Brevet FR3076911A1 — publié le 20190719

DISPOSITIF D'ECLAIRAGE DE MICROSCOPE PERMETTANT DE MESURER UN DEFAUT DE MISE AU POINT DESCRIPTION DOMAINE TECHNIQUE La présente invention concerne un dispositif d'éclairage pour un microscope en transmission permettant de mesurer quantitativement un défaut de mise au point. La mesure obtenue à l'aide de ce dispositif est utilisée pour réaliser une mise au point automatique. DESCRIPTION DU PROBLEME L'utilisation d'un microscope exige une opération de mise au point pour fournir une image exploitable. La mesure 10 du défaut de focalisation est donc une étape essentielle à la production d'images de bonne qualité. L'imprécision et la non reproductibilité qui découlent d'une erreur de mise au point affectent les résultats de l'exploitation des images. Les dispositifs existant permettant de mesurer le défaut de mise au point sont complexes, coûteux et imposent des commutations de composants optiques. 15 DEFINrnoNs Observation visuelle directe : robservation au travers des oculaires du microscope par l'observateur. Obse uelle indirecte : robservation sur un écran de l'image fournie par une caméra après numérisation de l'image. Focus : synonyme de « mise au point ». « Image au focus »: image nette. « Faire le focus »: faire la mise au 20 point. Focalisation : action de mise au point, c'est-à-dire de modifier la position relative de l'objet par rapport au microscope afin d'obtenir une image nette. Position de focus : position relative de l'objet par rapport au microscope pour laquelle on obtient une image nette. 25 ETAT DE LA TECHNIQUE ANTERIEURE La fourniture d'une image nette par un microscope est indispensable à l'exploitation ultérieure de cette image. La mise au point d'une image avec un microscope s'effectue principalement par le déplacement relatif le long de l'axe optique de l'objet par rapport à l'objectif de microscope, par le déplacement d'un groupe optique 30 intermédiaire ou par le déplacement du capteur d'image. Dans tous les cas, pour effectuer la mise au point de façon automatique, c'est-à-dire sans intervention de l'observateur, il faut disposer d'une mesure du défaut de mise au point et la transmettre à un système de correction. Il existe plusieurs familles de méthodes connues de l'art antérieur pour mesurer le défaut de mise au point. ta plus courante consiste à utiliser une caméra pour enregistrer une ou plusieurs images de l'échantillon observé à une ou plusieurs positions de mise au point. A partir des images obtenues, des paramètres quantitatifs ou des figures de mérite sont extraites et qui fournissent une mesure de la défocalisation. Le document Lawrence F. et al, "Comparison of Autofocus Methods for Automated Microscopy." Cytometry 12. no. 3 (1991): 195-206, présente une comparaison de méthodes appliquant ce principe. Pour cette famille de méthodes, il est nécessaire d'acquérir plusieurs images en modifiant la position de mise au point ce qui allonge la durée de l'examen. Cet aspect est particulièrement handicapant lorsque la technique d'observation exploite la fluorescence car le niveau de fluorescence décroit après chaque prise d'image en raison du photo-blanchiment des fluorochrornes. Par 10 ailleurs, les paramètres quantitatifs extraits de ces images dépendent du type d'échantillon : la méthode n'est pas universelle. La deuxième méthode couramment utilisée et décrite dans le document US3721827 consiste à projeter un faisceau de lumière et à analyser la lumière qui se réfléchit sur l'objet par mesure de l'intensité du faisceau réfléchi à l'aide d'un capteur photo-électrique, de son déplacement à l'aide d'un capteur de position, ou de sa 15 structure de phase avec une photodiode à quatre quadrants. Cette méthode n'est pas applicable en transmission et impose d'ajouter plusieurs composants optiques (source de lumière, lame séparatrice, lentilles, supports mécaniques). Une troisième méthode repose sur la projection d'un motif à la surface de l'échantillon, comme décrit dans le document US4406526. Selon ce document, un motif de ligne est tout d'abord décomposé par un système optique 20 afin d'obtenir la recomposition du motif quand la mise au point est effectuée. Ce dispositif ne fonctionne qu'en réflexion. Il impose une surface d'échantillon assez réfléchissante pour fournir une image en réflexion du motif projeté. De surcroît, cette méthode impose d'ajuster parfaitement la position de recomposition du motif et la position de mise au point de l'image de l'objet. Une autre méthode de mise au point d'une image pour la microscopie est décrite dans le document Liao et al., 25 "Single-Frame Rapid Autofocusing for Brightfield and Fluorescence Whole S'ide Imaging.", Biomedical Optics Express 7, no. 11 (November 1, 2016): 4763. Dans le dispositif décrit, deux diodes électroluminescentes sont disposées dans la pupille du condenseur d'éclairage du microscope. La position de ces deux diodes électroluminescentes permet, lorsqu'elles sont éclairées, de fournir dans le plan image du microscope, deux images décalées qui se superposent dans le plan du capteur d'images. L'amplitude du décalage dépend de la 30 valeur de la défocalisation. La mesure du défocus découle de l'analyse de t'image numérique enregistrée par une caméra. Pour ce dispositif, il est nécessaire de modifier le condenseur d'éclairage pour placer deux diodes électroluminescentes dans le plan de la pupille d'ouverture du condenseur. De plus, ces deux diodes électroluminescentes obturent partiellement le faisceau d'illumination, créant des phénomènes de diffraction modifiant l'image observée lorsqu'elle est illuminée par le faisceau issu du condenseur. Par ailleurs, comme les 35 diodes électroluminescentes sont placées dans le plan de la pupille d'ouverture du condenseur, le dispositif décrit ne permet qu'une seule direction d'illumination dans respace de robjet indépendamment de la distance ely ecindenceeir Pebiet La précision de la mesure du défaut de mise au point ne peut être optimale que pour 2 / 11 quelques grandissements et ne fonctionne bien que pour un intervalle fini de positions de défocalisation. De plus, ce dispositif est inopérant pour des objets présentant une structure de lignes orientées parallèlement à la droite passant par le centre des deux diodes électroluminescentes. Enfin, la méthode exposée dans ce document ne permet pas de connaître le sens à apporter à la correction, suivant que l'objet est au-dessus ou en-dessous de la position du plan de netteté. Pour contourner ce manque d'information, le microscope doit être défocalisé dans un sens donné pour supprimer l'ambiguïté de position. L'invention décrite dans le présent document permet de fournir un moyen de mesurer le défaut de mise au point par dédoublement de rimage de robjet observé par un microscope. Cette invention permet de connaître le sens de la correction de position à effectuer pour obtenir une image nette. Cette invention ne nécessite pas de placer 10 de composant optique entre l'objet et rimage. Quand rinvention est utilisée avec un condenseur d'illumination, la constitution du condenseur d'éclairage n'a pas à être modifiée et la structure du faisceau d'illumination issu du condenseur n'est pas altérée. Dans un mode avantageux, l'invention permet d'avoir une amplitude de mesure étendue qui s'adapte aux différents grandissements possibles avec un microscope. Dans un autre mode avantageux, le procédé décrit est mis en oeuvre dans un système d'éclairage complet sans composant optique. 15 EXPOSE DE L'INVENTION Dans différents modes de réalisation, la présente invention concerne également les caractéristiques suivantes qui devront être considérées isolément ou selon toutes leurs combinaisons techniquement possibles : le dispositif d'éclairage permettant de mesurer le défaut de mise au point sera constitué de plusieurs 20 sources discrètes disposées selon une structure d'anneau, le dispositif d'éclairage permettant de mesurer le défaut de mise au point sera constitué de plusieurs sources discrètes disposées selon une structure de plusieurs d'anneaux concentrique, le dispositif d'éclairage permettant de mesurer le défaut de mise au point sera constitué de plusieurs sources discrètes disposées selon une grille ou une matrice, 25 les sources du dispositif d'éclairage ne sont pas diamétralement opposée par rapport à l'axe optique du microscope, le dispositif d'éclairage permettant de mesurer le défaut de mise au point sera fixé sur le dispositif d'illumination conventionnel du microscope, les sources discrètes du dispositif d'éclairage seront choisies parmi les sources discrètes d'une structure 30 de plusieurs sources discrètes, comme par exemple un réseau d'anneaux concentriques de sources, une grille de sources, une matrice de sources. L'invention concerne également des procédures numériques d'analyse d'images obtenues avec le dispositif d'éclairage permettant de mesurer le défaut de mise au point. L'invention concerne également un microscope. Selon l'invention, ledit microscope comprend un dispositif 35 d'éclairage permettant de mesurer le défaut de mise au point tel que défini précédemment ainsi que : 3 / 11 des moyens mécaniques de positionner le dispositif d'éclairage permettant de mesurer le défaut de mise au point dans les trois directions de Yespace, d'un moyen électronique de contrôler les sources discrètes du dispositif d'éclairage permettant de mesurer le défaut de mise au point, Dans différents modes de réalisations possibles, l'invention sera décrite plus en détail en référence aux dessins annexés dans lesquels : - la figure 1 représente schématiquement le principe du dispositif d'éclairage permettant de mesurer le défaut de mise au point, - la figure 2A représente le dispositif d'éclairement dans un premier mode de réalisation de la présente 10 invention, - les figures 2B et 2C représentent deux configurations particulières de l'invention dans le premier mode de réalisation, - la figure 3A représente le dispositif d'éclairement dans un deuxième mode de réalisation de la présente invention, 15 - les figures 3B et 3C représentent deux configurations particulières de l'invention dans le deuxième mode de réalisation, - la figure 4A représente le dispositif d'éclairement dans un troisième mode de réalisation de la présente invention, la figure 4B représente une configuration particulière de l'invention dans le troisième mode de 20 réalisation, - la figure SA représente une procédure de mesure d'un défaut de mise au point avec le dispositif d'éclairage permettant de mesurer le défaut de mise au point, - la figure 543 représente schématiquement un résultat obtenue lors d'un étape de la procédure de mesure d'un défaut de mise au point avec le dispositif d'éclairage permettant de mesurer le défaut de mise au 25 point, - la figure 6A représente deux images expérimentales enregistrées avec le dispositif d'éclairage permettant de mesurer le défaut de mise au point, - la figure 6B représente un résultat expérimental de mesures de plusieurs défauts de mise au point avec le dispositif d'éclairage permettant de mesurer le défaut de mise au point dans un premier mode de réalisation, 30 - la figure 6C représente une table de mesures quantitatives du défaut de mise au point obtenues avec le dispositif d'éclairage permettant de mesurer le défaut de mise au point, - la figure 7 représente un résultat expérimental de mesures de plusieurs défauts de mise au point avec le dispositif d'éclairage permettant de mesurer le défaut de mise au point dans un deuxième mode de réalisation. 4 / 11 La figure 1 donne une description de l'invention. Un objet 100 est placé sur un support transparent 101 comme par exemple une lame de microscope. Un objectif de microscope 102 transporte l'image de l'objet jusqu'au plan d'un capteur d'image 104. Selon le type d'objectif de microscope utilisé, un groupe optique additionnel 103 peut être intercalé entre l'objectif de microscope et le capteur d'image. Deux sources de lumière 1051 et 1052 sont placées sous l'objet sur un support 106. Ces sources peuvent être choisies parmi les diodes électroluminescentes, les sources à filament de petites tailles, les diodes électroluminescentes organiques, les diodes lasers, les diodes lasers à cavité verticale. L'axe 110 correspond à l'axe optique du microscope. Dans un premier mode d'utilisation de l'invention, l'objet 100 étant en place, la mesure du défaut de mise au point est réalisée en plusieurs étapes représentées à la Fig. 5A. Une première étape 201 consiste à allumer une 10 des sources de lumière 1052 ou 1052 pour éclairer l'objet, par exemple avec la source 1051. Une deuxième étape 202 consiste à enregistrer une première image h. Une troisième étape 203 consiste à éteindre la source allumée à l'étape 201. Une quatrième étape 204 consiste à allumer la seconde source de lumière, par exemple la source 1052 si la première source de lumière allumée était 1051. Une cinquième étape 205 consiste à enregistrer une deuxième image 12. 15 La mesure du défaut de mise au point est calculée en combinant numériquement les images h et 12. Par exemple, on peut réaliser une étape 206 consistant à calculer l'inter-corrélation des images h et 12 enregistrées aux étapes 202 et 205: le résultat de l'inter-corrélation est une matrice à deux dimensions 211. Une étape 207 est ensuite réalisée, consistant à calculer le vecteur CM. Le point C du vecteur CM est le centre 213 de la matrice 211 et le point fvl du vecteur CM correspond à la position du maximum 212 de l'inter corrélation 211. La norme du vecteur 20. CM (repère 210) est proportionnelle à la mesure du défaut de mise au point et sa direction donne le sens de la correction. Par exemple, si Xra et Ym sont les coordonnées du maximum 212 de l'inter-corrélation et Xc et Yc les coordonnées du centre de la matrice 211, la norme du vecteur CM 210 est calculée selon la relation suivante : 210 = - Xc + frA4 -vc)2.Equation 1 Le sens de correction est donné par la comparaison de Xm à Xc, ou de Ym à Yc. Si Xe.gest supérieur à Xc, on corrigera 25 dans un sens donné à définir par une étape d'étalonnage et si Xm est inférieur à Xc, on corrigera dans le sens inverse.ilest important de noter que la connaissance du sens de correction est obtenue grâce à l'enregistrement distinct des Images h et!? dans un ordre déterminé. La distance 210 est transmise à un dispositif de correction de la position, par exemple un contrôleur d'actionneur comme un moteur tournant, un dispositif de déplacement piézo-électrique, une lentille à focale variable. 30 La succession des étapes 201 à 207 est désignée par le repère 200. Préalablement à l'utilisation de ce premier mode pour fournir une consigne de déplacement à un contrôleur de déplacement, une procédure d'étalonnage est réalisée. Par exemple, on peut procéder en appliquant la procédure 200 à une première position axiale de l'objet et enregistrer une première distance 210 notée 210e L'objet est ensuite déplacé selon l'axe optique d'une quantité Az connue, par exemple en se repérant aux graduations de la molette de mise au point ou en déplaçant un moteur de commande de mise au point d'une consigne connue relative à Az. L'unité de Az pourra être indifféremment exprimée en mètre, en graduation, en pas moteur, en pas codeur. On applique ensuite la procédure 200 à cette nouvelle position axiale et on enregistre une deuxième distance 210 notée 2102. La correspondance entre la distance 210 et le déplacement physique Zr, à effectuer pour obtenir une image nette est exprimée par la relation suivante : Zc =210x [ Equation 2] 2102 - 210i Une autre façon de réaliser l'étalonnage du dispositif de correction revient à enregistrer plusieurs coules (Az ; 201) et à calculer le coefficient directeur de la droite de régression linéaire entre les valeurs de Az et les valeurs 10 de 210. Dans un deuxième mode d'utilisation, les deux sources 1051 et 1052 sont choisies pour qu'elles émettent chacune des rayonnements optiques de longueur d'onde différente. De façon avantageuse, les rayonnements des deux sources sont émis dans des intervalles spectraux distincts. Le choix des intervalles spectraux est fait selon le type de capteur d'image utilisé. Par exemple, pour un détecteur d'image couleur à matrice de Bayer, on choisira 15 préférentiellement une source émettant une couleur rouge et une source émettant une couleur bleue, comme des diodes électroluminescentes. La procédure 200 est alors modifiée : les étapes 201 à 205 sont remplacées par une première étape d'allumage simultané des deux sources et d'une deuxième étape d'enregistrement de l'image de l'objet par le microscope à raide d'une caméra couleur. Une troisième étape consiste à décomposer l'image couleur en trois images monochromatiques correspondant chacune aux composantes rouge, verte et 20 bleue. Si la source 1051 émet un rayonnement rouge et la source 1052 émet un rayonnement bleu, on associe, par exemple, la composante rouge à l'image il et la composante bleue à l'image 12 et on applique les étapes 206 à 208. L'avantage de ce deuxième mode d'utilisation est de réduire le temps nécessaire à la procédure de mesure de la distance de mise au point en réduisant le nombre d'enregistrement d'images. la connaissance du sens de correction est obtenue grâce à l'association déterminée des images h et h aux composantes rouge et bleue. 25 Un premier mode de réalisation possible selon les deux modes d'utilisation est décrit par la Fig. 2. Dans ce premier mode de réalisation, le support 106 comportant les sources 1051 et 1052 est conçu pour se placer sur un diamètre externe du support 107 de l'optique du condenseur du microscope. La Fig. 2A représente une vue de côté avec le support 106 en coupe. La Fig. 2B représente la vue de dessus.. Dans ce premier mode de réalisation, le condenseur du microscope n'est pas modifié et le faisceau d'éclairement de l'objet sortant du condenseur 30 n'est pas altéré par la présence des sources 1051 et 1052. Ce premier mode de réalisation permet de régler la précision de la mesure de cléfocalisation en modifiant la position du condenseur le long de l'axe optique. Dans un premier mode avantageux selon ce premier mode de réalisation, les deux sources de lumière 1051 et 1052 sont disposées sur le support 106 de telle sorte que les axes passant par le centre du condenseur et le centre de chaque source font un angle A comme représenté en Fig. 28. Ce mode avantageux permet d'obtenir un déqinubfereerat de l'image pour toutes les orientations des structures de l'objet. Dans un deuxième mode 6/11 avantageux selon ce premier mode de réalisation, on place plusieurs sources sur le support 106 comme représenté en Fig. 2.C. Ce mode permet de choisir la direction de dédoublement de l'image en sélectionnant le couple de sources allumées. Dans un deuxième mode de réalisation selon les deux modes d'utilisation, e support 106 se fixe en lieu et place du condenseur. Ce mode de réalisation peut être choisi quand aucun condenseur n'est utilisé, par exemple, quand une observation en épi-illumination est utilisée, comme l'épi-fluorescence. Dans la Fig. 3, on a représenté un support 106 muni, par exemple, d'une queue d'aronde mâle pouvant se fixer sur la queue d'aronde femelle, non représentée, présente sur les microscopes. La Fig. 3A représente une vue de côté avec le support 106 qui supporte les sources 1051 et 1052 et la queue d'aronde male 108. La Fig. 39 représente la vue de dessus. Ce mode 10 de réalisation permet d'ajuster la précision de la mesure du défaut de mise au point en modifiant la distance entre les sources 105 et l'objet 100. Dans un premier mode avantageux selon ce deuxième mode de réalisation, les deux sources de lumière 1051 et 1052 sont disposées sur le support 106 de telle sorte que les axes passant par le centre du condenseur et le centre de chaque source font un angle A différent de 180e comme représenté en Fig. 39. Ce mode avantageux permet 15 d'obtenir un dédoublement de l'image pour toutes les orientations des structures de l'objet. Dans un deuxième mode avantageux selon ce deuxième mode de réalisation, on place plusieurs sources sur le support 106 comme représenté en Fig. 3C. Ce mode permet de choisir la direction de dédoublement de l'image en sélectionnant le couple de sources allumées. Dans un troisième mode de réalisation selon les deux modes d'utilisation représenté en Fig. 4, on dispose sur le 20 support 106 plusieurs sources selon plusieurs anneaux concentriques. En Fig. 4A, on a représenté trois anneaux 1081, 1082 et 1083 sur lesquels on dispose six sources, 1051 et 1052 sur l'anneau 1081, 1053 et 1054 sur l'anneau 1082 et 105s et 1056 sur l'anneau 1083. Pour dédoubler l'image, on choisira d'allumer les sources par paire, par exemple 1051 et 1052, 1053 et 1054 ou 1055 et 1056. On pourra aussi associer les sources de toutes les manières possibles, par exemple 1051 et 1054, 1051 et 1053. Le choix de la paire de sources allumées permet de régler la 25 précision de mesure du défaut de mise au point en modifiant l'amplitude du dédoublement : pour une même défocalisation, ramplitude est plus grande pour les sources placées le plus loin du centre des anneaux. L'avantage de cette configuration est qu'elle permet d'augmenter le domaine de mise au point : pour une forte cléfocalisation, on allume les sources de l'anneau ayant le plus petit diamètre. Pour une faible défocalisation, on allume les sources de l'anneau ayant le plus grand diamètre. La précision de la mesure du défaut de mise au 30 point peut être ajustée en modifiant la distance à robjet 100 du support 106. Dans un premier mode avantageux selon ce troisième mode de réalisation, les sources de lumière 105 sont disposées sur le support 106 de telle sorte que les axes passant par le centre du condenseur et le centre de chaque source font un angle A, comme représenté en Fig. 4A. Ce mode avantageux permet d'obtenir un dédoublement de l'image pour toutes les orientations des structures de l'objet. Dans un deuxième mode avantageux selon le troisième mode de 35 réalisation, on place plusieurs sources sur chaque anneau du support 106 comme représenté en Fig. 49. Ce mode permet de choisir la direction de dédoublement de l'image en sélectionnant le couple de sources allumées. Une source 111 peut être ajoutée au centre de la structure. Ce mode de réalisation constitue un dispositif complet 7 / 11 d'illumination qui se substitue au condenseur d'illumination. Les sources 105 peuvent être réparties de manière circulaire comme représenté en Fig. 4B ou en matrice rectangulaire. RESULTATS EXPERIMENTAUX OBTENUS AVEC L'INVENTION Des résultats expérimentaux sont présentés. Une première expérience est réalisée selon le troisième mode de réalisation avec une structure de sources comme représentée en Fig. 4B. Un réticule micrométrique est l'objet 100. Les deux sources 105/ et 1052 sont des diodes électroluminescentes vertes placées de façon asymétriques par rapport à l'axe optique 110. 105/ est placée à 1 cm de l'axe optique et 1052 à 2 cm. Les axes parallèles au plan objet passant par le centre des sources et l'axe optique font entre eux un angle de 116°. L'image 104 de 10 l'objet formée par le microscope est enregistrée avec une caméra couleur avec un grandissement de 10 fois. La Fig. 6A représente une première image 301 enregistrée avec la source 105/ seule allumée et une deuxième image 302 enregistrée avec la source 1052 seule allumée. Le décalage de l'image 302 par rapport à l'image 301 est nettement visible. La Fig. 6B représente dans un graphique à deux dimensions les positions du maximum d'inter-corrélation 212 15 pour plusieurs défocus 303 à 310 calculé en appliquant la procédure 200. Chaque position est marquée par une croix. De 303 à 309, l'objet est déplacé de 12.5 "lm après chaque enregistrement d'image. De 309 à 310, t'objet est déplacé de 25 um. La position de mise au point est repérée par le cercle plein 311. A partir des valeurs expérimentales, une droite de régression linéaire est calculée et représentée par le repère 312. Les points expérimentaux sont bien alignés sur cette droite. L'écart moyen entre les points 303 à 309 est de 16.28 pixels. 20 L'écart entre les points 309 et 310 est de 32.55 pixels ce qui correspond au double de la valeur précédente. En appliquant la relation établie précédemment, on converti, pour les points 303 à 310, les distances 210 en écart à la position de mise au point comme illustré dans ta Fig. 6C: la colonne de gauche reprend les repères des points 303 à 310 et la colonne de droite donne l'écart à la position de mise au point exprimée en micromètre. Une deuxième expérience est réalisée en utilisant le deuxième mode d'utilisation. La source 105/ est une diode 25 électroluminescente rouge et la source 1052 est une diode électroluminescente bleue. Les deux sources sont allumées en même temps et une image est enregistrée avec une caméra couleur pour plusieurs positions de l'objet. La procédure de traitement de cette image selon le deuxième mode d'utilisation est appliquée. Une courbe similaire à celle de la Fig. 6B est obtenue et illustrée en Fig. L'exploitation des données est effectuée de façon identique à celle de l'exemple précédent. 30 8 / REVENDICATIONS1. Dispositif d'éclairage d'un objet observé au microscope permettant de mesurer un défaut de mise au point qui comprend un système d'illumination d'un objet (100) placé sur un support (101), un objectif de microscope (102) apte à former une image de l'objet à la surface d'un capteur d'image 104 caractérisé en ce que : le système d'illumination est composé de deux sources lumineuses discrètes (1051 et 1052) placées avant l'objet de telle manière que l'objectif forme une première image 301 quand une des sources est allumée et une deuxième image 302 quand l'autre source est allumée, les deux images étant décalées l'une par rapport à l'autre quand la mise au point n'est pas assurée, 10 une procédure est appliquée pour enregistrer une première image 301 en éclairant l'objet avec la première source et une deuxième image 302 en éclairant l'objet avec la deuxième source, une procédure de comparaison du décalage des deux images est appliquée dont le résultat fourni une mesure proportionnelle au défaut de mise au point. 2. Dispositif d'éclairage d'un objet observé au microscope permettant de mesurer un défaut de 15 mise au point selon la revendication 1 caractérisé en ce que les sources lumineuses sont choisies parmi les diodes électroluminescentes, les diodes électroluminescentes organiques, les diodes lasers, les diodes lasers à cavité verticale. 3. Dispositif d'éclairage selon la revendication 1 caractérisé en ce que : - les deux sources lumineuses ne sont pas placées de façon symétrique par rapport à l'axe optique (110), 20 - l'angle A entre les axes parallèles au plan objet passant par le centre des sources et l'axe optique est différent de 180e. 4. Dispositif d'éclairage d'un objet observé au microscope permettant de mesurer un défaut de mise au point selon la revendication 1 caractérisé en ce que les deux sources sont choisies parmi une pluralité de sources. 25 5. Dispositif d'éclairage d'un objet observé au microscope permettant de mesurer un défaut de mise au point selon la revendications 1 caractérisé en ce que : la procédure de comparaison des deux images intègre une opération d'inter-corrélation entre les deux images, à partir de la matrice d'inter-corrélation, un vecteur CM est calculé, avec C le centre de la matrice 30 d'inter-corrélation et M le point correspondant à la valeur maximum dans la matrice d'inter-corrélation. La norme du vecteur CM est proportionnelle à la mesure du défaut de mise au point et sa direction donne le sens de la correction. 6. Dispositif d'éclairage d'un objet observé au microscope permettant de mesurer un défaut de 35 mise au point qui comprend un système d'illumination d'un objet (100) placé sur un support (101), un objectif de microscope (102) apte à former une image réelle de l'objet à la surface d'un capteur d'image 104 capable d'enregistrer des images en couleur caractérisé en ce que : 9 / 11 - le système d'illumination est composé de deux sources lumineuses discrètes (1052 et 1052) émettant chacune des rayonnements optiques de longueur d'onde différente, - les deux sources sont placées avant l'objet de telle manière que l'objectif forme une première image 301 à la première longueur d'onde et une deuxième image 302 à la deuxième longueur d'onde, les deux images étant décalées l'une par rapport à l'autre quand la mise au point n'est pas assurée, une procédure est appliquée comprenant une première étape d'enregistrement des deux images en éclairant l'objet simultanément avec la première source et avec la deuxième source, une deuxième étape de séparation des trames de couleurs pour obtenir deux images correspondant chacune à l'image de l'objet par la première source et à celle de l'objet par la deuxième source et d'une procédure de comparaison du décalage des 10 deux images dont le résultat fourni une mesure proportionnelle au défaut de mise au point. 7. Dispositif d'éclairage d'un objet observé au microscope permettant de mesurer un défaut de mise au point selon la revendication 6 caractérisé en ce que les sources lumineuses sont choisies parmi les diodes électroluminescentes, les diodes électroluminescentes organiques, les diodes lasers, les diodes lasers à cavité verticale. 15 8. Dispositif d'éclairage d'un objet observé au microscope permettant de mesurer un défaut de mise au point selon la revendication 6 caractérisé en ce que les deux sources sont choisies parmi une pluralité de sources. 9. Dispositif d'éclairage d'un objet observé au microscope permettant de mesurer un défaut de mise au point selon la revendications 6 caractérisé en ce que : 20 la procédure de comparaison des deux images intègre une opération d'inter-corrélation entre les deux images, à partir de la matrice d'inter-corrélation, un vecteur CM est calculé, avec C le centre de la matrice d'inter-corrélation et M le point correspondant à la valeur maximum dans la matrice d'inter-corrélation. La norme du vecteur CM est proportionnelle à la mesure du défaut de mise au point et sa direction donne le sens 25 de la correction. 10 / 11