Brevet FR3074489A1 — publié le 20190607

Plateforme de nanostructures pour I'interfacage cellulaire et procede de fabrication correspondant 1. Domaine La presente technique se rapporte aux domaines des nanostructures et plus particulierement des nanostructures a destination de captation de phenomenes biologiques. Plus particulierement, la presente technique se rapporte a une plateforme de mesure et de stimulation de cellules de type neurales ou encore de cardiomyocytes, et plus generalement a tout type de cellules dont il est envisageable de capter une activite electrique ou electrophysiologique, pouvant etre des cultures cellulaires dissociees (neurones, cellules musculaires cardiaques, ...), des cultures tissulaires d'organe ou des tranches de tissus (hippocampe, cervelet, moelle epiniere, refine, ...) ou des cultures de cellules derivees de cellule souches. 2. Art Anterieur L'etude des etats electrophysiologiques des cellules excitables (neurones, cardiomyocytes) et des groupes et reseaux formes par ces cellules permet d'ameliorer la comprehension des etats fonctionnels et pathologiques des organes auxquels ces cellules se rapportent. L'etat electrophysiologique de la cellule est traditionnellement etudie avec des sondes qui peuvent avoir acces a l'interieur (cytoplasme) de la cellule, permettant ainsi les mesures des fluctuations de potentiels dune ou plusieurs cellules dans un reseau de cellules. Ces sondes comprennent des « patch-clamp » avec micropipette en verre, des matrices de microelectrodes/ nanoelectrodes (MEAs / NEA), et des nano-fils (nano-sonde) a effet de champs (FET), et avec differents materiaux, tels que des reseaux de nano-fils verticaux en sillicium (Si), platine (Pt) et oxyde d'iridium (IrOx). Des electrodes de micropipette en verre avec un procede de « patch-clamp » ont traditionnellement ete utilisees. Elles permettent de realiser des mesures de bonne qualite, mais d'une part elles ne peuvent pas etre utilisees pour un grand nombre de cellules de maniere simultanee (de fait de la difficulte de mise en oeuvre de ces sondes) et d'autre part elles entrainent la mort des cellules a relativement court terme, de fait de la penetration de la micropipette au sein de la cellule. 2 Plus recemment, les developpements technologiques ont permis de developper des reseaux de microelectrodes planaires qui sont devenus des plateformes standards de l'etude des reponses electrophysiologiques des reseaux cellulaires sur de longues periodes (plusieurs semaines). Ces reseaux de microelectrodes presentent I'avantage de ne pas alterer I'enveloppe de 5 des cellules et donc de ne pas entrainer Ia mort prematuree de celles-ci. Cependant, les reseaux de microelectrodes planaires presentent !Inconvenient de ne pas pouvoir acceder au cytoplasme cellulaire et donc de ne pas pouvoir mesurer les variations de potentiel a l'interieur de Ia cellule de maniere aussi precise que les electrodes a micropipette. Or Ia mesure des variations de potentiels est une donnee importante qu'iI convient de mesurer. Le probleme principal reside 10 cependant de ces reseaux existants et de ces plateformes est Ia faible interaction cellule/microelectrodes qui induit des signaux (potentiel d'action) tres degrades en termes d'amplitude et donc difficilement utilisables. Les plateformes et reseaux a base de microelectrodes ont fait ('objet de developpements technologiques importants, tels que ceux presentes dans les documents US7,905,013 et 15 W02017127551. Dans l'exemple de US7,905,013, une couche dielectrique sur une couche conductrice est gravee selectivement a l'etat humide, formant des trous de contact avec des parois inclinees dans Ia couche dielectrique et exposant des regions de Ia couche conductrice. Des interfaces neuronales de nano-fils IrOx sont ensuite developpees a partir des regions exposees de Ia couche 20 conductrice. Les interfaces neuronales a nano-fils IrOx ont chacune une section transversale comprise entre 0,5 et 10 micrometres, une hauteur moyenne comprise entre environ 10 nanometres (nm) et environ 10 micrometres (p.m) et un diametre d'extremite proximal moyen dans une plage d'environ 1 nm a environ 1 p.m. Zhang rapporte des grappes de sondes sur des puces allant de 1 a 100 millimetres carres. Les groupes comprennent chacun de 2 a jusqu'a 12 25 electrodes, situees dans un diametre de groupe compris entre 5 et 50 micrometres, le nombre de groupes sur Ia puce etant compris entre 2 et 100. Dans l'exemple de W02017127551, un reseau de capteurs a sonde neurale est decrit. Un tel reseau comprenant un substrat avec un motif metallique sur celui-ci. Un reseau de sondes de nano-fils verticaux semi-conducteurs s'etend a distance du substrat, et les sondes sont adressees 30 electriquement, de maniere individuelle, a travers le motif metallique. Le motif metallique est isole avec un dielectrique, et les parties de base et les tiges des nano-fils sont egalement de 3 preference isolees. Cette plateforme permet de stimuler individuellement les cellules qui prennent place sur les nano-fils. Bien que permettent de mesurer les potentiels electriques des cellules qui ont une activite electriques, voire de les grouper en reseaux ordonnes de cellules, ces plateformes ne 5 permettent pas de mesurer tout a la fois les potentiels electrique et les concentrations d'ions extracellulaires. Or l'obtention de ces deux informations est preferable afin de permettre une meilleure analyse des phenomenes electrochimiques qui parcourent les reseaux de cellules. 3. Résumé 10 La presente technique a ete construite sur Ia base de ces problemes de l'art anterieur. Plus particulierement, Ia presente technique se rapporte a une plateforme de mesure et de stimulation de cellules de type neurales ou encore de cardiomyocytes, et plus generalement a tout type de cellules dont il est envisageable de capter une activite electrique ou electrophysiologique. Plus particulierement, une plateforme de ce type ameliore les plateformes 15 connues en ce qu'elle permet tout a Ia fois de mesurer des potentiels electriques et des concentrations ioniques avec des resolutions cellulaires.. Plus particulierement, il est propose une plateforme pour l'interfagage cellulaire, comprenant au moins une nano-sonde a base de nano-fils comprenant chacun une extremite conductrice destinee a etre en contact avec une cellule, plateforme caracterisee en ce qu'elle 20 comprend au moins un transistor a effet de champs, dit nano-FET positionne a une distance predeterminee de ladite nano-sonde. Ainsi, il est possible, avec cette plateforme, de disposer de nano-dispositifs de detection et/ou de mesure de potentiel et de concentration ionique, sur un meme dispositif (Ia plateforme). Plus particulierement, grace a cette plateforme, il est possible de permet de mettre en correlation 25 le potentiel electrique et les courants ioniques mesures sur ces cellules. Selon un mode de realisation particulier, Ia plateforme comprend un ensemble de nanocapteurs, chaque nano-capteur comprenant un couple forme d'une nano-sonde et d'un nano-FET espace d'une distance comprise entre 1 et 5 micrometres. Ainsi, il est propose une plateforme comprenant des nano-capteurs, par exemple repartis 30 selon un schema predetermine, qui permet de detecter et/ou mesure l'activite electrophysiologique de cellules en culture et ou en developpement, sans qu'il soit necessaire de conformer Ia croissance ou le developpement de ces cellules. Une plateforme de ce type permet 4 de mesurer les potentiels et les concentrations d'ion d'ensembles de cellules avec une sensibilite superieure a celle des plateformes anterieures, de par le couplage nano-sonde et nano-FET. Selon un mode de realisation particulier, la plateforme comprend un ensemble de nano-sondes et un ensemble de nano-FETs repartis sur ladite plateforme pour former au moins un 5 reseau de nano-capteurs comprenant au moins un parcours predetermine. Ainsi, il est propose une plateforme qui permet tout a la fois de mesurer un potentiel electrique, a l'aide d'au moins une nano-sonde et un courant d'ion en extracellulaire avec un transistor. Des lors, les mesures realisables a l'aide d'une telle plateforme sont plus precises et plus fiables que celle realisees avec les plateformes et methodes de l'art anterieur. 10 Selon une caracteristique particuliere, la plateforme comprend en outre, des zones hydrophiles localisees au niveau des nano-sondes et dudit au moins un nano-FET. Selon une caracteristique particuliere, la plateforme comprend une pluralite de parcours predetermines, chaque parcours predetermine reliant au moins deux nano-sondes dudit reseau de nano-sondes. 15 Selon une caracteristique particuliere, la plateforme comprend en outre, des zones hydrophiles localisees au niveau desdits parcours predetermines. Ainsi, il est possible de favoriser la croissance des cellules sur les zones hydrophiles, et donc il est possible de conformer la croissance et le developpement des cellules aux emplacements ou sont disposes les nano-dispositifs de mesure et de stimulation des cellules. 20 Selon une caracteristique particuliere, chaque parcours predetermine entre deux nano- sondes comprend une pluralite de nano-FETs, chaque nano-FET etant implante a intervalles reguliers le long du parcours. Selon une caracteristique particuliere, chaque parcours predetermine entre deux nano-sondes comprend une pluralite de nano-sondes de parcours, chaque nano-sonde de parcours 25 etant implantee a intervalles reguliers le long du parcours. Selon un mode de realisation particulier, ladite au moins une nano-sonde comprend entre un et neuf nano-fils. Ainsi, la constitution de ces nano-sondes, a base de un a neuf fils, permet de favoriser ('interaction entre la sonde et la cellule ; En effet, les inventeurs ont constate qu'un nombre de fil 30 reduit (et donc une densite de fil moins importante) sur une sonde permet a la cellule, et plus particulierement au soma, d'epouser plus completement la sonde, et in fine, favorise la mesure 5 ou la stimulation. Dans un mode de realisation particulier, une nano sonde de soma comprend quatre nano-fils. Selon un mode de realisation particulier, le nano-FET est un transistor a ailette de type fin-FET. 5 Selon un autre aspect, ('invention se rapporte egalement a un procede de fabrication d'une plateforme pour l'interfagage intracellulaire, procede de type descendant. Selon ('invention, un tel procede comprend, posterieurement a une etape de structuration verticale d'au moins une nano-sonde a base de nano-fils, une etape de structuration planaire d'au moins un transistor a effet de champs, dit nano-FET. 10 Selon une caracteristique particuliere, posterieurement a l'etape de structuration planaire dudit au moins un nano-FETs, !edit procede comprend une etape de siliciuration de platine, provoquant !'implantation d'une couche de siliciure de platine (PtSi) sur ladite au moins une nano-sonde et sur des zone source (S) et de drain (D) dudit au moins un nano-FET. Selon une caracteristique particuliere, !edit procede comprend en outre une etape 15 d'adjonction, sur les nano-fils de ladite au moins une nano-sonde, d'un materiau organique conducteur, tel que le PEDOT:PSS. Selon une caracteristique particuliere, posterieurement a l'etape de structuration planaire dudit au moins un nano-FETs, !edit procede comprend une etape de fonctionnalisation de la surface de ladite plateforme definissant une pluralite de zones hydrophiles. 20 4. Dessins D'autres caracteristiques et avantages apparaitront plus clairement a la lecture de la description suivante d'un mode de realisation preferentiel, donne a titre de simple exemple illustratif et non limitatif, et des dessins annexes, parmi lesquels : la figure 1 decrit le principe de specialisation de surface optionnellement mis en oeuvre 25 sur une plateforme de la presente technique ; la figure 2 decrit un premier mode de realisation d'une plateforme de la presente technique ; la figure 3 decrit un deuxieme mode de realisation d'une plateforme de la presente technique ; 30 la figure 4a est une representation microscopique d'une nano-sonde de la presente technique ; 6 la figure 4b est une representation microscopique d'un nano-FET de la presente technique ; la figure 5 est une representation microscopique d'un nano capteur comprenant une nano-sonde et un nano-FET ; 5 la figure 6 est une representation simplifiee du procede de fabrication d'une plateforme dans un mode de realisation particulier. 5. Description 5.1. Rappels des principes 10 Comme exposé precedemment, la presente technique se rapporte a une plateforme de detection, de mesure et de stimulation pour l'interfagage intra-neuronal a l'echelle de la cellule individuelle. La plateforme repose sur des nano-dispositifs a base de nanostructures a ratio surface/volume tres eleves (nano-fils (NFs), nano-ailettes (Fin) qui combinent des reseaux verticaux (clamps) et des reseaux horizontaux (nano-transistors). Ces nano dispositifs permettent 15 de realiser des mesures de haute sensibilite. Ainsi, des nanostructures forment la base de nos nano dispositifs (nano-sondes, nanoFETs) d'enregistrement comprenant une interface a base de « PtSi ») qui rendent possibles un enregistrement de tres bonne resolution tout en restant isole du milieu de culture. Plus particulierement une plateforme de la presente technique comprend a la fois des nano-sondes de 20 mesure et de stimulation de cellules, a base de nano-fils verticaux et des transistors a effet de champs (nano-FETs) de mesure des concentrations d'ions traversant les cellules. La combinaison de ces deux types de nano-dispositif sur la plateforme permet de realiser des mesures de plus grande precision tout en garantissant une survie sur le « long » terme des cellules (plusieurs jours, voire semaines), de fait du caractere faiblement intrusif des nanostructures ainsi que de ('isolation 25 entre le milieu de culture de la cellule et de la plateforme. Coupler sur la meme plateforme mais surtout a une distance tres reduite (de la taille d'une cellule individuelle) une nanosonde de mesures de potentiel d'action avec un nano transistor pour la mesure de concentration d'especes ioniques ouvre de nouveaux champs d'etude en biologie. Ce couple de capteurs peut etre distribue sur la plateforme afin de mesurer l'activite electrique dans un reseau de cellules 30 electriquement excitable ou des tissus ou tranches d'organes comprenant des cellules electriquement excitables. Les mernes dispositifs peuvent simultanement exciter localement 7 (stimuler electriquement) une cellule ou une zone de cellules puis mesurer l'activite sur cette cellule ainsi que sur ('ensemble du reseau apres cette stimulation. Selon Ia presente technique, un premier mode de realisation de Ia plateforme se compose de couples de capteurs (nano-sondes verticales et transistors a effet de champs, par exemple de 5 type planaire, espaces de 1 a 5 p.m l'un de l'autre) qui sont distribues regulierement sur Ia partie utile de Ia surface de Ia plateforme afin de pouvoir acceder a une resolution spatiale du reseau de cellules et/ou de Ia coupe d'organe etudie, sans conformation de culture (a Ia difference du deuxieme mode de realisation). II s'agit de permettre, dans ce mode de realisation, ('etude de cellules auto-organisees. Par partie «utile de Ia plateforme, on entend Ia partie qui sert a 10 effectuer une culture de cellules. Selon Ia presente technique, un deuxieme mode de realisation de Ia plateforme definit un ou plusieurs reseaux de nano-dispositifs qui definissent des emplacements de positionnement et des chemins (parcours) de croissance des prolongements des cellules de sorte a former, lors de Ia mise en oeuvre d'un processus biologique de culture et/ou de croissance de cellules, des reseaux 15 de cellules conformes aux reseaux de nano-dispositifs de Ia plateforme. II s'agit de permettre des cultures organisees de cellules. Quel que soit le mode de realisation, une plateforme objet de Ia presente peut tout a Ia fois etre utilisee comme plateforme de detection et/ou de mesure de potentiel et de concentration ionique, mais egalement comme plateforme de stimulation 20 Selon Ia presente technique, dans un autre aspect, Ia mise en oeuvre de ces nano- dispositifs est couplee a une fonctionnalisation de surface capable de precisement localiser les cellules et de guider Ia croissance des prolongements de celles-ci. Ainsi, les reseaux de dispositifs implantes sur Ia plateforme permettent de stimuler et d'enregistrer precisement les potentiels d'action generes par ces cellules, directement dans les somas mais aussi le long des 25 prolongements dendritiques et axonals et cela sur plusieurs semaines. Selon Ia presente technique, des transistors a nano-fils horizontaux disposes le long de ces prolongements permettent egalement de pouvoir comparer les enregistrements intra et extracellulaire. Ainsi, selon Ia presente technique, les reseaux formes sur Ia plateforme sont soumis a un 30 traitement surfacique dont Ia particularite est de favoriser ('implantation et Ia croissance des cellules a des localisations predefinies sur Ia plateforme. Plus particulierement, Ia plateforme est soumise a une fonctionnalisation de surface, qui permet, en culture, de localiser les somas et de 8 guider la croissance des prolongements neuronaux. II est ainsi possible de stimuler et d'enregistrer precisement les potentiels d'action generes par ces neurones sur la plateforme. Plus particulierement, it est optionnellement mis en oeuvre, sur la plateforme, une fonctionnalisation de surface auto alignee (S-A-F). Selon la presente technique, cette 5 fonctionnalisation est mise en oeuvre posterieurement a la creation de la plateforme. Plus particulierement, la fonctionnalisation de surface est realisee apres la construction des reseaux de nano-dispositifs sur la plateforme. En effet, bien que la problematique de controle de la localisation des somas et de leurs extensions pour pouvoir coupler ces cultures organisees avec des dispositifs d'enregistrement nanometriques, ne soit pas nouvelle, les approches actuelles 10 tendent a mixer la micro fabrication de la plateforme et le protocole biologique (consistant a deposer une couche attractive (peptides) sur la surface hydrophile pour favoriser le developpement des cellules). Plus particulierement, dans l'approche conventionnelle (AC, figure 1) (M. Kwiat, R. Elnathan, A. Pevzner, A. Peretz, B. Barak, H. Peretz, T. Ducobni, D. Stein, L. Mittelman, U. Ashery, and F. Patolsky, "Highly Ordered Large-Scale Neuronal Networks of 15 Individual Cells Toward Single Cell to 3D Nanowire Intracellular Interfaces," ACS Appl. Mater. Interfaces, vol. 4, no. 7, pp. 3542-3549, Jul. 2012.), l'etape de photolithographie permettant de definir des zones attractives et repulsives sur la puce, doit etre realisee apres le traitement hydrophobe (HPhob) de l'integralite du substrat. C'est une etape critique puisque la resine (RES) adhere tres difficilement sur de telles surfaces SHphob) et que la qualite du traitement doit etre 20 degradee pour atteindre un niveau d'hydrophobicite compatible avec l'etape de photolithographie. Selon la presente technique (AP, Fig 1), en sus de la capacite a mesurer a la fois les concentrations d'ions et les potentiels electriques, et compte tenu des limitations de l'approche conventionnelle, une methode de fonctionnalisation chimique complementaire a ete construite, permettant de tirer parti d'un traitement hydrophobe non degrade, tout en dissociant 25 completement le protocole de microfabrication (FAB) et le protocole biologique (B10). Contrairement a l'approche classique, pour laquelle la molecule d'adhesion (AM) se depose seulement sur les zones ouvertes de la resine structuree par lithographie, la localisation de la molecule d'adhesion est uniquement controlee a l'aide du contraste hydrophile/hydrophobe de la surface. 30 Afin d'être le plus proche possible de la surface finale des puces formant la plateforme de capteurs (5i02), les developpements sont realises sur un substrat de silicium (Si) recouvert de d'environ 600 nm d'oxyde de silicium (5i02). La structuration des motifs est effectuee par 9 lithographie a I'aide d'un photorepeteur i-line sur resine positive ECI (1.1 p.m), permettant d'obtenir une resolution inferieure au micron, ainsi qu'une excellente precision d'alignement. Un traitement hydrophobe (HPhob) en phase gaz est ensuite realise sur le substrat et ne se fixe que sur les zones ouvertes de Ia resine. La resine est alors retiree par bains successifs d'acetone puis 5 de « piranha » (H202/ H2SO4 1:1). A ce stade du procede de fonctionnalisation, Ia surface de SiO2 presente des zones hydrophiles (zones precedemment protegees par Ia resine) et des zones hydrophobes (zones ouvertes, HPhob). Le greffage des molecules d'adhesion (AM) (de Ia solution d'adhesion, par exemple polylysine, polyornithine) est ensuite realise selectivement sur les parties hydrophiles. Grace a ce procede de fonctionnalisation auto-aligne, une parfaite dissociation entre 10 le protocole de microfabrication en salle blanche et le protocole biologique est obtenu. La solution d'adhesion n'est deposee qu'au moment de Ia culture et ne risque pas d'être degradee lors du retrait de Ia resine. De plus, Ia photolithographie s'effectue avant le traitement hydrophobe de Ia surface ce qui permet d'eviter les problemes lies a une mauvaise accroche de celle-ci sur le substrat hydrophobe et qui autorise ('utilisation d'un traitement hydrophobe le plus 15 performant possible. A partir d'une telle plateforme, it est possible de provoquer des stimulations de neurones par des agents chimiques (type simulant de gaz neurotoxiques ou induisant des depolarisations) ou biologiques pour etudier au plus pres des cellules en culture, les reactions et les processus mis en jeu et ce dans un objectif de mise au point de traitements ou de molecules adaptes a curation 20 de maladies et notamment de maladies neuro degeneratives. Les nano-sondes captent les potentiels principalement en extracellulaire. Dans quelques cas les sondes peuvent percer spontanement Ia membrane (tres peu de cas) et mesurer le potentiel intracellulaire. On peut forcer ('entree des sondes en ouvrant Ia membrane lipidique par stimulation electrique. A noter que le potentiel electrique intracellulaire ou extracellulaire designe Ia meme 25 mesure (ce ne sont pas deux potentiels differents). La difference est qu'en extracellulaire le potentiel est ecrante par Ia membrane de Ia cellule et sa resolution est theoriquement plus faible. Neanmoins grace aux nano-sondes, l'affinite entre Ia nano-sonde et Ia cellule est tres grande ce qui permet bien qu'etant en mesure extracellulaire d'acceder a des resolutions de signaux qui sont de tres bonne qualite, bien meilleures que celles mesurees avec des microelectrodes 30 conventionnelles. 5.2. Description d'un premier mode de realisation 10 Comme explicite, la presente technique a ete mise en oeuvre pour definir une plateforme de detection, de mesure et de stimulation de cellules, et plus particulierement de cellules electrosensibles. La presente technique concerne une plateforme de detection et/ou de mesure et/ou stimulation a base de nano-sondes et un procede d'utilisation d'une telle plateforme pour 5 effectuer des mesures electrophysiologiques. Dans ce premier mode de realisation de la plateforme de la presente technique, comme illustre sur la Figure 2, des couples {nano-sondes, nano-FET} sont regulierement implantes sur la plateforme. L'objectif, dans ce mode de realisation est d'obtenir des mesures de potentiels d'action et de concentration ionique au niveau des cellules. Chaque couple {nano-sondes, nano-FET} forme un nano capteur independant. Au sein 10 d'un capteur, chaque nano dispositif est adressable independamment : chaque nano dispositif dispose d'une ligne d'acces a partir de la peripherie de la plateforme. Dans ce mode de realisation, des nano-FET sont des transistors a effet de champs a ailette, egalement appeles finFET. La disposition des nano-capteurs est effectuee en fonction des besoins : l'espacement entre les nano-capteurs, notamment, peut etre fonction de la destination de la plateforme, c'est-a-dire 15 d'une specialisation de la plateforme, notamment au niveau des types de cellules a cultiver : certains types de cellules peuvent requerir des espacements plus grands ou plus petits entre les capteurs, par exemple pour eviter que deux capteurs ne soient positionnes sous une cellule unique. Dans ce premier mode de realisation de la plateforme de la presente technique, comme 20 illustre sur la figure 2, la plateforme P1, dispose d'un ensemble de nano-sondes (100-1,...100-n) comprenant un a neuf nano-fils verticaux (par exemple quatre pour favoriser la descente de la cellule sur la nano sonde) directement en contact avec une ligne d'acces conductrice (101-1,... 101-n). Cet ensemble est destine a accueillir des cellules en culture ou en observation. Chaque nano-sonde, excepts sa pointe et sa ligne d'acces conductrice (101-1...), est recouverte dune 25 couche isolante (non representee). Les nano-sondes (100-1,...100-n) sont en communication avec un pourtour de la plateforme via une ligne d'acces conductrice (101-1,... 101-n) dediee, qui est connectable (connectee) electriquement a un instrument (egalement non represents) pour generer ou detecter un signal electrique. La plateforme peut ainsi etre utilisee pour etudier les interactions neurones-neurones, par exemple en envoyant un signal electrique dans un neurone 30 d'un reseau neuronal via une ou plusieurs nano-sonde(s) en contact electrique avec ce neurone puis en detectant les signaux electriques d'un autre neurone du reseau via les nano-sondes en contact avec cet autre neurone. 11 En sus de ces nano-sondes, la plateforme P1 comprend des transistors a ailettes de silicium (fin-FET) permettant de detecter et mesurer les concentrations d'ion en extracellulaire (concentration ionique). Ces fin-FETs (200-1,...200-m) sont disposes au plus proches des nano-sondes pour mesurer les concentrations ioniques resultantes. Chaque fin-FET est associe a une 5 nano-sonde afin de former un couple {nano-sonde, fin-FET} appele nano-capteur. Les nano-FETs (200-1,...200-m) sont en communication avec un pourtour de la plateforme via une ligne d'acces conductrice (201-1,... 201-m) dediee, qui est connectable (connectee) electriquement a un instrument (egalement non represents) pour detecter un signal electrique et plus particulierement une concentration d'ion en extracellulaire. Ainsi, lorsqu'une activite electrique 10 se propage dans les cellules, les nano-sondes peuvent mesurer le potentiel se propageant (et notamment la vitesse de propagation de celui-ci) d'une cellule a l'autre, tout autant que les potentiels electriques de depart et d'arrivee, ainsi que les concentrations ioniques. Seuls quelques capteurs sont representes sur la figure pour plus de lisibilite. La figure 4a est une representation microscopique d'une nano-sonde a quatre fils verticaux de la plateforme. La figure 4b est une 15 representation microscopique d'un fin-FET de la plateforme. La figure 5 est une representation microscopique d'une nano-sonde a un fil vertical associe a un fin-FET pour former un nanocapteur tel que presents precedemment. Dans ce premier mode de realisation, l'objectif est de permettre une observation des comportements de groupes de cellules en croissance et/ou en culture, sans contraindre ces 20 dernieres. 5.3. Description d'un deuxieme mode de realisation. Dans ce deuxieme mode de realisation de la plateforme de la presente technique, comme illustre sur la Figure 3, une cellule neuronale CNO (ses axones ou dendrites etant marques CNOa) est mise en contact avec la surface de la plateforme P1, qui dispose d'un reseau de nano-sondes 25 de somas (100-1,...100-n) comprenant un a neuf nano-fils (par exemple quatre) verticaux directement en contact avec une ligne d'acces conductrice (101-1,... 101-n). Cc reseau, primaire, est appele reseau de nano-sondes de somas car it est destine a accueillir les somas des cellules, a la difference, comme cela est exposé ci-apres, de nano-sondes de parcours. Chaque nano-sonde, excepts sa pointe et la ligne d'acces conductrice, est recouverte dune couche isolante (non 30 representee). Les nano-sondes de somas (100-1,...100-n) sont en communication avec un pourtour de la plateforme via une ligne d'acces conductrice (101-1,... 101-n) dediee, qui est connectable (connectee) electriquement a un instrument (egalement non represents) pour 12 generer ou detecter un signal electrique. La plateforme peut ainsi etre utilisee pour etudier les interactions neurones-neurones, par exemple en envoyant un signal electrique dans un neurone d'un reseau neuronal via une ou plusieurs nano-sonde(s) en contact electrique avec ce neurone puis en detectant les signaux electriques d'un autre neurone du reseau via les nano-sondes en 5 contact avec cet autre neurone. En sus de ces nano-sondes, la plateforme P1 comprend des transistors a ailettes de silicium (nano-FET) permettent de detecter et mesurer les concentrations d'ion en extracellulaire (concentration ionique). Ces nano-FETs (200-1,...200-m) sont disposes au plus proches des nano-sondes de soma pour mesurer les concentrations ioniques resultantes. Des capteurs (nano-sondes 10 ou nano FETs) sont egalement repartis sur les chemins pour suivre la propagation Ces chemins permettent de relier les differentes nano-sondes de somas (100-1,...100-n) entre elles pour former un reseau de nano sondes de somas. L'objet de ces chemins (parcours) preetablis, comme exposé precedemment, est de guider la culture des cellules selon des parametres predetermines. L'objectif de ce guidage etant de constituer un reseau de cellules reliees entre elles, de sorte a 15 pouvoir mesurer des valeurs de potentiels et de quantite de courant ionique entre ces cellules lorsqu'elles sont positionnees (cultivees) sur le reseau de nano-sondes et que les dendrites ou axones permettent la propagation de courant electrique d'une cellule a l'autre. Afin de garantir des mesures precises, les nano-sondes ou nano-FETs sont positionnes le long de parcours (chemins) dont on sait, de par la specialisation de surface de la plateforme, qu'ils seront les 20 receptacles des dendrites ou axones des cellules lors de leur croissance. Les nano-FETs (200- 1,...200-m) sont en communication avec un pourtour de la plateforme via une ligne d'acces conductrice (201-1,... 201-m) dediee, qui est connectable (connectee) electriquement a un instrument (egalement non represents) pour detecter un signal electrique et plus particulierement un courant d'ion. Ainsi, lorsqu'une activite electrique se propage dans les 25 cellules, les nano-sondes peuvent mesurer le potentiel se propageant (et notamment la vitesse de propagation de celui-ci) d'une cellule a l'autre, tout autant que les potentiels electriques de depart et d'arrivee ainsi que les concentrations ioniques. Dans au moins un mode de realisation, tel que celui presents en relation avec la figure 3 un parcours entre deux nano sondes de soma comprend des nano-FETs (300-1,..., 300-I) et/ou des 30 nano-sondes de parcours (400-1,..., 400-j). Ces nano-sondes de parcours permettent de mesurer le potentiel electrique a differentes localisations de Ia dendrite ou de l'axone (seuls deux chemins sont representes sur Ia figure pour plus de lisibilite). 13 Les nano-sondes et nano-FET (transistors a ailettes de silicium) utilises dans la presente technique peuvent etre formes de n'importe quel materiau electriquement conducteur, de preference un materiau inorganique, tel que du silicium, un metal, un semi-conducteur compose, un oxyde conducteur et un siliciure. La couche isolante revetue sur les composants de cette 5 plateforme est formee d'un materiau a faible cytotoxicite, tel que l'oxyde de silicium, l'oxyde d'aluminium et le nitrure de silicium. Les pointes des nano-sonde sont soit exposees (c'est-a-dire exemptes dune couche de revetement isolante) soit revetues dune couche electriquement conductrice, comme cela est explicite par la suite dans le cadre de la presentation du procede de fabrication de ladite plateforme, selon une approche descendante. La couche conductrice 10 electrique est egalement formee d'un materiau a faible cytotoxicite, tel que l'or, l'argent et le platine, un alliage de ces metaux ou un materiau organique conducteur (par exemple pedot :pss). 5.4. Details du procede de fabrication de plateforme en co-integration Une plateforme de mesure a base de nano-fils, telle que presentee precedemment, est 15 obtenue a partir d'un substrat 4 pouces de silicium sur isolant (S01) (Si actif 4p.m/Oxyde enterre 1µm/substrat 400p.m). Une approche (descendante) « top-down » est utilisee avec un procede de fabrication en photolithographie UV a l'aide d'un photorepeteur i-line suivi d'une gravure plasma RIE, afin de reduire les coats de fabrication et de faciliter une fabrication a grande echelle. Pour augmenter la reproductibilite du procede sur ('ensemble du substrat, une couche anti-reflective 20 (BARC) est utilisee sous la resine photosensible. Plus particulierement, en relation avec la figure 6, le procede de fabrication comprend les etapes suivantes, qui sont realisees sur une base comprenant un substrat sur lequel est deposee une couche de 1pm de dioxyde de silicium (5i02), elle-meme recouverte d'une couche de silicium (Si) monocristallin de 4p.m : 25 fabrication (E10) de nano-Fils verticaux : structuration verticale de la plateforme ; o cette fabrication se base sur une technique de Photolithographie, comprenant un depot local d'un motif de resine qui sert de masque de protection (nano-plot resistant de 500 nm de diametre), en utilisant une resine organique conventionnelle (par exemple de type ex : ECI 3012) ; et 30 o gravure RIE (gravure ionique reactive profonde) de 3,5 p.m : gravure seche par bombardement d'ions (issus d'un plasma) ; cette technique presente l'avantage dune forte anisotropie de la gravure: la frontiere entre les zones gravees et non 14 gravees sera la plupart du temps rectiligne et verticale ; la resine restante est retiree par gravure chimique (resine issue de la sous etape precedente) ; o a l'issue de cette premiere etape, on dispose sur la plateforme de nano fils verticaux, formant des groupes constitues de 1 a 4 nano-fils et repartis sur la 5 plateforme pour former un embryon de reseau, qui est retravaille dans les etapes suivantes afin de leur adjoindre la proprietes attendues ; - creation (E20) des nano-FET et des lignes d'acces : structuration planaire de la plateforme : o depot d'une photo-resine epaisse (5 p.m) pour proteger et ne pas deteriorer les 10 nano-fil precedemment obtenus ; o photolithographie pour definir la zone a masquer selon un procede identique a celui de l'etape precedente pour dessiner les nano-FETs (canaux et lignes d'acces), ainsi que les lignes d'acces des nano-sondes ; o gravure jusqu'a atteindre I'oxyde enterre (ou Burried Oxide - BOx) du SOI : le 15 silicium est creuse sur une profondeur d'environ 0,5p.m. o a I'issue de cette deuxieme etape, on dispose sur Ia plateforme de nano fils verticaux et d'embryon de nano-FET , rattaches par les lignes d'acces a des contacts electriques au bord de Ia plateforme, qui comme les nano-fils, sont repartis sur Ia plateforme pour completer le ou les reseaux de groupes de nano- 20 fils ; amincissement (E30) conjoint des volumes des nano-fils et des ailettes des nano-FETs par oxydation sacrificielle : o une oxydation humide a environ 850 °C pendant une duree de 60 mn pleine plaque est realisee ; cette operation permet de preparer Ia reduction de diametre 25 des nano-fils d'environ 500 nm a environ 200 nm et de preparer l'amincissement du canal du nano-FET a environ 20nm ; o cette operation permet egalement d'eliminer les defauts de surface induits par Ia gravure plasma et d'ameliorer l'anisotropie de Ia nano-sonde ; o le canal de chaque nano-FET est ensuite protégé par de Ia resine par 30 photolithographie ; o puis une gravure humide Buffer HF (5%) est effectuee : elle permet de retirer l'oxyde sur ('ensemble des surfaces, a ('exception de celles des canaux des nano- 15 FET car la resine n'est pas attaquee: chaque canal est, de reste, recouvert d'oxyde (SiO2). dopage (E40) de type P des zones source (S) et drain (D) des nano-FET, des nano-Fil et des lignes d'acces : 5 o cette etape consiste en une implantation de Bore a 1020atm/cm3 sur !'ensemble de la plateforme a !'exception des canaux des nano-FET, qui restent protégés par la resine de l'etape precedente ; o le canal n'est pas dope afin de conserver la sensibilite de celui-ci. retrait de la resine de masquage du canal des nano FET et recuit d'activation du dopant : 10 o La resine est retiree du canal et le dopant est active par temperature (environ 1000°c pendant environ 30 minutes) ; o cette phase de recuit active electroniquement le dopant dans le silicium ; o a !'issue de cette etape, on dispose d'une plateforme comprenant les nano-Fils verticaux, les zones S et D des nano-FET et les lignes d'acces en Si dope : seuls les 15 canaux restent recouverts d'oxyde. siliciuration (E50) du platine : o pour creer des zones S et D (des nano FET) faiblement resistives et ameliorer !'interface entre la nano-sonde et le milieu liquide, une etape de depot isotrope de platine pleine plaque est effectuee ; 20 o un recuit d'activation (500°C pdt 3 mn) permet ensuite de creer l'alliage PtSi ; L'avantage ici est que le PtSi ne se cree que lorsque le Pt est en contact direct avec le Si et non du SiO2 : la technique employee permet donc de ne pas avoir de PtSi sur le BOx (constitue de SiO2), ni sur le canal des nano-FETs, permettant ainsi de conserver la sensibilite de mesure de ceux-ci. 25 On note ici un avantage du procede de fabrication tel que propose : il n'est pas necessaire de realiser une etape de lithogravure pour !'implantation sur le metal : on a pas besoin de couvrir le canal par de la resine car il est déjà protégé par de l'oxyde de Si. II ne s'agit cependant pas du seul avantage : cette etape de siliciuration du platine permet d'augmenter fortement !Integration des nano-dispositifs, tout en autorisant une forte biocompatibilite avec le milieu vivant et ce grace 30 au recuit d'activation du platine sur le Si. gravure (E60) selective du Pt par rapport au PtSi a !'eau regale (mélange chimique de HCI : HNO3: EDI qui permet de graver seulement le metal : le silicium n'est pas attaque) : 16 o it s'agit d'une etape de gravure chimique selective qui permet de graver le Pt non transforms (issu de l'etape precedente) sans attaquer le PtSi : le Pt (non transforms) est donc ate du BOX et des canaux des nano-FET ; o L'interet du PtSi est double : du point de vue des nano-sondes it ne s'oxyde pas 5 (en comparaison du Si seul) et permet de conserver une faible impedance d'interface electrolyte/sonde dans le temps ; du point de vue des nano-FETs : it delivre une faible resistance de contact surface/volume ameliorant la sensibilite des nano-FETs. metallisation (E70) a ('aluminium (Alu) permettant reduire la resistance des lignes 10 d'acces : o un depot conforme sur ('ensemble de la plateforme d'Alu (500 nm) suivi d'une photolithographie et d'une gravure chimique de l'alu non protégé par la resine « etch-back » sont ensuite mis en oeuvre pour metalliser les lignes d'acces ; o l'alu n'est conserve que sur les lignes d'acces. 15 isolation (E80) de la plateforme par rapport au milieu : o Un oxyde (oxyde d'isolation) est ensuite depose de maniere conforme pour isoler les nano fils et les nano-FETs du (futur) milieu de culture : l'oxyde employe peut etre du SiO2, de AL203 ou du Hf02, ou un dielectrique specifique ; ouverture (E90) du sommet des nano-fils, des contacts exterieurs et du canal des nano- 20 FET (structure cceur-coquille) : o une etape de photolithographie est utilisee a l'aide d'une resine epaisse (5 p.m) pour graver l'oxyde (d'isolation), precedemment depose, au niveau des contacts exterieurs (des lignes d'acces) et du canal du nano-FET (entre la source et le drain) ; 25 o la resine restante est ensuite reduite en epaisseur par gravure plasma 02 pour liberer le haut de la nano-sonde ; o la hauteur de resine peut varier entre 1 et 3 p.m en fonction de la dimension du contact sensible desiree pour la nano-sonde. gravure (E100) chimique de l'oxyde ouvert : 30 o Les zones ouvertes de la resine sont gravees chimiquement a l'aide d'une solution de HF tamponnee (buffer HF) de (5%) ; cette gravure permet de liberer le sommet 17 de la nano-sonde, de desoxyder les contacts exterieurs et de reduire l'epaisseur d'oxyde sur le canal pour ameliorer Ia detection et/ou Ia mesure ; o Ia resine est ensuite eliminee ; o a l'issue de cette etape, on dispose d'une plateforme comprenant un reseau de 5 nano-fils formant des groupes de nano-fils (un groupe comprenant de un a quatre nano-fils), des nano-FETs disposes a proximite des nano-sondes ; et de lignes d'acces a ('ensemble de ces composants, a partir de Ia peripherie de Ia plateforme, et ce quelle que soit Ia cartographie de celle-ci. En l'etat, a ('issue de cette etape de gravure chimique d'oxyde, cette plateforme, 10 fabriquee selon le procede precedemment exposé, permet de resoudre Ia problematique !lee a Ia mesure conjointe, a l'aide d'une meme plateforme, d'un potentiel electrique, a l'aide d'au moins une nano-sonde et de concentration d'ion en extracellulaire avec un ou plusieurs transistors (nano-FET). Cependant, afin de permettre ulterieurement, des experimentations sur des cultures neuronales avec une croissance dirigee des cellules sur Ia plateforme, les inventeurs ont mis en 15 oeuvre une etape supplementaire de specialisation de Ia surface de Ia plateforme, cette etape supplementaire permettant de contraindre Ia culture et Ia croissance des cellules a des localisations predeterminees, comme cela a ete presente precedemment. Plus particulierement, selon Ia presente technique, le procede de fabrication comprend en outre une etape de fonctionnalisation (E110) chimique comprenant une photolithogravure de definition de motifs 20 d'accroche des cellules et plus specifiquement de motifs hydrophiles. Ces motifs sont realises au niveau des zones specifiques de plateforme sur lesquelles on souhaite favoriser Ia croissance des cellules. Des zones hydrophiles de plus grandes surfaces sont creees au niveau des nano-sondes, aux endroits oq on souhaite favoriser ('implantation de soma. Des zones hydrophiles sont egalement creees dans le prolongement des nano-sondes, afin de 25 permettre aux prolongements de cellules (axones, dendrites si necessaires) afin de diriger Ia croissance de ces prolongements vers d'autres nano-sondes, sur lesquelles d'autres somas seront fixes. 5.5. divers Toutes les caracteristiques decrites peuvent etre combinees et ce dans n'importe quelle 30 combinaison. Chaque caracteristique divulguee dans cette specification peut etre remplacee par une caracteristique equivalente servant le meme objectif. Ainsi, sauf indication contraire, chaque 18 caracteristique decrite nest qu'un exemple dune serie generique de caracteristiques equivalentes ou similaires. De maniere complementaire aux aspects precedemment decrit, la plateforme objet de la presente peut etre mise en oeuvre de differente maniere. Un avantage de cette plateforme, 5 apporte par le fait que chaque nano-dispositif est adressable, est qu'elle permet de realiser une localisation des cellules deposees (et/ou mise en developpement) a des endroits tres précis de la plateforme. Par ailleurs, ('utilisation de la plateforme n'est pas limitee a des cellules de type neurone, mais peut etre mise en oeuvre pour tout type de cellules. Les nano-sondes peuvent etre utilisees pour mesurer un potentiel d'une part et transmettre une impulsion electrique aux 10 cellules, d'autre part. Cette transmission d'impulsion peut etre utilisee pour ouvrir localement Ia paroi de Ia cellule stimulee, REVENDICATIONS1. Plateforme pour l'interfagage cellulaire (P1, P2), comprenant au moins une nano-sonde (100-1,...100-n) a base de nano-fils comprenant chacun une extremite conductrice destinee a etre en contact avec une cellule, plateforme caracterisee en ce qu'elle comprend au moins un transistor a effet de champs, dit nano-FET (200-1, 200-m) positionne a une distance predeterminee de ladite nano-sonde. 2. Plateforme selon la revendication 1, caracterisee en ce qu'elle comprend un ensemble de nano-capteurs, chaque nano-capteur comprenant un couple forme d'une nano-sonde (100-1) et d'un nano-FET (200-1) espace d'une distance comprise entre 1 et 5 micrometres. 3. Plateforme selon la revendication 1, caracterisee en ce qu'elle comprend un ensemble de nano-sondes et un ensemble de nano-FETs repartis sur ladite plateforme pour former au moins un reseau de nano-capteurs comprenant au moins un parcours predetermine. 4. Plateforme selon la revendication 1, caracterisee en ce qu'elle comprend en outre, des zones hydrophiles localisees au niveau des nano-sondes et dudit au moins un nano-FET. 5. Plateforme selon la revendication 3, caracterisee en ce qu'elle comprend une pluralite de parcours predetermines, chaque parcours predetermine reliant au moins deux nano-sondes dudit reseau de nano-sondes. 6. Plateforme selon la revendication 5, caracterisee en ce qu'elle comprend en outre, des zones hydrophiles localisees au niveau desdits parcours predetermines. 7. Plateforme selon la revendication 5, caracterisee en ce que chaque parcours predetermine entre deux nano-sondes comprend une pluralite de nano-FETs, chaque nano-FET etant implante a intervalles reguliers le long du parcours. 20 8. Plateforme selon la revendication 5, caracterisee en ce que chaque parcours predetermine entre deux nano-sondes comprend une pluralite de nano-sondes de parcours, chaque nano-sonde de parcours etant implantee a intervalles reguliers le long du parcours. 5 9. Plateforme selon l'une des revendications 1 a 8, caracterise en ce que ladite au moins une nano-sonde comprend entre un et neuf nano-fils. 10. Plateforme selon l'une des revendications 1 a 9, caracterise en ce que le nano-FET est un 10 transistor a ailette de type fin-FET. 11. Procede de fabrication d'une plateforme pour l'interfagage intracellulaire, procede de type descendant, caracterise en ce qu'il comprend, posterieurement a une etape de structuration verticale d'au moins une nano-sonde a base de nano-fils, une etape de 15 structuration planaire d'au moins un transistor a effet de champs, dit nano-FET. 12. Procede de fabrication d'une plateforme pour l'interfagage intracellulaire, selon la revendication 11, caracterise en ce que posterieurement a l'etape de structuration planaire dudit au moins un nano-FET, !edit procede comprend une etape de siliciuration 20 de platine, provoquant !'implantation d'une couche de siliciure de platine (PtSi) sur ladite au moins une nano-sonde et sur des zone source (S) et de drain (D) dudit au moins un nano-FET. 13. Procede de fabrication d'une plateforme pour l'interfagage intracellulaire, selon la 25 revendication 11, caracterise en ce qu'il comprend en outre une etape d'adjonction, sur les nano-fils de ladite au moins une nano-sonde, d'un materiau organique conducteur, tel que le PEDOT:PSS. 14. Procede de fabrication d'une plateforme pour l'interfagage intracellulaire, selon la 30 revendication 11, caracterise en ce que posterieurement a l'etape de structuration planaire dudit au moins un nano-FETs, !edit procede comprend une etape de fonctionnalisation de la surface de ladite plateforme definissant une pluralite de zones hydrophiles.