Brevet FR3072686A1 — publié le 20190426

Système d'expression baculovirus Domaine technique L'invention concerne un procédé pour produire un baculovirus recombinant dont le génome comprend un ou plusieurs transgène(s) codant chacun une enzyme de maturation des protéines et au moins deux transgènes codant chacun un polypeptide d'intérêt, des baculovirus ou des génomes de baculovirus recombinants obtenus par ce procédé, des jeux d'éléments de recombinaison homologue, des cellules comprenant un baculovirus recombinant ou un génome de baculovirus recombinant ainsi que l'utilisation des baculovirus ou des génomes de baculovirus recombinants pour la production de polypeptides d'intérêt. Arrière-plan technologique Les baculovirus sont une famille de virus en forme de bâtonnet, spécifiques des arthropodes, qui compte quatre genres (Alphabaculovirus, Betabaculovi rus, Deltabaculovirus, Gammabaculovirus) regroupant 49 espèces. Les baculovirus ne sont pas capables de se répliquer dans les cellules de mammifères ou d'autres vertébrés. Le génome des baculovirus est constitué d'une molécule d'ADN bicaténaire, circulaire, d'une taille comprise entre 80 et 180 kpb. Le génome des baculovirus s'associe à des protéines hautement basiques de 6,5 kDa, au sein d'une nucléocapside à symétrie hélicoïdale, qui contient une protéine de capside de 39 kDa. La taille du génome détermine la longueur de la nucléocapside. La nucléocapside est ensuite enfermée dans une enveloppe lipoprotéique pour former la particule virale ou virion. Ces structures peuvent être recouvertes d'une matrice cristalline ou polyèdre constituée essentiellement d'une seule protéine (la polyédrine) d'environ 30 kDa. Les polyèdres sont de grandes structures dont la taille varie de 1 à 15 pm de diamètre avec une enveloppe externe polysaccharidique qui confère une protection supplémentaire. Les baculovirus, dont le génome a été modifié génétiquement, sont utilisés en biotechnologie pour la production de protéines recombinantes (i.e. baculovirus recombinants). Après pénétration dans une cellule d'insecte, ces baculovirus recombinants vont utiliser la machinerie de la cellule d'insecte pour produire la protéine recombinante. Les baculovirus recombinants sont obtenus en insérant un ou plusieurs gènes provenant d'autres espèces (par exemple des êtres humains, d'autres vertébrés, plantes, bactéries et virus) dans le génome d'un baculovirus parent. Ces gènes sont placés sous le contrôle d'un promoteur viral ou cellulaire (par exemple le promoteur du gène de la 2 polyédrine) pour générer un génome de baculovirus recombinant. Le promoteur permet la transcription du gène étranger en ARN messager qui à son tour est traduit en protéine dans la cellule d'insecte infectée par le baculovirus recombinant. L'avantage d'utiliser ce système est que le niveau de production de la protéine recombinante dans les cellules d'insecte 5 infectées par le baculovirus recombinant peut être très important. La protéine recombinante peut ensuite être purifiée à partir des cellules infectées si la protéine est intracellulaire ou bien à partir du milieu de culture si la protéine est sécrétée. Le système d'expression baculovirus est largement utilisé dans l'industrie et dans les laboratoires de recherche. En plus de l'importante productivité du système d'expression baculovirus, ce système est 10 également très apprécié car il permet de produire des protéines recombinantes biologiquement actives. En effet, les cellules d'insectes permettent généralement d'obtenir des modifications post-traductionnelles appropriées. Néanmoins, certaines protéines nécessitent des modifications post-traductionnelles que les cellules d'insecte ne sont pas capables de faire. Ces modifications post- 15 traductionnelles étant normalement effectuées par des enzymes de maturation des protéines spécifiques. Par exemple, la majorité des glycoprotéines humaines présentent une glycosylation dite complexe, elles sont en général sialylées (Figure 12A). La sialylation est un élément important de la stabilisation de la structure de certaines protéines, elle les rend plus solubles, 20 plus résistantes à la chaleur et aux protéases. Le taux de sialylation d'une protéine peut directement influencer sa demi-vie dans le sérum, les protéines désialylées étant rapidement captées par les récepteurs aux asialoprotéines. Il y a une exception à ce modèle de demi-vie, les anticorps. En effet, la demi-vie des anticorps est contrôlée essentiellement via leur interaction avec un récepteur au domaine Fc (FcR) (Fc pour « fragment cristallisable » : 25 région constante de l'anticorps (Figure 13)), particulier appelé récepteur FcRn. La glycosylation a cependant un rôle très important dans le contrôle de l'activité des anticorps tout particulièrement la N-glycosylation présente dans le domaine CH2 de la région constante des IgG sur Asn297 (Figure 13). En effet, la nature de cette N-glycosylation permet la modulation de ce que l'on appelle les activités effectrices de l'anticorps, activités 30 qui vont permettre par exemple de tuer une cellule tumorale ciblée par un anticorps. Il a notamment été démontré que (i) l'ADCC (Antibody Dependent Cell-mediated Cytotoxicity) est augmentée très significativement lorsque le fucose 121,6 est éliminé du core du glycanne et (ii) la CDC (Complement Dependent Cytotoxicity) est dépendante de la présence de galactose. Enfin, même si le mécanisme d'action est encore très controversé, la sialylation de ce motif glycannique serait importante pour bloquer l'activité proinflammatoire des anticorps. 3 Ainsi si l'on veut produire des anticorps très cytotoxiques, anticorps capables d'induire des activités ADCC et CDC élevées, par exemple pour détruire spécifiquement une tumeur, l'idéal est de produire des anticorps galactosylés. Par contre, un anticorps qui sera utilisé simplement comme ligand, ligand d'un récepteur cellulaire par exemple pour induire une 5 apoptose, ou bien pour faire de l'imagerie en marquant spécifiquement un tissu, il sera souhaitable d'utiliser un anticorps incapable d'induire de la cytotoxicité cellulaire, dans ce cas un anticorps sialylé sera le plus adapté. De nombreuses études sur le potentiel de N-glycosylation des cellules d'insectes montrent très clairement que si l'addition des glycannes est spécifique, c'est-à-dire qu'elle 10 est toujours effectuée sur les résidus asparagine identiques à ceux qui sont glycosylés naturellement sur la protéine d'origine exprimée par le tissu (par exemple l'Asn297 des anticorps), la structure des glycannes est différente, ils sont plus courts et il n'y a pas de glycannes complexes (Figure 12B). Il a également été montré que ces structures tronquées résultaient de l'absence ou de la faible activité de plusieurs enzymes impliquées dans la 15 biosynthèse des glycannes complexes comme, la N-acétylglucosaminyltransférase II (GnT-II) et la 13-1,4 galactosyltransférase (13-1,4 GalT), les sialyltransférases et de l'absence d'un nucléotide-sucre, le CMP-NeuAc. Dans le but d'obtenir des protéines d'intérêt correctement maturées, il est donc important de compléter le potentiel enzymatique de maturation de la cellule d'insecte. 20 Il existe donc un besoin de mettre au point des procédés faciles à mettre en oeuvre et qui permettent de produire des protéines recombinantes d'intérêt, notamment des protéines comprenant plusieurs sous-unités distinctes, tels que les anticorps dans des systèmes d'expression baculovirus et qui peuvent notamment être développés à l'échelle industrielle et qui sont capables d'induire une maturation appropriée de la protéine d'intérêt. 25 Partant de ce constat, le demandeur a mis au point un procédé particulièrement efficace et facile à mettre en oeuvre pour préparer des baculovirus recombinants homogènes et stables, et qui permet d'envisager un développement au niveau industriel de la production de protéines recombinantes, par exemple de protéines multimériques comprenant plusieurs sous-unités distinctes. 4 Résumé de l'invention Dans un premier aspect l'invention concerne un procédé pour produire un baculovirus recombinant dont le génome comprend un ou plusieurs transgène(s) codant chacun une enzyme de maturation des protéines et n transgènes codant chacun un polypeptide d'intérêt, 5 ledit procédé comprend les étapes de : a) Préparer, dans une cellule d'insecte, un génome de baculovirus capable de se répliquer qui comprend un ou plusieurs transgène(s) codant chacun une enzyme de maturation des protéines et n transgènes codant chacun un polypeptide d'intérêt, par recombinaison homologue entre : 10 a1) un génome de baculovirus recombinant déficient pour la réplication dans lequel n gènes essentiels à la réplication virale sont non-fonctionnels et qui comprend un ou plusieurs transgène(s) codant chacun une enzyme de maturation des protéines, et a2) n vecteurs de transfert comprenant chacun: 15 i) une séquence nucléotidique permettant de restaurer la fonction d'un des n gènes essentiels à la réplication virale non-fonctionnel, ii) un des n transgènes codant un polypeptide d'intérêt, l'ensemble des séquences nucléotidiques i) des n vecteurs de transfert étant capables de restaurer la réplication du génome de baculovirus déficient pour la 20 réplication, n étant un nombre entier au moins égal à 2 ; et b) générer un baculovirus recombinant dans une cellule d'insecte qui comprend le génome de baculovirus recombinant obtenu à l'étape a). Dans un deuxième aspect l'invention concerne un baculovirus recombinant ou un 25 génome de baculovirus recombinant comprenant : a) n séquences nucléotidiques de formule (I) : [transgène codant un polypeptide d'intérêt]-[séquence nucléotidique intercalaire]- [gène essentiel à la réplication virale fonctionnel] (I), ladite séquence d'acides nucléiques intercalaire est constituée de 0 à 600 pb, 30 ledit gène essentiel à la réplication virale fonctionnel est sélectionné parmi 1629 (ORF9), Pk1 (ORF10), lef-1 (ORF14), 0RF34, lef-11 (0RF37), p47 (ORF40), lef8 (ORF50), DNAJ domain (ORF51), 0RF53, vp1054 (0RF54), Lef-9 (0RF62), DNA Pol (0RF65), lef-3 (0RF67), 0RF73, 0RF75, ORF81, p95 (0RF83), vp39 (0RF89), lef-4 5 (ORF90), p33 (0RF92), helicase (0RF95), Vp80 (ORF104), ORF106-107, odv-ec43 (ORF109), gp64/67 (0RF128), 0RF132, 0RF133, odv-ec27 (0RF144), 0RF146, lei (ORF147), lef-2 (ORF6); n étant un nombre entier au moins égal à 2 ; et 5 b) un ou plusieurs transgène(s) codant chacun une enzyme de maturation des protéines. Dans un troisième aspect l'invention concerne un jeu d'éléments de recombinaison homologue comprenant : a) un génome de baculovirus déficient pour la réplication dans lequel n gènes 10 essentiels à la réplication virale sont non-fonctionnels et qui comprend un ou plusieurs transgène(s) codant chacun une enzyme de maturation des protéines ; b) n vecteurs de transfert comprenant chacun: I) une séquence d'acides nucléiques permettant de restaurer la fonction d'un des n gènes essentiels à la réplication virale non-fonctionnel, 15 ii) un transgène codant un polypeptide d'intérêt, n étant un nombre entier au moins égal à 2. Dans un quatrième aspect l'invention concerne une cellule comprenant un baculovirus recombinant ou un génome de baculovirus recombinant selon l'invention ou un jeu d'éléments de recombinaison homologue selon l'invention. 20 Dans un cinquième aspect l'invention concerne l'utilisation d'un baculovirus recombinant ou d'un génome de baculovirus recombinant selon l'invention ou d'une cellule selon l'invention pour la production de n polypeptides d'intérêt. 6 Description détaillée de l'invention Définitions Dans le cadre de la présente invention, on entend désigner par l'expression « baculovirus » un virus en forme de bâtonnet spécifique des arthropodes. Un baculovirus 5 comprend généralement une nucléocapside renfermant un génome de baculovirus. Des exemples de baculovirus sont BmNPV, AcMNPV, ApNPV, BsSNPV, CfMNPV, EoSNPV, HaNPV, HzNPV, LdMNPV, MbMNPV, OpMNPV, SIMNPV, SeMNPV et TeNPV. Dans le cadre de la présente invention, on entend désigner par l'expression « génome de baculovirus » l'ensemble du matériel génétique d'un baculovirus, comprenant 10 en particulier toutes les séquences nucléotidiques codantes et non codantes d'un baculovirus. Dans le cadre de la présente invention, on entend désigner par l'expression « génome de baculovirus déficient pour la réplication », un génome de baculovirus dans lequel au moins deux gènes essentiels à la réplication virale ont été soit délétés (entièrement 15 ou partiellement) soit mutés de telle sorte que le génome de baculovirus a perdu sa capacité de réplication dans une cellule d'insecte. Par exemple, le gène essentiel à la réplication virale ne s'exprime plus ou il est transcrit puis traduit en une protéine non-fonctionnelle. Ainsi, les gènes délétés (entièrement ou partiellement) ou mutés sont appelés « gènes essentiels à la réplication virale non-fonctionnels ». Les génomes de baculovirus déficients pour la 20 réplication virale sont fabriqués à partir de génomes de baculovirus parents en utilisant des techniques de biologie moléculaire bien connues de l'homme du métier, et permettant notamment l'insertion et/ou la délétion de séquences nucléotidiques dans le génome de baculovirus parent. De préférence, le génome de baculovirus déficient pour la réplication virale comprend au moins une séquence nucléotidique qui lui permet de se répliquer au sein 25 d'une cellule bactérienne. Les séquences nucléotidiques permettant la réplication au sein d'une cellule bactérienne ne sont pas des transgènes d'intérêt au sens de l'invention. Un exemple d'élément de réplication bactérienne est la séquence nucléotidique « Mini-F ». De tels éléments de réplication sont bien connus dans l'état de la technique. La cellule bactérienne peut être Escherichla col': Un génome de baculovirus qui comprend une 30 séquence nucléotidique qui lui permet de se répliquer au sein d'une cellule bactérienne est connu sous la dénomination « Bacmid ». De préférence, le génome de baculovirus déficient pour la réplication comprend également une ou plusieurs séquences nucléotidiques codant un ou plusieurs marqueurs de sélection permettant de sélectionner ou d'identifier les cellules bactériennes transfectées par le génome de baculovirus déficient pour la réplication. Les 35 séquences nucléotidiques de sélection ne sont pas des transgènes d'intérêt au sens de 7 l'invention. Il peut s'agir par exemple du gène de résistance à l'ampicilline, du gène de résistance à la kanamycine, du gène de résistance à l'hygromycine, du gène de résistance à la zéocine et/ou du gène de résistance à la tétracycline. Dans le cadre de la présente invention, on entend désigner par l'expression 5 « génome de baculovirus recombinant », un génome de baculovirus qui comprend un ou plusieurs transgène(s) codant chacun une enzyme de maturation des protéines et n transgènes codant chacun un polypeptide d'intérêt. Le terme « génome de baculovirus recombinant » selon l'invention correspond au génome de baculovirus obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, c'est-à-dire le génome de baculovirus obtenu par 10 recombinaison homologue entre le génome de baculovirus déficient pour la réplication et n vecteurs de transfert. Dans le cadre de la présente invention, on entend désigner par l'expression « baculovirus recombinant », un baculovirus dont le génome est un génome de baculovirus recombinant, c'est-à-dire un baculovirus dont le génome comprend un ou plusieurs 15 transgène(s) codant chacun une enzyme de maturation des protéines et n transgènes codant chacun un polypeptide d'intérêt. Le baculovirus recombinant peut être produit après réplication du génome de baculovirus recombinant dans une cellule d'insecte. Le baculovirus recombinant est capable d'infecter des cellules d'insecte. De préférence, le baculovirus recombinant selon l'invention est infectieux pour une cellule d'insecte. 20 Par « gène », on entend une séquence nucléotidique capable d'être transcrite puis traduite en polypeptide, par exemple en protéine. On parle alors de gène codant un polypeptide. Dans le cadre de la présente invention, on entend par « transgène », un gène qui n'est pas naturellement présent dans le génome d'un baculovirus. Il peut s'agir par exemple 25 d'un gène d'origine humaine, d'un gène d'origine animale, d'un gène d'origine végétale, d'un gène d'origine virale ou d'un gène d'origine bactérienne. Dans le cadre de l'invention, le transgène est soit un « transgène codant une enzyme de maturation des protéines », soit un « transgène codant un polypeptide d'intérêt ». On entend par « transgènes distincts », des transgènes n'ayant pas la même 30 séquence nucléotidique. Un transgène au sens de la présente invention est placé sous le contrôle d'éléments appropriés pour son expression dans la cellule d'insecte. Par "éléments appropriés", on entend l'ensemble des éléments nécessaires à sa transcription en ARN messager (ARNm) et à la traduction de l'ARNm en polypeptide. Parmi les éléments nécessaires à la transcription, 35 le promoteur revêt une importance particulière. Il peut s'agir d'un promoteur constitutif ou 8 d'un promoteur régulable et il peut être d'origine baculovirale ou d'origine arthropode (e.g. d'origine insecte). L'important est que le promoteur choisi soit adapté pour l'expression du transgène dans la cellule d'insecte. D'une façon générale, un promoteur en usage dans la présente invention, peut être modifié de manière à contenir des séquences régulatrices. 5 A titre d'exemples de promoteurs, on peut citer le promoteur polyédrine, le promoteur P10, les promoteurs synthétiques dérivés des promoteurs polyédrine et P10, le promoteur IE1 du baculovirus CfMNPV, le promoteur IE1 du baculovirus LdMNPV, le promoteur gp64 du baculovirus OpMNPV, le promoteur IE1 du virus de crevette WSSV (White spot syndrome virus), le promoteur P9 du densovirus de JUI70171d coenla (3cDNV), le promoteur cellulaire A3 10 (actine 3) du vers à soie Bombyx mon. Dans un mode de réalisation particulier, un ou plusieurs des transgènes est placé sous le contrôle d'un promoteur synthétique dérivé du promoteur P10 sauvage (SEQ ID NO : 1), de préférence le promoteur synthétique P10S1A (SEQ ID NO: 2) ou P10S1B (SEQ ID NO: 3). Par « cassette d'expression », on entend une séquence nucléotidique généralement 15 constituée d'un ou plusieurs gènes et des éléments appropriés pour son/leur expression, par exemple un transgène et les éléments appropriés pour son expression dans la cellule d'insecte. Par « enzyme de maturation des protéines », on entend une enzyme impliquée dans la maturation des protéines. En particulier, la maturation opérée par une enzyme de 20 maturation des protéines conduit à la production d'une protéine stable et/ou ayant toutes ou partie de son activité biologique. Par exemple, l'enzyme de maturation des protéines peut agir au niveau de la séquence peptidique d'une protéine (par exemple par clivage), au niveau du repliement (c'est le cas par exemple des protéines chaperonnes), au niveau de la glycosylation, ou au niveau de toute autre modification post-traductionnelle comme par 25 exemple la phosphorylation ou la méthylation. L'enzyme de maturation des protéines peut être une peptidase signal, une furine, une proprotéine convertase, une glycosyltransférase, une glycosidase, une protéine chaperone, une disulfide isomérase, une acyltransférase, une méthyltransférase, une hydroxylase, une transglutaminase, une farnésyltransférase, une géranylgéranyltransférase, une N-myristoyltransférase, une palmityltransférase, une protéine 30 kinase, une phosphatase, une transpeptidase, une carboxylase et/ou une ubiquitine ligase. Par « glycosyltransférase », on entend une enzyme capable de catalyser le transfert d'un monosaccharide, depuis un sucre activé (donneur), généralement par un phosphate, vers une molécule accepteur (le plus souvent un alcool ou une amine). L'accepteur du transfert peut aussi être un résidu peptidique, le plus souvent la sérine, la thréonine ou plus 35 rarement la tyrosine, l'hydroewlysine et hydroxyproline lors des 0-glycosylations (0-mannose, 9 0-fucose, 0-GaINAc, 0-GIcNAc, 0-galactose et 0-glucose), ou une asparagine lors d'une N-glycosylation. Un mannose activé peut également être transféré sur un tryptophane pour former un C-mannosyl tryptophane. La glycosyltransférase peut être choisie parmi les N-acétylglucosaminyltransférases I, II, III, IV, V, VB, VI et IX, une galactosyltransférase, par 5 exemple une béta-1,4-galactosyltransférase, par exemple choisie parmi la béta-1,4- galactosyltransférase 1, 2, 3, 4, 5, 6 et 7, la CMP-NeuAc synthase, la NeuAc synthase, les protéine-O-mannosyltransférases 1 et 2, les protéine-O-fucosyltransférases 1 et 2, la protéine-O-glucosyltransférase 1, la protéine-O-GIcNAc transférase, la GaINAc transférase, les fucosyltransférases 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 et 11 (FUT1 à FUT11) et les 10 sialyltransférases, par exemple 1'122,3 sialyltransférase et 1'122,6 sialyltransférase. On entend par « polypeptide » une chaine d'acides aminés reliés par des liaisons peptidiques. Par exemple, un polypeptide peut être une protéine, une sous-unité de protéine, un fragment de protéine ou simplement une chaine d'acides aminés. Généralement, un polypeptide est formé d'au moins 10 acides aminés. 15 Par « polypeptide d'intérêt » ou « polypeptide recombinant d'intérêt », on entend un polypeptide codé par un transgène. Par exemple, le polypeptide d'intérêt peut être une sous-unité d'une protéine multimérique. Avantageusement, il s'agit d'un polypeptide d'intérêt thérapeutique et/ou diagnostique, c'est-à-dire un polypeptide qui peut être utilisé en thérapie ou en diagnostique. 20 On entend par « polypeptides d'intérêt distincts », des polypeptides n'ayant pas la même séquence en acides aminés. On entend par « sous-unités distinctes », des sous-unités d'une protéine multimérique n'ayant pas la même séquence en acides aminés. Ainsi, une « protéine comprenant n sous-unités distinctes » est une protéine qui comprend n sous-unités ayant 25 chacune une séquence en acides aminés propre qui sont liées entre elles par des liaisons non-covalentes et/ou des liaisons covalentes. Une « protéine multimérique » est une protéine comprenant plusieurs sous-unités. Une protéine multimérique peut comprendre plusieurs sous-unités identiques (protéine homomultimérique) ou plusieurs sous-unités distinctes (protéine hétéromultimérique). 30 On entend par « complexe protéique » un ensemble constitué de plusieurs protéines ayant un lien fonctionnel ou structurel entre elles, par exemple une « Virus-Like-Particle » (VLP) ou un complexe multienzymatique. Au sens de la présente invention, l'expression « réplication » ou « réplication virale » s'entend à la fois par la réplication du génome de baculovirus et du baculovirus. Etant 10 entendu que la réplication du génome de baculovirus dans une cellule d'insecte est essentielle à la réplication du baculovirus dans la cellule d'insecte. Ainsi, un gène essentiel à la réplication virale s'entend comme un gène essentiel à la réplication du baculovirus dans la cellule d'insecte. La réplication du baculovirus dans la cellule d'insecte permet la génération 5 de baculovirus infectieux. Ainsi, le procédé de l'invention permet de générer un baculovirus recombinant infectieux dans une cellule, notamment une cellule d'insecte. Dans le cadre de la présente invention, on entend désigner par l'expression « recombinaison homologue », l'échange d'information génétique entre deux séquences nucléotidiques différentes, nécessitant la présence de séquences homologues entre les deux 10 séquences nucléotidiques différentes. Le terme « anticorps » est utilisé ici dans le sens le plus large et englobe diverses structures d'anticorps largement décrites dans la littérature, y compris, mais sans s'y limiter, les anticorps quelle que soit leur origine, les anticorps monoclonaux, les anticorps polyclonaux et les fragments d'anticorps tant qu'ils présentent l'activité souhaitée (par 15 exemple la liaison à l'antigène). Il peut s'agir d'un anticorps mono-spécifique ou multi- spécifique, par exemple bi-spécifique. L'anticorps peut être une IgA, IgD, IgE, IgG ou une IgM. Des exemples de fragments d'anticorps comprennent, mais sans s'y limiter, les fragments Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ; les diabodies; les scFv/Fc ; les anticorps de type camélidés (par exemple les VHH); les molécules d'anticorps à chaîne unique (par exemple scFv). 20 Procédé de préparation d'un baculovirus recombinant L'invention concerne un procédé pour produire un baculovirus recombinant dont le génome comprend un ou plusieurs transgène(s) codant chacun une enzyme de maturation des protéines et n transgènes codant chacun un polypeptide d'intérêt, ledit procédé 25 comprend les étapes de : a) Préparer, dans une cellule d'insecte, un génome de baculovirus capable de se répliquer qui comprend un ou plusieurs transgène(s) codant chacun une enzyme de maturation des protéines et n transgènes codant chacun un polypeptide d'intérêt, par recombinaison homologue entre : 30 a1) un génome de baculovirus déficient pour la réplication dans lequel n gènes essentiels à la réplication virale sont non-fonctionnels et qui comprend un ou plusieurs transgène(s) codant chacun une enzyme de maturation des protéines, et a2) n vecteurs de transfert comprenant chacun: i) une séquence nucléotidique permettant de restaurer la fonction d'un 35 des n gènes essentiels à la réplication virale non-fonctionnel, 11 ii) un des n transgènes codant un polypeptide d'intérêt, l'ensemble des séquences nucléotidiques i) des n vecteurs de transfert étant capables de restaurer la réplication du génome de baculovirus déficient pour la réplication, 5 n étant un nombre entier au moins égal à 2; et b) Générer un baculovirus recombinant dans une cellule d'insecte qui comprend le génome de baculovirus recombinant obtenu à l'étape a). Les n transgènes codant chacun un polypeptide d'intérêt sont portés par les n vecteurs de transfert qui recombinent avec le génome de baculovirus déficient pour la 10 réplication virale dans lequel n gènes essentiels à la réplication virale sont non-fonctionnels et qui comprend un ou plusieurs transgène(s) codant chacun une enzyme de maturation des protéines. Après recombinaison, les n transgènes codant chacun un polypeptide d'intérêt se retrouvent intégrés dans le génome du baculovirus recombinant. 15 Etape a) La recombinaison se fait dans une cellule d'insecte entre (a1) un génome de baculovirus déficient pour la réplication dans lequel n gènes essentiels à la réplication virale sont non-fonctionnels et qui comprend un ou plusieurs transgène(s) codant chacun une enzyme de maturation des protéines et (a2) les n vecteurs de transfert. 20 Avantageusement, la recombinaison dans le cadre de la présente invention se fait en une seule étape dans la cellule d'insecte. C'est-à-dire que la recombinaison des n transgènes codant chacun un polypeptide d'intérêt avec le génome de baculovirus déficient pour la réplication se fait de manière simultanée ou quasi-simultanée dans la cellule d'insecte. Cette recombinaison simultanée est un des principaux avantages du procédé selon l'invention car il 25 permet de produire le génome de baculovirus recombinant désiré rapidement et en une seule étape. Dans un mode de réalisation particulier, le génome de baculovirus déficient pour la réplication est obtenu à partir d'un génome de baculovirus sélectionné parmi ou dérivé du génome de BmNPV, AcMNPV, ApNPV, BsSNPV, CfMNPV, EoSNPV, HaNPV, HzNPV, LdMNPV, 30 MbMNPV, OpMNPV, SIMNPV, SeMNPV ou TeNPV, de préférence AcMNPV. Dans un mode de réalisation préféré, le génome de baculovirus déficient pour la réplication mis en oeuvre dans le procédé est sous forme circulaire. Ainsi, le procédé selon l'invention ne nécessite pas la linéarisation du génome déficient pour la réplication. Les vecteurs de transfert peuvent également contenir une ou plusieurs séquences 35 nucléotidiques qui leur permettent de se répliquer au sein d'une cellule bactérienne. 12 Ils peuvent également contenir des gènes codant un marqueur de sélection permettant de sélectionner ou identifier les cellules bactériennes transformées avec un vecteur de transfert. L'un des principaux avantages du procédé de l'invention est que la capacité à se répliquer du génome de baculovirus déficient pour la réplication virale est restaurée par la 5 recombinaison avec les n vecteurs de transfert. En effet, chacun des n vecteurs de transfert code, en plus d'un des n transgènes codant un polypeptide d'intérêt, une séquence nucléotidique permettant de restaurer la fonction d'un des n gènes essentiels à la réplication virale non-fonctionnels. Ainsi, seule une recombinaison avec l'ensemble des n vecteurs de transfert permet de restaurer la réplication du génome de baculovirus déficient pour la 10 réplication. Ainsi le procédé de l'invention garantit que seuls les génomes de baculovirus recombinants contenant les n transgènes codant un polypeptide d'intérêt pourront générer des baculovirus recombinants infectieux. Ce procédé évite d'avoir à utiliser des tests coûteux et chronophages pour identifier les baculovirus recombinants contenant les n transgènes codant un polypeptide d'intérêt. 15 Dans un mode de réalisation préféré, les gènes essentiels à la réplication virale sont choisis parmi 1629 (ORF9), Pk1 (ORF10), lef-1 (ORF14), 0RF34, lef-11 (0RF37), p47 (ORF40), lef8 (ORF50), DNAJ domain (ORF51), 0RF53, vp1054 (0RF54), Lef-9 (0RF62), DNA Pol (0RF65), lef-3 (0RF67), 0RF73, 0RF75, ORF81, p95 (0RF83), vp39 (0RF89), lef-4 (ORF90), p33 (0RF92), hélicase (0RF95), vp80 (ORF104), ORF106-107, odv-ec43 (ORF109), 20 gp64/67 (0RF128), 0RF132, 0RF133, odv-ec27 (0RF144), 0RF146, ie1 (0RF147) et lef-2 (ORF6). Ces gènes sont préférés car ils sont adjacents à un gène non-essentiel à la réplication virale. Ainsi, dans un mode de réalisation préféré, dans le génome de baculovirus déficient pour la réplication virale, les n gènes essentiels à la réplication virale non-fonctionnels sont chacun adjacents à un gène non-essentiel à la réplication virale. 25 Comme détaillé tout au long de la présente demande, les n transgènes recombinent chacun au niveau d'un gène non-essentiel à la réplication virale adjacent à un gène essentiel à la réplication virale non-fonctionnel. Etant donné que le gène non-essentiel à la réplication virale n'est pas essentiel pour la réplication du génome de baculovirus, la recombinaison n'affecte pas la capacité du génome de baculovirus recombinant à se répliquer. 30 Au sens de la présente invention, un gène essentiel à la réplication virale non- fonctionnel est adjacent à un gène non-essentiel à la réplication virale lorsque les deux gènes se succèdent ou se recouvrent partiellement sur le génome du baculovirus, de préférence aucun autre gène n'est compris entre le gène essentiel à la réplication virale non-fonctionnel et le gène non-essentiel à la réplication virale. Avantageusement, les deux gènes 35 susmentionnés sont séparés par une séquence nucléotidique intercalaire, par exemple une 13 séquence nucléotidique intercalaire non codante. En particulier, la séquence nucléotidique intercalaire a une longueur allant de 1 pb à 600 pb. Il est également possible qu'aucune séquence nucléotidique intercalaire (i.e. 0 pb) ne sépare les deux gènes susmentionnés, c'est-à-dire que les deux gènes susmentionnés sont accolés sur le génome du baculovirus ou 5 se recouvrent partiellement. Alternativement, la séquence nucléotidique intercalaire peut comprendre un gène non-essentiel à la réplication virale. Le demandeur s'est aperçu que le choix de gènes essentiels à la réplication virale non-fonctionnels adjacents à des gènes non-essentiels à la réplication virale était particulièrement avantageux et permettait d'obtenir des recombinaisons homologues 10 homogènes et donc d'obtenir des génomes baculovirus recombinants homogènes. Comme expliqué par ailleurs, seule une parfaite recombinaison des n vecteurs permet d'obtenir un génome de baculovirus recombinant capable de se répliquer dans une cellule d'insecte. Ainsi, les génomes des baculovirus recombinants préparés par le procédé selon l'invention sont homogènes à plus de 90%, avantageusement à plus de 95%, de préférence à plus de 99% 15 et de manière tout à fait préférée à environ 100%, par exemple les génomes de baculovirus recombinants préparés par le procédé selon l'invention sont tous identiques. Dans un mode de réalisation particulier, le gène non-essentiel à la réplication virale est choisi parmi Ph (ORF 8), ORF11, ORF13, egt (ORF15), v-ubiquitin (0RF35), 39K (0RF36), 0RF38, p43 (0RF39), lef-12 (ORF41), pcna (0RF49), 0RF52, 0RF55, Fp (ORF61), 0RF63, 20 gp37 (0RF64), 0RF68, 0RF72, 0RF74, 0RF82, cg30 (0RF88), ORF91, pif-4 (0RF96), he65 (ORF105), ORF108, ORF110, cathepsine (0RF127), p24 (0RF129), pp34 (ORF131), 0RF134, 0RF145, odv-e56 (0RF148), ORF5. Avantageusement, le couple gène essentiel à la réplication virale/gène non-essentiel à la réplication virale est choisi parmi les couples listés dans le tableau suivant : Couple Gène essentiel Gène non essentiel Espacement entre les 2 gènes 1629 (ORF9) Ph (ORF 8) 29 bp 2 Pk1 (ORF10) ORF11 163 bp 3 lef-1 (ORF14) ORF13 Chevauchement 112 bp ou egt (ORF15) 4 0RF34 v-ubiquitin (0RF35) 20 bp 5 lef-11 (0RF37) 39K (0RF36) ou 0RF38 Chevauchement Chevauchement 6 p47 (ORF40) p43 (0RF39) ou lef-12 (ORF41) 7 bp Chevauchement 7 Lef8 (ORF50) pcna (0RF49) 109 bp 14 8 DNAJ domain (ORF51) 0RF52 202 bp 9 0RF53 0RF52 1 bp 10 vp1054 (0RF54) 0RF55 91 bp 11 Lef-9 (0RF62) Fp (ORF61) ou 0RF63 26 bp 60 bp 12 DNA Pol (0RF65) gp37(0RF64) 137 bp 13 lef-3 (0RF67) 0RF68 Chevauchement 14 0RF73 0RF72 8 bp 15 0RF75 0RF74 17 bp 16 ORF81 0RF82 Chevauchement 17 p95 (0RF83) 0RF82 Chevauchement 18 vp39 (0RF89) cg30 (0RF88) 2 bp 19 lef-4 (ORF90) ORF91 0 bp 20 p33 (0RF92) ORF91 37 bp 21 helicase (0RF95) pif-4 (0RF96) Chevauchement 22 vp80 (ORF104) he65 (ORF105) 27 bp 23 ORF106-107 he65 (ORF105) 544 bp 24 odv-ec43 (ORF109) ORF108 ou ORF110 11 bp 35 bp 25 g p64/67 (0RF128) cathepsine (0RF127) ou p24 (0RF129) 224 bp 182 bp 26 0RF132 pp34 (ORF131) 211 bp 27 0RF133 0RF134 50 bp 28 odv-ec27 (0RF144) 0RF145 69 bp 29 0RF146 0RF145 Chevauchement 30 ie1 (0RF147) odv-e56 (0RF148) 61 bp 31 lef-2 (ORF6) ORF5 Chevauchement Le procédé selon l'invention met en oeuvre un mécanisme de recombinaison homologue intermoléculaire. D'une manière générale, le mécanisme de recombinaison homologue consiste en l'échange de séquences nucléotidiques homologues entre le génome 5 de baculovirus déficient pour la réplication et les n vecteurs de transfert. Ces séquences nucléotidiques peuvent être identiques ou substantiellement homologues. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, les vecteurs de transfert comprennent, de part et d'autre de la cassette d'expression du transgène codant un polypeptide d'intérêt, des séquences flanquantes homologues au génome de baculovirus déficient pour la réplication. 10 Le degré d'homologie des séquences flanquantes avec la partie correspondante du génome de baculovirus déficient pour la réplication peut être variable mais doit être suffisant pour 15 permettre la recombinaison intermoléculaire. Aux fins de la présente invention, il est préférable qu'il soit supérieur à 70%, avantageusement supérieur à 80%, de préférence supérieur à 90% et de manière tout à fait préférée aux environs de 100%, de préférence identique. De plus, une courte région d'homologie peut être suffisante pour permettre la 5 recombinaison intermoléculaire, c'est-à-dire au moins 10 nucléotides (ou paires de bases) consécutifs communs entre les séquences flanquantes et leurs séquences homologues dans le génome de baculovirus déficient pour la réplication. Dans le cadre de la présente invention, la longueur des séquences flanquantes peut aller de 10 pb (i.e. 10 paires de bases) à 10 kb (i.e. 10 000 paires de bases), avantageusement de 100 pb à 6 kb, de 10 préférence de 200 pb à 6 kb et, de manière tout à fait préférée de 400 pb à 6 kb. Ainsi, le matériel génétique localisé entre les séquences flanquantes des n vecteurs de transfert remplace le matériel génétique localisé entre les deux séquences homologues aux séquences flanquantes du génome de baculovirus déficient pour la réplication. Cet échange intermoléculaire permet d'obtenir un génome de baculovirus recombinant capable de générer 15 un baculovirus recombinant infectieux dans la cellule d'insecte. Selon l'invention, l'ensemble des séquences nucléotidiques i) (i.e. les séquences nucléotidiques permettant de restaurer la fonction des n gènes essentiels à la réplication virale non-fonctionnels) des n vecteurs de transfert sont capables de restaurer la réplication du génome de baculovirus déficient pour la réplication. En effet, l'échange intermoléculaire 20 permet de restaurer la fonction des n gènes essentiels à la réplication virale non- fonctionnels. En d'autres termes, la restauration de la fonction des n gènes essentiels à la réplication virale non-fonctionnels se fait lorsque la recombinaison homologue se produit correctement. Cela vient du fait que les n vecteurs de transfert comprennent chacun une séquence nucléotidique permettant de restaurer la fonction d'un des n gènes essentiels à la 25 réplication virale non-fonctionnels. Par exemple, lorsque n=2, un génome de baculovirus déficient pour la réplication dans lequel deux gènes essentiels à la réplication virale sont non-fonctionnels recombine avec deux vecteurs de transfert qui comprennent chacun une séquence nucléotidique permettant de restaurer la fonction d'un des deux gènes essentiels à la réplication virale 30 non-fonctionnel. Ce qui veut dire que la recombinaison avec le premier vecteur de transfert permet de restaurer la fonction d'un premier gène essentiel à la réplication virale non-fonctionnel et la recombinaison avec le deuxième vecteur de transfert permet de restaurer la fonction du deuxième gène essentiel à la réplication virale non-fonctionnel. Ainsi, seule la recombinaison des deux vecteurs de transfert avec le génome de baculovirus déficient pour 35 la réplication permet de restaurer la fonction des deux gènes essentiels à la réplication virale 16 non-fonctionnels et donc de restaurer la réplication du génome de baculovirus déficient pour la réplication. Cette restauration de la fonction des deux gènes essentiels permet d'obtenir un génome de baculovirus recombinant capable de générer des baculovirus recombinants infectieux dans la cellule d'insecte. 5 Ainsi, selon le procédé de l'invention, la recombinaison avec les n vecteurs de transfert, ou multirecombinaison, est nécessaire pour restaurer la réplication du génome de baculovirus déficient pour la réplication. De manière surprenante, les inventeurs ont mis en évidence que la multirecombinaison pouvait se faire en une seule étape dans la cellule d'insecte. Ceci est 10 particulièrement avantageux puisque le génome de baculovirus déficient pour la réplication et les n vecteurs de transfert peuvent être introduits en même temps dans la cellule d'insecte, c'est-à-dire que le génome de baculovirus déficient pour la réplication et les n vecteurs de transfert sont introduits simultanément dans la cellule d'insecte, en d'autres termes le génome de baculovirus déficient pour la réplication et les n vecteurs de transfert 15 sont introduits en une seule étape dans la cellule d'insecte. La multirecombinaison en une seule étape permet d'obtenir facilement et rapidement des génomes de baculovirus recombinants homogènes. Le procédé selon l'invention permet de produire un baculovirus recombinant qui comprend n transgènes codant chacun un polypeptide d'intérêt. L'ensemble des n 20 polypeptides d'intérêt peuvent former, par exemple, une protéine comprenant plusieurs sous-unités. L'ensemble des n polypeptides d'intérêt peuvent également être les protéines constitutives d'un complexe protéique, par exemple d'une VLP. L'ensemble des n polypeptides d'intérêt sont produits par une cellule d'insecte infectée par le baculovirus recombinant qui comprend les n transgènes codant chacun un polypeptide d'intérêt. 25 Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, les n polypeptides d'intérêt forment plusieurs protéines d'intérêt distinctes. Il peut s'agir de plusieurs protéines d'intérêt distinctes comprenant une seule chaine polypeptidique, de plusieurs protéines d'intérêt distinctes comprenant plusieurs sous-unités identiques et/ou de plusieurs protéines d'intérêt distinctes comprenant plusieurs sous-unités distinctes. Le nombre de protéines d'intérêt distinctes 30 formées par les n polypeptides d'intérêt sera égal ou inférieur à n. Par exemple, trois polypeptides d'intérêt (n=3) peuvent former (i) une première protéine d'intérêt comprenant une seule chaine polypeptidique et une seconde protéine d'intérêt comprenant deux sous-unités distinctes, (ii) trois protéines d'intérêt distinctes comprenant chacune une seule chaine polypeptidique, (iii) une première protéine d'intérêt comprenant plusieurs sous-unités 17 identiques et une seconde protéine d'intérêt comprenant deux sous-unités distinctes, ou (iv) trois protéines d'intérêt distinctes comprenant chacune plusieurs sous-unités identiques. Dans un autre mode de réalisation particulier, les n polypeptides d'intérêt forment une seule protéine. Dans ce mode de réalisation, la protéine comprend alors n sous-unités 5 distinctes, chacune des sous-unités étant un des n polypeptides d'intérêt. Le procédé selon l'invention est donc particulièrement avantageux pour préparer un baculovirus recombinant qui comprend des transgènes codant une protéine d'intérêt comprenant plusieurs sous-unités distinctes, par exemple une protéine d'intérêt qui n'est active que lorsqu'elle comprend toutes ses sous-unités. Les sous-unités étant généralement 10 liées entre elles par des liaisons non-covalentes (e.g. liaisons hydrophobes) et/ou des liaisons covalentes (e.g. ponts disulfures entre deux cystéines). Le procédé de l'invention est donc particulièrement avantageux pour préparer un baculovirus recombinant qui comprend des transgènes codant une protéine multimérique, par exemple un anticorps ou un fragment d'anticorps. 15 Le nombre de vecteurs de transfert dépendra du nombre souhaité de polypeptides d'intérêt distincts que l'on souhaite produire. Par exemple, deux vecteurs de transfert seront utilisés pour une protéine comprenant deux sous-unités distinctes, trois vecteurs de transfert seront utilisés pour une protéine comprenant trois sous-unités distinctes, etc. Avantageusement, chaque vecteur de transfert comprend un transgène codant un 20 polypeptide d'intérêt différent des transgènes codant les autres polypeptides d'intérêt compris dans les autres vecteurs de transfert. Dans un mode de réalisation particulier, un vecteur de transfert peut comprendre plus d'un transgène, par exemple deux transgènes, codant chacun un polypeptide d'intérêt. Dans ce mode de réalisation particulier, les transgènes peuvent être présents dans un même locus, de préférence au maximum deux 25 transgènes par locus. Avantageusement, n est un nombre entier allant de 2 à 31, par exemple allant de 2 à 10. Par exemple, pour une protéine d'intérêt comprenant plusieurs sous-unités distinctes, la valeur de n correspondra au nombre de sous-unités distinctes de ladite protéine d'intérêt. Dans un mode de réalisation particulier, n=2 et : 30 - les deux transgènes codent chacun une sous-unité d'une protéine comprenant deux sous-unités, avantageusement les deux transgènes codent chacun une sous-unité distincte d'une protéine comprenant deux sous-unités distinctes. Par exemple, le premier transgène code la chaine légère d'un anticorps et le deuxième transgène code la chaine lourde d'un anticorps. La protéine comprenant 18 deux sous unités distinctes peut être un anticorps monospécifique ou une hormone peptidique comprenant deux sous unités distinctes ; ou - les deux transgènes codent chacun un polypeptide d'intérêt distinct. Par exemple, les deux polypeptides d'intérêt distincts constituent un ensemble de deux 5 protéines virales, un complexe multienzymatique, un complexe protéique, par exemple une VLP composée de deux protéines distinctes. Dans un mode de réalisation particulier, n=3 et : - les trois transgènes codent chacun une sous-unité d'une protéine comprenant trois sous-unités, avantageusement les trois transgènes codent chacun une sous- 10 unité distincte d'une protéine comprenant trois sous-unités distinctes. La protéine comprenant trois sous unités distinctes peut être un anticorps bispécifique ou une hormone peptidique comprenant trois sous unités distinctes. Par exemple, le premier transgène code une première chaine légère d'un anticorps bispécifique, le deuxième transgène code une deuxième chaine légère d'un anticorps bispécifique 15 et le troisième transgène une chaine lourde d'un anticorps bispécifique ; ou - les trois transgènes codent chacun un polypeptide d'intérêt distinct. Par exemple, les trois polypeptides d'intérêt constituent un ensemble de trois protéines virales, un complexe multienzymatique, un complexe protéique, par exemple une VLP composée de trois protéines distinctes. 20 Dans un mode de réalisation particulier, n=4 et : - les quatre transgènes codent chacun une sous-unité d'une protéine comprenant quatre sous-unités, avantageusement les quatre transgènes codent chacun une sous-unité distincte d'une protéine comprenant quatre sous-unités distinctes. La protéine comprenant quatre sous unités distinctes peut être une hormone 25 peptidique comprenant quatre sous unités distinctes ; ou - les quatre transgènes codent chacun un polypeptide d'intérêt distinct. Par exemple, les quatre polypeptides d'intérêt constituent un ensemble de quatre protéines virales, un complexe multienzymatique, un complexe protéique, par exemple une VLP composée de quatre protéines distinctes. 30 Avantageusement, le baculovirus recombinant produit par la mise en oeuvre du procédé de l'invention ne comprend pas de séquence d'acides nucléiques qui lui permet de se répliquer au sein d'une cellule bactérienne. Eventuellement, la séquence d'acides nucléiques qui permet de répliquer le génome de baculovirus déficient pour la réplication au sein d'une cellule bactérienne peut être éliminée lors de l'étape de recombinaison homologue 35 dans la cellule d'insecte. 19 L'étape a) est réalisée après introduction dans la cellule d'insecte des vecteurs de transfert et du génome de baculovirus déficient pour la réplication. Cette introduction peut être réalisée avec les techniques largement décrites dans l'art antérieur. On peut citer notamment la technique au phosphate de calcium, la technique au DEAE dextran, 5 l'électroporation, les méthodes basées sur les chocs osmotiques, la microinjection ou les méthodes basées sur l'emploi de liposomes, de préférence la lipofection. Le procédé selon l'invention est particulièrement avantageux car il permet d'introduire les n vecteurs de transfert et le génome de baculovirus déficient pour la réplication en une seule étape dans la cellule d'insecte. Les quantités de génome de baculovirus déficient pour la réplication et de 10 vecteurs de transfert introduits dans la cellule d'insecte peuvent varier. On préfère employer une quantité 5 fois plus importante de chacun des n vecteurs de transfert par rapport à la quantité de génome de baculovirus déficient pour la réplication. Le génome de baculovirus déficient pour la réplication est avantageusement introduit dans la cellule d'insecte sous forme circulaire, c'est-à-dire sans avoir été linéarisé au préalable. La linéarisation est inutile 15 puisque le génome de baculovirus est déficient pour la réplication, même sous forme circulaire puisqu'il comprend des gènes essentiels à la réplication virale non-fonctionnels. L'absence d'étape de linéarisation est un des avantages majeurs du procédé de l'invention. Comme détaillé plus haut, l'enzyme de maturation des protéines peut être choisie parmi une peptidase signal, une furine, une proprotéine convertase, une glycosyltransférase, 20 une glycosidase, une protéine chaperone, une disulfide isomérase, une acyltransférase, une méthyltransférase, une hydroxylase, une transglutaminase, une farnésyltransférase, une géranylgéranyl-transférase, une N-myristoyltransférase, une palmityltransférase, une protéine kinase, une phosphatase, une transpeptidase, une carboxylase ou une ubiquitine ligase. 25 Le choix de la ou des enzyme(s) de maturation des protéines dépendra des polypeptides d'intérêt, notamment du type de maturation que devront subir les polypeptides d'intérêt. Par exemple, lorsque les polypeptides d'intérêt forment les sous-unités d'une protéine d'intérêt glycosylée, par exemple un anticorps, la ou les enzyme(s) de maturation peuvent être une ou plusieurs glycosyltransférase(s) permettant d'obtenir la glycosylation souhaitée. L'homme 30 du métier pourra aisément sélectionner la ou les glycosyltransférase(s) appropriée(s) en fonction de la glycosylation souhaitée. Par exemple, la ou les glycosyltransférase(s) peut/peuvent être choisie(s) parmi les N-acétylglucosaminyltransférase I, II, II, IV, V; VB, VI, IX, une galactosyltransférase (e.g. une béta-1,4-galactosyltransférase, par exemple choisie parmi la béta-1,4-galactosyltransférase 1, 2, 3, 4, 5, 6 et 7), la CMP-NeuAc synthase, 35 la NeuAc synthase, une sialyltransférase (e.g. 1'122,3 sialyltransférase ou 1'122,6 20 sialyltransférase), les protéine-O-mannosyltransférases 1 et 2, les protéine-0- fucosyltransférases 1 et 2, la protéine-O-glucosyltransférase 1, la protéine-O-GIcNAc transférase, la GaINAc transférase, les fucosyltransférases 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 et 11 (FUT1 à FUT11). 5 Dans un mode de réalisation particulier, la glycosyltransférase est une ou plusieurs glycosyltransférase(s) choisie(s) parmi la N-acétylglucosaminyltransférase II, une béta-1,4- galactosyltransférase et une sialyltransférase. 10 Etape a1 Dans un mode de réalisation particulier, le génome de baculovirus déficient pour la réplication de l'étape a1) est préparé, dans une cellule bactérienne, par recombinaison homologue entre : i) un génome de baculovirus déficient pour la réplication dans lequel n gènes 15 essentiels à la réplication virale sont non-fonctionnels, et ii) une ou plusieurs séquence(s) nucléotidique(s) comprenant chacune un ou plusieurs transgène(s) codant chacun une enzyme de maturation des protéines. Ainsi, dans ce mode de réalisation particulier, le procédé de l'invention comprend les étapes de : 20 a') Préparer, dans une cellule bactérienne, un premier génome de baculovirus déficient pour la réplication dans lequel n gènes essentiels à la réplication virale sont non-fonctionnels et qui comprend un ou plusieurs transgène(s) codant chacun une enzyme de maturation des protéines, par recombinaison homologue entre : a'1) un génome de baculovirus déficient pour la réplication dans lequel n gènes 25 essentiels à la réplication virale sont non-fonctionnels, et a'2) une ou plusieurs séquence(s) nucléotidique(s) comprenant chacune un ou plusieurs transgène(s) codant chacun une enzyme de maturation des protéines ; a) Préparer, dans une cellule d'insecte, un deuxième génome de baculovirus capable de se répliquer qui comprend un ou plusieurs transgène(s) codant chacun une 30 enzyme de maturation des protéines et n transgènes codant chacun un polypeptide d'intérêt (génome de baculovirus recombinant), par recombinaison homologue entre : a1) le premier génome de baculovirus déficient pour la réplication obtenu à l'étape a), et 21 a2) n vecteurs de transfert comprenant chacun: I) une séquence nucléotidique permettant de restaurer la fonction d'un des n gènes essentiels à la réplication virale non-fonctionnel, ii) un des n transgènes codant un polypeptide d'intérêt, 5 l'ensemble des séquences nucléotidiques i) des n vecteurs de transfert étant capables de restaurer la réplication du premier génome de baculovirus déficient pour la réplication, n étant un nombre entier au moins égal à 2 ; et b) Générer un baculovirus recombinant dans une cellule d'insecte qui comprend 10 le génome de baculovirus recombinant obtenu à l'étape b). Dans ce mode de réalisation, une première recombinaison se fait dans une cellule bactérienne entre (a'1) un génome de baculovirus déficient pour la réplication dans lequel n gènes essentiels à la réplication virale sont non-fonctionnels et (a'2) une ou plusieurs séquence(s) nucléotidique(s) comprenant chacune un ou plusieurs transgène(s) codant 15 chacun une enzyme de maturation des protéines. De préférence, le ou les transgène(s) codant une enzyme de maturation des protéines recombinent chacun au niveau d'un gène non-essentiel à la réplication virale, de préférence au niveau d'un gène non-essentiel à la réplication virale non-adjacent à un gène essentiel à la réplication virale non fonctionnel. Le gène non-essentiel à la réplication virale 20 est avantageusement sélectionné parmi ptp (ORF1), cbc (ORF3), ORF4, ORF7, odv-e26 (ORF16), ORF17, ORF18, ORF19, ARIF-1 ORF20-21, pif2 (0RF22), protéine F (0RF23), iap1 (0RF27), lef6 (0RF28), 0RF29, ORF30, sod (ORF31), fgf (0RF32), gta (0RF42), 0RF43, 0RF44, 0RF45, odv-e66 (0RF46), 0RF47, 0RF56, 0RF57, chaB-like (0RF58/59), chaB-like (ORF60), mtase (0RF69), hcf-1 (ORF70), iap2 (ORF71), 0RF86, 0RF87, ORF111, ORF114, 25 pif3 (ORF115), ORF116, ORF117, pif1 (ORF119), ORF120, ORF121, 0RF122, pk2 (0RF123), 0RF124, lef7 (0RF125), chitinase (0RF126), gp16 (ORF130), p35 (0RF135), p26 (0RF136), p10 (0RF137), p74 (0RF138), 0RF149, ORF150, ie2 (ORF151), pe38 (0RF153) et 0RF154. Dans ce mode de réalisation particulier, la cellule bactérienne est une bactérie qui supporte la réplication des génomes de baculovirus contenant une origine de réplication 30 mini-F. La cellule bactérienne est de préférence E. coli, notamment DH1OB ou EL350. 22 Etape b) L'étape b) consiste à générer un baculovirus recombinant dans une cellule d'insecte qui comprend le génome de baculovirus recombinant obtenu à l'étape a). Par exemple, il peut s'agir de la cellule d'insecte de l'étape a). 5 Avantageusement, la cellule d'insecte est cultivée dans des conditions adaptées pour qu'elle exprime le baculovirus recombinant, notamment dans un milieu de culture adapté à la croissance des cellules. Le milieu de culture peut contenir un sérum d'origine animale ou peut être un milieu de culture sans sérum. Avantageusement, la cellule d'insecte est sélectionnée parmi Sf9, Sf21, Tn5-b14, les 10 lignées cellulaires de lépidoptères sensibles au baculovirus AcMNPV, les lignées Sf21, la lignée « High Five », de préférence il s'agit de Sf9. Le baculovirus recombinant ainsi généré peut être utilisé pour infecter d'autres cellules d'insectes. Ces cellules d'insecte infectées par le baculovirus recombinant peuvent alors produire chacun des transgènes. Cette production de chacun des transgènes permet 15 donc d'obtenir les n polypeptides d'intérêt ayant été maturés par la ou les enzyme(s) de maturation des protéines. Dans un mode de réalisation particulier, le baculovirus recombinant peut être utilisé pour infecter des cellules eucaryotes. Il a en effet été montré que les baculovirus pouvaient infecter des cellules eucaryotes. 20 Le procédé selon l'invention permet donc de produire facilement et rapidement un baculovirus recombinant dont le génome comprend un ou plusieurs transgène(s) codant chacun une enzyme de maturation des protéines et n transgènes distincts codant chacun un polypeptide d'intérêt distinct. 25 Baculovirus recombinant La présente invention vise également à protéger un baculovirus recombinant ou génome de baculovirus recombinant comprenant : a) n séquences nucléotidiques de formule (I) : [transgène codant un polypeptide d'intérêt]-[séquence nucléotidique intercalaire]- 30 [gène essentiel à la réplication virale fonctionnel] (I), ladite séquence d'acides nucléiques intercalaire est constituée de 0 à 600 pb, ledit gène essentiel à la réplication virale fonctionnel est sélectionné parmi 1629 (ORF9), Pk1 (ORF10), lef-1 (ORF14), 0RF34, lef-11 (0RF37), p47 (ORF40), lef8 (ORF50), DNAJ domain (ORF51), 0RF53, vp1054 (0RF54), Lef-9 (0RF62), DNA Pol (0RF65), lef-3 35 (0RF67), 0RF73, 0RF75, ORF81, p95 (0RF83), vp39 (0RF89), lef-4 (ORF90), p33 (0RF92), 23 helicase (0RF95), Vp80 (ORF104), ORF106-107, odv-ec43 (ORF109), gp64/67 (0RF128), 0RF132, 0RF133, odv-ec27 (0RF144), 0RF146, lei (ORF147), lef-2 (ORF6); n étant un nombre entier au moins égal à 2 ; et b) un ou plusieurs transgène(s) codant chacun une enzyme de maturation des 5 protéines. Avantageusement, le baculovirus recombinant ou le génome de baculovirus recombinant selon l'invention ne comprend pas de séquence d'acides nucléiques qui lui permet de se répliquer au sein d'une cellule bactérienne. Il a en effet été démontré que l'absence d'une telle séquence permettait d'augmenter la stabilité du baculovirus 10 recombinant, comparé à un baculovirus recombinant comportant une telle séquence (Piljmann et al (2003) Journal of General Virology. Avantageusement, le baculovirus recombinant ou génome de baculovirus recombinant selon l'invention ne comprend pas n gènes non-essentiels à la réplication virale choisis parmi Ph (ORF 8), ORF11, ORF13, egt (ORF15), v-ubiquitin (0RF35), 39K (0RF36), 15 0RF38, p43 (0RF39), lef-12 (ORF41), pcna (0RF49), 0RF52, 0RF55, Fp (ORF61), 0RF63, gp37(0RF64), 0RF68, 0RF72, 0RF74, 0RF82, cg30 (0RF88), ORF91, pif-4 (0RF96), he65 (ORF105), 0RF108, 0RF110, Cathepsine (ORF127), p24 (ORF129), pp34 (ORFi3i), ORF134, ORFi45, odv-e56 (ORF148), ORF5. Avantageusement, un des n gènes non-essentiels à la réplication virale non compris dans le baculovirus recombinant ou génome de baculovirus 20 recombinant est le gène codant la cathepsine car il a été montré que la cathepsine peut avoir un effet délétère sur les polypeptides d'intérêt produits. Selon l'invention, n est un nombre entier au moins égal à 2, par exemple un nombre entier allant de 2 à 30, par exemple allant de 2 à 10, comme détaillé dans la partie « Procédé de préparation du baculovirus recombinant » ci-dessus. 25 La présente invention vise également à protéger un baculovirus recombinant ou un génome de baculovirus recombinant, susceptible d'être obtenu par le procédé de production selon l'invention, comprenant : a) n séquences nucléotidiques de formule (I) : [transgène codant un polypeptide d'intérêt]-[séquence nucléotidique intercalaire]- 30 [gène essentiel à la réplication virale fonctionnel] (I), ladite séquence d'acides nucléiques intercalaire est constituée de 0 à 600 pb, ledit gène essentiel à la réplication virale fonctionnel est sélectionné parmi 1629 (ORF9), Pk1 (ORF10), lef-1 (ORF14), 0RF34, lef-11 (0RF37), p47 (ORF40), lef8 (ORF50), DNAJ domain (ORF51), 0RF53, vp1054 (0RF54), Lef-9 (0RF62), DNA Pol (0RF65), lef-3 35 (0RF67), 0RF73, 0RF75, ORF81, p95 (0RF83), vp39 (0RF89), lef-4 (ORF90), p33 (0RF92), 24 helicase (0RF95), Vp80 (ORF104), ORF106-107, odv-ec43 (ORF109), gp64/67 (0RF128), 0RF132, 0RF133, odv-ec27 (0RF144), 0RF146, lei (ORF147), lef-2 (ORF6); n étant un nombre entier au moins égal à 2 ; et b) un ou plusieurs transgène(s) codant chacun une enzyme de maturation des 5 protéines. Avantageusement, les n séquences nucléotidiques de formule (I) sont réparties sur tout le génome du baculovirus recombinant, ce qui permet d'en améliorer la stabilité. Les n séquences nucléotidiques de formule (I) sont donc suffisamment espacées sur le génome du baculovirus. Avantageusement, chacune des n séquences nucléotidiques de formule (I) est 10 espacée d'au moins 500 nucléotides par rapport à une autre des n séquences nucléotidiques de formule (I). L'obtention d'un baculovirus recombinant ou d'un génome de baculovirus recombinant avec n séquences nucléotidiques de formule (I) réparties sur tout le génome ne présente aucune difficulté particulière pour l'homme du métier puisque la répartition sur le génome sera liée aux couples « gène essentiel/gène non essentiel » qui seront choisis. 15 Avantageusement, et cela est inhérent à la mise en oeuvre du procédé de préparation selon l'invention, les n séquences nucléotidiques de formule (I) ne sont pas dupliquées sur le génome du baculovirus recombinant. Il a en effet été démontré une diminution de la stabilité du baculovirus recombinant lorsque les séquences sont dupliquées sur le génome (données non-présentées). 20 Jeu d'éléments de recombinaison homologue La présente invention vise également à protéger un jeu d'éléments de recombinaison homologue comprenant : a) un génome de baculovirus déficient pour la réplication dans lequel n gènes 25 essentiels à la réplication virale sont non-fonctionnels et qui comprend un ou plusieurs transgène(s) codant chacun une enzyme de maturation des protéines ; b) n vecteurs de transfert comprenant chacun: I) une séquence d'acides nucléiques permettant de restaurer la fonction d'un des n gènes essentiels à la réplication virale non-fonctionnel, 30 ii) un transgène codant un polypeptide d'intérêt, n étant un nombre entier au moins égal à 2. Avantageusement, les gènes essentiels à la réplication virale non-fonctionnels sont chacun adjacents à un gène non-essentiel à la réplication virale, comme décrit dans la partie « Procédé de préparation du baculovirus recombinant » ci-dessus. 25 Dans un mode de réalisation particulier, les vecteurs de transfert comprennent, de part et d'autre de la cassette d'expression du transgène, des séquences flanquantes homologues au génome de baculovirus déficient pour la réplication. Avantageusement, les séquences flanquantes de chacun des vecteurs de transfert sont homologues à tout ou partie 5 dudit gène essentiel à la réplication virale non-fonctionnel et à tout ou partie dudit gène non- essentiel à la réplication virale. Avantageusement, les séquences flanquantes ont une longueur qui peut aller de 10 pb (i.e. 10 paires de bases) à 10 kb (i.e. 10 000 paires de bases), avantageusement allant de 100 pb à 6 kb, de préférence allant de 200 pb à 6 kb et, de manière tout à fait préférée allant de 400 pb à 6 kb. Les séquences flanquantes sont 10 décrites en détail dans la partie « Procédé de préparation du baculovirus recombinant » ci- dessus. Avantageusement, n est un nombre entier allant de 2 à 31, par exemple allant de 2 à 10, comme détaillé dans la partie « Procédé de préparation du baculovirus recombinant » ci-dessus. 15 Cellule La présente invention vise également à protéger une cellule comprenant un baculovirus recombinant ou un génome de baculovirus recombinant selon l'invention, ou une cellule comprenant un jeu d'éléments de recombinaison homologue selon l'invention. 20 Dans un mode de réalisation particulier, la cellule est une cellule d'insecte, de préférence sélectionnée parmi Sf9, Sf21, Tn5-b14, les lignées cellulaires de lépidoptères sensibles au baculovirus AcMNPV, les lignées Sf21, de préférence Sf9, comme décrit plus en détail dans la partie « Procédé de préparation du baculovirus recombinant » ci-dessus. 25 Utilisation La présente invention vise également l'utilisation d'un baculovirus recombinant ou d'un génome de baculovirus recombinant selon l'invention ou d'une cellule selon l'invention pour la production de n transgènes codant chacun un polypeptide d'intérêt. La production polypeptide recombinant d'intérêt à partir d'un baculovirus est bien 30 décrite dans l'art antérieur et peut facilement être mise en oeuvre par des techniques bien connues de l'homme de l'art. 26 Baculovirus « mono-recombinant » Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de l'invention peut être utilisé pour produire un baculovirus « mono-recombinant », c'est-à-dire un baculovirus comprenant un seul transgène codant un polypeptide d'intérêt. 5 Dans ce mode de réalisation particulier, le procédé pour produire un baculovirus recombinant dont le génome comprend un ou plusieurs transgène(s) codant chacun une enzyme de maturation des protéines et un transgène codant un polypeptide d'intérêt, comprend les étapes de : a) Préparer, dans une cellule d'insecte, un génome de baculovirus recombinant 10 capable de se répliquer qui comprend un ou plusieurs transgène(s) codant chacun une enzyme de maturation des protéines et un transgène codant un polypeptide d'intérêt, par recombinaison homologue entre : al) un génome de baculovirus déficient pour la réplication dans lequel n gènes essentiels à la réplication virale sont non-fonctionnels et qui 15 comprend un ou plusieurs transgène(s) codant chacun une enzyme de maturation des protéines, et a2) n vecteurs de transfert comprenant chacun une séquence nucléotidique (i) permettant de restaurer la fonction d'un des n gènes essentiels à la réplication virale non-fonctionnel, 20 un des n vecteurs comprenant le transgène codant le polypeptide d'intérêt, l'ensemble des séquences nucléotidiques (i) des n vecteurs de transfert étant capables de restaurer la réplication du génome de baculovirus déficient pour la réplication, 25 n étant un nombre entier au moins égal à 2; et b) Générer un baculovirus recombinant dans une cellule d'insecte qui comprend le génome de baculovirus recombinant obtenu à l'étape a). 27 FIGURES La Figure 1 est un schéma qui illustre les étapes de préparation du BacMid1. Légende: ORF : open reading frame 5 Polyédrine ou PH: gène baculovirus codant la polyédrine : gène non essentiel à la réplication virale. 0RF603 : gène baculovirus codant la protéine 603, gène non essentiel. 0RF1629 : gène baculovirus codant la protéine 1629: gène essentiel à la réplication virale pVT : plasmide vecteur de transfert. 10 Mini-F : origine de réplication bactérienne. KanR : cassette d'expression bactérienne exprimant le gène de résistance à la kanamycine. AmpR : cassette d'expression bactérienne exprimant le gène de résistance à l'ampicilline. Fragment de recombinaison : fragment d'ADN contenant la cassette d'expression à intégrer dans l'ADN cible. Ce fragment présente des régions flanquantes de part et d'autre de la 15 cassette d'expression pour pouvoir cibler spécifiquement la région qui subira la recombinaison homologue via la Red recombinase. La Figure 2 est un schéma qui illustre l'étape de délétion partielle du gène codant l'ADN polymérase virale, le gène dna pol pour la préparation du BacMid2. 20 Légende : gp37 : gène baculovirus codant la glycoprotéine gp37, gène non essentiel à la réplication virale. gp37 A252 aa : gène gp37 délété de la région codant les 252 acides aminés N-terminaux. DNAPol : gène baculovirus codant l'ADN polymérase virale, gène essentiel à la réplication 25 virale. DNAPol .4466 aa : gène dna pol délété de la région codant les 466 acides aminés C-terminaux. HygroR : cassette d'expression bactérienne exprimant le gène de résistance à l'hygromycine. Fragment de recombinaison : fragment d'ADN contenant la cassette d'expression à intégrer 30 dans l'ADN cible. Ce fragment présente des régions flanquantes de part et d'autre de la cassette d'expression pour pouvoir cibler spécifiquement la région qui subira la recombinaison homologue via la Red recombinase. La Figure 3 est un schéma qui illustre l'étape de délétion partielle du gène codant la gp64 35 pour la préparation du BacMid3. 28 Légende : Chit : gène baculovirus codant la chitinase, gène non essentiel à la réplication virale. Cath : gène baculovirus codant la cathepsine virale, gène non essentiel à la réplication virale. gp64 : gène baculovirus codant la glycoprotéine gp64 virale, gène essentiel à la réplication 5 virale. gp64.A188 aa : gène gp64 délété de la région codant les 188 acides aminés C-terminaux. ZeoR : cassette d'expression bactérienne exprimant le gène de résistance à la zéocine. Fragment de recombinaison : fragment d'ADN contenant la cassette d'expression à intégrer dans l'ADN cible. Ce fragment présente des régions flanquantes de part et d'autre de la 10 cassette d'expression pour pouvoir cibler spécifiquement la région qui subira la recombinaison homologue via la Red recombinase. La Figure 4 est un schéma qui illustre le vecteur de transfert pVT/gp37 et son utilisation avec le BacMid2 pour la génération d'un génome de baculovirus recombinant comprenant un 15 transgène X. Légende: pVT : plasmide vecteur de transfert. gp37 : gène baculovirus codant la glycoprotéine gp37, gène non essentiel à la réplication virale. 20 DNAPol : gène baculovirus codant l'ADN polymérase virale, gène essentiel à la réplication virale. DNAPol .4466 aa : gène dna pol délété de la région codant les 466 acides aminés C-terminaux. Gène exogène : transgène d'intérêt. 25 P : promoteur viral ou cellulaire qui contrôle l'expression du transgène. HygroR : cassette d'expression bactérienne exprimant le gène de résistance à la hygromycine. La Figure 5 est un schéma qui illustre la construction et l'utilisation du vecteur de transfert 30 PH pVT/PH avec le BacMid2 et pour la génération d'un génome de baculovirus recombinant comprenant un transgène X. Légende: pVT/PH : plasmide vecteur de transfert polyédrine. PH : tout ou partie du gène baculovirus codant la polyédrine, gène non essentiel à la 35 réplication virale. 29 0RF603: gène baculovirus codant la protéine 603, gène non essentiel. 0RF1629 : gène baculovirus codant la protéine 1629, gène essentiel à la réplication virale. Gène exogène : transgène d'intérêt. P : promoteur viral ou cellulaire qui contrôle l'expression du transgène. 5 KanR : cassette d'expression bactérienne exprimant le gène de résistance à la kanamycine. Mini-F : origine de réplication bactérienne. La Figure 6 est un schéma qui illustre la construction et l'utilisation du vecteur de transfert pVT/gp37Cy. avec le BacMid2 pour la génération d'un génome baculovirus recombinant 10 comprenant la chaine lourde d'un anticorps. Légende : pVT : plasmide vecteur de transfert. pVT/gp37-Cy1: plasmide vecteur de transfert spécifique de la chaine lourde d'une immunoglobuline. 15 Cy1 : ADNc codant le domaine constant y1 d'une immunoglobuline humaine. VH : ADNc codant le domaine variable de la chaine lourde d'une immunoglobuline. DNAPol : gène baculovirus codant l'ADN polymérase virale, gène essentiel à la réplication virale. DNAPolA466 aa : gène DNAPol délété de la région codant les 466 acides aminés C- 20 terminaux. P : promoteur viral ou cellulaire qui contrôle l'expression du transgène. HygroR : cassette d'expression bactérienne exprimant le gène de résistance à la hygromycine. PS : ADNc codant une séquence signal (sécrétion de la chaîne lourde). 25 La Figure 7 est un schéma qui illustre la construction et l'utilisation du vecteur de transfert pVT/PHCK avec le BacMid2 pour la génération d'un génome de baculovirus recombinant comprenant la chaine légère d'un anticorps. Légende : 30 0RF603 : gène baculovirus codant la protéine 603. 0RF1629 : gène baculovirus codant la protéine 1629: gène essentiel à la réplication virale. Mini-F : origine de réplication bactérienne. pVT : plasmide vecteur de transfert. pVT/PH-CK : plasmide vecteur de transfert spécifique de la chaine légère d'une 35 immunoglobuline. 30 Ci(: ADNc codant le domaine constant kappa d'une immunoglobuline humaine. VL : ADNc codant le domaine variable de la chaine légère d'une immunoglobuline. P : promoteur viral ou cellulaire qui contrôle l'expression du transgène. KanR : cassette d'expression bactérienne exprimant le gène de résistance à la kanamycine. 5 PS : ADNc codant une séquence signal (sécrétion de la chaîne légère). La Figure 8 est un schéma qui illustre la construction du vecteur pVT/Chit-Cath et son utilisation avec le BacMid3 et la génération d'un génome de baculovirus recombinant comprenant un transgène. 10 Légende : pVT Chit/Cath : plasmide vecteur de transfert capable de recombiner au niveau de la région comprenant les 2 gènes non essentiels, ChiA codant la chitinase et Cath codant la cathepsi ne. gp64A188 aa : gène gp64, gène essentiel, délété de la région codant les 188 acides aminés 15 C-terminaux. Gène exogène : transgène d'intérêt. P : promoteur viral ou cellulaire qui contrôle l'expression du transgène. ZeoR : cassette d'expression bactérienne exprimant le gène de résistance à la zéocine. 20 La Figure 9 est A) l'analyse par Southern blot du génome de 3 baculovirus recombinants indépendants purifiés, générés au cours de la même transfection, et B) l'analyse de l'anticorps recombinant après purification sur Protéine A Sepharose (GE Healthcare). Légende : A: analyse de l'organisation des génomes de 3 baculovirus recombinants indépendants 25 exprimant l'anticorps 1313811. Ces baculovirus ont été isolés à partir d'une seule expérience de transfection. Les hybridations réalisées respectivement avec une sonde spécifique de la région constante de la chaîne légère kappa : sonde Ci( et une sonde spécifique de la région constante de la chaine lourde gamma 1: sonde Cy1 démontrent une organisation correcte et identique des 3 virus recombinants. 30 B. Analyse par électrophorèse en gel de polyacrylamide (SDS, 2-mercaptoéthanol) et coloration argentique de l'anticorps recombinant purifié. L'anticorps sécrété dans le milieu de culture des cellules infectées par le baculovirus recombinant a été purifié sur colonne de Protéine A Sepharose. 31 PC1 : Plasmide contrôle, plasmide contenant le gène de la chaine légère kappa, PC2 : Plasmide contrôle, plasmide contenant le gène de la chaine lourde 71, R1-3, baculovirus recombinant 1, 2 et 3, MW : marqueur de taille. 5 La Figure 10 est l'analyse en Southern blot du génome d'un virus triple recombinant exprimant les protéines M, HA et NA du virus de la grippe. Légende : M : gène du virus de la grippe codant la protéine de Matrice. HA : gène du virus de la grippe codant l'hémagglutinine. 10 NA: gène du virus de la grippe codant la neuraminidase. bp : taille des fragments d'ADN exprimée en paire de base. La Figure 11 est un schéma qui illustre en A la structure de l'anticorps bispécifique en B l'analyse par électrophorèse en gel de polyacrylamide de l'anticorps bispécifique purifié sur 15 colonne de protéine A Sepha rose. Légende : A: Représentation schématique de la structure de l'anticorps bispécifique. L1 : chaine légère de l'anticorps 1 ; L2, chaine légère de l'anticorps 2. B: Anticorps bispécifique purifié, analysé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Les 20 protéines ont été révélées par coloration argentique. (1) électrophorèse en conditions réductrices (SDS, 2-mercaptoéthanol). (2) électrophorèse en conditions non réductrices. H : chaine lourde de l'anticorps, L: chaîne légère de l'anticorps, H2L4 : composition de l'anticorps bispécifique : 2 chaînes lourdes fusionnées reliées par 4 ponts disulfures au niveau de 2 régions charnières + 4 chaines légères (2 chaines L1 + 2 chaines L2) appariées 25 de manière spécifique aux régions VH1-CH1 et VH2-CH1 correspondantes. La Figure 12 est une représentation des structures glycanniques liées aux glycoprotéines synthétisées par (A) des cellules humaines (B) des cellules de lépidoptères. 30 La Figure 13 est représentation d'une immunoglobuline (IgG) humaine. Le résidu aspargine 297, (Asn297) lié à un Abglycanne est représenté par un losange. La nature de cette Ab glycosylation, comme la présence de galactose et d'acide sialique, peut être un élément important de la structure de l'anticorps puisqu'elle permet une modulation de certaines activités effectrices, par exemple l'ADCC et la CDC. 35 32 La Figure 14 est une représentation des différentes étapes nécessaires à la construction d'un BacMid « Glyco » c'est-à-dire un BacMid2 dont le génome comprend un transgène codant chacun une enzyme de biosynthèse des glycannes - ou d'une manière plus générale d'un BacMid2 dont le génome comprend un ou plusieurs transgène(s) codant chacun une 5 enzyme de maturation des protéines. La figure 14 exemplifie spécifiquement l'intégration d'un transgène codant la GNT-II dans le locus non essentiel 39K du BacMid2. Deux cassettes d'expression ont été successivement insérées dans le locus non essentiel 39k préalablement cloné dans un plasmide pUC (i) une cassette d'expression virale, composée 10 d'un promoteur précoce viral ou cellulaire (voir le Tableau 1) et du gène codant la GNT-II et (ii) une cassette d'expression bactérienne contrôlant le gène de la résistance à la zéocine (ZeoR). Un « fragment de recombinaison » contenant les 2 cassettes a été généré par digestion du plasmide ci-dessus par 2 endonucléases de restriction. Ce dernier a été introduit dans la bactérie EL350/BacMid2 par électroporation. Une recombinaison homologue s'est 15 produite via la Red Recombinase entre les régions flanquantes du fragment de recombinaison et l'ADN du BacMid2 permettant l'intégration des 2 cassettes d'expression. Les bactéries recombinantes ainsi obtenues ont été sélectionnées avec de la zéocine puis le gène codant la résistance à cet antibiotique a été éliminé de l'ADN du bacmid par simple digestion/réparation/religation. Le bacmid obtenu appelé BacMid2-GNTII, a été réintroduit 20 par électroporation dans une bactérie EL350 (EL350/BacMid2-GNT-II). La Figure 15 est une représentation du principe de l'utilisation du BacMid2-Gal (BacGal) pour la génération de génomes de baculovirus double- ou mono-recombinants. A. Génération d'un génome de baculovirus double-recombinant. 25 Les 2 transgènes d'intérêt sont clonés dans leur vecteur de transfert respectif, le pVT/PH ciblant le couple GNE/GE PH/1629 et le pVT/gp37 ciblant le couple GNE/GE gp37/DNAP0l. Les cellules Sf9 sont transfectées avec les 2 pVT et de l'ADN du BacMid2-Gal. Au cours de la recombinaison homologue, les 2 transgènes d'intérêt sont intégrés dans le génome du BacMid2-Gal tandis que simultanément, les gènes non fonctionnels 1629 et dnapol portés 30 par le BacMid2-Gal sont remplacés par une copie fonctionnelle. Ces évènements auront pour conséquence l'élimination de l'origine de réplication bactérienne et la génération d'un génome de baculovirus recombinant infectieux. Des baculovirus recombinants sont alors produits et sécrétés dans le milieu de culture, puis clonés par la méthode des plages de lyse. B. Génération d'un génome de baculovirus mono-recombinant. 33 Le gène d'intérêt est cloné dans le vecteur de transfert pVT/gp37. Les cellules Sf9 sont transfectées avec le pVT/gp37 comprenant un transgène, le pVT/PH ne contenant pas de transgène et de l'ADN du BacMid2-Gal. Au cours de la recombinaison homologue, il y a réparation du bacmid dans les 2 locus et donc génération de baculovirus infectieux. 5 Légende : GE : Gène essentiel GNE : Gène non essentiel pVT/PH : Vecteur de transfert qui cible le couple GNE/GE PH/1629 pVT/gp37 : vecteur de transfert qui cible le couple GNE/GE gp37/DNAP0l 10 DNA PoINF : Gène codant la DNA polymérase virale non fonctionnelle DNA PolF : Gène codant la DNA polymérase virale fonctionnelle 1629NF : Gène codant la protéine 1629 non fonctionnelle 1629F : Gène codant la protéine 1629 fonctionnelle 131,4 GaIT : 131,4 galactosyltransférase 15 GNT-II : Nacétylglucosaminyltransférase II KanR : gène de résistance à la kanamycine mini-F : Origine de réplication bactérienne PH : gène polyédrine 20 La Figure 16 est une représentation du principe de la préparation d'un génome de baculovirus double-recombinant exprimant un anticorps galactosylé. Les cellules Sf9 sont transfectées avec les pVT/H (voir Figure 6), pVT/L (voir Figure 7) et de l'ADN du BacMid2- Gal. Au cours de la recombinaison homologue, les transgènes codant les chaînes lourdes et légères sont intégrés dans le génome du BacMid2-Gal tandis que simultanément, les gènes 25 non fonctionnels 1629 et dnapol portés par le BacMid2-Gal sont remplacés par une copie fonctionnelle, rendant le génome de baculovirus infectieux. Des baculovirus recombinants sont alors produits, sécrétés dans le milieu de culture puis clonés par la méthode des plages de lyse. Légende : 30 GE : Gène essentiel GNE : Gène non essentiel pVT/PH : Vecteur de transfert qui cible le couple GNE/GE PH/1629 pVT/gp37 : vecteur de transfert qui cible le couple GNE/GE gp37/DNAP0l DNA PoINF : Gène codant la DNA polymérase virale non fonctionnelle 35 DNA PolF : Gène codant la DNA polymérase virale fonctionnelle 34 1629NF : Gène codant la protéine 1629 non fonctionnelle 1629F : Gène codant la protéine 1629 fonctionnelle 131,4 GaIT : 131,4 galactosyltransférase GNT-II : Nacétylglucosaminyltransférase II 5 KanR : gène de résistance à la kanamycine mini-F : Origine de réplication bactérienne PH : gène polyédrine La Figure 17 représente une analyse par western blot et lectine blot des anticorps produits 10 par une cellule Sf9 infectée par un baculovirus recombinant généré à partir du BacMid2 ou du BacMid2-Gal. Ces anticorps humains (les anticorps recombinants 13B8II et 14C12 présentent un domaine constant humain) ou murins ne présentant pas de glycosylation dans leur paratope, les analyses révèlent donc la nature de la N-glycosylation qui est portée par leur domaine constant. 15 Légende: A et B: Puits 1: BSA (67 kDa), Puits 2: Fétuine (61-68 kDa), Puits 3: Anticorps recombinant 13B8II/BacGal, Puits 4: Anticorps recombinant 13B8II/BacMan, Puits 5 : Anticorps 14C12/BacGal. MW : Marqueur de masse moléculaire (Marqueur précoloré, Biolabs référence P7706). 20 A. Western blot. La membrane a été incubée avec un anticorps de mouton anti-IgG humaine entière conjugué à la peroxydase (référence NA933V, GE Heathcare). B. Lectine blot. La membrane a été incubée en présence de RCA120 conjuguée à la biotine. La présence de la lectine a été révélée comme décrit dans l'Exemple 13. C et D : Puits 1: Anticorps recombinant murin/BacGal, Puits 2 Anticorps recombinant 25 murin/BacMan. MW : Marqueur de masse moléculaire (Marqueur précoloré, Biolabs référence P7706). C. Western blot. La membrane a été incubée avec un anticorps de mouton anti-IgG murine entière conjugué à la peroxydase (référence NA931V, GE Heathcare). D. Lectine blot. La membrane a été incubée en présence de RCA120 conjuguée à la biotine. 30 La présence de la lectine a été révélée comme décrit dans l'Exemple 13. La Figure 18 est un schéma qui décrit l'utilisation des BacMid2-Sia pour la préparation de génomes de baculovirus multi-recombinants. Les transgènes sont clonés dans leurs vecteurs de transfert respectifs. Dans la figure, les transgènes 1 et 2 sont clonés respectivement dans 35 le pVT/PH ciblant le couple GNE/GE PH/1629 et dans le pVT/gp37 ciblant le couple GNE/GE 35 gp37/DNAP0l. Le génome du BacMid-Sia est équipé de tous les gènes nécessaires à la sialylation en a2,3 [a2,3 sialyltransférase] (BacMid2-Sia3 ou BacSia3) ou en a2,6 [a2,6 sialyltransférase] (BacMid2-Sia6 ou BacSia6) ou en a2,3 + a2,6 [a2,3 sialyltransférase + a2,6 sialyltransférase] (BacMid2-Sia3/6 ou BacSia3/6) et des 2 gènes nécessaires à la 5 biosynthèse du nucléotide sucre CMP-NeuAC. Les cellules Sf9 sont transfectées avec les 2 pVT et de l'ADN de l'un des BacMid-Sia. Au cours de la recombinaison homologue, les 2 transgènes sont intégrés dans le génome du BacMid2-Sia tandis que, simultanément, les gènes non fonctionnels 1629 et dnapol portés par le BacMid2-Sia sont remplacés par une copie fonctionnelle, rendant le génome de baculovirus infectieux. Des baculovirus 10 recombinants sont alors produits et sécrétés dans le milieu de culture puis clonés par la méthode des plages de lyse. Légende : GE : Gène essentiel GNE : Gène non essentiel 15 pVT/PH : Vecteur de transfert qui cible le couple GNE/GE PH/1629 pVT/gp37 : vecteur de transfert qui cible le couple GNE/GE gp37/DNAP0l DNA PoINF : Gène codant la DNA polymérase virale non fonctionnelle DNA PolF : Gène codant la DNA polymérase virale fonctionnelle 1629NF : Gène codant la protéine 1629 non fonctionnelle 20 1629F: Gène codant la protéine 1629 fonctionnelle 131,4 GaIT : 131,4 galactosyltransférase GNT-II : N acétylglucosaminyltransférase II a2,3 ST : a2,3 sialyltransférase a2,6 ST : a2,6 sialyltransférase 25 KanR : gène de résistance à la kanamycine mini-F : Origine de réplication bactérienne PH : gène polyédrine La Figure 19 représente l'analyse par Western blot et lectine blot de la protéine X 30 recombinante produite grâce à un baculovirus recombinant généré à partir du BacSia6. Cette protéine étant soluble, les analyses ci-dessous ont été effectuées sur la protéine purifiée. Après électrophorèse en gel de polyacrylamide puis transfert sur membrane, la protéine a été incubée en présence soit d'un anticorps spécifique pour l'analyse en Western blot (A) soit d'une lectine spécifique pour le lectine blot, la SNA (B), ou la MM (C). 35 36 Légende : Puits 1, la protéine X a été produite après infection des cellules Sf9 avec un baculovirus recombinant généré à partir du BacMid2. Puits 2, la protéine X a été produite après infection des cellules Sf9 avec un baculovirus recombinant généré à partir du BacSia6. Puits 3, 5 Protéine X du commerce produite en cellules CHO. La présence de la lectine a été révélée comme décrit dans l'Exemple 13. MW : Marqueur de masse moléculaire (Marqueur précoloré, Biolabs référence P7706). La Figure 20 représente l'analyse par Western blot et lectine blot de la protéine VSVg 10 produite grâce à un baculovirus recombinant généré à partir du BacSia6. La protéine VSVg étant membranaire, les analyses ont été effectuées sur des culots de cellules Sf9 infectées. A et B : Analyse de la protéine VSVg. A. Western blot, après électrophorèse en gel de polyacrylamide puis transfert sur membrane, les protéines ont été incubées en présence d'un anticorps spécifique dirigé contre la VSVg 15 (Anticorps de souris conjugué à la peroxydase, référence A5977 Sigma). Légende : Puits 1, Fétuine, 7 14 de la protéine purifiée, cette protéine sialylée en a2,6 a constitué le contrôle « positif SNA » fourni dans le kit « Dig glycan differentiation » de chez Roche. Selon le fournisseur la masse molaire (*) de cette protéine varie entre 68 et 61 kDa. 20 Puits 2, et 3, cellules Sf9 infectées par un baculovirus recombinant exprimant la protéine VSVg et généré à partir du BacSia6 (puits 2) ou un Bacmid2 (puits 3). B. Lectine blot. Les protéines transférées sur une membrane de nitrocellulose ont été mises en présence de la lectine SNA (Sarnbucus mgra agglutinin) spécifique des résidus d'acides sialiques liés en a2,6. La présence de la lectine a été révélée comme décrit dans l'Exemple 25 13. C et D. Analyse de la protéine virale gp64. La glycoprotéine gp64 est la glycoprotéine majeure du baculovirus, elle est localisée à la surface du baculovirus. Il a été montré que cette glycoprotéine était susceptible d'être galactosylée et sialylée. Nous avons donc vérifié que le baculovirus recombinant exprimant la 30 VSVg sialylée (voir ci-dessus) portait également une gp64 sialylée. Pour cela, les baculovirus sécrétés dans le surnageant de culture ont été sédimentés puis repris par un tampon de lyse pour être analysés en Western blot puis lectine blot. C. Western blot, la gp64 a été révélée avec un anticorps spécifique (anticorps anti-gp64 AcV5, référence 5C65499, Santa Cruz Biotechnology). 35 37 Légende : Puits 1, Fétuine, 7 14 de la protéine purifiée, cette protéine sialylée en a2,6 a constitué le contrôle « positif SNA » fourni dans le kit « Dig glycan differentiation ». Selon le fournisseur la masse molaire (*) de cette protéine varie entre 68 et 61 kDa. Puits 2, et 3, particules de 5 baculovirus préparés à partir des surnageants de culture de cellules infectées avec le baculovirus recombinant exprimant la protéine VSVg et généré à partir du BacMid2-Sia6 (puits 2) ou un Bacmid2 (puits 3). D. Les protéines ont été incubées en présence de la lectine SNA (Sarnbucus mgra agglutinin) spécifique des résidus d'acides sialiques liés en a2,6. La présence de la lectine a été révélée comme décrit dans l'Exemple 13. 10 38 EXEMPLES Exemple 1 : Construction d'un génome de baculovirus déficient pour la réplication dans lequel 1 gène essentiel à la réplication virale est non-fonctionnel (BacMid1) Le BacMid1 présente la délétion d'un gène essentiel à la réplication virale, le gène 1629. 5 1. Intégration de l'origine de réplication bactérienne dans un génome du baculovirus Cette opération est réalisée dans la cellule d'insecte. L'origine de réplication bactérienne Mini-F a été introduite dans le locus polyédrine du génome de baculovirus AcMNPV par recombinaison homologue dans les cellules d'insectes Sf9 (Spodoptera frupperda). Pour cela, les cellules ont été transfectées avec (i) un vecteur 10 de transfert PH (pVT/Mini-F-KanR) dans lequel la séquence du gène ph a été remplacée par un fragment d'ADN portant le Mini-F + une cassette d'expression bactérienne conférant la résistance à la kanamycine (KanR), et (ii) un génome de baculovirus AcMNPV (Baculovirus isolé à partir du lépidoptère Autographa californica). Les baculovirus générés ont été purifiés par la technique des plages de lyse puis caractérisés afin de confirmer qu'ils avaient bien 15 intégré le Mini-F et la cassette d'expression KanR. Un baculovirus a été sélectionné et a ensuite été transféré dans la bactérie E. coli EL350, générant ainsi un premier BacMid (BacMidO, non déficient pour la réplication virale en cellules d'insecte). 1. Délétion du gène essentiel 1629 Une cassette d'expression bactérienne conférant la résistance à l'ampicilline (AmpR) et 20 présentant en 5' et 3' le site de restriction MauBI - site absent du génome de baculovirus AcMNPV - a été intégré en aval de la cassette d'expression bactérienne KanR par recombinaison homologue dans la bactérie E. coli EL350. Au cours de cette recombinaison, un fragment d'ADN codant les 27 acides aminés C-terminaux de la protéine 1629 a été délété, rendant la protéine 1629 non-fonctionnelle (BacMidO/ampR). Le gène de résistance à 25 l'ampicilline a ensuite été éliminé après digestion par MauBI puis religation, générant ainsi le BacMid1. Le génome du baculovirus (i.e. le BacMid1) est alors déficient pour la réplication en cellules d'insectes, car un gène essentiel à la réplication virale (i.e. le gène codant la protéine 1629) est non-fonctionnel. Les bactéries contenant le BacMid1 sont appelées ci-après « bactéries E. co/iEL350/BacMid1 ». 30 La Figure 1 illustre les étapes de préparation du BacMid1. 39 Exemple 2 : Construction d'un génome de baculovirus déficient pour la réplication dans lequel 2 gènes essentiels à la réplication virale sont non-fonctionnels (BacMid2) Le BacMid2 présente la délétion de 2 gènes essentiels à la réplication virale, le gène 1629 et 5 le gène codant l'ADN polymérase virale (DNAPol). A partir du BacMid1, la délétion du gène DNAPol a été réalisée dans les bactéries E. coli EL350/BacMid1 après électroporation d'un fragment de recombinaison de 4222 bp dans lequel une partie des gènes codant la gp37 (252 acides aminés) et la DNAPol (466 acides aminés C-terminaux) a été délétée et remplacée par une cassette d'expression bactérienne permettant la production 10 d'hygromycine B phosphotransférase (HygroR) conférant ainsi la résistance à l'hygromycine (HygroR). Le gène HygroR a été placé sous le contrôle du promoteur bactérien EM7 (issu du vecteur commercial pSelect-Hygro-mcs, Invitrogen), le terminateur glms a été introduit en aval du gène HygroR (Gay N.J. et al. Biochern J., 1986, 234, 111-117). Les bactéries contenant le BacMid2 (E. coli EL350/BacMid2) ont été sélectionnées pour leur résistance à 15 l'hygromycine. Le génome de baculovirus (i.e. le BacMid2) est déficient pour la réplication en cellules d'insectes, car deux gènes essentiels à la réplication virale (i.e. le gène codant la protéine 1629 et le gène codant la DNAPol) sont non-fonctionnels. La Figure 2 est un schéma qui illustre l'étape de délétion d'une partie du gène DNAPol pour la préparation du BacMid2. 20 Note : On peut utiliser le BacMid2 pour produire une seule protéine (voir Exemple 4). Il suffit d'avoir deux vecteurs de transfert, l'un apportant le transgène et tout ou partie du gène essentiel délété 1 et l'autre apportant le gène sauvage correspondant au gène essentiel délété 2. Les deux gènes délétés sont réparés lors de la recombinaison homologue. 25 Exemple 3 : Construction d'un génome de baculovirus déficient pour la réplication dans lequel 3 gènes essentiels à la réplication virale sont non-fonctionnels (BacMid3) 30 Le BacMid3 présente la délétion de 3 gènes essentiels, 1629, DNAPol et gp64. A partir du BacMid2, la délétion du gène gp64 a été effectuée dans les bactéries E. coli EL350/BacMid2 après électroporation d'un fragment de recombinaison de 3260pb dans lequel la totalité du gène de la cathepsine plus 779 bp de la séquence codant 259 acides aminés de la chitinase et une partie du gène de la gp64, délétion de 566 bp codant 188 acides aminés, a été remplacée par une cassette d'expression bactérienne conférant une résistance à la zéocine (ZeoR)(Drocourt et al, Nucleic Acids Research, vo/.18 n°13, 1990). Le gène ZeoR issu du plasmide commercial pCRC)-Blunt (Invitrogen) a été placé sous contrôle du promoteur bactérien T5N25, issu du phage T5 (Gelez and Buiard, J. Bacteriology, vo/.164 5 n°1, 1985) et suivi du terminateur de transcription rrnBT1 (E.coli ribosomal RNA opéron Ti terminator) (Kwon et al, J Biol. Chem., vol 274 n°41, 1999). Les bactéries contenant le BacMid3 (E. coli EL350/13acMid3) ont été sélectionnées pour leur résistance à la zéocine. Le génome de baculovirus (i.e. le BacMid3) est déficient pour la réplication en cellules d'insectes, car trois gènes essentiels à la réplication virale (i.e. le gène codant la protéine 10 1629 et le gène codant la DNAPol et le gène codant la gp64) sont non-fonctionnels. La Figure 3 est un schéma qui illustre l'étape de délétion de gp64 pour la préparation du BacMid3. 15 Exemple 4: Utilisation du BacMid2 Un vecteur de transfert pVT/gp37 a été construit pour pouvoir générer des baculovirus recombinants exprimant 2 transgènes. Pour cela, le fragment EcoRI F du génome de baculovirus AcMNPV contenant le gène gp37 et le gène DNAPol a été cloné dans un plasmide bactérien pUC, générant ainsi le pUC/gp37. 20 Ce plasmide a ensuite été modifié de la façon suivante : une grande partie du gène codant la gp37 a été délété (724pb), l'ATG initiateur a été muté et remplacé par deux sites de restriction uniques XbaI et Avril permettant l'intégration d'un transgène sous contrôle du promoteur naturel de la gp37. Ces modifications ont ainsi conduit à l'obtention du vecteur de transfert pVT/gp37. 25 Les cellules Sf9 ont été transfectées par lipofection avec les vecteurs de transfert pVT/PH et pVT/gp37 chargés avec les transgènes et l'ADN du BacMid2. Les virus générés après la recombinaison homologue ont été clonés par la méthode des plages de lyse. La production de la protéine recombinante a été vérifiée par une méthode adaptée (e.g. par exemple ELISA, Western blot, dosage enzymatique). Le génome des virus recombinants a été vérifié 30 par Southern blot et la séquence du transgène intégré dans le génome viral a été vérifiée par séquençage après amplification PCR. La Figure 4 est un schéma qui illustre le vecteur de transfert pVT/gp37 pour l'expression d'un gène X (où X est un gène différent du gène codant la chaine lourde d'un anticorps). 41 Les génomes de baculovirus recombinants générés après recombinaison homologue entre le BacMid2 et les vecteurs de transfert n'expriment plus la gp37 (protéine non-essentielle à la réplication virale). Pour que l'ADN viral soit réparé dans les 2 locus du BacMid2, une seconde recombinaison 5 doit avoir lieu avec un vecteur de transfert PH chargé ou non avec un transgène. Dans tous les cas, l'ADN du génome de baculovirus sera réparé et donc infectieux. Il sera possible également d'utiliser le pVT/PH contenant une séquence sauvage, c'est-à-dire contenant la cassette d'expression sauvage (non modifiée) conduisant à la production de 10 polyédrine. Le pVT/PH pourra également être « vide » c'est-à-dire ne pas contenir de transgène ni le gène polyédrine. De la même manière il sera possible d'intégrer le transgène dans le locus PH. Dans ce cas, un pVT/gp37 non délété (gène non essentiel fonctionnel) ou délété totalement ou 15 partiellement tel que décrit dans la Figure 4 sera utilisé pour réparer le locus gp37/DNAp0l. Il est à noter que la séquence du gène gp37 qui est présent dans le pVT/gp37 décrit dans la Figure 4, a été modifiée, l'ATG initiateur (ATGi) a été muté et le gène gp37 a été délété de 240 acides aminés, comme expliqué ci-après XbaI AvrII/BamHI 20 pos. 51403 pos. 51433 pos. 52159 TTTAGCCATTTGAGCGTATCTGCATTCGTCGTCTAGAcctaggatccCGCAGCAAACAATGCAA TTAATAATGCAATaATTATGATTATACTTATAGAACACTAATCGGAATAATA ^ Sens de transcription du gène 25 Légende : Séquence du gène en gras ATG initiateur souligné Polylinker XbaI/AvrII/BamHI en encadré La séquence nucléique présentée ci-dessus est la séquence SEQ ID NO : 16 30 La Figure 5 est un schéma qui illustre la construction et l'utilisation du vecteur de transfert PH pVT/PH pour l'expression d'un transgène X (où X est un transgène différent du gène codant une chaine légère d'un anticorps). 35 42 Expression de la chaine lourde d'un anticorps. Construction d'un pVT/gp37 spécifique, le pVT/gp37-Cy1 Ce vecteur de transfert contient la cassette d'expression suivante : - Promoteur viral P10 sauvage (SEQ ID NO :1) 5 - Séquence d'ADN codant une séquence signal d'une immunoglobuline humaine (séquence de sécrétion) - 2 sites de restriction uniques pour le clonage en phase de la région variable (VH) de l'anticorps (région qui donne la spécificité de l'anticorps) - Séquence d'ADN qui code une région constante d'IgG (y1-4) epsilon, mu, ou alpha 10 humaine. La Figure 6 est un schéma qui illustre la construction et l'utilisation du vecteur de transfert pVT/gp37C71 pour l'expression de la chaine lourde d'un anticorps. Expression de la chaine légère d'un anticorps. 15 Construction d'un pVT/PH spécifique, le pVT/PH-CL. Ce vecteur de transfert contient la cassette d'expression suivante : - Promoteur viral P10 P10S1B (SEQ ID NO: 3) - Séquence d'ADN codant une séquence signal d'une immunoglobuline humaine (séquence de sécrétion) 20 - 2 sites de restriction uniques pour le clonage en phase de la région variable (VL) de l'anticorps (région qui donne la spécificité de l'anticorps) - Séquence d'ADN qui code une région constante de chaine légère (CL) kappa (I() ou lambda (X) d'IgG humaine. La Figure 7 est un schéma qui illustre la construction et l'utilisation du vecteur de transfert 25 pVT/PHC- pour l'expression de la chaine légère d'un anticorps. Exemple 5 : Utilisation du BacMid3. Un vecteur de transfert, pVT/Chit-Cath a été construit pour pouvoir générer des génomes de 30 baculovirus recombinants exprimant 3 transgènes. Le fragment BstXI-XbaI issu des régions EcoRI E et H du baculovirus AcMNPV a été cloné dans un plasmide pUC. Une délétion EcoNI-EcoRI de 1175 pb permet d'inactiver les gènes codant la chitinase, non essentielle et la cathepsine non essentielle également. L'addition d'un site XbaI entre les sites EcoNI et EcoRI permet d'intégrer un transgène. Ces 35 modifications ont ainsi conduit à la l'obtention du vecteur de transfert pVT/Chit-Cath. 43 Les cellules Sf9 sont transfectées par lipofection avec les vecteurs de transfert pVT/PH, pVT/gp37 et pVT/chitCath chargés avec les transgènes et l'ADN du BacMid3. Les virus générés au cours de la recombinaison homologue ont été clonés par la méthode des plages de lyse. La production de la protéine recombinante a été contrôlée par une méthode 5 adaptée, ELISA, Western blot, dosage enzymatique ... le génome des virus recombinants a été contrôlé par Southern blot et la séquence du transgène a été contrôlée après amplification PCR. La Figure 8 est un schéma qui illustre la construction du vecteur pVT/Chit-Cath et sa recombinaison homologue avec le BacMid3. 10 Exemple 6: Production d'un anticorps monoclonal anti-CD4 (13E811) en utilisant le BacMid2. Les ADNc codant les régions VH et VL de l'anticorps ont été intégrées respectivement dans 15 les vecteurs de transfert pVT/PH-C- et pVT/gp37-C71. Des baculovirus recombinants ont été générés après recombinaison homologue entre les 2 pVT et l'ADN du BacMid2 de l'Exemple 4: L'ADNc codant la région VL de l'anticorps a été introduit dans le pVTPH/Ck qui recombine avec la région PH/1629 du BacMid2, 20 L'ADNc codant la région VH de l'anticorps a été cloné dans le pVT/gp37-C71 qui recombine avec la région gp37 du BacMid2. Les cellules Sf9 ont été transfectées par lipofection avec le BacMid2 et les 2 vecteurs de transfert obtenus dans l'Exemple 4 puis incubées pendant 4 jours à 28°C. Les surnageants de culture ont été prélevés et les baculovirus recombinants générés, sécrétés dans le milieu 25 de culture ont été clonés par la technique des plages de lyse. L'organisation du génome des baculovirus recombinants a été contrôlée par Southern blot (voir Figure 9A) et les transgènes intégrés (i.e. VL et VH) ont été vérifiés après amplification PCR, clonage puis séquençage. Les anticorps recombinants sécrétés dans le milieu de culture ont été purifiés sur colonne de Protéine A Sepharose (GE Healthcare) puis 30 analysés après migration en gel de polyacrylamide et coloration à l'argent (Figure 9B). 44 Exemple 7: Utilisation du BacMid3 pour la production de VLP (Virus-LikeParticle). Production de VLP de grippe Pour produire ces VLPs, les 3 gènes du virus de la grippe, M, HA et NA ont été co-exprimés. 5 Ces 3 gènes ont été intégrés dans les trois vecteurs de transfert nécessaires pour recombiner avec le BacMid3 de l'Exemple 5 : Le gène M a été introduit dans le vecteur de transfert pVT/PH comme décrit dans la Figure 5. Le gène HA a été introduit dans le vecteur de transfert pVT/gp37 comme décrit dans 10 la Figure 4. Le gène NA a été introduit dans le vecteur de transfert pVT/Chit/Cath comme décrit dans la Figure 8. Les cellules Sf9 ont été transfectées par lipofection avec le BacMid3 et les 3 vecteurs de transfert obtenus ci-dessus, puis incubées pendant 4 jours à 28°C. Les baculovirus 15 recombinants générés puis sécrétés dans le surnageant de culture ont été clonés par la méthode des plages de lyse. L'organisation des génomes de baculovirus recombinants a été contrôlée par Southern blot (voir Figure 10) et les gènes intégrés ont été vérifiés après amplification PCR, clonage puis séquençage. Le Southern blot a été réalisé sur l'ADN génomique du virus recombinant 20 exprimant les 3 protéines HA, NA et M du virus de la grippe. Cette expérience réalisée avec des sondes spécifiques de ces 3 gènes, a permis de détecter la présence des ADNc codant les 3 protéines dans le génome de baculovirus recombinant. 25 Exemple 8: Utilisation du BacMid3 pour la production d'anticorps bispécifiques. L'anticorps bispécifique construit selon le brevet (PCT/IB2012/053482) est constitué d'une chaine lourde composée des domaines VH+CH1+CH2+CH3 d'un anticorps 1, fusionnée en N-terminal aux domaines VH+CH1 d'un anticorps 2. Des mutations introduites à l'interface des régions CL et CH1 de l'anticorps 1 favorisent les appariements corrects entre les 30 domaines VL1 et VL2 des chaines légères L1 et L2 qui sont produites séparément et les domaines VH1 et VH2 correspondants. La production de cet anticorps nécessite la production simultanée et en quantité égale de 3 chaines, la chaine lourde fusionnée, la chaine légère L1 et la chaine légère L2. L'ADNc codant la chaine légère L1 a été introduit dans le vecteur de transfert pVT/PH comme décrit dans la Figure 5. L'ADNc codant la chaîne légère L2 a été introduit dans le vecteur de transfert pVT/gp37 comme décrit dans la Figure 4. 5 L'ADNc codant la chaine lourde fusionnée a été introduit dans le vecteur de transfert pVT/Chit-Cath comme décrit dans la Figure 8. La Figure 11 est un schéma qui illustre en A la structure de l'anticorps bispécifique en B l'analyse par électrophorèse en gel de polyacrylamide de l'anticorps bispécifique purifié sur colonne de Protéine A Sepharose (GE Healthcare). 10 Exemple 9: Construction du BacMid2-Gal permettant la génération de baculovirus recombinants exprimant des protéines galactosylées. 15 Le BacMid2-Gal a été construit à partir du BacMid2 obtenu à l'Exemple 2. Les gènes codant 2 glycosyltransférases manquantes dans les cellules de lépidoptères et nécessaires à la biosynthèse des glycannes galactosylés, la N-acétylglucosaminyltransférase II (GNT-II) et la 131,4 galactosyltransférase (131,4GalT) ont été introduits dans des gènes ou régions non essentiels du BacMid2 par recombinaison homologue. De manière à ce que les activités 20 enzymatiques de 131,4GaIT et de GNT-II soient exprimées avant la synthèse du ou des transgène(s) d'intérêt codant un polypeptide d'intérêt, les transgènes codant GNT-II et 131,4GaIT ont été clonés en aval de promoteurs précoces viraux tel que décrit dans le tableau 1. Tableau 1. Locus Promoteur Gène exprimé d'insertion Origine du promoteur Polymérase Gène Origine 39k Promoteur P9 du ARN polymérase GNT-II Humaine densovirus JcNDV cellulaire egt Promoteur du gène ARN polymérase (31,4GaIT Bovine gp64 du baculovirus cellulaire et virale d'Orgla pseudostugata MNPV lap2 Promoteur du gène ARN polymérase NeuAc Humaine IE1 du baculovirus de cellulaire et virale synthase Lyrnantria dispar 46 lap2 Promoteur du gène ARN polymérase CMP NeuAc Humaine IE1 du baculovirus de cellulaire et virale synthase Choristoreura furniferana 01f51 Promoteur IE1 du ARN polymérase 5T6 Gal I Humaine WSSV (White Spot cellulaire Syndrome Virus) 01f51 Promoteur IE1 du ARN polymérase 5T3 Gal IV Humaine WSSV (White Spot cellulaire Syndrome Virus) Orf51 - Promoteur IE1 du ARN polymérase 5T3 GalIV + 5T6 Gal I Humaines WSSV expression 5T6 cellulaire et ARN polymérase - Promoteur du gène cellulaire Actine 3 de B. moni expression de 5T3 Légende du tableau 1 : Les gènes codant les glycosyltransférases (gènes exprimés) nécessaires à la glycosylation complexe (galactosylation, sialylation) des protéines ont été insérés dans des gènes non essentiels. Les promoteurs utilisés sont des promoteurs précoces 5 de manière à produire les glycosyltransférases avant la biosynthèse des protéines d'intérêt qui seront exprimées sous le contrôle de promoteurs tardifs. La Figure 14 illustre de manière générale les différentes étapes nécessaires à la construction d'un BacMid comprenant un ou plusieurs transgène(s) codant chacun une enzyme de maturation des protéines. En particulier dans la Figure 14, le transgène codant 10 l'enzyme de maturation des protéines est le gène codant la GNTII (gène GNTII). L'addition des transgènes codant respectivement la GNT-II et la 131,4GaIT a été effectuée de manière itérative dans le BacMid2. - Insertion du transgène GNT-II Ce transgène a été introduit par recombinaison homologue dans le gène non essentiel 39K 15 (0RF36, position dans le génome 29242-30069, GenBank NC_001623) situé dans la région EcoRI 3 du virus AcMNPV. Afin d'intégrer les sites uniques de clonage XbaI (italique) et Bsu36I (souligné) (position 29226 du génome viral), une partie de la région 39K a été amplifiée par double PCR avec les amorces suivantes : 47 anti-Sens39k 5'-CCTGGTAA 11111 GACCACGG-3' (position 28806 dans le génome viral) (SEQ ID NO: 7) et Sens mut39k 5 5'-GCCTTAGG TCTA GAGTATATTTAATGGTTTTTATTATTGTTATTATTAATACCCTCC-3' (SEQ ID NO: 6) puis Anti-sens mut39k 5'-C TCTAGACCTAAGGCATAAAAG 111111 ATTTAATCTGACATATTTGTATCTTGTGTATTATCGC-3' (SEQ ID NO: 5) 10 et Sens 39k 5'-CGCAGCAATTCCAGCGAGC-3' (position 29657 dans le génome viral) (SEQ ID NO: 4) Le fragment PCR de 861 bp a été cloné dans un plasmide pGEMcTeasy et contrôlé par 15 séquençage, pour donner le plasmide pGEM-39K. Deux cassettes d'expression ont été introduites dans le plasmide pGEM-39K ci-dessus. Une cassette d'expression virale, composée comme suit [Promoteur P9 du densovirus -JcNDV - transgène codant GN77I - stop TkpA] a été insérée au niveau du site XbaI, pour donner le plasmide pGEM-39K-GNTII. Le Promoteur P9 du densovirus JcNDV est décrit dans Shirk PD, 20 Bossin H, Furlong RB, Gillett JL. Regulation of Junonia coenia densovirus P9 promoter expression. Insect Mol Biol. 2007 Oct;16(5):623-33. Epub 2007 Aug 22. La cassette d'expression bactérienne « zeocine resistance » (ZeoR) (obtenue à partir du plasmide commercial pCR®131unt, InVitrogen) composée comme suit : [Promoteur bactérien T5N25 - ZeoR - terrninateur rmBT1] a été cloné au niveau du site Bsu36I. Cette seconde 25 cassette permet l'expression du gène ZeoR et conférera ainsi à la bactérie porteuse la résistance à la zéocine, pour donner le plasmide pGEM-39K-GNTII-ZeoR. Le promoteur bactérien T5N25 est décrit dans Gentz R, Bujard H. Promoters recognized by Escherichia coli RNA polymerase selected by function: highly efficient promoters from bacteriophage T5. J Bacteriol. 1985 Oct;164(1):70-7. Le terminateur de transcription rrnBT1 est décrit dans Kwon 30 YS, Kang C. Bipartite modular structure of intrinsic, RNA hairpin-independent termination signal for phage RNA polymerases. J Biol Chem. 1999 Oct 8;274(41):29149-55. Le fragment de recombinaison de 3493 bp obtenu après digestion par EcoRI du plasmide généré ci-dessus pGEM-39K-GNTII-ZeoR et présentant des régions 48 flanquantes pour la recombinaison homologue de 420 bp et 428 pb de part et d'autre du fragment de recombinaison, a été électroporé dans les bactéries EL350/BacMid2. Les bactéries contenant le BacMid2/GNTII-ZeoR (E. coli EL350/BacMid2/GNTII-ZeoR) ont été sélectionnées pour leur résistance à la kanamycine, l'hygromycine et la zéocine. L'ADN de 3 5 clones de Bacmid2/GNTII-ZeoR sélectionnés a été extrait puis les gènes GNT-II et ZeoR insérés dans le nouveau locus viral - locus 39k - ont été contrôlés par PCR puis séquençage. La cassette d'expression bactérienne flanquée de part et d'autre d'un site Bsu36I a ensuite été éliminée par simple digestion par Bsu36I, réparation des extrémités de l'ADN avec l'ADN polymérase de Klenow puis ligation du plasmide sur lui-même. Il convient de noter que la 10 séquence Bsu36I « réparée » [5' CCTNATNAGG 3'] a été conservée dans le Bacmid2/GNTII ainsi généré après ligation du plasmide. Cette séquence est donc présente dans le baculovirus recombinant et elle peut constituer une signature spécifique. Le transgène codant la GNTII a été cloné dans le même sens que le gène 39K. Le BacMid2/GNTII a ainsi été obtenu puis contrôlé comme décrit plus haut avant d'être 15 utilisé pour l'insertion du gène codant la 01,4GalT. - Insertion du gène ,81,4GaIT Le transgène codant la 131,4GaIT a été intégré dans le locus du gène non essentiel egt 20 (Ecdysterdid glycosyltransferase, ORF15, position dans le génome position 11426 - 12946 du génome viral AcMNPV) du BacMid2/GNTII selon le principe général décrit ci-dessus. Le fragment PstI-BamHI de 5110 bp (position 9999 à 15110 dans le génome viral d'AcMNPV) contenant le gène egt, a été préalablement cloné dans un plasmide pUC pour donner le plasmide pUC-EGT. Puis la cassette d'expression virale comprenant l'ADNc codant la 25 131,4GaIT bovine sous contrôle du promoteur gp67 d'OpMNPV a été introduite dans le gène egt par insertion (inactivation du gène par insertion) au site unique XbaI (position 12782 dans le génome du baculovirus) présent dans la séquence codante du gène egt, pour donner le plasmide pUC-EGT-GalT. Le transgène codant la 131,4GT a été cloné dans le même sens que le gène egt. 30 Un adaptateur NsiI-Bsu36I-NsiI a ensuite été inséré dans le site NsiI situé en aval du gène 131,4GalT, ce qui a permis l'introduction de la cassette d'expression bactérienne ZéoR en Bsu36I générant le plasmide pUC-EGT-GaIT-ZéoR. 49 Le fragment de recombinaison de 3128 bp a été préparé après digestion du plasmide ci-dessus pUC-EGT-GaIT-ZéoR par SnaBI-NruI générant ainsi des régions flanquantes pour la recombinaison homologue de 474 bp et 866 pb de part et d'autre du fragment. Après électroporation dans la bactérie EL350/BacMid2-GNTII, les bactéries ont été sélectionnées 5 sur zéocine. Comme précédemment, La cassette d'expression bactérienne ZéoR a été éliminée par digestion Bsu36I, réparation puis ligation. On a ainsi obtenu le BacMid2/GNTII/131,4GaIT (aussi appelé BacMid2-Gal ou BacGal). Le génome de BacMid2-Gal a été contrôlé par Southern puis séquençage de tous les gènes intégrés. 10 Exemples 10 : Construction du BacMid-Sia3 (ou BacSia3). Les transgènes codant les enzymes 122,3-sialyltransférase (5T3), N-acetylneuraminate synthase (NeuAc Synthase ou NeuAcS) et CMP-N-acetylneuraminic acid synthetase (CMPNeuAc synthase ou CMPNeuAcS) ont été insérés dans le BacMid2/GNTII-131,4GT de 15 manière intérative selon le principe général décrit dans la Figure 14 : la N-acétylglucosaminyltransférase II humaine (GNT-II) (EC 2.4.1.143, Accession n° NM_002408.3) la 13 1,4 galactosyltransférase (131,4GalT) bovine (EC 2.4.1.38, Accession n° NM_177512.2) 20 l'a2,6 sialyltransférase humaine, ST6GalI (EC 2.4.99.1, accession n° X17247) l'a2,3 sialyltransférase humaine, ST3GalIV (EC 2.4.99.4, accession n° X74570) la NeuAc synthase humaine (EC 2.5.1.56, accession n° AF257466) - la CMPNeuAc synthase humaine (EC 2.7.7.43, accession n° NM_018686.5) 25 - Clonage des deux transgènes codant respectivement CMP NeuAc synthase et NeuAc Synthase) dans le locus iap2 du BacMid2-Gal. La Demanderesse a choisi de cloner ces deux enzymes en tête-bêche sous le contrôle de promoteurs très précoces, le promoteur IE1 (immediate-early 1) du baculovirus de Choristoreura furniferana pour le contrôle l'expression du gène CMP NeuAc synthase et celui 30 du baculovirus de Lyrnantria dispar pour le contrôle de l'expression du gène NeuAc synthase (voir Tableau 1) La région comprenant le gène iap2 (ORF71) du baculovirus AcMNPV (Position dans le génome 61016-61765) a été préalablement amplifiée par double PCR avec les amorces suivantes : Sens iap2 5'- GATATTGTGTGCTCAATGTC-3' (Position 60736 dans le génome viral) 5 (SEQ ID NO : 8) Anti-sens BstBI 5'- CCTAAGGTCTAGATTCGAATACGTGTGTCG -3' (SEQ ID NO: 9) puis Sens BstBI 5'- CGAATCTAGACCTTAGGCCGCGGCTAAGCGTTAAACC -3' (SEQ ID NO : 10) Anti-sens iap2 5'- CGATCACCGTCGCTGTCGTCTTC -3' (Position 61951 dans le génome viral) 10 (SEQ ID NO : 11) Ces PCR successives ont également permis (i) d'intégrer les sites uniques Bsu36I (en souligné ci-dessus) et XbaI (en double souligné ci-dessus) et (ii) de déléter une grande partie de la séquence codant iap2, délétion de 334 bp/111 acides aminés. Le fragment 15 amplifié de 896 bp a été cloné dans un plasmide pGEMcTeasy, pour donner le plasmide pGEM-IAP2. Une cassette d'expression virale, composée comme suit [Stop 5V40-CMPNeuAc SynthasePromoteur IE1Cf-Promoteur IElLd-NeuAc Synthase] a été insérée au site XbaI du pGEMIAP2, pour donner le plasmide pGEM-iap2-CMPNeuAcS-NeuAcS. 20 La cassette d'expression bactérienne «zeocine resistance » (Zed) composée comme suit : [Promoteur bactérien T5N25-ZeoR-terrninateur rmBT1] a été cloné au site Bsu36I du pGEMiap2-CMPNeuAcS-NeuAcS, pour donner le plasmide pGEM-iap2-CMPNeuAcS-NeuAcS-ZeoR. Cette seconde cassette permet l'expression du gène ZeoR et confère ainsi à la bactérie porteuse de ce plasmide la résistance à la zéocine. 25 Le fragment de recombinaison [CMPNeuAc-NeuAcS-ZeoR] de 4548 pb a été préparé après digestion du plasmide pGEM-iap2-CMPNeuAcS-NeuAcS-ZeoR par l'endonucléase de restriction NotI qui génère des régions flanquantes pour la recombinaison homologue de 486 bp et 396pb de part et d'autre du fragment. Les bactéries EL350/BacMid2-GNTII-131,4GT ont été électroporées avec le fragment de recombinaison générant ainsi le BacMid2-GNTII-131,4GT- 30 CMPNeuAcS-NeuAcS-ZéoR. Comme précédemment, la cassette de résistance à la zéocine a été éliminée après digestion par Bsu36I, réparation puis religation. On a ainsi obtenu le BacMid2-GNTII-131,4GT-CMPNeuAcS-NeuAcS. 51 - Clonage du transgène a2,3-sialyltransférase IV (ST3GalIV) dans le locus orf51 du BacMid2-GNTII-81,4GT-CMPNeuAcS-NeuAcS. L'ORF51, (position dans le génome 43180 - 44136), gène non essentiel à la réplication virale, se situe dans le fragment EcoRI N du baculovirus AcMNPV. Un fragment contenant ce 5 gène a été obtenu après amplification par double PCR avec les amorces suivantes : Sens orf51 5'- GGAAAACTL I I I CCGAAGACGAAC (position 43814 dans le génome viral) (SEQ ID NO : 12) et Anti-sens Xba/orf51 5'-CCTAAGGTCTAGAGTGCL IIII GT1TGCTATTTTGCGCCG-3' (SEQ ID NO :13) 10 puis Sens Xba/orf51 5'-CTCTAGACCTTAGGTCCGCGCTCTCCCACGC-3' (SEQ ID NO : 14) et Anti-sens orf51 5'- GGTGCAGAACATAATGACGTGGCCTTAC (position 44723 dans le génome viral) (SEQ ID NO :15) Ces PCR successives ont permis (i) d'intégrer les sites uniques Bsu36I (en souligné ci- 15 dessus) et XbaI (en double souligné ci-dessus). Le fragment obtenu de 922 bp a été cloné dans un pGEM®T easy (Promega), pour donner le plasmide pGEM-ORF51. Comme pour les autres enzymes, la ST3GalIV doit être présente avant que les glycoprotéines d'intérêt soient exprimées. Nous avons choisi le promoteur IE1 du virus de crevette WSSV (White Spot Syndrome Virus) identifié comme étant un promoteur fonctionnel en cellule Sig 20 de type « immediate-early » (Voir Tableau 1)(Liu and al., Virology, 2005; Liu and al. 3 of virology, 2007; Gao and al., J. Biotechnology, 2007). Une cassette d'expression virale, composée comme suit [promoteur WS5V-57-3] a été insérée au site XbaI du pGEM-ORF51, pour donner le plasmide pGEM-ORF51-5T3. La ST3GalIV a été clonée dans le sens inverse de l'orf51. 25 La cassette d'expression bactérienne «zéocine resistance (Zed)» composée comme suit : [Promoteur bactérien T5N25-ZeoR-terrninateur rmBT1] a été cloné au site Bsu36I du pGEMORF51-ST3, pour donner le plasmide pGEM-ORF51-5T3-Zed. Cette seconde cassette permet l'expression du gène ZeoR et confère ainsi à la bactérie porteuse de ce plasmide la résistance à la zéocine. 30 Un fragment de recombinaison [ST3GalIV-Zedi de 2589 pb a été généré à partir du pGEMORF51-ST3-ZeoR par digestion par l'endonucléase de restriction NotI. Cette digestion a 52 généré des régions flanquantes pour la recombinaison homologue de 498 bp et 411pb de part et d'autre de la cassette d'expression. La recombinaison homologue a été réalisée dans la bactérie EL350/BacMid2-GNTII-131,4GT-CMPNeuAcS-NeuAcS, générant le BacMid2-GNTII131,4GT-CMPNeuAcS-NeuAcS-5T3 (ou BacSia3). Le génome du BacSia3 a été contrôlé par 5 Southern puis séquençage de tous les gènes intégrés. Exemple 11 : Construction du BacMid-Sia6 (ou BacSia6). - Clonage du transgène a2,6-sialyltransferase I (ST6GalI) dans le locus orf51 du BacMid2-GNTII- 131,4GT-CMPNeuAcS-NeuAcS. 10 La méthode de clonage est similaire à celle décrite à l'Exemple 10 pour le transgène codant la ST3GalIV, résumée comme suit : - Une cassette d'expression virale, composée comme suit [promoteur WSSV-5T6 ] a été insérée au site XbaI du pGEM-ORF51, pour donner le plasmide pGEM-ORF51-5T6. La ST6GalI est clonée dans le sens inverse de l'orf51 15 - La cassette d'expression bactérienne «zeocine resistance » (ZeoR) composée comme suit : [Promoteur bactérien T5N25-ZeoR-terrninateur rmBT1] a été cloné au site Bsu36I du pGEM-ORF51-5T6 générant le plasmide pGEM-ORF51-5T6-ZeoR. Cette seconde cassette permet l'expression du gène ZeoR et confère ainsi à la bactérie porteuse de ce plasmide la résistance à la zéocine. 20 - Un fragment de recombinaison [ST6GaII-Zedi de 2825 pb a été généré à partir du pGEM-ORF51-5T6-ZeoR par digestion par l'endonucléase de restriction NotI. Cette digestion a généré des régions flanquantes pour la recombinaison homologue de 498 bp et 411pb de part et d'autre de la cassette d'expression. La recombinaison homologue a été réalisée dans la bactérie EL350/BacMid2-GNTII-131,4GT-CMPNeuAcS-NeuAcS, générant le BacMid2-GNTII- 25 f31,4GT-CMPNeuAcS-NeuAcS-5T6 (ou BacSia6). Le génome de BacSia6 a été contrôlé par Southern puis séquençage de tous les gènes intégrés. 53 Exemple 12 : Construction du BacMid-Sia3/6 ou BacSia3/6. - Clonage des transgènes ST6GalI et ST3GalIV en tête bèche dans la région orf51 dans le BacMid2-GNTII-61,4GT-CMPNeuAcS-NeuAcS. La méthode de clonage est similaire à celle décrite aux Exemples 10 et 11 pour le transgène 5 codant la ST3GalIV et le transgène codant la ST6GaII, résumée comme suit : - Une cassette d'expression virale comprenant un transgène codant ST6GalI et un transgène codant ST3GalIV, composée comme suit [5T6-promoteur WSSV-prornoteur Actine 3 B. rnori-5T3-Stop actine 3] a été insérée au site XbaI du pGEM-ORF51, pour donner le plasmide pGEM-ORF51-5T3/ST6. 10 - La cassette d'expression bactérienne «zeocine resistance » (ZeoR) composée comme suit : [Promoteur bactérien T5N25-ZeoR-terrninateur rmBT1] a été cloné au site Bsu36I du pGEM-ORF51-5T3/5T6, pour donner le plasmide pGEM-ORF51-5T3/5T6-ZeoR. Cette seconde cassette permet l'expression du gène ZeoR et confère ainsi à la bactérie porteuse de ce plasmide la résistance à la zéocine. 15 Un fragment de recombinaison [ST3IST6-Zedi de 5008 pb a été généré à partir du pGEMORF51-5T3/5T6-ZeoR par digestion par l'endonucléase de restriction NotI. Cette digestion a généré des régions flanquantes pour la recombinaison homologue de 490 bp et 426pb de part et d'autre de la cassette d'expression. La recombinaison homologue a été réalisée dans la bactérie EL350/BacMid2-GNTII-131,4GT-CMPNeuAcS-NeuAcS, pour donner le BacMid2- 20 GNTII-131,4GT-CMPNeuAcS-NeuAcS-5T3/5T6 (ou BacSia3/6). Le génome de BacSia3/6 été contrôlé par Southern puis séquençage de tous les gènes intégrés. Exemple 13: Utilisation du BacMid2-Gal pour la production d'anticorps galactosylés. 25 Une N-galactosylation terminale étant une caractéristique de la glycosylation de l'Asn297 située dans le domaine constant des IgG (Figures 12 et 13), les exemples décrits ci-dessous concernent la production d'anticorps recombinants. Le BacMid2-Gal a été utilisé comme le BacMid2 décrit précédemment (Exemples 4 et 6) pour la génération en une seule étape d'un baculovirus double recombinant (Figures 15 et 16). 30 Comme pour le BacMid2, la co-transfection avec le BacMid2-Gal a conduit à un taux très élevé, voisin de 100%, de virus recombinants (Figures 9A). 54 Insertion de transgènes codant les chaines lourde et légère d'un anticorps. 1. Principe de la génération des baculovirus recombinants. Les ADNc codant les régions variables VH et VL de l'anticorps d'intérêt ont été insérés dans les vecteurs de transfert (pVT) baculovirus spécifiques des chaînes lourde et légère des 5 anticorps, pVT/gp37-H (pour le clonage de la région variable de la chaîne lourde) (Figure 6) et pVT/PH-L (pour le clonage de la région variable de la chaîne légère) (Figure 7). Ces vecteurs ont été décrits dans (Juba« 5, Lévêque M, Cérutti P, Ozil A, Choblet 5, Violet ML, Slornianny MC, Harduin-Lepers A, Cérutti M. Engineering the baculovirus genorne to produce galactosylated antibodies in lepidopteran cells. Methods Mol Biol. 2013;988:59-77. doi: 10 10.1007/978-1-62703-327-55). Les cellules Sf9 ont ensuite été transfectées avec les 2 pVT chargés et de l'ADN BacMid2-Gal. Des virus double-recombinants co-exprimant les chaînes lourde et légère de l'anticorps ont alors été produits en une seule étape (Figure 16). 2. Construction d'un virus recombinant exprimant un anticorps galactosylé. 15 Des virus recombinants exprimant les mêmes anticorps ont été produits à partir du BacMid2 et du BacMid2-Gal. Les anticorps produits après infection des cellules Sf9 avec le virus recombinant issu du BacMid2 servent de contrôle puisqu'ils présentent une glycosylation « insecte », c'est-à-dire des motifs glycanniques de type de paucimannosidique et dans une moindre proportion de type oligomannosidique (Figure 12). 20 o Clonage dans les vecteurs de transfert. Les fragments d'ADNc codant les régions variables des chaînes lourde et légère de l'anticorps d'intérêt ont été clonés dans les vecteurs de transfert respectifs (pVT/gp37-H et pVT/PH-L). Au cours de ce clonage, les gènes complets codant les 2 chaînes d'anticorps sont reconstitués (Figures 6 et 7). 25 o Génération et clonage des baculovirus recombinants. Les cellules Sf9 ont été transfectées par lipofection avec les pVT/gp37-H et pVT/PH-L chargés et de l'ADN du Bacmid2-Gal ou du BacMid2 (Figure 16). Après 7 jours d'infection à 28°C, les baculovirus sécrétés dans le surnageant de culture ont été clonés par la technique des plages de lyse. 30 o Contrôle de l'organisation génornique des virus recombinants. Plusieurs clones baculoviraux ont été sélectionnés, amplifiés et leur génome extrait pour être analysé par Southern blot. Les gènes codant les chaînes lourde et légère insérés dans le génome baculoviral ont également été amplifiés par PCR puis séquencés. o Production et purification des anticorps recombinants. Des cellules Sf9 adaptées à la croissance en milieu sans sérum ont été infectées à une moi de 3 PFU/cellule. Après 3 jours d'infection, le surnageant de culture a été récolté et déposé sur une colonne de Protéine A Sepharose (GE-Healthcare). La qualité des anticorps a été 5 vérifiée après migration en gel de polyacrylamide et coloration argentique. o Analyse de la glycosylation par lectine blot . Principe du lectine blot : Les lectines sont des molécules qui se fixent spécifiquement sur des motifs glycanniques. Il est ainsi très simple de mettre en évidence la présence d'un glycanne particulier lié à une protéine après électrophorèse en gel de polyacrylamide, 10 transfert sur une membrane de nitrocellulose et incubation de la membrane avec une lectine conjuguée à la biotine (exemple la lectine RCA120 biotinylée, référence B1085, Vector Laboratories) ou à la digoxigénine (exemples les lectines du kit « DIG Glycan Differenciation Kit », référence 11210238001, Roche). La présence des lectines est alors détectée indirectement grâce à un anticorps dirigé contre la biotine ou la digoxigénine lui-même 15 conjugué à la peroxydase ou à phosphatase alcaline. La présence de ces enzymes est alors détectée grâce à leur activité enzymatique qui génèrera soit un précipité brun rouge pour la peroxydase ou une coloration bleue pour la phosphatase alcaline. o Expérimentation La production des anticorps a été contrôlée par Western blot. Les protéines ont été 20 séparées par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide à 10% en présence de SDS et de 2-mercaptoéthanol puis transférées sur une membrane de nitrocellulose (ProtranTM 0,45 lm NC, GE Healthcare). Le transfert des protéines a été vérifié après coloration par le rouge ponceau. La membrane a été incubée avec (A) un anticorps polyclonal de mouton dirigé contre les IgG humaines et conjugué à la peroxydase (Référence NA933V, GE Healthcare) ou 25 (C) avec un anticorps polyclonal de mouton dirigé contre les IgG de souris et conjugué à la peroxydase (Référence NA931V, GE Healthcare). La peroxydase a été révélée par chimioluminescence avec le système SuperSignalC) West Pico chemiluminescent Substrate (référence : 34080, Pierce). Analyse en lectine blot (B et D). Dans cet exemple, nous avons utilisé la lectine 30 RCA120 biotinylée (Ricinus cornrnunis agglutinin) qui se fixe spécifiquement sur les résidus beta-galactosyl. Les protéines ont été séparées par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide comme décrit plus haut pour le western blot, transférées sur membrane ProtranTM 0,45 lm NC (GE Healthcare) puis incubée en présence de RCA120 biotinylée. La 56 lectine a été révélée indirectement après incubation de la membrane avec un anticorps antibiotine conjugué à la peroxydase (Anticorps de chèvre, référence A4541, Sigma). La révélation a été effectuée en présence d'un substrat de la peroxydase, le 1-amino-3-ethyl carbazol et de peroxyde d'hydrogène. La réaction conduit à la formation d'un précipité brun. 5 3. Résultats Des anticorps recombinants humains (Figure 17A et 17B) et murins (Figure 17C et 17D) ont été produits, purifiés sur Protéine A Sepharose (GE Healthcare) puis analysés en Western blot et en lectine blot. La Figure 17A confirme bien la présence des anticorps recombinants 10 humains (puits 3, 4 et 5). La Figure 17B, montre que seuls les anticorps produits par les cellules infectées avec les baculovirus recombinants générés à partir du BacMid2-Gal sont reconnus par le RCA120 (Puits 3 et 5). L'anticorps produit par le virus recombinant issu du BacMid2 n'a pas été reconnu par la lectine (puits 4). Ces observations ont été confirmées avec l'analyse des anticorps murins recombinants (Figure 17C, Western blot et Figure 15 17D, Lectine blot). Comme précédemment, seul l'anticorps recombinant produit après infection des cellules Sf9 par le baculovirus recombinant généré à partir du BacMid2-Gal a été reconnu par la RCA120 (Figure 17D, puits 1). L'anticorps recombinant produit après infection des cellules Sf9 par le baculovirus généré à partir du BacMid2 n'a pas été marqué (Figure 17D, puits 2). 20 Exemple 14: Utilisation du BacMid-Sia3 1. Construction d'un baculovirus recombinant exprimant une protéine recombinante sialylée en alpha 2,3. La protéine modèle utilisée pour cet exemple est la gp120 du VIH1 (sérotype YU2). En 25 contrôle, un baculovirus recombinant dont le génome comprend un transgène codant la gp120 a été construit à partir du BacMid2. - Génération et clonage des baculovirus recombinants. Le fragment d'ADNc (transgène) codant la protéine d'intérêt (gp120 du VIH1) a été cloné dans le pVTPH selon le principe général décrit dans la Figure 18. Les cellules Si9 ont été 30 transfectées par lipofection avec les pVTPH chargés et le pVT/gp37 modifié et de l'ADN du Bacmid2 (contrôle) ou le BacMid-Sia3 obtenu dans l'Exemple 10. Après 7 jours d'infection à 57 28°C, les virus sécrétés dans le surnageant de culture ont été clonés par la technique des plages de lyse. Quatre clones viraux ont été sélectionnés, amplifiés et leur génome extrait pour être analysé par Southern blot. Le gène inséré dans le génome viral a été amplifié par PCR puis séquencé. 5 - Production des protéines recombinantes Des cellules 519 adaptées à la croissance en milieu sans sérum ont été infectées avec le virus recombinant sélectionné ci-dessus. Après 3 jours d'infection les surnageants de culture et culots cellulaires ont été isolés puis stockés à -20°C jusqu'à utilisation. - Analyse de la glycosylation par lectine blot 10 La lectine utilisée dans cet exemple a été la MM (Maackia arnurensis agglutinin) qui reconnaît les acides sialiques liés en 122,3. Le protocole qui a été utilisé est semblable à celui qui est décrit dans l'Exemple 13. La MM est conjuguée à la digoxigénine. Le protocole de révélation qui a été utilisé est celui qui est préconisé par le fournisseur du Kit « DIG Glycan Differentiation Kit». Brièvement, la membrane a été incubée avec un anticorps anti- 15 digoxigénine marqué à la phosphatase alcaline. L'activité de cette dernière a été révélée en présence de son substrat le NBT/BCIP, la réaction conduit à la formation d'une coloration bleue. 2. Résultats 20 Seule la gp120 produite à partir du virus recombinant généré à partir du Bacmid2-Sia3 est reconnue par la lectine MM. Exemple 15: Utilisation du BacMid-Sia6 1. Construction d'un baculo virus recombinant exprimant une protéine recombinante sialylée 25 en alpha 2,6. Les protéines d'intérêt produites dans cet exemple sont la gp120 du VIH1, VSVg (Glycoprotéine G du virus de la Stomatite Vésiculaire) et la protéine X. - Génération et clonage des baculo virus recombinants. Le fragment d'ADNc codant la protéine d'intérêt a été cloné dans le pVTPH selon le principe 30 général décrit dans la Figure 18. Les cellules Sig ont été transfectées par lipofection avec 58 les pVTPH chargés, le pVT/gp37 modifié et de l'ADN du Bacmid2 (contrôle) ou du BacMidSia6 obtenu dans l'Exemple 11. Après 7 jours d'infection à 28°C, les virus sécrétés dans le surnageant de culture ont été clonés par la technique des plages de lyse. Quatre clones viraux ont été sélectionnés, amplifiés et leur génome extrait pour être analysé par Southern 5 blot. Les gènes insérés dans le génome viral ont été amplifiés par PCR puis séquences. - Production des protéines recombinantes Les protéines ont été produites comme décrit dans l'Exemple 14. - Analyse de la glycosylation par lectine blot La présence des protéines recombinantes a été contrôlée par Western lot. Après transfert 10 des protéines, les membranes de nitrocellulose ont été incubées en présence des différents anticorps spécifiques, anti-gp120 (anticorps polyclonal de chèvre dirigé contre la gp120 du VIH1, référence Ab21179, Abcam), anti-VSVg (anticorps monoclonal de souris conjugué à la peroxydase, référence A5977, Sigma), anti-gp64 (anticorps monoclonal de souris AcV5 référence 5C65499, Santa Cruz Biotechnology). La révélation a été effectuée soit 15 directement comme décrit dans l'Exemple 13 lorsque l'anticorps est directement conjugué à la peroxydase soit après incubation avec un anticorps secondaire conjugué à la peroxydase (sérum de lapin anti-IgG de souris conjugué à la peroxydase, référence A9044, Sigma ou sérum de lapin anti-IgG de chèvre conjugué à la peroxydase, référence A5420, Sigma). La peroxydase a été révélée par chimioluminescence avec le système ECL SuperSignalC) West 20 Pico chemiluminescent Substrate (référence : 34080, Pierce). La lectine qui a été utilisée dans cet exemple est la SNA (Sarnbuscus mgra agglutinin) qui reconnaît les acides sialiques liés en 122,6. La SNA a été révélée comme décrit dans l'Exemple 14. 25 2. Résultats a. Glycosylation de la gp120 exprimée par le baculovirus recombinant généré à partir du BacSia6. Seule la gp120 produite à partir du virus recombinant généré à partir du BacSia6 a été reconnue par la lectine SNA. 59 b. Glycosylation de la protéine X exprimée par le baculovirus recombinant généré à partir du BacSia6 Comme le montre le Western lot, Figure 19A, lorsque la protéine X a été produite avec un virus recombinant issu du BacMid2, sa taille est nettement inférieure à celle de la protéine du 5 commerce qui a été produite par des cellules de mammifères, ici la cellule CHO (comparer les puits 1 et 3). Par contre, lorsqu'elle a été produite avec un baculovirus recombinant issu du BacSia6, la protéine X a présenté une taille comparable à celle qui a été produite en cellules CHO (comparer puits 2 et puits 3). L'analyse par lectine Blot, Figure 19B, a confirmé la présence d'acides sialiques liés en 122,6 10 sur cette protéine lorsqu'elle a été produite avec un baculovirus recombinant issu du BacSia6 (puits 2). La protéine X a en effet été reconnue par la SNA (protocole de révélation décrit dans l'Exemple 14), expliquant ainsi l'augmentation de la masse molaire de la protéine X. Cette expérience a également montré l'absence d'un tel motif sur la protéine commerciale qui a été produite en cellules CHO (puits 3), en effet la lignée CHO exprime uniquement une 15 122,3 sialyltransférase. Ainsi comme le montre la Figure 19C, la protéine X exprimée en CHO (puits 3) a été reconnue par la MM (protocole de révélation décrit dans l'Exemple 14) qui est spécifique des acides sialiques liés en 122,3, ce qui n'est pas le cas de la protéine qui a été exprimée avec le baculovirus recombinant issu du BacSia6 (puits 2). c. Glycosylation de la VSVg exprimée par le baculovirus recombinant généré à 20 partir du BacSia6. La VSVg étant une protéine membranaire nous avons analysé les culots des cellules infectées. Comme le montre la Figure 20A (puits 2 et 3), la protéine VSVg a été produite après infection des cellules Sf9 avec les 2 virus recombinants qu'ils soient issus du BacMid2 ou du BacSia6. 25 Par contre, l'analyse par lectine blot avec la SNA (protocole de révélation décrit dans l'Exemple 14) a montré un marquage intense de la protéine VSVg uniquement lorsqu'elle est exprimée à partir du baculovirus issu du BacSia6 (Figure 20B, puits 2). Avec la protéine VSVg produite après infection avec le baculovirus issu du BacMid2 on a uniquement noté un marquage non spécifique (Figure 20B, puits 3). La protéine « contrôle positif » qui est 30 fourni avec le Kit de différenciation des glycannes (Dig Glycan Differentiation Kit), la fétuine, a très bien été marquée par la SNA (Figure 20B, puits 1). d. Glycosylation de la gp64 du baculovirus recombinant généré à partir du BacSia6. La glycoprotéine gp64 est la glycoprotéine majeure du baculovirus, elle est impliquée dans les toutes premières étapes de l'infection. Elle est localisée à la surface du virus. Il a été 5 montré que cette glycoprotéine était susceptible d'être galactosylée et sialylée (Jarvis DL, Finn EE. Siochernical analysis of the N-glycosylation pathway in baculovirus-infected lepidopteran insect cells. Virology. 1995 Oct 1;212(2):500-11). Nous avons donc vérifié que le virus recombinant exprimant la VSVg sialylée (voir ci-dessus) portait également une gp64 sialylée. Pour cela, les baculovirus sécrétés dans le surnageant de culture ont été sédimentés 10 (35 000 rpm pendant 60 minutes, centrifugeuse Beckman Optima LE-80K, rotor TI-70-1) puis repris par un tampon de lyse pour être analysés en Western blot puis lectine blot. Comme précédemment la fétuine a été utilisée comme marqueur positif à la SNA (Figure 20C et Figure 20D, puits 1). La Figure 20C montre bien la présence de la gp64 dans les puits 2 et 3. Comme ce que 15 nous observons avec la VSVg, la gp64 qui a été produite après infection avec le virus issu du BacSia6 (puits 2) est la seule qui est reconnue par la SNA (protocole de révélation décrit dans l'Exemple 14) (Figure 20D) confirmant ainsi que la gp64 est sialylée en a2,6. On notera également la présence de marquages non spécifiques dans les puits 2 et 3 (marquages identiques dans les 2 puits). 20 Exemple 16: Utilisation du BacMid Sia3/6 1. Construction d'un baculovirus recombinant exprimant une protéine recombinante sialylée en alpha 2,3 et en alpha 2,6. La protéine modèle utilisée dans cet exemple a été la gp120 du VIH1. 25 - Génération et clonage des baculovirus recombinants. Le fragment d'ADNc (transgènes) codant la protéine d'intérêt (gp120 du VIH1) a été cloné dans le pVTPH (Selon le principe général décrit dans la Figure 18). Les cellules Sig ont été transfectées par lipofection avec les pVTPH chargés et le pVT/gp37 modifié et de l'ADN du Bacmid2 (contrôle) ou du BacMid-Sia3/6. Après 7 jours d'infection à 28°C, les virus sécrétés 30 dans le surnageant de culture ont été clonés par la technique des plages de lyse. Quatre clones viraux ont été sélectionnés, amplifiés et leur génome extrait pour être analysé par 61 Southern blot. Les gènes insérés dans le génome viral ont été amplifiés par PCR puis séquences. - Production des protéines recombinantes Les protéines ont été produites comme décrit dans l'Exemple 14. 5 - Analyse de la glycosylation par lectine blot Les protocoles d'analyse ont été identiques à ceux décrits dans l'Exemple 14. 2. Résultats Seule la gp120 produite après infection avec le virus recombinant généré à partir du 10 BacSia3/6 est reconnue par les 2 lectines, MM et SNA, montrant que la gp120 produite à partir du BacMid Sia3/6 est sialylée en 2,3 et en 2,6. REVENDICATIONS1. Procédé pour produire un baculovirus recombinant dont le génome comprend un ou plusieurs transgène(s) codant chacun une enzyme de maturation des protéines et n transgènes codant chacun un polypeptide d'intérêt, ledit procédé comprend les étapes de : a) Préparer, dans une cellule d'insecte, un génome de baculovirus recombinant capable de se répliquer qui comprend un ou plusieurs transgène(s) codant chacun une enzyme de maturation des protéines et n transgènes codant chacun un polypeptide d'intérêt, par recombinaison homologue entre : al) un génome de baculovirus déficient pour la réplication dans lequel n gènes essentiels à la réplication virale sont non-fonctionnels et qui comprend un ou plusieurs transgène(s) codant chacun une enzyme de maturation des protéines, et a2) n vecteurs de transfert comprenant chacun: i) une séquence nucléotidique permettant de restaurer la fonction d'un des n gènes essentiels à la réplication virale non-fonctionnel, ii) un des n transgènes codant un polypeptide d'intérêt, l'ensemble des séquences nucléotidiques i) des n vecteurs de transfert étant capables de restaurer la réplication du génome de baculovirus déficient pour la réplication, n étant un nombre entier au moins égal à 2 ; et b) Générer un baculovirus recombinant dans une cellule d'insecte qui comprend le génome de baculovirus recombinant obtenu à l'étape a). 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel génome de baculovirus déficient pour la réplication de l'étape al) est préparé, dans une cellule bactérienne, par recombinaison homologue entre : - un génome de baculovirus déficient pour la réplication dans lequel n gènes essentiels à la réplication virale sont non-fonctionnels, et - une ou plusieurs séquence(s) nucléotidique(s) comprenant chacune un ou plusieurs transgène(s) codant chacun une enzyme de maturation des protéines. 63 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, dans lequel les gènes essentiels à la réplication virale sont sélectionnés parmi 1629 (ORF9), Pk1 (ORF10), lef-1 (ORF14), 0RF34, lef-11 (0RF37), p47 (ORF40), lef8 (ORF50), DNA.1 domain (ORF51), 0RF53, vp1054 (0RF54), Lef-9 (0RF62), DNA Pol (0RF65), lef-3 (0RF67), 0RF73, 0RF75, ORF81, p95 (0RF83), vp39 (0RF89), lef-4 (ORF90), p33 (0RF92), helicase (0RF95), vp80 (ORF104), ORF106-107, odv-ec43 (ORF109), gp64/67 (0RF128), 0RF132, 0RF133, odvec27 (0RF144), 0RF146, ie1 (0RF147), lef-2 (ORF6). 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel les n gènes essentiels à la réplication virale non-fonctionnels sont chacun adjacents à un gène non-essentiel à la réplication virale. 5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel le gène non-essentiel à la réplication virale est sélectionné parmi Ph (ORF 8), ORF11, ORF13, egt (ORF15), v-ubiquitin (0RF35), 39K (0RF36), 0RF38, p43 (0RF39), lef-12 (ORF41), pcna (0RF49), 0RF52, 0RF55, Fp (ORF61), 0RF63, gp37 (0RF64), ORF68, 0RF72, 0RF74, 0RF82, cg30 (0RF88), ORF91, pif-4 (0RF96), he65 (ORF105), ORF108, ORF110, cathepsine (0RF127), p24 (0RF129), pp34 (ORF131), 0RF134, 0RF145, odv-e56 (0RF148), ORF5. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel les n transgènes codant un polypeptide recombinent chacun au niveau d'un gène non-essentiel à la réplication virale adjacent à un gène essentiel à la réplication virale non fonctionnel. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel l'enzyme de maturation des protéines est choisie parmi une peptidase signal, une furine, une proprotéine convertase, une glycosyltransférase, une glycosidase, une protéine chaperone, une disulfide isomérase, une acyltransférase, une méthyltransférase, une hydroxylase, une transglutami nase, une farnésyltransférase, une géranylgéranyl-transférase, une Nmyristoyltransférase, une palmityltransférase, une protéine kinase, une phosphatase, une transpeptidase, une carboxylase, une ubiquitine ligase. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 7, dans lequel le ou les transgène(s) codant une enzyme de maturation des protéines recombinent chacun au niveau d'un gène non-essentiel à la réplication virale, de préférence au niveau d'un gène non- 64 essentiel à la réplication virale non-adjacent à un gène essentiel à la réplication virale non fonctionnel:- 9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel le gène non-essentiel à la réplication virale est sélectionné parmi ptp (ORF1), cb( (ORF3), ORF4, ORF7, odv-e26 (ORF16), ORF17, ORF18, ORF19, ARIF-1 ORF20-21, pif2 (0RF22), protéine F (0RF23), iap1 (0RF27), lef6 (0RF28), 0RF29, ORF30, sod (ORF31), fgf (0RF32), gta (0RF42), 0RF43, 0RF44, 0RF45, odv-e66 (ORF46), 0RF47, 0RF56, ORF57, chaB-like (0RF58/59), chaB-like (ORF60), mtase (0RF69), hcf-1 (ORF70), iap2 (ORF71), 0RF86, 0RF87, ORF111, ORF114, pif3 (ORF115), ORF116, ORF117, pif1 (ORF119), ORF120, ORF121, 0RF122, pk2 (0RF123), 0RF124, lef7 (0RF125), chitinase (0RF126), gp16 (ORF130), p35 (0RF135), p26 (0RF136), p10 (0RF137), p74 (0RF138), 0RF149, ORF150, ie2 (ORF151), pe38 (0RF153) et 0RF154. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans lequel la cellule d'insecte est sélectionnée parmi Sf9, Sf21, Tn5-b14, les lignées cellulaires de lépidoptères sensibles au baculovirus AcMNPV, les lignées Sf21, de préférence Sf9. 11.. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 10, dans lequel la cellule bactérienne est E. cou i sélectionnées parmi DH1OB et EL350 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, dans lequel le génome de baculovirus déficient pour la réplication est obtenu à partir d'un génome de baculovirus sélectionné parmi ou dérivé du génome de BmNPV, AcMNPV, ApNPV, BsSNPV, CfMNPV, EoSNPV, HaNPV, HzNPV, LdMNPV, MbMNPV, OpMNPV, SIMNPV, SeMNPV ou TeNPV, de préférence AcMNPV. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, dans lequel n est un nombre entier allant de 2 à 31, par exemple allant de 2 à 10. 14. Baculovirus recombinant ou génome de baculovirus recombinant, susceptible d'être obtenu par le procédé de production selon l'une des revendications 1 à 13, comprenant : a) un ou plusieurs transgène(s) codant chacun une enzyme de maturation des protéines, et b) n séquences nucléotidiques de formule (I) : 65 [transgène codant un polypeptide d'intérêt]-[séquence nucléotidique intercalaire]-[gène essentiel à la réplication virale fonctionnel] (I), ladite séquence d'acides nucléiques intercalaire est constituée de 0 à 600 pb, ledit gène essentiel à la réplication virale fonctionnel est sélectionné parmi 1629 (ORF9), Pk1 (ORF10), lef-1 (ORF14), 0RF34, lef-11 (0RF37), p47 (ORF40), lef8 (ORF50)1 DNA] domain (ORF51), 0RF53, vp1054 (0RF54), Lef-9 (0RF62), DNA Pol (0RF65), lef-3 (0RF67), 0RF73, 0RF75, ORF81, p95 (0RF83), vp39 (0RF89), lef-4 (ORF90), p33 (0RF92), helicase (0RF95), Vp80 (ORF104), ORF106-107, odv-ec43 (ORF109), gp64/67 (0RF128), 0RF132, 0RF133, odv-ec27 (0RF144), 0RF146, ie1 (0RF147), lef-2 (ORF6); n étant un nombre entier au moins égal à 2. 15. Baculovirus recombinant ou génome de baculovirus recombinant selon la revendication 14, ne comprenant pas n gènes non-essentiels à la réplication virale choisis parmi Ph (ORF 8), ORF11, ORF13, egt (ORF15), v-ubiquitin (0RF35), 39K (0RF36), 0RF38, p43 (0RF39), lef-12 (ORF41), pcna (0RF49), 0RF52, 0RF55, Fp (ORF61), 0RF63, gp37(0RF64), 0RF68, 0RF72, 0RF74, 0RF82, cg30 (0RF88), ORF91, pif-4 (0RF96), he65 (ORF105), ORF108, ORF110, Cathepsine (0RF127), p24 (0RF129), pp34 (ORF131), 0RF134, 0RF145, odv-e56 (0RF148), ORF5. 16. Jeu d'éléments de recombinaison homologue comprenant : a) un génome de baculovirus déficient pour la réplication dans lequel n gènes essentiels à la réplication virale sont non-fonctionnels et qui comprend un ou plusieurs transgène(s) codant chacun une enzyme de maturation des protéines ; b) n vecteurs de transfert comprenant chacun: i) une séquence d'acides nucléiques permettant de restaurer la fonction d'un des n gènes essentiels à la réplication virale non-fonctionnel, ii) un transgène codant un polypeptide d'intérêt, n étant un nombre entier au moins égal à 2. 17. Cellule comprenant un baculovirus recombinant ou un gènome de baculovirus recombinant selon l'une quelconque des revendications 14 ou 15 ou un jeu d'éléments de recombinaison homologue selon la revendication 16. 66 18. Utilisation d'un baculovirus recombinant ou d'un génome de baculovirus recombinant selon l'une quelconque des revendications 14 ou 15 ou d'une cellule selon la revendication 17 pour la production de n polypeptides d'intérêt.