Brevet FR3074420A1 — publié le 20190607

NOUVEAUX VECTEURS DE MOLECULES PHARMACOLOGIQUEMENT ACTIVES ET NON HYDROSOLUBLES ET LEUR PROCEDE DE PREPARATION La prosente invention concerne de nouveaux vecteurs de molecules pharmacologiquement actives et non hydrosolubles a effets secondaires roduits. La chimiotherapie anticancereuse conventionnelle a pour principal inconvenient un impact tres fort sur les patients via de nombreux effets indosirables. Ces effets secondaires posent de nombreux problemes dans le quotidien des patients et deviennent le principal facteur limitant du traitement. Ces problemes de toxicite proviennent de deux causes : - un manque de solectivito de la molecule active, lui conforant un faible index therapeutique, - la presence de solvants toxiques servant a la solubilisation des composes non hydrosolubles. Deux pistes sont disponibles pour dim inuer les effets secondaires des traitements : - un meilleur ciblage des cellules cancereuses, de fawn a augmenter l'efficacito du traitement tout en diminuant sa toxicite, - une meilleure solubilisation des composes non hydrosolubles grace a des solvants ou des vecteurs non toxiques. Le developpement des nanoparticules commence a prendre de ('importance et permet de resoudre au moins l'un des deux problemes, en particulier le probleme de solubilite. L'une des molecules antitumorale les plus utilisees est le paclitaxel de la famille des taxanes. Cette molecule prosente une solubilito inferieure a 1 mg/I. La formulation pharmaceutique de ce compose contient des excipients comme l'huile de ricin pour permettre sa solubilisation. Ces excipients prosentent par eux-memes une toxicite. Durant les dernieres annees, de nombreux nanovecteurs permettant le transport efficace du paclitaxel ont oto doveloppos via divers vecteurs : Liaison Soluble covalente Albumine Non Oui Micelle Non Non Liposome Non Non Emulsion par Non Non voie orale Nanodiamant Oui Non Tableau 1 : Principaux moyens de nanovectorisation des molecules actives 30 antitumorales 2 Mais ces nouveaux vecteurs repondent souvent a un seul des deux criteres. Par exemple, le nanovecteur a partir de l'albumine permet de resoudre le probleme de faible solubilito de la molecule active. Par contre, la liaison entre la molecule active et l'albumine est faible. II est donc facile de cliver cette liaison, ce qui implique un risque 5 de relargage de la molecule active dans ('ensemble des parties du corps et donc des effets secondaires non negligeables. De la meme fawn, le nanovecteur a partir de diamant permet d'obtenir des nanovecteurs lies par liaison covalente a la molecule active. Par contre, ces nanoparticules de diamant ne sont pas solubles dans l'eau. Les effets toxiques a 10 court et long terme de ces nanoparticules de carbone dures ne sont pas connus. L'un des aspects de l'invention concerne une nouvelle nanoplateforme capable de lier de fawn covalente une molecule pharmacologiquement active, notamment antitumorale, et non hydrosoluble, tout en restant soluble dans l'eau. Un autre aspect de l'invention concerne une nouvelle nanoplateforme comportant 15 une molecule pharmacologiquement active, notamment antitumorale, et qui est susceptible de lier de fawn covalente un fluorophore ayant une longueur d'onde d'emission permettant le suivi de la nanoplateforme. Un autre aspect de l'invention concerne une nouvelle nanoplateforme comportant une molecule pharmacologiquement active, notamment antitumorale, et qui est 20 susceptible de lier de fawn covalente un agent d'adressage qui permet d'amoliorer le transport cible de ladite molecule pharmacologiquement active, notamment antitumorale, et ainsi de limiter les effets secondaires. La prosente invention concerne une nanoplateforme pharmacologiquement active qui est constituoe : 25 d'une nanoplateforme (NPC2) comprenant ou constituoe de carbone, d'hydrogene, d'oxygene, et d'azote, d'une molecule pharmacologiquement active (M), d'un oventuel fluorophore (F), et d'un oventuel agent d'adressage (A), et dans laquelle - NPC2 est hoe par liaisons covalentes avec M via un linker L, ladite nanoplateforme NPC2 possedant les proprietes suivantes : la solubilito de NPC2 en milieu aqueux est de 25 a 500 g/L le module de Young de NPC2 est de 1 a 4 GPa, la densito de NPC2 est de 1 a 3, la taille seche de NPC2 est de 10 a 40 nm, le diametre hydrodynamique de NPC2 est de 10 a 150 nm, NPC2 est substantiellement amorphe ladite nanoplateforme NPC2 possedant en surface des fonctions acides carboxyliques et hydroxyles et un nombre de fonctions amines primaires de greffage de 0.3 a 7 mmol par gramme de nanoplateforme, 3 ladite molecule pharmacologiquement active M ayant une solubilito en milieu aqueux inferieure a 200 mg/I, ladite nanoplateforme pharmacologiquement active ayant une solubilito en milieu 5 aqueux de 5 a 500 g/I, avec la reserve que : - NPC2 soit substantiellement depourvue de lipides, d'acides nucleiques, de proteines et de peptides. Les nanoplateformes pharmacologiquement actives selon la prosente invention 10 peuvent contenir des molecules pharmacologiquement actives quelconques tant qu'elles ne sont pas solubles dans l'eau mais rendues solubles dans l'eau suite a leur liaison avec la nanoplateforme. La prosente invention concerne une nanoplateforme active qui est constituoe : d'une nanoplateforme (NPC2) comprenant ou constituoe de carbone, 15 d'hydrogene, d'oxygene, et d'azote, d'une molecule active antitumorale (M), d'un oventuel fluorophore (F), et d'un oventuel agent d'adressage (A), et dans laquelle zo NPC2 est hoe par liaisons covalentes avec M via un linker L, ladite nanoplateforme NPC2 possedant les proprietes suivantes : la solubilito de NPC2 en milieu aqueux est de 25 a 500 g/L le module de Young de NPC2 est de 1 a 4 GPa, la densito de NPC2 est de 1 a 3, 25 la taille seche de NPC2 est de 10 a 40 nm, le diametre hydrodynamique de NPC2 est de 10 a 150 nm, NPC2 est substantiellement amorphe ladite nanoplateforme NPC2 possedant un nombre de fonctions amine primaire de greffage en surface de 0.3 a 7 mmol par gramme de nanoplateforme, 30 ladite molecule active antitumorale M ayant une solubilito en milieu aqueux inferieure a 200 mg/I, ladite nanoplateforme active ayant une solubilito en milieu aqueux de 5 a 500 g/I, avec la reserve que : - NPC2 soit substantiellement depourvue de lipides, d'acides nucleiques, de 35 proteines et de peptides. Au sens de la prosente invention, on entend par « nanoplateforme » une nanoparticule servant de support et comprenant des fonctions de greffage en surface permettant le greffage de composants a la surface, et incluant les oventuels fluorophore et agent d'adressage tant que la molecule active antitumorale n'est pas 40 greffee. 4 Au sens de la prosente invention, on entend par « nanoplateforme active » une nanoplateforme sur laquelle la molecule active antitumorale est greffee, otant entendu que le fluorophore et/ou l'agent d'adressage peuvent etre presents ou non. Au sens de la prosente invention, on entend par « fonctions de greffage en surface » 5 des fonctions situees en surface de la nanoplateforme capables de lier de fawn covalente les molecules d'interet a la nanoplateforme. Ces fonctions sont choisies parmi les fonctions amines de preference primaires, les fonctions acides carboxyliques ou les fonctions alcools. Au sens de la prosente invention, on entend par « molecules d'interet », les 10 molecules devant etre greffees a la nanoplateforme, c'est a dire soit la molecule active antitumorale, le fluorophore s'il est present et/ou l'agent d'adressage s'il est present. Au sens de la prosente invention, on entend par « nanoplateforme substantiellement amorphe » une nanoplateforme ne comportant pas de raie caracteristique sur le 15 spectre DRX, mais susceptible de contenir des inclusions microcristallines non detectables par cette mothode d'analyse. Au sens de la prosente invention, on entend par « nanoplateforme substantiellement depourvue de lipides, d'acides nucleiques, de proteines et de peptides» une nanoplateforme contenant moins de 5% de lipides, moins de 5% d'acides 20 nucleiques, moins de 5% de peptides et moins de 5% de proteines en poids, par rapport au poids total de la nanoplateforme. Les nanoplateformes actives selon la prosente invention prosentent l'avantage d'être des nanovecteurs de molecules actives antitumorales capables de solubiliser lesdites molecules insolubles grace a la solubilito propre de la nanoplateforme. 25 Les nanoplateformes actives selon la prosente invention prosentent l'avantage d'avoir des liaisons covalentes entre la nanoplateforme et les molecules attachoes a celle-ci. L'interet est de pouvoir controler le relargage ou le non-relargage des fonctions attachoes a la nanoplateforme active. Ainsi, it est possible en choisissant les liaisons covalentes de fawn appropriee, de permettre le relargage de la molecule 30 active antitumorale uniquement a proximito d'une tumeur, tout en ne relargant pas, dans le meme temps, le fluorophore. Les nanoplateformes selon la prosente invention comportent : - soit uniquement une molecule active antitumorale, - soit une molecule active antitumorale, ainsi qu'un fluorophore, 35 - soit une molecule active antitumorale ainsi qu'un agent d'adressage, - soit une molecule active antitumorale, un agent d'adressage et un fluorophore. Les nanoplateformes actives selon la presente invention presentent l'avantage d'être modulables. II est ainsi possible de greffer des molecules differentes selon les fonctions que l'on souhaite voir remplir par les nanoplateforme actives. Ainsi, si l'on 40 souhaite que la molecule active antitumorale cible un type de cellules en particulier, it 5 est possible de fixer un agent d'adressage sur la nanoplateforme active ciblant particulierement les cellules concernees. Mais si l'on souhaite que l'ensemble du corps soit cible, ('absence d'agent d'adressage permet de retirer le caractere discriminant de la nanoplateforme active. 5 Les nanoplateformes actives selon la prosente invention sont solubles en milieu aqueux, ce qui permet de s'affranchir de l'ajout de solvants toxiques, et sont capables de transporter efficacement la molecule active antitumorale vers une destination cibloe par ('agent d'adressage (s'il est present), et ainsi d'augmenter la solectivito de la molecule active. Les nanoplateformes selon la prosente invention 10 permettent de surmonter les deux causes principales des effets secondaires des traitements antitumoraux connus a ce jour. Dans un mode de realisation particulier, les fonctions de greffage en surface de la nanoplateforme active telle que docrite ci-dessus, comprennent des groupements NH2 ou sont constituees de groupements NH2, lesdites fonctions de greffage en 15 surface otant susceptibles d'être hoes par des liaisons covalentes a M et/ou F et/ou A, le taux de fonctions de greffage hoes otant compris d'environ 50 % a environ 100 % du total des fonctions de greffage en surface de la nanoplateforme NPC2. Au sens de la prosente invention, on entend par « fonction de greffage liee » une fonction de greffage en surface de la nanoplateforme sur laquelle est greffe un 20 compose pouvant etre soit un linker, soit une molecule d'interet. Au sens de la prosente invention, on entend par « linker» un compose capable de lier de fawn covalente la nanoplateforme et les molecules d'interet. Les linkers sont identiques ou differents selon les molecules d'interet. Le terme « linker » est un anglicisme correspondant au terme « lieur ». 25 Au sens de la prosente invention, on entend par « molecule pharmacologiquement active non hydrosoluble » l'ensemble des molecules pharmacologiquement actives dont la solubilito en milieu aqueux est inferieure a 200 mg par litre. Au sens de la prosente invention, on entend par « taux de fonctions de greffage liees » le rapport entre le nombre de fonctions de greffage effectivement hoes et le 30 nombre de fonctions de greffage prosentes en surface. Dans ce mode de realisation, les molecules d'interet qui sont hoes a la nanoplateforme, sont hoes sur des fonctions amines. Ces fonctions sont les plus reactives dans le cas de cette invention. Ces fonctions se lient plus facilement que les fonctions acides carboxyliques ou alcools. 35 Dans un mode de realisation particulier, la nanoplateforme active telle que docrite ci- dessus comprend un fluorophore F, et NPC2 est hoe par liaisons covalentes avec F, via un linker LF. Dans ce mode de realisation, la nanoplateforme est hoe avec une molecule active antitumorale et avec un fluorophore. Ce fluorophore permet de suivre revolution de 6 la nanoplateforme active a laquelle it est lie dans l'organisme, en particulier dans des longueurs d'onde adaptees a la biologie. Dans ce mode de realisation, les liaisons covalentes permettent de lier la nanoplateforme avec le fluorophore et de provenir ('accumulation de fluorophore 5 dans l'organisme hate. Dans un mode de realisation particulier, la nanoplateforme active telle que docrite cidessus comprend un agent d'adressage A, et NPC2 est hoe par liaisons covalentes avec A, via un linker LA. Dans ce mode de realisation, la nanoplateforme est hoe avec une molecule active 10 antitumorale et avec un agent d'adressage. Cet agent d'adressage permet de cibler les cellules ou les organes qui doivent etre vises par le traitement. Cet agent d'adressage peut etre un anticorps, un peptide ou une petite molecule qui lient des recepteurs fortement exprimes par les cellules de la barriere hemato-encephalique, les cellules tumorales ou qui ciblent la neo angiogenese (LDLR, transferrine 15 recepteur, EGFR, VEGF). II peut s'agit par exemple des peptides RGD, TAT, angiopep-2, ou d'anticorps anti EGFR ou anti VEGF. Dans un mode de realisation particulier, la nanoplateforme active telle que docrite cidessus comprend un fluorophore F, et un agent d'adressage A, et NPC2 est hoe par liaisons covalentes avec F via un linker LF et NPC2 est hoe par liaisons covalentes 20 avec A via un linker LA. Dans ce mode de realisation, la nanoplateforme est hoe avec une molecule active antitumorale, avec un agent d'adressage et aussi avec un fluorophore. Cette nanoplateforme permet de cibler le lieu d'accumulation et d'action de la nanoplateforme active grace a ('agent d'adressage, et de suivre revolution dans 25 l'organisme de la nanoplateforme active grace au fluorophore, par imagerie de fluorescence. Dans un mode de realisation particulier, la nanoplateforme active telle que docrite cidessus comprend une nanoplateforme NPC2 fluorescente. Dans ce mode de realisation, la nanoplateforme avant sa liaison avec la molecule 30 active antitumorale ou meme avant reventuelle liaison avec le fluorophore est déjà fluorescente avec une longueur d'onde d'emission (par exemple, Xmax = 460nm pour la nanoplateforme de ('exemple 1.1) peu favorable a l'imagerie en milieu biologique. C'est pour cette raison qu'un fluorophore omettant a une longueur d'onde favorable a l'imagerie du vivant, typiquement le proche infrarouge 35 (750nm 0 ou d>0, la refonctionnalisation est effective et des fonctions de greffage non dosirees comme les fonctions OH et COOH reagissent pour obtenir des fonctions amines primaires. 15 Dans ce mode de realisation, les Formule b et Formule B sont deux ocritures differentes d'une meme nanoplateforme NPC2. Les fonctions de greffage T, TA et TF sont choisies parmi les fonctions de greffages disponibles sur la surface de la nanoplateforme de Formule b, soit NH2, OH et COOH. Dans ce mode de realisation, une otape supplementaire de synthese de la 20 nanoplateforme initiale peut etre effectuoe. Dans ce mode de realisation, si un procurseur de linker est mis en contact avec une nanoplateforme active ou non, le linker obtenu a la suite de la liaison de ce procurseur sur la nanoplateforme est un linker long. Par contre si une molecule d'interet est hoe sans qu'un precurseur de linker ne soit lie, le linker obtenu est un 25 linker court. Dans un mode de realisation particulier, le procede de preparation tel que docrit cidessus de ladite nanoplateforme active de Formule IX, 24 Formule IX dans laquelle : - NP,, T, TF, TA, M, F, A, Z, ZF, ZA, R, RF, RA, Q, QF, QA, I, IF et IA ont les 5 significations de la Formule I, comprend : a. une otape de refonctionnalisation par mise en contact d'une nanoplateforme NPC1 de Formule a, NH2 NPc -COOH Formule a OH 10 dans laquelle : - NPc ayant la signification indiquoe dans la Formule I, avec une molecule organique de type a,w-diamino-alcane comportant deux fonctions amines de preference deux fonctions amines primaires et/ou secondaires et de fawn encore plus preforentielle deux fonctions 15 amines primaires, pour obtenir une nanoplateforme NPC2 de Formule b ou de Formule H, (NH 2)(1 +b+d) TF I I NPc COOF1(1_10) Formule b NPc -T Formule H 1 1 0H(1_d) TA dans lesquelles : - b et d sont respectivement le taux de refonctionnalisation des 20 fonctions de greffage COOH en NH2 et le taux de refonctionnalisation des fonctions de greffage OH en NH2, b et d otant des nombres reels superieurs strictement a 0, - les fonctions de greffage TF, T et TA sont choisies parmi les fonctions de greffage de la nanoplateforme de Formule b, en particulier NH2, 25 b. une otape de liaison d'un fluorophore par l'eventuelle mise en contact d'un precurseur de linker LF' de Formule 1, 25 ZF-RF-QF Formule 1 avec ladite nanoplateforme NPC2 de Formule H, pour obtenir une nanoplateforme de Formule J, Formule J 5 T TA suivie par la mise en contact de ladite nanoplateforme de Formule J avec ledit fluorophore F, pour obtenir une nanoplateforme de Formule K, IF ZF-RF-QF F I NPc T Formule K T TA ladite otape b ayant lieu selon le schema suivant TF TF ZF-RF-QF F-RF-Q IF NPc -T + IF LF NPc -T + F NPc -T 1 1 1 TA TA TA 10 Formule H Formule J Formule K c. une otape de greffage d'une molecule active antitumorale par l'eventuelle mise en contact de ladite nanoplateforme de Formule K avec un precurseur de linker L' de Formule 2 Z R Q 15 Formule 2 pour obtenir une nanoplateforme de Formule L, ZF-RF-QF F IF R-Q IF NPc I TA Formule L 26 suivie par la mise en contact de ladite nanoplateforme de Formule L avec ladite molecule active antitumorale M pour obtenir une nanoplateforme active de Formule M, TF ZF-RF-QF IF R-Q M Formule M rt T TA 5 ladite otape c ayant lieu selon le schema suivant TF ZF-RF-QF F IF NPc Z-R-Q TA FRF-QF i F / NPc TZ R Q M TA + M F RF-QFj F IF NPc -T TA + I L' Formule K Formule L Formule M d. une oventuelle otape de liaison d'un agent d'adressage par l'eventuelle mise en contact de ladite nanoplateforme active de Formule M avec un 10 precurseur de linker LA' de Formule 3, ZA-RA-QA Formule 3 pour obtenir une nanoplateforme active de Formule N, F-RF-Q IF Formule N TA(ZA-RA-QA) IA 15 suivie par la mise en contact de ladite nanoplateforme active de Formule N avec ledit agent d'adressage A pour obtenir ladite nanoplateforme active de Formule IX ladite otape d ayant lieu selon le schema suivant 27 IA F-RF-QF F IF F-RF-QF F /IF -TtZ-R-QM /I A-RA-QA TF F-RF-QF F IF NPc T Z R Q M TAZA-RA-QA A M + IA LA. NPc TA +A NPc TA Formule M Formule N Formule IX Dans ce mode de realisation particulier, l'etape de refonctionnalisation n'est pas totale. II peut rester des fonctions de greffage OH et COOH sur Ia surface de Ia 5 nanoplateforme. Dans ce mode de realisation, les Formule b et Formule H sont deux ocritures differentes d'une meme nanoplateforme NPC2. Les fonctions de greffage T, TA et TF sont choisies parmi les fonctions de greffage disponibles sur la surface de la nanoplateforme de Formule b, soit NH2, OH et COOH. 10 Dans un mode de realisation particulier, le procede de preparation tel que docrit ci- dessus de ladite nanoplateforme active de Formule X, ZF-RF-QF-F T Z RQ M ZA- RA- QA -A Formule X dans laquelle : 15 - NPc, T, TF, TA, M, F, A, Z, ZF, ZA, R, RF, RA, Q, QF et QA ont les significations de la Formule I, comprend a. une otape de refonctionnalisation par mise en contact d'une nanoplateforme NPC1 de Formule a, NH2 NPc COOH Formule a 20 OH avec une molecule organique de type a-co diamino-alcane comportant deux fonctions amines de preference deux fonctions amines primaires et/ou secondaires et de fawn encore plus preforentielle deux fonctions TF NPc TA 28 amines primaires, pour obtenir une nanoplateforme NPC2 de Formule b ou de Formule H, (NH 2)(1 +b+d) TF I I NPc COOF1(1-b) Formule b NPc -T Formule H OH (1-d) +A dans lesquelles : 5 - b, d, TF, TA et T ayant les significations de la Formule I, b. une otape de liaison d'un fluorophore par la mise en contact d'un procurseur de linker LF' de Formule 1, ZF-RF-QF Formule 1 10 avec ladite nanoplateforme NPC2 de Formule H pour obtenir une nanoplateforme de Formule 0 TF ZF-RF-QF Formule 0 T TA suivie par la mise en contact de ladite nanoplateforme de Formule 0 avec ledit fluorophore F pour obtenir une nanoplateforme de Formule P, TF ZF-RF-QF-F Formule P T 15 TA ladite otape b ayant lieu selon le schema suivant TF TF-ZF-RF-QF I NPc -T + LF I I I TA TA TA Formule H Formule 0 Formule P c. une otape de greffage d'une molecule active antitumorale par la mise en contact de ladite nanoplateforme de Formule P avec un precurseur de 20 linker L' de Formule 2 TF ZF RF QF F NPc -T + F -1"- NPc -T 29 Z R Q Formule 2 pour obtenir une nanoplateforme de Formule Q, TF ZF-RF-QF-F T-Z-R-Q Formule Q I TA suivie par la mise en contact de ladite nanoplateforme de Formule Q avec ladite molecule active antitumorale M pour obtenir une nanoplateforme active de Formule R, TF ZF-RF-QF-F T-Z-R-Q-M Formule R T TA ladite otape c ayant lieu selon le schema suivant TF-ZF- RF-QF-F TF-ZF- RF-QF-F TF-ZF- RF-QF-F NPc -T + L' NPc T-Z-R-Q + M NPc TZR Q M TA TA TA Formule P Formule Q Formule R d. une otape de liaison d'un agent d'adressage par la mise en contact de ladite nanoplateforme active de Formule R avec un precurseur de linker LA' de Formule 3 ZA- RA-QA Formule 3 pour obtenir une nanoplateforme active de Formule S, ZF-RF-QF-F T-Z-R-Q-M Formule S ZA RA-QA TF I NPc T TA 30 suivie par la mise en contact de ladite nanoplateforme active de Formule S avec ledit agent d'adressage A pour obtenir ladite nanoplateforme active de Formule X ladite otape d ayant lieu selon le schema suivant TF-ZF-RF-QF-F NPc TZR Q M +LA. TF-ZF-RF-QF-F TF-ZF-RF-QF-F NPc TZRQ M + A NPc TZRQ M TA TA ZA RA QA TA ZA RA-QA-A 5 Formule R Formule S Formule X Dans ce mode de realisation, les trois molecules d'interet sont respectivement hoes par des linkers longs a la nanoplateforme, les trois linkers pouvant etre identiques ou differents entre eux selon les besoins pour la nanoplateformes actives io Dans un mode de realisation particulier, le procede de preparation tel que docrit ci- dessus de ladite nanoplateforme active de Formule VI, TF F Z RQ M Formule VI dans laquelle : 15 - NPc, T, M, F, TF, Z, R, et Q ont les significations de la Formule I, comprend a. une otape de refonctionnalisation par mise en contact d'une nanoplateforme NPC1 de Formule a, NH2 NPc -COOH Formule a OH 20 avec une molecule organique de type a-co diamino-alcane comportant deux fonctions amines de preference deux fonctions amines primaires et/ou secondaires et de fawn encore plus preforentielle deux fonctions amines primaires, pour obtenir une nanoplateforme NPC2 de Formule b ou de Formule T, (NH2)(1 +b+d) 31 NPc COOF1(1-b) Formule b TF 1 NPc -T Formule T 0Ho_co dans laquelle : - b, d, T et TF ayant les significations de la Formule I, b. une otape de liaison d'un fluorophore par la mise en contact dudit 5 fluorophore F, avec une nanoplateforme NPC2 de Formule T, pour obtenir une nanoplateforme de Formule U TF F Formule U ladite otape b ayant lieu selon le schema suivant TF TF F 1 1 NPc -T + F NPc -T Formule T Formule U 10 c. une otape de greffage d'une molecule active antitumorale par la mise en contact de ladite nanoplateforme de Formule U avec un precurseur de linker L' de Formule 2 Z R Q 15 Formule 2 pour obtenir la nanoplateforme de Formule W TF I F NPc -T Z R Q Formule W suivie par la mise en contact de ladite nanoplateforme de Formule W avec ladite molecule active antitumorale M, pour obtenir ladite nanoplateforme 20 active de Formule VI, ladite otape c ayant lieu selon le schema suivant TF-F NPc -T + L' Formule U TF-F NPc T-Z-R-Q + M Formule W TF-F NPc T ZR Q M Formule VI 32 Dans ce mode de realisation, le fluorophore est lie directement a la nanoplateforme via un linker court, tandis que la molecule active antitumorale est hoe a la nanoplateforme via un linker long. Dans un mode de realisation particulier, le procede de preparation tel que docrit ci- 5 dessus de ladite nanoplateforme active de Formule IV, N "T Z R Q M Formule IV dans laquelle : - NPc, T, M, Z, R et Q ont les significations de la Formule I, 10 comprend : a. une otape de refonctionnalisation par mise en contact d'une nanoplateforme NPC1 de Formule a, NH2 NPc -COOH Formule a OH avec une molecule organique de type a-co diamino-alcane comportant 15 deux fonctions amines de preference deux fonctions amines primaires et/ou secondaires et de fawn encore plus preforentielle deux fonctions amines primaires, pour obtenir une nanoplateforme NPC2 de Formule b ou de Formule Y, (NH 2)0 +b+d) NPc COOF1(1-b) Formule b NPc -T Formule Y OH _co 20 dans laquelle : - b, d et T ayant les significations de la Formule I, b. une otape de greffage d'une molecule active antitumorale par la mise en contact de ladite nanoplateforme de Formule Y avec un precurseur de linker L' de Formule 2 25 Formule 2 pour obtenir une nanoplateforme de Formule Z 33 NPc T Z R Q Formule Z suivie par la mise en contact de ladite nanoplateforme de Formule Z avec ladite molecule active antitumorale M, pour obtenir la nanoplateforme active de Formule IV, 5 ladite otape b ayant lieu selon le schema suivant NPc -T + L' NPc -T-Z-R-Q + M NPc T ZR Q M Formule Y Formule Z Formule IV Dans un mode de realisation particulier, le procede de preparation tel que docrit cidessus de ladite nanoplateforme active de Formule VIII, T Z RQ M ZA-RA-QA-A 10 Formule VIII dans laquelle : - NPc, T, TA, M, A, Z, ZA, R, RA, Q, et QA ont les significations de la Formule I, comprend : 15 a. une otape de refonctionnalisation par mise en contact d'une nanoplateforme NPC1 de Formule a, NH2 NPc -COOH Formule a OH avec une molecule organique de type a-co diamino-alcane, comportant deux fonctions amines de preference deux fonctions amines primaires 20 et/ou secondaires et de fawn encore plus preforentielle deux fonctions amines primaires, pour obtenir une nanoplateforme NPC2 de Formule b ou de Formule AA, 34 (NH 2)(1 +b+d) NPc -COOFI(1-b) Formule b NPc -T Formule AA OH (1-d) TA dans laquelle : - b, d, T et TA ayant les significations de la Formule I, b. une otape de greffage d'une molecule active antitumorale par la mise en 5 contact de ladite nanoplateforme de Formule AA avec un precurseur de linker L' de Formule 2 Z R Q Formule 2 pour obtenir une nanoplateforme de Form ule AB N T Z R Q Formule AB 10 TA suivie par la mise en contact de ladite nanoplateforme de Formule AB avec ladite molecule active antitumorale M, pour obtenir une nanoplateforme active de Formule AC, N c T Z R Q M Formule AC TA 15 ladite otape b ayant lieu selon le schema suivant NPc -T + L' NPc -T-Z-R-Q + M NPc TZRQ M TA TA TA Formule AA Formule AB Formule AC c. une otape de liaison d'un agent d'adressage par la mise en contact de ladite nanoplateforme active de Formule AC avec un precurseur de linker 20 La' de Formule 3, ZA- RA-QA Formule 3 pour obtenir une nanoplateforme active de Form ule AD 35 N c T Z R Q M Formule AD TA ZA RA-QA suivie par la mise en contact de ladite nanoplateforme active de Formule AD avec ledit agent d'adressage A pour obtenir ladite nanoplateforme active de Form ule VIII 5 ladite otape c ayant lieu selon le schema suivant NPc -T-Z-R-Q M +LA' NPc T ZR Q M + A NPc TZR Q M TA TA ZA QA TA ZA RA-QA-A Formule AC Formule AD Formule VIII Dans un mode de realisation particulier, le procede de preparation tel que docrit cidessus comprend avant l'eventuelle otape de refonctionnalisation d'une 10 nanoplateforme NPC1, une otape de synthese de ladite nanoplateforme NPC1 de Formule a NH2 NPc -COOH Formule a OH par la mise en contact d'acide citrique avec du diethylenetriamine dans l'eau sous micro-ondes pendant un temps suffisant pour obtenir ladite nanoplateforme de 15 Formule a, selon le schema H2N\ NH-\ Micro-ondes NH2 NPc -COOH OH HO OH NH2 OH Formule a dans lequel : - NPc a la signification de la Form ule I, 20 Dans ce mode de realisation, la nanoplateforme initiale (NPC1) est synthetisee a partir de molecules organiques pouvant etre biosourcees. Cette synthese permet d'obtenir directement les nanoplateformes. S'il n'y a pas d'etape de 36 refonctionnalisation, les nanoplateformes obtenues suite a cette synthese sont celles utilisees pour greffer les molecules d'interet. Dans un mode de realisation particulier, le procede de preparation tel que docrit cidessus comprend, 5 une otape de refonctionnalisation d'une nanoplateforme NPC1 de Formule a, NH2 NPc -COOH Formule a OH par la mise en contact de ladite nanoplateforme NPC1 de Formule a avec un exces de 1,2-6thylenediamine a une temperature comprise de 100 a 150°C pendant 2 a 24 heures, notamment 12 heures, pour obtenir une nanoplateforme NPC2 de Formule b, 10 selon le schema, NH2 (NH 2)(1+b+d) NPc -COON + H2N NH2 OH 115 °C 12 h NPc -(COON)(l_b) (OH) (1-d) Formule a Formule b dans lequel - b, d et NPc ont les significations de la Formule I, Dans ce mode de realisation, la nanoplateforme initiale (NPC1) apres avoir oto 15 synthetisee est refonctionnalisoe avec un compose amine pour accroitre le nombre de fonctions de greffage amine primaire a la surface de la nanoplateforme. Cette otape peut etre effectuoe avec une diamine primaire. Cette diamine primaire peut etre de la 1,2 othylenediamine, du 1,3-diaminopropane ou du 1,4 diaminobutane. Dans ce mode de realisation, le taux de refonctionnalisation est de 95%. 20 Dans un mode de realisation particulier, le procede de preparation tel que docrit ci- dessus de ladite nanoplateforme active de Formule XII, HN Rhodamine B 0 N Paclitaxel o Formule XII dans laquelle : 37 - NI', a la signification de la Formule I, cornprend a. une otape de synthese d'une nanoplateforme NPC1 de Formule a, NH2 NPc -COOH Formule a OH 5 par la mise en contact d'acide citrique avec de la diethylenetriamine dans l'eau sous micro-ondes avec une puissance de 500 a 1000 W, notamment 600 W, pendant un temps de 1 a 5 minutes, notamment 2 minutes, pour obtenir ladite nanoplateforme de Formule a, selon le schema + H2N\ NH-\ Micro-ondes NH2 OH NPc -COOH OH Formule a HO NH2 10 OH b. une otape de refonctionnalisation de ladite nanoplateforme NPC1 de Formule a, par la mise en contact de ladite nanoplateforme NPC1 de Formule a avec un exces de 1,2-6thylenediamine a une temperature comprise de 100 a 150°C pendant 2 a 24 heures, notamment 12 heures, 15 pour obtenir une nanoplateforme NPC2 de Formule b ou de Formule AE, (NH 2)(1 +b+d) Formule b NH2 1 NPc COOF1(-1-b) NPc -NH2 Formule AE 6H(1-d) dans laquelle : - b et d ont la signification de la Formule I, selon le schema, NH2 (NH 2)(1+b+d) NPc -COOH + H2N NH2 OH 115 °C 12 h NPc (COOH) (1 _b) (OH) (1-d) Formule b 20 Formule a 38 c. une otape de liaison d'un fluorophore par la mise en contact d'un fluorophore F constitue par de la Rhodamine B, avec ladite nanoplateforme NPC2 de Formule AE, pour obtenir une nanoplateforme de Formule AF HN Rhodamine B Formule AF NPc NH2 5 ladite otape c ayant lieu selon le schema suivant NH2 NH Rhodamine B NPc -NH2 Rhodamine B NPc -NH2 Formule AF Formule AE d. une otape de greffage d'une molecule active antitumorale par la mise en contact de ladite nanoplateforme de Formule AF avec un precurseur de 10 linker L', de l'anhydre succinique et une base, du Na2CO3, pour obtenir la nanoplateforme de Formule AG HN Rhodamine B O OH Formule AG O suivie par la mise en contact de ladite nanoplateforme de Formule AG avec ladite molecule active antitumorale M, du paclitaxel, pour obtenir 15 ladite nanoplateforme active de Formule XII, ladite otape d ayant lieu selon le schema suivant HN-Rhodamine B NPc -NH O O Formule AF Formule AG Formule XII Selon un autre aspect, l'Invention concerne une nanoplateforme active dans laquelle 20 la nanoplateforme NPC2 a. ne prosente pas de toxicito cellulaire in vitro; et b. est susceptible d'être internalisoe par des cellules en culture in vitro, a une concentration comprise de 1 pg/mL a 25 pg/mL. Selon un aspect plus particulier, l'Invention concerne une nanoplateforme active 25 dans laquelle la nanoplateforme NPC2 c. ne prosente pas de toxicito cellulaire in vitro, notamment sur la lignee cellulaire cancereuse U-87-MG et sur les lignees non-cancereuses NH2 OH HN-Rhodamine B O-Paclitaxel 0 Paclitaxel 39 HMEC-1 et NHDF ; et d. est susceptible d'être internalisoe par des cellules en culture in vitro, notamment par la lignoe cellulaire cancereuse U-87-MG, a une concentration comprise de 1 pg/mL a 25 pg/mL. 5 La prosente Invention concerne ogalement ('utilisation de la nanoplateforme active procedemment docrite comme medicament. La prosente Invention concerne ogalement la nanoplateforme active procedemment docrite pour son utilisation comme medicament. A ce titre, l'Invention a pour objet une composition pharmaceutique comprenant au 10 moins une nanoplateforme active docrite ci-dessus en association avec un excipient pharmacologiquement acceptable. Selon un aspect particulier, l'Invention a pour objet une composition pharmaceutique comprenant au moins une nanoplateforme active docrite ci-dessus ou ladite molecule active antitumorale M est choisie parmi les taxanes ou les anthracyclines, 15 et en association avec un excipient pharmacologiquement acceptable. Selon un aspect plus particulier, l'Invention a pour objet une composition pharmaceutique comprenant au moins une nanoplateforme active docrite ci-dessus ou ladite molecule active antitumorale M est du paclitaxel ou de la doxorubicine, et en association avec un excipient pharmacologiquement acceptable. 20 Selon un aspect particulier, l'Invention a pour objet une composition pharmaceutique comprenant au moins une nanoplateforme active docrite ci-dessus ou ladite molecule active antitumorale M est du paclitaxel, et en association avec un excipient pharmacologiquement acceptable. Selon un aspect encore plus particulier, l'Invention a pour objet une composition 25 pharmaceutique comprenant au moins une nanoplateforme active docrite ci-dessus ou ladite molecule active antitumorale M est de la doxorubicine, et en association avec un excipient pharmacologiquement acceptable. Les compositions pharmaceutiques selon l'Invention comprennent avantageusement un ou plusieurs excipients ou vehicules, acceptables sur le plan pharmaceutique. On 30 peut citer par exemple des solutions salines, physiologiques, isotoniques, tamponnees, etc., compatibles avec un usage pharmaceutique et connues de l'Homme du métier. Les compositions peuvent contenir un ou plusieurs agents ou vehicules choisis parmi les dispersants, solubilisants, stabilisants, conservateurs, etc. Des agents ou vehicules utilisables dans des formulations (liquides et/ou injectables 35 et/ou solides) sont notamment la mothylcellulose, l'hydroxymothylcellulose, la carboxymothylcellulose, le polysorbate 80, le mannitol, la gelatine, le lactose, ('acacia, etc. Les compositions peuvent etre formulees sous forme de solutions ou de suspensions injectables, gels, comprimos, poudres, golules, capsules, etc. 40 Par ailleurs, ('Invention, laquelle contient par exemple 45 mg de paclitaxel par g de NPC2 (donnees RMN), englobe ogalement une composition pharmaceutique formuloe en dose unitaire comprenant de 1 g a 15 g de nanoplateformes actives, notamment de 3 g a 12,5 g de nanoplateformes actives et de preference de 5 g a 10 5 g de nanoplateformes actives. Autrement dit, la composition pharmaceutique selon ('Invention est formuloe en dose unitaire de 1 ; 1,5 ; 2 ; 2,5 ; 3 ; 3,5 ; 4 ; 4,5 ; 5 ; 5,5 ; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; 9; 9,5; 10; 10,5; 11 ; 11,5; 12; 12,5; 13; 13,5; 14; 14,5 et/ou 15 g de nanoplateformes actives. Selon un autre aspect, ('Invention a pour objet une composition pharmaceutique formuloe a une dose de nanoplateformes actives de 20 mg/kg a 200 mg/kg de poids corporel (ou de 0,88 g/m2 a 8,8 g/m2 de surface corporelle). Selon un autre aspect particulier, ('Invention a pour objet une composition pharmaceutique formuloe a une dose de nanoplateformes actives de 20 mg/kg a 200 mg/kg de poids corporel, notamment de 40 mg/kg a 180 mg/kg, particulierement de 15 60 mg/kg a 160 mg/kg et de preference de 80 mg/kg a 140 mg/kg. Autrement dit, la composition pharmaceutique selon ('Invention est formuloe en dose unitaire de 20 ; 25; 30; 35; 40; 45; 50; 55; 60; 65; 70; 75; 80; 85; 90; 95; 100; 105; 110; 115; 120; 125; 130; 135; 140; 145; 150; 155; 160; 165; 170; 175; 180; 185; 190 ; 195 et/ou 200 mg/kg de nanoplateformes actives. 20 Selon un aspect particulier, ('Invention a pour objet une composition pharmaceutique formuloe a une dose de nanoplateformes actives de 0,88 g/m2 a 8,8 g/m2 de surface corporelle, notamment de 1 g/m2 a 8 g/m2, particulierement de 3 g/m2 a 6 g/m2 et de preference de 3g/m2 a 6 g/m2. Autrement dit, la composition pharmaceutique selon ('Invention est formuloe en dose unitaire de 0,88 ; 1 ; 1,5 ; 2 ; 2,5 ; 3 ; 3,5 ; 4 ; 4,5 ; 5 ; 25 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5 et/ou 8,8 g/m2 de nanoplateformes actives. Afin d'être administroe a un mammifere, notamment a I'Homme, ('Invention a pour objet une composition pharmaceutique formuloe pour etre administrable par toute voie d'administration appropriee en particulier par voie enterale ou parenterale. 30 Parmi les voies enterales, on peut notamment citer la voie buccale, sublinguale, perlinguale, ou rectale. Parmi les voies parenterales, on peut notamment citer l'injection intraveineuse, l'injection sous-cutanoe, l'injection intradermique, l'injection intramusculaire, l'injection intraperitoneale, l'injection intrathecale ou l'injection intratumorale. La voie d'administration vaginale, nasale, pulmonaire, auriculaire, 35 ophtalmique ou transdermique est aussi possible. Les injections peuvent etre realisees sous forme de bolus, et/ou par perfusion continue. Selon un mode d'administration preforentielle, la composition pharmaceutique selon ('Invention est formuloe pour etre administrable par voie enterale choisie parmi la voie buccale, sublinguale, perlinguale, ou rectale. 41 Les preparations pour une administration parenterale peuvent inclure des solutions aqueuses ou non-aqueuses steriles, des suspensions ou des emulsions. Des exemples de solvants non-aqueux sont le propylene glycol, le polyethylene glycol, des huiles vegetales, telle que l'huile d'olive, ou des esters organiques injectables 5 tels que l'othyloleate. Des vehicules aqueux comprennent l'eau, des solutions alcool/eau, des emulsions ou des suspensions. Selon un autre mode d'administration preforentielle, la composition pharmaceutique selon l'Invention est formuloe pour etre administrable par voie parenterale choisie parmi ('injection intraveineuse, sous-cutanoe, intradermique, intramusculaire, 10 intraperitoneale, intrathecale ou intratumorale. Selon un autre mode d'administration preforentielle, la composition pharmaceutique selon l'Invention est formuloe pour etre administrable par voie sous-cutanoe. Un autre aspect de l'Invention concerne des nanoplateformes actives pour leur utilisation dans le traitement de cancers notamment des tumeurs corobrales 15 primitives et plus particulierement le glioblastome et/ou les metastases corobrales issues de tumeurs primaires de localisation non corobrale. Un aspect de l'Invention plus précis concerne des nanoplateformes actives pour leur utilisation dans le traitement du glioblastome et des metastases corobrales issues de differentes tumeurs primaires de localisation non corobrale. 20 Un aspect de l'Invention encore plus précis concerne des nanoplateformes actives pour leur utilisation dans le traitement du glioblastome. Un aspect de l'Invention encore plus précis concerne des nanoplateformes actives pour leur utilisation dans le traitement des metastases corobrales issues de differentes tumeurs primaires de localisation non corobrale. 25 Un aspect particulier de l'Invention comprend des nanoplateformes actives dans laquelle la liaison entre le paclitaxel ou la doxorubicine et le linker L de la nanoplateforme de Formule 20 est clivable et permet le relargage du paclitaxel ou de la doxorubicine, en particulier en rompant par hydrolyse la liaison ester entre le linker L et le paclitaxel ou la doxorubicine, 30 Un aspect tres précis de l'Invention comprend des nanoplateformes actives dans laquelle la liaison entre le paclitaxel et le linker L de la nanoplateforme de Formule 20 est clivable et permet le relargage du paclitaxel, en particulier en rompant par hydrolyse la liaison ester entre le linker L et le paclitaxel. Un autre aspect tres précis de l'Invention comprend des nanoplateformes actives 35 dans laquelle la liaison entre la doxorubicine et le linker L de la nanoplateforme de Formule 20 est clivable et permet le relargage de la doxorubicine, en particulier en rom pant par hydrolyse la liaison ester entre le linker L et la doxorubicine. 42 Figures : La Figure 1 A reprosente une image des nanoplateformes NPC1 ou NPC2 obtenue par microscopie electronique a transmission (TEM). L'ochelle est de 50 nm, et la distribution visuelle de la taille des nanoplateformes est nettement inferieure a cette 5 ochelle. La Figure 1 B reprosente, le diagramme de distribution de la taille des nanoplateformes obtenues, et la courbe modelisant cette distribution par une fonction log-normale. La distribution est centroe autour d'une taille de 17 nm. La Figure 2 reprosente le diffractogramme des nanoplateformes NPC1 ou NPC2 10 obtenu par DRX (mesures effectuees sur poudre en utilisant un diffractometre de poudre rayon-X Bruker D2 Phaser). La courbe est representative d'un compose amorphe. La Figure 3 A reprosente le spectre Raman des nanoplateformes NPC1 ou NPC2 (mesures effectuees sur poudre en utilisant un microscope Raman Explora equipe 15 d'un objectif a air (50x) et operant a 785 nm). La presence d'une bande intense a 1575 cm-1 (Bande G du graphite), ('absence d'une bande a 2714 cm-1 (Bande 2D du graphite), et la faible bande entre 1310 et 1350 cm-1 (Bande D du graphite) ne suggerent pas la presence de graphite dans rechantillon. La Figure 3 B reprosente le spectre Infrarouge des nanoplateformes NPC1 ou NPC2 20 (mesures effectuees sur pastille de KBr en utilisant un spectrometre PerkinElmer Spectrum 100 Optica). La Figure 4 A reprosente le spectre XPS des nanoplateformes NPC1 ou NPC2 (mesures effectuees sur poudre en utilisant un spectrometre K-alpha) pour le carbone. 25 La Figure 4 B reprosente le spectre XPS des nanoplateformes NPC1 ou NPC2 (mesures effectuees sur poudre en utilisant un spectrometre K-alpha) pour l'azote. Le pic est centre autour d'une onergie de liaison de 399.8 eV. La Figure 4 C reprosente le spectre XPS des nanoplateformes NPC1 ou NPC2 (mesures effectuees sur poudre en utilisant un spectrometre K-alpha) pour 30 roxygene. Le premier pic est centre autour d'une onergie de liaison de 531,0 eV, le second 532.2 eV et le troisieme 533.2 eV. La Figure 5 A reprosente les spectres d'emission (courbe pointillee) et d'absorption (courbe pleine) des nanoplateformes (mesures effectuees en solution dans l'eau en utilisant un fluorimetre Fluoro-Max et un spectrometre UV-Visible Jasco V-570 35 respectivement) NPC1 ou NPC2. La Figure 5 B reprosente rintensito de remission de fluorescence des nanoplateformes NPC1 ou NPC2 en fonction de la longueur d'onde incidente et de la 43 longueur d'onde emise. L'optimale correspond a une longueur d'onde incidente de 360 nm pour une emission de 455 nm. La Figure 6 reprosente le spectre d'emission des nanoplateformes NPC1 ou NPC2, a 37°C et avec une concentration de 25 pg/ml dans un milieu biologique (milieu de 5 culture + serum de veau foetal), en fonction du temps, et avec une longueur d'onde incidente a 360 nm. La Figure 7 reprosente les tests colorimetriques mesurant la survie des cellules, effectuos apres 72 h d'incubation des NPC2 (A, B et C). Le test d'impodance en temps reel mesurant la survie des cellules est effectue au moins pendant 72 h d'incubation des NPC2 (D, E et F). Ces tests ont oto realises avec des doses de 1 a 100 pg/mL sur les cellules U-87-MG (A et D), HMEC-1 (B et E) et sur NHDF (C et F). Panel A, B et C : axe des abscisses = Concentration en pg/mL et l'axe des ordonnees = viabilito cellulaire en %. Pour l'ensemble de ce panel, - le test MTT est reprosento par des tirets marques d'un losange, 15 - le test Sulforhodamine B est reprosento par des pointilles marques d'un car* et - le test Alamar Blue est reprosento par un trait marque d'un triangle. Panel D, E et F : axe des abscisses = temps en h et l'axe des ordonnees = viabilito cellulaire en %. Pour l'ensemble de ce panel, 20 - la dose de 5 pg/mL est reprosentee par un trait gris fonce - la dose de 25 pg/mL est reprosentee par un trait gris tres clair - la dose de 50 pg/mL est reprosentee par un trait gris clair - la dose de 100 pg/mL est reprosentee par un trait noir profond. La Figure 8 reprosente l'internalisation des NPC2 dans les cellules U-87-MG, HMEC- 25 1, et NHDF apres une incubation de 4 h (marque NPC2 1 pg/mL et NPC2 5 pg/mL) avec des vues orthogonales montrant la distribution des NPC2 dans l'opaisseur des cellules. L'internalisation des NPC2 par les HMEC- 1 et les NHDF est negligeable alors que ('('internalisation dans les cellules U-87-MG est visible. Ce constat est fait a partir d'images de fluorescence a deux photons obtenues a une excitation de 740 nm 30 et des emissions de 480 a 550 nm apres correction de l'autofluorescence, ainsi que des images obtenues en lumiere transmise pour localiser les cellules. Barre d'ochelle: 35 pm La Figure 9 reprosente l'internalisation des NPC2 dans les cellules U-87-MG, HMEC1, et NHDF apres une incubation de 4 h et une concentration en NPC2 de 25 pg/mI. 35 Les cellules U-87-MG et les cellules NHDF ne prosentent pas de modification majeure de l'internalisation des NPC2 par rapport a la Figure 8. Par contre, l'internalisation des NPC2 a 25 pg/mL est amolioree dans les cellules HMEC-1 telles qu'observees a partir d'images de fluorescence a deux photons apres correction de l'autofluorescence. Des images en lumiere transmise sont egalement fournies pour 40 localiser les cellules. 44 Barre d'ochelle: 35 pm La Figure 10 reprosente l'internalisation des NPC2 dans les cellules U-251 MG apres une incubation de 4 h et une concentration en NPC2 de 1, 5 et/ou 25 pg/mL. Les cellules controles ont oto exposees au milieu de culture seulement. II est mis en 5 evidence une internalisation des NPC2 dans ces cellules comme le montrent les images de fluorescence a deux photons obtenues a une excitation de 740 nm et des emissions de 480 a 550 nm apres correction de l'autofluorescence. Des images en lumiere transmise sont ogalement fournies pour localiser les cellules. Barre d'ochelle: 35 pm 10 La Figure 11 reprosente l'internalisation des NPC2 dans les cellules U-87 MG avec une concentration en nanoplateformes NPC2 de 0 (controles), 1 ou 5 pg/ml dans des conditions de blocage ou non de l'endocytose (sans blocage, inhibition de l'endocytose onergie-dopendante, inhibiteur de clathrine, inhibiteur de caveoline, inhibiteur de rafts lipidiques). 15 Les NPC2 sont internalises dans les cellules U-87-MG apres traitement par des concentrations de 1 et 5 pg/mL pendant 4 heures en ('absence d'inhibition de l'endocytose (controle positif). Lorsque ces memes cellules sont cultivoes a 4° C afin de bloquer l'endocytose onergie-dopendante ou a des inhibiteurs de l'endocytose utilisant la voie de la caveoline ou des radeaux lipidiques, nous ne retrouvons pas de 20 NPC2 a l'interieur des cellules ce qui tomoigne de ('implication de ces voies d'endocytose dans l'internalisation cellulaire de NPC2. Par contre, celles en presence d'un inhibiteur de l'endocytose utilisant la voie de la clathrine restent capables d'internaliser les NPC2 a des concentrations de 1 et 5 pg/mL. Les images en lumiere transmise sont fournies pour localiser les cellules. Toutes les images de fluorescence 25 a deux photons obtenues a une excitation de 740 nm avec une emission de 480 a 550 nm sont corrigees en soustrayant l'autofluorescence des cellules tomoins non traitees. Barre d'ochelle: 35 pm La Figure 12 reprosente les tests de viabilito cellulaire comparatifs entre le paclitaxel 30 seul (PTX) et les nanoplateformes actives de l'exemple 3.1 (NPC2-PTX) sur les cellules HMEC-1 (A) ; SK-N-SH (B) et U-87 MG (C), et mesuros par le test MTT, apres 72 heures de traitement avec une gamme de concentration allant de 0, 1 a 100 nM exprimoe en PTX ou equivalent PTX porte par NPC2, ou mesure par le test d'impodance en temps reel apres 72 h de traitement des HMEC-1 (D) pour les 35 nanoplateformes actives de l'exemple 3.1. Ces donnees ont permis de determiner les IC50 du paclitaxel et des nanoplateformes actives de l'exemple 3.1 selon la lignoe consideree. Axe des abscisses = Concentration de PTX ou equivalent PTX porte par NPC2 en nM et l'axe des ordonnees = viabilito cellulaire en % La Figure 13 reprosente l'activito pharmacologique du PTX (A et C) et des NPC2PTX (B et D), analysoe par immunofluorescence indirecte de la tubuline sur cellules HMEC-1 (A et B) et U-87 MG (C et D) apres 6 h de traitement avec des concentrations de PTX ou equivalent PTX porte par NPC2 de 10, 50 et/ou 100 nM. 5 Barre d'ochelle : 0,5 cm = 10 pm La Figure 14 reprosente l'activito pharmacologique du PTX et des NPC2-PTX, determinee par microscopie optique sur les cellules U-87 MG en culture 3D avant traitement (JO) et 7 et 14 jours apres traitement avec des concentrations qui correspondent a l'IC50 calculoe en 2D (doses equitoxiques), a 2,8 fois l'IC50 et a 4 fois 10 1'1 C50. Barre d'ochelle : 500 pm La Figure 15 reprosente l'activito du PTX et des NPC2-PTX, mesuree sur les cellules U-87 MG en culture 3D par le test d'Alamar Blue 7 jours (A) et 14 jours apres traitement (B). Les resultats sont exprimos en pourcentage par rapport au controle 15 normalise a 100 %. Axe des abscisses = Concentration en multiple de l'IC50 et l'axe des ordonnees = viabilito cellulaire en % Axe des abscisses = Concentration en multiple de l'IC50 et l'axe des ordonnees = viabilito cellulaire en % 20 Exemples Exem - le 1 : S nthese de Ia nano - lateforme initiale NPC1 et de Ia nanoplateforme NPC2 1. Synthese de la nanoplateforme initiale NPC1 Dans un Becher de 50 ml, de l'acide citrique monohydrato (5,25 g, 25,0 mmol) 25 est dissous dans de l'eau distillee (5 ml), puis de la diethylene triamine est ajoutoe au goutte a goutte (3,0 ml, 2.87g, 27,6 mmol). La solution aqueuse jaune resultante est chauffoe a l'aide d'un four a micro-ondes pendant 2 minutes a 600 W de puissance. Apres refroidissement du residu, de ('ethanol (25 ml) est ajouto et le residu est gratto avec une spatule jusqu'a formation 30 d'une poudre logerement brune. Apres sonication aux ultrasons pendant 2 minutes, la suspension homogene est centrifugoe a 6000 tr / min pendant 10 minutes. La poudre brunatre au fond du cylindre de centrifugation est recueillie et lavoe avec de ('ethanol puis avec de ('ether diethylique donnant 4,8 g de nanoplateformes initiale NPC1 en poudre brune apres sochage complet sous 35 vide soit un rendement massique de 60%. 2. Synthese de la nanoplateforme NPC2 Des nanoplateformes NPC2 (200mg) sont mis en solution dans 1 ml d'othylenediamine. Cette solution est maintenue a une temperature de 115 °C sous 46 agitation pendant 12 heures. La solution brune obtenue est refroidie a la temperature ambiante puis additionnoe goutte a goutte a 20 ml de dichloromothane sous agitation. Une suspension est alors obtenue. Celle-ci est centrifugoe a 6000 tours/minute pendant 10 minutes. Le culot est remis en 5 suspension dans 20 ml de dichloromothane a l'aide d'ultrasons pendant 5 minutes puis de nouveau centrifuge dans les memes conditions que procedemment. Ce processus est repoto une 3eme fois. La poudre marron obtenue est alors sochee sous vide (0.1 torr) a 50°C pendant 2 h. On obtient 190 mg de poudre seche soit un rendement massique de 95% par rapport a 10 NPC2. Le test de Kaiser permet le dosage du nombre de fonctions amines primaires a la surface des nanoparticules soit 2.7 mequivalents de NH2 /g. La meme reaction realisee avec le 1,3 diaminopropane a 135°C pendant 12 h conduit a 185 mg de poudre seche (Rendement massique = 92.5% / NPC2) portant 3 mequivalents de NH2/g de nanoparticules. 15 Exemple 2 : Caracteristique de la nanoplateforme NPC2 1. Composition de la nanoplateforme NPC2 En raison de la taille de la nanoplateforme obtenue, ('utilisation de la technique XPS permet de connaitre les liaisons internes et de surface de la nanoplateforme et donc les atomes composant la nanoplateforme. Les 20 nanoplateformes NPC2 sous forme de poudre sont « ancrees » mocaniquement dans une matrice en indium ultra-pur (par pression), puis ('ensemble est analyse par un spectrometre K-alpha. Les resultats, prosentes sur la figure 3, montre la presence des liaisons suivantes dans les nanoplateformes : C=C, CC, C-CO, C-CN, C-0, C-N, N-C=O, C-NHR et COO. 25 2. Mesure de la solubilito de la nanoplateforme NPC2 En raison de la tres forte solubilito des nanoplateformes dans l'eau, combinoe a une tres forte absorptivite, une technique d'absorption est impossible a utiliser. La solubilito a oto mesuroe par un controle uniquement visuel. Pour cette mesure, de la poudre de nanoplateforme telle qu'obtenue procedemment est 30 ajoutoe dans 64 mg d'eau. La solution est agitoe pendant quelques minutes. Avec un ajout de 16.7 mg de nanoplateforme, la solution apres agitation est fortement coloroe et limpide a La solubilito des nanoplateformes est donc superieure a 250 g/I. 3. Durete de la nanoplateforme NPC2 35 La durete des nanoplateformes a oto mesuroe par microscopie a force atomique (AFM). Le microscope a force atomique utilise est un module Bruker Dimension Icon et la pointe utilisoe est une pointe ScanAsyst-Air avec un rayon de courbure de 2 nm. Le module de Young est mesure en utilisant le mode peak force de l'appareil. Une solution aqueuse de nanoplateformes est deposee 40 sur une lame en verre de microscope, puis le module de Young de l'ochantillon 47 est mesure et est compare a deux references : un film de polystyrene qui possede un module de Young de 3-3.5 GPa et un film de PDMS qui possede un module de Young de 3.5 MPa. Plusieurs depots de nanoplateformes ont oto effectuos. Les valeurs des modules de Young mesures pour les divers 5 ochantillons se situent entre 1 et 4 GPa. On peut donc en conclure que les nanoplateformes ont une durete proche de celle du polystyrene (polymere organ ique). 4. Densito de la nanoplateforme NPC2 La densito de la nanoplateforme est mesuree sur un pycnometre AccuPyc II 10 1340 a partir de nanoplateformes sous forme de poudre et selon la technique d'expansion de gaz d'holium. Dix mesures successives sont realisees, puis la valeur de la densito est calculoe comme otant la moyenne de ces dix mesures, soit une densito de 1.53. 5. Taille seche de la nanoplateforme NPC2 15 La mesure de la taille « seche » des nanoplateformes est faite sur un microscope electronique a transmission (HITACHI H7650 a 80 kV). Une goutte de solution aqueuse de nanoplateformes est deposee sur une grille de cuivre (recouverte d'un film de carbone) prealablement chargoe positivement selon la technique « Glow discharge » (afin d'augmenter l'affinito des nanoplateformes 20 pour la grille). Apres une minute, l'exces de solution aqueuse est elimine par capillarito au moyen d'un papier absorbant puis une goutte d'une solution aqueuse d'acetate d'uranyle est ajoutoe sur la grille pendant une minute. Apres ce temps, l'exces de la solution aqueuse d'acetate d'uranyle est elimine par capillarito au moyen d'un papier absorbant. L'operation est repotee deux fois 25 pour le contrastant (acetate d'uranyle), puis la grille une fois seche est prete pour ('observation. La taille des nanoplateformes est mesuree aleatoirement sur plusieurs clichés a l'aide du logiciel ImageJ (nombre de particules mesurees > 400). La taille moyenne obtenue par TEM des nanoplateformes est de 17 nm. 30 6. Cristallinito de la nanoplateforme NPC2 a. Par DRX Des nanoplateformes sous forme de poudre sont analysees sur un diffractometre de poudre rayon-X Bruker D2 Phaser. A titre d'information, le graphite prosente une raie tres fine et intense correspondant au plan 35 (002) aux petits angles (20 - 26°), et comme le montre le spectre de diffraction X sur poudre des nanoplateformes sur la figure 2, it n'y a aucune trace de cette raie caracteristique du graphite. b. Par spectroscopie Raman Des nanoplateformes sous forme de poudre sont dispersees sur une lame 40 de microscope, puis les spectres Raman sont mesures sur cette lame au 48 moyen du microscope Raman Explora en utilisant un objectif a air (50x) et un laser a 785 nm. Le graphite est caracterise par plusieurs bandes en spectroscopie Raman, la bande G qui se situe a 1575 cm-1, la bande D qui se situe entre 1310 et 5 1350 cm-1, et la bande 2D qui se situe a 2714 cm-'(pour un laser a 785 nm) De fait, sur le spectre Raman des nanoplateformes (figure 3), on peut observer une bande a 1583 cm-1 qui pourrait etre la bande G, cependant, it n'y a pas de certitude sur la presence de la bande D. Enfin la bande 2D 10 est absente du spectre. II faut toutefois noter que dans certains cas, docrits dans la litterature, la bande 2D peut etre absente pour des nanoplateformes de carbone. La mesure par DRX et par Raman suggere le caractere substantiellement amorphe de la nanoplateforme. 15 7. Taux de fonctions de greffage amine primaire en surface de la nanoplateforme NPC2 Dans un tube a homolyse, sont mélanges 20pL d'une solution aqueuse de nanoplateformes (typiquement quelques mg/mL), 100 pL d'une solution aqueuse de KCN contenant de la pyridine (Kit test Kaiser aldrich), 100 pL d'une 20 solution alcoolique de phenol (80% dans ('ethanol, Kit test Kaiser aldrich) et 100 pL d'une solution alcoolique de ninhydrine (6% dans ('ethanol, Kit test Kaiser aldrich). Le mélange est chauffe a 120°C pendant 5 minutes, puis laisse a refroidir a temperature ambiante. 20 pL de la solution procedemment obtenue sont diluos dans 2 mL d'othanol, puis l'absorbance a 580 nm de cette nouvelle 25 solution est mesuroe. La concentration en amine primaire ayant reagi avec la ninhydrine est deduite de la valeur de l'absorbance et reflete donc la quantito d'amine primaire reactive prosente a la surface des nanoplateformes. Pour les nanoplateformes, la valeur obtenue est de 0.7 pmol de NH2 reactive par mg de nanoplateformes. Pour les nanoplateformes refonctionnalisees, le taux de 30 fonctions de greffage amine primaire est de 3.3 pmol de NH2 reactive par mg de nanoplateformes refonctionnalisees. 8. Fluorescence de la nanoplateforme NPC2 L'absorbance d'une solution aqueuse de nanoplateformes (aoree et equilibree therm iquement) fralchement proparee est mesuree sur un spectrometre JASCO 35 V-570 a temperature ambiante, dans une cuve en quartz avec un trajet optique de 1 cm. L'absorbance maximale des nanoplateformes a lieu a la longueur d'onde de 360 nm. L'emission de fluorescence des nanoplateformes est mesuroe sur la meme solution de nanoplateformes apres dilution prealable de celle-ci jusqu'a atteindre une absorbance inferieure a 0.15 a 360 nm. La 49 fluorescence est enregistroe sur un fluorimetre Fluoro-Max (Horiba) et la longueur d'onde d'emission maximale est de 455 nm. 9. Stabilito de la nanoplateforme NPC2 La stabilito des nanoplateformes NPC2 a oto testoe : 5 - dans differents milieux (eau, PBS, milieu de culture avec serum de veau foetal), - a differentes concentrations (25 pg/ml et 100 pg/ml) - a differents pH (de 4 a 11) - a differentes temperatures ( 4° et 37°C) 10 La stabilito des nanoplateformes est suivi grace a revolution de remission de fluorescence sous une longueur d'onde incidente de 360 nm. Les resultats de la figure 5 montrent une diminution de rintensito de la fluorescence emise dans le temps pendant les premieres 24 h avant d'atteindre un palier au bout de 48 h. 15 Exemple 3 : Syntheses des nanoplateformes actives 1. Synthese d'une nanoplateforme active avec linker long et paclitaxel Une solution de nanoplateformes dans le DMSO (50 g/L, 2 mL) est proparee, puis de ('anhydride succinique est ajouto (9.4 mg). La solution est agitoe a temperature ambiante pendant la nuit, puis le DMSO est elimine par 20 lyophilisation. Les traces de DMSO sont eliminees en faisant procipiter les nanoplateformes dans du dichloromothane. La poudre obtenue est sochee sous vide (m = 66 mg). Les nanoplateformes obtenues sont maintenant porteuses du linker long. Les nanoplateformes avec le linker succinique sont ensuite dissoute dans du DMF (67 g/L, 0.6 mL) est ajouto du paclitaxel (6.0 mg), du DMAP en 25 quantito catalytique puis de I'EDC.HCI (6.2 mg). Le mélange reactionnel est agito a temperature ambiante pendant 60 h, puis de l'eau est ajouto pour detruire I'EDC qui n'a pas reagi. Le mélange de solvent (eau et DMF) est evapore sous pression roduite, puis la poudre obtenue est levee par de racetone et est recoltee par centrifugation. Le solide obtenu est purifio sur une 30 colonne de Sephadex LH2O en utilisant l'eau comme oluant. Les phases aqueuses contenant le bon produit sont rassemblees puis evaporees sous pression roduite. La poudre obtenue correspond a la nanoplateforme active (m = 31.7 mg) comportant la molecule active paclitaxel hoe par un linker long. 2. Synthese d'une nanoplateforme active avec linker long et doxorubicine 35 Une solution de nanoplateformes porteuses du linker long dans le DMSO (100 g/L, 1 mL) est proparee, tel que docrite ci-dessus, puis une solution d'EDC.HCI dans le DMSO (0.178 mol/L, 0.27 mL) est ajoutoe. La solution est agitoe a temperature ambiante 5 minutes puis une solution de Nhydroxysuccinimide dans le DMSO (0.174 mol/L, 0.26 mL) est ajoutoe. La solution est agitoe a temperature ambiante pendant 21 h puis du dichloromothane (12 mL) est ajouto afin de saturer le DMSO en dichloromothane et de faire procipiter les nanoplateformes actives. La suspension est agitoe fortement pendant 5 minutes, puis le procipito est 5 recupere par centrifugation (6500 tpm, 4 minutes) puis lave 3 fois par du dichloromothane. Les traces residuelles de solvant sont eliminees sous pression roduite. La poudre obtenue correspond a la nanoplateforme active (m = 80.8 mg) comportant le linker long active NHS. Les nanoplateformes avec le linker long active NHS peuvent etre dissous dans une solution de DMSO 10 contenant du carbonate de potassium et du chlorhydrate de doxorubicine. Cette solution est agitoe a temperature ambiante pendant une nuit puis du dichloromothane peut etre rajoute. Le procipito obtenu est recolto par centrifugation et lave au dichloromothane 3 fois. Une fois le solvant residuel elimine sous pression roduite, si le produit obtenu n'est pas pur, le residu est 15 purifio sur Sephadex LH2O avec l'eau comme oluant. Les phases aqueuses contenant le produit pur sont rassemblees et le solvant est elimine par lyophilisation. Le residu solide obtenu correspond a la nanoplateforme active comportant la molecule active doxorubicine hoe par un linker long. 20 3. Synthese d'une nanoplateforme active avec fluorophore et linker court et molecule active avec linker long. Une solution de nanoplateformes dans le DMF (25 g/L, 4 mL) est proparee, puis du carbonate de sodium est ajouto (424 mg). La solution est chauffoe a 61°C et 25 une fois cette temperature atteinte, de la lissamine rhodamine B est ajoutoe (1.5 mg). La solution est agitoe a 61 °C pendant la nuit et le DMF est evapore sous pression roduite puis le residu obtenu est neutralise par de l'acide chlorhydrique (pH-1). La solution aqueuse est concentroe sous pression roduite puis le residu est solubilise dans de ('ethanol, centrifuge et le 30 surnageant est collecto afin d'oliminer les sels non solubles dans ('ethanol. Une fois ('ethanol elimine sous pression roduite, la poudre obtenue (69 mg) est sochee sous vide. Les nanoplateformes obtenues sont maintenant porteuses du fluorophore lissamine rhodamine B avec le linker court. Les nanoplateformes avec le fluorophore lissamine rhodamine B (60 mg) sont ensuite dissoute dans 35 du DMSO, puis du carbonate de sodium est ajouto (424 mg). La suspension est agitoe a temperature ambiante pendant 5 minutes, puis de ('anhydride succinique (100 mg) est ajoute. La solution est agitoe a temperature ambiante pendant la nuit puis de l'eau est ajoutoe, suivi d'acide chlorhydrique jusqu'a ce que le pH de la solution atteigne -1. La solution est concentroe sous pression 40 roduite puis les solvants residuels sont elimines par lyophilisation. Le residu obtenu est dissout dans de ('ethanol absolu et les sels non soluble sont ohm inos par centrifugation. La phase alcoolique surnageante est recoltee puis evaporee sous pression roduite jusqu'a l'obtention d'une poudre. Les traces d'acide 51 succinique residuelles sont eliminees en lavant le residu solide obtenu par du chloroforme puis par de ('acetone. La poudre residuelle (38 mg) est sochee sous vide. Les nanoplateformes porteuses du fluorophore lissamine rhodamine B avec le linker court obtenues sont maintenant porteuses du linker long. Une 5 solution des nanoplateformes avec le fluorophore lissamine rhodamine B et le linker long dans le DMF (12.5 g/L, 2 mL) est proparee puis du paclitaxel (3 mg), du DMAP (quantite catalytique) et de I'EDC.HCI (6.18 mg) sont ajoutos. La solution est agitoe a temperature ambiante pendant 60h puis de l'eau est ajoutoe. La solution est concentroe sous pression roduite et la poudre residuelle 10 obtenue est lavoe par de ('acetone. Une fois sochee, la poudre obtenue est purifiee sur Sephadex LH2O en utilisant de l'eau comme oluant. Les phases aqueuses contenant le bon produit sont rassemblees puis l'eau est eliminee par lyophilisation. La poudre obtenue (22.9 mg) correspond a la nanoplateforme active cornportant le fluorophore lissamine rhodamine B lie par un linker court et 15 la molecule active paclitaxel hoe par un linker long. 4. Synthese d'une nanoplateforme active avec agent d'adressage avec linker long et molecule active avec linker long. Une solution de nanoplateformes dans le DMSO (50 g/L, 2 mL) est preparee, 20 puis de ('anhydride succinique est ajouto (9.4 mg). La solution est agitoe a temperature ambiante pendant la nuit, puis le DMSO est elimine par lyophilisation. Les traces de DMSO sont eliminees en faisant procipiter les nanoplateformes dans du dichloromothane. La poudre obtenue est sochee sous vide (m = 66 mg). Les nanoplateformes obtenues sont maintenant porteuses du 25 linker long. Les nanoplateformes avec le linker succinique sont ensuite dissoute dans du DMF (67 g/L, 0.6 mL). Dans la solution obtenue est ajouto du paclitaxel (6.0 mg), du DMAP en quantito catalytique puis de I'EDC.HCI (6.2 mg). Le mélange reactionnel est agito a temperature ambiante pendant 60 h, puis de l'eau est ajoutoe pour detruire I'EDC qui n'a pas reagi. Le mélange de solvant 30 (eau et DMF) est evapore sous pression roduite, puis la poudre obtenue est lavoe par de ('acetone et est recoltee par centrifugation. Le solide obtenu est purifio sur une colonne de Sephadex LH2O en utilisant l'eau comme oluant. Les phases aqueuses contenant le bon produit sont rassemblees puis evaporees sous pression roduite. La poudre obtenue correspond a la nanoplateforme 35 active (m = 31.7 mg) comportant la molecule active linker long. Les nanoplateformes avec la molecule active linker succinique peuvent ensuite etre dissoutes dans du DMF, puis un derive diester du peptide RGD et de I'EDC.HCI sont ajoutos. Le mélange reactionnel est agito a temperature ambiante pendant 60 h, puis de l'eau est ajoutoe pour detruire I'EDC qui n'a pas reagi. Le 40 mélange de solvant (eau et DMF) est evapore sous pression roduite, puis la poudre obtenue est lavoe par de ('acetone et est recoltee par centrifugation. Le solide obtenu est purifio sur une colonne de Sephadex LH2O en utilisant l'eau comme oluant. Les phases aqueuses contenant le bon produit sont 52 rassemblees puis evaporees sous pression roduite. La poudre obtenue correspond a la nanoplateforme active comportant ('agent d'adressage lie par un linker long et la molecule active hoe par un linker long. 5. Synthese d'une nanoplateforme active avec agent d'adressage / molecule 5 active avec linker long et fluorophore avec linker court. Une solution de nanoplateformes dans le DMF (25 g/L, 4 mL) est preparee, puis du carbonate de sodium est ajouto (424 mg). La solution est chauffoe a 61°C et une fois cette temperature atteinte, de la lissamine rhodamine B est ajoutoe 10 (1.5 mg). La solution est agitoe a 61 °C pendant la nuit et le DMF est evapore sous pression roduite. Le residu obtenu est neutralise par de l'acide chlorhydrique (pH-1). La solution aqueuse est concentroe sous pression roduite puis le residu est solubilise dans de ('ethanol, centrifuge et le surnageant est collecto afin d'oliminer les sels non solubles dans ('ethanol. Une 15 fois ('ethanol elimine sous pression roduite, la poudre obtenue (69 mg) est sochee sous vide. Les nanoplateformes obtenues sont maintenant porteuses du fluorophore lissamine rhodamine B avec le linker court. Les nanoplateformes avec le fluorophore lissamine rhodamine B (60 mg) sont ensuite dissoutes dans du DMSO, puis du carbonate de sodium est ajouto (424 mg). La suspension est 20 agitoe a temperature ambiante pendant 5 minutes, puis de ('anhydride succinique (100 mg) est ajoute. La solution est agitoe a temperature ambiante pendant la nuit puis de l'eau est ajoutoe, suivie d'acide chlorhydrique jusqu'a ce que le pH de la solution atteigne -1. La solution est concentroe sous pression roduite puis les solvants residuels sont elimines par lyophilisation. Le residu 25 obtenu est dissout dans de ('ethanol absolu et les sels non solubles sont elimines par centrifugation. La phase alcoolique surnageante est recoltee puis evaporee sous pression roduite jusqu'a l'obtention d'une poudre. Les traces d'acide succinique residuelles sont eliminees en lavant le residu solide obtenu par du chloroforme puis par de ('acetone. La poudre residuelle (38 mg) est 30 sochee sous vide. Les nanoplateformes porteuses du fluorophore lissamine rhodamine B avec le linker court obtenues sont maintenant porteuses du linker long. Une solution des nanoplateformes avec le fluorophore lissamine rhodamine B et le linker long dans le DMF (12.5 g/L, 2 mL) est proparee puis du paclitaxel (3 mg), du DMAP (quantite catalytique) et de I'EDC.HCI (6.18 mg) 35 sont ajoutos. La solution est agitoe a temperature ambiante pendant 60h puis de l'eau est ajoutoe. La solution est concentroe sous pression roduite et la poudre residuelle obtenue est lavoe par de ('acetone, puis une fois sochee est purifiee sur Sephadex LH2O en utilisant de l'eau comme oluant. Les phases aqueuses contenant le bon produit sont rassemblees puis l'eau est eliminee par 40 lyophilisation. La poudre obtenue (22.9 mg) correspond aux nanoplateformes acitves porteuses du fluorophore lissamine rhodamine B (linker court) avec le paclitaxel (linker long). Les nanoplateformes avec la molecule active linker long et le fluorophore linker court sont ensuite dissoute dans du DMF, puis un derive 53 diester du peptide RGD et de l'EDC.HCI sont ajoutos. Le mélange reactionnel est agito a temperature ambiante pendant 60 h, puis de l'eau est ajoutoe pour detruire I'EDC qui n'a pas reagi. Le mélange de solvant (eau et DMF) est evapore sous pression roduite, puis Ia poudre obtenue est lavoe par de 5 ('acetone et est recoltee par centrifugation. Le solide obtenu est purifio sur une colonne de Sephadex LH2O en utilisant l'eau comme oluant. Les phases aqueuses contenant le bon produit sont rassemblees puis evaporees sous pression roduite. La poudre obtenue correspond a Ia nanoplateforme active comportant ('agent d'adressage et Ia molecule active lies chacun par un linker 10 long et le fluorophore lie par un linker court. Exemple 4 : Etude in vitro de l'innocuite des NPC2 Le but est de mesurer le taux de survie cellulaire en presence d'une gamme de NPC2 et determiner l'impact de ces nanoplateformes sur la viabilite cellulaire. 15 Culture cellulaire L'ensemble des tests in vitro est realise sur trois lignees cellulaires : Lignee Lignee cancereuse Lignee non Lignee non cellulaire de glioblastome cancereuse de cancereuse de U-87-MG cellules endotheliales fibroblastes HMEC-1 NHDF (Human (Normal Human Microvascular Dermal Endothelial Cells-1) Fibroblasts) Fournisseur American Type ATCC Lonza Culture Collection (ATCC) Milieu de Eagle's Minimum MCB1 131 (Gibco) Fibroblast growth culture Essential Medium 10 % SVF inactive medium (EMEM, Invitrogen) par la chaleur (Lonza) supplements 10 % serum de veau 2 mM Glutamine avec le kit fetal SVF (Lonza) (Gibco) fibroblast growth 2 mM Glutamine 1 % (100 U/mL) (Lonza) (Gibco) penicilline- 1 % (100 U/mL) streptomycine ponicilline- (Gibco) streptomycine 10 ng/mL Endothelial 54 (Gibco) Growth Factor (EGF human protein, Life technologies) Densite 12 500 cellules/cm2 9 400 cellules/cm2 3 500 ensemencement cellules/cm2 Mai 24 h 24 h 48 h ensemencement avant traitement Tableau [41. Licinees cellulaires et conditions d'experimentation in vitro Test de survie - Traitement Suite a l'ensemencement des cellules comme docrit ci-dessus, les cellules adherentes sont traitees avec une gamme de concentrations (1, 5, 25, 50, 75 et 100 pg/mL) de NPC2 disperses dans le milieu de culture. Le volume total est maintenu a 5 200 pL par puits et chaque condition est realisee en quadruple (test d'impodance) et/ou quintuple (test colorimetrique). Un test de viabilito cellulaire est realise soit par un test colorimetrique apres 72 h de traitement, soit par un test d'impodance sur une poriode d'au moins 72 h. Tous les tests colorimetriques ont oto *otos 3 fois pour chaque lignee, tandis que le test d'impodance a oto repoto 2 fois sur les lignees U- 10 87-MG et HMEC-1 et a oto fait une fois sur la lignee NDHF. (1) Test colorimetrique - Test MTT Ce test utilise comme reactif le 3-(4,5-Dimothylthiazol-2-y1)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide (MTT), lequel est converti en formazan (cristal violet) par les cellules vivantes. Ce dernier absorbant a la longueur donde de 600 nm est detectable par 15 une mesure d'absorbance. Les cellules, apres avoir subi le traitement ci-dessus avec des NPC2, sont incubees avec 200 pL de reactif MTT a 0,5 mg/mL disperse dans le milieu de culture (Correard, F., et al. (2014). International Journal of Nanomedicine 9: 5415-5430) pendant 3 a 4 h a 37°C. Des lors que les cristaux de formazan sont visibles dans les 20 cellules au microscope a champ lumineux, le milieu est remplace par 200pL de dimothylsulfoxyde (DMSO). Les cellules sont alors lysoes, les cristaux de formazan dissous et l'absorbance est mesuree avec un Spectrophotometre Multiskan (Ascent, Labtec Systems) avec un filtre a 600 nm. Le pourcentage de viabilito est obtenu en comparant la valeur d'absorbance des 25 cellules traitees avec la valeur d'absorbance des cellules controles non traitees, laquelle est consideree comme reference et equivalente a 100 % de viabilite. L'ocart type est calcule a partir de 3 experiences indopendantes. (2) Test colorimetrique - Test Alamar Blue Ce test se fait en une otape et utilise un reactif a base de resazurine, lequel est 30 roduit par les cellules vivantes. Ceci entraine un decalage de l'absorbance du reactif dont le pic d'absorbance passe de 570 nm (forme oxydee) a 595 nm (forme roduite) detectable par une mesure d'absorbance. Les cellules, apres avoir subi le traitement ci-dessus avec des NPC2, sont incubees avec 20 pL de reactif Alamar Blue ; soit 10 % du volume de milieu (Pasquier, E., et 35 al. (2013). Angiogenesis. 2013 Apr;16(2):373-86) pendant 4 a 5 h a 37°C. L'absorbance est ensuite mesuree avec un lecteur de microplaque POLARstar Omega (BMG LABTECH) avec un filtre a 570 nm et un filtre a 595 nm. Le pourcentage de viabilito est obtenu en comparant le taux de fluorescence emise par le reactif Alamar Blue roduit dans les cellules traitees avec le taux present dans 56 les cellules controles non traitees, lequel est considers comme reference et equivalent a 100 % de viabilite. L'ocart type est calcule a partir de 3 experiences indopendantes. (3) Test colorimetrique - Test Sulforhodamine B 5 Ce test est base sur la biomasse proteique et utilise une sonde anionique sulforhodamine B, laquelle se fixe fortement aux proteines. L'inhibition de la croissance cellulaire est mesuree en utilisant un kit de dosage sulforhodamine B (Sigma Aldrich) comme docrit procedemment dans : Berges, R., et al. (2016). Mol Cancer Ther. 2016 Nov; 15(11):2740-2749. 10 Les cellules, apres avoir oto traitees comme ci-dessus avec des NPC2, sont fixoes a 4°C avec 50 pL d'acide trichloroacetique (TCA) 10 % froid. Les cellules sont ensuite lavoes plusieurs fois avec de l'eau doionisee pour enlever toute trace de milieu et/ou de TCA. Les cellules sont alors sochoes pour enlever toute trace d'eau et 50 pL de sulforhodamine B sont ajoutos dans chaque puits. Les cellules sont incubees 30 min, 15 puis rincees 4-5 fois avec de l'acide acetique 10 % et sochoes a l'air libre. Un volume de 200 pL de Tris base a 10 mM est ajouto dans chaque puits et la microplaque est agitoe faiblement pour homogenoiser la sonde anionique sulforhodamine B. L'absorbance est ensuite mesuree avec un lecteur de microplaque POLARstar Omega (BMG LABTECH) avec un filtre a 565 nm et un filtre a 620 nm pour oliminer 20 le bruit de fond. Afin de s'affranchir des interactions parasites entre la sonde et le plastique, des « blancs » sont realises a partir de puits qui n'ont subi aucun traitement. Ceci peut egalement etre utilise pour s'assurer du lavage correct de cellules. Le pourcentage de viabilite cellulaire est obtenu en comparant l'absorbance hoe aux 25 cellules traitees avec l'absorbance hoe aux cellules controles non traitees, laquelle est consideree comme reference et equivalente a 100 % de viabilite. L'ocart type est calcule a partir de 3 experiences indopendantes. (4) Test d'impedance en temps reel Le test d'impodance est base sur une mesure en temps reel de la resistance induite 30 par une monocouche cellulaire cultivoe sur une electrode d'or, qui montre une variation lorsque les cellules se detachent de la surface. La mesure d'impodance est realisee avec un impodancemetre (Xcelligence, ACEA Biosciences), et permet d'obtenir des informations quantitatives sur l'etat des cellules vivantes (adhesion, proliferation, mortalite) en continu et en temps reel. 35 Une plaque 96 puits, recouverte d'electrodes d'or (E-plate 96) est ensemencoe de la maniere docrite procedemment (cf. tableau Z) dans un volume de 100 pL. Lorsque la mesure d'impodance atteint un plateau, la plaque est retiree du compteur, le milieu de culture est retire et les cellules sont traitees avec des NPC2 comme docrit cidessus. La plaque est ensuite reinseree dans le lecteur et ('impedance est mesuree 40 toutes les 15 minutes pendant au moins 72 h. 57 Le pourcentage de viabilito cellulaire est obtenu en comparant la mesure d'impodance des cellules traitees par rapport a la mesure d'impodance des cellules controles non traitees, laquelle est consideree comme reference et oquivalente a 100 % de viabilite. L'ocart-type est calcule a partir du nombre d'experiences 5 indopendantes menses pour cheque lignoe cellulaire consideree. Resultats - Figure [7] La viabilito cellulaire a oto mesuree apres ('incubation des cellules avec des concentrations croissantes de NPC2 de 1 a 100 pg/mL pendant au moins 72 h. Les cellules U-87 MG ne montrent aucune reduction de la viabilito cellulaire meme a la 10 concentration maximum de 100 pg/mL (Figure 7A, D), et ce quel que soit le test consider& Les cellules HMEC-1 montrent une logere diminution de 20 % de la viabilito cellulaire a des concentrations superieures a 50 pg/mL avec le test MTT (Figure 7B), laquelle s'observe ogalement a des concentrations superieures a 25 pg/mL avec le test d'impodance (Figure 7E). Pour les cellules NHDF, une diminution 15 de 20 % de la viabilito cellulaire a des concentrations superieures a 25 pg/mL est observoe avec le test MTT et a 100 pg/mL avec le test d'impodance (Figure 7C, F), alors qu'aucune inhibition significative de la viabilito cellulaire n'est mesuree avec le test Alamar Blue (Figure 7C). Concernant le test sulforhodamine B, aucune diminution de la viabilito cellulaire n'est mesuree quelle que soit la lignoe cellulaire 20 consideree (Figure 7A, B et C). De maniere generale, la diminution de viabilito cellulaire maximum observoe est de 20 % pour la concentration maximale de 100 pg/mL de NPC2 apres 72 h de traitement. Ceci demontre de fawn tres satisfaisante la faible toxicito de ces nanoplateformes vis-a-vis des lignees cellulaires humaines cancereuses et/ou non 25 cancereuses testees. Exemple [51 : Etude in vitro d'internalisation cellulaire Le but est de demontrer qu'il existe une internalisation cellulaire des NPC2. Culture cellulaire Voir Exemple [4], tableau [4]. 30 Les cellules U-251 MG sont ogalement utilisees. Elles sont transfectoes avec du dsRed (Alves, I. D., et al. (2014). Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes 1838(8): 2087-2098) et cultivoes dans du : - Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Invitrogen) avec du rouge phenol, - 2 mM de glutamine, 35 - 10 % de SVF, et - 1 % (100 U/mL) de penicilline-streptomycine. Elles sont ensemencees 24 h avant traitement, a la densito de 20 000 cellules/cm2. Test d'internalisation cellulaire (1) Traitement 58 Apres avoir ensemence les cellules U-87-MG, U251-MG, HMEC-1 et NHDF comme docrit procedemment, le milieu de culture est remplace par du milieu de culture contenant des NPC2 (1, 5 et/ou 25 pg/mL dans un volume equivalent a celui de l'ensemencement). Les cellules sont ensuite incubees 4 h a 37°C avant que le milieu 5 soit retire et les cellules fixoes en vue de realiser de la microscopie a 2-photons. Cette experience est repotee 3 fois avec les cellules U-87-MG et 2 fois avec les cellules U-251 MG, HMEC1 et NHDF. Les repetitions sont realisees avec des passages cellulaires differents (2) Fixation 10 Les cellules sont lavoes plusieurs fois avec du Phosphate Buffer Saline (PBS), fixoes avec du paraformaldehyde 4 % en PBS (15 min a temperature ambiante) et rincees 2 fois avec du PBS. Les cellules fixoes sont conservoes a 4°C dans du PBS. (3) Microscopie a 2-photons Les cellules sont imagoes avec un microscope a 2-photons Zeiss couple a un laser 15 pulse MAI-TAI, dont la longueur d'onde d'excitation est de 740 nm (Aex = 740 nm), et un photomultiplicateur capable de detecter des longueurs d'onde d'emission allant de 480 nm a 550 nm (480 nm Aern 550 nm). Un objectif sec 20 x est utilise. L'intensito moyenne de fluorescence et l'ocart type des cellules controles non traitees avec les NPC2 sont utilises pour determiner le seuil de contribution 20 d'autofluorescence dans les cellules traitees avec les NPC2 en utilisant MATLAB. Seules les intensitos de fluorescence superieures a au moins une fois l'ocart type de l'intensito moyenne controle sont affichoes en utilisant MATLAB. Resultats - Figures [8 ; 9 ; 10] L'innocuito des NPC2 otant demontree, it est nocessaire de s'assurer qu'ils sont bien 25 internalises par des cellules de glioblastome en vue de leurs applications therapeutiques futures. Pour cela, le protocole d'experimentation docrit ci-dessus a oto mis en place et une fois la correction de fluorescence appliquee sur les cellules traitees it ressort que : - Apres 4 h d'incubation avec les NPC2, it existe une importante internalisation 30 de ces derniers par les cellules U-87-MG aux concentrations de 1 et 5 pg/mL, alors qu'elle est negligeable avec les cellules HMEC-1 et NHDF (Figure 8). - A la concentration de 25 pg/mL, les cellules U-87-MG prosentent toujours une excellente internalisation des NPC2 et ce de maniere homogene. A cette meme concentration, les cellules NHDF n'internalisent pas les NPC2 alors que 35 les cellules HMEC-1 montrent une legere augmentation de ('internalisation des NPC2 mais pas de maniere uniforme (Figure 9). - La localisation cellulaire des NPC2 au sein des cellules U-87-MG a egalement oto observoe en realisant un Z-scanning des cellules. Les images de fluorescence selon l'axe XY et les coupes orthogonales correspondantes XZ 40 et YZ montrent une distribution homogene des NPC2 le long de l'axe Z (Figure 8, vues orthogonales des cellules U-87-MG). 59 - Les resultats obtenus avec la lignoe additionnelle de glioblastome humain U251 MG montrent ogalement une internalisation massive des NPC2 apres 4 h d'incubation a toutes les concentrations (1, 5 et 25 pg/mL de NPC2) (Figure 5 10) contrairement aux lignees cellulaires HMEC-1 et NHDF. Par ailleurs, it a oto observe que 4 h d'incubation des NPC2 est la duree optimale d'internalisation par les cellules U-87-MG par rapport a une incubation courte de 2 h et une incubation prolongoe de 24 h. Ici, it est ogalement demontre que les NPC2 sont preforentiellement internalises dans les cellules cancereuses. 10 Exemple f61 : Determination de la voie utilisee pour ('internalisation cellulaire des NPC2 Le but est de determiner le mecanisme cellulaire mis en ceuvre. Culture cellulaire Seules les cellules U-87-MG sont utilisees : voir Exemple [4], tableau [4], colonne U15 87-MG. Test d'internalisation cellulaire Voir exemple [5]. Inhibition de ('internalisation energie-dependante Apres avoir ensemence les cellules U-87-MG comme docrit procedemment, les 20 cellules sont traitees avec 1 et/ou 5 pg/mL de NPC2 et incubees 4 h a 4°C puis rincees avec du PBS et fixoes en vue de realiser ('observation par microscopie a 2-photons (voir Exemple [5]). Inhibition des differentes voies d'endocytose 25 Apres avoir ensemence les cellules U-87-MG comme docrit procedemment, les cellules sont traitees avec : - 5 pg/mL de chlorpromazine (inhibiteur de clathrine), ou - 200 pM de genisteine (inhibiteur de caveoline), ou - 1 mM de methyl-p-cyclodextrine (inhibiteur des radeaux lipidiques). 30 Apres 30 min d'incubation a 37°C, les cellules sont levees avec du PBS froid puis traitees avec 1 et/ou 5 pg/mL de NPC2 pendant 4 h a 37°C tandis que les cellules controles sont incubees avec du milieu seul. Les cellules sont ensuite rincees avec du PBS et fixoes en vue de realiser de la microscopie a 2-photons (voir Exemple [5]). Ces experiences sont realisees 2 fois avec des passages cellulaires differents. 35 Resultats - Figure [11] Afin de definir le mocanisme mis en ceuvre par les cellules pour ('internalisation les NPC2, les cellules U-87-MG ont oto incubees avec les NPC2 a 4°C. A cette temperature, ('internalisation des NPC2 est negligeable ce qui suggere un mocanisme d'internalisation onergie-dependant (Figure 11, ligne 2). Les cellules U87-MG ont oto ogalement traitees avec de la chlorpromazine (inhibiteur de clathrine), ou de la genisteine (inhibiteur de caveoline), ou de la methyl-p-cyclodextrine 5 (inhibiteur du radeau lipidique). II a alors oto observe qu'inhiber la clathrine n'a pas d'effet prononce sur ('internalisation des NPC2, alors qu'inhiber la caveoline ou la voie des radeaux lipidiques roduit drastiquement celle-ci (Figure 11, lignes 3-5). Ces observations suggerent par consequent que le mocanisme d'internalisation des NPC2 utilise principalement les voies d'endocytose hoes a la caveoline et aux 10 radeaux lipidiques. Cela pourrait ogalement indiquer un effet de la « couronne proteique » qui se croe a la surface des NPC2, laquelle se lierait soit a la caveoline soit aux radeaux lipidiques presents a la surface des cellules de glioblastome. En effet, it a oto demontre que cette « couronne proteique » favorise ('internalisation de nanoparticules d'or d'un diametre inforieur a 20 nm par un mocanisme caveoline- 15 dependant, tandis que les nanoparticules plus grosses sont internalisees par un mocanisme clathrine-dependant (Cheng, X., et al. (2015). ACS Applied Materials & Interfaces 7(37): 20568-20575). Par consequent et au vu de ces resultats, it en est deduit que la « couronne proteique » en combinaison avec la taille des NPC2 favorisent preforentiellement une internalisation hoe a la caveoline par les cellules de 20 glioblastome. Exem - le 7 : Etude in vitro de la c totoxicite induite PTX ar le PTX et les NPC2- Le but est de mesurer le taux de survie cellulaire en presence d'une gamme de PTX ou d'une gamme de NPC2-PTX et de determiner I'1 C50 correspondant a la 25 concentration de PTX ou de NPC2-PTX inhibant 50 % de la viabilite cellulaire. Culture cellulaire L'ensemble des tests in vitro est realise sur trois lignees cellulaires : Voir tableau ciapres. 61 Li nee Lignoe cancereuse Lignoe non Lignoe cancereuse cellulaire de glioblastome cancereuse de de neuroblastome U-87-MG cellules SK-N-SH endotheliales HMEC-1 (Human Microvascular Endothelial Cells-1) Fournisseur American Type ATCC ATCC Culture Collection (ATCC) Milieu de Eagle's Minimum MCB1 131 (Gibco) RPMI-1640 (Lonza) culture Essential Medium 10 % SVF inactive par la chaleur (Lonza) 10 % SVF (Lonza) (EMEM, Invitrogen) 2 mM Glutamine 2 mM Glutamine 10 % SVF (Lonza) (Gibco) (Gibco) 2 mM Glutamine 1 % (100 U/mL) 1 % (100 U/mL) (Gibco) penicilline- penicilline- 1 % (100 U/mL) streptomycine streptomycine penicilline- (Gibco) (Gibco) streptomycine 10 ng/mL (Gibco) Endothelial Growth Factor (EGF human protein, Life technologies) Densite 12 500 cellules/cm2 9 400 cellules/cm2 33 000 cellules/cm2 d'ensemence ment Mai 24 h 24 h 24 h d'ensemence ment avant traitement Tableau [51. Lignees cellulaires et conditions d'experimentation in vitro 62 Test de survie (1) Traitement & test MTT Suite a l'ensemencement des cellules comme docrit ci-dessus, les cellules adherentes sont traitees avec une gamme de concentration soit de paclitaxel (PTX), 5 soit de paclitaxel couple aux NPC2 (NPC2-PTX) comme suit : - les U-87 MG sont traitees par une gamme de PTX allant de 1 a 100 nM et une gamme de NPC2-PTX allant de a 0,35 a 70 nM (equivalent PTX) ; - les HMEC-1 sont traitees par une gamme de PTX allant de 0,05 a 50 nM et une gamme de NPC2-PTX allant de 0,0175 a 17,5 nM (equivalent PTX) ; et 10 - les SK-N-SH sont traitees par une gamme de PTX allant de 5 a 100 nM et une gamme de NPC2-PTX allant de 5 a 100 nM (equivalent PTX). Le volume d'ensemencement et de traitement est maintenu a 150 pL par puits et cheque condition est realisee avec une incubation classique a 37°C. Un test de viabilite cellulaire est realise par un test MTT apres 72 h de traitement. Ce test utilise 15 comme reactif le 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide (MTT), lequel est converti en formazan (cristal violet) par les cellules vivantes. Ce dernier absorbant a la longueur donde de 600 nm est detectable par une mesure d'absorbance. Les cellules, apres avoir subi le traitement ci-dessus avec du PTX et/ou avec des 20 NPC2-PTX, sont traitees avec 150 pL de reactif MTT a 0,5 mg/mL disperse dans le milieu de culture (Correard, F., et al. (2014). International Journal of Nanomedicine 9: 5415-5430) pendant 3 a 5 h a 37°C. Des lors que les cristaux de formazan sont visibles dans les cellules au microscope a champ lumineux, le milieu est remplace par 150 pL de dimethylsulfoxyde (DMSO). Les cellules sont alors lysees, les cristaux 25 de formazan dissous et ('absorbance est mesuree avec un spectrophotometre Multiskan (Ascent, Labtec Systems avec un filtre a 600 nm. Le pourcentage de viabilite est obtenu en comparant la valeur d'absorbance des cellules traitees avec la valeur d'absorbance des cellules controles non traitees, laquelle est consideree comme reference et equivalente a 100 % de viabilite. L'ecart 30 type est calcule a partir de 3 experiences independantes. (2) Traitement & Test d'impedance en temps reel Ce test, realise uniquement avec la lignee cellulaire HMEC-1, est base sur une mesure en temps reel de la resistance induite par une monocouche cellulaire cultivee sur une electrode d'or, qui montrera une variation lorsque les cellules se detachent 35 de la surface. La mesure d'impedance est realisee avec le systeme Real Time Cell laAnalyser (RTCA, ACEA Biosciences), et permet d'obtenir des informations quantitatives de l'etat biologique des cellules (adhesion, proliferation, mortalite) en continu et en temps reel. 63 L'ensemencement d'une plaque 96 puits, recouverte d'electrodes d'or (E-plate 96) est realise comme docrit procedemment (cf. tableau 5). Lorsque la mesure d'impodance atteint un plateau, la plaque est retiree de la station RTCA, le milieu de culture est retire et les cellules sont traitees par une gamme de NPC2-PTX allant de 5 0,35 a 17,5 nM (equivalent PTX). La plaque est ensuite reinseree dans la station et ('impedance est mesuree toutes les 15 minutes pendant au moins 72 h. Le pourcentage de viabilito cellulaire est obtenu en comparant la mesure d'impodance des cellules traitees par rapport a la mesure d'impodance des cellules controles non traitees, laquelle est consideree comme reference et oquivalente a 100 10 % de viabilite. L'ocart-type est calcule a partir de deux experiences indopendantes. Resultats - Figure [12] Les tests de viabilito cellulaire ont oto realises par deux techniques : un test au MTT puis un test d'impodance afin de confirmer l'absence d'interaction entre les NPC2- PTX et le reactif colorimetrique utilise (MTT) pour la mesure de survie cellulaire. 15 Les resultats obtenus avec les tests au MTT sont résumés dans le tableau ci- dessous : Lignee cellulaire U-87 MG HMEC-1 SK-N-SH IC50 du PTX (nM) 9,2 ± 1,2 5,7 ± 2,0 40,5 ± 7,8 IC50 des NPC2-PTX 25,5 ± 6,9 6,0 ± 1,4 48,9 ± 6,3 (nM) Significativite p = 0,0053 p = 0,96 p = 0,22 Tableau f61. Resultats du test au MTT En résumé, il est montre une activito similaire du PTX et des NPC2-PTX sur les lignees HMEC-1 et SK-N-SH, alors que pour la lignoe U-87 MG le PTX est 20 significativement plus actif que les NPC2-PTX. Cette difference d'activito entre PTX et NPC2-PTX sur les U-87 MG pourrait etre due a une difference de mocanisme de penetration intracellulaire entre le PTX et le NPC2-PTX. Pour les SK-N-SH, il est a noter que des concentrations plus elevoes en PTX et NPC2-PTX sont nocessaires pour atteindre l'1050, par rapport aux deux autres lignees cellulaires. 25 Le test d'impodance est realise sur les cellules HMEC-1 (Figure 12D). Les resultats obtenus pour les NPC2-PTX avec cette mothode (1050 = 6,5 ± 1,3 nM) sont comparables aux resultats obtenus avec le test MTT (1050 = 6,0 ± 1,4 nM, p = 0,56). Ceci confirme l'absence d'interaction avec le reactif colorimetrique et valide les resultats obtenus par les tests utilisant le MTT. 30 Exemple f81 : Etude cellulaire par immunofluorescence But : visualiser le reseau microtubulaire, cible du PTX, afin de rechercher les effets pharmacologiques induits par les NPC2-PTX, en comparaison au PTX. 64 Culture cellulaire Seules les lignees U-87-MG et HMEC-1 sont utilisees (voir tableau 5). Immunofluorescence Les cellules U-87-MG et HMEC-1 sont ensemencees sur des chambres de culture 5 Lab-Tek® (Nunc). Apres 24 h d'incubation, le milieu est remplace par differentes concentrations de NPC2-PTX ou de PTX (10, 50 et 100 nM). Apres 6 h de traitement, le milieu est remplace par une solution de methanol glace permettant de fixer et de permeabiliser les cellules. Apres saturation avec une solution de PBS-BSA (Bovine Serum Albumin) 1 %, les cellules sont incubees 1 h a 37°C avec un anticorps anti a- l() tubuline de souris (clone DM1A, Sigma) dilue dans une solution de PBS-BSA 1 %, puis 1 h a 37°C a l'obscurito avec un anticorps secondaire anti-souris couple au FITC (Cell Signaling Technology) dilue dans la solution de PBS-BSA 1 %. Le marquage du noyau est realise par une solution de DAPI ou 4,6-diamidino-2-phonylindole (0,25 pg/mL ; Sigma) pendant 2 min. La lame est finalement montoe avec de 15 l'« antifading » Prolong® (Invitrogen). L'observation est effectuoe au microscope a opifluorescence (Leica DM-IRBE) couple a une camera digitale (Princeton Instruments ; CCD camera coolsnap FX). Resultats - Figure [13] Par immunofluorescence indirecte a l'aide d'un anticorps anti a-tubuline et marquage 20 des noyaux au DAPI (Figure 13), il est observe au niveau des cellules controles, a la fois U-87-MG et HMEC, un reseau microtubulaire bien otale, des cellules allongoes, un noyau interphasique standard et quelques cellules en mitose. Apres traitement par du PTX (Figure 13-A et 13-C), aux 3 concentrations testees, les cellules s'arrondissent, le reseau microtubulaire est perturb& II y a formation de bundles 25 (association des microtubules) dans les cellules interphasiques et de fuseaux mitotiques anormaux sous la forme de pseudo-asters dans les cellules mitotiques. II est ogalement observe une augmentation du nombre de mitoses. Ces effets sont caracteristiques d'un traitement par taxane. Apres traitement par des NPC2-PTX (figure 13-B, 13-D), iI existe des effets 30 comparables a ceux obtenus apres traitement par PTX a toutes les concentrations testees. II est observe des cellules arrondies, des bundles ainsi que des pseudo asters. Le nombre de mitoses est ogalement augmento par rapport au controle. Ainsi, ('ensemble des effets cytotoxiques specifiques du PTX sont retrouvos apres traitement de cellules en culture 2D par NPC2-PTX, ce qui confirme que le PTX est 35 libere de sa liaison a NPC2 pour etre pharmacologiquement actif. Exemple f91 : Etude de cytotoxicite en culture 3D But : observer des modifications de taille des spherofdes induites par le PTX ou les NPC2-PTX, par rapport au controle, et mesurer le taux de survie cellulaire sur des cellules en culture 3D en presence d'une gamme de concentrations de PTX ou de NPC2-PTX. Culture cellulaire 3D Les sphoroIdes (cellules en culture 3D) permettent de mieux reprosenter 5 l'environnement tumoral. Elles sont composees de cellules en nocrose en leur centre et de cellules proliforantes en poriphorie. L'application des NPC2-PTX sur ces sphoroIdes permet de les otudier sur un temps plus long par rapport a retude en 2D. Les cellules U-87 MG sont cultivoes en milieu EMEM supplements par 10 % de SVF, 2 mM de L-glutamine, 100 U/ml de ponicilline-streptomycine et 20 % (m/v) de 10 mothylcellulose. Les cellules sont ensemencees sur une plaque de culture 96 puits a fond rond, a la concentration de 1000 cellules/puits, 72 h avant traitement. Les cellules sont maintenues a 37°C et 5 % de CO2 et 10 pl de milieu frais sont ajoutos tous les deux jours a ('ensemble des puits (controles et traites). Traitement 15 Les cellules sont incubees dans du milieu de culture (cellules controles) ou contenant du PTX (9, 25 et 40 nM) ou des NPC2-PTX (25, 70, 100 nM). Ces concentrations correspondent a r IC50 calculoe en 2D (doses equitoxiques), a 2,8 fois r IC50 et a 4 fois r IC50. Le suivi du traitement se fait le jour du traitement (j0), 7 jours (j7) et/ou 14 jours (j14) apres traitement. 20 (1) Microscopie optique Avant traitement puis tous les deux jours, les sphoroIdes sont observes au microscope optique couple a une camera (Nikon ECLIPSE TS100), au grossissement x4. (2) Test colorimetrique - Test Alamar Blue 25 Cette mesure se fait en une otape et utilise un reactif a base de resazurine, lequel est roduit par les cellules vivantes. Le compose roduit (= resofurine) est detectable par fluorescence (Aex = 584 nm et Aern = 620 nm) et le signal mesure est proportionnel au nombre de cellules vivantes. Une fois le traitement ci-dessus mis en place, 10 pL d'Alamar Blue sont ajoutos a 30 chaque puits 7 jours ou 14 jours apres traitement puis les cellules sont incubees 12 h avant la mesure de fluorescence. Les donnees sont obtenues par lecture de la fluorescence au POLARstar Omega (BMG LABETCH) apres excitation a 584 nm et lecture de remission a 620 nm. Le pourcentage de viabilito est obtenu en comparant le taux de fluorescence emise 35 par le reactif Alamar Blue roduit dans les cellules traitees avec le taux present dans les cellules controles non traitees, lequel est considers comme reference et equivalent a 100 % de viabilite. L'ocart type est calcule a partir de 3 experiences indopendantes. 66 Resultats - Figure [14 ; 15] (1) Les concentrations de PTX et NPC2-PTX utilisees sur les sphoroIdes sont exprimees en multiple de l'IC50 obtenue en culture 2D, afin de comparer des doses oquitoxiques. Comme attendu, il a oto observe une croissance des sphoroIdes non 5 traitos (controle). En effet, en culture 3D, ces sphoroIdes prosentent une augmentation tres significative de leur taille au cours du temps avec un diametre (d) de 313 +/- 0 pm a j0 contre 785 +/- 6 pm a j14 (p REVENDICATIONS1. Nanoplateforme active constituoe : d'une nanoplateforme (NPC2) comprenant ou constituoe de carbone, d'hydrogene, d'oxygene, et d'azote, d'une molecule active antitumorale (M), d'un oventuel fluorophore (F), et d'un oventuel agent d'adressage (A), et dans laquelle NPC2 est hoe par liaisons covalentes avec M via un linker L, ladite nanoplateforme NPC2 possedant les proprietes suivantes : la solubilito de NPC2 en milieu aqueux est de 25 a 500 g/L le module de Young de NPC2 est de 1 a 4 GPa, la densito de NPC2 est de 1 a 3, la taille seche de NPC2 est de 10 a 40 nm, le diametre hydrodynamique de NPC2 est de 10 a 150 nm, NPC2 est substantiellement amorphe ladite nanoplateforme NPC2 possedant un nombre de fonctions amine primaire de greffage en surface de 0.3 a 7 mmol par gramme de nanoplateforme, ladite molecule active antitumorale M ayant une solubilito en milieu aqueux inferieure a 200 mg/I, ladite nanoplateforme active ayant une solubilito en milieu aqueux de 5 a 500 g/I, avec la reserve que : - NPC2 soit substantiellement depourvue de lipides, d'acides nucleiques, de proteines et de peptides. 2. Nanoplateforme active selon la revendication 1, dans laquelle : o ladite nanoplateforme active comprend un fluorophore F et dans laquelle NPC2 est hoe par liaisons covalentes avec F, via un linker LF, ou o ladite nanoplateforme active comprend un agent d'adressage A et dans laquelle NPC2 est hoe par liaisons covalentes avec A, via un linker LA, ou o dans laquelle ladite nanoplateforme active comprend un fluorophore F et un agent d'adressage A et dans laquelle NPC2 est hoe par liaisons covalentes avec F via un linker LF et NPC2 est hoe par liaisons covalentes avec A via un linker LA. 3. Nanoplateforme active selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, dans laquelle ladite nanoplateforme active est de Formule I 69 (L,) ( F) f f N c L M (LA) (A) a a Formule I dans laquelle : - NPR reprosente le cceur de la nanoplateforme NPC2 sans les fonctions de 5 greffage situees en surface, NPC2 ayant la signification de la revendication 1 - M, F et A ayant les significations de la revendication 1, - f et a sont des nombres entiers valant indopendamment 0 ou 1, - LF, L et LA representent les linkers liant par l'intermediaire de liaisons 10 covalentes le cceur de la nanoplateforme NIDc avec les composes F, M et A de Formule II, Formule Ila et Formule Ilb, ZF-RF-QF )IF Formule II T Z-R-Q 15 Formule Ila dans TA ZA-RA-QA IA Formule Ilb lesquelles : o TF, T et TA representent les fonctions de greffage de la 20 nanoplateforme NPC2 apres leur integration dans les linkers LF, L et o o LA, ZF, Z et ZA representent les fonctions de liaison des linkers LF, L et LA apres leur liaison sur les fonctions de greffage TF, T et TA, RF, R et RA representent les chaines fonctionnelles des linkers LF, L 25 o et LA, QF, Q et QA representent les fonctions de liaison des linkers LF, L et o LA apres leur liaison sur le fluorophore, la molecule active antitumorale et ('agent d'adressage, I, IF et IA sont des nombres entiers egaux ou differents entre eux et 30 valant 0 ou 1. TF 70 4. Nanoplateforme active selon I'une quelconque des revendications 1 a 3, dans laquelle : ladite nanoplateforme active est de Formule III, 5 N R CO- M I Formule III dans laquelle : - NIDc, T, Z, R, Q et I ont les significations de la revendication 3, ou dans laquelle ladite nanoplateforme active est de Formule IV, NPc T Z R Q M 10 Formule IV 15 dans laquelle : - TF, ZF, RF, QF et IF ont les significations de la revendication 3 ou, dans laquelle ladite nanoplateforme active est de Formule VI, TF F Z RQ M Formule VI 20 ou dans laquelle ladite nanoplateforme active est de Formule VII, ou dans laquelle ladite nanoplateforme active est de Formule V, F-RF-QF F IF R Q Formule V IA Formule VII dans laquelle : - TA, ZA, RA, QA et IA ont les significations de la revendication 3. 5 ou dans laquelle ladite nanoplateforme active est de Formule VIII, Z RQ M I TA ZA-RA-QA-A Formule VIII ou dans laquelle ladite nanoplateforme active est de Formule IX, 10 Formule IX ou dans laquelle ladite nanoplateforme active est de Formule X, R Q A-RA-QA 71 TF ZF-RF-QF-F 1 Z RQ M ZA-RA-QA-A Formule X 72 5. Nanoplateforme active selon l'une quelconque des revendications 1 a 4, dans laquelle ladite molecule active antitumorale M est choisie parmi les taxanes comme le paclitaxel ou les anthracyclines comme la doxorubicine. 6. Nanoplateforme active selon l'une quelconque des revendications 1 a 5, dans 5 laquelle ledit fluorophore F est choisi parmi la Rhodamine B, la Fluoresceine isocyanate, la Lucifer Yellow cadaverine, la famille des Alexa Fluor ou la famille des cyanines NIR. 7. Nanoplateforme active selon l'une quelconque des revendications 1 a 6, dans laquelle lesdits linkers L, LF et LA sont choisis parmi les composes de Formule 10 XI. o O 0 R3 R3 O 7 RA1 \ Formule XI dans laquelle : - R1 et R2 sont indopendamment choisis parmi : -NH-, -COO, -NHCO-, -0-, - 15 OCO-, -NHCSNH- et -NHCONH-. - R3 est choisi parmi : -NH- ; -COO- ;-0-... 8. Nanoplateforme active selon l'une quelconque des revendications 1 a 7 repondant a la Formule XII ou a la Formule XIIA, HN Rhodamine B 0 N Paclitaxel o 0 20 Formule XII 0 HN Rhodamine B N c NH Doxorubicine 0 73 Formule XIIA dans laquelle : - NP, a la signification de la revendication 3. 9. Procede de preparation d'une nanoplateforme active telle que definie dans les 5 revendications 1 a 8, comprenant une otape de greffage d'une molecule active antitumorale, - par une oventuelle mise en contact d'une nanoplateforme NPC2 avec un precurseur L' dudit linker L, pour obtenir une nanoplateforme hoe par liaison covalente audit linker L, suivie 10 - par la mise en contact de ladite nanoplateforme hoe par liaison covalente audit linker L avec une molecule active antitumorale M, dans lequel NPC2, L et M ont les significations des revendications 1 et 3, pour obtenir une nanoplateforme active constituoe d'une nanoplateforme hoe par liaison covalente a ladite molecule active antitumorale. 15 10. Procede de preparation d'une nanoplateforme active, selon la revendication 9, comprenant les otapes suivantes : a. une oventuelle otape de refonctionnalisation d'une nanoplateforme, - par la mise en contact d'une nanoplateforme avec une molecule organique de type a-co diamino-alcane, comportant deux fonctions 20 amine de preference deux fonctions amine primaire et/ou secondaire et de fawn encore plus preforentielle deux fonctions amine primaire pour accroltre le taux de fonctions de greffage comportant des groupements amine en surface de ladite nanoplateforme et ainsi obtenir une nanoplateforme oventuellement refonctionnalisoe, 25 b. une oventuelle otape de liaison d'un fluorophore, - par une oventuelle mise en contact de ladite nanoplateforme oventuellement refonctionnalisoe avec precurseur LF' dudit linker LF, pour obtenir une nanoplateforme oventuellement refonctionnalisoe et oventuellement hoe audit linker LF, suivie 30 - par une oventuelle mise en contact de ladite nanoplateforme oventuellement refonctionnalisoe et oventuellement hoe audit linker LF avec un fluorophore F, pour obtenir une nanoplateforme oventuellement refonctionnalisoe et oventuellement hoe audit fluorophore F, 35 c. une otape de greffage d'une molecule active antitumorale, - par une oventuelle mise en contact de ladite nanoplateforme oventuellement refonctionnalisoe et oventuellement hoe audit fluorophore F, avec un precurseur L' dudit linker L, pour obtenir une nanoplateforme oventuellement refonctionnalisoe, oventuellement hoe audit fluorophore F et hoe par liaison covalente audit linker L, suivie 74 - par la mise en contact de ladite nanoplateforme oventuellement refonctionnalisoe, oventuellement hoe audit fluorophore F et hoe par liaison covalente audit linker L avec une molecule active antitumorale M, pour obtenir une nanoplateforme active constituoe d'une 5 nanoplateforme hoe par liaison covalente a ladite molecule active antitumorale M, oventuellement refonctionnalisoe et oventuellement hoe audit fluorophore F, d. une oventuelle otape de liaison d'un agent d'adressage, - par une oventuelle mise en contact de ladite nanoplateforme hoe par 10 liaison covalente a ladite molecule active antitumorale M, oventuellement refonctionnalisoe et oventuellement hoe audit fluorophore F avec un precurseur LA' dudit linker LA, pour obtenir une nanoplateforme hoe par liaison covalente a ladite molecule active antitumorale M, oventuellement refonctionnalisoe, oventuellement 15 hoe audit fluorophore F et oventuellement lie audit linker LA, suivie - par une oventuelle mise en contact de ladite nanoplateforme hoe par liaison covalente a ladite molecule active antitumorale M, oventuellement refonctionnalisoe, oventuellement hoe audit fluorophore F et oventuellement lie audit linker LA avec un d'agent 20 d'adressage A, dans lequel NPC2, LF, L, LA, F, M et A ont les significations des revendications 1 et 3, pour obtenir une nanoplateforme active constituoe d'une nanoplateforme hoe 25 par liaison covalente a ladite molecule active antitumorale M, oventuellement refonctionnalisoe, oventuellement hoe audit fluorophore F et oventuellement hoe audit agent d'adressage A. 11. Procede de preparation d'une nanoplateforme active, selon l'une quelconque 30 des revendications 9 et 10, ladite nanoplateforme active otant de Formule I, (LF) ( F ) I f f NPc L M (LA) (A) a a Formule I dans laquelle : - NIDc, F, M, A, T, TF, TA, Z, ZF, ZA, R, RF, RA, Q, QF, QA, I, IF, IA, a et f ont 35 les significations de la revendication 3, 75 ledit procede comprenant : a. une oventuelle otape de refonctionnalisation par mise en contact d'une nanoplateforme NPC1 de Formule a NH2 NPc -COOH Formule a OH 5 avec une molecule organique de type a-co diamino-alcane, comportant deux fonctions amine de preference deux fonctions amine primaire et/ou secondaire et de fawn encore plus preforentielle deux fonctions amine primaire, pour obtenir une nanoplateforme NPC2 de Formule b ou de Formule B, (NH 2)( +b+d) (7-1 f NPc -T Formule B NPc -COOH(1-b) Formule b 10 OH (1-d) dans lesquelles : - b et d sont des nombres reels compris entre 0 et 1 correspondant respectivement au taux de refonctionnalisation des fonctions de greffage COOH en NH2 au taux de refonctionnalisation des fonctions 15 de greffage OH en NH2, - les fonctions de greffage TF, T et TA sont choisies parmi les fonctions de greffage de la nanoplateforme de Formule b (NH2, COOH, OH), - a et f sont des nombres entiers valant 0 ou 1, egaux ou differents. b. une oventuelle otape de liaison d'un fluorophore par l'eventuelle mise en 20 contact d'un precurseur de linker LF' de Formule 1 ZF-RF-QF Formule 1 avec une nanoplateforme NPC2 de Formule B pour obtenir une nanoplateforme de Formule C (LF 1 f 25 Formule C suivie par la mise en contact de ladite nanoplateforme de Formule C avec ledit fluorophore F pour obtenir une nanoplateforme de Formule D, 76 Formule D c. une otape de greffage d'une molecule active antitumorale par l'eventuelle mise en contact de ladite nanoplateforme de Formule D avec un precurseur de linker L' de Formule 2 5 Formule 2 pour obtenir une nanoplateforme de Formule E, (L Formule E (TA)a suivie par la mise en contact de ladite nanoplateforme de Formule E avec 10 ladite molecule active antitumorale M pour obtenir une nanoplateforme active de Formule F, (LF f -M Formule F (TA a d. une oventuelle otape de liaison d'un agent d'adressage par l'eventuelle mise en contact de ladite nanoplateforme active de Formule F avec un 15 precurseur de linker LA' de Formule 3 ZA-RA-QA Formule 3 pour obtenir une nanoplateforme active de Formule G, 77 L-M Formule G suivie par la mise en contact de ladite nanoplateforme active de Formule G avec ledit agent d'adressage A pour obtenir ladite nanoplateforme active de Formule I. 5 12. Procede de preparation d'une nanoplateforme active selon I'une quelconque des revendications 9 a 11, ladite nanoplateforme active otant de Formule XII, HN Rhodamine B 0 N Paclitaxel o 0 Formule XII dans laquelle : 10 - NPc a la signification de la revendication 3. ledit procede comprenant : a. une otape de synthese d'une nanoplateforme NPC1 de Formule a, NH2 NPc -COOH Formule a OH par la mise en contact d'acide citrique avec du diethylenetriamine dans 15 l'eau sous micro-ondes avec une puissance de 500 a 1000 W, notamment 600 W, pendant un temps de 1 a 5 minutes, notamment 2 minutes, pour obtenir ladite nanoplateforme de Formule a, b. une otape de refonctionnalisation de ladite nanoplateforme NPC1 de Formule a, par la mise en contact de ladite nanoplateforme NPC1 de 20 Formule a avec un exces de 1,2-6thylenediamine a une temperature comprise de 100 a 150°C pendant 2 a 24 heures, notamment 12 heures, pour obtenir une nanoplateforme NPC2 de Formule b ou de Formule AE, V 5 78 (NH2)(i+b+d) NH2 -COOH(t-b) Formule b -NH2 Formule AE OH(i_d) dans laquelle : - b et d ont la signification de la revendication 3. selon le schema, c. une etape de liaison d'un fluorophore par la mise en contact d'un fluorophore F constitue par de la Rhodamine B, avec ladite nanoplateforme NPC2 de Formule AE, pour obtenir une nanoplateforme de Formule AF HN Rhodamine B aliff NH2 Formule AF 10 d. une etape de greffage d'une molecule active antitumorale par la mise en contact de ladite nanoplateforme de Formule AF avec un precurseur de linker L', de l'anhydre succinique et une base, du Na2CO3, pour obtenir Ia nanoplateforme de Formule AG HN Rhodamine B 0 NH OH Formule AG 0 15 suivie par Ia mise en contact de ladite nanoplateforme de Formule AG avec ladite molecule active antitumorale M, du paclitaxel, pour obtenir ladite nanoplateforme active de Formule XII, 13. Nanoplateforme active selon I'une quelconque des revendications 1 a 8, pour son utilisation comme medicament. 20 14. Composition pharmaceutique comprenant au moins une nanoplateforme active selon I'une quelconque des revendications 1 a 8, oil ladite molecule active antitumorale M est du paclitaxel ou de la doxorubicine et ladite nanoplateforme active etant en association avec un excipient pharmacologiquement acceptable. 15. Nanoplateforme active selon I'une quelconque des revendications 1 a 8, pour son 25 utilisation dans le traitement de cancers et des tumeurs cerebrales plus particulierement le glioblastome et les metastases cerebrales issues de differentes tumeurs primaires.