Brevet FR3080372A1 — publié le 20191025

PROCEDE DE BIO-FONCTIONNALISATION DE SURFACE. DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne le domaine de la bio-fonctionnalisation de surface par nanolithographie, pour application en biologie, en chimie, et plus généralement en biochimie, par microscopie optique de ladite surface. Dans le domaine de la nanolithographie, il est connu par exemple le document EP2736635, qui vise à réaliser des motifs de nanoparticules métalliques sur un substrat. Typiquement, les nanoparticules métalliques sont en or et le substrat est un oxyde inorganique à haut indice de réfraction optique (par exemple Ti02, Zn0...). Il est également connu le document US9180519 qui décrit une méthode de fabrication de nano structures distribuées selon un motif prédéterminé afin d'y accrocher une cible, que ce soit pour des dispositifs optiques ou biologiques. Les nano structures sont typiquement des nano plots en or. D'autres documents sont connus, par exemple U52005046758, W02014052759, ou encore la publication « Nanometric protein-patch arrays on glass and poyudimethylsiloxane for cell adhesion studies », F. Pi et al., Nano Lett. 2013, 13, 3372-3378. Cependant, tous ces documents prévoient de réaliser des nano structures métalliques (également appelées nano plots, îlots ou nanoparticules) permettant l'accrochage de protéines, en particulier en or. Or la présence de telles nano structures métalliques posent des problèmes en microscopie optique, par exemple par des effets optiques non linéaires. La présente invention permet de résoudre ce problème. RESUME DE L'INVENTION Plus précisément, l'invention concerne un procédé de traitement de surface d'une plaque de diélectrique transparent à la lumière visible, pour l'observation par microcopie optique de ladite plaque de diélectrique. Il est essentiellement caractérisé en ce qu'il comprend des étapes consistant à: 2 - déposer sur ladite plaque un film négatif comprenant une composition polymérisable qui polymérise lorsqu'elle est exposée à un faisceau d'électrons, - polymériser la composition du film négatif en un ensemble de points représentant un motif prédéterminé, par exposition dudit film négatif à un faisceau d'électrons, 5 - développer le film négatif par dissolution de la composition non polymérisée et obtenir un ensemble de plots de composition polymérisée, chaque plot correspondant à un point du motif prédéterminé, - déposer un film de métal sur le film négatif de la surface de la plaque, et - solubiliser le film négatif développé, pour obtenir un film de métal percé de trous, 10 chaque trou du film de métal correspondant à la base d'un plot. On peut prévoir en outre une étape consistant à: - fonctionnaliser la surface de la plaque de diélectrique par dépôt d'une monocouche de protéines dans les trous du film de métal, pour réaliser un ensemble d'îlots de protéines, 15 chaque îlot étant disposé dans un trou du film de métal respectif. On peut prévoir en outre, préalablement à l'étape de fonctionnalisation, une étape consistant à : - déposer un primaire d'accrochage dans les trous du film de métal. 20 On peut prévoir en outre une étape consistant à: - dissoudre le film de métal. On peut prévoir en outre une étape consistant à: 25 - passiver la surface de la plaque par une couche de passivation entre les îlots de protéines. On peut prévoir en outre une étape consistant à: - Mettre en contact la surface de la plaque passivée et un premier ensemble d'au moins 30 une protéine fonctionnelle susceptible de réagir avec les protéines des îlots. On peut prévoir en outre une étape consistant à: - Fonctionnaliser la couche de passivation par un deuxième ensemble d'au moins une protéine fonctionnelle, les protéines du deuxième ensemble étant différentes des protéines du 35 premier ensemble. On peut prévoir en outre une étape consistant à: 3 - déposer un promoteur d'accroche sur la surface de la plaque préalablement au dépôt du film négatif. On peut prévoir que l'exposition du film négatif à un faisceau d'électrons est mise en 5 oeuvre à température constante prédéterminée. On peut prévoir que l'étape de dépôt du film de métal sur la surface de la plaque est mise en oeuvre par évaporation ou par pulvérisation, l'épaisseur du film de métal étant inférieure à celle du film négatif. 10 Grâce à l'invention, les îlots de protéines sont disposés selon un motif prédéterminé dont la surface totale peut représenter de quelques micromètres carrés jusqu'à 1 ou 2 mm2. Chaque îlot 70 de protéines peut présenter un diamètre équivalent aussi petit que 50 nm. 15 Les îlots peuvent être disposés en réseau dont le pas est aussi petit que 100 nm. Ainsi, quand une cellule biologique est posée sur une plaque support, elle est en contact avec une pluralité d'îlots de protéines. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront plus 20 clairement à la lecture de la description suivante donnée à titre d'exemple illustratif et non limitatif et faite en référence aux figures annexées. DESCRIPTIF DES DESSINS 25 la figure 1A illustre une plaque de diélectrique transparent à la lumière visible, la figure 1B illustre une coupe transversale selon l'axe A-A de la figure 1A, la figure 2A illustre la plaque de la figure 1A après dépôt d'une couche de promoteur d'accroche, la figure 2B illustre une coupe transversale selon l'axe A-A de la figure 2A, 30 la figure 3A illustre la plaque de la figure 2A après dépôt d'un film négatif, la figure 3B illustre une coupe transversale selon l'axe A-A de la figure 3A, la figure 4A illustre la plaque de la figure 3A après exposition à un faisceau d'électrons, la figure 4B illustre une coupe transversale selon l'axe A-A de la figure 4A, la figure 5A illustre la plaque de la figure 4A après développement du film négatif, 35 la figure 5B illustre une coupe transversale selon l'axe A-A de la figure 5A, la figure 6A illustre la plaque de la figure 5A après dépôt d'un film de métal, la figure 6B illustre une coupe transversale selon l'axe A-A de la figure 6A, 4 la figure 7A illustre la plaque de la figure 6A après dissolution du film négatif, la figure 7B illustre une coupe transversale selon l'axe A-A de la figure 7A, la figure 8A illustre la plaque de la figure 7A après fonctionnalisation, la figure 8B illustre une coupe transversale selon l'axe A-A de la figure 8A, 5 la figure 9A illustre la plaque de la figure 8A après dissolution du film de métal, la figure 9B illustre une coupe transversale selon l'axe A-A de la figure 9A, la figure 10A illustre la plaque de la figure 9A après passivation, la figure 10B illustre une coupe transversale selon l'axe A-A de la figure 10A, la figure 11A illustre la plaque de la figure 10A après fonctionnalisation, 10 la figure 11B illustre une coupe transversale selon l'axe A-A de la figure 11A, la figure 12A illustre la plaque de la figure 11A après fonctionnalisation de la couche de passivation, et la figure 12B illustre une coupe transversale selon l'axe A-A de la figure 12A. 15 DESCRIPTION DETAILLEE La présente invention consiste en un traitement de surface d'une plaque 10 de diélectrique transparent à la lumière visible, pour l'observation par microcopie optique de ladite plaque de diélectrique, en l'espèce une plaque de verre (figure 1B), ci-après « plaque » par 20 concision. Par concision, la plaque 10 de diélectrique transparent à la lumière visible, qui sert de support, est appelée « plaque » ci-après. 25 On peut prévoir optionnellement de déposer une couche de promoteur d'accroche 20, uniformément sur la surface de la plaque 10 (figure 2B). Ensuite, on prévoit de déposer sur la plaque 10 un film négatif 30 comprenant une composition polymérisable qui polymérise lorsqu'elle est exposée à un faisceau d'électrons 30 (figure 3B), par exemple une composition comprenant un solvant organique, des chaînes de polymères en solution et des molécules d'agent de liaison, le catalyseur facilitant de la réaction de polymérisation, ou encore le film AR-N 7520-18 de la société ALLRESIST. De préférence, le film négatif 30 est déposé selon de sorte à présenter une épaisseur uniforme sur la surface de la plaque 10, par exemple par enduction centrifuge. 35 De préférence, l'exposition du film négatif 30 à un faisceau d'électrons est mise en oeuvre à température constante prédéterminée. 5 On peut ensuite exposer le film négatif 30 à un faisceau d'électrons FE (figure 4A) en un ensemble de points afin de représenter un motif prédéterminé, typiquement un motif de réseau. 5 Chaque point de contact entre le faisceau d'électrons FE et le film négatif 30 permet de polymériser la composition du film négatif 30 au droit du point de contact, ce qui créé un cylindre ou plot de composition polymérisée 40. Par exemple la composition est une résine. Une fois le motif prédéterminé entièrement représenté, on prévoit de développer le film 10 négatif 30 pour solubiliser la composition non polymérisée, par exemple par immersion dans un solvant. On obtient ainsi un ensemble de plots de résine polymérisée, chaque plot correspondant à un point du motif prédéterminé (figure 5A). 15 On peut alors prévoir de déposer un film (ou couche) de métal 50 sur le film négatif de la surface de la plaque (figure 6A), ce qui forme un masque qui sert de motif aux îlots 70 de protéines décrits ultérieurement. 20 En l'espèce, le dépôt est réalisé par évaporation ou par pulvérisation. En l'espèce, le métal est de l'aluminium. De préférence, l'épaisseur du film de métal 50 est inférieure à celle du film négatif 30. Autrement dit, la hauteur des plots 40 est supérieure à l'épaisseur du film de métal 50 (figure 25 6B). On peut prévoir que le ratio entre l'épaisseur du film de métal et l'épaisseur du film négatif 30 est supérieur à une valeur seuil. 30 On peut alors solubiliser le film de résine 30. En l'espèce, la dissolution est réalisée par trempage dans un bain de solvant organique adapté à la composition polymérisable. La solubilisation du film de résine 30, c'est-à-dire des plots 40, entraine le décollement du film de métal 50 sur les plots 40 mais pas entre les plots 40. Ainsi, après solubilisation, le film de métal 50 sur la surface extérieure de la plaque 10 présente des trous 60 à la place des plots 40 et une 35 épaisseur constante autrement (figure 7B). Chaque trou 60 correspond donc à la base d'un plot 40. 6 A ce stade le temps de conservation de la plaque 10 peut être de plusieurs mois. On prévoit alors de fonctionnaliser la surface de la plaque 10 par dépôt d'une couche de 5 protéines fonctionnelles, par exemple une monocouche, par exemple par incubation dans un bain protéique, dans les trous 60 du film de métal, pour réaliser un ensemble d'îlots 70 de protéines, chaque îlot 70 de protéines étant disposé dans un trou 60 du film de métal respectif (figure 8B) ; la fonctionnalisation comprenant typiquement une étape de rinçage. 10 En l'espèce la monocouche de protéines est une monocouche d'albumine de sérum bovin marquée par une étiquette, en l'espèce la biotine (vitamine H). A cet effet, on prévoit de préférence de déposer un primaire d'accrochage (non illustré) dans les trous 60 du film de métal 50 préalablement au dépôt d'une monocouche de protéines, 15 par exemple par évaporation ou en plongeant la plaque 10 dans une solution aqueuse. Le primaire d'accrochage est par exemple une molécule permettant d'établir à la fois des liaisons covalentes avec le verre de la plaque 10 et permettant de servir d'accrochage avec des protéines prédéterminées, en l'espèce une molécule de type amino silane. 20 Chaque îlot 70 de protéines peut présenter un diamètre équivalent aussi petit que 50 nm. Selon le motif prédéterminé choisi, les îlots 70 de protéines peuvent être disposés en réseau dont le pas est aussi petit que 100 nm. 25 Ainsi, quand une cellule biologique est posée sur une plaque support fonctionnalisée selon l'invention, elle peut être en contact avec une pluralité d'îlots 70 de protéines. Une cellule biologique en contact avec une plaque fonctionnalisée selon l'invention réagit différemment non seulement en fonction du motif (notamment du diamètre équivalent des îlots, 30 de la densité des îlots et du pas du réseau) mais aussi en fonction de la nature des protéines des îlots. Ainsi, de préférence, tous les îlots 70 de protéines comprennent les mêmes protéines. On peut prévoir ensuite de dissoudre le film de métal 50 (figure 9A, figure 9B), en l'espèce dans un bain de soude. L'avantage de l'aluminium est qu'il est dissout par de la soude alors 35 que les protéines des îlots 70 de protéines ne sont pas attaquées par la soude. 7 Ainsi, à la suite de la dissolution du film de métal 50, il ne reste sur la surface de la plaque 10 que des nano plots de protéines, c'est à dire les protéines des îlots 70 de protéines, accrochés directement sur la surface de la plaque 10 ou via le promoteur d'accroche 20, c'est à dire sans nano structures métalliques qui vient en outre interférer avec la lumière d'un 5 microscope optique. Ainsi, contrairement à l'art antérieur cité en début de description, grâce à la présente invention, il ne reste aucun nano plot métallique entre les îlots 70 de protéines et la surface de la plaque 10. 10 A ce stade, le temps de conservation de la plaque 10 peut être de plusieurs jours. On peut prévoir également de passiver la surface de la plaque 10 par une couche de passivation 80 entre les îlots 70 de protéines (figure 10A, figure 10B), par exemple par une 15 couche organique, une couche de polymère, une couche lipidique (en l'espèce une double couche lipidique) ou une autre protéine. La passivation peut être mise en oeuvre par exemple par dépôt ou bain et adsorption d'une couche de passivation, inerte au regard des protéines marquées, ce qui permet de garantir que les protéines actives de l'étape de fonctionnalisation ci-après ne se lient qu'avec les protéines marquées des îlots. 20 On peut alors finaliser la fonctionnalisation de la surface de la plaque 10 en mettant en contact la surface de la plaque 10, éventuellement passivée, avec un premier ensemble d'au moins une protéine fonctionnelle 90 susceptible de réagir avec les protéines des îlots 70 de protéines (figure 11A, figure 11B), par exemple des anticorps, éventuellement via une protéine 25 intermédiaire de liaison. Le premier ensemble d'au moins une protéine fonctionnelle 90 permet l'étude de cellules biologiques vivantes mises en contact avec la surface de la plaque 10, notamment par microscopie optique. Une plaque 10 fonctionnalisée selon la présente invention peut se présenter sous forme de laboratoire sur puce. A ce stade le temps de conservation de la plaque 10 peut être de plusieurs heures. La présente invention n'est pas limitée aux modes de réalisation précédemment décrits. 30 35 8 Par exemple, on peut prévoir de fonctionnaliser également la couche de passivation 80 (figure 12A, figure 12B). A cet effet, on peut prévoir un deuxième ensemble d'au moins une protéine fonctionnelle 5 100, les protéines du deuxième ensemble 100 étant différentes des protéines du premier ensemble 90 et de préférence ne sont pas susceptibles de réagir avec les protéines des îlots 70 de protéines. Par exemple, pour des cellules immunitaires (cellules T), on prévoit que le premier 10 ensemble est un récepteur et que le deuxième ensemble est un co-récepteur. Grâce à l'invention, plusieurs îlots 70 de protéines peuvent être fabriqués simultanément. Nomenclature 10 plaque de diélectrique transparent à la lumière visible 20 promoteur d'accroche 30 film négatif qui polymérise lorsqu'il est exposé à un faisceau d'électrons plot de résine polymérisée 50 film de métal 60 Trou dans le film de métal 50 70 îlot de protéines 80 couche de passivation 90 premier ensemble de protéines fonctionnelles, susceptibles de réagir avec les protéines des "dol REVENDICATIONS1. Procédé de traitement de surface d'une plaque (10) de diélectrique transparent à la lumière visible, pour l'observation par microcopie optique de ladite plaque de diélectrique, caractérisé en ce qu'il comprend des étapes consistant à: - déposer sur ladite plaque (10) un film négatif (30) comprenant une composition polymérisable qui polymérise lorsqu'elle est exposée à un faisceau d'électrons, - polymériser la composition du film négatif (30) en un ensemble de points représentant un motif prédéterminé, par exposition dudit film négatif à un faisceau d'électrons, - développer le film négatif (30) par dissolution de la composition non polymérisée et obtenir un ensemble de plots (40) de composition polymérisée, chaque plot (40) correspondant à un point du motif prédéterminé, - déposer un film de métal (50) sur le film négatif (30) de la surface de la plaque (10), et - solubiliser le film négatif (30) développé, pour obtenir un film de métal (50) percé de trous, chaque trou (60) du film de métal (50) correspondant à la base d'un plot (40. 2. Procédé selon la revendication 1, comprenant en outre une étape consistant a: - fonctionnaliser la surface de la plaque de diélectrique par dépôt d'une monocouche de protéines dans les trous (60) du film de métal (50), pour réaliser un ensemble d'îlots (70) de protéines, chaque îlot (70) étant disposé dans un trou (60) respectif du film de métal (50). 3. Procédé selon la revendication 2, comprenant en outre, préalablement à l'étape de fonction nalisation, une étape consistant à : - déposer un primaire d'accrochage dans les trous (60) du film de métal (50). 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant en outre une étape consistant à: - dissoudre le film de métal. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, comprenant en outre une étape consistant à: 10 - passiver la surface de la plaque par une couche de passivation (80) entre les îlots (70) de protéines. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, comprenant en 5 outre une étape consistant à: - Mettre en contact la surface de la plaque (10) passivée et un premier ensemble (90) d'au moins une protéine fonctionnelle susceptible de réagir avec les protéines des îlots. 10 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 ou 6, comprenant en outre une étape consistant à: - Fonctionnaliser la couche de passivation (80) par un deuxième ensemble (100) d'au moins une protéine fonctionnelle, les protéines du deuxième ensemble étant différentes des protéines du premier ensemble. 15 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant en outre une étape consistant à: - déposer un promoteur d'accroche sur la surface de la plaque préalablement au dépôt du film négatif. 20 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'exposition du film négatif à un faisceau d'électrons est mise en oeuvre à température constante prédéterminée. 25 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel : - L'étape de dépôt du film de métal sur la surface de la plaque est mise en oeuvre par évaporation ou par pulvérisation, l'épaisseur du film de métal (50) étant inférieure à celle du film négatif (30). 30 35