Brevet FR3068364A1 — publié le 20190104

UTILISATION DE SOUCHES DE SARCOCYSTIDAE COMME VECTEURS MULTIRECOMBINANTS D'ANTIGENES POUR LA PREVENTION DE MALADIES INFECTIEUSES Les Apicomplexes sont des parasites majoritairement intracellulaires obligatoires qui possèdent un cycle de vie pouvant faire intervenir plusieurs hôtes. Le phylum de ces parasites se subdivise en plusieurs familles. Toxoplasma gondii (T gondii) appartient à la famille des Sarcocystidae. Le chat, hôte définitif, excrète le parasite dans l'environnement sous forme d'oocystes. Les hôtes intermédiaires (i.e. l'ensemble des homéothermes) et définitif peuvent s'infecter en ingérant des oocystes présents sur les aliments. Le parasite se transforme alors en tachyzoïtes qui se disséminent dans l'organisme et qui, sous la pression du système immunitaire, s'enkystent avec un tropisme préférentiel pour le système nerveux central, la rétine ou les muscles. L'ingestion de tissus enkystés est la deuxième cause de contamination des hôtes définitifs et intermédiaires. Récemment, une souche vivante atténuée de Toxoplasma gondii, le parasite responsable de la toxoplasmose a été mise au point par invalidation de deux gènes codant pour les protéines TgMIC1 et TgMIC3 (Cérède et al., 2005, 1 Exp. Med., 201(3) : 453-63). Cette souche, dénommée Toxo micI-3 KO génère une réponse immunitaire forte et spécifique contre Toxoplasma gondii et permet de prévenir les effets d'une infection ultérieure chez la souris (Ismael et al., 2006, 1 Infect. Dis., 194(8) : 1176-83) et chez la brebis (Mévelec et al., 2010, Vet. Res., 41(4) :49). Neospora caninum (N. caninum) est un parasite intracellulaire, responsable de la néosporose. Il appartient également à la famille des Sarcocystidae. Le cycle de vie de Neospora caninum est très proche de celui de T gondii avec deux phases distinctes : une phase sexuée chez l'hôte final (i.e. les canidés et le chien en particulier) qui conduit à la production d'oocystes éliminés dans les fèces et une phase asexuée chez un hôte intermédiaire (i.e. les ovins, les caprins, les bovins, les équidés, etc...) qui conduit à la production de tachyzoïtes puis de kystes contenant les bradyzoïtes. Plus récemment, il a été obtenu une souche vivante atténuée de Neospora caninum, la souche Neo ncmicI-3 KO, qui a été invalidée pour les gènes ncmicl et ncmic3 par recombinaison homologue. Il a été montré que cette souche mutante possède des propriétés infectieuses et immunogènes conférant aux mammifères une protection vaccinale vis-à-vis des effets délétères de la néosporose. 2 Les parasites de la famille Sarcocystis tels que Toxoplasma gondii et Neospora caninum peuvent être utilisés pour exprimer des protéines hétérologues provenant d'autres parasites tels que Plasmodium spp, Cryptosporidium parvum ou Leishmania spp. Ainsi, la souche sauvage RH de Toxoplasma gondii a été utilisée comme vecteur de l'antigène CSP (Protéine Circum Sporozoite) de Plasmodium knowlesi (Di Cristina et al., 1999, Infect Immun., 67(4) : 1677-82). Après intégration aléatoire de la séquence d'intérêt, la souche recombinante a été inoculée à des singes Rhesus et induit chez l'animal une réponse immunitaire humorale spécifique de la protéine CSP. En la souche thermosensible ts-4 HXGPRT-/- de Toxoplasma gondii a été utilisé comme vecteur de l'antigène CSP de Plasmodium yoelii (Charest et al., 2000, 1 Immunol., 165(4) : 2084-92). Après intégration aléatoire de la séquence d'intérêt, les parasites recombinants ont été inoculés à la souris induisant une réponse immunitaire humorale spécifique de l'antigène CSP mais insuffisante pour induire une protection contre une infection avec Plasmodium yoelii. Une souche de Toxoplasma gondii a également été utilisée pour exprimer les gènes gp40, gp15 et le précurseur gp40/gp15 de Cryptosporidium parvum, le parasite responsable de la cryptosporidiose (O'Connor et al., Infect. Immun., 2003 71(10) :6027-35; O'Connor et al., 2007, Mol Biochem Parasitol., 152(2) :148-58). Les gènes gp40/gp15, gp40 et gp15 ont été clonés, placés sous le contrôle d'un promoteur de T gondii et intégrés de manière aléatoire dans le génome du parasite. Les auteurs ont montré que les parasites recombinants exprimaient les protéines d'intérêt et que la glycosylation de la protéine GP40 exprimée par T gondii était similaire à la glycosylation de la protéine native. Cependant, les auteurs ont démontré que le clivage de la pré-protéine GP40/GP15 était inefficace dans les tachyzoïtes bien que des enzymes permettant le clivage soient présentes chez le parasite T gondii. Une autre équipe s'est également intéressée à l'utilisation de Toxoplasma gondii comme vecteur d'antigène de Cryptosporidium parvum et notamment de la protéine de surface immunodominante P23 (Shirafuji et al., 2005, 1 Parasitol., 91(2) :476-9). Le poids moléculaire et les propriétés antigéniques de P23 recombinantes sont similaires à ceux de protéine native et des souris immunisées avec des tachyzoïtes lyses exprimant la protéine P23 produisent des anticorps neutralisant dirigés contre C. parvum. Enfin, T gondii a été utilisé comme vecteur d'expression de l'antigène Kmpl 1 de Leishmania. La souche recombinante obtenue permet une protection significative des animaux lors d'un challenge avec L. major (Ramirez et al ., 2001, Vaccine, 20:455-61). Neospora caninum a également été utilisé comme vecteur d'antigènes hétérologues et une souche recombinante de N. caninum exprimant de manière stable l'antigène SAG1 de 3 T gondii a été construite (Zhang et al., 2010, Vaccine, 60(1) :105-7). Le niveau d'expression, le poids moléculaire et les propriétés antigéniques de la protéine SAG1 exprimée dans N. caninum sont similaires à ceux de la protéine SAG1 native et des souris immunisées produisent une réponse immunitaire de type Thl spécifique de SAG1 de T gondii et sont protégées contre un challenge létal avec T gondii. Les méganucléases sont des endonucléases qui reconnaissent des sites d'ADN très spécifiques de 12 à 45 paires de bases (Thierry et Dujon, 1992, Nucleic Acids Res., 20(21) :5625-31). Dans la Nature, les méganucléases sont retrouvées chez des phages, des bactéries, des archaebactéries et chez différents eucaryotes. Les méganucléases induisent au niveau de leur site de restriction, une coupure double brin de l'ADN (Rouet et al., 1994, Mol Cell Biot., 14(12) :8095-106; Choulika et al., 1995, Mol. Cell Biot., 15(4) :1968-73 ; Elliott et al., 1998, Mol. Cell Biot., 18(1) :93-101 ; Donoho et al., 1998, Mol. Cell Biot., 18(7) :4070-8 ; Puchta et al., 1993, Nucleic Acids Res., 21(22) :5034-40; Rong et Golic, 2000; Rong et Golic, 2001, Science, 288(5473) :2013-8). La très haute spécificité de reconnaissance des sites de restriction et les propriétés d'endonucléase qui favorisent la recombinaison homologue, offre des perspectives de développement très importantes en génie génétique. Des recherches ont été entreprises pour modifier le site de reconnaissance des méganucléases en modifiant les acides aminés qui participent à l'interaction avec l'ADN sans modifier l'efficacité catalytique de la protéine (Seligman et al., 2002, Nucleic Acids Res., 30(17) :3870- 9 ; Sussman et al., 2004, 1 Mol. Biot., 342(1) ::31-41 ; Rosen et al., 2006, Nucleic Acids Res., 34(17) :4791-800; Doyon et al., 2006, 1 Am. Chem. Soc., 128(7) :2477-84). Une méthodologie pour modifier spécifiquement le site de reconnaissance avec l'ADN et basée sur un screening haut-débit a été précédemment décrit (Arnould et al., 2006, 1 Mol. Biot., 355(3) :443-58) et a permis d'aboutir à la construction de nombreuses méganucléases aux propriétés différentes et qui peuvent être utilisées dans de nombreuses applications. La plupart des thérapies géniques sont basées sur des approches de complémentation dans lesquelles un gène défaillant est complété par l'apport d'une copie saine, en utilisant les fonctions de certains virus qui permettent l'intégration aléatoire, dans le génome, du gène correctif entrainant la réparation du défaut génétique (Hacein-Bey-Abina et al., 2008, J. Clin. Invest., 118(9) :3132-42). Cette approche efficace présente cependant de nombreuses limites et notamment la possibilité que le gène correctif s'insère dans un gène endogène ou qu'il provoque l'activation transcriptionnelle de gènes voisins. L'utilisation des méganucléases en 4 thérapie génique va permettre d'intégrer le gène correctif non plus de manière aléatoire mais en remplacement du gène défaillant. Différentes études in vitro réalisées sur cellules embryonnaires ont démontré que les fréquences de recombinaison étaient comprises entre 10-5 et 10-1 évenements par cellules (Alwin et al., 2005, Mol Ther., 12(4) :610-7). Récemment, des méganucléases dérivées d'I-CreI ont démontré leur efficacité à induire une recombinaison ciblée de gènes endogènes sur deux loci humains différents, XPG et RAG1 (Smith et al., Nucleic Acids Res., 32(22) :e149; Arnould et al., 2007, J. Mol. Biol., 371(1) :49-65; Grizot et al., 2009, Nucleic Acids Res., 37(16) : 5405-19; Grizot et al., 2009, Nucleic Acids Res., 38(6) : 2006-18) avec des taux de recombinaison pouvant atteindre 6%. Ces fréquences de recombinaison peuvent être suffisante pour des stratégies de réparation de gènes. Les méganucléases peuvent également être utilisées comme agent antiviral notamment pour les virus à ADN double brin ou pour les virus qui impliquent dans leur cycle une étape ADN double brin. Les méganucléases peuvent être utilisées pour cliver spécifiquement l'ADN viral et soit exciser soit éliminer l'ADN viral des cellules de l'hôte. L'un des avantages de cette approche est la possibilité de cibler les formes latentes du virus. Des expériences en utilisant un herpes-virus (HSV-1) contenant un site de reconnaissance I-SceI ont démontré que la réplication virale pouvait être réduite drastiquement dans des cellules transcfectées avec un plasmide d'expression de l'enzyme I-SceI (Galetto et al., 2009, Expert Opin. Biol Ther., 9(10) : 1289-303). De plus, la méganucléases I-CreI modifiée pour spéficiquement reconnaître un site de l'HSV1 permet de réduire de 50% la charge virale (Grosse et al., 2011, Mol. Ther., 19(4) :694-702). Enfin, les méganucléases peuvent être utilisées comme outil de recherche in cellulo. En effet, comme les méganucléases sont des enzymes de restriction très spécifique qui facilite la recombinaison homologue ciblée dans différents types cellulaires et différents espèces (Arnould et al., 2007, J. Mol. Biol., 371(1) :49-65 ; Grizot et al., 2009, Nucleic Acids Res., 37(16) : 5405-19; Grizot et al., 2009, Nucleic Acids Res., 38(6) : 2006-18), elles représentent de puissants outils de recherche pour les modifications génétiques in cellulo incluant l'insertion de transgène, les délétions de gènes et la modulation de l'expression des gènes. Dans la présente invention, nous avons utilisé les propriétés des méganucléases pour modifier spécifiquement des parasites de la famille des Sarcocystidae tels que Toxoplasma gondii et Neospora caninum et pour construire des souches parasitaires exprimant simultanément plusieurs antigènes hétérologues provenant de parasites, de virus ou de bactéries. La présente invention est la première description de l'utilisation des méganucléases chez des parasites mais également la première description de souches de Sarcocystidae exprimant plusieurs antigènes et potentiellement utilisables en tant qu'outil prophylactique. La présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle la fonction d'au moins une protéine essentielle à la virulence est supprimée, caractérisée en qu'elle contient au moins un acide nucléique codant respectivement pour au moins un antigène hétérologue immunogène et les éléments nécessaires à son expression, sous réserve que lorsque ladite souche mutante contient un acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène, ladite souche mutante est dépourvue de gène de sélection. Par « protéine essentielle à la virulence » on entend une protéine dont la suppression de la fonction permet de réduire significativement la virulence in vivo du parasite de la famille des Sarcocystidae. Par « antigène hétérologue immunogène » on entend tout peptide ou protéine provenant d'un organisme différent de ladite souche mutante et capable de provoquer une réaction immunitaire. Un antigène peut correspondre à un épitope ou à plusieurs épitopes, cela peut être une protéine entière hétérologue, une protéine de fusion, un fragment de protéine, un peptide, une polyprotéine, un polypeptide. L'expression « moyens nécessaire à l'expression » s'entend de tout moyen qui permet d'obtenir une protéine correspondant ici audit antigène hétérologue immunogène, notamment un promoteur, un terminateur de transcription, une origine de réplication, une séquence de Kozak. Lesdits moyens nécessaires à l'expression sont liés de façon opérationnelle audit acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène. L'expression « liés de façon opérationnelle », fait référence à une juxtaposition desdits moyens nécessaires à l'expression et l'ADN hétérologue, lesquels sont en une relation telle que cela leur permet de fonctionner de façon attendue. Par exemple, il peut exister des bases 6 supplémentaires entre le promoteur et le gène d'intérêt tant que leur relation fonctionnelle est préservée. Par l'expression « sous réserve que lorsque ladite souche mutante contient un acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène, ladite souche mutante est dépourvue de gène de sélection», on entend que dans le cas où une souche mutante selon l'invention comporte seulement un acide nucléique codant pour un antigène, cette souche ne contient pas de gène de sélection. Cependant, lorsqu'une souche mutante selon l'invention comporte deux acides nucléiques ou plus, codant respectivement pour un antigène hétérologue immunogène, cette souche peut : - soit contenir un gène de sélection, - soit ne pas contenir de gène de sélection, et ainsi être dépourvue de gène de sélection. Par « gène de sélection », on entend tout gène permettant la survie des cellules en présence d'agents normalement toxiques. Un gène de sélection permet d'apporter notamment la résistance à un antibiotique, un antiparasitaire ou un antiviral. Par exemple, le gène cat (chloramphenicol acetyl transferase) permet la résistance au chloramphénicol, le gène dhfr*(Dihydrofolate reductase) permet la résistance à la pyriméthamine, le gène ble permet la résistance à la phléomycine . On entend également tout gène permettant la mort des cellules en présence d'agents normalement non toxiques. Un gène de contre sélection permet d'apporter la sensibilité à un antibiotique, un antiparasitaire ou un antiviral. Par exemple, le gène TK (Thymidine kinase) permet la sensibilité au ganciclovir. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle la fonction d'au moins une protéine essentielle à la virulence est supprimée, caractérisée en qu'elle contient au moins un acide nucléique codant respectivement pour au moins un antigène hétérologue immunogène et les éléments nécessaires à son expression, et caractérisée en ce qu'elle est dépourvue de gène de sélection. 7 Autrement dit dans ce mode de réalisation, une souche mutante selon l'invention comportant un acide nucléique, deux acides nucléiques ou plus, codant chacun respectivement pour un antigène hétérologue immunogène, ne contient pas de gène de sélection. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae, dans laquelle la fonction de deux protéines essentielles à la virulence sont supprimées, lesdites deux protéines étant les protéines MIC1 et MIC3. Les protéines MIC1 et MIC3 sont des protéines des micronèmes, organelles sécrétoires des Apicomplexes qui jouent un rôle central dans la reconnaissance et l'adhésion aux cellules hôtes. Elles sont respectivement codées par les gènes mic/ et mic3. La suppression de la fonction des protéines MIC3 et MIC1, conduit à une souche mutante qui possède des propriétés infectieuses et immunogènes conférant aux mammifères une protection vaccinale. La famille des Sarcocystidae est une famille qui s'inscrit dans le phylum des Apicomplexes , et qui renferme notamment les genres Toxoplasma spp. et Neospora spp.. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae telle que décrite précédemment, ladite souche mutante étant une souche du genre Toxoplasma spp., en particulier une souche de l'espèce Toxoplasma gondii. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae telle que décrite précédemment, ladite souche mutante étant une souche du genre Neospora spp., en particulier une souche de l'espèce Neospora caninum. 8 Les protéines sont les effecteurs de l'activité cellulaire. La suppression de la fonction d'une protéine peut résulter de son absence de biosynthèse ou de sa non fonctionnalité. L'origine de ce dysfonctionnement peut être liée à des perturbations survenant lors de la transcription du gène codant la protéine, lors de sa traduction ou encore survenir lors de processus de maturation de la protéine (modifications post-traductionelles). La délétion du gène explique également qu'aucune protéine ne puisse être synthétisée. Dans la présente invention, on entend par « la fonction de la protéine MIC1 est supprimée », soit l'absence de l'expression de la protéine MIC1, soit l'expression d'une protéine MIC1 non fonctionnelle, par exemple l'expression d'une protéine ne possédant pas la fonction de la protéine MIC1 et ayant une certaine identité de séquence en acides aminés avec celle de la protéine MIC1 . On entend par « la fonction de la protéine MIC3 est supprimée », soit l'absence de l'expression de MIC3, soit l'expression d'une protéine MIC3 non fonctionnelle, par exemple une protéine ne possédant pas la fonction de la protéine MIC3 et ayant une certaine identité de séquence en acides aminés avec celle de la protéine MIC3. L'absence de l'expression de la protéine MIC1 et de la protéine MIC3 peut résulter de la délétion de la totalité des gènes mic/ et mic3 codant respectivement pour les protéines MIC1 et MIC3, ou de sa région codante, ou d'une mutation, d'une délétion ou d'une insertion d'un ou plusieurs nucléotides dans la région codante des gènes mic/ et mic3 entrainant l'absence d'expression des protéines ou des protéines avec peu d'identité de séquence en acides aminés avec les protéines MIC1 et MIC3, ou d'un dysfonctionnement de la région promotrice ou de la région régulatrice en cis ou en trans des gènes mic/ et mic3, ou d'un dysfonctionnement d'un ou plusieurs facteurs de transcription susceptibles de se lier à ladite région promotrice, ou d'un dysfonctionnement de la traduction de l'ARN messager, ou de quelques modifications épigénétiques bien connues de l'homme de l'art. Ainsi, la fonction d'une protéine peut être supprimée par l'inhibition de l'expression des gènes. On entend par « inhibition de l'expression des gènes mic/ et mic3 », tous les mécanismes qui perturbent la transcription des gènes mic/ et mic3 en un ARN messager ou tous les mécanismes qui perturbent la traduction des ARN messager en protéines MIC1 et MIC3, ces deux étapes étant nécessaires à la synthèse d'une protéine MIC1 et MIC3 fonctionnelle. 9 Une protéine MIC1 non fonctionnelle ou une protéine MIC3 non fonctionnelle est une protéine qui ne possède pas la capacité de reconnaître les cellules hôtes ou qui ne permet pas l'adhésion du parasite audites cellules hôtes. Une protéine non fonctionnelle peut résulter d'une délétion ou d'une insertion d'un ou plusieurs acides aminés ou du décalage du cadre de lecture. Dans ce cas de figure, la modification de l'acide nucléique de la région codante ne bloque pas le mécanisme d'expression de la protéine qui peut éventuellement conserver une certaine identité de séquence en acides aminés avec celle de la protéine MIC1 ou celle de la protéine MIC3, mais change le cadre de lecture de l'ARNm correspondant lors de la traduction de la protéine. La non fonctionnalité de la protéine MIC3 et de la protéine MIC1, peut également être la conséquence de modifications post-traductionnelles inopérantes ou insuffisantes (i.e. glycosylation, isoprénylation, phosphorylation, sulfatation, amidation, acétylation, alkylation, etc) et qui lui permettaient d'assurer sa fonction. La fonction des protéines MIC3 et MIC1, peut également être supprimée de manière indirecte, notamment en altérant ou en supprimant l'expression d'une ou plusieurs autres protéines (notamment d'autres adhésines) qui se lient aux protéines MIC3 et MIC1, pour former un complexe fonctionnel. La déstructuration d'un tel complexe entraine une perte de fonction des protéines MIC3 et MIC1. La fonction d'une protéine peut être supprimée par : - une mutation, une délétion ou une insertion d'un ou plusieurs nucléotides dans la séquence nucléotidique du gène codant pour ladite protéine, ou - la délétion totale du gène codant pour ladite protéine, ou - la délétion totale ou partielle de la région promotrice et/ou la délétion totale ou partielle de la séquence codante, ou - une déstabilisation de l'ARN messager résultant de la transcription du gène codant pour ladite protéine, ou - une inhibition de la traduction de l'ARN messager du gène codant pour ladite protéine. Par « mutation d'un ou plusieurs nucléotides », on entend la substitution, permutation ou le remplacement d'un ou plusieurs nucléotides d'une séquence nucléotidique par un ou plusieurs nucléotides non présents dans la séquence sauvage. Par séquence sauvage, on désigne la séquence nucléotidique trouvée à l'état naturel dans la souche sauvage du parasite. La séquence sauvage est par définition dépourvue de toute intervention humaine par le biais du génie génétique. Par « délétion d'un ou plusieurs nucléotides », on entend la suppression d'un ou plusieurs nucléotides d'une séquence nucléotidique. Par « insertion d'un ou plusieurs nucléotides », on entend l'addition, l'ajout ou l'intégration d'un ou plusieurs nucléotides dans une séquence nucléotidique. La mutation, la délétion ou l'insertion d'un ou plusieurs nucléotides peut avoir lieu à l'intérieur d'un ou plusieurs exons du gène correspondant et modifier par conséquent la région codante dudit gène, ou bien avoir lieu à l'intérieur d'un ou plusieurs introns et modifier le site d'épissage d'un intron concerné. Cette modification du site d'épissage change par conséquent le cadre de lecture de l'ARNm et aboutit à la traduction d'une nouvelle protéine dont la séquence en acides aminés diffère de la séquence de la protéine dite sauvage. On entend par « délétion totale du gène », la délétion de la séquence codante entière (introns et exons), la délétion de la région promotrice et la délétion des régions transcrites non traduites 5' et 3', dites 5' et 3'UTR, le terme « gène » désignant la région promotrice (également appelée promoteur), la séquence codante et les régions 5' et 3' UTR. On entend par « délétion totale de la région promotrice », la suppression de la séquence promotrice totale c'est-à-dire la suppression de la séquence nucléotidique située en amont de la région 5' UTR transcrite non traduite qui sert de boitier de régulation de l'expression d'un gène. La délétion partielle de la région promotrice ou la délétion partielle de la séquence codante correspond à une délétion partielle du gène. Par délétion partielle de la séquence codante on entend la suppression d'une partie des exons de la séquence codante, suffisante pour altérer la fonction de la protéine exprimée, ou la suppression d'une partie des introns entrainant une altération de l'épissage. On entend par « délétion partielle de la région promotrice », la suppression d'une partie de la séquence promotrice c'est-à-dire d'une partie de la séquence nucléotidique située en amont de la région 5' UTR transcrite non traduite qui sert de boitier de régulation de l'expression d'un gène. Par « déstabilisation de l'ARN messager », on entend une diminution de sa durée de demi-vie, c'est-à-dire de la période de temps pendant laquelle un ARN messager est disponible pour permettre sa traduction en une protéine. La stabilisation des ARN messagers est assurée par des éléments cis (les séquences 5' et 3' UTR bordant les séquences codantes d'un gène) et des 11 éléments trans, notamment des protéines capables de se lier aux éléments cis. La durée de demi-vie d'un ARN messager peut varier en réponse à divers stimuli tels que des facteurs environnementaux, des facteurs de croissance ou des hormones. Une modification, réalisée in vitro par génie génétique, des séquences nucléotidiques des éléments cis est susceptible de modifier la durée de demi-vie de l'ARN messager. Par « inhibition de la traduction de l'ARN messager d'un gène », on entend le blocage de la traduction de l'ARN messager en la protéine lui correspondant. Dans ce cas de figure, l'ARN messager d'un gène est présent dans la cellule, alors que la protéine lui correspondant est absente. L'inhibition de la traduction de l'ARN messager d'un gène peut résulter du dysfonctionnement d'un élément de la machinerie traductionnelle, notamment des ribosomes, des ARNs ribosomiques (ARNr) ou des ARNs de transfert (ARNt), ou des aminoacyl-ARNt synthétases. Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae, dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par : - une mutation, une délétion ou une insertion d'un ou plusieurs nucléotides dans la séquence nucléotidique du gène mic/ codant pour la protéine MIC1 et/ou dans la séquence promotrice du gène mic/, ou - la délétion totale du gène mic/, ou - la délétion totale ou partielle de la région promotrice et/ou la délétion totale ou partielle de la séquence codante du gène mic/, ou - une déstabilisation de l'ARN messager résultant de la transcription du gène mic/, ou - une inhibition de la traduction de l'ARN messager du gène mic/, et dans laquelle la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par : - une mutation, une délétion ou une insertion d'un ou plusieurs nucléotides dans la séquence nucléotidique du gène mic3 codant pour la protéine MIC3 ou dans la séquence promotrice du gène mic3, ou - la délétion totale du gène mic3, ou - la délétion totale ou partielle de la région promotrice et/ou la délétion totale ou partielle de la séquence codante du gène mic3, ou 12 - une déstabilisation de l'ARN messager résultant de la transcription du gène mic3, ou - une inhibition de la traduction de l'ARN messager du gène mic3. Selon un mode de réalisation plus particulier, la souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est une souche dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par délétion totale du gène mic/, et la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par délétion totale du gène mic3. Dans un mode de réalisation, ladite souche mutante de Sarcocystidae selon l'invention, comporte au moins un acide nucléique codant respectivement pour au moins un antigène hétérologue immunogène de virus, de parasite ou de bactérie. Ledit virus peut appartenir aux groupes suivant : - Groupe I, II de la classification de Baltimore comprenant les virus dont le génome est constitué d'ADN susceptible d'infecter un poussin, en particulier un virus naturel appartenant à la famille des Herpesviridae, et plus particulièrement le virus de la maladie Marek chez la poule domestique, - Groupe III, IV et V de la classification de Baltimore comprenant les virus dont le génome est constitué d'ARN simple brin ou double brin et qui sont susceptibles d'affecter un poussin, en particulier des virus appartenant à la famille des Orthomyxoviridae et plus particulièrement les virus Influenza aviaires. - Groupe VI de la classification de Baltimore comprenant les virus à ARN requérant une rétrotranscription en ADN pour la multiplication virale et susceptibles d'infecter un poussin, en particulier les virus de la famille des Retroviridae, - Groupe VII de la classification de Baltimore comprenant les virus à ADN requérant une rétrotranscription en ARN pour la multiplication virale et susceptibles d'infecter un poussin, en particulier les virus de la famille des 13 Hepadnaviridae, et plus particulièrement le virus de l'hépatite du canard de Pekin (DHBV). Ledit virus qui peut être : - un myxovirus, en particulier le virus Influenza, ou - un coronavirus, en particulier le virus de la bronchite infectieuse aviaire, ou - un reovirus, en particulier du virus de l'arthrite virale du poulet, ou - un picornavirus, en particulier le virus de l'hépatite du caneton, - un herpesvirus, en particulier le virus de la maladie de Mareck, - un adénovirus, en particulier le virus de l'entérite hémorragique de la dinde. Dans un mode de réalisation particulier, ladite souche mutante de Sarcocystidae selon l'invention, comporte au moins un acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène de virus, ledit virus étant le virus Influenza. Ladite bactérie peut appartenir aux groupes suivant : - Des Coques GRAM positif qui sont susceptibles d'affecter un poussin directement ou par l'un de ces sous-produits' en particulier des bactéries appartenant au genre Staphylococcus, Streptococcus ou Enteroccoccus ; - Des Coques GRAM négatif qui sont susceptibles d'affecter un poussin directement ou par l'un de ces sous-produits, en particulier des bactéries appartenant au genre Neisseria ; - Des bacilles GRAM positif qui sont susceptibles d'affecter un poussin directement ou par l'un de ces sous-produits, en particulier des bactéries appartenant au genre Listeria, Erysipelothryx, Corynebacterium ou Bacillus ; - Des bacilles GRAM négatif qui sont susceptibles d'affecter un poussin directement ou par l'un de ces sous-produits, en particulier des bactéries appartenant à la famille des Enterobacteriacae. Pseudomonaceae, Vibrionaceae ou appartenant aux genres Escherichia, Brucella, Haemophilus, Pasteurella, Bordetella, Legionella, Ornithobacterium ou Salmonella ; - Des bactéries de forme spiralées GRAM positives ou négatives qui sont susceptibles d'affecter un poussin directement ou par l'un de ces sous-produits, en 14 particulier des bactéries appartenant au genre Treponema, Leptospira ou Borrelia ; - Des bactéries de type mycoplasme qui sont susceptibles d'affecter un poussin directement ou par l'un de ces sous-produits, en particulier des bactéries appartenant au genre Mycoplasma et Ureaplasma ; - Des bactéries non sus-mentionnées ayant la capacité d'envahir une cellule de poussin, en particulier des bactéries appartenant au genre Chlamydia, Rickettsia ou Mycobacterium. Plus particulièrement, ladite bactérie peut être une bactérie des genres: - Escherichia spp., en particulier l'espèce Escherichia cou - Clostridium spp. en particulier l'espèce Clostridium perfringens - Mycoplasma spp., en particulier l'espèce Mycoplasma gallisepticum, - Salmonella spp., en particulier l'espèce Salmonella pullorum, responsable de la salmonellose aviaire. - Pasteurella spp., en particulier l'espèce Pasteurella multocida - Ornithobacterium spp., en particulier l'espèce Ornithobacterium rhinotracheale - Chlamydia spp., responsable de la chlamydiose, en particulier Chlamydia abortum Salmonella Enteritidis est responsable de toxi-infections alimentaires et de gastro-entérites. L'Homme s'infecte par l'intermédiaire de viandes de volailles ou d'oeufs contaminés. La poule domestique est l'un des plus importants vecteurs de salmonelles. Elle s'infecte par voie orale. La bactérie colonise ensuite le tube digestif et peut s'implanter durablement dans les ovaires au cours d'une phase transitoire de dissémination systémique. Le portage long terme dans le tube digestif, notamment dans les coeca, est responsable de la contamination des viandes lors de l'abattage et de la contamination de la coquille d'oeuf lors du passage par le cloaque. Le portage des salmonelles dans les ovaires peut être responsable du transfert vertical des salmonelles à l'intérieur de l'oeuf. Ce mode de contamination est moins fréquent mais potentiellement plus dangereux car il est difficilement détectable et il n'y a pas de mesure corrective possible. Dans un mode de réalisation particulier, ladite souche mutante de Sarcocystidae selon l'invention, comporte au moins un acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène de bactérie, ladite bactérie étant Chlamydia abortum. Ledit parasite peut appartenir aux groupes suivant : - Protozoaires susceptibles d'affecter directement un poussin, en particulier des protozoaires appartenant à l'embranchement des sporozoaires, Rhizoflagellés, des ciliés ou appartenant aux genres Encephalitozoon, Enterocytozoon ou Blastocystis ; - Némathelminthes susceptibles d'affecter directement un poussin, en particulier des Némathelminthes appartenant au genre Trichuris, Ascaris, Anisakis, Necator, Strongyloïdes, Toxocara, Ancylostoma, Trichinella, Loa, Onchocerca, Wichereria, ou Enterobius ; - Plathelminthes susceptibles d'affecter directement un poussin, en particulier des Plathelminthes appartenant au genre Fasciola, Paragonimus, Opisthorchis, Sasciolopsis, Dicrocoelium, Clonorchis, Taenia, Diphyllobothrium, Echinococcus, Multiceps, Hymenolepsis et Shistosoma ; - Arthropodes susceptibles d'être responsable d'une affection ou de la vectorisation d'un agent infectieux vis-à-vis un poussin, en particulier des arthropodes appartenant à l'ordre des Anoploures des hétéroptères, des Shiphonaptères, des Diptères, des Brachycères ou des Acariens. Plus particulièrement, ledit parasite qui peut être : - Eimeria spp., en particulier l'espèce Eimeria acervulina responsable de la coccidiose - Echinuria spp., en particulier l'espèce Echinuria uncinata responsable de la spirurose - Trichostrongylus spp. en particulier l'espèce Trichostrongylus tenuis - Ascaris spp., en particulier l'espèce Ascaridia galli - Cestoda spp. en particulier l'espèce Choanotaenia infundibulum - Leishmania spp., en particulier l'espèce Leishmania infantum. Dans un mode de réalisation particulier, ladite souche mutante de Sarcocystidae selon l'invention, comporte au moins un acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène de parasite, ledit parasite étant Leishmania infantum. 16 La leishmaniose est une maladie grave, engageant le pronostic vital de l'animal, dont le diagnostic n'est pas toujours aisé et dont le traitement est lourd et coûteux. Il s'agit également d'une maladie transmissible à l'homme. Le chien, bien qu'il ne soit pas forcément directement responsable de la contamination humaine, constitue un important réservoir du parasite (y compris les chiens porteurs du parasite mais n'exprimant pas la maladie). La leishmaniose est une infection due au parasite Leishmania spp. Elle se contracte via des piqûres répétées d'un insecte : le phlébotome. Selon un mode de réalisation particulier, la souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est caractérisée en ce qu'elle contient au moins deux acides nucléiques codant respectivement pour au moins deux antigènes hétérologues immunogènes. Selon un mode de réalisation particulier, la souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est caractérisée en ce qu'elle contient au moins deux acides nucléiques codant respectivement pour au moins deux antigènes hétérologues immunogènes de virus. Dans un mode de réalisation particulier, lesdits au moins deux antigènes hétérologues immunogènes de virus sont des antigènes d'un même virus. Dans un mode de réalisation particulier, lesdits au moins deux antigènes hétérologues immunogènes de virus sont des antigènes hétérologues immunogènes de deux virus distincts. Selon un mode de réalisation particulier, la souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est caractérisée en ce qu'elle contient au moins deux acides nucléiques codant respectivement pour au moins deux antigènes hétérologues immunogènes de bactérie. Dans un mode de réalisation particulier, lesdits au moins deux antigènes hétérologues immunogènes de bactérie sont des antigènes hétérologues immunogènes d'une même espèce de bactérie. 17 Dans un mode de réalisation particulier, lesdits au moins deux antigènes hétérologues immunogènes de bactérie sont des antigènes hétérologues immunogènes d'espèces de bactéries distinctes. Par « espèces de bactéries distinctes », on entend qu'il s'agit de deux espèces de bactéries différentes. Selon un mode de réalisation particulier, la souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est caractérisée en ce qu'elle contient au moins deux acides nucléiques codant respectivement pour au moins deux antigènes hétérologues immunogènes de parasite. Dans un mode de réalisation particulier, lesdits au moins deux antigènes hétérologues immunogènes de parasite sont des antigènes hétérologues immunogènes d'une même espèce de parasite. Dans un mode de réalisation particulier, lesdits au moins deux antigènes hétérologues immunogènes de parasite sont des antigènes hétérologues immunogènes d'espèces de parasites distinctes. Par « espèces de parasites distinctes », on entend qu'il s'agit de deux espèces de parasites différentes. Selon un mode de réalisation particulier, la souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est caractérisée en ce qu'elle contient au moins deux acides nucléiques codant respectivement pour au moins deux antigènes hétérologues immunogènes, dans laquelle au moins l'un desdits au moins deux acides nucléiques est un acide nucléique codant pour antigène hétérologue immunogène de virus et au moins l'un desdits au moins deux acides nucléiques est un acide nucléique codant pour antigène hétérologue immunogène de bactérie. Selon un mode de réalisation particulier, la souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est caractérisée en ce qu'elle contient au moins deux acides nucléiques codant respectivement pour au moins deux antigènes hétérologues immunogènes, dans laquelle 18 au moins l'un desdits au moins deux acides nucléiques est un acide nucléique codant pour antigène hétérologue immunogène de virus et au moins l'un desdits au moins deux acides nucléiques est un acide nucléique codant pour antigène hétérologue immunogène de parasite. Selon un mode de réalisation particulier, la souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est caractérisée en ce qu'elle contient au moins deux acides nucléiques codant respectivement pour au moins deux antigènes hétérologues immunogènes, dans laquelle au moins l'un desdits au moins deux acides nucléiques est un acide nucléique codant pour antigène hétérologue immunogène de bactérie et au moins l'un desdits au moins deux acides nucléiques est un acide nucléique codant pour antigène hétérologue immunogène de parasite. Selon un mode de réalisation particulier, la souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est caractérisée en ce qu'elle contient au moins trois acides nucléiques codant respectivement pour au moins trois antigènes hétérologues immunogènes. Selon un mode de réalisation particulier, la souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est caractérisée en ce qu'elle contient au moins trois acides nucléiques codant respectivement pour au moins trois antigènes hétérologues immunogènes de virus. Selon un mode de réalisation particulier, la souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est caractérisée en ce qu'elle contient au moins trois acides nucléiques codant respectivement pour au moins trois antigènes hétérologues immunogènes de bactérie. Selon un mode de réalisation particulier, la souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est caractérisée en ce qu'elle contient au moins trois acides nucléiques codant respectivement pour au moins trois antigènes hétérologues immunogènes de parasites. Selon un mode de réalisation particulier, la souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est caractérisée en ce qu'elle contient au moins trois acides nucléiques codant respectivement pour au moins trois antigènes hétérologues immunogènes, dans laquelle au moins l'un desdits au moins trois acides nucléiques est un acide nucléique codant pour antigène hétérologue immunogène de bactérie et 19 au moins l'un desdits au moins trois acides nucléiques est un acide nucléique codant pour antigène hétérologue immunogène de parasite et au moins l'un desdits au moins trois acides nucléiques est un acide nucléique codant pour antigène hétérologue immunogène de virus. Selon un mode de réalisation particulier, la souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est caractérisée en ce qu'elle contient au moins trois acides nucléiques codant respectivement pour au moins trois antigènes hétérologues immunogènes, dans laquelle au moins deux desdits au moins trois acides nucléiques sont des acides nucléiques codant respectivement pour deux antigènes hétérologues immunogènes de virus et au moins un desdits au moins trois acides nucléiques est un acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène de parasite. Selon un mode de réalisation particulier, la souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est caractérisée en ce qu'elle contient au moins trois acides nucléiques codant respectivement pour au moins trois antigènes hétérologues immunogènes, dans laquelle au moins deux desdits au moins trois acides nucléiques sont des acides nucléiques codant respectivement pour deux antigènes hétérologues immunogènes de parasite et au moins un desdits au moins trois acides nucléiques est un acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène de virus. Selon un mode de réalisation particulier, la souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est caractérisée en ce qu'elle contient au moins trois acides nucléiques codant respectivement pour au moins trois antigènes hétérologues immunogènes, dans laquelle au moins deux desdits au moins trois acides nucléiques sont des acides nucléiques codant respectivement pour deux antigènes hétérologues immunogènes de bactérie et au moins un desdits au moins trois acides nucléiques est un acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène de parasite. Selon un mode de réalisation particulier, la souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est caractérisée en ce qu'elle contient au moins trois acides nucléiques codant respectivement pour au moins trois antigènes hétérologues immunogènes, dans laquelle au moins deux desdits au moins trois acides nucléiques sont des acides nucléiques codant respectivement pour deux antigènes hétérologues immunogènes de parasite et au moins un desdits au moins trois acides nucléiques est un acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène de bactérie. Selon un mode de réalisation particulier, la souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est caractérisée en ce qu'elle contient au moins trois acides nucléiques codant respectivement pour au moins trois antigènes hétérologues immunogènes, dans laquelle au moins deux desdits au moins trois acides nucléiques sont des acides nucléiques codant respectivement pour deux antigènes hétérologues immunogènes de virus et au moins un desdits au moins trois acides nucléiques est un acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène de bactérie. Selon un mode de réalisation particulier, la souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est caractérisée en ce qu'elle contient au moins trois acides nucléiques codant respectivement pour au moins trois antigènes hétérologues immunogènes, dans laquelle au moins deux desdits au moins trois acides nucléiques sont des acides nucléiques codant respectivement pour deux antigènes hétérologues immunogènes de bactérie et au moins un desdits au moins trois acides nucléiques est un acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène de virus. Selon un mode de réalisation particulier, ladite souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est une souche dans laquelle ledit au moins un acide nucléique code pour au moins un antigène hétérologue immunogène de virus, ledit antigène hétérologue immunogène étant un antigène hétérologue immunogène du virus Influenza choisi parmi la liste A suivante: la protéine de SEQ ID NO : 211 (fragment N-ter du virus influenza humain), ou la protéine de SEQ ID NO : 214 (fragment N-ter de la protéine M2e du virus influenza du porc), ou la protéine de SEQ ID NO: 212 (fragment N-ter de la protéine M2 du virus influenza aviaire de type I) ou la protéine de SEQ ID NO : 213 (fragment N-ter de la protéine M2 du virus influenza aviaire de type II), la protéine de SEQ ID NO : 209, la protéine de SEQ ID NO: 206, la protéine de SEQ ID NO 253, la protéine de SEQ ID NO: 233 ou la protéine de SEQ ID NO :255. La protéine de SEQ ID NO :209 correspond à la fusion, dans l'ordre de deux protéines SEQ ID NO : 211, d'une protéine SEQ ID NO : 214, une protéine SEQ ID NO :212 et une protéine SEQ ID NO : 213, espacée chacune par un linker SEQ ID NO : 215 pour permettre une bonne conformation des protéines de fusion SEQ ID NO : 206 et SEQ ID NO : 253. 21 Selon un mode de réalisation particulier, ladite souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est une souche dans laquelle ledit au moins un acide nucléique code pour au moins un antigène hétérologue immunogène de virus, ledit au moins un acide nucléique étant acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène du virus Influenza, choisi parmi la liste B suivante: l'acide nucléique SEQ ID NO :172 codant pour la protéine de SEQ ID NO : 211 (fragment N-ter du virus influenza humain), ou l'acide nucléique SEQ ID NO :191 codant pour la protéine de SEQ ID NO: 214 (fragment N-ter de la protéine M2e du virus influenza du porc), ou l'acide nucléique SEQ ID NO :173 codant pour la protéine de SEQ ID NO: 212 (fragment N-ter de la protéine M2 du virus influenza aviaire de type I) ou l'acide nucléique SEQ ID NO :181 codant pour la protéine de SEQ ID NO : 213 (fragment N-ter de la protéine M2 du virus influenza aviaire de type II), l'acide nucléique SEQ ID NO :210 codant pour la protéine de SEQ ID NO : 209, l'acide nucléique SEQ ID NO :310 codant pour la protéine de SEQ ID NO : 206, l'acide nucléique SEQ ID NO :311 codant pour la protéine de SEQ ID NO :253, l'acide nucléique SEQ ID NO :312 codant pour la protéine de SEQ ID NO :255 et l'acide nucléique SEQ ID NO :313 codant pour la protéine de SEQ ID NO : 233. La présente invention concerne également des modes de réalisation dans lesquelles ladite souche mutante de Sarcocystidae comprend deux ou trois acides nucléiques codant respectivement pour deux ou trois antigènes hétérologues immunogènes du virus Influenza, lesdits deux ou trois antigènes hétérologues immunogènes du virus Influenza, étant également choisis parmi la liste A décrite ci-dessus. La présente invention concerne également des modes de réalisation dans lesquelles ladite souche mutante de Sarcocystidae comprend deux ou trois acides nucléiques codant respectivement pour deux ou trois antigènes hétérologues immunogènes du virus Influenza, lesdits deux ou trois acides nucléiques étant également choisis parmi la liste décrite B ci-dessus. Selon un mode de réalisation particulier, ladite souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est une souche dans laquelle ledit au moins un acide nucléique code pour 22 au moins un antigène hétérologue immunogène de bactérie, ledit antigène hétérologue immunogène de bactérie étant un antigène hétérologue immunogène de la bactérie Chlamydia abortum choisi parmi la liste C suivante : la protéine CPAF de SEQ ID NO : 289 , la protéine MOMP de SEQ ID NO : 297, la protéine PmpG de SEQ ID NO :270, la protéine de fusion de SEQ ID NO : 288, la protéine de fusion de SEQ ID NO : 296 ou la protéine de fusion de SEQ ID NO :304. Selon un mode de réalisation particulier, ladite souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est une souche dans laquelle ledit au moins un acide nucléique code pour au moins un antigène hétérologue immunogène de bactérie, ledit au moins un acide nucléique étant acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène de la bactérie Chlamydia abortum, choisi parmi la liste D suivante : l'acide nucléique SEQ ID NO :290 codant pour la protéine CPAF de SEQ ID NO : 289, l'acide nucléique SEQ ID NO :298 codant pour la protéine MOMP de SEQ ID NO: 297, l'acide nucléique SEQ ID NO :271 codant pour la protéine PmpG de SEQ ID NO: 270, l'acide nucléique SEQ ID NO :294 codant pour la protéine de fusion SEQ ID NO :288, l'acide nucléique SEQ ID NO :302 codant pour la protéine de fusion SEQ ID NO :296, l'acide nucléique SEQ ID NO :292 codant pour la protéine de fusion SEQ ID NO :304. La présente invention concerne également des modes de réalisation dans lesquelles ladite souche mutante de Sarcocystidae comprend deux ou trois acides nucléiques codant respectivement pour deux ou trois antigènes hétérologues immunogènes de la bactérie Chlamydia abortum, lesdits deux ou trois antigènes hétérologues immunogènes de la bactérie Chlamydia abortum étant également choisis parmi la liste C décrite ci-dessus. La présente invention concerne également des modes de réalisation dans lesquelles ladite souche mutante de Sarcocystidae comprend deux ou trois acides nucléiques codant respectivement pour deux ou trois antigènes hétérologues immunogènes de la bactérie Chlamydia abortum, lesdits deux ou trois acides nucléiques étant également choisis parmi la liste D décrite ci-dessus. Selon un mode de réalisation particulier, ladite souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est une souche dans laquelle ledit au moins un acide nucléique code pour au moins un antigène hétérologue immunogène de parasite, ledit antigène hétérologue immunogène de parasite étant un antigène hétérologue immunogène du parasite Leishmania 23 infantum choisi parmi la liste E suivante : la protéine KMP11 de SEQ ID NO: 259, ou la protéine NH36 de SEQ ID NO : 269, ou la protéine CYP1 de SEQ ID NO: 279, ou la protéine de fusion de SEQ ID NO : 257, ou la protéine de fusion de SEQ ID NO : 267, ou la protéine de fusion de SEQ ID NO : 285. Selon un mode de réalisation particulier, ladite souche mutante de Sarcocystidae selon la présente invention est une souche dans laquelle ledit au moins un acide nucléique code pour au moins un antigène hétérologue immunogène de parasite, ledit au moins un acide nucléique étant acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène du parasite Leishmania infantum, choisi parmi la liste F suivante : l'acide nucléique SEQ ID NO :258 codant pour la protéine KMP11 de SEQ ID NO: 259, l'acide nucléique SEQ ID NO :268 codant pour la protéine NH36 de SEQ ID NO : 269, l'acide nucléique SEQ ID NO :278 codant pour la protéine CYP1 de SEQ ID NO : 279, l'acide nucléique SEQ ID NO :265 codant pour la protéine de fusion de SEQ ID NO: 257, l'acide nucléique SEQ ID NO :275 codant pour la protéine de fusion de SEQ ID NO : 267, ou l'acide nucléique SEQ ID NO :277 codant pour la protéine de fusion de SEQ ID NO : 285. La présente invention concerne également des modes de réalisation dans lesquelles ladite souche mutante de Sarcocystidae comprend deux ou trois acides nucléiques codant respectivement pour deux ou trois antigènes hétérologues immunogènes du parasite Leishmania infantum, lesdits deux ou trois antigènes hétérologues immunogènes du parasite Leishmania infantum, étant également choisis parmi la liste E décrite ci-dessus. La présente invention concerne également des modes de réalisation dans lesquelles ladite souche mutante de Sarcocystidae comprend deux ou trois acides nucléiques codant respectivement pour deux ou trois antigènes hétérologues immunogènes du parasite Leishmania infantum, lesdits deux ou trois acides nucléiques étant également choisis parmi la liste F décrite ci-dessus. Selon un mode particulier de réalisation, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae, dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Toxoplasma gondii 24 dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par une délétion totale de gène mic/ codant pour la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par une délétion totale du gène mic3 codant pour la protéine MIC3, et contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO: 311 codant pour un antigène hétérologue immunogène du virus Influenza de séquence SEQ ID NO : 253 ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO :310 codant pour un antigène hétérologue immunogène du virus Influenza de séquence SEQ ID NO : 206 ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 312 codant pour un antigène hétérologue immunogène du virus Influenza de séquence SEQ ID NO : 255, ladite souche étant dépourvue de gène de sélection. Selon un mode particulier de réalisation, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae, dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Toxoplasma gondii dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par une délétion totale de gène mic/ codant pour la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par une délétion totale du gène mic3 codant pour la protéine MIC3, et contenant deux acides nucléiques de séquence SEQ ID NO : 311 et SEQ ID NO : 310 codant respectivement pour deux antigènes hétérologues immunogènes du virus Influenza de séquence SEQ ID NO : 253, et de séquence SEQ ID NO : 206, ladite souche étant dépourvue de gène de sélection. Selon un mode particulier de réalisation, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae, dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Toxoplasma gondii dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par une délétion totale de gène mic/ codant pour la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par une délétion totale du gène mic3 codant pour la protéine MIC3, et contenant deux acides nucléiques de séquence SEQ ID NO : 312 et SEQ ID NO : 310 codant respectivement pour deux antigènes hétérologues immunogènes du virus Influenza de séquence de séquence SEQ ID NO : 255 et de séquence SEQ ID NO : 206 ou contenant deux acides nucléiques de séquence SEQ ID NO : 312 et SEQ ID NO : 311 codant respectivement pour deux antigènes hétérologues immunogènes du virus Influenza de séquence de séquence SEQ ID NO : 255 et de séquence SEQ ID NO : 253 ladite souche étant dépourvue de gène de sélection ou ladite souche contenant un gène de sélection étant en particulier un gène de sélection conférant une résistance à la pyriméthamine et une sensibilité au ganciclovir, et plus particulièrement de séquence SEQ ID NO :134. Selon un mode particulier de réalisation, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae, dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Neospora caninum dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par une délétion totale de gène mic/ codant pour la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par une délétion totale du gène mic3 codant pour la protéine MIC3, et contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 311 codant pour un antigène hétérologue immunogène du virus Influenza de séquence SEQ ID NO : 253 ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO :310 codant pour un antigène hétérologue immunogène du virus Influenza de séquence SEQ ID NO : 206 ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 312 codant pour un antigène hétérologue immunogène du virus Influenza de séquence SEQ ID NO : 255 ladite souche étant dépourvue de gène de sélection. Selon un mode particulier de réalisation, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae, dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Neospora caninum dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par une délétion totale de gène mic/ codant pour la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par une délétion totale du gène mic3 codant pour la protéine MIC3, et contenant deux acides nucléiques de séquence SEQ ID NO : 312 et SEQ ID NO : 310 codant respectivement pour deux antigènes hétérologues immunogènes du virus Influenza de séquence de séquence SEQ ID NO : 255 et de séquence SEQ ID NO : 206 ou contenant deux acides nucléiques de séquence SEQ ID NO : 312 et SEQ ID NO : 311 codant respectivement pour deux antigènes hétérologues immunogènes du virus Influenza de séquence de séquence SEQ ID NO : 255 et de séquence SEQ ID NO : 253 ladite souche étant dépourvue de gène de sélection ou ladite souche contenant un gène de sélection étant en particulier un gène de sélection conférant une résistance à la 26 pyriméthamine et une sensibilité au ganciclovir, et plus particulièrement de séquence SEQ ID NO :134. Selon un mode particulier de réalisation, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae, dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Toxoplasma gondii dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par une délétion totale de gène mic/ codant pour la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par une délétion totale du gène mic3 codant pour la protéine MIC3, et contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 265 codant pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 257 ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 275 codant pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 267 ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 277 codant pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 285 ladite souche étant dépourvue de gène de sélection. Selon un mode particulier de réalisation, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae, dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Toxoplasma gondii dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par une délétion totale de gène mic/ codant pour la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par une délétion totale du gène mic3 codant pour la protéine MIC3, et contenant deux acides nucléiques de séquence SEQ ID NO : 265 et de séquence SEQ ID NO : 275 codant respectivement pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID: 257 et un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 267 ou contenant deux acides nucléiques de séquence SEQ ID NO: 265 et de séquence SEQ ID NO : 277 codant respectivement pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID: 257 et un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 285 ou contenant deux acides nucléiques de séquence SEQ ID NO: 275 et de séquence SEQ ID NO : 277 codant respectivement pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania 27 infantum de séquence SEQ ID: 267 et un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 285 ladite souche étant dépourvue de gène de sélection ou ladite souche contenant un gène de sélection étant en particulier un gène de sélection conférant une résistance à la pyriméthamine et une sensibilité au ganciclovir, et plus particulièrement de séquence SEQ ID NO :134. Selon un mode particulier de réalisation, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae, dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Toxoplasma gondii dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par une délétion totale de gène mic/ codant pour la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par une délétion totale du gène mic3 codant pour la protéine MIC3, et contenant trois acides nucléiques de séquence SEQ ID NO : 265, de séquence SEQ ID NO : 275 et de séquence SEQ ID NO: 277, codant respectivement pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID: 257, un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID: 267, et un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 285, ladite souche étant dépourvue de gène de sélection ou ladite souche contenant un gène de sélection étant en particulier un gène de sélection conférant une résistance à la pyriméthamine et une sensibilité au ganciclovir, et plus particulièrement de séquence SEQ ID NO :134. Selon un mode particulier de réalisation, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae, dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Neospora caninum dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par une délétion totale de gène mic/ codant pour la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par une délétion totale du gène mic3 codant pour la protéine MIC3, et contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 265 codant pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 257 ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 275 codant pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 267 28 ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO: 277 codant pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 285 ladite souche étant dépourvue de gène de sélection. Selon un mode particulier de réalisation, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae, dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Neospora caninum dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par une délétion totale de gène mic/ codant pour la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par une délétion totale du gène mic3 codant pour la protéine MIC3, et contenant deux acides nucléiques de séquence SEQ ID NO : 265 et de séquence SEQ ID NO: 275 codant respectivement pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID: 257 et un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 267 ou contenant deux acides nucléiques de séquence SEQ ID NO: 265 et de séquence SEQ ID NO : 277 codant respectivement pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID: 257 et un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 285 ou contenant deux acides nucléiques de séquence SEQ ID NO: 275 et de séquence SEQ ID NO : 277 codant respectivement pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID: 267 et un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 285 ladite souche étant dépourvue de gène de sélection ou ladite souche contenant un gène de sélection étant en particulier un gène de sélection conférant une résistance à la pyriméthamine et une sensibilité au ganciclovir, et plus particulièrement de séquence SEQ ID NO :134. Selon un mode particulier de réalisation, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae, dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Toxoplasma gondii dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par une délétion totale de gène mic/ codant pour la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par une délétion totale du gène mic3 codant pour la protéine MIC3, 29 et contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO: 294 codant pour un antigène hétérologue immunogène de Chlamydia abortus de séquence SEQ ID : 288 ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 302 codant pour un antigène hétérologue immunogène de Chlamydia abortus de séquence SEQ ID : 296 ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 292 codant pour un antigène hétérologue immunogène de Chlamydia abortus de séquence SEQ ID: 304 ladite souche étant dépourvue de gène de sélection. Selon un mode particulier de réalisation, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae, dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Neospora caninum dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par une délétion totale de gène mic/ codant pour la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par une délétion totale du gène mic3 codant pour la protéine MIC3, et contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 294 codant pour un antigène hétérologue immunogène de Chlamydia abortus de séquence SEQ ID : 288 ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 302 codant pour un antigène hétérologue immunogène de Chlamydia abortus de séquence SEQ ID : 296 ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 292 codant pour un antigène hétérologue immunogène de Chlamydia abortus de séquence SEQ ID : 304 ladite souche étant dépourvue de gène de sélection. La présente invention concerne également un procédé d'obtention d'une souche mutante de Sarcocystidae, dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Toxoplasma gondii ou de Neospora caninum dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par une délétion totale de gène mic/ codant pour la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par une délétion totale du gène mic3 codant pour la protéine MIC3, ladite souche étant dépourvue de gène de sélection et contenant au moins un acide nucléique codant respectivement pour au moins un antigène hétérologue immunogène comprenant : - une étape A de délétion totale du gène mic3, une étape B de délétion totale du gène mic/, les étapes A et B pouvant être réalisée dans un ordre A suivi de B ou B suivi de A, puis - une étape C de modification génétique de la souche avec l'insertion aléatoire d'au moins un plasmide comportant un acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène, et un gène de sélection, - une étape D de validation de la souche ayant intégrée le plasmide de l'étape C par PCR et/ou immunofluorescence et/ou profil de résistance, - une étape E de suppression du gène de sélection par une méganucléase, en particulier la méganucléase I-CreI - une étape F de validation de la souche comportant la suppression du gène de sélection de l'étape E par PCR et/ou immunofluorescence et/ou profil de résistance. La méganucléase est une endonucléase qui reconnait un site d'ADN très spécifique de 12 à 45 paires de bases. Une méganucléase induit au niveau de son site de restriction, une coupure double brin de l'ADN. Les méganucléases I-SceI et I-CreI sont décrites. L'étape C est réalisée par pression de sélection, les parasites sont cultivés en présence d'une drogue (pyriméthamine) auquel le parasite est sensible. Seuls les parasites ayant intégré le plasmide pourront avoir une croissance normale en présence de la drogue. L'étape E est réalisée par pression de sélection (contre-sélection), les parasites sont cultivés en présence d'une drogue (ganciclovir) auquel le parasite est sensible (dû à l'insertion du gène TK). Seuls les parasites ayant perdu la cassette de selection DHFR*TY-TK SEQ ID NO :134 suite à l'action de la méganucléase pourront avoir une croissance normale en présence de la drogue. Dans un mode particulier, la présente invention concerne un procédé d'obtention d'une souche mutante de Sarcocystidae, dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Toxoplasma gondii ou de Neospora caninum. 31 dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par une délétion totale de gène mic/ codant pour la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par une délétion totale du gène mic3 codant pour la protéine MIC3, ladite souche étant dépourvue de gène de sélection et contenant au moins un acide nucléique codant respectivement pour au moins un antigène hétérologue immunogène comprenant : - une étape A comprenant ou constituée de la délétion du gène mic3 par recombinaison homologue et insertion d'une cassette de sélection encadrée par deux sites de recombinaison spécifique identiques , suivi de l'excision de ladite cassette de sélection par une enzyme permettant la recombinaison spécifique, ladite enzyme étant en particulier la Cre-recombinase, suite à laquelle un seul des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette reste intégré au locus dudit gène mic3 délété, une étape B comprenant ou constituée de la délétion du gène mic/ par recombinaison homologue et insertion d'une cassette de sélection encadrée par deux sites de recombinaison spécifique identiques, suivi de l'excision de ladite cassette de sélection par une enzyme permettant la recombinaison spécifique, ladite enzyme étant en particulier la Cre-recombinase, suite à laquelle un seul des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette reste intégré au locus dudit gène mic/ délété les deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette de sélection insérée au locus du gène mic/ étant différents des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette de sélection insérée au locus du gène mic3, les étapes A et B pouvant être réalisée dans un ordre A suivi de B ou B suivi de A, puis - une étape C de modification génétique de la souche avec l'insertion aléatoire d' au moins un plasmide comportant un acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène, et un gène de sélection, - une étape D de validation de la souche ayant intégrée le plasmide de l'étape C par PCR et/ou immunofluorescence et/ou profil de résistance, 32 - une étape E de suppression du gène de sélection par une méganucléase, en particulier la méganucléase I-CreI - une étape F de validation de la souche comportant la suppression du gène de sélection de l'étape E par PCR et/ou immunofluorescence et/ou profil de résistance. A la suite des étapes A et B, la souche mutante de Sarcocystidae, comporte la délétion totale du gène mic3 et la délétion totale du gène mic/. Par action d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique, il est donc obtenu une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes mic/ et mic3 sont délétés, contenant deux sites de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, lesdits sites de recombinaison spécifique étant au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés, le site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment de la Cre-recombinase, au locus du gène mic/ délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété. Par « enzyme permettant une recombinaison spécifique », on entend enzyme catalysant la recombinaison d'ADN dans un sens défini, entre des sites spécifiques déterminés par des séquences propres à chaque enzyme. Elle permettent notamment l'excision, l'insertion, l'inversion ou la translocation d'une séquence nucléotidique flanquée de sites spécifiques. Comme exemple d'enzyme permettant une recombinaison spécifique, on peut citer par exemple la Cre recombinase, la FLP recombinase, la Tre recombinase, les protéines RecA et Hin recombinase (bactérie). La Cre recombinase est une topoisomerase dérivée du bacteriophage Pl, cette enzyme est fonctionnelle chez les parasites. L'utilisation possible de plusieurs sites lox n'interagissant pas entre eux permet d'envisager plusieurs délétions. Comme exemples de sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase (sites lox), on peut citer de manière non exhaustive, les sites loxP, loxN, 1ox2272, lox71, 1ox66, lox511, 1ox5171 et loxM2. Selon un mode particulier de réalisation, ladite enzyme permettant une recombinaison spécifique est la Cre-recombinase, et lesdites sites de recombinaison spécifique sont choisis parmi les sites loxN SEQ ID NO : 5 et loxP SEQ ID NO :12. 33 Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae telle que décrite précédemment, pour son utilisation comme médicament, en particulier comme vaccin. Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae telle que décrite précédemment, pour son utilisation comme immunostimulant. On entend par « immunostimulant », que ladite souche mutante, contenant éventuellement un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène, permet de stimuler les défenses immunitaires (comme un vaccin, par exemple). Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant une souche mutante de Sarcocystidae telle que décrite précédemment, et un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant une souche mutante de Sarcocystidae telle que décrite précédemment, et comprenant au moins un produit choisi parmi : un adjuvant, un stabilisant ou un conservateur, ou un mélange de ceux-ci. Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant une souche mutante de Sarcocystidae telle que décrite précédemment, formulée sous forme de dose unitaire variant de 102 à 109 tachyzoïtes d'une souche mutante telle que définie précédemment. Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne une composition vaccinale comprenant une souche mutante de Sarcocystidae telle que décrite précédemment, et un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 34 Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae telle que décrite précédemment pour son utilisation dans la prévention de pathologies d'origine virale, parasitaire ou bactérienne chez un mammifère, ledit mammifère étant choisi parmi les ovidés, les caprins, les porcins, les bovins, les équidés, les camélidés, les canidés ou les félidés, ou chez un oiseau. La présente invention concerne également une souche mutante de Sarcocystidae selon l'invention, comportant au moins un acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène de virus, pour utilisation dans la prévention de la pathologie associée audit virus. Dans un mode particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae selon l'invention, comportant au moins un acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène de virus Influenza, pour utilisation dans la prévention de la grippe aviaire. La présente invention concerne également une souche mutante de Sarcocystidae selon l'invention, comportant au moins un acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène de parasite, pour utilisation dans la prévention de la pathologie associée audit parasite. Dans un mode particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae selon l'invention, comportant au moins un acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum, pour utilisation dans la prévention de la leishmaniose. La présente invention concerne également une souche mutante de Sarcocystidae selon l'invention, comportant au moins un acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène de bactérie, pour utilisation dans la prévention de la pathologie associée à la dite bactérie. Dans un mode particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae selon l'invention, comportant au moins un acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène de Chlamydia abortum, pour utilisation dans la prévention de la chlamydiose. 36 DESCRIPTIONS DES FIGURES Figure 1 : cette figure est une représentation schématique de recombinaison par le système Cre/loxP appliqué au gène X encadré par les sites loxP identiques Figure 2-A : cette figure est une représentation schématique du plasmide pNcMIC3-KOCAT-GFP loxN. Ce plasmide de 10063 paires de bases comprend le gène de sélection codant pour la protéine chimérique CAT-GFP placé sous le contrôle du promoteur de l'a-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l'expression du gène dans le parasite. Cette cassette de sélection est encadrée par deux sites loxN identiques de même orientation, ajoutés par PCR. De part et d'autre de la cassette, les régions homologues et flanquée par les régions homologues des séquences flanquant le gène ncmic3. Figure 2-B : cette figure est une représentation schématique du plasmide pNcMIC1-KOCAT-GFP loxP. Ce plasmide de 10069 paires de bases comprend le gène de sélection codant pour la protéine chimérique CAT-GFP placé sous le contrôle du promoteur de l'a-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l'expression du gène dans le parasite. Cette cassette de sélection est encadrée par deux sites loxP identiques de même orientation, ajoutés par PCR. De part et d'autre de la cassette, les régions homologues et flanquée par les régions homologues des séquences flanquant le gène tgmic3. Figure 2-C : cette figure est une représentation schématique du plasmide pTSAG1- Cre Recombinase. Ce plasmide de 4 694 paires de bases comprend le gène codant pour la protéine CRE-Recombinase placé sous le contrôle du promoteur de sagl de Toxoplasma gondii pour permettre l'expression du gène dans le parasite. En aval du gène codant la Cre Recombinase, la séquence 3'UTR du gène sagl de Toxoplasma gondii est insérée pour stabiliser l'ARNm codant la protéine Cre Recombinase. Figure 3-A : cette figure illustre les 4 étapes pour obtenir la souche Neo ncmic1-3 KO 2G. La première étape de recombinaison homologue permet l'intégration du gène codant pour l'enzyme CAT-GFP au locus du gène mic3. Une sélection par le chloramphénicol permet d'amplifier la souche simple mutante Neo ncmic3 KO. Dans une seconde étape, le gène codant pour la protéine CAT-GFP est supprimé par action de la Cre Recombinase. La troisième étape permet l'intégration du gène codant pour l'enzyme CAT-GFP au locus du 37 gène miel. Une sélection par le chloramphénicol permet d'amplifier la souche simple mutante Neo ncmic1-3 KO. Enfin, dans une dernière étape, le gène codant pour la protéine CAT-GFP est supprimé par action de la Cre Recombinase. Figure 3-B : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus respectivement avec la souche sauvage NC-1 de Neospora caninum, la souche Neo ncmic3 KO, la souche Neo ncmic3 KO 2G, la souche Neo ncmic1-3 KO et la souche Neo ncmic1-3 KO 2G en utilisant les jeux d'amorces des PCR du Tableau 3. Figure 3-C : cette figure représente les résultats des séquençages obtenus sur la souche Neo ncmic/-3 KO 2G et conforme que les gènes miel et mic3 ont été supprimés et remplacés respectivement par des cicatrices LoxP et LoxN. Figure 4-A : cette figure illustre l'analyse par immunofluorescence de la détection de la protéine MIC3 obtenue respectivement avec la souche sauvage NC-1 de Neospora caninum et souche Neo ncmic1-3 KO 2G en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre la protéine MIC3. Figure 4-B : cette figure illustre l'analyse par immunofluorescence de la détection de la protéine CATGFP obtenue respectivement avec la souche sauvage NC-1 de Neospora caninum et les souches mutantes de Neospora caninum en utilisant la fluorescence intrinsèque de la protéine CATGFP. Cette figure permet de mettre en évidence la présence de la protéine CATGFP ou l'absence de la protéine CATGFP suite à l'action de la Cre Recombinase. Figure 5-A : cette figure est une représentation schématique du plasmide pTgMIC3-KOCAT-GFP loxP. Ce plasmide de 9 931 paires de bases comprend le gène de sélection codant pour la protéine chimérique CAT-GFP placé sous le contrôle du promoteur de l'a-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l'expression du gène dans le parasite. Cette cassette de sélection est encadrée par deux sites loxP identiques de même orientation, ajoutés par PCR. De part et d'autre de la cassette, les régions homologues et flanquée par les régions homologues des séquences flanquant le gène tgmic3. Figure 5-B : cette figure est une représentation schématique du plasmide pTgMIC1-KOCAT-GFP loxN. Ce plasmide de 10 285 paires de bases comprend le gène de sélection codant 38 pour la protéine chimérique CAT-GFP placé sous le contrôle du promoteur de l'a-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l'expression du gène dans le parasite. Cette cassette de sélection est encadrée par deux sites loxN identiques de même orientation, ajoutés par PCR. De part et d'autre de la cassette, les régions homologues et flanquée par les régions homologues des séquences flanquant le gène tgmic3. Figure 6-A : cette figure illustre les 4 étapes pour obtenir la souche Toxo tgmic1-3 KO 2G. La première étape de recombinaison homologue permet l'intégration du gène codant pour l'enzyme CAT-GFP au locus du gène mic3. Une sélection par le chloramphénicol permet d'amplifier la souche simple mutante Toxo tgmic3 KO. Dans une seconde étape, le gène codant pour la protéine CAT-GFP est supprimé par action de la Cre Recombinase. La troisième étape permet l'intégration du gène codant pour l'enzyme CAT-GFP au locus du gène mic/. Une sélection par le chloramphénicol permet d'amplifier la souche simple mutante Toxo tgmic1-3 KO. Enfin, dans une dernière étape, le gène codant pour la protéine CAT-GFP est supprimé par action de la Cre Recombinase. Figure 6-B : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus respectivement avec la souche sauvage RH de Toxoplasma gondii, la souche Toxo tgmic3KO, la souche Toxo tgmic3 KO 2G, la souche Toxo tgmic1-3 KO et la souche finale Toxo tgmic/-3 KO 2G en utilisant les jeux d'amorces des PCR du Tableau 7. Figure 6-C : cette figure représente les résultats des séquençages obtenus sur la souche Toxo tgmic/-3 KO 2G et conforme que les gènes mic/ et mic3 ont été supprimés et remplacés respectivement par des cicatrices LoxN et LoxP. Figure 7 : cette figure illustre l'analyse par immunofluorescence de la détection des protéines MIC1, MIC3 ou CAT-GFP obtenus respectivement avec la souche sauvage RH de Toxoplasma gondii, la souche Toxo tgmic3 KO, la souche Toxo tgmic3 KO 2G, la souche Toxo tgmic1-3 KO et la souche Toxo tgmicl 3 KO 2G en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre la protéine MIC1, MIC3 ou directement avec les propriétés fluorescentes intrinsèques de la protéine CAT-GFP. Figure 8 : cette figure est une représentation schématique du plasmide pTgRop 1 6K0- Gra 1 5IIKI-CAT-GFP 1ox2272. Ce plasmide de 12721 paires de bases comprend le gène de 39 sélection codant pour la protéine chimérique CAT-GFP placé sous le contrôle du promoteur de l'a-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l'expression du gène dans le parasite. Cette cassette de sélection est encadrée par deux sites 1ox2272 identiques de même orientation, ajoutés par PCR. En aval de cette cassette a été intégré la cassette d'expression permettant de coder la protéine Gra15HAII. Puis de part et d'autre de ces cassettes ont été insérées les régions homologues flanquant le gène tgrop16. Figure 9-A : cette figure illustre les 2 étapes pour obtenir la souche Toxo mic1-3 KO rop16 KO GRA1511 KI-2G. La première étape de recombinaison homologue permet l'intégration du gène codant pour l'enzyme CAT-GFP et le gène gra1511HA au locus du gène rop16. Une sélection par le chloramphénicol permet d'amplifier la souche mutante Toxo micl3 KO rop16 KO GRA1511 KI. Dans une seconde étape, le gène codant pour la protéine CATGFP est supprimé par action de la Cre Recombinase pour obtenir la souche Toxo micl3 KO rop16 KO GRA1511 KI-2G. Figure 9-B : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus respectivement avec les souches Toxo mic1-3 KO 2G, Toxo mic1-3 KO rop16 KO GRA1511 KI et Toxo mic1-3 KO rop16 KO GRA1511 KI 2G. Figure 9-C : cette figure représente les résultats des séquençages obtenus sur la souche Toxo mic1-3 KO rop16 KO GRA1511 KI 2G et confirme que les gènes rop16 et cat-e ont été supprimés et remplacés par la cicatrice Lox2272 et le gène gral5HAII. Figure 10 : cette figure illustre l'analyse par immunofluorescence de la détection de la protéine GRA15 (via le tag HA) obtenu respectivement avec les souches Toxo micl3 KO rop16 KO GRA1511 KI et Toxo mic1-3 KO rop16 KO GRA1511 KI-2G en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre le tag HA. Cette figure illustre également la suppression de la cassette CATGFP avec la disparition de la fluorescence GFP pour la souche Toxo mic1-3 KO rop16 KO GRA1511 KI-2G. Figure 11-A : cette figure illustre la position des amorces nucléiques utilisées dans la présente invention pour détecter la présence des trois gènes ncmic3, ncmicl, cat-gfp dans les souches sauvages et/ou des souches mutantes de Neo ncmic3 KO et/ou Neo ncmic3 KO 2G et/ou Neo ncmic1-3 KO et/ou Neo ncmic1-3 KO 2G de Neospora caninum. Les chiffres représentent la numérotation des séquences d'amorces (SEQ ID NO :x) définies dans la présente demande. Figure 11-B : cette figure illustre la position des amorces nucléiques utilisées dans la présente invention pour détecter la présence des trois gènes tgmic3, tgmicl, cat-gfp dans les souches sauvages et/ou des souches mutantes de Toxo tgmic3 KO et/ou Toxo tgmic3 KO 2G et/ou Toxo tg-in/cl-3K° et/ou Toxo tg-in/cl-3K° 2G de Toxoplasma gondii. Les chiffres représentent la numérotation des séquences d'amorces (SEQ ID NO :x) définies dans la présente demande. Figure 11-C : cette figure illustre la position des amorces nucléiques utilisées dans la présente invention pour détecter la présence des trois gènes tgrop16, gra1511, cat-gfp dans les souches sauvages et/ou des souches mutantes de Toxo mic1-3 KO rop16 KO Gral 511 KI de Toxoplasma gondii. Les chiffres représentent la numérotation des séquences d'amorces (SEQ ID NO :x) définies dans la présente demande. Figure 12 cette figure est une représentation schématique du plasmide pUC18 4G2 IcreI. Ce plasmide de 8364 paires de bases comprend le gène de sélection codant pour la protéine chimérique DHFR*-TY-TK placé sous le contrôle du promoteur de DHFR de Toxoplasma gondii pour permettre l'expression du gène dans le parasite. Cette cassette de sélection est encadrée par deux sites IcreI identiques avec une orientation inversée, ajoutés par PCR. De part et d'autre de cette cassette, des séquences permettant la validation de la recombinaison ont également été insérés par PCR (c43 en amont et f3y en aval). Enfin une cassette d'expression permettant l'expression d'un futur transgène a été inséré, cette cassette d'expression se compose d'un promoteur boosté (fusion du promoteur de sagl et de l'atubuline de Toxoplasma gondii et d'un 3'UTR de sagl de Toxoplasma gondii. Figure 13 : Mécanisme d'action de la méganucléase I-CreI et obtention de souches dépourvues de gènes de sélection Figure 14 :cette figure est une représentation schématique du plasmide pTgsagl IcreI c43y. Ce plasmide de 4166 paires de bases comprend le gène codant la méganucléase I-CreI placé sous le contrôle du promoteur de l'a-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l'expression du gène dans le parasite. Le plasmide contient également la séquence c43y, matrice qui 41 permettra de favoriser la recombinaison entre les parties c43 et f3y après coupure par la méganucléase I-CreI. Figure 15 cette figure est une représentation schématique du plasmide pUC18 4G2 IcreI M2e. Ce plasmide de 9796 paires de bases comprend le gène codant la protéine de fusion SAG1M2e placé sous le contrôle du promoteur de l'a-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l'expression du gène dans le parasite. Figure 16 cette figure est une représentation schématique du plasmide pUC18 4G2 IcreI M2eGPI. Ce plasmide de 9874 paires de bases comprend le gène codant la protéine de fusion SAG1M2eGPI placé sous le contrôle du promoteur de l'a-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l'expression du gène dans le parasite. Figure 17 cette figure est une représentation schématique du plasmide pUC18 4G2 IcreI HA. Ce plasmide de 10030 paires de bases comprend le gène codant la protéine de fusion SAG1HAGPI placé sous le contrôle du promoteur de l'a-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l'expression du gène dans le parasite. Figure 18 : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus pour les souches Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e et Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e avec les mix : « Mix M2e », « Mix M2eGPI ou M2e », « Mix Gène d'intérêt » et « Mix DHFR*TYTK ». Figure 19: cette figure illustre l'analyse par immunofluorescence de la détection de la protéine M2e obtenue respectivement avec les souches Toxo tgmic1-3 KO - 2G , Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e et Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e IcreI en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre la protéine M2e. Figure 20 : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e IcreI et Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e IcreI avec les mix : « Mix M2e », « Mix M2eGPI ou M2e », « Mix Gène d'intérêt », « Mix DHFR*TYTK » et Mix IcreI M2eGPI ou M2e. 42 Figure 21 : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus pour les souches Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI et Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI avec les mix : « Mix M2eGPI ou M2e », « Mix Gène d'intérêt » et « Mix DHFR*TYTK ». Figure 22: cette figure illustre l'analyse par immunofluorescence de la détection de la protéine M2e obtenue respectivement avec les souches Toxo tgmic1-3 KO - 2G , Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI et Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI IcreI en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre la protéine M2e. Figure 23 : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI IcreI avec les mix : « Mix M2eGPI ou M2e », « Mix Gène d'intérêt », « Mix DHFR*TYTK » et « Mix IcreI M2eGPI ou M2e ». Figure 24 : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus pour les souches Toxo tgmic1-3 KO - 2G HA et Neo ncmic1-3 KO - 2G HA avec les mix : « Mix HA», « Mix Gène d'intérêt » et « Mix DHFR*TYTK ». Figure 25: cette figure illustre l'analyse par immunofluorescence de la détection de la protéine HA obtenue respectivement avec les souches Toxo tgmic1-3 KO - 2G, Toxo tgmicl3 KO - 2G HA et Toxo tgmic1-3 KO - 2G HA IcreI en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre la protéine HA. Figure 26 : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G HA IcreI avec les mix : « Mix HA », « Mix Gène d'intérêt », « Mix DHFR*TYTK » et Mix IcreI HA. Figure 27 : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA avec les mix : « Mix M2eGPI ou M2e », « Mix HA», « Mix Gène d'intérêt » , « Mix DHFR*TYTK » et « Mix IcreI M2eGPI ou M2e ».. Figure 28: cette figure illustre l'analyse par immunofluorescence de la détection des protéines M2e et HA obtenue respectivement avec les souches Toxo tginic1-3 KO - 2G et 43 Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre les protéines M2e et HA. Figure 29 : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA Icretavec les mix : « Mix M2eGPI ou M2e » « Mix HA », « Mix Gène d'intérêt », Mix IcreI HA et « Mix IcreI M2eGPI ou M2e ». Figure 30: cette figure illustre l'analyse par immunofluorescence de la détection des protéines M2e et HA obtenue respectivement avec les souches Toxo tgmic1-3 KO - 2G, Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA et Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA creI en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre les protéines M2e et HA. Figure 31 : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e HA avec les mix : « Mix M2e », « Mix M2eGPI ou M2e » , « Mix HA», « Mix Gène d'intérêt » , « Mix DHFR*TYTK » et « Mix IcreI M2eGPI ou M2e ». Figure 32: cette figure illustre l'analyse par immunofluorescence de la détection des protéines M2e et HA obtenue respectivement avec les souches Toxo tgmic1-3 KO - 2G et Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e HA en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre les protéines M2e et HA. Figure 33: cette figure illustre l'analyse par immunofluorescence de la détection de la protéine M2e obtenue respectivement avec les souches Neo ncmic1-3 KO - 2G , Neo ncmicl3 KO - 2G M2e et Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e IcreI en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre la protéine M2e. Figure 34: cette figure illustre l'analyse par immunofluorescence de la détection de la protéine M2e obtenue respectivement avec les souches Neo ncmic1-3 KO - 2G et Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre la protéine M2e. Figure 35: cette figure illustre l'analyse par immunofluorescence de la détection de la protéine HA obtenue respectivement avec les souches Neo ncmic1-3 KO - 2G et Neo ncmicl3 KO - 2G HA en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre la protéine HA. 44 Figure 36: cette figure illustre l'analyse par immunofluorescence de la détection des protéines M2e et HA obtenue respectivement avec les souches Neo ncmicl-3 KO - 2G, Neo ncmicl-3 KO - 2G M2e Icrel et Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e HA en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre les protéines M2e et HA. Figure 37: cette figure est une représentation schématique du plasmide pUC18 4G2 IcreI Kmpll. Ce plasmide de 8665 paires de bases comprend le gène codant la protéine Kmp 11 placé sous le contrôle du promoteur de l'a-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l'expression du gène dans le parasite. Figure 38 : cette figure est une représentation schématique du plasmide pUC18 4G2 IcreI Nh36. Ce plasmide de 9643 paires de bases comprend le gène codant la protéine Nh36 placé sous le contrôle du promoteur de l'a-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l'expression du gène dans le parasite. Figure 39 : cette figure est une représentation schématique du plasmide pUC18 4G2 IcreI Cypl. Ce plasmide de 8917 paires de bases comprend le gène codant la protéine Cypl placé sous le contrôle du promoteur de l'a-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l'expression du gène dans le parasite. Figure 40 : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus respectivement avec la souche ToxoK0 2G (1), la souche ToxoK0 2G Kmpll ou Kmpll IcreI (2), la souche ToxoK0 2G Nh36 ou Nh36 IcreI (3), la souche ToxoK0 2G Cypl ou Cypl IcreI (4), la souche ToxoK0 2G Kmpl 1 Nh36 ou Kmpl 1 Nh36 IcreI (5), la souche ToxoK0 2G Kmpll Cypl ou Kmpll Cypl IcreI (6) et la souche ToxoK0 2G Kmpll Cypl Nh36 (7) en utilisant le jeu d'amorces des PCR du Tableau 29. Figure 41: cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus respectivement avec la souche ToxoK0 2G, la souche ToxoK0 2G Kmpll ou Kmpll IcreI, la souche ToxoK0 2G Nh36 ou Nh36 IcreI, la souche ToxoK0 2G Cypl ou Cypl IcreI, la souche ToxoK0 2G Kmpll Nh36 ou Kmpll Nh36 IcreI et la souche ToxoK0 2G Kmpll Cypl ou Kmpll Cypl IcreI en utilisant le jeu d'amorces des PCR du Tableau 29. Figure 42 : cette figure illustre l'analyse par immunofluorescence de la détection des protéines Kmp 1 1, Nh36 ou Cyp 1 obtenue respectivement avec la souche ToxoK0 2G, la souche ToxoK0 2G Kmpll ou Kmpll IcreI , la souche ToxoK0 2G Nh36 ou Nh36 IcreI , la souche ToxoK0 2G Cyp 1 ou Cyp 1 IcreI , la souche ToxoK0 2G Kmpl 1 Nh36 ou Kmp 11 Nh36 IcreI et la souche ToxoK0 2G Kmpl 1 Cyp 1 ou Kmpl 1 Cyp 1 IcreI en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre chaque tag (Myc, V5 et HA) associé à chaque protéine (respectivement Kmpll, Nh36 et Cypl). Figure 43 : cette figure illustre l'analyse par immunofluorescence de la détection des protéines Kmp 1 1, Nh36 ou Cyp 1 en cytométrie en flux obtenus respectivement avec la souche ToxoK0 2G, la souche ToxoK0 2G Kmp 1 1 Nh36 IcreI, la souche ToxoK0 2G Kmpl 1 Cyp 1 IcreI et la souche ToxoK0 2G Kmpl 1 Cyp 1 Nh36 en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre chaque tag (Myc, V5 et HA) associé à chaque protéine (respectivement Kmpll, Nh36 et Cypl). Figure 44 : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus respectivement avec la souche NeoK0 2G (1), la souche NeoK0 2G Nh36 (2), la souche NeoK0 2G Cypl (3) et la souche NeoK0 2G Cypl Nh36 (4) en utilisant le jeu d'amorces des PCR du Tableau 29. Figure 45 : cette figure illustre l'analyse par immunofluorescence de la détection des protéines Nh36 et/ou Cyp 1 obtenue respectivement avec la souche NeoK0 2G, la souche NeoK0 2G Nh36, la souche NeoK0 2G Cyp 1 et la souche NeoK0 2G Cyp 1 Nh36 en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre chaque tag (V5 et HA) associé à chaque protéine (respectivement Nh36 et Cypl). Figure 46 : cette figure est une représentation schématique du plasmide pUC18 4G2 IcreI CPAF. Ce plasmide de 10210 paires de bases comprend le gène codant la protéine CPAF placé sous le contrôle du promoteur de l'a-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l'expression du gène dans le parasite. Figure 47 : cette figure est une représentation schématique du plasmide pUC18 4G2 IcreI MOMP. Ce plasmide de 9556 paires de bases comprend le gène codant la protéine MOMP 46 placé sous le contrôle du promoteur de l'a-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l'expression du gène dans le parasite. Figure 48 : cette figure est une représentation schématique du plasmide pUC18 4G2 IcreI PmpG. Ce plasmide de 9760 paires de bases comprend le gène codant la protéine PmpG placé sous le contrôle du promoteur de l'a-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l'expression du gène dans le parasite. Figure 49 : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus respectivement avec la souche ToxoK0 2G (1), la souche ToxoK0 2G CPAF (2), la souche ToxoK0 2G MOMP (3) et la souche ToxoK0 2G PmpG (4) en utilisant les jeux d'amorces des PCR du Tableau 29. Figure 50 : cette figure illustre l'analyse par immunofluorescence de la détection des protéines CPAF, MOMP et PmpG obtenue respectivement avec la souche ToxoK0 2G (A, B et C), la souche ToxoK0 2G CPAF (A), la souche ToxoK0 2G MOMP (B) et la souche ToxoK0 2G PmpG (C) en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre chaque tag (V5, myc et VSV) associé à chaque protéine (respectivement CPAF, MOMP et PmpG). Figure 51 : cette figure illustre l'analyse par Western Blot de la détection de la protéine PmpG obtenue respectivement avec la souche ToxoK0 2G (1) et la souche ToxoK0 2G PmpG (2) en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre le Tag VSV associé à la protéine PmpG. Figure 52: cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus respectivement avec la souche NeoK0 2G et la souche NeoK0 2G MOMP en utilisant les jeux d'amorces des PCR du Tableau 29. Figure 53 : cette figure illustre l'analyse par immunofluorescence de la détection de la protéine MOMP obtenue respectivement avec la souche NeoK0 2G et la souche NeoK0 2G MOMP en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre le tag myc associé à MOMP. Figure 54 : la figure 54 illustre le taux de survie des souris les 24 jours suivant l'injection des souches vaccinales (aucune mortalité n'a été observée après J24). - en abscisse 47 nombre de jours suite à l'injection des souches vaccinales réalisée au jour 0.- en ordonnée : pourcentage de survie des souris. Des souris n'ayant reçu aucun tachyzoïtes servent de témoins et ont un taux de survie de 100 °A. Figure 55 : la figure 55 illustre le dosage des anticorps de type IgG anti-Toxoplasma gondii dans le sérum des souris. Le dosage des anticorps de type IgG anti-Toxoplasma gondii dans le sérum a été réalisé avant l'injection et 34 jours après que les souris aient reçu 100 tachyzoïtes de la souche vaccinale selon son lot. Figure 56 : la figure 56 illustre le dosage des anticorps de type IgG anti-M2e dans le sérum des souris. Le dosage des anticorps de type IgG anti-M2e dans le sérum a été réalisé 34 jours après que les souris aient reçu 100 tachyzoïtes de la souche vaccinale selon son lot. Les souris issues du lot 1 servent de témoins négatifs.- Figure 57: la figure 57 illustre la production d'IFN-y après différentes restimulations de splénocytes de souris 34 jours après la vaccination. Les stimulations ont été réalisées avec de l'extrait total de la souche Toxo mic1-3 KO 2G (A) ou des protéines HA ou du mix petptides M2e (B). 48 Exemple 1 : Construction de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G L'haploïdie du génome de Neospora caninum lors de la phase proliférative permet l'invalidation d'un gène en une seule recombinaison homologue. Culture des parasites Tous les tachyzoïtes de la souche de Neospora caninum utilisés ont été produits en fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634)) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (SVF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine. Ils ont été récoltés après lyse mécanique des cellules hôtes par 3 passages en seringue 25G. Construction des plasmides - Plasmide pNcMIC3-KO-CAT-GFP loxN Le plasmide pNcMic3KO-CAT-GFP loxN SEQ ID NO : 1 contient une cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6 comprenant le gène de sélection cat-e SEQ ID NO: 2 codant pour la protéine de fusion CAT-GFP permettant à la fois la résistance au chloramphénicol (CAT) et une fluorescence verte (GFP : Green Fluorescent Protein), sous le contrôle du promoteur de l'a-tubuline de Toxoplasma gondii SEQ ID NO :3 pour permettre l'expression du gène dans le parasite. En aval du gène cat-e SEQ ID :2, la séquence 3'UTR du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 4 est insérée. Cette séquence a pour objectif de stabiliser l'ARNm codant la protéine de fusion CAT/GFP. Cette cassette de sélection SEQ ID NO :6 est encadrée par deux sites loxN SEQ ID NO :5 identiques de même orientation.. Pour obtenir ce plasmide, la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6 a été amplifiée par PCR sur le plasmide pT230 CAT-GFP SEQ ID NO :9 avec les amorces cat-gfp LoxN For SEQ ID NO :7 et catgfp loxN rev SEQ ID NO :8 (2380pb), digérée par les enzymes de restriction ClaI et XbaI (2348 pb) et clonée dans le plasmide pNcMic3KO-DHFR SEQ ID NO :10 digéré par ClaI et XbaI (7715 pb). Le plasmide alors obtenu est le plasmide pNcMic3KO-CAT-GFP loxN SEQ ID NO : 1. Les séquences des amorces figurent dans le Tableau 1 ci-dessous. Le plasmide pNcMic3KOCAT-GFP loxN contient donc une cassette CAT-GFP SEQ ID NO :6 encadrée par une 49 séquence 5'HR du gène Ncmic3 SEQ ID NO : 98 et une séquence 3'HR du gène Ncmic3 SEQ ID NO :97. Tableau 1 : liste des amorces utilisées pour la construction du plasmide pNcMIC3-KO-CATGFP loxN catgfp loxN For SEQ ID NO :7 catgfp loxN rev TCCGCTCTCAGAGAATCGATGAAGCTTATAACTTCGTATAGT ATACCTTATACGAAGTTATGATATGCATGTCCGCGTTCGTGA AATCTC ClaI LoxN SEQ ID NO :8 ATACGTAAACTTCTAGATCCATAACTTCGTATAAGGTATACT ATACGAAGTTATCCCTCGGGGGGGCAAGAATTGTGTTAACCG XbaI loxN GTTCGA - Plasmide pNcMIC1-KO-CAT-GFP lox Le plasmide pNcMiclKO-CAT-GFP loxP SEQ ID NO: 11 contient une cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO: 6 comprenant le gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO: 2 codant pour une protéine de fusion CAT-GFP permettant à la fois la résistance au chloramphénicol (CAT) et une fluorescence verte (GFP : Green Fluorescent Protein), sous le contrôle du promoteur de l'a-tubuline de Toxoplasma gondii SEQ ID NO: 3 pour permettre l'expression du gène dans le parasite. En aval de la séquence codant CAT-GFP, la séquence 3'UTR du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO: 4 est insérée. Cette séquence a pour objectif de stabiliser l'ARNm codant la protéine de fusion CAT/GFP. Cette cassette de sélection SEQ ID NO :6 est encadrée par deux sites loxP SEQ ID NO :12 identiques de même orientation. Pour obtenir ce plasmide, la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6 a été amplifiée par PCR sur le plasmide pT230 CAT-GFP SEQ ID NO :9 avec les amorces CN10 SEQ ID NO :13 et CN11 SEQ ID NO :14 permettant l'ajout des sites loxP SEQ ID NO :12 (2394 pb), digérée par les enzymes de restriction HindIII et BamHI (2339 pb) et clonée dans le plasmide pT230-ble SEQ ID NO : 37 digéré par HindIII et BamHI (293 lpb). Le plasmide alors obtenu est le plasmide pT230 CAT-GFP loxP SEQ ID NO :113. La région 3 HR du gène ncmicl a été amplifiée par PCR à partir de l'ADN génomique de la souche NC-1 de Neospora caninum. Pour l'amplification, les amorces 3 HR NCmicl F KpnI et 3 HR NCmicl R HindIII (SEQ ID NO: 114 et SEQ ID NO:115) permettent l'amplification de la région 3 HR du gène ncmicl et la création de deux sites de restrictions qui ont été utilisés pour cloner le fragment 3HR en amont de la cassette de sélection CAT-GFP dans le pT230 CAT-GFP loxP SEQ ID NO :113. Le plasmide obtenu est dénommé pNcmic1-3HR CATGFP loxP SEQ ID NO: 118. La région 5 HR du gène ncmicl a été amplifiée par PCR à partir de l'ADN génomique de la souche NC-1 de Neospora caninum. Pour l'amplification, les amorces 5 HR NCmicl F BamHI et 5 HR NCmicl R NotI (SEQ ID NO: 116 et SEQ ID NO:117) permettent l'amplification de la région 5'UTR du gène ncmicl et la création de deux sites de restrictions qui ont été utilisés pour cloner le fragment 5HR en aval de la cassette de sélection CAT-GFP dans le plasmide pNcmic1-3HR CATGFP loxP SEQ ID NO: 118 (BamHI -NotI). Le plasmide alors obtenu est le plasmide pNcMiclKO-CAT-GFP loxP SEQ ID NO : 11. Le plasmide pNcMiclKO-CAT-GFP loxP contient donc une cassette CAT-GFP SEQ ID NO :6 encadrée par une séquence 5'HR du gène Ncmicl SEQ ID NO: 96 et une séquence 3'HR du gène Ncmicl SEQ ID NO : 95. Les séquences des amorces figurent dans le Tableau 2 ci-dessous. Tableau 2 : liste des amorces utilisées pour la construction du plasmide pNcmicl KO CATGFP loxP Construction du plasmide pNcmicl KO CATGFP loxP SEQ ID NO: 13 CN10 GCGGCCAAGCTTA TAACTTCGTATAATGTATGCTATACGA HindIII loxP AGTTA TGATATGCATGTCCGCgttcgtgaaatctctgatcaagcgg CN1 1 SEQ ID NO: 14 SpeI, BamHI, loxP cgacgcacgctgtcactcaacttgctGCTAGAACTA GTGGATC CA TAA CTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTA TCCCTCGGGGG GGCAAGAATT 3 HR NCmicl F SEQ ID NO: 114 KpnI KpnI CGCGGTACCAGGCAGAAGTAAAGAAGGTTCCTC 3 HR NCmicl R SEQ ID NO: 115 HindIII HindIII CGCAAGCTTTGATCACGCAAGAAAAGAAGC 5 HR NCmicl F SEQ ID NO: 116 BamHI BamHI CGCGGATCCCATTTGTAGATACGGTTGCACAC 5 HR NCmicl R SEQ ID NO: 117 NotI CGCGCGGCCGCACATTCAGACGGCAGAACTCTG NotI 51 - Plasmide pTSAG1- Cre Recombinase Le plasmide pT-SAG1-Cre-Recombinase SEQ ID NO :15 a été construit pour exprimer de manière transitoire dans les parasites Toxoplasma gondii et Neospora caninum, et leurs dérivés modifiés génétiquement le gène codant la protéine Cre Recombinase dérivée du bactériophage P1 (Brecht et al., 1999, Gene, 234(2) :239-47). Le plasmide pT-SAG1-Cre-Recombinase SEQ ID NO :15 dérive du plasmide pUC18 (plasmide commercial).qui contient une cassette d'expression de la Cre Recombinase du bactériophage Pl. Dans le plasmide pT-SAG1-Cre-Recombinase SEQ ID NO :15, le gène codant la Cre Recombinase SEQ ID NO :16 est placé sous la dépendance du promoteur du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO :17, ce qui permet l'expression de la protéine Cre Recombinase dans les parasites Toxoplasma gondii transfectés. En aval du gène codant la Cre Recombinase, la séquence 3'UTR du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO :4 est insérée. Cette séquence a pour objectif de stabiliser l'ARNm codant la protéine Cre Recombinase. L'absence de cassette de sélection spécifique ne permet pas une intégration stable du matériel génétique transfecté mais seulement une expression transitoire de la Cre Recombinase. Construction de la souche Neomic1-3 KO - 2G La construction de la souche vivante atténuée de seconde génération, dénommée Neo ncmic/- 3 KO - 2G, est faite en 4 étapes distinctes : 1. Délétion par recombinaison homologue du gène Ncmic3 et son remplacement par la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6 encadrée par des séquences LoxN SEQ ID NO :5. Pour obtenir cette souche, la souche sauvage NC-1 de Neospora caninum est électroporée avec le plasmide pNcMIC3-KO-CAT-GFP lox N SEQ ID NO :1. 20 1.1g de plasmide purifié puis linéarisé par KpnI sont ajoutés à 107 parasites mis en suspension dans le milieu d' électroporation CYTOMIX contenant de l' ATP (3 mM) et du Glutathion (3 mM) (Van den Hoff et al., Nucleic Acid Research, Jun 11; 20(11):2902), et l'électroporation a été réalisée en cuvette d'écart 4 mm, dans un volume de 800 !IL sur un appareil BioRad (Paramètres : 2000V, 50 ohms, 25 pF, avec deux chocs électriques). Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture est remplacé et supplémenté par l'agent de sélection (chloramphénicol 20 pM), 52 24 heures après l'électroporation. 10 à 15 jours après sélection, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique au DNAzol des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Neo ncmic3 KO. Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et remplacé par la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant la cassette de sélection CATGFP est la SEQ ID NO : 101. Le gène mic/ n'étant pas délété, la séquence du gène mic/ SEQ ID NO :106 est présente dans le génome de la souche. 2. Suppression de la cassette de sélection SEQ ID NO :6 : la souche Neo ncmic3 KO obtenue est électroporée avec le plasmide pT-SAG1-CRE-Recombinase SEQ ID NO :15. L'enzyme exprimée transitoirement va permettre l'excision de la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6. Le protocole d'électroporation est similaire au protocole précédent. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Après 2 à 7 jours de culture, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique au DNAzol des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Neo ncmic3 KO - 2G. Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO : 18. Le gène mic/ n'étant pas délété, la séquence du gène mic/ SEQ ID NO :106 est présente dans le génome de la souche. 3. Délétion par recombinaison homologue du gène ncmicl et son remplacement par la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6 encadrée par des séquences LoxP SEQ ID NO :12. Pour obtenir cette souche, la souche Neo ncmic3 KO - 2G est électroporée avec le plasmide pNcMIC1-KO-CAT-GFP lox P SEQ ID NO :11 linéarisé par KpnI, selon le protocole précédemment décrit. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture est remplacé et supplémenté par l'agent de sélection (chloramphénicol 20 pM), 24 heures après l'électroporation. 10 à 15 jours après sélection, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones 53 d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Neo ncmic1-3 KO. Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO : 18. Dans cette souche, le gène mic/ a été délété et remplacé par la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic/ délété contenant la cassette de sélection CATGFP est la SEQ ID NO : 102. 4. Suppression de la cassette de sélection SEQ ID NO :6 : la souche Neo Ncmic1-3 KO obtenue est électroporée avec le plasmide pT-SAG1-CRE-Recombinase SEQ ID NO :15. L'enzyme exprimée transitoirement va permettre l'excision de la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Après 2 à 7 jours de culture, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique au DNAzol des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Neo ncmic1-3 KO - 2G. Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO: 18. Dans cette souche, le gène mic/ a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic/ délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO : 91. Validation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G par PCR Pour valider la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G des analyses PCR sont effectuées à partir de l'ADN génomique extrait au DNAzol à partir d'un culot parasitaire constitué de 107 parasites. Les amorces utilisées pour les PCR sont décrites dans la Figure 8-A et sont détaillées dans le Tableau 3 ci-dessous. Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose (Figure 3-B). Leur taille attendue et leur taille observée sont également décrites dans le Tableau 4 ci-dessous. Pour plus de clarté sur la figure 3-B, seules les 3 étapes de la réalisation sont représentées (ncmic3, ncmic3K0 CATGFP et ncmic3K0 loxN (2G) ou ncmicl, 54 ncmic1K0 CATGFP et ncmic1K0 loxP(2G)), les résultats obtenus sont conformes aux tailles attendues Tableau 3 : liste des amorces utilisées pour la validation des souches. Amorce F Séquence Amorce R Séquence Ncmic3 (mixl) c Nc mic3 F SEQ ID NO :22 d Nc mic3 R SEQ ID NO :23 TTTCCCTTCTAAACACAGTCG CCTTCAGTGGTTCTCCATGAGT Validation KO i Integ NCmic3 F SEQ ID NO :24 j ORF SEQ ID NO 25 5 'Ncmic3 (mix2) GAAAGTGTCAGTGGTAGAGACTGC CATGFP R CCGTTTGGTGGATGTCTTCT Validation KO 3 'Ncmic3 (mix3) k ORF CATGFP F SEQ ID NO :26 1 Integ NCmic3 R SEQ ID NO :27 GCATCGACTTCAAGGAGGAC TGTTTACAGGTGATCCAGAAAAGG Cicatrice Ncmic3(m x4) g AF3 SEQ ID NO :32 h AF4 SEQ ID NO : 33 GTCATCGACCGCCGGAACTAGTAGT GCAGAGGTTCTGCGTATCTAACACGG Ncmicl (mix5) a Nc micl F SEQ ID NO :20 b Nc micl R SEQ ID NO :21 ACCCGGAGAATTATCGCCTA TTCTCCAGGCACTCACCT Validation KO m Integ NCmicl F SEQ ID NO :28 j ORF SEQ ID NO :25 5 'Ncmicl (mix6) CCGAGCAAGTTAGCAAGTCC CATGFP R CCGTTTGGTGGATGTCTTCT Validation KO k ORF CATGFP F SEQ ID NO :26 n Integ NCmicl R SEQ ID NO :29 3 'Ncmicl(mix7) GCATCGACTTCAAGGAGGAC CTTGTCCGTCACATCGTTTG Cicatrice Ncmicl (m x8) e ncmicicrelox F B SEQ ID NO :30 f ncmicicrelox R B SEQ ID NO :31 GGCGACATACTGCATTGGAT GATCGGAGTCTGTCCCTCAA Tableau 4 : Taille attendue des amplicons (en paires de base) des différentes PCR de validation de la construction des souches KO de Neospora caninum NC-1 Neo ncmic3 KO Neo ncmic3 KO loxN Neo nemic1-3 KO loxP Neo ncmic1-3 KO 2G Ncmic3 (mixl) 850 Validation KO 5 'Ncmic3 (mix2) - 2960 - - - Validation KO 3 'Ncmic3 (mix3) - 3668 - - - Cicatrice Ncmic3 (mix4) 2163 2575 276 276 276 Ncmicl (mix5) 701 701 701 - - Validation KO 5'Ncmic1 (mix6) - - - 3359 - Validation KO 3 'Ncmicl (mix7) - - - 3421 - Cicatrice Ncmicl (mix8) 3 161 3161 3161 2560 261 Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces c SEQ ID NO :22 et d SEQ ID NO :23 (mix 1) permettent de mettre en évidence une bande à 850 paires de bases pour la souche NC-1, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène Ncmic3 SEQ ID NO :105 dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans les souches Neo Ncmic3 KO, Neo Ncmic3 KO - 2G, Neo Ncmicl-3 KO et Neo Ncmicl-3 KO - 2G confirmant la suppression du gène dans ces souches. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces i SEQ ID NO :24 et j SEQ ID NO :25 et les amorces k SEQ ID NO :26 et 1 SEQ ID NO :27 (mix Ncmic3) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 2960 et 3668 paires de bases pour la souche Neo Ncmic3 KO, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène de sélection cat-e dans cette souche à la place du gène Ncmic3. Cette bande n'est pas détectée dans les souches NC-1, Neo Ncmic3 KO - 2G, Neo Ncmicl-3 KO et Neo Ncmicl-3 KO - 2G confirmant l'absence du gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO :2 au locus Ncmic 3 dans ces souches. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces g SEQ ID NO :32 et h SEQ ID NO :33 (cicatrice Ncmic3) permettent de mettre en évidence différentes bandes conformément à la taille de bande attendue. Une bande à 2163 paires de bases pour la souche NC-1, confirme la présence du gène Ncmic3 SEQ ID NO :105 dans cette souche. Une bande de 2575 paires de bases est mise en évidence pour la souche Neo Ncmic3 KO confirmant la présence de la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 à la place du gène Ncmic3. Enfin une bande de 276 paires de bases est mise en évidence pour les souches Neo Ncmic3 KO - 2G Neo Ncmicl-3 KO et Neo Ncmicl-3 KO - 2G confirmant la suppression du gène de sélection cat-e SEQ ID NO :2 dans ces souches, laissant une cicatrice loxN SEQ ID NO :5 dans le génome. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces a SEQ ID NO :20 et b SEQ ID NO :21 (mix Ncmicl) permettent de mettre en évidence une bande à 644 paires de bases pour les souches NC-1, Neo Ncmic3 KO, Neo Ncmic3 KO - 2G, conformément aux tailles de bandes attendues et confirmant la présence du gène Ncmicl SEQ ID NO :106 dans ces souches. Ces bandes ne sont pas détectées dans les souches Neo Ncmicl-3 KO et Neo Ncmicl-3 KO - 2G confirmant la suppression du gène dans ces souches. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces m SEQ ID NO :28 et j SEQ ID NO :25 et les amorces k SEQ ID NO :26 et n SEQ ID NO :29 (mix Ncmicl) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 3359 et 3421 paires de bases pour la souche Neo Ncmicl-3 KO, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène de sélection cat-e SEQ ID NO :2 dans cette souche à la place du gène Ncmicl. Cette 56 bande n'est pas détectée dans les souches sauvage NC-1 de N. caninum, Neo Ncmic3 KO, Neo Ncmic3 KO - 2G, et Neo Ncmicl-3 KO - 2G confirmant l'absence du gène de sélection at-gfp SEQ ID NO :2 au locus Ncmic 1 dans ces souches. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces SEQ ID NO :30 et f SEQ ID NO :31 (cicatrice Ncmicl) permettent de mettre en évidence différentes bandes conformément à la taille de bande attendue. Une bande à 2182 paires de bases pour les souches NC-1, Neo Ncmic3 KO, Neo Ncmic3 KO - 2G confirme la présence du gène Ncmicl dans ces souches. Une bande de 2560 paires de bases est mise en évidence pour la souche Neo Ncmicl-3 KO confirmant la présence de la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 à la place du gène Ncmicl. Enfin une bande de 261 paires de bases est mise en évidence pour la souche Neo Ncmicl-3 KO - 2G confirmant la suppression du gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO :2 dans cette souche, laissant une cicatrice loxP SEQ ID NO :12 dans le génome. Les produits PCR « cicatrice » (mix 4 et 8) ont été séquences et les séquençages ont confirmés que : - le gène ncmic3 SEQ ID NO :105 a été supprimé et que la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a bien été supprimée par action de la Cre-Recombinase laissant une cicatrice LoxN SEQ ID NO :5 conforme à la séquence attendue (Figure 3C). - le gène ncmicl SEQ ID NO :106 a été supprimé et que la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a bien été supprimée par action de la Cre-Recombinase laissant une cicatrice LoxP SEQ ID NO :12 conforme à la séquence attendue (Figure 3C). Validation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G par immunofluorescence Les tachyzoïtes cultivés 24h sur lamelles en verre recouvertes d'une monocouche de cellules HFF. Les cellules infectées ont été lavés 2 fois en PBS1X, et fixés par du formaldéhyde 4% pendant 30 min. Après 3 lavages en PBS1X, les cellules HFF infectées ont été perméabilisées avec 0,1% de Triton X-100 dans du PBS1X pendant 5 min. Après 3 lavages au PBS 1X, une étape de saturation est effectuée avec une solution de PB S 1X/SVF 10% pendant 30 min.. Les cellules ont ensuite été incubées avec l'anticorps primaire dilué dans 2% SVF pendant 1 heure, lavées 3 fois au PBS1X puis incubées avec un anticorps secondaire dilué dans une solution de PBS/SVF 2% pendant 1 heure. Après 2 lavages au PBS1X, les lamelles en verre sont montés sur lame avec de l'Immu-MountTm et observées au microscope à fluorescence. L'anticorps primaire Tgmic3 permet une reconnaissance de la protéine Ncmic3, il permet de détecter l'expression de la protéine NcMIC3 SEQ ID NO : 118 dans le parasite (anticorps de 57 lapin anti-mic3 : rnAb anti-MIC3 s3) et l'anticorps secondaire commercial utilisé est l'Alexa fluor® 594 chèvre anti-lapin (Life technologies réf. A-11012). Les résultats montrent qu'aucune fluorescence n'est détectable au pôle apical du parasite révélant l'absence des protéines MIC3 (Figure 4-A). L'anticorps primaire Tgmicl ne permet pas une reconnaissance de la protéine NcMIC1 SEQ ID NO: 119. Les résultats montrent que les parasites expriment une fluorescente verte reflétant l'expression de la protéine CATGFP SEQ ID NO : 120 suite à la réalisation des délétions de gènes (Neo ncmic3 KO et Neo ncmic1-3 KO) alors qu'après action de la Cre recombinase, les souches Neo ncmic3 KO - 2G et Neo ncmic1-3 KO - 2G ne sont plus fluorescentes (suppression de de la cassette CATGFP SEQ ID NO :6) (Figure 4-B). Exemple 2 : Construction de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G L'haploïdie du génome de Toxoplasma gondii lors de la phase proliférative permet l'invalidation d'un gène en une seule recombinaison homologue. Culture des parasites Tous les tachyzoïtes de la souche de Toxoplasma gondii utilisés ont été produits en fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634)) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (SVF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine. Ils ont été récoltés après lyse mécanique des cellules hôtes et 3 passages en seringue 25G. Construction des plasmides - Plasmide pTgMIC3-KO-CAT-GFP loxP Le plasmide pTgMIC3-KO-CAT-GFP Lox P SEQ ID NO: 34 (Figure 5A) a été construit pour supprimer le gène codant la protéine TgMIC3 de Toxoplasma gondii (référence ATCC : souche RH Pra310) par recombinaison homologue. Le plasmide pTgMic3KO-CAT-GFP loxP SEQ ID NO : 34 contient une cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO: 6 comprenant un gène de sélection cat-e SEQ ID NO: 2 codant pour une protéine de fusion CAT-GFP permettant à la fois la résistance au chloramphénicol 58 (CAT) et une fluorescence verte (GFP : Green Fluorescent Protein), sous le contrôle du promoteur de l'a-tubuline de Toxoplasma gondii SEQ ID NO: 3. En aval du gène cat-e SEQ ID NO :2, la séquence 3'UTR du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO: 4 est insérée. La SEQ ID NO :6 a été amplifiée à partir du plasmide pT230 CAT-GFP SEQ ID NO : 9 en utilisant les amorces SEQ ID NO : 35 et SEQ ID NO: 36 qui permettent l'ajout des sites loxP (SEQ ID NO : 12) et des sites de restrictions HindIII et SpeI. La séquence nucléotidique amplifiée par PCR (2389 pb) a ensuite été cloné dans le plasmide pT230TUB Ble SEQ ID NO : 37 par digestion enzymatique avec les enzymes de restriction HindIII et SpeI. Le plasmide obtenu est dénommé pCATGFP loxP SEQ ID NO : 38. La région 3'HR du gène Tginic3 SEQ ID NO: 39 a été obtenu par la double digestion enzymatique du plasmide pmic3K0-2 SEQ ID NO : 40 avec les enzymes de restriction KpnI et HindIII (2145pb), puis cloné dans le plasmide pCATGFP loxP SEQ ID NO: 38 digéré par KpnI et HindIII (5238pb). Le plasmide obtenu est dénommé p3'UTRmic3-CATGFP loxP SEQ ID NO :41. La région 5'HR du gène Tginic3 SEQ ID NO: 42 a été amplifiée par PCR à partir de l'ADN génomique de la souche RH de T gondii. Pour l'amplification, les amorces SEQ ID NO : 43 et SEQ ID NO: 44 permettent l'amplification de la région 5'UTR du gène Tginic3 et la création de deux sites de restrictions (2568pb / sites SpeI et XbaI). Ces sites de restrictions ont été utilisés pour cloner le fragment 5HR digéré par SpeI et XbaI (2548pb) dans le plasmide p3'UTRmic3-CATGFP loxP SEQ ID NO: 38 en aval de la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO: 6 au niveau du site SpeI du plasmide précédemment décrit (7383pb) pour obtenir le plasmide pTgMic3KO-CAT-GFP loxP SEQ ID NO : 34. Les séquences des amorces figurent dans le Tableau 5 ci-après. Tableau 5 : Séquences des amorces utilisées pour la construction du plasmide pTgMIC3- KO-CAT-GFP loxP. Construction du plasmide pTgmic3K0 CA T-GFP loxP SEQ ID NO : 35 GCGGCCAAGCTTA TAACTTCGTATAATGTATGCTATACGA HindIII 1 oxP A GTTA TGATATGCATGTCCGCgttcgtgaaatctctgatcaagcgg SEQ ID NO : 36 cgacgcacgctgtcactcaacttgctGCTAGAACTA GTGGATC CA TAA SpeI , BamHI, loxP CTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTA TCCCTCGG SEQ ID NO : 43 GGGATCCACTAGTTTACGTATCGCGACTAGCAGCAAG BamHI, SpeI, SnaBI, NruI TTGAGTGACAGCG SEQ ID NO : 44 GCTGCAGTCTAGAGATATCCACGTGGAATTCCTCTTGG PstI, XbaI, EcoRV Pm1I GAAGAACAAT 59 - Plasmide pTgMIC1-KO-CAT-GFP loxN Le plasmide pTgMIC1-KO-CAT-GFP loxN SEQ ID NO: 45 (Figure 5-B) a été construit pour supprimer le gène codant la protéine TgMIC1 de Toxoplasma gondii par recombinaison homologue. Le plasmide pTgMiclKO-CAT-GFP loxN SEQ ID NO : 45 contient une cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO: 6 comprenant le gène de sélection cat-e SEQ ID NO: 2 codant pour la protéine de fusion CAT-GFP permettant à la fois la résistance au chloramphénicol (CAT) et une fluorescence verte (GFP : Green Fluorescent Protein), sous le contrôle du promoteur de l'a-tubuline de Toxoplasma gondii SEQ ID NO: 3. En aval du gène cat-e SEQ ID NO :2, la séquence 3'UTR du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 4 a été insérée. La SEQ ID NO :6 a été amplifiée à partir du plasmide pT230 CAT-GFP SEQ ID NO: 9 en utilisant les amorces SEQ ID NO : 46 et SEQ ID NO : 47 qui permettent l'ajout des sites loxN (SEQ ID NO : 5) et des sites de restrictions ClaI et XbaI. La séquence nucléotidique amplifiée par PCR a ensuite été clonée dans le plasmide pNcMic3KO-DHFR SEQ ID NO : 10 digéré par ClaI et XbaI (7715 pb) par digestion enzymatique avec les enzymes de restriction ClaI et XbaI. Le plasmide obtenu est dénommé pNCmic3K0 CATGFP LoxN SEQ ID NO : 48. Le fragment 5HR tgmicl SEQ ID NO : 49 a été amplifié par PCR avec les amorces SEQ ID NO : 50 et SEQ ID NO : 51 (2364pb), les sites de restriction KpnI et ClaI ont été ajoutés par PCR. Le fragment amplifié est digéré par les enzymes de restriction KpnI et ClaI (2337pb) et cloné dans le plasmide pNCmic3K0 CATGFP LoxN SEQ ID NO : 48 (voir exemple 1 pour l'obtention du plasmide pNCmic3K0 CATGFP LoxN) digéré par KpnI et ClaI (7740pb) pour remplacer le fragment 5HR ncmic3 (fragment digéré par KpnI et ClaI). Le plasmide obtenu est dénommé pTgmic1K05HR-NCm1c3K03HR CATGFP LoxN SEQ ID NO: 111. Puis le fragment 3HR tgmicl SEQ ID NO : 52 a été amplifié par PCR avec les amorces SEQ ID NO : 53 et SEQ ID NO : 54 (2750pb), les sites de restriction XbaI et NotI ont été ajoutés par PCR. Le fragment amplifié est digéré par les enzymes de restriction XbaI et NotI (2720 pb) puis cloné dans le plasmide pTgmic1K05HR-NCm1c3K03HR CATGFP LoxN SEQ ID NO : 111 digéré par les enzymes de restriction XbaI et NotI (7565 pb) pour remplacer le fragment 3HR ncmic3 (fragment digéré par XbaI et NotI).Le plasmide obtenu est dénommé pTgmic1K0 CAT-GFP LoxN SEQ ID NO : 45. Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le tableau 6 ci-dessous. Tableau 6 : Amorces permettant la Construction du plasmide pTgmic3K0 CAT-GFP loxP Construction du plasmide pTgmic3K0 CAT-GFP loxP SEQ ID NO : 46 TCCGCTCTCAGAGAATCGATGAAGCTTATAACTTCG ClaI LoxN TATAGTATACCTTATACGAAGTTATGATATGCATGT CCGCGTTCGTGAAATCTC SEQ ID NO : 47 ATACGTAAACTTCTAGATCCATAACTTCGTATAAGG XbaI loxN TATACTATACGAAGTTATCCCTCGGGGGGGCAAGAA TTGTGTTAACCGGTTCGA SEQ II) 1\10 : 50 GTAGCAAGGTACCACAAGCTAAAGAAACTAGTGCC 5HR tgmic 1For KpnI TCTTCTAAA SEQ ID NO: 51 TAAACGGGCTGATCGATGCAGGTAAATTCTATAGCC 5HR tgmic 1 Rev ClaI GGGT SEQ II) 1\10 : 53 TAAACGGGCTGATCGATGCAGGTAAATTCTATAGCC 3HR tgmic 1For XbaI GGGT SEQ II) NO : 54 AAAAACTCGGTGGCGGCCGCATAAAGAAGAGCAAG 3HR tgmic lev NotI GAAAA - Plasmide pTSAG1- Cre Recombinase Le plasmide pT-SAG1-Cre-Recombinase SEQ ID NO : 15 a été construit pour exprimer de manière transitoire dans les parasites Toxoplasma gondii et Neospora caninum et leurs dérivés modifiés génétiquement le gène codant la protéine Cre Recombinase dérivée du bactériophage P1 (Brecht et al., 1999, même référence que précédemment). Le plasmide pT-SAG1-Cre-Recombinase SEQ ID NO : 15 dérive du plasmide pUC18 (plasmide commercial) qui contient une cassette d'expression de la Cre Recombinase du bactériophage Pl. Dans le plasmide pT-SAG1-Cre-Recombinase SEQ ID NO :15, le gène codant la Cre Recombinase SEQ ID NO :16, est placé sous la dépendance du promoteur du gène sag 1 de Toxoplasma gondii SEQ ID NO :17, ce qui permet l'expression de la protéine Cre Recombinase dans les parasites Toxoplasma gondii transfectés. En aval du gène codant la Cre Recombinase SEQ ID NO :16, la séquence 3'UTR du gène sag 1 de Toxoplasma gondii SEQ ID NO :4 est insérée. Cette séquence a pour objectif de stabiliser l'ARNm codant la protéine Cre Recombinase. L'absence de cassette de sélection spécifique ne permet pas une intégration stable du matériel génétique transfecté mais seulement une expression transitoire de la Cre Recombinase. 61 Construction de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G La construction de la souche vivante atténuée de seconde génération, dénommée Toxo tgmic1-3 KO - 2G, est faite en 4 étapes distinctes (Figure 6-A) : 1. Délétion par recombinaison homologue du gène Tgmic3 et son remplacement par la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6 encadrée par des séquences LoxP SEQ ID NO :12. Pour obtenir cette souche, la souche sauvage de Toxoplasma gondii RH (référence ATCC : PRA-310) est électroporée avec le plasmide pTgMIC3-KO-CAT-GFP loxP SEQ ID NO :34. 20 1.1g de plasmide purifié puis linéarisé par KpnI sont ajoutés à 107 parasites mis en suspension dans le milieu d'électroporation CYTOMIX contenant de l'ATP (3 mM) et du Glutathion (3 mM) (Van den Hoff et al., Nucleic Acid Research, Jun 11; 20(11):2902), et l'électroporation a été réalisée en cuvette d'écart 4 mm, dans un volume de 800 !IL sur un appareil BioRad (Paramètres : 2000V, 50 ohms, 25 1.1F, avec deux chocs électriques). Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture est remplacé et supplémenté par l'agent de sélection (chloramphénicol 20 1.1M), 24 heures après l'électroporation. 10 à 15 jours après sélection, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique au DNAzol des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Toxo tgmic3 KO. Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et remplacé par la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant la cassette de sélection CATGFP est la SEQ ID NO : 103. Le gène mic/ n'étant pas délété, la séquence du gène mic/ SEQ ID NO :108 est présente dans le génome de la souche. 2. Suppression de la cassette de sélection SEQ ID NO :6: la souche Toxo tgmic3 KO obtenue est électroporée avec le plasmide pT-SAG1-CRE-Recombinase SEQ ID NO :15. L'enzyme exprimée transitoirement va permettre l'excision de la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6. Le protocole d'électroporation est similaire au protocole précédent. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Après 2 à 7 jours de culture, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont 62 identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique au DNAzol des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Toxo tgmic3 KO - 2G. Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisée. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO : 19. Le gène mic/ n'étant pas délété, la séquence du gène mic/ SEQ ID NO :108 est présente dans le génome de la souche. 3. Délétion par recombinaison homologue du gène tgmicl et son remplacement par la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6 encadrée par des séquences Lox N SEQ ID NO :5. Pour obtenir cette souche, la souche Toxo tgmic3 KO - 2G est électroporée avec le plasmide pTgMIC1-KO-CAT-GFP lox N SEQ ID NO :45 linéarisé par PciI, selon le protocole précédemment décrit. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture est remplacé et supplémenté par l'agent de sélection (chloramphénicol 20 1.1M), 24 heures après l'électroporation. 10 à 15 jours après sélection, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Toxo tgmic1-3 KO. Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisée. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO: 19. Dans cette souche, le gène mic/ a été délété et remplacé par la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic/ délété contenant la cassette de sélection CATGFP est la SEQ ID NO : 104. 4. Suppression de la cassette de sélection SEQ ID NO :6: la souche Toxo tgmic1-3 KO obtenue est électroporée avec le plasmide pT-SAG1-CRE-Recombinase SEQ ID NO :15. L'enzyme exprimée transitoirement va permettre l'excision de la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Après 2 à 7 jours de culture, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique au DNAzol des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Toxo tgmic1-3 KO - 2G. 63 Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisée. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO: 19. Dans cette souche, le gène mic/ a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisée. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic/ délété contenant un seul site lox N SEQ ID NO : 5, est la SEQ ID NO : 92. Validation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G par PCR Pour valider la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G des analyses PCR sont effectuées à partir de l'ADN génomique extrait au DNAzol à partir d'un culot parasitaire constitué de 107 parasites. Les amorces utilisées pour les PCR sont décrites dans la Figure 11-B et sont détaillées dans le Tableau 7 ci-dessous. Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose (Figure 6-B). Leur taille attendue et leur taille observée sont également décrites dans le Tableau 8 ci-dessous. Pour plus de clarté sur la figure 6-B, seules les 3 étapes de la réalisation sont représentées (tgmic3, tgmic3K0 CATGFP et tgmic3K0 loxP (2G) ou tgmicl, tgmic1K0 CATGFP et tgmic1K0 loxN(2G)), les résultats obtenus sont conformes aux tailles attendues. 64 Tableau 7 : liste des amorces utilisées pour la validation des souches. Tgmic3 (mixl ) 5 TgMIC3 For SEQ ID NO 61: 6 TgMIC3 Rev SEQ ID NO 62: CCTCCGATGTGACTITTGGT GATCCTCGGAGCAAGTCAAC Validation 1 CN5 8 SEQ ID NO 63 : i ORF KO 3 ATACGAAGGGATTCGACGTG CATGFP 5 'Tgmic3 (mi R SEQ ID NO 25: x2) CC GTTTGGTGGATGTCTTCT Validation k ORF 1 HR Mic3 SEQ ID NO 64 KO CATGF SEQ ID NO 26: 4 RL ATATGCGGATGAGTGCTCGAA 3 'Tgmic3 (mix3) P F GCATCGACTTCAAGGAGGAC TT Cicatrice 9 Tgmic3 SEQ ID NO 65 : 1 Tgmic3 SEQ ID NO 66 : Tgmic3 loxN F GTGTGGAGACTTTTTACTTCGT 0 loxN R CCTCCGATGTGACTITTGGT (mix4) GTTAC Tgmic 1 3 TgMIC1 SEQ ID NO 55: 4 TgMIC1R SEQ ID NO 56: (mix5) For ATGCGCGCTATAAAGAATCG ev AGAAACAACGCCTGGCCCAT Validation 1 tgmic 1K SEQ ID NO 57 : i ORF SEQ ID NO 25 : KO 1 0 integ GTGCGATGACGTGGCTTCTCTATC CATGFP CC GTTTGGTGGATGTCTTCT 5 'Tgmic 1(mi x6) F ATGTGT R Validation k ORF SEQ ID NO 26 : 1 tgmic1K0 SEQ ID NO 58 : KO CATGF GCATCGACTTCAAGGAGGAC 2 integ R GATTCGCTTCGTCACTTCTGGTACG 3 ' Tgmic 1 (mix7) P F GATGC Cicatrice 7 Tgmic 1 SEQ ID NO 59 : 8 Tgmic 1 SEQ ID NO 60 : Tgmic 1 (mix8) loxN F CCCGTCTAGCAAGACCTCAA loxN R TCGGTGCTGCTCAGTAATTG Tableau 8 : Taille attendue des amplicons (en paires de base) des différentes PCR de validation de la construction des souches KO de Toxoplasma gondii RH Toxo tgmic3 Toxo tgmic3 Toxo tgmic1-3 Toxo tgmic1-3 KO KO- 2G KO KO - 2G Tgmic3 (mix 1 ) 808 - - - - Validation KO - 3253 - - - 5 ' Tgmic3(mix2) Validation KO 3 'Tgmic3 - 3309 - - - (mix3) Cicatrice Tgmic3 (mix4) 1596 2525 226 226 226 Tgmicl(mix5) 608 608 608 - - Validation KO 5 'Tgmicl - - - 3040 - (mix6) Validation KO 3 'Tgmicl - - - 3593 - (mix7) Cicatrice Tgmicl(mix8) 4198 4198 4198 3129 830 Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces 5 SEQ ID NO :61 et 6 SEQ ID NO : 62 (mix 1) permettent de mettre en évidence une bande à 808 paires de bases pour la souche RH, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène Tgmic3 dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans les souches Toxo tgmic3 KO, Toxo tgmic3 KO - 2G, Toxo tgmic1-3 KO et Toxo tgmic1-3 KO - 2G confirmant la suppression du gène dans ces souches. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces 13 SEQ ID NO :63 et j SEQ ID NO :25, et les amorces k SEQ ID NO :26 et 14 SEQ ID NO :64 (mix 2 et 3) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 3253 et 3537 paires de bases pour la souche Toxo tgmic3 KO, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO :2 dans cette souche à la place du gène Tgmic3 SEQ ID NO :107. Cette bande n'est pas détectée dans les souches RH, Toxo tgmic3 KO - 2G, Toxo tgmic1-3 KO et Toxo tgmic1-3 KO - 2G confirmant l'absence du gène de sélection cat-e SEQ ID NO :2 au locus Tgmic 3 dans ces souches. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces 9 SEQ ID NO :65 et 10 SEQ ID NO :66 (mix 4) permettent de mettre en évidence différentes bandes conformément à la taille de bande attendue. Une bande à 1596 paires de bases pour la souche RH, confirme la présence du gène Tgmic3 SEQ ID NO :107 dans cette souche. Une bande de 2525 paires de bases est mise en évidence pour la souche Toxo tgmic3 KO confirmant la présence de la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 à la place du gène Tgmic3. Enfin une bande de 226 paires de bases est mise en évidence pour les souches Toxo tgmic3 KO - 2G, Toxo tgmic1-3 KO et Toxo tgmic1-3 KO - 2G confirmant la suppression du gène de sélection cate SEQ ID NO :2 dans ces souches, laissant une cicatrice loxP SEQ ID NO :12 dans le génome. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces 3 SEQ ID NO :55 et 4 SEQ ID NO :56 (mix 5) permettent de mettre en évidence une bande à 608 paires de bases pour les souches RH, Toxo tgmic3 KO et Toxo tgmic3 KO - 2G, conformément aux tailles de bandes attendues et confirmant la présence du gène Tgmicl SEQ ID NO :108 dans ces souches. Ces bandes ne sont pas détectées dans les souches Toxo tgmic1-3 KO et Toxo tgmic1-3 KO - 2G confirmant la suppression du gène dans ces souches. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces 11 SEQ ID NO :57 et j SEQ ID NO :25, et les amorces k SEQ ID NO :26 et 12 SEQ ID NO :58 (mix 6 et 7) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 3040 et 3593 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du 66 gène de sélection cat-e SEQ ID NO :2 dans cette souche à la place du gène tgmic3 SEQ ID NO :107. Cette bande n'est pas détectée dans les souches sauvage RH de T gondii (référence ATCC : PRA-310), Toxo tgmic3 KO, Toxo tgmic3 KO - 2G, et Toxo tgmic1-3 KO - 2G confirmant l'absence du gène de sélection cat-e SEQ ID NO :2 au locus Tgmicl dans ces souches. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces 7 SEQ ID NO :59 et 8 SEQ ID NO :60 (mix 8) permettent de mettre en évidence différentes bandes conformément à la taille de bande attendue. Une bande à 4198 paires de bases pour les souches RH, Toxo tgmic3 KO et Toxo tgmic3 KO - 2G confirme la présence du gène Tgmicl SEQ ID NO :108 dans ces souches. Une bande de 3129 paires de bases est mise en évidence pour la souche Toxo tgmic1-3 KO confirmant la présence de la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 à la place du gène Tgmicl Enfin une bande de 830 paires de bases est mise en évidence pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G confirmant la suppression du gène de sélection cat-e SEQ ID NO :2 dans cette souche, laissant une cicatrice loxN SEQ ID NO :5 dans le génome. Les produits PCR « cicatrice » (mix 4 et 8) ont été séquences et les séquençages ont confirmés que : - le gène Tgmic3 SEQ ID NO :107 a été supprimé et que la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a bien été supprimée par action de la Cre-Recombinase laissant une cicatrice LoxP SEQ ID NO :12 conforme à la séquence attendue (Figure 6-C). - le gène Tgmicl SEQ ID NO :108 a été supprimé et que la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a bien été supprimée par action de la CRE-Recombinase laissant une cicatrice LoxN SEQ ID NO :5 conforme à la séquence attendue (Figure 6-C). Validation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G par immunofluorescence Les tachyzoïtes sont cultivés 24h sur lamelles en verre recouvertes d'une monocouche de cellules HFF. Les cellules infectées ont été lavés 2 fois en PBS1X, et fixés par du formaldéhyde 4% pendant 30 min. Après 3 lavages en PBS1X, les cellules HFF infectées ont été perméabilisées avec 0,1% de Triton X-100 dans du PBS1X pendant 5 min. Après 3 lavages au PB S 1X, une étape de saturation est effectuée avec une solution de PB S 1X/SVF 10% pendant 30 min. Les cellules ont ensuite été incubées avec l'anticorps primaire dilué dans 2% SVF pendant 1 heure, lavées 3 fois au PBS1X puis incubées avec un anticorps secondaire dilué dans une solution de PBS/SVF 2% pendant 1 heure. Après 2 lavages au PBS1X, les 67 lamelles en verre sont montés sur lame avec de l'Immu-MountTm et observés au microscope à fluorescence. L'anticorps primaire Tgmic3 utilisé est un anticorps qui permet de détecter l'expression de la protéine TgMIC3 SEQ ID NO : 121 dans le parasite (anticorps de lapin anti-mic3 : rnAb antiMIC3 s3) et l'anticorps secondaire commercial utilisé est l'Alexa fluor® 594 chèvre anti-lapin (Life technologies réf. A-11012). L'anticorps primaire Tgmicl utilisé est un anticorps qui permet de détecter l'expression de la protéine TgMIC1 SEQ ID NO : 122 dans le parasite (anticorps de souris anti-micl : mAb anti-MIC1 T104F8E12) et l'anticorps secondaire commercial utilisé est l'Alexa fluor® 594 chèvre anti-souris, Life technologies réf. A-11005). Les résultats montrent qu'aucune fluorescence n'est détectable au pôle apical du parasite révélant l'absence des protéines MIC1 et MIC3 dans des tachyzoïtes Toxo tgmic1-3 KO - 2G alors qu'une fluorescence au pôle apical du parasite de la souche sauvage démontre l' expression des protéines MIC1 et MIC3 (figure 7). Les résultats montrent que les parasites expriment une fluorescente verte reflétant l'expression de la protéine CATGFP SEQ ID NO : 120 suite à la réalisation des délétions de gènes (Toxo tgmic3 KO et Toxo tgmic1-3 KO) alors qu'après action de la Cre recombinase, les souches Toxo tgmic3 KO - 2G et Toxo tgmic1-3 KO - 2G ne sont plus fluorescentes (suppression de de la cassette CATGFP) (Figure 7). 68 Exemple 3 : Construction de la souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI Matériel et méthode L'haploïdie du génome de Toxoplasma gondii lors de la phase proliférative permet l'invalidation d'un gène en une seule recombinaison homologue. Culture des parasites Tous les tachyzoïtes de la souche de Toxoplasma gondii utilisés ont été produits en fibroblastes humains (HFF) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (SVF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine. Ils ont été récoltés après lyse mécanique des cellules hôtes et 3 passages en seringue 25G. Construction du plasmide Le plasmide pTgRopl6KO-Gral5HKI-CAT-GFP 1ox2272 SEQ ID NO: 67 (Figure 8) contient la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO : 6 comprenant le gène de sélection cat-e SEQ ID NO: 2, codant pour la protéine de fusion CAT-GFP conférant une résistance au chloramphénicol (CAT) et une fluorescence verte (GFP), sous le contrôle du promoteur de l'a-tubuline de Toxoplasma gondii SEQ ID NO: 3 pour permettre l'expression du gène dans le parasite. En aval du gène de sélection SEQ ID NO : 2, la séquence 3'UTR du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO: 4 est insérée. Cette séquence a pour objectif de stabiliser l'ARNm codant la protéine de fusion CAT-GFP. La cassette de sélection SEQ ID NO : 6 est encadrée par deux sites Lox2272 SEQ ID NO : 68, sites de reconnaissance spécifiquement reconnus par la Cre Recombinase et qui seront utilisés ultérieurement pour supprimer la cassette de sélection CAT-GFP. En aval du deuxième site Lox2272, une cassette d'expression du gène gral5H SEQ ID NO : 69 a été cloné. Cette cassette d'expression est constituée du promoteur de gral5H amplifié à partir de l'ADN génomique de la souche ME49 et du gène gral5HSEQ ID NO : 70 amplifié à partir de l'ADN génomique de la souche ME49, incluant un tag HA en 3' SEQ ID NO: 72 pour faciliter la localisation et de la séquence 3'UTR du gène sagl de T gondii SEQ ID NO :4 amplifié à partir de l'ADN génomique de la souche RH. Ce plasmide permet donc la 69 réalisation simultanée d'un mutant ropl6K0 1ox22 72 CATGFP 1ox22 72 et l'insertion de gra1511HA au locus rop16. Le plasmide pTgROP16-KO-CAT-tdTomato SEQ ID NO : 73 contient une cassette CATtdTomato SEQ ID NO :125 - encadrée par une séquence 5'HR du gène Tgrop16 SEQ ID NO : 99 et une séquence 3'HR du gène Tgrop16 SEQ ID NO: 100. Le clonage a été fait à partir du plasmide pTgROP16-KO-CAT-tdTomato SEQ ID NO : 73 digéré par les enzymes SphI et AgeI (6073pb). Ce clonage a nécessité 4 PCR indépendantes. La première PCR a permis l'amplification à partir du plasmide pCATGFP lox P SEQ ID NO : 38, d'une cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO: 6 comportant le promoteur aTubuline, le gène de sélection cat-e et la région 3'UTR de sagl de T gondii, avec ajout du site 1ox2272 SEQ ID NO: 68 avec les amorces tub F AgeI SEQ ID NO : 74 et 3 UTR 1ox2272 R SEQ ID NO : 75 (2090pb). La deuxième PCR a permis l'amplification à partir du plasmide pT230 2G gral5II SEQ ID NO :76, du promoteur gra1511 SEQ ID NO : 71 avec ajout en 5' du site 1ox2272 SEQ ID NO: 68 avec les amorces pGral5 F 1ox2272 SEQ ID NO: 77 et P Gral5 R SEQ ID NO: 78 (1975pb). La troisième PCR a permis l'amplification à partir du plasmide pT230 2G gral5II SEQ ID NO :76, du gène gra1511 HA avec le 3'UTR de sagl SEQ ID NO : 79 (2092 pb) avec les amorces Gral5F SEQ ID NO 126et UTR sagl rop16 R SEQ ID NO 127. Les amorces utilisées pour la construction de ce plasmide sont répertoriées dans le tableau 9 ci-dessous. Tableau 9 : Amorces utilisées pour la construction du plasmide pT230 2G Gral5II tub F AgeI SEQ ID NO : 74 : GTGATCCTGGTTGGACCGGT 3 UTR 1ox2272 R SEQ ID NO : 75: ATAACTTCGTATAAAGTATCCTATACGAAGTTATCGGTTCGACTAGAACAACTG pGral5 F 1ox2272 SEQ ID NO : 77 : CTTTATACGAAGTTATGGATCCACTAGTTGACTGCC P Gral5 R SEQ ID NO :78 : GTCACCATTGTTGAATGC Gral5F SEQ ID NO 126 : GCATTCAACAATGGTGAC UTR sagl rop16 R SEQ ID NO 127 : CGAATTTCGGGAGTTCTCGGGGGGGCAAGAATTGTG Ropl6F SEQ ID NO : 81 : GAACTCCCGAAATTCGTCAA Ropl6R SphI SEQ ID NO : 82 : AATACACGCGACCGCATGC La dernière PCR a permis l'amplification d'une partie de 3'Rop16 SEQ ID NO: 80 avec les amorces Ropl6F SEQ ID NO: 81 et Ropl6R SphI SEQ ID NO: 82 (570pb) sur le plasmide pTgrop16 KO CAT-tdTomato SEQ ID NO : 73 comme matrice. Les 4 fragments de PCR amplifiés ont été directement clonés dans le vecteur pTgrop16 KO CAT-tdTomato SEQ ID NO: 73 digéré par AgeI et SphI grâce au kit In-Fusion® de Ozyme (In-Fusion® HD Cloning Kit - Clonetech). La technologie de clonage In-Fusion® permet le clonage en une étape sans purification ou digestion d'un ou de plusieurs produits de PCR dans un vecteur linéarisé. Des extrémités complémentaires aux extrémités des fragments adjacents sont ajoutées par PCR. La réaction se fait selon les recommandations du constructeur. Le plasmide obtenu est dénommé pTgRopl6KO-Gral5HKI-CAT-GFP 1ox2272 SEQ ID NO : 67. Le plasmide dénommé pTgRopl6KO-Gral5HKI-CAT-GFP 1ox2272 SEQ ID NO: 67 contient donc une cassette CAT- GFP SEQ ID NO: 6 et une cassette d'expression de gral5HAII SEQ ID NO: 69 , encadrées par une séquence 5'HR du gène Tgrop16 SEQ ID NO : 99 et une séquence 3'HR du gène Tgrop16 SEQ ID NO: 100. Construction de la souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI -2G La construction de la souche vivante atténuée de seconde génération, dénommée Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II M -2G, est faite en 2 étapes distinctes : 71 1. Délétion par recombinaison homologue du gène rop16 et son remplacement par la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO : 6 encadrée par des séquences Lox2272 SEQ ID NO : 38 et la cassette gral5II SEQ ID NO :69. Pour obtenir cette souche, la souche Toxo tgmic3 KO - 2G est électroporée avec le plasmide pTgRopl6KO-Gral5HKI-CAT-GFP lox 2272 SEQ ID NO: 67 (20 1.1g ) linéarisé par PciI, selon le protocole précédemment décrit. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture est remplacé et supplémenté par l'agent de sélection (chloramphénicol 20 1.1M), 24 heures après l'électroporation. 10 à 15 jours après sélection, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II M. Dans cette souche, le gène rop16 a été délété et remplacé par la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 et la cassette d'expression de gral5HAII SEQ ID NO :69 . Ainsi, la séquence théorique au locus du gène rop16 délété contenant la cassette de sélection CATGFP et la cassette d'expression de gral5HAII est la SEQ ID NO : 112. Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO: 19. Dans cette souche, le gène mic/ a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic/ délété contenant un seul site lox N SEQ ID NO : 5, est la SEQ ID NO : 92. 2. Suppression de la cassette de sélection: la souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI obtenue est électroporée avec le plasmide pT-SAG1-CRE-Recombinase SEQ ID NO : 15 (Figure 2-C). L'enzyme exprimée transitoirement va permettre l'excision de la cassette de sélection CAT-GFP. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Après 2 à 7 jours de culture, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique au DNAzol des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI -2G. 72 Dans cette souche, le gène rop16 a été délété et remplacé par la cassette d'expression de gral5HAII SEQ ID NO :69 et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène rop16 délété contenant la cassette un seul site lox 2272 SEQ ID NO : 68 et la cassette d'expression de gral5HAII est la SEQ ID NO : 93. Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO: 19. Dans cette souche, le gène mic/ a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic/ délété contenant un seul site lox N SEQ ID NO : 5, est la SEQ ID NO : 92. Validation de la souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gra1511 KI -2G par PCR Pour valider la souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI 2G des analyses PCR sont effectuées à partir de l'ADN génomique extrait au DNAzol à partir d'un culot parasitaire constitué de 107 parasites. Les amorces utilisées pour les PCR sont décrites dans la Figure 11C et sont détaillées dans le Tableau 10 ci-dessous. Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d' agarose (Figure 9-B). Leur taille attendue et leur taille observée sont également décrites dans le Tableau 11 ci-dessous. Tableau 10 : liste des amorces utilisées pour la validation de la souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI 2G. Amorce F Séquence Amorce R Séquence Tgrop16 (mixl) Rgl AGD rop 16CDS F SEQ ID NO: 83 Rg2 AGD rop 16CDS R SEQ ID NO: 84 GTTTGAGGAAGCGCAAAAAG TGCTGTGATTTCGCAAGTTC Validation KO en amont (mix2) Rg3 Rop 16K0 valid 5F1 SEQ ID NO: 85 Rg4 Amont ropl6R SEQ ID NO: 86 ACCCCCTGACCCCTTGTCTG TCGTCGTGGTATTCACTCCA Validation KO en aval (mix3) Rg5 Gral5 qPCR 2F SEQ ID NO: 87 Rg6 Aval ropl6R SEQ ID NO: 88 CACGTACACAACCCATCTCG AAAACGAATGCGAAGGAAGA Cicatrice ropl6K0 gral5 loxP (mix4) Rg7 cicrop16 loxF SEQ ID NO: 89 Rg8 cicrop16 loxGraR SEQ ID NO: 90 CAGTACCAGCCACGTTAGCA CAAGCAATCTGTGGCAAAAA Gral5PII (mix5) Gral5PII F SEQ ID NO: 109 Gral5PII F SEQ ID NO: 110 GTGCAAAGCCAACTTCCACT GGACCTGGATCAGAGATCGT 73 Tableau 11 : Taille attendue des amplicons (en paires de base) des différentes PCR de validation de la construction de la souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI 2G Toxo tgmic1-3 KO - 2G Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI -2G Gral5II KI Tgrop 16 (mixl) 1682 - Validation KO 5'Tgrop16 - 2759 - (mix2) Validation KO 3' Tgrop16 - 2870 2870 (mix3) Cicatrice ropl6K0 gral5loxP - 2550 321 (mix4) Gral5I/II (mix5) 560 560 et 308 560 et 308 Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces rgl SEQ ID NO: 83 et rg2 SEQ ID NO: 84 (mix 1) permettent de mettre en évidence une bande à 1682 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène Tgrop16 dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans les souches Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI et Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI -2G confirmant la suppression du gène dans ces souches. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces rg3 SEQ ID NO: 85et rg4 SEQ ID NO: 86 (mix 2) permettent de mettre en évidence une bande à 2759 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI, conformément à la taille des bandes attendues et confirmant la suppression du gène Tgrop16 dans cette souche et l'insertion du gène de sélection CATGFP et gra1511 à la place du gène Tgrop16. Cette bande n'est pas détectée dans les souches Toxo tgmic1-3 KO - 2G et Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI -2G. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces rg5 SEQ ID NO: 87 et rg6 SEQ ID NO: 88 (mix 3) permettent de mettre en évidence une bande à 2870 paires de bases pour les souches Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI et Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI -2G, conformément à la taille des bandes attendues et confirmant la suppression du gène Tgrop16 dans cette souche et l'insertion du gène gra1511 à la place du gène Tgrop16. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces rg7 SEQ ID NO: 89 et rg8 SEQ ID NO: 90 (mix 4) permettent de mettre en évidence une bande de 2550 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI confirmant la présence de la cassette 74 de sélection CATGFP SEQ ID NO: 6 à la place du gène Tgrop16. Enfin une bande de 321 paires de bases est mise en évidence pour la souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI -2G confirmant la suppression du gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO : 2 dans cette souche, laissant une cicatrice 1ox2272 SEQ ID NO : 68 dans le génome. Aucune bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G. Le produit PCR « cicatrice » obtenue pour la souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI -2G (321 paires de bases) a été séquence et les séquençages ont confirmés que : - le gène Tgrop16 a été supprimé et que la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO: 6 a bien été supprimée par action de la Cre-Recombinase laissant une cicatrice Lox2272 SEQ ID NO : 68 conforme à la séquence attendue (Figure 9-C). Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces SEQ ID NO: 109 et SEQ ID NO: 110 (mix 5) permettent de mettre en évidence une bande à 560 paires de bases pour les souches Toxo tgmic1-3 KO - 2G, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène Tggral5 dans cette souche. Une bande supplémentaire à 308 paires de bases est détectée dans les souches Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI et Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI -2G confirmant la présence du gène gral5HAII dans ces souches. Validation de la souche Toxo tguncl-3 KO rop16 KO Gral5II KI -2G par immunofluorescence Les tachyzoïtes sont cultivés 24h sur lamelles en verre recouvertes d'une monocouche de cellules HFF. Les cellules infectées ont été lavés 2 fois en PBS1X, et fixés par du formaldéhyde 4% pendant 30 min. Après 3 lavages en PBS1X, les cellules HFF infectées ont été perméabilisées avec 0,1% de Triton X-100 dans du PBS1X pendant 5 min. Après 3 lavages au PBS 1X, une étape de saturation est effectuée avec une solution de PBS 1X/SVF 10% pendant 30 min. Les cellules ont ensuite été incubées avec l'anticorps primaire dilué dans 2% SVF pendant 1 heure, lavées 3 fois au PBS1X puis incubées avec un anticorps secondaire dilué dans une solution de PBS/SVF 2% pendant 1 heure. Après 2 lavages au PBS1X, les lamelles en verre sont montés sur lame avec de l'Immu-MountTm et observés au microscope à fluorescence. L'anticorps primaire utilisé est l'anticorps de souris anti-HA qui permet de détecter l'expression de la protéine GRA1511-HA SEQ ID NO : 123 dans le parasite. L'anticorps secondaire est l'anticorps secondaire commercial : Alexa fluor® 594 chèvre anti lapin (Life Technologies A-11012). Les anticorps sont dilués au 1/1000 dans du PBS SVF 2%. Pour la souche sauvage Toxo tgmic1-3 KO 2G, aucune fluorescence rouge n'est observé au pôle apical du parasite révélant ainsi l'absence de la protéine GRA1511-HA. Au contraire, pour la souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO gral5II KI, une fluorescence rouge est observé démontrant la protéine GRA1511-HA. La souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO gral5II KI exprime une fluorescente verte reflétant l'expression de la protéine CATGFP SEQ ID NO: 120 alors qu'après action de la Cre recombinase, la souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO gral5II KI 1ox2272 n'est plus fluorescente (Figure 10). Exemple 4 : Construction d'un plasmide permettant l'intégration et l'expression de transgènes au sein de souches de Toxoplasma gondii et Neospora caninum sans persistance d'une cassette de sélection. L'objectif de cette expérience est de construire un plasmide qui permette l'intégration dans le génome de Toxoplasma gondii ou dans celui de Neospora caninum d'un transgène hétérologue d'origine parasitaire, virale, bactérienne ou tumorale, son expression et sans persistance d'une cassette de sélection. Le plasmide dénommé pUC18 4G2 ICreI SEQ ID NO :128 (Figure 12) est constitué : - D'une cassette d'expression constitué du promoteur de l'a-Tub8 SEQ ID NO: 130 (Soldati et al., 1995 Mol Cell Biol. 1995 Jan;15(1):87-93) - fusion d'une partie du promoteur de Tgsagl et Tgtub), d'un site de clonage multiple MCS SEQ ID NO : 131 pour permettre l'intégration future de transgène hétérologue et de la séquence 3'UTR du gène Tgsagl SEQ ID NO: 132 qui doit permettre de stabiliser l'ARNm du gène hétérologue. - D'une cassette de sélection dhfr*-ty-tk SEQ ID NO: 134 comprend un gène de fusion dhfr*-ty-tk SEQ ID NO: 135 codant la protéine de fusion DHFR*TYTK SEQ ID NO : 136, placée sous la dépendance du promoteur du gène dhfr de T gondii SEQ ID NO: 137 et en aval de la séquence 3'UTR du gène dhfr de T gondii SEQ ID NO: 138. La cassette de sélection est entourée par deux sites ICreI SEQ ID NO : 139, site de reconnaissance de la méganucléase I-CreI. Une séquence nucléotidique af3 de 102 paires de bases SEQ ID NO : 140 est ajoutée en amont de la cassette de sélection et une séquence nucléotidique f3y de 100 paires de bases SEQ ID NO : 141 en aval. Ces 76 deux séquences doivent permettre après action de la méganucléases I-CreI de favoriser la réparation de l'ADN par recombinaison homologue entre les deux séquences f3 SEQ ID NO: 142 pour aboutir à une séquence c43y non fonctionnelle SEQ ID NO: 143, en lieu et place de la cassette de sélection. La cassette de sélection dhfr*-ty-tk SEQ ID NO : 134 doit permettre la sélection positive des parasites ayant intégré le transgène par action de la pyriméthamine et la sélection négative des parasites dont la cassette de sélection aura été supprimée suite à l'action de la méganucléase I-CreI, par action du ganciclovir (figure 13). Construction de la cassette d'expression La cassette d'expression Tub8MCS 3UTR SEQ ID NO : 129 comporte le promoteur de l'aTub8 SEQ ID NO: 130 , un site de clonage multiple SEQ ID NO: 131 et la séquence 3'UTR du gène sagl SEQ ID NO: 132. Pour cela, le promoteur de l'a-Tub8 SEQ ID NO : 130 a été amplifié par PCR avec les amorces K7mcs1 SEQ ID NO : 144 et K7mcs2 SEQ ID NO : 145 sur le pTUB8TY TAIL SEQ ID NO: 146. La taille de l'amplicon obtenu est de 540 paires de bases SEQ ID NO: 147 composé du promoteur de l'a-Tub8 SEQ ID NO : 130 et d'une partie du futur site de clonage multiple SEQ ID NO : 148 (EcoRI, PmeI, DraI, AflII, NotI, NcoI, PacI, AseI). La séquence 3'UTR du gène sagl SEQ ID NO: 132 a été obtenue par PCR avec les amorces K7mcs3 SEQ ID NO: 149 et K7mcs4 SEQ ID NO: 150. La taille de l'amplicon obtenu est de 395 paires de bases SEQ ID NO : 151. Les deux fragments PCR ont été fusionnés par PCR chevauchante avec les amorces K7mcs1 SEQ ID NO: 144 et K7mcs4 SEQ ID NO: 150. L'amplicon obtenu (914pb) SEQ ID NO: 152 a été séquence puis digéré par KpnI et SacI (902pb) et clonée dans le pUC18 SEQ ID NO : 153 après digestion enzymatique par KpnI SacI (2682 paires de bases). Tableau 12 : liste des amorces utilisées pour la Construction de la cassette d'expression K7mcs 1 PT SEQ ID NO: 144 K7mcs 2 Tub 8 Ter R SEQ ID NO: 145 UB8 MCS 4 AAAGGTACCTCTAGAAGTATA CTATTCGAAAAACTAGTATCG ATAAGCTTGAACAC AACTTAAGAATTTTGTTTAAACAGGG F K7mcs 3 MCS 3UTR TER F SEQ ID NO: 149 K7mcs 4 MCS SEQ ID NO: 150 TTTAAACAAAATTCTTAAGTT GCGGC 3UTR TTTGAGCTCTCTAGAATTTAAATCCTA GG TER R 77 Le plasmide obtenu est appelé pUC 18 -Tub8MCS 3UTR SEQ ID NO: 133 Construction de la cassette de sélection La cassette de sélection dhfr*-ty-tk a été réalisée à partir de 3 fragments PCR : - L'amplification du premier fragment PCR SEQ ID NO : 154 a été effectuée sur le plasmide pUC18DHFR* SEQ ID NO: 155 (Donald & Roos 1993) avec les amorces Dhtkl SEQ ID NO: 156 et Dhtk2 SEQ ID NO: 157 (674pb) et permet l'amplification de la fin de la séquence codante de DHFR* SEQ ID NO : 158 et d'ajouter la séquence codant le TY SEQ ID NO: 159 en 3'. - La deuxième PCR SEQ ID NO: 160 a été effectuée sur une séquence synthétisée du gène codant la Thymidine Kinase de l'Human herpes virus 1 (TK) SEQ ID NO : 161 avec les amorces Dhtk3 SEQ ID NO : 162 et Dhtk4 SEQ ID NO : 163 (1161pb) et permet l'amplification de la séquence codante de la Thymidine Kinase avec ajout de la séquence codant le TY SEQ ID NO : 159 en 5'. - L'amplification du troisième fragment de PCR SEQ ID NO : 164 a été effectuée sur pUC18DHFR* SEQ ID NO: 155 avec les amorces Dhtk5 SEQ ID NO: 165 et Dhtk6 SEQ ID NO: 166 (363pb) et permet l'amplification de la fin de la séquence codante de la Thymidine Kinase SEQ ID NO: 167 et du 3'UTR de DHFR* SEQ ID NO : 168. Les deuxième et troisième fragments de PCR (respectivement SEQ ID NO : 160 et SEQ ID NO: 164) sont fusionnés par PCR chevauchante SEQ ID NO: 169 avec les amorces Dhtk3 SEQ ID NO: 162 et Dhtk6 SEQ ID NO: 166 (1501pb). Enfin le premier fragment SEQ ID NO : 154 digéré par BamHI et BglII (646pb) et la fusion des deux autres PCR SEQ ID NO: 169 digéré par BamHI et XbaI (1474pb) sont clonés dans le plasmide pUC18DHFR* SEQ ID NO : 155 digéré par BglII et XbaI (5258pb). Tableau 13 : liste des amorces utilisées pour la Construction de la cassette de sélection Dhtkl AF DHFRint Bgl F SEQ ID NO: 156 Dhtk2 AF DHFR TY R SEQ ID NO: 157 CTGAGAAGGGCGTGAAGATC GTCAAGTGGATCCTGGTTAGTATGGAC CTCGACAGCCATCTCCATCTGGATTCG Dhtk3 TY HSVTK F SEQ ID NO : 162 Dhtk4 HSVTK stop TAA R SEQ ID NO : 163 GAGGTCCATACTAACCAGGATCC ACTTGACATGGCTTCGTACCCCTG CCATCA TTAGTTAGCCTCCCCCATCTCCC Dhtk5 AFHSVT K3 UTRD HFRF SEQ ID NO : 165 Dhtk6 AF 3UTRD HFR XbaR SEQ ID NO : 166 GGGAGATGGGGGAGGCTAACTAA CGGAAATACAGAAGCTGCCCGTC TCT TTTTTCTAGAATCCTGCAAGTGCATAG AAGGAA 78 Le plasmide obtenu est appelé plasmide pUC18 DHFR*TYTK SEQ ID NO: 170. Construction du plasmide pUC18 4G2 La cassette d'expression Tub8MCS 3UTR SEQ ID NO : 129 obtenue par digestion du pUC 18 -Tub8MCS 3UTR SEQ ID NO: 133 avec l'enzyme XbaI (890pb) a ensuite été clonée dans le plasmide pUC18 DHFR*TYTK SEQ ID NO : 170 digéré par XbaI et déphosphorylé (7378pb). Le plasmide obtenu plasmide pUC18 4G2 SEQ ID NO: 171 présente la cassette d'expression Tub8MCS 3UTR transcrite en sens inverse par rapport à la cassette DHFR*TYTK. Construction du plasmide final pUC18 4G2 ICreI Le plasmide final pUC18 4G2 ICreI SEQ ID NO : 128 présente en amont et en aval de la cassette de sélection dhfr*-ty-tk SEQ ID NO : 134 des séquences permettant l'action de la méganucléase I-CreI. La séquence (43 IcreI SEQ ID NO : 182 est ajoutée en amont de la cassette de sélection dhfr*- ty-tk SEQ ID NO: 134. Pour cela deux fragments sont amplifiés par PCR (respectivement 142 pb :SEQ ID NO: 174 et 153 pb : SEQ ID NO: 175) avec les amorces IcreIl SEQ ID NO : 176 et IcreI2 SEQ ID NO : 177 sur le pTsag1I-CreI c43y SEQ ID NO : 178 (pour le fragment de 142pb) et IcreI3 SEQ ID NO : 179 et IcreI4 SEQ ID NO : 180 sur le pUC18 DHFR*TYTK SEQ ID NO: 170 (pour le fragment de 153pb). Les deux fragments PCR ont été directement clonés dans le plasmide pUC18 4G2 digéré par les enzymes de restriction Pml I et KasI (7990pb) avec la technique In-Fusion de Ozyme. La séquence IcreI f3y SEQ ID NO : 183 est ajoutée en aval de la cassette de sélection dhfr*-tytk SEQ ID NO: 134. Pour cela deux fragments sont amplifiés par PCR (respectivement 546 pb :SEQ ID NO : 184 et 133 pb : SEQ ID NO: 185) avec les amorces IcreI5 SEQ ID NO : 186 et IcreI6 SEQ ID NO : 187 sur le pTIcreI300 SEQ ID NO : 188 (546pb) et IcreI7 SEQ ID NO : 189 et IcreI8 SEQ ID NO : 190 sur le pTsag1I-CreI c43y SEQ ID NO : 178 (133pb) permettent l'ajout de la séquence IcreI f3y SEQ ID NO : 183 dans le plasmide précédemment décrit digéré par les enzymes de restriction NsiI et Avril (7734pb). 79 Tableau 14 : liste des amorces utilisées pour la Construction du plasmide final pUC18 4G2 ICreI Icr PC SEQ ID NO: 176 Icr oz4g SEQ ID NO: 177 ci R AATACCGCATCAGGCGCCTAGAACCTGTTA ei mn AAAACGTCGTGAGACAGTTTGGTGAGATATCTTCA AAAGATATATAGC 1 oz4 2 'kr g mn eIr 1F AAAATAT Icr oz4 g SEQ ID NO: 179 Icr oz4g SEQ ID NO: 180 ei mn GTCTCACGACGTTTTGAACCCAGAAGCTTCGC ei mn CGGATATGGTTACACGTG 3 2 4 2R Icre IF CAGGCTGTAAAT Icr oz SEQ ID NO: 186 Icr oz 4g 3 SEQ ID NO: 187 ci 4g 3F CGCCTCCGTCCCATGCAT ei cre R CCAAACTGTCTCACGACGTT 5 6 Icr oz 4g4 FIcr el SEQ ID NO: 189 Icr oz 4g4 SEQ ID NO: 190 ci CGTGAGACAGTTTGGCTAAAAATTTATTTTAA ATAATCTTAT ci R GAGGCGCGCCAACCTAGGAGGGCCCGGGCGCCAT GGC 7 8 avril Le plasmide final obtenu est nommé pUC18 4G2 ICreI SEQ ID NO :128. Exemple 5 : Construction d'un plasmide d'expression de la méganucléase I-CreI dans les souches Toxoplasma gondii et Neospora caninum. Le plasmide ptsag1I-CreI c43y SEQ ID NO : 178 (Figure 14) a été construit pour permettre l'expression transitoire de la méganucléase I-CreI SEQ ID NO : 193 dans les parasites Toxoplasma gondii et Neospora caninum. Il possède également la séquence a43y SEQ ID NO: 143, matrice qui permettra de favoriser la recombinaison entre les parties c43 SEQ ID NO : 182 et f3y SEQ ID NO : 183 après coupure par la méganucléase I-CreI. Le gène 1-crel codant la méganucléase I-CreI SEQ ID NO : 194 est placé sous la dépendance du promoteur du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO: 17. La protéine méganucléase I-CreI SEQ ID NO: 193 sera donc exprimée dans les parasites transfectés. En aval du gène codant la méganucléase I-CreI, la séquence 3'UTR du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 4 est insérée. Cette séquence a pour objectif de stabiliser l'ARNm codant la méganucléase I-CreI. La séquence codant la méganucléase I-CreI SEQ ID NO : 193 nous a été fournie dans le plasmide pCLS2220 SEQ ID NO: 197 par la société Cellectis. Le fragment de PCR SEQ ID NO : 198 (537pb) amplifié avec les amorces IcreI9 SEQ ID NO : 199 et Icrel0 SEQ ID NO : 200 digéré par les enzymes NsiI et PacI (524pb) est cloné dans le plasmide pTsaglCre recombinase SEQ ID NO : 15 digéré par les enzymes NsiI et PacI (en lieu et place de la CRE recombinase - 3642pb). Le plasmide obtenu est nommé ptsagl I-CreI SEQ ID NO : 201. La séquence matrice c43y SEQ ID NO: 143 a été amplifiée par PCR SEQ ID NO : 202 (170pb) sur une séquence synthétisée a43y avec les amorces IcreI 11 SEQ ID NO : 203 et IcreI12 SEQ ID NO : 204 et clonée directement dans le ptsag1I-CreI SEQ ID NO : 201 digéré par NotI et SacI (4145 pb) avec la technique In-Fusion de Ozyme. Tableau 15 : liste des amorces utilisées pour la Construction du plasmide plasmide ptsag1ICreI af3y Icrei 9 sagl ICreI For SEQ ID NO: 199 Icrei 10 I Cre I rev SEQ ID NO : 200 AGTATGCATCCCAAGAAGAAGAGGAAGGT GGCCAATACCAAATATAACAAAGAGTTCCT GC CTTTAATTAATCGGCCGCCGGGG AGG Icrei 1 1 AB F SEQ ID NO :203 Icrei 12 BG R SEQ ID NO : 204 CACTAGTTCTAGAGCTAGAACCTGTTAAAAA GGGAACAAAAGCTGGAGGGCCC TATAATCCA GGGCGCCATGGCA Exemple 6 : Construction de plasmides permettant l'intégration et l'expression de transgènes du virus Influenza dans des souches de Toxoplasma gondii et Neospora caninum sans persistance d'une cassette de sélection. L'objectif de cette expérience est de construire des plasmides qui permettent l'intégration dans le génome de Toxoplasma gondii ou dans celui de Neospora caninum d'un transgène hétérologue du virus Influenza son expression et sans persistance d'une cassette de sélection. - Plasmide pUC18 4G2 ICreI - M2eGPI Le plasmide pUC18 4G2 ICreI - M2eGPI SEQ ID NO : 205 (Figure 15) permet la production d'une protéine de fusion sag1M2eGPI SEQ ID NO : 206, comprenant : 81 - une grande partie de la protéine SAG1 SEQ ID NO : 207 de Toxoplasma gondii codée par la séquence SEQ ID NO : 208, - une répétition de 5 M2e du virus d'Influenza espacée par des linkers (Lee et al, 2015, PLoS ONE 10(9): e0137822. doi:10.1371/journal.pone.0137822) SEQ ID NO: 209. Chaque fragment M2e constitue le domaine extracellulaire (fragment Nter) de la protéine M2 d'une origine spécifique. La séquence nucléotidique des 5 M2e reliés SEQ ID NO : 210 permet de coder deux M2e d'origine humaine SEQ ID NO : 211 codés par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 172 , un M2e d'origine aviaire de souche de type I SEQ ID NO : 212 codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 173 , un M2e d'origine aviaire de souche de type II SEQ ID NO : 213 codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 181 et un M2e d'origine porcine SEQ ID NO : 214 codés par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 191. Entre chaque M2e, un linker de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 215 est inséré, ce même linker est codé respectivement par les séquences nucléotidiques SEQ ID NO :192, SEQ ID NO :195, SEQ ID NO :196 et SEQ ID NO :220. La séquence nucléotidique de cette répétition de 5 M2e a été optimisée pour Toxoplasma gondii. - un Tag V5 SEQ ID NO : 216 codée par la séquence SEQ ID NO : 217 - et en C terminal, une séquence d'ancrage en GPI de la protéine SAG1 SEQ ID NO: 218 de Toxoplasma gondii codée par la séquence SEQ ID NO : 219. L'amplification de 3 fragments PCR a été nécessaire pour cette construction : - L'amplification de la séquence codante de sagl a été effectuée sur l'ADN génomique de Toxoplasma gondii avec les amorces da SEQ ID NO : 222 et db SEQ ID NO : 223 (PCR : SEQ ID NO : 221 - 906pb). - L'amplification de la séquence d'ADN codant pour la répétition des 5 fragments M2e de 5 types de virus influenza et contenant un tag V5a été effectuée à partir d'un gène synthétique optimisée pour son expression chez Toxoplasma gondii. avec les amorces dc SEQ ID NO : 225 et dd SEQ ID NO : 226 (PCR : SEQ ID NO : 224 : 588 pb) - L'amplification de la séquence d'ADN codant pour l'ancrage GPI a été effectuée sur l'ADN génomique de Toxoplasma gondii avec les amorces de SEQ ID NO : 228 et df SEQ ID NO : 229 (PCR : SEQ ID NO : 227 ; 98pb). 82 Tableau 16 : liste des amorces utilisées pour la Construction du plasmide pUC18 4G2 ICreI - M2eGPI Amor ce F Séquence Amor ce R Séquence D a Ozsa gl 4G F SEQ ID NO :222 d b Sagl M2e R SEQ ID NO :223 CTTGAATTCCCTGTTTAAACGACAAAATGTTTCC GAAGGCAGTG TCAGCAAGGACCTAGGTGCAGCCCCGGCA A d M2e F SEQ ID NO :225 d Oz M2e GPI R SEQ ID NO :226 c CCTAGGTCCTTGCTGACTGA d GGCTGTTCCCGCAGCCGTAGAATCGAGAC CGAGGA d oZ GPI F SEQ ID NO :228 d oZ GPI R SEQ ID NO :229 e GCTGCGGGAACAGCCAGTCA f ACCATGGAAGCGGCCGCTTACGCGACACA AGCTGCGAT Les fragments de PCR ont été directement clonés dans le plasmide pUC18 4G2 ICreI SEQ ID NO : 128 digéré par les enzymes PmeI et NotI (8344pb) avec la technique In-Fusion de Ozyme. - Construction du plasmide pUC18 4G2 IcreI M2e Le plasmide pUC18 4G2 ICreI - M2e SEQ ID NO : 244 (Figure 16) permettra la production d'une protéine de fusion sag1M2e SEQ ID NO : 253, comprenant : - une grande partie de la protéine SAG1 SEQ ID NO : 207 de Toxoplasma gondii codée par la séquence SEQ ID NO : 208, - une répétition de 5 M2e du virus d'Influenza espacée par des linkers (Lee et al) SEQ ID NO : 209 .Chaque fragment M2e constitue le domaine extracellulaire (fragment Nter) de la protéine M2. La séquence nucléotidique des 5 M2e reliés SEQ ID NO : 210 se compose de deux M2e d'origine humaine SEQ ID NO : 211, un M2e d'origine aviaire de souche de type I SEQ ID NO : 212, un M2e d'origine aviaire de souche de type II SEQ ID NO : 213 et un M2e d'origine porcine SEQ ID NO : 214. Entre chaque M2e, un linker SEQ ID NO : 215 est inséré La séquence nucléotidique de cette répétition de 5 M2e a été optimisée pour Toxoplasma gondii. - un Tag V5 SEQ ID NO : 216 codée par la séquence SEQ ID NO : 217. L'amplification de 2 fragments PCR a été nécessaire pour cette construction : 83 - L'amplification de la séquence codante de sagl a été effectuée sur l'ADN génomique de Toxoplasma gondii avec les amorces da SEQ ID NO : 222 et db SEQ ID NO : 223 (PCR : SEQ ID NO : 221 ; 906pb). - L'amplification de la séquence d'ADN codant pour la répétition des 5 fragments M2e de 5 types de virus influenza et contenant un tag V5 a été effectuée à partir d'un gène synthétique optimisée pour son expression chez Toxoplasma gondii. avec les amorces dc SEQ ID NO : 225 et dg SEQ ID NO : 231 (PCR : SEQ ID NO : 230; 593 pb) Tableau 17 : liste des amorces utilisées pour la Construction du plasmide pUC18 4G2 ICreI - M2e Amor ce F Séquence Amor ce R Séquence D a Ozsag 1 4G F SEQ ID NO :222 d b Sagl M2e R SEQ ID NO :223 CTTGAATTCCCTGTTTAAACGACAAAATGTTTCCGAA GGCAGTG TCAGCAAGGACCTAGGTGCAGCCCC GGCAA dc M2e F SEQ ID NO :225 d g Oz M2e R SEQ ID NO :231 CCTAGGTCCTTGCTGACTGA ACCATGGAAGCGGCCGCTTACGTAG AATC Les fragments de PCR ont été directement clonés dans le plasmide pUC18 4G2 ICreI SEQ ID NO : 205 digéré par les enzymes PmeI et NotI (8344pb) avec la technique In-Fusion de Ozyme. - Plasmide pUC18 4G2 ICreI - HA Le plasmide pUC18 4G2 ICreI - HA SEQ ID NO : 232 (Figure 17) permet la production d'une protéine de fusion saglHA SEQ ID NO : 255, comprenant : - une grande partie de la protéine SAG1 SEQ ID NO : 207 de Toxoplasma gondii codée par la séquence SEQ ID NO : 208, - la tête de la protéine HA SEQ ID NO: 233 a été effectuée à partir d'un gène synthétique optimisée pour son expression chez Toxoplasma gondii SEQ ID NO: 235 et sélectionnée à partir de la souche d'origine : A/Swan/hungary/4999/2006 H5N1 (Kapcynski et al., 2015) SEQ ID NO : 234. - un Tag myc SEQ ID NO : 236 codée par la séquence SEQ ID NO : 237 - et en C terminal, une séquence d'ancrage en GPI de la protéine SAG1 SEQ ID NO: 218 de Toxoplasma gondii codée par la séquence SEQ ID NO : 219. 84 L'amplification de 3 fragments PCR a été nécessaire pour cette construction : - L'amplification de la séquence codante de sagl a été effectuée sur l'ADN génomique de Toxoplasma gondii avec les amorces da SEQ ID NO : 222 et db SEQ ID NO : 223 (PCR: SEQ ID NO : 221 ; 906pb). - L'amplification de la séquence d'ADN codant pour la tête de la protéine HA avec ajout d'un tag myc SEQ ID NO : 238 (722pb) a été effectuée à partir d'un gène synthétique avec les amorces di SEQ ID NO : 239 et dj SEQ ID NO : 240 (PCR: SEQ ID NO : 238 : 722 pb) - L'amplification de la séquence d'ADN codant pour l'ancrage GPI avec ajout du tag myc SEQ ID NO : 241 a été effectuée sur l'ADN génomique de Toxoplasma gondii avec les amorces dk SEQ ID NO : 242 et df SEQ ID NO : 243 (PCR: SEQ ID NO: 241 ; 121pb). Tableau 18 : liste des amorces utilisées pour la Construction du plasmide pUC18 4G2 ICreI - HA Amorce F Séquence Amorce R Séquence D a Ozsagl 4G F SEQ ID NO :222 d b Oz sag 1 tete HA r SEQ ID NO :223 CTTGAATTCCCTGTTTAAACGACAAAAT GTTTCCGAAGGCAGTG CGTCCAAGTCCCTAGGTGCAGCCCCGGCA AACTCC di Oz Tete HA F SEQ ID NO :239 dj Oz tete HA myc R SEQ ID NO :240 CCTAGGGACTTGGACGGAGTGAAG TCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCGTTTCCA TACTCAAGCTTAGATTT d k Oz myc GPI F SEQ ID NO :242 df oZ GPI R SEQ ID NO :243 AACTCATCTCAGAAGAGGATCTGGCTGC GGGAACAGCCAGT ACCATGGAAGCGGCCGCTTACGCGACAC AAGCTGCGAT Les fragments de PCR ont été directement clonés dans le plasmide pUC18 4G2 ICreI SEQ ID NO : 205 digéré par les enzymes PmeI et NotI (8344pb) avec la technique In-Fusion de Ozyme. Exemple 7: Construction de souches Toxo tgmic1-3 KO - 2G exprimant un ou plusieurs antigènes du virus Influenza et ne comportant pas de gène de sélection Souches de Toxoplasma gondii La souche utilisée dans le présent exemple est une souche atténuée de Toxoplasma gondii, dénommée Toxo tgmic/-3 KO 2G. Elle a été obtenue par la délétion par recombinaison homologue de deux gènes de virulence : les gènes mic/ et mic3. Les tachyzoïtes de la souche Toxo tgmic/-3 KO 2G sont produits sur fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634)) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (SVF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine. Ils ont été récoltés après lyse mécanique des cellules hôtes et 3 passages en seringue 25G. Construction des souches - protocole La construction de chaque souche vaccinale contenant un ou plusieurs antigènes se fait à chaque étape avec un protocole identique. Le protocole expérimental est dans un premier temps détaillé ici puis appliqué pour chaque construction de souche vaccinale, celui-ci comporte plusieurs étapes : a- Electroporation et sélection de la souche d'intérêt avec le plasmide exprimant un antigène du virus de la grippe : souches Toxo tgmic1-3 KO - 2G Influenza Les parasites Toxo tgmic1-3 KO - 2G sont électroporés avec 201.1g de plasmide pUC18 4G2 ICreI - Influenza linéarisé. Après électroporation, les tachyzoïtes sont soumis à une pression de sélection par l'agent de sélection (Pyriméthamine 11.1M). 10 à 15 jours après sélection et passages successifs sur cellules HFF, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF puis amplifiés en plaques 24 puits sur une monocouche de cellules HFF. b- Validation de la souche ayant intégré le plasmide par PCR Pour valider une souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Influenza, des analyses PCR sont effectuées à partir de l'ADN génomique extrait au DNAzol à partir d'un culot parasitaire constitué de 107 parasites. Les amorces sont détaillées dans le Tableau 19 ci-dessous. Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose. Leurs tailles attendues sont également 86 décrites dans le Tableau 20 ci-dessous. Plusieurs mix sont possibles et les PCR sont réalisées en fonction des souches testées. Tableau 19 : liste des amorces utilisables pour la validation des souches. Mix M2e M2e F SEQ lD NO : 245 oz M2e R SEQ lD NO : 246 CCTAGGTCCTTGCTGACTGA ACCATGGAAGCGGCCGCTTACGTAGAATC Mix M2e F SEQ lD NO : 245 oz M2e GPI R SEQ lD NO : 247 M2eGPI ou M2e CCTAGGTCCTTGCTGACTGA GGCTGTTCCCGCAGCCGTAGAATCGAGACCG AGGA Mix HA oz tete HA F SEQ lD NO : 239 Seq SEQ lD NO : 248 CCTAGGGACTTGGACGGAGTG AAG HA AGTCTCTGGTTCAGAGTGGA RI Influenza seq TU B MC S F SEQ lD NO : 249 seq 3utr MCS R SEQ lD NO : 250 AACCCGCGCAGAAGACATCC ATGGGGCACATGCTGCACGAA DHFR*TYT K Dhf r int Bgl H F SEQ ID NO :251 qPC R TK R SEQ ID NO : 252 CTGAGAAGGGCGTGAAGATC ACACCCGCCAGTAAGTCATC Tableau 20 : Taille attendue des amplicons (en paires de base) des différentes PCR de validation de la construction des souches Toxo tgmic1-3 KO - 2G Influenza Mix Mix M2eGPI ou M2e Mix Gène d'intérêt DHFR* TYTK ] ] Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e 588 593 - 1641 945 Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e GPI - 593 - 1719 945 Toxo tgmic1-3 KO - 2G HA - - 506 1875 945 Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e HA 588 593 506 1641/ 945 1 8 7 5 Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e GPI - 593 506 1719/ 945 HA 1 8 7 5 87 c- Validation de la souche ayant intégré le plasmide par immunofluorescence Les tachyzoïtes sont cultivés 24h sur lamelles en verre recouvertes d'une monocouche de cellules HFF. Les cellules infectées ont été lavés 2 fois en PBS1X, et fixés par du formaldéhyde 4% pendant 30 min. Après 3 lavages en PBS1X, les cellules HFF infectées ont été perméabilisées avec 0,1% de Triton X-100 dans du PBS1X pendant 5 min. Après 3 lavages au PBS 1X, une étape de saturation est effectuée avec une solution de PBS 1X/SVF 10% pendant 30 min. Les cellules ont ensuite été incubées avec l'anticorps primaire dilué dans 2% SVF pendant 1 heure, lavées 3 fois au PBS1X puis incubées avec un anticorps secondaire dilué dans une solution de PBS/SVF 2% pendant 1 heure. Après 2 lavages au PBS1X, les lamelles en verre sont montées sur lame avec de l'Immu-MountTm et observés au microscope à fluorescence. L'anticorps primaire M2 utilisé est un anticorps commercial (Anti influenza A virus M2 Protein antibody [14C2] ab5416) qui permet de détecter l'expression de la protéine de fusion Sag1M2e SEQ ID NO: 253 ou Sag1M2eGPI SEQ ID NO : 206 dans le parasite ou la vacuole parasitophore, l'anticorps primaire HA utilisé est un anticorps commercial (Anti-influenza A virus (H5N1/HA1) antibody [2B7]) ab135382) qui permet de détecter l'expression de la protéine de fusion SaglHA SEQ ID NO : 255 dans le parasite et enfin l'anticorps secondaire commercial utilisé est l'Alexa fluor® 594 goat anti-mouse. d- Validation de la souche a ant inté ré le -lasmide sar anal se du iro l de résistance Le profil d'antibiorésistance est analysé pour les clones validés en PCR et immunofluorescence. Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF. Les parasites Toxo tgmic1-3 KO - 2G Influenza ayant intégré un plasmide pUC18 4G2 ICreI - Influenza linéarisé doivent être résistants à la pyriméthamine (11.1M - grâce à la présence du gène DHFR*) et sensible au ganciclovir (501.1M - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance est validé en cultivant les parasites sur fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634)) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (SVF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine, supplémenté ou non de la pyriméthamine ou du ganciclovir. Les souches validées par PCR, immunofluorescence et ayant le bon profil d'antibiorésistance sont nommées Toxo tgmic1-3 KO - 2G Influenza (Toxo tgmic1-3 KO 88 - 2G M2e, Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI, Toxo tgmic1-3 KO - 2G HA ,Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e HA ou Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA). e- Electroporation de la Toxo tgmic1-3 KO - 2G Influenza avec un plasmide pTsaglIcreIctfly et contre sélection de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK : souches Toxo tgmic1-3 KO - 2G Influenza IcreI Les parasites Toxo tgmic1-3 KO - 2G Influenza sont électroporés avec 201.1g de plasmide pTsaglIcreI a43y circulaire SEQ ID NO : 178. Après électroporation, les tachyzoïtes sont soumis à une pression de sélection par l'agent de sélection (Ganciclovir 501.1M). 10 à 15 jours après sélection et passages successifs sur cellules HFF, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF puis amplifiés en plaques 24 puits sur une monocouche de cellules HFF. f- Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK par PCR Pour valider une souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Influenza IcreI, des analyses PCR sont effectuées à partir de l'ADN génomique extrait au DNAzol à partir d'un culot parasitaire constitué de 107 parasites. Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans les tableaux 19 (point b) et 21 ci-dessous. Les premières PCR sont identiques aux PCR faites pour la validation des souches Toxo tgmic1-3 KO - 2G Influenza, la deuxième série de PCR permet de valider la suppression de la cassette DHFR*-TY-TK et la présence de la cicatrice ce. Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose. Leurs tailles attendues sont également décrites dans le Tableau 22 ci-dessous. Plusieurs mixs sont possibles et les PCR sont réalisées en fonction des souches testées. Tableau 21 : liste des amorces utilisables pour la validation des souches. Mix IcreI M2e F SEQ ID NO :245 MC1 SEQ ID NO :254 M2e ou CCTAGGTCCTTGCTGACTGA TGAAATACCGCACAGATGCG M2eGPI Mix IcreI HA oz tete HAF SEQ ID NO :239 MC1 SEQ ID NO :254 CCTAGGGACTTGGACGGAGTGAAG TGAAATACCGCACAGATGCG 89 Tableau 22 : Taille attendue des amplicons (en paires de base) des différentes PCR de validation de la construction des souches Toxo tgmic1-3 KO - 2G Influenza (voir point b pour les 5 premiers mixs). Mix Mix Mix HA Gène d'intérêt DHFR* TYTK Mix IcreI Mix M2eGPI ou M2e M2e ou IcreI M2eGPI HA Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e IcreI 588 593 - 1641 - 1114 - Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e GPI IcreI - 593 - 1719 - 1192 - Toxo tgmic1-3 KO - 2G HA IcreI - - 506 1875 - - 1348 Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e HA 588 593 506 1641/1875 945 1114 - Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e HA IcreI 588 593 506 1641/1875 - 1114 1348 Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e GPI HA - 593 506 1719/1875 945 1192 - Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e GPI HA IcreI - 593 506 1719/1875 - 1192 1348 g- Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK par immunofluorescence La validation des souches par immunofluorescence se fait suivant le protocole précédemment décrit (point c). h- Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK par analyse du profil de résistance Les parasites Toxo tgmic1-3 KO - 2G Influenza ayant perdu la cassette de sélection DHFR*- TY-TK doivent être sensibles à la pyriméthamine (11.1M - grâce à la suppression du gène DHFR*) et résistants au ganciclovir (501.1M - grâce à la suppression du gène TK). Ce profil de résistance est validé en cultivant les parasites sur fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (SVF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine, supplémenté ou non de la pyriméthamine ou du ganciclovir. Les souches validées par par PCR, immunofluorescence et ayant le bon profil d'antibiorésistance sont nommées Toxo tgmic1-3 KO - 2G Influenza IcreI (Toxo tgmicl3 KO - 2G M2e IcreI, Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI IcreI, Toxo tgmic1-3 KO - 2G HA IcreI, Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e HA IcreI ou Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA IcreI). Résultats - Construction des souches exprimant un antigène du virus Influenza et ne comportant pas de gène de sélection A. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G M2e IcreI 1. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G M2e L'électroporation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G avec le plasmide pUC18 4G2 ICreI - M2e SEQ ID NO : 244 a été réalisée selon le protocole décrit (point a). Les clones obtenus résistants à la pyriméthamine sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d'interetM2e et l'expression de la protéine. Validation de la souche Toxo tginic1-3 KO - 2G M2e par PCR Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO : 245 et oz M2e R SEQ ID NO: 246 (Mix M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 588 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2e dans cette souche (figure 18). Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tginic1-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2eGPI R SEQ ID NO: 247 (Mix M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 593 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2e dans cette souche. En effet, cette PCR permet de différencier l'insertion du plasmide pUC18 4G2 ICreI - M2eGPI (PCR négative) de l'insertion du plasmide pUC18 4G2 ICreI - M2e (PCR positive à 588pb) (figure 18). Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tginic1-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO: 250 (Mix Gène d'intérêt) permettent de mettre en évidence une bande à 1641 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2e dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tginic1-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. (figure 18) Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces Dhfr int Bgl II F SEQ ID NO :251 et qPCR TK R SEQ ID NO: 252 (Mix DHFR*TYTK) permettent de mettre en évidence une bande à 945 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène DHFR*TYTK 91 dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. (figure 18) La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e est validée par PCR. Validation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e par immunofluorescence Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti M2e aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Toxo tgmic1-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée dans les parasites et dans les vacuoles parasitophores de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine M2e. (figure 19) La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e est validée par immunofluorescence. Validation de la souche ayant intégré le plasmide par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (11.1M) ou de ganciclovir (501.1M). La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - possible qu'en cas d'absence du gène TK). La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - grâce à la présence du gène DHFR*) alors qu'elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance (sensible au ganciclovir et résistance à la pyriméthamine) permet de confirmer l'intégration du plasmide pUC18 4G2 ICreI - M2e SEQ ID NO : 244 dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e. L'ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e. 2. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G M2e IcreI L'électroporation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e avec le plasmide pTsaglIcreI c43y circulaire SEQ ID NO : 178 a été réalisée selon le protocole décrit (point e). Les clones obtenus résistants au ganciclovir sont sélectionnés et analysés par PCR et 92 Immunofluorescence pour valider la présence du gène d'interet M2e et l'expression de la protéine M2e et pour valider la suppression de la cassette de résistance DHFR*TYTK. Validation de la souche Toxo tguncl-3 KO - 2G M2e IcreI par PCR Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2e R SEQ ID NO: 246 (Mix M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 588 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e IcreI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2e dans cette souche (figure 20). Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tenic1-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2eGPI R SEQ ID NO: 247 (Mix M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 593 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e IcreI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2e dans cette souche(figure 20). Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tguncl-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO: 250 (Mix Gène d'intérêt) permettent de mettre en évidence une bande à 1641 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e IcreI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2e dans cette souche (figure 20).Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tguncl-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces Dhfr int Bgl II F SEQ ID NO :251 et qPCR TK R SEQ ID NO: 252 (Mix DHFR*TYTK) ne mettent pas en évidence de bande à 945 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e IcreI, conformément à ce qui est attendu et confirmant la suppression de la cassette DHFR*TYTK dans cette souche. (figure 20). Cette bande n'est pas non plus détectée dans la souche Toxo tguncl-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et MC1 SEQ ID NO: 254 (Mix IcreI M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 1114 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e IcreI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2e et la suppression de la cassette DHFR*TYTK dans cette souche (figure 20). Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tguncl-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. 93 La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e IcreI est validée par PCR. Validation de la souche Toxo t mic1-3 KO - 2G M2e IcreI iar immuno uorescence Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti M2e aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Toxo tgmic1-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée dans les parasites et dans les vacuoles parasitophores de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e IcreI obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine M2e. (figure 19) La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e IcreI est validée par immunofluorescence. Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (11.1M) ou de ganciclovir (501.1M). La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - possible qu'en cas d'absence du gène TK). Alors que la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - grâce à la présence du gène DHFR*) et qu'elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - à cause de la présence du gène TK), la souche Toxo tgmicl3 KO - 2G M2e IcreI n'est plus capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - grâce à la perte du gène DHFR*) alors qu'elle est redevenue capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - grâce à la perte du gène TK). Ce profil de résistance (résistance au ganciclovir et sensible à la pyriméthamine) permet de confirmer la suppression de la cassette DHFR*TYTK suite à l'action de la méganucléase I-CreI. L'ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e IcreI. 94 B. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G M2eGPI IcreI 1. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G M2eGPI L'électroporation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G avec le plasmide pUC18 4G2 ICreI - M2eGPI SEQ ID NO : 205 a été réalisée selon le protocole décrit (point a). Les clones obtenus résistants à la pyriméthamine sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d'intérêt M2eGPI et l'expression de la protéine. Validation de la souche Toxo tginic1-3 KO - 2G M2eGPI par PCR Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO : 245 et oz M2eGPI R SEQ ID NO: 247 (Mix M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 593 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2eGPI dans cette souche. (figure 21).Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tginic1-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2e R SEQ ID NO: 246 (Mix M2e) ne permettent pas de mettre en évidence une bande à 588 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI, conformément à ce qui est attendu. En effet, cette PCR permet de différencier l'insertion du plasmide pUC18 4G2 ICreI - M2eGPI (PCR négative) de l'insertion du plasmide pUC18 4G2 ICreI - M2e (PCR positive à 588pb). Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tginic1-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO: 250 (Mix Gène d'intérêt) permettent de mettre en évidence une bande à 1719 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2eGPI dans cette souche (figure 21).Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tginic1-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces Dhfr int Bgl II F SEQ ID NO :251 et qPCR TK R SEQ ID NO: 252 (Mix DHFR*TYTK) permettent de mettre en évidence une bande à 945 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène DHFR*TYTK dans cette souche (figure 21).Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI est validée par PCR. Validation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI par immunofluorescence Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti M2e aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Toxo tgmic1-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée sur la membrane des parasites de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine M2eGPI. (figure 22) La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI est validée par immunofluorescence. Validation de la souche ayant intégré le plasmide par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (11.1M) ou de ganciclovir (501.1M). La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - possible qu'en cas d'absence du gène TK). La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - grâce à la présence du gène DHFR*) alors qu'elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance (sensible au ganciclovir et résistance à la pyriméthamine) permet de confirmer l'intégration du plasmide pUC18 4G2 ICreI - M2eGPI SEQ ID NO : 205 dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI. L'ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI. 2. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G M2eGPI IcreI L'électroporation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI avec le plasmide pTsaglIcreI c43y circulaire SEQ ID NO : 178 a été réalisée selon le protocole décrit (point e). Les clones obtenus résistants au ganciclovir sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d'intérêt M2eGPI et l'expression de la protéine M2eGPI et pour valider la suppression de la cassette de résistance DHFR*TYTK. 96 Validation de la souche Toxo tguncl-3 KO - 2G M2eGPI IcreI par PCR Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2eGPI R SEQ ID NO: 247 (Mix M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 593 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2eGPI dans cette souche (figure 23). Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tguncl-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2e R SEQ ID NO: 246 (Mix M2e) ne permettent pas de mettre en évidence une bande à 588 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI, conformément à ce qui est attendu (figure 23). En effet, cette PCR permet de différencier l'insertion du plasmide pUC18 4G2 ICreI - M2eGPI (PCR négative) de l'insertion du plasmide pUC18 4G2 ICreI - M2e (PCR positive à 588pb). Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tguncl-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO: 250 (Mix Gène d'intérêt) permettent de mettre en évidence une bande à 1719 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2eGPI dans cette souche (figure 23). Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tguncl-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces Dhfr int Bgl II F SEQ ID NO :251 et qPCR TK R SEQ ID NO: 252 (Mix DHFR*TYTK) ne mettent pas en évidence de bande à 945 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI IcreI, conformément à ce qui est attendu et confirmant la suppression de la cassette DHFR*TYTK dans cette souche (figure 23). Cette bande n'est pas non plus détectée dans la souche Toxo tguncl-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et MC1 SEQ ID NO: 254 (Mix IcreI M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 1192 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI IcreI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2eGPI et la suppression de la cassette DHFR*TYTK dans cette souche (figure 23). Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tguncl-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI IcreI est validée par PCR. 97 Validation de la souche Toxo KO - 2G M2eGPI IcreI par immunofluorescence Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti M2e aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Toxo KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée pour les parasites Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI IcreI obtenue. La localisation de la protéine semble membranaire (dû à l'ancrage GPI) alors que pour la version M2e, la localisation semble dans la vacuole parasitophore et dans le parasite. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine M2eGPI. (figure 22) La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI IcreI est validée par immunofluorescence. Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (11.1M) ou de ganciclovir (501.1M). La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - possible qu'en cas d'absence du gène TK). Alors que la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - grâce à la présence du gène DHFR*) et qu'elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - à cause de la présence du gène TK, la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI IcreI n'est plus capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - grâce à la perte du gène DHFR*) alors qu'elle est redevenue capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - grâce à la perte du gène TK). Ce profil de résistance (résistance au ganciclovir et sensible à la pyriméthamine) permet de confirmer la suppression de la cassette DHFR*TYTK suite à l'action de la méganucléase I-CreI. L'ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI IcreI. 98 C. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G HA IcreI 1. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G HA L'électroporation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G avec le plasmide pUC18 4G2 ICreI - HA SEQ ID NO : 232 a été réalisée selon le protocole décrit (point a). Les clones obtenus résistants à la pyriméthamine sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d'intérêt HA et l'expression de la protéine. Validation de la souche Toxo KO - 2G HA par PCR Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces oz tete HA F SEQ ID NO :239 et Seq HA R I SEQ ID NO : 248 (Mix HA) permettent de mettre en évidence une bande à 506 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G HA, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène HA dans cette souche (figure 24). Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tginic1-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO: 250 (Mix Gène d'intérêt) permettent de mettre en évidence une bande à 1875 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G HA, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène HA dans cette souche (figure 24). Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tginic1-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces Dhfr int Bgl II F SEQ ID NO :251 et qPCR TK R SEQ ID NO: 252 (Mix DHFR*TYTK) permettent de mettre en évidence une bande à 945 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G HA, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène DHFR*TYTK dans cette souche (figure 24). Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tginic1-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G HA est validée par PCR. Validation de la souche Toxo KO - 2G HA par immunofluorescence Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti HA aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Toxo tginic1-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée sur la membrane des parasites de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G HA obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine HA. (figure 25) La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G HA est validée par immunofluorescence. 99 Validation de la souche ayant intégré le plasmide par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (11.1M) ou de ganciclovir (501.1M). La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - possible qu'en cas d'absence du gène TK). La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G HA est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - grâce à la présence du gène DHFR*) alors qu'elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance (sensible au ganciclovir et résistance à la pyriméthamine) permet de confirmer l'intégration du plasmide pUC18 4G2 ICreI - HA SEQ ID NO: 232 dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G HA. L'ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G HA. 2. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G HA IcreI L'électroporation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G HA avec le plasmide pTsaglIcreI c43y circulaire SEQ ID NO : 178 a été réalisée selon le protocole décrit (point e). Les clones obtenus résistants au ganciclovir sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d'intérêt HA et l'expression de la protéine HA et pour valider la suppression de la cassette de résistance DHFR*TYTK. Validation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G HA IcreI par PCR Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces oz tete HA F SEQ ID NO :239 et Seq HA R I SEQ ID NO: 248 (Mix HA) permettent de mettre en évidence une bande à 506 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G HA, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène HA dans cette souche (figure 26). Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO: 250 (Mix Gène d'intérêt) permettent de mettre en évidence une bande à 1875 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G HA, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène HA dans cette souche (figure 26). Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces Dhfr int Bgl II F SEQ ID NO :251 et qPCR TK R SEQ ID NO: 252 (Mix DHFR*TYTK) ne mettent pas en évidence de bande à 945 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G HA IcreI, conformément à ce qui est attendu et confirmant la suppression de la cassette DHFR*TYTK dans cette souche (figure 26). Cette bande n'est pas non plus détectée dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces oz tete HAF SEQ ID NO :239 et MC1 SEQ ID NO : 254 (Mix IcreI HA) permettent de mettre en évidence une bande à 1348 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G HA IcreI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène HA et la suppression de la cassette DHFR*TYTK dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G HA IcreI est validée par PCR. Validation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G HA IcreI par immunofluorescence Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti HA aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Toxo tgmic1-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée pour les parasites Toxo tgmic1-3 KO - 2G HA IcreI obtenue. La localisation de la protéine semble bien membranaire (dû à l'ancrage GPI). Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine HA. (figure 25) La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G HA IcreI est validée par immundluorescence. Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*TYTK par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (11.1M) ou de ganciclovir (501.1M). La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - pas de gène DHFR*) mais elle se 101 multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50uM - possible qu'en cas d'absence du gène TK). Alors que la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G HA est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (1uM - grâce à la présence du gène DHFR*) et qu'elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50uM - à cause de la présence du gène TK, la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G HA IcreI n'est plus capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (luM - grâce à la perte du gène DHFR*) alors qu'elle est redevenue capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50uM - grâce à la perte du gène TK). Ce profil de résistance (résistance au ganciclovir et sensible à la pyriméthamine) permet de confirmer la suppression de la cassette DHFR*TYTK suite à l'action de la méganucléase I-CreI. L'ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G HA IcreI. Résultats - Construction des souches exprimant plusieurs antigènes du virus Influenza et comportant ou non ungène de sélection A. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G M2eGPI HA IcreI 1. Construction de la souche Toxo tginic1-3 KO - 2G M2eGPI HA L'électroporation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI IcreI avec le plasmide pUC18 4G2 ICreI - HA SEQ ID NO : 232 a été réalisée selon le protocole décrit (point a). Les clones obtenus résistants à la pyriméthamine sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d'intérêt HA et l'expression de la protéine. Validation de la souche Toxo tginic1-3 KO - 2G M2eGPI HA par PCR Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2eGPI R SEQ ID NO: 247 (Mix M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 593 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2eGPI dans cette souche (figure 27). Cette bande est détectée dans la souche Toxo tginic1-3 KO - 2G M2eGPI IcreI confirmant la présence de ce gène dans la souche de départ. 102 Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2e R SEQ ID NO: 246 (Mix M2e) ne permettent pas de mettre en évidence une bande à 588 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA, conformément à ce qui est attendu. En effet, cette PCR permet de différencier l'insertion du plasmide pUC18 4G2 ICreI - M2eGPI (PCR négative) de l'insertion du plasmide pUC18 4G2 ICreI - M2e (PCR positive à 588pb). Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tginic1-3 KO - 2G M2eGPI IcreI confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces oz tete HA F SEQ ID NO :239 et Seq HA R I SEQ ID NO : 248 (Mix HA) permettent de mettre en évidence une bande à 506 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène HA dans cette souche (figure 27).. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI ICreI confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO: 250 (Mix Gène d'intérêt) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 1875 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour HA et une bande à 1719 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour M2e GPI pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA, confirmant la présence des gènes HA et M2eGPI dans cette souche (figure 27). Ces bandes ne sont pas détectées dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ et la souche électroporée Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI IcreI ne présente que la bande à 1719 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour M2e GPI. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces Dhfr int Bgl II F SEQ ID NO :251 et qPCR TK R SEQ ID NO: 252 (Mix DHFR*TYTK) permettent de mettre en évidence une bande à 945 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène DHFR*TYTK dans cette souche (figure 27). Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI IcreI confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA est validée par PCR. 103 Validation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA par immunofluorescence Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti HA aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Toxo tgmic1-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée sur la membrane des parasites de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine HA. (figure 28) Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti M2e aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Toxo tgmic1-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée pour les parasites Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI IcreI et la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA obtenue. La localisation de la protéine semble membranaire (dû à l'ancrage GPI) alors que pour la version M2e, la localisation semble dans la vacuole parasitophore et dans le parasite. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine M2eGPI. (figure 28) La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA est validée par immunofluorescence. Validation de la souche ayant intégré le plasmide par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (11.1M) ou de ganciclovir (501.1M). La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI IcreI est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - possible qu'en cas d'absence du gène TK). La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - grâce à la présence du gène DHFR*) alors qu'elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance (sensible au ganciclovir et résistance à la pyriméthamine) permet de confirmer l'intégration du plasmide pUC18 4G2 ICreI - HA SEQ ID NO: 232 dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA. L'ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA. 2. Construction de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA IcreI L'électroporation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA avec le plasmide pTsaglIcreI c43y circulaire SEQ ID NO : 178 a été réalisée selon le protocole décrit (point e). 104 Les clones obtenus résistants au ganciclovir sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence des gènes d'intérêt M2eGPI et HA et l'expression des protéines M2eGPI et HA et pour valider la suppression de la cassette de résistance DHFR*TYTK. Validation de la souche Toxo tguncl-3 KO - 2G M2eGPI HA IcreI par PCR Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2eGPI R SEQ ID NO: 247 (Mix M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 593 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA IcreI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2eGPI dans cette souche (figure 29). Cette bande est détectée dans la souche Toxo tguncl-3 KO - 2G M2eGPI IcreI confirmant la présence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2e R SEQ ID NO: 246 (Mix M2e) ne permettent pas de mettre en évidence une bande à 588 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA IcreI, conformément à ce qui est attendu. En effet, cette PCR permet de différencier l'insertion du plasmide pUC18 4G2 ICreI - M2eGPI (PCR négative) de l'insertion du plasmide pUC18 4G2 ICreI - M2e (PCR positive à 588pb). Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tguncl-3 KO - 2G M2eGPI IcreI confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces oz tete HA F SEQ ID NO :239 et Seq HA R I SEQ ID NO : 248 (Mix HA) permettent de mettre en évidence une bande à 506 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA IcreI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène HA dans cette souche (figure 29). Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI ICreI confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO: 250 (Mix Gène d'intérêt) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 1875 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour HA et une bande à 1719 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour M2e GPI pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA IcreI, confirmant la présence des gènes HA et M2eGPI dans cette souche (figure 29). Ces bandes ne sont pas détectées dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ et la souche électroporée Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA présente les deux bandes (à 1719 et 1875 paires de bases) conformément à la taille de bande attendue pour M2e GPI et HA. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces Dhfr int Bgl II F SEQ ID NO :251 et qPCR TK R SEQ ID NO: 252 (Mix DHFR*TYTK) ne mettent pas en évidence de bande à 945 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA IcreI, conformément à ce qui est attendu et confirmant la suppression de la cassette DHFR*TYTK dans cette souche (figure 29). Cette bande n'est pas non plus détectée dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI IcreI confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et MC1 SEQ ID NO: 254 (Mix IcreI M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 1192 paires de bases pour les souches Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI IcreI, et Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA IcreI conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2eGPI et la suppression de la cassette DHFR*TYTK dans ces souches (figure 29). Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tguncl-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces oz tete HAF SEQ ID NO :239 et MC1 SEQ ID NO : 254 (Mix IcreI HA) permettent de mettre en évidence une bande à 1348 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA IcreI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène HA et la suppression de la cassette DHFR*TYTK dans cette souche (figure 29). Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI IcreI confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA IcreI est validée par PCR. Validation de la souche Toxo tguncl-3 KO - 2G M2eGPI HA IcreI par immunofluorescence Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti HA aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Toxo tguncl-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée sur la membrane des parasites de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA et de la souche obtenue Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA IcreI. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine HA. (figure 30) Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti M2e aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Toxo tguncl-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée pour les parasites Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA et la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA IcreI 106 obtenue. La localisation de la protéine semble membranaire (dû à l'ancrage GPI) alors que pour la version M2e, la localisation semble dans la vacuole parasitophore et dans le parasite. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine M2eGPI. (figure 30) La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA IcreI est validée par immunofluorescence. Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (11.1M) ou de ganciclovir (501.1M). La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - possible qu'en cas d'absence du gène TK). Alors que la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - grâce à la présence du gène DHFR*) et qu'elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - à cause de la présence du gène TK, la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA IcreI n'est plus capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - grâce à la perte du gène DHFR*) alors qu'elle est redevenue capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - grâce à la perte du gène TK). Ce profil de résistance (résistance au ganciclovir et sensible à la pyriméthamine) permet de confirmer la suppression de la cassette DHFR*TYTK suite à l'action de la méganucléase I-CreI. L'ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA IcreI. B. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G M2e HA IcreI 1. Construction de la souche Toxo tginic1-3 KO - 2G M2e HA L'électroporation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e IcreI avec le plasmide pUC18 4G2 ICreI - HA SEQ ID NO : 232 a été réalisée selon le protocole décrit (point a). Les clones 107 obtenus résistants à la pyriméthamine sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d'intérêt HA et l'expression de la protéine. Validation de la souche Toxo tguncl-3 KO - 2G M2e HA par PCR Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2eGPI R SEQ ID NO: 247 (Mix M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 593 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e HA, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2e dans cette souche (figure 31). Cette bande est détectée dans la souche Toxo tguncl-3 KO - 2G M2e IcreI confirmant la présence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2e R SEQ ID NO: 246 (Mix M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 588 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e HA, conformément à ce qui est attendu. En effet, cette PCR permet de différencier l'insertion du plasmide pUC18 4G2 ICreI - M2eGPI (PCR négative) de l'insertion du plasmide pUC18 4G2 ICreI - M2e (PCR positive à 588pb) (figure 31). Cette bande est détectée dans la souche Toxo tguncl-3 KO - 2G M2e IcreI confirmant la présence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces oz tete HA F SEQ ID NO :239 et Seq HA R I SEQ ID NO : 248 (Mix HA) permettent de mettre en évidence une bande à 506 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e HA, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène HA dans cette souche (figure 31). Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e ICreI confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO: 250 (Mix Gène d'intérêt) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 1875 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour HA et une bande à 1641 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour M2e pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e HA, confirmant la présence des gènes HA et M2e dans cette souche (figure 31). Ces bandes ne sont pas détectées dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ et la souche électroporée Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e IcreI ne présente que la bande à 1641 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour M2e. 108 Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces Dhfr int Bgl II F SEQ ID NO :251 et qPCR TK R SEQ ID NO: 252 (Mix DHFR*TYTK) permettent de mettre en évidence une bande à 945 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e HA, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène DHFR*TYTK dans cette souche (figure 31). Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e IcreI confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e HA est validée par PCR. Validation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e HA par immunofluorescence Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti HA aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Toxo tgmic1-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée sur la membrane des parasites de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e HA obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine HA. (figure 32) Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti M2e aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Toxo tgmic1-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée pour les parasites Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e IcreI et la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e HA obtenue. La localisation de la fluorescence semble être dans la vacuole parasitophore et dans le parasite (alors que pour la version M2eGPI, la localisation de la protéine semble membranaire). Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine M2e. (figure 32) La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e HA est validée par immunofluorescence. Validation de la souche ayant intégré le plasmide par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (11.1M) ou de ganciclovir (501.1M). La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e IcreI est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - possible qu'en cas d'absence du gène TK). La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e HA est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - grâce à la présence du gène DHFR*) alors qu'elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance (sensible au ganciclovir et résistance à la pyriméthamine) permet de confirmer l'intégration du 109 plasmide pUC18 4G2 ICreI - HA SEQ ID NO: 232 dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e HA. L'ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e HA. 2. Construction de la souche Toxo tgunc1-3 KO - 2G M2e HA IcreI L'électroporation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e HA avec le plasmide pTsaglIcreI a43y circulaire SEQ ID NO : 178 a été réalisée selon le protocole décrit (point e). Les clones obtenus résistants au ganciclovir sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence des gènes d'intérêt M2e et HA et l'expression des protéines M2e et HA et pour valider la suppression de la cassette de résistance DHFR*TYTK. Validation de la souche Toxo tguncl-3 KO - 2G M2e HA IcreI par PCR Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2eGPI R SEQ ID NO: 247 (Mix M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 593 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e HA IcreI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2e dans cette souche. Cette bande est détectée dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e HA confirmant la présence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2e R SEQ ID NO: 246 (Mix M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 588 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eHA IcreI, conformément à ce qui est attendu. En effet, cette PCR permet de différencier l'insertion du plasmide pUC18 4G2 ICreI - M2eGPI (PCR négative) de l'insertion du plasmide pUC18 4G2 ICreI - M2e (PCR positive à 588pb). Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e ICreI confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces oz tete HA F SEQ ID NO :239 et Seq HA R I SEQ ID NO : 248 (Mix HA) permettent de mettre en évidence une bande à 506 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e HA IcreI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène HA dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e ICreI confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO: 250 (Mix Gène d'intérêt) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 1875 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour HA et une bande à 1641 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour M2e pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e HA IcreI, confirmant la présence des gènes HA et M2e dans cette souche. Ces bandes ne sont pas détectées dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ et la souche électroporée Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e HA présente les deux bandes (à 1641 et 1875 paires de bases) conformément à la taille de bande attendue pour M2e et HA. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces Dhfr int Bgl II F SEQ ID NO :251 et qPCR TK R SEQ ID NO: 252 (Mix DHFR*TYTK) ne mettent pas en évidence de bande à 945 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e HA IcreI, conformément à ce qui est attendu et confirmant la suppression de la cassette DHFR*TYTK dans cette souche. Cette bande n'est pas non plus détectée dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e IcreI confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et MC1 SEQ ID NO: 254 (Mix IcreI M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 1114 paires de bases pour les souches Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e IcreI, et Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e HA IcreI conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2e et la suppression de la cassette DHFR*TYTK dans ces souches. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tenic1-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces oz tete HAF SEQ ID NO :239 et MC1 SEQ ID NO : 254 (Mix IcreI HA) permettent de mettre en évidence une bande à 1348 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e HA IcreI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène HA et la suppression de la cassette DHFR*TYTK dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e IcreI confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e HA IcreI est validée par PCR. Validation de la souche Toxo tguncl-3 KO - 2G M2e HA IcreI par immunofluorescence Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti HA aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Toxo tguncl-3 KO - 2G et la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e IcreI , alors qu'une fluorescence est détectée sur la membrane des parasites de la souche Toxo tgmic1-3 111 KO - 2G M2e HA IcreI obtenue et la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e HA. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine HA. Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti M2e aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Toxo tginic1-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée pour les parasites Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e HA et la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e HA obtenue. La localisation de la fluorescence semble être dans la vacuole parasitophore et dans le parasite (alors que pour la version M2eGPI, la localisation de la protéine semble membranaire). Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine M2e. La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e HA IcreI est validée par immunofluorescence. Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (11.1M) ou de ganciclovir (501.1M). La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - possible qu'en cas d'absence du gène TK). Alors que la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e HA est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - grâce à la présence du gène DHFR*) et qu'elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - à cause de la présence du gène TK), la souche Toxo tgmicl3 KO - 2G M2e HA IcreI n'est plus capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - grâce à la perte du gène DHFR*) alors qu'elle est redevenue capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - grâce à la perte du gène TK). Ce profil de résistance (résistance au ganciclovir et sensible à la pyriméthamine) permet de confirmer la suppression de la cassette DHFR*TYTK suite à l'action de la méganucléase I-CreI. L'ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e HA IcreI. 112 Exemple 8 : Construction d'une souche Neo ncmic1-3 KO - 2G exprimant un ou plusieurs antigènes du virus Influenza et ne comportant pas de gène de sélection Souches de Neospora caninurn La souche utilisée dans le présent exemple est une souche atténuée de Neospora caninum NC1 dénommée Neo ncmic/-3 KO 2G. Elle a été obtenue par la délétion par recombinaison homologue de deux gènes de virulence : les gènes mic/ et mic3. Les tachyzoïtes de la souche Neo ncmic/-3 KO 2G sont produits sur fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634)) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (SVF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine. Ils ont été récoltés après lyse mécanique des cellules hôtes et 3 passages en seringue 25G. Construction des souches - protocole La construction de chaque souche vaccinale contenant un ou plusieurs antigènes se fait à chaque étape avec un protocole identique. Le protocole expérimental est dans un premier temps détaillé ici puis appliqué pour chaque construction de souche vaccinale, celui-ci comporte plusieurs étapes : a- Electroporation et sélection de la souche d'intérêt avec le plasmide exprimant un antigène du virus de la grippe : souches Neo ncmic1-3 KO - 2G Influenza Les parasites Neo ncmic1-3 KO - 2G sont électroporés avec 201.1g de plasmide pUC18 4G2 ICreI - Influenza linéarisé. Par «plasmide pUC18 4G2 ICreI - Influenza », on entend le plasmide pUC18 4G2 ICreI - M2e SEQ ID NO: 244, ou le plasmide pUC18 4G2 ICreI - M2eGPI SEQ ID NO : 205 ou le plasmide pUC18 4G2 ICreI - HA SEQ ID NO : 232. Après électroporation, les tachyzoïtes sont soumis à une pression de sélection par l'agent de sélection (Pyriméthamine 41.1M). 10 à 15 jours après sélection et passages successifs sur cellules HFF, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF puis amplifiés en plaques 24 puits sur une monocouche de cellules HFF. b- Validation de la souche ayant intégré le plasmide par PCR Pour valider une souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Influenza, des analyses PCR sont effectuées selon le même protocole que celui utilisé dans l'exemple 7 - point b. Les tailles attendues sont également décrites dans le Tableau 23 ci-dessous. 113 Tableau 23 : Taille attendue des amplicons (en paires de base) des différentes PCR de validation de la construction des souches Neo ncmic1-3 KO - 2G Influenza Mix M2e Mix M2eGPI ou M2e Mix HA Gène d'intérêt DHFR* TYTK Neo ncmicl -3 KO - 2G M2e 588 593 - 1641 945 Neo ncmicl -3 KO - 2G M2e GPI - 593 - 1719 945 Neo ncmicl -3 KO - 2G HA - - 506 1875 945 Neo ncmicl -3 KO - 2G M2e HA 588 593 506 1641 / 1875 945 Neo ncmicl -3 KO - 2G M2e GPI HA - 593 506 1719/1875 945 c- Validation de la souche ayant intégré le plasmide par immunofluorescence La validation des souches par immunofluorescence se fait suivant le protocole précédemment décrit (point c- exemple 7). d- Validation de la souche a ant inté ré le -lasmide sar anal se du iro l de résistance Le profil d'antibiorésistance est analysé pour les clones validés en PCR et immunofluorescence. Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF. Les parasites Neo ncmic1-3 KO - 2G Influenza ayant intégré un plasmide pUC18 4G2 ICreI - Influenza linéarisé doivent être résistants à la pyriméthamine (41.1M - grâce à la présence du gène DHFR*) et sensible au ganciclovir (501.1M - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance est validé en cultivant les parasites sur fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634)) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (SVF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine, supplémenté ou non de la pyriméthamine ou du ganciclovir. Les souches validées par PCR, immunofluorescence et ayant le bon profil d'antibiorésistance sont nommées Neo ncmic1-3 KO - 2G Influenza (Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e, Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI, Neo ncmic1-3 KO - 2G HA ,Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e HA ou Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA). e- Electroporation de la Neo ncmic1-3 KO - 2G Influenza avec un plasmide pTsaglIcreIce et contre sélection de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK : souches Neo ncmic1-3 KO - 2G Influenza IcreI Le protocole est identique à celui décrit dans le point protocole - e de l'exemple 6. 114 f- Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK par PCR Pour valider une souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Influenza IcreI, des analyses PCR sont effectuées selon le même protocole que celui utilisé dans l'exemple 7 - point b et f. Les tailles attendues sont également décrites dans le Tableau xx ci-dessous. Plusieurs mix sont possibles et les PCR sont réalisées en fonction des souches testées. Tableau 24 : Taille attendue des amplicons (en paires de base) des différentes PCR de validation de la construction des souches Neo ncmic1-3 KO - 2G Influenza. Mix M2e Mix M2eGPI ou M2e Mix HA Gène d'intérêt DHFR* TYTK Mix IcreI Mix M2e ou IcreI M2eGPI HA Neo ncmicl -3 KO - 2G M2e IcreI 588 593 - 1641 - 1114 - Neo ncmicl -3 KO - 2G M2e GPI IcreI - 593 - 1719 - 1192 - Neo ncmicl -3 KO - 2G HA IcreI - - 506 1875 - - 1348 Neo ncmicl -3 KO - 2G M2e HA 588 593 506 1641/1875 945 1114 - Neo ncmicl -3 KO - 2G M2e HA IcreI 588 593 506 1641/1875 - 1114 1348 Neo ncmicl -3 KO - 2G M2e GPI HA - 593 506 1719/1875 945 1192 - Neo ncmicl -3 KO - 2G M2e GPI HA IcreI - 593 506 1719/1875 - 1192 1348 g- Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK par immunofluorescence La validation des souches par immunofluorescence se fait suivant le protocole précédemment décrit (point c- exemple 7). h- Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK par analyse du profil de résistance Les parasites Neo ncmic1-3 KO - 2G Influenza ayant perdu la cassette de sélection DHFR*- TY-TK SEQ ID NO :134 doivent être sensibles à la pyriméthamine (41.1M - grâce à la suppression du gène DHFR*) et résistants au ganciclovir (501.1M - grâce à la suppression du gène TK). Ce profil de résistance est validé en cultivant les parasites sur fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (SVF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine, supplémenté ou non de la pyriméthamine ou du ganciclovir. Les souches validées par PCR, immunofluorescence et ayant le bon profil d'antibiorésistance sont nommées Neo ncmic1-3 KO - 2G Influenza IcreI (Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e IcreI, Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI IcreI, Neo ncmic1-3 KO - 2G HA IcreI, Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e HA IcreI ou Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA IcreI). Résultats - Construction des souches exprimant un antigène du virus Influenza et ne comportant pas de gène de sélection D. Construction de la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G M2e IcreI 1. Construction de la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G M2e L'électroporation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G avec le plasmide pUC18 4G2 ICreI - M2e SEQ ID NO : 244 a été réalisée selon le protocole décrit (point a). Les clones obtenus résistants à la pyriméthamine sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d'intérêt M2e et l'expression de la protéine. Validation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e par PCR Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2e R SEQ ID NO : 246 (Mix M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 588 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2e dans cette souche (figure 18). Cette bande n'est pas détectée dans la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2eGPI R SEQ ID NO: 247 (Mix M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 593 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2e dans cette souche (figure 18). En effet, cette PCR permet de différencier l'insertion du plasmide pUC18 4G2 ICreI - M2eGPI SEQ ID NO :205 (PCR négative) de l'insertion du plasmide pUC18 4G2 ICreI - M2e SEQ ID NO :244 (PCR positive à 588pb). Cette bande n'est pas détectée dans la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO: 250 (Mix Gène d'intérêt) permettent de mettre en évidence une bande à 1641 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2e dans cette 116 souche (figure 18). Cette bande n'est pas détectée dans la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces Dhfr int Bgl II F SEQ ID NO :251 et qPCR TK R SEQ ID NO: 252 (Mix DHFR*TYTK) permettent de mettre en évidence une bande à 945 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène DHFR*TYTK dans cette souche (figure 18). Cette bande n'est pas détectée dans la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. (figure XX) La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e est validée par PCR. Validation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e par immunofluorescence Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti M2e aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Neo ncmic/-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée dans les parasites et dans les vacuoles parasitophores de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine M2e. (figure 33) La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e est validée par immunofluorescence. Validation de la souche ayant intégré le plasmide par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (41.1M) ou de ganciclovir (501.1M). La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (41.1M - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - possible qu'en cas d'absence du gène TK). La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (41.1M - grâce à la présence du gène DHFR*) alors qu'elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance (sensible au ganciclovir et résistance à la pyriméthamine) permet de confirmer l'intégration du plasmide pUC18 4G2 ICreI - M2e SEQ ID NO : 244 dans la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e. L'ensemble des résultats permet de valider la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e. 117 2. Construction de la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G M2e IcreI L'électroporation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e avec le plasmide pTsaglIcreI c43y circulaire SEQ ID NO : 178 a été réalisée selon le protocole décrit (point e). Les clones obtenus résistants au ganciclovir sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d'intérêt M2e et l'expression de la protéine M2e et pour valider la suppression de la cassette de résistance DHFR*TYTK. Validation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e IcreI par PCR Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2e R SEQ ID NO: 246 (Mix M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 588 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e IcreI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2e dans cette souche (figure 20). Cette bande n'est pas détectée dans la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2eGPI R SEQ ID NO: 247 (Mix M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 593 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e IcreI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2e dans cette souche (figure 20). Cette bande n'est pas détectée dans la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO: 250 (Mix Gène d'intérêt) permettent de mettre en évidence une bande à 1641 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e IcreI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2e dans cette souche (figure 20). Cette bande n'est pas détectée dans la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces Dhfr int Bgl II F SEQ ID NO :251 et qPCR TK R SEQ ID NO: 252 (Mix DHFR*TYTK) ne mettent pas en évidence de bande à 945 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e IcreI, conformément à ce qui est attendu et confirmant la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO :134 dans cette souche (figure 20). Cette bande n'est pas non plus détectée dans la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et MC1 SEQ ID NO: 254 (Mix IcreI M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une 118 bande à 1114 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e IcreI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2e et la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO :134 dans cette souche (figure 20). Cette bande n'est pas détectée dans la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e IcreI est validée par PCR. Validation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e IcreI par immunofluorescence Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti M2e aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Neo ncmic/-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée dans les parasites et dans les vacuoles parasitophores de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e IcreI obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine M2e. (figure 33) La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e IcreI est validée par immunofluorescence. Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*TYTK par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (41.1M) ou de ganciclovir (501.1M). La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (41.1M - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - possible qu'en cas d'absence du gène TK). Alors que la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (41.1M - grâce à la présence du gène DHFR*) et qu'elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - à cause de la présence du gène TK), la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e IcreI n'est plus capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (41.1M - grâce à la perte du gène DHFR*) alors qu'elle est redevenue capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - grâce à la perte du gène TK). Ce profil de résistance (résistance au ganciclovir et sensible à la pyriméthamine) permet de confirmer la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO :134 suite à l'action de la méganucléase I-CreI. 119 L'ensemble des résultats permet de valider la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e IcreI. E. Construction de la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G M2eGPI IcreI 1. Construction de la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G M2eGPI L'électroporation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G avec le plasmide pUC18 4G2 ICreI - M2eGPI SEQ ID NO : 205 a été réalisée selon le protocole décrit (point a). Les clones obtenus résistants à la pyriméthamine sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d'interet M2eGPI et l'expression de la protéine M2eGPI SEQ ID NO :206. Validation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI par PCR Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2eGPI R SEQ ID NO: 247 (Mix M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 593 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2eGPI dans cette souche (figure 21). Cette bande n'est pas détectée dans la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2e R SEQ ID NO: 246 (Mix M2e) ne permettent pas de mettre en évidence une bande à 588 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI, conformément à ce qui est attendu . En effet, cette PCR permet de différencier l'insertion du plasmide pUC18 4G2 ICreI - M2eGPI SEQ ID NO :205 (PCR négative) de l'insertion du plasmide pUC18 4G2 ICreI - M2e SEQ ID NO :244 (PCR positive à 588pb). Cette bande n'est pas détectée dans la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO: 250 (Mix Gène d'intérêt) permettent de mettre en évidence une bande à 1719 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2eGPI dans cette souche (figure 21). Cette bande n'est pas détectée dans la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces Dhfr int Bgl II F SEQ ID NO :251 et qPCR TK R SEQ ID NO: 252 (Mix DHFR*TYTK) permettent de mettre en évidence une bande à 945 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène DHFR*TYTK dans cette souche (figure 21). Cette bande n'est pas détectée dans la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI est validée par PCR. Validation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI par immunofluorescence Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti M2e aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Neo ncmic/-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée sur la membrane des parasites de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine M2eGPI SEQ ID NO :206. (figure 34) La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI est validée par immunofluorescence. Validation de la souche ayant intégré le plasmide par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (41.1M) ou de ganciclovir (501.1M). La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (41.1M - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - possible qu'en cas d'absence du gène TK). La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (41.1M - grâce à la présence du gène DHFR*) alors qu'elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance (sensible au ganciclovir et résistance à la pyriméthamine) permet de confirmer l'intégration du plasmide pUC18 4G2 ICreI - M2eGPI SEQ ID NO: 205 dans la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI. L'ensemble des résultats permet de valider la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI. 2. Construction de la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G M2eGPI IcreI L'électroporation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI avec le plasmide pTsaglIcreI c43y circulaire SEQ ID NO : 178 a été réalisée selon le protocole décrit (point e). Les clones obtenus résistants au ganciclovir sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d'intérêt M2eGPI et l'expression de la 121 protéine M2eGPI SEQ ID NO :206 et pour valider la suppression de la cassette de résistance DHFR*TYTK SEQ ID NO :134. Validation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI IcreI par PCR Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2eGPI R SEQ ID NO: 247 (Mix M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 593 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2eGPI dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2e R SEQ ID NO: 246 (Mix M2e) ne permettent pas de mettre en évidence une bande à 588 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI, conformément à ce qui est attendu. En effet, cette PCR permet de différencier l'insertion du plasmide pUC18 4G2 ICreI - M2eGPI SEQ ID NO :205 (PCR négative) de l'insertion du plasmide pUC18 4G2 ICreI - M2e SEQ ID NO :244 (PCR positive à 588pb). Cette bande n'est pas détectée dans la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO: 250 (Mix Gène d'intérêt) permettent de mettre en évidence une bande à 1719 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2eGPI dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces Dhfr int Bgl II F SEQ ID NO :251 et qPCR TK R SEQ ID NO: 252 (Mix DHFR*TYTK) ne mettent pas en évidence de bande à 945 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI IcreI, conformément à ce qui est attendu et confirmant la suppression de la cassette DHFR*TYTK dans cette souche. Cette bande n'est pas non plus détectée dans la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et MC1 SEQ ID NO: 254 (Mix IcreI M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 1192 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI IcreI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2eGPI et la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO :134 dans cette souche. Cette bande 122 n'est pas détectée dans la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI IcreI est validée par PCR. Validation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI IcreI par immunofluorescence Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti M2e aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Neo ncmic/-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée pour les parasites Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI IcreI obtenue. La localisation de la protéine semble membranaire (dû à l'ancrage GPI) alors que pour la version M2e, la localisation semble dans la vacuole parasitophore et dans le parasite. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine M2eGPI SEQ ID NO :206. La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI IcreI est validée par immunofluorescence. Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (41.1M) ou de ganciclovir (501.1M). La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (41.1M - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - possible qu'en cas d'absence du gène TK). Alors que la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (41.1M - grâce à la présence du gène DHFR*) et qu'elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - à cause de la présence du gène TK, la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI IcreI n'est plus capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (41.1M - grâce à la perte du gène DHFR*) alors qu'elle est redevenue capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - grâce à la perte du gène TK). Ce profil de résistance (résistance au ganciclovir et sensible à la pyriméthamine) permet de confirmer la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO :134 suite à l'action de la méganucléase I-CreI. 123 L'ensemble des résultats permet de valider la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI IcreI. F. Construction de la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G HA IcreI 3. Construction de la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G HA L'électroporation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G avec le plasmide pUC18 4G2 ICreI - HA SEQ ID NO : 232 a été réalisée selon le protocole décrit (point a). Les clones obtenus résistants à la pyriméthamine sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d'intérêt HA et l'expression de la protéine SEQ ID NO :255. Validation de la souche Neo ncmicI-3 KO - 2G HA par PCR Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces oz tete HA F SEQ ID NO :239 et Seq HA R I SEQ ID NO : 248 (Mix HA) permettent de mettre en évidence une bande à 506 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G HA, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène HA dans cette souche (figure 24). Cette bande n'est pas détectée dans la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO: 250 (Mix Gène d'intérêt) permettent de mettre en évidence une bande à 1875 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G HA, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène HA dans cette souche (figure 24). Cette bande n'est pas détectée dans la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces Dhfr int Bgl II F SEQ ID NO :251 et qPCR TK R SEQ ID NO: 252 (Mix DHFR*TYTK) permettent de mettre en évidence une bande à 945 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G HA, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène DHFR*TYTK dans cette souche (figure 24). Cette bande n'est pas détectée dans la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G HA est validée par PCR. 124 Validation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G HA par immunofluorescence Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti HA aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Neo ncmic/-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée sur la membrane des parasites de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G HA obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine HA SEQ ID NO :255. (figure 35) La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G HA est validée par immunofluorescence. Validation de la souche ayant intégré le plasmide par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (41.1M) ou de ganciclovir (501.1M). La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (41.1M - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - possible qu'en cas d'absence du gène TK). La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G HA est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (41.1M - grâce à la présence du gène DHFR*) alors qu'elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance (sensible au ganciclovir et résistance à la pyriméthamine) permet de confirmer l'intégration du plasmide pUC18 4G2 ICreI - HA SEQ ID NO: 232 dans la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G HA. L'ensemble des résultats permet de valider la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G HA. 4. Construction de la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G HA IcreI L'électroporation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G HA avec le plasmide pTsaglIcreI c43y circulaire SEQ ID NO : 178 a été réalisée selon le protocole décrit (point e). Les clones obtenus résistants au ganciclovir sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d'intérêt HA et l'expression de la protéine HA SEQ ID NO :255 et pour valider la suppression de la cassette de résistance DHFR*TYTK SEQ ID NO :134. Validation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G HA IcreI par PCR Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces oz tete HA F SEQ ID NO :239 et Seq HA R I SEQ ID NO : 248 (Mix HA) permettent de mettre en évidence une bande à 506 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G HA, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène HA dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO: 250 (Mix Gène d'intérêt) permettent de mettre en évidence une bande à 1875 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G HA, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène HA dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces Dhfr int Bgl II F SEQ ID NO :251 et qPCR TK R SEQ ID NO: 252 (Mix DHFR*TYTK) ne mettent pas en évidence de bande à 945 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G HA IcreI, conformément à ce qui est attendu et confirmant la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO :134 dans cette souche. Cette bande n'est pas non plus détectée dans la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces oz tete HAF SEQ ID NO :239 et MC1 SEQ ID NO: 254 (Mix IcreI HA) permettent de mettre en évidence une bande à 1348 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G HA IcreI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène HA et la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO :134 dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G HA IcreI est validée par PCR. Validation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G HA IcreI par immunofluorescence Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti HA aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Neo ncmic/-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée pour les parasites Neo ncmic1-3 KO - 2G HA IcreI obtenue. La localisation de la protéine semble bien membranaire (dû à l'ancrage GPI). Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine HA SEQ ID NO :255. La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G HA IcreI est validée par immunofluorescence. 126 Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (4uM) ou de ganciclovir (50uM). La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (4uM - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50uM - possible qu'en cas d'absence du gène TK). Alors que la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G HA est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (4uM - grâce à la présence du gène DHFR*) et qu'elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50uM - à cause de la présence du gène TK, la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G HA IcreI n'est plus capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (4uM - grâce à la perte du gène DHFR*) alors qu'elle est redevenue capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50uM - grâce à la perte du gène TK). Ce profil de résistance (résistance au ganciclovir et sensible à la pyriméthamine) permet de confirmer la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO :134 suite à l'action de la méganucléase I-CreI. L'ensemble des résultats permet de valider la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G HA IcreI. Résultats - Construction des souches exprimant plusieurs antigènes du virus Influenza et comportant ou non un de gène de sélection C. Construction de la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G M2eGPI HA IcreI 1. Construction de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA L'électroporation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI IcreI avec le plasmide pUC18 4G2 ICreI - HA SEQ ID NO : 232 a été réalisée selon le protocole décrit (point a). Les clones obtenus résistants à la pyriméthamine sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d'intérêt HA et l'expression de la protéine. 127 Validation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA par PCR Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2eGPI R SEQ ID NO: 247 (Mix M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 593 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2eGPI dans cette souche. Cette bande est détectée dans la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G M2eGPI IcreI confirmant la présence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2e R SEQ ID NO: 246 (Mix M2e) ne permettent pas de mettre en évidence une bande à 588 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA, conformément à ce qui est attendu. En effet, cette PCR permet de différencier l'insertion du plasmide pUC18 4G2 ICreI - M2eGPI SEQ ID NO :205 (PCR négative) de l'insertion du plasmide pUC18 4G2 ICreI - M2e SEQ ID NO :244 (PCR positive à 588pb). Cette bande n'est pas détectée dans la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G M2eGPI IcreI confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces oz tete HA F SEQ ID NO :239 et Seq HA R I SEQ ID NO : 248 (Mix HA) permettent de mettre en évidence une bande à 506 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène HA dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI ICreI confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO: 250 (Mix Gène d'intérêt) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 1875 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour HA et une bande à 1719 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour M2e GPI pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA, confirmant la présence des gènes HA et M2eGPI dans cette souche. Ces bandes ne sont pas détectées dans la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ et la souche électroporée Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI IcreI ne présente que la bande à 1719 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour M2e GPI. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces Dhfr int Bgl II F SEQ ID NO :251 et qPCR TK R SEQ ID NO: 252 (Mix DHFR*TYTK) permettent de mettre en évidence une bande à 945 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène 128 DHFR*TYTK dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI IcreI confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA est validée par PCR. Validation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA par immunofluorescence Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti HA aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Neo ncmic/-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée sur la membrane des parasites de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine HA SEQ ID NO :255. Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti M2e aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Neo ncmic/-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée pour les parasites Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI IcreI et la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA obtenue. La localisation de la protéine semble membranaire (dû à l'ancrage GPI) alors que pour la version M2e, la localisation semble dans la vacuole parasitophore et dans le parasite. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine M2eGPI SEQ ID NO :206. La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA est validée par immunofluorescence. Validation de la souche ayant intégré le plasmide par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (41.1M) ou de ganciclovir (501.1M). La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI IcreI est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (41.1M - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - possible qu'en cas d'absence du gène TK). La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (41.1M - grâce à la présence du gène DHFR*) alors qu'elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance (sensible au ganciclovir et résistance à la pyriméthamine) permet de confirmer l'intégration du plasmide pUC18 4G2 ICreI - HA SEQ ID NO: 232 dans la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA. L'ensemble des résultats permet de valider la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA. 129 2. Construction de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA IcreI L'électroporation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA avec le plasmide pTsaglIcreI c43y circulaire SEQ ID NO : 178 a été réalisée selon le protocole décrit (point e). Les clones obtenus résistants au ganciclovir sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence des gènes d'intérêt M2eGPI et HA et l'expression des protéines M2eGPI SEQ ID NO :206 et HA SEQ ID NO :255 et pour valider la suppression de la cassette de résistance DHFR*TYTK SEQ ID NO :134. Validation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA IcreI par PCR Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2eGPI R SEQ ID NO: 247 (Mix M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 593 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA IcreI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2eGPI dans cette souche. Cette bande est détectée dans la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G M2eGPI IcreI confirmant la présence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2e R SEQ ID NO: 246 (Mix M2e) ne permettent pas de mettre en évidence une bande à 588 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA IcreI, conformément à ce qui est attendu. En effet, cette PCR permet de différencier l'insertion du plasmide pUC18 4G2 ICreI - M2eGPI SEQ ID NO :205 (PCR négative) de l'insertion du plasmide pUC18 4G2 ICreI - M2e SEQ ID NO :244 (PCR positive à 588pb). Cette bande n'est pas détectée dans la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G M2eGPI IcreI confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces oz tete HA F SEQ ID NO :239 et Seq HA R I SEQ ID NO: 248 (Mix HA) permettent de mettre en évidence une bande à 506 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA IcreI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène HA dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI ICreI confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO: 250 (Mix Gène d'intérêt) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 1875 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour HA et une bande à 1719 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour M2e GPI pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA IcreI, confirmant la présence des gènes HA et M2eGPI dans cette souche. Ces bandes ne sont pas détectées dans la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ et la souche électroporée Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA présente les deux bandes (à 1719 et 1875 paires de bases) conformément à la taille de bande attendue pour M2e GPI et HA. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces Dhfr int Bgl II F SEQ ID NO :251 et qPCR TK R SEQ ID NO: 252 (Mix DHFR*TYTK) ne mettent pas en évidence de bande à 945 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA IcreI, conformément à ce qui est attendu et confirmant la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO :134 dans cette souche. Cette bande n'est pas non plus détectée dans la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI IcreI confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et MC1 SEQ ID NO: 254 (Mix IcreI M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 1192 paires de bases pour les souches Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI IcreI, et Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA IcreI conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2eGPI et la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO :134 dans ces souches. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces oz tete HAF SEQ ID NO :239 et MC1 SEQ ID NO : 254 (Mix IcreI HA) permettent de mettre en évidence une bande à 1348 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA IcreI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène HA et la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO :134 dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI IcreI confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA IcreI est validée par PCR. Validation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA IcreI par immunofluorescence Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti HA aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Neo ncmic/-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée sur la membrane des parasites de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA et de la souche obtenue Neo 131 ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA IcreI. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine HA SEQ ID NO :255. Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti M2e aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Neo ncmic/-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée pour les parasites Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA et la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA IcreI obtenue. La localisation de la protéine semble membranaire (dû à l'ancrage GPI) alors que pour la version M2e, la localisation semble dans la vacuole parasitophore et dans le parasite. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine M2eGPI SEQ ID NO :206. La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA IcreI est validée par immunofluorescence. Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (41.1M) ou de ganciclovir (501.1M). La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (41.1M - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - possible qu'en cas d'absence du gène TK). Alors que la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (41.1M - grâce à la présence du gène DHFR*) et qu'elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - à cause de la présence du gène TK, la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA IcreI n'est plus capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (41.1M - grâce à la perte du gène DHFR*) alors qu'elle est redevenue capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - grâce à la perte du gène TK). Ce profil de résistance (résistance au ganciclovir et sensible à la pyriméthamine) permet de confirmer la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO :134 suite à l'action de la méganucléase I-CreI. L'ensemble des résultats permet de valider la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA IcreI. 132 D. Construction de la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G M2e HA IcreI 1. Construction de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e HA L'électroporation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e IcreI avec le plasmide pUC18 4G2 ICreI - HA SEQ ID NO : 232 a été réalisée selon le protocole décrit (point a). Les clones obtenus résistants à la pyriméthamine sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d'intérêt HA et l'expression de la protéine. Validation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e HA par PCR Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2eGPI R SEQ ID NO: 247 (Mix M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 593 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e HA, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2e dans cette souche (figure 31). Cette bande est détectée dans la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G M2e IcreI confirmant la présence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2e R SEQ ID NO: 246 (Mix M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 588 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e HA, conformément à ce qui est attendu (figure 31). En effet, cette PCR permet de différencier l'insertion du plasmide pUC18 4G2 ICreI - M2eGPI SEQ ID NO :205 (PCR négative) de l'insertion du plasmide pUC18 4G2 ICreI - M2e SEQ ID NO :244 (PCR positive à 588pb). Cette bande est détectée dans la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G M2e IcreI confirmant la présence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces oz tete HA F SEQ ID NO :239 et Seq HA R I SEQ ID NO : 248 (Mix HA) permettent de mettre en évidence une bande à 506 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e HA, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène HA dans cette souche (figure 31). Cette bande n'est pas détectée dans la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e ICreI confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO: 250 (Mix Gène d'intérêt) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 1875 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour HA et une bande à 1641 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour M2e pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e HA, confirmant la présence 133 des gènes HA et M2e dans cette souche (figure 31). Ces bandes ne sont pas détectées dans la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ et la souche électroporée Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e IcreI ne présente que la bande à 1641 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour M2e. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces Dhfr int Bgl II F SEQ ID NO :251 et qPCR TK R SEQ ID NO: 252 (Mix DHFR*TYTK) permettent de mettre en évidence une bande à 945 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e HA, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène DHFR*TYTK dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e IcreI confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e HA est validée par PCR. Validation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e HA par immunofluorescence Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti HA aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Neo ncmic/-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée sur la membrane des parasites de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e HA obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine HA SEQ ID NO :255. (figure 36) Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti M2e aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Neo ncmic/-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée pour les parasites Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e IcreI et la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e HA obtenue. La localisation de la fluorescence semble être dans la vacuole parasitophore et dans le parasite (alors que pour la version M2eGPI, la localisation de la protéine semble membranaire). Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine M2e SEQ ID NO :253. (figure 36) La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e HA est validée par immunofluorescence. Validation de la souche ayant intégré le plasmide par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (41.1M) ou de ganciclovir (501.1M). La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e IcreI est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (41.1M - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - possible qu'en cas d'absence du gène TK). 134 La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e HA est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (41.1M - grâce à la présence du gène DHFR*) alors qu'elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance (sensible au ganciclovir et résistance à la pyriméthamine) permet de confirmer l'intégration du plasmide pUC18 4G2 ICreI - HA SEQ ID NO: 232 dans la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e HA. L'ensemble des résultats permet de valider la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e HA. 2. Construction de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e HA IcreI L'électroporation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e HA avec le plasmide pTsaglIcreI c43y circulaire SEQ ID NO : 178 a été réalisée selon le protocole décrit (point e). Les clones obtenus résistants au ganciclovir sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence des gènes d'intérêt M2e et HA et l'expression des protéines M2e SEQ ID NO :253 et HA SEQ ID NO :255 et pour valider la suppression de la cassette de résistance DHFR*TYTK SEQ ID NO :134. Validation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e HA IcreI par PCR Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2eGPI R SEQ ID NO: 247 (Mix M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 593 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e HA IcreI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2e dans cette souche. Cette bande est détectée dans la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e HA confirmant la présence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et oz M2e R SEQ ID NO: 246 (Mix M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 588 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2eHA IcreI, conformément à ce qui est attendu. En effet, cette PCR permet de différencier l'insertion du plasmide pUC18 4G2 ICreI - M2eGPI SEQ ID NO :205 (PCR négative) de l'insertion du plasmide pUC18 4G2 ICreI - M2e SEQ ID NO :244 (PCR positive à 588pb). Cette bande n'est pas détectée dans la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e ICreI confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces oz tete HA F SEQ ID NO :239 et Seq HA R I SEQ ID NO: 248 (Mix HA) permettent de mettre en évidence une bande à 506 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e HA IcreI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène HA dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e ICreI confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO: 250 (Mix Gène d'intérêt) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 1875 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour HA et une bande à 1641 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour M2e pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e HA IcreI, confirmant la présence des gènes HA et M2e dans cette souche. Ces bandes ne sont pas détectées dans la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ et la souche électroporée Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e HA présente les deux bandes (à 1641 et 1875 paires de bases) conformément à la taille de bande attendue pour M2e et HA. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces Dhfr int Bgl II F SEQ ID NO :251 et qPCR TK R SEQ ID NO: 252 (Mix DHFR*TYTK) ne mettent pas en évidence de bande à 945 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e HA IcreI, conformément à ce qui est attendu et confirmant la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO :134 dans cette souche. Cette bande n'est pas non plus détectée dans la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e IcreI confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces M2e F SEQ ID NO :245 et MC1 SEQ ID NO: 254 (Mix IcreI M2eGPI ou M2e) permettent de mettre en évidence une bande à 1114 paires de bases pour les souches Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e IcreI, et Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e HA IcreI conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène M2e et la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO :134 dans ces souches. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces oz tete HAF SEQ ID NO :239 et MC1 SEQ ID NO: 254 (Mix IcreI HA) permettent de mettre en évidence une bande à 1348 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e HA IcreI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène HA et la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO :134 dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e IcreI confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e HA IcreI est validée par PCR. 136 Validation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e HA IcreI par immunofluorescence Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti HA aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Neo ncmic/-3 KO - 2G et la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e IcreI , alors qu'une fluorescence est détectée sur la membrane des parasites de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e HA IcreI obtenue et la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e HA. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine HA SEQ ID NO :255. Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti M2e aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Neo ncmic/-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée pour les parasites Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e HA et la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e HA obtenue. La localisation de la fluorescence semble être dans la vacuole parasitophore et dans le parasite (alors que pour la version M2eGPI, la localisation de la protéine semble membranaire). Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine M2e SEQ ID NO :253. La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e HA IcreI est validée par immunofluorescence. Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (41.1M) ou de ganciclovir (501.1M). La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (41.1M - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - possible qu'en cas d'absence du gène TK). Alors que la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e HA est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (41.1M - grâce à la présence du gène DHFR*) et qu'elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - à cause de la présence du gène TK), la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e HA IcreI n'est plus capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (41.1M - grâce à la perte du gène DHFR*) alors qu'elle est redevenue capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - grâce à la perte du gène TK). Ce profil de résistance (résistance au ganciclovir et sensible à la pyriméthamine) permet de confirmer la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO :134 suite à l'action de la méganucléase I-CreI. 137 L'ensemble des résultats permet de valider la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G M2e HA IcreI. Exemple 9 : Construction de plasmides permettant l'intégration et l'expression de transgènes du parasite Leishmania infantum dans des souches de Toxoplasma gondii et Neospora caninum sans persistance d'une cassette de sélection. L'objectif de cette expérience est de construire des plasmides qui permettent l'intégration dans le génome de Toxoplasma gondii ou dans celui de Neospora caninum d'un transgène hétérologue du parasite Leishmania infantum son expression et sans persistance d'une cassette de sélection. - Plasmide pUC18 4G2 ICreI - Kmpll Le plasmide pUC18 4G2 ICreI - Kmpll SEQ ID NO: 256 (figure 37) permet la production d'une protéine de fusion Kmpll-tag Myc SEQ ID NO : 257, comprenant : la séquence du gène kmp 1 1 de Leishmania infantum SEQ ID NO: 258 codant pour la protéine Kmpll SEQ ID NO : 259 un tag Myc SEQ ID NO : 260 codée par la séquence SEQ ID NO : 261 Une PCR a été nécessaire pour l'amplification des ces fragments pour cette construction avec les amorces MC7 SEQ ID NO : 262 et MC8 SEQ ID NO : 263 (PCR : SEQ ID NO : 264 329 pb) (Tableau 25). L'amplification de cette séquence a été effectué à partir d'un gène synthétique codant pour Kmpll et a une taille de 329 pb SEQ ID NO : 264. Tableau 25 : Amorces MC7 et MC8 Amor ce F Séquence Amor ce R Séquence MC7 SEQ ID NO :262 MC8 SEQ ID NO 263 AAACGACAAAATGGCCACCACG TACGAGG CCGCGGCCGCTTACAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCCTTGG ACGGGTACTGCGCAG 138 Le fragment de PCR digéré par les enzymes PmeI et NotI (325 pb, SEQ ID NO : 265) a été directement clonés dans le plasmide pUC18 4G2 ICreI SEQ ID NO : 128 digéré par les enzymes PmeI et NotI (8344pb). - Plasmide pUC18 4G2 ICreI - Nh36 Le plasmide pUC18 4G2 ICreI - Nh36 SEQ ID NO : 266 (figure 38) permet la production d'une protéine de fusion Nh36-tag V5 SEQ ID NO : 267, comprenant : - la séquence du gène nh36 de Leishmania infantum SEQ ID NO: 268 codant pour la protéine Nh36 SEQ ID NO : 269 - un tag V5 SEQ ID NO : 270 codée par la séquence SEQ ID NO : 271 Une PCR a été nécessaire pour l'amplification des ces fragments pour cette construction avec les amorces MC9 SEQ ID NO : 272 et MC10 SEQ ID NO: 273 (PCR: SEQ ID NO : 274 1007 pb) (Tableau 26). L'amplification de cette séquence a été effectué à partir d'un gène synthétique codant pour Nh36 et a une taille de 1007 pb SEQ ID NO : 274. Tableau 26 : Amorces MC9 et MC10 Amo rce F Séquence Amo rce R Séquence MC9 SEQ ID NO :272 MC1 0 SEQ ID NO 273 AAACGACAAAATGCCGCGCA AGATTATTCTC CAGCGGCCGCTTACGTAGAATCGAGACCGAGGAGAGGGTTAGGGATAG GCTTACCTTGAGGATCGCCGATGCGC Le fragment de PCR digéré par les enzymes PmeI et NotI (1003 pb, SEQ ID NO : 275) a été directement clonés dans le plasmide pUC18 4G2 ICreI SEQ ID NO : 128 digéré par les enzymes PmeI et NotI (8344pb). - Plasmide pUC18 4G2 ICreI - Cypl Le plasmide pUC18 4G2 ICreI - Cyp 1 SEQ ID NO : 276 (figure 39) permet la production d'une protéine de fusion Cypl-tag HA SEQ ID NO : 277, comprenant : - la séquence du gène cyp 1 de Leishmania infantum SEQ ID NO: 278 codant pour la protéine Cypl SEQ ID NO : 279 139 un tag HA SEQ ID NO : 280 codée par la séquence SEQ ID NO : 281 Une PCR a été nécessaire pour l'amplification des ces fragments pour cette construction avec les amorces MC11 SEQ ID NO: 282 et MC12 SEQ ID NO: 283 (PCR: SEQ ID NO: 284 581 pb) (Tableau 27). L'amplification de cette séquence a été effectué à partir d'un gène synthétique codant pour Cypl et a une taille de 581 pb SEQ ID NO : 284. Tableau 27 : Amorces MC11 et MC12 Amor ce F Séquence Amor ce R Séquence MC1 1 SEQ ID NO :xx MC1 2 SEQ ID NO xx AAACGACAAAATGTCTTACACGCC GCACTAC CAGCGGCCGCTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAAAGCT GTCCGCAGGCAGC Le fragment de PCR digéré par les enzymes PmeI et NotI (577 pb, SEQ ID NO : 285) a été directement clonés dans le plasmide pUC18 4G2 ICreI SEQ ID NO : 128 digéré par les enzymes PmeI et NotI (8344pb). Exemple 10: Construction d'une souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G exprimant un ou plusieurs antigènes du parasite Leishmania infantum et ne comportant pas de gène de sélection Souches de Toxoplasma gondii La souche utilisée dans le présent exemple est une souche atténuée de Toxoplasma gondii, dénommée Toxo tgmic/-3 KO 2G. Elle a été obtenue par la délétion par recombinaison homologue de deux gènes de virulence : les gènes mic/ et mic3. Les tachyzoïtes de la souche Toxo tgmic/-3 KO 2G sont produits sur fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634)) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (SVF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine. Ils ont été récoltés après lyse mécanique des cellules hôtes par 3 passages en seringue 25G. Construction des souches - protocole La construction de chaque souche vaccinale contenant un ou plusieurs antigènes se fait à chaque étape avec un protocole identique. Le protocole expérimental est dans un premier temps détaillé ici puis appliqué pour chaque construction de souche vaccinale, celui-ci comporte plusieurs étapes : a- Electroporation et sélection de la souche d'intérêt avec le plasmide exprimant un antigène du parasite Leishmania infantum : souches Toxo tgmic1-3 KO - 2G Leishmania Les parasites Toxo tgmic1-3 KO - 2G sont électroporés avec 201.1g de plasmide pUC18 4G2 ICreI - Leishmania linéarisé. Par « plasmide pUC18 4G2 ICreI - Leishmania », on entend le plasmide pUC18 4G2 ICreI - Kmpll SEQ ID NO :256, le plasmide pUC18 4G2 ICreI - Nh36 SEQ ID NO :266, ou le plasmide pUC18 4G2 ICreI - Cypl. Après électroporation, les tachyzoïtes sont soumis à une pression de sélection par l'agent de sélection (Pyriméthamine 11.1M). 10 à 15 jours après sélection et passages successifs sur cellules HFF, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF puis amplifiés en plaques 24 puits sur une monocouche de cellules HFF. b- Validation de la souche ayant intégré le plasmide par PCR Pour valider une souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Leishmania, c'est-à-dire une souche de T gondii ayant intégré un ou plusieurs plasmides pUC18 4G2 ICreI - Leishmania, des analyses PCR sont effectuées à partir de l'ADN génomique extrait au DNAzol à partir d'un culot parasitaire constitué de 107 parasites. Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le Tableau 28 (point f). Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose. Leurs tailles attendues sont également décrites dans le Tableau xx (point f). Plusieurs mix sont possibles et les PCR sont réalisées en fonction des souches testées. c- Validation de la souche ayant intégré le plasmide par immunofluorescence Les tachyzoïtes sont cultivés 24h sur lamelles en verre recouvertes d'une monocouche de cellules HFF. Les cellules infectées ont été lavés 2 fois en PBS1X, et fixés par du formaldéhyde 4% pendant 30 min. Après 3 lavages en PBS1X, les cellules HFF infectées ont été perméabilisées avec 0,1% de Triton X-100 dans du PBS1X pendant 5 min. Après 3 lavages au PBS 1X, une étape de saturation est effectuée avec une solution de PBS 1X/SVF 10% pendant 30 min. Les cellules ont ensuite été incubées avec l'anticorps primaire dilué dans 2% SVF pendant 1 heure, lavées 3 fois au PBS1X puis incubées avec un anticorps secondaire dilué dans une solution de PBS/SVF 2% pendant 1 heure. Après 2 lavages au PBS1X, les lamelles en verre sont montées sur lame avec de l'Immu-MountTm et observées au microscope à fluorescence. 141 Les anticorps primaires utilisés sont : un anticorps commercial dirigé contre le tag Myc couplé en C-ter à Kmpll (Myc epitope Tag antibody (Myc.A7), réf : MA1-21316, Thermo Scientific ou c-Myc Tag Antibody, réf SAB4301136, Sigma-Aldrich) qui permet de détecter l'expression de la protéine Kmpll-c-Myc SEQ ID NO : 257, un anticorps commercial dirigé contre le tag V5 couplé en C-ter à Nh36 (V5 epitope Tag antibody (E10/V4RR), réf : MA-15253 ou PA1-993, Thermo Scientific ou V5 epitope Tag Antibody Alexa Fluore488 conjugate (2F11F7), réf : 37-7500-A488) qui permet de détecter l'expression de la protéine Nh36-V5 SEQ ID NO: 267, un anticorps commercial dirigé contre le tag HA couplé en C-ter à Cyp 1 (Anti-HA antibody, réf : 26183 ou 71-5500, ou HA Epitope Tag Antibody, Alexa Fluor® 594 conjugate (16B12), réf : A21-288, Thermo Scientific) qui permet de détecter l'expression de la protéine Cyp 1-HA SEQ ID NO : 277 et enfin les anticorps secondaires commerciaux utilisés sont l'Alexa fluor() 594 goat anti-mouse ou anti-rabbit (réf : A-11005 ou A-11012), l'Alexa fluor® 488 goat anti-mouse ou anti-rabbit (réf : A-11001 ou A-27012 et l'Alexa fluor® 430 goat anti-rabbit (Réf : A-11063, Thermo Scientific). d- Validation de la souche a ant inté ré le -lasmide sar anal se du iro 1 de résistance Le profil d' antibiorésistance est analysé pour les clones validés en PCR et immunofluorescence. Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF. Les parasites Toxo tgmic1-3 KO - 2G Leishmania infantum ayant intégré un plasmide pUC18 4G2 ICreI - Leishmania linéarisé doivent être résistants à la pyriméthamine (11.1M - grâce à la présence du gène DHFR*) et sensible au ganciclovir (501.1M - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance est validé en cultivant les parasites sur fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (SVF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine, supplémenté ou non de la pyriméthamine ou du ganciclovir. Les souches validées par PCR, immunofluorescence et ayant le bon profil d'antibiorésistance sont nommées Toxo tgmic1-3 KO - 2G Leishmania (Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll, Toxo tgmic1-3 KO - 2G Nh36, Toxo tgmic1-3 KO - 2G Cypl, Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Nh36, Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cypl, Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cypl Nh36). 142 e- Electroporation de la Toxo tgmic1-3 KO - 2G Leishmania avec un plasmide pTsaglIcreIce et contre sélection de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK : souches Toxo tgmic1-3 KO - 2G Leishmania IcreI Les parasites Toxo tgmic1-3 KO - 2G Leishmania sont électroporés avec 201.1g de plasmide pTsaglIcreI a43y circulaire SEQ ID NO : 178. Après électroporation, les tachyzoïtes sont soumis à une pression de sélection par l'agent de sélection (Ganciclovir 501.1M). Dix à quinze jours après sélection et passages successifs sur cellules HFF, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF puis amplifiés en plaques 24 puits sur une monocouche de cellules HFF. f- Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK par PCR Pour valider une souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Leishmania IcreI, des analyses PCR sont effectuées à partir de l'ADN génomique extrait au DNAzol à partir d'un culot parasitaire constitué de 107 parasites. Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le Tableau 29 ci-dessous. Les premières PCR sont identiques aux PCR faites pour la validation des souches Toxo tgmic1-3 KO - 2G Leishmania, la deuxième série de PCR permet de valider la suppression de la cassette DHFR*-TY-TK et la présence de la cicatrice c43y SEQ ID NO : 143, et ainsi de vérifier l'absence de l'insertion du plasmide pTsaglIcreI af3y. Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose. Leurs tailles attendues sont également décrites dans le Tableau 30 ci-dessous. Plusieurs mixs sont possibles et les PCR sont réalisées en fonction des souches testées. Tableau 29 : liste des amorces utilisables pour la validation des souches. Gène d'intérêt seq TUB MCS F SEQ ID NO : 249 seq 3utr MCS R SEQ ID NO : 250 AACCCGCGCAGAAGACATCC ATGGGGCACATGCTGCACGAA Mix IcreI Gène d'intérêt et cicatrice MC4 SEQ ID NO : 286 MC1 SEQ ID NO : 254 TCGTAGAGAACAAGCACTCG TGAAATACCGCACAGATGCG 143 Tableau 30 : Taille attendue des amplicons (en paires de base) des différentes PCR de validation de la construction des souches Toxo tgmic1-3 KO - 2G Influenza. Gène d'intérêt Mix IcreI Gène d'intérêt et cicatrice Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll 510 5843 Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll IcreI 510 999 Toxo tgmic1-3 KO - 2G Nh36 1188 6521 Toxo tgmic1-3 KO - 2G Nh36 IcreI 1188 1677 Toxo tgmic1-3 KO - 2G Cypl 762 6095 Toxo tgmic1-3 KO - 2G Cypl IcreI 762 1251 Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Nh36 510/1188 999/6521 Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Nh36 IcreI 510/1188 999/1677 Toxo tgmic 1-3 KO - 2G Kmpll Cypl 510/762 999/6095 Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cypl IcreI 510/762 999/1251 Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cypl Nh36 510/762/1188 999/1251/6521 g- Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK par immunofluorescence La validation des souches par immunofluorescence se fait suivant le protocole précédemment décrit (point c). h- Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK par analyse du profil de résistance Les parasites Toxo tgmic1-3 KO - 2G Leishmania ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK SEQ ID NO: 134 doivent être sensibles à la pyriméthamine (11.1M - grâce à la suppression du gène DHFR*) et résistants au ganciclovir (501.1M - grâce à la suppression du gène TK). Ce profil de résistance est validé en cultivant les parasites sur fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (SVF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine, supplémenté ou non de la pyriméthamine ou du ganciclovir. Les souches validées par PCR, immunofluorescence et ayant le bon profil d'antibiorésistance sont nommées Toxo tgmic1-3 KO - 2G Leishmania IcreI (Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll IcreI, Toxo tgmic1-3 KO - 2G Nh36 IcreI, Toxo tgmic1-3 KO - 2G Cypl IcreI, Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Nh36 IcreI, Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cypl IcreI). 144 Résultats - Construction des souches exprimant un antigène du parasite Leishmania et ne comportant pas de gène de sélection A. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G Kmpll IcreI 1. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G Kmpll L'électroporation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G avec le plasmide pUC18 4G2 ICreI - Kmpll SEQ ID NO : 256 a été réalisée selon le protocole décrit (point a). Les clones obtenus résistants à la pyriméthamine sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d'intérêt kmpl 1 et l'expression de la protéine Kmpll SEQ ID NO :259. Validation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll par PCR Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO: 250 (Mix Gène d'intérêt) permettent de mettre en évidence une bande à 510 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène kmpl 1 dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. (figure 40) La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll est validée par PCR. Validation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll par immunofluorescence Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti Myc aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Toxo tgmic1-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée dans les parasites et dans les vacuoles parasitophores de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine Kmpll-Myc SEQ ID NO :257. (figure 42) La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll est validée par immunofluorescence. Validation de la souche ayant intégré le plasmide par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (11.1M) ou de ganciclovir (501.1M). La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - possible qu'en cas d'absence du gène TK). La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - grâce à la présence du gène DHFR*) alors qu'elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance (sensible au ganciclovir et résistance à la pyriméthamine) permet de confirmer l'intégration du plasmide pUC18 4G2 ICreI - Kmpll SEQ ID NO: 256 dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll. L'ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll. 2. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G Kmpll IcreI L'électroporation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll avec le plasmide pTsaglIcreI c43y circulaire SEQ ID NO : 178 a été réalisée selon le protocole décrit (point e). Les clones obtenus résistants au ganciclovir sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d'intérêt kmpl 1 et l'expression de la protéine Kmpll et pour valider la suppression de la cassette de résistance DHFR*TYTK. Validation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll IcreI par PCR Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO: 250 (Mix gène d'intérêt) permettent de mettre en évidence une bande à 510 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll IcreI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène kmpl dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. (figure 40). Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces MC4 SEQ ID NO :286 et MC1 SEQ ID NO : 254 (Mix IcreI Gène d'intérêt et cicatrice) permettent de mettre en évidence une bande à 999 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll IcreI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène kmpl 1 et la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. (figure 41). La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll est validée par PCR. 146 Validation de la souche Toxo tgmicI-3 KO - 2G Kmpll IcreI par immunofluorescence Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti Myc aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Toxo tgmicI-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée dans les parasites et dans les vacuoles parasitophores de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll IcreI obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine Kmpll SEQ ID NO :259. (figure 42) La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll IcreI est validée par immunofluorescence. Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (11.1M) ou de ganciclovir (501.1M). La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - possible qu'en cas d'absence du gène TK). Alors que la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - grâce à la présence du gène DHFR*) et qu'elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - à cause de la présence du gène TK), la souche Toxo tgmicl3 KO - 2G Kmpll IcreI n'est plus capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - grâce à la perte du gène DHFR*) alors qu'elle est redevenue capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - grâce à la perte du gène TK). Ce profil de résistance (résistance au ganciclovir et sensible à la pyriméthamine) permet de confirmer la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 suite à l'action de la méganucléase I-CreI. L'ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll IcreI. 147 B. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G Nh36 IcreI 1. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G Nh36 L'électroporation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G avec le plasmide pUC18 4G2 ICreI - Nh36 SEQ ID NO : 266 a été réalisée selon le protocole décrit (point a). Les clones obtenus résistants à la pyriméthamine sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d'intérêt nh36 et l'expression de la protéine Nh36 SEQ ID NO 269. Validation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Nh36 par PCR Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO : 250 (Mix Gène d'intérêt) permettent de mettre en évidence une bande à 1188 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Nh36, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène nh36 dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. (figure 40) La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Nh36 est validée par PCR. Validation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Nh36 par immunofluorescence Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti V5, aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Toxo tgmic1-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée sur les parasites de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Nh36 obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine Nh36. (figure 42) La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Nh36 est validée par immunofluorescence. Validation de la souche ayant intégré le plasmide par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (11.1M) ou de ganciclovir (501.1M). La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - possible qu'en cas d'absence du gène TK). 148 La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Nh36 est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - grâce à la présence du gène DHFR*) alors qu'elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance (sensible au ganciclovir et résistance à la pyriméthamine) permet de confirmer l'intégration du plasmide pUC18 4G2 ICreI - Nh36 SEQ ID NO : 266 dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Nh36. L'ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Nh36. 2. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G Nh36 IcreI L'électroporation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Nh36 avec le plasmide pTsaglIcreI a43y circulaire SEQ ID NO : 178 a été réalisée selon le protocole décrit (point e). Les clones obtenus résistants au ganciclovir sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d'intérêt nh36 et l'expression de la protéine Nh36 et pour valider la suppression de la cassette de résistance DHFR*TYTK SEQ ID NO :134. Validation de la souche Toxo KO - 2G Nh36 IcreI par PCR Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO: 250 (Mix gène d'intérêt) permettent de mettre en évidence une bande à 1188 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Nh36 IcreI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène nh36 dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. (figure 40). Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces MC4 SEQ ID NO :286 et MC1 SEQ ID NO : 254 (Mix IcreI Gène d'intérêt et cicatrice) permettent de mettre en évidence une bande à 1677 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Nh36 IcreI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène nh36 et la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ (figure 41). La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll est validée par PCR. 149 Validation de la souche Toxo tginic1-3 KO - 2G Nh36 IcreI par immunofluorescence Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti V5 aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Toxo tginic1-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée dans les parasites et dans les vacuoles parasitophores de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Nh36 IcreI obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine Nh36 SEQ ID NO :269. (figure 42) La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Nh36 IcreI est validée par immunofluorescence. Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (11.1M) ou de ganciclovir (501.1M). La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - possible qu'en cas d'absence du gène TK). Alors que la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Nh36 est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - grâce à la présence du gène DHFR*) et qu'elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - à cause de la présence du gène TK), la souche Toxo tgmicl3 KO - 2G Nh36 IcreI n'est plus capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - grâce à la perte du gène DHFR*) alors qu'elle est redevenue capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - grâce à la perte du gène TK). Ce profil de résistance (résistance au ganciclovir et sensible à la pyriméthamine) permet de confirmer la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 suite à l'action de la méganucléase I-CreI. L'ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Nh36 IcreI. C. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G Cypl IcreI 1. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G Cypl L'électroporation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G avec le plasmide pUC18 4G2 ICreI - Cypl SEQ ID NO : 276 a été réalisée selon le protocole décrit (point a). Les clones obtenus résistants à la pyriméthamine sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d'intérêt cypl et l'expression de la protéine Cypl SEQ ID NO :279. Validation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Cypl par PCR Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO: 250 (Mix Gène d'intérêt) permettent de mettre en évidence une bande à 762 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Cypl, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène cyp 1 dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. (figure 40) La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Cypl est validée par PCR. Validation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Cypl par immunofluorescence Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti tag HA, aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Toxo tgmic1-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée sur les parasites de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Cypl obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine Cypl SEQ ID NO :279. (figure 42) La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Cypl est validée par immunofluorescence. Validation de la souche ayant intégré le plasmide par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (11.1M) ou de ganciclovir (501.1M). La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - possible qu'en cas d'absence du gène TK). La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Cypl est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - grâce à la présence du gène 151 DHFR*) alors qu'elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance (sensible au ganciclovir et résistance à la pyriméthamine) permet de confirmer l'intégration du plasmide pUC18 4G2 ICreI - Cypl SEQ ID NO : 276 dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Cypl. L'ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Cypl. 2. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G Cypl IcreI L'électroporation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Cypl avec le plasmide pTsaglIcreI a43y circulaire SEQ ID NO : 178 a été réalisée selon le protocole décrit (point e). Les clones obtenus résistants au ganciclovir sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d'intérêt cyp 1 et l'expression de la protéine Cypl et pour valider la suppression de la cassette de résistance DHFR*TYTK. Validation de la souche Toxo tguncl-3 KO - 2G Cypl IcreI par PCR Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO: 250 (Mix gène d'intérêt) permettent de mettre en évidence une bande à 762 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Cypl IcreI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène cyp 1 dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tg-und-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. (figure 40). Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces MC4 SEQ ID NO :286 et MC1 SEQ ID NO : 254 (Mix IcreI Gène d'intérêt et cicatrice) permettent de mettre en évidence une bande à 1677 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Cypl IcreI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène cypl et la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tg-und-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ (figure 41). La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Cypl est validée par PCR. Validation de la souche Toxo tguncl-3 KO - 2G Cyp 1 IcreI par immunofluorescence Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti V5 aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Toxo tg-und-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée dans les parasites et dans les vacuoles parasitophores de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Cypl IcreI obtenue. 152 Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine Cypl SEQ ID NO :279. (figure 42) La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Cypl IcreI est validée par immunofluorescence. Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (111.M) ou de ganciclovir (501.1M). La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - possible qu'en cas d'absence du gène TK). Alors que la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Cypl est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - grâce à la présence du gène DHFR*) et qu'elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - à cause de la présence du gène TK), la souche Toxo tgmicl3 KO - 2G Cypl IcreI n'est plus capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - grâce à la perte du gène DHFR*) alors qu'elle est redevenue capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - grâce à la perte du gène TK). Ce profil de résistance (résistance au ganciclovir et sensible à la pyriméthamine) permet de confirmer la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 suite à l'action de la méganucléase I-CreI. L'ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Cypl IcreI. Résultats - Construction des souches exprimant plusieurs antigènes du parasite Leishmania infantum et comportant ou non un gène de sélection A. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G Kmpl 1 Nh36 IcreI 1. Construction de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Nh36 L'électroporation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll IcreI avec le plasmide pUC18 4G2 ICreI - Nh36 SEQ ID NO: 266 a été réalisée selon le protocole décrit (point a). Les clones obtenus résistants à la pyriméthamine sont sélectionnés et analysés par PCR et 153 Immunofluorescence pour valider la présence des gènes d'intérêt kmpl 1 et nh36 et l'expression des protéines Kmpll SEQ ID NO :259 et Cypl SEQ ID NO :279. Validation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Nh36 par PCR Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO: 250 (Mix Gène d'intérêt) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 510 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour kmpl 1 et une bande à 1188 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour nh36 pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Nh36, confirmant la présence des gènes kmpl 1 et nh36 dans cette souche. Ces bandes ne sont pas détectées dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G confirmant l'absence de ces gènes dans la souche de départ et la souche électroporée Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll IcreI ne présente que la bande à 510 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour kpm11. (figure 40) La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Nh36 est validée par PCR. Validation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Nh36 par immunofluorescence Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti V5 aucune fluorescence n'est détectable pour les parasites Toxo tgmic1-3 KO - 2G et Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll, alors qu'une fluorescence est détectée sur les parasites de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Nh36 obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine Nh36 couplé à l'épitope V5 SEQ ID NO :267. (figure 42) Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti Myc aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Toxo tgmic1-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée pour les parasites Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpl 1 IcreI et la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Nh36 obtenue. (figure 42) Les résultats montrent qu'après un double marquage avec les anticorps anti Myc et anti V5 aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Toxo tgmic1-3 KO - 2G, alors que 2 fluorescences sont détectées pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Nh36 obtenue. (figure 42) La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Nh36 est validée par immunofluorescence. 154 Validation de la souche ayant intégré le plasmide par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (11.1M) ou de ganciclovir (501.1M). La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll IcreI est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - possible qu'en cas d'absence du gène TK). La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Nh36 est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - grâce à la présence du gène DHFR*) alors qu'elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance (sensible au ganciclovir et résistance à la pyriméthamine) permet de confirmer l'intégration du plasmide pUC18 4G2 ICreI - Nh36 SEQ ID NO : 266 dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Nh36. L'ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Nh36. 2. Construction de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Nh36 IcreI L'électroporation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Nh36 avec le plasmide pTsaglIcreI c43y circulaire SEQ ID NO : 178 a été réalisée selon le protocole décrit (point e). Les clones obtenus résistants au ganciclovir sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence des gènes d'intérêt kmpl 1 et nh36 et l'expression des protéines Kmpll SEQ ID NO : 259 et Nh36 SEQ ID NO : 269 et pour valider la suppression de la cassette de résistance DHFR*TYTK SEQ ID NO :134. Validation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Nh36 IcreI par PCR Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO: 250 (Mix Gène d'intérêt) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 510 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour kmpl 1 et une bande à 1188 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour nh36 pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Nh36 IcreI, confirmant la présence des gènes kmpl 1 et nh36 dans cette souche. Ces bandes ne sont pas détectées dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G confirmant l'absence de ces gènes dans la souche de départ et la souche électroporée Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Nh36 présente les deux bandes (à 510 et 1188 paires de bases) conformément à la taille de bande attendue pour kmp I I et nh36. (figure 40) Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces MC4 SEQ ID NO :286 et MC1 SEQ ID NO : 254 (Mix IcreI Gène d'intérêt et cicatrice) permettent de mettre en évidence une bande à 999 paires de bases pour les souches Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpl 1 IcreI, et Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Nh36 IcreI conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène kmpl I et la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO: 134 dans ces souches (figure 41). Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tgmicI-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Cependant la bande attendue à 1677 paires de base confirmant la présence du gène nh36 et la suppression de la cassette DHFR*TYTK n'a pas été observée. La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Nh36 IcreI est partiellement validée par PCR. Validation de la souche Toxo tgmicI-3 KO - 2G Kmpll Nh36 IcreI par immunofluorescence Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti Myc aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Toxo tgmicI-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée sur les parasites de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Nh36 et de la souche obtenue Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Nh36 IcreI. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine Kmpll SEQ ID NO :259. (figure 42) Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti V5 aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Toxo tgmicI-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée pour les parasites Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Nh36 et la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Nh36 IcreI obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine Nh36 SEQ ID NO :269. (figure 42) Les résultats montrent qu'après un double marquage avec les anticorps anti Myc et anti V5 aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Toxo tgmicI-3 KO - 2G, alors que 2 fluorescences sont détectées pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Nh36 IcreI obtenue. (figure 42) La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Nh36 IcreI est validée par immunofluorescence. 156 Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (luM) ou de ganciclovir (50uM). La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (1 - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50uM - possible qu'en cas d'absence du gène TK). Alors que la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Nh36 est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (1 - grâce à la présence du gène DHFR*) et qu'elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50uM - à cause de la présence du gène TK), la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Nh36 IcreI n'est plus capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (1uM - grâce à la perte du gène DHFR*) alors qu'elle est redevenue capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50uM - grâce à la perte du gène TK). Ce profil de résistance (résistance au ganciclovir et sensible à la pyriméthamine) permet de confirmer la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 suite à l'action de la méganucléase I-CreI. L'ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Nh36 IcreI. B. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G Kmpll Cyp 1 IcreI 1. Construction de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cypl L'électroporation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll IcreI avec le plasmide pUC18 4G2 ICreI - Cypl SEQ ID NO : 276 a été réalisée selon le protocole décrit (point a). Les clones obtenus résistants à la pyriméthamine sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence des gènes d'intérêt kmpl 1 et cypl et l'expression des protéines Kmpll SEQ ID NO : 259 et Cypl SEQ ID NO :279. Validation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cypl par PCR Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO: 250 (Mix Gène d'intérêt) permettent de mettre en 157 évidence respectivement une bande à 510 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour kmpl 1 et une bande à 762 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour cyp 1 pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cypl, confirmant la présence des gènes Kmpll et Cypl dans cette souche. Ces bandes ne sont pas détectées dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G confirmant l'absence de ces gènes dans la souche de départ et la souche électroporée Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll IcreI ne présente que la bande à 510 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour kpm11. (figure 40) La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cypl est validée par PCR. Validation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cypl par immunofluorescence Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti tag HA aucune fluorescence n'est détectable pour les parasites Toxo tgmic1-3 KO - 2G et Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll, alors qu'une fluorescence est détectée sur les parasites de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cypl obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine Cypl couplé à l'épitope HA SEQ ID NO :277. (figure 42) Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti Myc aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Toxo tgmic1-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée pour les parasites Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpl 1 IcreI et la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cyp 1 obtenue. (figure 42) Les résultats montrent qu'après un double marquage avec les anticorps anti Myc et anti Tag HA aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Toxo tgmic1-3 KO - 2G, alors que 2 fluorescences sont détectées pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cypl obtenue. (figure 42) La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cypl est validée par immunofluorescence. Validation de la souche ayant intégré le plasmide par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (11.1M) ou de ganciclovir (501.1M). La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll IcreI est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - possible qu'en cas d'absence du gène TK). 158 La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cypl est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - grâce à la présence du gène DHFR*) alors qu'elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance (sensible au ganciclovir et résistance à la pyriméthamine) permet de confirmer l'intégration du plasmide pUC18 4G2 ICreI - Cypl SEQ ID NO : 276 dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cypl. L'ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cypl. 2. Construction de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cypl IcreI L'électroporation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cypl avec le plasmide pTsaglIcreI c43y circulaire SEQ ID NO : 178 a été réalisée selon le protocole décrit (point e). Les clones obtenus résistants au ganciclovir sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence des gènes d'intérêt kmp 1 1 et cypl et l'expression des protéines Kmpl 1 SEQ ID NO: 259 et Cypl SEQ ID NO: 279 et pour valider la suppression de la cassette de résistance DHFR*TYTK SEQ ID NO :134. Validation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cyp 1 IcreI par PCR Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO: 250 (Mix Gène d'intérêt) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 510 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour kmpl 1 et une bande à 762 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour cypl pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cypl IcreI, confirmant la présence des gènes kmpl 1 et cypl dans cette souche. Ces bandes ne sont pas détectées dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G confirmant l'absence de ces gènes dans la souche de départ et la souche électroporée Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cypl présente les deux bandes (à 510 et 762 paires de bases) conformément à la taille de bande attendue pour kmpl 1 et cyp 1. (figure 40) Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces MC4 SEQ ID NO :286 et MC1 SEQ ID NO : 254 (Mix IcreI Gène d'intérêt et cicatrice) permettent de mettre en évidence une bande à 999 paires de bases pour les souches Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll IcreI, et Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpl 1 Cypl IcreI conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène kmpl 1 et la suppression de la cassette 159 DHFR*TYTK SEQ ID NO: 134 dans ces souches (figure 41). Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tgmicI-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Cependant la bande attendue à 1251 paires de base confirmant la présence du gène cypl et la suppression de la cassette DHFR*TYTK n'a pas été observée. La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cypl IcreI est partiellement validée par PCR. Validation de la souche Toxo tgmicI-3 KO - 2G Kmpll Cypl IcreI par immunofluorescence Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti Myc aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Toxo tgmicI-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée sur les parasites de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cypl et de la souche obtenue Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cypl IcreI. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine Kmpll SEQ ID NO :259. (figure 42) Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti tag HA aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Toxo tgmicI-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée pour les parasites Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cypl et la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cypl IcreI obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine Cypl SEQ ID NO :279. (figure 42) Les résultats montrent qu'après un double marquage avec les anticorps anti Myc et anti tag HA aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Toxo tgmicI-3 KO - 2G, alors que 2 fluorescences sont détectées pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cypl IcreI obtenue. (figure 42) La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cypl IcreI est validée par immunofluorescence. Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*TYTK par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (11.1M) ou de ganciclovir (501.1M). La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - possible qu'en cas d'absence du gène TK). Alors que la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cypl est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - grâce à la présence du gène DHFR*) et qu'elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - à cause de la présence du gène TK), la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cypl IcreI n'est plus capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - grâce à la perte du gène DHFR*) alors qu'elle est redevenue capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - grâce à la perte du gène TK). Ce profil de résistance (résistance au ganciclovir et sensible à la pyriméthamine) permet de confirmer la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO : 134 suite à l'action de la méganucléase I-CreI. L'ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cypl IcreI. C. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G Kmpll Cyp 1 Nh36 L'électroporation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cypl IcreI avec le plasmide pUC18 4G2 ICreI - Nh36 SEQ ID NO: 266a été réalisée selon le protocole décrit (point a). Les clones obtenus résistants à la pyriméthamine sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence des gènes d'intérêt kmpl 1, cypl et nh36 et l'expression des protéines Kmpll SEQ ID NO :259, Cypl SEQ ID NO : 279 et Nh36 SEQ ID NO : 269. Validation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cypl Nh36 par PCR Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO: 250 (Mix Gène d'intérêt) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 510 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour kmpl 1, une bande à 762 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour cypl et une bande à 1188 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour nh36 pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cypl Nh36, confirmant la présence des gènes kmpl 1, cypl et nh36 dans cette souche. Ces bandes ne sont pas détectées dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G confirmant l'absence de ces gènes dans la souche de départ et la souche électroporée Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cypl IcreI ne présente que 161 les bandes à 510 et 762 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour kpml 1 et cypl . (figure 40) La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cypl Nh36 est validée par PCR. Validation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cyp 1 Nh36 par immunofluorescence Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti tag HA aucune fluorescence n'est détectable pour les parasites Toxo tgmic1-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée sur les parasites de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cypl obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine Cypl couplé à l'épitope HA SEQ ID NO :277. Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti V5 aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Toxo tgmic1-3 KO - 2G et Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cypl IcreI, alors qu'une fluorescence est détectée pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cypl Nh36 obtenue. Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti Myc aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Toxo tgmic1-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée pour les parasites Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cypl IcreI et la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cypl Nh36 obtenue. Dans un même temps, chaque antigène (Kmpl 1, Cypl et Nh36) a été marqué avec leur anticorps spécifique (respectivement anti Myc, anti tag HA et anti V5) couplé à des fluorochromes différents. Les fluorescences ont été analysées en FACS. Les résultats montrent qu'aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Toxo tgmic1-3 KO - 2G, alors que 3 fluorescences sont détectées pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cypl Nh36 obtenue. (figure 43) La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cypl Nh36 est validée par immunofluorescence. Validation de la souche ayant intégré le plasmide par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (11.1M) ou de ganciclovir (501.1M). 162 La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cypl IcreI est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - possible qu'en cas d'absence du gène TK). La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cypl Nh36 est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - grâce à la présence du gène DHFR*) alors qu'elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance (sensible au ganciclovir et résistance à la pyriméthamine) permet de confirmer l'intégration du plasmide pUC18 4G2 ICreI - Nh36 SEQ ID NO : 266 dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cypl Nh36. L'ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Kmpll Cypl Nh36. Exemple 11 : Construction d'une souche Neo ncmic1-3 KO - 2G exprimant un ou plusieurs antigènes du parasite Leishmania infantum et ne comportant pas de gène de sélection Souches de Neospora caninum La souche utilisée dans le présent exemple est une souche atténuée de Neospora caninum NC1 dénommée Neo ncmic/-3 KO 2G. Elle a été obtenue par la délétion par recombinaison homologue de deux gènes de virulence : les gènes mic/ et mic3. Les tachyzoïtes de la souche Neo ncmic/-3 KO 2G sont produits sur fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634)) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (SVF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine. Ils ont été récoltés après lyse mécanique des cellules hôtes par 3 passages en seringue 25G. Construction des souches - protocole La construction de chaque souche vaccinale contenant un ou plusieurs antigènes se fait à chaque étape avec un protocole identique. Le protocole expérimental est dans un premier 163 temps détaillé ici puis appliqué pour chaque construction de souche vaccinale, celui-ci comporte plusieurs étapes : a- Electroporation et sélection de la souche d'intérêt avec le plasmide exprimant un antigène du parasite Leishmania infantum : souches Neo ncmic1-3 KO - 2G Leishmania Les parasites Neo ncmic1-3 KO - 2G sont électroporés avec 201.1g de plasmide pUC18 4G2 ICreI - Leishmania linéarisé. Par « plasmide pUC18 4G2 ICreI - Leishmania », on entend le plasmide pUC18 4G2 ICreI - Kmpll SEQ ID NO :256, le plasmide pUC18 4G2 ICreI - Nh36 SEQ ID NO :266, ou le plasmide pUC18 4G2 ICreI - Cypl. Après électroporation, les tachyzoïtes sont soumis à une pression de sélection par l'agent de sélection (Pyriméthamine 41.1M). 10 à 15 jours après sélection et passages successifs sur cellules HFF, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF puis amplifiés en plaques 24 puits sur une monocouche de cellules HFF. b- Validation de la souche ayant intégré le plasmide par PCR Pour valider une souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Leishmania, des analyses PCR sont effectuées selon le même protocole que celui utilisé dans l'exemple 10 - point b. Les tailles attendues sont également décrites dans le Tableau 31 ci-dessous. Tableau 31 : Taille attendue des amplicons (en paires de base) des différentes PCR de validation de la construction des souches Neo ncmic1-3 KO - 2G Leishmania Gène d'intérêt Leishmania Neo ncmic1-3 KO - 2G Nh36 1188 Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl 762 Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl Nh36 1188/762 c- Validation de la souche ayant intégré le plasmide par immunofluorescence La validation des souches par immunofluorescence se fait suivant le protocole précédemment décrit (point c- exemple 10). d- Validation de la souche a ant inté ré le lasmide sar anal se du ro 1 de résistance Le profil d'antibiorésistance est analysé pour les clones validés en PCR et immunofluorescence. Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF. Les parasites Neo ncmic1-3 KO - 2G Leishmania ayant intégré 164 un plasmide pUC18 4G2 ICreI - Leishmania linéarisé doivent être résistants à la pyriméthamine (41.1M - grâce à la présence du gène DHFR*) et sensible au ganciclovir (501.1M - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance est validé en cultivant les parasites sur fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634)) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (SVF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine, supplémenté ou non de la pyriméthamine ou du ganciclovir. Les souches validées par PCR, immunofluorescence et ayant le bon profil d'antibiorésistance sont nommées Neo ncmic1-3 KO - 2G Leishmania (Neo ncmic1-3 KO - 2G Nh36, Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl ou Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl Nh36). e- Electroporation de la Neo ncmic1-3 KO - 2G Leishmania avec un plasmide pTsaglIcreIce et contre sélection de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK : souches Neo ncmic1-3 KO - 2G Leishmania IcreI Le protocole est identique à celui décrit dans le point protocole - e de l'exemple 6. f- Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK par PCR Pour valider une souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Leishmania IcreI, des analyses PCR sont effectuées selon le même protocole que celui utilisé dans l'exemple 10 - point b et f Les tailles attendues sont également décrites dans le Tableau 32 ci-dessous. Plusieurs mix sont possibles et les PCR sont réalisées en fonction des souches testées. Tableau 32 : Taille attendue des amplicons (en paires de base) des différentes PCR de validation de la construction des souches Neo ncmic1-3 KO - 2G Leishmania. Gène d'intérêt Leishmania Mix IcreI Gène d'intérêt et cicatrice Neo ncmic1-3 KO - 2G Nh36 1188 6521 Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl 762 6095 Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl IcreI 762 1251 Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl Nh36 762/1188 1677 Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl Nh36 IcreI 762/1188 1251/1677 g- Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK par immunofluorescence La validation des souches par immunofluorescence se fait suivant le protocole précédemment décrit (point c- exemple 10). h- Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK par analyse du profil de résistance Les parasites Neo ncmic1-3 KO - 2G Leishmania ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK doivent être sensibles à la pyriméthamine (41.1M - grâce à la suppression du gène DHFR*) et résistants au ganciclovir (501.1M - grâce à la suppression du gène TK). Ce profil de résistance est validé en cultivant les parasites sur fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (SVF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine, supplémenté ou non de la pyriméthamine ou du ganciclovir. Les souches validées par PCR, immunofluorescence et ayant le bon profil d'antibiorésistance sont nommées Neo ncmic1-3 KO - 2G Leishmania IcreI ( Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl IcreI ou Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl Nh36 ICreI). Résultats - Construction des souches exprimant un antigène du parasite Leishmania infantum et ne comportant pas de gène de sélection A. Construction de la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G Nh36 IcreI 1. Construction de la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G Nh36 L'électroporation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G avec le plasmide pUC18 4G2 ICreI - Nh36 SEQ ID NO :266 a été réalisée selon le protocole décrit (point a). Les clones obtenus résistants à la pyriméthamine sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d'intérêt nh36 et l'expression de la protéine. Validation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Nh36 par PCR Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO: 250 (Mix Gène d'intérêt Leishmania) permettent de mettre en évidence une bande à 1188 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G 166 Nh36, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène nh36 dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. (figure 44) La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Nh36 est validée par PCR. Validation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Nh36 par immunofluorescence Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti V5 aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Neo ncmic/-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée dans les parasites et dans les vacuoles parasitophores de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Nh36 obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine Nh36 SEQ ID NO :269. (figure 45) La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Nh36 est validée par immunofluorescence. Validation de la souche ayant intégré le plasmide par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (41.1M) ou de ganciclovir (501.1M). La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (41.1M - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - possible qu'en cas d'absence du gène TK). La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Nh36 est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (41.1M - grâce à la présence du gène DHFR*) alors qu'elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance (sensible au ganciclovir et résistance à la pyriméthamine) permet de confirmer l'intégration du plasmide pUC18 4G2 ICreI - Nh36 SEQ ID NO : 266 dans la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Nh36. L'ensemble des résultats permet de valider la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Nh36. 2. Construction de la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G Nh36 IcreI L'électroporation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Nh36 avec le plasmide pTsaglIcreI c43y circulaire SEQ ID NO : 178 a été réalisée selon le protocole décrit (point e). Les clones obtenus résistants au ganciclovir sont sélectionnés et analysés par PCR et 167 Immunofluorescence pour valider la présence du gène d'intérêt nh36 et l'expression de la protéine Nh36 SEQ ID NO :269 et pour valider la suppression de la cassette de résistance DHFR*TYTK SEQ ID NO :134. Validation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Nh36 IcreI par PCR Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO: 250 (Mix Gène d'intérêt Leishmania) permettent de mettre en évidence une bande à 1188 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Nh36 IcreI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène nh36 dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces MC4 SEQ ID NO :286 et MC1 SEQ ID NO : 254 (Mix IcreI Gène d'intérêt et cicatrice) permettent de mettre en évidence une bande à 1677 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Nh36 IcreI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène nh36 et la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO :134 dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Nh36 IcreI est validée par PCR. Validation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Nh36 IcreI par immunofluorescence Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti V5 aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Neo ncmic/-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée dans les parasites et dans les vacuoles parasitophores de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Nh36 IcreI obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine Nh36 SEQ ID NO :269 La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Nh36 IcreI est validée par immunofluorescence. Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*TYTK par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (41.1M) ou de ganciclovir (50uM). La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (41.1M - pas de gène DHFR*) mais elle se 168 multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - possible qu'en cas d'absence du gène TK). Alors que la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Nh36 est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (41.1M - grâce à la présence du gène DHFR*) et qu'elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - à cause de la présence du gène TK), la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Nh36 IcreI n'est plus capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (41.1M - grâce à la perte du gène DHFR*) alors qu'elle est redevenue capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - grâce à la perte du gène TK). Ce profil de résistance (résistance au ganciclovir et sensible à la pyriméthamine) permet de confirmer la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO :134 suite à l'action de la méganucléase I-CreI. L'ensemble des résultats permet de valider la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Nh36 IcreI. B. Construction de la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G Cypl IcreI 1. Construction de la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G Cypl L'électroporation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G avec le plasmide pUC18 4G2 ICreI - Cypl SEQ ID NO :276 a été réalisée selon le protocole décrit (point a). Les clones obtenus résistants à la pyriméthamine sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d'intérêt cypl et l'expression de la protéine Cypl SEQ ID NO :279. Validation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl par PCR Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO: 250 (Mix Gène d'intérêt Leishmania) permettent de mettre en évidence une bande à 762 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène cypl dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. (figure 44) La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl est validée par PCR. 169 Validation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Cyp 1 par immunofluorescence Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti tag HA aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Neo ncmic/-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée dans les parasites et dans les vacuoles parasitophores de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Cyp 1 obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine Cypl SEQ ID NO :279. (figure 45) La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl est validée par immunofluorescence. Validation de la souche ayant intégré le plasmide par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (41.1M) ou de ganciclovir (501.1M). La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (41.1M - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - possible qu'en cas d'absence du gène TK). La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (41.1M - grâce à la présence du gène DHFR*) alors qu'elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance (sensible au ganciclovir et résistance à la pyriméthamine) permet de confirmer l'intégration du plasmide pUC18 4G2 ICreI - Cypl SEQ ID NO : 276 dans la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl. L'ensemble des résultats permet de valider la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl. 2. Construction de la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G Cyp 1 IcreI L'électroporation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl avec le plasmide pTsaglIcreI c43y circulaire SEQ ID NO : 178 a été réalisée selon le protocole décrit (point e). Les clones obtenus résistants au ganciclovir sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d'intérêt cyp 1 et l'expression de la protéine Cypl SEQ ID NO :279 et pour valider la suppression de la cassette de résistance DHFR*TYTK SEQ ID NO :134. Validation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl IcreI par PCR Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO: 250 (Mix Gène d'intérêt Leishmania) permettent de mettre en évidence une bande à 762 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl IcreI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène cypl dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces MC4 SEQ ID NO :286 et MC1 SEQ ID NO : 254 (Mix IcreI Gène d'intérêt et cicatrice) permettent de mettre en évidence une bande à 1251 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl IcreI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène cypl et la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO :134 dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl IcreI est validée par PCR. Validation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl IcreI par immunofluorescence Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti tag HA aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Neo ncmic/-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée dans les parasites et dans les vacuoles parasitophores de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl IcreI obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine Cypl SEQ ID NO :279. La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl IcreI est validée par immunofluorescence. Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (41.1M) ou de ganciclovir (50uM). La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (41.1M - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50uM - possible qu'en cas d'absence du gène TK). 171 Alors que la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Cyp 1 est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (41.1M - grâce à la présence du gène DHFR*) et qu'elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - à cause de la présence du gène TK), la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl IcreI n'est plus capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (41.1M - grâce à la perte du gène DHFR*) alors qu'elle est redevenue capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - grâce à la perte du gène TK). Ce profil de résistance (résistance au ganciclovir et sensible à la pyriméthamine) permet de confirmer la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO :134 suite à l'action de la méganucléase I-CreI. L'ensemble des résultats permet de valider la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl IcreI. Résultats - Construction des souches exprimant plusieurs antigènes du parasite Leishmania infantum et comportant ou non un de gène de sélection A. Construction de la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G Cypl Nh36 IcreI 1. Construction de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl Nh36 L'électroporation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl IcreI avec le plasmide pUC18 4G2 ICreI - Nh36 SEQ ID NO: 266 a été réalisée selon le protocole décrit (point a). Les clones obtenus résistants à la pyriméthamine sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence des gènes d'intérêt cypl et nh36 et l'expression des protéines Cypl SEQ ID NO :279 et Nh36 SEQ ID NO :269. Validation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl Nh36 par PCR Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO: 250 (Mix Gène d'intérêt Leishmania) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 762 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour cypl et une bande à 1188 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour nh36 pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl Nh36, confirmant la présence des gènes cypl et nh36 dans cette souche. Ces bandes ne sont pas détectées dans la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ et la 172 souche électroporée Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl IcreI ne présente que la bande à 762 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour cypl. (figure 44) La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl Nh36 est validée par PCR. Validation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Cyp 1 Nh36 par immunofluorescence Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti tag HA aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Neo ncmic/-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée sur les parasites de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl Nh36 obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine Cypl SEQ ID NO :279. (figure 45) Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti V5 aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Neo ncmic/-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée pour les parasites Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl IcreI et la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl Nh36 obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine Nh36 SEQ ID NO :269. (figure 45) Les résultats montrent qu'après un double marquage avec les anticorps anti tag HA et anti V5 aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Neo ncmic1-3 KO - 2G, alors que 2 fluorescences sont détectées pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Cypl Nh36 obtenue. (figure 45) La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl Nh36 est validée par immunofluorescence. Validation de la souche ayant intégré le plasmide par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (41.1M) ou de ganciclovir (501.1M). La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl IcreI est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (41.1M - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - possible qu'en cas d'absence du gène TK). La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl Nh36 est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (41.1M - grâce à la présence du gène DHFR*) alors qu'elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance (sensible au ganciclovir et résistance à la pyriméthamine) permet de confirmer l'intégration du 173 plasmide pUC18 4G2 ICreI -Nh36 SEQ ID NO: 266 dans la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl Nh36. L'ensemble des résultats permet de valider la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl Nh36. 2. Construction de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl Nh36 IcreI L'électroporation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl Nh36 avec le plasmide pTsaglIcreI a43y circulaire SEQ ID NO : 178 a été réalisée selon le protocole décrit (point e). Les clones obtenus résistants au ganciclovir sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence des gènes d'intérêt cypl et nh36 et l'expression des protéines Cypl SEQ ID NO :279 et Nh36 SEQ ID NO :269 et pour valider la suppression de la cassette de résistance DHFR*TYTK SEQ ID NO :134. Validation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl Nh36 IcreI par PCR Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO: 250 (Mix Gène d'intérêt Leishmania) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 762 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour cypl et une bande à 1188 paires de bases conformément à la taille de bande attendue pour nh36 pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl Nh36 IcreI, confirmant la présence des gènes cyp 1 et nh36 dans cette souche. Ces bandes ne sont pas détectées dans la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ et la souche électroporée Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl Nh36 présente les deux bandes (à 762 et 1188 paires de bases) conformément à la taille de bande attendue pour cypl et nh36. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces MC4 SEQ ID NO :xx et MC1 SEQ ID NO : xx (Mix IcreI Gène d'intérêt et cicatrice) permettent de mettre en évidence deux bande à 1251 et 1677 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl Nh36 IcreI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence des gènes cypl et nh36 et la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO :134 dans cette souche. La bande à 1677 n'est pas détectée dans la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl Nh36 confirmant l'absence de la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO :134 dans cette souche. La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl Nh36 IcreI est validée par PCR. 174 Validation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Nh36 Cypl IcreI par immunofluorescence Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti tag HA aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Neo ncmic/-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée sur les parasites de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl Nh36 IcreI obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine Cypl SEQ ID NO :279. Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti V5 aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Neo ncmic/-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée pour les parasites Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl IcreI et la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl Nh36 IcreI obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine Nh36 SEQ ID NO :269. Les résultats montrent qu'après un double marquage avec les anticorps anti tag HA et anti V5 aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Neo ncmic1-3 KO - 2G, alors que 2 fluorescences sont détectées pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Cypl Nh36 IcreI obtenue. La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl Nh36 IcreI est validée par immunofluorescence. Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (41.1M) ou de ganciclovir (50uM). La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (41.1M - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50uM - possible qu'en cas d'absence du gène TK). Alors que la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl Nh36 est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (41.1M - grâce à la présence du gène DHFR*) et qu'elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50uM - à cause de la présence du gène TK), la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl Nh36 IcreI n'est plus capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (41.1M - grâce à la perte du gène DHFR*) alors qu'elle est redevenue capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50uM - grâce à la perte du gène TK). Ce profil de résistance (résistance au ganciclovir et sensible à la pyriméthamine) permet de confirmer la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO :134 suite à l'action de la méganucléase I-CreI. L'ensemble des résultats permet de valider la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Cypl Nh36 IcreI. Exemple 12 : Construction de plasmides permettant l'intégration et l'expression de transgènes de la bactérie Chlamydia abortus dans des souches de Toxoplasma gondii et Neospora caninum sans persistance d'une cassette de sélection. L'objectif de cette expérience est de construire des plasmides qui permettent l'intégration dans le génome de Toxoplasma gondii ou dans celui de Neospora caninum d'un transgène hétérologue du virus Chlamydia abortus, son expression et sans persistance d'une cassette de sélection. - Plasmide pUC18 4G2 CPAF Le plasmide pUC18 4G2 ICreI - CPAF SEQ ID NO : 287 (figure 46) permet la production d'une protéine de fusion CPAF tag V5 SEQ ID NO : 288, comprenant : une partie de la protéine CPAF SEQ ID NO: 289 de Chlamydia abortus codée par la séquence SEQ ID NO : 290, un tag V5 SEQ ID NO : 270 codée par la séquence SEQ ID NO : 271 Le fragment cpaf-V5 a été obtenu à partir d'une digestion par les enzymes PmeI et NotI sur un gène synthétique optimisé pour son expression chez Toxoplasma gondii (SEQ ID NO : 293) Cette séquence digérée a une de taille de 1870 pb SEQ ID NO : 294. Le fragment cpaf-V5 digéré (SEQ ID NO : 294) a été directement cloné dans le plasmide pUC18 4G2 ICreI SEQ ID NO: 128 digéré par les enzymes PmeI et NotI (8344pb). 176 - Plasmide pUC18 4G2 MOMP Le plasmide pUC18 4G2 ICreI - MOMP SEQ ID NO : 295 (figure 47) permet la production d'une protéine de fusion MOMP tag myc SEQ ID NO : 296, comprenant : - la protéine MOMP SEQ ID NO: 297 de Chlamydia abortus codée par la séquence SEQ ID NO :298, - un tag myc SEQ ID NO : 260 codée par la séquence SEQ ID NO : 261 Le fragment momp-myc a été obtenu à partir d'une digestion par les enzymes PmeI et NotI sur un gène synthétique optimisé pour son expression chez Toxoplasma gondii (SEQ ID NO: 301) Cette séquence digérée a une de taille de 1216 pb SEQ ID NO : 302. Le fragment momp-myc digéré (SEQ ID NO : 302) a été directement clonés dans le plasmide pUC18 4G2 ICreI SEQ ID NO: 128 digéré par les enzymes PmeI et NotI (8344pb). - Plasmide pUC18 4G2 PmpG Le plasmide pUC18 4G2 ICreI - PmpG SEQ ID NO : 303 (figure 48) permet la production d'une protéine de fusion PmpG tag VSV SEQ ID NO : 304, comprenant : - Une partie protéine PmpG SEQ ID NO: 305 de Chlamydia abortus codée par la séquence SEQ ID NO : 306, - un tag VSV SEQ ID NO : 299 codée par la séquence SEQ ID NO : 300 Le fragment pmpG-VSV a été obtenu à partir d'une digestion par les enzymes PmeI et NotI sur un gène synthétique optimisé pour son expression chez Toxoplasma gondii (SEQ ID NO: 291) Cette séquence digérée a une de taille de 1420 pb SEQ ID NO : 292. Le fragmentpmpG-VSV digéré (SEQ ID NO : 292) a été directement cloné dans le plasmide pUC18 4G2 ICreI SEQ ID NO: 128 digéré par les enzymes PmeI et NotI (8344pb). 177 Exemple 13 : Construction d'une souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G exprimant un ou plusieurs antigènes de la bactérie Chlamydia abortus et ne comportant pas de gène de sélection Souches de Toxoplastna gondii La souche utilisée dans le présent exemple est une souche atténuée de Toxoplasma gondii, dénommée Toxo tgmic/-3 KO 2G. Elle a été obtenue par la délétion par recombinaison homologue de deux gènes de virulence : les gènes mic/ et mic3. Les tachyzoïtes de la souche Toxo tgmic/-3 KO 2G sont produits sur fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634)) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (SVF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine. Ils ont été récoltés après lyse mécanique des cellules hôtes par 3 passages en seringue 25G. Construction des souches - protocole La construction de chaque souche vaccinale contenant un ou plusieurs antigènes se fait à chaque étape avec un protocole identique. Le protocole expérimental est dans un premier temps détaillé ici puis appliqué pour chaque construction de souche vaccinale, celui-ci comporte plusieurs étapes : a- Electroporation et sélection de la souche d'intérêt avec le plasmide exprimant un antigène de la bactérie Chlamydia abortus : souches Toxo tgmic1-3 KO - 2G Chlamydia Les parasites Toxo tgmic1-3 KO - 2G sont électroporés avec 201.1g de plasmide pUC18 4G2 ICreI - Chlamydia linéarisé. Par « de plasmide pUC18 4G2 ICreI - Chlamydia », on entend le plasmide pUC18 4G2 ICreI - CPAF, le plasmide pUC18 4G2 ICreI - MOMP ou le plasmide pUC18 4G2 ICreI - PmpG. Après électroporation, les tachyzoïtes sont soumis à une pression de sélection par l'agent de sélection (Pyriméthamine 11.1M). 10 à 15 jours après sélection et passages successifs sur cellules HFF, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF puis amplifiés en plaques 24 puits sur une monocouche de cellules HFF. 178 b- Validation de la souche ayant intégré le plasmide par PCR Pour valider une souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Chlamydia, des analyses PCR sont effectuées selon le même protocole que celui utilisé dans l'exemple 10 - point b. Les tailles attendues sont également décrites dans le Tableau 33 ci-dessous. Tableau 33 : Taille attendue des amplicons (en paires de base) des différentes PCR de validation de la construction des souches Toxo tgmic1-3 KO - 2G Chlamydia Gène d'intérêt Chlamydia Toxo tgmic1-3 KO - 2G CPAF 2055 Toxo tgmic1-3 KO - 2G MOMP 1401 Toxo tgmic1-3 KO - 2G PmpG 1605 c- Validation de la souche ayant intégré le plasmide par immunofluorescence La validation des souches par immunofluorescence se fait suivant le protocole précédemment décrit (point c- exemple 10). d- Validation de la souche ayant intégré le plasmide par Western Blot Le western blot a été réalisé soit sur des extraits protéiques de parasites (40 1.1g équivalents à 2.107 parasites), soit à partir de protéines purifiées en système procaryote (1 1.1g). Pour l'obtention d'extraits protéiques de parasite, un culot a été repris dans 19 pl de tampon DNase 1X en tampon PBS (phosphate buffered saline, Sigma), et 1 pl de DNase, avant une incubation à 37 °C durant 20 min. A l'issu de cette incubation, le tampon Laemmli 4X (BioRad) a été ajouté, avant une nouvelle incubation de 5 min à 100 °C. Après 5 min dans la glace, les échantillons ont été déposés sur gel SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) contenant 12 ou 14% d'acrylamide pré-coulés (Miniproteane TGXTM BioRad), et un marqueur de taille a également été déposé (Page ruler prestained protein ladder, Thermo Scientific) pour suivre la migration. Après migration des échantillons pendant environ 35 min à 200 volts (générateur PowerPacTM) en tampon TGS (Tris glycine SDS Buffer, BioRad), le gel a été déposé sur une membrane de nitrocellulose (TransBlote TurboTM Blotting System Transfer Pack, BioRad) pour un transfert actif grâce au TransBlote TurboTM (BioRad). Après transfert, la membrane a été colorée au rouge Ponceau pour vérifier le transfert des protéines. La membrane a ensuite été rincée à l'eau milliQ avant d'être saturée avec du TBS (tris-buffered saline) 1X/Tween 0,05% - BSA 3% pendant 1 h sous agitation à température ambiante. L'anticorps primaire (Rabbit anti Tag 179 VSV-V référence V4888 - Sigma) a ensuite été ajouté, après dilution en TBS 1X/Tween 0,05% - BSA 3%, et la membrane a été incubée pendant 1 h sous agitation à température ambiante. Après lavages avec du TBS 1X/Tween 0,05%, la membrane a été incubée avec l'anticorps secondaire couplé à la phosphatase alcaline (Goat anti Rabbit référence A3687 - Sigma)), dilué en TBS 1X/Tween 0,05% - BSA 3%, pendant 1 h sous agitation à température ambiante. La révélation a été réalisée avec le NBT/BCIP (Promega) selon les recommandations du fournisseur. La réaction a été stoppée par ajout d'eau milliQ, et la membrane a été séchée sur papier Whatman. e- Validation de la souche a ant inté ré le -lasmide sar anal se du iro 1 de résistance Le profil d'antibiorésistance est analysé pour les clones validés en PCR et immunofluorescence. Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF. Les parasites Toxo tgmic1-3 KO - 2G Chlamydia ayant intégré un plasmide pUC18 4G2 ICreI - Chlamydia linéarisé doivent être résistants à la pyriméthamine (11.1M - grâce à la présence du gène DHFR*) et sensible au ganciclovir (501.1M - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance est validé en cultivant les parasites sur fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634)) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (SVF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine, supplémenté ou non de la pyriméthamine ou du ganciclovir. Les souches validées par PCR, immunofluorescence et ayant le bon profil d'antibiorésistance sont nommées Toxo tgmic1-3 KO - 2G Chlamydia (Toxo tgmic1-3 KO - 2G CPAF, Toxo tgmic1-3 KO - 2G MOMP ou Toxo tgmic1-3 KO - 2G PmpG). f- Electroporation de la Toxo tgmic1-3 KO - 2G Chlamydia avec un plasmide pTsaglIcreIctfly et contre sélection de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK : souches Toxo tgmic1-3 KO - 2G Chlamydia IcreI Le protocole est identique à celui décrit dans le point protocole - e de l'exemple 6. g- Validation des souches Toxo tgmic1-3 KO - 2G Chlamydia IcreI ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK par PCR Pour valider une souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G Chlamydia IcreI, des analyses PCR sont effectuées selon le même protocole que celui utilisé dans l'exemple 10 - point b et f Les tailles attendues sont également décrites dans le Tableau 34 ci-dessous. Plusieurs mix sont possibles et les PCR sont réalisées en fonction des souches testées. Tableau 34 : Taille attendue des amplicons (en paires de base) des différentes PCR de validation de la construction des souches Toxo tgmic1-3 KO - 2G Chlamydia et Toxo tgmic1-3 KO - 2G Chlamydia IcreI. Gène d'intérêt Chlamydia Mix IcreI Gène d'intérêt Chlamydia et cicatrice Toxo tgmic1-3 KO - 2G CPAF 2055 7388 Toxo tgmic1-3 KO - 2G MOMP 1401 6734 Toxo tgmic1-3 KO - 2G PmpG 1605 6938 Toxo tgmic1-3 KO - 2G CPAF IcreI 2055 2544 Toxo tgmic1-3 KO - 2G MOMP IcreI 1401 1890 Toxo tgmic1-3 KO - 2G PmpG ICreI 1605 2094 h- Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK par immunofluorescence La validation des souches par immunofluorescence se fait suivant le protocole précédemment décrit (point c- exemple 10). i- Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK par analyse du profil de résistance Les parasites Toxo tgmic1-3 KO - 2G Chlamydia IcreI ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK SEQ ID NO :134 doivent être sensibles à la pyriméthamine (11.1M - grâce à la suppression du gène DHFR*) et résistants au ganciclovir (501.1M - grâce à la suppression du gène TK). Ce profil de résistance est validé en cultivant les parasites sur fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (SVF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine, supplémenté ou non de la pyriméthamine ou du ganciclovir. 181 Les souches validées par PCR, immunofluorescence et ayant le bon profil d'antibiorésistance sont nommées Toxo tgmic1-3 KO - 2G Chlamydia IcreI ( Toxo tgmic1-3 KO - 2G CPAF IcreI, Toxo tgmic1-3 KO - 2G MOMP IcreI ou Toxo tgmic1-3 KO - 2G PmpG ICreI). Résultats - Construction des souches exprimant un antigène de la bactérie Chamydia abortus et ne comportant pas de gène de sélection A. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G CPAF Icrel 1. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G CPAF L'électroporation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G avec le plasmide pUC18 4G2 ICreI - CPAF SEQ ID NO :287 a été réalisée selon le protocole décrit (point a). Les clones obtenus résistants à la pyriméthamine sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d'intérêt cpaf et l'expression de la protéine CPAF SEQ ID NO : 290. Validation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G CPAF par PCR Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO: 250 (Mix Gène d'intérêt Chlamydia) permettent de mettre en évidence une bande à 2055 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G CPAF, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène cpaf dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. (figure 49) La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G CPAF est validée par PCR. Validation de la souche Toxo t mic1-3 KO - 2G CPAF iar immuno uorescence Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti V5 aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Toxo tgmic/-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée dans les parasites et dans les vacuoles parasitophores de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G CPAF obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine CPAF SEQ ID NO :289. (figure 50) La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G CPAF est validée par immunofluorescence. 182 Validation de la souche ayant intégré le plasmide par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (11.1M) ou de ganciclovir (501.1M). La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - possible qu'en cas d'absence du gène TK). La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G CPAF est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - grâce à la présence du gène DHFR*) alors qu'elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance (sensible au ganciclovir et résistance à la pyriméthamine) permet de confirmer l'intégration du plasmide pUC18 4G2 ICreI - CPAF SEQ ID NO: 287 dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G CPAF. L'ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G CPAF. 2. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G CPAF IcreI L'électroporation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G CPAF avec le plasmide pTsaglIcreI c43y circulaire SEQ ID NO : 178 a été réalisée selon le protocole décrit (point e). Les clones obtenus résistants au ganciclovir sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d'intérêt cpaf et l'expression de la protéine CPAF SEQ ID NO :289 et pour valider la suppression de la cassette de résistance DHFR*TYTK SEQ ID NO :134. Validation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G CPAF IcreI par PCR Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO: 250 (Mix Gène d'intérêt Chlamydia) permettent de mettre en évidence une bande à 2055 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G CPAF IcreI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène cpaf dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces MC4 SEQ ID NO :286 et MC1 SEQ ID NO : 254 (Mix IcreI Gène d'intérêt et cicatrice) permettent de mettre en 183 évidence une bande à 2544 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G CPAF IcreI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène cpaf et la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO :134 dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans les souches Toxo tgmic/-3 KO - 2G et Toxo tgmic1-3 KO - 2G CPAF confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G CPAF IcreI est validée par PCR. Validation de la souche Toxo tginic1-3 KO - 2G CPAF IcreI par immunofluorescence Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti V5 aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Toxo tgmic/-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée dans les parasites et dans les vacuoles parasitophores de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G CPAF IcreI obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine CPAF SEQ ID NO :289. La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G CPAF IcreI est validée par immunofluorescence. Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*TYTK par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (11.1M) ou de ganciclovir (501.1M). La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - possible qu'en cas d'absence du gène TK). Alors que la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G CPAF est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - grâce à la présence du gène DHFR*) et qu'elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - à cause de la présence du gène TK), la souche Toxo tgmicl3 KO - 2G CPAF IcreI n'est plus capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - grâce à la perte du gène DHFR*) alors qu'elle est redevenue capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - grâce à la perte du gène TK). Ce profil de résistance (résistance au ganciclovir et sensible à la pyriméthamine) permet de confirmer la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO :134 suite à l'action de la méganucléase I-CreI. 184 L'ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G CPAF IcreI. B. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G MOMP IcreI 1. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G MOMP L'électroporation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G avec le plasmide pUC18 4G2 ICreI - MOMP SEQ ID NO :295 a été réalisée selon le protocole décrit (point a). Les clones obtenus résistants à la pyriméthamine sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d'intérêt momp et l'expression de la protéine MOMP SEQ ID NO :297. Validation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G MOMP par PCR Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO: 250 (Mix Gène d'intérêt Chlamydia) permettent de mettre en évidence une bande à 1401paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G MOMP, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène momp dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. (figure 49) La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G MOMP est validée par PCR. Validation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G MOMP par immunofluorescence Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti tag Myc aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Toxo tgmic/-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée dans les parasites et dans les vacuoles parasitophores de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G MOMP obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine MOMP SEQ ID NO :297. (figure 50) La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G MOMP est validée par immunofluorescence. Validation de la souche ayant intégré le plasmide par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (11.1M) ou de ganciclovir (501.1M). La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - possible qu'en cas d'absence du gène TK). La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G MOMP est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - grâce à la présence du gène DHFR*) alors qu'elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance (sensible au ganciclovir et résistance à la pyriméthamine) permet de confirmer l'intégration du plasmide pUC18 4G2 ICreI - MOMP SEQ ID NO: 295 dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G MOMP. L'ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G MOMP. 2. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G MOMP IcreI L'électroporation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G MOMP avec le plasmide pTsaglIcreI c43y circulaire SEQ ID NO : 178 a été réalisée selon le protocole décrit (point e). Les clones obtenus résistants au ganciclovir sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d'intérêt momp et l'expression de la protéine MOMP SEQ ID NO :297 et pour valider la suppression de la cassette de résistance DHFR*TYTK SEQ ID NO :134. Validation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G MOMP IcreI par PCR Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO: 250 (Mix Gène d'intérêt Chlamydia) permettent de mettre en évidence une bande à 1401 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G MOMP IcreI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène momp dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces MC4 SEQ ID NO :286 et MC1 SEQ ID NO : 254 (Mix IcreI Gène d'intérêt et cicatrice) permettent de mettre en évidence une bande à 1890 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G MOMP IcreI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène momp et la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO :134 dans cette souche. Cette bande 186 n'est pas détectée dans les souches Toxo tgmic/-3 KO - 2G et Toxo tgmic1-3 KO - 2G MOMP confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G 1V101VIP IcreI est validée par PCR. Validation de la souche Toxo tginic1-3 KO - 2G MOMP IcreI par immunofluorescence Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti tag Myc aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Toxo tgmic/-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée dans les parasites et dans les vacuoles parasitophores de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G MOMP IcreI obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine MOMP SEQ ID NO :297. La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G MOMP IcreI est validée par immunofluorescence. Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (11.1M) ou de ganciclovir (501.1M). La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - possible qu'en cas d'absence du gène TK). Alors que la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G MOMP est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - grâce à la présence du gène DHFR*) et qu'elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - à cause de la présence du gène TK), la souche Toxo tgmicl3 KO - 2G MOMP IcreI n'est plus capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - grâce à la perte du gène DHFR*) alors qu'elle est redevenue capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - grâce à la perte du gène TK). Ce profil de résistance (résistance au ganciclovir et sensible à la pyriméthamine) permet de confirmer la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO :134 suite à l'action de la méganucléase I-CreI. 187 L'ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G MOMP IcreI. C. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G PmpG IcreI 1. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G PmpG L'électroporation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G avec le plasmide pUC18 4G2 ICreI - PmpG SEQ ID NO :303 a été réalisée selon le protocole décrit (point a). Les clones obtenus résistants à la pyriméthamine sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d'intérêt pmpG et l'expression de la protéine PmpG SEQ ID NO :305. Validation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G PmpG par PCR Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO: 250 (Mix Gène d'intérêt Chlamydia) permettent de mettre en évidence une bande à 1605 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G PmpG, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène pmpG dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. (figure 49) La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G PmpG est validée par PCR. Validation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G PmpG par immunofluorescence Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti tag VSV aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Toxo tgmic/-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée dans les parasites et dans les vacuoles parasitophores de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G PmpG obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine PmpG SEQ ID NO :305. La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G PmpG est validée par immunofluorescence. Validation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G PmpG par Western Blot Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti tag VSV aucune bande n'est détectable pour le parasite Toxo tgmic/-3 KO - 2G, alors qu'une bande à la taille attendue est détectée pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G PmpG obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine PmpG SEQ ID NO :305 (figure 52). 188 La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G PmpG est validée par Western Blot. Validation de la souche ayant intégré le plasmide par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (11.1M) ou de ganciclovir (501.1M). La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - possible qu'en cas d'absence du gène TK). La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G PmpG est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - grâce à la présence du gène DHFR*) alors qu'elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance (sensible au ganciclovir et résistance à la pyriméthamine) permet de confirmer l'intégration du plasmide pUC18 4G2 ICreI - PmpG SEQ ID NO: 303 dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G PmpG. L'ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G PmpG. 2. Construction de la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G PmpG IcreI L'électroporation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G PmpG avec le plasmide pTsaglIcreI c43y circulaire SEQ ID NO : 178 a été réalisée selon le protocole décrit (point e). Les clones obtenus résistants au ganciclovir sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d'intérêt pmpG et l'expression de la protéine PmpG SEQ ID NO : 305 et pour valider la suppression de la cassette de résistance DHFR*TYTK SEQ ID NO :134. Validation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G PmpG IcreI par PCR Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO: 250 (Mix Gène d'intérêt Chlamydia) permettent de mettre en évidence une bande à 1605 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G PmpG IcreI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène pmpg dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tgmic/-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. 189 Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces MC4 SEQ ID NO :286 et MC1 SEQ ID NO : 254 (Mix IcreI Gène d'intérêt et cicatrice) permettent de mettre en évidence une bande à 2094 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G PmpG IcreI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène PmpG et la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO :134 dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans les souches Toxo tgmic/-3 KO - 2G et Toxo tgmic1-3 KO - 2G PmpG confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G PmpG IcreI est validée par PCR. Validation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G PmpG IcreI par immunofluorescence Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti tag VSV aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Toxo tgmic/-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée dans les parasites et dans les vacuoles parasitophores de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G PmpG IcreI obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine PmpG SEQ ID NO :305. La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G PmpG IcreI est validée par immunofluorescence. Validation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G PmpG par Western Blot Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti tag VSV aucune bande n'est détectable pour le parasite Toxo tgmic/-3 KO - 2G, alors qu'une bande à la taille attendue est détectée pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G PmpG obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine PmpG SEQ ID NO :305. La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G PmpG est validée par Western Blot. Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (11.1M) ou de ganciclovir (501.1M). La souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - possible qu'en cas d'absence du gène TK). Alors que la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G PmpG est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - grâce à la présence du gène DHFR*) et qu'elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - à cause de la présence du gène TK), la souche Toxo tgmicl3 KO - 2G PmpG IcreI n'est plus capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (11.1M - grâce à la perte du gène DHFR*) alors qu'elle est redevenue capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - grâce à la perte du gène TK). Ce profil de résistance (résistance au ganciclovir et sensible à la pyriméthamine) permet de confirmer la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO :134 suite à l'action de la méganucléase I-CreI. L'ensemble des résultats permet de valider la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G PmpG IcreI. Exemple 14: Construction d'une souche Neo ncmic1-3 KO - 2G exprimant un ou plusieurs antigènes de la bactérie Chlamydia abortus et ne comportant pas de gène de sélection Souches de Neospora caninurn La souche utilisée dans le présent exemple est une souche atténuée de Neospora caninum NC1 dénommée Neo ncmic/-3 KO 2G. Elle a été obtenue par la délétion par recombinaison homologue de deux gènes de virulence : les gènes mic/ et mic3. Les tachyzoïtes de la souche Neo ncmic/-3 KO 2G sont produits sur fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634)) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (FBS), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine. Ils ont été récoltés après lyse mécanique des cellules hôtes et 3 passages en seringue 25G. Construction des souches - protocole La construction de chaque souche vaccinale contenant un ou plusieurs antigènes se fait à chaque étape avec un protocole identique. Le protocole expérimental est dans un premier temps détaillé ici puis appliqué pour chaque construction de souche vaccinale, celui-ci comporte plusieurs étapes : 191 a- Electroporation et sélection de la souche d'intérêt avec le plasmide exprimant un antigène de la bactérie Chlamydia abortus : souches Neo ncmic1-3 KO - 2G Chlamydia Les parasites Neo ncmic1-3 KO - 2G sont électroporés avec 201.1g de plasmide pUC18 4G2 ICreI - Chlamydia linéarisé. Par « de plasmide pUC18 4G2 ICreI - Chlamydia », on entend le plasmide pUC18 4G2 ICreI - CPAF, le plasmide pUC18 4G2 ICreI - MOMP ou le plasmide pUC18 4G2 ICreI - PmpG. Après électroporation, les tachyzoïtes sont soumis à une pression de sélection par l'agent de sélection (Pyriméthamine 41.1M). 10 à 15 jours après sélection et passages successifs sur cellules HFF, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF puis amplifiés en plaques 24 puits sur une monocouche de cellules HFF. b- Validation de la souche ayant intégré le plasmide par PCR Pour valider une souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Chlamydia, des analyses PCR sont effectuées selon le même protocole que celui utilisé dans l'exemple 10 - point b. Les tailles attendues sont également décrites dans le Tableau 35 ci-dessous. Tableau 35 : Taille attendue des amplicons (en paires de base) des différentes PCR de validation de la construction des souches Neo ncmic1-3 KO - 2G Chlamydia Gène d'intérêt Chlamydia Neo ncmic1-3 KO - 2G MOMP 1401 c- Validation de la souche ayant intégré le plasmide par immunofluorescence La validation des souches par immunofluorescence se fait suivant le protocole précédemment décrit (point c- exemple 7). d- Validation de la souche a ant inté ré le -lasmide sar anal se du iro l de résistance Le profil d'antibiorésistance est analysé pour les clones validés en PCR et immunofluorescence. Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF. Les parasites Neo ncmic1-3 KO - 2G Chlamydia ayant intégré un plasmide pUC18 4G2 ICreI - Chlamydia linéarisé doivent être résistants à la pyriméthamine (41.1M - grâce à la présence du gène DHFR*) et sensible au ganciclovir (501.1M - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance est validé en cultivant les parasites sur fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634)) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (SVF), 2mM glutamine, 192 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine, supplémenté ou non de la pyriméthamine ou du ganciclovir. Les souches validées par PCR, immunofluorescence et ayant le bon profil d'antibiorésistance sont nommées Neo ncmic1-3 KO - 2G Chlamydia (Neo ncmic1-3 KO - 2G MOMP). e- Electroporation de la Neo ncmic1-3 KO - 2G Chlamydia avec un plasmide pTsaglIcreIce et contre sélection de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK : souches Neo ncmic1-3 KO - 2G Chlamydia IcreI Le protocole est identique à celui décrit dans le point protocole - e de l'exemple 7. f- Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK par PCR Pour valider une souche Neo ncmic1-3 KO - 2G Chlamydia IcreI, des analyses PCR sont effectuées selon le même protocole que celui utilisé dans l'exemple 10 - point b et f Les tailles attendues sont également décrites dans le Tableau 36 ci-dessous. Plusieurs mix sont possibles et les PCR sont réalisées en fonction des souches testées. Tableau 36: Taille attendue des amplicons (en paires de base) des différentes PCR de validation de la construction des souches Neo ncmic1-3 KO - 2G Chlamydia. Gène d'intérêt Chlamydia Mix IcreI Gène d'intérêt et cicatrice Neo ncmic1-3 KO - 2G MOMP 1401 6734 Neo ncmic1-3 KO - 2G MOMP IcreI 1401 1890 g- Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK par immunofluorescence La validation des souches par immunofluorescence se fait suivant le protocole précédemment décrit (point c- exemple 7). h- Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK par analyse du profil de résistance Les parasites Neo ncmic1-3 KO - 2G Chlamydia ayant perdu la cassette de sélection DHFR*- TY-TK doivent être sensibles à la pyriméthamine (41.1M - grâce à la suppression du gène 193 DHFR*) et résistants au ganciclovir (501.1M - grâce à la suppression du gène TK). Ce profil de résistance est validé en cultivant les parasites sur fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (SVF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine, supplémenté ou non de la pyriméthamine ou du ganciclovir. Les souches validées par PCR, immunofluorescence et ayant le bon profil d'antibiorésistance sont nommées Neo ncmic1-3 KO - 2G Chlamydia IcreI ( Neo ncmicl3 KO - 2G MOMP IcreI). Résultats - Construction des souches exprimant un antigène de la bactérie Chlamydia abortus ne comportant pas de gène de sélection A. Construction de la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G MOMP IcreI 1. Construction de la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G MOMP L'électroporation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G avec le plasmide pUC18 4G2 ICreI - MOMP SEQ ID NO :295 a été réalisée selon le protocole décrit (point a). Les clones obtenus résistants à la pyriméthamine sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d'intérêt momp et l'expression de la protéine MOMP SEQ ID NO :297. Validation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G MOMP par PCR Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO: 250 (Mix Gène d'intérêt Chlamydia) permettent de mettre en évidence une bande à 1401 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G MOMP, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène momp dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. (figure 52) La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G 1V101VIP est validée par PCR. Validation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G MOMP par immunofluorescence Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti Myc aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Neo ncmic/-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée dans les parasites et 194 dans les vacuoles parasitophores de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G MOMP obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine MOMP SEQ ID NO :297. (figure 53) La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G 1V101VIP est validée par immunofluorescence. Validation de la souche ayant intégré le plasmide par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (41.1M) ou de ganciclovir (501.1M). La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (41.1M - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - possible qu'en cas d'absence du gène TK). La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G MOMP est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (41.IM - grâce à la présence du gène DHFR*) alors qu'elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (501.1M - à cause de la présence du gène TK). Ce profil de résistance (sensible au ganciclovir et résistance à la pyriméthamine) permet de confirmer l'intégration du plasmide pUC18 4G2 ICreI - MOMP SEQ ID NO: 295 dans la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G MOMP. L'ensemble des résultats permet de valider la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G 1V101VIP. 2. Construction de la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G MOMP IcreI L'électroporation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G MOMP avec le plasmide pTsaglIcreI c43y circulaire SEQ ID NO : 178 a été réalisée selon le protocole décrit (point e exemple 10). Les clones obtenus résistants au ganciclovir sont sélectionnés et analysés par PCR et Immunofluorescence pour valider la présence du gène d'intérêt momp et l'expression de la protéine MOMP SEQ ID NO :297 et pour valider la suppression de la cassette de résistance DHFR*TYTK SEQ ID NO :134. Validation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G MOMP IcreI par PCR Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces seq TUB MCS F SEQ ID NO :249 et seq 3utr MCS SEQ ID NO: 250 (Mix Gène d'intérêt Chlamydia) permettent de mettre en évidence une bande à 1401 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G MOMP IcreI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène momp dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Neo ncmic/-3 KO - 2G confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces MC4 SEQ ID NO :286 et MC1 SEQ ID NO : 254 (Mix IcreI Gène d'intérêt et cicatrice) permettent de mettre en évidence une bande à 1890 paires de bases pour la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G MOMP IcreI, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène momp et la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO :134 dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans les souches Neo ncmic/-3 KO - 2G et Neo ncmic1-3 KO - 2G MOMP confirmant l'absence de ce gène dans la souche de départ. La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G 1V101VIP IcreI est validée par PCR. Validation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G MOMP IcreI par immunofluorescence Les résultats montrent qu'avec l'anticorps anti Myc aucune fluorescence n'est détectable pour le parasite Neo ncmic/-3 KO - 2G, alors qu'une fluorescence est détectée dans les parasites et dans les vacuoles parasitophores de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G MOMP IcreI obtenue. Les résultats montrent que les parasites expriment bien la protéine MOMP SEQ ID NO :297. La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G 1V101VIP IcreI est validée par immunofluorescence. Validation de la souche ayant perdu la cassette de sélection DHFR*-TY-TK par analyse du profil de résistance Les tachyzoïtes (de 1.105 à 5.105) sont cultivés 5 jours sur une monocouche de cellules HFF (fibroblastes humains HFF Hs27 ATCC CRL-1634) en présence de pyriméthamine (41.1M) ou de ganciclovir (50uM). La souche Neo ncmic1-3 KO - 2G est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (41.1M - pas de gène DHFR*) mais elle se multiplie et lyse le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50uM - possible qu'en cas d'absence du gène TK). Alors que la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G MOMP est capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (41.1M - grâce à la présence du gène DHFR*) et qu'elle est incapable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de ganciclovir (50uM - à cause de la présence du gène TK), la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G MOMP IcreI n'est plus capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de pyriméthamine dans le milieu (41.1M - grâce à la perte du gène DHFR*) alors qu'elle est redevenue capable de se multiplier et de lyser le tapis cellulaire en présence de 196 ganciclovir (501.1M - grâce à la perte du gène TK). Ce profil de résistance (résistance au ganciclovir et sensible à la pyriméthamine) permet de confirmer la suppression de la cassette DHFR*TYTK SEQ ID NO :134 suite à l'action de la méganucléase I-CreI. L'ensemble des résultats permet de valider la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G 1V101VIP IcreI. Exemple 15 : Etude d'innocuité et d'immunogénicité des souches Toxo tgmic1-3 KO- 2G exprimant un ou plusieurs antigènes du virus Influenza dans un modèle murin L'objectif de cette expérimentation est de déterminer si la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G exprimant des antigènes du virus Influenza permet l'obtention d'une réponse immunitaire humorale et cellulaire envers les antigènes viraux ciblés. Matériel et méthode Production de parasites Toxo tgmic1-3 KO - 2G exprimant un ou plusieurs antigènes du virus Influenza Les souches Toxo tgmic1-3 KO - 2G exprimant un ou plusieurs antigènes du virus Influenza sont produits en fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (SVF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine.. Les tachyzoïtes ont été récoltés après lyse mécanique des cellules hôtes par 3 passages en seringue 25G. Les parasites ont été énumérés sur cellule de Malassez et dilués dans du milieu DMEM pour atteindre une concentration de 500 parasites par mL. Animaux Au total 64 souris SWISS femelles de 6 semaines ont été inclues dans l'étude. Les animaux ont été hébergés et manipulés, dans le strict respect des normes éthiques en vigueur en France et des normes d'élevage imposées par la règlementation européenne. L'alimentation et l'eau 197 de boisson ont été distribuées ad-libitum durant toute la durée de l'expérimentation. Après une période de 15 jours d'acclimatation, les souris ont été identifiées individuellement et réparties aléatoirement en 7 groupes. Lot 1 : Toxo tgmic1-3 KO - 2G (n=10) Lot 2 : Toxo tgmic1-3 KO - 2G pUC18 4G2 IcreI (n=10) Lot 3 : Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI IcreI (n=10) Lot 4 : Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e IcreI (n=10) Lot 5 : Toxo tgmic1-3 KO - 2G HA IcreI (n=10*) Lot 6 : Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA (n=10) Lot 7 : naïf (n=4) A JO, 100 tachyzoïtes ont été injectés en intra-péritonéal dans un volume de 200 !IL de DMEM. Les animaux ont ensuite été suivis et sacrifiés environ 7 semaines post-injection (J52) et les rates ont été prélevées. Avant (J-1) et 34 jours post-injection, du sang a été prélevé par voie rétro-orbitale et laissé à température ambiante pour une durée minimum de 30 minutes. Le sérum a été obtenu par conservation des surnageants d'une centrifugation à 3 000 g durant 10 minutes. Les séra préparés ont été conservés à -20°C. Dosage IgG par ELISA Une plaque 96 puits a été adsorbée avec différentes protéines à 10 1.1.g/mL (protéine recombinante HA 95-101 (Pro Sci), un mix de 4 peptides M2e synthétiques à 10 1.1.g/mL (Anaspec) correspondant aux 4 M2e présents dans la construction de la protéine de fusion sag1M2e ou de l'extrait protéique de Toxo tgmic1-3 KO - 2G (10 1.1g/m1) dilué en tampon carbonate pH 9,6 pendant une nuit à 4 °C. Après lavages en PBS 1X/Tween 0,05%, la plaque a été saturée avec du PBS 1X/Tween 0,05% - BSA 4% pendant 1h30 à 37 °C. Ensuite, pour le titrage, les dilutions sériées 2 de 2 en, en PBS 1X/Tween 0,05% des sera murins à tester ont été déposées. Après 1 h d'incubation à 37 °C, la plaque a été lavée, puis l'anticorps secondaire (IgG anti-mouse IgG couplé à la phosphatase alcaline) est ajouté et dilué au 1/30 000 en PBS 1X/Tween 0,05%, avant une nouvelle incubation à 37 °C durant 1h30. Après lavages, le pNPP a été utilisé à une concentration de 1 mg/mi dilué en tampon DEA-HCL pour la révélation, et la plaque a été incubée 1 h à 37 °C. L'absorbance à 405 nm de chaque puits avec une contre lecture à 620 nm a été lue via le lecteur de plaque Nanoquant Infinite M200 PRO (TECAN). 198 Dosage par ELISA d'IFN-y sécrété par des splénocytes stimulés in vitro Après chaque prélèvement, la rate a été broyée sur un tamis 100 iam placé au-dessus d'un tube Falcon de 50 ml avec ajout de 5 ml de milieu RPMI. Le broyat a ensuite été centrifugé 10 min à 400 g. Le culot a été repris dans 300 pl de RPMI, puis 1 ml de tampon de lyse a été ajouté. Le tube a été incubé 3 min à 4 °C, et la réaction a été stoppée avec ajout de PB S 1X/SVF 2% en excès, puis les cellules ont été centrifugées 10 min à 400 g. Les culots de cellules obtenus ont ensuite été repris dans 5 ml de milieu de stimulation. Les cellules ont été dénombrées sur cellule de Malassez en présence de bleu trypan qui colore les cellules mortes. Les cellules ont été mises en culture en plaques 96 puits à raison de 5.105 cellules/puit. Différents stimulants ont pu être ajoutés : des extraits antigéniques de Toxo tgmic1-3 KO - 2G (10 ltg/ml), de la protéine recombinante HA 95-101 (Pro Sci - 10 tg/ml), un mix de 4 peptides M2e synthétiques à 10 iag/mL (Anaspec) correspondant aux 4 M2e présents dans la construction de la protéine de fusion sag1M2e ou de la concanavaline A (5 ltg/ml) qui sert de témoin positif Les plaques ont été mises en culture en étuve à 37 °C, 5% de CO2 pour 72 h. Le dosage d'IFN-y a été réalisé sur les surnageants de culture des splénocytes en présence de différents stimulants. Le dosage a été effectué par un test ELISA selon le protocole du kit « Mouse IFN-y ELISA Ready-set-goe (Ebiosciences). Résultats Survie et signes cliniques Il est observé qu'en fonction des souches parasitaires, il y a des fortes disparités dans le taux de survie engendré chez les souris SWISS (tableau 37), avec notamment aucune survie pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G HA IcreI (n=10) et une survie totale pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA. La plupart des souris ont présenté des signes cliniques tels que le poil ébouriffé, un gonflement de l'abdomen et une prostration à l'exception des souris n'ayant pas reçu de souches parasitaires. Tableau 37 : pourcentage de survie suite à la vaccination. Naïves Toxo Toxo tgmicl -3 KO - Toxo tgmicl -3 KO Toxo tgmicl -3 Toxo tgmicl -3 Toxo tgmicl - tgmicl -3 2G puc 4 G2 IcreI - 2G M2eGPI IcreI KO - 2G M2e KO - 2G HA 3 KO - 2G KO - 2G IcreI IcreI M2eGPI HA survie 100% 0% 90% 30% 50% 0% 100% 199 Evaluation de la réponse humorale adaptative envers le vecteur Toxo tgmic 1-3 KO - 2G Le dosage des IgG sériques dirigés contre les protéines de Toxo tgmic1-3 KO - 2G permet d'observer très nettement que les sera issus des souris avant injection ne produisent pas d'anticorps spécifiques de cette souche. Concernant les sera prélevés 34 jours après l'injection, une forte augmentation de l'absorbance synonyme de la séroconversion des souris suite à la vaccination par Toxo tgmic1-3 KO - 2G a été observée. Au total, en fonction des lots, entre 78% et 100% des souris sont séroconverties pour la toxoplasmose. (figure 54 et tableau 38). Tableau 38 : pourcentage de séroconversion suite à la vaccination. Naïves Toxo tgmicl- 3 KO - 2G Toxo tgmic1-3 Toxo tgmic1-3 Toxo tgmic1-3 Toxo tgmic1-3 Toxo tgmic1-3 KO - 2G puc 4 KO - 2G M2eGPI KO - 2G M2e KO - 2G HA IcreI KO - 2G G2 IcreI IcreI IcreI M2eGPI HA IgG + 0% - 78% (7/9) 100% 100% - 100% Evaluation de la réponse humorale adaptative envers les antigènes d'Influenza Le dosage des IgG sériques dirigés contre HA n'a pas permis de mettre en évidence une production d'anticorps spécifiquement dirigé contre HA pour la souche vaccinée avec la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA. Alors que suite à une injection d'une souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G exprimant M2e ou M2eGPI, il est observé une production d'anticorps spécifique de l'antigène M2e exprimé par les souches Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI IcreI, Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2e IcreI et Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA (figure 55). Evaluation de la réponse cellulaire spécifique de Toxo tgmic 1-3 KO - 2G ou des antigènes d'Influenza Afin d'évaluer la mise en place d'une réponse immunitaire cellulaire, l'IFN-y (cytokine indiquant la mise en place d'une réponse de type Thl) sécrété dans les surnageants de culture des splénocytes suite à divers stimuli, a été dosé 72 h après la mise en culture. Pour l'ensemble des souris vaccinées avec Toxo tgmic1-3 KO - 2G pUC4G 2 IcreI, ou Toxo tgmic1-3 KO - 2G Influenza, des concentrations importantes d'IFN-y sont mesurées lorsque les cellules sont stimulées avec des extraits antigéniques de Toxo tgmic1-3 KO - 2G , par rapport aux souris non vaccinées (figure 56). Concernant les cellules restimulées avec M2e, aucune production d'IFN-y n'est détectable pour l'ensemble des souris, qu'elles soient naïves, vaccinées avec Toxo tgmic1-3 KO - 2G pUC18 4G2 IcreI ou avec Toxo tgmic1-3 KO - 2G Influenza. Pour les cellules restimulées avec HA, une production significativement élevée d'IFN-y est observée pour le lot Toxo tgmic1-3 KO - 2G M2eGPI HA(figure 57), alors qu'aucune production d'IFN-y n'est détectée pour les lots n'exprimant pas HA. Il a donc été observé la mise en place d'une réponse immunitaire humorale vis-à-vis de la construction 1VI2e mais également d'une réponse immunitaire cellulaire vis-à-vis de la construction HA suite à REVENDICATIONSI. Souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les fonctions des deux protéines MIC1 et MIC3 essentielles à la virulence sont supprimées respectivement par une délétion totale du gène mic/ codant pour la protéine MIC1 et par une délétion totale du gène mic3 codant pour la protéine MIC3, caractérisée en qu'elle contient au moins un acide nucléique codant respectivement pour au moins un antigène hétérologue immunogène et les moyens nécessaires à son expression, sous réserve que lorsque ladite souche mutante contient un acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène, ladite souche mutante est dépourvue de gène de sélection, ledit au moins un antigène hétérologue immunogène étant un antigène hétérologue immunogène de virus, de parasite ou de bactérie. 2. Souche mutante de Sarcocystidae selon la revendication 1, dans laquelle ladite souche mutante est une souche du genre Toxoplasma spp., en particulier une souche de l'espèce Toxoplasma gondii. 3. Souche mutante de Sarcocystidae selon la revendication 1, dans laquelle ladite souche mutante est une souche du genre Neospora spp., en particulier une souche de l'espèce Neospora caninum. 4. Souche mutante de Sarcocystidae selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle contient au moins deux acides nucléiques codant respectivement pour au moins deux antigènes hétérologues immunogènes, en particulier au moins deux acides nucléiques codant respectivement pour au moins deux antigènes hétérologues immunogènes de virus, ou en particulier au moins deux acides nucléiques codant respectivement pour au moins deux antigènes hétérologues immunogènes de bactérie, en particulier au moins deux acides nucléiques codant respectivement pour au moins deux antigènes hétérologues immunogènes de parasites. 5. Souche mutante de Sarcocystidae selon l'une des revendications 1 à 4, dans laquelle ledit au moins un antigène hétérologue immunogène est un antigène du virus Influenza choisi parmi 202 la protéine de SEQ ID NO : 211 (fragment N-ter du virus influenza humain), ou la protéine de SEQ ID NO : 214 (fragment N-ter de la protéine M2e du virus influenza du porc), ou la protéine de SEQ ID NO : 212 (fragment N-ter de la protéine M2 du virus influenza aviaire de type I) ou la protéine de SEQ ID NO: 213 (fragment N-ter de la protéine M2 du virus influenza aviaire de type II), la protéine de SEQ ID NO : 209, la protéine de SEQ ID NO: 206, la protéine de SEQ ID NO 253, la protéine de SEQ ID NO : 233 ou la protéine de SEQ ID NO :255, ou ledit au moins un antigène hétérologue immunogène est un antigène de la bactérie Chlamydia abortum choisi parmi la protéine CPAF de SEQ ID NO : 289 , la protéine MOMP de SEQ ID NO : 297, la protéine PmpG de SEQ ID NO :270, la protéine de fusion de SEQ ID NO : 288, la protéine de fusion de SEQ ID NO : 296 ou la protéine de fusion de SEQ ID NO: 304 ou ledit au moins un antigène hétérologue immunogène est un antigène du parasite Leishmania infantum choisi parmi la protéine KMP11 de SEQ ID NO : 259, ou la protéine NH36 de SEQ ID NO: 269, ou la protéine CYP1 de SEQ ID NO: 279, ou la protéine de fusion de SEQ ID NO: 257, ou la protéine de fusion de SEQ ID NO: 267, ou la protéine de fusion de SEQ ID NO : 285. 6. Souche mutante de Sarcocystidae selon l'une des revendications 1 à 2 et 4 à 5, dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Toxoplasma gondii dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par une délétion totale du gène mic/ codant pour la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par une délétion totale du gène mic3 codant pour la protéine MIC3, ladite souche étant dépourvue de gène de sélection, et contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO: 311 codant pour un antigène hétérologue immunogène du virus Influenza de séquence SEQ ID NO : 253, ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO :310 codant pour un antigène hétérologue immunogène du virus Influenza de séquence SEQ ID NO : 206, ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO: 312 codant pour un antigène hétérologue immunogène du virus Influenza de séquence SEQ ID NO : 255, ou contenant deux acides nucléiques de séquence SEQ ID NO : 311 et SEQ ID NO : 310 codant respectivement pour deux antigènes hétérologues immunogènes du virus Influenza de séquence SEQ ID NO : 253, et de séquence SEQ ID NO : 206, 203 ou contenant deux acides nucléiques de séquence SEQ ID NO : 312 et SEQ ID NO : 310 codant respectivement pour deux antigènes hétérologues immunogènes du virus Influenza de séquence de séquence SEQ ID NO : 255 et de séquence SEQ ID NO : 206, ou contenant deux acides nucléiques de séquence SEQ ID NO : 312 et SEQ ID NO : 311 codant respectivement pour deux antigènes hétérologues immunogènes du virus Influenza de séquence de séquence SEQ ID NO : 255 et de séquence SEQ ID NO : 253, ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO: 265 codant pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 257, ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO: 275 codant pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 267, ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO: 277 codant pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 285, ou contenant deux acides nucléiques de séquence SEQ ID NO: 265 et de séquence SEQ ID NO: 275 codant respectivement pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID: 257 et un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 267, ou contenant deux acides nucléiques de séquence SEQ ID NO: 265 et de séquence SEQ ID NO: 277 codant respectivement pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID: 257 et un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 285, ou contenant deux acides nucléiques de séquence SEQ ID NO: 275 et de séquence SEQ ID NO: 277 codant respectivement pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID: 267 et un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 285, ou contenant trois acides nucléiques de séquence SEQ ID NO: 265, de séquence SEQ ID NO: 275 et de séquence SEQ ID NO: 277, codant respectivement pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID: 257, un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 267, et un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 285. 204 7. Souche mutante de Sarcocystidae selon l'une des revendications 1 et 3 à 5, dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Neospora caninum dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par une délétion totale du gène mie/ codant pour la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par une délétion totale du gène mic3 codant pour la protéine MIC3, ladite souche étant dépourvue de gène de sélection et contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO: 311 codant pour un antigène hétérologue immunogène du virus Influenza de séquence SEQ ID NO : 253, ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO :310 codant pour un antigène hétérologue immunogène du virus Influenza de séquence SEQ ID NO : 206, ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO: 312 codant pour un antigène hétérologue immunogène du virus Influenza de séquence SEQ ID NO : 255, ou contenant deux acides nucléiques de séquence SEQ ID NO : 312 et SEQ ID NO : 310 codant respectivement pour deux antigènes hétérologues immunogènes du virus Influenza de séquence de séquence SEQ ID NO : 255 et de séquence SEQ ID NO : 206, ou contenant deux acides nucléiques de séquence SEQ ID NO : 312 et SEQ ID NO : 311 codant respectivement pour deux antigènes hétérologues immunogènes du virus Influenza de séquence de séquence SEQ ID NO : 255 et de séquence SEQ ID NO : 253, ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO: 265 codant pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 257, ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO: 275 codant pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 267, ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO: 277 codant pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 285, ou contenant deux acides nucléiques de séquence SEQ ID NO: 265 et de séquence SEQ ID NO: 275 codant respectivement pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID: 257 et un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 267, ou contenant deux acides nucléiques de séquence SEQ ID NO: 265 et de séquence SEQ ID NO: 277 codant respectivement pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania 205 , infantum de séquence SEQ ID: 257 et un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 285, ou contenant deux acides nucléiques de séquence SEQ ID NO: 275 et de séquence SEQ ID NO: 277 codant respectivement pour un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID: 267 et un antigène hétérologue immunogène de Leishmania infantum de séquence SEQ ID : 285, ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO: 294 codant pour un antigène hétérologue immunogène de Chlamydia abortus de séquence SEQ ID : 288, ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO: 302 codant pour un antigène hétérologue immunogène de Chlamydia abortus de séquence SEQ ID : 296, ou contenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO: 292 codant pour un antigène hétérologue immunogène de Chlamydia abortus de séquence SEQ ID : 304. 8. Procédé d'obtention d'une souche mutante de Sarcocystidae selon l'une des revendications 1 à 7, dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Toxoplasma gondii ou de Neospora caninum dans laquelle la fonction de la protéine MIC1 est supprimée par une délétion totale du gène mic/ codant pour la protéine MIC1 et la fonction de la protéine MIC3 est supprimée par une délétion totale du gène mic3 codant pour la protéine MIC3 ladite souche étant dépourvue de gène de sélection et contenant au moins un acide nucléique codant respectivement pour au moins un antigène hétérologue immunogène comprenant : - une étape A de délétion totale du gène mic3, - une étape B de délétion totale du gène mia, les étapes A et B pouvant être réalisée dans un ordre A suivi de B ou B suivi de A, puis - une étape C de modification génétique de la souche avec l'insertion aléatoire d' au moins un plasmide comportant un acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène, et un gène de sélection, 206 - une étape D de validation de la souche ayant intégrée le plasmide de l'étape C par PCR et/ou immunofluorescence et/ou profil de résistance, - une étape E de suppression du gène de sélection par une méganucléase, en particulier la méganucléase IcreI - une étape F de validation de la souche comportant la suppression du gène de sélection de l'étape E par PCR et/ou immunofluorescence et/ou profil de résistance. 9. Procédé d'obtention d'une souche mutante de Sarcocystidae selon la revendication 8 dans laquelle : une étape A comprenant ou constituée de la délétion du gène mic3 par recombinaison homologue et insertion d'une cassette de sélection encadrée par deux sites de recombinaison spécifique identiques , suivi de l'excision de ladite cassette de sélection par une enzyme permettant la recombinaison spécifique, ladite enzyme étant en particulier la Cre-recombinase, suite à laquelle un seul des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette reste intégré au locus dudit gène mic3 délété, une étape B comprenant ou constituée de la délétion du gène mic/ par recombinaison homologue et insertion d'une cassette de sélection encadrée par deux sites de recombinaison spécifique identiques, suivi de l'excision de ladite cassette de sélection par une enzyme permettant la recombinaison spécifique, ladite enzyme étant en particulier la Cre-recombinase, suite à laquelle un seul des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette reste intégré au locus dudit gène mic/ délété les deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette de sélection insérée au locus du gène mic/ étant différents des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette de sélection insérée au locus du gène mic3 les étapes A et B pouvant être réalisée dans un ordre A suivi de B ou B suivi de A, puis - une étape C de modification génétique de la souche avec l'insertion aléatoire d'au moins un plasmide comportant un acide nucléique codant pour un antigène hétérologue immunogène, et un gène de sélection, 207 ' - une étape D de validation de la souche ayant intégrée le plasmide de l'étape C par PCR et/ou immunofluorescence et/ou profil de résistance, - une étape E de suppression du gène de sélection par une méganucléase, en particulier la méganucléase IcreI - une étape F de validation de la souche comportant la suppression du gène de sélection de l'étape E par PCR et/ou immunofluorescence et/ou profil de résistance. 10. Souche mutante de Sarcocystidae selon l'une des revendications 1 à 7 pour son utilisation comme médicament, en particulier comme vaccin ou immunostimulant. 11. Souche mutante de Sarcocystidae selon l'une des revendications 1 à 7 pour son utilisation dans la prévention de pathologies d'origine virale, parasitaire ou bactérienne chez un mammifère, ledit mammifère étant choisi parmi les ovidés, les caprins, les porcins, les bovins, les équidés, les camélidés, les canidés ou les félidés, ou chez un oiseau, en particulier pour son utilisation dans la prévention de la grippe aviaire, en particulier pour son utilisation dans la prévention de la leishmaniose, en particulier pour son utilisation dans la prévention de la chlamydiose.