Brevet FR3079524A1 — publié le 20191004

PLAQUES DE MICROPUITS EN HYDROGEL BIOCOMPATIBLE La présente invention concerne une plaque de micropuits en hydrogel biocompatible adaptés à la croissance d'agrégats cellulaires, son procédé de préparation et son utilisation pour la croissance d'agrégats cellulaires dans les puits, en particulier pour observer la réponse des agrégats cellulaires cultivés en réaction à des stimuli, comme par exemple leur exposition à des substances toxiques ou à des candidats médicaments. ARRIERE PLAN TECHNOLOGIQUE Il est maintenant admis que la culture cellulaire 2D ne représente que peu l'environnement cellulaire in vivo et de nombreux systèmes se développent pour cultiver les cellules en 3D, avec des agrégats cellulaires, en particulier des agrégats cellulaires organisés. Un des modèles en plein essor est l'utilisation de cellules s'auto-organisant en sphères (Multicellular Tumor Spheroids -MCTS). Il existe des systèmes de plaques 96 puits standard présentant une très faible adhésion cellulaire pour former les agrégats cellulaires. Il existe également des systèmes de plaques sur lesquelles les agrégats cellulaires sont cultivés à partir d'une cellule liée à la plaque, comme les plaques commercialisées sous la marque ONCOSPHERESTM par la société CYTOO (https://cytoo.com/). Il existe également des plaques de micropuits en PDMS dont la surface est enduite d'un matériau biocompatible comme le polyethylène glycol (Karp et al., Lab Chip, 2007, 7, 786-794). Ces solutions présentent toutefois l'inconvénient d'offrir une paroi rigide aux cellules, et donc de contraindre fortement la structure des agrégats, ce qui influe sur leurs réactions, notamment sur leurs capacités à modifier leur volume et leur organisation en fonction d'un stimulus. Il existe également des plaques de « micro-puits » en matériaux biocompatibles comme l'agarose, permettant la formation d'agrégats, comme les plaques commercialisées sous la marque 3D Petri Dish® par la société Microtissues (www.microtissues .com). Les micro-puits en hydrogel (agarose) ont l'avantage de laisser librement diffuser les molécules de taille 30 kPa standard 4,5 78°C 100 °C ambiante 10 min Tableau 2. Volume d'agarose à déposer sur les différents moules en PDMS pour un 25 moule de 20 mm de diamètre Diamètre des puits (lm) 500 200 100 Mixte : 100 et 200 Volume d'agarose (pL) 100 120 120 120 Etape 5) Ensemencement des cellules dans les micro-puits 10 Une fois l'agarose gélifié, les micropuits sont démoulés, placé dans du PBS et stérilisé par traitement UV. Ces micro-puits peuvent être gardés ainsi plusieurs jours à 4°C sans détérioration. Les micro-puits sont ensuite incubés avec du milieu de culture (2h), avant de 5 les ensemencer avec des cellules (1.2 105 cellules total, dans 3 mL par puits). RÉFÉRENCES - Burnette & al. (2014), The Journal of Cell Biology, 205(1), 83-96 - Delanoê-Ayari & al. (2010) Physical Review Letters, 105(24), 2-5. 10 - Karp et al., Lab Chip, 2007, 7, 786-794 - Gong & al., 2015, PLOS ONE, 10(6) - Loessner & al., 2016, Nature Protocol 11(4):727-746 - Napolitano & al., BioTechniques, 2017, 43, No. 4 - Nath & Devi, Pharmacology & Therapeutics, 2016, 163, 94-108 15 - Séguin & al. (2010) Applied Surface Science, 256(8), 2524-2531 - Style& al. (2014) 10(23), 4047-4055 - Wu & al. (2011) Surface and Coatings Technology, 205(10), 3182-3189 - Zhao & al. (1997), Journal of Materials Chemistry, 7(7), 1069-1074 - Zhou & al. (2012) Electrophoresis, 33(1), REVENDICATIONS1 Plaque de micropuits adaptés à la croissance d'agrégats cellulaires, caractérisée en ce qu'elle comprend une première couche d'hydrogel biocompatible comprenant les micropuits posée sur une plaque support en matériau rigide transparent aux rayonnements lumineux, la distance entre le fond des micropuits et la surface de la plaque support allant de 50 à 500 pm. 2. Plaque de micropuits selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'hydrogel biocompatible est un hydrogel d'agarose. 3. Plaque de micropuits selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que l'hydrogel biocompatible comprend de 1 à 5% en masse d'agarose par rapport à la masse totale de l'hydrogel. 4. Plaque de micropuits selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la couche d'hydrogel biocompatible adhère à la plaque support. 5. Plaque de micropuits selon la revendication 4, caractérisée en ce que la plaque support est une plaque de verre dont la face supérieure supportant la couche d'hydrogel biocompatible a été traitée pour permettre l'adhésion entre la plaque et la couche d'hydrogel. 6. Plaque de micropuits selon la revendication 5, caractérisée en ce que la face de la plaque de verre est traitée par l'application d'une couche de silane. 7. Plaque de micropuits selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que la couche d'hydrogel a une épaisseur de 200 à 1000 pm. 8. Plaque de micropuits selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que les micropuits ont un diamètre de au moins 5 pm. 9. Plaque de micropuits selon la revendication 8, caractérisée en ce que les micropuits ont un diamètre de 100 à 500 pm. 10. Plaque de micropuits selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que les micropuits sont répartis régulièrement sur un repère orthonormé. 11. Procédé de préparation d'une plaque de micropuits selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de préparer un moule inerte vis-à-vis de l'agarose, ledit moule comprenant une plaque sensiblement plane et une pluralité de doigts s'élevant perpendiculairement à la plaque, la plaque correspondant à la face supérieure 12 de la couche d'hydrogel biocompatible et chaque doigt correspondant à un puit de la couche d'hydrogel biocompatible, - appliquer sur le moule inerte une quantité appropriée d'une solution d'agarose, - appliquer sur la solution d'agarose une plaque de support en matériau rigide 5 transparent de manière à étaler ladite solution sur une épaisseur constante dans le moule, - laisser gélifier la solution d'agarose en hydrogel biocompatible, et - démouler la plaque de micropuits obtenue. 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que le moule est en 10 polydiméthylsiloxane (PDMS). 13. Procédé selon l'une des revendications 11 ou 12, caractérisé en ce que la préparation du moule comprend son chauffage à une température de 30 à 100 °C. 14. Utilisation d'une plaque de micropuits selon l'une des revendications 1 à 10 15 pour la culture d'agrégats cellulaires dans les micropuits. 15. Utilisation d'une plaque de micropuits selon l'une des revendications 1 à 10 pour l'analyse des réactions d'agrégats cellulaires cultivés dans les micropuits en réponse à un stimulus.