Brevet FR3075820A1 — publié le 20190628

MOLECULE D'ADN DOUBLE-BRIN POUR LA DETECTION ET LA CARACTERISATION DES INTERACTIONS MOLECULAIRES DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention se rapporte au domaine de la micromanipulation des molécules. Plus particulièrement, la présente invention se rapporte à des molécules et des procédés permettant de détecter et de caractériser des interactions moléculaires à l'échelle d'une seule molécule. ART ANTERIEUR Les techniques de micromanipulation, tels que les pinces optiques et la microscopie à force atomique, permettent de caractériser les interactions moléculaires entre différentes molécules à tester et de déterminer des informations thermodynamiques et cinétiques à l'échelle d'une seule molécule, ceci notamment en fonction d'une force appliquée. Ces techniques sont en plein essor du fait qu'elles nécessitent peu de réactifs par rapport aux méthodes plus classiques (telle que celles faisant intervenir des - biosensors » basés sur la résonance plasnnonique de surface ou l'interférométrie optique), et qu'elles permettent d'obtenir des informations nnécanistiques de meilleure qualité du fait de l'individualisation des suivis moléculaires. La détection des interactions moléculaires par des techniques de micromanipulation nécessite le plus souvent un accrochage des molécules à tester entre deux supports. S'il est envisageable qu'au moins une des molécules à tester puisse être fixée directement à un support, cela n'est pas souhaitable car ceci est source d'artefacts compte tenu des interactions non-spécifiques de type support-support ou molécule-support qui peuvent avoir lieu. Afin de réduire les artéfacts, différentes molécules ont été décrites permettant d'accrocher des molécules à tester de façon indirecte aux supports, notamment par le biais de molécules peptidiques et/ou nucléotidiques (voir, par exemple, Gao et al., 2012). Ces molécules peuvent elles-mêmes être reliées l'une à l'autre de façon directe ou indirecte, par exemple par une tierce molécule, appelée ici une - longe » (voir, par exemple, Kim et al., 2010 ; Halvorsen et al., 2011 ; Rognoni et al., 2012 ; Kilchherr et al., 2016). Ainsi une molécule utilisée pour étudier des interactions moléculaires par la micromanipulation correspond généralement à une molécule dans laquelle plusieurs - sous-molécules » sont combinées, dont au moins deux molécules à tester. Les molécules actuellement utilisées pour étudier des interactions moléculaires peuvent être regroupées dans quatre catégories distinctes en fonction de la composition de la 2 molécule (e.g. comprenant des éléments polypeptidiques et/ou polynucléotidiques), comme décrit ci-après. La première catégorie de molécules comprend des molécules qui sont composées uniquement d'acides aminés, dont des polypeptides et/ou des protéines. Plus précisément, 5 les molécules à tester sont fixées à deux supports différents au moyen de protéines globulaires (voir, par exemple, Wiita et al., 2006 ; Popa et al., 2011). Généralement, les molécules à tester sont liées à des protéines globulaires et/ou à une longe polypeptidique au sein d'une protéine de fusion. Cependant, l'utilisation de protéines de fusion limite le type de molécules à tester pouvant être intégrées aux seules molécules de nature protéique. De 10 plus, ces molécules nécessitent un important effort de préparation à chaque fois que les molécules à tester sont modifiées du fait que la longe et/ou les protéines globulaires sont exprimées et purifiées en même temps que les molécules à tester. De plus, en fonction de la conformation des protéines, le taux d'interaction positive entre les molécules à tester peut être diminué de façon artificielle à cause de contraintes confornnationnelles (e.g. 15 d'orientation, d'accessibilité) liées à la structure tridimensionnelle de la molécule. Enfin, afin de réduire les interactions entre la longe et les autres éléments de la molécule, et d'empêcher la formation de structures secondaires parasites, particulièrement lors de l'expression, la longueur de la longe polypeptidique est limitée à environ 100 acides aminés et sa séquence doit être soigneusement choisie. Cette limitation de longueur augmente 20 également la concentration effective en molécules à tester, qui est déterminée par la distance moyenne entre ces deux molécules. À titre d'exemple, la concentration effective des molécules à tester est de l'ordre de 1 nnM lorsqu'une longe polypeptidique d'une cinquantaine d'acides aminés est utilisée, ce qui fait qu'uniquement les associations moléculaires ayant des constantes de vitesse suffisamment lentes peuvent être étudiées. À 25 titre d'exemple, pour une résolution temporelle donnée, qui permet de détecter les changements de conformations en 10 ms, la valeur limite au-delà de laquelle les constantes de vitesse ne peuvent plus être mesurées est de 105 M-1s-1. La deuxième catégorie de molécules comprend des molécules d'ADN double-brin, reliées l'une à l'autre par une longe polypeptidique (voir, par exemple, Rognoni et al, 2012 ; 30 Kim et al., 2010). Les contraintes associées à l'utilisation d'une longe polypeptidique restent donc les mêmes ici que pour les molécules de nature peptidique de la première catégorie. De plus, compte tenu du faible nombre d'outils disponibles à ce jour permettant de modifier les liens peptidiques, les molécules à tester doivent être, encore une fois, exclusivement de nature protéique et exprimées en même temps que la longe (e.g. dans des protéines de fusion). 3 Ainsi, ces deux types de molécules sont peu souples dans leur utilisation, d'une part par la nature des molécules à tester qui peuvent être incorporées, et d'autre part par la limite imposée aux concentrations effectives les plus faibles pouvant être étudiées. Une troisième catégorie de molécules comprend des molécules composées d'ADN 5 simple-brin recouvert d'oligonucléotides (voir, par exemple, WO 2013/067489; Halvorsen et al., 2011). Dans ce cas, l'ADN simple-brin fonctionne comme une - molécule support » pour les oligonucléotides, qui s'hybrident et transforment l'ADN simple-brin en une structure tridimensionnelle discontinue comprenant uniquement des liaisons de type phosphodiester, selon une approche de synthèse de type - origami » (voir, par exemple, Rothennund, 2006). 10 Cependant, la longueur de ce type de molécule peut difficilement dépasser la limite pratique d'environ 25 000 nucléotides, ce qui correspond à la longueur du plus grand génome d'ADN simple-brin présent dans la nature, et qui pourrait potentiellement fonctionner comme - molécule support » (même si, pour l'instant la technique n'a été illustrée qu'avec des - molécules support » dont la longueur était, au maximum, d'environ 7250 nucléotides). De 15 plus, lorsque les oligonucléotides s'hybrident à la molécule d'ADN simple-brin il reste encore de nombreuses entailles sur toute la longueur de la structure obtenue. Enfin, la technique d'« origami » reste délicate à mettre en oeuvre. Les oligonucléotides peuvent notamment avoir des structures secondaires et/ou interagir entre eux lorsqu'ils sont mélangés, et ce d'autant plus quand ils présentent une longueur 20 importante (e.g. > 20 bases). À titre d'exemple, pour un support composé d'environ 7250 nucléotides, 121 oligonucléotides différents ayant une longueur de 60 bases ont été hybridés (Halvorsen et al., 2011). Si la probabilité qu'un oligonucléotide individuel soit correctement hybridé est élevée, même avec une probabilité de 99%, la probabilité que la molécule support comprenne bien 121 oligonucléotides hybridés n'est que de 0.99121, soit environ 30%. Si la 25 probabilité qu'un oligonucléotide individuel soit correctement hybridé atteint les 99,9% alors la probabilité que la molécule support comprenne bien 121 oligonucléotides hybridés n'est que de 89%. Ces considérations indiquent que l'approche « origami » produit fréquemment des molécules d'ADN possédant : (1) Des propriétés chimiques hétérogènes (régions hybridées double-brin intactes, 30 régions non-hybridées simple-brin, et entailles entre deux oligonucléotides hybridés) ; (2) Des propriétés mécaniques variables d'une molécule à une autre, la réponse mécanique précise d'une molécule donnée dépendant du rapport exact entre longueur totale des régions hybridées double-brin et longueur totale des régions 35 non-hybridées simple brin ; (3) Des propriétés topologiques défavorables (la molécule ne peut pas être superen roulée par exemple) ; 4 (4) Un risque de séparation important entre la - molécule support » et les oligonucléotides, si des forces élevées sont appliquées à la structure. Il résulte de ceci une grande variabilité, d'une molécule à l'autre, des propriétés intrinsèques des molécules utilisées pour ces études. La complexité de l'assemblage de ce 5 type de molécule fait qu'il est impossible de garantir l'homogénéité d'un ensemble de molécules d'ADN ainsi construit. Or, pour mesurer des interactions à l'échelle d'une seule molécule, il est nécessaire de pouvoir s'assurer d'un très haut niveau de qualité pour chaque molécule individuelle incorporant lesdites molécules à tester. La quatrième catégorie de molécules comprend deux faisceaux de molécules d'ADN 10 double-brin liées l'un à l'autre par une longe en ADN simple-brin (Kilchherr et al., 2016), comprenant ainsi uniquement des liaisons de type phosphodiester. L'assemblage d'un faisceau de molécules d'ADN dépendant également de la technique dite d'- origami », cette molécule possède les mêmes désavantages associés à cette technique que ceux décrits ci-dessus. De plus, compte tenu du grand nombre d'oligonucléotides qui compose les faisceaux, 15 ces compositions sont particulièrement rigides ; la liberté conforrnationnelle des molécules à tester est donc très éloignée de ce qu'elle est en solution. En contraste de la rigidité des faisceaux, la longe d'ADN simple-brin est flexible, composée d'une simple succession de liaisons phosphodiesters. De ce fait, il est impossible d'effectuer des études impliquant l'application d'un couple sur des molécules comprenant une longe d'ADN simple-brin. Une 20 longe d'ADN simple-brin est également susceptible de former des structures secondaires et/ou d'interagir avec d'autres éléments de la molécule. Il existe donc, à l'heure actuelle, un besoin pour de nouvelles molécules stables et homogènes, dans lesquelles une grande diversité de molécules à tester pourrait être intégrée. Il existe également un besoin pour de nouvelles molécules dans lesquelles les interactions 25 non-spécifiques (e.g. entre une molécule à tester et un ou plusieurs autres éléments de la molécule, telle qu'une longe) sont réduites, avantageusement dans lesquelles les interactions non-spécifiques sont entièrement absentes. Il existe également un besoin pour de nouvelles molécules qui sont à la fois flexibles, afin de minimiser les contraintes conforrnationnelles subies par les molécules à tester et ainsi éviter une réduction artificielle dans le taux 30 d'interactions entre les molécules à tester, mais aussi rigides, afin de pouvoir avoir accès facilement au domaine des basses forces commençant sous environ 2 pN. En effet, les molécules actuellement utilisées, par exemple qui sont composées de faisceaux de molécules d'ADN ou de polypeptides, ne peuvent pas être utilisées pour caractériser des interactions moléculaires qui ont lieu à des basses forces (e.g. en dessous de 2 pN). 35 Il existe également un besoin pour de nouvelles molécules qui seraient facilement modulables. Plus précisément, il existe un besoin particulier pour de nouvelles molécules qui permettraient de mesurer des interactions entre des molécules à tester ayant une grande 5 diversité de structures et/ou de compositions, notamment au-delà des acides nucléiques et acides aminés (e.g. polymères, petites molécules chimiques, nanoparticules, etc.). Il existe également un besoin pour de nouvelles molécules comprenant des éléments facilement ajustables en longueur (e.g. pas limitée à 25 000 nucléotides), tels que la longe et/ou les 5 molécules reliant les molécules à tester aux supports, afin de pouvoir moduler les concentrations effectives des molécules à tester et ainsi pouvoir mesurer des constantes de vitesse d'association supérieures à environ 105M ls-1. Il existe également un besoin pour un nouveau dispositif pour la mesure des interactions moléculaires, ledit dispositif comprenant une molécule ayant au moins l'un des 10 avantages décrits ci-dessus, ainsi qu'un nouveau procédé permettant de caractériser les interactions moléculaires par le biais d'une telle molécule ou d'un tel dispositif. Enfin, il existe un besoin pour une méthode de fabrication desdites molécules et dispositifs qui soit rapide, simple, peu coûteuse, et/ou qui implique un minimum d'étapes. RESUME DE L'INVENTION 15 La présente invention a pour objet une nouvelle molécule qui permet de répondre à l'ensemble des besoins cités ci-dessus. Plus particulièrement, la présente invention a pour objet une molécule d'ADN double-brin comprenant une première molécule d'ADN double-brin (1) reliée à une deuxième molécule d'ADN double-brin (2) par au moins une liaison covalente qui n'est pas une liaison phosphodiester, avantageusement par une longe, ladite longe étant 20 avantageusement une molécule d'ADN double-brin. En effet, les inventeurs ont démontré de façon avantageuse que la molécule d'ADN double-brin selon l'invention est plus homogène que les molécules connues jusqu'à présent, ce qui permet d'améliorer la qualité des résultats obtenus lorsqu'une telle molécule est utilisée pour effectuer des études d'interactions moléculaires. L'homogénéité chimique de la 25 molécule permet d'éliminer un grand nombre d'artefacts potentiels liés aux interactions différentielles entre protéines et différents types d'acides nucléiques (simple-brin par exemple). L'homogénéité chimique de la molécule renforce également la stabilité de la molécule en réduisant le nombre de façons dont la molécule peut se dégrader. Avantageusement, la molécule d'ADN double-brin selon l'invention ne comprend ni structure 30 secondaire, ni structure tertiaire. Les inventeurs ont également démontré, de façon surprenante, que la molécule d'ADN double-brin selon l'invention peut être utilisée pour étudier un grand nombre d'interactions différentes, avec différents types de molécules à tester (e.g. des protéines, des polynucléotides, des petites molécules chimiques) sans avoir besoin d'adapter les différents éléments de la molécule (e.g. les molécules d'ADN double- 35 brin (1) et (2) et/ou la longe). Ceci est particulièrement avantageux par rapport aux 6 molécules comprenant des éléments polypeptidiques telles que décrites ci-dessus (selon la première ou la deuxième catégorie de molécules). De façon surprenante, les inventeurs ont également démontré que la molécule d'ADN double-brin selon l'invention est flexible, ce qui permet de façon avantageuse de minimiser 5 les contraintes confornnationnelles subies par les molécules à tester, et ainsi d'éviter une réduction artificielle dans le taux d'interactions entre les molécules à tester. De plus, de façon surprenante, les inventeurs ont démontré que la molécule d'ADN double-brin est aussi suffisamment rigide afin de pouvoir caractériser des interactions moléculaires ayant lieu à des basses forces commençant en-dessous environ 2 pN. 10 Avantageusement, l'invention a pour objet une molécule d'ADN double-brin dans laquelle ladite longe est attachée par au moins une liaison covalente qui n'est pas une liaison phosphodiester à la première molécule d'ADN double-brin (1) et par au moins une liaison covalente qui n'est pas une liaison phosphodiester à la deuxième molécule d'ADN double-brin (2). 15 Avantageusement, l'invention a pour objet une molécule d'ADN double-brin dans laquelle ladite longe est attachée à la première molécule d'ADN double-brin (1) par une première liaison covalente entre la première extrémité de ladite longe et une région intermédiaire de la première molécule d'ADN double-brin (1) et à la deuxième molécule d'ADN double-brin (2) par une deuxième liaison covalente entre la deuxième extrémité de 20 ladite longe et une région intermédiaire de la deuxième molécule d'ADN double-brin (2). Avantageusement, l'invention a pour objet une molécule d'ADN double-brin dans laquelle une première molécule à tester est liée à une première extrémité de la ladite première molécule d'ADN double-brin (1) et une deuxième molécule à tester est liée à une première extrémité de la ladite deuxième molécule d'ADN double-brin (2). 25 Avantageusement, l'invention a pour objet une molécule d'ADN double-brin dans laquelle la deuxième extrémité de ladite première molécule d'ADN double-brin (1) est liée à un premier support et la deuxième extrémité de ladite deuxième molécule d'ADN double-brin (2) est liée à un deuxième support, avantageusement dans laquelle au moins un des deux supports est un support mobile. 30 De façon avantageuse, il y a une grande liberté dans le choix des supports auxquels la molécule d'ADN double-brin peut être attachée. De façon avantageuse, la longueur de ladite première molécule d'ADN double-brin (1) et/ou ladite deuxième molécule d'ADN double-brin (2) et/ou ladite longe peuvent être facilement ajustée. Ceci permet notamment d'optimiser la résolution des mesures 35 d'extension lors de la caractérisation des interactions entre molécules à tester. Ceci permet également de faciliter la distinction entre des les signaux qui résultent d'une interaction spécifique entre deux molécules à tester aux signaux qui résultent d'une interaction non- 7 spécifique (e.g. entre des molécules à tester et les surfaces ou supports environnantes). De façon particulièrement avantageuse, la longueur de ladite longe peut être facilement ajustée afin de pouvoir moduler les concentrations effectives des molécules à tester (Ce) et notamment permettre de déterminer des constantes de vitesse d'association supérieures à 5 environ 105 M-1s-1. Ceci est d'ailleurs d'autant plus facile que l'ADN double-brin a une grande longueur de persistance (environ 50 nnn, soit environ 160 paires de bases). Selon un mode préférentiel, l'invention a pour objet une molécule d'ADN double-brin dans laquelle : - ladite première molécule d'ADN double-brin (1) et/ou ladite deuxième molécule 10 d'ADN double-brin (2) a une longueur de 300 à 5000 paires de bases, de préférence de 650 à 1500 paires de bases ; - la première extrémité de la première molécule d'ADN double-brin (1) et/ou la première extrémité de la deuxième molécule d'ADN double-brin (2) à une longueur de 10 à 150 paires de bases, avantageusement de 30 à 50 paires de bases ; et/ou 15 - ladite longe à une longueur d'environ 300 à environ 50 000 paires de bases, avantageusement d'environ 500 à 10 000 paires de bases, plus avantageusement d'environ 600 à 3000 paires de bases. Avantageusement, l'invention a pour objet une molécule d'ADN double-brin dans laquelle ladite première et/ou ladite deuxième molécule à tester est sélectionnée dans le 20 groupe composé des molécules suivantes : polymères, acides aminés, peptides, polypeptides, protéines, nucléosides, nucléotides, polynucléotides, oligonucléotides, sucres, polysaccharides, petites molécules, drogues, aptannères, antigènes, anticorps, lipides, lectines, hormones, vitamines, virus, fragments de virus, nanoparticules, molécules cellulaires de surface, et facteurs de transcription. 25 Avantageusement, l'invention a pour objet une molécule d'ADN pour une utilisation dans la caractérisation des interactions entre au moins deux molécules à tester. Avantageusement, l'invention a pour objet un dispositif comprenant la molécule d'ADN double-brin décrit ici avec ses supports. Avantageusement, l'invention a pour objet une molécule d'ADN double-brin 30 comprenant une première molécule d'ADN double-brin (A) et une deuxième molécule d'ADN double-brin (B), ladite molécule (A) comprenant un site de clivage qui est présent uniquement dans ladite molécule d'ADN double-brin (A), ladite molécule d'ADN double-brin (A) étant reliée à la molécule d'ADN double-brin (B) par deux liaisons covalentes qui ne sont pas des liaisons phosphodiesters, de part et d'autre dudit site de clivage. 35 La molécule d'ADN double-brin comprenant une première molécule d'ADN double-brin (1) reliée à une deuxième molécule d'ADN double-brin (2) par au moins une liaison covalente qui n'est pas une liaison phosphodiester selon la présente invention est avantageusement 8 fabriquée à partir de la molécule d'ADN double-brin comprenant une première molécule d'ADN double-brin (A) et une deuxième molécule d'ADN double-brin (B) telle que décrite ci-dessus, appelée la molécule d'ADN - intermédiaire ». Aussi, l'invention a pour objet un procédé de fabrication de la molécule d'ADN double- 5 brin telle que décrite ici, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape suivante : a) le clivage de la molécule d'ADN double-brin (A) (présente dans la molécule d'ADN - intermédiaire » telle que décrite ci-dessus) audit site de clivage, générant ainsi une molécule d'ADN comprenant une première molécule d'ADN double-brin (1) et une deuxième molécule d'ADN double-brin (2). Un tel procédé de fabrication est très avantageux car très 10 facile à mettre en oeuvre. De plus, de façon avantageuse, la molécule - intermédiaire » est obtenue avec un rendement satisfaisant (e.g. d'au moins 8 %). De façon avantageuse, la molécule - intermédiaire » ouvre sur une succession d'étapes de synthèse qui conduisent, avec des rendements de plus de 90 %, à la molécule d'ADN double-brin selon l'invention (données non démontrées). 15 Selon un aspect particulier, l'invention a pour objet la molécule d'ADN double-brin obtenue par ce procédé. La présente invention a également pour objet un procédé de caractérisation d'une interaction entre au moins deux molécules à tester liées à une molécule d'ADN double-brin ou telle que comprise dans le dispositif, comprenant : 20 a) l'application d'une force physique basse, FLF, à la molécule d'ADN double-brin, qui permet aux molécules à tester de s'associer ; b) l'application d'une force physique haute, FHF, à la molécule d'ADN double-brin, qui permet de déterminer si les molécules à tester sont associées ou dissociées ; et 25 c) la détection d'un changement dans les propriétés conforrnationnelles de la molécule d'ADN comprenant : la détermination de l'extension zu entre la deuxième extrémité de la première molécule d'ADN double-brin (1) et la deuxième extrémité de la deuxième molécule d'ADN double-brin (2) à l'étape a) ; 30 la détermination des extensions ZHF-A et ZHF-D entre la deuxième extrémité de la première molécule d'ADN double-brin (1) et la deuxième extrémité de la deuxième molécule d'ADN double-brin (2), à l'étape b) ; et la comparaison des extensions ZLF, ZHF-A, et ZHF-D, en fonction du temps t. Avantageusement, l'invention a pour objet un procédé selon lequel la force physique à 35 l'étape a) est de 0,01 picoNewton (pN) à 0,4 pN et/ou selon lequel la force physique à l'étape b) est de 0,5 à 70 pN, avantageusement de 0,5 à 40 pN. 9 Avantageusement, l'invention a pour objet un procédé selon lequel la caractérisation de l'interaction comprend la détermination d'au moins une des caractéristiques choisies parmi : le temps caractéristique d'association, le temps caractéristique de dissociation, la constante de vitesse de dissociation, l'énergie d'activation de dissociation, la distance 5 séparant l'état de transition du complexe lors de la dissociation, et la constante d'équilibre de dissociation. En effet, les inventeurs ont mis en évidence que la molécule d'ADN double-brin selon l'invention est particulièrement adaptée à une utilisation dans des dispositifs et des méthodes permettant de caractériser des interactions moléculaires entre au moins deux 10 molécules à tester. DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1. Représentation conceptuelle d'une molécule d'ADN double-brin selon l'invention comprenant une première molécule d'ADN double-brin (1) reliée à une deuxième molécule d'ADN double-brin (2) par une longe (L), dans laquelle une première molécule à tester (M1) 15 est liée à une première extrémité de la première molécule d'ADN double-brin (1) et une deuxième molécule à tester (M2) est liée à une première extrémité de la deuxième molécule d'ADN double-brin (2). Des groupes fonctionnels sont présents sur la deuxième extrémité de la première molécule d'ADN double-brin (1) et sur la deuxième extrémité de la deuxième molécule d'ADN double-brin (2) (ovales et losanges, respectivement), permettant leur 20 attachement aux supports. Les deux extrémités des molécules d'ADN double-brin (1) et (2) sont illustrées en gris clair, et la région intermédiaire de chaque molécule est illustrée en gris foncé. La longe est représentée en noir. Les liaisons covalentes non-phosphodiesters entre la longe (L) et les molécules d'ADN double-brin (1) ou (2) sont illustrées par les triangles. Figure 2. Représentation conceptuelle d'un dispositif comprenant une molécule d'ADN 25 double-brin selon la Figure 1 et ses supports, dans lequel A) les deux molécules à tester, (M1) et (M2), sont dissociées et B) les deux molécules à tester, (M1) et (M2), sont associées. Figure 3. Représentations conceptuelles d'une molécule d'ADN double-brin - intermédiaire » comprenant une première molécule d'ADN double-brin (A) et une deuxième molécule d'ADN double-brin (B). La molécule (B) correspond à la longe. La molécule (A) correspond au 30 précurseur des molécules d'ADN double brin (1) et (2). À titre d'exemple, les régions de la molécule d'ADN double-brin (A) pouvant correspondre aux extrémités des deux molécules d'ADN double-brin (1) et (2) à lesquelles des molécules à tester peuvent être liées sont illustrées en gris clair, selon deux configurations différentes. 10 Figure 4. Schéma d'une méthode de fabrication d'une molécule d'ADN double-brin à partir d'une molécule d'ADN double-brin - intermédiaire », comprenant les étapes A) Synthèse des molécules d'ADN double-brin (1) et (2) ; B) Synthèse et assemblage des extrémités fonctionnalisées destinées aux supports. 5 Figure 5. Schéma de l'aménagement des extrémités destinées aux molécules à tester, comprenant les étapes A) Digestion des extrémités (par exemple par l'enzyme Nb.BbvC1) ; B) Liaison des molécules à tester aux extrémités. Figure 6. Schéma d'un procédé de fabrication d'une molécule d'ADN double-brin - intermédiaire », comprenant les étapes A) Synthèse des jonctions ; B) Synthèse de la 10 molécule (A), correspondant à un précurseur des première et deuxième molécules d'ADN double-brin (1) et (2) ; C) Synthèse et assemblage de la molécule (B), correspondant à la longe. Figure 7. Principe de mesure du temps de vie, t, A) pour les molécules à tester sous leur forme dissociée et B) pour les molécules à tester sous leur forme associée. La conformation 15 de la molécule d'ADN peut être déterminée à partir de l'enregistrement au cours du temps de l'extension, z, lorsque la force F est cyclée entre une valeur haute et une valeur basse, pour des durées T (THF/TLF, respectivement). HF correspond à l'application d'une force haute (- High Force »); LF correspond à l'application d'une force basse (- Low Force »). Les molécules à tester peuvent être soit associées (A pour - Associated ») ; soit dissociées (D pour 20 - Dissociated »). Le repérage sur les traces temporelles d'événement de changement d'extension (E) permet de déterminer t. n correspond au nombre de cycles effectués avant détection d'un événement dans les expériences d'association. Figure 8. Étude de l'interaction covalente entre deux bouts cohésifs des extrémités d'ADN double-brin en présence de l'ADN ligase du phage T4 puis de l'enzyme de restriction Sm'. 25 Ces deux bouts cohésifs, où des groupes phosphates terminaux sont présents en 5' et des groupes hydroxyles terminaux sont présents en 3', constituent eux-mêmes ici les deux molécules à tester. La molécule d'ADN utilisée correspond à celle schématisée dans la Figure 1 dans un dispositif tel qu'illustré dans la Figure 2, et obtenu par le procédé de fabrication décrit dans les Exemples 3, 1 puis 7. Les expériences sont réalisées à 34°C dans le tampon RB. 30 A) Schéma des quatre configurations sous lesquelles peut se trouver la molécule d'ADN. Le dispositif peut être soumis soit à une force haute (HF pour - High Force ») ; soit à une force basse (LF pour - Low Force »). Les molécules à tester peuvent être soit associées (A pour - Associated ») ; soit dissociées (D pour - Dissociated »). B) Suivi temporel de l'extension de la molécule d'ADN lorsque la force est cyclée entre une force haute FFIF = 1,4 pN pendant un 11 temps THF = 80 s et une force basse FLF = 0,05 pN pendant un temps TLF = 80 s (TS : tracé schématique des cycles FHF/FLF). Figure 9. Mesure du temps caractéristique d'association / ligature de deux bouts francs des extrémités de la molécule d'ADN double-brin en présence des protéines participant au 5 système de réparation NHEJ humain. Ces deux bouts francs, où des groupes phosphates terminaux sont présents en 5' et des groupes hydroxyles terminaux sont présents en 3', constituent eux-mêmes ici les deux molécules à tester. La molécule d'ADN utilisée correspond à celle schématisée dans la Figure 1 dans un dispositif tel qu'illustré dans la Figure 2, et obtenu par le procédé de fabrication, et obtenu par le procédé de fabrication décrit dans les 10 Exemples 3, 1 puis 8. Les expériences sont réalisées à 34°C dans le tampon RB. A) Suivi temporel de l'extension de la molécule d'ADN double-brin lorsque la force est cyclée entre une force haute FFIF = 1,4 pN pendant un temps THF = 300 s et une force basse FLF = 0,05 pN pendant un temps TLF = 300 s (TS : tracé schématique des cycles FHF/FLF). HF correspond à l'application d'une force haute (- High Force »); LF correspond à l'application d'une force 15 basse (- Low Force »). Les molécules à tester peuvent être soit associées (A pour - Associated ») ; soit dissociées (D pour - Dissociated »). Les molécules à tester sont tout d'abord seules puis les protéines composant le système NHEJ sont introduites dans le capillaire (indiqué par la flèche). Ceci conduit à la formation de liens covalents entre les bouts francs après un certain nombre de passages à basse force, réaction qui se traduit par un 20 raccourcissement de l'extension mesurée à haute force. Ici deux passages à basse force auront été nécessaires pour obtenir la ligature. Finalement, l'ajout de l'enzyme de restriction Snnal permet de cliver les liens unissant les bouts francs et de retrouver l'extension maximale à haute force. B) Histogramme des différences d'extension, - ZHF-D - ZHF-A, », entre les états HF-A (état de force haute - molécules à tester associées) et HF-D (état de force haute - 25 molécules à tester dissociées), et extraction de la valeur moyenne, - ZHF-D - ZHF-A, » = 161 nnn, par ajustement gaussien. C) Histogramme du nombre de passages à force basse, nu-D, nécessaire pour obtenir l'association / ligature et extraction du temps caractéristique d'association / ligature, TA, par ajustement exponentiel. Le résultat exprimé en nombre de passages, nu_D, est égal à 0,8 ± 0,2 ; il peut être converti en temps par multiplication par TLF, 30 ce qui conduit à TA = 240 ± 60 s. Figure 10. Mise en évidence de la capacité du dispositif à appliquer un couple aux molécules à tester lorsqu'elles sont associées, ceci lors de l'étude des interactions entre deux bouts francs des extrémités de la molécule d'ADN double-brin et les protéines participant au système de réparation NHEJ humain. Ces deux bouts francs, où des groupes phosphates 35 terminaux sont présents en 5' et des groupes hydroxyles terminaux sont présents en 3', constituent eux-mêmes ici les deux molécules à tester. La molécule d'ADN utilisée correspond 12 à celle schématisée dans la Figure 1 dans un dispositif tel qu'illustré dans la Figure 2, et obtenu par le procédé de fabrication décrit dans les Exemples 3, 1 puis 8. Les expériences sont réalisées à 34°C dans le tampon RB. L'extension de la molécule d'ADN double-brin (bas) est suivie en fonction des modulations de la position des aimants, qui correspond à une 5 modulation de la force (haut), et de l'orientation des aimants (milieu). Un premier essai de surenroulennent à basse force (environ 0,4 pN, première zone, Z1) est effectué avant introduction des protéines de réparation et aucune variation de hauteur de la bille n'est observée car les jonctions permettent une libre rotation des différents éléments fonctionnels de la molécule d'ADN (e.g. la longe et les molécules d'ADN double-brin (1) et (2)). Un second 10 essai de surenroulennent (seconde zone, Z2) est effectué après introduction des protéines du système NHEJ et réparation aux niveaux des bouts francs, la hauteur de la bille varie maintenant en fonction de l'angle des aimants, signe que les deux extrémités ont été ligaturées et qu'aucune entaille n'existe le long de l'enchaînement de la molécule d'ADN double-brin (1) ou de la molécule d'ADN double-brin (2). 15 Figure 11. Mesure du temps caractéristique de dissociation de la liaison non-covalente formée par deux bouts francs des extrémités d'ADN double-brin en présence des protéines participant au système de réparation NHEJ humain. Ces bouts francs, qui ne présentent que des groupes hydroxyles terminaux, constituent eux-mêmes ici les deux molécules à tester. La molécule d'ADN utilisée correspond à celle schématisée dans la Figure 1 dans un dispositif tel 20 qu'illustré dans la Figure 2, et obtenu par le procédé de fabrication décrit dans les Exemples 3, 1 puis 8. Les expériences sont réalisées à 34 °C dans le tampon RB. A) Suivi temporel de l'extension, z, de la molécule d'ADN lorsque la force F est cyclée entre une valeur haute FHF et une valeur basse FLF (TS : tracé schématique des cycles FHF/FLF). HF correspond à l'application d'une force haute (- High Force »); LF correspond à l'application d'une force 25 basse (- Low Force »). Les molécules à tester peuvent être soit associées (A pour - Associated ») ; soit dissociées (D pour - Dissociated »). À chaque passage à FLF = 0,05 pN pendant un temps TLF = 250 s les molécules à tester s'associent puis après passage à FHF = 1,4 pN elles se séparent au bout d'un temps noté tFIF-A. La force haute est appliquée pendant THF = 250 s. A') Zoom sur une mesure de tFIF-A. B) Histogramme des différences d'extension, - ZHF-D - 30 ZHF-A, » , entre les états HF-D (état de force haute - molécules à tester dissociées) et HF-D (état de force haute - molécules à tester associées), et extraction de la valeur moyenne, - ZHF-D - ZHF-A, » = 166 nnn, par ajustement gaussien. C) Histogramme des temps de vie des synapses, tFIFA, sous une force élevée FHF = 1.4 pN, et extraction du temps caractéristique de dissociation, TD = 2,2 ± 0,3 s, par ajustement exponentiel. 35 Figure 12. Mesure du temps caractéristique de dissociation de la liaison non-covalente unissant les protéines FKBP12 et FRB en présence de la rapannycine. Les protéines FKBP12 et 13 FRB constituent ici les deux molécules à tester. La molécule d'ADN utilisée correspond à celle schématisée dans la Figure 1 dans un dispositif tel qu'illustré dans la Figure 2, et obtenu par le procédé de fabrication illustré dans la Figure 6 suivi par les procédés illustrés dans les Figures 4 puis 5 (décrits dans les Exemples 3, 1 puis 2). Les expériences sont réalisées à 25 °C 5 dans le tampon DB. A) Suivi temporel de l'extension de molécule d'ADN double-brin lorsque la force est cyclée entre valeur haute et valeur basse (TS : tracé schématique des cycles FHF/FLF). HF correspond à l'application d'une force haute (- High Force »); LF correspond à l'application d'une force basse (- Low Force »). Les molécules à tester peuvent être soit associées (A pour - Associated ») ; soit dissociées (D pour - Dissociated »). À chaque passage 10 à FLF = 0,05 pN pendant un temps TLF = 13 s les molécules à tester s'associent puis après passage à FHF = 1,4 pN elles se séparent au bout d'un temps noté tFIF-A. La force haute est appliquée pendant THF = 125 s. B) Histogramme des tFIF-A sous une force haute de 1,4 pN et extraction du temps caractéristique de dissociation, TD = 31,1 ± 2,3 s, par ajustement exponentiel. 15 Figure 13. Mesure du temps caractéristique de dissociation de la liaison non-covalente unissant les protéines FKBP12 et FRB en présence de la rapannycine, ceci pour d'autres valeurs de la force haute, FHF, et/ou de la température que celles utilisées dans la Figure 10. Les protéines FKBP12 et FRB constituent ici les deux molécules à tester. La molécule d'ADN utilisée correspond à celle schématisée dans la Figure 1 dans un dispositif tel qu'illustré dans 20 la Figure 2, et obtenu par le procédé de fabrication illustré dans la Figure 6 suivi par les procédés illustrés dans les Figures 4 puis 5 (décrits dans les Exemples 3, 1 puis 2). Les expériences sont réalisées à 30 °C dans le tampon DB. A) Suivi temporel de l'extension de la molécule d'ADN double-brin lorsque la force est cyclée entre valeur haute et valeur basse (TS : tracé schématique des cycles FHF/FLF). HF correspond à l'application d'une force haute 25 (- High Force »); LF correspond à l'application d'une force basse (- Low Force »). Les molécules à tester peuvent être soit associées (A pour - Associated ») ; soit dissociées (D pour - Dissociated »). À chaque passage à FLF = 0,05 pN pendant un temps TLF = 13 s les molécules à tester s'associent puis après passage à FHF = 1,4 pN elles se séparent au bout d'un temps noté tFIF-A. La force haute est appliquée pendant un temps THF = 155 s. B) Histogramme des tHF-A 30 sous une force haute de 1,4 pN et extraction du temps caractéristique de dissociation TD = 20,6 ± 2,6 s, par ajustement exponentiel. C) Suivi temporel de l'extension de la molécule d'ADN double-brin lorsque la force est cyclée entre valeur haute et valeur basse (TS : tracé schématique des cycles FHF/FLF). À chaque passage à FLF = 0,05 pN pendant un temps TLF = 14 s les molécules à tester s'associent puis après passage à FHF = 6 pN elles se séparent au bout 35 d'un temps noté tFIF-A. La force haute est appliquée pendant un temps THF = 125 s. D) 14 Histogramme des tFIF-A sous une force haute de 6 pN et extraction du temps caractéristique de dissociation, TD = 15,4 ± 1,9 s, par ajustement exponentiel. Figure 14. Mise en évidence de la capacité du dispositif à distinguer les interactions spécifiques entre molécules à tester des interactions entre une des molécules à tester et l'un 5 des supports, ceci lors de l'étude des interactions entre les protéines FKBP12 et FRB en présence de la rapannycine. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Comme indiqué précédemment, dans le cadre de la présente invention, les inventeurs ont mis en évidence de nouvelles molécules d'ADN double-brin comprenant une première 10 molécule d'ADN double-brin (1) reliée à une deuxième molécule d'ADN double-brin (2) par au moins une liaison covalente qui n'est pas une liaison phosphodiester, avantageusement par une longe. Ces nouvelles molécules double-brin sont très avantageuses car elles présentent une stabilité, une flexibilité et une homogénéité améliorées, grâce notamment à l'utilisation de molécules d'ADN double-brin et à leur configuration. 15 MOLECULE D'ADN Un premier aspect de l'invention concerne donc une molécule d'ADN double-brin comprenant une première molécule d'ADN double-brin (1) reliée, par au moins une liaison covalente qui n'est pas une liaison phosphodiester, à une deuxième molécule d'ADN double-brin (2). 20 Par - comprenant » ou - contenant », on entend ici que les éléments énumérés sont requis ou obligatoires, mais que d'autres éléments optionnels peuvent être ou non présents. Ainsi, à titre d'exemple non-limitatif, une molécule d'ADN double-brin selon l'invention peut notamment comprendre d'autres molécules, dont d'autres molécules d'ADN double-brin, en surplus des molécules (1) et (2). 25 Les termes - un/une» et - le/la» tels qu'utilisés ici comprennent des formes plurielles sauf si le contenu de la présente demande indique clairement le contraire. À titre d'exemple, - un site de restriction" peut donc comprendre deux sites de restriction ou plus. Par - acide nucléique », - molécule d'acide désoxyribonucléique » ou - molécule d'ADN », on entend, au sens de la présente invention, un polymère composé de monomères 30 de désoxyribonucléotides ou des analogues de ceux-ci. Plus particulièrement, les monomères désoxyribonucléotidiques décrits ici se réfèrent à des monomères comprenant un groupe triphosphate, la base azotée adénine (- A »), cytosine (- C »), guanine (- G »), ou thymine (- T »), et un sucre de désoxyribose. De façon générale, un analogue d'un nucléotide aura la même spécificité d'appariement de bases (e.g. un analogue de - A » s'apparie avec - T »). 15 Des nucléotides modifiés sont également inclus ici, et peuvent comprendre, par exemple, des modifications dans les moitiés base, sucres, et/ou phosphate (i.e. des squelettes phosphorothioates). Ladite molécule d'ADN peut également comprendre un ou plusieurs nucléotides modifiés, tels qu'un acide nucléique bloqué (LNA), qui est un nucléotide dans 5 lequel la fraction ribose est modifiée par un pont supplémentaire reliant l'oxygène 2' et le carbone 4', ou un acide nucléique peptidique (PNA), le squelette étant composé de motifs répétés de N-(2-anninoéthyl)-glycine liés par des liaisons peptidiques, ou des nucléotides modifiés tels que l'hypoxanthine, la xanthine, la 7-nnéthylguanine, ou la 5-nnéthylcytosine. La molécule d'ADN double-brin selon l'invention est un polymère composé 10 nnajoritairennent de désoxyribonucléotides (i.e. plus de 50 %). Avantageusement, la molécule d'ADN double-brin selon l'invention est un polymère composé d'au moins 50% de désoxyribonucléotides, plus avantageusement d'au moins 60%, d'au moins 70%, d'au moins 75%, d'au moins 80%, d'au moins 85%, encore plus avantageusement d'au moins 90%, d'au moins 95%, d'au moins 96%, d'au moins 97%, d'au moins 98%, ou d'au moins 99% de 15 désoxyribonucléotides. Avantageusement, la molécule d'ADN double-brin selon l'invention est un polymère composé entièrement (i.e. 100%) de désoxyribonucléotides. Ainsi, selon un mode préférentiel, la première molécule d'ADN double-brin (1) et/ot la deuxième molécule d'ADN double-brin (2), compris dans la molécule d'ADN double-brin selon l'invention, sont avantageusement des polymères composés d'au moins 50%, d'au moins 60%, d'au moins 70%, 20 d'au moins 75%, d'au moins 80%, d'au moins 85%, d'au moins 90%, d'au moins 95%, d'au moins 96%, d'au moins 97%, d'au moins 98%, ou d'au moins 99%, plus avantageusement composés entièrement de désoxyribonucléotides. La première molécule d'ADN double-brin (1) et la deuxième molécule d'ADN double-brin (2) peuvent être des polymères composés de différentes proportions de désoxyribonucléotides, par exemple selon les pourcentages décrits 25 ci-dessus. Lorsque d'autres molécules d'ADN double-brin sont présentes dans la composition (e.g. une molécule d'ADN (3)), elles sont aussi avantageusement des polymères composés d'au moins 50% de désoxyribonucléotides voir plus, selon les pourcentages décrits ci-dessus, et ont les mêmes caractéristiques que les molécules d'ADN double-brin (1) et/ou (2) décrites ici. Le plus souvent, l'acide nucléique double-brin sera une molécule d'ADN, mais il est 30 compris que l'invention s'applique également à des duplex de deux molécules d'ADN simple- brin, parfaitement appariées ou non parfaitement appariées. En outre, le duplex peut consister en l'appariement au moins partiel de deux brins uniques obtenus à partir d'échantillons d'origines différentes. Enfin, l'invention s'applique également aux structures secondaires d'un seul ADN simple-brin, formant ainsi des structures en forme double-brin. 35 La molécule d'ADN double-brin selon l'invention peut être d'origine naturelle (e.g. d'origine eucaryote ou procaryote), ou artificielle, ou comprendre un mélange d'ADN d'origine naturelle et artificielle selon n'importe quel ratio. La première molécule d'ADN 16 double-brin (1) et la deuxième molécule d'ADN double-brin (2) peuvent donc être composées d'ADN de la même origine ou d'origine différente. Le plus souvent, l'origine de l'ADN dépendra des besoins expérimentaux (e.g. besoin d'une molécule d'ADN ayant une longueur particulière, possédant certain(s) site(s) de restriction, etc.). De même, les séquences des 5 première et deuxième molécules d'ADN double-brin (1) et (2) peuvent être identiques ou différentes. De façon avantageuse, la première molécule d'ADN double-brin (1) et de la deuxième molécule d'ADN double-brin (2) ont des séquences différentes. Les longueurs des première et deuxième molécules d'ADN double-brin (1) et (2) peuvent être choisies selon les besoins expérimentaux, tels que détaillés ci-dessous, et/ou en 10 fonction des autres éléments de la molécule d'ADN (e.g. pour que les deux molécules d'ADN double-brin (1) et (2) aient chacune une longueur particulière ou selon la longueur d'une longe). Les longueurs de la première molécule d'ADN double-brin (1) et de la deuxième molécule d'ADN double-brin (2) peuvent être identiques ou différentes. La longueur de la première molécule d'ADN double-brin (1) peut, par exemple, être plus courte que celle de la 15 deuxième molécule d'ADN double-brin (2), ou plus longue. Une différence dans la longueur de la première molécule d'ADN double-brin (1) par rapport à la deuxième molécule d'ADN double-brin (2) est particulièrement avantageuse lorsque la molécule d'ADN est utilisée pour détecter et/ou mesurer des interactions moléculaires. En effet, les inventeurs ont démontré de façon surprenante que, lorsque la molécule d'ADN est utilisée pour détecter et/ou 20 mesurer des interactions moléculaires, une différence de longueur de la première molécule d'ADN double-brin (1) par rapport à la deuxième molécule d'ADN double-brin (2) permet de mieux différencier les signaux qui résultent d'une interaction spécifique entre deux molécules à tester aux signaux qui résultent d'une interaction non-spécifique (i.e. entre un support et une molécule à tester (voir par exemple la Figure 14 et l'Exemple 10). 25 Alors que la longueur» d'une molécule d'ADN est généralement exprimée en nombre de nucléotides ou paires de bases (pb), elle peut également être exprimée selon sa longueur physique, par exemple en nanonnètres ou micromètres (1 paire de base correspond à environ 0,32 nnn). De façon préférée, la longueur d'une molécule d'ADN est exprimée ici en paires de bases. Par exemple, la première molécule d'ADN double-brin (1) et/ou la deuxième molécule 30 d'ADN double-brin (2) peut avoir une longueur de 300 à 5 000 paires de bases, de 500 à 5 000 paires de bases, ou de 650 à 1 500 paires de bases. Ainsi, la longueur totale des molécules d'ADN double-brin (1) et (2) peut être comprise entre 600 et 10 000 paires de bases, entre 1 000 et 10 000, ou entre environ 1 300 et 3 000 paires de bases (± 50 paires de bases). Selon un mode préféré de l'invention, la première molécule d'ADN double-brin (1) 35 et/ou la deuxième molécule d'ADN (2) a une longueur de 300 à 5 000 paires de bases, de préférence de 650 à 1 500 paires de bases. Selon un mode de réalisation particulier, la première molécule d'ADN double-brin (1) et la deuxième molécule d'ADN double-brin (2) ont 17 chacune une longueur de 1500 paires de bases. Selon un autre mode de réalisation particulier, la première molécule d'ADN double-brin (1) a une longueur de 650 paires de bases alors que la deuxième molécule d'ADN (2) a une longueur de 1 350 paires de bases. Avantageusement, la longueur totale des molécules d'ADN double-brin (1) et (2) est 5 comprise entre 600 et 10 000 paires de bases, entre 1 000 et 10 000, ou entre 1300 et 3000 paires de bases. Selon un mode particulier de l'invention, la longueur totale des molécules d'ADN double-brin (1) et (2) est comprise entre 2 050 paires de bases et 3 000 paires de bases, avantageusement d'environ 2 050 ou d'environ 3 000 paires de bases (± 50 paires de bases). 10 Dans certains cas, l'ADN est sélectionné pour ne pas comprendre d'éléments qui pourraient interagir avec une ou plusieurs des molécules à tester. À titre d'exemple, lorsqu'une molécule à tester est une protéine susceptible d'interagir avec une molécule d'ADN double-brin ayant une séquence et/ou une structure particulière (e.g. MutS, Za), la molécule d'ADN double-brin selon l'invention ne comprend pas ces séquences et/ou 15 structures (e.g. absence de nnisnnatch, pas de structure de type Z-ADN) sauf sur le site conçu pour accueillir la deuxième molécule à tester (e.g. séquence avec un nnisnnatch, Z-ADN). La molécule d'ADN double-brin peut notamment comprendre une partie (e.g. 0,6, 1, 5, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ou 90 %) ou la totalité (100%) d'un génome d'ADN double-brin d'un virus de groupe I, tel qu'un génome d'un virus de l'ordre Caudovirales, Herpesvirales, ou 20 Ligamenvirales, plus particulièrement de la famille Siphoviridae. À titre d'exemple non- limitatif, la molécule d'ADN double-brin comprend une partie ou la totalité d'un génome d'ADN double-brin d'un bactériophage, tel que le phage lambda, le phage P1 de Mycoplasma, le phage c2 de Lactococcus phage c2, le phage F108 de Pasteurella, ou tout autre génome d'ADN double-brin de phage. À titre d'exemple non-limitatif, la longueur du génome 25 incorporé dans la molécule d'ADN double-brin selon l'invention peut être comprise environ 11 500 et environ 50 000 paires de bases (± 50 paires de bases). Lorsque la molécule d'ADN double-brin selon l'invention comprend un génome entier, ledit génome est avantageusement sous forme linéaire. Lorsqu'une molécule d'ADN double-brin est sous forme circulaire (e.g. un génome circulaire, un plasmide), elle est avantageusement linéarisée avant d'être incorporée 30 dans la molécule d'ADN double-brin selon l'invention. La molécule d'ADN double-brin selon l'invention peut être continue ou discontinue. Une molécule d'ADN est discontinue lorsqu'au moins une liaison phosphodiester liant deux nucléotides localisés l'un à côté de l'autre sur un seul brin est absente, ou lorsque la molécule d'ADN comprend une région d'ADN simple-brin. Dans certains cas, une molécule 35 d'ADN peut avoir un ou plusieurs sites de discontinuité sur les deux brins, à condition que les sites de discontinuité ne soient pas présents entre deux nucléotides appariés sur les deux brins. Cependant, dans la cadre de la présente invention, l'ADN double-brin de la première 18 molécule d'ADN double-brin (1) et/ou de la deuxième molécule d'ADN double-brin (2) est avantageusement continu. Selon un mode de réalisation préféré, la molécule d'ADN double-brin selon l'invention comprenant une première molécule d'ADN double-brin (1) reliée à une deuxième molécule d'ADN double-brin (2) par une liaison covalente qui n'est pas une liaison 5 phosphodiester est continue. En effet, la continuité de la molécule permet avantageusement de garantir les propriétés mécaniques de la molécule d'ADN double-brin, dont sa longueur de persistance et sa capacité à être superenrouleé (- supercoiled »). Avantageusement, tout site de discontinuité dans la molécule d'ADN double-brin selon l'invention est fermé, par exemple par une ligase lors de la fabrication de ladite molécule 10 d'ADN double-brin, avant son utilisation. Avantageusement, la molécule d'ADN double-brin selon l'invention est parfaitement appariée. La molécule d'ADN double-brin selon l'invention comprend plus particulièrement au moins deux molécules d'ADN double-brin distinctes, appelés ici les molécules d'ADN double-brin (1) et (2), qui sont reliées l'une à l'autre par au moins une liaison covalente. 15 Par - liaison covalente » on entend ici une liaison chimique dans laquelle au moins une paire d'électrons est partagée entre deux atomes. De façon avantageuse, selon la présente invention, au moins une liaison covalente est formée entre un atome d'un premier groupe fonctionnel et un atome d'un deuxième groupe fonctionnel. À titre d'exemple non-limitatif, une liaison covalente peut être une ou plusieurs liaison(s) amide ou ester, ou un pont 20 disulfure. Le terme - la liaison covalente » inclut donc plusieurs types de liaisons covalentes. À titre d'exemple non-limitatif, ladite liaison covalente peut également comprendre d'autres éléments, tels qu'un ou plusieurs polymères, composés cycliques, ou particules, pouvant lier les deux sous-unités en formant une liaison covalente avec chaque sous-unité. Selon un mode de réalisation préféré, ladite au moins une liaison covalente n'est pas 25 une liaison phosphodiester. Une liaison phosphodiester est une liaison entre le carbone 3' d'un premier désoxyribose et le carbone 5' d'un deuxième désoxyribose par la formation d'une liaison phosphoester de chacun des carbones avec un groupe phosphate. Au sens de la présente invention, une liaison phosphodiester est plus particulièrement une liaison entre deux désoxyribonucléotides, tel que connu par l'homme de métier. À titre d'exemple non- 30 limitatif, une liaison covalente autre qu'une liaison phosphodiester peut être une liaison formée sur la base de la chimie click, telle qu'une liaison formée par la cycloaddition d'un azoture à une alcyne (voir, par exemple, Hein et al., 2008). Avantageusement, ladite liaison covalente reliant les deux molécules d'ADN double-brin (1) et (2) est formée par une réaction entre une fonction azoture et une fonction alcyne, entre une fonction azoture et une fonction 35 dibenzocyclooctyne (DBCO), entre une fonction tétrazine et une fonction transcyclooctène, entre une fonction thiol et une fonction alcyne, entre une fonction thiol et une fonction alcène, entre une fonction thiol et une fonction thiol (générant ainsi un pont disulfure), entre 19 une fonction thiol et une fonction nnaléinnide, entre une fonction amine et un acide activé (e.g. par des réactifs tels que le N-hydroxysuccininnide, le N,N'-dicyclohexylcarbodiinnide ou le 1-éthyl-3-(3-dinnéthylanninopropyl)carbodiinnide), entre une fonction hydroxyle et une fonction nnaléinnide, et/ou entre une fonction azoture et une fonction phosphine (réaction de 5 Staudinger). Dans certains cas, ladite première molécule d'ADN double-brin (1) est liée à ladite deuxième molécule d'ADN double-brin (2) par une longe. Par - longe » on entend au sens de la présente invention une troisième molécule distincte, qui est liée à la fois à la première (1) et à la deuxième (2) molécule d'ADN double-brin. De façon avantageuse, lorsque la molécule 10 d'ADN double-brin selon l'invention est utilisée pour caractériser des interactions moléculaires entre au moins deux molécules à tester, la longe permet de garder les deux molécules à tester à proximité l'une de l'autre après leur dissociation. Lorsque les deux molécules d'ADN double-brin (1) et (2) sont liées par une longe, ladite longe peut être liée à chaque molécule d'ADN par au moins une liaison covalente qui 15 n'est pas une liaison phosphodiester. Ainsi, la molécule d'ADN double-brin selon l'invention comprend avantageusement au moins deux liaisons covalentes qui ne sont pas des liaisons phosphodiesters (voir, par exemple, la Figure 1). De façon alternative, ladite longe peut être composée de plusieurs molécules distinctes, qui sont elles-mêmes avantageusement reliées les unes aux autres par des liaisons covalentes qui ne sont pas des liaisons phosphodiesters. 20 Selon un mode de réalisation préféré, ladite première molécule d'ADN double-brin (1) est donc liée à ladite deuxième molécule d'ADN double-brin (2) par une longe. La longe peut être composée de tout type de matière et/ou comprendre tout type de molécule, tels que des polypeptides, des polynucléotides, tels que l'ADN double-brin, et/ou des polymères. À titre d'exemple non-limitatif, la longe est un polymère composé d'au moins 25 50%, 60%, 70% de désoxyribonucléotides, avantageusement au moins 75%, 80%, 85%, plus avantageusement au moins 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, encore plus avantageusement au moins 99% de désoxyribonucléotides. Avantageusement, la longe est un polymère composé entièrement (i.e. 100%) de désoxyribonucléotides. Lorsque la longe comprend de l'ADN double-brin, ledit ADN double-brin peut comprendre n'importe quelle caractéristique telle 30 que détaillée ci-dessus. À titre d'exemple, la longe d'ADN double-brin est continue. Lorsque la longe est une molécule d'acide nucléique double-brin (e.g. une molécule d'ADN ou d'ARN double-brin), elle comprend elle-même des liaisons phosphodiesters. Toutefois, comme indiqué ci-dessus, l'au moins une liaison covalente entre la longe et ladite première ou deuxième molécule d'ADN double-brin (1) ou (2) n'est pas une liaison phosphodiester. Dans 35 certains cas, ladite longe peut elle-même comprendre des liaisons covalentes (e.g. du - crosslinking » entre les deux brins d'une molécule ADN double-brin, lorsque la longe est un 20 polymère d'ADN double-brin). Ceci est notamment avantageux lorsque des forces supérieures à 70 pN seront appliquées à la molécule d'ADN double-brin. Selon un mode de réalisation préféré, la longe est une molécule d'ADN double-brin. De façon avantageuse, la structure double hélice d'une longe d'ADN double-brin est 5 uniquement présente sous forme linéaire. La longe ne peut donc se replier en aucune structure tertiaire. De plus, lorsque la longe est une molécule d'ADN double-brin, elle est stable et est donc peu encline à interagir avec l'une ou plusieurs des molécules à tester. La longueur de la longe est également avantageusement facilement ajustable. L'utilisation d'une longe d'ADN double-brin est aussi avantageuse car des molécules 10 d'ADN double-brin ont une longueur de persistance d'environ 50 nnn dans des conditions de laboratoire usuelles. Par longueur de persistance » on entend une propriété mécanique permettant de caractériser la rigidité d'un polymère linéaire (Doi, 1996, et Bouchiat et al., 1999). Il s'agit plus particulièrement de la longueur typique sur laquelle un polymère linéaire peut rester aligné malgré les déformations dues à l'agitation thermique. 15 Avec une telle longueur de persistance, une variation de longueur de la longe se traduit en une variation conséquente de la distance moyenne entre les jonctions avec les molécules d'ADN double-brin (1) et (2), ce qui permet d'ajuster la concentration effective en molécules à tester, Ceff. À titre d'exemple, avec une molécule d'ADN double-brin selon l'invention comprenant une longe en ADN double-brin d'environ 50 000 paires de bases, la Ceff est de 20 l'ordre des nM. Ceci veut dire qu'il est possible de mesurer les temps caractéristiques d'association, TA, pour des réactions dont les constantes cinétiques d'association entre molécules à tester sont aussi grandes que 3x109 m-1--1 , par exemple, avec une acquisition vidéo fonctionnant à quelques dizaines de Hz (e.g. 10 à 30 Hz). La longueur de persistance de la longe en ADN double-brin permet en outre, lorsque la 25 molécule d'ADN double-brin est utilisée pour mesurer des interactions entre au moins deux molécules à tester, de sonder la dépendance du temps de vie d'un complexe moléculaire (e.g. entre deux molécules à tester) en fonction de la force physique. En effet la molécule d'ADN double-brin s'étire facilement, ce qui permet de mesurer la différence d'extension entre les conformations associées et dissociée de molécules à tester lorsque des forces 30 faibles, en dessous d'environ 2 pN, sont appliquées. De façon avantageuse, il est possible de mesurer la différence d'extension entre les conformations associées et dissociée de molécules à tester lorsque des forces aussi faibles que 0,1 pN sont appliquées (par exemple avec une longe d'environ 700 pb). En revanche pour parvenir au même résultat avec des molécules ayant une longueur de persistance plus petite (e.g. des molécules d'ADN simple-brin, de 35 polypeptide), il faut appliquer des forces plus importantes pour étendre significativement la longe dans l'état dissocié, et donc avoir une chance de pouvoir le distinguer de l'état associé. 21 Ceci empêche donc toute étude utilisant des forces en dessous de l'ordre de quelques pN avec ces molécules. La longueur de la longe est un paramètre important dans la mesure d'interactions entre des molécules et elle peut varier selon les besoins expérimentaux (i.e. selon le but de 5 l'expérience, selon les longueurs des molécules d'ADN double-brin (1) et (2) et/ou les molécules à tester). Une longe trop courte (e.g. inférieure à 300 pb) peut notamment faire qu'une interaction qui vient de se terminer entre deux molécules à tester se reforme si rapidement qu'il n'est pas possible de la distinguer de la précédente. A l'inverse, une augmentation de la longueur de la longe réduit la fréquence à laquelle les interactions entre 10 des molécules à tester sont observées. Ceci peut être utile pour l'étude des réactions où l'association se fait très rapidement, mais peut être rédhibitoire pour l'étude des réactions où l'association se fait lentement. La longueur appropriée de la longe peut être déterminée par l'homme du métier en fonction des besoins expérimentaux, notamment en tenant compte des aspects détaillés ci-dessus. À titre d'exemple, dans le cadre de la présente invention, la 15 longe peut avoir une longueur d'environ 300 à environ 50 000 paires de bases (± 50 paires de bases). De façon préférée, la longe d'ADN double-brin a une longueur d'environ 300 à environ 50 000 paires de bases, avantageusement d'environ 500 à 10 000 paires de bases, avantageusement de 1 000 à 10 000 paires de bases, de 600 à 3 000 paires de bases (± 50 20 paires de bases), plus avantageusement de 600 à 1 000 paires de bases, encore plus avantageusement d'environ 700 paires de bases (± 50 paires de bases). La longe peut être attachée à la première molécule (1) et/ou à la deuxième molécule (2) d'ADN double-brin par un ou plusieurs liaisons covalentes qui ne sont pas des liaisons phosphodiesters. Avantageusement, au moins une liaison covalente non-phosphodiester est 25 formée entre un nucléotide de la longe comprenant un groupe fonctionnel et un nucléotide de la première molécule (1) et/ou de la deuxième molécule (2), comprenant un autre groupe fonctionnel. À titre d'exemple non-limitatif, la première molécule d'ADN double-brin (1) peut comprendre une fonction azoture qui réagit avec une fonction DBCO présente sur la longe par la technique de chimie click, formant ainsi une liaison covalente non-phosphodiester entre les 30 deux molécules. La longe peut être attachée aux molécules d'ADN double-brin (1) et (2) par ses deux extrémités, respectivement, ou par des nucléotides localisés dans la région intermédiaire de la longe. Par - région intermédiaire » on entend au sens de la présente invention un segment d'une molécule qui est localisé entre les deux extrémités de ladite molécule. De telles 35 régions intermédiaires sont notamment schématisées pour les molécules d'ADN (1) et (2), à titre d'exemple, dans la Figure 1 (segments en gris foncé). 22 Par - extrémité » on entend, au sens de la présente invention, les 30 à 150 paires de bases localisées à l'extrémité d'une molécule (e.g. de la longe, de la première molécule d'ADN double-brin (1), de la deuxième molécule d'ADN double-brin (2), avantageusement les 30 à 50 paires de bases localisées à l'extrémité d'une molécule. De telles extrémités sont 5 notamment schématisées pour les molécules d'ADN (1) et (2), à titre d'exemple, dans la Figure 1 (segments en gris clair). Ainsi, à titre d'exemple, une longe, (ou la première ou deuxième molécule d'ADN double-brin (1) ou (2)), comprenant 1 000 paires de bases, comprend deux extrémités, une première extrémité correspondante aux paires de bases 1 à 150 et une deuxième extrémité correspondant aux paires de bases 850 à 1 000. Dans le 10 présent contexte, les termes première extrémité et deuxième extrémité ne doivent pas être interprétés comme correspondant à des extrémités spécifiques de la longe, mais permettre simplement de différencier une extrémité de la longe de l'autre. Ainsi, il n'a y pas de notion de direction ou d'orientation associée auxdites première et deuxième extrémités. L'homme de métier saura facilement identifier les extrémités d'une molécule d'ADN double-brin telle 15 qu'elle est définie ici. Une liaison entre une extrémité d'une longe et une molécule d'ADN double-brin (1) ou (2) peut donc avoir lieu à une ou plusieurs bases nucléotidiques d'une extrémité d'une longe. Avantageusement, au moins une base ultime d'une extrémité de la longe est attachée par une liaison covalente non-phosphodiester à la première ou deuxième molécule d'ADN double- 20 brin (1) ou (2). Ainsi, selon un mode de réalisation préféré, la longe est attachée par sa première extrémité à la première molécule d'ADN double-brin (1) et par sa deuxième extrémité à la deuxième molécule d'ADN double-brin (2), avantageusement par une base ultime de chaque extrémité de la longe. De façon avantageuse, la longe est attachée par au moins deux bases 25 nucléotidiques dans chaque extrémité à la première et la deuxième molécule d'ADN double- brin (1) et (2), respectivement, lesdites au moins deux bases nucléotidiques comprenant, de façon plus avantageuse, une base ultime à chaque extrémité de la longe. Selon un mode de réalisation alternatif, la longe peut être attachée à la première molécule d'ADN double-brin (1) et/ou à la première molécule d'ADN double-brin (2) par au 30 moins une base localisée dans la région intermédiaire de la longe, lesdites bases étant avantageusement séparés par au moins 300 paires de bases, plus avantageusement par au moins 500 paires de bases, encore plus avantageusement par au moins 600 paires de bases. À titre d'exemple non-limitatif, la longe peut être attachée à la première molécule d'ADN double-brin (1) par au moins une première base, ladite base étant localisée entre le point 35 central de la longe et sa première extrémité et/ou attachée à la deuxième molécule d'ADN double-brin (2) par au moins une deuxième base, ladite base étant localisée entre le point central de la longe et sa deuxième extrémité. Par - point central » on entend une localisation 23 qui est sensiblement équidistante entre la première et la deuxième extrémité de la molécule. Ceci est particulièrement avantageux lorsqu'au moins une extrémité de la longe comprend un autre élément de la molécule d'ADN double-brin selon l'invention (e.g. est liée à une autre molécule à tester). 5 Dans certains cas, le site de la liaison covalente entre la longe et la première molécule d'ADN double-brin (1) et/ou la deuxième molécule d'ADN double-brin (2) est localisé dans la région intermédiaire de ladite molécule d'ADN double-brin (1) ou (2), c'est-à-dire entre les deux extrémités de ladite molécule d'ADN (1) ou (2). À titre d'exemple non-limitatif, une liaison covalente non-phosphodiester est formée entre une extrémité de la longe (ou tout 10 autre point de la longe qui sera approprié, tel que décrit ci-dessus), et un point central de ladite molécule d'ADN double-brin (1). La liaison covalente non-phosphodiester entre la longe et ladite première molécule d'ADN double-brin (1) forme ainsi une jonction avec trois embranchements (voir par exemple la Figure 1). Dans d'autres cas, une liaison covalente entre la longe et la première molécule d'ADN 15 double-brin (1) et/ou la deuxième molécule d'ADN double-brin (2) peut être localisée dans une extrémité de ladite molécule d'ADN double-brin (1) ou (2), ou à une base nucléotidique, qui permet de distinguer l'extrémité de la molécule d'ADN double-brin (1) ou (2) de sa région intermédiaire (voir, par exemple, la Figure 1). Dans le contexte de la présente invention, aucune liaison covalente n'est avantageusement formée entre une base ultime de la molécule 20 d'ADN (1) ou (2) et une base quelconque de la longe. Ainsi, selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la longe est attachée à la première molécule d'ADN double-brin (1) par une première liaison covalente entre la première extrémité de ladite longe et une région intermédiaire de la première molécule d'ADN double-brin (1) et à la deuxième molécule d'ADN double-brin (2) par une deuxième 25 liaison covalente entre la deuxième extrémité de ladite longe et une région intermédiaire de la deuxième molécule d'ADN double-brin (2). Les extrémités des molécules d'ADN double-brin (1) et (2) n'étant pas attachées à la longe, elles restent avantageusement disponibles pour d'autres finalités (e.g. pour d'autres interactions). À titre d'exempte, tes deux extrémités de ta première molécule d'ADN double- 30 brin (1) ou de la deuxième molécule d'ADN double-brin (2) peuvent notamment être liées respectivement à une molécule à tester et à un support. De façon avantageuse, une première extrémité de ladite première molécule d'ADN double-brin (1) est liée à une première molécule à tester et une première extrémité de la ladite deuxième molécule d'ADN double-brin (2) est liée à une deuxième molécule à tester. 35 La molécule à tester peut être liée de façon directe ou indirecte à l'extrémité. La liaison d'une première ou d'une deuxième molécule à tester à une première extrémité de la première ou de la deuxième molécule d'ADN double-brin (1) ou (2) est avantageuse car elle 24 permet d'éloigner les molécules à tester de la longe et du reste de la molécule d'ADN double-brin (1) et/ou (2). Les molécules à tester sont notamment moins susceptibles de subir une gêne stérique et de voir les caractéristiques de leur interaction modifiées dans cette configuration. De plus, l'utilisation d'une molécule d'ADN double-brin selon l'invention 5 permet de laisser la longe et les molécules d'ADN double-brin (1) et (2) relativement libres de se réorienter dans l'espace indépendamment l'une de l'autre, de telle sorte que les molécules à tester ne se trouvent privées d'aucun degré de liberté de mouvement. Enfin, la liaison des molécules à tester aux extrémités des molécules d'ADN double-brin (1) et (2) permet également d'éloigner les molécules à tester des supports, ce qui diminue les 10 interactions non-spécifiques. Dans certains cas, une molécule à tester peut être liée de de façon directe ou indirecte à une base ultime d'une extrémité de la molécule d'ADN double-brin (1) ou (2). Lorsque la molécule à tester est liée de façon indirecte, elle est avantageusement liée par un - espaceur ». L'espaceur peut correspondre, par exemple, à une séquence de bases nucléotidiques double-brin ou simple-brin, à un polymère, un peptide, ou 15 une petite molécule, et peut être aisément sélectionné par l'homme de métier. L'addition d'espaceurs aux molécules d'ADN double-brin (1) et (2) peut être effectuée avec n'importe laquelle des méthodes couramment utilisées en biologie moléculaire. Selon une mode de réalisation préféré de l'invention, au moins une molécule à tester est liée de façon directe ou indirecte à une base ultime d'une extrémité d'une molécule 20 d'ADN double-brin donnée. Selon un autre mode de réalisation préféré, une molécule à tester est liée de façon indirecte à une base ultime d'une extrémité d'une molécule d'ADN (1) ou (2), avantageusement par un espaceur. Dans une configuration typique de l'invention, les deux molécules à tester sont liées de façon spécifique à la première et la deuxième molécule d'ADN à double-brin (1) et (2), 25 respectivement. A titre d'exemple, une extrémité de la première molécule d'ADN double-brin (1) et une extrémité de la deuxième molécule d'ADN double-brin (2) sont digérées avec une ou plusieurs nucléases, par exemple l'enzyme Nb.Bbv0, afin de générer deux bouts cohésifs différents (voir aussi la Figure 5A). Des oligonucléotides synthétiques auxquelles des molécules à tester ont été liées, peuvent ensuite être hybridées et ligaturées de façon 30 spécifique aux extrémités par des bouts cohésifs complémentaires (voir aussi la Figure 5B). De façon alternatif, chaque molécule à tester peut être liée de façon spécifique à une extrémité de la molécule d'ADN double-brin (1) ou (2) par une liaison covalente, par exemple une liaison covalente non-phosphodiester, selon les méthodes décrites ici, par exemple par la technique de chimie click. 35 À titre d'exemple non-limitatif, au moins une des molécules à tester, telle que ladite première et/ou ladite deuxième molécule à tester, est sélectionnée dans le groupe composé des molécules suivantes : polymères, acides aminés, peptides, polypeptides, protéines, 25 nucléosides, nucléotides, polynucléotides, oligonucléotides, sucres, polysaccharides, petites molécules, drogues, aptannères, antigènes, anticorps, lipides, lectines, hormones, vitamines, virus, fragments de virus, nanoparticules, molécules cellulaires de surface, et facteurs de transcription, ou des analogues ou peptidonninnétiques de l'une de celles-ci. Dans certains 5 cas, la première et la deuxième molécule à tester sont de même nature (e.g. deux protéines, deux polymères, deux molécules d'ADN double-brin, etc.), voire sont identiques (e.g. deux sous-unités d'une protéine, deux protéines formant un honnodinnère telles que des fragments de cadhérines). Dans d'autres cas, la première molécule à tester est de nature différente de la deuxième molécule à tester (e.g. antigène/anticorps, virus/récepteur, facteur de 10 transcription/ADN, protéine-petite molécule, etc.). Lorsque au moins une des molécules à tester est une molécule d'ADN double-brin, ladite molécule est avantageusement liée directement à l'extrémité d'une des molécules d'ADN (1) ou (2). Dans certains cas, une ou plusieurs autres molécules à tester peut être liées à la molécule d'ADN double-brin selon l'invention. Avantageusement, l'une ou plusieurs autres 15 molécules à tester peut également être choisie dans le groupe de molécules ci-dessus. À titre d'exemple, une troisième molécule à tester peut être liée à une extrémité d'une molécule d'ADN double-brin (3) ou à une extrémité de la longe lorsque celle-ci est libre. Dans certains cas, au moins une autre molécule à tester peut être mise en contact avec la molécule d'ADN double-brin selon l'invention comprenant au moins deux molécules à tester, par exemple 20 dans une suspension aqueuse. À titre d'exemple non-limitatif, ladite troisième molécule peut être un cofacteur de la première et/ou de la deuxième molécule à tester. Selon un mode préférentiel de l'invention, ladite première et/ou ladite deuxième molécule à tester est sélectionnée dans le groupe composé des molécules suivantes : polymères, acides aminés, peptides, polypeptides, protéines, nucléosides, nucléotides, 25 polynucléotides, oligonucléotides, sucres, polysaccharides, petites molécules, drogues, aptannères, antigènes, anticorps, lipides, lectines, hormones, vitamines, virus, fragments de virus, nanoparticules, molécules cellulaires de surface, et facteurs de transcription. Avantageusement, ladite première molécule à tester est de nature différente de ladite deuxième molécule à tester. Avantageusement, ladite première molécule à tester est de 30 même nature, voire est identique, à ladite deuxième molécule à tester. Dans une configuration typique de l'invention, la première et la deuxième molécule d'ADN à double-brin (1) et (2) peuvent être spécifiquement attachées à des supports. Par - support » on entend tout type de surface ou substrat solide, ladite support pouvant être avantageusement fonctionnalisée pour pouvoir réagir avec une extrémité fonctionnalisée de 35 la molécule d'ADN double-brin selon l'invention. À titre d'exemple non-limitatif, le support peut être une bille (e.g. des billes de silice, verre à pores contrôlés, billes magnétiques, billes de séparation bionnagnétiques telles que Dynabeadse, résine Wang, résine Merrifield, 26 résine copolystyrène chloronnéthylée - divinylbenzène (DVB), billes Sephadexe / Sepharosee, billes de cellulose, etc.), un support plat tel qu'un filtre en fibre de verre, une surface diélectrique (e.g. verre, silice, nitrure de silicium, alumine), une surface métallique (e.g. acier, or, argent, aluminium, et cuivre), une surface semi-conductrice (e.g. silicium, senni- 5 conducteur III-V, semi-conducteur II-VI), des matériaux plastiques, y compris plaques ou membranes nnultipuits (e.g. en polyéthylène, polypropylène, polyamide, polyfluorure de vinylidène), une aiguille, une nnicropipette, ou un cantilever utilisé en microscopie à force atomique. Une bille selon l'invention peut avoir n'importe quelle structure en trois dimensions et n'importe quelle taille. Avantageusement, la taille de la bille est comprise 10 entre 0,5 et 100 pnn en diamètre. Les supports sont avantageusement des substrats solides (par exemple une surface de verre telle qu'une lame de microscope, une nnicropipette, une nnicroparticule), qui peuvent être du même type (i.e. deux nnicroparticules) ou de type différent (e.g. une surface de verre et une nnicroparticule). De façon avantageuse, dans le cadre de la présente invention, lorsque 15 des molécules à tester sont liées aux premières extrémités des première et deuxième molécules d'ADN (1) et (2), la deuxième extrémité de ladite première molécule d'ADN double-brin (1) est liée à un premier support et la deuxième extrémité de la ladite deuxième molécule d'ADN double-brin (2) est liée à un deuxième support. De façon avantageuse, au moins un des deux supports est une bille telle qu'une 20 nnicrobille, une nnicroparticule, une surface en verre, une nnicropipette, ou un cantilever utilisé en microscopie à force atomique. Afin d'attacher des molécules d'ADN double-brin à des supports, on peut utiliser l'une quelconque des techniques connues dans le domaine. À titre d'exemple, l'ADN peut être lié directement sur un support, par exemple une nnicrobille, ce qui implique une 25 fonctionnalisation de ce support, par exemple en l'enrobant de streptavidine, d'un polymère portant des groupes COOH, etc., capable de réagir avec une extrémité fonctionnalisée de l'ADN double-brin. De telles méthodes nécessitent en général de fonctionnaliser une molécule d'ADN double-brin, notamment à l'une de ses extrémités, c'est-à-dire de greffer au moins un groupe 30 fonctionnel approprié sur celle-ci. À cette fin, différentes procédures peuvent être adoptées. Dans le cadre de la présente invention, le plus simple est de fonctionnaliser, à l'aide d'oligonucléotides synthétiques, une extrémité de la première molécule d'ADN double-brin (1) avec un groupe fonctionnel et une extrémité de la deuxième molécule d'ADN double-brin (2) avec un groupe fonctionnel. De façon avantageuse, dans le cadre de la présente invention, 35 l'extrémité de la première molécule d'ADN (1) est fonctionnalisée avec un premier groupe fonctionnel et la deuxième molécule d'ADN (2) est fonctionnalisée avec un deuxième groupe fonctionnel, ce qui permet d'attacher une extrémité sur chacune des deux supports qui ont 27 été prétraitées de façon différente (e.g. une première extrémité fonctionnalisée avec la biotine s'attache à un support recouvert de streptavidine alors que une deuxième extrémité, fonctionnalisée avec un group amine, s'attache à un support recouvert d'un polymère portant des groupes COOH, respectivement). 5 L'avantage de cette méthode réside dans sa capacité à fonctionnaliser tout type de molécule d'ADN double-brin ayant n'importe quelle longueur en conservant les mêmes réactifs. Dans ce cas, les deux extrémités des molécules d'ADN double-brin (1) et (2) destinées à être attachées à des supports sont clivées en utilisant par exemple deux enzymes de restriction (ou plus), ce qui permet d'obtenir une première molécule d'ADN ayant un 10 premier site de restriction à l'une de ses extrémités et une deuxième molécule d'ADN ayant un deuxième site de restriction à l'une de ses extrémités. Ceci permet de traiter les deux extrémités différemment. Dans certains cas, il peut être avantageux d'ajouter un - espaceur » à la suite duquel on ajoute un groupe fonctionnel à une extrémité de la première molécule d'ADN double-brin 15 (1) et/ou à une extrémité de la deuxième molécule d'ADN double-brin (2) ; les deux séquences espaceur donnant ainsi à chaque groupe fonctionnel de l'espace supplémentaire pour se lier à son support dédié. L'espaceur peut correspondre à une séquence de bases nucléotidiques double-brin ou simple-brin, un polymère, un peptide, ou une petite molécule, tel que décrit ci-dessus. L'espaceur comprend avantageusement au moins un groupe 20 fonctionnel. L'addition d'espaceurs aux molécules d'ADN double-brin (1) et (2) peut être effectuée avec n'importe laquelle des méthodes couramment utilisées en biologie moléculaire. Ces méthodes sont bien connues de l'homme du métier et il n'y a donc pas lieu de les détailler ici. En ce qui concerne les techniques d'attachement elles-mêmes, elles sont nombreuses 25 et elles dérivent des techniques d'attachement de macromolécules (protéines, ADN, etc.) à des supports prétraités qui sont disponibles dans le commerce ou facilement réalisable en laboratoire. La plupart de ces techniques ont été développées pour des tests d'immunologie, et relient des protéines (immunoglobulines) à des supports portant des groupes (-COOH, -NH2, -OH, etc.) capables de réagir avec le carboxyle (-COOH) ou les extrémités amine (-NH2) des 30 protéines. L'attachement de la molécule d'ADN double-brin selon l'invention à un support peut être réalisé directement, via le phosphate libre de l'extrémité 5' de la molécule, qui réagit avec une amine secondaire (surface Covalink -NH commercialisée par Polylabo à Strasbourg) pour former une liaison covalente. Il est également possible de fonctionnaliser l'ADN avec un 35 groupe amine puis de procéder comme avec une protéine. À titre d'exemple alternatif, une molécule ADN fonctionnalisée avec un group thiol (S-H) se lie de façon covalente à un support en or par la formation d'une liaison thiolate S-Au. 28 Il existe également des supports revêtus de streptavidine (e.g. billes de Dynal et similaires), qui permettent un attachement quasi-covalent entre la streptavidine et une molécule d'ADN biotinylée. Enfin, en greffant un anticorps dirigé contre la digoxigénine sur un support (par les méthodes mentionnées ci-dessus), une molécule d'ADN fonctionnalisée 5 par la digoxigénine peut y être attachée. Ceci représente simplement un exemple d'une des nombreuses techniques d'attachement possibles. Parmi les techniques de fixation et d'attachement, on citera par exemple les techniques décrites dans le brevet EP 152 886 utilisant un couplage enzymatique pour la fixation de l'ADN sur un support solide tel que la cellulose. Le brevet EP 146 815 décrit également diverses méthodes de fixation d'ADN à un 10 support. De même, la demande de brevet WO 92/16659 propose une méthode utilisant un polymère pour fixer l'ADN. Naturellement, une molécule d'ADN peut être fixée directement sur un support mais, le cas échéant, et notamment en vue de limiter l'influence des supports, la molécule d'ADN peut être fixée à la fin d'un bras inerte de nature peptidique ou autre (autrement dit, un espaceur), tel que par exemple cela est décrit dans le brevet EP 329 198. 15 Les deux molécules d'ADN double-brin (1) et (2) étant liées à des supports différents, elles peuvent être liées à leurs supports respectifs par des moyens différents. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, lesdites deuxièmes extrémités desdites première et deuxième molécules d'ADN double-brin (1) et (2) sont attachées auxdits premier et deuxième supports de façon directe ou indirecte. De façon avantageuse, au moins 20 un des deux supports est un support mobile, avantageusement une bille, plus avantageusement une bille magnétique. De façon avantageuse, lesdites deuxièmes extrémités desdites première et deuxième molécules d'ADN double-brin (1) et (2) sont attachées auxdits premier et deuxième supports à un seul point ou à plusieurs points. De façon avantageuse, lesdites deuxièmes extrémités desdites première et deuxième molécules d'ADN double-brin 25 (1) et (2) sont attachées au premier et au deuxième supports respectivement par une base nucléotidique, ladite base étant avantageusement fonctionnalisée. De façon avantageuse, ladite deuxième extrémité desdites première et deuxième molécules d'ADN double-brin (1) et (2) sont attachées par au moins deux bases nucléotidiques, lesdites bases étant plus avantageusement fonctionnalisées. 30 Selon un aspect particulier de l'invention, la molécule d'ADN double-brin selon l'invention comprend deux molécules à tester. Cependant, selon la configuration de la molécule (i.e. selon le nombre d'extrémités dans les différentes molécules d'ADN et/ou la longe comprise dans la molécule d'ADN double-brin selon l'invention, ladite molécule peut comprendre au moins trois, quatre, cinq, ou six molécules à tester. Lesdites molécules à 35 tester pourraient notamment être liées aux extrémités de la longe ou à d'autres molécules d'ADN double-brin (e.g. une troisième molécule d'ADN double-brin (3), une quatrième molécule d'ADN double-brin (4), etc.). De préférence, lorsque la molécule d'ADN double-brin 29 selon l'invention comprend au moins trois molécules d'ADN double-brin, lesdites molécules sont également attachées à la longe, avantageusement à des bases différentes. L'invention a pour autre objet la molécule d'ADN double-brin telle que décrite ici, pour une utilisation dans la détection et/ou la caractérisation des interactions entre au moins 5 deux molécules à tester, avantageusement la détermination des propriétés thermodynamiques et/ou cinétiques de ces interactions. À titre d'exemple non-limitatif, la caractérisation de l'interaction comprend la détermination d'au moins une des caractéristiques choisies parmi : le temps caractéristique d'association, le temps caractéristique de dissociation, la constante de vitesse de dissociation, l'énergie d'activation 10 de dissociation, la distance séparant l'état de transition du complexe lors de la dissociation, et la constante d'équilibre de dissociation. Ainsi, selon un mode préféré, la molécule d'ADN double-brin est utilisée pour la caractérisation d'au moins une interaction moléculaire, avantageusement choisi parmi les caractéristiques décrites ci-dessus, entre au moins deux molécules à tester. 15 DISPOSITIF L'invention a pour autre objet un dispositif comprenant la molécule d'ADN double-brin telle que décrite ici avec ses supports. Un exemple d'un tel dispositif est notamment illustré dans la Figure 2. Avantageusement, le dispositif selon l'invention est utilisé pour détecter et/ou mesurer des interactions, avantageusement pour mesurer des propriétés 20 thermodynamiques et/ou cinétiques, entre au moins deux molécules à tester, telles que celles décrites ci-dessus. Alors que la caractérisation d'une interaction s'effectue à l'échelle d'une molécule unique, il est possible de mesurer des interactions individuelles de façon simultanée, au sein d'au moins deux molécules d'ADN double-brin différents. Une méthode de détection ayant un 25 niveau de résolution suffisamment élevée pour distinguer entre les interactions ayant lieu au sein des différentes molécules d'ADN double-brin peut notamment être utilisée. Afin de mesurer plusieurs (e.g. au moins deux) interactions individuelles de façon simultanée, plusieurs molécules d'ADN double-brin peuvent être liées à un même support. La distribution des molécules d'ADN double-brin peut être faite de façon régulière, par exemple, sur un 30 support de type réseau ou puce, ou de façon aléatoire, de préférence à une densité permettant de pouvoir mesurer les interactions au sein de chaque molécule d'ADN double-brin séparément. Dans certains cas, il peut être avantageux de séparer les molécules d'ADN double-brin au sein du dispositif (e.g. par une répartition dans des puits individuels). Les molécules d'ADN double-brin peuvent être liées à un même support fixe et à un même 35 support mobile (e.g. un système nnulticantilevers, comprenant par exemple une surface de verre en tant que support fixe et un réseau de cantilevers nnicrofabriqués sur un même 30 substrat en tant que support mobile). De façon alternative, les molécules d'ADN double-brin peuvent être liées à un même support fixe et à différents supports mobiles (e.g. des pinces magnétiques, comprenant par exemple une surface de verre en tant que support fixe et des billes en tant que supports mobiles, chaque molécule d'ADN double-brin étant liée à une bille 5 différente). De façon alternative, les molécules d'ADN double-brin peuvent être liées à différents supports fixes et à différents supports mobiles (e.g. des pinces optiques nnultiplexées, comprenant par exemple des billes en tant que supports fixes et en tant que supports mobiles, chaque molécule d'ADN double-brin étant liée à un couple de billes différent). 10 Dans une configuration typique, la molécule d'ADN double-brin selon l'invention est attachée de manière spécifique entre deux supports solides, l'une des extrémités de la première molécule d'ADN double-brin (1) pouvant être fixée directement ou indirectement à un support, tandis que l'une des extrémités de la deuxième molécule d'ADN double-brin (2) est attachée directement ou indirectement à un support mobile. L'une des extrémités de la 15 première molécule d'ADN double-brin (1) peut plus particulièrement être fixée directement ou indirectement à un support fixe ou mobile. Ledit dispositif selon l'invention comprend avantageusement au moins deux molécules d'ADN double-brin selon l'invention, lesdites molécules étant liées aux supports, les différentes molécules d'ADN double brin pouvant être liées aux mêmes supports et/ou à des 20 supports différents. Avantageusement, lors de la liaison des molécules d'ADN double-brin aux supports, lesdites molécules sont liées à une densité permettant à chaque molécule individuelle d'être résolue individuellement, avantageusement dans laquelle chaque molécule individuelle est ou peut devenir adressable spatialennent. Comme l'extension des au moins deux molécules d'ADN double-brin peut être mesurée 25 de façon simultanée mais indépendante, les molécules à tester et donc les interactions moléculaires à caractériser dans les au moins deux molécules d'ADN double-brin peuvent être différentes. La caractérisation de différentes interactions est particulièrement avantageuse lorsqu'un grand nombre de molécules à tester doivent être évaluées, par exemple lors d'un criblage destiné à identifier une molécule interagissant avec un récepteur particulier ou 30 modulant l'interaction entre deux protéines. À titre d'exemple, différentes molécules à tester peuvent être liées à l'une des molécules d'ADN (1) ou (2) ou introduites en solution aqueuse pour caractériser les interactions entre ladite molécule et le(s) molécule(s) à tester liée(s) à la molécule d'ADN double-brin. Dans certains cas, il est possible qu'aucune interaction moléculaire ne soit détectée entre les molécules à tester. 35 Dans certains cas, la molécule d'ADN selon l'invention, ainsi que le dispositif comprenant ladite molécule et ses supports, peuvent être utilisées dans le contexte d'études à haut-débit, par exemple, lors d'un criblage pharmaceutique pour la recherche de nouvelles 31 molécules ayant des caractéristiques d'interaction particulières avec une molécule particulière (e.g. un récepteur, un complexe protéique). En effet, il est connu que différentes drogues peuvent interagir avec un même récepteur avec des cinétiques différentes, engendrant des effets différents. Il est aussi connu que différentes drogues 5 peuvent interagir avec des assemblées de protéines et en moduler la stabilité. Ainsi, l'utilisation du présent dispositif est très avantageuse pour la détermination de différentes caractéristiques cinétiques et/ou thermodynamiques. De façon alternative, une même interaction moléculaire peut être caractérisée en parallèle pour chaque molécule d'ADN, lorsque celles-ci comprennent les mêmes molécules à 10 tester. Ceci permet notamment de nnoyenner les mesures, et ainsi d'avantageusement d'améliorer la précision. Ceci permet aussi de s'assurer de la reproductibilité des mesures. Lorsque les au moins deux molécules d'ADN double-brin comprennent les mêmes molécules à tester, elles sont avantageusement liées aux deux supports selon une même orientation (e.g. la première molécule à tester est liée à la première molécule d'ADN double-brin (1), lui- 15 même liée à un premier support pour chaque la molécule d'ADN double-brin). MOLECULE D'ADN « INTERMEDIAIRE » Un autre aspect de l'invention concerne une molécule - intermédiaire » à partir de laquelle la molécule d'ADN double-brin selon l'invention peut être obtenue. L'invention a donc pour autre objet une molécule d'ADN double-brin comprenant une première molécule 20 d'ADN double-brin (A) et une deuxième molécule d'ADN double-brin (B), ladite molécule d'ADN double-brin (A) comprenant un site de clivage qui est présent uniquement dans ladite molécule d'ADN double-brin (A), ladite molécule d'ADN double-brin (A) étant reliée à la molécule d'ADN double-brin (B) par deux liaisons covalentes qui ne sont pas des liaisons phosphodiesters, de part et d'autre dudit site de clivage. Des exemples d'un telle molécule 25 - intermédiaire » sont notamment illustrés dans la Figure 3. Avantageusement, lesdites premières extrémités des molécules d'ADN double-brin (1) et (2) sont différentes des deuxièmes extrémités des molécules d'ADN double-brin (1) et (2). Par première et deuxième extrémité, on fait référence aux deux extrémités différentes au sein de la molécule d'ADN double-brin (1) ou (2). Cependant, les termes première et 30 deuxième extrémité ne doivent pas être interprétés comme correspondant à des extrémités spécifiques, mais permettre simplement de différencier une extrémité d'une molécule de l'autre extrémité. Ainsi, il n'a y pas de notion de direction ou d'orientation associée auxdites première et deuxième extrémités. Avantageusement, les quatre extrémités de la molécule d'ADN double-brin (e.g., les 35 deux extrémités de la molécule d'ADN double-brin (1) et les deux extrémités de la molécule d'ADN double-brin (2)) sont différentes. 32 La molécule d'ADN double-brin (A) a avantageusement une longueur comprise entre environ 600 et 10 000 paires de bases, avantageusement entre environ 1 000 et 4 000 paires de bases, avantageusement entre environ 1 500 et 3 000 paires de bases (± 50 paires de bases). La molécule d'ADN double-brin (B) a avantageusement une longueur comprise entre 5 environ 300 à environ 50 000 paires de bases, avantageusement choisi selon le but de l'expérience et les molécules à tester d'environ 500 à 10 000 paires de bases, avantageusement de 600 à 3 000 paires de bases, plus avantageusement de 600 à 1 000 paires de bases, encore plus avantageusement d'environ 700 paires de bases (± 50 paires de bases). Par - site de clivage » on entend au sens de la présente invention une structure ou 10 séquence polynucléotidique qui est capable d'être clivée de façon spécifique par un agent de clivage, tel qu'une enzyme de restriction, une nucléase, une nickase, un ribozyme, une DNAzynne, et des fragments de celles-ci. À titre d'exemple non-limitatif, le site de clivage peut donc être un site d'enzyme de restriction, un site de ribozyme, un site de nickase, un site de DNAzynne ou un site de clivage de nucléase. De tels agents et de tels sites sont bien 15 connus par l'homme de métier. Par - enzyme de restriction » on entend plus particulièrement une enzyme qui coupe l'ADN double-brin au niveau ou à proximité d'une séquence nucléotidique spécifique. Les spécificités de nombreuses enzymes de restriction sont bien connues dans l'art et un grand nombre d'enzymes de restriction sont disponibles dans le commerce et leurs conditions de réaction, la nécessité de la présence de cofacteurs 20 et autres exigences établies par les fournisseurs d'enzymes sont bien connues. À titre d'exemple non-limitatif, l'enzyme de restriction peut être une enzyme de restriction de type Il, de type III ou artificielle (telle qu'une nucléase à doigts de zinc, une nucléase effectrice de type activateur de transcription (TALEN), une nnéga-nucléase, ou une endonucléase de type CRISPR), encore plus préférablement une enzyme de restriction de type II. Les enzymes de 25 restriction de type II comprennent les catégories IIP, IIS, IIC, IIT, IIG, 11E, IIF, IIG, IIM et IIB, comme décrit par exemple dans Pingoud et Jeltsch, 2001. L'enzyme de restriction peut générer des bouts francs (i.e. les deux brins ayant le même longueur) ou des bouts cohésifs (un brin étant plus long que l'autre brin, généralement de quelques nucléotides). Selon un mode préféré de l'invention, le site de clivage dans la molécule d'ADN 30 double-brin (A) de la molécule d'ADN double-brin - intermédiaire » est un site d'enzyme de restriction, avantageusement un site d'enzyme de restriction de type II, plus avantageusement deux sites de restriction, encore plus avantageusement deux sites de restriction générant deux bouts différents (e.g. un bout franc et un bout cohésif, ou deux bouts cohésifs non-complémentaires). À titre d'exemple non-limitatif, le site de clivage peut 35 consister en un site de restriction de l'enzyme Sacl et un site de restriction de l'enzyme Xbal. Lorsque le site de clivage comprend au moins deux sites différents, lesdits sites peuvent être séparés l'un de l'autre, par exemple par au moins 1, au moins 2, au moins 3, au moins 4, au 33 moins 5, au moins 6, au moins 12, au moins 25, au moins 50, au moins 100, au moins 200, au moins 500, ou au moins 1000 paires de bases. De façon avantageuse, lesdits sites sont séparés par au moins 6 paires de bases (- Restriction Endonucleases Technical Guide », New England Biolabs). 5 PROCEDE DE FABRICATION DE LA MOLECULE D'ADN Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de fabrication d'une molécule d'ADN double-brin à partir d'une molécule d'ADN double-brin - intermédiaire ». L'invention a donc pour autre objet un procédé de fabrication caractérisé en ce qu'il comprend l'étape suivante : 10 a) le clivage de la molécule d'ADN double-brin (A) audit site de clivage, générant ainsi une molécule d'ADN double-brin comprenant une première molécule d'ADN double-brin (1) et une deuxième molécule d'ADN double-brin (2). L'étape de clivage peut être effectuée par des techniques bien connues de l'homme de métier, tel qu'une digestion double par deux enzymes de restriction de façon simultanée 15 ou séquentielle. Avantageusement, le clivage est effectué par au moins un agent de clivage telle que définie ci-dessus, plus avantageusement par au moins une enzyme de restriction telle que définie ci-dessus. Avantageusement le clivage est effectué par deux enzymes de restriction différentes permettant d'obtenir deux bouts cohésifs différents, avantageusement lesdits bouts cohésifs étant non-complémentaires. Avantageusement, les deux sites de clivage 20 sont séparés l'un de l'autre selon l'une des modes de réalisation décrit ci-dessus. Avantageusement, après l'étape a), au moins une étape supplémentaire peut être effectuée. Une telle étape pourrait comprendre, par exemple, une étape de fonctionnalisation d'une extrémité de la première et/ou de la deuxième molécule d'ADN double-brin (1) et (2), et/ou la liaison d'une molécule à tester à une extrémité de la 25 première et/ou de la deuxième molécule d'ADN double-brin (1) et (2). Avantageusement, le procédé de fabrication de la molécule d'ADN double-brin selon l'invention comprend, en outre après l'étape a), l'étape suivante : b) l'attachement d'au moins une base fonctionnalisée à une extrémité de ladite première molécule d'ADN double-brin (1) et l'attachement d'une autre base fonctionnelle à 30 une extrémité de ladite deuxième molécule d'ADN double-brin (2). Selon un premier mode de réalisation, les extrémités fonctionnalisées sont celles générées lors de l'étape a). Selon un deuxième mode de réalisation, les extrémités fonctionnalisées sont celles déjà présentes dans la molécule d'ADN double-brin (A) de la molécule d'ADN double-brin - intermédiaire » avant l'étape a). De façon avantageuse, 35 l'extrémité de la première molécule d'ADN double-brin (1) et l'extrémité de la deuxième molécule d'ADN double-brin (2) sont fonctionnalisées par deux fonctions différentes, de façon 34 à ce qu'elles puissent être liées à des supports différents. À titre d'exemple non-limitatif, une extrémité de la première molécule d'ADN double-brin (1) est fonctionnalisée par l'ajout d'au moins un groupe biotine alors qu'une extrémité de la deuxième molécule d'ADN double-brin (2) est fonctionnalisée par l'ajout d'au moins un groupe digoxigénine. Ainsi, l'extrémité 5 biotinylée peut se lier de façon quasi-covalente à une surface ou un support recouvert de streptavidine alors que l'extrémité fonctionnalisée par la digoxigénine peut se lier à une surface ou un support recouvert d'anticorps dirigé contre la digoxigénine. De façon préférée, l'extrémité de la première molécule d'ADN double-brin (1) et/ou l'extrémité de la deuxième molécule d'ADN double-brin (2) sont fonctionnalisés par l'ajout de plusieurs groupes afin 10 d'améliorer l'accrochage de l'extrémité au support. Selon un mode de réalisation particulier, le(s) groupe(s) fonctionnel(s) sont présent(s) dans une molécule d'ADN simple-brin ou double-brin qui est incorporée à l'extrémité de la première molécule d'ADN double-brin (1) et dans une autre molécule d'ADN simple-brin ou double-brin qui est incorporée à l'extrémité de la deuxième molécule d'ADN double-brin (2) en utilisant des techniques bien connues par 15 l'homme du métier (e.g. hybridation et ligation). À titre d'exemple non-limitatif, la Figure 4 illustre les étapes a) et b) telles que décrites ici. Selon un mode préférentiel de l'invention, ladite au moins une base fonctionnalisée est comprise dans une troisième (3) et/ou quatrième molécule d'ADN double-brin (4), ladite troisième molécule d'ADN double-brin (3) étant avantageusement liée à la deuxième 20 extrémité de ladite première molécule d'ADN double-brin (1), et ladite quatrième molécule d'ADN double-brin (4) étant avantageusement liée à la deuxième extrémité de la deuxième première molécule d'ADN double-brin (2). Avantageusement, ladite au moins une base fonctionnalisée de ladite molécule d'ADN (3) double-brin est fonctionnalisée par un groupe fonctionnel différent de ladite au moins une base fonctionnalisée de ladite molécule d'ADN 25 double-brin (4). Avantageusement, la molécule d'ADN double-brin (1), (2), (3) et/ou (4) a une longueur comprise entre 600 et 10 000 paires de bases, plus avantageusement entre 650 à 1500 paires de bases. Lorsqu'un fragment d'ADN simple-brin est présent à l'extrémité d'une des molécules 30 d'ADN double-brin (1) ou (2) après incorporation d'une molécule d'ADN fonctionnalisée, ledit fragment peut être avantageusement : 1) enlevé, par exemple par une enzyme ayant une activité exonucléase, ou 2) complété par l'ajout d'un deuxième fragment complémentaire, par exemple par l'activité d'une polyrnérase ADN (e.g. fragment Klenow, le polyrnérase T4, etc.) en présence 35 des dNTPs. Avantageusement, le procédé de fabrication de la molécule d'ADN double-brin selon l'invention comprend, en outre après l'étape a), l'étape suivante : 35 C) la liaison d'une première molécule à tester à une extrémité de la ladite première molécule d'ADN double-brin (1) et la liaison d'une deuxième molécule à tester à une extrémité de la ladite deuxième molécule d'ADN (2). À titre d'exemple non-limitatif, la Figure 5 illustre cette étape. 5 Avantageusement, la liaison selon l'étape c) comprend la liaison d'une cinquième (5) molécule d'ADN comprenant ladite première molécule à tester à ladite première extrémité de la première molécule d'ADN double-brin (1), et/ou la liaison d'une sixième (6) molécule d'ADN comprenant ladite deuxième molécule à tester à ladite première extrémité de la deuxième molécule d'ADN double-brin (2). 10 Ladite cinquième (5) molécule d'ADN et/ou sixième (6) molécule d'ADN comprenant une molécule à tester peut avantageusement être une molécule d'ADN double-brin comprenant une extrémité débordante ou un oligonucléotide. Dans ce cas, la liaison selon l'étape c) comprend avantageusement des étapes d'hybridation et de ligation afin de lier les molécules d'ADN ensemble. Toutefois, les molécules à tester peuvent être liées auxdites 15 extrémités des molécules d'ADN double-brin (1) et (2) selon n'importe quelle technique connue par l'homme de métier. L'étape c) peut être effectuée avant ou après l'étape b). Selon un autre mode de réalisation, une des étapes b) et c) est effectuée avec l'étape a) (i.e. en ajoutant les molécules à tester ou les groupes fonctionnels aux extrémités déjà présentes dans la 20 molécule d'ADN double-brin précurseur (A), et l'autre des étapes b) et c) est effectuée après l'étape a), lorsque les deux molécules d'ADN double-brin (1) et (2) ainsi que leurs deuxièmes extrémités sont générées. Ceci peut être avantageux lorsque la première extrémité de la molécule d'ADN double-brin (1) et/ou la première extrémité de la molécule d'ADN double-brin (2), comprise dans la molécule d'ADN précurseur double-brin (A) ont un bout identique 25 (i.e. une même bout cohésif ou franc) à au moins une des extrémités qui est formée par le clivage de la molécule d'ADN double-brin (A). Ceci permet avantageusement d'attacher chaque groupe fonctionnel et chaque molécule à tester à une extrémité particulière, tout en utilisant un nombre d'enzymes de restriction réduit. Avantageusement, avant l'étape c) les extrémités auxquelles seront fixées les molécules à tester sont clivées, plus avantageusement 30 par une enzyme de restriction, telle que décrite ci-dessus. Toutefois, cette étape n'est pas nécessaire lorsque les extrémités concernées ont déjà subi une étape de clivage auparavant (par exemple avant l'étape a) ou avant l'étape b)). De façon alternative, les molécules à tester peuvent être liées directement aux molécules d'ADN double-brin (1) et (2) à des bouts francs (par exemple selon la méthode de 35 ligation à bout franc). Cette technique est bien connue de l'homme du métier. À titre d'exemple non-limitatif, la ligation à bout franc comprend des étapes de déphosphorylation des extrémités des molécules d'ADN double-brin (1) et (2) et de phosphorylation de 36 l'extrémité libre des molécules d'ADN comprenant les molécules à tester avant de mettre les molécules en contact dans un tampon approprié et en présence d'une ligase. Avantageusement, l'attachement d'au moins une des molécules d'ADN fonctionnalisées à l'étape b) et/ou l'attachement d'au moins une des molécules à tester à 5 l'étape c) comprend des étapes d'hybridation et de ligation, avantageusement par hybridation de deux bouts cohésifs complémentaires (i.e. l'un étant présent sur la molécule d'ADN double-brin (1) ou (2) et l'autre étant présent sur une molécule d'ADN comprenant au moins une base fonctionnalisée ou une molécule à tester). À titre alternatif, l'attachement d'au moins une des molécules d'ADN fonctionnalisées à l'étape b) et/ou l'attachement d'au 10 moins une des molécules à tester à l'étape c) comprend une étape de conjugaison, avantageusement entre au moins deux groupes fonctionnels, plus avantageusement selon des méthodes de la chimie click. Dans le cas d'études d'interactions entre des molécules à tester qui sont des protéines, il est envisageable de faire appel à des réactions de marquage où des - protéines 15 étiquettes » sont fusionnées avec les molécules à tester et viennent réagir de façon spécifique avec des ligands se situant aux extrémités des molécules d'ADN (1) et/ou (2). De nombreux systèmes sont aujourd'hui commercialement disponibles, qui permettent autant de réactions orthogonales. Les adduits formés peuvent, par exemple, être covalents comme dans le cas de la fixation par la protéine SNAP-tag du ligand benzylguanine, par CLIP-tag de la 20 benzylcytosine, par HaloTag d'un groupe chloroalkane, ou par une combinaison d'au moins deux de celles-ci. De façon alternative, on pourrait avoir recours à la formation de complexes non-covalents comme ceux résultant de l'interaction entre la streptavidine et la biotine, entre un épitope et un antigène ou encore entre une cible protéique et son aptannère. Dans ces trois derniers cas, il serait avantageux que la connplexation soit suffisamment forte pour 25 conduire à la fonctionnalisation d'un nombre important des extrémités par les molécules à tester et pour qu'il n'y ait pas rupture à la traction. De façon avantageuse, l'utilisation des - protéines étiquettes » rend superflue l'étape de digestion des extrémités, illustré à la Figure 5A. Avantageusement, il n'y a plus à synthétiser de conjugués - oligonucléotide - molécule à tester », ce qui est assez long et qui 30 peut parfois être complexe à cause de de problématique liées à la purification et à la stabilité des espèces obtenues. Ainsi, de façon avantageuse, on se repose simplement sur l'expression et la purification de protéines de fusion. Avantageusement, lesdites premières extrémités des molécules d'ADN double-brin (1) et (2) sont différentes des deuxièmes extrémités des molécules d'ADN double-brin (1) et (2). 35 Avantageusement, le procédé de fabrication de la présente invention utilise des techniques de synthèse biochimiques, et non un assemblage de type - origami ». La structure de la molécule d'ADN double-brin selon l'invention peut être garantie à la base près, et est 37 donc de très haute qualité. En effet, les inventeurs ont notamment montré lors des études de surenroulennent, qu'aucune liaison phosphodiester n'est manquante sur les environ 3600 bases qui sont comprises dans la molécule d'ADN double-brin exemplifié dans l'Exemple 8 et la Figure 10. 5 PROCEDE DE FABRICATION - ETAPES SUPPLEMENTAIRES Le procédé de fabrication selon l'invention peut comprendre en outre une ou plusieurs étapes supplémentaires, telle qu'une ou plusieurs étapes de synthèse en amont de l'étape a), permettant avantageusement de générer la molécule d'ADN double-brin « intermédiaire », à partir de laquelle la molécule d'ADN double-brin selon l'invention peut être obtenue. À titre 10 d'exemple non-limitatif, le procédé de fabrication comprend en outre, en amont de l'étape a), les étapes suivantes : - la synthèse d'un oligonucléotide (1) comprenant une jonction obtenue par réaction d'un premier groupe fonctionnel présent sur l'extrémité d'un premier oligonucléotide avec un deuxième groupe fonctionnel présent sur l'un des 15 nucléotides intermédiaires d'un deuxième oligonucléotide ; - la synthèse d'un oligonucléotide (2) comprenant une jonction obtenue par réaction d'un premier groupe fonctionnel présent sur l'extrémité d'un troisième oligonucléotide avec un deuxième groupe fonctionnel présent à un point intermédiaire d'un quatrième oligonucléotide (voir aussi l'exemple 20 illustré à la Figure 6A) ; - la synthèse de ladite molécule d'ADN double-brin (A), ladite molécule d'ADN (A) comprenant l'oligonucléotide (1) à sa première extrémité et l'oligonucléotide (2) à sa deuxième extrémité (voir aussi l'exemple illustré à la Figure 6B) ; et 25 - l'attachement d'une longe, par la première et la deuxième extrémité de ladite longe, à la jonction de l'oligonucléotide (1) et de l'oligonucléotide (2), respectivement (voir aussi l'exemple illustré à la Figure 6C et 6D). Selon un premier mode de réalisation, l'étape de synthèse de la molécule d'ADN double-brin (A) est effectuée par PCR en utilisant les oligonucléotides (1) et (2) en tant 30 qu'amorces. Avantageusement, la molécule (A) est produite par PCR, avantageusement suivi par la digestion enzymatique de chacune de ses extrémités par une enzyme de restriction, avantageusement par deux enzymes de restriction différentes. Selon un deuxième mode de réalisation, l'étape de synthèse de la molécule d'ADN double-brin (A) comprend des étapes d'hybridation et de ligature de l'oligonucléotide (1) à la 35 première extrémité d'une molécule d'ADN double-brin, tel qu'un génome de phage, et de l'oligonucléotide (2) à la deuxième extrémité. Avantageusement, la molécule d'ADN double- 38 brin (A) comprend un surplomb à chacune de ses extrémités, avantageusement comprend deux surplombs différents. Avantageusement l'oligonucléotide (1) et l'oligonucléotide (2) comprennent des régions d'ADN complémentaires auxdits surplombs. Avantageusement, l'attachement de la molécule (B) comprend l'hybridation et la 5 ligature d'un cinquième oligonucléotide sur la jonction de l'oligonucléotide (1) et d'un sixième oligonucléotide sur la jonction de l'oligonucléotide (2), respectivement, afin de générer des surplombs sur chaque jonction (voir par exemple, Figure 6C). Avantageusement, la molécule d'ADN double-brin (B) est synthétisée par PCR, plus avantageusement suivi par la digestion enzymatique de chacune de ses extrémités par une 10 enzyme de restriction, encore plus avantageusement par deux enzymes de restriction différentes (voir par exemple, Figure 6C). La molécule d'ADN double-brin (A) et/ou la molécule d'ADN double-brin (B) a avantageusement au moins une des caractéristiques (e.g. longueur), telles que décrites ci-dessus. Avantageusement, l'invention a pour autre objet la molécule d'ADN double-brin 15 comprenant une première molécule d'ADN double-brin (A) et une deuxième molécule d'ADN double-brin (B), ladite molécule (A) comprenant un site de clivage qui est présent uniquement dans ladite molécule (A), ladite molécule (A) étant reliée à la molécule (B) par deux liaisons covalentes qui ne sont pas des liaisons phosphodiesters, de part et d'autre dudit site de clivage obtenu par le procédé décrit ci-dessus. 20 Avantageusement, la longueur de la première molécule d'ADN double-brin (1), de la deuxième molécule d'ADN (2), et de la longe peuvent être facilement ajustées lors de la fabrication de la molécule d'ADN double-brin selon le procédé de fabrication tel que décrit ici. Avantageusement, l'ajustement de la longueur de la longe permet de moduler la 25 concentration effective en molécules à tester (aussi appelé - Ceff >). Ceci est d'ailleurs d'autant plus facile que l'ADN double-brin a une grande longueur de persistance. La longueur de la longe peut notamment être déterminée en fonction de la longueur des molécules d'ADN double-brin (1) et (2), ou vice-versa, et selon la concentration effective des molécules à tester et/ou la résolution spatiotennporelle souhaitée. En effet, dans certains cas, une 30 réduction de la longueur totale de la molécule d'ADN double-brin selon l'invention d'un facteur numérique N, augmente la résolution spatiotennporelle de l'expérience d'environ le même facteur N, ledit facteur N étant avantageusement compris entre 1 et 6. Cependant, il peut être avantageuse de conserver une longueur de la longe d'au moins 300 pb. Il peut également être avantageux de conserver une longueur des molécules d'ADN double-brin (1) et 35 (2) d'au moins 100 pb afin d'éviter les interactions entre les supports et les molécules à tester. Pour des constructions comprenant déjà une longe très courte, (e.g. moins d'environ 39 300 paires de bases), la seule façon de réduire la longueur de la construction est de raccourcir la longueur des première et deuxième molécules d'ADN (1) et (2). PRO CEDE DE CARACTERISATION D'INTERACTIONS MOLECULAIRES L'invention a pour autre objet un procédé de détection et/ou de caractérisation d'au 5 moins une interaction moléculaire entre au moins deux molécules à tester, lesdites molécules à tester étant avantageusement liées à une molécule d'ADN double-brin selon l'invention. La caractéristique déterminée peut être, par exemple, de nature thermodynamique ou cinétique. À titre d'exemple, un temps caractéristique d'association, un temps caractéristique de dissociation, une constante de vitesse de dissociation, une énergie 10 d'activation de dissociation, une distance séparant l'état de transition du complexe lors de la dissociation, et/ou une constante d'équilibre de dissociation peut être déterminé. Plus particulièrement, l'invention a pour objet un procédé de caractérisation d'une interaction entre au moins deux molécules à tester, lesdites molécules à tester étant liées à une molécule d'ADN double-brin, ou à une molécule d'ADN double-brin telle que comprise 15 dans le dispositif de l'invention, comprenant : a) l'application d'une force physique basse, FLF, à la molécule d'ADN double-brin, qui permet aux molécules à tester de s'associer ; b) l'application d'une force physique haute, FHF, à la molécule d'ADN double-brin, qui permet de déterminer si les molécules à tester sont associées ou dissociées ; 20 et c) la détection d'un changement dans les propriétés conforrnationnelles de la molécule d'ADN comprenant : la détermination de l'extension zu entre la deuxième extrémité de la première molécule d'ADN double-brin (1) et la deuxième extrémité de la 25 deuxième molécule d'ADN double-brin (2) à l'étape a) ; la détermination des extensions ZHF-A et ZHF-D entre la deuxième extrémité de la première molécule d'ADN double-brin (1) et la deuxième extrémité de la deuxième molécule d'ADN double-brin (2), à l'étape b) ; et la comparaison des extensions ZLF, ZHF-A, et ZHF-D, en fonction du temps t. 30 Dans certains cas, les étapes a) à c) telles que décrites ci-dessus peuvent être répétées plusieurs fois, afin de suivre de multiples cycles de dissociation/association. La répétition des étapes est très avantageuse car elle permet d'augmenter le nombre de mesures et ainsi d'améliorer les statistiques et la fiabilité de la caractérisation, notamment en filtrant les résultats sur des critères de reproductibilité. Ainsi, selon un mode préférentiel, 35 les étapes a) à c) du procédé sont répétées plusieurs fois. Une force physique » ou force » selon l'invention correspond à toute influence qui fait subir à un objet un certain changement, que ce soit en ce qui concerne son mouvement, sa direction ou sa construction géométrique (e.g. sa conformation). Il apparaîtra clairement à l'homme du métier qu'une force selon l'invention est différente d'autres paramètres physiques 5 tels que, par exemple, la température (qui est une propriété directe de la matière plutôt qu'une influence exercée sur celle-ci). Les forces physiques selon l'invention comprennent des forces telles que la friction, la tension (aussi appelée force de traction »), la rotation, la force normale, la force de résistance d'un fluide, la force appliquée et la force élastique. De manière préférée, la force physique selon l'invention comprend une force de tension, 10 avantageusement la force physique selon l'invention consiste en une force de tension. La force physique selon l'invention peut également comprendre une force de rotation, avantageusement un couple. La force physique peut consister en une force de couple. Dans certains cas, la force physique comprend la tension et la rotation, avantageusement une tension et un couple. La force est exprimée ici en picoNewtons (pN), sauf indication contraire 15 explicite. L' application » de telles forces physiques est bien connue par l'homme de métier, notamment dans le contexte des différents appareils dans lesquels la molécule d'ADN, ou le dispositif comprenant la molécule d'ADN, selon l'invention peut être incorporé (voir par exemple Woodside et al., 2006; les brevets U.S. N° 7,052,650 et 7,244,391 ; WO 2011/147931 ; et Yang et al., 2016). 20 Par extension », on entend au sens de la présente invention la distance entre deux extrémités d'un polymère. Dans la présente invention, l'extension correspond plus particulièrement à la distance z » mesurée entre les supports auxquelles la molécule d'ADN double-brin selon l'invention est attachée. L'extension est donc être inférieure ou égale à la longueur de la molécule d'ADN double-brin. L'extension de la molécule d'ADN double brin est 25 exprimée en nnn ou pnn. La distance zu, correspond à la distance entre deux extrémités de la molécule d'ADN selon l'invention, de façon préférée la distance entre les supports auxquelles la molécule d'ADN double-brin selon l'invention est attachée, lorsqu'une basse force FLF est appliquée. À titre d'exemple, en-dessous d'un seuil de force appliqué, qui varie selon les molécules à tester (généralement compris entre 0,01 et 0,4 pN), les supports se rapprochent 30 l'un de l'autre. La distance zFiF, correspond à la distance entre deux extrémités de la molécule d'ADN selon l'invention, de façon préférée la distance entre les supports auxquelles la molécule d'ADN double-brin selon l'invention est attachée, lorsqu'une haute force FFIF est appliquée. À titre d'exemple, au-dessus d'un seuil de force appliqué, qui varie selon les molécules à tester (généralement compris entre 0,5 et 70 pN), les supports s'éloignent l'un 35 de l'autre. Lorsque les molécules à tester s'associent, deux distances peuvent être déterminées, correspondant à deux états d'extension, ZFIF-A et ZHF-D. Plus précisément, les distances ZFIF-A et ZFIF-D correspondent à la distance entre deux extrémités de la molécule 41 d'ADN selon l'invention lorsqu'une haute force FFIF est appliquée, et que les molécules à tester sont associées (zFiF.A) ou dissociées (zFiF.D). La distance ZFIF-D est supérieure à la distance ZHF-A, du fait que les molécules d'ADN double-brin (1) et (2) sont liées l'un à l'autre uniquement par la longe (en non par les molécules à tester), voir aussi schéma aux Figures 7, 5 8A. La conformation de la molécule d'ADN double-brin peut donc être déterminée par des mesures directes de l'extension de celle-ci, par exemple, sous une force, comme décrit ici. Les différentes distances - z » sont déterminées au cours du temps et en fonction de la force appliquée. Dans certains cas, il peut être avantageux de mesurer les distances de façon précise (e.g. en nnn). De façon générale, l'extension de la molécule d'ADN double-brin 10 lorsque les molécules à tester sont associées (A, e.g. ZHF-A) correspond approximativement à l'extension d'une molécule linéaire d'ADN double-brin de longueur la somme des longueurs des molécules d'ADN double-brin (1) et (2), à laquelle est appliquée une force FFIF. De façon générale, l'extension de la molécule d'ADN double-brin lorsque les molécules à tester sont dissociées (D, e.g. ZHF-D) correspond approximativement l'extension d'une molécule linéaire 15 d'ADN double-brin de longueur la somme des la longueur de la longe plus la somme des longueurs des molécules d'ADN double-brin (1) et (2) à l'exclusion des parties se situant entre les molécules à tester et les jonctions, à laquelle est appliquée une force FFIF. À haute force, extension et longueur sont presque proportionnelles, ce qui favorise l'établissement de correspondance entre les différents z. 20 L'extension peut notamment être déduite de la mesure de la distance entre les deux supports (e.g. le support fixe et le support mobile), ce dernier pouvant, par exemple, être localisé par suivi vidéo, comme dans les cas de billes magnétiques, ou par déflection de faisceau laser, comme dans le cas de certains pièges optiques ou de l'AFM. Une force physique est avantageusement appliquée aux deux extrémités attachées aux deux supports 25 lorsque les supports sont éloignés. Lorsque les changements de conformation de la molécule d'ADN double-brin sont observés sous une force physique, par exemple sous une tension, la transition entre l'association et la dissociation des molécules à tester est indiquée par une augmentation de l'extension de la molécule d'ADN double-brin, la distance ZHF-A correspondant à un état d'association entre les deux molécules étant plus faible que la 30 distance ZFIF-D correspondant à un état de dissociation entre les deux molécules. Toutefois, la détermination des différentes distances - z » n'est pas obligatoire. En effet, dans certains cas, il peut être avantageux de simplement déterminer si chaque état d'extension est présent, afin de déterminer si des molécules à tester sont capables d'interagir. À titre d'exemple, une telle détermination peut être effectuée en identifiant, sur 35 une trace temporelle de zFiF, un changement de l'extension qui est attribuée au passage entre la mesure de la distance ZFIF-A et la mesure de la distance ZHF-D. Un tel changement peut, par 42 exemple, être abrupt (e.g. en moins de 3 points d'acquisition, soit 90 nnillisecondes pour une fréquence d'acquisition vidéo de 30 Hz), telle qu'illustré à la Figure 8B. Par - trace temporelle » on entend le suivi d'une interaction moléculaire (e.g. association/dissociation) en fonction d'une force appliqué et au cours du temps (à titre 5 d'exemple, voir la Figure 8B ou la Figure 9A). Dans certains cas, l'extension mesurée (e.g. zu, ZHF-A, et/ou ZHF-D) peut être comparée avec une extension prédite par un modèle théorique, telle que le modèle d'élasticité WLC - worm-like chain » appliqué aux deux conformations, A et D, pour les deux forces étudiées, FLF et FFIF. Ce modèle est particulièrement avantageux pour décrire le comportement 10 élastique des molécules d'ADN double-brin (Bouchiat et al., 1999 et Sarkar et Rybenkov, 2016). Cependant d'autres modèles, tel celui de la chaîne librement jointe, peuvent aussi convenir (Doi, 1996, et Sarkar et Rybenkov, 2016). Dans un mode de réalisation préféré, une force physique, par exemple une tension, est appliquée à la molécule d'ADN double-brin lorsque les supports sont éloignés. Lorsque la 15 force physique haute est supérieure ou égale à 0,5 pN, 1 pN, 5 pN, 10 pN, 15 pN, 20 pN, 30 pN, 40 pN, 50 pN, ou 60 pN) il devient aisé de distinguer les changements de conformations par mesure de l'extension z, et donc de déterminer si les molécules à tester sont associées ou dissociées (Figure 7). Lorsque la force est basse (e.g. inférieure à 0,4 pN) l'extension diminue et les molécules à tester s'associent plus facilement car elles sont plus proches. Cependant, à 20 basse force il est alors impossible de déterminer la conformation (Figure 7; Figure 8A). Avantageusement, la basse force correspond à une force constante (i.e. une seule force basse appliquée). Avantageusement, la force haute correspond à une force constante (i.e. une seule force haute appliquée). Avantageusement, la force appliquée est cyclée entre une force élevée constante (e.g. supérieure ou égale à 0,5 pN) et une basse force constante 25 (e.g. égale ou inférieur à 0,4 pN), comme illustré dans la Figure 7. À titre alternatif, les fluctuations spontanées de la distance entre les supports, respectivement de la force, sont observées à force appliquée constante (voir, par exemple, Kim et al., 2010), respectivement à distance constante (voir, par exemple Kilchherr et al., 2016). Dans un troisième mode de réalisation, la force appliquée peut être augmentée entre 30 une basse force et une force élevée de façon linéaire dans le temps (e.g. une augmentation de la force par 0.01 pN/s) et toute la courbe donnant l'extension en fonction de la force mesurée (voir, par exemple, Kim et al., 2010, Halvorsen et al., 2011 et Kilchherr et al., 2016). Avantageusement, la force physique appliquée à l'étape a) est de l'ordre de 0,01 pN à 35 0,4 pN, avantageusement comprise entre 0,01 pN et 0,1 pN. En effet, en dessous d'une force physique de 0,01 pN, il devient difficile de déterminer assez précisément zu à cause du bruit de fond. Avantageusement, la force physique appliqué à l'étape a) est constante. 43 Avantageusement, la force physique appliquée à l'étape b) est supérieure ou égale à 0,5 pN, avantageusement comprise entre 0,5 et 70 pN. En effet, à une force physique au-delà de 70 pN, la longe risque de s'ouvrir car les points d'attache aux molécules d'ADN double-brin (1) et (2) sont situés sur des brins opposés. Toutefois, dans certains cas, la force physique 5 appliquée pourrait être supérieure à 70 pN, notamment lorsque des interactions plus fortes doivent être étudiées et/ou que les deux brins de la longe ont été cross-linkés par des agents chimiques (par exemple le psoralène ou le cisplatine). De façon avantageuse, la force physique appliquée restera inférieure au seuil de déformation plastique de l'ADN (e.g. de 70 pN, en l'absence de crosslinking de la longe). Avantageusement, la force physique appliqué à 10 l'étape b) est constante. Selon un premier mode de réalisation préférentiel, lorsque des études d'interaction font intervenir des petites molécules en tant que molécules à tester, la force physique à l'étape b) est avantageusement comprise entre 0,5 et 70 pN. Selon un premier mode de réalisation préférentiel, lorsque des études d'interaction 15 font intervenir des protéines en tant que molécules à tester, la force physique à l'étape b) est avantageusement comprise entre 0,5 et 40 pN. En effet, au-delà de ce seuil certaines protéines commencent à se dénaturer. La force physique appliquée peut varier avec la température, le type de molécule à tester et le tampon, mais l'homme du métier adaptera facilement ladite force physique vis-à- 20 vis de ces paramètres afin de mesurer les interactions moléculaires. Dans certains cas, un couple peut également être appliqué à la molécule d'ADN double-brin. La molécule d'ADN double-brin selon l'invention est très avantageuse car elle peut être utilisée pour effectuer des études mécaniques de réponse en torsion du complexe formé par les molécules à tester (Figure 10). 25 La comparaison des distances ZLF, ZHF-A, et ZHF-D en fonction du temps (t) permet, de façon avantageuse, de déterminer au moins une des caractéristiques choisies parmi : la constante de vitesse de dissociation, l'énergie d'activation de dissociation, la constante d'équilibre de dissociation. Il est également possible de déterminer, de façon avantageuse, le temps caractéristique de dissociation, qui n'est que l'inverse de la constante de vitesse de 30 dissociation, et la constante d'équilibre d'association, qui n'est que l'inverse de la constante d'équilibre de dissociation. Plus précisément, la comparaison de ces distances au cours du temps donne le - temps de vie » de la conformation associée et/ou dissociée des molécules à tester, noté tLF.D pour les expériences d'association et t ..HF-A pour les expériences de dissociation. 35 Le - temps caractéristique de dissociation » correspond plus particulièrement à la durée de temps pendant laquelle l'extension z de la molécule, correspondant à un état d'association, est détecté. De même, le - temps caractéristique d'association » correspond 44 plus particulièrement à la durée de temps pendant laquelle l'extension z de la molécule, correspondant à un état dissocié, est détecté. Lorsque la force appliquée est cyclée entre une force élevée constante et une basse force constante, une ou plusieurs valeurs - t» peuvent être collectées. Les valeurs - t» sont 5 avantageusement rassemblées sous forme d'histogramme, afin de pouvoir être analysées par ajustement exponentiel et déterminer le temps caractéristique de dissociation TD le temps caractéristique de dissociation TA. À titre d'exemple, l'histogramme des ty.D donne le temps caractéristique d'association TA en utilisant la formule Probabilité x exp[-ty.D/TA] et l'histogramme des tFIF-A donne le temps caractéristique d'association TD en utilisant la formule 10 Probabilité x exp[-tFiF.A/TD]. À partir du temps caractéristique de dissociation, TD, il est notamment possible de calculer la constante de vitesse de dissociation, IcD, par inversion : IcD = 1 / 'CD. La - distance séparant l'état de transition du complexe lors de la dissociation » correspond à la distance à partir de laquelle la configuration des molécules à 15 tester (e.g. état associé) iront toujours vers une autre configuration (e.g. état dissocié). L'état de transition est une caractéristique bien connue de l'homme de métier (voir par exemple Pilling et Seakins, 1995). A titre d'exemple, en effectuant des expériences pour différentes valeurs de FFIF et/ou de la température, l'homme de métier pourra déterminer la distance séparant l'état de transition du complexe lors de la dissociation, ceci en utilisant 20 l'équation d'Arrhenius/Bell (Popa et al., 2011). De même, l'homme de métier pourra déterminer l'énergie d'activation de la réaction de dissociation (Popa et al., 2011). Dans certains cas, le procédé comprend en outre une étape de comparaison de ladite caractéristique avec une valeur de référence. Le procédé tel que décrit ci-dessus peut comprendre en outre l'étape suivante : 25 d) l'ajout d'au moins une troisième molécule. Lorsque la troisième molécule n'est pas incorporée dans la molécule d'ADN double-brin selon l'invention, elle est avantageusement ajoutée dans l'environnement du dispositif, plus avantageusement en solution aqueuse. Ainsi, selon un mode de réalisation préféré, le procédé de caractérisation d'une interaction a lieu dans un environnement aqueux. Selon un 30 mode de réalisation particulier, la concentration de ladite troisième molécule peut varier au cours du temps. Le procédé selon l'invention peut notamment être utilisé pour caractériser des interactions en la présence ou l'absence d'au moins une troisième molécule qui a une activité agoniste ou antagoniste sur les interactions, telle qu'un cofacteur, un inhibiteur orthostérique ou allostérique, etc. 35 Dans certains modes de réalisation, une cinétique d'association et de dissociation peut être déterminée en mesurant les longueurs de la molécule d'ADN sur une période de temps, éventuellement dans une ou plusieurs conditions expérimentales (e.g. en changeant la force physique appliquée à l'étape b), le pH, la salinité, le tampon, la température, etc.). Ainsi, le procédé selon l'invention permet de façon très avantageuse de réaliser des expériences complexes sur une même paire de molécules à tester, par l'introduction d'autres 5 molécules interagissant avec les deux molécules à tester, et/ou par des changements des conditions expérimentales (e.g. force physique, pH, salinité). De façon avantageuse, le procédé de l'invention permet la mesure du paramètre TD, qui permet d'évaluer la durée de vie des interactions entre les molécules à tester, ceci par exemple en traçant l'histogramme de temps de vie de la forme associée (Exemple 6). 10 Cependant il est également avantageux de mesurer TA, le temps caractéristique de formation des interactions, ceci par exemple en traçant l'histogramme de temps de vie de la forme dissociée (Exemple 6). À longueur de longe fixe, différentes conditions expérimentales peuvent être comparées : présence / absence de certains réactifs (par exemple pour comprendre les mécanismes de recrutement), pH, salinité, température. 15 Les procédés de caractérisation des interactions moléculaires selon l'invention impliquent la détection des changements de longueur des molécules d'ADN double-brin selon l'invention. Les interactions peuvent être détectées ou déterminées en utilisant un certain nombre de techniques connues dans l'art, dont celles qui permettent aussi la micromanipulation et l'application de force : microscopie à force atomique, pinces optiques, 20 pinces magnétiques, microscopie à force centrifuge, bionnennbranes force probe, spectroscopie par force acoustique, micromanipulation à l'aide de cantilevers mécaniques ou de micro-aiguilles, etc. La détection des changements de longueur des molécules d'ADN double-brin selon l'invention peut aussi être effectuée à l'aide de techniques ne permettant pas la micromanipulation : - tethered particule motion », microscopie de fluorescence 25 (éventuellement en champ évanescent), spectroscopie de fluorescence (éventuellement résolue en espace et/ou en temps) selon des modes de quenching, transfert résonant d'énergie, etc. L'une quelconque de ces techniques peut être utilisée conjointement avec la molécule d'ADN double-brin, le dispositif, et les procédés décrits ici. Ces techniques sont connues dans la technique et certaines sont décrites brièvement ci-dessous (voir aussi, par 30 exemple, Conroy, 2008). À titre d'exemple, la force entre deux molécules à tester incorporées dans la molécule d'ADN double-brin selon l'invention peut être mesurée par microscopie à force atomique (AFM). Dans certains modes de réalisation, l'AFM peut être utilisé pour mesurer les forces d'étirement et de rupture du lieur à molécule unique. Dans certains modes de réalisation, la 35 force mesurée peut être de l'ordre de quelques pN. Dans certains modes de réalisation, l'AFM est réalisée avec des modes statiques ou dynamiques. 46 La force entre deux molécules à tester incorporées dans la molécule d'ADN double-brin selon l'invention peut être mesurée à l'aide d'une pince optique (également appelée - piège à force de gradient à faisceau unique »). Les pinces optiques utilisent un faisceau laser hautement focalisé pour fournir une force attrayante ou répulsive (typiquement de 5 l'ordre de pN), en fonction du désaccord d'indice de réfraction, pour maintenir physiquement et déplacer des objets diélectriques microscopiques, tels que l'ADN. Dans certains modes de réalisation, des pinces optiques sont utilisées pour manipuler la molécule d'ADN double-brin en exerçant des forces extrêmement faibles via un faisceau laser hautement focalisé. Dans certains modes de réalisation, des pièges optiques peuvent être utilisés pour détecter le 10 déplacement de l'ADN en tant que mesure de la force moléculaire. La force entre deux molécules à tester incorporées dans la molécule d'ADN double-brin selon l'invention peut être mesurée en utilisant une pince magnétique. Les pinces magnétiques exercent une force et un couple sur une molécule telle que la molécule d'ADN double-brin selon l'invention. L'extension de la molécule correspond à sa réponse à la 15 contrainte appliquée. Avantageusement, un appareil de pince magnétique est équipé d'aimants qui sont utilisés pour manipuler les particules magnétiques, dont la position est mesurée avec une vidéo-microscopie. La force entre deux molécules à tester incorporées dans la molécule d'ADN double-brin selon l'invention peut être mesurée en utilisant la microscopie à force centrifuge. Le 20 CFM exerce une force sur une molécule telle qu'un complexe d'acide nucléique de l'invention en utilisant une force centrifuge. L'extension de la molécule correspond à sa réponse à la contrainte appliquée. Dans certains modes de réalisation, un complexe est fixé à une extrémité à un support fixe et à l'autre à une particule qui peut être visualisée en utilisant par exemple la microscopie optique. La position de la particule et son mouvement par 25 rapport au support fixe peuvent être observés et mesurés en fonction de la force centrifuge appliquée à la molécule d'ADN double-brin. D'autres technologies de mesure de force mécanique peuvent être utilisées avec les modes de réalisation décrits ici, par exemple des cantilevers mécaniques, des - biomembrane force probes », etc. 30 La molécule, le dispositif, et le procédé selon l'invention peuvent être utilisés dans un grand nombre d'applications, notamment conjointement avec l'une des techniques décrites ci-dessus. En plus des études des propriétés mécaniques et des interactions entre deux molécules à tester, ils peuvent aussi être utilisés pour détecter des analytes en solution, pour effectuer des études de liaison compétitifs, cribler des molécules, etc. 35 À titre d'exemple, des tests de liaison compétitifs peut être effectués, notamment par l'introduction de molécules avant ou après l'établissement d'une liaison entre les au moins deux molécules à tester. Dans certains modes de réalisation, une fois que les deux molécules 47 à tester sont liées l'une à l'autre, des formes solubles ou des fragments de la première et/ou de la deuxième molécule à tester peuvent être ajoutés en excès, ceux-ci se liant à la première et/ou à la deuxième molécule à tester afin de rentrer en compétition avec leur contrepartie liée, avant de détecter un changement de liaison (par exemple par la 5 détermination de l'extension z). Selon un aspect, la molécule, le dispositif, et le procédé selon l'invention peuvent être utilisés pour détecter la présence d'un analyte d'intérêt dans un échantillon, par exemple à des fins diagnostics. Selon cet aspect, la molécule d'ADN comprend au moins deux molécules à tester qui ont une spécificité pour un même analyte. Dans certains cas, les au 10 moins deux molécules à tester peuvent être identiques, à condition qu'elles puissent se lier simultanément à l'analyte. Par exemple, elles peuvent être des anticorps identiques, à condition que l'antigène auquel elles se lient ait plusieurs épitopes qui peuvent être liés par les différents anticorps simultanément et sans interférence. À titre alternatif, les au moins deux molécules à tester peuvent être différentes l'une de l'autre mais avoir une affinité de 15 liaison pour un même analyte. Par exemple, elles peuvent être des anticorps qui se lient à différents épitopes sur le même antigène à condition qu'elles puissent se lier à l'antigène simultanément et sans interférence. La longueur de la molécule d'ADN lorsque les molécules à tester fixent l'analyte ou non peut être utilisée pour déterminer la présence ou l'absence d'un analyte dans un échantillon. Si l'analyte est présent, les molécules à tester se lieront à 20 l'analyte. En l'absence de l'analyte, la liaison ne se produira pas et l'extension correspondra El ZHF-D- Selon un autre aspect, la molécule, le dispositif, et le procédé selon l'invention peuvent être utilisés dans des méthodes de criblage de molécules. Dans ce cas, une seule ou les deux molécules à tester peuvent être connues comme pouvant interagir. Dans certains 25 modes de réalisation, une des deux molécules à tester est un membre d'une bibliothèque de molécules identifié comme pouvant interagir avec l'autre molécule à tester de façon putative, et le procédé est conçu afin de cribler les différentes molécules de la bibliothèque afin d'identifier des molécules ayant une affinité pour une cible particulière (c.-à-d. l'autre molécule à tester). Dans certains modes de réalisation, les molécules à tester sont connues 30 pour avoir une affinité l'une pour l'autre, alors que dans d'autres modes de réalisation, on ne sait pas a priori si elles ont une affinité mutuelle ou si le degré d'affinité dans une paire donnée est connu. KIT L'invention a pour autre objet des kits pour la fabrication de la molécule d'ADN 35 double-brin selon l'invention. Un tel kit peut comprendre au moins : 48 - une molécule d'ADN - intermédiaire » ayant des longueurs des molécules (A) et (B) préétablies en fonction des besoins expérimentaux, - optionnellennent, des oligonucléotides et/ou des molécules d'ADN comprenant des groupes fonctionnels, 5 - optionnellennent, une ou plusieurs molécules à tester, avantageusement liées à des oligonucléotides. Selon un mode de réalisation préféré, le kit comprend au moins la molécule d'ADN double-brin selon l'invention, avec ou sans l'intégration des molécules à tester dans ladite molécule d'ADN. 10 Selon un autre mode de réalisation préféré, le kit comprend le dispositif selon l'invention, avec ou sans l'intégration des molécules à tester dans la molécule d'ADN double-brin selon l'invention qui est comprise dans ledit dispositif. Le kit peut en outre contenir au moins un quelconque des autres molécules ou réactifs décrits ici (e.g. une polynnérase, une ligase, des dNTPs, un ou plusieurs tampons de 15 réaction, un ou plusieurs supports tels que des billes magnétiques ou des lamelles de verre). Les différents composants du kit peuvent être présents dans des récipients séparés. Lorsque certains composants sont compatibles, ils peuvent être préconnbinés dans un seul récipient, comme souhaité. En plus des composants mentionnés ci-dessus, les kits selon l'invention peuvent en 20 outre comprendre des instructions pour utiliser lesdits composants du kit, plus particulièrement pour mettre en oeuvre les procédés de l'invention (e.g. instructions pour synthétiser la molécule d'ADN double-brin selon l'invention, des instructions pour générer le dispositif selon l'invention, etc.). 25 La pratique de l'invention utilise, sauf indication contraire, des techniques conventionnelles de la chimie des protéines, de la biologie moléculaire, de la microbiologie, de la technologie de l'ADN recombinant et de la pharmacologie, qui font partie des compétences de l'art. De telles techniques sont entièrement expliquées dans la littérature. (Voir Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Eds., John Wiley Et Sons, Inc. New 30 York, 1995 ; Rennington's Pharnnaceutical Sciences, 17ènne éd., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985 ; Sannbrook et al., Molecular cloning : Un manuel de laboratoire, 2e édition, Cold Spring Harbor Laboratory Press - Cold Spring Harbor, NY, USA, 1989 ; Lahann, Click Chemistry for Biotechnology and Materials Science, John Wiley Et Sons, Chichester, England, 2009). 49 EXEMPLES L'invention est illustrée par les exemples non limitatifs suivants. Ces enseignements comprennent des alternatives, des modifications et des équivalents, qui pourront être appréciés par un homme du métier. 5 EXEMPLE 1: PROCEDE DE FABRICATION DE LA MOLECULE D'ADN DOUBLE-BRIN Le protocole donné ci-dessous correspond à la synthèse des molécules d'ADN utilisées pour les Exemples 7 et 8. En ce qui concerne celles utilisées pour l'Exemple 9 quelques variantes ont été mises en oeuvre, qui sont résumées dans le Tableau 1, ci-dessous. Tableau 1 : Résumé des informations concernant les tailles des molécules et leurs 10 séquences, en fonction des Exemples Exemples 7 et 8 Exemple 9 SEQ ID NO de la molécule (A) 9 30 Taille de la molécule (A) avant la digestion de l'étape A) 3 000 pb 2 100 pb SEQ ID NO de la molécule (B) 10 10 Taille de la molécule (B) Environ 700 pb Environ 700 pb (689 pb) (689 pb) Taille totale de la molécule d'ADN avant et après l'étape A) 3 700 pb 2 800 pb Tailles des fragments liés à la longe après la digestion de l'étape A) 1 500 pb et 1 500 pb 700 et 1 400 pb Enzyme servant à digérer la molécule selon SEQ ID NO la 1, marqué à la biotine Sacl Xbal Enzyme servant à digérer la molécule selon SEQ ID NO : 1, marqué à la digoxigénine Xbal Sacl Taille totale de la molécule d'ADN après Entre 5 700 et Entre 4 800 et 5 300 pb l'étape B) 6 300 pb Molécule d'ADN double-brin (1) 26 ou 27 28 ou 29 Molécule d'ADN double-brin (2) 31 ou 32 33 ou 34 ÉTAPE A) LA SYNTHESE DES MOLECULES D'ADN DOUBLE-BRIN (1) ET (2) La digestion par deux enzymes de restriction de la molécule d'ADN - intermédiaire » (illustré à la Figure 3, ayant les séquences de SEQ ID NO : 9 (correspondant à la séquence de la molécule d'ADN (A) et de SEQ ID NO : 10 (correspondant à la séquence de la molécule 15 d'ADN (B)) permet la linéarisation. Par la même occasion, on obtient deux bouts cohésifs non- complémentaires (Figure 4A). Dans cette réalisation, ce sont les enzymes Xbal et Sac! qui sont utilisées. Plus précisément, après digestion par les enzymes Xbal et Sac!, un produit d'ADN d'environ 3,7 kpb (kilo paires de bases) constitué de la molécule (B) d'environ 700 pb 5 (correspondant à la longe) et de deux molécules d'ADN double-brin linéaires, (correspondant en parties aux molécules d'ADN double-brin (1) et (2)) de 1,5 kpb est obtenu. Dans chaque molécule d'ADN (1) et (2) chaque extrémité de la longe est attachée à une base nucléotidique qui est situé à environ 40 à 50 pb des bouts étant à l'opposé de ceux générés par la digestion par Xbal et Sac!. 10 La digestion par Xbal et Sacl de la molécule d'ADN intermédiaire est effectuée simultanément et pendant 7 à 8 heures à 37 °C dans un volume total de 80 pl de solution aqueuse dont les conditions ioniques sont fixées par l'emploi du tampon de réaction - CutSmart » selon les recommandations du fabriquant (New England Biolabs). La réaction comprend 6 pg de la molécule d'ADN - intermédiaire », 100 unités de Xbal, et 50 unités de 15 Sacl. La réaction est arrêtée en inactivant les enzymes de restriction par passage sur colonne de purification du kit - Nucleospin Gel and PCR Cleanup » (Macherey-Nagel). ÉTAPE B) : SYNTHESE ET ASSEMBLAGE DES EXTREMITES FONCTIONNALISEES DESTINEES AUX SUPPORTS Un premier fragment d'ADN double-brin de longueur d'environ 2 300 paires de bases 20 est synthétisé par PCR en incorporant des nucléotides modifiés par la biotine, molécule complémentaire de la streptavidine qui recouvre la bille magnétique faisant office de support. Les oligonucléotides utilisés pour amplifier ce premier fragment (ayant la séquence de SEQ ID NO : 1, amplifié à partir du génome du phage A) ont les séquences 5'- G CG TATTAG CGAC CCATC GTCTTTCTG -3' et 5' -GATGCACGCAATGGTGTAGCAATAATTGC -3', 25 respectivement, correspondant aux séquences de SEQ ID NO : 2 et 3). Plus précisément, la réaction PCR est effectuée dans un volume final de 100 pl de solution aqueuse, distribués en deux tubes de 50 pl chacun. Ces 100 pl incluent 50 ng de matrice (le génome du bactériophage A), 30 prnol des oligonucléotides d'amorçage, 10 nrnol de chaque désoxyribonucléotide triphosphate, 3.5 unités du mélange de polyrnérases thermostables 30 - Expand High Fidelity » (Roche), 5 nrnol de biotin-16-dUTP (Roche), et le tampon réactionnel fourni par le fabriquant (Roche) à une concentration finale de lx selon le protocole du fournisseur (Roche). Le programme PCR employé consiste en une première étape de 2 min à 95°C, suivi par une seconde étape de 15 s à 95°C, suivi par une troisième étape de 30 s à 56°C, suivi par une quatrième étape de 80 s à 72°C, suivi par 25 répétitions de la seconde, 35 troisième, et quatrième étapes en succession. A la fin du programme une dernière étape de 3 51 min à 72°C est effectuée, puis l'échantillon est ramené à 16 °C. Le produit de la réaction est ensuite purifié avec un kit - PCR Cleanup » (Macherey-Nagel). Ce premier fragment est ensuite digéré par Sac! afin de générer deux fragments d'environ 1 300 pb et d'environ 950 pb possédant chacun un bout cohésif complémentaire de 5 celui de la molécule (1). Plus précisément, le produit PCR est tout d'abord quantifié par spectrophotométrie UV. La digestion est ensuite effectuée pendant 2 h à 37°C dans un volume réactionnel de 50 pl de solution aqueuse comprenant 5 pg d'ADN marqué, 100 unités de Sacl (New England Biolabs), et le tampon réactionnel - CutSmart » fourni par le fabriquant (New England Biolabs) à une concentration finale de lx selon le protocole du fournisseur. Les 10 fragments obtenus peuvent ensuite être purifiés par électrophorèse sur gel d'agarose et extraits du gel avec un kit - Nucleospin Gel and PCR Cleanup » (Macherey-Nagel). Alternativement, les fragments peuvent également être purifiés simplement avec un kit - Nucleospin Gel and PCR Cleanup » (Macherey-Nagel). Les fragments digérés et purifiés sont finalement quantifiés par spectrophotométrie UV. 15 Un second fragment d'ADN double-brin de longueur d'environ 2 300 paires de bases est synthétisé par PCR en incorporant des nucléotides modifiés par la digoxigénine, molécule complémentaire de l'anticorps qui tapissera la lamelle de verre et qui fera office de second support. Le protocole suivit pour cette PCR est le même que ci-dessus, utilisant les mêmes oligonucléotides (selon les séquences de SEQ ID NO : 2 et 3) amplifiant le même fragment du 20 génome du phage A, le biotin-16-dUTP étant juste remplacé par la forme stable en conditions alcalines du digoxigénine-11-dUTP (Roche). Ce second fragment d'ADN double-brin est ensuite digéré par Xbal afin de préparer deux fragments d'environ 1 050 pb et d'environ 1 200 pb portant chacun un bout cohésif complémentaire de celui de la molécule (2). Plus précisément, le produit PCR est tout d'abord 25 quantifié par spectrophotométrie. La digestion est ensuite effectuée pendant 2 h à 37°C dans un volume réactionnel de 50 pl de solution aqueuse comprenant 5 pg d'ADN marqué, 250 unités de Xbal (New England Biolabs), et le tampon réactionnel - CutSmart » fourni par le fabriquant (New England Biolabs) à une concentration finale de lx selon le protocole du fournisseur. Les fragments obtenus peuvent ensuite être purifiés par électrophorèse sur gel et 30 extraits du gel avec un kit - Nucleospin Gel and PCR Cleanup » (Macherey Nagel). Alternativement, les fragments peuvent également être purifiés simplement avec un kit - Nucleospin Gel and PCR Cleanup » (Macherey-Nagel). Les fragments digérés et purifiés sont quantifiés par spectrophotométrie UV. Le substrat utilisé pour les réactions PCR est ici le génome du phage A, sans que 35 cela n'ait aucun caractère obligatoire. La longueur des extrémités fonctionnalisées peut varier et aller jusqu'à 10 000 pb mais la valeur d'environ 1 000 pb est un bon compromis entre rendement de production et efficacité d'attachement des molécules d'ADN selon 52 l'invention sous microscope. On peut aussi imaginer des fragments d'ADN plus courts et/ou portant une petite molécule réactive unique à leur extrémité. Finalement, dans d'autres variantes possibles, des groupes fonctionnels autres que la biotine et la digoxigénine peuvent être employés, par exemple des thiols qui se fixeront sur une surface couverte d'or. 5 La synthèse de la molécule d'ADN double-brin est finalisée par la ligation des fragments marqués à la biotine et à la digoxigénine aux molécules d'ADN (1) et (2), respectivement à l'aide de l'ADN ligase du phage T4 (Figure 4B). Plus précisément, une réaction de ligature dans un volume total de 10 pl a été conduite dans les conditions recommandées par le fabricant (tampon ADN T4 DNA Ligase lx 10 de New England Biolabs), la molécule d'ADN était à une concentration de 3 nM, les fragments marqués à la biotine et à la digoxigénine étaient chacun à 9 nM ; 200 unités (0,5 pl) d'ADN ligase T4 ont été utilisées pour ligaturer l'ADN pendant 3 heures à température ambiante avant d'inactiver thernniquennent la ligase. Des molécules d'ADN double-brin (1) et (2) ayant les séquences selon le SEQ ID NOs 15 indiquées dans le Tableau 1 ci-dessus sont obtenues. EXEMPLE 2 : AMENAGEMENT DES EXTREMITES DES TINEES AUX MOLECULES A TESTER Les séquences des extrémités ont été choisies de façon à pouvoir générer, par digestion enzymatique, des bouts cohésifs non-complémentaires permettant la liaison par hybridation spécifique puis ligature de deux conjugués oligonucléotide - molécule à tester 20 (voir Figure 5). Étape A) : Digestion des extrémités L'enzyme Nb.Bbv0 a été utilisé pour la digestion des extrémités (Figure 5A). Cette enzyme est dite de - nicking » car elle ne clive que l'un des deux brins de la double hélice, ce qui permet de générer des bouts cohésifs relativement longs. De plus, les bouts cohésifs 25 formés peuvent posséder toute séquence voulue par le concepteur, dans la limite de quelques bases immuables au niveau du site de reconnaissance. Ceci est à mettre en regard avec les enzymes de restriction classiques avec lesquelles on ne dégage souvent que quatre nucléotides de séquence fixe. Dans le cas présent on génère des bouts 5'- débordants possédant 9 nucléotides. Cette valeur de 9 nucléotides est avantageuse car d'une part assez 30 grande pour permettre un adressage stable et spécifique de chacune des extrémités par reconnaissance moléculaire (les séquences produites ne sont bien-sûr ni identiques, ni complémentaires) et d'autre part assez courte pour éviter tout problème de repliement/hybridation parasite. Cette étape de digestion éventuellement peut être effectuée en même temps que l'étape A de l'Exemple 1. 53 Plus précisément, la digestion par Nb.BbvCI de la molécule d'ADN intermédiaire est effectuée simultanément à la digestion par Xbal et Sacl de la molécule d'ADN intermédiaire, pendant 7 à 8 heures à 37°C dans un volume total de 80 pl de solution aqueuse dont les conditions ioniques sont fixées par l'emploi du tampon de réaction - CutSmart » selon les 5 recommandations du fabriquant (New England Biolabs). La réaction comprend 6 pg de la molécule d'ADN - intermédiaire », et, en plus des 100 unités de Xbal, et 50 unités de Sacl employées, 30 unités de Nb.BbvCI (New England Biolabs). La réaction est arrêtée en inactivant les enzymes de restriction par passage sur colonne de purification du kit - Nucleospin Gel and PCR Cleanup » (Macherey-Nagel). L'élimination des fragments 10 complémentaires après digestion est relativement aisée, elle s'effectue par purification sur gel d'électrophorèse 1 % à 37°C pendant toute une nuit. Étape B) : Liaison des molécules à tester aux extrémités Les molécules à tester, ici les protéines FRB et FKBP12, sont conjugués à deux oligonucléotides appelés oligo-Tc. Chacun de ces derniers possède à son extrémité 3' une 15 séquence complémentaire de l'une de celles présentes aux bouts cohésifs non-complémentaires des extrémités des molécules d'ADN (1) et (2). La conjugaison des protéines aux oligonucléotides a été réalisée par chimie click entre un groupe fonctionnel DBCO porté à l'extrémité 5' des oligo-Tc et un groupe fonctionnel azide introduit dans la séquence des protéines par mutagenèse et incorporation d'un acide aminé artificiel, l'azido-phénylalanine, 20 en cours d'expression. La protéine FRB ayant la séquence de SEQ ID NO: 6, et comprenant un group azide à la position 2 020 par substitution de l'acide aminé alanine par la 4-azido-Lphenylalanine, est conjuguée à Oligo-Tci, ayant la séquence 5'-TATATGAGGC-3'de SEQ ID NO : 4. La protéine FKBP12 ayant la séquence de SEQ ID NO : 7, comprenant un groupe azide à la position 1 par substitution de l'acide aminé méthionine par la 4-azido-L-phenylalanine, 25 est conjuguée à Oligo-Tc2, ayant la séquence 5'-TTGTAAGAGC-3'de SEQ ID NO : 5. La première base - T - en 5' des oligos-Tc correspond à DBCO-dT. D'autres systèmes de conjugaison entre oligonucléotides et protéines sont bien entendus possibles : les premiers peuvent ainsi porter, par exemple, un groupe fonctionnel nnaléinnide, carboxylique, ou benzylguanine qui réagira respectivement avec un groupe fonctionnel cystéine, amine, ou SNAP-tag localisé sur les 30 secondes. Ces groupes fonctionnels peuvent aussi être localisés à l'extrémité 3' des oligo-Tc à condition de revoir l'aménagement des extrémités pour que l'hybridation des oligonucléotides reste possible. Dans la présente réalisation, l'oligonucléotide est directement lié à la molécule à tester. Il est cependant envisageable de relier les deux espèces au travers d'un espaceur de 35 type biopolynnère (e.g. ADN double-brin, ADN simple-brin, ARN, polypeptide, protéine), polymère organique (e.g. PEG) ou même colloïde (e.g. nanoparticule d'or, quantum dot). Les 54 extrémités pourront ainsi être rallongées et la nature de l'interaction pourra être modulée (e.g. élimination de comportement non-spécifique, modification de l'environnement électrostatique). La dernière étape de la synthèse du dispositif consiste à hybrider les conjugués 5 - oligonucléotide - protéine » aux bouts cohésifs des extrémités et à effectuer une ligature grâce à l'ADN ligase du phage T4 (voir aussi la Figure 5B). Cette ligation est effectuée dans un volume total de 50 pl de solution aqueuse pendant 5 h à 16°C et comprend : 2.5 fnnol de la construction d'ADN selon l'invention dont les extrémités sont déjà marquées à la biotine et à la digoxigénine, 2.5 fnnoles du complexe nucléoprotéique correspondant à la protéine FKBP12 10 couplée à Oligo-TC1, et 2.5 fnnoles du complexe du complexe nucléoprotéique correspondant à la protéine FRB couplée à Oligo-TC2. La solution aqueuse contient en outre du DU (2 nnM), de l'ATP (1 nnM) et 200 unités de T4 DNA ligase (New England Biolabs). La solution aqueuse contient également un agent tamponnant (20 nnM de Tris, pH 7.5) et du sel (300 nnM NaCl). Aucune étape d'inactivation thermique ou de purification n'est appliquée par la suite. 15 EXEMPLE 3: PROCEDE DE PREPARATION DE LA MOLECULE D'ADN DOUBLE-BRIN « INTERMEDIA IRE » Étape A) : Synthèse des jonctions Cette étape consiste à préparer, par couplage covalent d'oligonucléotides, deux structures en Y (aussi appelées - jonctions ») qui feront le lien entre les molécules d'ADN (1) 20 ou (2) et la longe. Plus précisément, pour chaque jonction, un groupe fonctionnel porté par une des extrémités d'un premier oligonucléotide appelé oligo-L est mis à réagir avec un groupe fonctionnel présent au milieu d'un second oligonucléotide appelé oligo-TS (Figure 6A). Plus particulièrement, dans le cas présent, un groupe fonctionnel DBCO situé à l'extrémité 5' de l'oligo-L et une fonction azide située au milieu de l'oligo-TS ont été 25 utilisées. Des fonctions alternatives peuvent cependant être utilisées. Par exemple, l'extrémité 5' réactive de l'oligo-L peut consister en un groupe de type nnaléinnide, auquel cas l'oligo-TS doit porter une modification de type thiol en son milieu. On peut également employer un groupe NHS en 5' de l'oligo-L et un groupe NH2 au milieu de l'oligo-TS. D'autres 30 chimies pourront aussi être trouvées ou développées à l'avenir, qui seront compatibles avec cette procédure d'assemblage. De plus, pour chaque chimie, un certain nombre de variations sont envisageables : échanger le groupe fonctionnel en 5' de l'oligo-L avec le groupe fonctionnel situé au milieu de l'oligo-TS, positionner en 3' le groupe fonctionnel porté par l'oligo-L, positionner ailleurs que sur une base le groupe fonctionnel intégré au milieu de 35 l'oligo-TS (e.g. sur le squelette phosphate, sur un sucre, sur un espaceur, etc.). Dans nos réalisations les deux jonctions sont de même nature fonctionnelle. Cependant, les deux jonctions peuvent être de nature fonctionnelle différente, par exemple, selon l'une des variantes qui viennent d'être énumérées. Les séquences des quatre oligonucléotides, i.e. celles des deux oligo-L et des deux 5 oligo-TS ne sont ni identiques, ni complémentaires, afin de pouvoir s'hybrider de façon spécifique. Le nombre de bases de chaque oligo-L doit juste permettre la suite du protocole, il est typiquement égal à 20 à 30 bases. Il en va de même pour le nombre de bases séparant le groupe fonctionnel de l'extrémité 3' de chaque oligo-TS, sa valeur est typiquement égale à 15 à 20 bases. Par contre, dans le présent exemple, le nombre de bases séparant le groupe 10 fonctionnel de l'extrémité 5' de chaque oligo-TS conditionne la longueur des extrémités. Ici, la longueur de l'extrémité est égale à 30 à 60 bases, mais les capacités en synthèse oligonucléotidique permettent d'atteindre des valeurs autour de 150 bases. Finalement, la présente étape peut correspondre à l'initiation de la mise en place des groupes fonctionnels ou des séquences (e.g. des sites de restriction) destinées à la liaison 15 spécifique des molécules à tester aux extrémités. Plus précisément deux modes de liaison principales sont envisagés : soit par hybridation d'un oligonucléotide tel que détaillé dans l'Exemple 5 (Figure 5), soit par réaction chimique entre groupes fonctionnels spécifiques. Dans le premier cas on choisira judicieusement les séquences afin de pouvoir générer, le moment venu, les bouts cohésifs ad hoc, i.e. capables de réagir de façon orthogonale. Dans le 20 second cas on choisira judicieusement les groupes fonctionnels afin de pouvoir attacher, le moment venu, les molécules à tester de façon orthogonale. Plus précisément, dans le cas présent, les oligonucléotides oligo-Li et oligo-L2, où la première thymine en 5' est une base DBCO-dT, et les oligonucléotides oligo-TS, et oligo-TS2, comprenant une base Azido-dT au milieu de l'oligonucléotide, tels que définis ci-dessous dans 25 le Tableau 2, ont été remis en suspension à 10 pg/pl dans du formannide à 37°C. 50 pg de chacun des oligonucléotides Oligo-L1 et Oligo-TS, ont été combinés. De même, 50 pg chacun de Oligo-L2 et Oligo-TS2 ont été combinés. Comme indiqué dans la Tableau 2, les séquences des oligonucléotides qui sont combinés diffèrent lorsque la molécule intermédiaire » est utilisée en aval pour la réalisation des Exemples 7 et 8 ou pour la réalisation de l'Exemple 9. 30 Les oligonucléotides combinés ont été incubés 8 h à 37°C et les produits correspondant aux oligonucléotides couplés par de façon covalente ont été séparés sur un gel à 8 % acrylannide : bisacrylamide (29: 1) contenant 8M d'urée fonctionnant à environ 10V / cm dans du tampon Tris-borate-EDTA. Des tranches de gel correspondant au produit ont été excisées du gel, en utilisant une voie d'imagerie sacrificielle pour effectuer l'ombrage UV permettant d'identifier 35 les bandes pertinentes. L'ADN a été purifié en éluant d'abord l'ADN à partir du fragment de gel broyé pendant une nuit dans un tampon phosphate 10 mM pH 8,0 avec agitation à 4°C. Une cartouche SepPak C18 (Waters) a été conditionnée avec de l'acétonitrile puis de l'eau ; 56 l'éluât a été chargé sur la cartouche, lavé avec de l'eau, et l'oligonucléotide a été libéré de la cartouche en éluant avec de l'acétonitrile. L'acétonitrile a été évaporé par centrifugation sous vide et l'oligonucléotide a été remis en suspension à environ 10 JIM. 5 Tableau 2: Oligonucléotides utilisées pour synthétiser les jonctions Oligonucléotide Séquence* SEQ ID NO Exemple(s) Oligo-TS, 5' -GAGAGACCCGGGCACGACTTATCGCCACTGG CAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGC-3' 11 7 et 8 Oligo-L1 5' - TGAGCCAAGACGCCTCCATCCATGCA-3' 12 7 et 8 Oligo-TS2 5' -GAGAGACCCGGGCACCGTCTCCTTCGAACTTA TTCGCAATGGAGTGTCATTCATCAAGGACG -3' 13 7 et 8 Oligo-L2 5' - TCCATGGGCATACTGATCGGTAGGG -3' 14 7 et 8 Oligo-TS, 5' -ATATGAGGCTGAGGAAGCGGTTAGCTCCTTC GGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCC GCAG-3' 15 9 Oligo-L1 5' - TCCATGGGCATACTGATCGGTAGGG -3' 16 9 Oligo-TS2 5' -TGTAAGAGCTGAGGCGGTGACCAATATCTACA ACATCAGCCTTGGTATCCAGCGTGATG-3' 17 9 Oligo-L2 5' - TGAGCCAAGACGCCTCCATCCATGCA-3' 18 9 * la première base « T - indiquée en gras et italique en 5' des oligos-L correspond à DBCO-dT (avec l'aimable autorisation de John Randolph, Glen Research, USA) ; la base - T - indiquée en gras et soulignée dans les oligos-TS correspond à Azido-dT (Trilink, USA). Étape B) : Synthèse de la molécule (A) - le précurseur des molécules d'ADN (1) et (2) 10 Les deux structures en Y obtenues ci-dessus sont utilisées comme amorces dans une réaction PCR destinée à générer une molécule ADN double-brin qui sera transformé en molécules d'ADN (1) et (2) plus tard (Figure 6B). Plus précisément, les séquences à l'extrémité 3' des deux oligo-TS vont d'hybrider sur le substrat et servir à initier la polymérisation. Les deux oligo-L n'interviennent pas et ne sont pas modifiés par la réaction 15 PCR. L'ADN double-brin produit possède donc à chaque extrémité une jonction aboutissant d'une part à un oligo-L et d'autre part à une extrémité dont la fonctionnalisation par une séquence ou groupe fonctionnel spécifique a été initiée. La séquence de cet ADN double-brin peut être choisie par sélection du substrat : le vecteur de clonage Charonnid 9-5 ASbfl (un dérivé de plasmide Charonnid 9-5 à partir duquel le site Sbfl naturel a été éliminé par 20 digestion Sbfl, remplissage et re-ligature, ayant la séquence de SEQ ID NO : 8) a été retenu ici. De plus la longueur du produit est déterminée par la position des amorces sur le substrat : elle est d'environ 3 050 paires de bases dans le cas des Exemple 7 et 8, d'environ 2 100 paires de bases dans le cas de l'Exemple 9. Ce chiffre peut en fait aller jusqu'à environ 10 000 paires de bases, limite au-delà de laquelle le rendement des réactions PCR chute. 57 La réaction PCR est assemblée en combinant 1,25 pg d'ADN matrice (Charonnid 9-5 ASbfl ; SEQ ID NO : 8), 90 pnnoles de l'oligonucléotide en structure - Y » obtenu en couplant Oligo-TS1 (SEQ ID NO : 11) et Oligo-L1 (SEQ ID NO : 12) , 90 pnnoles de l'oligonucléotide en structure - Y » obtenu en couplant Oligo-TS2 (SEQ ID NO : 13) et Oligo-L2 (SEQ ID NO : 14), 125 5 nnnoles de chacun des quatre désoxyribonucléotides triphosphates, 5 pl de DMSO, 17,5 unités de mélange de polynnérases thermostables - Expand High Fidelity PCR System » (Roche), 25 pl du tampon de réaction fourni par la fabriquant (Roche), et de l'eau ultrapure afin d'atteindre un volume total de 250 pl. Ce volume est divisé en dix tubes, chacun contenant 25 pl. Ces dix tubes sont soumis à des cycles thermiques selon le protocole qui suit. Les tubes sont chauffés 10 pendant 2 minutes à 94°C. Ensuite, les tubes sont soumis à 8 cycles thermiques, chaque cycle comprenant une étape de 15 secondes à 94°C, suivie d'une étape de 30 secondes à 72°C, suivie d'une étape de 4 minutes à 68°C. A chaque itération de ces 8 cycles la température utilisée pour l'étape de 30 secondes est diminuée de 2°C par rapport à l'itération précédente. Ensuite, les tubes sont soumis à 22 cycles thermiques, chaque cycle comprenant une étape de 15 15 secondes à 94°C, suivie d'une étape de 30 secondes à 56°C, suivie d'une étape de 4 minutes à 68°C. Ensuite, les tubes sont maintenus pendant 7 minutes à 72°C avant que leur température ne soit ramenée à 16°C afin de terminer la réaction. La molécule d'ADN ainsi produite a ensuite été purifiée par extraction sur colonne à l'aide du kit « Nucleospin Gel and PCR Cleanup » (Macherey-Nagel). 20 Étape C) : Synthèse et assemblage de la molécule (B), correspondant à la longe La longe est produite par PCR puis digestion par deux enzymes de restriction du double-brin obtenu, ceci afin de générer deux extrémités cohésives différentes (Figure 6D). Sans raison impérative, c'est le vecteur de clonage Charonnid 9-5 ASbfl, ayant la séquence de SEQ ID NO : 8, qui a encore une fois été utilisé comme substrat pour l'amplification. 25 Plus précisément, dans le cas présent la longe (ayant la séquence de SEQ ID NO : 10) a été obtenue par amplification PCR de la matrice Charonnid C9-5 4Sbfl avec les oligonucléotides 5'-GAGAGAACGCGTTACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGG (SEQ ID NO: 19) et 5' -GAGAGACCTGCAGGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACC (SEQ ID NO: 20) (afin de générer un fragment ayant la séquence de SEQ ID NO : 25), digestion par Mlul et Sbfl, et 30 purification par électrophorèse sur gel d'agarose puis extraction sur colonne à l'aide du kit - Nucleospin Gel and PCR Cleanup » (Macherey-Nagel). Ces étapes sont réalisées selon les protocoles standards de biologie moléculaire, en suivant les instructions des fabricants. La longe fabriquée a ici une longueur d'environ 700 paires de bases mais le procédé PCR permet d'aller jusqu'à des valeurs de 10 000 paires de bases si cela est souhaitable. Pour 35 atteindre des longueurs encore plus grandes on pourra avoir recours à de l'ADN - naturel » tel que décrit ici. À titre d'exemple, le génome du phage A fait 48 502 paires de bases. 58 Étape D) : Assemblage de la molécule « intermédiaire » Deux oligonucléotides appelés oligo-Lc sont hybridés sur les oligo-L de la molécule afin de générer des bouts cohésifs complémentaires de ceux flanquant la longe (Figure 6C). Une réaction de ligature permet ensuite d'assembler la molécule (B) correspondant à la 5 longe avec la molécule (A) et d'obtenir une molécule d'ADN - intermédiaire » (Figure 6D). Afin d'atteindre un rendement non négligeable pour la formation de la molécule d'ADN - intermédiaire » (8,5 %), il est avantageux de travailler avec quatre sites de restriction et d'effectuer la ligature, par exemple par l'ADN ligase du phage T4, en présence des quatre enzymes correspondantes. L'utilisation de deux sites de restriction différents, 10 présents à la fois au niveau des jonctions et au niveau des extrémités de la longe permet de limiter la formation de sous-produits issus de réactions de ligation non-souhaitées comme décrit plus bas. En effet, il est difficile d'ajuster les concentrations afin de diminuer la quantité de sous-produits issus de réactions entre molécules (B) ou entre molécules (A) lorsque seulement deux sites de restriction différents, présents à la fois au niveau des 15 jonctions et au niveau des extrémités de la longe, sont utilisées. Plus précisément, une des extrémités de la longe est digéré par Sbfl, ce qui crée un bout cohésif 3'-débordant de séquence 5'-TGCA-3' précédée des bases GG. Les séquences des oligo-L2 et oligo-Lc2 sont choisies de façon à obtenir un bout cohésif 3'-débordant de séquence 5'-TGCA-3' précédé de la base A, ce qui correspond au site de restriction de Nsil. Lors de 20 la ligature, il est donc possible de former des dimères molécule (B) - molécule (B), molécule (A) - molécule (A) et molécule (B) -molécule (A) car les deux types d'extrémités cohésives peuvent s'apparier entre elles. Cependant, si les enzymes Sbfl et Nsil sont ajoutés au mélange réactionnel les honnodinnères sont digérés en permanence et les monomères recyclés. Seuls les hétérodinnères sont stables et s'accumulent car le site de ligature possède 25 alors une séquence qui ne peut être reconnue par aucune des deux enzymes, i.e. 5'- ATGCAGG-3'. Une stratégie similaire est mise en place à l'autre extrémité de la longe et au niveau de la jonction portant le duplex issu de l'hybridation entre oligo-L1 et oligo-Lci ; ce sont cette fois-ci les enzymes Mlul et Ascl qui sont impliquées. Plus précisément, les oligonucléotides oligo-L1 et oligo-L2 (séquences indiqués ci- 30 dessus, dans la Tableau 2, en fonction du mode de réalisation), intégrés à la molécule (A) selon les étapes A et B, ont été hybridés, respectivement, aux oligonucléotides d'ADN simple-brin oligo-Lciet oligo-Lc2, en rapport équimolaire à une concentration finale d'environ 300 nM chacun pendant une heure à température ambiante dans du tampon « SureCut - lx (New England Biolabs). Comme illustré dans le Tableau 3, ci-dessous, les séquences des 35 oligonucléotides diffèrent lorsque la molécule - intermédiaire» est utilisée en aval pour la réalisation des Exemple 7 et 8 ou pour la réalisation de l'Exemple 9. 59 Tableau 3 : Oligonucléotides utilisées pour l'assemblage de la molécule " intermédiaire - Oligonucléotide Séquence SEQ ID Exemple(s) NO Oligo-Lci 5' -TGGATGGAGGCGTCTTGGCTCA-3' 21 7 et 8 Oligo-Lc2 5' -CGCGCCCTACCGATCAGTATGCCCATGGA-3' 22 7 et 8 Oligo-Lci 5' -CGCGCCCTACCGATCAGTATGCCCATGGA-3' 23 9 Oligo-Lc2 5' -TGGATGGAGGCGTCTTGGCTCA-3' 24 9 Ensuite, les molécules d'ADN (A) et (B) préparées comme ci-dessus ont été 5 combinées à une concentration finale d'environ 130 nM chacune dans 30 Ill de tampon - SureCut » lx (New England Biolabs), avec 0,5 pl chacun de Sbfl-HF (soit 10 unités), Mlul-HF (soit 10 unités), Nsil-HF (soit 10 unités) et Ascl (soit 5 unités), ADN-ligase HC-T4 (soit 1 000 unités) (New England Biolabs) et 1 nnM d'ATP et 2 nnM de DU, et laissés pendant une nuit à température ambiante. La réaction a été arrêtée par inactivation pendant 20 minutes à 65°C. 10 EXEMPLE 4 : ASSEMBLAGE DE LA MOLECULE D'ADN SUR UN MICROSCOPE Pour l'assemblage sur le microscope de la molécule d'ADN obtenue à l'Exemple 1, après les éventuelles étapes de digestion enzymatiques décrites dans les Exemple 7 ou 8, ou de celle obtenue à l'Exemple 2, le mélange réactionnel final est dilué à une concentration nominale d'ADN de 50 pM dans du tampon Tris (TrisCl 10 nnM, pH 8). En parallèle des billes 15 magnétiques (de type Dynal MyOne Cl de Thernnofisher) ont été préparées en prenant 10 pl de solution stock fournie par le fabricant, en les lavant avec 100 pl de tampon utilisé pour les expériences de micromanipulation, i.e. RB pour les Exemples 7 et 8 et DB pour l'Exemple 9 (voir l'Exemple 5 pour les compositions), en les concentrant avec un aimant, en éliminant le surnageant et en remettant les billes en suspension dans 10 pl du même tampon. Ensuite, 0,5 20 pl de la solution de molécule d'ADN double-brin selon l'invention est mélangé avec 10 pl de suspension de billes lavées. Après 5 à 10 secondes le volume du mélange est finalement ajusté par ajout de tampon pour arriver à un volume total de 25 pl puis injecté dans la cellule de mesure. La cellule de mesure consiste en deux lamelles de verre d'épaisseur n°1 (-180 pnn) 25 séparées par deux épaisseurs de parafilnn (-2 x 80 pnn) dans lesquelles un canal (1 mm x 50 mm) a été découpé. Les deux lamelles sont fonctionnalisées avec l'antidigoxigénine et passivées comme décrit dans Duboc et al., 2017. L'une des lamelles a des trous de 2 mm de diamètre situés au-dessus de chaque extrémité du canal et qui sont utilisés pour remplir et drainer le canal rempli de réactifs. La surface, aussi nommée support, est montée sur une 30 platine conçue sur mesure et placée au-dessus d'un objectif de microscope à immersion à huile (PlanA, 100x, NA 1.25, Olympus). Cet objectif fait partie d'un dispositif de piège magnétique (Lionnet et al., 2012 et Sarkar et Rybenkov, 2016) dans lequel une paire d'aimants permanents de haute qualité situés au-dessus de l'échantillon peut être translatée à la verticale de l'échantillon : la force appliquée aux billes magnétiques est augmentée, 5 alternativement réduite, en rapprochant, alternativement éloignant, les aimants de l'échantillon. La paire d'aimants permanents peut aussi effectuer un mouvement de rotation autour de l'axe optique de l'objectif de microscope, ce qui impose un mouvement de rotation à la bille et permet de surenrouler l'ADN. Dans son ensemble, le dispositif de piège magnétique permet de modifier les contraintes mécaniques appliquées à l'ADN. Un logiciel de 10 suivi de particules en temps réel, PicoJai (PicoTwist SARL), permet le suivi par vidéo- microscopie des billes magnétiques avec une résolution nanonnétrique et en temps réel (dans cette réalisation à environ 30 Hz, mais potentiellement également à 10 kHz). Un échantillon typique consiste en un champ de vision du microscope contenant environ 30 à 50 molécules d'ADN double-brin individuelles qui peuvent être surveillées 15 simultanément. Le fonctionnement des dispositifs selon l'invention (la solidité de l'attachement aux supports, l'absence d'interactions non-spécifiques avec les supports, etc.) sont systématiquement vérifiées avant toutes caractérisations des molécules à tester. On contrôle par exemple le changement approprié de l'extension des molécules d'ADN double-brin selon l'invention lorsque la force appliquée est variée entre 0,05 pN et environ 1 à 3 pN 20 (e.g. 1,4 pN). Lorsque cela est nécessaire, on peut vérifier en outre qu'une seule molécule d'ADN est attachée entre chaque bille et la surface de verre. Pour cela on s'assure que la position de la bille le long de l'axe optique ne change pas lorsque les aimants sont mis en rotation, ce qui est effectivement attendu lors de la libre rotation autour des jonctions. Par contre ce ne serait pas le cas si deux molécules d'ADN ou plus s'entortillaient l'une autour de 25 l'autre. EXEMPLE 5: CONDITIONS EXPERIMENTALES GENERALES Les exemples 7 et 8 ont été réalisés à 34°C dans du tampon de réaction RB (K-Hepes 20 nnM pH 7,8, KCl 100 nnM, MgCl2 5 nnM, DU 1 nnM, Tween-20 0,05%, BSA 0,5 mg/ml). Pour les expériences de ligature / réparation, l'ADN ligase du phage T4 (New England Biolabs) est 30 utilisée à une concentration de 200U/ml et les composants NHEJ (préparation en laboratoire) sont utilisés à une concentration de 10 nM Ku70/80 (dimère), 100 pM de DNA-PKcs, 20 nM de PAXX, 20 nM de XRCC4, 20 nM de XLF et 20 nM de ligase IV. Afin de digérer les molécules d'ADN qui avaient subi une ligature / réparation, nous avons perfusé le capillaire avec 100 pl de RB contenant soit 20 unités de Xnnal ou 10 unités de Snnal (New England Biolabs). 61 L'exemple 9 a été réalisé soit à 25°C soit à 30°C dans du tampon de réaction DB (KHepes 20 nnM pH 7,8, KCl 100 nnM, MgCl2 5 nnM, DU 2 nnM, Tween-20 0,1%, BSA 0,1 mg/ml). La rapannycine (Sigma) est utilisée diluée à 500 nM dans le tampon. EXEMPLE 6 : COLLECTION ET ANALYSE DES DONNEES 5 Les données de pinces magnétiques à l'échelle d'une molécule unique, donnant la position de chaque bille magnétique en fonction du temps et sous des cycles de modulation de la force appliquée, ont été obtenues en utilisant la suite logicielle PicoJai (Picotwist SARL). Ce programme de suivi de particules en temps réel permet d'analyser jusqu'à 100 molécules uniques en parallèle, avec une résolution nanonnétrique dans les 3 dimensions de 10 l'espace (Lionnet et al., 2012 ; Sarkar et Rybenkov, 2016). Il permet aussi de déterminer la tension appliquée à des molécules d'ADN par analyse des fluctuations browniennes des billes faisant office de support. Dans le cadre des Exemples 7, 8 et 9, les forces FHF et FLF sont inférées à partir de la position le long de l'axe optique des aimants, en ayant recours à une calibration préalable sur des molécules d'ADN plus longues (Charonnid 9-11, 11 kpb). 15 L'homogénéité en charge magnétiques des billes utilisées ainsi que la variation lente de force en fonction de position des aimants fait que ce procédé est robuste. En ce qui concerne les mesures associées à la caractérisation des interactions moléculaires entre molécules à tester, l'extension z des molécules d'ADN selon l'invention a été déterminée par analyse des traces de temps, ceci au cours de cycles variés où la force 20 appliquée F varie en fonction du temps selon un programme temporel établi (Figure 7). Plus précisément, la mesure du temps de vie, t, pour les molécules à tester sous leur forme dissociée - D » ou sous leur forme associée - A », requiert une variation de F entre une valeur basse, FLF, et une valeur haute, FHF, les cycles temporels suivis étant différents selon le type de mesure, e.g. association ou association (Figure 7). La valeur de FLF choisie doit permettre 25 une association efficace des molécules à tester tandis que la valeur FHF choisie doit permettre de distinguer les conformations - A » et - D » par mesure de l'extension z. Les événements donnant lieu à une modification de l'extension à haute force entre les formes A et D sont identifiés et le temps de vie associés à ces événements n'entrent dans l'analyse ultérieure que si la valeur - ZHF-D - ZHF-A, » observée se situe à moins de 3 écarts-types de l'amplitude 30 attendue (i.e. environ 160 nnn dans le cas d'une longe d'environ 700 pb). L'écart-type est celui obtenu en traçant l'histogramme des - ZHF-D - ZHF-A, » mesurés et en l'ajustant avec une gaussienne (Figures 11B et 9B). Les longueurs des passages à basse et haute force, de longueur respective TLF et THF, sont choisies en fonction d'hypothèses sur les temps caractéristiques d'association et de 35 dissociation, TA et TD. L'objectif est ici de pouvoir détecter, avec la plus grande précision possible, le plus grand nombre de transitions confornnationnelles sur la durée d'une 62 expérience. Chaque cycle décrit dans la Figure 7 conduit à la mesure éventuelle d'un temps de vie t, noté tLF.D pour les expériences d'association (Figure 7A, 9A) et tFIF-A pour les expériences de dissociation (Figure 7B, 11A). Ces cycles sont reproduits en série sur une même molécule et les données sont acquises en parallèle sur une vingtaine de molécules. Les 5 valeurs de t collectées sont ensuite rassemblées sous forme d'histogramme afin de pouvoir être analysées par ajustement exponentiel. L'histogramme des tLF.D donne le temps caractéristique d'association TA en utilisant la formule Probabilité x exp[-tLF.D/TA] (Figure 9C) et l'histogramme des tFIF-A donne le temps caractéristique de dissociation TD en utilisant la formule Probabilité x exp[-tFiF.A/TD] (Figures 1 1C). 10 Le temps caractéristique de dissociation peut ensuite être converti en vitesse de réaction de dissociation par inversion : kp = 1/TD. En effectuant ensuite des expériences pour différentes valeurs de FFIF et/ou de la température l'homme de l'art pourra finalement extraire des données collectées l'énergie d'activation de la réaction de dissociation et la distance séparant l'état de transition du complexe lors de la dissociation, ceci en utilisant 15 l'équation d'Arrhenius/Bell (voir Exemple 9) (Popa et al., 2011). EXEMPLE 7: INTERACTION COVALENTE ENTRE DEUX BOUTS COHESIFS D'ADN DOUBLE-BRIN, EN PRESENCE DE L'ADN LIGASE DU PHAGE T4 PUIS DE L'ENZYME DE RESTRICTION SMAI Matériels et méthodes 20 La molécule d'ADN double-brin est fabriquée en suivant les étapes (A) à (C) de l'Exemple 3 (Figure 6) suivi par les étapes (A) et (B) de l'Exemple 1 (Figure 4), en utilisant une molécule d'ADN ayant les séquences de SEQ ID : 9 et SEQ ID : 10, pour les molécules d'ADN (A) et (B) respectivement. Une digestion enzymatique est ensuite effectuée par Xnnal afin de générer un bout cohésif 5'-débordant de séquence 5'-CCGG-3' à chaque extrémité. 25 Cette digestion est effectuée en combinant 1 pl de solution à 3 nM de la molécule d'ADN selon l'invention issue de l'étape B de l'Exemple 1 et 10 unités de Xnnal (New England Biolabs) dans un volume final de 30 pl tamponné par la solution CutSnnart (New England Biolabs) selon le protocole du fabriquant. La digestion est effectuée à 37°C sur la nuit. L'enzyme de restriction a été inactivée par la chaleur selon les recommandations du 30 fabricant, et la construction a été diluée 30 fois à une concentration d'ADN nominale de 100 pM et stockée à -20°C. Les deux bouts cohésifs complémentaires peuvent donc par la suite s'apparier par interaction Watson-Crick. Les molécules à tester sont donc ici les bouts cohésifs des extrémités eux-mêmes. Les molécules d'ADN double-brin selon l'invention sont ensuite 35 couplées à des nnicrobilles magnétiques recouvertes de streptavidine, de diamètre 1 pnn (tel 63 que décrit, par exemple à l'Exemple 4). Le tout est finalement introduit dans un capillaire tapissé d'anti-digoxigénine ce qui permet de finaliser l'assemblage du dispositif en fixant les molécules d'ADN double-brin aux supports (Fig. 2). Résultats 5 À ce stade, les bouts cohésifs des extrémités ne s'apparient pas de façon stable. Sous l'effet d'une force alternant entre 0,05 et 1,4 pN on voit la distance bille - support passer de zu = 400 nnn à ZFIF-D = 1 080 nnn et inversement, signe que les molécules d'ADN double-brin transitent entre les états LF-D, - Low Force - Dissociated », et HF-D, - High Force - Dissociated » (Fig. 7). Cependant, après ajout d'ADN ligase du phage T4, au temps 10 expérimental d'environ 500 s, nous observons que l'extension maximale de la molécule d'ADN double-brin, sous l'effet d'une force de FFIF = 1,4 pN, n'est plus que de ZFIF-A = 880 nnn (Fig. 7B). Cette réduction résulte de la ligature des bouts cohésifs complémentaires lors du premier passage à basse force. Cette réaction conduit à exclure la longe de la mesure d'extension dans l'état HF-A, - High Force - Associated » et à lui substituer les deux bouts 15 associés en série (Fig. 7A). Plus précisément, la différence de position de la bille entre les deux états - High Force », déterminée par - ZHF-D - ZHF-A, «, correspond à 170 nnn, une valeur en accord avec l'estimation pouvant être tirée du modèle d'élasticité WLC (- worm-like chain », c.f. (Bouchiat et al., 1999)) lorsqu'une molécule linéaire d'ADN double-brin passe de 3 610 à 2 990 paires de bases et que la traction est de 1,4 pN. D'autre part, ce même modèle nous 20 indique que la variation de d'extension entre les deux états - Low Force », i.e. sous une traction FLF = 0,05 pN, devrait être noyée dans le bruit de fond de la mesure, ce qui est également mis en évidence ici (Fig. 7B). Finalement, le rajout de l'enzyme de restriction Snnal, au temps expérimental d'environ 1 600 s, permet de couper la liaison covalente entre les bouts cohésifs des extrémités et de retrouver l'extension maximale de la construction, 25 telle que mesurée en début d'expérience (Fig. 7B). Discussion Cet exemple démontre que des molécules d'ADN double-brin selon l'invention, ainsi que des dispositifs comprenant lesdites molécules et leurs supports, peuvent être fabriqués et sont pleinement fonctionnels. Elle valide le principe de la détection d'interaction entre 30 molécules à tester situées aux bouts des extrémités par mesure de la distance entre les extrémités des molécules d'ADN (1) et (2) attachées au supports (e.g. la deuxième extrémité de la première molécule d'ADN double-brin (1) et la deuxième extrémité de la deuxième molécule d'ADN double-brin (2)). 64 EXEMPLE 8: INTERACTIONS COVALENTE ET NON-COVALENTE ENTRE DEUX BOUTS FRANCS D'ADN DOUBLE-BRIN, EN PRESENCE DES PROTEINES PARTICIPANT AU S YS TEME DE REPA RATION NHEJ Matériels et méthodes 5 La molécule d'ADN double-brin est fabriquée en suivant les étapes (A) à (C) de l'Exemple 3 (Figure 6) suivi par les étapes (A) et (B) de l'Exemple 1 (Figure 4), en utilisant une molécule d'ADN ayant les séquences de SEQ ID : 9 et SEQ ID : 10, pour les molécules d'ADN (A) et (B) respectivement. Une digestion enzymatique est ensuite effectuée par Snnal afin de générer un bout franc à chaque extrémité. Cette digestion est effectuée en 10 combinant 1 pl de solution à 3 nM de construction issue de l'étape B de l'Exemple 1 et 20 unités de Snnal (New England Biolabs) dans un volume final de 30 pl tamponné par la solution CutSnnart (New England Biolabs) selon le protocole du fabriquant. La digestion est effectuée à 25°C sur la nuit. L'enzyme de restriction a été inactivée par la chaleur selon les recommandations du fabricant, et la construction a été diluée 2 fois à une concentration 15 d'ADN nominale de 50 pM et stockée à -20 °C. Le protocole de préparation est arrêté à ce stade si l'on souhaite étudier le phénomène de réparation jusqu'à la formation des liaisons covalentes reliant chacun des brins de la double-hélice. Par contre, une étape de déphosphorylation des bouts francs des extrémités est réalisée en utilisant l'antarctic phosphatase si l'on souhaite étudier les 20 interactions transitoires entre les deux extrémités d'ADN. Plus précisément, les bouts francs des extrémités de la molécule d'ADN ont été déphosphorylés en combinant, dans un volume de 10 pl de tampon lx ad hoc fourni par le fournisseur, 2 unités de phosphatase antarctique (New England Biolabs) et 0,6 fnnol du produit de digestion obtenu ci-dessus. La réaction a durée au moins 1 heure à 37°C avant d'être inactivée thernniquennent selon les 25 recommandations du fabricant. Encore une fois les molécules à tester sont donc ici les bouts francs des extrémités eux-mêmes. Résultats De la même façon que nous avons étudié la réparation par la ligase du phage T4 des 30 cassures présentant des bouts cohésifs (Figure 8B), nous nous intéressons au fonctionnement du système humain NHEJ (- non-homologous end-joining ») qui lui répare les cassures présentant des extrémités franches. Ce dernier est plus précisément constitué des protéines Ku70/Ku80, DNA-PKcs, PAXX, XRCC4, XLF et Ligase IV. La Figure 9A montre une expérience très similaire à celle effectuée lors de l'Exemple 7. En l'absence de liaison covalente entre 35 les bouts francs, l'extension varie entre zu.D = 400 nnn et ZFIF-D = 1 080 nnn lorsque la force varie entre FLF = 0,05 pN et FFIF = 1,4 pN. Cependant, après ajout du système NHEJ, au temps expérimental d'environ 600 s, l'extension maximale de l'ADN sous l'effet d'une force FFIF = 1,4 pN n'est plus que de ZFIF-A = 880 nnn. Cette réduction est attribuée à la ligature des bouts francs lors du second passage à basse force. Comme précédemment, le rajout de l'enzyme de 5 restriction Snnal après un certain nombre de cycles entre - High Force » et « Low Force », au temps expérimental d'environ 4 000 s, permet de couper la liaison covalente qui avait été formée et de retrouver l'extension maximale telle qu'initialement mesurée. Lorsque ce protocole est reproduit sur un grand nombre de billes, la mesure de la différence d'extension entre les formes HF-A et HF-D peut être affinée (Figure 9B) : la valeur moyenne - ZHF-D - ZHF- 10 Â» = 161 nnn déterminée à FFIF =1,4 pN est en accord avec l'estimation trouvée lors de l'Exemple 7 et avec les prédictions dérivées du modèle WLC - worm-like chain ». Finalement, on peut aussi tracer l'histogramme du nombre de passages à basse force, nu-D, nécessaires pour obtenir la ligature (Figure 9C). Par ajustement avec une exponentielle cette courbe fournit une estimation du temps caractéristique nécessaire à la formation de liens covalents 15 entre les molécules à tester, TA = 0,8 ± 0,2 cycle soit 240 ± 60 s si le résultat donné en cycles est multiplié par la durée d'un passage à basse force, à savoir TLF = 300 s. Ces expériences de ligature covalente ont aussi permis de tester la surenroulabilité des molécules d'ADN double-brin (1) et (2) associées en série (Figure 9) ; il n'y a aucune entaille dans les éléments fonctionnels susmentionnés. 20 Dans un second type d'expériences, nous avons cherché à mesurer le temps caractéristique de dissociation du complexe nucléoprotéique dans lequel les bouts francs ont été déphosphorylés, ce qui empêche le système NHJE de créer des liens covalents. Chaque passage à FLF = 0,05 pN permet aux bouts francs de s'associer et c'est donc la forme HF-A qui est observée lorsque l'on augmente la force à FFIF =1,4 pN. Puis, au bout d'un temps noté tHF. 25 A, l'extension de la construction passe à sa valeur maximale, signe que les bouts francs se sont dissociés et que c'est maintenant la longe qui est mise en tension (Figure 11A). Le tracé de l'histogramme des différences d'extension entre les formes HF-A et HF-D donne une valeur moyenne de - ZHF-D - ZHF-A, » = 166 nnn (Figure 1 1B). D'autre part un temps caractéristique de dissociation TD = 2,2 ± 0,3 s peut être extrait de l'histogramme des tFIF-A par ajustement 30 exponentiel (Figure 11C). Discussion Cet exemple met en évidence l'utilité de la molécule d'ADN selon l'invention, ainsi que des dispositifs comprenant lesdites molécules et leurs supports, pour conduire des études sur les processus de réparation de l'ADN. De plus, le fait de pouvoir injecter divers mélanges 35 de protéines et de pouvoir à chaque fois caractériser les complexes formés (données non présentées) est très avantageuse pour des études de criblage. 66 D'un point de vue technique, cet exemple illustre : (i) un protocole de mesure du temps caractéristique d'association lorsqu'une force constante est appliquée à des molécules à tester interagissant entre-elles ; (ii) un protocole de mesure de temps caractéristique de dissociation lorsqu'une force 5 constante est appliquée à des molécules à tester interagissant entre-elles ; et (iii) la possibilité d'appliquer, au travers de la rotation des aimants, un couple au complexe formé par les molécules à tester. EXEMPLE 9: INTERACTION NON-COVALENTE ENTRE LES PROTEINES FKBP12 ET FRB, EN PRESENCE DU MEDICAMENT RAPAMYCINE 10 Cet exemple porte sur un système pharmaceutique pertinent qu'il serait très avantageux de caractériser dans le domaine de la découverte/conception de médicaments. Matériels et méthodes La molécule d'ADN double-brin est celle réalisée selon la description donnée dans l'Exemple 3, suivi par les Exemples 1 et 2 (voir aussi Figure 6, Figure 4 et Figure 5, 15 respectivement pour une illustration de ces étapes), en utilisant une molécule d'ADN ayant les séquences de SEQ ID : 30 et SEQ ID : 10, pour les molécules d'ADN (A) et (B) respectivement. Cela nous permet de greffer spécifiquement les deux molécules à tester, à une extrémité la sous-unité FRB du complexe protéique nnTOR et à l'autre la protéine FKBP12. 20 Résultats La drogue rapannycine perturbe l'activité de la voie de signalisation nnTOR en se liant à la fois à FRB et à FKBP12. Afin d'estimer TD, le temps caractéristique de dissociation de ce complexe ternaire, nous avons utilisé un protocole expérimental très semblable à celui mis en oeuvre pour les associations non covalentes impliquant le système NHEJ (Figure 11). Les 25 traces temporelles enregistrées à 25°C lors d'une modulation de la force entre les valeurs FLF = 0,05 pN et FFIF = 1,4 pN à (Figure 12A) ont été converties en histogramme des tFIF-A dont on a pu ensuite extraire TD = 31,1 ± 2,3 s par ajustement nnonoexponentiel (Figure 12B). De plus, nous avons estimé la différence d'extension entre les formes HF-A et HF-D - ZHF-D - ZHF-A, » à environ 170 nnn, elle est essentiellement inchangée par rapport aux mesures effectuées lors 30 des Exemples 7 et 8. En effet la longueur de la longe moins celle des extrémités est restée la même dans la molécule d'ADN utilisée dans le présent Exemple 9, soit environ 700 pb, et le modèle « WLC » est très proche de la linéarité pour les hautes forces, ce qui explique une contribution identique de ces 700 pb à l'extension totale, ceci malgré l'utilisation de 67 molécules d'ADN (1) et (2) de taille différentes dans les Exemples 7 et 8 et dans le présent Exemple 9. A partir du temps caractéristique de dissociation, TB, il est possible de calculer la constante de vitesse de dissociation, kB, par inversion : kB = 1 / TB. Il vient donc dans le cas de 5 la Figure 12, qui correspond à une force appliquée FFIF = 1,4 pN et à une température T = 298 K, kB = 32,2 X 10-3 s-1. De mêmes mesures peuvent être effectuées à une force et/ou à une température différente, comme démontré dans la Figure 13. A T = 303 K nous obtenons ainsi kB = 48,4 x 10-3 s-1 pour FFIF = 1,4 pN et kB = 64,9 x 10-3 s-1 pour FFIF = 6 pN. Il est alors possible d'utiliser l'équation d'Arrhenius/Bell, k(FFIF,T) = A x exp[-ED/RT] x exp[XDFFIF/kBT], pour 10 calculer ED, l'énergie d'activation de la réaction de dissociation, et XD, la distance séparant l'état de transition du complexe lors de la dissociation (Popa et al., 2011). A est ici un préfacteur, R la constante universelle des gaz parfaits et kB la constante de Boltzmann ; R = 8,31 J K-1 mol' et kB = 1,38 x 10-23 J K. On trouve ED = 61,1 kJ mol-1 et XD = 2,66 Â. Discussion 15 D'un point de vue technique, le protocole de mesure de temps de vie de dissociation à force constante est confirmé. Il permet de déterminer de façon simple la constante de vitesse de dissociation. En effectuant ces mesures à différentes forces hautes et/ou à différentes températures, il est également possible de déterminer l'énergie d'activation de la réaction de dissociation et la distance séparant l'état de transition du complexe lors de la dissociation. 20 EXEMPLE 10: MISE EN EVIDENCE DE LA CAPACITE DU DISPOSITIF A DISTINGUER LES INTERACTIONS SPECIFIQUES DES INTERACTIONS NON-SPECIFIQUES Matériels et méthodes Comme à l'exemple 9, la molécule d'ADN double-brin est celle réalisée selon la description donnée dans l'Exemple 3, suivi par les Exemples 1 et 2 (voir aussi Figure 6, 25 Figure 4 et Figure 5, respectivement pour une illustration de ces étapes), en utilisant une molécule d'ADN ayant les séquences de SEQ ID : 30 et SEQ ID : 10, pour les molécules d'ADN (A) et (B) respectivement. Les protéines FKBP12 et FRB constituent ici les deux molécules à tester, qui sont greffées aux extrémités des molécules d'ADN (1) et (2) de façon spécifique. Les expériences sont réalisées à 25°C dans le tampon DB. 30 Résultats En plus des conformations A et D classiquement observées, caractérisées par les extensions ZLF, ZHF-A et ZHF-D, la molécule d'ADN reste ici bloquée dans une quatrième 68 conformation pendant un peu moins de 6 000 s. Cette conformation, notée S pour - Support », est caractérisée par les extensions zu et ZHF-s, la valeur de ce dernier paramètre indiquant une interaction de l'extrémité portant une des molécules à tester avec un des supports (voir la Figure 14). 5 Discussion Cet exemple démontre la capacité du dispositif à distinguer les interactions spécifiques des interactions non-spécifiques (e.g. entre une des molécules à tester et un des supports peuvent être mises en évidence, Figure 14). Avantageusement, l'utilisation de molécules d'ADN (1) et (2) de longueurs différentes et judicieusement choisies par rapport à 10 celle de la longe permet de détecter des variations non-spécifiques de l'extension à haute force (e.g. entre une des molécules à tester et un des supports), et donc par conséquent de ne pas analyser les événements concernés. Une stratégie permettant d'accrocher des molécules à tester de type protéique aux 15 extrémités et d'étudier des réactions d'association/dissociation entre elles, ceci en présence d'une molécule à tester de type petite molécule en solution, a notamment été mise en oeuvre dans ces exemples. Aussi, de façon très avantageuse, la molécule d'ADN selon l'invention, le dispositif comprenant ladite molécule d'ADN et ses supports, ainsi que le procédé de caractérisation d'une ou plusieurs interactions peut être utilisé pour détecter et caractériser 20 des interactions moléculaires, notamment afin d'identifier, de cribler, et/ou de concevoir de nouveaux médicaments, ou d'étudier les interactions moléculaires de médicaments actuels. 69 REFERENCES Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Eds., John Wiley Et Sons, Inc. New York, 1995. Bouchiat et al., Biophys. J. 1999; 76: 409-413. 5 Conroy, "Force Spectroscopy with Optical and Magnetic Tweezers," dans le Handbook of Molecular Force Spectroscopy, pages 23-96 (ed. A. Noy, Springer, 2008). Doi, Introduction to Polynner Physics, Clarendon Press, 1996. Duboc et al., Methods Enzynnol. 2017; 582 : 275-296. Gao et al., Science 2012 ; 337(6100) :1340-1343. 10 Halvorsen et al., Nanotechnology. 2011 ; 22(49) : 494005. 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Wiita et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2006; 103(19) : 7222-7227. Woodside et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103 (16): 6190-6195, 2006 Yang et al., Nat Commun. 2016 Mar 17;7:11026. doi: 10.1038/nconnnns11026. REVENDICATIONS1. Molécule d'ADN double-brin comprenant une première molécule d'ADN double-brin (1) reliée à une deuxième molécule d'ADN double-brin (2) par au moins une liaison covalente qui n'est pas une liaison phosphodiester, avantageusement par une longe, ladite longe étant avantageusement une molécule d'ADN double-brin. 2. Molécule d'ADN double-brin selon la revendication 1, dans laquelle ladite longe est attachée par au moins une liaison covalente qui n'est pas une liaison phosphodiester à la première molécule d'ADN double-brin (1) et par au moins une liaison covalente qui n'est pas une liaison phosphodiester à la deuxième molécule d'ADN double-brin (2). 3. Molécule d'ADN double-brin selon la revendication 1 ou_2, dans laquelle ladite longe est attachée à la première molécule d'ADN double-brin (1) par une première liaison covalente entre la première extrémité de ladite longe et une région intermédiaire de la première molécule d'ADN double-brin (1) et à la deuxième molécule d'ADN double-brin (2) par une deuxième liaison covalente entre la deuxième extrémité de ladite longe et une région intermédiaire de la deuxième molécule d'ADN double-brin (2). 4. Molécule d'ADN double-brin selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle une première molécule à tester est liée à une première extrémité de la ladite première molécule d'ADN double-brin (1) et une deuxième molécule à tester est liée à une première extrémité de la ladite deuxième molécule d'ADN double-brin (2). 5. Molécule d'ADN double-brin selon la revendication 4, dans laquelle ta deuxième extrémité de ladite première molécule d'ADN double-brin (1) est liée à un premier support et la deuxième extrémité de ladite deuxième molécule d'ADN double-brin (2) est liée à un deuxième support, avantageusement dans laquelle au moins un des deux supports est un support mobile. 6. Molécule d'ADN double-brin selon l'une quelconque des revendications 4 ou 5, dans laquelle : - ladite première molécule d'ADN double-brin (1) et/ou ladite deuxième molécule d'ADN double-brin (2) a une longueur de 300 à 5000 paires de bases, de préférence de 650 à 1500 paires de bases ; 71 - ta première extrémité de la première molécule d'ADN double-brin (1) et/ou la première extrémité de la deuxième molécule d'ADN double-brin (2) à une longueur de 10 à 150 paires de bases, avantageusement de 30 à 50 paires de bases ; et/ou - ladite longe à une longueur d'environ 300 à environ 50 000 paires de bases, avantageusement d'environ 500 à 10 000 paires de bases, plus avantageusement d'environ 600 à 3000 paires de bases. 7. Molécule d'ADN double-brin selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, dans laquelle ladite première et/ou ladite deuxième molécule à tester est sélectionnée dans le groupe composé des molécules suivantes : polymères, acides aminés, peptides, polypeptides, protéines, nucléosides, nucléotides, polynucléotides, oligonucléotides, sucres, polysaccharides, petites molécules, drogues, aptamères, antigènes, anticorps, lipides, lectines, hormones, vitamines, virus, fragments de virus, nanoparticules, molécules cellulaires de surface, et facteurs de transcription. 8. Molécule d'ADN double-brin selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, pour une utilisation dans la mesure des interactions entre au moins deux molécules à tester. 9. Dispositif comprenant la molécule d'ADN double-brin telle que décrite dans l'une quelconque des revendications 1 à 7 avec ses supports. 10. Molécule d'ADN double-brin comprenant une première molécule d'ADN double-brin (A) et une deuxième molécule d'ADN double-brin (B), ladite molécule d'ADN double-brin (A) comprenant un site de clivage qui est présent uniquement dans ladite molécule d'ADN double-brin (A), ladite molécule d'ADN double-brin (A) étant reliée à la molécule d'ADN double-brin (B) par deux liaisons covalentes qui ne sont pas des liaisons phosphodiesters, de part et d'autre dudit site de clivage. 11. Procédé de fabrication de la molécule d'ADN double-brin telle que décrite dans l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape suivante : a) le clivage de ta molécule d'ADN double-brin (A) telle que décrite dans la revendication 10 audit site de clivage, générant ainsi une molécule d'ADN double-brin comprenant une première molécule d'ADN double-brin (1) et une deuxième molécule d'ADN double-brin (2). 72 12. Molécule d'ADN double-brin obtenue par te procédé selon la revendication 11. 13. Procédé de caractérisation d'une interaction entre au moins deux molécules à tester liées à une molécule d'ADN double-brin telle que décrite dans l'une quelconque des revendications 1 à 7 ou telle que comprise dans le dispositif de la revendication 9, comprenant : a) l'application d'une force physique basse, FLF, à la molécule d'ADN double-brin, qui permet aux molécules à tester de s'associer ; b) l'application d'une force physique haute, FHF, à la molécule d'ADN double-brin, qui permet de déterminer si les molécules à tester sont associées ou dissociées ; et c) la détection d'un changement dans les propriétés conformationnelles de la molécule d'ADN comprenant : ta détermination de l'extension zu entre la deuxième extrémité de ta première molécule d'ADN double-brin (1) et la deuxième extrémité de la deuxième molécule d'ADN double-brin (2) à l'étape a) ; la détermination des extensions ZHF-A et zi-IF_D entre ta deuxième extrémité de la première molécule d'ADN double-brin (1) et la deuxième extrémité de la deuxième molécule d'ADN double-brin (2), à l'étape b) ; et la comparaison des extensions zu, zHF-A, et ZHF-D, en fonction du temps t. 14. Procédé selon la revendication 13, selon lequel la force physique à l'étape a) est de 0,01 pN à 0,4 pN et/ou selon lequel la force physique à l'étape b) est de 0,5 à 70 pN, avantageusement de 0,5 à 40 pN. 15. Procédé selon l'une des revendications 13 ou 14, selon lequel la caractérisation de l'interaction comprend la détermination d'au moins une des caractéristiques choisies parmi : le temps caractéristique d'association, le temps caractéristique de dissociation, la constante de vitesse de dissociation, l'énergie d'activation de dissociation, la distance séparant l'état de transition du complexe lors de la dissociation, et la constante d'équilibre de dissociation.