Brevet FR3068710A1 — publié le 20190111

PROCÉDÉ DE RÉTABLISSEMENT DE LA REPRODUCTION SEXUÉE CHEZ LE CHAMPIGNON TRICHODERMA REESEI La présente invention concerne un procédé de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles du champignon Trichoderma reesei. Trichoderma reesei (T. reesei) est une espèce de champignon filamenteux cellulolytique, du genre Trichoderma, qui a été découvert pendant la Seconde Guerre mondiale dans le Pacifique Sud. Ce champignon a la capacité de sécréter une grande quantité d'enzymes cellulosiques (cellulases et hémicellulases), et il est aujourd'hui principalement utilisé dans le cycle de production des biocarburants de deuxième génération. En effet, les enzymes produites par ce champignon sont particulièrement utiles pour la transformation des matières de la biomasse végétale en bioproduits utiles à l'industrie, tels que le bioéthanol. Les biocarburants de deuxième génération (issus de ressources non alimentaires) sont particulièrement d'intérêt de nos jours, étant donné que les biocarburants de première génération (issus de ressources alimentaires) ne peuvent être produits qu'en quantité limitée, dans la mesure où ils rentrent en concurrence avec la production alimentaire. Le procédé de production des biocarburants de deuxième génération comprend quatre étapes principales : le prétraitement de la biomasse lignocellulosique, l'hydrolyse enzymatique de la biomasse lignocellulosique, la fermentation et la distillation. Même si toutes les étapes de la production des biocarburants de deuxième génération peuvent et doivent être optimisées -afin d'augmenter la production-, un effort particulier est porté sur l'étape d'hydrolyse enzymatique. Cette étape d'hydrolyse met en jeu les enzymes de type cellulase produites par le champignon filamenteux T. reesei. De manière plus générale, Trichoderma reesei peut être utilisé comme souche plateforme pour la production de protéines d'intérêt industrielles homologues ou hétérologues. Afin d'optimiser les performances de Trichoderma reesei, il est essentiel d'améliorer les souches de Trichoderma reesei produisant les protéines d'intérêt. Parmi les méthodes d'améliorations envisagées pour une diminution du coût de l'hydrolyse, l'ingénierie génétique de T. reesei est ainsi une solution. Elle permet d'améliorer les performances de sécrétion du champignon filamenteux producteur de cellulases, les propriétés des enzymes et de maitriser la stabilité des souches en conditions industrielles. La mutagénèse est une technique communément utilisée en génie génétique. Elle vise à introduire volontairement des mutations dans l'ADN afin de créer des gènes génétiquement 2 modifiés. Ceci peut permettre de générer des souches aux caractéristiques intéressantes d'un point de vue industriel. Il existe deux méthodes de mutagénèse couramment utilisées pour introduire des mutations chez T. reesei : la mutagénèse aléatoire et la mutagénèse dirigée. La mutagénèse aléatoire consiste à induire des mutations non ciblées, n'importe où 5 dans l'ADN. Ces mutations sont provoquées par l'exposition de l'organisme cible à des agents chimiques mutagènes ou à des radiations. Etant donné que les mutations sont un phénomène naturel, la mutagénèse aléatoire est donc considérée comme un accélérateur de ce processus naturel et les organismes ainsi obtenus sont considérés comme naturels et non comme organismes génétiquement modifiés (OGM) ; ils ne sont donc pas soumis à 10 l'obligation de traçabilité. Cependant, cette méthode engendre en plus de la mutation responsable du caractère d'intérêt, un grand nombre de mutations indésirables dites « collatérales » qui contribuent, en s'accumulant, à l'instabilité, à la mauvaise santé, voire à la létalité de l'organisme muté. La mutagénèse dirigée permet d'introduire des mutations identifiées dans un gène 15 précis. Pour ce faire, l'ADN d'intérêt contenant les mutations est synthétisé puis introduit dans la cellule à muter où le mécanisme de réparation de l'ADN s'occupe de l'intégrer dans le génome. L'utilisation d'un marqueur de sélection permet d'identifier les cellules ayant intégré la mutation de celles qui ne l'ont pas intégrée. Cependant, les organismes ayant subi cette mutagénèse sont considérés comme des OGM (en raison de l'introduction d'ADN exogène), 20 et sont donc soumis à une obligation de traçabilité. Dans le cas de l'utilisation de T. reesei pour la production de biocarburants de deuxième génération, l'amélioration de l'étape d'hydrolyse, via l'introduction de mutations (aléatoires ou dirigées) chez T. reesei n'est donc pas satisfaisante, en raison de l'accumulation des mutations indésirables que cela entraine, ou bien en raison de l'introduction d'ADN 25 exogène. Il existe donc un besoin pour une nouvelle méthode d'amélioration de l'étape d'hydrolyse. Les inventeurs de la présente invention ont ainsi développé une nouvelle méthode d'amélioration des performances de T. reesei en utilisant la reproduction sexuée de T. reesei. A ce jour la reproduction sexuée de T. reesei n'a jamais été utilisée comme outil 30 d'amélioration car T. reesei a toujours été considéré comme ne pouvant pas faire de reproduction sexuée. Néanmoins la découverte d'une sexualité chez T. reesei (Seidl et al., 2009) a ouvert de nouvelles possibilités d'amélioration génétique des souches. La reproduction sexuée permet, entre autres, de créer de la diversité génétique, de conserver les mutations bénéfiques et de supprimer du génome les mutations « collatérales ». 3 T. reesei est un champignon dit hétérothallique, c'est-à-dire que la reproduction sexuée n'est possible qu'entre individus de type-sexuel compatibles (MAT]-] et MAT] -2). De plus, T. reesei est hermaphrodite, c'est-à-dire qu'une souche produit à la fois des organes sexuels femelle et mâle (Figure 1). 5 La reproduction sexuée entre deux isolats naturels, fertiles et compatibles, de T. reesei donne lieu à des stromata qui contiennent la descendance (Figure 2A). Afin de tester la reproduction sexuée sur les souches industrielles, une souche QM6a MAT]-] a été construite par ingénierie génétique (Seidl et al., 2009). La reproduction sexuée entre les souches QM6a compatibles ne permet pas d'obtenir de stromata car ces souches sont 10 femelles stériles (Figure 2B) (Seidl et al., 2009). Toutes les souches industrielles existantes connues de T. reesei ont été générées à partir de la souche naturelle QM6a. Etant donné que la souche naturelle QM6a est de type sexuel MAT]-2, toutes les souches industrielles de T. reesei sont aujourd'hui de type sexuel MAT]-2, et sont femelles stériles mais mâles fertiles. 15 La reproduction sexuée peut être un outil d'amélioration rapide et efficace, mais si elle ne peut pas avoir lieu entre les souches industrielles, son utilité reste limitée. Des études scientifiques ont tenté de comprendre pourquoi les souches industrielles de T. reesei sont femelles stériles et comment y remédier. Ces recherches ont permis d'identifier le gène idcl comme déterminant de la stérilité femelle et montrent que le remplacement du gène 20 défectueux par un gène fonctionnel permet de rétablir la fertilité femelle de la souche QM6a et de réaliser une reproduction sexuée (Kubicek et al., 2014 (W02014/102241) ; Linke et al., 2015). Néanmoins, cette stratégie présente un inconvénient majeur. En effet, cela nécessite d'introduire le gène fonctionnel dans chacune des souches industrielles à reproduire pour 25 pouvoir rétablir la fertilité femelle des souches industrielles. D'autre part, cette stratégie ne prend pas en compte le fait que les souches industrielles sont issues de mutagénèses successives et qu'il est possible que d'autres gènes importants pour la fertilité femelle aient été modifiés. Ainsi, l'apport du gène idcl fonctionnel ne sera pas suffisant pour rétablir la fertilité femelle et ainsi rétablir la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de 30 T. reesei. Ainsi, être capable de rétablir la fertilité femelle dans la souche QM6a, ne signifie pas qu'elle pourra être rétablie dans les souches industrielles générées à partir de ladite souche QM6a. Il existe donc un besoin pour une méthode permettant de rétablir la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de T. reesei, notamment la souche QM6a ou les 4 souches industrielles femelles stériles dérivées de la souche QM6a ou toute autre souche femelle stérile de T. reesei. Les inventeurs de la présente invention ont ainsi mis au point une stratégie de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de T. reesei qui 5 ne nécessite ni d'introduire dans les souches femelles stériles une version fonctionnelle du gène idcl, qui ne nécessite pas de vérifier si la présence d'une version fonctionnelle du gène idcl est ou non suffisante pour rétablir la reproduction sexuée, ni même d'avoir à identifier et remplacer les autres gènes qui pourraient être défectueux. Les inventeurs de la présente invention ont ainsi développé une stratégie de rétablissement de la reproduction sexuée entre 10 deux souches femelles stériles de T. reesei qui est simple et efficace à mettre en place. La présente invention repose en effet sur les résultats des inventeurs selon lesquels l'utilisation d'une souche assistante 2I MAT (c'est-à-dire une souche femelle fertile de T. reesei dans laquelle le locus du type sexuel, soit MAT]-] ou MAT1-2, a été invalidé) en combinaison 15 avec un arrosage séquentiel des conidies d'une souche femelle stérile de T. reesei d'un premier type sexuel, puis des conidies d'une souche femelle stérile de T. reesei d'un deuxième type sexuel permettait de rétablir la reproduction sexuée entre ces deux souches femelles stériles. 20 L'utilisation d'une souche assistante a déjà été utilisée mais pas chez l'espèce T. reesei (Silar, P. (2014)). Plus précisément, Jamet-Vierny et al. ont décrit l'utilisation d'une souche assistante qui permet d'apporter les protéines IDC1 nécessaires au développement des stromata dans le cadre de la reproduction des souches de Podospora anserina. Cette méthode qui repose sur la fabrication de tricaryon permet de rétablir la fertilité des souches de 25 Podospora anserina. Cependant, il est à noter que cette méthode ne peut pas être utilisée avec les souches de T. reesei : en effet la seule utilisation de la méthode des tricaryons ne permet pas de rétablir la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de T. reesei (cf exemple 2a). Les inventeurs de la présente invention ont néanmoins montré, de façon surprenante, 30 que la méthode des tricaryons permettait de rétablir la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de T. reesei lorsqu'elle était utilisée en combinaison avec la technique de l'arrosage séquentiel (c'est-à-dire un arrosage avec des conidies d'une souche femelle stérile de T. reesei d'un premier type sexuel, puis des conidies d'une souche femelle stérile de T. reesei d'un deuxième type sexuel). Cet arrosage séquentiel, utilisé en combinaison avec une 5 souche assistante LIMA T, permet de rétablir la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de T. reesei, et permet d'obtenir de façon répétitive des stromata (cf exemple 2i). 5 Dans un premier aspect, l'invention concerne ainsi un procédé de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de Trichoderma reesei comprenant les étapes suivantes : - une incubation dans un milieu approprié d'une souche assistante 4MAT, ladite souche étant une souche femelle fertile de Trichoderma reesei dans laquelle le locus du type 10 sexuel MAT a été invalidé, - un premier arrosage de ladite souche assistante 4MAT avec des conidies d'une première souche de Trichoderma reesei d'un premier type sexuel, - un deuxième arrosage de ladite souche assistante 4MAT et des conidies d'une première souche de Trichoderma reesei d'un premier type sexuel avec des conidies 15 d'une deuxième souche de Trichoderma reesei d'un deuxième type sexuel. Le « rétablissement de la reproduction sexuée » selon l'invention s'entend de l'obtention de stromata à partir de conidies d'une première souche femelle stérile de T. reesei d'un premier type sexuel et d'une deuxième souche femelle stérile de T. reesei d'un deuxième type sexuel, à l'aide d'une souche LIMA T. 20 Une « souche femelle stérile de T. reesei » selon l'invention s'entend de toutes les souches de T. reesei qui sont femelles stériles et mâles fertiles. Il s'agit des souches de T. reesei dont la fertilité femelle peut être rétablie et qui peuvent être utilisées dans un procédé de rétablissement de la reproduction sexuée selon l'invention. De telles souches sont par exemples les souches QM6a, NG14, RUTC30, QM9414, CL847, QM9136, QM9978, 25 QM9979, PC3-7, TU-6, ... En d'autres termes, il s'agit de toutes les souches produites à partir de la souche QM6a et qui sont femelles stériles mais cela peut aussi être des souches de T. reesei issues d'autres isolats géographiques et qui sont femelles stériles et males fertiles. Une « incubation dans un milieu approprié » selon l'invention s'entend d'une incubation dans un milieu de culture approprié pour la croissance des champignons. Un tel 30 milieu est par exemple le milieu PDA (Potato Dextrose Agar), le milieu SDA (Sabouraud Dextrose Agar), le milieu SPDA (Sweet Potato Dextrose Agar), le milieu MEA (Malt Extract Agar), le milieu Oatmeal Agar, le milieu Cornmeal Agar, et est de préférence un milieu complet. Un milieu complet selon l'invention est un milieu qui contient en plus des composants du milieu minimum, les métabolites finaux qui sont nécessaires pour la 6 croissance, comme les acides aminés, les vitamines,les bases,... contrairement au milieu minimum qui est un milieu comportant les éléments chimiques strictement nécessaires à la croissance d'un organisme. Une « souche assistante 21MAT » selon l'invention s'entend d'une souche de T. reesei 5 dans laquelle le locus du type sexuel (mating-type) MAT]-] ou MAT1-2 a été invalidé. Ladite souche assistante 2I MAT peut être obtenue par toutes techniques d'invalidation de gènes/locus bien connues de l'homme du métier, ou par exemple par la méthode décrite dans l'exemple 1. La souche à partir de laquelle la souche assistante 2IMAT est obtenue doit être femelle fertile. Bien qu'appartenant à l'espèce T. reesei, cette souche assistante n'entre pas dans la définition 10 d'une « souche femelle stérile de T. reesei » selon l'invention, en raison de l'invalidation du locus du mating type MAT]-] ou MAT1-2. Cette souche assistante n'entre pas en jeu dans le processus de caryogamie puisqu'elle a été invalidée du locus du type-sexuel qui régule ledit processus. Le mécanisme de la souche assistante est inconnu, mais les hypothèses quant à son fonctionnement sont les suivantes : 15 - Dans le cas de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles : il peut y avoir fusion des noyaux, mais comme le gène ide]/la protéine IDC1 sont défectueux, il n'y a pas de recrutement des hyphes pour la construction et le développement des stromata dans laquelle va se faire la caryogamie et le développement de la descendance. - Dans le cas de la reproduction entre deux souches femelles stériles et en 20 présence de la souche assistante (Figure 3) : il peut y avoir fusion des noyaux parentaux. Dans ce cas il y a expression du gène idcl par la souche assistante, et ainsi synthèse de la protéine IDC1. Etant donné qu'il y a fusion de noyaux et présence des protéines IDC1, il peut y avoir recrutement des hyphes pour la construction et le développement des stromata dans laquelle va pouvoir se faire la caryogamie et le développement de la descendance. Les tissus 25 femelles sont fournis par la souche 2IMAT, tandis que les tissus zygotiques sont fournis par les souches femelles stériles. Le terme « conidies » selon l'invention s'entend d'une spore issue de la multiplication végétative d'un champignon (tel que T. reesei). Les conidies d'une souche de T. reesei du type sexuel MAT]-] ou du type sexuel MAT]-2 sont obtenues selon les mêmes conditions. Par 30 exemple, les conidies selon l'invention d'un premier type ou d'un deuxième type sexuel peuvent être obtenus par des mises en culture et incubations dans un milieu approprié (tel que le PDA), respectivement d'une souche de T. reesei d'un premier type sexuel ou d'une souche de T. reesei d'un deuxième type sexuel, jusqu'à l'apparition de conidies. De préférence les souches sont incubées à la lumière, et à une température d'environ 24-30°C jusqu'à 7 l'apparition de conidies. Les conidies peuvent ensuite être récupérées par rinçage de la boite de culture avec de l'eau distillée/stérile. Le terme « conidies d'une première souche de T. reesei d'un premier type sexuel » selon l'invention s'entend des conidies d'une des deux souches de T. reesei utilisées dans le procédé de rétablissement de la reproduction sexuée 5 selon l'invention. Le terme « conidies d'une deuxième souche de T. reesei d'un deuxième type sexuel » selon l'invention s'entend des conidies d'une souche de T. reesei, compatible avec la première souche. Selon l'invention, le type sexuel de la première souche de T. reesei est MAT]-] ou MAT]-2, notamment MAT]-]. 10 Selon l'invention, le type sexuel de la deuxième souche de T. reesei est MAT]-] ou MAT]-2, notamment MAT]-2. Les termes «MAT]-] ou MAT]-2 » font référence aux signes sexuels des champignons. Ce sont les deux types sexuels compatibles. Etant donné que T. reesei est un champignon dit hétérothallique, si le type sexuel de la première souche de T. reesei est MATI- 15 /, alors le type sexuel de la deuxième souche de T. reesei est nécessairement MAT]-2. Inversement, si le type sexuel de la première souche de T. reesei est MAT]-2, alors le type sexuel de la deuxième souche de T. reesei est nécessairement MAT]-]. Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, le type sexuel de la première souche de T. reesei est MAT]-], et le type sexuel de la deuxième souche de T. reesei est MAT]-2. 20 La première souche et la deuxième souche de T. reesei utilisées dans un procédé de rétablissement de la reproduction sexuée selon l'invention peuvent être des souches identiques ou différentes, sous réserves que les types sexuels soient compatibles. Par exemple, lorsque les souches sont identiques la première souche peut être une souche QM6a MAT]-] et la deuxième souche peut être une souche QM6a MAT]-2. Au contraire, lorsque les souches 25 sont différentes, la première souche peut être une souche NG14 MAT]-] et la deuxième souche peut être une souche RUTC30 MAT]-2. Selon l'invention, la souche de T. reesei est toute souche femelle stérile, telle que la souche QM6a ou une souche dérivée de la souche QM6a. Ainsi, dans un mode de réalisation de l'invention, la première souche de T. reesei est QM6a MAT]-] ou une souche dérivée, et la 30 deuxième souche de T. reesei est QM6a MAT]-2 ou une souche dérivée. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, la première souche de T. reesei est QM6a MAT]-2 ou une souche dérivée, et la deuxième souche de T. reesei est QM6a MAT]-] ou une souche dérivée. Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, la première souche de T. reesei est QM6a MAT]-] ou une souche dérivée, et la deuxième souche de T. reesei est QM6a MAT]-2 8 ou une souche dérivée. De préférence, la souche QM6a MAT]-2 fait référence à la souche déposée sous la référence ATCC® 13613. Une souche MAT]-] femelle stérile (telle que QM6a MAT]-]) peut être obtenue (i) en remplaçant le locus MAT]-2 par le locus MAT]-], (par exemple selon la méthode décrite dans l'article Linke, R. et al. (2015)) ; (ii) par 5 croisement (par exemple une souche QM6a MAT]-2 est croisée avec un isolat naturel de type sexuel MAT]-]. Parmi les descendants obtenus, les individus de type sexuel MAT]-] femelle fertile peuvent être recroisés avec par exemple, la souche QM6a MAT]-2. Ce procédé est répété au moins 7 fois. Le fait de recroiser systématiquement le descendant avec le parent QM6a MAT]-2 sept fois de suite permet d'obtenir un descendant final qui a une identité 10 génétique identique à celle de la souche QM6a MAT]-2 à l'exception du type sexuel qui sera MAT]-]. Il s'agit d'un rétrocroisement. Le descendant final est de type sexuel MAT]-] et est femelle stérile. Un exemple de rétrocroisement est donné dans la demande internationale W02014/102241). Toutefois à chaque étape de ces rétrocroisements des souches stériles MAT]-] ou MAT]-2 peuvent être obtenues et utilisées dans le procédé. Le terme « souche 15 dérivée de la souche QM6a » selon l'invention s'entend de toutes les souches obtenues à partir de l'isolat naturel QM6a. Il s'agit notamment de toutes les souches industrielles de T. reesei connues à ce jour ou encore de toutes les souches de T. reesei femelles stériles. Le terme « arrosage » selon l'invention s'entend du versement d'une solution contenant les conidies d'un premier type sexuel (par exemple 107 à 108 de conidies MAT]-]) 20 ou le versement d'une solution contenant les conidies d'un deuxième type sexuel (par exemple 107 à 108 de conidies MAT]-2). Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, l'arrosage est uniquement réalisé avec des conidies d'un premier et/ou d'un deuxième type sexuel (par exemple sans ajout d'extrait cellulaire). Ainsi, dans un mode de réalisation préféré de l'invention, l'arrosage est réalisé à l'aide d'une solution appropriée contenant uniquement 25 les conidies d'un premier et/ou d'un deuxième type sexuel. Une solution appropriée s'entend par exemple de l'eau telle que de l'eau distillée ou de l'eau stérile. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, l'incubation dans un milieu approprié de ladite souche assistante ZIMAT est une incubation à l'obscurité. L'obscurité limite la production de conidies et favorise l'accès des organes sexuels femelles par les 30 organes sexuels mâles. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, l'incubation dans un milieu approprié de ladite souche assistante 2IMAT dure au moins 4 jours, de préférence entre 4 et 5 jours. L'incubation pendant 4 à 5 jours permet d'optimiser le procédé de rétablissement (exemple 2i). 9 Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, les conidies de la première souche de T. reesei d'un premier type sexuel et/ou les conidies de la deuxième souche de T. reesei d'un deuxième type sexuel sont présentes à une concentration d'au moins 106 conidies/ml, notamment de 106 à 108 conidies/ml, et de préférence de 107 à 108 conidies/ml. Une 5 concentration de 107 à 108 conidies/ml permet d'optimiser le procédé de rétablissement (cf exemple 2i). Les conditions optimales de l'arrosage séquentiel sont une incubation (ou pré-incubation) de la souche assistante 2IMAT pendant 4 ou 5 jours, ainsi qu'une concentration de conidies de 107 à 108 conidies/ml (cf exemple 2i). 10 Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, l'incubation dans un milieu approprié de ladite souche assistante ZIMAT est effectuée à une température ambiante, notamment à 24°C. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ledit procédé de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de T. reesei comprend, en outre, 15 entre le premier et le deuxième arrosage, une étape d'incubation dans un milieu approprié de ladite souche assistante ZIMAT et des conidies d'une première souche de T. reesei d'un premier type sexuel. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite incubation, dans un milieu approprié de ladite souche assistante LIMA T et des conidies d'une première souche de T. 20 reesei d'un premier type sexuel, est une incubation en alternance jour/nuit. Préférentiellement, l'alternance jour/nuit est une alternance de 12 heures de lumière et de 12 heures d'obscurité. 11 s'agit de la condition la plus favorable à la reproduction sexuée (Seidl, V., et al. (2009)). Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite incubation, dans un milieu approprié de ladite souche assistante LIMA T et des conidies d'une première souche de T. 25 reesei d'un premier type sexuel, dure 5 à 7 jours, de préférence 7 jours. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite incubation, dans un milieu approprié de ladite souche assistante LIMA T et des conidies d'une première souche de T. reesei d'un premier type sexuel, est effectuée à une température ambiante, notamment à 24°C. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ledit procédé de rétablissement de 30 la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de T. reesei comprend, en outre une étape d'obtention de stromata. Selon l'invention, le terme « stromata » s'entend des structures macroscopiques (de diamètre de 3-4mm à 2cm) qui résultent de la reproduction sexuée. Ces structures sont constituées de tissus d'origine maternelle (les tissus qui les 10 constituent proviennent de la souche assistante jouant le rôle de femelle) et sont pigmentés (couleur marron) en surface. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ledit procédé de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de T. reesei comprend, en outre, 5 après le deuxième arrosage, une étape d'incubation dans un milieu approprié de la souche assistante 2I MAT, des conidies d'une première souche de T. reesei d'un premier type sexuel et des conidies d'une deuxième souche de T. reesei d'un deuxième type sexuel, notamment jusqu'à l'apparition des stromata, et plus particulièrement jusqu'à ce que les stromata pigmentés soient visibles à l'oeil nu. 10 Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite incubation, dans un milieu approprié de ladite souche assistante 2I MAT, des conidies d'une première souche de T. reesei d'un premier type sexuel et des conidies d'une deuxième souche de T. reesei d'un deuxième type sexuel, est une incubation en alternance jour/nuit. Préférentiellement, l'alternance jour/nuit est une alternance de 12 heures de lumière et de 12 heures d'obscurité. 15 Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite incubation, dans un milieu approprié de ladite souche assistante LIMA T, des conidies d'une première souche de T. reesei d'un premier type sexuel et des conidies d'une deuxième souche de T. reesei d'un deuxième type sexuel, est effectuée à une température ambiante, notamment à 24°C. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré de l'invention, ledit procédé est 20 un procédé de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de T. reesei, comprenant les étapes suivantes : - une incubation, notamment à l'obscurité, dans un milieu approprié d'une souche assistante ZIMAT, ladite souche étant une souche femelle fertile de T. reesei dans laquelle le locus du type sexuel MAT a été invalidé, 25 - un premier arrosage de ladite souche assistante ZIMAT avec des conidies d'une première souche femelle stérile MAT]-], - une étape d'incubation, notamment en alternance jour/nuit, de ladite souche assistante 2I MAT et des conidies de la première souche femelle stérile MAT]-], - un deuxième arrosage de ladite souche assistante 2IMAT et des conidies de la première 30 souche femelle stérile MAT]-], avec des conidies d'une deuxième souche femelle stérile MAT] -2, - une étape d'incubation, notamment en alternance jour/nuit, de ladite souche assistante 2I MAT et des conidies de la première souche femelle stérile MAT]-], avec des conidies 11 de la deuxième souche femelle stérile MAT]-2, notamment jusqu'à l'apparition des stromata. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré de l'invention, ledit procédé est un procédé de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles 5 de T. reesei, comprenant les étapes suivantes : - une incubation, notamment à l'obscurité, dans un milieu approprié d'une souche assistante ZIMAT, ladite souche étant une souche femelle fertile de T. reesei dans laquelle le locus du type sexuel MAT a été invalidé, - un premier arrosage de ladite souche assistante ZIMAT avec des conidies d'une 10 première souche QM6a MAT]-] ou d'une souche femelle stérile MAT]-], - une étape d'incubation, notamment en alternance jour/nuit, de ladite souche assistante ZIMAT et des conidies de la souche QM6a MAT]-] ou d'une souche femelle stérile MAT]-], - un deuxième arrosage de ladite souche assistante 2IMAT et des conidies de la souche 15 QM6a MAT]-], ou d'une souche femelle stérile MAT]-], avec des conidies d'une deuxième souche QM6a MAT]-2 ou d'une souche dérivée de la souche QM6a MATI-2 ou d'une souche femelle stérile MAT]-2, - une étape d'incubation, notamment en alternance jour/nuit, de ladite souche assistante ZIMAT et des conidies de la souche QM6a MAT]-], ou d'une souche femelle stérile 20 MAT]-], avec des conidies de souche QM6a MAT]-2 ou d'une souche dérivée de la souche QM6a MAT]-2 ou d'une souche femelle stérile MAT]-2, notamment jusqu'à l'apparition des stromata. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ledit procédé de rétablissement, comprend en outre l'obtention d'une souche de T. reesei. L'obtention de cette nouvelle 25 souche de T. reesei, issue de souches de T. reesei femelles stériles, signifie que le rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de T. reesei a bien été rétabli selon le procédé de l'invention. Dans un deuxième aspect, l'invention concerne ainsi l'utilisation d'une souche de T. reesei obtenue par le procédé mentionné ci-dessus pour la production de cellulases ou de 30 biocarburant. L'invention sera mieux illustrée par les exemples et les figures suivantes. Les exemples ci-après visent à éclaircir l'objet de l'invention et illustrer des modes de réalisation avantageux, mais en aucun cas vise à restreindre la portée de l'invention. 12 FIGURES La Figure 1 représente le principe de la reproduction sexuée chez le champignon filamenteux T. reesei. 5 La Figure 2 représente la reproduction sexuée chez T. reesei. La partie (A) représente la reproduction sexuée entre deux isolats naturels (A) et la partie (B) représente la reproduction sexuée entre deux souches QM6a. La Figure 3 représente le principe de la méthode de la souche assistante. La Figure 4 représente le protocole de la mise en oeuvre de la méthode de la souche 10 assistante selon la présente invention. La Figure 5 représente les stromata obtenus suite à la mise en oeuvre de la méthode de la souche assistante selon la présente invention. La Figure 6 représente l'assemblage final de la cassette d'invalidation dans le plasmide pUC19 (plasmide utilisé pour obtenir la souche assistante ZIMAT selon la présente 15 invention). Les traits correspondent aux amorces qui ne sont pas positionnées à l'échelle. Les numéros correspondent aux amorces : 1 = 5'mat1-2-F ; 2 = 5'mat1-2-R ; 3 = mat1-2/Hph-F; 4 = mat1-2/Hph-R ; 5 = 3'mat1-2-F ; 6 = 3'mat1-2-R ; 7 = K7 Del Mati-2-F et 8 = K7-DelMati-2-R. La Figure 7 représente la position des amorces choisies pour l'amplification des 20 différents fragments de la cassette d'invalidation. Le chiffre « (1) » représente le fragment « Flank5' + marqueur », et le chiffre « (2) » représente le fragment « marqueur + flank3' ». EXEMPLES 25 Exemple 1 : Matériel & Méthodes La présente invention met en jeu trois souches différentes. Les trois souches qui ont été utilisées dans les exemples sont les suivantes : Les deux souches stériles à croiser : la souche QM6a MAT]-] et la souche QM6a 30 MAT]-2. Pour obtenir la souche QM6a MAT]-], le locus MAT]-2 a été remplacé par le locus MAT]-] dans la souche QM6a MAT]-2. La souche QM6a MAT]-2 a été obtenue auprès de l'ATCC (référence ATCC® 13631). Il s'agit de l'isolat naturel à l'origine de toutes les souches industrielles. 13 - La souche assistante AMAT qui est une souche dans laquelle le locus de type sexuel MAT a été invalidé. Cette souche peut être construite selon le protocole indiqué ci-dessous : 5 Construction de la souche assistante AilfAT Cette souche doit être construite à partir d'une souche femelle fertile qui peut se croiser avec les deux souches stériles à croiser avant la manipulation génétique. Pour construire la cassette d'invalidation du locus MAT1-2, le gène de résistance à l'hygromycine B et les séquences 5' et 3' du locus MAT1-2 ont été assemblés dans un 10 plasmide pUC19 (Figure 6) grâce au Gibson Assembly Kit (New England Biolabs) en suivant les recommandations du fabricant. Le gène de résistance à l'hygromycine B a été utilisé comme marqueur de sélection dans la présente invention mais un autre marqueur de sélection peut tout à fait être utilisé. Le plasmide receveur pUC19 a préalablement été digéré par les enzymes XbaI et 15 EcoRI. Les séquences d'environ 1000 pb en amont et en aval du locus MAT1-2 ont été amplifiées en utilisant les amorces 5'mat1-2-F et 5'mat1-2-R pour la région amont et 3'matl2-F et 3'mat1-2-R pour la région aval (Tableau 1). Ces amorces contiennent des régions d'homologies permettant la recombinaison avec pUC19 d'un côté et le gène de résistance à l'hygromycine de l'autre. Le gène de résistance à l'hygromycine B a été amplifié à partir du 20 plasmide pUT1140 à l'aide des amorces mat1-2/Hph-F et mat1-2/Hph-R. Ces amorces contiennent des régions d'homologies permettant la recombinaison avec le locus MAT1-2 d'un côté et pUC19 de l'autre. Dans un second temps, la cassette d'invalidation a été amplifiée à partir de l'ADN bactérien à l'aide des amorces K7-Del-Mat1-2-F et K7-Del-Mat1-2-R. Les produits PCR 25 obtenus ont été purifiés à l'aide du PCR Purification Kit (Qiagen) et transformés dans des protoplastes de la souche sauvage fertile B31 à l'aide de CaC12 et polyethylène-glycol (PEG). Une souche autre que la souche B31 aurait pu être utilisée, à la condition qu'elle soit femelle fertile. La séquence du plasmide ayant servi à transformer les souches B31 est représentée par la SEQ ID NO : 17. 30 La souche B31 (de type sexuel MAT1-2) est un descendant de la souche de T. reesei CBS999.97 (ATCC® 204423) (Sexually Competent, Sucrose- and Nitrate-Assimilating Strains of Hypocrea jecorina (Trichoderma reesei) from South American Soils). C'est l'équivalent de la souche CBS999.97 MAT1-2 de l'article de Seidl et al. (2009). 14 Les transformants ont été stabilisés et régénérés sur un milieu PDA contenant 0,8 M de saccharose et 1001..tg/m1 d'hygromycine B. Les colonies ont ensuite été repiquées et ont été purifiées par isolement des conidies sur le milieu de sélection PDA-hygromycine. Elles ont ensuite été soumises à un criblage phénotypique qui consiste à croiser les transformants B31 5 avec l'isolat naturel A2 qui est de type sexuel MAT]-] et qui est compatible avec la souche B31 : si le locus MAT a bien été invalidé, alors il n'y aura pas de reproduction sexuée et donc absence de stromata. Une amplification PCR permet ensuite de vérifier que le gène natif a bien été remplacé par la cassette d'invalidation. Cette validation se fait en deux étapes. La première consiste à 10 vérifier l'invalidation du gène en réalisant une PCR avec les amorces permettant d'amplifier le gène (Mati-2-F interne et Mati-2-R interne) (Erreur ! Source du renvoi introuvable.7). Si ce dernier est bien invalidé, aucune amplification ne doit être obtenue. Cependant, afin de vérifier que ce résultat est bien une conséquence de l'absence du gène et non d'un mauvais fonctionnement de la PCR, un couple d'amorces témoin (EF1 et EF2) permettant 15 l'amplification d'un fragment interne de 880 pb du gène tefl (codant pour le facteur d'élongation de la traduction al) présent dans le génome de toutes les souches de T. reesei est également utilisé. Dans un second temps, l'amplification des fragments « flank 5' + marqueur » et « marqueur + flank 3' » est réalisée afin de vérifier la présence de la cassette d'invalidation au locus. La position des amorces choisies est présentée sur la Figure 7. Pour 20 valider l'insertion de la cassette génétique au site, les amorces doivent être choisies en aval du fragment flank5' et en amont du fragment flank3' (amorces Dmat1-2verif5F associée à verifHygro5' et Dmat1-2verif3R associée à verifHygro3'). Les séquences des amorces utilisées dans la présente invention sont indiquées dans le Tableau 1 ci-dessous. looneopenreemlupporolurelmuoperprolurprouleerpolerprolupploeefoeloropepeol ooeeproloroluourr oppolooluoollpeopeoupeopolurepolelluperpeoplurpoolunlopoelruperpoloolooplu orepopoluellueol poeolllereuerpoloporpourporrourpololoplulueolopoloolepolourolooleololepoop ululuouluroperro Illerlelolourpourpepollureproluolourpooloopeoluoolnepeolepoloppolupeopoore emeoplonoppor ropeoluporproulonoreepoluloroompeoloeepeoloponloolluolpeoloureoulopolourol ollnuporprelooleeplunolulo relurroellolomplorpuerlorolurunuloerpelellonunnourreopounlerelorlloeleroll uolurnuoluroluolerloul epuelopeopollolonollulourlololouluurelurrepoololoplenololeepoepenolorlolol uoloollueuropoolululu lurupeernuroulurrollupereuureerolulouroluluonnueouloupporeomplunruArourere uroeeenprelool Ilueleorpoulumeomeluerernolupouluenulounporolupouromprouroeprelfurpoomuruu rreleeerluppeor rullonuolooreerroperopurperoluppropporroeupornmulepolonoluppoluronouroluol oolourponolupploperropporponourr eopeouloornuounonourronnoproupporpolopproloulnoroloopeouporporolueleuulupo rrulurprolopronnoolorour rollulproloeourlut. ulolopeloroululeeerrueeereuroppolnurperlooreueroluluounollopulloo molnuloorerempounuluoulurerouroleolnoulernoonurolloorlopulernloollorouropp orlonerlolorel eololopprouplereorellullorpolorleelurepelonnupeeloproupluoloreolooloreurno lupprollorrulo urroppeerompreoronopelurtroullurruplemelonulurloleelroompolunolenonluperep eourloploneerulu ollupourellnuolourolourrelureloppolluourproppelerlouroonloeoluerourlurelre oluelolerololueleopeloroulol elrononureelropporpreluoleourroluromulupplonoromuroleurponoloeelillolopour rupporrulouleluurnrop uppropoeurrulupelloureourluerolopoeeloluolololorolouunnoroloorperluppoenop elueleolerelurrulurel loeloopeloonooperlopeoluolooluollourpoornelupoelulorourerouprolnurp-euluee nurelulolopollormoup unlorpopprounrolorolouleellurnuropurpeerpourelpeopplerpeproflorolurnuolleo pleoppoololoppourro ouluropoeurreepeeroleoupeopeoreporpopolopouleloeilloopoullueopurlulollelop polunloonlol eluorolonnoolonnoolooleounnloopourouppouurrelulopurpeololelluneolelloelolo orpoolleollool mumpluelopourrupolloeoupeerpreolopurlooluluourreurepoolloorpoureeluloeep romporneepreporouppeorepenouppororoupeolloreloolorouleporeuleperropenoorno lolur leolupploloeupoulllooluulololoolopuluouloopororeloloreurollorporpoulerloor eerlonoleloulurropuleroeuprollo lot. ulueopmnolourporloeurolepollemerporloporpourruuurourrollolololurolommloole ellonoleurroleuureul pooperpepeproonomeelournoppeuurpoelupplumenmoolereempleurrumurnmuonourrume nermommuluolormuropero llourelluournelorolopuleeloolerpeurreprelerlourouperpeproulorerlorepoolopo rullerpolorprA (LI ON QI CMS) amutsuid np a3uanbas snDoT np luounDuTdmal uompqrAum Jnod saasTpin SODJOULIE sof) sprpnIduDau : j nearini (91 ON QI ÙJS) LIDINDIVOELDVDDVIDVVDD ZdJ (SI ON QI ÙJS) DVDVVDVDDVDOVVIDDDIN IdJ (17T ON QI ÙJS) IDVVDDOVVDOVVDIDLLDD atualuT N-z-Tiew (£1 ON QI ÙJS) VaLLILVDDDOELLOELDVALL atualuT j-z-Tiew (Z1 ON QI ÙJS) DINVDDVDOVVVDDDOELDID £cuâ'if }pian (II ON QI ÙJS) DODVINVDDDVDVVIDDDID ÇOJ1}-jJTJA (0 ON QI ÙJS) DVVVDDVDIDIDVVDDVDDD 21£31-10AZ- I Mua (6 ON QI ÙJS) DIDIDODDLIDLIDDIDVID dgInAZ- I Mua (a ON QI ÙJS) VIDDLLDVDVDIDDDIDDID 21-Z- I in\l-pa-LN (L ON QI ÙJS) VIDVDDVDVOELLIDODDVDD d-Z- I iuw-pa-LN (9 ON QI ÙJS) DDOELVDVDDVIINVDVIDIVALLVVOELDVDDODDVDDVVVVIDLL (ç ON QI ÙJS) DVIDVDVDVIDDOVVVDDOELIDDOELDVDDVI (17: ON QI ÙJS) DVIDIDIDIDVIDDIDVDDOVVDDOELLIDD 21-11dH/Z- Tem (£ ON QI ÙJS) DIDLLVDDIDIDDVIDIDVVDDIDVDDDVVD d-IldH/Z- I eul (Z ON QI ÙJS) DIDDIVOELDVOELLODDIDVDDLLDVDVID9 (1 ON cu ùJs) DIDVDDIDDDVDIDDLIDDDVDVIDIDVDDIDDVDDIDDOELVDDI À- Z- I eulS sa33oure (,£ REVENDICATIONS1. Procédé de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de Trichoderma reesei comprenant les étapes suivantes : - a) une incubation dans un milieu approprié d'une souche assistante ZIMAT, ladite souche étant une souche femelle fertile de Trichoderma reesei dans laquelle le locus du type sexuel MAT a été invalidé, - b) un premier arrosage de ladite souche assistante ZIMAT avec des conidies d'une première souche de Trichoderma reesei d'un premier type sexuel, - c) un deuxième arrosage de ladite souche assistante 2IMAT issue de l'étape b) avec des conidies d'une deuxième souche de Trichoderma reesei d'un deuxième type sexuel. 2. Procédé de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de Trichoderma reesei selon la revendication 1, dans lequel le premier type sexuel de 15 la première souche de Trichoderma reesei est MAT]-] ou MAT1-2, notamment MAT]-]. 3. Procédé de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de Trichoderma reesei selon la revendication 1, dans lequel le deuxième type sexuel de la deuxième souche de Trichoderma reesei est MAT]-] ou MAT1-2, notamment MAT1-2. 20 4. Procédé de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de Trichoderma reesei selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle la souche de Trichoderma reesei est la souche QM6a ou une souche dérivée de la souche QM6a. 25 5. Procédé de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de Trichoderma reesei selon l'une des revendications précédentes, dans lequel l'étape a) d'incubation dans un milieu approprié de ladite souche assistante ZIMAT dure au moins 4 jours, de préférence entre 4 et 5 jours. 30 6. Procédé de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de Trichoderma reesei selon l'une des revendications précédentes, dans lequel les conidies de la première souche de Trichoderma reesei d'un premier type sexuel et/ou les conidies de la deuxième souche de Trichoderma reesei d'un deuxième type sexuel sont 23 présentes à une concentration d'au moins 106 conidies/ml, notamment de 106 à 108 conidies/ml, et de préférence de 107 à 108 conidies/ml. 7. Procédé de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles 5 stériles de Trichoderma reesei selon l'une des revendications précédentes comprenant, en outre, entre le premier et le deuxième arrosage, une étape d'incubation dans un milieu approprié de ladite souche assistante 2I MAT issue de l'étape b). 8. Procédé de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles 10 stériles de Trichoderma reesei selon l'une des revendications précédentes comprenant, en outre, après le deuxième arrosage, une étape d'incubation dans un milieu approprié de la souche assistante 2I MAT issue de l'étape c), notamment jusqu'à l'apparition de stromata. 9. Procédé de rétablissement de la reproduction sexuée entre deux souches femelles stériles de Trichoderma reesei selon l'une des revendications précédentes comprenant, en outre, l'obtention d'une souche de Trichoderma reesei. 10. Utilisation d'une souche de Trichoderma reesei obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes pour la production de cellulases ou de 20 biocarburant.