Brevet FR3068361A1 — publié le 20190104

SYSTEME FLUIDIQUE DE PRODUCTION DE VESICULES EXTRACELLULAIRES ET PROCEDE ASSOCIE DOMAINE DE L'INVENTION L'invention concerne un système de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices, un procédé de production et de récupération de telles vésicules et des vésicules produites par un tel système, par exemple utilisées dans la thérapie cellulaire et dans la médecine régénérative. ETAT DE LA TECHNIQUE Les cellules sont connues pour libérer des vésicules extracellulaires dans leur environnement, par exemple, in vivo, dans les fluides biologiques d'un organisme. Les vésicules extracellulaires ont été identifiées comme des moyens efficaces pour administrer des médicaments, de manière personnalisée ou ciblée, dans le corps humain. Elles présentent d'abord une biocompatibilité native et une tolérance immunitaire. Elles peuvent également comprendre des nanoparticules théranostiques, permettant à la fois d'imager certaines parties du corps et de délivrer des principes actifs ayant des fonctions thérapeutiques. Les vésicules extracellulaires ont également une fonction de communication intercellulaire : elles permettent, par exemple, de transporter des lipides, des protéines membranaires et cytoplasmiques et/ou des nucléotides du cytoplasme cellulaire, tels que des ARNm, des microARN ou des ARN longs non-codants, entre différentes cellules. En particulier, l'utilisation de vésicules extracellulaires peut permettre de résoudre des problèmes connus lors de l'utilisation thérapeutique de cellules, tels que la réplication cellulaire, la différentiation, les occlusions vasculaires, les risques de rejet et les difficultés de stockage et congélation. Il existe en conséquent un besoin industriel pour la production de vésicules cellulaires en quantités 2 suffisantes pour une utilisation thérapeutique, notamment en remplacement ou en complément de thérapies cellulaires. A cet effet, Piffoux et al. (Piffoux, M., Silva, A. K., Lugagne, J. B., Hersen, P., Wilhelm, C., Et Gazeau, F., 2017, Extracellular Vesicle 5 Production Loaded with Nanoparticles and Drugs in a Trade-off between Loading, Yield and Purity: Towards a Personalized Drus Delivery System, Advanced Biosystems) décrivent la comparaison de différentes méthodes de production de vésicules extracellulaires. Une première méthode consiste à produire des vésicules 10 extracellulaires à partir de cellules endothéliales de la veine du cordon ombilical (HUVEC), en soumettant ces cellules à des contraintes hydrodynamiques mimant les contraintes exercées dans des conditions physiologiques au sein des capillaires sanguins ou dans des conditions pathologiques lors de sténose des vaisseaux sanguins. Ces contraintes sont 15 entraînées par le passage des cellules productrices dans des canaux microfluidiques, pendant quatre heures. Une puce microfluidique comprend deux cents canaux dans lesquels les cellules sont transportées dans un écoulement laminaire, pour produire des vésicules de manière parallélisée. Toutefois, cette méthode présente des problèmes de 20 dimensionnement : les quantités de vésicules produites par une puce microfluidique ne sont pas adaptées aux quantités requises pour les applications susmentionnées. De plus, le rendement de vésicules extracellulaires produites par cellule introduite dans une telle puce (environ 2.104 vésicules par cellule) est très inférieur au rendement 25 théorique maximum de vésicules produites par une cellule, par exemple de l'ordre de 3,5.106 vésicules par cellule pour une cellule de type MSC (acronyme de cellule souche mésenchymateuse en anglais). Enfin, cette méthode nécessite une conformité aux normes dite G.M.P. (acronyme anglais de Bonnes Pratiques de Fabrication), nécessaires à la fabrication de 30 médicaments. 3 Une deuxième méthode couramment utilisée dans la littérature et décrite par Piffoux et al. consiste à cultiver des HUVEC dans un milieu de culture de type DMEM (acronyme anglais de Dulbecco's Modified Eagle's Medium) sans sérum, pendant trois jours (technique dite de starvation en 5 anglais, ou carence en sérum). L'absence de sérum entraîne un stress cellulaire déclenchant une libération de vésicules par les cellules productrices. Cette méthode présente un rendement plus élevé et permet de produire une plus grande quantité de vésicules que la méthode utilisant une puce microfluidique (environ 4.104 vésicules par cellule productrice). 10 Toutefois, le rendement calculé correspond à une durée de production beaucoup plus longue que la durée de production de la méthode précédente. Cette méthode ne permet pas de produire une quantité de vésicules extracellulaires suffisante pour les applications susmentionnées. Enfin, cette méthode ne permet pas de produire des vésicules de manière 15 continue car elle induit la mort des cellules. Watson et al. (Watson, D. C., Bayik, D., Srivatsan, A., Bergamaschi, C., Valentin, A., Niu, G., ... Et Jones, J. C., 2016, Efficient production and enhanced tumor delivery of engineered extracellular vesicles, Biomaterials, 105, 195-205) décrivent une méthode de production des 20 vésicules permettant d'augmenter la quantité de vésicules produites. Cette méthode consiste à cultiver des cellules de type HEK293 dans des flasques de culture, puis dans des membranes à fibres creuses (Hollow Fiber Membrane en anglais). Le passage central des fibres creuses permet d'acheminer le milieu de culture aux cellules productrices. Les cellules 25 productrices sont au préalable ensemencées autour de ce passage, où elles produisent des vésicules dans un espace inter-fibre. Le milieu liquide compris dans l'espace inter-fibre est collecté trois fois par semaine, permettant de produire environ 3.1012 vésicules en plusieurs semaines, pour des quantités de cellules ensemencées très grandes, par exemple de l'ordre 30 de 5.108 cellules, entraînant un rendement d'environ 6000 vésicules extracellulaires par cellule et un ratio de pureté très bas (par exemple 4 1,09.109 particules par microgramme de protéines). Cette production n'est toutefois pas assez élevée et trop lente au regard des applications susmentionnées. De plus, cette méthode est décrite en utilisant des cellules productrices correspondant à une lignée cellulaire particulièrement 5 résistante à la culture en milieu dépourvu en sérum : cette méthode peut ne pas être transposable à une production de vésicules par des cellules productrices telles que des cellules souches, par exemple humaines, moins résistantes et particulièrement appropriées aux applications thérapeutiques visées. 10 RESUME DE L'INVENTION Un but de l'invention est de proposer une solution pour produire des vésicules extracellulaires en grande quantité à partir de cellules productrices, plus rapidement qu'avec les méthodes connues, dans des 15 conditions conformes aux normes G.M.P. Un autre but de l'invention est de proposer une solution permettant d'augmenter le rendement du système de production de vésicules, c'est-à-dire le rapport entre le nombre de vésicules produites et le nombre de cellules productrices introduites dans le système de production. Un autre but de l'invention est de proposer un 20 système adapté à produire des vésicules extracellulaires à partir d'une large gamme de cellules productrices adhérentes, quelle que soit la résistance du type de cellule introduite dans le système de production et résistante ou non à une carence en sérum. Un autre but de l'invention est de proposer une solution pour produire et récupérer des vésicules extracellulaires en 25 continu. Enfin, un autre but de l'invention est de simplifier la structure du système fluidique pour la production de vésicules et de réduire son coût de fabrication. En particulier, un objet de l'invention est un système fluidique de 30 production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices, comprenant au moins un récipient, un milieu liquide contenu par le 5 récipient et des cellules productrices, caractérisé en ce qu'il comprend également des microporteurs en suspension dans le milieu liquide, la majorité des cellules productrices étant adhérentes à la surface des microporteurs, et un agitateur de milieu liquide, l'agitateur et la forme et 5 les dimensions du récipient étant adaptés à la génération d'un écoulement turbulent du milieu liquide dans le récipient. On comprend qu'avec un tel système, il est possible de produire des vésicules en grande quantité, et dans un système adapté aux normes G.M.P. On comprend également qu'un tel système est plus simple et moins couteux 10 à fabriquer que les systèmes connus pour produire des vésicules extracellulaires. L'invention est avantageusement complétée par les caractéristiques suivantes, prises individuellement ou en l'une quelconque de leurs combinaisons techniquement possibles : 15 - l'agitateur du milieu liquide et les dimensions du récipient sont adaptés à commander un écoulement du milieu liquide, la longueur de Kolmogorov de l'écoulement étant inférieure ou égale 75 pm, et préférentiellement à 50 pm ; le système fluidique comprend une sortie et une connectique reliée à la 20 sortie, la connectique étant susceptible de comprendre du milieu liquide et des vésicules extracellulaires ; l'agitateur est un agitateur rotatif dont la ou les vitesses de rotation, la forme, la taille sont adaptés, avec la forme et les dimensions du récipient, à la génération d'un écoulement turbulent du milieu liquide 25 dans le récipient ; les microporteurs sont des microbilles, le diamètre des microbilles étant compris entre 100 pm et 300 pm ; le système fluidique comprend un séparateur de vésicules extracellulaires, relié fluidiquement au récipient de manière à être 30 susceptible de réintroduire dans le récipient un milieu liquide appauvri en vésicules. 6 Un autre objet de l'invention est un procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices, comprenant : une commande d'un agitateur entraînant un écoulement turbulent d'un 5 milieu liquide dans un récipient, le récipient comprenant une sortie, le milieu liquide comprenant des cellules productrices adhérentes sur la surface de microporteurs, les microporteurs étant en suspension dans le milieu liquide, et une collecte du milieu liquide comprenant des vésicules extracellulaires 10 en sortie du récipient. Le procédé est avantageusement complété par les caractéristiques suivantes, prises individuellement ou en l'une quelconque de leurs combinaisons techniquement possibles : on agite le milieu liquide pendant plus de trente minutes ; 15 on commande l'agitateur pour entraîner un écoulement du milieu liquide, la longueur de Kolmogorov de l'écoulement étant inférieure ou égale à 75 pm et préférentiellement à 50 pm ; un séparateur appauvrit une partie du milieu liquide collecté en sortie du récipient en vésicules extracellulaires, et on réintroduit la partie du 20 milieu liquide dans le récipient. L'invention a également pour objet des vésicules extracellulaires susceptibles d'être obtenus par le procédé de production de vésicules extracellulaires objet de l'invention. L'invention a également pour objet une composition 25 pharmaceutique comprenant des vésicules extracellulaires susceptibles d'être obtenues par le procédé de production de vésicules extracellulaires objet de l'invention. Avantageusement, la composition pharmaceutique comprenant des vésicules extracellulaires peut être utilisée en médecine régénérative. 30 7 DEFINITIONS Le terme « vésicule extracellulaire » désigne de manière générale une vésicule libérée de manière endogène par une cellule productrice, dont le diamètre est compris entre 30 nm et 5000 nm. Une vésicule 5 extracellulaire correspond en particulier à unexosome et/ou une microvésicule et/ou un corps apoptotique cellulaire. Les termes « microporteur » et « microsupport » désignent une matrice sphérique permettant la croissance de cellules productrices adhérentes à sa surface ou à l'intérieur et dont la taille maximum est 10 comprise entre 50 pm et 500 pm, et préférentiellement entre 100 pm et 300 pm. Les microporteurs sont généralement des billes dont la densité est choisie sensiblement proche de celle du milieu liquide de culture des cellules productrices. Ainsi, un mélange doux permet aux billes de rester en suspension dans le milieu liquide de culture. 15 PRESENTATION DES FIGURES D'autres caractéristiques et avantages ressortiront encore de la description qui suit, laquelle est purement illustrative et non limitative, et doit être lue en regard des figures annexées, parmi lesquelles : 20 - la figure 1 illustre schématiquement un système fluidique pour la production de vésicules extracellulaires ; - la figure 2 illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules HUVEC dans un système fluidique pour différentes agitations ; 25 - la figure 3 illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules HUVEC dans un système fluidique pour différentes agitations ; - la figure 4 illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules MSC dans un système fluidique pour différentes agitations ; - la figure 5 illustre l'influence de la longueur de Kolmogorov sur le nombre 30 de vésicules extracellulaires produites par des cellules HUVEC et MSC ; 8 - la figure 6 illustre des cellules productrices adhérentes sur la surface de microporteurs ; - la figure 7 illustre des cellules productrices adhérentes sur la surface de microporteurs ; 5 - la figure 8 illustre le rendement de la production de vésicules extracellulaires pour différentes durées d'agitation, pour différentes cellules productrices et pour différentes conditions d'agitations ; - la figure 9 illustre le rendement de la production de vésicules extracellulaires pour différentes cellules productrices, et pour différentes 10 conditions d'agitations, après 240 minutes d'agitation en comparaison avec la méthode de privation de sérum pendant 72 h ; - la figure 10 illustre la concentration de cellules productrices adhérentes sur les microporteurs avant et après agitation, pour différentes conditions d'agitation ; 15 - la figure 11 illustre le métabolisme des cellules productrices de type HUVEC dans des conditions d'agitation pour la production de vésicules extracellulaires ; - la figure 12 illustre le métabolisme des cellules productrices de type HUVEC dans des conditions d'agitation pour la production de vésicules 20 extracellulaires ; - la figure 13 illustre le métabolisme des cellules productrices de type MSC murines dans des conditions d'agitation pour la production de vésicules extracellulaires EV ; - la figure 14 illustre le métabolisme des cellules productrices de type MSC 25 murines dans des conditions d'agitation pour la production de vésicules extracellulaires ; - la figure 15 est une microphotographie en cryo-microscopie électronique de vésicules extracellulaires produites par un système fluidique ; - la figure 16 illustre la distribution du diamètre de vésicules 30 extracellulaires produites par le système fluidique ; 9 - la figure 17 illustre la pureté en vésicules extracellulaires donnée par le rapport entre le nombre de particules et la masse de protéines, produites par le système fluidique dans le milieu liquide en comparaison avec la méthode de privation de sérum pendant 72 h ; 5 - la figure 18 illustre les propriétés pro-angiogéniques d'un milieu liquide comprenant des vésicules extracellulaires produites par le système fluidique ; - la figure 19 illustre les propriétés pro-angiogéniques d'un milieu liquide comprenant des vésicules extracellulaires produites par le système 10 fluidique, la méthode de privation de sérum ou la méthode de libération spontanée de vésicules ; - la figure 20 illustre l'activité métabolique de cardiomyocytes (lignée H9C2) après une journée d'incubation dans des milieux de culture comprenant des vésicules extracellulaires produites par le système 15 fluidique ; - la figure 21 illustre l'activité métabolique de cardiomyocytes (lignée H9C2) après deux journées d'incubation dans différents milieux de culture comprenant des vésicules extracellulaires produites par le système fluidique ; 20 - la figure 22 illustre l'effet dose d'une incubation d'un milieu de culture liquide comprenant une concentration variable de vésicules extracellulaires produites par un système fluidique sur la prolifération de cardiomyocytes ; - la figure 23 illustre la prolifération de cardiomyocytes (lignée H9C2) après deux journées d'incubation en présence d'un milieu de culture liquide 25 comprenant des vésicules extracellulaires ; - la figure 24 illustre l'utilisation d'une composition de vésicules extracellulaires produites par le système fluidique comme composition pharmaceutique dans un gel de poloxamer pour le traitement des fistules entre le peux et le caecum chez le rat ; 30 - la figure 25 illustre l'utilisation d'une composition de vésicules extracellulaires produites par le système fluidique comme composition 10 pharmaceutique dans un gel de poloxamer pour le traitement des fistules entre le peux et le caecum chez le rat. 5 DESCRITPION DETAILLEE Elements théoriques La longueur de Kolmogorov (ou dimension de Kolmogorov ou longueur d'eddy) est la longueur à partir de laquelle la viscosité d'un fluide 10 permet de dissiper l'énergie cinétique d'un écoulement de ce fluide. En pratique, la longueur de Kolmogorov correspond à la taille des plus petits tourbillons dans un écoulement turbulent. Cette longueur LK est calculée dans la publication de Kolmogorov (Kolmogorov, A. N., 1941, January, The local structure of turbulence in incompressible viscous fluid for very large 15 Reynolds numbers, In Dokl. Akad. Nauk, SSSR, Vol. 30, No. 4, pp. 301-305) et décrite par la formule (1) suivante : Lk = (1) 20 dans laquelle y est la viscosité cinématique du milieu liquide en écoulement et £ est l'énergie dissipée dans le fluide par unité de masse (ou taux d'injection d'énergie dans le fluide). Zhou et al. (Zhou, G., Kresta, S. M., 1996, Impact of tank geometry on the maximum turbulence energy dissipation rate for impellers, AlChE 25 journal, 42(9), 2476-2490) décrivent la relation entre £ et la géométrie d'un récipient dans lequel un milieu liquide est agité par agitateur de type roue à aubes. Cette relation est donnée par la formule (2) suivante : E = ND5 N3 P' - V (2) 30 11 dans laquelle Np est le nombre de puissance (ou nombre de Newton) adimensionné de l'agitateur dans le milieu liquide, D est le diamètre de l'agitateur (en mètre), N est la vitesse de rotation (en nombre de tours par seconde) et V est le volume de milieu liquide (en mètre cube). Cette 5 relation est utilisée pour le calcul de £ correspondant à la géométrie d'un récipient et d'un agitateur utilisés pour la mise en oeuvre de l'invention. Le nombre de puissance Np est donné de manière connue par la formule (3) : N= P N3D5p 10 dans laquelle P est la puissance apportée par l'agitateur, et p est la densité du milieu liquide. La formule (3) peut être ajustée comme décrit dans Nienow et al. (Nienow, A. W., Et Miles, D., 1971, impeller power numbers in closed vessels, Industrial Et Engineering Chemistry Process Design and 15 Development, 10(1), 41-43) ou Zhou et al. (Zhou, G., Kresta, S. M., 1996, Impact of tank geometry on the maximum turbulence energy dissipation rate for impellers, AlChE journal, 42(9), 2476-2490) en fonction du nombre de Reynolds de l'écoulement du milieu liquide. Il est également possible de calculer le nombre de Reynolds du système par la formule (4) suivante : 20 N.D2 (4) Re = .1, Architecture générale du système fluidique 25 La figure 1 illustre schématiquement un système fluidique 1 pour la production de vésicules extracellulaires EV. Le système fluidique 1 de production de vésicules extracellulaires EV vise à la production en grande quantité de vésicules extracellulaires EV dans un récipient 4. Toutefois, l'invention n'est pas limitée à ce mode de réalisation et peut comprendre 30 une série de récipients 4 reliés fluidiquement en parallèle ou en série. P (3) 12 Le récipient 4 contient un milieu liquide 5. Le récipient 4 peut être une cuve, une flasque, par exemple en verre ou en matière plastique, ou tout autre récipient adapté à contenir un milieu liquide 5. Le volume du récipient 4 est l'un des facteurs permettant de produire des vésicules 5 extracellulaires EV en grande quantité : ce volume peut être compris entre 50 mL et 500 L, préférentiellement entre 100 mL et 100 L, et préférentiellement entre 500 mL et 10 L. Le volume du récipient 4 illustré schématiquement dans la figure 1 est de 1 L. Le récipient 4 comprend typiquement une entrée gazeuse et une sortie gazeuse, par lesquels peut 10 s'écouler une atmosphère comprenant des concentrations en 02 et en CO2 adaptées à la culture cellulaire, par exemple comprenant 5% de CO2. Cette atmosphère peut provenir d'un injecteur/mélangeur de gaz adapté ou d'une étuve à atmosphère contrôlée en CO2. Une deuxième pompe 17 permet de commander cet écoulement gazeux dans le récipient 4. Le 15 récipient 4 comprend également une sortie 9 susceptible de comprendre du milieu liquide 5 et des vésicules extracellulaires EV. Cette sortie est complétée d'un moyen de séparation et/ou de filtration des microporteurs 3 permettant de ne pas récupérer des microporteurs 3 en dehors du récipient 4. Cette sortie 9 permet d'extraire hors du récipient 4 les vésicules 20 extracellulaires EV produites. Le récipient 4 peut également comprendre au moins une entrée 8 adaptée à introduire le milieu liquide 5 dans le récipient 4. Le milieu liquide 5 peut être de manière générale une solution saline, 25 par exemple isotonique. Préférentiellement, le milieu liquide 5 est un milieu liquide de culture avec ou adjonction de composés permettant la culture des cellules d'intérêt, ou un milieu complémenté en sérum préalablement purifié des vésicules extracellulaires ou un milieu sans sérum, permettant de ne pas contaminer les vésicules extracellulaires EV 30 produites par le système fluidique 1 par des protéines ou des d'autres vésicules provenant d'un sérum. Un milieu liquide 5 de type DMEM sans 13 sérum peut être utilisé. Le volume maximum de milieu liquide 5 est déterminé en partie par le récipient 4. Ce volume maximum peut également être compris entre 50 mL et 500 L, préférentiellement entre 100 mL et 100 L, et plus préférentiellement entre 500 mL et 10 L. Le volume minimum de 5 milieu liquide 5 contenu par la récipient 4 est en partie déterminé par le choix de l'agitateur 7 permettant d'agiter de milieu liquide 5. Le système fluidique 1 comprend également des microporteurs 3 en suspension dans le milieu liquide 5. Les microporteurs 3 peuvent être des 10 microbilles 14, par exemple en Dextran, chaque microbille 14 pouvant être recouverte d'une couche de collagène ou autre matériau nécessaire à la culture de cellules. D'autres matériaux peuvent être utilisés pour la fabrication des microporteurs 3, tels que le verre, le polystyrène, le polyacrylamide, le collagène et/ou l'alginate. De manière générale, 15 l'ensemble des microporteurs adaptés pour la culture cellulaire est adapté à la production de vésicules extracellulaires EV. La densité des microporteurs 3 peut être par exemple légèrement supérieure à celle du milieu liquide 5. La densité des microbilles 14 en Dextran est par exemple de 1,04. Cette densité permet aux microbilles 14 d'être suspendues dans le 20 milieu liquide 5 en agitant faiblement le milieu liquide 5, la traînée de chaque microporteur 3 dans le milieu liquide 5 étant dépendante de la densité du microporteur 3. La taille maximale des microporteurs 3 peut être comprise entre 50 pm et 500 pm, préférentiellement entre 100 pm et 300 pm, et préférentiellement entre 130 pm et 210 pm. 25 Les microporteurs 3 peuvent par exemple être des microbilles 14 de type Cytodex 1 (marque déposée). On peut réhydrater et stériliser une poudre formée par ces microbilles 14 avant utilisation. On peut utiliser 5g du PBS, puis dans un milieu de culture (par exemple du DMEM) sans sérum, à 4°C avant une utilisation. 30 14 Le système fluidique 1 comprend également des cellules productrices 6. Les vésicules extracellulaires EV sont produites par te système fluidique 1 à partir de ces cellules productrices 6. Les cellules productrices 6 peuvent être cultivées, avant la production de vésicules 5 extracellulaires EV par le système fluidique 1, sur ta surface des microporteurs 3 dans un milieu de culture cellulaire adapté. Ainsi, aucun transfert de cellules n'est nécessaire entre la culture des cellules productrices 6 et la production des vésicules extracellulaires EV, ce qui permet d'éviter toute contamination et de simplifier te procédé dans son 10 ensemble. La majorité des cellules productrices 6 sont adhérentes à la surface des microporteurs 3, même si une proportion minoritaire de cellules productrices 6 peuvent être décollées, par exemple par l'agitation du milieu liquide 5. Les autres cellules productrices sont alors et en suspension dans le milieu liquide 5 ou sédimentées au fond du récipient 4. De manière 15 générale, tout type de cellules productrices 6 peut être utilisé, y compris des cellules productrices non adhérentes, et de préférence des cellules productrices 6 adhérentes. Les cellules productrices 6 peuvent être par exemple des cellules multipotentes ou des cellules souches pluripotentes induites (IPS ou IPSCs, Induced Piuripotent Stem Cells en anglais). Elles 20 peuvent être également des cellules génétiquement modifiées et/ou des lignées tumorales. Le récipient 4 comprend également un agitateur 7 permettant d'agiter le milieu liquide 5. L'agitateur 7 peut être une roue à aubes, dont 25 les aubes sont au moins en partie plongées dans le milieu liquide 5, et mise en mouvement par une transmission de forces magnétiques. L'agitateur 7 peut également être un système de perfusion de milieu liquide 5 à un débit suffisant pour agiter le milieu liquide 5 contenu par le récipient, ou un système à murs rotatifs (par exemple agencés sur des rouleaux). L'agitateur 15 7 et les dimensions du récipient 4 sont adaptés à commander un écoulement turbulent du milieu liquide 5 dans le récipient 4. Par écoulement turbulent, on entend un écoulement dont le nombre de Reynolds est supérieur à 2000. Le nombre de Reynolds peut par exemple être calculé par la formule (4). 5 Préférentiellement, le nombre de Reynolds Re de l'écoulement de milieu liquide 5 est supérieur à 7 000, préférentiellement à 10 000 et préférentiellement à 12 000. L'agitateur 7 utilisé dans les exemples de réalisation de l'invention 10 comprend une roue à aube agencée dans un récipient 4 et mise en mouvement par un système de transmission de forces magnétiques. La vitesse de la roue à aube dans le milieu liquide 5 entraine un écoulement du milieu liquide 5. L'agitateur est adapté à commander un écoulement, qui, compte-tenu des dimensions du récipient 4, est turbulent. Dans le cas 15 de l'agitateur 7 illustré en figure 1, plusieurs paramètres permettent de calculer une valeur représentative de la turbulence du milieu liquide 5, en particulier la viscosité cinématique y du milieu liquide 5, les dimensions du récipient 4 et en particulier le volume V de milieu liquide 5 contenu dans le récipient 4, le nombre de puissance Np correspondant à la partie immergée 20 de la roue à aube, le diamètre D de l'agitateur et en particulier de la roue, la vitesse N de rotation de la roue. L'utilisateur peut ainsi calculer, en fonction de ces paramètres, des valeurs représentatives de la turbulence de l'écoulement, et en particulier la longueur de Kolmogorov LK, telle que donnée par les équations (1), (2) et (3). En particulier, l'agitateur 7 est 25 adapté à commander un écoulement dans lequel la longueur LK est inférieure ou égale à 75 pm et préférentiellement à 50 pm. Dans un exemple de réalisation du système fluidique 1, la vitesse de rotation de l'agitateur 7 est susceptible d'être commandée à 100 rpm (rotations par minute), le diamètre d'une roue à aube est de 10,8 cm et le 30 volume de milieu liquide contenu par le récipient 4 est de 400 mL. Le nombre de puissance Np mesuré de la roue à aube dans le milieu liquide 5, 16 par la formule (3), est sensiblement égal à 3,2. L'énergie dissipée par unité de masse E, calculée, par la formule (2), est égale à 5,44.10-1 J.kg-1. La longueur de Kolmogorov LK calculée par la formule (1) est ainsi égale à 41, 8 pm. 5 Préparation des microporteurs et des cellules productrices Le récipient 4 peut être à usage unique ou bien stérilisé avant toute introduction de milieu liquide 5, de microporteurs 3 et de cellules productrices 6. Les microporteurs 3, en l'occurrence des microbilles 14, 10 sont également stérilisés. Les microbilles 14 sont incubées dans le milieu de culture des cellules productrices 6, comprenant du sérum, dans le récipient 4. Cette incubation permet d'oxygéner le milieu de culture et de recouvrir la surface des microbilles 14 d'une couche, au moins partielle, de protéines, favorisant l'adhésion des cellules productrices 6 à la surface des microbilles 15 14. Les cellules productrices 6, avant d'être introduites dans le système fluidique 1, sont mises en suspension au moyen d'un milieu comprenant de la trypsine. Elles peuvent être ensuite centrifugées à 300 G pendant cinq minutes pour être concentrées dans le culot d'un tube, de manière à 20 remplacer le milieu comprenant de la trypsine par un milieu DMEM. Les cellules productrices 6 ensuite sont introduites dans le récipient 5, comprenant du milieu de culture et les microbilles 14, dans une quantité correspondant sensiblement à 5 à 20 cellules productrices 6 par microbille 14. Les cellules productrices 6 et les microbilles 14 sont ensuite agitées puis 25 sédimentées, de manière à mettre en contact les microbilles 14 et les cellules productrices 6, et favoriser l'adhésion des cellules productrices 6 sur la surface des microbilles 14. L'agitation peut reprendre périodiquement, de manière à favoriser l'homogénéité de l'adhésion des cellules productrices 6 à la surface des microbilles 14, par exemple toutes 30 les 45 minutes pendant 5 à 24 heures. La culture des cellules productrices est ensuite réalisée avec une faible agitation du milieu de culture (par 17 exemple la rotation d'une roue à aube à une vitesse de 20 rpm), ainsi qu'un remplacement régulier du milieu de culture (par exemple un remplacement de 5% à 40% du milieu de culture chaque jour). 5 Exemple de production des vésicules extracellulaires EV Les vésicules extracellulaires EV sont produites dans un récipient 4 contenant un milieu liquide 5, par exemple sans sérum, des microporteurs 3 et des cellules productrices 6 adhérentes à la surface des microporteurs 3. Le milieu utilisé avant la production pour la culture des cellules 10 productrices 6 sur les microporteurs 3 comprenant du sérum, on lave trois à quatre fois le récipient 4 avec du milieu liquide 5 DMEM sans sérum, chaque lavage correspondant par exemple à un volume d'environ 400 mL. On commande ensuite l'agitation du milieu liquide 5 par l'agitateur 7 de manière à entraîner un écoulement turbulent dans le récipient 4. 15 L'agitation est préférentiellement réglée de manière à commander un écoulement du milieu liquide 5 dans lequel la longueur de Kolmogorov LK est inférieure ou égale à 75 pm et préférentiellement à 50 pm. L'agitation du milieu liquide 5 est commandée au moins pendant une demi-heure, préférentiellement pendant plus d'une heure, et préférentiellement 20 pendant plus de deux heures. La production de vésicules extracellulaires EV peut être mesurée pendant la production. A cet effet, l'agitation peut être momentanément interrompue. On laisse sédimenter les microbilles 14 au fond du récipient 4, puis on prélève un échantillon de milieu liquide 5 comprenant des vésicules extracellulaires EV. On réalise une centrifugation 25 de l'échantillon à 2000 G pendant 10 minutes, de manière à éliminer les débris cellulaires. Le surnageant est analysé par une méthode de suivi individuel de particules (ou NTA, acronyme anglais de Nanoparticle Tracking Analysis) de manière à compter le nombre de vésicules extracellulaires EV et d'en déduire la concentration en vésicules extracellulaires EV des 30 échantillons. On peut vérifier que la concentration en vésicules 18 extracellulaires EV au début de l'agitation est proche de zéro ou négligeable. Les vésicules extracellulaires EV produites peuvent également être 5 observées et/ou comptées par cryo-microscopie électronique à transmission. A cet effet, une goutte de 2,7 pL de solution comprenant des vésicules extracellulaires EV est déposée sur une grille adaptée à la cryomicroscopie, puis plongée dans l'éthane liquide, entraînant une congélation quasi-instantanée de ladite goutte, évitant la formation de cristaux de 10 glace. La grille supportant les vésicules extracellulaires EV est introduite dans le microscope et les vésicules extracellulaires EV sont observées à une température de l'ordre de -170°C. Séparation des vésicules extracellulaires 15 Les vésicules extracellulaires EV produites dans le récipient 4 sont susceptibles d'être extraites du récipient 4 par la sortie 9 du récipient 4, suspendues dans du milieu liquide 5. Un filtre 18 peut être agencé à la sortie 9 de manière à filtrer les microporteurs 3 et les cellules productrices 6 adhérentes aux microporteurs 3 lors de l'extraction de vésicules 20 extracellulaires EV du récipient 4. Une connectique 13 est fluidiquement reliée à la sortie 9, permettant le transport du milieu liquide 5 comprenant les vésicules extracellulaires EV produites. Le système fluidique 1 peut comprendre un séparateur 15 de vésicules extracellulaires EV. Le séparateur 15 comprend une entrée du 25 séparateur 10, dans laquelle le milieu liquide 5 comprenant des vésicules extracellulaires EV issu du récipient 4 peut être acheminé de manière directe ou indirecte. Le séparateur 15 peut également comprendre une première sortie 11 du séparateur, par laquelle le milieu liquide 5 est susceptible de sortir du séparateur 15 avec une concentration en vésicules 30 extracellulaires EV plus petite qu'en entrée 10 du séparateur 15, voire sensiblement nulle. Le séparateur 15 peut également comprendre une 19 deuxième sortie 12 du séparateur 15, par laquelle le milieu liquide 5 est susceptible de sortir du séparateur 15 avec une concentration en vésicules extracellulaires EV plus élevée qu'en entrée 10 du séparateur 15. De manière générale, le séparateur 15 de vésicules extracellulaires 5 EV peut être relié fluidiquement au récipient 4 de manière à être susceptible de réintroduire un milieu liquide 5 appauvri en vésicules EV dans le récipient 4, par exemple par l'entrée 8 du récipient 4. Ainsi, la production et/ou l'extraction de vésicules extracellulaires EV peut être réalisée de manière continue, à volume de milieu liquide 5 sensiblement 10 constant dans le récipient 4. Dans l'exemple de réalisation d'un système fluidique 1 illustré dans la figure 1, le milieu liquide 5 peut être extrait du récipient 4 par une première pompe 16, via une connectique 13, de manière à transporter le milieu liquides dans un collecteur 19. Une autre première pompe 16 permet 15 d'acheminer le milieu liquide 5 contenu dans le collecteur 19 à l'entrée 10 du séparateur 15, via une autre connectique. La première sortie 11 du séparateur 15 est reliée au récipient 4 via une connectique, de manière à réintroduire du milieu liquide 5 appauvri en vésicules extracellulaires EV dans le récipient 4. La deuxième sortie 12 du séparateur 15 est reliée au 20 collecteur 19 via une connectique, de manière à enrichir le milieu liquide 5 contenu dans le collecteur 19 en vésicules extracellulaires EV. Dans une variante, l'entrée 10 du séparateur 15 peut être directement reliée à la sortie 9 du récipient 4 (ou par l'intermédiaire d'une première pompe 16). La première sortie 11 du séparateur 15 est reliée au récipient 4 et la 25 deuxième sortie 12 du séparateur 15 est reliée au collecteur 19. Plusieurs séparateurs peuvent également être disposés en série pour faire varier le degré de séparation en vésicules extracellulaires EV dans le milieu liquide 5, et/ou en parallèle pour adapter le débit de milieu liquide 5 dans chaque séparateur 15 au débit d'une première pompe 16. 30 Influence de l'agitation sur la production des vésicules extracellulaires EV 20 La figure 2 illustre le nombre de vésicules extracellulaires EV produites dans un système fluidique 1 pour différentes agitations commandées par l'agitateur 7. L'ordonnée de gauche correspond aux nombres de vésicules extracellulaires EV produites dans le récipient 4. 5 Chaque colonne correspond à une production de vésicules extracellulaires EV pour différentes vitesses de rotation de l'agitateur 7 dans le récipient 4. L'ordonnée de droite correspond à la longueur LK entraînée par l'agitateur 7 pendant la production de vésicules extracellulaires EV, calculée par les formules (1), (2) et (3). Les vésicules extracellulaires EV sont produites à 10 partir de cellules productrices 6 de type HUVEC dans le récipient 4 en utilisant une concentration de 3 g.L-1 de microporteurs 3 dans 50 mL de milieu liquide 5 dans une flasque à agitation (spinner flask en anglais) de 100 ml. Une production significativement élevée de vésicules extracellulaires EV est observable en commandant un écoulement de milieu 15 liquide 5 dans lequel la longueur LK est égale à 35 pm (production correspondant à la colonne 300 RPM) par rapport à la production en vésicules extracellulaires EV dans des conditions d'agitation plus faible dans lequel la longueur LK est égale à 75 pm et préférentiellement à 50 pm (production correspondant à la colonne 150 RPM). 20 La figure 3 illustre le nombre de vésicules extracellulaires EV produites dans un système fluidique 1 pour différentes agitations commandées par l'agitateur 7. Vingt millions de cellules productrices 6 de type HUVEC sont utilisées, en utilisant une concentration de 3 g.L-1 de 25 microporteurs 3 dans 350 mL de milieu liquide 5 dans une spinner flask de 1000 ml. L'ordonnée de gauche correspond aux nombres de vésicules extracellulaires EV produits dans le récipient 4. Chaque colonne correspond à une production de vésicules extracellulaires EV pour différentes vitesses de rotation de l'agitateur 7 dans le récipient 4. L'ordonnée de droite 30 correspond à la longueur LK entraînée pendant la production de vésicules extracellulaires EV, calculée par les formules (1), (2) et (3). Une production 21 significativement élevée de vésicules extracellulaires EV est observable en commandant un écoulement de milieu liquide 5 dans lequel la longueur LK est inférieure à 40 pm par rapport à la production en vésicules extracellulaires EV dans des conditions d'agitation plus faible (production 5 correspondant aux colonnes 125 RPM, 150 RPM et 175 RPM). La figure 4 illustre le nombre de vésicules extracellulaires EV produits dans un système fluidique 1 pour différentes agitations commandées par l'agitateur 7. Des cellules productrices 6 de type MSC (acronyme de cellule 10 souche mésenchymateuse en anglais) sont utilisées, et les microporteurs 3 sont introduits à une concentration de 3 g.L-1 dans 200 mL de milieu liquide 5 dans une spinner flask de 500 ml. L'ordonnée de gauche correspond aux nombres de vésicules extracellulaires EV produits dans le récipient 4. Chaque colonne correspond à une production de vésicules extracellulaires 15 EV pour différentes vitesses de rotation de l'agitateur 7 dans le récipient 4. L'ordonnée de droite correspond à la longueur LK entraînée pendant la production de vésicules extracellulaires EV, calculée par les formules (1), (2) et (3). Une production significativement élevée de vésicules extracellulaires EV est observable en commandant un écoulement de milieu 20 liquide 5 dans lequel la longueur LK est égale à 35 pm (production correspondant à la colonne 175 RPM), par rapport à la production en vésicules extracellulaires EV dans des conditions d'agitation plus faible dans lequel la longueur LK est égale à 50 pm. 25 La figure 5 illustre l'influence de la longueur de Kolmogorov LK sur le nombre de vésicules extracellulaires EV produites. La longueur LK est un paramètre d'échelle concernant la production des vésicules extracellulaires EV. Les carrés (a) correspondent aux productions de vésicules extracellulaires EV illustrées dans la figure 2 pour différentes longueurs LK, 30 les losanges (b) correspondent aux productions de vésicules extracellulaires EV illustrées dans la figure 3 pour différentes longueurs LK et les triangles 22 (c) correspondent aux productions de vésicules extracellulaires EV illustrées dans la figure 4 pour différentes longueurs LK. Une valeur caractéristique de LK caractérisant le changement de pente de la production de vésicules extracellulaires EV en fonction de LK peut être extraite du diagramme de la 5 figure 5, sensiblement égale à LK = 50 pm. Ainsi, pour des valeurs de LK inférieure ou égale à 50 pm, la production de vésicules extracellulaires EV augmente de manière significative. La figure 6 illustre des cellules productrices 6 adhérentes sur la 10 surface de microporteurs 3, en l'occurrence des microbilles 14, suspendus dans le milieu liquide 5, avant l'agitation correspondant à une production de vésicules extracellulaires EV. Des cellules productrices 6 adhérentes à la surface des microporteurs 3 sont visibles et quantifiables. 15 La figure 7 illustre des cellules productrices 6 adhérentes sur la surface de microporteurs 3, en l'occurrence des microbilles 14, suspendus dans le milieu liquide 5, après l'agitation correspondant à une production de vésicules extracellulaires EV. Des cellules productrices 6 adhérentes à la surface des microporteurs 3 sont visibles et quantifiables. La comparaison 20 entre le nombre de cellules productrices adhérentes à la surface des microporteurs 3 avant et après l'agitation pour la production de vésicules extracellulaires EV permet de vérifier que les conditions d'agitation décrite précédemment, par exemple une agitation entraînant un écoulement dans lequel la longueur LK est inférieure à 75 pm et préférentiellement à 50 pm, 25 n'entraînent pas le détachement des cellules productrices 6 des microporteurs 3. La figure 8 illustre le rendement de la production de vésicules extracellulaires EV pour différentes durées d'agitation, pour différentes 30 cellules productrices, et pour différentes conditions d'agitations, correspondant à différentes longueurs LK de l'écoulement commandé par 23 l'agitateur 7. La courbe (a) illustre l'évolution, au cours de l'agitation, du rapport entre le nombre de particules produites (dont des vésicules extracellulaires EV) et entre le nombre de cellules productrices 6 introduites dans le récipient 4, les cellules productrices 6 étant de type MSC 5 murines, et l'écoulement du milieu liquide 5 étant caractérisé par une longueur LK sensiblement égale à 35 pm. La courbe (b) illustre la même évolution, les cellules productrices 6 étant de type MSC humaines, et l'écoulement du milieu liquide 5 étant caractérisé par une longueur LK sensiblement égale à 33 pm. La courbe (c) illustre la même évolution, les 10 cellules productrices 6 étant de type HUVEC, et l'écoulement du milieu liquide 5 étant caractérisé par une longueur LK sensiblement égale à 35 pm. La courbe (d) illustre la même évolution, les cellules productrices 6 étant de type MSC humaines, et l'écoulement du milieu liquide 5 étant caractérisé par une longueur LK sensiblement égale à 35 pm. La courbe (e) illustre la 15 même évolution, les cellules productrices étant de type HUVEC, et l'écoulement du milieu liquide 5 étant caractérisé par une longueur LK sensiblement égale à 50 pm. La courbe (f) illustre la même évolution, les cellules productrices étant de type MSC murines, et l'écoulement du milieu liquide 5 étant caractérisé par une longueur LK sensiblement égale à 50 pm. 20 La courbe (g) illustre la même évolution, les cellules productrices 6 étant de type MSC humaines, et l'écoulement du milieu liquide 5 étant caractérisé par une longueur LK sensiblement égale à 50 pm. La courbe (h) illustre la même évolution, les cellules productrices étant de type MSC murines, et l'écoulement du milieu liquide 5 étant caractérisé par une longueur LK 25 sensiblement égale à 53 pm. Ainsi, des vésicules extracellulaires EV sont produites à des rendement supérieurs à ceux connus, pour une durée de l'agitation supérieure à une demi-heure. La figure 9 illustre le rendement de la production de vésicules 30 extracellulaires EV pour différentes cellules productrices 6, et pour différentes conditions d'agitations, après 240 minutes d'agitation. Les 24 quatre colonnes de gauche illustrent le rendement de la production de vésicules extracellulaires EV en utilisant des cellules productrices 6 de type MSC murines. Le rendement de production pour trois conditions d'agitation, correspondant à une agitation entraînant une longueur LK de 50 pm 5 (première colonne), 47 pm (deuxième colonne) et 35 pm (troisième colonne) est comparé au rendement de production selon la méthode de carence en sérum (ou méthode de starvation ou serum deprivation en anglais). Le rendement de production de vésicules extracellulaires EV dans les conditions LK = 47 pm et LK = 35 pm est significativement plus élevé que 10 dans les conditions LK = 50 pm et de carence en sérum. Trois colonnes illustrent le rendement de la production de vésicules extracellulaires EV en utilisant des cellules productrices 6 de type HUVEC. Le rendement de production pour deux conditions d'agitation, correspondant à une agitation entraînant une longueur LK de 50 pm (quatrième colonne) et 47 pm 15 (cinquième colonne) est comparé au rendement de production selon la méthode de carence en sérum. Le rendement de production de vésicules extracellulaires EV dans la condition LK = 35 pm est plus élevé que dans les conditions LK = 50 pm et de carence en sérum. Les quatre colonnes les plus à droite de la figure illustrent le rendement de la production de vésicules 20 extracellulaires EV en utilisant des cellules productrices 6 de type MSC humaines. Le rendement de production pour trois conditions d'agitation, correspondant à une agitation entraînant une longueur LK de 50 pm (huitième colonne), 35 pm (neuvième colonne) et 33 pm (dixième colonne) est comparé au rendement de production selon la méthode de carence en 25 sérum. Le rendement de production de vésicules extracellulaires EV dans les conditions LK = 35 pm et LK = 33 pm est significativement plus élevé que dans les conditions LK = 50 pm et de carence en sérum. La figure 10 illustre la concentration de cellules productrices 6 30 adhérentes sur les microporteurs 3 avant et après agitation, pour différentes conditions d'agitation. Les colonnes (a) correspondent à la 25 concentration des cellules productrices 6 avant une agitation (JO) pour la production de vésicules extracellulaires EV et une journée après l'agitation (J1), dans des conditions d'agitation dites « fortes », c'est-à-dire lorsqu'on commande l'agitateur 7 pour entraîner un écoulement caractérisé par une 5 longueur LK = 35 pm. Les colonnes (b) correspondent à la concentration des cellules productrices 6 avant une agitation (JO) pour la production de vésicules extracellulaires EV et une journée après l'agitation (J1), dans des conditions d'agitation dites « faibles », c'est-à-dire lorsqu'on commande l'agitateur 7 pour entraîner un écoulement caractérisé par une longueur LK 10 = 50 pm. Aucune diminution significative de la concentration en cellules productrices 6 n'est observable après l'agitation du milieu liquide 5 pour la production de vésicules extracellulaires EV. La figure 11 illustre l'activité métabolique des cellules productrices 15 6 de type HUVEC dans des conditions d'agitation pour la production de vésicules extracellulaires EV. L'agitation du milieu liquide 5 est commandé par un agitateur 7 en rotation à 75 RPM, dans une spinner flask de 1 L, entraînant un écoulement caractérisé par une longueur LK sensiblement égale à 50 pm, pendant 240 minutes. Le métabolisme est mesuré en 20 observant la variation de la longueur d'onde émise par le réactif Alamar blue dans le milieu liquide 5. Aucune baisse significative du métabolisme des cellules productrices 6 n'est observable dans ces conditions d'agitation. La figure 12 illustre le métabolisme des cellules productrices 6 de 25 type HUVEC dans des conditions d'agitation pour la production de vésicules extracellulaires EV. L'agitation du milieu liquide 5 est commandé par un agitateur 7 en rotation à 125 RPM dans une spinner flask de 1 L, entraînant un écoulement caractérisé par une longueur LK sensiblement égale à 35 pm pendant 240 minutes. Le métabolisme est mesuré en observant la variation 30 de la longueur d'onde émise par le réactif Alamar blue dans le milieu liquide 5. Une baisse, voire une disparition du métabolisme des cellules productrice 26 6 est observable au bout de 250 minutes d'agitation. Cette diminution du métabolisme cellulaire n'empêche cependant pas la production de vésicules extracellulaires EV au cours de l'agitation. 5 La figure 13 illustre le métabolisme des cellules productrices 6 de type MSC dans des conditions d'agitation pour la production de vésicules extracellulaires EV. L'agitation du milieu liquide 5 est commandé par un agitateur 7 en rotation à 75 RPM dans une spinner flask de 1 L, entraînant un écoulement caractérisé par une longueur LK sensiblement égale à 50 pm, 10 pendant 240 minutes. Le métabolisme est mesuré en observant la variation de longueur d'onde émise par le réactif Alamar blue dans le milieu liquide 5. Aucune baisse significative du métabolisme des cellules productrices 6 n'est observable dans ces conditions d'agitation. 15 La figure 14 illustre le métabolisme des cellules productrices 6 de type MSC dans des conditions d'agitation pour la production de vésicules extracellulaires EV. L'agitation du milieu liquide 5 est commandé par un agitateur 7 en rotation à 125 RPM dans une spinner flask de 1 L, entraînant un écoulement caractérisé par une longueur LK sensiblement égale à 35 pm 20 pendant 240 minutes. Le métabolisme est mesuré en observant la variation de longueur d'onde émise par le réactif Alamar blue dans le milieu liquide 5. Aucune baisse significative du métabolisme des cellules productrices 6 n'est observable dans ces conditions d'agitation. Ainsi, les conditions de faible agitation, correspondant à une 25 agitation entraînant un écoulement caractérisé par une longueur LK sensiblement égale à 50 pm, permettent de réutiliser les cellules productrices 6 pour des productions de vésicules extracellulaires EV ultérieures. 30 La figure 15 est une microphotographie de vésicules extracellulaires EV produites par des cellules MSC murines par un système fluidique 1. La 27 barre d'échelle correspond à une longueur de 200 nm. La microphotographie est réalisée en utilisant la technique de cryomicroscopie électronique à transmission (cryo-TEM). 5 La figure 16 illustre la distribution du diamètre des vésicules extracellulaires EV produites par le système fluidique 1 mesurée par cryo TEM. La distribution (a) correspond à des vésicules extracellulaires EV produites par des cellules MSC murines avec une agitation entraînant un écoulement caractérisé par une longueur LK sensiblement égale à 35 pm 10 (condition de forte agitation). La distribution (b) correspond à des vésicules extracellulaires EV produites avec une agitation entraînant un écoulement caractérisé par une longueur LK sensiblement égale à 50 pm (condition de faible agitation). Le diamètre médian des vésicules extracellulaires EV produites dans des conditions de faible agitation est supérieure au diamètre 15 médian des vésicules extracellulaires EV produites dans des conditions de forte agitation. La taille des vésicules extracellulaires EV peut être sensiblement comprise entre 30 et 500 nm. La figure 17 illustre la pureté des vésicules extracellulaires EV 20 produites par le système fluidique 1 dans le milieu liquide 5 indiqués par le rapport entre le nombre de particules et la masse de protéines en microgramme. Lors de la production de vésicules extracellulaires EV, différentes entités peuvent être produites par les cellules productrices 6, en l'occurrence des vésicules extracellulaires EV mais aussi des agrégats de 25 protéines. La quantification des particules par analyse du suivi individuel de particules (ou NTA pour Nanoparticle Tracking Analysis) ne permet pas de différencier ces différentes entités : aussi, il est avantageux de quantifier le rapport entre le nombre de particules mesurées par NTA et la masse de protéines produites, définissant la pureté en vésicules extracellulaires EV. 30 Les colonnes (a) illustrée dans la figure 17 correspondent à une production de vésicules extracellulaires EV à partir de cellules productrices 6 de type 28 MSC murines, et les colonnes (b) correspondent à une production de vésicules extracellulaires EV à partir de cellules productrices 6 de type MSC humaines. Les deux colonnes de gauche correspondent à une production de vésicules extracellulaires EV dans des conditions de forte agitation, et les 5 deux colonnes de droite correspondent à une production de vésicules extracellulaires EV selon la méthode de carence en sérum. La pureté en vésicules extracellulaires EV du milieu obtenu après la production est comparable dans les deux méthodes. 10 La figure 18 illustre les propriétés pro-angiogéniques d'un milieu liquide sans sérum 5 comprenant des vésicules extracellulaires EV produites par des cellules MSC murines par le système fluidique 1. Le panneau A de la figure 18 est une photographie d'une surface sur laquelle de cellules de type HUVEC sont adhérentes. Des cellules ont été enlevées d'une partie de 15 la surface (zone sans cellules au milieu de la photographie). Cette photographie est prise au début d'une expérience, au temps t = 0 h, pendant de laquelle les cellules sont recouvertes d'un milieu liquide 5 comprenant des vésicules extracellulaires EV produites par le système fluidique 1. Le panneau B de la figure 18 est une photographie de la même 20 surface, après 4h d'incubation dans le milieu liquide 5 comprenant les vésicules extracellulaires EV. Le panneau C de la figure 18 est une photographie de la même surface, après 9h d'incubation dans le milieu liquide 5 comprenant les vésicules extracellulaires EV. Au cours de l'expérience, les cellules de types HUVEC recouvrent la partie de la surface 25 sur laquelle aucune cellule n'est présente au début de l'expérience. Ainsi, le milieu liquide 5 comprenant les vésicules extracellulaires EV présente des propriétés pro-angiogéniques et/ou pro-prolifératives. La figure 19 illustre les propriétés pro-angiogéniques d'un milieu 30 liquide 5 comprenant des vésicules extracellulaires EV produites par des cellules MSC murines par le système fluidique 1 dans différentes conditions. 29 Chaque colonne illustre le pourcentage normalisé de fermeture des berges entre 0 h (correspondant au panneau A de la figure 18) et 9 h (correspondant au panneau C de la figure 18) pour chaque condition d'incubation. La première colonne (« milieu complet ») correspond à une incubation dans un 5 milieu de culture des cellules HUVEC (correspondant à un contrôle positif). La deuxième colonne (« ctrl neg ») correspond à une incubation dans un milieu liquide 5 (milieu de culture) sans vésicules extracellulaires EV, sans sérum où un volume donné de PBS a été ajouté. La troisième colonne (« forte agitation 10/1 ») correspond à une incubation dans un milieu 10 liquide 5 de culture où le même volume donné de PBS a été ajouté comprenant des vésicules extracellulaires EV produites par un système fluidique 1 dans des conditions de forte agitation, dans lequel la quantité de cellules productrices 6 introduites correspond à 10 cellules productrices 6 MSC murines pour une cellule HUVEC réceptrice. La quatrième colonne 15 (« faible agitation 10/1 ») correspond à une incubation dans un milieu 5 de culture où le même volume donné de PBS a été ajouté comprenant des vésicules extracellulaires EV produites par un système fluidique 1 dans des conditions de faible agitation, dans lequel la quantité de cellules productrices 6 introduites correspond à 10 cellules productrices 6 MSC 20 murines pour une cellule HUVEC réceptrice La cinquième colonne (« lib 10/1 ») correspond à une incubation dans un milieu de culture des cellules HUVEC, déplété en exosomes, la quantité de cellules productrices 6 introduites correspondant à 10 cellules productrices 6 pour une cellule HUVEC réceptrice. La sixième colonne (« stress 10/1 ») correspond à une 25 incubation dans un milieu liquide 5 de culture où le même volume donné de PBS a été ajouté comprenant des vésicules extracellulaires EV produites par carence en sérum, la quantité de cellules productrices 6 introduites correspondant à 10 cellules productrices 6 MSC murines pour une cellule HUVEC réceptrice. Une incubation dans un milieu liquide 5 comprenant des 30 vésicules extracellulaires EV produites dans des conditions de forte 30 agitation (« forte agitation 10/1 ») permet de recouvrir significativement la partie initialement dépourvue de cellules. La figure 20 illustre la prolifération de cardiomyocytes après une 5 journée d'incubation dans différents milieux liquides, mesurée par du bleu de alamar compris dans le milieu d'incubation. La première colonne correspond à une incubation dans un milieu adapté à la culture des cardiomyocytes H9C2 (« milieu complet », contrôle positif). La deuxième colonne correspond à une incubation dans du PBS. La troisième colonne 10 correspond à une incubation dans un milieu liquide 5 comprenant des vésicules extracellulaires EV produites par un système fluidique 1 dans des conditions de forte agitation (« forte agitation 10/1 »), la quantité de cellules productrices 6 introduites correspondant à 10 cellules productrices 6 pour une cellule réceptrice. La quatrième colonne correspond à une 15 incubation dans un milieu liquide 5 comprenant des vésicules extracellulaires EV produites par un système fluidique 1 dans des conditions de faible agitation (« faible agitation 10/1 »), la quantité de cellules productrices 6 introduites correspondant à 10 cellules productrices 6 pour une cellule réceptrice. La cinquième colonne correspond à une incubation 20 dans un milieu de culture des cardiomyocytes, déplété en exosomes (« lib 10/1 »), la quantité de cellules productrices 6 introduites correspondant à 10 cellules productrices 6 pour une cellule réceptrice. La sixième colonne correspond à une incubation dans un milieu liquide 5 comprenant des vésicules extracellulaires EV produites par une méthode de production dans 25 un milieu sans sérum « stress », la quantité de cellules productrices 6 introduites correspondant à 10 cellules productrices 6 pour une cellule réceptrice. Les conditions d'incubation dans un milieu liquide 5 comprenant des vésicules extracellulaires EV produites dans un système fluidique 1 dans des conditions de forte agitation et/ou de faible agitation entraînent une 30 prolifération significativement plus élevée des cardiomyocytes par rapport 31 aux conditions d'incubation dans du PBS, et dans les conditions « exo » et « stress ». La figure 21 illustre la prolifération de cardiomyocytes H9C2 après 5 deux journées d'incubation. Les cardiomyocytes incubés dans un milieu liquide 5 comprenant des vésicules extracellulaires EV produites à partir de cellules productrices 6 de type MSC murines par un système fluidique 1 dans des conditions de faible agitation, dans des conditions de forte agitation, ainsi que par libération spontanée dans un milieu complet déplété en 10 exosomes, prolifèrent significativement plus que des cardiomyocytes incubés dans un milieu présentant une carence en sérum. Les cardiomyocytes incubés dans un milieu liquide 5 comprenant des vésicules extracellulaires EV produites dans des conditions de faible agitation et dans des conditions de forte agitation prolifèrent significativement plus que des 15 cardiomyocytes incubés dans un milieu présentant une carence en sérum. La figure 22 illustre l'effet dose sur la prolifération de cardiomyocytes H9C2 d'une incubation d'un milieu liquide 5 comprenant une concentration variable de vésicules extracellulaires EV produites par un 20 système fluidique 1. L'activité métabolique des cardiomyocytes est mesurée après deux jours d'incubation dans un milieu liquide par bleu de alamar. Le métabolisme des cardiomyocytes est mesuré pour trois conditions d'incubation : dans un milieu liquide 5 comprenant des vésicules extracellulaires EV produites dans des conditions de faible agitation en (a), 25 dans des conditions de faible agitation en (b) et dans un milieu liquide présentant une carence en sérum en (c). La mesure du métabolisme des cardiomyocytes est réalisée, dans les courbes (a) et (b), pour différents rapports entre la concentration de vésicules extracellulaires EV et la concentration de cardiomyocytes, affichés en abscisse. La courbe (a) 30 illustre l'effet dose de la prolifération en présence de vésicules extracellulaires EV : le métabolisme des cardiomyocytes croît lorsque le 32 rapport des concentrations entre vésicules extracellulaires EV et cardiomyocytes croît. La figure 23 illustre la prolifération de cardiomyocytes après deux 5 journées d'incubation en présence d'un milieu liquide 5 comprenant des vésicules extracellulaires EV des cellules MSC murines à une concentration de 100 000 vésicules extracellulaires EV par cardiomyocyte. La prolifération des cardiomyocytes après deux jours est significativement plus élevée quand le milieu liquide 5 d'incubation comprend des vésicules 10 extracellulaires EV produites par un système fluidique 1 dans des conditions de forte agitation ou de faible agitation, par rapport à un milieu liquide comprenant des vésicules extracellulaires EV obtenues par carence en sérum et/ou à un milieu de culture des cardiomyocytes contenant des vésicules extracellulaires EV obtenues libération spontanée dans un milieu 15 complet déplété en exosomes. La figure 24 illustre l'utilisation d'une composition de vésicules extracellulaires EV produites par le système fluidique 1 comme composition pharmaceutique. Une coecostomie est réalisée sur chaque rat d'un groupe 20 de rats. La présence d'excréments est observée à l'orifice d'une fistule formée par la coecostomie, dans trois conditions : une condition de contrôle, une condition correspondant à un traitement par l'application d'un gel comprenant du poloxamère 407 sur l'orifice de la fistule de chaque souris (« gel ») et une condition correspondant à l'application de ce gel 25 comprenant des vésicules extracellulaires EV produites par un système fluidique 1 selon un procédé objet de l'invention, par exemple dans des conditions de forte agitation (« gel + vésicules »). Les colonnes en gris clair correspondent aux orifices de fistules présentant des excréments et les colonnes en gris foncé correspondent aux orifices de fistules ne présentant 30 pas d'excréments. L'application d'un gel comprenant des vésicules extracellulaires EV permet de diminuer significativement la présence 33 d'excréments à l'orifice de la fistule dans ces conditions et entraîne une diminution des cas de fistules productives (qui libèrent des sécrétions intestinales) par rapports aux groupes contrôle et gel sans vésicules. Ainsi, la composition de vésicules extracellulaires EV produite par le système 5 fluidique 1 peut être utilisée en médecine régénérative. La figure 25 illustre l'utilisation d'une composition de vésicules extracellulaires EV produites par le système fluidique 1 comme composition pharmaceutique. Un score est calculé à partir des observations présentées 10 dans la figure 24. Un score égal à 1 est attribué lorsque l'orifice d'une fistule présente des excréments et un score égale à zéro est attribué lorsque l'orifice d'une fistule ne présente pas d'excréments. La figure 25 illustre le score moyen, pour l'ensemble des coecostomies et pour chacune des conditions : contrôle, « gel » et « gel + vésicules ». L'application d'un gel 15 comprenant des vésicules extracellulaires EV entraîne une diminution du score moyen de productivité des fistules par rapports aux groupes contrôle et gel sans vésicules et permet de diminuer significativement la présence d'excréments à l'orifice de la fistule dans ces conditions. Ainsi, REVENDICATIONS1. Système fluidique (1) de production de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices (6), comprenant au moins un récipient (4), un milieu liquide (5) contenu par le récipient (4) et des cellules productrices (6), caractérisé en ce qu'il comprend également des microporteurs (3) en suspension dans le milieu liquide (5), la majorité des cellules productrices (6) étant adhérentes à la surface des microporteurs (3), et un agitateur (7) de milieu liquide (5), l'agitateur (7) et la forme et les dimensions du récipient (4) étant adaptés à la génération d'un écoulement turbulent du milieu liquide (5) dans le récipient (4). 2. Système fluidique (1) selon la revendication 1, dans lequel l'agitateur (7) du milieu liquide (5) et les dimensions du récipient (4) sont 15 adaptés à commander un écoulement du milieu liquide (4), la longueur de Kolmogorov de l'écoulement étant inférieure ou égale à 75 pm. 3. Système fluidique (1) selon la revendication 1 ou 2, comprenant une sortie (9) et une connectique (13) reliée à la sortie (9), la 20 connectique (13) étant susceptible de comprendre du milieu liquide (5) et des vésicules extracellulaires (EV). 4. Système fluidique (1) selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel un agitateur (7) de milieu liquide est un agitateur rotatif dont 25 la ou les vitesses de rotation, la forme et la taille sont adaptées, avec la forme et les dimensions du récipient (4), à la génération d'un écoulement turbulent du milieu liquide (5) dans le récipient. 5. Système fluidique (1) selon l'une des revendications 1 à 4 dans 30 lequel les microporteurs (3) sont des microbilles (14), le diamètre des microbilles (14) étant compris entre 100 pm et 300 pm. 35 6. Système fluidique (1) selon l'une des revendications 1 à 5 comprenant un séparateur (15) de vésicules extracellulaires (EV), relié fluidiquement au récipient (4) de manière à être susceptible de réintroduire 5 dans le récipient (4) un milieu liquide (5) appauvri en vésicules extracellulaires (EV). 7. Procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices (6), comprenant : 10 - une commande d'un agitateur (7) entraînant un écoulement turbulent d'un milieu liquide (5) dans un récipient (4), le récipient comprenant une sortie (9), le milieu liquide (5) comprenant des cellules productrices (6) adhérentes sur la surface de microporteurs (3), les microporteurs (3) étant en suspension dans le milieu liquide (5), et - une collecte du milieu liquide (5) comprenant des vésicules extracellulaires (EV) en sortie (9) du récipient (4). 8. Procédé selon la revendication 7 dans lequel on agite le milieu liquide (5) pendant plus de trente minutes. 9. Procédé selon la revendication 7 ou 8, dans lequel on commande l'agitateur (7) pour entraîner un écoulement du milieu liquide (5), la longueur de Kolmogorov de l'écoulement étant inférieure ou égale à 75 pm, préférentiellement inférieure ou égale à 75 pm. 10. Procédé selon l'une des revendications 7 à 9 dans lequel un séparateur appauvrit une partie du milieu liquide (5) collecté en sortie du récipient (4) en vésicule extracellulaire (EV), et dans lequel on réintroduit la partie du milieu liquide (5) dans le récipient (4). 25 30 36 11. Vésicules extracellulaires (EV) susceptibles d'être obtenues par le procédé selon l'une des revendications 7 à 10. 5 12. Composition pharmaceutique comprenant des vésicules extracellulaires (EV) selon la revendication 11. 13. Composition pharmaceutique selon la revendication 12, pour son utilisation en médecine régénérative. 10