Brevet FR3071511A1 — publié le 20190329

Signatures moléculaires du vieillissement de fibroblastes dermiques et équivalent de derme comprenant ces fibroblastes âgés La présente invention concerne l'identification de fibroblastes dermiques âgés. On cherche à mettre au point, depuis plusieurs années, des modèles de peau reconstruite qui permettent d'effectuer les études nécessaires à la meilleure compréhension du rôle de la peau tant dans le domaine mécanique que dans le domaine physiologique. Ainsi, des modèles plus ou moins proches de la peau humaine ont pu être mis au point. De manière très générale, les modèles de peau reconstruite décrits jusqu'à présent comprennent des kératinocytes humains associées ou non à d'autres cellules de la peau comme les mélanocytes et/ou les cellules de Langerhans, déposés sur un support, souvent un équivalent de derme, et cultivés dans des conditions telles qu'ils entrent dans un programme de différenciation aboutissant à la formation d'un équivalent d'épiderme. Parmi les équivalents de derme décrits jusqu'à présent, on trouve en particulier des lattices mixtes collagène/fibroblastes, les fibroblastes utilisés provenant généralement initialement de tout type de donneur sans distinction d'âge. La peau a des fonctions importantes en cours de la vie. En particulier, elle a un rôle de barrière anatomique contre les pathogènes et les dommages. Lorsque la peau vieillit, elle devient plus fine et plus facilement endommageable. Le processus de vieillissement de la peau est gouverné par des changements dans les compartiments épidermique, dermo-épidermique et dermique. Distribués de manière éparse, les fibroblastes dermiques (papillaires et réticulaires) sont considérés comme étant responsables de la synthèse des trois groupes majeurs de protéines de la matrice extracellulaire dermique et cet assemblage de matrice extracellulaire, via un remodelage aberrant, influe la fonction changeante de la peau âgée. La peau âgée est caractérisée par un aplatissement de la jonction dermoépidermique, une atrophie marquée et une perte d'élasticité du tissu conjonctif dermique, associée à une réduction et une désorganisation des composants principaux de la matrice extracellulaire, tels que le collagène et d'autres fibres élastiques, les protéoglycanes et les glycosaminoglycanes. Ces changements dans la matrice extracellulaire dermique seraient associés à des changements dans les propriétés de fibroblastes dermiques. Au vu de l'importance du rôle des composants du derme dans le vieillissement cutané, il existe donc un besoin important d'équivalents de derme in vitro reflétant le plus possible les caractéristiques d'un derme d'une peau âgée. 2 Faisant l'hypothèse que les fibroblastes papillaires dermiques se différenciaient en fibroblastes réticulaires dermiques au cours du vieillissement, les auteurs de Janson et al. (2013) Exp. Dermatol. 22:48-53 ont cherché à mimer ce processus de différenciation par la mise en oeuvre d'une culture à long terme (méthode dite de sénescence réplicative). 5 Des peaux reconstruites ont ensuite été produites en utilisant comme fibroblastes des fibroblastes papillaires obtenus avant et après sénescence réplicative et des fibroblastes réticulaires. Dans Mancini et al. (2012) Aging 4:843-853, les auteurs ont utilisé la sénescence réplicative après culture prolongée pour modéliser le vieillissement des fibroblastes 10 dermiques. Ils ont montré une corrélation entre l'entrée en sénescence des fibroblastes et la surexpression de 2 micro-ARN : miR 152 et miR 181a, qui pourraient cibler l'intégrine 152 et la collagène de type XVI. Il a ainsi été proposé dans la demande européenne EP 2 703 498 de mettre en oeuvre une méthode de criblage de composés à visée anti-âge comprenant la mise en 15 contact de composés candidats avec un échantillon de fibroblastes, la mesure de l'expression ou de l'activité du micro-ARN 152 et la sélection du composé candidat comme étant un composé anti-âge lorsque l'inhibition mesurée est d'au moins 20% par rapport à des fibroblastes non traités. Toutefois, l'ensemble de ces méthodes est basé sur une modélisation du 20 vieillissement cutané basée sur la sénescence réplicative après culture prolongée de fibroblastes. Or, la fidélité d'une telle modélisation reste sujette à discussion (Rubin (2002) Arch. Gerontol. Geriatr. 34 :275-286). Il existe donc toujours un besoin important d'équivalents de derme in vitro comprennent des fibroblastes présentant les caractéristiques de fibroblastes âgés in situ. 25 La présente invention répond à ce besoin. Les inventeurs ont en effet identifié, à partir d'échantillons de peau provenant de donneurs spécifiquement jeunes ou âgées, des signatures moléculaires, impliquant un nombre réduit de biomarqueurs, permettant d'identifier et de distinguer des fibroblastes âgés de fibroblastes jeunes, tant parmi les fibroblastes papillaires que parmi les 30 fibroblastes réticulaires. Les présents inventeurs ont en effet montré que les fibroblastes papillaires âgés et les fibroblastes réticulaires âgés pouvaient être identifiés en mesurant le niveau d'expression d'au moins un gène choisi parmi les gènes ACAN, PSG1, et éventuellement UCP2, SFRP2, COL11A1 et KANK4. 35 Ainsi, les niveaux des produits d'expression des gènes UCP2 et SFRP2 sont significativement moins élevés et les niveaux des produits d'expression des gènes PSG1, 3 COL11A1, ACAN et KANK4 sont significativement plus élevés dans les fibroblastes papillaires provenant de donneurs âgés, tandis que les niveaux des produits d'expression des gènes ACAN et PSG1 sont significativement plus élevés dans les fibroblastes réticulaires provenant de donneurs âgés. 5 La présente invention concerne ainsi une méthode in vitro d'identification d'un fibroblaste dermique comme étant un fibroblaste dermique jeune ou âgé, comprenant les étapes suivantes : a) fournir un échantillon biologique comprenant au moins un fibroblaste dermique, b) mesurer le niveau d'un produit d'expression d'au moins un gène choisi dans le 10 groupe constitué des gènes ACAN, PSG1, et éventuellement UCP2, SFRP2, COL11A1 et KANK4, et c) sur la base du ou des niveau(x) mesuré(s) à l'étape b), identifier le fibroblaste dermique comme étant un fibroblaste dermique jeune ou âgé. La présente invention concerne également l'utilisation d'un produit d'expression 15 d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué des gènes ACAN, PSG1, et éventuellement UCP2, SFRP2, COL11A1 et KANK4, comme marqueur pour identifier in vitro un fibroblaste dermique comme étant un fibroblaste dermique jeune ou âgé. En sélectionnant spécifiquement ces fibroblastes papillaires et réticulaires âgés identifiés sur la base des biomarqueurs ci-dessus, les inventeurs ont en outre pu préparer 20 un équivalent de derme âgé in vitro ne mettant en oeuvre que des fibroblastes papillaires et réticulaires identifiés comme étant âgés. Un autre objet de l'invention concerne ainsi un équivalent de derme âgé in vitro comprenant : (i) une sous-population de fibroblastes papillaires dans lesquels 25 - le niveau d'un produit d'expression du gène UCP2 est diminué par rapport à un niveau contrôle, - le niveau d'un produit d'expression du gène PSG1 est augmenté par rapport à un niveau contrôle, - le niveau d'un produit d'expression du gène SFRP2 est diminué par 30 rapport à un niveau contrôle, - le niveau d'un produit d'expression du gène COL11A1 est augmenté par rapport à un niveau contrôle, - le niveau d'un produit d'expression du gène ACAN est augmenté par rapport à un niveau contrôle, et/ou 35 - le niveau d'un produit d'expression du gène KANK4 est augmenté par rapport à un niveau contrôle, 4 et/ou (ii) une sous-population de fibroblastes réticulaires dans lesquels - le niveau d'un produit d'expression du gène ACAN est augmenté par rapport à un niveau contrôle, et/ou 5 - le niveau d'un produit d'expression du gène PSG1 est augmenté par rapport à un niveau contrôle. La présente invention concerne également un équivalent de peau in vitro comprenant un équivalent de derme selon l'invention. Un autre objet de l'invention concerne un kit pour identifier un fibroblaste dermique 10 comme étant un fibroblaste jeune ou âgé, ledit kit comprenant au moins un moyen de mesure choisi dans le groupe constitué d'un moyen de mesure du niveau d'un produit d'expression du gène ACAN, un moyen de mesure du niveau d'un produit d'expression du gène PSG1, et éventuellement un moyen de mesure du niveau d'un produit d'expression du gène UCP2, un moyen de mesure du niveau d'un produit d'expression du gène 15 SFRP2, un moyen de mesure du niveau d'un produit d'expression du gène COL11A1 et un moyen de mesure du niveau d'un produit d'expression du gène KANK4. La présente invention concerne également une puce à ADN pour identifier un fibroblaste dermique comme étant un fibroblaste jeune ou âgé, ladite puce comprenant au moins une sonde choisie dans le groupe constitué d'une sonde détectant un produit 20 d'expression du gène ACAN, une sonde détectant un produit d'expression du gène PSG1, et éventuellement une sonde détectant un produit d'expression du gène UCP2, une sonde détectant un produit d'expression du gène SFRP2, une sonde détectant un produit d'expression du gène COL11A1 et une sonde détectant un produit d'expression du gène KAN K4. 25 Description détaillée de l'invention Fibroblastes Par "fibroblaste dermique", on entend ici tout fibroblaste provenant du derme. 30 Par "fibroblaste papillaire", on entend ici un fibroblaste du derme papillaire, le derme papillaire étant caractérisé par une matrice extracellulaire relativement fine et une forte densité cellulaire. Les fibroblastes papillaires en culture ont typiquement une morphologie mince et fusiforme. Par "fibroblaste réticulaire", on entend ici un fibroblaste du derme réticulaire, le 35 derme réticulaire étant caractérisé par un réseau très dense de fibres matricielles et une 5 faible densité cellulaire. Les fibroblastes réticulaires en culture ont typiquement une apparence étendue et plus carrée. Par "fibroblaste de même type", on entend ici un fibroblaste de la même partie du derme (papillaire ou réticulaire) et présentant une morphologie cellulaire semblable 5 (papillaire ou réticulaire). Par "fibroblaste dermique âgé", on entend ici un fibroblaste présentant des caractéristiques similaires à un fibroblaste dermique de même type provenant d'un donneur de plus de 50 ans, en particulier de plus de 55 ans, plus de 60 ans ou plus de 65 ans. 10 Par "fibroblaste dermique jeune", on entend ici un fibroblaste présentant des caractéristiques similaires à un fibroblaste dermique de même type provenant d'un donneur de moins de 30 ans, en particulier moins de 28 ans, moins de 25 ans ou moins de 22 ans. 15 Méthode d'identification L'étape (a) de la méthode d'identification selon l'invention comprend la fourniture d'un échantillon biologique comprenant au moins un fibroblaste dermique, tel que défini dans la section "Fibroblastes" ci-dessus. L'échantillon biologique peut en particulier être une culture in vitro de fibroblastes 20 dermiques ou d'un mélange de fibroblastes dermiques, un échantillon provenant d'une biopsie de peau, ou un échantillon provenant d'un équivalent de derme ou de peau in vitro. L'étape (b) de la méthode d'identification selon l'invention comprenant la mesure du niveau d'un produit d'expression d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué 25 des gènes ACAN, PSG1, et éventuellement UCP2, SFRP2, COL11A1 et KANK4. Par "gène ACAN", on entend ici le gène codant l'" aggrecan core protein". Le gène ACAN est aussi appelé gène AGC1, CSPG1 et MSK16 et la protéine ACAN est aussi appelée "aggrecan" ou "cartilage-specific proteoglycan core protein" ou CSPCP ou "chondroitin sulfate proteoglycan core protein 1" ou "chondroitin sulfate proteoglycan 1". 30 Elle fait partie de la matrice extracellulaire dans le tissu cartilagineux. Il s'agit d'un protéoglycane. Elle est typiquement décrite dans Doege et al. (1991) J. Biol. Chem. 15:894-902. La séquence de la protéine ACAN humaine est typiquement référencée sous le numéro UniProt P16112. Par "gène PSG1", on entend ici le gène codant la glycoprotéine 81 spécifique de la 35 grossesse 1 ("pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 1"). Le gène PSG1 est aussi appelé gène B1G1, gène PSBG1 ou gène PSGGA et la protéine PSG1 est aussi appelée 6 protéine PS-beta-G-1, PSBG-1, glycoprotéine 1 spécifique de la protéine ("pregnancyspecific glycoprotein 1"), "CD66 antigen-like family member F', antigène 1/2 non-spécifique du foie fétal ("fetal liver non-specific cross-reactive antigen 1/2'), protéine FLNCA-1/2, protéine PSG95, glycoprotéine 131 C/D spécifique de la grossesse ("pregnancy- 5 specific beta-1 glycoprotein C/D"), protéine PS-beta-C/D ou CD66f. Elle fonctionne principalement comme immuno-modulateur pour protéger le foetus en développement. Elle est typiquement décrite dans Watanabe et aL (1988) J. BioL Chem 263:2049-2054. La séquence de la protéine PSG1 humaine est typiquement référencée sous le numéro UniProt P11464. 10 Par "gène UCP2", on entend ici le gène codant la "mitochondrial uncoupling protein 2'. Le gène UCP2 est aussi appelé gène SLC25A8 et la protéine UCP2 est aussi appelée UCPH ou "solute carrier family 25 member 8'. Elle appartient à la famille des protéines support anionique mitochondriales (MACP) et contrôle les espèces d'oxygène réactives dérivées des mitochondries. Elle est typiquement décrite dans Pecqueur et aL 15 (1999) Biochemical and Biophysical Research Communications 255:40-46. La séquence de la protéine UCP2 humaine est typiquement référencée sous le numéro UniProt P55851. Par "gène SFRP2", on entend ici le gène codant la "secreted frizzled-related protein 2'. Le gène SFRP2 est aussi appelé gène FRP2 ou gène SARP1 et la protéine 20 SFRP2 est aussi appelée FRP-2, protéine liée à l'apoptose sécrétée 1 ("secreted apoptosis-related protein 1") ou protéine SARP-1. Elle agit comme modulateur soluble de la voie de signalisation SFRP. Elle est typiquement décrite dans Melkonyan et aL (1997) Proc. Natl. Acad. Science USA 94:13636-13641. La séquence de la protéine SFRP2 humaine est typiquement référencée sous le numéro UniProt Q96HF1. 25 Par "gène COL11A1", on entend ici le gène codant la chaîne al (XI) du collagène. Le gène COL11A1 est aussi appelé gène COLLE. Cette chaine est une des deux chaines alpha du collagène de type XI, un collagène fibrillaire mineur. Elle est typiquement décrite dans Yoshioka et aL (1990) J. BioL Chem. 15:6423-6426. La séquence de la protéine COL11A1 humaine est typiquement référencée sous le numéro UniProt P12107. 30 Par "gène KANK4", on entend ici le gène codant la "KN motif and ankyrin repeat domain-containing protein 4" (KANK4). Le gène KANK4 est aussi appelé gène ANKRD38 et la protéine KANK4 est aussi appelée "ankyrin repeat domain-containing protein 38'. Elle serait impliquée dans le contrôle de la formation du cytosquelette en régulant la polymérisation d'actine. Elle est typiquement décrite dans Zhu et aL (2008) Biochemical 35 Biophysica Acta 1780:128-133. La séquence de la protéine KANK4 humaine est typiquement référencée sous le numéro UniProt Q5T7N3. 7 Dans le contexte de l'invention, les références UniProt citées ci-dessus sont celles qui étaient disponibles au 31 juillet 2017. Dans un mode de réalisation particulier, l'étape (b) comprend la mesure du niveau d'un produit d'expression d'au moins deux gènes choisis dans le groupe constitué des 5 gènes ACAN, PSG1, et éventuellement UCP2, SFRP2, COL11A1 et KANK4, de préférence d'au moins 3, 4, 5 ou 6 gènes choisis dans le groupe constitué des gènes ACAN, PSG1, UCP2, SFRP2, COL11A1 et KANK4. Dans un mode de réalisation particulier, en particulier lorsque le fibroblaste dermique est un fibroblaste réticulaire, l'étape (b) comprend la mesure du niveau d'un 10 produit d'expression d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué des gènes ACAN et PSG1, de préférence la mesure du niveau des produits d'expression des gènes ACAN et PSG1. Dans un autre mode de réalisation particulier, en particulier lorsque le fibroblaste dermique est un fibroblaste papillaire, l'étape (b) comprend la mesure du niveau d'un produit d'expression d'au moins un gène, de préférence, au moins deux, en 15 particulier au moins 3, 4 ou 5 gènes, choisi dans le groupe constitué des gènes ACAN, PSG1, UCP2, SFRP2, COL11A1 et KANK4, de préférence la mesure du niveau des produits d'expression des gènes ACAN, PSG1, UCP2, SFRP2, COL11A1 et KANK4. Par "produit d'expression du gène X", on entend ici l'ARNm codé par ledit gène X ou la protéine codée par ledit gène X. Le niveau du produit d'expression du gène X peut 20 donc être mesuré en quantifiant l'ARNm ou la protéine correspondant(e). Dans un mode de réalisation particulier, ledit produit d'expression du gène X est l'ARNm codé par ledit gène X. De préférence, le niveau du produit d'expression correspond à la concentration ou la quantité du produit d'expression. 25 Le niveau du produit d'expression d'un gène X peut être mesuré à l'étape (b) par toute technique bien connue de l'homme du métier. En particulier, lorsque le produit d'expression est une protéine, le niveau du produit d'expression peut être mesuré au moyens de dosages immunologiques tels que des dosages ELISA, des dosages immunofluorescents (IFA), des dosages radio-immunologiques (RIA), des tests de liaison 30 compétitive ou des Western Blot. Lorsque le produit d'expression est un ARNm, le niveau du produit d'expression peut être mesuré par RT-PCR, qRT-PCR, ddPCR (Droplet Digital PCR), par séquençage, par exemple par séquençage de type NGS (Next generation sequencing) ou par séquençage par ddSEQTM single cell isolator. L'étape (c) de la méthode d'identification selon l'invention comprend l'identification, 35 sur la base du ou des niveau(x) mesuré(s) à l'étape b), du fibroblaste dermique comme étant un fibroblaste dermique jeune ou âgé. 8 Dans un mode de réalisation particulier, l'étape (c) de la méthode d'identification selon l'invention comprend la comparaison du ou des niveau(x) mesuré(s) à l'étape b) à un ou des niveau(x) contrôle. Par "niveau contrôle", on entend ici une valeur de référence correspondant de 5 préférence au niveau dudit produit d'expression dudit gène dans un fibroblaste dermique du même type (tel que défini à la section "Fibroblastes" ci-dessus), connu comme étant un fibroblaste dermique jeune, en particulier un fibroblaste dermique du même type provenant d'un sujet de moins de 30 ans, en particulier de 28 ans, de moins de 25 ans ou de moins de 22 ans. En particulier, lorsque le fibroblaste dermique étudié est un 10 fibroblaste papillaire, le niveau contrôle est de préférence le niveau dudit produit d'expression dudit gène dans un fibroblaste papillaire connu comme étant un fibroblaste papillaire jeune, en particulier un fibroblaste papillaire provenant d'un sujet de moins de 30 ans, en particulier de 28 ans, de moins de 25 ans ou de moins 22 ans. Lorsque le fibroblaste dermique étudié est un fibroblaste réticulaire, le niveau contrôle est de 15 préférence le niveau dudit produit d'expression dudit gène dans un fibroblaste réticulaire connu comme étant un fibroblaste réticulaire jeune, en particulier un fibroblaste réticulaire provenant d'un sujet de moins de 30 ans, en particulier de 28 ans, de moins de 25 ans ou de moins de 22 ans. Dans un mode de réalisation particulier, lorsque le fibroblaste dermique est un 20 fibroblaste papillaire, le niveau d'un produit d'expression d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué des gènes UCP2, PSG1, SFRP2, COL11A1, ACAN et KANK4 est de préférence mesuré à l'étape b), et le fibroblaste papillaire est identifié comme étant un fibroblaste papillaire âgé quand : (i) le niveau d'un produit d'expression du gène UCP2 est diminué par rapport à un 25 niveau contrôle, (ii) le niveau d'un produit d'expression du gène PSG1 est augmenté par rapport à un niveau contrôle, (iii) le niveau d'un produit d'expression du gène SFRP2 est diminué par rapport à un niveau contrôle, 30 (iv) le niveau d'un produit d'expression du gène COL11A1 est augmenté par rapport à un niveau contrôle, (v) le niveau d'un produit d'expression du gène ACAN est augmenté par rapport à un niveau contrôle, et/ou (vi) le niveau d'un produit d'expression du gène KANK4 est augmenté par rapport 35 à un niveau contrôle, 9 les niveaux contrôle de (i), (ii), (iii), (iv), (v) et (vi) étant de préférence respectivement le niveau du produit d'expression des gènes UCP2, PSG1, SFRP2, COLI 1A1, ACAN et KANK4 dans un fibroblaste papillaire connu comme étant un fibroblaste papillaire jeune. Dans un autre mode de réalisation particulier, lorsque le fibroblaste dermique est 5 un fibroblaste réticulaire, le niveau d'un produit d'expression d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué des gènes ACAN et PSG1 est de préférence mesuré à l'étape b), et le fibroblaste réticulaire est identifié comme étant un fibroblaste réticulaire âgé quand : (i) le niveau d'un produit d'expression du gène ACAN est augmenté par rapport à 10 un niveau contrôle, et/ou (ii) le niveau d'un produit d'expression du gène PSG1 est augmenté par rapport à un niveau contrôle, les niveaux contrôle de (i) et (ii) étant de préférence respectivement le niveau du produit d'expression des gènes ACAN et PSG1 dans un fibroblaste réticulaire connu comme 15 étant un fibroblaste réticulaire jeune. Par "niveau augmenté", on entend ici un niveau statistiquement significativement augmenté par rapport au niveau contrôle. De préférence, le niveau augmenté est augmenté d'au moins 1,3 fois, d'au moins 1,38 fois, d'au moins 1,4 fois, d'au moins 1,5 fois, d'au moins 1,59 fois, d'au moins 1,6 fois, d'au moins 1,7 fois, d'au moins 1,73 fois, 20 d'au moins 2 fois, d'au moins 2,5 fois, d'au moins 2,9 fois, d'au moins 2,92 fois, d'au moins 5 fois, d'au moins 10 fois, d'au moins 10,9 fois, d'au moins 15 fois, d'au moins 20 fois, d'au moins 21 fois, d'au moins 21,5 fois ou d'au moins 21,56 fois par rapport au niveau contrôle tel que défini ci-dessus. De préférence, le fibroblaste papillaire est identifié comme étant un fibroblaste 25 papillaire âgé quand : (ii) le niveau d'un produit d'expression du gène PSG1 est augmenté d'au moins 20 fois, en particulier d'au moins 21 fois, d'au moins 21,5 fois ou d'au moins 21,56 fois par rapport à un niveau contrôle tel que défini ci-dessus, (iv) le niveau d'un produit d'expression du gène COLI 1A1 est augmenté d'au 30 moins 1,4 fois, en particulier d'au moins 1,5 fois ou d'au moins 1,59 fois par rapport à un niveau contrôle tel que défini ci-dessus, (v) le niveau d'un produit d'expression du gène ACAN est augmenté d'au moins 1,3 fois, en particulier d'au moins 1,38 fois par rapport à un niveau contrôle tel que défini ci-dessus, et/ou 10 (vi) le niveau d'un produit d'expression du gène KANK4 est augmenté d'au moins 1,6 fois, en particulier d'au moins 1,7 fois ou d'au moins 1,73 fois par rapport à un niveau contrôle tel que défini ci-dessus. De préférence, le fibroblaste réticulaire est identifié comme étant un fibroblaste 5 réticulaire âgé quand : (i) le niveau d'un produit d'expression du gène ACAN est augmenté d'au moins 2,5 fois, en particulier d'au moins 2,9 fois ou d'au moins 2,92 fois par rapport à un niveau contrôle tel que défini ci-dessus, et/ou (ii) le niveau d'un produit d'expression du gène PSG1 est augmenté d'au moins 10 10 fois, en particulier au moins 10,5 fois ou d'au moins 10,9 fois par rapport à un niveau contrôle tel que défini ci-dessus. Par "niveau diminué", on entend ici un niveau statistiquement significativement diminué par rapport au contrôle. De préférence, le niveau diminué est diminué d'au moins 2 fois, d'au moins 2,5 fois, d'au moins 2,51 fois, d'au moins 3 fois, d'au moins 4 fois, d'au 15 moins 4,2 fois ou d'au moins 4,23 fois par rapport au niveau contrôle tel que défini ci- dessus. De préférence, le fibroblaste papillaire est identifié comme étant un fibroblaste papillaire âgé quand : (i) le niveau d'un produit d'expression du gène UCP2 est diminué d'au moins 2 20 fois, en particulier d'au moins 2,5 fois ou d'au moins 2,51 fois par rapport à un niveau contrôle tel que défini ci-dessus, et/ou (iii) le niveau d'un produit d'expression du gène SFRP2 est diminué d'au moins 3 fois, en particulier d'au moins 4 fois, d'au moins 4,2 fois ou d'au moins 4,23 fois par rapport à un niveau contrôle tel que défini ci-dessus. 25 La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un produit d'expression, tel que défini ci-dessus, d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué des gènes ACAN, PSG1, et éventuellement UCP2, SFRP2, COL11A1 et KANK4, comme marqueur pour identifier in vitro un fibroblaste dermique, tel que défini à la section "Fibroblastes" ci- 30 dessus comme étant un fibroblaste dermique jeune ou âgé. Equivalents de derme et de peau Grâce à la méthode d'identification décrite ci-dessus, les inventeurs ont pu préparer pour la première fois un équivalent de derme âgé in vitro à partir de fibroblastes 35 dermiques exclusivement âgés, présentant les mêmes caractéristiques que les fibroblastes dermiques obtenus à partir de donneurs âgés. 11 La présente invention a ainsi pour objet un équivalent de derme âgé in vitro comprenant : (i) une sous-population de fibroblastes papillaires, tels que définis à la section "Fibroblastes" ci-dessus, dans lesquels 5 - le niveau d'un produit d'expression du gène UCP2 est diminué par rapport à un niveau contrôle, - le niveau d'un produit d'expression du gène PSG1 est augmenté par rapport à un niveau contrôle, - le niveau d'un produit d'expression du gène SFRP2 est diminué par 10 rapport à un niveau contrôle, - le niveau d'un produit d'expression du gène COL11A1 est augmenté par rapport à un niveau contrôle, - le niveau d'un produit d'expression du gène ACAN est augmenté par rapport à un niveau contrôle, et/ou 15 - le niveau d'un produit d'expression du gène KANK4 est augmenté par rapport à un niveau contrôle, et/ou (ii) une sous-population de fibroblastes réticulaires, tels que définis dans la section "Fibroblastes" ci-dessus dans lesquels 20 - le niveau d'un produit d'expression du gène ACAN est augmenté par rapport à un niveau contrôle, et/ou - le niveau d'un produit d'expression du gène PSG1 est augmenté par rapport à un niveau contrôle. Les termes "produit d'expression", "augmenté", "diminué" et "niveau contrôle" ont 25 ici les mêmes définitions que celles fournies à la section "Méthode d'identification" ci- dessus. L'équivalent de derme selon l'invention comprend de préférence en outre du collagène. Le collagène présent dans l'équivalent de derme selon l'invention peut être tout 30 type de collagène de toute origine. De préférence, le collagène est choisi parmi les collagènes fibrillaires de type I, III ou V. De préférence, le collagène est du collagène de type I. De préférence, le collagène est d'origine animale, en particulier d'origine bovine. De manière particulièrement préférée, le collagène est du collagène bovin de type I. Alternativement, le collagène peut être un mélange de collagène de différents types en 35 toute proportion et/ou de différentes origines. 12 Les fibroblastes présents dans l'équivalent de derme selon l'invention peuvent provenir de toute origine, mais sont de préférence des fibroblastes d'origine humaine. Les fibroblastes présents dans l'équivalent de derme selon l'invention proviennent de préférence d'une culture de fibroblastes dont une partie a été utilisée pour mettre en 5 oeuvre la méthode d'identification selon l'invention, permettant ainsi d'identifier l'ensemble de la culture comme étant une culture de fibroblastes âgés. L'équivalent de derme selon l'invention peut également contenir tout autre composant pouvant être présent constitutivement dans la peau comme des cellules endothéliales, des macrophages, des monocytes, des précurseurs de macrophages, des 10 précurseurs de cellules dendritiques ou des cellules nerveuses. La présente invention concerne également un procédé de préparation d'un équivalent de derme tel que défini ci-dessus comprenant une étape initiale d'identification de fibroblastes dermiques comme étant des fibroblastes dermiques âgés, comprenant les 15 étapes suivantes : A) la fourniture d'une culture homogène de fibroblastes dermiques, B) le prélèvement d'une partie de la culture de fibroblastes dermiques fournie à l'étape A), C) l'identification de la partie de la culture de fibroblastes dermiques prélevée à 20 l'étape B) comme étant une culture de fibroblastes dermiques âgés en mettant en oeuvre la méthode d'identification telle que définie à la section "Méthode d'identification" ci-dessus, et D) l'utilisation de la partie de la culture de fibroblastes dermiques non prélevée à l'étape B) pour préparer un équivalent de derme. 25 La préparation de l'équivalent de derme à l'étape D) peut être mise en oeuvre par toute technique bien connue de l'homme du métier. La préparation de l'équivalent de derme à l'étape D) peut ainsi comprendre une étape de préparation d'une lattice comprenant du collagène et une suspension cellulaire de fibroblastes dermiques âgés, de préférence de fibroblastes dermiques papillaires et 30 réticulaires âgés, en particulier identifiés comme étant âgés à l'étape C). Comme indiqué précédemment, le collagène utilisé peut être tout type de collagène, de toute origine, seul ou en mélange. De préférence, la lattice comprend des fibroblastes à une concentration de 1 x105 à 5x106 cellules / ml, de préférence à une concentration de 2x105 à 2x106 cellules / ml. 35 La lattice peut être préparée par toute technique bien connue de l'homme du métier. 13 En particulier, une solution comprenant du collagène et les fibroblastes dermiques âgés peut être préparée et déposée sur un support. De préférence, la solution est incubée de manière à permettre la gélification du collagène, par exemple pendant 10 à 30 min, puis maintenue à incuber pour permettre la 5 contraction de la lattice. De préférence, la lattice est ainsi maintenue à incuber pendant 1 à 7 jours, de manière encore préférée pendant 3 ou 4 jours. Dans la mesure où le contenu dermique influence le compartiment épidermique, 10 l'équivalent de derme âgé selon l'invention peut servir de support pour la formation d'un équivalent de peau âgé. La présente invention concerne ainsi également un équivalent de peau in vitro comprenant un équivalent de derme tel que défini ci-dessus. L'équivalent de peau selon l'invention comprend, sur l'équivalent de derme, un 15 équivalent d'épiderme comprenant au moins des kératinocytes. Les kératinocytes peuvent provenir de toute origine mais sont préférentiellement des kératinocytes d'origine humaine. Ils peuvent être préparés par n'importe quelle méthode bien connue de l'homme du métier. Ainsi, les kératinocytes peuvent être préparés par culture d'épiderme dissocié provenant de prélèvement de peau normale ou 20 par culture de kératinocytes issus de la gaine du follicule pileux. De préférence, les kératinocytes sont des kératinocytes de peau humaine normale. De manière encore préférée, les kératinocytes sont préparés à partir d'épiderme humain dissocié provenant de prélèvement de peau humaine normale selon la méthode 25 décrite dans Régnier et al., Frontier of Matrix Biology, Vol. 9, 4-35 (Karger, Basel, 1981). L'équivalent d'épiderme peut comprendre tout autre type cellulaire, tel que des cellules de Langerhans et/ou des précurseurs de cellules de Langerhans et/ou des mélanocytes. De manière avantageuse, l'équivalent d'épiderme comprend en outre des 30 mélanocytes, et/ou des cellules de Langerhans et/ou des précurseurs de cellules de Langerhans. Les mélanocytes peuvent être isolés à partir de tout organe en contenant tel que la peau normale ou le follicule de cheveu. Préférentiellement, les mélanocytes sont isolés à partir de peau normale. Toute méthode de préparation des mélanocytes connue de 35 l'homme du métier peut être utilisée, telle que la méthode décrite dans Olsson et aL (1994) Acta. Derm. Venereol. 74:226-268. 14 Les cellules de Langerhans et/ou les précurseurs de cellules de Langerhans peuvent être tels que décrits dans la demande de brevet européen EP 789074. La présente invention concerne également un procédé de préparation d'un 5 équivalent de peau tel que défini ci-dessus comprenant une étape de préparation d'un équivalent de derme par le procédé de préparation d'équivalent de derme tel que défini ci-dessus. De préférence, le procédé de préparation d'un équivalent de peau comprend, après l'étape de préparation de l'équivalent de derme, une étape de reconstitution, sur 10 l'équivalent de derme, d'un équivalent d'épiderme comprenant au moins des kératinocytes. Cette étape de reconstitution d'un équivalent d'épiderme peut être réalisée par toute technique bien connue de l'homme du métier, telle que les techniques décrites dans les demandes de brevet EP 285471, EP285474, EP789074, EP502172, EP418035, 15 W091/16010, EP197090, EP20753, FR2665175, FR2689904 ou celle décrite dans Asselineau et al. (1985) Exp. Cell. Res. 159:536-539, dans Asselineau et al. (1987), Models in dermato., col III, Ed. Lowe&Mailbach, 1-7 ou dans Asselineau et al. (1984) Br J DermatoL 111 Suppl 27:219-22. Cette étape de reconstitution peut être avantageusement précédée d'une étape de 20 collage, dans une boite de culture, de l'équivalent de derme préparé, par exemple avec une solution de colle comprenant du milieu MEM 1,76X, du SVF, du NaOH 0,1N et du MEM 25 mM Hepes 10% SVF. De préférence, l'étape de reconstitution est mise en oeuvre par ensemencement de kératinocytes sur l'équivalent de derme, de préférence dans un anneau 25 d'ensemencement. Avantageusement, après ensemencement des kératinocytes sur l'équivalent de derme, la culture peut être maintenue immergée dans un milieu nutritif qui peut être par exemple le milieu décrit par Rheinwald et Green (1975) Ce// 6:317-330, milieu qui permet la prolifération des kératinocytes. 30 Après un temps d'incubation de préférence de 3 à 15 jours, de manière davantage préférée de 7 à 9 jours, l'équivalent de peau est de préférence maintenu à l'interface air/liquide par exemple par dépôt sur une grille métallique. Le liquide est alors préférentiellement constitué du même milieu nutritif que précédemment. L'incubation se poursuit alors ensuite de préférence jusqu'à l'obtention d'un 35 équivalent de peau présentant les caractéristiques d'une peau, à savoir un équivalent de 15 derme recouvert d'un équivalent d'épiderme présentant les quatre types de couches cellulaires classiques, à savoir les couches basale, suprabasale, granuleuse et cornée. Ainsi, l'incubation se poursuit de préférence pendant une durée comprise entre 5 et 30 jours, de préférence entre 7 et 10 jours. 5 Utilisations La présente invention concerne également l'utilisation d'un équivalent de derme tel que défini à la section "Equivalent de derme et de peau" ci-dessus ou d'un équivalent de peau tel que défini à la section "Equivalent de derme et de peau" ci-dessus, pour étudier 10 le vieillissement de la peau. L'équivalent de derme et/ou l'équivalent de peau selon l'invention sont en particulier utiles pour étudier l'apparition de rides, l'apparition de taches pigmentaires, ou tout autre phénomène associé au vieillissement de la peau, en particulier associé au photovieillissement, plus particulièrement associé à l'effet des rayonnements ultraviolets 15 sur la peau, tel que les kératoses actiniques. La présente invention concerne également un procédé de criblage d'un composé présentant une activité après application topique sur la peau âgée, en particulier dans le domaine de l'anti-âge comme pour le traitement des rides et ridules et/ou le traitement des taches pigmentaires, ledit procédé de criblage comprenant l'application d'un composé 20 candidat sur l'équivalent de derme selon l'invention ou l'équivalent de peau selon l'invention. Kit et puce La présente invention a également pour objet un kit pour identifier un fibroblaste 25 dermique comme étant un fibroblaste jeune ou âgé, ledit kit comprenant au moins un moyen de mesure choisi dans le groupe constitué d'un moyen de mesure du niveau d'un produit d'expression du gène ACAN, un moyen de mesure du niveau d'un produit d'expression du gène PSG1, et éventuellement un moyen de mesure du niveau d'un produit d'expression du gène UCP2, un moyen de mesure du niveau d'un produit 30 d'expression du gène SFRP2, un moyen de mesure du niveau d'un produit d'expression du gène COL11A1 et un moyen de mesure du niveau d'un produit d'expression du gène KAN K4. Le kit peut en particulier comprendre, comme composants séparés, des anticorps reconnaissant les protéines codées par lesdits gènes dans un échantillon biologique tel 35 que défini ci-dessus. Le kit peut comprendre, comme composants séparés, des amorces et/ou sondes s'hybridant spécifiquement aux ARNm codés par lesdits gènes. 16 Le kit peut en outre comprendre des composants additionnels optionnels pour mettre en oeuvre la méthode d'identification selon l'invention. De tels composants optionnels sont par exemple des conteneurs, mélangeurs, tampons, instructions pour mettre en oeuvre la méthode, marqueurs ou supports. 5 Le kit selon l'invention peut en outre comprendre un contrôle ou plusieurs contrôles à partir du(des)quel(s) le niveau contrôle, tel que défini à la section "Méthode d'identification" ci-dessus, peut être obtenu. La présente invention a également pour objet une puce à ADN pour identifier un 10 fibroblaste dermique comme étant un fibroblaste jeune ou âgé, ladite puce comprenant au moins une sonde choisie dans le groupe constitué d'une sonde détectant un produit d'expression du gène ACAN, une sonde détectant un produit d'expression du gène PSG1, et éventuellement une sonde détectant un produit d'expression du gène UCP2, une sonde détectant un produit d'expression du gène SFRP2, une sonde détectant un produit 15 d'expression du gène COL11A1 et une sonde détectant un produit d'expression du gène KANK4. Par "puce à ADN", on entend ici un arrangement ordonné d'au moins deux sondes sur un substrat. De préférence, la puce à ADN selon l'invention comprend en outre une sonde contrôle ou standard. 20 Par "sonde", on entend ici un oligonucléotide ou polynucléotide, ARN ou ADN, qui existe naturellement comme dans un produit de digestion purifié d'une enzyme de restriction ou qui est produit de manière synthétique, et qui est capable de s'hybrider spécifiquement avec un polynucléotide portant une séquence complémentaire de celle de la sonde. La sonde peut être simple brin ou double brin. De préférence, la sonde 25 comprend ou consiste en 10 à 100 nucléotides, de préférence 15 à 50 nucléotides ou 15 à 25 nucléotides. Dans toute la description ci-dessus, sauf mention contraire, le terme "compris(e) entre x et y" ou "allant de x à y" correspond à une gamme inclusive, c'est-à-dire que les 30 valeurs x et y sont incluses dans la gamme. La présente invention sera illustrée plus en détail par l'exemple ci-dessous. 35 Exemple 17 Exemple L'exemple ci-dessous montre l'identification par les inventeurs de signatures moléculaires permettant de distinguer des sous-populations de fibroblastes papillaires et 5 réticulaires jeunes et âgés. Matériel et méthodes Préparation des cellules Les fibroblastes papillaire (Fp) et réticulaire (Fr) ont été isolés à partir de peau 10 humaine non dégraissée. Ces prélèvements sont collectés après réduction mammaires pour cause esthétique. Six femmes ont été incluses : 3 donneuses "jeunes" (22, 25 et 28 ans) et 3 donneuses "âgées" (55, 61 et 65 ans). L'isolement des Fr s'effectue sur la partie de tissu ainsi déplétée de son hypoderme. Le tissu est alors dermatomé à hauteur de 700 iim. Seule la partie inférieure 15 du tissu est conservée. L'isolement des Fp s'effectue sur tissu dermatomé à 300 lm puis dé-épidermisé après action de dispase (Roche - 2,4 Unité/ml) pendant 16h à 4°C. Après dilacération, les fragments de derme sont digérés sous l'action de 20 collagénase de type 11 à 0,2% (Gibco) à 37°C. Les cellules sont ensuite amplifiées en milieu MEM - 10% sérum de veau foetal complémenté en Glutamine, sodium pyruvate, acide-aminés non essentiel, pénicilline, streptomycine et fungizone, sous atmosphère humide, à 37°C et 5% de CO2. 25 Analyse transcriptomique et RT-qPCR Après expansion des cellules (entre 7 et 10 doublements de population), les ARNm sont extraits sur colonne QIAgen selon les consignes données par le fournisseur. Les échantillons ont été divisés en 2 : une partie a été réservée à l'analyse transcriptomique, l'autre partie a été utilisée pour la validation de biomarqueurs par PCR. 30 L'étude transcriptomique a été réalisé sur puce Affymetrix de type GeneChip HG- U133 Plus 2.0. Les probes sets considérés comme différentiellement exprimés devaient présenter un fold change > à 2 pour une p-value non-ajusté REVENDICATIONS1. Méthode in vitro d'identification d'un fibroblaste dermique comme étant un fibroblaste dermique jeune ou âgé, comprenant les étapes suivantes : a) fournir un échantillon biologique comprenant au moins un fibroblaste dermique, b) mesurer le niveau d'un produit d'expression d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué des gènes ACAN, PSG1, et éventuellement UCP2, SFRP2, COL11A1 et KANK4, et c) sur la base du ou des niveau(x) mesuré(s) à l'étape b), identifier le fibroblaste dermique comme étant un fibroblaste dermique jeune ou âgé. 2. Méthode selon la revendication 1, dans lequel le fibroblaste dermique est un fibroblaste papillaire et le niveau d'un produit d'expression d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué des gènes UCP2, PSG1, SFRP2, COL11A1, ACAN et KANK4 est mesuré à l'étape b), et dans lequel le fibroblaste papillaire est identifié comme étant un fibroblaste papillaire âgé quand : (i)- le niveau d'un produit d'expression du gène UCP2 est diminué par rapport à un niveau contrôle, (ii) le niveau d'un produit d'expression du gène PSG1 est augmenté par rapport à un niveau contrôle, (iii) le niveau d'un produit d'expression du gène SFRP2 est diminué par rapport à un niveau contrôle, (iv) le niveau d'un produit d'expression du gène COL11A1 est augmenté par rapport à un niveau contrôle, (v) le niveau d'un produit d'expression du gène ACAN est augmenté par rapport à un niveau contrôle, et/ou (vi) le niveau d'un produit d'expression du gène KANK4 est augmenté par rapport à un niveau contrôle. 30 3. Méthode selon la revendication 1, dans lequel le fibroblaste dermique est un fibroblaste réticulaire et le niveau d'un produit d'expression d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué des gènes ACAN et PSG1 est mesuré à l'étape b), et dans lequel le fibroblaste réticulaire est identifié comme étant un fibroblaste réticulaire âgé 35 quand : 21 (i) le niveau d'un produit d'expression du gène ACAN est augmenté par rapport à un niveau contrôle, et/ou (ii) le niveau d'un produit d'expression du gène PSG1 est augmenté par rapport à un niveau contrôle. 5 4. Méthode selon la revendication 2 ou 3, dans laquelle le(s)dit(s) niveau(x) de contrôle est(sont) le(s) niveau(x) du(des)dit(s) produit(s) d'expression correspondant(s) dans un fibroblaste dermique du même type provenant d'un sujet de moins de 30 ans. 10 5. Equivalent de derme âgé in vitro comprenant : (i) une sous-population de fibroblastes papillaires dans lesquels - le niveau d'un produit d'expression du gène UCP2 est diminué par rapport à un niveau contrôle, - le niveau d'un produit d'expression du gène PSG1 est augmenté par 15 rapport à un niveau contrôle, - le niveau d'un produit d'expression du gène SFRP2 est diminué par rapport à un niveau contrôle, - le niveau d'un produit d'expression du gène COL11A1 est augmenté par rapport à un niveau contrôle, 20 - le niveau d'un produit d'expression du gène ACAN est augmenté par rapport à un niveau contrôle, et/ou - le niveau d'un produit d'expression du gène KANK4 est augmenté par rapport à un niveau contrôle, et/ou 25 (ii) une sous-population de fibroblastes réticulaires dans lesquels - le niveau d'un produit d'expression du gène ACAN est augmenté par rapport à un niveau contrôle, et/ou - le niveau d'un produit d'expression du gène PSG1 est augmenté par rapport à un niveau contrôle. 6. Equivalent de derme selon la revendication 5, dans lequel le(s)dit(s) niveau(x) de contrôle est(sont) le(s) niveau(x) du(des)dit(s) produit(s) d'expression correspondant(s) dans un fibroblaste dermique du même type provenant d'un sujet de moins de 30 ans. 7. Equivalent de peau in vitro comprenant un équivalent de derme selon la revendication 5 ou 6. 22 8. Kit pour identifier un fibroblaste dermique comme étant un fibroblaste jeune ou âgé, ledit kit comprenant au moins un moyen de mesure choisi dans le groupe constitué d'un moyen de mesure du niveau d'un produit d'expression du gène ACAN, un moyen de 5 mesure du niveau d'un produit d'expression du gène PSG1, et éventuellement un moyen de mesure du niveau d'un produit d'expression du gène UCP2, un moyen de mesure du niveau d'un produit d'expression du gène SFRP2, un moyen de mesure du niveau d'un produit d'expression du gène COL11A1 et un moyen de mesure du niveau d'un produit d'expression du gène KANK4. 10 9. Puce à ADN pour identifier un fibroblaste dermique comme étant un fibroblaste jeune ou âgé, ladite puce comprenant au moins une sonde choisie dans le groupe constitué d'une sonde détectant un produit d'expression du gène ACAN, une sonde détectant un produit d'expression du gène PSG1, et éventuellement une sonde détectant un produit 15 d'expression du gène UCP2, une sonde détectant un produit d'expression du gène SFRP2, une sonde détectant un produit d'expression du gène COL11A1 et une sonde détectant un produit d'expression du gène KANK4. 20