du dichlorométhane jusqu'à ce que les explants coulent au fond du flacon en verre (environ 10 minutes). Enfin, les explants ont été incubés dans 20 ml de dibenzyl éther 20 (DBE) (indice de réfraction 1,56, Sigma 108014) jusqu'à transparisation, puis les explants sont ensuite stockés dans du DBE à température ambiante. Imagerie 25 Avant observation au microscope, les explants de peau ont été placés dans une goutte de DBE dans une boite de Pétri ayant un fond en verre. L'imagerie a été réalisée en utilisant un microscope confocal inversé (Leica TCS-5P5) avec un objectif d'immersion dans l'huile 63x14- 30 0.6. Le liquide d'immersion utilisé était de type F (indice de réfraction 19 1,5180, Leica 11 513 859). Le traitement de l'image a été réalisé en utilisant le logiciel LAS-AF 1.6.5. La rhodamine B a été excitée au moyen d'un LASER argon-ion émettant à la longueur d'onde de 514 nm et les émissions ont été 5 collectées entre 530 et 630 nm. De multiples acquisitions ont été réalisées dans l'axe Z (Z-stack) depuis la surface du stratum corneum jusqu'au derme papillaire. Ces piles d'images ont été effectuées avec une vitesse de balayage de 200 Hz et un moyennage de 4 par image. Le pas entre chaque image était de 0,35 pm. Les images 2D et les « z-stacks » ont été 10 obtenus en utilisant une fréquence de balayage à 200 Hz avec une moyenne de « frame » de 4. Le step size était de 0,35 pm. Les reconstructions en 3D de l'expiant à partir des images confocales ont été réalisées au moyen du logiciel 'maris. 15 Résultats Les résultats de la figure 1 montrent que la coloration (marquage) est répartie dans tout l'épiderme et le signal est constant depuis le stratum corneum jusqu'à la couche basale (figures la à 1i). Etant donné que la jonction entre l'épiderme et le derme n'est pas plate, différentes 20 profondeurs (couches) peuvent être visualisées sur le même plan focal. Le fond des cellules basales peut être clairement visualisé et montre plusieurs projections cellulaires dans le derme (figures le et 1f). Cette caractéristique met en évidence l'interaction étroite entre la couche basale et le derme papillaire. Dans le derme, des cellules isolées apparaissent 25 avec une forme d'aster révélant les fibroblastes entourés d'une matrice constituée de fibres (figures 1h & i). Au milieu de certaines papilles, des structures compactes peuvent être distinguées et faire ressortir la présence d'une boucle capillaire (figure 1i). Les images ont été acquises à fort grossissement. 30 Les images peuvent également être obtenus en coupe après découpage de l'expiant à l'aide d'une lame de rasoir par exemple (figure 20 3). L'épaisseur de l'épiderme dans son ensemble peut ainsi être visualisée. La haute résolution permet de voir les limites cellulaires entre chaque cellule de l'épiderme viable. Il est ainsi possible d'apprécier l'évolution de la couche basale (a-i). Les papilles dermiques présentent une grande 5 diversité de formes et peuvent être orientées selon différents angles de la surface de la peau. La forme dendritique de la couche de cellules basales en contact avec le derme est clairement visible. Dans le derme, les fibroblastes sont visibles. Il est également possible de deviner un vaisseau capillaire venant irriguer le derme papillaire (figure 3 g-i). 10 Les images tridimensionnelles sont présentées en figure 4. Ces représentations 3D révèlent les détails morphologiques de différentes faces de l'expiant. La figure 4 (b & c) montre en particulier la surface de l'épiderme. Outre la topologie avec des sillons et des plateaux, la forme hexagonale des kératinocytes et l'aspect de la surface sont clairement 15 visibles. Ces images révèlent en outre des détails morphologiques de la surface extrême des kératinocytes. L'aspérité cellulaire, la porosité, les micro-rides sont accessibles. L'autre face, la couche basale, peut également être étudiée. Le rendu des volumes a permis de visualiser la complexité de la topographie de la DEJ (figure 4d). Le nombre, la forme 20 des papilles dermiques est visible. La segmentation de la surface de la couche cornée et l'interface DEJ de la reconstruction confocale peuvent être facilement réalisées. Ainsi, le profil de rugosité, la taille des cellules peut être analysée. La Figure 4e, montre la segmentation de la DEJ. L'existence de ce type de structure et leur évolution avec l'âge font 25 toujours l'objet d'études. Le procédé selon l'invention fournit ainsi des informations rapides et précises pour mesurer le volume, la hauteur, l'orientation des papilles dermiques. Exemple 2: 30 Deux biopsies cutanées (explants 1 et 2) ont été obtenues comme dans l'exemple 1. 21 L'expiant 1 est fixé, transparisé et cartographié comme dans l'exemple 1. L'expiant 2 est traité avec une émulsion tel que décrit dans Sakata et al. [25], puis fixé comme décrit dans l'exemple 1. L'expiant 2 traité est 5 ensuite transparisé et cartographié de manière identique à l'expiant 1. On compare les images tridimensionnelles obtenues des expiants 1 et 2 et on identifie l'effet de l'émulsion sur l'état de surface de la peau. Le procédé de l'invention permet ainsi d'analyser la topographie du 10 stratum corneum ainsi que celle de la DEJ. A plus fort grossissement, l'aspect des cellules, leur interconnexion et leur rugosité peuvent également être étudiées. L'organisation des cellules au sein de l'épiderme, leur agencement, leur forme, peuvent également être des critères distinctifs. 15 22 Liste des références [1] M. T. Martin, A. Vulin, and J. H. Hendry, "Human epidermal stem cells: Role in adverse skin reactions and carcinogenesis from radiation," Mutat. Res. Mutat. Res., vol. 770, pp. 349-368,2016. 5 [2] E. Fuchs, "Skin stem cells: Rising to the surface," J. Ce!! Biol., vol. 180, no. 2, pp. 273-284,2008. [3] L. Competition, D. Affects, and I. In, "NIH Public Access," vol. 86, no. 12, pp. 3279-3288,2008. [4] V. W. Wong, B. Levi, J. Rajadas, M. T. Longaker, and G. C. 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Procédé de construction d'une image tridimensionnelle d'un échantillon de peau comprenant les étapes suivantes : (a) marquage in vitro d'au moins un des éléments constitutifs de l'échantillon de peau au moyen d'un marqueur détectable par microscopie de fluorescence ; (b) transparisation in vitro de l'échantillon de peau marqué à l'étape (a) ; et (c) construction de l'image tridimensionnelle de l'échantillon de peau transparisé à l'étape (b) à partir d'images successives obtenues par une technique de microscopie de fluorescence. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'échantillon de peau est un échantillon d'origine humaine ou animale, naturelle ou synthétique. 3. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'échantillon de peau a un diamètre allant de 1,5 à 50 mm et une épaisseur moyenne allant de 50 pm à 1 mm. 20 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le marqueur est un marqueur colorant fluorescent, de préférence choisi dans le groupe comprenant les molécules organiques fluorescentes comprenant au moins un groupe aromatique. 25 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la transparisation de l'échantillon de peau est réalisée dans au moins un solvant organique ou mélange(s) solvant(s) organique(s)/eau, ledit solvant organique étant de préférence choisi dans le groupe 30 comprenant le tétrahydrofurane, le dichlorométhane, le dibenzyl éther, 26 l'alcool benzylique, l'ester benzylique de l'acide benzoïque et leurs mélanges, et comprend une ou plusieurs étape(s) successive(s). 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, 5 dans lequel la technique de microscopie de fluorescence est choisie dans le groupe comprenant la microscopie confocale à balayage LASER, la microscopie confocale à disque rotatif (ou disque de Nipkov), le biphoton et la feuille de lumière. 10 7. Méthode in vitro d'identification d'un effet cosmétique et/ou dermatologique d'un actif ou d'une formulation comprenant les étapes suivantes : (i) Mise en oeuvre in vitro du procédé tel que défini dans l'une quelconque des revendications précédentes sur un premier échantillon de peau non traité par l'actif ou la formulation cosmétique et/ou dermatologique ; (ii) Mise en oeuvre in vitro du procédé tel que défini dans l'une quelconque des revendications précédentes sur un deuxième échantillon de peau traité par l'actif ou la formulation cosmétique et/ou dermatologique ; et (iii) Comparaison des images tridimensionnelles obtenues aux étapes (i) et (ii) et identification de l'effet de l'actif ou la formulation dans la peau. 8. Méthode selon la revendication précédente, dans laquelle l'effet cosmétique à identifier est choisi parmi un effet anti-âge, hydratant, nourrissant, séborégulateur, apaisant, pigmentant, dépigmentant et/ou, antiperspirant. 9. Méthode selon la revendication 7, dans laquelle l'effet dermatologique à identifier est choisi parmi un effet sur un mécanisme 27 biologique lié à la dermatite atopique, l'eczéma, l'ichthyose, la rosacée, la couperose, le psoriasis, les pemphigoïdes, l'acné, le lentigo et/ou l'albinisme.