Brevet FR3067110A1 — publié le 20181207

DISPOSITIF ET PROCEDE DE DETECTION ET D'IMAGERIE D'ELEMENTS BIOCONTAMINANTS DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne un dispositif et un procédé de détection et d'imagerie d'éléments biocontaminants. Le dispositif selon la présente invention comprend plus particulièrement une matrice de pixels détecteurs ayant une face active sur laquelle une lumière est incidente, un support transparent à la lumière et qui recouvre la face active, sur lequel les éléments biocontaminants sont susceptibles de se déposer, des moyens d'éclairage, qui produisent un faisceau de lumière qui est incident sur la face active, et des moyens de visualisation aptes visualiser, sous forme d'images fixes ou d'images vidéo, un signal numérique délivré par des moyens de traitement. ART ANTERIEUR La maîtrise de la biocontamination est un enjeu de santé publique, aussi bien au niveau de la sécurité alimentaire qu'au niveau des établissements de santé ou de la pharmacopée. De même, dans l'habitat, en particulier dans l'habitat collectif (établissements scolaires, restauration, crèche, école, garderie, maison médicalisée), le respect des règles d'hygiène doit être garanti. Il est donc nécessaire de disposer de moyens de suivi de la qualité de l'air et de la propreté des environnements et surfaces. Dans le domaine des salles propres et bio-propres, il existe des compteurs optiques pour le suivi particulaire (particule 30 viable ou non) ainsi des échantillonneurs actifs de suivi 3067110 2 des biocontaminants (par impaction, filtration ou barbotage) ou passifs par sédimentation (géloses). L'air est généralement contaminé par une flore microbienne 5 diversifiée qui est souvent résistante et variable dans le temps et l'espace. Pour mettre en place une chaîne globale de la maîtrise de la propreté et de l'hygiène, il faut pouvoir mesurer de manière précise et réactive les biocontaminants. De plus, compte tenu de la cinétique de 10 reproduction de ces biocontaminants (pour certaines bactéries, toutes les 20 à 40 minutes), il faut pouvoir disposer de moyens de contrôle in situ, fiables et rapides de suivi de la croissance de ces biocontaminants. 15 Pour les établissements de santé, les niveaux de propreté bactériologique sont définis dans la norme NF S 90 351. La norme NF S 90 351 recommande des performances techniques en fonction des zones à risques. Dans le domaine pharmaceutique, le guide des Bonnes Pratiques de Fabrication (BPF) propose 20 quatre niveaux de propreté (cf. référence [1]). Les BPF françaises et européennes proposent aussi une surveillance et une classification microbiologique des zones de production en activité, dans le cas de la fabrication des médicaments stériles. 25 La norme NF EN ISO 14698-1 décrit deux catégories de dispositifs de prélèvement d'air applicables aux environnements maîtrisés : les échantillonneurs passifs : plaques de 30 sédimentation - les échantillonneurs actifs par impaction, filtration et barbotage. 3067110 3 Toutes ces techniques de prélèvement reposent sur les méthodes conventionnelles de culture (ou culturales) c'est-à-dire l'aptitude des microorganismes, déposés sur un milieu de culture gélose approprié, donner naissance à des 5 colonies visibles à 1 'oeil nu, en fonction du milieu de culture utilisé et des conditions d'incubation (durée et température). La durée d'incubation est habituellement de 2 à 5 jours pour 10 les bactéries et de 5 à 7 jours pour les levures et moisissures. En pratique, une première lecture est faite en laboratoire après 48h pour les bactéries et à 5 jours pour les levures et moisissures. La température d'incubation est habituellement de 30 à 35 °C pour les bactéries et 20 à 25°C 15 pour les levures et moisissures. A noter le développement de méthodes alternatives (plus rapides que les méthodes conventionnelles) présentant un niveau de réponse plus court et un niveau de qualité des résultats au moins équivalent à celui des méthodes conventionnelles. 20 Parmi ces méthodes alternatives, retenons la cytométrie de flux, la fluorescence des particules, intrinsèque ou après marquage par un fluorochrome. 25 Pour ce qui concerne le marquage reposant sur une réaction enzymatique avec le réactif fluorochrome, seuls les microorganismes viables sont rendus fluorescents. Cette technologie allie la filtration de l'échantillon, le marquage direct des micro-organismes viables et le dénombrement de cellules par cytométrie à balayage laser et visualisation au moyen d'un microscope à épi-fluorescence automatisé, en moins de 3 heures. 3067110 4 A ce jour, le suivi des processus de biocontamination s'effectue en utilisant des échantillonneurs passifs ou actifs. 5 Les échantillonneurs actifs fonctionnent par sédimentation. La sédimentation est une méthode simple consistant collecter les micro-organismes par gravité sur des boites de Petri ouvertes contenant des milieux de culture géloses. Les résultats sont exprimés par unité de surface pendant un temps 10 donné. Cette méthode est requise par les Bonnes Pratiques de Fabrication de l'industrie pharmaceutique pour la fabrication des médicaments stériles. Cette méthode ne permet pas d'avoir un résultat quantitatif de l'aérobiocontamination mais sert plutôt à évaluer le risque 15 de biocontamination d'une surface exposée dans cet environnement, à partir d'un nombre de particules viables sédimentées sur la boite en fonction de la surface et du temps d'exposition. 20 Les échantillonneurs actifs proposent une collecte active des biocontaminants. Les différentes méthodes de collecte des biocontaminants recueillis dans un certain volume aspiré d'air pendant un certain temps (ou biocollecteurs) sont : - la méthode par impaction sur le milieu de culture qui 25 est la plus répandue et qui impose une brève durée d'échantillonnage suivie d'une longue durée de mise en culture et d'analyse microbiologique ; - la méthode par filtration qui permet des prélèvements plus longs (optimaux sur 8h) et le recours à différentes 30 méthodes d'analyse microbiologique après récupération de la membrane filtrante en milieu liquide et dilutions successives de l'échantillon (il convient toutefois de 3067110 5 s'assurer que les conditions de filtration n'affectent pas la viabilité des micro-organismes recueillis) ; - la méthode par barbotage en milieu liquide qui a pour intérêt majeur d'éviter le risque de dessiccation de 5 l'échantillon, les microorganismes étant transférés directement en milieu liquide. Cette méthode de collecte est jugée moins stressante pour les biocontaminants et serait donc à privilégier. 10 L'art antérieur présente les inconvénients suivants. Les échantillonneurs passifs sont des plaques témoins que l'on expose dans les mêmes conditions que celles dans lesquelles est exposé l'individu ou l'objet dont on cherche 15 à surveiller la biocontamination. Ces plaques témoin sont ensuite prélevées, conditionnées proprement et transportées jusqu'à une étuve pour une mise en incubation qui va favoriser la croissance des 20 biocontaminants et permettre un dénombrement visible à l'oeil mais après une durée non négligeable pouvant aller jusqu'à 72h-une semaine suivant les microorganismes et les milieux de culture. C'est un processus long et fastidieux qui, de plus, ne garantit pas la qualité du résultat, dans la mesure 25 où certains des micro-organismes présents sur les plaques peuvent mourir avant d'arriver au laboratoire d'analyses biologiques, ou encore se mettre en état dit « adverse », c'est-à-dire un état quasi léthargique, sans reproduction et donc non détectable. 30 Les résultats obtenus avec ces échantillonneurs actifs sont des résultats de biocontamination sédimentée exprimés en UFC par unité de surface. 3067110 6 Les échantillonneurs actifs, ou biocollecteurs, présentent les mêmes inconvénients que les échantillonneurs passifs quant à leur temps de réponse longs liés à la période 5 d'incubation. A noter toutefois qu'il existe aujourd'hui des échantillonneurs actifs qui permettent de palier à cet inconvénient car ils sont couplés a des méthodes de 10 microbiologie rapide (Rapid Microbiology Method ou RMM). Citons parmi ces RMM, les méthodes qui reposent sur l'autofluorescence détectée par un système d'imagerie CCD ou CMOS. Une méthode encore plus efficace est la méthode de marquage fluorescent et excitation laser qui permet de 15 détecter des microcolonnies en croissance. Les résultats de biocontamination obtenus avec ces préleveurs actifs sont des données de biocontamination aéroportée et s'expriment en UFC par unité de volume prélevé. 20 il existe en conséquence au moins deux sources d'erreur dans le dénombrement actuel des micro-organismes selon les, techniques de l'art antérieur : au niveau de la collecte dynamique des microorganismes (une étude récente (cf. référence [2]) a 25 montré une efficacité physique qui varie entre 1 et 100% suivant les modèles de biocollecteurs, - au niveau de la culture elle-même car la même étude montre que l'efficacité biologique de culture à partir d'un échantillon de L. Pneumophila par exemple en milieu liquide 30 peut varier de 1 à 5. Le dispositif selon l'invention ne présente pas ces inconvénients. 3067110 7 Par ailleurs, on connait, selon l'art antérieur, un dispositif de détection et d'imagerie d'éléments biocontaminants comprenant une matrice de pixels détecteurs 5 ayant une face active sur laquelle une lumière est incidente, un support transparent à la lumière et qui recouvre la face active, support sur lequel les éléments biocontaminants sont susceptibles de se déposer, des moyens d'éclairage qui produisent la lumière qui est incidente sur la face active, 10 des moyens de traitement aptes à transformer le signal délivré par la matrice de pixels détecteurs en signal numérique, et des moyens de visualisation aptes à visualiser sous forme d'images fixes ou d'images vidéo le signal numérique délivré par les moyens de traitement. Ce dispositif 15 est décrit dans le document brevet FR 2 964 980 publié le 23/03/2010. Toutefois, les images fixes ou vidéo obtenues par ce dispositif comportent des granularités laser, des tavelures 20 et/ou présentent un chatoiement, formant des petites taches. En langue anglaise, ces taches sont dénommées "speckle". RESUME DE L'INVENTION 25 L'invention propose un dispositif de détection et d'imagerie d'éléments biocontaminants qui ne présente pas les inconvénients précités des dispositifs de l'art antérieur et qui, notamment, présente des images de qualité améliorée en s'affranchissant du "speckle". 30 A cet effet, l'invention a pour premier objet un dispositif de détection et d'imagerie d'éléments biocontaminants, comprenant : 3067110 8 une matrice de pixels détecteurs ayant une face active sur laquelle une lumière est incidente, un support transparent à la lumière qui couvre la face active, sur lequel support, des éléments biocontaminants 5 sont susceptibles de se déposer et de se multiplier, des moyens d'éclairage qui produisent la lumière incidente sur la face active, des moyens de visualisation aptes à visualiser, sous forme d'images fixes ou d'images vidéo, un signal numérique 10 délivré par des moyens de traitement, caractérisé en ce que la lumière est la lumière réémise par les éléments biocontaminants et en ce que le dispositif comprend en outre au moins un filtre, un polariseur et un analyseur, ledit polariseur et ledit analyseur étant 15 positionnés en configuration croisée pour s'affranchir des granularités laser dans lesdites images. Elle a pour second objet un procédé de détection et d'imagerie d'éléments biocontaminants comprenant les étapes 20 de : fourniture d'un dispositif comprenant une matrice (M) de pixels détecteurs ayant une face active sur laquelle une lumière est incidente, un support transparent à la lumière qui couvre la face active, sur lequel support les éléments 25 biocontaminants sont susceptibles de se déposer et de se multiplier, des moyens d'éclairage qui produisent la lumière incidente sur la face active, des moyens de visualisation aptes à visualiser, sous forme d'images fixes ou d'images vidéo, un signal numérique délivré par des moyens de 30 traitement, et au moins un filtre, un polariseur et un analyseur, ledit polariseur et ledit analyseur étant positionnés en configuration croisée ; 3067110 9 dépose et multiplication des éléments biocontaminants sur le support ; éclairage du support portant les éléments biocontaminants par les moyens d'éclairage ; 5 filtration de la lumière réémise par les éléments biocontaminants par le filtre, et polarisation et analyse de ladite lumière filtrée ; acquisition d'un signal d'image par la matrice de pixels détecteurs ; 10 traitement de ce signal acquis par les moyens de traitement et communication du signal numérique aux moyens de visualisation en vue de la visualisation d'images fixes ou vidéo représentatives des éléments biocontaminants. 15 De manière avantageuse, - le support comprend un ou plusieurs milieux de croissance des biocontaminants ; - le ou les milieux de croissance des biocontaminants sont des milieux nutritifs desdits biocontaminants ; - le ou les milieux de croissance des biocontaminants comprennent des marqueurs 20 chimiques fluorescents ; - le support comprend une mosaïque de milieux de croissance des biocontaminants, les caractéristiques d'au moins deux de ces milieux de croissances étant différentes ; - le dispositif comprend un filtre de forte densité optique centré autour de la longueur 25 d'onde d'émission du faisceau de lumière incident, avec une bande passante étroite, comprise entre plus et moins 20 nm ; le dispositif comprend un filtre passe haut filtrant le faisceau de lumière incident ; - le dispositif comprend un système de chauffage, et des moyens de contrôle de la 30 température du ou des milieux nutritifs ; - le dispositif comporte en outre un couvercle opaque asservi ; - les moyens d'éclairage sont des moyens laser ; - la matrice et/ou le support sont mobiles ; - le support est divisé en une 3067110 10 mosaïque de milieux de croissance des biocontaminants, les caractéristiques d'au moins deux de ces milieux de croissances étant différentes ; - le dispositif comprend en outre un couvercle opaque (C), et l'ouverture et la fermeture 5 de ce couvercle sont synchronisées avec la phase de détection ; et - le dispositif comprend en outre une pompe couplée à un débitmètre, de manière à prélever activement l'air de la salle, qui est projeté à la surface du support et les Unités Formant Colonies par m3 d'air prélevé sont calculées, et 10 l'aérobiocontamination mesurée. BREVE DESCRIPTION DES FIGURES L'invention sera mieux comprise à la lecture de la 15 description non limitative qui suit, rédigée au regard des dessins annexés, dans lesquels : la figure 1 est une représentation schématique du dispositif selon l'invention ; la figure 2 présente, de manière schématique, un mode 20 de réalisation du dispositif selon l'invention, dans lequel le milieu de collecte forme une mosaïque de géloses spécifiques, et dans lequel le dispositif comprend un couvercle éventuellement chauffant visant à faciliter l'incubation, sur des courtes durées de l'ordre de l'heure, 25 et à optimiser la détection et l'image des particules viables fluorescentes ; et les figures 3A et 3B sont des images réelle (Fig. 3A) et obtenues au moyen d'un dispositif selon l'invention (Fig. 3B) dans le cas d'un exemple dans lequel une solution très 30 concentrée (10 heures de culture en milieu liquide « LB » avec agitation à 32°C) de Bacillus subtilis dont les membranes ont été marquées par le marqueur fluorescent 3067110 11 référencé FM 1-43 spécifique de la membrane plasmique de tout être vivant. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Des définitions sont données ci-dessous, de termes utilisés dans la présente description selon l'invention. Bio-contamination : Contamination d'une matière, d'un appareil, d'un individu, d'une surface, d'un liquide, d'un gaz ou de l'air par des particules viables selon la norme ISO 14698-1. 15 Les biocontaminants présentent pour particularités supplémentaires par rapport à une contamination particulaire ou chimique : - leur capacité à se reproduire très rapidement, - leur capacité à muter, s'adapter aux conditions même 20 les plus sévères. Les grandes familles de biocontaminants sont : - les bactéries, - les virus, 25 - les levures, les moisissures et les champignons. Bactéries : Les bactéries sont des êtres vivants unicellulaires 30 microscopiques, se reproduisant par scissiparité et dont le noyau n'est pas délimité par une membrane. Les bactéries, comme toutes les autres cellules, ont besoin d'énergie. L'ATP est la source d'énergie biochimique universelle. L'ATP est 5 10 3067110 12 commune à toutes les formes de vie, mais les réactions d'oxydoréduction impliquées dans sa synthèse sont très variées selon les organismes et notamment chez les bactéries. Elles peuvent ainsi utiliser une très large variété de source 5 de carbone et/ou d'énergie. Bien que leur nom dérive du grec baktêria, « bàton », les bactéries ont des formes variables : - sphérique (cocci, du grec kÔkkos, grain ou 10 microcoques), - en bâtonnet (bacilles pl. baccili, du Latin baculus, bâton), - ou spiralée (spirochètes). 15 La taille des bactéries varie de 0,02 micromètre pour les nanobactéries à 0,75 millimètre pour Thiomargari ta namibiensis, visible à 1 'oeil nu. La plupart mesure toutefois entre 0,5 et 100pm. 20 Les bactéries se reproduisent de façon asexuée, par scissiparité (une simple division cellulaire) . Le matériel génétique est tout d'abord dupliqué, puis la bactérie s'allonge, se contracte en son milieu et se divise, formant deux cellules filles identiques à la cellule mère. 25 Ainsi, la descendance d'une cellule bactérienne est un clone de cellules génétiquement identiques, appelé colonie. On dénombre ensuite les bactéries en termes d'Unités Formant Colonies(UFC).Certaines bactéries se divisent toutes les 20 30 à 40 min. Dans des conditions favorables, à raison d'une division toutes les 30 min, une seule cellule aura produit, en quinze heures seulement, un milliard de cellules-filles, colonie visible à l'oeil nu. 3067110 13 En revanche, dans de mauvaises conditions, certaines espèces produisent des spores, formes dormantes de la cellule, capables de supporter des conditions extrêmes de température 5 ou de sécheresse. Le taux de mutations spontanées des bactéries est très élevé, surtout lorsqu'elles sont placées dans un environnement défavorable. Levure : 10 Une levure est un champignon unicellulaire (certaines levures sont cependant capables d'arborer un aspect pseudo pluricellulaire par la formation, par ex., de pseudomycélium) apte à provoquer la fermentation des 15 matières organiques animales ou végétales. Les levures sont employées pour la fabrication du vin, de la bière, des spiritueux, des alcools industriels, du pain et d'antibiotiques. 20 Ces micro-organismes, de forme variable selon l'espèce (sphérique, ovoïde, en bouteille, triangulaire) mais généralement ovales, d'environ 6 à 10 microns et jusqu'à 50 micromètres, se multiplient par bourgeonnement ou par scissiparité Ils sont souvent capables d'accomplir une 25 sporulation soit dans un but de dormance en milieu défavorable, soit dans un but de dispersion. Micro-organismes : 30 Les micro-organismes sont des entités microbiologiques, cellulaires ou non, capables de se reproduire ou de transférer du matériel génétique. 3067110 14 Moisissures : Les moisissures sont des organismes pluricellulaires. Ce sont des champignons microscopiques filamenteux du règne des 5 mycètes. Il en existe des milliers de variétés différentes. Une espèce donnée de champignon microscopique peut générer plusieurs types de mycotoxines, et une même mycotoxine peut être produite par plusieurs espèces de moisissures. Ce sont des molécules de faible poids moléculaire ( REVENDICATIONS1. Dispositif de détection et d'imagerie d'éléments biocontaminants (BC), comprenant : une matrice (M) de pixels détecteurs ayant une face active (FA) sur laquelle une lumière (L) est incidente, un support (S) transparent à la lumière qui couvre la face active (FA), sur lequel support (S) les éléments biocontaminants (BC) sont susceptibles de se déposer et de se multiplier, des moyens d'éclairage (ME) qui produisent la lumière (L) incidente sur la face active (FA), des moyens de visualisation (MV) aptes à visualiser, sous forme d'images fixes ou d'images vidéo, un signal numérique (SMT) délivré par des moyens de traitement (MT), caractérisé en ce que la lumière incidente (L) est la 15 lumière émise par les éléments biocontaminants (BC) et en ce que le dispositif comprend en outre au moins un filtre (F), un polariseur (P) et un analyseur (A), ledit polariseur (P) et ledit analyseur (A) étant positionnés en configuration croisée pour s'affranchir des granularités laser dans 20 lesdites images. 2. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que le support (S) comprend un ou plusieurs milieux de croissance des biocontaminants. 25 3. Dispositif selon la revendication 2, caractérisé en ce que le ou les milieux de croissance des biocontaminants sont des milieux nutritifs desdits biocontaminants. 30 4. Dispositif selon l'une des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que le ou les milieux de croissance des 3067110 27 biocontaminants comprennent des marqueurs chimiques fluorescents. 5. Dispositif selon l'une des revendications 2 à 4, 5 caractérisé en ce que le support (S) comprend une mosaïque de milieux de croissance des biocontaminants, les caractéristique d'au moins deux de ces milieux de croissances étant différentes. 10 6. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend un filtre de forte densité optique centré autour de la longueur d'onde d'émission du faisceau de lumière incident, avec une bande passante étroite, comprise entre plus et moins 20 nm. 7. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend un filtre passe haut filtrant le faisceau de lumière incident. 8. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend un système de chauffage, et des moyens de contrôle de la température du ou des milieux nutritifs. 9. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte en outre un couvercle opaque asservi. 10. Dispositif selon l'une des revendications 30 précédente, caractérisé en ce que les moyens d'éclairage sont des moyens laser. 3067110 28 11. Dispositif selon l'un des revendications précédentes, caractérisé en ce que la matrice (M) et/ou le support (S) sont mobiles. 5 12. Procédé de détection et d'imagerie d'éléments biocontaminants (BC) comprenant les étapes de : fourniture d'un dispositif comprenant une matrice (M) de pixels détecteurs ayant une face active (FA) sur laquelle une lumière (L) est incidente, un support (S) transparent à 10 la lumière qui couvre la face active (FA), sur lequel support (S) les éléments biocontaminants (BC) sont susceptibles de se déposer et de se multiplier, des moyens d'éclairage (ME) qui produisent la lumière (L) incidente sur la face active (FA), des moyens de visualisation (MV) aptes à visualiser, 15 sous forme d'images fixes ou d'images vidéo, un signal numérique (SMT) délivré par des moyens de traitement (MT), et au moins un filtre, un polariseur et un analyseur, ledit polariseur et ledit analyseur étant positionnés en configuration croisée ; 20 dépose et multiplication des éléments biocontaminants (BC) sur le support (S) ; éclairage du support (S) portant les éléments biocontaminants (BC) par les moyens d'éclairage (ME) ; filtration de la lumière réémise par les éléments 25 biocontaminants (BC) par le filtre, et polarisation et analyse de ladite lumière filtrée ; acquisition d'un signal d'image par la matrice de pixels détecteurs ; traitement de ce signal acquis par les moyens de traitement et communication du signal numérique (SMT) aux moyens de visualisation (MV) en vue de la visualisation d'images fixes ou vidéo représentatives des éléments biocontaminants (BC). 3067110 29 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que support (S) est divisé en une mosaïque de milieux de croissance des biocontaminants, les caractéristique d'au moins deux de ces milieux de croissances étant différentes. 5 14. Procédé selon l'une des revendications 12 ou 13, caractérisé en ce que le dispositif comprend en outre un couvercle opaque (C), et en ce que l'ouverture et la fermeture de ce couvercle sont synchronisées avec la phase 10 de détection. 15. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le dispositif comprend en outre une pompe couplée à un débitmètre, de manière à prélever 15 activement l'air de la salle, qui est projeté à la surface du support (S) et en ce que les Unités Formant Colonies par m3 d'air prélevé sont calculées, et l'aérobiocontamination mesurée.