Brevet FR3074998A1 — publié le 20190621

PROCEDE POUR IDENTIFIER ET ISOLER DES COMPOSES BIOACTIFS A PARTIR D'EXTRAITS D'ALGUES Domaine de l'invention La presente invention concerne de fawn generale un procede pour purifier et isoler des composes bioactifs responsables de la stimulation de la croissance vegetale partir d'extraits d'algues. Contexte de l'invention L'un des delis de l'agriculture moderne est de repondre a la demande societale de durabilite, de qualite et de faible impact dans la production agrico le et de s'adapter l'augmentation de la population mondiale par l'amelioration des rendements et de la tolerance des cultures a un environnement changeant. Des bio stimulants peuvent etre utilises pour ameliorer la nutrition des plantes, ce qui a un impact sur les parametres de rendement et de qualite. Les biostimulants de vegetaux se classent de fawn generale dans l'une de ces categories, c'est-à-dire, les produits contenant des hormones, les produits a base d'extraits vegetaux, les produits base de micronutriments, les produits contenant des acides amines et les produits contenant de l'acide humique mais ils peuvent ne pas etre strictement restreints a ces categories seules. Des biostimulants de vegetaux sont utilises pour traiter des cultures dans un contexte commercial au vu de leur capacite a augmenter les taux de croissance, augmenter la tolerance aux stress, a augmenter le taux de photosynthese et a augmenter la tolerance aux maladies. On pense de fawn generale que les biostimulants de vegetaux fonctionnent par induction ou repression des genes de genes de voies biologiques des. Tels que &finis par l'European Biostimulant Industry Council (EBIC), les biostimulants de vegetaux contiennent une ou plusieurs substance(s) et/ou des microorganismes dont la fonction lorsqu'ils sont appliqués sur des plantes ou la rhizosphere est de stimuler des processus naturels pour amplifier/favoriser l'absorption de nutriments, l'efficacite de nutriments, la tolerance a un stress abiotique, et la qualite des cultures. Les biostimulants n'ont aucune action directe contre les nuisibles et, par consequent, n'entrent pas dans le cadre reglementaire des produits phytopharmaceutiques. Des biostimulants sont disponibles dans diverses formulations et avec des composants variables mais ils sont generalement classes sur la base de leur source et de 2 leur contenu. Ces groupes comprennent les substances humiques (HS), et les produits contenant des acides amines (AACP). Des biostimulants sont disponibles dans diverses formulations et avec des composants variables mais ils sont generalement classes en sept groupes principaux sur la 5 base de leur source et de leur contenu. Ces groupes comprennent les substances humiques (acides humique et fluvique), les hydrolysats de proteines et d'autres composes contenant de l'azote, des extraits d'algues et des produits botaniques, le chitosan et autres biopolymeres, des composes inorganiques, des champignons benefiques et des bacteries benefiques. 10 En depit de la disponibilite dans le commerce de nombreux engrais et biostimulants de vegetaux, it continue a y avoir une demande de produits ameliores capables de servir divers besoins. Par consequent, de nouveaux produits et procedes pour ameliorer les reponses de la plante et le developpement de la croissance vegetate sont necessaires. 15 Les algues et des produits derives des algues ont ete largement utilises dans la production de cultures en raison de la presence d'un certain nombre de composes stimulant la croissance vegetate au sein de ces produits. Ainsi, le potentiel de biostimulation d'un grand nombre de ces produits n'a pas ete pleinement exploite a cause du manque de donnees scientifiques sur les facteurs de croissance presents dans les algues 20 et leurs divers modes (Faction touchant la croissance vegetate. Alors que les effets physiologiques des extraits d'algues sur les defenses des plantes et la croissance vegetate ont ete etudies, on sait peu de choses quant aux composes bioactifs particuliers dans les extraits d'algues qui sont responsables de ces effets stimulants sur les vegetaux. Il serait souhaitable d'accelerer l'identification de ces 25 composants bioactifs dans les algues, y compris, par exemple, les extraits d'algues brunes. Les Pheophycees ou algues brunes representent un grand groupe d'algues multicellulaires pour la plupart marines, y compris de nombreux types d'algues localisees dans les eaux des deux hemispheres. Elles jouent un role important dans les environnements marins, a la fois en tant que ressources trophiques et en tant qu'habitats. 30 De nombreuses algues brunes, telles que des membres de l'ordre des Fucales, se developpent communement le long des rivages marins rocheux. Dans le monde entier, on connait plus de 1500 especes d'algues brunes. Certaines especes, comme Ascophyllum nodosum, sont importantes pour un usage commercial et ont egalement un impact environnemental. 3 Le brevet US No. 7 611 716 de Michailovna et al. decrit un procede de traitement des algues pour obtenir, dans un unique procede, des extraits comprenant des polysaccharides acides et neutres et un extrait comprenant des composes biologiquement actifs de masse moleculaire basse qui peuvent etre utilises en medecine, dans 5 ralimentation, en parfumerie et dans l'industrie cosmetique. Toutefois, la reference decrit uniquement un procede de traitement d'algues et ne fournit aucun moyen pour identifier des composes biostimulants de vegetaux potentiels contenus a 1' interieur. Le brevet US No. 3 856 569 de Strong, decrit un procede pour purifier et concentrer un polysaccharide souhaitable tel que le carraghenane ou l'alginate a partir de 10 solutions aqueuses derivees d'algues marines (Rhodophycees et Pheophycees) en soumettant les solutions a une ultrafiltration. Toutefois, a nouveau, cette reference fournit uniquement un procede de traitement des- algues et ne fournit aucun moyen pour identifier des composes biostimulants contenus dedans. A cause de la demande croissante en produits biologiques, respectueux de 15 l'environnement et sans danger pour la sante humaine, le besoin de biostimulants naturels a augmente. En outre, it existe un besoin de biostimulants similaires ou plus efficaces que les biostimulants traditionnels qui ont ete utilises. En outre, it demeure un besoin, dans Part, d'un procede ameliore pour isoler et purifier des composes biostimulants, y compris a partir d'extraits derives d'algues. 20 Résumé de l'invention Un objet de la presente invention est d'identifier et de purifier des substances qui peuvent etre utilisees en tant que biostimulants de vegetaux. Un autre objet de la presente invention est d'identifier et de purifier des composes bioactifs dans divers extraits d'algues qui sont responsables de la stimulation de la 25 croissance vegetale. Dans cet objectif, selon un mode de realisation, la presente invention concerne de fawn generale une ou plusieurs molecules bioactives isolees d'une espece d'algues, la ou les plusieurs molecules bioactives ayant une masse moleculaire situ& dans la plage d'environ 0,15 kDa a environ 1,0 kDa. Selon un autre mode de realisation, la presente invention concerne de facon generale un procede pour isoler et purifier des composes bioactifs dans un extrait obtenu a partir d'algues, le procede comprenant les &apes suivantes : 4 a) la circulation de l'extrait a travers une membrane d'ultrafiltration presentant un seuil de coupure de masse moleculaire approprie ; b) le recueil du filtrat a partir de l'extrait d'algues pour obtenir une premiere fraction de filtrat et un retentat ; et 5 c) le rincage du retentat pour obtenir une ou plusieurs fractions supplementaires de filtrat. Breve description des figures Pour mieux comprendre l'invention, it est fait reference a la description suivante accompagnee de figures, parmi lesquelles 10 Les figures la et lb illustrent le fractionnement par chromatographie d'exclusion sterique (SEC) effectue sur l'extrait RM-3496 filtre et un chromatogramme d'etalons injectes sur la SEC pour evaluer les masses moleculaires moyennes des molecules presentes dans les differentes fractions. La figure 2 illustre des diagrammes en boites a moustaches (boxplot) montrant 15 l'efficacite du fractionnement par SEC du RM-3496 sur des laitues. Les figures 3a et 3b illustrent des diagrammes en boites a moustaches montrant les poids de rosettes fraiches et les poids de racines fraiches de cultures in vitro d'Arabidopsis thaliana traitees avec la fraction F3 comparativement au temoin non traite, a l'extrait RM3496 et a l'extrait RM-3496 reconstitue. 20 La figure 4 illustre une vue du procede d'ultrafiltration conformement a un aspect de la presente invention. La figure 5 illustre des diagrammes en boites montrant les poids de pousses fraiches de laitues traitees avec diverses fractions, divers retentats et extraits ultrafiltres. La figure 6 illustre des diagrammes en boites montrant les poids de pousses 25 fraiches de bles traites avec diverses fractions, divers retentats et extraits ultrafiltres. Description detaillee des modes de realisation preferes Par « biostimulants » de vegetaux, on entend un materiau organique qui contient une ou plusieurs substances et/ou micro-organismes dont la fonction lorsqu'ils sont appliqués sur des plantes ou la rhizosphere est de stimuler des processus naturels pour 30 amplifier/favoriser l'absorption des nutriments, Pefficacite des nutriments, la tolerance a un stress abiotique, et la qualite des cultures. Lors de Pintroduction d'elements de la presente invention ou de son/ses mode(s) de realisation prefere(s), les articles « un », « une », « le », « la » et « ledit/ladite » sont 5 censes signifier qu'il y a un ou plusieurs des elements. Les termes « comprenant », incluant » et « ayant » sont censes etre inclusifs et signifient qu'il peut y avo ir des elements supplementaires autres que les elements enumeres. Tel qu'utilise ici, le terme « environ » se rapporte a une valeur mesurable telle 5 qu'un parametre, une quantite, une duree temporelle, et analogues et est cense inclure des variations de +/- 15 ou inferieures, de preference des variations de +/- 10 % ou inferieures, de fawn davantage prefer& des variations de +/- 5 % ou inferieures, de *on meme davantage prefer& des variations de +/- 1 % ou inferieures, et de fawn encore davantage prefer& des variations de +/- 0,1 % ou inferieures de et a partir de la valeur 10 eh& en particulier, tant que de telles variations sont appropriees pour s'exercer dans l'invention decrite ici. En outre, it faut egalement comprendre que la valeur a laquelle la preposition « environ » se rapporte est elle-meme specifiquement divulguee ici. La presente invention decrit un procede pour purifier et isoler des composes biostimulants a partir d'extraits derives d'algues qui sont capables craugmenter les taux de 15 croissance et les rendements d'un large &entail de cultures. Telle que decrite ici, selon un mode de realisation, la presente invention fournit un procede pour purifier des composes bioactifs responsables de la stimulation de la croissance vegetate dans des extraits d'algues par le profilage metabolomique des extraits d'algues. 20 Ainsi, selon un mode de realisation, la presente invention concerne de fawn generale une ou plusieurs molecules bioactives isolees d'une espece d'algues, la ou les plusieurs molecules bioactives ayant une masse moleculaire situ& dans la plage d'environ 0,15 kDa a environ 1,0 kDa. La ou les plusieurs molecules bioactives sont celles capables d'ameliorer la croissance vegetate. Dans un mode de realisation, l'espece d'algues est une 25 espece d'algues brunes. Les algues brunes peuvent comprendre une espece d'algues choisie dans le groupe comprenant Ascophyllum nodosum, Fiscus vesiculosus, Sargassum sp., et des combirraisons d'une ou de plusieurs des precedentes. Selon un mode de realisation, la ou les plusieurs molecules bioactives ne comprennent pas de polysaccharide sulfate ou de laminarine. 30 La presente invention concerne egalement de fawn generale un procede pour ameliorer la croissance vegetate, le procede comprenant l'etape d'application d'une composition comprenant la ou les plusieurs molecules bioactives isolees a au moins un choisi parmi le sol, une plante, ou une graine. L'amelioration de la croissance vegetate comprend au moins un choisi parmi : l'activation de la germination des grainer, la 6 stimulation du developpement des racines, la prolongation d'une periode vegetative, le rallongement d'une periode de production, ou le rallongement d'une periode de recolte. La presente invention concerne egalement de facon generale un procede pour isoler et purifier des composes bioactifs dans un extrait obtenu a partir d'algues, le 5 procede comprenant les etapes suivantes a) la circulation de l'extrait a travers une membrane d'ultrafiltration presentant un seuil de coupure de masse moleculaire approprie ; b) le recueil du filtrat a partir de l'extrait d'algues pour obtenir une premiere fraction de filtrat et un retentat ; et 10 c) le rincage du retentat pour obtenir une ou plusieurs fractions supplementaires de filtrat. Le procede comprend en outre l'etape devaluation de la bioactivite de la premiere fraction du filtrat et des fractions supplementaires du filtrat pour determiner leur efficacite sur la croissance vegetate. L'efficacite sur la croissance vegetate peut comprendre au 15 moins un choisi parmi l'activation de la germination des graines, la stimulation du developpement des racines, la prolongation d'une periode vegetative, le rallongement d'une periode de production, ou le rallongement d'une periode de recolte. Selon un mode de realisation, l'extrait est produit a partir d'une espece d'algues brunes. L'extrait peut 'etre obtenu a partir des algues Ascophyllum nodosum, Fucus vesiculosus, ou Sargassum sp. 20 Selon un mode de realisation prefere, le retentat comprend des molecules actives choisies dans le groupe consistant en des polysaccharides sulfates et de la laminarine, qui sont des molecules actives capables de stimuler la tolerance a un stress abiotique, tel qu'un exces de sel, dans les cultures. Le premier filtrat comprend des molecules_bioactives ayant une masse moleculaire situ& dans la plage d'environ 0,15 kDa a environ 1,0 kDa. 25 La membrane d'ultrafiltration peut presenter un seuil de coupure de masse moleculaire (MWCO) inferieur a 3 kDa, de preference un MWCO inferieur a 2 kDa, et plus preferentiellement un MWCO inferieur a 1 kDa. Ascophyllum nodosum (varech) est une espece fucoide d'algues brunes trouvees dans l'ocean Atlantique Nord et elle a ete utilisee comme source de biostimulants pour des 30 cultures agricoles afin d'ameliorer la croissance vegetate, la productivite vegetate et la qualite alimentaire. Plusieurs techniques de purification ont ete testees pour dessaler et purifier ces extraits d'algues selon la polarite et la taille des molecules. Pour chaque procedure de purification, les fractions ont ete testees sur des laitues pour s'assurer que la bioactivite 7 etait conservee dans les differentes fractions dessalees ou si elle demeurait associee aux sels. Cette ≊ de purification a ete appliquee sur un extrait d'algues (RM-2705, un extrait fucoIde disponible chez Goemar) et les fractions non polaires purifiees ont montre un haut niveau de purete. La majorite des biomolecules (environ 69 %) ont ete co-eluees 5 avec les sels afin de demontrer que les molecules bioactives etaient localisees dans l'une des fractions non polaires purifiees. Ensuite, les differentes fractions ont ete testees sur des laitues comparativement a l'extrait total. Toutefois, les resultats ont montre que les molecules bioactives responsables de la stimulation de la croissance vegetale etaient presentes dans la fraction polaire qui contenait egalement des sels. Il a ete determine que 10 le fractionnement selon la polarite des molecules contenues dans les extraits RM-2705 et RM-3496 n'etait pas approprie pour le dessalage et la purification des extraits d'algues. En effet, pour toutes les techniques de fractionnement utilisees, les molectiles bioactives sont restees associees aux sels. Ainsi, le defi souleve a ete de trouver un autre procede de dessalage des extraits 15 d'algues, tout en maintenant l'activite biostimulante sur la croissance vegetale. Diverses techniques de purification ont ete etudiees, y compris l'extraction liquide-liquide (LLE) avec de l'acetate d'ethyle, l'extraction sur phase solide (SPE) avec differents materiaux absorbants (une phase normale : cyanopropyl-silice et une phase inverse : Amberlite® XAD2), l'extraction solide-liquide (SLE) avec du butanol et la chromatographie 20 d'exclusion sterique (SEC). En outre, afin d'obtenir des informations quant a la stabilite des molecules bioactives, la stabilite a la chaleur de l'activite de l'extrait RM-27055 a ete analysee sur des laitues. Les resultats ont montre une stabilite a la chaleur des molecules bioactives, et l'autoclavage ou l'ebullition des extraits takes a amplifie les poids des pousses fralehes de 25 laitues. Le fractionnement selon la polarite est apparu inefficace dans la purification des molecules bioactives, si bien que l'extrait d'algues a ete fractionne selon la taille des particules de ses molecules pour tenter son dessalage. Il a ete determine que toutes ces techniques sont apparues inefficaces pour 30 l'objectif a l'exception de la chromatographie d'exclusion sterique (SEC) avec une matrice Superdex®30, egalement appelee ici chromatographie par filtration sur gel (GF). Il a ete trouve que la SEC est le seul procede efficace pour dessaler etpurifier le filtrat d'algues. Sur cette base, l'extrait d'algues (RM-3496) a ete fractionne par le procede de fractionnement par SEC et les molecules ont ete eluees selon leur taille (ou masses 8 moleculaires) comme it est represents sur la figure 1.a. Une matrice Superdex30® (GE Healthcare, Bjorkgatan, Suede) a ete utilisee pour assurer une bonne separation des molecules avec une masse moleculaire inferieure a 10 kDa. Plus les molecules etaient petites (c'est-d-dire, masses moleculaires inferieures), plus elles etaient emprisonnees dans 5 les billes poreuses du gel et eluees ulterieurement. Ainsi, les masses moleculaires des molecules diminuent de la premiere fraction (c'est-A-dire, F 1) a la derniere fraction (c'esta-dire, F6). Les fractions F1 et F2 etaient constituees des molecules plus grosses qui circulent a travers la colonne plus rapidement que les sels et les molecules de masse moleculaire tres basse ont ete eluees dans les fractions F5 et F6. 10 Afin d'evaluer les plages de masses moleculaires des molecules contenues dans les differentes fractions, un mélange d'etalons (0,5 % p/v) a ete injects sur le systeme de SEC. Le chromatogramme des etalons est illustre sur la figure 1.b. a) Laminarine (environ 3 a environ 5 kDa), b) Raffinose (594 Da), c) Saccharose (343,3 Da), d) Sel citrate (343,3 Da), e) Mannitol (182,2 Da) et 0 Glycine (75,1 Da). Selon ces resultats, la fraction 15 F1 contenait des molecules avec des masses moleculaires elevees (superieures a 4 kDa), la fraction F2 contenait la laminarine (d'environ 3 a environ 4 kDa) qui a ete eluee entre les fractions Fl et F2. Un ultrafiltrat, obtenu apres l'ultrafiltration de l'extrait RM-2705 sur un systeme d'ultrafiltration avec un seuil de coupure de membrane de 1 kDa, a ete injects sur le 20 systeme de SEC. Le profil chromatographique de l'ultrafiltrat a montre seulement les pics chromatographiques correspondant a ceux des fractions F3, F4, F5 et F6 provenant du fractionnement par SEC de l'extrait RM-2705. Ainsi, la fraction F3 contenait des molecules avec des masses moleculaires inferieures a 1 kDa jusqu'a environ 0,18 kDa, la fraction F4 contenait des molecules avec des masses moleculaires inferieures a environ 25 0,2 kDa comme le mannitol (182,2 Da) et les fractions F5 et F6 contenaient des sels et des molecules de masses moleculaires tres basses comme la glycine (75 Da). Les spectres de RMN des differentes fractions ont confirms la presence de polysaccharides sulfates (polymeres de fucane) dans la premiere fraction F 1 alors que la seconde fraction F2 contient la laminarine (d'environ 3 a environ 4 kDa) et la fraction F4 contient le rnannitol 30 (182,2 Da). Les deux dernieres fractions F5 et F6 contenaient des molecules de masses moleculaires tres basses et des sels. Les differentes fractions obtenues par fractionnement par SEC ont ete testees pour leur activite de stimulation de la croissance vegetale sur des laitues comparativement l'extrait total d'algues RM-3496. Avant l'injection sur la chromatographie, l'extrait 9 d'algues a ete are et cet extrait filtre a ete egalement tests sur des laitues pour verifier son efficacite. Les resultats ont montre que les molecules bioactives ont ete trouvees dans la fraction F3 comme it est illustre sur la figure 2. Une activite significative a ete trouvee dans la fraction F3 qui contenait des molecules situees dans la plage d'environ 0,15 kDa a 5 environ 1 kDa. La combinaison des differentes techniques utilisees pour dessaler l'extrait RM2705 a fourni des informations quant aux proprietes physico-chimiques de la ou des molecules bioactives. En particulier, it a ete determine que les molecules bioactives sont polaires et leurs masses moleculaires se situent dans la plage d'environ 0,15 a environ 10 1 kDa. Ainsi, d'apres ces informations, les polymeres de fucanes qui sont les polysaccharides sulfates majeurs dans l'extrait acide d'Ascophyllum nodosum, la laminarine (d'environ 3 a environ 4 kDa), un eliciteur beta-1,3-glucane, et le mannitol (182 Da), un polyol qui peut representer jusqu'a environ 8 a 10 % de l'extrait en poids sec, sont exclus des polymeres bioactifs favorisant la croissance. 15 Min de confirmer la bioactivite de la fraction F3 purifiee, une culture in vitro utilisant la plante modele Arabidopsis thaliana a ete developpee et reproduite plusieurs fois. Ces tests illustres sur la figure 3.a. ont confirms la bioactivite de la fraction F3 tandis que la presence de sels dans l'extrait RM-3496 a perturbs la croissance d'Arabidopsis thaliana dans ces- conditions de culture. Toutefois, le RM-3496 reconstitue correspondant 20 a la reconstitution de l'extrait d'algues avec les fractions de SEC, a montre une activite favorisant la croissance. En outre, dans cette analyse de bioactivite in vitro, la fraction F3 et le RM-3496 reconstitue ont egalement semble amplifier la croissance des racines comme represents sur la figure 3.b. La fraction F3 a demontre une forte activite de stimulation de la croissance tandis 25 que les fractions F1 et F2 ont ete inactives. Toutefois, durant le developpement du dernier essai biologique, it a ete montre qu'en presence de sel (100 mM de NaCI), la fraction F3 n'a plus ete active pour stimuler la croissance, tandis que F1 et F2 ont affiche des effets similaires, et que l'extrait total RM-2705 a confers une tolerance aux sels. Ces resultats indiquent que l'extrait RM-2705 contient differents composes actifs avec differents modes 30 d'action, y compris (1) la fraction de masse moleculaire basse (LMW) responsable de la stimulation de la croissance, et (2) des fractions contenant de la laminarine et des fucanes qui conferent une tolerance aux stress (sel, ainsi que resistance a un stress biotique). 10 Pris ensemble, ces resultats indiquent que le fractionnement de l'extrait RM-2705 peut fournir au moms deux types de produits avec des modes d'action distincts et ainsi differentes applications en utilisant les manes materiaux bruts. Puisque la SEC n'est pas transferable a une echelle industrielle, it a ete souhaitable 5 de developper egalement un autre procede capable de produire des produits fractionnes d'extraits d'algues qui peuvent fournir une activite stimulante de la croissance vegetale sur une plus grande echelle. Une variante a la SEC est l'ultrafiltration (UF), un procede de fractionnement dans lequel l'extrait d'algues est filtre a travers des membranes d'ultrafiltration avec des seuils 10 de coupure de masse moleculaire (MWCO) appropries, qui selon un mode de realisation peuvent etre un MWCO de 1 lcDa pour produire une fraction ayant des molecules bioactives situees dans la plage souhaitee d'environ 0,15 kDa a 1,0 kDa Ainsi, dans un mode de realisation, un extrait d'algues peut etre ultrafiltre en utilisant une membrane de MWCO de 1 lcDa. 15 Selon un mode de realisation et dans le sens le plus large, la presente invention fournit un procede de purification d'une composition biostimulante derivee d'un extrait d'algues comprenant une ≊ d'ultrafiltration utilisant une membrane d'ultrafiltration semi-permeable pour separer les molecules d'interet du reste du mélange selon leur masse moleculaire, leur taille et leur forme. 20 L'etape d'ultrafiltration peut etre realisee en utilisant un equipement d'ultrafiltration dans lequel une solution d'extrait d'algues comprenant entre environ 1 % en poids et environ 15 % en poids de matiere seche, de preference entre environ 2 % en poids et environ 7 % en poids de matiere seche, est soumise a une ultrafiltration en utilisant une membrane avec un seuil de coupure de masse moleculaire (MWCO) 25 approprie. Selon un mode de realisation, le procede d'ultrafiltration implique une ultrafiltration tangentielle. Le filtrat est recueilli pour ses proprietes biostimulantes tout en mettant en recirculation le retentat (ou le concentre), qui est laisse de cote pour d'autres applications A la fm du procede. Bien que cela ne soit generalement pas necessaire ou requis, si c'est 30 souhaite, une purification supplementaire du retentat (ou du concentre) peut etre obtenue par l'addition d'eau fraiche a une vitesse correspondant a celle a laquelle l'eau, conjointement avec les molecules ayant une masse moleculaire inferieure ou egale 1 kDa est eliminee de l'ultrafiltrat. 11 Comme it est observe sur la figure 4, l'ultrafiltration peut etre realisee par un procede dans lequel le reservoir de la solution (1) est chargé avec un lot d'extrait d'algues. La solution est mise en circulation par le tuyau (2) et la pompe (3) dans un collecteur d'admission (4) d'une unite d'ultrafiltration (5). L'unite d'ultrafiltration (5) comprend une 5 ou plusieurs cartouches disposees en parallele pour fournir la surface de membrane d'ultrafiltration appropriee. L'ultrafiltrat sort ensuite de l'unite d'ultrafiltration (5) par le tuyau de sortie (6) et est recupere dans is cuve (7). Le concentre d'ultrafiltration sort de l'unite d'ultrafiltration (5) par le collecteur de sortie (8) et retourne par le tuyau (9) vers le reservoir de la solution (1). 10 La membrane contenue dans l'unite d'ultrafiltration (5) peut etre une membrane de type polymere ou ceramique. Selon un mode de realisation, la membrane comprend une membrane ceramique tubulaire comprenant une pluralite de canaux. Par exemple, la membrane peut contenir entre environ 15 et environ 50 canaux, de preference entre environ 19 et environ 39 canaux et peut avoir une longueur situ& entre environ 50 et 15 environ 150 cm. Selon d'autres modes de realisation, des membranes en spirale et des membranes de filtration tangentielle peuvent etre egalement utilisees dans la pratique de l'invention. La surface de la membrane se situe generalement entre environ 0,20 et environ 0,6 m2, de preference entre environ 0,30 et 0,40 m2. Le retentat est rince plusieurs fois pour eliminer la majeure partie des molecules 20 avec une masse moleculaire inferieure au seuil de coupure de la membrane. Les ultrafiltrats contiennent des molecules avec une masse moleculaire inferieure au seuil de coupure de la membrane. Dans un cas, le seuil de coupure est de 3 kDa, de preference de 2 kDa, et plus preferentiellement de 1 kDa. Les molecules qui sont contenues dans les ultrafiltrats affichent des masses moleculaires basses inferieures au MWCO, par exemple, 25 1 kiJa, et sont couramment appelees metabolites. Les retentats contiennent des molecules avec des masses moleculaires superieures au seuil de coupure des membranes, par exemple, 1 kDa. Les molecules qui sont contenues dans le retentat affichent des masses moleculaires elevees (par exemple, la iaminarine d'environ 3 a environ 4 kDa ou les fucoRlanes superieurs a environ 30 kDa et d'autres biopolymeres de masse moleculaire 30 elevee des algues brunes). 11 a ete trouve que toutes les especes d'algues de l'ordre des Fucales affichent une activite prometteuse et peuvent etre soumises aux procedes decrits ici. Ces especes d'algues comprennent, mail n'y sont pas limitees, des especes des families des Fucacees, des Sargassacees et des Durvilleacees. D'autres especes des ordres des Fucales et des 12 Laminariales comprennent, mais n'y sont pas limitees, les Ascoseirales, les Asterocladales, les Desmarestiales, les Dictyotales, les Dictyotophycidae, les Discosporangiales, les Discosporangiophycidae, les Ectocarpales, les Fucales, les Fucophycidae, les Ishigeales, les Ishigeophycidae, les Laminariales, les Nemodermatales, les Onslowiales, des 5 Pheophycees ordo incertae sedis, les Phaeosiphoniellales, les Ralfsiales, les Scytothamnales, les Sphacelariales, les Sporochnales, les Stschapoviales, les Syringodermatales, les Tilopteridales, parmi d'autres. En outre, alors que la presente invention est decrite et montree comme demontrant des resultats positifs sur des especes d'algues de l'ordre des Fucales, le procede n'est pas 10 limite a ces especes d'algues et peut 'etre egalement utilise pour isoler et analyser des filtrats de toute algue ou d'autres especes qui peuvent agir comme des biostimulants pour determiner la bioactivite de tels filtrats. Tel qu'utilise sur les figures ici, le terme « filtrat » se rapporte au filtrat et aux ultrafiltrats obtenus apres une ou plusieurs ultrafiltrations a travers l'unite d'ultrafiitration. 15 Tel qu'utilise sur les figures ici, le terme « retentat » se rapporte au retentat sans rincage et aux retentats obtenus apres un ou plusieurs rincages. EXEMPLES Exemple 1 Un extrait RM-3496 a ete ultrafiltre a Pechelle de laboratoire avec une membrane 20 ayant un MWCO de 1 kDa et le retentat a ete rince trois fois avec de l'eau. L'ultrafiltrat, contenant des molecules avec des masses moleculaires inferieures a 1 kDa, et le retentat, contenant des molecules avec des masses moleculaires superieures a 1 kDa ont ete testes sur des laitues et du ble. Ainsi, les differents filtrats et retentats ont ete appliqués sur des laitues et des bles. Les extraits GF142 et GS142 (disponibles aupres des Laboratoires 25 Goemar) ont ete fabriques avec le meme procede a partir de Fucus vesiculosus et de Sargassum natans respectivement. Les resultats sont presentes sur les figures 5 et 6, qui illustrent des diagrammes en boite a moustaches montrant les poids des pousses fraiches des plantes temoins, des plantes traitees avec quatre extraits d'algues differents (RM-2705, RM-3496, GF142 et GS142), les plantes traitees avec des molecules avec des masses 30 moleculaires elevees correspondent aux retentats nommes : RM-3496.retentat, GF142.retentat et GS142.retentat, et les plantes traitees avec des molecules avec des masses moleculaires basses correspondent aux filtrats nommes : RM-3496.filtrat, GF142.filtrat et GS142.filtrat. Ces resultats confirment l'efficacite des extraits d'algues et 13 montrent une activite dans les filtrats favorisant la croissance, alors que les retentats apparaissent inefficaces dans l'activation de la croissance vegetale. Exemple 2 Dix litres d'un extrait aqueux provenant d'Ascophyllum nodosum (pH 2,76) ont ete 5 places dans un reservoir de solution d'une unite d'ultrafiltration a l'echelle pilote equip& d'une membrane d'ultrafiltration en ceramique tubulaire, d'une longueur de 58 cm (diametre : 25 mm, 23 canaux, seuil de coupure de 1 kDa) (fournie par Tami Industries). La solution a ete pomp& a travers le tuyau d'ultrafiltration avec une recirculation complete du concentre de retour vers le reservoir. Six litres de filtrat ont ete preleves et 10 identifies comme F1. Le retentat (41) a ete rince deux fois avec 5 litres d'eau pour produire 2 filtrats (F2 = 5 1; F3 = 5 1). Les differents filtrats (F1, F2, F3) ont ete en outre evalues pour leurs proprietes biostimulantes. Exemple 3 Cinq litres d'un extrait aqueux provenant de Fucus vesiculosus (pH 2,42) ont ete 15 places dans un reservoir de solution d'une unite d'ultrafiltration a l'echelle pilote equip& d'une membrane d'ultrafiltration en ceramique tubulaire, d'une longueur de 58 cm (diametre : 25 mm, 23 canaux, seuil de coupure de 1 kDa) (fournie par Tami Industries). La solution a ete pomp& a travers le tuyau d'ultrafiltration avec une recirculation complete du concentre de retour vers le reservoir. Le filtrat a ete preleve et identifie 20 comme Fl. Le retentat (2,5 1) a ete rince une fois avec 2,5 1 d'eau pour produire 2,5 litres de filtrat (F2 = 2,5 1). Les differents filtrats (F1, F2) ont ete en outre evalues pour leurs proprietes biostimulantes. Exemple 4 Cinq litres d'un extrait aqueux provenant de Sargassum natans (pH 2,92) ont ete 25 places dans un reservoir de solution d'une unite d'ultrafiltration a Pechelle pilote equip& d'une membrane d'ultrafiltration en ceramique tubulaire, d'une longueur de 58 cm (diametre : 25 mm, 23 canaux, seuil de coupure de 1 kDa) (fournie par Tami Industries). La solution a ete pomp& a travers le tuyau- d'ultrafiltration avec une recirculation complete du concentre de retour vers le reservoir. Le filtrat a ete preleve et identifie 30 comme Fl. Le retentat (2,5 1) a ete rince une fois avec 2,5 1 d'eau pour produire 1 litre de filtrat (F2 = 2,5 1). Les differents filtrats (F1, F2) ont ete en outre evalues pour leurs proprietes biostimulantes. 14 Exemple 5 RM-3496, fabrique par les Laboratoires Goemar a partir d'un extrait d'Ascophyllum nodosum et deux autres extraits d'algues (GF142 et GS142, fabriques par les Laboratoires Goemar a partir de Fucus vesiculosus et de Sargasssum natans 5 respectivement) ont ete soumis a une ultrafiltration et &allies pour leurs proprietes biostimulantes. Ces trois extraits fucoIdes ont ete ultrafiltres sur une membrane en ceramique (disponible auprs de TAME Industries) ayant un MWCO approprie (c'est-A-dire, 1 kDa). Dix litres de RM-3496 ont ete ultrafiltres et cinq litres de l'ultrafiltrat ont ete preleves et 10 ont constitue le filtrat 1 utilise dans des experiences supplementaires sur la laitue et le ble. Le retentat (5 1) a ete rince deux fois avec 5 litres d'eau, alors que les retentats de GF142 et GS142 (2,5 1) ont ete rinces seulement une fois avec 2,5 litres d'eau. Les poids secs des filtrats, des ultrafiltrats et des retentats ont ete mesures. Selon le procede de fractionnement de l'extrait RM-3496, les poids secs totaux des filtrats (contenant des 15 molecules avec des masses moleculaires inferieures a 1 I(Da) representaient d'environ 80 % de l'extrait RM-3496 et le retentat representait d'environ 20 % de l'extrait RM-3496. Les details des experiences de croissance vegetale sont decrits ci-dessous. Les traitements ont ete effectues avec differents extraits de Goemar (RM-2705, RM-3496, GF142 et GS142) et un facteur de dilution de 250 (equivalent a 4 millilitres 20 d'extrait liquide par litre de solution nutritive) a ete utilise pour touter les experiences. Les differentes fractions resultant du fractionnement par SEC et du fractionnement par ultrafiltration ont ete appliquees sur des plantes selon leurs rendements de purification qui ont ete calcules a partir des poids secs. Plusieurs repetitions biologiques independantes ont ete effectuees avec les differentes fractions avec n plantes par traitement. 25 Les experiences de croissance sur des laitues ont ete effectuees avec des graines de laitue Lactuca sativa des ecotypes Fabietto ou Janero (disponibles aupres de Voltz, Colmar, France). Les laitues ont ete cultivees dans une chambre de croissance, sur une table rotative pour obtenir un phenotype vegetal aussi homogene que possible pour toute condition de traitement. Les plantes ont ete cultivees sous des lampes d'iodure de sodium 30 a pression &rev& avec un rayonnement photosynthetique actif de 150 ± 10 gmol de photons.m-2.s-1, une thermoperiode de 20/18 °C (jour/nuit) et une photoperiode rallongee de 16 h de lumiere. Afm de controler les apports nutritifs aux plantes et afin de faciliter la recolte des racines, les graines des laitues ont ete cultivees dans des pots de sable. Les plantes ont ete arrosees trois fois par semaine avec une solution nutritive commerciale 15 (disponible aupres de Puteaux, Les Clayes-sous-Bois, France) ayant des concentrations en azote, phosphate, et potassium dans un rapport de N/P/K de 20/20/20 (1 g/1). Les laitues ont ete traitees deux fois (une fois/semaine aux jours 21 et 28) avec les differents extraits d'algues et les fractions ont ete ajoutees a la solution nutritive et les 5 bases des pots ont ete immergees dans la solution nutritive jusqu'a observation de l'absorption totale. Les plantes ont ete recoltees 16 jours apres le premier traitement, et les pousses et les racines ont ete rassemblees separement. Trois repetitions biologiques independantes ont ete effectuees avec les differents extraits d'algues et les differentes fractions. 10 Douze laitues (n = 12) ont ete utilisees par traitement pour les experiences de fractionnement par SEC alors que dix-huit laitues (n = 18) ont ete utilisees par traitement pour les experiences d'ultrafiltration. Des graines d'Arabidopsis thaliana de l'ecotype Columbia (Col-0 obtenues aupres du centre de stock de graines ABRC) ont ete cultivees in vitro. Les graines ont ete d'abord 15 sterilisees a la surface et elles ont ete semees sur des boites de Petri carrees contenant du milieu basal de Murashige et Skoog (MS) dilue au demi complements avec 1 % (p/v) de saccharose (30 mM) et 0,6 % (p/v) de Phytagel®. Les boites de Petri ont ete incubees sous une lumiere fluorescente froide avec une intensite de 225 ± 10 umol de photons.m2.s-1, avec une photoperiode rallongee de 16 h de lumiere a 21 °C ± 0,5 °C. 20 L'emplacement des boites de Petri sous les lampes neon a ete-change tous les jours et ceci tout le long de l'experience pour randomiser l'experience. Les plantules presentant une croissance uniforme ont ete choisies et transferees 6 jours apres la germination sur le milieu de traitement. Pour chaque condition, 6 boites de Petri contenant 6 plantules chacune ont ete preparees. 25 Les plantes ont ete recoltees 9 jours apres le transfert sur le milieu de traitement. Quatre analyses independantes de bioactivite ont ete effectuees et six replicats (n = 6) ont ete utilises par traitement pour les experiences de fractionnement par SEC. Les experiences de croissance sur des tiles ont ete effectuees avec des graines de ble d'hiver (Triticum aestivum L.) variete Altigo (disponible aupres de Limagrain, Saint- 30 Beauzire, France). Les bles ont ete cultives dans une chambre de croissance sur une table rotative afin d'obtenir pour chaque condition un phenotype vegetal aussi homogene que possible Afin de controler les apports nutritifs aux plantes, les graines de ble ont ete cultivees dans des pots de vermiculite. Les plantes ont ete cultivees dans la chambre de croissance sous des lampes d'iodure de sodium a haute pression avec un rayonnement 16 photosynthetique actif de 150 +/- 10 umol de photons.m-2.s-1 et une thermoperiode de 22/18 °C avec une photoperiode rallongee de 16 heures. Dix jours apres le semis, des plantes homogenes ont ete distribuees dans differents plateaux ; 6 plantes par plateau et deux plateaux par condition. Les plantes ont ete arrosees trois fois par semaine avec la 5 meme solution nutritive commerciale que celle utilisee pour les experiences sur les laitues. Deux semaines apres le semis, les bles ont ete traites cinq fois (tous les 2 ou 3 jours) avec les differentes fractions et les differents extraits et ont ete recoltes 13 jours apres le premier traitement. L'efficacite des differentes fractions a ete estimee par comparaison des poids des pousses fraiches. Trois repetitions bialogiques independantes 10 ont ete effectuees avec les differents extraits d'algues et les differentes fractions. Douze bles (n = 12) ont ete utilises par traitement pour les experiences d'ultrafiltration. Dans la presente invention, l'efficacite des differentes fractions et des differents extraits sur la stimulation de la croissance vegetale a ete evaluee par une approche statistique. En effet, pour chaque analyse de bioactivite presentee, la normalite des 15 donnees a ete d'abord verifiee avec les tests de normalite de Shapiro-Wilk, avec les diagrammes Quantiles-Quantiles et avec les histogrammes de densite. L'homoscedasticite de ces donnees a ete egalement verifiee avec le test de Barlett, avant d'effectuer les tests parametriques sur ces donnees. Plusieurs analyses de bioactivité (trois a quatre repetitions independantes dans le temps) ont ete realisees pour estimer les differents traitements sur 20 la stimulation de la croissance vegetale avec un nombre N-de plantes par traitement. Une analyse de variance a deux facteurs (Anova a deux facteurs) a ete ensuite effectuee sur les donnees pour determiner s'il y a eu une difference significative (avec une erreur alpha de 5 %) entre les moyennes des differents traitements pour chaque analyse de bioactivite et entre les moyennes de chaque traitement pour les differentes analyses de bioactivite 25 realisees. Selon les resultats de l'Anova, un test de Tukey HSD post-hoc parametrique ou une comparaison multiple par paire a ete effectue sur les donnees pour determiner la plage et definir quelles moyennes etaient significativement differentes les unes des autres. Les resultats du test de Tukey sont presentes sur les diagrammes en boites a moustaches avec les lettres en gras. Les moyennes des traitements qui sont significativement 30 differentes les unes des autres affichent des lettres en gras differentes. Ces moyennes sont illustrees sur chaque diagramme en boite a moustaches par un point. Les composes decrits ici peuvent etre utilises sur diverses cultures y compris, par exemple, le soja, le trials, des cereales (c'est-à-dire, le ble, l'orge, le seigle, et l'avoine), le colza, le canola, le tournesol, la betterave a sucre, les pommes de terre, les legumes secs 17 (c'est-à-dire, les lentilles, les haricots secs, etc.), la canne a sucre, les legumes-fruits, y compris les tomates, l'aubergine, les poivrons, les cucurbitacees, etc., les legumes a bulbes, y compris les oignons et les poireaux, les legumes a fetes et a feuilles, y compris la laitue, les epinards et le celeri, les brassicacees, les fruits a noyau, les fruits a pepins, 5 les agrumes, le café, le cacao, les fruits a coque, les baies, les raisins (de table et pour vinification), entre autres. Enfin, it faudra egalement comprendre que les revendications suivantes sont prevues pour couvrir toutes les caracteristiques generiques et specifiques de l'invention decrite ici et toutes les declarations de l'etendue de l'invention qui, en matiere de langage, REVENDICATIONS1. Une ou plusieurs molecules bioactives isolees d'une espece d'algues, la ou les plusieurs molecules bioactives ayant une masse moleculaire situ& dans la plage d'environ 0,15 kDa a environ 1,0 kDa. 2. Une ou plusieurs molecules bioactives selon la revendication 1, oil la ou les plusieurs molecules bioactives sont capables d'ameliorer la croissance vegetale. 3. Une ou plusieurs molecules bioactives selon la revendication 1 ou 2, oil l'espece d'algues est une espece d'algues brunes. 4. Une ou plusieurs molecules bioactives selon la revendication 3, oil l'algue brune comprend une espece d'algues choisie dans le groupe comprenant Ascophyllum nodosum, 10 Fucus vesiculosus, Sargassum sp., et des combinaisons d'une ou de plusieurs des precedentes. 5. Une ou plusieurs molecules bioactives selon !'une quelconque des revendications 1 a 4, oil la ou les plusieurs molecules bioactives ne comprennent pas un polysaccharide sulfate ou de la laminarine. 15 6. Procede d'amelioration de la croissance vegetale, le procede comprenant l'etape d'application d'une composition comprenant la ou les plusieurs molecules bioactives isolees selon l'une quekonque des revendications 1 a 5 sur au moins un choisi parmi le sol, une plante, ou une graine. 7. Procede selon la revendication 6, dans lequel l'amelioration de la croissance vegetale 20 comprend au moins un choisi parmi : l'activation de la germination des graines, la stimulation du developpement des racines, la prolongation d'une periode vegetative, le rallongement d'une periode de production, ou le rallongement d'une periode de recolte. 8. Procede pour isoler et purifier des composes bioactifs dans un extrait obtenu a partir d'algues, le procede comprenant les &apes suivantes : 25 a) la circulation de l'extrait a travers une membrane d'ultrafiltration presentant un seuil de coupure de masse moleculaire approprie ; b) le recueil du filtrat a partir de l'extrait d'algues pour obtenir une premiere fraction de filtrat et un retentat ; et 19 c) le rincage du retentat pour obtenir une ou plusieurs fractions supplementaires de filtrat. 9. Procede selon la revendication 8, comprenant en outre retape devaluation de la bioactivite de la premiere fraction du filtrat et des fractions supplementaires du filtrat pour determiner leur efficacite sur la croissance vegetale. 5 10. Procede selon la revendication 8 ou 9, dans lequel refficacite sur la croissance vegetale comprend au moins un choisi parmi : l'activation de la germination des graines, la stimulation du developpement des racines, la prolongation d'une periode vegetative, le rallongement d'une periode de production, ou le rallongement d'une periode de recolte. 11. Procede selon l'une quelconque des revendications 8 a 10, dans lequel l'extrait est produit a partir d'une espece d'algues brunes. 12. Procede selon l'une quelconque des revendications 8 a 11, dans lequel l'extrait est obtenu a partir d'algues Ascophyllum nodosum, Fucus vesiculosus, ou Sargassum sp. 13. Procede selon l'une quelconque des revendications 8 a 12, dans lequel le retentat comprend des molecules actives choisies dans le groupe consistant en des polysaccharides sulfates et de la laminarine, et dans lequel les molecules actives sont capables de stimuler la tolerance a un stress abiotique dans des cultures. 14. Procede selon l'une quelconque des revendications 8 a 13, dans lequel le premier filtrat comprend des molecules bioactives ayant une masse moleculaire situ& dans la plage d'environ 0,15 kDa a environ 1,0 kDa. 15. Procede selon rune quelconque des revendications 8 a 14, dans lequel la membrane d'ultrafiltration presente un seuil de coupure de masse moleculaire inferieur a 3 kDa. 16. Procede selon la revendication 15, dans lequel la membrane d'ultrafiltration presente un seuil de coupure de masse moleculaire inferieur a 2 kDa. 17. Procede selon la revendication 16, dans lequel la membrane d'ultrafiltration presente 25 un seuil de coupure de masse moleculaire inferieur a 1 kDa.