Brevet FR3085825A1 — publié le 20200320

HUILE DE MICROORGANISMES RICHES EN ACIDE DOCOSAHEXAÉNOÏQUE DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne une huile de microorganismes riche en acide docosahexénoïque (DHA, 022:6n3), comprenant plus de 60% de DI-IA par rapport à la masse totale de matière grasse. ETAT DE LA TECHNIQUE Les huiles contenant du DHA proviennent de plusieurs sources, les plus connues 10 sont le poisson, le krill et les microorganismes comme les microalgues. On connaît de nombreuses souches de microorganismes productrices de PUFA, notamment d'acide docosahexaénoïque (DHA), d'acide arachidonique (ARA) ou d'acide eicosapentaendique (EPA) également identifiés par les signes o3 et o6. Ces PUFA sont largement employés en industrie, notamment pour l'alimentation humaine ou animale ou en cosmétique, et leur 15 production industrielle fait l'objet de constantes améliorations depuis de nombreuses années (WO 1997/037032, WO 2001/054510, WO 2013/136028, WO 2015/004402). Les critères de sélection de souches adaptées à la production industrielle sont leur productivité élevée en biomasse, une accumulation importante de triglycérides (TG) et une teneur élevée en PUFA dans la matière grasse. On connaît aujourd'hui de 20 nombreuses souches industrielles qui répondent à ces trois premiers critères,avec une teneur en PUFA dans la matière grasse de l'ordre de 35 %, voire 50% dans le meilleur des cas. Or; il existe une demande d'huiles concentrées à fortes teneurs en PUFA, soit pour la fourniture de produits concentrés, comme des gélules d'huile concentrée qui permettent 25 de diminuer les prises pour une quantité équivalent de PUFA. Pour obtenir des huiles à forte teneur en PUFA (par exemple supérieur à 55% de DHA), les huiles sont concentrées par un procédé qui transforme les triglycérides en ethyl esters en impliquant l'utilisation de solvant tel que l'éthanol. Les ethyl esters sont une forme chimique artificielle, ils ne sont pas présents dans la nature. La biodisponibilité des acides aras sous forme d'ethyl esters 30 est bien moindre que sous forme de triglycérides (Ghasernitard et al., 2014). De plus, le procédé élimine les vitamines et les anti-oxydants qui sont présents dans l'huile brute. Par conséquent, l'huile concentrée est plus vulnérable à l'oxydation. Il est possible de convertir ces ethyl esters à nouveau en triglycérides, ce sont des triglycérides « reformés », afin d'améliorer la biodisponibilité. Des antioxydants peuvent 35 également être ajoutés pour accroître la stabilité de l'huile dans le temps. Cependant, cette huile concentrée est assez différente de l'huile naturelle, elle a subi de nombreux procédés de transformation qui ont changé sa composition profil en acides gras, 2 vitamines, pigments et autres molécules asti-oxydantes, privant les PUFAs de leur protection naturelle. Or les PUFAs sont des molécules sensibles, notamment à la température qui peut convertir les liaisons ois en liaison trans (Tsuzuki W, 2012). 11 faut également noter que la re-formation des triglycérides n'est pas complète, l'huile ainsi traitée contient encore une proportion variable d'éthyi esters, ce qui la distingue de l'huile non traitée. L'éthanol libéré lors de la trans-estérification (conversion des ethyl esters en triglycérides) est généralement éliminé par évaporation. H reste néanmoins des traces d'éthanol dans l'huile concentrée, Une autre raison pour vouloir minimiser les procédés de traitement de l'huile est la formation de contaminants comme les monochloropropanediol (2-MCPDs, 3-MCPDs) et le glycidol ainsi que leurs dérivés (esters de 2-MCPDs, de 3-MCPDs et esters d'acides gras de glyciciol). La présence de ces contaminants a été détectée notamment suite aux étapes de purification et de désodorisation de l'huile de poisson (Miyazaki and Koyama, 2017). Il y a peu de données disponibles pour l'instant concernant l'impact des procédés de concentration sur la formation des contaminants. Cependant, la re-formation des triglycérides â partir des ethyl esters peut engendrer une augmentation des diglycérides, composés précurseurs des contaminants. Le niveau de glycidol (et d'esters de glycidol) fait l'objet d'une régulation (EU) 2018/290/EC afin de limiter sa teneur dans les aliments : la concentration ne doit pas dépasser 1000 pg/kg dans les huiles alimentaires exceptés pour les huiles alimentaires destinées à la préparation d'aliments pour bébés et nourrissons où la limite est de 500 pg/kg. Dans les préparations pour bébés et nourrissons, la teneur maximale est encore plus basse 75 log/kg dans les poudres et 10 ug/Kg dans les liquides. Cette teneur sera encore réduite (50 et 6 pgikgrespectivement) en 2019. L'évaluation des concentrations maximales en MCPD est actuellement en cours pour les huiles et les aliments pour bébés. Pour l'instant, la réglementation ne concerne que les protéines végétales hydrolysées et la sauce soja (limite de 20 peo). Il est donc intéressant d'obtenir une huile naturellement riche en PUFAs, dont la composition est la plus proche possible des substances liposolubles du microorganisme producteur, avec un minimum de contaminants produits lors des traitements. Cela la rend particulièrement indiquée pour l'intégration de DHA dans les produits alimentaires. Sa très faible teneur en 3-MCPD et en glycidol, combinée avec sa haute teneur en DHA la rend idéale pour la préparation d'aliments destinés aux bébés et aux nourrissons. De plus, ces huiles concentrées sont généralement obtenues par des procédés de traitements coûteux et non-respecteux de l'environnement. Une autre solution connue consiste à générer des microorganismes génétiquement modifiés pour chercher à favoriser les voies métaboliques de production de PUFA (Hamilton & al., 2016). Toutefois, le choix des solutions techniques est limité par l'usage 3 fait des huiles obtenues, notamment en alimentation humaine (Fedorova-Cahms L & al., 2011). Il existe un besoin d'huiles naturellement concentrées en PUFA, qui ne nécessitent pas d'autres traitements que des méthodes d'extraction, c'est à dire pour lesquels les 5 PUFA sont essentiellement sous la forme de triglycérides tels que produits par les microorganismes. Plus particulièrement il existe un besoin d'huiles à forte teneur en PUFA et une plus faible teneur en acides gras saturés. Outre la question de la qualité des huiles, l'intérêt d'une faible teneur en acides gras saturés va vers une huile moins visqueuse, plus aisée à employer à des niveaux industriels, notamment nécessitant moins 10 d'énergie pour sa manipulation. L'invention répond à cette demande avec une huile à forte teneur en DHA, comprenant au moins 60% de DHA par rapport à la masse totale de matière grasse. Cette huile ne contient pas d'ethylesters, ni de traces de solvant (ethanol ou methanol) et une teneur réduite en 3-MCPD et en glycidol (par comparaison avec; les huiles contenant plus 15 de 60% de DHA actuellement sur le marché). EXPOSE DE L'INVENTION L'huile selon l'invention est une huile microbienne qui comprend plus de 60% de DHA par rapport à la masse totale de matière grasse, avantageusement au moins 62% de DHA, plus avantageusement au moins 65% de DHA, de préférence plus de 67%, plus 20 préférentiellement au moins 70%, encore plus préférentiellement 75% de DHA par rapport à la masse totale de matière grasse. Ces caractéristiques de l'huile selon l'invention concernent tant l'huile telle que présente dans la biomasse de microorganismes que dans l'huile extraite de cette biomasse, qu'elle soit brute ou purifiée. 25 L'invention concerne aussi une huile diluée, comprenant l'huile selon l'invention mélangée avec une autre huile. L'invention concerne aussi omposition pharmaceutique, cosmétique ou alimentaire qui comprend une huile selon l'invention: qu'elle soit brute, raffinée ou diluée. L'invention concerne également l'utilisation d'une huile selon l'invention; brute, 30 raffinée ou diluée, ou d'une biomasse contenant l'huile, pour l'alimentation humaine ou animale; en particulier pour l'alimentation des nouveaux nés; des enfants, ou des femmes enceintes ou allaitantes. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION L'huile selon l'invention est une huile d'origine microbienne, obtenue à partir d'une .35 biomasse de cellules de microorganismes cultivés dans des conditions permettant à la fois la croissance cellulaire (pour produire la biomasse) et la production d'une huile à forte teneur en DHA. 4 L'huile selon l'invention est une huile microbienne qui comprend plus de 60% de DHA par rapport à la masse totale de matière grasse, avantageusement au moins 62% de DHA, plus avantageusement au moins 65% de DHA, de préférence plus de 67%, plus préférentiellement au moins 70%, encore plus préférentiellement au moins 75% de DHA par rapport à la masse totale de matière grasse. De préférence l'huile selon l'invention e une teneur élevée en acides gras insaturés par rapport aux acides gras saturés. Les acides gras insaturés dans l'huile selon l'invention sont essentiellement du DHA et du DPA (acide clocosapentanoïque, 022:5n6). La teneur en ARA (acide arachidonique, 020:4n6) est généralement inférieure à 0;5%, 10 voire inférieure à 0,3%, avantageusement inférieure à 0,1%. La teneur en EPA (acide eicosapentaénoïque, 020:5n3) est généralement inférieure à 1,5%, avantageusement inférieure à 1%, plus avantageusement inférieure à 0,5%. Les pourcentages en ARA et EPA sont donnés par rapport à la masse totale de matière grasse. De manière avantageuse, la teneur cumulée en DHA et en DPA est d'au moins 70% 15 par rapport à la masse totale de matière grasse, avantageusement d'au moins 75%, plus avantageusement d'au moins 80%, voire plus de 85% par rapport à la niasse totale de matière grasse. Dans certains cas; le total DHA+DPA représente jusqu'à 90% de la niasse totale de matière grasse. Pour les huiles où la teneur en DHA est la plus forte, d'au moins 70%, la teneur cumulée en DHA et en DPA est d'au moins 80%, préférentiellement 20 d'au moins 85%. Pour une huile riche en DHA selon l'invention, le rapport DHA/DPA est de préférence d'au moins 3, plus préférentiellement d'au moins 4; pouvant aller de 4 à 9. Pour les huiles où la teneur en DHA. est la plus forte, d'au moins 70%, le rapport DH.AIDPA est avantageusement de 4 à 7. 25 La teneur en acides gras saturés est de préférence inférieure à 25% par rapport à la masse totale de matière grasse, voire inférieure à 20%, plus préférentiellement inférieure à 15%, encore plus préférentiellement inférieure à 10%. Les acides gras saturés sont essentiellement de l'acide palmitique (016 :0). Les autres acides gras saturés sont présents à une teneur inférieure à 2%, voire inférieure à 30 1%, notamment l'acide pendadécylique (015:0) ou l'acide myristique (014:0) ou encore l'acide stéarique (018:0). Avantageusement, les acides gras saturés en 010 à C22autres que l'acide palmitique sont, indépendamment les uns des autres, présents à l'état de traces, chacun en teneur inférieure à 0;1%, voire absents (0% tenant compte des incertitudes des méthodes d'analyse), en particulier pour les acides gras saturés en 010, 35 C11, C12, C17, C20, C21 et 022. Les pourcentages sont donnés par rapport â la masse totale de matière grasse. La teneur en acide palmitique est de préférence inférieure à 20% de la masse totale de matière grasse, plus préférentiellement inférieure â 15%, encore plus préférentiellement inférieure à 10%. Pour les huiles où la teneur en DHA est la plus forte, d'au moins 70%, la teneur en acides gras saturés en 010 à 022 est de préférence inférieure à 15%, plus 5 préférentiellement inférieure à 10%. Une manière de mesurer la forte teneur en DHA de l'huile selon l'invention et la faible teneur en acides gras saturés (AGS) consiste à établir un rapport DHA/AGS. Il est avantageusement d'au moins 2,5, préférentiellement d'au moins 3, plus préférentiellement d'au moins 5, encore plus préférentiellement d'au moins 6. Il peut aller 10 jusqu'à au moins 8 dans certains cas, voire d'au moins 9. Pour les huiles où la teneur en DHA est la plus forte, d'au moins 70%, le rapport DHA/AGS est d'au moins 4, préférentiellement d'au moins 6; plus préférentiellement d'au moins 8, jusqu'à environ 9. On peut aussi mesurer la forte teneur en acides gras polyinsaturés par rapport aux acides aras saturés (AGS) en faisant le rapport (DHA+DPA)/AGS. 15 Il est avantageusement d'au moins 2,5, préférentiellement d'au moins 3, plus préférentiellement d'au moins 4, encore plus préférentiellement d'au moins 5. Il peut aller jusqu'à au moins 8 dans certains cas; voire d'au moins 9. Pour les huiles où la teneur en DHA est la plus forte, d'au moins 70%, le rapport (DHA+DPA)/AGS est d'au moins 5, préférentiellement d'au moins 7, plus préférentiellement d'au moins 10, jusqu'à environ 11 20 ou plus. Les huiles selon l'invention sont essentiellement sous la forme de triglycérides. Les triglycérides représentent avantageusement au moins 80% de la masse totale de matière grasse, de manière plus avantageuse au moins 90%, de manière encore plus avantageuse au moins 93% de la masse totale de matière grasse. La teneur en 25 triglycérides est par exemple analysée par chromatographie sur couche mince (Jouet et al., 2003). Ces caractéristiques de l'huile selon l'invention concernent tant l'huile telle que présente dans la biomasse de microorganismes que dans l'huile extraite de cette biomasse, qu'elle soit brute ou purifiée. 30 Dans certains cas, selon le procédé employé, l'extraction de l'huile â partir de la biomasse peut conduire à une légère augmentation de la teneur en DHA et en DPA, favorisant l'extraction de ces PUFA par rapport à aux acides gras saturés de plus bas poids moléculaire. Toutefois, cette concentration ne modifie pas de manière substantielle les propriétés intrinsèques de l'huile contenue dans la biomasse; notamment la teneur en 35 triglycérides. Dans tous les cas, l'huile selon l'invention est une huile qui n'a pas subi de modifications substantielles de sa teneur en acides gras par l'ajout de PU FA, par exemple 6 sous forme d'esters, par concentration et/ou par l'élimination d'acides gras saturés comme l'acide palmitique. L'huile selon un mode particulier de l'invention contient plus 10 mg de caroténoïdes natifs par kg d'huile, voire plus de 30 rrigikg, préférentiellement plus de 40 mg/Kg, encore 5 plus préférentiellement plus de 60 mg/kg, voire au moins 65 mgikg. Les caroténoïdes présents sont majoritairement de l'astaxanthine et des bêta-carotènes. L'huile contient plus de 20 mg/kg d'astaxanthine, voire plus de 30 mg/kg, plus préférentiellement plus de 40 mg/kg. La canthaxanthine est également présente mais en quantité moindre. D'autre caroténoïdes comme la lutéine et la zéaxanthine peuvent être présents mais ils sont à la 10 limite de détection de la méthode utilisée. Le terme « caroténoïdes natifs » signifie que les caroténoïdes n'ont pas été ajouté, ils proviennent de la même biomasse que l'huile et sont extraits de cette biomasse en même temps que l'huile. lis sont produits par la souche dans des conditions de fermentation en hétérotrophie, sans stimulus particulier. Ces caroténoïdes natifs sont donc présents tout au long du procédé, protégeant les acides 15 gras, en particulier le CHA, contre l'oxydation. Le procédé de raffinage peut éliminer les pigments, donc l'huile raffinée pourra contenir moins, voire plus du tout, de caroténokies. La couleur de l'huile est habituellement évaluée par la mesure de l'indice de Gardner, selon la méthode décrite dans la norme AOCS Cc 13j-97 (révisée en 2017) avec un spectrophotomètre. L'échelle de mesure comprend 18 grades, allant du transparent (1) 20 au rouae foncélmarron (18). Certains caroténoïdes, dont I' astaxanthine et les bêta-carotènes, présentent une coloration, plus au moins intense suivant leur concentration. Leur présence se traduit donc par un indice de Gardner plus haut. L'huile selon un mode particulier de l'invention présente un indice de Gardner supérieur à 8; voire supérieur à 10, de préférence entre 12 et 17. 25 L'échelle de Gardner est traditionnellement utilisée pour évaluer le vieillissement des huiles car l'oxydation des huiles riches en acides gras poiyinsaturés (PUFAs) peut se traduire par un jaunissement de la couleur (pour une huile transparente), donc une valeur de Gardner plus haute. Cependant, l'oxydation des huiles riche en PUFAs est plus précisément mesurée par l'indice d'anisidine et l'indice de peroxydation. Les huiles selon 30 l'invention possèdent à la fois des indices d'anisidine et de peroxide bas, gages d'un produit peu oxydé, et un indice de Gardner haut, due à la présence de carotenoides. Les huiles selon l'invention possèdent un indice d'anisidine inférieur à 5, voir inférieur à 2; de préférence inférieur à 1,5 et un indice de peroxydation inférieur à 5, voir inférieur ou égal à 1, de préférence inférieur ou égal à 0,5. 35 Les huiles selon l'invention possèdent une température de fusion assez basse, qui baisse en corrélation avec l'augmentation du taux du DHA. La température de fusion est mesurée selon la norme ISO 6321. En effet, les huiles; à plus de 600 mg de DHA /g 7 d'acides gras (soit environ plus de 62% de DHA) ont une température de fusion inférieure à 2000, voir inférieure ou égale à 5°C. Flics sont donc liquides à température ambiante. Les huiles à plus de 700 mg de DHA par g d'acides gras (soit environ plus de 73% de DHA) ont une température de fusion inférieure à -5°C. Une température de fusion basse facilite le stockage et la manipulation (le pompage en particulier), puisqu'il est possible de conserver l'huile sous forme liquide tout en la réfrigérant afin de limiter le vieillissement. Les huiles qui figent lors de la conservation doivent être réchauffées pour les prélèvements et pour leur intégration dans des mélanges. Or la température est un facteur accélérateur de l'oxydation. 10 Cette propriété se traduit également par la valeur de viscosité, mesurée par un viscosimètre à 22°C (Viscoman. Gilson). Les huiles selon l'invention ont une valeur de viscosité à température ambiante inférieure ou égale à 50 Pas, voire inférieure à 40, de préférence inférieure à 30. Les huiles selon l'invention sont obtenues par culture de microorganismes 15 producteurs d'huiles riches en DHA. Les souches de microorganismes qui permettent d'obtenir de telles huiles sont des souches industrielles, c'est à dire selon l'invention, des souches dont la teneur en matière grasse représente au moins 45 % de la matière sèche, préférentiellement au moins environ 50 % de la matière sèche, et qui ont une capacité de croissance à une densité cellulaire d'au moins 50 g/L, préférentiellement d'au moins 70 20 giL, plus préférentiellement d'au moins 100 g/L. L'homme du métier connaît bien les souches industrielles de microorganismes productrices de PUFA principalement parmi les traustochytrides, les dinophycées, les diatomées, les eustigmatophycées, notamment les microorganismes des genres Crypthecodiniurn, Schizochytrium, Traustochytriurn ou Aurantiochytnum pour la 25 production de DHA. L'analyse de la teneur en PUFA dans la matière grasse se fait selon les méthodes usuelles de l'homme du métier, notamment décrites dans l'article suivant : Gas Chromatographic Quantification of Fatty Acid Methyl Esters: Flame lonization Detection vs. Electron Impact Mass Spectrometry, Dodds et al., Lipids, Vol. 40, no. 4 (2005). 30 On citera plus particulièrement les souches Aurantiochytnurn tnangrovei CCAP4062/7 et CCAP4062/6 et Schizochythum sp. CCAP4087/7 qui produisent des huiles comprenant plus de 60% de DHA par rapport à la masse totale de matière grasse. L'invention concerne également ces souches capables de produire des huiles comprenant plus de 60% de DHA. 35 Les procédés de culture industrielle de microorganismes pour la production d'un moût de fermentation qui servira ensuite à la production d'huile sont bien connus de l'homme du méfier, qu'ils soient en mode autotrophe, hétérotrophe ou mixotrophe. La culture industrielle en hétérotrophie ou mixotrophie permet d'obtenir des densités cellulaires d'au moins 50 g/L, préférentiellement d'au moins 70 g/L., plus préférentiellement d'au moins 100 g/L. Par « culture industrielle » on entend selon l'invention une culture des souches dans 5 un milieu de culture approprié à leur croissance et à la production de PUFA et dans un volume approprié pour la production des quantités suffisantes pour adresser un marché. Ces cultures industrielles sont réalisées par fermentation en mode discontinu dit "batch", en mode serni-continu dit "fed batch" ou en mode continu. Les fermenteurs ont des volumes qui peuvent aller de 1000 Là plus de 200 m3. 10 Le milieu de culture approprié est de préférence un milieu de culture chimiquement défini qui comprend une source de carbone, une source d'azote, une source de phosphore et des sels. Par "milieu de culture chimiquement défini ", on entend un milieu de culture dans lequel la teneur de chaque élément est connue. Avantageusement, le milieu ne comporte pas de matières organiques riches ou complexes. Par matières 15 organiques riches ou complexes on entend des matières organiques non purifiées, se présentant sous la forme de mélanges pour lesquels la composition exacte et les concentrations des divers composants du mélange ne sont pas connues avec exactitude, pas rnaitrisées, et peuvent présenter une variabilité significative d'un lot à un autre. Comme exemple de matière organique riche ou complexe, on peut citer les extraits de 20 levure ou les peptones qui sont des produits d'une réaction d'hydrolyse de protéines ou encore les matières minérales riches comme par exemple les sels minéraux marins ou autres agents de croissance complexes, n'ayant pas de concentration fixe de chacun de leurs composants. Généralement, les procédés de culture industrielle comprennent une étape de 25 croissance pour favoriser la production de biomasse, puis une étape d'accumulation pour favoriser la production de matière grasse et de PUFA en particulier. C'est le cas notamment pour le procédé décrit dans la demande de brevet WO 2001/054510. Plus récemment, des procédés ont été décrits mettant en oeuvre des conditions de cultures qui favorisent de manière concomitante la production de biomasse et celle des PUFA. On 30 citera en particulier les méthodes de culture décrites dans les demandes \NO 2012/035262, WO 2015/004402 et WO 2015/004403. Bien entendu, l'homme du métier pourra adapter les conditions de culture, notamment la composition du milieu, les conditions d'ajout de nutriments au cours de la culture, les cycles de température, d'oxygénation et les conditions d'éclairage pour favoriser la production de biomasse. 35 Les températures de culture industrielle sont avantageusement supérieures à 17 °C. On entend avantageusement par "biomasse" selon l'invention un ensemble de cellules de microorganismes produits par leur culture, en particulier par les méthodes 9 décrites ci-dessus, cellules qui peuvent avoir conservé ou non leur intégrité physique. On comprend donc que ladite biomasse peut comprendre une quantité de cellules de microorganismes dégradées allant de 0% à 100%. Par "dégradée on entend que l'intégrité physique desdites cellules de microorganismes a pu être altérée comme par 5 exemple des microorganismes lysés, résultant par exemple d'un procédé d'homogénéisation ou lyse enzymatique. Une fois produite, cette biomasse pourra être brute, juste séparée de son milieu de culture, séchée ou non, dégradée ou non. La biomasse, selon qu'elle soit séchée ou non, totalement ou en partie, peut comprendre un taux d'humidité de 1% à 90%. 10 L'invention concerne donc aussi une biomasse de microorganismes comprenant une huile telle que définie précédemment. Selon un premier mode de réalisation, la biomasse a un taux d'humidité de 70% à 90 °70, préférentiellement 80% à 85 %. C'est en particulier le cas lorsqu'elle est essentiellement constituée des microorganismes industriels optimisés cultivés après 15 filtration du mout de fermentation pour séparer les microorganismes cultivés du milieu de culture, avant séchage. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la biomasse est séchée, totalement ou en partie et présente un taux d'humidité de 1% à 10%, préférentiellement de 2% à 7%. 20 La biomasse pourra être conditionnée pour son stockage ou pour son utilisation en tant que telle, par exemple comme complément alimentaire ou aliment pour l'alimentation humaine ou animale. Les méthodes permettant d'isoler une huile selon l'invention à partir d'une biomasse produite par la culture de microorganismes sont bien connues de l'homme du métier. On 25 citera en particulier l'extraction solide-liquide qui repose sur l'utilisation d'un solvant (phase liquide) pour extraire l'huile contenue dans la biomasse séchée (phase solide) par aspersion ou macération ; l'extraction qui repose sur la séparation de la phase aqueuse de l'huile après la lyse préalable des cellules puis décantation ou centrifugation. De préférence l'extraction est faite sans solvants organiques. On citera en 30 particulier les demandes WO 01153512, \NO 02110423, \A/0 2014/122092, WO 2015/092546 et VVO 2015/095694. On citera aussi une méthode préférée qui permet d'améliorer les rendements d'extraction de matières grasses de microorganismes pour des huiles riches en PUFA. Cette méthode consiste à effectuer une lyse cellulaire à une première température, cette 35 dernière étant poursuivie à une deuxième température inférieure à la première, puis une séparation mécanique de l'huile de la biomasse lysée (filtration, décantation). 10 La lyse cellulaire est faite par lyse enzymatique ou mécanique (broyage). La température de la première partie de lyse est de préférence d'au moins 50°C tout en restant inférieure à des températures qui viendraient dégrader la composition des huiles en plus de favoriser la lyse cellulaire, c'est à dire des températures inférieures à 80°C, de 5 préférence d'au plus 70 "C. On connaît les enzymes susceptibles d'être employées, notamment décrites dans W02015/095688, W02011/153246, US6750048 et W02015/095694, en particulier des protéases ou des cellulases telles que les enzymes commercialisées par la société Novozyme sous les appellations « Alcalase 2,5 L », « Alcalase 2,4 L », « Novozym 10 37071 », « Flavourzyme 1000 L », « Novozym FM 2,4 L », « Protamex », « Viscozyme Les conditions de mise en oeuvre sont celles préconisées par le fournisseur, la température étant celle préconisée pour une activité optimale des enzymes, d'au moins 50°C et jusqu'à 70 'C, de préférence d'environ 65°C. Avantageusement la lyse enzymatique est mise en oeuvre sous une atmosphère pauvre en oxygène. 15 Les méthodes de lyse mécaniques sont également bien connues, notamment par broyeur à billes, mélangeur-disperseur, homogénéisateur haute pression broyeur à broches ou broyeur à impact, ultra-sons; champs électrique pulsés. On citera notamment pour le broyeur à billes : Netzsch « Discus-1000 » WAB « ECM-AP60 »; pour l'homogénéisateur haute pression GEA « Ariete » ; pour le mélangeur-disperse.ur 20 Silverson / « 700-X », pour le broyeur à broche : Hosakawa / « Contraplex » ; pour le broyeur à impact : Netzsch / « Condux ». La première partie de la lyse est mise en oeuvre dans les conditions usuelles préconisées de l'état de la technique pour une lyse cellulaire, notamment en termes de durée de la lyse enzymatique ou les cycles de broyages. 25 L'étape de poursuite de la lyse permet de compléter cette dernière en modifiant les conditions de mise en oeuvre sans avoir à extraire la biomasse lysée au préalable. La température de lyse dans cette deuxième partie est inférieure d'au moins 10°C à celle de la première partie. De préférence, la température de la seconde partie de lyse est inférieure ou égale à 40°C, avantageusement allant de 5°C à 40°C. Cette deuxième partie 30 de lyse à température inférieure, ou fin de lyse, est avantageusement mise en oeuvre pendant au moins 30', pouvant aller jusqu'à 30 h. La séparation mécanique d'une huile à partir d'une biomasse lysée est également bien connue de l'homme du métier, comme une séparation gravitaire, notamment par centrifugation comme décrite dans la demande de brevet WO 01/53512. On peut aussi 35 employer une séparation continue, en particulier par séparateur centrifuge à assiettes. De tels séparateurs sont connus pour extraire en continu des huiles de milieux complexes comprenant des résidus solides et de l'eau, tels que décrits dans la demande de brevet 11 WO 2010/096002, notamment commercialisés par les sociétés Alfa Laval, Flottweg ou SPX Flow Technology Santorso, notamment. Cette étape de séparation continue est préférée dans le procédé employé pour obtenir l'huile selon l'invention. L'huile obtenue est généralement une huile appelée huile brute, qui peut être 5 employée telle quelle ou faire l'objet d'un raffinage; notamment pour faciliter sa conservation, en évitant qu'elle ne rancisse, ou pour modifier sa couleur de manière à la rendre plus acceptable pour un consommateur. Ces étapes de raffinage sont bien connues de l'homme du métier, notamment de dégommage, clarification et de désodorisation. Elles permettent d'éliminer (tout ou bien en parte) les phospholipides, les 10 pigments, les volatiles et les acides gras libres. De fait, ces méthodes rie viennent pas modifier substantiellement la teneur relative en acides gras, saturés ou insaturés, ni la teneur en triglycérides de l'huile raffinée obtenue par rapport à l'huile brute. L'invention concerne aussi une huile conditionnée comprenant un récipient de volume approprié pour contenir ladite huile; l'huile étant une huile riche en DHA telle que 15 définie précédemment, brute ou raffinée; et conditionnée en une quantité d'huile supérieure à 1 L, avantageusement en une quantité d'huile supérieure â 10 L, plus particulièrement en une quantité d'huile de l'ordre de 220 L, et plus particulièrement en une quantité d'huile de l'ordre de 20m". Tout récipient capable de contenir le volume d'huile ou de biomasse et les protéger 20 pour leur conservation et leur transport pourra être employé par l'homme du métier. De manière avantageuse, le volume du récipient sera égal ou sensiblement supérieur à celui de l'huile ou de la biomasse conditionnée de manière à limiter la présence d'air dans le récipient et limiter l'oxydation. Le récipient sera avantageusement opaque afin d'éviter l'altération du produit par les rayons lumineux, en particulier les UV. De manière 25 avantageuse, le récipient sera étanche à l'air de telle manière que tout volume non occupé avec de l'huile ou de la biomasse puisse être rempli d'un gaz inerte. L'huile selon l'invention peut être mélangée à d'autres huiles pour leur utilisation finale. Cette dilution vient modifier la teneur globale en DHA et autres acides gras insaturés dans la composition de l'huile diluée. Il reste toutefois possible d'identifier dans 30 l'huile finale, au vu du profil en acide gras de l'huile employée pour la dilution, les pourcentages relatifs en acides gras qui proviennent de l'huile riche en DHA selon l'invention et de l'huile de dilution. L'invention concerne donc aussi une huile diluée, comprenant l'huile selon l'invention mélangée avec une autre huile. Les huiles employées pour diluer l'huile riche 35 en DHA selon l'invention sont généralement et de préférence des huiles végétales adaptées à une consommation alimentaire humaine ou animale. On citera en particulier les huiles de tournesol, de colza; de soja, de noix, de sésame, de chanvre, de noisette, 12 d'argan, d'olive, de lin, ou de toute autre huile adaptée à un usage alimentaire. L'huile ajoutée peut aussi être une huile comprenant d'autres PUFA, en particulier de l'ARA et/ou de l'EPA, en particulier d'autres huiles d'origine microbienne ou encore des huiles de poisson. L'invention concerne aussi une composition qui comprend une huile selon l'invention, qu'elle soit brute, raffinée ou diluée, ou encore qui comprend la biomasse selon l'invention. Une composition selon l'invention peut comprendre un ou plusieurs excipients. Un excipient est un composant, ou mélange de composants, qui est utilisé dans la présente 10 invention pour donner des caractéristiques souhaitables â la composition pour sa conservation et son usage, y compris des aliments et des compositions pharmaceutiques, cosmétiques et industrielles. Un excipient peut être décrit comme un excipient "pharmaceutiquement acceptable" lorsqu'il est ajouté à une composition pharmaceutique dont les propriétés sont connues de la pharmacopée pour être employés au contact des 15 tissus humains et animaux sans toxicité excessive, irritation, réaction allergique ou autres complications. Différents excipients peuvent être utilisés comme une base organique ou minérale, un acide organique ou minéral; un tampon de pH, un stabilisant, un antioxydant, un agent d'adhésion, un agent de séparation, un agent de revêtement, un composant de phase extérieure, un composant â libération contrôlée, un agent tensioactif, un 20 humectant, une charge, un émollient ou des combinaisons de ceux-ci. Selon leur destination, les compositions selon l'invention sont en particuEier des compositions pharmaceutiques; cosmétiques, nutraceutiques ou des aliments. Les aliments sont destinés tant aux humains qu'aux animaux et comprennent des compositions solides, pâteuses ou liquides. On citera en particulier les aliments courants, 25 les produits liquides, y compris laits, boissons, boissons thérapeutiques et boissons nutritionnelles, les aliments fonctionnels, les suppléments, les nutraceutiques, les préparations pour nourrissons, y compris les préparations pour nourrissons prématurés, les aliments pour femmes enceintes ou allaitantes, les aliments pour adultes, les aliments gériatriques et aliments pour animaux. 0 L'huile riche en DHA selon l'invention, qu'elle soit brute ou raffinée ou la biomasse qui la contient peut être utilisée directement comme ou ajouté en tant qu'additif dans une huile, une pâte à tartiner, un autre ingrédient gras, une boisson, une sauce à base de soya ou à base de soja, des produits laitiers (lait, yaourt, fromage, crème glacée), des produits de boulangerie, des produits nutritionnels, par exemple sous forme de 35 complément nutritionnel (sous forme de gélule ou de comprimé), des suppléments vitaminiques, des compléments alimentaires, des poudres à diluer pour boissons, comme des boissons énergétiques ou des poudres de laits pour des formulations infantiles, des 13 produits alimentaires en poudre fini ou semi-fini, etc.; selon les usages connus de l'homme du métier. Les aliments pour animaux sont également connus de l'homme du métier. Ils sont en particulier destinés aux animaux d'élevage, comme les vaches, cochons, poulets, 5 moutons; chèvres ou dans la pisciculture pour les crustacés ou les poissons d'élevage. Les compositions pharmaceutiques comprenant une huile riche en DHA sont également connues de l'homme du métier, l'huile étant employée seule ou en combinaison avec d'autres médicaments. L'huile selon l'invention; brute ou raffinée ou la biomasse qui la contient, peut être 10 formulée sous la forme de compositions unidoses, notamment sous forme de comprimés, de gélules, de capsules, de poudres, de granulés, adaptés â une administration per os, L'avantage de l'huile riche en DHA selon l'invention, qu'elle soit brute ou raffinée, ou de la biomasse qui la contient, est qu'elle peut être employée en moindres quantités dans ces mélanges et compositions. 15 L'invention concerne également l'utilisation d'une huile selon l'invention; brute, raffinée ou diluée ou encore la biomasse qui la contient, pour l'alimentation humaine ou animale, en particulier pour l'alimentation des nouveaux nés, des enfants, ou des femmes enceintes ou allaitantes, De tels usages sont, bien connus de l'homme du métier, notamment décrits dans la 20 demande de brevet WO 2010/107415 et sur le site Web de la société DSM (https://www.dsm.com/rnarketsifoodandbeverages/en_US/products nutritionallipids/lifedh e. h tm I) EXEMPLES EXEMPLE 1 : Profil de Acides Gras de la biomasse de traustochytrides à haute 25 teneur en DHA Les souches de traustochytrides (Aurantiochytrium mangrovei -FCCB1897, FCCB1800, CCAP4062/8) sont cultivées en Erlemneyer dans le milieu de culture ATCC 790 (modifié). Des résultats similaires sont obtenus avec des souches de Schizochytrium sp. ((notamment avec la souche CCAP408717). 30 Une fois les cultures en phase stationnaire, la biomasse est récupérée par centrifugation puis lyophilisée avant l'analyse de la composition de la biomasse en acides gras par GC-FID (méthode adaptée de la norme 150 12966-2). Composition du milieu ATCC 790 modifié : Extrait de Levures 5.0 g/L 35 Peptone 5.0 g/L D+-Glucose 30.0 g/L Sels marins 20 14 Le Tableau 1 représente la composition en acides gras contenus dans la biomasse. Les résultats, sont exprimés en pourcentage par rapport à la teneur en acides gras totale. Les AGS sont les acides gras saturés. Tableau FCCE11897 FCCB1800 CCAP4O6218 010:0 Jo,o 00 0,0 C11 :0 0,0 0,0 0,0 012:0 00 0,0 0,0 C13:0 0,0 0,0 0,C) 014 :0 I 0,_2 0!3 0,3____ 014 :1 I 0.0 0,0 0,0 015:0 I 0,6 1,0 1,7 015:1 1 0,0 0,0 0,0 016:0 6,8 65 8,3 016 :1 I 0;0 0,0 0,0 1 0,0 0;0 0,0 016:21 ,0 016:3 ' 0 0 0,0 0,0 I , 016:4 1. 0.0 0,0 0,0 017:0 1 1,1 1,4 1,5 017:1 I 0,3 0,3 0,2 C18 :0 1 0,5 0;5 0,4 018 :1 1- 0;0 0,0 0,0 C18 :2 I 1 0,0 0;0 0,0 018 :3n3 0,1 1-' C18 :3n6 1 0,1 , 0,1 0,0 018 :4n3 1 0,3 0,5 0,4 , 0,1 0;1 0,0 C20 :0 I 020 :4n6 (ARA) 0,3 0,3 0,3 020 :5n3 (EPA) 1 1,1 1,0 _k 1,2___ 021 :0 r 0,0 0.0 1 0,0 - ----- +------- ----- -------------------- 022 :0 ' 0,0 02- 0 I 0,0 ---------------------------- ----- ------------------4---------------------- ---------- -h-------------------------- 022 :5n3 (DPAn3) 1 0,4 0,3 1 0,4 022 :5n.6 (DPAn6) 1 16,7 16;5 ' 16;8 C22 :6n3 (DHA) , : 70 9 70,9 68 1 . DHA+DPA 88,0 87,8 85,2 AGS 7,7 7,8 10,2 DHAJDPA 1 t 4,2 4,2 4,0 DHA/AGS 1 9,2 9,1 6,7 (DHA+DPA)IAGS 1 11,4 11,3 j 8,4 5 EXEMPLE 2 Cultures en fermenteur de souches à haute teneur en DHA Les cultures sont réalisées dans des fermenteurs (bioréacteurs) de 1 à 5 L utiles avec automates dédiés et supervision par station informatique. Elles sont effectuées à partir de deux souches cf Aurantiochytrium mangrovei et avec deux protocoles de cultures 10 différents. Le système est régulé à pH 5 via l'ajout de base (NH4OH pour exemple bl et 15 b2 et avec NaOH pour exemple a) avec ajustement du pH réalisé sur toute la durée de la culture, et fournissant une alimentation d'azote (dans le cadre des exemples b1 et b2). La température de culture a été fixée à 30°C puis 22`C et enfin 18°C sur la fin de la culture. La souche CCAP4062/7 est utilisée pour l'exemple a et b1 tandis que la souche FCCB1897 est utilisée pour l'exemple b2. La composition des milieux de culture est donnée dans le Tableau 2. Tableau 2 a b1 et b2 CaCl2, 2H20 0,55 0,55 g/L MgSO4, 7H20 4-8 4-8 H3B03 0,00875-0,175 0,00875-0,0175 g/L K2SO4 2,08 0,00 g/L KH2PO4 4,00 4,00 gIL Na4EDTA, 2H20 0,12 0,12 g/t. FeSO4, 7H20 0,04 0,04 g/t. (NH4)2SO4 9,00 1,00-2,00 glt.. MnCl2, 4H20 0,0108 0,0108 g/L ZnSO4, 7H20 0,0108 0,0108 g/L CoCl2, 6H20 0,000108 0,000108 a/L Na2MoO4, 2H20 0,000108 0,000108 g/L Na2SeO3 1,73E-07 1,73E-07 g/L CuSO4, 5H20 0,0072 - 0,0072 g/L NiSO4, 6H20 0-0.0056 0-0,0056 g/L Thiamine 0,0320 0,0320 g/L Vitamine B12 0,0005 0,0005 g/t. Panthotenate 0,0108 0,0108 glL Antimousse Biospurnex 153K 0,40 0,40 mL/L Glucose, 1 H20 55,00 55,00 91- Des ajouts de glucose sous forme d'une solution d'enrichissement sont faits avec 10 un ratio molaire de carbone : azote : phosphore (CNP) de 533: 11 : 1 (exemple a) soit avec une solution composée uniquement de glucose (exemples b1 et b2). Suivi des cultures La concentration en biomasse totale est suivie par mesure de la masse sèche (filtration sur filtre GFIF, Vt/hatrnan, puis séchage en étuve, à 105°C, pendant 24 h 15 minimum avant pesée). Les analyses des acides gras sont réalisées selon une méthode adaptée de ISO 12966-2 pour la biomasse, et suivant la Pharmacopée Européenne 9.0 (2.4.29.) pour les huiles. Les profils en acides gras des biomasses obtenues avec les conditions a, b1 et b2 sont donnés dans le Tableau 3. Les résultats sont exprimés en pourcentage par rapport à 20 la teneur en acides gras totale. Tableau 3 r._________________________-------- 1 --- ----- -------------------------------------------------- 9 ELPH191._.7: 0 a 1 bl 1 b2 i ----- _0.:_.60TH..___.60FII60:_60.._____. 6 012:0 0,0 0,0 0,0 013:0 0,0 I 0,0 i 0,0 014:0 1 1,2 1 0,3 0,8 I 014:1 0,0 L _ 0,0 j 0,0_ 015:0 0,0 1 0,1 1 1,7 015:1 0,0 1 0,0 i ----- ,------------------- 0,0 10,9 0,2 0,0 016:0 I 19,6 1 _____________________ ----- _--------------------------------------------,--------------- 13,6 1 0,2 1 016:1 0,1 1 + 016 :2 -+ 0.0 1 0.0 1 016 :3 0,0 1 0,0 1 0,0 C16 :4 0,0 11 0,0 0,0 017 :0 0,0 1 0,0 1 017:1 0,0 0,0 0,3 018:0 0,5 1 0,6 1 0,6 018 :1 0,2 1 0,3 i 0,4 018 :2 0,0 1 0,0 1 0,0 018 :3n3 0,2 1 0,1 1 0,2 _________________________________..__ ----- -------------: i--------------------- C18 :3n6 0.1 1 0 1 - - - --- ----- ----- ------------------------------------------------ t , . ----------------- 018 :4n3 0,3 1 0,3 1 0,3 020:0 0,1 1 0,1 1 0,1 020 :4n6 (ARA) 0,1 1 0,0 1 0,1 020 :5n3 (EPA) 0.4 1 0.'6 1 0,6 021 :0 0,0 i 0,1 1 0,0 022 :0 0,1 1 0,0 1 0,0 022 :5n3 (DPAn3) 022 :5n6 (DPAn6) 0.2 1 0,0 1 0,2 022 :6n3 (DHA) DHA+DPA 12,9 1 9,6 I 12,7 66,6 1 62,5 1 70,1 79,7 1 72 1 83 AGS 15,1 j 22 I 11,4 DHAIDPA MINAGS 5,2 1 6,5 1 5,5 4,4 I -1- 6,2 2,9 1 (DHA+DPA)JAGS 5,3 1 3,3 1 7,3 EXEMPLE 3 : Culture en conditions industrielles Les souches à haute teneur en DHA produisent une biomasse de composition similaire en acides gras lorsque qu'elles sont cultivées en fermenteurs de taille industrielle, comme des cuves de 10 m3 ou bien de 180 m3, selon des conditions similaires à l'exemple 2, avec le milieu de culture b et des ajouts de glucose sous forme d'une solution d'enrichissement sont faits avec un ratio molaire de carbone : azote : phosphore (CNP) de 533 : 0,4 : 1. 17 Les profils en acides gras de la biomasse de la souche CCAP406217 après une culture dans des cuves de 10 m3 et de 180m3 sont donnés dans le Tableau 4. Les résultats sont exprimés en pourcentage par rapport à la teneur en acides gras totale. Tableau 4 010:0 10m3 180m3 0,0 0,0 C11 :0 0,0 0,0 012 :0 0,0 0,0 013 :0 0,0 0,0 014 :0 0,7 0,5 015:0 0,0 __ 0,0 ---------------------------____-____ _ C15 :1 0 ,0 0,0 016:0 18,1 13,6 016:1 0,0 0,0 016:2 0,0 0,0 016:3 0,0 0,0 016:4 0,0 0,0 017:0 0,0 0,0 017:1 0,0 0,0 C18 :0 0,8 0,0 --------------------------------------______-______ _________ ,______ 018 :1 0,0 0,0 018 :2 0,0 0,0 018 :3n3 0,3 0,3 018 ,3n6 0,0 0,0 018 :4n3 0,0 0,0 020 :0 0,0 0,0 C20 :4n6 (ARA) 0,2 0,1 020 :5n3 (EPA) 0,9 0,4 021 :0 0,0 0,0 0,0 ------6-0-- 022 :5n3 (DPAn3) 0,0 0,0 C22 :5n6 (DPAn6) 11,2 13,4 C22 :6n3 (DHA) 63,9 66,8 DHA+DPA 75,1 80,2 AGS 19,6 14,7 DHA/DPA 5,3 4,8 DHA/AGS 3,3 4,5 (DHA+DPA)/AGS 3,8 5,5 5 EXEMPLE 4 : extraction de l'huile à partir de la biomasse des souches à haute teneur en DHA L'huile est extraite à partir de la biomasse de l'exemple 3 (cuve de 180 m') selon une méthode décrite dans W02015/095694 (exemple 9). La composition en acide gras de 10 l'huile est semblable à celle de la biomasse; donnée dans le Tableau 4. 18 EXEMPLE 5 extraction de l'huile à partir de la biomasse des souches à haute teneur en DHA L'extraction de la biomasse produite dans les mêmes conditions que l'exemple 3 est réalisée en suivant la séquence (a) lyse cellulaire par voie enzymatique (ex: avec l' « Alcalase 2,5 L » ou « Alc,alase 2,4 L » ou « Novozym 37071 » de Novozymes) pendant 4h à une température de 65°C, (b) poursuite de la lyse en abaissant la température comprise entre 5 et 40°C, pendant une durée comprise entre 30 minutes et 30h, (c) séparation mécanique de l'huile par séparateur centrifuge à assiettes. 10 Le rendement d'extraction est de 60% de lipides extraits de la biomasse. Le profil lipidique de l'huile extraite à partir de la biomasse est donné dans le Tableau 6. Les résultats sont exprimés en pourcentage par rapport à la teneur en acides gras totale. Tableau 6 1 10 m3 0.0 0,0 0.0 0,0 I 180 m3 0.6 0,0 0,0 0,0 1 016 :0 1 ci 1 :0 1 I C12 :0 013 :0 1 1! I 014 :0 0,3 0,0 0,0 i 014 :1 0.0 III 0,0 015 :0 0,0 0,0 15.3 0.0 0.00.0 1 0,0 0.0 8,3 0,0 0.0 0.0 015 :1 t 1 016 :0 1 1 016 :1 ' 016 :2 I 1-016 :3 1 t I C16 :4 0,0 0,0 0,0 C17 :0 0.0 1 0,0 017 :1 0,0 I 0,0 0,4 C18 :0 0,4 r 018:1 0.0 1 0,0 018 :2 0,0 0.0 0,0 0.0 0,00.0 1 0,0 0.0 0,0 0.0 h 1 0,0 018 :3n3 1 0,0 018 :3n6 C18 :4n3 1 i 020 :0 i 020 :4n6 (ARA) I 020 :5n3 (EPA) 0,5 1 0,2 I 1 021 :0 0.0 1 0,0 I 022 :0 C22 :5n3 (DPAn3) C22 :5116(5PX né) 0.0 I 0,0 0,0 1 0,0 -1-1,--6- 15,3 19 022 :6n3 (DHA) 71,1 1 75 DHA+DPA 82,7 1 90,3 SFA 16 8,7 DHA/DPA 5,9 4,8 DHNSFA 4,4 8,6 (DHA+DPA)/SFA 5,2 10,4 EXEMPLE 6 : qualité de l'huile : anti-oxydants et contaminants Plusieurs fermentations en hétérotrophie sont réalisées suivant les conditions de l'exemple 3. L'huile est extraite à partir du moût de fermentation suivant les conditions de 5 l'exemple 5. Les caroténoïdes sont mesurés dans l'huile extraite, par LC/DAD, selon les méthodes suivantes : Astaxanthine (formes esters incluses), Méthode de référence : DSM Ver. 1.5 2009 ; Bêta-carotène (somme de cis- & trans-), saponifié, Méthode de référence : EN 12823-2:2000 Canthaxanthine, Méthode de référence: Roche Index nu 2264 ; Lutéine & Zéaxanthine, Méthode de référence: Roche Index n" 2264. 10 Tableau 7 NI° de lot A E . C Il D E 1 1 DHA (mg/g AG) i 6741 1 700 707 6701 663 DHA (% MG) 7r1,61 71:11 2 I 72,2 72;4 Béta-carotènes (mg/kg AG) - 14,1. 1 11,7 11,9 Esters 'astaxanthine (/g AGI 141 3,31 70,61 3,7 3,8 Canthaxanthine (mg/kg AG) 3,5 13,41 i 3,2 Total caroténokies (mg/kg AG) Indice de Gardner 65,61 63;31 59,61 48,3 46,6 14,8 16,71 >181 12,3 12,3 Indice d'anisidine 1,17 1,131 0,54 1,35 1,97 Indice de peroxyde (meg/kg) 11 0,11 0,1 i 1 0,1 Les contaminants comme le glycidoi et les 2- et 3-MCPDs sont également dosés dans les mêmes lots. Tableau 8 Nu de lot i A 1 B 1C D E I DHA (mgig AG) 1 670 674 663 700 707 9 lypidyl esters _.45 2-kr1CPD (libre et esters, pg/kg) I 2000 >2000 19 Echantillon 2 634 - 67 139 >2000 41 >2000 11 2000 5 REFERENCES 10 Fedorova-Dahms I. & al., Safety evaluation of DHA-rich algal oil from Schizocittrium sp, Food and Chemicai Toxicolcgy, 2011, 49, 3310-3318 Folch J, et aï, A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Bio! Chem. 1957 May; 226(1):497-509 15 - - Hamilton M. & al., Heterotrophic Production of Omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acids by Trophically Converted Marine Diatom Phaeodactylum tricornum, Marine Drugs, 2016, 14, 53 Omega-3 long chain fatty acid "bioavailability": a review cf evidence and methodolooical c,onsiderations 20 - Ghasemifard S, Turchini GM, Sinclair A.J. Prog Lipid Res. 2014 Oct;56:92-108. dol: 10.1016/j.plipres.2014.09.001. Epub 2014 Sep 16, Review. Wakako TSUZUKI; Study of the Formation of trans Fatty Acids in Model Oi!s (triacylglycerols) and Edible Cils during the Heating Process , jARO 46 (3), 215 - 220 (2012) 25 Kinuko Miyazaki* and Kazuo Koyama, An. Improved Enzymatic Indirect Method for Simultaneous Determinations of 3-MCPD Esters and Glycidyl Esters in Fish Cils , J. Oleo Sci. 66, (10) 1085-1093 (2017) Jouhet J., Marechal E., Bligny R., Joyard J., Block M. A. (2003). Transient increase of phosphatidylcholine in plant cells in response to phosphate deprivation. FEBS Lett. 30 54463-68. EP 0 223 960 ; EP 1 001 034 WO 1994/008467 ; WO 1997/037032 ; WO 2001/054510 ; WO 03/049832 ; VVO 2010/107415 ; VVO 2012/035262 ; VVO 2013/136025; WO 2013/136028 ; 1IVO 20147146098 ; VVO 2015/004402: VVO 2015/004403: VVO 2015/150716: VVO 2016/030631 REVENDICATIONS1. Huile microbienne qui comprend de l'acide docosahexénoïque (DHA), caractérisée en ce qu'elle comprend plus de 60% de DHA par rapport à la masse totale de matière grasse et que la teneur en acides gras saturés est inférieure à 25% par rapport à la masse totale de matière grasse. e Huile microbienne selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins 65% de DHA par rapport à la masse totale de matière grasse. 3. Huile microbienne selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comprend de l'acide docosapentanoïque (DPA) et en ce que la teneur cumulée en 10 DHA et en DPA est d'au moins 70% par rapport à la masse totale de matière grasse. 4. Huile microbienne selon la revendication 1. caractérisée en ce qu'elle comprend au moins 70% de DHA. 5. Huile microbienne selon la revendication 4, caractérisée en ce que la teneur cumulée en DHA et en DPA est d'au moins 80% par rapport à la masse totale de 15 matière grasse. 6. Huile microbienne selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le rapport DHA/DPA est d'au moins 4. 7. Huile microbienne selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que la teneur en acides gras saturés est inférieure à 15% par rapport à la masse totale de 20 matière grasse. 8. Huile microbienne selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'elle comprend au moins 80% de triglycérides par rapport à la niasse totale de matière grasse. 9. Huile microbienne selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce 25 qu'elle a une viscosité à température ambiante inférieure ou égale à 50 Pas. 10. Huile microbienne modifiée selon la revendication 7. caractérisée en ce qu'elle a une viscosité inférieure à 30 Pa.s. 11. Huile microbienne diluée, caractérisée en ce qu'elle comprend une huile microbienne selon l'une des revendications 1 à 10, mélangée avec une autre huile. '30 12. Biomasse de microorganismes, caractérisée en ce qu'elle comprend une huile selon l'une des revendications 1 à 10. 13. Utilisation d'une huile selon l'une des revendications 1 à 11 ou d'une biomasse selon la revendication 12 pour l'alimentation humaine ou animale, en particulier pour l'alimentation des nouveaux nés, des enfants, ou des femmes enceintes ou 35 allaitantes. 14. Aliment, qui comprend une huile selon l'une des revendications 1 à 11.