Brevet FR3086300A1 — publié le 20200327

AMORCES UNIVERSELLES ET LEUR UTILISATION POUR LA DÉTECTION ET/OU L'IDENTIFICATION D'UNE PLANTE DU GENRE CUCU/111S La présente invention a pour objet de nouvelles amorces universelles, ainsi que leur utilisation pour la détection etiou l'identification d'espèces végétales du genre notamment dans des substrats complexes ou dégradés. La Famille des Cucurbitacées contient environl5 tribus-120 genres-900 espèces (Renner et al., (2013) The Cucurbitaceae of India: Accepted naines, synonyms, geographic distribution, and information on images and DNA sequences). De nombreuses espèces du genre Cucumis sont cultivées pour leurs fruits comestibles (courges, courgettes, concombres, cornichons, melons, pastèques, chayotes, etc.) et parfois pour leurs graines (courge à huile, pistache africaine). Les différentes méthodes permettant l'identification de végétaux basées sur l'analyse du génome sont connues. Par exemple, le «DNA barcoding» est l'une des méthodes de biologie moléculaire permettant de déterminer les espèces présentes dans un échantillon grâce à la présence d'une signature génétique, également appelé marqueur. Ce marqueur est un fragment d'ADN encadré par des régions très conservées et donc universelles, et qui, une fois séquence, montre des variations de séquences génétiques entre individus d'espèces différentes et des séquences identiques entre individus d'une même espèce (Hebert, Paul DN et al., (2003) Biological identifications through DNA barcodes). La délimitation des espèces, grâce au «DNA barcoding», est basée sur le ratio « divergence intraspécifiqueldivergence interspécifique » (Hebert, Paul DN et al., (2004) Identification of birds through DNA barcodes). Cc ratio est appelé le «barcoding gap». D'un point de vue théorique, le séquençage d'une région homologue suffisamment longue (plusieurs centaines de paires de bases) permet l'identification d'une espèce chez les végétaux. Une telle région doit être encadrée par des zones très conservées autorisant la conception d'amorces universelles pour l'amplification. En ce qui concerne l'ADN nucléaire, les US (Internat Transcripted Spacer de l'ADN ribosomique) ont été utilisés pour la détection et l'identification de végétaux. Des amorces universelles ont été décrites chez les champignons et se sont avérées fonctionner également chez les végétaux. De ce fait, cette région de quelques centaines de paires de bases a été utilisée pour effectuer des phylogénies entre espèces proches chez les végétaux (Renaud Lahaye et al. (2008) DNA barcoding the foras of biodiversity hotspots). Cependant, l'ADN nucléaire possède dos inconvénients. En effet, les régions identifiées sont trop longues pour être utilisées dans le cas de substrats très dégradés. De plus, les amorces peuvent amplifier plusieurs types de séquence au sein d'une même espèce. Enfin, les amorces ne sont pas réellement universelles et il peut être difficile d'obtenir une amplification chez certaines espèces. Par ailleurs, les ADN mitochondriaux et chloroplastiques ont également été étudiés, car ils sont présents de manière hautement répétées dans chaque cellule (plusieurs centaines de copies). Il en 2 résulte qu'ils représentent une cible pour l'amplification beaucoup plus accessible dans le cas de substrats dégradés. L'ADN mitochondrial ou chloroplastique est cependant trop peu variable chez les végétaux. Plusieurs articles décrivent des amorces universelles ciblant différentes régions de l'ADN chloroplastique (Bafeel S.O., et al., (2012) DNA barcoding of arid wild plants using rbcL gene 5 sequences) qui montrent par exemple que le gène rbcL permet l'identification de seulement 17% des espèces de plantes étudiées. Ainsi, les solutions proposées pour l'identification spécifique d'espèces de plantes ne sont pas complètement satisfaisantes car elles concernent soit des séquences trop longues pour être efficaces dans l'analyse de substrats dégradés, soit des fragments trop courts dont le niveau de variabilité n'est 10 pas assez élevé pour être vraiment utile dans leur identification. Les marqueurs pouvant être utilisés communément pour la détermination et/ou l'identification d'une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsacetts, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis SatiVilS restent encore à être identifiés. En effet, il n'existe pas, à ce jour, de marqueur suffisamment variable et possédant des amorces universelles pour 15 permettre une bonne résolution par le «DNA barcoding» chez ces espèces. Ceci est d'autant plus vrai pour l'analyse par le «DNA barcoding» de substrats dégradés. La détermination et/ou l'identification de plantes à partir d'ADN dégradé est très importante, notamment à des fins de contrôle-qualité de produits alimentaires, de compléments alimentaires ou cosmétiques pour lesquels l'utilisation de plantes connaît un succès croissant. Néanmoins, les régions 20 d'ADN de plante suffisamment courtes (pour pouvoir analyser des échantillons d'ADN dégradé) et suffisamment variables (pour permettre de déterminer et/ou d'identifier les plantes, notmnment les espèces de plantes) sont rares et à ce jour aucune n'a été caractérisée. Dc plus, il n'existe pas d'amorces universelles encadrant un tel fragment d'ADN d'une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et 25 Cucumis satines (de taille comprise de 90 et 120 paires de bases) permettant d'amplifier de l'ADN dégradé. Il existe donc un réel de besoin de pouvoir déterminer et/ou identifier une plante choisie dans le genre Cucumis à partir d'ADN dégradé. Il existe également un réel besoin de déterminer des régions d'ADN d'une plante choisie 30 parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis clipsacetts, Cucumis racla, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus suffisamment courtes et suffisamment variables pour pouvoir être utilisées dans la détermination et/ou l'identification desdites plantes. Il existe aussi un réel besoin de déterminer des amorces universelles permettant d'amplifier les régions d'ADN desdites plantes suffisamment courtes et suffisamment variables, notamment de 35 nouvelles amorces universelles permettant d'amplifier de l'ADN dégradé (de taille comprise entre 90 et 120 paires de bases). 3 il existe aussi un réel besoin de déterminer un marqueur suffisamment variable et possédant des amorces universelles pour pLrmettre une bonne résolution par le «DNA bareoding» d'une plante choisie parmi les espèces Chinants anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo' Cucumis mettilifer, Chinants myriocarpus. et Chinants sativus. 5 C'est pourquoi l'un des buts de l'invention est de fournir des régions d'ADN desdites plantes suffisamment courtes et suffisamment variables pour pouvoir être utilisées dans la détermination et/ou l'identification d'une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Chinants melo. Cucumis metutifer, Cucumis myrionnpus et Cucumis sativus. L'un des buts de l'invention est également de fournir des amorces universelles permettant 10 d'amplifier lesdites régions d'ADN d'une plante choisie parmi les espèces Canants anguria, Chinants dipsaceus, Chinants Fileta Cucumis metillifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus suffisamment courtes et suffisamment variables. L'un des buts de l'invention est aussi de fournir un procédé de détermination et/ou d'identification d'une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Chinants 15 melo, Cucumis metutifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus à partir d'ADN dégradé. DESCRIPTION DE L'INVENTION Pour remédier aux inconvénients de l'état de la technique, la présente invention propose de 20 nouvelles amorces universelles, ainsi que leur utilisation pour la détection et/ou l'identification d'une plante du genre Ciselants, en particulier choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis La présente invention repose également sur la détermination, par les inventeurs, (i) de régions d'ADN d'une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus. Cucumis melo, 25 Chinants metulifer, Cucumis myriocarpus ei Cuctinus. sativus suffisamment courtes et suffisamment variables pour pouvoir être utilisées dans la détermination et/ou l'identification desdites espèces, et (ii) des amorces universelles permettant d'amplifier lesdites régions d'ADN desdites espèces. Ces régions courtes d'ADN desdites espèces constituent des marqueurs dits «courts» et ont été identifiées dans le gène NdhA (codant la sous-unité 1 de la NADH plastoquinone oxydoreductase) des 30 plantes choisies parmi les espèces ("mullas anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis meadifer. Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus. La présente invention concerne ainsi l'utilisation d'une paire d'amorces pour la détection et/ou l'identification d'une plante choisie dans le genre (1ucutnis et plus particulièrement parmi les espèces Cucumis anguria. Cucumis ClipSCICellS. Cucumis melo, Cucumis rnenslifer. Cucumis myriocarpus et 35 Canants sativus dans un échantillon susceptible d'en contenir, par l'amplification d'au moins une région variable du gène NdhA, ladite région variable du gène NdhA constituant un marqueur de détection et de préférence d'identification d'au moins une desdites espèces. 4 La présente invention concerne aussi les amorces (ou oligonucléotides), notamment les paires d'amorces, les séquences cibles desdites amorces, et les régions amplifiées per se. La présente invention concerne aussi l'utilisation des régions amplifiées pour la détermination et/ou l'identification d'une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Onciales clipsacens, 5 Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus. La présente invention concerne aussi l'utilisation d'une paire d'amorcés pour la détection et de préférence l'identification d'une plante choisie parmi lesdites espèces, dans laquelle l'espèce est Guez/mis me/o. La présente invention concerne aussi l'utilisation d'une paire d'amorces pour la détection et 10 de préférence l'identification d'une plante choisie parmi lesdites espèces, dans laquelle la paire d'amorces consiste en une première amorce (un premier oligonucléotidc) qui s'hybride à une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus, choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 1 du gène NdhA et une deuxième amorce (un deuxième oligonucléotide) qui s'hybride à une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus, choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 2 du gène NdhA. 15 La présente invention concerne également l'utilisation d'une paire d'amorces dans laquelle: -la première amorce s'hybride à une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 1 du gène NclhÀ. et -la deuxième amorce s'hybride à une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 2 du gène NdhA, 20 pour la détection et/ou l'identification d'une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsacetts, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis saline dans un échantillon susceptible d'en contenir, par amplification d'au moins une région variable du gène NdhA, ladite région variable constituant un marqueur de détection et/ou d'identification d'une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis clipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metultfér, 25 Cucumis myriocarpus et Cuctonis sativus. Selon la présente invention, les séquences SEQ Ill NO: 1 et SEQ Ill NO: 2 sont situées respectivement de la position 122821 à la position 122850 et de la position 122957 à la position 122986 sur le chloroplaste de Cucumis melo (n° Accession Gcnbank: JE412791.1). Le gène NdhA se situe entre les positions 121617 et 123867 sur le chloroplaste de Cucumis melo. 30 Selon la présente invention, les ternies «amorce» et «oligonucléotide» sont interchangeables. Unc amorce ou un oligonucléotide signifie une courte séquence de nucléotides, dont le nombre varie d'une dizaine à environ 100 bases (ou 100 nucléotides en considérant la présence d'un ose et d'un, de deux ou de trois groupes phosphate; la relation base/nucléotides étant bien connue de l'homme du métier). Ainsi, l'expression «paire d'amorces ou paire d'oligonucléotides» fait référence à 35 l'association de deux oligonucléotides. Les deux oligonucléotides formant la paire d'oligonucléotides (amorces) n'ont pas nécessairement la même taille: par exemple le premier oligonucléotide qui s'hybride à la séquence de SEQ ID NO: I peut comprendre 21 nucléotides et le deuxième 5 oligonucléotide qui s'hybride à une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 2 peut comprendra 20 nucléotides, par exemple. Dans un aspect particulier de l'invention, le premier oligonucléotide correspond à une amorce sens et le deuxième oligonucléotide correspond à une amorce anti-sens. 5 Le ternie «contigus» signifie que les oligonucléotides s'hybrident aux 15 à 30 nucléotides successifs, situés les uns à la suite des autres, sans discontinuité. Le terme « SEQ ID NO: 1» doit s'entendre comme une séquence de SEQ ID NO : 1 ou une séquence ayant un pourcentage d'identité d'au moins 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% avec ladite SEQ ID NO : 1, notamment 95% et plus particulièrement 98% ou 10 99%. Le terme «SEQ ID NO: 2» doit s'entendre comme une séquence de SEQ ID NO : 2 ou une séquence ayant un pourcentage d'identité d'au moins 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% avec ladite SEQ ID NO : 2, notamment 95% et plus particulièrement 98% ou 99%. 15 Le terme «détection» signifie que l'utilisation de la paire d'oligonucléotides susmentionnée permet de conclure quant à la présence ou à l'absence de plante dans l'échantillon testé. Lc terme «identification» signifie que l'utilisation de la paire d'oligonucléotides susmentionnée permet d'identifier une plante présente dans l'échantillon testé comme étant une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis metulifer, Cucumis 20 myriocarpus, Cucumis satints et Cucumis melo. L'expression «la détection et/ou l'identification» signifie «la détection» ou «l'identification» ou «la détection et l'identification», et plus particulièrement «l'identification». L'expression «échantillon susceptible d'en contenir» signifie que l'échantillon peut comprendre ou peut ne pas comprendre une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, 25 Cucumis clipsaceus, Cucumis melo, Cucumis meiuther, Cucumis myriocarpus el Cucumis saiitts, et notamment peut comprendre ou peut ne pas comprendre d'ADN d'une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis chpsaceus, Cucumis men), Cucumis metuhfer, Cucumis myriocarptts et Cucumis sativus. Le terme «hybrider» signifie que les amorces (ou oligonucléotides) formant la paire d'amorces 30 (ou paire d'oligonucléotides) de l'invention s'hybrident avec une séquence «marqueur» de référence du gène NdhA (notamment les séquences de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2) à un niveau supérieur au bruit de fond de manière significative. Le niveau du signal généré par l'interaction entre la séquence capable de s'hybrider de manière sélective (les séquences formant la paire d'amorces d'oligonucléotides) et les séquences de référence (les séquences cibles) est généralement 10 fois, de 35 préférence 100 fois plus intense que celui de l'interaction des autres séquences d'ADN générant le bruit de fond. Les conditions d'hybridation stringentes permettant une hybridation sélective sont bien connues de l'homme du métier. 6 L'expression «conditions de stringence suffisantes» signifie par exemple une température d'hybridation de 40-65°C, de préférence de 50-60°C, notamment 53-58°C, et plus particulièrement 53°C, 55°C, 58°C dans un tampon d'amplification d'une concentration saline comprise de 0,001 à 0,5M notamment comprenant du MgC12 2mM. 5 La présente invention a pour autre objet, l'utilisation d'une paire d'amorces, dans laquelle ledit premier oligonucléotide ou ledit deuxième oligonucléotide de la paire d'amorces s'hybride à sa séquence cible respective choisie parmi les séquences SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO:2 du gène NdhA, à une température comprise de 40 à 65°C, et plus particulièrement de 50-60°C et une concentration saline comprise de 0,001 à 0,5 M, et plus particulièrement de 0,05 à 0,1 M, et encore plus 10 particulièrement de à 0,001 à 0,005M. L'expression «amplification d'au moins une région variable du gène A/c/hA » fait référence à toute amplification enzymatique in vitro d'une séquence définie d'ADN du gène NdhA, par exemple par une réaction d'amplification en chaîne par polymérase (PCR). L'expression «ladite région variable constituant un marqueur de détection et/ou 15 d'identification d'une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, CLIC711171.S' myriocarpus et Cucumis sativus» signifie que la région variable du gène NdhA qui est amplifiée constitue une région d'ADN de plante suffisamment courte et suffisamment variable pour pouvoir détecter et/ou identifier une plante choisie parmi les espèces CUCU/711S anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metuhfer, Cucuznis myriocarpus et 20 Cucumis StniVUS. Dans un autre aspect particulier, l'invention concerne l'utilisation d'une paire d'amorces dans laquelle - la première amorce a une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 3 ou une séquence ayant un pourcentage d'identité d'au moins 90%, 91%, 25 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% avec ladite SEQ ID NO : 3, et - la deuxième amorce a une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 4 ou une séquence ayant un pourcentage d'identité d'au moins 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% avec ladite SEQ ID NO : 4. Plus particulièrement, l'invention concerne l'utilisation d'une paire d'amorces dans laquelle : 30 - la première amorce a une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 3, et - la deuxième amorce a une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 4, pour la détection et/ou l'identification d'une plante choisie parmi les espèces ClietIMIS anguria, 35 Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metuhfér, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus dans un échantillon susceptible d'en contenir, par amplification d'au moins une région variable du gène NdhA, ladite région variable constituant un marqueur de détection et/ou d'identification d'une plante 7 choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis me hfer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus. Dans un autre aspect préféré, ladite première amorce s'hybride à une séquence d'au moins 20 nucléotides contigus choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 1 du gène NdhA et a une séquence d'au 5 moins 20 nucléotides contigus choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 3. Dans un autre aspect préféré, ladite deuxième amorce s'hybride à une séquence d'au moins 20 nucléotides contigus choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 2 du gène NdhA et a une séquence d'au moins 20 nucléotides contigus choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 4. L'expression «d'au moins 15 nucléotides contigus » signifie par exemple 15, 16, 17, 18, 19, 10 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucléotides contigus. Le terme « SEQ ID NO : 3 » doit s'entendre comme une séquence de SEQ ID NO : 3 ou une séquence ayant un pourcentage d'identité d'au moins 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% avec ladite SEQ ID NO : 3, notamment 95% et plus particulièrement 98% ou 99%. 15 Le terme « SEQ ID NO : 4 » doit s'entendre comme une séquence de SEQ ID NO : 4 ou une séquence ayant un pourcentage d'identité d'au moins 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% avec ladite SEQ ID NO 4, notamment 95% et plus particulièrement 98% ou 99%. Dans un aspect particulier, l'invention concerne l'utilisation d'une paire d'amorces dans 20 laquelle la première amorce a une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus choisie dans le groupe constitué par l'une des séquences suivantes: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID 25 NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO : 39, SEQ Ill NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, ou SEQ ID NO: 47. Bien entendu, lesdites séquences constituent des exemples non limitatifs de séquences de 15 à 30 nucléotides choisies dans la séquence de SEQ ID NO:3 pouvant être utilisées dans le cadre de la présente invention. 30 Dans un aspect particulier, l'invention concerne l'utilisation d'une paire d'amorces susmentionnée, dans laquelle la deuxième amorce a une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus choisie dans le groupe constitué par l'une des séquences suivantes: SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO : 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID 35 NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO : 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO : 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 8 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, ou SEQ ID NO: 83. Bien entendu, lesdites séquences constituent des exemples non limitatifs de séquences de 15 à 30 nucléotides choisies dans la séquence de SEQ ID NO: 4 pouvant être utilisées dans le cadre de la présente invention. 5 Dans un aspect particulier, l'invention concerne l'utilisation d'une paire d'amorces susmentionnée, dans laquelle ladite région variable du gène NdhA qui est amplifiée a une taille comprise de 90 à 120 paires de bases L'expression « une taille comprise de 90 à 120 paires de bases » signifie notamment 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 10 114, 115, 116, 116, 117, 118, 119 ou 120 paires de bases. Dans un aspect particulier, l'invention concerne l'utilisation d'une paire d'amorces susmentionnée, dans laquelle ladite région variable du gène NdhA comprend ou consiste en une séquence choisie dans le groupe constitué par: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, ou SEQ ID NO: 11, ou une séquence ayant un pourcentage 15 d'identité d'au moins 90% avec ladite séquence et notamment 95% et plus particulièrement 98% ou 99%. Selon la présente invention, la séquence SEQ ID NO: 5 représente une séquence consensus pour laquelle les lettres «K», «M» et «W» représentent un nucléotide choisi parmi A, T, C ou G. De préférence «K» représente un «T ou G», «M» représente un «A ou C», et «W» représente un «A ou 20 T». Dans un aspect particulier, l'invention concerne l'utilisation d'une paire d'amorces susmentionnée, dans laquelle ledit échantillon est un produit qui est susceptible de contenir au moins une molécule d'ADN d'une plante choisie parmi les espèces Cumulais anguria. Cumulais dipsaceus, Cucumis meid Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis s'admis. 25 Dans un aspect particulier, l'invention concerne l'utilisation d'une paire d'amorces susmentionnée, dans laquelle ledit échantillon est un produit qui comprend ou consiste en au moins une molécule d'ADN d'une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria Cucumis dipsaceus, Cucumis meid Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus el Cucumis saliens. Dans un aspect particulier, l'invention concerne l'utilisation d'une paire d'amorces 30 susmentionnée, dans laquelle ledit échantillon est un produit qui ne comprend pas au moins une molécule d'ADN d'une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, CW1111115 dipsaceus, Cucumis men), Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus. Dans un aspect encore plus particulier, lorsque ladite molécule d'ADN d'une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis 35 myriocarpus et Cucumis sativus correspond au gène NdhA (ou un fragment dudit gène NdhA), alors la molécule d'ADN, correspondant à la partie amplifiée, possède au maximum 120 paires de bases, selon la détermination ci-après: la séquence de l'amorce sens (20 paires de bases par exemple) + les 9 fragments correspondant à la région amplifiée (90 à 120 paires de bases) + la séquence de l'amorce anti-sens (20 paires de bases par exemple). Dans un aspect particulier, l'invention concerne l'utilisation d'une paire d'amorces susmentionnée, dans laquelle ledit échantillon est choisi parmi : un produit à base d'une plante choisie 5 parmi les espèces Cueumis anguria, Cumulais dipsaceus, Cumulais Indy), Cueumis metulifer, Cueumis myriocarpus ea Cucumis sativus, un produit qui contient au moins une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis tnelo, Cucumis metuttfer, (incluras myriocarpus et Cucumis sativus processée, un extrait d'une plante choisie parmi les espèces Camants anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis indu, Cucumis metultfer, Cucumis myriocarpus et CUCU/171S sativus, un 10 mélange de plantes choisies parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis indu, Cucumis metultfem, encrants myriocarpus et Cucumis sativus, un produit à base d'une plante pure choisie parmi les espèces Cumulais anguria, Cucumis dipsaceus, Cueumis melo, Cucumis metraifèr, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus, un produit qui ne contient pas de plante choisie parmi les espèces Cueumis. anguria, Cueumis dipsaceus, Cucu/Ms moto, Cucumis metratfer, Cueumis 15 myriocarpus et Cucumis sativus. L'expression «produit à base d'une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cueumis. indu. Cueumis meiulfer, (leurras tnyriocarpus et encrants sativus» signifie un produit contenant au moins une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cueumis indu, encrants metulifer, Cueumis myriocarpus et Cucumis sativus dont 20 l'intégrité de l'ADN n'a pas été altérée. L'expression « un produit qui contient au moins une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Guaranis mato, Cucumis metufifer, encrants myriocarpus et Cucumis sativus processée» signifie un produit contenant au moins une desdites plantes dont l'intégrité de l'ADN a été altérée. 25 L'expression « un extrait de plantes » signifie un échantillon obtenu par extraction d'une plante choisie parmi les espèces Lucanes anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis 111e10, ("limants mendié); Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus, c'est-à-dire un échantillon/extrait comprenant au moins de l'ADN d'une plante choisie parmi les espèces Cueumis anguria, Cueumis dipsaceus, Cucumis inch), Cucumis mendifer, Cintras myriocarpus et Cucumis sativus, l'intégrité dudit ADN in étant altérée ou non altérée. L'expression « un mélange do plantes » signifie un mélange contenant de l'ADN de plantes d'au moins deux plantes choisies parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis indu, Cucumis metutifer, Cucumis myriocarpus et Camants sativus, notamment des plantes dont l'ADN a été processé. 35 L'expression «un produit qui ne contient pas de plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, encrants dipsaceus, Cueumis indu. Cucumis mendifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus» signifie un produit contenant 0% d'ADN d'une plante choisie parmi les espèces Cucumis 10 anguria, Cucumis dipsaceus,Cucumis melo, Cucumis metuhfer, Cucumis myriocarpus et Cucumis saltrus. L'expression «plante pure» signifie un produit contenant 100% d'ADN d'une seule desdites espèces. 5 Dans un aspect particulier, l'invention concerne l'utilisation d'une paire d'amorces susmentionnée, dans laquelle ladite détection et/ou identification d'une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis Judo, Cucumis metulitér, Cucumis mytiocatpus et Cucumis sativus est effectuée par hybridation dans des conditions de stringence suffisantes pour l'amplification de ladite région variable du gène NdhA. 10 L'expression REVENDICATIONS1. Utilisation d'une paire d'amorces pour la détection et de préférence l'identification d'une plante choisie dans le genre C'ucuenis et plus particulièrement parmi les espèces Cueumis anguria, Czteumis dipsaceus, Cucurais inetulifer, Cucurnis myriocatpus et CücwMiS sativus dans un échantillon susceptible d'en contenir, par l'amplification d'au moins une région variable du gène Nilltd, ladite région variable du gène ArdhA constituant un marqueur de détection et de préférence d'identification d'au moins une desdites espèces, dans laquelle la paire d'amorces consiste en une première amorce qui s'hybride à une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus, choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 1 du gène NilhA et une deuxième amorce qui s'hybride à une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus, choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 2 du gène ArdhA. 2. Utilisation d'une paire d'amorces pour la détection et de préférence l'identificatio d'une plante selon la revendication I, dans laquelle l'espèce est Cucumis melo. 15 3. Utilisation d'une paire d'amorces selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle - la première amorce a une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus choisie dans la séquence SEQ rD NO: 3, et 20 - la deuxième amorce a une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus choisie dans la séquence SEQ U) NO: 4. 4. Utilisation d'une paire d'amorces selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle ladite région variable du gène ArilhA qui est amplifiée a une taille comprise 25 de 90 à 120 paires de bases. 5. Utilisation d'une pave d'amorces selon L'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle ladite réon variable du gène ItyragiA comprend ou consiste en une séquence choisie dans le groupe constitué par: SEQ ID NO: 5 à 11, ou une séquence ayant un pourcentage 30 d'identité d'au moins 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%. 6. Paire d'amorces dans laquelle: - une première amorce comprend ou est constituée d'une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus, complémentaire de la séquence SEQ ID NO: 1, et - une deuxième amorce comprend ou est constituée d'une séquence de 15 à 30 contigus, complémentaire de la séquence SEQ ID NO: 2. 30 7. Paire d'amorces lon la revendication 6, dans laquelle: -la première amorce d'une taille comprise de 15 à 30 nucléotides contigus comprend ou est constituée par une séquence choisie parmi: SEQ II) NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ Ill NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEC) ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ 1D NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO: 24, SEQ II) NO: 25, SEQ il) NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEC) [D NO: 30, SEQ ID 31, SEC) I1) NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ LD NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO: 40, SEC) ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ NO: 44, SEQ ID 10 NO: 45, SEQ ID NO: 46, ou SEQ ID NO: 47, et -la deuxième amorce d'une taille comprise de 15 à 30 nucléotides contigus comprend ou est constituée par une séquence choisie parmi:SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO : 59, SEQ ID NO: 60, SEP ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID 15 NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEC)11) NO: 65, SEQ II) NO: 66, SEQ ID NO : 67, SEQ ID NO: 68, SEP ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEP ID NO: 71, SEC) ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEP ID NO : 75, SEP ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ H) NO: 82, ou SEO toi Na 83. 20 8. Marqueur de détection et de préférence d'identification d'une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, CUCUMiS dipsaceus, Cucuinis melo, Cucumis metulifer, Cirerais myriocatpus et Citerais sativus ayant une taille comprise de 90 à 120 paires de bases, ledit marqueur comprenant ou étant constitué par une séquence amplifiée ayant un pourcentage d'identité d'au moins 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%. ou 100% avec une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 5 à 11. 25 Marqueur de détection et préférence d'identification selon la revendication 8, dans lequel ledit marqueur comprend ou est constitué par une séquence amplifiée ayant un pourcentage d'identité d'au moins 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% avec une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 5 à 11 pour détecter ou de préférence identifier respectivement une 30 plante choisie parmi les espèces Citerais anguria, Citerais dipsaceus, Cucumis mata, Cucumis metuliferus, Cucumis miriaearp-us, et Crameis sativus. 10. Procédé d'amplification et d'identification d'au moins une région variable du gène NdnA, ladite région variable constituant un marqueur de détection et de préférence d'identification d'une plante choisie parmi les espèces Cucurnis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis inein, Citerais metulifer, Citerais myrinearpus et Citerais satinas, comprenant ou étant constitué des étapes suivantes: 31 a) une étape d'amplification de ladite région variable du gène WhA susceptible d'être contenue dans un produit ou un échantillon, en utilisant -la paire d'amorces consistant en une première amorce qui s'hybride à une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus choisie dans la séquence de SEQ iD NO: 1 du gène NdhA et une deuxième amorce qui s'hybride à une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 2 du gène Nd/A , b) une étape de détermination ou d'identification de la présence d'une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucuees needo, Cucumis metulifer, Cucwnis rnyriocarinus et Cucumis sativus dans ledit produit ou échantillon par la détection d'au moins une région variable 10 amplifiée du gène Milt4, Procédé d'amplification et d'identification d'au moins une région variable du gène Ndhil selon la. revendication 10, dans lequel ledit procédé comprend en outre avant l'étape a) une étape d'extraction du matériel nucléique d'un produit ou échantillon susceptible de contenir ladite région 15 variable du gène NtlhA 12. Procédé d'amplification et d'identification selon la revendication 10 ou 11, dans lequel ledit procédé comprend en outre une étape e) d'identification d'une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucurnis dipsaceus, Cucumis mei°, Cueurnis menet/fer, Cucumis etyriecarpus et 20 C14711111iS sativus par séquençage de ladite région variable amplifiée et détectée du gène Naltit