Brevet FR3073050A1 — publié le 20190503

APPAREIL ET PROCEDE DE MICROSCOPIE A FLUORESCENCE A SUPER-RESOLUTION ET DE MESURE DE TEMPS DE VIE DE FLUORESCENCE L'invention porte sur un appareil et sur un procédé de microscopie à fluorescence à super-résolution permettant d'effectuer des mesures de temps de vie de fluorescence avec une résolution spatiale nanométrique et à l'échelle de la molécule individuelle. Elle porte également sur un produit programme d'ordinateur permettant de mettre en oeuvre des étapes de traitement de données d'un tel procédé. L'invention relève du domaine de la microscopie optique, et plus précisément de la microscopie à fluorescence, et est principalement destinée à des applications à la biologie et à la biochimie. La résolution spatiale des techniques de microscopie optique conventionnelle est limitée par les effets de diffraction à une valeur de l'ordre de grandeur de la longueur d'onde de la lumière utilisée (typiquement quelques centaines de nanomètres). De nombreuses méthodes ont cependant été envisagées pour permettre l'obtention de résolutions meilleures que la limite de diffraction ; on parle alors de « super-résolution ». On peut citer en particulier l'imagerie en champ proche et des techniques de microscopie à fluorescence en champ lointain telle la microscopie à illumination structurée. Les techniques de microscopie à fluorescence sont particulièrement importantes en biologie, et leur développement a notamment été récompensé par le prix Nobel de chimie de 2014. Parmi les techniques de microscopie à fluorescence à super- résolution on peut citer en particulier la microscopie STED (de l'anglais « STimulated-Emission-Depletion », c'est-à-dire déplétion par émission stimulée) et la SMLM (de l'anglais « Single-Molecule Localization Microscopy », c'est-à-dire microscopie par localisation de molécules uniques), qui englobe le PALM (de l'anglais « Photoactivated Localization Microscopy », microscopie par localisation photoactivée), et le STORM (de l'anglais « Stochastic Optical Reconstruction Microscopy », c'est-à-dire microscopie par reconstruction optique stochastique). Voir par exemple : 2 - S. W. Hell, J. Wichmann « Breacking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy », Optics Letters, Vol. 19, No. 11, 1er juin 1994; - T. A. Klar et al. « Fluorescence microscopy with diffraction 5 resolution barrier broken by stimulated emission », PNAS, Vol. 97, No. 15, 18 juillet 2000. La microscopie STED est une technique de microscopie confocale à balayage utilisant deux faisceaux lumineux d'éclairage colinéaires : un premier faisceau excitant l'émission fluorescente d'un 10 fluorophore (marqueur fluorescent) et un deuxième faisceau, en forme d'anneau, qui induit une déplétion de l'émission stimulée éteignant la fluorescence dans la périphérie de la région éclairée par le premier faisceau. Cette technique permet d'obtenir une résolution de quelques dizaines de nanomètres mais, comme dans toutes les techniques à balayage, le temps 15 d'acquisition dépend de la taille de l'image et peut devenir très important. En outre, elle ne permet de détecter des molécules individuelles que lorsque la densité du marquage fluorescent est très faible, de telle sorte qu'en moyenne une seule molécule fluorescente se trouve dans une tache de diffraction. Même dans ce cas, il est impossible de suivre la diffusion d'une molécule. 20 La SMLM est une technique de type stochastique, qui utilise des marqueurs fluorescents photoconvertibles, c'est-à-dire pouvant passer d'un premier à un deuxième état sous l'effet d'un rayonnement lumineux à une longueur d'onde déterminée. L'éclairage s'effectue au moyen de deux faisceaux lumineux de longueurs d'ondes différentes : un premier faisceau qui 25 induit la photoconversion du marqueur, et un deuxième faisceau qui induit une émission fluorescente des molécules du marquer se trouvant dans leur deuxième état (photoconverties ou photoactivées). Les molécules du marqueur passent de manière aléatoire du premier au deuxième état. Dans le deuxième état, les molécules peuvent être excitées par le deuxième faisceau 30 et émettre des photons de fluorescence pendant un temps limité jusqu'à subir une altération irréversible (blanchiment) qui éteint leur fluorescence, ce temps étant typiquement de l'ordre de quelques dizaines de millisecondes. Ainsi, la 3 fluorescence des différentes molécules du marqueur « s'allume » et « s'éteint » au cours du temps de manière aléatoire. Plusieurs images successives sont acquises, dans lesquelles les différents émetteurs fluorescents individuels apparaissent comme des taches de diffraction. 5 L'intensité du premier faisceau est choisie de telle façon que, à un instant donné, les molécules dans le deuxième état et donc émettant un rayonnement de fluorescence quand elles sont excitées par le deuxième faisceau soient espacées d'une distance moyenne supérieure à la limite de diffraction. De cette façon la plupart des taches de diffraction peuvent être distinguées, ce 10 qui permet l'identification des émetteurs fluorescents individuels. Ensuite, la position de ces derniers est déterminée avec une précision nanométrique par estimation du centre de la tache de diffraction correspondante. De cette façon, une image super-résolue peut être reconstruite. Par rapport à la microscopie STED, la technique SMLM présente l'avantage d'être « plein champ », donc 15 avec un temps d'acquisition indépendant de la taille de l'image, et de permettre l'identification et le suivi dans le temps de molécules individuelles. La SMLM est décrite, par exemple, dans : - E. Betzig et al. « Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution », Science, Vol. 313, 15 septembre 2006 ; 20 - M. J. Rust et al. « Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) », Nature Methods, Vol. 3, No. 10, octobre 2006. Le temps de vie de la fluorescence d'un fluorophore (c'est-à-dire la réciproque du taux de décroissance de sa probabilité de désexcitation) 25 dépend de son environnement et des interactions moléculaires qu'il subit. Sa mesure fournit donc des informations utiles sur le contexte biochimique. La microscopie par imagerie de temps de vie de fluorescence (FLIM, de l'anglais « Fluorescence-Lifetime Imaging Microscopy ») est une technique d'imagerie produisant des images basée sur les différences de 30 temps de vie de la fluorescence d'un échantillon fluorescent. Typiquement, sa résolution est limitée par diffraction. Voir par exemple : 4 - C.-W. Chang et al. « Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy », Methods in Cell Biology, Vol. 81, chapitre 24. Deux techniques ont été proposées dans le but d'obtenir des mesures de temps de vie de fluorescence avec une super-résolution spatiale. 5 Le document EP 1 584 918 décrit un procédé combinant les techniques STED et FLIM, et un appareil pour sa mise en oeuvre. Cette approche présente les inconvénients déjà décrits au propos de la microscopie STED : temps d'acquisition dépendant de la taille de l'image à cause du fait que l'excitation des molécules fluorescentes s'effectue par balayage confocal, 10 et donc potentiellement très long, et impossibilité de détecter des molécules individuelles. De plus, les intensités lumineuses mises en oeuvre sont élevées, et donc difficilement compatibles avec l'imagerie in vivo à cause de phénomènes bien connus de phototoxicité. Le document CN 102033058 décrit un appareil de 15 microscopie comprenant deux objectifs agencés face à face. L'un de ces objectifs est utilisé pour détecter, par balayage, des molécules individuelles, tandis que l'autre permet d'effectuer des mesures de temps de vie de fluorescence. Si elle permet la détection de molécules individuelles, cette technique présente l'inconvénient commun à toutes les approches à 20 balayage, à savoir un temps d'acquisition dépendant de la taille de l'image. En outre le dispositif ne se base pas sur un microscope conventionnel (commercial) et son alignement est très complexe et délicat. L'invention vise à surmonter les inconvénients précités de l'art antérieur. Plus précisément, elle vise à procurer une technique de 25 microscopie à super-résolution « plein champ », permettant la détection et le suivi dans le temps de molécules individuelles et une mesure simultanée de leurs temps de vie de fluorescence. Avantageusement une telle technique doit être simple à mettre en oeuvre autour d'un système de microscopie commercial et compatible avec l'imagerie de cellules vivantes. 30 Conformément à l'invention, ce but est atteint en combinant la technique SMLM et des mesures de temps de vie de fluorescence. Il est intéressant de noter que cette combinaison était auparavant réputée 5 impossible : voir Becker, W. (Ed.) (2015). « Advanced time-correlated single photon counting applications (Vol. 111) » Springer (Chapitre 2, Wolfgang Becker, Vladislav Shcheslavskiy, Hauke Studier « TCSPC FLIM with Different Optical Scanning Techniques », section 2.10). 5 Un objet de l'invention est donc un procédé de microscopie à fluorescence à super-résolution comprenant les étapes suivante : a) éclairer un échantillon contenant des émetteurs fluorescents photoconvertibles au moyen d'un premier faisceau lumineux à une première longueur d'onde et d'un deuxième faisceau lumineux à une 10 deuxième longueur d'onde, la première longueur d'onde étant choisie de manière à activer lesdits émetteurs fluorescents en provoquant leur conversion d'un premier état vers un deuxième état différent du premier, la deuxième longueur d'onde étant différente de la première et adaptée pour induire une émission fluorescente des émetteurs fluorescents dans leur 15 deuxième état ; et b) acquérir une séquence d'images de ladite émission fluorescente au moyen d'un système d'imagerie comprenant un capteur d'images matriciel ; caractérisé en ce que : 20 - ledit deuxième faisceau lumineux est pulsé, l'intervalle temporel entre deux impulsions successives étant supérieur au temps de vie de fluorescence des émetteurs fluorescents; - et en ce qu'il comprend également une étape de comptage de photons de l'émission fluorescente pour déterminer des retards 25 d'arrivée desdits photons par rapport aux impulsions dudit deuxième faisceau lumineux, ledit comptage étant effectué avec une résolution spatiale permettant d'associer chaque photon à un ensemble de pixels dudit capteur d'images matriciel ; et - en ce que l'intensité du premier faisceau lumineux est 30 choisie de telle sorte que, pendant le temps d'acquisition d'une dite image, un émetteur fluorescent individuel au plus soit activé en moyenne dans une 6 région de l'échantillon correspondant à un dit ensemble de pixels du capteur d'images matriciel. Selon des modes de réalisation particuliers d'un tel procédé - Ladite étape de comptage de photons peut comprendre : 5 c) diriger une portion de ladite émission fluorescente vers un détecteur ou matrice de détecteurs à comptage de photon, ledit ou chaque détecteur de la matrice étant associé à un ensemble de pixels dudit capteur d'images matriciel ; et d) utiliser le ou les détecteurs à comptage de photons pour 10 mesurer des retards d'arrivée de photons de fluorescence par rapport aux impulsions dudit deuxième faisceau lumineux. - Le procédé peut comprendre également les étapes suivantes : e) utiliser la séquence d'images acquise lors de l'étape b) 15 pour construire une image à super-résolution en localisant lesdits émetteurs fluorescents individuels ; f) utiliser les retards d'arrivé des photons de fluorescence mesurés lors de l'étape d) pour calculer des temps de vie de fluorescence, et les associer aux émetteurs fluorescents individuels localisés lors de l'étape 20 e) ; les étapes e) et f) étant mises en oeuvre au moyen d'un processeur électronique. - Ladite étape e) peut comprendre une localisation desdits émetteurs fluorescents individuels par estimation des centres de tâches de 25 diffraction présents dans les images acquises lors de l'étape b). - Le procédé peut comprendre également une étape g) de corrélation spatio-temporelle entre les images acquises lors de l'étape b) et les retards d'arrivé des photons de fluorescence mesurés lors de l'étape d) pour associer lesdites durées de vie de fluorescence auxdits émetteurs 3 0 fluorescents individuels. 7 - Ladite matrice de détecteurs à comptage de photons peut comprendre une pluralité de dits détecteurs agencés suivant une pluralité de lignes et de colonnes. Un autre objet de l'invention est un appareil de microscopie à 5 fluorescence à super-résolution comprenant : - une première source de lumière adaptée pour émettre un premier faisceau lumineux à une première longueur d'onde, ladite première longueur d'onde étant choisie de manière à activer des émetteurs fluorescents en provoquant leur conversion d'un premier état vers un deuxième état 10 différent du premier ; - une deuxième source de lumière adaptée pour émettre un deuxième faisceau lumineux à une deuxième longueur d'onde, différente de la première, ladite deuxième longueur d'onde étant différente de la première et adaptée pour induire une émission fluorescente des émetteurs fluorescents 15 dans leur deuxième état ; - un système optique configuré pour diriger le premier et le deuxième faisceau lumineux vers un échantillon ; - un système de détection optique configuré pour acquérir une séquence d'images de fluorescence dudit échantillon ; 20 caractérisé en ce que : - ladite deuxième source de lumière est une source pulsée, l'intervalle temporel entre deux impulsions successives de cette source étant supérieur au temps de vie de fluorescence des émetteurs fluorescents ; et en ce que le système de détection optique est également configuré pour 25 effectuer un comptage de photons de l'émission fluorescente pour déterminer des retards d'arrivée desdits photons par rapport aux impulsions dudit deuxième faisceau lumineux, ledit comptage étant effectué avec une résolution spatiale permettant d'associer chaque photon à un ensemble de pixels dudit capteur d'images matriciel. 30 Selon des modes de réalisation particuliers d'un tel appareil - Le système de détection optique peut comprendre : un système d'imagerie configuré pour acquérir ladite séquence d'images de 8 fluorescence dudit échantillon ; un détecteur ou matrice de détecteurs à comptage de photons agencé de manière à recevoir une portion d'une émission fluorescente dudit échantillon, ledit ou chaque détecteur de la matrice étant associé audit ensemble de pixels dudit capteur d'images 5 matriciel ; et un circuit électronique associé audit détecteur ou matrice de détecteurs à comptage de photons, configuré pour mesurer des retards d'arrivée de photons arrivant sur ledit ou chaque dit détecteur par rapport aux impulsions dudit deuxième faisceau lumineux. - L'appareil peut comprendre également un processeur 10 électronique configuré pour : recevoir en entrée la séquence d'images de fluorescence acquise par ledit capteur d'images matriciel et l'utiliser pour construire une image à super-résolution en localisant, dans les images de la séquence, des émetteurs fluorescents individuels ; recevoir en entrée des mesures de retard obtenues par ledit circuit électronique et les utiliser pour 15 calculer des durées de vie de fluorescence ; et associer lesdites durées de vie de fluorescence aux émetteurs fluorescents individuels localisés. - Ledit processeur électronique peut être configuré pour localiser lesdits émetteurs fluorescents individuels par estimation des centres de tâches de diffraction présents dans les images acquises par ledit capteur 2 0 d'images matriciel. - Ledit processeur électronique peut être configuré pour associer lesdits temps de vie de fluorescence aux émetteurs fluorescents individuels localisés en effectuant une corrélation spatio-temporelle entre les images acquises par ledit capteur d'images matriciel et les mesures de retard 25 obtenues par ledit circuit électronique. - Ledit ou lesdits détecteurs à comptage de photons peuvent être des diodes à avalanche à photons individuels. - L'appareil peut comprendre une dite matrice de détecteurs à comptage de photons. La matrice de détecteurs à comptage de 30 photons peut notamment être une matrice de diodes à avalanche à photons individuels non contigus, l'appareil comprenant également une matrice de microlentilles convergentes contiguës comprenant une dite microlentille 9 agencée en regard de chaque diode à avalanche à photons individuels de la matrice, chaque dite microlentille étant optiquement conjuguée à un ensemble de pixels dudit capteur d'images matriciel. - De manière alternative, l'appareil peut comprendre une 5 pluralité de dits détecteurs à comptage de photon, ainsi qu'un faisceau de fibres optiques de telle façon qu'une première face d'extrémité de chaque fibre optique soit optiquement conjuguée à un ensemble de pixels dudit capteur d'images matriciel, un dit détecteur à comptage de photons étant agencé en regard d'une deuxième face d'extrémité de chaque dite fibre 10 optique. Encore un autre objet de l'invention est un produit programme d'ordinateur comprenant des instructions exécutables par un ordinateur pour mettre en oeuvre au moins les étapes e) et f) d'un procédé tel qu'évoqué ci-dessus. 15 D'autres caractéristiques, détails et avantages de l'invention ressortiront à la lecture de la description faite en référence aux dessins annexés donnés à titre d'exemple et qui représentent, respectivement : - La figure 1, un schéma d'un appareil selon un mode de réalisation de l'invention ; 20 - La figure 2, une représentation fonctionnelle d'une matrice de détecteurs à comptage de photons associée à un réseau de microlentilles dans l'appareil de la figure 1 ; - La figure 3, une illustration du principe de l'invention ; - La figure 4, un organigramme d'un procédé selon 25 l'invention ; - Les figures 5A et 5B, une preuve de principe de l'invention ; et - La figure 6 un détail d'un appareil selon un mode de réalisation alternatif de l'invention. 3 0 Comme illustré sur la figure 1, un appareil selon un mode de réalisation de l'invention comprend deux sources optiques, généralement des lasers : 10 - Une première source SL1 émet un premier faisceau lumineux FL1 à une longueur d'onde Xi apte à induire la photoactivation d'un marqueur fluorescent photoconvertible. Par exemple, lorsque le marqueur est un fluorophore photoactivable Dendra, EOS ou Alexa Fluor (marques 5 déposées) il peut s'agir d'une diode laser à faible puissance ( REVENDICATIONS1. Procédé de microscopie à fluorescence à super-résolution comprenant les étapes suivante : a) éclairer un échantillon (E) contenant des émetteurs fluorescents photoconvertibles au moyen d'un premier faisceau lumineux (FL1) à une première longueur d'onde et d'un deuxième faisceau lumineux (FL2) à une deuxième longueur d'onde, la première longueur d'onde étant choisie de manière à activer lesdits émetteurs fluorescents en provoquant leur 0 conversion d'un premier état vers un deuxième état différent du premier, la deuxième longueur d'onde étant différente de la première et adaptée pour induire une émission fluorescente (FLF) des émetteurs fluorescents dans leur deuxième état ; et b) acquérir une séquence d'images (IM) de ladite émission 15 fluorescente au moyen d'un système d'imagerie (SI) comprenant un capteur d'images matriciel (CIM) ; caractérisé en ce que : - ledit deuxième faisceau lumineux est pulsé, l'intervalle temporel entre deux impulsions successives étant supérieur au temps de vie 2 0 de fluorescence des émetteurs fluorescents; - et en ce qu'il comprend également une étape de comptage de photons de l'émission fluorescente pour déterminer des retards d'arrivée desdits photons par rapport aux impulsions (IL2) dudit deuxième faisceau lumineux, ledit comptage étant effectué avec une résolution spatiale 25 permettant d'associer chaque photon à un ensemble de pixels (EPX) dudit capteur d'images matriciel ; et - en ce que l'intensité du premier faisceau lumineux est choisie de telle sorte que, pendant le temps d'acquisition d'une dite image, un émetteur fluorescent individuel (EFI) au plus soit activé en moyenne dans une 3 0 région de l'échantillon correspondant à un dit ensemble de pixels du capteur d'images matriciel. 19 2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel ladite étape de comptage de photons comprend : c) diriger une portion de ladite émission fluorescente vers un détecteur ou matrice de détecteurs à comptage de photons (MDCP), ledit ou 5 chaque détecteur de la matrice (DCP) étant associé à un ensemble de pixels (EPX) dudit capteur d'images matriciel ; et d) utiliser le ou les détecteurs à comptage de photons pour mesurer des retards d'arrivée (Mi, Ott) de photons de fluorescence par rapport aux impulsions dudit deuxième faisceau lumineux. 3. Procédé selon la revendication 2 comprenant également les étapes suivantes : e) utiliser la séquence d'images acquise lors de l'étape b) pour construire une image à super-résolution en localisant lesdits émetteurs 15 fluorescents individuels ; f) utiliser les retards d'arrivé des photons de fluorescence mesurés lors de l'étape d) pour calculer des temps de vie de fluorescence, et les associer aux émetteurs fluorescents individuels localisés lors de l'étape e) ; 20 les étapes e) et f) étant mises en oeuvre au moyen d'un processeur électronique (PR). 4. Procédé selon la revendication 3 dans lequel ladite étape e) comprend une localisation desdits émetteurs fluorescents individuels par 25 estimation des centres de tâches de diffraction (TD) présents dans les images acquises lors de l'étape b). 5. Procédé selon l'une des revendications 3 ou 4 comprenant également une étape g) de corrélation spatio-temporelle entre les 30 images acquises lors de l'étape ID} et les retards d'arrivé des photons de fluorescence mesurés lors de l'étape d) pour associer lesdites durées de vie de fluorescence auxdits émetteurs fluorescents individuels. 20 6. Procédé selon l'une des revendications 2 à 5 dans lequel ladite matrice de détecteurs à comptage de photons comprend une pluralité de dits détecteurs (DCP) agencés suivant une pluralité de lignes et de 5 colonnes. 7. Appareil de microscopie à fluorescence à super-résolution comprenant : - une première source de lumière (SL1) adaptée pour 10 émettre un premier faisceau lumineux (FL1) à une première longueur d'onde, ladite première longueur d'onde étant choisie de manière à activer des émetteurs fluorescents en provoquant leur conversion d'un premier état vers un deuxième état différent du premier ; - une deuxième source de lumière (SL2) adaptée pour 15 émettre un deuxième faisceau lumineux (FL2) à une deuxième longueur d'onde, différente de la première, ladite deuxième longueur d'onde étant différente de la première et adaptée pour induire une émission fluorescente des émetteurs fluorescents dans leur deuxième état ; - un système optique (MD1, L1, MD2, OBJ) configuré pour 20 diriger le premier et le deuxième faisceau lumineux vers un échantillon (E) ; - un système de détection optique (SI, SCP) configuré pour acquérir une séquence d'images (IM) de fluorescence dudit échantillon ; caractérisé en ce que : - ladite deuxième source de lumière est une source pulsée, 25 l'intervalle temporel entre deux impulsions successives de cette source étant supérieur au temps de vie de fluorescence des émetteurs fluorescents ; et en ce que le système de détection optique est également configuré pour effectuer un comptage de photons de l'émission fluorescente pour déterminer des retards d'arrivée (At1, At2) desdits photons par rapport aux impulsions 30 (IL2) dudit deuxième faisceau lumineux, ledit comptage étant effectué avec une résolution spatiale permettant d'associer chaque photon à un ensemble de pixels (EPX) dudit capteur d'images matriciel. 21 8. Appareil selon la revendication 7 dans lequel le système de détection optique comprend : - un système d'imagerie (SI) configuré pour acquérir ladite 5 séquence d'images de fluorescence dudit échantillon ; - un détecteur ou matrice de détecteurs à comptage de photons (MDCP) agencé de manière à recevoir une portion d'une émission fluorescente dudit échantillon, ledit ou chaque détecteur (DCP) de la matrice étant associé audit ensemble de pixels (EPX) dudit capteur d'images 10 matriciel ; et - un circuit électronique (CMR) associé audit détecteur ou matrice de détecteurs à comptage de photons, configuré pour mesurer des retards d'arrivée de photons arrivant sur ledit ou chaque dit détecteur par rapport aux impulsions dudit deuxième faisceau lumineux. 9. Appareil selon la revendication 8 comprenant également un processeur électronique (PR) configuré pour : - recevoir en entrée la séquence d'images de fluorescence acquise par ledit capteur d'images matriciel et l'utiliser pour construire une 20 image à super-résolution en localisant, dans les images de la séquence, des émetteurs fluorescents individuels ; - recevoir en entrée des mesures de retard obtenues par ledit circuit électronique et les utiliser pour calculer des durées de vie de fluorescence ; et 25 - associer lesdites durées de vie de fluorescence aux émetteurs fluorescents individuels localisés. 10. Appareil selon la revendication 9 dans lequel ledit processeur électronique est configuré pour localiser lesdits émetteurs 30 fluorescents individuels par estimation des centres de tâches de diffraction (TD) présents dans les images acquises par ledit capteur d'images matriciel. 22 11. Appareil selon l'une des revendications 9 ou 10 dans lequel ledit processeur électronique est configuré pour associer lesdits temps de vie de fluorescence aux émetteurs fluorescents individuels localisés en effectuant une corrélation spatio-temporelle entre les images acquises par 5 ledit capteur d'images matriciel et les mesures de retard obtenues par ledit circuit électronique. 12. Appareil selon l'une des revendications 9 à 11 dans lequel ledit ou lesdits détecteurs à comptage de photons sont des diodes à 10 avalanche à photons individuels. 13. Appareil selon l'une des revendications 9 à 12 comprenant une dite matrice de détecteurs à comptage de photons. 15 14. Appareil selon la revendication 13 dans lequel ladite matrice de détecteurs à comptage de photons est une matrice de diodes à avalanche à photons individuels non contigus, l'appareil comprenant également une matrice de microlentilles convergentes (MML) contiguës comprenant une dite microlentille agencée en regard de chaque diode à avalanche à photons individuels de la matrice, chaque dite microlentille étant optiquement conjuguée à un ensemble de pixels dudit capteur d'images matriciel. 15. Appareil selon l'une des revendications 9 à 12 comprenant une pluralité de dits détecteurs à comptage de photons (DCP), l'appareil comprenant également un faisceau de fibres optiques (FF) agencé de telle façon qu'une première face d'extrémité de chaque fibre optique soit optiquement conjuguée à un ensemble de pixels dudit capteur d'images matriciel, un dit détecteur à comptage de photons étant agencé en regard d'une deuxième face d'extrémité de chaque dite fibre optique. 23 16. Produit programme d'ordinateur comprenant des instructions exécutables par un ordinateur pour, lorsque ledit programme est exécuté sur un ordinateur : - recevoir en entrée une séquence d'images (IM) 5 d'émission fluorescente d'un échantillon (E) contenant des émetteurs fluorescents photoconvertibles individuels, acquise au moyen d'un système d'imagerie (SI) comprenant un capteur d'images matriciel (CIM) ; - recevoir en entrée des retards d'arrivée (Ati, At2) de photons de ladite émission fluorescente par rapport à des impulsions d'un 0 faisceau lumineux pulsé, lesdits photons étant détectés par un détecteur ou matrice de détecteurs à comptage de photons (MDCP), ledit ou chaque détecteur de la matrice (DCP) étant associé à un ensemble de pixels (EPX) dudit capteur d'images matriciel ; - utiliser ladite séquence d'images pour construire une 15 image à super-résolution de l'échantillon en localisant lesdits émetteurs fluorescents photoconvertibles individuels ; et - utiliser les retards d'arrivé des photons de ladite émission fluorescente pour calculer des temps de vie de fluorescence et les associer auxdits émetteurs fluorescents photoconvertibles individuels. 20