Brevet FR3085072A1 — publié le 20200221

Procédé d'observation d'un échantillon Description DOMAINE TECHNIQUE Le domaine technique de l'invention est lié à l'observation d'un échantillon, en particulier un échantillon biologique, l'observation étant réalisée à des fins d'analyse histologique. L'observation de l'échantillon est réalisée selon une configuration d'imagerie sans lentille. ART ANTERIEUR La caractérisation d'échantillons biologiques par imagerie spectrale infrarouge est à présent une technologie largement décrite dans la littérature pour ses applications dans le diagnostic, et en particulier dans le domaine de l'histopathologie. Elle permet d'obtenir, sans marquage, des informations biomoléculaires relatives à des cellules ou à des tissus. Cette méthode est basée sur une signature spectrale d'un échantillon vis-à-vis d'une pathologie. Lorsqu'un faisceau lumineux traversant l'échantillon présente une longueur d'onde correspondant à une énergie entre deux niveaux de vibration moléculaire, une partie du faisceau est absorbée. Ainsi, par spectrométrie d'absorption, on peut estimer une absorbance spectrale de l'échantillon, permettant l'obtention d'une information sur la composition moléculaire de ce dernier. Le spectre de l'absorbance constitue en cela une signature moléculaire de l'échantillon. Cependant, dans ce type de méthode, il est nécessaire de balayer l'échantillon avec un faisceau laser. La taille du faisceau laser conditionne en effet la résolution spatiale de la mesure. Aussi, lorsqu'on souhaite obtenir une information spectrale spatialement résolue, le faisceau laser doit être fin. Il en résulte qu'une analyse d'une surface d'échantillon de quelques mm2 ou quelques cm2 est longue. De plus, l'instrumentation liée à l'imagerie spectrale infrarouge est complexe et onéreuse. En dehors du domaine de l'infrarouge, l'observation d'échantillons, et en particulier des échantillons biologiques, par imagerie sans lentille, connaît un développement important depuis ces dix dernières années. Cette technique permet d'observer un échantillon en le disposant entre une source de lumière et un capteur d'image, sans disposer de lentille de formation d'image entre l'échantillon et le capteur d'image. Ainsi, le capteur d'image collecte une image d'une onde lumineuse transmise par l'échantillon, sans conjugaison entre le capteur d'image et l'échantillon. 2 Le document W02008090330 décrit par exemple un dispositif permettant l'observation de particules biologiques, par imagerie sans lentille. Les particules biologiques sont par exemple des cellules. Le dispositif permet d'associer, à chaque cellule, une figure d'interférence dont la morphologie permet d'identifier le type de cellule. L'imagerie sans lentille apparaît alors comme 5 une alternative simple, et peu onéreuse, à un microscope classique. De plus, elle confère un champ d'observation nettement plus important que ne peut l'être celui d'un microscope. Dans le domaine visible, l'imagerie sans lentille a été appliquée pour examiner des lames de tissus, de type lames d'anatomo-pathologie. Des exemples d'application ont par exemple été décrits dans W02016189257 ou dans EP3199941. On accède alors à des images exploitables de 10 l'échantillon, mais ces images ne comportent pas d'information moléculaire, ou d'information relative au type de cellules présentes dans l'échantillon. Dans le domaine de l'infrarouge, une application de l'imagerie sans lentille est présentée dans EP3147646. Dans ce document, on décrit un procédé permettant de former une image d'une particule. L'image obtenue permet d'observer une particule. 15 Une autre approche de l'imagerie sans lentille est décrite dans U520050190286. Dans ce document, on décrit une formation d'une image de particules déposées au contact de pixels d'un capteur d'image. Cette méthode est désignée par le terme ombroscopie. L'image formée par le capteur d'image comporte des ombres de chaque particule, ce qui permet d'accéder à la forme de chaque particule. On peut alors identifier les particules en fonction de leur forme. 20 Les inventeurs proposent une méthode permettant une caractérisation d'un échantillon, en particulier une lame de tissu, en utilisant un dispositif relativement simple. La méthode permet d'adresser un champ d'observation important, ce qui permet d'obtenir un résultat rapide. Elle permet d'obtenir une cartographie de l'échantillon, pour établir des informations relatives à des molécules ou à des liaisons moléculaires. La cartographie réalisée peut être utilisée en vue 25 d'établir un diagnostic. EXPOSE DE L'INVENTION Un objet de l'invention est un procédé d'observation d'un échantillon, notamment un échantillon biologique, l'échantillon étant disposé entre une source de lumière et un capteur d'image pixelisé, la source de lumière émettant un faisceau lumineux incident, se propageant 30 jusqu'à l'échantillon selon un axe de propagation, et selon une longueur d'onde d'émission comprise entre 1 pm et 20 grn, le procédé comportant les étapes suivantes : a) illumination de l'échantillon par la source de lumière ; 3 b) acquisition d'une image de l'échantillon par le capteur d'image pixelisé, aucune optique de formation d'image n'étant disposée entre l'échantillon et le capteur d'image ; le procédé étant caractérisé en que l'échantillon est apte à absorber une partie du faisceau lumineux incident, de telle sorte que l'image acquise est représentative d'une absorption du 5 faisceau incident par l'échantillon, à la longueur d'onde d'émission. De préférence, la longueur d'onde d'émission est comprise entre 5 pm et 20 pm. De préférence, la source de lumière est une source de lumière laser. Selon un mode de réalisation, le procédé comporte également les étapes suivantes : c) illumination du capteur d'image par la source de lumière, à la longueur d'onde 10 d'émission, sans échantillon entre le capteur d'image et la source de lumière, de façon à obtenir une image de fond ; d) comparaison de l'image acquise lors de l'étape b) et de l'image de fond acquise lors de l'étape c) pour obtenir une image de l'absorbance de l'échantillon à la longueur d'onde d'émission. 15 La comparaison peut notamment prendre la forme d'un ratio. Selon un mode de réalisation, la longueur d'onde d'émission est une longueur d'onde d'absorption d'un analyte, correspondant à un pic d'absorption de l'analyte, le procédé comportant une cartographie d'une quantité de l'analyte dans l'échantillon à partir de l'image de l'absorbance à la longueur d'onde d'émission. Par pic d'absorption d'un analyte, on entend 20 une plage de longueurs d'onde correspondant à un maximum local d'absorption. Selon un mode de réalisation, la longueur d'onde d'émission est une longueur d'onde d'absorption d'un analyte, correspondant à un pic d'absorption de l'analyte, de façon à obtenir une image de l'absorbance de l'échantillon à la longueur d'onde d'absorption, le procédé comportant les étapes suivantes : 25 e) illumination de l'échantillon selon une longueur d'onde de base, à laquelle l'absorption de l'analyte est inférieure à l'absorption de l'analyte à la longueur d'onde d'absorption; f) acquisition d'une image de l'échantillon par le capteur d'image pixelisé ; g) illumination du capteur d'image par la source de lumière, à la longueur d'onde de base, sans échantillon entre le capteur d'image et la source de lumière, de façon à obtenir une 30 image de fond à la longueur d'onde de base ; 4 h) comparaison de l'image acquise lors de l'étape f) et de l'image de fond acquise lors de l'étape g) pour obtenir une image de l'absorbance de l'échantillon à la longueur d'onde de base. Par absorption de l'analyte, on entend une absorption du faisceau lumineux incident par 5 l'analyte. La longueur d'onde de base est de préférence une longueur d'onde voisine du pic d'absorption de l'analyte. Il peut notamment s'agir d'une longueur d'onde définissant une ligne de base du pic d'absorption. Le procédé peut alors comporter une soustraction des images d'absorbance de l'échantillon 10 respectivement à la longueur d'onde d'absorption et à la longueur d'onde de base, de manière à obtenir une image d'absorbance due à l'analyte. Selon un mode de réalisation, les étapes a) à d) sont répétées en illuminant successivement l'échantillon selon : - une première longueur d'onde d'absorption, correspondant à une longueur d'onde 15 d'absorption d'un premier analyte ; - une deuxième longueur d'onde d'absorption, correspondant à une longueur d'onde d'absorption d'un deuxième analyte ; de manière à obtenir des images de l'absorbance de l'échantillon respectivement à la première longueur d'onde d'absorption et à la deuxième longueur d'onde d'absorption. 20 Les étapes e) à h) peuvent également être répétées en illuminant successivement l'échantillon selon : - une première longueur d'onde de base, à laquelle l'absorption du premier analyte est inférieure à l'absorption du premier analyte à la première longueur d'onde d'absorption Pua); 25 - une deuxième longueur d'onde de base, à laquelle l'absorption du deuxième analyte est inférieure à l'absorption du deuxième analyte à la deuxième longueur d'onde d'absorption; de manière à obtenir des images de l'absorbance de l'échantillon respectivement à la première longueur d'onde de base et à la deuxième longueur d'onde de base. 30 Le procédé peut également comporter : - une soustraction des images d'absorbance de l'échantillon respectivement à la première longueur d'onde d'absorption et à la première longueur d'onde de base, de manière à obtenir une image d'absorbance due au premier analyte ; 5 - une soustraction des images d'absorbance de l'échantillon respectivement à la deuxième longueur d'onde d'absorption et à la deuxième longueur d'onde de base, de manière à obtenir une image d'absorbance due au deuxième analyte ; - une comparaison de l'image d'absorbance due au premier analyte et de l'image 5 d'absorbance due au deuxième analyte. Le procédé peut comporter l'une des caractéristiques suivantes, prises isolément ou selon les combinaisons techniquement réalisables : l'échantillon est une lame de tissu biologique ; - la source de lumière éclaire une surface de l'échantillon supérieure à 1 mrna ou 10 supérieure à 5 mm2; l'image de l'échantillon acquise par le capteur d'image correspond à une surface d'échantillon supérieure à 1 mm2 ou supérieure à 5 mm2; les pixels du capteur d'image définissent un plan de détection, l'échantillon étant disposé à une distance du plan de détection inférieure à 1 mm ; 15 - le procédé comporte, à partir de l'image acquise, une étape de détermination d'au moins une région d'intérêt de l'échantillon. L'échantillon peut être maintenu par un support comportant au moins un des matériaux suivants: - silicium ; 20 - et/ou germanium ; - et/ou fluorure de calcium ; - et/ou fluorure de baryum. Un autre objet de l'invention est un dispositif d'observation d'un échantillon, comportant une source de lumière émettant dans une bande spectrale comprise entre 1 pm et 20 pm, un capteur 25 d'image sensible dans ladite bande spectrale, et un élément de maintien de l'échantillon, apte à recevoir un échantillon, l'élément de maintien d'échantillon étant configuré de telle sorte que l'échantillon, lorsqu'il est disposé sur l'élément de maintien, s'étend entre une source de lumière et un capteur d'image, le dispositif étant tel qu'aucune optique de formation d'image n'est disposée entre l'échantillon, lorsqu'il est disposé sur l'élément de maintien d'échantillon, et le 30 capteur d'image. Le dispositif peut comporter une unité de traitement, par exemple un microprocesseur, configurée pour recevoir au moins une image acquise par le capteur d'image, et pour mettre en oeuvre les opérations de traitement d'images décrites ci-dessus ou ci-après. 6 D'autres avantages et caractéristiques ressortiront plus clairement de la description qui va suivre de modes particuliers de réalisation de l'invention, donnés à titre d'exemples non limitatifs, et représentés sur les figures listées ci-dessous. FIGURES 5 La figure 1 représente un dispositif permettant une mise en oeuvre de l'invention. La figure 2A est une image visible d'un premier échantillon. La figure 2B montre des images du premier échantillon obtenues en mettant en oeuvre l'invention. La figure 2B est représentative d'une absorption du premier échantillon à une longueur d'onde de 7.35 p.m. La figure 3A schématise un pic d'absorption d'un analyte. La figure 3B comporte les principales 10 étapes d'un mode de réalisation de l'invention. La figure 3C est une image de l'absorbance d'un deuxième échantillon à un nombre d'onde de 1081 cm-1 (soit X = 9.2 pm). La figure 3D est une image de l'absorbance du deuxième échantillon à un nombre d'onde de 1654 cm-1 (soit X = 6 Prr1). 15 EXPOSE DE MODES DE REALISATION PARTICULIERS La figure 1 représente un exemple de dispositif permettant une mise en oeuvre de l'invention. Une source de lumière 11 est configurée pour émettre un faisceau lumineux 12, dit faisceau lumineux incident, se propageant en direction d'un échantillon 10. Le faisceau lumineux incident atteint l'échantillon en se propageant selon un axe de propagation Z. 20 Dans cet exemple, l'échantillon 10 un échantillon biologique que l'on souhaite caractériser. Il peut notamment s'agir d'une lame de tissu destinée à une analyse histologique, ou lame d'anatomo-pathologie, comportant une fine épaisseur de tissu déposée sur une lame transparente 15 faisant office de support d'échantillon. Par fine épaisseur, on entend une épaisseur de préférence inférieure à 100 itm, et de préférence inférieure à 10 pm, typiquement 25 quelques micromètres. L'échantillon s'étend selon un plan Pio, dit plan de l'échantillon. Le plan de l'échantillon est de préférence perpendiculaire ou sensiblement perpendiculaire à l'axe de propagation Z. Le terme sensiblement perpendiculaire signifie perpendiculaire en admettant une tolérance angulaire de quelques degrés, inférieure à 20° ou 10°. La lame de tissu 10 est obtenue selon des procédés de préparation connus, à partir d'un 30 prélèvement tissulaire extrait par biopsie ou frottis. Le prélèvement est ensuite préparé de façon à se présenter sous la forme d'une fine épaisseur déposée sur la lame transparente 15. De tels procédés sont connus dans le domaine de l'histologie. Ils comportent par exemple une découpe 7 d'un tissu congelé, ou une inclusion d'un tissu prélevé dans une matrice de paraffine. De préférence, l'échantillon n'a subi aucun marquage préalable, à l'aide d'un marqueur exogène ajouté à l'échantillon avant son analyse. L'échantillon peut comporter un analyte, dont on souhaite évaluer une distribution spatiale dans 5 l'échantillon. Par analyte, on entend par exemple une molécule ou une partie d'une molécule ou une liaison moléculaire. La lame 15 est transparente vis-à-vis du faisceau incident 12. Elle peut comprendre ou être constituée de matériaux tels le silicium, le germanium, le fluorure de calcium (CaF2), le fluorure de baryum (BaF2). 10 La distance A entre la source de lumière et l'échantillon, selon l'axe Z, est de préférence supérieure à 1 cm. Elle est de préférence comprise entre 2 et 30 cm. De préférence, la source de lumière, vue par l'échantillon, est considérée comme ponctuelle. Cela signifie que son diamètre (ou sa diagonale) est préférentiellement inférieur au dixième, mieux au centième de la distance entre l'échantillon et la source de lumière. Ainsi, de préférence, la lumière parvient 15 à l'échantillon sous la forme d'ondes planes, ou pouvant être considérées comme telles. La source de lumière 11 est une source émettant dans l'infrarouge. Il peut s'agir de l'infrarouge court, usuellement désigné par l'acronyme SWIR (Short Wavelenght Infrared), s'étendant entre 1 et 3 pm, ou du moyen infrarouge, usuellement désigné par l'acronyme MWIR (Medium Wavelenght Infrared), s'étendant entre 3 et 5 pm, ou encore de l'infrarouge long, usuellement 20 désigné par l'acronyme LWIR (Long Wavelenght Infrared), s'étendant entre 8 et 20 [lm. Ainsi, d'une façon générale, le faisceau incident 12 est émis selon une longueur d'onde X s'étendant entre 1 pm et 20 pm, ce qui correspond à un nombre d'onde (1/X) compris entre 500 cm-1 et 10000 cm-1. Dans l'exemple représenté, le dispositif comporte un réflecteur 13, pour réfléchir le faisceau lumineux 12 émis par la source de lumière 11 vers l'échantillon. De préférence, la 25 longueur d'onde est comprise entre 5pm et 20 pm. La source de lumière 11 est de préférence une source laser. Il peut notamment s'agir d'une source laser accordable en longueur d'onde, par exemple un laser QCL, acronyme de Quantum Cascade Laser, signifiant laser à cascade quantique, en particulier un laser à cavité externe. La largeur de la bande spectrale d'émission de la source de lumière est de préférence inférieure à 30 50 nm, voire à 10 nm, voire à 5 nm. Une source de lumière peut comporter plusieurs sources laser élémentaires QCL, émettant respectivement dans différentes bandes spectrales. 8 L'échantillon 10 est disposé entre la source de lumière 11 et un capteur d'image 20. Ce dernier s'étend de préférence parallèlement, ou sensiblement parallèlement à la lame transparente 15 supportant l'échantillon. Le terme sensiblement parallèlement signifie que les deux éléments peuvent ne pas être rigoureusement parallèles, une tolérance angulaire de quelques degrés, 5 inférieure à 20° ou 10° étant admise. L'échantillon est disposé sur un élément de maintien, configuré pour maintenir l'échantillon, et son support, entre la source de lumière et le capteur d'image. Sous l'effet de l'illumination par le faisceau lumineux 12, se propageant selon l'axe de propagation Z jusqu'à l'échantillon, ce dernier transmet une onde lumineuse 14, dite onde 10 lumineuse transmise. L'onde lumineuse transmise 14 se propage, parallèlement à l'axe Z, jusqu'à un capteur d'image 20. L'échantillon absorbe une partie du faisceau lumineux 12. Aussi, l'onde lumineuse transmise 14 correspond à une partie du faisceau lumineux 12 non absorbée par l'échantillon. Le capteur d'image 20 est apte à former une image de l'onde lumineuse transmise 14 selon un 15 plan de détection P20. Dans cet exemple, le capteur d'image est formé par une matrice de bolomètres, chaque bolomètre de la matrice présentant une bande spectrale de détection comprise entre 5 pm et 20 grn. Chaque bolomètre forme un pixel. Dans les exemples décrits par la suite, chaque pixel est formé par un bolomètre encapsulé sous vide. De façon classique, on peut acquérir une image de noir, correspondant au bruit de chaque bolomètre en l'absence 20 d'illumination. L'image de noir est ensuite soustraite de chaque image acquise. Lorsque l'échantillon est disposé entre le capteur d'image et la source de lumière, l'image acquise par le capteur d'image est représentative de l'absorption du faisceau incident 12 par l'échantillon 10. Lorsque le capteur d'image 20 comporte des pixels non fonctionnels, ou pixels morts, l'intensité de chaque pixel non fonctionnel est remplacée par une moyenne des intensités mesurées par 25 les pixels adjacents au pixel non fonctionnel. La distance d entre chaque pixel et l'échantillon 10 est de préférence inférieure à 5 mm. Plus elle est réduite, meilleure est la résolution spatiale de l'image acquise par le capteur d'image. Aussi, il est avantageux que la distance d soit inférieure à 1 mm, voire inférieure à 500 pm. L'échantillon peut être déposé au contact direct des pixels du capteur d'image 20, selon une 30 configuration d'ombroscopie, telle que décrite dans US20050190286. Du fait de l'absence d'optique de formation d'image entre l'échantillon 10 et le capteur d'image 20, le champ d'observation du capteur d'image est défini par la taille du capteur d'image et la 9 taille du faisceau incident. Le champ d'observation peut être supérieur à 1 mm2, voire supérieur à 5 mmz ou 10 mmz. De ce fait, l'acquisition d'une seule image permet d'obtenir simultanément une intensité de l'onde lumineuse 14 transmise par plusieurs mm2 de l'échantillon, typiquement au moins 5 ou 10 mmz de l'échantillon. 5 De préférence, la lame transparente 15 comporte un revêtement antireflet. Par exemple, lorsque la lame transparente est constituée de silicium, elle peut comporter une couche mince de germanium ou de sulfure de zinc (ZnS). Cela permet de limiter l'apparition de franges d'interférence sur les images formées par le capteur d'image. En l'absence d'une couche mince antireflet, la lame transparente 15 se comporter comme une cavité de type Fabry-Perot, ce qui 10 conduit à la formation de franges d'interférence indésirables sur l'image acquise par le capteur d'image 20. Une unité de traitement, prenant par exemple la forme d'un microprocesseur 22, est configurée pour effectuer, à partir des images acquises par le capteur d'image 20, des opérations de traitement d'images telles que décrites par la suite. Le microprocesseur 22 est relié à une 15 mémoire 23, comportant des instructions relatives aux traitements d'images à effectuer. Il peut être relié à un écran 24. La figure 2A représente un premier échantillon ayant été examiné à l'aide d'un dispositif tel que décrit sur la figure 1. Il s'agit d'une coupe de tissu musculaire prélevé d'une souris, puis congelé. Le tissu prélevé comportait une tumeur suite à l'injection de cellules tumorales de type CAL33. 20 II a été découpé pour obtenir un échantillon d'épaisseur égale à 4 p.m. L'échantillon a ensuite été déposé sur une lame de silicium ou sur une lame de CaF2 (Fluorure de Calcium). Les paramètres expérimentaux étaient : - source de lumière : source laser QCL émettant à la longueur d'onde de 7.35 p.m. - diamètre du faisceau incident : 1.5 mm ; 25 - capteur d'image : matrice de 80x80 bolomètres de 17 pm de côté, avec un écart centre- à-centre de chaque pixel égal à 30 pm, conférant un champ d'observation d'environ 2.4 x 2.4 mm2. La lame 15 a été montée sur une platine de translation, de façon à être translatée selon deux directions orthogonales X et Y perpendiculairement à l'axe de propagation Z. Le balayage a 30 permis de constituer une matrice de 150 images agencées selon 25 lignes et 6 colonnes. Le champ couvert par la matrice d'images correspond à une surface d'échantillon de largeur 3 mm et de longueur 12.5 mm. La surface de l'échantillon observée est encadrée sur la figure 2A. La 10 zone centrale de l'échantillon, repérée par la lettre T, correspond à une tumeur maligne tandis que la zone périphérique, repérée par la lettre H, correspond à un tissu sain. La figure 2B montre les images acquises par le capteur d'image. On observe que les images correspondant à la zone tumorale T ont un aspect dense, tandis que 5 les images correspondant à la zone saine H ont un aspect spongieux. Ainsi, une image infrarouge, acquise selon une modalité d'imagerie sans lentille, permet de détecter la présence d'une zone tumorale et de la visualiser. Elle permet de définir, sur l'échantillon, une région d'intérêt correspondant à la zone tumorale ou à la zone saine. Les figures 3A à 3D correspondent à un deuxième mode de réalisation, dans lequel plusieurs 10 images d'un échantillon sont réalisées, en modulant la longueur d'onde X du faisceau d'illumination 12. Il est connu que la transmittance spectrale de la lumière d'un échantillon varie en fonction de la composition de ce dernier, en raison de la présence de pics d'absorption correspondant à des modes de vibrations de molécules composant l'échantillon. La présence de pics d'absorption est 15 la base des méthodes de spectrométrie vibrationnelle de type spectroscopie infrarouge ou spectrométrie Raman. Par transmittance trxi, on entend un ratio entre une intensité i2, de l'onde lumineuse 14 transmise par l'échantillon, et détectée par le capteur d'image, à la longueur d'onde 2i, sur une intensité de l'onde lumineuse détectée par le capteur d'image, à la même longueur d'onde, en 20 l'absence d'échantillon. Ainsi, selon la loi de Beer-Lambert : trAi = i1 (1) où est l'intensité détectée par le capteur d'image en l'absence d'échantillon. L'absorbance abs,ii à la longueur d'onde 2.1 est obtenue selon l'expression : 25 = -In (trii) = -InH) (1') ro,t, La figure 3A montre un exemple de spectre d'absorption d'un analyte, l'axe des abscisses représentant la longueur d'onde. On distingue un pic d'absorption, repéré par une flèche, à une longueur d'onde d'absorption 4. De part et d'autre du pic d'absorption s'étend une ligne de base, repérée par une droite en pointillés. La ligne de base correspond à des longueurs d'onde 11 de base Ab, s'étendant de part et d'autre du pic d'absorption. Ainsi, une longueur d'onde de base est une longueur d'onde située en dehors du pic d'absorption de l'analyte. De préférence, une longueur d'onde de base délimite le pic d'absorption. A la longueur d'onde de base, l'absorption du faisceau lumineux incident par l'analyte est inférieure à l'absorption du faisceau incident par 5 l'analyte dans le pic d'absorption. La démarche proposée par les inventeurs consiste à déterminer une cartographie d'une absorbance résultant de la présence d'un analyte, dont la longueur d'onde d'absorption 2..a est connue. Pour ce faire, le procédé consiste à : - acquérir une image, représentative de l'absorption du faisceau lumineux 12 par 10 l'échantillon, correspondant à une image 1ao acquise par le capteur d'image lorsque le faisceau d'illumination est émis selon la longueur d'onde d'absorption de l'analyte Une telle image est désignée par le terme image d'absorption. - acquérir une image, dite image de fond, correspondant à une image /0,2' acquise par le capteur d'image en l'absence d'échantillon, à la longueur d'onde d'absorption .la. 15 La comparaison de l'image d'absorptiontia et de l'image de fond /0.4 peut permettre d'obtenir une image d'absorbance Absaa de l'échantillon, à la longueur d'onde d'absorption AtT, telle que: ((x, Absao(x, y) = -ln ( 0.44(x. ), y) (2) où - A bs ao(x, y) est la valeur de l'image d'absorbance A bs aci aux coordonnées (x, y) ; 20 laa(x , y) et 10,4(x, y) sont respectivement les intensités des pixels de l'image d'absorption et de fond, aux coordonnée (x, y). Ces images peuvent être corrigées de l'image de noir du capteur d'image. Les coordonnées (x, y) sont définies dans le plan de détection P20. Ce dernier étant parallèle au plan de l'échantillon Pio, les coordonnées (x, y) correspondent également à des coordonnées 25 dans le plan de l'échantillon Pio. A partir de l'image d'absorbance Absao, il est possible d'estimer une quantité Q (x, d'analyte à chaque coordonnée (x, y), avec Absaa(t,y) Q(x,y) = (3), où : PU° e(x.3)) 12 - E(K, y) est l'épaisseur de l'échantillon, selon l'axe de propagation Z, au niveau des coordonnées (x,y); - Rat, est le coefficient d'absorption de l'analyte, par unité de longueur, à la longueur d'onde Ail. 5 Ces étapes sont résumées sur la figure 3B: Etape 100: acquisition d'une image d'absorption /fia, lorsque l'échantillon est illuminé par une source de lumière à la longueur d'onde d'absorption 4. Etape 110: acquisition d'une image de fond /0,4, sans échantillon entre le capteur d'image et la source de lumière, à la longueur d'onde d'absorption 10 Etape 120: calcul d'un ratio entre l'image d'absorption et l'image de fond, pour obtenir une image d'absorbance de l'échantillon Absab, à la longueur d'onde d'absorption À. Selon une variante, l'échantillon est illuminé selon une longueur d'onde de base 2b, à laquelle l'absorption du faisceau incident par l'échantillon est inférieure à l'absorption à la longueur d'onde d'absorption 'la. Le procédé comporte alors les étapes suivantes : 15 Etape 130: acquisition d'une image d'absorption /2,b, lorsque l'échantillon est illuminé par une source de lumière à la longueur d'onde de base .1.b. Etape 140: acquisition d'une image de fond /0,xb, sans échantillon entre le capteur d'image et la source de lumière, à la longueur d'onde de base À,,. Etape 150: calcul d'un ratio entre l'image d'absorption et l'image de fond, pour obtenir une 20 image d'absorbance de l'échantillon Abs4, à la longueur d'onde de base 2.b. Etape 160 : soustraction de l'image d'absorbance de l'échantillon à la longueur d'onde de base, à l'image d'absorbance de l'échantillon à la longueur d'onde d'absorption, de façon à obtenir une image /, représentative de l'absorbance due à l'analyte. / = AbsÀb- Absxh. Cependant, il peut être difficile d'estimer des quantités d'analyte de façon quantitative. Les 25 inventeurs estiment qu'il peut être préférable d'effectuer des comparaisons entre des images d'absorbance résultant de différents analytes, et par exemple de différents biomarqueurs. On sait que l'activité cancéreuse peut être caractérisée par un indicateur morphologique, représentatif d'un ratio entre le volume du noyau et le volume du cytoplasme dans l'échantillon. En effet, il est connu que les cellules cancéreuses ont une activité métabolique plus importante 30 que les cellules saines. De ce fait, elles tendent à avoir un noyau dont le volume est plus 13 important que celui des cellules saines. De ce fait, le ratio volume nucléaire sur volume du cytoplasme est un indicateur utilisé par les histo-pathologistes pour établir le caractère malin d'une tumeur. La publication Amrania H "Digistain : a digital staining instrument for histopathology", Optics 5 Express 7299, Vol. 20, No. 7, 26 March 2012, décrit une méthode basée sur une comparaison de l'absorbance due à des groupes P02, représentatif de liaisons phosphodiester à l'intérieur du noyau cellulaire, et de l'absorbance due à des liaisons Amide, ces dernières étant représentatives de liaisons peptidiques, à l'intérieur du cytoplasme. En effectuant une comparaison entre l'absorbance due aux liaisons phosphodiester et l'absorbance due aux 10 liaisons peptidiques, on peut obtenir un indicateur morphologique représentant un ratio volume nucléaire / volume cytoplasmique. Les inventeurs se sont inspirés de cette méthode. Pour cela, ils ont illuminé successivement un échantillon, tel décrit en lien avec la figure 2A, selon différentes longueurs d'onde 210,1, 210,2, Xb,1 et X1),2, telles que : 15 1/X0,1= 1081 cm 1, ce qui correspond à un pic d'absorption de P02; - 1/Xa,2= 1654 cm-1, ce qui correspond à un pic d'absorption de d'un groupement Amide, dans une bande spectrale communément désignée Amide I, correspondant à une vibration de la liaison C=O. - 1/Xba = 951 cm-1, ce qui correspond à la ligne de base autour du pic d'absorption de PO2- 20 - InLb,2= 1491 cm 1, ce qui correspond à la ligne de base autour du pic d'absorption Amide La source de lumière utilisée comportait 4 lasers QCL, émettant respectivement dans les plages spectrales suivantes : 25 - 1949 cm-là 1706 cm-1; - 1712 cm-là 1410 cm-1 ; - 1464 cm-là 1149 cm-1 ; - 1218 cm-là 896 cm-1. A chaque longueur d'onde X, deux images ont été acquises : 30 une image de fond 10,4 sans échantillon entre la source de lumière et le capteur d'image; 14 - une image d'absorption lx, l'échantillon étant disposé entre la source de lumière et le capteur d'image. En effectuant un ratio entre l'image d'absorption lx et l'image de fond 10,2' on a obtenu, à chaque longueur d'onde x, des images d'absorbance Abs;' 5 On a ainsi obtenu, pour chaque analyte, en l'occurrence pour P02 et la liaison Amide : - une image d'absorbance au niveau de chaque pic d'absorption; ces images étant notées Absku et Absx'2; - une image d'absorbance au niveau de la ligne de base s'étendant de part et d'autre de chaque pic d'absorption, ces images étant notées Absxb et Abs42; 10 Les figures 3C et 3D représentent une image d'absorbance aux longueurs d'onde 1081 cm-1 et 1654 cm* On a ensuite soustrait, à l'image d'absorbance obtenue à chaque longueur d'onde d'absorption, l'image d'absorbance obtenue à une longueur d'onde de base, de façon à obtenir une image, représentant une absorbance due de chaque analyte. Dans cet exemple, les analytes considérés 15 sont P02 et un groupement amide. Les images des absorbances dues à chaque analyte /1 et /2 correspondant respectivement à P02 et à la liaison amide, sont telles que : = AbsÀ.,i- Absxfri (4) 12 = Absx, - Abs42 (4') 20 Ce mode de réalisation revient à effectuer les étapes 100 à 160 décrites en lien avec la figure 3B, une première fois en considérant les longueurs d'onde Àaa et Àba, et une deuxième fois en considérant les longueurs d'onde 42 et À.b,2. On peut alors effectuer un ratio entree deux images 11 et /2, de façon à obtenir une cartographie du ratio volume nucléaire / volume cytoplasmique. En fonction du ratio /2(xix) on définit, sur ' 25 l'échantillon, des régions d'intérêt correspondant à des zones tumorales. Comme le montrent les exemples qui précèdent, l'invention permet de définir, sans marquage, des régions d'intérêt d'un échantillon, susceptibles de présenter un caractère pathologique. La configuration d'imagerie sans lentille permet d'adresser un champ d'observation REVENDICATIONS1. Procédé d'observation d'un échantillon biologique (10), l'échantillon étant disposé entre une source de lumière (11) et un capteur d'image pixellisé (20), la source de lumière émettant un faisceau lumineux incident (12), se propageant jusqu'à l'échantillon selon un axe de propagation (Z), et selon une longueur d'onde d'émission (X) comprise entre 1 lm et 20 le procédé comportant les étapes suivantes : a) illumination de l'échantillon par la source de lumière ; b) acquisition d'une image (Ix) de l'échantillon par le capteur d'image pixelisé (20), aucune optique de formation d'image n'étant disposée entre l'échantillon et le capteur d'image; le procédé étant caractérisé en que l'échantillon (10) est apte à absorber une partie du faisceau lumineux incident, de telle sorte que l'image acquise (/i) est représentative d'une absorption du faisceau incident (12) par l'échantillon, à la longueur d'onde d'émission. 2. Procédé selon la revendication 1, comportant également les étapes suivantes : c) illumination du capteur d'image (20) par la source de lumière (11), à la longueur d'onde d'émission, sans échantillon entre le capteur d'image et la source de lumière, de façon à obtenir une image de fond (4,2,) ; d) comparaison de l'image (a) acquise lors de l'étape b) et de l'image de fond (4.x) acquise lors de l'étape c) pour obtenir une image (Absx) de l'absorbance de l'échantillon à la longueur d'onde d'émission. 3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel la longueur d'onde d'émission est une longueur d'onde d'absorption (fia) d'un analyte, correspondant à un pic d'absorption de l'analyte, le procédé comportant une cartographie d'une quantité de l'analyte dans l'échantillon à partir de l'image de l'absorbance (Absx) à la longueur d'onde d'émission. 4. Procédé selon la revendication 2, dans lequel la longueur d'onde d'émission est une longueur d'onde d'absorption d'un analyte (2a), correspondant à un pic d'absorption de l'analyte, de façon à obtenir une image de l'absorbance de l'échantillon à la longueur d'onde d'absorption (Abs4), le procédé comportant également les étapes suivantes : e) illumination de l'échantillon selon une longueur d'onde de base (Ab), à laquelle l'absorption de l'analyte est inférieure à l'absorption de l'analyte à la longueur d'onde d'absorption (2,.,) ; 16 f) acquisition d'une image (4d de l'échantillon par le capteur d'image pixelisé (20) ; g) illumination du capteur d'image (20) par la source de lumière (11), à la longueur d'onde de base, sans échantillon entre le capteur d'image et la source de lumière, de façon à obtenir une image de fond (/0,4) à la longueur d'onde de base ; 5 h) comparaison de l'image (lad acquise lors de l'étape f) et de l'image de fond (./0,2,b) acquise lors de l'étape g) pour obtenir une image (Absxh) de l'absorbance de l'échantillon à la longueur d'onde de base (4); le procédé comportant également une soustraction des images d'absorbance de l'échantillon respectivement à la longueur d'onde d'absorption et à la longueur d'onde de base 10 (AbsawAb%), de manière à obtenir une image d'absorbance (1) due à l'analyte. 5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel : les étapes a) à d) sont répétées en illuminant successivement l'échantillon selon : - une première longueur d'onde d'absorption Pa,1), correspondant à une longueur d'onde d'absorption d'un premier analyte ; 15 - une deuxième longueur d'onde d'absorption (4,2), correspondant à une longueur d'onde d'absorption d'un deuxième analyte ; de manière à obtenir des images de l'absorbance de l'échantillon (Absaa,Absaj respectivement à la première longueur d'onde d'absorption et à la deuxième longueur d'onde d'absorption ; 20 et dans lequel les étapes e) à h) sont répétées en illuminant successivement l'échantillon selon: - une première longueur d'onde de base (1b.1), à laquelle l'absorption du premier analyte est inférieure à l'absorption du premier analyte à la première longueur d'onde d'absorption (2,1); (4,2), à laquelle l'absorption du deuxième - une deuxième longueur d'onde de base 25 l'analyte est inférieure à l'absorption du deuxième analyte à la deuxième longueur d'onde d'absorption (2,2); de manière à obtenir des images de l'absorbance de l'échantillon (Ahsab,,Abs2fr2) respectivement à la première longueur d'onde de base et à la deuxième longueur d'onde de base ; 30 le procédé comportant également - une soustraction des images d'absorbance de l'échantillon respectivement à la première longueur d'onde d'absorption et à la première longueur d'onde de base 17 ,Abstb Abs.a ), de manière à obtenir une image d'absorbance due au premier analyte (/i); - une soustraction des images d'absorbance de l'échantillon respectivement à la deuxième longueur d'onde d'absorption et à la deuxième longueur d'onde de base 5 (Abs2,,,Abs2b),), de manière à obtenir une image d'absorbance due au deuxième analyte 02); - une comparaison de l'image d'absorbance due au premier analyte et de l'image d'absorbance due au deuxième analyte. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'échantillon est 10 une lame de tissu biologique. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la source de lumière éclaire une surface de l'échantillon supérieure à 1 mmz ou supérieure à 5 mmz. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'image de l'échantillon acquise par le capteur d'image (20) correspond à une surface d'échantillon 15 supérieure à 1 mmz ou supérieure à 5 mmz. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les pixels du capteur d'image définissent un plan de détection (Pm), l'échantillon étant disposé à une distance du plan de détection inférieure à 1 mm. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comportant, à partir de 20 l'image acquise, une étape de détermination d'au moins une région d'intérêt de l'échantillon. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'échantillon (10) est maintenu par un support (15) comportant au moins un des matériaux suivants : - silicium ; - et/ou germanium ; 25 - et/ou fluorure de calcium ; - et/ou fluorure de baryum.