Brevet FR3080858A1 — publié le 20191108

FACTEUR DE CROISSANCE CELLULAIRE D'ORIGINE NON ANIMALE ET SON UTILISATION DOMAINE DE L'INVENTION L'invention concerne un facteur de croissance d'origine non animale, un milieu de culture cellulaire in vitro et leur utilisation, notamment pour maintenir et/ou induire une croissance cellulaire et/ou induire la synthèse d'éléments cellulaires tels que des éléments de la matrice extracellulaire dermique. ETAT DE LA TECHNIQUE Les facteurs de croissance sont des substances nécessaires à la croissance d'un organisme ou micro-organisme. Il s'agit de suppléments ajoutés à un milieu de culture et qui contiennent de nombreuses protéines et facteurs de stimulation du métabolisme cellulaire. Ces facteurs de croissance sont majoritairement des polypeptides dont l'interaction avec la membrane cellulaire induit, notamment, une réponse hypertrophique (augmentation de la taille des cellules) et une réponse hyperplasique (augmentation de la population cellulaire), c'est-à-dire une prolifération clonale des cellules. En outre, ils favorisent l'adhésion et l'étalement des cellules sur un support. Les facteurs de croissance cellulaire conventionnels utilisés en culture cellulaire sont d'origine animale, cellulaire et/ou végétale, c'est-à-dire obtenus à partir d'une matière première biologique. A titre d'exemple, des facteurs largement utilisés en culture cellulaire in vitro sont la toxine du choléra, le sérum de veau foetal (SVF), tout extrait de glande pituitaire de boeuf ou encore les complexes ou fractions indéfinis du lait ou du soja. Cependant, la composition exacte de ces facteurs de croissance n'est pas clairement identifiée. En d'autres termes, l'importante variété des protéines qui les composent ne permet pas de connaitre la formulation et constitue un frein à la qualité des cultures ou des purifications de protéines d'intérêts sécrétées par les cellules en culture, de même qu'à la reproductibilité des conditions de culture cellulaire in vitro. 2 Un facteur de croissance cellulaire d'origine animale conventionnellement utilisé en culture cellulaire in vitro est le SVF. Il s'agit d'un sérum préparé à partir de sang prélevé, par ponction intracardiaque, de foetus extraits de vaches gestantes. Un autre facteur de croissance cellulaire utilisé en culture cellulaire in vitro est le MPC 5 (« Milk Peptide Complex »). Il s'agit de peptides naturels présents dans des fractions ou extrais obtenus à partir de lait d'origine bovine. Ces facteurs de croissance sont également utilisés en cosmétique. Cependant, l'utilisation de ces facteurs de croissance cellulaire de formulation variable, indéfinie et d'origine animale ou végétale est de plus en plus décriée, notamment en 10 raison du manque de traçabilité de ces composants, de la variabilité de leur qualité, d'un risque de contamination et du manque de reproductibilité des effets observés. De plus, la présence d'allergènes ne peut pas être vérifiée puisque les formulations de ces facteurs de croissance sont indéterminées. Il existe donc un risque d'allergies développées en réponse à leur utilisation. 15 Pour les facteurs de croissance cellulaire d'origine animale, notamment bovine, une autre source de préoccupation publique s'ajoute et consiste en la présence potentielle de contaminations virales ou de maladies à prions. A la connaissance du Demandeur, aucun facteur de croissance d'origine non animale, dont la formulation est entièrement tracée et traçable, pour induire la croissance 20 cellulaire, notamment des cellules cutanées, n'a été mise au point et qui ne présente pas les inconvénients mentionnés précédemment. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Le Demandeur a constaté que, de manière surprenante, une association de plusieurs composés, qui sont parfaitement sûrs et adaptés à l'utilisation en culture cellulaire in 25 vitro, ex vivo, pour l'homme ou l'animal, ou en cosmétique humaine, permet de répondre à ces besoins. Plus précisément, le Demandeur a constaté qu'il est possible d'induire la croissance des cellules cutanées avantageusement humaines ou animales, de préférence des 3 fibroblastes et/ou kératinocytes via l'utilisation d'une association spécifique de composés incorporée dans le milieu de culture déplété en facteur de croissance. Cette combinaison de composés se substitue donc à un facteur de croissance cellulaire et, a fortiori, à toute supplémentation en facteur de croissance dans un milieu de culture 5 cellulaire. Par « facteur de croissance », on désigne un ensemble de substances nécessaires à la survie et/ou la croissance (prolifération, différenciation,...) cellulaire, et/ou la synthèse d'éléments (protéines, sucres,...) avantageusement constitutifs de la matrice extracellulaire dermique, par la cellule. 10 Par « milieu de culture », on désigne un support qui permet la culture des organismes eucaryotes ou procaryotes. Ce milieu fourni les composants indispensables pour la multiplication ces cellules. Le terme « milieu de culture » correspond à tout milieu de culture conventionnellement utilisé, tel que les milieux de culture minimum, empirique, sélectif, enrichi, différentiel ou encore discriminant. Il s'agit donc de cultiver des 15 cellules sur un milieu synthétique, en conditions stériles et dans un environnement contrôlé. Par « culture cellulaire », on désigne un ensemble de techniques biologiques utilisées pour permettre la survie et la croissance d'un tissu ou organe extrait d'un organisme (culture cellulaire ex vivo) ou de cellules en dehors de leur milieu d'origine (culture 20 cellulaire in vitro). Par « éléments cellulaire », on désigne les éléments synthétisés par la cellule, notamment les éléments constitutifs de la matrice extracellulaire dermique tels que l'élastine, le collagène ou encore les glycosaminoglycanes. Ainsi et selon un premier aspect, l'invention a pour objet un facteur de croissance 25 cellulaire comprenant : - de l'acide ci-lipoïque ou l'un de ses sels ; - un dérivé de vitamine C choisi parmi l'éthyle acide ascorbique et l'ascorbate de sodium ou leur mélange ; et - de l'acide hyaluronique. 4 L'acide a-lipoïque (no CAS :1077-28-7), également connu sur le nom d'acide lipoïque ou acide thioctique, possède un atome en C6 qui est chiral. Par conséquent, il existe deux énantiomères de cette molécule : l'acide (R)-(+)-lipoïque et l'acide (S)-(-)-lipoïque, dont le mélange forme le racémique acide (R/S)-lipoïque. L'énantiomère (R) est 5 naturellement synthétisé par les animaux. Selon un mode de réalisation de l'invention, l'acide a-lipoïque est l'acide (R)-(+)- lipoïque, l'acide (S)-(-)-lipoïque ou leur mélange racémique. L'acide a-lipoïque est une molécule endogène que l'on retrouve dans tous les organismes eucaryotes. Chez les mammifères, il agit comme un cofacteur d'au moins 4 10 enzymes mitochondriales qui neutralisent le stress oxydatif via une diminution de la production excessive de radicaux libres. Ce composé a donc pour rôle de protéger les protéines contre l'oxydation par les radicaux libres. Selon un mode de réalisation de l'invention, la composition comprend un sel d'acide alipoïque sous forme (R)-(+), (S)-(-) ou bien racémique. 15 A titre d'exemple, les sels d'acide a-lipoïque qui peuvent être mis en oeuvre selon l'invention sont le lipoate de sodium, le lipoate de L-lysine, le lipoate de L-arginine, ou le lipoate de N-methylglucamine. L'acide a-lipoïque, ou l'un de ses sels, avantageusement l'énantiomère (R) et/ou (S), est généralement obtenu par synthèse chimique mais il peut également être obtenu par 20 synthèse à partir de champignons ou de bactéries. Dans un mode de réalisation préféré, l'acide a-lipoïque, ou l'un de ses sels, peut être utilisé dans la composition de l'invention sous forme purifiée ou isolée. En pratique, l'acide a-lipoïque ou l'un de ses sels peut avoir un degré de pureté, de préférence, au moins égal à 60%, 70%, 80%, 90%, 95% voire au moins égale à 99% en poids. 25 A titre d'exemple, l'acide a-lipoïque qui peut être mis en oeuvre selon l'invention est commercialisé par l'entreprise SABINSA CORPORATION sous le nom d'Alpha Lipoic Acid et correspondant à la dénomination INCI Thioctic acid. 5 A titre d'exemple, un sel d'acide a-lipoïque qui peut être mis en oeuvre selon l'invention est la matière première commercialisée par la société SHANGAI BOYLE CHEMICAL CO., LTD sous le nom Sodium thioctate. L'éthyle acide ascorbique est disponible sous deux formes, à savoir, le 3-0-Éthyl éther 5 d'acide ascorbique (no CAS 86404-04-8), connu également sous la dénomination 3-0- éthyl éther ascorbyle et le 2- 0-Éthyl éther d'acide ascorbique (no CAS 112894-37-8) connu également sous la dénomination 2-0-éthyl éther ascorbyle. Ces deux formes constituent des formes stabilisées de vitamine C (également dénommée acide ascorbique). En d'autres termes, il s'agit de dérivés de vitamine C. 10 Le 3-0-éthyl éther d'acide ascorbique et le 2-0-éthyl éther d'acide ascorbique sont des précurseurs de l'acide ascorbique, lequel joue un rôle général et fondamental dans la cellule. L'utilisation de ces formes d'éthyle acide ascorbique chez l'Homme est donc parfaitement sûre. L'éthyle acide ascorbique est généralement obtenu par synthèse chimique mais il peut 15 également être obtenu par synthèse à partir de champignons ou de bactéries. Dans un mode de réalisation préféré, l'éthyle acide ascorbique peut être utilisé dans la composition de l'invention sous forme purifiée ou isolée. En pratique, l'éthyle acide ascorbique peut avoir un degré de pureté, de préférence, au moins égal à 60%, 70%, 80%, 90%, 95% voire au moins égale à 99% en poids. 20 A titre d'exemple, la matière première Activita commercialisée par la société RIED INTERNATIONAL CORP. et correspondant à la désignation INCI 3-0-ethyl Ascorbic Acid peut être mise en oeuvre selon l'invention. Alternativement, la matière première EVC-2 commercialisée par la société SOGO PHARMACEUTICAL CO. et correspondant à la désignation INCI 2-0-Ethyl Ascorbic 25 Acid peut être mise en oeuvre au sens de l'invention. Dans un mode de réalisation alternatif, un mélange de 3-0-éthyl éther d'acide ascorbique et de 2-0-éthyl éther d'acide ascorbique peut être mis en oeuvre selon 1 ' invention. 6 L'ascorbate de sodium correspond au sel de sodium de la vitamine C et est notamment utilisé comme additif alimentaire pour son effet antioxydant, de préservateur de couleur ou encore comme supplément vitaminique. L'utilisation de l'ascorbate de sodium est donc sûre chez l'Homme. 5 Dans un mode de réalisation préféré, l'ascorbate de sodium peut être utilisé dans la composition de l'invention sous forme purifiée ou isolée. En pratique, l'ascorbate de sodium peut avoir un degré de pureté, de préférence, au moins égal à 60%, 70%, 80%, 90%, 95% voire au moins égale à 99% en poids. A titre d'exemple, la matière première Sodium ascorbate USP/FCC commercialisée par 10 la société MCKINLEY RESOURCES, INC. et correspondant à la désignation INCI Sodium ascorbate peut être utilisée dans le cadre de la présente invention. Selon un mode de réalisation préféré, le dérivé de vitamine C est l'éthyle acide ascorbique, avantageusement le 3-0-éthyl éther d'acide ascorbique. Pour la suite de la description, par « poids moléculaire (Mw) » on désigne le poids 15 moléculaire moyen en poids (Mw ou Molecular weight). Dans un mode de réalisation préféré, la composition selon l'invention comprend de l'acide hyaluronique, de préférence de poids moléculaire (Mw) compris entre 0,1 et 15 kDa, avantageusement entre 0,5 et 10 kDa, ou l'un de ses sels (no CAS :9004-61-9). Dans un mode de réalisation préféré, l'acide hyaluronique de poids moléculaire (Mw) 20 compris entre 0,1 et 15 kDa, avantageusement entre 0,5 et 10 kDa, a un contenu en acide uronique compris entre 4% et 51,3% et un contenu en acide hyaluronique compris entre 88% et 100%. Dans un mode de réalisation préféré, l'acide hyaluronique de poids moléculaire (Mw) compris entre 0,1 et 15 kDa, avantageusement entre 0,5 et 10 kDa, peut être utilisé dans 25 la composition de l'invention sous forme purifiée ou isolée. En pratique, l'acide hyaluronique de poids moléculaire (Mw) compris entre 0,1 et 15 kDa, avantageusement entre 0,5 et 10 kDa, peut avoir un degré de pureté, de préférence, au moins égal à 60%, 70%, 80%, 90%, 95% voire au moins égale à 99% en poids. 7 L'acide hyaluronique de poids moléculaire (Mw) compris entre 0,1 et 15 kDa, avantageusement entre 0,5 et 10 kDa, est généralement obtenu par hydrolyse enzymatique ou chimique d'acide hyaluronique natif issu des biotechnologies. D'autres sources d'acide hyaluronique et procédés peuvent être envisagés pour obtenir l'acide 5 hyaluronique de poids moléculaire (Mw) compris entre 0,1 et 15 kDa, avantageusement entre 0,5 et 10 kDa, au sens de l'invention. Selon l'invention, les hyaluronates, par exemple, le hyaluronate de sodium, sont également des formes d'acide hyaluronique qui peuvent être mises en oeuvre dans une composition telle que décrite. 10 A titre d'exemple, les matières premières Mini HA, Hyalo-oligo, OLIGO-HA' ou Oligohyaferre commercialisées respectivement par les sociétés LEHVOSS, IMCD, SAFIC ALCAN et CONTIPRO peuvent être utilisées dans le cadre de la présente invention. Selon encore un autre aspect, l'invention a également pour objet un milieu de culture in 15 vitro de cellules cutanées, avantageusement des fibroblastes et/ou de kératinocytes, de préférence des fibroblastes humains ou animaux, comprenant un facteur de croissance cellulaire d'origine non animale comprenant : - de l'acide a-lipoïque ou l'un de ses sels; - un dérivé de vitamine C choisi parmi l'éthyle acide ascorbique, l'ascorbate de sodium 20 ou leur mélange, avantageusement le 3-0 éthyl éther d'acide ascorbique ; et - de l'acide hyaluronique. Avantageusement, l'acide a-lipoïque ou l'un de ses sels représente de moins de 0,1%, avantageusement moins de 0,01% en poids du milieu de culture cellulaire, de préférence entre 0,001% et 0,0005%. 25 Avantageusement, le dérivé de vitamine C choisi parmi l'éthyle acide ascorbique et l'ascorbate de sodium ou leur mélange, avantageusement l'éthyle acide ascorbique, de préférence le 3-0 éthyl éther d'acide ascorbique, représente entre 0,001% et 10% en poids du milieu de culture cellulaire, avantageusement entre 0,01% et 5%, de préférence entre 0,1% et 1%. 8 Avantageusement, l'acide hyaluronique, dont le poids moléculaire (Mw) est avantageusement compris entre 0,5 et 15 kDa, de préférence 0,5 et 10 kDa, représente entre 0,001% et 10% en poids du milieu de culture cellulaire, avantageusement entre 0,01% et 5%, de préférence entre 0,1% et 1%. 5 Avantageusement, l'invention concerne un milieu de culture in vitro de cellules cutanées, avantageusement des fibroblastes et/ou de kératinocytes, de préférence des fibroblastes humains ou animaux, comprenant un facteur de croissance cellulaire d'origine non animale comprenant : - de l'acide ci-lipoïque ou l'un de ses sels; 10 - un dérivé de vitamine C choisi parmi l'éthyle acide ascorbique, avantageusement le 3-0 éthyl éther d'acide ascorbique, et l'ascorbate de sodium ou leur mélange ; et - de l'acide hyaluronique avantageusement dont le poids moléculaire (Mw) est compris entre 0,5 et 15 kDa, avantageusement entre 0,5 et 10 kDa ; en outre, au moins un composé choisi parmi : 15 -du glucose, représentant entre 0,1% et 0,6% en poids du milieu de culture cellulaire ; de L-hydroxyproline représentant entre 0,001% et 0,1% en poids du milieu de culture cellulaire ; -un mélange d'adénosine, de guanine, de ribose représentant chacun entre 0,000001% à 0,0001% en poids du milieu de culture cellulaire ; 20 -une fraction d'acides aminés, dont certains essentiels, représentant moins de 0,5% en poids du milieu de culture cellulaire, avantageusement moins de 0,35%; -une fraction de vitamines hydrosolubles représentant moins de 0,2% en poids du milieu de culture cellulaire, avantageusement moins de 0,015%; -une fraction inorganique, dont des oligo-éléments et des sels métalliques, représentant 25 moins de 5% en poids du milieu de culture cellulaire, avantageusement moins de 2%. Dans un mode de réalisation particulier, le milieu de culture selon l'invention contient en outre tout élément nécessaire à la survie et à la prolifération des cellules. Par milieu de culture cellulaire au sens de l'invention, on désigne un milieu de culture conventionnel supplémenté en facteur de croissance cellulaire d'origine non animale tel que défini précédemment. 9 A titre d'exemple, le milieu de culture cellulaire selon l'invention comprend : - une concentration en glucose d'au moins 0,45% en poids du milieu de culture cellulaire, et par exemple comprise entre 0,1% et 0,6%; - une concentration en L-hydroxyproline d'au moins 0,003% en poids du milieu de 5 culture cellulaire, et par exemple comprise entre 0,001% et 0,01%; - une concentration en acide ascorbique d'au moins de 0,0001% en poids du milieu de culture cellulaire, et par exemple comprise entre 0,00001% et 0,001% ; et - une concentration en chacun des composés suivants, à savoir adénosine, guanine, et ribose de 0,00001% au moins en poids du milieu de culture cellulaire, et par 10 exemple comprise entre 0,000001% et 0,0001%. Selon un mode préféré de réalisation, le pH du milieu de culture cellulaire est compris entre 5,0 et 8,0, avantageusement entre 5,5 et 7,9, encore plus avantageusement entre 7,4 et 7,5, par exemple à une valeur de 7,45 et/ou l'osmolarité est comprise entre 280 et 360 mOsmole, avantageusement entre 300 et 350 mOsmole. 15 Les milieux de culture cellulaire décrits précédemment, supplémentés par le facteur de croissance cellulaire ou les principes actifs selon l'invention, en l'espèce, l'association de l'acide ci-lipoïque, d'un dérivé de la vitamine C et d'acide hyaluronique, sont adaptés à l'utilisation en qualité de milieux de culture, de survie et de croissance de plusieurs lignées cellulaires, avantageusement des cellules cutanées. 20 Selon un mode de réalisation, le milieu de culture cellulaire selon l'invention, c'est-à- dire supplémenté en facteur de croissance d'origine non animale comprenant l'association de l'acide ci-lipoïque, d'un dérivé de la vitamine C et d'acide hyaluronique correspond à la formulation suivante : INGREDIENTS POURCENTAGES (%) Composés selon l'invention 3-0-ethyl ascorbic acid (dérivé de vitamine C) 0,2 Hyaluronic acid (acide hyaluronique de poids 0,2 moléculaire (Mw) compris entre 0,5 et 10 kDa) Thioctic acid (acide ci-lipoïque) 0,00104 Autres composés 10 Sodium Chloride 0,6885 Alanyl glutamine 0,20466 Glucose 0,45 Arginine HC1 0,04214 Sodium acetate 0,03 Disodium phosphate 0,0284 Leucine 0,01312 Serine 0,01366 Magnesium chloride 0,012 Potassium chloride 0,0112 Valine 0,00703 Sodium pyruvate 0,0055 Lysine HC1 0,007 Histidine HC1 0,005 Cysteine HC1 0,0042 Adenine 0,0019 Threonine 0,0024 Inositol 0,002 Glutamic acid 0,004 Asparagine 0,00292 Methionine 0,002 Tyrosine 0,00117 Phenylalanine 0,001 Tryptophan 0,00093 Alanine 0,00181 Glycine 0,002 Isoleucine 0,0006 Aspartic acid 0,00173 Sodium sulfate 0,00034 Ferrous sulfate 0,000139 11 Folie acid 0,00018 Thymine 0,00002 Cyanocobalamin 0,000041 Calcium pantothenate 0,00013 Thiamine HC1 0,00013 Zinc sulfate 0,0000144 Pyridoxine HC1 0,000106 Niacinamide 0,000104 Riboflavin 0,000014 Biotin 0,000002 Copper sulfate 0,0000004 Manganese chloride 0,0000002 Proline 0,00461 Hydroxyproline 0,003 Ascorbic acid 0,0001 Ascorbate de sodium 0,0002 Adenosine 0,00001 Guanine 0,00001 Ribose 0,00002 Sodium hyaluronate (sel d'acide hyaluronique de poids moléculaire (Mw) supérieur à 1000 kDa ; agent gélifiant) 0,07 Carnosine 0,1 xylitol 0,01 mannitol 0,01 rhamnose 0,005 Fructooligosaccharides 0,01 A titre d'exemple et de façon non limitative, on peut citer les fibroblastes humains normaux, les lignées fibroblastiques telle que la lignée 3T3, les fibroblastes de cornée de lapin (SIRC), les lignées de fibroblastes pulmonaires humains (WI 38, L 132, Hel 5 299), la lignée de kératinocytes humains HaCaT, la lignée L 929 issue de tissu 12 conjonctif de souris, la lignée de cellules épithéliales de hamster chinois (CHO-K1), la lignée de mélanome de souris B16F1, la lignée de macrophages murins (Raw 264.7), la lignée humaine d'adénocarcinome utérin HeLa, etc... Avantageusement, le milieu de culture cellulaire selon l'invention est pour utilisation 5 pour la maintenir la survie et/ou induire une croissance des cellules et/ou la synthèse d'éléments cellulaires, de préférence de cellules cutanées humaines ou animales, avantageusement des fibroblastes et/ou kératinocytes humains ou animaux, encore plus avantageusement des fibroblastes humains ou animaux. L'invention concerne également une composition, avantageusement cosmétique, 10 comprenant milieu de culture in vitro selon l'invention. La composition selon l'invention est pour utilisation pour lutter contre le vieillissement cutané et/ou induire une régénération cellulaire et/ou une cicatrisation des plaies cutanées. La manière dont l'invention peut être réalisée et les avantages qui en découlent 15 ressortiront mieux des exemples de réalisation qui suivent, donnés à titre indicatif et non limitatif, à l'appui de la figure annexée. DESCRIPTION DES FIGURES La figure 1 montre l'effet du mélange d'acide ci-lipoïque (0,001% en poids du milieu de culture), d'éthyl-vitamine C (0,2% en poids du milieu de culture) et d'acide 20 hyaluronique de poids moléculaire (Mw) compris entre 0,5 et 10 kDa (0,2% en poids du milieu de culture) sur la croissance des FHN en milieu de culture dit Base nutritive complexe (BNC). FHN = Fibroblastes Humains Normaux ; DMEM- = milieu DMEM déplété ; DMEM + SVF = milieu DMEM contenant du sérum de veau foetal ; BNC- = milieu BNC déplété ; 25 BNC + MPC = milieu BNC contenant du « Milk Peptide Complex » ; ALA = acide lipoïque ; et-vit C = l'éthyl-vitamine C; HA= acide hyaluronique de poids moléculaire (Mw) compris entre 0,5 et 10 kDa. 13 EXEMPLES DE REALISATION I - Milieu de culture cellulaire in vitro au sens de l'invention INGREDIENTS POURCENTAGES (%) Composés selon l'invention 3-0-ethyl ascorbic acid (dérivé de vitamine C) 0,2 Hyaluronic acid (acide hyaluronique de poids 0,2 moléculaire (Mw) compris entre 0,5 et 10 kDa) Thioctic acid (acide ci-lipoïque) 0,00104 Autres composés Sodium Chloride 0,6885 Alanyl glutamine 0,20466 Glucose 0,45 Arginine HC1 0,04214 Sodium acetate 0,03 Disodium phosphate 0,0284 Leucine 0,01312 Serine 0,01366 Magnesium chloride 0,012 Potassium chloride 0,0112 Valine 0,00703 Sodium pyruvate 0,0055 Lysine HC1 0,007 Histidine HC1 0,005 Cysteine HC1 0,0042 Adenine 0,0019 Threonine 0,0024 Inositol 0,002 Glutamic acid 0,004 Asparagine 0,00292 14 Methionine 0,002 Tyrosine 0,00117 Phenylalanine 0,001 Tryptophan 0,00093 Alanine 0,00181 Glycine 0,002 Isoleucine 0,0006 Aspartic acid 0,00173 Sodium sulfate 0,00034 Ferrous sulfate 0,000139 Folic acid 0,00018 Thymine 0,00002 Cyanocobalamin 0,000041 Calcium pantothenate 0,00013 Thiamine HC1 0,00013 Zinc sulfate 0,0000144 Pyridoxine HC1 0,000106 Niacinamide 0,000104 Riboflavin 0,000014 Biotin 0,000002 Copper sulfate 0,0000004 Manganese chloride 0,0000002 Proline 0,00461 Hydroxyproline 0,003 Ascorbic acid 0,0001 Ascorbate de sodium 0,0002 Adenosine 0,00001 Guanine 0,00001 Ribose 0,00002 15 Sodium hyaluronate (sel d'acide hyaluronique de poids moléculaire (Mw) supérieur à 1000 kDa ; agent gélifiant) 0,07 Carnosine 0,1 xylitol 0,01 mannitol 0,01 rhamnose 0,005 Fructooligosaccharides 0,01 II - Evaluation de l'effet de l'association de l'acide ci-lipoïque, d'un dérivé de vitamine C et de l'acide hyaluronique de poids moléculaire (Mw) compris entre 0,5 et 10 kDa, sur la croissance de fibroblastes humains normaux dans plusieurs milieux de croissance 5 cellulaire II-1 Objectif de l'étude Le but de l'étude est de comparer l'effet de l'association des actifs selon l'invention sur la croissance des fibroblastes humains normaux (FHN) dans le milieu culture BNC en comparaison avec les milieux de culture BNC ou DMEM éventuellement supplémentés 10 en facteur de croissance d'origine animale. II-2 Eléments d'essai Les données relatives aux actifs testés sont regroupées dans le tableau suivant : Abréviation Dénomination ALA Acide ci-lipoïque HA Acide hyaluronique de poids moléculaire (Mw) compris entre 0,5 et 10 kDa et-vit C 3-0-Éthyl éther d'acide ascorbique (dérivé de vitamine C) II-3 Principe de l'étude 16 Afin d'évaluer l'effet de l'association des actifs sur la croissance cellulaire, l'étude est réalisée sur des fibroblastes humains normaux ensemencés à faible densité, cultivés en milieu standard déplété en facteur de croissance. Le suivi de la croissance cellulaire est évalué par mesure spectrophotométrique par utilisation du Cell Proliferation Reagent 5 WST1 (Roche Laboratories). II-4 Matériel et méthodes i) Milieux et réactifs Tous les réactifs nécessaires à l'expérimentation sont purs à plus de 95% (analytical grade). Ils ont été manipulés et utilisés en conditions stériles. Du tampon phosphate 10 (PBS, Sigma-Aldrich) a également été employé en cours d'étude. Milieux de croissance de cellules utilisés: Milieu standard "Dulbecco's Modified Eagle's medium" ou DMEM (PAN BioTech DUTSCHER) 15 Milieu « éléments vitaux essentiels » ou BNC : la composition de ce milieu, est indiqué dans l'exemple I. Le milieu DMEM a été employé sans supplémentation de facteurs de croissance (DMEM-) ou supplémenté avec 10% de Sérum de veau foetal (DMEM + SVF). L'adjonction d'actifs selon l'invention est indiquée dans les figures avec les 20 concentrations utilisées. Le milieu BNC a été employé sans supplémentation de facteurs de croissance (BNC-) ou bien supplémenté avec 10% de MPC (BNC + MPC). L'adjonction d'actifs selon l'invention dans le milieu BNC est indiquée dans les figures avec les concentrations 25 utilisées. ii) Fibroblastes humains normaux Les fibroblastes humains normaux néonataux ont été sourcés chez ScienCell Research Laboratories. 17 iii) Solubilisation des éléments d'essais Pour chaque condition testée, une solution mère (stock solution) réalisée en DMEM non supplémenté avec des facteurs de croissance (DMEM-) est préparée, filtrée à 22uM et conservée à 4°C. 5 Les concentrations préparées pour les solutions mères sont les suivantes : Acide a-lipoïque: 0,1% Acide hyaluronique de poids moléculaire (Mw) compris entre 0,5 et 10 kDa: 1% 3-0-Éthyl éther d'acide ascorbique (dérivé de vitamine C) : 1% iv) Protocole expérimental 10 Les fibroblastes humains normaux sont mis en culture, à la densité de 4.104 cellules/ml, dans des plaques de 96 puits (200 pi/puits) en milieu de culture standard des fibroblastes, le milieu DMEM enrichi de 10% de sérum de veau foetal (SVF) ou de MPC et le milieu BNC enrichi de 10% de MPC. Ils sont incubés à 37°C, 5% CO2 pendant 24h. Au 2' jour, le milieu de culture est 15 éliminé, les actifs en solution dans le milieu DMEM- ou BNC- sont ajoutés dans les puits (2000 /puits) et les cellules sont incubées à 37°C, 5% CO2. Chaque condition est réalisée en triplicate. Les milieux ne sont pas renouvelés au cours de l'expérimentation. La densité cellulaire est évaluée avant la mise au contact des actifs correspondants aux 20 différentes conditions d'étude (= TO). La croissance cellulaire des fibroblastes est évaluée au premier (Ti), deuxième (T2) et troisième jour (T3) de culture en présence des actifs par la technique de conversion du WST-1 qui consiste à évaluer l'activité du système mitochondrial succinate-tetrazolium reductase des cellules vivantes. 25 Le WST-1 est réduit en un précipité coloré de formazan. La viabilité cellulaire est déterminée par lecture spectrophotométrique à 450nm. L'intensité de la densité optique est proportionnelle au nombre de cellules vivantes et en donne par conséquent une mesure. 18 v) Analyse des résultats L'absorbance est mesurée à 450 nm. Les valeurs de densité optique (DO), reflet de la croissance cellulaire, sont représentées sous forme d'histogramme. II-5 Résultats 5 Les résultats obtenus après calcul des moyennes de DO lues à 450 nm sont représentés par la figure 1 annexée. La figure 1 montre l'effet de l'association de l'acide ci-lipoïque, de l'éthyl-vitamine C et de l'acide hyaluronique de poids moléculaire (Mw) compris entre 0,5 et 10 kDa sur la croissance des FHN en milieu BNC. 10 L'association des trois composés (ALA, et-vit C et HA) permet d'obtenir une stimulation de croissance cellulaire supérieur au milieu BNC supplémenté avec du MPC et analogue à la croissance observée en milieu DMEM supplémenté avec du SVF. L'association des composés selon l'invention, présent en milieu de croissance cellulaire conventionnel déplété en facteurs de croissance d'origine animale, induit une croissance 15 cellulaire égale ou supérieure à ce qui est observé en présence d'un facteur de croissance d'origine animale (SVF REVENDICATIONS1/ Facteur de croissance cellulaire d'origine non animale comprenant : - de l'acide ci-lipoïque ou l'un de ses sels; - un dérivé de vitamine C choisi parmi l'éthyle acide ascorbique et l'ascorbate de sodium ou leur mélange ; et - de l'acide hyaluronique. 2/ Facteur de croissance cellulaire selon la revendication 1, caractérisée en ce que le poids moléculaire moyen en poids (Mw) de l'acide hyaluronique est compris entre 0,5 et 15 kDa, avantageusement entre 0,5 et 10 kDa. 3/ Facteur de croissance cellulaire selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que le dérivé de vitamine C est l'éthyle acide ascorbique, avantageusement le 3-0 éthyl éther d'acide ascorbique. 4/ Facteur de croissance cellulaire selon l'une des revendications précédentes, pour utilisation dans le maintien de la survie cellulaire et/ou l'induction d'une croissance des cellules cutanées humaines ou animales et/ou d'une activité de synthèse d'éléments cellulaires, avantageusement constitutifs de la matrice extracellulaire dermique, par des cellules cutanées humaines ou animales, avantageusement des fibroblastes et/ou kératinocytes, de préférence des fibroblastes. 5/ Milieu de culture in vitro de cellules comprenant le facteur de croissance cellulaire tel que défini dans les revendications 1 à 4. 6/ Milieu de culture in vitro de cellules selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'acide ci-lipoïque ou l'un de ses sels représente moins de 0,1% en poids du milieu de culture cellulaire, avantageusement moins de 0,01%, de préférence entre 0,001% et 30 0,0005%. 7/ Milieu de culture in vitro de cellules selon la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce que le dérivé de vitamine C choisi parmi l'éthyle acide ascorbique et l'ascorbate de 20 sodium ou leur mélange, avantageusement l'éthyle acide ascorbique, de préférence le 3-0 éthyl éther d'acide ascorbique, représente entre 0,001% et 10% en poids du milieu de culture cellulaire, avantageusement entre 0,01% et 5%, encore plus avantageusement entre 0,1% et 1%. 5 8/ Milieu de culture in vitro de cellules selon les revendications 5 à 7 caractérisé en ce que l'acide hyaluronique, dont le poids moléculaire (Mw) est avantageusement compris entre 0,5 et 15 kDa, de préférence 0,5 et 10 kDa, représente entre 0,001% et 10% en poids du milieu de culture cellulaire, avantageusement entre 0,01% et 5%, de 10 préférence entre 0,1% et 1%. 9/ Milieu de culture in vitro de cellules selon la revendication 5 à 8, caractérisé en ce que les cellules sont des cellules cutanées humaines ou animales, avantageusement des fibroblastes et/ou kératinocytes, de préférence des fibroblastes. 10/ Milieu de culture in vitro de cellules selon les revendications 5 à 9, pour utilisation pour le maintien de la survie et/ou la croissance cellulaire et/ou la synthèse d'éléments cellulaires, avantageusement constitutifs de la matrice extracellulaire dermique. 11/ Composition comprenant le milieu de culture in vitro de cellules tel que défini par les revendications 5 à 9. 15 20