Brevet FR3085964A1 — publié le 20200320

PROCEDE A HAUT DEBIT POUR DETECTER DES ABERRATIONS CHROMOSOMIQUES ET/OU DES ABERRATIONS DE TELOMERES La présente demande concerne un procédé à haut débit pour détecter 5 des aberrations chromosomiques et/ou des aberrations de télomères. Au cours de la dernière décennie, de nombreux travaux de recherches ont démontré le rôle majeur des télomères dans l'intégrité et la stabilité du génome. A chaque division cellulaire, les télomères constituant l'extrémité de chaque chromosome se raccourcissent. Quand les télomères deviennent trop 10 courts, et avant que les gènes ne soient affectés ou que les chromosomes fusionnent entre eux, la cellule cesse de se diviser et entre en sénescence. Les télomères sont donc considérés comme une horloge biologique qui gouverne le vieillissement des cellules. Il est désormais bien documenté que la longueur des télomères est un biomarqueur important dans les maladies liées au vieillissement 15 comme les cancers et les maladies cardiovasculaires athérosclérotiques. [Hubert J et al, Circ Res.16;122(4):616-623 2018 ; Staerk L et al, J Am Heart Assoc. 2017 Nov 14;6(11)]. La détermination de la longueur des télomères et des aberrations chromosomiques n'a pas seulement des implications pratiques pour les cliniciens 20 dans la prise en charge thérapeutique des patients mais ouvre également de nouveaux champs de recherche et des applications en recherche clinique, et en particulier au cours d'essais thérapeutiques. L'étude de la longueur des télomères est donc cruciale pour la compréhension des mécanismes cellulaires, l'évaluation et la prise en charge des 25 patients. A ce jour, plusieurs techniques d'analyse existent. L'analyse des fragments de restriction terminaux (TRF ou Terminal Restriction Fragmentation) est la première méthode développée pour déterminer la longueur des télomères. Elle est souvent considérée comme la méthode de référence. Cette méthode permet d'estimer le nombre moyen de répétitions 30 terminales portées par l'ensemble des chromosomes. La procédure consiste en la digestion de l'ADN génomique par une ou plusieurs enzymes de restriction. Les fragments sont ensuite séparés par électrophorèse en fonction de leur taille. La taille des fragments terminaux est estimée par comparaison avec des fragments de longueur connue. [Allshire, Dempster & Hastie, Nucleic Acids Res. 1989 Jun 35 26;17(12):4611-27]. Cette méthode présente l'inconvénient d'être longue et 2 fastidieuse et nécessite de grandes quantités d'ADN (>1pg). De plus, elle conduit à l'obtention d'une valeur moyenne de longueur et non à la mise en évidence individuelle du raccourcissement ou de l'absence de télomère. La technique de PCR quantitatif, par exemple MMqPCR, aTL qPCR, a été développée afin de contourner l'obstacle de l'utilisation de grandes quantités d'ADN. Cependant, l'un des principaux inconvénients de cette méthode est que l'on observe de grandes variations de mesures entre différents aliquotes. De plus, comme pour la méthode TRF, les valeurs mesurées correspondent à une moyenne. La méthode Q-FISH (L'hybridation in-situ de fluorescence, éventuellement combinée avec la cytométrie en flux, permet la visualisation des télomères par hybridation en utilisant une sonde de fluorescence sur des métaphases. [Lansdorp et al. Hum Mol Genet. 1996 May;5(5):685-91.]. L'avantage de cette technique est qu'elle permet d'estimer la taille 15 individuellement de chacun des 184 télomères humains et n'est pas limitée à une moyenne ou aux petits télomères. En revanche la méthode de quantification sur métaphases était très laborieuse à mettre en pratique et les longueurs sont exprimées en unité de fluorescence relative. En 2007, l'équipe de Maria Blasco [Canela et al. Proc Nat/ Acad Sci U S A. 20 2007 Mar 27;104(13):5300-5] a décrit une nouvelle technique basée sur le Q- FISH mais sur des noyaux interphasiques en utilisant l'objectif de grossissement 63X dans la quantification globale des télomères et une plaque de 96 puits pour les cultures des cellules et les hybridations. Cependant, cette technique ne permet pas la quantification des télomères de chaque chromosome ni la 25 détection des aberrations télomériques. D'ailleurs, la technique de l'équipe de Maria Blasco reste longue et laborieuse, car elle ne permet que l'analyse d'environ 1000 cellules en 2 heures. Concernant la détection des aberrations chromosomiques, le marquage 30 homogène des chromosomes demeure la technique conventionnelle la plus utilisée en cytogénétique clinique (classification des chromosomes) comme en toxicologie génétique ou en dosimétrie biologique. Mais cette technique consomme beaucoup de temps et nécessite du personnel hautement qualifié. En effet, cette technique se base sur un prélèvement du sang d'un tube héparine- 3 lithium d'au moins 5 ml. Cet acte nécessite le passage du patient à la salle de prélèvement ou dans un laboratoire d'analyse médicale. Les approches cytogénétiques, combinées avec l'hybridation in situ par des sondes ADN dirigées contre un chromosome entier ou un gène spécifique, demeurent les approches les plus sensibles et les plus fiables dans le diagnostic des patients mais aussi dans les études des effets clastogènes des produits chimiques. Cependant, cette technique est coûteuse à cause du prix des sondes ADN et le temps d'hybridation. Par ailleurs, les approches génomiques (Transcriptome, CGH-array, SNP, NGS) ont été proposées comme une alternative dans la détection des altérations du génome. Mais, ces techniques comme les autres approches génomiques, perdent leur sensibilité quand les altérations du génome touchent des séquences répétitives (les séquences télomériques et centromériques). Par conséquent, il y a toujours une nécessité de développer un procédé à haut débit pour détecter des aberrations du génome touchant à la fois les séquences uniques mais aussi les séquences répétitives en utilisant une quantité très réduite de cellules. La présente invention a pour objet de proposer un procédé à haut débit permettant de détecter à la fois les aberrations chromosomiques et les aberrations de télomères utilisant un échantillon biologique de 150p1 à 200p1, ledit procédé comprenant : - la préparation d'une lame cytogénétique à partir dudit échantillon dans une microplaque, l'indice mitotique dans ladite lame cytogénétique étant 3 fois plus élevé en moyenne que celui de la procédure conventionnelle consistant à cultiver les cellules dans des flasques avec 10 à 20 ml de milieu, - le marquage simultané des télomères et des centromères par des sondes d'acides nucléiques peptidiques avec un temps d'hybridation de 30 minutes à 1,5 heures. - la quantification par flux d'images de l'intensité de fluorescence de télomères sur des noyaux interphasiques en utilisant un objectif de grossissement 10x pour une quantification globale des télomères, et 4 - la capture automatique des chromosomes en métaphase pour détecter les aberrations chromosomiques et/ou les aberrations de télomères de chaque chromosome. 5 On entend par « aberration chromosomique », l'anomalie de nombre ou de structure d'un chromosome conduisant à une altération du caryotype. A titre d'exemple d'aberrations chromosomiques de structure, on peut citer le chromosome dicentrique, les anneaux centriques, les chromosomes acentriques, les translocations chromosomiques, l'isochromosome, les insertions et les 10 délétions. A titre d'exemple d'anomalie du nombre de chromosomes, on peut citer les chromosomes surnuméraires. On entend par « aberrations de télomères » les aberrations touchant la région contenant la séquence répétitive des télomères qui se situe dans les régions terminales de chromosomes. Comme exemple d'aberrations de 15 télomères, on peut citer la perte d'un télomère, la perte de deux télomères du même bras (délétion) et la formation de dédoublements des télomères. On entend par « indice mitotique » le taux des cellules en mitose, dans un échantillon cellulaire donné, par rapport au nombre total de cellules. L'indice mitotique reflète la vitesse de division cellulaire. 20 La présente invention est mise en oeuvre grâce à la mise au point des techniques suivantes : - la préparation d'une lame cytogénétique dans laquelle la proportion de cellules en métaphase est supérieure à celle d'une lame cytogénétique 25 conventionnelle; - la mise au point d'une méthode de marquage des télomères et des centromères qui réduit considérablement le temps de marquage par rapport à une technique conventionnelle nécessitant 4 à 6 heures de travail, - l'utilisation d'un objectif microscopique de grossissement 10x qui 30 permet de quantifier globalement les télomères dans 10 000 cellules interphasiques en moins de 2 minutes, - la capture automatique des métaphases permettant de réaliser des marquages successifs sur les mêmes métaphases mais aussi une automatisation dans le dénombrement des aberrations télomériques ou chromosomiques. 5 Le présent procédé présente plusieurs avantages techniques par rapport aux méthodes existantes. Premièrement, le procédé de l'invention est mis en oeuvre avec une quantité très réduite de cellules. Par exemple, il suffit d'utiliser seulement 150p1 5 à 200p1 du sang total, autrement dit une quantité du sang qui peut être obtenue en piquant l'index en utilisant le même principe que la mesure de la glycémie. Cette réduction du volume de l'échantillon facilite son prélèvement, économise considérablement le temps d'analyse et les réactifs consommés. Deuxièmement, contre toute attente, il est observé pour la première fois 10 par l'Inventeur que le rapport surface/volume d'un récipient de culture peut influencer l'indice mitotique et que le rapport surface/volume d'un puits de microplaque est particulièrement favorable pour augmenter cet indice et avoir des cultures très riches et facile à analyser. L'utilisation d'une microplaque pour la culture de l'échantillon permet non seulement de réduire la quantité 15 d'échantillon nécessaire et le temps de culture, mais permet également de préparer une lame cytogénétique avec un indice mitotique supérieur à celle d'une lame cytogénétique conventionnelle, ce qui permet, d'une part, une étude cytogénétique plus fiable et d'autre part, de réaliser un marquage simultané des télomères et des centromères sur des cellules en interphase et des cellules en 20 métaphase. Cette approche permet de donner rapidement à la fois des informations relatives à la quantification globale des télomères sur noyaux interphasiques mais aussi des informations sur chaque chromosome afin de détecter des aberrations chromosomiques et les aberrations de télomères en utilisant les 25 métaphases. Le procédé de la présente invention permet, d'une part, d'établir une relation entre la taille des télomères et la fréquence des aberrations chromosomiques sur une même lame, mais également de réaliser aussi le classement des chromosomes (caryotype) à partir des chromosomes en métaphase et de chercher une éventuelle mutation génétique. 30 Préparation d'une lame cvtooénétiaue On entend par « lame cytogénétique » une lame transparente, telle qu'une lame de verre, apte à être observée par microscopie, sur laquelle sont étalées les cellules à analyser et fixés en métaphase et en interphase. L'indice 35 mitotique, qui nous permet d'avoir une idée sur la richesse de la lame en 6 métaphase, a été calculé par la présente invention et par la méthode de cytogénétique conventionnelle sur les mêmes échantillons. Le rapport de l'indice mitotique est compris entre 1,5 et 4 entre une lame cytogénétique préparée par la présente invention et celle préparée par la technique de cytogénétique 5 conventionnelle. Dans un échantillon préparé selon une méthode conventionnelle, une culture en suspension de cellules est effectuée dans un récipient de volume de 10 à 20 ml. L'augmentation de l'indice mitotique est corrélée avec l'augmentation de 10 la proportion des cellules en métaphase. Etant donné que les chromosomes en métaphase sont plus condensés et plus visibles, l'augmentation qualitative et quantitative de la proportion des chromosomes en métaphase permet non seulement d'améliorer la détection des aberrations chromosomiques mais aussi d'automatiser le dénombrement des 15 aberrations chromosomiques. Dans le cadre de la présente invention, on entend par « échantillons biologiques » des préparations de liquides ou tissus biologiques d'un animal contenant des cellules à analyser. De préférence il s'agit d'échantillons sanguins, 20 de liquide amniotique dans le cas de diagnostic prénatal ou de moelle osseuse pour les hémopathies malignes. De préférence, l'animal est un mammifère, et plus favorablement un humain, quel que soit son sexe ou son âge. Il peut s'agir d'un embryon, d'un foetus, d'un nouveau-né, d'un enfant, d'un adolescent, ou d'un adulte. 25 Dans un mode de réalisation avantageux, ledit échantillon biologique est un échantillon du sang total, de la moelle, ou un échantillon de cellules tissulaires. Ledit échantillon du sang total peut être obtenu en utilisant le même principe que l'obtention de quelques gouttes de sang pour la mesure de la glycémie. 30 Ledit échantillon de cellules tissulaires peut être obtenu à partir d'un fragment de tissu de nature tumorale ou non tumorale qui peut être prélevé d'un patient par biopsie. Ledit échantillon de cellules tissulaires peut être une culture primaire ou une culture secondaire. 35 7 Selon un mode de réalisation du procédé de la présente invention, l'étape de préparation de la lame cytogénétique comprend : - la culture des cellules dans un puits de microplaque, le rapport entre la surface du puits et la quantité du milieu de culture étant de lml/cm2 à 1,5m1/cm2. 5 Plus particulièrement, ladite microplaque peut être une microplaque de 24 puits, dont le volume de travail de chaque puits est de 0,5 ml à 1,5 ml. La culture de cellules peut être effectuée avec un milieu de culture liquide 10 conventionnel pendant 72h. Ledit milieu de culture peut être le milieu RPMI1640. Après la culture, les cellules sont traitées par un inhibiteur du fuseau mitotique, par exemple la colchicine, pour arrêter les chromosomes en métaphase. Les cellules subissent ensuite un choc hypotonique qui entraine le gonflement des cellules par différence de pression osmotique. 15 Les constituants cellulaires sont ensuite fixés grâce à un fixateur, par exemple un mélange acide acétique/méthanol. La proportion volumique entre l'acide acétique et le méthanol dans un tel mélange peut être 1V/3V. Les susdits traitements de cellules peuvent être effectués directement dans un puits de microplaque. 20 Méthode de marquage Dans un mode de réalisation avantageux du procédé de la présente invention, le marquage simultané des télomères et des centromères par des sondes d'acides nucléiques peptidiques comprend : 25 - une seule étape de traitement d'une lame cytogénétique pendant 1 à 3 minutes, en particulier 2 minutes, par une solution de 3-5%, en particulier une solution de formaldéhyde à 4%. Contrairement à une méthode conventionnelle qui nécessite de mettre en oeuvre plusieurs fois la fixation par le formaldéhyde, le procédé de la présente 30 invention nécessite une seule étape de traitement par une solution de formaldéhyde. Ce traitement permet de fixer la structure tridimensionnelle des chromosomes. 35 8 Dans un mode de réalisation plus avantageux du procédé de la présente invention, le marquage simultané des télomères et des centromères par des sondes d'acides nucléiques peptidiques comprend en outre, après l'étape de traitement par le formaldéhyde, 5 - une seule étape de traitement de la lame cytogénétique par de la pepsine pendant 3-5 minutes, en particulier 4 minutes, par immersion d'une lame cytogénétique préalablement traitée par du formaldéhyde dans une solution de pepsine à une concentration de 0,1-0,2ug/ml. Le traitement par pepsine permet d'hydrolyser les protéines nucléaires et 10 de favoriser l'accès des sondes. Dans un mode de réalisation plus avantageux du procédé de la présente invention, le marquage simultané des télomères et des centromères comprend, en outre, après l'étape de traitement par la pepsine, les étapes suivantes : 15 la déshydratation de la lame cytogénétique successivement pendant 1 minute par une solution aqueuse d'éthanol à 50%, une solution aqueuse d'éthanol à 70% et de l'éthanol pur, la dénaturation de l'ADN chromosomique présent sur la susdite lame cytogénétique obtenue à la fin de l'étape précédente et la dénaturation 20 des sondes d'acides nucléiques peptidiques pour télomères et centromères, - l'hybridation pendant 10-30 minutes, en particulier 20 minutes, à température ambiante, entre l'ADN chromosomique dénaturé et les sondes d'acides nucléiques peptidiques dénaturés obtenus dans l'étape précédente, - les lavages successifs de ladite lame cytogénétique après hybridation. 25 Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux du procédé de la présente invention, le marquage simultané des télomères et des centromères par des sondes d'acides nucléiques peptidiques comprend ou consiste en les étapes suivantes : 30 - le traitement d'une lame cytogénétique pendant 1-3 minutes, en particulier 2 minutes, par une solution de 3-5%, en particulier une solution de formaldéhyde à 4%, - le traitement de la lame cytogénétique obtenue à la fin de l'étape précédente par de la pepsine pendant 3-5 minutes, en particulier 4 minutes, par 9 immersion de ladite lame cytogénétique dans une solution de pepsine à une concentration de 0,1-0.2ug/ml, - la déshydratation de la lame cytogénétique obtenue à la fin de l'étape précédente successivement pendant 1 minute par une solution aqueuse d'éthanol 5 à 50%, une solution aqueuse d'éthanol à 70% et de l'éthanol pur, - la dénaturation de l'ADN chromosomique présent sur la lame cytogénétique obtenue à la fin de l'étape précédente et la dénaturation des sondes d'acides nucléiques peptidiques pour télomères et centromères, - la hybridation pendant 10-30 minutes, en particulier 20 minutes, à 10 température ambiante, entre l'ADN chromosomique dénaturé et les sondes d'acides nucléiques peptidiques dénaturés obtenus dans l'étape précédente, - les lavages successifs de ladite lame cytogénétique obtenue à la fin de l'étape précédente. 15 Par rapport à la technique conventionnelle qui nécessite une journée de travail, le marquage simultané des télomères et des centromères avec le procédé de la présente invention peut être réalisé en 1h en gardant une intensité du signal comparable avec celle obtenue par la technique conventionnelle. On entend par « sonde d'acide nucléique peptidique » un oligomère 20 artificiel similaire à une molécule d'ADN ou d'ARN, dont le squelette est composé d'une répétition d'unités N-(2-aminoéthyl)-glycine reliées par une liaison peptidique, les bases purine et pyrimidine étant attachées au squelette par des liaisons méthylcarbonyles. Ladite sonde possède de 5 à 30 bases nucléiques. Les séquences des sondes d'acides nucléiques peptidiques sont 25 respectivement complémentaires de la séquence répétitive dans la région télomérique ou de la séquence répétitive dans la région centromérique. Par conséquent, les sondes d'acides nucléiques peptidiques s'hybrident avec les télomères ou les centromères sur ces régions. Les sondes d'acides nucléiques peptidiques sont marquées 30 respectivement par un fluorochrome, tel que les dérivés de cyanine 3, les dérivés de rhodamine ou les dérivés de fluorescéine. La densité de la fluorescence émise par les sondes d'acides nucléiques peptidiques s'hybridant sur les télomères permet par conséquent de quantifier la longueur des télomères. L'étape de marquage de la présente invention permet de marquer les 35 télomères et les centromères avec un signal très fort en un temps d'hybridation 10 de 30 minutes à 1,5 heures. Le marquage simultané des télomères et des centromères permet de définir rapidement un chromosome par son centromère et le territoire chromosomique par les télomères, ce qui va rendre le dénombrement des aberrations chromosomiques et le classement des 5 chromosomes plus fiables et plus robustes et indépendants de la personne qui analyse. Dans un mode de réalisation particulier du procédé de la présente invention, une première sonde d'acides nucléiques peptidiques marque les 10 télomères et une 2ème sonde d'acides nucléiques peptidiques marque les centromères, la première sonde et la 2ème sonde émettant respectivement une fluorescence distinctive. La séquence de la lève sonde d'acide nucléique peptidique est complémentaire de la séquence répétitive dans la région télomérique. 15 La séquence de la 2ème sonde d'acide nucléique peptidique est complémentaire de la séquence répétitive dans la région centromérique. Quantification de la taille des télomères par flux d'images Contrairement à la quantification du signal fluorescent en cytogénétique 20 qui a toujours été réalisée avec l'objectif microscopique de grossissement 63X, le présent procédé utilise un objectif de grossissement 10x pour la quantification globale des télomères par l'observation de l'intensité de fluorescence totale des noyaux interphasiques. L'observation est effectuée avec un objectif de grossissement 10x pour un grand champ d'observation et une profondeur de 25 champ au moins équivalente à l'épaisseur de l'échantillon. Cela permet d'analyser un grand nombre de cellules en gardant la précision et sensibilité et en évitant les problèmes de saturation dans la capture d'un signal fluorescent. La rapidité du système d'acquisition et d'analyse rend cette mesure particulièrement intéressante. Avec cette technique, 10 000 cellules pourront être analysées en 30 moins de 2 minutes. Elle offre en plus un histogramme de la fréquence de la longueur des télomères et des données sur la morphologie cellulaire (irrégularités, rondeurs, concavité...) en fonction de la taille des télomères ou de la quantité de 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) utilisé pour marquer les chromosomes. Des contrôles internes pourront être introduits à chaque 35 coloration. Il s'agit de deux lignées lymphoblastoïdes avec une caractérisation 11 cytogénétique et télomérique bien établie. La taille des télomères de ces deux lignées a été mesurée par plusieurs autres techniques de quantification des télomères (TRF, PCR and Flow FISH). Ces deux contrôles nous permettent de convertir l'intensité de la fluorescence en unité kilobase. A ce contrôle interne 5 s'ajoute un contrôle externe comportant des billes fluorescentes avec une intensité bien précise. Cette lame de calibration a pour objectif de vérifier l'intensité de fluorescence du système de capture, y compris l'intensité de fluorescence de la lampe. Un ajustement de l'intensité de fluorescence sera réalisé avant chaque capture en ajustant plusieurs paramètres tels que l'intensité de la lampe ou le gain de la caméra... Capture automatique des chromosomes en métaphase La recherche et la capture des métaphases sont effectuées automatiquement par microscopie à fluorescence à l'aide d'un logiciel avec un 15 temps d'intégration de capture bien déterminé. Les différentes parties des chromosomes sont marquées par différents fluorochromes. Les chromosomes peuvent être marqués par différents fluorochromes qui se lient chacun fortement à certaines bases nucléiques : par exemple, les centromères sont marqués par FITC porté par une sonde d'acide 20 nucléique peptidique ciblant les centromères, les télomères sont marqués par la cyanine 3 porté par une sonde d'acide nucléique peptidique ciblant les télomères et les squelettes du chromosome sont marqués par le DAPI (4',6-diamidino-2- phénylindole). Ce marquage du chromosome permet de déterminer une codification de 25 chaque chromosome comme de chaque aberration et la mise au point d'un logiciel. A l'aide de ce logiciel spécifique, le squelette du chromosome, la distance de chaque télomère par rapport à l'extrémité du squelette (distance D), et la distance entre chaque télomère et le centromère (distance d) sont calculés. Les 30 distances d and D sont utilisées pour identifier les paires des chromosomes. Les paramètres tels que, le ratio p/q, le nombre de télomères détectés, la somme de l'intensité de fluorescence, le moyen de l'intensité fluorescence, le médium de l'intensité fluorescence, sont calculés. Ces informations permettent de classer les chromosomes et d'indiquer les 35 aberrations chromosomiques ou les aberrations de télomères. 12 Le procédé de la présente invention peut aussi être combiné avec les autres techniques cytogénétiques, tels que la technique M-FISH (multiplex fluorescence in situ hybridization) et NGS (Next-Generation Sequencing)-exome qui permet d'étudier les régions codant les protéines du génome. A titre 5 d'exemple, l'association du procédé de la présente invention avec la technique de NGS-exome pourra cibler uniquement les régions codantes du génome impliquées dans les remaniements détectés après marquage des télomères et des centromères suivis d'une coloration M-FISH. Cette approche permet de réaliser un NGS ciblé. 10 Un autre objet de la présente invention concerne un kit de détection à haut débit pour la quantification des télomères et la détection des aberrations chromosomiques et/ou des aberrations de télomères, comprenant : 15 - une solution prête à l'emploi des sondes d'acides nucléiques peptidiques pour des télomères et des centromères, - des tampons de lavage nécessaires pour l'hybridation, - des lames étalons pour la quantification des télomères, - des lames étalons pour contrôler l'intensité de fluorescence du microscope. 20 Les lames étalons pour la quantification des télomères sont des lames de référence préparées à partir des lignées lymphoblastoïdes dérivées de sujets sains. La taille des télomères a été mesurée par la technique de référence TRF pour avoir la taille en kilobase. Ces lignées ne comportent aucune aberration 25 chromosomique. Les lames étalons pour contrôler l'intensité de fluorescence du microscope sont des lames avec des billes fluorescentes calibrées avec une intensité bien définie. 30 La présente invention est expliquée davantage par les figures et les exemples ci-après. Figures 13 Figure 1 : cette figure illustre un schéma du procédé à haut débit de quantification des télomères et de détection des aberrations chromosomiques et télomériques de la présente invention. Figure 2: cette figure montre la comparaison entre la qualité et la 5 quantité des métaphases obtenues par la technique de microplaque et la technique conventionnelle. Images des métaphases issues de la culture conventionnelles (cadre en haut) et images des métaphases issues des cultures en microplaque (cadre en bas). Cette comparaison a été faite dans les mêmes conditions avec le même échantillon cellulaire. lo Figure 3A : cette figure montre la comparaison de l'intensité de fluorescence des billes de 6 pm de calibration mesurée par un objectif microscopique 10x ou un objectif microscopique 63x avec des intensités différentes (100%, 33% et 10%). Figure 3B : cette figure montre la répartition de l'intensité de 15 fluorescence des cellules en quartile mesurée par un objectif microscopique 10x ou un objectif microscopique 63x. Figure 4 : cette figure montre la comparaison de la quantification des télomères sur des métaphases (C2-FISH) et sur des interphases (présente invention) en utilisant quatre lignées cellulaires. 20 Figure 5 : cette figure montre la comparaison entre la quantification des télomères mesurée par le procédé de l'invention et le résultat obtenu par TRF (A) et le résultat obtenu par PCR (B). Figure 6 : cette figure montre la corrélation entre la taille moyenne des télomères mesurée par la présente invention et l'âge sur une cohorte de 420 25 donneurs sains. La taille moyenne est exprimée en kb. Figure 7 : reproductibilité du procédé de l'invention avec deux mesures différentes du même échantillon comportant 420 donneurs. Figure 8 : cette figure montre la détection dans un prélèvement prénatal par le procédé de l'invention d'un chromosome marqueur surnuméraire 30 correspondant à un anneau centrique. Cette aberration ne peut pas être détectée par la technique RBG ou la technique M-FISH seule. Figure 9 : cette figure montre la détection d'une translocation chromosomique et l'identification de la nature de cette translocation par la technique conventionnelle (figure en haut) et par le procédé de l'invention (figure 35 en bas). 14 Figure 10 : cette figure montre que une analyse séquentielle après marquage des télomères et des centromères associé à la technique de M-FISH qui permet une classification des chromosomes très précise et aussi une détection des aberrations chromosomiques, tels que le chromosome dicentrique 5 avec une configuration très spécifique, une aberration chromosomique difficile à détecter par une technique conventionnelle. Exemples 10 1. Matériels et méthodes Lignées cellulaires Les lignées cellulaires testées dans les exemples sont des lignées lymphoblastiques dérivées de donneurs sains, des lignées tumorales du lymphome de Hodgkin, du lymphome de Burkitt et des lymphomes de manteau 15 ont été utilisées. Essai Q-FISH L'essai Q-FISH, qui permet la visualisation des télomères par hybridation en utilisant une sonde de fluorescence sur des métaphases, est mis en oeuvre 20 selon la méthode décrite dans [Lansdorp et al. Hum Mol Genet. 1996 May;5(5):685-91.] Essai TRF L'analyse TRF est mise en oeuvre selon la technique décrite dans [Kimura et al., 25 Nat Protoc. 2010 Sep;5(9):1596-607] Essai qPCR L'essai qPCR est mis en oeuvre selon la méthode décrite dans [OCallaghan Fenech, Clin Nutr. 2012 Feb;31(1):60-4]. 30 Marquage des télomères et des centromères Un protocole de marquage des télomères et des centromères est illustré ci-après. 15 1. lavage des lames cytogénétiques dans une première solution de tampon phosphate salin (PBS)1 pendant 1 minute à température ambiante, 2. fixation dans une solution de formaldéhyde à 4% pendant 2 minutes à température ambiante, 5 3. lavage 2 fois dans une solution de tampon phosphate salin (PBS) pendant 1 minute, 4. traitement par une solution de pepsine (0,1ug/m1) à 37°C pendant 4 minutes, 5. lavage 2 fois dans une solution de tampon phosphate salin pendant 10 1 minute, 6. déshydrations successives pendant 1 minute à 4°C par une solution aqueuse d'éthanol à 50%, une solution aqueuse d'éthanol à 70%, d'éthanol pur 7. séchage des lames, 8. dénaturation des sondes et d'ADN chromosomique à 80°C pendant 3 15 minutes, 9. hybridation pendant 20 minutes à température ambiante, 10. lavages des lames cytogénétique 11. coloration des chromosomes par le DAPI et application d'un colorant de contraste. 20 2. Résultats 2.1 Validation technique du procédé de l'invention 25 Validation de l'approche culture sur microplaque La culture cellulaire en microplaque a été validée par rapport à la technique conventionnelle (culture en flasque de 25cm2) sur une cohorte de 70 patients atteints de pathologies lymphoïdes. Du sang total de 50 patients et de la moelle de 20 patients ont été mis en culture avec les deux approches. Aucun 30 échec de culture n'a été observé avec la technique de microplaque et avec une qualité des métaphases permettant une analyse cytogénétique fiable et sensible. Par contre, à l'aide de la technique conventionnelle, plusieurs échecs de culture ont été observés (5 moelles sur 20 et 7 sang total sur 50) avec une qualité des métaphases moins intéressantes et qui ne permettra pas une analyse 35 automatique des aberrations chromosomiques (figure 2). 16 Capture de noyau interphasique par un objectif de grossissement 10x La méthode de capture de la fluorescence par un objectif de grossissement 10x est comparée avec une méthode qui utilise un objectif de grossissement 63x. Les intensités de fluorescence émise par les perles calibrées sont respectivement 5 mesurées par un objectif microscopique 10x et un objectif microscopique 63x. Les résultats obtenus sont comparables (figures 3A et 3B). Cependant, pour les faibles intensités fluorescentes, l'utilisation de l'objectif 10x permet de se rapprocher de la valeur exacte de fluorescence des billes. La méthode de capture de noyau interphasique par un objectif de lo grossissement 10x et la méthode classique (Q-FISH) de capture des métaphases utilisant un objectif de grossissement 63x sont aussi testées sur différentes lignes cellulaires humaines et sur les lymphocytes circulants des patients atteints de cancer. On observe une forte corrélation entre l'intensité de fluorescence obtenue à partir des métaphases par la méthode Q-FISH et l'intensité de 15 fluorescence obtenue à partir de noyaux interphasiques par le procédé de la présente invention (figure 4). Quantification de télomères Le résultat de quantification de télomères obtenu par le procédé de la zo présente invention est aussi comparé avec celui obtenu par la technique TRF (terminal restricted fragment) et celui obtenu par la technique PCR (figure 5). Cette comparaison montre une corrélation significative entre le procédé de la présente invention et les techniques conventionnelles en ce qui concerne la quantification de télomères et valide ainsi cette nouvelle approche par rapport à 25 la technique de référence (TRF) et aussi par rapport à la technique la plus utilisé actuellement (PCR). 2.2 Application du procédé de l'invention 3o Impact de l'âge sur la taille des télomères Les tailles des télomères dans les lymphocytes circulants obtenus de 420 donneurs sains âgés de 1 à 80 ans ont été analysées par le procédé de l'invention. Les donneurs sont classés en 5 groupes d'âge. L'intensité de fluorescence totale des télomères est quantifiée. Pour chaque échantillon, plus de 35 10 000 cellules sont analysées. Le résultat obtenu montre clairement une 17 diminution progressive de la longueur des télomères avec l'augmentation de l'âge (figure 6). Par ailleurs, le procédé de l'invention donne une bonne reproductibilité avec deux mesures de la taille des télomères de la même population à deux ans 5 d'intervalle (figure 7). Précision dans la détection des aberrations chromosomiques Exemple 1 Un chromosome marqueur surnuméraire correspondant à un anneau centrique, essentiellement constitué de séquences centromériques, peut être détecté par le procédé de l'invention. Le phénotype est une infertilité. Cette aberration chromosomique est indétectable par la technique conventionnelle comme la cytogénétique moléculaire ou la technique de M-FISH seule (figure 8). 15 Le marquage des télomères et des centromères a permis de voir des séquences centromériques et de définir la nature de l'aberration chromosomique. Exemple 2 En diagnostic prénatal, présence d'une translocation t(9;10)(q34;q26.3) 20 chez le père et le foetus, la technique conventionnelle (RBG) comme les techniques de cytogénétiques moléculaires (M-Banding et chromosome painting) détectent une translocation non-équilibrée. Le procédé de l'invention qui conduit au marquage des télomères et des centromères a permis d'observer que le chromosome 10 n'a échangé que la 25 partie télomérique avec le chromosome 9 (figure 9). La présence des séquences télomériques dans le chromosome 9 a permis de montrer qu'il s'agit par conséquent d'une translocation équilibrée. Par rapport aux techniques classiques, le procédé de l'invention permet non seulement de détecter l'aberration chromosomique, mais aussi avec plus de précision la nature de l'aberration. 30 Exemple 3 Le procédé de la présente invention permet aussi de détecter une configuration spécifique du chromosome dicentrique, une configuration, qui est très difficilement détectée par les techniques conventionnelles. Le procédé de 18 l'invention permet une classification des chromosomes plus précise et une détection des aberrations chromosomiques plus fiable (figure 10). 19 Références: Benetos A, Toupance S, Gautier S, Labat C, Kimura M, Rossi PM, Settembre N, Hubert J, Frimat L, Bertrand B, Boufi M, Flecher X, Sadoul N, Eschwege P, Kessler 5 M, Tzanetakou IP, Doulamis IP, Konstantopoulos P, Tzani A, Korou M, Gkogkos A, Perreas K, Menenakos E, Samanidis G, Vasiloglou-Gkanis M, Kark JD, Malikov S, Verhulst S, Aviv A. Short Leukocyte Telomere Length Precedes Clinical Expression of Atherosclerosis: The Blood-and-Muscle Model. Circ Res. 2018 Feb 10 16;122(4):616-623. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.117.311751. Epub 2017 Dec 14. Staerk L, Wang B, Lunetta KL, Helm RH, Ko D, Sherer JA, Ellinor PT, Lubitz SA, McManus DD, Vasan RS, Benjamin EJ, Trinquart L. Association Between Leukocyte 15 Telomere Length and the Risk of Incident Atrial Fibrillation: The Framingham Heart Study. J Am Heart Assoc. 2017 Nov 14;6(11). Allshire RC(1), Dempster M, Hastie ND Human telomeres contain at least three types of G-rich repeat distributed non -randomly. Nucleic Acids Res. 1989 Jun 20 26;17(12):4611-27. Canela A, Vera E, Klatt P, Blasco MA. High-throughput telomere length quantification by FISH and its application to human population studies. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Mar 27;104(13):5300-5. Epub 2007 Mar 16. 25 Harley CB(1), Futcher AB, Greider CW. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature. 1990 May 31;345(6274):458-60. Kimura M, Stone RC, Hunt SC, Skurnick J, Lu X, Cao X, Harley CB, Aviv A. 30 Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nat Protoc. 2010 Sep;5(9):1596-607. Cawthon RM. Telomere measurement by quantitative PCR. Nucleic Acids Res. 2002 35 May 15;30(10):e47. 20 Cawthon RM. Telomere length measurement by a novel monochrome multiplex quantitative PCR method. Nucleic Acids Res. 2009 Feb;37(3):e21. 5 O'Callaghan NJ(1), Toden S, Bird AR, Topping DL, Fenech M, Conlon MA. Colonocyte telomere shortening is greater with dietary red meat than white meat and is attenuated by resistant starch. Clin Nutr. 2012 Feb;31(1):60-4. REVENDICATIONS1. Procédé à haut débit pour détecter des aberrations chromosomiques et/ou des aberrations de télomères utilisant un échantillon biologique de 150p1 à 200p1, 5 comprenant : - la préparation d'une lame cytogénétique à partir dudit échantillon dans une microplaque, l'indice mitotique dans ladite lame cytogénétique étant 3 fois plus élevé en moyenne que la procédure conventionnelle consistant à cultiver les cellules dans des flasques avec 10 à 20 ml de milieu 10 - le marquage simultané des télomères et des centromères par des sondes d'acides nucléiques peptidiques avec un temps d'hybridation de 30 minutes à 1,5 heures, - la quantification par flux d'images de l'intensité de fluorescence de télomères sur des noyaux interphasiques en utilisant un objectif de 15 grossissement 10x pour une quantification globale des télomères, et - la capture automatique des chromosomes en métaphase pour détecter les aberrations chromosomiques et/ou les aberrations de télomères de chaque chromosome. 20 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit échantillon biologique est un échantillon de sang total, de la moelle, ou un échantillon de cellules tissulaires. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel l'étape de préparation de la 25 lame cytogénétique comprend : - la culture des cellules dans un puits de microplaque, dont le rapport entre la surface du puits et la quantité du milieu de culture est de 1m1/cm2 à 1,5m1/cm2. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le 30 marquage simultané des télomères et des centromères comprend : - une seule étape de traitement d'une lame cytogénétique pendant 1 à 3 minutes, en particulier 2 minutes par une solution de 2- 5%, en particulier une solution de formaldéhyde à 4% 22 5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel le marquage simultané des télomères et des centromères comprend en outre, après le traitement par le formaldéhyde, - une seule étape de traitement de la lame cytogénétique par de la pepsine pendant 3-5 minutes, en particulier 4 minutes, par immersion d'une lame cytogénétique préalablement traitée par du formaldéhyde dans une solution de pepsine à une concentration de 0,1-0.2ug/ml. 6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel le marquage simultané des 10 télomères et des centromères comprend, en outre, après l'étape de traitement par la pepsine, les étapes suivantes : la déshydratation de la lame cytogénétique successivement pendant 1 minute par une solution aqueuse d'éthanol à 50%, une solution aqueuse d'éthanol à 70% et de l'éthanol pur, 15 la dénaturation de l'ADN chromosomique présent sur la susdite lame cytogénétique obtenue à la fin de l'étape précédente et la dénaturation des sondes d'acides nucléiques peptidiques pour télomères et centromères, l'hybridation pendant 10-30 minutes, en particulier 20 minutes, à température ambiante, entre l'ADN chromosomique dénaturé et les sondes 20 d'acides nucléiques peptidiques dénaturés obtenus dans l'étape précédente, - les lavages successifs de ladite lame cytogénétique après hybridation. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'une première sonde d'acides nucléiques peptidiques marque les télomères 25 et une 2ème sonde d'acides nucléiques peptidiques marque simultanément les centromères, la première sonde et la 2ème sonde émettant respectivement une fluorescence distinctive. 8. Kit de détection à haut débit pour la quantification des télomères et la 30 détection des aberrations chromosomiques et/ou des aberrations de télomères, comprenant : - une solution prête à l'emploi des sondes d'acides nucléiques peptidiques pour des télomères et des centromères, - des tampons de lavage nécessaires pour l'hybridation, 35 - des lames étalons pour la quantification des télomères, 23 - des lames étalons pour contrôler l'intensité de fluorescence du microscope.