Brevet FR3069155A1 — publié le 20190125

COMPOSITION COMPRENANT UNE CONCENTRATION ELEVEE EN LIPOPEPTIDES ITURINIQUES L'invention a trait à des compositions présentant une concentration élevée en lipopeptides ituriniques. En particulier, les compositions selon l'invention présentent une concentration en lipopeptides ituriniques comprise entre 5 et 200 g/L, et sont stables et homogènes grâce à la présence de tensioactifs et/ou de molécules hydrotropes. Les lipopeptides ituriniques sont des molécules produites par différentes souches de Bacillus sp. et plus particulièrement les souches de Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus megaterium, Bacillus thermoamylovorans, Bacillus thermocloacae, Bacillus firmus, Bacillus mojavensis, Bacillus velenzensis, Bacillus valissmortis. On citera en exemple et de manière non exhaustive, les souches Bacillus subtilis ATCC6633, W23, ATCC19659, DSM23117, QST713 ou AQ713, FMBJ, 3-10, RB14 , BH072 et leurs dérivées, les souches Bacillus amyloliquefaciens FZB42, KB3, SYBC H47, GA1 et leurs dérivés. Cette famille de molécules comprend l'iturine A, AL et C, la mojavensine, la mycosubtilline et les bacillomycines A, B, C, D, F, L et Lc. Ces composants sont connus essentiellement pour leur pouvoir antifongique mais ils présentent également des propriétés antibactériennes. Ces propriétés proviennent de leur nature amphiphile qui leur permet d'interagir avec différents constituants membranaires. Les molécules ituriniques peuvent être produites en solution dans le bouillon de fermentation par les différentes souches mentionnées ci-dessus, puis elles peuvent être récupérées selon des méthodes connues de l'homme du métier afin de les extraire, de les concentrer et de les purifier à partir d'un surnageant de culture. Néanmoins, leur comportement en solution est dépendant de leur concentration. En effet, il est connu qu'au-dessus de la concentration micellaire critique (située entre 10 et 20 mg/L), les composés ituriniques comme les autres molécules de types lipopeptides forment des micelles plus ou moins complexes. Par ailleurs, la taille de ces micelles va évoluer pour former des structures de plus en plus complexes quand on augmente leur concentration, passant d'une taille moyenne de 10 nm à des concentrations en dessous de 500 mg/L (Jauregi et al., 2013), à des structures vésiculaires d'un diamètre moyen de 150 nm au- dessus d'1 g/L (Grau et al. 2001), puis à des superstructures de type bicouche lamellaire à une concentration de 10 g/L (Hamley et al., 2013). Comme le révèlent ces travaux sur la mycosubtiline (Hamley et al., 2013) ou sur l'iturine A (Grau et al. 2001), ces superstructures ne sont pas retrouvées chez les autres molécules lipopeptidiques de la famille des surfactines par exemple. Par ailleurs l'augmentation de la concentration en 2 composés ituriniques tant à augmenter leur interaction avec les protéines contenues dans le milieu de culture et ainsi à augmenter la taille des structures conduisant à les rendre insolubles (Jauregi et al. 2013). Ces propriétés physico-chimiques des composés ituriniques posent donc des problèmes 5 de solubilité, donnant lieu à des compositions instables et ayant tendance à précipiter ou à gélifier lorsque l'on augmente la concentration en lipopeptides ituriniques des compositions. Problèmes résolus par la présente invention Les inventeurs ont montré qu'il est possible de préparer une composition stable et 10 homogène dans laquelle la concentration en lipopeptides ituriniques est supérieure à 5g/L grâce à l'ajout de molécules ayant des propriétés tensioactives. En effet, les agents tensioactifs permettent d'améliorer la solubilisation des lipopeptides ituriniques au-delà de 5g/L, en particulier à 10 g/L et à 20g/L et jusqu'à 50, 100 voire 200 g/L sans apparition de précipité ou de gel. 15 La présente invention trouve notamment des applications dans la production de solutions concentrées de molécules biopesticides antifongiques, antibactériennes ou biosurfactants pour l'industrie phytosanitaire, mais également dans les domaines des industries alimentaire, cosmétique, pharmaceutique et pétrolière. 20 DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Un premier objet de l'invention concerne une composition liquide stable et homogène comprenant un mélange de lipopeptides dans laquelle la concentration en lipopeptides ituriniques est supérieure à 5 g/L. Dans une telle composition, les lipopeptides sont associés à des molécules ayant des 25 propriétés tensioactives, grâce auxquelles la composition concentrée en lipopeptides ituriniques reste stable et homogène. Par composition « stable et homogène », on entend une composition qui ne comprend pas de précipité, et qui reste homogène à des températures comprises entre 4°C et 40°C. L'absence de prise en masse est également un critère important, c'est-à-dire que 30 la solution est liquide et non sous forme gélifiée. 3 Selon un mode de réalisation préféré, la composition selon l'invention comprend entre 20 et 200 g/L de lipopeptides ituriniques. Elle peut comprendre par exemple 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou 200 g/L de lipopeptides ituriniques. De manière préférée, la concentration en lipopeptides ituriniques de la composition est supérieure à 50 g/L. 5 Par « molécules de la familles des iturines », on entend l'iturine A, AL et C, la mojavensine, la mycosubtiline et les bacillomycines A, B, C, D, F, L et Lc. Les compositions de la présente invention comprennent des molécules ayant des propriétés tensioactives. 10 Par « molécules ayant des propriétés tensioactives », aussi appelées « agents tensioactifs » ou plus simplement « tensioactifs », on entend notamment les molécules amphiphiles, les surfactants, les lipopeptides, comme par exemple, la surfactine, la fengycine (ou plipastatine), les tensioactifs chimiques et les tensioactifs biologiques, comme par exemple les rhamnolipides, les polysaccharides, etc.... Ces molécules peuvent 15 être utilisées seules ou en association dans les compositions de l'invention. Parmi les agents tensioactifs, on peut citer l'héparine, l'acide hyaluronique, le dextrane, l'amylose, le chitosane, des tensioactifs anioniques dérivés d'acides aminés, des tensioactifs non-ioniques dérivés des poly-glycosides, des tensio-actifs hydrotropes, des lipopeptides tels que les isomères de surfactine et/ou les isomères de fengycine (ou 20 plipastatine), les rhamnolipides et les huiles végétales. Les compositions de l'invention peuvent, en outre, contenir des adjuvants tels que des sources lipidiques, des sels et des solvants. Ces adjuvants peuvent participer à la solubilisation sans pour autant être des tensioactifs. A titre d'exemple de solvants, on peut citer l'éthanol, le méthanol, l'acétonitrile, le dimethyl sulfoxide, le butanol, le 25 pentanol, l'acétone... Selon un premier aspect, l'invention concerne une composition comprenant entre 5 et 50 g/L de lipopeptides ituriniques et entre 1 et 40 g/I de surfactine. Dans une composition particulière, les lipopeptides ituriniques sont des mycosubtilines. Dans une autre composition particulière, la quantité de lipopeptides ituriniques est de 30 préférence comprise entre 10 g/L et 50g/L, voire entre 20 et 50 g/L, de manière encore préférée entre 30 et 50 g/L. 4 Selon un second aspect, l'invention concerne une composition comprenant entre 5 et 100 g/L de lipopeptides ituriniques, entre 1 et 40 g/I de surfactine et entre 1 et 100 g/I de fengycine (ou plipastatine). Dans une composition particulière, la quantité de lipopeptides ituriniques est de 5 préférence comprise entre 10 et 80 g/L, voire entre 20 et 80 g/L, de manière préférée entre 30 et 80 g/L. Selon un troisième aspect, l'invention concerne une composition comprenant entre 5 et 100 g/L de lipopeptides ituriniques, entre 1 et 40 g/I de surfactine et entre 1 et 30 g/I de tensioactifs chimiques. 10 Dans une composition particulière, la quantité de lipopeptides ituriniques est de préférence comprise entre 10 et 80 g/L, voire entre 20 et 80 g/L, de manière préférée entre 30 et 80 g/L. Dans un mode de réalisation particulier, les tensioactifs chimiques peuvent être des tensioactifs non ioniques de la famille des polyglycosides ou des tensioactifs anioniques 15 dérivés d'acides aminés. De manière préférée, les tensioactifs chimiques consistent en un mélange de tensioactifs anioniques et de tensioactifs non ioniques. Selon un quatrième aspect, l'invention concerne une composition comprenant entre 5 et 100 g/L de lipopeptides ituriniques, entre 1 et 40 g/I de surfactine, entre 1 et 100 g/I de de fengycine (ou plipastatine) et entre 1 et 30 g/I de tensioactifs chimiques. 20 Dans une composition particulière, la quantité de lipopeptides ituriniques est de préférence comprise entre 10 et 80 g/L, voire entre 20 et 80 g/L, de manière préférée entre 30 et 80 g/L. Selon un cinquième aspect, l'invention concerne une composition comprenant entre 5 et 100 g/L de lipopeptides ituriniques micro-émulsionnée dans des composés huileux ou 25 corps gras, comme par exemple de l'huile végétale. Dans une telle composition, la concentration en huile est comprise entre 1% et 100%, de préférence entre 50% et 100%, de manière particulièrement préférée entre 80% et 100%. Parmi les huiles végétales qui peuvent être utilisées, on peut citer l'huile de maïs. Dans un mode de réalisation préféré, une telle composition comprend entre 10 et 80 g/L, 30 voire entre 20 et 80 g/L de mycosubtiline, de manière préférée entre 50 et 80 g/L de mycosubtiline. 5 Ainsi, une composition particulière selon l'invention comprend: 2 à 8 % de lipopeptides ituriniques 3 % de tensioactifs chimiques constitués d'un mélange de tensioactifs non-ioniques et anioniques à hauteur de 1,5 % chacun 5 2 à 4 % de surfactines 0 à 10% de fengycines ou de plipastatines Dans un mode de réalisation particulier, la composition comprend environ 3% de lipopeptides (1,25% de mycosubtiline et 1,85% de surfactine), 1,5% d'un tensioactif 10 non-ionique dérivé des poly-glycosides et 1,5% d'un tensio-actif anionique dérivé d'acides aminés. Dans un autre mode de réalisation particulier, la composition comprend environ 5% de lipopeptides (2,45% de mycosubtiline et 2,65% de surfactine) et 3 à 8% de fengycine 15 (ou de plipastatine). Les compositions selon l'invention peuvent être prêtes à l'emploi ou sous forme concentrée ; les solutions concentrées peuvent être diluées avant emploi. Un deuxième objet selon l'invention concerne une composition déshydratée comprenant 20 un mélange de lipopeptides dans laquelle la concentration en lipopeptides ituriniques est supérieure à 0,5%. De telles compositions déshydratées se présentent sous forme de poudre ou de lyophilisat et sont « prêtes à l'emploi » ; en effet, il suffit de les réhydrater dans 100 mL de solution pour obtenir une composition dont la concentration en lipopeptides ituriniques 25 est au minimum de 5 g/L. Les ingrédients et leurs quantités relatives dans ces compositions solides sont les mêmes que celles décrites ci-dessus pour les compositions liquides. En effet, les concentrations en poids sec des différents composants de ces solutions déshydratées permettent d'obtenir des compositions liquides dont la concentration en lipopeptides ituriniques est 30 supérieure à 0,5 g/L qui sont stables et homogènes conformément à l'invention. Un troisième objet de l'invention concerne un procédé de préparation d'une composition comprenant un mélange de lipopeptides dans laquelle la concentration en lipopeptides ituriniques est supérieure à 5 g/L. 35 6 Les lipopeptides ituriniques de la composition peuvent être obtenus par fermentation d'une souche de Bacillus sp. et récoltés et concentrés depuis le surnageant de culture. Les compositions selon l'invention peuvent être préparées en utilisant des préparations 5 de lipopeptides disponibles dans le commerce sous forme de poudre. Ces poudres de départ contiennent une quantité de lipopeptides ituriniques variable pouvant aller de 10 à plus de 80%, par exemple 15% ou 75%. Ces poudres peuvent contenir un mélange de mycosubtiline et de surfactine dans un rapport de 30/70 à 70/30, voire de 95/5, par exemple de 35/65, de 40/60, de 45/55 ou de 50/50. 10 Pour préparer une composition selon l'invention, il faut ajouter au moins un tensioactif à une solution contenant une teneur élevée en lipopeptides ituriniques. Le procédé de préparation de telles compositions peut comporter une étape 15 supplémentaire de déshydratation de sorte à proposer une composition « prête à l'emploi » sous forme de poudre, dont les caractéristiques sont conformes aux compositions de la présente invention une fois réhyd ratée. Ainsi le procédé permet de préparer des solutions liquides ou solides (sous forme de 20 poudre ou de lyophilisat). De telles solutions concentrées sont particulièrement adaptées pour le stockage et la distribution. Elles sont à diluer avant utilisation. De ce fait, une composition selon l'invention peut être obtenue par dissolution d'une poudre permettant la reconstitution d'une composition liquide telle que définie 25 précédemment. Les compostions selon l'invention trouvent leurs applications dans le domaine de l'agroalimentaire, des phytosanitaires et de la cosmétique ainsi que dans le domaine médical et pharmaceutique. 30 L'invention est illustrée à l'aide des exemples qui suivent. EXEMPLES Préparation de solutions contenant des lipopeptides à partir de surnageant de 35 cultures de souches Bacillus 1 - Obtention des surnageants de culture 7 Les lipopeptides sont obtenus à partir d'un procédé de fermentation aérobie d'une souche Bacillus dérivée de la souche Bacillus subtilis ATCC 6633 pour la production de lipopeptides ituriniques et de souches dérivées de la souche de Bacillus subtilis 168 pour 5 la production de surfactine et/ou de fengycine (ou de plipastatine). La culture est réalisée dans un milieu contenant une source de carbone (glucose, saccharose...), une source d'azote (sulfate d'ammonium, peptone, acides aminés libres, extrait de levures,...) et des oligoéléments et des sels sous agitation à 30°C. Le pH est maintenu à une valeur de 7. La culture est récoltée après 48 à 72h. Elle est ensuite centrifugée ou filtrée pour 10 éliminer les cellules. Le surnageant de culture est ensuite concentré. 2 - Préparation de compositions à teneur élevée en lipopeptides ituriniques à partir de surnageants de culture 15 Pour obtenir des compositions à teneur élevée en lipopeptides ituriniques, les surnageants de culture peuvent être concentrés. La concentration du surnageant de culture peut être obtenue par toute méthode connue de l'homme du métier, en particulier : Par ultrafiltration tangentielle en utilisant une membrane dont le seuil de coupure 20 peut être de 1KDa à 300 KDa. Pour exemple, 1000L de surnageant de culture obtenu comme décrit précédemment sont concentrés par passage sur la membrane d'ultrafiltration pour obtenir un retentât d'un volume de 10 à 100L. Les petites molécules sont ensuite éliminées par une ou des étapes de diafiltration. La solution ainsi obtenue peut être séchée par lyophilisation, atomisation ou utilisée 25 telle quelle. Par précipitation à pH acide : une diminution du pH dans le but de précipiter sélectivement les lipopeptides est réalisée. Une addition d'acide sulfurique concentré est réalisée sur le surnageant obtenu. Après l'obtention d'un pH final aux alentours de 1, la solution est laissée sous agitation de 2 à 12h. Une 30 centrifugation permet de récupérer un culot de matière contenant les lipopeptides. Ce culot est ensuite dissout par addition d'eau et de soude afin d'obtenir une valeur de pH comprise entre 7 et 8,5. La solution ainsi obtenue peut être séchée par lyophilisation, atomisation ou utilisée telle quelle. Par évaporation : le surnageant est concentré par évaporation sous vide. Par 35 exemple 20L sont introduits dans un rotavapor et concentrés à 1 à 2L. Le pourcentage de lipopeptides obtenu à l'issue de ces deux exemples de préparation est de l'ordre de 0,5 à 20% (poids/volume). 8 3 - Préparation de compositions à teneur élevée en lipopeptides ituriniques à partir de poudres de lipopeptides Une composition à teneur élevée en lipopeptides ituriniques peut être préparée à partir 5 de poudre de lipopeptides, comme illustré dans les deux exemples de compositions ci- après : Composition 1 : Une composition comprenant environ 3,1% (m/v) de lipopeptides (soit 1,25% de mycosubtiline et 1,85% de surfactine) a été obtenue en resuspendant une poudre de lipopeptides comprenant un mélange mycosubtiline/surfactine en proportions 10 40/60 et d'une pureté environ égale à 15% en phase aqueuse (pH compris entre 7,5 et 8,5). Composition 2 : Une composition comprenant environ 5,1% (m/v) de lipopeptides (soit 2,45% de mycosubtiline et 2,65% de surfactine) a été obtenue en resuspendant une poudre de lipopeptides comprenant un mélange mycosubtiline/surfactine en proportions 15 45/55 et d'une pureté environ égale à 75 % en phase aqueuse (pH compris entre 7,5 et 8,5). 4 - Préparation de compositions à teneur élevée en lipopeptides ituriniques comprenant des tensioactifs. 20 Des tensioactifs ont été ajoutés aux compositions 1 et 2 décrites précédemment de sorte à évaluer l'effet de telles molécules sur les propriétés des compositions. Composition 1 : Deux tensioactifs ont été ajoutés à la composition 1 chacun dans une proportion de 10% (v/v), à savoir un tensioactif hydrotrope non-ionique dérivé des poly- 25 glycosides (Nom commercial = SimulsoIR SL 7C commercialisé par la société Seppic) et un tensio-actif anionique dérivé d'acides aminés (Nom commercial = ProteoIR APL commercialisé par la société Seppic). Composition 2 : 3 à 8% (m/v) de fengycine (ou de plipastatine) ont été ajoutés à la composition 2. 30 5 - Caractérisation des compositions obtenues : homogénéité et stabilité dans le temps. a. Essai de stabilité à température ambiante 35 L'aspect des solutions 1 et 2 avec et sans tensioactifs a été étudié à température ambiante, ici à environ 21°C. 9 Composition 1 : L'ajout des deux tensioactifs a permis d'obtenir une solution homogène et d'éviter tout phénomène de précipitation ou de sédimentation. La composition 1 avec tensioactifs présente un aspect trouble mais homogène. Composition 2 : L'ajout de fengycine (ou de plipastatine) a permis d'obtenir une solution 5 homogène et éviter tout phénomène de prise en masse (qui a lieu en absence de fengycine ou de plipastatine). La composition 2 avec fengycine (ou de plipastatine) présente un aspect limpide et homogène. b. Essais de stabilité à basse température 10 Des solutions lipopeptidiques concentrées (compositions 1 et 2) ont été placées à 4°C pour une période de 1 à 30 jours. Seules les solutions complémentées en tensioactifs ou en fengycine (ou de plipastatine) sont restées homogènes et aucun dépôt n'a été observé. Sans ces ajouts, REVENDICATIONS1. Composition stable et homogène comprenant un mélange de lipopeptides caractérisée en ce que la concentration en lipopeptides ituriniques est supérieure à 5 g/L et en ce que la composition contient des tensioactifs 2. Composition selon la revendication 1 dans laquelle la concentration en lipopeptides ituriniques est comprise entre 5 à 200 g/L, de préférence supérieure à 50g/L. 3. Composition selon l'une des revendications 1 ou 2 dans laquelle les tensioactifs sont choisis parmi les molécules de la famille des surfactines, des fengycines de ou plipastatines et des tensioactifs chimiques ou biologiques et des huiles. 4. Composition selon la revendication 3 dans laquelle la concentration en lipopeptides est comprise entre 5 et 50 g/I et les tensioactifs sont la surfactine, la concentration de la surfactine dans la composition étant comprise entre 1 et 40 g/L. 5. Composition selon la revendication 3 dans laquelle la concentration en lipopeptides est comprise entre 5 et 100 g/I et les tensioactifs sont la surfactine et la fengycine (ou plipastatine), la concentration de la surfactine étant comprise entre 1 et 40 g/L et la concentration de la fengycine ou de la plipastatine étant comprise entre 1 et 100 g/L. 6. Composition selon la revendication 3 dans laquelle la concentration en lipopeptides est comprise entre 5 et 100 g/I et les tensioactifs sont la surfactine et des tensioactifs chimiques, la concentration en surfactine étant comprise entre 1 et 40 g/L et la concentration en tensioactifs chimiques étant comprise entre 1 et 30 g/L. 7. Composition selon la revendication 3 dans laquelle la concentration en lipopeptides en comprise entre 5 et 100 g/I et les tensioactifs sont la surfactine, la fengycine ou la plipastatine, et des tensioactifs chimiques, la concentration de la surfactine étant comprise entre 1 et 40 g/L, la concentration de la fengycine ou de la plipastatine étant comprise entre 1 et 100 g/L et la concentration en tensioactifs chimiques étant comprise entre 1 et 30 g/L. 8. Composition selon l'une des revendications 3, 6 ou 7, dans laquelle les tensioactifs chimiques sont choisis parmi les tensioactifs non ioniques de la famille des polyglycosides et/ou les tensioactifs anioniques dérivés d'acides aminés. 11 9. Composition selon la revendication 3 dans laquelle la concentration en lipopeptides est comprise entre 5 et 100 g/I et les tensioactifs sont des huiles, la concentration en huile étant comprise entre 1 et 100%. 10. Composition selon l'une des revendications précédentes dans laquelle les lipopeptides 5 ituriniques sont des mycosubtilines. 11. Procédé de préparation d'une composition telle que définie à l'une des revendications 1 à 10 comprenant les étapes de préparation d'une solution à teneur élevée en lipopeptides ituriniques et d'ajout de tensioactifs. 12. Procédé de préparation selon la revendication 11 comprenant en outre une étape de 10 déshydratation. 13. Utilisation d'une composition selon l'une des revendications 1 à 10 dans des applications agroalimentaires, phytosanitaires ou cosmétiques. 14. Composition selon l'une des revendications 1 à 10 pour son utilisation dans le domaine médical ou pharmaceutique. 15