Brevet FR3068704A1 — publié le 20190111

28061/037FR1 1VIATERI4U SOLIDE ORGANIQUE ANTIBACTERIEN DOMAINE TECHNIQUE [0001] La présente description concerne des copolymères amphiphiles à blocs du type méthacrylique et des matériaux solides organiques ; leur procédé de préparation ; et leur utilisation pour application antibactérienne, antimicrobienne, antivirale, antiinflammatoire et/ou antifongique. ETAT DE L'ART [0002] La résistance microbienne aux antibiotiques est devenue un enjeu de santé publique. Certains antibiotiques comme la méticilline ou la vancomycine sont en effet devenus inefficaces pour lutter contre des infections provenant de bactéries comme les Staphylococus aureus résistant à la méticilline ou la vancomycine (MRSA ou VRSA respectivement). Les matériaux antibactériens peuvent donc jouer un rôle dans la lutte contre les infections bactériennes, et ce plus particulièrement dans le domaine hospitalier où les infections sont notamment une des causes principales de complications dans les services de réanimation. [0003] Différentes méthodes existent aujourd'hui pour élaborer des matériaux antibactériens : i) l'inclusion de molécules biocides (antibiotiques ou molécules à base d'argent par exemple) mais qui sont relarguées hors du matériau, conduisant à une perte d'activité du matériau, dans certains cas des effets secondaires et/ou une exacerbation du phénomène de résistance antimicrobienne ; ii) la modification de surface du matériau par greffage ou couplage, qui est une méthode longue, couteuse et multi-étapes ; iii) l'utilisation de surfactants antibactériens (à hauteur d'environ 10 % en poids) pour réaliser des films antimicrobiens. [0004] Depuis quelques années, les peptides antimicrobiens (appelés AMP pour « antimicrobial peptides ») font l'objet de nombreuses études pour tenter d'offrir une alternative aux antibiotiques actuels. Contrairement aux antibiotiques classiques, les AMP présentent en effet l'avantage de ne pas induire de résistance grâce à un mécanisme d'action différent touchant principalement la membrane des bactéries (Michl et al. Polym. Chem. 2014, 19, 5813). Cependant, le principal frein à l'utilisation des AMP est leur cout et leur faible volume de production, les peptides étant soit obtenus par synthèse peptidique sur phase 2 28061/037FR1 solide dans le cas des peptides synthétiques soit extraits de différentes sources naturelles comme des venins par exemple. Pour pallier à ces problèmes, divers copolymères synthétiques ont été étudiés pour mimer l'activité antimicrobienne des AMP mais tout en étant facilement synthétisables et ce à grande échelle. Ces copolymères, appelés SMAMP 5 pour « synthetic mimic antimicrobial peptides », sont en général des copolymères amphiphiles présentant une partie hydrophile, le plus souvent chargée, venant interagir avec la membrane des bactéries pour s'y accrocher et une partie hydrophobe venant déstabiliser ou percer la membrane des bactéries (Kuroda et al. Nanomed. Nanobiotechnology 2013, 5, 49 ; Takahashi et al. Macromol. Biosci. 2013, 13, 1285). Si le mode d'action des SMAMP 10 reproduit celui des AMP, leur synthèse est par contre beaucoup plus aisée car réalisée par différentes techniques de polymérisation et en particulier par polymérisation radicalaire qui permet une production à très grande échelle. [0005] Par ailleurs, Lenoir et al. (Biomacromolecules, 2006, 7, 2291) ont rapporté en 2006 la dispersion de copolymères dibloc poly(éthylène-co-butylène)-b-poly(2-(tert- 15 butylamino)éthyl méthacrylate) (PEB-b-PTBAEMA, M = 14000 g/mol) pour conférer des propriétés antimicrobiennes à des films de polyéthylène basse densité (PEBD). Les copolymères ont été mélangés dans du PEBD à hauteur de 10 % en poids et ont montré une activité contre E. cou i (Gram -). Zuo et al. (Journal of Applied Polymer Science, 2012, 125, 3537) ont rapporté pour leur part l'élaboration de poly(méthacrylate de méthyle) (PMMA) 20 commercial rendu antibactérien par mélange avec au minimum 10 % en poids de poly(tertbutylamino)éthyl méthacrylate) (PTBAEMA, M 1,0) sont diluées 1/100 dans 3 ml de milieu MH ou LB frais et incubées à 37° C, 200 tr/min jusqu'à ce que les bactéries atteignent la phase logarithmique de croissance (OD environ 0,6). Les bactéries sont ensuite diluées dans du 20 milieu MH ou LB pour atteindre une densité bactérienne autour de 10E5 bactéries/ml. 135 pl de suspension bactérienne sont ensuite ajoutés dans chacun des 96 puits d'une microplaque de polypropylène stériles (Greiner BioOne) contenant déjà 15 tl d'antimicrobien dilué en série (1:2 dans l'eau distillée). Les plaques sont incubées à 37° C pendant 18-24 h avant la mesure de POD600nm en utilisant un lecteur de microplaques. La CIM est définie comme la plus faible 25 concentration d'antimicrobien qui inhibe la croissance visible de l'organisme (99 % d'inhibition). Les résultats sont décrits aux tables 2 et 3, NS étant pour non soluble. 18 28061/037FR1 Table 2 Copolymère à blocs CIM ("LM) en milieu LB E coli B subtilis S aureus P aeruginosa P1 PMMA-b-PDMAEMA 2,6 1,3 > 21 2,6 P2 PMMA-b-PDEAEMA 9,35 9,35 > 37 9,35 P3 PBMA-b-PDMAEMA 5,75 2,88 > 23 2,88 P4 PBMA-b-PDEAEMA 10 5 > 40 10,00 P5 PBMA-b-PDMAEMA 4,77 2,37 > 38 5 P6 PBMA-b-PDMAEMA NS NS NS NS P7 PBMA-b-PDMAEMA 5 >20 P8 PBMA-b-PDMAEMA 0,98 1 > 15,8 1 P9 PBMA-b-PDMAEMA 5 3 P10 PBMA-b-PDMAEMA 3 1 P11 PBMA-b-DMAEMA 20 20 P12 PBMA-b-PDMAEMA 1 1 P13 PBMA-b-PDMAEMA 20 10 P14 PBMA-b-PDMAEMA 2,5 P15 PBMA-b-PDMAEMA 10 P16 PBMA-b-PDMAEMA >20 P17 PBMA-b-PDMAEMA 5 19 28061/037FR1 Table 3 Copolymère à blocs CIM ("LM) en milieu MH E coli B subtilis S aureus Pseudo- MRSA E faecalis VER monas FQR P1 PMMA-b-PDMAEMA 5,250 0,660 21,300 2,6 2,6 >21,3 P2 PMMA-b-PDEAEMA > 37 >37 > 37 9,35 >37 >37,4 P3 PBMA-b-PDMAEMA 5,750 0,360 23,100 1,4 2,8 >23,1 P4 PBMA-b-PDEAEMA > 40 20,000 > 40 10 5 >40,2 P5 PBMA-b-PDMAEMA 9,550 1,180 19,100 2,4 4,75 38,2 P6 PBMA-b-PDMAEMA NS NS NS NS NS NS P7 PBMA-b-PDMAEMA >20 >20 6,5 >20 >26,1 P8 PBMA-b-PDMAEMA 1,975 0,490 7,900 0,98 0,98 15,8 P9 PBMA-b-PDMAEMA 1,250 0,313 2,5 5 20 P10 PBMA-b-PDMAEMA 1,250 0,625 2,5 5 >20 P11 PBMA-b-DMAEMA >20 0,625 20 1,25 1,25 P12 PBMA-b-PDMAEMA 0,625 0,150 2,5 1,25 20 P13 PBMA-b-PDMAEMA 20,000 10,000 20 1,25 2,5 P14 PBMA-b-PDMAEMA 0,6 0,3 0,3 0,6 P15 PBMA-b-PDMAEMA 0,6 0,3 2.5 1,25 P16 PBMA-b-PDMAEMA 0,6 0,6 1,25 0,15 P17 PBMA-b-PDMAEMA 0,6 0,15 0,6 0,07 20 28061/037FR1 [0082] Caractères hémolytiques des copolymères amphiphiles à blocs du type méthacrylique en solution [0083] Le caractère hémolytique des copolymères P1 -P17 a été testé en solution. Spécifiquement, l'activité hémolytique a été déterminée par la perte d'hémoglobine à partir 5 d'érythrocytes humains (obtenus auprès de Divbioscience, NL). Les érythrocytes humains ont été lavés 3 fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et concentrés par centrifugation à 800 g pendant 5 min. Les érythrocytes humains ont ensuite été remis en suspension dans du PBS à une concentration finale de 8%. 135 pl d'érythrocytes humains ont ensuite été ajoutés dans chacun des 96 puits d'une microplaque stérile contenant 15 1.1,1 10 d'antimicrobiens dilués (1:2 dans de l'eau distillée). Après 1 h à 37° C, la microplaque a été centrifugée à 800 g pendant 5 min. 100 pl ont ensuite été soigneusement collectés et transférés dans une nouvelle microplaque à 96 puits et la DO a été mesurée à 405 nm. L'hémolyse provoquée par les copolymères a été exprimée en pourcentage d'hémolyse, le Triton-X100 à 0,1% (v:v) étant utilisé comme témoin positif et donnant 100% d'hémolyse. 15 Les résultats sont décrits à la table 4. [0084] Tables 2-4. activités antibactériennes et caractères hémolytiques des copolymères di blocs en solution (HMC représente la concentration causant 100% d'hémolyse et HC50 la concentration causant 50% d'hémolyse ; hRBC et sRBC sont pour « human red blood cell » et « sheep red blood cell », respectivement). Table 4 Copolymère à blocs HMC (el) HC50 ("LM) hRBC sRBC hRBC sRBC Pl. PMMA-b-PDMAEMA 10,6 > 21,3 2,6-5,3 > 21,3 P2 PMMA-b-PDEAEMA 23,1 1,4-2,8 >23,1 P4 PBMA-b-PDEAEMA 38 0,59-1,19 >38 P6 PBMA-b-PDMAEMA NS NS NS NS 21 28061/037FR1 P7 PBMA-b-PDMAEMA 20 >20 1,25 20,00 P12 PBMA-b-PDMAEMA 20 >20 >20 >20 P14 PBMA-b-PDMAEMA 0,039 P15 PBMA-b-PDMAEMA >20 P16 PBMA-b-PDMAEMA >20 P17 PBMA-b-PDMAEMA >20 [0085] Procédé de fabrication du matériau solide organique [0086] A l'issu de tests biologiques en solution des copolymères préparés, différents matériaux solides organiques à base de PS et PMMA contenant différentes quantités de 5 copolymères à base de butyl méthacrylate (BMA) et de N,N-diméthyl-amino éthyl méthacrylate (DMAEMA) (quaternisé ou pas) ont été préparés et testés. [0087] Les matrices polymériques à base de PS et PMMA ont été préparées par la même méthode d'évaporation de solvant. Par exemple, dans le cas du PS, une solution stock de 20% en poids de PS dans du THF est préparée. 226 mg de copolymère PX (i.e., P1-P17) sont 10 dissouts dans 5 ml de la solution de PS à 20% dans le THF pour donner une solution de copolymère/PS à 17% en poids. Le même mode opératoire est utilisé pour préparer une solution de copolymère à 2% en poids/PS en utilisant 22,6 mg de copolymère et 5 ml de la solution de PS 20%/THF. 500 pl de la solution de copolymère à 2% en poids/PS sont ensuite dilués avec 4,5 ml de la solution de PS20%/THF pour donner une solution de copolymère/PS 15 à 0,2% en poids. Le même procédé est utilisé pour préparer des solutions de copolymère/PS à 22 28061/037FR1 0,02% en poids. Après 1 heure d'agitation à température ambiante, 150 pl de chaque solution sont versés dans chacun des 96 puits d'une microplaque de polypropylène stériles (Greiner BioOne). Une ligne de la microplaque est consacrée à chacune des différentes concentrations de copolymère et une ligne est remplie avec seulement une solution PS20%/THF comme 5 essai à blanc. Après 2 jours d'évaporation du THF à température ambiante, les films de copolymère/PS obtenus sont ensuite testés en terme d'hémolyse et en terme d'activité antimicrobienne contre E. cou i et B. subtilis. [0088] Activités antimicrobiennes d'une série matériaux solides organiques [0089] L'activité antimicrobienne de matériaux solides organiques contenant des 10 copolymères dibloc P5, P8 et P12 ont été testés. L'activité antimicrobienne a été évaluée selon une procédure adaptée ISO 22196. La matrice polymérique (PS ou PMMA) contenant le copolymère dibloc est introduite dans des microplaques à 96 puits de polypropylène stériles (Greiner BioOne). Des suspensions bactériennes sont préparées comme réalisé pour les essais CIM, à la différence que la suspension bactérienne en phase logarithmique de croissance 15 (0D600 nm environ 0,6) est centrifugée à 6 000 tr/min pendant 10 min à 4° C. Les culots bactériens sont lavés avec 10 ml de solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) et centrifugés (6 000 tr/min, 10 min, 4° C). Les bactéries sont finalement diluées dans du PBS stérile pour atteindre une densité bactérienne autour de 10E5 bactéries/ml. 10 pl de ces suspensions (correspondant à 1 000 bactéries) sont ajoutés sur la surface de copolymères 20 polymérisés. Des témoins négatifs sont obtenus en ajoutant la suspension bactérienne de 10 pl directement sur la surface du polymère témoin sans addition de copolymère à blocs (PMMA ou PS). Après 60 minutes d'incubation à température ambiante, les bactéries sont collectées en ajoutant 90 pl de PBS stérile sur la surface et en répétant le pipetage vers le haut et vers le bas. Les bactéries sont ensuite diluées en série (dilution 1 sur 10) dans du PBS stérile avant 25 d'étaler 10 pl de la suspension bactérienne sur des plaques de gélose LB. Après une nuit d'incubation à 37° C, des plaques sont observées et les colonies sont comptées. Le nombre de bactéries viables a été exprimé en fonction du nombre d'unités de formation de colonies (CFU) observées. Les expériences ont été effectuées en trois exemplaires indépendants (n = 3). Les résultats des tests antimicrobiens effectués sur les matériaux solides organiques sont 30 présentés dans les Figures 1 à 3. [0090] Caractères hémolytiques d'une série matériaux solides organiques [0091] Le caractère hémolytique de matériaux solides organiques contenant des copolymères dibloc P5, P8 et P12 ont été testés. 10 pl de suspension d'érythrocytes humains (8% dans PBS) sont ajoutés dans chacun de 96 puits d'une microplaque contenant matériaux 23 28061/037FR1 solides organiques (PS ou PMMA avec un copolymère dibloc). Après 60 minutes d'incubation à température ambiante, 90 pl de PBS sont ajoutés et la microplaque est centrifugée à 800 g pendant 5 min. 50 pl sont ensuite soigneusement collectés des puits et transférés dans une nouvelle microplaque à 96 puits et la DO est mesurée à 405 nm. 5 L'hémolyse provoquée par les copolymères est exprimée en pourcentage d'hémolyse, le Triton-X100 étant utilisé comme témoin positif Les résultats des tests hémolytiques effectués sur les matériaux solides organiques sont présentés dans les Figures 1 à 3. [0092] Comme montré sue les Figures 1 à 3, les tests effectués sur E. colt et B. subtilis montrent que les matériaux solides organiques préparés sont actifs jusqu'à 2 wt% et ce, sans 10 caractère hémolytique (tests sur globules rouges humains, RBC). [0093] Bien que des modes de réalisation de la présente description mentionnés ci-dessus soient décrits en détail, il est entendu que d'autres modes de réalisation peuvent être envisagés. Ainsi, par exemple, des matrices polymériques autres que du PMMA ou PS peuvent être envisagées pour obtenir un matériau solide organique selon le premier aspect ; 15 des méthacrylates autres que du DMAEMA ou DEAEMA peuvent être envisagés pour obtenir un matériau solide organique selon le premier aspect ; des copolymères à base de composés autres que du MMA, BMA, S et/ou ACN peuvent être envisagés pour obtenir un matériau solide organique selon le premier aspect. 24 28061/037FR1 REVENDICATIONS1. Matériau solide organique comprenant au moins un copolymère amphiphile à blocs du type méthacrylique, le copolymère à blocs étant dispersé dans une matrice 5 polymérique, le copolymère à blocs présentant une masse molaire moyenne en nombre (Mn) supérieure ou égale à 20 000 g/mol. 2. Matériau solide organique selon la revendication 1, dans lequel le copolymère à blocs présente une masse molaire moyenne en nombre (Mn) inférieure ou égale à 100 000 10 g/mol. 3. Matériau solide organique selon la revendication 1 ou la revendication 2, comprenant de 0,02 à 10 % en poids du copolymère à blocs. 15 4. Matériau solide organique selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le copolymère à blocs comprend au moins un bloc méthacrylique hydrophile comprenant au moins un groupe amine tertiaire et/ou ion ammonium quaternaire. 5. Matériau solide organique selon la revendication 4, dans lequel le bloc 20 méthacrylique hydrophile comprend un motif de répétition hydrophile choisi parmi le groupe constitué par le méthacrylate de N,N-(dialkylamino)alkyle et un ion ammonium quaternaire de celui-ci. 6. Matériau solide organique selon l'une quelconque des revendications précédentes, 25 dans lequel le copolymère à blocs comprend au moins un bloc méthacrylique hydrophobe. 7. Matériau solide organique selon la revendication 6, dans lequel le bloc méthacrylique hydrophobe comprend un motif de répétition hydrophobe choisi parmi le groupe constitué par un méthacrylate d'alkyle linéaire, ramifié, cyclique ou cyclique et 30 ramifié. 8. Matériau solide organique selon la revendication 7, dans lequel le méthacrylate d'alkyle est choisi parmi le groupe constitué par le méthacrylate de méthyle (MMA) et le méthacrylate de butyle (BMA). 25 28061/037FR1 9. Matériau solide organique selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant une des formulations suivantes : PMMA-b-PDMAEMA, PMMA-b-PDEAEMA, PBMA-b-PDMAEMA, PBMA-b-PDEAEMA, P(MMA-Co-S)-b-PDMAEMA, P(MMA-Co- S)-b-PDEAEMA, P(BMA-Co-S)-b-PDMAEMA, P(BMA-Co-S)-b-PDEAEMA, P(MMA-CoACN)-b-PDMAEMA, P(MMA-Co-ACN)-b-PDEAEMA, P(BMA-Co-ACN)-b-PDMAEMA, P(BMA-Co-ACN)-b-PDEAEMA, PMMA-b-P(DMAEMA-Co-S), PMMA-b-P(DEAEMACo-S), PBMA-b-P(DMAEMA-Co-S), PBMA-b-P(DEAEMA-Co-S), PMMA-bP(DMAEMA-Co-ACN), PMMA-b-P(DEAEMA-Co-ACN), PBMA-b-P(DMAEMA-Co- ACN), PBMA-b-P(DEAEMA-Co-ACN), P(MMA-Co-S)-b-P(DMAEMA-Co-S), P(MMACo-S)-b-P(DEAEMA-Co-S), P(BMA-Co-S)-b-P(DMAEMA-Co-S), P(BMA-Co-S)-bP(DEAEMA-Co-S), P(MMA-Co-ACN)-b-P(DMAEMA-Co-ACN), P(MMA-Co-ACN)-bP(DEAEMA-Co-ACN), P(BMA-Co-ACN)-b-P(DMAEMA-Co-ACN), P(BMA-Co-ACN)-bP(DEAEMA-Co-ACN), P(MMA-Co-S)-b-P(DMAEMA-Co-ACN), P(MMA-Co-S)-b- P(DEAEMA-Co-ACN), P(BMA-Co-S)-b-P(DMAEMA-Co-ACN), P(BMA-Co-S)-bP(DEAEMA-Co-ACN), P(MMA-Co-ACN)-b-P(DMAEMA-Co-S), P(MMA-Co-ACN)-bP(DEAEMA-Co-S), P(BMA-Co-ACN)-b-P(DMAEMA-Co-S) et P(BMA-Co-ACN)-bP(DEAEMA-Co-S). 10. Procédé de préparation d'un matériau solide organique comprenant la dispersion d'au moins un copolymère amphiphile à blocs du type méthacrylique dans une matrice polymérique, dans lequel le copolymère à blocs présente une masse molaire moyenne en nombre (Mn) supérieure ou égale à 20 000 g/mol. 11. Procédé selon la revendication 10, comprenant la préparation du copolymère à blocs par polymérisation radicalaire contrôlée par des nitroxydes. 12. Procédé selon la revendication 10 ou la revendication 11, dans lequel le copolymère à blocs comprend au moins un bloc méthacrylique hydrophile comprenant au 30 moins un groupe amine tertiaire, le procédé comprenant la quatemisation de l'amine tertiaire. 13. Dispositif médical comprenant un matériau solide organique selon l'une quelconque des revendications 1 à 9. 26 28061/037FR1 14. Dispositif médical selon la revendication 13, choisi parmi le groupe constitué par un cathéter. 5 15. Copolymère amphiphile à blocs du type méthacrylique pour son utilisation en tant que médicament, le copolymère à blocs présentant une masse molaire moyenne en nombre (Mn) supérieure ou égale à 20 000 g/mol. 16. Copolymère amphiphile à blocs du type méthacrylique pour son utilisation en tant 10 que médicament antiviral, antifongique et/ou antiinflammatoire, le copolymère à blocs présentant une masse molaire moyenne en nombre (Mn) supérieure ou égale à 20 000 g/mol. 17. Matériau solide organique selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 pour son utilisation en tant que médicament antibactérien, antimicrobien, antiviral, antifongique 15 et/ou antiinflammato ire.