Brevet FR3081683A1 — publié le 20191206

La présente invention est du domaine des compléments alimentaires, et concerne plus particulièrement, mais non exclusivement, un complément alimentaire destiné à l'alimentation animale, et vise encore plus particulièrement un complément destiné à l'alimentation porcine, ou bovine, pour la prévention et le traitement des effets délétères liés aux mycotoxines par la mise en oeuvre d'au moins un extrait de plante dite « halophyte ». Les céréales et les produits issus de leur transformation représentent la ressource alimentaire humaine et animale la plus importante au monde. Ces matrices sont néanmoins susceptibles d'être contaminées par des microorganismes, parmi lesquels certaines espèces de champignons peuvent se révéler toxinogèngs, c'est-à-dire capables de produire des mycotoxines. La contamination en mycotoxines est une problématique mondiale. La FAO (Food and Agriculture Organisation) estime qu'environ un quart des récoltes de la planète est susceptible d'être contaminé par les mycotoxines, soit environ 1000 millions de tonnes/an. Cela implique des pertes économiques et un risque sanitaire potentiel. L'impact des mycotoxines sur l'industrie alimentaire et l'élevage est estimé à un coût annuel d'environ 5 milliards de dollars pour les Etats-Unis et le Canada par exemple. En Europe, la perte économique potentielle est évaluée entre 800 et 1000 millions d'euros par la contamination de céréales en ochratoxine A. Une grande partie des volumes de blé collectés en France contiennent des teneurs en mycotoxines appartenant à la catégorie des fusariotoxines, c'est-à-dire produites par le des champignons du genre Fusarium, supérieures aux limites réglementaires. La contamination des produits peut se faire à différentes étapes de la production du blé. Elle peut se produire au champ et/ou se poursuit au cours des processus de récolte, de séchage ou lors du stockage. Sous des climats où les chaleurs excessives ne durent que très peu de temps, et avec une humidité relative élevée, le genre Fusarium est le champignon mycotoxinogène le plus abondant au champ en Europe. La filière de production animale, notamment porcine, est particulièrement sensible au risque représenté par les fusariotoxines. La consommation par les animaux de produits contaminés peut avoir des conséquences lourdes, à la fois sur le plan sanitaire et économique, se traduisant par une diminution des performances anatomiques, physiologiques, en terme d'hygiène des élevages et qui entraînent une perte de rentabilité. Parmi les mycotoxines produites par Fusarium, le déoxynivalénol (DON) et la zéaralénone (ZEA) sont importants parce qu'ils se développent au champ avant la récolte, mais aussi après la récolte lors du stockage. Ainsi leur présence ne peut pas être complètement évitée. 2 Les grains de blé, de triticale et de maïs sont spécialement vulnérables à l'infection par Fusarium et sont fréquemment contaminés par DON et ZEA, souvent en proportions plus élevées que les autres céréales. Les animaux monogastriques d'élevage, volailles et porcs en tête, sont très exposés à ce type de mycotoxines du fait de l'importance de la part des céréales dans leur alimentation. De plus, 5 l'absence d'organe de mastication contenant des microorganismes capables de détoxifier les toxines avant leur absorption intestinale, est un facteur aggravant, comme cela est souligné dans le rapport de AFSSA (agence française de sécurité sanitaire) sur les Mycotoxines de 2009. Une altération des performances chez le poulet en croissance est connue lors d'exposition à de faibles doses de fusariotoxines. Chez le porc, espèce considérée comme la plus sensible, une diminution de la 10 croissance pondérale, des vomissements, des diarrhées, des symptômes neurologiques, des lésions dermatologiques et une réduction de la réponse vaccinale ont été directement corrélée à la présence de DON dans leur alimentation. Différentes méthodes de prévention au champ sont connues pour réduire le risque de 15 mycotoxines dans les céréales. Ces méthodes consistent à limiter le développement et la prolifération des fusariotoxines par rotation des cultures, enfouissement des résidus de culture, labour, diminution de la densité du semis. Bien que ces stratégies préventives soient souvent appliquées, il demeure difficile d'éviter complètement la contamination dans les champs, car le climat reste le facteur déterminant de cette contamination. Il faut donc avoir recours à des méthodes de détoxification. De 20 nombreuses méthodes physiques et chimiques ont été développées pour la destruction des mycotoxines, telles les aflatoxines, dans les aliments. Néanmoins, seuls quelques-unes, comme la destruction par un traitement à l'ammoniaque ou encore l'irradiation aux rayons gamma, ont été acceptées pour une utilisation pratique. En outre, la plupart de ces traitements sont inefficaces sur les fusariotoxines, et inabordables pour les éleveurs. 25 Des produits dits antimycotoxin igues, comme des additifs probiotiques, ont été développés et montrent une efficacité contre les mycotoxines selon l'article de Biernasiak J. et al., 2006, Detoxification of mycotoxins by probiotic preparation for broiler chickens. Mycotoxin Res 22(4)230-5.. Toutefois, ces différents additifs ont souvent montré une capacité limitée à lutter 30 contre les effets néfastes des mycotoxines, notamment de DON. La demande W0201386548 décrit l'emploi de composés intégrant du sélénium, voire des sels de séléniums, dans une alimentation céréalière pour lutter contre la mycotoxine ZEA, ou d'autres tel 3 que la mycotoxine DON ou la toxine 12. Cependant seuls des tests expérimentaux tendent à montrer une efficacité probable à l'égard de DON, avec une adjonction de sulfite dans le complément. Les plantes halophytes sont des plantes littorales connues pour leur grande diversité 5 biologique et chimique, et leurs activités biologiques importantes. L'invention vise en particulier à identifier et/ou produire des extraits d'halophytes en vue de valoriser ces extraits en alimentation animale. Pour remédier en tout ou partie aux inconvénients de l'art antérieur, la présente invention 10 concerne un complément alimentaire destiné à protéger les cellules animales vis-à-vis de l'effet toxinogène (en particulier oxydant) des mycotoxines comportant au moins un extrait sélectionné parmi des extraits de plantes halophytes. Les inventeurs ont montré de manière tout à fait inattendue le pouvoir protecteur des 15 ingrédients des extraits contre une alimentation contaminée en mycotoxines, et en particulier les mycotoxines DON, ZEN et la toxine 12. Les inventeurs ont démontré que les extraits disposent d'un pouvoir cytoprotecteur intéressant. Le traitement de cellules rénales bovines (M DB K) et intestinales porcines (IPEC-J2) avec les extraits a 20 permis de réduire significativement la toxicité des fusariotoxines (toxine 12 et zéaralénone (ZEA)), en restaurant la viabilité cellulaire. Ces résultats présentés dans la suite de la présente description mettent en évidence le rôle antimycotoxin igue des halophytes. Les inventeurs ont réalisé l'évaluation de l'activité antioxydante des extraits selon le test de 25 piégeage du radical DPPH qui a permis de démontrer leur grande activité antiradicalaire et une forte oepacité antioxydante selon le test dit « CAT » (CAT étant l'acronyme pour : « capacité antioxydante totale »). En outre, le fractionnement bioguidé des extraits suggère l'implication de molécules hautement antioxydantes dans l'activité protectrice, au vu de la présence majoritaire de composés tels que des composés phénoliques dans les fractions actives qui sont décrites ci-après dans la présente 30 description. L'extrait de plante halophyte est avantageusement un extrait d'un organe aérien de la plante. Un organe aérien correspond aux parties de la plante autres que les racines, par exemple les feuilles, les 4 fleurs ou les tiges. Les plantes ont été rincées à l'eau distillée, congelées, lyophilisées, broyées et conservées sous forme de poudre en vue de l'étape d'extraction. Les différentes plantes halophytes testées proviennent de différentes zones de la région 5 bretonne. Les extraits de plantes ont tous montrées une activité, ces extraits font parti du genre Con volvulus, Galium, Frankenia, Matthiola, Frankenia, Dianthus, Limonium, Eryngium, Helichrysum, Ononis, Plantago, Spergula, Spergula et Suaeda, définit selon la classification phylogénétique APG III. Les extraits de plantes sont de préférence sélectionnés parmi Convolvulus soldanella (Cs), Galium arenarium (Ga), Galium verum (Gv), Frankenia laevis (FI), Matthiola 10 sinuata (Ms), Dianthus arenarius (Da), Limonium vulgare (Lv), Eryngium campestre (Ec), Helichrysum stoechas (Hs), Ononis repens (Or), Plantago lanceolata (PI), Spergula marina (Sm) et Suaeda vera (Sv). L'extrait de plante halophyte est avantageusement choisi parmi au moins un extrait de Con volvulus soldanella (Cs) et un extrait de Galium arenarium (Ga). Les deux espèces Cs et Ga précitées sont celles qui ont montrées les meilleures activités anti mycotoxi n igues. 15 Sur le modèle de la lignée cellulaire MDBK, l'ensemble des extraits se révèle actif contre la toxine 12 et la ZEA. En revanche, aucun extrait ne présente d'activité notable à l'égard du DON. L'extrait de Ga à la dose testée (voir la partie expérimentale à la suite) procure le pourcentage de viabilité le plus élevé en condition d'exposition à la toxine 12, suivi de l'extrait de Cs. En cas 20 d'exposition à la ZEA, c'est encore l'extrait de Ga qui se distingue avec un pourcentage de viabilité de, suivi d'Ec, Lv et Or. En présence de DON, les extraits de Ga et de Hs assurent les pourcentages de viabilité les plus élevés, même s'ils ne sont significativement pas différents du témoin « toxicité DON ». Le pourcentage de viabilité obtenu est un pourcentage qui exprime la capacité des extraits à protéger les cellules contre les mycotoxines. Un pourcentage de viabilité important correspond à un 25 extrait actif. Le témoin toxicité exprime la toxicité de la mycotoxine testée seule sur les cellules sans aucun agent protecteur. Des extraits ont fait l'objet d'une étude du pouvoir antimycotoxinique des cellules IPEC-J2. Il s'agit d'extrait de Cs, Ec, Ga, Hs et Or. Une première approche des résultats montre que tous les 30 extraits possèdent un pouvoir antimycotoxin igue notable contre la toxine 12. L'activité la plus élevée est observée chez l'extrait d' Ec, qui donne un pourcentage de viabilité de 97,6%, contre 52,1% pour le témoin toxicité de la toxine 12. 5 L'extrait de plante halophyte comprend avantageusement au moins une molécule sélectionnée parmi un iridoïde, un flavonoïde de préférence un flavonol, et un polyphénol. L'iridoïde est avantageusement de l'aspéruloside. Le flavonoïde est avantageusement de la quercétine, ou un de ses dérivés, ou de la myricétine, ou un de ses dérivés. Le polyphénol est avantageusement de l'acide 5 chlorogénique ou un de ses dérivés. Le dérivé de la quercétine susvisé est choisi avantageusement parmi la quercétine-3-0-rutinoside, la quercétine-3-0-glucoside et la quercétine-3-0-glucos-6"- acetate. Dans le cadre de l'invention les noms des molécules citées précédemment correspondent aux 10 formules des composés présentés ci-dessous : - L'acide ch lorogén igue : av 15 - L'aspéruloside : 20 - la quercétine : - la myricétine : OH 6 5 HO OH OH - la quercétine-3-0-rutinoside : HO HO 10 15 15 7 - la quercétine-3-0-g lucose-6"-acetate : OH - un iridoïde au sens de la présente invention se définit selon l'acception la plus courante : il 10 s'agit d'une molécule comportant un squelette iridane : - quercétine-3-0-glucoside : OH OH HO OH 0 OH 0 HO OH OH 5 3 15 8 PARTIE EXPERIMENTALE : L Préparation des extraits d'halophytes 5 Les plantes sont séchées puis réduites en poudre. Les poudres de chaque plante sont soumises à une extraction avec une solution éthanol/eau 50:50 (v/v), à raison de 100 ml de solvant pour 1 g de biomasse sèche. Le mélange est laissé pendant 20 mn sous agitation magnétique, à la température ambiante. L'extraction est répétée trois fois pour 10 chaque plante. Après chaque extraction, le mélange est centrifugé à 4000 rpm et à 4°C (Centrifugeuse JouanTM OR 4-22), le surnageant est prélevé puis filtré sur du papier filtre Whatman®. Les trois filtrats recueillis pour une même plante sont rassemblés puis évaporés grâce à un évaporateur rotatif pour obtenir des extraits secs. 15 IL Protocoles mis en oeuvre pour l'évaluation de l'activité antioxidante des extraits 1.1. Test CAT (Capacité antioxydante totale) 20 La capacité antioxydante totale des extraits a été évaluée selon la méthode de Prieto et al., 1999, Anal Biochem. May 1 ;269(4:337-41. Cette technique est basée sur la réduction du molybdène Mo (VI) en molybdène Mo (V) en présence d'agents antioxydants pour former un complexe vert de phosphate/Mo(V) à pH acide. Un volume de 0,1 ml de chaque extrait a été mélangé à 1 ml du réactif 25 (0,6 M d'acide sulfurique, 28 mM de phosphate de sodium et 4 mM de molybdate d'ammonium). Le mélange est incubé à 95°C pendant 90 min. Après retoidissement, l'absorbance du mélange est mesurée à 695 nm contre le blanc qui contient de l'éthanol à la place de l'extrait (Beckman Coulter DTX 880). La capacité antioxydante totale est exprimée en mg d'équivalent acide ascorbique par gramme de matière sèche d'extrait (mg EAA/g MS). 30 1.2. Test DPPH En présence d'un antioxydant, le radical DPPH de couleur violette est réduit en un composé jaune, dont l'intensité de la couleur est inversement proportionnelle à la capacité de l'antioxydant à 9 donner des protons Sanchez-Moreno, 2002, Food Science and Technology International 8(3):121-137. La mesure de l'activité de piégeage du radical DPPH par les extraits a été effectuée selon la méthode de Brand-Williams et al., 1995, Food Science and Technology, vol. 28, Issue 1 :25-30. Cette méthode a été miniaturisée afin d'être appliquée en microplaques. 5 Brièvement, un total de 100 pl d'extrait dilué est ajouté à 100 pl DPPH (100 pM) préalablement préparé dans le méthanol 90%, le mélange est ensuite incubé à température ambiante et à l'abri de la lumière pendant 30 minutes. L'absorbance est lue à 517 nm contre un « blanc » qui ne contient que le solvant d'extraction ou de fractionnement (Beckman Coulter DIX 880). Les conditions expérimentales ont été réalisées en triplicata avec différentes concentrations. Le pourcentage 10 d'inhibition du radical DPPH est calculé selon l'équation suivante : Pourcentage d'inhibition du DPPH ((Y()) = (1 - (DO essai / DO blanc)) x 100. (Où DO essai correspond à l'absorbance de la solution avec l'extrait et DO blanc correspond à l'absorbance de solution avec le solvant). L'activité antiradicalaire d'un extrait est exprimée en IC50 pg/ml (Concentration de l'extrait requise pour inhibition de 50% du radical DPPH). Les valeurs d'IC50 les plus basses correspondent à une plus forte activité 15 antiradicalaire. 1.3 Exploitation des données 20 Les données ont été analysées à l'aide du logiciel de traitement statistique R. Après avoir vérifié la normalité de distribution de la variable (test de Shapiro-Wilk) et l'homoscédasticité des variances (test de Bartlett), une analyse de la variance (« ANOVA » en anglais) à un facteur a été réalisée. Une différence significative entre les traitements (P