Brevet FR3075819A1 — publié le 20190628

DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention se situe dans le domaine de la microbiologie. Elle concerne de nouvelles souches isolées de bactéries, ainsi que leur utilisation pour produire des composés d'intérêt industriel, notamment des alcools tels que l'éthanol, des acides carboxyliques ou leurs sels tels que l'acide acétique ou l'un de ses sels. La présente invention concerne également des méthodes de production de composés d'intérêt industriel utilisant ces nouvelles souches bactériennes. ART ANTERIEUR La majorité des composés d'intérêt industriel, tels que les acides carboxyliques, les sels d'acides carboxyliques et les alcools sont produits par synthèse chimique de matières premières dérivées du pétrole. Toutefois, les ressources pétrolières sont limitées et en passe d'épuisement, ce qui entraine notamment une augmentation de leurs coûts d'exploitation. En outre, l'exploitation de ces ressources est une importante source de pollution et contribue à l'effet indésirable de serre. Face à ces inconvénients, des procédés industriels de production des composés d'intérêt industriel faisant appel à des ressources renouvelables ont été développés. Ainsi, des composés organiques d'intérêt industriel peuvent être produits par fermentation à l'aide de microorganismes qui utilisent de telles ressources renouvelables comme matière première, notamment des déchets. L'utilisation de microorganismes capables de métaboliser des déchets industriels ou agricoles dans ces bioprocédés offre le double avantage de produire des composés d'intérêt tout en permettant d'éliminer des déchets encore difficiles à valoriser et/ou à recycler. Le monoxyde de carbone (CO), le dioxyde de carbone (CO2) et le dihydrogène (H2, parfois communément appelé hydrogène) représentent une part importante des déchets industriels et agricoles. Particulièrement difficiles à recycler, ces gaz sont souvent rejetés directement dans l'atmosphère, contribuant ainsi à la pollution atmosphérique et à l'effet de serre. Une solution consiste à exploiter les capacités de certains microorganismes à transformer de tels déchets industriels ou agricoles en différents composés d'intérêt industriel, en particulier des acides carboxyliques, des sels de tels acides, et/ou des alcools. En effet, certaines bactéries anaérobies sont capables de métaboliser le monoxyde de carbone, le dioxyde de carbone et/ou du dihydrogène, notamment les bactéries du genre 2 Acetobacterium de l'ordre des Clostridiales. Les bactéries du genre Acetobacterium sont des bactéries anaérobies acétogènes, car l'acétate (de formule CH3C00-, ou CH3COOH sous sa forme acide acétique) est le sous-produit principal de leur métabolisme anaérobie. A. woodii (DSM1030) a été la première espèce d'Acetobacterium identifiée (Batch et al. , 5 1977). C'est aussi la plus décrite. Le genre Acetobacterium compte également d'autres représentants, parmi lesquels A. malicum (DSM 4132), A. wieringae (DSM 1911), A. psammolithicum (SMCC/W751), A. fimetarium (DSM 8238) et A. carbinolicum (DSM 2925). La plupart de ces bactéries ont été initialement décrites comme étant honnoacétogènes, c'est-à-dire comme étant uniquement capables de produire de l'acide acétique et sa base 10 conjuguée, l'acétate, par oxydation anaérobie du dihydrogène et réduction du dioxyde de carbone, selon l'équation : 4 H2 + 2 CO2 -> CH3COOH + 2 H20 Réaction (1) L'acide acétique est utilisé dans la synthèse de l'acétate de vinyle, de l'acétate de polyvinyle et de l'acétate de cellulose, par exemple. L'acétate de cellulose peut 15 notamment servir dans la fabrication de films en photographie, de vernis, d'adhésifs, d'explosifs ou de fibres textiles. Ce composé est également utilisé comme matière plastique, dans différents domaines. L'acide acétique est également utilisé comme solvant dans des procédés de production d'acide téréphtalique (TPA), un précurseur du polyester PET (Polytéréphtalate d'éthylène). 20 De rares travaux montrent que certaines de ces souches sont également capables de produire un mélange d'acétate et d'éthanol, à partir d'une source de carbone organique. Ainsi, A. woodii, A. wieringae et A carbinolicum peuvent produire un mélange d'acétate et d'éthanol à partir de glucose ou de fructose, sous une atmosphère composée d'un mélange binaire de dioxyde de carbone et d'azote (Buschhorn et al., 1989). A. woodii est 25 également capable de produire un mélange d'acétate et d'éthanol avec pour substrat un mélange de formate et de monoxyde de carbone (Bertsch and Müller, 2015). L'éthanol est un alcool primaire de formule CH3CH2OH présentant un fort intérêt industriel. L'éthanol est principalement utilisé comme biocarburant (bioéthanol). Ce composé est également utilisé par l'industrie agroalinnentaire, ou encore comme solvant 30 dans la parfumerie et la pharmacie galénique. Il est nnajoritairennent produit par fermentation alcoolique de plantes sucrières à l'aide de levures. Toutefois, ce type de procédé est fortement générateur de CO2, gaz délétère pour l'environnement. Aussi, la production d'acétate et d'éthanol, et préférentiellement d'éthanol, à l'échelle industrielle à partir de CO, de CO2 et/ou d'Hz, par un microorganisme tel 3 qu'Acetobacterium constitue une perspective très intéressante, permettant en même temps de valoriser les déchets industriels ou agricoles de CO, de CO2 et/ou d'H2. Toutefois, les quantités d'éthanol produites par les souches d'Acetobacterium identifiées, A. woodii, A. wieringae et A carbinolicum, sont relativement faibles et largement 5 inférieures à la quantité d'acétate produite (d'un facteur 5 au minimum). En outre, la production d'éthanol par ces souches requiert la présence d'une source de carbone organique, telle qu'un sucre ou un acide carboxylique, augmentant ainsi les coûts de production et l'impact négatif sur l'environnement (Buschhorn et al., 1989 ; Bertsch and Müller, 2015). 10 Il existe donc toujours le besoin d'identifier de nouveaux microorganismes capables de transformer le CO, le CO2 et/ou l'Hz, en différents composés d'intérêt industriel. La présente invention permet de répondre à ce besoin. Les présents Inventeurs ont pu identifier de nouvelles souches isolées de bactéries du genre Acetobacterium. Les Inventeurs ont montré que, de manière surprenante, ces nouvelles souches sont capables 15 de synthétiser des quantités significatives d'éthanol et d'acétate, à partir d'un mélange de CO, de CO2 et d'Hz, ou d'un mélange de CO et d'Hz, en particulier en l'absence de toute autre source de carbone. Ces nouvelles souches constituent le premier exemple de bactéries du genre Acetobacterium ayant la capacité de produire de l'éthanol en quantité supérieure à l'acétate et en particulier en l'absence de source de carbone organique. 20 RESUME DE L'INVENTION Dans le cadre de la présente invention, les Inventeurs ont mis en évidence, de manière tout à fait surprenante, de nouvelles souches isolées de bactéries, appartenant au genre Acetobacterium de l'ordre des Clostridiales. 25 La présente invention concerne donc un groupe de nouvelles souches appartenant au genre Acetobacterium. Les Inventeurs ont pu montrer de manière surprenante que ces nouvelles souches isolées possèdent la capacité de produire des quantités significatives d'au moins un composé d'intérêt industriel. Ces nouvelles souches peuvent notamment produire des quantités 30 significatives d'au moins un alcool d'intérêt industriel, tel que l'éthanol, et/ou des quantités significatives d'au moins un acide carboxylique et/ou d'au moins un d'acide carboxylique d'intérêt industriel, tel que l'acide acétique et/ou l'acétate. La présente invention concerne plus précisément des souches isolées de bactéries Acetobacterium sp. (sp. pour espèce ou - species »), possédant la capacité à produire par 4 fermentation au moins un composé d'intérêt industriel. L'invention concerne plus particulièrement six souches isolées de bactéries Acetobacterium sp. L'invention concerne également des méthodes de production d'au moins un composé d'intérêt industriel, notamment un alcool, tel que l'éthanol, et/ou un acide carboxylique 5 et/ou un de ses sels, tel que l'acide acétique et/ou l'acétate à l'aide d'au moins une des nouvelles souches isolées de l'invention. L'invention concerne également l'utilisation d'au moins une des nouvelles souches de l'invention pour produire ledit composé d'intérêt industriel, notamment l'éthanol et/ou l'acide acétique et/ou de l'acétate. 10 DESCRIPTION DES FIGURES La Figure 1 présente un dendogrannnne phylogénétique des 26 souches isolées (représentation graphique réalisée sur NCBI Tree View, Neighbor joining). La Figure 2 présente un dendogrannnne phylogénétique des 6 souches sélectionnées 15 (représentation graphique réalisée sur NCBI Tree View, Neighbor joining). La Figure 3 montre un exemple de courbes de croissance (D0600) et de pH, de consommation de syngas et production de métabolites (éthanol et acétate) par la souche P4066. La Figure 4 montre un exemple de courbes de croissance (D0600) et de pH, consommation 20 de syngas et production de métabolites (éthanol et acétate) par la souche P4073. La Figure 5 montre les courbes de croissance (D0600) et de pH, consommation de syngas et production de métabolites (éthanol et acétate) par la souche P4074. La Figure 6 présente un exemple de courbes de croissance (D0600) et de pH (A), de consommation de syngas (B) et production de métabolites (éthanol et acétate ; C) par la 25 souche P4066, en milieu minimum, sous agitation à 18Orpnn et à 25°C. La Figure 7 montre un exemple de courbes de croissance (D0600) et de pH (A), de consommation de syngas (B) et production de métabolites (éthanol et acétate ; C) par la souche P4073, en milieu minimum, sous agitation à 18Orpnn et à 25°C. La Figure 8 montre un exemple de courbes de croissance (D0600) et de pH (A), de 30 consommation de syngas (B) et production de métabolites (éthanol et acétate ; C) par la souche P4074, en milieu minimum, sous agitation à 18Orpnn et à 25°C. La Figure 9 montre un exemple de courbes de croissance (D0600) et de pH (A), de consommation de syngas (B) et production de métabolites (éthanol et acétate ; C) par la souche P4112 (A. wieringae), en milieu minimum, sans agitation (statique) et à 30°C. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Définitions Par - microorganisme » ou - micro-organisme », on entend un organisme vivant 5 microscopique. Les micro-organismes comprennent notamment des bactéries, des champignons microscopiques, des archéobactéries, des protistes, des algues vertes microscopiques, des animaux du plancton, des planaires, et des amibes. Par - bactérie », on entend un microorganisme vivant procaryote, issu de n'importe quel 10 milieu environnemental. Par - bactérie du genre Acetobacterium », - bactérie Acetobacterium », - bactérie Acetobacterium sp.», ou -Acetobacterium sp.», on entend une bactérie anaérobie appartenant au genre Acetobacterium, au sein de la famille des Eubacteriaceae, dans 15 l'ordre des Clostridiales et la classe des Clostridia, positive à la coloration de Gram. L'acide acétique (ou acétate) est le sous-produit principal du métabolisme anaérobie des bactéries du genre Acetobacterium. Le genre Acetobacterium comprend notamment les espèces A. malicum (DSM4132), A. wieringae (DSM1911), A. woodii (DSM1030), A. fimetarium (DSM8238) et A. carbinolicum (DSM2925). 20 Par « souche -, on entend une bactérie appartenant à un genre défini. Au sens de la présente invention, une souche peut désigner une bactérie appartenant à une espèce ou à une sous-espèce au sein dudit genre défini. En effet, une espèce définie peut comprendre plusieurs souches distinctes, sur la base de différents critères. Au sens de la présente 25 invention, une souche peut également désigner une bactérie appartenant audit genre défini et dont l'espèce n'a pas été définie. Ainsi, au sens de la présente invention, une souche appartenant au même genre peut appartenir à la même espèce ou à une espèce différente d'une souche distincte. Au sens de la présente invention, deux souches sont distinctes si elles diffèrent par au moins une caractéristique moléculaire, telle que la 30 séquence du gène codant l'ARN ribosomique (ARNO 16S, la teneur en guanine (G) et cytosine (C) de leur ADN génonnique, ou la séquence de l'ADN génonnique total (déterminé par hybridation des ADN génonniques des souches à comparer). 5 6 Par « souche isolée -, on entend une souche de bactérie qui est extraite de son environnement naturel (c'est-à-dire séparée d'au moins un autre composant auquel elle est naturellement associée). 5 Par « fermentation -, on entend un processus métabolique effectué par un microorganisme vivant, notamment une bactérie, comprenant la conversion (ou la dégradation) partielle ou totale d'un ou plusieurs substrats en au moins un métabolite ou produit de fermentation, le plus souvent par oxydoréduction. La fermentation peut être réalisée en atmosphère aérobie (en présence de dioxygène, 02) 10 ou en atmosphère anaérobie (en absence de dioxygène). On peut distinguer plusieurs types de fermentations en fonction du ou des produit(s) de fermentation (appelé aussi métabolite) obtenu(s) par la mise en oeuvre de ce processus métabolique. On parle par exemple de fermentation alcoolique lorsque les produits de fermentation obtenus consistent en un mélange d'au moins un alcool, tel que l'éthanol, et 15 de gaz (le plus souvent le gaz carbonique, également appelé anhydride carbonique, ou dioxyde de carbone, de formule chimique CO2). On peut parler de fermentation mixte lorsqu'un mélange plus complexe de produits de fermentation est obtenu. Ce mélange peut par exemple comprendre un ou plusieurs alcools, tels que l'éthanol, le butanol ; un ou plusieurs acides carboxyliques ou des sels de ceux-ci, tels que l'acide acétique ou 20 l'acétate, l'acide formique ou le formate, l'acide butyrique ; de l'acide lactique ou du lactate ; un ou plusieurs gaz, tels que le dihydrogène (H2), le dioxyde de carbone (CO2), le monoxyde de carbone (CO) ou le dioxygène (02). Par « atmosphère anaérobie -, « milieu anaérobie -, « condition anaérobie ou 25 « anaérobiose », on entend une atmosphère, un milieu, un environnement, un récipient ou une enceinte qui ne contient pas ou très peu de dioxygène (02). De préférence, l'atmosphère anaérobie, le milieu anaérobie, la condition anaérobie, ou l'anaérobiose, contient moins d'1% de dioxygène, en pourcentage volumique. De préférence encore, l'atmosphère anaérobie, le milieu anaérobie, la condition anaérobie, 30 ou l'anaérobiose, contient moins de 0,99e de dioxygène, de préférence encore moins de 0,8% de dioxygène, de préférence encore moins de 0,7% de dioxygène, de préférence encore moins de 0,6% de dioxygène, de préférence encore moins de 0,5% de dioxygène, de préférence encore moins de 0,49e de dioxygène, de préférence encore moins de 0,3% de dioxygène, de préférence encore moins de 0,2% de dioxygène, de préférence encore moins de 0,1% de dioxygène, de préférence encore moins de 0,09% de dioxygène, de préférence encore moins de 0,05% de dioxygène, de préférence encore moins de 0,01% de dioxygène, 7 de préférence encore moins de 0,005% de dioxygène, de préférence encore moins de 0,001% de dioxygène, en pourcentage volumique. De manière encore plus préférée, l'atmosphère anaérobie, le milieu anaérobie, la condition anaérobie, ou l'anaérobiose, est dépourvue de (ou contient 0%) dioxygène. 5 Par « milieu de culture », on entend un milieu, ou support, ou environnement, permettant la croissance de microorganismes vivants, ici des bactéries, c'est-à-dire un support comprenant les composants indispensables pour leur croissance. Le milieu de culture peut être sous forme liquide ou solide. Les milieux solides présentent en général 10 une composition similaire au milieu de culture liquide correspondant, additionné d'au moins un agent gélifiant, tel que l'agar-agar ou la gélose. Un milieu de culture peut être un milieu minimum ou un milieu riche. Un milieu minimum, ou milieu défini, est un milieu comportant les éléments chimiques strictement nécessaires à la croissance de la souche bactérienne ou du mélange de souches bactériennes d'intérêt. 15 Les éléments chimiques strictement nécessaires à la croissance bactérienne (ou éléments essentiels) sont les composés que les bactéries d'intérêt ne sont pas capables de synthétiser par elles-mêmes. Le milieu minimum est en général un milieu synthétique, dont la composition qualitative et quantitative exacte est connue. Un milieu riche est un milieu comprenant tous les éléments chimiques strictement nécessaires à la croissance de 20 la souche bactérienne ou du mélange de souches bactériennes d'intérêt ainsi que des éléments supplémentaires nécessaires à la croissance mais que ces bactéries sont capables de synthétiser. Par - croissance » ou - croissance bactérienne », on entend le phénomène 25 d'augmentation ou de multiplication du nombre de bactéries présentes initialement dans une culture donnée. La croissance bactérienne peut se diviser en plusieurs phases. En général, Les caractéristiques des différentes phases de croissance peuvent être visualisées sur un graphique représentant le nombre de cellules N en fonction du temps t (typiquement une 30 courbe lnN=f(t)). La croissance bactérienne peut notamment comprendre une phase de croissance exponentielle et/ou une phase stationnaire. Par « phase de croissance exponentielle -, on entend le laps de temps ou la période durant lequel ou laquelle le nombre de cL.) augmente de façon logarithmique. Durant cette phase, la vitesse de reproduction cellulaire a atteint son maximum et reste 35 constante. 8 Par - phase stationnaire -, on entend le laps de temps ou la période durant lequel ou laquelle le nombre de cellules reste constant. La croissance apparaît donc nulle. Durant cette phase, le nombre de cellules qui se divisent est égal au nombre de cellules qui meurent (notamment par lyse cellulaire). En général, cette phase survient après la phase 5 exponentielle. Le nombre de cellules est donc maximal, et reste constant. Par « culture », on entend un milieu de culture et au moins une cellule d'au moins un microorganisme appartenant à une souche définie. Par « culture biologiquement pure », on entend une culture d'une unique souche de microorganisme. La présence de tout autre 10 microorganisme vivant que la souche particulière ainsi cultivée est exclue. Ainsi, la culture biologiquennent pure au sens de la présente invention comprend un milieu de culture et au moins une cellule d'un microorganisme appartenant à une unique souche définie, à l'exclusion de toute cellule vivante appartenant à une autre souche. En pratique, la culture biologiquennent pure peut être fixée sur ou contenue dans un support approprié. 15 Par « substrat », on entend une substance utilisée comme réactif de départ dans une réaction chimique, biochimique ou biologique, qui est modifiée, dégradée ou convertie lors de ladite réaction pour former une ou plusieurs substance(s), dite(s) substance(s) finale(s) ou produit(s) final(s), différente(s) de la substance de départ. La substance de départ 20 et/ou la substance finale/ le produit final peut être un élément ou un mélange d'éléments, une molécule ou un mélange de molécules, un composé ou un mélange de composés, ou encore un mélange d'éléments et/ou de molécules et/ou de composés. Par « source de carbone », on entend un élément ou un mélange d'éléments, une 25 molécule ou un mélange de molécules, un composé ou un mélange de composés contenant des atomes de carbone et pouvant être utilisés comme source d'énergie par un microorganisme vivant, pour son métabolisme et sa croissance. La source de carbone pourra être utilisée directement par le microorganisme pour en extraire le carbone, ou pourra être convertie en un ou plusieurs composé(s) intermédiaire duquel le 30 microorganisme pourra extraire le carbone. Par» source de carbone organique », on entend une molécule ou un composé comprenant au moins un atome de carbone (C), un atome d'oxygène (0) et un atome d'hydrogène (H). 35 Par - syngas », - syngaz », - synthesis gaz » ou - gaz de synthèse », on entend un mélange gazeux comprenant au moins du dioxyde de carbone (CO2) et/ou du monoxyde de 9 carbone (CO), et/ou du dihydrogène (H2). Ce mélange gazeux peut également comprendre du méthane (CH4), de la vapeur d'eau (H20), et des impuretés. Ce mélange gazeux peut provenir de déchets industriels, agricoles, municipaux ou domestiques. Il peut également avoir été synthétisé par pyrolyse. De préférence, le syngas comprend du dioxyde de 5 carbone (CO2), du monoxyde de carbone (CO), du dihydrogène (H2), un mélange de monoxyde de carbone (CO) et d'hydrogène (H2), un mélange de dioxyde de carbone (CO2) et d'hydrogène (H2), ou encore un mélange de dioxyde de carbone (CO2), de monoxyde de carbone (CO) et d'hydrogène (H2). De préférence, le syngas contient moins de 59 de méthane (CH4), de vapeur d'eau (H20) et d'impuretés, en pourcentage volumique, de 10 préférence encore moins de 49 de méthane (CH4), de vapeur d'eau (H20) et d'impuretés, de préférence encore moins de 396, de préférence encore moins de 2%, de préférence encore moins d'1%, de préférence encore moins de 0,8%, de préférence encore moins de 0,6%, de préférence encore moins de 0,4%, de préférence encore moins de 0,2%, de préférence encore moins de 0,1%, de préférence encore moins de 0,05%, de préférence 15 encore moins de 0,01%, de préférence encore moins de 0,005%, de préférence encore moins de 0,001% de méthane (CH4), de vapeur d'eau (H20) et d'impuretés, en pourcentage volumique. De manière encore plus préférée, le syngas contient 0% (est dépourvu) de méthane (CH4), de vapeur d'eau (H20) et d'impuretés. Le syngas contient de préférence entre 25 et 50% d'Hz, entre 35 et 60% de CO et/ou entre 5 et 30% de CO2, en % volumiques. 20 De préférence encore, le syngas consiste en du CO, ou en un mélange de CO2, de CO et d'Hz, ou en un mélange de CO et d'Hz, ou encore en un mélange de CO2 et d'Hz. De préférence encore, le syngas contient 38% d'Hz, 48% de CO et 14% de CO2, en % volumiques. 25 Par produit de fermentation », produit final de fermentation », produit final », composé produit par fermentation », ou métabolite », ou métabolite final », ou métabolite de fermentation », on entend une substance obtenue par la mise en oeuvre d'une fermentation. Cette substance peut être un élément ou un mélange d'éléments, une molécule ou un mélange de molécules, un composé ou un mélange de composés, ou encore 30 un mélange d'élément(s), molécule(s) et/ ou composé(s). Par alcool », on entend un composé dont l'un des atomes de carbone est lié à un groupe hydroxyle (-OH). L'alcool méthylique (ou méthanol), l'alcool éthylique (ou éthanol), l'alcool propylique (ou propanol) et l'alcool butylique (ou butanol) sont des exemples 35 d'alcools. L'éthanol est un alcool présentant un fort intérêt industriel, de par ses 10 nombreuses applications. Par - éthanol » ou - alcool éthylique », on entend un alcool de formule senni-développée CH3-CH2-0H. Par - acide carboxylique », on entend un composé comprenant un groupement carboxyle 5 (C(0)0H). Ce sont des acides et leurs bases conjuguées sont appelées ions carboxylates (elles comprennent un groupement carboxylate (C00-). En solution dans l'eau, la forme acide se dissocie partiellement en ion carboxylate, pour la plupart des acides carboxyliques, selon l'équation : RCOOH + H2O.=- RC00- + H30+ Réaction (2) 10 Ainsi, un acide carboxylique peut être présent sous ces deux formes dans une solution aqueuse et, dans ce cas, un équilibre s'établit entre la forme acide et la forme basique. L'acide nnéthanoïque (ou acide formique), l'acide éthanoïque (ou acide acétique), l'acide propanoïque (ou acide propionique) et l'acide butanoïque (ou acide butyrique) sont des exemples d'acides carboxyliques. Leurs bases conjuguées sont respectivement le 15 nnéthanoate (ou ion formiate, ou formiate), l'éthanoate (ou ion acétate, ou acétate), le propanoate (ou ion propionate, ou propionate) et le butanoate (ou ion butyrate, ou butyrate). Un acide carboxylique ou sa base conjuguée peuvent également se trouver en complexe avec un élément qui le permet. Des exemples de tels éléments incluent les métaux 20 alcalins, tels le potassium (K) et le sodium (Na), des métaux alcalino-terreux, tels le calcium (Ca) et le magnésium (Mg), et les métaux de transition, tels le cuivre (Cu) et le fer (Fe). Par - sel d'acide carboxylique », on entend donc un acide carboxylique ou sa base conjuguée en complexe avec un élément. Des exemples de sels d'acide carboxylique 25 incluent l'acétate de calcium, l'acétate de potassium, l'acétate de magnésium, l'acétate de sodium, l'acétate de cuivre et l'acétate de fer. Ainsi, au sens de la présente invention, les termes - acide carboxylique » se réfèrent à la fois à la forme acide carboxylique, à sa forme basique ou ionique conjuguée, et à leurs sels. 30 Au sens de la présente invention, les termes - acide éthandique », ou «acide acétique », désignent donc à la fois l'acide carboxylique de formule senni-développée CH3-CO-OH, sa base conjuguée, l'éthanoate, l'ion acétate, ou l'acétate, de formule senni-développée CH3C00-, et leurs sels, tels que l'acétate de calcium, l'acétate de potassium, l'acétate de sodium, et l'acétate de cuivre. De la même façon, par - acétate », «ion acétate », ou 35 - éthanoate » on entend l'ion acétate de formule senni-développée CH3C00-, ainsi que son 11 acide conjugué, l'acide éthanoïque, ou l'acide acétique, de formule senni-développée CH3- CO-OH, et leurs sels. Par - bioréacteur », - fermenteur » ou - propagateur », on entend un appareil, une cuve 5 ou une enceinte qui peut être ouvert(e) ou fermé(e), hermétique ou non, adapté(e) pour la culture, dans lequel ou laquelle on cultive des microorganismes vivants pour la production de biomasse, et/ou pour la production d'un produit de fermentation (ou métabolite) ou encore pour la bioconversion d'une molécule d'intérêt (ou substrat). Un bioréacteur comprend par exemple une culture, une atmosphère (aérobie ou anaérobie), 10 un ou des substrat(s), et éventuellement un ou des produit(s) de fermentation. Par - biomasse », on entend la masse totale de l'ensemble des microorganismes présents dans un milieu, un système, un environnement, ou un bioréacteur donné. 15 Par - mode batch », - mode d'alimentation par batch », - mode discontinu », - mode d'alimentation discontinu », - fermentation en mode batch », - fermentation batch », - fermentation discontinue », ou - culture batch » on entend une fermentation réalisée dans un appareil, une cuve, un système ou une enceinte (par exemple un bioréacteur ou un fermenteur), ouvert(e) ou fermé(e), se déroulant sans ajout ni récupération (ou 20 soutirage) de milieu de culture, de substrat, de nutriments, de biomasse, ou de produit de fermentation. Le milieu de culture est inoculé avec des microorganismes (appelés inoculat) en début de processus. L'évolution des conditions de culture peut être suivie, par exemple par la mesure du pH, de la température, de la pression, ou de la densité optique, à l'aide d'appareils ou de systèmes adaptés et connus de l'homme du métier. La fermentation en 25 mode batch n'exclut pas la réalisation de prélèvements d'échantillons (de biomasse, de milieu de culture, de produit de fermentation, d'atmosphère, etc.), à des fins notamment de suivi de la culture. Le contenu de l'appareil de culture est récupéré en fin de fermentation. 30 Par - mode fed-batch », - mode batch alimenté », - mode d'alimentation par fedbatch », - mode continu-discontinu », ou - fermentation en mode fed-batch », - fermentation fed-batch », ou - culture fed-batch », on entend une fermentation réalisée dans un appareil, une cuve, un système ou une enceinte (par exemple un bioréacteur ou un fermenteur), ouvert(e) ou fermé(e), se déroulant sans récupération ou 35 soutirage, et avec une alimentation en continu ou en discontinu par du milieu de culture ou un mélange de nutriments. La fermentation en mode fed-batch se déroule 12 généralement en plusieurs phases. En début de processus, l'appareil de culture est partiellement empli du milieu de culture et inoculé avec des microorganismes (appelés inoculat). Durant une première phase, le microorganisme se multiplie dans le volume initial de milieu de culture. La croissance démarre généralement plus rapidement qu'en 5 mode batch, étant donné que le volume de culture peut être réduit. La concentration obtenue peut alors être plus élevée qu'en mode batch. Durant une seconde phase, du milieu de culture est ajouté dans l'appareil de culture, de manière continue ou discontinue selon les cas (alimentation continue ou discontinue). Le volume de la culture dans l'appareil de culture ou le fermenteur varie donc continuellement. L'évolution des 10 conditions de culture peut être suivie, par exemple par la mesure du pH, de la température, de la pression, ou de la densité optique, à l'aide d'appareils ou de systèmes adaptés et connus de l'homme du métier. La culture en fed-batch peut notamment être utilisée pour optimiser les conditions d'apport d'un nutriment susceptible d'avoir un effet retardateur sur la croissance. 15 Par - mode continu », - mode d'alimentation continu », - fermentation en mode continu », - fermentation continue », ou - culture continue », on entend une fermentation réalisée dans un appareil, une cuve, un système ou une enceinte (par exemple un bioréacteur ou un fermenteur), ouvert(e) ou fermé(e), se déroulant avec une 20 alimentation en continu par du milieu de culture ou un mélange de nutriments et une récupération ou soutirage en continu de la culture contenue dans l'appareil de culture. En général, les débits d'alimentation et de soutirage sont identiques, afin de maintenir constant le volume de culture dans l'appareil. Dans ce cas, un tel dispositif permet, contrairement à la fermentation discontinue, de maintenir constants et à une valeur 25 voulue la concentration cellulaire, le taux de croissance de la biomasse, les équilibres nutritifs du milieu et/ou la production en métabolite(s) ou produit(s) de fermentation recherché(s). La fermentation en mode continu peut notamment comprendre une première étape d'inoculation du milieu de culture avec des microorganismes. Dans ce cas, l'appareil de culture est partiellement ou complètement empli du milieu de culture en début de 30 processus, et inoculé avec des microorganismes. Une première phase peut alors être réalisée, durant laquelle le microorganisme se multiplie dans le volume initial de milieu de culture, sans alimentation et/ou sans soutirage. Cette première phase est alors comparable à une fermentation en mode batch ou à la première phase d'une fermentation en mode fed-batch. Elle permet notamment de laisser le temps aux microorganismes de se 35 multiplier, avant la mise en place de l'alimentation en continu et/ou du soutirage en continu. Une fois la concentration cellulaire, le taux de croissance de la biomasse, les 13 équilibres nutritifs du milieu et/ou la production en métabolite(s) ou produit(s) de fermentation souhaité(s) atteint(s), l'alimentation en continu et le soutirage en continu démarrent. L'évolution des conditions de culture peut être suivie, par exemple par la mesure du pH, de la température, de la pression, ou de la densité optique, à l'aide 5 d'appareils ou de systèmes adaptés et connus de l'homme du métier. La culture en continu peut notamment être utilisée pour produire de la biomasse ou des produits de fermentation en grande quantités de manière continue. Souche isolée 10 Les Inventeurs ont identifié, de manière tout à fait surprenante, un groupe de 26 nouvelles souches de bactéries appartenant au genre Acetobacterium. Ces nouvelles souches sont notamment capables de produire des composés d'intérêt industriel, lorsqu'elles sont mises en culture en présence d'un substrat approprié. Les Inventeurs ont montré pour six de ces nouvelles souches qu'elles sont capables de produire par fermentation au moins un alcool, 15 en particulier l'éthanol, et/ou au moins un acide carboxylique ou un sel de celui-ci, en particulier l'acétate. Ces six souches ont été déposées auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris, France), sous les numéros d'enregistrement 20 respectifs CNCM-I-5192, CNCM-I-5194, CNCM-I-5195, CNCM-I-5191, CNCM-I-5193, et CNCM-I- 5190. La présente invention concerne donc une souche isolée de bactéries Acetobacterium sp., caractérisée en ce qu'elle possède la capacité d'une souche choisie parmi les souches 25 déposées auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris, France), sous les numéros d'enregistrement CNCM-I-5192, CNCM-I-5194, CNCM-I-5195, CNCM-I-5191, CNCM-I-5193, et CNCM-I-5190, à produire par fermentation au moins un composé d'intérêt industriel. 30 Selon un mode de réalisation préféré, la souche isolée possède la capacité de la souche CNCM-I-5192 ou de la souche CNCM-I-5194, à produire par fermentation au moins un composé d'intérêt industriel. Par - composé d'intérêt industriel », on entend une substance pouvant être utilisée 35 notamment par l'industrie ou l'agriculture, pour fabriquer, générer ou synthétiser un 14 produit de consommation ou une substance pouvant elle-même être utilisée notamment par l'industrie ou l'agriculture, pour fabriquer, générer ou synthétiser un produit de consommation. Un composé d'intérêt industriel présente donc de préférence une valeur ajoutée vis-à-vis de la matière première et de l'énergie nécessaire pour l'obtenir. Ladite 5 substance peut être un élément ou un mélange d'éléments, une molécule ou un mélange de molécules, un composé ou un mélange de composés, ou encore un mélange d'élément(s), molécule(s) et/ou composé(s). Un composé d'intérêt industriel est par exemple un produit de fermentation ou un métabolite, ou encore un mélange de ceux-ci. Les alcools, les acides carboxyliques, leurs bases conjuguées ou leurs sels sont des 10 exemples de composés d'intérêt industriel. Par - capacité à produire par fermentation au moins un composé d'intérêt industriel », on entend la propriété d'un microorganisme à synthétiser un composé d'intérêt industriel, par exemple à partir d'un substrat, durant un processus de fermentation. 15 Les Inventeurs ont montré que, de manière surprenante, les six nouvelles souches de l'invention sont notamment capables de croissance rapide, peuvent réaliser une fermentation, et sont capables de produire des quantités significatives de composés d'intérêt industriel, en particulier de l'éthanol et de l'acétate. Cette propriété est 20 d'autant plus surprenante que seuls trois exemples de souches de bactéries du genre Acetobacterium décrites à ce jour sont capables de synthétiser de l'éthanol (A. woodii, A. wieringae et A carbinolicum). Les souches de l'invention sont notamment capables de basculer d'une production d'un composé d'intérêt industriel à un autre. Les Inventeurs montrent en effet que, de manière 25 surprenante, les souches de l'invention sont capables de produire nnajoritairennent de l'acétate ou de l'éthanol, ou un mélange des deux, en fonction des conditions de culture ou de fermentation. Une telle propriété n'a à ce jour pas été décrite pour des bactéries du genre Acetobacterium. En outre, les Inventeurs ont montré que ces nouvelles souches sont capables de consommer 30 du CO, de l'Hz et/ou du CO2, en fonction des conditions de culture. Les Inventeurs ont montré en particulier que, de manière surprenante, ces nouvelles souches sont capables de synthétiser des quantités significatives d'éthanol et d'acétate, à partir d'un mélange de CO, de CO2 et d'I-12, ou d'un mélange de CO et d'I-12, en l'absence de toute autre source de carbone. Ces nouvelles souches constituent le premier exemple 35 de bactéries du genre Acetobacterium ayant la capacité de produire de l'éthanol en l'absence de toute source de carbone organique. 15 Les inventeurs ont également montré que ces nouvelles souches sont capables de produire de l'éthanol en quantité supérieure à l'acétate. Cette propriété est d'autant plus surprenante que les quantités d'éthanol produites par les souches A. woodii, A. wieringae et A carbinolicum de l'art antérieur sont relativement faibles et largement inférieures à la 5 quantité d'acétate produite (d'un facteur 5 au minimum). Plus généralement, la présente invention concerne une souche isolée de bactérie Acetobacterium sp., caractérisée en ce qu'elle possède toutes les caractéristiques d'intérêt industriel d'une souche choisie parmi les souches déposées auprès de la CNCM 10 (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris, France), sous les numéros d'enregistrement CNCM-I-5192, CNCM-I-5194, CNCM-I-5195, CNCM-I-5191, CNCM-I-5193, et CNCM-I-5190. De préférence la souche isolée de bactéries Acetobacterium possède toutes les caractéristiques d'intérêt industriel de la souche CNCM-I-5192 ou de la souche CNCM-I-5194. 15 Les caractéristiques d'intérêt industriel d'une souche isolée selon l'invention comprennent par exemple la capacité à produire par fermentation au moins un composé d'intérêt industriel, une croissance rapide, la capacité à consommer du CO, du CO2 et/ou de l'Hz, la capacité à synthétiser des quantités significatives d'éthanol et d'acétate à partir d'un 20 mélange de CO, de CO2 et d'Hz, ou d'un mélange de CO et d'Hz, en l'absence de toute autre source de carbone, et/ou la capacité à produire de l'acétate ou de l'éthanol ou un mélange des deux en fonction des conditions de culture, en particulier en l'absence d'une source de carbone organique. 25 Selon un mode de réalisation, la souche isolée est choisie parmi les souches CNCM-I-5192, CNCM-I-5194, CNCM-I-5195, CNCM-I-5191, CNCM-I-5193, et CNCM-I-5190. Selon un mode de réalisation préféré, la souche isolée est la souche CNCM-I-5192 ou la souche CNCM-I-5194. 30 La présente invention concerne en outre une culture biologiquernent pure d'une souche isolée telle que définie ci-dessus. 16 Méthode de production d'un composé d'intérêt industriel Les 26 nouvelles souches identifiées par les Inventeurs sont capables de produire des composés d'intérêt industriel, lorsqu'elles sont mises en culture en présence d'un substrat approprié, notamment par fermentation. 5 Ainsi, la présente invention concerne une méthode pour produire un composé d'intérêt industriel par fermentation, comprenant les étapes consistant en : (i) la culture d'au moins une souche isolée telle que définie ci-dessus, en présence d'un substrat approprié, dans un milieu de culture et des conditions permettant la 10 croissance de ladite souche isolée, de manière à produire ledit composé d'intérêt industriel ; (ii) optionnellennent la récupération du milieu de culture comprenant ledit composé, produit à l'étape (i) ; et (iii) optionnellennent, la purification dudit composé à partir du milieu de culture 15 récupéré à l'étape (ii). Selon un mode de réalisation, les conditions permettant la croissance de ladite souche isolée sont des conditions de fermentation comprenant : - une température comprise entre 20 et 37°C, de préférence comprise entre 22 et 20 35°C, de préférence encore comprise entre 23 et 33°C, de préférence encore comprise entre 24 et 31°C, de préférence encore comprise entre 25 et 30°C de préférence encore entre 26 et 29°C, de préférence encore entre 27 et 28°C ; et/ou - une agitation, par exemple une agitation orbitale, latérale, verticale, horizontale, et/ou ascensionnelle ; et/ou 25 - une atmosphère anaérobie. De préférence, la culture de l'étape (i) est réalisée dans un bioréacteur. Selon un mode de réalisation, la culture de l'étape (i) est réalisée en mode batch, par 30 exemple dans un bioréacteur. Selon un autre mode de réalisation, la culture de l'étape (i) est réalisée en mode fed-batch, par exemple dans un bioréacteur. Selon un autre mode de réalisation, la culture de l'étape (i) est réalisée en mode continu, par exemple dans un bioréacteur. Selon un mode de réalisation particulier, la culture de l'étape (i) comprend une combinaison de fermentation ou de culture réalisées en mode batch, fed-batch et/ou 35 continu. 17 Selon un mode de réalisation, la récupération du milieu de culture de l'étape (ii) est réalisée en mode batch, par exemple dans un bioréacteur. Selon un autre mode de réalisation, la récupération du milieu de culture de l'étape (ii) est réalisée en mode fedbatch, par exemple dans un bioréacteur. Selon un autre mode de réalisation, la 5 récupération du milieu de culture de l'étape (ii) est réalisée en mode continu, par exemple dans un bioréacteur. Selon un mode de réalisation particulier, la récupération du milieu de culture de l'étape (ii) comprend une combinaison de récupérations réalisées en mode batch, fed-batch et/ou continu. 10 De préférence, lorsque le milieu de culture est récupéré selon l'étape (ii), le mode de récupération utilisé correspond au mode de culture de l'étape (i). Ainsi, si la culture de l'étape (i) est réalisée en mode batch, la récupération du milieu de culture de l'étape (ii) est réalisée de préférence en mode batch. De la même façon, si la culture de l'étape (i) est réalisée en mode fed-batch, la récupération du milieu de culture de l'étape (ii) est 15 réalisée de préférence en mode fed-batch et si la culture de l'étape (i) est réalisée en mode continu, la récupération du milieu de culture de l'étape (ii) est réalisée de préférence en mode continu. Selon un mode de réalisation, ledit substrat approprié est introduit ou injecté dans le 20 milieu de culture dans l'appareil de culture (par exemple un bioréacteur), par exemple à l'aide d'une buse, d'un conduit et/ou d'un tuyau. Selon un mode de réalisation, le substrat est mélangé avec du milieu de culture avant d'être introduit ou injecté dans l'appareil de culture. Ledit substrat approprié peut être à l'état liquide, à l'état gazeux, ou être un mélange de liquides et de gaz. 25 Selon un mode de réalisation, la méthode pour produire un composé d'intérêt industriel par fermentation comprend une étape d'inoculation du milieu de culture avec au moins une souche isolée telle que définie ci-dessus (inoculurn), effectuée avant l'étape i). De préférence, l'inoculation est réalisée avec une culture biologiquernent pure d'une souche 30 isolée telle que définie ci-dessus, ou un échantillon ou une fraction d'une telle culture. L'homme du métier saura adapter les conditions de culture et/ou de fermentation décrites dans les exemples pour mettre en oeuvre les cultures selon les modes de fermentation qu'il souhaite. 35 18 Selon un mode de réalisation, ledit substrat approprié comprend une source de carbone. De préférence, ledit substrat approprié consiste en une source de carbone. Selon un mode de réalisation, ladite source de carbone est choisie parmi un sucre, tel que 5 le glucose, le fructose, le dextrose ; un acide carboxylique ou un sel d'acide carboxylique, tel que l'acétate, l'oxaloacétate, le formate, le funnarate, le nnalate ; un alcool, tel que le méthanol, l'éthanol, le propanol, le butanol, le pentanol ; un diol, tel que le propane diol, le butane diol ; l'éthylène glycol, le tétraéthylène glycol ; le polyéthylène glycol (PEG) ; le nnéthoxyéthanol ; l'éthoxyéthanol ; le trinnéthoxybenzoate ; le trinnéthocycinnannate ; 10 l'acétoïne ; le glycérol ; le lactate ; le pyruvate ; le nnéthoxyacétate ; le glycolate ; le cafféate ; l'éthanolannine ; la choline ; la trinnéthylannine ; la bétaïne ; la glycine ; le syngas ; et un mélange quelconque de ceux-ci. Ledit substrat approprié peut également être un mélange complexe de composés, tel que de l'extrait de levure. 15 Selon un mode de réalisation, ledit substrat approprié est sous forme gazeuse. Selon un mode de réalisation, la pression à l'intérieur du bioréacteur est comprise entre 0,5 et 3 bars, de préférence entre 0,9 et 2,5 bars, de préférence encore entre 1 et 2,4 bars, de préférence encore entre 1,1 et 2,3 bars, de préférence encore entre 1,2 et 2,2 bars, de préférence encore entre 1,5 et 2,1 bars, de préférence encore entre 1,6 et 2 bars. 20 De préférence, ladite source de carbone comprend, ou consiste en, un mélange de dioxyde de carbone (CO2) et de dihydrogène (H2), ou en un mélange de monoxyde de carbone (CO) et optionnellennent de dihydrogène (H2), ou encore un mélange de dioxyde de carbone, de dihydrogène et de monoxyde de carbone. Selon un mode de réalisation préféré, ladite source de carbone est le syngas, ledit syngas comprenant de préférence du dioxyde de carbone (CO2) et du dihydrogène (H2), ou du monoxyde de carbone (CO) et optionnellennent du dihydrogène (H2), ou encore du dioxyde de carbone, du dihydrogène et du monoxyde de carbone. Selon un mode de réalisation préféré, ledit mélange ou ledit syngas est un mélange de CO2, de CO et d'I-12. Selon un autre mode de réalisation préféré, ledit mélange ou ledit syngas est un mélange de CO et d' H2 Selon un autre mode de réalisation préféré, le syngas consiste en un mélange de CO2 et d'I-12, ou en un mélange de CO et d'I-12. 25 30 35 19 Ledit syngas ou Ledit mélange contient de préférence entre 25 et 50% d'I-12, entre 35 et 60% de CO et/ou entre 5 et 30% de CO2, en % volumiques. De préférence encore, ledit syngas ou ledit mélange contient entre 30 et 40% d'I-12, entre 40 et 50% de CO et/ou entre 10 et 20% de CO2, en % volumiques. De manière particulièrement préférée, ledit syngas ou ledit 5 mélange contient 38% d'I-12, 48% de CO et 14% de CO2, en % volumiques. L'homme du métier saura définir la composition des milieux de culture pour mettre en oeuvre les cultures selon les modes de fermentation d'intérêt. 10 Ledit milieu de culture est par exemple un milieu minimum. Le milieu minimum est par exemple un milieu dépourvu d'une source de carbone en sus du substrat tel que défini ci-dessus. Le milieu minimum peut alternativement comprendre une quantité non significative d'une source de carbone en sus du substrat tel que défini ci-dessus. Une quantité non significative d'une source de carbone en sus du substrat tel que défini ci- 15 dessus consiste par exemple en moins de 0,1% (poids/volume) d'une source de carbone en sus du substrat tel que défini ci-dessus, de préférence encore moins de 0,07% (poids/volume), de préférence encore moins de 0,05% (poids/volume), de préférence encore moins de 0,03% (poids/volume), de préférence encore moins de 0,01% (poids/volume) d'une source de carbone en sus du substrat tel que défini ci-dessus. 20 Ledit milieu de culture peut être par exemple un milieu riche. Un milieu riche contient par exemple au moins 0,2% (poids/volume) d'une source de carbone en sus du substrat tel que défini ci-dessus, de préférence au moins de 0,4% (poids/volume), de préférence encore au moins 0,6% (poids/volume), de préférence encore au moins 0,8% (poids/volume), de 25 préférence encore au moins 1% (poids/volume), de préférence encore au moins 1,2% (poids/volume) d'une source de carbone en sus du substrat tel que défini ci-dessus. Les Inventeurs ont montré que, de manière surprenante, les souches selon l'invention sont capables de produire par fermentation au moins un alcool, en particulier de l'éthanol, 30 et/ou au moins un acide carboxylique ou un sel de celui-ci, en particulier de l'acétate. Ainsi, selon un mode de réalisation, ledit composé d'intérêt industriel est un alcool, un acide carboxylique, un sel d'acide carboxylique ou un mélange quelconque de ceux-ci. 35 Selon un mode de réalisation préféré, ledit composé d'intérêt industriel est l'éthanol, l'acide acétique et/ou l'acétate, un sel d'acide acétique, ou un mélange de ceux-ci. Dans 20 un mode de réalisation particulièrement préféré, ledit composé d'intérêt industriel est l'éthanol. Selon une mode de réalisation, la méthode comprend l'étape (iii) de purification dudit 5 composé d'intérêt industriel à partir du milieu de culture récupéré à l'étape (ii). L'homme du métier saura définir les conditions et les méthodes de purification dudit composé, notamment en fonction de la nature dudit composé, de la composition du milieu de culture et/ou de l'application industrielle ou non envisagée pour ledit composé. 10 Utilisation pour produire un composé d'intérêt industriel La présente invention concerne l'utilisation d'une souche isolée telle que définie ci-dessus pour produire un composé d'intérêt industriel. 15 Selon un mode de réalisation, ledit composé d'intérêt industriel est produit par fermentation d'un substrat approprié au moyen de ladite souche isolée. Ledit composé d'intérêt industriel, ledit substrat approprié et lesdites conditions de fermentation sont telles que décrites ci-dessus. 20 EXEMPLES PARTIE A: MATERIELS A.1. Milieu minimum : milieu M238 25 Tableau 1 : Composition du milieu minimum M238. M238 (MINIMUM) 1L MGCL2.61-120 0,1 G KI-12PO4 0,3 G K21-1PO4.31-120 0,39 G NH4CL 1 G CACL2.2H20 0,1 G KCL 0,1 G NACL 1G 21 M238 (MINIMUM) IL EXTRAIT DE LEVURE 0,1 G CYSTEINE.HCL 0,3 G SOLUTION OLIGO-ELEMENTS S20 10 ML NA2W04.2H20 (0,2G/L) 1 ML RESAZURINE 0,1% (P/V) 1 ML PH AVANT STERILISATION (KOH) 8 AJOUTS AVANT UTILISATION IL NAHCO3 8 G NA2CO3 0,5 G NA2S.91-120 0,4 G NA2S203 1,6 G SOLUTION DE VITAMINES 513 10 ML Quand le syngas est utilisé dans le milieu M238, il n'y a pas d'ajout de Na2S203. A.2. Milieu riche : milieu M243 5 Tableau 2 : Composition du milieu riche M243. M243 (RICHE) IL NH4CL 1 G KH2PO4 0,33 G K2HPO4.31-120 0,585 G MGS04.7H20 0,1 G SOLUTION OLIGO-ELEMENTS S20 20 ML EXTRAIT DE LEVURE 2 G RESAZURINE 0,1% (P/V) (ML) 1 ML D-FRUCTOSE 10G CYSTEINE.HCL 0,5G NAHCO3 10G PH AVANT STERILISATION (KOH) 8,2 AJOUTS AVANT UTILISATION IL NA2CO3 1 G NA2S.91-120 0,4 G VITAMINES S13 (V/V) 10 ML 22 Pour réaliser les milieux minima à partir de milieux riches, les sources de carbone organiques (ex : fructose, éthanol, lactate, extrait de levure) sont supprimées et remplacées par le syngas. 5 A.3. Suppléments Tableau 3 : Composition de la solution d'oligoéléments 520. S20 1L (100X) ACIDE NITRILOACETIQUE 1,5 G MGS04.71-120 3 G MNS04.21-120 0,5 G NACL 1G FES04.7H20 0,1 G COSO4.7H20 0,18 G CACL2.2H20 0,1 G ZNS04.71-120 0,18 G CUS04.5H20 0,01 G ALK(SO4)2 0,01 G H3B03 0,01 G NA2M004.21-120 0,01 G NICL2.61-120 0,025 G NA2SE03.51-120 0,3 G Les solutions d'oligoéléments sont conservées à 4°C à l'abri de la lumière. Tableau 4 : Composition de la solution de vitamines 513. S13 1L (100X) BIOTINE 2 MG ACIDE FOLIQUE 2 MG PYRIDOXINE-HCL 10 MG THIAMINE-HCL 5 MG RIBOFLAVINE 5 MG ACIDE NICOTINIQUE 5 MG CYANOCOBALAMINE (B12) 0,1 MG ACIDE P-AMINOBENZQIQUE 5 MG ACIDE THIOCTIQUE 5 MG ACIDE PANTOTHENIQUE 5 MG 23 Les solutions de vitamines sont stérilisées par filtration (0,2unn) et conservées à 4°C à l'abri de la lumière. 5 A.4. Milieu de cryoconservation MI Tableau 5 : Composition du milieu de cryoconservation Ml. M1 1L NACL 18G KCL 0,84 G CACL2.2H20 1,27 G NAHCO3 0,4G GLYCEROL 300 G MOPS 6G Un mélange d'un volume d'une culture de souche en phase exponentielle de croissance avec un volume de milieu de cryoconservation M1 est réalisé et réparti dans des tubes 10 cryogéniques qui sont ensuite conservés à -80°C. 24 A.5. Substrat gazeux : syngas Tableau 6 : Composition du syngas en % volumiques. SYNGAS 100% (POURCENTAGES VOLUMIQUES) DIHYDROGENE (H2) 38% MONOXYDE DE CARBONE (CO) 48% DIOXYDE DE CARBONE (CO2) 14% 5 PARTIE B: EXEMPLES (Méthodes et Résultats) Exemple 1 : Identification de nouvelles souches bactériennes B.1.1. Enrichissements Des enrichissements ont été réalisés à partir de divers écosystèmes susceptibles de contenir des microorganismes acétogènes, afin d'isoler de nouvelles souches capables de 10 se développer en milieu minimum en présence de syngas comme seule source de carbone et d'énergie. Les enrichissements ont été réalisés avec un milieu minimum, le M238 (Tableau 1) dont la composition varie suivant l'écosystème testé, à 25°C et 37°C. De ce fait, la salinité (0 à 15 10g/L NaCl) et le pH (5,5-8,5) ont été adaptés. Un syngas comprenant 38% H2 / 48% CO/ 14% CO2, en % volumiques (Tableau 6), a été choisi comme substrat. Les écosystèmes ont été sélectionnés en fonction de leur diversité microbienne, de la 20 présence de métabolites pertinents, de la température (écosystèmes nnésophiles) et de leur origine. En effet, les 46 écosystèmes testés sont issus d'eaux et de sédiments (ex : divers écosystèmes d'Auvergne ou du bassin d'Arcachon, en France), de fèces (ex : vache, poulet, lapin, chèvre, tortue) et d'écosystèmes extrênnophiles (ex : source hydrothermale). 25 Ces 46 écosystèmes (codifiés de MC-1 à MC-46) ont été enrichis soit à 25°C, soit à 37°C sous agitation (18Orpnn) à 2 bars de syngas, soit 92 conditions d'enrichissement. Une analyse micro-GC a été réalisée 1 à 2 fois par semaine, suivie par le renouvellement de la 25 phase gazeuse. Ceci permet de détecter - rapidement » l'apparition de souches capables d'utiliser le syngas et de poursuivre l'isolement. Parmi ces 46 écosystèmes, 12 ont présenté des résultats intéressants en termes de 5 croissance et de consommation de syngas, à 25°C et/ou à 37°C. Parmi ceux-ci, 10 écosystèmes ont présenté une croissance et une consommation de syngas satisfaisante à 25°C et 6 écosystèmes à 37°C, dont 4 écosystèmes à 25°C et 37°C (Tableau 7 ci-dessous). Tableau 7: Résultats de croissance et de consommation de syngas des écosystèmes présélectionnés. ECOSYSTEMES Milieu 25°C 37°C Croissance Consommation syngas Croissance Consommation syngas MC-3 M238 10g/L NaCl; + - pH6,8 MC-7 M238 1g/L NaCl; + - pH8 MC-8 M238 1g/L NaCl; ± _ pH8 MC-24 M238 10g/L NaCl; + - pH8 MC-27 M238 10g/L NaCl; + - pH8 MC-29 M238 1g/L NaCl; pH6,8 MC-30 M238 1g/L NaCl; + - pH6,8 MC-31 M238 1g/L NaCl; pH6,8 MC-32 M238 0,5g/L NaCl; pH6,8 MC-34 M238 0,5g/L NaCl; pH6,8 MC-35 M238 0,5g/L NaCl; pH6,8 MC-38 M238 0,5g/L NaCl; + - pH6,8 10 L'écosystème apporte, entre autres, des sources de carbone et d'énergie dont les teneurs sont suffisantes pour assurer une croissance bactérienne lors des enrichissements. C'est pour cette raison que certaines cultures ont présenté une croissance significative sans consommation de syngas. 15 26 B.1.2. Isolements Les enrichissements présentant une croissance et une consommation de syngas significatives ont été repiqués plusieurs fois dans les mêmes conditions de culture en flacons pénicillines afin de favoriser l'émergence des souches recherchées. Suivant la 5 densité, la diversité et la consommation de syngas, plusieurs cycles de repiquage ont été nécessaires. Une série de 10 dilutions successives au 1/10è" en tubes de Hungate sur milieu gélose a été réalisée à partir du dernier repiquage positif en flacon pénicilline en présence de 2 10 bars de syngas. La croissance des souches a été suivie par observation des colonies à la loupe binoculaire et par le suivi de la consommation du syngas à la micro-GC. Les colonies ont été prélevées en utilisant l'enceinte anaérobie afin de préserver au mieux l'anoxie. Plusieurs isolements successifs en conditions gélosées ont parfois été nécessaires pour l'obtention de colonies isolées. Un dernier passage en dilution liquide a alors été réalisé. 15 Un numéro de collection a alors été attribué à chaque isolat et leur conservation a été réalisée à -80°C en présence d'un cryoprotecteur (milieu de cryoconservation, Tableau 5). Les 26 souches isolées à partir des enrichissements MC-7, MC-8 et MC-29, ont été mises en collection avec un numéro de collection allant de P4060 à P4085. Ces souches ont la 20 capacité de consommer le syngas comme seule source de carbone et d'énergie. Exemple 2: Caractérisation phylogénétique et fonctionnelle des 26 nouvelles souches isolées B.2.1. Caractérisation phylogénétique 25 L'ADN génonnique des 26 souches isolées a été préparé et le séquençage du gène codant l'ARNr 165 a été réalisé. Les alignements des résultats de ces séquençages avec les bases de données de séquences ont permis de montrer que les séquences des gènes codant l'ARNr 165 pour ces 26 souches sont originales, avec au maximum 99,06 % d'identité détectés pour la souche la plus proche (Tableau 8). Ce résultat indique que ces 26 souches 30 sont toutes nouvelles. Les résultats révèlent en outre que ces 26 nouvelles souches sont proches taxononniquennent d'espèces appartenant au genre Acetobacterium. Les souches phylogénétiquennent les plus proches identifiées par cette analyse sont les suivantes : A. malicum (D5M4132), A. wieringae (DSM1911), A. psammolithicum 27 (SMCC/W751), A. woodii (DSM1030), A. fimetarium (DSM8238) et A. carbinolicum (DSM2925). Les résultats montrent que la souche la plus proche phylogénétiquernent de ces 26 nouvelles souches isolées est Acetobacterium malicum. 5 Le Tableau 8 détaille les résultats d'identification taxonomique des nouvelles souches isolées. Tableau 8: Identification taxonomique des 26 souches isolées sur la base de l'ADNr 165. ECOSYSTEME N °d'identification Homologie de séquence de l'ADNr 16S MC-8 P4061 98,80 % Acetobacterium malicum (Sources des Saladis Rocs Bleues. Martre de Veyre, 63) P4062 98,94 % P4063 98,87 % P4064 98,94% P4065 98,87 % P4066 98,94 % MC-29 P4060 98,80% (Cocoon-présalé-pistel) P4067 98,94 % P4068 98,87 % P4069 98,87 % P4070 98,87% P4071 98,94 % P4072 98,87 % P4073 98,98 % P4074 98,94% P4075 99,06 % MC-7 P4076 98,79 % (Sources du Sait Mirefleurs, 63) P4077 98,80 % P4078 98,79 % P4079 98,94 % P4080 98,80% P4081 98,87 % P4082 98,80 % P4083 98,87 % P4084 98,95 % P4085 98,88 % Les 5 souches phylogénétiquernent les plus proches encore disponibles dans les collections ont été commandées auprès de la collection DSMZ (Tableau 9; A. psammolithicum 10 (SMCC/W751) n'est plus disponible). 28 Tableau 9: Mise en collection des souches les plus proches phylogénétiquennent. N °d'identification Espèce et N° d'enregistrement P4104 A. malicum (DSM4132) P4112 A. wieringae (DSM1911) P4108 A. woodii (DSM1030) P4110 A. fimetarium (DSM8238) P4109 A. carbinolicum (DSM2925) Les espèces appartenant au genre Acetobacterium sont décrites comme étant honnoacétogènes. Elles sont capables de produire de l'acétate à partir de mélanges d'I-12 + 5 CO2 et d'utiliser le CO comme seule source de carbone et d'énergie. Elles sont également chinnioorganotrophes honnoacétogènes sur quelques substrats. Elles utilisent la voie métabolique du tétrahydrofolate pour produire de l'acétate. Le positionnement taxonomique de ces souches est représenté dans la Figure 1. 10 Ces 26 nouvelles souches ont pu être réparties en 6 clusters distincts, en fonction de leur positionnement taxonomique : Cluster 1 : P4064; Cluster 2 : P4073 et P4075 ; Cluster 3 : P4076 et P4078; 15 Cluster 4: P4084 et P4085 ; Cluster 5 : P4081, P4083, P4060, P4077, P4082, P4066 et P4080; Cluster 6: P4062, P4065, P4063, P4071, P4067, P4072, P4070, P4068, P4079, P4074, P4069 et P4061. 20 8.2.2. Caractérisation fonctionnelle : Production d'éthanol et d'acétate B.2.2.1. Evaluation des souches dans les conditions de culture utilisées lors des isolements Afin de pouvoir sélectionner les souches les plus intéressantes, une caractérisation physiologique a été réalisée. La souche Clostridium ljungdahlii (P4006) a été utilisée 25 comme souche témoin. Les 26 souches ont été testées sur le milieu utilisé lors de leur isolement en présence de 2 bars de syngas. 29 Ces tests (conditions non optimisées) ont été réalisés en flacons pénicillines sous 2 bars de syngas (pression relative) à 25°C avec une agitation à 180 rpnn. Les cinétiques ont été suivies comme décrit ci-dessous pendant 3 semaines : 5 - Croissance (Densité optique à 600nnn (D0600)) - pH (bandelettes) - Consommation du syngas (micro-GC) - Production de métabolites pertinents tels que l'éthanol et l'acétate (GC) 10 Les résultats sont présentés dans le Tableau 10 ci-dessous : Tableau 10: Bilan de la croissance, la production métabolites et du ratio éthanol/acétate en conditions de culture non optimisées. Souche Cluster D0600 maximale Ethanol Acétate Ratio maximal maximal maximal éthanol/acétate (mM) (mM) (M/M) P4064 1 2,3 19,7 30,4 1,1 P4073 2 2,3 22,2 14,4 9,4 P4075 2 2,6 18,6 23,4 2,2 P4076 3 2,2 22,4 11,0 4,3 P4078 3 3,4 16,5 28,6 3,6 P4081 4 2,5 10,6 23,2 0,8 P4083 4 1,7 26,7 27,2 1 P4060 4 2,8 19,1 18,8 2,0 P4077 4 3,3 13,8 30,5 2,3 P4082 4 1,8 13,6 9,0 1,7 P4066 4 2,0 20,1 28,0 2,8 P4080 4 2,2 11,6 28,0 1,7 P4062 5 2,1 20,0 31,3 2,0 P4065 5 2,6 23,8 21,5 2,8 P4063 5 2,5 18,1 25,5 1,8 P4071 5 2,2 21,4 20,6 2,8 P4067 5 2,4 22,0 29,4 3,1 P4072 5 2,0 21,6 29,2 2,0 P4070 5 2,1 20,2 31,0 1,2 P4068 5 2,2 18,0 25,7 2,2 P4079 5 2,4 24,5 33,1 0,8 30 Souche Cluster D0600 maximale Ethanol Acétate Ratio maximal maximal maximal éthanol/acétate (mM) (mM) (M/M) P4074 5 2,3 19,1 29,0 1,9 P4069 5 2,9 23,6 27,8 2,1 P4061 5 2,6 18,4 28,8 1,2 P4084 6 1,9 26,9 25 1,4 P4085 6 1,4 21,7 18,2 3,9 P4006 (témoin) N/A 0,8 6,5 23,3 0,3 NB : les différentes valeurs du tableau ont été obtenues à des temps de culture différents. Par exemple, les optima en concentration d'éthanol et en ratio éthanol/acétate ne sont pas simultanés. En grisé : les 6 souches sélectionnées (voir section B.2.2.2). 5 Les résultats montrent que l'ensemble des 26 nouvelles souches testées présente une croissance rapide et satisfaisante dans les conditions de culture testées. En outre, ces résultats montrent que ces 26 nouvelles souches sont toutes capables de produire de l'éthanol et de l'acétate, en présence de syngas. Par ailleurs, un basculement ("switch") de l'acétate vers l'éthanol a été observé pour la plupart des souches. Les 10 concentrations maximales obtenues en éthanol étaient de 10,6 à 26,7 mM et de 9 à 33,1 mM pour l'acétate. Le ratio molaire éthanol/acétate était de 0,8 à 9,4. Ces résultats ont été comparés avec les meilleurs résultats obtenus pour la souche témoin P4006 (Clostridium ljungdahlii), dans des conditions de culture optimisées. De manière 15 surprenante, la croissance de cette souche ainsi que la production maximale en éthanol est plus faible pour cette souche témoin que pour les 26 nouvelles souches, avec 6,5 mM maximum d'éthanol produit en conditions de culture optimisées. La production maximale en acétate était de 23,3 mM et le ratio molaire éthanol/acétate maximal était de 0,3, dans les conditions testées. 20 Ainsi, la présente étude a permis d'identifier 26 nouvelles souches isolées, capables de produire en quantités significatives de l'éthanol et de l'acétate en présence de syngas. En particulier, les niveaux de production d'éthanol obtenus sont significativement plus élevés que le niveau de production maximal d'éthanol obtenu pour la souche témoin, Clostridium 25 ljungdahlii, dans les conditions testées. Ces 26 nouvelles souches permettent donc de mettre en oeuvre des procédés de bio-production d'éthanol et/ou d'acétate à partir de syngas. 31 8.2.2.2. Sélection des souches présentant le meilleur potentiel Six souches ont été sélectionnées parmi ces 26 souches, sur la base des résultats. Au sein de chacun des 6 clusters identifiés, la souche présentant le meilleur potentiel sur la base des critères suivants : ratio éthanol/acétate, niveau de production d'éthanol, niveau de 5 croissance et observation d'un basculement de la production d'acétate vers éthanol, a été retenue pour réaliser des tests complémentaires (Exemple 3 ci-dessous et suivants). Ces souches ont été déposées auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris, France), sous les numéros d'enregistrement indiqués dans le Tableau 11 ci-dessous. 10 Tableau 11: Numéro provisoire d'enregistrement à la CNCM. Souche Numéro provisoire d'enregistrement de ta CNCM P4064 CNCM-I-5190 P4066 CNCM-I-5191 P4073 CNCM-I-5192 P4074 CNCM-I-5193 P4076 CNCM-I-5194 P4085 CNCM-I-5195 Exemple 3 : Caractérisations phylogénétique et physiologique des 6 souches sélectionnées B.3.1. Caractérisation phylogénétique 15 8.3.1.1. Positionnement taxonomique Le positionnement taxonomique des 6 nouvelles souches sélectionnées (section B.2.2. ci-dessus) a été réalisé sur la base des séquences du gène codant l'ARNr 165, dans les mêmes conditions que l'exemple B.2.1 ci-dessus. Le résultat est représenté dans la Figure 2. 20 8.3.1.2. Comparaison des teneurs en G + C de l'ADN génomique Les teneurs en G+C (mol %) de l'ADN génonnique ont été déterminées pour 3 des 6 souches sélectionnées (P4066, P4073 et P4074). Le Tableau 12 ci-dessous compare les teneurs en G+C (mol %) entre ces 3 souches isolées et les souches phylogénétiquennent les plus 25 proches (pour celles-ci, les Inventeurs ont exploité des données bibliographiques). Les résultats montrent des différences significatives entre les teneurs en G+C de l'ADN 32 génonnique des souches connues et celui des 3 nouvelles souches isolées (à l'exception de A. wieringae). Tableau 12: Comparaison du G+C % des souches P4066, P4073 et P4074 avec celui des souches phylogénétiquennent proches. Identification taxonomique N °d'identification N ° d'enregistrement mol % G+C collection Nouvelles Acetobacterium P4066 CNCM 1-5191 43,2 sp. P4073 CNCM 1-5192 43,2 P4074 CNCM 1-5193 43,1 Acetobacterium malicum P4104 DSM 41321- 44,1 Acetobacterium wieringae P4112 DSM 1911' 43 Acetobacterium woodii P4108 DSM 10301- 39 Acetobacterium P4109 DSM 29251- 38,5 carbinoculum Acetobacterium P4110 DSM 82381- 45,8 fimetarium 5 8.3.1.3. Hybridation ADN-ADN Afin d'affiner les résultats d'identification obtenus par séquençage de l'ADNr 165, l'ADN génonnique total de 3 des 6 souches sélectionnées a été hybridé avec l'ADN génonnique total de la souche la plus proche (Acetobacterium malicum DSM 4132). Les résultats sont 10 présentés dans le Tableau 13. Tableau 13 : Pourcentage de similitude ADN/ADN (Les moyennes des mesures réalisées en duplicat sont entre parenthèses). Souche P4104 (Acetobacterium malicum DSM 4132) P4066 47,2 et 53,7 (50,5) P4073 40,2 et 48,7 (44,5) 15 P4074 37,2 et 39,9 (38,6) On considère généralement que deux souches dont le % d'identité en hybridation génome/génome est inférieur à 70% appartiennent à des espèces différentes (Wayne et al., 1987). Ainsi, la souche type Acetobacterium malicum DSM 4132 (P4104) n'appartient 20 pas à la même espèce que la souche P4066, ni à la même espèce que la souche P4073 ou que la souche P4074. Ces 3 souches sont donc affiliées à au moins une nouvelle espèce du genre Acetobacterium. 33 L'ADN génonnique total de 3 des 6 souches sélectionnées a alors été hybridé avec l'ADN génonnique total des autres souches phylogénétiquennent les plus proches identifiées dans l'exemple B.2.1 ci-dessus (P4104 : A. malicum (DSM 4132), P4112 : A. wieringae (DSM 1911), P4109: A. psammolithicum (SMCC/W751), P4108: A. woodii (DSM 1030), A. 5 fimetarium (DSM 8238) et P4110: A. carbinolicum (DSM 2925). Le Tableau 14 ci-dessous résume les résultats d'hybridation ADN-ADN obtenus. Tableau 14: Résultats d'hybridation ADN-ADN A. malicum (DSM 4132T) A. woodii (DSM A. A. wieringae (DSM 1911T) A. P4066 P4073 P4074 1030T) carbinolicum (DSM 2925T) . pmetarium (DSM 8238T) A. malicum 100 (DSM 4132T) A. woodii 15% 100 (DSM 1030T) A. 26% 69% 100 carbinolicum (DSM 2925T) A. wieringae (DSM 1911T) 30% 28% 36% 100 A. 14% 24% 23% 25% 100 fimetarium (DSM 8238T) P4066 50,45% n.d. n.d. n.d. n.d. 100 P4073 44,45% n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 100 P4074 38,55% n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 100 Ces résultats montrent que les souches P4066, P4073 ou P4074 n'appartiennent à aucune 10 des espèces identifiées comme étant les souches phylogénétiquennent les plus proches. Ces 3 souches représentent donc une nouvelle espèce du genre Acetobacterium. 8.3.2. Caractérisation physiologique B.3.2.1. Morphologie 15 La morphologie des 6 souches sélectionnées a été étudies par microscopie. Le Tableau 15 présente les caractéristiques morphologiques observées. 34 Tableau 15 : Morphologie des souches. Souche Observation microscopique P4064 Bâtonnets fusiformes isolés ou par paires, mobiles, présence de quelques chaînettes. P4066 Bâtonnets fusiformes isolés ou par paires, mobiles, présence de chaînettes et de bâtonnets déformés. P4073 Bâtonnets fusiformes isolés ou par paires, mobiles, présence de quelques chaînettes et d'amas. P4074 Bâtonnets fusiformes isolés ou par paires, mobiles, présence de chaînettes et de bâtonnets déformés. P4076 Bâtonnets fusiformes, isolés ou par paires, mobiles. Présence de chaînettes. P4085 Bâtonnets fusiformes, isolés ou par paires, mobiles. 8.3.2.2. Substitution syngas par un composé organique soluble Des essais ont été réalisés avec les souches P4064, P4066, P4073, P4074, P4076 et P4085 5 afin de substituer le syngas par un composé organique soluble : - M238 (1 ou 20X de FeSO4.7H20), pH 7 ou 8, à 25 °C : les sources de carbone organique n'ont pas permis d'obtenir de croissance significative de ces 6 souches. - M238 à 30 °C : les souches P4064, P4066, P4073 et P4074 n'ont pas montré de croissance significative en présence de fructose. 10 Les résultats sont présentés dans le Tableau 16. 35 Tableau 16 : Substitution du syngas par un substrat organique. Temp (°C) Milieu Source de carbone P4064 P4066 P4073 P4074 P4076 P4085 25 M238 Fructose 20 mM - - - ++ - - Glucose 20 mM - - - - - - Extrait de 1 g/L - - - - - - levure Formate 120 mM - - - - - - Lactate 40 mM - - - - - - 30 M243 Fructose 55 mM ++ ++ ++ ++ + + M238 Fructose + 20 mM +/- +/- +/- +/- ++ ++ Acétate 10 mM Ces résultats mettent en évidence des différences significatives de croissance entre les souches, en fonction du substrat utilisé. 5 8.3.2.3. Caractérisation fonctionnelle des 6 souches sélectionnées a) Évaluation des souches dans les conditions de culture utilisées lors des isolements La croissance des 6 souches sélectionnées a été évaluée dans les conditions décrites dans 10 la section B.2.2.1 ci-dessus. Les Figures 3 à 5 présentent les résultats obtenus pour 3 de ces souches (P4066, P4073 et P4074). Lors de la phase exponentielle de croissance (0 à 110 h) des souches P4066, P4073 et 15 P4074, une consommation significative de CO et un peu moindre de H2, ainsi qu'une production de CO2, ont été observées. La production d'acétate a eu lieu au cours de la phase exponentielle de croissance. Au cours de cette phase, un basculement (- switch ») de l'acétate vers l'éthanol a été observé, de manière surprenante. En effet, en début de phase stationnaire, la 20 concentration en acétate a diminué et la concentration d'éthanol a augmenté. Une fois la concentration en éthanol stationnaire, les souches ont à nouveau accumulé de l'acétate. Ainsi, il est possible d'ajuster le temps de culture de ces nouvelles souches au type de produit final souhaité (éthanol ou acétate). Alternativement, le milieu de culture peut donc être récupéré à différents moments, en fonction du produit final d'intérêt. 36 Les ratios éthanol/acétate (molaires) atteints ont été respectivement de 2.8, 9.4 et 1.9 pour les nouvelles souches P4066, P4073 et P4074. Ainsi, de manière surprenante, ces nouvelles souches sont capables de produire de plus grandes quantités d'éthanol que d'acétate, après ce basculement. 5 Le basculement de la production d'acétate vers la production d'éthanol a coïncidé avec une diminution de la consommation de CO et une forte diminution de la production de CO2. La souche P4073 a présenté les résultats les plus pertinents en termes de croissance et de production d'éthanol et acétate. 10 8) Tests de culture en petit volume Les conditions de culture testées sont présentées ci-dessous. Les compositions des milieux de culture sont décrites dans l'exemple 1 ci-dessus. - 1' repiquage (1R) en 5nnL de milieu + 1nnL d'inoculunn issu d'un cryotube conservé 15 à -80°C o P4066, P4073 et P4074: M238 (milieu minimum) + syngas (2 bars pression relative) à 25 °C o P4104, P4108 et P4112 : M243 (milieu riche) à 30°C o P4109 : M244 (milieu riche) à 30°C 20 o P4110 : M245 (milieu riche) à 30°C - 2è" et 3è" repiquage (2R et 3R) en 5 nnL de milieu (cf. ci-dessus) + inoculunn en phase exponentielle de croissance (10%, v/v) issu du repiquage précédent. A partir du 4è" repiquage (4R), trois repiquages successifs (adaptation du métabolisme de 25 la souche) dans les conditions de culture décrites ci-dessous : - Toutes les souches : M238 + syngas (2 bars pression relative) - Uniquement pour les souches types P4104, P4108, P4112 et P4109: milieux de culture riches en substituant les sources de carbone organiques par le syngas (2 bars pression relative). 30 - Témoin : souches types : milieu riche pour valider la viabilité de l'inoculunn. Les 4è" et 5è" repiquages (4R et 5R) ont été réalisés en tubes de Hungate (5nnL). Les résultats de croissance au cours de ces 2 repiquages sont présentés dans le Tableau 17. Tableau 17 : Résultats de croissance des souches avec les milieux testés (riche : sources 35 de carbone organiques ; - : pas de croissance significative ; ++ : culture dense ; nd. : non déterminé). 37 Milieu Substrat P4066 P4073 P4074 P4104 P4108 P4109 P4110 P4112 M238 syngas ++ ++ ++ - - ++ nd. ++ M243 riche nd. nd. nd. ++ ++ nd. nd. ++ syngas - - nd. nd. - M244 riche nd. nd. nd. nd. nd. ++ nd. nd. syngas nd. nd. nd. nd. nd. ++ nd. nd. M245 riche nd. nd. nd. nd. nd. nd. +1- nd. syngas nd. nd. nd. nd. nd. nd. nd. nd. Les 4 souches témoin P4104 (A. malicum), P4108 (A. woodii), P4109 (A. carbinolicum) et P4112 (A. wieringae) ont présenté une croissance significative avec les milieux riches. En revanche, la souche P4110 (A. fimetarium) n'a présenté de croissance suffisamment 5 significative dans aucun des milieux testés. Cette souche n'a donc pas été utilisée dans la suite de cette étude. Dans les conditions de culture décrites ci-dessus, seules les souches témoin P4109 (A. carbonilicum DSM 2925) et P4112 (A. wieringae DSM 1911) ont été capables d'utiliser le 10 syngas comme seule source de carbone : - P4109 : M244 sans source de carbone organique + syngas (2 bars pression relative) et M238 + syngas (2 bars pression relative) à 30°C - P4112 : M238 + syngas (2 bars pression relative) à 30°C. 15 Les 2 autres souches témoin P4104 (A. malicum DSM 4132) et P4108 (A. woodii DSM 1030) n'ont pas présenté de croissance significative en présence de syngas comme seule source de carbone et d'énergie, dans les conditions de culture testées. La présence de CO (un gaz toxique) dans le syngas utilisé (Tableau 6) pourrait expliquer cette absence de croissance de ces deux souches. Ainsi, A. malicum et A. woodii ne seraient pas capables d'assimiler le 20 CO, dans les conditions de culture testées. En revanche, les trois nouvelles souches testées (P4066, P4073 et P4074) ont présenté une croissance significative en présence de syngas comme seule source de carbone et d'énergie dans les conditions de culture testées. Ces souches sont donc capables d'utiliser le syngas 25 comme seule source de carbone et d'énergie et d'assimiler le CO, dans les conditions de culture testées, contrairement aux souches témoin A. fimetarium, A. malicum et A. woodii. 38 y) Tests de culture en volume moyen Le 6è" repiquage (6R) a été réalisé en flacon Pénicilline (50 nnL) afin d'évaluer la consommation et la production de gaz (H2, CO2 et CO) en micro-GC, et de suivre la croissance (D0600) et le pH sur une période d'au moins 3 semaines, en cultures de volume 5 moyen. Les conditions de culture des souches en flacons Pénicilline (6R) sont les suivantes : - 50 nnL milieu de culture (flacon Pénicilline de 121.5 nnL) - Inoculation à 10% (v/v) 10 - Incubation à 25°C pour les souches P4066, P4073 et P4074 et à 30°C pour les souches types. - Agitation orbitale : 180 rpnn sauf pour la P4112, incubation statique. - Suivi croissance : D0600 et pH (bandelette) - Analyses GC: production acétate et éthanol 15 - Analyses micro-GC : consommation et production de gaz (H2, CO2 et CO) Les résultats des suivis de croissance, du pH, de la production ou de la consommation de gaz et la production de métabolites sont présentés dans les Figures 6 à 9. 20 Les nouvelles souches P4066, P4073, P4074 et la souche témoin P4112 (A. wieringae, culture non agitée) ont présenté des valeurs maximales de D0600 comprises entre 0,8 et 1 avec une acidification significative au cours de la cinétique. La consommation de l'Hz et du CO ont été significatives pour ces 4 souches. De la même façon que pour les cultures réalisées dans les conditions utilisées lors des isolements 25 (paragraphe a ci-dessus), une production de CO2 est observée pour les souches P4066, P4073 et P4074 lors de la phase de croissance exponentielle, qui diminue fortement lors de la phase stationnaire (Figures 6 à 8). En revanche, la souche témoin P4112 a présenté une production régulière et significative de CO2 jusqu'en fin de culture. Cette souche témoin n'est donc pas capable de diminuer sa production de CO2, dans les conditions de culture 30 testées (Figure 9). Les 4 souches testées ont produit de l'acétate. Cependant, seules les nouvelles souches P4066, P4073 et P4074 ont produit de l'éthanol contrairement à la souche témoin P4112 (A. wieringae). En outre, une fois le basculement de la production de l'acétate vers 35 l'éthanol effectué pour ces souches, les quantités d'éthanol produites ont été significativement supérieures aux quantités d'acétate produites durant toute la durée de 39 la phase stationnaire, jusqu'en fin de culture pour 2 des 3 souches (P4073 et P4074, Figures 7 et 8). Par ailleurs, la souche P4109 (A. carbinoculum) n'a pas présenté de croissance significative 5 dans les essais réalisés en flacon Pénicilline contrairement aux essais en tube de Hungate. Ainsi, cette souche perd sa capacité de croissance en présence de syngas lors du passage de la petite échelle de culture (5nnL, Hungate) à la moyenne échelle (50 nnL, flacon Pénicilline). 10 Les souches P4066, P4073 et P4074 sont physiologiquement différentes des souches types phylogénétiquennent les plus proches car elles présentent des différences significatives de croissance et de métabolisme en présence de syngas. De manière surprenante, ces 3 nouvelles souches isolées sont toutes capables de synthétiser de l'éthanol et de l'acétate en utilisant le syngas comme seul substrat, à la fois en volumes petit (5nnL) et moyen (50 15 nnL). Parmi les souches Acetobacterium sp. de l'art antérieur testées, seule la souche A. wieringae (P4112) est capable de croître dans les mêmes conditions. En revanche, cette souche n'est pas capable produire de l'éthanol en présence de syngas. Les autres souches Acetobacterium sp. de l'art antérieur testées ne sont quant à elles pas capables de croissance dans toutes les conditions de culture testées. Ainsi, A. fimetarium 20 (P4110), A. malicum DSM 4132 (P4104) et A. woodii DSM 1030 (P4108) ne sont pas capables de croissance en présence du syngas utilisé dans cette étude comme seule source de carbone et d'énergie, quelles que soient les conditions testées. La souche A. carbinoculum (P4109) n'est plus capable de croître en présence de syngas lorsque le volume de culture augmente. 25 Cette étude met ainsi en évidence pour la première fois un groupe de nouvelles souches du genre Acetobacterium sp., qui sont capables à la fois de croître en présence de syngas composé d'un mélange de CO, H2 et CO2 et d'utiliser ce syngas comme substrat pour produire des quantités significatives d'éthanol et d'acétate. Ces nouvelles souches sont 30 originales car elles sont capables d'assimiler un substrat contenant du CO pour produire de l'acétate et de l'éthanol, dans toutes les conditions de culture testées, contrairement aux souches Acetobacterium sp. de l'art antérieur. Les nouvelles souches ainsi identifiées dans la présente étude sont d'autant plus intéressantes qu'elles sont capables de produire de l'acétate puis de l'éthanol, de manière 35 différentielle, grâce à un basculement (- switch ») de la production de l'acétate vers l'éthanol. Selon les conditions de culture, ces nouvelles souches sont capables de maintenir un niveau élevé de production d'éthanol et un niveau plus faible, voire quasi nul, de production d'acétate. Ces souches offrent donc la possibilité de jouer sur les conditions et le temps de culture, en fonction du produit final d'intérêt souhaité. Les 6 nouvelles souches du genre Acetobacterium sp. identifiées dans la présente étude 5 représentent donc des microorganismes de choix pour mettre en oeuvre des procédés de bio-production industrielle d'éthanol et/ou d'acétate, en particulier d'éthanol, à partir de syngas, notamment à partir de syngas contenant du CO. 41 RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES Batch WE, Schoberth S, Tanner RS, Wolfe RS, (1977). Acetobacterium, A New Genus of Hydrogen Oxidizing, Carbon Dioxide Reducing, Anaerobic Bacteria. Int. J. Syst. Bacteriol. 27: 355-361. 5 Bertsch J and Müller V, (2015). CO Metabolism in the Acetogen Acetobacterium woodii. Appt Environ Microbiol. Sep 1;81(17):5949-56. Buschhorn H, Dürre P, Gottschalk G, (1989). Production and Utilization of Ethanol by the Homoacetogen Acetobacterium woodii. Appt Environ Microbiol. Jul;55(7):1835-40. REVENDICATIONS1. Souche isolée de bactéries Acetobacterium sp., caractérisée en ce qu'elle possède la capacité d'une souche choisie parmi les souches déposées auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris, France), sous les numéros d'enregistrement CNCM-I-5192, CNCM-I-5194, CNCM-I-5195, CNCM-I-5191, CNCM-I5193, et CNCM-I-5190, à produire par fermentation au moins un composé d'intérêt industriel. 2. Souche isolée selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle possède la capacité de la souche CNCM-I-5192 ou de la souche CNCM-I-5194, à produire par fermentation au moins un composé d'intérêt industriel. 3. Souche isolée selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les souches CNCM-I-5192, CNCM-I-5194, CNCM-I-5195, CNCM-I-5191, CNCM-I-5193, et CNCM-I- 5190. 4. Souche isolée selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'il s'agit de la souche CNCM-I-5192 ou de la souche CNCM-I-5194. 5. Culture biologiquennent pure d'une souche isolée selon l'une quelconque des revendications 1 à 4. 6. Méthode pour produire un composé d'intérêt industriel par fermentation, comprenant les étapes consistant en : (i) la culture d'au moins une souche isolée selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, en présence d'un substrat approprié, dans un milieu de culture et des conditions permettant la croissance de ladite souche isolée, de manière à produire ledit composé d'intérêt industriel ; (ii) optionnellennent la récupération du milieu de culture comprenant ledit composé, produit à l'étape (i) ; et (iii) optionnellennent, la purification dudit composé à partir du milieu de culture récupéré à l'étape (ii). 43 7. Méthode selon la revendication 6, dans laquelle lesdites conditions sont des conditions de fermentation comprenant : - une température comprise entre 20 et 37°C, de préférence comprise entre 22 et 35°C, de préférence encore comprise entre 24 et 33°C, de préférence encore 5 comprise entre 25 et 30°C ; et/ou - une agitation ; et/ou - une atmosphère anaérobie. 8. Méthode selon la revendication 6 ou 7, dans laquelle la culture de l'étape (i) et 10 optionnellennent l'étape (ii) est(sont) réalisée(s) dans un bioréacteur en mode batch, en mode fed-batch ou en mode continu. 9. Utilisation d'une souche isolée selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 pour produire un composé d'intérêt industriel. 15 10. Utilisation selon la revendication 9, dans laquelle ledit composé d'intérêt industriel est produit par fermentation d'un substrat approprié au moyen de ladite souche isolée. 11. Méthode selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, ou utilisation selon la 20 revendication 10, dans laquelle ledit substrat approprié comprend une source de carbone. 12. Méthode ou utilisation selon la revendication 11, dans laquelle ledit substrat approprié est sous forme gazeuse. 25 13. Méthode ou utilisation selon la revendication 11 ou 12, dans laquelle ladite source de carbone est choisie parmi un sucre, tel que le glucose, le fructose, le dextrose ; un acide carboxylique ou un sel d'acide carboxylique, tel que l'acétate, l'oxaloacétate, le formate, le funnarate, le nnalate ; un alcool, tel que le méthanol, l'éthanol, le propanol, le butanol, le pentanol ; un diol, tel que le propane diol, le butane diol ; l'éthylène glycol, le 30 tétraéthylène glycol ; le polyéthylène glycol (PEG) ; le nnéthoxyéthanol ; l'éthoxyéthanol ; le trinnéthoxybenzoate ; le trinnéthocycinnannate ; l'acétoïne ; le glycérol ; le lactate ; le pyruvate ; le nnéthoxyacétate ; le glycolate ; le cafféate ; l'éthanolannine ; la choline ; la trinnéthylannine ; la bétaïne ; la glycine ; le syngas ; et un mélange quelconque de ceux-ci. 35 14. Méthode ou utilisation selon la revendication 13, dans laquelle ladite source de carbone est le syngas, ledit syngas comprenant de préférence du dioxyde de carbone (CO2) 44 et du dihydrogène (H2), ou du monoxyde de carbone (CO) et optionnellernent du dihydrogène, ou encore un mélange de dioxyde de carbone, de dihydrogène et de monoxyde de carbone. 5 15. Souche isolée selon la revendication 1 ou 2, méthode selon l'une quelconque des revendications 6 à 8 et 11 à 14, ou utilisation selon l'une quelconque des revendications 9 à 14, dans laquelle ledit composé d'intérêt industriel est un alcool, un acide carboxylique, un sel d'acide carboxylique ou un mélange quelconque de ceux-ci. 10 16. Souche, méthode ou utilisation selon la revendication 15, dans laquelle ledit composé d'intérêt industriel est l'éthanol, l'acide acétique, un sel d'acide acétique, ou un mélange de ceux-ci, ledit composé d'intérêt industriel étant de préférence l'éthanol. 15