Brevet FR3066503A1 — publié le 20181123

Procédé d'analyse de microorganismes Description DOMAINE TECHNIQUE Le domaine technique de l'invention est la caractérisation de microorganismes, notamment la caractérisation de levures ou de bactéries. ART ANTERIEUR L'utilisation de microorganismes tels des levures ou des bactéries, ou leurs dérivés, trouve de nombreuses applications dans de nombreux domaines. Dans le domaine de l'agroalimentaire, par exemple, l'utilisation de levures est répandue dans différents secteurs, tels la boulangerie, la production de vin, la brasserie ou encore la fabrication de produits laitiers. L'application de levures ou de bactéries concerne de nombreux aliments par le biais de probiotiques, ces derniers étant par exemple ajoutés à des céréales ou à des aliments pour animaux. En dehors de l'agroalimentaire, de nombreux domaines industriels peuvent mettre en oeuvre des microorganismes. Il s'agit par exemple de l'agriculture ou de l'horticulture, avec le développement de produits phytosanitaires ou de fertilisants plus respectueux de l'environnement, ou encore de la production de biocombustibles obtenus à partir de végétaux. D'autres applications concernent le domaine de la pharmacie et du diagnostic médical. A des fins de contrôle qualité, l'étape de caractérisation de tels microorganismes constitue un maillon essentiel de la chaîne de production. Des contrôles microbiologiques sont fréquemment utilisés, sur des échantillons prélevés dans des milieux de culture, de façon à détecter et dénombrer les microorganismes vivants. La mise en culture sur des boîtes de Pétri est toujours très utilisée, mais comporte certains inconvénients, en particulier la préparation, la durée de l'analyse et l'impossibilité de détecter des microorganismes vivants et non cultivables. Des techniques par dénombrement direct ont été développées, en utilisant par exemple des marqueurs de viabilité aptes à faire varier les propriétés optiques de microorganismes de façon différente selon qu'ils sont morts ou vivants. De tels marqueurs peuvent agir sur la couleur ou une propriété de fluorescence des microorganismes examinés. Mais l'étape de détection, effectuée au microscope, est généralement longue, le champ d'observation étant faible. La publication Feizi "Rapid, portable and cost effective yeast cell viability and concentration analysis using lensfree on-chip microscopy and machine learning", Lab Chip, 2016, 16, 4350- 4358, décrit une méthode de caractérisation de levures Saccharomyces cerevisiae, basé sur la 3066503 2 microscopie sans lentille. Le dispositif présenté est simple, et permet de discriminer les levures mortes des levures vivantes en offrant un champ d'observation élevé. Du bleu de méthylène est préalablement mélangé au milieu de culture dans lequel baignent les levures examinées. Le procédé comporte l'acquisition d'une image du milieu de culture par un capteur d'image, et 5 l'application d'un opérateur de propagation holographique à l'image acquise en considérant de multiples distances de propagation, de façon à effectuer une focalisation numérique, ce qui permet d'établir une distance dite optimale. Lorsque la distance optimale est obtenue, chaque levure est classifiée selon une catégorie vivante ou morte en fonction d'un indicateur établi à partir d'une image reconstruite à ladite distance optimale. 10 Les inventeurs ont proposé une alternative à cette méthode, de façon à effectuer une classification entre des microorganismes morts et vivants selon un procédé simple et peu coûteux en temps de calcul. Par ailleurs, comme décrit dans la description, le procédé permet une analyse plus aboutie des microorganismes vivants. EXPOSE DE L'INVENTION 15 Un premier objet de l'invention est un procédé d'analyse de microorganismes, les microorganismes étant disposés dans un échantillon, l'échantillon comportant un marqueur de viabilité, apte à modifier une propriété optique des microorganismes de façon différente selon qu'ils sont morts ou vivants, le procédé comportant les étapes suivantes : a) illumination de l'échantillon à l'aide d'une source de lumière, la source de lumière 20 émettant une onde lumineuse incidente se propageant vers l'échantillon selon un axe de propagation; b) acquisition, à l'aide d'un capteur d'image, d'une image de l'échantillon, formée dans un plan de détection, l'échantillon étant disposé entre la source de lumière et le capteur d'image, chaque image étant représentative d'une onde lumineuse dite d'exposition, à 25 laquelle est exposé le capteur d'image sous l'effet de l'illumination ; le procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend également les étapes suivantes : c) détermination de positions radiales de différents microorganismes dans un plan parallèle au plan de détection, chaque position radiale étant associée à un microorganisme ; 30 d) à partir de l'image acquise lors de l'étape b), application d'un opérateur de propagation, de façon à calculer au moins une grandeur caractéristique de l'onde lumineuse d'exposition, à chaque position radiale déterminée lors de l'étape c), et à une pluralité de distances du plan de détection; 3066503 3 e) formation d'un profil, représentant une évolution de la grandeur caractéristique calculée lors de l'étape d) selon un axe parallèle à l'axe de propagation et passant par chaque position radiale déterminée lors de l'étape c), chaque profil étant associé à un microorganisme ; 5 f) en fonction de chaque profil formé lors de l'étape e), identification des microorganismes vivants. Par grandeur caractéristique, on entend par exemple un module ou une phase de l'onde lumineuse d'exposition, ou leur combinaison. Par application d'un opérateur de propagation à partir d'une image, on entend que l'opérateur 10 de propagation est appliqué à ladite image ou à une image résultant d'une transformation de ladite image, par exemple une racine carrée de ladite image, ainsi qu'une éventuelle normalisation de l'image. L'étape f) peut comporter une identification des microorganismes morts. Selon un mode de réalisation, le procédé comporte suite à l'étape f), une étape g) d'analyse de 15 la faculté du microorganisme à se diviser, l'étape g) comportant les sous-étapes suivantes pour au moins un microorganisme considéré comme vivant lors de l'étape f): gi) obtention d'une première image d'observation de l'échantillon, à un premier instant, l'image d'observation comportant des régions d'intérêt respectivement associées à des microorganismes, et détection d'une région d'intérêt associée audit microorganisme ; 20 gii) acquisition d'une image de l'échantillon à un deuxième instant, postérieur au premier instant, et obtention d'une deuxième image d'observation de l'échantillon à partir de l'image acquise au deuxième instant ; giii) détection, sur la deuxième image d'observation, d'une région d'intérêt correspondant au microorganisme ; 25 giv) comparaison des régions d'intérêt détectées lors des sous-étapes gi) et giii) ; gv) détermination de la faculté du microorganisme à se diviser en fonction de la comparaison effectuée lors de la sous-étape giv). L'étape g) permet alors d'identifier, parmi les microorganismes identifiés comme étant vivants, les microorganismes viables et non cultivables. Elle peut être appliquée à chaque 30 microorganisme considéré comme vivant suite à l'étape f). Lors des sous-étapes gi) et gii), la première image d'observation et la deuxième image d'observation peuvent être obtenues par application d'un opérateur de propagation respectivement à partir d'une image acquise au premier instant et à partir d'une image acquise 3066503 4 au deuxième instant. La première image d'observation peut résulter de l'image acquise lors de l'étape b). L'intervalle temporel entre le premier instant et le deuxième instant peut être compris entre 5 heures et 70 heures. 5 Selon un mode de réalisation, lors de l'étape d) l'opérateur de propagation est appliqué à partir de l'image acquise, lors de l'étape b), selon une pluralité de distances de propagation, de façon à obtenir une pile d'images complexes. Selon un autre mode de réalisation, l'étape d) comporte les sous-étapes suivantes : di) application d'un opérateur de propagation, à partir de l'image acquise lors de l'étape b) 10 de façon à calculer une image complexe, dite image de référence, représentative de l'échantillon, dans un plan de référence ; dii) application d'un opérateur de propagation à l'image de référence, de façon à obtenir des images complexes, dites images complexes secondaires, à différentes distances du plan de référence selon l'axe de propagation, les images complexes secondaires et 15 l'image de référence formant une pile d'images complexes ; diii) détermination d'une position radiale de microorganismes à partir des images de la pile d'images complexes obtenue lors de la sous-étape dii). Selon ce mode de réalisation, la première image d'observation peut être issue de l'image de référence, en étant par exemple l'image du module ou l'image de la phase de l'image de 20 référence. L'étape c) peut être mise en oeuvre à partir d'une image complexe de la pile d'images complexes résultant de l'étape d), ou à partir de l'image complexe de référence, en considérant le module ou la phase de ladite image complexe. Selon un mode de réalisation, le marqueur de viabilité induit une coloration des 25 microorganismes lorsqu'ils sont morts, selon une bande spectrale de coloration. Lors de l'étape a), l'illumination de l'échantillon est effectuée selon une bande spectrale d'illumination, la bande spectrale d'illumination ne comportant pas tout ou partie de la bande spectrale de coloration. Le procédé peut comporter une des caractéristiques suivantes, prises isolément ou selon les combinaisons techniquement réalisables : 30 dans l'étape d), la grandeur caractéristique est déterminée à partir du module ou de la phase de l'onde lumineuse d'exposition, à chaque distance du plan de détection. L'étape f) comporte une classification de chaque profil selon une première classe, correspondant à des profils caractéristiques de microorganismes vivants et une 3066503 5 deuxième classe, correspondant à des profils caractéristiques de microorganismes morts. La classification de chaque profil peut être effectuée en fonction de sa forme ou d'une valeur maximale ou d'une valeur minimale du profil. - Aucune optique de formation d'image n'est disposée entre l'échantillon et le capteur 5 d'image. - Un système optique de formation d'image est disposé entre l'échantillon et le capteur d'image, le système optique présentant un plan focal objet, l'échantillon s'étendant dans un plan de l'échantillon, le plan de l'échantillon étant décalé par rapport au plan focal objet. 10 Un autre objet de l'invention est un dispositif pour l'analyse de microorganismes disposés dans un échantillon, le dispositif comportant : une source de lumière apte à émettre une onde lumineuse incidente se propageant vers l'échantillon; un capteur d'image; 15 un support, configuré pour maintenir l'échantillon entre la source de lumière et le capteur d'image; un processeur, configuré pour recevoir une image de l'échantillon acquise par le capteur d'image et à mettre en oeuvre les étapes c) à f) d'un procédé selon le premier objet de l'invention. 20 Selon un mode de réalisation, aucune optique de grossissement ou de formation d'image ne s'étend entre le capteur d'image et l'échantillon, lorsque ce dernier est maintenu sur le support. Selon un autre mode de réalisation, un système optique de formation d'image est disposé entre l'échantillon et le capteur d'image, le système optique présentant un plan focal objet, l'échantillon s'étendant dans un plan de l'échantillon, le dispositif étant agencé de telle sorte 25 que le plan de l'échantillon est décalé par rapport au plan focal objet. D'autres avantages et caractéristiques ressortiront plus clairement de la description qui va suivre de modes particuliers de réalisation de l'invention, donnés à titre d'exemples non limitatifs, et représentés sur les figures listées ci-dessous. FIGURES 30 La figure 1 représente un exemple de dispositif selon l'invention. La figure 2 illustre les principales étapes d'un procédé permettant d'identifier des microorganismes vivants ainsi que, parmi ces derniers, des microorganismes viables non cultivables. 3066503 6 La figure 3A est une image du module d'une image complexe reconstruite à partir d'une image acquise, à un premier instant, d'un échantillon. Cette image a été obtenue au cours d'un essai expérimental réalisé en utilisant un échantillon comportant des levures. La figure 3B est détail de la figure 3A. Les figures 3C et 3D représentent respectivement des profils d'amplitude et de 5 phase d'une onde lumineuse reconstruite à partir de l'image de la figure 3B, chaque profil passant par une position radiale, dans le plan du capteur d'image, à laquelle est associée une levure. La figure 4A représente une observation au microscope de levures. La figure 4B montre, sur une partie de l'image représentée sur la figure 3B, les levures considérées comme mortes et celles 10 considérées comme vivantes, en mettant en oeuvre l'invention. Cette image correspond à l'état des levures à un premier instant. La figure 4C montre une image obtenue par reconstruction holographique à partir d'une image acquise, à un deuxième instant. Elle représente l'état des levures au deuxième instant. La comparaison entre les figures 4B et 4C permet l'identification, parmi les levures vivantes, de levures viables et non cultivables. 15 EXPOSE DE MODES DE REALISATION PARTICULIERS La figure 1 représente un exemple de dispositif selon l'invention. Une source de lumière 11 est apte à émettre une onde lumineuse 12, dite onde lumineuse incidente, se propageant en direction d'un échantillon 10, selon un axe de propagation Z. L'onde lumineuse est émise selon une bande spectrale d'illumination 4X. 20 L'échantillon 10 est un échantillon que l'on souhaite caractériser. Il comprend notamment un milieu 10m dans lequel baignent des micro-organismes 101. Le milieu 10m est généralement un milieu de culture, comportant des nutriments permettant le développement des microorganismes. Par microorganisme, on entend notamment une levure, une bactérie, une spore, un champignon ou une cellule, qu'il s'agisse d'une cellule eucaryote ou procaryote, ou 25 une microalgue. L'échantillon comporte également un marqueur de viabilité 10,, ce dernier étant apte à modifier une propriété optique d'un microorganisme 101 de façon différente selon que le microorganisme est vivant ou mort. Comme évoqué en lien avec l'art antérieur, par modification de l'aspect visuel, on entend par exemple une modification de la couleur du microorganisme. 30 L'utilisation de tels marqueurs de viabilité est bien connue. Il peut s'agir du bleu de méthylène, ou du bleu trypan. La modification de la propriété optique peut également être une modification de l'intensité d'une lumière de fluorescence émise par un microorganisme analysé en utilisant par exemple un indicateur de viabilité, parfois désigné par le terme marqueur fluorogène, des 3066503 7 exemples de tels marqueurs étant décrits dans W09855861A1, ou encore dans la publication Kwolek-Mirek M "comparison of methods used for assessing the viability and vitality of yeast cells", FEMS Yeast Res 14 (2014) 1068-1079. Dans l'exemple décrit ci-après, l'indicateur de viabilité 10, est du bleu de méthylène. Sous son 5 effet, les microorganismes morts se colorent selon une bande spectrale de coloration 4X', en l'occurrence le bleu, tandis que les microorganismes vivants restent translucides. L'échantillon 10 est, dans cet exemple, contenu dans une chambre fluidique 15. La chambre fluidique 15 est par exemple une chambre fluidique de type Gene Frame® d'épaisseur e=250 um. L'épaisseur e de l'échantillon 10, selon l'axe de propagation, varie typiquement entre 10 10 um et 1 cm, et est de préférence comprise entre 20 um et 500 um. L'échantillon s'étend selon un plan P10, dit plan de l'échantillon, perpendiculaire à l'axe de propagation Z. Il est maintenu sur un support 10s à une distance d d'un capteur d'image 16. La concentration de microorganismes peut varier entre 500 par microlitre et 5000 par microlitre. La distance D entre la source de lumière 11 et la chambre fluidique 15 est de préférence 15 supérieure à 1 cm. Elle est de préférence comprise entre 2 et 30 cm. Avantageusement, la source de lumière, vue par l'échantillon, est considérée comme ponctuelle. Cela signifie que son diamètre (ou sa diagonale) est préférentiellement inférieur au dixième, mieux au centième de la distance entre la chambre fluidique 15 et la source de lumière. Sur la figure 1, la source de lumière est une diode électroluminescente. Elle est généralement associée à diaphragme 18, ou 20 filtre spatial. L'ouverture du diaphragme est typiquement comprise entre 5 um et 1 mm, de préférence entre 50 um et 500 um. Dans cet exemple, le diaphragme est fourni par Thorlabs sous la référence P150S et son diamètre est de 150 um. Le diaphragme peut être remplacé par une fibre optique, dont une première extrémité est placée face à la source de lumière 11 et dont une deuxième extrémité est placée en regard de l'échantillon 10. Le dispositif représenté sur la 25 figure 1 comporte également un diffuseur 17, disposé entre la source de lumière 11 et le diaphragme 18. L'usage d'un tel diffuseur permet de s'affranchir de contraintes de centrage de la source de lumière 11 par rapport à l'ouverture du diaphragme 18. La fonction d'un tel diffuseur est de répartir le faisceau lumineux, produit par une source de lumière élémentaire 11 selon un cône d'angle a. De préférence, l'angle de diffusion a varie entre 10° et 80°. 30 Alternativement, la source de lumière peut être une source laser, telle une diode laser. Dans ce cas, il n'est pas utile de lui associer un filtre spatial ou un diffuseur. 3066503 8 De préférence, la bande spectrale d'émission 4X de l'onde lumineuse incidente 12 a une largeur inférieure à 100 nm. Par largeur de bande spectrale, on entend une largeur à mi-hauteur de ladite bande spectrale. Selon un mode de réalisation, la source de lumière 11 comporte plusieurs sources de lumière 5 élémentaires 11k, chacune étant apte à émettre une onde lumineuse incidente 12k dans une bande spectrale 44. De préférence, les bandes spectrales 4Xk des différentes sources de lumière 11k sont différentes les unes des autres. L'échantillon 10 est disposé entre la source de lumière 11 et le capteur d'image 16 précédemment évoqué. Ce dernier s'étend de préférence parallèlement, ou sensiblement 10 parallèlement au plan P10 selon lequel s'étend l'échantillon. Le terme sensiblement parallèlement signifie que les deux éléments peuvent ne pas être rigoureusement parallèles, une tolérance angulaire de quelques degrés, inférieure à 20° ou 10° étant admise. Dans cet exemple, l'échantillon s'étend selon un plan XY, perpendiculaire à l'axe de propagation Z. Le capteur d'image 16 est apte à former une image /0 de l'échantillon 10 selon un plan de 15 détection P0. Dans l'exemple représenté, il s'agit d'un capteur d'image comportant une matrice de pixels, de type CCD ou un CMOS. Le plan de détection Po s'étend de préférence perpendiculairement à l'axe de propagation Z de l'onde lumineuse incidente 12. La distance d entre l'échantillon 10 et la matrice de pixels du capteur d'image 16 est préférentiellement comprise entre 50 um et 2 cm, de préférence comprise entre 100 um et 2 mm. 20 On remarque, dans ce mode de réalisation, l'absence d'optique de grossissement ou de formation d'image entre le capteur d'image 16 et l'échantillon 10. Cela n'empêche pas la présence éventuelle de microlentilles de focalisation au niveau de chaque pixel du capteur d'image 16, ces dernières n'ayant pas de fonction de grandissement de l'image acquise par le capteur d'image, leur fonction étant d'optimiser l'efficacité de détection. 25 Sous l'effet de l'onde lumineuse incidente 12, les microorganismes101 présents dans l'échantillon peuvent engendrer une onde diffractée 13, susceptible de produire, au niveau du plan de détection P0, des interférences, en particulier avec une partie de l'onde lumineuse incidente 12' transmise par l'échantillon. Par ailleurs, l'échantillon peut absorber une partie de l'onde lumineuse incidente 12. Ainsi, l'onde lumineuse 14, transmise par l'échantillon, et à 30 laquelle est exposé le capteur d'image 16, désignée par le terme "onde d'exposition", peut comprendre : 3066503 9 une composante 13 résultant de la diffraction de l'onde lumineuse incidente 12 par chaque microorganisme de l'échantillon ; une composante 12' résultant de la transmission de l'onde lumineuse incidente 12 par l'échantillon, une partie de cette dernière pouvant être absorbée dans l'échantillon. 5 Ces composantes forment des interférences dans le plan de détection. Aussi, l'image acquise par le capteur d'image comporte des figures d'interférences (ou figures de diffraction), chaque figure d'interférence pouvant être associée à un microorganisme 101 de l'échantillon. Un processeur 20, par exemple un microprocesseur, est apte à traiter chaque image /0 acquise par le capteur d'image 16. En particulier, le processeur est un microprocesseur relié à une 10 mémoire programmable 22 dans laquelle est stockée une séquence d'instructions pour effectuer les opérations de traitement d'images et de calculs décrites dans cette description. Le processeur peut être couplé à un écran 24 permettant l'affichage d'images acquises par le capteur d'image 16 ou calculées par le processeur 20. Une image /0 acquise par le capteur d'image 16, également appelée hologramme, ne permet 15 pas d'obtenir une représentation suffisamment précise de l'échantillon observé. Comme décrit en lien avec l'art antérieur, on peut appliquer, à chaque image acquise par le capteur d'image, un opérateur de propagation holographique h, de façon à calculer une grandeur représentative de l'onde lumineuse d'exposition 14. Il est alors possible de reconstruire une expression complexe A de l'onde lumineuse 14 en tout point de coordonnées (x, y, z) de l'espace, et en 20 particulier dans un plan de reconstruction Pz situé à une distance I z i du capteur d'image 16, dite distance de reconstruction, ce plan de reconstruction étant de préférence le plan selon lequel s'étend l'échantillon P10, avec : A (x, y, z) = I0(x, y, z) * h * désignant l'opérateur produit de convolution, ou, et de préférence, A(x, y, z) = I I 0(x, y, z) * h, ou encore : 25 A (x, y, z) = ,I10(x,y,z) * h, Io étant une moyenne de l'image acquise. L'opérateur de propagation h a pour fonction de décrire la propagation de la lumière entre le capteur d'image 16 et un point de coordonnées (x, y, z), situé à une distance I z I du capteur d'image. Il est alors possible de déterminer le module M(x, y, z) et/ou la phase (p (x, y, z) l'onde lumineuse 14, à cette distance I z i, dite distance de reconstruction, avec : 30 - M(x, y, z) = abs [A (x, y, z)] ; - ço(x, y, z) = arg [A (x, y, z)] ; Les opérateurs abs et ar g désignent respectivement le module et l'argument. 3066503 10 L'opérateur de propagation est par exemple la fonction de Fresnel-Helmholtz, telle que : h(x, y, z) = 1 ej2n- u IÂexp n- x Az ). jAz Autrement dit, l'expression complexe A de l'onde lumineuse 14, en tout point de coordonnées (x, y, z) de l'espace, est telle que : A (x, y, z) = M (x, y, z)e-IÇP(x'Y'z). 5 Dans la suite de cette description, les coordonnées (x, y) désignent une position radiale dans un plan radial XY perpendiculaire à l'axe de propagation Z. La coordonnée z désigne une coordonnée selon l'axe de propagation Z. L'expression complexe A est une grandeur complexe dont l'argument et le module sont respectivement représentatifs de la phase et de l'intensité de l'onde lumineuse 14 d'exposition 10 détectée par le capteur d'image 16. Le produit de convolution de l'image /0 par l'opérateur de propagation h permet d'obtenir une image complexe AZ représentant une distribution spatiale de l'expression complexe A dans un plan de reconstruction Pz, s'étendant à une distance I z I du plan de détection Po. Dans cet exemple, le plan de détection Po a pour équation z = O. L'image complexe AZ correspond à une image complexe de l'échantillon dans le plan de reconstruction 15 P. Elle représente également une distribution spatiale bidimensionnelle des propriétés optiques de l'onde d'exposition 14. Un tel procédé, désigné par le terme reconstruction holographique, permet notamment de reconstruire une image du module ou de la phase de l'onde lumineuse d'exposition 14 dans le plan de reconstruction Il est possible de former des images Mz et (pz représentant respectivement le module ou la 20 phase d'une image complexe complexe AZ dans un plan Pz situé à une distance Izi du plan de détection Po, avec Mz = mod (AZ) et (pz = arg(Az). Les inventeurs ont mis au point un procédé de caractérisation de microorganismes, par exemple des levures, ce procédé étant décrit en lien avec la figure 2, et dont certains résultats sont illustrés sur les figures 3A à 3D et 4A à 4C. Ces résultats ont été obtenus selon les conditions 25 expérimentales suivantes : Echantillon 10 : il comporte des levures sèches actives ADY (Active Dry Yeast) dispersées dans un milieu de culture Sabouraud, auquel une solution de bleu de méthylène (0.1 mg.m1-1) a été ajoutée. La concentration est d'environ 1500 levures par Source de lumière 11 : diode électroluminescente Cree MC-E Color, comportant trois 30 diodes électroluminescentes pouvant être simultanément ou successivement activées, chaque diode émettant respectivement dans les bandes spectrales 4X suivantes : 3066503 11 450nm - 465 nm ; 520nm - 535 nm ; 620nm - 630 nm. Dans les essais qui suivent, seule la bande spectrale 620nm - 630 nm a été mise en oeuvre. Capteur d'image 16 : Capteur 8 bits CMOS monochrome 3884 x 2764 pixels, chaque pixel mesurant 1.67 um de côté, la surface de détection s'étendant sur environ 30 mm2. 5 Compte tenu de l'épaisseur de la chambre fluidique, le volume d'échantillon adressé par chaque image s'élève à 7.5 ul. Distance D entre la source de lumière 11 et l'échantillon 10 : 5 cm. Distance d entre l'échantillon 10 et le capteur d'image 16 : 1000 um. Epaisseur e de la chambre fluidique 15 : 250 um. 10 Diamètre de l'ouverture du filtre spatial 18 : 150 um. Les principales étapes du procédé de numération selon l'invention sont : L'acquisition, par le capteur d'image, d'une image /0 de l'échantillon dans une ou plusieurs bandes spectrales d'illumination, l'image étant acquise à un premier instant 15 A partir de l'image acquise, l'obtention d'une première image d'observation /(t1), correspondant au premier instant, puis, à partir de cette image d'observation, la détection de régions d'intérêt ROLL correspondant aux microorganismes 101 et la détermination de leurs coordonnées radiales respectives (x1, y1), le terme "radial" signifiant dans un plan parallèle au plan de détection. 20 A partir de l'image acquise, le calcul d'une grandeur caractéristique, par exemple le module ou la phase, de l'onde lumineuse d'exposition 14, à différentes distances de l'échantillon, dites distances de reconstruction ; cela passe notamment par l'obtention d'une pile d'images complexes représentant l'onde lumineuse d'exposition, les images complexes s'étendant selon des plans parallèles disposés entre le plan de détection Po 25 et le plan de l'échantillon P,0. La formation d'un profil représentant une évolution de la grandeur caractéristique en fonction de la distance de reconstruction, chaque profil étant associé à un microorganisme. A partir d'un ou plusieurs profil associé à chaque microorganisme, l'identification de 30 microorganismes vivants ou morts. Le procédé peut comporter l'acquisition d'une image de l'échantillon à un deuxième instant t2, le deuxième instant étant postérieur au premier instant t1, et l'obtention d'une deuxième image d'observation /(t2) associée au deuxième instant. La comparaison des images d'observation 3066503 12 respectivement associées au premier et au deuxième instant permet d'identifier, parmi les microorganismes considérés comme vivants, les microorganismes viables non cultivables. La notion de microorganisme viable et non cultivable (VNC) est connue de l'homme du métier. Il s'agit d'un microorganisme vivant, car présentant une activité métabolique, mais ne pouvant 5 pas se diviser dans le milieu dans lequel il est plongé. Il ne peut donc pas se développer dans son milieu. L'état VNC peut être influencé par différents facteurs, par exemple la température, la teneur de l'environnement ou du milieu de culture en certains nutriments ou éléments chimiques, l'exposition à la lumière, autant de facteurs pouvant induire un stress au microorganisme. L'identification de microorganismes VNC permet une caractérisation 10 rigoureuse de la qualité de l'échantillon considéré. Étape 100 : Acquisition d'une image /0 de l'échantillon 10 par le capteur d'image 16, cette image formant un hologramme. Un des intérêts de la configuration sans lentille, représentée sur la figure 1, est le large champ observé, permettant d'adresser simultanément un volume d'échantillon élevé. Cela permet d'observer simultanément plusieurs microorganismes, et ainsi 15 d'obtenir une caractérisation rapide de l'échantillon. Le champ observé dépend de la taille du capteur d'image, en étant légèrement inférieur à la surface de détection de ce dernier, du fait de l'espacement entre les pixels du capteur et l'échantillon. Le champ observé est généralement supérieur à 10 mm2, et est typiquement compris entre 10 mm2 et 50 mm2, ce qui est significativement plus élevé qu'avec un microscope. Dans cet exemple, cette image est acquise 20 à un premier instant t1 et peut être notée 10(t1). Étape 110 : Formation d'une image de référence. Du fait de l'absence d'optique de formation d'image, l'image acquise /0 peut comporter un grand nombre de figures d'interférence, et peut ne pas être aisément exploitable pour localiser les microorganismes présents dans le champ observé. Ces derniers sont plus facilement identifiables à partir d'une image complexe 25 reconstruite par application d'un opérateur de propagation holographique à l'image acquise. Dans cet exemple, cette image complexe est une image de référence A'f, obtenue en effectuant une reconstruction holographique dans un plan de référence P'f à une image obtenue à partir de l'image acquise I. Une première solution est d'appliquer l'opérateur de propagation à l'image acquise /0, ou de 30 préférence à la racine carrée de l'image acquise j, éventuellement normalisée par la valeur moyenne /0 de l'image acquise. L'image de référence A'f est une image complexe comportant des informations de phase et d'amplitude de l'onde lumineuse 14 à laquelle est exposé le 3066503 13 capteur d'image 16. Le plan de référence est un plan avantageusement perpendiculaire à l'axe de propagation Z, et/ou parallèle au plan de détection P0. Il s'agit de préférence du plan de l'échantillon P10. En effet, c'est généralement dans ce plan que la résolution spatiale d'une image complexe reconstruite est la meilleure, un tel principe étant à la base des algorithmes dits 5 de focalisation numérique. Cependant, l'image acquise ne comporte pas d'information relative à la phase de l'onde d'exposition 14. De ce fait, la reconstruction holographique s'effectue sur la base d'une information optique incomplète, basée uniquement sur l'intensité de l'onde lumineuse collectée sur le capteur d'image. L'amélioration de la qualité de la reconstruction holographique 10 a fait l'objet de nombreux développements, en mettant en oeuvre des algorithmes fréquemment dénommés « Phase retrieval », permettant une estimation de la phase de l'onde lumineuse à laquelle le capteur d'image est exposé. Ce type d'algorithme permet de limiter le bruit de reconstruction affectant l'image complexe reconstruite A'f. Un exemple d'algorithme utilisable est par exemple décrit dans U52012/0218379. 15 Selon une possibilité, l'échantillon est illuminé successivement ou simultanément dans différentes bandes spectrales Ailk, et on acquiert, dans le plan de détection P0, une image /0(Ailk) représentative de chaque bande spectrale. L'algorithme permet d'obtenir une image complexe A'f (Ailk) de l'échantillon 10, dans le plan de référence, dans chaque bande spectrale AÀk. Les images complexes ainsi obtenues peuvent être combinées, par exemple en effectuant 20 une moyenne, en chaque pixel, de leur module et de leur phase, ce qui permet de former l'image de référence A'f. Alternativement, l'image complexe de référence est une image complexe Are f (Ailk) dans une bande spectrale Ailk. Un tel algorithme a été décrit dans la publication S. N. A. Morel, A. Delon, P. Blandin, T. Bordy, O. Cioni, L. Hervé, C. Fromentin, J. Dinten, and C. Allier, "Wide-Field Lensfree Imaging of Tissue Slides," in Advanced Microscopy Techniques IV; 25 and Neurophotonics II, E. Beaurepaire, P. So, F. Pavone, and E. Hillman, eds., Vol. 9536 of SPIE Proceedings (Optical Society of America, 2015) ainsi que dans la demande de brevet FR1554811 déposée le 28 mai 2015, et plus précisément dans les étapes itératives 100 à 500 décrites dans cette demande. On a montré que l'utilisation de deux ou trois bandes spectrales différentes permet d'obtenir une bonne qualité de reconstruction. 30 Une autre possibilité, qui correspond au mode de réalisation préféré, est de reconstruire une image complexe de référence en se basant sur une image acquise de l'échantillon lorsque ce dernier est illuminé dans une seule bande spectrale 4X. L'image complexe de référence peut 3066503 14 être obtenue en utilisant un algorithme itératif tel que décrit dans la demande de brevet FR1652500 déposée le 23 mars 2016, et plus précisément selon les étapes 110 à 160 décrites dans ladite demande de brevet. La coordonnée z'f du plan de référence P'f est déterminée soit a priori, notamment lorsque 5 la position de l'échantillon est maîtrisée par rapport au capteur d'image 16, soit par le biais d'une focalisation numérique. La focalisation numérique permet de définir un plan de focalisation Pfo', reconstruisant plusieurs images et définissant un critère de netteté de chaque image reconstruite. Le plan de focalisation Pfocus correspond à celui dans lequel l'image reconstruite présente un critère de netteté optimal. Il correspond au plan dans lequel s'étend une majorité 10 des microorganismes. L'image de référence Aref est alors formée dans un plan de référence P'f correspondant au plan de focalisation Pfocus- Le plan de focalisation correspond à un plan selon lequel s'étend l'échantillon. L'image complexe Aref est désignée comme étant une image de référence, car elle sert de base à la formation de profils sur la base duquel les microorganismes de l'échantillon sont 15 caractérisés. La figure 3A montre une image du module M'f de l'image complexe de référence obtenue en mettant en oeuvre l'algorithme décrit dans le paragraphe précédent. Étape 120: construction d'une pile d'images. Cette étape comporte une application d'un l'opérateur de propagation h à l'image complexe de référence Aref de façon à calculer des images complexes Aref dites secondaires, le long de 20 l'axe de propagation Z. Au cours de cette étape, l'image complexe de référence Aref est propagée selon une pluralité de distances de reconstruction z, en utilisant un opérateur de propagation h tel que précédemment défini, de façon à disposer d'une pluralité d'images complexes, dites secondaires, A'f,z reconstruites aux différentes distances z du plan de référence P'f. Ainsi, cette étape comprend la détermination d'une pluralité d'images 25 complexes A'f,z telles que : Aref,z = Aref * hz avec zinin REVENDICATIONS1. Procédé d'analyse de microorganismes (10i), les microorganismes étant disposés dans un échantillon, l'échantillon comportant un marqueur de viabilité (10v), apte à modifier une propriété optique des microorganismes de façon différente selon qu'ils sont morts ou vivants, le procédé comportant les étapes suivantes : a) illumination de l'échantillon à l'aide d'une source de lumière (11), la source de lumière émettant une onde lumineuse incidente (12) se propageant vers l'échantillon (10) selon un axe de propagation (Z) ; b) acquisition, à l'aide d'un capteur d'image (16), d'une image (In) de l'échantillon (10), formée dans un plan de détection (P0), l'échantillon étant disposé entre la source de lumière (11) et le capteur d'image (16), chaque image étant représentative d'une onde lumineuse (14) d'exposition, à laquelle est exposé le capteur d'image (16) sous l'effet de l'illumination ; le procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend également les étapes suivantes : c) détermination de positions radiales (x1, y1) de différents microorganismes (101) dans un plan parallèle au plan de détection, chaque position radiale étant associée à un microorganisme ; d) à partir de l'image acquise (In) lors de l'étape b), application d'un opérateur de propagation (h), de façon à calculer au moins une grandeur caractéristique (M, (p) de l'onde lumineuse d'exposition (14), à chaque position radiale (xi, yi) déterminée lors de l'étape c), et à une pluralité de distances (z) du plan de détection (P0); e) formation d'un profil (M1(z), (pi(z)), représentant une évolution de la grandeur caractéristique calculée lors de l'étape d) selon un axe parallèle à l'axe de propagation (Z) et passant par chaque position radiale (x1, y1) déterminée lors de l'étape c), chaque profil étant associé à un microorganisme (101); f) en fonction de chaque profil formé lors de l'étape e), identification des microorganismes vivants (10i,a). 2. Procédé selon la revendication 1, comportant, suite à l'étape f), une étape g) d'analyse de la 30 faculté du microorganisme à se diviser, l'étape g) comportant les sous-étapes suivantes pour au moins un microorganisme considéré comme vivant lors de l'étape f) : gi) obtention d'une première image d'observation (1(t1)) de l'échantillon, à un premier instant (t1), l'image d'observation comportant des régions d'intérêt (ROLL) 3066503 23 respectivement associées à des microorganismes (10i) et détection d'une région d'intérêt (ROli) associée audit microorganisme (10i,'); gii) acquisition d'une image de l'échantillon (10(t2)) à un deuxième instant (t2), le deuxième instant étant postérieur au premier instant, et obtention d'une deuxième image 5 d'observation (1(t2)) de l'échantillon à partir de l'image (10(t2)) de l'échantillon acquise au deuxième instant ; giii) détection, sur la deuxième image d'observation, d'une région d'intérêt (R04) correspondant au microorganisme (10i,a); giv) comparaison des régions d'intérêt détectées lors des sous-étapes gi) et giii) ; 10 gv) détermination de la faculté du microorganisme à se diviser en fonction de la comparaison effectuée lors de la sous-étape giv). 3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel la sous-étape gv) comporte l'identification, parmi les microorganismes vivants (10i,a), de microorganismes viables et non cultivables (10i,a2)- 15 4. Procédé selon la revendication 2 ou la revendication 3, dans lequel lors des sous-étapes gi) et gii), la première image d'observation (1(t1)) et la deuxième image d'observation (/(t2)) sont obtenues par application d'un opérateur de propagation (h) respectivement à partir d'une image (10(t1)) acquise au premier instant et à partir de l'image (10(t2)) acquise au deuxième instant. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 4 dans lequel lors de la sous-étape gi), 20 la première image d'observation (1(t1)) est obtenue à partir de l'image acquise (4) lors de l'étape b). 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, dans lequel l'intervalle temporel (At) entre le premier instant et le deuxième instant est compris entre 5 heures et 70 heures. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel lors de l'étape 25 d) l'opérateur de propagation est appliqué à partir de l'image acquise (In) lors de l'étape b), selon une pluralité de distances de propagation, de façon à obtenir une pile d'images complexes. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 dans lequel l'étape d) comporte : les sous-étapes suivantes : di) application d'un opérateur de propagation (h), à partir de l'image (10) acquise lors de l'étape b) de façon à calculer une image complexe (A' f), dite image de référence, représentative de l'échantillon, dans un plan de référence (P'f); 3066503 24 dii) application d'un opérateur de propagation (h) à l'image de référence (Aret), de façon à obtenir des images complexes, dites images complexes secondaires (A'f,,), à différentes distances (z) du plan de référence (Pref) selon l'axe de propagation (Z), les images complexes secondaires et l'image de référence formant une pile d'images 5 complexes ; diii)détermination d'une position radiale (xi, yi) de microorganismes (10i) à partir des images de la pile d'images complexes obtenue lors de la sous-étape dii). 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le marqueur de viabilité (10,,) induit une coloration des microorganismes lorsqu'ils sont morts, selon une bande 10 spectrale de coloration (4X'), et dans lequel lors de l'étape a), l'illumination de l'échantillon est effectuée selon une bande spectrale d'illumination (4X), la bande spectrale d'illumination ne comportant pas tout ou partie de la bande spectrale de coloration. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel dans l'étape d), la grandeur caractéristique est déterminée à partir du module ou de la phase de l'onde 15 lumineuse d'exposition, à chaque distance du plan de détection. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'étape f) comporte une classification de chaque profil (M1(z), (pi(z)) selon une première classe, correspondant à des profils caractéristiques de microorganismes vivants (101,a) et une deuxième classe, correspondant à des profils caractéristiques de microorganismes morts 20 (10i4). 12. Procédé selon la revendication 11 dans lequel la classification de chaque profil (M1(z), (pi(z)) est effectuée en fonction de sa forme ou d'une valeur maximale ou d'une valeur minimale du profil. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel aucune 25 optique de formation d'image n'est disposée entre l'échantillon et le capteur d'image. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, dans lequel un système optique de formation d'image est disposé entre l'échantillon et le capteur d'image, le système optique présentant un plan focal objet, l'échantillon s'étendant dans un plan de l'échantillon, le plan de l'échantillon étant décalé par rapport au plan focal objet. 30 15. Dispositif pour l'analyse de microorganismes (101) disposés dans un échantillon (10), le dispositif comportant : 3066503 25 une source de lumière (11) apte à émettre une onde lumineuse incidente (12) se propageant vers l'échantillon (10) ; un capteur d'image (16) ; un support (10s), configuré pour maintenir l'échantillon (10) entre la source de lumière 5 (11) et le capteur d'image (16) ; un processeur (20), configuré pour recevoir une image (In) de l'échantillon acquise par le capteur d'image (16) et à mettre en oeuvre les étapes c) à f) d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14. 10