Brevet FR3070004A1 — publié le 20190215

Utilisation thérapeutique ou non-thérapeutique de protozoaires comme fongistatique et/ou fongicide Domaine technique de l'invention La présente invention concerne l'utilisation de protozoaires, par exemple des protozoaires du genre amibien Willaertia, comme fongistatique et/ou fongicide. Contexte de l'invention Les champignons (levures et moisissures) sont responsables de nombreuses maladies affectant à la fois les plantes, les animaux et les humains. De nombreux fongicides ont ainsi été développés pour éliminer les champignons ou limiter leur développement, et par conséquent traiter et/ou prévenir les maladies induites par les champignons. En revanche, l'utilisation de ces composés n'est souvent pas optimale que ce soit en termes d'efficacité ou en termes de toxicité pour l'homme ou l'environnement. En effet, l'utilisation massive, agricole ou non, de pesticides ou d'antifongiques chimiques soulève de nombreux problèmes sanitaires et écologiques. Sur le plan environnemental, on constate une contamination croissante des sols et des nappes phréatiques par les molécules contenues dans les produits phytosanitaires. Ces polluants peuvent être à l'origine de perturbations au sein des écosystèmes contaminés, de par leurs effets toxicologiques potentiels sur les organismes non ciblés. Outre les risques écologiques, les dangers liés à l'utilisation et à l'exposition aux pesticides sont également bien documentés et font l'objet d'une mise en garde de l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS). Concernant le traitement des mycoses, il est nécessaire de fournir un composé antimycosique qui soit non toxique pour l'homme. De plus, l'utilisation massive de ces composés a comme conséquence l'apparition de souches résistantes à ces produits. L'évolution des populations conduit à terme à des baisses d'efficacité des produits qui peut aller jusqu'à la perte totale. La prise de conscience des risques écologiques et sanitaires induits par l'utilisation massive de pesticides chimiques a donc contribué à promouvoir depuis quelques années le développement d'une demande pour des produits antifongiques d'origine naturelle, dont l'impact toxicologique et environnemental est plus faible. Ces produits moins nocifs pour l'homme et son environnement présentent également l'avantage d'une utilisation simplifiée, car ils bénéficient d'une réglementation allégée. 2 II existe donc un besoin important pour le développement de nouvelles compositions fongicide naturelles, à large spectre qui soient à la fois efficaces, simples à mettre en oeuvre, et dont les couts de production soient maitrisés. II serait également avantageux que de telles compositions puissent agir sur les 5 spores, afin de présenter une efficacité optimale. Objet de l'invention Dans ce contexte, les inventeurs ont mis en évidence, de façon totalement inattendue, que les protozoaires, et notamment les protozoaires du genre amibien Willaertia possèdent 10 une activité fongistatique et/ou fongicide, en particulier en agissant sur les spores. Un premier aspect de la présente invention est l'utilisation non-thérapeutique de protozoaires, par exemple du genre Willaertia, comme fongistatique et/ou fongicide. Un second aspect de la présente invention est un protozoaire du genre Willaertia, pour son utilisation comme médicament antimycosique. 15 Selon la présente invention, les protozoaires peuvent être utilisés de manière préventive ou curative. Les protozoaires de genre Willaertia peuvent être utilisés selon la présente invention seuls, ou de façon avantageuse, en combinaison avec d'autres protozoaires, et notamment des protozoaires du genre amibien Solunntris, des protozoaires Cercozoa du genre 20 Cercomonas ou des protozoaires Cercozoa du genre Paracercomonas. Tel qu'utilisé ici, le terme « champignon » se réfère aux champignons unicellulaires ou pluricellulaires, incluant les levures et les moisissures, sous forme de spores ou sous forme de mycélium. De préférence, les protozoaires utilisés appartiennent à l'espèce Willaertia magna. 25 De manière encore plus préférentielle, les protozoaires utilisés dans le cadre de l'invention correspondent à la souche déposée le 21 août 2006 sous le numéro PTA 7824 à l'ATCC ou à la souche déposée le 21 août 2006 sous le numéro PTA 7825 à l'ATCC, ces deux souches ayant été déposées aux noms du CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS) - 3 rue Michel Ange - 75794 PARIS CEDEX 30 16/France et UNIVERSITE LYON 1 CLAUDE BERNARD - 43 Boulevard du 11 Novembre 1918 - 69622 VILLEURBANNE Cedex/France. Lesdites souches déposées sont également décrites dans la publication de la demande internationale PCT W02008/043969. 3 L'utilisation non-thérapeutique selon l'invention trouve, en particulier, de multiples applications : - pour lutter contre la prolifération des champignons parasites des végétaux, de préférence pour le traitement des maladies fongiques de la vigne, des céréales, des 5 pommes de terre, des arbres fruitiers et des cultures maraichères, de manière encore plus préférentielle pour le traitement des maladies fongiques choisies parmi l'oïdium de la vigne, le mildiou de la vigne, la septoriose et la fusariose des céréales, l'helminthosporiose des céréales, le mildiou et l'alternariose de la pomme de terre, la tavelure du pommier, le Sclerotinia des colza et des cultures légumière 10 et une combinaison de celles-ci. - pour la désinfection des réseaux (autres que les tours aéro-réfrigérantes) de centrales de traitement de l'air ; - pour lutter contre les contaminations fongiques et/ou la formation de biofilms fongiques dans les denrées alimentaires, les équipements de 15 transformation/production des denrées alimentaires, les usines de transformation/production des denrées alimentaires, les surfaces venant en contact avec les denrées alimentaires ; - pour lutter contre les contaminations fongiques et/ou la formation de biofilms fongiques dans les produits cosmétiques, les équipements de 20 transformation/production des produits cosmétiques, les usines de transformation/production des produits cosmétiques, les surfaces venant en contact avec les produits cosmétiques. L'utilisation comme médicament antimycosique selon l'invention trouve en particulier 25 application dans le traitement des infections provoquées par les champignons choisis parmi Aspergillus, Candida, U. botrytis, A.niger, P.variotii, A.alternata, et une combinaison de ceux-ci, de préférence Candida, de manière encore plus préférentielle Candida albicans. L'utilisation trouve aussi application dans le traitement des maladies nosocomiales provoquées par les champignons, en particulier des pathologies respiratoires. 30 De préférence, les protozoaires du genre Willaertia sont utilisés selon l'invention pour lutter contre un champignon choisi parmi la division des Ascomycètes, plus préférentiellement parmi la classe des sordariomycetes, eurotiomycètes, dothideomycetes, saccharomycetes, leotiomycetes et une combinaison de celles-ci, encore plus préférentiellement parmi le genre des Fusarium, Penicillium, Chaetomium, Trichoderma, 4 Aspergillus, Alternaria, Candida, Ulocladium, Epicoccum, Cladosporium et une combinaison de ceux-ci et de manière encore plus préférée parmi F. solani, C. globosum, P. chrysogenum, T viride, T harzianum, A. fumigatus, A.alternata, A.flavus, P. variotii, A.niger, C. albicans, U. botrytis, E. nigrum, B. cinerea, P. roqueforti, C. cladosporioides, 5 E. chevalieri, A. pullulans et une combinaison de ceux-ci. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, les protozoaires du genre Willaertia sont utilisés selon l'invention pour lutter contre F. solani pour le traitement des maladies fongiques des végétaux (céréales et maïs). Dans un autre mode de réalisation 10 particulier de l'invention, les protozoaires du genre Willaertia sont utilisés selon l'invention pour lutter contre C. globosum pour le traitement des maladies fongiques des végétaux, de préférence affectant les céréales ou le riz ou pour le traitement des contaminations des produits à base de cellulose tels que le papier et les matériaux de construction. 15 Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, les protozoaires du genre Willaertia sont utilisés selon l'invention pour lutter contre les moisissures du genre Penicillium comme P. chrysogenum du genre Aspergillus comme Aspergillus niger, ou du genre Cladosporium comme Cladosporium cladosporioides pour le traitement des contaminations des environnements intérieurs tels que les murs, les matériaux, les 20 équipements et les systèmes de ventilation, etc. Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, les protozoaires du genre Willaertia sont utilisés selon l'invention pour lutter contre T viride et/ou T harzianum pour le traitement des contaminations des denrées alimentaires et des environnements intérieurs tels que les murs, les matériaux, les équipements et les systèmes 25 de ventilation, etc. Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, les protozoaires du genre Willaertia sont utilisés selon l'invention pour lutter contre A. fumigatus pour le traitement des maladies nosocomiales, en particulier des pathologies respiratoires. Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, les protozoaires du 30 genre Willaertia sont utilisés selon l'invention pour lutter contre A.alternata pour le traitement des maladies fongiques des végétaux, de préférence l'alternariose de la pomme de terre ou le traitement des lésions cutanées, mycoses et infections de l'appareil respiratoire supérieur chez l'homme. 5 Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, les protozoaires du genre Willaertia sont utilisés selon l'invention pour lutter contre P. variotii pour le traitement des contaminations fongiques et/ou la formation de biofilms fongiques dans les denrées alimentaires, de préférence les céréales ou pour le traitement des mycoses, 5 pneumonies, sinusites chez l'homme. Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, les protozoaires du genre Willaertia sont utilisés selon l'invention pour lutter contre A.niger pour le traitement des contaminations fongiques et/ou la formation de biofilms fongiques dans les denrées alimentaires, des environnements intérieurs tels que les murs, les matériaux, les 10 équipements et les systèmes de ventilation , etc. ou pour le traitement des mycoses de l'oreille interne ou aspergillose pulmonaires chez l'homme. Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, les protozoaires du genre Willaertia sont utilisés selon l'invention pour lutter contre C. albicans pour le traitement des mycoses chez l'homme. 15 Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, les protozoaires du genre Willaertia sont utilisés selon l'invention pour lutter contre U. botrytis pour le traitement des maladies fongiques des végétaux, le traitement des contaminations fongiques et/ou la formation de biofilms fongiques dans les denrées alimentaires et pour le traitement de l'onychomycose. 20 Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, les protozoaires du genre Willaertia sont utilisés selon l'invention pour lutter contre E. nigrum ou A. pullulans pour le traitement des contaminations fongiques et/ou la formation de biofilms fongiques dans les denrées alimentaires ou les cosmétiques ou de la contamination des environnements intérieurs tels que les murs, les matériaux, les équipements et les systèmes 25 de ventilation, etc. Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, les protozoaires du genre Willaertia sont utilisés selon l'invention pour lutter contre A.flavus, P. roqueforti, B. cinerea, C. cladosporioides ou E. chevalieri pour le traitement des contaminations fongiques et/ou la formation de biofilms fongiques dans les denrées alimentaires ou les 30 cosmétiques. Pour les utilisations non-thérapeutiques, les protozoaires pourront être directement mis en contact sur les équipements de transformation/production et les surfaces venant en contact avec les denrées alimentaires ou les cosmétiques, ou sur les végétaux à traiter. Le 6 traitement peut être fait par exemple par pulvérisation, par exemple sous la forme d'une solution aqueuse en aérosol. De tels protozoaires pourront donc être également utilisés en combinaison avec d'autres agents désinfectants et/ou pesticide. 5 Pour l'utilisation comme médicament antimycosique, les protozoaires pourront être appliqués sur les lésions de manière topique sur la peau ou les muqueuses (par exemple sous la forme d'une crème, pommade, spray ou poudre à appliquer sur la peau ou les muqueuses, typiquement les muqueuses vaginales ou anales). 10 L'invention vise donc également une composition pharmaceutique comprenant une quantité efficace des protozoaires comme antimycosiques et un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Ladite composition pharmaceutique peut être en particulier un pansement à substance active, un cataplasme, un emplâtre médicamenteux, un gel, une pâte, une lotion, une mousse, une huile, une émulsion, solution aqueuse, 15 suspension aqueuse, crème, pommade, poudre ou spray à appliquer sur la peau ou les muqueuses. Un autre objet de l'invention est un procédé de lutte contre la prolifération des champignons, à l'exception des méthodes de traitement appliquées au corps humain ou 20 animal, comprenant une étape de mise en contact de protozoaires du genre Willaertia avec lesdits champignons. Exemples Les exemples ci-après permettent d'illustrer l'invention mais n'ont aucun caractère 25 limitatif. Analyse qPCR de l'ADN fongique des interactions champignon- Willaertia sur 20 souches. 30 Les essais d'interaction sur les 20 souches de champignons (tableau 1) ont été réalisés en mettant les spores en contact avec l'amibe «Willaertia magna C2c Maky» selon un ratio amibe/spore = 10 amibes / spores, en plaques de 24 puits. 7 Dans une première plaque, des spores seules de chaque souche ont été incubées dans les mêmes conditions (dans 2 ml de MEAc). Après 3H de contact, la solution est centrifugée à 14 000 rpm pendant 5 minutes. Le surnageant est ensuite éliminé et le culot repris dans 200p1 pour l'extraction d'ADN. 5 Pour les essais à 24H réalisés dans une seconde plaque, le surnageant est éliminé directement du puits après 24 heures et les « mélanges spores-amibes » sont repris dans 2041 pour extraire l'ADN. Un suivi par observations microscopiques est effectué à chaque étape. Une extraction d'ADN est effectuée sur les échantillons (2041) à l'aide du 10 kit « NucleoSpin plant II - Macherey-Nagel» selon les instructions du fabricant après une étape de broyage avec du sable fin. L'amplification par qPCR de l'ADN des champignons seuls et des complexes Willaertia-champignons a été effectuée sur un appareil CFX96-Biorad. La quantification 15 est réalisée dans un volume final de 241 contenant 51.11 d'ADN, les amorces (300nM) et 141 de SybrGreen-Mix. Le programme suivant a été utilisé : une étape de dénaturation 95°C pendant 10 minutes avec une étape d'amplification « 95°C pdt 15S + 60°C pdt lmin » de 35 cycles. Les tests effectués sur les 20 souches de champignons sont réalisés selon le protocole 20 validé dans l'étape précédente. Les plaques sont observées au microscope avant de lancer l'analyse moléculaire. Les résultats sont présentés dans le Tableau 1 (qPCR obtenus en triplicat pour chaque condition, spores-3H, spores-24H, spore-amibe3H et sporeamibe24H). Étant donné que l'analyse qPCR utilise des amorces universelles, une gamme du champignon P.chrysogenum a été utilisée pour estimer approximativement la quantité 25 d'ADN amplifié pour chaque essai. Ces données permettent d'évaluer le passage du stade spore au mycélium dans les témoins sans amibe ainsi que le degré d'inhibition de la germination en présence des amibes. Tableau 1: Ecart d'amplification qPCR entre les essais réalisés sur les spores seules 30 (écart entre 3 et 24 heures) ou en interaction avec les amibes après 24H de contact. ACq (3H-24H) : écart en nombre de cycles entre les spores à 3H et 24H. ACq (T24HWillaertia24H) : écart en nombre de cycles entre les spores seules (T24H) et en présence d'amibes (Amibes 24H) après 24H d'incubation. 8 Souche ACq (3H-24H) ACq (T24H- Willaertia 2411)* F. solani 3,3 -4,1 C. globosum 7,6 -3,8 P. chrysogenum 8,4 -7,0 T viride 13,3 -12,9 T. harzianum 9,3 -8,7 A. .finnigatus 7,4 -8,7 A.alternata 3,4 -3,3 A.flavus 4,5 -9,3 P. variotii 6,2 -6,6 A.niger 8.92 -9.63 C. albicans 10,7 -3,3 U. botrytis 4,0 -5,0 E. nigrum 0,1 -4,6 B. cinerea 4,9 -6,2 C herbarum 0,9 -0,8 P. roqueforti 6,4 -13 C. clado.sporioides 12,0 -11,1 E. chevalieri 1,9 -4,5 A. pullulans * : les valeurs de ACq (T24H-Willaertia24H) sont négatives car les valeurs de Cq correspondant aux essais « champignon-amibe 24H » (biomasse fongique faible) sont supérieures à celles des essais des témoins à 24H (biomasse élevée). 5 CONCLUSION L'analyse par qPCR a permis de quantifier la biomasse fongique et de différencier les stades de développement des champignons et de montrer l'effet fongistatique et/ou REVENDICATIONS1. Utilisation non-thérapeutique de protozoaires, comme fongistatique et/ou fongicide, par exemple des protozoaires du genre amibien Willaertia. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisé en ce que les protozoaires appartiennent à l'espèce Willaertia magna. 3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que des protozoaires du genre amibien Willaertia sont utilisés en association avec d'autres protozoaires, par exemple des protozoaires du genre amibien Solumitris, des protozoaires cercozoaires du genre Cercomonas ou des protozoaires cercozoaires du genre Paracercomonas. 4. Utilisation selon la revendication 1, 2 ou 3, pour lutter (i) contre un champignon choisi parmi la division des Ascomycètes, plus préférentiellement parmi la classe des sordariomycetes, eurotiomycètes, dothideomycetes, saccharomycetes, leotiomycetes et une combinaison de celles-ci, encore plus préférentiellement parmi le genre des Fusarium, Penicillium, Chaetomium, Trichoderma, Aspergillus, Alternaria, Candida, Ulocladium, Epicoccum, Cladosporium et une combinaison de ceux-ci, et/ou (ii) pour lutter contre un champignon choisi parmi F. solani, C. globosum, P. chrysogenum, T viride, T harzianum, A. fumigatus, A.alternata, A.flavus, P. variotii, A.niger, C. albicans, U. botrytis, E. nigrum, B. cinerea, P. roqueforti, C. cladosporioides, E. chevalieri, A. pullulans et une combinaison de ceux-ci. 5. Utilisation selon la revendication 1 à 4, caractérisé en ce que ces protozoaires correspondent, à la souche déposée sous le numéro PTA 7824 à l'ATCC ou à la souche déposée sous le numéro PTA 7825 à l'ATCC. 6. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, pour lutter contre la prolifération des champignons parasites des végétaux. 10 7. Utilisation selon la revendication 6, pour le traitement des maladies fongiques de la vigne, des céréales, des pommes de terre, des arbres fruitiers et des cultures maraichères, en particulier pour le traitement des maladies fongiques choisies parmi l'oïdium de la vigne, le mildiou de la vigne, la septoriose et la fusariose des 5 céréales, l'helminthosporiose des céréales, le mildiou et l'alternariose de la pomme de terre, la tavelure du pommier, le Sclerotinia des colza et des cultures légumière et une combinaison de celles-ci. 8. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, 10 (i) pour la désinfection des réseaux de centrales de traitement de l'air, (ii) pour lutter contre les contaminations fongiques et/ou la formation de biofilms fongiques dans les denrées alimentaires, les équipements de transformation/production des denrées alimentaires, les usines de transformation/production des denrées alimentaires ou des produits cosmétiques, 15 les surfaces venant en contact avec les denrées alimentaires ou les produits cosmétiques, ou, (iii) pour le traitement des contaminations des environnements intérieurs. 9. Protozoaires du genre Willaertia, de préférence de l'espèce Willaertia magna pour 20 son utilisation comme médicament antimycosique, par exemple pour le traitement des maladies nosocomiales provoquées par les champignons. 10. Protozoaires du genre Willaertia selon la revendication 9, pour le traitement des infections provoquées par les champignons choisis parmi Aspergillus, Candida, U. 25 botrytis, A. figer, P.variotii, A.alternata, les champignons résistants aux antimycosiques, et une combinaison de ceux-ci, de préférence, pour le traitement des infections provoquées par le champignon Candida, et plus préférentiellement, Candida albicans.