Brevet FR3082944A1 — publié le 20191227

Procédé d'observation d'un échantillon par imagerie sans lentille, avec prise en compte d'une dispersion spatiale dans l'échantillon Description DOMAINE TECHNIQUE Le domaine technique de l'invention est l'observation d'un échantillon, notamment un échantillon comportant des particules, par imagerie sans lentille, ou par imagerie dite défocalisée. ART ANTERIEUR L'imagerie sans lentille s'est développée ces dernières années, et ses applications pour la caractérisation d'échantillons se multiplient, par exemple dans le domaine du diagnostic médical, de la culture cellulaire, de l'analyse biologique ou dans le domaine de l'agroalimentaire. Cette technique permet en effet d'obtenir, à bas coût, une image d'un échantillon selon un champ d'observation élevé. L'application d'algorithmes de reconstruction holographiques à des images obtenues selon une configuration sans lentille permet d'obtenir des images exploitables d'échantillons, ce qui constitue une alternative à bas coût à la microscopie conventionnelle, tout en bénéficiant d'un champ d'observation étendu. Différents documents décrivent l'utilisation de l'imagerie sans lentille pour l'observation d'échantillons. Par exemple, le document W02016189257 décrit l'application de l'imagerie sans lentille, couplée à des algorithmes de reconstruction holographique, à l'observation de lames de tissus à des fins de diagnostic. Les documents W02016151248 ou W02017178723 décrivent le recours à l'imagerie sans lentille pour caractériser des cellules dans un échantillon. La technique décrite dans ces documents est basée sur l'acquisition d'une image à l'aide d'un capteur d'image placé face à un échantillon. L'application d'un algorithme de reconstruction holographique permet de former des profils représentatifs de l'onde lumineuse à laquelle est exposé le capteur d'image. A partir des profils, on caractérise les cellules placées dans l'échantillon. Le recours à des profils permet d'être peu sensible à la position d'une cellule à caractériser dans l'échantillon, et en particulier à la distance entre la cellule et l'échantillon. Une difficulté associée à l'application d'algorithmes de reconstruction holographique est qu'il est nécessaire de connaître la distance entre le capteur d'image et l'échantillon. Cependant, lorsque l'échantillon comporte des particules, la position de ces dernières, par rapport au capteur d'image, peut varier dans l'épaisseur de l'échantillon. Ainsi, les images obtenues par reconstruction holographique peuvent être nettes pour certaines particules, mais floues pour 2 d'autres particules. L'invention permet de surmonter cette difficulté, en permettant une formation d'une image sur laquelle différentes particules, situées à différentes distances du capteur d'image, apparaissent nettes, sans nécessiter une multiplication d'acquisitions d'images. Ainsi, l'invention permet d'augmenter la profondeur de champ de l'imagerie sans 5 lentille. EXPOSE DE L'INVENTION Un premier objet de l'invention est un procédé d'observation d'un échantillon comportant les étapes suivantes : a) illumination de l'échantillon à l'aide d'une source de lumière, la source de lumière 10 émettant une onde lumineuse incidente se propageant vers l'échantillon selon un axe de propagation; b) acquisition, à l'aide d'un capteur d'image, d'une image de l'échantillon, formée dans un plan de détection, l'échantillon étant disposé entre la source de lumière et le capteur d'image, chaque image étant représentative d'une onde lumineuse d'exposition, à 15 laquelle est exposé le capteur d'image sous l'effet de l'illumination, l'image comportant des pixels, chaque pixel correspondant à une position radiale définie dans un plan parallèle au plan de détection ; c) formation d'une pile d'images complexes, dites images reconstruites, à partir de l'image acquise lors de l'étape b), chaque image reconstruite étant obtenue par l'application 20 d'un opérateur de propagation numérique, selon une distance de reconstruction, le long de l'axe de propagation, la pile d'images comportant autant d'images reconstruites que de distances de reconstruction différentes, chaque image reconstruite étant représentative d'une onde lumineuse d'exposition à laquelle est exposé le capteur d'image ; 25 d) à partir de chaque image de la pile d'images, calcul d'un indicateur de netteté pour différentes positions radiales, chaque indicateur de netteté étant associé à une position radiale et à une distance de reconstruction ; le procédé étant caractérisé en ce qu'il comporte également les étapes suivantes : e) prise en compte d'un critère de sélection ; 30 f) pour chaque position radiale, et en fonction du critère de sélection, sélection d'un indicateur de netteté, parmi les différents indicateurs de netteté définis, à la position radiale, à partir des différentes images reconstruites, l'indicateur de netteté sélectionné étant associé à une image reconstruite optimale pour la position radiale considérée; 3 g) formation d'une image d'observation de l'échantillon, dont chaque pixel est associé à une position radiale, la valeur de pixels de l'image d'observation, voire de chaque pixel de l'image d'observation, étant déterminée en fonction de la valeur, à la position radiale du pixel, de l'image reconstruite optimale. 5 Le procédé peut comprendre, suite à l'étape f), une détermination, pour chaque position radiale considérée, d'une distance optimale, correspondant à la distance de reconstruction de l'image reconstruite optimale associée à la position radiale. Selon un mode de réalisation, chaque indicateur de netteté est calculé à partir d'une image élémentaire, l'image élémentaire étant établie à partir du module et/ou de l'argument et/ou de 10 la partie réelle et/ou de la partie imaginaire d'une image reconstruite. Une image élémentaire correspond à une image formée de valeurs scalaires, obtenue à partir d'une image reconstruite. L'étape d) peut comporter, pour chaque position radiale considérée, un calcul d'un gradient de l'image élémentaire, en la position radiale, selon une direction de gradient. Selon un mode de réalisation, l'étape d) comporte, pour chaque image reconstruite de la pile 15 d'images: - un calcul d'une image de gradient, représentative d'un gradient de l'image reconstruite selon au moins une direction de gradient; - un calcul d'une norme de l'image de gradient ; de telle sorte que l'indicateur de netteté, en chaque position radiale, est obtenu à partir de la 20 norme de l'image de gradient à la position radiale. L'étape f) peut comporter une prise en compte d'une plage de validité, et un rejet d'un indicateur de netteté sélectionné si la distance de reconstruction qui lui est associée n'est pas comprise dans la plage de validité. Lors de l'étape g), l'image d'observation, à chaque position radiale, peut être obtenue à partir 25 de l'image reconstruite optimale pour la position radiale considérée. Selon un mode de réalisation, aucune optique de formation d'image n'est disposée entre l'échantillon et le capteur d'image. Selon un autre mode de réalisation, un système optique est disposé entre l'échantillon et le capteur d'image, le système optique conjuguant un plan image à un plan objet, le plan de détection étant distant du plan image, ou l'échantillon étant distant 30 du plan objet, le plan de détection étant décalé par rapport au plan image,et/ou l'échantillon étant décalé du plan objet, de telle sorte que l'image acquise par le capteur d'image est une image défocalisée de l'échantillon. L'échantillon peut être maintenu dans ou sur un élément de maintien, l'échantillon étant immobile par rapport à l'élément de maintien. L'échantillon peut comporter des particules. Le procédé peut alors comporter une étape h) de caractérisation des particules à partir de l'image d'observation de l'échantillon, la caractérisation comprenant: - un comptage des particules ; 5 - et/ou une détermination d'une taille et/ou d'une forme des particules ; - et/ou un comptage de particules en fonction de leur taille et/ou de leur forme ; - et/ou une détermination d'une position tridimensionnelle des particules. Les particules peuvent être immobiles par rapport à l'élément de maintien. Un deuxième objet de l'invention est un dispositif pour l'identification d'un échantillon, 10 comportant : une source de lumière configurée pour émettre une onde lumineuse incidente se propageant vers l'échantillon; un capteur d'image ; un support, configure pour maintenir l'échantillon entre la source de lumière et le 15 capteur d'image; un processeur, configuré pour recevoir une image de l'échantillon acquise par le capteur d'image et pour mettre en oeuvre les étapes c) à g) d'un procédé selon le premier objet de l'invention. Selon un mode de réalisation, aucune optique de formation d'image n'est disposée entre 20 l'échantillon et le capteur d'image. Selon un mode de réalisation, le dispositif comporte un système optique définissant une configuration de mise au point, selon laquelle le capteur d'image est conjugué d'un plan passant par l'échantillon, le dispositif étant tel que le capteur d'image ou l'échantillon sont décalés par rapport à la configuration de mise au point, de telle sorte que lors de l'étape b), le capteur 25 d'image acquiert une image défocalisée de l'échantillon. D'autres avantages et caractéristiques ressortiront plus clairement de la description qui va suivre de modes particuliers de réalisation de l'invention, donnés à titre d'exemples non limitatifs, et représentés sur les figures listées ci-dessous. FIGURES 30 La figure 1A représente un exemple de dispositif selon l'invention. La figure 1B représente une source de lumière dans un mode de réalisation de l'invention. La figure 2A représente une image d'un échantillon acquise par un capteur d'image. La figure 2B montre une image reconstruite selon l'art antérieur, en considérant une distance de reconstruction "moyenne". 5 La figure 2C montre une image désignée par le terme "image d'observation", obtenue en mettant en oeuvre l'invention. La figure 2D représente des images, dites images élémentaires, obtenues sur la base d'images complexes reconstruites à différentes distances de reconstruction. Les images élémentaires 5 formant une pile d'images élémentaires de l'échantillon. La figure 3 illustre les principales étapes d'un procédé selon l'invention. Les figures 4A et 4B sont des images d'un même échantillon obtenues à l'aide d'un microscope, respectivement selon deux plans focaux différents. Les figures 4C et 4D sont des images de l'échantillon représenté sur les figures 4A et 4B, ces 10 images étant obtenues par imagerie sans lentille respectivement selon l'art antérieur et en mettant en oeuvre l'invention. Les figures 5A et 5B sont des images d'un échantillon obtenues par imagerie sans lentille respectivement selon l'art antérieur et en mettant en oeuvre l'invention. La figure 6 est un autre exemple de dispositif convenant à une mise en oeuvre de l'invention. 15 EXPOSE DE MODES DE REALISATION PARTICULIERS La figure lA représente un exemple de dispositif selon l'invention. Une source de lumière 11 est configurée pour émettre une onde lumineuse 12, dite onde lumineuse incidente, se propageant en direction d'un échantillon 10, selon un axe de propagation Z. L'onde lumineuse 12 est émise selon une bande spectrale d'illumination Ak. 20 L'échantillon 10 est un échantillon que l'on souhaite caractériser. L'échantillon comporte un milieu 10m, par exemple un milieu liquide, dans lequel baignent des particules 10p. Les particules peuvent être des cellules, ou des microorganismes, ou des microalgues, ou leur fragment. Par microorganisme, on entend notamment une levure, une bactérie, une spore, un champignon. Le terme particules peut également désigner particules solides, en particulier des 25 microbilles, par exemple des microbilles métalliques, des microbilles de verre ou des microbilles organiques, couramment mises en oeuvre dans des protocoles biologiques. Il peut également s'agir de gouttelettes insolubles baignant dans un milieu liquide, par exemple des gouttelettes lipidiques dans une émulsion de type huile dans eau. Les particules peuvent avoir un diamètre ou une diagonale inférieure à 100 jim. Elles peuvent être inscrites dans un cercle ou une sphère 30 dont le diamètre est inférieur à 100 p.m. Le milieu 10m peut être un milieu solide ou un milieu formant un gel. Le milieu 10m peut comporter un liquide corporel, par exemple, et à de façon non limitative, du sang, de l'urine, de 6 la lymphe ou du liquide céphalo-rachidien. Il peut s'agir d'un milieu de culture, propice au développement de cellules ou de microorganismes. L'échantillon 10 est maintenu par un élément de maintien 15. L'élément de maintien a pour fonction de maintenir l'échantillon face au capteur d'image 16. Il est de préférence transparent 5 ou translucide. L'élément de maintien peut être une lame transparente, par exemple une lame de verre, ou une chambre fluidique. Dans l'exemple représenté sur la figure 1A, l'élément de maintien 15 est une chambre fluidique de type Gene Frame® d'épaisseur e=250 11m. L'épaisseur e de l'échantillon 10, selon l'axe de propagation Z, varie typiquement entre 10 ii.rn et 1 cm, et est de préférence comprise entre 20 11m et 1 mm. L'échantillon 10 est maintenu sur un support 10 lOs à une distance d d'un capteur d'image 16. La distance D entre la source de lumière 11 et la chambre fluidique 15 est de préférence supérieure à 1 cm. Elle est de préférence comprise entre 2 et 30 cm. Avantageusement, la source de lumière, vue par l'échantillon, est considérée comme ponctuelle. Cela signifie que son diamètre (ou sa diagonale) est préférentiellement inférieur au dixième, mieux au centième de 15 la distance entre la chambre fluidique 15 et la source de lumière. Sur la figure 1, la source de lumière est une diode électroluminescente. Elle est généralement associée à diaphragme 18, ou filtre spatial. L'ouverture du diaphragme est typiquement comprise entre 5 p.m et 1 mm, de préférence entre 50 m et 500 'mn. Dans cet exemple, le diaphragme est fourni par Thorlabs sous la référence P1505 et son diamètre est de 150 iirn. Le diaphragme peut être remplacé par 20 une fibre optique, dont une première extrémité est placée face à la source de lumière 11 et dont une deuxième extrémité est placée en regard de l'échantillon 10. Le dispositif représenté sur la figure 1 comporte également un diffuseur 17, disposé entre la source de lumière 11 et le diaphragme 18. L'usage d'un tel diffuseur permet de s'affranchir de contraintes de centrage de la source de lumière 11 par rapport à l'ouverture du diaphragme 18. La fonction d'un tel 25 diffuseur est de répartir le faisceau lumineux, produit par une source de lumière élémentaire 11 selon un cône d'angle a. De préférence, l'angle de diffusion a varie entre 100 et 80°. Alternativement, la source de lumière peut être une source laser, telle une diode laser. Dans ce cas, il n'est pas recommandé de lui associer un filtre spatial ou un diffuseur, comme décrit dans le document US2017317125. 30 De préférence, la bande spectrale d'émission A2L de l'onde lumineuse incidente 12 a une largeur de bande inférieure à 100 nm. Par largeur de bande spectrale, on entend une largeur à mi-hauteur de ladite bande spectrale. 7 Selon un mode de réalisation, la source de lumière 11 comporte plusieurs sources de lumière élémentaires 11k, chacune étant configurée pour émettre une onde lumineuse incidente 12k dans une bande spectrale AX.k. Une telle source de lumière est représentée sur la figure 1B. De préférence, les bandes spectrales a2g, des différentes sources de lumière nk sont différentes les 5 unes des autres. Une telle configuration est décrite dans le document W02016189257. L'échantillon 10 est disposé entre la source de lumière 11 et un capteur d'image 16. Le capteur d'image 16 est configuré pour former une image /0 de l'échantillon 10 selon un plan de détection Po. Dans l'exemple représenté, il s'agit d'un capteur d'image comportant une matrice de pixels, de type CCD ou un CMOS. La matrice de pixel forme le plan de détection Po. Le plan de détection 10 P0 s'étend de préférence perpendiculairement à l'axe de propagation Z de l'onde lumineuse incidente 12. Le plan de détection s'étend selon un plan radial XY, défini par deux axes X et Y, le plan radial étant perpendiculaire à l'axe de propagation Z. La distance d entre l'échantillon 10 et la matrice de pixels du capteur d'image 16 est préférentiellement comprise entre 50 pm et 2 cm, de préférence comprise entre 100 pm et 2 15 mm. On remarque, dans ce mode de réalisation, l'absence d'optique de grossissement ou de formation d'image entre le capteur d'image 16 et l'échantillon 10. Cela n'empêche pas la présence éventuelle de microlentilles de focalisation au niveau de chaque pixel du capteur d'image 16, ces dernières n'ayant pas de fonction de grandissement de l'image acquise par le 20 capteur d'image, leur fonction étant d'optimiser l'efficacité de collecte de la lumière par les pixels. Sous l'effet de l'onde lumineuse incidente 12, les particules présentes dans l'échantillon peuvent engendrer une onde diffractée 13, susceptible de produire, au niveau du plan de détection P0, des interférences, en particulier avec une partie de l'onde lumineuse incidente 12' transmise par 25 l'échantillon. Par ailleurs, l'échantillon peut absorber une partie de l'onde lumineuse incidente 12. Ainsi, l'onde lumineuse 14, transmise par l'échantillon, et à laquelle est exposé le capteur d'image 16, désignée par le terme "onde d'exposition", peut comprendre : une composante 13 résultant de la diffraction de l'onde lumineuse incidente 12 par chaque particule de l'échantillon ; 30 une composante 12' résultant de la transmission de l'onde lumineuse incidente 12 par l'échantillon, une partie de cette dernière pouvant être absorbée dans l'échantillon. 8 Ces composantes forment des interférences dans le plan de détection. Aussi, l'image acquise par le capteur d'image comporte des figures d'interférences (ou figures de diffraction), dues aux différentes particules de l'échantillon Un processeur 20, par exemple un microprocesseur, est configuré pour traiter chaque image /0 5 acquise par le capteur d'image 16, selon les étapes décrites ci-après. En particulier, le processeur est un microprocesseur relié à une mémoire programmable 22 dans laquelle est stockée une séquence d'instructions pour effectuer les opérations de traitement d'images et de calculs décrites dans cette description. Le processeur peut être couplé à un écran 24 permettant l'affichage d'images acquises par le capteur d'image 16 ou calculées par le processeur 20. 10 Du fait de l'absence d'optique de formation d'image, une image /0 acquise par le capteur d'image 16, également appelée hologramme, ne permet pas d'obtenir une représentation suffisamment précise de l'échantillon observé. L'image acquise Io peut notamment comporter un grand nombre de figures d'interférence, et peut ne pas être aisément exploitable pour identifier les particules présentes dans l'échantillon. 15 La figure 2A montre une telle image, l'échantillon étant formé de billes de polystyrène de diamètre 5 im baignant dans de l'eau. La figure 2A a été obtenue en disposant un échantillon 10 à une distance de 700 Inn d'un capteur d'image 16 de type Capteur CMOS monochrome 8 bits comportant 3884 x 2764 pixels, chaque pixel mesurant 1.67 p.m de côté. La source de lumière était une diode électroluminescente de type Cree MC-E Color, comportant trois diodes 20 électroluminescentes pouvant être simultanément ou successivement activées, chaque diode émettant respectivement dans les bandes spectrales AX suivantes : 450nm -465 nm ; 520nm - 535 nm ; 620nm -630 nm. Seule la bande spectrale 450 nm -465 nm a été mise en oeuvre. La source de lumière était disposée à une distance de 5 cm de l'échantillon. On peut appliquer, à l'image /0 acquise par le capteur d'image, un opérateur de propagation 25 holographique h, de façon à calculer une grandeur représentative de l'onde lumineuse d'exposition 14. Il est alors possible de reconstruire une expression complexe A de l'onde lumineuse 14 en tout point de coordonnées (x, y, z) de l'espace, et en particulier dans un plan de reconstruction Px situé à une distance I z I du capteur d'image 16, dite distance de reconstruction, ce plan de reconstruction étant par exemple le plan P10 selon lequel s'étend 30 l'échantillon, avec : A(x, y, z) = 10(x, y, z) * h (1)* désignant l'opérateur produit de convolution. L'opérateur de propagation h a pour fonction de décrire la propagation de la lumière entre le capteur d'image 16 et un point de coordonnées (x, y, z), situé à une distance Izi du capteur 9 d'image. Il est alors possible de déterminer le module M(x, y, z) et/ou la phase cp(x, y, z) l'onde lumineuse 14, à la distance I z I, avec : M(x, y, z) = abs [A(x, y, z)] ; w(x, y, z) = arg [A(x, y, z)]. 5 Les opérateurs abs et arg désignent respectivement le module et l'argument. L'opérateur de propagation est par exemple la fonction de Fresnel-Helmholtz, telle que : , h(x, y, = -1 e -9exp -) avec2 = -1. jar Az Autrement dit, l'expression complexe A de l'onde lumineuse 14, en tout point de coordonnées (x, y, z) de l'espace, est telle que : A(x, y, z) = M(x, y, 10 Dans la suite de cette description, les coordonnées (x, y) désignent une position radiale dans un plan radial XY parallèle au plan de détection. La coordonnée z désigne une coordonnée selon l'axe de propagation Z. L'expression complexe A est une grandeur complexe dont l'argument et le module sont respectivement représentatifs de la phase et de l'intensité de l'onde lumineuse 14 d'exposition 15 détectée par le capteur d'image 16. Le produit de convolution de l'image /0 par l'opérateur de propagation h permet d'obtenir une image complexe A, représentant une distribution spatiale de l'expression complexe A dans un plan de reconstruction Pz, s'étendant à une distance I z I du plan de détection P0. Dans cet exemple, le plan de détection P0 a pour équation z = 0. L'image complexe A, correspond à une image complexe de l'échantillon dans le plan de reconstruction 20 P. L'image A, est définie à des coordonnées radiales (x, y), de telle sorte que A,(x, y) = A(x, y, z). L'image A, représente également une distribution spatiale bidimensionnelle de l'expression complexe de l'onde d'exposition 14. Un tel procédé, désigné par le terme reconstruction holographique, permet notamment de reconstruire une image du module ou de la phase de l'onde lumineuse d'exposition 14 dans le plan de reconstruction. Pour cela, on peut 25 former des images M, et rp, représentant respectivement le module ou la phase de l'image complexe A,, avec M, = mod (A,) et cp, = arelz). L'application d'un opérateur de reconstruction holographique à une image acquise, selon l'expression (1), peut s'accompagner de la formation d'un bruit affectant les images reconstruites. Afin de limiter l'apparition de ce bruit, l'application de l'opérateur de 30 reconstruction holographique est effectuée selon des algorithmes itératifs de reconstruction holographique. De tels algorithmes sont par exemple décrits : - dans le document W02016189257, en particulier dans les étapes 100 à 150 décrites dans ce dernier ; 10 - ou dans le document W02017162985, et plus précisément selon les étapes 110 à 160 décrites dans ce dernier. L'image représentée sur la figure 2B a été obtenue en appliquant un algorithme de reconstruction holographique, tel que décrit dans W02017162985, à l'image représentée sur la 5 figure 2A. La figure 28 montre une image du module M, d'une image complexe reconstruite Az, la distance de reconstruction z correspondant à une distance entre un plan médian de l'échantillon P10 et le capteur d'image 16. Le plan médian de l'échantillon P10 s'étend parallèlement au plan de détection, selon la mi-épaisseur de l'échantillon. Une telle image permet une observation acceptable de l'échantillon. Cependant, certaines particules, désignées 10 par une flèche, apparaissent sous la forme d'anneaux concentriques. De telles particules sont situées à une distance du capteur d'image différente de la distance de reconstruction considérée. Elles sont éloignées du plan médian P10. De ce fait, elles n'apparaissent pas nettement sur l'image reconstruite dans le plan médian. Ainsi, les images obtenues à partir du module ou de la phase de l'onde lumineuse d'exposition 14 permettent une observation 15 acceptable de l'échantillon 10, et en particulier des particules 10p situées à une distance du capteur d'image 16 correspondant à la distance de reconstruction. Cependant, les particules situées à une distance du capteur d'image 16 supérieure ou inférieure à la distance de reconstruction n'apparaissent pas de façon nette sur ces images. Les inventeurs ont mis au point un procédé permettant de remédier à cela, dont les principales 20 étapes sont décrites ci-après, en lien avec la figure 3. [tape 100: Acquisition d'une image /0 de l'échantillon 10 par le capteur d'image 16, cette image formant un hologramme. Un des intérêts de la configuration sans lentille, représentée sur la figure 1A, est le large champ observé, permettant d'adresser simultanément un volume d'échantillon élevé. Le champ observé dépend de la taille du capteur d'image, en étant 25 légèrement inférieur à la surface de détection de ce dernier, du fait de l'espacement entre les pixels du capteur et l'échantillon. Le champ observé est généralement supérieur à 10 mrn2, et est typiquement compris entre 10 mrn2 et 50 mrn2, ce qui est significativement plus élevé qu'avec un microscope conventionnel. [tape 110 : Obtention d'une pile d'images reconstruites. 30 Cette étape comporte une reconstruction de plusieurs images complexes en effectuant des reconstructions holographiques à différentes distances de reconstruction zi du plan de détection Pp. On obtient alors une pile d'images complexes A71. Chaque image complexe A de 11 la pile d'images est reconstruite à une distance de reconstruction z1, de telle sorte que zi,j. .z1 z, avec : z1=1 représentant une distance minimale du capteur d'image, selon l'axe Z, à laquelle une image complexe Azi=i est reconstruite ; 5 2.1-1 représentant une distance maximale du capteur d'image, selon l'axe Z, à laquelle une image complexe Aii.1 est reconstruite. Chaque indice] est un entier naturel indexant une distance de reconstruction, avec 1 j J, J étant le nombre d'images complexes Azi dans la pile d'images. De préférence, les distances de reconstruction z1 encadrent l'échantillon 10. Si l'échantillon 10 s'étend, selon l'axe de propagation Z, entre deux distances zmir, et .zn,', par rapport au capteur d'image 16, avec znii' REVENDICATIONS1. Procédé d'observation d'un échantillon (10) comportant les étapes suivantes : a) illumination de l'échantillon à l'aide d'une source de lumière (11), la source de lumière émettant une onde lumineuse incidente (12) se propageant vers l'échantillon (10) selon un axe de propagation (Z) ; b) acquisition, à l'aide d'un capteur d'image (16), d'une image (4) de l'échantillon (10), formée dans un plan de détection (P0), l'échantillon étant disposé entre la source de lumière (11) et le capteur d'image (16), chaque image étant représentative d'une onde lumineuse d'exposition (14), à laquelle est exposé le capteur d'image (16) sous l'effet de l'illumination, l'image comportant des pixels, chaque pixel correspondant à une position radiale (x, y) définie dans un plan parallèle au plan de détection ; c) formation d'une pile d'images complexes, dites images reconstruites, à partir de l'image acquise (/) lors de l'étape b), chaque image reconstruite étant obtenue par l'application d'un opérateur de propagation numérique (h), selon une distance de reconstruction (z1), le long de l'axe de propagation (Z), la pile d'images comportant autant d'images reconstruites (A2.) que de distances de reconstruction différentes, chaque image reconstruite (A21) étant représentative d'une onde lumineuse d'exposition (14) à laquelle est exposé le capteur d'image (16) ; d) à partir de chaque image (Azi) de la pile d'images, calcul d'un indicateur de netteté (Ci (x, y)) pour différentes positions radiales (x, y), chaque indicateur de netteté étant associé à une position radiale (x, y) et à une distance de reconstruction le procédé étant caractérisé en ce qu'il comporte également les étapes suivantes : e) prise en compte d'un critère de sélection ; f) pour chaque position radiale (x, y), et en fonction du critère de sélection, sélection d'un indicateur de netteté (Ci t(x, y)), parmi les différents indicateurs de netteté (Ci (x, y)) définis, à la position radiale (x, y), à partir des différentes images reconstruites (A71), l'indicateur de netteté sélectionné (Ci, (x, y)) étant associé à une image reconstruite optimale (A7 pour la position radiale considérée; g) formation d'une image d'observation (/) de l'échantillon, dont chaque pixel est associé à une position radiale (x, y), la valeur de pixels de l'image d'observation étant déterminée en fonction de la valeur, à la position radiale du pixel, de l'image reconstruite optimale (A,» qui lui est associée. 19 2. Procédé selon la revendication 1, comportant, suite à l'étape f), une détermination, pour chaque position radiale (x, y) considérée, d'une distance optimale (zj, (x, y)), correspondant à la distance de reconstruction de l'image reconstruite optimale (Az...) associée à la position radiale. 5 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel chaque indicateur de netteté (C (x , y)) est calculé à partir d'une image élémentaire ('Z)' l'image élémentaire étant établie à partir du module et/ou de l'argument et/ou de la partie réelle et/ou de la partie imaginaire d'une image reconstruite (Az». 4. Procédé selon la revendication 3, dans lequel l'étape d) comporte, pour chaque position 10 radiale considérée, un calcul d'un gradient de l'image élémentaire (Izi), en la position radiale, selon une direction de gradient (X, Y). 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'étape d) comporte, pour chaque image reconstruite (Azi) de la pile d'images: - un calcul d'une image de gradient (G x(1-2 (x, y)), Gy(Izi (x,y))), représentative d'un 15 gradient de l'image reconstruite (Azi) selon au moins une direction de gradient (X,Y); - un calcul d'une norme de l'image de gradient ; de telle sorte que l'indicateur de netteté (Cj(x, y)), en chaque position radiale (x, y), est obtenu à partir de la norme de l'image de gradient à la position radiale. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'étape f) 20 comporte une prise en compte d'une plage de validité (Az), et un rejet d'un indicateur de netteté sélectionné (Cit(x, y)) si la distance de reconstruction (zit(x, y)) qui lui est associée n'est pas comprise dans la plage de validité (az). 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel lors de l'étape g), l'image d'observation, à chaque position radiale (x, y), est obtenue à partir de l'image 25 reconstruite optimale (Azi.) pour la position radiale considérée. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel aucune optique de formation d'image n'est disposée entre l'échantillon et le capteur d'image. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications là 7, dans lequel un système optique (19) est disposé entre l'échantillon et le capteur d'image, le système optique conjuguant un plan 30 image (Pim) à un plan objet (Pobj), le plan de détection étant décalé par rapport au plan image, 20 et/ou l'échantillon étant décalé du plan objet, de telle sorte que l'image acquise par le capteur d'image est une image défocalisée de l'échantillon (10). 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'échantillon est maintenu dans ou sur un élément de maintien (15), l'échantillon (10) étant immobile par 5 rapport à l'élément de maintien. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'échantillon comporte des particules (10p), le procédé comportant une étape h) de caractérisation des particules à partir de l'image d'observation (/) de l'échantillon, la caractérisation comprenant : - un comptage des particules ; 10 - et/ou une détermination d'une taille et/ou d'une forme des particules ; - et/ou un comptage de particules en fonction de leur taille et/ou de leur forme ; - et/ou une détermination d'une position tridimensionnelle des particules. 12. Dispositif pour l'identification d'un échantillon, comportant : une source de lumière (11) configurée pour émettre une onde lumineuse incidente (12) 15 se propageant vers l'échantillon (10) ; un capteur d'image (16) ; un support (10s), configuré pour maintenir l'échantillon (10) entre la source de lumière (11) et le capteur d'image (16) ; un processeur (20), configuré pour recevoir une image (fo) de l'échantillon acquise par le capteur 20 d'image (16) et pour mettre en oeuvre les étapes c) à g) d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11. 13. Dispositif selon la revendication 12, dans lequel aucune optique de formation d'image n'est disposée entre l'échantillon (10) et le capteur d'image (16). 14. Dispositif selon la revendication 12, comportant un système optique (19) définissant une 25 configuration de mise au point, selon laquelle le capteur d'image (16) est conjugué d'un plan passant par l'échantillon, le dispositif étant tel que le capteur d'image (16) ou l'échantillon (10) sont décalés par rapport à la configuration de mise au point, de telle sorte que lors de l'étape b), le capteur d'image (16) acquiert une image défocalisée de l'échantillon (10)