Brevet FR3069163A1 — publié le 20190125

Extrait aqueux d'un broyat de planaires. La présente invention concerne une préparation à base d'extrait d'organismes plathelminthe utile notamment pour la régénération de cellules humaines ou animales, 5 notamment de mammifères. Le terme de « planaire » est utilisé pour désigner un certain nombre de vers plats de l'embranchement des Plathelminthes. Il désigne principalement les Turbellaridés non-exclusivement parasitaires d'eau douce, soit les Paludicola, mais est aussi utilisé pour les Turbellaridés marins, voire pour tous les vers plats. Les Plathelminthes sont des vers plats 10 dont de nombreuses espèces sont des parasites. Cet embranchement regroupe principalement des vers qui sont des animaux allongés sans appendice. Les vers les plus connus de la classe des Turbellarla (vers plats non exclusivement parasites) sont les planaires, vers dont l'épaisseur du corps peut mesurer moins d'un millimètre. Les planaires sont des donc vers plats aquatiques appartenant à plusieurs espèces dans la classe des 15 Turbellaridés. Les planaires peuvent être nageuses ou rampantes, et vivre en mer ou en eau douce, ou encore dans les sols très humides (en forêt tropicale). Les planaires sont des organismes capables de se régénérer perpétuellement, et n'importe quelle partie de son corps, du fait de la présence d'une grande quantité de cellules souches (20-30%) dans ses tissus comparés aux autres organismes vivants pour lesquels la 20 quantité de cellules souches est de l'ordre de lppm. Les cellules souches de planaire se multiplient et se régénèrent continuellement, à la différence des cellules souches des organismes plus évolués, lesquelles ne se multiplient pas ou peu. Les facteurs biochimiques permettant la multiplication des cellules souche chez une planaire reste non-identifiés. De par sa capacité de régénération, si une partie d'une planaire est séparée du reste 25 de son corps, l'animal recrée dans son intégralité l'autre partie manquante. Ce phénomène de « fission transversale », également mis en jeu lors de la reproduction asexuée, existe chez d'autres animaux, métazoaires notamment, mais rares sont ceux qui peuvent rivaliser avec les planaires dans ce domaine. On a découvert, selon la présente invention, qu'un extrait de planaire notamment de 30 l'espèce Schrnidtea rnediterranea, est capable d'activer la multiplication de cellules souches humaines, lequel extrait planaire du fait de cette activité de régénération cellulaire peut donc 2 être utile dans de nombreuses applications cosmétique ou médicale, notamment dermatologique, ou encore alimentaire. Plus précisément, la présente invention fournit un extrait aqueux utile notamment pour la régénération de cellules humaines ou animales, notamment de mammifères, comprenant un extrait aqueux débarrassé de tout débris solide non soluble de broyat d'organismes du type plathelminthe présentant une capacité de régénération, contenant au moins les composants intracellulaires des cellules desdits organismes d'un lysat cellulaire des dites cellules des dits organismes. On entend ici par « lysat cellulaire » que les cellules desdits organismes sont cassées de sorte que les composants intracellulaires sont libérés dans ledit extrait lors du broyage du dit organisme. Et, ledit extrait aqueux de broyat est un extrait aqueux des dits organismes broyés débarrassés de tout débris solide non soluble, c'est-à-dire qu'on ne retient donc en quelque sorte que le « jus de planaires » résultant du broyage contenant seulement les composants intracellulaires des cellules desdits organismes d'un lysat cellulaire desdites cellules desdits organismes. Plus particulièrement, lesdits organismes sont des vers plats aquatiques du type planaire. Plus particulièrement encore, lesdits organismes sont des espèces Schrnidtea rnediterranea, Dugesla japonica, Dendricoelurn lacteurn, Polycelis nigra, Polycelys tenuis ou 20 Planarla torva. Plus particulièrement encore, ledit extrait aqueux de broyat comprend un surnageant de centrifugation dudit broyat. Plus particulièrement encore, ledit extrait aqueux de broyat comprend en outre un milieu de culture cellulaire, de préférence un milieu de culture apte à cultiver des cellules 25 humaines ou animales à régénérer. Plus particulièrement encore, le dit extrait aqueux de broyat comprend le broyat de 50 à 200 mg de vers /mL de solution aqueuse, notamment pour des vers de 1 à 5 mg, ledit extrait aqueux de broyat étant en outre dilué de préférence à plus que 1/5ième et moins que 1/100ième, de préférence dilué au 1/10ième à 1/50'è" ; notamment au 1/20'è", de 30 préférence encore dilué dans du dit milieu de culture des dites cellules. 3 En particulier, pour des vers de 2.2 mg en moyenne, le dit extrait aqueux de broyat comprend le broyat de 88 à 110 mg de vers /mL de solution aqueuse, soit de 40 à 50 vers/mL, ledit extrait aqueux de broyat étant en outre dilué au 1/20ième. Plus particulièrement encore, un spectre de dit extrait aqueux de broyat par 5 spectrométrie de masse dite de type MALDI TOF comprend les 16 pics caractéristiques majoritaires (c'est à dire de plus grandes intensités( valeur S/N maximales) mentionnés dans le tableau 1 suivant, dans lequel les différents pics caractéristiques sont numérotés dans la première colonne, et les paramètres suivants ont les significations suivantes : - M/z : rapports (masse en Dalton/charge) en abscisse des différents pics 10 caractéristiques du spectre, - S/N : rapports (intensité du pic/intensité du bruit de fond) des différents pics caractéristiques du spectre, Tableau 1 M/Z Ecart type S/N Ecart type M/Z S/N 1 8618.401 118.031 10852424.610 11358052.088 2 8270.340 143.008 4620996.274 5564954.057 3 7696.982 133.512 5240359.923 7010776.551 4 7236.251 151.442 8121705.361 11556323.264 5 6803.343 116.896 10708147.034 18373045.879 6 6261.480 163.376 11319617.938 13604702.931 7 5790.573 116.345 21402383.693 37624416.818 8 5330.950 180.245 23085485.049 21438811.717 9 4787.963 120.365 22731248.668 23171439.149 10 4298.636 175.285 24470357.501 21953618.321 11 3793.559 113.425 21664847.045 17673326.341 12 3282.861 172.508 24634530.736 27003268.283 13 2792.441 122.205 22551669.576 22432014.766 14 2294.281 174.311 20589324.299 17568023.101 15 1807.544 115.976 19890585.114 18182405.582 16 1395.545 119.208 33019669.177 29193485.572 4 La présente invention fournit également un lyophilisat d'un extrait aqueux de broyat selon l'invention. La présente invention fournit également un procédé de réalisation d'un extrait aqueux de broyat selon l'invention caractérisé qu'on réalise les étapes dans lesquelles : 5 a) lesdits organismes vivants, de préférence qui ont été lavés à l'eau et n'ont pas été nourris pendant une semaine au moins, sont placés dans un milieu liquide aqueux contenant de préférence un milieu de culture cellulaire ; b) la préparation aqueuse obtenue à l'étape a) est broyée, notamment par broyage mécanique, jusqu'à obtenir la lyse des cellules des dits organismes, de préférence encore les 10 débris de broyat étant de taille inférieure à entre 5 et 10 pm (soit des débris de taille inférieure à la taille de cellules du dit organismes) ; c) on élimine les débris non solubles par centrifugation ; et on récupère le surnageant, d) de préférence, le surnageant de centrifugation est dilué dans une solution aqueuse 15 à plus que 1/5 ième et moins que 1/100ième, de préférence dilué entre 1/10ième et 1/50ième , ladite solution comprenant de préférence encore des composants d'un milieu de culture cellulaire apte à cultiver des cellules humaines ou animales à régénérer . La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un extrait aqueux de broyat ou lyophilisat selon l'invention pour la fabrication d'une composition utile pour régénérer des cellules humaines ou animales, notamment des cellules souches ou différentiées. On cite en particulier les cellules différentiées des types suivants : épithéliale, fibroblaste, kératinocyte, endothéliale, neuronale ou nerveuse. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un extrait aqueux de broyat ou lyophilisat selon l'invention pour la fabrication d'une composition utile pour régénérer des cellules souches humaines ou animales, par exemple une composition utile pour régénérer des cellules souches humaines dentaires. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un extrait aqueux de broyat ou lyophilisat selon l'invention pour la fabrication d'une composition cosmétique ou 5 dermatologique en combinaison avec des supports et/ou excipients appropriés, notamment une composition cosmétique ou dermatologique antivieillissement formulée pour une application topique sous forme de gel, lotion (notamment une solution aqueuse ou sérum), crème, pommade, savon et pâte ( notamment pour masque). 5 La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un extrait aqueux de broyat ou lyophilisat selon l'invention pour la fabrication d'une composition alimentaire. Plus particulièrement encore, un produit cosmétique antivieillissement selon l'invention est formulé pour une application topique sous forme de gel, lotion, crème, pommade, savon ou pâte. 10 Les compositions topiques selon l'invention peuvent comprendre divers excipients usuels adaptés à une administration topique externe, en particulier des excipients acceptables sur le plan dermatologique et cosmétologique. Ces excipients appropriés pour la formulation sont bien connus de l'homme du métier et comprennent par exemple des agents favorisant la pénétration, des agents hydratants, des agents épaississants, des agents 15 émollients et des agents tensioactifs, des agents émulsifiants ; des agents conservateurs. Ces formes d'administration par voie topique sont préparées par les techniques connues, et par exemple, dans le cas d'une crème, par dispersion d'une phase grasse dans une phase aqueuse pour obtenir une émulsion huile dans eau, ou inversement pour préparer une émulsion eau dans huile. 20 Dans un mode particulier de réalisation, le produit cosmétique selon l'invention est formulé sous forme de crème comprenant, les dits éléments du dit complexe et au moins les excipients suivants additionnels : agent émulsifiant, agent émollient, agent épaississant, agent hydratant et agents conservateur et agent ajusteur de Ph. Dans un mode particulier de réalisation, le produit cosmétique selon l'invention est 25 formulé sous forme de solution aqueuse (notamment sérum d'eau physiologique) ou de gel aqueux comprenant, en mélange homogène dans de l'eau, les dits éléments du dit complexe et pour le gel au moins les excipients suivants additionnels de gel : agent gélifiant, agent épaississant, agent hydratant et agent conservateur et agent ajusteur de Ph. Les préparations contiennent généralement d'autres excipients et/ou auxiliaires et parfois d'autres principes actifs, par exemple des colorants, pigments de coloration, capteurs de radicaux, parfums, agents stabilisants. 6 Les produits cosmétiques peuvent aussi comprendre des auxiliaires et parfois d'autres principes actifs, par exemple vitamines antioxydantes telles que la vitamine E, la vitamine C, des agents antioxydants comme les polyphénols naturels, des enzymes, principes actifs végétaux, substances anti-inflammatoires naturelles, des alcools, polyols, esters, électrolytes, 5 huiles polaires et non polaires, des polymères, copolymères, phopholipides, des colorants; des parfums; ou encore des agents de gommage de la peau. L'invention a encore pour objet un procédé cosmétique de traitement de la peau pour lutter contre les signes du vieillissement cutané, et en particulier les rides d'expression provoquées par les contractions musculaires faciales incontrôlées, consistant à appliquer sur 10 les zones de la peau nécessitant un tel traitement, un produit cosmétique topique selon l'invention. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront mieux à la lecture de la description des exemples qui vont suivre, faite de manière illustrative et non limitative, en référence aux figures suivantes. 15 - Les figures 1A à et 1C représentent la croissance au 91ème jour des cellules souches dentaires humaines traitées par des extraits de planaires de l'exemple 3A dilués au 1/20Ième (figure 1A : extrait aqueux (A1), extrait contenant du PBS (A2) et extraits contenant du milieu de culture des cellules (A3) dilués au 1/51ème ( figure1B) et au 1/100'ème (figure 1C). La figure 2 représentent des microphotographies montrant la croissance des cellules 20 souches humaine traité par de l'extrait A dilué au 1/20 pendant 9 jours (B2) et avant traitement (B1). Les cellules sont colorées en Giemsa. - La figure 3 représente l'absence de croissance au 91ème jour des cellules humaines traitées par du broyat de planaire entier non débarrassé des débris solides de l'exemple 1. - La figure 4 représente la croissance des cellules humaines traitées par de l'extrait 25 lyophilisé solubilisé de l'exemple 3B. 1-Méthodes 1.1 Planaires: Des planaires de l'espèce Schrnetea rnediterranea sont maintenues à 19°C dans de l'eau stérile filtrée sur cartouche charbon actif/céramique et sur membrane filtrante 0.22 pm 30 millipore, sans antibiotiques. L'eau est changée tous les deux à trois jours afin d'éliminer les 7 déchets tels que les déjections de planaires. Les planaires sont nourries avec du foie de veaux, une fois par semaine. Ils sont privés de nourriture 1 semaine avant les expériences pour les purger. Leur poids moyen est 2.2mg/ver. 1.2 Cellules souches : 5 Des cellules souches de pulpe dentaire humaine (CLS 300702) sont maintenues selon les conditions standards de culture in vitro dans du milieu de culture cellulaire DMEM/F12 (de GibCoBRL) complémenté avec du sérum de veaux foetal (10%) et des composés antibiotiques tel que pénicilline et streptomycine. (5000U/ml, 5000pg/m1 respectivement), à une température de 37°C sous une atmosphère à 5% de CO2. Les cellules sont dédoublées 10 une fois par semaine, après trypsinisation (0,05%) pour décoller les cellules adhérentes, par une dilution au 1/3 dans du milieu de culture DMEM/F12 (GibCoBRL) complémenté avec du sérum de veaux foetal (10%) et un cocktail d'antibiotiques (Penicilline-Streptomicine, Gentamicine, Vancomyci ne, Ciprofloxacine) (5000 U/ml, 5000pg/ml, 50pg/ml, 10pg/ml, 20pg/m1 respectivement), après traitement à la trypsine 0.05 °/(:), (GibCoBRL). 15 Exemple 1: Préparation de l'extrait de planaire (protocole A): la) Les planaires (25 individus) sont prélevées et lavées deux fois avec du tampon PBS (Phosphate Buffer Salts, 1X) à PH=7.2, à la température de la pièce, puis mises dans 550 pl d'eau (extrait Al) ou de PBS (extrait A2) ou de milieu de culture DMEM/F12 (GibCoBRL) (extrait A3), à une concentration de 110mg de planaires/mL soit 50 20 planaires/mL, à 4°C. Les planaires sont broyées avec un pilon plastique, puis l'extrait est passé 10 fois (aller-retour) au travers d'une seringue 23G, afin de casser les cellules. lb) L'extrait est alors centrifugé à 200g pendant 5 minutes, sous une température de 4° C. 25 L'extrait centrifugé présente alors avec 2 phases, une phase dense au fond du tube et une phase aqueuse surnageant. La phase aqueuse surnageant est alors prélevée (environs 500p1) et stockée congelée à une température de -80°C, ou congelée dans l'azote liquide (-196°C), sous forme d'aliquote de 100p1 avant utilisation. Exemple 2. Préparation de l'extrait de planaire lyophilisé (protocole B): 8 Un extrait aqueux de surnageant de centrifugation de broyat de planaires contenant du milieu de culture, congelé sont préparés selon le protocole A ci-dessus, est mis dans une fiole en verre pour lyophilisation de 2 ml avec bouchon placé à une température de -20°C pendant une nuit avant lyophilisation. La lyophilisation est réalisée dans un lyophilisateur 5 COSMOS de la société CRYOTEC (France) pendant une la nuit. Le lyophilisat est ensuite entreposé à +4°C à l'obscurité jusqu'à utilisation. Avant utilisation le lyophilisat est remis en suspension dans 500 pl d'eau distillé stérile. 2. Résultats de régénération de cellules. Exemple 3A : Incubation des cellules souche humaines avec l'extrait aqueux obtenu 10 selon le protocole A. Des surnageants de centrifugation de broyat de planaire de l'espèce S. rnéditerranea obtenus à l'étape lb) de l'exemple 1 sont ajoutés à différentes dilutions finales de 1/5ième, 1/20ième et 1/100 ième à des cellules souche dentaire humaine à raison de 5x103 cellules / puits, de plaque de 48 puits, en culture dans du milieu DMEM/F12 (GibCoBRL) complémenté 15 avec du sérum de veaux foetal (10%) et de la pénicilline et streptomycine (5000U/ml, 5000pg/m1 respectivement), sous 37°C, et atmosphère 5% CO2. Les cellules sont alors maintenues sous les conditions suivantes : 37°C, atmosphère 5% CO2 pendant 9 jours. Après 9 jours les cellules sont énumérées et la croissance déterminée. Sur les figures 1A à 1C on montre la croissance des cellules souches humaines 20 traitées par des extraits Al à A3 dilués au 1/5ième (figure 1A), l'extrait A3 (avec milieu de culture) au 1/20ième (figure 1B), et l'extrait A3 (avec milieu de culture) au 1/100ième (figure 1C), pendant 9 jours. (*P REVENDICATIONS1. Extrait aqueux utile notamment pour la régénération de cellules humaines ou animales, notamment de mammifères, comprenant un extrait aqueux débarrassé de tout débris solide non soluble d'un broyat d'organismes du type plathelminthe présentant une capacité de régénération, contenant au moins les composants intracellulaires des cellules desdits organismes d'un lysat cellulaire des dites cellules des dits organismes. 2. Extrait aqueux selon la revendication 1 caractérisé en ce que lesdits organismes sont des vers plats aquatiques du type planaire. 3. Extrait aqueux selon la revendication 2 caractérisé en ce que les dits organismes sont de l'espèce Schrnidtea rnedilerranea. 4. Extrait aqueux selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que ledit extrait aqueux de broyat comprend un surnageant de centrifugation dudit broyat. 5. Extrait aqueux selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que ledit extrait aqueux de broyat comprend en outre un milieu de culture cellulaire, de préférence un milieu de culture apte à cultiver des cellules humaines ou animales à régénérer. 6. Extrait aqueux selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que le dit extrait aqueux de broyat comprend le broyat de 50 à 200 mg de vers par mL de solution aqueuse ; de préférence de 75 à 150 mg de vers par mL de solution aqueuse, le dit extrait aqueux de broyat étant en outre dilué de préférence à plus que 1/5ième et moins que 1/100ième, de préférence dilué entre 1/10ième et 1/50ième. 7. Extrait aqueux selon la revendication 6 caractérisé en ce que le dit extrait aqueux de broyat comprend le broyat de 110 mg de vers par mL de solution aqueuse ; le dit extrait aqueux de broyat étant en outre dilué à 1/20 ième. 8. Extrait aqueux selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce qu'un spectre de ladite préparation par spectrométrie de masse dite de type MALDI TOF comprend les 16 pics majoritaires caractéristiques mentionnés dans le tableau 1 suivant, dans lequel les différents pics caractéristiques sont numérotés dans la première colonne, et les paramètres suivants ont les significations suivantes : 22 - M/z : rapports (masse en Dalton/charge) en abscisse des différents pics caractéristiques du spectre, - S/N : rapports (intensité du pic/intensité du bruit de fond) des différents pics caractéristiques du spectre. 5 Tableau 1 M/Z Ecart type S/N Ecart type M/Z S/N 1 8618.401 118.031 10852424.610 11358052.088 2 8270.340 143.008 4620996.274 5564954.057 3 7696.982 133.512 5240359.923 7010776.551 4 7236.251 151.442 8121705.361 11556323.264 5 6803.343 116.896 10708147.034 18373045.879 6 6261.480 163.376 11319617.938 13604702.931 7 5790.573 116.345 21402383.693 37624416.818 8 5330.950 180.245 23085485.049 21438811.717 9 4787.963 120.365 22731248.668 23171439.149 10 4298.636 175.285 24470357.501 21953618.321 11 3793.559 113.425 21664847.045 17673326.341 12 3282.861 172.508 24634530.736 27003268.283 13 2792.441 122.205 22551669.576 22432014.766 14 2294.281 174.311 20589324.299 17568023.101 15 1807.544 115.976 19890585.114 18182405.582 16 1395.545 119.208 33019669.177 29193485.572 9. Lyophilisat d'un extrait aqueux de broyat selon l'une des revendications 1 à 8. 10. Procédé de préparation d'un extrait aqueux selon l'une des revendications 1 à 9 10 caractérisé qu'on réalise les étapes dans lesquelles : 23 a) les dits organismes vivants, de préférence qui ont été lavés à l'eau et n'ont pas été nourris pendant une semaine au moins, sont placés dans un milieu liquide aqueux contenant de préférence un milieu de culture cellulaire ; b) la préparation aqueuse obtenue à l'étape a) est broyée jusqu'à obtenir la lyse des 5 cellules des dits organismes, de préférence encore les débris cde broyat étant de taille inférieure entre 5 et 10 pm; c) on élimine les débris non solubles par centrifugation ; et récupère le surnageant, et d) de préférence, le surnageant de centrifugation est dilué dans une solution aqueuse à plus que 1/5ième et moins que 1/100ième, de préférence dilué entre 1/10ième et 10 1/50ième , ladite solution comprenant de préférence encore des composants d'un milieu de culture cellulaire apte à cultiver des cellules humaines ou animales à régénérer. 11. Utilisation d'un extrait aqueux ou lyophilisat selon l'un des revendications 1 à 10 pour la fabrication d'une composition utile pour régénérer des cellules humaines ou animales. 15 12. Utilisation d'un extrait aqueux ou lyophilisat selon la revendication 11 pour la fabrication d'une composition utile pour régénérer des cellules souches humaines ou animales. 13. Utilisation d'un extrait aqueux ou lyophilisat selon l'un des revendications 11 ou 12 en combinaison avec des supports et/ou excipients appropriés pour la fabrication d'une 20 composition alimentaire, cosmétique ou dermatologique.