Brevet FR3068360A1 — publié le 20190104

Procédé d'analyse et de culture cellulaire et système associé La présente invention concerne un procédé d'analyse et de culture cellulaire. Dans le domaine de la culture cellulaire, il est connu de faire croître des colonies cellulaires sur la surface de plaque comprenant un milieu de croissance gélifié par un agent gélifiant notamment de l'agar-agar. Un système couramment utilisé comporte des plaques d'agar-agar disposées dans des boîtes de Petri. Les cellules individuelles sont étalées sur la surface des plaques et se multiplient jusqu'à former une colonie cellulaire. Les colonies cellulaires sont appelées clones, de telles colonies constituent un amas de cellules issues d'une cellule individuelle. Les cellules sont, par exemple, des microorganismes comme des bactéries, des levures ou des champignons filamenteux. Les systèmes sur plaques permettent de quantifier et d'identifier les cellules. Les cellules peuvent être identifiées à partir de nombreuses méthodes, par exemple, une vérification de la capacité de croissance d'une colonie sur un milieu sélectif, un marquage sélectif, une mesure de spectroscopie de masse ou autre. La croissance de colonies bactériennes sur un milieu sélectif contenant un antibiotique est utilisée, par exemple, pour déterminer la résistance d'une bactérie à l'antibiotique. Cependant, certaines cellules doivent être étudiées dans des conditions particulières telles que des conditions anoxiques. L'anoxie est une diminution de l'oxygène dissous ou présent et biodisponible dans le milieu. Par exemple, les cellules qui vivent dans des milieux extrêmes tels que le fond d'un océan, le fond de puits de pétrole ou les intestins d'un animal survivent dans les milieux anoxiques ou anaérobies. On appelle « milieu anaérobie », un milieu où il n'y a pas de présence d'oxygène sous forme de dioxygène. Ainsi, chaque étape pour cultiver ou étudier ces cellules doit être effectuée sous des conditions de sécurité particulières de façon à préserver le caractère anaérobie du milieu des cellules. Ainsi, il est connu de manipuler les cellules dans une boîte à gants. Une boîte à gants est une enceinte étanche qui permet des manipulations dans une atmosphère particulière. Des gants, fixés à une des parois transparentes de l'enceinte, permettent d'accéder à l'intérieur sans que le confinement ne cesse. L'opérateur place ses mains dans les gants et voit alors ses manipulations à travers la paroi transparente. Par exemple, dans une boite à gants, l'opérateur isole des cellules par dilution limite dans une plaque de microtitration. Puis, une fois les cellules isolées dans les puits de la plaque, la plaque est scellée. La plaque est ensuite sortie hors de la boite à gant et transférée dans un incubateur pour permettre la culture des cellules et la formation de clones. A la suite d'une phase d'incubation, la plaque est ensuite introduite à nouveau 2 dans une boîte à gant sous atmosphère contrôlée puis descellée et les clones sont récupérés pour effectuer différentes analyses. Il est connu d'effectuer, par exemple, un tri de clone par un cytomètre placé dans une boîte à gant sous atmosphère anaérobie. Cependant, l'ensemble de ces manipulations rend le procédé très contraignant et 5 difficile à contrôler. En outre, l'espace de manipulation dans une boite à gant est relativement restreint, ce qui limite le nombre d'actions possibles pour le manipulateur. Aussi, étant donnés la lourdeur des manipulations, le nombre d'étapes dans une boite à gants est réduits au maximum. Par exemple, il n'est effectué qu'une seule mesure sur les échantillons à la fin de l'incubation. De telles manipulations empêchent donc les analyses 10 à haut-débit de cellules avec un suivi au cours de l'incubation. Un but de l'invention est de fournir un procédé permettant de façon simple, un isolement de cellules, une mise en culture de cellules et une caractérisation de la culture ainsi qu'une récupération, pour des populations de cellules particulières en limitant les risques de contamination. 15 A cet effet, l'invention a pour objet un procédé d'analyse et de culture cellulaire comprenant les étapes suivantes : - la génération d'un train de gouttes ordonnées dans un fluide porteur, le train de gouttes comprenant au moins une goutte de culture, la goutte de culture comprenant un milieu de culture et au moins une cellule, 20 - la mise en circulation du train de gouttes dans un tube, - l'incubation du train de gouttes dans le tube, - la mesure d'au moins un paramètre indicatif du contenu de la goutte de culture dans le tube à différents instants, - la récupération de la goutte de culture à une extrémité du tube, 25 les étapes étant effectuées dans une atmosphère contrôlée. Le procédé d'analyse et de culture cellulaire selon l'invention peut comprendre l'une ou plusieurs des caractéristiques suivantes, prises isolément ou selon toute combinaison techniquement possible : - le procédé comprend, en outre, une étape d'analyse des mesures effectuées 30 pour la goutte de culture, la récupération de la goutte de culture ou la poursuite de l'incubation dépendant du résultat de l'analyse ; - l'atmosphère contrôlée est une atmosphère anaérobie ; - le paramètre est un paramètre indicatif de la croissance d'un clone dans la goutte de culture ; 3 - le procédé comprend une étape de préparation du système dans lequel un gaz, dont la composition est contrôlée, est injecté dans le tube avant l'étape de génération du train de gouttes. L'invention a également pour objet un système d'analyse et de culture cellulaire 5 comprenant : - un tube, - un module de génération d'un train de gouttes ordonnées dans un fluide porteur, le train de gouttes comprenant au moins une goutte de culture, la goutte de culture comprenant un milieu de culture et au moins une cellule, 10 - un dispositif de mise en circulation du train de gouttes dans le tube, - un dispositif d'incubation du train de gouttes dans le tube, - un dispositif de mesure, propre à mesurer au moins un paramètre indicatif du contenu de la goutte de culture dans le tube à différents instants, - un dispositif de récupération de la goutte de culture à une extrémité du tube, 15 - un dispositif de contrôle de l'atmosphère propre à contrôler l'atmosphère dans le système d'analyse et de culture. Le système d'analyse et de culture cellulaire selon l'invention peut comprendre l'une ou plusieurs des caractéristiques suivantes, prises isolément ou suivant toute combinaison techniquement possible : 20 - le dispositif de contrôle de l'atmosphère comprend une enceinte à atmosphère contrôlée contenant le module de génération, le dispositif de mise en circulation, le tube, le dispositif d'incubation, le dispositif de mesure, et le dispositif de récupération ; - le tube est imperméable aux gaz, le dispositif de contrôle de l'atmosphère comprenant une enceinte à atmosphère contrôlée contenant le dispositif de récupération, 25 au moins une partie du tube étant disposée hors de l'enceinte à atmosphère contrôlée ; - le tube présente une zone de mesure, le dispositif de mesure étant propre à mesurer le paramètre indicatif du contenu de la goutte de culture à différents instants au niveau de la zone de mesure, la zone de mesure du tube étant placée dans une enceinte à atmosphère contrôlée, les parties du tubes ne s'étendant pas dans une enceinte à 30 atmosphère contrôlée étant couvert par une gaine imperméable ; - le train de gouttes comprend au moins une goutte comprenant un agent indicateur d'oxygène ; - le train de gouttes comprend au moins une goutte comprenant un agent réducteur d'oxygène ; 35 - le dispositif d'incubation comprend une bobine propre à être régulée en température, une partie du tube étant enroulée autour de la bobine ; 4 - le module de génération comprend : - un réservoir comprenant une suspension de cellules dans une atmosphère anaérobie, le réservoir étant scellé par un septum, - un dispositif de prélèvement propre à percer le septum pour prélever une 5 partie de la suspension ; - le système d'analyse et de culture cellulaire comprend au moins une électrovanne imperméable propre à isoler entre elles deux parties du tube. L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui va suivre, donnée uniquement à titre d'exemple et faite en se référant aux dessins annexés, sur 10 lesquels : - la figure 1 est une représentation schématique d'un premier système d'analyse et de culture cellulaire selon l'invention ; - la figure 2 est une représentation schématique d'un deuxième système d'analyse et de culture cellulaire selon l'invention ; et 15 - la figure 3 est une représentation schématique d'un troisième système d'analyse et de culture cellulaire selon l'invention, - la figure 4 est une vue d'une partie d'un quatrième système d'analyse et de culture cellulaire selon l'invention. Dans la description qui va suivre, les termes « amont » et « aval » et les termes 20 « entrée » et « sortie » sont utilisés en référence aux sens normaux de circulation des fluides dans le système. Le terme « diamètre » désigne l'étendue maximale du tube considéré dans un plan transversal, c'est-à-dire perpendiculaire, à l'axe central du tube, par exemple, le diamètre d'un cercle dans le cas où la section transversale du tube est circulaire ou la diagonale d'un rectangle dans le cas où la section transversale du tube est 25 rectangulaire. La figure 1 illustre un premier système d'analyse et de culture cellulaire. Le premier système d'analyse et de culture cellulaire 1 est un système pour cultiver, analyser et récupérer des cellules 4 en atmosphère contrôlée 6. Les cellules 4 sont, par exemple, des microorganismes comme des bactéries, des 30 levures, des algues ou des champignons filamenteux. Les cellules 4 sont, par exemple, des cellules procaryotes ou eucaryotes. Les cellules 4 sont par exemple à anaérobies stricts, c'est-à-dire des cellules qui meurent lorsqu'elles sont exposés à du dioxygène à teneur atmosphérique, et peuvent indifféremment utiliser la fermentation ou la respiration anaérobie. 35 En variante, les cellules 4 sont à anaérobies facultatives, c'est-à-dire des cellules qui peuvent utiliser le dioxygène en présence dans le milieu de culture. En présence 5 d'oxygène, ces cellules 4 peuvent utiliser la respiration aérobie, alors que, en absence d'oxygène, une partie de ces organismes fermentent et la seconde effectue une respiration anaérobie. En variante, les cellules 4 sont des microaérophiles, c'est-à-dire des cellules qui 5 peuvent utiliser l'oxygène, mais dans des concentrations minimes (de l'ordre de la !mol); leur développement est inhibé dans les conditions normales de concentration en oxygène (près de 200 !mol). Ces cellules utilisent en majorité la respiration aérobie, même si une partie peut aussi utiliser la respiration anaérobie. Par exemple, les cellules 4 sont issues de lignées cellulaires. En variante, les 10 cellules 4 sont issues de prélèvements. Les prélèvements sont par exemple effectués au sein de puits de pétrole, d'une carotte glaciaire, au fond d'un océan ou au sein d'un organisme vivant. Par exemple, les cellules 4 sont des bactéries intestinales. Les cellules sont, par exemple, des bactéries choisies parmi Clostridium difficile, Mycobacterium tuberculosis et Nocardia asteroides. En variante, les cellules 4 sont des bactéries du sol, 15 tels que Clostridium subterminale, C. sordellii, C. sporogenes, C. indolis, C. bifermentans, C. mangenoti, C. perfringen, C. Botulinum, ou C. tetani. On appelle une « atmosphère contrôlée» 6, une atmosphère dont la concentration en différent gaz est contrôlée, comme cela sera décrit par la suite. Avantageusement, l'atmosphère contrôlée 6 est dépourvue d'oxygène et adaptée à la survie des cellules 4 20 étudiées. Le premier système d'analyse et de culture cellulaire 1, selon l'invention, comporte un tube 10, un module de génération 12 d'un train 14 de gouttes 16 destiné à circuler dans le tube 10, un dispositif de mise en circulation 18 du train 14 de gouttes 16 dans le tube 10, un dispositif d'incubation 20 du train 14 de gouttes 16 dans le tube 10, un 25 dispositif de mesure 22, une unité centrale 24, un dispositif de récupération 26 et un dispositif de contrôle 28 de l'atmosphère. Le tube 10 est un tube capillaire ou tube fluidique à l'échelle millimétrique c'est-à-dire présentant un diamètre intérieur de l'ordre du dixième du millimètre au millimètre, de préférence compris entre 0,5 et 2 mm. 30 Le tube 10 présente une section transversale intérieure de contour arrondi, tel que circulaire ou elliptique, ou polygonale telle que rectangulaire. Le tube 10 présente une zone d'incubation 30 et une zone de mesure 32. En outre, le tube 10 présente une extrémité d'entrée 34 et une extrémité de sortie 36. Le module de génération 12 d'un train 14 de gouttes 16 est propre à générer un 35 train 14 de gouttes 16. 6 Un train 14 de gouttes 16 est une succession de gouttes 16 ordonnées dans un fluide porteur 40. Le fluide porteur 40 est, avantageusement, une phase organique, notamment une phase huileuse. Le fluide porteur 40 comprend, par exemple, des hydrofluoroéthers 5 comme FC-40 ou HFE-7500, formant une huile fluorée. En variante, le fluide porteur 40 comprend une huile silicone ou une huile organique telle que de l'huile minérale. Le fluide porteur 40 est apte à séparer deux gouttes 16 successives du train 14 de gouttes 16. Le train 14 de gouttes 16 comprend au moins une goutte de culture 42. En outre, 10 tel que représenté sur la figure 1, le train de gouttes comprend au moins une goutte de test 44 et une goutte d'absorption 46. Le train 14 de gouttes 16 comprend avantageusement des séparateurs 120. Un séparateur 120 est une bulle de gaz. Par exemple, la composition en gaz dans le séparateur 120 correspond à la composition de l'atmosphère contrôlée 6. Le séparateur 15 120 favorise l'espacement entre deux gouttes 16 successives du train 14 de gouttes 16 pour prévenir le contact ou la fusion des gouttes 16. Dans un exemple non représenté, le train 14 de gouttes 16 comprend un séparateur 120 entre chaque goutte 16. Chaque goutte 16 du train 14 de gouttes 16 constitue un compartiment fermé 20 rempli de fluide interne 48. Chaque goutte 16 comprend un fluide interne 48 non miscible avec le fluide porteur 40. On entend par non miscible que le coefficient de partage entre les deux fluides est inférieur à 10-3. Le fluide interne 48 est, avantageusement, une phase aqueuse. Le volume des gouttes 16 du train 14 de gouttes 16 est, par exemple, compris 25 entre 100 nL et 2 pL. Dans un exemple, le volume des gouttes de culture 42 est sensiblement le même d'une goutte de culture 42 à l'autre. La goutte de culture 42 comprend un milieu de culture 50 et au moins une cellule 4. 30 Le milieu de culture 50 comprend un milieu de culture liquide adapté à la survie et à la croissance de la cellule 4 comme une solution tamponnée complétée avec des nutriments de culture, des vitamines, des donneurs et des accepteurs d'électrons. Par exemple, le milieu de culture 50 liquide est du Yeast extract-Casein hydrolysate-Fatty Acids (YCFA), du Cooked Meat Broth (CMB), du Chopped Meat Carbohydrate Broth, du 35 Columbia broth, du milieu de culture au sang, du milieu infusion coeur-cerveau, (Brain- 7 heart infusion medium BHIM) ou du milieu à base d'extrait d'estomac de mouton. Par exemple, le milieu de culture 50 contient avantageusement des antibiotiques. Avantageusement, la goutte de culture 42 comprend, en outre, un marqueur de viabilité des cellules 4 tel que de la calcéine AM. 5 Avantageusement, la goutte de culture 42 comprend, en outre, un indicateur de croissance. Par exemple, l'indicateur est la carboxyfluorescein diacetate (CFDA) ou un indicateur de la présence d'ATP utilisant une luciférase. La goutte de culture 42 comprend en outre des éléments sécrétés par la cellule 4 comme des protéines. Avantageusement la goutte de culture 40 comprend des entités de 10 signalisation propre à indiquer la présence d'éléments sécrétés et à permettre leur quantification. Par exemple, les entités de signalisation sont des substrats fluorogénique qui indique la présence d'une enzyme. Avantageusement, des gouttes de test 44 et des gouttes d'absorption 46 sont placées au voisinage de chaque goutte de culture 42 dans le train 14 de goutte 16. 15 Par exemple, le train 14 de gouttes 16 comprend successivement, pour chaque goutte de culture 42, une goutte d'absorption 46, une goutte de test 44, ladite goutte de culture 42, une goutte de test 44 et une goutte d'absorption 46. Ainsi, les gouttes de test 44 encadrent la goutte de culture 42. Une goutte de test 44 permet de vérifier la composition en gaz dissous au 20 voisinage de la goutte de culture 42. La goutte de test 44 comprend un agent indicateur d'oxygène. L'agent indicateur d'oxygène est par exemple un indicateur coloré. L'agent indicateur d'oxygène est, par exemple, la resazsurine ou encore MitoXpresse Xtra (Luxcel Biosciences). En variante ou en complément, la goutte de test 44 présente d'autres indicateurs permettant de détecter 25 la présence d'autres gaz. La goutte d'absorption 46 comprend un agent réducteur d'oxygène. L'agent réducteur est par exemple propre à réduire le dioxygène de la goutte d'absorption 46. Cette réduction d'oxygène permet de réduire le taux de dioxygène dissous au voisinage de la goutte de culture 42. L'agent réducteur de l'oxygène dissout dans l'eau pourra être 30 choisi parmi l'hydrazine ou un de ses sels, des sulfites acide ou neutre alcalin ou alcalino- terreux, tel que sulfite de sodium, nitrites, hyposulphites, thiosulfates, hydroxylamine, acide ascorbique, ou un mélange de deux ou plus de ceux-ci. Préférentiellement, on utilisera de l'hydrate d'hydrazine qui présente l'avantage d'être un réducteur immédiat de l'oxygène dissous dans l'eau, à faible concentration. 8 Dans une variante, des agents indicateurs d'oxygène et/ou réducteur d'oxygène sont placés directement dans la goutte de culture 42. Ces agents réducteurs pourront être choisis parmi la cystéine, l'acide ascorbique ou le sodium thioglycollate. Le module de génération 12 du train 14 de gouttes 16 comporte un ou une 5 pluralité de réservoirs 60, un dispositif de prélèvement 62 et un circuit d'entrée 64. Le module de génération 12 comporte, en outre, un réservoir complémentaire 61. Le réservoir complémentaire 61 comporte du fluide porteur 40. Chaque réservoir 60 comprend un fluide nécessaire à la formation du train 14 de gouttes 16. 10 Par exemple, des réservoirs 60 sont différents compartiments d'une plaque 66 de microtitration. En variante, les réservoirs 60 sont des tubes à essais tel que des tubes Falcon® ou des microtubes comme ceux commercialisés par Eppendorf®. Un réservoir 60 comprend une suspension de cellules 4. La concentration des cellules 4 dans le réservoir 60 de cellules 4 est avantageusement adaptée pour que lors 15 de la génération des gouttes de culture 42, les gouttes de culture 42 comprennent uniquement une cellule 4. Par exemple, la concentration de cellules 4 dans la suspension est comprise entre 102 et 105 cellules par millilitres. Par exemple, un réservoir 60 comporte le milieu de culture 50. Par exemple, d'autres réservoirs 60 contiennent des réactifs à mettre dans la goutte de culture. 20 Par exemple, un réservoir 60 comprend un agent indicateur d'oxygène. Par exemple, un réservoir 60 comprend un agent réducteur d'oxygène. Le dispositif de prélèvement 62 est propre à prélever des solutions dans chacun des réservoirs 60 de sorte à former un train 14 de gouttes 16 ordonnées dans le fluide porteur 50, le train 14 de gouttes 16 comprenant au moins une goutte de culture 42. 25 Le dispositif de prélèvement 62 est propre à préparer le train de gouttes dans le circuit d'entrée 64. Par exemple, le dispositif de prélèvement 62 comporte un bras robotisé de pipetage. En variante ou en complément, le dispositif de prélèvement 62 comporte une tête d'aspiration. L'utilisation d'un dispositif de prélèvement 62 robotisé permet de limiter 30 l'espace nécessaire aux manipulations. Par exemple le dispositif de prélèvement 62 comprend un réservoir de gaz 68. Le gaz du réservoir 68 présente une composition de gaz correspondant à la composition de l'atmosphère contrôlée. Le réservoir de gaz 68 sert, par exemple, à mettre sous pression les différents réservoirs 60, 61 pour faciliter le prélèvement. Par exemple, le dispositif de 35 prélèvement 62 est propre à injecter un fluide dans le circuit d'entrée 64 en poussant le fluide depuis le réservoir 60, 61 au moyen du gaz jusque dans le circuit d'entrée 64. 9 En variante ou en complément, le dispositif de prélèvement 62 comporte, une pompe d'aspiration placée à la sortie 36. La pompe est propre à aspirer les différents fluides et à placer les réservoirs 60,61 sous dépression. Par exemple, la pompe est un compresseur ou une pompe gerotor. 5 Le dispositif de prélèvement 62 comprend avantageusement un robot propre à préparer le contenu des réservoirs 60 dans l'enceinte. Le circuit d'entrée 64 est connecté à l'entrée 34 du tube 10. Le circuit d'entrée 64 comporte un dispositif de fragmentation 70 propre à générer des gouttes 16 à partir de la suspension prélevée et d'un fluide porteur 40. 10 Par exemple, le circuit d'entrée 64 comprend un décrochement ou une marche facilitant la fragmentation des fluides et la génération des gouttes 16. En variante, le circuit d'entrée 64 comprend une jonction à focalisation de flux, dite jonction « flow focusing », ou une jonction T. Le fluide porteur 40 est, par exemple, injecté, au niveau du circuit d'entrée 64, le 15 long du tube d'aspiration 10 par le dispositif d'injection de sorte à former les gouttes 16 du train de goutte par co-écoulement Le dispositif de mise en circulation 18 du train 14 de gouttes 16 est propre à déplacer le train 14 de gouttes 16 au sein du tube 10 depuis l'entrée 34 jusqu'à la sortie 36. 20 Le dispositif de mise en circulation 18 comprend, par exemple, une unité de soufflage et/ou une unité d'aspiration. Le dispositif de mise en circulation 18 est avantageusement propre à faire circuler le train 14 de gouttes 16 de la zone d'incubation 30 à la zone de mesure 32 puis de la zone de mesure 32 à la zone d'incubation 30. Les gouttes 16 peuvent ainsi être 25 déplacées dans les deux sens dans le tube 10. Par exemple, la zone de mesure 32 est située en aval de la zone d'incubation 30. Le dispositif de mise en circulation 18 est propre à faire passer la goutte de culture 42 de la zone d'incubation 30 à la zone de mesure 32 pour mesurer le paramètre indicatif du contenu de la goutte de culture 42. Le dispositif de mise en circulation 18 est également 30 propre à faire passer la goutte de culture 42 de la zone de mesure 32 à la zone d'incubation 30 pour poursuivre l'incubation de la goutte de culture 42. Le dispositif de mise en circulation 18 est propre à générer un débit du train 14 de gouttes 16 et de fluide porteur 40 dans le tube compris entre 0,1 mL/hr et 5 mL/hr. Le dispositif d'incubation 20 est propre à contrôler la température de la zone 35 d'incubation 30 du tube 10. Par exemple, le dispositif d'incubation 20 est propre à chauffer ou à refroidir la zone d'incubation 30 du tube à une température comprise entre 4° et 10 100°C, par exemple comprise entre 20 °C et 50°C etnotamment à 37°C. Dans un exemple, pour cultiver et analyser des microorganismes associés à des pathologies humaines, la température est réglée à 37°C. Le dispositif d'incubation 20 comprend une bobine 72 propre à être régulée en 5 température, la partie du tube 10 correspondant à la zone d'incubation 30 étant enroulée autour de la bobine 72. Cet enroulement permet de réduire l'encombrement nécessaire pour avoir une grande longueur d'incubation. Par exemple la longueur du tube 10 enroulée dans la zone d'incubation 30 est comprise entre 10 mètres et 100 mètres. 10 En variante, le dispositif d'incubation comprend une chambre délimitée par des parois d'isolation thermique, un élément chauffant et refroidissant tel qu'un module Peltier, un ventilateur permettant de faire circuler le gaz de convection de contenu et une sonde de température. Le dispositif de mesure 22 est propre à mesurer un paramètre indicatif du contenu 15 de la goutte de culture 42 dans le tube 10 au niveau de la zone de mesure 32 à différent instant. Par exemple, le paramètre est représentatif de la croissance d'un clone dans la goutte ou de la survie des cellules. De telles mesures successives permettent de réaliser pour chaque goutte de culture des courbes de cinétiques de croissance au sein de la 20 goutte au cours de l'incubation. Par exemple, le dispositif de mesure est propre à effectuer une mesure de densité optique, de diffusion de la lumière, et/ou une analyse sur une 'image d'une goutte. En variante ou en complément le dispositif de mesure 22 est propre à détecter ou à quantifier une protéine. 25 Par exemple, la mesure est une mesure optique, comme une mesure de fluorescence. Avantageusement, le dispositif de mesure 22 est propre à mesurer le taux d'oxygène dans un goutte 16. Par exemple, la mesure du taux d'oxygène est effectuée par détection de l'agent indicateur d'oxygène. 30 L'unité centrale 24 comporte une mémoire et un microprocesseur. L'unité centrale 24 est propre à enregistrer les données du dispositif de mesure 18 pour chaque goutte de culture 42. L'unité centrale 24 est propre à analyser les mesures effectuées pour une goutte de culture 42 et à contrôler la récupération de la goutte de culture 42 ou la poursuite de 35 l'incubation selon le résultat de l'analyse. 11 Le dispositif de récupération 26 est propre à permettre la récupération de chaque goutte 16 individuellement. Le dispositif de récupération 26 comprend, par exemple, un récipient de récupération 80 comprenant plusieurs compartiments 82, et un dispositif de déplacement 5 84 du récipient de récupération 80 par rapport à la sortie 36 du tube 10 de sorte qu'un nouveau compartiment 82 soit placé en regard de la sortie 36 du tube pour chaque goutte 16 à récupérer. Le dispositif de contrôle de l'atmosphère 28 est propre à contrôler l'atmosphère 6 dans le système d'analyse de culture. 10 L'atmosphère contrôlée 6 est une atmosphère adaptée aux cellules. L'atmosphère contrôlée 6 est, par exemple, une atmosphère anaérobie. Par exemple, l'atmosphère contrôlée 6 est stabilisée à 85% de diazote et 15 (3/0 de dioxyde de carbone. Une atmosphère anaérobie est une atmosphère ne comprenant pas d'oxygène. En variante ou en complément, l'atmosphère contrôlée 6 comprend de 15 l'hydrogène. La composition peut alors être 85% de diazote et 10 (3/0 de dioxyde de carbone et 5% de dihydrogène. Le dispositif de contrôle de l'atmosphère 28 comporte un sas 90, une enceinte 92 fermée et un dispositif de régulation 94. Le sas 90 permet d'introduire, par exemple, une plaque 66 avec les différents 20 réservoirs 60, un réservoir complémentaire 61 contenant le fluide porteur préalablement dégazé ou de récupérer le récipient de récupération 80. En variante ou en complément, le sas 90 permet de recharger les réservoirs 60 de liquides ou de gaz. Le sas 90 définit un volume intérieur à atmosphère contrôlée et comporte une 25 porte extérieure 96 et une porte intérieure 98. Chaque porte 96, 98 est mobile entre une position ouverte et une position fermée. La porte extérieure 96 permet en position ouverte, l'introduction de composants dans le sas 90 ou l'extraction de composant depuis le sas 90. La porte extérieure 96 est propre à isoler l'atmosphère du sas 90 de l'atmosphère extérieur en position fermée. 30 Le sas 90 est relié à l'enceinte 92 par la porte intérieure 98. La porte intérieure 98 permet en position ouverte l'introduction de composants depuis le sas 90 dans l'enceinte 92 ou l'introduction de composants depuis l'enceinte 92 vers le sas 90. La porte intérieure 98 est propre à isoler l'atmosphère du sas 90 de l'atmosphère de l'enceinte 92 en position fermée. 35 L'enceinte 92 définit un volume intérieur 100 à atmosphère contrôlée 6. 12 Dans un exemple, l'enceinte 92 est une boite à gants. Les gants permettent d'agir manuellement, par exemple, pour préparer les réservoirs avant la formation du train de goutte ou pour sceller ou pour desceller un récipient, pour déplacer le récipient de récupération 80 vers le sas 90. 5 En variante, l'enceinte 92 est une carcasse fermée sans gants et un robot permet d'automatiser les opérations effectuées manuellement. Le dispositif de régulation 94 est propre à contrôler l'état de l'atmosphère 6 dans l'enceinte 92 et dans le sas 90. Le dispositif de régulation 94 est propre à injecter un gaz dans le volume intérieur 100 en fonction de la pression partielle des différents gaz 10 contenus dans le volume intérieur 100. Le dispositif de régulation 94 comporte, par exemple, pour chaque gaz de l'atmosphère contrôlée, un capteur 102 et une réserve de gaz 104. En variante, le dispositif de régulation 94 comporte une unique réserve de gaz 104 comprenant avec le mélange de gaz dans des proportions correspondant aux proportions 15 dans l'atmosphère contrôlée 6. En complément, le dispositif de contrôle 28 de l'atmosphère comprend, avantageusement, un détecteur d'oxygène 106. Le dispositif comprend un système d'élimination de l'oxygène résiduel comprenant un catalyseur. 20 Dans le premier système d'analyse et de culture 1, le tube 10, le module de génération 12 du train 14 de gouttes 16, le dispositif de mise en circulation 18 du train 14 de gouttes 16, le dispositif d'incubation 20 du train 14 de gouttes 16, le dispositif de mesure 22 et le dispositif de récupération 26 sont disposés dans le volume intérieur de l'enceinte 92. 25 Les dimensions externes du dispositif de contrôle 28 sont ainsi les dimensions externes du premier système d'analyse et de culture cellulaire 1. Avantageusement, les dimensions du dispositif de contrôle 28 sont telles qu'il puisse être disposé sur une paillasse de laboratoire. Dans un exemple, le dispositif de contrôle 28 mesure 1452 mm de longueur, 1056 mm de profondeur et 993 mm de 30 hauteur. Dans un autre exemple, le dispositif de contrôle 28 mesure 810 mm de longueur, 760 mm de profondeur et 635 mm de hauteur. Le procédé d'analyse et de culture cellulaire va maintenant être décrit. Le procédé comprend la fourniture d'un premier système d'analyse et de culture cellulaire. 35 Avantageusement, le procédé comprend une étape de préparation du système à l'analyse. 13 Au cours de cette étape, la composition en gaz du volume intérieur 100 de l'enceinte 92 est vérifiée et régulée pour être à l'atmosphère contrôlée 6. Les réservoirs 60 sont par exemple scellés et introduit dans l'enceinte 92 par le sas 90. Ils sont ensuite descellés une fois dans l'enceinte 92. 5 Les réservoirs 60 contenant les liquides à utiliser sont ensuite laissé pendant 24 heures dans l'enceinte 92 du dispositif de contrôle 28 afin d'équilibrer les gaz dissous. En variante, les réservoirs 60 sont préparés dans l'enceinte avant la génération du train 14 de gouttes 16. Par exemple, cette préparation est manuelle, en variante, elle est effectuée par un robot. 10 Le procédé comprend, en outre, la génération d'un train 14 de gouttes 16 ordonnées dans un fluide porteur 12, la mise en circulation du train 14 de gouttes 16 dans le tube 10, l'incubation du train 14 de gouttes 16, la mesure d'au moins un paramètre indicatif du contenu de la goutte de culture 42 dans le tube 10 à différents instants au cours de l'incubation et la récupération de la goutte de culture 42 à une extrémité 36 du 15 tube 10, les étapes étant effectuées dans une atmosphère contrôlée 6. Le train 14 de gouttes 16 est généré par le module de génération 12 du train de gouttes. Par exemple, le train 14 de gouttes 16 est mis en circulation à un débit de 1mL/hr. La zone d'incubation 30 du tube est maintenue à une température de 37°C 20 L'incubation est effectuée dans la zone d'incubation 30 du tube 10. L'incubation est effectuée par phases successives, une mesure est effectuée à la fin de chaque phase d'incubation. Avantageusement, chaque phase d'incubation dure 30 minutes. Par exemple, au total l'incubation dure entre 4 heures et 72 heures. 25 Lors de l'étape de mesure, la goutte de culture 42 est placée dans la zone de mesure 32. La mesure comprend par exemple, la mesure d'un signal de fluorescence indicatif de la croissance d'un clone dans la goutte de culture 42. Avantageusement, la mesure comprend en outre la mesure du taux d'oxygène dans la goutte de culture 42 ou dans la goutte de test 44. Par exemple, la mesure du taux 30 d'oxygène est effectuée par détection de l'agent indicateur d'oxygène. Avantageusement, le procédé comprend en outre, une étape d'analyse des mesures effectuées pour la goutte de culture 42, la récupération de la goutte de culture ou la poursuite de l'incubation dépendant du résultat de l'analyse. Cette étape est mise en oeuvre par l'unité centrale 24. 35 Avantageusement, la vitesse de croissance est déterminée par l'unité centrale 18, la goutte de culture 42 est récupérée après un ralentissement de la croissance du clone. 14 Par exemple, lorsqu'il est détecté dans la goutte de culture 42 qu'une molécule est produite par une cellule 4 ou une population de cellule, la goutte de culture 42 est récupérer dans le support de récupération 80. Si la mesure correspond à un critère de sélection de l'utilisateur par exemple 5 lorsqu'il est mesuré que le clone est encore en phase d'accélération de la croissance, la goutte de culture 42 est remise dans la zone d'incubation 30 par le dispositif de mise en circulation 18. Le critère est, par exemple, une quantité de biomasse finale ou une vitesse de croissance. Par exemple, lorsqu'il est détecté que la goutte de culture 42 ne comprend pas de cellules, la goutte de culture 42 est évacuée. De même, si la mesure ne 10 correspond pas aux critères de sélection de l'utilisateur la goutte de culture 42 est évacuée. La méthode permet ainsi d'isoler des cellules, au moment de la formation du train de gouttes, de les cultiver en atmosphère contrôlée et d'effectuer un contrôle au cours de la culture des cellules, puis de trier et récupérer isolément les clones obtenus. 15 Dans ce système, l'ensemble des éléments du système étant contenu dans l'enceinte 92, la vérification de la qualité de l'atmosphère 8 est simplifiée. Un deuxième système d'analyse et de culture cellulaire 110 va être présenté en regard de la figure 2. Seules les différences avec le premier système 1 vont être présentées. Le deuxième système d'analyse et de culture cellulaire 110 diffère du premier 20 système d'analyse et de culture cellulaire 1 en ce que le tube 10 est imperméable aux gaz. Le tube 10 est notamment imperméable à l'oxygène ce qui permet d'éviter de contaminer le milieu interne du tube 10 par ses parois. Dans ce deuxième système, le réservoir de cellules 112 comprenant la suspension 25 de cellules 4 est scellée par un septum 114. Par exemple, les autres réservoirs 60, 61 sont des canisters scellés et dégazés. Par exemple un indicateur de qualité est ajouté dans chaque liquide. Avantageusement, le volume intérieur de chaque réservoir 60, 72 est clos et présente l'atmosphère présente la composition de l'atmosphère contrôlée 6. 30 Les réservoirs 60, 61 sont mis sous pression par injection d'un gaz dont la composition est contrôlée. En outre, le dispositif de prélèvement 62 est propre à percer le septum 114 pour prélever une partie de la suspension de cellules 4. Le circuit d'entrée 64 et le tube 10 comprennent des électrovannes 122. 15 Chaque électrovanne 122 est imperméable et propre à isoler fluidiquement entre elles deux parties du circuit d'entrée 64 ou deux parties du tube 10 ou le circuit d'entrée 64 du tube 10. Par exemple, le deuxième système 110 comprend avantageusement une 5 électrovanne 122 à chaque entrée du circuit d'entrée 64 et une électrovanne 122 avant la zone de génération des gouttes 16. Par exemple, une électrovanne 122 sépare la zone de mesure de la sortie 34 du tube 10. Dans la partie en contact avec le fluide porteur 40, l'électrovanne 122 est en 10 matériau compatible avec le fluide porteur 40. Par exemple, chaque électrovanne est en EPDM (éthylène-propylène-diène monomère). Lorsque le dispositif de mise en circulation 18 comporte une unité de soufflage, celle-ci souffle un gaz à la composition de l'atmosphère contrôlée 6. 15 Le dispositif de contrôle de l'atmosphère 130 comprend une enceinte 132 à atmosphère contrôlée contenant le dispositif de récupération 26. L'enceinte 132 est analogue à l'enceinte 92 décrit précédemment. Avantageusement le dispositif de contrôle de l'atmosphère 130 comprend un sas 90 connecté à l'enceinte 132 et un dispositif de régulation 94 tel que précédemment décrit. 20 Le volume de l'enceinte 132 est compris entre 0,4 m3 et 1,5 m3. Le tube 10 est pourvu d'un joint d'étanchéité 134 entre la partie extérieure à l'enceinte et la partie intérieure de l'enceinte. Le procédé de d'analyse et de culture cellulaire avec le deuxième système 110 diffère du procédé précédemment décrit en ce que au cours de l'étape de préparation du 25 deuxième système, un gaz, dont la composition est contrôlée, est injecté dans le tube 10. L'étape de préparation est réalisée avant l'étape de génération du train 14 de gouttes 16. Le gaz introduit dans le tube 10 est poussé jusqu'à la sortie 36 pour éliminer les résidus d'oxygène avant l'opération. Un récipient de sortie est branché au niveau de la sortie. Par exemple, le récipient 30 de sortie est détaché sous flux de gaz constant pour éviter une entrée d'air par la sortie. Pour vérifier qu'il n'y a pas de contamination, l'étanchéité du système est vérifiée avant la mise en circulation ou après la récupération En outre, les indicateurs permettent de vérifier le taux d'oxygène au cours de l'incubation. 16 Ce deuxième système 110 permet une consommation de gaz limitée pour le contrôle de l'atmosphère 6. En effet, le volume de l'enceinte est restreint car il ne comprend que la zone de récupération. Dans une variante du deuxième système 110, les réservoirs 60 sont différents 5 compartiments d'une plaque de microtitration. La plaque est par exemple préparée et scellée en amont dans un environnement contrôlé. Dans une variante du deuxième système, le fluide porteur 40 comprend une huile fluorée. Le coeur du tube 10 est en PTFE, ce matériau étant compatible avec l'huile fluoré et transparent. Le PTFE n'étant pas complétement imperméable à l'oxygène, le tube est 10 recouvert d'une gaine externe. La gaine externe est imperméable à l'oxygène. Avantageusement la gaine externe est transparente pour permettre la mesure. En variante, le coeur du tube est en FEP (pour Fluorinated ethylene propylene). Un troisième système d'analyse et de culture cellulaire 140 va être présenté en regard de la figure 2. Seules les différences avec le deuxième système 1 vont être 15 présentées. Le deuxième système d'analyse et de culture cellulaire 140 diffère du premier système d'analyse et de culture cellulaire 1 en ce que la zone de récupération et de préparation sont dans une même enceinte 132. Ainsi, les mêmes réservoirs que dans le mode de réalisation de la figure 1 peuvent être utilisés. Dans une variante du troisième système d'analyse 140, le même robot et la même 20 pointe sont utilisés pour les étapes de préparation et de récupération. Par exemple, une des extrémités 34, 36 du tube 10 est à la fois utilisée comme extrémité d'entrée et extrémité de sortie. Un quatrième système d'analyse et de culture cellulaire 200 va être présenté en regard de la figure 3. Seules les différences avec le deuxième système 1 vont être 25 présentées. Le quatrième système d'analyse et de culture cellulaire 200 diffère du deuxième système d'analyse et de culture cellulaire 110 en ce que les parties du tube 10 ne s'étendant pas dans une enceinte à atmosphère contrôlée sont couverts par une gaine imperméable 202. Par exemple la gaine 202 imperméable est métallique. 30 La gaine 202 est défaite au niveau de la zone de mesure 32. La zone de mesure 32 du tube 10 est placée dans une enceinte à atmosphère contrôlée 204. L'enceinte 204 est analogue à l'enceinte 92 décrit précédemment. Avantageusement le dispositif de contrôle de l'atmosphère 130 comprend un dispositif de régulation 94 tel que précédemment décrit propre à réguler l'atmosphère dans l'enceinte 204. 35 Le dispositif de mesure 22 est disposé dans l'enceinte à atmosphère contrôlée 204. L'enceinte 204 est avantageusement opaque pour éviter qu'une lumière externe 17 n'arrive sur la zone de mesure 32. En outre, l'enceinte 24 permet un contrôle de l'atmosphère dans la zone de mesure 32. Le tube 10 comporte un joint d'étanchéité 206 en entrée et en sortie de l'enceinte 202 de la zone de mesure 32.Dans un autre mode de réalisation, le système de culture et 5 d'analyse cellulaire comprend une pluralité de bobines 72. Cela permet d'effectuer plusieurs incubations en parallèle. Ceci est particulièrement avantageux lorsque les cultures sont très lentes. Une bobine supplémentaire permet de stocker les gouttes 16 en cours d'incubation. Dans un autre mode de réalisation, le système de culture et d'analyse cellulaire 10 permet la sélection d'une goutte 16 au cours de l'incubation et sa mise en circulation dans un circuit dérivé Par exemple, les conditions d'incubation dans le circuit dérivée sont différentes. Un avantage du système de culture et d'analyse cellulaire 1, 110, 140, 200 est qu'il permet la détection de formation de clone et la mesure de la production de 15 métabolite. L'invention permet de façon automatisée, miniaturisée et à haut débit d'effectuer à la fois de la culture, de l'isolement, du criblage pour des cellules nécessitant un milieu contrôlé. En outre, la nature de l'atmosphère REVENDICATIONS1.- Procédé d'analyse et de culture cellulaire comprenant les étapes suivantes : - la génération d'un train (14) de gouttes (16) ordonnées dans un fluide porteur (40), le train (14) de gouttes (16) comprenant au moins une goutte de culture (42), la goutte de culture (42) comprenant un milieu de culture (50) et au moins une cellule (4), - la mise en circulation du train (14) de gouttes (16) dans un tube (10), - l'incubation du train (14) de gouttes (16) dans le tube (10), - la mesure d'au moins un paramètre indicatif du contenu de la goutte de culture (42) dans le tube (10) à différents instants, - la récupération de la goutte de culture (42) à une extrémité (36) du tube (10), les étapes étant effectuées dans une atmosphère contrôlée (6). 2.- Procédé d'analyse et de culture cellulaire selon la revendication 1 comprenant en outre, une étape d'analyse des mesures effectuées pour la goutte de culture (42), la récupération de la goutte de culture (42) ou la poursuite de l'incubation dépendant du résultat de l'analyse. 3.- Procédé d'analyse et de culture cellulaire selon la revendication 1 ou 2, dans lequel l'atmosphère contrôlée (6) est une atmosphère anaérobie. 4.- Procédé d'analyse et de culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le paramètre est un paramètre indicatif de la croissance d'un clone dans la goutte de culture (42). 5.- Procédé d'analyse et de culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, comprenant une étape de préparation du système dans lequel un gaz, dont la composition est contrôlée, est injecté dans le tube (10) avant l'étape de génération du train (14) de gouttes (16). 6.- Système d'analyse et de culture cellulaire (1, 110, 140, 200) comprenant : - un tube (10), - un module de génération (12) d'un train (14) de gouttes (16) ordonnées dans un fluide porteur (40), le train (14) de gouttes (16) comprenant au moins une goutte de 19 culture (42), la goutte de culture (42) comprenant un milieu de culture (50) et au moins une cellule (4), - un dispositif de mise en circulation (18) du train (14) de gouttes (16) dans le tube (10), 5 - un dispositif d'incubation (20) du train (14) de gouttes (16) dans le tube (10), - un dispositif de mesure (22), propre à mesurer au moins un paramètre indicatif du contenu de la goutte de culture (42) dans le tube (10) à différents instants, - un dispositif de récupération (26) de la goutte de culture (42) à une extrémité (36) du tube (10), 10 - un dispositif de contrôle de l'atmosphère (28, 130) propre à contrôler l'atmosphère (6) dans le système d'analyse et de culture (1, 110, 140, 200). 7.- Système d'analyse et de culture cellulaire (1) selon la revendications 6, dans lequel le dispositif de contrôle de l'atmosphère (28) comprend une enceinte à atmosphère 15 contrôlée (92) contenant le module de génération (12), le dispositif de mise en circulation (18), le tube (10), le dispositif d'incubation (20), le dispositif de mesure (22), et le dispositif de récupération (26). 8.- Système d'analyse et de culture cellulaire (110, 140, 200) selon la 20 revendication 6, dans lequel le tube (10) est imperméable aux gaz, le dispositif de contrôle de l'atmosphère (130) comprenant une enceinte à atmosphère contrôlée (132) contenant le dispositif de récupération (26), au moins une partie du tube (10) étant disposée hors de l'enceinte à atmosphère contrôlée (132). 25 9.- Système d'analyse et de culture cellulaire (110, 140, 200) selon la revendication 6 ou 7, dans lequel le tube (10) présente une zone de mesure (32), le dispositif de mesure (22) étant propre à mesurer le paramètre indicatif du contenu de la goutte de culture (42) à différents instants au niveau de la zone de mesure (32), la zone de mesure (32) du tube (10) étant placée dans une enceinte à atmosphère contrôlée 30 (204), les parties du tube ne s'étendant pas dans une enceinte à atmosphère contrôlée (204) étant couvert par une gaine imperméable (202). 10.- Système d'analyse et de culture cellulaire (1, 110, 140, 200) selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, dans lequel le train (14) de gouttes (16) comprend 35 au moins une goutte (16, 42, 44) comprenant un agent indicateur d'oxygène. 20 11.- Système d'analyse et de culture cellulaire (1, 110, 140, 200) selon l'une quelconque des revendications 6 à 10, dans lequel le train (14) de gouttes (16) comprend au moins une goutte (16, 42, 46) comprenant un agent réducteur d'oxygène. 5 12.- Système d'analyse et de culture cellulaire (1, 110, 140, 200) selon l'une quelconque des revendications 6 à 11, dans lequel le dispositif d'incubation (20) comprend une bobine (72) propre à être régulée en température, une partie (30) du tube (10) étant enroulée autour de la bobine (72). 10 13.- Système d'analyse et de culture cellulaire (1, 110, 140, 200) selon la revendication 12, dans lequel le module de génération (12) comprend : - un réservoir (112) comprenant une suspension de cellules (4) dans une atmosphère anaérobie, le réservoir (112) étant scellé par un septum (114), - un dispositif de prélèvement (64) propre à percer le septum (114) pour prélever 15 une partie de la suspension. 14.- Système d'analyse et de culture cellulaire (1, 110, 140 200) selon l'une quelconque des revendications 6 à 13 comprenant au moins une électrovanne (122) imperméable propre à isoler entre elles deux parties du tube (10).