Brevet FR3070398A1 — publié le 20190301

TITRE MATÉRIEL ET MÉTHODE POUR LE STOCKAGE, LE TRANSFERT ET LA DÉLIVRANCE DE CELLULES SOUCHES MESENCHYMATEUSES IMMÉDIATEMENT DISPONIBLES ET FONCTIONNELLES DANS UN CONTEXTE D'INFARCTUS DU MYOCARDE DOMAINE TECHNIQUE La demande décrit une méthode qui comprend le fait de différentier des cellules souches mésenchymateuses (MSC) en cellules contractiles et d'associer les cellules différenciées à un support 3D afin d'obtenir un tissu contractile. L'activité paracrine des MSC est induite au cours du processus. Les biomatériaux obtenus sont compatibles avec le stockage, le transfert, et la délivrance de MSC à basse température. Les préparations sont immédiatement disponibles et fonctionnelles. La demande fournit donc un biomatériau cellulaire contractile, un procédé de production de ce biomatériau ainsi que des applications médicales de ce biomatériau. Le biomatériau de la demande est particulièrement adapté à la préservation, l'angiogenèse, le contrôle du remodelage et la régénération de tissu myocardique notamment tissus myocardique infarci. ARRIÈRE-PLAN TECHNOLOGIQUE Le tissu myocardique peut subir des lésions qui diminuent sa contractilité. Ces lésions myocardiques peuvent conduire le patient à une insuffisance cardiaque. Elles peuvent avoir différentes origines, par exemple une origine virale, une origine génétique ou une origine ischémique. La principale cause de lésions myocardiques est l'infarctus du myocarde. L'infarctus du myocarde surgit généralement du fait de l'obstruction d'une ou plusieurs artères coronaires, qui prive de l'apport en sang, et donc en oxygène, dont les cellules du tissu myocardique ont besoin, conduisant ainsi à une nécrose d'une ou plusieurs zones du myocarde. L'infarctus du myocarde est une pathologie extrêmement fréquente dans les pays industrialisés (1/500), survenant plutôt chez des sujets âgés de plus de 50 ans, avec 25% de formes graves. Même lorsqu'il est traité à temps dans les 2h, par exemple par réouverture des artères obstruées (angioplastie), l'infarctus du myocarde conduit généralement à une insuffisance cardiaque avec perte plus ou moins importante de contractilité myocardique. L'insuffisance cardiaque secondaire a une mortalité à 5 ans du même ordre que les cancers avec 50% de mortalité. 2 La diminution de la contractilité myocardique est notamment due à la perte (par nécrose) de cellules musculaires cardiaques. Elle est également due à une perte de matrice extracellulaire myocardique ainsi qu'à une perte en cellules de soutien de cette matrice extracellulaire, notamment à une perte en fibroblastes cardiaques. Or, cette matrice extracellulaire et ces 5 cellules de soutien sont nécessaires à la régénération des cellules musculaires cardiaques, qui sont des cellules adhérentes. La perte de matrice et de cellules de soutien limite donc les possibilités de régénération des cellules musculaires cardiaques. Elle conduit en outre à un remodelage du ventricule, qui doit s'adapter au nouveau régime de pression sanguine appliqué. La perte de cellules et de matrice extracellulaire s'accompagne en outre d'une réaction 10 inflammatoire (initiée notamment par les débris de cellules et de matrice cellulaire). Lors de l'infarctus, des mécanismes sont mis en jeu très rapidement. La nécrose des cellules, fragments matrice extracellulaire et les cellules locales vont recruter des cellules inflammatoires initialement des polynucléaires neutrophiles (PNN) à 8h, puis des macrophages M1 après 24h. Sous l'effet des myofibroblastes locaux il va y avoir une transformation des macrophages de type 15 M1 en macrophages de type M2 régénératifs, angiogéniques, peu détersifs. L'accélération de la présence des macrophages M2 améliore la récupération et la préservation du tissu myocardique. Les myofibroblastes sont de plus en plus reconnus comme les acteurs principaux de la régulation de la réponse après infarctus. Le tissu myocardique post-infarctus est donc un tissu ischémique et inflammatoire, qui a subi une 20 perte cellulaire et une perte de matrice extracellulaire. Le corps humain est théoriquement capable d'une certaine récupération, régénération myocardique, contrôlée par les myofibroblastes naturellement générés par différenciation de fibroblastes locaux ou issus de la moelle osseuse. Néanmoins, cette transformation naturelle n'est pas immédiate : la transformation des fibroblastes en myofibroblastes met au moins une 25 semaine et donc ces cellules ne sont pas présentent à la phase aigüe, et la réaction inflammatoire qui se développe en suite de l'infarctus tend à conduire à un remodelage du ventricule et à une altération de la contractilité ventriculaire. Pour les formes les plus avancées d'insuffisance cardiaque, la transplantation cardiaque et/ou l'assistance mécanique restent un traitement possible. Le problème de ces assistances est que les 30 meilleures survies ne sont que de quelques années, elles sont très chères, avec beaucoup d'accidents d'anticoagulations et des conditions de vie altérées. Les transplantations cardiaques sont réservées aux sujets jeune car il y a un manque cruel de greffons. Il s'agit d'intervention très lourde avec une survie de 50% à 10 ans et de nombreuses complications avec les traitements immunosuppresseurs et cancers secondaires, rejets des greffons etc. Pour l'infarctus qui est une 3 maladie extrêmement fréquente et grave il faut donc trouver un traitement qui soit efficace, peu cher et pouvant être utilisé à tous les âges. En cas d'infarctus avec choc cardiogénique initial, il n'y a pratiquement pas eu de progrès depuis 15 ans même avec des revascularisations précoces avec 50% de mortalité hospitalière et 50% de 5 mortalité pour les survivants lors de la première année. La thérapie cellulaire a suscité bien des espérances pour améliorer les résultats dans le cas de l'infarctus mais avec pour l'instant peu d'application clinique car les résultats sont trop décevants même si certains résultats chez l'animal sont prometteurs. Une des explications des différences entre les études cliniques et les études chez l'animal pourrait être la disponibilité supérieure des 10 cellules pour des raisons de logistique dans un contexte d'infarctus. Il n'y a pas chez l'homme de préparation immédiatement disponible. Les thérapies sont effectuées avec délai et les cellules ne sont pas utilisées avec des fonctionnalités optimales. Des thérapies cellulaires ont donc été envisagées à des fins de préservation, de cicatrisation ou de régénération du tissu myocardique. Ont été testés différents types cellulaires, notamment des 15 cellules différenciées (par exemple des cardiomyocytes) et des cellules souches (par exemple des cellules souches mésenchymateuses). Tous les résultats avec les cellules MSC bien que ce soient des cellules prometteuses ne s'accompagnent que d'une amélioration de la fonction ventriculaire contractile très faible (moins de 5% seulement alors qu'il faudrait une amélioration supérieure à 5% pour avoir un gain en termes de survie chez les patients). Chez l'animal, il a été montré que 20 des MSC allogénique administrées immédiatement après l'infarctus et modifiées avec des gènes de survie notamment AkT ou BcI2 pouvaient entrainer une amélioration de la contractilité systolique. Il a été montré également une corrélation entre le niveau de prise de greffe initial des cellules et la récupération. Les cellules doivent être appliquées très précocement. Un des modes d'action rapporté des MSC in vivo est le switch entre les cellules de détersion initiales 25 macrophages M1 vers des macrophages angiogéniques régénératifs de type M2. Si les MSC sont administrées trop tardivement, leur effet est diminué. Les cellules différenciées, telles que des cardiomyocytes, posent le problème de la difficulté d'obtenir des cellules adultes en quantité suffisante. Par suite, les choix se sont davantage orientés vers les cellules souches telles que les cellules souches mésenchymateuses. 30 Dans les thérapies cellulaires de l'art antérieur, on constate le plus souvent qu'il a une survie insuffisante des cellules administrées, et que le niveau de prise en greffe de ces cellules sur la zone infarcie est très limité avec perte de 90% après seulement 1h (facteur encore aggravé si le myocarde se contracte), de sorte que les cellules administrées peuvent migrer vers des sites qui sont sans rapport avec la zone ou le tissu à traiter. 4 Des patches de collagène ont été utilisés pour limiter la migration des cellules souches, notamment des cellules souches mésenchymateuses. Certains de ces patches ont pu conduire à une limitation du remodelage du ventricule avec, par exemple, une limitation de la distension diastolique, mais ces patches ne conduisent pas à une amélioration de la contractilité 5 myocardique, notamment de la contractilité ventriculaire systolique (cf. Simpson et al., 2007 Stem Cells 25(9) : 2350-2357; plus particulièrement le tableau 2 de cette publication). Le problème de la survie, de la viabilité et de la prise en greffe des cellules administrées est d'autant plus délicat que la zone à traiter est une zone ischémique et inflammatoire, c'est-à-dire non favorable à la survie et à la viabilité cellulaire. 10 La logistique pour transférer des cellules nécessite d'avoir au minimum un délai de 5-7 jours pour l'acheminement et la délivrance. Transférer les cellules à température de 37°C nécessite d'avoir des incubateurs portables, du CO2 et de l'oxygène, la capacité de cultiver ces cellules à l'arrivée en conditions cGMP et des centres accrédités. D'autre part, les MSC sont des cellules adhérentes qui vont soit s'agglutiner entre elles, soit adhérer aux parois du container de transfert. La 15 délivrance de ces cellules est donc techniquement problématique. À 37°C, le métabolisme des cellules est élevé. Les MSC sont des cellules multipotentes qui vont se différencier de manière anarchique. Si les cellules sont préservées à 37°C, il n'y a pas possibilité de contrôler cette différenciation. Au niveau demande métabolique, du fait de ses propriétés contractile, les tissus contractiles par rapport aux tissus non contractile à température ambiante sont particulièrement 20 demandeurs de nutriments et d'oxygène. Les thérapies cellulaires de l'art antérieur mettent généralement en oeuvre des cellules qui sont conservées par congélation. Comme cela est cité dans une étude de Marquez-Curtis et al. (review Cryobiology. 2015 Oct;71(2):181-97), « le monde du tissu engineering, de la thérapie génique, de la médecine régénérative et de la transplantation reposent sur la capacité à préserver, stocker et 25 transporter ces cellules ». Pour des raisons de logistique avec les MSC, il est indiqué que la question n'est pas de savoir s'il faut les congeler puisqu'il n'y a pas d'autre solution, mais comment faire pour préserver leur fonctionnalité après congélation. La congélation est donc considérée comme indispensable avec les techniques actuelles. Les cellules mésenchymateuses sont des cellules en faible nombre dans les tissus et qui doivent donc être amplifiées in vitro en 30 culture 2D. Lors des phases d'expansion, les cellules sont repiquées en utilisant des solutions enzymatiques. Lorsqu'un batch suffisant de MSC est amplifié, les MSC sont alors stockées. Un batch de test à visée de sécurités virales (possible mutation génétique) est effectué. La congélation permet également de maintenir les MSC dans un état de différenciation donné (pour stocker les MSC et les délivrer dans les centres). Après décongélation, en culture les cellules vont 5 mettre plusieurs jours à récupérer leur fonctionnalité (au moins 72h). Ces MSC ne sont pas immédiatement disponibles dans un contexte d'infarctus et nécessitent une expertise et une accréditation du centre pouvant re-expandre ces cellules. Ces compétences bloquent l'utilisation de ces cellules. 5 Ces cellules doivent donc être décongelées avant d'être administrées au patient. L'étape de décongélation retarde d'autant la prise en charge thérapeutique du patient. En outre, quelle que soit la technique de cryopréservation mise en oeuvre, le fait de congeler et décongeler diminue la viabilité des cellules. Par exemple, le fait de congeler et décongeler des cellules souches mésenchymateuses s'accompagne d'une grande mortalité cellulaire, d'une anomalie 10 ultra-structurale des cellules, d'une non-adhérence des cellules pendant plus de 24 heures et d'une perte de la capacité immunosuppressive paracrine de ces cellules pendant 48 à 72 heures après décongélation. Une perte de l'activité paracrine immuno-modulatrice a même pu être constatée à l'issue de la décongélation (Moll et al. 2014 Stem Cells 32(9) : 2430-2442). De manière générale, le fait de congeler et décongeler des cellules adhérentes, qu'il s'agisse de 15 cellules souches mésenchymateuses ou de cellules contractiles, altère la capacité d'adhérence de ces cellules ou retarde le retour de leur capacité d'adhérence cellulaire. La récupération des cellules nécessite de cultiver les cellules en incubateur. Les cellules après décongélation n'étant pas adhérentes, si on les injecte avec un support, elles ne vont pas adhérer au support et la perte cellulaire initiale serait très importante. L'adhérence des cellules au support de contractilité et 20 l'engagement des cellules dans des interactions de contractilité (avec augmentation et amélioration des interactions cellules/cellules et cellules/support) permet une meilleure rétention initiale des cellules dans la zone à traiter contrairement à l'injection de cellules en libre qui s'accompagne de la perte de 90% des cellules après 1h seulement et encore plus dans un coeur qui bat. L'approche proposée dans la demande permet d'optimiser les performances de la 25 thérapie cellulaire par une meilleure rétention initiale des cellules et par une meilleure préservation du contingent cellulaire (meilleure rétention initiale, meilleure survie, moindre migration secondaire). Elle permet également d'appliquer des cellules au contact de, et non pas dans, la zone infarcie, ce qui permet de préserver le phénotype paracrine immunosuppressif pro-régénératif des cellules et de préserver leur état de différenciation. 30 Une approche pour délivrer les MSC pourrait être de cultiver les MSC en culture 2D en hypothermie pour ralentir leur métabolisme. Néanmoins, pour des températures basses inférieures à 10°C en milieu de culture classique avec sérum, 90% des MSC ou des cellules contractiles sont déjà mortes après seulement 24h (Mathew et al., Tissue Eng. 2004;10(1112):1662-1671). À basse température >0°C il y a des modifications du cycle de production de 6 l'ATP, dégradation de transporteurs membranaires (responsable de modifications des ions avec augmentation du calcium intracellulaire, perte du potassium intracellulaire et augmentation du sodium, acidose avec pH cytoplasmique à 4 normalement à 7). À basse température, la modification des propriétés viscoélastique des membranes conduit à des membranes plus 5 rigides. Des cascades de dommage cellulaire sont mises en jeu avec la libération d'enzymes intracytoplasmiques, l'activation de phospholipase calcium dépendante, l'activation de voie de mort cellulaire par apoptose et la destruction de la matrice intracellulaire impliquée dans les phénomènes de contractilité (Baust et al., Organogenesis. 2009;5(3):90-96). Ce qui est remarquable dans notre invention, c'est que dans le milieu de culture classique avec sérum nous 10 sommes capables de préserver les cellules pendant plus d'une semaine sans perte de cette contractilité. Des solutions hypothermiques riches en lactobionate ont été proposées pour remplacer le chlore et diminuer sa concentration intracellulaire pour limiter la pression oncotique des solutions de type lactobionate sucrose et mannitol. Les solutions sont également tamponnées par Hepès. 15 Des solutions hypothermiques de type HYPERTHERMOSOL® ont été testées avec des cellules progénitrices pour cardiomyocytes. Dans ces solutions, outre la survie diminuée avec le temps notamment après 4 jours et plus de 50% mortalité après 1 semaine (Van Burskirk et al., Bioprocess International. 2004:42-48), il existe une baisse très importante d'alpha-actinine après 48h (Herias, Cytotherapy, 16(4), S38). Il existe d'autre part une baisse très importante du 20 marqueur CD9 (Ginis et al., Tissue Eng Part C Methods. 2012;18(6):453-463) qui est un marqueur des fibroblastes. Lors des phases de réchauffement, le milieu est toxique pour les cellules avec la libération de radicaux libres. Il faut donc changer le milieu lors du réchauffement, centrifuger les cellules et utiliser un incubateur pour régénérer les cellules. Après réchauffement, changement du milieu et culture en incubateur, il faut 24h à 48h pour que les cellules survivantes produisent 25 des battements (Snyder et al., 2005, Cell Preservation Technology, 3(1), 61-74.). Donc ces approches ne permettent pas d'avoir des préparations à plus de 5 jours alors qu'il faut un minimum de 7 jours pour des questions de logistiques pour transférer les préparations. Si on imagine que ces préparations vont servir pour un événement aléatoire il faut une capacité de durée de stockage supplémentaire ce que ne permet encore moins les approches précédentes. 30 II en résulte qu'en pratique, en l'occurrence en clinique, les thérapies cellulaires destinées à la cicatrisation ou la régénération d'un tissu myocardique infarci présentent un faible rapport bénéfice / risque. Dans la demande, le dispositif est immédiatement disponible. Il n'y a pas besoin de remonter la température à 37°C. À température ambiante le dispositif est contractile. Les cellules dans les 7 supports de contractilité peuvent éventuellement être utilisées avec des solutions hypothermiques. Dans ce cas, comme les cellules sont déjà adhérentes au support, on peut laver les cellules et le support par simple changement de milieu. Dans le support de contractilité les interactions entre les cellules entre elles et entre les cellules et le support entrainent une 5 activation du gène de survie AKt de manière physiologique et les protéines du stress sont diminuées. Cela pourrait expliquer la résistance des cellules dans cette structure en hypothermie. La demande propose des moyens de thérapie régénérative (ou cicatricielle) du tissu myocardique, notamment du tissu myocardique infarci, qui présentent des avantages par rapport 10 aux moyens de l'art antérieur, et notamment l'avantage de ne pas requérir la conservation sous forme congelée des cellules destinées à être administrées au patient ou sujet. Les moyens de la demande peuvent notamment conduire non seulement à limiter voire à éviter le remodelage du myocarde, mais également à une amélioration de la contractilité myocardique. 15 RÉSUMÉ La demande décrit un biomatériau, un procédé de production de ce biomatériau ainsi que des applications médicales de ce biomatériau. Le biomatériau de la demande est contractile et sa contractilité est spontanée ou provoquée. En 20 outre, il peut présenter une activité paracrine inductible (notamment une activité paracrine d'immunosuppression de cellules T). Le biomatériau de la demande est particulièrement adapté à la réparation (ou cicatrisation) du tissu myocardique, notamment du tissu myocardique infarci. Le biomatériau de la demande peut notamment favoriser la régénération myocardique et/ou 25 favoriser l'angiogenèse au niveau de la zone infarcie. Le biomatériau de la demande peut diminuer la taille de la zone infarcie et/ou limiter voire éviter le remodelage du ventricule. De manière particulièrement notable, le biomatériau de la demande peut conduire à une moindre diminution ou amélioration de la contractilité myocardique. De manière particulièrement avantageuse, le biomatériau de la demande ne nécessite pas d'être 30 congelé pour être conservé : il peut être conservé à une température supérieure à 0°C sans pour autant perdre ses propriétés de contractilité (et éventuellement d'activité paracrine). Le biomatériau de la demande comprend un support tridimensionnel à complaisance d'élasticité, qui favorise la survie et la différenciation de cellules souches en cellules contractiles et qui 8 permet la formation d'un tissu contractile. Le support peut être un support solide, et la colonisation cellulaire du support peut être favorisé par une structure poreuse. Le tissu contractile est formé par la différenciation de cellules souches, notamment de cellules souches mésenchymateuses. Les cellules souches mésenchymateuses de la demande incluent 5 également des préparations contenant des MSC comme des « clusters » de type cardiosphère préparés à partir de fragments tissulaires cardiaques et enrichis en progéniteurs pour CKIT+ et MSC. Le tissu contractile peut, par exemple, comprendre ou être constitué de cellules choisies parmi les myofibroblastes, les fibroblastes, les myocytes, les cardiomyocytes et les cellules musculaires 10 (y compris les mélanges de deux, trois, quatre ou cinq de ces types cellulaires) et progéniteurs pour ces cellules et les cellules capables de se différencier en ces cellules. La différenciation des cellules souches, notamment mésenchymateuses, peut notamment comprendre une mise en contact de ces cellules avec au moins un agent choisi parmi TGFbêta (y compris TGFbêta1), CTGF, EGF et NUX1, un stress mécanique, ou une stimulation électrique. 15 Une activité paracrine du tissu contractile peut être induite par mise en contact de cellules de ce tissu avec au moins un agent choisi parmi IFNgamma, TNFalpha et IL1bêta et/ou par application d'une hypoxie transitoire sur ces cellules. Le support (solide optionnellement poreux) peut présenter une complaisance d'élasticité de 0,1 à 30 kPa-1. Par exemple, les supports de contractilité sans cellule peuvent avoir une complaisance 20 d'élasticité de 0,4 kPa-1 et de 1.5 kPa-laprès colonisation cellulaire. BRÈVE DESCRIPTION DES FIGURES La Figure 1 montre une observation au microscope électronique d'un biomatériau de la demande 25 (matrice de collagène réticulée à titre de support solide poreux et MSC différenciées par contact avec du lysat plaquettaire ; cf. exemple 1 ci-dessous). Les rectangles tracés délimitent les zones identifiables de protéines filaments contractiles. Les flèches montrent une interruption régulière de ces filaments par des denses bodies ou peut être un sarcomère. Le biomatériau s'est donc organisé en structure contractile. À notre connaissance, des bandes de stress et une organisation 30 terminale de l'appareil contractile n'ont jamais été mises en évidence avec des MSC placées en culture standard 2D. La Figure 2 illustre le résultat de contractilité présenté par un biomatériau de la demande (matrice de collagène réticulée par DHT ; MSC différenciées en myofibroblastes à au moins 80%). 9 Les cinétiques de contraction et de relaxation sont proches de celles du tissu placentaire (cf. exemple 2 ci-dessous). Les Figures 3A et 3B illustrent le fait que la propriété de relaxation d'un biomatériau de la demande est bien un phénomène actif, et non un phénomène passif (relaxation avec 5 allongement [courbes du haut en Figure 3A et 3B] et avec diminution de la force développée [courbes du bas en Figures 3A et 3B]). Figure 3A; cas d'un biomatériau avec une matrice de collagène réticulée par DHT et avec des molécules de peptide RGD, sous stimulation électrique en tétanus et avec inhibition de la relaxation par RISORDAN. Figure 3B : cas d'un biomatériau avec une matrice de collagène réticulée par DHT, sous stimulation par KCI 0,05 M, et avec une 10 inhibition par BDM (cf. exemple 2 ci-dessous). La Figure 4 montre qu'une courbe de Hill a pu être établie pour un biomatériau de la demande (biomatériau avec matrice de collagène réticulée par DHT, et conservé à une température supérieure à 0°C -en l'occurrence de 4°C environ-). La courbe de Hill (hyperbole) est spécifique des tissus contractiles (abscisses : tension (mN) ; ordonnées vélocité Lo/s(10-3) ; cf. exemple 2 15 ci-dessous). La Figure 5 montre la migration des cellules des cardiosphères dans les supports (changement Vs. IICSps (échelle log)), les cellules ne restent pas sous forme de cluster (cf. g) mais migrent et se répartissent dans tout le support (cf. h). Une induction des marqueurs cardiaques et une diminution des protéines du stress Hsp70, Hsp72, Hsp90 a été observée. A également été 20 observée une activation de Akt dans les cellules MSC. DESCRIPTION DÉTAILLÉE La demande est relative à un biomatériau contractile, plus particulièrement à un (bio)matériau 25 cellulaire contractile. Ce biomatériau est notamment adapté à la thérapie régénérative (ou cicatricielle) du tissu myocardique, plus particulièrement à une thérapie régénérative (ou cicatricielle) appliquée à un tissu myocardique ischémique et inflammatoire, plus particulièrement à la cicatrisation myofibroblastique post-infarctus. 30 Les moyens de la demande peuvent notamment - limiter voire éviter le remodelage ventriculaire ; et/ou - diminuer la taille de l'infarctus myocardique ou favoriser la régénération myocardique ; et/ou - favoriser ou augmenter l'angiogenèse au niveau de la zone infarcie. 10 De manière particulièrement notable, les moyens de la demande peuvent conduire à une amélioration de la contractilité myocardique. Le biomatériau comprend des cellules et un support, qui est un support de contractilité. Ledit support est avantageusement un support tridimensionnel. Le support peut être un support 5 solide, notamment un support solide poreux, plus particulièrement un support solide poreux tridimensionnel. Ledit support peut par exemple être une éponge (par exemple une éponge réticulée par DHT) ou une mousse. Ledit support peut, par exemple, être un gel ou un hydrogel. Le support peut être associé à un agent. 10 Le support peut être stimulé physiquement Le support peut être injectable ou administrable par voie mini-invasive. Il peut avoir une mémoire de forme. Il peut être obtenu par 3D printing. Le support peut être réticulé chimiquement, physiquement, ou enzymatiquement. Le support peut être orienté. Le support peut par exemple être un support à base de collagène (collagène naturel ou non, 15 purifié ou non), éventuellement chimiquement modifié par traitement chimique, par la chaleur, ou par traitement à la gélatine. Le support peut être modifié avec des molécules d'adhésions liées de manière covalente. Les cellules sont obtenues par différenciation de cellules souches. Elles forment un tissu cellulaire 20 et sont présentes à l'intérieur de la structure moléculaire (poreuse) du support (solide), c'est-à-dire dans les pores du support (solide poreux). Le support, plus particulièrement le support solide optionnellement poreux, peut donc être perçu comme un support 3D (par opposition à la culture cellulaire classique, qui est une culture 2D). Le biomatériau est contractile, c'est-à-dire qu'il a des propriétés de contraction et de relaxation. 25 En effet, le tissu cellulaire qui est produit par différenciation des cellules souches est contractile, et le support (solide) (poreux) qui contient ce tissu cellulaire présente une complaisance d'élasticité qui permet à cette contractilité de s'exprimer. Avantageusement, le biomatériau (c'est-à-dire le tissu cellulaire qu'il contient) présente en outre une activité paracrine inductible. L'activité paracrine inductible ou induite comprend notamment 30 une activité d'immuno-modulation, notamment d'immunosuppression de cellules T. De manière remarquable, le biomatériau peut être conservé hors congélation. En effet, il peut être conservé à une température supérieure à 0°C et conserver ses propriétés de contractilité. Par exemple, il présente toujours des propriétés de contractilité, et optionnellement d'activité 11 paracrine inductible, après conservation pendant 5 jours à une température supérieure à 0°C mais inférieure à 10°C. Le biomatériau de la demande ne requiert donc pas d'être congelé et, de ce fait, peut donc être très rapidement disponible et fonctionnel : à la sortie de son récipient de stockage, le 5 biomatériau de la demande est en fait immédiatement administrable ou transplantable. Le sujet ou patient peut le recevoir sans délai de décongélation, changement de milieu, ou culture. Il peut être même utilisé à température ambiante, pas nécessairement à 37°C. Les cellules étant adhérentes au support et le support ayant une porosité importante, il y a une libre diffusion des milieux à travers le support qui va permettre le changement de milieu sans nécessiter de faire 10 des centrifugations itératives pour récupérer normalement des cellules en suspensions. Lorsqu'il est placé sur un tissu myocardique ischémique et inflammatoire, le biomatériau de la demande agit comme un pansement cicatriciel. Il y favorise la régénération myocardique. Il peut également y favoriser l'angiogenèse. Le biomatériau de la demande permet de limiter voire d'éviter le remodelage ventriculaire 15 post-infarctus. Il peut en outre diminuer la taille de la zone infarcie. Le biomatériau peut éventuellement préparer le ventricule à une thérapie cellulaire, ou autre visant à traiter un myocarde altéré. Plusieurs biomatériaux peuvent être utilisés simultanément ou dans le temps. Les biomatériaux peuvent être empilés ou utilisés sous forme de « sandwich ». Ils peuvent être appliqués dans un site extracardiaque avant d'être appliqués en libre ou en greffon vascularisé 20 sur la zone infarcie. Un des sites peut être la cavité péritonéale avec notamment l'épiploon, des muscles. Le biomatériau peut être couvert ou protégé sur le myocarde par un dispositif ou éventuellement un patch péricardique. De manière particulièrement notable, le biomatériau de la demande peut conduire à une préservation ou une amélioration de la contractilité myocardique. 25 La demande décrit un procédé de production de ce biomatériau. Le procédé de la demande comprend le fait d'induire la différenciation de cellules souches en cellules contractiles, plus particulièrement en cellules qui forment (entre elles) (et avec le support) un tissu contractile. Le procédé de la demande peut comprendre le fait d'induire la différenciation de cellules souches 30 en cellules contractiles préférentiellement dans le support tridimensionnel de contractilité qui va aider à cette différenciation. Ce support de contractilité avec une complaisance d'élasticité déterminée va permettre de développer un tissu contractile avec apparition de force et de raccourcissement de la structure formée. Cette contractilité peut être spontanée ou provoquée. Elle peut ne pas être permanente. Pour avoir un tissu contractile il est important que les cellules 12 dans le support soient contractiles ou aient la capacité de le devenir. Ces cellules contractiles doivent être connectées entre elles et avec le support. Les monomères/polymères du support peuvent être connectés. La complaisance d'élasticité du support ne doit pas être nulle. Elle doit être compatible avec une déformation par le contingent cellulaire associé. Il ne s'agit pas d'une émulsion où les 5 éléments cellulaires et contractiles ne sont pas connectés et la complaisance d'élasticité est nulle. Si la complaisance d'élasticité est trop importante du tissu osseux cartilagineux sera produit. Si la complaisance d'élasticité est trop basse, on n'obtiendra pas du tissu contractile (et les fibroblastes par exemple ne se différencieront pas en myofibroblastes). 10 Les cellules souches utilisées pour la mise en oeuvre de l'invention ne nécessitent pas la destruction d'embryons humains et peuvent être des cellules souches multipotentes et/ou des cellules souches pluripotentes, notamment des cellules souches adultes (non-embryonnaires), notamment des cellules souches cardiaques (CSC) ou des cellules souches mésenchymateuses, plus particulièrement des cellules souches mésenchymateuses. Il s'agit plus particulièrement de cellules humaines. Les cellules 15 peuvent éventuellement être modifiées génétiquement. Les cellules souches peuvent provenir de la reprogrammation génétique de cellules différentiées. Les cellules peuvent être des cellules pluripotentes induite (« IPS »). Les cellules souches peuvent provenir de banque de cellules utilisables en clinique. Les cellules peuvent être produite sous la forme de cluster cellulaire. Les cellules peuvent être fusionnées. 20 Les cellules souches mésenchymateuses sont souvent dérivées du mésoderme et également d'une trans-différenciation de l'endothélium ou épithélium vers le mésenchyme. Les cellules souches, notamment les cellules souches mésenchymateuses, peuvent provenir de toute origine que la personne du métier juge appropriée, par exemple d'un tissu adipeux, de la moelle osseuse, d'un tissu de soutien d'un organe, d'un os, d'un cartilage, ou d'un muscle, du tissu cardiaque 25 et dérivés. Les cellules souches, notamment les cellules souches mésenchymateuses, peuvent être autologues ou hétérologues. Les cellules peuvent être autologues ou allogéniques. Elles peuvent provenir de tissu humain non utilisé ou éliminé pour une autre cause également de tissu prélevé chez une personne décédée récemment. 30 Dans la présente demande, à moins que cela ne soit autrement spécifié, ou que le contexte n'en dicte autrement, tous les termes ont leur sens habituel dans le(s) domaine(s) concerné(s). Par exemple, le terme « cellules souches mésenchymateuses » (Mesenchymal Stem Cells ou Mesenchymal Stromal Cells ou MSC) se réfère en général aux cellules telles que définies dans Dominici et al. 2006 (Cytotherapy 8(4) : 315-317), c'est-à-dire à des cellules adhérentes au plastique (après 24h de contact avec la surface du plastique d'une boîte culture par exemple), qui 13 expriment CD105, CD73 et CD90, qui n'expriment pas CD45, CD34, CD14 (ou C11b), CD79a (ou CD19), et HLA-DR. Les MSC peuvent en outre être caractérisées par le fait qu'elles peuvent se différencier en ostéoblastes, adipocytes et chondroblastes. 5 Le fait d'induire la différenciation de cellules souches, notamment de cellules souches mésenchymateuses, en cellules contractiles, plus particulièrement en cellules formant un tissu contractile, peut notamment comprendre la mise en contact des cellules souches, notamment des cellules souches mésenchymateuses, avec au moins un agent favorisant la différenciation choisi parmi 10 TGFbêta (Tumor Growth Factor bêta) (plus particulièrement au moins TGFbêta1), CTGF (Connective Tissue Growth Factor), EGF (Epidermal Growth Factor) et RUNX1 (Runt-related transcription factor 1), les régulateurs de transcription et 15 un stress mécanique, plus particulièrement parmi TGFbêta, CTGF, EGF et RUNX1, plus particulièrement avec au moins TGFbêta (plus particulièrement au moins TGFbêta1), et plus particulièrement avec au moins TGFbêta (plus particulièrement au moins TGFbêta1) et optionnellement avec au moins un autre agent de différenciation choisi parmi CTGF, EGF et 20 RUNX1. Le lysat plaquettaire est un produit qui contient TGFbêta (plus particulièrement TGFbêta1) et/ou CTGF et/ou EGF et/ou RUNX1, plus particulièrement au moins TGFbêta (et optionnellement CTGF et/ou EGF et/ou RUNX1), plus particulièrement au moins TGFbêta1 (et optionnellement CTGF et/ou EGF et/ou RUNX1). Le fait d'induire la différenciation de cellules souches, notamment de 25 cellules souches mésenchymateuses, en cellules formant un tissu contractile peut donc comprendre la mise en contact des cellules souches, notamment des cellules souches mésenchymateuses, avec (au moins) du lysat plaquettaire. Les cellules contractiles (ou les cellules qui forment le tissu contractile) peuvent être des cellules 30 différenciées, ou un mélange de cellules différenciées et de cellules souches (lequel mélange comprenant au moins 50%, notamment au moins 80%, de cellules différenciées). Les cellules contractiles (ou les cellules (différenciées) formant le tissu contractile) peuvent comprendre ou être des cellules choisies parmi les myofibroblastes, les fibroblastes, les myocytes, les cardiomyocytes, les cellules musculaires (y compris les mélanges de deux, trois, 14 quatre ou cinq de ces types cellulaires), plus particulièrement des cellules choisies parmi les myofibroblates et les fibroblastes (y compris les mélanges de myofibroblastes et de fibroblastes). Plus particulièrement, les cellules (différenciées) formant le tissu contractile peuvent comprendre ou être des myofibroblates. 5 Plus particulièrement, cellules contractiles (ou les cellules (différenciées) formant le tissu contractile) peuvent comprendre ou être des cellules contractiles. Le procédé comprend en outre la production d'un support (solide) (poreux) qui contient ce tissu contractile et permet le développement de la contractilité. L'expression « un support (solide) 10 (poreux) qui contient un tissu contractile » signifie que tout ou partie d'un tissu contractile se trouve à l'intérieur du support (solide) (poreux), plus particulièrement dans les pores du support (solide) (poreux). Les cellules dans le support (poreux) vont adhérer aux parois de la structure et également empilement de cellules, l'ensemble connecté va permettre une activité synchrone contractile efficace. 15 Les cellules souches, notamment les cellules souches mésenchymateuses, ont une activité paracrine inductible. Le tissu contractile obtenu dans le support compliant comprend des cellules qui se sont différenciées (généralement, au moins 80% des cellules souches, notamment des cellules souches mésenchymateuses, se sont différenciées). 20 Or, de manière remarquable, le tissu contractile obtenu dans le support (solide) présente toujours une activité paracrine qui est inductible et même amplifiée avec apparition de facteurs spécifiques alors que les cellules ne sont plus en culture 2D mais 3D, et que les cellules se sont majoritairement différentiées en cellules contractiles. Cette activité paracrine inductible ou induite comprend une activité (paracrine) 25 d'immuno-modulation, notamment d'immunosuppression, plus particulièrement d'immunosuppression de cellules T. L'activité immunosuppressive des MSC sur les lymphocytes T n'est pas due à un contact direct entre les MSC et les lymphocytes T. La fonction immunosuppressive des MSC passe par l'activation de l'indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) qui va induire une consommation du tryptophane du milieu de culture qui est en grande partie 30 responsable sur l'effet antiprolifératif sur les lymphocytes T. Cette activation va s'accompagner également de la synthèse de très nombreux facteurs de croissance qui vont être relargués dans le milieu. Les facteurs libérés sont par exemple le facteur de croissance épidermique (epidermal growth factor ou EGF), platelet derived growth factor (PDGF), le facteur de croissance des plaquettes sanguines (vascular endothelial growth factor ou VEGF), le facteur de croissance 15 transformant (transforming growth factor ou TGFbêta), le facteur de croissance des hépatocytes (hepatocyte growth factor ou HGF), le facteur de croissance ressemblant à l'insuline (insulin growth factor tel que IGF1), l'angiopoïétine 1 (Ang1), le facteur de croissance des kératinocytes (keratinocyte growth factor ou KGF), le facteur 1 dérivé du stroma (stroma derived factor 1 ou 5 SDF1), la protéine de type follistatine 1 (Follistatin-like 1/TSC36 ou FSLT1), l'Interleukine 10 (11-10), la PGE2, des métalloprotéinases et des régulateurs comme MMP2, MMP9, T1MP1, T1MP2. La majorité de ces cytokines ont leurs sécrétions amplifiées dans la structure 3D à complaisance d'élasticité. Le support de contractilité augmente la signalisation IL-1 et TGFbêta. IL-1 est le premier médiateur mis en route dans l'inflammation après infarctus et est responsable 10 du recrutement initial des cellules inflammatoires PNN (polynucléaires neutrophiles) dans les toutes premières heures. De nombreux facteurs immunomodulateurs sont également relargués par les MSC activées comme IDO, semaphorine-3A, B7-H4, LIE, TSG6, galectine, HO-1, 11-6, IL-10, TGFbêta, PGE2, PD-L1/2. Certains facteurs paracrines libérés nécessitent une structure 3D avec complaisance d'élasticité comme le TSG6 et CXCR4. Le TSG6 est connu pour avoir un rôle 15 important dans l'infarctus. Dans les supports 3D à complaisance d'élasticité la production de PGE2 est particulièrement augmentée. L'activation des cellules dans du support par l'interféron gamma va augmenter la synthèse de TGFbêta, PGE2, BMP2, facteur H (inhibiteur du complément), Ga19. Le facteur H est très important car dans la zone infarcie il y a beaucoup de complément qui va conduire à la lyse locale des cellules. Le facteur H va donc protéger les 20 cellules de la lyse par le complément et donc améliorer leur survie. Les cellules décongelées ont une diminution du facteur H est donc sont particulièrement sensible à la lyse par le complément. La préparation de la demande est donc très supérieure. L'IL-10 est connue pour réduire la réponse inflammatoire après infarctus. L'IDO et la PGE2 favorisent la transformation des macrophages de type M1 vers des macrophages de type M2 après infarctus. Pour ce qui est de la 25 lyse du collagène naturel non dénaturé les MSC en culture 2D ne peuvent pas lyser le collagène car les activités MMP14, MMP1, MMP8 ou MMP13 ne sont pas présentes. L'activité MMP14 est une métalloprotéinase membranaire qui reste confinée à la cellule. Comme les MSC restent dans le support cette activité va donc rester contenue dans le support. L'activité MMP14 peut permettre de lyser effectivement le collagène naturel qui est particulièrement surreprésenté 30 après infarctus dans la zone d'escarre. L'activité MMP14 permet également de modifier les activités des métalloprotéinases MMP2 et MMP9 solubles qui seront une fois activées capables de lyser le collagène naturel. Ces facteurs pourront alors modifier le collagène naturel environnant. 16 Il a été montré que les facteurs paracrines libérés par les MSC in vitro immunosuppressives sont des facteurs qui vont promouvoir la régénération tissulaire in vivo. Les facteurs paracrines libérés par les MSC immunosuppressive vont par exemple accélérer la transformation des macrophages M1 vers des macrophages de type M2 dans l'infarctus. 5 Ces facteurs peuvent être éventuellement relargués dans des vésicules ou dans des structures membranaires plus complexes de types « exosomes ». L'activité paracrine inductible ou induite peut ainsi comprendre une activité (paracrine) d'inhibition de la prolifération des lymphocytes T. 10 Plus particulièrement, l'activité paracrine inductible ou induite est une activité (paracrine) qui favorise l'immuno-modulation (notamment l'immunosuppression) et qui favorise la génération cellulaire et/ou l'angiogenèse. Plus particulièrement, l'activité paracrine inductible ou induite est une activité (paracrine) qui favorise l'immunosuppression de cellules T. Le procédé de la demande peut donc en outre comprendre le fait d'induire une activité paracrine 15 desdites cellules contractiles (ou dudit tissu contractile, c'est-à-dire d'induire une activité paracrine chez des cellules de ce tissu contractile). Le fait d'induire une activité paracrine desdites cellules contractiles (ou de cellules dudit tissu contractile) peut notamment comprendre : - la mise en contact de cellules de ces cellules contractiles (ou de ce tissu contractile) avec 20 au moins un agent inducteur d'activité paracrine choisi parmi IFNgamma (interféron gamma), TN Falpha (Tumor Necrosis Factor alpha) et IL1bêta (interleukine 1 bêta), plus particulièrement avec au moins de l'IFNgamma, 25 plus particulièrement avec de l'IFNgamma et optionnellement au moins un autre agent inducteur de différenciation choisi parmi TNFalpha et IL1bêta, et/ou - l'application d'une hypoxie transitoire sur lesdites cellules contractiles (ou sur des cellules dudit tissu contractile), par exemple une hypoxie inférieure à 5% pendant 1 ou 2 jours. La mise en contact avec l'IFNgamma peut par exemple être faite à hauteur de plus de 10 Ul/mL, 30 plus particulièrement de 50 à 1000 Ul/mL, plus particulièrement de 50 à 500 Ul/mL d'IFNgamma. Alternativement ou complémentairement à l'induction d'une activité paracrine du tissu contractile, le procédé de la demande peut comprendre l'induction d'une activité paracrine sur les cellules souches, plus particulièrement sur les cellules souches mésenchymateuses, avant qu'elles ne soient différenciées en cellules formant un tissu contractile. Ainsi, avant d'induire la 17 différenciation des cellules souches, plus particulièrement des cellules souches mésenchymateuses, en cellules contractiles, plus particulièrement en cellules formant un tissu contractile, le procédé de la demande peut comprendre (alternativement ou complémentairement à l'induction d'une activité paracrine du tissu contractile) : 5 - la mise en contact desdites cellules souches, plus particulièrement desdites cellules mésenchymateuses, avec au moins un agent inducteur d'activité paracrine choisi parmi IFNgamma (interféron gamma), TNFalpha (Tumor Necrosis Factor alpha) et IL1bêta (interleukine 1 bêta), plus particulièrement avec au moins de l'IFNgamma, plus particulièrement avec de l'IFNgamma et optionnellement au moins un autre agent inducteur de différenciation choisi 10 parmi TNFalpha et IL1bêta, et/ou - l'application d'une hypoxie transitoire sur lesdites cellules souches, plus particulièrement desdites cellules mésenchymateuses (par exemple une hypoxie inférieure à 5% pendant 1 ou 2 jours). 15 Complémentairement ou alternativement au fait d'être poreux, le support (solide) mis en oeuvre peut avantageusement présenter une complaisance d'élasticité de 0,1 à 30 kPa-1, plus particulièrement de 0.4 à 20 kPa-1, plus particulièrement de 0.5 à 15 kPa-1, plus particulièrement de 0.5 à 5 kPa-1 (complaisance du support solide (poreux) avec ou sans cellule, plus particulièrement sans cellule). 20 La complaisance d'élasticité du support peut être obtenue après colonisation cellulaire et réticulation. La colonisation cellulaire et la réticulation augmentent la complaisance d'élasticité du support. Au sens de la science des matériaux, la complaisance d'élasticité (compliance en anglais) est une grandeur qui caractérise le comportement élastique d'un matériau. Une complaisance d'élasticité 25 est définie comme l'inverse d'un module élastique, et s'exprime en Pa-1. Schématiquement, la complaisance d'élasticité peut être vue comme le degré auquel un contenant peut subir une pression ou force sans se rompre. Le procédé de la demande peut ainsi être défini comme étant un procédé de production d'un 30 biomatériau cellulaire contractile, caractérisé en ce que le procédé comprend : - le fait d'induire la différenciation de cellules souches mésenchymateuses multipotentes en cellules contractiles dans un support de contractilité qui est un support (solide) (tridimensionnel), et le fait d'induire une activité paracrine desdites cellules contractiles, l'activité 18 paracrine induite comprenant en outre une activité d'immunosuppression de cellules T et/ou activation de l'indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), ledit procédé étant en outre caractérisé en ce que - le fait d'induire la différenciation de cellules souches mésenchymateuses multipotentes 5 en cellules contractiles comprend la mise en contact des cellules souches mésenchymateuses avec au moins un agent favorisant la différenciation choisi parmi TGFbêta, CTGF, EGF, NUX1, les régulateurs de transcription et un stress mécanique et une stimulation électrique, plus particulièrement parmi TGFbêta, CTGF, EGF et NUX1, - ledit support (solide) tridimentionnel présente une complaisance d'élasticité de 10 0,1 à 30 kPa-1, et - le fait d'induire une activité paracrine desdites cellules contractiles comprend la mise en contact de ces cellules contractiles avec au moins un agent inducteur d'activité paracrine choisi parmi IFNgamma, TNFalpha et IL1bêta, et/ou l'application d'une hypoxie transitoire sur des cellules de ce tissu contractile, 15 le support (solide) de contractilité contenant les cellules contractiles ainsi produit étant un biomatériau cellulaire contractile adapté à la thérapie régénérative du tissu myocardique. Plus particulièrement, le procédé de la demande peut ainsi être défini comme étant un procédé de production d'un (bio)matériau cellulaire contractile adapté à la thérapie régénérative du tissu 20 myocardique, qui comprend : le fait d'induire la différenciation de cellules souches mésenchymateuses en cellules contractiles et de produire un support (solide) (poreux) qui contient ces cellules contractiles, et le fait d'induire une activité paracrine chez ces cellules contractiles, l'activité paracrine induite comprenant une activité d'immunosuppression de cellules T, 25 ledit procédé étant en outre caractérisé en ce que l'induction de la différenciation des cellules souches mésenchymateuses en cellules contractiles comprend la mise en contact des cellules souches mésenchymateuses avec au moins un agent favorisant la différenciation choisi parmi TGFbêta (plus particulièrement avec au moins TGFbêta1), CTGF, EGF et RUNX1, plus particulièrement avec au moins TGFbêta (plus 30 particulièrement avec au moins TGFbêta1), plus particulièrement avec au moins TGFbêta (plus particulièrement avec au moins TGFbêta1) et optionnellement au moins un autre agent favorisant la différenciation choisi parmi CTGF, EGF, RUNX1, les régulateurs de transcription et un stress mécanique, plus particulièrement parmi CTGF, EGF et RUNX1, 19 les cellules contractiles comprennent ou sont des cellules choisies parmi les myofibroblastes, les fibroblastes, les myocytes, les cardiomyocytes, les cellules musculaires (y compris les mélanges de deux, trois, quatre ou cinq de ces types cellulaires), plus particulièrement comprennent ou sont des cellules choisies parmi les myofibroblates et les 5 fibroblastes, plus particulièrement comprennent ou sont des myofibroblates, ledit support (solide) (poreux) présente une complaisance d'élasticité de 0,1 à 30 kPa-1, et l'induction de l'activité paracrine chez les cellules contractiles comprend la mise en contact de ces cellules contractiles avec au moins un agent inducteur d'activité paracrine choisi parmi IFNgamma, TNFalpha et IL1bêta, plus particulièrement 10 avec au moins IFNgamma et optionnellement avec au moins un autre agent inducteur d'activité paracrine choisi parmi TNFalpha et IL1bêta, et/ou l'application d'une hypoxie transitoire sur ces cellules contractiles. Plus particulièrement, le procédé de la demande peut ainsi être défini comme étant un procédé 15 de production d'un (bio)matériau cellulaire contractile adapté à la thérapie régénérative du tissu myocardique après infarctus, et en ce que les cellules contractiles sont choisies parmi les myofibroblastes, les fibroblastes, les myocytes, les cardiomyocytes et les cellules musculaires et les progéniteurs de ces cellules, et les cellules capables de se différencier en ces cellules. 20 Plus particulièrement, ledit procédé est caractérisé en ce que : - le fait d'induire la différenciation des cellules souches mésenchymateuses en cellules contractiles comprend la mise en contact des cellules souches mésenchymateuses avec TGFbêta, plus particulièrement avec TGFbêta1, et - le fait d'induire une activité paracrine desdites cellules contractiles comprend la mise en 25 contact des cellules de ce tissu avec IFNgamma. Avantageusement, les cellules contractiles forment un tissu contractile dans le support (solide) (poreux). Le support (solide) (poreux) contenant le tissu contractile ainsi produit est un biomatériau 30 cellulaire contractile adapté à la thérapie régénérative de tissus, notamment de tissus humains, tels qu'un tissu musculaire, un tissu humain non contractile, un tissu cardiaque, plus particulièrement un tissu myocardique humain. 20 Plus particulièrement, le procédé de la demande peut être défini comme étant un procédé de production d'un (bio)matériau cellulaire contractile adapté à la thérapie régénérative du tissu myocardique, qui comprend le fait d'induire la différenciation de cellules souches mésenchymateuses en cellules contractiles qui dans le support à complaisance d'élasticité vont 5 former une structure contractile (notamment, un tissu contractile), et le fait d'induire une activité paracrine chez ces cellules contractiles, l'activité paracrine induite comprenant une activité d'immunosuppression de cellules T, ledit procédé étant en outre caractérisé en ce que l'induction de la différenciation des cellules souches mésenchymateuses en cellules contractiles comprend la mise en contact des cellules souches mésenchymateuses avec (au moins) TGFbêta 10 plus particulièrement avec (au moins) TGFbêta1 (et optionnellement au moins un autre agent favorisant la différenciation choisi parmi CTGF, EGF et RUNX1), les cellules contractiles comprennent ou sont des cellules choisies parmi les myofibroblastes, les fibroblastes, les myocytes, les cardiomyocytes, les cellules musculaires et leurs progéniteurs, une préparation de cellules souches contenant des cellules mésenchymateuses, comme des 15 « cardiosphères » par exemple, pour ces cellules (y compris les mélanges de deux, trois, quatre ou cinq de ces types cellulaires), plus particulièrement comprennent ou sont des cellules choisies parmi les myofibroblates et les fibroblastes, plus particulièrement comprennent ou sont des myofibroblates, ledit support (solide) (poreux) présente une complaisance d'élasticité de 0,1 à 30 kPa-1, et 20 l'induction de l'activité paracrine chez les cellules contractiles comprend la mise en contact de ces cellules contractiles avec (au moins) IFNgamma (et optionnellement avec au moins un autre agent inducteur d'activité paracrine choisi parmi TNFalpha et IL1bêta). Selon un mode de réalisation avantageux, on place ou implante les cellules souches (notamment 25 les cellules souches mésenchymateuses) dans le support (solide) (poreux) (notamment dans les pores de ce support (solide) (poreux)) avant d'induire leur différenciation en cellules formant un tissu contractile. Toutes les cellules souches (notamment toutes les cellules souches mésenchymateuses), ou au moins 50% d'entre elles ou au moins 60% d'entre elles ou au moins 80% d'entre elles, peuvent être placées ou implantées (ou contenues) à l'intérieur de la structure 30 (moléculaire) poreuse du support (solide). Le procédé de la demande peut alors comprendre le fait de placer ou implanter des cellules souches (mésenchymateuses) dans le support (solide) (poreux) (plus particulièrement dans les pores du support (solide) (poreux)), puis d'induire la différenciation de ces cellules souches (mésenchymateuses) en cellules formant un tissu contractile. 21 L'induction de la différenciation de cellules souches (mésenchymateuses) en cellules formant un tissu contractile et la production d'un support (solide) (poreux) qui contient ce tissu contractile peuvent ainsi être réalisées : en produisant un support (solide) (poreux) dans lequel (dans les pores duquel) des cellules 5 souches (mésenchymateuses) sont contenues et en induisant la différenciation de tout ou partie (au moins 50%, plus particulièrement au moins 80%) de ces cellules souches (mésenchymateuses) en cellules qui forment un tissu contractile (à l'intérieur de la structure poreuse du support (solide)). 10 Les cellules qui forment le tissu contractile peuvent notamment être liées entre elles par des jonctions intercellulaires. Les jonctions intercellulaires peuvent notamment être ou comprendre des jonctions intercellulaires à connexines (c'est-à-dire des jonctions intercellulaires dont les protéines de jonction comprennent une ou des connexines). Les jonctions intercellulaires peuvent plus particulièrement être ou comprendre des jonctions intercellulaires communicantes, 15 plus particulièrement des jonctions intercellulaires communicantes à connexons. Le tissu contractile est, ou se trouve, fixé au support. Avantageusement, ledit tissu contractile est lié au support (solide) (poreux), par exemple par des jonctions d'ancrage. Les jonctions d'ancrage peuvent notamment être des molécules d'ancrage. Les molécules d'ancrage peuvent notamment comprendre des protéines d'ancrage, plus particulièrement au moins une protéine 20 transmembranaire relié au cytosquelette et à l'appareil contractile de la cellule. Les jonctions d'ancrage peuvent notamment être des molécules d'ancrage, notamment des protéines d'ancrage, qui comprennent au moins une intégrine qui sont des mécanorécepteurs et donc vont permettre de déterminer la complaisance d'élasticité du support. La stimulation des récepteurs va induire une augmentation des connexions des cellules entres elles et également améliorer la 25 survie des cellules et favoriser la différenciation en cellules contractiles et une organisation de l'appareil contractiles en fonction de la localisation de cette interaction en la renforçant également. Plus particulièrement, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que les cellules 30 contractiles forment un tissu contractile, et en ce que ce tissu contractile est lié au support de contractilité par des molécules d'ancrage qui comprennent au moins une intégrine. La différenciation des cellules souches, notamment des cellules souches mésenchymateuses, en cellules formant un tissu contractile peut être induite jusqu'à détection d'un marqueur cellulaire 22 de différenciation, ledit marqueur cellulaire étant par exemple choisi parmi l'alphaSMA (alphaSmoothMuscleActine) et la mysosine (plus particulièrement la mysosine de type II). Ledit marqueur cellulaire est plus particulièrement l'alphaSMA. Le tissu contractile contient alors des cellules qui présentent au moins le marqueur alphaSMA, plus particulièrement le marqueur 5 alphaSMA et la myosine (plus particulièrement la mysosine de type II). Au niveau des cellules contractiles dans les supports de contractilité, l'alphaSMA va être associée aux bandes de contractilité elles même en regard de l'interaction de surface intégrinique. Les cellules formant un tissu contractile peuvent être ou comprendre des myofibroblastes, des 10 fibroblastes, des myocytes, des cardiomyocytes, des cellules musculaires (notamment des cellules musculaires squelettiques, des cellules musculaires lisses ou des cellules musculaires striées). Les cellules formant un tissu contractile peuvent être un mélange de plusieurs de ces types cellulaires, par exemple un mélange d'au moins deux ou d'au moins trois types cellulaires choisis parmi les myofibroblastes, les fibroblastes, les myocytes, les cardiomyocytes et les cellules 15 musculaires, par exemple un mélange de myofibroblastes et de fibroblastes. Les cellules peuvent être associés à d'autre cellules contractiles ou non contractiles comme des cellules endothéliales. Globalement toutes les cellules présentent dans le coeur peuvent être associées. Plus particulièrement, les cellules formant un tissu contractile peuvent être ou comprendre des 20 myofibroblastes qui expriment le marqueur alphaSMA. Le tissu contractile est essentiellement formé de cellules différenciées : généralement, au moins 80% des cellules qui le forment sont des cellules différenciées (qui peuvent par exemple exprimer le marqueur myofibroblastique alphaSMA). Pourtant, les cellules qui forment le tissu contractile 25 expriment toujours certains marqueurs cellulaires qui sont usuellement observés sur les cellules souches (mésenchymateuses), et non sur des cellules différenciées (qui en l'occurrence peuvent par ailleurs exprimer le marqueur alphaSMA et/ou la myosine). Par exemple, le tissu contractile peut comprendre des cellules qui sont positives pour un ou plusieurs des marqueurs CD105, CD54, CD73, CD105 et CD90, plus particulièrement pour un ou 30 plusieurs des marqueurs CD105, CD54, CD73 et CD105. Par exemple, le tissu contractile peut comprendre des cellules qui sont négatives pour un ou plusieurs des marqueurs CD45, HLA-DR, CD14, CD19, CD34 et CD106, plus particulièrement pour un ou plusieurs des marqueurs CD45 et HLA-DR. 23 Le tissu contractile peut notamment comprendre des cellules qui sont positives pour un ou plusieurs des marqueurs CD105, CD54, CD73 et CD105, et qui sont négatives pour un ou plusieurs des marqueurs CD45 et HLA-DR. Le tissu contractile peut par exemple comprendre des cellules qui sont positives pour les 5 marqueurs CD105, CD54, CD73 et CD105, et qui sont négatives pour les marqueurs CD45 et HLA-DR. Ainsi, le tissu contractile peut comprendre des cellules qui sont positives pour le marqueur alphaSMA (et optionnellement positives pour la myosine), positives pour les marqueurs CD105, CD54, CD73 et CD105, et négatives pour les marqueurs CD45 et HLA-DR. 10 Alternativement ou complémentairement, la différenciation des cellules souches, notamment des cellules souches mésenchymateuses, en cellules formant un tissu contractile peut être induite jusqu'à activation de la voie de signalisation Wnt canonique. L'activation de la voie de signalisation Wnt canonique peut causer l'accumulation de bêta-caténine dans le cytoplasme et sa translocation dans le noyau pour agir comme co-activateur transcriptionnel de facteurs de 15 transcription. De manière surprenante, le tissu contractile a conservé une activité paracrine inductible (notamment une activité paracrine inductible favorisant l'immunosuppression de cellules T). Le fait de présenter une activité paracrine inductible, notamment une activité immunosuppressive 20 paracrine inductible, est particulièrement avantageux pour les applications médicales visées (contrôle et diminution des risques de rejets immunitaires). L'induction de cette activité paracrine peut conduire à : une activation ou stimulation del'IDO (inducible indoleamine 2,3-dioxygenase) et/ou à une augmentation de l'expression de certaines protéines, notamment de certaines 25 métalloprotéinases, telles que MM P2, MMP9 et MMP14, et/ou à une augmentation de l'expression d'une ou plusieurs des molécules choisies parmi TSG6 (tumor necrosis factor Inducible gene 6), VEGF (Vascular endothelial growth factor), PDGF (Platelet-Derived Growth Factor), 30 angiopoïétine, IL1 (Interleukin-1), 1G F1 (Insulin-Like Growth Factor-1), FSL1 (synthetic lipoprotein Pam2CGDPKHPKSF), et PGE2 (Prostaglandine E2). 24 L'induction de l'activité paracrine (de cellules) dudit tissu contractile peut donc être réalisée jusqu'à (en une quantité et/ou durée suffisantes pour) obtention d'un ou plusieurs des éléments suivants : activation ou stimulation de l'IDO, 5 expression, ou augmentation de l'expression d'au moins une métalloprotéinase (telle que MMP9 et/ou MMP2 et/ou MMP14), plus particulièrement jusqu'à (en une quantité et/ou durée suffisantes pour) obtention d'un ou plusieurs des éléments suivants : activation ou stimulation de l'IDO, 10 sécrétion, ou augmentation de la sécrétion, de MM P9, sécrétion, ou augmentation de la sécrétion, de MMP2, et expression (membranaire), ou augmentation de l'expression (membranaire), de MMP14, plus particulièrement au moins jusqu'à activation ou stimulation de l'IDO et/ou expression ou augmentation de l'expression d'une ou plusieurs métalloprotéinases, plus particulièrement au 15 moins jusqu'à activation ou stimulation de l'IDO et/ou sécrétion ou augmentation de la sécrétion de MMP9 et/ou MMP2, plus particulièrement au moins jusqu'à sécrétion ou augmentation de la sécrétion de M M P9. Ainsi, après induction de l'activité paracrine, le tissu contractile peut comprendre des cellules, qui expriment MMP9, MMP2 et MMP14, plus particulièrement qui sécrètent MMP9, MMP2, plus 20 particulièrement qui sécrètent MMP9. Il a en outre été constaté que l'activité paracrine inductible (ou induite) peut même être supérieure à celle qui serait observée avec les cellules souches indifférenciées. Par exemple, les cellules (différenciées) du tissu contractile de la demande (contenu dans le support solde poreux) peuvent présenter une sécrétion de métalloprotéinase(s), plus particulièrement de MMP9 et 25 MMP2, plus particulièrement de MMP9, qui est supérieure à celle observée avec des cellules souches mésenchymateuses (en culture classique 2D). Cette caractéristique est favorable à l'angiogenèse, et est donc avantageuse pour les applications médicales visées, plus particulièrement pour une thérapie régénérative d'un tissu myocardique dans un contexte d'infarctus chronique. 30 Ainsi, de manière surprenante, le tissu contractile comprend des cellules contractiles lesquelles comprennent des cellules qui expriment le marqueur alphaSMA et optionnellement la myosine, et qui, après induction par TGFbêta1, sécrètent au moins une métalloprotéinase choisie parmi MMP9 et MMP2 et MMP14. 25 Le support (poreux) à complaisance d'élasticité peut par exemple être un gel, hydrogel, une structure à mémoire de forme. Le support tridimensionnel peut être en phase liquide et une fois délivré après activation peut être converti en phase solide comme par exemple solution, pâte, un gel, une suspension colloïde, un plasma. Le support peut être un cryogel ou support injectable 5 avec mémoire de forme. Les constituants du support peuvent être des agents intelligents capables de s'assembler, de se déformer et éventuellement de se réassembler. Il s'agit de matériaux ayant tendance à s'assembler à l'échelon moléculaire pour former des nano, micro ou macrostructures ou combinaisons. 10 Le support peut être des filaments, une éponge, matériaux avec ultrastructure filaire, ultrastructure alvéolaire d'éponge, analogues structuraux à forme d'interface, poudre, conduits, sphère, microsphère, film, micro ou nanofibrilles, membrane lipidique, fibres, matrices, patches, tissus, structure tissée, bêta ou alpha structures impliquées dans leur formation. Le support peut être composé par l'association des différents supports ou d'empilement d'un même support. 15 Cela peut être des films multicouches obtenus par microfluidique par exemple. Le support peut être fabriqué par des technique de type « 3D printed ». Le support (solide) (poreux) peut être un support tissé ou un support non tissé, plus particulièrement un gel, un hydrogel, une mousse, une éponge. 20 Le support peut être fabriqué à partir de monomère, polymère ou combinaison. Il peut s'agir de matériaux naturels ou pas. Pour les matériaux naturels ils peuvent être éventuellement produits par des techniques de biologie moléculaires. Le support peut être totalement, partiellement ou pas biodégradable. 25 Le support peut être fabriqué à partir de polymères, monomères, naturels ou pas. Tous les polymères peuvent être utilisés, synthétiques ou naturels ou combinaison dans la mesure où le support obtenu répond aux propriétés de différenciation et de contractilité comme défini précédemment notamment en termes de complaisance d'élasticité. On préfèrera cependant les polymères naturels qui ont des molécules d'adhésions. Parmi les polymères naturels : le 30 collagène. Le collagène est le composant naturel de la matrice extracellulaire dans les tissus et est donc particulièrement adapté. Le support peut contenir ou être fabriqué avec un polymère naturel comme le collagène, la gélatine, un produit dérivé du collagène, fibrinogène, fibrine, soie en incluant la soie FIBROIN qui pourrait avoir un intérêt particulier du fait de molécule d'adhésion particulière, algue, alginate, 26 protéoglycanes, glycoprotéines, glycoaminoglycanes, alginate, agarose, l'acide hyaluronique, l'agar, le chitosane, le fibrinogène/fibrine, le chitosan carboxyméthylé, octasulfate de sucrose, dextrane, cellulose, cellulose méthylée, sépharose, protéine imitée par le SEPHADEX (comme le latex) ou leur association. Les propriétés de ces polymères peuvent éventuellement être 5 modifiées. Le support 3D peut provenir du regroupement de différents supports tissu micro ou nano structures, des filaments ou tubes, d'éponge, de poudre, de conduit, de sphère, de microsphère, de film, micro ou nanofibrilles, membrane, fibre, maille, matrice, patch, feuille de tissu, tissu décellularisé (dépourvu de cellules), tissu tricoté, ouatine ou combinaison. 10 L'échafaudage tridimensionnel contient du collagène qui est constitué de collagène (I, Il, III, IV, V, VI, VII, XI et d'autres collagènes), ou de l'association de différentes espèces. Le terme « collagène » désigne également collagène insoluble, collagène soluble, atélocollagène préparé en enlevant des télopeptides sur les extrémités des molécules de collagène en utilisant une protéase autre que la collagénase. Il peut s'agir d'un collagène de synthèse. Cela peut être 15 également de la gélatine de synthèse recombinante. L'échafaudage tridimensionnel de collagène peut également être un tissu normal d'origine autologue, homologue ou hétérologue. Ce tissu peut être du tissu décellularisé. Différents protocoles pour décellulariser les tissus peuvent être utilisés (par choc osmotique, détergents ioniques et non-ioniques, digestions protéolytique, traitements par DNase/RNase). La décellularisation peut être couplée à des techniques visant à 20 modifier les propriétés du support comme la porosité. Le tissu décellularisé pourrait éventuellement être utilisé mais le problème de ces tissus est leur rigidité. En effet après extraction des cellules il y a une compaction des espaces vides et la rigidité augmente. Il s'agit également de tissus peu poreux. Les méthodes pour augmenter la porosité de ces tissus rendent ces tissus plus immunogènes et perdent des propriétés mécaniques de ces tissus. 25 Le collagène peut être purifié à partir de tissu contenant le collagène : autologue, homologue ou hétérologue comme uretère, péricarde, matrice tissulaire comme le coeur, sous muqueuse comme la sous muqueuse intestinale de porc « SIS », vaisseau sanguin, tendon, fascia, derme décellularisé ou pas, aponévrose, membrane type membrane amniotique, dure-mère. Ce pourrait être des copies synthétiques du collagène telles que des fibres de polymères ou des 30 peptides formant des fibrilles. Le collagène peut être chimiquement modifié et le produit obtenu par succinylation ou estérification ou formation de carboxyamides, ou désamination des collagènes. L'échafaudage peut être fabriqué à partir de polymères synthétiques organiques tels que poly (acide lactique) (PGA) et/ou poly (DL-Iactide-Co-glycolide) (PLGA) et/ou poly (DL-lactide-Co- 27 caprolactone) (PCL), un dérivé de collagène tel que la gélatine, un polypeptide obtenu par l'hydrolyse du collagène, collagène dénaturé par le chauffage. Des polymères synthétiques liés au collagène peuvent être choisis parmi Poly(3-hydroxybutyrate) (PHB)+++, poly(e-caprolactone) (PCL), soie, acide poly-lactique (PLA), polyamide (PA) , l'acide polylactique (PLA), l'acide 5 polyglycolique (PGA), poly (L-lactique) (PLLA), PLGA, poly (anhydrides) (PA), le polycarbonate (PC) les hydroxy acides, poly ortho- esters (POE), propylfumarates) (PPF), polysaccharides, la polylactone (PL), des poly caprolactones, polyamides, acides de polyamino, polyacétals des polyphosphazènes (PPZ), polycyanoacrylates biodégradables, les polyuréthanes biodégradables (unité centrale), polysaccharides, polypyrrole, polyanilines, polythiophène, polystyrène, polyester 10 (PE), polyuréthanes non-biodégradables, polyurées, poly (éthylène-téréphtalate) (PET), poly (acétate de vinyle d'éthylène), polypropylène, polyméthacrylate, polyéthylène, polycarbonates, poly oxyde d'éthylène, poly alcool de vinyle (PVA), fuseau-tex (polytétrafluoroéthylène), dacron (téréphtalate de polyéthylène), polytétrafluoroéthylène (PTFE), poly-éthylène-glycol (PEG), polyglycérol sébacate (PGS), copolymères décrits ci-dessus, avec l'un des additifs ci-dessus, et 15 mélanges de l'un des polymères, des copolymères, et des additifs entre eux et association de dérivés synthétiques avec les produits biologiques. Préférentiellement on utilisera les collagènes purifiés de type I, Il et III. Certains collagènes ont des propriétés d'adhérence spécifique et pourront alors être associé comme collagène IV. L'échafaudage peut être une matrice de type éponge obtenu par réticulation déshydratation 20 hydrothermique (DHT). L'échafaudage peut être aussi une mousse, par une mousse de gélatine. Cela peut être une mousse de collagène comme GELFOAMTm. La matrice DHT correspond à des matrices obtenues par liaison croisée déshydrothermique. La fabrication de ces supports peut s'accompagner d'une étape de lyophilisation ou la température est abaissée en dessous de zéro degré pour augmenter la porosité du support puis une réticulation haute température basse 25 pression est effectuée pour réticuler le support. Une matrice obtenue par DHT correspond aux matrices ULTRAFOAMTm de chez Bard. Une matrice fabriquée avec du collagène de type I et de type III peut être utilisée comme une éponge hémostatique. Le collagène initial est soluble dans une solution de 0,5% w/w de collagène dans acide acétique 0.05 M pH 3.5. La préparation est desséchée par le froid de manière contrôlée afin d'obtenir des éponges. La taille des pores et la 30 distribution dépend principalement de la rapidité de la congélation (0,25-1°C/min.), de la température de congélation finale de (-90°C à -5°C). Cette éponge est alors soumise à une réticulation par DHT (105°C pendant 16h pour une pression inférieure à 100 mTorr) pour introduire des liaisons covalentes entre les chaines du collagène sans le dénaturer en gélatine. 28 Pendant la fabrication le support peut être orienté en jouant par exemple sur le gradient de température. Le collagène peut être associé à des glycoaminoglycanes. Les échafaudages peuvent éventuellement être fabriqués par une technique d'électrofilage (electrospinning) mais le 5 problème de cette approche est que les supports ont une complaisance d'élasticité très élevée et il y a une difficulté à coloniser ces supports. Le support peut être orienté. Les supports ont une porosité très importante proche de 98%. La porosité définie la capacité du support à laisser passer les liquides. Le support peut avoir une structure d'éponge à l'échelon ultra-structural. Cette structure d'éponge va favoriser la mise en 10 cage initiale des cellules avec rétention dans le support. Certains supports se comportent également comme des éponges avec aspiration sous l'effet de la compression initiale des supports, et rétention à l'intérieur des cellules et des liquides. Dans le support il existe initialement une migration très importante des cellules qui vont permettre de coloniser rapidement l'intégralité du support dans la première semaine. Lorsque les structures contractiles 15 se développent cette capacité de migration est perdue. Cette capacité de migration peut être éventuellement utilisée pour coloniser d'autres supports 3D mis au contact. Cette approche permet de réaliser des cultures à très faible coût dans un environnement 3D sans avoir à faire des cultures itératives dans des systèmes 2D. D'autre part, cette culture 3D permet de cultiver plus de cellules dans un espace limité. 20 Le support peut avantageusement avoir des pores de taille intermédiaire pour permettre la diffusion des nutriments, la colonisation cellulaire in vitro, la colonisation cellulaire in vivo. La porosité du support solide poreux est adaptée à la présence de cellules contractiles dans ces pores. La porosité peut notamment être de 20 à 200 um, par exemple de 50 à 100 p.m. Cette porosité peut être homogène ou non-homogène. 25 Le support peut être orienté. Les supports orientés à complaisance d'élasticité favorisent la différenciation vers des cellules contractiles. Les forces développées dans des structures orientées sont supérieures. Il existe une synergie d'action entre l'orientation des supports et une éventuelle stimulation mécanique de ces supports. 30 Le support peut être réticulé. Il existe différentes méthodes de réticulation chimique (comme par exemple aldéhydes, isocyanates, carbodiimides), physique, biologique et combinaison. Dans les réticulations physiques par exemple l'UV, déshydrothermale (DHT). Pour les réticulations chimiques on pourra choisir des réticulants de préférence non toxiques pour les cellules comme diphenylphosphorylazide, carbodiimides, [DC (1-ethy1-3-(3-dimethylaminopropyl-carbodiimide 29 hydrochloride), EDC/NHS [DC (1-ethy1-3-(3-dimethylaminopropyl-carbodiimide hydrochloride) en présence de NHS (N-hydroxy-succinimide), EGS (ethylene glycol-bis (succinic acid Nhydroxysuccinimide ester), génipine. Eventuellement le glutaraldéhyde peut être utilisé s'il est détoxifié. Il peut être possible d'utiliser l'acide citrique comme agent de réticulation lors de 5 procédé d'electrofilage (« electrospinning ») du collagène par exemple. On peut également utiliser une réticulation enzymatique comme par exemple la transglutaminasase. La réticulation peut avoir lieu in vivo. Le support peut être réticulé plusieurs fois in vitro et in vivo. La réticulation chimique fait diminuer les sites d'adhésions pour les cellules. Nous proposons d'associer la réticulation à des molécules d'adhésions pour améliorer la fonctionnalité des supports. Nous 10 avons observé qu'il était possible de réticuler le support par la génipine (concentration 0°C, de préférence entre 0-10°C. Les exemples qui suivent sont donnés à titre purement illustratifs. Ils ne limitent en aucune façon l'invention. 25 EXEMPLES Exemple 1 : production d'un biomatériau contractile 30 Préparation du support solide poreux Quatre types de matrices ont été produites : - une matrice de collagène réticulée par déshydratation hydrothermique (DHT), - une matrice de collagène réticulée par DHT et comprenant des molécules de peptide d'adhésion, à savoir des molécules de RGD (Arg-Gly-Asp), 39 - une matrice de collagène réticulée par génipine, - une matrice de collagène réticulée par génipine et comprenant des molécules de peptide RGD. La matrice de collagène réticulée par DHT a été produite. La matrice obtenue par DHT 5 correspond aux matrices Ultrafoam TM de chez Bard. La matrice a été fabriquée avec du collagène de type I et de type III et utilisée comme une éponge hémostatique. Le collagène initial est soluble dans une solution de 0,5% w/w de collagène dans l'acide acétique 0,05 M pH 3,5. La préparation est desséchée par le froid de manière contrôlée afin d'obtenir des éponges. La taille des pores et la distribution dépend principalement de la rapidité de la congélation 10 (0,25-1°C/min), de la température de congélation finale de (-90°C à -5°C). Cette éponge est alors soumise à une réticulation par DHT (105°C pendant 16h pour une pression inférieure à 100 mTorr) pour introduire des liaisons covalentes entre les chaines du collagène sans le dénaturer en gélatine. Les fibres de collagène ont spontanément tendance à se grouper en structure poreuse. Cette capacité reste présente avec de la gélatine mais la porosité est plus faible. 15 Pendant la congélation il est possible de faire un gradient thermique pour orienter le support. La matrice peut également être produite sous forme de mousse poreuse de gélatine (« foom templating »). Une phase gazeuse (azote) est générée par réaction entre l'acide sulfamique et le nitrite de sodium dans une solution de gélatine et en présence d'un polymère tensioactif et de SDS. La 20 mousse est préparée à 45°C puis placée à 5°C pour prise en gel. Après purification, le gel physique est auto-réticulé avec de l'EDC et peut être lyophilisé. Les vides et interconnections sont de l'ordre de 230 et 90 microns, respectivement. La matrice de collagène réticulée par génipine a été produite. Nous avons observé qu'il était possible de réticuler le support par la génipine (concentration Exemple 2 : contractilité du biomatériau La contractilité des biomatériaux de l'exemple 1 ci-dessus a été testée par stimulation électrique (contraction tétanique provoquée en courant alternatif) et par stimulation chimique au KCI 5 (0.05 M), en suivant le même protocole que celui qui a été appliqué sur du tissu placentaire comme décrit dans Lecarpentier et al. 2013 (Placenta 34: 1163-1169) et Lecarpentier et al. 2015 (PLoS ONE 10(11) : e0142471). Les biomatériaux de l'exemple 1 ont été conservés au réfrigérateur à une température supérieure à 0°C et inférieure ou égale à 4°C jusqu'à utilisation. Ils ont ensuite été placés dans un 10 bain à 30°C pendant 30 min, et soumis aux tests de contractilité. Pour les stimulations mécaniques les tests peuvent être effectués après simple réchauffement à température ambiante. Les préparations sont extrêmement stables durant toutes les mesures qui s'effectuent sur plusieurs heures avec les mêmes réponses en début et fin d'expérience. On peut remettre les préparations au frigo et observer le même type de réponse les jours suivants. 15 Après stimulation électrique en tétanus, il y a un important raccourcissement des supports. Ce raccourcissement cesse lorsque la stimulation cesse (cf. Figure 2). De manière intéressante, la cinétique de la contraction et de la relaxation sont très similaires avec un retour à l'état basal avec la même cinétique. Comme la contraction, la relaxation est un phénomène provoqué par le contingent cellulaire associé au support. La relaxation est un mécanisme dynamique et non passif 20 (si la relaxation était passive, il y aurait une difficulté au remplissage du coeur, qui pourrait conduire à une insuffisance cardiaque diastolique par difficulté de remplissage ventriculaire). De manière remarquable, les cinétiques de contraction et de relaxation sont proches de celles du tissu placentaire. Les tests ont alors été reproduits en maintenant le stimulus de contraction (courant électrique ou 25 KCI) et en ajoutant dans le milieu un inhibiteur de l'interaction actine-myosine (à savoir le 2,3-butanedione monoxime (BDM) à 4 mM), ou un activateur de la voie de l'oxyde nitrique et du monophosphate de guanosine cyclique (NO-cGMP) (à savoir le dinitrate d'isosorbide (ISD ou RISORDANTM) à 1,7 le M). L'induction de NO dans les préparations signifie que les préparations sont viables et extrêmement fonctionnelles puisque au moins 4 cascades intracellulaires sont 30 mises en jeu pour obtenir la relaxation. Les résultats sont illustrés par la Figure 3A (cas d'un biomatériau avec matrice de collagène réticulé par DHT et avec molécules de peptide RGD, sous stimulation électrique en tetanus et avec inhibition par RISORDANTM) et par la Figure 3B (cas d'un biomatériau avec matrice de collagène réticulée par DHT, sous stimulation par KCI 0,05 M, et avec inhibition par BDM). On a 46 pu observer que l'inhibiteur (RISORDANTM ou BDM) induit une relaxation du même si le stimulus ayant provoqué la contraction (courant électrique ou KCI) est maintenu. Ceci démontre que la relaxation est un phénomène actif médié par les unités contractiles (actine myosine) du tissu du biomatériau. 5 II a été observé que la présence de molécules d'adhésion (peptide RDG) augmente les paramètres de contractilité, en général d'un facteur de 2 ou 3. De manière tout à fait exceptionnelle une courbe de Hill a pu être établie (cf. Figure 4), qui est caractéristique des tissus contractiles musculaires après stimulation par KCI ou stimulation électrique. Les courbes que nous avons observées sont très superposables à celles qui ont par 10 ailleurs été décrites pour du tissu placentaire humain expiante. Les complaisances d'élasticité des supports ont été déterminées. Pour le support de collagène la complaisance d'élasticité sans cellules était de 0,4 KPa. La complaisance d'élasticité des supports colonisés par les cellules était de 1.5 KPa. 15 Exemple 3 : induction d'une activité paracrine Des lymphocytes T ont été marqués avec le marqueur de fluorescence intracellulaire cytoplasmique CFSE (dont la fluorescence est divisée par deux à chaque division cellulaire), et ont été activés par antiCD3 et antiCD28 pendant 48h. 20 Les biomatériaux de l'exemple 1 ont été incubés avec de l'IFNgamma à 500 Ul/mL pendant 7 jours. Avant et après cette incubation avec l'IFNgamma, les surnagent des biomatériaux ont été placés en contact avec les lymphocytes T activés et marqués. La consommation en tryptophane a été mesurée dans le milieu d'incubation (selon la méthode 25 Boxam et Warren). La consommation du tryptophane dans le milieu dans les MSC est due à l'activation de l'IDO. Dans le milieu d'incubation des biomatériaux non stimulés par IFNgamma, il n'y a quasiment pas de consommation de trytophane. Par contre, dans le milieu d'incubation des biomatériaux stimulés par IFNgamma, une forte consommation de trytophane a été observée. Elle est du même ordre de grandeur que celle qui serait observée avec une culture standard 2D 30 de cellules MSC non différenciées. Or, il y a très peu de prolifération cellulaire dans le biomatériau par rapport à une culture (standard 2D) de MSC non différenciées. La fonction paracrine du biomatériau est donc supérieure à celle d'une culture (standard 2D) de MSC non différenciées. 47 La fluorescence CFSE a été mesurée. On peut observer que le biomatériau (avec MSC différenciées en myofibroblastes à plus de 80%) inhibe la prolifération des lymphocytes B qu'il soit à base de collagène réticulé ou de collagène réticulé par DHT avec molécules de peptide RGD. 5 L'expression de différents facteurs liés à une fonction paracrine, et notamment l'expression de cytokines et de métalloprotéinases, a été mesurée. Il a été notamment observé (en particulier à J7) une augmentation de l'expression des métalloprotéinases MMP9, MMP2 et MMP14, après stimulation par IFNgamma du biomatériau, et notamment une augmentation de la sécrétion de MMP9 et MMP2, plus particulièrement de 10 MMP9. Il a donc été observée que, bien que, dans le biomatériau, les MSC se soient différenciées en cellules formant un tissu contractile, l'activité paracrine inductible n'a pas été perdue. Elle apparaît même augmentée. 15 Exemple 4 : conservation hors congélation Les biomatériaux de l'exemple 1 ont été conservés pendant 10 jours dans un réfrigérateur (à une température d'environ 4°C). La contractilité et la fonction paracrine de ces biomatériaux ont été mesurées comme décrit en exemples 2 et 3 ci-dessus. Aucune altération de contractilité ou 20 de fonction paracrine n'a été détectée. Les biomatériaux peuvent donc être conservés hors congélation, et sont immédiatement fonctionnels. Par contraste, des MSC (non différenciées) conservées par congélation ne reprennent une fonction paracrine qu'au bout de 7 jours après décongélation. Les biomatériaux ont également pu être envoyés par la poste classiquement dans des containers 25 de polystyrène. Les biomatériaux étant dans leur milieu de culture contenant du sérum et des antibiotiques dans des tubes de 50 mL. À l'intérieur du polystyrène pour maintenir la température basse aux alentours de zéro degré avec des blocs réfrigérants pour glacière « pain de glace » et éventuellement de la carboglace en évitant les contacts directs avec le tube contenant le biomatériau. À leur arrivée les tubes contenant les biomatériaux sont stockés au 30 frigo entre 0-4°C. Dans certains cas des préparations sont arrivées après 6 jours sans problème particulier même si la carboglace n'était plus présente. Des packs de glaces permettant d'éviter la congélation comme des matériaux utilisés pour délivrer les produits pharmaceutiques de type CRYOPAC permettant de maintenir des températures déterminées de préférence ici entre +2°C et +8°C peuvent être utilisées. On peut 48 éventuellement monitorer la température dans le container. Si on souhaite changer le milieu des préparations, les biomatériaux avec les cellules peuvent être mis dans un nouveau container avec le milieu adéquat. Eventuellement le changement peut être fait au bloc opératoire ou sous une hôte à flux laminaire adapté. 5 Une autre solution, pour ne pas exposer la préparation à l'air libre est de faire cette modification en milieu confiné. Une solution peut être d'avoir plusieurs réservoirs en séries avec dans le premier réservoir le milieu final désiré, dans le réservoir du milieu les cellules avec support et le 3ème réservoir pouvant être vide et servir de poubelle. On peut varier sur le nombre de réservoir et leur 10 organisation. Ils n'ont pas tous forcément le même volume. Il peut y avoir présence de communication par des canaux entre les réservoirs avec la possibilité d'avoir des systèmes de fermeture ou antiretour. Il peut également y avoir des systèmes de filtre bactérien. Exemple 5 : thérapie post-infarctus myocardique sur modèle animal 15 Les biomatériaux de l'exemple 1 ont été administrés à des rats servant de modèles d'infarctus du myocarde. Un modèle d'infarctus myocardique a été développé chez le rat comme décrit dans Vallée et al. 2012 (Stem Cells Translational Medicine 1 :248-260). Des rats OFA (Oncins France souche A), de 20 250 g chacun, ont été obtenus auprès de la société CHARLES RIVER (Wilmington MA; U.S.A.). Les rats ont été immunodéprimés par tacrolimus (8 mg/kg/j. en deux injections) avant l'opération et pendant 45 j. Les rats ont été anesthésiés par un mélange de kétamine 100 mg/kg et xylazine 10 mg/kg administré par injection intra-péritonéale, et ont été ventilés après intubation trachéale. Une thoracotomie gauche a été pratiquée pour aborder le coeur et la cavité 25 péricardique. L'infarctus myocardique a été produit par une ligature définitive de l'artère intraventriculaire antérieure au fil de suture PROLENETM 6/0. L'infarctus s'accompagne d'une élévation du segment ST sur l'électrocardiogramme, d'une cyanose localisée sur le territoire en aval du vaisseau occlus et d'une akinésie de la zone (en l'occurrence du myocarde antérieur). La taille de l'infarctus et les fonctions du ventricule gauche ont été mesurées par IRM à J2, J7 et 30 J45. La ligature de l'artère intraventriculaire antérieure provoque un infarctus de 25% en taille, qui reste stable dans le temps. La fraction d'éjection du ventricule gauche (qui est de 68% à la normale hors ligature et infarctus) passe à 53% à J2, puis à 45% à J7 et J45. Les biomatériaux de l'exemple 1 ont été conservés pendant 7 jours au réfrigérateur (température de 4°C), puis ont été placés en contact avec de l'IFNgamma pendant 5 jours à température 49 ambiante. Les biomatériaux ont été placés sur la zone infarcie (avec suture optionnelle au fil P ROLEN [TM) La taille de l'infarctus n'est plus que de 10% à J7 (biomatériau de l'exemple 1 avec matrice de collagène réticulé par DHT et MSC différenciées en myofibroblates), alors qu'elle reste à 25% 5 avec une injection de MSC non différenciées. La fraction d'éjection du ventricule gauche est de 60% à J2, 59% à J7 et 58% à J45 biomatériau de l'exemple 1 avec matrice de collagène réticulé par DHT et MSC différenciées en myofibroblates, alors qu'elle est de 54%, 52% et 49% à J2, J7 et J45, respectivement, avec un biomatériau dans lequel la différenciation des MSC n'a pas été induite (biomatériau non contractile). 10 Le biomatériau de l'exemple 1 (matrice de collagène réticulé par DHT ; MSC différenciées en myofibroblates) permet de réduire la dilation ventriculaire après l'infarctus notamment la distension diastolique du ventricule. Il permet en outre d'augmenter la contractilité segmentaire systolique, ce à quoi ne parvient pas le biomatériau non contractile (différenciation des MSC non induite). 15 Les cellules MSC humaines transfectées avec la RLuc ont été identifiées in vivo après injection du substrat pour la luciférase à .11, J4, J8 et J25. Avec les patches de collagènes avec des cellules multipotentes non contractiles il y a une baisse massive à J4 de l'ordre de 75% alors que cette baisse est retardée avec les patches contractiles contenant ou pas du RGD. À 1 mois avec les patches contractiles à base de collagène, 30% des cellules sont encore présentes et 50% si les 20 patches contractiles contiennent le collagène-RGD. Exemple 6 : possibilité d'utiliser cette approche en dehors du coeur In vivo le support de collagène améliore la rétention initiale des cellules au contact de tissu 25 musculaire des cellules multipotentes indifférenciées. Les cellules MSC ont cependant dans les matrices de collagène une migration secondaire. La différenciation des MSC en cellules contractiles permet de retarder cette migration à plus de 2 semaines. Il a été montré que les MSC ne doivent pas être forcément présentes de manière permanente mais leur niveau d'initial de prise de greffe détermine une grande partie de leur effet. 30 Nous avons développé un système de traçage des cellules in vivo après transfection de ces cellules avec le gène de la luciférase. Les MSC humaines multipotentes ont été marquées. Les cellules MSC multipotentes ont été cultivées pendant 48h dans les supports. Après 4 jours seulement 50% des cellules localement ont disparu et il reste moins de 10% des cellules à partir du 8ème jour jusqu'à 1 mois. Ces résultats sont cependant supérieurs à ceux obtenus si les MSC sont injectées en libre dans la cuisse où moins de 10% des cellules sont présentes après 24h. Donc la présence des cellules dans un support améliore leur rétention à .11. Nous avons comparé des supports avec des cellules différentiées J9 en structures contractiles. Avec ces patches à J4 pratiquement 100% des cellules sont encore présentes. À partir de J8 il y a une baisse du nombre 5 de cellules et 50% des cellules à J11. À 1 mois il reste encore 20% REVENDICATIONS1. Procédé de production d'un biomatériau cellulaire contractile, caractérisé en ce que le procédé comprend : le fait d'induire la différenciation de cellules souches mésenchymateuses multipotentes en cellules contractiles, de préférence choisies parmi les myofibroblastes, les fibroblastes, les myocytes, les cardiomyocytes et les cellules musculaires et les progéniteurs de ces cellules, et les cellules capables de se différencier en ces cellules, dans un support de contractilité qui est un support tridimensionnel, et le fait d'induire une activité paracrine desdites cellules contractiles, l'activité paracrine induite comprenant en outre une activité d'immunosuppression de cellules T et/ou activation de l'indoleamine 2,3-dioxygenase (ID0), ledit procédé étant en outre caractérisé en ce que - le fait d'induire la différenciation de cellules souches mésenchymateuses multipotentes en cellules contractiles comprend la mise en contact des cellules souches mésenchymateuses avec au moins un agent favorisant la différenciation choisi parmi TGFbêta, CTGF, EGF, NUX1, les régulateurs de transcription, un stress mécanique et une stimulation électrique, plus particulièrement parmi TGFbêta, CTGF, EGF et NUX1, - ledit support tridimensionnel présente une complaisance d'élasticité de 0,1 à 30 kPa-1, et - le fait d'induire une activité paracrine desdites cellules contractiles comprend la mise en contact de ces cellules contractiles avec au moins un agent inducteur d'activité paracrine choisi parmi IFNgamma, TNFalpha et IL1bêta, et/ou l'application d'une hypoxie transitoire sur ces cellules contractiles, le support de contractilité contenant les cellules contractiles ainsi produit étant un biomatériau cellulaire contractile adapté à la thérapie régénérative du tissu myocardique. 2. Le procédé de la revendication 1, caractérisé en ce que : - le fait d'induire la différenciation de cellules souches mésenchymateuses en cellules contractiles comprend la mise en contact des cellules souches mésenchymateuses avec TGFbêta, plus particulièrement avec TGFbêta1, et 52 - le fait d'induire une activité paracrine desdites cellules contractiles comprend la mise en contact des cellules de ce tissu avec IFNgamma. 3. Le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 2, caractérisé en ce que les cellules contractiles forment un tissu contractile, et en ce que ce tissu contractile est lié au support de contractilité par des molécules d'ancrage qui comprennent au moins une intégrine. 4. Le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les cellules contractiles comprennent des cellules qui expriment le marqueur alphaSMA et optionnellement la myosine, et qui, après induction par TGFbêta1, sécrètent au moins une métalloprotéinase choisie parmi MMP9 et MMP2 et MMP14. 5. Le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ledit support de contractilité est un échafaudage tridimensionnel de polymère réticulé, plus particulièrement de collagène réticulé, qui présente une porosité de 20 à 200 11m, et qui optionnellement comprend des molécules de peptide d'adhésion, plus particulièrement des molécules de peptide RGD, liées de manière covalente à la structure polymérique du support solide. 6. Le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit support de contractilité est un solide, un gel ou un hydrogel, optionnellement réticulé et/ou optionnellement poreux, pouvant avoir la structure d'une éponge ou d'une mousse ; et en ce que ledit support peut être associé à un agent et/ou peut être stimulé physiquement. 7. Biomatériau cellulaire contractile adapté à la thérapie régénérative du tissu myocardique, susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, pour son utilisation sous une forme adaptée pour une administration par voie péricardique, par sternotomie, par voie mini-thoracotomique, par voie xiphoïdienne, ou par voie péricardiotomie et voie mini-invasive. 8. Biomatériau cellulaire contractile adapté à la thérapie régénérative du tissu myocardique, susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend : 53 - un support solide optionnellement poreux qui présente une complaisance d'élasticité de 0,1 à 30 kPa-1, et - un tissu contractile qui est contenu dans le support solide optionnellement poreux, les cellules contractiles comprenant des cellules choisies parmi les nnyofibroblastes, les fibroblastes, les myocytes, les cardiomyocytes et les cellules musculaires et les progéniteurs de ces cellules. 9. Biomatériau cellulaire contractile adapté à la thérapie régénérative du tissu myocardique, susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que ledit biomatériau peut être conservé hors congélation, notamment à une température supérieure ou égale à 0°C, plus particulièrement à une température supérieure à 0°C, plus particulièrement à une température supérieure à 0°C et inférieure à 32°C, plus particulièrement à une température supérieure à 0°C et inférieure à 10°C, notamment à une température supérieure à 0°C et inférieure à 4°C ; et est immédiatement disponible et fonctionnel. 10. Le biomatériau de la revendication 8 ou 9, pour son utilisation dans le traitement régénératif d'un tissu cardiaque, d'un tissu musculaire ou d'un tissu humain non contractile, plus particulièrement dans le traitement d'une insuffisance myocardique post-infarctus.