Brevet FR3075370A1 — publié le 20190621

PROCEDE DE CALIBRATION D'UN DISPOSITIF D'ANALYSE ET DISPOSITIF ASSOCIE DOMAINE TECHNIQUE La presente invention concerne le domaine de l'analyse optique de particules biologiques. Les particules biologiques peuvent etre des microorganismes tels que des bacteries, des champignons ou des levures par exemple. 11 peut egalement s'agir de cellules, organismes multicellulaires, ou toute autre particule de type particule polluante, poussiere. L'invention trouve une application particulierement avantageuse pour positionner un systeme optique sur une particule biologique d'interet afin d' ameliorer les mesures des caracteristiques physiologiques de la particule biologique, par exemple a l'aide de la 15 spectroscopie Raman. ART ANTERIEUR La spectroscopie Raman est une methode non destructive de determination des 20 caracteristiques physiologiques d'une particule biologique. Cette methode exploite le phenomene physique selon lequel un milieu modifie legerement la frequence de la lumiere circulant dans le milieu. Cette modification de la frequence de la lumiere correspond a un echange d'energie entre le rayon lumineux et le milieu, et donne des informations sur la particule biologique presente dans le milieu. La spectroscopie Raman 25 consiste a envoyer une lumiere monochromatique, par exemple un faisceau laser, sur la particule biologique et a analyser la lumiere diffusee. La demande de brevet international N° WO 2016/075279 decrit un procede d'analyse d'un echantillon contenant des particules biologiques au moyen d'un systeme 30 d'imagerie mettant en oeuvre une spectroscopie Raman. Un ensemble de detection recherche la position d'une particule biologique dans un milieu. Lorsqu'une particule est selectionnee, l'echantillon et/ou l'ensemble de detection est &place de sorte que le faisceau laser soit focalise sur la particule biologique. 2 Pour connaitre la consigne de &placement a appliquer a rechantillon et/ou l'ensemble de detection par rapport au faisceau laser, un modele de correspondance entre positions numeriques et positions reelles est utilise de sorte a faire la correspondance entre la position mesuree du pixel central de la particule dans l'image et les &placements 5 reels a accomplir. Lorsque le &placement est effectue, un ensemble d'analyse realise un tir laser sur la particule et capture la lumiere ayant interagi avec la particule de sorte a determiner au moins une caracteristique de la particule. 10 Un ensemble d'incertitudes, de defauts de construction ou de defauts lies aux tolerances des differentes pieces mecaniques et optiques peuvent conduire a une grande imprecision du &placement a effectuer pour positionner correctement la particule par rapport a l'ensemble d'analyse. En effet, un mode d'analyse fin, tel que la micro- spectroscopie Raman confocale adaptee a la mesure sur cellule individuelle, impose de positionner un objet dune taille inferieure a 1i.tm3, le volume confocal, avec un objet dont la dimension caracteristique est egalement de l'ordre du p.m'. Le probleme technique objectif de la presente invention est, par consequent, 20 d'ameliorer la precision du &placement de l'echantillon et/ou de l'ensemble de detection de sorte a ameliorer l'analyse d'une particule biologique presente dans un echantillon. EXPOSE DE L 'INVENTION 25 Pour resoudre le probleme technique, l'invention propose de calibrer le modele de correspondance entre positions numeriques et positions reelles en observant l'influence de plusieurs consignes de &placement sur la position d'au moins un element sur l'image issue de l'ensemble de detection. Pour ce faire, l'invention utilise un ensemble de detection, tres rapide, integrant une simple acquisition sans focalisation precise, associee 30 a une reconstruction numerique de la focalisation comportant au moins une focalisation numerique destinee a &teeter un element present dans l'echantillon et obtenir rapidement une position dudit element. 3 A cet effet, l'invention concerne un procede de calibration d'un dispositif d'analyse d'au moins un element present dans un echantillon, ledit dispositif comportant : un ensemble de detection comportant une source lumineuse configuree pour illuminer ledit echantillon, un systeme optique configure pour collecter le 5 rayonnement lumineux en provenance dudit echantillon, et un capteur d'image plan configure de sorte a acquerir une image formee par l'interference entre ladite source lumineuse et ledit rayonnement provenant de l'echantillon ; et des moyens de traitement numeriques configures pour &teeter une position numerique d'au moins un element dans ledit echantillon a partir de ladite image 10 acquise, et pour calculer une position reelle dudit element en fonction de ladite position numerique et d'un modele de correspondance entre positions numeriques et positions reelles. L'invention est caracterisee en ce que ledit procede de calibration comporte la mise 15 en oeuvre de plusieurs &placements predetermines dudit echantillon relativement audit systeme optique, et, pour l'ensemble desdits &placements, la detection d'une position numerique d'un meme element de sorte a determiner ledit modele de correspondance entre positions numeriques et positions reelles en fonction des &placements predetermines et des positions numeriques dudit element apres chaque &placement, ladite detection comportant les &apes suivantes : acquisition d'une image ; construction numerique d'une serie de matrices electromagnetiques modelisant, a partir de ladite image acquise, l'onde electromagnetique dans des plans paralleles au plan du capteur d'image et compris dans ledit echantillon pour une pluralite d'ecarts par rapport audit plan ; determination d'une matrice electromagnetique a une distance de mise au point, en particulier moyenne, dudit echantillon a partir de la serie de matrices electromagnetiques ; selection dudit element dans la premiere matrice electromagnetique ; et determination de ladite position numerique dudit element dans ladite premiere matrice electromagnetique. 4 L'invention permet ainsi de compenser, d'une maniere generale, les defauts optiques de l'ensemble de detection et les defauts mecaniques resultant du &placement entre l'echantillon et/ou de l'ensemble de detection. 5 Le systeme optique de l'ensemble de detection peut avantageusement etre reutilise pour realiser une analyse micro-spectroscopique Raman car le defaut de positionnement entre l'axe optique du systeme optique et l'axe normal de l'echantillon est compense par l'utilisation du modele de correspondance calibre selon l'invention. 10 Pour pouvoir determiner ce modele de correspondance rapidement, la mise au point est effectuee de maniere numerique a partir d'une image defocalisee associee a une reconstruction numerique de la focalisation. Ainsi, la position numerique de l'element est determinee a partir de l'image focalisee numeriquement. Il s'ensuit que les instruments de mesure sont simplifies car it n'est pas necessaire d'utiliser des appareils de mise au point 15 extremement précis pour mettre au point une image de l'ordre de la centaine de nanometres. Le modele de correspondance de l'invention permet ainsi de &teeter rapidement et avec une grande precision la position reelle d'une particule a partir d'une position 20 numerique d'une particule d'une image. Ce modele de correspondance peut ensuite etre utilise pour calculer le &placement de l'echantillon relativement au systeme d'analyse, et ainsi focaliser precisement un tir laser sur une particule dont la position dans l'image est connue. La difference de positionnement entre l'utilisation d'une &belle de transformation et la matrice de l'invention est reduite mais elle suffit a ameliorer 25 grandement les performances d'une spectroscopie Raman par exemple. Pour un exemple typique, un faisceau laser est focalise sur les coordonnees (0, 0, 0) d'un espace numerique tridimensionnel. Une particule d'interet est detectee aux coordonnees pixel (550, 0, 0). En utilisant une &belle de transformation liees aux 30 caracteristiques theoriques des divers elements composant le systeme, les &placements de l'echantillon peuvent correspond aux coordonnees (39.71, 0, 0) en micrometres. Avec l'invention et la calibration du modele de correspondance, les &placements de l'echantillon correspondent aux coordonnees (39.61, -0.23, 0.18) en micrometres. 5 Il s'ensuit que l'invention permet d'obtenir la precision de positionnement importante requise par ce type d'application, tout en s'affranchissant de contraintes trop fortes ou trop couteuses sur la conception de l'instrument. 5 Selon un mode de realisation, ledit modele de correspondance entre positions numeriques et positions reelles correspond a une matrice triaxiale suivant trois axes d'un systeme metrique, ladite ≊ de determination de ladite position numerique dudit element dans ladite premiere matrice electromagnetique etant realisee selon un axe, modelisant la position dudit element en profondeur dudit echantillon, en fonction de ladite 10 matrice electromagnetique a la distance de mise au point dudit echantillon. Ce mode de realisation permet ainsi de determiner la profondeur de l'element dans l'echantillon en utilisant les reconstructions numeriques de la focalisation. En effet, le maximum de focalisation sur un element de l'echantillon correspond a une position 15 precise en profondeur dans l'echantillon qu'il est possible d'estimer numeriquement. Selon un mode de realisation, les &placements predetermines sont realises dans deux directions opposees pour chaque axe dudit systeme metrique. 20 Ce mode de realisation vise a realiser deux &placements de sens opposes par axe de &placement de sorte a tenir compte du comportement dissymetrique du &placement, mis en oeuvre par exemple par le jeu d'une platine avec des moteurs pas-d-pas. De preference, ce mode de realisation est egalement mis en oeuvre avec des platines qui comprennent des organes de correction de type «correction de jeu » ou « backlash 25 correction », dont la fonction est de corriger ce type d'erreur. Par exemple, selon un premier axe et en partant de la position centrale, les moyens de &placement effectuent un premier &placement de 15 p.m et un second &placement de -15 p.m. Il s'ensuit egalement que le &placement total est de 30 p.m et les variations de la position de l'element sont egalement plus importantes. Ainsi, la determination du rapport entre les 30 &placements numeriques et reels est plus precise. 6 Selon un mode de realisation, la determination dudit modele de correspondance entre positions numeriques et positions reelles est realisee par l'intermediaire d'une moyenne des variations des positions numerique de plusieurs elements presents dans ladite image. Ce mode de realisation permet egalement d'ameliorer la precision du 5 rapport entre les &placements numeriques et reels. Selon un mode de realisation, ledit systeme optique ayant un axe optique et realisant la conjugaison entre un plan de mise au point et un plan focal, l'etape d'acquisition de ladite image est realisee alors que ledit systeme optique est place par rapport audit 10 echantillon de sorte que lesdits elements dudit echantillon ne sont pas dans ledit plan de mis au point. Selon un mode de realisation, avant les &apes d'acquisition d'une image pour obtenir lesdites positions numeriques dudit element, le procede comporte une ≊ 15 d'acquisition d'une image d'arriere-plan, les images obtenues lors desdits &apes d'acquisition etant normalisees par ladite image d' arriere-plan. Ce mode de realisation permet de supprimer les impuretes presentes sur le systeme optique ou le capteur afin d'ameliorer la nettete de l'image acquise pour les differents 20 &placements predetermines dudit echantillon relativement audit systeme optique. Selon un mode de realisation, ledit element correspond a un repere dudit echantillon. Par exemple, un marqueur peut etre positionne sur ou dans l'echantillon avec des caracteristiques bien distinctes du milieu de sorte a faciliter la detection de la position 25 numerique du marqueur dans la premiere matrice electromagnetique. Selon un mode de realisation, ledit element correspond a une particule presente dans ledit echantillon. Ce mode de realisation permet de reutiliser les particules presentes dans l'echantillon pour effectuer la calibration. Ainsi, it n'est pas necessaire de 30 positionner un marqueur dans l'echantillon. Selon un mode de realisation, ladite ≊ consistant a determiner ladite position numerique de ladite particule dans ladite premiere matrice electromagnetique est realisee en recherchant le centre de ladite particule. 7 Certaines particules s' etendent sur plusieurs pixels de l'image et sur plusieurs unites de profondeur de l'echantillon, ce mode de realisation vise a rechercher un centre de chaque particule afin de determiner la position de la particule. Ce faisant, ce mode de realisation ameliore la precision de la micro-spectroscopie Raman car cette methode est 5 d'autant plus precise que la focalisation est realisee sur le centre d'une particule. Selon un mode de realisation, ledit modele de correspondance entre positions numeriques et positions reelles est realise en considerant plusieurs particules presentes dans ledit echantillon, les positions numeriques des particules entre deux images 10 consecutives etant determinees en recherchant les positions des particules desdits deux images, en calculant les vecteurs reliant les particules deux a deux et on determinant un vecteur de &placement probable correspondant au vecteur le plus recurrent. Bien que l'utilisation des particules de l'echantillon permette de supprimer l'etape 15 de fixation d'un marqueur, it peut etre complexe de reconnaitre le &placement d'une particule specifique entre deux images contenant plusieurs particules. Pour remedier a ce probleme, ce mode de realisation propose ce calculer les vecteurs de &placement de plusieurs particules afin de determiner le &placement global des particules a l'aide du vecteur le plus recurrent. 20 Pour determiner le vecteur le plus recurrent, chaque vecteur peut etre prealablement approxime de sorte a masquer les imprecisions dans la detection de l'ensemble des vecteurs. De meme, pour simplifier la correlation des vecteurs, it peut etre considers uniquement une partie des deux images. 25 DESCRIPTION SOMMAIRE DES FIGURES La maniere de realiser l'invention ainsi que les avantages qui en decoulent, ressortiront bien du mode de realisation qui suit, donne a titre indicatif mais non limitatif, 30 a l'appui des figures annexees dans lesquelles les figures 1 a 5 representent : figure 1 : une representation schematique en coupe d'un dispositif d'analyse d'une particule presente dans un echantillon selon un mode de realisation de l'invention ; 8 figure 2: une representation schematique d'un organigramme de fonctionnement des moyens de traitement de la figure 1 selon un premier mode de realisation ; figure 3: une representation schematique d'un organigramme de 5 fonctionnement du module de determination d'une image focalisee moyenne de la figure 2 ; et figure 4 : une representation des images obtenues pour cinq deplacements de l'echantillon du dispositif d'analyse de la figure 1. 10 DESCRIPTION DETAILLEE DE L INVENTION La figure 1 illustre un dispositif d'analyse 10 d'une particule 11 presente dans un echantillon 12. L' echantillon 12 est dispose entre une source lumineuse 13, spatialement et temporellement coherente (e.g. un laser) ou pseudo-coherente (e.g. une diode 15 electroluminescente, une diode laser), d'axe d'illumination Aill, et un capteur numerique 16 sensible dans la gamme spectrale de la source lumineuse 13. De preference, la source lumineuse 13 comporte une faible largeur spectrale, par exemple inferieure a 200nm, inferieure a 100nm ou encore inferieure a 25 nm. Ces proprietes spectrales conferent a la source lumineuse 13 une coherence temporelle permettant la reconstruction 20 holographique dans une gamme compatible avec les incertitudes de positionnement rencontrees de l'ordre de la centaine de nanometre. La geometrie de la source lumineuse 13, sa taille apparente et sa position dans l'espace, sont preferentiellement choisies en fonction des proprietes optiques du systeme (grandissement, taille du point source...) pour que la coherence spatiale de cette source lumineuse 13 ne soit pas 25 limitante par rapport a la coherence temporelle define par les proprietes de largeur spectrale proposee ci-dessus. Dans ce qui suit, it est fait reference a la longueur d'onde d'emission centrale de la source lumineuse 13, par exemple dans le domaine visible. La source lumineuse 13 emet 30 un signal coherent Sn oriente sur une premiere face 23 de l' echantillon, par exemple achemine par un guide d'onde tel qu'une fibre optique. 9 L'echantillon 12 consiste en un liquide tel que de l' eau, une solution tampon, un milieu de culture ou un milieu reactif (comprenant ou non un antibiotique), dans lequel se trouvent les particules 11 a observer. 5 En variante, l'echantillon 12 peut se presenter sous la forme d'un milieu solide, de preference translucide, tel qu'une gelose agar, dans et sur lequel se trouvent les particules 11. L'echantillon 12 peut egalement etre un milieu gazeux. Les particules 11 peuvent se situer a l'interieur du milieu ou bien a la surface de rechantillon 12. 10 Les particules 11 peuvent etre des microorganismes tels que des bacteries, des champignons ou des levures. Il peut egalement s'agir de cellules, organismes multicellulaires, ou toute autre particule de type particule polluante, poussiere. La taille des particules 11 obseryees varie entre 500nm et plusieurs centaines de p.m, voire quelques millimetres. 15 L'echantillon 12 est contenu dans une chambre d'analyse, delimitee verticalement par une lame inferieure et une lame superieure, de preference des lames planes et paralleles, par exemple des lames de microscope conventionnelles. La chambre d'analyse est delimitee lateralement par un adhesif ou par tout autre materiau etanche. En variante, 20 l'echantillon peut etre depose sur une lame de microscope ou support equivalent, sans etre emprisonne dans une chambre d'analyse. Les lames inferieure et superieure sont transparentes a la longueur d'onde de la source lumineuse 13, l'echantillon et la chambre laissant passer par exemple plus de 50% 25 la longueur d'onde de la source lumineuse 13 sous incidence normale sur la lame inferieure. De preference, les particules 11 sont disposees dans l'echantillon 12 au niveau de la lame superieure. La face inferieure de la lame superieure comprend a cet effet des ligands 30 permettant d'accrocher les particules, par exemple des polycations (e.g. poly-L-lysine) ou des anticorps dans le cadre de microorganismes. Ceci permet de contenir les particules 11 dans une epaisseur egale a, ou proche de, la profondeur de champ du systeme optique, a savoir dans une epaisseur inferieure a 1mm (e.g. lentille), et de preference inferieure a 10 100[tm (e.g. objectif de microscope). Les particules 11 peuvent neanmoins se &placer dans l'echantillon 12. De preference, le dispositif comprend un systeme optique 18 constitue, par 5 exemple, d'un objectif de microscope, e.g. un objectif a focal fixe, et d'une lentille de tube, dispose dans l'air. Le systeme optique 18 est optionnellement equipe d'un filtre pouvant etre situe devant l'objectif ou entre l'objectif et la lentille de tube. Le systeme optique 18 est caracterise par son axe optique Aopt, son plan objet, egalement denomme plan de mise au point, a une distance de l'objectif, et son plan d'image, conjugue du plan 10 d'objet par le systeme optique. En d'autres termes, a un objet situe dans le plan d'obj et, correspond une image nette de cet objet dans le plan image, egalement appele plan focal. Les proprietes optiques du systeme optique 18 sont fixes (e.g. optique a focale fixe). Les plans objet et image sont 15 idealement orthogonaux a l'axe optique, et supposes comme tels pour les modelisations mathematiques &ernes ci-dessous. Le capteur d'image 16 est plan et est situe, en regard d'une face superieure 14 de l'echantillon 12, dans le plan focal ou a proximite de ce dernier aux erreurs d'assemblage 20 et de construction pres. Le capteur d'image 16, par exemple un capteur CCD ou CMOS plan, comprend un reseau bidimensionnel periodique de sites elementaires sensibles, et une electronique de proximite qui regle le temps d'exposition et la remise a zero des sites, d'une maniere connue en soi. Le signal de sortie d'un site elementaire est fonction de la quantite de rayonnement de la gamme spectrale incident sur ledit site pendant la duree 25 d'exposition. Ce signal est ensuite converti, par exemple par l'electronique de proximite, en point image, ou « pixel », d'une image numerique. Le capteur d'image 16 produit ainsi une image numerique sous forme d'une matrice a C colonnes et L lignes. Chaque pixel de cette matrice, de coordonnees (c, 1) dans la 30 matrice, correspond d'une maniere connue en soi a une position de coordonnees cartesiennes (x(c,1),y(c,1))) dans le plan focal du systeme optique 18, par exemple la position du centre du site sensible elementaire de forme rectangulaire. Le capteur d'image 16 comporte egalement un axe A, normal a la surface plane du capteur 11 d'image 16 pour lequel l'image Ih issue du capteur d'image 16 presente un minimum de deformation par rapport a la scene observee. Preferentiellement, le pas et le facteur de remplissage du reseau periodique sont 5 choisis pour respecter le critere Shannon-Nyquist vis-à-vis de la taille des particules observees, de maniere a definir au moins deux pixels par particule. Ainsi, le capteur d'image 16 acquiert une image en transmission de l'echantillon 12 dans la gamme spectrale de la source lumineuse 13. 10 L'image Ih acquise par le capteur d'image 16 comprend des informations holographiques dans la mesure on elle resulte de l'interference entre une onde diffractee Fi par les particules 11 et une onde de reference Fn ayant traversee l'echantillon 12 sans avoir interagi avec lui. Comme decrit plus haut, dans le cadre d'un capteur CMOS ou CCD, l'image numerique Ih acquise et memorisee dans les moyens de traitement numeriques 25 est une image en intensite, l'information de phase etant donc codee en intensite, avec l'image numerique Ih selon la relation : ih(1,1) ih(c, 1) ... ih(C,1)\ Ih = I ih(1, 1) ... ih(c, 1) ih(C , 1) \ih(1, L) ih(c, L) ih(C , L)/ Alternativement, it est possible de diviser le signal coherent Sn issu de la source lumineuse 15 en deux composantes, par exemple au moyen d'une lame semi-transparente. La premiere composante sert alors d' onde de reference et la seconde composante est 25 diffractee par l'echantillon 12, l'image dans le plan image du systeme optique 23 resultant de l' interference entre l'onde diffractee Fi et l'onde de reference Fn. 15 20 12 L'image en intensite Ih acquise par le capteur d'image 16 n'est pas focalisee sur une particule 11 a observer et l'obtention d'une information focalisee sur une particule 11 est obtenue numeriquement par des moyens de traitement numeriques 25 connectes au capteur d'image 16 pour recevoir les images Ih acquises par ce dernier. 5 Par « defocalisee », on entend ici qu'il n'y a pas d'intersection entre le plan de mise au point et la particule 11 objet de l'observation. Les moyens de traitement numeriques 25 peuvent correspondre a un ordinateur, un microcontroleur, une tablette tactile ou un telephone intelligent, ou de maniere generale tout systeme informatique a base de 10 processeur capable de recevoir des donnees, traiter ces donnees en mettant en oeuvre des instructions informatiques stockees dans une memoire informatique, et de delivrer et/ou stocker dans une memoire informatique le resultat du traitement. Les moyens de traitement numeriques 25 peuvent etre connectes de maniere filaire 15 ou non filaire avec le capteur d'image 16 ou au moyen d'une communication sans fil. Les moyens de traitement numeriques 25 peuvent etre associes a un ecran pour l'affichage des resultats intermediaires ou finaux du procede de l'invention. En variante, les moyens de traitement numeriques 25 peuvent correspondre a un ensemble de plusieurs systemes informatiques avec un systeme dedie au capteur d'image 16 et d'autres systemes 20 specifiques pour les autres elements relies aux moyens de traitement numeriques 25. La source lumineuse 13, le capteur d'image 16 et les moyens de traitement numeriques 25 forment un dispositif d'analyse d'au moins une particule 11 dans l'echantillon 12 de sorte a obtenir la position d'au moins une particule d'interet 11 dans 25 l'echantillon 12. Pour realiser l'analyse d'une particule d'interet 11 specifique, presente dans l'echantillon 12, le dispositif integre egalement une platine 20 de &placement de l'echantillon 12. La platine 20 assure un &placement tri-axial d'axes X, Y, Z a base de 30 moteurs pas-à-pas commandos par une unite de commande, par exemple les moyens de traitement numeriques 25, en fonction d'une consigne de position ou de &placement. La platine 20 permet de &placer l'echantillon 12 relativement au systeme optique 18 selon un axe Z idealement parallele a l'axe optique Aoptet de &placer l'echantillon 12 selon 13 deux autres axes X, Y idealement definissant un plan orthogonal a l'axe optique Aopt. En variante, la platine 20 peut etre configuree pour &placer le systeme optique 18 et/ou la source lumineuse 13 alors que l'echantillon 12 est fixe. 5 Ainsi, les &placements selon les axes X, Y permettent de regler la position de l'axe optique Aopt sur l'echantillon 12, et donc la position d'un laser Raman sur echantillon 12. En outre, les &placements selon l'axe Z permettent de regler la distance entre l'echantillon 12 et le systeme optique 18, et par consequent la position du plan focal (ou de maniere equivalente la position du volume confocal) par rapport a l' echantillon 12. 10 Dans l'ideal, l'axe optique Aopt, l'axe mecanique Z de &placement de la platine 20, l'axe d'illumination A111, l'axe A, normal a la surface plane du capteur 16 et l'axe An normal a la surface plane de l'echantillon 12 devraient etre alignes mais les erreurs de construction et la presence de jeu peuvent rendre ces alignements imparfaits 15 lorsqu'une grande precision est requise. On peut ainsi definir un systeme d'axes reel, different du systeme X, Y, Z, lie au capteurs d'images comme X',Y' et Zi, ou X' et Y' sont compris dans la surface plane du capteur 16 et Zr, colineaire a l'axe Ac. Les calculs de reconstruction numerique du front d'onde decrits ci-apres ou des 20 consignes de &placement, sont bases sur une telle hypothese. En realite, it existe des defauts d'alignement que l'invention corrige au moyen de la calibration du modele de correspondance. L'ensemble d'analyse par spectroscopie Raman comporte, par exemple, une source 25 lumineuse monochromatique 17 et un spectrometre 19. La source lumineuse 17 correspond preferentiellement a un laser. Le faisceau issu du laser est oriente dans le systeme optique 18, et donc sur l'echantillon 12, par exemple par un ensemble de miroirs et de filtres 28. Le systeme 30 optique 18 permet de focaliser la source lumineuse 17 sur une position particuliere de l'echantillon, la position de la focalisation etant reglable en deplacant echantillon 12 par rapport au systeme optique 18 a l'aide de la platine 20. D'une maniere connue en soi, la platine 20 recoit une consigne de position pour l'echantillon 12, ce qui permet de 14 positionner le tir laser sur ce dernier, consigne par exemple communiquee aux moyens de traitement numeriques 25, notamment la position d'une particule detectee comme decrit ci-dessous. En particulier, les moyens de traitement numeriques 25 determinent une position numerique de la particule en fonction d'un traitement d'image et convertit cette 5 position numerique en une position reelle de la particule dans Pechantillon (e.g. dans un repere fixe lie au bati du dispositif ou a la platine d'une maniere connue en soi), position reelle communiquee au moyen de &placement en tant que consigne de position. Pour ce faire, les moyens de traitement numeriques 25 utilisent un modele de correspondance entre une position numerique, notee Pn, et une positions reelles notee Pr. La calibration 10 de ce modele de correspondance sera decrite plus loin. La diffusion Raman du faisceau laser dans Pechantillon 12 est cap-tee par le spectrometre 19 en passant egalement par l'ensemble de miroirs et de filtres 28. Le laser et le spectrometre 19 sont connectes aux moyens de traitement numeriques 25 qui 15 commandent le tir laser et receptionnent l'image de la diffusion. Bien entendu, les differents elements peuvent etre agences differemment sans changer l'invention. La position du systeme optique 18 et les &placements de Pechantillon 12 ont pour but de focaliser le faisceau laser sur une particule d'interet 11 presente dans 20 Pechantillon 12. Pour ce faire, la Figure 2 illustre les modules de traitement informatique 51-56, integres dans les moyens de traitement numeriques 25 sous forme d'instructions informatiques mises en oeuvre par l'ordinateur, suite a l' acquisition 50 de l'image en intensite Ih par le capteur d'image 16. Un premier module 51 construit une serie de matrices complexes 11,...,1n, ..., IN, nommees « matrices 25 electromagnetiques » EM, modelisant a partir de l'image Ih le front d'onde lumineux propage le long de l' axe optique pour une pluralite d'ecarts par rapport au plan de mise au point du systeme optique 18, et en particulier des &arts positionnes dans Pechantillon. Une methode de calcul de fronts d'onde par propagation numerique est explique 30 dans Particle de Sang-Hyuk Lee et al. Intitule « Holographic microscopy of holographically trapped three-dimensional structures » publie dans Optics Express, Vol. 15 ; N°4, 19 Fevrier 2017, pp. 1505-1512. 15 Plus precisement, si l'on note hz(r) la fonction de propagation de Rayleigh- Sommerfeld, soit : 1 a etkR hz(r) = 2rc az R ou : - z est la hauteur dite de « defocalisation », autrement dit l'ecart par rapport au 5 plan de mise au point, - r = (ad, 0) est la position en coordonnees polaires dans le plan d'image, de coordonnee radiale In I et de coordonnees angulaire, - R2 = 1712 + z2 , et - k = 2n-n/A, est un nombre d'onde relatif au milieu de propagation d'indice de 10 refraction n a la longueur d'onde A de la source lumineuse. A partir de cette relation, l'onde electromagnetique a(r, z), d' amplitude I a(r, z)I et de phase cp(r, z), dans le plan d' ordonnee z peut etre exprimee sous la forme : a(r,z) = la(r,z)lexp(iv(r,z)) 1 +" a(r,z) = -47r2 Lc° B (q)H_z(q) exp(iqr) d2 q 15 ou - b(r) est intensite mesuree, i.e. l'image Ih (l'intensite de l'onde de reference est ici supposee constante), - B (q) est la transformee de Fourier de b(r), - H_z(q) est la transformee de Fourier de h_z(r) , et 20 - q est la variable duale de r dans la transformee de Fourier. Les equations ci-dessus definissent une formulation analytique de l'amplitude a(r, z). Bien que ce modele soit developpe pour la propagation dans un milieu homogene (et donc sans modification du nombre d'onde, sans presence d'interface 25 source de reflexion et/ou de deviation de l'onde, etc.), et par consequent sans rapport avec l'echantillon 12 et la chambre (qui comprennent de nombreuses interfaces et changement d'indices par exemple), les inventeurs ont note qu'il permet de reconstruire des informations electromagnetiques riches en rapport avec les particules observees, comme cela sera decrit-apres. 16 Ainsi, avantageusement, les moyens de traitement numeriques 25 memorisent un seul nombre d'onde, commun pour tous les milieux en jeux, par exemple l'indice de l' air. En variante, les moyens de traitement numeriques 25 memorisent les indices de refraction et epaisseurs des differents milieux en jeu le long de l'axe optique et construit les matrices 5 /1 - IN de proche en proche pour tenir compte des phenomenes aux interfaces. Pour des bacteries, le pas d'echantillonnage en z est inferieur de preference au dixieme de l'epaisseur de la bacterie, par exemple inferieure a 0,1 p.m, et de preference inferieure a 0,03 p.m. 10 On comprend ainsi que l' on peut construire une pile de matrices electromagnetiques /1 - IN pour des ordonnees z1, z2, zn, zN le long de l'axe optique, l'origine des ordonnees (z = 0) etant prise a la position axiale de mise au point, chaque matrice In etant define par une amplitude complexe a(r, zn) selon les relations : 7a(1,1)zn a(c , 1) zn a(C zi,\ a(1, l) zn a(c, 1) zn a(C \a(L; 1) zn a(c, Ozn a(C, Ozni 15 V(c,1) E [1, C] x [1,1] : a(c, 1) zn = a (7- ((c, 1), y(c , 1)), zn)) Les moyens de traitement numeriques 25 calculent ensuite sur chaque matrice In une application surjective positive AS de l'espace complexe CcxL vers l'espace reel i-zCxL: AS (a(1,1) zn) AS (a(c, 1) zn) ... AS (a(C , 1) zn)\ AS (In) = AS (a(1, Ozn) AS (a( c , 1) zn) ... AS (a(C , 1) zn) \AS (a(1,, 1)zn) AS (a( c, 1,) zn) AS (a(' , L) zn)/ 20 Par exemple, les moyens de traitement numeriques 25 calculent la norme hermitienne (ou son carree) des composantes a(c, 0 zn, la valeur absolue ou le cane de la partie imaginaire (notee Im(a(c, 0 zn) ou de la partie reelle (notee Re(a(c , 1) zn)) des 17 composantes a(c, Ozn, ou Re2 (a(c 0 zn) + Im2 (a(c , zn) ou (Re2 (a(c,l) zn) Im2 (a(c, zn))112 Sans etre lie par la theorie, les matrices AS(I1) - AS(IN) ne representent pas 5 necessairement une intensite lumineuse, mais les inventeurs ont note leur ressemblance avec des images en intensite obtenues sous eclairage non coherent. Notamment, les particules sont representees, comme dans une photographie, sous leur forme de particules. Il est ainsi possible d'appliquer tout type de traitement d'image classique 10 (segmentation, seuillage, detection de particule sur la base de leur morphologie, etc.), et meme pour un operateur d'identifier les particules (a la difference d'une image codant des interferences qui sont codees en intensite sous la forme de franges). Dans ce qui suit, pour alleger les notations, les matrices AS(I1) - AS(IN) sont no-tees /1 - IN, et la notation a(c, 0 zn correspondant a AS (a(c, l)). 15 Le procede consiste ensuite a identifier des particules dans l' echantillon en fonction des matrices /1 - IN, et pour chaque particule identifiee, a determiner une distance z de focalisation optimale, i.e. de mise au point, pour cette particule, puis a determiner dans la matrice de la serie 11 - IN correspondant a cette distance, un ensemble de pixels 20 appartenant a cette particule. Le second module 52 vise a determiner une distance de focalisation moyenne zfmoy a partir de la serie de matrices /1 - IN et a selectionner dans cette serie la matrice, notee I fmoy, dont la distance z est egale ou la plus proche de la distance zfmoy. 25 En variante, les moyens de traitement numeriques 25 recalculent la matrice I fmoy pour la distance zfmoy. Cette distance de focalisation moyenne zfmoy est celle qui correspond au mieux aux conditions ideales de mise au point sur l'ensemble des particules 11 au sens d'un 30 critere de focalisation predetermine. Cette distance peut etre determinee par toutes les techniques connues de traitement du signal ou du domaine de la photographie, par exemple de l'autofocus. La matrice electromagnetique resultante I fmoy est suffisamment « focalisee » pour des particules a differentes profondeurs puissent etre 18 detectees dans la matrice I fmoy. Les particules detectees sont notamment celles comprises dans une profondeur d'echantillon egale a la profondeur de champ. Comme decrit precedemment, dans un mode de realisation prefere, les particules sont disposees dans un volume d'epaisseur proche ou egale a cette profondeur de champ, de sorte que la 5 totalite, ou la quasi-totalite, des particules de l'echantillon peuvent etre detectees dans la matrice I fmoy. La figure 3 illustre un exemple de determination de la distance de focalisation moyenne zfmoy en representant, pour chaque coordonnee (c, /), la variation de a(c, 0 zn 10 en fonction de la distance z dans la pile d'images /1 - IN. Lorsqu'une particule est situee dans l'echantillon 12 sur l'axe, parallele a l'axe optique du systeme 18, de coordonnee (c,l) dans le plan focal, on observe une variation de a(c, 0 zn. Par exemple, la representation, en 57, des variations a(c, zn est analogue a une fonction gaussienne en fonction de la distance z. Au contraire, lorsqu'aucune particule n' est presente sur cet axe, 15 signifiant que seul le milieu de l' echantillon est present, a(c, 0 zn ne vane pas ou tres peu. Il est ainsi possible de detecter, en 58, un optimum Ipm pour chaque coordonnee (c, 1) representant la distance z de mise au point particuliere pour cette coordonnee. La distance de focalisation moyenne zfmoy peut donc etre recherchee par les 20 moyens de traitement numeriques 25 en calculant, en 59, la moyenne des distances z obtenues en detectant l'optimum Ipm de chaque coordonnee (c,l). Ifmoy est donc la matrice de la serie de matrices /1 - IN la plus proche de la distance z calculee. En variante, les moyens de traitement numeriques 25 25 selectionnent les P coordonnees, par exemple les 10000 coordonnees, presentant les plus grandes variations de leurs valeurs 25 a(c, zn en fonction de z (e.g. presentant les plus grands &arts entre la valeur maximale et la valeur minimale), puis calcule la distance zfmoy sur ces P coordonnees, ce qui augmente la precision sur cette distance. En variante, les valeurs a(c, Ozn de ces P coordonnees sont moyennees et 30 l'optimum de la courbe moyennee en fonction de z est calcule, la distance z de l'optimum etant la distance zfmoy. 19 Bien que la distance de focalisation moyenne zfmoy illustre une mise au point generale de l'image, la mise au point de chaque particule 11 n'est pas optimale, notamment en raison des variations de profondeur des particules 11 entre elles. Pour ameliorer la mise au point d'une particule 11 particuliere, l'invention propose de 5 determiner une distance de focalisation optimale pour chaque particule et de determiner une matrice focalisee specifique a la particule. A cet effet, les moyens de traitement numeriques 25 comportent un module 53 de selection des particules et un module 54 de determination des coordonnees des particules 11 dans l'image. 10 Le module 53 de selection des particules dans la matrice I fmoy peut prendre plusieurs formes de segmentation d'image de l'etat de la technique, tel qu'un balayage de cette matrice jusqu' a detecter les contours d'un element fini. En variante, les moyens de traitement numeriques 25 appliquent un seuillage prealable a la matrice I fmoy, la valeur seuil etant par exemple egale a Moy(I fmoy) + p x E(Ifmoy), on Moy(I fmoy) est la 15 moyenne des pixels de la matrice I fmoy, E(Ifmoy) est leur ecart-type, et p un entier superieur a 1, par exemple egal a 6. Les valeurs superieures a ce seuil sont alors determinees comme appartenant a des particules, et une segmentation d'image sur la matrice seuillee est mise en oeuvre. A 20 l'issue de l'identification, it est ainsi obtenu I ensembles de coordonnees de pixel (c,1), notes Part_l, ..., Part_i, ...Part_l. Chaque ensemble, memorise dans une memoire 26 associee aux moyens de traitement numeriques 25, repertorie les coordonnees dans le plan X,, Yi, des pixels de 25 l'image I fmoy appartenant a une meme particule. Le procede determine ensuite, en 54, pour chaque ensemble de coordonnees Parti, quelle distance z offre la meilleure focalisation pour la particule correspondante, puis determine quelle matrice de la serie /1 - IN correspond a cette 30 distance (ou calcule d'un nouvelle image pour cette distance), et finalement determine les coordonnees de la particule 11 presente dans cette image I f p. 20 Le calcul de la distance de focalisation optimale est, par exemple, realise de maniere analogue au calcul de la distance de focalisation moyenne. Pour chaque coordonnee (c,1) de l'ensemble Partj, la distance correspondant a l'optimum de a(c, l) zn est calculee, puis la distance de focalisation optimale est choisie egale a la 5 moyenne des distances z calculees. En variante, les valeurs a(c, l)zi, de l'ensemble Part_is sont moyennees, et l'optimum de la courbe des valeurs moyennees en fonction de z est calcule, la distance z de l'optimum etant la distance de focalisation optimale choisie. 10 La distance focale optimale correspond a une focalisation moyenne sur la particule 11, menant usuellement a une mise au point sur un plan median de la particule 11. Cette focalisation moyenne permet d'obtenir une information de profondeur, c'est-d-dire selon l'axe Z,, de la particule 11 dans l'echantillon 12. Il est ainsi possible de &teeter avec precision et sans focus la position en Xn, Y. et Z', d'une particule 11 dans 15 l'echantillon 12. Les particules 11 peuvent s'etendre sur plusieurs pixels de l'image dans le plan Xn, Y. et sur plusieurs unites de profondeurs selon l'axe Zn. Dans ce cas, la position en Xn, Y. et Z. de la particule 11 dans l'echantillon 12 sera determinee en fonction du centre de 20 la particule 11. Pour focaliser un tir laser sur une particule 11 selon la spectroscopie Raman, it est classique de &teeter une particule 11 dans une image et &placer l'echantillon 12 selon les axes X, Y en appliquant une transformation d'echelle entre la position de la 25 particule 11 et un &placement reel. L'invention propose de realiser ce &placement au moyen d'une matrice triaxiale Mc, plus precise. La matrice triaxiale Mc est obtenue, a l'etape 55, en determinant les coordonnes d'au moins une particule 11 dans plusieurs images Ifp en 30 fonction de plusieurs &placements predetermines 56. La matrice triaxiale Mc vise a modeliser le &placement reellement effectue par l'echantillon 12 suite a une consigne de &placement transmise par les moyens de traitement numeriques 25 aux moyens de &placement 20 tout en integrant les defauts optomecaniques du dispositif 10. 21 Comme decrit precedemment, les differents calculs electromagnetiques et de &placements sont realises en faisant rhypothese d'un alignement ideal des differents reperes et axes, ce qui induit une difference entre les &placements reels et les &placements souhaites pour l' echantillon 12 par rapport a l'ensemble de detection. Une 5 correction est mise en oeuvre compenser cette erreur au travers d'une matrice de changement de base Mc permettant de transformer la position numerique de la particule determinee par les moyens de traitement numeriques 25 en une position reelle de cette derniere dans rechantillon. 10 La matrice triaxiale Mc reflete la transformation entre l'espace numerique dont les valeurs xn, yn et zn sont codees en pixels sur l'image Ifp a l'espace metrique reel des &placement de l' echantillon par rapport au bloc optique dont les valeurs xs, ys et zs sont classiquement exprimees en micrometres. Ainsi, la matrice triaxiale Mc de changement de base peut s'exprimer selon la relation suivante : 15 (xn xs) yn) = Mc x (ys zn zs Cxx Cxy Cxz Mc = (Cyx Cyy Cyz Czx Czy Czz Pour determiner les coefficients de cette matrice triaxiale Mc, plusieurs &placements sont effectues et revolution de la position de la meme particule 11 est comparee avec les consignee de &placement transmises aux moyens de &placement 20. 20 Le nombre de &placements a effectuer peut dependre du systeme a qualifier et de ses proprietes. Au minimum un &placement par axe de &placement, de rotation ou de translation, est a effectuer. 11 est egalement possible que les proprietes du systeme imposent de realiser un &placement dans chaque sens de &placement si le systeme 25 presente des asymetries de comportement selon le sens, par exemple en raison d'une erreur de jeu du systeme d'entrainement dans un sens donne. 22 En particulier, dans le cas d'un systeme dote de trois axes de translation et possedant une asymetrie de comportement selon chacun des axes, six &placements sont effectues par rapport a une position centrale selon les consignee des moteurs pas a pas, par exemple: 5 - un premier &placement aux coordonnees (0, 0, -30)s ; - un deuxieme &placement aux coordonnees (+15, 0, -30)s ; - un troisieme &placement aux coordonnees (-15, 0, -30)s ; - un quatrieme &placement aux coordonnees (0, +15, -30)s ; - un cinquieme &placement aux coordonnees (0, -15, -30)s ; et 10 - un sixieme &placement aux coordonnees (0, 0, +30)s. Dans le cas d'un systeme dote de trois axes de translation et muni d'un systeme d'entrainement ne presentant aucune asymetrie, ou une asymetrie jugee non prejudiciable, il est possible realiser plus simplement seulement 3 &placements, par exemple : 15 - un premier &placement aux coordonnees (0, 0, -30)s ; - un deuxieme &placement aux coordonnees (+15, 0, -30)s ; et - un troisieme &placement aux coordonnees (0, +15, -30)s. En outre, un autre &placement peut etre effectue pour acquerir une image de fond 20 permettent de s' assurer de la qualite des images acquises pour chaque &placement meme dans des cas complexes oil de nombreuses poussieres et debris viennent masque les particules d'interet. En particulier, un &placement aux coordonnees aux coordonnees (0, 0, 300)s peut etre realise pour acquerir une image de fond. En variante, l'image de fond est acquise une unique fois si le systeme est repute propre ou ne pas evoluer dans le 25 temps. Dans la suite, il est fait reference au cas le plus complexe pour un systeme a 3 axes de translation au comportement asymetrique pour illustrer l'utilisation des images ainsi obtenues, a savoir six &placements. 30 La figure 4 illustre cinq images Ifp obtenues pour les cinq premiers &placements. L'image Ifp centrale illustre les particules 11 obtenues suite au premier &placement. La particule 11 entouree est selectionnee et ses coordonnes sont determinees par la methode precedemment decrite. Les coordonnes de cette particule 11 sont stockees dans la 23 memoire 26 et le second &placement est effectue. L'image Ifp de droite illustre ce second &placement. Le decalage de 15um selon l'axe X entraine un &placement de la particule 11 par rapport a la premiere image Ifp obtenue pour le premier &placement. Le troisieme &placement guide l'echantillon 12 selon l'axe X jusqu'a un decalage de -15 5 um par rapport a la premiere position. Ainsi, entre le deuxieme et le troisieme &placement la distance reelle parcourue par l'echantillon 12 est de 30 um alors que les autres axes sont invariants. Il est donc possible de simplifier la determination des coefficients de la matrice 10 triaxiale Mc selon l'equation suivante : (xn1) (Cxx Cxy Cxz) (30) yn1 = - - - x 0 znl - - - 0 La determination des positions de la particule 11, entouree entre ces deux &placements, permet donc d'obtenir les coefficients Cxx, Cyx, et Czx. 15 De la meme maniere, les quatriemes et cinquiemes &placements permettent d'obtenir les coefficients Cxy, Cyy et Czy selon la relation simplifiee suivante : (xn2) - - 0) yn2 = Cyx Cyy Cyz x 30 zn2 0 20 De la meme maniere, les premiers et sixieme &placements permettent d'obtenir les coefficients Cxz, Cyz et Czz selon la relation simplifiee suivante : (xn3) 0 yn3 = x 0 zn3 Czx Czy Czz 60 La resolution de ces systemes d' equations permet donc d'obtenir les coefficients de 25 la matrice triaxiale Mc. Une matrice inverse Md de la matrice triaxiale Mc modelise la transformation des pixels en &placements. La matrice inverse Md s'exprime selon les coefficients suivants : 24 (CORRx CORRxy CORRxz Md = CORRyx CORRy CORRyz CORRzx CORRzy CORRz Ainsi, la matrice triaxiale Mc ou la matrice inverse Md presentent des rotations et des homotheties sur tous les axes possibles. Selon un exemple non limitatif, la matrice inverse Md peut integrer les coefficients suivants : 5 (0.07220 0.00040 -0.00129 Md --, -0.00042 0.07234 -0.00063 0.00034 -0.00019 0.10953 Meme si les valeurs typiques sont faibles, ces valeurs sont suffisantes pour alterer significativement les resultats dune mesure par la spectroscopie Raman dont la precision recherchee est de l'ordre de 0.07um selon les axes x et y, et 0.02um selon l'axe z. Dans 10 l'exemple ci-dessus, les coefficients sont obtenus en considerant les &placements d'une seule particule 11, entouree sur les images I f p de la figure 4. En variante, chaque coefficient peut etre obtenu par une moyenne des variations des coordonnees de plusieurs particules 11 presentes sur deux &placements. En outre, un seul 15 &placement peut etre realise dans chaque direction pour obtenir la matrice triaxiale Mc. Lorsque la matrice triaxiale Mc est connue, une consigne de &placement peut etre transmise par les moyens de traitement numeriques 25 de sorte a &placer echantillon 12 afin de focaliser le laser 17 sur une particule d'interet 11 dont la position a ate determinee 20 telle que decrit ci-dessus. Ainsi, un tir laser précis peut etre effectue sur la particule d'interet 11 alors que le spectrometre 19 capte la diffusion de la lumiere issue du laser 17 de sorte a determiner des caracteristiques, notamment physiologiques, de la particule d'interet 11. En outre, cette matrice triaxiale Mc peut etre utilisee plusieurs fois afin de determiner des caracteristiques physiologiques de plusieurs particules d'interet 11. 25 La matrice Mc, et donc la matrice Md, peut etre mise a jour regulierement, lors de l'introduction d'un echantillon 12 dans le dispositif d'analyse (necessitant par exemple l'ouverture/fermeture d'un tiroir ou d'une porte pouvant induire un &placement des 25 differentes pieces du systeme), ou a chaque fois qu'une analyse d'une particule 11 est souhaitee. Il a ete decrit la determination de la matrice de changement de base par analyse de 5 la position d'une particule 11 dans des images. Plusieurs particules 11 peuvent etre analysees pour moyenner le resultat et obtenir une determination plus robuste de la matrice Mc. De meme, it a ete decrit l'analyse de la position d'une particule, e.g. une bacterie 10 dans un echantillon biologique. Tout type de repere, par exemple un defaut du milieu (e.g. une bulle, une craquelure), peut etre utilise pour proceder a cette analyse. La description fait egalement mention d'une platine 20 pour &placer l'echantillon 12 a l'aide de moteurs pas-d-pas. En variante, d'autres moyens de &placement peuvent etre mis en oeuvre et les &placements peuvent etre effectues manuellement par un operateur. La matrice de 15 correspondance indiquant alors a l'operateur les &placements précis a effectuer pour cibler une particule 11 dans l'echantillon REVENDICATIONS1. Procede de calibration d'un dispositif d'analyse (10) d'au moins un element (11) present dans un echantillon (12), ledit dispositif (10) comportant : un ensemble de detection comportant une source lumineuse (13) configuree pour illuminer ledit echantillon (12), un systeme optique (18) configure pour collecter un rayonnement lumineux en provenance dudit echantillon (12), et un capteur d'image plan (16) configure de sorte a acquerir une image (Ih) formee par l'interference entre ladite source lumineuse (13) et ledit echantillon (12) ; et des moyens de traitement numeriques (25) configures pour &teeter une position numerique (Pn) d'au moins un element (11) dans ledit echantillon (12) a partir de ladite image acquise (Ih), et pour calculer une position reelle (Pr) dudit element (11) en fonction de ladite position numerique (Pn) et d'un modele de correspondance entre positions numeriques (Pn) et positions reelles (Pr); caracterise en ce que ledit procede de calibration comporte la mise en oeuvre de plusieurs &placements predetermines dudit echantillon (12) relativement audit systeme optique (18), et, pour l'ensemble desdits &placements, la detection d'une position numerique (Pn) d'un meme element (11) de sorte a determiner (55) ledit modele de correspondance entre positions numeriques (Pn) et positions reelles (Pr) en fonction des &placements predetermines et des positions numeriques (Pn) dudit element (11) apres chaque &placement, ladite detection comportant les &apes suivantes : acquisition (50) d'une image (Ih); construction numerique (51) d'une serie de matrices electromagnetiques (/1 - IN) modelisant, a partir de ladite image acquise (Ih), l'onde electromagnetique dans des plans paralleles au plan du capteur d'image et compris dans ledit echantillon (12) pour une pluralite d' &arts par rapport audit plan ; determination (52) d'une matrice electromagnetique (I fmoy) a une distance de mise au point dudit echantillon (12) a partir de la serie de matrices electromagnetiques (/1 - IN); selection (53) dudit element (11) dans la premiere matrice electromagnetique (I fmoy) ; et 27 - determination (54) de ladite position numerique (Pn) dudit element (11) dans ladite premiere matrice electromagnetique (I fmoy). 2. Procede de calibration selon la revendication 1, dans lequel ledit modele de 5 correspondance entre positions numeriques (Pn) et positions reelles (Pr) correspond a une matrice triaxiale (Mc) suivant trois axes d'un systeme metrique, ladite etape de determination (54) de ladite position numerique (Pn) dudit element (11) dans ladite premiere electromagnetique (I fmoy) etant realisee selon un axe (z), modelisant la position dudit element (11) en profondeur dudit echantillon (12), 10 en fonction de ladite matrice electromagnetique (I fmoy) a la distance de mise au point dudit echantillon (12). 3. Procede de calibration selon la revendication 2, dans lequel les &placements predetermines sont realises dans deux directions opposees pour chaque axe dudit 15 systeme metrique. 4. Procede de calibration selon l'une des revendications 1 a 3, dans lequel la determination (55) dudit modele de correspondance entre positions numeriques (Pn) et positions reelles (Pr) est realisee par l'intermediaire d'une moyenne des 20 variations des positions numerique (Pn) de plusieurs elements (11) presents dans ladite image (Ih). 5. Procede de calibration selon l'une des revendications 1 a 4, dans lequel, ledit systeme optique (18) ayant un axe optique AopT et realisant la conjugaison entre un 25 plan de mise au point et un plan focal, l'etape d'acquisition (50) de ladite image (Ih) est realisee alors que ledit systeme optique (18) est place par rapport audit echantillon (12) de sorte que lesdits elements (11) dudit echantillon (12) ne sont pas dans ledit plan de mis au point. 30 6. Procede de calibration selon l'une des revendications 1 a 5, dans lequel, avant les etapes d'acquisition (50) d'une image (Ih) pour obtenir lesdites positions numeriques (Pn) dudit element (11), le procede comporte une etape d'acquisition 28 d'une image d'arriere-plan, les images (Ih) obtenues lors desdits &apes d'acquisition (50) etant normalisees par ladite image d'arriere-plan. 7. Procede de calibration selon l'une des revendications 1 a 6, dans lequel ledit 5 element (11) correspond a un repere dudit echantillon (12). 8. Procede de calibration selon l'une des revendications 1 a 7, dans lequel ledit element (11) correspond a une particule (11) presente dans ledit echantillon (12). 10 9. Procede de calibration selon la revendication 8, dans lequel ladite ≊ consistant determiner (54) ladite position numerique (Pn) de ladite particule (11) dans ladite premiere matrice electromagnetique (I fmoy) est realisee en recherchant le centre de ladite particule (11). 15 10. Procede de calibration selon la revendication 8 ou 9, dans lequel ledit modele de correspondance entre positions numeriques (Pn) et positions reelles (Pr) est realise en considerant plusieurs particules (11) presentes dans ledit echantillon (12), les positions numeriques (Pn) des particules (11) entre deux images consecutives etant determinees en recherchant les positions (Pn) des particules (11) desdits deux 20 images, en calculant les vecteurs reliant les particules (11) deux a deux et en determinant un vecteur de &placement probable correspondant au vecteur le plus recurrent. 11. Dispositif d' analyse (10) d' au moins un element (11) present dans un echantillon 25 (12), ledit dispositif (10) comportant : un ensemble de detection comportant une source lumineuse (13) configuree pour illuminer ledit echantillon (12), un systeme optique (18) configure pour collecter un rayonnement lumineux en provenance dudit echantillon (12), et un capteur d'image plan (16) configurer de sorte a acquerir une image (Ih) formee 30 par l'interference entre ladite source lumineuse (13) et ledit echantillon (12) ; et 29 des moyens de traitement numeriques (25) configures pour &teeter une position numerique (Pn) d' au moins un element (11) dans ledit echantillon (12) a partir de ladite image acquise (Ih), et pour calculer une position reelle (Pr) dudit element (11) en fonction de ladite position numerique 5 (Pn) et d'un modele de correspondance entre positions numeriques (Pn) et positions reelles (Pr); des moyens de &placement de l'echantillon (12) relativement au systeme optique (18), lesdits moyens de &placement etant pilotes par les moyens de traitement numerique ; 10 caracterise en ce que les moyens de traitement numeriques sont configures pour commander les moyens de &placement de maniere a realiser plusieurs &placements predetermines dudit echantillon (12) relativement audit systeme optique (18), et, pour l' ensemble desdits &placements, pour &teeter une position numerique (Pn) d'un meme element (11) de sorte a determiner (55) ledit modele de 15 correspondance entre positions numeriques (Pn) et positions reelles (Pr) en fonction des &placements predetermines et des positions numeriques (Pn) dudit element (11) apres chaque &placement, ladite detection de la position numerique comportant les &apes suivantes : acquisition (50) d'une image (Ih); 20 construction numerique (51) d'une serie de matrices electromagnetiques (/1 - IN) modelisant, a partir de ladite image acquise (Ih), l'onde electromagnetique dans des plans paralleles au plan du capteur d'image et compris dans ledit echantillon (12) pour une pluralite d' &arts par rapport audit plan ; determination (52) d'une matrice electromagnetique (I fmoy) a une distance de 25 mise au point dudit echantillon (12) a partir de la serie de matrices electromagnetiques (/1 - IN); selection (53) dudit element (11) dans la premiere matrice electromagnetique (I fmoy) ; et determination (54) de ladite position numerique (Pn) dudit element (11) dans 30 ladite premiere matrice electromagnetique (I fmoy). 30 12. Dispositif selon la revendication 11, dans lequel les moyens de traitement numerique sont configures pour mettre en oeuvre un procede selon l'une quelconque des revendications 1 a 10.