Brevet FR3074912A1 — publié le 20190614

METHODE POUR DISTINGUER UN ETAT D'IMMUNISATION PAR LE VACCIN CONTRE BRUCELLA ABORTUS D'UN ETAT D'INFECTION NATURELLE Domaine technique La présente invention porte sur une méthode permettant de distinguer un état d'immunisation par le vaccin contre Brucella abortus d'un état d'infection naturelle ; elle appartient au domaine technique de la détection de produits biologiques. Technique antérieure La brucellose étant une zoonose importante elle menace sérieusement la santé publique et le développement sain de l'industrie de l'élevage. Pour les animaux d'élevage, les principaux symptômes de la brucellose sont la fièvre ondulante, la perte de poids, l'émaciation et la diminution de la production laitière et, pour les femelles gravides, elle provoque des symptômes tels qu'avortement, mortinaissance et infertilité à long terme. La brucellose constitue une menace sérieuse pour le commerce international et affecte également l'exportation de produits animaux dérivés ; elle est considérée par l'Office international des épizooties (OIE) comme une maladie infectieuse de classe B, et a été placée en Chine sur la liste B des maladies. Quelques pays développés faisant exception, la brucellose est survenue dans plus de 170 pays du monde et est particulièrement répandue en Asie centrale et au Moyen-Orient. La brucellose était bien contrôlée en Chine depuis les années 60 jusqu'aux années 80 du siècle dernier mais, ces dernières années, le nombre d'épidémies de brucellose et l'incidence sur la population animale ont augmenté d'année en année. La brucellose étant une zoonose qui affecte sérieusement la santé publique et le développement sain de l'industrie de l'élevage, sa prévention et son contrôle sont devenus urgents. La brucellose a été incluse en Chine dans le « Plan national de lutte à moyen et long terme contre les maladies animales (2012-2020) ». Dans les pays ou les régions où la brucellose est éliminée, des mesures telles que la vaccination, la quarantaine et l'abattage sont couramment combinées pour atteindre l'objectif de purification de la population. La vaccination est l'une des mesures les plus efficaces pour contrôler et prévenir la 30 brucellose chez les animaux. La souche S19 de Brucella abortus et la souche S2 de Brucella 1 suis jouent un rôle important dans la prévention et le contrôle de la brucellose en Chine. En particulier, la souche S2, développée en Chine dans les années 1960, a de bons effets protecteurs sur les animaux sensibles à la brucellose et est caractérisée par une faible virulence et une menace relativement faible pour la santé publique posée par les réactions 5 secondaires de la vaccination. Cependant, les deux vaccins ci-dessus sont des souches lisses et les anticorps qu'ils produisent ne se distinguent pas de ceux produits lors d'infections naturelles, ce qui rend l'utilisation des vaccins très difficile. Résumé de l'invention Le but de la présente invention est d'établir une méthode technique capable de 10 distinguer entre l'immunisation par le vaccin contre Brucella abortus et l'infection naturelle. La présente invention est basée sur la méthode ELISA indirecte établie précédemment pour les anticorps de sous-types IgG et IgM de Brucella abortus (CN105067812A et CN106771182A), comprenant : le suivi continu du régime de croissance et de déclin des sous-types IgG et IgM dans le sang des bovins adultes vaccinés par voie sous-cutanée avec 15 un vaccin vivant contre Brucella abortus (souche A19), vaccinés par voie orale avec un vaccin vivant contre Brucella abortus (souche S2), et ayant reçu une injection de bérarium vivant de la souche virulente 2308 de Brucella abortus pour obtenir une infection artificielle, respectivement, et la détermination d'une valeur critique pour différents états (immunisation / infection), afin d'établir un modèle des régimes de croissance et de déclin des sous-types 20 d'anticorps dans les cas d'immunisation / infection naturelle par le vaccin Brucella abortus, et de fournir une méthode technique pour identifier l'immunisation par le vaccin anti-Brucella et l'infection naturelle au moyen des sous-types d'anticorps, répondant ainsi aux exigences de l'enquête épidémiologique sur la brucellose en Chine. Solutions techniques de la présente invention 25 1. Une méthode pour distinguer un état d'immunisation par le vaccin contre Brucella abortus d'un état d'infection naturelle selon la présente invention, caractérisée par la détermination de l'état d'infection / immunisation d'un bétail testé par analyse du niveau d'anticorps de sous-types IgG et IgM spécifiquement contre Brucella chez le bétail, de manière à faire la différence entre l'immunisation par le vaccin contre Brucella abortus et l'infection naturelle et répondre ainsi à l'exigence d'investigation épidémiologique de la brucellose, sachant qu'il ne s'agit pas là d'une méthode de diagnostic de la maladie. 2 2. La méthode pour distinguer un état d'immunisation par le vaccin contre Brucella abortus d'un état d'infection naturelle selon la présente invention, caractérisée en outre par le fait que la détection du niveau d'anticorps de sous-types IgG et IgM spécifiquement antiBrucella est basée sur un kit spécifique de détection des anticorps IgG de Brucella abortus et 5 un kit spécifique de détection des anticorps IgM de Brucella abortus. 3. La méthode pour distinguer un état d'immunisation par le vaccin contre Brucella abortus d'un état d'infection naturelle selon la présente invention, caractérisée en outre par le fait que la détermination de l'état d'infection / immunisation du bétail testé est effectuée selon les étapes suivantes : établissement des régimes de croissance et de déclin des IgG et 10 IgM chez le bétail immunisé avec un vaccin anti-Brucella et des régimes de croissance et de déclin des IgG et IgM chez le bétail où l'infection naturelle de Brucella est simulée, et délimitation de plages pour l'immunisation par le vaccin anti Brucella et l'infection naturelle, c'est-à-dire que les indicateurs pour juger de l'état d'infection / immunisation des animaux testés sont les suivants : 15 lorsque la valeur P% d'un échantillon de sérum est supérieure ou égale à 20 %, cela indique que l'échantillon de sérum est positif pour l'anticorps de sous-type IgG de Brucella abortus, et lorsque la valeur P% de l'échantillon de sérum est inférieure à 20 %, cela indique que l'échantillon de sérum est négatif pour l'anticorps IgG de Brucella abortus ; et lorsque la valeur P% d'un échantillon de sérum est supérieure ou égale à 85 %, cela 20 indique que l'échantillon de sérum est positif pour l'anticorps de sous-type IgM de Brucella abortus, et lorsque la valeur P% de l'échantillon de sérum est inférieure à 85 %, cela indique que l'échantillon de sérum est négatif pour l'anticorps IgM de Brucella abortus. 4. La méthode pour distinguer un état d'immunisation par le vaccin contre Brucella abortus d'un état d'infection naturelle selon la présente invention, caractérisée en outre par le 25 fait que les indicateurs permettant de juger de l'état d'infection / immunisation de l'animal testé sont établis sur la base des résultats de test suivants : quand les résultats de test sont : IgG S/P > 60 % ; et IgM, S/P 60 % ; et IgM, S/P > 85 %, ils sont marqués 30 comme état 2, c.-à-d. infection naturelle ou stade précoce de l'immunisation A19; quand les résultats de test sont : IgG, S/P entre 20 % et 60 % ; et IgM, S/P > 85 %, ils 3 sont marqués comme état 3, c.-à-d. immunisation A19 ; quand les résultats de test sont : IgG, S/P entre 20 % et 60 % ; et IgM, S/P 85 %, ils sont marqués comme état 5, c.-à-d. immunisation S2 ou infection aiguë. 5. La méthode pour distinguer un état d'immunisation par le vaccin contre Brucella abortus d'un état d'infection naturelle selon la présente invention, dans lequel le traitement des données peut être effectué par des moyens informatiques. 10 Formes spécifiques de réalisation de la présente invention La présente invention détermine les titres d'anticorps à l'aide, respectivement, d'un kit ELISA indirect de détection d'anticorps IgG contre Brucella abortus et d'un kit ELISA indirect de détection d'anticorps IgM contre Brucella abortus (CN105067812A et CN106771182A) et la méthode spécifique se réfère à la note 1. 15 1. La présente demande a établi les régimes d'évolution des anticorps chez les bovins vaccinés par le vaccin anti-brucellose vivant (souche A19) (ci-après dénommé vaccin A19). Plus de 50 bovins négatifs à la brucellose ont été sélectionnés et vaccinés par injection conformément au mode d'emploi du vaccin A19. Des échantillons de sang ont été prélevés à différents moments et le sérum a été séparé. Les titres d'anticorps ont été déterminés à l'aide, 20 respectivement, d'un kit ELISA indirect de détection d'anticorps IgG contre Brucella abortus et d'un kit ELISA indirect de détection d'anticorps IgM contre Brucella abortus (CN105067812A et CN106771182A) et les valeurs P mesurées à chaque étape ont été enregistrées. Dans la présente invention, 92 bovins adultes négatifs aux anticorps anti-Brucella ont 25 été vaccinés par injection du vaccin A19, et des échantillons de sérum ont été prélevés respectivement les jours 7, 15, 30, 60, 90, 120 et 150 après la vaccination aux fins de détection des anticorps, cela de manière à définir les régimes d'évolution des IgG et des IgM chez les bovins après vaccination par le vaccin A19. Les résultats de l'étude (voir Figure 1) ont montré que les anticorps IgG et IgM chez les bovins commençaient à apparaître au '7e 30 jour après vaccination par le vaccin A19, atteignaient un pic au 15e jour, puis diminuaient graduellement. En ce qui concerne les IgG, après le 15ème jour, le taux d'anticorps dans le 4 groupe vacciné par le vaccin A19 a diminué de façon significative, et la valeur moyenne des IgG était proche de la valeur critique le 90e jour ; et les taux positifs dans la population à différents moments étaient de 62,64 % (7e jour), 84,78 % (15e jour), 78,26 % (30e jour), 75 % (60e jour), 36,95 % (90e jour), 27,17 % (120e jour) et 14,22 % (150e jour). Il y avait 5 des différences statistiques dans les niveaux d'anticorps aux différents moments, avec la différence la plus significative entre le 60e jour et le 90e jour (p 60 % ; IgM, S/P 60 % ; IgM, S/P > 85 % ; appelé état 2), (3) immunisation par le vaccin A19 (IgG, S/P 20 % - 60 % ; IgM, S/P > 85 % ; 20 appelé état 3), (4) stade avancé après vaccination par le vaccin A19 ou stade avancé après infection par la souche 2308 (IgG, S/P 20 % - 60 % ; IgM, S/P 85 % ; appelé état 5). En ce qui concerne les états 2 et 4, afin de garantir l'authenticité des résultats, les échantillons doivent être prélevés à nouveau après 15 jours pour effectuer la détection. 25 Les résultats du test supplémentaire peuvent être utilisés pour juger avec précision de l'état d'infection / immunisation des animaux testés, et les indicateurs permettant de juger de l'état d'infection / immunisation de l'animal testé sont définis comme suit : lorsque la valeur P% de l'échantillon de sérum est supérieure ou égale à 20 %, cela indique que l'échantillon de sérum est positif pour l'anticorps de sous-type IgG de Brucella 30 abortus, et lorsque la valeur P% de l'échantillon de sérum est inférieure à 20 %, cela indique que l'échantillon de sérum est négatif pour l'anticorps IgG de Brucella abortus ; et 9 lorsque la valeur P% de l'échantillon de sérum est supérieure ou égale à 85 %, cela indique que l'échantillon de sérum est positif pour l'anticorps de sous-type IgM de Brucella abortus, et lorsque la valeur P% de l'échantillon de sérum est inférieure à 85 %, cela indique que l'échantillon de sérum est négatif pour l'anticorps IgM de Brucella abortus. 5 Tableau 1. Intervalles des différents états IgG (S/P * États IgM (S/P * 100 %) États 100 %) 1 > 60 % 60% > 85% l'immunisation par le vaccin A19 3 20 % - 60 % > 85 % Immunisation par le vaccin A19 Stade avancé de l'immunisation A19 ou stade avancé de l'infection 4 20 % - 60 % 85% aiguë 5. La détection effectuée sur des échantillons cliniques au passé connu confirme la fiabilité de la présente invention. L'état de 50 échantillons cliniques au passé connu a été évalué au moyen de la méthode établie dans la présente invention, et 92 % des appréciations réalisées (46/50) étaient 10 conformes aux situations réelles (pour plus de détails, voir le tableau 2 de l'exemple 1). Il y avait deux situations possibles pour les états 2 et 4, et les résultats de la vérification ont montré qu'un total de 6 échantillons avaient été classés dans l'état 2, sachant que 5 de ces échantillons étaient des infections naturelles et 1 une immunisation par le vaccin A19, ce qui indique qu'à ce stade l'infection naturelle était majoritaire. En ce qui concerne l'état 4, un 15 total de 6 échantillons ont été testés dont 2 échantillons, représentant 33% du total, étaient des immunisations par le vaccin A19, dans cette condition limite il est difficile de distinguer entre infection naturelle et immunisation par le vaccin A19 et il faut combiner les résultats de la deuxième détection pour pouvoir porter un jugement. Les résultats ci-dessus ont prouvé que la méthode établie par la présente invention permet d'identifier de manière plus fiable 20 l'état d'immunisation par un vaccin anti-Brucella et l'état d'infection naturelle. Brève description des illustrations 10 La figure 1 est un graphique reliant le titre d'anticorps des bovins vaccinés par le vaccin A19 et le temps depuis la vaccination (jour). Le graphique A montre la relation entre le titre d'anticorps IgG (P%) et le temps depuis la vaccination (jour) ; et le graphique B montre la relation entre le titre d'anticorps IgM (P%) et le temps depuis la vaccination (jour) (*** 5 indique une différence très significative p REVENDICATIONS1. Une méthode in vitro pour distinguer chez le bétail un état d'immunisation procuré par le vaccin contre Brucella abortus d'un état d'infection naturelle, caractérisée en ce que l'on détermine les régimes de croissance et de déclin des anticorps de sous-type IgG et IgM spécifiquement dirigés contre Brucella dans un échantillon de sérum de bétail et en ce que l'on détermine des plages pour différents états d'infection ou de vaccination. 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée par le fait que les indicateurs permettant de juger de l'état d'infection / immunisation de l'animal dont le sérum est testé sont les suivants : quand le titre d'IgG spécifiquement dirigés contre Brucella est S/P > 60 % ; et le titre d'IgM spécifiquement dirigés contre Brucella est S/P 60 % ; et le titre d'IgM spécifiquement dirigés contre Brucella est S/P > 85 %, l'animal dont le sérum a été testé est marqué comme état 2, c.-à-d. infection naturelle ou stade précoce de l'immunisation par le vaccin utilisant la souche A19; quand le ratio d'IgG spécifiquement dirigés contre Brucella est S/P entre 20 % et 60 % ; et le titre d'IgM spécifiquement dirigés contre Brucella est S/P > 85 %, ledit animal dont le sérum a été testé est marqué dans l'état 3, c.-à-d. immunisation par le vaccin utilisant la souche A19; quand le ratio d'IgG spécifiquement dirigés contre Brucella est S/P entre 20 % et 60 % ; et le titre d'IgM spécifiquement dirigés contre Brucella est S/P 85 %, ledit animal dont le sérum a été testé est marqué état 5, c.-à-d. immunisation par le vaccin utilisant la souche S2 ou infection aiguë. 3. Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que l'on effectue un second prélèvement dans un délai de 15 à 30 jours après la première détection lorsque l'animal dont 5 le sérum a été testé est classé dans la catégorie 4 et en ce que l'on détermine à nouveau le titre des anticorps IgG et IgM spécifiquement dirigés contre Brucella. 4. La méthode pour distinguer un état d'immunisation par le vaccin contre Brucella abortus d'un état d'infection naturelle conformément à la revendication 1, caractérisée par le fait que le traitement des données peut être réalisé par des moyens informatiques. 10