Brevet FR3063736A1 — publié le 20180914

Microfibre cellulaire creuse et procédé de fabrication d'une telle microfibre cellulaire creuse L'invention a trait à une microfibre cellulaire creuse présentant une structure, une histologie et des propriétés mécaniques proches de celles de vaisseaux du système vasculaire animal. L'invention a également trait à un procédé de fabrication permettant d'obtenir une telle microfibre cellulaire creuse. L'invention trouve des applications notamment dans le domaine de l'ingénierie tissulaire et des greffes de tissus, pour permettre la vascularisation de tissus, et dans le domaine pharmacologique, pour l'étude notamment de molécules candidates ayant une activité liée à la vascularisation. Depuis plusieurs années, l'ingénierie tissulaire vasculaire s'est développée, avec pour but de recréer artificiellement des vaisseaux sanguins ou lymphatiques, pour permettre notamment la vascularisation de tissus in vitro. Ainsi, une méthode consiste à mouler un hydrogel chargé en cellules autour de tubes à base d' agarose. Les tubes d'agarose sont par la suite retirés, pour créer des réseaux de microtubes (Bertassoni et al., Lab Chip. 2014 Jul 7 ; 14(13) :2202-2211). Une autre technique consiste à couler un gel de collagène sur un tube en gélatine ou polydimethylsiloxane (PDMS), qui est retiré une fois la matrice de collagène gélifiée (Backer et al., Lab Chip. 2013 Aug 21; 13(16) : 3246-3252 et Jimenez-Torres et al., Methods Mol Biol. 2016; 1458 :59-69). Dans tous les cas, la structure obtenue est un bloc d' agarose, collagène ou autre, dans lequel les pseudos-vaisseaux sont formés. Il n'est donc pas possible de les en extraire, pour les greffer et revasculariser des tissus. L'utilisation de ces vaisseaux est ainsi limitée à l'étude in vitro des propriétés anti-angiogéniques, anti-thrombotiques, etc., de molécules d'intérêt. En outre, ces solutions ne permettent pas de tenir compte de la structure et de l'histologie des vaisseaux naturels, ni des contraintes auxquelles ils sont normalement soumis. Une autre approche consiste à former un tube en enroulant sur elle-même une couche de fibroblastes, avant de dévitaliser lesdits fibroblastes. Des cellules musculaires lisses et des cellules endothéliales sont alors cultivées dans le tube, pour reproduire des microfibres cellulaires mimant des vaisseaux sanguins. Le procédé de fabrication de telles microfibres est cependant complexe, nécessitant de multiples manipulations et un temps de développement de plusieurs mois (Peck et al., Materials Today 14(5) :218-224 May 2011). Récemment, des microfibres contenant des cellules endothéliales enveloppées dans une couche d'hydrogel ont été obtenues par co-extrusion (Onoe et al., Nature Materials 31 March 2013). 3063736 2 Ces microfibres ne présentent cependant pas des propriétés mécaniques comparables à celles des vaisseaux sanguins ou lymphatiques. 11 existe donc toujours un besoin en des microfibres cellulaires creuses, qui puissent être individualisées et manipulables et qui présentent une histologie et des propriétés mécaniques 5 proches de celles de vaisseaux sanguins ou lymphatiques naturels. Résumé de l'invention En travaillant sur des nouvelles voies de formation de vaisseaux sanguins et lymphatiques, les inventeurs ont découvert qu'il est possible de fabriquer des microfibres cellulaires creuses reproduisant du point de vue histologique et mécanique des vaisseaux du système vasculaire de 10 mammifères, tel que des vaisseaux sanguins. Plus précisément, les inventeurs ont mis au point un procédé d'encapsulation de cellules endothéliales et de cellules musculaires lisses dans une enveloppe d'alginate, à l'intérieur de laquelle les cellules s'organisent d'elles-mêmes en couches homocentriques autour d'une lumière. Le procédé selon l'invention permet d'obtenir des tubes de longueurs et de diamètres modulables en fonction des besoins. Notamment, il est 15 possible de réaliser des tubes de quelques centimètres et jusqu'à plus de 1 mètre. De même, le diamètre externe des tubes selon l'invention peut varier de 70 p.m à plus de 5 mm, de manière à mimer tout type de vaisseaux sanguins et lymphatiques, depuis les veines jusqu'aux artères. En outre, la lumière s'étend dans toute la longueur du tube, rendant lesdits tubes perfusables. Les vaisseaux ainsi obtenus peuvent être aisément individualisés et manipulés. 20 L'invention a donc pour objet une microfibre cellulaire creuse comprenant successivement, organisées autour d'une lumière - au moins une couche de cellules endothéliales ; - au moins une couche de cellules musculaires lisses ; - une couche de matrice extracellulaire ; et optionnellement 25 - une couche externe en hydrogel. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la microfibre cellulaire est un vaisseau sanguin ou un vaisseau lymphatique. L'invention a également pour objet un procédé de préparation d'une telle microfibre cellulaire creuse, selon lequel une solution d'hydrogel et une solution de cellules comprenant des cellules 3063736 3 endothéliales et des cellules musculaires lisses dans une matrice extracellulaire sont coextrudées de manière concentrique dans une solution de réticulation apte à réticuler au moins un polymère de la solution d'hydrogel. Brève description des figures 5 Figure 1 : Représentation en coupe transversale d'une microfibre cellulaire creuse selon un exemple de réalisation de l'invention, comprenant successivement, depuis l'extérieur vers l'intérieur, une couche externe en alginate (1), une couche de matrice extracellulaire (2), une couche de cellules musculaires lisses (3), une couche de cellules endothéliales (4) et une lumière centrale (5) ; 10 Figure 2 : Représentation schématique d'un système de coextrusion concentrique pouvant être utilisé pour réaliser les microfibres cellulaires selon l'invention, dans lequel une première pompe comprend une solution d'alginate (ALG), une seconde pompe comprenant une solution intermédiaire comprenant du sorbitol (SI), et la troisième pompe comprenant une solution de cellules (C), ces trois solutions étant amenées jusqu'à une pointe de coextrusion et la pointe (6) 15 étant immergée dans un bain de réticulation (7) pour former la microfibre cellulaire creuse (8) ; Figure 3 : Vues au microscope de la structure tubulaire d'une microfibre cellulaire obtenue selon le procédé de l'invention. Juste après la formation du tube (Figure 3A), les cellules sont rondes et disposées à l'intérieur de l'ensemble du tube d'alginate ; Après 1 jour de culture 3D (Figure 3B), les cellules viennent s'ancrer sur les bords internes du tube d'alginate, via la 20 matrice extracellulaire, pour former une lumière à l'intérieur du tube. Description détaillée Microfibre cellulaire creuse L'invention a pour objet des microfibres cellulaires creuses dont l'histologie et les propriétés mécaniques et physiologiques miment celles de vaisseaux du système vasculaire animal, et 25 notamment du système vasculaire des mammifères. Les inventeurs ont réussi à produire in vitro des microfibres à base de cellules musculaires lisses et de cellules endothéliales, dont l'organisation en couches concentriques autour d'une lumière rend lesdites microfibres perfusables. Par « perfusable », on entend dans le contexte de l'invention qu'il est possible d'injecter un fluide dans ladite microfibre, à l'intérieur de laquelle 30 il peut circuler. Avantageusement, les microfibres cellulaires creuses selon l'invention sont également étanches, en ce sens que le fluide injecté dans lesdites microfibres ne s'échappe pas 3063736 4 ou que très faiblement à travers l'épaisseur des microfibres. L'étanchéité d'une microfibre selon l'invention dépend principalement du taux de confluence des cellules dans ladite microfibre. Le taux de confluence peut notamment être adapté en jouant sur le nombre de cellules injectées lors de la formation de la microfibre. En outre, les microfibres selon l'invention sont 5 manipulables, car individualisées. Selon l'invention, la microfibre cellulaire est une structure tubulaire creuse, contenant des couches sensiblement homocentriques, en ce sens qu'elles sont organisées successivement autour d'un même point. Ainsi, la lumière centrale 5 de la microfibre est bordée par la couche de cellules endothéliales 4, qui est entourée par la couche de cellules musculaire lisse 3, elle- 10 même entourée par une couche de matrice extracellulaire 2 et éventuellement une couche externe en hydrogel 1 (figure 1). Une section transversale de la microfibre cellulaire selon l'invention comprend ainsi des couches successives sensiblement concentriques. La lumière est générée, au moment de la formation du tube, par les cellules musculaires lisses et endothéliales qui s'auto-assemblent et s'orientent spontanément par rapport à la couche de 15 matrice extracellulaire. Avantageusement, la lumière contient un liquide et plus particulièrement du milieu de culture. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la microfibre cellulaire creuse comprend une couche externe d'hydrogel. Dans le contexte de l'invention, la « couche externe d'hydrogel » désigne une structure tridimensionnelle formée à partir d'une matrice de chaînes 20 de polymères gonflée par un liquide, et préférentiellement de l'eau. Avantageusement, le ou les polymères de la couche externe d'hydrogel sont des polymères réticulables lorsque soumis à un stimulus, tel qu'une température, un pH, des ions, etc. Avantageusement, l'hydrogel utilisé est biocompatible, en ce sens qu'il n'est pas toxique pour les cellules. En outre, la couche d'hydrogel doit permettre la diffusion d'oxygène et de nutriments pour alimenter les cellules 25 contenues dans la microfibre et permettre leur survie. Les polymères de la couche d'hydrogel peuvent être d'origine naturelle ou synthétique. Par exemple, la couche externe d'hydrogel contient un ou plusieurs polymères parmi les polymères à base de sulfonate, tel que le polystyrène sulfonate de sodium, les polymères à base d'acrylate, tel que le polyacrylate de sodium, le polyéthylène glycol diacrylate, le composé gélatine méthacrylate, les 30 polysaccharides, et notamment les polysaccharides d'origine bactérienne, telle que la gomme gellane, ou d'origine végétale, telles que la pectine ou l'alginate. Dans un mode de réalisation, la couche externe d'hydrogel comprend au moins de l'alginate. Préférentiellement, la couche externe d'hydrogel ne comprend que de l'alginate. Dans le contexte de l'invention, on entend par « alginate » des polysaccharides linéaires formés à partir de P-D-mannuronate (M) et a-L- 3063736 5 guluronate (G), des sels et dérivés de ceux-ci. Avantageusement, l'alginate est un alginate de sodium, composé à plus de 80% de G et moins de 20% de M, avec une masse moléculaire moyenne de 100 à 400 kDa (par exemple : PRONOVA® SLG100) et une à concentration totale comprise entre 0.5% et 5% en masse volumique (poids/volume). 5 La couche externe d'hydrogel peut permettre de renforcer la rigidité de la microfibre cellulaire et ainsi de faciliter sa manipulation. Avantageusement, la couche d'hydrogel comprend des polymères aptes à limiter l'adhésion cellulaire (« cell-repellent »), afin de faciliter le cas échéant la séparation de ladite couche d'hydrogel de la microfibre cellulaire ou sa dégradation sans affecter la structure de la 10 microfibre cellulaire. Dans un mode de réalisation de l'invention, la microfibre cellulaire est dépourvue de couche externe d'hydrogel et comprend directement, en tant que couche la plus externe, une couche de matrice extracellulaire. Préférentiellement, la couche de matrice extracellulaire forme un gel sur la face interne de la 15 couche en hydrogel, c'est-à-dire la face dirigée vers la lumière du microcompartiment. La couche de matrice extracellulaire comprend un mélange de protéines et de composés extracellulaires nécessaires à la culture cellulaire. Préférentiellement, la matrice extracellulaire comprend des protéines structurelles, telles que des laminines contenant les sous-unités al, a4 ou a5, les sous-unités 131 ou 132, et les sous-unités y 1 ou y3, de la vitronectine, des laminines, 20 du collagène, ainsi que des facteurs de croissance, tels que du TGF-béta et/ou de l'EGF. Dans un mode de réalisation, la couche de matrice extracellulaire consiste en, ou contient du Matrigel®, de la Geltrex®, du collagène, et notamment du collagène de type 1 à 19, modifié ou non, de la gélatine, de la fibrine, de l'acide hyaluronique, du chitosan, ou un mélange d'au moins deux de ces composants. 25 Selon l'invention, la microfibre cellulaire comprend des cellules musculaires lisses, organisées en une ou plusieurs couches autour et éventuellement au moins en partie dans la couche de matrice extracellulaire. Les cellules musculaires lisses peuvent être notamment choisies parmi les cellules musculaires lisses vasculaires, les cellules musculaires lisses lymphatiques, les cellules musculaires lisses 30 du tube digestif, les cellules musculaires lisses de bronches, les cellules musculaires lisses de reins, les cellules musculaires lisses de vessie, les cellules musculaires lisses de derme, les cellules musculaires lisses d'utérus et les cellules musculaires lisses de globe oculaire, de 3063736 6 mammifère et notamment humaines. Préférentiellement, les cellules musculaires lisses sont choisies parmi les cellules musculaires lisses d'origine lymphatique ou vasculaire, telles que les cellules musculaires lisses d'artère ombilicale, les cellules musculaires lisses d'artère coronaire, les cellules musculaires lisses d'artère pulmonaire, etc. 5 Dans un mode de réalisation particulier, les cellules musculaires lisses sont des cellules musculaires lisses d'artère coronaire, telles que des cellules musculaires lisses d'artère coronaire humaine. Dans un mode de réalisation particulier, les cellules musculaires lisses sont obtenues à partir de cellules souches induites pluripotentes, qui ont été forcées à se différencier en cellules 10 musculaires lisses. Selon l'invention, l'épaisseur de la ou des couches de cellules musculaires lisses peut varier en fonction de la destination de la microfibre cellulaire. Par « épaisseur », on entend la dimension dans une section transversale de la microfibre s'étendant radialement par rapport au centre de ladite section transversale. Les cellules musculaires lisses permettent la contraction de la 15 microfibre. Il est donc possible d'adapter la force contractile de la microfibre cellulaire, selon qu'elle est destinée à être utilisée en tant que vaisseau sanguin ou vaisseau lymphatique, mais également en fonction de la nature dudit vaisseau reproduit (artère, veine cave, veine, veinule, etc.). L'homme du métier sait quelle est la force contractile attendue en fonction du vaisseau à reproduire et sait ainsi adapter l'épaisseur de la ou des couches de celles musculaires lisses, de 20 même que la nature des cellules musculaires lisses. Avantageusement, la ou les couches de cellules musculaires lisses contient au moins 95% en volume, préférentiellement au moins 96%, 97%, 98%, 99% de cellules musculaires lisses et de matrice produite par lesdites cellules. La ou les couches de cellules musculaires lisses peuvent éventuellement comprendre des cellules endothéliales. Avantageusement, le pourcentage en 25 volume de cellules endothéliales dans la couche de cellules musculaires lisses est inférieur à 5%, préférentiellement inférieur à 4%, 3%, 2%, 1%. Selon l'invention, la microfibre cellulaire creuse comprend une couche de cellules endothéliales, bordant et délimitant la lumière centrale. Les cellules endothéliales peuvent notamment être choisies parmi les cellules endothéliales de 30 la veine de cordon ombilical (UVEC), les cellules endothéliales de microvaisseaux de peau (DMEC), les cellules endothéliales du sang de derme (DBEC), les cellules endothéliales lymphatiques de derme (DLEC), les cellules endothéliales de microvaisseaux de coeur (CMEC), 3063736 7 les cellules endothéliales de microvaisseaux de poumon (PMEC) et les cellules endothéliales de microvaisseaux d'utérus (UtMEC), de mammifères et notamment humaines. Dans un mode de réalisation particulier, les cellules endothéliales sont des cellules endothéliales de la veine de cordon ombilical (UVEC), et notamment des cellules endothéliales de la veine 5 de cordon ombilical humain (HUVEC). Dans un mode de réalisation particulier, les cellules endothéliales sont obtenues à partir de cellules souches induites pluripotentes, qui ont été forcées à se différencier en cellules endothéliales. Avantageusement, la microfibre cellulaire comprend une unique couche de cellules 10 endothéliales. Avantageusement, la ou les couches de cellules endothéliales contient au moins 95% en volume, préférentiellement au moins 96%, 97%, 98%, 99% de cellules endothéliales et de matrice produite par lesdites cellules. La ou les couches de cellules endothéliales peuvent éventuellement comprendre des cellules musculaires lisses. Avantageusement, le pourcentage 15 en volume de cellules musculaires lisses dans la couche de cellules endothéliales est inférieur à 5%, préférentiellement inférieur à 4%, 3%, 2%, 1%. Selon l'invention, il est possible, notamment en fonction de l'utilisation qui sera faite de la microfibre cellulaire creuse, d'utiliser des cellules animales de toute origine, telles que des cellules de souris, des cellules de singe, des cellules humaines, etc. Avantageusement, les 20 cellules utilisées pour réaliser la microfibre cellulaire selon l'invention sont des cellules humaines. Dans un mode de réalisation particulier, le ratio moyen cellules endothéliales / cellules musculaires lisses, en cm2, dans une microfibre cellulaire creuse de l'invention est compris entre 3/1 et 2/1 25 Avantageusement, le diamètre interne de la microfibre cellulaire est compris entre 50 !lm et 500 pin, préférentiellement entre 50 !lm et 200 pin, plus préférentiellement entre 50 !lm et 150 pin, encore plus préférentiellement entre 50 !lm et 100 pin, +/- 10 !lm. Par « diamètre interne », on entend le diamètre de la lumière de la microfibre. Dans un mode de réalisation particulier, le diamètre interne de la microfibre cellulaire est de 100 !lm. Dans un autre mode de réalisation, 30 le diamètre interne est de 70 !lm. 3063736 8 Le diamètre externe de la microfibre cellulaire peut également varier. Par « diamètre externe », on entend le plus grand diamètre de la microfibre. En présence d'une couche externe d'hydrogel, le diamètre externe est avantageusement compris entre 250 !lm et 5 mm. En l'absence de couche externe d'hydrogel, le diamètre externe est avantageusement compris entre 5 70 !lm et 5 mm, préférentiellement entre 70 !lm et 500 pin, plus préférentiellement entre 70 !lm et 200 pin, encore plus préférentiellement entre 70 !lm et 150 pin, +/- 10 !lm. Dans un mode de réalisation particulier, le diamètre externe de la microfibre, en présence de la couche externe d'hydrogel, est de 300 !lm. Dans un mode de réalisation particulier, le diamètre externe de la microfibre, en l'absence de la couche externe d'hydrogel, est de 150 !lm. 10 Dans un mode de réalisation particulier, la microfibre cellulaire selon l'invention comprend une couche externe d'hydrogel de 100 à 150 !lm d'épaisseur, une épaisseur de cellules (cellules endothéliale et cellules musculaires lisses) de 150 à 200 !lm et une lumière de 100 à 150 !lm de diamètre. Avantageusement, la microfibre cellulaire selon l'invention a une longueur, ou plus grande 15 dimension, d'au moins 50 cm, préférentiellement au moins 60 cm, 70 cm, 80 cm, 90 cm, 100 cm, 110 cm, ou plus. Procédé de préparation d'une microfibre cellulaire creuse L'invention a également pour objet un procédé de préparation permettant d'obtenir une microfibre cellulaire creuse selon l'invention. Plus particulièrement, l'invention propose 20 d'encapsuler des cellules endothéliales et des cellules musculaires lisses dans une enveloppe externe d'hydrogel à l'intérieure de laquelle lesdites cellules vont se réorganiser pour former des couches sensiblement concentriques et ménager une lumière centrale. L'encapsulation se fait au moyen d'un procédé de coextrusion concentrique, lors duquel la solution d'hydrogel est coextrudée avec la solution de cellules directement dans un bain de réticulation, ou solution de 25 réticulation, comprenant un agent de réticulation permettant de réticuler l'hydrogel et ainsi de former l'enveloppe externe autour des cellules. Tout procédé d'extrusion permettant de coextruder de manière concentrique de l'hydrogel et des cellules peut être utilisé. Notamment, il est possible de réaliser les microfibres cellulaires selon l'invention en adaptant la méthode et le dispositif microfluidique décrits dans Alessandri 30 et al., (PNAS, September 10, 2013 vol. 110 no.37 14843-14848 ; Lab on a Chip, 2016, vol. 16, no. 9, p. 1593-1604) ou dans Onoe et al., (Nat Material 2013, 12(6):584-90), de manière à ce que l'ensemble des solutions soit coextrudé dans un bain de réticulation, plutôt qu'au-dessus d'un tel bain. Par exemple, le procédé selon l'invention est mis en oeuvre au moyen d'un 3063736 9 dispositif d'extrusion à double ou triple enveloppes concentriques tel que décrit dans le brevet FR2986165. Dans le contexte de l'invention, on entend par «solution de réticulation», une solution comprenant au moins un agent réticulant adapté pour réticuler un hydrogel comprenant au 5 moins un polymère hydrophile, tel que de l'alginate, lorsqu'elle est mise en contact avec celui- ci. La solution de réticulation peut être par exemple une solution comprenant au moins un cation divalent. La solution de réticulation peut également être une solution comprenant un autre agent réticulant connu de l'alginate ou du polymère hydrophile à réticuler, ou un solvant, par exemple de l'eau ou un alcool, adapté pour permettre une réticulation par irradiation ou par toute autre 10 technique connue dans l'art. Avantageusement, la solution de réticulation est une solution comprenant au moins un cation divalent. Préférentiellement, le cation divalent est un cation permettant de réticuler de l'alginate en solution. Il peut s'agir par exemple d'un cation divalent choisi dans le groupe comprenant Ca2±. Mg2+, Ba2+ et Sr2+, ou d'un mélange d'au moins deux de ces cations divalents. Le cation 15 divalent, par exemple le Ca2+, peut être associé à un contre-ion pour former par exemple des solutions de type CaC12 ou CaCO3, bien connues de l'homme du métier. La solution de réticulation peut également être une solution comprenant du CaCO3 couplé à du Glucono deltalactone (GDL) formant une solution de CaCO3-GDL. La solution de réticulation peut également être un mélange de CaCO3-CaSO4-GDL. 20 Dans un mode de mise en oeuvre particulier du procédé selon l'invention, la solution de réticulation est une solution comprenant du calcium, notamment sous la forme Ca2+. L'homme du métier est à même d'ajuster la nature du cation divalent et/ou du contre-ion, ainsi que sa concentration aux autres paramètres du procédé de la présente invention, notamment à la nature du polymère utilisé et à la vitesse et/ ou au degré de réticulation désiré(e). Par exemple, 25 la concentration de cation divalent dans la solution de réticulation est comprise entre 10 et 1000 mM. La solution de réticulation peut comprendre d'autres constituants, bien connus de l'homme du métier, que ceux décrit ci-dessus, afin d'améliorer la réticulation de la gaine d'hydrogel dans les conditions, notamment temps et/ou température, particulières. 30 Avantageusement, les cellules endothéliales ont été préalablement cultivées dans un milieu de culture comprenant des facteurs de croissances de l'endothélium vasculaire (VEGF) de manière 3063736 10 à favoriser la formation d'endothélium et l'angiogenèse. Dans un exemple de réalisation, les cellules endothéliales ont été préalablement cultivées dans du milieu EGM-2®. Avantageusement, les cellules musculaires lisses ont été préalablement cultivées dans un milieu de culture comprenant des facteurs de croissance adaptés à la culture des cellules musculaires 5 lisses, tel que le facteur de croissance transformant 131, le facteur EGF, le facteur bFGF, etc. Dans un exemple de réalisation, les cellules musculaires lisses ont été préalablement cultivées dans du milieu SmGM2® de la société Lonza ou dans un milieu de culture spécifiquement adapté aux cellules musculaires lisses commercialisé par la société Promocell (par exemple le milieu HCASMC®, HAoSMC®, etc.). 10 La solution de cellules utilisée pour la coextrusion comprend des cellules endothéliales et des cellules musculaires lisses en suspension dans de la matrice extracellulaire. Dans un mode de réalisation particulier, la solution de cellules comprend entre 20 et 30% en volume de cellules et entre 70 et 80% en volume de matrice extracellulaire. Le ratio en volume de cellules endothéliales / cellules musculaires lisses dans la solution de 15 cellules est avantageusement compris entre 3/1 et 2/1. Selon le procédé de l'invention, la coextrusion est réalisée de manière à ce que la solution d'hydrogel entoure la solution de cellules. Dans un mode de réalisation particulier, la coextrusion implique également une solution intermédiaire, comprenant du sorbitol. Dans ce cas, la coextrusion est réalisée de manière à ce 20 que la solution intermédiaire soit disposée entre la solution d'hydrogel et la solution de cellules (figure 2A). Dans un mode de mise en oeuvre particulier, la vitesse d'extrusion de la solution d'alginate est comprise entre 1 et 10 ml/h, préférentiellement entre 2 et 5 ml/h, encore plus préférentiellement égale à 3 ml/h et de manière préférée égale à 2 ml/h, +/- 0,5 ml/h. 25 Dans un mode de mise en oeuvre particulier, la vitesse d'extrusion de la solution intermédiaire est comprise entre 0,1 et 5 ml/h, préférentiellement entre 0,5 et 1 ml/h, encore plus préférentiellement égale à 0,5 ml/h, +/- 0,05 ml/h. Dans un mode de mise en oeuvre particulier, la vitesse d'extrusion de la solution de cellules est comprise entre 0,1 et 5 ml/h, préférentiellement entre 0,5 et 1 ml/h, encore plus 30 préférentiellement égale à 0,5 ml/h, +/- 0,05 ml/h. 3063736 11 La vitesse de coextrusion des différentes solutions peut être facilement modulée par l'homme du métier, de manière à adapter le diamètre interne de la microfibre et l'épaisseur de la couche d'hydrogel. Dans tous les cas, la vitesse d'extrusion de la solution d'hydrogel est supérieure à la vitesse 5 d'extrusion de la solution de cellules et éventuellement de la solution intermédiaire. Notamment, la vitesse d'extrusion de la solution d'hydrogel est au moins deux fois, trois fois ou quatre fois supérieure à la vitesse d'extrusion de la solution de cellules. Préférentiellement, les vitesses d'extrusion de la solution de cellules et de la solution intermédiaire sont identiques. 10 Dans un mode de mise en oeuvre particulier du procédé selon l'invention, la vitesse d'extrusion de la solution d'hydrogel est de 2 ml/h, +/- 0,05 ml/h, et la vitesse d'extrusion de la solution de cellules comme de la solution intermédiaire est de 0,5 ml/h, +/- 0,05 ml/h. Dans un autre mode de mise en oeuvre particulier du procédé selon l'invention, la vitesse d'extrusion de la solution d'hydrogel est de 9 ml/h, +/- 0,05 ml/h, et la vitesse d'extrusion de la 15 solution de cellules comme de la solution intermédiaire est de 3 ml/h, +/- 0,05 ml/h. Dans un autre mode de mise en oeuvre particulier du procédé selon l'invention, la vitesse d'extrusion de la solution d'hydrogel est de 3 ml/h, +/- 0,05 ml/h, la vitesse d'extrusion de la solution de cellules est de 2 ml/h, +/- 0,05 ml/h, et la vitesse d'extrusion de la solution intermédiaire est de 1 ml/h, +/- 0,05 ml/h. 20 Dans un autre mode de mise en oeuvre particulier du procédé selon l'invention, la vitesse d'extrusion de la solution d'hydrogel est de 2 ml/h, +/- 0,05 ml/h, et la vitesse de coextrusion de la solution de cellules comme de la solution intermédiaire est de 0,5 ml/h, +/- 0,05 ml/h. Dans un mode de mise en oeuvre particulier du procédé selon l'invention, tel qu'illustré aux figures 2A et 2B, la solution de réticulation, la solution intermédiaire et la solution de cellules 25 sont chargées dans trois compartiments concentriques d'un dispositif de coextrusion, de manière à ce que la solution de réticulation (ALG), formant le premier flux, entoure la solution intermédiaire (SI) qui forme le second flux, qui elle-même entoure la solution de cellules (C) qui forme le troisième flux. La pointe 6 du dispositif d'extrusion, par laquelle sortent les trois flux, débouche dans la solution de réticulation 7, de sorte qu'au sortir de la pointe 6 un tube 8 30 se forme. Le premier flux constitue l'enveloppe externe rigide en hydrogel. Le second flux 3063736 12 constitue l'enveloppe intermédiaire et le troisième flux l'enveloppe interne contenant les cellules. Le procédé selon l'invention permet d' encapsuler des cellules musculaires lisses et des cellules endothéliales dans une gaine externe en hydrogel. De manière surprenante, les inventeurs ont 5 observé qu'après seulement quelques heures, les cellules contenues dans cette gaine d'hydrogel se réorganisent d'elles-mêmes, de telle manière que les cellules endothéliales délimitent une lumière interne longitudinale s'étendant sur toute la longueur de la microfibre cellulaire, et que les cellules musculaires lisses s'orientent vers l'extérieur par rapport à la lumière. La présence de matrice extracellulaire lors de la coextrusion semble nécessaire pour que les cellules puissent 10 s'ancrer à la matrice et ainsi s'étaler, se diviser et proliférer. La matrice permet également de diminuer les risques d' apoptose des cellules à l'intérieur de la microfibre cellulaire, et favorise le phénomène de réorganisation cellulaire au sein de la gaine d'hydrogel. Avantageusement, la microfibre cellulaire obtenue par coextrusion est maintenue dans un milieu de culture adaptée pendant au moins 10h, préférentiellement au moins 20h, encore plus 15 préférentiellement au moins 24h avant d'être utilisée. Ce temps de latence permet avantageusement aux cellules de se réorganiser dans la gaine d'hydrogel de manière à former les couches concentriques autour d'une lumière, telles que décrites ci-dessus. Selon l'invention, il est possible d'utiliser directement la microfibre cellulaire creuse obtenue par coextrusion, c'est-à-dire une microfibre comprenant une gaine d'hydrogel, ou de procéder 20 à une hydrolyse de ladite gaine afin de récupérer une microfibre exempte d'hydrogel. Applications Les microfibres cellulaires creuses objets de la présente invention peuvent être utilisées pour de nombreuses applications, notamment à visées médicales ou pharmacologiques. Les microfibres cellulaires selon l'invention peuvent notamment être utilisées pour des tests 25 d'identification et/ou de validation de molécules candidates ayant une action sur tout ou partie du système vasculaire, et notamment sur les vaisseaux sanguins ou lymphatiques. Par exemple, de telles microfibres peuvent être utilisées pour tester les propriétés anti-angiogéniques, antithrombotiques, régulatrices de la tension artérielle, de transport de gaz dans le sang, etc., de molécules candidates. 30 Les microfibres cellulaires creuses selon l'invention peuvent également être utilisées en ingénierie tissulaire, afin de vasculariser des échantillons de tissus biologiques de synthèse et 3063736 13 augmenter ainsi leur viabilité. De tels échantillons de tissus vascularisés peuvent être utilisés par exemple par les industries pharmaceutiques et cosmétiques, afin de réaliser des tests in vitro, notamment en alternative aux tests sur animaux. De même, les microfibres cellulaires creuses selon l'invention peuvent être utilisées en 5 médecine régénératrice, afin de permettre la vascularisation d'organes de synthèses, tels que des tissus de peau, de cornée, de foie, etc. obtenus par impression 3D ou autre, avant de les greffer dans un sujet. EXEMPLES 10 Exemple 1 : Protocole d'obtention d'une microfibre cellulaire creuse Matériel & méthode Cellules .- Cellules endothéliales de cordon ombilical humain (HUVEC) cultivées dans un milieu de culture comprenant du VEGF en passage 3 (p3), 4 (p4) ou 5 (p5), fournies à l'état cryopréservé 15 dans de l'azote liquide à -80°C sous la référence c-12205 par la société PromoCell®. Cellules musculaires lisses d'artère coronaire humaine, en passage 2 (p2), fournies à l'état cryopréservé dans de l'azote liquide à -80°C sous la référence CC-2583 par la société Lonza. Milieux : Milieu de culture des cellules endothéliales : Promocell EGM2® kit (ref C-22111) (milieu à 20 +4°C et compléments à -20°C). Milieux pour détacher les cellules endothéliales : Detach KIT® [Hepes BSS (30 mM HEPES) + Trypsin / EDTA Solution (0.04 % / 0.03 %) + Trypsin Neutralizing Solution (TNS)] de la société PromoCell (ref C-41210). Milieu de congélation des cellules endothéliales : Cryo-SFM de la société PromoCell (ref C- 25 29912). Milieu de culture des cellules musculaires lisses : SmGm2-bullet® kit de la société Lonza (ref CC-3182) (milieu à +4°C et compléments à -20°C). 3063736 14 Milieu pour détacher les cellules musculaires lisses : Detach KIT® de la société PromoCell (ref C-41210). Milieu de congélation des cellules musculaires lisses : Cryo-SFM de la société PromoCell (ref C-29912). 5 Solutions .- Solution de réticulation : CaC12 100mM Solution intermédiaire : Sorbitol 300mM Solution d'hydrogel : alginate 2,5% w/v (LF200FTS) dans 0,5mM SDS Matrice extracellulaire : Matrigel® classique (sans rouge phénol et avec facteurs de croissance) 10 Traitement des cellules endothéliales HUVEC : Amplification Des cellules HUVEC au stade p3 sont décongelées et amplifiées selon les protocoles usuels jusqu'au stade p5, p6 ou p7, la coextrusion étant réalisée avec des cellules entre les stades p5 et P7. 15 Traitement des cellules musculaires lisses (SMC) : Amplification Les cellules SMC au stade p2 sont décongelées, puis cultivées selon les protocoles usuels jusqu'au stade p5, p6 ou p7, la coextrusion étant réalisée avec des cellules entre les stades p5 et P7. 20 Système de coextrusion - 3 seringues hamilton 12m1 contenant respectivement de l'alginate 2,5% et les deux autres du sorbitol 300 mM stériles -tuyau strandard Teflon de diamètre 13 - pompe à seringues neMESYS® (de la société Cetoni) et logiciel associé 3063736 15 - puce d'injection imprimée en 3D (voir publication Ales sandri K et al., 2016) Procédé d'extrusion - Reprendre 30 pl de cellules (1/2 SMC et 1/2 HUVEC) dans 600 de Matrigel® - procéder à la coextrusion des trois solutions selon la méthode décrite dans Alessandri et al., 5 2016 (Figure 2A) avec comme vitesses d'extrusion 2m1/heure pour alginate et 0,5m1/h pour la solution de sorbitol et la solution de cellules, en maintenant la pointe du dispositif d'extrusion immergée dans la solution de réticulation (figure 2B). Résultats La coextrusion des trois solutions dans une solution de Ca2+ telle que décrite ci-dessus a permis 10 d'obtenir des tubes, ou microfibres cellulaires creuses, d'environ 1 mètre de longueur et de diamètre externe 300 !lm. Après 24h (figure 3B), les cellules se sont réorganisées et auto-as semblées à l'intérieur du tube d'alginate de manière à créer une lumière centrale de diamètre environ 150 !lm. Le tube comprend alors successivement, et organisées de manière concentrique autour de la lumière, une couche de cellules HUVEC, une couche de cellules 15 SMC, une couche de Matrigel® et une couche d'alginate réticulée. Exemple 2 : Caractérisation des microfibres cellulaires creuses Les microfibres cellulaires creuses obtenues à l'exemple 1 ont été caractérisées aux moyens de marqueurs spécifiques par immunofluorescence et microscopie confocale. La réorganisation 20 des cellules à l'intérieur de l'enveloppe d'alginate a été suivie par vidéomicroscopie. Matériel & méthode Immunomarquage : Les microfibres cellulaires, ou tubes, ont été fixées à des temps différents (J1/J5), avec 4% paraformaldéhyde dilué dans du DMEM sans rouge phénol (PAN), toute la nuit à 4°C. 25 Les cellules des tubes ont alors été perméabilisées (30 min en triton 1% dans du DMEM sans rouge phenol, à température ambiante sous agitation). Les sites non spécifiques des cellules ont 3063736 16 été saturés pendant une heure à 4°C dans une solution de BSA1%/SVF2% (bovine serum albumine et serum de veau foetal). Les microfibres cellulaires ont ensuite été mises en présence d'anticorps primaires spécifiques, dirigés chacun contre une protéine d'intérêt : 5 CD3 1 : marqueur spécifique des membranes des cellules endothéliales aSMA (alpha smooth muscle actine) : marqueur spécifique du cytosquelette des SMC VE-Cadhérine : marqueur spécifique des jonctions cellulaires endothéliales et de la formation d'un endothélium imperméable tubuline : marqueur spécifique ducytosquelette 10 K167 : marqueur spécifique de la prolifération cellulaire aCaspase3 : marqueur spécifique de l'apoptose. L'anticorps primaire a été dilué au 1/100ème dans du DMEM sans rouge phénol + 1%BSA/2%SVF toute la nuit sous agitation à 4°C. Après 2x15min de lavage en DMEM sans rouge phénol, les tubes ont été incubés avec un anticorps secondaire (qui va reconnaitre 15 spécifiquement l'anticorps primaire) couplé à un fluorochrome, dilué au 1/1000ème dans du DMEM sans rouge phénol + 1%BSA/2%SVF pendant lh à température ambiante. Après 2x15min de lavages en DMEM sans rouge phénol, les tubes ont été analysés en microscopie confocal pour visualiser la fluorescence. Résultats : 20 - J1 : un jour après formation du tube, les cellules sont organisées de la manière suivante : SMC (marqueur aSMA spécifique, alpha Smooth Muscle Actine) côté Matrigel® et HUVEC (marqueur CD3 1 spécifique) côté lumière. Les deux types cellulaires prolifèrent (marqueur K167 positif) et ne présentent que très peu de mort cellulaire (peu de marquage caspase 3 spécifique). 25 - J5: 5 jours après formation du tube, les jonctions cellulaires deviennent serrées : le contour cellulaire des HUVEC est beaucoup plus visible avec des cellules de plus en plus rapprochées. Ce phénomène correspond à l'« endothélialisation », c'est-à-dire la formation d'un endothélium dont la fonction est de devenir étanche. De plus, à J5, les cellules arrêtent de proliférer (perte du signal K167) mais ne meurent pas pour autant (pas d'augmentation du signal 30 caspase 3), ce qui indique que les cellules entrent en quiescence, comme c'est le cas dans un endothélium vasculaire humain normal. 3063736 17 Exemple 3 : Evaluation de la capacité de perfusion des microfibres cellulaires creuses La perfusabilité des microfibres a par ailleurs été évaluée en les reliant à un système d'injection comprenant des solutions fluorescentes. Un système de perfusion des microfibres cellulaires creuses a été mis au point en utilisant des 5 pipettes Pasteur en verre étirées sous la flamme jusqu'à avoir un diamètre correspondant au diamètre interne des microfibres cellulaires, soit 1501..tm. Les pipettes étirées ont été connectées à une seringue contenant du milieu de culture (EGM2® Promocell), elle-même branchée à un pousse-seringue pour permettre la perfusion de liquide à une vitesse physiologique de 501..IL/min. La vitesse de perfusion peut varier en fonction du diamètre interne de la microfibre 10 cellulaire. Les microfibres cellulaires sont coupées en morceaux de quelques centimètres de long et sont placées dans du milieu de culture en boite de pétri 3cm, sous une loupe binoculaire. Elles sont alors raccordées à la pointe des pipettes Pasteur étirées. Le système complet (microfibre cellulaire /milieu de culture, pipette étirée, seringue) est ensuite 15 remis en culture (incubateur 37°C, 5% de CO2) et permet la perfusion de milieu EGM2® en permanence dans les tubes vasculaires. Un système de perfusion identique a été utilisé pour vérifier l'étanchéité des microfibres cellulaires. 2001..IL de traceur fluorescent ont été injectés à l'intérieur des microfibres cellulaires selon l'invention (HUVEC + SMC), de même qu'à l'intérieur de microfibres cellulaires ne 20 comprenant que des cellules endothéliales et à l'intérieur d'un tube d'alginate (Fluorescein isothiocyanate FITC-dextran de 500kDa ou 20 kDa Sigma-Aldrich) à une vitesse physiologique de 501..11/min. La vitesse de diffusion de chaque traceur fluorescent à travers l'alginate a été filmée et quantifiée. 25 Résultats - Contrôle négatif (tube d'alginate sans cellule + FITC-Dextran 500kDa) : les molécules de Dextran, de haut poids moléculaire, ne passe pas à travers les pores de l'alginate ; - Contrôle positif (tube d'alginate sans cellule + FITC-Dextran 20kDa) : les molécules de Dextran, de faible poids moléculaire, diffuse facilement à travers les pores de l'alginate ; 3063736 18 - Microfibre alginate / HUVEC/SMC selon l'invention + FITC Dextran 20kDa : les molécules de Dextran, de faible poids moléculaire, ne diffusent pas ou très peu à travers les couches de cellules, qui rendent la microfibre étanche ; - Microfibre HUVEC/SMC selon l'invention (après hydrolyse de la couche externe d'alginate) 5 + FITC Dextran 20kDa : la vitesse de diffusion des molécules de Dextran à travers les couches de cellules est proche de celle observée pour la microfibre selon l'invention comprenant encore la couche externe d'alginate. Ainsi, même en l'absence de la couche externe d'alginate, la structure, la perfusabilité et l'étanchéité de la microfibre cellulaire creuse selon l'invention du tube sont maintenues. 10 REVENDICATIONS1. Microfibre cellulaire creuse comprenant successivement, organisées autour d'une lumière - au moins une couche de cellules endothéliales ; - au moins une couche de cellules musculaires lisses ; - une couche de matrice extracellulaire ; et optionnellement - une couche externe en hydrogel. 2. Microfibre cellulaire creuse selon la revendication 1, dans laquelle la couche externe en hydrogel comprend de l'alginate. 3. Microfibre cellulaire creuse selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle le ratio en cm2 cellules endothéliales / cellules musculaires lisses dans la microfibre cellulaire creuse est compris entre 3/1 et 2/1. 4. Microfibre cellulaire creuse selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle les cellules endothéliales sont choisies parmi les cellules endothéliales de la veine de cordon ombilical (UVEC), les cellules endothéliales de microvais seaux de peau (DMEC), les cellules endothéliales du sang de derme (DBEC), les cellules endothéliales lymphatiques de derme (DLEC), les cellules endothéliales de mirovaisseaux de coeur (CMEC), les cellules endothéliales de microvaisseaux de poumon (PMEC), les cellules endothéliales de microvaisseaux d'utérus (UtMEC) de mammifère. 5. Microfibre cellulaire creuse selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle les cellules musculaires lisses sont choisies parmi les cellules musculaires lisses vasculaires, les cellules musculaires lisses lymphatiques, les cellules musculaires lisses du tube digestif, les cellules musculaires lisses de bronches, les cellules musculaires lisses de reins, les cellules musculaires lisses de vessie, les cellules musculaires lisses de derme, les cellules musculaires lisses d'utérus, les cellules musculaires lisses de globe oculaire de mammifère. 6. Microfibre cellulaire creuse selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle les cellules endothéliales et/ou les cellules musculaires lisses ont été obtenues à partir de cellules souches induites à la pluripotence (IPS) 3063736 20 7. Microfibre cellulaire creuse selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle le diamètre interne est compris entre 50 p.m et 500 pm, préférentiellement entre 50 p.m et 200 pm, plus préférentiellement entre 50 p.m et 150 pm, encore plus préférentiellement entre 50 p.m et 70 pm, +/- 10 p.m. 5 8. Microfibre cellulaire creuse selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle le diamètre externe, en présence de la couche externe d'hydrogel, est compris entre 250 p.m et 5 mm, et le diamètre externe en l'absence de la couche d'hydrogel est compris entre 70 p.m et 5 mm, préférentiellement entre 70 p.m et 500 pm, plus préférentiellement entre 70 p.m et 200 pm, encore plus préférentiellement entre 70 p.m et 150 pm, +/- 10 p.m. 10 9. Microfibre cellulaire creuse selon l'une des revendications 1 à 8, ladite microfibre cellulaire étant un vaisseau sanguin. 10. Microfibre cellulaire creuse selon l'une des revendications 1 à 8, ladite microfibre cellulaire étant un vaisseau lymphatique. 11. Procédé de préparation d'une microfibre cellulaire creuse selon l'une des revendications 1 15 à 10, selon lequel une solution d'hydrogel et une solution de cellules comprenant des cellules endothéliales et des cellules musculaires lisses dans une matrice extracellulaire sont coextrudées concentriquement dans une solution de réticulation apte à réticuler l'alginate. 12. Procédé de préparation d'une microfibre cellulaire creuse selon la revendication 11, selon lequel la solution de cellules comprend entre 20 et 30% en volume de cellules et entre 70 et 20 80% en volume de matrice extracellulaire. 13. Procédé de préparation d'une microfibre cellulaire creuse selon la revendication 11 ou 12, selon lequel le ratio en volume de cellules endothéliales / cellules musculaires lisses dans la solution de cellules est compris entre 3/1 et 2/1. 14. Procédé de préparation d'une microfibre cellulaire creuse selon l'une des revendications 11 25 à 13, selon lequel la vitesse d'extrusion de la solution de cellules est comprise entre 0,1 et 5 ml/h, préférentiellement entre 0,5 et 1 ml/h, encore plus préférentiellement égale à 0,5 ml/h, +10,05 ml/h, et/ou la vitesse d'extrusion de la solution d'alginate est comprise entre 1 et 10 ml/h, préférentiellement entre 2 et 5 ml/h, encore plus préférentiellement égale à 3 ml/h, +/- 0,5 ml/h. 15. Procédé de préparation d'une microfibre cellulaire creuse selon l'une des revendications 11 à 14, selon lequel une solution intermédiaire, comprenant du sorbitol, est co-extrudée entre la solution d'alginate et la solution de cellules, la vitesse d'extrusion de la solution intermédiaire 3063736 21 étant préférentiellement comprise entre 0,1 et 5 ml/h, préférentiellement entre 0,5 et 1 ml/h, encore plus préférentiellement égale à 0,5 ml/h, +/- 0,05 ml/h. 16. Procédé de préparation d'une microfibre cellulaire creuse selon l'une des revendications 11 à 15, comprenant l'étape supplémentaire consistant à hydrolyser la couche externe en alginate 5 après formation du vaisseau.