Brevet FR3076294A1 — publié le 20190705

DOMAINE DE L'INVENTION La presente invention se situe dans le domaine des procedes de purification de compositions comprenant un anticorps produit dans le lait d'un nnannnnifere non humain. Elle concerne un procede de preparation d'une composition comprenant un anticorps a partir de lait brut d'un nnannnnifere non humain exprimant ledit anticorps dans son lait, comprenant a) une etape de precipitation du lait brut a l'acide caprylique, b) une etape de separation consistant en une centrifugation ou une filtration a travers un filtre en profondeur, et optionnellement c) une etape de filtration a travers un filtre en profondeur a charbon actif. ART ANTERIEUR Les anticorps sont utilises dans un grand nombre d'applications industrielles et pharmaceutiques, tels que le diagnostic et la therapie. Afin d'obtenir des quantites suffisantes de facon reguliere, les anticorps sont generalennent produits de maniere recombinante par des systennes d'expression, tels que des organismes unicellulaires (bacteries ou levures), des cellules d'insecte (systenne baculovirus/cellule d'insecte) ou encore des plantes transgeniques. Neannnoins, ces systennes d'expression presentent de nombreuses limitations, en particulier en lien avec un repliement proteique imparfait, l'innpossibilite de produire des proteines complexes tels que les anticorps ou encore une glycosylation incomplete ou differente de celle retrouvee chez l'homme. Compte tenu de ces limitations, les systennes d'expression les plus utilises pour la production d'anticorps, en particulier pour des applications pharmaceutiques, sont, a l'heure actuelle, les cellules de nnannnnifere. A titre d'exemple, le principe actif de MabThera® (rituxinnab), un anticorps chinnerique anti-CD20 pour le traitement du lymphome non-hodgkinien, est produit de maniere recombinante dans la lignee cellulaire CHO (Chinese Ovary Hamster). Ce systenne permet la production d'anticorps avec des motifs de glycosylation tres proches de celles des proteines endogenes humaines mais offrent generalennent des rendements de production faibles. De plus, ce systenne impose aux fabricants des carts significatifs de production. Afin produire des anticorps avec un haut rendement et a moindre coat que ceux obtenus a partir des lignees cellulaires, ['expression d'anticorps dans le lait de nnannnniferes nonhumains transgeniques, tels que les vaches, les lapines ou les chevres, a ete developpee. En 2 effet, it a ete estinne que le coCit brut de production d'une proteine recombinante dans le lait transgenique est 5 a 100-fois inferieur au coCit de sa production dans la lignee cellulaire CHO. Dans cette approche, ['expression de l'anticorps est dirigee au niveau des cellules epitheliales mammaires. L'anticorps est ainsi secrete dans le lait et peut etre recupere a partir de ce 5 fluide par des procedes d'extraction et de purification. A titre d'exennple, on peut notamment citer les travaux de Wei et a1-2011, decrivant ['expression de l'anticorps chinnerique chHabl8 dans le lait de souris transgeniques. Bien que la production d'anticorps dans le lait de nnannnniferes non humains permette d'obtenir un niveau d'expression tres satisfaisant, ['extraction et la purification des anticorps a 10 partir du lait demeure une des &apes linnitantes de ce systenne d'expression. En effet, le lait est un fluide biologique tres connplexe, constitue d'environ 10% en poids de nnatiere seche et d'environ 90% en poids d'eau et comprenant divers constituants que l'on peut regrouper en trois categories. La premiere categorie, appelee lactoserunn (ou petit lait), est constituee de glucides, de proteines solubles, telles que les lactalbunnines et les 15 lactoglobulines, ainsi que les albunnines et les innnnunoglobulines provenant du sang, de nnineraux et de vitamines hydrosolubles. La deuxienne categorie, appelee phase lipidique (ou crème), est constituee essentiellennent de lipides sous forme d'ennulsion de globules gras d'environ 2 a 12 pm de diannetre. La troisienne categorie, denonnnnee phase nnicellaire colloldale, est constituee essentiellennent des proteines de caseine et de sets 20 phosphocalciques, qui forment des complexes nnicellaires colloldaux, pouvant atteindre des diannetres d'environ 0,5 pm, et se presente notamment sous la forme d'agregats ( 4,8 log* Pas de virus detecte dans Hold 1 et Hold 2 PPV 4,5 log* Pas de perte significative de virus dans Hold 1 et Hold 2 *Valeurs logarithmiques exprinnees en logs decinnaux. 37 Bien que par des nnecanisnnes differents, le procede selon ['invention a permis de reduire le titre viral de plus de 4 logs decinnaux, a la fois pour le virus enveloppe X-MLV et pour le virus non enveloppe PPV. 5 EXEMPLE 3 : STABILITE DE LA COMPOSITION COMPRENANT L'ANTICORPS La composition obtenue par le procede a ete placee a 4°C pendant plus de 6 mois. Les IgG ainsi purifiees sont stables plusieurs mois a 4°C. 38 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Alnnagro et al. 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Procede selon la revendication 1, caracterise en ce que le Tait brut n'a subi aucune etape prealable de clarification et/ou d'ecremage et/ou d'acidification. 3. Procede selon la revendication 1 ou 2, caracterise en ce que le pourcentage final (masse/masse) d'acide caprylique mis en oeuvre a l'etape a) est compris entre 0,5 et 3,0 %, de preference compris entre 1,0 et 2,5 %, de maniere encore plus preferee entre 1,3% et 2,0% et est de preference de 1,7 %. 4. Procede selon l'une quelconque des revendications 1 a 3, caracterise en ce qu'a l'etape a) apres addition de l'acide caprylique le pH du melange est ajuste a une valeur inferieure a 4,8, de preference comprise entre 4,0 et 4,8, de preference a une valeur de 4,3. 5. Procede selon l'une quelconque des revendications 1 a 4, caracterise en ce que, prealablement a l'etape a), le Tait brut n'est pas dilue ou est dilue a un ratio (fait brut/diluant, exprime en volumes) altant de 1/0,1 a 1/4, de preference egal a 1/3. 6. Prod.& selon l'une quelconque des revendications 1 a 5, caracterise en ce que la concentration en proteines totales du Tait brut avant l'etape a) de precipitation par l'acide caprylique est comprise entre 25 et 100 g/l, de preference entre 30 et 60 g/l, de preference egale a 50 g/l. 7. Procede selon l'une quelconque des revendications 1 a 6, caracterise en ce que la concentration en anticorps du Tait brut avant l'etape a) de precipitation par l'acide caprylique est comprise entre 3 et 50 g/l, de preference entre 5 et 30 g/l et de preference egale a 20 g/l. 8. Procede scion l'une quelconque des revendications 1 a 7, caracterise en ce que retape b) est une filtration en profondeur effectuee a l'aide d'un filtre compose de fibres de cellulose. 9. Procede selon la revendication 8, caracterise en ce que ladite filtration en profondeur realisee a l'etape b) est effectuee a ['aide d'un filtre ayant un seuil de coupure comprise entre 10 et 80 pm, de preference entre 20 et 50 pm. 10. Procede selon ['une quelconque des revendications 1 a 9, caracterise en ce _comprend_gq_outre _au _moins_ une_etap_e_additionnelle,_ et _posterieure_ _ retape_b_)_lorsque l'etape c) n'est pas mise en oeuvre, choisie parmi les etapes de : i. concentration, notamment par ultrafiltration et/ou diafiltration, purification, notamment par chromatographie echangeuse d'ions ou d'affinite, de preference une chromatographie d'affinite utilisant des ligands aptameres, formulation, et/ou securisation biologique, notamment une inactivation virale et/ou une elimination virale. 11. Procede selon l'une quelconque des revendications 1 a 9, caracterise en ce qu'il comprend en outre au moins une etape additionnelle, et posterieure a l'etape c) lorsque celle-ci est mise en oeuvre, choisie parmi les &apes de : 1. concentration, notamment par ultrafiltration et/ou diafiltration, ii purification, notamment par chromatographie echangeuse d'ions ou d'affinite, de preference une chromatographie d'affinite utilisant des ligands aptameres, iii formulation, et/ou iv. securisation biologique, notamment une inactivation virale et/ou une elimination virale. 12. Procede selon l'une quelconque des revendications 1 a 11, dans lequel le mammifere non humain exprimant un anticorps dans son lait est la lapine, la vache ou la chevre. 2