Brevet FR3069325A1 — publié le 20190125

L'invention concerne un procédé autonome d'évaluation en ligne de la toxicité de solutions aqueuses par analyse du comportement locomoteur d'organismes aquatiques de petite taille (0.1cnn-5cnn) maintenus en état léthargique. CONTEXTE ET ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE La qualité de la ressource en eau est une préoccupation sociétale majeure à la fois du point de vue de la préservation de l'environnement mais aussi de la santé. C'est pourquoi les états membres de l'Union Européenne se sont fixés des lignes directrices capitales à savoir une épuration des eaux de rejet (91/271/CEE), limiter l'entrée dans l'environnement de substances prioritaires (2013/39/UE), réduire à la source l'entrée de contaminants et atteindre un - bon état » des masses d'eau sur l'ensemble du territoire (DCE 2000/60/CE). Bien que la majorité des déversements des rejets urbains et industriels passe par une phase de traitement, ces derniers sont aujourd'hui conçus pour éliminer principalement la matière organique et limiter l'eutrophisation des milieux aquatiques liée à l'apport d'azote et de phosphore selon la sensibilité de l'hydrosystènne récepteur. Toutefois, les rejets restent un vecteur important d'entrée de contaminants (nnicropolluants) dans l'environnement (Cairns et Van Der Schalie, 1980), constituant un enjeu fort aujourd'hui pour les gestionnaires du traitement des eaux usées et constituent un élément clef dans la protection des milieux et la préservation de la ressource en eau. Le principe de - surveillance des systèmes de collecte des eaux usées et des stations d'épuration en vue d'en maintenir et d'en vérifier l'efficacité » par les collectivités est institué depuis 1991 par la directive européenne sur le traitement des Eaux Résiduaires Urbaines (ERU). Les récentes évolutions de la législation française, notamment par l'arrêté ministériel du 21 juillet 2015 impose une approche, à l'échelle du système d'assainissement, d'autoévaluation. Aujourd'hui, ces systèmes d'autoévaluation reposent sur des prélèvements ponctuels, moyennes sur 24h, ne permettant pas de connaitre le fonctionnement dynamique de la station. Dans l'anticipation d'une législation plus sévère et dans le but de limiter l'apport de contaminants dans l'environnement, une réelle demande d'outil d'analyse de la qualité des rejets en ligne est formulée de la part des gestionnaires de l'eau public et privé. Au-delà de l'aspect réglementaire, le développement d'outils d'auto-surveillance constituerait une réelle opportunité pour affiner les connaissances des gestionnaires sur leur rejet, notamment leur évolution dans le temps, et de caractériser en temps-réel leur qualité pour optimiser la gestion des systèmes d'assainissement. Pour obtenir une évaluation globale, robuste et significative du point de vue environnemental, il est choisi de s'appuyer sur des valeurs écotoxicologiques. Les analyses chimiques, avec les 2 techniques actuelles et pour la caractérisation des rejets, semblent difficiles en raison des fortes hétérogénéités temporelles et du grand nombre de molécules qui les compose (Cairns et Van Der Van, 1980 ; Sornonn, 2012). De plus, le simple fait de connaitre les concentrations de quelques produits ne suffit pas pour produire des informations de gestion utile (Cairns et Van 5 Der Schalie, 1980), c'est pourquoi l'utilisation d'outils biologiques, qui intègrent tous les facteurs du milieu et la part biodisponible des contaminants présents dans le rejet est plus prometteuse. Par ailleurs, évaluer en ligne la qualité des rejets sans passer par des prélèvements ponctuels comme c'est le cas aujourd'hui pour pratiquer des tests de toxicité normalisés Afnor permettrait d'éviter un grand nombre de limites actuelles de la bioévaluation 10 (évaluation ponctuelle, dénaturation des échantillons lors du transport et de leur conservation, réponse longue à acquérir). L'utilisation d'outils biologiques, notamment l'analyse du comportement locomoteur pour évaluer la qualité toxique des rejets est une solution robuste et adéquate puisque ce bionnarqueur est reconnu pour être ubiquiste, généraliste et avoir un temps très court de 15 réponse (Blaxter et Hallers-Tjabbes, 1992; Hellou, 2011). Ce bionnarqueur est basé notamment sur des réponses de chénnoréceptions de l'organisme (Gerhardt, 1996). Le suivi en ligne du comportement locomoteur permet de détecter de plus faibles concentrations de contaminants que les études de létalité conventionnelles (10-1000 fois plus sensibles) (Hellou et al., 2008; Robinson 2009) et de connaitre, avec un pas de temps faible, la toxicité des 20 rejets avant leurs déversements dans le milieu naturel. L'idée d'utiliser des nnacroorganisnnes aquatiques pour évaluer la toxicité en continu de milieux aquatiques n'est pas nouvelle. Des dispositifs ont commencé à se développer en se basant sur le suivi de poissons (Henderson et Pickering, 1963) puis se sont affinés pour suivre des invertébrés comme le gammare, l'hydropsyche (Gerhardt, 1996), la daphnie (Ren et al. 2007; 25 Jeon et al., 2008, Chevalier, 2014). L'ensemble de ces travaux assoit la pertinence de l'utilisation du bionnarqueur de l'activité locomotrice dans l'évaluation précoce et sensible de contaminant dans l'eau. A présent que la preuve de pertinence n'est plus à faire, il est nécessaire d'adapter ce concept d'outils à l'analyse des eaux de rejet et de les rendre autonomes. Pour ce faire, d'importants verrous doivent être levés à savoir la conception d'un 30 dispositif permettant le suivi à long terme de l'ordre de plusieurs semaines, de plusieurs nnacroorganisnnes simultanément et adapté pour recevoir des eaux de rejets (Figure 1). Il est également nécessaire de développer un signal toxique adapté à l'évaluation en ligne et sur site des rejets urbains et industriels. Ce dernier doit détecter de faibles concentrations de contaminants tout en excluant des facteurs de confusion intrinsèques aux conditions de 35 l'exposition, à savoir la présence de vibrations sur les sites industriels ou urbains (pompe, activité humaine, passage de véhicule, etc.) et les variations naturelles de compositions 3 physico-chimiques en ions majeurs de l'eau de rejet, qui peuvent avoir une incidence sur le comportement locomoteur des bioessais. Un des procédés d'analyse consiste à surveiller ces nnacroorganisnnes vivants pendant toute la durée de l'exposition pour en étudier le comportement, et en déduire en continu la toxicité du 5 milieu testé tout au long de l'exposition. Pour ce faire, un organisme est disposé dans un récipient transparent au moins sur une face d'observation, et des images du récipient sont acquises à travers la face d'observation par un innageur disposé en face de la face d'observation. Toutefois, s'agissant d'êtres vivants, il existe un certain aléa quant à la réaction de l'organisme vivant à l'exposition du rejet étudié et potentiellement toxique, voire même des pertes 10 inévitables de ceux-ci. Il est donc nécessaire d'étudier plusieurs êtres vivants simultanément et de faire un traitement statistique des résultats pour gommer ces aléas. Il n'est cependant pas opportun généralement de disposer plusieurs êtres vivants dans le même récipient puisque les nnacroorganisnnes peuvent alors interférer entre eux, ce qui peut compliquer l'interprétation des résultats de la surveillance. 15 Le principe du procédé de l'invention repose sur la mise en état léthargique des nnacrorganisnnes avant leur exposition dans des conditions d'observation stables et contrôlées. Cette léthargie correspond ici à un comportement locomoteur minimal de l'espèce observée (extrême réduction de la locomotion, absence de comportement de recherche alimentaire et de prise alimentaire). La présence de contaminants dans le milieu d'exposition se traduit alors 20 par une sortie de cet état de léthargie du fait des capacités de chénnoréception des organismes utilisés et du comportement d'évitement face au stress chimique qui s'en suit. Le procédé de l'invention ne nécessite a priori pas de liquide témoin. Pour se garantir de la robustesse de la détection de cette réponse de sortie de l'état léthargique, il est avantageux d'étudier un lot d'individus homogène au regard de leurs caractéristiques biologiques : individus calibrés en 25 sexe, taille, statut reproducteur, provenant d'une population unique, de préférence stabulés au laboratoire avant la transplantation dans les chambres d'observation. Il est également nécessaire que les êtres vivants conservent cette homogénéité au cours de la période d'observation (absence de mue, de ponte, de croissance). Le procédé de l'invention est particulièrement avantageux car il permet d'évaluer en ligne la 30 toxicité de façon autonome entre 2 et 30 jours de suivi avec une fréquence d'évaluation sur des pas de temps faibles (entre 2-120 minutes). FIGURES Figure 1 : Photographie du toxinnètre développé par Irstea-ViewPoint 4 Figure 2 : Graphique d'enregistrement de l'évolution de l'indice locomoteur lors de changements brutaux de conductivité Figure 3 : Evolution de l'indice locomoteur sur 3 semaines lors d'ajout ponctuel de solution contaminée au Méthonnyl (100pg/L) 5 Figure 4 : Suivi de la qualité toxique d'eau traitée à la sortie d'une station d'épuration durant 28 jours Figure 5 : photographie de Gammarus fossarum (Amphipode de la famille des Gannnnaridae 8- 30nnnn) Figure 6 : photographie de Erpobdella testacea (Annelide sous classe des Hirudinea (sangsue) 10 de 15-40nnnn) Figure 7 : photographie de Radix auricularia (Gastéropode pulmoné de 6-30nnnn) Figure 8 : Photographie d'une ZebraBox DEFINITIONS 15 Au sens de la présente invention, « mouvement » signifie changement de position dans l'espace. Ce changement peut se caractériser de multiples manières comme la mesure d'une distance parcourue, une vitesse, une rotation, les changements d'orientation d'un corps entier ou d'une de ses parties (tête, patte, etc.). Au sens de la présente invention, « comportement » signifie mesure de mouvement par unité 20 de temps. Au sens de la présente invention, état de léthargie signifie l'état d'un lot d'individus caractérisé par un comportement moyen (i) constant sur une durée de deux heures a minima, de préférence 6 heures et avantageusement 12 heures, et (ii) diminué a minima de 60%, de préférence de 80% et de façon avantageuse de 90% par rapport au comportement mesuré pendant la première 25 heure d'observation du lot d'individus. Au sens de la présente invention, sortie de la léthargie signifie l'augmentation du comportement moyen d'un lot d'individus d'au moins un facteur deux sur une période d'au moins 10 minutes. Au sens de la présente invention, « stabulation » signifie maintien en conditions contrôlées (pH, 30 alimentation, conductivité, luminosité) des nnacroorganisnnes aquatiques, afin d'homogénéiser le lot d'individus utilisés lors de l'expérimentation (réserves énergétiques, état physiologique) et éliminer les individus affaiblis lors du prélèvement, et les conditionner aux conditions d'exposition futures. Au sens de la présente invention, « indice locomoteur » correspond à une distance moyenne 35 calculée selon les contextes d'étude (terrain ou laboratoire) sur les 10 à 80% des valeurs les 5 plus faibles de distances individuelles parcourues. L'indice locomoteur est la moyenne de ces distances les plus faibles. Cet indice locomoteur est calculé sur un pas de temps d'intégration pouvant être choisi entre 2 et 120 minutes. Les valeurs de distances parcourues sont mises au carré avant le calcul de l'indice, ainsi l'indice locomoteur s'exprime en nnnn2/unité de temps. 5 Au sens de la présente invention, - contaminant » signifie l'ensemble des substances chimiques (produits phytosanitaires, métaux lourds, NAPs, polluants organiques, résidus médicamenteux, etc.) capable d'engendrer un comportement d'évitement chez les nnacroorganisnnes exposés. DESCRIPTION DETAILLEE 10 L'invention concerne un procédé de détermination de la présence d'un contaminant dans un liquide, de préférence l'eau, comprenant les étapes suivantes : a) un lot de nnacroorganisnnes aquatiques de petite taille sont conditionnés afin qu'ils entrent dans un état léthargique b) lesdits nnacroorganisnnes aquatiques sont immergés dans le liquide, chaque organisme 15 étant isolé individuellement, c) le comportement de chaque organisme aquatique est enregistré en continu lors de l'exposition ; d) les données de comportement sont analysées au moyen d'un dispositif de traitement pour déterminer le comportement des nnacroorganisnnes aquatiques 20 e) la présence de contaminants toxiques est déterminée en fonction du comportement des nnacroorganisnnes aquatiques ; caractérisé en ce que l'analyse des données comprend la détermination, pour chacune des espèces desdits nnacroorganisnnes aquatiques, d'un comportement moyen représentatif des déplacements des nnacroorganisnnes aquatiques de cette espèce pendant une durée 25 déterminée, les nnacroorganisnnes aquatiques étant placés pendant la période d'observation dans des conditions dans lesquelles l'absence de toxicité se traduit par le maintien de l'ensemble du lot de nnacroorganisnnes dans un état léthargique, lesdites conditions étant favorables au maintien en vie desdits nnacroorganisnnes aquatiques et comprenant une absence d'apport de nourriture pendant la période d'observation, 30 et en ce que la détermination de la présence de toxicité comprend la comparaison dudit comportement moyen par rapport au comportement moyen de l'état léthargique, la présence de toxicité étant avérée lorsque le comportement moyen augmente d'au moins un facteur deux sur une période d'au moins 10 minutes. 6 Tous les nnacroorganisnnes aquatiques peuvent être placés dans des conditions adéquates d'absence de stimuli permettant d'atteindre l'état léthargique. Le procédé de l'invention est particulièrement avantageux car autonome sur une durée prolongée d'au moins deux jours, de préférence d'au moins deux semaines et de manière 5 particulièrement préférée de 30 jours. Chaque nnacroorganisnne aquatique est isolé individuellement dans une chambre d'observation afin de s'assurer que les données d'un individu ne sont pas perturbées par la présence d'un ou plusieurs autres individus et d'assurer une évaluation robuste en ayant un grand nombre de réplicats. 10 Avantageusement, au moins 12 nnacroorganisnnes, de préférence au moins 16 nnacroorganisnnes, par espèce sont inclus dans le procédé de l'invention et observés (Figure 1). De préférence, à l'étape c) le comportement de chaque organisme aquatique est enregistré par acquisition simultanée d'images au moyen d'un innageur ou par mesure de l'impédance (- Monitoring Behavioural Responses to Metals in Gammarus pulex (L.) (Crustacea) with 15 Innpeadance Conversion, Alnnut Gerhardt, Environ. Sci. And Pollut. Res. 2(1), 1995). Les images sont analysées et le calcul de l'indice locomoteur est calculé en continu et transmis en ligne (sur un site internet) en temps-réel. De préférence, le procédé selon l'invention est précédé d'une étape préalable à l'étape a) de sélection des nnacroorganisnnes aquatiques pour que chaque espèce représente une population 20 d'êtres vivants la plus homogène possible : calibrés en sexe, taille, statut reproducteur, non- parasités. Avantageusement, les individus de chaque espèce proviennent d'une population unique. Il est également nécessaire que cette population d'êtres vivants conserve son homogénéité : pas de mue, pas de ponte, pas d'alimentation. 25 Les réserves énergétiques des nnacroorganisnnes choisis permettent leur maintien en vie pendant toute la durée de mise en oeuvre du procédé selon l'invention sans apport de nourriture, de préférence durant au moins deux jours, de manière particulièrement préférée durant un mois. Ainsi, l'acquisition des images n'est pas perturbée par un apport de nourriture dans le liquide. Les daphnies ne sont pas adaptées au procédé de l'invention puisque ne 30 supportant pas une diète prolongée. De préférence, les nnacroorganisnnes aquatiques sont préalablement sélectionnés pour qu'ils représentent une population homogène en taille, en sexe et non-parasitée. 7 On privilégiera des individus qui n'auront pas de petits pendant la durée du procédé, par exemple de sexe non-femelle ou immatures sexuellement afin d'éviter la production de petits dans le liquide qui perturberont l'acquisition des images. On privilégiera des individus qui ne muent pas pendant la durée du procédé. 5 De préférence encore, les nnacroorganisnnes aquatiques seront préalablement à l'étape b) stabulés afin de les acclimater aux conditions de la mesure. Lesdits nnacroorganisnnes peuvent appartenir à la même espèce ou être choisis parmi plusieurs espèces, de préférence d'ordres phylogénétiques différents, de préférence jusqu'à trois espèces. 10 De préférence, lesdits nnacroorganisnnes aquatiques sont des invertébrés, des poissons, des têtards. Lesdits nnacroorganisnnes aquatiques sont de petite taille, de préférence une taille inférieure à 5 cm, de préférence inférieure à 2 cm, de manière particulièrement préférée inférieure à 1 cm. 15 Avantageusement, on privilégiera des gastéropodes, des sangsues et/ou des crustacés. De préférence, l'espèce de gastéropode est du genre Radix, de préférence Radix auricularia. De préférence, l'espèce de sangsue est de l'ordre des Arhynchobdellida, de préférence de la famille des Erpobdellidae, par exemple Erpobdella testacea. De préférence, l'espèce de crustacé est un amphipode, de préférence de la famille des 20 Gannnnaridae, par exemple Gammarus fossarum. Avantageusement, lesdits nnacroorganisnnes aquatiques présentent un taux de survie de plus de 80% à 30 jours de diète dans les conditions physico-chimiques du procédé de l'invention sans contaminant. De préférence, les images sont acquises à l'étape c) toutes les 66 nnS (15 Hertz) et intégrées 25 sur 20 secondes. EXEMPLES Dans les exemples, sont exposés uniquement des nnacroorganisnnes calibrés en termes de taille, sexe, non parasités, provenant d'une population unique et stabulés deux semaines en 30 laboratoire. Les nnacroorganisnnes sont placés dans un encagement sous caméra où seize individus sont placés seuls dans un volume de 50m1 d'eau. L'encagement est construit à partir de matériaux neutres (polypropylène) et sans la moindre utilisation de produits toxiques (pas de colle). Ces encagements (Figure 1) sont branchés à une 8 alimentation de liquide préalablement buttée, thernno-régulée et filtrée puis circule dans la chambre qui reçoit l'effluent à un débit de 6L/h. Pendant la durée d'exposition (30 jours), les nnacroorganisnnes sont exposés dans des conditions favorables à leur maintien (13±2°C, saturée d'oxygène et sans prédateur) et mis en diète pour 5 homogénéiser le comportement (les réserves énergétiques des nnacroorganisnnes choisis permettent dans ces conditions leur maintien en vie durant un mois). L'une des applications possibles de l'évaluation en ligne de la toxicité d'un liquide par l'analyse du comportement de fuite de nnacroorganisnnes est l'analyse des eaux de rejets urbains ou industriels en sortie de traitement. L'outil est conçu pour être transportable et effectuer les 10 mesures sur site afin d'avoir une évaluation en direct et en continu. Une première expérience a été effectuée dans une station d'épuration afin d'intégrer dans le suivi de la toxicité des eaux traitées tous les facteurs qui peuvent avoir une influence sur le comportement des nnacroorganisnnes en les activant et biaiser l'évaluation de la toxicité (vibrations issues des pompes, des activités humaines, passages de véhicules, etc.). De plus, les eaux traitées 15 présentent des variations naturelles physico-chimiques dans le temps (selon les déversements dans le bassin versant, épisodes pluvieux, fonctionnement station d'épuration, etc.). Pour mesurer l'influence de ces deux facteurs, à savoir les perturbations sur site et les variations physico-chimiques, trois toxinnètres ont été placées dans une station d'épuration connectées avec de l'eau non-contaminée durant 9 jours. Les deux premiers jours permettent aux sondes 20 biologiques d'atteindre un état léthargique caractérisé par une inactivité qui ne sont pas présentés dans ce résultat. A la suite de ces deux jours, le suivi de la toxicité démarre. Au quatrième jour, il a été ajouté de manière brutale dans les toxinnètres 1 et 2 des solutions enrichies en sels afin de passer à une conductivité de 400 us.cnn-1 à respectivement 1400 et 1900uS.cnn-1. Ces changements de conductivité ont été mesurés en continu par un 25 conductinnètre. Les suivis des trois toxinnètres sont présentés dans la Figure 2. L'indice locomoteur de chacun des toxinnètres ne présente aucune modification durant les fortes variations de conductivités où durant l'ensemble de l'expérience due aux perturbations de vibrations engendrées par l'activité intrinsèque de la station. L'expérience montre que la méthode d'analyse de la toxicité développée exclut deux importants facteurs de confusion à 30 savoir les variations dans le temps de la conductivité et la présence de perturbations dues à l'activité de la station d'épuration. Cet outil et la méthode de calcul sont ainsi appropriés pour l'évaluation en ligne de la toxicité des eaux traitées. Une expérimentation a été menée pour vérifier la détection de toxicité par le toxinnètre et sa méthode de calcul de l'indice locomoteur. Trois toxinnètres sont connectés à une eau non- 35 contaminée puis le toxinnètre 1 reçoit 1 épisode de contamination de 20-24h aux semaines 1,2 et 3, le toxinnètre 2 reçoit un épisode de contamination de 20-24h aux semaines 2 et 3 et le toxinnètre 3 sert de témoin afin de s'assurer que les potentielles activations des sondes biologiques ne soient pas issues d'une perturbation (forte vibration). L'épisode de 9 contamination correspond à l'ajout d'un insecticide, le nnéthonnyl, à une concentration de 100pg.L-1. Cette concentration est choisie élevée pour être sûr d'observer des effets sur le comportement locomoteur des nnacroorganisnnes sélectionnés (LC50 chez la Daphnie à 28pg.L-1 après 48h d'exposition). Les trois suivis sont présentés dans la Figure 3. Il est observé que la 5 méthode de suivi permet de détecter une toxicité du produit en 3h, et cela même après plusieurs épisodes de contamination. Il est important de souligner que ces concentrations, dans un environnement d'eau de sortie de station d'épuration peuvent être habituelles. Après avoir ainsi validé que l'indice locomoteur développé détecte la toxicité de contaminants 10 à des concentrations environnementales et qu'il est insensible aux variations de teneurs en ions majeurs, un suivi de la toxicité d'une eau en sortie de traitement de station d'épuration a été effectué. Deux toxinnètres ont été connectés en ligne sur les rejets d'une station d'épuration et un dernier a été connecté à une eau non-contaminée afin d'assurer une condition témoin sur sites. Les suivis sont présentés dans la Figure 4. Ce suivi montre que le dispositif développé 15 permet de suivre en totale autonomie durant un mois l'activité locomotrice des nnacroorganisnnes dans le toxinnètre alors qu'il est connecté à une eau en sortie de traitement (eau trouble, forte teneur en MES). Le témoin présente un indice locomoteur constant et très faible le long du suivi correspondant au maintien de l'état léthargique du lot d'individus exposés sur site. En contraste, les deux toxinnètres, connectés à la même eau de rejet en parallèle de 20 ce témoin, détecte simultanément deux épisodes de sortie de l'état léthargique traçant une dégradation de la qualité toxique des effluents ; un premier le 7 octobre 2016 de 11h30 à 16h et un second le 10 octobre 2016 de 10h à 12h30. L'outil et la méthode développés permettent ainsi de suivre en ligne la qualité toxique d'une solution aqueuse en autonomie par l'analyse du comportement de fuite de nnacroorganisnnes. 25 Les étapes de cette évaluation sont successivement la sélection des espèces, le prélèvement, la stabulation pendant une quinzaine de jours, le tri (calibration), la mise en chambre d'encagement, mise en eau du toxinnètre à l'effluent et l'analyse individuelle en continu du comportement locomoteur des nnacroorganisnnes. 30 EXEMPLE 1 : SELECTION DES ESPECES, PRELEVEMENT, STABULATION ET TRI DES MACROORGANISMES I. MATERIEL - SELECTION DES ESPECES : troubleau, colonne de tamis, seaux en polyéthylène, installation 35 pour stabulation à 13°C en aquarium de 16L. - PRELEVEMENT : troubleau, colonne de tamis de vide de maille 1.6nnnn, 2 mm, 2,5 mm et un dégrilleur, seaux en polyéthylène. - STABULATION : installation pour stabulation à 13 °C en aquariums de 16L. 10 - TRI : table lumineuse ; plats transparents en pyrex ; maille ; épuisette ; seaux en polypropylène (type seaux alimentaires), plaque en polystyrène. II. METHODE 5 11.1. SELECTION DES ESPECES La sélection des espèces est une étape primordiale puisqu'elle influe directement sur la pertinence de l'évaluation toxique. Les critères de sélection vérifiés sur le cheptel d'espèces testé au laboratoire sont décrits ci-dessous avec leur justification : - correspondance entre la zone de répartition de l'espèce et le site d'étude pour ne pas 10 apporter de pollution biologique dans les milieux aquatiques en cas d'accident. - présent en forte quantité dans l'environnement toute l'année afin de ne pas être limité à un moment donné par la réserve d'organisme. - pouvant survivre plus de 30 jours en diète car le toxinnètre se veut indépendant sur un mois et que la présence d'une réserve de nourriture altérerait la qualité du vidéo-tracking. 15 - ordre phylogénétique différent, représentatif de la biodiversité rivulaire, et sensible à la présence de contaminants. En augmentant la diversité des espèces, le spectre de sensibilité aux contaminants est plus important avec des sensibilités différentes. L'évaluation à partir de ce toxinnètre se révèle pertinent puisqu'il possède une représentativité environnementale. - comportement mesurable en continu et dans le temps afin d'obtenir un diagnostic en direct 20 et prévenir rapidement les gestionnaires en cas de problèmes. - une espèce placée à horizontale et deux autres à la verticale pour optimiser la place dans le toxinnètre (cube de 30cnn). - facilement nnanipulable, transportable et stabulable afin que la mise en place demeure facile. Les nnacroorganisnnes sélectionnés pour l'évaluation toxique des rejets en Europe sont 25 Gammarus fossarum (Figure 5), qui est placé dans l'encagement horizontal, Erpobdella testacea (Figure 6) et Radix auricularia (Figure 7) sont placés dans les encagements verticaux. 11.2. PRELEVEMENT DES MACROORGANISMES Les nnacroorganisnnes proviennent d'une population source présentant de fortes densités tout 30 au long de l'année. Dans l'exemple développé, les organismes sont issus de l'ancienne cressonnière du Bugey sur la commune de Saint-Maurice-de-Rennens, dans le département de l'Ain qui a été définie comme station de prélèvement. Le prélèvement est effectué à l'aide d'un troubleau en régime stabilisé dans les différents habitats de chacune des espèces. 35 L'échantillon recueilli au fond du troubleau est ensuite déposé sur la colonne de tamis de vide de maille de 1,60nnnn, 2,00 mm, 2,50 mm et du dégrilleur. Un rinçage sur la colonne de tamis est ensuite effectué à l'aide d'un seau, puis directement dans la rivière. Les nnacroorganisnnes sont contenus dans les différents tamis. 11 Cette opération est répétée plusieurs fois selon la quantité de nnacroorganisnnes souhaitée. 11.3. STABULATION DES MACROORGANISMES AVANT IMPLANTATION DANS LE TOXIMETRE Avant stabulation, chaque espèce est séparée des autres nnacroorganisnnes, des débris végétaux 5 et minéraux. Ensuite, ils sont placés dans des aquariums de 16 L contenant de l'eau du site renouvelée au goutte à goutte (volume renouvelé quatre fois par jour) par une eau douce de forage d'une conductivité de 450 uS.cnn-1, oxygénée par l'intermédiaire d'un bullage continu. L'aquarium est placé dans un bain marie thernno-régulé à 13 ± 1°C, exposé à une photopériode de 14 heures de jour / 10 heures de nuit. L'alimentation est effectuée ad libitum et la durée 10 de stabulation préconisée est de deux semaines. La stabulation a pour objectif d'éliminer les nnacroorganisnnes affaiblis lors du prélèvement, d'assurer une certaine homogénéité physiologique » des nnacroorganisnnes utilisés quelle que soit la saison (réserves énergétiques, taux d'activité comportementale comme la locomotion, l'alimentation), et de les acclimater aux futures conditions d'exposition. Les caractéristiques de l'eau de stabulation sont les 15 suivantes : température = 13 ± 1 °C ; conductivité = 450 ± 50 uS.cnn-1 ; pH = 7,6 ± 0,2 ; photopériode = 14h jour /10h nuit. Les nnacroorganisnnes sont placés à l'obscurité les deux derniers jours avant l'installation dans le toxinnètre. 11.4. TRI DES MACROORGANISMES (CALIBRATION) 20 La préparation des nnacroorganisnnes s'effectue au laboratoire quelques jours avant l'exposition. Les nnacroorganisnnes sélectionnés sont des mâles (pour les gammares, les radix et sangsues sont hermaphrodites), non-parasités et de taille uniforme pour chaque espèce. Le tri s'effectue sur table lumineuse avec de l'eau du milieu de stabulation. Le sexage s'effectue à l'ceil nu. Les nnacroorganisnnes sont séparés et placés avec de la nourriture adaptée dans un 25 encagement de polypropylène, matériaux sans effet toxique. A l'aide d'une maille, les nnacroorganisnnes sont triés selon les critères de taille, sexe et non parasité de chaque espèce puis les transférer dans le second plat. Seuls les gammares ayant juste mués, peuvent intégrer le toxinnètre afin d'éviter une activation due à une mue. 30 ETAPE 2 : MISE EN PLACE DE L'EXPERIMENTATION Une installation doit être montée sur le site d'étude afin de suivre le comportement locomoteur des nnacroinvertébrés aquatiques. Les nnacroinvertébrés aquatiques sont placés individuellement dans des cellules afin de suivre le comportement locomoteur des nnacroorganisnnes. Le Toxinnètre ou les ZebraBoxe (Figure 8) (Viewpoint, 35 ht ° "..1zebrabox) sont appropriés pour ce genre de suivi. La solution à tester est préalablement filtrée ( REVENDICATIONS1. Procédé de détermination de la présence d'un contaminant dans un liquide, de préférence l'eau, comprenant les étapes suivantes : a) un lot de nnacroorganisnnes aquatiques de petite taille sont conditionnés afin qu'ils entrent dans un état léthargique b) lesdits nnacroorganisnnes aquatiques sont immergés dans le liquide, chaque organisme étant isolé individuellement, c) le comportement de chaque organisme aquatique est enregistré en continu lors de l'exposition ; d) les données de comportement sont analysées au moyen d'un dispositif de traitement pour déterminer le comportement des nnacroorganisnnes aquatiques e) la présence de contaminants toxiques est déterminée en fonction du comportement des nnacroorganisnnes aquatiques ; caractérisé en ce que l'analyse des données comprend la détermination, pour chacune des espèces desdits nnacroorganisnnes aquatiques, d'un comportement moyen représentatif des déplacements des nnacroorganisnnes aquatiques de cette espèce pendant une durée déterminée, les nnacroorganisnnes aquatiques étant placés pendant la période d'observation dans des conditions dans lesquelles l'absence de toxicité se traduit par le maintien de l'ensemble du lot de nnacroorganisnnes dans un état léthargique, lesdites conditions étant favorables au maintien en vie desdits nnacroorganisnnes aquatiques et comprenant une absence d'apport de nourriture pendant la période d'observation, et en ce que la détermination de la présence de toxicité comprend la comparaison dudit comportement moyen par rapport au comportement moyen de l'état léthargique, la présence 25 de toxicité étant avérée lorsque le comportement moyen augmente d'au moins un facteur deux sur une période d'au moins 10 minutes. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que à l'étape c) le comportement de chaque organisme aquatique est enregistré par acquisition simultanée d'images au moyen 30 d'un innageur. 14 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, lesdits nnacroorganisnnes étant choisis parmi une ou plusieurs espèces d'ordres phylogénétiques différents, de préférence de une à trois espèces. 5 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, lesdits nnacroorganisnnes étant choisis parmi les gastéropodes, les sangsues et/ou les crustacés. 5. Procédé selon la revendication 4, lesdits gastéropodes étant du genre Radix, de préférence Radix auricularia. 10 6. Procédé selon la revendication 4 ou 5, lesdites sangsues étant de l'ordre des Arhynchobdellida, de préférence de la famille des Erpobdellidae, par exemple Erpobdella testacea. 15 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, lesdits crustacés étant des amphipodes, de préférence de la famille des Gannnnaridae, par exemple Gammarus fossarum, 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, comprenant une étape 20 préalable à l'étape a) de sélection des nnacroorganisnnes aquatiques pour que chaque espèce représente une population homogène en taille, en sexe et non-parasitée. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, chaque espèce de nnacroorganisnnes aquatiques provenant d'une population unique. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, présentant une étape de stabulation préalable à l'étape b) desdits nnacroorganisnnes aquatiques afin de les acclimater aux conditions de la mesure. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, lesdits nnacroorganisnnes aquatiques n'étant pas des nnacroorganisnnes femelles. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, lesdits nnacroorganisnnes aquatiques présentant un taux de survie de plus de 80% à 30 jours de diète.