Brevet FR3083246A1 — publié le 20200103

Modèles cellulaires et tissulaires comprenant des fibroblastes de la jonction dermo-hypodermique et ses applications La présente invention concerne de nouveaux modèles cellulaire et tissulaire comprenant des fibroblastes de la jonction dermo-hypodermique, ainsi que leurs procédés de préparation. Par ailleurs, l'invention concerne également l'utilisation de ces modèles comme outils de criblage d'actifs favorisant la différenciation des fibroblastes en cellules adipocytes, ostéoblastes et/ou chondroblastes. La peau est constituée de trois compartiments liés, à savoir l'épiderme, le derme et l'hypoderme. L'épiderme est majoritairement constitué de trois types cellulaires, à savoir les kératinocytes, eux-mêmes majoritaires parmi les cellules de l'épiderme, les mélanocytes et les cellules de Langerhans. Ces cellules constituent un épithélium kératinisé qui se différencie en couches superposées surmontées d'une couche de cellules mortes formant le stratum corneum. L'hypoderme est constitué de travées conjonctives encadrant des lobules graisseux formés par l'accumulation d'adipocytes. Les travées conjonctives stabilisent la cohésion du tissu tout en facilitant le passage des vaisseaux. Les fonctions premières de l'hypoderme sont d'assurer une régulation thermique du corps mais aussi un stockage de molécules énergétiques et de toxines. Epiderme et hypoderme encadrent le derme. Ce dernier fournit à l'épiderme un support solide. C'est également son élément nourricier. Il est principalement constitué de fibroblastes et d'une matrice extracellulaire. Les fibroblastes souvent surnommés « cellules de soutien » sont présents dans de nombreux tissus conjonctifs, et en particulier au niveau de la peau, des tendons, du cartilage, du tissu osseux, etc... Aujourd'hui, seules deux sous populations de fibroblastes dans la peau ont été identifiées dans la littérature : les fibroblastes papillaires et les fibroblastes réticulaires. Leur potentiel à titre d'outil de criblage a notamment été mis en évidence par des études in vitro montrant leur capacité à se différencier en d'autres types cellulaires 1 formant les tissus conjonctifs telles que les cellules adipeuses (adipocytes), les cellules cartilagineuses (chondroblastes), les cellules osseuses (ostéoblastes). Ainsi, des modèles permettant de cribler des actifs favorisant la différenciation de fibroblastes en adipocytes, chondroblastes, et/ou ostéoblastes ont déjà été décrits 5 dans la littérature. On peut citer notamment Brun C et al. "Intrinsically aged dermal fibroblasts fail to differentiate into adipogenic lineage" Exp Dermatol. 2016 Nov 25(11):906-909; Chen FG et al."C/ona/ analysis of nestin(-) vimentin(+) multipotent fibroblasts isolated from humas dormis", J Cell Sci. 2007 Aug 15 120(Pt 16):2875-83 ; Jeney F et al. "Cytochemical studies on the fibroblast-preadipocyte relationships in 10 cultured fibroblast cell lines"Acta H istochem. 2000 Nov; 102(4):381-9. Outre l'utilisation pour l'étude de la capacité de différenciation des fibroblastes, de tels modèles s'avèrent également intéressant dans l'étude du vieillissement de la peau. Il est, en effet, connu que le vieillissement cutané corrèle une perte de capacité des fibroblastes à se différencier en adipocytes (Cécilia Brun et al. 'Altération de la 15 différenciation adipogénique des fibroblastes dermiques avec l'âge" annales de Dermatologie et Vénérologie, vol 143, Dec 2016). Cependant, il s'avère que ces modèles ne sont pas suffisamment efficaces, notamment pas suffisamment sensibles de telle sorte qu'ils écartent des actifs faux négatifs comme le montre les comparatifs ci-après. 20 Il demeure donc un besoin de fournir des modèles cellulaires ou tissulaires plus efficaces, et/ou plus sensibles qui permettent d'éviter l'obtention de résultat faux négatifs lors de leurs mises en oeuvre dans des procédés de criblage d'actifs favorisant la différenciation des fibroblastes en cellules adipocytes, ostéoblastes et/ou chondroblastes. 25 La Demanderesse a mis en évidence que l'utilisation d'une sous-population de fibroblastes dermiques particulière, les fibroblastes de la jonction dermohypodermique permet d'obtenir des modèles cellulaires ou tissulaires favorisant la différenciation de ces cellules en adipocytes, chondroblastes, et/ou ostéoblastes bien plus sensibles que ceux divulgués dans l'état de la technique, et en particulier permet 30 d'éviter les faux négatifs générés par une proportion trop importante de cellules de type fibroblastes papillaire et/ou réticulaire non répondeuses. Ainsi, la présente invention a pour premier objet un procédé de préparation in vitro d'un modèle cellulaire comprenant au moins une étape de culture de fibroblastes de la jonction dermo-hypodermique. 2 La présente invention se rapporte également à un procédé de préparation in vitro d'un modèle tissulaire comprenant au moins une étape de culture de fibroblastes de la jonction dermo-hypodermique sur éponge de collagène. Selon un autre de ses objets, la présente invention concerne les modèles 5 cellulaire et tissulaire obtenu par lesdits procédés. La présente invention concerne également un procédé de criblage d'actifs favorisant la différenciation de fibroblastes de la jonction dermo-hypodermique en cellules adipocytes, ostéoblastes et/ou chondroblastes mettant en oeuvre lesdits modèles cellulaire et tissulaire. 10 Description détaillée de l'invention Fibroblastes de la jonction dermo-hypodermique Par "fibroblaste de la jonction dermo-hypodermique" ou "fibroblaste FJDH", on entend ici un fibroblaste de la zone se trouvant au niveau des travées conjonctives 15 émises par le derme dans l'hypoderme. Les fibroblastes FJDH en culture ont typiquement une morphologie très hétérogène. Ainsi, des formes très diverses peuvent être observées dans le tapis cellulaire allant de toutes petites cellules tricuspides, à de très larges cellules multipolaires présentant un réseau trabéculaire intracellulaire fortement marqué (visible en microscopie optique). 20 Outre leurs caractéristiques morphologiques et leur localisation telles que mentionnées ci-dessus, les fibroblastes de la jonction dermo-hypodermique selon l'invention peuvent être identifiés en mesurant le niveau d'expression d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué des gènes UCP2, ACAN, FGF9 et COL11A1, et du niveau d'un produit d'expression du gène KLF9 25 En particulier, la méthode d'identification de fibroblastes comme étant les fibroblastes de la jonction dermo-hypodermique comprend : a) la fourniture d'un échantillon biologique comprenant au moins un fibroblaste dermique, b) la mesure, dans l'échantillon biologique fournis à l'étape a), du niveau d'un 30 produit d'expression d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué des gènes UCP2, ACAN, FGF9 et COL11A1, et du niveau d'un produit d'expression du gène KLF9, c) l'identification du fibroblaste dermique de l'étape a) comme étant un fibroblaste de la jonction dermo-hypodermique quand : 3 1) (i) le niveau du produit d'expression du gène UCP2 est diminué par rapport à un niveau contrôle, (ii) le niveau du produit d'expression du gène ACAN est augmenté par rapport à un niveau contrôle, 5 (iii) le niveau du produit d'expression du gène FGF9 est augmenté par rapport à un niveau contrôle, et/ou (iv) le niveau du produit d'expression du gène COL11A1 est augmenté par rapport à un niveau contrôle, et 10 2) le niveau du produit d'expression du gène KLF9 est augmenté par rapport à un niveau contrôle, les niveaux contrôle de 1(i), 1(ii), 1(iii) et 10v) étant de préférence respectivement le niveau du produit d'expression des gènes UCP2, ACAN, FGF9 et COL11A1 dans un fibroblaste dermique connu comme étant un fibroblaste papillaire et le niveau contrôle 15 de 2) étant de préférence le niveau du produit d'expression du gène KLF9 dans un fibroblaste dermique connu comme étant un fibroblaste réticulaire. Avantageusement, l'échantillon biologique fournis à l'étape a) est une culture in vitro de fibroblastes dermiques ou d'un mélange de fibroblastes dermiques, un échantillon provenant d'une biopsie de peau, ou un échantillon provenant d'un 20 équivalent de derme ou de peau obtenu in vitro. De préférence, l'échantillon biologique de fibroblastes dermiques est isolé à partir de peau humaine non dégraissée, au niveau des travées conjonctives présentes à la jonction dermo-hypodermique. Ces dernières sont prélevées à l'aide d'une pince et de ciseaux. 25 En particulier, l'échantillon provient d'une biopsie de peau humaine réalisée sur des sujets jeunes, tels que des sujets ayant entre 15 et 40 ans, de préférence, entre 17 et 31 ans. Par "produit d'expression du gène X", on entend ici l'ARNm codé par ledit gène X ou la protéine codée par ledit gène X. Le niveau du produit d'expression du gène X 30 peut donc être mesuré en quantifiant l'ARNm ou la protéine correspondant(e). Dans un mode de réalisation particulier, ledit produit d'expression du gène X est l'ARNm codé par ledit gène X. De préférence, le niveau du produit d'expression correspond à la concentration ou la quantité du produit d'expression. 4 Le niveau du produit d'expression du gène X dans l'échantillon testé est dit augmenté lorsque le ratio [niveau d'expression du gène X dans l'échantillon testé / niveau contrôle du gène X] est supérieur ou égal à 2. Le niveau du produit d'expression du gène X dans l'échantillon testé est dit 5 diminué lorsque le ratio [niveau contrôle du gène X / niveau d'expression du gène X dans l'échantillon testé] est supérieur ou égal à 2. Lorsque le ratio [niveau contrôle du gène X / niveau d'expression du gène X dans l'échantillon testé] est supérieur ou égal à 2, le signe (-) est apposé devant la valeur obtenue. 10 Ce ratio est plus communément appelé « fold change ». Par "niveau contrôle", on entend ici une valeur de référence correspondant de préférence au niveau dudit produit d'expression dudit gène dans un fibroblaste dermique connu comme étant un fibroblaste dermique papillaire ou réticulaire issu du du même donneur. 15 Par "fibroblaste dermique connu comme étant un fibroblaste dermique papillaire ou réticulaire", on entend ici un fibroblaste dermique dont le type (papillaire ou réticulaire) a préalablement été déterminé au vu de sa morphologie, de sa provenance ou de biomarqueurs détectés. En particulier, les fibroblastes dermiques connus comme étant des fibroblastes 20 dermiques papillaires ou réticulaires sont prélevés comme suit : a) les fibroblastes papillaire (Fp), réticulaire (Fr) ont été isolés à partir de peau humaine non dégraissée ; b) l'isolement des Fr s'effectue sur la partie de tissu ainsi déplétée de sa jonction dermo-hypodermique, le tissu est alors dermatomé à hauteur de 25 700 pm. Seule la partie inférieure du tissu est conservée ; et/ou c) l'isolement des Fp s'effectue sur tissu dermatomé à 300 pm puis déépidermisé après action de dispase (Roche - 2,4 Unité/ml) pendant 16h à 4°C. Le niveau du produit d'expression d'un gène X peut être mesuré à l'étape (b) de 30 la méthode d'identification précitée par toute technique bien connue de l'homme du métier. En particulier, lorsque le produit d'expression est une protéine, le niveau du produit d'expression peut être mesuré au moyens de dosages immunologiques tels que des dosages ELISA, des dosages immuno-fluorescents (IFA), des dosages radio-immunologiques (RIA), des tests de liaison compétitive ou des Western Blot. Lorsque 5 le produit d'expression est un ARNm, le niveau du produit d'expression peut être mesuré par RT-PCR, qRT-PCR, ddPCR (Droplet Digital PCR), par séquençage, par exemple par séquençage de type NGS (Next generation sequencing) ou par séquençage par ddSEQTM single cell isolator. 5 Par "fibroblaste dermique", on entend ici tout fibroblaste provenant du derme. Par "fibroblaste papillaire", on entend ici un fibroblaste du derme papillaire, le derme papillaire étant caractérisé par une matrice extracellulaire relativement fine et une forte densité cellulaire et se situe, au niveau tissulaire, entre l'épiderme et le plexus superficiel encore appelé rete subpapillae. Les fibroblastes papillaires en culture ont 10 typiquement une morphologie mince et fusiforme. Par "fibroblaste réticulaire", on entend ici un fibroblaste du derme réticulaire, le derme réticulaire étant caractérisé par un réseau très dense de fibres matricielles et une faible densité cellulaire. Au niveau tissulaire, il s'étend du plexus superficiel au plexus profond encore appelé rete cutaneum. Les fibroblastes réticulaires en culture 15 ont typiquement une apparence étendue et plus carrée. Par "gène UCP2", on entend ici le gène codant la "mitochondrial uncoupling protein 2". Le gène UCP2 est aussi appelé gène SLC25A8 et la protéine UCP2 est aussi appelée UCPH ou "solute carrier family 25 member 8". Elle appartient à la famille des protéines support anionique mitochondriales (MACP) et contrôle les espèces 20 d'oxygène réactives dérivées des mitochondries. Elle est typiquement décrite dans Pecqueur et al. (1999) Biochemical and Biophysical Research Communications 255:40-46. La séquence de la protéine UCP2 humaine est typiquement référencée sous le numéro UniProt P55851. Par "gène ACAN", on entend ici le gène codant Imaggrecan core protein". Le 25 gène ACAN est aussi appelé gène AGC1, CSPG1 et MSK16 et la protéine ACAN est aussi appelée "aggrecan" ou "cartilage-specific proteoglycan core protein" ou CSPCP ou "chondroitin sulfate proteoglycan core protein 1" ou "chondroitin sulfate proteoglycan 1". Elle fait partie de la matrice extracellulaire dans le tissu cartilagineux. Il s'agit d'un protéoglycane. Elle est typiquement décrite dans Doege et aL (1991) J. 30 Biol. Chem. 15:894-902. La séquence de la protéine ACAN humaine est typiquement référencée sous le numéro UniProt P16112. Par "gène FGF9", on entend ici le gène codant le facteur de croissance de fibroblaste 9. La protéine FGF9 est aussi appelée "Glia-activating factor" ou GAF ou "heparin-binding growth factor 9" ou HBGF-9. Elle a un effet stimulateur de croissance 6 sur les cellules gliales en culture. Elle est typiquement décrite dans Miyamoto et a/. (1993) Molecular and Cellular Biology 13:4251-4259. La séquence de la protéine FGF9 humaine est typiquement référencée sous le numéro UniProt P31371. Par "gène COL11A1", on entend ici le gène codant la chaîne al (XI) du 5 collagène. Le gène COL11A1 est aussi appelé gène COLLE. Cette chaine est une des deux chaines alpha du collagène de type XI, un collagène fibrillaire mineur. Elle est typiquement décrite dans Yoshioka et al. (1990) J Biot Chem. 15:6423-6426. La séquence de la protéine COL11A1 humaine est typiquement référencée sous le numéro UniProt P12107. 10 Par "gène KLF9", on entend ici le gène codant le facteur Krueppel-like 9 (ou "Krueppel-like factor 9"). Le gène KLF9 est aussi appelé gène BTEB ou gène BTEB1 et la protéine KLF9 est aussi appelée facteur de transcription BTEB1 ou protéine de liaison à la GC-box 1 ("GC-box-binding protein 1") ou "basic transcription elementbinding protein 1" ou protéine de liaison à BTE 1 ("BTE-binding protein 1"). Elle fait 15 partie de la famille des facteurs de transcription à doigt de zinc de type Spi C2H2. Elle est typiquement décrite dans Spar' et a/. (2012) Proc. Nati. Acad. Science USA 109:10903-10908. La séquence de la protéine KLF9 humaine est typiquement référencée sous le numéro UniProt Q13886. Dans le contexte de l'invention, les références UniProt citées ci-dessus sont 20 celles qui étaient disponibles au 19 juin 2018. Modèle cellulaire Procédé de préparation du modèle cellulaire La présente invention a pour objet un procédé de préparation in vitro d'un 25 modèle cellulaire comprenant au moins une étape de culture de fibroblastes de la jonction dermo-hypodermique. De préférence, lesdits fibroblastes de la jonction dermo-hypodermique sont identifiés conformément à la méthode d'identification telle que définie selon la section "Fibroblastes de la jonction dermo-hypodermique". 30 Lesdits fibroblastes sont en particulier ensemencés en un nombre compris entre 700 et 5000 cellules par cm2, de préférence entre 1000 et 4000 cellules par cm2. En outre, le support de culture utilisé est un support de culture 2D bien connu de l'homme du métier comme par exemple une boite de pétri traitée pour culture 7 cellulaire en plastique ou des plaques de culture multi puits telles que des microplaques 24 ou 96 puits. Avantageusement, lesdits fibroblastes sont cultivés entre 24h et 72h après atteinte d'au moins 80% de confluence, de préférence pendant 48h après atteinte d'au 5 moins 80% de confluence, encore mieux pendant 48h après atteinte de la confluence. On entend par "confluence" un tapis cellulaire présentant aucun interstice entre chaque cellule adhérente cultivée en monocouche sur un support approprié et peut par exemple être observée à l'oeil nu ou au microscope. Lesdits fibroblastes de la jonction dermo-hypodermique sont de préférence 10 cultivés dans un milieu de culture permettant leur amplification, en particulier un milieu choisi parmi MEM, DMEM, DMEM/F12, et/ou FGM comprenant en outre au moins 5% de sérum foetal de veau (SVF), de la glutamine, du sodium pyruvate, des acides aminés non essentiels et optionnellement des antibiotiques et/ou antimycotiques. Dans un mode de réalisation particulier, lesdits fibroblastes de la jonction 15 dermo-hypodermique sont cultivés dans un milieu de culture MEM comprenant en outre 10% de sérum foetal de veau (SVF), de la glutamine, du sodium pyruvate, des acides aminés non essentiels et optionnellement des antibiotiques et/ou antimycotiques. Par "amplification" on entend ici la prolifération ou multiplication des cellules. 20 Dans un premier mode de réalisation, le procédé de préparation in vitro d'un modèle cellulaire selon l'invention comprend en outre une étape de centrifugation des fibroblastes obtenus à l'issue de ladite étape de culture. Dans un second mode de réalisation le procédé de préparation in vitro d'un modèle cellulaire selon l'invention ne comprend pas d'étape de centrifugation des 25 fibroblastes obtenus à l'issue de ladite étape de culture. Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de préparation du modèle cellulaire selon l'invention ne comprend pas de mise en oeuvre d'étape de culture de fibroblastes autres que ceux de la jonction dermo-hypodermique, notamment ne comprend pas d'étape de culture de fibroblastes papillaires et/ou réticulaires. 30 Dans un autre mode de réalisation, l'étape de culture de fibroblastes de la jonction dermo-hypodermique dans le procédé de préparation selon l'invention est réalisée à partir d'un échantillon biologique comprenant une quantité de fibroblastes de la jonction dermo-hypodermique d'au moins 60%, de préférence d'au moins 80% par rapport à la quantité totale de cellules présentes dans ledit échantillon biologique. 8 De manière encore plus préférée, l'étape de culture de fibroblastes de la jonction dermo-hypodermique dans le procédé de préparation selon l'invention est réalisée à partir d'un échantillon biologique comprenant une quantité de fibroblastes de la jonction dermo-hypodermique comprise entre 60% et 95%, encore mieux entre 5 80% et 95% par rapport à la quantité totale de cellules présentes dans ledit échantillon biologique. L'échantillon biologique peut être une culture in vitro de fibroblastes dermiques ou d'un mélange de fibroblastes dermiques, un échantillon provenant d'une biopsie de peau, ou un échantillon provenant d'un équivalent de derme ou de peau obtenu in 10 vitro. De préférence, l'échantillon biologique de fibroblastes dermiques est isolé à partir de peau humaine non dégraissée, au niveau des travées conjonctives présentes à la jonction dermo-hypodermique. Ces dernières sont prélevées à l'aide d'une pince et de ciseaux. 15 Modèle cellulaire La présente invention concerne également un modèle cellulaire susceptible d'être obtenu selon le procédé précité à la sous-section "Procédé de préparation du modèle cellulaire". 20 De préférence, le modèle cellulaire selon l'invention comprend des fibroblastes de la jonction dermo-hypodermique, pour lesquels : 1) (i) le niveau du produit d'expression du gène UCP2 est diminué par rapport à un niveau contrôle, (ii) le niveau du produit d'expression du gène ACAN est augmenté par 25 rapport à un niveau contrôle, (iii) le niveau du produit d'expression du gène FGF9 est augmenté par rapport à un niveau contrôle, et/ou (iv) le niveau du produit d'expression du gène COL11A1 est augmenté par rapport à un niveau contrôle, 30 et 2) le niveau du produit d'expression du gène KLF9 est augmenté par rapport à un niveau contrôle, les niveaux contrôle de 1(i), 1(ii), 1(iii) et 10v) étant de préférence respectivement le niveau du produit d'expression des gènes UCP2, ACAN, FGF9 et 9 COL11A1 dans un fibroblaste dermique connu comme étant un fibroblaste papillaire et le niveau contrôle de 2) étant de préférence le niveau du produit d'expression du gène KLF9 dans un fibroblaste dermique connu comme étant un fibroblaste réticulaire. On réutilisera les définitions des termes "niveau contrôle", "fibroblaste dermique 5 connu comme étant un fibroblaste dermique papillaire ou réticulaire", "produit d'expression du gène X", "fibroblaste dermique", "fibroblaste papillaire", "fibroblaste réticulaire", "gène UCP2", "gène ACAN", "gène FGF9", "gène COL11A1", et "gène KLF9" mentionnées plus haut à la section "Fibroblastes de la jonction dermohypodermique". 10 Lorsque le procédé selon l'invention comprend en outre une étape de centrifugation des fibroblastes obtenus à l'issue de ladite étape de culture, alors le modèle cellulaire se présente sous la forme d'un sphéroïde. On entend par "sphéroïde" un amas de cellules de forme irrégulière et non organisé. 15 Dans un mode de réalisation particulier, le modèle cellulaire selon l'invention est constitué de fibroblastes de la jonction dermo-hypodermique, pour lesquels : 1) (i) le niveau du produit d'expression du gène UCP2 est diminué par rapport à un niveau contrôle, (ii) le niveau du produit d'expression du gène ACAN est augmenté par 20 rapport à un niveau contrôle, (iii) le niveau du produit d'expression du gène FGF9 est augmenté par rapport à un niveau contrôle, et/ou (iv) le niveau du produit d'expression du gène COL11A1 est augmenté par rapport à un niveau contrôle, 25 et 2) le niveau du produit d'expression du gène KLF9 est augmenté par rapport à un niveau contrôle, les niveaux contrôle de 1(i), 10i), 1(iii) et 10v) étant de préférence respectivement le niveau du produit d'expression des gènes UCP2, ACAN, FGF9 et 30 COL11A1 dans un fibroblaste dermique connu comme étant un fibroblaste papillaire et le niveau contrôle de 2) étant de préférence le niveau du produit d'expression du gène KLF9 dans un fibroblaste dermique connu comme étant un fibroblaste réticulaire. 10 Dans un autre mode de réalisation particulier, les fibroblastes de la jonction dermo-hypodermique sont présents dans le modèle cellulaire selon l'invention en une quantité d'au moins 60%, de préférence d'au moins 80% par rapport à la quantité totale de cellules présentes dans ledit modèle cellulaire. 5 De manière encore plus préférée, les fibroblastes de la jonction dermo- hypodermique sont présents dans le modèle cellulaire selon l'invention en une quantité comprise entre 60% et 95%, encore mieux entre 80% et 95% par rapport à la quantité totale de cellules présentes dans ledit modèle cellulaire. 10 Modèle tissulaire Procédé de préparation du modèle tissulaire La présente invention a également pour objet un procédé de préparation in vitro d'un modèle tissulaire comprenant au moins une étape de culture de fibroblastes de 15 la jonction dermo-hypodermique sur éponge de collagène. Le terme "éponge de collagène" est aussi bien connu de l'homme du métier. Il désigne des biopolymères à base de collagène. Selon l'invention, le collagène peut être tout type de collagène de toute origine, préférentiellement d'origine animale, en particulier d'origine bovine. A cet égard, on se 20 référera aux différents types de collagène cités dans les revues de Van der Rest et Garonne, 1990, Biochem., vol. 72, 473-484 ou encore 1991, Faseb journal, vol.5, 2814-2823. Ainsi, selon l'invention, le collagène est choisi de préférence parmi les collagènes fibrillaires de type I, III ou V, encore mieux le collagène utilisé dans le cadre 25 de la présente invention est du collagène de type I. On peut citer à titre d'exemple d'éponge de collagène, les éponges Mimedisk® commercialisé par BASF Beauty Care, ou encore Symatese Biomateriaux. Lesdits fibroblastes sont de préférence ensemencés en un nombre compris entre 125 000 et 500 000 cellules, de préférence entre 200 000 et 300 000 cellules. 30 De préférence, lesdits fibroblastes sont cultivés pendant 10 à 20 jours, de manière particulièrement préférée pendant 14 jours. Avantageusement, le modèle tissulaire selon l'invention ne se présente pas sous la forme d'une lattice de collagène. Le terme "lattice de collagène" est bien connu dans l'état de l'art (Bell et al. 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.76, N°3, pp.1274- 11 1278) et il désigne un modèle d'équivalent de derme connu et utilisé depuis des décennies. Lesdits fibroblastes de la jonction dermo-hypodermique sont de préférence cultivés dans un milieu de culture permettant leur amplification, en particulier un milieu 5 choisi parmi MEM, DMEM, DMEM/F12, et/ou FGM comprenant en outre au moins 5% de sérum foetal de veau (SVF), de la glutamine, du sodium pyruvate, des acides aminés non essentiels et optionnellement des antibiotiques et/ou antimycotiques. Dans un mode de réalisation particulier, lesdits fibroblastes de la jonction dermo-hypodermique sont cultivés dans un milieu de culture MEM comprenant en 10 outre 10% de sérum foetal de veau (SVF), de la glutamine, du sodium pyruvate, des acides aminés non essentiels et optionnellement des antibiotiques et/ou antimycotiques Par "amplification" on entend ici la prolifération ou multiplication des cellules. Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de préparation du modèle 15 tissulaire selon l'invention ne comprend pas de mise en oeuvre d'étape de culture de fibroblastes autres que ceux de la jonction dermo-hypodermique, notamment ne comprend pas d'étape de culture de fibroblastes papillaires et/ou réticulaires. Dans un autre mode de réalisation, l'étape de culture de fibroblastes de la jonction dermo-hypodermique dans le procédé de préparation selon l'invention est 20 réalisée à partir d'un échantillon biologique comprenant une quantité de fibroblastes de la jonction dermo-hypodermique d'au moins 60%, de préférence d'au moins 80% par rapport à la quantité totale de cellules présentes dans ledit échantillon biologique. De manière encore plus préférée, l'étape de culture de fibroblastes de la jonction dermo-hypodermique dans le procédé de préparation selon l'invention est 25 réalisée à partir d'un échantillon biologique comprenant une quantité de fibroblastes de la jonction dermo-hypodermique comprise entre 60% et 95%, encore mieux entre 80% et 95% par rapport à la quantité totale de cellules présentes dans ledit échantillon biologique. L'échantillon biologique peut être une culture in vitro de fibroblastes dermiques 30 ou d'un mélange de fibroblastes dermiques, un échantillon provenant d'une biopsie de peau, ou un échantillon provenant d'un équivalent de derme ou de peau obtenu in vitro. De préférence, l'échantillon biologique de fibroblastes dermiques est isolé à partir de peau humaine non dégraissée, au niveau des travées conjonctives présentes 12 à la jonction dermo-hypodermique. Ces dernières sont prélevées à l'aide d'une pince et de ciseaux. 5 Modèle tissulaire La présente invention concerne également un modèle tissulaire susceptible d'être obtenu selon le procédé précité à la sous-section "Procédé de préparation du modèle tissulaire". De préférence, le modèle tissulaire selon l'invention comprend des fibroblastes 10 de la jonction dermo-hypodermique, pour lesquels : 1) (i) le niveau du produit d'expression du gène UCP2 est diminué par rapport à un niveau contrôle, (ii) le niveau du produit d'expression du gène ACAN est augmenté par rapport à un niveau contrôle, 15 (iii) le niveau du produit d'expression du gène FGF9 est augmenté par rapport à un niveau contrôle, et/ou (iv) le niveau du produit d'expression du gène COL11A1 est augmenté par rapport à un niveau contrôle, et 20 2) le niveau du produit d'expression du gène KLF9 est augmenté par rapport à un niveau contrôle, les niveaux contrôle de 1(i), 1(ii), 1(iii) et 10v) étant de préférence respectivement le niveau du produit d'expression des gènes UCP2, ACAN, FGF9 et COL11A1 dans un fibroblaste dermique connu comme étant un fibroblaste papillaire 25 et le niveau contrôle de 2) étant de préférence le niveau du produit d'expression du gène KLF9 dans un fibroblaste dermique connu comme étant un fibroblaste réticulaire. On réutilisera les définitions des termes "niveau contrôle", "fibroblaste dermique connu comme étant un fibroblaste dermique papillaire ou réticulaire", "produit d'expression du gène X", "fibroblaste dermique", "fibroblaste papillaire", "fibroblaste 30 réticulaire", "gène UCP2", "gène ACAN", "gène FGF9", "gène COL11A1", et "gène KLF9" mentionnées plus haut à la section "Fibroblastes de la jonction dermohypodermique". Dans un mode de réalisation particulier, le modèle tissulaire selon l'invention est constitué des fibroblastes de la jonction dermo-hypodermique, pour lesquels : 13 1) (i) le niveau du produit d'expression du gène UCP2 est diminué par rapport à un niveau contrôle, (ii) le niveau du produit d'expression du gène ACAN est augmenté par rapport à un niveau contrôle, 5 (iii) le niveau du produit d'expression du gène FGF9 est augmenté par rapport à un niveau contrôle, et/ou (iv) le niveau du produit d'expression du gène COL11A1 est augmenté par rapport à un niveau contrôle, et 10 2) le niveau du produit d'expression du gène KLF9 est augmenté par rapport à un niveau contrôle, les niveaux contrôle de 1(i), 1(ii), 1(iii) et 10v) étant de préférence respectivement le niveau du produit d'expression des gènes UCP2, ACAN, FGF9 et COL11A1 dans un fibroblaste dermique connu comme étant un fibroblaste papillaire 15 et le niveau contrôle de 2) étant de préférence le niveau du produit d'expression du gène KLF9 dans un fibroblaste dermique connu comme étant un fibroblaste réticulaire. Dans un autre mode de réalisation particulier, les fibroblastes de la jonction dermo-hypodermique sont présents dans le modèle tissulaire selon l'invention en une 20 quantité d'au moins 60%, de préférence d'au moins 80% par rapport à la quantité totale de cellules présentes dans ledit modèle tissulaire. De manière encore plus préférée, les fibroblastes de la jonction dermo-hypodermique sont présents dans le modèle tissulaire selon l'invention en une quantité comprise entre 60% et 95%, encore mieux entre 80% et 95% par rapport à la quantité totale de cellules présentes dans ledit 25 modèle tissulaire. Utilisation et Procédé de criblage La présente invention se rapporte également à l'utilisation des modèles cellulaire ou tissulaire in vitro tels que définis dans les sections "Modèle cellulaire" et 30 "Modèle tissulaire" comme outil de criblage d'actifs favorisant la différenciation de fibroblastes de la jonction dermo-hypodermique en cellules adipocytes, ostéoblastes et/ou chondroblastes. 14 On entend par "adipocyte" des cellules caractérisée par une accumulation de gouttelettes lipidiques dans leurs corps cellulaires, ces gouttelettes peuvent fusionner pour constituer une seule vacuole lipidique qui occupera tout le volume de la cellule. Leur présence est souvent confirmée par l'utilisation de colorant lipidique tel que l'huile 5 rouge (Oil Red O) ou les soudans (noir soudan). On entend par "ostéoblaste" des cellules dont la morphologie ne diffère pas de celle des fibroblastes en culture bi-dimensionnelle. Leur présence est généralement confirmée par l'utilisation de colorant révélant la synthèse d'une matrice extracellulaire typique de celle d'une minéralisation osseuse. Pour ce faire des colorant comme 10 l'alizarine rouge sont utilisées. Celle-ci présente une forte affinité pour les dépôts calciques. Il est également possible de doser l'activité de l'alkaline phosphatase (enzyme fortement présente au sein de ces cellules). On entend par "chondroblaste" des cellules dont la morphologie ne diffère pas de celle des fibroblastes en culture bi-dimensionnelle. La présence de chondroblastes 15 est généralement mise en évidence par l'utilisation de colorant présentant une forte affinité pour la matrice extracellulaire qu'ils secrètent. Parmi les colorant fréquemment utilisés, nous pouvons citer : le bleu de Toluidine et la safranine O. Celles-ci possèdent une forte affinité pour les protéoglycans acides très présent dans le cartilage. Après fixation la safranine O se colore en orange voir en rouge, alors que le bleu de toluidine 20 présentera une coloration violette. Des marquages immunohistochimique dirigés contres des protéines fortement présentes dans cette matrice extracellulaire peuvent également être réalisé. On peut ainsi citer le collagène de type II, le collagène de type XI ou encore l'aggrecan. La présente invention concerne également un procédé de criblage d'actifs 25 favorisant la différenciation de fibroblastes de la jonction dermo-hypodermique en cellules adipocytes, ostéoblastes et/ou chondroblastes comprenant les étapes suivantes : i. disposer d'un modèle cellulaire ou tissulaire tel que défini selon les sections "Modèle cellulaire" et "Modèle tissulaire", 30 ii mettre en contact ledit modèle avec moins un agent à cribler, 15 W. effectuer une mesure qualitative et/ou quantitative de l'expression d'au moins un marqueur des cellules adipocytes, ostéoblastes et/ou chondroblastes, ou de leur(s) activité(s) biologique(s), puis iv. comparer la mesure effectuée à l'étape iii) à celle obtenue à partir 5 d'un témoin. Avantageusement, le témoin est un modèle cellulaire ou tissulaire cultivé dans les mêmes conditions que celui mis en oeuvre à l'étape i) mais qui n'aura pas reçu l'actif à cribler. Selon un premier mode de réalisation, ledit modèle à l'étape i) est un modèle 10 cellulaire susceptible d'être obtenu selon le procédé de préparation comprenant au moins une étape de culture de fibroblastes de la jonction dermo-hypodermique et permet d'effectuer à l'étape W) une mesure qualitative et/ou quantitative de l'expression d'au moins un marqueur des cellules adipocytes et/ou ostéoblastes, ou de leur(s) activité(s) biologique(s). 15 Selon un second mode de réalisation, ledit modèle à l'étape i) est un modèle cellulaire susceptible d'être obtenu selon le procédé de préparation comprenant au moins une étape de culture de fibroblastes de la jonction dermo-hypodermique suivie d'une étape de centrifugation et permet d'effectuer à l'étape iii) une mesure qualitative et/ou quantitative de l'expression d'au moins un marqueur des cellules chondroblastes 20 ou de leur(s) activité(s) biologique(s). Selon un troisième mode de réalisation, ledit modèle à l'étape i) est un modèle tissulaire susceptible d'être obtenu selon le procédé de préparation comprenant au moins une étape de culture de fibroblastes de la jonction dermo-hypodermique sur éponge de collagène et permet d'effectuer à l'étape W) une mesure qualitative et/ou 25 quantitative de l'expression d'au moins un marqueur des cellules adipocytes et/ou ostéoblastes, ou de leur(s) activité(s) biologique(s). On entend par "mesure qualitative et/ou quantitative de l'expression d'au moins un marqueur des cellules adipocytes, ostéoblastes et/ou chondroblastes", aussi bien des caractéristiques morphologiques visibles à l'oeil nu ou au microscope, mais 30 également la présence et/ou l'expression de gènes et/ou protéines spécifiques à un type cellulaire donné (adipocyte, ostéoblaste ou chondroblaste) comme mentionné plus haut à la section "Utilisation et Procédé de criblage" ainsi que dans les publications ci-après : Pittenger et al. Science 1999, Peiffer et al. Leukemia 2007, Choudhery et al. J Transi Med 2014. 16 On entend "activité biologique des cellules adipocytes, ostéoblastes et/ou chondroblastes", une activité enzymatique et/ou de production de métabolites spécifiques d'un type cellulaire donné (adipocyte, ostéoblaste ou chondroblaste) comme mentionné plus haut à la section "Utilisation et Procédé de criblage " ainsi que 5 dans les publications ci-après : Pittenger et al. Science 1999, Peiffer et al. Leukemia 2007, Choudhery et al. J Transi Med 2014. L'avantage d'un tel procédé de criblage est notamment la possibilité de sélectionner des actifs d'intérêt dans le domaine du soin de la peau et en particulier de l'anti-âge. 10 En outre, le procédé de criblage selon l'invention permet d'identifier de nouveaux actifs pour prévenir et/ou traiter les signes du vieillissement cutané et notamment des actifs visant à prévenir et/ou traiter les défauts esthétiques consécutifs à une perte de tissu conjonctif, comme par exemple une perte de tissu adipeux. 15 Les exemples et figures qui suivent sont proposés à titre illustratif et non limitatif du domaine de l'invention. Figures Figure 1 : Visualisation de la zone de prélèvement des fibroblastes de la jonction dermo-hypodermique. 20 Figure 2 : Mise en évidence de la différenciation de fibroblastes de la jonction dermo- hypodermique en cellules adipocytes dans un modèle cellulaire selon l'exemple 1. Figure 3 : Mise en évidence de la différenciation de fibroblastes de la jonction dermohypodermique en cellules ostéoblastes dans un modèle cellulaire selon l'exemple 1. Figure 4 : Mise en évidence de la différenciation de fibroblastes de la jonction dermo- 25 hypodermique en cellules chondroblastes dans un modèle cellulaire sphéroïde selon l'exemplel. Figure 5 : Mise en évidence de la différenciation de fibroblastes de la jonction dermohypodermique en cellules adipocytes dans un modèle tissulaire selon l'exemple 2. Figure 6 : Mise en évidence de la différenciation de fibroblastes Fp (hors invention), 30 Fr (hors invention), et F-JDH (selon l'invention) en cellules adipocytes dans un modèle cellulaire. Figure 7 : Mise en évidence de la différenciation de fibroblastes Fp (hors invention), Fr (hors invention), et F-JDH (selon l'invention) en cellules ostéoblastes dans un 17 modèle cellulaire. Figure 8 : Mise en évidence de la différenciation de fibroblastes Fp (hors invention), Fr (hors invention), et F-JDH (selon l'invention) en cellules chondroblastes dans un modèle cellulaire. 5 Exemple 1 : Procédé de préparation d'un modèle cellulaire obtenu à partir de fibroblastes de la JDH et validation de son utilisation à titre d'outil de criblage d'actifs favorisant la différenciation des fibroblastes de la JDH en cellules adipocytes, ostéoblastes et chondroblastes 1) Prélèvement des fibroblastes de la JDH 10 Les fibroblastes de la jonction dermo-hypodermique (F-JDH) ont été isolés à partir de peau humaine non dégraissée. Ces prélèvements sont collectés après réduction mammaires pour cause esthétique. L'isolement des F-JDH se fait à partir des travées conjonctives présentes à la jonction dermo-hypodermique. Ces dernières sont prélevées à l'aide d'une pince et de ciseaux. (voir Figure 1) 15 Après dilacération, les fragments de derme sont digérés sous l'action de collagénase de type II à 0,2% (Gibco) à 37°C. Les cellules sont ensuite amplifiées en milieu MEM - 10% sérum de veau foetal complémenté en Glutamine, sodium pyruvate, acide-aminés non essentiel, penicilline, streptomycine et fungizone, sous atmosphère humide, à 37°C et 5% de 20 CO2. 2) Méthode d'identification des fibroblastes de la JDH (vérification du phénotype cellulaire par RT-qPCR) Après amplifications des fibroblastes (entre 7 et 10 doublements de 25 population), les ARNm sont extraits sur colonne QIAgen selon les consignes données par le fournisseur. Les sondes considérées comme différentiellement exprimés devaient présenter un fold change > à 2 pour une p-value REVENDICATIONS1. Procédé de préparation in vitro d'un modèle cellulaire comprenant au moins une étape de culture de fibroblastes de la jonction dermo-hypodermique. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel les fibroblastes sont cultivés entre 24h et 72h après atteinte d'au moins 80% de confluence, de préférence lesdits fibroblastes sont cultivés pendant 48h après atteinte d'au moins 80% de confluence. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2 comprenant en outre une étape de centrifugation des fibroblastes obtenus à l'issue de ladite étape de culture. 15 4. Procédé de préparation in vitro d'un modèle tissulaire comprenant au moins une étape de culture de fibroblastes de la jonction dermo-hypodermique sur éponge de collagène. 5, Procédé selon la revendication 4 dans lequel lesdits fibroblastes sont cultivés 20 pendant 10 à 20 jours, de préférence pendant 14 jours. 6. Procédé de préparation in vitra d'un modèle cellulaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 ou procédé de préparation in vitro d'un modèle tissulaire selon la revendication 4 ou 5, comprenant en outre une étape 25 d'identification d'un fibroblaste dermique comme étant un fibroblaste de la jonction dermo-hypodermique, ladite étape d'identification étant préalable à ladite étape de culture et comprend a) la fourniture d'un échantillon biologique comprenant au moins un fibroblaste dermique, 30 b) la mesure, dans l'échantillon biologique fournis à l'étape a), du niveau d'un produit d'expression d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué des gènes UCP2, ACAN, FGF9 et COL11A1, et du niveau d'un produit d'expression du gène KLF9, c) l'identification du fibroblaste dermique de l'étape a) comme étant un 35 fibroblaste de la jonction dermo-hypodermique quand : 27 10 1) (i) le niveau du produit d'expression du gène UCP2 est diminué par rapport à un niveau contrôle, (ii) le niveau du produit d'expression du gène ACAN est augmenté par rapport à un niveau contrôle, 5 (iii) le niveau du produit d'expression du gène FGF9 est augmenté par rapport à un niveau contrôle, et/ou (iv) le niveau du produit d'expression du gène COL11A1 est augmenté par rapport à un niveau contrôle, et 2) le niveau du produit d'expression du gène KLF9 est augmenté par rapport à un niveau contrôle. 7. Modèle cellulaire in vitro susceptible d'être obtenu selon le procédé tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 3, et 6. 8. Modèle tissulaire in vitro susceptible d'être obtenu selon le procédé tel que défini dans l'une quelconque des revendications 4 à 6. 9. Utilisation des modèles cellulaire ou tissulaire in vitro tels que définis selon les revendications. 7 ou 8 comme outil de criblage d'actifs favorisant la différenciation de fibroblastes de la jonction dermo-hypodermique en cellules adipocytes, ostéoblastes et/ou chondroblastes. 10. Procédé de criblage d'actifs favorisant la différenciation de fibroblastes de la jonction dermo-hypodermique en cellules adipocytes, ostéoblastes et/ou chondroblastes comprenant les étapes suivantes L disposer d'un modèle cellulaire ou tissulaire te! que défini selon les revendications 7 ou 8, ii. mettre en contact ledit modèle avec au moins un agent à cribler, iii. effectuer une mesure qualitative et/ou quantitative de l'expression d'au moins un marqueur des cellules adipocytes, ostéoblastes et/ou chondroblastes, ou de leur(s) activité(s) biologique(s), puis iv. comparer la mesure effectuée à l'étape Hi) à celle obtenue à partir d'un témoin. 28