Brevet FR3071504A1 — publié le 20190329

PRODUIT BIOLOGIQUE POUR AMELIORER LA STABILITE PROTEIQUE DE BOISSONS A BASE DE MOUTS VEGETAUX Domaine de l'invention La présente invention a pour objet un produit 5 biologique pour le traitement de boissons à base de moûts végétaux, notamment le vin, la bière ou les jus de fruits, et plus particulièrement pour améliorer la stabilité protéique et pour éviter le trouble de tels boissons, généralement dû à la présence de levures, de particules en suspension, 10 principalement des protéines, pouvant présenter des tailles et des compositions très différentes. On sait que la commercialisation des boissons susvisées en bouteilles demande non seulement qu'elles soient limpide lors de la mise en bouteille mais qu'elles le reste au 15 cours du temps, surtout pour les vins qui sont conservés sur des durées relativement longues. Or on sait que les traitements actuels de stabilisation des vins sont peu satisfaisants, que ce soit face aux précipitations de sels tartriques ou protéiques dites 20 dans le métier de l'oenologie "casses tartriques et protéiques". Une solution connue consiste à traiter les moûts et les vins à la bentonite mais les doses nécessaires en fonction des besoins peuvent être suffisamment élevées pour appauvrir 25 les caractéristiques organoleptiques des vins ainsi traités. Des essais ont été conduits par voie enzymatique en utilisant des protéases exogènes ou à partir de levures afin d'éliminer les protéines responsables de la casse protéique mais les résultats n'ont pas donné satisfaction. 30 Etat de la technique On connaît dans l'état de la technique l'article « Effect of free and immobilised stem bromelain on protein 2 hazein white wine », auteurs I. BENUCCI, M. ESTI and K. LIBURDIn publié dans la revue « Australian Journal of Grape and Wine Research 20, 347-352, 2014». On connaît dans l'état de la technique la demande 5 de brevet américain US20030165592 décrivant un procédé de vinification consistant à utiliser une protéinase pour éliminer des protéines instables à la chaleur qui provoquent un précipité induit par la chaleur. Ce document de l'art antérieur expose que l'introduction de protéinase au début de 10 la fermentation, avant la génération de facteurs inhibiteurs, évite l'utilisation de bentonite normalement requise pour une stabilisation du vin. Ce document expose également que la protéine de fruit, la protéinase peut être utilisée en tant qu'agent anti-moussant dans des jus de fruit et pendant la 15 fermentation des jus de fruit. Ce document de l'art antérieur propose différentes source de protéase : microbiennes, végétales et/ou animales, la protéase devant conserver une activité suffisante au pH du fruit (entre 2,5 et 4,0 environ) pour éliminer les protéines 20 instables à la chaleur, et notamment: - les protéases fongiques provenant de sources telles que Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Rhizomucor meihei et Neosartorya fischeri; - les protéases de levure provenant de sources 25 telles que Candida olea et Saccharomyces cerevisiae; Proteases bactériennes de Bacillus subtilis, ou Bacillus lichenifomis; - les protéases animales de la pepsine et de la trypsine provenant de bovins ou de porc, parmi celles-ci, la protéase d'Aspergillus niger, var. 30 Inconvénients de l'art antérieur Parmi toutes ces solutions, les protéases végétales constituent une voie préférentielle pour des boissons alimentaires. Il est toutefois admis dans l'art antérieur, et notamment dans le document US20030165592, que les protéases 3 végétales suivantes : la ficin de Ficus spp., la papaïne de Carica papaya, la bromélaïne d'Ananas comosus ou d'Ananas bracteratus ne présentent pas une bonne activité au pH acide des fruits et ne sont donc pas censées pouvoir hydrolyser les protéines des fruits. Ce document susvisé précise que la bromélaine et / ou la papaïne (obtenues auprès de Valley Research, Inc., South Bend, Ind.) ont été utilisées pour comparer avec l'activité de la protéase de A. niger. Il apparaît dans l'art antérieur que la bromélaïne 10 ne permet pas d'obtenir des résultats satisfaisants. Solution apportée par l'invention De manière surprenante, les inventeurs ont observé que la sélection d'une forme particulière de bromélaïne provenant du fruit , peu exploitée industriellement, et 15 l'ajout d'un agent comprenant un composé soufré, permet de remédier aux inconvénients de l'art antérieur et de proposer un additif de stabilisation protéique d'origine végétale particulièrement actif. A ce titre, l'invention concerne selon son 20 acception la plus générale un additif pour la stabilisation protéique de boissons à base de moûts végétaux comprenant de la bromélaïne caractérisé en ce que la bromélaïne est extraite du fruit d'ananas (hors feuilles, tiges et racines) et en ce qu'il contient en outre un acide aminé soufré ou un peptide 25 comprenant des acides aminés soufrés. On entend par « extraite du fruit d'ananas » au sens du présent brevet le fait que la variété de bromélaïne objet de l'invention est obtenue par une extraction à partir des seuls fruits de l'ananas, comprenant la peau du fruit et 30 la pulpe, après élimination des feuilles, tiges et racines. Ce mode d'extraction n'est pas habituel, la tradition consistant plutôt à utiliser les déchets des ananas pour l'extraction de la bromélaïne, ou encore spécifiquement les tiges de l'ananas. En effet, en médecine traditionnelle, à 4 Hawaï, au Japon et à Taiwan, on utilise le latex (la sève) des tiges d'ananas pour nettoyer les plaies et les brûlures et accélérer leur guérison, ainsi que pour faciliter la digestion et pour traiter certains cancers. 5 En 1957, Ralph Heinicke, du Pineapple Research Institute, a découvert que les tiges des plants d'ananas, jusque-là considérées comme de simples résidus de production, étaient riches en cet enzyme. Dès les années 1960, les Européens se sont intéressés à la bromélaïne. Aujourd'hui, elle est utilisée sur ce continent pour accélérer la guérison après une intervention chirurgicale ou une blessure sportive ainsi que pour soigner la phlébite et la sinusite et depuis plus de 30 ans, la bromélaïne est aussi utilisé par l'industrie alimentaire pour attendrir la viande. Pour ces raisons, la bromélaïne commercialisée est généralement issue de déchets d'ananas, et principalement les tiges. Pour les extraits obtenus à partir de fruits d'ananas victoria, la préparation obtenue sans aucun ajout 20 présente tout de même une efficacité, l'extrait contenant naturellement une quantité significative de peptides soufrés. Avantageusement, ledit acide aminé soufré est : - de la cystéine - de la méthionine 25 Selon une variante, le peptide est du glutathion. Selon des variantes, ladite boisson est : - un vin - un vin blanc 30 - un vin rosé - une bière - un jus de fruits. L'invention concerne aussi un procédé de préparation d'un additif pour la stabilisation protéique de 5 boissons à base de moûts végétaux comportant les étapes suivantes : - broyage de fruits d'ananas frais avec un tampon à pH supérieur à 5, et de préférence à pH 7, et un peptide ou un 5 acide aminé soufré (les fruits peuvent par exemple être des fruits avariés impropres à la commercialisation) - centrifugation à une température comprise entre 2°C et 8°C. - clarification et ultrafiltration. 10 La force du tampon est avantageusement comprise entre 0,05 et 1 Mol., et de préférence 0,1 Mol. L'homme du métier pour déterminer la force optimale par des expériences de routine, par des essais successifs avec des forces variées. 15 Description détaillée d'un exemple non limitatif de l'invention La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée d'un exemple non limitatif de l'invention qui suit, se référant aux dessins annexés où : - la figure 1 représente le profil électrophorétique d'un échantillon de vin blanc traité avec différentes concentrations d'additif selon l'invention - les figures 2 et 3 représentent la variation des protéines de raisin du témoin en fonction des traitements 25 appliqués. Sélection de la forme optimale de la bromélaïne Un des aspects importants de la présente invention concerne le choix de la forme optimale de la bromélaïne constituant le principe actif principal de l'additif de 30 stabilisation de boissons à base de moûts végétaux. 6 Le tableau ci-dessous présentent les différentes formes de bromélaïnes (en anglais cysteine proteinases) issues de l'espèce Ananas comosus répertoriés par les inventeurs : 5 Nom Abbréviation Masse Point iso- Séquence Glycosylation scientifique moléculaire électrique ou en Dalton commercial Bromélaïne extraite de la tige Stem F4 et F5 2800 >10 212 Glycosylé bromelain (séquence + acides EC 3.4.22.32 sucre) aminés Ananain F9 23464 >10 216 Non Glycosylé EC 3.4.22.31 (séquence) acides aminés Comosain F9/b 24509 et >10 N-term Glycosylé 23569 SBA/a et 23550 et 4,8 et 4,9 N-term Glycosylé SBA/b 23560 Bromélaïne extraite du fruit Fruit 23000 4,6 N-term Non glocosylé bromelain EC 3.4.22.33 La bromélaïne objet de la présente invention est 10 extraite à partir du fruit, mais contient néanmoins deux types de bromélaïnes : principalement le type « fruit bromelain » mais aussi le type « stem bromelain », beaucoup moins présent. Extraction et pré-purification par filtration et ultrafiltration de l'activité enzymatique 15 La description qui suit présente un exemple non limitatif de procédé de préparation d'un additif selon l'invention. 7 Etape 1 : broyage et extraction 100g de déchets d'ananas frais plus 200m1 de tampon phosphate 0,1M à pH 7 plus cystéine 15mM. Broyage (broyeur à ailettes en inox) à vitesse 5 maximale pendant 1 minute. Laisser au repos pendant 1 heure. Centrifuger à 8000 tr/min pendant 20 minutes à +4°C. Etape 2 : lyophilisation de l'extrait sec susvisé 10 Exemple 1 : Effet de l'additif sur un vin de type Sauvignon blanc avec un pH 3,25 L'effet de l'additif est vérifié par la mesure du taux d'hydrolyse des protéines d'une variété de vin. 15 Le protocole suivi est le suivant : Préparation : - Vin : type Sauvignon blanc présentant un pH 3,25. - Peser 3 quantités différentes de lyophilisat obtenu à l'étape 2 du procédé susvisé : 20 o 25,5mg à dissoudre dans 0,9m1 de vin blanc o 12,5 mg à dissoudre dans 0,9m1 de vin blanc. o 5 mg à dissoudre dans 0,9m1 de vin blanc. o 25,5mg à dissoudre dans 0,9m1 d'eau. - Laisser en contact pendant 16 heures, à la plaque agitant à 80 tr/min et à température ambiante. Adsorption et analyse des protéines après hydrolyse : - Ajouter ensuite 0,1 ml de bentonite (électra) à 10g/1. - Mettre à la roue pendant 30 minutes à 40 tr/min. - Centrifuger pendant 10 minutes à 7000 tr/min à 10 °C. - Reprendre le culot dans 0,05m1 de Laemmli 1X. - Mettre sur une plaque agitant pendant 16 heures à température ambiante. 8 - Centrifuger pendant 10 minutes à 7000 tr/min à 10 °C. - Réaliser l'analyse d'électrophorèse grâce à l'appareil Experion®. La figure 1 représente les profils 5 électrophorétiques d'un échantillon de vin blanc, avec le profil (1) du vin sans traitement, et les profils (2 à 4) du vin après traitement avec un additif selon l'invention, à des concentration respectivement de 25,5, 12,5, 5 mg/ml. La courbe (5) correspond au profil de l'extrait susvisé, avec une 10 concentration de 5 mg/ml dans de l'eau. Les profils ont été établis par un équipement d'électrophorèse EXPERION (nom commercial). Il en ressort que les protéines du vin ont été partiellement hydrolysées. Les échantillons traités avec 15 l'additif selon l'invention présentent les deux bandes associées aux protéines de raisin (28 et 33 kDa environ) et également une bande inférieure à 25 kDa qui correspond à la masse moléculaire de la bromélaïne. 20 Exemple 2 : Effet de l'additif sur un vin de type Sauvignon blanc avec un pH 3,34 et un vin Sauvigon blanc avec un pH ajusté à 3,8 Préparation : - Vin : type Sauvignon blanc présentant un pH 3,34 et 25 Sauvignon blanc avec un pH ajusté à 3,8. - Peser deux quantités différentes de lyophilisat obtenu à l'étape 2 du procédé susvisé : o 50mg à dissoudre dans 0,9m1 de vin blanc o 25,5mg à dissoudre dans 0,9m1 d'eau. 30 - Laisser en contact pendant 16 heures, à la plaque agitant à 80 tr/min et à température ambiante. Adsorption et analyse des protéines après hydrolyse : 9 - Ajouter ensuite 0,1 ml de bentonite (électra) à 10g/1. - Mettre à la roue pendant 30 minutes à 40 tr/min. - Centrifuger pendant 10 minutes à 7000 tr/min à 10 °C. - Reprendre le culot dans 0,05m1 de Laemmli 1X. 5 - Mettre sur une plaque agitant pendant 16 heures à température ambiante. - Centrifuger pendant 10 minutes à 7000 tr/min à 10 °C. - Réaliser l'analyse d'électrophorèse grâce à l'appareil Experion®. 10 La figure 2 représente les profils protéiques avec deux poids moléculaires, 28 Kda et 33 Kda, pour le premier vin de Sauvignon au pH 3,34. Les pics (11, 12 et 13) quantifient la teneur en protéines de poids de 28Kda respectivement du témoin sans 15 additif, du vin à pH 3,34 traité avec 25,5 mg/ml d'additif et du vin traité avec 50 mg/ml d'additif. Les pics (21, 22 et 23) quantifient la teneur en protéines de poids de 33 Kda respectivement du témoin sans additif, du vin à pH 3,34 traité avec 25,5 mg/ml d'additif et 20 du vin traité avec 50 mg/ml d'additif. On observe dans tous les cas une réduction de la teneur en protéine lors de l'ajout de l'additif, avec des effets différenciés en fonction du poids moléculaire. 25 La figure 3 représente les profils protéiques avec deux poids moléculaires, 28 Kda et 33 Kda, pour le premier vin de Sauvignon au pH 3,8. Les pics (41, 32 et 33) quantifient la teneur en 30 protéines de poids de 28Kda respectivement du témoin sans additif, du vin à pH 3,8 traité avec 25,5 mg/ml d'additif et du vin traité avec 50 mg/ml d'additif. Les pics (41, 42 et 43) quantifient la teneur en protéines de poids de 33 Kda respectivement du témoin sans 10 additif, du vin à pH 3,8 traité avec 25,5 mg/ml d'additif et du vin traité avec 50 mg/ml d'additif. On observe dans tous les cas une réduction de la teneur en protéine lors de l'ajout de l'additif, avec des 5 effets différenciés en fonction du poids moléculaire, de manière plus marquée que pour le vin à pH 3,34. Résultats Les résultats d'électrophorèse indiquent que le pH 10 plus élevé améliore l'efficacité de l'additif selon l'invention. Les résultats de la quantification des protéines de raisin (masses à 28 et à 33 kDa) sur les données de fluorescence confirment ceux observés sur gel. Le pH élevé 15 améliore l'activité de l'extrait à 50 mg/mL. Composition de l'additif En synthèse, l'additif selon l'invention comprend : - un composé actif principal constitué par la bromélaïne extraite du fruit d'ananas (et non pas des tiges, 20 feuilles ou racines) - un peptide ou un acide aminé ayant un composé soufré, notamment : - la cystéine - la méthionine. 25 - le glutathion. L'ajout d'acide aminé peut être réalisé sous forme de poudre ou de l'ajout d'extraits riches en acide aminé (écorce de levure sèche, crucifère, alliacés oignon, choux,...). REVENDICATIONS1 - Additif pour la stabilisation protéique de boissons à base de moûts végétaux comprenant de la bromélaïne caractérisé en ce que la bromélaïne est extraite du fruit d'ananas et en ce qu'il contient en outre un acide aminé soufré ou un peptide comprenant un acide aminé soufré. 2 - Additif pour la stabilisation protéique de boissons à base de moûts végétaux selon la revendication 1 10 caractérisé en ce que ledit acide aminé est de la cystéine. 3 - Additif pour la stabilisation protéique de boissons à base de moûts végétaux selon la revendication 1 caractérisé en ce que ledit acide aminé est de la méthionine. 15 4 - Additif pour la stabilisation protéique de boissons à base de moûts végétaux selon la revendication 1 caractérisé en ce que ledit peptide est du glutathion. 20 5 - Additif pour la stabilisation protéique de boissons à base de moûts végétaux caractérisé en ce que ladite boisson est le vin et en ce que ledit additif comprend de la bromélaïne extraite du fruit d'ananas et en outre un acide aminé soufré ou un peptide comprenant un acide aminé soufré. 25 6 - Additif pour la stabilisation protéique de boissons à base de moûts végétaux caractérisé en ce que ladite boisson est la bière et en ce qu'il comprend de la bromélaïne extraite du fruit d'ananas et en outre un acide aminé soufré 30 ou un peptide comprenant un acide aminé soufré. 7 - Additif pour la stabilisation protéique de boissons à base de moûts végétaux caractérisé en ce que ladite boisson est le jus de fruits et en ce qu'il comprend de la 12 bromélaïne extraite du fruit d'ananas et en outre un acide aminé soufré ou un peptide comprenant un acide aminé soufré. 8 - Procédé de préparation d'un additif pour la 5 stabilisation protéique de boissons à base de moûts végétaux comportant les étapes suivantes : - broyage et extraction de fruits d'ananas frais avec un tampon à pH supérieur à 5 et un acide aminé soufré ou un peptide comprenant un acide aminé soufré - centrifugation à une température comprise entre 2°C et 8°C. - clarification et ultrafiltration. 9 - Procédé de stabilisation protéique de boissons 15 à base de moûts végétaux consistant à ajouter, pour un litre de jus de fruit, une dose comprise entre 5 mg/ml et 30 mg/ml d'un additif selon l'une au moins des revendications 1 à 4. 10 - Procédé de stabilisation protéique de vin 20 consistant à ajouter, pour un litre de vin, une dose comprise entre 5 mg/ml et 30 mg/ml d'un additif selon l'une au moins des revendications 1 à 4. 11 - Procédé de stabilisation protéique de bière 25 consistant à ajouter, pour un litre de bière, une dose comprise entre 5 mg/ml et 30 mg/ml d'un additif selon l'une au moins des revendications 1 à 4. 12 - Procédé de stabilisation protéique de jus de 30 fruits consistant à ajouter, pour un litre de jus de fruit, une dose comprise entre 5 mg/ml et 30 mg/ml d'un additif selon l'une au moins des revendications 1 à 4.