Brevet FR3065644A1 — publié le 20181102

DOMAINE TECHNIQUE DE L'INVENTION La prÃ©sente invention concerne des extraits de 20-hydroxyecdysone (20E) purifiÃ©e, et leur utilisation thÃ©rapeutique, en particulier pour l'amÃ©lioration de la fonction musculaire, en augmentant la masse et la force musculaire ainsi que la mobilitÃ© chez les mammifÃ¨res, la 20E ayant des effets anabolisants chez les mammifÃ¨res. Plus particuliÃ¨rement l'invention permet d'amÃ©liorer et/ou de prÃ©venir la dÃ©gradation de la fonction musculaire des mammifÃ¨res sarcopÃ©niques ou de mammifÃ¨res ayant Ã©tÃ© immobilisÃ©s notamment aprÃ¨s une intervention chirurgicale ou atteints de dystrophies musculaires notamment d'origine gÃ©nÃ©tique. En outre, l'invention permet de lutter contre les maladies cardio-mÃ©taboliques dont les maladies cardiovasculaires et le diabÃ¨te, grÃ¢ce aux effets mÃ©taboliques de la 20E. ÃTAT DE LA TECHNIQUE Les phytoecdysones reprÃ©sentent une importante famille de stÃ©rols polyhydroxylÃ©s. Ces molÃ©cules sont produites pas diverses espÃ¨ces de plantes (fougÃ¨res, gymnospermes, angiospermes) et participent Ã la dÃ©fense de ces plantes contre les ravageurs. De par leur abondance dans la nature, et la difficultÃ© de leur synthÃ¨se chimique, les phytoecdysones proposÃ©es dans divers complÃ©ments alimentaires sont extraites Ã partir de plantes cultivÃ©es Ã cette fin. Ces plantes produisent un cocktail complexe de phytoecdysones (e.g. Bathori et al., 1999 ; Kokoska & Jankovska, 2009) et leurs extraits contiennent majoritairement de la 20E, mais aussi un ensemble de phytoecdysones dites mineures, ainsi que des composÃ©s appartenant Ã d'autres familles chimiques, la somme des phytoecdysones reprÃ©sentant selon les prÃ©parations de 5 Ã 90% des extraits. La nature des phytoecdysones mineures dÃ©pend des plantes utilisÃ©es comme matiÃ¨re premiÃ¨re (Hunyadi et al., 2016), de la saison Ã laquelle est faite la rÃ©colte, voire de la rÃ©gion dans laquelle elles sont cultivÃ©es (sol, climat) et est de ce fait susceptible de varier sensiblement d'un lot Ã un autre. Ces variations sont progressivement attÃ©nuÃ©es au cours de la purification. 3065644 2 Les donnÃ©es de la littÃ©rature dÃ©crivent la 20E comme faiblement cytotoxique mais, si cela s'applique Ã la molÃ©cule pure, il n'en va pas de mÃªme des prÃ©parations incomplÃ¨tement purifiÃ©es. Dans le but de mettre Ã profit les effets bÃ©nÃ©fiques de la 20E sur la qualitÃ© 5 musculaire dans le cadre d'un mÃ©dicament, il est nÃ©cessaire de disposer d'un extrait de 20E de grade pharmaceutique. OBJET DE L'INVENTION La prÃ©sente invention vise un extrait de plante ou d'une partie de plante, ladite 10 plante Ã©tant choisie parmi les vÃ©gÃ©taux contenant au moins 0,5% de 20-hydroxyecdysone en poids sec dudit vÃ©gÃ©tal, caractÃ©risÃ© en ce que ledit extrait comporte au moins 95%, et de prÃ©fÃ©rence au moins 97%, de 20-hydroxyecdysone. L'extrait selon l'invention, aussi appelÃ© par la suite 810101, est de faÃ§on remarquable dÃ©pourvu d'impuretÃ©s, comme des composÃ©s mineurs, susceptibles 15 d'affecter l'innocuitÃ©, la disponibilitÃ© ou l'efficacitÃ© d'une application pharmaceutique dudit extrait. Selon une caractÃ©ristique de l'invention, les impuretÃ©s absentes de 810101 sont des composÃ©s Ã 19 ou 21 atomes de carbone, comme la RubrostÃ©rone, la DihydrorubrostÃ©rone ou la PoststÃ©rone. 20 La plante Ã partir de laquelle est produit 810101 est avantageusement choisie parmi Stemmacantha carthamoides (aussi appelÃ©e Leuzea carthamoides), Cyanotis arachnoidea et Cyanotis vaga. L'invention vise plus particuliÃ¨rement l'obtention de 810101 Ã partir des racines de ces plantes. L'invention s'intÃ©resse tout spÃ©cialement Ã un extrait de racines de 25 Stemmacantha carthamoides comportant au moins 95%, et de prÃ©fÃ©rence au moins 97%, de 20-hydroxyecdysone. GrÃ¢ce Ã l'extrait selon l'invention, la 20E est purifiÃ©e au grade pharmaceutique et 810101 peut Ãªtre utilisÃ© pour des applications pharmaceutiques diverses. De maniÃ¨re avantageuse, 810101 est destinÃ© Ã Ãªtre utilisÃ© pour amÃ©liorer 30 et/ou prÃ©venir la dÃ©gradation de la fonction musculaire de mammifÃ¨res sarcopÃ©niques ou de mammifÃ¨res ayant Ã©tÃ© immobilisÃ©s, notamment aprÃ¨s une intervention chirurgicale, ou atteints de dystrophies musculaires, notamment d'origine gÃ©nÃ©tique. En outre, l'utilisation de 810101 permet de lutter contre les maladies 3065644 3 cardio-mÃ©taboliques dont les maladies cardiovasculaires et le diabÃ¨te, grÃ¢ce aux effets mÃ©taboliques de la 20E. 610101 est destinÃ© Ã Ãªtre utilisÃ© dans le traitement d'affections musculaires ou cardio-mÃ©taboliques. 5 Tout particuliÃ¨rement, l'invention concerne un extrait de racines de Stemmacantha carthamoides comportant au moins 95%, et de prÃ©fÃ©rence au moins 97%, de 20-hydroxyecdysone pour son utilisation dans le traitement et/ou la prÃ©vention de la sarcopÃ©nie. De mÃªme, l'invention concerne tout particuliÃ¨rement un extrait de racines de 10 Stemmacantha carthamoides comportant au moins 95%, et de prÃ©fÃ©rence au moins 97%, de 20-hydroxyecdysone pour son utilisation dans le traitement et/ou la prÃ©vention de dystrophies musculaires en particulier d'origine gÃ©nÃ©tique. L'invention concerne encore tout particuliÃ¨rement un extrait de racines de Stemmacantha carthamoides comportant au moins 95%, et de prÃ©fÃ©rence au moins 15 97%, de 20-hydroxyecdysone pour son utilisation dans le traitement et/ou la prÃ©vention de la perte de masse et de fonction musculaire suite Ã une immobilisation, notamment dans un contexte post chirurgical. Plus particuliÃ¨rement, 610101 est utilisÃ© Ã raison d'une administration de 200 Ã 1000 mg/jours, en une ou plusieurs prises, chez un patient. 20 L'invention concerne en outre une composition comprenant Ã titre d'agent actif l'extrait selon l'invention (BI0101). La composition contient de prÃ©fÃ©rence entre 200 et 1000 mg d'agent actif (BI0101). L'invention concerne Ã©galement un procÃ©dÃ© de prÃ©paration d'un extrait selon 25 l'invention, Ã partir d'une prÃ©paration de 20-hydroxyecdysone pure Ã de l'ordre de 90%, caractÃ©risÃ© en ce qu'il comprend les Ã©tapes suivantes : a) Dissolution Ã chaud de 20-hydroxyecdysone pure Ã de l'ordre de 90% dans du mÃ©thanol, filtration et concentration partielle, b) Ajout de 3 volumes d'acÃ©tone, 30 c) Refroidissement Ã une tempÃ©rature comprise entre 0 et 5Â°C, sous agitation, d) Filtration du prÃ©cipitÃ© obtenu, e) RinÃ§ages successifs avec de l'acÃ©tone et de l'eau, et f) SÃ©chage. 3065644 4 Cette purification met en jeu un processus de recristallisation appropriÃ© Ã cette molÃ©cule et apte Ã Ãªtre rÃ©alisÃ© Ã l'Ã©chelle industrielle. De maniÃ¨re avantageuse, la filtration de l'Ã©tape a) est rÃ©alisÃ©e grÃ¢ce Ã un filtre Ã particules de 0,2 pm. 5 La concentration partielle de l'Ã©tape a) est avantageusement effectuÃ©e par distillation sous vide, Ã une tempÃ©rature de l'ordre de 50Â°C, en prÃ©sence de Me0H. L'Ã©tape f) de sÃ©chage est effectuÃ©e sous vide Ã une tempÃ©rature de l'ordre de 50Â°C. 10 BRÃVE DESCRIPTION DES FIGURES D'autres avantages, buts et caractÃ©ristiques particuliÃ¨res de la prÃ©sente invention ressortiront de la description non limitative qui suit d'au moins un mode de rÃ©alisation particulier des dispositifs objets de la prÃ©sente invention, en regard des dessins annexÃ©s, dans lesquels : 15 La figure 1 reprÃ©sente schÃ©matiquement la structure de la 20-hydroxyecdysone (20E). La figure 2 illustre schÃ©matiquement le procÃ©dÃ© de purification de la 20E selon l'invention. La figure 3 illustre le profil pharmacocinÃ©tique de diffÃ©rentes cohortes 20 d'individus ayant reÃ§u une administration unique d'extrait selon l'invention (BI0101). La figure 4 est un diagramme reprÃ©sentatif des effets du traitement chronique de 810101, sur la vitesse maximale de course de souris Ã¢gÃ©es. 25 DESCRIPTION DÃTAILLÃE DE MODES DE RÃALISATION DE L'INVENTION La prÃ©sente description est donnÃ©e Ã titre non limitatif. 1. ProcÃ©dÃ© de purification par recristallisation 30 Le procÃ©dÃ© a Ã©tÃ© dÃ©veloppÃ© en partant d'une prÃ©paration de 20E extraite de Stemmacantha carthamoides, mais il peut s'appliquer Ã des prÃ©parations de 20E issues d'autres plantes. Une fiche technique de 20E pure Ã 90% utilisable comme prÃ©paration initiale est dÃ©crite en annexe. 3065644 5 Le processus de purification, illustrÃ© sur la figure 2, commence par la dissolution de 10kg de 20E pure Ã 90%, dans 40L de mÃ©thanol, dans un premier rÃ©acteur. La solution obtenue est ensuite chauffÃ©e Ã 45-50Â°C, jusqu'Ã apparition d'une 5 coloration marron claire. La solution est alors filtrÃ©e Ã travers un filtre Ã particules de 0,2 pm dans un second rÃ©acteur. Le filtre Ã particules est rincÃ© avec 5L de Me0H, dans ledit second rÃ©acteur, puis la solution est concentrÃ©e Ã un volume de 25L par distillation sous vide Ã une tempÃ©rature de 50Â°C. On ajoute 80L d'acÃ©tone comme anti-solvant Ã 45-50Â°C. On provoque la 10 cristallisation de la 20E en refroidissant Ã 15-20Â°C et en agitant pendant 16 Ã 18 heures Ã 15-25Â°C, puis en refroidissant Ã 0-5Â°C eten agitant pendant au moins 4 heures. On filtre le prÃ©cipitÃ© puis on le lave avec 20L d'acÃ©tone prÃ©alablement refroidie Ã 0-5Â°C, et on le sÃ¨che dans un courant dazote gazeux pendant au moins 1,5 heure. 15 On charge le second rÃ©acteur avec le produit ainsi obtenu, qui est remis en suspension dans 20L d'eau pour Ã©liminer l'acÃ©tone rÃ©siduelle. On agite la suspension Ã 15-25Â°C pendant 2 heures, puis on la filtre Ã traders le filtre Ã particules et on lave le matÃ©riau avec 20L d'eau purifiÃ©e avant de le sÃ©cher sous vide Ã une tempÃ©rature infÃ©rieure ou Ã©gale Ã 50Â°C. 20 2. Analyse du produit fini Le produit fini (BI0101) a Ã©tÃ© analysÃ© par HPLC-MS/MS. Les composants mineurs ont Ã©tÃ© isolÃ©s par HPLC Ã partir des liqueurs-mÃ¨res puis analysÃ©s en spectromÃ©trie de masses et spectromÃ©trie RMN. Il s'avÃ¨re que les composants 25 significatifs prÃ©sents dans une quantitÃ© supÃ©rieure ou Ã©gale Ã 0,05% en poids sec de 610101, sont exclusivement des phytoecdysones. Les valeurs reportÃ©es dans le tableau 1 ci-dessous correspondent Ã des moyennes sur quatre lots distincts d'extrait brut de racines (Stemmacantha carthamoides) et quatre lots distincts de produit fini. En ce qui concerne les donnÃ©es de l'extrait brut de racines, les valeurs sont 30 rapportÃ©es Ã la somme des phytoecdysones observÃ©es en HPLC, mais en fait la 20E ne reprÃ©sente que 15-21% en poids dans le rÃ©sidu sÃ©chÃ© de l'extrait alcoolique des racines sÃ©chÃ©es (n = 2). 3065644 6 Tableau 1 Nom Extraits de Stemmacantha carthamoides Extrait brut de MatiÃ¨re Initiale Produit fini racines (20E pure Ã (BI0101) 90%) 20E 60,04 93,57 97,10 3-AcÃ©tate de 20E 16,47 0,86 0,27 2-AcÃ©tate de 20E 7,7 0,94 0,32 AjugastÃ©rone C 5,3 1,84 0,52 RubrostÃ©rone 4,5 0,14 - DihydrorubrostÃ©rone (17(3-0H) 0,71 0,04 - PoststÃ©rone 0,67 0,07 - DihydrorubrostÃ©rone (17a-OH) 0,63 - - 20,26-Dihydroxyecdysone (25R et 0,54 0,81 0,68 25S) TurkestÃ©rone 0,38 0,03 0,01 2-DÃ©soxy-20,26-hydroxyecdysone 0,37 0,27 0,18 InokostÃ©rone 0,27 0,30 0,32 14-DÃ©soxy-20-Hydroxyecdysone 0,19 0,24 0,17 StachystÃ©rone B - 0,16 0,06 Autres phytoecdysones 2,23 0,73 0,16 On notera qu'Ã l'issue de l'ensemble des Ã©tapes du procÃ©dÃ© de purification, certaines phytoecdysones ont Ã©tÃ© Ã©liminÃ©es. De plus, un composÃ© nouveau est apparu : la stachystÃ©rone B. Ce dernier correspond Ã un produit de dÃ©shydratation 5 issu de la perte de l'hydroxyle tertiaire en position 14 de la 20E. Ce composÃ© est en partie Ã©liminÃ© lors de la purification, et aucun autre produit nouveau n'apparaÃ®t lors du procÃ©dÃ©. En ce qui concerne les quatre molÃ©cules Ã©liminÃ©es, il s'agit de molÃ©cules issues d'une coupure de la chaÃ®ne latÃ©rale de la 20E et qui sont donc des molÃ©cules 10 Ã 21C (poststÃ©rone) ou 19C (rubrostÃ©rone, dihydrorubrostÃ©rone). A la diffÃ©rence de la 20E, ces molÃ©cules sont susceptibles d'interagir avec les rÃ©cepteurs nuclÃ©aires des androgÃ¨nes ou des oestrogÃ¨nes (Lapenna et al., 2015) et il est donc primordial de les Ã©liminer afin d'Ã©viter tout risque d'interfÃ©rence voire d'effets indÃ©sirables du produit fini. Ce point est d'autant plus important que ces molÃ©cules, de polaritÃ© 15 rÃ©duite par rapport Ã la 20E, ont une biodisponibilitÃ© trÃ¨s supÃ©rieure Ã cette derniÃ¨re et sont donc proportionnellement beaucoup mieux (de l'ordre de vingt fois mieux) biodisponibles. 3. CaractÃ©risation de la BI0101 Le tableau 2 ci-dessous prÃ©sente la caractÃ©risation de l'extrait obtenu 20 ci-dessus. 3065644 7 Tableau 2 Attribut MÃ©thode SpÃ©cification Ph. Eur. 5.14 - 103 CFU/g - 102 CFU/g Absence / 1g TAMC TYMC Escherichia coli CaractÃ©ristiques Aspect Visuelle Poudre blanche Ph. Eur. SolubilitÃ© Dans l'Ã©thanol Dans l'eau pure Dans le DMSO TrÃ¨s soluble LÃ©gÃ¨rement soluble TrÃ¨s soluble Identification 20-hydroxyecdysone (temps de rÃ©tention en HPLC) Temps de rÃ©tention identique Ã celui d'un composÃ© de rÃ©fÃ©rence HPLC 20-hydroxyecdysone (spectre IR) Identique Ã rÃ©fÃ©rence Ph. Eur. 2.2.24 Tests Teneur en eau (% w/w) Ph. Eur. 2.5.12 0,5% Cendres sulfuriques Ph. Eur. 2.4.14 ) Identification TLC Conformed Chemical Items: Extract Ratio/Active Beta ecdysterone 90% Min 91.67% Ingredients: HPLC Loss on Drying 5.0% Max 4.10% (Eur.Ph.6.0 ) Sulphated Ash 1.0% Max 0.20% (Eur.Ph.7.0 ) Residual Solvent 50ppm MaxUSP34 Conformed Residual Pesticides 10ppb Max Conformed (PCNB,DDT,BHC) Heavy Metals 10ppm Max (CP2010) Conformed Arsenic (As) 2ppm Max (ICP-MS) Conformed Lead (Pb) 2ppm Max (ICP-MS) Conformed Cadmium (Cd) lppm Max (ICP-MS) Conformed Mercury (Hg) 0.1ppm Max (ICP-MS) Conformed GMO Status GMO Free Conformed BSE/TSE Status BSE/TSE Free Conformed Preservative status Preservative Free Conformed lrradiated Status Non-irradiated Conformed Pesticides Negative Conformed Carrier Used or Excipients None Conformed Added Sterilization method High Temperature & Conformed Pressure Microbiolody Control Total Plate Count 10,000cfu/g (USP) Conformed Total Yeast & Mold 1,000cfu/g (USP) Conformed E.Coli Negative (USP) Conformed Salmonella Negative (USP) Conformed Staphylococcus Negative (USP) Conformed The product could be used for human consumption. Packaging: 25kg/Drum Storage Store in a cool dry area. Do not freeze. Keep away from strong direct light. Shelf Life 2 Years when properly stored. REVENDICATIONS1. Extrait de plante ou d'une partie de plante, ladite plante Ã©tant choisie parmi les vÃ©gÃ©taux contenant au moins 0,5% de 20-hydroxyecdysone, en poids sec dudit vÃ©gÃ©tal, caractÃ©risÃ© en ce que ledit extrait comporte au moins 95%, et de prÃ©fÃ©rence au moins 97%, de 20-hydroxyecdysone. 2. Extrait selon la revendication 1, caractÃ©risÃ© en ce qu'il comporte entre 0 et 0,05 %, en poids sec de l'extrait, d'impuretÃ©s susceptibles d'affecter l'innocuitÃ©, la disponibilitÃ© ou l'efficacitÃ© d'une application pharmaceutique dudit extrait. 3. Extrait selon la revendication 2, caractÃ©risÃ© en ce que les impuretÃ©s sont des phytoecdysones Ã 19 ou 21 atomes de carbone, comme la RubrostÃ©rone, la DihydrorubrostÃ©rone ou la PoststÃ©rone. 4. Extrait selon l'une quelconques des revendications prÃ©cÃ©dentes, caractÃ©risÃ© en ce que la plante est choisie parmi Stemmacantha carthamoides, Cyanotis arachnoidea et Cyanotis vaga. 5. Extrait de racines de Stemmacantha carthamoides comportant au moins 95%, et de prÃ©fÃ©rence au moins 97%, de 20-hydroxyecdysone. 6. Extrait selon l'une quelconque des revendications prÃ©cÃ©dentes, pour son utilisation dans le traitement d'affections musculaires ou cardio-mÃ©taboliques. 7. Extrait de racines de Stemmacantha carthamoides comportant au moins 95%, et de prÃ©fÃ©rence au moins 97%, de 20-hydroxyecdysone pour son utilisation dans le traitement et/ou la prÃ©vention de la sarcopÃ©nie. 8. Extrait de racines de Stemmacantha carthamoides comportant au moins 95%, et de prÃ©fÃ©rence au moins 97%, de 20-hydroxyecdysone pour son utilisation dans le traitement et/ou la prÃ©vention de dystrophies musculaires en particulier d'origine gÃ©nÃ©tique. 9. Extrait de racines de Stemmacantha carthamoides comportant au moins 95%, et de prÃ©fÃ©rence au moins 97%, de 20-hydroxyecdysone pour son utilisation dans le traitement et/ou la prÃ©vention de la perte de masse et de fonction musculaire suite Ã une immobilisation, notamment dans un contexte post chirurgical. 10. Composition caractÃ©risÃ©e en ce qu'elle comprend Ã titre d'agent actif un extrait selon l'une quelconque des revendications 1 Ã 5. 3065644 16 11: ProcÃ©dÃ© de prÃ©paration d'un extrait selon l'une quelconque des revendications 1 Ã 5, Ã partir d'une prÃ©paration de 20-hydroxyecdysone pure Ã de l'ordre de 90%, caractÃ©risÃ© en ce qu'il comprend les Ã©tapes suivantes : a) Dissolution Ã chaud de 20-hydroxyecdysone pure Ã de l'ordre de 90% 5 dans du mÃ©thanol, filtration et concentration partielle, b) Ajout de 3 volumes d'acÃ©tone, c) Refroidissement Ã une tempÃ©rature comprise entre 0 et 5Â°C sous agitation, d) Filtration du prÃ©cipitÃ© obtenu, 10 e) RinÃ§ages successifs avec de l'acÃ©tone et de l'eau, et f) SÃ©chage. 12. ProcÃ©dÃ© selon la revendication prÃ©cÃ©dente, caractÃ©risÃ© en ce que la filtration de l'Ã©tape a) est rÃ©alisÃ©e grÃ¢ce Ã un filtre Ã particules de 0,2 pm, en ce que la concentration partielle de l'Ã©tape a) est effectuÃ©e par distillation sous vide, Ã 15 une tempÃ©rature de l'ordre de 50Â°C, en prÃ©sence de Me0H, et en ce que l'Ã©tape f) de sÃ©chage est effectuÃ©e sous vide Ã une tempÃ©rature de l'ordre de 50Â°C.