Brevet FR3065967A1 — publié le 20181109

PROCEDE IN VITRO DE DETECTION ET DE QUANTIFICATION DE L'ADN DU VIH-2 Domaine de l'invention La prÃ©sente invention concerne un procÃ©dÃ© in vitro de dÃ©tection et quantification du virus de l'immunodÃ©ficience humaine 2 (VIH-2). ArriÃ¨re-plan technique L'infection par le VIH-2, principalement limitÃ©e Ã l'Afrique de l'Ouest, est caractÃ©risÃ©e par une progression lente de la maladie associÃ©e Ã une diminution lente du nombre de lymphocytes T CD4+, un taux faible de transmission par voie sexuelle ou verticale et une rÃ©plication virale plus faible que celle du VIH-1. Par ailleurs, on observe chez les individus infectÃ©s par le VIH-2 une rÃ©sistance naturelle aux inhibiteurs non-nuclÃ©osidiques de la transcriptase inverse (INNTI), aux inhibiteurs de fusion (par exemple l'Enfuvirtide) et Ã certains inhibiteurs de protÃ©ase (IP). Le traitement des individus infectÃ©s par le VIH-2 nÃ©cessite donc une prise en charge thÃ©rapeutique spÃ©cifique et diffÃ©rente des individus infectÃ©s par le VIH-1. Toutefois, la dÃ©tection des individus infectÃ©s par le VIH-2 est difficile. En effet, mÃªme en l'absence de thÃ©rapie antirÃ©trovirale, une forte proportion de ces individus prÃ©sente une charge plasmatique en ARN du VIH-2 indÃ©tectable. Ainsi, dans la cohorte nationale franÃ§aise du VIH-2 (1086 patients en mai 2016), 71% des individus n'ayant jamais reÃ§u de thÃ©rapie antirÃ©trovirale avaient des charges virales d'ARN du VIH-2 infÃ©rieures Ã 100 copies/mL. En outre, les donnÃ©es des individus infectÃ©s d'Afrique de l'Ouest ont rÃ©vÃ©lÃ© que chez 46,5% des individus n'ayant jamais reÃ§u de traitement antirÃ©troviral, l'ARN du VIH-2 Ã©tait indÃ©tectable ( Ce marqueur est notamment utile pour la confirmation du diagnostic d'une mono ou d'une co-infection par le VIH-1 dans des cas de forte rÃ©activitÃ© sÃ©rologique croisÃ©e. De plus, la dÃ©tection de l'ADN du VIH-2 est essentielle pour le diagnostic prÃ©coce chez les enfants nÃ©s de mÃ¨res sÃ©ropositives pour le VIH-2. Enfin, ce marqueur peut Ãªtre utile pour les Ã©tudes physiopathologiques des rÃ©servoirs du VIH-2. 3065967 2 Plusieurs techniques de quantification de l'ADN du VIH-2 font partie de l'Ã©tat de la technique, telle que celle dÃ©crite par Damond et al. (2001) J. Clin. Microbiol. 39: 4264-4268, dans laquelle les auteurs rÃ©alisent une rÃ©action en chaine par polymÃ©rase (PCR) en temps rÃ©el visant Ã amplifier la rÃ©gion gag du gÃ©nome viral. 5 Toutefois, les techniques actuelles de l'ADN du VIH-2 prÃ©sentent des difficultÃ©s pour quantifier l'ADN du VIH-2 du groupe B. De plus, elles souffrent d'un manque de sensibilitÃ© et ne permettent pas toujours de dÃ©tecter l'ADN du VIH-2 dans certains Ã©chantillons issus d'individus infectÃ©s. Du reste, aucun test de quantification de l'ADN du VIH-2 n'est actuellement 10 disponible dans le commerce. Ainsi, l'objet de l'invention est de fournir un procÃ©dÃ© de dÃ©tection et de quantification de l'ADN du VIH-2 permettant de surmonter ces difficultÃ©s, notamment en amÃ©liorant la reproductibilitÃ©, la sensibilitÃ© et/ou la spÃ©cificitÃ© des procÃ©dÃ©s de l'Ã©tat de la technique, en particulier pour les deux groupes 15 endÃ©miques A et B du VIH-2. RÃ©sumÃ© de l'invention La prÃ©sente invention dÃ©coule de la mise en Ã©vidence inattendue, par les inventeurs, qu'une PCR en temps rÃ©el rÃ©alisÃ©e avec un ensemble d'amorces de 20 sÃ©quences SEQ ID NO: 1 et 2 et d'une sonde de sÃ©quence SEQ ID NO: 3, et un ensemble d'amorces de sÃ©quences SEQ ID NO : 4 et 5 et d'une sonde de sÃ©quence SEQ ID NO: 6, permettait de dÃ©tecter et de quantifier de maniÃ¨re reproductible l'ADN du VIH-2 de type A et B avec une spÃ©cificitÃ© de 100%, une limite de dÃ©tection Ã 3 copies/PCR et une limite de quantification Ã 6 copies/PCR. 25 La prÃ©sente invention concerne donc un procÃ©dÃ© de dÃ©tection ou quantification de l'acide dÃ©soxyribonuclÃ©ique (ADN) du virus de l'immunodÃ©ficience humaine 2 (VIH-2) dans un Ã©chantillon comprenant de l'ADN comprenant : a) rÃ©aliser une rÃ©action en chaine par polymÃ©rase (PCR) en temps rÃ©el sur l'Ã©chantillon, ou une fraction de celui-ci comprenant de l'ADN, avec au moins deux 30 ensembles d'amorces et de sonde comprenant chacun respectivement deux amorces et une sonde marquÃ©e destinÃ©s Ã la dÃ©tection ou Ã la quantification de l'ADN du VIH-2, dont l'un au moins des ensembles est choisi dans le groupe constituÃ© de : 3065967 3 - un ensemble comprenant une amorce comprenant ou consistant en une sÃ©quence SEQ ID NO : 1 ou une sÃ©quence ayant au moins 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NO : 1, une amorce comprenant ou consistant en une sÃ©quence SEQ ID NO : 2 ou une sÃ©quence ayant 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NO : 2 ou les 5 complÃ©mentaires de ces sÃ©quences, et une sonde marquÃ©e comprenant ou consistant en une sÃ©quence SEQ ID NO : 3, ou une sÃ©quence ayant au moins 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NO : 3 ou la complÃ©mentaire de ces sÃ©quences, et - un ensemble comprenant une amorce comprenant ou consistant en une sÃ©quence SEQ ID NO : 4 ou une sÃ©quence ayant au moins 90% d'identitÃ© avec la 10 SEQ ID NO : 4, une amorce comprenant ou consistant en une sÃ©quence SEQ ID NO: 5 ou une sÃ©quence ayant 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NO : 5 ou les complÃ©mentaires de ces sÃ©quences, et une sonde marquÃ©e comprenant ou consistant en une sÃ©quence SEQ ID NO : 6, ou une sÃ©quence ayant au moins 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NO : 6 ou la complÃ©mentaire de ces sÃ©quences. 15 b) dÃ©terminer Ã partir de celle-ci la prÃ©sence ou l'absence et/ou la quantitÃ© d'ADN du VIH-2 dans l'Ã©chantillon biologique. Dans un mode de rÃ©alisation de l'invention, dans le procÃ©dÃ© de dÃ©tection ou quantification de l'ADN du VIH-2 tel que dÃ©fini ci-dessus, l'Ã©tape a) de rÃ©alisation d'une rÃ©action en chaine par polymÃ©rase (PCR) en temps rÃ©el sur l'Ã©chantillon, ou 20 une fraction de celui-ci comprenant de l'ADN, est rÃ©alisÃ©e avec (i) au moins 4 amorces comprenant ou consistant respectivement en : - une sÃ©quence SEQ ID NO: 1 ou une sÃ©quence ayant au moins 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NO: 1 ou la complÃ©mentaire de ces sÃ©quences, et - une sÃ©quence SEQ ID NO : 2 ou une sÃ©quence ayant 90% d'identitÃ© avec la 25 SEQ ID NO : 2 ou la complÃ©mentaire de ces sÃ©quences, et - une sÃ©quence SEQ ID NO : 4 ou une sÃ©quence ayant 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NO : 4 ou la complÃ©mentaire de ces sÃ©quences, et - une sÃ©quence SEQ ID NO : 5 ou une sÃ©quence ayant 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NO : 5 ou la complÃ©mentaire de ces sÃ©quences, et 30 (ii) au moins 2 sondes marquÃ©es comprenant ou consistant respectivement en : - une sÃ©quence SEQ ID NO : 3, une sÃ©quence complÃ©mentaire Ã la SEQ ID NO: 3, ou une sÃ©quence ayant au moins 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NO : 3 ou la complÃ©mentaire de celle-ci, et 3065967 4 - une sÃ©quence SEQ ID NO : 6, une sÃ©quence complÃ©mentaire Ã la SEQ ID NO: 6, ou une sÃ©quence ayant au moins 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NO : 6 ou la complÃ©mentaire de celle-ci. Dans un mode de rÃ©alisation particulier du procÃ©dÃ© tel que dÃ©fini ci-dessus, on 5 ajoute Ã l'Ã©chantillon ou Ã la fraction de celui-ci au moins un virus Ã ADN ou au moins une molÃ©cule d'ADN n'ayant essentiellement aucune similaritÃ© de sÃ©quence avec la sÃ©quence gÃ©nomique du VIH-2, ainsi que les amorces et sonde nÃ©cessaires Ã son amplification et sa dÃ©tection par PCR en temps rÃ©el, Ã titre de contrÃ´le interne d'extraction et/ou d'inhibition. 10 Dans un autre mode de rÃ©alisation particulier de l'invention, le procÃ©dÃ© de dÃ©tection ou quantification de l'ADN du VIH-2 tel que dÃ©fini ci-dessus comprend en outre dÃ©terminer ou quantifier des acides nuclÃ©iques du VIH-1 dans un Ã©chantillon ou une fraction de celui-ci. La prÃ©sente invention concerne Ã©galement un kit ou mÃ©lange pour dÃ©tecter 15 ou quantifier l'ADN du VIH-2, comprenant : a) au moins deux ensembles d'amorces et de sonde comprenant chacun respectivement deux amorces et une sonde destinÃ©s Ã la dÃ©tection ou Ã la quantification de l'ADN du VIH-2, de prÃ©fÃ©rence les amorces et la sonde Ã©tant chacune prÃ©sente dans une concentration comprise entre 300 et 500 nM, et dont 20 l'un au moins des ensembles est choisi dans le groupe constituÃ© de : - un ensemble comprenant une amorce comprenant ou consistant en une sÃ©quence SEQ ID NO : 1 ou une sÃ©quence ayant au moins 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NO : 1, une amorce comprenant ou consistant en une sÃ©quence SEQ ID NO : 2 ou une sÃ©quence ayant 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NO : 2 ou les 25 complÃ©mentaires de ces sÃ©quences, et une sonde marquÃ©e, en particulier avec du 6-carboxyfluorescÃ©ine (FAM) en son extrÃ©mitÃ© 5' et du Black Hole Quencher-1 (BHQ1) en son extrÃ©mitÃ© 3', comprenant ou consistant en une sÃ©quence SEQ ID NO: 3, ou une sÃ©quence ayant au moins 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NO : 3 ou la complÃ©mentaire de ces sÃ©quences, et 30 - un ensemble comprenant une amorce comprenant ou consistant en une sÃ©quence SEQ ID NO : 4 ou une sÃ©quence ayant au moins 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NO : 4, une amorce comprenant ou consistant en une sÃ©quence SEQ ID NO: 5 ou une sÃ©quence ayant 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NO : 5 ou les complÃ©mentaires de ces amorces, et une sonde marquÃ©e, en particulier avec du 6- 3065967 5 carboxyfluorescÃ©ine (FAM) en son extrÃ©mitÃ© 5' et du Black Hole Quencher-1 (BHQ1) en son extrÃ©mitÃ© 3', comprenant ou consistant en une sÃ©quence SEQ ID NO : 6, ou une sÃ©quence ayant au moins 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NO : 6 ou la complÃ©mentaire de ces sÃ©quences, et 5 b) au moins un virus Ã ADN ou au moins une molÃ©cule d'ADN n'ayant essentiellement aucune similaritÃ© de sÃ©quence avec la sÃ©quence gÃ©nomique du VIH-2, ainsi que les amorces et sonde nÃ©cessaires Ã son amplification et sa dÃ©tection par PCR en temps rÃ©el, Ã titre de contrÃ´le interne d'extraction et/ou d'inhibition, et c) facultativement des rÃ©actifs additionnels pour rÃ©aliser une PCR. 10 Dans un mode de rÃ©alisation particulier de l'invention, le kit ou mÃ©lange tel que dÃ©fini ci-dessus comprend : ai) au moins 4 amorces, de prÃ©fÃ©rence Ã une concentration comprise entre 300 et 500 nM, comprenant ou consistant respectivement en : - une sÃ©quence SEQ ID : NO 1 ou une sÃ©quence ayant au moins 90% d'identitÃ© 15 avec la SEQ ID NO: 1 ou la complÃ©mentaire de ces sÃ©quences, et - une sÃ©quence SEQ ID NO : 2 ou une sÃ©quence ayant 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NO : 2 ou la complÃ©mentaire de ces sÃ©quences, et - une sÃ©quence SEQ ID NO : 4 ou une sÃ©quence ayant 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NO : 4 ou la complÃ©mentaire de ces sÃ©quences, et 20 - une sÃ©quence SEQ ID NO : 5 ou une sÃ©quence ayant 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NO : 5 ou la complÃ©mentaire de ces sÃ©quences, et 02) au moins 2 sondes marquÃ©es, en particulier avec du 6-carboxyfluorescÃ©ine (FAM) en leur extrÃ©mitÃ© 5' et du Black Hole Quencher-1 (BHQ1) en leur extrÃ©mitÃ© 3', de prÃ©fÃ©rence Ã une concentration comprise entre 300 et 500 nM, comprenant ou 25 consistant respectivement en : - une sÃ©quence SEQ ID NO 3, une sÃ©quence complÃ©mentaire Ã la SEQ ID NO: 3, ou une sÃ©quence ayant au moins 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NI : 3 ou la complÃ©mentaire de celle-ci, et - une sÃ©quence SEQ ID NO : 6, une sÃ©quence complÃ©mentaire Ã la SEQ ID NO: 30 6, ou une sÃ©quence ayant au moins 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NO : 6 ou la complÃ©mentaire de celle-ci. Dans un mode de rÃ©alisation de l'invention, le kit ou mÃ©lange tel que dÃ©fini ci- dessus comprend en outre des amorces et au moins une sonde marquÃ©e pour dÃ©tecter ou quantifier des acides nuclÃ©iques du VIH-1. 3065967 6 La prÃ©sente invention concerne Ã©galement l'utilisation du kit ou mÃ©lange tel que dÃ©fini ci-dessus, pour dÃ©tecter ou quantifier les acides nuclÃ©iques du VIH-2 d'un Ã©chantillon contenant de l'ADN. La prÃ©sente invention concerne Ã©galement un procÃ©dÃ©, en particulier un 5 procÃ©dÃ© in vitro, pour diagnostiquer une infection par VIH-2, ou dÃ©terminer une charge virale du VIH-2, chez un individu, comprenant les Ã©tapes de : (a) rÃ©aliser le procÃ©dÃ© pour dÃ©tecter ou quantifier l'ADN du VIH-2 dans un Ã©chantillon biologique pris chez un individu tel que dÃ©fini ci-dessus ; (b) dÃ©terminer Ã partir de celui-ci si l'individu est infectÃ© par le VIH-2 ou la 10 charge virale du VIH-2 de l'individu. La prÃ©sente invention concerne Ã©galement un procÃ©dÃ©, en particulier un procÃ©dÃ© in vitro, pour dÃ©terminer si un individu est susceptible de bÃ©nÃ©ficier d'un traitement d'une infection par le VIH-2 ou d'un ajustement du traitement, comprenant rÃ©aliser le procÃ©dÃ© pour diagnostiquer une infection par VIH-2, ou 15 dÃ©terminer une charge virale du VIH-2, tel que dÃ©fini ci-dessus. La prÃ©sente invention concerne Ã©galement un procÃ©dÃ©, en particulier un procÃ©dÃ© in vitro, pour le suivi de la charge virale du VIH-2 d'un individu traitÃ© pour une infection par le VIH-2, comprenant rÃ©aliser le procÃ©dÃ© pour diagnostiquer une infection par VIH-2, ou dÃ©terminer une charge virale du VIH-2, tel que dÃ©fini ci- 20 dessus. La prÃ©sente invention concerne Ã©galement des inhibiteurs nuclÃ©osidiques de la transcriptase inverse (INTI), des inhibiteurs de protÃ©ase (IP) et/ou des inhibiteurs d'intÃ©grase pour une utilisation dans la prÃ©vention ou le traitement d'une infection par VIH-2 chez un individu, dans laquelle l'individu a Ã©tÃ© dÃ©terminÃ© comme Ã©tant 25 susceptible de bÃ©nÃ©ficier d'un traitement d'une infection par le VIH-2 par le procÃ©dÃ© tel que dÃ©fini ci-dessus. Description dÃ©taillÃ©e de l'invention 30 ADN du VII-1-2 Le virus de l'immunodÃ©ficience humaine 2 (VIH-2) dont l'infection peut mener au syndrome de l'immunodÃ©ficience acquise (SIDA) est bien connu de l'homme du mÃ©tier. Le VIH-2 est un membre du genre Lentivirus, qui fait partie de la famille des Retroviridae. Son cycle de rÃ©plication implique l'entrÃ©e de l'ARN simple 3065967 7 brin du VIH-2 dans une cellule, la transcription inverse pour donner un ADN simple brin et ensuite un ADN double brin qui est intÃ©grÃ© dans le gÃ©nome de la cellule hÃ´te. Le VIH-2 selon l'invention peut Ãªtre d'un groupe quelconque, en particulier de groupe A, B ou de groupes non endÃ©miques, notamment C, D, E ou H. 5 Avantageusement, le procÃ©dÃ© selon l'invention dÃ©tecte ou quantifie l'ADN du VIH-2 de groupe A ou B dans un Ã©chantillon avec une spÃ©cificitÃ© de l'ordre de 100%. Par le terme Â«ADN du VIH-2 Â» on entend l'ADN qui code le gÃ©nome du VIH-2 en totalitÃ© ou en partie. L'ADN du VIH-2 devant Ãªtre dÃ©tectÃ© ou quantifiÃ© selon l'invention peut ainsi Ãªtre en particulier un ADN simple brin, notamment un ADN 10 simple brin sens ou antisens, ou un ADN double brin. PCR en temps rÃ©el La rÃ©action en chaine par polymÃ©rase (PCR) en temps rÃ©el est bien connue de l'homme du mÃ©tier et est aussi connue sous le nom de PCR quantitative 15 (qPCR). L'homme du mÃ©tier peut facilement dÃ©terminer Ã partir d'une PCR en temps rÃ©el si l'ADN du VIH-2 est prÃ©sent, c'est Ã dire dÃ©tecter, et/ou quantifier l'ADN du VIH-2. Typiquement, dans la PCR en temps rÃ©el un signal, gÃ©nÃ©ralement un signal fluorescent, dont l'intensitÃ© est une consÃ©quence de l'accumulation d'ADN amplifiÃ©, 20 est mesurÃ© par le thermocycleur qui exÃ©cute la PCR. Au cours de la PCR, si l'intensitÃ© du signal mesurÃ©, en particulier du signal fluorescent, est supÃ©rieure Ã un seuil de signal, gÃ©nÃ©ralement l'intensitÃ© du signal de fond, il en est dÃ©duit que l'amplification a eu lieu, i.e. que l'ADN du VIH-2 est prÃ©sent dans l'Ã©chantillon biologique. Inversement, si aucune intensitÃ© du signal supÃ©rieure Ã l'intensitÃ© du signal de fond 25 n'est mesurÃ©e au cours de la PCR, il en est dÃ©duit soit qu'aucune molÃ©cule d'ADN n'est prÃ©sente dans l'Ã©chantillon biologique soit que la quantitÃ© d'ADN est infÃ©rieure au niveau de dÃ©tection. En outre, le cycle de la PCR au cours duquel une intensitÃ© du signal supÃ©rieure Ã l'intensitÃ© du signal de fond est mesurÃ©e, est appelÃ© cycle seuil (Cr pour Â« threshold cycle Â»). Il est bien connu de l'homme du mÃ©tier que les 30 valeurs de Cr sont proportionnelles au logio des quantitÃ©s initiales d'ADN dans l'Ã©chantillon soumis Ã la PCR en temps rÃ©el. Par consÃ©quent, la quantitÃ© d'ADN prÃ©sente, i.e. la charge d'ADN de l'Ã©chantillon biologique, peut Ãªtre facilement dÃ©terminÃ©e, si nÃ©cessaire par rÃ©fÃ©rence Ã une courbe Ã©talon. 3065967 8 De nombreuses techniques de PCR en temps rÃ©el, se diffÃ©renciant gÃ©nÃ©ralement par le systÃ¨me de production du signal et les sondes marquÃ©es utilisÃ©es, peuvent Ãªtre utilisÃ©es selon l'invention, telles que les technologies dites Taqman ou Molecular Beacons (balises molÃ©culaires). De prÃ©fÃ©rence, la PCR selon 5 l'invention est de type Taqman. La PCR en temps rÃ©el de type Taqman est bien connue de l'homme du mÃ©tier et a Ã©tÃ© dÃ©crite Ã l'origine en 1991 par Holland et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 : 7276-7280. BriÃ¨vement, les sondes Taqman consistent en un fluorophore attachÃ© de maniÃ¨re covalente Ã l'extrÃ©mitÃ© 5' d'une sonde oligonuclÃ©otidique et d'un autre 10 type de fluorophore appelÃ© Â« quencher Â» se trouvant au niveau de l'extrÃ©mitÃ© 3'. La sonde est telle que le quencher Ã©teint la fluorescence Ã©mise par le fluorophore lorsqu'il est excitÃ© par une source de lumiÃ¨re du thermocycleur, ce phÃ©nomÃ¨ne Ã©tant connu sous le nom de transfert d'Ã©nergie par rÃ©sonnance en fluorescence ou FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfert). Ainsi, tant que le fluorophore et le 15 quencher sont Ã proximitÃ©, i.e. sont attachÃ©s Ã la sonde, l'extinction inhibe tout signal de fluorescence. Par ailleurs, les sondes Taqman sont conÃ§ues de sorte qu'elles s'hybrident Ã une cible Ã l'intÃ©rieur d'une rÃ©gion d'ADN amplifiÃ©e. De cette faÃ§on, lorsque la polymÃ©rase thermostable utilisÃ©e pour rÃ©aliser la PCR Ã©tend l'amorce et synthÃ©tise le brin naissant, son activitÃ© exonuclÃ©ase 5'-3' dÃ©grade la 20 sonde qui s'est hybridÃ©e Ã la cible. La dÃ©gradation de la sonde entraÃ®ne la libÃ©ration du fluorophore et casse la proximitÃ© au quencher, dissipant l'effet d'extinction et dÃ©clenchant ainsi la fluorescence du fluorophore. Ainsi, la fluorescence dÃ©tectÃ©e dans le thermocycleur de PCR quantitative est directement proportionnelle au fluorophore libÃ©rÃ© et Ã la quantitÃ© de matrice ADN prÃ©sente dans la PCR. 25 PrÃ©fÃ©rablement, la PCR en temps rÃ©el selon l'invention comprend les conditions de thermocyclage suivantes : - 2 minutes Ã 50Â°C, suivies de - 10 minutes Ã 95Â°C, suivies de - 50 cycles de 95Â°C pendant 5 secondes et 60Â°C pendant 1 minute. 30 Avantageusement, les conditions de thermocyclage dÃ©finies ci-dessus sont compatibles avec, voire identiques Ã , celles utilisÃ©es pour la dÃ©tection et/ou la quantification de l'ADN du VIH-1, notamment Ã l'aide du test GENERIC HIV DNA Cell de la sociÃ©tÃ© Biocentric (Grasse, France). Par consÃ©quence, le procÃ©dÃ© de dÃ©tection et quantification de l'ADN du VIH-2 dans un Ã©chantillon contenant de 3065967 9 l'ADN selon l'invention peut Ãªtre utilisÃ© dans le mÃªme thermocycleur, avec le mÃªme programme informatique et mÃªme, si nÃ©cessaire, dans la mÃªme plaque d'amplification que les Ã©chantillons destinÃ©s Ã la dÃ©tection ou quantification de l'ADN du VIH-1, voire dans les mÃªmes Ã©chantillons. 5 Amorces et sondes Comme on l'entend ici, une Â« amorce Â» est un oligonuclÃ©otide, prÃ©fÃ©rablement un oligonuclÃ©otide d'ADN, utile pour amorcer la rÃ©plication par une ADN polymÃ©rase, en particulier une ADN polymÃ©rase thermostable. PrÃ©fÃ©rablement, 10 les amorces selon l'invention ne comprennent pas plus de 50 nuclÃ©otides, plus prÃ©fÃ©rablement pas plus de 40 nuclÃ©otides, et plus prÃ©fÃ©rablement pas plus de 30 nuclÃ©otides. Comme on l'entend ici, une Â« sonde Â» est un oligonuclÃ©otide, prÃ©fÃ©rablement un oligonuclÃ©otide d'ADN, qui peut s'hybrider aux molÃ©cules d'ADN 15 amplifiÃ©es, c'est-Ã -dire aux amplimÃ¨res, dans le cadre de la PCR en temps rÃ©el selon l'invention. PrÃ©fÃ©rablement, les sondes selon l'invention ne comprennent pas plus de 50 nuclÃ©otides, plus prÃ©fÃ©rablement pas plus de 40 nuclÃ©otides, et plus prÃ©fÃ©rablement pas plus de 30 nuclÃ©otides. La sonde marquÃ©e est telle qu'un signal dÃ©tectable, prÃ©fÃ©rablement de la fluorescence, est Ã©mis et augmente en intensitÃ© 20 comme consÃ©quence de l'accumulation des molÃ©cules d'ADN amplifiÃ©es. Plus prÃ©fÃ©rablement, les sondes selon l'invention sont marquÃ©es, en particulier marquÃ©es de maniÃ¨re covalente, par un premier fluorophore et par un deuxiÃ¨me fluorophore de type Â« quencherÂ», la paire fluorophore-quencher Ã©tant telle que le quencher Ã©teint l'Ã©mission de fluorescence Ã©mise par le fluorophore. Dans ce cadre, il est 25 prÃ©fÃ©rÃ© que le fluorophore soit attachÃ© au niveau ou prÃ¨s de l'extrÃ©mitÃ© 5' de la sonde et que le quencher soit attachÃ© au niveau ou prÃ¨s de l'extrÃ©mitÃ© 3' de la sonde. De nombreuses paires fluorophore-quencher adaptÃ©es selon l'invention peuvent Ãªtre conÃ§ues par l'homme du mÃ©tier. A titre d'exemple, les paires fluorophore-quencher 6-carboxyfluorescÃ©ine (FAM)-carboxytetramÃ©thylrhodamine 30 (TAMRA) et 6-carboxyfluorescÃ©ine (FAM)-Black Hole Quencher-1 (BHQ1) sont convenables pour les sondes marquÃ©es selon l'invention. Une paire fluorophorequencher particuliÃ¨rement prÃ©fÃ©rÃ©e selon l'invention est la paire 6- carboxyfluorescÃ©ine (FAM)-Black Hole Quencher-1 (BHQ1). Par ailleurs, il est aussi prÃ©fÃ©rÃ© que les deux sondes marquÃ©es selon l'invention soient marquÃ©es avec la 3065967 10 mÃªme paire fluorophore-quencher. Ainsi, il est particuliÃ¨rement prÃ©fÃ©rÃ© selon l'invention que les deux sondes marquÃ©es soient marquÃ©es avec une 6- carboxyfluorescÃ©ine (FAM) Ã leurs extrÃ©mitÃ©s 5' et avec un Black Hole Quencher-1 (BHQ1) Ã leurs extrÃ©mitÃ©s 3'. 5 Dans la prÃ©sente invention, lorsqu'une amorce ou une sonde selon l'invention est dite Â« comprendre Â» une sÃ©quence particuliÃ¨re, l'amorce ou la sonde peuvent aussi comprendre des sÃ©quences additionnelles s'Ã©tendant Ã partir de l'extrÃ©mitÃ© 5' et/ou l'extrÃ©mitÃ© 3' de la sÃ©quence particuliÃ¨re. En revanche, lorsqu'une amorce ou une sonde selon l'invention Â« consiste en Â» ou Â« est constituÃ©e 10 d' Â» une sÃ©quence particuliÃ¨re, l'amorce ou la sonde ne comprennent pas de sÃ©quences supplÃ©mentaires en plus de la sÃ©quence particuliÃ¨re. PrÃ©fÃ©rablement, les au moins 4 amorces selon l'invention consistent respectivement en les sÃ©quences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4 et SEQ ID NO: 5, et les deux sondes marquÃ©es selon l'invention consistent respectivement 15 en les sÃ©quences SEQ ID NO : 3 et SEQ ID NO :6. Dans la prÃ©sente invention, une Â« sÃ©quence ayant au moins 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NO: X Â», en particulier diffÃ¨re de la SEQ ID NO: X par l'insertion, la suppression ou la substitution d'au moins un nuclÃ©otide. Par ailleurs, le pourcentage d'identitÃ© entre deux sÃ©quences nuclÃ©otidiques est dÃ©fini ici comme Ã©tant le 20 nombre de positions pour lesquelles les bases sont identiques quand les deux sÃ©quences sont alignÃ©es de maniÃ¨re optimale, divisÃ© par le nombre total de bases de la plus longue des deux sÃ©quences. Deux sÃ©quences sont dites Ãªtre alignÃ©es de maniÃ¨re optimale quand le pourcentage d'identitÃ© est maximal. Par ailleurs, selon la pratique habituelle de l'homme du mÃ©tier, il est possible dans certains cas d'ajouter 25 un nombre limitÃ© d'espaces afin d'obtenir un alignement optimal entre les deux sÃ©quences. PrÃ©fÃ©rablement, une sÃ©quence selon l'invention ayant au moins 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, Sou 6 a respectivement au moins 95%, plus prÃ©fÃ©rablement au moins 98% d'identitÃ© avec les SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. 30 Les amorces selon l'invention comprenant les sÃ©quences SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO : 2 ou les sÃ©quences ayant au moins 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NO: 1 et la SEQ ID NO: 2 et la sonde comprenant ou consistant en la SEQ ID NO: 3, une sÃ©quence complÃ©mentaire de la SEQ ID NO: 3, ou une sÃ©quence ayant au moins 3065967 11 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NO : 3 ou la complÃ©mentaire de celle-ci, sont utilisÃ©es pour dÃ©tecter une portion de la rÃ©gion LTR du gÃ©nome du VIH-2. Les amorces selon l'invention comprenant les sÃ©quences SEQ ID NO : 4 et SEQ ID NO : 5 ou des sÃ©quences ayant au moins 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NO : 4 5 et la SEQ ID NO: 5 et la sonde comprenant ou consistant en la sÃ©quence SEQ ID NO: 6, une sÃ©quence complÃ©mentaire de la SEQ ID NO : 6, ou une sÃ©quence ayant au moins 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NO: 6 ou la complÃ©mentaire de celle-ci, sont utiles pour dÃ©tecter une portion de la rÃ©gion gag du gÃ©nome du VIH-2. Comme il sera clair pour l'homme du mÃ©tier et Ã titre d'exemple, la 10 sÃ©quence complÃ©mentaire Ã une sÃ©quence : - 5'-AGCAGGTAGAGCCTGGGTGTT-3' (SEQ ID NO: 1) est 5'- AACACCCAGGCTCTACCTGCT-3' (SEQ ID NO: 7) ; - 5'-TCTTTAAGCAAGCAAGCGTGG-3' (SEQ ID NO: 2) est 5'- CCACGCTTGCTTGCTTAAAGA-3' (SEQ ID NO : 8) ; 15 - 5'-CTTGGCCGGYRCTGGGCAGA-3' (SEQ ID NO: 3) est 5'- TCTGCCCAGYRCCGGCCAAG-3' (SEQ ID NO : 9) ; - 5'-GCGCGAGAAACTCCGTCTTG-3' (SEQ ID NO: 4) est 5'- CAAGACGGAGTTTCTCGCGC-3' (SEQ ID NO: 10) ; - 5'-TTCGCTGCCCACACAATATGTT-3' (SEQ ID NO: 5) est 5'20 AACATATTGTGTGGGCAGCGAA-3' (SEQ ID NO: 11) ; - 5'-TAGGTTACGGCCCGGCGGAAAGA-3' (SEQ ID NO: 6) est 5' CTTTCCGCCGGGCCGTAACCTA-3' (SEQ ID NO: 12) ; Par ailleurs, comme il sera aussi clair pour l'homme du mÃ©tier la SEQ ID NO: 3 (CTTGGCCGGYRCTGGGCAGA) est une sÃ©quence dite dÃ©gÃ©nÃ©rÃ©e dans 25 laquelle Y reprÃ©sente C et T, et R reprÃ©sente A et G. De prÃ©fÃ©rence, les amorces et les sondes selon l'invention, sont prÃ©sentes dans une concentration comprise entre 300 et 500 nM chacune. De prÃ©fÃ©rence Ã©galement les amorces et les sondes sont toutes prÃ©sentes Ã une mÃªme concentration. 30 De maniÃ¨re avantageuse, l'utilisation d'amorces et de sondes selon l'invention dans une PCR en temps rÃ©el (i) permet la dÃ©tection spÃ©cifique et la quantification de l'ADN du VIH-2 par rapport aux acides nuclÃ©iques du VIH-1, (ii) diminue la limite de dÃ©tection et quantification des tests de l'Ã©tat de l'art, et (iii) permet une meilleure dÃ©tection et quantification de l'ADN du VIH-2 de groupe B. 3065967 12 ContrÃ´le interne Dans la prÃ©sente invention, le contrÃ´le interne d'extraction et/ou d'inhibition permet notamment de valider l'ensemble du processus analytique par 5 PCR en temps rÃ©el, de l'extraction Ã l'amplification, sans compÃ©tition entre l'ADN du VIH-2 et le contrÃ´le interne, y compris pour les valeurs faibles. Par le terme Â« contrÃ´le interne d'extraction et/ou d'inhibition)) on entend ici un virus Ã ADN ou une molÃ©cule d'acide nuclÃ©ique exogÃ¨ne, n'ayant essentiellement aucune similaritÃ© de sÃ©quence avec le gÃ©nome humain ou avec 10 des pathogÃ¨nes affectant les humains. PrÃ©fÃ©rablement le contrÃ´le interne d'extraction et/ou d'inhibition selon l'invention est une molÃ©cule d'ADN. PrÃ©fÃ©rablement, le contrÃ´le interne selon l'invention ainsi que les amorces et sonde nÃ©cessaires Ã son amplification et sa dÃ©tection par PCR en temps rÃ©el sont ajoutÃ©s avant l'extraction. 15 PrÃ©fÃ©rablement, le contrÃ´le interne d'extraction et/ou d'inhibition selon l'invention est marquÃ© avec un fluorochrome. Plus prÃ©fÃ©rablement, le contrÃ´le interne d'extraction et/ou d'inhibition selon l'invention est marquÃ© par le fluorochrome Yellow Dye ref. DICD-YD-L100. 20 Echantillon contenant de l'ADN Dans la prÃ©sente invention un Â« Ã©chantillon contenant de l'ADN Â» concerne tout Ã©chantillon, notamment solide, fluide ou liquide, susceptible de contenir de l'ADN du VIH-2. L'Ã©chantillon contenant de l'ADN selon l'invention peut notamment Ãªtre un Ã©chantillon biologique ou un Ã©chantillon, notamment de type 25 expÃ©rimental, contenant des cellules ou des fractions de cellules infectÃ©es in vitro par le VIH-2. De prÃ©fÃ©rence, l'Ã©chantillon biologique selon l'invention est issu d'un prÃ©lÃ¨vement rÃ©alisÃ© sur un individu, notamment un individu humain, et peut notamment Ãªtre un Ã©chantillon de sang total, un Ã©chantillon de plasma, un 30 Ã©chantillon de sÃ©rum, un Ã©chantillon sÃ©minal, un Ã©chantillon de cellules mononuclÃ©es du sang pÃ©riphÃ©rique (PBMC), ou de fractions de celles-ci, ou un Ã©chantillon de leucocytes, ou de fractions de ceux-ci. Comme il sera clair pour l'homme du mÃ©tier l'Ã©chantillon contenant de l'ADN selon l'invention peut avoir Ã©tÃ© traitÃ©, notamment aprÃ¨s avoir Ã©tÃ© prÃ©levÃ© chez 3065967 13 l'individu, avant d'Ãªtre soumis Ã une PCR en temps rÃ©el selon l'invention. De tels traitements englobent notamment la centrifugation, le traitement par un anticoagulant, tel quel l'EDTA, ou la concentration, la purification ou l'extraction d'ADN. Ainsi, Ã titre d'exemple, un Ã©chantillon biologique selon l'invention peut Ãªtre 5 une solution d'ADN d'un Ã©chantillon, tel qu'un Ã©chantillon de sang total, prÃ©levÃ© chez un individu humain. Kit et mÃ©lange Par le terme Â« kit)) on comprend qu'un ou plusieurs des composants du kit 10 peuvent Ãªtre emballÃ©s ou compartimentÃ©s sÃ©parÃ©ment du reste des composants. Par le terme Â« mÃ©lange)) on comprend que tous les composants du mÃ©lange sont dans un seul compartiment. PrÃ©fÃ©rablement, le mÃ©lange selon l'invention est un mÃ©lange de PCR. Des rÃ©actifs additionnels par rapport aux amorces et aux sondes selon 15 l'invention peuvent Ãªtre facilement conÃ§us par l'homme du mÃ©tier et peuvent notamment englober une ADN polymÃ©rase thermostable, une transcriptase inverse, des dNTPs, des sels, en particulier du Mn2+ et Mg2+, et des tampons. Traitement d'une infection par le VII-1-2 20 Dans la prÃ©sente invention, un Â« traitement d'une infection par le VIH-2 Â» concerne tout traitement permettant de prÃ©venir ou de traiter une infection par le VIH-2, notamment en rÃ©duisant la charge virale du VIH-2 ou en la rendant indÃ©tecta ble. De prÃ©fÃ©rence, le traitement d'une infection par le VIH-2 selon l'invention 25 est sÃ©lectionnÃ© dans le groupe constituÃ© d'une thÃ©rapie antirÃ©trovirale (TAR), notamment Ã l'aide d'un inhibiteur nuclÃ©osidique de la transcriptase inverse (INTI), d'un inhibiteur de protÃ©ase (IP) et/ou d'un inhibiteur d'intÃ©grase, d'un immunomodulateur, d'une molÃ©cule pouvant agir au niveau des points de contrÃ´le immunitaires, d'un anticorps monoclonal, d'une molÃ©cule anti-latence ayant un 30 mÃ©canisme d'action au niveau Ã©pigÃ©nÃ©tique et d'un vaccin. La prÃ©sente invention sera davantage explicitÃ©e, de maniÃ¨re non limitative, Ã l'aide des figures et de l'exemple qui suivent. 3065967 14 Description des figures Figure 1 La figure 1 reprÃ©sente la courbe Ã©talon du cycle seuil (Cr) (axe vertical) dÃ©terminÃ© 5 par la mise en oeuvre d'une PCR en temps rÃ©el selon l'invention en fonction du nombre de copies d'ADN du VIH-2 introduites (axe horizontal, Ã©chelle logarithmique). Les valeurs mÃ©dianes et les intervalles interquartiles Ã 25% et 75% du CT sont indiquÃ©s. 10 Figures 2 et 3 Les Figures 2A-2B reprÃ©sentent le logio du nombre de copies de d'ADN du VIH-2 obtenues par extraction automatique Ã partir de 106 PBMC (Figure 2A) ou leucocytes (Figure 2B) (axe vertical) en fonction du logio du nombre de copies de d'ADN du VIH-2 obtenues par extraction manuelle Ã partir de 106 PBMC (Figure 2A) 15 ou leucocytes (Figure 2B) (axe horizontal), les PBMC Ã©tant issues de culots cellulaires (Figure 2A) et les leucocytes de sang total (Figure 2B). Le coefficient de corrÃ©lation (r) et seuil de significativitÃ© (p) sont reprÃ©sentÃ©s. 20 Figures 4 et 5 Les figures 4 et 5 reprÃ©sentent la quantitÃ© d'ADN total du VIH-2 (axe vertical, logio du nombre de copies pour 106 PBMC) en fonction de la quantitÃ© d'ARN du VIH-2 (axe horizontal, en logio du nombre de copies par mL (Figure 3) ou en strates du nombre de copies par mL (Figure 4)) pour des patients positifs au VIH-2 du groupe A traitÃ©s 25 (triangles noirs), des patients positifs au VIH-2 du groupe A non traitÃ©s (triangles blancs), des patients positifs au VIH-2 du groupe B traitÃ©s (cercles noirs) et des patients positifs au VIH-2 du groupe B (cercles blancs). Une valeur arbitraire de 1,60 logio copies/mL a Ã©tÃ© attribuÃ©e aux Ã©chantillons avec une charge virale plasmatique non dÃ©tectable. 30 3065967 15 EXEMPLE MatÃ©riels et mÃ©thodes Echantillons biologiques selon l'invention 5 Des aliquots de cellules mononuclÃ©es du sang pÃ©riphÃ©rique (PBMC) congelÃ©s de 63 patients infectÃ©s par le VIH-2 inclus dans la cohorte nationale franÃ§aise du VIH2 (ANRS C05) ont Ã©tÃ© sÃ©lectionnÃ©s selon le gÃ©notype viral et la charge d'ARN du VIH-2 plasmatique dÃ©terminÃ©e comme dÃ©crit dans Avettand-Fenoel et al. (2014) J. Clin. Microbiol. 52 : 3017-3022. Un consentement par Ã©crit a Ã©tÃ© obtenu de de la part 10 de tous les patients au moment de l'inclusion dans la cohorte. Parmi ces 63 patients, 71% (n = 45) ont Ã©tÃ© traitÃ©s avec une thÃ©rapie antirÃ©trovirale, et concernant le groupe viral, dÃ©terminÃ© comme dÃ©crit dans Charpentier et al. (2014) AIDS Lond Engl 28: 1161-1169, 35 d'entre eux prÃ©sentaient un virus du groupe A (71% traitÃ©s) et 28 prÃ©sentaient un virus du groupe B (71% traitÃ©s). Les Ã©chantillons sÃ©lectionnÃ©s avaient 15 les caractÃ©ristiques suivantes : charge en ARN du VIH-2 REVENDICATIONS1. ProcÃ©dÃ© de dÃ©tection ou quantification de l'acide dÃ©soxyribonuclÃ©ique (ADN) du virus de l'immunodÃ©ficience humaine 2 (VIH-2) dans un Ã©chantillon contenant de l'ADN comprenant : a) rÃ©aliser une rÃ©action en chaine par polymÃ©rase (PCR) en temps rÃ©el sur l'Ã©chantillon, ou une fraction de celui-ci comprenant de l'ADN, avec au moins deux ensembles d'amorces et de sonde comprenant chacun respectivement deux amorces et une sonde marquÃ©e destinÃ©s Ã la dÃ©tection ou Ã la quantification de l'ADN du VIH-2, dont l'un au moins des ensembles est choisi dans le groupe constituÃ© de : - un ensemble comprenant une amorce comprenant ou consistant en une sÃ©quence SEQ ID NO: 1 ou une sÃ©quence ayant au moins 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NO: 1, une amorce comprenant ou consistant en une sÃ©quence SEQ ID NO :2 ou une sÃ©quence ayant 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NO: 2 ou les complÃ©mentaires de ces sÃ©quences, et une sonde marquÃ©e comprenant ou consistant en une sÃ©quence SEQ ID NO: 3, ou une sÃ©quence ayant au moins 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NO: 3 ou la complÃ©mentaire de ces sÃ©quences, et - un ensemble comprenant une amorce comprenant ou consistant en une sÃ©quence SEQ ID NO: 4 ou une sÃ©quence ayant au moins 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NO :4, une amorce comprenant ou consistant en une sÃ©quence SEQ ID NO :5 ou une sÃ©quence ayant 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NO: 5 ou les complÃ©mentaires de ces sÃ©quences, et une sonde marquÃ©e comprenant ou consistant en une sÃ©quence SEQ ID NO: 6, ou une sÃ©quence ayant au moins 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NO: 6 ou la complÃ©mentaire de ces sÃ©quences, et b) dÃ©terminer Ã partir de celle-ci la prÃ©sence ou l'absence et/ou la quantitÃ© d'ADN du VIH-2 dans l'Ã©chantillon biologique. 3065967 2 2. ProcÃ©dÃ© selon la revendication 1, dans lequel l'Ã©tape a) de rÃ©alisation d'une rÃ©action en chaine par polymÃ©rase (PCR) en temps rÃ©el sur l'Ã©chantillon, ou une fraction de celui-ci comprenant de l'ADN, est rÃ©alisÃ©e avec (i) au moins 4 amorces comprenant ou consistant respectivement en : 5 - une sÃ©quence SEQ ID NO: 1 ou une sÃ©quence ayant au moins 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NO: 1 ou la complÃ©mentaire de ces sÃ©quences, et - une sÃ©quence SEQ ID NO: 2 ou une sÃ©quence ayant 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NO: 2 ou la complÃ©mentaire de ces 10 sÃ©quences, et - une sÃ©quence SEQ ID NO: 4 ou une sÃ©quence ayant 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NO: 4 ou la complÃ©mentaire de ces sÃ©quences, et - une sÃ©quence SEQ ID NO: 5 ou une sÃ©quence ayant 90% 15 d'identitÃ© avec la SEQ ID NO: 5 ou la complÃ©mentaire de ces sÃ©quences, et (ii) au moins 2 sondes marquÃ©es comprenant ou consistant respectivement en : - une sÃ©quence SEQ ID NO : 3, une sÃ©quence complÃ©mentaire Ã 20 la SEQ ID NO :3, ou une sÃ©quence ayant au moins 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NO : 3 ou la complÃ©mentaire de celle-ci, et - une sÃ©quence SEQ ID NO: 6, une sÃ©quence complÃ©mentaire Ã la SEQ ID NO :6, ou une sÃ©quence ayant au moins 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NO : 6 ou la complÃ©mentaire de celle-ci. 25 3. ProcÃ©dÃ© selon la revendication 1 ou 2, dans lequel l'Ã©chantillon contenant de l'ADN est un Ã©chantillon biologique ou un Ã©chantillon comprenant des cellules infectÃ©es in vitro par le VIH-2. 30 4. ProcÃ©dÃ© selon l'une quelconque des revendications 1 Ã 3, dans lequel les amorces et les sondes sont prÃ©sentes dans une concentration comprise entre 300 et 500 nM chacune. 3065967 3 5. ProcÃ©dÃ© selon l'une quelconque des revendications 1 Ã 4, dans lequel les amorces consistent respectivement en SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO :2, SEQ ID NO: 4 et SEQ ID NO: 5, et les sondes marquÃ©es consistent respectivement en les sÃ©quences SEQ ID NO : 3 et SEQ ID NO : 6. 5 6. ProcÃ©dÃ© selon l'une quelconque des revendications 1 Ã 5, dans lequel les sondes marquÃ©es sont marquÃ©es avec du 6-carboxyfluorescÃ©ine (FAM) en leur extrÃ©mitÃ© 5' et avec du Black Hole Quencher-1 (BHQ1) en leur extrÃ©mitÃ© 3'. 10 7. ProcÃ©dÃ© selon l'une quelconque des revendications 1 Ã 6, dans lequel on ajoute Ã l'Ã©chantillon ou Ã la fraction de celui-ci au moins un virus Ã ADN ou au moins une molÃ©cule d'ADN n'ayant essentiellement aucune similaritÃ© de sÃ©quence avec la sÃ©quence gÃ©nomique du VIH-2, ainsi que les amorces et sonde nÃ©cessaires Ã son amplification et sa dÃ©tection par PCR en temps rÃ©el, 15 Ã titre de contrÃ´le interne d'extraction et/ou d'inhibition. 8. ProcÃ©dÃ© selon l'une quelconque des revendications 1 Ã 7, dans lequel la PCR comprend les conditions de thermocyclage suivantes : - 2 minutes Ã 50Â°C, suivis de 20 - 10 minutes Ã 95Â°C, suivis de -50 cycles de 95Â°C pendant 15 secondes et 60Â°C pendant 1 minute. 9. ProcÃ©dÃ© selon l'une quelconque des revendications 1 Ã 8, comprenant en outre dÃ©terminer ou quantifier des acides nuclÃ©iques du VIH-1 dans 25 l'Ã©chantillon ou une fraction de celui-ci. 10. Kit ou mÃ©lange pour dÃ©tecter ou quantifier l'ADN du VIH-2, comprenant : a) au moins deux ensembles d'amorces et de sonde comprenant chacun respectivement deux amorces et une sonde destinÃ©s Ã la dÃ©tection ou Ã la 30 quantification de l'ADN du VIH-2, de prÃ©fÃ©rence les amorces et la sonde Ã©tant chacune prÃ©sente dans une concentration comprise entre 300 et 500 nM, et dont l'un au moins des ensembles est choisi dans le groupe constituÃ© de : - un ensemble comprenant une amorce comprenant ou consistant en une sÃ©quence SEQ ID NO: 1 ou une sÃ©quence ayant au moins 90% 3065967 4 d'identitÃ© avec la SEQ ID NO: 1, une amorce comprenant ou consistant en une sÃ©quence SEQ ID NO : 2 ou une sÃ©quence ayant 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NO :2 ou les complÃ©mentaires de ces sÃ©quences, et une sonde marquÃ©e, en particulier avec du 6-carboxyfluorescÃ©ine (FAM) en 5 son extrÃ©mitÃ© 5' et du Black Hole Quencher-1 (BHQ1) en son extrÃ©mitÃ© 3', comprenant ou consistant en une sÃ©quence SEQ ID NO: 3, ou une sÃ©quence ayant au moins 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NO: 3 ou la complÃ©mentaire de ces sÃ©quences, et - un ensemble comprenant une amorce comprenant ou consistant en 10 une sÃ©quence SEQ ID NO: 4 ou une sÃ©quence ayant au moins 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NO :4, une amorce comprenant ou consistant en une sÃ©quence SEQ ID NO : 5 ou une sÃ©quence ayant 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NO : 5 ou les complÃ©mentaires de ces amorces, et une sonde marquÃ©e, en particulier avec du 6-carboxyfluorescÃ©ine (FAM) en 15 son extrÃ©mitÃ© 5' et du Black Hole Quencher-1 (BHQ1) en son extrÃ©mitÃ© 3', comprenant ou consistant en une sÃ©quence SEQ ID NO: 6, ou une sÃ©quence ayant au moins 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NO: 6 ou la complÃ©mentaire de ces sÃ©quences, et b) au moins un virus Ã ADN ou au moins une molÃ©cule d'ADN n'ayant 20 essentiellement aucune similaritÃ© de sÃ©quence avec la sÃ©quence gÃ©nomique du VIH-2, ainsi que les amorces et sonde nÃ©cessaires Ã son amplification et sa dÃ©tection par PCR en temps rÃ©el, Ã titre de contrÃ´le interne d'extraction et/ou d'inhibition, et c) facultativement des rÃ©actifs additionnels pour rÃ©aliser une PCR. 25 11. Kit ou mÃ©lange selon la revendication 10, comprenant : al) au moins 4 amorces, de prÃ©fÃ©rence Ã une concentration comprise entre 300 et 500 nM, comprenant ou consistant respectivement en : - une sÃ©quence SEQ ID: NO 1 ou une sÃ©quence ayant au moins 30 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NO: 1 ou la complÃ©mentaire de ces sÃ©quences, et - une sÃ©quence SEQ ID NO: 2 ou une sÃ©quence ayant 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NO: 2 ou la complÃ©mentaire de ces sÃ©quences, et 3065967 5 - une sÃ©quence SEQ ID NO: 4 ou une sÃ©quence ayant 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NO: 4 ou la complÃ©mentaire de ces sÃ©quences, et - une sÃ©quence SEQ ID NO: 5 ou une sÃ©quence ayant 90% 5 d'identitÃ© avec la SEQ ID NO: 5 ou la complÃ©mentaire de ces sÃ©quences, et a2) au moins 2 sondes marquÃ©es, en particulier avec du 6-carboxyfluorescÃ©ine (FAM) en leur extrÃ©mitÃ© 5' et du Black Noie Quencher-1 (BHQ1) en leur extrÃ©mitÃ© 3', de prÃ©fÃ©rence Ã une concentration comprise entre 300 et 500 nM, comprenant 10 ou consistant respectivement en : - une sÃ©quence SEQ ID NO 3, une sÃ©quence complÃ©mentaire Ã la SEQ ID NO: 3, ou une sÃ©quence ayant au moins 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NI : 3 ou la complÃ©mentaire de celle-ci, et - une sÃ©quence SEQ ID NO: 6, une sÃ©quence complÃ©mentaire Ã 15 la SEQ ID NO : 6, ou une sÃ©quence ayant au moins 90% d'identitÃ© avec la SEQ ID NO : 6 ou la complÃ©mentaire de celle-ci. 12. Kit ou mÃ©lange selon la revendication 10 ou 11, comprenant en outre des amorces et au moins une sonde marquÃ©e pour dÃ©tecter ou quantifier des 20 acides nuclÃ©iques du VIH-1. 13. Utilisation du kit ou du mÃ©lange tel que dÃ©fini dans l'une des revendications 10 Ã 12, pour dÃ©tecter ou quantifier des acides nuclÃ©iques du VIH-2 d'un Ã©chantillon contenant de l'ADN. 25 14. ProcÃ©dÃ© in vitro pour diagnostiquer une infection par VIH-2, ou dÃ©terminer une charge virale du VIH-2, chez un individu, comprenant les Ã©tapes de : (a) rÃ©aliser le procÃ©dÃ© pour dÃ©tecter ou quantifier l'ADN du VIH-2 dans un Ã©chantillon biologique pris chez un individu tel que dÃ©fini dans les 30 revendications 1 Ã 9; (b) dÃ©terminer Ã partir de celui-ci si l'individu est infectÃ© par le VIH-2 ou la charge virale du VIH-2 de l'individu. 3065967 6 15. ProcÃ©dÃ© in vitro pour le suivi de la charge virale du VIH-2 d'un individu traitÃ© pour une infection par le VIH-2, comprenant rÃ©aliser le procÃ©dÃ© pour diagnostiquer une infection par VIH-2, ou dÃ©terminer une charge virale du VIH2, selon la revendication 14. 16. ProcÃ©dÃ© in vitro pour dÃ©terminer si un individu est susceptible de bÃ©nÃ©ficier d'un traitement d'une infection par le VIH-2 ou d'un ajustement du traitement, comprenant rÃ©aliser le procÃ©dÃ© pour diagnostiquer une infection par VIH-2, ou dÃ©terminer une charge virale du VIH-2, selon la revendication 14. 5 10