Brevet FR3079832A1 — publié le 20191011

La présente invention concerne une protéine chimérique dont l'activité recombinase est photo-inductible. Elle concerne également l'utilisation d'une telle protéine pour contrôler, via une exposition à la lumière, des évènements de recombinaison dans une cellule hôte ou in vitro. ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE DE L'INVENTION L'essor des biotechnologies est largement basé sur la capacité à contrôler et modifier le patrimoine génétique des cellules. A cet effet, les recombinases comptent parmi les outils les plus efficaces en génie génétique, que ce soit pour manipuler des transgènes dans des cellules eucaryotes ou procaryotes. Parmi les recombinases disponibles, la recombinase CRE est très largement utilisée dans différents modèles procaryotes et eucaryotes comme outil de manipulation de l'ADN in vitro et in vivo. Cette recombinase est issue du bactériophage P1 et catalyse la réaction de recombinaison entre deux sites spécifiques LoxP. Le site LoxP, long de 34 paires de bases, comprend à ses extrémités deux régions palindromiques de 13 paires de bases chacune appelées RBE (Recombinase Binding Element) qui encadrent une région orientée de 8 paires de bases, laquelle détermine la direction du site LoxP. Si les deux sites LoxP sont orientés dans le même sens, la recombinase provoque l'excision irréversible de la région se trouvant entre les deux sites. A contrario, si les deux sites LoxP sont orientés en sens inverse, la recombinase induit l'inversion réversible de la séquence se trouvant entre les deux sites. De nombreuses techniques permettant l'activation conditionnelle du système CRE-LoxP ont été développées au cours des dernières décennies. L'une de ces techniques permet notamment la mutagénèse conditionnelle in vivo chez la souris et ainsi d'étudier l'effet de mutations qui seraient létales si elles étaient non tissu-spécifiques. Brièvement, les sites LoxP sont tout d'abord intégrés de part et d'autre d'un allèle du gène d'intérêt par recombinaison homologue dans des cellules souches embryonnaires. Ces cellules sont ensuite injectées dans un blastocyte de souris pour obtenir une lignée cellulaire qui sera croisée avec une autre lignée de souris transgéniques exprimant la recombinase CRE sous le contrôle d'un promoteur tissu-spécifique. Les animaux issus de ce croisement sont « doublement » transgéniques et présentent la mutation souhaitée uniquement dans le tissu cible. Ces animaux sont dit « mosaïques » 2 en ce sens que leur patrimoine génétique n'est pas unitaire et diffère selon les cellules (Babinet and Cohen-Tannoudji, 2000, Med Sci (Paris), 16, 1, 31-42). L'activation conditionnelle du système CRE-LoxP a également été utilisée chez la levure, et notamment S. cerevisae (Sauer, 1987, Mol. Cell. Biol. 7, 2087-2096). Le 5 gène codant pour la recombinase CRE a été placé sous le contrôle du promoteur GAL1 dont l'activité est réprimée en présence de glucose et stimulée en présence de galactose. Il a été démontré que l'ajout de galactose dans le milieu de culture induisait l'excision du gène cible LEU2 encadré par deux sites LoxP de même orientation et préalablement intégrés dans le génome. La cinétique d'apparition de l'auxotrophie à la leucine montre 10 que l'activité recombinase de la CRE dans la levure débute après huit heures d'induction en galactose pour être maximale après 24 heures. Cette cinétique a été améliorée en réalisant une pré-culture en présence de raffinose. Un contrôle temporel de l'activité du système CRE-LoxP a également été obtenu en utilisant une recombinase CRE dont l'activité est dépendante d'un ligand (Metzger et 15 al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. 92, 6991-6995). Cette enzyme est obtenue par fusion du gène codant pour la recombinase CRE avec un cDNA du domaine de liaison au ligand (LBD) des récepteurs aux hormones stéroïdes et en particulier du récepteur humain à l'estrogène (hER). En absence de ligand (progestérone, estrogène), la recombinase CRE n'est pas ou peu active. A l'inverse, en présence du ligand, la protéine chimérique subit 20 un changement conformationnel et présente une activité CRE recombinase. Ce système a été amélioré en introduisant différentes mutations dans le domaine LBD afin de remplacer les hormones naturelles par un stéroïde artificiel, le tamoxifène, et/ou d'augmenter la spécificité et l'efficacité d'activation (Indra et al.. 1999, Nucleic Acids Res. 27, 43244327; Metzger and Chambon, 2001, Methods 24, 71-80). 25 L'activité du système CRE-LoxP peut également être contrôlée par la température. Utilisant un poisson comme modèle d'étude, il a en effet été démontré que l'expression de la recombinase CRE pouvait être contrôlée par un «heat shock element» (HSE) (Kobayashi et al., 2013, Genes. N. Y. N 2000 51, 59-67). Le système HSE-CRE est ainsi activable par choc thermique (39°C pendant deux heures). La réponse obtenue 30 est cependant variable en fonction des différents types cellulaires et en fonction du stade de développement durant lequel le choc thermique a eu lieu. Plusieurs systèmes CRE-LoxP inductibles par la lumière ont également été décrits. 3 L'un de ces systèmes est une adaptation du système CRE-ER rendu localement photo-activable par l'utilisation d'un inducteur photo-chimique, le cyclofène-OH. Ce substrat, dont la structure est proche du tamoxifène-OH, est entouré de groupes photo-labiles. En réponse à une illumination, le ligand libéré de ces groupes peut se fixer au 5 récepteur ER et ainsi activer la recombinase CRE. Ce système a été utilisé chez le poisson (Sinha et al., 2010, Zebrafish, 7, 199-204; Sinha et al., 2010, ChemBioChem 11, 653663) et chez la souris (Lu et al., 2012, Bioconjug. Chem. 23, 1945-1951). Le contrôle spatial et temporel de cette activation est toutefois particulièrement complexe en ce qu'il requiert de maîtriser la qualité, la quantité et la diffusion du ligand photoactivable. 10 De la même manière, le système photo-inductible d'expression de gènes Light On a été utilisé pour contrôler l'expression de la recombinase CRE (Wang et al., 2012, Nat. Methods 9, 266-269). Ce système est basé sur l'utilisation d'un transactivateur qui, sous l'action de la lumière, se fixe à un promoteur transcriptionnel et l'active. Ce système présente cependant l'inconvénient de nécessiter des périodes d'illumination très longues 15 (de l'ordre de 22 heures). Un autre système Cre-LoxP photo-activable a également été décrit par Kawano et al. (Nat Chem Biol. 2016 Dec ;12(12):1059-1064). Ce système utilise deux protéines de fusion, chacune comprenant un fragment de la recombinase CRE fusionné à un photo-commutateur appelé « Magnet ». L'illumination du système provoque la dimérisation des 20 « Magnets » et l'association des fragments de la recombinase CRE qui devient ainsi active. Un système similaire de Cre-LoxP photo-activable a été décrit par Taslimi et al. (Nat Chem Biol. 2016 June;12(6):425-430). Ce système utilise également deux protéines de fusion, chacune comprenant un fragment de la recombinase CRE fusionné à un 25 domaine de dimérisation photosensible appelé CRY2-CIB. L'illumination du système provoque la dimérisation des deux protéines chimériques et l'association des fragments de la recombinase CRE qui devient ainsi active. Un autre système de Cre-LoxP photo-activable a été décrit dans des cellules humaines par Zhang et al. (Nature Methods. 2017 14(4):391-394). Ce système utilise un 30 domaine protéique appelé PhoC1 qui est clivé lors de la photoactivation, ainsi qu'un domaine de liaison au ligand des récepteurs aux hormones stéroïdes (SR). La protéine chimérique décrite appelée SR-PhoCl-Cre-PhoCl-SR est inactive à cause des domaines SR qui recrutent la protéine inhibitrice Hsp90 de la cellule hôte. Après illumination, le 4 double clivage de la protéine libère les domaines SR et lève ainsi l'inhibition imposée par Hsp90. Compte-tenu de l'importance des recombinases en tant qu' outils en génie génétique, de nombreuses études ont été et sont menées pour en améliorer le contrôle. 5 Les différents systèmes inductibles disponibles à ce jour restent cependant complexes, coûteux et/ou imprécis. Il demeure donc un réel besoin pour une technologie simple et efficace assurant le contrôle de l'activité recombinase dans une cellule individuelle ou un ensemble de cellules à un instant donné. RESUME DE L'INVENTION 10 L'objectif de la présente invention est de fournir un système recombinase dont l'utilisation serait simple et peu coûteuse afin d'être adaptée à un usage industriel, tout en assurant un contrôle temporel et spatial précis de l'activité recombinase. A cette fin, les inventeurs ont développé une recombinase photoactivable. Contrairement aux systèmes développés précédemment où la dépendance à la lumière est 15 indirecte (par exemple via un activateur chimique photo-protégé ou un activateur transcriptionnel photo-inductible), la recombinase selon l'invention est directement activée par la lumière, simplifiant ainsi considérablement le procédé. Ainsi, selon un premier aspect, la présente invention concerne une protéine de fusion comprenant un domaine recombinase fusionné à un domaine photorécepteur et 20 dans laquelle l'activité recombinase est photoactivable. De préférence, le domaine recombinase est fusionné en N-terminal au domaine photorécepteur. De préférence, le domaine photorécepteur comprend, ou consiste en, un domaine LOV2 de phototropine, ou un variant ou dérivé de celui-ci. En particulier, le domaine 25 photorécepteur peut être un dérivé d'un domaine LOV2, de préférence un domaine iLID (improved light inducible dimer), et de manière plus particulièrement préférée un domaine iLID dérivé du domaine LOV2 de la phototropine 1 d'Avena sativa. Selon certains modes particuliers, le domaine photorécepteur de la protéine de fusion est un domaine iLID présentant la séquence SEQ ID NO : 13 dans laquelle X représente un à 30 trois acides aminés, de préférence X représente A, D, K, L, IL, VV, AI ou QPG. S Le domaine recombinase est de préférence sélectionné dans le groupe constitué de la recombinase CRE (SEQ ID NO : 1), et des variants fonctionnels de celle-ci. En particulier, le domaine recombinase peut être un variant fonctionnel de la recombinase CRE comprenant, ou consistant en, la séquence SEQ ID NO: 2, ou une séquence 5 présentant au moins 80% d'identité de séquence avec la SEQ ID NO : 2. De manière plus particulièrement préférée, le domaine recombinase est un variant fonctionnel de la recombinase CRE, ledit variant comprenant, ou consistant en, une recombinase CRE de SEQ ID NO : 1 dans laquelle 18, 19, 26 ou 31 acides aminés ont été délétés en N-terminal, et présentant de manière optionnelle une substitution au niveau du 10 résidu correspondant au résidu E340 de la SEQ ID NO: 1 et/ou une substitution au niveau du résidu correspondant au résidu D341 de la SEQ ID NO: 1 La présente invention concerne également un acide nucléique codant pour une protéine de fusion selon l'invention, une cassette d'expression comprenant un acide nucléique selon l'invention, un vecteur d'expression comprenant un acide nucléique selon 15 l'invention ou une cassette d'expression selon l'invention, une cellule hôte comprenant un acide nucléique, une cassette d'expression ou un vecteur d'expression selon l'invention. La présente invention concerne également un procédé pour induire une activité recombinase dans une cellule comprenant 20 - la fourniture d'une cellule exprimant une protéine de fusion selon l'invention ou l'insertion d'un acide nucléique, une cassette d'expression ou un vecteur d'expression selon l'invention dans une cellule et - l'exposition de ladite cellule à une lumière capable d'activer le domaine photorécepteur de ladite protéine de fusion et donc l'activité recombinase. 25 La présente invention concerne également un procédé pour modifier un acide nucléique, comprenant - la mise en contact d'une protéine de fusion selon l'invention, avec ledit acide nucléique d'intérêt comprenant un ou plusieurs sites de reconnaissance reconnus par le domaine recombinase de ladite protéine de fusion, et 30 - l'exposition de la protéine de fusion et dudit acide nucléique à une lumière capable d'activer le domaine photorécepteur de ladite protéine de fusion et donc l'activité recombinase. 6 Ce procédé peut notamment être utilisé pour moduler l'expression d'une molécule d'intérêt dans la cellule hôte, pour induire de la diversité génétique dans la cellule hôte ou pour modifier une activité biologique dans le cadre d'une thérapie génique. 5 La présente invention concerne en outre un kit comprenant une protéine de fusion, un acide nucléique, une cassette d'expression, un vecteur d'expression et/ou une cellule hôte selon l'invention, et optionnellement une source lumineuse capable d'activer le domaine photorécepteur de la protéine de fusion. Elle concerne également l'utilisation dudit kit pour induire une activité recombinase dans une cellule selon le procédé selon 10 l'invention et/ou pour modifier un ou plusieurs acides nucléiques selon le procédé selon l'invention. BREVE DESCRIPTION DES DESSINS Figure 1: Système rapporteur permettant de détecter et quantifier l'activité CRE recombinase dans des cellules de levure. La partie gauche représente la construction 15 génétique du système. La partie droite représente le phénotype d'une cellule de levure portant cette construction. Figure 2 : Représentation des résultats de test d'activité CRE recombinase. A) L'histogramme montre des données produites par cytométrie en flux. Abscisse: intensité du signal FL1-H correspondant à la fluorescence GFP. Ordonnée: nombre de cellules 20 ayant cette intensité de signal. Les données sont analysées pour déterminer un seuil de signal GFP permettant de départager les cellules OFF (faible signal) des cellules ON (fort signal). B) L'efficacité de recombinaison est la proportion de cellules ON dans une population de cellules ayant exprimé la protéine testée. Figure 3: Résultats du test d'activités de mutants CRE C-Ter. Barres d'erreur: 25 écart-type, n = 3. Figure 4 : Résultats du test d'activités de mutants CRE N-Ter. Barres d'erreur: écart-type, n = 3. Figure 5 : Schéma de la construction des fusions iLID-CRE par recombinaison homologue. Cre/AA: séquence codante de la ou d'une portion de la protéine Cre ou du 30 variant Cre_A340A341. TRP1: gène de S. cerevisiae permettant une sélection auxotrophique des levures transformées. Flèches noires: oligonucléotides (amorces) 7 utilisés pour l'amplification. Etoile: mutation éventuellement portée sur l'oligonucléotide amont. PromGALl: promoteur du gène GAL1 de S. cerevisiae permettant d'induire ou de réprimer l'expression de la protéine d'intérêt. Figure 6 : Les fusions iLID-Cre19, iLID-Cre27, iLID-Cre32 et iLID-CreAA20 5 ont une activité CRE accrue après stimulation par la lumière. Noir (obscurité): sans illumination. Bleu (lumière): après illumination des cellules à 460 nm de 36,3 mW/cm2 durant 30 minutes. Barres d'erreur: écart-type, n = 5. Figure 7 : Activité des fusions iLID-xn-Cre32. Séquence de la jonction: 24A et 24B: iLID-QIA-Cre32, 24F: iLID-QIK-Cre32, 241: iLID-QIL-Cre32, 25C: iLID-QIIL- 10 Cre32, 25F: iLID-QIVV-Cre32, 25X: iLID-QIAI-Cre32, 26R: iLID-QIQPG-Cre32. Noir (obscurité): sans illumination. Bleu (lumière): en incluant une illumination à 460 nm de 2,2 mW/cm2 durant 90 minutes. Barres d'erreur: écart-type, n = 3. Figure 8 : Effets de différentes conditions d'illumination dans le cadre d'une expression contrôlée par le promoteur GAL1. Noir: sans illumination. Bleu: en incluant 15 une illumination à 460nm durant le temps indiqué (30, 60 ou 90) minutes et différentes intensités: 10,20, 50, 100 correspondant respectivement à 2,2, 5,1, 17,9 et 36,3 mW/cm2. Barres d'erreur: écart-type, n = 3. Figure 9 : Effets de différentes conditions d'illumination dans le cadre d'une expression contrôlée par le promoteur MET17. Noir: sans illumination. Bleu: en incluant 20 une illumination à 460 nm durant le temps indiqué (30, 90 ou 180) minutes et différentes intensités: 5%, 10% et 20% correspondant respectivement à 1, 2,2 et 5,1 mW/cm2. Barres d'erreur: écart-type, n = 3. Figure 10: Comparaison de l'activité de fusion iLID-CreAA20 seule ou avec NLS. Noir (obscurité): sans illumination. Bleu (10%): en incluant une illumination à 460 25 nm de 2,2 mW/cm2 durant 180 minutes. Barres d'erreur: écart-type, n = 3. Figure 11 : Comparaison du système selon l'invention avec le système nMag/pMag-Cre. Noir (obscurité): sans illumination. Bleu (lumière): en incluant une illumination à 460 nm de 2,2 mW/cm2 durant 180 minutes. Barres d'erreur: écart-type, n =3. 8 DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Les inventeurs ont conçu une protéine chimérique douée d'une activité recombinase directement photoactivable. Ils ont pour cela fusionné un domaine recombinase à un domaine photorécepteur et ont démontré que l'activation par la lumière 5 du domaine photorécepteur permettait d'activer le domaine recombinase. L'activité recombinase de cette protéine est donc directement dépendante de l'exposition à la lumière. En l'absence de lumière, la protéine de fusion selon l'invention n'a que peu ou pas d'activité recombinase. En revanche, les inventeurs ont démontré qu'une courte exposition à la lumière de cette protéine permettait d'induire fortement cette activité. 10 La protéine de fusion développée par les inventeurs constitue ainsi un outil génétique simple et efficace pour procéder à des modifications de l'ADN in vivo ou in vitro sous l'impulsion d'une simple stimulation lumineuse. Ainsi, selon un premier aspect, la présente invention concerne une protéine de 15 fusion comprenant un domaine recombinase fusionné à un domaine photorécepteur. Dans le présent document, les termes « peptide », « oligopeptide », « polypeptide » et « protéine » sont utilisés indifféremment et se réfèrent à une chaîne d'acides aminés reliés par des liaisons peptidiques, quel que soit le nombre de résidus d'acide aminé constituant cette chaîne. 20 Les acides aminés sont ici représentés par leur code à une lettre ou à trois lettres selon la nomenclature suivante: A: alanine (Ala); C: cystéine (Cys); D: acide aspartique (Asp); E: acide glutamique (Glu); F: phénylalanine (Phe); G: glycine (Gly); H: histidine (His); I: isoleucine (Ile); K: lysine (Lys); L: leucine (Leu); M: méthionine (Met); N: asparagine (Asn); P: proline (Pro); Q: glutamine (Gin); R: arginine (Arg); S: sérine (Ser); 25 T: thréonine (Thr); V: valine (Val); W: tryptophane (Trp) et Y: tyrosine (Tyr). Les acides aminés constituant la protéine de fusion selon l'invention peuvent être de configuration L ou D, de préférence de configuration L. Tel qu'utilisé ici, le terme « protéine de fusion » se réfère à une protéine artificielle comprenant au moins deux domaines protéiques fusionnés en une seule molécule, étant 30 entendu que ces deux domaines ne se trouvent jamais associés dans une protéine naturelle. Chacun des domaines de cette protéine peut être un domaine naturel, c'est-à-dire une protéine naturelle ou un fragment de celle-ci, ou un domaine synthétique, c'est-à-dire un 9 domaine protéique n'existant pas dans la nature ou dans une protéine naturelle. La protéine de fusion est le plus souvent le produit d'un gène de fusion dans lequel les séquences codantes des différents domaines sont en phase. La protéine de fusion selon l'invention peut présenter une ou plusieurs 5 modifications post-traductionnelles et/ou une ou plusieurs modifications chimiques telles que des glycosylations, amidations, acylations, acétylations, ubiquitinations, phosphorylations ou méthylations. Afin d'augmenter la résistance de la protéine de fusion selon l'invention aux protéases, notamment dans le cas d'utilisation in vitro, des groupements protecteurs peuvent être ajoutés aux extrémités C- et/ou N-terminale. Par 10 exemple, le groupement protecteur à l'extrémité N-terminale peut être une acylation ou une acétylation et le groupement protecteur à l'extrémité C-terminale peut être une amidation ou une estérification. La protéine selon l'invention peut également comprendre des liaisons pseudo-peptidiques remplaçant les liaisons peptidiques « classiques » CONH et conférant une résistance accrue aux protéases, telles que CHOH-CH2, NHCO, CH2- 15 0, CH2CH2, C0-CH2, N-N, CH=CH, CH2NH, et CH2-S. Selon certains modes de réalisation, la protéine de fusion peut comprendre, outre le domaine recombinase fusionné à un domaine photorécepteur, un domaine peptidique additionnel en N-terminal ou C-terminal, de préférence en C-terminal. Ce domaine additionnel est de préférence fusionné au domaine recombinase de la protéine de fusion. 20 Le domaine additionnel peut être un tag (ou étiquette) utile pour la purification ou l'immobilisation de la protéine de fusion. De tels tags sont bien connus de l'homme du métier et incluent par exemple les tags histidine (His6), FLAG, HA (épitope dérivé de l'hémagglutinine du virus de la grippe), MYC (épitope dérivé de la proto-oncoprotéine humaine MYC) ou GST (glutathion-S-transférase). Optionnellement, la protéine de 25 fusion peut comprendre un site de clivage par une protéase ou un agent chimique permettant de supprimer ce domaine additionnel. Le domaine recombinase de la protéine de fusion selon l'invention peut être tout domaine protéique présentant une activité recombinase. 30 Tel qu'utilisé ici, le terme « recombinase » se réfère à une ADN recombinase site- spécifique, c'est-à-dire une ADN recombinase qui reconnaît et se lie à des régions cibles spécifiques, ou sites de reconnaissance, de l'ADN et catalyse une réaction de recombinaison entre les acides nucléiques de ces sites. Les sites de reconnaissance sont 10 généralement de courtes séquences (d'environ 30 à 40 nucléotides) qui sont spécifiques de chaque recombinase. Ces enzymes présentent à la fois une activité endonucléase et une activité ligase et catalysent (i) la délétion d'un fragment d'ADN flanqué de deux sites de reconnaissance compatibles et dans la même orientation et/ou (ii) l'inversion d'un 5 fragment d'ADN flanqué de deux sites de reconnaissance compatibles et dans des orientations opposées et/ou (iii) la translocation intra- ou intermoléculaire d'un fragment d'ADN flanqué d'un site de reconnaissance vers un autre site de reconnaissance compatible. L' activité recombinase d'une protéine peut être évaluée par toute méthode connue de l'homme du métier, notamment par la méthode exposée dans la partie 10 expérimentale du présent document ou par l'un des nombreux tests décrits dans la littérature tels que par exemple l'apparition ou la disparition d'un signal rapportant la présence ou l'intégrité d'un acide nucléique ciblé par la recombinase, tel qu'une molécule d'ADN comprenant d'une part une séquence codant une protéine rapportrice telle que la beta-galactosidase, la GFP (Green Fluorescent Protein), la luciférase ou la protéine 15 fluorescente mCherry, et d'autre part un ou plusieurs sites de reconnaissance de la recombinase, et dont le remaniement par la recombinase affecte l'expression de la protéine rapportrice (disparition ou apparition du signal). Le domaine recombinase peut être une protéine recombinase ou un variant fonctionnel de celle-ci. 20 De nombreuses recombinases ont été décrites dans la littérature et sont utilisables dans la présente invention. Des exemples de recombinases comprennent, sans y être limités, la recombinase CRE du phage Pl, la recombinase FLP de Saccharomyces cerevisiae, la recombinase R de Zygosaccharomyces rowcii, la recombinase HIN de Salmonella, la recombinase A de Kluyveromyces drosophilarium ou Kluyveromyces 25 waltii, l'intégrase î, Int, la recombinase GIN du phage Mu, l'intégrase PhiC31, la résolvase Tn3, la recombinase TRE, la recombinase DRE (Anastassiadis et al. Disease Models & Mechanisms 2009 2: 508-515) et la beta-recombinase procaryote. De préférence, la protéine recombinase est choisie dans le groupe constitué de la recombinase CRE et de la recombinase FLP. 30 La recombinase FLP est une enzyme dérivée du plasmide 2-micron de Saccharomyces cerevisiae et catalysant la réaction de recombinaison entre deux sites spécifiques FRT. Comme les sites LoxP, les sites FRT sont constitués d'une séquence 11 asymétrique de 8 ph encadrée par deux bras palindromiques de 13 ph. Il existe de nombreuses variations/mutants des sites FRT et LoxP. De manière plus particulièrement préférée, la protéine recombinase est la recombinase CRE. La recombinase CRE (Uniprot : P06956 ; NCBI GeneID : 2777477) 5 est une tyrosine recombinase issue du bactériophage P1 dont la séquence est présentée en SEQ ID NO: 1. Comme mentionné précédemment, cette enzyme catalyse la réaction de recombinaison entre deux sites spécifiques LoxP. Le terme « variant fonctionnel » se réfère à une protéine dont la séquence diffère de la protéine parente par au moins une substitution, insertion ou délétion mais qui 10 conserve une activité recombinase. De nombreux variants de protéines recombinases ont été décrits dans la littérature, en particulier des variants des recombinases CRE et FLP, et sont utilisables dans la présente invention. Ces variants peuvent être naturels ou synthétiques et présentent une activité recombinase telle que définie ci-dessus. Ils peuvent par exemple reconnaître 15 d'autres sites de reconnaissance que l'enzyme sauvage (voir par exemple l'article de Santoro and Schultz, Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Apr 2;99(7):4185-90 décrivant des variants de la recombinase CRE), présenter des caractéristiques améliorées telles qu'une thermostabilité accrue (voir par exemple les variants thermostables de la recombinase FLP décrits dans les articles de Buchholz et al., 1998, Nat Biotechnol. 16, 657-662 et 20 Raymond and Soriano, 2007, PLoS ONE 2. e162), une précision accrue (voir par exemple les variants de la recombinase CRE décrits dans la demande WO 2014/158593), une expression améliorée dans les cellules de mammifères (voir par exemple les variants de la recombinase CRE décrits dans le brevet US 6,734,295). De préférence, les variants fonctionnels présentent au moins 80% d'identité de 25 séquence avec la protéine recombinase parente, de manière plus particulièrement préférée au moins 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% d'identité de séquence avec la protéine recombinase parente. Tel qu'utilisé ici, le terme "identité de séquence" ou "identité" se réfère au nombre (/0) d'appariements (résidus d'acides aminés identiques) aux positions provenant d'un 30 alignement de deux séquences polypeptidiques. L'identité de séquence est déterminée en comparant les séquences lorsqu'elles sont alignées de manière à maximiser le chevauchement et l'identité tout en minimisant les interruptions de séquence. En particulier, l'identité de séquence peut être déterminée en utilisant l'un quelconque des 12 nombreux algorithmes d'alignement global ou local, en fonction de la longueur des deux séquences. Des séquences de longueurs similaires sont de préférence alignées en utilisant des algorithmes d'alignement global (e.g. Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol 48:443, 1970) qui alignent les séquences de manière optimale sur toute la longueur, tandis que 5 des séquences de longueurs sensiblement différentes sont de préférence alignées en utilisant un algorithme d'alignement local, par exemple l'algorithme de Smith et Waterman (Smith et Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981) ou l'algorithme d'Altschul (Altschul et al (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 ; Altschul et al (2005) FEBS J. 272:5101-5109). L'alignement dans le but de déterminer le pourcentage d'identité de 10 séquence d'acides aminés peut être réalisé par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple en utilisant un logiciel disponible sur des sites Internet tels que http: //blast.ncbi.nlm. nih goy / ou http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/. L'homme de l'art peut aisément déterminer les paramètres appropriés pour mesurer l'alignement. Aux fins de la présente invention, les valeurs de pourcentage d'identité de séquence d'acides aminés 15 désignent des valeurs générées en utilisant le programme EMBOSS Needle d'alignement de séquences par paires qui crée un alignement global optimal de deux séquences en utilisant l'algorithme de Needleman-Wunsch dans lequel les paramètres sont les paramètres par défaut : Scoring matrix = BLOSUM62, Gap open = 10, Gap extend = 0.5, End gap penalty = false, End gap open = 10 and End gap extend = 0.5. 20 Alternativement, les variants fonctionnels d'une recombinase diffèrent de cette dernière par 1 à 50, 1 à 40, 1 à 30, 1 à 20, 1 à 10 ou 1 à 5 substitutions, insertions et/ou délétions d'acides aminés, de préférence par 1 à 50, 1 à 40, 1 à 30, 1 à 20, 1 à 10 ou 1 à 5 substitutions et/ou délétions d'acides aminés. En particulier, les variants fonctionnels d'une recombinase peuvent différer de cette dernière par 1 à 50, 1 à 40, 1 à 30, 1 à 20, 1 25 à 10 ou 1 à 5 substitutions d'acides aminés, de préférence par 1 ou 2 substitutions d'acides aminés. Le terme « substitution », tel qu'utilisé ici par rapport à une position ou à un acide aminé, signifie que l'acide aminé dans la position particulière a été remplacé par un autre acide aminé ou qu'un acide aminé différent de celui de la protéine de type sauvage est 30 présent. Le terme « substitution » peut désigner le remplacement d'un résidu d'acide aminé par un autre choisi parmi les 20 résidus d'acides aminés standard naturels, les résidus d'acides aminés naturels rares (par exemple hydroxyproline, hydroxylysine, allohydroxylysine, 6-N-méthyllysine, N-éthylglycine, N-méthylglycine, N- 13 éthylasparagine, allo-isoleucine, N-méthylisoleucine, N-méthylvaline, pyroglutamine, acide aminobutyrique, ornithine) et d'acides aminés non naturels (par exemple norleucine, norvaline et cyclohexyl-alanine). De préférence, le terme « substitution » se réfère au remplacement d'un résidu d'acide aminé par un autre choisi parmi les 20 résidus d'acides 5 aminés standards naturels (G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, R, Q, N, E, D, S et T). Dans le présent document, la terminologie suivante est utilisée pour désigner une substitution: D341A indique que le résidu d'acide aminé à la position 341 de SEQ ID NO : 1 (acide aspartique, D) est changé en alanine (A). La ou les substitutions peuvent être des substitutions conservatives ou non 10 conservatives. Le terme « substitution conservative » tel qu'utilisé dans ce document, se réfère à une substitution d'un résidu d'acide aminé par un autre qui présente des propriétés chimiques ou physiques similaires (taille, charge ou polarité). Des exemples de substitutions conservatives se font parmi (i) les acides aminés basiques (arginine, lysine et histidine), (ii) les acides aminés acides (acide glutamique et acide aspartique), (iii) les 15 acides aminés polaires (glutamine et asparagine ou sérine, thréonine et tyrosine ), (iv) les acides aminés hydrophobes (méthionine, leucine, isoleucine et valine), (y) les acides aminés aromatiques (phénylalanine, tryptophane) et (vi) les petits acides aminés (glycine, alanine). Selon certains modes de réalisation, le variant fonctionnel est obtenu en délétant 20 des résidus en N-ter et/ou C-ter d'une recombinase de façon à obtenir un fragment comprenant au moins 100, 150, 200, 250 ou 300 acides aminés contigus de ladite recombinase, tout en conservant l'activité recombinase. De préférence, le fragment est obtenu par délétion de 1 à 50, 1 à 40, 1 à 30, 1 à 20, 1 à 10 ou 1 à 5 acides aminés en N-terminal et/ou C-terminal d'une protéine recombinase. Le nombre d'acides aminés qui 25 peuvent être délétés sans affecter l'activité recombinase dépend de la nature de la protéine et peut être aisément déterminé par l'homme du métier au moyen de techniques de routine. Dans un mode de réalisation particulier, le domaine recombinase est la 30 recombinase CRE ou un variant fonctionnel de celle-ci. Le variant fonctionnel peut être tout variant de la recombinase CRE connu de l'homme du métier et décrit dans la littérature tel que par exemple les variants décrits dans l'article de Santoro and Schultz (Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Apr 2;99(7):4185- 14 90), dans la demande WO 2014/158593, dans le brevet US 6,734,295, et dans l'article de Frank Buchholz and A. Francis Stewart (Nature Biotechnology 2001 19:1047-1052). Selon un mode de réalisation, le variant fonctionnel de la recombinase CRE a une séquence présentant au moins 80% d'identité de séquence avec la SEQ ID NO: 1, de 5 préférence au moins 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%. 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% d'identité de séquence avec la SEQ ID NO : 1. Les inventeurs ont ici démontré que la recombinase CRE conserve son activité après délétion de 31 résidus en N-ter et/ou de 3 résidus en C-ter. 10 Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, le variant fonctionnel de la recombinase CRE peut comprendre, ou consister en, - la séquence SEQ ID NO : 2 (résidus 32 à 340 de la SEQ ID NO: 1), ou - une séquence présentant au moins 80% d'identité de séquence avec la SEQ ID NO : 2, de préférence au moins 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 15 ou 99% d'identité de séquence avec la SEQ ID NO : 2. Le variant fonctionnel de la recombinase CRE peut également comprendre, ou consister en, une recombinase CRE de SEQ ID NO : 1 dans laquelle au maximum 31 acides aminés ont été délétés en N-terminal et/ou au maximum 3 acides aminés ont été délétés en C-terminal. En particulier, le variant fonctionnel de la recombinase CRE peut 20 comprendre, ou consister en, une recombinase CRE de SEQ ID NO: 1 dans laquelle 18, 19, 26 ou 31 acides aminés ont été délétés en N-terminal. Dans certains modes de réalisation, le variant fonctionnel de la recombinase CRE peut présenter une substitution au niveau du résidu correspondant au résidu E340 de la 25 SEQ ID NO: 1 et/ou une substitution au niveau du résidu correspondant au résidu D341 de la SEQ ID NO: 1. Les résidus du variant correspondant aux résidus E340 et D341 de la SEQ ID NO: 1 sont aisément identifiés par l'homme du métier au moyen d'un algorithme d'alignement de séquences. Le ou les résidus de substitution sont choisis indépendamment dans le groupe 30 constitué de A, G, V, L, I, P, M, W, C. N, Q, S, T et Y. De préférence, le ou les résidus sont substitués par un résidu alanine. 15 Selon un mode particulier de réalisation, le domaine recombinase est un variant fonctionnel de la recombinase CRE, ledit variant comprenant, ou consistant en, une recombinase CRE de SEQ ID NO : 1 dans laquelle 18, 19, 26 ou 31 acides aminés ont été délétés en N-terminal, et présentant de manière optionnelle une substitution au niveau du 5 résidu correspondant au résidu E340 de la SEQ ID NO: 1 et/ou une substitution au niveau du résidu correspondant au résidu D341 de la SEQ ID NO: 1. De préférence, le domaine recombinase est un variant fonctionnel de la recombinase CRE, ledit variant comprenant, ou consistant en, une recombinase CRE de SEQ ID NO: 1 dans laquelle 19 ou 31 acides aminés ont été délétés en N-terminal, et 10 présentant de manière optionnelle une substitution au niveau du résidu correspondant au résidu E340 de la SEQ ID NO : 1 et/ou une substitution au niveau du résidu correspondant au résidu D341 de la SEQ ID NO: 1 Selon un mode de réalisation préféré, le domaine recombinase est 15 - un variant fonctionnel de la recombinase CRE de la SEQ ID NO: 1 obtenu par délétion de 19 acides aminés en N-terminal et substitution des résidus 340 et 341 de la SEQ ID NO: 1 par une alanine (SEQ ID NO: 3), ou - un variant fonctionnel de la recombinase CRE de la SEQ ID NO: 1 obtenu par délétion de 31 acides aminés en N-terminal (SEQ ID NO : 4). 20 Le domaine photorécepteur de la protéine de fusion selon l'invention est un domaine obtenu à partir d'une protéine photoréceptrice et qui a la propriété de changer de conformation lorsqu'il est exposé à la lumière. De préférence, le domaine photorécepteur est sensible à la lumière bleue, soit une lumière d'une longueur d'onde 25 comprise entre 400 et 500 nm Les protéines photoréceptrices sont des protéines sensibles à la lumière impliquées dans la perception et la réponse à la lumière d'une grande variété d'organismes. Ces capteurs de lumière possèdent un domaine photorécepteur qui réagit et déclenche une cascade de transduction de signal. Les photorécepteurs nécessitent 30 généralement la présence de co-facteurs qui captent les photons, comme par exemple la flavine adénine dinucléotide (FAD) ou la flavine mononucléotide (FMN). Le domaine photorécepteur de la protéine de fusion selon l'invention peut être obtenu à partir de toute protéine photoréceptrice connue de l'homme du métier telle que 16 la rhodopsine, la mélanopsine, la photopsine, la protéine kinase C, les photolyases cryptochrome 1 et 2, les phototropines, le phytochrome, les protéines fluorescentes photoconvertibles, les protéines contenant un domaine PAS (Per-ARNT-Sim) telles que décrites dans Taylor, I. B. Zhulin, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63, 479 (1999) ou les 5 protéines contenant un domaine BLUF telles que décrites dans Wu. Q., and Gardner, K.H. (2009) Biochemistry (Mosc.) 48, 2620-2629. De préférence, le domaine photorécepteur de la protéine de fusion est un domaine LOV (Light Oxygen Voltage). Les domaines LOV appartiennent à la superfamille des domaines PAS et sont des photorécepteurs flavine-dépendant. 10 Selon un mode de réalisation, le domaine photorécepteur de la protéine de fusion selon l'invention comprend, ou consiste en, un domaine LOV d'une phototropine, ou un variant ou dérivé de celui-ci. Les phototropines sont des photorécepteurs végétaux qui possèdent deux domaines LOV et un domaine Ser/Thr kinase. En particulier, le domaine photorécepteur 15 peut être choisi parmi les domaines LOV des phototropines d'Avena Sativa (UNIPROT Gene ID: 049003) , Arabidopsis thaliana (Gene ID: 823721 et 835926), Neurospora crassa (GenB ank ID: AAK08514.1), Brucella mellitus ou Chlamydomonas reinhardtii (Zoltowski, B.D., Vaccaro, B., and Crane, B.R. (2009) Nat. Chem. Biol. 5, 827-834). De préférence, le domaine photorécepteur est un domaine LOV de phototropine 20 d' Avena sativa, en particulier le domaine LOV1 ou LOV2 de la phototropine 1 d' Avena sativa, et de manière plus particulièrement préférée le domaine LOV2 de la phototropine 1 d' Avena sativa. Le domaine LOV2 d' Avena sativa (asLOV2) est constitué de 143 acides aminés (SEQ ID NO: 14) (résidus 404 à 546 de la phototropine 1, Genbank ID : AAC05083) et 25 se lie à la FMN (Flavine MonoNucléotide). Comme les autres membres de la famille LOV, la structure de asLOV2 révèle un domaine PAS, formé de 2 brins 13 (A et B) et de 3 hélices a (C, D et E), complété par un connecteur hélical Fa et de 3 feuillets 13 (G, H, I). Les 5 brins 13 forment un feuillet 13 antiparallèle torsadé qui avec la boucle Fa et les hélices permettent l'insertion de FMN. La structure de ce photorécepteur montre une 30 particularité à son extrémité C-Terminale, une hélice Ja d'une vingtaine d'acide aminés ainsi qu'une hélice A'a en extrémité N-Terminale (Halavaty and Moffat, 2007, Biochemistry (Mosc.) 46, 14001-14009; Harper, 2003, Science 301, 1541-1544; Zayner et al., 2012. J. Mol. Biol. 419, 61-74). Sous l'effet de la lumière bleue, le photorécepteur 17 asLOV2 subit une succession de réactions entraînant un changement conformationnel de la protéine et une libération ainsi qu'un relâchement de l'hélice Jet. Lorsque le domaine est intégré dans la phototropine (son contexte naturel), cette modification déclenche l'activité kinase de la phototropine. 5 Le domaine photorécepteur peut également être un variant fonctionnel d'un domaine LOV de phototropine, en particulier un variant du domaine asLOV2. Le variant conserve la capacité du domaine LOV à changer de conformation en réponse à une stimulation lumineuse et présente au moins 80% d'identité de séquence avec le domaine LOV parent, de manière plus particulièrement préférée au moins 85%, 90%, 91%, 92%, 10 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% d'identité de séquence avec le domaine LOV parent. La capacité du variant à changer de conformation en réponse à une stimulation lumineuse peut être aisément testé par toute technique connue de l'homme du métier telle que, par exemple, le test de liaison de asLOV2-SsrA à SspB décrit dans l'article de Lungu et al. 2012, Chem. Biol. 19, 507-517. 15 Selon un mode de réalisation préféré, le domaine photorécepteur est un dérivé d'un domaine LOV, de préférence un dérivé du domaine asLOV2. Par comparaison aux domaines LOV parents, ces dérivés présentent en général une réactivité accrue à la lumière, une expression accrue par la cellule hôte ou une stabilité différente. De nombreux dérivés de domaine LOV, et en particulier du domaine asLOV2, ont 20 été décrits dans la littérature. Ces dérivés incluent, sans y être limités, le domaine LOV- SsrA dans lequel le peptide SsrA bactérien a été incorporé dans l'hélice C-terminale d'asLOV2 (Lungu et al., 2012, Chem. Biol. 19, 507-517), le domaine iLID (Improved Light Induced Dimer) (Guntas et al., 2015, Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 112-117), les mutants G528A et N358E tels que décrits dans l'article Strickland et al. Nature Methods 25 (2010), 7 (8) 623-626, et les mutants décrits dans l'article de Kawano et al. PLoS One 2013 8(12): e82693 tels que V416T ou V416L. Selon un mode de réalisation particulier, le domaine photorécepteur de la protéine de fusion est un domaine iLID comprenant, ou consistant en, la séquence suivante MRGSHHHHHHGS LATTLERIEKNFVITD PRLPDNPIIFA S D S FLQLTEYS REEILG 30 RNCRFLQGPETDRATVRKIRDAIDNQTEVTVQLINYTKS GKKFWNVFHLQPMR DYKGDVQYFIGVQLDGTERLHGAAEREAVCLIKKTAFQIX (SEQ ID NO: 13), dans laquelle X représente un ou plusieurs acides aminés. 18 X peut être toute séquence d'acides aminés adoptant une conformation en hélice alpha. De préférence, X représente un à 10 acides aminés, de manière plus préférée un à 9, 8, 7, 6, 5 ou 4 acides aminés, et de manière plus particulièrement préférée de un à trois acides aminés 5 Selon certains modes particuliers de réalisation, X est choisi dans le groupe constitué - d'un acide aminé choisi parmi A, D, K et L, - d'une séquence de deux acides aminés choisie parmi IL, VV et AI, et - de la séquence QPG. 10 Le domaine photorécepteur de la protéine de fusion peut être fusionné en N-terminal ou C-terminal du domaine recombinase. De préférence, le domaine photorécepteur de la protéine de fusion est fusionné en N-terminal du domaine recombinase. 15 Les deux domaines peuvent être immédiatement adjacents ou séparés par une ou plusieurs séquences de liaison. De préférence, les domaines sont séparés d'au maximum 10 acides aminés. De manière plus particulièrement préférée, les deux domaines sont directement adjacents, c'est-à-dire sans séquence de liaison entre eux. 20 Selon un mode de réalisation particulier, la protéine de fusion selon l'invention comprend, ou consiste en, une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO: 5 à 12. 25 La protéine de fusion selon l'invention présente une activité recombinase photoactivable. Cela signifie que l'activation du domaine photorécepteur induit l'activation ou une augmentation de l'activité du domaine recombinase. L'activation du domaine photorécepteur est réalisée par exposition à une lumière dont la longueur d'onde peut varier selon la nature du photorécepteur. Comme mentionné 30 ci-dessus, le domaine photorécepteur est de préférence sensible à la lumière bleue, soit une lumière d'une longueur d'onde comprise entre 400 et 500 nm La durée d'exposition à la lumière et l'intensité lumineuse peuvent être aisément déterminées par l'homme du métier. 19 De préférence, la protéine de fusion peut être exposée à une intensité lumineuse comprise entre 2 mW/cm2 et 40 mW/cm2, de manière plus particulièrement préférée entre 2 mW/cm2 et 10 mW/cm2. De préférence, la durée d'exposition à la lumière est comprise entre 10 min et trois 5 heures, de manière plus particulièrement préférée entre 30 min et deux heures. Selon un mode de réalisation particulier, l'activité recombinase de la protéine de fusion est induite par une exposition de 10 min à trois heures, de préférence de 30 min à deux heures, à une lumière bleue d'une intensité de 2 mW/cm2 et 40 mW/cm2, de préférence de 2 mW/cm2 et 10 mW/cm2. 10 Tel qu'utilisé ici, le terme « photoactivable » signifie de préférence que l'exposition de la protéine de fusion selon l'invention à la lumière permet d'obtenir une augmentation au minimum 25 % de l'activité recombinase, de préférence une augmentation d'au minimum 30%, 40% ou 50% de l'activité recombinase, par rapport au niveau sans exposition lumineuse. De manière plus particulièrement préférée, 15 l'exposition de la protéine de fusion selon l'invention à une lumière bleue d'une intensité d'environ 2 mW/cm2 durant 90 min permet d'obtenir une augmentation d'au minimum 50% de l'activité recombinase, par rapport au niveau sans exposition lumineuse. La présente invention concerne également un support solide sur lequel est 20 immobilisée une protéine de fusion selon l'invention. Elle concerne également un procédé de préparation d'un tel support solide comprenant la fourniture d'une protéine de fusion selon l'invention et d'un support solide adapté, et l'immobilisation de ladite protéine sur ledit support. Les moyens d'immobilisation sont bien connus de l'homme de l'art (voir par 25 exemple « Enzyme Technology » de Martin Chaplin et Christopher Bucke, Cambridge University Press, 1990). La protéine de fusion selon l'invention peut être immobilisée sur le support solide par tout moyen adapté tel qu'une liaison covalente ou non covalente. Une grande variété de matériaux peut être utilisée comme support d'immobilisation. Ces matériaux sont en général des matrices polymériques ou inorganiques inertes. Le support 30 peut être par exemple membranaire, particulaire (e.g. billes, nanobilles, microbilles) ou fibreux. Des exemples de support comprennent, sans y être limité, des matrices de polyuréthane, du sépharose activé, de l'alginate, des résines Amberlite, Sephadex ou Duolite, des résines acryliques, des résines polystyrène ou des résines macroréticulées. 20 La présente invention concerne également un acide nucléique codant pour une protéine de fusion selon l'invention. L'acide nucléique peut être de l'ADN (ADNc ou ADNg), de l'ARN ou un mélange des deux. Il peut être sous forme monocaténaire ou sous forme duplex ou un mélange des 5 deux. Il peut comprendre des nucléotides modifiés, comprenant par exemple une liaison modifiée, une base purine ou pyrimidine modifiée, ou un sucre modifié. Il peut être préparé par toute méthode connue de l'homme du métier, telle que la synthèse chimique, la recombinaison et la mutagenèse. L'acide nucléique selon l'invention peut être déduit de la séquence de la protéine de fusion selon l'invention et l'utilisation des codons peut être 10 adaptée en fonction de la cellule hôte dans laquelle l'acide nucléique doit être transcrit et/ou traduit. Ces étapes peuvent être réalisées selon des méthodes bien connues de l'homme du métier et dont certaines sont décrites dans le manuel de référence Sambrook et al. (Sambrook et al., 2001, Molecular cloning: a laboratory manual, Third Edition Cold Spring Harbor). 15 La présente invention concerne en outre une cassette d'expression comprenant un acide nucléique selon l'invention, Le terme « cassette d'expression » désigne ici une construction d'acide nucléique comprenant une région codante comprenant un acide nucléique selon l'invention et une 20 ou plusieurs séquences régulatrices, la région codante et la ou les séquences régulatrices étant liées de manière opérationnelle. L'expression « lié de manière opérationnelle » indique que les éléments sont combinés de manière à ce que l'expression de la région codante soit sous le contrôle de la ou des séquences régulatrices. 25 L'expression « séquence régulatrice » désigne une séquence d'acide nucléique nécessaire à l'expression ou contrôlant l'expression de la région codante. Les séquences régulatrices peuvent être endogènes ou hétérologues à la cellule hôte. De telles séquences sont bien connues de l'homme du métier qui peut aisément sélectionner les séquences régulatrices adaptées à chaque application et notamment à la cellule hôte dans laquelle 30 l'expression est souhaitée. Sans y être limité, ces séquences peuvent comprendre notamment un promoteur, une séquence de polyadénylation, un terminateur de transcription, une région 3'UTR, une région 5 'UTR et un peptide signal. 21 De préférence, la cassette d'expression selon l'invention comprend, ou consiste en, un promoteur permettant d'initier la transcription, un acide nucléique selon l'invention, et un terminateur de transcription. Typiquement, la séquence du promoteur est placée en amont de la région codante et à une distance compatible avec le contrôle de 5 l'expression de ladite région. Le promoteur contient des séquences de contrôle transcriptionnel qui initient l'expression de l'acide nucléique codant pour une protéine de fusion de l'invention. Il peut être un promoteur reconnu par une cellule hôte ou un système d'expression in vitro. Le promoteur peut être tout polynucléotide présentant une activité transcriptionnelle dans les 10 conditions d'utilisation envisagées, i.e. in vitro ou in vivo, et peut notamment être un promoteur obtenu à partir de gènes codant pour des polypeptides endogènes ou hétérologues à la cellule hôte, ou un promoteur mutant, tronqué ou hybride. Le promoteur peut être un promoteur fort, faible, constitutif ou inductible. Sur la base de ses connaissances, l'homme du métier peut aisément choisir le promoteur adapté. 15 Le terminateur de transcription est reconnu par une cellule hôte pour terminer la transcription. Le terminateur est fonctionnellement lié à l'extrémité 3' de l'acide nucléique selon l'invention. Tout terminateur qui est fonctionnel dans la cellule hôte peut être utilisé dans la présente invention. 20 La présente invention concerne également un vecteur d'expression comprenant un acide nucléique ou une cassette d'expression selon l'invention. Ce vecteur d'expression peut être utilisé pour transformer une cellule hôte et permettre l'expression de l'acide nucléique selon l'invention dans ladite cellule. Le vecteur peut être un ADN ou un ARN, circulaire ou non, simple- ou double- 25 brin. Il est avantageusement choisi parmi un plasmide, un phage, un phagemide, un virus, un cosmide et un chromosome artificiel. De manière générale, le vecteur est choisi de manière à être compatible avec la cellule hôte dans laquelle il doit être introduit. Le vecteur peut être un vecteur se répliquant de manière autonome, c'est-à-dire un vecteur existant en tant qu'entité extra- 30 chromosomique dont la réplication est indépendante de la réplication chromosomique, ou un vecteur qui, lorsqu'il est introduit dans la cellule hôte, est intégré dans le génome et répliqué avec le chromosome dans lequel il a été intégré. 22 Avantageusement, le vecteur d'expression comprend des éléments régulateurs permettant l'expression de l'acide nucléique selon l'invention. Ces éléments peuvent comporter par exemple des promoteurs de transcription, des activateurs de transcription, des séquences terminatrices, des codons d'initiation et de terminaison. Les méthodes pour 5 sélectionner ces éléments en fonction de la cellule hôte dans laquelle l'expression est souhaitée, sont bien connues de l'homme du métier. Le vecteur peut comporter en outre des éléments permettant sa sélection dans la cellule hôte comme, par exemple, un gène de résistance à un antibiotique ou un gène de sélection assurant la complémentation du gène respectif délété dans le génome de la 10 cellule hôte. De tels éléments sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature. Selon certains modes de réalisation, le vecteur comprend un ou plusieurs éléments permettant l'intégration du vecteur dans le génome de la cellule hôte. Cette intégration peut reposer sur une recombinaison homologue ou non homologue. Dans le cas d'une 15 intégration ciblée, le vecteur peut contenir des séquences homologues d'une région cible du génome et qui permettent de cibler l'intégration par recombinaison homologue à un emplacement précis dans le génome de la cellule hôte. Lorsque la réplication autonome du vecteur est souhaitée, le vecteur peut comprendre une origine de réplication fonctionnelle dans la cellule hôte. 20 Les méthodes pour sélectionner ces différents éléments en fonction du vecteur et de la cellule hôte dans laquelle l'expression est souhaitée sont bien connues de l'homme du métier. Les vecteurs selon l'invention peuvent être construits par les techniques classiques de biologie moléculaire. 25 La présente invention concerne l'utilisation d'un acide nucléique, d'une cassette d'expression ou d'un vecteur d'expression selon l'invention pour transformer ou transfecter une cellule. La cellule hôte peut être transformée/transfectée de manière transitoire ou stable et l'acide nucléique, la cassette ou le vecteur peut être contenu dans la cellule sous forme d'épisome ou sous forme chromosomique. 30 La présente invention concerne également une cellule hôte comprenant un acide nucléique, une cassette ou un vecteur d'expression selon l'invention. La cellule hôte peut être une cellule procaryote ou une cellule eucaryote. 23 Selon un mode de réalisation, la cellule hôte est une cellule procaryote, de préférence une bactérie. Selon un autre mode de réalisation, la cellule hôte est une cellule eucaryote, de préférence une levure, une cellule de champignon, une cellule d'algue, une cellule de 5 plante ou une cellule animale, et de manière plus particulièrement préférée une cellule animale ou une levure. Selon un mode de réalisation particulier, la cellule hôte est une cellule animale, de préférence une cellule d'insecte ou de mammifère, et de manière plus particulièrement préférée une cellule de souris, une cellule de hamster (par exemple une cellule CHO) ou 10 une cellule humaine. Dans un mode de réalisation particulier, la cellule est non-humaine et/ou n'est pas une cellule souche embryonnaire. Selon un autre mode de réalisation particulier, la cellule hôte est une cellule de mammifère non humain. 15 Selon un autre mode de réalisation particulier, la cellule hôte est une cellule animale, de préférence humaine, et n'est pas une cellule souche embryonnaire humaine. Selon un autre mode de réalisation particulier, la cellule hôte est un microorganisme, de préférence une bactérie ou une levure. Le terme « cellule hôte » englobe également toute progéniture d'une cellule hôte 20 parente qui n'est pas identique à la cellule hôte parente en raison des mutations qui se produisent pendant la réplication. L'acide nucléique, cassette d'expression ou vecteur d'expression selon l'invention peut être introduit dans la cellule hôte par toute méthode connue de l'homme du métier, telle que l'infection, l'électroporation, la conjugaison, la transduction, la transformation 25 de cellules compétentes, la transformation de protoplaste, la fusion de protoplastes, la biolistique ou encore des méthodes de transformation faisant intervenir le PEU, des agents lipidiques, l'acétate de lithium ou des liposomes. Selon les modes de réalisation, une ou plusieurs copies d'un acide nucléique, d'une cassette ou d'un vecteur selon la présente invention peut être insérée dans une cellule hôte. 30 La cellule hôte peut être une cellule isolée (transformation/transfection ex vivo) ou une cellule présente dans un organisme (transformation/transfection in vivo). De préférence, la cellule hôte est une cellule isolée. Tel qu'utilisé ici, le terme « cellule isolée » se réfère à une cellule séparée et/ou récupérée à partir de son 24 environnement naturel. En particulier, la cellule peut être isolée/récupérée à partir d'un organisme pluricellulaire afin d'être manipulée ex vivo. Selon un autre aspect, la présente invention concerne un procédé de production 5 d'une protéine de fusion selon l'invention comprenant l'expression d'un acide nucléique codant pour ladite protéine de fusion et la récupération de celle-ci. La présente invention concerne en particulier un procédé de production in vitro d'une protéine de fusion selon l'invention comprenant (a) la mise en contact d'un acide nucléique, d'une cassette ou d'un vecteur selon l'invention avec un système d'expression 10 in vitro; et (b) la récupération de la protéine de fusion. Les systèmes d'expression in vitro sont bien connus de l'homme du métier et de nombreux systèmes sont disponibles dans le commerce. La présente invention concerne de préférence un procédé de production d'une protéine de fusion selon invention comprenant 15 (a) la culture d'une cellule hôte selon l'invention dans un milieu de culture approprié et dans des conditions appropriées pour produire ladite protéine de fusion; et (b) la récupération de la protéine de fusion à partir de la culture cellulaire. Les cellules hôtes sont cultivées dans un milieu nutritif approprié pour la production de la protéine de fusion en utilisant des procédés bien connus de l'homme du 20 métier. Par exemple, la cellule hôte peut être cultivée en flacon ou en fermenteur dans un milieu approprié et dans des conditions permettant à la protéine de fusion d'être exprimée et/ou isolée. La culture a lieu dans un milieu nutritif approprié comprenant notamment des sources de carbone, d'azote et des sels inorganiques, en utilisant des procédures bien 25 connues de l'homme du métier. De tels milieux sont disponibles auprès de fournisseurs commerciaux ou peuvent être préparés selon des compositions publiées (par exemple, dans les catalogues de l'American Type Culture Collection). Si la protéine de fusion est sécrétée dans le milieu nutritif, celle-ci peut être récupérée directement à partir du surnageant de culture. Si elle n'est pas sécrétée, elle peut 30 être récupérée à partir des lysats cellulaires ou après perméabilisation. La protéine de fusion peut être détectée et récupérée en utilisant tout procédé connu de l'homme du métier tel que des méthodes de chromatographie et/ou des méthodes électrophorétiques. 25 Selon un autre aspect, la présente invention concerne également un procédé pour stimuler l'activité recombinase dans une cellule comprenant - la fourniture d'une cellule exprimant une protéine de fusion selon l'invention ou 5 l'insertion d'un acide nucléique, une cassette d'expression ou un vecteur d'expression selon l'invention dans une cellule, et - l'exposition de ladite cellule à une lumière capable d'activer le domaine photorécepteur de ladite protéine de fusion et donc l'activité recombinase. La cellule peut être une cellule hôte telle que définie ci-dessus. 10 L'insertion de l'acide nucléique, de la cassette ou du vecteur selon l'invention dans la cellule peut se faire par toute technique connue de l'homme du métier. La cellule peut éventuellement avoir été préalablement génétiquement modifiée afin d'insérer un ou plusieurs sites de reconnaissance reconnus par le domaine recombinase de la protéine de fusion, et éventuellement un ou plusieurs acides nucléiques 15 dont l'expression, le nombre et/ou la localisation dans le génome se trouveront modifiés par l'action de la recombinase au niveau desdits sites de reconnaissance. En particulier, la cellule peut être un microorganisme, par exemple une bactérie ou une levure, dans lequel un ou plusieurs gènes d'intérêt ont été introduits (par exemple des gènes codant pour des enzymes donnant lieu à la production d'un composé d'intérêt) 20 en combinaison avec des sites de reconnaissance reconnus par le domaine recombinase de la protéine de fusion. L'exposition de cette cellule à une lumière capable d'activer le domaine photorécepteur de la protéine de fusion génère un réarrangement chromosomique qui permet, selon la configuration des sites de reconnaissance de la recombinase, par exemple d'activer ou d'inhiber l'expression du ou des gènes d'intérêt, 25 et/ou de déléter, insérer ou transloquer un ou plusieurs gènes d'intérêt de la cellule hôte. Ce type de modulation est bien connue de l'homme du métier. En revanche, l'avantage majeur du procédé selon l'invention est d'utiliser la lumière comme agent d'induction de l'activité recombinase et non un inducteur chimique. 30 La présente invention concerne également un procédé pour modifier un ou plusieurs acides nucléiques, comprenant 26 - la mise en contact d'une protéine de fusion selon l'invention, avec un ou des acides nucléiques d'intérêt comprenant un ou plusieurs sites de reconnaissance reconnus par le domaine recombinase de ladite protéine de fusion. et - l'exposition de la protéine de fusion et du ou des acides nucléiques à une lumière 5 capable d'activer le domaine photorécepteur de ladite protéine de fusion et donc l'activité recombinase. Les modifications apportées aux acides nucléiques peuvent être des translocations, inversions, insertions et/ou délétions. Celles-ci peuvent notamment conduire à induire ou bloquer l'expression d'un gène, ou à introduire une mutation dans 10 une séquence codante (séquence sauvage vers séquence mutée ou vice-versa). Ce type de modifications au moyen de recombinases est bien connu de l'homme du métier. La mise en contact de la protéine de fusion avec le ou les acides nucléiques d'intérêt peut avoir lieu dans une cellule, in vivo ou ex vivo, ou in vitro. Dans le cas d'une mise en contact dans une cellule, la protéine de fusion est de 15 préférence exprimée par ladite cellule qui comprend également le ou les acides nucléiques à modifier. Dans le cadre d'une utilisation in vivo, la protéine de fusion selon l'invention peut être mise en contact avec le ou les acides nucléiques à modifier en administrant soit un vecteur ou une cassette d'expression codant pour ladite protéine, soit directement ladite 20 protéine dans l'organisme, le tissu ou la cellule cible. L'activation de l'activité recombinase peut être réalisée par photothérapie, photochimiothérapie ou via des sources lumineuses offrant une précision spatiale telles que des fibres optiques. Ce type d'application trouve un intérêt tout particulier en thérapie génique lorsqu'il est nécessaire de modifier l'activité ou la viabilité d'une cellule ou d'un groupe de cellules impliquées 25 dans une pathologie ou dans son évolution (voir par exemple Greco et al. Gene Therapy volume 13, pages 206-215 (2006)). Dans le cas d'une mise en contact in vitro, la protéine de fusion est de préférence mise en contact avec un mélange réactionnel comprenant le ou les acides nucléiques d'intérêt sous la forme d'une protéine purifiée. La protéine de fusion peut être utilisée en 30 solution ou sous une forme immobilisée. De préférence, le mélange réactionnel comprend également un système de transcription et traduction in vitro. Selon un mode de réalisation, ce procédé est utilisé pour générer de la diversité génétique au sein d'une cellule ou d'une population de cellules, de préférence une 27 population de bactéries ou de levures, ou dans un acide nucléique ou mélange d'acides nucléiques. De manière optionnelle, le génome de la cellule ou l'acide nucléique peut être préalablement synthétisé ou modifié afin comprendre une pluralité de sites de reconnaissance insérée de manière ciblée ou aléatoire et générant ainsi, sous l'action de 5 la recombinase, une diversité génétique contrôlée ou aléatoire. Les procédés selon l'invention peuvent trouver une application dans un très grand nombre de domaines, notamment - pour moduler l'expression d'une molécule d'intérêt, par exemple dans le cadre 10 d'un procédé de bioproduction. L'expression de la molécule d'intérêt peut notamment être induite, stoppée, augmentée ou diminuée. Le composé d'intérêt peut être notamment tout produit de fermentation, un composé changeant la physiologie ou la viabilité de la cellule hôte ou de cellules en contact direct ou indirect avec celle-ci, un composé contrôlant une propriété moléculaire ou cellulaire de ladite cellule hôte ou de cellules en 15 contact direct ou indirect avec celle-ci. Le composé d'intérêt peut également être une protéine ou un acide nucléique présentant une mutation par rapport à la version produite par la cellule hôte avant l'action de la recombinase ; - pour induire de la diversité génétique dans une cellule hôte ou une population de cellules hôtes, par exemple pour des applications d'évolution dirigée ou de criblage. Les 20 cellules ainsi obtenues peuvent ensuite être criblées afin d'identifier ou de sélectionner des cellules présentant de nouvelles caractéristiques d'intérêt, telles que par exemple, la synthèse d'un nouveau composé, une résistance accrue à des conditions particulières de culture ou une productivité accrue ; ou - pour modifier une activité biologique dans le cadre d'une thérapie génique, par 25 exemple comme décrit ci-dessus. Selon un autre aspect, la présente invention concerne également un kit comprenant une protéine de fusion, un acide nucléique, une cassette ou un vecteur d'expression selon l'invention et/ou une cellule hôte selon l'invention, et optionnellement une source 30 lumineuse capable d'activer le domaine photorécepteur de la protéine de fusion. Elle concerne également l'utilisation de ce kit pour mettre en oeuvre un procédé selon l'invention, notamment pour induire une activité recombinase dans une cellule et/ou pour modifier in vivo, ex vivo ou in vitro un ou plusieurs acides nucléiques. 28 Toutes les références citées dans cette description sont incorporées par référence dans la présente demande D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront mieux à la lecture des exemples suivants donnés à titre illustratif et non 5 limitatif. EXEMPLES Matériel et méthodes Système rapporteur permettant de quantifier l'activité CRE recombinase in vivo. Le système rapporteur est illustré sur la Figure 1. Ce système est intégré au locus 10 HO du génome de cellules de levure Saccharomyces cerevisiae. Il est constitué des éléments de séquence consécutifs suivants: - PromTEF: promoteur conférant une expression constitutive (provient du gène TEF1 de Saccharomyces cerevisiae). - LoxP: site de reconnaissance de la CRE recombinase. 15 -K1LEU2: séquence codante du gène K1LEU2 de la levure Kluyveromyces lactis, codant pour une Beta-isopropylmalate dehydrogenase. -TermADH1: sequence terminatrice de transcription provenant du gène ADH1 (Alcohol DeHydrogenase 1) de Saccharomyces cerevisiae. Cette séquence comporte un ou plusieurs codons STOP qui assurent également une terminaison de la traduction. 20 -LoxP: site de reconnaissance de la CRE recombinase. - GFP: séquence codante de la Green Fluorescent Protein - TermCYCl: séquence terminatrice de transcription provenant du gène CYC1 de Saccharomyces cerevisiae. En l'absence d'activité CRE recombinase, les cellules portant cette construction ne 25 sont pas fluorescentes. En présence d'activité CRE recombinase, la recombinaison entre les deux sites loxP génère l'excision de la portion K1LEU2-TermADH1, et place ainsi la portion GFP sous l'activité transcriptionnelle conférée par la portion PromTEF. Les cellules ayant subi cette excision expriment ainsi la protéine GFP et sont fluorescentes. 29 Conditions expérimentales du test de l'activité CRE recombinase. Des cellules de levures correspondant à la souche 0Y1761 de génotype MATalpha his3A200 leu2A1 trplA63 ura3A0 hoA::loxKlLEU2loxGFP et portant le système rapporteur décrit ci-dessus sont transformées avec un plasmide portant une cassette 5 d'expression d'une protéine candidate susceptible d'avoir une activité CRE recombinase. La souche de levure ainsi transformée est cultivée durant une nuit sur milieu sélectif dans des conditions où la protéine candidate est exprimée. Ce milieu est appelé milieu de préculture ci-après. Le lendemain, 1001.11 de cette culture sont transférés dans une plaque 96-puits de plastique transparent à fond plat et, le cas échéant, illuminé à température 10 ambiante dans les conditions souhaitées de temps, longueur d'onde et énergie lumineuse. Une partie des cellules de cet échantillon sont ensuite cultivées durant 4 heures dans un milieu correspondant à des conditions où la protéine candidate n'est pas exprimée. Ce milieu est appelé milieu de récupération ci-après. Un échantillon de ces cellules est ensuite transféré dans un milieu appelé milieu d'analyse ci-après et analysé à la vitesse de 15 400 évènements par seconde sur un cytomètre en flux FACSCalibur (BDBiosciences) dans lequel la GFP a été excitée avec un laser à 488 nm et la fluorescence émise à travers un filtre 530/30 a été quantifiée pour produire des données telles que celles représentées sur la Figure 2A. En fonction de la fluorescence des cellules, celles-ci sont classées en deux groupes: OFF (fluorescence faible) et ON (fluorescence élevée) qui correspondent 20 aux cellules qui n'ont pas (OFF) ou qui ont (ON) activé le système rapporteur. La proportion de cellules ON est utilisée comme indicateur de l'activité CRE recombinase, comme indiqué sur la Figure 2B. Milieux et tampons utilisés Le tampon TBS est une dilution au dixième dans l'eau du tampon TBS10X, lequel 25 correspond à une solution aqueuse (Tris 30 g/L, NaC180 g/L, KC12 g/L) ajustée à pH 7,4 avec de l'acide chlorydrique fumant. Les milieux de culture de cellules de levure sont préparés à partir d'un mélange poudreux d'acides aminés et de nucléotides appelé MixW- dont la composition est la suivante: 30 Adénine (Ad) 1 g, Uracile (U) 2 g, Alanine (A) 2 g, Arginine (R) 2 g, Aspartate (D) 2 g, Asparagine (N) 2 g, Cystéine (C) 2 g, Glutamate (E) 2 g, Glutamine (Q) 2 g, Glycine (G) 30 2 g, Histidine (H) 2 g, Isoleucine (I) 2 g, Leucine (L) 4 g, Lysine (K) 2 g, Méthionine (M) 2 g, Phénylalanine (F) 2 g, Proline (P) 2 g, Sérine (S) 2 g, Thréonine (T) 2 g, Tyrosine (Y) 2 g, Valine (V) 2 g. D'autres mélanges, appelés MixW-X- où X désigne un des composés du mélange, sont préparés de la même manière mais en omettant le composé 5 X. Ainsi, par exemple, le mélange MixW-M- ne contient pas de méthionine. De manière similaire, d'autres mélanges, appelés MixW-X-Y- sont préparés en omettant deux composés désignés par X et Y. Protocole Pl: La procédure décrite dans la section 'Conditions expérimentales du test de l'activité CRE 10 recombinase' ci-dessus est appliquée, avec les milieux suivants: - Milieu de préculture: 6,7 g de Yeast Nitrogen Base without Amino-Acids (Difco, BDBiosciences), 20g de galactose, 20g de raffinose, et 2g de MixW- décrit ci-dessus dont dilués dans 1L d'eau distillée, lmL de NaOH 1M est rajouté et la solution est autoclavée à 0.5 bar. 15 - Milieu de récupération: 6,7 g de Yeast Nitrogen Base without Amino-Acids (Difco, BDBiosciences), 20g de glucose, et 2g de MixW- décrit ci-dessus dont dilués dans 1L d'eau distillée, lmL de NaOH 1M est rajouté et la solution est autoclavée à 0.5 bar. - Milieu d'analyse: Tampon TBS auquel est rajouté 1mM d'azide de sodium. 20 Protocole P2: La procédure décrite dans la section 'Conditions expérimentales du test de l'activité CRE recombinase' ci-dessus est appliquée, avec les milieux suivants: - Milieu de préculture: 6,7 g de Yeast Nitrogen Base without Amino-Acids (Difco, BDBiosciences), 20g de glucose, et 2g de MixW-M- décrit ci-dessus dont dilués dans 1L 25 d'eau distillée, lmL de NaOH 1M est rajouté et la solution est autoclavée à 0.5 bar. - Milieu de récupération: 6,7 g de Yeast Nitrogen Base without Amino-Acids (Difco, BDBiosciences), 20g de glucose, et 2g de MixW-H- décrit ci-dessus dont dilués dans 1L d'eau distillée, lmL de NaOH 1M est rajouté et la solution est autoclavée à 0.5 bar. - Milieu d'analyse: Tampon TBS. 31 Protocole P3: La procédure décrite dans la section 'Conditions expérimentales du test de l'activité CRE recombinase' ci-dessus est appliquée, avec les milieux suivants: - Milieu de préculture: 6,7 g de Yeast Nitrogen Base without Amino-Acids (Difco, 5 BDBiosciences), 20g de glucose, et 2g de MixW-M-U- décrit ci-dessus dont dilués dans 1L d'eau distillée, lmL de NaOH 1M est rajouté et la solution est autoclavée à 0.5 bar. - Milieu de récupération: 6,7 g de Yeast Nitrogen Base without Amino-Acids (Difco, BDBiosciences), 20g de glucose, et 2g de MixW-H-U- décrit ci-dessus dont dilués dans 1L d'eau distillée, lmL de NaOH 1M est rajouté et la solution est autoclavée à 0.5 bar. 10 - Milieu d'analyse: Tampon TBS. Résultats Effets de mutations de l'extrémité en C-terminale de la CRE recombinase Le mutant Cre_Stop341 a été obtenu par mutagénèse dirigée d'un plasmide où le codon D341 a été remplacé par un codon Stop. Le mutant Cre_A340A341 a été obtenu 15 par mutagénèse dirigée d'un plasmide où les codons E340 et D341 ont été remplacés par A340 et A341. Dans les plasmides ainsi obtenus, l'expression de la protéine recombinase sauvage ou mutante est placée sous le contrôle du promoteur du gène GAL1 de Saccharomyces cerevisiae. Les conditions du test sont celles du protocole P1 sans illumination. 20 Les résultats montrant l'activité CRE recombinase de ces mutants sont présentés sur la Figure 3. Le mutant mutant Cre_Stop341 présente une activité complète. Ceci démontre que la recombinase CRE délétée de 3 acides-aminés C-terminaux est active. D'autre part, les résultats montrent que le mutant Cre_A340A341 présente une activité légèrement réduite par rapport à la CRE recombinase sauvage. 25 Effets de mutations de l'extrémité en N-terminale de la CRE recombinase Les mutants Cre_3.2-21 et Cre_42-28 ont été obtenus par i) PCR où la matrice ADN a été le plasmide pGY115 et où les amorces ont été 1L80 dont la séquence est 5'-tggtatctttatagtcctgtcgg-3' (SEQ ID NO : 15) et, pour Cre_42- 21 1L71 dont la séquence est 5'-gaacatgtccatcaggttcttgcgaacctccatttaacactcagataa-3' 32 (SEQ ID NO: 16), et pour Cre_A2-28 1L72 dont la séquence est 5'- agaaaacgcctggcgatccctgaacatgtccatttaac actcagataa-3 (SEQ ID NO : 17). ii) digestion du plasmide pGY115 par l'enzyme AgeI et purification sur gel d'agarose 1% du fragment de 6.3Kb 5 iii) co-transformation des produits des étapes i) et ii) dans une souche de levure trplA et sélection sur milieu sans tryptophane. La dénomination Ax-y indique ici la délétion des acides aminés situés de la position x incluse à la position y incluse. Dans les plasmides ainsi obtenus, l'expression de la protéine recombinase sauvage 10 ou mutante est placée sous le contrôle du promoteur du gène GAL1 de Saccharomyces cerevisiae. Les conditions du test sont celles du protocole P1 sans illumination. Les résultats montrant l'activité de ces mutants sont présentés sur la figure 4. L'activité CRE du mutant Cre_32-21 est complète tandis que celle du mutant Cre_A2-28 est réduite de moins de 10%. 15 Construction de fusions LOV2-CRE Le photorécepteur iLID dérivé de asLOV2 et décrit dans l'article de Guntas et al. 2015 P.N.A.S. 112(1):112-117 a été fusionné en N-terminal de plusieurs variants de la protéine CRE recombinase. La méthode utilisée est schématisée sur la Figure 5. Elle a été de transférer, par recombinaison homologue spontanée dans des cellules de levure, un 20 fragment d'ADN amplifié par PCR et contenant la séquence du variant CRE ainsi que, éventuellement, certaines modifications de séquence souhaitées en N-terminal dudit variant, dans un plasmide contenant un système d'expression et la séquence codante de iLID. En particulier, la construction iLID-Crel9 a été obtenue par i) PCR où la matrice 25 ADN a été le plasmide pGY115 et où les amorces ont été 1042 dont la séquence est 5'- AGAAAAGGAGAGGGCCAAGA-3' (SEQ ID NO :18) et 1M43 dont la séquence est 5'- CTTATTAAGAAAACCGCATTTCAAATCgccacgagtgatgaggttcgcaag-3' (SEQ ID NO :19), ii) digestion du plasmide pGY408 par les enzymes MfeI et B siWI et purification sur gel d'agarose 1% du fragment de 4,4Kb, iii) co-transformation des produits des étapes 30 i) et ii) dans la souche de levure GY1761 et sélection sur milieu sans tryptophane. De manière similaire, la construction iLID-Cre27 a été obtenue en appliquant les étapes i) à iii) ci-dessus avec la modification suivante de l'étape i): utilisation de l'amorce 33 1M51 dont la séquence est 5'-CTTATTAAGAAAACCGCATTT CAAATCgccctgatggacatgttcagggat-3 (SEQ ID NO :20) à la place de l'amorce 1M43. De manière similaire, la construction iLID-Cre32 contenue dans le plasmide pGY415 a été obtenue en appliquant les étapes i) à iii) ci-dessus avec la modification 5 suivante de l'étape i): utilisation de l'amorce 1M53 dont la séquence est 5'- CTTATTAAGAAAACCGCA TTTCAAATCgccagggatcgccaggcgttttctg-3' (SEQ ID NO :21) à la place de l'amorce 1M43. De manière similaire, la construction iLID-CreAA20 contenue dans le plasmide pGY416 a été obtenue en appliquant les étapes i) à v) ci-dessus avec les modifications 10 suivantes de l'étape i): utilisation de l'amorce 1M44 dont la séquence est 5'- CTTATTAAG AAAACCGCATTTCAAATCgccagtgatgaggttcgcaagaac-3' (SEQ ID NO :22) à la place de l'amorce 1M43 et utilisation de la matrice pGY372 au lieu de la matrice pGY115. Dans les constructions ainsi obtenues, l'expression de la protéine de fusion est 15 placée sous le contrôle du promoteur du gène GAL1 de Saccharomyces cerevisiae. Démonstration de la photoactivation de ces protéines de fusion. L'activité des protéines de fusions a été évaluée en appliquant ou non une illumination des cellules selon le protocole Pl. Les résultats obtenus sont présentés en figure 6. La fusion iLID-Crel9 présente une activité de 25% sans illumination et de 32% 20 après illumination, la fusion iLID-Cre27 présente une activité de 50% sans illumination et de 60% après illumination, la fusion iLID-Cre32 présente une activité de 15% sans illumination et de 45% après illumination, et la fusion iLID-CreAA20 présente une activité nulle sans illumination et de 18% après illumination. Obtention et activités des constructions iLID(QI)-xn-Cre32 25 Une série de mutants notés iLID(QI)-xi-Cre32 a été générée afin d'introduire un acide aminé aléatoire à la jonction entre iLID et Cre32. Cette série a été obtenue en amplifiant par PCR la séquence comportant une portion de la CRE recombinase en utilisant l'amorce antisens 1F14 de séquence 5'-gtgatgacggtgaaaacctc-3' (SEQ ID NO :23) et l'amorce sens 1N24 de séquence 5'-CTT ATT AAG AAA ACC GCA TTT CAA ATC- 30 VNN-agg gat cgc cag gcg ttt tct g-3' (SEQ ID NO :24) où V correspond aléatoirement à 34 A, C ou G, et N correspond aléatoirement à A, T, C ou G. L'amplicon obtenu a été inséré par recombinaison homologue dans le vecteur de 4,4kb issu de la digestion NcoI-BsiWI du plasmide pGY417. Une autre série de mutants notés iLID(QI)-x2-Cre32 a été générée de manière 5 similaire en utilisant l'amorce 1N25 de séquence 5'-CTT ATT AAG AAA ACC GCA TTT CAA ATC-VNN VNN-agg gat cgc cag gcg ttt tct g-3' (SEQ ID NO :25) au lieu de l'amorce 1N24. Une autre série de mutants notés iLID(QI)-x3-Cre32 a été générée de manière similaire en utilisant l'amorce 1N26 de séquence 5'-CTT ATT AAG AAA ACC GCA 10 TTT CAA ATC-VNN VNN VNN-agg gat cgc cag gcg ttt tct g-3' (SEQ ID NO :26) au lieu de l'amorce 1N24. Dans les constructions ainsi obtenues, l'expression de la protéine de fusion est placée sous le contrôle du promoteur du gène GAL1 de Saccharomyces cerevisiae. L'activité des protéines de fusions a été évaluée en appliquant ou non une 15 illumination selon le protocole Pl. La Figure 7 présente les activités sans ou avec illumination pour plusieurs constructions iLID(QI)-x11-Cre32 ainsi générées. Ces constructions présentent un gain d'activité après illumination. Activité lors de différentes conditions d'illumination Des conditions d'illumination de temps et d'intensités différentes ont été 20 appliquées à des cellules de levure contenant la construction iLID_Cre32 ou la construction iLID_CreAA20, placée dans deux types de cassette d'expression. La première cassette comprend le promoteur du gène GALL Les résultats obtenus avec cette cassette et selon le protocole Pl, en appliquant ou non une illumination des cellules selon des intensités et des durées variables, sont présentés sur la figure 8. La seconde cassette 25 comprend le promoteur du gène MET17. Les résultats obtenus avec cette cassette et selon le protocole P2, en appliquant ou non une illumination des cellules selon des intensités et des durées variables, sont présentés sur la figure 9. Ces résultats montrent que l'activité recombinase des constructions est activable dans des conditions de temps et d'intensité très variées. Ajout d'un peptide d'adressage au noyau. Une construction NLS_iLID_CreAA20 a été étudiée. Cette construction correspond à la fusion à l'extrémité N-terminale de iLID_CreAA20 d'un peptide dont la séquence VPKKKRKV (SEQ ID NO : 27) (Nuclear Localization Signal, NLS) est connue 5 pour adresser des protéines au noyau des cellules, comme indiqué dans l'article de Cheng et al. Endocrinology 157: 127-140, 2016, suivie de la séquence GGSGG (SEQ ID NO: 28). Cette construction a été obtenue en réalisant une amplification PCR avec les amorces 1080 (5'-atgtgagttacctcactcat-3' (SEQ ID NO: 29)) et 1084 (5'- GCTAAAGAACCGTGATGGTGGTGATGATGTGAACCTCTCATACCTCCGGAac 10 caccgacttttctcttct-3' (SEQ ID NO : 30)) sur le plasmide pGY491 et en co-transformant le produit de ladite amplification avec le fragment SacI-EcoRI du plasmide pGY466 dans une souche de levure. Dans les constructions ainsi obtenues, l'expression de la protéine de fusion est placée sous le contrôle du promoteur du gène MET17 de Saccharomyces cerevisiae. L'activité de cette construction a été évaluée en appliquant le protocole P2. 15 L'activité de cette construction est présentée dans les résultats de la figure 10. Test comparatif avec le système nMag/pMag-CRE Un système de recombinase activable basé sur la dimérisation photo-inductible de peptides appelés nMag et pMag, a été décrit dans l'article de Kawano et al. Nat. Chem. Biol. 2016 12(12): 1059-1064. Ce système comporte deux protéines de fusion distinctes 20 qui doivent être exprimées dans la même cellule. Afin de comparer les performances de ce système à celles de la présente invention, deux constructions plasmidiques ont été réalisées: pMet17-Cre18to59-nMag-NLS-URA (SEQ ID NO : 31) et pMet17-ATG-NLSpMag-Cre60to343-TRP (SEQ ID NO: 32). Dans ces constructions, l'expression de chacune des protéines de fusion est placée sous le contrôle du promoteur du gène MET17 25 de Saccharomyces cerevisiae. La combinaison de ces deux plasmides est appelée nMag/pMag-CRE ci-après. L'activité de ce système a été testée en comparaison de la présente invention selon le protocole P3 et les résultats obtenus sont présentés sur la figure 11. Ces résultats confirment que le système nMag/pMag-CRE est photoactivable (activité de 10% sans 30 illumination et de 35% après illumination). Ils montrent également que ce système est moins performant que le système de la présente invention, en particulier que les fusions 36 iLID_Cre32 et iLID_CreAA20: celles-ci présentent un différentiel d'activité lié à l'illumination REVENDICATIONS1. Protéine de fusion comprenant un domaine recombinase fusionné à un domaine photorécepteur et dans laquelle l'activité recombinase est photoactivable. 2. Protéine de fusion selon la revendication 1, dans laquelle le domaine recombinase est fusionné en N-terminal au domaine photorécepteur. 3. Protéine de fusion selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le domaine photorécepteur comprend, ou consiste en, un domaine LOV2 de phototropine, ou un variant ou dérivé de celui-ci. 4. Protéine de fusion selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le domaine photorécepteur est un dérivé d'un domaine LOV2, de préférence un domaine iLID (improved light inducible dimer), et de manière plus particulièrement préférée un domaine iLID dérivé du domaine LOV2 de la phototropine 1 d' Avena sativa. 5. Protéine de fusion selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le domaine photorécepteur de la protéine de fusion est un domaine iLID présentant la séquence SEQ ID NO: 13 dans laquelle X représente un à trois acides aminés, de préférence X représente A, D, K, L, IL, VV, AI ou QPG. 6. Protéine de fusion selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le domaine recombinase est sélectionné dans le groupe constitué de la recombinase CRE (SEQ ID NO: 1), et des variants fonctionnels de celle-ci. 7. Protéine de fusion selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le domaine recombinase est un variant fonctionnel de la recombinase CRE comprenant, ou consistant en, la séquence SEQ ID NO: 2, ou une séquence présentant au moins 80% d'identité de séquence avec la SEQ ID NO: 2. 37 38 8. Protéine de fusion selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le domaine recombinase est un variant fonctionnel de la recombinase CRE, ledit variant comprenant, ou consistant en, une recombinase CRE de SEQ ID NO: 1 dans laquelle 18, 19, 26 ou 31 acides aminés ont été délétés en N-terminal, et présentant de manière optionnelle une substitution au niveau du résidu correspondant au résidu E340 de la SEQ ID NO: 1 et/ou une substitution au niveau du résidu correspondant au résidu D341 de la SEQ ID NO : 1 9. Acide nucléique codant pour une protéine de fusion selon l'une quelconque des revendications précédentes. 10. Cassette d'expression comprenant un acide nucléique selon la revendication 9. 11. Vecteur d'expression comprenant un acide nucléique selon la revendication 9 ou une cassette d'expression selon la revendication 10. 12. Cellule hôte comprenant un acide nucléique selon la revendication 9, une cassette d'expression selon la revendication 10 ou un vecteur d'expression selon la revendication 11. 13. Procédé pour induire une activité recombinase dans une cellule hôte isolée comprenant - la fourniture d'une cellule hôte isolée exprimant une protéine de fusion selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 ou l'insertion d'un acide nucléique selon la revendication 9, une cassette d'expression selon la revendication 10 ou un vecteur d'expression selon la revendication 11 dans une cellule hôte isolée et - l'exposition de ladite cellule à une lumière capable d'activer le domaine photorécepteur de ladite protéine de fusion et donc l'activité recombinase. 14. Procédé pour modifier un acide nucléique, comprenant - la mise en contact in vitro ou ex vivo d'une protéine de fusion selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, avec ledit acide nucléique d'intérêt comprenant un ou plusieurs sites de reconnaissance reconnus par le domaine recombinase de ladite protéine de fusion, et - l'exposition de la protéine de fusion et dudit acide nucléique à une lumière capable 39 d'activer le domaine photorécepteur de ladite protéine de fusion et donc l'activité recombinase. 15. Procédé selon la revendication 14, qui est utilisé - pour moduler l'expression d'une molécule d'intérêt dans la cellule hôte, - pour induire de la diversité génétique dans la cellule hôte, ou - pour modifier une activité biologique dans le cadre d'une thérapie génique. 16. Kit comprenant une protéine de fusion selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, un acide nucléique selon la revendication 9, une cassette d'expression selon la revendication 10, un vecteur d'expression selon la revendication 11 et/ou une cellule hôte selon la revendication 12, et optionnellement une source lumineuse capable d'activer le domaine photorécepteur de la protéine de fusion. 17. Utilisation d'un kit selon la revendication 16, pour induire une activité recombinase dans une cellule selon le procédé de la revendication 13 et/ou pour modifier un ou plusieurs acides nucléiques selon le procédé de la revendication 14 ou 15.