Brevet FR3074681A1 — publié le 20190614

SOLUTION INJECTABLE A PH 7 COMPRENANT AU MOINS UNE INSULINE BASALE DONT LE PI EST COMPRIS ENTRE 5,8 ET 8,5 ET UN CO-POLYAMINOACIDE PORTEUR DE CHARGES CARBOXYLATES ET DE RADICAUX HYDROPHOBES [0001] L'invention concerne les thérapies par injection d'insuline(s) pour traiter le diabète. [0002] L'invention concerne des compositions stables physiquement sous forme d'une solution aqueuse injectable, dont le pH est compris entre 6,0 et 8,0, comprenant au moins une insuline basale dont le point isoélectrique (pI) est compris entre 5,8 et 8,5 et un co-polyaminoacide porteur de charges carboxylates et de radicaux hydrophobes. [0003] L'insulinothérapie, ou thérapie du diabète par injection d'insuline, a connu ces dernières années des progrès remarquables grâce notamment à la mise au point de nouvelles insulines offrant une meilleure correction de la glycémie des patients en comparaison de l'insuline humaine et qui permettent de mieux simuler l'activité physiologique du pancréas. [0004] Lorsqu'un diabète de type II est diagnostiqué chez un patient, un traitement graduel est mis en place. Le patient prend en premier lieu des antidiabétiques oraux (OAD) comme la Metformine. Lorsque les OAD seuls ne suffisent plus à réguler le niveau de glucose dans le sang, un changement dans le traitement doit être fait et, en fonction des spécificités des patients, différentes associations de traitements peuvent être mises en place. Le patient peut par exemple avoir un traitement à base d'une insuline basale de type insuline glargine ou insuline detemir en complément des OAD, puis ensuite en fonction de l'évolution de la pathologie un traitement à base d'insuline basale et d'insuline prandiale. [0005] Par ailleurs, aujourd'hui, pour assurer la transition des traitements par les OAD, lorsque ceux-ci ne sont plus en mesure de contrôler le niveau de glucose dans le sang, vers un traitement insuline basale/insuline prandiale, l'injection d'analogues de GLP-1 RA est préconisée. [0006] Les GLP-1 RA pour agonistes du récepteur Glucagon-Like Peptide-1, sont des peptides insulinotropiques ou incrétines, et appartiennent à la famille des hormones gastro-intestinales (ou Gut Hormones) qui stimulent la sécrétion d'insuline lorsque la glycémie est trop élevée, par exemple après un repas. [0007] Les hormones gastro-intestinales (Gut hormones) sont aussi appelées hormones de satiété. Elles comprennent notamment le GLP-1 RA (Glucagon like peptide- 2 1 receptor agonist) et le GIP (Glucose-dependent insulinotropic peptide), l'oxyntomoduline (un dérivé du proglucagon), le peptide YY, l'amyline, la cholecystokinine, le polypeptide pancréatique (PP), la ghreline et l'entérostatine qui ont des structures peptidiques ou protéiques. Elles stimulent également la sécrétion 5 d'insuline, en réponse au glucose et aux acides gras et sont donc à ce titre des candidats potentiels pour le traitement du diabète. [0008] Parmi celles-ci, les GLP-1 RA sont celles qui ont apporté à ce jour les meilleurs résultats dans le développement de médicaments. Elles ont permis à des patients atteints de diabète de type II de perdre du poids tout en ayant un meilleur 10 contrôle de leur glycémie. [0009] Des analogues ou des dérivés de GLP-1 RA ont ainsi été développés notamment pour améliorer leur stabilité. [00010] D'autre part, pour couvrir ses besoins journaliers en insuline, un patient 15 diabétique dispose, actuellement, de façon schématisée, de deux types d'insulines ayant des actions complémentaires : les insulines prandiales (ou insulines dites à action rapide) et les insulines basales (ou insulines dites à action lente). [00011] Les insulines prandiales permettent une prise en charge rapide (métabolisation et/ou stockage) du glucose apporté lors des repas et collations. Le 20 patient doit s'injecter une insuline prandiale avant chaque prise alimentaire, soit environ 2 à 3 injections par jour. Les insulines prandiales les plus utilisées sont : l'insuline humaine recombinante, NovoLog® (insuline aspart de NOVO NORDISK), Humalog® (insuline lispro de ELI LILLY) et Apidra® (insuline glulisine de SANOFI). [00012] Les insulines basales assurent le maintien de l'homéostasie glycémique du 25 patient, en dehors des périodes de prise alimentaire. Elles agissent essentiellement pour bloquer la production endogène de glucose (glucose hépatique). La dose journalière d'insuline basale correspond généralement à 40-50 % des besoins totaux journaliers en insuline. Selon l'insuline basale utilisée, cette dose est dispensée en 1 ou 2 injections, régulièrement réparties au cours de la journée. Les insulines basales les plus utilisées 30 sont Levemir® (insuline detemir de NOVO NORDISK) et Lantus® (insuline glargine de SANOFI). [00013] On notera pour être exhaustif que la NPH (insuline NPH pour Neutral Protamine Hagedorn ; Humuline NPH®, Insulatard®) est la plus ancienne insuline basale. Cette formulation est le résultat d'une précipitation de l'insuline humaine (anionique à 35 pH neutre) par une protéine cationique, la protamine. Les microcristaux ainsi formés sont dispersés dans une suspension aqueuse et se dissolvent lentement après injection sous-cutanée. Cette dissolution lente assure une libération prolongée de l'insuline. Cependant cette libération n'assure pas une concentration constante d'insuline au cours 3 du temps. Le profil de libération est en forme de cloche et dure seulement entre 12 et 16 heures. Elle est donc injectée deux fois par jour. Cette insuline basale NPH est bien moins performante que les insulines basales modernes, Levemir® et Lantus®. La NPH est une insuline basale à action intermédiaire. 5 [00014] Le principe de la NPH a évolué avec l'apparition des insulines analogues rapides pour donner des produits appelés « Premix » offrant à la fois une action rapide et une action intermédiaire. NovoLog Mix® (NOVO NORDISK) et Humalog Mix® (ELI LILLY) sont des formulations comprenant une insuline analogue rapide, Novolog® et Hurnalog®, complexée partiellement par la protamine. Ces formulations contiennent 10 ainsi des microcristaux d'insuline analogue dont l'action est dite intermédiaire et une partie d'insuline restée soluble dont l'action est rapide. Ces formulations offrent bien l'avantage d'une insuline rapide mais elles ont aussi le défaut de la NPH, c.-à-d. une durée d'action limitée entre 12 et 16 heures et une insuline libérée en « cloche ». Cependant, ces produits permettent au patient de s'injecter en une seule fois une 15 insuline basale à action intermédiaire avec une insuline prandiale à action rapide. Or nombreux sont les patients soucieux de réduire leur nombre d'injections. [00015] Les insulines basales actuellement commercialisées peuvent être classées en fonction de la solution technique qui permet d'obtenir l'action prolongée et à ce jour deux approches sont utilisées. 20 [00016] La première, celle de l'insuline detemir est la liaison à l'albumine in vivo. Il s'agit d'un analogue, soluble à pH 7, qui comprend une chaine latérale d'acide gras (tetradecanoyl) fixée à la position B29 qui, in vivo, permet à cette insuline de s'associer à l'albumine. Son action prolongée est principalement due à cette affinité pour l'albumine après injection sous-cutanée. 25 [00017] Cependant son profil pharmacocinétique ne permet pas de couvrir une journée, ce qui fait qu'elle est le plus souvent utilisée en deux injections par jour. [00018] Une autre insuline soluble à pH 7, est l'insuline degludec commercialisée sous le nom de TresibedJ. Elle comprend également une chaîne latérale d'acide gras fixée sur l'insuline (hexadecandioyl-y-L-Glu). 30 [00019] La seconde, celle de l'insuline glargine, est la précipitation à pH physiologique. L'insuline glargine est un analogue de l'insuline humaine obtenu par élongation de la partie C-terminale de la chaine B de l'insuline humaine par deux résidus arginine, et par substitution du résidu d'asparagine A21, par un résidu de glycine (US 5,656,722). L'addition de deux résidus d'arginine a été pensée pour ajuster le pI (point 35 isoélectrique) d'insuline glargine au pH physiologique, et ainsi rendre cet analogue de l'insuline humaine insoluble en milieu physiologique. [00020] Aussi, la substitution de l'A21 a été pensée afin de rendre l'insuline glargine stable à pH acide et pouvoir ainsi la formuler sous forme de solution injectable à pH 4 acide. Lors de l'injection sous-cutanée, le passage de l'insuline glargine d'un pH acide (pH 4-4,5) à un pH physiologique (pH neutre) provoque sa précipitation sous la peau. La redissolution lente des micro-particules d'insuline glargine assure une action lente et prolongée. 5 [00021] L'effet hypoglycémiant de l'insuline glargine est quasi-constant sur une durée de 24 heures ce qui permet à la plupart des patients de se limiter à une seule injection par jour. [00022] L'insuline glargine est considérée aujourd'hui comme l'insuline basale la plus utilisée. 10 [00023] Cependant le pH nécessairement acide des formulations d'insulines basales, dont le point isoélectrique est compris entre 5,8 et 8,5, de type insuline glargine, peut être un réel inconvénient, car ce pH acide de la formulation d'insuline glargine entraîne parfois chez les patients des douleurs à l'injection et surtout empêche toute formulation avec d'autres protéines et en particulier avec les insulines prandiales 15 car ces dernières ne sont pas stables à pH acide. L'impossibilité de formuler une insuline prandiale, à pH acide, tient au fait qu'une insuline prandiale subit, dans ces conditions, une réaction secondaire de déamidation en position A21, ce qui ne permet pas de répondre aux exigences de stabilité applicables aux médicaments injectables. 20 [00024] A ce jour, dans les demandes WO 2013/021143 Al, WO 2013/104861 Al, WO 2014/124994 Al et WO 2014/124993 Al il a été démontré qu'il était possible de solubiliser ces insulines basales, de type insuline glargine dont le point isoélectrique est compris entre 5,8 et 8,5, à pH neutre, tout en maintenant une différence de solubilité entre le milieu in-vitro (le contenant) et le milieu in-vivo (sous la peau), 25 indépendamment du pH. [00025] La demande WO 2013/104861 Al, en particulier, décrit des compositions sous forme d'une solution aqueuse injectable, dont le pH est compris entre 6,0 et 8,0, comprenant au moins (a) une insuline basale dont le point isoélectrique pI est compris 30 entre 5,8 et 8,5 et (b) un co-polyaminoacide porteur de charges carboxylates substitué par des radicaux hydrophobes. [00026] Ces compositions de l'art antérieur ont l'inconvénient majeur de ne pas être suffisamment stables pour répondre aux cahiers des charges applicables aux formulations pharmaceutiques. 35 [00027] Dans les exemples de la partie expérimentale de la présente demande de brevet il est démontré que les compositions décrites en particulier dans WO 2013/104861 Al présentent une stabilité insatisfaisante dans le temps. 5 [00028] Il existe donc un besoin de trouver une solution qui permet de solubiliser une insuline basale dont le point isoélectrique (pI) est compris entre 5,8 et 8,5 tout en conservant son profil basal après injection mais qui permettent également de satisfaire à des conditions de stabilité physique standard pour les produits pharmaceutiques à 5 base d'insuline. [00029] De manière surprenante, la demanderesse a trouvé que les co- polyaminoacides porteurs de charges carboxylates et de radicaux hydrophobes selon l'invention permettent d'obtenir des compositions sous forme de solutions qui non seulement répondent aux exigences décrites dans WO 2013/104861 Al mais qui de plus 10 sont en mesure de conférer une stabilité physique améliorée auxdites compositions sans avoir à augmenter la quantité d'excipients utilisée. [00030] Ces performances a priori jamais atteintes sont de plus conservées lorsque l'insuline basale dont le point isoélectrique est compris entre 5,8 et 8,5 est associée dans la composition avec une insuline prandiale et/ou une hormone gastro-intestinale. 15 [00031] Ainsi, de façon surprenante, l'affinité des co-polyaminoacides selon l'invention pour l'insuline glargine a été augmentée en ce qu'elle permet d'obtenir une solubilisation et une stabilisation des solutions d'insuline glargine à un ratio [Hy]/[insuline basale] inférieur à celui de l'art antérieur ; ces résultats sont de plus obtenus sans altérer, voire en améliorant, la propension de l'insuline glargine à 20 précipiter comme cela est démontré dans la partie expérimentale. [00032] Cette amélioration de l'affinité permet en outre dans le cadre de traitements chroniques de limiter le niveau d'exposition auxdits excipients. [00033] Les co-polyaminoacides porteurs de charges carboxylates et de radicaux hydrophobes Hy selon l'invention présentent une excellente résistance à l'hydrolyse. 25 Ceci peut notamment être vérifié en conditions accélérées, par exemple par des tests d'hydrolyse à pH basique (pH 12). [00034] En outre des tests d'oxydation forcée, par exemple du type oxydation de Fenton, montrent que les co-polyaminoacides porteurs de charges carboxylates et de radicaux hydrophobes Hy présentent une bonne résistance à l'oxydation. 30 [00035] L'invention concerne ainsi des compositions stables physiquement sous forme d'une solution aqueuse injectable, dont le pH est compris entre 6,0 et 8,0, comprenant au moins : a) une insuline basale dont le point isoélectrique (pI) est compris entre 5,8 35 et 8,5 et b) un co-polyaminoacide porteur de charges carboxylates et d'au moins un radical hydrophobe de formule X. 6 [00036] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une composition sous forme d'une solution aqueuse injectable, dont le pH est compris entre 6,0 et 8,0, comprenant au moins : a) une insuline basale dont le point isoélectrique pI est compris entre 5,8 et 5 8,5; b) un co-polyanninoacide porteur de charges carboxylates et de radicaux hydrophobes -Hy, ledit co-polyaminoacide étant constitué d'unités glutamiques ou aspartiques et lesdits radicaux hydrophobes Hy étant de formule X suivante : 10 *--(GpIR) (GpG)g (GpA G L Gp1-137- GpC I ]I' a' Formule X dans laquelle GpR est choisi parmi les radicaux de formules VII, VII' ou VII" : o H HH 15 *-N-R-N-* Formule VII ou * R-N_* Formule VII' ou 0 0 Formule VII"; GpG et GpH identiques ou différents sont choisis parmi les radicaux de formules XI ou XI': 20 0 *-NH-G-NH-* Formule XI' H m G - * Formule XI - GpA est choisi parmi les radicaux de formule VIII *-NH- Formule VIII 25 Dans laquelle A' est choisi parmi les radicaux de formule VIII',VIII" ou VIII" A1 CO Ai-N- A2 N A3 Formule VIII' Formule VIII" Formule VIII' 7 -GpL est choisi parmi les radicaux de formule XII O HN-* * Il Al EiNi-* Formule XII, GpC est un radical de formule IX : 5 Formule IX; - les * indiquent les sites de rattachement des différents groupes liés par des fonctions amides ; a est un entier égal à 0 ou à 1 et a' = 1 si a = 0 et a' = 1, 2 ou 3 si a = 1 ; 10 - a' est un entier égal à 1, à 2 ou à 3 - b est un entier égal à 0 ou à 1; c est un entier égal à 0 ou à 1, et si c est égal à 0 alors d est égal à 1 ou à 2; - d est un entier égal à 0, à 1 ou à 2; e est un entier égal à 0 ou à 1 ; 15 g est un entier égal à 0, à 1, à 2, à 3 à 4 à 5 ou à 6; h est un entier égal à 0, à 1, à 2, à 3 à 4 à 5 ou à 6, et au moins un des g, h ou I est différent de 0; - I est un entier égal à 0 ou 1 et l' = 1 si I = 0 et l' = 2 si I = 1 ; r est un entier égal à 0 ou à 1, et 20 - s' est un entier égal à 0 ou 1 ; A, Ai, A2 et A3 identiques ou différents sont des radicaux alkyles linéaires ou ramifiés comprenant de 1 à 6 atomes de carbone; B est un radical alkyle linéaire ou ramifié, éventuellement comprenant un noyau aromatique, comprenant de 1 à 9 atomes de carbone ; 25 - Cx est un radical alkyl monovalent linéaire ou ramifié, dans lequel x indique le nombre d'atomes de carbone et : Lorsque le radical hydrophobe -Hy porte 1 -GpC, alors 9 Molécule 10 : Produit obtenu par le couplage entre la molécule 9 et la N-Boc éthylènediamine. [000384] A une suspension de la molécule 9 (24,0 g, 46,63 mmol) dans le DCM (285 mL) à 0 °C sont ajoutés successivement du N-hydroxybenzotriazole (HOBt, 714 mg, 5 46,66 mmol), de la N-Boc éthylènediamine (BocEDA, 8,97 g, 55,96 mmol) en solution dans le DCM (25 mL) puis du chlorhydrate de (3-diméthylaminopropyI)-N'- éthylcarbodiimide (EDC, 9,83 g, 51,30 mmol). Le milieu réactionnel est agité pendant 1 h à 0 °C puis 18 h à température ambiante. La phase organique est lavée par une solution aqueuse saturée en NaHCO3 (2 x 300 mL), une solution aqueuse de HCI 1 N (2 10 x 300 mL), une solution aqueuse saturée en NaCl (500 mL). Du méthanol (40 mL) est ajouté, la phase organique est séchée sur Na2SO4, filtrée et concentrée sous pression réduite. Un solide blanc de la molécule 10 est obtenu après recristallisation dans l'acétonitrile. Rendement : 27,15 g (89 0/0) 15 RMN 11-I (CDCI3, ppm) : 0,87 (3H) ; 1,07-1,68 (22H) ; 1,42 (9H) ; 1,97-2,18 (4H) ; 2,22-2,31 (2H) ; 2,35-2,55 (4H) ; 3,19-3,29 (2H) ; 3,30-3,38 (2H) ; 3,66 (3H) ; 3,68 (3H) ; 4,34-4,41 (1H) ; 4,42-4,48 (1H) ; 5,54 (1H) ; 6,99-7,18 (2H) ; 7,56 (1H). LC/MS (ESI+) : 657,4 (calculé ([M+H]) : 657,4). 20 Molécule A2 [000385] A une solution de la molécule 10 (27,15 g, 41,33 mmol) dans un mélange DCM/méthanol (410 mL) à 0 °C est ajoutée une solution de HCI 4 N dans le dioxane (51,7 mL) et le milieu est agité pendant 2 h à 0 °C puis 16 h à température ambiante. Après concentration sous pression réduite et co-évaporation au méthanol (2 x 150 mL), 25 un solide blanc de la molécule A2 sous la forme d'un sel de chlorhydrate est obtenu après recristallisation dans l'acétonitrile. Rendement : 23,2 g (95 0/0) RMN 11-1 (DMSO-d6, ppm) : 0,85 (3H) ; 1,05-1,52 (22H) ; 1,71-1,85 (2H) ; 1,87-2,03 (2H) ; 2,07-2,18 (2H) ; 2,24-2,37 (4H) ; 2,84 (2H) ; 3,24-3,38 (2H) ; 3,58 (3H) ; 3,58 30 (3H) ; 4,17-4,24 (2H) ; 7,95-8,08 (5H) ; 8,14 (1H). LC/MS (ESI+) : 557,3 (calculé ([M+H]) : 557,4). 56 Exemple A3 : molécule A3 Molécule 11 : Produit obtenu par la réaction entre le chlorure de myristoyle et la Lproline. [000386] A une solution de L-proline (300,40 g, 2,61 mol) dans de la soude aqueuse 5 2 N (1,63 L) à 0 °C est ajouté lentement sur 1 h du chlorure de myristoyle (322 g, 1,30 mol) en solution dans du dichlorométhane (DCM, 1,63 L). A la fin de l'ajout, le milieu réactionnel est remonté à 20 °C en 3 h, puis agité 2 h supplémentaires. Le mélange est refroidi à 0 °C puis une solution aqueuse de HCI à 37 % (215 mL) est ajoutée en 15 min. Le milieu réactionnel est agité pendant 1 h entre 0 °C et 20 °C. La phase organique 10 est séparée, lavée avec une solution aqueuse de HCI 10 % (3 x 430 mL), une solution aqueuse saturée en NaCl (430 mL), séchée sur Na2SO4, filtrée sur coton puis concentrée sous pression réduite. Le résidu est solubilisé dans de l'heptane (1,31 L) à 50 °C, puis la solution est ramenée progressivement à température ambiante. Après amorçage de la cristallisation à l'aide d'une tige en verre, le milieu est à nouveau chauffé à 40 °C 15 pendant 30 min puis ramené à température ambiante pendant 4 h. Un solide blanc est obtenu après filtration sur fritté, lavage à l'heptane (2 x 350 mL) et séchage sous pression réduite. Rendement : 410 g (97 0/0) RMN 1H (CDCI3, ppm) : 0,88 (3H) ; 1,28 (20H) ; 1,70 (2H) ; 1,90-2,10 (3H) ; 2,36 20 (2H) ; 2,51 (1H) ; 3,47 (1H) ; 3,56 (1H) ; 4,61 (1H). LC/MS (ESI) : 326,4 ; 651,7 ; (calculé ([M+H]+) : 326,3 ; ([2M+H]) : 651,6). Molécule 12 : Produit obtenu par le couplage entre la molécule 11 et le L-glutamate de méthyle. 25 [000387] Par un procédé similaire à celui utilisé pour la préparation de la molécule 8 et appliqué à la molécule 11 (30,0 g, 92,17 mmol) et au L-glutamate de méthyle (15,60 g, 96,78 mmol), un solide blanc de la molécule 12 est obtenu après solubilisation dans l'acétone au reflux, refroidissement à température ambiante et filtration sur fritté. Le filtrat est évaporé et le résidu est précipité dans l'acétone comme précédemment, cette 30 opération étant répétée 3 fois. Rendement : 15,5 g (36 0/0) RMN 1H (DMSO-d6, ppm) : 0,85 (3H) ; 1,07-1,37 (20H) ; 1,40-1,50 (2H) ; 1,71-2,27 (8H) ; 2,30-2,40 (2H) ; 3,28-3,54 (2H) ; 3,58 (1,3H) ; 3,59 (1,7H); 4,14-4,28 (1H); 4,28-4,37 (1H) ; 8,06 (0,55H) ; 8,33 (0,45H) ; 12,64 (1H). 35 LC/MS (ESI+) : 469,2 (calculé ([M+H]) : 469,3). 57 Molécule 13 : Produit obtenu par le couplage entre la molécule 12 et la N-Boc éthylènediamine. [000388] Par un procédé similaire à celui utilisé pour la préparation de la molécule 10 et appliqué à la molécule 12 (15,5 g, 33,05 mmol) et à la BocEDA (5,83 g, 36,36 5 mmol), un solide blanc de la molécule 13 est obtenu après recristallisation dans l'acétonitrile. Rendement : 19,8 g (83 0/0) 10 LC/MS (ESI+) : 611,4 (calculé ([M+H]) : 611,4). Molécule A3 [000389] Par un procédé similaire à celui utilisé pour la préparation de la molécule 15 A2 et appliqué à la molécule 13 (16,8 g, 27,50 mmol), un solide blanc de la molécule A3 sous la forme d'un sel de chlorhydrate est obtenu après recristallisation dans l'acétonitrile. Rendement : 13,5 g (90 °/0) RMN 1H (DMSO-d6, ppm) : 0,85 (3H) ; 1,08-1,52 (22H) ; 1,70-2,37 (10H) ; 2,80-2,90 20 (2H) ; 3,22-3,62 (4H) ; 3,57 (3H) ; 4,15-4,28 (1,7511); 4,41-4,44 (0,2511); 7,81-8,13 (4,5H) ; 8,24-8,29 (0,2511); 8,33-8,39 (0,25H). LC/MS (ESI+) : 511,3 (calculé ([M+H]+) : 511,4). Exemple A4 : Molécule A4 25 Molécule 14 : Produit obtenu par la réaction entre le chlorure de lauroyle et la L-proline [000390] Par un procédé similaire à celui utilisé pour la préparation de la molécule 11 et appliqué à au chlorure de lauroyle (27,42 g, 685,67 mmol) et à la L-proline (60,0 g, 247,27 mmol), un solide blanc de la molécule 14 est obtenu. Rendement : 78,35 g (96 0/0) 30 RMN 1H (CDCI3, ppm) : 0,87 (3H) ; 1,26 (16H) ; 1,70 (2H) ; 1,90-2,10 (3H) ; 2,35 (2H) ; 2,49 (1H) ; 3,48 (1H) ; 3,56 (1H) ; 4,60 (1H). LC/MS (ESI+) : 298,1 (calculé ([M+H]+) : 298,2). Molécule 15 : Produit obtenu par le couplage entre la molécule 14 et le L-glutamate de 35 méthyle. [000391] Par un procédé similaire à celui utilisé pour la préparation de la molécule 8 et appliqué à la molécule 14 (34,64 g, 116,46 mmol) et au L-glutamate de méthyle RMN 1H (DMSO-d6, ppm) : 0,85 (3H) ; 1,07-1,55 (22H) ; 1,37 (9H) ; 1,69-2,19 (7H) ; 2,22-2,36 (3H) ; 2,91-3,17 (4H) ; 3,28-3,60 (5H) ; 4,11-4,18 (0,7H) ; 4,20-4,28 (1H) ; 4,38-4,42 (0,311); 6,74 (1H) ; 7,64 (0,71-1) ; 7,87 (0,711); 7,98 (0,311) ; 8,22 (0,3H). 58 (19,14 g, 118,79 mmol), un solide blanc de la molécule 15 est obtenu après recristallisation dans l'acétonitrile. Rendement : 37,28 g (73 0/0) RMN 1H (CDCI3, ppm) : 0,85 (3H) ; 1,08-1,42 (16H) ; 1,54-1,06 (2H) ; 1,80-2,47 (10H) 5 ; 3,42-3,80 (2H) ; 3,65 (2,55H) ; 3,67 (0,45H) ; 4,37-4,40 (0,15H) ; 4,51-4,58 (0,85H) ; 4,58-4,67 (1H) ; 7,26 (0,15H) ; 7,65 (0,85H) ; 8,06 (1H). LC/MS (ESI+) : 441,1 (calculé ([M+H]+) : 441,3). Molécule 16 : Produit obtenu par le couplage entre la molécule 15 et la N-Boc 10 éthylènediamine. [000392] Par un procédé similaire à celui utilisé pour la préparation de la molécule 10 et appliqué à la molécule 15 (37,30 g, 84,66 mmol) et à la BocEDA (14,92 g, 93,13 mmol), un solide blanc de la molécule 16 est obtenu après recristallisation dans l'acétonitrile. 15 Rendement : 43,10 g (87 0/0) RMN 1I-1 (DMSO-d6, ppm) : 0,85 (3H) ; 1,08-1,53 (18H) ; 1,37 (9H) ; 1,70-2,36 (10H) ; 2,91-3,60 (9H) ; 4,11-4,18 (0,7H) ; 4,21-4,28 (1H) ; 4,38-4,42 (0,3H) ; 6,38 (0,1H) ; 6,74 (0,9H) ; 7,65 (0,7H) ; 7,87 (0,7H) ; 7,99 (0,3H) ; 8,22 (0,3H). LC/MS (ESI+) : 583,4 (calculé ([M+H]) : 583,4). 20 Molécule A4 [000393] Par un procédé similaire à celui utilisé pour la préparation de la molécule A2 et appliqué à la molécule 16 (43,10 g, 73,96 mmol), un solide blanc de la molécule A4 sous la forme d'un sel de chlorhydrate est obtenu après recristallisation dans 25 l'acétonitrile. Rendement : 31,90 g (83 %) RMN 1H (DMSO-d6, ppm) : 0,85 (3H) ; 1,05-1,37 (16H) ; 1,39-1,52 (2H) ; 1,70-2,37 (10H) ; 2,29-2,91 (2H) ; 3,20-3,62 (7H) ; 4,16-4,29 (1,7H) ; 4,42-4,46 (0,3H) ; 7,868,18 (4,6H) ; 8,32 (0,3H) ; 8,40 (0,3H). 30 LC/MS (ESI+) : 483,2 (calculé ([M+H]+) : 483,3). Exemple A5 : molécule A5 Molécule 17 : Produit obtenu par la réaction entre la 1-amino-4,7,10-trioxa-13- tridécane amine et le tert-butyl phénylcarbonate. 35 [000394] À une solution de 1-amino-4,7,10-trioxa-13-tridécane amine (112,29 g, 509,71 mmol) dans l'éthanol (510 mL) à 80 °C est ajouté au goutte à goutte du tertbutyl phénylcarbonate (49,50 g, 254,86 mmol). Le milieu réactionnel est agité à 80 °C 59 pendant 3 h 30 puis concentré sous pression réduite. Le résidu est solubilisé dans de l'eau (250 mL), le pH est ajusté à 2,3 avec une solution de HCI 37 % et le mélange est extrait au méthyl tert-butyléther (MTBE, 2 x 150 mL). La phase aqueuse est basifiée à pH 12,6 par addition d'une solution de NaOH 2 N et extraite au DCM (3 x 250 mL). La 5 phase organique est lavée avec une solution aqueuse de NaOH 1 N (1 x 100 mL), une solution aqueuse saturée en NaCI (100 mL), séchée sur Na2SO4, filtrée et concentrée sous pression réduite. Une huile jaune de molécule 17 est obtenue. Rendement : 54,4 g (67 9/0) RMN 1H (CDCI3, ppm) : 1,40-1,58 (11H) ; 1,73-1,81 (4H) ; 2,80-2,84 (2H) ; 3,20-3,70 10 (14H) ; 5,11 (1H). LC/MS (ESI+) : 321,2 (calculé ([M+H]) : 321,2). Molécule 18 : Produit obtenu par le couplage entre la molécule 12 et la molécule 17. [000395] Par un procédé similaire à celui utilisé pour la préparation de la molécule 15 10 et appliqué à la molécule 12 (20,46 g, 43,66 mmol) et à la molécule 17 (16,79 g, 52,39 mmol), une cire blanche de la molécule 18 est obtenue après purification par chromatographie flash (éluant : DCM, méthanol), solubilisation du résidu dans le DCM (300 mL), lavages de la phase organique avec une solution aqueuse de NaHCO3 (2 x 150 mL), une solution aqueuse de HCI 10 % (2 x 150 mL), une solution aqueuse saturée 20 en NaCI (2 x 150 mL), séchage sur Na2SO4 et concentration sous pression réduite. Rendement : 30,15 g (90 %) RMN 1H (DMSO-d6, ppm) : 0,85 (3H) ; 1,09-1,52 (31H) ; 1,55-1,67 (4H) ; 1,69-2,36 25 LC/MS (ESI+) : 771,4 (calculé ([M+H]) : 771,5). Molécule A5 [000396] Par un procédé similaire à celui utilisé pour la préparation de la molécule 30 A2 et appliqué à la molécule 18 (30,0 g, 38,91 mmol), un solide blanc de la molécule A5 sous la forme d'un sel de chlorhydrate est obtenu après solubilisation du résidu dans l'eau (500 mL) et lyophilisation. Rendement : 25,2 g (91 %) RMN 1H (DMSO-d6, ppm) : 0,85 (3H) ; 1,06-1,37 (20H) ; 1,39-1,52 (2H) ; 1,58-1,66 35 (2H) ; 1,70-2,37 (12H) ; 2,78-2,85 (2H) ; 3,01-3,15 (2H) ; 3,31-3,62 (17H) ; 4,11- 4,17 (0,7H) ; 4,19-4,27 (1H) ; 4,41-4,44 (0,3H) ; 7,63-7,71 (0,7H) ; 7,90-8,24 (4H) ; 8,28-8,35 (0,3H). (10H) ; 2,91-2,98 (2H) ; 3,02-3,17 (2H) ; 3,28-3,61 (17H) ; 4,12-4,17 (0,7H) ; 4,20- 4,28 (1H) ; 4,39-4,42 (0,3H) ; 6,37 (0,1H) ; 6,71 (0,9H) ; 7,59 (0,7H) ; 7,85 (0,7H) ; 7,94 (0,3H) ; 8,21 (0,3H). LC/MS (ESI+) : 671,4 (calculé ([M+H]) : 671,5). Exemple A7 : molécule A7 Molécule 21 : Produit obtenu par couplage entre la molécule 11 et la L-lysine. 5 [000397] Par un procédé similaire à celui utilisé pour la préparation de la molécule 8 appliqué à la molécule 11 (133,00 g, 408,61 mmol) et à la L-lysine (31,36 g, 214,52 mmol), un solide blanc de molécule 21 est obtenu après cristallisation 2 fois dans l'acétone. Rendement : 106,50 g (68 0/0) 10 RMN 11-1 (DMSO-c16, ppm) : 0,85 (6H) ; 1,26 (40H) ; 1,35-1,50 (6H) ; 1,50-2,10 (10H) ; 2,10-2,25 (4H) ; 3,01 (2H) ; 3,31-3,55 (4H) ; 4,10-4,40 (3H) ; 7,68 (0,6H) ; 7,97 (1H) ; 8,27 (0,4H) ; 12,50 (1H). LC/MS (ESI): 761,8 ; (calculé ([M+H]): 762,1). 15 Molécule 22 : Produit obtenu par couplage entre la molécule 21 et la L-Iysinate de méthyle. [000398] Par un procédé similaire à celui utilisé pour la préparation de la molécule 10 appliqué à la molécule 21 (43,00 g, 56,50 mmol) en solution dans le THF et au chlorhydrate de L-Iysinate de méthyle (20,12 g, 67,79 mmol), un solide transparent de 20 molécule 22 est obtenu et utilisé sans purification complémentaire. Rendement : 55,80 g (98 0/0) RMN 11-1 (DMSO-d6, ppm) : 0,86 (6H) ; 1,08-2,03 (64H) ; 1,37 (9H) ; 2,07-2,30 (4H) ; 2,84-3,09 (4H) ; 3,29-3,57 (4H) ; 3,58-3,65 (3H) ; 4,14-4,43 (4H) ; 6,40 (0,1H) ; 6,74 (0,9H) ; 7,69 (0,6H) ; 7,82 (0,6H) ; 7,95-8,06 (1H) ; 8,11-8,20 (0,4H) ; 8,26 (0,4H). 25 LC/MS (ESI) : 1003,8 (calculé ([M+H]) : 1003,8). Molécule 23 : Produit obtenu par saponification de la molécule 23. [000399] Une solution de molécule 22 (55,80 g, 55,61 mmol) dans un mélange THF/eau 1:1 (370 mL) à 0 °C est traitée par addition lente d'une solution de LiOH (2,00 30 g, 83,41 mmol) dans l'eau (185 mL). Après 16 h d'agitation à 0 °C, le milieu est concentré sous pression réduite et le résidu est repris dans l'eau (500 mL). Du DCM (500 mL) est ajouté, le mélange hétérogène est refroidi à 10 °C et acidifié par ajout d'une solution aqueuse de HCI 10 % jusqu'à pH 1. La phase aqueuse est extraite au DCM (2 x 300 mL), les phases organiques combinées sont lavées par une solution 35 aqueuse saturée en NaCI (2 x 300 mL), séchées sur Na2SO4, filtrées et concentrées sous pression réduite. Un solide blanc de molécule 23 est obtenu après cristallisation dans l'acétone. 61 Rendement : 46,10 g (84 %) RMN 1H (pyridine-d6, ppm) : 0,85 (6H) ; 1,05-2,03 (67H) ; 2,07-2,61 (10H) ; 3,12- 3,93 (8H) ; 4,54-4,93 (2H) ; 4,98-5,16 (2H) ; 7,35-7,45 (1H) ; 8,34-8,63 (1H) ; 8,949,41 (2H). 5 LC/MS (ESI) : 989,8 (calculé ([M+H]) : 989,8). Molécule A7 [000400] À une solution de la molécule 23 (12,00 g, 12,13 mmol) dans le dichlorométhane (40 mL) à 0 °C est ajoutée une solution de HCI 4 N dans le dioxane 10 (15,20 mL) puis le milieu est agité pendant 15 h à 0 °C et 5 h température ambiante. Le mélange réactionnel est concentré sous pression réduite, le résidu est solubilisé dans un mélange de DCM (120 mL) et de NaOH 2 N (60 mL). Après séparation des phases, la phase organique est lavée par une solution de NaOH 2 N (60 mL), séchée sur Na2SO4 et concentrée sous pression réduite. 15 (0,6H) ; 4,30-4,39 (1H) ; 4,42-4,46 (0,4H) ; 7,29-7,42 (1H) ; 7,71-7,80 (0,6H) ; 7,97- 8,05 (0,6H) ; 8,10-8,24 (0,4H) ; 8,33-8,45 (0,4H). 20 [000403] LC/MS (ESI) : 887,7 (calculé ([M-H]-) : 887,7) [000401] Rendement : 10,90 g (98 %) [000402] RMN 1H (DMSO-d6, ppm) : 0,86 (6H) ; 1,05-2,27 (70H) ; 2,45-2,52 (2H) ; 2,90-3,58 (6H) ; 3,67-3,76 (1H) ; 4,02-4,10 (0,6H) ; 4,11-4,17 (0,4H) ; 4,20-4,26 62 Partie B nthèse des co-ol aminoacides h d o hobes CO structure polyaminoacide B1 Na0 HN 12H27 Na0 = 0,038, DP = 26 Ri = H ou pyroglutamate B2 Hy = 0,15 , DP (m + n) = 40 Hy = o C13 H27 ONa = H ou pyroglutamate H H23 63 B3 B4 C131-127 0 UNa H o Hy i= 0,15, DP (m + n) = 40 Hy = Ri = H ou pyroglutamate __EDNa i= 0,15, DP (m + n) = 40 Hy = Ri = H ou pyroglutamate 64 B5 i= 0,15, DP (m + n) = 40 Hy = Ri = H ou pyroglutamate B7 i = 0,038, DP = 26 Ri = H ou pyroglutamate Co-polyaminoacide Bi: poly-L-glutamate de sodium modifié à une de ses extrémités par la molécule Al et ayant une masse molaire moyenne en nombre (Mn) de 2800 g/mol 5 [000404] Dans un ballon préalablement séché à l'étuve, du y-benzyl-L-glutamate N-carboxyanhydride (8,95 g, 34 mmol) est solubilisé dans du DMF anhydre (34 mL). Le mélange est refroidi à 4 °C, puis une solution de molécule Al (1,64 g, 1,55 mmol) dans le chloroforme (6,6 mL) est introduite rapidement. Le mélange est agité entre 4 °C et température ambiante pendant 68 h, puis chauffé à 65 °C pendant 2 h. La moitié du solvant est distillé sous pression réduite puis le milieu réactionnel est refroidi à température ambiante et versé goutte à goutte dans du diisopropyléther (300 mL) sous agitation. Le précipité blanc est récupéré par filtration, lavé avec du diisopropyléther (5 5 x 50 mL) puis séché sous pression réduite à 30 °C pour obtenir un solide blanc. Le solide (7,9 g) est dilué dans du TFA (30 mL), et une solution d'acide bromhydrique (HBr) à 33 % dans de l'acide acétique (21 mL, 120 mmol) est alors ajoutée au goutte à goutte à 0 °C. La solution est agitée pendant 2 h à température ambiante puis est coulée goutte à goutte sur un mélange 1:1 (v/v) de diisopropyléther/eau sous agitation (360 mL). Après 10 2 h d'agitation, le mélange hétérogène est laissé au repos pendant une nuit. Le précipité blanc est récupéré par filtration, lavé successivement avec de l'IPE (2 x 30 mL) puis avec de l'eau (2 x 30 mL). Le solide obtenu est solubilisé dans de l'eau (200 mL) en ajustant le pH à 7 par ajout d'une solution aqueuse de soude 1 N. De l'eau (65 mL) est ajoutée. Le mélange est filtré sur filtre 0,45 pm puis purifié par ultrafiltration contre une 15 solution de NaCl 0,9 % puis de l'eau jusqu'à ce que la conductinnétrie du perméat soit inférieure à 50 pS/cm. La solution de co-polyanninoacide est ensuite concentrée à environ 25 g/L théorique, le pH est ajusté à 7 et la solution aqueuse est filtrée sur 0,2 pm. Cette solution est diluée avec de l'eau et de l'acétone afin d'obtenir une solution à 12 g/L contenant 30 % massique d'acétone, puis elle est filtrée sur filtre de charbon 20 actif (3M R53SLP). L'acétone est distillée (40 °C, 100 mbar) et la solution est purifiée par ultrafiltration contre une solution de NaCI 0,9 % puis de l'eau jusqu'à ce que la conductinnétrie du perméat soit inférieure à 50 pS/cm. La solution de co-polyanninoacide est ensuite concentrée et le pH est ajusté à 7. La solution aqueuse est filtrée sur 0,2 pm et conservée à 4 °C. 25 Extrait sec : 17,8 mg/g DP (estimé d'après la RMN 1H) : 26 D'après la RMN 11-1 : i = 0,038 La masse molaire moyenne calculée du co-polyaminoacide B1 est de 4994 g/mol. HPLC-SEC organique (calibrant PEG) : Mn = 2800 g/mol 30 Co-polyaminoacide B2 : poly-L-glutamate de sodium modifié par la molécule A2 dont les esters sont saponifiés et ayant une masse molaire moyenne en nombre (Mn) de 5200 g/mol Co-polvaminoacide S2-1 : acide poly-L-glutamique issu de la polymérisation du y- 35 benzyl-L-glutamate N-carboxyanhydride initiée par l'hexylamine [000405] Dans un réacteur à double enveloppe, du y-benzyl-L-glutamate N- carboxyanhydride (500 g, 1,90 mol) est solubilisé dans du DMF anhydre (1100 mL). Le mélange est alors agité jusqu'à complète dissolution, refroidi à 0 °C, puis de 66 l'hexylannine (6,27 mL, 47,5 mmol) est introduite rapidement. Le mélange est agité à 0 °C pendant 5 h, entre 0 °C et 20 °C pendant 7 h, puis à 20 °C pendant 7 h. Le milieu réactionnel est ensuite chauffé à 65 °C pendant 2 h, refroidi à 55 °C et du méthanol (3300 mL) est introduit en 1 h 30. Le mélange réactionnel est alors refroidi à 0 °C et 5 laissé sous agitation pendant 18 h. Le précipité blanc est récupéré par filtration, lavé au diisopropyléther (2 x 800 mL) puis séché sous pression réduite à 30 °C pour donner un acide poly(gamma-benzyl-L-glutamique) (PBLG). [000406] A une solution de PBLG (180 g) dans du N,N-diméthylacétamide (DMAc, 450 mL) est ajouté du Pd/A1203 (36 g) sous atmosphère d'argon. Le mélange est placé 10 sous atmosphère d'hydrogène (10 bar) et agité à 60 °C pendant 24 h. Après refroidissement à température ambiante et filtration du catalyseur sur fritté P4 puis sur membrane Omnipore 0,2 pm PTFE hydrophile, une solution d'eau à pH 2 (2700 mL) est coulée goutte à goutte sur la solution de DMAc, sur une période de 45 min et sous agitation. Après 18 h sous agitation, le précipité blanc est récupéré par filtration, lavé 15 avec de l'eau (4 x 225 mL) puis séché sous pression réduite à 30 °C Co-polyaminoacide B2 [000407] Le co-polyaminoacide B2-1 (15,0 g) est solubilisé dans du DMF (230 mL) à 40 °C puis de la N-méthylmorpholine (NMM, 11,57 g, 114,4 mmol) est ajoutée. En 20 parallèle, la molécule A2 sous forme de sel de chlorhydrate (10,17 g, 17,2 mmol) est mise en suspension dans du DMF (250 mL) et de la triéthylamine (2,39 mL, 17,2 mmol) est ajoutée, puis le mélange est légèrement chauffé sous agitation jusqu'à complète dissolution. À la solution de co-polyaminoacide, refroidie à 25 °C, sont successivement ajoutés la solution de molécule A2, de la N-oxyde de 2-hydroxypyridine (HOPO, 3,81 g, 25 34,3 mmol) puis du N-(3-dimethylaminopropyI)-N'-ethylcarbodiimide (EDC, 6,58 g, 34,3 mmol). Le milieu réactionnel est agité à 25 °C pendant 2 h, filtré sur filtre tissé 0,2 mm et coulé au goutte-à-goutte sur 2,6 L d'eau contenant du NaCI à 15 % massique et du HCI (pH 2) sous agitation. A la fin de l'ajout, le pH est réajusté à 2 avec une solution de HCI 1 N, et la suspension est laissée reposer une nuit. Le précipité est collecté par 30 filtration, puis rincé par 2 x 100 mL d'eau. Le solide blanc obtenu est solubilisé dans 1,2 L d'eau par ajout lent d'une solution aqueuse de NaOH 1 N jusqu'à pH 7 sous agitation, puis la solution est filtrée sur filtre 0,45 pm. De l'éthanol (30 % massique) est ajouté puis la solution est filtrée sur filtre de charbon actif (3M R53SLP). Une solution de NaOH 10 N est lentement ajoutée sous agitation jusqu'à pH 13 puis le mélange est laissé sous 35 agitation pendant 2 h. Après neutralisation à pH 7 par ajout d'une solution de HCI 37 Wo, la solution limpide obtenue est purifiée par ultrafiltration contre une solution de NaCI 0,9 % puis de l'eau, jusqu'à ce que la conductimétrie du perméat soit inférieure à 50 67 pS/cm. La solution de co-polyaminoacide est ensuite concentrée et le pH est ajusté à 7. La solution aqueuse est filtrée sur 0,2 pm et conservée à 4 °C. Extrait sec : 22,6 mg/g DP (estimé d'après la RMN 1H) : 40 5 D'après la RMN 1H : i = 0,15 La masse molaire moyenne calculée du co-polyaminoacide B2 est de 9301 g/mol. HPLC-SEC organique (calibrant PEG) : Mn = 5200 g/mol. Co-polyaminoacide B3 poly-L-glutamate de sodium modifié par la molécule 10 A3 dont l'ester est saponifié et ayant une masse molaire moyenne en nombre (Mn) de 4900 g/mol [000408] Le co-polyaminoacide B2-1 (12,0 g) est solubilisé dans du DMF (92 mL) à 40 °C puis de la N-méthylmorpholine (NMM, 9,25 g, 91,5 mmol) est ajoutée. En parallèle, une solution de la molécule A3 sous forme de sel de chlorhydrate (7,51 g, 15 13,7 mmol) et de N,N-diisopropylethylamine (DIPEA, 2,39 mL, 13,7 mmol) dans du DMF (27 mL) est préparée. À la solution de co-polyaminoacide refroidie à 25 °C, sont successivement ajoutés la solution de molécule A3 et de la N-oxyde de 2- hydroxypyridine (HOPO, 3,05 g, 27,4 mmol). Le mélange est refroidi à 0 °C puis du EDC (5,26 g, 27,4 mmol) est ajouté. Après 5 min à 0 °C, le milieu réactionnel est agité à 25 20 °C pendant 2 h, filtré sur filtre tissé 0,2 mm et coulé au goutte-à-goutte sur 950 mL d'eau contenant du NaCI à 15 % massique et du HCI (pH 2) sous agitation. A la fin de l'ajout, le pH est réajusté à 2 avec une solution de HCI 1 N, et la suspension est laissée reposer une nuit. Le précipité est collecté par filtration, puis rincé par 3 x 100 mL d'eau. Le solide obtenu est solubilisé dans 1 L d'eau par ajout lent d'une solution aqueuse de 25 NaOH 1 N jusqu'à pH 7 sous agitation. Une fois la solubilisation complète, le pH est ajusté à pH 12 pendant 2 h puis à pH 13 pendant 1 h par ajout d'une solution de NaOH 10 N. Après neutralisation à pH 7 par ajout d'une solution de HCI 37 %, cette solution est diluée avec de l'eau et de l'acétone afin d'obtenir une solution à 12 g/L contenant 30 % massique d'acétone, puis elle est filtrée sur filtre de charbon actif (3M R53SLP). 30 La solution obtenue est filtrée sur 0,45 pm et purifiée par ultrafiltration contre une solution de NaCI 0,9 % puis de l'eau jusqu'à ce que la conductimétrie du perméat soit inférieure à 50 pS/cm. La solution de co-polyaminoacide est ensuite concentrée et le pH est ajusté à 7. La solution aqueuse est filtrée sur 0,2 pm et conservée à 4 °C. Extrait sec : 20,6 mg/g 35 DP (estimé d'après la RMN 1H) : 40 D'après la RMN 1H : i = 0,15 La masse molaire moyenne calculée du co-polyaminoacide B3 est de 8977 g/mol. HPLC-SEC organique (calibrant PEG) : Mn = 4900 g/mol. 68 Co-polyaminoacide B4: poly-L-glutamate de sodium modifié par la molécule A4 dont l'ester est saponifié et ayant une masse molaire moyenne en nombre (Mn) de 4700 g/mol 5 [000409] Par un procédé similaire à celui utilisé pour la préparation du co- polyaminoacide B3 appliqué au sel de chlorhydrate de la molécule A4 (7,12 g, 13,7 mmol) et au co-polyaminoacide B2-1 (12,0 g), un poly-L-glutamate de sodium modifié par la molécule A4 dont l'ester est saponifié est obtenu. Extrait sec : 19,4 mg/g 10 DP (estimé d'après la RMN 1H) : 40 D'après la RMN 1H : i = 0,15 La masse molaire moyenne calculée du co-polyaminoacide B4 est de 8809 g/mol. HPLC-SEC organique (calibrant PEG) : Mn = 4700 g/mol. 15 Co-polyaminoacide B5 : poly-L-glutamate de sodium modifié par la molécule A5 dont l'ester est saponifié et ayant une masse molaire moyenne en nombre (Mn) de 5400 g/mol [000410] Par un procédé similaire à celui utilisé pour la préparation du co- polyaminoacide B3 appliqué au sel de chlorhydrate de la molécule A5 (9,71 g, 13,7 20 mmol) et au co-polyaminoacide B2-1 (12,0 g), un poly-L-glutamate de sodium modifié par la molécule A5 dont l'ester est saponifié est obtenu. Extrait sec : 20,8 mg/g DP (estimé d'après la RMN 1H) : 40 D'après la RMN 1H : i = 0,15 25 La masse molaire moyenne calculée du co-polyaminoacide B5 est de 9939 g/mol. HPLC-SEC organique (calibrant PEG) : Mn = 5400 g/mol. Co-polyaminoacide B7 : poly-L-glutamate de sodium modifié à l'une de ses extrémités par la molécule A7 et ayant une masse molaire moyenne en nombre 30 (Mn) de 2500 g/mol [000411] Par un procédé similaire à celui utilisé pour la préparation du co- polyaminoacide B1 appliqué à la molécule A7 (2,50 g, 2,74 mmol) et à du y-benzyl-Lglutamate N-carboxyanhydride (15,89 g, 60,4 mmol), un poly-L-glutamate de sodium modifié à l'une de ses extrémités par la molécule A7 est obtenu. 35 Extrait sec : 20,3 mg/g DP (estimé d'après la RMN 1H) : 26 D'après la RMN 1H : i = 0,038 La masse molaire moyenne calculée du co-polyaminoacide B7 est de 3893 g/mol. 69 HPLC-SEC organique (calibrant PEG) : Mn = 2500 g/mol Partie C - Solutions d'insuline rapides et lentes Exemple Cl Solution d'insuline analogue rapide (Hurrronr,°) à 100 UfrdL 5 [000412] Cette solution est une solution commerciale d'insuline lispro commercialisée par la société ELI LILLY sous le nom de Humalog®. Ce produit est une insuline analogue rapide. Les excipients dans Humalog° sont le méta-crésol (3,15 mg/mL), le glycérol (16 mg/mL), le phosphate de disodiunn (1,88 mg/mL), l'oxyde de zinc (pour avoir 0,0197 mg d'ion zinc/nnL), l'hydroxyde de sodium et l'acide 10 chlorhydrique pour l'ajustement du pH (pH 7-7,8) et de l'eau. Exemple C2 : Solution d'insuline analogue rdpIcl Espro à 100-600 U/mL [000413] Cette solution est une solution d'insuline préparée à partir de poudre d'insuline lispro produite par la société Gan&Lee. Ce produit est une insuline analogue 15 rapide. Les excipients utilisés sont le m-crésol, le glycérol, l'oxyde de zinc, l'hydroxyde de sodium et l'acide chlorhydrique pour l'ajustement du pH (pH 7-7,8) et de l'eau. La concentration de zinc est de 300 pM pour 100 UI/mL d'insuline. La concentration des autres excipients varie en fonction de celle de lispro pour obtenir les concentrations souhaitées dans les formulations finales. 20 Exemple C3 : Solution d'insuline analogue lente (Lantus®' à 100 U/mL [000414] Cette solution est une solution commerciale d'insuline glargine commercialisée par la société SANOFI sous le nom de Lantus®. Ce produit est une insuline analogue lente. Les excipients dans Lantus® sont le chlorure de zinc (30 pg/mL), 25 le m-crésol (2,7 mg/mL), le glycérol (20 mg/mL), le polysorbate 20 (16 pM), l'hydroxyde de sodium et l'acide chlorhydrique pour l'ajustement du pH (pH 4) et de l'eau. Exemole C4 : Solution l'insuline glargine à 100-400 LI /rnL [000415] Cette solution est une solution d'insuline glargine préparée à partir de 30 poudre d'insuline glargine produite par la société GaniàLee. Ce produit est une insuline analogue lente. Les excipients utilisés sont le chlorure de zinc, le m-crésol, le glycérol, l'hydroxyde de sodium et l'acide chlorhydrique pour l'ajustement du pH (pH 4) et de l'eau. La concentration de zinc est de 460 pM pour 100 UI/mL d'insuline. La concentration des autres excipients varie en fonction de celle de Glargine pour obtenir 35 les concentrations souhaitées dans les formulations finales. Partie CA - Compositions comprenant de l'insuline ularoine [000416] Procédé de préparation CA1 : Préparation d'une composition diluée co- polyaminoacide/insuline glargine 50 U/mL à pH 7,1, suivant un procédé utilisant l'insuline glargine sous forme liquide (en solution) et un co-polyaminoacide sous forme 5 liquide (en solution). [000417] À une solution mère de co-polyaminoacide à pH 7,1 sont ajoutées des solutions concentrées de méta-crésol et de glycérine de manière à obtenir une solution de co-polyaminoacide de concentration Cmère co-polyaminoacide/excipients (mg/rnL). La quantité d'excipients ajoutée est ajustée de manière à obtenir une concentration de méta-crésol 10 de 35 mM et glycérine de 184 mM dans la composition co-polyaminoacide/insuline glargine 50 U/mL à pH 7,1. [000418] Dans un pot stérile, un volume Vinsuline glargine d'une solution d'insuline glargine à une concentration de 100 U/mL décrite en C3 ou C4 est ajouté à un volume Vmère co-polyaminoacide /excipients d'une solution de co-polyaminoacide à la concentration Cmère 15 co-polyaminoacide /excipients (mg/nriL) de manière à obtenir une composition diluée co- polyaminoacide Cco-polyaminoacide dilué (mg/mL)/insuline glargine 50 U/mL à pH 7,1. Un trouble apparaît. Le pH est ajusté à pH 7,1 par ajout de NaOH concentrée et la solution est placée en statique à 40 °C pendant 2 h jusqu'à solubilisation complète. Cette solution visuellement limpide est placée à 4 °C. 20 Procédé de préparation CA2 : Préparation d'une composition co-polyaminoacide/insuline glargine concentrée à pH 7,1 à l'aide d'un co-polyaminoacide, suivant un procédé de concentration d'une composition diluée. [000419] Une composition co-polyaminoacide/insuline glargine 50 U/mL à pH 7,1 25 décrite dans l'exemple CA1 est concentrée par ultrafiltration sur une membrane 3 kDa en cellulose régénérée (Annicon® Ultra-15 commercialisée par la société Millipore). A l'issue de cette étape d'ultrafiltration, le rétentat est limpide et la concentration en insuline glargine dans la composition est déterminée par chromatographie en phase inverse (RP-HPLC). La concentration en insuline glargine dans la composition est ensuite 30 ajustée à la valeur souhaitée par dilution dans une solution d'excipients m- crésol/glycérine/Tween 20 de manière à obtenir une concentration finale en m-crésol de 35 mM, en Tween 20 de 52 pM et une osmolarité de 300 mOsm/kg. Le pH est mesuré et ajusté à pH 7,1 par ajout de NaOH et HCI concentré. Cette solution à pH 7,1, visuellement limpide, présente une concentration en insuline glargine Cinsuline glargine 35 (U/mL) et une concentration en co-polyaminoacide Cco-polyaminoacide (mg/m L) = Cco- polyaminoacide dilué (mg/rnL) x Cinsuline glargine (U/mL)/50 (U/mL). 71 Procédé de préparation CA3 : Préparation d'une composition concentrée copolyaminoacide / insuline glargine à pH 7,1, suivant un procédé utilisant l'insuline glargine sous forme liquide (en solution) et un co-polyaminoacide sous forme liquide (en solution). 5 [000420] À une solution mère de co-polyaminoacide à pH 7,1 est ajoutée une solution de glargine à 220-400 UI/mL contentant les excipients décrits dans l'exemple C4. La concentration des excipients dans la solution de glargine est ajustée de manière à obtenir une concentration de m-crésol de 35 mM, et en glycérine de 184 mM dans la composition co-polyaminoacide/insuline glargine à pH 7,1. Un trouble apparaît. Le pH 10 est ajusté à pH 7,1 par ajout de NaOH concentré et la solution est placée en statique dans une étuve à 40 °C pendant 2 h jusqu'à solubilisation complète. Cette solution visuellement limpide est placée à 4 °C après ajout d'un volume de solution concentrée de polysorbate 20 pour obtenir une concentration finale de 52 pM. 15 [000421] Selon les procédés de préparation CA2 ou CA3, des compositions co- polyaminoacide/insuline glargine ont été préparées par exemple avec des concentrations en insuline glargine entre 200 U/mL et 300 U/mL. Exemple CA4 : Préparation de compositions co-polyaminoacide/insuline glargine 200 20 U/mL à pH 7,1. [000422] Des compositions co-polyaminoacide/insuline glargine 200 U/mL sont préparées selon les procédés décrits dans CA2 et CA3 de manière à obtenir une concentration en insuline glargine Cinsuline glargune = 200 U/mL et une concentration en copolyaminoacide Cco-polyaminoaade (mg/mL). 25 Ces compositions sont présentées dans le Tableau 1. Composition Co- Concentration Insuline Aspect polyaminoacide en co- g larg me visuel de la polyaminoacide (U/mL) solution (en mg/mi) CA3-1 B7 5 200 limpide CA2-1 B1 6 200 limpide CA3-2 B9 5 200 limpide Tableau 1 : Compositions d'insuline glargine (200 U/mL) en présence de copolyaminoacide. 72 [000423] Les co-polyaminoacides permettent de solubiliser l'insuline glargine à pH neutre et de conduire à une solution limpide. 5 Partie CB - Compositions comprenant de l'insuline (l'amine et insuline lispro Procédé de préparation CB1 : Préparation d'une composition diluée copolyaminoacide/insuline glargine 43 (U/mL)/insuline lispro 13,5 (U/mL) [000424] À un volume Vco-polyaminoacide / insuline glargine dilué de la composition diluée co- 10 polyaminoacide / insuline glargine 50 U/mL à pH 7,1 décrite dans l'exemple CA1 est ajoutée un volume Vinsuline lispro d'une solution lispro à 100 U/mL et de l'eau de manière à obtenir une composition co-polyaminoacide/insuline glargine 43 (U/mL)/insuline lispro 13,5 (U/mL). 15 Procédé de préparation CB2 : Préparation d'une composition co-polyaminoacide / insuline glargine / insuline lispro concentrée à pH 7,1 [000425] Une composition co-polyaminoacide/insuline glargine 43 (U/mL)/insuline lispro 13,5 (U/mL) décrite dans l'exemple CB1 est concentrée par ultrafiltration sur une membrane 3 kDa en cellulose régénérée (Amicone Ultra-15 commercialisée par la 20 société MILLIPORE). À l'issue de cette étape d'ultrafiltration, le rétentat est limpide et la concentration en insuline glargine dans la composition est déterminée par chromatographie en phase inverse (RP-HPLC). Les concentrations en insuline glargine et insuline lispro dans la composition sont ensuite ajustées à la valeur souhaitée par dilution dans une solution d'excipients m-crésol/glycérine/Tween 20 de manière à 25 obtenir une concentration finale en m-crésol de 35 mM, en Tween de 52 pM et une osmolarité de 300 mOsmole/kg. Le pH est mesuré et ajusté si nécessaire à pH 7,1 par ajout de NaOH et HCI concentré. Cette solution à pH 7,1, visuellement limpide, présente une concentration en insuline glargine Cinsuline glargine (U/mL), une concentration en insuline lispro Cinsuline lispro = Cinsuline glargine X 0,33 et une concentration en co- 30 polyaminoacide Cco-polyaminoacide (mg/mL) = Cco-polyaminoacide dilué (mg/mL) X Cinsuline glargine (U/mL) / 50 (U/mL). Procédé de préparation CB3 : Préparation d'une composition co-polyaminoacide/insuline glargine/insuline lispro concentrée à pH 7,1 35 [000426] À un volume Vco-polyaminoacide / insuline glargine concentré de la composition concentrée co-polyaminoacide/insuline glargine à pH 7,1 décrite dans l'exemple CA3 est ajoutée un volume Vinsuline lispro d'une solution lispro décrite dans l'exemple C2. Un volume de 73 solution de polysorbate 20 est aussi ajouté pour obtenir une concentratione finale de 52 pM. La solution résultante à pH 7,1, visuellement limpide, présente une concentration en insuline glargine Cinsuline glargine (U/mL), une concentration en insuline lispro Cinsuline lispro = Cinsuline glargine X 0,33 et une concentration en co-polyaminoacide Cco-poiyaminoacide (mg/mL) 5 = Cco-polyaminoacide dilué (mg/mL) x Cinsuline glargine (U/rnL)/50 (1.1/mL). La concentration de m- crésol est de 35 mM et celle de glycérine 230 mM. Exemple CB2 et CB3 : Préparation de compositions co-polyaminoacide/insuline glargine 200 U/mL/insuline lispro 66 U/mL à pH 7,1 10 [000427] Des compositions co-polyaminoacide/insuline glargine 200 U/mL/insuline lispro 66 U/mL sont préparées selon un des procédés décrits dans les exemple CB2 ou CB3 de manière à obtenir une concentration en insuline glargine Cinsuline glargine = 200 U/mL, une concentration en insuline lispro Cinsuline lispro = 66 U/mL et une concentration en co-polyaminoacide Cco-polyanunoacide (Mg/ML). 15 Ces compositions sont présentées dans le Tableau 2. Compositio Co- Concentration Insulin Insulin Aspect polyaminoacid en co- e Lispro visuel polyaminoacid glargin (U /mL de la e (en mg/m1) solutio (11/ m LL CB3-1 B7 5 200 66 limpide CB2-2 B1 6 200 66 limpide CB3-2 B4 5 200 66 limpide Tableau 2 : Compositions d'insuline glargine (200 U/mL) et d'insuline lispro (66 U/mL) en présence de co-polyaminoacide. 20 [000428] Les co-polyaminoacides permettent de solubiliser l'insuline glargine en présence d'insuline lispro à pH neutre et de conduire à une solution limpide. 74 Partie D - Résula_mts Mise en évidence de la stabilité physique des compositions selon l'invention par l'étude des compositions précédemment préparées 5 Exemple Di Stabilité accélérée à 2 °C en dv_narniQue [000429] 3 vials de 3 mL remplis avec 1 mL de composition copolyaminoacide/insuline glargine ou co-polyaminoacide/insuline glargine/insuline prandiale sont placés verticalement sur un agitateur orbital. L'agitateur est placé dans une étuve à 25 °C et les vials sont soumis à une agitation de 250 rpm. Les vials sont 10 inspectés visuellement de manière quotidienne/hebdomadaire afin de détecter l'apparition de particules visibles ou d'une turbidité. Cette inspection est réalisée selon les recommandations de la Pharmacopée Européenne (EP 2.9.20) : les vials sont soumis à un éclairage d'au moins 2000 Lux et sont observés face à un fond blanc et un fond noir. Le nombre de jours de stabilité correspond à la durée à partir de laquelle au moins 15 2 vials présentent des particules visibles ou sont turbides. Le résultat de stabilité accélérée avec le co-polyaminoacide B5 est présenté dans le Tableau 3. Composition Co-polyaminoacide Concentration en Stabilité en jours CA3-1 B4 co- > 12 polyaminoacide (en mg/m1) 5 Tableau 3 : résultats des stabilités des compositions co-polyaminoacide/insuline 20 glargine (200 U/rnL)/insuline lispro (66 U/mL) à 25 °C en dynamique. [000430] Le co-polyaminoacide B4 permet de solubiliser l'insuline glargine en présence d'insuline REVENDICATIONS1. Composition sous forme d'une solution aqueuse injectable, dont le pH est compris entre 6, 0 et 8,0, comprenant au moins : une insuline basale dont le point isoélectrique pI est compris entre 5,8 et 8,5 ; un co-polyaminoacide porteur de charges carboxylates et de radicaux hydrophobes Hy, ledit co-polyaminoacide étant constitué d'unités glutamiques ou aspartiques et lesdits radicaux hydrophobes Hy étant de formule X suivante : *--(GpR)r (GpG)g (GpA) a GpHi GpCi a Formule X dans laquelle GpR est choisi parmi les radicaux de formules VII, VII' ou VII": 0 H H *-N-R-N-* Formule VII ou * * pp Formule VII' ou 0 0 R IL* Formule VII"; GpG et GpH identiques ou différents sont choisis parmi les radicaux de formules XI ou XI': 0 H *- NH-G- NH-* G N * Formule XI Formule XI' GpA est choisi parmi les radicaux de formule VIII *--NH- Formule VIII Dans laquelle A' est choisi parmi les radicaux de formule VIII',VIII" ou VIII'" CO - A2 AI-N- A2 -N- A3 Formule VIII' Formule VIII" Formule VIII' 76 -GpL est choisi parmi les radicaux de formule XII O HN-* _LA/ Liki * - Formule XII, GpC est un radical de formule IX : 5 Formule IX; les * indiquent les sites de rattachement des différents groupes liés par des fonctions amides a est un entier égal à 0 ou à 1 et a' = 1 si a = 0 et a' = 1,2 ou 3 si a = 1 ; - a' est un entier égal à 1, à 2 ou à 3 10 - b est un entier égal à 0 ou à 1; - c est un entier égal à 0 ou à 1, et si c est égal à 0 alors d est égal à 1 ou à 2; d est un entier égal à 0, à 1 ou à 2 ; e est un entier égal à 0 ou à 1 ; g est un entier égal à 0, à 1, à 2, à 3 à 4 à 5 ou à 6; 15 h est un entier égal à 0, à 1, à 2, à 3 à 4 à 5 ou à 6, et au moins un des g, h ou I est différent de 0; I est un entier égal à 0 ou 1 et = 1 si I = 0 et l' = 2 si I = 1; r est un entier égal à 0 ou à 1, et s' est un entier égal à 0 ou 1 ; 20 A, A1, A2 et A3 identiques ou différents sont des radicaux alkyles linéaires ou ramifiés comprenant de 1 à 6 atomes de carbone; B est un radical alkyle linéaire ou ramifié, éventuellement comprenant un noyau aromatique, comprenant de 1 à 9 atomes de carbone ; Cx est un radical alkyl monovalent linéaire ou ramifié, dans lequel x indique le 25 nombre d'atomes de carbone et : Lorsque le radical hydrophobe -Hy porte 1 -GpC, alors 9 5 x 5 25, Lorsque le radical hydrophobe -Hy porte 2 -GpC, alors 9 5 x 5 15, Lorsque le radical hydrophobe -Hy porte 3 -GpC, alors 7 5 x 5 13, - Lorsque le radical hydrophobe -1-ly porte 4 -GpC, alors 7 5 x 5 11, - Lorsque le radical hydrophobe -Hy porte au moins 5 -GpC alors, 6 5 x 5 11, 77 G est un radical alkyle ramifié de 1 à 8 atomes de carbone ledit radical alkyle portant une ou plusieurs fonction(s) acide carboxylique libre. H est un radical alkyle ramifié de 1 à 8 atomes de carbone ledit radical alkyle portant une ou plusieurs fonction(s) acide carboxylique libre., 5 R est un radical choisi dans le groupe constitué par un radical alkyle divalent, linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, un radical alkyle divalent, linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 12 atomes de carbone portant une ou plusieurs fonctions -CONH2 ou un radical éther ou polyéther non substitué comprenant de 4 à 14 atomes de carbone et de 1 à 5 atomes d'oxygène : 10 Le ou les radicaux hydrophobes -Hy de formule X étant liés au PLG: via une liaison covalente entre un carbonyle du radical hydrophobe -Hy et un atome d'azote porté par le PLG formant ainsi une fonction amide issue de la réaction d'une fonction amine_portée par le PLG et une fonction acide portée par le précurseur -Hy' du radical hydrophobe -Hy, et 15 via une liaison covalente entre un atome d'azote du radical hydrophobe -Hy et un carbonyle porté par le PLG formant ainsi une fonction amide issue de la réaction d'une fonction amine du précurseur -Hy' du radical hydrophobe -Hy et une fonction acide portée par le PLG, le ratio M entre le nombre de radicaux hydrophobes et le nombre d'unités 20 glutamiques ou aspartiques étant compris entre 0 6. Composition selon l'une quelconque des revendications 4 ou 5, caractérisée en ce que le co-polyaminoacide porteur de charges carboxylates et de radicaux hydrophobes est choisi parmi les co-polyaminoacides de formules XXXb dans laquelle R2 est un radical hydrophobe de formule X dans laquelle r = 1 et GpR est de Formule VII. 15 7. Composition selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, caractérisé en ce que Ri est un radical choisi dans le groupe constitué par un groupe acyle linéaire en C2 à Cio, un groupe acyle ramifié en C4 à C10, un benzyle, une unité « acide aminé » terminale et un pyroglutamate. 20 8. Composition selon la revendication précédente, caractérisé en ce que Ri est un radical choisi dans le groupe constitué par un groupe acyle linéaire en C2 à C10 ou un groupe acyle ramifié en C4 à C10. 25 9. Composition selon l'une quelconque des revendications 3 à 8, caractérisée en ce que le co-polyaminoacide porteur de charges carboxylates et de radicaux hydrophobes est choisi parmi les co-polyaminoacides de formules XXXa', XXXa ou XXXb dans lesquels le co-polyaminoacide est choisi parmi les co-polyaminoacides dans lesquels le groupe D est un groupe -CH2- (unité aspartique). 30 81 10. Composition selon l'une quelconque des revendications 3 à 8, caractérisée en ce que le co-polyaminoacide porteur de charges carboxylates et de radicaux hydrophobes est choisi parmi les co-polyaminoacides de formules XXXa', XXXa ou XXXb dans lesquels le co-polyaminoacide est choisi parmi les co-polyaminoacides dans lesquels le groupe D 5 est un groupe -CH2-CH2- (unité glutamique). 11. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'insuline basale dont le point isoélectrique est compris entre 5,8 et 8,5 est l'insuline glargine 10 12. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend entre 40 et 500 U/mL d'insuline basale dont le point isoélectrique est compris entre 5,8 et 8,5. 15 13. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la concentration en co-polyaminoacide porteur de charges carboxylates et de radicaux hydrophobes est au plus de 60 mg/mL. 14. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, 20 caractérisée en ce que la concentration en co-polyaminoacide porteur de charges carboxylates et de radicaux hydrophobes est au plus de 40 mg/mL. 15. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la concentration en co-polyaminoacide porteur de charges 25 carboxylates et de radicaux hydrophobes est au plus de 20 mg/mL. 16. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la concentration en co-polyaminoacide porteur de charges carboxylates et de radicaux hydrophobes est au plus de 10 mg/mL. 30