Brevet FR3081882A1 — publié le 20191206

Procédé de valorisation du CO2 par réduction biologique L'invention a trait à un procédé microbiologique de réduction du CO2 en formiate, catalysé par Stenotrophomonas maltophilia. Selon l'invention, le formiate produit peut ensuite être utilisé pour produire des molécules organiques à plus forte valeur ajoutée, et notamment du méthane, du lactate ou des alcools Ci-Cs. Le procédé selon l'invention peut également être mis en oeuvre pour traiter des fumées industrielles riches en CO2 ou du biogaz contenant principalement un mélange de méthane et de CO2, afin de réduire la teneur en CO2 dudit biogaz. Arrière-plan technologique Le dioxyde de carbone (CO2) compte pour plus de 75 % des émissions globales de gaz à effet de serre (GES), avec des émissions anthropogéniques annuelles d'environ 25 à 35 Gt. Ces émissions proviennent surtout des industries lourdes et de production d'énergie, telles que les cimenteries, sites de production d'aluminium et d'acier, centrale à charbon ou à fuel, etc., ainsi que du transport routier. L'utilisation du CO2 comme matière première au niveau industriel est actuellement envisagée comme une des solutions possibles pour diminuer les émissions de ce gaz à l'atmosphère. Dans ce cadre, la conversion directe du CO2 anthropique en carburants alternatifs (tels que le méthane, les alcools C1-05 ou l'acide formique) est devenue un sujet de recherche majeur depuis cinquante ans. Cependant, la molécule de CO2 a une forte stabilité chimique et l'activation du CO2 nécessite donc des températures et pressions relativement élevées ainsi que des catalyseurs efficaces et sélectifs. Des catalyseurs homogènes ou hétérogènes ont été développés, qui catalysent des réactions d'hydrogénation, de photosynthèse artificielle ou de réduction électrochimique pour obtenir des carburants à partir de CO2. Néanmoins, ces voies de conversion chimique présentent encore de faibles rendement, durabilité et/ou sélectivité. Des processus biologiques d'activation du CO2 ont également été développés. Ces processus biologiques sont particulièrement intéressants car ils consomment peu d'énergie et ils évitent en général les réactifs et/ou les sous-produits qui pourraient avoir un impact négatif sur l'environnement. A ce jour, cependant, seuls des procédés mettant en oeuvre des microorganismes photosynthétiques de type microalgues ou cyanobactéries ont atteint une échelle industrielle. Les produits principaux de la valorisation du CO2 par ces procédés sont des 2 lipides qui peuvent ensuite être transformés en biodiesel. La technologie en bassin ouvert a permis le changement d'échelle dans la valorisation du CO2 par des micro-algues. Cependant, le développement de ce procédé reste encore limité à cause (i) du besoin d'ensoleillement qui implique de faibles profondeurs de photo-bioréacteurs (et donc de grandes surfaces) mais aussi 5 des problèmes de transfert de masse en nutriments, (ii) de la nécessité de maintenir un pH basique (8-10) et (iii) de la nécessité de récolter les microorganismes pour leur extraire les composés d'intérêt. Toutes ces contraintes se traduisent par de faibles productivités et des coûts relativement élevés. A l'échelle laboratoire, des cyanobactéries ont été modifiées génétiquement pour produire 10 directement des alcools à partir de CO2. Très récemment, la voie métabolique d'assimilation du carbone de la cyanobactérie Synechococcus elongatus PCC 7942 a été dirigée vers la production de 2,3-butanediol à partir de CO2 et de glucose dans l'obscurité. Une telle avancée permet de surmonter les limitations liées au besoin d'ensoleillement. Néanmoins, le besoin d'ajouter du glucose rend ce bioprocédé inintéressant du point de vue économique. De plus, la stabilité 15 biologique des cyanobactéries modifiées est encore insuffisante pour permettre son utilisation à l'échelle industrielle. Une voie de synthèse enzymatique du formiate (forme basique de l'acide formique) à partir de dioxyde de carbone (CO2) a également été étudiée. Plus précisément, des enzymes de type formiate déshydrogénase (FDH) extraites de microorganismes, ont été purifiées et modifiées 20 pour améliorer leurs performances de catalyse, et utilisées pour réduire le CO2 en formiate (Alissandratos et al. 2013, Appl Environ Microbiol., 79(2), 741-4 ; Spinner et al., 2012 Catal. Sci. Technol., 2, 19-28). Récemment, les enzymes de type nitrogénase ont également été reportées comme capable de catalyser la réduction du CO2 en formiate et en méthane, en plus de leur activité de réduction du N2 (Khadka et al. 2016, Inorg. Chem., 55, 8321-8330; Zheng 25 et al. 2018, Nature Microbiology, 3, 281-286). Néanmoins, l'addition d'un cofacteur onéreux est nécessaire pour réaliser la réaction de bioconversion, rendant ces alternatives incompatibles avec une application industrielle. Des réacteurs assistés électrochimiquement (dits aussi bio-électrolyseurs) qui sont inoculés avec des bactéries litho-autotrophes électro-actives constituent une autre voie biologique pour 30 la conversion du CO2. Divers produits tels que du formiate, de l'acétate, des alcools C3-05, du polyhydroxybutyrate (PHB) ou de la biomasse ont pu être obtenus. Dans ces systèmes, deux configurations ont été implémentées : (1) les électrons nécessaires à la réduction du CO2 sont directement fournis par la cathode polarisée et les protons proviennent quant à eux de l'oxydation de l'eau à l'anode ou (2) les électrons de la cathode sont transportés jusqu'aux 3 bactéries par des médiateurs électrochimiques (tels que le dihydrogène ou le formiate) qui peuvent être ajoutés au milieu ou générés in situ à la cathode polarisée. Cependant, jusqu'à maintenant, les productions sont limitées dans la configuration (1) et l'utilisation de formiate ou d'un vecteur énergétique propre et coûteux tel que le dihydrogène (H2) reste problématique 5 dans la configuration (2). Résumé de l'invention En travaillant sur la valorisation du CO2, les inventeurs ont découvert que la bactérie Sténotrophomonas maltophilia, connue pour sa capacité à fixer le CO2 par ses enzymes carboxylases, est également apte à réduire le CO2 en formiate qui est la forme basique de l'acide 10 formique. L'acide formique, ou acide méthanoïque, est un acide carboxylique aliphatique d'origine naturelle, qui se présente sous la forme d'un liquide incolore à odeur persistante. L'acide formique trouve de nombreuses applications dans l'industrie du cuir et du textile, dans la composition des teintures et produits de traitement, les insecticides, les solvants, les fumigènes, les produits de traitement anti-moisissures, etc., mais également dans la parfumerie 15 et l'industrie agro-alimentaire en tant que molécule aromatique. Récemment, il a été montré que l'acide formique peut être utilisé comme carburant dans des piles à combustibles (Yu et al., 2008, Journal of Power Sources, 182(1), 124-132) ou pour stocker de l'hydrogène qui peut ensuite être libéré par déshydrogénation de l'acide formique (Fellay et al. 2008, Angewandte Chemie, 120(21), 4030-4032). La possibilité d'utiliser l'acide formique en tant que vecteur 20 énergétique laisse présager que les besoins en acide formique vont s'accroitre dans les prochaines années. En outre, le formiate peut être utilisé dans des bioprocédés secondaires pour obtenir des sources d'énergie telles que du méthane (Conrad, Contribution of hydrogen to methane production and control of hydrogen concentrations in methanogenic soils and sediments, FEMS Microbiology Ecology, 28(3) (1999) 193-202) ou des alcools (Li et al., 25 Integrated electromicrobial conversion of CO2 to higher alcohols, Science, 335 (2012) 1596; Pen et al., An innovative membrane bioreactor for methane biohydroxylation. Bioresource Technology, 174 (2014) 42-52). Cette nouvelle voie de réduction par S. maltophilia présente de nombreux atouts par rapport aux bioprocédés existants. En effet, ce biocatalyseur est une cellule native. Par comparaison à 30 des enzymes, il n'est donc pas nécessaire de procéder à des extractions protéiques ni d'ajouter des cofacteurs en conditions stoechiométriques, car les cellules en possèdent déjà leur propre stock. Cette cellule ne requiert pas non plus de modifications génétiques, qui sont mal supportées à l'échelle industrielle. Par ailleurs, aucun apport en dihydrogène (H2) ou photons (lumière) n'est nécessaire à la réaction de réduction du CO2 car la cellule possède un stock de 4 donneur de protons et d'électrons intracellulaire, qu'elle accumule lors de la phase de culture (par exemple sur de l'acétate issu de l'oxydation méthane ou sur un mélange de peptone et d'extrait de levure). L'invention a donc pour objet un procédé de valorisation du CO2 par réduction biologique 5 comprenant une étape de mise en contact d'une phase liquide contenant la bactérie Stenotrophomonas maltophilia avec une phase gazeuse contenant du CO2 dans des conditions permettant la production de formiate à partir dudit CO2. Notamment, l'étape de mise en contact peut être réalisée à 30°C, +/- 5°C, sous pression atmosphérique. 10 La phase liquide comprend avantageusement des sels minéraux utiles à la maintenance ou survie des bactéries lors de la réaction de réduction du CO2 en formiate. L'homme du métier saura adapter la composition en sels minéraux. Par exemple, la phase liquide contient du MgC12 et/ou des phosphates, etc. Avantageusement, l'étape de mise en contact entre la phase liquide et le CO2 est réalisée dans 15 un réacteur fermé, ou dans un réacteur semi-fermé. Afin d'intensifier la réaction de réduction du CO2, il est possible d'apporter des protons et électrons exogènes, ou extracellulaires, c'est-à-dire autres que les protons et électrons intracellulaires de Stenotrophomonas maltophilia. Par exemple, il est possible d'introduire dans le réacteur un donneur d'électrons et de protons, tel qu'un polymère et notamment du 20 polyhydroxybutyrate (PHB) et/ou une assistance électrochimique de type bio-électrolyse. En effet, les inventeurs ont montré que Stenotrophomonas maltophilia est capable d'utiliser les électrons d'une cathode faiblement polarisée et les protons issus de l'oxydation de l'eau à l'anode. Dans un mode de réalisation, l'énergie apportée à la bio-électrolyse est d'origine verte, solaire notamment, ce qui rend ce procédé autonome du point de vue énergétique. 25 Selon l'invention, il est possible également de coupler l'utilisation de Stenotrophomonas maltophilia à une autre bactérie, notamment une bactérie apte à utiliser le formiate pour produire d'autres molécules d'intérêt, telles que du méthane, du lactate ou des alcools, notamment en C1-05 (tels que le méthanol, l'isobutanol ou le méthyl- 1-butanol). L'invention a également pour objet l'utilisation d'une bactérie Stenotrophomonas maltophilia 30 pour la production de formiate par réduction de CO2 5 Brève description des figures Figure 1. Cinétiques de production en formiate marqué au 13C, obtenues pour trois essais indépendants, dans un réacteur fermé mis en oeuvre avec la bactérie Sténotrophomonas maltophilia. 5 Figure 2. Spectres RMN du milieu de réaction contenant le consortium S. maltophilial M. trichosporium OB3b à (a) t = 0 jours, où le 13CO2 et sa forme dissoute H13CO3- sont présents; (b) t = 7 jours montrant l'apparition d'un nouveau composé avec déplacement chimique caractéristique du formiate, qui est zoomé en (c). Figure 3 Spectres RMN du milieu de réaction contenant le consortium S. maltophilial M. 10 oxydons à (a) t = 5 jours montrant l'apparition de nouveaux composés avec des déplacements chimiques caractéristiques du formiate et du lactate ; (b) t = 8 jours montrant des pics de formiate et de lactate, ainsi que l'apparition de plusieurs pics non identifiés associés à des déplacements chimiques compris entre 125 - 155 ppm et 15 - 65 ppm ; (c) t= 12 jours montrant des pics de formiate et de lactate, ainsi que l'apparition de pics non identifiés dans des zones de 15 déplacements chimiques compris entre 125 - 155 ppm et 15 - 65 ppm. Figure 4. Schéma d'un exemple de réalisation d'un réacteur semi-fermé, assisté par voie électrochimique de type bio-électrolyse pour la réaction de réduction du CO2 selon le procédé de l'invention. Figure 5. Evolution du courant mesuré au cours du temps sur une cathode polarisée et exposée 20 à Stenotrophomonas maltophilia, dans un réacteur semi-fermé, assisté par voie électrochimique selon un mode de réalisation du procédé de l'invention. Six phases sont distinguées, correspondant aux différentes conditions opératoires mises en oeuvre : (a) bullage de CO2 (25 mL.min-1); (b) bullage d'argon, noté Ar (10 mL.min-1) ; (c) arrêt du bullage d'argon ; (d) bullage de CO2 (5 mL.min-1); (e) bullage d'argon (100 mL.min-1) et (f) bullage de CO2 (25 mL.min-1). 25 Le symbole (#) indique les interruptions de polarisation pour l'acquisition des voltamétries cycliques (mesures du courant au cours du balayage de différentes valeurs de tension de polarisation). Description détaillée de l'invention Les inventeurs ont découvert que Stenotrophomonas maltophilia est capable de produire du 30 formiate par réduction directe du CO2 dans des conditions opératoires douces. De manière particulièrement intéressante, les inventeurs ont mis en évidence que Stenotrophomonas 6 maltophilia est apte à produire sélectivement du formiate en utilisant comme seule source de carbone le CO2, et cela sans apport de cofacteurs ou facteurs de croissance coûteux. La bactérie Stenotrophomonas maltophilia est une bactérie aérobie à Gram négatif, de la ramille ?u,itchnnoliculaccue. Elle n'a jusqu'à présent jamais été utilisée à des fins industrielles. Or, 5 les inventeurs ont découvert que cette bactérie est particulièrement intéressante pour la production de molécules d'intérêt à partir de CO2. En effet, les inventeurs ont découvert que cette bactérie présente la capacité de produire du formiate à partir de CO2 comme seule source de carbone, dans des conditions de culture normales, c'est-à-dire en culture pure aérobie sur un milieu organique usuel de type Luria Broth Miller, ou en co-culture avec une bactérie 10 méthanotrophe, telle que Methylosinus trichosporium OB3b, sur un milieu minéral mis en contact avec un mélange méthane/air (1 :1). La voie en co-culture est particulièrement avantageuse car elle permet de garantir un bilan carbone optimal car le méthane, d'origine renouvelable, est la seule source de carbone nécessaire à la culture. Avantageusement, et quel que soit le mode de culture, les cultures sont réalisées à 30°C, +1- 15 5°C et à pression atmosphérique. Selon l'invention, la phase gazeuse contenant du CO2 mise en contact avec la phase liquide contenant la bactérie Stenotrophomonas maltophilia peut être de l'air atmosphérique. La phase gazeuse peut autrement être du CO2 pur ou un mélange gazeux, tel qu'un mélange CO2-air, CO2-N2, CO2-02, CO2-CH4, CO2-H2, CO2-CH4-H2, CO2-CH4-air, CO2-CH4-N2 ou CO2-CH4- 20 02. Dans un mode de réalisation, la phase gazeuse contient ou est constituée de biogaz. Dans un autre mode de réalisation, la phase gazeuse contient ou est constituée de fumées industrielles ou agricoles riches en CO2. Dans un mode de réalisation particulier, la phase gazeuse comprend au moins 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% de CO2. Le formiate étant obtenu directement par réduction du CO2, le rendement en formiate du procédé 25 selon l'invention dépend directement de l'apport en CO2. L'homme du métier saura adapter les concentrations en CO2 aux rendements souhaités. Selon l'invention, l'apport en CO2 peut être réalisé par tout moyen connu et notamment par des contacteurs membranaires (Pen et al. 2014, Bioresource Technology, 174, 42-52), un fritté poreux de distribution de gaz (Kim et al. 2010, Biotechnology and Bioprocess Engineering, 30 15(3), 476-480; Duan et al. Bioresource Technology, 102(15), 7349-7353) ou un simple contact gaz-liquide dans un réacteur fermé (Pen et al. 2014, Bioresource Technology, 174, 4252). 7 Dans un mode de réalisation, le procédé de valorisation du CO2 est mis en oeuvre dans un réacteur fermé (« batch »). Selon l'invention, la phase gazeuse contenant le CO2 peut être injectée dans l'espace de tête du réacteur. Dans un mode de réalisation, il est possible de supprimer l'air présent dans l'espace 5 de tête du réacteur préalablement à l'injection de la phase gazeuse, de manière à placer la réaction sous une atmosphère constituée uniquement de la phase gazeuse. De manière alternative ou complémentaire, la phase gazeuse peut être injectée au centre du réacteur fermé, au coeur de la phase liquide contenant la bactérie Stenotrophomonas maltophilia, au moyen notamment d'un distributeur à gaz. 10 Dans le cas d'un réacteur semi-fermé (« fed-batch »), la phase gazeuse contenant du CO2 est apportée en continu, préférentiellement par bullage, à l'intérieur du réacteur. Dans un exemple de réalisation, le pH dans le milieu de réaction, c'est-à-dire la phase liquide, est maintenu entre 5 et 8, préférentiellement à pH 6,5, +/- 0,5. Avantageusement, le CO2 dissous dans l'eau forme un tampon suffisant pour permettre le maintien du pH, sans régulation externe. 15 De même la température dans le milieu de réaction est préférentiellement maintenue entre 20°C et 50°C, de manière préférée entre 25°C et 35°C, et de manière encore préférée à 30°C, +/- 1. Selon l'invention, il est possible, préalablement à l'étape de réaction, c'est-à-dire préalablement à la mise en contact de la bactérie avec le CO2 pour produire le formiate, de placer la bactérie dans un milieu de culture dans des conditions de température et de pH favorables à sa 20 croissance. Par « milieu de culture », on entend le milieu dans lequel les bactéries sont mises à croître, pour produire de la biomasse bactérienne. Le milieu de culture comprend de manière classique les éléments chimiques strictement nécessaires à la croissance bactérienne sous une forme utilisable par les bactéries, à savoir une source de carbone, des sels minéraux et de l'eau. Des 25 milieux standards sont disponibles dans le commerce, décrits dans la littérature scientifique ou dans les catalogues des fournisseurs de souches bactériennes. L'homme du métier sait quels sont les composants minimums requis en l'absence desquels les Stenotrophomonas maltophilia ne peuvent se développer, et peut sans difficulté cultiver une telle bactérie. Les conditions générales de culture (température, composition du milieu, agitation, etc.) permettant la 30 croissance ou le maintien des Stenotrophomonas maltophilia, sont aisément définies par l'homme du métier. 8 Cette étape de culture préalable peut par exemple permettre à la bactérie d'accumuler des donneurs de protons et d'électrons nécessaires à la réaction de réduction du CO2 en formiate selon l'équation CO2 + fr + 2e- -> HC00- (équation 1). De manière alternative ou complémentaire, il est possible d'ajouter dans le réacteur un donneur 5 d'électrons et de protons exogènes, tel qu'un polymère, de manière à fournir à la bactérie les électrons et protons nécessaires à la réaction, même en l'absence ou après épuisement de donneurs intracellulaires. Notamment, il est possible d'ajouter du polyhydroxybutyrate (PHB) dans le réacteur. Dans un mode de réalisation, le PHB est préalablement produit par des bactéries méthanotrophes à partir de méthane, notamment renouvelable (Pieja et al., 10 Distribution and selection of poly-3-hydroxybutyrate production capacity in methanotrophic proteobacteria, Microbial. Ecology, 62(3) (2011) 564-573). Un tel mode de réalisation est particulièrement avantageux d'un point de vu économique. De manière alternative ou complémentaire, et notamment dans le cas d'un réacteur semi-fermé, il peut être particulièrement avantageux d'utiliser un dispositif d'assistance électrochimique. 15 Un tel dispositif, logé à l'intérieur du réacteur et en contact avec la bactérie, permet de fournir des électrons et des protons à la bactérie. L'assistance électrochimique peut notamment être de type bio-électrolyse (figure 4). Avantageusement, l'énergie utilisée pour faire fonctionner le bio-électrolyseur est une énergie solaire. De manière alternative ou complémentaire, la phase liquide comprend en plus de la bactérie 20 Stenotrophomonas maltophilia un autre micro-organisme, incapable de réduire le CO2 mais apte à utiliser le formiate issu de la réduction du CO2 pour former des métabolites plus complexes, tels que du méthane, du lactate ou des alcools. Les inventeurs ont montré qu'un tel consortium, ou co-culture, peut conduire à une synergie apte à intensifier le flux de CO2 réduit par la bactérie Stenotrophomonas maltophilia. 25 Tout ou partie du procédé selon l'invention peut être mis en oeuvre à l'échelle du laboratoire ou à l'échelle industrielle, c'est-à-dire sur des fermenteurs de moyenne (d'environ 1 à 100 m3) ou de grande capacité (de plus de 100 m3). Dans un mode de mise en oeuvre particulier, le procédé de production de formiate selon l'invention comprend les étapes consistant à : 30 Introduire Stenotrophomonas maltophilia dans un réacteur contenant un milieu de réaction ; Approvisionner le milieu de réaction, ou phase liquide, en une phase gazeuse contenant du CO2; et optionnellement 9 Récupérer le formiate produit dans le réacteur par réduction du CO2, sous forme de formiate et/ou d'acide formique. Dans un mode de réaction, le milieu de réaction contient 20 mM de tampon phosphate à pH 7,0 ± 0,1 et 5,0 mM de MgC12. Dans un autre mode de réalisation, le milieu de réaction contient 5 KC1 1,3 mM, NH4C1 28,0 mM, NaHCO3 29,8 mM et NaH2PO4 5,0 mM. L'homme du métier est à même de choisir le milieu de réaction approprié pour la réduction du CO2 en formiate par Stenotrophomonas maltophilia. Dans un mode de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, le formiate produit est récupéré sous forme d'acide formique à partir du milieu de réaction. 10 Dans un mode de réalisation particulier, l'étape de récupération de l'acide formique à partir du milieu de réaction est réalisée par électrodialyse ou par extraction-liquide avec un co-solvant. Ces dispositifs de récupération permettent de récupérer en continu l'acide formique et éviter ainsi l'éventuelle inhibition des bactéries par un excédent de produit, tout en obtenant un acide formique exempt d'impuretés (comme les sels du milieu de réaction). Dans le cas d'une 15 récupération en continu du produit, un apport continu en CO2 peut être réalisé dans le bioréacteur. Dans le cas d'un procédé de récupération par électrodialyse, un module d'électrodialyse bipolaire est avantageusement couplé avec un module de microfiltration pour séparer et récupérer en continu le formiate produit sous sa forme acide (acide formique). En particulier, l'électrodialyse bipolaire peut être réalisée sur un milieu de réaction sans 20 biocatalyseurs, obtenu en continu après avoir séparé les bactéries du milieu par un module de microfiltration tangentielle. L'électrodialyse bipolaire consiste à combiner une membrane bipolaire pour acidifier le formiate en acide formique et des membranes monopolaires pour extraire les sels du milieu de réaction. Le formiate et/ou l'acide formique obtenu(s) à partir d'un tel procédé microbiologique peut être 25 avantageusement utilisé dans toute industrie susceptible d'en avoir besoin, et notamment dans l'industrie du cuir et du textile, dans la parfumerie, dans l'industrie agro-alimentaire, etc. Préférentiellement, le formiate et/ou l'acide formique obtenu(s) à partir d'un tel procédé microbiologique est utilisé dans un procédé biologique secondaire (in situ ou ex situ) pour obtenir des composés organiques de plus forte valeur ajoutée, et notamment du méthane, du 30 lactate ou des alcools C1-05. Si les composés obtenus sont des alcools, un procédé de stripping réalisé par un bullage de gaz contenant du CO2 peut être mis en oeuvre pour récupérer en continu les alcools produits. 10 Dans un mode de mise en oeuvre particulier, il est possible, préalablement à l'étape de réaction, de co-cultiver Stenotrophomonas maltophilia avec une ou plusieurs autres espèces bactériennes méthanotrophes. Il est ainsi possible de produire de l'acétate à partir de méthane, ledit acétate étant ensuite utilisé par Stenotrophomonas maltophilia comme source de carbone. Par exemple, 5 les inventeurs ont mis en évidence que la co-culture sous un mélange méthane/air et sur milieu minéral de Stenotrophomonas maltophilia avec une bactérie méthanotrophe, telle que Methylos inus tricho s po rium OB3b, permet la production d'acétate utilisable par Stenotrophomonas maltophilia pour sa croissance. Les inventeurs ont par ailleurs montré que la présence d'une telle bactérie méthanotrophe dans la phase liquide lors de l'étape de réaction 10 ultérieure ne perturbe pas la réduction du CO2 ni la production de formiate par Stenotrophomonas maltophilia. De manière alternative ou complémentaire, il est possible lors de l'étape de réaction (c'est-à-dire mise en contact de Stenotrophomonas maltophilia avec la phase gazeuse contenant le CO2) d'ajouter à la phase liquide un ou plusieurs autres microorganismes, et notamment des bactéries 15 et/ou levures, aptes à utiliser le formiate pour produire des molécules à plus forte valeur ajoutée. Il est également possible de co-cultiver Stenotrophomonas maltophilia avec une ou plusieurs de ces microorganismes préalablement à l'étape de réaction, puis d'ajouter l'ensemble dans la phase liquide pour l'étape de réaction. Dans un mode de réalisation, on ajoute à Stenotrophomonas maltophilia la bactérie Microbacterium oxydans . Dans un mode de 20 réalisation, on ajoute à Stenotrophomonas maltophilia la bactérie Ralstonia eutropha H16 (LH74D), afin d'obtenir notamment des alcools en C4-05. Dans un mode de réalisation, on ajoute à Stenotrophomonas maltophilia une bactérie méthanotrophe ainsi qu'un inhibiteur de la méthanol déshydrogénase, afin d'obtenir du méthanol. De manière alternative, l'étape de réaction de réduction du CO2 en formiate par 25 Stenotrophomonas maltophilia est réalisée dans un premier réacteur, et le formiate produit est récupéré pour alimenter un second réacteur dans lequel se trouve le ou les microorganismes aptes à utiliser le formiate pour produire des molécules à plus forte valeur ajoutée. L'invention a également pour objet l'utilisation d'une Stenotrophomonas maltophilia, pour la production de formiate par réduction de CO2 comme exposé ci-dessus. L'utilisation de 30 Stenotrophomonas maltophilia pour produire du formiate permet de consommer des quantités de CO2 significatives et de répondre ainsi aux problèmes environnementaux liés à l'accumulation de CO2 dans l'atmosphère. 11 D'autres aspects et avantages de la présente invention apparaîtront dans la partie expérimentale suivante, qui doit être regardée à titre illustratif, ne limitant en aucune façon l'étendue de la protection recherchée. Exemples 5 Al Matériels et méthodes 1. Culture de la bactérie Sténotrophomonas maltophilia Deux voies de culture de S. maltophilia ont été mises en oeuvre: (i) Co-culture aérobie avec la bactérie méthanotrophe Methylosinus trichosporium OB3b Dans ce cas, la source de carbone et d'énergie utilisée est le méthane qui est converti par la 10 bactérie méthanotrophe en nutriments organiques assimilables par la bactérie S. maltophilia pour sa croissance. En particulier, de l'acétate, à une concentration de l'ordre de 35 mg.L-1, est mesurée dans le réacteur de culture en fin de croissance. Une telle synergie entre ces deux types de bactéries a déjà été reportée dans la nature et pour un consortium les impliquant, la production d'acétate par des méthanotrophes a déjà été mise en évidence dans des conditions 15 limitantes en oxygène (C. Costa et al., Denitrification with methane as electron donor in oxygen-limited bioreactors, Appl. Microbiol. Biotechnol., 53(6) (2000) 754-762). Le milieu de culture est un milieu minéral enrichi en cuivre et en fer. Le milieu de base est composé de : 1,06 g/L KH2PO4, 4,34 g/L Na2HPO4.12H20, 1,7 g/L NaNO3, 0,34 g/L K2SO4 et 0,074 g/L MgSO4.7H20. Une fois préparé, le pH de ce milieu de base est ajusté à 7,0 ± 0,1 avec 20 NaOH, 0,1 M ou HC1, 0,1 M puis autoclavé. Les solutions de minéraux, de cuivre et de fer sont préparées indépendamment et stérilisées par filtration sur filtres en acétate de cellulose de diamètre de pores 0,2 i.tm avant d'être ajoutés au milieu de base. Les concentrations finales en minéraux sont : 0,57 mg/L ZnSO4.7H20, 0,446 mg/L MnSO4.H20, 0,124 mg/L H3B03, 0,096 mg/L Na2Mo04.2H20, 0,096 mg/L KI et 7,00 mg/L CaC12.2H20. Les concentrations finales en 25 cuivre et en fer sont : 0,798 mg/L CuSO4 and 11,20 mg/L FeSO4.7H20. Les cultures sont conduites dans des réacteurs fermés étanches, incubés à 30°C et sous rotation constante (160 rpm). L'espace de tête des réacteurs est rempli par un mélange d'air et de méthane (1 :1) ; le volume de gaz est trois fois plus grand que celui du liquide. Les pourcentages d'inoculation en S. maltophilia peuvent varier de 10 à 50 % v/v. Les cultures sont arrêtées 30 lorsque la densité optique à 600 nm (D0600nm) est constante. 12 Deux cultures successives sont conduites avant de mettre en oeuvre le consortium pour la réaction de réduction du CO2. (ii) Culture pure aérobie du biocatalyseur La bactérie S. maltophilia a tout d'abord été isolée d'un consortium formé avec la bactérie M. 5 trichosporium OB3b (obtenu selon le protocole décrit précédemment). L'isolement a été réalisé par repiquage successifs de colonies de S. maltophilia sur des géloses de milieu Luria Broth (LB) Miller (Sigma Aldrich, France). La pureté et l'identification de la bactérie isolée sont confirmées par des analyses biochimiques (voir point 2 ci-dessous). La souche est conservée d'une part sur géloses LB stockées à 4°C, et d'autre part, au congélateur à -20°C dans son milieu 10 liquide natif de culture auquel est ajouté du glycérol (20 % v/v). Le réacteur de culture est un réacteur fermé avec un bouchon perméable à l'air qui est dédié aux cultures stériles. Un milieu de culture liquide LB est ensemencé avec la bactérie S. maltophilia, 5 % v lv à partir d'un aliquote congelé ou avec l'intégralité des colonies d'une gélose, puis incubé 24 h incubés à 30°C et sous rotation constante (160 rpm). Les cultures sont arrêtées lorsque la phase 15 stationnaire débute (DO600nm est constante). Deux cultures successives sont conduites avant de mettre en oeuvre le biocatalyseur pour la réaction de réduction du CO2. Une corrélation entre la D0600nm (-) et la concentration C en bactérie S. maltophilia (g de cellules sèches.L1) est établie pour déterminer les productivités en formiate ; la corrélation est 20 obtenue sur la base de cinq points répliqués indépendamment : C (g de cellules sèches.L-1) = 0,3035 x D0600nm (R2 = 0,995) 2. Analyses biochimiques L'isolat de S. maltophilia issu de la co-culture a été caractérisé avec une coloration Gram et par spectrométrie de masse. La coloration Gram a mis en évidence que l'isolat est un bacille à Gram 25 négatif. L'analyse par spectrométrie de masse a permis de confirmer que l'isolat est bien pur et d'identifier la bactérie S. maltophilia qui est en effet un bacille à Gram négatif. En spectrométrie de masse, il est à noter qu'un score supérieur à 1,90 indique une identification fiable et que le score obtenu pour S. inaltophilia est de 2,18. Avant chaque culture, une analyse qualitative des colonies de S. maltophilia étalées sur géloses est réalisée afin de déceler une éventuelle 30 contamination. 13 3. Préparation de la suspension bactérienne mise en oeuvre dans les essais de réduction du CO2 A la fin de la culture, les cellules sont collectées par centrifugation à 4°C et 4000 g pendant 20 min. Elles sont alors remises en suspension dans un tampon phosphate 20 mM à pH 7.0 puis 5 centrifugées à nouveau dans les mêmes conditions que précédemment et le culot bactérien est récupéré. Un milieu de réaction contenant 20 mM de tampon phosphate à pH 7.0 et 5 mM de MgC12 est utilisé pour re-suspendre le culot bactérien et obtenir une D0600nm de l'ordre de 10. Un échantillon de la suspension préparée est toujours stocké à -20°C avec du glycérol (20 % v/v) pour d'éventuelles analyses biochimiques ultérieures. Le reste de la suspension est utilisé 10 immédiatement pour les essais de réduction du CO2. Le milieu de réaction ne contient pas de nutriments organiques permettant la croissance du biocatalyseur, celui-ci est donc utilisé comme une cellule au repos. 4. Essais de réduction du CO2 en réacteur fermé La suspension bactérienne obtenue à l'étape précédente est distribuée dans des réacteurs fermés 15 étanches de 60 mL en ajoutant 6 mL de suspension à chaque réacteur. Afin d'évaluer la capacité du biocatalyseur à réduire le CO2, l'espace de tête est rempli avec un mélange de 13CO2:air (300/0-70%) qui est stérilisé par filtration sur des filtres en téflon de diamètre de pores 0,2 !am (Sartorius). Pour chaque expérience, un set de plusieurs réacteurs est préparé dans des conditions identiques et incubé à 30°C sous agitation constante (160 rpm). Chaque cinétique 20 est suivie pendant plus de 20 jours ; pour cela, à chaque temps d'échantillonnage, un réacteur est sacrifié pour les analyses. Différentes mesures sont réalisées : densité optique à 600 nm (0D600nm), pH, dosage du formiate et de l'acétate par Chromatographie Gazeuse couplée à la Spectrométrie de Masse (GC-MS), caractérisation de l'évolution de la composition gazeuse de l'espace de tête par GC-MS, dosage des ions ammonium par chromatographie ionique (CI). Les 25 produits issus du 13CO2 sont mis en évidence dans le milieu de réaction par GC-MS et RMN. 5. Essais de réduction du CO2 en réacteur semi-fermé, assisté par voie électrochimique Un réacteur en verre est utilisé. Son volume liquide utile est de 60 mL et son espace de tête représente environ 40 % de son volume total. Un couvercle est vissé sur le réacteur et l'étanchéité de la jonction couvercle-réacteur est garantie par un joint. Ce couvercle présente 30 un port d'entrée pour l'alimentation du gaz (12CO2 100 %) qui est réalisée au coeur de la solution par un distributeur à gaz, un port pour la sortie du gaz et 3 ports pour le positionnement des électrodes. 14 Le système électrochimique est un dispositif classique à 3 électrodes (électrode de travail, électrode de référence et contre-électrode). L'électrode de travail est un coupon de graphite de surface 2,5 cm x 2,5 cm et d'épaisseur 0,5 cm (Goodfellow), connecté électriquement avec une tige de titane (Goodfellow). Avant chaque expérience, le coupon de graphite est lavé pendant 5 lh dans une solution d'HC1 1N pour dissoudre les éventuelles espèces adsorbées puis dans une solution de NaOH 1N pour neutraliser l'acidité et finalement rincé avec de l'eau stérile ultrapure avant d'être laissé une nuit dans 1 L d'eau ultrapure stérile pour chasser les éventuels résidus de soude inclus dans les pores du graphite. La tige en titane est quant à elle nettoyée à l'acétone puis autoclavée. La contre-électrode est une grille de platine, préalablement nettoyée et 10 désinfectée à la flamme. Les potentiels sont contrôlés et exprimés par rapport à une électrode de référence Ag/AgC1 (potentiel de 0,240 V/ESH, Radiometer analytical). Le potentiel de polarisation de l'électrode de travail est appliqué avec un potentiostat une voie (Ametek VersaSTAT3) et le courant est enregistré toutes les 900 s. La chronoampérométrie est périodiquement arrêtée pour acquérir des voltamétries cycliques (CV) à 5 mV/s entre -1 et 1 V 15 vs Ag/AgC1. Dans un premier temps, le réacteur est rempli avec une suspension bactérienne de S. maltophilia dans du milieu de réaction (préparée selon 2.c), saturée en CO2 par un bullage continu de CO2 100% (5 ou 25 ml.min-1) puis une polarisation de -0,7 V vs Ag/AgC1 est appliquée. La polarisation est débutée en même temps que la chronoampérométrie. En parallèle, un réacteur 20 témoin sans électrodes (et donc sans polarisation) est mis en oeuvre de la même manière que le réacteur électrochimique. Des prélèvements sont effectués au cours du temps, sous hotte microbiologique, pour mesurer la densité optique à 600 nm (D0600.), le pH et la concentration en formiate dans la suspension complète. Le pH s'est révélé être constant et égal à 6,6 ± 0,2. 6. Analyses physico-chimiques 25 - Traitement des échantillons liquides Le milieu de réaction complet (avec bactéries) et le surnageant (sans bactéries) sont analysés. Le milieu de réaction complet est soit directement analysé soit congelé à -20°C dès collecte pour analyse ultérieure. Le surnageant est obtenu par centrifugation du milieu complet venant d'être prélevé ; la centrifugation est conduite pendant 10 min à 10 000 g et 4 °C et le surnageant 30 est collecté dès la fin de la centrifugation pour analyse immédiate ou congélation à -20°C. Le culot est conservé à -20°C pour analyse ultérieure. 15 - Analyses réalisées par Chromatographie Gazeuse couplée à la Spectrométrie de Masse (GC-MS) : - Matériel La chromatographie gazeuse (Clarus 580, Perkin Elmer) est conduite avec une colonne 5 capillaire (30 m x 0,25 mm ID, épaisseur de film 8 !am, Rt-Q-Bond Plot, Restek), couplée à la spectrométrie de masse (Clarus SQ-8-MS, Perkin Elmer) équipée d'un détecteur quadripolaire sélectif de masse sur impact électronique (ET) opéré à 70 eV. Un passeur d'échantillons (Turbomatrix Headspace 16S, Perkin Elmer) est mis en en oeuvre pour l'injection des espaces de tête obtenus après chauffage à 100°C des échantillons liquides. Pour l'analyse de la 10 composition de l'espace de tête du réacteur fermé maintenu à 30°C, les échantillons sont directement prélevés dans le réacteur avec une seringue étanche aux gaz (50 pL) et injectés manuellement dans la GC-MS. L'hélium est utilisé comme gaz vecteur au débit de 1,5 ml / min. - Dosage du formiate et de l'acétate dans les échantillons liquides Une méthode d'estérification basée sur le protocole décrit par Wallage et al (2008) (Formic acid 15 and methanol concentrations in death investigations, Journal of Analytical Toxicology, 32 (2008) 241-248) a été utilisée pour la quantification du formiate et de l'acétate. La réaction d'estérification est réalisée entre les acides organiques présents dans l'échantillon liquide et le méthanol ajouté dans des conditions acides. Dans un flacon d'analyse GC-MS (22 mL), 600 pt d'échantillon, 100 1..IL d'acétonitrile (157,2 mg.L-1) en tant qu'étalon interne, 100 1..IL d'acide 20 sulfurique concentré et 1001..t.L de méthanol en tant qu'agent de dérivation sont introduits dans cet ordre. Le flacon d'analyse est alors placé dans le passeur d'échantillons et chauffé à 100 ° C pendant 15 minutes afin de terminer la réaction d'estérification. Dans le cas de l'analyse du milieu complet (avec bactéries), un étalement du mélange sur gélose a permis de vérifier que ces conditions permettent la lyse des bactéries car aucune re-croissance n'a été mise en 25 évidence. La température de l'injecteur est fixée à 200 ° C et le split à 1:16. Dans le four, un gradient de température est réalisé de 40 à 150 ° C, à la vitesse de 10 ° C / min. Les ions détectés, en mode d'enregistrement à un seul ion (SIR), étaient m / z 60 pour le formiate de méthyle, m / z 41 pour l'acétonitrile et m / z 74 pour l'acétate de méthyle. Afin de déterminer si le carbone est 12C ou 13C, [M + 1] a également été évalué pour les deux composés (m / z 61 et m / z 75 30 respectivement). La présence d'espèces marquées n'est considérée que pour des teneurs significativement supérieures à 1 %, qui dépassent donc le pourcentage lié à l'abondance isotopique naturelle. Des courbes d'étalonnage ont été établies préalablement avec des standards de formiate et d'acétate : Na(HC00), Na(H13C00) et Na(CH3C00), obtenus chez Sigma-Aldrich. 16 - Analyse des gaz dans l'espace de tête du réacteur fermé L'espace de tête du réacteur fermé est analysé pour déterminer les espèces gazeuses présentes au cours du temps. Pour chaque temps d'échantillonnage, 50 [IL d'espace de tête sont prélevés dans le réacteur incubé à 30°C à l'aide d'une seringue étanche aux gaz et 30 pt sont injectés 5 dans la GC-MS. La température de l'injecteur est fixée à 200°C et le split à 1:16. Dans le four, un gradient de température est réalisé de 100 à 150°C, à la vitesse de 10°C / min. En mode SIR, les ions détectés sont m / z 28 (N2), m / z 44 (CO2), m / z 45 (13CO2), m / z 16 (12CH4), m / z 17 (13CH4 et NH3). A terme, une quantification de ces espèces est possible. - Dosage des ions ammonium par chromatographie ionique (CI) 10 Les ions NH4 + sont dosés dans les surnageants. L'analyse est réalisée en injectant 25 1..IL d'échantillon dans un dispositif chromatographique Dionex ICS-1000 (Thermo Scientific) équipée d'une colonne capillaire IonPAc AS19 (0.4 x 250 mm). Le programme d' élution est le suivant : 10mM KOH (de 0 à 10 min), puis 10-45 mM KOH (de 10 à 30 min). - Analyses réalisées par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) : 15 Pour ces analyses, 500 1..IL d'échantillon liquide (réaction menée avec du 13CO2, 2.d) sont introduits dans un tube RMN de 5 mm de diamètre avec 50 1..IL de D20 puis analysés par un RMN BRUKER Avance III - 500MHz pendant 4 h. Différents standards (formiate de sodium marqué et non marqué, acétate de sodium, méthanol, éthanol, formaldéhyde, acétaldéhyde, lactate de sodium, glycérol, isobutanol, succinate de sodium, fumarate de sodium, pyruvate de 20 sodium, oxaloacétate de sodium) préparés dans du milieu de réaction ont été préalablement analysés par RMN pour obtenir les empreintes de ces molécules. Bl Résultats 1. Essais de réduction du 13CO2 en réacteur fermé Afin d'évaluer la capacité du biocatalyseur à réduire le CO2, du CO2 marqué au 13C est utilisé. 25 Deux produits issus de la réduction directe du CO2 peuvent être obtenus : le formiate et le méthane. Le marquage du CO2 a pour but de pouvoir mettre en évidence par GC-MS l'apparition de formiate marqué dans le milieu de réaction et de méthane marqué dans l'espace de tête. Ceci permet de distinguer les produits issus de la réduction du CO2 de ceux issus d'un simple relargage cellulaire. Par ailleurs, ce marquage permet aussi d'observer par RMN 30 l'ensemble des produits présentant un ou plusieurs 13C qui peuvent résulter (i) de la réduction du CO2, (ii) de l'utilisation de formiate marqué par la cellule pour synthétiser des molécules 17 plus complexes et (iii) de la fixation du CO2 par la cellule. La densité optique à 600 nm (D0600.) est mesurée pour suivre l'évolution de la concentration bactérienne. La teneur en ions ammonium (NH4) dans le milieu de réaction et le relargage éventuel d'ammoniac (NH3) dans l'espace de tête sont suivis pour déceler une activité de l'enzyme nitrogénase qui est capable de 5 réduire le N2 en NH3 (ou NH4) en fonction du pH. Suivi de la D0600nm et du pH Pour l'ensemble des trois cinétiques suivies, la mesure de la densité optique à 600 nm (DO600nm) met en évidence que la concentration massique en biocatalyseurs, initialement à 3,1 ± 0,1 g cellule sèche.L-1, chute sur les 10 premiers jours puis reste constante à une valeur moyenne de 10 0,5 ± 0,1 g cellule sèche.L-1 (données non montrées). Ceci signifie donc qu'une partie de la suspension de biocatalyseur se lyse sur les 10 premiers jours de la cinétique puis que la suspension reste stable. Le pH décroit aussi de 7,0 à 6,6 ± 0,1 en 5 jours puis demeure égal à cette valeur qui correspond au pKa du couple acido-basique CO2,H20/HCO3- induit par la dissolution de CO2 dans le milieu 15 de réaction (données non montrées). Le pH du milieu est donc tamponné tout au long de la cinétique. Mise en évidence de l'utilisation du 13CO2 Initialement, le milieu de réaction ne contient pas de formiate marqué au 13C, qu'il soit exo- ou intracellulaire (Figure 1). L'apparition de formiate marqué en cours de cinétiques démontre 20 donc que celui-ci est produit à partir de la seule espèce marquée au 13C présente dans le réacteur fermé, c'est-à-dire le 13CO2 introduit en début de réaction. L'analyse GC-MS a mis en évidence que le formiate marqué se retrouve dans le milieu de réaction complet (avec bactéries) mais pas dans les surnageants. Ceci signifie donc que le formiate marqué est intracellulaire, ce qui montre que la production de ce formiate est réalisée par les bactéries intègres restant dans le milieu de 25 réaction et non pas par des enzymes libres issues de la lyse cellulaire observée sur la base de la D0600.. Ce formiate marqué apparaît au bout de 8 à 10 jours, ce qui peut correspondre à la période nécessaire pour que la bactérie consomme tous les résidus organiques issus de la lyse cellulaire observée initialement avant de s'accoutumer au seul substrat carboné encore disponible, c'est-à-dire le CO2. Cette phase peut donc être apparentée à une phase de latence. 30 Le méthane pouvant être également un produit de réduction du CO2, du méthane marqué est aussi recherché dans l'espace de tête du réacteur mais aucune trace de méthane marqué n'est décelée au cours des cinétiques. 18 Hypothèses mécanistiques sur la voie de transformation du 13CO2 en formiate marqué A ce stade, trois voies peuvent être proposées : (1) Une voie possible est la fixation du 13CO2 dans de petites molécules organiques déjà existantes au sein de la cellule (et accumulées lors de la croissance de la bactérie), grâce aux enzymes 5 carboxylases de la bactérie. Dans un processus fermentaire, ces molécules pourraient alors être oxydées en formiate. Cette voie a été exclue grâce aux résultats obtenus en réacteur semi-fermé, assisté par voie électrochimique. (2) Une autre voie possible d'assimilation du 13CO2 en formiate marqué par la bactérie est la 10 réduction du 13CO2 catalysée par l'enzyme intracellulaire Formiate Déshydrogénase (FDH), présente dans les tous les procaryotes, selon l'équation suivante : 13CO2+ NADH -> H13C00- + NAD + (Equation 2) (3) Enfin, une dernière voie envisageable repose sur l'enzyme nitrogénase. En plus de réduire son substrat naturel (N2) en NH3, de récents travaux ont en effet mis en évidence que cette enzyme 15 est aussi capable de réduire le CO2 en formiate. Or, Sténotrophomonas maltophilia possède une nitrogénase. La réduction du 13CO2 pourrait donc être catalysée par l'enzyme intracellulaire nitrogénase (NIT) selon l'équation suivante : 13CO2+ E2(2H) -> H13C00- + Eo(H) (Equation 3) où Eo(H) désigne le cofacteur de l'enzyme nitrogénase (7Fe-9S-1Mo-1C-1R-homocitrate) dans 20 sa forme la plus oxydée et E2(2H) désigne ce cofacteur qui a accumulé 2 électrons et 2 protons. Le tableau 1 ci-dessous renseigne les concentrations de NH4 + (forme acide de NH3) mesurées dans le milieu de réaction du réacteur fermé en cours de cinétiques. Tableau 1. Concentrations de NH4 + mesurées dans le milieu de réaction en cours de cinétiques. Temps (jour) [NH4] (mg.L-1) 0 5 17 220 ± 10 Il apparaît que des ions ammonium (NH4) ont été produits en cours de cinétiques. Or, 25 initialement, aucune espèce azotée n'était présente dans le milieu autre que l'azote atmosphérique (N2). Il est donc possible que le NH4 + produit provienne de la réduction du N2 19 par l'enzyme nitrogénase de la bactérie et il n'est donc pas exclu que cette enzyme puisse participer à la réduction du CO2. La réduction enzymatique du CO2 requiert une source intracellulaire de protons et d'électrons. Cette source est très certainement accumulée pendant la phase de culture du biocatalyseur en 5 tant que réserve énergétique. A l'heure actuelle, deux types de molécules ont été identifiées comme pouvant jouer ce rôle : le PolyHydroxyButyrate (PHB) qui est un polymère naturel et les lipides. Une cinétique de réduction du CO2 a été mise en oeuvre en réacteur batch (selon le protocole décrit ci-dessus) mais en rajoutant initialement du PHB au milieu de réaction, à la concentration de 0,3 g.L-1. La bactérie S. maltophilia serait en effet capable d'excréter des 10 dépolymérases qui peuvent hydrolyser le PHB et permettre son assimilation par la cellule (Wani et al., 3 Biotech, 6 (2016) 179-184). En présence de PHB, la cinétique de production en formiate suit le même comportement qu'une cinétique standard si ce n'est que la production est augmentée par un facteur proche de 2,5 (données non montrées). Production en formiate marqué et flux de 13CO2 réduit 15 Les concentrations maximales en formiate marqué ont été obtenues entre 15 - 20 jours et sont comprises entre 10 - 20 mg.L-1 (Figure 1). La production en formiate Pformiate, en mg formiate. (g cellule sèche)-- 1 .j--1 ou en "'mol formiate. (g cellule sèche)' .f', f-1, est définie comme étant : Pformiate - AC / At / Cbactérie (Equation 4) 20 avec At : période de production (jour), AC : différence de concentration en formiate sur la période de production (mg.L-1 ou p.mol.L1), Cbactérie : concentration bactérienne initialement introduite (Cbaetérie = 3,0 ± 0,2 g cellule sèche.L1), et non pas concentration bactérienne en phase de production (0,5 ± 0,1 g cellule sèche.L-1), 25 pour tenir compte de l'apport en bactéries qu'il a été nécessaire de mettre en oeuvre. De la même manière, si l'on considère qu'une mole de formiate marqué produite correspond à une mole de 13CO2 réduite (voir équations 2 et 3), alors le flux Foce de 13CO2 réduit en "'mol '3CO2. (g cellule sèche)-- 1 .j--1 sera donc égal à la production en formiate Pformiate exprimée en innol formiate.(g cellule sèche)--1.j-- 1. Le flux volumique FCO2,vo1 de 13CO2 réduit exprimé en mL 30 /3CO2. (g cellule sèche)--1» sera calculé selon l'équation suivante : 20 FCO2,v01 = FCO2 Vm (Equation 5) OÙ vm est le volume molaire à 30°C du 13CO2 supposé gaz parfait (25,19 10-3 mLemo1-1) Le tableau 2 détaille les valeurs de AC et At pour chacune des trois cinétiques présentées, ainsi que les productions en formiate (Pformiate) formiate) et les flux de 13CO2 réduit (Fc02 et FCO2, vol). 5 Tableau 2. Production en formiate et flux de 13CO2 réduit obtenus en réacteur fermé Cinétique AC At (j) Pformiate Pformiate FCO2,vo1 (mg.1J1) (mg (j.tmol (mL 13CO2.(g formiate.(g formiate. (g cellule sèche)- cellule sèche)- cellule sèche)- 1.j-1) 1i-1) 1.j-1) 1 (bleue) 9,4 7 0,5 10,0 0,3 2 (rouge) 18,8 7 0,9 20,0 0,5 3 (verte) 7,7 7 0,4 8,2 0,2 Moyenne 11,8 ± 5,6 7 0,6 ± 0,3 12,7 ± 6,3 0,3 ± 0,2 Production en formiate marqué et flux de 13CO2 réduit : discussion des résultats Les concentrations maximales en formiate produites (10 - 20 mg.L-1, Figure 1) sont inférieures à la concentration maximale théorique en formiate marqué qui aurait pu être atteinte si tout le 10 CO2 marqué présent dans le réacteur avait été réduit (soit 4,6 g.L-1). Ce calcul se base (i) sur le nombre de moles de CO2 introduites dans l'espace de tête (obtenu par la loi des gaz parfaits) et (ii) sur une stoechiométrie 1:1 vis-à-vis du CO2 et du formiate. Une première solution pour augmenter la production de formiate est d'apporter le CO2 au coeur de la solution par un distributeur à gaz. 15 En effet, la présence d'ADN libre provenant de la lyse cellulaire observée pourrait créer des résistances importantes au transfert de masse dans les cellules. Une étude a en effet déjà reporté ce type de phénomène pour la bactérie E. cou, (Castan et al., John Wiler & Sons, Inc. Biotechnol. Bioeng. 77 (2002) 324-328), qui présente des similitudes avec la bactérie S. maltophilia, car elle est aussi une bactérie aérobie de type bacille à Gram négatif. Dans l'étude 20 de Castan et al., la présence d'ADN libre limiterait le transfert de masse en oxygène (02) dissous vers les cellules. Dans le cas présent, une telle limitation pourrait aussi se produire pour le CO2. 21 Une autre solution, non exclusive, est d'éliminer l'oxygène de l'espace de tête du réacteur fermé et de se placer sous une atmosphère de CO2 pur. En effet, la réduction du CO2 étant catalysée par voie enzymatique (nitrogénase ou formiate déshydrogénase), il est possible que l'oxygène présent dans le réacteur, et par conséquent 5 dissous en partie dans le milieu de réaction, endommage de manière irréversible certains composants de ces enzymes, conduisant ainsi à leur perte d'activité catalytique au cours du temps. Les résultats obtenus en réacteur semi-fermé tendent à confirmer que le transfert de masse en CO2 et la présence d'oxygène sont des éléments influents sur la production en formiate marqué. 10 En effet, dans le réacteur semi-fermé alimenté en continu par du CO2 pur au moyen d'un distributeur à gaz, la production en formiate marqué est près de 100 fois supérieure à celle obtenue en réacteur fermé. Viabilité des cellules après réaction A la fin des cinétiques, des bactéries sont prélevées dans le réacteur batch et ensemencées sur 15 un milieu de culture frais afin d'évaluer leur capacité à croître de nouveau. Dans tous les cas, les bactéries se développent avec une cinétique de croissance normale, ce qui démontre la présence de bactéries viables à la fin des essais de réduction du CO2. Etude de la spécificité de la souche Afin d'évaluer la spécificité de la bactérie S. maltophilia isolée au Laboratoire, une bactérie S. 20 maltophilia produite par une banque de culture cellulaire a été mise en oeuvre dans les conditions décrites ci-dessus (point A] 4). La cinétique de production en formiate marqué obtenue avec cette souche s'est révélée être comparable celle observée avec la souche isolée (données non montrées), ce qui met en évidence que la capacité de réduction du CO2 n'est pas limitée à la seule bactérie S. maltophilia isolée au Laboratoire. 25 Etude d'effets synergiques avec d'autres bactéries La bactérie S. maltophilia a été mise en consortium avec des bactéries susceptibles d'utiliser du formiate pour étudier leurs synergies éventuelles. Dans un premier temps, un consortium formé par la bactérie S. maltophilia et la bactérie méthanotrophe M. trichosporium OB3b, obtenu après culture sur méthane (selon le protocole 30 décrit en section A] 1), a été mis en oeuvre dans les conditions de réaction détaillées en section 22 A] 4. Une analyse RMN du milieu de réaction a été conduite initialement et au bout de 7 jours. Depuis le début (t =0 jours) et tout au long de la réaction, les pics de résonnance du 13CO2 (Ô = 124.63 ppm) et de sa forme ionique H13CO3- (Ô = 160.24 ppm) sont jours visibles (Figure 2a). Après 7 jours de cinétique, un nouveau pic apparaît (Ô = 170.99 ppm, Figure 2b), correspondant 5 à l'empreinte du standard réalisé avec du formiate marqué au 13C acheté chez Sigma Aldrich. Ceci démontre la production de formiate marqué dans ces conditions, à une concentration supérieure ou égale à la limite de détection de formiate marqué par analyse RMN, soit 6 mg.L1. L'analyse RMN du surnageant n'a révélé aucun formiate marqué, ce qui signifie que le formiate marqué produit est intracellulaire, comme observé dans les cinétiques avec S. 10 maltophilia seule. Aucun autre produit marqué n'a été mis en évidence dans le spectre RMN (Figure 2b). Des essais sur la bactérie méthanotrophe M. trichosporium OB3b seule, dont la pureté a été vérifiée au préalable, ont démontré que cette bactérie ne catalyse pas la réduction du CO2 et qu'elle est capable de former des spores qui empêchent la lyse cellulaire sur 25 jours au minimum. 15 Ce résultat suggère donc que la présence de cette bactérie méthanotrophe dans le milieu de réaction ne perturbe pas la réduction du CO2 et la production de formiate par S. maltophilia. Pour certaines applications, co-cultiver le biocatalyseur S. maltophilia avec la bactérie méthanotrophe M. trichosporium OB3b peut donc être envisagé pour garantir un bilan carbone optimal car le méthane, d'origine renouvelable, serait la seule source de carbone nécessaire à 20 la culture. Dans un second temps, un consortium formé par la bactérie S. maltophilia et la bactérie de type bacille à Gram positif Microbacterium oxydans, obtenu après culture sur milieu LB (selon un protocole similaire à celui décrit en section A] 1), a été mis en oeuvre dans les conditions de réaction détaillées en section A] 4. Une analyse RMN du milieu de réaction a été réalisée à 5, 25 8, 12 et 15 jours (Figure 2). Une analyse GC-MS a complété cette analyse pour le douzième jour. Tout comme le spectre initial obtenu avec le consortium S. maltophilial M. trichosporium OB3b, seuls les pics des substrats (13CO2 et H13CO3-) sont visibles à t = 0 jours. Après 5 jours de cinétique, un pic de formiate apparaît (Ô = 170.99 ppm, Figure 3a), 30 correspondant à une concentration supérieure ou égale à 6 mg.L-1. Par comparaison aux cinétiques réalisées en culture pure avec S. maltophilia, le temps de latence apparaît réduit de deux jours au minimum. L'analyse RMN du surnageant n'ayant pas révélé la présence de 23 produits marqués, ceci montre donc que le formiate marqué est aussi produit intra cellulairement. Au bout de 8 jours de réaction, l'amplitude du pic de formiate augmente significativement (par un facteur 11 environ), ce qui signifie que la concentration en formiate produit est plus 5 importante qu'à 5 jours (Figures 3a et 3b). Une approche semi-quantitative du spectre RMN permet d'estimer la concentration obtenue en formiate marqué intracellulaire à environ 100 mg.L-1, qui est près de 5 fois supérieure à la concentration maximale obtenue en mettant en oeuvre S. maltophilia seule. Par ailleurs, de nouveaux pics intracellulaires marqués au 13C apparaissent dont un pic (Ô = 182.19 ppm) pouvant probablement correspondre à l'empreinte 10 du lactate, ainsi que des forêts de pics dans la zone de déplacements chimiques comprise entre 125 - 155 ppm (Figure 3b). Une explication possible à ces observations est l'établissement d'une synergie entre les deux bactéries en présence : S. maltophilia réduisant le CO2 en formiate et expulsant le formiate produit en dehors de sa cellule pour que M. oxydans l'utilise pour former de nouveaux composés nécessaires à sa subsistance tels que le lactate. La présence de 15 la bactérie M. oxydans boosterait donc la réduction du CO2 par S. maltophilia et donc ainsi la production de formiate. Dans ce contexte, le fait de ne pas détecter de formiate marqué dans les surnageants pourrait s'expliquer par son captage par M. oxydans dès son excrétion pour être assimilé dans la cellule. Après 12 jours de cinétique, l'amplitude du pic RMN relatif au formiate diminue 20 significativement (par un facteur 10 environ) par rapport au pic obtenu à 8 jours (Figure 3b). Le dosage par GC-MS révèle que l'amplitude du pic à 12 jours correspond à une concentration en formiate marqué intracellulaire de 18,0 mg.L-1. Du lactate est toujours présent, avec une amplitude de pic comparable à celle observée à 8 jours et la forêt de pic visible dans la zone de déplacements chimiques comprise entre 125 - 155 ppm semble être plus intense (Figures 3b et 25 3c). De nouveaux composés marqués au 13C apparaissent aussi dans la zone de déplacements chimiques comprise entre 15 - 65 ppm (Figure 3c). 2. Essai de réduction du CO2 en réacteur semi-fermé, assisté par voie électrochimique Un réacteur semi-fermé assisté par voie électrochimique a été mis en oeuvre. Ce design de réacteur a pour objectif de permettre l'intensification de la réaction de réduction du CO2 par le 30 biocatalyseur S. maltophilia. L'assistance électrochimique vise à se substituer au donneur intracellulaire de protons et d'électrons nécessaires à la réaction de réduction du CO2. Dans ce dispositif à 3 électrodes (voir Figure 4 et section A] 5), la cathode polarisée a pour rôle de fournir les électrons nécessaires à la réaction de réduction du CO2 alors que l'oxydation de 24 l'eau à l'anode permet d'une part de fournir les protons et d'autre part de fermer le circuit électrique (bio-électrolyse); l'électrode de référence permet quant à elle de maintenir une tension de polarisation (Vpolansation) constante à la cathode. Le transfert électronique à la cathode peut s'établir de deux manières : (i) par voie directe, c'est-à-dire par des nanofils ou des 5 cytochromes conducteurs présents à la surface de la bactérie qui forment un biofilm autour de la cathode ou (ii) par voie indirecte, c'est-à-dire par des médiateurs électrochimiques expulsés par la bactérie en suspension. Dans un premier temps, la tension de polarisation est décidée par une approche thermodynamique. Le potentiel d' oxydo-réduction du couple CO2/formiate étant de -670 mV vs Ag/AgC1, il faut donc imposer un potentiel inférieur à ce potentiel pour que la 10 réaction de réduction du CO2 soit favorisée. Un potentiel de - 700 mV est choisi. En effet, un potentiel plus bas pourrait permettre également la réduction de l'eau en H2, ce qui n'est pas souhaité dans cette étude. Un bullage continu de CO2 pur est aussi mis en oeuvre pour (1) désoxygéner la solution et éviter la compétition avec la voie métabolique aérobie (où le 02 deviendrait accepteur d'électrons à 15 la place du CO2) mais aussi (2) pour préserver l'activité catalytique de réduction de l'enzyme réductrice de CO2. Afin de garantir un transfert de masse gaz-liquide optimal, l'apport en CO2 est réalisé par un distributeur poreux à gaz et un faible volume de liquide (60 mL) est utilisé pour permettre un fort taux de barbotage (volume de gaz par volume de liquide par minute). Ce faible volume permet également un rapport surface de cathode/volume de liquide élevé mais 20 aussi une forte concentration d'éventuels médiateurs électrochimiques naturels (produits par la bactérie) en cas de transfert électronique indirect entre la cathode et la bactérie. Discussions des résultats La ligne de base correspond à un courant nul (Figure 5), ce qui est confirmé par la voltamétrie cyclique réalisée en début de cinétique (donnée non montrée). Ceci montre donc 25 qu'initialement, aucun élément présent dans la suspension bactérienne ne s'oxyde ou ne se réduit. Au bout de 60 h (2,5 jours), un courant de réduction significatif apparaît en suivant une allure comparable à celle d'une cinétique de croissance microbienne (Figure 1). Il n'y a cependant pas de croissance microbienne visible dans la suspension car la D0600nm mesurée initialement était 30 de 5,6 alors que celle mesurée à 136 h était de 2,2. Néanmoins, ceci n'exclut pas la croissance d'un biofilm à la surface de la cathode. La voltamétrie cyclique réalisée à 136 h confirme l'adéquation du courant mesuré avec le potentiel de polarisation imposé (donnée non montrée). Cette voltamétrie montre par ailleurs un palier de diffusion sur le courant de réduction allant de 25 0 mV à -800 mV, ce qui suggère qu'une tension de polarisation plus faible par valeur absolue (par exemple -200 mV) pourrait être suffisante pour obtenir le même courant de réduction. Un recensement des espèces présentes dans le milieu de réaction pouvant être réduites au potentiel de -700 mV, et donc générer un courant de réduction, mène au CO2 et aux phosphates. 5 Néanmoins, si les phosphates étaient réduits, un courant de réduction aurait été visible dès le début de l'expérience. De plus, un calcul faradique permet de se rendre compte que la quantité de phosphates présente dans le milieu ne serait pas suffisante pour permettre un tel courant de réduction sur une durée aussi longue. Ce courant de réduction est donc lié au CO2. Afin de vérifier expérimentalement le lien du courant de réduction avec le CO2, des barbotages 10 d'un gaz noble inerte (argon) ont été réalisés dans le but de chasser tout ou partie du CO2 dissous. Un premier bullage d'argon à un débit de 10 mL.min-1 est réalisé pendant lh et a pour conséquence de réduire quasi-instantanément le courant de réduction par un facteur 2 environ, de - 850 à - 450 IJA (Figure 5, zones a et b). Puis, tout débit de gaz est coupé et le courant de réduction demeure quasi-constant, aux alentours de - 500 IJA (Figure 5, zone c). Lorsque qu'un 15 faible débit de CO2 est réappliqué, alors le courant de réduction diminue à nouveau (Figure 5, zone d), jusqu'à retrouver sa valeur stable initiale, soit - 850 IJA (Figue 5, zone d). Enfin, l'application d'un fort débit d'argon (100 mL.min-1) pendant 3 h a pour conséquence de faire disparaître tout courant de réduction puisque le courant remonte à 0 IJA (Figure 5, zone e). Ces conditions sont donc suffisantes pour chasser tout le CO2 dissous dans la suspension. Le courant 20 redescend à nouveau à l'application d'un flux de CO2 (Figure 5, zone f). L'ensemble de ces éléments permet de démontrer que le CO2 est bien l'élément réduit qui génère ce courant à la cathode. La réaction qui se produit à la cathode est donc : CO2 + fr + 2e- -> HC00- (Equation 1) 25 Cette réduction est catalysée par l'activité enzymatique de la cellule qui ne requiert plus de source intracellulaire de donneurs d'électrons et de protons comme décrit dans les équations (2) et (3). Par comparaison avec le réacteur fermé, il pourra être noté que la phase de latence qui précède l'amorce de la réaction de réduction du CO2 est très réduite : 2,5 jours contre 8-10 jours (Figures 30 1 et 5). Une explication peut être que le biocatalyseur est aidé par l'énergie que lui apporte l'électrolyse. En ce qui concerne le temps pendant lequel le CO2 est réduit, il est du même ordre 26 de grandeur dans les deux cas : 7 jours pour le réacteur fermé sans limitation de CO2 (Fig. 1) contre 190 h (soit 8 jours) pour le réacteur semi-fermé (Fig. 4). Calcul du flux de CO2 réduit Ce flux est calculé en se basant sur le courant de réduction produit et la loi de Faraday. La 5 charge Q (en Coulomb) qui circule dans le circuit électrique se calcule selon : Q = I. dt (Equation 5) où I (A) est la valeur du courant de réduction (en valeur absolue) t (s) est le temps Cette charge est également calculable selon : 10 Q = ne_ . F (Equation 6) où ne_ (mol) est le nombre de moles d'électrons ayant circulé F est la constante de Faraday (96 500 C.mo1-1) De plus, d'après l'équation (5), le nombre de moles de CO2 réduit 11CO2 est relié au nombre de moles d'électrons ayant circulé n, par une stoechiométrie 1:2. Il vient donc : 15 2. 11CO2 = ne- (Equation 7) Le flux FCO2 de CO2 réduit en mol CO2.(g cellule sèche)-1.j-1 sera : Fc02 = (nCO2 IV) / At / Cbactérie (Equation 8) avec nCO2 (mol) le nombre de moles de CO2 réduit, V le volume du réacteur (V = 60 mL) 20 At : période de production d'un courant de réduction (8 jours), Cbactérie : concentration bactérienne initialement introduite (Cbactérie = 3,0 ± 0,2 g cellule sèche.L1) pour tenir compte de l'apport en bactéries qu'il a été nécessaire de mettre en oeuvre 27 Enfin, le flux volumique FCO2,vo1 de CO2 réduit exprimé en mL CO2.(g cellule sèche)-1.j-1 est calculé à partir de Fc02 selon l'équation (4). Le tableau 3 donne les valeurs obtenues pour la charge Q, le nombre de moles de CO2 réduit 11032, le flux FCO2 de CO2 réduit et le flux volumique FCO2,vo1 de CO2 réduit. 5 Tableau 3. Flux FCO2 de CO2 réduit obtenu en réacteur semi-fermé, assisté électrochimiquement. Charge Q (C) nco2 (mol) FCO2 FCO2,v01 (mol CO2.(g cellule sèche)-1.j-1) (mL CO2.(g cellule sèche)-1.j-1) 3,35 102 1,73 10-3 1,20 10-3 30 Le flux volumique de CO2 réduit (Fco2,v01) obtenu en réacteur semi-fermé est de 30 mL CO2.(g cellule sèche)-1.j-1 (tableau 3), ce qui est près de 100 fois plus important que celui obtenu en 10 réacteur fermé (tableau 2). Cette augmentation significative dans le réacteur semi-fermé peut se justifier par (1) un transfert de masse amélioré grâce à l'apport gazeux au sein de la suspension, (2) le fait qu'il n'y ait pas d'apport d'oxygène qui puisse endommager l'enzyme nitrogénase et (3) une assistance électrochimique qui permet à la bactérie de disposer d'une source d'électrons REVENDICATIONS1. Procédé de valorisation du CO2 par réduction biologique comprenant une étape de mise en contact d'une phase liquide contenant la bactérie Stenotrophomonas maltophilia avec une phase gazeuse contenant du CO2 dans des conditions permettant la production de formiate à partir dudit CO2. 2. Procédé de valorisation du CO2 par réduction biologique selon la revendication 1, selon lequel l'étape de mise en contact entre la phase liquide et le CO2 est réalisée dans un réacteur fermé. 3. Procédé de valorisation du CO2 par réduction biologique selon la revendication 2, dans lequel la phase gazeuse contenant du CO2 est injectée au centre du réacteur, par exemple par un distributeur à gaz. 4. Procédé de valorisation du CO2 par réduction biologique selon la revendication 2, selon lequel l'air présent dans un espace de tête du réacteur est supprimé, et la phase gazeuse contenant du CO2 est injectée dans ledit espace de tête du réacteur, de manière à placer la réaction de production de formiate sous une atmosphère constituée uniquement de ladite phase gazeuse. 5. Procédé de valorisation du CO2 par réduction biologique selon la revendication 1, selon lequel l'étape de mise en contact entre la phase liquide et la phase gazeuse contenant du CO2 est réalisée en réacteur semi-fermé, dans lequel la phase gazeuse contenant du CO2 est apportée en continu, préférentiellement par bullage, à l'intérieur du réacteur. 6. Procédé de valorisation du CO2 par réduction biologique selon l'une des revendications 2 à 5, selon lequel l'étape de mise en contact entre la phase liquide et la phase gazeuse contenant du CO2 est réalisée en présence d'un donneur d'électrons, intra ou extracellulaire. 7. Procédé de valorisation du CO2 par réduction biologique selon l'une des revendications 2 à 6, selon lequel le réacteur contient une assistance électrochimique, préférentiellement de type bio-électrolyse. 8. Procédé de valorisation du CO2 par réduction biologique selon l'une des revendications précédentes, comprenant une phase préliminaire de co-culture de Stenotrophomonas 29 maltophilia avec au moins une bactérie méthanotrophe avant l'étape de mise en contact de la phase liquide avec la phase gazeuse. 9. Procédé de valorisation du CO2 par réduction biologique selon l'une des revendications précédentes, selon lequel la phase liquide contient également au moins un micro-organisme 5 apte à utiliser le formiate pour produire des composés organiques d'intérêt, tels que du méthane, du lactate ou des alcools, notamment en Ci/Cs. 10. Procédé de valorisation du CO2 par réduction biologique selon l'une des revendications précédentes, selon lequel la phase gazeuse est un biogaz. 11. Procédé de valorisation du CO2 par réduction biologique selon l'une des revendications 10 précédentes, comprenant une étape additionnelle consistant à récupérer le formiate produit sous forme de formiate et/ou d'acide formique et/ou des composés organiques d'intérêt issus de l'utilisation du formiate par un micro-organisme apte à utiliser ledit formiate pour produire des composés organiques d'intérêt. 12. Utilisation d'une bactérie Stenotrophomonas maltophilia pour la production de formiate par 15 réduction de CO2