Brevet FR3082208A1 — publié le 20191213

Méthode de modification d'une séquence cible d'acide nucléique d'une cellule hôte. La présente invention concerne une méthode de modification d'une séquence cible d'acide nucléique d'une cellule hôte comprenant la mise en contact de la dite cellule hôte in vitro ou ex vivo avec un système biologique. Les procaryotes sont capables d'acquérir une immunité adaptative contre l'invasion d'éléments génétiques, tels que les plasmides ou les phages, via l'incorporation dans leur génome de courtes séquences d'ADN étranger (de 21 à 72 nucléotides [nt]), système appelé CRISPR- Cas (courtes répétitions palindromiques groupées et régulièrement espacée) [1, 2] . L'acquisition de ces séquences d'ADN étranger survient de façon adjacente aux gènes Cas qui ont pour rôle de cliver l'ADN étranger en fragments de petites tailles. CRISPR-Cas confère ainsi une résistance face à une seconde infection [14, 15] À ce jour, le système CRISPR-Cas n'avait été observé que chez les bactéries et les archées [16], mais pas chez des virus [1, 2]. La découverte des virus géants d'amibes, vivant en compétition avec d'autres microbes, a contesté la définition classique d'un virus [4, 5]. Depuis leur découverte, les virus géants ont révélé des caractéristiques phénotypiques et génotypiques uniques qui vont à l'encontre de la définition classique d'un virus, les plaçant à proximité de certains microbes. Les Mimivirus au diamètre supérieur à 0,5 micromètre, sont aisément visibles avec un simple microscope optique. Ils possèdent un génome large et complexe qui contient des séquences provenant d'autres organismes [6]. En outre, leur infection possible par des virus, les virophages, qui se multiplient dans l'usine à virus des Mimivirus, et la présence des éléments mobiles (transpovirons, polintons) ont suscité de vifs débats sur l'origine de ces virus [7]. De plus, les virophages, comme les bactériophages, peuvent s'intégrer au génome de Mimivirus sous la forme de provirophage [9].Un des 2 virophages qui parasite la famille des Mimivirus a été baptisé zamilon [10]. Dans cette étude publiée dans le journal Nature [8], les chercheurs ont observé qu'un groupe parmi les Mimivirus (appelé 5 lignées A) a développé une résistance contre l'infection par un virophage nommé zamilon, alors que les virus géants des lignées B et C sont sensibles à l'infection par ce virophage. Les chercheurs ont trouvé la présence d'une séquence répétée d'ADN de zamilon qui sert à accrocher le virophage uniquement dans la lignée A. Ce complexe a 10 ainsi été nommé MIMIVIRE (Mimivirus Vlrophage Résistance Elément) et présente des similarités fonctionnelles avec le système de défense CRISPR-Cas existant jusqu'alors uniquement chez les bactéries et les archées et comportant une enzyme déroulant l'ADN (hélicase R350) et une autre le coupant (nucléase R354). L'inactivation du complexe 15 MIMIVIRE a permis de restaurer la susceptibilité de Mimivirus à l'infection par le virophage. Les protéines partenaires comprises dans ce complexe MIMIVIRE sont impliquées dans la dégradation spécifique de l'ADN étranger. Le système de défense virale, MIMIVIRE, confère ainsi une immunité aux virus géants qui ont pu intégrer dans leur génome 20 l'ADN du virophage infectant. Plus précisément, 59 souches de la collection des virus géants de la famille des Mimiviridae d'Acanthamoeba polyphaga (dont 28 de la lignée A, 8 de la lignée B et 23 de la lignée C), ont été infectées par les virophages zamilon ou Sputnik, un autre virophage [11]. Après 24 25 heures, une augmentation de l'ADN de Sputnik a été observée dans l'ensemble des trois lignées de Mimiviridae. En revanche, zamilon a été capable de se répliquer uniquement avec les souches des lignées B et C de Mimiviridae, mais aucune souche de la lignée A. Une séquence de 28 nucléotides (nt), spécifique de zamilon, et trois répétitions de 15 nt ont 30 été retrouvées dans l'ensemble des génomes de la lignée A contrairement aux deux autres lignées (B et C). Ces séquences sont localisées dans un gène codant une transposase-A chez zamilon, et sont 3 intégrées dans le gène R349 de Mimivirus et dans les gènes orthologues, chez tous les Mimivirus de la lignée A. Ces séquences répétées sont séparées par des séquences de 9,48 et 63 nt respectivement. L'étude de l'environnement génomique au voisinage des 5 séquences répétées de zamilon a mis en évidence des ORF (open reading frame, cadre de lecture ouvert) conservés chez les Mimiviruses. Ces ORF possèdent une similarité distante avec les Cas protéines qui sont de type hélicase et nucléase. Silencés par RNA interférence, l'inactivation des ORF contenant la séquence répétée d'ADN de zamilon, 10 ou des ORF proche des Cas protéines, a permis de restaurer la susceptibilité de la lignée A des Mimivirus à l'infection par zamilon. En outre, l'expression des gènes a confirmé qu'ils codent une hélicase R350 et une nucléase R354. Désormais, les virus géants des lignée B et C sont dénommés 15 respectivement Momovirus pour la lignée B et Mégavirus pour la lignée C, Mimivirus étant réservé à la lignée A. Dans la suite de la présente demande de brevet lorsqu'il est indiqué Mimivirus, il s'agit donc de virus géant Mimivirus de la lignée A dont la séquence du génome est déposée dans Genebank sous la référence AY653733.1 et/ou qui a été déposé à 20 la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur (Paris) selon le traité de Budapest sous le numéro d'enregistrement CNCM I-5322 le 31 Mai 2018 sous la référence APBC1. Dans un article récent [17] la structure et l'activité nucléase de la protéine R354 ont été étudiées. 25 Les protéines R350 et R354 de Mimivirus sont connues de l'homme de l'art et ont été décrite [8,17] et reproduites dans les séquences SEQ. ID. N°: 1 et 2 du listage de séquences. Ce système de défense virale confère ainsi une immunité adaptative aux virus géants qui ont pu intégrer dans leur génome l'ADN 30 du virophage infectant. C'est pourquoi ce complexe a été nommé Mimivire (Mimivirus virophage resistance element) [11]. 4 Suite à l'étude de Nature 2016 (8), il a été toutefois contesté que Mimivirus puisse être également capable de développer un outil de type ciseaux biologiques analogue à celui de CRISPR-Cas [12]. Toutefois, selon la présente invention, on a démontré que le 5 système MIMIVIRE peut être adapté - mais différemment que le système CRISPR-Cas tel que décrit par exemple dans EP 2 800 811- pour offrir un nouvel outil biologique du type « ciseaux biologiques » comparable au système CRISPR-Cas pour des gènes étrangers autres que zamilon. Le but de la présente invention est donc de rechercher les 10 modalités selon lesquelles le système Mimivire peut être adapté pour fournir un système de « ciseaux biologiques » analogue au système CRISPR-Cas pour cibler des gènes autres que le gène zamilon dans Mimivirus et ainsi pour modifier des gènes ou séquences non codantes de bactéries ou cellules eucaryotes notamment. 15 Pour ce faire, la présente invention fournit une méthode de modification par coupure et/ou dégradation totale ou partielle d'une séquence cible d'acide nucléique d'une cellule hôte comprenant la mise en contact de la dite cellule hôte in vitro ou ex vivo avec un système biologique comprenant : 20 - un premier composant comprenant au moins une protéine choisie parmi les protéines R350 et R354 de virus géant Mimivirus de lignée A ou au moins un vecteur d'expression d'au moins une séquence d'acide nucléique des gènes R350 et/ou R354 codant pour respectivement au moins une dite protéine R350 et/ou R354, et 25 - un deuxième composant comprenant au moins une séquence d'acide nucléique, dénommée séquence d'affinité, la dite séquence d'affinité comprenant au moins une séquence complémentaire d'une séquence spécifique de ladite séquence cible, la dite séquence spécifique de ladite séquence cible comprenant au moins 10 nucléotides, 30 de préférence 15 nucléotides. 5 La séquence cible peut être une séquence d'ADN ou une séquence d'ARN transcrite du génome d'une dite cellule hôte. On comprend que ladite séquence spécifique de ladite séquence cible est autre qu'une séquence répétée du virophage zamilon contenue dans ledit gène R349. 5 La cellule hôte peut être une cellule de bactérie ou d'archée ou une cellule eucaryote unicellulaire ou pluricellulaire, notamment de plante ou d'animal. Les protéines R350 et R354 de Mimivirus sont connues de l'homme de l'art et ont été décrites ci-après dans les séquences SEQ. ID. N°: 1 10 et 2 du listage de séquences. Ces protéines R350 et R354 sont connues comme ayant des propriétés de d'hélicase et respectivement nucléase comprenant des activités d'exonuclease et d'endonucléase de sorte que la modification de la dite séquence cible peut comprendre une coupure en un site 15 spécifique et/ou une dégradation totale ou partielle de la dite séquence cible. On entend par « séquence complémentaire d'une séquence spécifique de 15 nucléotides de ladite séquence cible », une séquence d'ADN ou d'ARN qui s'hybride avec la dite séquence cible et qui ne 20 s'hybride avec aucune autre séquence d'une dite cellule hôte et desdits gènes R349, R350 ou R354. En revanche on comprend que les dites séquences flanquantes sont tirées dudit gène R349. Le gène R349 de Mimivirus est connu de l'homme de l'art et a été 25 décrit ci-après dans la séquence SEQ. ID. N°: 5 du listage de séquences. Des séquences des gènes R350 et 354 codant pour les protéines 350 et 354 de Mimivirus sont connues de l'homme de l'art et ont été 6 décrites dans les séquences SEQ. ID. N°: 3 et 4 du listage de séquences. Plus particulièrement, ledit deuxième composant comprend la dite la séquence d'affinité sous forme d'ADN ou de préférence sous forme 5 d'ARN. De préférence, ladite la séquence d'affinité comprend au moins 2 mêmes dites séquences complémentaires d'une même séquence spécifique, de préférence de 2 à 4, de préférence encore 4 mêmes dites séquences complémentaires d'une même séquence spécifique, répétées 10 de façon espacée. De préférence encore, la dite ou chaque dite séquence complémentaire de la même dite séquence spécifique de la séquence d'affinité comprend est flanquée en 3' et 5' de séquences adjacentes encadrant une séquence de 15 nucléotides du virophage zamilon 15 contenue et répétée 4 fois dans le gène R349 de virus géant Mimivirus. De préférence encore, les dites même séquences complémentaires de la même séquence spécifique de la séquence cible sont flanquées en 3' et 5' de séquences flanquantes différentes les unes des autres entre les différentes mêmes séquences complémentaires et les dites 20 séquences flanquantes correspondant respectivement aux séquences flanquantes des différentes mêmes séquences répétées du virophage zamilon contenues dans ledit gène R349 de Mimivirus. On comprend que les dites séquences flanquantes sont tirées de la séquence de 28 nucléotides (SEQ.ID. N 24) incluant la dite séquence 25 répétée de 15 nucléotides du virophage zamilon (SEQ.ID. N 6) dans le gène R349 ou tirées des séquences de 9, 48 et respectivement 63 nucléotides (SEQ. ID. N°26-28) qui séparent les séquences répétées du virophage zamilon dans le gène R349, ou une séquence flanquante en 3' de la dernière séquence spécifique répétée en 3' de 15 nucleotides du 30 virophage zamilon dans le gène R349. 7 Plus particulièrement, ladite séquence d'affinité comprend le gène R349 modifié dans lequel seules les 4 séquences répétées de 15 nucléotides du virophage zamilon sont remplacées aux mêmes localisations par les dites 4 mêmes séquences complémentaires d'une 5 dite séquence spécifique de la dite séquence cible. Un tel gène R349 modifié est illustré par la séquence SEQ.ID N° 7 incluant une séquence spécifique de 15 nucléotides du gène de résistance à la tétracycline de la séquence SEQ.ID N°23. Plus particulièrement encore, ladite séquence d'affinité est 10 intégrée dans un vecteur de clonage de la dite séquence d'affinité apte à transformer ou transfecter une dite cellule hôte et y répliquer la dite séquence d'affinité. Plus particulièrement encore, ladite séquence d'affinité est intégrée sous forme d'ADN placée sous le contrôle d'un promoteur de 15 transcription apte à transcrire la dite séquence d'affinité d'ADN en ARN dans la dite cellule hôte. Plus particulièrement encore, ladite cellule hôte est une bactérie ou une cellule eucaryote. Plus particulièrement encore, ledit premier composant comprend 20 un vecteur d'expression d'au moins une séquence d'acide nucléique R350 et/ou R354 codant pour et apte à exprimer respectivement au moins une dite protéine R350 et/ou R354 dans une dite cellule hôte. Plus particulièrement, les séquences d'acides nucléiques codant pour les protéines R350 et/ou R354 sont intégrés dans un plasmide, 25 sous le contrôle d'un promoteur d'expression, par exemple le promoteur T7 pour une bactérie et le promoteur CMV pour une cellule eucaryote, et encadrés des séquences de localisation nucléaire (NLS) afin d'adresser les protéines dans le noyau de la cellule eucaryote le cas échéant. 8 Plus particulièrement encore, les dits premier et deuxième composants sont intégrés dans un même dit vecteur, de préférence un plasmide. Selon la présente invention, on a en particulier découvert que la 5 protéine R350 n'est pas une simple hélicase avec mais présente une activité endonucléase spécifique qui coupe spécifiquement les dites séquences spécifiques répétées au sein de la séquence cible de la cellule hôte. Dans un mode préféré de réalisation, la présente invention fournit 10 une méthode pour au moins couper en un site spécifique la dite séquence cible, caractérisé en ce que le dit premier composant comprend au moins la protéine R350 ou au moins un vecteur d'expression d'au moins une séquence d'acide nucléique du gène R350 codant pour respectivement au moins une dite protéine R350. 15 Plus particulièrement, la présente invention fournit une méthode pour au moins couper en un site spécifique et dégrader au moins partiellement la dite séquence cible, caractérisé en ce que le dit premier composant comprend au moins la protéine R350 et la protéine R354 ou au moins un vecteur d'expression d'au moins des séquences d'acides 20 nucléiques des gènes R350 et R354 codant pour respectivement au moins les dites protéines R350 et R354. Plus particulièrement encore, les dits premier et deuxième composants sont intégrés dans un même dit vecteur comprenant les séquences de Mimivirus de lignée A incluant : 25 - au moins une partie modifiée du gène R349, de préférence le gène R349 modifié complet, ladite partie modifiée du gène R349 incluant une partie du gène 349 incluant au moins une des 4 séquences répétées de 15 nucléotides du virophage zamilon du gène R349, de préférence les 4 séquences répétées, la dite modification de la dite 30 partie modifiée du gène R349 consistant en ce que la (ou les) dite(s) séquence(s) répétée(s) de 15 nucléotides du virophage zamilon du gène 9 R349 est (ou sont) remplacée(s) par une même dite séquence complémentaire d'une séquence spécifique de la dite séquence cible, et - une séquence permettant la transcription en ARN dans une dite cellule hôte de ladite partie modifiée du gène R349, de préférence du 5 gène R349 modifié complet, et - les gènes R350 et 354, ainsi que des séquences permettant l'expression des gènes R350 et R354 dans une dite cellule hôte. Plus particulièrement encore, pour une cellule hôte de bactérie, les dits premier et deuxième composants sont intégrés dans un même 10 dit vecteur comprenant les séquences de Mimivirus de lignée A incluant l'une des séquences SEQ.ID.N°22 ou SEQ.IDN°25 dans laquelle la séquence répétée 4 fois spécifique du gène de résistance à la tétracycline SEQ.ID.N°23 est remplacée par une dite séquence complémentaire d'une séquence spécifique de 15 nucléotides de la 15 séquencé cible. La présente invention fournit aussi un système biologique utile pour la mise en oeuvre d'une méthode selon l'invention de modification par coupure et/ou dégradation totale ou partielle d'une séquence cible d'acide nucléique d'une cellule hôte comprenant la mise en contact de la 20 dite cellule hôte in vitro ou ex vivo, tel que définie ci-dessus comprenant : - un premier composant comprenant au moins une protéine choisie parmi les protéines R350 et R354 de virus géant Mimivirus de lignée A ou au moins un vecteur d'expression d'au moins une séquence d'acide 25 nucléique de(s) gène(s) R350 et/ou R354 codant pour respectivement au moins une dite protéine R350 et/ou R354, et - un deuxième composant comprenant une séquence d'acide nucléique, dénommée séquence d'affinité, la dite séquence d'affinité comprenant au moins une séquence complémentaire d'une séquence 30 spécifique de ladite séquence cible, la dite séquence spécifique de ladite 10 séquence cible comprenant au moins 10 nucléotides, de préférence 15 nucléotides, de préférence la ou chaque dite séquence complémentaire d'une séquence spécifique de ladite séquence cible étant flanquée en 3' et 5' de séquences adjacentes encadrant une séquence de 15 5 nucléotides du virophage zamilon contenue et répétée 4 fois dans le gène R349 de virus géant Mimivirus. La présente invention couvre également des dites méthodes et systèmes biologiques selon l'invention mis en oeuvre avec des dites séquences d'acides ou de protéines qui sont homologues voire 10 orthologues à celles des dites séquences, et/ou présentant des similarités notamment avec au moins 90% d'identité de dites séquences. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront mieux à la lecture de la description qui va suivre, faite de manière illustrative et non limitative, en référence aux dessins annexés 15 sur lesquels : Les figures 1A-1B et 2A-2B représentent des gels d'électrophorèse d'agarose de diverses séquences d'acides nucléiques en présence ou non des protéines R350 et/ou R354. La figure 3 est un schéma du mode d'action hypothétique de 20 l'hélicase R350 et la nucléaseR354. La figure 4 représente un gel d'électrophorèse de polyacrylamide (15%) montrant l'effet de l'ARN. La figure 5 est un schéma illustrant le mode d'action .de l'ARN sur la réplication de l'ADN en présence d'ADN polymérase. 25 La figure 6 montre les constructions des plasmides PP20 et PP21 d'expression des protéines R350 et R354. Les figures 7A-7B représentent des gels SDS-PAGE et analyse par Western-blot des protéines extraites des cellules eucaryotes 11 transfectées ou non par les plasmides PP20 et/ou PP21 sur une membrane de nitrocellulose hybridée avec un anticorps anti-FLAG. La figure 8A représente le vecteur PP14 comprenant la séquence SEQ.ID.N°25 incluant le système Mimivire modifié de la séquence SEQ. 5 ID. N°22 comprenant une séquence dirigée contre le gène de résistance à la tétracycline de la séquence SEQ.ID.N°23. La figure 8B représente le vecteur pACYC184 portant une séquence dirigée contre le gène de résistance à la tétracycline (SEQ.ID.N°23). 10 Les figures 9 à 12 montrent des résultats comparatifs de culture de bactéries avec abolition la résistance à la tétracycline pour les bactéries transformées par le vecteur PP14. Les résultats des exemples d'expériences réalisées sont rapportés ci-après (paragraphes I.A, I.B et I.C) et les matériels et méthodes sont 15 explicités en fin de description (Paragraphe II). Un listage de séquences reprend des séquences SEQ.ID.N°1 à 33 mentionnées ci-après. On a réalisé ci-après deux séries d'expériences. La première série d'expériences (I.A) vise à expliciter la compréhension du mécanisme d'action du système Mimivire. La deuxième série d'expériences (I.B, I.C) 20 vise à confirmer les résultats mis en évidence précédemment en utilisant le système MIMIVIRE pour modifier une séquence spécifique du gène de résistance à la tétracycline dans un système procrayote (E.co/i) (I.C) et modification d'un gène reporteur dans des cellules eucaryote (I.B) en réalisant l'inactivation d'un gène rapporteur sera facilement 25 identifiable. I.A) Première série d'expériences vise à expliciter la compréhension du mécanisme d'action du système Mimivire. 1) On a utilisé les 2 protéines recombinantes R354 (Nucléase) et R350 (Hélicase) sur différents substrats nucléiques notamment (a) 12 l'ORF4 du virophage zamilon de 594 nucléotides (produit amplifié par les amorces SEQ. ID. N° 12 et 13 du tableau 1 ci-après) qui porte la séquence répétée de 15 nucléotides du virophahe zamilon (SEQ. ID. N°6) ainsi que (b) le gène R349 (SEQ. ID. N°5), tous 2 obtenus par PCR 5 avec les amorces de séquences SEQ.ID.N° 10 à 13 du tableau 1). Les figures 1A et 1B représentent des gels d'électrophorèse d'agarose (1%) de séquences d'ADN des gènes amplifiés par PCR de la séquence ORF4 de zamilon (fig.1A) et du gène R349 de Mimivire (fig.1B) traités avec une protéine R354 (N), une protéine R350 (N), les deux 10 protéines (N+H) et un contrôle sans protéine (C). Seule une activité exonucléasique de la protéine R354 a été observée avec dégradation totale non spécifique de l'ADN (Figures 1A et 1B). 2) On a recherché si l'action du système Mimivire impliquerait 15 l'assistance de l'ARN correspondant à la séquence répétée, qui formerait ainsi un hétéroduplexe avec le simple brin de l'ORF4 notamment lors de la réplication de l'ADN du virophage et provoquerait ainsi l'arrêt de la réplication de l'ADN virophage. Pour ce faire, on a réalisé des tests in vitro utilisant une matrice 20 d'ADN synthétique correspondant à (a) une zone de 130 nucléotides de l'ORF4 de zamilon incluant la séquence répétée (séquence sens ou « forward » SEQ. ID. N° 8 et séquence anti-sens ou« reverse SEQ. ID. N° 9) et (b) un ARN de 15 nucléotides correspondant la séquence répétée (séquence sens ou « forward » SEQ. ID. N° 18 et séquence 25 anti-sens ou « reverse » SEQ. ID. N° 19). Après hybridation, l'action de la nucléase R354, hélicase R350ou nucléase + hélicase a été testée. La figure 2A représente des gels d'électrophorèse de polyacrylamide (15%) de séquences d'acides nucléiques comprenant l'ADN simple brin du gène ORF4 de zamilon et une séquence d'ARN de 30 15 nucléotides complémentaires à la séquence répétées du virophage 13 zamilon, avec une protéine R354 (N), une protéine R350 (N), les deux protéines (N+H) et un contrôle sans protéine (C). La figure 2B représente des gels d'électrophorèse de polyacrylamide (15%) de séquences d'acides nucléiques comprenant 5 l'ADN double brin du gène ORF4 de zamilon et une séquence d'ARN de 15 nucléotides complémentaires à la séquence répétées du virophage zamilon, avec une protéine R354 (colonnes N), une protéine R350 (N), les deux protéines (N+H) et un contrôle sans protéine (C). Le résultat montre de façon surprenante que l'hélicase coupe au 10 niveau du l'héteroduplexe alors que le nucléase dégrade totalement la matrice ADN (Figure 2A). Parallèlement, aucune action des deux protéines n'a été observée sur le double brin (Figure 2B). Ces résultats suggèrent que la protéine codée par le gène R350 a une fonction d'endonucléase contrairement aux prédictions 15 bioinformatique (hélicase). Afin de déterminer le site de coupure de manière exact, les fragments issus de cette digestion ont été séquences. Le séquençage nous a permis de situer entre la 8ieme et 9ieme nucléotide de la séquence répétée le site de coupure (TGATAATGvAATCTGA). 20 Ceci suggère que son action n'intervient que sur l'hétéroduplexe ADN/ARN retrouvé notamment lors de la réplication de l'ADN. Le mécanisme de résistance de Mimivirus envers zamilon pourrait s'opérer à travers l'introduction de cette coupure au niveau de l'ORF4 de zamilon par la protéine codée par le gène R350 suivie par la dégradation par la 25 nucléase R354 comme illustré sur le schéma de la figure 3 sur laquelle l'ARN est référencé par A, la protéine R350 par B, et la protéine R354 par C. La figure 3 illustre le mode d'action de l'hélicase et la nucléase sur l'ORF4 de zamilon in vivo. 14 De plus, on a observé que la présence de cet ARN de séquence répétée bloque la polymérisation d'une zone de l'ORF4 de zamilon incluant la séquence répétée et génère des formes tronquées (Figure 4). On peut donc en inférer qu'à l'échelle de la réplication de zamilon, la 5 réplication est stoppée comme illustré dans la figure 5 au niveau de l'ORF4. La Figure 4 représente un gel d'électrophorèse de polyacrylamide (15%) montrant l'effet de l'ARN de séquence complémentaire (SEQ. ID. N° 18 et 19) à l'unité de séquence répétée sur la réplication d'un 10 oligonucléotide de 130 bases (SEQ. ID. N° 8 et 9) correspondant la séquence de l'ORF4. On a réalisé l'electrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant (15 % PAGE) d'un ADN synthétique (sens (SEQ. ID. N° 8) ou anti-sens (SEQ. ID. N° 9) utilisé comme matrice par l'ADN polymérase ADN dépendante (Klenow) après une hybridation 15 préalable avec un ARN complémentaire correspondant à l'unité de séquence répétée (SEQ. ID. N° 18 et 19). Les contrôles ont été réalisés dans les mêmes conditions en absence de Klenow (C= sans Klenow) ou d'ARN (+= avec ARN ou - = sans ARN). La figure 5 est un schéma illustrant le mode d'action .de l'ARN 20 complémentaire à l'unité de séquence répétée (1) sur la réplication de l'ADN (2) en présence d'ADN polymérase (3) montrant l'importance cruciale de cet ARN dans le processus d'action du système Mimivire. I.B) Utilisation du système MIMIVIRE dans des cellules eucaryotes. 25 On a cherché à confirmer les résultats précédemment mis en évidence en utilisant le système MIMIVIRE dans un système eucaryote en effectuant l'inactivation d'un gène rapporteur facilement identifiable. On a choisi d'inactiver le gène de la Green Fluorescent Protein (GFP) dans la lignée de cellules humaines HEK293. Dans un premier 30 temps, on a cloné respectivement les gènes R350 et R354 étiquetés 15 FLAG et flanqués des séquences NLS dans les plasmides pcDNA3.1/Hygro ou pcDNA3.1/Zeo comme illustré dans la figure 6 La figure 6 montre les constructions des plasmides de transfection PP20 et PP21 utilisées dans cette étude pour valider le système 5 MIMIVIRE dans lesquels les gènes MIMI_R354 (nucléase) et MIMI_R350 (hélicase) sont sous le contrôle du promoteur CMV et encadrés des séquences de localisation nucléaire (NLS) afin d'adresser l'hélicase et la nucléase dans le noyau de la cellule. On a transfecté les cellules 293GFP avec ces plasmides afin 10 d'établir une nouvelle lignée de cellules HEK293 GFP qui exprime les protéines R350 et R354. L'expression de la nucléase et de l'hélicase a été confirmée par Western Blot avec un anticorps monoclonal anti-FLAG (figures 7A-7B). Cet anticorps anti-FLAG reconnait les bandes a 101.6 KDa pour l'hélicase et 70.8 KDa pour la nucléase. 15 Les Figures 7A-7B représentent des gels SDS-PAGE et analyse par Western-blot des protéines extraites des cellules 293GFP. On a réalisé des électrophorèses sur gel 10% SDS-PAGE de 50 pg d'un extrait protéique provenant des cellules 293GFP transfectées ou non par les plasmides PP20 et/ou PP21(Fig.7A) sur une membrane de nitrocellulose 20 hybridée avec un anticorps anti-FLAG au 1:1000 (Fig.7B). Les tailles sont indiquées à gauche en KDa. Dans un second temps, on a fait synthétiser un ARN de 45 nucléotides (séquences sens et antisens SEQ.ID.N°20-21, tableau 1) comprenant 2 unités de séquence spécifique répétées de 15 nucléotides 25 provenant de la GFP (séquences sens et antisens SEQ.ID.N°29-30, tableau 1) et encadrée de la même séquence que l'on peut trouver dans le gène R349 de Mimivirus (tableau 1, séquences sens SEQ.ID.N°20 incluant la séquence SEQ.ID. N°29 et séquences antisens SEQ.ID.N°21 incluant la séquence SEQ.ID. N°30). Cette séquence 15 nucléotides est 30 une partie du guide ARN utilisé pour inactiver le gène de la GFP avec le 16 système CRISPR/Cas9 tel que décrit dans l'article Science. 2014 Jan 3;343:84-87. On a transfecté cet ARN dans les cellules HEK293 GFP qui expriment les gènes R350 et R354. La lecture de ces expérimentations a 5 permis de suivre l'extinction relative de la fluorescence de la GFP par FACS. I.C) Utilisation du système MIMIVIRE dans des cellules procaryotes. On a vectorisé le système dans un vecteur d'expression PP14 10 (SEQ. ID. N°25) pour procaryote sous contrôle du promoteur T7 inductible par l'IPTG. La séquence du gène R349 a été modifiée (SEQ. ID. N°7) afin d'agir contre le gène de la résistance à la tétracycline en remplaçant les 15 nucléotides de la séquence répétée de zamilon par 15 nucléotides spécifique du gène de résistance à la tétracycline (SEQ. ID. 15 N°23 : CACCCTGGATGCTGT). Les gènes R350 et R354 ont été ajoutés à la suite du R349 et sont organisés en opéron sous contrôle du promoteur inductible T7 (annexe 1, SEQ. ID. N°22). Les figures 8A-8B représentent le vecteur Mimivire (PP14-figure 8A) portant la séquence SEQ. ID. N°25 incluant la séquence 20 SEQ.ID.N°22 avec le gène R349 modifié (SEQ. ID. N°7) par une séquence dirigée contre le gène de résistance à la tétracycline (SEQ. ID. N°23) ainsi que des gènes R350 (SEQ. ID. N°3) et R354 (SEQ. ID. N°4) sous la commande d'un même promoteur T7 (SEQ. ID. N°31) avec une organisation en « opéron » à l'aide de séquences d'opéron Lac (SEQ. ID. 25 N°32), séquence de Shine-Dalgarno et terminateur T7 (SEQ. ID. N°33). Le vecteur PP14 dans lequel sont clonés les gènes R349, R350 et R354 fait partie de la famille des vecteurs pET qui sont des vecteurs d'expression chez les bactéries. Ces vecteurs embarquent entres autres, un promoteur T7 inductible c'est-à-dire que l'expression ne se fait qu'en 30 présence d'un certain composé dans le milieu de culture à savoir l'IPTG (Isopropyl (3-D-1-thiogalactopyranoside). Ce vecteur permet de 17 synthétiser de manière constitutive une protéine appelée lad qui se fixe sur la séquence Lac operator et ainsi bloque la transcription du gène cloné en aval du promoteur T7 du fait que la T7 ARN polymérase fixée au préalable sur le promoteur T7 ne peut pas transcrire le gène à cause 5 de l'encombrement stérique que lui crée la présence de la protéine lacI. Néanmoins, en présence d'IPTG, la protéine lad se complexe avec cette molécule IPTG entrainant un changement de conformation de la protéine lad la rendant incapable de se fixer sur la séquence lac operator, ce qui permet à la T7 RNA polymérase de transcrire le gène cloné en aval du 10 promoteur T7. Et, le terminateur T7 stoppe la T7 RNA polymérase à la fin de la transcription. La séquence Shine-Dalgarno est reconnue par le ribosome de la bactérie. Chez les bactéries il est possible de faire traduire un ARN messager dit « polycistronique » c'est-à-dire qui contient la 15 transcription de plusieurs gènes à la suite selon une organisation en « opéron ». Pour ce faire, chaque partie de l'ARN messager qui contient la transcription d'un gène doit être précédée d'une séquence ShineDalgarno reconnue par le ribosome qui pourra donc se fixer dessus et initier la traduction de l'ARN messager. 20 En présence de l'IPTG dans le milieu, on réalise la transcription en ARN du R349 modifié qui embarque les 4 unités repeat correspondant à la tétracycline d'une part et d'autre part, on réalise la transcription d'un autre ARN messager qui embarque les gènes R350 (hélicase) et R354 (nucléase). Les 2 transcriptions sont indépendantes l'une de l'autre. 25 Ce vecteur PP14 est ensuite transféré par électroporation dans des bactéries E.co/i BL21 préalablement transformées par le vecteur pACYC184 (figure 8B) permettant l'expression du gène de la résistance à la tétracycline. Les bactéries sont établies selon différentes dilutions sur boite LB/agar contenant soit Ampiciline/Tetracycline/IPTG (50pg/m1; 30 12pg/m1; 0.1pM respectivement) soit Ampiciline/IPTG (50pg/m1; 0.1pM respectivement). 18 Les figures 9 à 11 et 13 montrent des résultats comparatifs de culture de bactéries avec abolition de la résistance à la tétracycline pour les bactéries transformées par le vecteur PP14. La Figure 9 montre les résultats de le la première expérience. Sur 5 les boites Amp/IPTG on dénombre (de gauche à droite) 16 ; 3 et 48 bactéries pour des dilutions étalées correspondantes respectivement au 1/10 ; 1/50 ; et au reste de la transformation. Sur les boites Amp/Tet/IPTG, on dénombre respectivement 0 ; 0 et 8 bactéries. La Figure 10 montre les résultats de la seconde expérience. Sur 10 les boites Amp/IPTG on dénombre (de gauche à droite) 5 et 28 bactéries pour des dilutions étalées correspondantes respectivement au 1/5 et au reste de la culture. Volume de départ de 1mI. Sur les boites Amp/Tet/IPTG, on dénombre respectivement 9 et 4 bactéries. Ces résultats montrent que le système Mimivire permet bien 15 d'abolir la résistance à la tétracycline. Ces résultats ont été confirmés par d'autres expériences assurant de la présence ou l'absence du vecteur conférant la résistance à la tétracycline. Dans un premier temps, on a testé l'induction de l'expression des gènes du système Mimivire par l'IPTG sur la croissance d'E. coli BL21- 20 DE3 doublement transformée (pACYC184 et PP14). La Figure 11 montre l'effet de l'induction du système Mimivire : Les bactéries contenant le vecteur pACYC184 sont électroporées avec le vecteur PP14 contenant le système Mimivire et étalées à volume égal sur des boites LB/Agar Ampicilline/Tétracycline +ou- IPTG. 25 Sur la figure 11, on voit clairement que l'induction de l'expression des gènes du système Mimivire se traduit par la diminution drastique du nombre de colonies quel que soit l'antibiotique. Suite à ces résultats, on a voulu caractériser des clones bactériens doublement transformés du système Mimivire. Pour ce faire, 19 on a mis en culture les clones bactériens issus des boites LB/Agar Ampicilline/Tétracycline sans IPTG, en milieu Ampicilline +IPTG dans le but d'activer le système Mimivire et en parallèle, les mêmes clones sont mis en culture en milieu Ampicilline sans IPTG comme control négatif. 5 L'action du système Mimivire est testée à l'aide d'une amplification (PCR) du gène de résistance à la Tétracycline à partir de la culture bactérienne. Dans l'hypothèse d'une action du système Mimivire, cette amplification devrait être impossible. Un test de l'action du système Mimivire. PCR a été réalisée à 10 partir de la culture bactérienne de 10 clones issus de la boite LB/Agar Ampicilline/Tétracycline et poussé 16h en Ampicilline seul ou Ampicilline + IPTG. Le résultat de la PCR montre l'amplification d'un fragment de 1.3 kb correspondant au gène de résistance de la tétracycline. 15 Dans les conditions expérimentales utilisées pour l'amplification du gène de résistance à la tétracycline, ce résultat ne permet pas de visualiser une absence totale ou partielle du vecteur pACYC184 portant le gène de résistance à la Tétracycline. Une faible présence de vecteur intact peut engendrer un fragment lors de l'amplification et expliquer 20 ainsi les résultats obtenus dans la figure 12. Une amplification en temps réel (qPCR) a permis une meilleure interprétation de l'action du système Mimivire. Il est à noter que sur les 10 clones, 2 seulement ont poussé en milieu Ampicilline/IPTG (clone 7 et 10) alors que les 10 clones ont 25 poussé en milieu Ampicilline seul. Ce dernier résultat montre majoritairement que l'induction du système Mimivire à un effet sur la pousse des bactéries tout comme le résultat issue de la figure 11. La Figure 12 montre l'étalement du clone 7 sur boite Tétracycline (284 bactéries) avec IPTG et sur boite Tétracycline (402 bactéries) 30 sans IPTG à une dilution correspondante à 103 CFU théorique. 20 Le clone 7 répond à l'induction du système Mimivire via l'IPTG car on passe de 346 (boites Ampicilline/IPTG) à 284 bactéries (boites Tétracycline/IPTG) soit une diminution d'environ 18%, alors que l'on ne montre pas de différences notable sur le contrôle sans IPTG (passage de 5 393 à 402 bactéries). L'absence de colonies sur tétracycline confirme une action du système Mimivire sur l'inhibition de la résistance à la Tétracycline. II) Matériels et Méthodes 1) Traitement enzymatique 10 Les réactions enzymatiques ont été effectuées en incubant chaque produit de PCR, de transcription in vitro (IVT) ou d'amorce avec la nucléase (R354), l'hélicase (R350) ou les deux enzymes. Les réactions enzymatiques ont été conduites dans du tampon CutSmart® (Ref: B7204S) de New England Biolabs (acétate de potassium 50 mM, acétate 15 de trisium 20 mM, acétate de magnésium 10 mM, 100 ug ml-1 de BSA, pH 7,9) à 32° C pendant 2 heures, en utilisant une concentration de protéine de 0,5 mg.ml-1 pour chaque enzyme. Après incubation, toutes les réactions ont été traitées par la protéinase K pour éviter que l'ADN ou l'ARN ne se répande dans les puits des gels. Après incubation, les 20 produits des réactions enzymatiques ont été soumis à une électrophorèse sur gel d'agarose (1,5%) ou de PolyAcrylamide dénaturant (dPAGE) à 15%. Les contrôles ont été effectués avec les mêmes conditions, en absence de l'enzyme R354 ou R350. 2) Conditions de cultures. 25 2.1) Dans des cellules eucaryotes : Les amibes Acanthamoeba castellanll (ATCC 30010) ont été ensemencées à 5 x 106 dans le milieu salin amibien (PAS) de Page comme décrit précédemment (7). La lignée HEK293 GFP (cellules humaine de rein embryonnaire, Clinisciences) a été cultivée à 37°C dans 21 un incubateur à CO2 à 5% dans du milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) additionné de 10% de FBS (Gibco), GlutaMAX 2 mM (Life Technologies), 100 U / ml de pénicilline, 100 ug / ml. Streptomycine et 100 pg / ml d'acide aminé non essentiel. 5 2.2) Dans des cellules procaryotes : Les bactéries Escherichia Coli One ShotTM BL21 (DE3) chimiquement compétente (Thermo Fischer, Réf: C600003) ont été cultivées dans du milieu Luria-Bertani (LB) avec un antibiotique approprié. Les bactéries ont été étalées sur LB-agar avec un 10 antibiotique approprié (12pg / ml pour la tétracycline et 50pg / ml pour l'ampicilline). Le système Mimivire a été induit par l'ajout de 0,2 pM d'isopropyl B-D-1-thigalactopyranoside (IPTG) sur des plaques de LBagar. 3) Test d'infection et de transfection. 15 Les amibes A. Castellanll ont été infectées ou co-infectées respectivement avec Mimivirus ou Mimivirus et le virophage zamilon en utilisant une MOI de 10. Les cellules ont ensuite été incubées à 32 ° C et à des points réguliers post-infection, les cellules ont été recueillies pour l'extraction d'ARN avec le Kit d'isolation mirRenaTM miRNA 20 (Ambion). Les cellules 293GFP ont été ensemencées sur des plaques 6 puits (Corning) 48 h avant la transfection à une densité de 300 000 cellules/puits. Les cellules ont été transfectées à 80-90% de confluence en utilisant la Lipofectamine 2000 (Life Technologies) en suivant le protocole recommandé par le fabricant. Un total de 4 ug de 25 PP20vector/PP21vector (hébergeant respectivement la séquence NLSR350-NLS et NLS-R354-NLS) ont été utilisés pour la transfection. MIMI_R354 (Nucléase) et MIMI_R350 (Hélicase) sont marqués par 3 séquences FLAG à l'extrémité N-terminale (3xDYKDDDDK) pour confirmer l'expression des protéines correspondantes par des 30 expériences de Western Blot avec un anticorps monoclonal anti-FLAG (Clone M2, Sigma). Le lendemain, ces cellules sont ensemencées dans 22 une flask T75. Une sélection avec de l'hygromycine (100 ug / ml) et de la zéocine (100 ug / ml) a été appliquée au jour 3 après la transfection. Ces cellules ont été cultivées dans ces conditions pendant 3 semaines afin d'isoler des cellules doublement transfectée stables (lignée 293GFP 5 [PP20 / PP21]). 4) Test de transformation. Les plasmides utilisés dans ces expériences sont le PP14 synthétisé par Genscript hébergeant une expression inductible du système Mimivire sous le contrôle du promoteur T7 (voir l'annexe 1 et la 10 figure 8 A) et le vecteur pACYC184 (société Mo Bi Tec Ref: V32402). Les bactéries Escherichia Coli One ShotTM BL21 (DE3) a été transformé par le plasmide pACYC184 selon le protocole et les instructions du fabricant. Les bactéries ont été étalées sur une plaque de LB-agar tétracycline (Tet) (jour 1). Le lendemain, un clone a été prélevé et cultivé dans 10 15 ml de milieu LB sélectif Tet pendant une nuit à 37° C sous agitation à 200 tr/min. Au jour 3, 200 pl de la culture ont été inoculés dans 20 ml de milieu LB+Tet frais jusqu'à ce que la DO à 600 nm atteigne 0,7. Les bactéries ont été récoltées par centrifugation à 7000 tr / min pendant 1 minute à 4° C et lavées trois fois avec du glycérol 10%. Après la 20 première centrifugation, toutes les étapes ont été réalisées sur glace et en chambre froide. Les bactéries ont été remises en suspension dans 50 ul de glycérol 10% et 200 ng de vecteur PP14 ont été ajoutés. Le mélange a été transféré dans une cuvette Gene Pulser® avec un espace de 0,1 cm (Bio-Rad, Réf 165-2089) et une impulsion électrique a été 25 produite avec le MicroPulser Electroporator (Bio-Rad, Réf: 165-2100) en utilisant le programme Ec1. Le temps d'électroporation indiqué par le dispositif après l'impulsion était de 5,8 ms. Après électroporation, 1 ml de LB a été ajouté immédiatement et incubé pendant 1 heure à 37° C sous agitation à 200 tr/min. Plusieurs dilutions ont été étalées sur des 30 plaques de LB-agar sélectif Tet / Amp/IPTG ou Amp/IPTG et incubées pendant une nuit à 37° C. Le lendemain, les colonies ont été comptées. 5) Clonage, expression et purification. 23 Les séquences des gènes codant pour la protéine R350 et R354 de Mimivirus ont été optimisées pour maximiser l'expression dans E.coli et synthétisé par GenScript. La protéine R354 inclut une étiquette polyhistidine (SEQ.ID.N°34) à l'extrémité C-terminale. La séquence du 5 R349 reste inchangée à l'exception de l'unité repeat de 15 nucléotides qui correspond à une séquence de la tétracycline (SEQ.ID. N°7 incluant SEQ.ID. N°23 répétée 4 fois). Ces gènes ont été inséré entre les sites de coupure XbaI et Xhol du plasmide pET22b (+) (annexe 1, SEQ.ID. N°22). 10 Les protéines recombinantes ont été exprimées dans E. coli BL21 (DE3) -pGro7 / GroEL (TaKaRa) en utilisant un milieu ZYP-5052. Chaque culture a été cultivée à 37° C jusqu'à obtention d'une absorbance à 600 nm de 0,8 suivie de l'addition de L-arabinose (0,2% m / v) et d'une induction avec une transition de température à 18° C pendant 20 h. Les 15 cellules ont été récoltées par centrifugation (5 000 g, 30 min, 4° C) et les culots résultants ont été remis en suspension dans du tampon de charge (20 mM MES pH 6,0) et conservés à -80° C pendant une nuit. Les cellules congelées ont été décongelées et incubées sur de la glace pendant 1 h après addition de lysozyme et de fluorure de 20 phénylméthylsulfonyle (PMSF) à des concentrations finales respectives de 0,25 mg ml-1 et 0,1 mM. Les cellules partiellement lysées ont ensuite été perturbées par trois cycles consécutifs de sonication (30 s, amplitude 45) effectués sur un système de sonication Q700 (QSonica). Les débris cellulaires ont été jetés après une étape de centrifugation 25 (11 000 g, 20 min, 4° C). La protéine recombinante a été purifiée en utilisant une colonne échangeuse de cations à partir de 6 ml de RESOURCE S (GE Heathcare) en utilisant un tampon MES 20 mM pH 6,0 et un gradient linéaire à 0,5 M de NaCI dans 10 volumes de colonne. Les fractions ont été analysées 30 par SDS-PAGE colorée au bleu de Coomassie (10%) et les activités d'hélicase ont été évaluées sur une électrophorèse sur gel de Polyacrylamide dénaturant comme décrit précédemment (15% de 24 dPAGE). Les fractions actives (générant un clivage au niveau de l'unité répétée de 15 nucléotides de zamilon) ont été regroupées et purifiées davantage en utilisant une Chromatographie d'affinité sur métal immobilisé (tampon de chargement et de lavage: Tris 50 mM pH 8, NaCI 5 300 mM, imidazole 20 mM, tampon d'élution: Tris 50 mM pH 8, NaCI 300 mM, imidazole 250 et 500 mM) sur une colonne de 5 ml d'HisTrap FF brut (GE Healthcare). Les fractions ont été analysées en utilisant SDSPAGE à 10% (coloration de Coomassie) et évaluées en utilisant l'activité hélicase comme décrit précédemment. 10 6) Extraction ARN et caractérisation Les cultures obtenues ont été traitées avec le kit mirVanaTM miRNA (Ambion). Des fractions enrichies de petits ARN ( REVENDICATIONS1. Méthode de modification par coupure et/ou dégradation totale ou partielle d'une séquence cible d'acide nucléique d'une cellule hôte comprenant la mise en contact de la dite cellule hôte in vitro ou ex vivo avec un système biologique comprenant : - un premier composant comprenant au moins une protéine choisie parmi les protéines R350 et R354 de virus géant Mimivirus de lignée A ou au moins un vecteur d'expression d'au moins une séquence d'acide nucléique des gènes R350 et/ou R354 codant pour respectivement au moins une dite protéine R350 et/ou R354, et - un deuxième composant comprenant au moins une séquence d'acide nucléique, dénommée séquence d'affinité, la dite séquence d'affinité comprenant au moins une séquence complémentaire d'une séquence spécifique de ladite séquence cible, la dite séquence spécifique de ladite séquence cible comprenant au moins 10 nucléotides, de préférence 15 nucléotides. 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisé en ce que le dit deuxième composant comprend la dite la séquence d'affinité sous 20 forme d'ADN ou de préférence sous forme d'ARN. 3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la dite la séquence d'affinité comprend au moins 2 mêmes dites séquences complémentaires d'une même séquence spécifique, de préférence de 2 à 4, de préférence encore 4 mêmes dites séquences 25 complémentaires d'une même séquence spécifique, répétées de façon espacée. 4. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la dite ou chaque dite séquence complémentaire de la même dite séquence spécifique de la séquence d'affinité comprend est flanquée en 30 3' et 5' de séquences adjacentes encadrant une séquence de 15 58 nucléotides du virophage zamilon contenue et répétée 4 fois dans le gène R349 de virus géant Mimivirus. 5. Méthode selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les dites même séquences complémentaires de la même séquence 5 spécifique de la séquence cible sont flanquées en 3' et 5' de séquences flanquantes différentes les unes des autres entre les différentes mêmes séquences complémentaires et les dites séquences flanquantes correspondant respectivement aux séquences flanquantes des différentes mêmes séquences répétées du virophage zamilon contenues 10 dans ledit gène R349 de Mimivirus. 6. Méthode selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la dite séquence d'affinité comprend le gène R349 modifié dans lequel seules les 4 séquences répétées de 15 nucléotides du virophage zamilon sont remplacées aux même localisations par les dites 4 mêmes 15 séquences complémentaires dune dite séquence spécifique de la dite séquence cible. 7. Méthode selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la dite séquence d'affinité est intégrée dans un vecteur de clonage de la dite séquence d'affinité apte à transformer ou transfecter une dite cellule hôte et y répliquer la dite séquence d'affinité. 8. Méthode selon la revendication 7, caractérisé en ce que la dite séquence d'affinité est intégrée sous forme d'ADN placée sous le contrôle d'un promoteur de transcription apte à transcrire de la dite séquence d'affinité d'ADN en ARN dans la dite cellule hôte. 9. Méthode selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la dite cellule hôte est une bactérie ou une cellule eucaryote. 10. Méthode selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le dit premier composant comprend un vecteur d'expression d'au moins une séquence d'acide nucléique de gène R350 et/ou R354 codant 59 pour et apte à exprimer respectivement au moins une dite protéine R350 et/ou R354 dans une dite cellule hôte. 11 Méthode selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que les dits premier et deuxième composants sont intégrés dans 5 un même dit vecteur, de préférence un plasmide. 12. Méthode selon l'une des revendications 1 à 11, pour au moins couper en un site spécifique la dite séquence cible, caractérisé en ce que le dit premier composant comprend au moins la protéine R350 ou au moins un vecteur d'expression d'au moins une séquence d'acide 10 nucléique du gène R350 codant pour respectivement au moins une dite protéine R350. 13. Méthode selon l'une des revendications 1 à 12, pour au moins couper en un site spécifique et dégrader au moins partiellement la dite séquence cible, caractérisé en ce que le dit premier composant 15 comprend au moins la protéine R350 et la protéine R354 ou au moins un vecteur d'expression d'au moins des séquences d'acides nucléiques des gènes R350 et R354 codant pour respectivement au moins les dites protéines R350 et R354. 14. Méthode selon l'une des revendications 10 à 12, caractérisé 20 en ce que les dits premier et deuxième composants sont intégrés dans un même dit vecteur comprenant les séquences de Mimivirus de lignée A incluant : - au moins une partie modifiée du gène R349, de préférence le gène R349 modifié complet, ladite partie modifiée du gène R349 25 incluant une partie du gène 349 incluant au moins une des 4 séquences répétées de 15 nucléotides du virophage zamilon du gène R349, de préférence les 4 séquences répétées, la dite modification de la dite partie modifiée du gène R349 consistant en ce que la (ou les ) dite(s) séquence(s) répétée(s) de 15 nucléotides du virophage zamilon du gène R349 est (ou sont) remplacée(s) par une même dite séquence complémentaire d'une séquence spécifique de la dite séquence cible, et 60 - une séquence permettant la transcription en ARN de ladite partie modifiée du gène R349, de préférence du gène R349 modifié complet dans une dite cellule hôte, et - les gènes R350 et 354, ainsi que des séquences permettant 5 l'expression des gènes R350 et R354 dans une dite cellule hôte. 15. Système biologique utile pour la mise en oeuvre d'un procédé de modification par coupure et/ou dégradation totale ou partielle d'une séquence cible d'acide nucléique d'une cellule hôte comprenant la mise en contact de la dite cellule hôte in vitro ou ex vivo, tel que défini dans 10 l'une des revendications 1 à 14 comprenant : - un premier composant comprenant au moins une protéine choisie parmi les protéines R350 et R354 de virus géant Mimivirus de lignée A ou au moins un vecteur d'expression d'au moins une séquence d'acide nucléique des gènes R350 et/ou R354 codant pour respectivement au 15 moins une dite protéine R350 et/ou R354, et - un deuxième composant comprenant une séquence d'acide nucléique, dénommée séquence d'affinité, la dite séquence d'affinité comprenant au moins une séquence complémentaire d'une séquence spécifique de ladite séquence cible, la dite séquence spécifique de ladite 20 séquence cible comprenant au moins 10 nucléotides, de préférence 15 nucléotides, de préférence la ou chaque dite séquence complémentaire d'une séquence spécifique de ladite séquence cible étant flanquée en 3' et 5' de séquences adjacentes encadrant une séquence de 15 nucléotides du virophage zamilon contenue et répétée 4 fois dans le 25 gène R349 de virus géant Mimivirus de lignée A.