Brevet FR3064635A1 — publié le 20181005

PURIFICATION DES PHYCOBILIPROTEINES DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne un nouveau procédé de purification des 5 phycobiliprotéines, en particulier résistantes aux pH acides, les phycobiliprotéines obtenues et leurs utilisations. ETAT DE LA TECHNIQUE La purification de phycobiliprotéines de Galdieria sulphuraria, en particulier de 10 C-Phycocyanine (C-PC), est beaucoup plus complexe que celle d'Arthrospira platensis (Spiruline) ou que d'autres cyanobactéries. Cela est partiellement dû à la composition de la paroi cellulaire de Galdieria sulphuraria qui nécessite une action mécanique pour être rompue (Sorensen et al., 2013). La lyse mécanique engendre la formation de micelles qui ne sont que partiellement éliminés par ultracentrifugation. 15 La présence de chlorophylle a et de caroténoïdes dissouts dans ces micelles contribue à augmenter les valeurs d'absorbance à 280 nm (absorbance dans les UV spécifique des protéines) ce qui peut expliquer les faibles taux de pureté des extraits brut de C-PC comparativement à ceux de Spiruline (Sorensen et al., 2013). Le taux de pureté de l'extrait brut peut donc être augmenté en éliminant les micelles et les 20 protéines solubles autres que les phycobiliprotéines. La purification de phycobiliprotéines extraites de Galdieria sulphuraria et de Spiruline par précipitation au sulfate d'ammonium a déjà été décrite dans la littérature (Moon et al., 2015 ; Cruz de Jesùs et al., 2006) mais elle est très difficilement applicable à l'échelle industrielle car elle demande beaucoup de sulfate d'ammonium, 25 ce qui pose de gros problèmes de retraitement du sulfate d'ammonium et du surnageant. Les autres méthodes de purification décrites permettant d'obtenir un taux de pureté telles que des méthodes de chromatographie sont très couteuses à mettre en oeuvre. 30 L'invention concerne donc un procédé de purification de phycobiliprotéines produites par culture en bioréacteur de microorganismes producteurs de phycobiliprotéines, aisé à mettre en oeuvre et économiquement adapté pour une mise en oeuvre à l'échelle industrielle. Par ailleurs, les phycobiliprotéines, en particulier les phycocyanines, sont des 3064635 2 mélanges de c-phycocyanine et d'allophycocyanine. Les procédés connus de purification ne permettent pas de les séparer de manière contrôlée industriellement. La purification par précipitation au sulfate d'ammonium entraîne les deux protéines de manière non contrôlée, de sorte qu'il peut être difficile d'obtenir un pigment aux propriétés stables. Cette méthode de précipitation engendre également des pertes de rendement d'extraction importante (Cruz de Jesùs et al., 2006) L'invention concerne donc aussi la préparation de phycobiliprotéines purifiées, en particulier de phycocyanine purifiée comprenant essentiellement de la cphycocyanine ou bien essentiellement de l'allophycocyanine, en particulier de phycobiliprotéines résistantes aux pH acides de composition contrôlée en phycocyanines. EXPOSE DE L'INVENTION L'invention concerne donc un procédé de purification de phycobiliprotéines 15 résistantes aux pH acides à partir d'un extrait brut de phycobiliprotéines résistantes aux pH acides, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de a) ajustement du pH de l'extrait brut de phycobiliprotéines résistantes aux pH acides à un pH inférieur à 6 de manière à faire précipiter les matières organiques autres que les phycobiliprotéines résistantes aux pH acides, 20 b) récupération du surnageant comprenant les phycobiliprotéines résistantes aux pH acides et c) isolation des phycobiliprotéines résistantes aux pH acides à partir du surnageant. L'invention concerne aussi les phycobiliprotéines résistantes aux pH acides obtenues par le procédé et en particulier, des phycocyanines résistantes aux pH 25 acides comprenant un mélange de c-phycocyanine et d'allophycocyanine, plus particulièrement dont le rapport molaire c-phycocyanine / allophycocyanine est d'au moins 2. DESCRIPTION DES FIGURES 30 Figure 1. Augmentation de l'indice de pureté de l'extrait brut en fonction du pH à partir d'un lysat de cellules fraîches. Figure 2. Mesure de la concentration en C-PC et APC dans différents extraits bruts obtenus par centrifugation d'un lysat de cellules fraîches à différents pH. En gris sont représentées les concentrations en APC en mg/ml, et en noir les concentrations 3064635 3 en C-PC en mg/ml. Figure 3. Mesure de la concentration en C-PC et APC dans les culots obtenus par centrifugation d'un lysat de cellules fraîches à différents pH. En gris sont représentées les concentrations en APC en mg/g de MS, et en noir les concentrations 5 en C-PC en mg/g de MS. Figure 4. Augmentation de l'indice de pureté de l'extrait brut en fonction du pH à partir d'un lysat de cellules lyophilisées et réhydratées. Figure 5. Mesure de la concentration en C-PC et APC dans différents extraits bruts obtenus par centrifugation d'un lysat de cellules, lyophilisées et réhydratée, à 10 différents pH. En gris sont représentées les concentrations en APC en mg/ml, et en noir les concentrations en C-PC en mg/ml. Figure 6. Purification et concentration de la C-PC par filtration tangentielle. L'extrait brut préalablement purifié par précipitation à pH acide, est filtré en utilisant un système de fibre creuse. Figure 7. Augmentation de la concentration en C-PC dans le rétentat lors de la filtration sur fibre creuse. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION L'invention concerne donc un procédé de purification de phycobiliprotéines 20 résistantes aux pH acides à partir d'un extrait brut de phycobiliprotéines résistantes aux pH acides. L'extrait brut de phycobiliprotéines est généralement obtenu à partir de cellules de microorganismes cultivés de manière industrielle dans des bioréacteurs de grande capacité, de préférence de manière à obtenir des moûts de fermentation comprenant 25 de grandes densités de microorganismes producteurs de phycobiliprotéines (par grandes densités on entend généralement plus de 50g de matière sèche (MS) par litre de moût de fermentaiton, préférentiellement plus de 100g/L). Ces méthodes de culture sont connues de l'homme du métier, pouvant être menées en autotrophie, hétérotrophie ou mixotrophie, notamment décrites dans les demandes WO 30 2017/050917, WO 2017/050918 et PCT/EP2016/079325 déposée le 30 novembre 2016. Les phycobiliprotéines produites par les microorganismes cultivés doivent être libérées après lyse cellulaire. En effet, les cellules de microorganismes contiennent de grandes quantités de phycobiliprotéines (Moon et al., 2015, Sorensen et al., 2013, Eriksen 2008). Par conséquent, la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, 3064635 4 nécessite d'abord la préparation d'un extrait aqueux provenant du moût de fermentation. L'extrait aqueux peut être préparé directement à partir du moût de fermentation tel qu'il est récupéré du réacteur en fin de fermentation, éventuellement additionné 5 d'une quantité appropriée d'eau. Il peut être préparé à partir de cellules fraiches séparées du moût de fermentation par toute méthode de séparation bien connue de l'homme du métier. Il peut également être préparé à partir de cellules préalablement lyophilisées ou séchées pour leur conservation. 10 Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'extrait aqueux est préparé à partir de cellules fraiches séparées du moût de fermentation après culture. La lyse cellulaire peut se faire par tout moyen de lyse cellulaire connu de l'homme du métier. Elle peut se faire alors que les cellules sont en suspension dans l'eau, moût de fermentation ou suspension reconstituée. 15 Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la lyse cellulaire est faite sur les cellules séparées du moût de fermentation, avant leur remise en suspension. De préférence, l'extrait aqueux est obtenu à partir de la suspension comprenant les cellules lysées en séparant les solides, par tout moyen de séparation connu de l'homme du métier pour éliminer les résidus solides de lyse cellulaire, notamment de 20 filtration. On obtient alors un extrait aqueux appelé « extrait de brut de phycobiliprotéines » ou encore « extrait brut » qui comprend, outre les phycobiliprotéines recherchées, en particulier résistantes aux pH acides, d'autres matières organiques comme les micelles et d'autres protéines hydrosolubles. 25 L'extrait brut de phycobiliprotéines peut être préparé à partir de cellules fraîches lysées (directement dans le moût de fermentation ou après séparation du moût de fermentation) ou à partir de cellules lyophilisées ou séchées, la lyse cellulaire intervenant avant ou après lyophilisation ou séchage. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'extrait brut est préparé à 30 partir de cellules fraîches. Le procédé de purification selon l'invention consiste à séparer les phycobiliprotéines, en particulier résistantes aux pH acides, recherchées de ces autres matières organiques telles que micelles et les autres protéines hydrosolubles. 3064635 5 Les microorganismes cultivés pour produire des phycobiliprotéines sont bien connus de l'homme du métier, en particulier choisis parmi le groupe des Cyanophyceae comme Arthrospira platensis (Spiruline), Spirulina maxima, Synechococcus elongatus, ou bien le groupe des cyanidiophyceae tel que Galdieria 5 sulphuraria, Cyanidium caldiarium, Cyanidioschyzon merolae. De manière préférée, les phycobiliprotéines sont des phycocyanines résistantes aux pH acides. Par phycobiliprotéines résistantes aux pH acides ou phycocyanines résistantes aux pH acides, on entend des phycobiliprotéines qui résistent à la précipitation aux pH acides. Par pH acide, on entend selon l'invention 10 un pH inférieur à 7, avantageusement de 6 ou moins. Avantageusement, les phycobiliprotéines résistantes aux pH acides ne précipitent pas dans une solution aqueuse à des pH inférieurs à 6. On pourra également les qualifier indifféremment de résistantes ou de stables aux pH acides. Bien entendu, les phycobiliprotéines purifiées selon l'invention seront plus ou 15 moins stables selon le pH acide considéré. Certaines seront stables dans une plage de valeur de pH voisine de 6. D'autres seront stables à des valeurs de pH bien inférieures à 6. Par conséquent, par phycobiliprotéine résistante au pH acide, on entend également un mélange de phycobiliprotéines dont la majorité ne précipite pas à un pH inférieur à 7, avantageusement inférieur à 6 ou moins. De manière avantageuse, l'invention concerne des phycobiliprotéines stables à des pH inférieurs à 5, préférentiellement inférieurs ou égaux à 4, plus préférentiellement allant de 4 à 2, encore plus préférentiellement inférieurs ou égaux à 3,5. De telles phycocyanines résistantes aux pH acides sont connues de l'homme du métier, notamment décrites dans la demande WO 2016/099261 ou la demande WO 2017/050918. Il s'agit en particulier de phycocyanines produites par des souches de microalgues des genres Cyanidioschyzon, Cyanidium ou Galdieria, notamment choisis parmi les espèces Cyanidioschyzon merolae 10D, Cyanidioschyzon merolae DBV201, Cyanidium caldarium, Cyanidium daedalum, Cyanidium maximum, Cyanidium partitum, Cyanidium rumpens, Galdieria daedala, Galdieria maxima, Galdieria partita, Galdieria sulphuraria, en particulier des souches de Galdieria sulphuraria, Cyanidium caldarium et Cyanidioschyzon merolae. Ces phycocyanines sont un mélange de c-phycocyanine (C-PC) et d'allophycocyanine (APC). 3064635 6 Avantageusement, l'apoprotéine de la C-PC comprend la protéine de SEQ ID NO 1 ou de SEQ ID NO 2 ou un variant de celles-ci. En particulier, l'apoprotéine de la sous-unité a de la C-PC comprend la protéine de SEQ ID NO 1 et l'apoprotéine de la sous-unité 13 de la C-PC comprend la protéine de SEQ ID NO 2 ou des variants de 5 celles-ci. SEQ ID 1 : MKTPITEAIA AADNQGRFLS NTELQAVNGR YQRAAASLEA ARSLTSNAQR LINGAAQAVY SKFPYTSQMP GPQYASSAVG KAKCARDIGY YLRMVTYCLV VGGTGPMDEY LIAGLEEINR TFDLSPSVVYV EALNYVKSNH GLSGQAANEA NTYIDYAINA LS 10 SEQ ID 2: MLDAFAKVVA QADARGEFLS NTQLDALSKM VSEGNKRLDV VNRITSNASA IVTNAARALF SEQPQLIQPG GNAYTNRRMA ACLRDMEIIL RYVSYAIIAG DSSVLDDRCL NGLRETYQAL GVPGASVAVG VEKMKDSAIA IANDPSGITT GDCSALMAEV GTYFDRAATA VQ Également avantageusement, la sous-unité a de ladite APC comprend la SEQ 15 ID NO 3 ou des variants de celles-ci et l'apoprotéine de la sous-unité p de ladite APC comprend la SEQ ID NO 4 ou des variants de celles-ci. SEQ ID 3: MSLISQIINT ADEELRYPNG GELSTLIYFF NTANTRINII NKLKEREKDI IQNASKKLFQ LHPEYVSSGG NASGPKQRAL CLRDYGVVYLR LVTYGILAGD ITPIEKIGII GVKDMYNSLG VPIIGMYDAI KCLKEASINI FELSEEKDLI 20 IPYFDYLSNA ILS SEQ ID 4: MSIVTKSIVN ADAEARYLSP GELDRIKSFV LSGQRRLRIA QILTDNRERI VKQAGQQLFQ QRPDIVSPGG NAYGEEMTAT CLRDLDYYLR LVTYGVVAGD ISPIEEIGLE DFMQDAITAV INTADVQGKY LDNSSIEKLK GYFQTGELRV RAAATIAANA AGIIKDAVAK SLLYSDITRP GGNMYTTRRY 25 AACIRDLDYY LRYATYSMLA GDPSILDERV LNGLKETYNS LGVPIGATIQ S I QAM KEVTS SLV Les apoprotéines des C-PC et APC d'une même source de phycocyanines ont généralement des points isoélectriques différents. En baissant le pH, il sera possible de séparer au moins en partie les C-PC des APC. 30 En effet, les inventeurs ont constaté que plus le pH de l'extrait brut était ajusté bas, plus les C-PC obtenues étaient pures. De manière avantageuse, lorsque la phycobiliprotéine est une phycocyanine résistante aux pH acides, l'abaissement du pH en deçà du point isoélectrique de l'APC 3064635 7 permet d'obtenir une phycocyanine comprenant un mélange C-PC/APC dont le rapport molaire est d'au moins 5, préférentiellement d'au moins 10, plus préférentiellement d'au moins 15. De préférence, le pH de l'extrait brut dans l'étape a) est ajusté à un pH inférieur 5 à 5. On peut obtenir alors de la phycocyanine résistante aux pH acides comprenant moins de 5% Molaires d'APC, préférentiellement moins de 1°A, plus préférentiellement moins de 0,1% d'APC, les pourcentages étant exprimés par rapport à la somme totale d'APC et de C-PC. Dans l'étape a), l'ajustement du pH se fait par l'ajout d'un acide, minéral ou 10 organique, fort ou faible, sous forme de solide ou de solution, la quantité d'acide ajoutée étant déterminée par le pH de l'extrait brut à traiter et la valeur de pH que l'homme du métier cherchera à obtenir. Parmi les acides minéraux bien connus de l'homme du métier, on citera plus particulièrement l'acide chlorhydrique et l'acide phosphorique. Parmi les acides organiques bien connus de l'homme du métier, on 15 citera en particulier l'acide acétique, l'acide citrique, l'acide tartrique, l'acide lactique, de préférence l'acide citrique. On peut également citer les polyphénols acides comme l'acide rosmarinique, l'acide tannique, l'acide digallique, l'acide quercitannic, l'acide gallotannique, les tannins acides comme la quercitine, les ellagitannines, castalagine, castaline, casuariticine, grandinine, punicaligine punicaline, roburine A, 20 tellimagrandine II, terflavine B, vescaligine, pendunculagine, casuariine, castline, vescaline, de préférence l'acide tannique. De préférence, les acides employés sont des acides autorisés pour un usage alimentaire, en particulier l'acide phophorique, l'acide citrique ou l'acide tannique. Pour l'étape b) de récupération du surnageant comprenant les phycobiliprotéines 25 résistantes aux pH acides, toute méthode de séparation connue de l'homme du métier pourra être employée, notamment par filtration tangentielle sur membranes céramiques ou membranes organiques tel que les fibres creuses en polyethersulfone. Les seuils de ces filtres peuvent être choisis pour séparer des molécules de poids moléculaire supérieur ou inférieur aux phycobiliprotéines ciblées. 30 Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la séparation à l'étape b) est faite par filtration tangentielle. Cette étape permet de concentrer et d'éliminer une partie des protéines autre que les phycobiliprotéines, augmentant ainsi le taux de pureté du produit final. 3064635 8 L'étape c) de séchage/déshydratation des phycobiliprotéines résistantes aux pH acides à partir du surnageant se fait par toute méthode d'élimination du solvant, l'eau en l'occurrence, par exemple par évaporation à pression atmosphérique ou sous vide. On citera en particulier l'atomisation, la lyophilisation, la zéodratation, le séchage par 5 infra rouge, ou le séchage par fenêtre de réfraction. Dans l'éventualité d'une évaporation par chauffage, l'homme du métier fera attention à ne pas employer des températures trop élevées susceptibles de provoquer une dénaturation des phycobiliprotéines. Il est possible, après récupération du surnageant à l'étape b), de recycler les 10 phycobiliprotéines contenues dans le précipité. Pour ce faire, les phycobilliprotéines résiduelles sont solubilisées dans une solution aqueuse de pH acide, d'environ 6, ou moins, pH auquel les impuretés restent insolubles alors que les phycobiliprotéines sont solubles. Ces phycobiliprotéines résiduelles sont alors séparées des impuretés et isolées 15 en reprenant les étapes b) et c) du procédé. C'est un processus itératif qui peut être répété autant de fois que nécessaire. Lorsque les conditions employées pour le procédé selon l'invention permettent une purification préférentielle des C-PC, les phycobiliprotéines résiduelles sont un mélange C-PC/APC enrichi en APC. Par le recyclage du précipité on obtient alors des phycobiliprotéines comprenant 20 un mélange C-PC/APC dont le rapport Molaire est inférieur à 5, en particulier inférieur à 4, avantageusement de l'ordre de 3 à 0,1. En reprenant les étapes a) à c) du procédé, précédemment décrit, on peut par un processus itératif, d'une part épuiser le précipité en C-PC, qui peut être jointe aux fractions précédemment obtenues pour en enrichir la teneur et d'autre part enrichir le 25 mélange résiduel de phycobiliprotéines en APC, avec un rapport APC/C-PC d'au moins 5, préférentiellement d'au moins 10, plus préférentiellement d'au moins 15. On peut obtenir alors un mélange d'APC comprenant moins de 5% Molaires de CPC, préférentiellement moins de 1%, plus préférentiellement moins de 0,1% de CPC, les pourcentages étant exprimés par rapport à la somme totale d'APC et de C30 PC. Ces APC isolées à partir du précipité peuvent ensuite être à nouveau purifiées par des techniques de chromatographie préparative bien connues de l'homme du métier pour la production d'allophycocyanines susceptible d'être employées comme dans le domaine de l'imagerie médicale par exemple de part ces propriétés 3064635 9 fluorescentes L'invention concerne également les phycobiliprotéines résistantes aux pH acides, en particulier phycocyanines, susceptibles d'être obtenues par le procédé de purification. 5 L'invention concerne aussi des phycocyanines purifiées résistantes aux pH acides comprenant un mélange C-PC/APC dont le rapport molaire est d'au moins 2. En particulier, l'invention concerne une phycocyanine résistante aux pH acides qui comprend au moins 95% Molaires de C-PC et moins de 5% Molaires d'APC, préférentiellement au moins 99% Molaires de C-PC et moins de 1`)/0 Molaires d'APC, 10 les pourcentages étant exprimés par rapport à la somme totale d'APC et de C-PC. Ces C-PC sont connues de l'homme du métier et notamment définies précédemment, en particulier celles dont la sous-unité a de la C-PC comprend la protéine de SEQ ID NO 1 et l'apoprotéine de la sous-unité 13 de la C-PC comprend la protéine de SEQ ID 2 ou des variants de celles-ci. 15 De manière avantageuse, les variants selon l'invention présentent une identité de séquence d'au moins 83 % pour les sous-unités a de la C-PC, et d'au moins 82% pour les sous-unitési3de la C-PC. De manière préférentielle, les variants selon l'invention ont une identité d'au moins 90% pour les sous-unités a (SEQ ID NO 1) et 13 (SEQ ID NO 2). 20 L'invention concerne également une phycocyanine purifiée enrichie en APC susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'invention. En particulier, l'invention concerne de la phycocyanine purifiée qui comprend un mélange enrichi en APC dont le rapport Molaire C-PC/APC est inférieur à 5, en particulier 4, avantageusement de l'ordre 3 à 0,1. 25 Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le mélange enrichi en APC a un rapport APC/C-PC d'au moins 5, préférentiellement d'au moins 10, plus préférentiellement d'au moins 15. Selon un mode plus particulier de réalisation de l'invention, la phycocyanine est constituée essentiellement d'APC, avec au moins 95% Molaires d'APC et moins de 30 5% Molaires de C-PC, préférentiellement au moins 99% Molaires d'APC et moins de 1% Molaires de C-PC, les pourcentages étant exprimés par rapport à la somme totale d'APC et de C-PC. 3064635 10 Ces APC sont connues de l'homme du métier et notamment définies précédemment, en particulier celles dont la sous-unité a de ladite APC comprend la SEQ ID NO 3 ou des variants de celles-ci et l'apoprotéine de la sous-unité 13 de ladite APC comprend la SEQ ID NO 4 ou des variants de celles-ci. 5 De manière avantageuse, les variants selon l'invention présentent une identité de séquence d'au moins 83 % pour les sous-unités a de l'APC, et d'au moins 82% pour les sous-unités I3de l'APC. L'homme du métier sait comment mesurer une identité de séquences protéiques selon les méthodes usuelles à sa disposition, notamment le programme BLASTP 10 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). De même, l'homme du métier sait comment identifier des variants desdites séquences et vérifier qu'ils conservent les mêmes propriétés structurelles par simple essai de stabilité en pH acide, par exemple en pratiquant un essai comme l'essai présenté à l'exemple 3 de la demande WO 2017/050918. 15 Il est connu de l'homme du métier qu'un polypeptide peut être modifié par substitution, insertion et/ou délétion d'au moins un acide aminé sans modifier de manière substantielle sa fonction. Par exemple, la substitution d'un acide aminé à une position donnée par un autre acide aminé chimiquement équivalent est un exemple connu de variation de séquence 20 qui n'affecte pas de manière substantielle les propriétés de la protéine. Ces substitutions "conservatrices" peuvent être définies comme des échanges à l'intérieur des groupes d'acides aminés suivants - Ala, Ser, Thr, Pro, Gly - Asp, Asn, Glu, Gln 25 - His, Arg, Lys - Met, Leu, lie, Val, Cys et - Phe, Tyr, Trp Ainsi, les variants des apoprotéines des phycocyanines et/ou des allophycocyanines selon l'invention peuvent comprendre de 1 à 30 acides aminés de 30 différence en nombre par rapport à la séquence dite de référence correspondante, particulièrement pour ce qui concerne les sous unités a et/ou 13 de la phycocyanine, dans la mesure où le variant obtenu conserve les propriétés de la protéine de référence et les pourcentages d'homologie/identité énoncés ci-dessus. 3064635 11 Plus précisément selon l'invention, - pour les variants des apoprotéines de la sous-unité a des phycocyanines utilisables dans les compositions acides selon l'invention, issus de substitutions, d'insertions et/ou de délétions, ils peuvent comprendre de 1 à 27 acides aminés 5 de différence par rapport à la séquence dite de référence correspondante, dans la mesure où le variant obtenu conserve les propriétés de la protéine de référence et les pourcentages d'identité énoncés ci-dessus; - pour les variants des apoprotéines de la sous-unité des phycocyanines utilisables dans les compositions acides selon l'invention, issus de substitutions, 10 d'insertions et/ou de délétions, ils peuvent comprendre de 1 à 30 acides aminés de différence par rapport à la séquence dite de référence correspondante, dans la mesure où le variant obtenu conserve les propriétés de la protéine de référence et les pourcentages d'identité énoncés ci-dessus; - pour les variants des apoprotéines de la sous-unité a des allophycocyanines 15 utilisables dans les compositions acides selon l'invention, issus de substitutions, d'insertions ou de délétions, ils peuvent comprendre de 1 à 24 acides aminés de différence par rapport à la séquence dite de référence correspondante, dans la mesure où le variant obtenu conserve les propriétés de la protéine de référence et les pourcentages d'identité énoncés ci-dessus; 20 - pour les variants des apoprotéines de la sous-unité des allophycocyanines utilisables dans les compositions acides selon l'invention, issus de substitutions, d'insertions et/ou de délétions, ils peuvent comprendre de 1 à 20 acides aminés de différence par rapport à la séquence dite de référence correspondante, dans la mesure où le variant obtenu conserve les propriétés de la protéine de 25 référence et les pourcentages d'identité énoncés ci-dessus. Très particulièrement selon l'invention, et quelle que soit la séquence de référence considérée (sous-unité a et/ou de la phycocyanine et/ou sous-unité a et/ou de l'allophycocyanine) les variants desdites sous-unités peuvent comprendre avantageusement de 1 à 15 acides aminés de différence, de préférence de 1 à 10 30 acides aminés de différence, en particulier bu 2 ou 3 ou 4 ou 5 ou 6 ou 7 ou 8 ou 9 ou 10 acides aminés de différence par rapport à la séquence dite de référence correspondante, dans la mesure où le variant obtenu conserve les propriétés de la protéine de référence et les pourcentages d'identité énoncés ci-dessus. De préférence, l'invention concerne la C-PC dont la protéine de la sous unité 3064635 12 alpha consiste en la protéine de SEQ ID 1 et la protéine de la sous unité bêta consiste en la protéine de SEQ ID 2. Selon un autre mode préféré, l'invention concerne l'APC dont la protéine de la sous unité alpha consiste en la protéine de SEQ ID 3 et la protéine de la sous unité 5 bêta consiste en la protéine de SEQ ID 4. Les phycobiliprotéines sont des colorants naturels essentiellement employés pour la coloration des aliments. L'invention concerne aussi l'utilisation des phycobiliprotéines résistantes aux pH acides obtenues par le procédé selon l'invention et en particulier les phycocyanines 10 résistantes aux pH acides définies ci-dessus comme colorant dans un produit alimentaire. L'invention concerne aussi une composition en particulier alimentaire comprenant de la phycobiliprotéine résistante aux pH acides obtenue par le procédé selon l'invention et en particulier de la phycocyanine résistante aux pH acides définies 15 ci-dessus. De telles utilisations et de telles compositions sont connues de l'homme du métier. De manière préférentielle, le produit alimentaire ou la composition alimentaire est une composition acide, telle que définie dans la demande WO 2017/050918. 20 Par composition acide on entend selon l'invention toute composition comprenant un acide minéral ou organique et de la phycocyanine. Cette composition peut être liquide, fluide ou visqueuse, pâteuse ou solide qui présente un pH acide et dans laquelle de la phycocyanine résistante au pH acide est incorporée. Pour les compositions liquides aqueuses, le pH est mesuré de manière usuelle. 25 Pour les compositions liquides non aqueuses ou pour les compositions pâteuses ou solides, le pH est mesuré après dissolution de la composition dans une quantité d'eau suffisante pour dissoudre les composés solubles qu'elle contient, dont les acides minéraux ou organiques et la phycocyanine. De manière avantageuse la composition selon l'invention est une composition 30 liquide aqueuse, éventuellement sous forme d'un gel, ou une composition pâteuse ou solide destinée à être dissoute dans une solution aqueuse ou dans une composition solide ou pâteuse comprenant de l'eau. Selon un autre mode avantageux de réalisation de l'invention, la composition acide composition pâteuse ou solide destinée à être employée et/ou stockée dans un environnement humide. 3064635 13 Les acides minéraux ou organiques susceptibles d'être employés dans les compositions selon l'invention sont bien connus de l'homme du métier. Parmi les acides minéraux, on citera en particulier les acides carbonique, phosphorique, chlorhydrique, sulfurique, perchlorique, sulfonique et nitrique. Parmi les acides 5 organiques, on citera en particulier les acides citrique, lactique, malique, tartrique, succinique, avantageusement l'acide citrique. Par composition alimentaire acide selon l'invention on entend toute composition destinée à être ingérée par l'homme ou les animaux qui entre dans la définition précédente. Les compositions acides neutraceutiques doivent être considérées 10 comme entrant dans la définition des compositions alimentaires acides au sens de l'invention. Les compositions alimentaires acides selon l'invention sont bien connues de l'homme du métier. Elles peuvent comprendre un véhicule pouvant comprendre des constituants structurels associé à des composés actifs identifiés au regard de leurs 15 apports nutritifs ou encore pour leurs propriétés bénéfiques à la santé de l'homme ou de l'animal. La composition alimentaire acide selon l'invention peut également comprendre des additifs alimentaires comme des agents de texture, des agents de saveur, des agents conservateurs, tous constituants bien connus de l'homme du métier. Le véhicule peut comprendre de l'eau et/ou des protéines et/ou des matières 20 grasses et/ou des fibres et/ou des sucres. Les constituants du véhicule peuvent avoir uniquement des propriétés structurelles mais ils sont généralement connus pour leurs apports nutritifs. La composition alimentaire acide selon l'invention peut être prête à l'emploi ou bien sous forme d'un additif alimentaire que l'on ajoute à une préparation solide, 25 pâteuse ou liquide pour préparer l'aliment qui pourra être ingéré. Pour les compositions alimentaires, l'acide sera choisi de préférence dans la liste des acidifiants autorisés dans l'alimentation, en particulier les acides carbonique, phosphorique, citrique, malique, tartrique et lactique, plus particulièrement l'acide citrique. 30 Concernant les compositions acides autres qu'alimentaires selon l'invention elles peuvent être entre autres pharmaceutiques, vétérinaires ou cosmétiques et comprendre en outre tout additifs et/ou actifs connus et utilisés dans ce genre de composition. Dans une composition acide solide, liquide ou pâteuse selon l'invention, la 3064635 14 phycocyanine peut être incorporée par exemple sous forme de poudre. Ladite composition acide, particulièrement ladite composition alimentaire acide pourra alors se présenter sous toute forme usuelle connue telle que des crèmes, gels, mousses, pates, etc... Particulièrement pour une composition alimentaire solide on peut citer 5 notamment les gâteaux ou biscuits, les aliments secs à cuire, les poudres à diluer, les compositions gélatineuses solides ou "jelly", des mousses etc. Selon l'invention, ladite composition acide liquide pourra être une composition aqueuse dans laquelle la phycocyanine est dissoute. Elle peut se présenter sous la forme d'une composition prête à l'emploi ou comme un concentré liquide à diluer, 10 notamment pour son ingestion ou à ajouter à un aliment solide soit pour sa préparation, soit pour son ingestion, par exemple une composition liquide concentrée d'enrobage ou "topping" qui sera déposée sur un gâteau pour lui apporter sa couleur. Parmi ces compositions concentrées, on peut citer les sirops, alcoolisés ou non. La composition acide liquide selon l'invention peut être de viscosité variable et 15 comprendre ou non des additifs tels que des agents de viscosité, des gélifiants, et autres additifs structurants connus de l'homme du métier et usuels pour la préparation de compositions alimentaires liquides. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la composition alimentaire liquide peut être une boisson acide, gazeuse ou non. On citera en particulier les sodas, 20 les jus, les boissons pour sportifs, boissons d'effort, boissons de récupération, etc. Les compositions de ces boissons sont bien connues de l'homme du métier et peuvent comprendre, notamment, des sucres, des sels minéraux, des additifs alimentaires, du gaz dissout, etc. La boisson selon l'invention est une boisson acide usuelle dans laquelle le colorant habituellement employé a été remplacé en totalité ou en partie par 25 une phycocyanine résistante à un pH acide selon l'invention. Selon l'invention la teneur en phycocyanine dans les compositions selon l'invention pourra être conforme aux usages de l'homme du métier. Par exemple lorsque la phycocyanine sera utilisée pour colorer la composition acide alors la teneur en phycocyanine dans ladite composition pourra être conforme 30 aux usages de l'homme du métier en matière de coloration. Dans une composition acide liquide au sens de l'invention la teneur en phycocyanine peut être comprise entre 2,5 mg/L et 2500 mg/L, préférentiellement entre 25 mg/L et 300 mg/L. Dans une composition liquide de type boisson prête à l'emploi, la teneur en 3064635 15 phycocyanine peut être généralement comprise entre 25 mg/I et 300 mg/L, préférentiellement entre 50 mg/L et 100 mg/L. Dans une composition liquide concentrée à diluer pour son usage, comme un sirop, la teneur en phycocyanine peut être généralement comprise entre 250 mg/I et 5 2500 mg/I, préférentiellement entre 500 mg/L et 1000 mg/L. Dans une composition solide, la teneur en phycocyanine peut être généralement comprise entre 0,01 mg/g et 10 mg/g, préférentiellement entre 0,1 mg/g et 5,0 mg/g, très préférentiellement entre 0,25 mg/g et 2,5 mg/g. 10 EXEMPLES Exemple 1. Purification par précipitation acide sur cellule fraiche. Un moût de fermentation de cellule de Galdieria sulphuraria centrifugé puis rincé avec un volume équivalent d'eau à subit un broyage mécanique afin de libérer les phycobiliprotéines dans une phase aqueuse à pH 6. Le broyat est acidifié par pallier 15 de 0,5 unité pH par ajout d'acide citrique. A chaque pallier, un prélèvement du mélange est effectué puis centrifugé 10 min à 11 000 g. Le surnageant contenant les phycobiliprotéines est prélevé et l'indice de pureté mesuré en faisant le rapport d'absorbance à 618 nm sur l'absorbance à 280 nm avec un spectrophotomètre (Amersham Biosciences Ultra Spec 2100 Pro). 20 Il apparaît clairement que plus le pH baisse plus le l'indice de pureté augmente (Figure 1). Cette augmentation de l'indice de pureté traduit une baisse des protéines contaminantes dans le surnageant, alors que la C-PC, elle, reste majoritairement dans le surnageant. De par sa résistance au pH acide il n'y a pas de perte importante de la teneur en C-PC dans le surnageant (Figure 2). De façon surprenante, 25 l'allophycocyanine (APC) elle disparaît totalement du surnageant pour des valeurs de pH inférieures à 5, pour se retrouver dans le culot avec les autres protéines précipitées et les débris cellulaires (Figure 3). Dans ce culot on retrouve également de la C-PC et de l'APC avec une teneur plus élevée en APC (Figure 3). L'acidification permet également d'obtenir une meilleure séparation des phases 30 liquide et solide et d'obtenir un culot de débris cellulaire et de protéines plus compacte et plus facile à séparer de la phase aqueuse. Exemple 2. Purification par précipitation acide sur cellule lyophilisée et réhydratées. 3064635 16 Un moût de fermentation de cellule de Galdieria sulphuraria centrifugé puis rincé avec un volume équivalent d'eau à subit un broyage mécanique afin de libérer les phycobiliprotéines dans une phase aqueuse à pH 6. Le broyat ensuite lyophilisé. La matière sèche lyophilisée est suspendue dans un volume d'eau équivalent au volume 5 initial du moût puis acidifié par pallier de 0,5 unité pH par ajout d'acide citrique. A chaque pallier, un prélèvement du mélange est effectué puis centrifugé 10 min à 11 000 g. Le surnageant contenant les phycobiliprotéines est prélevé et l'indice de pureté mesuré en faisant le rapport d'absorbance à 618 nm sur l'absorbance à 280 nm avec un spectrophotomètre (Amersham Biosciences Ultra Spec 2100 Pro). 10 Comme ce qui a été précédemment décrit dans l'exemple 1, nous pouvons constater une augmentation de l'indice de pureté corrélée avec une baisse du pH (Figure 4). Dans ce cas également, l'acidification permet également d'obtenir une meilleure séparation des phases liquides et solides et d'obtenir un culot de débris cellulaire et de protéines plus compacte et plus facile à séparer de la phase aqueuse. 15 De façon similaire à ce qui a été observé dans l'exemple 1, l'APC est retrouvée dans le culot et non dans la phase aqueuse (Figure 5) pour des pH inférieurs à 5. Pour des pH compris entre 6 et 5, la quantité d'APC diminue dans le surnageant en fonction de la baisse du pH. 20 Exemple 3. Purification et concentration la C-PC par filtration tangentielle. L'extrait brut après précipitation acide et centrifugation est filtré sur un module de filtration tangentielle de type fibre creuse. La filtration à travers ce maillage permet d'éliminer une partie des protéines autres que la C-PC et d'augmenter ainsi l'indice de pureté (Figure 6). L'indice de pureté pouvant être atteint par cette méthode 25 approche des valeurs normalement obtenues par des méthodes beaucoup plus complexe faisant intervenir des extractions biphasiques, ou des précipitations au sulfate d'ammonium, voir même des méthodes de chromatographie (Soresen et al., 2013; Cruz de Jesùs et al., 2006). En parallèle de la purification cette étape de filtration permet d'éliminer l'eau de l'extrait de C-PC (Figure 7), et de faciliter le 30 séchage du produit par la suite. 3064635 17 REFERENCES - Moon, Myounghoon, Sanjiv K Mishra, Chul Woong Kim, William I Suh, Min S Park, and Ji-Won Yang. "Isolation and Characterization of Thermostable Phycocyanin 5 from Galdieria Sulphuraria," Korean journal of chemical engineering, 31(2014): 1- 6. - Verônica Cruz de Jesùs, Gabriel Alfonso Gutiérrez-Rebolledo, Marcela Hernàndez-Ortega, Lourdes Valadez-Carmona, Angélica Mojica-Villegas, Gabriela Gutiérrez-Salmeàn and Germàn Chamorro-Cevallos. Methods for 10 Extraction, Isolation and Purification of C-phycocyanin: 50 years of Research in Review. (2016) Int J Food Nutr Sci 3(3): 1- 10. - Laila Sørensen, Andrea Hantke, Niels T. Eriksen. Purification of the photosynthetic pigment C-phycocyanin from heterotrophic Galdieria sulphuraria. J Sci Food Agric. 2013 Sep;93(12):2933-8. 15 - Eriksen NT. Production of phycocyanin - a pigment with applications in biology, biotechnology, foods and medicine. Appl Microbiol Biotechnol. 2008 Aug;80(1):1- 14. REVENDICATIONS1. Procédé de purification de phycobiliprotéines résistantes aux pH acides à partir d'un extrait brut de phycobiliprotéines résistantes aux pH acides provenant de 5 cellules de microorganismes producteurs de phycobiliprotéines, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de a) ajustement du pH de l'extrait brut de phycobiliprotéines résistantes aux pH acides à un pH inférieur à 6 de manière à faire précipiter les matières organiques autres que les phycobiliprotéines résistantes aux pH acides, 10 b) récupération du surnageant comprenant les phycobiliprotéines résistantes aux pH acides et c) isolation des phycobiliprotéines résistantes aux pH acides à partir du surnageant. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la 15 phycobiliprotéine est de la phycocyanine résistante aux pH acides. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la phycocyanine comprend un mélange c-phycocyanine (C-PC) et d'allophycocyanine (APC), le rapport molaire C-PC/APC étant d'au moins 5. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le 20 pH du milieu de culture dans l'étape a) est ajusté à un pH inférieur à 5. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la phycobiliprotéine comprend au moins 95% de C-PC résistante aux pH acides et moins de 5% Molaires d'APC, les pourcentages étant exprimés par rapport à la somme totale d'APC et de C-PC. 25 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la récupération du surnageant est faite par filtration. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le microorganisme producteur de phycobiliprotéine est choisi parmi les souches de microalgues des genres Cyanidioschyzon, Cyanidium ou Galdieria. 30 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la microalgue est choisie parmi les souches Galdieria sulphuraria, Cyanidium caldarium et Cyanidioschyzon merolae. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que les phycobiliprotéines contenues dans le culot sont solubilisées dans une solution 3064635 19 aqueuse de pH acide et séparées des impuretés et isolées en reprenant les étapes b) et c). 10. Phycobiliprotéine résistante aux pH acides obtenue par le procédé selon l'une des revendications 1 à 9. 11. Phycocyanine résistante aux pH acides comprenant un mélange c- phycocyanine (C-PC) et d'allophycocyanine (APC), caractérisée en ce que le rapport molaire C-PC/APC est d'au moins 5. 12. Phycocyanine selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle comprend moins de 5% Molaires d'APC. 13. Phycocyanine selon l'une des revendications 11 ou 12, caractérisée en ce que l'apoprotéine de la sous-unité a de la C-PC comprend la SEQ ID NO 1 et l'apoprotéine de la sous-unité 13 de la C-PC comprend la SEQ ID 2 ou des variants de celles-ci. 14. Utilisation d'une phycobiliprotéine selon la revendication 10 ou d'une 15 phycocyanine selon l'une des revendications 11 à 13, comme colorant dans un produit alimentaire. 15. Composition alimentaire caractérisée en ce qu'elle comprend une phycobiliprotéine selon la revendication 10 ou une phycocyanine selon l'une des revendications 11 à 13. 20 16. Phycocyanine comprenant un mélange d'allophycocyanine (APC) et de la c-phycocyanine (C-PC) dont le rapport Molaire C-PC/APC est inférieur à 5. 17. Phycocyanine selon la revendication 16, caractérisée en ce que l'apoprotéine de la sous-unité a de l'APC comprend la SEQ ID NO 3 et l'apoprotéine de la sous-unité 13 de l'APC comprend la SEQ ID 4 ou des variants de celles-ci. 25