Brevet FR3075037A1 — publié le 20190621

DOMAINE TECHNIQUE La presente invention concerne une association d'un retinoide et d'un extrait de Silybum marianum (L.) Gaertn., ainsi qu'une composition dermatologique ou dermocosmetique, de preference topique, contenant une telle association, notamment pour le traitement de l'acne, de la seborrhee, de la rosacee et/ou de la dermite seborrheique. ETAT DE LA TECHNIQUE ANTERIEURE Le nom scientifique Silybum marianum (L.) Gaertn. designe une plante appartenant a la famille des Asteraceae, annuelle ou bisannuelle a tige robuste pouvant atteindre plus de un metre de hauteur. Ses grandes feuilles luisantes, alternees, sans stipule sont marbrees de blanc et bordees d'epines dures et pointues. Les fleurs sont groupees en capitules terminaux, souvent solitaires. Ils sont entoures de grandes bractees epineuses a l'extremite tres aceree. Les fleurs, tubulees, a cinq lobes, sont de couleur pourpre violace. Les fruits sont des akenes luisants, noirs ou marbres de jaune, surmontes dune aigrette a soies denticulees en anneau a leur base. Le nom vernaculaire de cette plante est Chardon-Marie. L'akene (souvent denomme graine de maniere erronee dans la litterature) de Silybum marianum (L.) Gaertn. et ses preparations sont traditionnellement utilises par voie orale, dans le traitement symptomatique des troubles fonctionnels digestifs attribues a une origine hepatique. Dans la litterature, le principe actif principal de l'akene de Silybum marianum (L.) Gaertn. est la silymarine, mélange de plusieurs flavonolignanes (principalement silybine, isosilybine, silychristine et silydianine). Les akenes contiennent jusqu'a 3% en poids de silymarine. Ils sont egalement constitues d'huile (20-30% en poids), de mucilages et de proteines. Par ailleurs, un deficit en vitamine A a ete demontre dans la peau des patients acneiques (Millman, 0., and Vahlquist, A. (1985). Vitamin A in skin and serum--studies of acne vulgaris, atopic dermatitis, ichthyosis vulgaris and lichen planus. Br. J. Dermatol. 113(4), 405-413) et une deficience son de metabolisme a ete decrit dans 2 l'epithelium pilosebace (Everts, H. B. (2012). Endogenous retinoids in the hair follicle and sebaceous gland. Biochim. Biophys. Acta 1821(1), 222-229). Le retinaldehyde en application topique permet de delivrer les differents composants de la Vitamine A dans la peau humaine (Sorg, 0., and Saurat, J. H. (2014). Topical retinoids in skin ageing : A focused update with reference to sun induced epidermal vitamin A deficiency. Dermatology 228(4), 314-325), propriete qui est déjà utilisee dans la prevention et le traitement des peaux a tendance acneique. RESUME DE L' INVENTION Dans ce contexte, la Demanderesse a mis en evidence de maniere surprenante qu'un retinoide, tel que le retinaldehyde (encore appele retinal), en association avec un extrait de Silybum marianum, presentait des proprietes ameliorees pour le traitement de l'acne, de la seborrhee, de la rosacee ou de la dermite seborrheique. Plus particulierement, les resultats d'etudes obtenus ont demontre le role synergique du retinaldehyde associe a un extrait de Silybum marianum dans la production d'acides retinoides par les cellules de la peau. Un objet de l'invention concerne donc une association comprenant un retinoide et un extrait de Silybum marianum (L.) Gaertn.. Un autre objet de l'invention concerne une association comprenant un retinoide et un extrait de Silybum marianum (L.) Gaertn. pour son utilisation comme medicament. Un autre objet de l'invention concerne une association comprenant un retinoide et un extrait de Silybum marianum (L.) Gaertn. pour son utilisation dans le traitement de l'acne, de la seborrhee, de la rosacee et/ou de la dermite seborrheique. Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'une association comprenant un retinoide et un extrait de Silybum marianum (L.) Gaertn. pour la fabrication d'un medicament destine au le traitement de l'acne, de la seborrhee, de la rosacee et/ou de la dermite seborrheique. Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'une association comprenant un retinoide et un extrait de Silybum marianum (L.) Gaertn. dans le traitement de l' acne, de la seborrhee, de la rosacee et/ou de la dermite seborrheique. 3 Un autre objet de l'invention concerne une methode de traitement de l'acne, de la seborrhee, de la rosacee et/ou de la dermite seborrheique comprenant l' administration a une personne en ayant besoin d'une quantite efficace d'une association comprenant un retinoide et un extrait de Silybum marianum (L.) Gaertn.. Un autre objet de l'invention concerne une composition dermatologique ou dermo-cosmetique, de preference topique, comprenant un retinoide et un extrait de Silybum marianum (L.) Gaertn. en combinaison avec au moins un excipient dermatologiquement ou dermo-cosmetiquement acceptable. Un autre objet de l'invention concerne une composition dermatologique ou dermo-cosmetique, de preference topique, comprenant un retinoide et un extrait de Silybum marianum (L.) Gaertn. en combinaison avec au moins un excipient dermatologiquement ou dermo-cosmetiquement acceptable pour son utilisation dans le traitement de l'acne, de la seborrhee, de la rosacee et/ou de la dermite seborrheique. Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'une composition dermatologique ou dermo-cosmetique, de preference topique, comprenant un retinoide et un extrait de Silybum marianum (L.) Gaertn. en combinaison avec au moins un excipient dermatologiquement ou dermo-cosmetiquement acceptable dans le traitement de l'acne, de la seborrhee, de la rosacee et/ou de la dermite seborrheique. Un autre objet de l'invention concerne une methode de traitement de l'acne, de la seborrhee, de la rosacee et/ou de la dermite seborrheique comprenant l'administration, de preference par voie topique, a une personne en ayant besoin d'une quantite efficace d'une composition dermatologique ou dermo-cosmetique comprenant un retinoide et un extrait de Silybum marianum (L.) Gaertn. en combinaison avec au moins un excipient dermatologiquement ou dermo-cosmetiquement acceptable. Un autre objet de l'invention concerne une composition dermatologique ou dermo-cosmetique, de preference topique, comprenant : (i) un retinoide, et (ii) un extrait de Silybum marianum (L.) Gaertn. comme produits de combinaison, pour une utilisation simultanee, separee ou etalee dans le temps. Un autre objet de l'invention concerne une composition dermatologique ou dermo-cosmetique, de preference topique, comprenant : 4 (i) un retinoide, et (ii) un extrait de Silybum marianum (L.) Gaertn. comme produits de combinaison, pour une utilisation simultanee, separee ou etalee dans le temps dans le traitement de Facile, de la seborrhee, de la rosacee et/ou de la dermite seborrheique. Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation simultanee, separee ou etalee dans le temps d'un retinoide et d'un extrait de Silybum marianum (L.) Gaertn. dans le traitement de l'acne, de la seborrhee, de la rosacee et/ou de la dermite seborrheique. Un autre objet de l'invention concerne une methode de traitement de l'acne, de la seborrhee, de la rosacee et/ou de la dermite seborrheique comprenant l' administration de maniere simultanee, separee ou etalee dans le temps d'une quantite efficace d'un retinoide et d'une quantite efficace d'un extrait de Silybum marianum (L.) Gaertn. a une personne en ayant besoin. DESCRIPTION DETAILLEE Definitions Dans la presente description, la plante Silybum marianum (L.) Gaertn. pourra etre designee de maniere abregee par le terme Silybum marianum et le retinaldehyde pourra etre designe de maniere abrege par RAL. Par « acide gras », on entend, au sens de la presente invention, un acide carboxylique R1CO2H dont la chaine R1 est une chaine hydrocarbonee lineaire ou ramifiee, saturee ou comprenant des doubles liaisons C=C, l'acide carboxylique comprenant de 16 a 22 atomes de carbone (incluant l'atome de carbone de la fonction acide carboxylique). Par acide gras (incluant l'acide linoleique) « libre », on entend, au sens de la presente invention, un acide gras non lie a d'autres molecules (par ex. a du glycerol ou des derives de celui-ci pour donner des glycerides ou a un alcool pour donner un ester gras). Par « alcool en C1 en C3 », on entend, au sens de la presente invention, un alcool R2OH dont la chaine R2 est une chaine hydrocarbonee saturee, lineaire ou ramifiee, comprenant 1 a 3 atomes de carbone. Il pourra s'agir du methanol, de methanol, du n- propanol ou de l'isopropanol, en particulier du methanol, de methanol ou de l'isopropanol. De preference, it s'agira de l'isopropanol. Par « dermatologiquement ou dermo-cosmetiquement acceptable », on entend designer, dans la presente invention, ce qui est utile dans la preparation dune composition dermatologique ou dermo-cosmetique, qui est generalement sur, non toxique et ni biologiquement ni autrement non souhaitable et qui est acceptable pour une utilisation therapeutique ou cosmetique, notamment par application topique. Par « environ », on entend dans la presente description que la valeur concernee peut etre inferieure ou superieure de 10%, notamment de 5%, en particulier de 1%, a la valeur indiquee. Par « extrait sec », on entend, au sens de la presente invention, un extrait depourvu de solvant d'extraction ou en contenant uniquement a l'etat de trace non significative. Un tel extrait sec contient ainsi uniquement de la matiere issue de Silybum marianum (L.) Gaertn.. Il peut contenir egalement des traces non significatives de solvant d' extraction. Par « isosilybine », on entend, au sens de la presente invention, les deux diastereoisomeres isosilybine A et isosilybine B. Par « silybine », encore appelee dans Part silibinine, on entend, au sens de la presente invention, les quatre diastereoisomeres silybine A, silybine B, 2,3-cis-silybine A et 2,3-cis-silybine B. Par « silychristine », on entend, au sens de la presente invention, les deux diastereoisomeres silychristine A et silychristine B. Par « silymarine », on entend au sens de la presente invention un extrait purifie d'akenes de Silybum marianum (L.) Gaertn. comprenant majoritairement (au moins 95% en poids) un mélange des quatre flavonolignanes suivants : silybine, isosilybine, silychristine et silydianine (Kuki et al. 2012). Une teneur en silymarine inferieure a 0,2% en poids signifie donc que la quantite totale des constituants de la silymarine est inferieure a 0,2% en poids. Une telle teneur peut etre determinee notamment par HPLC (chromatographie en phase liquide a haute performance) ou UPLC (chromatographie en phase liquide a ultra haute performance) en calculant l'aire totale des pics correspondant a tous les constituants de la silymarine, notamment en utilisant un echantillon de 6 silymarine de reference, qui peut etre obtenu par exemple aupres de Sigma Aldrich, pour determiner la position de ces pies. Par « solvant organique non miscible a l'huile issue d'akenes de Silybum marianum (L.) Gaertn. », on entend, au sens de la presente invention, un solvant organique qui n' est pas capable de se melanger, ou seulement partiellement, avec l'huile issue d'akenes de Silybum marianum (L.) Gaertn., de sorte que le mélange du solvant organique et de l'huile issue d'akenes de Silybum marianum (L.) Gaertn. donne un mélange heterogene dans lequel it peut etre observe au moins deux phases distinctes. Par « sterol », on entend, au sens de la presente invention, une molecule possedant un noyau de sterane dont le carbone 3 est porteur d'un groupe hydroxyle OH, le sterane ayant la structure suivante : 1 1 2 A B 7 4 15 Par « tocopherol », on entend, au sens de la presente invention, l' a-tocopherol, le P-tocopherol, le y-tocopherol et le 6-tocopherol. Retinoide Le retinoide utilise dans le cadre de la presente invention pourra etre choisi parmi le retinol, le retinaldehyde et l'acide retinoique sous ses differentes formes isomeres (en particulier tout-trans, 13-cis et 9-cis). Avantageusement, le retinoide sera le retinol ou le retinaldehyde. De preference, le retinoide est le retinaldehyde. Extrait de Silybum marianum (L.) Gaertn. L'extrait utilise dans le cadre de la presente invention est un extrait de Silybum marianum, et notamment un extrait d'akenes de Silybum marianum. Selon un mode de realisation particulier, l'extrait selon l'invention contient moins de 0,2%, de preference moins de 0,1% en poids de silymarine par rapport au poids de l'extrait sec. 7 Selon un mode de realisation particulier, l'extrait selon l'invention contient au moins 0,5% en poids, de preference au moins 1,0% en poids de beta-sitosterol par rapport au poids de l'extrait sec. En particulier, l'extrait selon l'invention contient entre 0,5% et 2,5% en poids, notamment entre 1,0% et 2,0% en poids, par exemple environ 1,5% en poids de beta-sitosterol par rapport au poids de l'extrait sec. Avantageusement, l'extrait selon l'invention contient moins de 0,2%, de preference moins de 0,1% en poids de silymarine par rapport au poids de l'extrait sec. Le rapport massique silymarine/beta-sitosterol de l'extrait selon l'invention pourra etre en particulier inferieur a 0,4, notamment inferieur a 0,07. L'extrait selon l'invention pourra comprendre par ailleurs entre 2 et 7% en poids, notamment entre 3 et 6% en poids, par exemple entre 3 et 5% en poids de sterols par rapport au poids de l'extrait sec. Selon un mode de realisation particulier, l'extrait selon l'invention contient au moins 3% en poids, de preference au moins 4% en poids d'acide linoleique libre par rapport au poids de l'extrait sec. En particulier, l'extrait selon l'invention contient entre 3% et 15% en poids, notamment entre 4% et 10% en poids, en particulier entre 4% et 6% en poids, par exemple environ 5% en poids d'acide linoleique libre par rapport au poids de l'extrait sec. Avantageusement, l'extrait selon l'invention contient moins de 0,2%, de preference moins de 0,1% en poids de silymarine par rapport au poids de l'extrait sec. L'extrait selon l'invention pourra comprendre par ailleurs entre 10% et 70%, en particulier entre 10% et 30% en poids, notamment entre 15% et 25% en poids d'acides gras libres par rapport au poids de l'extrait sec. Selon un autre mode de realisation particulier, l'extrait selon l'invention contient entre 0,5% et 2,5% en poids, notamment entre 1,0% et 2,0% en poids, par exemple environ 1,5% en poids de beta-sitosterol par rapport au poids de l'extrait sec et entre 3% et 15% en poids, notamment entre 4% et 10% en poids, en particulier entre 4% et 6% en poids, par exemple environ 5% en poids d'acide linoleique libre par rapport au poids de l'extrait sec. Avantageusement, l'extrait selon l'invention contient moins de 0,2%, de preference moins de 0,1% en poids de silymarine par rapport au poids de l'extrait sec. Le rapport massique silymarine/beta-sitosterol de l'extrait selon l'invention pourra etre en particulier inferieur a 0,4, notamment inferieur a 0,07. L'extrait selon l'invention pourra comprendre par ailleurs entre 2 et 7% en poids, notamment entre 3 et 6% en poids, par exemple entre 3 et 5% en poids de sterols par rapport au poids de l'extrait sec 8 et entre 10% et 50%, en particulier entre 10% et 30% en poids, notamment entre 15% et 25% en poids d'acides gras libres par rapport au poids de l'extrait sec. Selon un mode de realisation particulier, l'extrait selon l'invention contient au moins 0,01% en poids, notamment au moins 0,05% en poids de tocopherols par rapport au poids de l'extrait sec. En particulier, l'extrait selon l'invention contient entre 0,01% et 0,5% en poids, notamment entre 0,05% et 0,2% en poids, par exemple environ 0,1% en poids de tocopherols par rapport au poids de l'extrait sec. Avantageusement, l'extrait selon l'invention contient moins de 0,2%, de preference moins de 0,1% en poids de silymarine par rapport au poids de l'extrait sec. Le rapport massique silymarine/tocopherols de l'extrait selon l'invention pourra etre en particulier inferieur 1, notamment inferieur a 0,1. Selon un autre mode de realisation particulier, l'extrait selon l'invention contient moins de 0,2%, de preference moins de 0,1% en poids de silymarine par rapport au poids de l'extrait sec ; entre 0,5% et 2,5% en poids, notamment entre 1,0% et 2,0% en poids, par exemple environ 1,5% en poids de beta-sitosterol par rapport au poids de l'extrait sec ; entre 3% et 15% en poids, notamment entre 4% et 10% en poids, en particulier entre 4% et 6% en poids, par exemple environ 5% en poids d'acide linoleique libre par rapport au poids de l'extrait sec ; et entre 0,01% et 0,5% en poids, notamment entre 0,05% et 0,2% en poids, par exemple environ 0,1% en poids de tocopherols par rapport au poids de l'extrait sec. L'extrait selon l'invention pourra comprendre par ailleurs entre 2 et 7% en poids, notamment entre 3 et 6% en poids, par exemple entre 3 et 5% en poids de sterols par rapport au poids de l'extrait sec et entre 10% et 50%, en particulier entre 10% et 30% en poids, notamment entre 15% et 25% en poids d'acides gras libres par rapport au poids de l'extrait sec. Le rapport massique silymarine/beta-sitosterol de l'extrait selon l'invention pourra etre en particulier inferieur a 0,4, notamment inferieur a 0,07. Le rapport massique silymarine/tocopherols de l'extrait selon l'invention pourra etre en particulier inferieur a 1, notamment inferieur a 0,1. De preference, l'extrait selon la presente invention sera un extrait sec. L'extrait selon la presente invention pourra etre obtenu par extraction d'une huile issue d'akenes de Silybum marianum (L.) Gaertn. par un solvant d'extraction 9 comprenant, notamment constitue par, une solution aqueuse hydrotropique, de l'eau subcritique ou un solvant organique non miscible a l'huile issue d'akenes de Silybum marianum (L.) Gaertn. eventuellement en mélange avec de l'eau ; en particulier un solvant organique non miscible a l'huile issue d'akenes de Silybum marianum (L.) Gaertn., tel qu'un un alcool en Ci en C3, eventuellement en mélange avec de l'eau. En particulier, le solvant d'extraction comprendra, notamment sera constitue par, le methanol, methanol ou l'isopropanol, eventuellement en mélange avec de l'eau, notamment dans un rapport volumique solvant organique/eau compris entre 80/20 et 100/0, notamment compris entre 85/15 et 95/5, en particulier d'environ 90/10. Avantageusement, it s'agira d'un mélange isopropanol / eau, notamment dans un rapport volumique d' environ 90/10. L'huile issue d'akenes de Silybum marianum peut etre avantageusement obtenue par extraction a partir d'akenes de Silybum marianum (L.) Gaertn. (les akenes pourront etre entiers ou en morceaux), notamment par pression, avantageusement par pression froid (c' est-à-dire sans chauffage, a temperature ambiante). L' ≊ d'extraction de l'huile issue d'akenes de Silybum marianum peut etre effectuee par mélange de l'huile avec le solvant d'extraction durant 1 a 12 h et en particulier a une temperature comprise entre 15 et 25°C, notamment d'environ 20°C. La quantite de solvant d'extraction utilise pour effectuer cette extraction sera avantageusement de 0,5 a 3 g, en particulier de 1 a 3 g pour 1 g d'huile. La phase d'extraction ainsi obtenue est ensuite separee de la phase lipidique, avant d'etre sechee et evaporee, partiellement ou totalement, notamment sous vide, pour eliminer plus ou moins le solvant d'extraction et obtenir soit l'extrait sec si on elimine totalement le solvant, soit l'extrait concentre qui est dilue dans du solvant residuel. Association selon l'invention L'association selon l'invention comprend un retinoide tel que defini ci-dessus et et un extrait de Silybum marianum (L.) Gaertn. tel que defini ci-dessus. L'association selon l'invention sera de preference une association du retinaldehyde comme retinoide avec un extrait de Silybum marianum, notamment un extrait d'akenes de Silybum marianum, essentiellement depourvu de silymarine, c' est-a- dire comprenant moins de 0,2%, de preference moins de 0,1% en poids de silymarine par rapport au poids de l' extrait sec. Compositions dermatologiques et dermo-cosmetiques selon l'invention La presente invention a egalement pour objet une composition dermatologique ou dermo-cosmetique comprenant au moins une association telle que define ci-dessus en combinaison avec au moins un excipient dermatologiquement ou dermocosmetiquement acceptable, plus particulierement destinee a une application topique, notamment sur la peau. Les compositions dermatologiques et dermo-cosmetiques selon l'invention pourront se presenter sous les formes qui sont habituellement connues pour une administration topique, c' est a dire notamment les lotions, les mousses, les gels, les dispersions, les emulsions, les sprays, les serums, les masques ou les crèmes, avec des excipients permettant notamment une penetration cutanee afin d'ameliorer les proprietes et l' accessibilite du principe actif. Avantageusement, it s'agira d'une crème. Ces compositions contiennent generalement, outre les ingredients de l'association selon la presente invention, un milieu physiologiquement acceptable, en general a base d' eau ou de solvant, par exemple des alcools, des ethers ou des glycols. Elles peuvent egalement contenir des agents tensioactifs, des agents complexant, des conservateurs, des agents stabilisants, des emulsifiants, des epaississants, des gelifiants, des humectants, des emollients, des oligo-elements, des huiles essentielles, des parfums, des colorants, des agents matifiants, des filtres chimiques ou mineraux, des agents hydratants, des eaux thermales, etc. Ces compositions peuvent en outre contenir d'autres principes actifs conduisant a un effet complementaire ou eventuellement synergique. Avantageusement, les compositions selon la presente invention comprendront 0,01 a 10% en poids, de preference 0,05 a 5% en poids, d'un extrait de Silybum marianum selon l'invention par rapport au poids total de la composition. Avantageusement, les compositions selon la presente invention comprendront 0,001 a 5% en poids, de preference 0,01 a 1% en poids, du retinoide par rapport au poids total de la composition. 11 Applications therapeutiques Les associations selon l'invention et les compositions dermatologiques ou dermo-cosmetiques selon l'invention sont utiles dans le traitement de Facile (par ex. acne juvenile, encore appelee acne de l'adolescent, ou acne tardive, pouvant etre kystique), de la seborrhee, de la dermite seborrheique et/ou de la rosacee, de preference par application topique, en particulier sur la peau. La presente invention est illustree par les exemples non limitatifs qui suivent. FIGURES La Figure 1 represente le chromatogramme UPLC de l'extrait I de Silybum marianum obtenu selon le Protocole 1. Les Figures 2A, 2B et 2C representent respectivement un chromatogramme UPLC de l'extrait M, de l'extrait E et de l'extrait I de Silybum marianum obtenu selon le Protocole 2. Les Figures 3A, 3B et 3C representent respectivement la zone 10-22 min (correspondant a la zone des acides gras) d'un chromatogramme GC / MS de l'extrait E, de l'extrait M et de l'extrait I de Silybum marianum obtenu selon le Protocole 3. Les Figures 4A, 4B et 4C representent respectivement la zone 22-28 min (correspondant a la zone des sterols) d'un chromatogramme GC / MS de l'extrait E, de l'extrait M et de l'extrait I de Silybum marianum obtenu selon le Protocole 3. La Figure 5 represente la quantite produite par les cellules de la peau de retinoides totaux en fonction du traitement recu, a savoir le vehicule seul (EtOH), du retinaldehyde a 211.M (RAL un extrait de Silybum marianum a 501.1..g/mL (SYL 50 pg/mL) ou l'association du retinaldehyde a 211.M et de l'extrait de Silybum marianum a 50 pg/mL (RAL + SYL). La Figure 6 represente la quantite produite par les cellules de la peau de retinoides totaux en fonction du traitement recu, a savoir le vehicule seul (EtOH), du retinol a 211.M (ROL 21.1..M), un extrait de Silybum marianum a 50 pg/mL (SYL 50 pg/mL) ou l'association du retinol a 211.M et de l'extrait de Silybum marianum a 50 pg/mL (ROL + SYL). 12 EXEMPLES I - Exemples de preparations d'extraits selon l'invention Extrait isopropanolique 90 (extrait I) obtenu selon le procede suivant : - pression a froid d'akenes de Silybum marianum pour obtenir une huile issue d'akenes de Silybum marianum, - extraction de l'huile issue d'akenes de Silybum marianum par un mélange isopropanol/eau (90/10 v/v) avec 1 gramme du mélange isopropanol / eau par gramme d'huile pendant 2 heures a 20°C, - recuperation de la phase isopropanolique, et - evaporation du solvant. Des extraits methanolique (extrait M) et ethanolique 90 (extrait E) ont ete obtenus de maniere similaire en remplacant le mélange isopropanol/eau (90/10 v/v) respectivement par du methanol et un mélange ethanol/eau (90/10 v/v). L'extraction de l'huile issue d'akenes de Silybum marianum se fait respectivement par 3 volumes de methanol et par 3 volumes du mélange ethanol/eau (90/10 v/v) pour 1 volume d'huile pendant 2 heures a 20°C. Ces differents extraits ont ete caracterises par UPLC (chromatographie en phase liquide a ultra haute performance) ou par GC-MS (chromatographie en phase gazeuse couplee la spectrometrie de masse) selon les protocoles detailles ci-dessous. Protocoles d' evaluation des extraits obtenus : 1. Protocole 1 : Evaluation de la teneur en Silymarine par UPLC o Preparation de Pechantillon et du temoin: - Temoin silymarine : Preparer une solution de silymarine a 5 mg dans 10 ml d'un mélange methanol / eau (60:40) (v/v). - Echantillon : - Extrait A : Preparer une solution a 100 mg d'extrait a analyser dans 10 ml d'un mélange methanol / dichloromethane (70:30) (v/v) - Extraits M, E, I : Chauffer l'extrait sec a analyser a 35°C sous agitation jusqu'd obtention d'une solution homogene et limpide. Peser exactement 200 mg (pe) 13 de l'extrait, le solubiliser dans 10 ml d'un mélange methanol / dichloromethane permettant la solubilisation totale de l'extrait et homogeneiser la solution. Ce mélange va du ratio methanol / dichloromethane (1:1) (v/v) au methanol pur. o Conditions analytiques : - Colonne : Acquity BEH Shield C18 150 mm x 2,1 mm - 1,71.tm (Waters) - Phase mobile : o A : Eau + 0,1% d'acide formique o B : Acetonitrile + 0,1% d'acide formique - Gradient : T (min) A (%) B (%) 0 90 10 60 40 0 100 39,5 0 100 40 90 10 45 90 10 - Temperature de la colonne : 40°C - Debit : 0,4 ml/min - Detection : 287 nm - Volume d'injection : 1 pt 2. Protocole 2 : Evaluation de la teneur en Acide linoleique par UPLC o Preparation de Pechantillon et du temoin - Temoin Acide linoleique : Preparer une solution d'acide linoleique a 10 mg dans 10 ml d'un mélange methanol / dichloromethane (1:1) (v/v). - Echantillon : - Extraits M, E, I : Chauffer l'extrait sec a analyser a 35°C sous agitation jusqu' obtention d'une solution homogene et limpide. Peser exactement 50 mg (pe) de l'extrait, le solubiliser dans 1 ml d'un mélange methanol / dichloromethane permettant la solubilisation totale de l'extrait et homogeneiser la solution. Ce mélange va du ratio methanol / dichloromethane (1:1) (v/v) au methanol pur. o Conditions analytiques - Colonne : Acquity BEH Shield C18 150 mm x 2,1 mm - 1,71.tm (Waters) 14 - Phase mobile : o A : Eau + 0,1% d'acide formique o B : Acetonitrile + 0,1% d'acide formique - Gradient : T (min) A (%) B (%) 0 50 50 1 50 50 10 0 100 15 0 100 15,5 50 50 20 50 50 - Temperature de la colonne : 40°C - Debit : 0,4 ml/min - Detection : 215 nm - Volume d'injection : 1 3. Protocole 3 : Evaluation de la teneur en Acides gras et Sterols par GC-MS o Preparation de Pechantillon - Chauffer l'extrait sec a analyser a 35°C en agitant jusqu'd obtention d'un liquide homogene limpide - Solubiliser 20 mg de l'extrait dans 800 µL d'un mélange methanol / dichloromethane (1:1) (v/v) - Aj outer 200 µL du deriyatisant N,O-Bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide (BSTFA) + Trimethylchlorosilane (TMCS) (99:1) (Supelco - Sigma Aldrich) - Agiter 1 minute au Vortex o Conditions de la chromatographie en phase gazeuse (CPG) - Colonne : DB-5ms (Agilent technologies) ; 30 m x 0,25 mm ; 0,25 p.m - Injection : T = 300°C ; Mode = Split ; Split ratio = 100: 1 - Four : Gradient de temperature (°C) : o Temperature initiale = 150°C o Gradient = 7°C / min jusqu'd Temperature finale = 340°C o Maintenir a 340°C pendant 10 minutes - Debit gaz vecteur : 1 mL/min 15 - Detection : MS - EI; T = 300°C ; Scan Time = 0,2 sec. ; Full Scan Start Mass = 40 ; Full Scan End Mass = 600 - Volume d'injection Resultats : L'extrait I contient majoritairement des substances ayant un temps de retention entre 13 et 30 minutes par UPLC (cf. Figure 1). Il presente les caracteristiques suivantes : Composants % en poids Silymarine 0,06 Acides gras libres (principalement acides palmitique, oleique et 24,6 linoleique) dont acide linoleique 5,1 Sterols 3,6 dont beta-sisterol 1,5 Les chromatogrammes UPLC et GC / MS des 3 extraits (extraits I, M et E) de Silybum marianum sont similaires (cf. Figures 2 et 3). II - Exemples de compositions comprenant un retinoide et/ou un extrait de Silybum marianum selon l'invention COMPOSITION 1 (crème) a base de retinaldehyde = RAL1 INCI designation Pourcentage en poids Oleamide de glycylglycine 0,1% Tocopheryl glucoside 0,1% retinaldehyde 0,05% Gelifi ant Carbomer 0,35% Squalane 15% Mineral Oil Caprylic capric triglycerides Eau Qsp 100% 16 COMPOSITION 2 (crème) a base de retinaldehyde = RAL2 INCI designation Pourcentage en poids Eau QSP 100% Sorbate Potassium 0,3 Ethanol 3 Glycolic Acid 6 Ceteareth 33 & cetearyl alcool 3 Polysorbate 60 6 Cetylic Alccol 11 Butylhydroxytoluene 0,01 Cyclopentasiloxane 10 Hydroxyde Sodium qs Retinaldehyde 0,1 Undecyl Rhamnoside 0,2 COMPOSITION 3 (crème) a base de retinaldehyde = RAL3 INCI designation Pourcentage en poids Eau QSP 100% Glycerine 6 Disodium EDTA 0,1 Pentylene glycol 3 Glyceryl Stearate & PEG-100 Stearate 3 Isododecane 7 Butylhydroxytoluene 0,02 Carbomer Papaine Crosspolymer 1 Retinaldehyde 0,1 Caprylic/Capric Triglycerides 7 1a-linolenate de 2-hydroxy-octyle 0,6 COMPOSITION 4 (crème) a base de retinaldehyde = RAL4 Le retinaldehyde a ete formule a 0,1% (p/p) dans un mélange comprenant : Glycerine 5% 17 Gelifiant 1,5% Silice 1% Eau qs. COMPOSITION 5 (crème) a base d'extrait de Silybum marianium = SYL1 L'extrait I prepare a l'exemple 1 a ete formule a 7% (p/p) dans un mélange isopropanol / PEG 300 (1:1) (p/p). COMPOSITION 6 (crème) a base d'extrait de Silybum marianium SYL2 (pourcentage p/p) SYL1 25% Glycerine 5% Gelifiant 1,5% Silice 1% Eau qs. COMPOSITION 7 (crème) comprenant l'association d'un extrait de Silybum marianum et de retinaldehyde = ASSO1 (pourcentage p/p) SYL1 25% Retinaldehyde 0,1% Glycerine 5% Gelifiant 1,5% Silice 1% Eau qs. COMPOSITION 8 (crème) comprenant l'association d'un extrait de Silybum marianum et de retinaldehyde = ASSO2 (Pourcentage p/p) SYL1 12,5% Retinaldehyde 0,1% Glycerine 5% Gelifiant 1,5% Silice 1% 18 Eau qs. III - Etudes cliniques Les differentes crèmes testees ont ete appliquees sur le visage (peau nettoyee), 2 applications/jour matin et soir par massage doux sauf pour les compositions comprenant du RAL : le soir uniquement. L'analyse des effets therapeutiques obtenus a ete effectuee selon la methode d'analyse globale de l'etat clinique IGA (Investigator Global Assessment) acceptee par la FDA (Food and Drug Administration) - pour l'acne et adaptee a la rosacee et a la dermite seborrheique - et appliquee par un dermatologiste expert clinique (Guidance for Industry Acne Vulgaris: Developing Drugs for Treatment). Avec une telle methode les Grades IGA suivants sont attribues selon la severite de l'acne observee : Grade IGA Etat du patient 0 Peau nette sans lesions inflammatoires ou non inflammatoires 1 Peau quasiment nette avec de rares lesions non inflammatoires et pas plus d'une petite lesion inflammatoire 2 Acne legere de severite superieure au grade 1 : quelques lesions non inflammatoires avec pas plus de quelques lesions inflammatoires (papules et pustules, pas de lesion nodulaire) 3 Acne moderee de severite superieure au grade 2 : jusqu'a de nombreuses lesions non inflammatoires et potentiellement quelques lesions inflammatoires mais pas plus d'une petite lesion nodulaire 4 Acne severe de severite superieure au grade 3 : jusqu' a. de nombreuses lesions non inflammatoires et inflammatoires mais pas plus de quelques lesions nodulaires Les resultats des differentes analyses sont presentes ci-dessous. 19 Analyse 1 : Avant traitement versus Extrait de Silybum marianum sans RAL versus association RAL + Extrait de Silybum marianum Patients Protocole (nombre de semaines Grade IGA successives d'un meme traitement et second traitement applique le jour suivant la fin du 1" traitement) Avant traitement Apres traitement Apres traitement RAL + Extrait de Silybum Extrait de marianum Silybum marianum Homme atteint de 35 semaines SYL1 2 1 0 rosacee et dermite puis 15 semaines SYL1 + RAL1 seborrheique Femme atteinte de 9 semaines SYL1 4 2 0 rosacee et dermite puis 50 semaines SYL1 + RAL1 seborrheique Homme atteint de 3 semaines SYL1 3 1 0 rosacee et dermite puis 18 semaines SYL1 + RAL1 seborrheique Femme atteinte 5 semaines SYL1 3 2 1 d'acne tardive puis 8 semaines SYL1 + RAL2 Adolescent atteint 5 semaines SYL1 3 1 0 d'acne puis 5 semaines SYL1 + RAL3 Adolescente atteinte 4 semaines SYL1 2 1 0 d'acne puis 28 semaines SYL1 + RAL3 Adolescent atteint 52 semaines SYL1 3 1 0 d'acne puis 16 semaines SYL1 + RAL3 Femme atteinte 10 semaines SYL1 3 2 1 d'acne tardive puis 20 semaines SYL1 + RAL3 Femme atteinte 8 semaines SYL1 3 2 2 d'acne tardive puis 8 semaines SYL1 + RAL3 Femme atteinte 24 semaines SYL2 3 2 1 d'acne tardive puis 4 semaines ASSO1 20 Adolescente atteinte 4 semaines SYL2 2 1 0 d'acne puis 6 semaines ASSO1 Adolescent atteint 16 semaines SYL2 3 2 1 d'acne puis 3 semaines ASSO1 Femme atteinte 6 semaines SYL2 3 2 1 d'acne tardive puis 3 semaines ASSO1 Femme atteinte 8 semaines SYL2 3 2 1 d'acne tardive puis 8 semaines ASSO2 Adolescente atteinte 12 semaines SYL1 4 2 1 d'acne puis 10 semaines ASSO2 Analyse 2 : Avant traitement versus RAL sans Extrait de Silybum marianum versus association RAL + Extrait de Silybum marianum Patients Protocole (nombre de semaines Grade IGA successives d'un meme traitement et second traitement applique le jour suivant la fin du 1" traitement) Avant traitement Apres traitement RAL Apres traitement RAL + Extrait de Silybum marianum Homme atteint de 35 semaines RAL1 3 2 1 dermite seborrheique + scalp chauve puis 43 semaines SYL1 + RAL1 Femme atteinte 6 semaines RAL 3 4 3 1 d'acne tardive puis 6 semaines SYL1 + RAL3 Femme atteinte 8 semaines RAL2 3 2 1 d'acne tardive Puis 8 semaines SYL1 + RAL2 Adolescente atteinte 60 semaines RAL2 3 2 1 d'acne Puis 16 semaines SYL1 + RAL2 Adolescent atteint 6 semaines RAL3 3 2 1 d'acne puis 20 semaines SYL1 + RAL3 Femme atteinte 8 semaines RAL3 4 3 2 d'acne tardive Puis 4 semaines ASSO1 21 Conclusion Les resultats obtenus avec les differents traitements a base respectivement d'une association retinaldehyde / extrait de Silybum marianum, du retinaldehyde seul ou de l'extrait de Silybum marianum seul, dans les etudes cliniques decrites ci-dessus, montrent que le retinaldehyde en association avec l'extrait de Silybum marianum, permet d'obtenir un meilleur resultat clinique. IV - Etudes in vitro : evaluation de la correction du deficit en vitamine A grace a l'association retinaldehyde (RAL) ou retinol (ROL) + extrait de Silybum marianum (SYL) Materiel et methodes : Culture : - 3 jours avant l'experience, cultiver les cellules A431 de carcinome epidermoide dans 2 plaques a 6 puits a une densite de 40'000 cellules par puits (2 ml par puits). Traitement des cellules (3 puits par condition, 2 ml par puits ; concentrations finales) : - Ethanol (solvant) : ethanol 1% ; - ROL : ROL 10 µM dans ethanol 1% ; - RAL : RAL 2µM dans ethanol 1% ; - SYL : Extrait I de Silybum marianum 50 µg/m1 dans ethanol 1% ; - ROL + SYL : ROL 10 µM + Extrait de Silybum marianum 50 µg/m1 dans ethanol 1% ; - RAL + SYL : RAL 2 [tM + Extrait de Silybum marianum 50 µg/m1 dans ethanol 1%. Incubation : 1 h Recolte des cellules : - Oter le milieu, laver 2 fois avec PBS (tampon phosphate salin) ; - Ajouter 500 pi par puits d'EDTA-NaOH (Acide ethylene diamine tetraacetique (EDTA) 0,02% + NaOH 200 pM), laisser reposer 10-15 minutes, puis detacher 22 les cellules a l'aide d'un grattoir en caoutchouc et les transferer dans des tubes en verre a extraction ; - Ajouter 10 pl d'HCl 20 mM, soniquer brievement, puis transferer 10 IA de suspension dans des tubes Eppendorf de 1.5 ml pour le dosage des proteines ; - Dans les tubes en verre, ajouter 500 pl de BHT (hydroxytoluene butyle) 200 11M/ethanol, 20 IA d'acetate de retinyle 20 µM (standard interne), puis 4 ml d'hexane ; - Vortexer vigoureusement 30 sec, puis centrifuger les tubes (900 g, 5 min) ; - Transferer le surnageant dans des tubes en verre sans bouchon, evaporer a sec sous azote ; - Reconstituer dans 200 pl de methanol, puis transferer dans des flacons pour HPLC (chromatographie liquide haute performance). Analyse des retinoides par HPLC : - chaine HPLC Agilent 1100 avec pompe quaternaire et detecteur DAD - colonne Macherey-Nagel Nucleodur C18 pyramid 3 p.m - phase mobile : o 0 - 6 min : methanol 100% o 6 - 8 min : gradient lineaire vers methanol/THF (4:1) o 8 - 18 min : methanol/THF (4:1) o 18 - 20 min : gradient lineaire vers methanol 100% o 20 - 30 min : methanol 100% - detection : 325 nm (retinol, retinyl esters); 383 nm (retinal). Resultats : Les resultats obtenus sont presentes sur les Figures 5 et 6. Conclusion : L'extrait de Silybum marianum ne permet pas a lui seul d'induire une production significative de retinoides. En revanche, les cellules de la peau fabriquent significativement plus de retinoides en presence de l' association d'un extrait de Silybum marianum avec du retinaldheyde ou du 23 retinol qu' en presence du retinaldehyde ou du retinol seul demontrant l'effet synergique de 1' association selon l'invention. REVENDICATIONS1. Association comprenant un retinoide et un extrait de Silybum marianum (L.) Gaertn.. 2. Association selon la revendication 1, caracterisee en ce que l'extrait de Silybum marianum (L.) Gaertn. est un extrait d'akenes de Silybum marianum (L.) Gaertn. comprenant moins de 0,2%, de preference moins de 0,1% en poids de silymarine par rapport au poids de l'extrait sec. 3. Association selon la revendication 2, caracterisee en ce que l'extrait de Silybum marianum (L.) Gaertn. contient entre 0,5% et 2,5% en poids, notamment entre 1,0% et 2,0% en poids, par exemple environ 1,5% en poids de beta-sitosterol par rapport au poids de l'extrait sec, avec avantageusement un rapport massique silymarine/ betasitosterol inferieur a 0,4, notamment inferieur a 0,07, et notamment entre 2 et 7% en poids, en particulier entre 3 et 6% en poids, par exemple entre 3 et 5% en poids de sterols par rapport au poids de l'extrait sec. 4. Association selon la revendication 2 ou 3, caracterisee en ce que l'extrait de Silybum marianum (L.) Gaertn. contient entre 3% et 15% en poids, notamment entre 4% et 10% en poids, en particulier entre 4% et 6% en poids, par exemple environ 5% en poids d'acide linoleique libre par rapport au poids de l'extrait sec, et notamment entre 10% et 50%, en particulier entre 10% et 30% en poids, en particulier entre 15% et 25% en poids d'acides gras libres par rapport au poids de l'extrait sec. 5. Association selon l'une quelconque des revendications 1 a 4, caracterisee en ce que l'extrait de Silybum marianum (L.) Gaertn. entre 0,01% et 0,5% en poids, notamment entre 0,05% et 0,2% en poids, par exemple environ 0,1% en poids de tocopherols par rapport au poids de l'extrait sec, avec avantageusement un rapport massique silymarine/tocopherols inferieur a 1, notamment inferieur a 0,1. 25 6. Association selon l'une quelconque des revendications 1 a 5, caracterisee en ce que le retinoide est choisi parmi le retinol, le retinaldehyde et l'acide retinoique sous ses differentes formes isomeres. 7. Association selon l'une quelconque des revendications 1 a 6, caracterisee en ce que le retinoide est le retinaldehyde. 8. Association selon l'une quelconque des revendications 1 a 7, caracterisee en ce que le retinoide est le retinaldehyde et l'extrait de Silybum marianum (L.) Gaertn. est un extrait d'akenes de Silybum marianum (L.) Gaertn. comprenant moins de 0,2%, de preference moins de 0,1% en poids de silymarine par rapport au poids de l'extrait sec. 9. Association selon l'une quelconque des revendications 1 a 8, pour son utilisation comme medicament. 10. Association selon l'une quelconque des revendications 1 a 8, pour son utilisation dans le traitement de l' acne, de la seborrhee, de la rosacee et/ou de la dermite seborrheique. 11. Composition dermatologique ou dermo-cosmetique comprenant au moins une association selon l'une quelconque des revendications 1 a 8 en combinaison avec au moins un excipient dermatologiquement ou dermo-cosmetiquement acceptable. 12. Composition dermatologique ou dermo-cosmetique selon la revendication 11, caracterisee en ce qu'elle comprend 0,01 a 10% en poids, de preference 0,05 a 5% en poids, d'un extrait de Silybum marianum (L.) Gaertn. par rapport au poids total de la composition. 13. Composition dermatologique ou dermo-cosmetique selon l'une quelconque des revendications 11 et 12, caracterisee en ce qu'elle comprend 0,001 a 5% en poids, de preference 0,01 a 1% en poids, du retinoide par rapport au poids total de la composition. 26 14. Composition dermatologique ou dermo-cosmetique selon l'une quelconque des revendications 11 a 13, caracterisee en ce qu' elle est destinee a une application topique, en particulier sur la peau. 15. Composition dermatologique ou dermo-cosmetique selon l'une quelconque des revendications 11 a 14, pour son utilisation dans le traitement de l' acne, de la seborrhee, de la rosacee et/ou de la dermite seborrheique.