Brevet FR3084086A1 — publié le 20200124

Description Titre de l'invention : Nouvelle souche virale atténuée et son uti- lisation en tant que vaccin Domaine technique [0001] La présente invention concerne des souches virales modifiées génétiquement à partir d'une nouvelle souche de metapneumovirus humain. [0002] La présente invention concerne ces souches modifiées, dont la virulence est atténuée, pour leur utilisation dans le traitement prophylactique ou thérapeutique des infections aux virus de la famille des Pneumoviridae, ainsi que des compositions vaccinales comprenant lesdites souches virales modifiées. INTRODUCTION [0003] Les infections aiguës des voies respiratoires inférieures sont l'une des causes majeures de morbidité et de mortalité à l'échelle mondiale. Chez les enfants de moins de 5 ans en particulier, elles représentent jusqu'à plus de 15 % de la mortalité, selon les pays évalués, et sont ainsi la deuxième cause de mortalité d'après l'Organisation Mondiale de la Santé. [0004] La majorité des infections aiguës des voies respiratoires inférieures, associées à des pathologies variables allant du simple rhume à la pneumonie grave, sont notamment causées par des virus, tels que ceux appartenant aux familles suivantes : i. virus de la famille des Orthomvxoviridae (comprenant notamment les virus Influenza) ; ü. virus de la famille des Paramyxoviridae ; iii. virus de la famille des Adenoviridae ; iv. virus de la famille des Picornaviridae ; y. virus de la famille des Coronaviridae et vi. virus de la famille des Pneumoviridae, comprenant notamment le virus res- piratoire syncytial humain et le métapneumovirus humain. 100051 Le virus respiratoire syncytial humain (hRSV) et le métapneumovirus humain (hMPV) sont des virus responsables d'infections aiguës des voies respiratoires telles que des bronchiolites, des bronchites ou des pneumonies. Ils touchent principalement les populations à risques que sont les jeunes enfants de moins de 5 ans, les personnes âgées et les personnes immunodéprimées. 100061 Le virus hRSV est l'agent étiologique principal des bronchiolites et pneumonies chez les nourrissons de moins de 1 an, avec une incidence accrue en-dessous de 6 mois de vie. Chez l'adulte, l'infection à hRSV est rare et bénigne, sauf chez le sujet âgé. La transmission se fait essentiellement, par voie respiratoire, le virus se répliquant dans le 2 tractus respiratoire. [0007] Le virus hRSV a été isolé en 1957. lI s'agit d'un un virus à ARN monocaténaire de polarité négative, de type « enveloppé », à capside à symétrie hélicoïdale. Il appartient à la famille des Pnewnoviridae et au genre Orthoptzeumovirus. [0008] Le virus hMPV est prévalent dans les bronchiolitcs et pneumonies chez les nourrissons, et touche particulièrement sévèrement les enfants entre 1 et 3 ans. [0009] Les principaux symptômes de l'infection par le hMPV chez l'enfant comportent la rhinorrhée, la toux, la détresse respiratoire ou encore de la fièvre. Lc hMPV peut aussi causer des infections des voies respiratoires supérieures, pouvant être associées à des otites, alors que les symptômes non respiratoires, tels que la diarrhée, les vomissements et l'apparition d'érythème, sont plus rares. Le hMPV cible préférentiellement les cellules ciliées de l'arbre respiratoire humain. [0010] Une infection par hMPV induit des modifications histo-pathologiques dans les poumons de l'organisme hôte, et génère en particulier les effets physiologiques suivants : Des dommages au niveau de l'épithélium respiratoire ; Une production excessive de mucus, et Une inflammation aie°, notamment au niveau des tissus pulmonaires interstitiels, liée à une sécrétion importante de cytokines pro-inflammatoires et chimiokincs. [0011] Dans les pathologies respiratoires chez les adultes, le virus hMPV a été identifié chez à 10% des adultes ou personnes âgées présentant une infection aigtie des voies respiratoires, et chez 3 à 5% des adultes ayant une exacerbation d'une pathologie pulmonaire chronique ou d'une pneumonie acquise en communauté. [0012] Le virus hMPV a été isolé et démit pour la première fois en 2001 aux Pays-Bas (van den Hoogen et al., 2001). L'année suivante, plusieurs souches de HMPV ont été isolées chez des patients localisés en Amérique du Nord (Peret et al., 2002). Les hMPV sont des virus à ARN monocaténaire négatif, appartenant à la famille des Pneumoviridae et au genre Metapneumovirus. [0013] L'âge moyen des enfants hospitalisés des suites d'une infection par le hMPV est de 6 à 12 mois, soit plus tard que celle provoquée par le hRSV, qui survient principalement entre 0 et 3 mois. Toutefois, l'épidémiologie du hMPV présente de nombreux points communs avec celle du hRSV : il est présent sur tous les continents ; sa distribution annuelle est majoritairement hivernale et printanière, recoupant celle du hRSV ; sa transmission se fait aussi probablement par gouttelettes salivaires. [0014] 11 n'existe aujourd'hui sur le marché aucune modalité prophylactique ou théra- 3 peutique efficace et spécifique contre l'infection par les virus hRSV et hMPV, bien que d'actives recherches soient en cours (Mazur et al., 2018). [0015] A titre de traitement, la ribavirine, non exempte d'effets indésirables, ou encore les immunoglobulines intraveineuses, très onéreuses, peuvent être utilisées ponctuellement dans les cas graves d'infections par hMPV ou hRSV. D'autres types de traitements sont en cours de développement tels que l'utilisation de peptides inhibiteurs de fusion, les glycosaminoglycancs sulfate, les ARN interférents et certains immunomodulateurs. [0016] La démarche clinique usuelle et largement privilégiée aujourd'hui consiste à traiter surtout les symptômes de l'infection, en mettant les patients sous assistance respiratoire (administration d'oxygène ou ventilation mécanisée) et en leur administrant des bronchodilatateurs, corticostéroïdes et/ou antibiotiques pour prévenir ou traiter les surinfections bactériennes. [0017] En ce qui concerne la vaccination, les populations particulièrement touchées par le hMPV étant les nourrissons, les jeunes enfants et les personnes âgées, il est crucial de pouvoir disposer rapidement de vaccins efficaces et sécuritaires, afin de réduire les atteintes respiratoires sévères qui ont un impact dramatique dans ces tranches d'âge. [0018] La mise au point d'un vaccin contre le hRSV et le hMPV représente donc non seulement un enjeu sanitaire majeur, mais également un réel enjeu socio-économique avec l'objectif de réduire les coûts importants des traitements et d'hospitalisations associés à ces infections, et de diminuer l'utilisation d'antibiotiques dans le contexte des surinfections bactériennes, et ainsi de limiter l'émergence de résistances. Technique antérieure [0019] Les tableaux 1, 2 et 3 ci-dessous listent les différentes approches en cours de déve- loppement pour obtenir des vaccins vivants atténués à partir de souches virales sauvages de hMPV. [0020] Des souches virales sont considérées comme étant atténuéesin vitro lorsque celles-ci présentent une capacité réplicative diminuée par rapport au virus sauvage (WT), et/ou lorsque ces souches virales entraincnt la formation de foyers infectieux, notamment de syncytia (cellules adjacentes fusionnant suite à l'infection virale), plus restreints. In vivo, les souches virales atténuées se répliquent à un titre maximal plus faible et/ou induisent une pathologie moins sévère (en termes de perte de poids ou de profil inflammatoire ou d'atteintes histo-pathologiques) que la souche virale sauvage. [Tableaux]] Na' "drus fresvnptren Atténuation Atténuation Anticorps Référence in vie', in vivo rocntra9smms prote CM1.1111 op-r-iFNfPL' M1I esedan, de 11 rentoilons. aa parmi les il nid' les par des passages sur cellules Vero, tempOrature d:aoroisoante "usgrià 2 rC y Vete. i 39Ï J.. H "He rfst de (BleiLl ") Graaf et al 2(108) op-ItkrPV HR4V2 ipifetui:xJ-9). 4 rettattens ce COki t" Vero > 1 tHerfst. de ceassaning de h RS`,..' te 3 i.-4- Graaf et al 260-13). rhMPV V-033 "IA LlifC 0) Mutations dans le domaine de saison à l'Integrine de ia protéine F !....- ...2 "OR v CE "Wei, Zhang et ai. 201$) znd M2 Suppression du sEte de N- eilyous,patior fast72) de la prof eirie F "' Vero. r' lel V t'il c`l'in. Li et al ' y M SCiD 21f2) (Liu. Snu et a 2013) HMPV-MTase 4 -L'HUIIl:Ci) Mu' .s dl.: e0CE / LL1.-MK2 ''' CR. Ignan g Vssei et al. 21.014'' met l- gitans feras e de la - pruvmeraec L 311. uôA 017C 0A, and D 1755A Liste des candidats vaccin atténués sur la base d'une souche de virus hhh3V présentant ne ou des mutations, développes ou en cours de développement 100211 Le terme « Vero » désigne une lignée de cellules de rein de singe vert africain, couramment utilisée en culture cellulaire pour tester divers virus. 100221 Le terme « LLC-MK2 » désigne une lignée cellulaire issue de cellules de rein de singe rhésus, utilisée pour des tests d'infection par divers virus. [0023] Le symbole wi indique que les cellules utilisées sont susceptibles à l'infection virale. [0024] Les abréviations suivantes sont utilisées pour les modèles d'études in vivo : M pour Mouse; H pour hamster; CR pour Cotton Rat; CM pour Cynomolgus Macaque; AGM pour African Green Monkey; Ch pour Chimpanze; Rh pour Singe Rhésus; et SCID pour Severe Combined ImmunoDeficiency. 5 [Tablcaux2] Non du virus Des cn puce e u.stlan in Atter0.tuaon en neoirai:sante paoteoteQa et; eg ces tain me, -fhp Deie u .-.3ent, La LLG-MK2 0H tBacch Skiactoçcinos et ar. 2004:: iBlacchest ft"ham el al. ç.A2te.,A N9 1 Sil / Ch ..21:05': "rthilP G L7e?etfon yèf 0 I1K2 à 3 ,,K> EFS , H fa at..c.her, , Szkiadopculos et a 2004) (BLacchesi Phosn et al. ',-.2te.fte.19.^ 31 , ' > ajours 2005": -, Hiv} F- L',H.'.2,G Délétion des oenes 3H et G 0 LLC-MK2 a 3 tourg 0 H > 3 louras iaacches1 2/CAN9.7-63) S:tiadopstil os cl ai 2C04) tIMPV- CiM[2 2 A.2,Ce..N97-83 y Mutations codon mita on + codon :stop ro , Ch `,Ettichheiz, BincenEEJ et S 20°51 iBtatchest, Pilarn et al 20054 t'Stthiàt., KBilf et a! 201:18`, HtrtP - 13i [12-1 Mutation ce n i..': \iercs 0 hi Etttatiloia, _:C...,,U497-831 stop Biarche st et al 20'95; G(jttaV- ii,M2-11 Deletton dl: gène M2 complet G tacet 0 R g fi ,Fitrhhnlz AW12-2 Biaccnes; et .A2t.,),N97-631 al 2G05'3 Liste des candidats vaccins vivants atténués développés développement, riant une souche de virus hrilPV présentant une délétion complète d'au moins [0025] A : délétion totale du gène. 0 = pas d'atténuation ou d'avantage réplicatif. [0026] Toutes les souches virales atténuées testées sont dérivées de la souche sauvage CAN97-83 du sous-groupe A2. 6 [Tableaux3] Nom du Description. AEtènuation Atteriu ;on Ac. Test .0 truque Ret virus itt vîtro in Y'kO neterallsants protecteurs FIMP)I-Pa (AWCANYi 031 Fond genettefue eiru-s HMPV (Sil stabilisé} [change du gère P 2.):.(:. r non-ielogue aMPV C 0 Vero v H w" H Phase ! (Pham, / .kseyl ,i- ACM #'1CT D12 5541U Biatthe si el at 2C05) ikapon. San Uatee el al. M'Ir HMP'v Na: jA2,C,AW91- 83) Ford gérètique yirus HMPV (SH stabiise EchangE du gène N avec 1 Morrolcèue aMPV C 0 Vero Y- g IZZ ' A'aF,S tp}3ar. Biacche si el. al. 2005) bit P11.3i hMPV Z2 Fond gen)tttcfue PN-3 ho'flin E Chan Ce d E 3 tiares F et MN avec leur hernelegne hP1,-3 3H ACM SchickG Est 1)/1.1.?1,11(1;031 Ajout F h1),,1 en 211), po 1 sur le. ger.or6e g AGM (hP ai 2603) 'n Rn rang, Séronégatif Mahencsd: et al. 2605) Se1/..1.1P1f-Ft (A21 CAND13- 16) Fond génètique ViLLIS Se] Y CR Y CR (Ruasei1 :ajout gène F hMPV trcr4-ue psur Sen domaine TM jolies e1 ai 201.71 Liste des candidats vaccins vivants atténués développés ou e japement, sas sur une souche de virus hMPV chimérique [0027] Les abréviations suivantes sont utilisées : TM = domaine transmembranaire ; PIV = Virus Parainfluenza; SeV = Virus Sendai. [0028] La demande internationale WO 2005/014626 est relative à plusieurs souches de virus hMPV, désignées par les dénominations suivantes : CAN 97-83, CAN 98-75 and HMPV 00-1. Ccttc demande décrit une souche de virus hMPV recombinante, désignée CAN 97-83, modifiée génétiquement pour atténuer sa virulence. Les modifications proposées concernent notamment la délétion totale des gènes codant pour les protéines G et/ou SH. Les souches virales modifiées peuvent être utilisées en thérapie humaine, pour prévenir ou traiter les infections aux pncumovirus. L'administration de la souche sauvage ou de ces souches atténuées à des hamsters permet de les protéger contre une infection ultérieure par un virus HMPV CAN 97-83. Toutefois, WO 2005/014626 ne fait pas état de propriétés complètes de protection, en particulier aucun suivi de poids des animaux traités n'est réalisé. Les mêmes résultats expérimentaux sont présentés dans les articles scientifiques cités dans le tableau 2. [0029] Avec les mêmes souches atténuées, des résultats in vivo ont ensuite été obtenus sur un modèle animal de singes ; les souches virales recombinantes délétées des gènes SH, G et M2-2 continuent à se répliquer dans les voies respiratoires des singes ; et par 7 ailleurs induisent la production d'anticorps neutralisants tout comme la souche virale sauvaee CAN97-83. [0030] D'autres souches de hMPV isolées ont été décrites dans le brevet US 8,841,433, leur utilisation pour la préparation de vaccins étant également proposée. [0031] Les vaccins basés sur l'utilisation de souches virales vivantes atténuées présentent de nombreux avantages. [0032] D'une part, les vaccins produits à partir de virus vivants atténués présentent l'avantage d'induire une forte réponse immunitaire à partir d'un virus dont la capacité à sc multiplier est considérablement réduite, permettant ainsi d'éviter l'apparition de la pathologie tout en mimant l'infection naturelle. Lors de la mise au point de ces souches atténuées, il est important de trouver la balance idéale entre l'atténuation et immunogénicité. [0033] D'autre part, ces vaccins peuvent être administrés par voie intra-nasale, et ainsi mimer la voie d'entrée naturelle des virus sauvages, induisant ainsi une réponse immunitaire assez similaire à la réponse physiologique à une infection. [0034] De plus, cette stratégie de vaccination ne génère pas une réaction inflammatoire exagérée, comme cela peut être le cas avec les vaccins inactivés. Enfin, l'ajout d'adjuvant n'est généralement pas nécessaire. [0035] C'est donc la stratégie vaccinale optimale pour la prévention dans les populations à risque tels que les jeunes enfants et les nourrissons. Exposé de l'invention [0036] L'invention a pour objet une souche virale atténuée dérivée d'une souche clinique particulière rC-85473 de metapneumovirus humain, comprenant la séquence génomique représentée par la séquence SEQ ID NO. I, ladite souche atténuée comprenant une ou des modifications génétiques de ladite séquence SEQ ID NO.1. [0037] Les souches virales atténuées selon l'invention sont notamment les souches recom- binantes modifiée par délétion des gènes codant pour les protéines accessoires G et/ou SH, pour générer des virus recombinants désignés AG rC-85473 et ASH rC-85473, respectivement. [0038] Ces souches ont été caractérisées aux niveaux de leur infectivité et leur réplication virale en modèles cellulaires in vitro et ex vivo (sur des épithéliums respiratoires humains reconstitués et cultivés à l'interface air-liquide), ainsi qu'au niveau de la pathogénèse virale et de la protection vaccinale en modèle murin d'infection par hMPV. [0039] Les résultats présentés dans la section expérimentale mettent en évidence les propriétés spécifiques de ces souches virales AG rC-85473 et ASH rC-85473, en com- paraison de celles de souches virales modifiées de manière similaire, également délétées des gènes G ou SH, mais dérivées d'une autre souche clinique de virus hMPV 8 (CAN98-75). [0040] Les virus AG ou ASH rC-85473 présentent en particulier : i. un caractère viral atténué en modèle murin, à la différence du virus recombinant ASH CAN98-75 qui lui est très virulent ; ii. tout en conservant leur capacité de réplication en systèmes cellulaires adhérents (lignée de référence LLC-MK2) et en suspension, à la différence des virus recombinants CAN98-75 qui sont beaucoup moins productifs ; iii. Les virus AG ou ASH C-85473 présentent de manière avantageuse des propriétés de protection significatives : 100% de survie des souris infectées, peu de perte de poids, induction d'une réponse d'anticorps neutralisants contre la souche virale homologue (C-85473, sérotype A) et au moins contre une souche hétérologue (CAN98-75, sérotype B), ainsi qu'une pathogénèse pulmonaire réduite chez les animaux infectés, vis-à-vis d'un challenge infectieux par un virus hMPV sauvage (souche rC-85473), qui lui occasionne 50% de létalité dans les groupes témoins non immunisés. [0041] Cette souche virale atténuée peut être utilisée in vitro en tant que vecteur d'expression d'au moins un gène exogène, en particulier un gène codant pour un antigène viral, et en premier lieu, des antigènes viraux issus du virus respiratoire syncytial (hRSV) et en particulier sa protéine de fusion F. [0042] L'invention concerne également cette souche virale atténuée pour son utilisation en tant que médicament, et plus particulièrement pour prévenir et/ou traiter les infections par des virus de la famille des Pneumoviridae. [0043] Enfin, l'invention concerne également une composition vaccinale comprenant, dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable, au moins une souche virale atténuée telle que définie ci-dessus, et optionnellement un adjuvant. Brève description des dessins [0044] Figure 1. Virus recombinants hMPV générés à partir des souches cliniques C- 85473 et CAN98-75. [0045] [fig. I A] Représentation schématique du génome des virus recombinants générés par génétique inverse à partir de la souche clinique C-85473, et dans laquelle a été clonée la séquence codante de la GFP (Green Fluorescent Protein) à son extrémité 3'. Le virus rC-85473 contient le génome de la souche C-85473 sauvage exprimant en plus le gène GFP. Les génomes des virus recombinants issus de la souche C-85473 et délétés des gènes SH (ASH-rC-85473) ou G (AG-rC-85473) sont représentés en dessous. Les virus modifiés génétiquement sont fonctionnels et réplicatifs, tel qu'indiqué par les clichés de cellules LLC-MK2 infectées à une Multiplicity of Infection (MOI) de 0,01 par ces 9 virus, et observées en microscopie à fluorescence à trois jours post-infection. [0046] [fig.1B] Représentation schématique du génome des virus recombinants générés par génétique inverse à partir de la souche clinique CAN98-75, et dans laquelle a été clonée la séquence codante de la GFP (Green Fluorescent Protein). Le virus rCAN98-75 contient le génome de la souche CAN98-75 sauvage exprimant en plus le gène GFP à son extrémité 3'. Les génomes des virus recombinants issus de la souche CAN98-75 et délétés des gènes SH (ASH-rCAN98-75) ou G (AG-rCAN98-75) sont représentés en dessous. Les virus modifiés génétiquement sont fonctionnels et réplicatifs, tel qu'indiqué par les clichés de cellules LLC-MK2 infectées à MOI 0,01 par ces virus et observés en microscopie à fluorescence à trois jours post-infection. [0047] Figure 2.Capacités réplicatives in vitro des souches virales rC-85473 et rCAN98-75 et de leurs souches dérivées. [0048] [fig.2A] Titre viral évalué en TCID50/m1 dans les surnageants cellulaires prélevés chaque jour pendant 7 jours après une infection de cellules LLC-MK2 par les virus recombinants rCAN98-75 (ronds noirs), ASH-rCAN98-75 (carrés noirs) et AG-rCAN98-75 (triangles noirs) à une multiplicité d'infection (MOI) de 0.01. [0049] [fig.2B] Titre viral évalué en TCID50/m1 dans les surnageants cellulaires prélevés chaque jour pendant 7 jours après une infection de cellules LLC-MK2 par les virus recombinants rC-85473 (ronds noirs), ASH-rC-85473 (canés noirs) et AG- rC-85473 (triangles noirs) à une multiplicité d'infection de 0.01. [0050] p ' p ITableaux41 ORF T1. P F M2-1 1022 G CAN97-83 (99) 93(99) X94 (99) 94 " 94 (94) 90 (95) 51 (688 94 (90} CAN98-7S (82) 96 (96) 05) 45(97) GD -, 70 (81} 56 ) 8 93} NI_ 091 (Al) 98 99} 97 (9 98 i99) 97 (99} G3t 493 93 (9 9, 6} 93 (99) (99) Pourcentage d'identité de séquence nuclMtidique pour chaque ORF {l'identité de !a séquence 'acides amines est indiquée entre parenthèses1 entre le virus rC-85473 et d'autres virus hMPV [0101] Au regard de la forte homologie de séquence observée avec la souche NL 00-1, il peut être conclu que cette souche rC-85473 est membre du sous-groupe A 1. [0102] La souche rC-85473 se caractérise par de grandes capacités fusogènes, lui permettant de pénétrer dans les cellules cibles à une haute fréquence d'infection. Cette grande capacité fusogénique de cette souche permet de générer des syncytia particulièrement étendus. Les syncytia sont des cellules géantes multinucléées. Le virus rC-85473 a une forte capacité à induire la fusion cellulaire in vitro, conduisant à la formation de ces syncytia très étendus, constitués d'un très grand nombre de noyaux cellulaires. Il a été montré que 5 acides aminés du domaine fonctionnel HRA de la protéine F, acides aminés uniques parmi les autres souches hMPV connues, sont en partie responsables de ce phénotype hyperfusogénique. (Aerts et al, 2015b ; Dubois et al., 2017) Technologie de génétique inverse 101031 La technologie de génétique inverse permet de créer, à partir d'une séquence d'acide nucléique, ADN ou ARN, et de cellules hôtes appropriées, un virus encapsidé fonctionnel. 101041 La souche recombinante rC-85473 de metapneumovirus humain a ainsi été obtenue à partir d'une souche clinique désignée C-85473, isolée chez un patient. 101051 Le premier système de génétique inverse appliqué au virus hMPV a été décrit en 2004 (Biachesi et al., 2004). Cette technologie est également présentée dans l'article (Aerts et al., 2015h). [0106] Le principe de cette technologie, qui permet la production de virus hMPV re- combinants, repose sur l'utilisation d'une lignée cellulaire de rein de hamster (BHK-21) modifiée pour exprimer constitutivement l'ARN polymérase du bactériophage T7 (cellules BHK-T7 ou BSR-T7/5). [0107] Les éléments génomiques sont répartis dans cinq éléments plasmidiques : un plasmide codant l'antigénome du virus hMPV et 4 plasmides « satellite », codant pour les protéines virales de la machinerie de transcription (L, P, N et M2-1). 16 [0108] Après co-transfection du plasmide antigénomique hMPV et des quatre plasmides « satellite » dans ces cellules, un brin d'ARN correspondant au brin génomique viral (brin d' ARN négatif), est transcrit par la T7polymérase à partir de son promoteur. [0109] Les quatre protéines impliquées dans la transcription virale du hMPV sont également exprimées par les cellules hôtes transfectécs pour constituer un complexe RNAdependant RNA polymerase (RdRP) actif. Cette polymérase virale fonctionnelle transcrit ainsi l'ARN génomique en ARNm viral puis le réplique en de nouvelles molécules d'ARN génomique viral, via la transcription de brins matrice. [0110] La traduction et l'assemblage des protéines virales avec l'ARN génomique permettent ainsi le bourgeonnement de particules infectieuses hMPV à partir de la membrane cytoplasmique des cellules BHK-T7 transfectécs. Ensuite, l'amplification des virus recombinants est permise grâce à l'ajout en co-culture de cellules LLC-MK2 (ATCC CCL-7), permissives à l'infection. [0111] Ainsi, à partir d'une séquence génomique d'une souche virale particulière, il est possible de produire des virus recombinants grâce à ces cellules modifiées, accessibles dans le commerce. [0112] Souche virale atténuée dérivée de la souche rC-85473 [0113] La présente invention concerne une souche virale atténuée dérivée d'une souche de metapneurnovi rus humain comprenant la séquence génomique représentée par la séquence SEQ ID NO. 1, ladite souche atténuée comprenant une ou des modifications génétiques de ladite séquence SEQ ID NO. 1. [0114] Dans la présente demande, les termes « un virus » et « une souche virale » sont utilisés indifféremment pour désigner une souche virale particulière, telle qu'identifiée précédemment. [0115] Au sens de l'invention, on entend par « souche dérivée » une souche virale re- combinante obtenue par l'introduction de modifications génétiques dans le génome d'une souche virale dite « souche d'origine ». La souche d'origine est avantageusement une souche sauvage, par exemple un isolat clinique. [0116] La virulence d'une souche virale correspond au degré de rapidité de multiplication d'un virus dans un organisme donné, donc à sa vitesse d'envahissement. Par « atténuer la virulence », on entend donc diminuer la vitesse d'envahissement d'un virus dans un organisme. [0117] Cette atténuation peut prendre la forme d'une diminution des capacités de réplication de la souche virale, d'une diminution de sa capacité d'infection des cellules cibles, ou encore d'une diminution de la pathologie induite par l'infection virale de l'organisme. [0118] Ainsi, par « souche virale atténuée » on entend, au sens de l'invention, un virus re- combinant dont la virulence est diminuée par rapport à celle de la souche virale d'origine, c'est-à-dire inférieure à celle de la souche virale d'origine. 17 [0119] Pour mesurer la virulence d'une souche virale, des tests in vitro, ex vivo ou in vivo peuvent être réalisés, comme par exemple des tests de capacité réplicative in vitro (mesurée par titration TCID50/ml ou PCR quantitative), le suivi par observation microscopique de l'évolution des effets cytopathiqucs in vitro et ex vivo, ou le suivi des signes cliniques de la pathologie et la mesure de titres viraux pulmonaires dans un modèle d'infection in vivo. [0120] Pour comparer les effets physiologiques d'une souche sauvage et d'une souche atténuée, il est également possible de mesurer / déterminer différents paramètres physiologiques modifiés au niveau du poumon et/ou du système immunitaire d'un organisme hôte du virus. [0121] Comme cela est présenté dans les exemples 7, 8 et 9 de la présente demande, les effets viro-induits suivants peuvent être évalués pour comparer l'effet physiologique de souches virales atténuées, soit entre elles soit avec la souche virale sauvage : La sécrétion de cytokines pro-inflammatoires (par les cellules de l'épithélium et/ou par les macrophages); La sécrétion de chimiokincs ; La sécrétion de facteurs de croissance ; Le taux d'inflammation pulmonaire (score calculé par évaluation de l'intensité de l'inflammation des tissus) ; et Le phénotypagc des cellules immunitaires recrutées sur le site de l'infection in vivo. [0122] Ces diverses mesures permettent de connaitre de manière plus précise l'effet phy- siologique de chaque souche virale, et de choisir en fonction de ces caractéristiques laquelle serait la plus adaptée pour développer un vaccin viral vivant atténué. [0123] Modifications génétiques introduites dans une souche virale pour obtenir son atténuation [0124] Diverses modifications génétiques permettant d'atténuer la virulence d'une souche virale sont connues de l'Homme du métier. Ces modifications peuvent être introduites dans le génome de la souche d'origine rC-85473. [0125] Les modifications génétiques désignent, au sens de l'invention, toutes les modi- fications d'une séquence nucléotidique originale telles que la délétion d'un ou plusieurs nucléotides, l'ajout d'un ou plusieurs nucléotides, et le remplacement d'un ou plusieurs nucléotides. Ces modifications comprennent notamment toutes les modifications permettant de décaler le cadre de lecture génétique, ou d'introduire un codon stop au milieu d'une séquence codante. [0126] Parmi les modifications génétiques destinées à atténuer la virulence d'une souche virale, on connait notamment les modifications génétiques permettant d'inactiver voire de supprimer un ou plusieurs gènes codant pour des protéines non essentielles pour la 18 croissance du virus en culture. [0127] Par exemple, des souches virales atténuées de metapneumovirus humains ont été obtenues par délétion des gènes codant pour les protéines accessoires SH, G et M2-2. [0128] Toutefois, en fonction des caractéristiques de la souche virale d'origine à partir de laquelle les souches atténuées sont dérivées, les caractéristiques fonctionnelles des souches virales atténuées pourront être très différentes, la virulence des souches dépendant à la fois du génome d'origine et des modifications génétiques apportées. [0129] Selon un premier aspect de l'invention, la souche virale atténuée selon l'invention est caractérisée en ce que les modifications de la séquence SEQ ID NO.1 comprennent l'inactivation du gène codant pour la protéine SH. [0130] Au sens de l'invention, l'inactivation d'un gène désigne le fait que ce gène est modifié de telle sorte que le produit du gène n'est plus exprimé, ou exprimé sous une forme non active, ou exprimé en une quantité si faible que l'activité de cette protéine est inexistante. Cette inactivation d'un gène peut être effectuée par toutes les techniques bien connues de l'Homme du métier. En particulier, l'inactivation d'un gène peut être obtenue par l'introduction d'une mutation ponctuelle dans le gène, par la délétion partielle ou totale des séquences codantes du gène, ou encore par modification du promoteur du gène. Ces différentes modifications génétiques seront effectuées selon l'un quelconque des techniques de biologie moléculaire bien connues de l'Homme du métier. [0131] Selon un mode de réalisation préféré, le gène codant pour la protéine SH est to- talement délété, c'est-à-dire que toute la séquence codante pour la protéine SH a été retirée de la séquence d'origine SEQ ID NO. 1. [0132] En particulier, ladite souche virale comprend la séquence nucléotidique telle que re- présentée en SEQ ID NO. 2. Plus spécifiquement, la séquence de ladite souche virale consiste en la séquence nucléotidique telle que représentée en SEQ ID NO. 2. [0133] Comme cela est illustré dans les exemples, cette souche atténuée désignée ASH- rC- 85473 présente les caractéristiques suivantes : In vitro, l'infection et la réplication sur des cellules en culture sont normales (pas de différence avec les caractéristiques de la souche d'origine); In vivo, l'infection de souris avec ce virus recombinant ASH-rC-85473 n'induit que très peu de perte de poids, à la différence d'une infection avec la souche originale ; la survie des souris infectées est de 100%, alors que ce virus atténué se réplique dans les tissus pulmonaires ; In vivo, une immunisation préalable de souris avec cette souche atténuée protège à 100% les souris challengées par une dose létale de virus rC-85473 sauvage. Cette protection est également illustrée par l'absence de détection de virus infectieux rC-85473 dans les poumons 5 jours après le challenge ; et par 19 un titre élevé de microneutralisation contre la souche virale homologue (C-85473, de sérotype A) et contre au moins une souche hétérologue (CAN98-75, de sérotype B) des sérums à:1+21 après le challenge infectieux ; In vitro, la capacité d'attachement aux cellules LLC-MK2 en culture et d'infection cellulaire est bien meilleure pour le virus atténué ASH- rC-85473 (environ 60% de cellules infectées) en comparaison de celles du virus ASHrCAN98-75 (environ 40% de cellules infectées) ; Ex vivo, l'infection d'un modèle d'épithélium respiratoire par cette souche atténuée induit la sécrétion de cytokines et chimiokines dans une quantité équivalente ou inférieure à celle induite par la souche sauvage ; la réponse inflammatoire est toutefois réduite par rapport à celle induite par la souche sauvage (figures 7A, 7B); In vitro, l'infection de macrophages par cette souche atténuée induit la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires, mais dans une cinétique différente de celle viro-induite par la souche sauvage (figures 8B, 8C); fil vivo, l'inflammation viro-induite des tissus pulmonaires est significativement plus faible suite à l'infection par cette souche atténuée, qu'avec la souche sauvage (figure 9A) ; toutefois, le recrutement des cellules immunitaires est toujours assuré (figure 9B). [0134] Selon un deuxième aspect de l'invention, la souche virale atténuée selon l'invention est caractérisée en ce que les modifications de la séquence SEQ ID NO.1 comprennent l'inactivation du gène codant pour la protéine G. [0135] Selon un mode de réalisation préféré, le gène codant pour la protéine G est to- talement délété, c'est-à-dire que toute la séquence codante pour la protéine G a été retirée de la séquence d'origine SEQ ID NO. 1. [0136] En particulier, ladite souche virale comprend la séquence nucléotidique telle que re- présentée en SEQ ID NO. 3. Plus spécifiquement, la séquence de ladite souche virale consiste en la séquence nucléotidique telle que représentée en SEQ ID NO. 3. [0137] Comme cela est illustré dans les exemples, cette souche atténuée désignée AG- rC- 85473 présente les caractéristiques suivantes : In vitro, l'infection et la réplication sur des cellules en culture sont normales (pas de différence avec les caractéristiques de la souche d'origine); In vivo, l'infection de souris infectées avec ce virus recombinant AGrC-85473 n'induit que très peu de perte de poids ; la survie des souris infectées est de 100% ; alors que ce virus se réplique dans les tissus pulmonaires ; In vivo, une immunisation préalable de souris avec cette souche atténuée protège à 100% les souris challengées par une dose létale de virus rC-85473 sauvage. Cette protection est également illustrée par l'absence de détection de virus infectieux et de génome rC-85473 sauvage dans les poumons à I-F5 après challenge ; et par un titre élevé de microncutralisation contre la souche virale homologue (C-85473, de sérotype A) et contre au moins une souche hétérologue (CAN98-75, de sérotype B) des sérums à J+21 après challenge infectieux ; fn vitro, la capacité d'attachement aux cellules LLCMK2 en culture et d'infection cellulaire est bien meilleure pour le virus atténué AG- rC-85473 (environ 60% de cellules infectées) en comparaison de celles du virus AGrCAN98-75 (moins de 20% de cellules infectées). Ex vivo, l'infection d'un modèle d'épithélium respiratoire par cette souche atténuée induit la sécrétion de cytokines et chimiokincs dans une quantité nettement inférieure à celle induite pas la souche sauvage (figure 7); hi vitro, l'infection de macrophages par cette souche atténuée induit la sécrétion de TNF-ct, de manière équivalente à la sécrétion viro-induite par la souche sauvage ; mais n'induit que très faiblement la sécrétion d'IL-113 (Figures 8B, 8C) ; In vivo, l'inflammation viro-induitc des tissus pulmonaires est significativement plus faible suite à l'infection par cette souche atténuée, qu'avec la souche sauvage ou qu'avec la souche atténuée ASH- rC-85473 (figure 9A). [0138] Selon un troisième aspect de l'invention, la souche virale atténuée selon l'invention est caractérisée en ce que les modifications de la séquence SEQ ID NO.1 comprennent en l'inactivation des deux gènes codant pour la protéine G et la protéine SH. [0139] Selon une mise en oeuvre particulière, l'inactivation des deux gènes correspond à la délétion complète de l'un ou de l'autre ou des deux gènes codant pour les protéines G et SH. [0140] De plus, il est entendu que toute autre modification génétique permettant d'atténuer la virulence de la souche rC-85437 pourra être introduite dans le génome de ladite souche, représenté par la séquence SEQ ID NO.1. [0141] Introduction de gènes exogènes au sein du génome de la souche virale rC-85473 [0142] Selon un aspect de l'invention, la séquence nucléotidique de la souche virale atténuée selon l'invention pourra être modifiée génétiquement par l'introduction d'au moins un gène exogène. [0143] Ainsi, la souche virale atténuée selon l'invention présente une séquence génomique qui comprend au moins un gène exogène. Ce gène exogène pourra en particulier être un gène codant pour un antigène viral. [0144] Au sens de l'invention, on entend par « antigène viral » un élément protéique ou d'une autre nature, exprimé par un virus, que le système immunologique d'un individu 21 reconnaît comme étranger et qui provoque une réponse chez ledit individu par la production d'anticorps spécifiques. [0145] Les antigènes viraux pourront en particulier être sélectionnés parmi les antigènes exprimés par au moins un virus influenza, ou par au moins un virus de la famille des Pneutnoviridae, tel que le virus hRSV, ou par au moins un virus de la famille des Paratnyxaviridae, tel que le virus parainflucnza. [0146] Plus particulièrement, ledit antigène viral pourra être choisi parmi tout ou partie de la protéine F du virus hRSV, et tout ou partie de l'hémagglutinine des virus influenza ou parainflucnza. [0147] Cette souche virale atténuée permettra, lors de son administration à un patient, de générer une réponse immunitaire multiple, à la fois contre l'antigène viral exprimé et contre le virus hMPV. [0148] Une telle souche permettant d'obtenir une réponse immunitaire combinée contre plusieurs virus, à la suite d'une seule administration, est très avantageuse. [0149] De plus, une telle souche virale atténuée comprenant au moins un gène exogène pourra être utilisée in vitro, en tant que vecteur d'expression d'au moins un gène exogène dans des cellules cibles du metapneumovirus humain. [0150] On entend par 'cellules cibles du metapneumovirus humain' les cellules épithéliales du tractus respiratoire des individus susceptibles d'être infectés par ce virus. Cette expression désigne également toutes les lignées cellulaires permettant la réplication in vitro dudit virus. [0151] Souche virale atténuée pour son utilisation en tant que médicament [0152] La présente invention concerne également une souche virale atténuée telle que définie ci-dessus, pour son utilisation en tant que médicament. [0153] En effet, cette souche peut être utilisée, notamment, pour traiter ou prévenir des in- fections virales. [0154] Le terme « traiter » désigne le fait de combattre l'infection par un virus dans un organisme humain ou animal. Grâce à l'administration d'au moins une composition selon l'invention, le taux d'infection virale (titre infectieux) dans l'organisme va diminuer, et de préférence le virus va disparaitre complètement de l'organisme. Le terme « traiter » désigne aussi le fait d'atténuer les symptômes associés à l'infection virale (syndrome respiratoire, défaillance rénale, fièvre, etc...). [0155] Au sens de l'invention, le terme « prévenir » désigne le fait d'empêcher, ou du moins de diminuer le risque d'apparition, d'une infection clans un organisme humain ou animal. Grâce à l'administration d'au moins une souche virale atténuée selon l'invention, les cellules humaines ou animales dudit organisme deviennent moins permissives à l'infection, et sont ainsi plus à même de ne pas être infectées par ledit virus. [0156] Plus spécifiquement, l'invention concerne une souche virale atténuée telle que définie ci-dessus, pour son utilisation pour prévenir et/ou traiter les infections par des virus de la famille des Pneumoviridae. [0157] Il est entendu que cette souche virale atténuée sera de préférence intégrée à une com- position vaccinale comprenant un véhicule pharmaceutiquement acceptable, adapté pour la mise en suspension de ladite souche et pour son administration. [0158] Ladite composition vaccinale comprend au moins une souche virale atténuée selon l'invention, permettant de stimuler de manière spécifique le système immunitaire d'un organisme humain ou animal. [0159] Ainsi, cette composition vaccinale comprend au moins une souche virale vivante atténuée qui joue le rôle d'antigène, c'est à dire de composé induisant une réponse immunitaire spécifique dans l'organisme, qui en conservera la mémoire. [0160] Une telle composition vaccinale pourra être utilisée en tant que vaccin préventif, c'est-à-dire destiné à stimuler une réponse immunitaire spécifique avant l'infection d'un organisme par un virus pathogène. [0161] Une telle composition vaccinale pourra également être utilisée en tant que vaccin thé- rapeutique, c'est-à-dire destiné à stimuler une réponse immunitaire spécifique de manière concomitante avec l'infection d'un organisme par ledit virus pathogène. [0162] La présente invention concerne également une méthode pour prévenir et/ou traiter les infections par des Pneutnoviridae chez l'Homme, comprenant l'administration, à des individus susceptibles d'être infectés par de tels virus, d'au moins une souche virale atténuée telle que décrite précédemment. [0163] La présente invention concerne également une méthode pour prévenir et/ou traiter les infections par des Pneumoviridae chez l'Homme, comprenant l'administration, à des individus susceptibles d'être infectés par de tels virus, d'au moins une composition vaccinale comprenant au moins une souche virale atténuée telle que décrite précédemment. [0164] Selon une mise en oeuvre spécifique de l'invention, les infections sont des infections par des metapneutnovirus humains. [0165] Selon une autre mise en oeuvre spécifique de l'invention, les infections sont des in- fections par des orthopneumovirus, tel que le virus respiratoire syncytial humain (hRSV). [0166] L'invention concerne également une souche virale atténuée dont la séquence comprend au moins un gène exogène codant pour un antigène viral, pour son utilisation pour prévenir et/ou traiter les infections par des virus dont au moins un antigène viral est exprimé par ladite souche virale atténuée. [0167] Selon une mise en oeuvre particulière, une souche virale atténuée selon l'invention comprenant, en tant qu'antigène viral exogène, la protéine F d'un virus hRSV, pourra être utilisée pour prévenir et/ou traiter les infections par un virus hRSV. 23 [0168] Selon une autre mise en oeuvre particulière, une souche virale atténuée selon l'invention comprenant, en tant qu'antigène viral exogène, r hemagglutininc d'un virus influenza, pourra être utilisée pour prévenir et/ou traiter les infections par un virus influenza. [0169] Composition pharmaceutique comprenant au moins une souche virale atténuée [0170] La présente invention concerne également une composition vaccinale comprenant, dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable, au moins une souche virale atténuée selon l'invention, et optionnellement un adjuvant. [0171] Selon l'invention, le terme « véhicule pharmaceutiquement acceptable » désigne des véhicules ou des excipients, c'est à dire des composés ne présentant pas d'action propre sur l'infection ici considérée. Ces véhicules ou excipients sont pharmaceutiquement acceptables, ce qui signifie qu'ils peuvent être administrés à un individu ou à un animal sans risque d'effets délétères significatifs ou d'effets indésirables rédhibitoires. [0172] Il est entendu que la composition vaccinale selon l'invention comprend au moins une quantité efficace de la souche virale atténuée. Par « quantité efficace », on entend au sens de l'invention une quantité de souche virale atténuée suffisante pour déclencher une réaction immunitaire dans l'organisme auquel elle est administrée. [0173] Les compositions vaccinales l'utilisation selon la présente invention sont adaptées pour une administration orale, sublinguale, par inhalation, sous-cutanée, intramusculaire ou intraveineuse. [0174] Selon une mise en oeuvre particulière de l'invention, la composition vaccinale selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle est sous une forme galénique destinée à une administration par inhalation [0175] L'inhalation désigne l'absorption par les voies respiratoires. C'est en particulier une méthode d'absorption de composés à des fins thérapeutiques, de certaines substances sous forme de gaz, de micro-gouttelettes ou de poudre en suspension. [0176] L'administration de compositions pharmaceutiques ou vétérinaires par inhalation, c'est-à-dire par les voies nasale et/ou buccale, est bien connue de l'Homme du métier. [0177] On distingue deux types d'administration par inhalation : l'administration par insufflation lorsque les compositions sont sous la forme de poudres, et l'administration par nébulisation lorsque les compositions sont sous la forme d'aérosols (suspensions) ou sous la forme de solutions, par exemple de solutions aqueuses, mises sous pression. L'utilisation d'un nébuliseur ou d'un pulvérisateur sera alors recommandée pour administrer la composition pharmaceutique ou vétérinaire. [0178] La forme galénique considérée ici est donc avantageusement choisie parmi : une poudre, une suspension aqueuse de gouttelettes ou une solution sous pression. 24 101791 La population d'individus à vacciner est principalement une population pédiatrique, c'est-à-dire constituée d'individus âgés de moins de 18 ans, et plus spécifiquement de jeunes enfants âgés de moins de 5 ans, et de nourrissons. En effet, les virus de la famille des Pneumoviriclue infectent principalement ces individus, qui ont tendance à présenter une immunité moins forte que des individus plus âgés. [0180] L'invention concerne également une composition vaccinale telle que présentée ci- dessus, pour son utilisation pour prévenir et/ou traiter les infections par des virus de la famille des Pneuntoviridae. Exemples [0181] Exemple 1 : Virus recombinants hMPV générés à partir des souches cliniques C-85473 et CAN98-75. 1 A [0182] Les constructions génétiques représentées en figures 1A et 1B ont été préparées afin que les virus soient détectables par expression de GFP (Green Fluorescent Prolein), et pour introduire dans les souches de référence recombinantes rC-85473 et rCAN98-75 les modifications génétiques destinées à atténuer leur virulence : La délétion du gène codant pour la protéine SH (ASH) ; La délétion du gène codant pour la protéine G (AG). [0183] Les séquences complètes de ces constructions génétiques sont présentées en SEQ 1D NO. 4 (GFP rC-85473), SEQ ID NO.5 (GFP ASH4C-85473), SEQ ID NO.6 (GFP AG-rC-85473) et SEQ ID NO. 8 (GFP rCAN98-75). Les séquences des souches virales dérivées de rCAN98-75 et couplées à la GFP ne sont pas représentées mais sont accessibles à l'Homme du métier, sur la base des autres constructions génétiques présentées. [0184] Comme le montrent les photos des cellules LLC-MK2 infectées à une multiplicité d'infection (MOI) de 0,01, les virus étant visibles grâce à la GFP, les virus recombinants générés suivants : ASH-rCAN98-75, AG-rCAN98-75, ASH-rC-85473 et AG-rC-85473 sont fonctionnels et réplicatifs. Les cellules sont observées en microscopie à fluorescence à trois jours post-infection. [0185] Les photos suggèrent que les virus recombinants rCAN98-75 semblent moins in- fectieux et moins réplicatifs que les virus recombinants rC-85473 : l'intensité de la fluorescence est plus faible, et les syncytia sont de dimensions plus réduites. [0186] Exemple 2 :Capacités réplicatives in vitro des virus recombinants rC-85473 et rCAN98-75. [0187] Des cellules LLC-MK2 ont été infectées séparément, à une multiplicité d'infection de 0.01, par les virus recombinants suivants : rCAN98-75, ASH-rCAN98-75 et AG-rCAN98-75 (figure 2A) rC-85473, ASH- rC-85473 et AG- rC-85473 (figure 2B) [0188] Les surnageants cellulaires ont été récoltés chaque jour pendant 7 jours, en triplicat, puis leurs titres viraux ont été évalués en TCID50/ml. Les tests statistiques Two-way ANOVA ont été réalisés pour comparer chaque virus recombinant délété (ASH et AG) au virus recombinant sauvage. [0189] Les figures 2A et 2B présentent les résultats obtenus : les capacités réplicatives et de production sont différentes en fonction de la nature de la souche d'origine, CAN98-75 ou C-85473, pour les virus recombinants atténués. [0190] Les virus recombinants rC-85473, ASH- rC-85473 et AG- rC-85473 présentent des capacités réplicatives et de production bien meilleures que celles des virus rCAN98-75, ASH-rCAN98-75 et AG-rCAN98-75. Les virus ASH-rCAN98-75 et AG-rCAN98-75 sont les moins performants, alors que les virus ASH- rC-85473 et AG- rC-85473 présentent les meilleures capacités de production en culture sur des cellules LLCMK2. [0191] Dans les tableaux ci-dessous, sont représentés les titres moyens des stocks viraux produits et concentrés pour chaque virus recombinant rCAN98-75, ASH-rCAN98-75 et AG-rCAN98-75 (tableau 5) et rC-85473, ASH- rC-85473 et AG- rC-85473 (tableau 6). [0192] Les titres viraux sont comptabilisés dans l'unité « TCID50 » qui représente la dernière dilution virale à laquelle 50% du tissu cellulaire est détruit par l'infection, ou montre des effets cytopathiques visibles (50% Tissue culture Infective Dose). [Tableaux5] Virus rmecmbunants Titre nuvyen du stock co ene-è (TC1D50/mn FCAN.98 75 4,37 E 7 ASH -rC g75 2 77 Et-O=? \D-rCA 98-75 8,a5 E FC6 [Tableaux6] Virus recombinants Titre;moyen du stock concentré TC D5Ointil) C-85473 3 92 E437 S - 5473 1 8'; E-38 Ab -rC -85473 2 04 Eq-D8 [0193] Ces titres viraux confirment les résultats précédents, à savoir que les souches virales atténuées dérivées de C-85437 présentent des capacités de réplication satisfaisantes et non diminuées par rapport à celles de la souche originale. [0194] Exemple 3 :Caractérisation in vivo desvirus hMPV recombinants rCAN98-75 et rC-85473 sur un modèle d'infection virale de souris BALB/c [0195] Des souris BALB/c ont été infectées par instillation intranasalc avec : 26 du milieu de culture OptiMem (mock) ou 2.5x105 Fluorescent Focal Unit (FFU) des virus recombinants exprimant la GFP : rCAN98-75, ASH-rCAN98-75 et AG-rCAN98-75, ou 5x105 TCID50 des virus n'exprimant pas la GFP : rC-85473, ASH-rC-85473 et AG-rC-85473. [0196] Les deux doses de virus utilisées sont équivalentes (les virus sauvages produisent des effets équivalents chez les souris après infection). [0197] Un suivi quotidien de poids et de survie des souris a été effectué pendant 14 jours (Moyenne de poids sur 10 souris ± SEM). [0198] De plus, 5 jours après l'infection, 5 souris par groupe ont été euthanasiées pour une mesure de titres viraux infectieux pulmonaires en TCID50. [0199] Des tests statistiques ont été réalisés (two-way ANOVA) pour comparer chaque virus à la condition mock. *p 160) des souris immunisées préalablement par les virus recombinants ASH-rC-85473 et AG-rC-85473. [0213] Le tableau 7 ci-dessous présente les résultats d'essais de micro-neutralisation, réalisés à partir des sérums prélevés chez les souris des différents groupes à 1+20 (1 jour avant le challenge infectieux) et à J+42 (21 jours après le challenge infectieux). [0214] Après inactivation 30 minutes à 56°C et dilution des sérums, ceux-ci ont été incubés avec 100 TCID50 (c'est-à-dire 100 unités infectieuses telles que déterminées d'après le TCDI50/m1) de virus rC-85473 ou de virus rCAN98-75 pendant 2 heures à 37°C. Ce mix a ensuite été appliqué à des cellules LLC-MK2 pour une détermination de titre (le neutralisation. [0215] Le titre d'anticorps neutralisant est déterminé par la plus forte dilution de sérum à laquelle les cellules LLC-MK2, incubées avec le mix sérum+virus, ne montrent pas d'effets cytopathiques, c'est-à-dire sont considérées négatives pour l'infection (sur la base de tests effectués en duplicat). 28 [Tablcaux7] Sérums Jour 20 avant Jour 42. 21 jours après le challenge infectieux (souche C-854T3) Jour 42, 21 jours après le challenge infectieux challenge Infectieux (souche C93-75, sérotype Mock s5 10 10 rC`-5413 5 160 80 ASH ;C-85473 5-l0 >_t60 - 160 AG TC-85473 5 - 10 ?.100 BO Essai de microneutràlisatiob [0216] Les chiffres représentent la dilution des sérums Lestés à laquelle les titres d'anticorps spécifiques neutralisent efficacement l'infection virale (titre de microneutralisation). [0217] Un résultat de 5 ou 10 est représentatif d'une primo réponse immunitaire (première rencontre avec le virus). Un résultat supérieur ou égal à 160 est caractéristique d'une réponse immunitaire maximale, et signifie que l'organisme avait déjà rencontré le virus précédemment et donc était immunisé. [0218] Les souches virales dérivées de la souche d'origine rC-85473 permettent d'obtenir une réponse humorale neutralisante satisfaisante contre le virus hMPV C-85473 (sérotype A) et au moins contre le virus CAN98-75 (sérotype B), après immunisation préalable par les souches atténuées. 10219] Exemple 5 :Capacités d'attachement cellulaire in vitro des virus recombinants rC-85473 et rCAN98-75. [0220] Des cellules LLCM K2 ont été infectées (t=0) avec : le virus rCAN98-75 et ses formes atténuées ASH-rCAN98-75 et AGrCAN98-75 (figure 5A) ; le virus rC-85473 et ses formes atténuées ASH-rC-85473 et AG-rC-85473 (figure 5B) ; [0221] Les cellules ont été infectées sur glace, pendant 0.5, 1, 2 ou 3h pour faire varier le temps d'attachement des virus aux cellules, avant d'être lavées puis incubées à 37°C pendant 24h. [0222] Le pourcentage de cellules infectées mesuré à 24h post-infection est représentatif de la quantité de virus capable de se lier aux cellules dans le temps imparti (0.5, 1, 2 ou 3h). [0223] Les résultats indiquent des capacités d'attachement aux cellules LLCMK2 en culture (et donc des capacités d'infection) différentes pour les virus recombinants en fonction de l'origine de leur génome CAN98-75 ou C-85473. [0224] Les résultats montrent une capacité d'attachement cellulaire et d'infection cellulaire 29 bien meilleure pour les virus atténués ASH- rC-85473 et AG-rC-85473 (environ 60% de cellules infectées) en comparaison de celles des virus ASH-rCAN98-75 (40%) et AG-rCAN98-75 (moins de 20% de cellules infectées). [0225] Exemple 6:Capacités réplicatives ex vivo des virus recombinants rC-85473 et rCAN98-75 en modèle 3D d'épithélium respiratoire humain reconstitué et cultivé à l'interface air-liquide. [0226] Des épithéliums respiratoires humains reconstitués (MucilAir® HAE, Epithclix) et maintenus en culture à l'interface air-liquide selon les instructions du fournisseur Epithelix, ont été utilisés pour réaliser ces expériences ex vivo. [0227] Les photos présentées en figure 6A indiquent que les virus recombinants rCAN98-75 apparaissent moins infectieux et moins réplicatifs que les virus recombinants rC-85473 (plus faible intensité de la fluorescence et dimensions plus réduites des foyers d'infection). [0228] Les résultats de quantification de génome viral dans les épithéliums (figure 6C) confirment les capacités réplicatives des virus recombinants rC-85473, ASH- rC-85473 et AG- rC-85473, ainsi que des virus recombinants rCAN98-75 et ASH-rCAN98-75, à la différence du virus AG-rCAN98-75 très faiblement réplicatif. [0229] Les résultats de quantification de génome viral à la surface du pôle apical des épi- théliums (figure 6B) indiquent une production de virus recombinants rCAN98-75, ASH-rCAN98-75, AG-rCAN98-75, rC-85473 et ASH- rC-85473. [0230] En revanche, aucun génome de virus AG- rC-85473 n'est détecté, indiquant l'absence de production de progéniture virale. Une hypothèse est que le virus AGrC-85473 aurait perdu la capacité de bourgeonner à la surface des cellules infectées dans ce système ex vivo complexe et pluristratifié. [0231] Ces différences seraient de nature à argumenter davantage en faveur du caractère inventif de notre invention, se focalisant sur les propriétés différentes entre virus recombinants de différentes origines en termes de souche virale hMPV, pour la protection de nos candidats vaccins vivants atténués ASH- rC-85473 et AG- rC-85473. [0232] Exemple 7 : Sécrétion de cytokines et chimiokines induites par l'infection des virus recombinants rC-85473 sur un modèle 3D d'épithélium respiratoire humain reconstitué et cultivé à l'interface air-liquide. [0233] Des épithéliums respiratoires humains reconstitués (MucilAir® HAE, Epithelix) maintenus en culture à l'interface air-liquide, selon les instructions du fournisseur Epithelix, ont été utilisés pour réaliser ces expériences ex vivo. [0234] La quantification d'une sélection de cytokines et chimiokines sécrétées dans le milieu basal des épithéliums infectés témoigne de l'induction d'une réponse cellulaire différente en fonction des virus recombinants rC-85473 évalués (figure 7). [0235] a) Le virus AG-rC-85473 induit la sécrétion d'une quantité significativement plus faible des différentes cytokines et chimiokincs testées, en comparaison avec la souche sauvage rC-85473, à l'exception de la cytokine pro-inflammatoire TNF-a. Ces résultats sont concordants avec ceux présentés en figure 6, qui montrent que l'infectivité de ce virus en épithélium respiratoire humain reconstitué est significativement réduite par rapport à l'infectivité de la souche sauvage. [0236] h) Le virus ASH-rC-85473, bien que sa capacité d'infection et de réplication en modèle d'épithélium respiratoire humain reconstitué soit augmentée par rapport à celle du virus recombinant sauvage rC-85473 (figure 6), induit la sécrétion d'une quantité équivalente ou inférieure du panel de cytokines et chimiokincs évaluées par rapport à celle viro-induite par le virus sauvage. [0237] Les niveaux des chimiokincs MCP-1, RANTES, 1L-8, G-CSF et des cytokines pro-inflammatoires IFN-y et TNF-a sécrétées semblent indiquer que les cellules épithéliales infectées par cc virus ASH-rC-85473 sont en capacité de recruter les cellules immunitaires lymphocytes T, monocytes/macrophages, éosinophiles et/ou neutrophiles nécessaires à la mise en place d'une réponse immunitaire innée et adaptative de l'hôte. [0238] De plus, le virus ASH-rC-85473 entrain° la sécrétion d'IL-7, cytokine induisant la différenciation des lymphocytes inactifs en lymphocytes T et B actifs, et de FGF, facteur de croissance impliqué dans la réparation des tissus organiques, en quantité similaire au virus rC-85473 sauvage. [0239] Ainsi, l'infection par le virus ASH-rC-85473 permet aux cellules épithéliales de mettre en place la réponse primaire de défense à l'infection, tout en étant associée à une réponse inflammatoire de l'hôte plus réduite, en comparaison avec celle induite par le virus sauvage. [0240] Ces différences seraient ainsi en faveur de l'utilisation de virus recombinants dérivés de la souche rC-85473 comme vaccin vivant atténué, et préférentiellement de la souche atténuée ASH-rC-85473. [0241] Exemple 8 : Réplication virale et sécrétion des cytokines pro-inflammatoires IL- 1p et TNF-a in vitro des virus hMPV recombinants rC-85473 sur un modèle de macrophages murins immortalisés. [0242] Une lignée immortalisée de macrophages de souris a été utilisée pour évaluer la capacité de réplication et d'induction de cytokines pro-inflammatoires par les virus recombinants rC-85473, ASH-rC-85473 et AG-rC-85473. [0243] Les macrophages font partie des premières cellules du système immunitaire recrutées sur le site de l'infection (dans le cas présent, sur l'épithélium respiratoire). Les macrophages participent à la réponse inflammatoire, à la réponse innée et à la stimulation de la réponse adaptative de l'hôte. [0244] Les macrophages ont été infectés par les virus recombinants rC-85473, ASH- rC-85473 ou AG-if-85473 et leurs surnageants cellulaires ont été récoltés chaque jour 31 pendant 2 jours. Les résultats sont présentés en figure 8. [0245] a) Les titres viraux mesurés en FbL1/m1 démontrent que le virus ASH-rC-85473 présente une capacité réplicative diminuée sur macrophages, par rapport au virus recombinant sauvage, alors que le virus AG-rC-85473 montre une réplication virale similaire au virus sauvage (figure 8A). Les tests statistiques Two-way ANOVA ont été réalisés pour comparer la cinétique de réplication du virus délété ASH-rC-85473 à celle du virus recombinant sauvage. [0246] h) La sécrétion des cytokines pro-inflammatoires TNF-a (figure 8B) et IL-1[i (figure 8C) a ensuite été mesurée dans le surnageant des macrophages infectés. [0247] Le virus ASH-rC-85473 entraine un profil cytokiniquc significativement différent de celui du virus sauvage rC-85473 avec un pic de sécrétion plus précoce après 1 jour post-infection, en comparaison avec le virus sauvage qui est associé à un pic de sécrétion à 2 jours post-infection, concernant ces deux cytokines. [0248] Le virus AG-rC-85473 induit la sécrétion de cytokine TNF-a à des niveaux com- parables au virus sauvage, mais n'induit pas la sécrétion de la cytokine durant les 2 premiers jours d'infection. [0249] Ces résultats démontrent que le virus ASH-rC-85473 conserve la capacité à infecter des macrophages murins, et surtout à entrainer la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires, malgré une cinétique modifiée. [0250] Le virus AG-rC-85473 infecte efficacement les macrophages murins, mais induit plus faiblement la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires, comme cela a été observé sur le modèle d'épithélium respiratoire humain reconstitué. [0251] Exemple 9 : Inflammation pulmonaire et recrutement de cellules immunitaires sur le site de l'infection in vivo induits après 5 jours d'infection de souris BALB/c par les virus hMPV recombinants rC-85473, AG-rE-85473 et ASH-rC-85473. [0252] Des souris BALB/c ont été infectées par instillation intranasale avec : [0253] - du milieu de culture OptiMem (mock) ou [0254] - 5x105TCID" des virus recombinants rC-85473, ASH-rC-85473 ou AG-rC-85473. [0255] Après 5 jours d'infection, 5 souris par groupe ont été euthanasiées et leurs poumons prélevés pour une analyse histo-pathologique et une mesure des scores d'inflammation résultant de l'infection (figure 9A). [0256] Des tests statistiques ont été réalisés (two-way ANOVA) pour comparer chaque condition les unes aux autres :*p y**, p