Brevet FR3071315A1 — publié le 20190322

Méthode de quantification d'un extrait de plante à faible dose dans de l'aliment pour bétail La présente invention se rapporte au domaine de l'extraction et de l'analyse des polyphénols, plus particulièrement des anthocyanes. Elle concerne tout particulièrement une méthode d'extraction et d'analyse visant à quantifier au moins une anthocyane issue d'un extrait de plante présent à très faible dose dans une matrice complexe, telle que l'aliment pour bétail. Les anthocyanes sont des flavonoïdes appartenant à la grande famille des polyphénols. Elles sont caractérisées par leur squelette flavylium. Elles sont fabriquées par les plantes pour se protéger et pour leurs propriétés colorées. A titre d'exemple, on peut citer la malvidine-3-0- glucoside, la cyanidine-3-0-glucoside, la delphinidine-3-0-glucoside, la peonidine-3-0- glucoside, la petunidine-3-0-glucoside et la pelargonidine-3-0-glucoside. Elles sont principalement produite par les baies rouges, noires et bleues, telles que le raisin, les fraises, les framboises, les mures, les myrtilles, les cerises et dans certains légumes comme les aubergines. Les polyphénols sont connus pour leurs propriétés antioxydantes (Manach et al. 2004). Des extraits de plantes riches en polyphénols sont utilisés en alimentation animale pour améliorer le statut antioxydant des animaux d'élevage. On retrouve parmi les extraits de plantes communément utilisées en alimentation animale, pour leur contenu en polyphénols, les extraits de raisin, de romarin, de thé ou encore de curcuma. Le 21 février 2017, la Commission Européenne a publié un règlement autorisant l'utilisation d'un extrait de raisin comme additif sensoriel pour l'alimentation animale au sein de l'Union Européenne (Règlement d'exécution 2017/307). Celui-ci comprend au moins 80 % de polyphénols totaux exprimés en équivalent catéchine, au moins 60% de proanthocyanidines, appartenant à la famille des flavonoïdes. Il contient également au moins 0,75% d'anthocyanes et d'anthocyanidines. La dose d'utilisation recommandée est de 5 à 100 grammes de l'extrait de raisin par tonne d'aliment complet distribué à l'animal. Cette très forte dilution dans une matrice extrêmement complexe, composée essentiellement de matière provenant également du règne végétal, rend difficile son identification et sa quantification spécifique dans l'aliment. Les polyphénols sont en effet des métabolites 2 secondaires des plantes et sont relativement ubiquitaires au sein du règne végétal (Bruneton, 2009). Il n'existe pas, à ce jour, de méthode permettant de doser spécifiquement un extrait de plante, contenant des anthocyanes, présent à très faible dose dans une matrice complexe 5 végétale telle que l'aliment complet pour bétail. Or l'absence d'une telle méthode d'analyse représente un point bloquant pour les utilisateurs de ces extraits de plantes et/ou les autorités qui souhaitent vérifier la dose présente dans cette matrice complexe. Certaines méthodes permettent de doser des polyphénols (individuellement ou dans leur totalité) à des doses relativement élevées dans diverses matrices alimentaires (baie entière 10 de raisin, jus de raisin, vin (Xu 2011, Aleixandre-Tudo et al. 2017), mais pas à de faibles doses (5ppm). Ces techniques ne font généralement appel qu'a un seul solvant pour solubiliser de manière non spécifique les analytes d'intérêt, sans opérer de traitement particulier de l'échantillon. Elles ne sont donc pas adaptées au dosage spécifique d'un extrait de plante utilisé à faible dose dans l'aliment pour bétail, tel que l'extrait de raisin concerné 15 par le règlement européen 2017/307. Seul un travail de recherche a mis en évidence une technique de dosage de certains polyphénols de raisins à faible dose dans une matrice alimentaire, non végétale, destinée à l'alimentation humaine (yaourt, Nagy et al, 2009). Malgré le fait qu'elle permette de doser certaines de ces molécules d'intérêt, elle n'est pas applicable pour une recherche de ces 20 composés dans une matrice végétale complexe telle que l'aliment pour bétail. En effet, la composition d'une telle matrice est très éloignée de celle d'un produit laitier. Elle est notamment très riche en toute une diversité de polyphénols issus des différents végétaux qui la composent, dont certains sont identiques aux polyphénols présents dans l'extrait de plante à doser. Afin de parvenir à une analyse quantitative de l'extrait de plante d'intérêt dans 25 l'aliment pour bétail, il est donc nécessaire de doser un phytomarqueur (molécule spécifique, représentative de l'additif) plutôt que l'ensemble des polyphénols de l'extrait de plante. Une telle matrice végétale complexe contient également de nombreuses molécules susceptibles d'interagir avec les polyphénols et/ou de perturber l'analyse. Cet aspect est crucial car la nature végétale de l'aliment pour bétail entraine un besoin de traitement (extraction- 30 purification) de l'échantillon pour l'analyse, couplé à une technique de détection capable de quantifier de très faibles doses de métabolites. 3 Il existe donc clairement un besoin pour un procédé permettant de doser efficacement, justement et de manière répétable les extraits de plantes contenant des polyphénols, dont les anthocyanes, dans les matrices complexes végétales que sont les aliments pour bétail. Les inventeurs ont mis au point des procédés permettant de résoudre tout ou partie des 5 problèmes évoqués ci-dessus, constitués d'une étape d'extraction-purification et d'une seconde étape d'analyse-quantification. Selon un premier aspect, l'invention a pour objet un procédé d'extraction comprenant au moins les étapes suivantes : a. Placer un échantillon à traiter dans au moins un solvant apolaire, ledit échantillon 10 étant une matrice végétale telle que de l'aliment pour bétail, comprenant un extrait de plante à quantifier à hauteur de 1 à 200ppm b. Procéder à au moins une extraction dudit échantillon à traiter sous atmosphère inerte, notamment sous azote c. Placer le même échantillon dans au moins un solvant constitué d'un alcool 15 d. Procéder à au moins une extraction dudit échantillon à traiter sous atmosphère inerte, notamment sous azote e. Récupérer l'extrait liquide obtenu par l'étape précédente, ledit extrait comprenant au moins un solvant et au moins une anthocyane f. Evaporer la totalité du solvant 20 g. Solubiliser l'extrait séché dans un volume connu de solvant polaire acidifié h. Centrifuger ledit extrait re-solubilisé et collecter le surnageant On entend par « échantillon à traiter » tout échantillon de matrice complexe composé, notamment, de matière végétale en grande quantité, et contenant un extrait de plante à quantifier présent à des doses comprises entre 1 et 200 mg/kg. 25 On entend par « extrait de plante à quantifier», un extrait de plante contenant au entre 0,5% et 5% d'anthocyanes totales. On entend par « anthocyane », les composés de type anthocyane et anthocyanidols. A titre d'exemples d'anthocyanes, on peut citer la malvidine-3-0-glucoside, la cyanidine-3-0- glucoside, la delphinidine-3-0-glucoside, la peonidine-3-0-glucoside, la petunidine-3-0- 30 glucoside, la pelargonidine-3-0-glucoside, la malvidine-3-0-(6"-acetyl-glucoside), la 4 malvidine-3-0-(6"-p-coumaroyl-glucoside), la malvidine-3-0-(6"-caffeoyl-glucoside), la cyanidine-3-0-rutinoside et la cyanidine-3-sambubioside. L'anthocyane recherchée par ledit procédé de l'invention doit être présente dans l'extrait de plante à doser et représenter plus de 10% des anthocyanes et anthocyanidines totales de 5 l'extrait et préférentiellement être spécifique de cette plante. Ledit procédé de l'invention utilise au moins un solvant apolaire, choisi parmi le chloroforme, le dichlorométhane, l'hexane et l'acétate d'éthyle, ainsi qu'au moins un alcool, choisis parmi l'éthanol, le méthanol et le butanol. En outre, les rendements d'extractions ont pu être améliorés en modulant les paramètres suivants : température et pression du solvant, 10 nombre d'extractions, durée des extractions, et/ou addition d'un acide dans l'alcool. Dans le procédé selon l'invention, au moins un solvant apolaire est utilisé, choisi parmi chloroforme, le dichlorométhane, l'hexane et l'acétate d'éthyle. Dans le procédé selon l'invention, au moins un alcool est utilisé, choisi parmi - l'éthanol, le méthanol et le butanol ; 15 et - l'alcool utilisé additionné de 0,1% à 5% d'acide, ledit acide étant choisi parmi l'acide formique, l'acide acétique et l'acide trifluoroacétique Selon un mode de réalisation particulier du procédé selon l'invention, le(s) solvant(s) apolaire(s) et le(s) alcool(s) sont portés à une pression supérieure à la pression 20 atmosphérique. En particulier dans une gamme allant de 5 à 150 bars, de préférence dans une plage allant de 50 à 100 bars. Selon un mode de réalisation particulier du procédé selon l'invention, le(s) solvant(s) apolaire(s) et le(s) alcool(s) sont portés à une température supérieure à la température ambiante. En particulier dans une gamme allant de 30°C à 200°C, de préférence dans une 25 plage allant de 30°C à 100°C. Selon un mode de réalisation particulier du procédé selon l'invention, le nombre d'extractions réalisées avec chaque solvant est compris dans une gamme allant de 1 à 10 extractions. 5 Selon un mode de réalisation particulier du procédé selon l'invention, la durée de chaque extraction est comprise entre 1 et 60 minutes, de préférence entre 1 et 15 minutes. Dans le procédé selon l'invention, l'eau utilisée est choisie parmi l'eau osmosée, distillée ou ultrafiltrée. 5 Selon un mode de réalisation particulier du procédé de l'invention, le solvant utilisé pour re- solubiliser l'extrait sec est choisi entre a. de l'eau b. un alcool et c. un mélange d'eau et d'un alcool 10 et est additionné d'un acide a. choisi entre l'acide formique, l'acide acétique et l'acide trifluoroacétique (TFA) b. à des doses comprises entre 0,1% à 5% Dans le procédé selon l'invention, la centrifugation de l'extrait re-solubilisé s'effectue dans une gamme allant de 10000 à 15000 g, pendant 5 à 15 min, préférentiellement 10 min. 15 Selon un deuxième aspect, l'invention a pour objet un procédé d'analyse comprenant au moins les étapes suivantes : a. Préparer une gamme d'ajouts dosés à partir des aliquotes du surnageant additionnés de quantités connues d'une solution mère d'une anthocyane ; et b. Analyser les échantillons en HPLC-MS/MS 20 Dans le procédé selon l'invention, les aliquotes doivent être de volume égal. On entend par « une solution mère d'une anthocyane » une solution de concentration connue d'un standard correspondant à l'anthocyane recherchée. La teneur en anthocyane de la solution mère peut être identifié par l'Homme de Métier au regard de ses connaissances générales et de sa connaissance de la composition de l'échantillon à traiter. En particulier, la 25 concentration d'une telle solution mère se situera dans une gamme allant de 10u.g/mL à 200u.g/m L. 6 On entend par « une gamme d'ajouts dosés » une gamme constituée d'aliquotes dans lesquels on ajoute a. des volumes connus et croissants d'une solution mère d'une anthocyane ; et b. des volumes décroissant d'un mélange d'eau et d'alcool pour obtenir un volume final 5 égal dans la totalité des aliquotes. Le volume de solution mère d'une anthocyane à ajouter à chaque aliquote peut être identifié par l'Homme de Métier au regard de ses connaissances générales. On entend par « Analyser les échantillons HPLC-MS/MS » l'injection d'une partie, de préférence de 1 à 5p.1, de chaque aliquote de la gamme d'ajouts dosés préparés dans un 10 système de chromatographie liquide haute pression couplée à un spectromètre de masse en tandem. Les réglages de l'appareil, ainsi que le couple ion moléculaire - fragment principal de l'anthocyane recherchée et leurs temps de rétention associés peuvent être identifiés par l'Homme de Métier au regard de ses connaissances générales. 7 Exemple d'un mode de réalisation de l'invention : quantification d'un extrait de raisin présent à très faible dose dans de l'aliment pour bétail. La présente invention permet de quantifier l'extrait sec de raisin (additif 2b485) dans un 5 échantillon d'aliment complet pour bétail comprenant l'additif à hauteur de 5 à 100 milligrammes par kilogramme. Le phytomarqueur utilisé dans le présent exemple de réalisation de l'invention est la malvidine-3-0-glucoside (anthocyane). - Masse de l'échantillon à analyser d'aliment pour bétail comprenant l'extrait de raisin d'intérêt: 15,0g 10 - Préparation pré-extraction : o Ajout de terre de diatomée à l'échantillon à analyser o Mise en cartouche d'extracteur automatique sous pression (cartouche de 120m1) selon les recommandations du fabricant. - [tape d'extraction 1 : élimination des composés apolaires indésirables 15 Cette étape constitue un point important dans la méthode car elle permet l'élimination de molécules apolaires, telles que des matières grasses. Elle est nécessaire car écarte une partie importante de la matrice complexe de l'aliment pour bétail et diminue ainsi l'effet de matrice tout en augmentant la spécificité de l'extraction. En outre, l'utilisation d'un extracteur automatique sous-pression est cruciale car elle permet de standardiser l'extraction, et 20 diminue donc drastiquement les variations intra/inter-journalières. o Préparation de l'appareil (nettoyage des voies, mise en pression) selon les recommandations du constructeur o Paramètres d'extraction : - Température d'extraction : 35°C 25 - Pression d'extraction : 100 bars - Solvants utilisés : Dichlorométhane, Acétate d'éthyle o L'extrait liquide obtenu est éliminé. o En fin d'extraction, retirer les cartouches d'échantillons à extraire et nettoyer les voies selon les recommandations du fabricant (solvant et gaz). 30 - [tape d'extraction 2 : extraction des composés d'intérêt : 8 Cette étape constitue l'extraction des analytes recherchés dans l'échantillon d'aliment pour bétail. o Préparation de l'appareil (nettoyage des voies, mise en pression) selon les recommandations du constructeur 5 o Paramètres d'extraction : - Température d'extraction : 35°C - Pression d'extraction : 100 bars - Solvant utilisé : Méthanol acide o L'extrait liquide obtenu est conservé pour la suite de l'analyse. 10 o En fin d'extraction, retirer les cartouches d'échantillons à extraire et nettoyer les voies selon les recommandations du fabricant (solvant et gaz). - Préparation de l'extrait pour analyse : Lors de cette étape, l'extrait liquide obtenu à l'étape précédente est évaporé à sec puis solubilisé dans un volume donné (étape de concentration). Un traitement (centrifugation) de 15 l'échantillon est opéré pour le purifier davantage avant de procéder à l'ajout d'une solution de standard. Ces ajouts dosés servent à établir l'équation nécessaire à la quantification de l'analyte recherché dans l'échantillon étudié. o Evaporer à sec l'extrait liquide, obtenu lors de l'étape précédente, à l'aide d'un évaporateur rotatif (température du bain marie inférieure à 40°C). 20 o Solubiliser l'extrait sec dans 1,5m1 de solvant polaire acide. o Centrifuger. o Prélever 5 aliquotes de 200u.L de surnageant o Préparer une gamme d'ajouts dosés à partir d'une solution mère de standard de Malvidine-3-0-glucoside (CAS 7228-78-6) 25 - Analyse de l'échantillon en chromatographie liquide couplée à de la spectrométrie de masse en tandem (UHPLC-ESI-MS/MS) : L'utilisation de la chromatographie en phase liquide couplée à de la spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) permet de parvenir à une détection de métabolites présents à de très faibles doses dans une matrice relativement complexe du fait des trois critères 30 clés : temps de rétention, rapport masse sur charge de la molécule ionisée et de son (ses) 9 fragment(s). Les étapes de préparations précédentes sont cruciales pour parvenir à réduire au maximum les effets de matrice lors de l'analyse UHPLC-MS/MS. o Colonne UHPLC : Agilent Zorbax SB C18 (100mm x 2,1mm ; 1,7um) o Solvants : 5 - A = Eau/Acide formique (97/3 v/v) - B = Acétonitrile/Eau/acide formique (50/47/3 v/v/v) - C = Acétonitrile (100%) o Gradient : Tableau 1. Temps (min) Solvant A (%) Solvant B (%) Solvant C (%) Débit (glimin) 0 75 25 0 400 0,70 75 25 0 400 1,00 70 30 0 400 2,70 67 33 0 400 2,85 67 33 0 400 3,00 50 50 0 400 4,50 43 57 0 400 4,55 5 95 0 400 5,00 5 95 0 400 5,01 0 0 100 400 9,40 0 0 100 400 9,41 75 25 0 400 13,80 75 25 0 400 Tableau 1. Gradient d'élution de la méthode UHPLC-MS/MS 10 o Volume injecté : 2 pl - Traitement des données obtenues en LC-M52 o Phytomarqueur d'intérêt (malvidine-3-0-glucoside): - SRM : couple ion moléculaire -> fragment = 493->331.1 (m/z) - Temps de rétention spécifique associé: pic à 3.50 min +/-30s 15 o A l'aide d'un logiciel de traitement des données adapté, identifier les pics du phytomarqueur chez les aliquotes analysés, intégrer et extraire les valeurs d'aires sous la courbe correspondantes. o A l'aide d'un logiciel de traitement de feuilles de calculs (type Excel®), pour les valeurs d'aire sous la courbe de chaque analyse, appliquer la formule associée 20 ci-dessous (où V correspond au Volume de la solution de phytomarqueur ajoutée à l'aliquote, en ut Cs1 correspond à la concentration en phytomarqueur de la solution 51, en ug/u.L, et [My] est exprimé en ug/u.L) : 10 [Mv] = V x Cs1 210 o Effectuer une régression linéaire en prenant en compte l'aire sous la courbe associée au phytomarqueur des échantillons analysés ainsi que sa concentration connue [My] dans les aliquotes. o Appliquer alors le calcul ci-dessous (où Vongme correspond à la valeur à l'origine et 5 Coeff.dir correspond au coefficient directeur de la droite de régression, RDTex correspond au rendement de l'extraction et %ACY correspond au pourcentage de l'extrait de plante que représente le phytomarqueur et où X correspond à la concentration en extrait de raisin d'intérêt dans l'aliment testé (en mg par kg)) : Vorigine X = Coeff.dir x 1575000 / RDTex / 1000 / 15 / %ACY Exemple 2 10 Un échantillon d'aliment pour bétail a été analysé à plusieurs reprises pour déterminer la répétabilité de la méthode de dosage présentée ici. La dose de l'extrait de raisin d'intérêt estimée par le fabricant était 5,1ppm (valeur théorique de formulation, sur l'hypothèse un mélange 100% homogène). 8 analyses furent réalisées lors de 3 différentes journées (3 analyses, 3 analyses et 2 15 analyses). Les valeurs obtenues sont présentées dans le tableau 2. Date Concentration Moyenne Coefficient Moyenne Coefficient d'analyse déterminée de journalière de variation globale de variation l'extrait de raisin dans (PPrn) journalier (mg/kg) global l'aliment (mg/kg) Journée 1 6,6 Journée 1 6,0 6,7 11,4% Journée 1 7,5 Journée 2 5,6 5,9 14,4% Journée 2 5,1 5,5 5,6% Journée 2 5,7 Journée 3 6,2 5,5 17,1% Journée 3 4,8 Tableau 2. Résultats obtenus à l'aide de la méthode présentée et variation intra- et inter-journalière associée 11 Les courbes de tendance obtenues à partir des valeurs d'ajouts dosés ont montré une très forte linéarité (R2> 0,99, cf. Figure 1). La valeur moyenne de la teneur en extrait sec de raisin (additif 2b485) dans cet échantillon d'aliment par la méthode présentée ici est de 5,9 ±0,9 ug/g. L'étude de la répétabilité a 5 montré que des valeurs proches étaient obtenues en intra- et inter-journalier. D'autre part, le coefficient de variation intra-journalier est inférieur à 20%, et celui inter-journalier est inférieur à 15%. La précision de la méthode d'analyse est donc fixée à ±20% de marge d'erreur. Enfin, la valeur moyenne obtenue est très proche de la valeur théorique annoncée par le 10 fabricant d'aliment pour bétail. La méthode de dosage présentée ici est donc jugée fidèle et répétable. Remarque : les exemples de réalisation de l'invention présentés ici ont recours à l'utilisation de la malvidine-3-0-glucoside comme anthocyane, mais la méthode fonctionne également pour d'autres anthocyanes (ex : cyanidine-3-sambubioside, données non montrées). 12 Références : Aleixandre-Tudo J-L., Buica A., Nieuwoudt H., Aleixandre J-L., du Toit W., Spectrophotometric Analysis of Phenolic Compounds in Grapes and Wines, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2017, 65, pp 4009-4026) 5 Bruneton J., Pharmacognosie - Phytochimie, Plantes médicinales, 4°Edition (2009), Editions Lavoisier et Tech & Doc 1269 pages Manach C., Scalbert A., Morand C., Rémésy C., Jiménez L., Polyphenols: food sources and bioavailability, The American journal of clinical nutrition, 2004, 79, 727-747 Nagy K., Redeuil K., Bertholet R., Steiling H., Kussmann M., Quantification of Anthocyanins 10 and Flavonols in Milk-Based Food Products by Ultra Performance Liquid Chromatography- Tandem Mass Spectrometry, Anal. Chem. 2009, 81, 6347-6356 Xu Y., Identifications of polyphenols and quantification of anthocyanidins in grapes and grape-derived products, Thèse, 2011 Union Européenne, Règlement d'exécution 2017/307 du 21 février 2017 concernant 15 l'autorisation de l'extrait sec de raisin de Vitis vinifera spp. vinifera en tant qu'additif destiné à l'alimentation de toutes les espèces animales à l'exception des chiens (disponible à l'adresse : https://members.wto.org/crnattachments/2017/SPS/EEC/17_1163_00_f.pdf, consulté le 20/06/17) REVENDICATIONS1. Procédé de quantification d'un extrait de plante contenant au moins une anthocyane contenu dans une matrice végétale complexe, ledit extrait de plante étant présent dans la matrice végétale complexe à des doses comprises entre 1 et 200 mg/kg et contenant entre 0,5% et 5% d'anthocyanes totales, ledit procédé comprenant les étapes : (1) d'extraction d'un échantillon de la matrice végétale complexe, ladite étape d'extraction comprenant les étapes a. placer un échantillon de la matrice végétale complexe à traiter dans au moins un solvant apolaire, b. procéder à au moins une extraction dudit échantillon placé dans au moins un solvant apolaire sous atmosphère inerte, de préférence sous azote, c. placer la matrice végétale non extraite à l'étape b. dans au moins un solvant constitué d'un alcool, d. procéder à au moins une extraction de l'extrait placé dans au moins un solvant constitué d'un alcool sous atmosphère inerte, de préférence sous azote, e. récupérer l'extrait liquide obtenu à l'étape d. comprenant au moins un solvant et au moins une anthocyane, f. évaporer la totalité du solvant pour obtenir un extrait séché, g. solubiliser l'extrait séché dans un volume connu de solvant polaire acidifié, ledit solvant polaire étant choisi entre l'eau, un alcool et un mélange d'alcool et d'eau, h. centrifuger ledit extrait solubilisé, i. collecter le surnageant ; et (Il) de quantification d'au moins une anthocyane dans ledit surnageant. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la matrice végétale complexe est un aliment pour bétail contenant en tant qu'additif un extrait de plante contenant au moins une anthocyane. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que - le solvant apolaire est choisi parmi le chloroforme, le dichlorométhane, l'hexane et l'acétate d'éthyle; - l'alcool est choisi parmi l'éthanol, le méthanol et le butanol et est additionné d'un acide ; - l'eau est choisie parmi l'eau osmosée, distillée ou ultrafiltrée. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'acide contenu dans le solvant polaire acidifié - est choisi dans le groupe comprenant l'acide formique, l'acide acétique et l'acide trifluoroacétique ; - représente entre 0, 1% et 5% du solvant polaire acidifié. 14 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les solvants d'extraction polaire et apolaire sont portés - à une température supérieure à la température ambiante, de préférence entre 30°C et 200°C, de manière tout à fait préférée entre 30°C et 100°C ; et - à une pression supérieure à la pression atmosphérique, de préférence entre 5 et 150 bars, de manière tout à fait préférée entre 50 et 100 bars. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la durée de chaque extraction est comprise entre 1 et 60 minutes, de préférence entre 1 et 15 minutes. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce l'étape (Il) de quantification comprend les étapes j. préparer des aliquotes dudit surnageant additionnées d'une gamme de quantités connues d'au moins une anthocyane ; et k. quantifier au moins une anthocyane en LA-PLC-MS/MS.