Brevet FR3082523A1 — publié le 20191220

La présente demande concerne un procédé de détection de la proportion de bactéries à Gram positif et de la proportion de bactéries à Gram négatif dans un échantillon, en particulier dans un échantillon complexe. La détection des bactéries se fait selon leur signal Gram. Elle concerne également un kit de marquage des bactéries à Gram positif en cytométrie en flux, notamment pour des échantillons complexes comme des échantillons de microbiote - humain ou animal. En particulier, l'invention se rapporte à un kit de marquage de bactéries pour utilisation, notamment dans des méthodes qui font l'objet de l'invention, en cytométrie en flux, alliant une lectine, la lectine de blé (en anglais, Wheat Germ Agglutinin ou WGA), couplée à un fluorochrome, avec un antibiotique, la vancomycine couplée à un fluorochrome émettant une fluorescence à une longueur d'onde différente de celle couplée au WGA. De manière optionnelle, le kit peut comprendre la vancomycine non-couplée à un fluorochrome (non-marquée) et/ou le chlorure de potassium. Le kit est utile pour la détection par fluorescence des bactéries à Gram positif, notamment par couplage des mesures de fluorescence relatives des deux fluorochromes différents. Ces mesures de fluorescence relatives permettent de distinguer des familles bactériennes à Gram positif entre elles. Elles permettent aussi de distinguer les genres bactériens entre eux. Elles permettent également de distinguer des espèces de bactéries à Gram positif telles que Bacillus subtilis, Lactococcus lactis, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, et Lactobacillus spp., entre elles. Cette liste n'est pas exhaustive et de nombreuses espèces aérobies ou anaérobies pourraient être distinguées comme des Clostridium et Faecalibacterium. Le microbiote intestinal humain, couramment appelé « flore intestinale », est l'ensemble des micro-organismes (bactéries, levures et champignons) qui se trouvent dans le système gastro-intestinal humain (estomac, intestin et côlon). La diversité 2 bactérienne est estimée à l'heure actuelle à environ 103espèces bactériennes composant le microbiote intestinal dominant d'un individu adulte, avec une abondance de 1014 bactéries, représentant un métagénome bactérien de 200 000 à 800 000 gènes chez chaque individu, soit 10 à 50 fois le nombre de gènes du génome humain. Ainsi, le 5 microbiote intestinal humain est un écosystème très diversifié, complexe et spécifique de chaque individu. La cytométrie en flux représente une technique intéressante par rapport aux méthodes basées sur la culture pour étudier des écosystèmes complexes comme le microbiote intestinal. Initialement conçue pour l'analyse des cellules, la cytométrie en 10 flux a été adaptée pour caractériser et dénombrer les populations microbiennes. Elle est notamment utilisée pour de la caractérisation microbienne comme la détermination de la sensibilité aux antibiotiques [Saint-Rut C., et al., Antibiotic Susceptibility Testing of the Gram-Negative Bacteria Based on Flow Cytometry. Frontiers in Microbiology, 2016. 7 et Pereira, P.M., et al., Fluorescence ratio imaging microscopy shows decreased access of 15 vancomycin to cell wall synthetic sites in vancomycin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother, 2007. 51(10) : p. 3627-33], l'analyse de la différenciation pendant la formation de biofilms, l'évaluation de la viabilité des populations ou encore la différenciation de bactéries à Gram positif et à Gram négatif. En cytométrie en flux, la discrimination entre les bactéries à Gram positif et celles à Gram négatif est différente de 20 la technique classique de coloration Gram qui se base uniquement sur la présence ou absence de la membrane externe. En cytométrie, la discrimination peut se faire via la présence de structures plus ou moins exprimées à la surface des bactéries ou plus ou moins accessibles. Ainsi, ce ciblage permet parfois d'observer une discrimination plus précise des populations bactériennes. 25 La détermination du statut Gram des populations microbiennes présentes dans des échantillons complexes peut s'effectuer avec des colorations utilisant le violet de gentiane et la safranine ou la fuchsine, par exemple. Les suspensions bactériennes doivent être fixées sur lame avant de pouvoir réaliser la coloration qui alterne les différents colorants, fixateurs, décolorants ainsi que les étapes de lavage et séchage. Ces 30 techniques peuvent donc être chronophages et les résultats obtenus peuvent être 3 variables. En effet, selon les décolorants utilisés, souvent l'acétone et l'éthanol, et les temps de pose, les résultats d'identification peuvent être différents et peuvent induire une mauvaise interprétation du statut Gram de l'échantillon analysé. Afin d'assurer la reproductibilité des résultats, de nouvelles techniques d'identification du statut Gram ont 5 été développées. Cela induit l'utilisation de marqueurs fluorescents pour réaliser des analyses en microscopie ou de plus en plus en cytométrie en flux. Le brevet WO 02/057482 décrit l'utilisation de la lectine WGA labélisée avec le fluorochrome Oregon Green® en combinaison avec un marqueur de l'ADN. Cette combinaison permet de déterminer le pourcentage de bactéries à Gram positif et à Gram 10 négatif dans un mélange de culture pure de différentes bactéries ou d'un échantillon de lait. La lectine WGA couplée à un autre fluorochrome, la fluorescéine isothiocyanate, a aussi été utilisée pour analyser des bactéries acidophiles et archées [ FIFE, D.J., et al., Evaluation of a Fluorescent Lectin-Based Staining Technique for Some Acidophilic Mining Bacteria. Appl Environ Microbiol, 2000. 66(5): p. 2208-2210]. 15 Un des désavantages de l'utilisation du WGA réside dans sa capacité à se fixer sur des structures particulières présentes chez les bactéries à Gram positif, mais non forcément spécifiques de ces bactéries. Certaines des structures reconnues par le WGA peuvent aussi être retrouvées chez des bactéries à Gram négatif. Des méthodes et le kit de la présente invention ont été développés pour permettre 20 une discrimination plus précise entre les bactéries à Gram positif et à Gram négatif, indépendamment de la viabilité de l'échantillon analysé et indépendamment du fait que les bactéries soient aérobies ou anaérobies. Les méthodes sont applicables sur des échantillons complexes comme des échantillons de microbiote. Elles sont également applicables sur des échantillons de cultures bactériennes (non complexes). 25 Sommaire de l'invention La présente invention concerne un procédé de détection dans un échantillon contenant des bactéries, de la proportion de bactéries à Gram positif et de la proportion de bactéries à Gram négatif, comprenant les étapes : 30 a) incubation de l'échantillon, simultanément ou séquentiellement, avec : 4 - la lectine du blé (le WGA), couplée à un fluorochrome, - la vancomycine couplée à un fluorochrome émettant une fluorescence à une longueur d'onde différente de celle couplée au WGA, - optionnellement la vancomycine non-couplée à un fluorochrome (non-marquée), 5 -optionnellement du chlorure de potassium. b) centrifugation de l'échantillon, c) optionnellement lavage de l'échantillon, d) mesure de la fluorescence de l'échantillon. Selon un mode de réalisation de l'invention, le fluorochrome couplé au WGA est 10 Alexa Fluor° 647 et celui couplé à la vancomycine est l'acide propénoïque 3-BODIPY. Selon un mode de réalisation de l'invention, l'étape de mesure est effectuée en moins de 40 minutes, de préférence, en moins de 30 minutes après la fin de l'étape c). Selon un mode de réalisation de l'invention, l'étape d) de mesure est effectuée avec un cytomètre en flux. 15 Selon un mode de réalisation de l'invention, à l'étape a), la concentration de la lectine du blé (le WGA) couplée à un fluorochrome, dans l'échantillon à analyser, est de 5 à 100 gg/ml, de préférence de 20 gg/mlet/ou la concentration finale de la vancomycine couplée à un fluorochrome, dans l'échantillon à analyser, est de 0,15 à 4µg/ml, de préférence 2 µg/ml. 20 Selon un mode de réalisation de l'invention, le temps d'incubation de l'étape a) est de 10 à 30 minutes, de préférence de 15 minutes. Selon un mode de réalisation de l'invention, l'échantillon est un échantillon de microbiote humain ou animal. Selon un mode de réalisation de l'invention, l'échantillon est une culture de 25 bactéries. La présente invention concerne également un procédé de détection, éventuellement de distinction et éventuellement d'identification dans un échantillon bactérien des familles, genres et/ou des espèces de bactéries à Gram positif et de bactéries à Gram négatif comprenant les étapes : 30 a) incubation de l'échantillon, simultanément ou séquentiellement, avec : 5 - la lectine du blé (le WGA), couplée à un fluorochrome, - la vancomycine couplée à un fluorochrome émettant une fluorescence à une longueur d'onde différente de celle couplée au WGA, - optionnellement la va ncomycine, 5 -optionnellement du chlorure de potassium, b) centrifugation de l'échantillon, c) optionnellement lavage de l'échantillon, d) mesure de la fluorescence de l'échantillon e) analyse des fluorescences relatives des deux fluorochromes 10 f) éventuellement distinction et éventuellement identification des familles, genres et/ou espèces bactérien(ne)s à Gram positif et à Gram négatif. Selon un mode de réalisation de l'invention, le fluorochrome couplé au WGA est Alexa Fluor° 647 et celui couplé à la vancomycine est l'acide propénoïque 3-BODIPY. La présente invention concerne également un kit de marquage des bactéries à 15 Gram positif pour utilisation dans les procédés précités. Ainsi, l'invention concerne un kit de marquage des bactéries à Gram positif, pour utilisation en cytométrie en flux, comprenant : i. la lectine du blé (le WGA), couplée à un fluorochrome, ii. la vancomycine couplée à un fluorochrome émettant une fluorescence à 20 une longueur d'onde différente de celle couplée au WGA, et iii. optionnellement la vancomycine, iv. optionnellement du chlorure de potassium. Selon un mode de réalisation de l'invention, les fluorochromes sont choisis parmi le groupe des agents de marquage Alexa Fluor®, l'acide propénoïque 3-BODIPY ou un de 25 ses dérivés, la fluorescéine ou l'un de ses dérivés, sels ou esters, les agents de marquage Cy, les agents de marquage CF, des fluorochromes conjugués. Selon un mode de réalisation de l'invention, le fluorochrome couplé au WGA est choisi parmi des agents de marquage Alexa Fluor®, la fluorescéine ou l'un de ses dérivés, sels ou esters. 6 Selon un mode de réalisation de l'invention, le fluorochrome couplé à la vancomycine est choisi parmi l'acide propénoïque 3-BODIPY ou un de ses dérivés, la fluorescéine ou l'un de ses dérivés, sels ou esters, notamment FITC. Selon un mode de réalisation de l'invention, le fluorochrome couplé au WGA est 5 Alexa Fluor® 647 et celui couplé à la vancomycine est l'acide propénoïque 3-BODIPY. Description des Figures La Figure 1 : Des résultats de cytométrie en flux de l'Exemple 1. L'axe X représente 10 l'intensité de la fluorescence à une longueur d'onde de 540nm ± 15nm, qui correspond à la fluorescence de la vancomycine couplée à Bodipy® FL. L'axe Y représente l'intensité de la fluorescence à une longueur d'onde de 670nm ± 15nm, qui correspond à la fluorescence de WGA couplé à Alexa Fluor°647. La Figure 2 : Des résultats de cytométrie en flux de l'Exemple 2. L'axe X représente 15 l'intensité de la fluorescence à une longueur d'onde de 540nm ± 15nm, qui correspond à la fluorescence de la vancomycine couplée à Bodipy®FL. L'axe Y représente l'intensité de la fluorescence à une longueur d'onde de 670nm ± 15nm, qui correspond à la fluorescence de WGA couplé à Alexa Fluor® 647. Les Figures 3A et 3B : Des résultats de l'expérience décrite à l'Exemple 3. La Figure 20 3A montre la moyenne géométrique des fluorescences obtenues, pour les différentes espèces testées, à une longueur d'onde de 540nm ± 15nm, qui correspond à la fluorescence de la vancomycine couplée à Bodipy® FL. Le graphique de la Figure 3B montre la moyenne géométrique des fluorescences obtenues, pour les différentes espèces testées, à une longueur d'onde de 670nm ± 15nm, qui correspond à la 25 fluorescence de WGA couplé à Alexa Fluor® 647®. 7 Description Détaillée Les inventeurs en cherchant des moyens de déterminer avec plus de précision des bactéries à Gram positif ont développé un kit et un procédé basés sur la combinaison 5 d'une lectine, le WGA, et d'un antibiotique, la vancomycine, couplés aux fluorochromes émettant de la fluorescence à des longueurs d'onde différentes. Cette combinaison permet d'analyser en cytométrie en flux la proportion de bactéries à Gram positif et à Gram négatif dans des échantillons complexes, tels que des échantillons de microbiote. Par « bactéries à Gram positif » on entend des bactéries qui sont mises en évidence 10 par le marquage de Gram (le violet de gentiane). Par « bactéries à Gram négatif » on entend des bactéries qui ne sont pas mises en évidence par le marquage de Gram. La vancomycine volumineuse (1500 à 2 000 daltons) est un glycopeptide qui inhibe la synthèse du peptidoglycane des bactéries en se fixant sur les chaines D-Ala-D-Ala terminales. Ces structures sont aussi retrouvées chez les bactéries à Gram négatif mais 15 ne sont pas accessibles par la vancomycine de par la présence de la membrane externe. En outre, la vancomycine est trop volumineuse pour emprunter les pores de la membrane extérieure des bactéries à Gram négatif. Par contre, la vancomycine ne se fixe pas sur les bactéries résistantes qui ne possèdent pas cette chaine D-Ala-D-Ala et par conséquent ne marque pas ces dernières. 20 Le WGA n'est pas, à la différence de la vancomycine, spécifique des bactéries à Gram positif. Il se fixe préférentiellement et différentiellement sur ces bactéries grâce à leur reconnaissance de structures plus ou moins présentes chez les bactéries à Gram positif, l'acide sialique et le N-acétyl-D-glucosamine. Nous pouvons donner comme exemple le Streptococcus agalactioe, plus connu sous le nom de Streptococcus B (SGB) 25 qui possède beaucoup d'acide sialique dans sa paroi induisant un marquage important par le WGA. L'ajout de WGA en plus de la vancomycine permet de renforcer l'identification de bactéries à Gram positif qui pourraient être résistantes à la vancomycine et donc non identifiées avec uniquement cet antibiotique. Ainsi, cette combinaison de ces deux 30 marqueurs - vancomycine couplée au premier fluorochrome et WGA couplé au deuxième 8 fluorochrome -représente une combinaison intéressante non seulement pour discriminer les populations à Gram positif et à Gram négatif, mais également pour pouvoir générer un signal fluorescent signature des espèces de bactéries à Gram positif présentes dans l'échantillon. Ces informations permettent de caractériser des populations bactériennes 5 complexes, telles que celles typiques des échantillons de microbiote, notamment des échantillons humain et animal. Des exemples de fluorochromes incluent, mais ne sont pas limités à des agents de marquage Alexa Fluor®, BODIPY®, fluorescéine ou l'un de ses dérivés, sels ou esters, des agents de marquage Oregon Green® 488 et Oregon Green® 514, des agents 10 de marquage Rhodamine Green et Rhodamine Green-X, éosine, tétraméthylrhodamine, des agents de marquage Lissamine Rhodamine B et Rhodamine Red-X, X-Rhodamine, des agents de marquage Texas Red® et Texas Red®-X, naphthofluorescéine ou l'un de ses dérivés, sels ou esters, Carboxyrhodamine 6G, des agents de marquage QSY : désactivateurs de fluorescence, vert de malachite non fluorescent, dérivés de coumarine, 15 l'agent de marquage Pacific Orange, Cascade Blue et autres dérivés pyrène, Cascade Yellow et autres dérivés pyridyloxazole, des naphtalènes (par exemple, chlorure de dansyle), l'agent de marquage dapoxyl, bimane, 1-diméthylamine-N(2- azidoéthyl) naphthalène-5 -sulfonamide, 6-(6-amino-2-(2-azidoéthy1)1,3-dioxo-1H- benzo(de)-2(3H)isoquinoléine, 6-(6-amino-2-(2-propiny1)1,3-dioxo-1H-benzo(de)- 20 2(3H)isoquinoléine, 8-(4-azidoéthyloxyphény1)-2,6-diéthy1-1,3,5,7-tétraméthyl-4,4- difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacène, 8-(4-propynyloxyphény1)-2,6-diéthy1-1,3,5,7- tétraméthyl-4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacène, 1-(3-azido-propoxy)-7- méthylamino-phénoxazine-3-one, 1-(2-propynyI)-7-méthylamino-phénoxazine-3-one, chlorure de N-(5-(3-azidopropylamino)-9H-benzo(a)-phénoxazine-9-ylidène)-N-méthyl- 25 méthanaminium, chlorure de N-(5-(3-propynyl-amino)-9H-benzo(a)-phénoxazine-9- ylidène)-N-méthyl-méthanaminium, perchlorate de (9-(3-azido-propoxy)-7-pipéridine-1- yl-phénoxazine-3-ylidène)-diméthyl-ammoniu m. On peut également citer (les) dérivé(s) de 4-méthylumbelliférone, 1-(2-benzoylphény1)-6-chloro-1H-indo1-3-yl-bêta- glucopyranoside; 1-(2-benzoylphény1)-6-chloro-1H-indo1-3-yl-bêta-galactopyranoside; 130 (2-benzoylphény1)-6-chloro-1H-indo1-3-yl-acétate; 1-(2-benzoylphényI)-6-chloro-1H- 9 indol-3-yl-phosphate, l'acide 8-hydroxypyrène-1,3,6-trisulfonique (HPTS), un composé cyanine ou l'un de ses dérivés. Voir également, Kele et al. (2009) Org. Biomol. Chem. 7:3486-3490; Nagy et al. (2010) Chem. Asian J. 5:773-777; Filnov et al. (2011) Nat. Biotechnol. 29:757-761; Subach et al. (2011) Nature Methods 8:771-777; Yang et al. 5 (2011) J. Am. Chem. Soc. 133:9964- 9967; Zin (2011) Nature Methods 8:726-728; et "Fluorophores and their amine- reactive derivatives," Chapitre 1. En tant que fluorochromes préférés pour utilisation dans l'invention, on peut citer les fluorochromes dans le Tableau 1 ci-dessous : Fluorochromes conjugués 30230-57-0 Aminocoumarine 350 445 330 Ester de Succinimidyle Flu rochr me (nom) f excitation émission (nnri) i ( Notes Numér CAS I lydroxycoumarine 325 R 386 331 Ester de Succinimidyle 43070-85-5 Ester de Succinimidyle 317 Cascade Blue (375) ; 401 C. Pacific Blue 403 Pacific Orange Lucifer Yellow Hydrazide 423 455 551 528 596 406 Maléimide 1122414-42-9 82446-52-4 Méthoxycoumarin 360 410 10 10 Fluorochrome h P Notes Numéro CAS (nom) Ir excitation émission (rtm) (nm) 466 NBD-X 539 294 R-Phycoerythrin (PE) 11016-17-4 578 I 240 k 480 ; 565 PE-Cy5 conjugates 670 480 ; 565 ; 650 aka Cychrome, R670, Tri-Color, Quantum Red PE-Cy7 conjugates 767 480 ; 565 ; 743 Red 613 480 565 ï 613 PE-Texas Red PerCP 490 l 675 Protéine de chlorophylle de péridinine TruRed 396076-95-2 490, 675 695 PerCP-Cy5.5 conjugate 494 520 587 (GE Healthcare) Fluorescéine 495 389 FITC ; sensible au i 2321-07-5 PH BODIPY® FL 165599-63-3 TRITC 572 i 444 TRITC 107347-53-5 11 Fluorochrome 1). PM Notes Nurnéro CAS (nom) Ir excitation émission X-Rhodamine Lissa mine Rhodamine B Texas Red Allophycocyanin (APC) APC-Cy7 conjugates Marqueurs Alexa Fluor® Fluor chrome excitation d émissions P Des ctiv tour Numéro CAS (nm) (lm) 244636-14-4 1.442 410 5 9 Alexa Fluor® 350 Alexa Fluor® 405 Alexa Fluor® 430 Alexa Fluor® 488 499 B Alexa Fluor® 500 503 525 343 401 ti 421 1028 3520-42-1 650 . 755 767 570 i 576 548 1 XRITC 874103-50- 1, 874103-51-2 589 615 625 I Chlorure de Sulfonyle 82354-19-6 PharRed 660 104 k 570 590 12 i Alexa Fluor® 514 517 ! 542 714 1 798557-07-0 , ; ,- , , ç Alexa Fluor® 532 , 530 555 ; 724 1 QY 0.61 247145-11-5 1 , 7 i 1 Alexa Fluor® 546 561 572 1079 i QY 0.79 247145-23-9 , F ^ 1 Alexa Fluor® 555 553 ( 568 ; 1250 ! QY 0.1 644990-77-2 REVENDICATIONS1. Procédé de détection dans un échantillon contenant des bactéries, de la proportion de bactéries à Gram positif et de la proportion de bactéries à Gram négatif, comprenant les étapes : a) incubation de l'échantillon, simultanément ou séquentiellement, avec : - la lectine du blé (le WGA), couplée à un fluorochrome, - la vancomycine couplée à un fluorochrome émettant une fluorescence à une longueur d'onde différente de celle couplée au WGA, - optionnellement la vancomycine non-couplée à un fluorochrome (non- marquée), -optionnellement du chlorure de potassium. b) centrifugation de l'échantillon, c) optionnellement lavage de l'échantillon, d) mesure de la fluorescence de l'échantillon. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le fluorochrome couplé au WGA est Alexa Fluor® 647 et celui couplé à la vancomycine est l'acide propénoïque 3-BODIPY. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'étape de mesure est effectuée en moins de 40 minutes, de préférence, en moins de 30 minutes après la fin de l'étape c). 4. Procédé selon la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce que l'étape d) de mesure est effectuée avec un cytomètre en flux. 5. Le procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que, à l'étape a), la concentration de la lectine du blé (le WGA) couplée à un fluorochrome, dans l'échantillon à analyser, est de 5 à 100 µg/ml, de préférence de 20 µg/ml et/ou la concentration finale de la vancomycine couplée à un fluorochrome, dans l'échantillon à analyser, est de 0,15 à 4 p.g/ml, de préférence 2 µg/ml. 6. Le procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le temps d'incubation de l'étape a) est de 10 à 30 minutes, de préférence de 15 minutes. 31 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'échantillon est un échantillon de microbiote humain ou animal. 8. Procédé de détection, éventuellement de distinction et d'identification dans un échantillon bactérien des familles, genres et/ou des espèces de bactéries à Gram 5 positif et de bactéries à Gram négatif comprenant les étapes : a) incubation de l'échantillon, simultanément ou séquentiellement, avec : - la lectine du blé (le WGA), couplée à un fluorochrome, - la vancomycine couplée à un fluorochrome émettant une fluorescence à une longueur d'onde différente de celle couplée au WGA, 10 - optionnellement la vancomycine, -optionnellement du chlorure de potassium, b) centrifugation de l'échantillon, c) optionnellement lavage de l'échantillon, d) mesure de la fluorescence de l'échantillon 15 e) analyse des fluorescences relatives des deux fluorochromes f) éventuellement distinction et identification des familles, genres et/ou espèces bactérien(ne)s à Gram positif et à Gram négatif. 9. Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce que le fluorochrome couplé au 20 WGA est Alexa Fluor® 647 et celui couplé à la vancomycine est l'acide propénoïque 3-BODIPY. 10. Kit de marquage des bactéries à Gram positif pour utilisation en cytométrie en flux, caractérisé en ce qu'il comprend : i. la lectine du blé (le WGA), couplée à un fluorochrome, 25 ii. la vancomycine couplée à un fluorochrome émettant une fluorescence à une longueur d'onde différente de celle couplée au WGA, et iii. optionnellement la vancomycine, iv. optionnellement du chlorure de potassium. 30 11. Le kit selon la revendication 10, caractérisé en ce que les fluorochromes sont choisis parmi le groupe des agents de marquage Alexa Fluor®, l'acide propénoïque 32 3-BODIPY ou un de ses dérivés, la fluorescéine ou l'un de ses dérivés, sels ou esters, les agents de marquages Cy, les agents de marquages CF, des fluorochromes conjugués. 12. Le kit selon la revendication 11, caractérisé en ce que le fluorochrome couplé au 5 WGA est choisi parmi des agents de marquage Alexa Fluor®, la fluorescéine ou l'un de ses dérivés, sels ou esters. 13. Le kit selon la revendication 11, caractérisé en ce que le fluorochrome couplé à la vancomycine est choisi parmi l'acide propénoïque 3-BODIPY ou un de ses dérivés, la fluorescéine ou l'un de ses dérivés, sels ou esters, notamment FITC. 10 14. Le kit selon l'une des quelconque revendications 11 à 13, caractérisé en ce que le fluorochrome couplé au WGA est Alexa Fluor® 647 et celui couplé à la vancomycine est l'acide propénoïque 3-BODIPY.