Brevet FR3082943A1 — publié le 20191227

Procédé de comptage de particules de petite taille dans un échantillon Description DOMAINE TECHNIQUE Le domaine technique de l'invention est l'observation d'un échantillon, notamment un échantillon comportant des particules de petite taille, par imagerie sans lentille, ou par imagerie dite défocalisée. ART ANTERIEUR L'imagerie sans lentille s'est développée ces dernières années, et ses applications pour la caractérisation d'échantillons se multiplient, par exemple dans le domaine du diagnostic médical, de la culture cellulaire, de l'analyse biologique ou dans le domaine de l'agroalimentaire. Cette technique permet en effet d'obtenir, à bas coût, une image d'un échantillon selon un champ d'observation élevé. L'application d'algorithmes de reconstruction holographiques à des images obtenues selon une configuration sans lentille permet d'obtenir des images exploitables d'échantillons, ce qui constitue une alternative à bas coût à la microscopie conventionnelle, tout en bénéficiant d'un champ d'observation étendu. Différents documents décrivent l'utilisation de l'imagerie sans lentille pour l'observation d'échantillons comportant des particules. Les documents W02016151248 ou W02017178723 décrivent le recours à l'imagerie sans lentille pour caractériser des cellules dans un échantillon. La technique décrite dans ces documents est basée sur l'acquisition d'une image à l'aide d'un capteur d'image placé face à un échantillon. L'application d'un algorithme de reconstruction holographique permet de former des profils représentatifs de l'onde lumineuse à laquelle est exposé le capteur d'image. A partir des profils, on caractérise les cellules placées dans l'échantillon. Le recours à des profils permet d'être peu sensible à la position d'une cellule à caractériser dans l'échantillon, et en particulier à la distance entre la cellule et le capteur. Une difficulté associée à l'application d'algorithmes de reconstruction holographique est qu'il est nécessaire de connaître la distance entre le capteur d'image et l'échantillon. Cependant, lorsque l'échantillon comporte des particules, la position de ces dernières, par rapport au capteur d'image, peut varier, dans l'épaisseur de l'échantillon. Ainsi, les images obtenues par reconstruction holographique peuvent être nettes pour certaines particules, pour lesquelles la distance, par rapport au capteur d'image, correspond à la distance de reconstruction prise en compte. En revanche, les images obtenues par reconstruction holographiques sont floues pour 2 les particules dont la distance, par rapport au capteur d'image, est différente de la distance de reconstruction prise en compte. Cette propriété est exploitée dans les algorithmes de focalisation numérique, ces derniers étant destinés à estimer une distance entre une particule et un capteur d'image. Plus précisément, de tels algorithmes exploitent le fait qu'une particule 5 est nette lorsque la distance qui la sépare du capteur correspond à la distance de reconstruction considérée. L'usage de ces algorithmes permet de remonter à la distance entre des particules et un capteur, ouvrant ainsi la voie à une détermination de la position 3D de particules, ainsi qu'au dénombrement de ces dernières. Un tel algorithme est par exemple décrit dans la publication Kemper B "Application of a 3D tracking, LED illumination and multi-wavelength techniques for 10 quantitative cell analysis in digital holographic microscopy", Proc. SPIE 7184, Three-Dimensional and Multidimensional Microscopy: Image Acquisition and Processing XVI, 71840K (4 March 2009). Un autre algorithme de suivi de particules, en l'occurrence des spermatozoïdes, est décrit dans W02014012031. Dans ces publications, un algorithme de suivi de position, ou "tracking" est appliqué à chaque particule. Cependant, lorsque le nombre de particules est important, il 15 est fastidieux d'effectuer un suivi de position pour toutes les particules, prises individuellement. Ainsi, lorsque la taille des particules diminue, et que leur nombre augmente, la mise en oeuvre d'algorithmes de focalisation numérique peut s'avérer délicate pour effectuer un dénombrement précis des particules présentes dans le champ observé Les inventeurs ont mis au point un procédé permettant d'effectuer un dénombrement plus précis de particules dans 20 un échantillon. EXPOSE DE L'INVENTION Un premier objet de l'invention est un procédé de comptage de particules dans un échantillon, l'échantillon comportant un milieu dans lequel baignent les particules, le milieu étant maintenu par un élément de maintien, le milieu étant de préférence immobile par rapport à l'élément de 25 maintien, le procédé comportant les étapes suivantes : a) illumination de l'échantillon par une source de lumière, l'échantillon étant disposé entre la source de lumière et un capteur d'image ; b) acquisition, à l'aide du capteur d'image, d'une image de l'échantillon, l'échantillon étant disposé entre la source de lumière et le capteur d'image, chaque image étant 30 représentative d'une onde lumineuse d'exposition, à laquelle est exposé le capteur d'image sous l'effet de l'illumination de l'échantillon ; c) à partir de l'image acquise lors de l'étape b), application d'un opérateur de propagation numérique pour obtenir une expression complexe de l'onde lumineuse d'exposition 3 dans différents plans de reconstruction, chaque plan de reconstruction étant associé à une distance de reconstruction, par rapport au capteur d'image; d) formation d'une pile d'images reconstruites, chaque image reconstruite étant obtenue à partir du module et/ou de l'argument d'une expression complexe dans un plan de 5 reconstruction, chaque image reconstruite étant associée à une distance de reconstruction différente l'une de l'autre ; e) segmentation de chaque image reconstruite, de façon à isoler, sur chaque image reconstruite, des régions d'intérêt, espacées les unes des autres, chaque région d'intérêt isolée correspondant à une particule ou à un amas de particules ; 10 f) à partir des régions d'intérêt isolées dans l'étape e), estimation d'une quantité de particules dans l'échantillon. Ainsi, le procédé effectue une combinaison de techniques de reconstruction holographique et de segmentation d'images, ce qui convient particulièrement à des échantillons comportant un nombre important de particules. Cela permet en particulier d'éviter d'effectuer une 15 détermination de la position de chaque particule, prise individuellement. L'élément de maintien a pour fonction de maintenir ou de confiner le milieu dans lequel baignent les particules. L'échantillon peut être disposé sur un support, pour maintenir l'échantillon entre le capteur d'image et la source de lumière. 20 Dans l'étape c), les distances de reconstruction peuvent être obtenues en déterminant une distance de focalisation, correspondant à une distance, par rapport au capteur d'image, à laquelle un nombre maximal de particules sont situées, chaque distance de reconstruction étant établie en appliquant un décalage par rapport à la distance de focalisation. La différence entre deux distances de reconstructions successives correspond à un pas de 25 reconstruction, le pas de reconstruction étant de préférence inférieur à 20 Les particules sont de préférence inscrites dans un cercle ou dans une sphère dont le diamètre est inférieur à 20 pm ou à 10 pm ou à 5 p.m. Les particules peuvent notamment être des thrombocytes, c'est-à-dire des plaquettes de sang. Lors de l'étape e), la segmentation de chaque image reconstruite peut être réalisée en 30 appliquant un seuillage, selon un seuil d'intensité, sur chaque image reconstruite. Chaque image reconstruite comportant des pixels, la valeur du seuil d'intensité peut être variable d'un pixel à un autre. La valeur du seuil d'intensité à un pixel peut être établie en : - définissant un voisinage autour de chaque pixel ; 4 - calculant une intensité moyenne de pixels appartenant au voisinage ; la valeur du seuil, à chaque pixel, dépendant de l'intensité moyenne ainsi calculée. Le procédé peut comporter une étape d'analyse des régions d'intérêt résultant de l'étape e), de façon à : 5 - déterminer un nombre de particules associées à chaque région d'intérêt ; - ou diviser des régions d'intérêt englobant plusieurs particules en différentes régions d'intérêt ne comportant qu'une seule particule. Selon un mode de réalisation, lors de l'étape f), une région d'intérêt dont l'étendue se limite à un pixel n'est prise en compte que si elle apparaît dans deux images reconstruites adjacentes. 10 La source de lumière peut être une source laser. De préférence, l'onde lumineuse émise par la source de lumière présente une largeur de bande spectrale inférieure à 10 nm. De préférence, l'onde lumineuse émise par la source de lumière présente une bande spectrale centrée sur une longueur d'onde inférieure à 500 nm, et préférentiellement comprise entre 400 nm et 500 nm. Un deuxième objet de l'invention est un dispositif pour le comptage de particules d'un 15 échantillon, comportant : une source de lumière apte à émettre une onde lumineuse incidente se propageant vers l'échantillon; un capteur d'image ; un support, configuré pour maintenir l'échantillon entre la source de lumière et le 20 capteur d'image ; et un processeur, configuré pour recevoir une image de l'échantillon acquise par le capteur d'image et à mettre en oeuvre les étapes c) à f) d'un procédé selon le premier objet de l'invention. Selon un mode de réalisation, aucune optique de formation d'image n'est disposée entre 25 l'échantillon et le capteur d'image. Selon un mode de réalisation, le dispositif comporte un système optique définissant une configuration de mise au point, selon laquelle le capteur d'image est conjugué d'un plan passant par l'échantillon, le dispositif étant tel que le capteur d'image ou l'échantillon sont décalés par rapport à la configuration de mise au point, de telle sorte que lors de l'étape b), le capteur 30 d'image acquiert une image défocalisée de l'échantillon. 5 D'autres avantages et caractéristiques ressortiront plus clairement de la description qui va suivre de modes particuliers de réalisation de l'invention, donnés à titre d'exemples non limitatifs, et représentés sur les figures listées ci-dessous. FIGURES 5 Les figures 1A et 1B représentent des exemples de dispositifs permettant une mise en oeuvre de l'invention. Les figures 2A et 2B sont des images reconstruites, dites images de module, ou image d'amplitude, d'un échantillon comportant des plaquettes. La figure 3 schématise les principales étapes d'un procédé selon l'invention. 10 Les figures 4A, 4B et 4C montrent l'influence d'un ajustement d'un paramètre de segmentation d'image sur l'identification de régions d'intérêt, ces dernières étant associées à des particules. Les figures SA et SB, ainsi que 5C et 5D, illustrent l'application d'un filtrage de type ligne de partage des eaux sur des régions d'intérêt. Les figures SA et SC sont des figures avant le filtrage. Les figures 5B et 5D sont des figures obtenues respectivement après application d'un filtrage 15 des figures 5A et 5C. La figure 6 représente le nombre de particules comptées en mettant en oeuvre l'invention (axe des ordonnées) en fonction du nombre de particules comptées selon une méthode de référence (axe des abscisses). Sur la figure 6, on a comparé les résultats de mesures respectivement sans prise en compte des régions d'intérêt monopixel, ne comportant qu'un seul pixel, et avec prise 20 en compte de certaines régions d'intérêt monopixel. Les figures 7A, 75 et 7C représentent le nombre de particules comptées en mettant en oeuvre l'invention (axe des ordonnées) en fonction du nombre de particules comptées selon une méthode de référence (axe des abscisses). Sur la figure 7A, on a une diode laser émettant dans le violet/bleu, ainsi qu'une diode électroluminescente émettant dans le bleu. Sur la figure 7B, 25 on a utilisé différentes diodes laser émettant soit dans le violet/bleu, soit dans le rouge. Sur la figure 7C, on a utilisé une diode laser émettant dans le violet/bleu, ainsi qu'une diode électroluminescente émettant dans le rouge. La figure 8 est un autre exemple de dispositif convenant à une mise en oeuvre de l'invention. EXPOSE DE MODES DE REALISATION PARTICULIERS 30 La figure lA représente un exemple de dispositif selon l'invention. Une source de lumière 11 est configurée pour émettre une onde lumineuse 12, dite onde lumineuse incidente, se propageant en direction d'un échantillon 10, selon un axe de propagation Z. L'onde lumineuse 12 est émise selon une bande spectrale d'illumination Ak. 6 L'échantillon 10 est un échantillon que l'on souhaite caractériser. L'échantillon comporte un milieu 10m, par exemple un milieu liquide, dans lequel baignent des particules 10p. Les particules 10p peuvent être des cellules, ou des fragments cellulaires, ou des microorganismes, ou des microalgues, ou leurs fragments. Le terme particules peut également désigner particules solides, 5 en particulier des microbilles, par exemple des microbilles métalliques, des microbilles de verre ou des microbilles organiques, couramment mises en oeuvre dans des protocoles biologiques. Il peut également s'agir de gouttelettes insolubles baignant dans un milieu liquide, par exemple des gouttelettes lipidiques dans une émulsion de type huile dans eau. Ainsi, le terme particule désigne à la fois des particules endogènes, initialement présentes dans l'échantillon examiné, et 10 des particules exogènes, ajoutées à cet échantillon avant l'analyse. L'invention s'adresse notamment à des particules de petite taille. Par particule de petite taille, on entend une particule inscrite dans un cercle ou dans une sphère dont le diamètre est inférieur à 20 pm, et de préférence inférieur à 10 p.m ou 5 pm. Une application visée est le comptage de plaquettes sanguines (thrombocytes). De façon plus générale, les particules sont de petite taille 15 relativement à l'épaisseur de l'échantillon, en étant par exemple de taille au moins 5 fois ou 10 fois plus faibles que l'épaisseur de l'échantillon. Le milieu 10m peut être un milieu solide ou un milieu formant un gel. Le milieu 10m peut comporter un liquide corporel, par exemple, et de façon non limitative, du plasma sanguin, de l'urine, de la lymphe ou du liquide céphalo-rachidien. Le milieu 10,' est de préférence transparent ou translucide. L'invention est particulièrement 20 adaptée à des particules de petite taille. L'échantillon 10 est maintenu par un élément de maintien 15. L'élément de maintien 15 a pour fonction de maintenir le milieu 10,,, dans lequel les particules 10p sont disposées. L'élément de maintien 15 est de préférence transparent ou translucide, en particulier entre la source de lumière et le capteur. L'élément de maintien 15 peut être une lame transparente, par exemple 25 une lame de verre, ou encore une plaque à puits, ou une enceinte. Dans cet exemple l'élément de maintien 15 est une chambre fluidique. L'épaisseur e de l'échantillon 10, selon l'axe de propagation Z, varie typiquement entre 10 pm et 1 cm, et est de préférence comprise entre 20 pim et 1 mm. L'échantillon 10 est maintenu sur un support 10s à une distance ci d'un capteur d'image 20. Le milieu 10,' dans lequel baignent les particules 10p est de préférence immobile par 30 rapport à l'élément de maintien 15 ou par rapport au capteur d'image 20. Les particules 10p peuvent être immobiles par rapport à l'élément de maintien 15 ou par rapport au capteur d'image 20. 7 La distance D entre la source de lumière 11 et la chambre fluidique 15 est de préférence supérieure à 1 cm. Elle est de préférence comprise entrez et 30 cm. Avantageusement, la source de lumière 11, vue par l'échantillon, est considérée comme ponctuelle. Cela signifie que son diamètre (ou sa diagonale) est préférentiellement inférieur au dixième, mieux au centième de 5 la distance entre la chambre fluidique 15 et la source de lumière 11. La source de lumière est de préférence une source ponctuelle, par exemple une source de lumière laser ou une diode électroluminescente. Comme décrit par la suite, de meilleurs résultats sont obtenus lorsque la source de lumière est une source laser, du fait d'une bande spectrale d'émission plus étroite. 10 Lorsque la source de lumière 11 est une diode électroluminescente, elle est de préférence associée à un diaphragme 18, formant un filtre spatial, comme représenté sur la figure 18. L'ouverture du diaphragme est typiquement comprise entre 5 pin et 1 mm, de préférence entre 50 pm et 500 pm, par exemple 150 p.m. Le diaphragme peut être remplacé par une fibre optique, dont une première extrémité est placée face à la source de lumière 11 et dont une deuxième 15 extrémité est placée en regard de l'échantillon 10. Un diffuseur 17 peut être disposé entre la diode électroluminescente et le diaphragme, comme décrit dans le document US2017317125. De préférence, la bande spectrale d'émission AX de l'onde lumineuse incidente 12 a une largeur de bande inférieure à 100 nm, et de préférence inférieure à 20 nm, voire à 10 nm. Par largeur de bande spectrale, on entend une largeur à mi-hauteur de ladite bande spectrale. Comme 20 décrit par la suite, plus la bande spectrale est étroite, meilleure est la précision du comptage des particules. L'échantillon 10 est disposé entre la source de lumière 11 et un capteur d'image 20. Le capteur d'image 20 est apte à former une image /0 de l'échantillon 10 selon un plan de détection Pu. L'image acquise est également désigné par le terme "hologramme". Dans l'exemple représenté, 25 il s'agit d'un capteur d'image comportant une matrice de pixels, de type CCD ou un CMOS. La matrice de pixels forme le plan de détection P0. Le plan de détection P0 s'étend de préférence perpendiculairement à l'axe de propagation Z de l'onde lumineuse incidente 12. Le plan de détection s'étend selon un plan radial XY, défini par deux axes X et Y, le plan radial étant perpendiculaire à l'axe de propagation Z. 30 La distance d entre l'échantillon 10 et la matrice de pixels du capteur d'image 20 est préférentiellement comprise entre 50 pm et 2 cm, de préférence comprise entre 100 pm et 2 mm. 8 On remarque, dans les modes de réalisation représentés sur les figures 1A et 1B, l'absence d'optique de grossissement ou de formation d'image entre le capteur d'image 20 et l'échantillon 10. Cela n'empêche pas la présence éventuelle de microlentilles de focalisation au niveau de chaque pixel du capteur d'image 20, ces dernières n'ayant pas de fonction de grandissement de 5 l'image acquise par le capteur d'image, leur fonction étant d'optimiser l'efficacité de collecte de la lumière par les pixels. Sous l'effet de l'onde lumineuse incidente 12, les particules 10' présentes dans l'échantillon peuvent engendrer une onde diffractée 13, susceptible de produire, au niveau du plan de détection P0, des interférences, en particulier avec une partie de l'onde lumineuse incidente 12' 10 transmise par l'échantillon. L'onde lumineuse transmise 12' correspond à une partie de l'onde lumineuse incidente 12 non absorbée par l'échantillon. Ainsi, l'onde lumineuse 14, transmise par l'échantillon, et à laquelle est exposé le capteur d'image 20, désignée par le terme "onde d'exposition", peut comprendre : une composante 13 résultant de la diffraction de l'onde lumineuse incidente 12 par 15 chaque particule de l'échantillon ; une composante 12' résultant de la transmission de l'onde lumineuse incidente 12 par l'échantillon, une partie de cette dernière pouvant être absorbée dans l'échantillon. Ces composantes forment des interférences dans le plan de détection P0. Aussi, l'image acquise par le capteur d'image comporte des figures d'interférences (ou figures de diffraction), dues aux 20 différentes particules 10, de l'échantillon. Un processeur 21, par exemple un microprocesseur, est apte à traiter chaque image /0 acquise par le capteur d'image 20, selon les étapes décrites ci-après. En particulier, le processeur est un microprocesseur relié à une mémoire programmable 22 dans laquelle est stockée une séquence d'instructions pour effectuer les opérations de traitement d'images et de calculs décrites dans 25 cette description. Le processeur peut être couplé à un écran 24 permettant l'affichage d'images acquises par le capteur d'image 20 ou calculées par le processeur 21. Du fait de l'absence d'optique de formation d'image, une image /0 acquise par le capteur d'image 20, également appelée hologramme, ne permet pas d'obtenir une représentation suffisamment précise de l'échantillon observé. L'image acquise /0 peut notamment comporter 30 un grand nombre de figures d'interférence, et peut ne pas être aisément exploitable pour identifier les particules présentes dans l'échantillon et procéder à leur comptage. On peut appliquer, à l'image /0 acquise par le capteur d'image, un opérateur de propagation holographique h, de façon à calculer une grandeur complexe représentative de l'onde 9 lumineuse d'exposition 14. Il est alors possible de reconstruire une expression complexe A de l'onde lumineuse d'exposition 14 en tout point de coordonnées (x, y, z) de l'espace, et en particulier dans un plan de reconstruction P situé à une distance I z I du capteur d'image 20, dite distance de reconstruction, ce plan de reconstruction étant par exemple le plan P10 selon 5 lequel s'étend l'échantillon. Une première façon d'obtenir l'expression complexe A(x, y, z) en un point (x, y, z) est d'appliquer l'expression : A(x, y, z) = 10(x, y, z) * h (1), * désignant l'opérateur produit de convolution. L'opérateur de propagation h a pour fonction de décrire la propagation de la lumière entre le capteur d'image 20 et un point de coordonnées (x, y, z), situé à une distance I z I du capteur 10 d'image. Il est alors possible de déterminer le module M (x, y, z) et/ou la phase (;) (x, y, z) l'onde lumineuse 14, à la distance de reconstruction I z I, avec : - M(x, y, z) = abs [A (x, y, z)] ; - w(x, y, z) = arg [A (x, y, z)]. Les opérateurs abs et ar g désignent respectivement le module et l'argument. 15 L'opérateur de propagation est par exemple la fonction de Fresnel-Helmholtz, telle que : iI x 2+ 2 h(x, y, z) - e 2IT Aexp y(in--) (2) avec i2 = -1. L'expression complexe A de l'onde lumineuse 14, en tout point de coordonnées (x, y, z) de l'espace, est telle que : A (x, y, z) = M (x, y, z)eiKzY.z). Dans la suite de cette description, les coordonnées (x, y) désignent une position radiale dans 20 un plan radial XY parallèle au plan de détection P0. La coordonnée z désigne une coordonnée selon l'axe de propagation Z. L'expression complexe A est une grandeur complexe dont l'argument et le module sont respectivement représentatifs de la phase et de l'intensité de l'onde lumineuse 14 d'exposition détectée par le capteur d'image 20. Le produit de convolution de l'image /0 par l'opérateur de 25 propagation h permet d'obtenir une image complexe Az représentant une distribution spatiale de l'expression complexe A dans un plan de reconstruction Pz, s'étendant à une distance I z I du plan de détection P0, parallèlement à ce dernier. Dans cet exemple, le plan de détection Pu a pour équation z = 0. L'image complexe A, correspond à une image complexe de l'échantillon dans le plan de reconstruction P. L'image Az est définie à des coordonnées radiales (x, y), de 30 telle sorte que Az(x, y) = A(x, y, z). L'image Az représente également une distribution spatiale bidimensionnelle de l'expression complexe de l'onde d'exposition 14. Un tel procédé, désigné par le terme reconstruction holographique, permet notamment de reconstruire une image du module ou de la phase de l'onde lumineuse d'exposition 14 dans le plan de reconstruction. Pour 10 cela, on peut former des images M, et yo, représentant respectivement le module ou la phase de l'image complexe Az, avec Mx = mod (Aï) et (pz = arg(A2). Dans la suite du texte, une image obtenue à partir du module ou de la phase d'une image complexe est désignée par le terme "image reconstruite". 5 L'application d'un opérateur de reconstruction holographique, à partir d'une image acquise, selon l'expression (1), peut s'accompagner de la formation d'un bruit affectant les images reconstruites. Afin de limiter l'apparition de ce bruit, l'application de l'opérateur de reconstruction holographique est effectuée selon des algorithmes itératifs de reconstruction holographique. De tels algorithmes de reconstruction sont par exemple décrits : 10 - dans le document W02016189257, en particulier dans les étapes 100 à 150 décrites dans ce dernier ; ou dans le document W02017162985, et plus précisément selon les étapes 110 à 160 décrites dans ce dernier. Les images représentées sur les figures 2A et 2B ont été obtenues en appliquant un algorithme 15 de reconstruction holographique à une image acquise par un capteur d'image 20. L'échantillon observé était un échantillon de plasma sanguin riche en plaquettes (PRP -acronyme de PlateletRich Plasma), obtenu par une centrifugation d'un plasma sanguin. L'échantillon 10 était disposé dans une chambre fluidique 15 d'épaisseur e égale à 100 pm, disposée à une distance de 1 mm d'un capteur d'image de type IDS UI-1492LE. Pour obtenir les figures 2A et 2B, on a appliqué un 20 algorithme de reconstruction holographique décrit dans W02017162985 à une image /0 acquise par le capteur d'image, en considérant respectivement deux distances de reconstruction z1 et z2. Les distances de reconstruction définissent respectivement deux plans de reconstruction P1 et P2, s'étendant dans l'échantillon, parallèlement au plan de détection P0. On a ainsi obtenu deux images complexes A1 et A2 représentatives d'une expression complexe de l'onde 25 lumineuse d'exposition 14 dans chaque plan de reconstruction P1 et P2 considéré. Les figures 2A et 2B correspondent respectivement au module de chaque image complexe obtenue. Il s'agit d'images du module M1 et M2, respectivement représentatives du module de l'onde lumineuse d'exposition 14 aux distances z1 et z2 par rapport au plan de détection P,. L'écart z2 - z1 entre les deux distances de reconstruction est faible, de préférence inférieur ou 30 égal à 20pm, et de préférence inférieur ou égal à 10 pm. Une partie des plaquettes apparaissant sur chacune de ces figures sont contournées d'un cercle en pointillés noirs sur les deux figures. En dépit du faible décalage entre les distances de reconstruction z1 et z2, on observe que certaines plaquettes sont visibles sur une figure 2B et non sur la figure 2A, ces dernières étant 11 contournées d'un cercle en pointillés blancs sur la figure 2B. Aussi, sur deux figures consécutives, respectivement reconstruites en considérant des distances de reconstruction proches, certaines particules apparaissent ou disparaissent brusquement. De plus, lorsque des plaquettes sont visibles sur les deux figures consécutives, elles apparaissent faiblement contrastées. 5 Lorsque la taille des particules est plus importante, le recours à des images reconstruites permet d'effectuer une localisation tridimensionnelle des particules, en mettant en oeuvre un algorithme de focalisation numérique, connu dans le domaine de l'holographie numérique. Selon un tel algorithme, on considère une pluralité d'images reconstruites selon différentes distances de reconstruction, ces images formant une pile d'images. Pour chaque particule 10 identifiée, on établit une évolution d'un indicateur de netteté sur les différentes images reconstruites. La coordonnée, selon l'axe Z, de la particule considérée correspond à la coordonnée de l'image reconstruite pour laquelle l'indicateur de netteté est le plus élevé. Cependant, les inventeurs ont constaté que lorsque le nombre de particules est élevé, il n'est pas optimal de mettre en oeuvre un algorithme de focalisation numérique, sur chaque particule, 15 prise individuellement, comme effectué dans l'art antérieur. En effet, cela est trop consommateur en ressources de calcul : mémoire et/ou temps de calcul. Une difficulté supplémentaire apparaît lorsque les particules sont de petites tailles, typiquement inférieure à 20 p.m ou à 10 p.m : les particules n'apparaissent alors que sur certaines images reconstruites, proches les unes des autres, et leur contraste est faible, ce qui ne permet pas une mise en oeuvre 20 optimale de la focalisation numérique. Cependant, un algorithme de focalisation numérique peut toutefois être mis en oeuvre, de façon à estimer une distance de focalisation moyenne zr, cette dernière correspondant à une distance, par rapport au capteur d'image 20, à laquelle se trouvent une majorité des particules 100 où à laquelle se trouvent un grand nombre de particules. 25 Les inventeurs ont mis en oeuvre un procédé, combinant la reconstruction holographique d'images et la segmentation d'images reconstruites, dont les principales étapes sont décrites-cidessous, en lien avec la figure 3, pour obtenir un dénombrement fiable de particules de petite taille, telles que des plaquettes, dans un échantillon. [tape 100: Illumination de l'échantillon 10 et acquisition d'une image /0 de l'échantillon 10 par 30 le capteur d'image 20, cette image formant un hologramme. Un intérêt de la configuration sans lentille, représentée sur les figures 1A ou 1B est le large champ observé, permettant d'adresser simultanément un volume d'échantillon élevé. Le champ observé dépend de la taille du capteur d'image, en étant légèrement inférieur à la surface de détection de ce dernier, du fait de 12 l'espacement entre les pixels du capteur d'image et l'échantillon. Le champ observé est généralement supérieur à 10 mm, et est typiquement compris entre 10 mm2 et 50 mm, ce qui est significativement plus élevé qu'avec un microscope conventionnel. Dans des applications liées au comptage de particules, cela permet d'effectuer un comptage basé sur un faible nombre 5 d'images acquises. Des essais ont été effectués en considérant plusieurs sources de lumière, dans différentes bandes spectrales, et de différentes cohérences temporelles. Ces essais sont décrits ci-après en lien avec les figures 6A à 6C [tape 110 : Obtention d'une pile d'images complexes. 10 Cette étape comporte une reconstruction de plusieurs images complexes en effectuant des reconstructions numériques à différentes distances de reconstruction zi du plan de détection Po. On obtient alors une pile d'images complexes A1. Chaque image complexe Ai de la pile d'images est reconstruite à une distance de reconstruction zi, avec z1_1 zj zj_f, où : z1_1 est une distance minimale du capteur d'image, selon l'axe Z, à laquelle une image 15 complexe .A1_1 est reconstruite ; est une distance maximale du capteur d'image, selon l'axe Z, à laquelle une image complexe Aj_f est reconstruite. Chaque indice] est un entier naturel représentant une distance de reconstruction, avec 1 REVENDICATIONS1. Procédé de comptage de particules dans un échantillon, l'échantillon comportant un milieu (10,p) dans lequel baignent les particules (10p), le milieu étant maintenu par un élément de maintien (15), le milieu étant immobile par rapport à l'élément de maintien (15), le procédé comportant les étapes suivantes : a) illumination de l'échantillon (10) par une source de lumière (11), l'échantillon étant disposé entre la source de lumière (11) et un capteur d'image (20) ; b) acquisition, à l'aide du capteur d'image (20), d'une image (10) de l'échantillon (10), l'échantillon étant disposé entre la source de lumière (11) et le capteur d'image (20), chaque image étant représentative d'une onde lumineuse (14) d'exposition, à laquelle est exposé le capteur d'image (20) sous l'effet de l'illumination de l'échantillon ; c) à partir de l'image acquise (10) lors de l'étape b), application d'un opérateur de propagation numérique (h) pour obtenir une expression complexe (A1) de l'onde lumineuse d'exposition (14) dans différents plans de reconstruction (Pi), chaque plan de reconstruction (z1) étant associé à une distance de reconstruction (z1), par rapport au capteur d'image (20) ; d) formation d'une pile d'images reconstruites, ... 4), chaque image reconstruite (1i) étant obtenue à partir du module et/ou de l'argument d'une expression complexe (A» dans un plan de reconstruction (P1), chaque image reconstruite étant associée à une distance de reconstruction (zi) différente l'une de l'autre ; e) segmentation de chaque image reconstruite, de façon à isoler, sur chaque image reconstruite, des régions d'intérêt (R0/0), espacées les unes des autres, chaque région d'intérêt isolée correspondant à une particule ou à un amas de particules ; f) à partir des régions d'intérêt (ROILI) isolées dans l'étape e), estimation d'une quantité de particules dans l'échantillon. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel dans l'étape c), les distances de reconstruction sont obtenues en déterminant une distance de focalisation (zi), correspondant à une distance, par rapport au capteur d'image, à laquelle un nombre maximal de particules sont situées, chaque distance de reconstruction (xi) étant établie en appliquant un décalage par rapport à la distance de focalisation. 21 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la différence entre deux distances de reconstructions successives correspond à un pas de reconstruction, le pas de reconstruction étant inférieur à 20 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les particules 5 sont inscrites dans un cercle ou dans une sphère dont le diamètre est inférieur à 20 j.ini ou à 10 pm ou à 5 p.m. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les particules sont des thrombocytes. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel lors de l'étape 10 e), la segmentation de chaque image reconstruite est réalisée en appliquant un seuillage, selon un seuil d'intensité, sur chaque image reconstruite. 7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel chaque image reconstruite comportant des pixels, la valeur du seuil d'intensité est variable d'un pixel à un autre. 8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel la valeur du seuil d'intensité à un pixel est établie 15 en : - définissant un voisinage autour de chaque pixel ; - calculant une intensité moyenne de pixels appartenant au voisinage ; la valeur du seuil, à chaque pixel, dépendant de l'intensité moyenne ainsi calculée. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comportant une étape 20 d'analyse des régions d'intérêt résultant de l'étape e), de façon à : - déterminer un nombre de particules associées à chaque région d'intérêt ; - ou diviser des régions d'intérêt englobant plusieurs particules en différentes régions d'intérêt ne comportant qu'une seule particule. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel lors de l'étape 25 f), une région d'intérêt dont l'étendue se limite à un pixel n'est prise en compte que si elle apparaît dans deux images reconstruites adjacentes. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la source de lumière est une source laser. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'onde 30 lumineuse émise par la source de lumière présente une largeur de bande spectrale inférieure à 10 nm. 22 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'onde lumineuse émise par la source de lumière présente une bande spectrale centrée sur une longueur d'onde inférieure à 500 nm, et préférentiellement comprise entre 400 nm et 500 nm. 14. Dispositif pour le comptage de particules d'un échantillon, comportant : 5 une source de lumière (11) apte à émettre une onde lumineuse incidente (12) se propageant vers l'échantillon (10) ; un capteur d'image (20) ; un support (10s), configuré pour maintenir l'échantillon (10) entre la source de lumière (11) et le capteur d'image (20) ; 10 un processeur (21), configuré pour recevoir une image (fo) de l'échantillon acquise par le capteur d'image (20) et à mettre en oeuvre les étapes c) à f) d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13. 15. Dispositif selon la revendication 14, dans lequel aucune optique de formation d'image n'est disposée entre l'échantillon (10) et le capteur d'image (20). 15 16. Dispositif selon la revendication 14, comportant un système optique (16) définissant une configuration de mise au point, selon laquelle le capteur d'image (20) est conjugué d'un plan passant par l'échantillon, le dispositif étant tel que le capteur d'image (20) ou l'échantillon (10) sont décalés par rapport à la configuration de mise au point, de telle sorte que lors de l'étape b), le capteur d'image (20) acquiert une image défocalisée de l'échantillon (10). 20