Brevet FR3068362A1 — publié le 20190104

NOUVELLES SOUCHES ATTENUEES D'APICO1VIPLEXES ET LEUR UTILISATION COMME VECTEURS D'ANTIGENE POUR LA PREVENTION DE MALADIES INFECTIEUSES La présente invention concerne de nouvelles souches atténuées d'apicomplexes et leur utilisation comme vecteur d'antigène pour la prévention de maladies infectieuses. Les Apicomplexes sont des parasites majoritairement intracellulaires obligatoires qui possèdent un cycle de vie pouvant faire intervenir plusieurs hôtes. Le phylum de ces parasites se subdivise en plusieurs familles. Toxoplasma gondii (T gondii) appartient à la famille des Sarcocystidae. Le chat, hôte définitif, excrète le parasite dans l'environnement sous forme d'oocystes. Les hôtes intermédiaires (i.e. l'ensemble des homéothermes) et définitif peuvent s'infecter en ingérant des oocystes présents sur les aliments. Le parasite se transforme alors en tachyzoïtes qui se disséminent dans l'organisme et qui, sous la pression du système immunitaire, s'enkystent avec un tropisme préférentiel pour le système nerveux central, la rétine ou les muscles. L'ingestion de tissus enkystés est la deuxième cause de contamination des hôtes définitifs et intermédiaires. Récemment, une souche vivante atténuée de Toxoplasma gondii, le parasite responsable de la toxoplasmose a été mise au point par invalidation de deux gènes codant pour les protéines TgMIC1 et TgMIC3 (Cérède et al., 2005, 1 Exp. Med., 201(3) : 453-63). Cette souche, dénommée Toxo tgmic/-3 KO génère une réponse immunitaire forte et spécifique contre Toxoplasma gondii et permet de prévenir les effets d'une infection ultérieure chez la souris (Ismael et al., 2006, 1 Infect. Dis., 194(8) : 1176-83) et chez la brebis (Mévelec et al., 2010, Vet. Res., 41(4) :49). Neospora caninum (N. caninum) est un parasite intracellulaire, responsable de la néosporose. Il appartient également à la famille des Sarcocystidae. Le cycle de vie de Neospora caninum est très proche de celui de T gondii avec deux phases distinctes : une phase sexuée chez l'hôte final (i.e. les canidés et le chien en particulier) qui conduit à la production d'oocystes éliminés dans les fèces et une phase asexuée chez un hôte intermédiaire (i.e. les ovins, les caprins, les bovins, les équidés, etc...) qui conduit à la production de tachyzoïtes puis de kystes contenant les bradyzoïtes. 2 Plus récemment, il a été obtenu une souche vivante atténuée de Neospora caninum, la souche Neo ncmicI-3 KO, qui a été invalidée pour les gènes ncmic I et ncmic3 par recombinaison homologue. Il a été montré que cette souche mutante possède des propriétés infectieuses et immunogènes conférant aux mammifères une protection vaccinale vis-à-vis des effets délétères de la néosporose. Les parasites de la famille Sarcocystidae tels que Toxoplasma gondii et Neospora caninum peuvent être utilisés pour exprimer des protéines hétérologues provenant d'autres parasites tels que Plasmodium spp, Cryptosporidium parvum ou Leishmania spp. Ainsi, la souche sauvage RH de Toxoplasma gondii a été utilisée comme vecteur de l'antigène CSP (Protéine Circum Sporozoite) de Plasmodium knowlesi (Di Cristina et al., 1999, Infect Immun., 67(4) : 1677-82). Après intégration aléatoire de la séquence d'intérêt, la souche recombinante a été inoculée à des singes Rhesus et induit chez l'animal une réponse immunitaire humorale spécifique de la protéine CSP. En la souche thermosensible ts-4 HXGPRT-/- de Toxoplasma gondii a été utilisé comme vecteur de l'antigène CSP de Plasmodium yoelii (Charest et al., 2000, 1 Immunol., 165(4) : 2084-92). Après intégration aléatoire de la séquence d'intérêt, les parasites recombinants ont été inoculés à la souris induisant une réponse immunitaire humorale spécifique de l'antigène CSP mais insuffisante pour induire une protection contre une infection avec Plasmodium yoelii. Une souche de Toxoplasma gondii a également été utilisée pour exprimer les gènes gp40, gp15 et le précurseur gp40/gp15 de Cryptosporidium parvum, le parasite responsable de la cryptosporidiose (O'Connor et al., Infect. Immun., 2003 71(10) :6027-35; O'Connor et al., 2007, Mol Biochem Parasitol., 152(2) :148-58). Les gènes gp40/gp15, gp40 et gp15 ont été clonés, placés sous le contrôle d'un promoteur de T gondii et intégrés de manière aléatoire dans le génome du parasite. Les auteurs ont montré que les parasites recombinants exprimaient les protéines d'intérêt et que la glycosylation de la protéine GP40 exprimée par T gondii était similaire à la glycosylation de la protéine native. Cependant, les auteurs ont démontré que le clivage de la pré-protéine GP40/GP15 était inefficace dans les tachyzoïtes bien que des enzymes permettant le clivage soient présentes chez le parasite T gondii. Une autre équipe s'est également intéressée à l'utilisation de Toxoplasma gondii comme vecteur d'antigène de Cryptosporidium parvum et notamment de la protéine de surface immunodominante P23 (Shirafuji et al., 2005, 1 Parasitol., 91(2) :476-9). Le poids moléculaire et les propriétés antigéniques de P23 recombinantes sont similaires à ceux de 3 protéine native et des souris immunisées avec des tachyzoïtes lyses exprimant la protéine P23 produisent des anticorps neutralisant dirigés contre C. parvum. Enfin, T gondii a été utilisé comme vecteur d'expression de l'antigène Kmpl 1 de Leishmania. La souche recombinante obtenue permet une protection significative des animaux lors d'un challenge avec L. major (Ramirez et al ., 2001, Vaccine, 20:455-61). Neospora caninum a également été utilisé comme vecteur d'antigènes hétérologues et une souche recombinante de N. caninum exprimant de manière stable l'antigène SAG1 de T gondii a été construite (Zhang et al., 2010, Vaccine, 60(1) :105-7). Le niveau d'expression, le poids moléculaire et les propriétés antigéniques de la protéine SAG1 exprimée dans N. caninum sont similaires à ceux de la protéine SAG1 native et des souris immunisées produisent une réponse immunitaire de type Thl spécifique de SAG1 de T gondii et sont protégées contre un challenge létal avec T gondii. Le système Cre/loxP a été utilisé dans les stratégies d'activation ou d'inactivation des gènes de cellules de mammifères (Fukushige et Sauer, 1992, PNAS, 89(17) : 7905-9) ou de souris transgéniques (Tsien et al., 1996, Cell, 87(7) :1317-26.). La Cre Recombinase est une enzyme issue du bactériophage P1 (Sternberg and Hamilton, 1981, 1 Mol. Biol., 150(4) : 487-507) de la famille des intégrases qui reconnaissent des sites très spécifiques et permettent une recombinaison entre deux sites identiques. Le site de restriction de la Cre Recombinase est le site loxP, une séquence nucléotidique de 34 paires de bases (SEQ ID NO : 12) qui comprend deux petites séquences de 13 paires de bases répétées et inversées et une région spacer (en gras) de 8 paires de bases. Plusieurs mutants du site loxP sont décrits et 3 sites ont été identifiés comme étant incompatibles entre eux (Livet et al., 2007, Nature, 450(7166) : 56-62). Il s'agit des sites LoxP (SEQ ID NO :12), LoxN (SEQ ID NO :5) et Lox 2272 (SEQ ID NO :68). Les propriétés de la Cre recombinase sont multiples et peuvent être utilisés pour (Figure 1) : - Supprimer une séquence d'ADN présente entre deux sites Lox identiques et avec la même orientation, - Inverser une séquence d'ADN présente entre deux sites Lox identiques et avec la orientation inverse, - Intégrer au niveau d'un site LoxP ou LoxN une séquence d'ADN contenant le site LoxP ou LoxN. Chez Toxoplasma gondii, le système Cre/Lox a été utilisé la première fois en 1999 (Brecht et al., 1999, Gene, 234(2) :239-47). Suite à l'insertion aléatoire d'un gène rapporteur encadré de 4 sites LoxP orientés dans un sens identique, l'action de la Cre Recombinase a permis la délétion du gène rapporteur et la formation d'une cicatrice LoxP. La Cre Recombinase a ensuite été utilisée pour intégrer un nouveau transgène hétérologue au niveau de cette cicatrice LoxP. Plus récemment ; le système Cre/LoxP a été utilisé pour la réalisation d'une souche de Toxoplasma gondii délétée pour le gène mornl (Heaslip et al., 2010, PloS Pathog, 6(2) : e1000754). Enfin dernièrement, des souches KO (knockout) de T gondii ont été créées en utilisant une forme dimérisable de la Cre Recombinase inductible seulement après ajout d'un ligand : la rapamycine (Andenmatten et al., 2013, Nat. Methods, 10(2) :125-7; Rugarabamu et al., 2015, Mol. Microbiol., 97(2) :244-62). La présente invention concerne de nouvelles souches atténuées de Sarcocystidae (Toxoplasma gondii et Neospora caninum). La presente invention concerne également l'utilisation de nouvelles souches atténuées de Sarcocystidae (Toxoplasma gondii et Neospora caninum), comme vecteur d'antigène pour la prévention de maladies infectieuses. La présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle l'un au moins des gènes mic/ ou mic3 est délété, contenant un site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique, au locus dudit au moins un gène délété, et dans le cas où les deux gènes mic/ et mic3 sont délétés, le site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique, au locus du gène mic/ délété est potentiellement différent de celui au locus du gène mic3 délété. Par « enzyme permettant une recombinaison spécifique », on entend enzyme catalysant la recombinaison d'ADN dans un sens défini, entre des sites spécifiques déterminés par des séquences propres à chaque enzyme. Elle permettent notamment l'excision, l'insertion, l'inversion ou la translocation d'une séquence nucléotidique flanquée de sites spécifiques. Comme exemple d'enzyme permettant une recombinaison spécifique, on peut citer par exemple la Cre recombinase, la FLP recombinase, la Tre recombinase, les protéines RecA et Hin recombinase (bactérie). Les gènes mic/ et mic3 permettent de coder les protéines MIC1 et MIC3. Ce sont sont des protéines des micronèmes, organelles sécrétoires des Apicomplexes qui jouent un rôle central dans la reconnaissance et l'adhésion aux cellules hôtes. Dans un mode de réalisation particulier, l'enzyme permettant une recombinaison spécifique est la cre-recombinase. Ainsi, dans ce cas la souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle l'un au moins des gènes mic/ ou mic3 est délété contient un site de recombinaison spécifique de la cre-recombinase, au locus dudit au moins un gène délété. et dans le cas où les deux gènes mic/ et mic3 sont délétés, le site de recombinaison spécifique de la cre-recombinase, au locus du gène mic/ délété est différent de celui au locus du gène mic3 délété. On entend par « délétion du gène », la délétion de la séquence codante entière (introns et exons), la délétion de la région promotrice et la délétion des régions transcrites non traduites 5' et 3', dites 5' et 3'UTR, le terme « gène » désignant la région promotrice (également appelée promoteur), la séquence codante et les régions 5' et 3' UTR. La Cre recombinase est une topoisomerase dérivée du bacteriophage Pl, cette enzyme est fonctionnelle chez les parasites. L'utilisation possible de plusieurs sites lox n'interagissant pas entre eux permet d'envisager plusieurs délétions. Comme exemples de sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase (sites lox), on peut citer de manière non exhaustive, les sites loxP, loxN, 1ox2272, lox71, 1ox66, lox511, 1ox5171 et loxM2. La présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes mic/ et mic3 sont délétés contenant deux sites de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, lesdits sites de recombinaison spécifique étant au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés, le site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment de la Cre-recombinase, au locus du gène mic/ délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle ladite enzyme permettant une recombinaison spécifique est la Cre-recombinase et dans laquelle dans le cas où les deux gènes mic/ et mic3 sont délétés, le 6 site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique, au locus du gène mic/ délété est différent de celui au locus du gène mic3 délété. Selon un mode de réalisation particulier, ladite souche mutante de Sarcocystidae est une souche du genre Toxoplasma spp.. Ce genre comprend entre l'espèce Toxoplasma gondii. Selon un mode de réalisation particulier, ladite souche mutante de Sarcocystidae est une souche de l'espèce Toxoplasma gondii. Selon un mode de réalisation particulier, ladite souche mutante de Sarcocystidae est une souche du genre Toxoplasma spp., en particulier une souche de l'espèce Toxoplasma gondii. Selon un autre mode de réalisation particulier, ladite souche mutante de Sarcocystidae est une souche du genre Neospora spp.. Ce genre comprend entre autres les espèces suivantes : Neospora caninum, Neospora hughesi. Selon un mode de réalisation particulier, ladite souche mutante de Sarcocystidae est une souche de l'espèce Neospora caninum. Selon un mode de réalisation particulier, ladite souche mutante de Sarcocystidae est une souche du genre Neospora spp., en particulier une souche de l'espèce Neospora caninum. Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes mic / et mic 3 sont délétés, et qui contient un site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus du gène mic / délété, et un site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment de la Crerecombinase, au locus du gène mic3 délété, le site de recombinaison spécifique au locus du gène mic/ délété étant différent du site de recombinaison spécifique au locus du gène mic3 délété. 7 Dans le cas où l'enzyme permettant une recombinaison spécifique est la Cre-recombinase, ladite souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes mic / et mic 3 sont délétés, contient un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic / délété, et un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic3 délété, le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic/ délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété. Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes mic / et mic 3 sont délétés, et contenant deux sites de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, chacun des deux sites étant respectivement au locus de chacun des susdits gènes délétés, le site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment de la Crerecombinase, au locus du gène mic/ délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété. Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes mic / et mic 3 sont délétés, et qui contient un site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus du gène mic / délété, et un site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment de la Crerecombinase, au locus du gène mic3 délété, le site de recombinaison spécifique au locus du gène mic/ délété étant différent du site de recombinaison spécifique au locus du gène mic3 délété, et ladite souche ne contenant pas d'ADN hétérologue, autres que ceux correspondant aux sites de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés. 8 Par « ne contenant pas d'ADN hétérologue autres que les ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique», on entend que la souche peut contenir comme seul(s) ADN hétérologue(s), une ou plusieurs séquences correspondant à un site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique. Dans le cas où l'enzyme permettant une recombinaison spécifique est la Cre-recombinase, ladite souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes mic / et mic 3 sont délétés, contient un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic / délété, et un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic3 délété, le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic/ délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété, ladite souche ne contenant pas d'ADN hétérologue, autres que ceux correspondant aux sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés. Par « contenant un ADN hétérologue, différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison de la cre-recombinase », on entend que ladite souche contient un ADN hétérologue qui ne correspond pas à une séquence d'un site de recombinaison spécifique de la cre-recombinase et qui ne comprend pas de séquence correspondant à un site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes mic/ et mic3 sont délétés, et contenant deux sites de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, chacun des deux sites étant respectivement au locus de chacun des susdits gènes délétés, le site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus du gène mic/ délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété, et ne contenant pas d'ADN hétérologue, autres que ceux correspondant aux sites de recombinaison spécifique d'une enzyme 9 permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés. Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes mic / et mic 3 sont délétés, et contenant un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic / délété, et un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic3 délété, le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic/ délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété. ladite souche ne contenant pas d'ADN hétérologue, autres que ceux correspondant aux sites de recombinaison spécifique la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés, et dans laquelle chacun des sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus respectif des gènes mic/ et mic3 délétés sont choisis parmi les sites suivants : lox N de SEQ ID NO :5, lox P de SEQ ID NO :12 et lox 2272 de SEQ ID NO :68, le site de recombinaison de la Cre-recombinase, au locus du gène mic/ délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété. Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante selon l'invention, dans laquelle les deux gènes mic/ et mic3 sont délétés, contenant deux sites de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique, au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés, le site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique, au locus du gène mic/ délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété, et ne contenant pas d'ADN hétérologue, autres que des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés, notamment ladite enzyme permettant une recombinaison spécifique étant la Cre-recombinase, et les sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés étant choisis parmi : lox N de SEQ ID NO :5, lox P de SEQ ID NO :12 et lox 2272 de SEQ ID NO :68. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes mic/ et mic3 sont délétés, et ne contenant pas d'ADN hétérologue, autres que ceux correspondant aux sites de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment de la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés et contenant deux sites de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique, ladite enzyme étant la Cre-recombinase, chacun des deux sites étant respectivement au locus de chacun des susdits gènes délétés, lesdits sites de recombinaison spécifique étant des sites de recombinaison spécifique de la cre-recombinase choisis parmi : lox N de SEQ ID NO :5, lox P de SEQ ID NO :12 et lox 2272 de SEQ ID NO :68, le site de recombinaison de la Cre-recombinase, au locus du gène mic/ délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété. Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes mic / et mic 3 sont délétés, et contenant un site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus du gène mic / délété, et un site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment de la Crerecombinase, au locus du gène mic3 délété, le site de recombinaison spécifique au locus du gène mic/ délété étant différent du site de recombinaison spécifique au locus du gène mic3 délété, et ladite souche contenant un ADN hétérologue au locus du gène mic/ délété ou au locus du gène mic3 délété, différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Crerecombinase, au locus respectif de chacun des gènes mic/ et mic3 délétés, de telle façon que : lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic/ délété, il est flanqué : - d'un premier site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, correspondant au site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus du gène mic/ délété, et - d'un second site de recombinaison spécifique identique audit premier site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic/ délété, ce second site étant 11 apporté de manière additionnelle aux sites déjà présents dans la souche, en raison de la recombinaison spécifique supplémentaire lors de l'ajout de l'ADN hétérologue. lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic3 délété, il est flanqué : - d'un premier site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, correspondant au site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus du gène mic3 délété, et - d'un second site de recombinaison spécifique identique audit premier site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic3 délété, ladite souche comprenant les moyens nécessaires à la transcription dudit ADN hétérologue. Ce mode de réalisation cible la production d'un ARN hétérologue à partir dudit ADN hétérologue dans une souche mutante telle que décrite ci-dessus. Par « moyens nécessaires à la transcription dudit ADN hétérologue », on entend un promoteur, un site d'initiation de la transcription, TATA box, un terminateur de transcription. L'ARN ainsi transcrit peut être un ARN messager, un ARN interférent, un ARN long non codant, un ARN tige-boucle (en anglais « Hairpin RNA »), Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes mic/ et mic3 sont délétés, et contenant deux sites de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, chacun des deux sites étant respectivement au locus de chacun des susdits gènes délétés, le site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus du gène mic/ délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété, et contenant un ADN hétérologue au locus du gène mic/ délété ou au locus du gène mic3 délété, différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés, ledit ADN hétérologue étant flanqué : 12 - d'un premier site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, correspondant au site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus du gène mic/ délété ou celui au locus du gène mic3 délété, et - d'un second site de recombinaison spécifique identique audit premier site de recombinaison spécifique et les moyens nécessaires à la transcription du susdit ADN hétérologue. Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche selon l'invention, contenant un ADN hétérologue au locus du gène mic/ délété ou au locus du gène mic3 délété, différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés, ledit ADN hétérologue étant flanqué : - d'un premier site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique, correspondant au site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique, au locus du gène mic/ délété ou au locus du gène mic3 délété et, - d'un second site de recombinaison spécifique identique audit premier site de recombinaison spécifique, correspondant au site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique, au locus du gène mic/ délété ou au locus du gène mic3 délété et, et les moyens nécessaires à sa transcription, notamment ladite enzyme permettant une recombinaison spécifique étant la Cre-recombinase et les sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant choisis parmi : lox N de SEQ ID NO : 5, lox P de SEQ ID NO: 12 et lox 2272 de SEQ ID NO : 68. Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes mic / et mic 3 sont délétés, et contenant un site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus du gène mic 1 délété, et un site de recombinaison 13 spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment de la Crerecombinase, au locus du gène mic3 délété, le site de recombinaison spécifique au locus du gène mic/ délété étant différent du site de recombinaison spécifique au locus du gène mic3 délété, ladite souche contenant un ADN hétérologue au locus du gène mic/ délété ou au locus du gène mic3 délété, autre que ceux correspondant aux sites de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des gènes mic/ et mic3 délétés, de telle façon que : lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic/ délété, il est flanqué : - d'un premier site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, correspondant au site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus du gène mic/ délété, et - d'un second site de recombinaison spécifique identique audit premier site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic/ délété, lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic3 délété, il est flanqué : - d'un premier site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, correspondant au site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus du gène mic3 délété, et - d'un second site de recombinaison spécifique identique audit premier site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic3 délété, ledit ADN hétérologue codant pour au moins une protéine, ladite souche mutante comporte également les moyens nécessaires à l'expression du susdit ADN hétérologue. Ce mode de réalisation cible l'expression protéique dudit ADN hétérologue dans une mutante telle que décrite précédemment. 14 Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche selon l'invention contenant un ADN hétérologue au locus du gène mic/ délété ou au locus du gène mic3 délété, différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique au locus respectif de chacun des susdits gènes mic/ et mic3 délétés, ledit ADN hétérologue codant pour une protéine et étant flanqué : - d'un premier site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique correspondant au site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique au locus du gène mic/ délété ou à celui au locus du gène mic3 délété, et d'un second site de recombinaison spécifique identique audit premier site de recombinaison spécifique, correspondant au site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique, au locus du gène mic/ délété ou au locus du gène mic3 délété et, et les moyens nécessaires à l'expression protéique du susdit ADN hétérologue, notamment ladite enzyme permettant une recombinaison spécifique étant la Crerecombinase et, les sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant choisis parmi : lox N de SEQ ID NO: 5, lox P de SEQ ID NO: 12 et lox 2272 de SEQ ID NO :68. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes mic/ e mic3 sont délétés, contenant deux sites de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, chacun des deux sites étant respectivement au locus de chacun des susdits gènes délétés, le site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus du gène mic/ délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété, et contenant un ADN hétérologue au locus du gène mic/ délété ou au locus du gène mic3 délété, différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés, ledit ADN hétérologue codant pour au moins une protéine et étant flanqué : - d'un premier site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, correspondant au site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase au locus du gène mic/ délété ou à celui au locus du gène mic3 délété, et - d'un second site de recombinaison spécifique identique audit premier site de recombinaison spécifique et les moyens nécessaires à l'expression du susdit ADN hétérologue. Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes mic / et mic 3 sont délétés, et contenant un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic / délété, et un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic3 délété, le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic/ délété (appelé site A) étant différent de celui au locus du gène mic3 délété (appelé site B), et ladite souche contenant un ADN hétérologue au locus du gène mic/ délété ou au locus du gène mic3 délété, différents de ceux correspondant aux sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des gènes mic/ et mic3 délétés, de telle façon que : lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic/ délété, il est flanqué : - d'un premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic/ délété (site A), et - d'un second site de recombinaison spécifique (site C), identique au premier site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic/ délété (site A), et les moyens nécessaires à l'expression du susdit ADN hétérologue, lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic3 délété, il est flanqué : - d'un premier site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, correspondant au site de 16 recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus du gène mic3 délété (site B), et - d'un second site de recombinaison spécifique (site C), identique au premier site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic3 (site B) délété, et les moyens nécessaires à l'expression du susdit ADN hétérologue. lesdits trois sites de recombinaison spécifique A, B et C étant choisis parmi les sites suivants : lox N de SEQ ID NO :5, lox P de SEQ ID NO :12 et lox 2272 de SEQ ID NO :68, tels que - ledit site A et ledit site B sont différents, et - ledit site C est identique audit site A ou B, étant entendu que ladite souche comporte les éléments nécessaires à la transcription dudit ADN hétérologue, ou les moyens nécessaires à l'expression dudit ADN hétérologue lorsque ledit ADN hétérologue code pour au moins une protéine. Selon un mode de réalisation particulier la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae contenant un ADN hétérologue au locus du gène mic/ délété ou au locus du gène mic3 délété, différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique, dans laquelle ladite enzyme est la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des susdits gènes mic/ et mic3 délétés, et contenant trois sites de recombinaison spécifique qui sont respectivement: - le site A correspondant au site de recombinaison spécifique de la Crerecombinase au locus du gène mic/ délété - le site B correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété, et - le site C correspondant audit second site de recombinaison spécifique qui flanque ledit second ADN hétérologue identique audit premier site de recombinaison spécifique, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase correspondant au susdit site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic/ délété (site A) ou au susdit site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété (site B) 17 lesdits trois sites de recombinaison spécifique A, B et C étant choisis parmi les sites suivants : lox N de SEQ ID NO :5, lox P de SEQ ID NO :12 et lox 2272 de SEQ ID NO :68, tels que - ledit site A et ledit site B sont différents, et - ledit site C est identique audit site A ou audit site B. Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes mic / et mic 3 sont délétés, et contenant un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic / délété, et un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic3 délété, tel que le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic/ délété (appelé site A) correspond à un site loxN SEQ ID NO: 5 et celui au locus du gène mic3 délété (appelé site B) correspond à un site loxP SEQ ID NO: 12, et ladite souche contenant un ADN hétérologue au locus du gène mic/ délété ou au locus du gène mic3 délété, différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des gènes mic/ et mic3 délétés, de telle façon que : lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic/ délété, il est flanqué : - d'un premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic/ délété (site A) correspondant à un site loxN SEQ ID NO : 5, et - d'un second site de recombinaison spécifique (site C) correspondant à un site loxN SEQ ID NO : 5, identique au premier site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic/ délété (site A), lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic3 délété, il est flanqué : - d'un premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic3 délété (site B) correspondant à un site loxP SEQ ID NO : 12, et - d'un second site de recombinaison spécifique (site C) correspondant à un site loxP SEQ ID NO : 12, identique au premier site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic3 (site B) délété, 18 étant entendu que ladite souche comporte les éléments nécessaires à la transcription dudit ADN hétérologue, ou les moyens nécessaires à l'expression dudit ADN hétérologue lorsque ledit ADN hétérologue code pour au moins une protéine. Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes mic / et mic 3 sont délétés, et contenant un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic / délété, et un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic3 délété, tel que le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic/ délété (appelé site A) correspond à un site loxP SEQ ID NO: 12 et celui au locus du gène mic3 délété (appelé site B) correspond à un site loxN SEQ ID NO: 5, et ladite souche contenant un ADN hétérologue au locus du gène mic/ délété ou au locus du gène mic3 délété, différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des gènes mic/ et mic3 délétés, de telle façon que : lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic/ délété, il est flanqué : - d'un premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic/ délété (site A) correspondant à un site loxP SEQ ID NO : 12, et - d'un second site de recombinaison spécifique (site C) correspondant à un site loxP SEQ ID NO : 12, identique au premier site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic/ délété (site A), lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic3 délété, il est flanqué : - d'un premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic3 délété (site B) correspondant à un site loxN SEQ ID NO : 5, et - d'un second site de recombinaison spécifique (site C) correspondant à un site loxN SEQ ID NO : 5, identique au premier site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic3 (site B) délété, 19 étant entendu que ladite souche comporte les éléments nécessaires à la transcription dudit ADN hétérologue, ou les moyens nécessaires à l'expression dudit ADN hétérologue lorsque ledit ADN hétérologue code pour au moins une protéine. Selon un mode de réalisation particulier la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae contenant un ADN hétérologue au locus du gène mic/ délété ou au locus du gène mic3 délété, différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique, dans laquelle ladite enzyme est la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des susdits gènes mic/ et mic3 délétés, et contenant trois sites de recombinaison spécifique qui sont respectivement: - le site A correspondant au site de recombinaison spécifique de la Crerecombinase au locus du gène mic/ délété - le site B correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété, et - le site C correspondant audit second site de recombinaison spécifique qui flanque ledit second ADN hétérologue identique audit premier site de recombinaison spécifique, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase correspondant au susdit site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic/ délété (site A) ou au susdit site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété (site B) lesdits trois sites de recombinaison spécifique A, B et C étant choisis parmi les sites suivants : lox N de SEQ ID NO :5, lox P de SEQ ID NO :12 et lox 2272 de SEQ ID NO :68, tels que - ledit site A est le site lox N SEQ ID NO :5 - ledit site B est le site lox P SEQ ID NO :12, et - ledit site C est le site lox N SEQ ID NO :5, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant le site A; ou tels que - ledit site A est le site lox N SEQ ID NO :5 - ledit site B est le site lox P SEQ ID NO :12, et - ledit site C est le site lox P SEQ ID NO :12, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant le site B ; ou tels que - ledit site A est le site lox P SEQ ID NO :12 - ledit site B est le site lox N SEQ ID NO :5, et - ledit site C est le site lox P SEQ ID NO :12, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant le site A; ou tels que de recombinaison - ledit site A est le site lox P SEQ ID NO :12 - ledit site B est le site lox N SEQ ID NO :5, et - ledit site C est le site lox N SEQ ID NO :5, ledit premier site spécifique de la Cre-recombinase étant le site B. Selon un mode de réalisation particulier la présente invention concerne une souche mutante de Toxoplasma spp., dans laquelle les deux gènes mic / et mic 3, et le gène rop161 sont délétés, et qui contient au locus de chacun de ces gènes délétés un site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, tel que le site de recombinaison spécifique au locus du gène mic/ délété est différent du site de recombinaison spécifique au locus du gène mic3 délété, et le site de recombinaison spécifique au locus du gène rop161 délété est différent du site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic/ délété et du site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic3 délété. Le gène rop16 permet de coder la protéine Rop16 qui est une protéines de rophtries. Cette protéine est une sérine thréonine kinase. Ces protéines ROPs, sont sécrétées pour permettre l'invagination de la membrane plasmique de la cellule hôte et la formation de la vacuole parasitophore . Les ROPs relarguées dans le cytosol de la cellule hôte peuvent migrer à la surface de la vacuole parasitophore (ROPS, 21 ROP18, ROP2) ou dans le noyau (ROP16, protéine phosphatase 2C ou PP2C-hn), permettant une modulation de l'expression de gènes impliqués dans la réponse immunitaire de l'hôte. Selon un mode de réalisation particulier la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle ladite souche mutante est une souche mutante de Toxoplasma spp., et dans laquelle le gène rop161 est délété, et qui contient un site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus dudit gène rop161 délété, ce susdit site étant différent dudit site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic/ délété et dudit site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic3 délété. Selon un mode de réalisation particulier la présente invention concerne une souche mutante de Toxoplasma spp., dans laquelle les deux gènes mic / et mic 3, et le gène rop161 sont délétés, et qui contient au locus de chacun de ces gènes délétés un site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, tel que le site de recombinaison spécifique au locus du gène mic/ délété est différent du site de recombinaison spécifique au locus du gène mic3 délété, et le site de recombinaison spécifique au locus du gène rop161 délété est différent du site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic/ délété et du site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic3 délété. et dans laquelle ladite souche mutante contient également au locus du gène rop161 , en aval dudit site de recombinaison spécifique au locus du gène rop161 délété, un gène codant pour la protéine GRA15II , ainsi que les moyens nécessaires à l'expression de ladite protéine, Les protéines GRAs sont associées au réseau nanotubulaire membraneux et à la membrane de la vacuole parasitophore (Mercier et al., Int J Parasitol. 2005 Jul;35(8):829-49. Review. Erratum in: Int J Parasitol. 2005 Dec;35(14):1611-2). Elles participent à l'échange de 22 nutriments entre le parasite et les organelles (mitochondries et du réticulum endoplasmique) de la cellule hôte (Sibley, Immunol Rev. 2011 Mar;240(1):72-91). Récemment, certaines protéines des granules denses dont GRA15, ont été identifiées comme protéines jouant un rôle dans la modulation/contrôle de la réponse immunitaire de la cellule hôte. GRA15 présente un polymorphisme selon la typologie du parasite (I, II, Dans ce mode de réalisation, ledit gène codant pour la protéine GRA15II au locus du gène rop/6/ délété est donc flanqué en amont par le susdit site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus dudit gène rop161 délété. Selon un mode de réalisation particulier la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle ladite souche mutante est une souche mutante de Toxoplasma spp., et dans laquelle le gène rop161 est délété et contient un site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus dudit gène rop161 délété, ce susdit site étant différent dudit site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic/ délété et dudit site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic3 délété, et ladite souche comprenant un gène codant pour la protéine GRA15II ainsi que les moyens nécessaires à l'expression de ladite protéine, au locus dudit gène rop161 délété, ledit gène codant pour la protéine GRA15II au locus dudit gène rop161 délété, étant flanqué en amont par le susdit site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus dudit gène rop161 délété. Selon un mode de réalisation particulier la présente invention concerne une souche mutante de Toxoplasma spp., dans laquelle les deux gènes mic / et mic 3, et le gène rop161 sont délétés, et qui contient au locus de chacun de ces gènes délétés un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, tel que le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic/ délété est différent du site de recombinaison spécifique au locus du gène mic3 délété, 23 et le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène rop161 délété est différent du site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase situé au locus du gène mic/ délété et du site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase situé au locus du gène mic3 délété ledit site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène rop161 délété est choisi parmi les sites suivants : lox N de SEQ ID NO :5, lox P de SEQ ID NO :12 et lox 2272 de SEQ ID NO :68. Selon un mode de réalisation particulier la présente invention concerne une souche mutante de Toxoplasma spp., dans laquelle les deux gènes mic / et mic 3, et le gène rop161 sont délétés, et qui contient au locus de chacun de ces gènes délétés un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, tel que le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic/ délété est différent du site de recombinaison spécifique au locus du gène mic3 délété, et le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène rop161 délété est différent du site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase situé au locus du gène mic/ délété et du site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase situé au locus du gène mic3 délété lesdits sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus des gènes micl, mic3 et rop161 délété sont choisis parmi les sites suivants : lox N de SEQ ID NO :5, lox P de SEQ ID NO :12 et lox 2272 de SEQ ID NO :68, tels que ces trois sites sont différents l'un de l'autre. Selon un mode de réalisation particulier la présente invention concerne une souche mutante de Toxoplasma spp., dans laquelle les deux gènes mic / et mic 3, et le gène rop161 sont délétés, et qui contient au locus de chacun de ces gènes délétés un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, tel que le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic/ délété est différent du site de recombinaison spécifique au locus du gène mic3 délété, 24 et le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène rop161 délété est différent du site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase situé au locus du gène mic/ délété et du site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase situé au locus du gène mic3 délété, et dans laquelle ladite souche mutante contient également au locus du gène rop161 , en aval dudit site de recombinaison spécifique au locus du gène rop161 délété, un gène codant pour la protéine GRA15II ainsi que les moyens nécessaires à l'expression de ladite protéine, ledit site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène rop161 délété est choisi parmi les sites suivants : lox N de SEQ ID NO :5, lox P de SEQ ID NO :12 et lox 2272 de SEQ ID NO :68. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle ladite enzyme permettant une recombinaison spécifique est la Cre-recombinase, et ledit site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique au locus dudit gène rop161 délété, est un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase choisi parmi les sites suivants : lox N de SEQ ID NO :5, lox P de SEQ ID NO :12 et lox 2272 de SEQ ID NO :68, ce site de recombinaison spécifique étant différent des sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic/ délété et au locus du gène mic3 délété. Selon un mode de réalisation particulier la présente invention concerne une souche mutante de Toxoplasma spp., dans laquelle les deux gènes mic / et mic 3, et le gène rop161 sont délétés, et qui contient au locus de chacun de ces gènes délétés un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, tel que le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic/ délété (appelé site A) est différent du site de recombinaison spécifique au locus du gène mic3 délété (appelé site B), et le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène rop161 délété (appelé site D) est différent du site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase situé au locus du gène mic/ délété (appelé site A) et du site de recombinaison spécifique de la Crerecombinase situé au locus du gène mic3 délété (appelé site B). tels que - ledit site A correspond à un site lox N, SEQ ID NO: 5 - ledit site B correspond à un site lox P, SEQ ID NO: 12 - ledit site D correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68; ou tels que - ledit site A correspond à un site lox P, SEQ ID NO: 12 - ledit site B correspond à un site lox N, SEQ ID NO: 5 - ledit site D correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68. Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle ladite souche mutante est une souche mutante de Toxoplasma spp., dans laquelle les deux gènes mic / et mic 3 sont délétés, et contenant deux sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, chacun des deux sites étant respectivement au locus de chacun des susdits gènes délétés, le site de recombinaison spécifique de la Crerecombinase, au locus du gène mic/ délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété. dans laquelle le gène rop161 est délété et ladite souche contient un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus dudit gène rop161 délété, ladite souche contenant trois sites de recombinaison spécifique qui sont respectivement: - le site A correspondant au site de recombinaison spécifique de la Crerecombinase au locus du gène mic/ délété - le site B correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété, et - le site D correspondant au site de recombinaison spécifique de la Crerecombinase au locus dudit gène rop161 délété 26 tels que - ledit site A est le site lox N SEQ ID NO : 5 - ledit site B est le site lox P SEQ ID NO : 12, - ledit site D est le site lox 2272 SEQ ID NO : 68; ou tels que - ledit site A est le site lox P SEQ ID NO : 12 - ledit site B est le site lox N SEQ ID NO : 5, - ledit site D est le site lox 2272 SEQ ID NO : 68. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante, dans laquelle ladite souche mutante est une souche mutante de Toxoplasma spp., et dans laquelle le gène rop161 est délété et contient un site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique au locus dudit gène rop161 délété, ce susdit site étant différent dudit site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic/ délété et dudit site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic3 délété et ladite souche mutante comprenant un gène codant pour la protéine GRA15II, ainsi que les moyens nécessaires à l'expression de ladite protéine, au locus dudit gène rop161 délété, ledit gène codant pour la protéine GRA15II au locus dudit gène rop161 délété, étant flanqué en amont par le susdit site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique au locus dudit gène rop161 délété, notamment dans laquelle ladite enzyme permettant une recombinaison spécifique est, la Cre-recombinase, et ledit site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique au locus dudit gène rop161 délété, est un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase choisi parmi les sites suivants : lox N SEQ ID NO :5, lox P SEQ ID NO :12 et lox 2272 SEQ ID NO :68, ce site de recombinaison spécifique étant différent des sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic/ délété et au locus du gène mic3 délété, ladite souche contenant trois sites de recombinaison spécifique qui sont respectivement : 27 - le site A correspondant au site de recombinaison spécifique de la Crerecombinase au locus du gène mic/ délété - le site B correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété, et - le site D correspondant au site de recombinaison spécifique de la Crerecombinase au locus dudit gène ropl6I délété en particulier tels que - ledit site A est le site lox N, - ledit site B est le site lox P, - ledit site D est le site lox 2272. Selon un mode de réalisation particulier la présente invention concerne une souche mutante de Toxoplasma spp., dans laquelle les deux gènes mic 1 et mic 3, et le gène ropl6I sont délétés, et qui contient au locus de chacun de ces gènes délétés un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, tel que le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic/ délété (appelé site A) est différent du site de recombinaison spécifique au locus du gène mic3 délété (appelé site B), et le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène ropl6I délété (appelé site D) est différent du site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase situé au locus du gène mic/ délété (appelé site A) et du site de recombinaison spécifique de la Crerecombinase situé au locus du gène mic3 délété (appelé site B), ladite souche contenant éventuellement un codant pour la protéine GRA15II ainsi que les moyens d'expression nécessaires à l'expression de ladite protéine, et ladite souche contenant un ADN hétérologue au locus du gène mic/ délété ou au locus du gène mic3 délété ou au locus du gène ropl6I délété, différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des gènes micl,mic3 et ropl6I délétés, de telle façon que : lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic/ délété, il est flanqué : 28 - d'un premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic/ délété (site A), et - d'un second site de recombinaison spécifique (site C), identique au premier site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic/ délété (site A), lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic3 délété, il est flanqué : - d'un premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic3 délété (site B), et - d'un second site de recombinaison spécifique (site C), identique au premier site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic3 (site B) délété, lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène rop161 délété, il est flanqué : - d'un premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène rop161 délété (site D), et - d'un second site de recombinaison spécifique (site C), identique au premier site de recombinaison spécifique situé au locus du gène rop161 (site D) délété, étant entendu que ladite souche comporte les éléments nécessaires à la transcription dudit ADN hétérologue, ou les moyens nécessaires à l'expression dudit ADN hétérologue lorsque ledit ADN hétérologue code pour au moins une protéine. Dans ce mode de réalisation particulier, ladite souche mutante contient alors quatre sites de recombinaison spécifique de la cre-recombinase défini de la manière suivante : - le site A correspondant audit site de recombinaison spécifique de la Crerecombinase au locus du gène mic/ délété - le site B correspondant audit site de recombinaison spécifique de la Crerecombinase au locus du gène mic3 délété, et 29 - le site C correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase au locus du gène mic/ délété (site A) lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic/ délété ou correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété (site B) lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic3 délété, ou correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène rop161 délété (site D) lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène rop161 délété - le site D correspondant audit site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase au locus dudit gène rop161 délété tels que, lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic/ délété, - ledit site A correspond à un site lox N, SEQ ID NO: 5 - ledit site B correspond à un site lox P, SEQ ID NO: 12 - ledit site C correspond à un site lox N, SEQ ID NO: 5 - ledit site D correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68; OU - ledit site A correspond à un site lox P, SEQ ID NO: 12 - ledit site B correspond à un site lox N, SEQ ID NO: 5 - ledit site C correspond à un site lox P, SEQ ID NO: 12 - ledit site D correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68; ou tels que lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic3 délété, - ledit site A correspond à un site lox N, SEQ ID NO: 5 - ledit site B correspond à un site lox P, SEQ ID NO: 12 - ledit site C correspond à un site lox P, SEQ ID NO: 12 - ledit site D correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68; OU - ledit site A correspond à un site lox P, SEQ ID NO: 12 - ledit site B correspond à un site lox N, SEQ ID NO: 5 - ledit site C correspond à un site lox N, SEQ ID NO: 5 - ledit site D correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68; ou tels que lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène ropl6I délété, - ledit site A correspond à un site lox N, SEQ ID NO: 5 - ledit site B correspond à un site lox P, SEQ ID NO: 12 - ledit site C correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68 - ledit site D correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68; OU - ledit site A correspond à un site lox P, SEQ ID NO: 12 - ledit site B correspond à un site lox N, SEQ ID NO: 5 - ledit site C correspond à un lox 2272, SEQ ID NO: 68 - ledit site D correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle ladite souche mutante est une souche mutante de Toxoplasma spp., ladite enzyme permettant une recombinaison spécifique est la Cre-recombinase, dans laquelle le gène ropl6I est délété et ladite souche contient un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus dudit gène ropl6I délété, ladite souche contenant quatre sites de recombinaison spécifique qui sont respectivement: - le site A correspondant au site de recombinaison spécifique de la Crerecombinase au locus du gène mic/ délété - le site B correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété, et - le site C correspondant audit second site de recombinaison spécifique qui flanque ledit ADN hétérologue identique audit premier site de recombinaison spécifique, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase correspondant au susdit site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic/ délété (site A) ou au susdit site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété (site B), ou au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène rop161 délété (site D) - le site D correspondant au site de recombinaison spécifique de la Crerecombinase au locus dudit gène ropl6I délété 31 tels que - ledit site A est le site lox N SEQ ID NO : 5 - ledit site B est le site lox P SEQ ID NO : 12, - ledit site C est le site lox N SEQ ID NO : 5, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant le site A, et - ledit site D est le site lox 2272 SEQ ID NO : 68 ; ou tels que - ledit site A est le site lox N SEQ ID NO : 5 - ledit site B est le site lox P SEQ ID NO : 12, - ledit site C est le site lox P SEQ ID NO : 12, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant le site B, et - ledit site D est le site lox 2272 SEQ ID NO : 68; ou tels que - ledit site A est le site lox P SEQ ID NO : 12 - ledit site B est le site lox N SEQ ID NO : 5, - ledit site C est le site lox P SEQ ID NO : 12, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant le site A, et - ledit site D est le site lox 2272 SEQ ID NO : 68; ou tels que - ledit site A est le site lox P SEQ ID NO : 12 - ledit site B est le site lox N SEQ ID NO : 5, - ledit site C est le site lox N SEQ ID NO : 5, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant le site B, et - ledit site D est le site lox 2272 SEQ ID NO : 68; ou tels que ledit site A est le site lox P SEQ ID NO : 12 ledit site B est le site lox N SEQ ID NO : 5, - ledit site C est le site lox 2272 SEQ ID NO : 68, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant le site D, et - ledit site D est le site lox 2272 SEQ ID NO : 68; ou tels que 32 - ledit site A est le site lox N SEQ ID NO : 5 site de - ledit site B est le site lox P SEQ ID NO : 12, - ledit site C est le site lox 2272 SEQ ID NO : 68, ledit premier recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant le site D, et - ledit site D est le site lox 2272 SEQ ID NO : 68. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae comprenant un ADN hétérologue telle que définies ci-dessus, dans laquelle ledit ADN hétérologue code pour une protéine d'intérêt. Selon un mode de réalisation particulier, ledit ADN hétérologue cité dans l'un quelconque des modes de réalisation précédemment décrit, est choisi parmi : la séquence SEQ ID NO : 212 qui code pour la protéine SEQ ID NO :208, la séquence SEQ ID NO: 213 qui code pour la protéine SEQ ID NO :209, la séquence SEQ ID NO: 214 qui code pour la protéine SEQ ID NO :210, la séquence SEQ ID NO : 215 qui code pour la protéine SEQ ID NO :211, la séquence SEQ ID NO : 173 qui code pour la protéine SEQ ID NO :167, ou la séquence SEQ ID NO: 168 qui code pour la protéine SEQ ID NO :165. Selon un mode de réalisation particulier, ledit ADN hétérologue cité dans l'un quelconque des modes de réalisation précédemment décrit, est choisi parmi : une séquence codant pour la protéine SEQ ID NO :208, une séquence codant pour la protéine SEQ ID NO :209, une séquence codant pour la protéine SEQ ID NO :210, une séquence codant pour la protéine SEQ ID NO :211, une séquence codant pour la protéine SEQ ID NO :167, ou une séquence codant pour la protéine SEQ ID NO :165, selon la dégénérescence du code génétique. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae comprenant un ADN hétérologue telle que définies ci-dessus, dans laquelle ladite protéine d'intérêt est un antigène hétérologue immunogène. Par « antigène hétérologue immunogène » on entend tout peptide ou protéine provenant d'un organisme différent de ladite souche mutante et capable de provoquer une réaction immunitaire. Un antigène peut correspondre à un épitope ou à plusieurs épitopes. 33 Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle ledit ADN hétérologue code pour au moins deux protéines d'intérêt et comprend les moyens nécessaires à leurs expressions, chacune desdites au moins deux protéines d'intérêt étant traduites de manière indépendante, c'est-à-dire qu'elles sont chacune contrôlées par des éléments nécessaires à leur traduction indépendants. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle ledit ADN hétérologue code pour au moins deux protéines d'intérêt et comprend les moyens nécessaires à leurs expressions, chacune desdites au moins deux protéines d'intérêt étant traduites de manière indépendante, et dans laquelle lesdites au moins deux protéines d'intérêt sont des antigènes hétérologues immunogènes. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae comprenant un ADN hétérologue dans laquelle ledit ADN hétérologue code pour au moins une protéine d'intérêt et une protéine de résistance et les moyens nécessaires l'expression desdites protéines, chacune desdites protéines d'intérêt et de résistance étant traduites de manière indépendantes. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae comprenant un ADN hétérologue dans laquelle ledit ADN hétérologue code pour au moins une protéine d'intérêt et une protéine de résistance et les moyens nécessaires l'expression desdites protéines, chacune desdites protéines d'intérêt et de résistance étant traduites de manière indépendantes, et dans laquelle ladite au moins une protéine d'intérêt est un antigène hétérologue immunogène. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae comprenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, dans laquelle ledit antigène hétérologue immunogène est un antigène hétérologue immunogène de virus. 34 Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae comprenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment dans laquelle ledit antigène hétérologue immunogène est un antigène hétérologue immunogène du virus Influenza. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae telle que définie précédemment, comprenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène, dans laquelle ledit antigène hétérologue immunogène est un antigène hétérologue immunogène du virus Influenza choisi parmi : la protéine de SEQ ID NO : 208(fragment N-ter d'un virus influenza humain I), ou la protéine de SEQ ID NO : 209 (fragment N-ter de la protéine M2 d'un virus influenza du porc), ou la protéine de SEQ ID NO : 201(fragment N-ter de la protéine M2 d'un virus influenza aviaireI) ou la protéine de SEQ ID NO : 211 (fragment N-ter de la protéine M2 d'un virus influenza aviaireII) ou la protéine de SEQ ID NO : 167 ,correspondant à la fusion, dans l'ordre, de deux protéines SEQ ID NO: 208, une protéine SEQ ID NO: 209, une protéine SEQ ID NO: 210 et une protéine SEQ ID NO : 211, espacée chacune par un linker pour permettre une bonne conformation de la protéine de fusion SEQ ID NO: 167, ou la protéine SEQ ID NO : 165, correspondant à la fusion, dans l'ordre, de la protéine SAG1 de T gondii SEQ ID NO : 166, de deux protéines SEQ ID NO: 208, une protéine SEQ ID NO : 209, une protéine SEQ ID NO : 210 et une protéine SEQ ID NO : 211. Selon un autre mode de réalisation particulier, les deux protéines SEQ ID NO : 208, la protéine SEQ ID NO : 209, la protéine SEQ ID NO : 210 et la protéine SEQ ID NO : 211, peuvent être fusionnées dans l'un des ordres suivants, en veillant toujours à ce qu'elles soient espacées par un linker : ['SEQ ID NO:211', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO2091 ['SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:211', 'SEQ ID NO:209'. 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO2081 ['SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:211', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO2091 ['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO2111 ['SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:211', 'SEQ ID NO:2081 LOI Z:ON CU OIS. `.I I Z:ON CH OIS. '.60Z:ON CII OIS. '.80Z:ON CH ins, `.80Z:ONUI OIS.] UOZ:ON CH OIS. `.80Z:ON CH OIS. `.60Z:ON GI OIS. `.0I Z:ON CH ÙS 11 Z:ON_ CH OIS.] 1.80Z:ON CII ùs ii Z:ON CII OIS. 'JO I Z:ON GI OIS. '.80Z:ON CII OIS. '.60Z:ON UI OIS.] LI I Z:01-1 G1 OIS. .80Z01-1 QI OIS. .80Z:ON CH OIS. .0I Z:ON CII OIS. `.60Z:ONUI OIS.] LOI Z:ONUI bas, ',60Z:ON CU OIS. '.80Z:ON CII ùS II Z:ON CII OIS. '.80Z:ON GI OIS.] Li I Z:ON CH OIS. `.0 I Z:ON CH OIS. .80Z:ON GI OIS. `.80Z:ON CH OIS. `.60Z:ON CH OIS.] 1.80Z:ON CH bas, `,80Z:ON CH ÙS il Z:01-1 CH OIS. `.60Z:ON CU OIS. `.0IZ:ON CH OIS.] LOI Z:ON CH OIS. `.80Z:ON CH ÙS il Z:ON CH OIS. `.80Z:ON CH OIS. ..60Z:ON CH OIS.] 1.60Z:ON CU ÙS ii Z:ON GI bas, '.80Z:ON CH Ùas, ',0 I Z:ON CH OIS. '.80Z:ON CH OIS.] 1.80Z:ON CH OIS. `.60Z01-1 CH OIS. `.01Z01^1 CH ÙS ii Z:ON CH OIS. `.80Z:ON CH OIS.] 1.80Z:ON CH OIS. '.80Z:ON GI ÙS 01 Z:ON CH OIS. '.60Z:ON CH ùs il Z:ON GI OIS.] 1.80Z:ON CH OIS. .1 I Z:ON_ CH OIS. .60Z:ON CH OIS. `.80Z01\1 CH OIS. `.01Z:ON CH OIS.] 1.80Z:ON CH OIS. '.60Z:ON CH OIS. `.0I Z:ON CH OIS. `.80Z:ON CH bas, `JIZ:ON CH OIS.] 1.80Z:ON CH OIS. .1 I Z:ON CH OIS. .80Z:ON CH OIS. '.01Z:ON CH OIS. `.60Z:ON CH OIS.] 1.80Z:ON CU OIS. II Z:ON CH ÙS 01Z:ON CH OIS. `.60Z:ON CH OIS. `.80Z:ONUI OIS.] 1.80Z:ON CH ÙS 01 Z:ON CH ÙS Ii Z:ONUi OIS. :.SOZ:ON CH OIS. `.60Z01N1 GI bas.1 1.80Z:ON CH OIS. `.01Z:ON GI OIS. '.80Z:ON GI ÙS il Z:01\1 CH ôas, `,60Z01^1 CH OIS.] 1.60Z:ON CH OIS. ..01 Z:01-1 CH OIS. 'JI I Z:ON CH OIS. `.80Z:ON CH OIS. `.80Z:ON CH OIS.] LOI Z:01\1 CH OIS. `.80Z:01-1 CH OIS. `.80Z:ONI CH OIS. `.I1 Z:01\1 CH OIS. `.60Z:ON CH OIS.] Li I Z:ON CH OIS. `.60Z:ON GI ens, ',80Z:ONIGI bas, ',OI Z:ONI CH OIS. `.80Z:ON CH OIS.] 1.60Z:ON GI OIS. .1 I Z:ON CH OIS. .80Z:ON CH OIS. `.80Z:ON CH OIS. `.0I Z:01-1 CH OIS.] L II Z:ON CH ôas, ',80Z:ON CH OIS. `.0I Z:ON CH OIS. '.80Z:ON GI OIS. `.60Z:ONUI OIS.] 1.80Z:ON CH OIS. `.60Z:01\1 CH ÙS ii Z:ON CH OIS. `.80Z01-1 CH ùs 01Z:01-1 CH OIS.] LoIZ:ON CH OIS. ..60Z:ON CH ÙS ii Z:ON CH OIS. '.80Z:ON CH OIS. '.80Z:ON CH OIS.] 1.80Z:ON CH OIS. `.60Z:ON CH OIS. `.80Z:ON CH ÔS 1 I Z:ON CH Ôs 01 Z:ON G1 OIS.] LI I Z:01\1 CH OIS. -.60Z:ON CH OIS. -.80Z:ON CH OIS. -.80Z:ON CH ÙS 01Z:ON CH OIS.] SE LOI Z:ONUI ÙqS, I Z:ONUI ÙqS, ',80Z:ONUI InS, `,80Z:ON CII baS, `,60Z:ONrn Ô3S.1 LI I Z:ON CII OIS, `,80Z:ON GI Ôs 01 ZON UI Ô1S, ..60Z:ON CII OIS, `,80Z01-1UI OIS.] LOI Z:01^1UI ÙS II Z:ONUI OIS, ',80Z:ON CU OIS. `,60Z:ON GI (MS, ',80Z:ON CII bas.] L6OZ:ON CII ÙS 01 Z:ON UI OIS, .80Z:ON CH OIS, ..80Z:ONUI ÙqS. `,1 I Z:ON CII OIS.] L li Z:ON CII OIS, '.80Z:ON CII baS, .60Z:ON CU OIS, `.0I Z:ON CII ÙqS, ',80Z:ON CII bas.] Lsoz:omUi bus, `,0I Z:01\1 CII OIS, ',80Z:ONI CII OIS, ..60Z:ON CII OIS, `,1 I Z:ON Ui OIS.] L8OZ:ON CII baS, ',0 I Z:ON CII ÙqS, `,60Z:ON UI ÙqS, `,80Z:ON CU ÙS ii Z:ON UI OIS.] L6OZ:ON CH OIS. `,80Z:ON_ CH OIS, `,80Z:ON GI ÙS 01 Z:ONUI OIS, `,1 I Z:ON CII bas,' L IIZ:ONI CU OIS, ',80Z:ON CII ÙS 6OZO UI ÙqS, ',80Z:ON CII ùS 01Z:ON CII OJS.1 L8OZ:ON CU OIS, `,60Z:ON GI ÙS 1 I Z:ON GI ÔS OiZOt GI OIS, `,80Z:ONUI 61S.1 L8OZ:ONUI OJS, `.80Z:ON CII ÙqS, ',0 IZ:ON CH OIS, 'JI Z:ON UI ÙqS, `,60Z:ON UI OIS.] LI I Z:ON CU OIS, `,80Z:ON CU OIS, `,80Z:ONUI ÙqS, ..60Z:ON CII OIS, `,01Z:ON GI OIS.] L6OZ:ONUI ÙqS, Ii Z:ONUI ÙS 01Z:ON GI ÙqS, `,80Z:ON QI ÙqS, ',80Z:ON CU OIS.] Li 1Z:ON CH ÙS 01 ZON UI OIS. .80Z:ON CH OIS, `,60Z:ON CH OIS. `,80Z:ON CII OIS.] LOI Z:ON CH bas, ',60Z:ON CII ÙJS, ',SOZ:ONUI Oas, `,80Z:ONUI ùS Ii Z:ON CII ÙqS.1 L8OZ:ON GI OIS, `,1 I Z:ON CH OIS, `,60Z:ON CH ÙS 01 Z:ON UI OIS...80Z:ONUI OIS.] L6OZ:01^1UI ÙJS, ',80Z01-1 CU OIS, `'I I Z:ONUI ÙS 01 Z:ON CII OIS, `,80Z:ON CII ÙqS.1 LSOZ:ON GI ÙqS, `.60Z:ON GI OIS, ..80Z:ON CH OIS, ..01Z:ON CU OIS, Ii Z:ON CII OIS.] L60Z:01-1 CH ÙS 01 Z:ON CII OIS, `,80Z:ON CII OIS, `,1 I Z:ONUI ?MS, `,80Z:ON CII OIS.] L6OZ:ON UI OaS, '.80Z:ON UI ÙS',80Z:ON GI ÙS II Z:ON CU OIS. ',01Z:ONUI OJS.1 Loi Z:ON C11 OIS, .80Z:ON CH OIS, .80Z:ONUI baS, `,60Z:ON UI OIS. `,11Z:ON UI OIS.] Loi z:ONUI OIS, `,80Z:ONUI ÙS il Z:ONUT ÙJS, ',60Z:ONUI OIS, '.80Z:ONUI OJS.1 Li I Z:ONUi OIS, `,60Z01\1Ui ÙS 01Z:ON UI OIS, `,80Z:ON CH OIS, `,80Z01-1 CU OIS.] L8OZ:ON CII OIS. `,80Z:ON CII ÙS ii Z:ONUI OIS, `,01Z:ON CU OIS, '.60Z:ON CII OIS.] LOI Z:ON GI OIS. ..80Z:ON GI OIS. `,60Z:ON CH OIS. ''I I Z:ON GI OIS. `.80Z:ON GI OIS.] LSOZ:ON CU OIS. -.0I Z:ON CU OIS. -.60Z:ON CU OIS. 'JI Z:ON CU OIS. -.80Z:ON CU OIS.] 9£ 37 ['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:211', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO2081 ['SEQ ID NO:211', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208'. 'SEQ ID NO2101 [SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:211', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:20911, la protéine issue de la fusion de ces protéines pouvant également être exprimée en fusion avec la protéine SAG1 de T gondil SEQ ID NO : 166. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae telle que définie précédemment, dans laquelle ledit antigène hétérologue immunogène est un antigène hétérologue immunogène de bactérie. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae telle que définie précédemment, dans laquelle ledit antigène hétérologue immunogène est un antigène hétérologue immunogène de parasite. Selon un mode de réalisation particulier, ledit ADN hétérologue code pour un antigène hétérologue immunogène de virus, de parasite ou de bactérie, et est en particulier constitué de la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 173, codant pour l'antigène du virus Influenza SEQ ID NO : 167. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae telle que définie précédemment dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Toxoplasma gondii et dans laquelle le gène mic/ et le gène mic3 sont délétés et dans laquelle - le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic/ délété est le site lox N de SEQ ID NO : 5 et - le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété est le site lox P de SEQ ID NO : 12. 38 Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae telle que définie précédemment dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Toxoplasma gondii, dans laquelle le gène mic/ et le gène mic3 sont délétés et dans laquelle - le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic/ délété est le site lox N de SEQ ID NO : 5 et - le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété est le site lox P de SEQ ID NO : 12. ladite souche comportant un ADN hétérologue SEQ ID NO : 168 permettant l'expression d'une protéine SEQ ID NO: 165, ledit ADN hétérologue étant au locus du gène mic/ délété, et étant flanqué en amont par un premier site de recombinaison correspondant audit site de recombinaison spécifique de la Crerecombinase au locus du gène mic/ délété est le site lox N de SEQ ID NO: 5 et en aval par un second site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase lox N de SEQ ID NO : 5. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae telle que définie précédemment dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Toxoplasma gondii, dans laquelle le gène mic/ et le gène mic3 sont délétés et dans laquelle - le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic/ délété est le site lox N de SEQ ID NO : 5 et - le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété est le site lox P de SEQ ID NO : 12. ladite souche comportant un ADN hétérologue SEQ ID NO : 168 permettant l'expression d'une protéine SEQ ID NO: 165, ledit ADN hétérologue étant au locus du gène mic3 délété, et étant flanqué en amont par un premier site de recombinaison correspondant audit site de recombinaison spécifique de la Crerecombinase au locus du gène mic3 délété est le site lox P de SEQ ID NO: 12 et en aval par un second site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase lox P de SEQ ID NO : 12. 39 Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae, ladite souche mutante étant une souche de Toxoplasma gondii, dans laquelle les gènes mic 1, le gène mic 3, et le gène ropl6I sont délétés, et dans laquelle - le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic/ délété est le site lox N de SEQ ID NO : 5, et - le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété est le site lox P de SEQ ID NO : 12, et - le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène ropl6I délété est le site lox 2272 de SEQ ID NO :68. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante selon l'invention, dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Toxoplasma gondii choisi parmi - une souche dans laquelle o le gène mic/ et le gène mic3 sont délétés et dans laquelle le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic/ délété est le site lox N SEQ ID NO : 5 et o le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété est le site lox P SEQ ID NO : 12. - une souche dans laquelle le gène mic 1, le gène mic 3 et le gène ropl6I sont délétés, et dans laquelle o le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic/ délété est le site lox N SEQ ID NO : 5, et o le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété est le site lox P SEQ ID NO : 12, et o ledit second site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase qui flanque ledit second ADN hétérologue codant pour la protéine GRA15II au locus du gène ropl6I délété, en amont de celui-ci est le site lox 2272 SEQ ID NO :68. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Toxoplasma spp., dans laquelle les gènes micl , mic3 et ropl6I sont délétés, contenant trois sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des 40 susdits gènes délétés, le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic/ délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété et le site de recombinaison spécifique au locus du gène rop161 délété étant différent des sites de recombinaison spécifique situés aux loci des gènes mic/ et mic3 délétés et ladite souche contenant un ADN hétérologue au locus du gène mic/ délété ou au locus du gène mic3 délété ou au locus du gène rop161 délété, ledit ADN hétérologue étant différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des gènes micl, mic3 et rop161 délétés, de telle façon que : - lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic/ délété, il est flanqué : - d'un premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic/ délété (site A), et d'un second site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase (site C), identique au premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase situé au locus du gène mic/ délété (site A), - lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic3 délété, il est flanqué : - d'un premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic3 délété (site B), et d'un second site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase (site C), identique au premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase situé au locus du gène mic3 (site B) délété, o lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène rop161 délété, il est flanqué : - d'un premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène rop161 délété (site D), et 41 - d'un second site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase (site C), identique au premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase situé au locus du gène rop161 (site D) délété, ladite souche comportant les éléments nécessaires à la transcription dudit ADN hétérologue, ou les moyens nécessaires à l'expression dudit ADN hétérologue lorsque ledit ADN hétérologue code pour au moins une protéine, ladite souche mutante contenant alors quatre sites de recombinaison spécifique de la Crerecombinase définis de la manière suivante : - le site A correspondant audit site de recombinaison spécifique de la Crerecombinase au locus du gène mic/ délété - le site B correspondant audit site de recombinaison spécifique de la Crerecombinase au locus du gène mic3 délété, et - le site C correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Crerecombinase au locus du gène mic/ délété (site A) lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic/ délété ou correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété (site B) lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic3 délété, ou correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène rop161 délété (site D) lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène rop161 délété - le site D correspondant audit site de recombinaison spécifique de la Crerecombinase au locus dudit gène rop161 délété tels que, lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic/ délété, - ledit site A correspond à un site lox N, SEQ ID NO: 5 - ledit site B correspond à un site lox P, SEQ ID NO: 12 - ledit site C correspond à un site lox N, SEQ ID NO: 5 - ledit site D correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68; ou tels que lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic3 délété, - ledit site A correspond à un site lox N, SEQ ID NO: 5 - ledit site B correspond à un site lox P, SEQ ID NO: 12 42 - ledit site C correspond à un site lox P, SEQ ID NO: 12 - ledit site D correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68; ou tels que lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène rop161 délété, - ledit site A correspond à un site lox N, SEQ ID NO: 5 - ledit site B correspond à un site lox P, SEQ ID NO: 12 - ledit site C correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68 - ledit site D correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Neospora caninum et dans laquelle le gène mic/ et le gène mic3 sont délétés et dans laquelle - le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic/ délété est le site lox P de SEQ ID NO : 12 et - le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété est le site lox N de SEQ ID NO : 5. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae telle que définie précédemment dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Neospora caninum, dans laquelle le gène mic/ et le gène mic3 sont délétés et dans laquelle - le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic/ délété est le site lox P de SEQ ID NO : 12. - le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété est le site lox N de SEQ ID NO : 5 et ladite souche comportant un ADN hétérologue SEQ ID NO : 168 permettant l'expression d'une protéine SEQ ID NO: 165, ledit ADN hétérologue étant au locus du gène mic/ délété, et étant flanqué en amont par un premier site de recombinaison correspondant audit site de recombinaison spécifique de la Crerecombinase au locus du gène mic/ délété est le site lox P de SEQ ID NO: 12 et en aval par un second site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase lox P de SEQ ID NO : 12. 43 Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae telle que définie précédemment dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Neospora caninum, dans laquelle le gène mic/ et le gène mic3 sont délétés et dans laquelle - le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic/ délété est le site lox P de SEQ ID NO : 12. - le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété est le site lox N de SEQ ID NO : 5 et ladite souche comportant un ADN hétérologue SEQ ID NO : 168 permettant l'expression d'une protéine SEQ ID NO: 165, ledit ADN hétérologue étant au locus du gène mic3 délété, et étant flanqué en amont par un premier site de recombinaison correspondant audit site de recombinaison spécifique de la Crerecombinase au locus du gène mic3 délété est le site lox N de SEQ ID NO: 5 et en aval par un second site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase lox N de SEQ ID NO : 5. La présente invention concerne également l'utilisation d'une souche mutante telle que définies précédemment, ne contenant pas d'ADN hétérologue différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés, pour l'insertion ciblée d'un ADN hétérologue. La présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, pour son utilisation comme médicament, en particulier comme vaccin ou comme immunostimulant. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, pour son utilisation dans la prévention de pathologies infectieuses d'origine virale, parasitaire ou bactérienne. 44 Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, pour son utilisation dans la prévention de pathologies infectieuses d'origine virale, parasitaire ou bactérienne chez un mammifère ou des oiseaux. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, pour son utilisation dans la prévention de pathologies infectieuses d'origine virale, parasitaire ou bactérienne chez un mammifère, ledit mammifère étant en particulier choisi parmi l'Homme, les ovidés, les caprins, les porcins, les bovins, les équidés, les camélidés, les canidés ou les félidés. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, pour son utilisation dans la prévention de pathologies infectieuses d'origine virale, parasitaire ou bactérienne chez un oiseau, ledit oiseau étant en particulier choisi parmi les poules, dindes, pintades, canards, oies, cailles, pigeons, faisans, perdrix, les autruches, les nandous, les émeus et les kiwis élevés ou détenus en captivité en vue de leur reproduction, de la production de viande ou d'oeufs de consommation ou de la fourniture de gibier de repeuplement. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, pour son utilisation dans la prévention d'une pathologie infectieuse affectant l'appareil digestif, provocant des diarrhées, affectant la digestibilité alimentaire ou l'absorption intestinale. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, pour son utilisation dans la prévention d'une pathologie infectieuse affectant le système nerveux central ou périphérique et toutes les conséquences sur les autres systèmes qui y seraient associées. 45 Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, pour son utilisation dans la prévention d'une pathologie infectieuse affectant l'appareil locomoteur, notamment affectant le système musculosquelettique ou articulaire en particulier les affections d'origine infectieuse provoquant des myosites, des arthrites ou affectant le vol. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, son utilisation dans la prévention d'une pathologie infectieuse affectant l'appareil respiratoire et notamment les fièvres catarrhales, les abcès obstructifs, les perforations et emphysème d'origine infectieux, les trachéites, les bronchites, les pneumonies, les pleurésies ou dans le cas particulier des oiseaux, d'aerosacculites. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, pour son utilisation dans la prévention d'une pathologie infectieuse affectant l'appareil reproducteur, la fécondité et la fertilité, notamment, une pathologie infectieuse affectant le développement normal de l'appareil reproducteur du mâle ou de la femelle, la physiologie du cycle reproducteur chez les femelles, affectant le bon déroulement de la gestation chez les mammifères incluant le développement foetal ou affectant la qualité des oeufs, en particulier, les pathologies infectieuses induisant des métrites, des salpingites, les mammites ou le syndrome de chute de ponte. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, pour son utilisation dans la prévention d'une pathologie d'origine infectieuse affectant l'appareil cardio-circulatoire, la moelle osseuse ou le sang, en particulier dans la prévention des affections d'origine infectieuse provocant une altération de la genèse des éléments figurés du sang et les septicémies incluant les conséquences associées sur les autres organes. 46 Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, pour son utilisation dans la prévention chez l'animal du portage de virus, de bactéries ou de parasites par un animal ou par un sous-produit dérivé et ayant un caractère potentiellement zoonotique, en particulier, pour une utilisation dans la prévention du portage chez l'animal de Salmonella spp., d'Escherichia spp. zoonotique, de Clostridies, de mycobactéries dont la tuberculose. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, pour son utilisation dans la prévention d'une pathologie infectieuse d'origine virale causée par un virus appartenant aux groupes suivant : - Groupe I, II de la classification de Baltimore comprenant les virus dont le génome est constitué d'ADN susceptible d'infecter un mammifère ou un oiseau, en particulier un virus naturel appartenant à la famille des Herpesviridae, et plus particulièrement le virus Epstein-Barr responsable de la mononucléose humaine, l'herpès virus bovin de type I responsable de la rhinotrachéite infectieuse bovine ou le virus de la maladie Marek chez la poule domestique. - Groupe III, IV et V de la classification de Baltimore comprenant les virus dont le génome est constitué d'ARN simple brin ou double brin et qui sont susceptibles d'affecter un mammifère ou un oiseau, en particulier des virus appartenant à la famille des Orthomyxoviridae et plus particulièrement les virus Influenza humains, aviaires et porcins. - Groupe VI de la classification de Baltimore comprenant les virus à ARN requérant une rétrotranscription en ADN pour la multiplication virale et susceptibles d'infecter un mammifère ou un oiseau, en particulier les virus de la famille des Retroviridae, tels que le virus de l'immunodéficience humaine (VIH), le virus de l'immunodéficience féline (FIV), le virus de l'arthrite et encéphalite caprine ou le virus de la leucose féline FELV. - Groupe VII de la classification de Baltimore comprenant les virus à ADN requérant une rétrotranscription en ARN pour la multiplication virale et susceptibles d'infecter un mammifère ou un oiseau en particulier les virus de la 47 famille des Hepadnaviridae, et plus particulièrement le virus de l'hépatite B humaine ou le virus de l'hépatite du canard de Pekin (DHBV). Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue SEQ ID NO : 165, pour son utilisation dans la prévention de la grippe causée par le virus Influenza. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, pour son utilisation dans la prévention d'une pathologie infectieuse d'origine bactérienne (ou causée par une toxine provenant d'une bactérie), ladite bactérie pouvant appartenir aux groupes suivant : - Des Coques GRAM positif qui sont susceptibles d'affecter directement ou par l'un de ces sous-produits, un mammifère ou un oiseau. En particulier des bactéries appartenant au genre Staphylococcus, Streptococcus ou Enteroccoccus ; - Des Coques GRAM négatif qui sont susceptibles d'affecter directement ou par l'un de ces sous-produits, un mammifère ou un oiseau, en particulier des bactéries appartenant au genre Neisseria ; - Des bacilles GRAM positif qui sont susceptibles d'affecter directement ou par l'un de ces sous-produits, un mammifère ou un oiseau, en particulier des bactéries appartenant au genre Listeria, Erysipelothryx, Corynebacterium ou Bacillus ; - Des bacilles GRAM négatif qui sont susceptibles d'affecter directement ou par l'un de ces sous-produits, un mammifère ou un oiseau, en particulier des bactéries appartenant à la famille des Enterobacteriacae. Pseudomonaceae, Vibrionaceae ou appartenant aux genres Escherichia, Brucella, Haemophilus, Pasteurella, Bordetella, Legionella, Ornithobacterium ou Salmonella ; - Des bactéries de forme spiralées GRAM positives ou négatives qui sont susceptibles d'affecter directement ou par l'un de ces sous-produits, un mammifère ou un oiseau, en particulier des bactéries appartenant au genre Treponema, Leptospira ou Borrelia ; - Des bactéries de type mycoplasme qui sont susceptibles d'affecter directement ou par l'un de ces sous-produits, un mammifère ou un oiseau, en particulier des bactéries appartenant au genre Mycoplasma et Ureaplasma ; 48 - Des bactéries non sus-mentionnées ayant la capacité d'envahir une cellule d'un mammifère ou d'un oiseau, en particulier des bactéries appartenant au genre Chlamydia, Rickettsia ou Micobacterium. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, pour son utilisation dans la prévention d'une pathologie ayant pour origine une infection parasitaire, le parasite pouvant appartenir aux groupes suivant : - Protozoaires susceptibles d'affecter directement un mammifère ou un oiseau, en particulier des protozoaires appartenant à l'embranchement des sporozoaires, Rhizoflagellés, des ciliés ou appartenant aux genres Encephalitozoon, Enterocytozoon ou blastocystis ; - Némathelminthes susceptibles d'affecter directement un mammifère ou un oiseau, en particulier des Némathelminthes appartenant au genre Trichuris, Ascaris, Ani saki s, Necator, Strongyloïdes, Toxocara, Ancylo stoma, Trichinella, Loa, Onchocerca, Wichereria, ou Enterobius ; - Plathelminthes susceptibles d'affecter directement un mammifère ou un oiseau, en particulier des Plathelminthes appartenant au genre Fasciola, Paragonimus, Opisthorchis, Sasciolopsis, Dicrocoelium, Clonorchis, Taenia, Diphyllobothrium, Echinococcus, Multiceps, Hymenolepsis et Shistosoma ; - Arthropodes susceptibles d'être responsable d'une affection ou de la vectorisation d'un agent infectieux vis-à-vis d'un mammifère ou d'un oiseau, en particulier des arthropodes appartenant à l'ordre des Anoploures des hétéroptères, des Shiphonaptères, des Diptères, des Brachycères ou des Acariens. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, pour son utilisation comme immunostimulant. 49 On entend par « immunostimulant », que ladite souche mutante, contenant éventuellement un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène, permet de stimuler les défenses immunitaires (comme un vaccin, par exemple). La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant une souche mutante telle que définie précédemment et un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une composition pharmaceutique, comprenant au moins un produit choisi parmi : un adjuvant, un stabilisant ou un conservateur, ou un mélange de ceux-ci. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une composition pharmaceutique, formulée sous forme de dose unitaire variant de 102 à 109 tachyzoïtes d'une souche mutante telle que définie précédemment. La présente invention concerne également une composition vaccinale comprenant une souche mutante telle que définie précédemment et un véhicule pharmaceutiquement acceptable. La présente invention concerne également une méthode de prévention d'une pathologie infectieuse d'origine virale, parasitaire ou bactérienne comprenant une étape d'administration à un mammifère ou à un oiseau d'une souche mutante. La présente invention concerne également un procédé d'obtention d'une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les gènes mic/ et mic3 sont délétés, à partir d'une souche sauvage, comprenant : une étape A comprenant ou constituée de la délétion du gène mic3 par recombinaison homologue et insertion d'une cassette de sélection encadrée par deux sites de recombinaison spécifique identiques, suivi de l'excision de ladite cassette de sélection par la cre-recombinase, suite à laquelle un seul des deux sites 50 de recombinaison spécifique encadrant la cassette reste intégré au locus dudit gène mic3 délété, - une étape B comprenant ou constituée de la délétion du gène mic/ par recombinaison homologue et insertion d'une cassette de sélection encadrée par deux sites de recombinaison spécifique identiques, suivi de l'excision de ladite cassette de sélection par la cre-recombinase, suite à laquelle un seul des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette reste intégré au locus dudit gène mic/ délété les étapes A et B pouvant être réalisée dans un ordre A suivi de B ou B suivi de A, et les deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette de sélection insérée au locus du gène mic/ étant différents des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette de sélection insérée au locus du gène mic3. La présente invention concerne également un procédé d'obtention d'une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les gènes micl, mic3 et rop161 sont délétés et dans laquelle un gène codant pour la protéine GRA15II est intégré au locus du gène rop161 délété, à partir d'une souche sauvage, comprenant : - Une étape A comprenant ou constituée de la délétion du gène mic3 par recombinaison homologue et insertion d'une cassette de sélection encadrée par deux sites de recombinaison spécifique identiques , suivi de l'excision de ladite cassette de sélection par la cre-recombinase, suite à laquelle un seul des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette reste intégré au locus dudit gène mic3 délété, - Une étape B comprenant ou constituée de la délétion du gène mic/ par recombinaison homologue et insertion d'une cassette de sélection encadrée par deux sites de recombinaison spécifique identiques, suivi d'une étape d'excision de ladite cassette de sélection par la cre-recombinase, suite à laquelle un seul des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette reste intégré au locus dudit gène mic/ délété les deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette de sélection insérée au locus du gène mic/ étant différents des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette de sélection insérée au locus du gène mic3 51 - une étape C comprenant ou constituée de la délétion du gène rop161 par recombinaison homologue et insertion d'une cassette comprenant une cassette de sélection encadrée par deux sites de recombinaison spécifique , et comprenant en aval de cette cassette de sélection une séquence codant pour le gène gra1511, suivi d'une étape d'excision de ladite cassette de sélection par la cre-recombinase, suite à laquelle ladite séquence codant pour le gène gra1511 est alors intégrée au locus du gène rop161 délété en aval d'un seul site de recombinaison spécifique les deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette de sélection insérée au locus du gène rop161 étant différents des deux sites de recombinaison spécifique encadrant les cassettes de sélection insérées aux locus des gènes mic/ et mic3. les étapes A, B et C pouvant être réalisée dans un ordre A suivi de B suivi de C, ou A suivi de C suivi de B, ou B suivi de A suivi de C, ou B suivi de C suivi de A, ou C suivi de A suivi de B, ou C suivi de B suivi de A. La présente invention concerne également un procédé d'obtention d'une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les gènes mic/ et mic3 sont délétés et dans laquelle un ADN hétérologue est intégré au locus du gène mic/ délété ou au locus du gène mic3 délété, à partir d'une souche sauvage, comprenant : - une étape A comprenant ou constituée de la délétion du gène mic3 par recombinaison homologue et insertion d'une cassette de sélection encadrée par deux sites de recombinaison spécifique identiques, suivi de l'excision de ladite cassette de sélection par la cre-recombinase, suite à laquelle un seul des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette reste intégré au locus dudit gène mic3 délété, - une étape B comprenant ou constituée de la délétion du gène mic/ par recombinaison homologue et insertion d'une cassette de sélection encadrée par deux sites de recombinaison spécifique identiques, suivi de l'excision de ladite cassette de sélection par la cre-recombinase, suite à laquelle un seul des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette reste intégré au locus dudit gène mic/ délété les deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette de sélection insérée au locus du gène mic/ étant différents des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette de sélection insérée au locus du gène mic3 52 les étapes A et B pouvant être réalisée dans un ordre A suivi de B ou B suivi de A, puis - une étape D comprenant ou constituée de l'insertion ciblée d'un ADN hétérologue flanqué par un site de recombinaison spécifique, ledit ADN hétérologue est intégré au locus du gène mic/ délété lorsque le site de recombinaison spécifique qui le flanque correspond au site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic/ délété, ledit ADN hétérologue est intégré au locus du gène mic3 délété lorsque le site de recombinaison spécifique qui le flanque correspond au site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic3 délété une fois intégré, ledit ADN hétérologue sera donc encadré par deux sites de recombinaison spécifique. La présente invention concerne également un procédé d'obtention d'une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les gènes micl, mic3 et rop161 sont délétés et dans laquelle un ADN hétérologue est intégré au locus du gène mic/ délété ou au locus du gène mic3 délété et un gène codant pour la protéine GRA15II est intégré au locus du gène rop161 délété, à partir d'une souche sauvage, comprenant : - Une étape A comprenant ou constituée de la délétion du gène mic3 par recombinaison homologue et insertion d'une première cassette de sélection encadrée par deux sites de recombinaison spécifique identiques, suivi de l'excision de ladite cassette de sélection par la cre-recombinase, suite à laquelle un seul des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette reste intégré au locus dudit gène mic3 délété, - Une étape B comprenant ou constituée de la délétion du gène mic/ par recombinaison homologue et insertion d'une cassette de sélection encadrée par deux sites de recombinaison spécifique identiques, suivi de l'excision de ladite cassette de sélection par la cre-recombinase, suite à laquelle un seul des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette reste intégré au locus dudit gène mic/ délété 53 les deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette de sélection insérée au locus du gène mic/ étant différents des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette de sélection insérée au locus du gène mic3 - Une étape C comprenant ou constituée de la délétion du gène rop16I par recombinaison homologue et insertion d'une cassette comprenant une cassette de sélection encadrée par deux sites de recombinaison spécifique, ces deux sites de recombinaison spécifique étant différents des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette de sélection insérée au locus du gène mic/ et de ceux encadrant la cassette de sélection insérée au locus du gène mic3, et comprenant en aval de cette cassette de sélection une séquence codant pour le gène gra1511, suivi de l'excision de ladite cassette de sélection par la cre-recombinase, suite à laquelle ladite séquence codant pour le gène gra1511 est alors intégrée au locus du gène rop16I délété en aval d'un seul site de recombinaison spécifique les étapes A, B et C pouvant être réalisée dans un ordre A suivi de B suivi de C, ou A suivi de C suivi de B, ou B suivi de A suivi de C, ou B suivi de C suivi de A, ou C suivi de A suivi de B, ou C suivi de B suivi de A, puis - une étape D comprenant ou constituée de l'insertion ciblée d'un ADN hétérologue flanqué par un site de recombinaison spécifique, ledit ADN hétérologue est intégré au locus du gène mic/ délété lorsque le site de recombinaison spécifique qui le flanque correspond au site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic/ délété, ledit ADN hétérologue est intégré au locus du gène mic3 délété lorsque le site de recombinaison spécifique qui le flanque correspond au site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic3 délété, ledit ADN hétérologue est intégré au locus du gène rop16 délété lorsque le site de recombinaison spécifique qui le flanque correspond au site de recombinaison spécifique situé au locus du gène rop16 délété, une fois intégré, ledit ADN hétérologue sera donc encadré par deux sites de recombinaison spécifique. 54 DESCRIPTIONS DES FIGURES Figure 1 : cette figure est une représentation schématique de recombinaison par le système Cre/loxP appliqué au gène X encadré par les sites loxP identiques Figure 2-A : cette figure est une représentation schématique du plasmide pNcMIC3-KOCAT-GFP loxN. Ce plasmide de 10063 paires de bases comprend le gène de sélection codant pour la protéine chimérique CAT-GFP placé sous le contrôle du promoteur de l'a-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l'expression du gène dans le parasite. Cette cassette de sélection est encadrée par deux sites loxN identiques de même orientation, ajoutés par PCR. De part et d'autre de la cassette ont été insérées les régions homologues flanquant le gène ncmic3. Figure 2-B : cette figure est une représentation schématique du plasmide pNcMIC1-KOCAT-GFP loxP. Ce plasmide de 10069 paires de bases comprend le gène de sélection codant pour la protéine chimérique CAT-GFP placé sous le contrôle du promoteur de l'a-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l'expression du gène dans le parasite. Cette cassette de sélection est encadrée par deux sites loxP identiques de même orientation, ajoutés par PCR. De part et d'autre de la cassette ont été insérées les régions homologues flanquant le gène ncmicl. Figure 2-C : cette figure est une représentation schématique du plasmide pTSAG1- Cre Recombinase. Ce plasmide de 4 694 paires de bases comprend le gène codant pour la protéine CRE-Recombinase placé sous le contrôle du promoteur du gène sagl de Toxoplasma gondii pour permettre l'expression du gène dans le parasite. En aval du gène codant la Cre Recombinase, la séquence 3'UTR du gène sagl de Toxoplasma gondii est insérée pour stabiliser l'ARNm codant la protéine Cre Recombinase. Figure 3-A : cette figure illustre les 4 étapes pour obtenir la souche Neo ncmic1-3 KO 2G. La première étape de recombinaison homologue permet l'intégration du gène codant pour l'enzyme CAT-GFP au locus du gène mic3. Une sélection par le chloramphénicol permet d'amplifier la souche simple mutante Neo ncmic3 KO. Dans une seconde étape, le gène codant pour la protéine CAT-GFP est supprimé par action de la Cre Recombinase. La troisième étape permet l'intégration du gène codant pour l'enzyme CAT-GFP au locus du 55 gène mic/. Une sélection par le chloramphénicol permet d'amplifier la souche simple mutante Neo ncmic1-3 KO. Enfin, dans une dernière étape, le gène codant pour la protéine CAT-GFP est supprimé par action de la Cre Recombinase. Figure 3-B : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus respectivement avec la souche sauvage NC-1 de Neospora caninum, la souche Neo ncmic3 KO, la souche Neo ncmic3 KO 2G, la souche Neo ncmic/-3 KO et la souche Neo ncmic/-3 KO 2G en utilisant les jeux d'amorces des PCR du Tableau 3. Figure 3-C : cette figure représente les résultats des séquençages obtenus sur la souche Neo ncmic/-3 KO 2G et confirme que les gènes mic/ et mic3 ont été supprimés et remplacés respectivement par des cicatrices LoxP et LoxN. Figure 4-A : cette figure illustre l'analyse par immunofluorescence de la détection de la protéine MIC3 obtenue respectivement avec la souche sauvage NC-1 de Neospora caninum et souche Neo ncmic/-3 KO 2G en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre la protéine MIC3. Figure 4-B : cette figure illustre l'analyse par immunofluorescence de la détection de la protéine CATGFP obtenue respectivement avec la souche sauvage NC-1 de Neospora caninum et les souches mutantes de Neospora caninum en utilisant la fluorescence intrinsèque de la protéine CATGFP. Cette figure permet de mettre en évidence la présence de la protéine CATGFP ou l'absence de la protéine CATGFP suite à l'action de la Cre Recombinase. Figure 5-A : cette figure est une représentation schématique du plasmide pTgMIC3-KOCAT-GFP loxP. Ce plasmide de 9 931 paires de bases comprend le gène de sélection codant pour la protéine chimérique CAT-GFP placé sous le contrôle du promoteur de l'a-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l'expression du gène dans le parasite. Cette cassette de sélection est encadrée par deux sites loxP identiques de même orientation, ajoutés par PCR. De part et d'autre de la cassette ont été insérées les régions homologues flanquant le gène tgmic3. Figure 5-B : cette figure est une représentation schématique du plasmide pTgMIC1-KOCAT-GFP loxN. Ce plasmide de 10 285 paires de bases comprend le gène de sélection codant pour la protéine chimérique CAT-GFP placé sous le contrôle du promoteur de l'a-tubuline de 56 Toxoplasma gondii pour permettre l'expression du gène dans le parasite. Cette cassette de sélection est encadrée par deux sites loxN identiques de même orientation, ajoutés par PCR. De part et d'autre de la cassette ont été insérées les régions homologues flanquant le gène tgmicl. Figure 6-A : cette figure illustre les 4 étapes pour obtenir la souche Toxo tgmic/-3 KO 2G. La première étape de recombinaison homologue permet l'intégration du gène codant pour l'enzyme CAT-GFP au locus du gène mic3. Une sélection par le chloramphénicol permet d'amplifier la souche simple mutante Toxo tgmic3 KO. Dans une seconde étape, le gène codant pour la protéine CAT-GFP est supprimé par action de la Cre Recombinase. La troisième étape permet l'intégration du gène codant pour l'enzyme CAT-GFP au locus du gène mic/. Une sélection par le chloramphénicol permet d'amplifier la souche simple mutante Toxo tgmic1-3 KO. Enfin, dans une dernière étape, le gène codant pour la protéine CAT-GFP est supprimé par action de la Cre Recombinase. Figure 6-B : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus respectivement avec la souche sauvage RH de Toxoplasma gondii, la souche Toxo tgmic3KO, la souche Toxo tgmic3 KO 2G, la souche Toxo tgmic/-3 KO et la souche finale Toxo tgmic/-3 KO 2G en utilisant les jeux d'amorces des PCR du Tableau 7. Figure 6-C : cette figure représente les résultats des séquençages obtenus sur la souche Toxo tgmic/-3 KO 2G et confirme que les gènes mic/ et mic3 ont été supprimés et remplacés respectivement par des cicatrices LoxN et LoxP. Figure 7 : cette figure illustre l'analyse par immunofluorescence de la détection des protéines MIC1, MIC3 ou CAT-GFP obtenus respectivement avec la souche sauvage RH de Toxoplasma gondii, la souche Toxo tgmic3 KO, la souche Toxo tgmic3 KO 2G, la souche Toxo tgmic/-3 KO et la souche Toxo tgmic/-3 KO 2G en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre la protéine MIC1, MIC3 ou directement avec les propriétés fluorescentes intrinsèques de la protéine CAT-GFP. Figure 8 : cette figure est une représentation schématique du plasmide pTgRopl6KOGral5HKI-CAT-GFP 1ox2272. Ce plasmide de 12721 paires de bases comprend le gène de sélection codant pour la protéine chimérique CAT-GFP placé sous le contrôle du promoteur 57 de l'a-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l'expression du gène dans le parasite. Cette cassette de sélection est encadrée par deux sites 1ox2272 identiques de même orientation, ajoutés par PCR. En aval de cette cassette a été intégré la cassette d'expression permettant de coder la protéine Gra51HAII. Puis de part et d'autre de ces cassettes ont été insérées les régions homologues flanquant le gène tgrop16. Figure 9-A : cette figure illustre les 2 étapes pour obtenir la souche Toxo tgmic/-3 KO rop16 KO GRA1511 KI-2G. La première étape de recombinaison homologue permet l'intégration du gène codant pour l'enzyme CAT-GFP et le gène gra1511HA au locus du gène rop16. Une sélection par le chloramphénicol permet d'amplifier la souche mutante Toxo tgmic/- 3 KO rop16 KO GRA1511 KI. Dans une seconde étape, le gène codant pour la protéine CATGFP est supprimé par action de la Cre Recombinase pour obtenir la souche Toxo tgmic/- 3 KO rop16 KO GRA1511 KI-2G. Figure 9-B : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus respectivement avec les souches Toxo tgmic/-3 KO 2G, Toxo tgmic/-3 KO rop16 KO GRA1511 KI et Toxo tgmic/-3 KO rop16 KO GRA1511 KI 2G. Figure 9-C : cette figure représente les résultats des séquençages obtenus sur la souche Toxo tgmic/-3 KO rop16 KO GRA1511 KI 2G et confirme que les gènes rop16 et cat-e ont été supprimés et remplacés par la cicatrice Lox2272 et le gène gral5HAII. Figure 10 : cette figure illustre l'analyse par immunofluorescence de la détection de la protéine GRA15 (via le tag HA) obtenu respectivement avec les souches Toxo tgmic/- 3 KO rop16 KO GRA1511 KI et Toxo tgmic/-3 KO rop16 KO GRA1511 KI-2G en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre le tag HA. Cette figure illustre également la suppression de la cassette CATGFP avec la disparition de la fluorescence GFP pour la souche Toxo tgmic/-3 KO rop16 KO GRA1511 KI-2G. Figure 11-A : cette figure illustre la position des amorces nucléiques utilisées dans la présente invention pour détecter la présence des trois gènes ncmic3, ncmicl, cat-gfp dans les souches sauvages et/ou des souches mutantes de Neo ncmic3 KO et/ou Neo ncmic3 KO 2G et/ou Neo ncmic1-3 KO et/ou Neo ncmic1-3 KO 2G de Neospora caninum. Les chiffres 58 représentent la numérotation des séquences d'amorces (SEQ ID NO :x) définies dans la présente demande. Figure 11-B : cette figure illustre la position des amorces nucléiques utilisées dans la présente invention pour détecter la présence des trois gènes tginic3, tgmicl, cat-gfp dans les souches sauvages et/ou des souches mutantes de Toxo tginic3 KO et/ou Toxo tginic3 KO 2G et/ou Toxo tg-in/cl-3K° et/ou Toxo tg-in/cl-3K° 2G de Toxoplasma gondii. Les chiffres représentent la numérotation des séquences d'amorces (SEQ ID NO :x) définies dans la présente demande. Figure 11-C : cette figure illustre la position des amorces nucléiques utilisées dans la présente invention pour détecter la présence des trois gènes tgrop16, gra1511, cat-gfp dans les souches sauvages et/ou des souches mutantes de Toxo tgmic/-3 KO rop16 KO Gral 5II KI de Toxoplasma gondii. Les chiffres représentent la numérotation des séquences d'amorces (SEQ ID NO :x) définies dans la présente demande. 59 Exemple 1 : Construction de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G L'haploïdie du génome de Neospora caninum lors de la phase proliférative permet l'invalidation d'un gène en une seule recombinaison homologue. Culture des parasites Tous les tachyzoïtes de la souche de Neospora caninum utilisés ont été produits en fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634)) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (SVF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine. Ils ont été récoltés après lyse mécanique des cellules hôtes par 3 passages en seringue 25G. Construction des plasmides - Plasmide pNcMIC3-KO-CAT-GFP loxN Le plasmide pNcMic3KO-CAT-GFP loxN SEQ ID NO : 1 contient une cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6 comprenant le gène de sélection cat-e SEQ ID NO: 2 codant pour la protéine de fusion CAT-GFP permettant à la fois la résistance au chloramphénicol (CAT) et une fluorescence verte (GFP : Green Fluorescent Protein), sous le contrôle du promoteur de l'a-tubuline de Toxoplasma gondii SEQ ID NO :3 pour permettre l'expression du gène dans le parasite. En aval du gène cat-e SEQ ID :2, la séquence 3'UTR du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 4est insérée. Cette séquence a pour objectif de stabiliser l'ARNm codant la protéine de fusion CAT/GFP. Cette cassette de sélection SEQ ID NO :6 est encadrée par deux sites loxN SEQ ID NO :5 identiques de même orientation.. Pour obtenir ce plasmide, la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6 a été amplifiée par PCR sur le plasmide pT230 CAT-GFP SEQ ID NO :9 avec les amorces cat-gfp LoxN For SEQ ID NO :7 et catgfp loxN rev SEQ ID NO :8 (2380pb), digérée par les enzymes de restriction ClaI et XbaI (2348 pb) et clonée dans le plasmide pNcMic3KO-DHFR SEQ ID NO :10 digéré par ClaI et XbaI (7715 pb). Le plasmide alors obtenu est le plasmide pNcMic3KO-CAT-GFP loxN SEQ ID NO: 1. Les séquences des amorces figurent dans le Tableau 1 ci-dessous. Le plasmide pNcMic3KOCAT-GFP loxN contient donc une cassette CAT-GFP SEQ ID NO :6 encadrée par une séquence 5'HR du gène Ncmic3 SEQ ID NO : 98 et une séquence 3'HR du gène Ncmic3 SEQ ID NO :97. 60 Tableau 1 : liste des amorces utilisées pour la construction du plasmide pNcMIC3-KO-CATGFP loxN catgfp loxN For SEQ ID NO :7 catgfp loxN rev TCCGCTCTCAGAGAATCGATGAAGCTTATAACTTCGTATAGT ATACCTTATACGAAGTTATGATATGCATGTCCGCGTTCGTGA AATCTC ClaI LoxN SEQ ID NO :8 ATACGTAAACTTCTAGATCCATAACTTCGTATAAGGTATACT ATACGAAGTTATCCCTCGGGGGGGCAAGAATTGTGTTAACCG XbaI loxN GTTCGA - Plasmide pNcMIC1-KO-CAT-GFP lox Le plasmide pNcMiclKO-CAT-GFP loxP SEQ ID NO : 11 contient une cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO: 6 comprenant le gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO: 2 codant pour une protéine de fusion CAT-GFP permettant à la fois la résistance au chloramphénicol (CAT) et une fluorescence verte (GFP : Green Fluorescent Protein), sous le contrôle du promoteur de l'a-tubuline de Toxoplasma gondii SEQ ID NO: 3 pour permettre l'expression du gène dans le parasite. En aval de la séquence codant CAT-GFP, la séquence 3'UTR du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO: 4 est insérée. Cette séquence a pour objectif de stabiliser l'ARNm codant la protéine de fusion CAT/GFP. Cette cassette de sélection SEQ ID NO :6 est encadrée par deux sites loxP SEQ ID NO :12 identiques de même orientation. Pour obtenir ce plasmide, la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6 a été amplifiée par PCR sur le plasmide pT230 CAT-GFP SEQ ID NO :9 avec les amorces CN10 SEQ ID NO :13 et CN11 SEQ ID NO :14 permettant l'ajout des sites loxP SEQ ID NO :12 (2394 pb), digérée par les enzymes de restriction HindIII et BamHI (2339 pb) et clonée dans le plasmide pT230-ble SEQ ID NO : 37 digéré par HindIII et BamHI (293 lpb). Le plasmide alors obtenu est le plasmide pT230 CAT-GFP loxP SEQ ID NO :113. La région 3 HR du gène ncmicl a été amplifiée par PCR à partir de l'ADN génomique de la souche NC-1 de Neospora caninum. Pour l'amplification, les amorces 3 HR NCmicl F KpnI et 3 HR NCmicl R HindIII (SEQ ID NO: 114 et SEQ ID NO:115) permettent l'amplification de la région 3 HR du gène ncmicl et la création de deux sites de restrictions qui ont été utilisés pour cloner le fragment 3HR en amont de la cassette de sélection CAT-GFP dans le pT230 CAT-GFP loxP SEQ ID NO :113. Le plasmide obtenu est dénommé pNcmic1-3HR CATGFP loxP SEQ ID NO: 118. La région 5 HR du gène ncmicl a été amplifiée par PCR à partir de l'ADN génomique de la souche NC-1 de Neospora caninum. Pour l'amplification, les amorces 5 HR NCmicl F 61 BamHI et 5 HR NCmicl R NotI (SEQ ID NO: 116 et SEQ ID NO:117) permettent l'amplification de la région 5'UTR du gène ncmicl et la création de deux sites de restrictions qui ont été utilisés pour cloner le fragment 5HR en aval de la cassette de sélection CAT-GFP dans le plasmide pNcmic1-3HR CATGFP loxP SEQ ID NO : 118 (BamHI -NotI). Le plasmide alors obtenu est le plasmide pNcMiclKO-CAT-GFP loxP SEQ ID NO : 11. Le plasmide pNcMiclKO-CAT-GFP loxP contient donc une cassette CAT-GFP SEQ ID NO :6 encadrée par une séquence 5'HR du gène Ncmicl SEQ ID NO: 96 et une séquence 3'HR du gène Ncmicl SEQ ID NO : 95. Les séquences des amorces figurent dans le Tableau 2 ci-dessous. Tableau 2 : liste des amorces utilisées pour la construction du plasmide pNcmicl KO CATGFP loxP Construction du plasmide pNcmicl KO CATGFP loxP SEQ ID NO: 13 CN10 GCGGCCAAGCTTA TAA CTTCGTATAATGTA TGCTA TA CGA HindIII loxP A GTTA TGATATGCATGTCCGCgttcgtgaaatctctgatcaagcgg CN1 1 SEQ ID NO: 14 SpeI , BamHI, loxP cgacgcacgctgtcactcaacttgctGCTAGAACTA GTGGATC CA TAA CTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTA TCCCTCGGGGG GGCAAGAATT 3 HR NCmicl F SEQ ID NO: 114 KpnI KpnI CGCGGTACCAGGCAGAAGTAAAGAAGGTTCCTC 3 HR NCmicl R SEQ ID NO: 115 HindIII HindIII CGCAAGCTTTGATCACGCAAGAAAAGAAGC 5 HR NCmicl F SEQ ID NO: 116 BamHI BamHI CGCGGATCCCATTTGTAGATACGGTTGCACAC 5 HR NCmicl R SEQ ID NO: 117 NotI CGCGCGGCCGCACATTCAGACGGCAGAACTCTG NotI - Plasmide pTSAG1- Cre Recombinase Le plasmide pT-SAG1-Cre-Recombinase SEQ ID NO :15 a été construit pour exprimer de manière transitoire dans le parasite Toxoplasma gondii et ses dérivés modifiés génétiquement le gène codant la protéine Cre Recombinase dérivée du bactériophage P1 (Brecht et al., 1999, même référence que précédemment). 62 Le plasmide pT-SAG1-Cre-Recombinase SEQ ID NO :15 dérive du plasmide pUC18 (plasmide commercial).qui contient une cassette d'expression de la Cre Recombinase du bactériophage Pl. Dans le plasmide pT-SAG1-Cre-Recombinase SEQ ID NO :15, le gène codant la Cre Recombinase SEQ ID NO :16 est placé sous la dépendance du promoteur du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO :17, ce qui permet l'expression de la protéine Cre Recombinase dans les parasites Toxoplasma gondii transfectés. En aval du gène codant la Cre Recombinase, la séquence 3'UTR du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO :4 est insérée. Cette séquence a pour objectif de stabiliser l'ARNm codant la protéine Cre Recombinase. L'absence de cassette de sélection spécifique ne permet pas une intégration stable du matériel génétique transfecté mais seulement une expression transitoire de la Cre Recombinase. Construction de la souche Neomic1-3 KO - 2G La construction de la souche vivante atténuée de seconde génération, dénommée Neo ncmic/- 3 KO - 2G, est faite en 4 étapes distinctes : 1. Délétion par recombinaison homologue du gène Ncmic3 et son remplacement par la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6 encadrée par des séquences LoxN SEQ ID NO :5. Pour obtenir cette souche, la souche sauvage NC-1 de Neospora caninum est électroporée avec le plasmide pNcMIC3-KO-CAT-GFP lox N SEQ ID NO :1. 20 1.1g de plasmide purifié puis linéarisé par KpnI sont ajoutés à 107 parasites mis en suspension dans le milieu d' électroporation CYTOMIX contenant de l' ATP (3 mM) et du Glutathion (3 mM) (Van den Hoff et al., Nucleic Acid Research, Jun 11; 20(11):2902), et l'électroporation a été réalisée en cuvette d'écart 4 mm, dans un volume de 800 !IL sur un appareil BioRad (Paramètres : 2000V, 50 ohms, 25 pF, avec deux chocs électriques). Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture est remplacé et supplémenté par l'agent de sélection (chloramphénicol 20 pM), 24 heures après l'électroporation. 10 à 15 jours après sélection, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique au DNAzol des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Neo ncmic3 KO. 63 Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et remplacé par la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant la cassette de sélection CATGFP est la SEQ ID NO : 101. Le gène mic/ n'étant pas délété, la séquence du gène mic/ SEQ ID NO :106 est présente dans le génome de la souche. 2. Suppression de la cassette de sélection SEQ ID NO :6 : la souche Neo ncmic3 KO obtenue est électroporée avec le plasmide pT-SAG1-CRE-Recombinase SEQ ID NO :15. L'enzyme exprimée transitoirement va permettre l'excision de la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6. Le protocole d'électroporation est similaire au protocole précédent. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Après 2 à 7 jours de culture, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique au DNAzol des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Neo ncmic3 KO - 2G. Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO : 18. Le gène mic/ n'étant pas délété, la séquence du gène mic/ SEQ ID NO :106 est présente dans le génome de la souche. 3. Délétion par recombinaison homologue du gène ncmicl et son remplacement par la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6 encadrée par des séquences LoxP SEQ ID NO :12. Pour obtenir cette souche, la souche Neo ncmic3 KO - 2G est électroporée avec le plasmide pNcMIC1-KO-CAT-GFP lox P SEQ ID NO :11 linéarisé par KpnI, selon le protocole précédemment décrit. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture est remplacé et supplémenté par l'agent de sélection (chloramphénicol 20 pM), 24 heures après l'électroporation. 10 à 15 jours après sélection, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Neo ncmic1-3 KO. 64 Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO : 18. Dans cette souche, le gène mic/ a été délété et remplacé par la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic/ délété contenant la cassette de sélection CATGFP est la SEQ ID NO : 102. 4. Suppression de la cassette de sélection SEQ ID NO :6 : la souche Neo Ncmic1-3 KO obtenue est électroporée avec le plasmide pT-SAG1-CRE-Recombinase SEQ ID NO :15. L'enzyme exprimée transitoirement va permettre l'excision de la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Après 2 à 7 jours de culture, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique au DNAzol des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Neo ncmic1-3 KO - 2G. Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO: 18. Dans cette souche, le gène mic/ a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic/ délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO : 91. Validation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G par PCR Pour valider la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G des analyses PCR sont effectuées à partir de l'ADN génomique extrait au DNAzol à partir d'un culot parasitaire constitué de 107 parasites. Les amorces utilisées pour les PCR sont décrites dans la Figure 11-A et sont détaillées dans le Tableau 3 ci-dessous. Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose (Figure 3-B). Leur taille attendue et leur taille observée sont également décrites dans le Tableau 4 ci-dessous. Pour plus de clarté sur la figure 3-B, seules les 3 étapes de la réalisation sont représentées (ncmic3, ncmic3K0 CATGFP et ncmic3K0 loxN (2G) ou ncmicl, ncmic1K0 CATGFP et ncmic1K0 loxP(2G)), les résultats obtenus sont conformes aux tailles attendues 65 Tableau 3 : Liste des amorces utilisées pour la validation des souches. Amorce F Séquence Amorce R Séquence Ncmic3 (mixl) c Nc mic3 F SEQ ID NO :22 d Nc mic3 R SEQ ID NO :23 TTTCCCTTCTAAACACAGTCG CCTTCAGTGGTTCTCCATGAGT Validation KO i Integ NCm c3 F SEQ ID NO :24 i ORF SEQ ID NO :25 5 'Ncmic3 (mix2) GAAAGTGTCAGTGGTAGAGAC TGC CATGFP R CCGTTTGGTGGATGTCTTCT Validation KO 3 'Ncmic3 (mix3) k ORF CATGFP F SEQ ID NO :26 1 Integ NCmic3 R SEQ ID NO :27 GCATCGACTTCAAGGAGGAC TGTTTACAGGTGATCCAGAAAAG G Cicatrice Ncmic3(m x4) g AF3 SEQ ID NO :32 h AF4 SEQ ID NO : 33 GTCATCGACCGCCGGAACTAGT AGT GCAGAGGTTCTGCGTATCTAACAC GG Ncmicl (mix5) a Nc micl F SEQ ID NO :20 b Nc micl R SEQ ID NO :21 ACCCGGAGAATTATCGCCTA TTCTCCAGGCACTCACCT Validation KO m Integ NCm cl F SEQ ID NO :28 i ORF SEQ ID NO :25 5 'Ncmic 1 (mix6) CCGAGCAAGTTAGCAAGTCC CATGFP R CCGTTTGGTGGATGTCTTCT Validation KO k ORF CATGFP F SEQ ID NO :26 n Integ NCmicl R SEQ ID NO :29 3 'Ncmicl(mix7) GCATCGACTTCAAGGAGGAC CTTGTCCGTCACATCGTTTG Cicatrice Ncmicl (mix8) e ncmicicrelox F B SEQ ID NO :30 f ncmicicrel ox R B SEQ ID NO :31 GGCGACATACTGCATTGGAT GATCGGAGTCTGTCCCTCAA Tableau 4 : Taille attendue des amplicons (en paires de base) des différentes PCR de validation de la construction des souches KO de Neospora caninum NC-1 Neo Neo ncmic3 KO loxN Neo nemicl- Neo ncmic1-3 KO 2G ncmic3 KO 3 KO loxP Ncmic3 (m xl) 850 _ _ Validation KO 5 'Ncmic3 (mix2) - 2960 - - - Validation KO 3 'Ncmic3 (mix3) - 3668 - - - Cicatrice Ncmic3 (mix4) 2163 2575 276 276 276 Ncmicl (m x5) 701 701 701 - - Validation KO 5 'Ncmicl (mix6) - - - 3359 - Validation KO 3 'Ncmicl (mix7) - - - 3421 - Cicatrice Ncmicl (mix8) 3 161 3161 3161 2560 261 Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces c SEQ ID NO :22 et d SEQ ID NO :23 (mix 1) permettent de mettre en évidence une bande à 850 paires de bases pour la souche NC-1, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène Ncmic3 SEQ ID NO :105 dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans les souches 66 Neo Ncmic3 KO, Neo Ncmic3 KO - 2G, Neo Ncmicl-3 KO et Neo Ncmicl-3 KO - 2G confirmant la suppression du gène dans ces souches. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces i SEQ ID NO :24 et j SEQ ID NO :25 et les amorces k SEQ ID NO :26 et 1 SEQ ID NO :27 (mix Ncmic3) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 2960 et 3668 paires de bases pour la souche Neo Ncmic3 KO, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène de sélection cat-e dans cette souche à la place du gène Ncmic3. Cette bande n'est pas détectée dans les souches NC-1, Neo Ncmic3 KO - 2G, Neo Ncmicl-3 KO et Neo Ncmicl-3 KO - 2G confirmant l'absence du gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO :2 au locus Ncmic 3 dans ces souches. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces amorces g SEQ ID NO :32 et h SEQ ID NO :33 (cicatrice Ncmic3) permettent de mettre en évidence différentes bandes conformément à la taille de bande attendue. Une bande à 2163 paires de bases pour la souche NC-1, confirme la présence du gène Ncmic3 SEQ ID NO :105 dans cette souche. Une bande de 2575 paires de bases est mise en évidence pour la souche Neo Ncmic3 KO confirmant la présence de la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 à la place du gène Ncmic3. Enfin une bande de 276 paires de bases est mise en évidence pour les souches Neo Ncmic3 KO - 2G Neo Ncmicl-3 KO et Neo Ncmicl-3 KO - 2G confirmant la suppression du gène de sélection cat-e SEQ ID NO :2 dans ces souches, laissant une cicatrice loxN SEQ ID NO :5 dans le génome. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces a SEQ ID NO :20 et b SEQ ID NO :21 (mix Ncmicl) permettent de mettre en évidence une bande à 644 paires de bases pour les souches NC-1, Neo Ncmic3 KO, Neo Ncmic3 KO - 2G, conformément aux tailles de bandes attendues et confirmant la présence du gène Ncmicl SEQ ID NO :106 dans ces souches. Ces bandes ne sont pas détectées dans les souches Neo Ncmicl-3 KO et Neo Ncmicl-3 KO - 2G confirmant la suppression du gène dans ces souches. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces m SEQ ID NO :28 et j SEQ ID NO :25 et les amorces k SEQ ID NO :26 et n SEQ ID NO :29 (mix Ncmicl) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 3359 et 3421 paires de bases pour la souche Neo Ncmicl-3 KO, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène de sélection cat-e SEQ ID NO :2 dans cette souche à la place du gène Ncmicl. Cette bande n'est pas détectée dans les souches sauvage NC-1 de N. caninum, Neo Ncmic3 KO, 67 Neo Ncmic3 KO - 2G, et Neo Ncmicl-3 KO - 2G confirmant l'absence du gène de sélection at-gfp SEQ ID NO :2 au locus Ncmic 1 dans ces souches. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces SEQ ID NO :30 et f SEQ ID NO :31 (cicatrice Ncmicl) permettent de mettre en évidence différentes bandes conformément à la taille de bande attendue. Une bande à 2182 paires de bases pour les souches NC-1, Neo Ncmic3 KO, Neo Ncmic3 KO - 2G confirme la présence du gène Ncmicl dans ces souches. Une bande de 2560 paires de bases est mise en évidence pour la souche Neo Ncmicl-3 KO confirmant la présence de la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 à la place du gène Ncmicl Enfin une bande de 261 paires de bases est mise en évidence pour la souche Neo Ncmicl-3 KO - 2G confirmant la suppression du gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO :2 dans cette souche, laissant une cicatrice loxP SEQ ID NO :12 dans le génome. Les produits PCR « cicatrice » (mix 4 et 8) ont été séquences et les séquençages ont confirmés que : - le gène ncmic3 SEQ ID NO :105 a été supprimé et que la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a bien été supprimée par action de la Cre-Recombinase laissant une cicatrice LoxN SEQ ID NO :5 conforme à la séquence attendue (Figure 3C). - le gène ncmicl SEQ ID NO :106 a été supprimé et que la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a bien été supprimée par action de la Cre-Recombinase laissant une cicatrice LoxP SEQ ID NO :12 conforme à la séquence attendue (Figure 3C). Validation de la souche Neo ncmic1-3 KO - 2G par immunofluorescence Les tachyzoïtes cultivés 24h sur lamelles en verre recouvertes d'une monocouche de cellules HFF. Les cellules infectées ont été lavés 2 fois en PBS1X, et fixés par du formaldéhyde 4% pendant 30 min. Après 3 lavages en PBS1X, les cellules HFF infectées ont été perméabilisées avec 0,1% de Triton X-100 dans du PBS1X pendant 5 min. Après 3 lavages au PBS 1X, une étape de saturation est effectuée avec une solution de PB S 1X/SVF 10% pendant 30 min.. Les cellules ont ensuite été incubées avec l'anticorps primaire dilué dans 2% SVF pendant 1 heure, lavées 3 fois au PBS1X puis incubées avec un anticorps secondaire dilué dans une solution de PBS/SVF 2% pendant 1 heure. Après 2 lavages au PBS1X, les lamelles en verre sont montés sur lame avec de l'Immu-MountTm et observés au microscope à fluorescence. L'anticorps primaire Tgmic3 permet une reconnaissance de la protéine Ncmic3, il permet de détecter l'expression de la protéine NcMIC3 SEQ ID NO : 118 dans le parasite (anticorps de lapin anti-mic3 : rnAb anti-MIC3 s3) et l'anticorps secondaire commercial utilisé est l'Alexa fluor® 594 chèvre anti-lapin (Life technologies réf. A-11012). 68 Les résultats montrent qu'aucune fluorescence n'est détectable au pôle apical du parasite révélant l'absence des protéines MIC3 (Figure 4-A). L'anticorps primaire Tgmicl ne permet pas une reconnaissance de la protéine NcMIC1 SEQ ID NO: 119. Les résultats montrent que les parasites expriment une fluorescente verte reflétant l'expression de la protéine CATGFP SEQ ID NO : 120 suite à la réalisation des délétions de gènes (Neo ncmic3 KO et Neo ncmic1-3 KO) alors qu'après action de la Cre recombinase, les souches Neo ncmic3 KO - 2G et Neo ncmic1-3 KO - 2G ne sont plus fluorescentes (suppression de de la cassette CATGFP SEQ ID NO :6) (Figure 4-B). Exemple 2 : Construction de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G L'haploïdie du génome de Toxoplasma gondii lors de la phase proliférative permet l'invalidation d'un gène en une seule recombinaison homologue. Culture des parasites Tous les tachyzoïtes de la souche de Toxoplasma gondii utilisés ont été produits en fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634)) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (SVF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine. Ils ont été récoltés après lyse mécanique des cellules hôtes par 3 passages en seringue 25G. Construction des plasmides - Plasmide pTgMIC3-KO-CAT-GFP loxP Le plasmide pTgMIC3-KO-CAT-GFP Lox P SEQ ID NO: 34 (Figure 5A) a été construit pour supprimer le gène codant la protéine TgMIC3 de Toxoplasma gondii (référence ATCC : souche RH Pra310) par recombinaison homologue. Le plasmide pTgMic3KO-CAT-GFP loxP SEQ ID NO : 34 contient une cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO: 6 comprenant un gène de sélection cat-e SEQ ID NO: 2 codant pour une protéine de fusion CAT-GFP permettant à la fois la résistance au chloramphénicol (CAT) et une fluorescence verte (GFP : Green Fluorescent Protein), sous le contrôle du promoteur de l'a-tubuline de Toxoplasma gondii SEQ ID NO: 3. En aval du gène cat-e SEQ ID NO :2, la séquence 3'UTR du gène sag 1 de Toxoplasma gondii SEQ ID NO: 4 est 69 insérée. La SEQ ID NO :6 a été amplifiée à partir du plasmide pT230 CAT-GFP SEQ ID NO : 9 en utilisant les amorces SEQ ID NO : 35 et SEQ ID NO: 36 qui permettent l'ajout des sites loxP (SEQ ID NO : 12) et des sites de restrictions HindIII et SpeI. La séquence nucléotidique amplifiée par PCR (2389 pb) a ensuite été cloné dans le plasmide pT230TUB Ble SEQ ID NO : 37 par digestion enzymatique avec les enzymes de restriction HindIII et SpeI. Le plasmide obtenu est dénommé pCATGFP loxP SEQ ID NO: 38. La région 3'HR du gène Tginic3 SEQ ID NO: 39 a été obtenu par la double digestion enzymatique du plasmide pmic3K0-2 SEQ ID NO : 40 avec les enzymes de restriction KpnI et HindIII (2145pb), puis cloné dans le plasmide pCATGFP loxP SEQ ID NO: 38 digéré par KpnI et HindIII (5238pb). Le plasmide obtenu est dénommé p3'UTRmic3-CATGFP loxP SEQ ID NO :41. La région 5'HR du gène Tginic3 SEQ ID NO: 42 a été amplifiée par PCR à partir de l'ADN génomique de la souche RH de T gondii. Pour l'amplification, les amorces SEQ ID NO : 43 et SEQ ID NO: 44 permettent l'amplification de la région 5'UTR du gène Tginic3 et la création de deux sites de restrictions (2568pb / sites SpeI et XbaI). Ces sites de restrictions ont été utilisés pour cloner le fragment 5HR digéré par SpeI et XbaI (2548pb) dans le plasmide p3'UTRmic3-CATGFP loxP SEQ ID NO: 38 en aval de la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO: 6 au niveau du site SpeI du plasmide précédemment décrit (7383pb) pour obtenir le plasmide pTgMic3KO-CAT-GFP loxP SEQ ID NO : 34. Les séquences des amorces figurent dans le Tableau 5 ci-après. Tableau 5: Séquences des amorces utilisées pour la construction du plasmide pTgMIC3-KOCAT-GFP loxP. Construction du plasmide pTgmic3K0 CA T-GFP loxP SEQ ID NO : 35 GCGGCCAAGCTTA TAA CTTCGTATAATGTA TGCTA TA CGA HindIII loxP A GTTA TGATATGCATGTCCGCgttcgtgaaatctctgatcaagcgg SEQ ID NO : 36 cgacgcacgctgtcactcaacttgctGCTAGAACTA GTGGATC CA TAA SpeI , BamHI, loxP CTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTA TCCCTCGG SEQ ID NO : 43 GGGATCCACTAGTTTACGTATCGCGACTAGCAGCAAG BamHI, SpeI, SnaBI, NruI TTGAGTGACAGCG SEQ ID NO : 44 GCTGCAGTCTAGAGATATCCACGTGGAATTCCTCTTGG PstI, XbaI, EcoRV Pm1I GAAGAACAAT 70 - Plasmide pTgMIC1-KO-CAT-GFP loxN Le plasmide pTgMIC1-KO-CAT-GFP loxN SEQ ID NO: 45 (Figure 5-B) a été construit pour supprimer le gène codant la protéine TgMIC1 de Toxoplasma gondii par recombinaison homologue. Le plasmide pTgMiclKO-CAT-GFP loxN SEQ ID NO : 45 contient une cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO: 6 comprenant le gène de sélection cat-e SEQ ID NO: 2 codant pour la protéine de fusion CAT-GFP permettant à la fois la résistance au chloramphénicol (CAT) et une fluorescence verte (GFP : Green Fluorescent Protein), sous le contrôle du promoteur de l'a-tubuline de Toxoplasma gondii SEQ ID NO: 3. En aval du gène cat-e SEQ ID NO :2, la séquence 3'UTR du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO: 4 a été insérée. La SEQ ID NO :6 a été amplifiée à partir du plasmide pT230 CAT-GFP SEQ ID NO: 9 en utilisant les amorces SEQ ID NO : 46 et SEQ ID NO : 47 qui permettent l'ajout des sites loxN (SEQ ID NO : 5) et des sites de restrictions ClaI et XbaI. La séquence nucléotidique amplifiée par PCR a ensuite été cloné dans le plasmide pNcMic3KO-DHFR SEQ ID NO : 10 digéré par ClaI et XbaI (7715 pb) par digestion enzymatique avec les enzymes de restriction ClaI et XbaI. Le plasmide obtenu est dénommé pNCmic3K0 CATGFP LoxN SEQ ID NO : 48. Le fragment 5HR tgmicl SEQ ID NO : 49 a été amplifié par PCR avec les amorces SEQ ID NO : 50 et SEQ ID NO : 51 (2364pb), les sites de restriction KpnI et ClaI ont été ajoutés par PCR. Le fragment amplifié est digéré par les enzymes de restriction KpnI et ClaI (2337pb) et cloné dans le plasmide pNCmic3K0 CATGFP LoxN SEQ ID NO : 48 (voir exemple 1 pour l'obtention du plasmide pNCmic3K0 CATGFP LoxN) digéré par KpnI et ClaI (7740pb) pour remplacer le fragment 5HR ncmic3 (fragment digéré par KpnI et ClaI). Le plasmide obtenu est dénommé pTgmic1K05HR-NCm1c3K03HR CATGFP LoxN SEQ ID NO: 111. Puis le fragment 3HR tgmicl SEQ ID NO : 52 a été amplifié par PCR avec les amorces SEQ ID NO : 53 et SEQ ID NO : 54 (2750pb), les sites de restriction XbaI et NotI ont été ajoutés par PCR. Le fragment amplifié est digéré par les enzymes de restriction XbaI et NotI (2720 pb) puis cloné dans le plasmide pTgmic1K05HR-NCm1c3K03HR CATGFP LoxN SEQ ID NO : 111digéré par les enzymes de restriction XbaI et NotI (7565 pb) pour remplacer le fragment 3HR ncmic3 (fragment digéré par XbaI et NotI).Le plasmide obtenu est dénommé pTgmic1K0 CAT-GFP LoxN SEQ ID NO : 45. 71 Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le tableau 6 ci-dessous. Tableau 6 : Amorces permettant la construction du plasmide pTgmic3K0 CAT-GFP loxP Construction du plasmtde pTgmic3K0 CAT-GFP loxP SEQ ID NO : 46 TCCGCTCTCAGAGAATCGATGAAGCTTATAACITCG ClaI LoxN TATAGTATACCTTATACGAAGTTATGATATGCATGT CCGCGTTCGTGAAATCTC SEQ ID NO : 47 ATACGTAAACTTCTAGATCCATAACTTCGTATAAGG XbaI loxN TATACTATACGAAGTTATCCCTCGGGGGGGCAAGAA TTGTGTTAACCGGTTCGA m NO : 0 GTAGCAAGGTACCACAAGCTAAAGAAACTAGTGCC 5HR tgmic 1For SEQ 5 KpnI TCTTCTAAA SEQ ID NO : 51 TAAACGGGCTGATCGATGCAGGTAAATTCTATAGCC 5HR tgmic 1 Rev ClaI GGGT ID TAAACGGGCTGATCGATGCAGGTAAATTCTATAGCC 3HR tgmic 1For XbaI SEQ 53 NO : GGGT : AAAAACTCGGTGGCGGCCGCATAAAGAAGAGCAAG 3HR tgmic lrev SEQ ID NO 54 NotI GAAAA - Plasmide pTSAG1- Cre Recombinase Le plasmide pT-SAG1-Cre-Recombinase SEQ ID NO : 15 a été construit pour exprimer de manière transitoire dans le parasite Toxoplasma gondii et ses dérivés modifiés génétiquement le gène codant la protéine Cre Recombinase dérivée du bactériophage P1 (Brecht et al., 1999, même référence que précédemment). Le plasmide pT-SAG1-Cre-Recombinase SEQ ID NO : 15 dérive du plasmide pUC18 (plasmide commercial) qui contient une cassette d'expression de la Cre Recombinase du bactériophage Pl. Dans le plasmide pT-SAG1-Cre-Recombinase SEQ ID NO :15, le gène codant la Cre Recombinase SEQ ID NO :16, est placé sous la dépendance du promoteur du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO :17, ce qui permet l'expression de la protéine Cre Recombinase dans les parasites Toxoplasma gondii transfectés. En aval du gène codant la Cre Recombinase SEQ ID NO :16, la séquence 3'UTR du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO :4 est insérée. Cette séquence a pour objectif de stabiliser l'ARNm codant la protéine Cre Recombinase. L'absence de cassette de sélection spécifique ne permet pas une intégration stable du matériel génétique transfecté mais seulement une expression transitoire de la Cre Recombinase. Construction de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G La construction de la souche vivante atténuée de seconde génération, dénommée Toxo tgmic1-3 KO - 2G, est faite en 4 étapes distinctes (Figure 6-A) : 72 1. Délétion par recombinaison homologue du gène Tginic3 et son remplacement par la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6 encadrée par des séquences LoxP SEQ ID NO :12. Pour obtenir cette souche, la souche sauvage de Toxoplasma gondii RH (référence ATCC : PRA-310) est électroporée avec le plasmide pTgMIC3-KO-CAT-GFP loxP SEQ ID NO :34. 20 1.1g de plasmide purifié puis linéarisé par KpnI sont ajoutés à 107 parasites mis en suspension dans le milieu d'électroporation CYTOMIX contenant de l'ATP (3 mM) et du Glutathion (3 mM) (Van den Hoff et al., Nucleic Acid Research, Jun 11; 20(11):2902), et l'électroporation a été réalisée en cuvette d'écart 4 mm, dans un volume de 800 !IL sur un appareil BioRad (Paramètres : 2000V, 50 ohms, 25 1.1F, avec deux chocs électriques). Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture est remplacé et supplémenté par l'agent de sélection (chloramphénicol 20 1.1M), 24 heures après l'électroporation. 10 à 15 jours après sélection, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique au DNAzol des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Toxo tgmic3 KO. Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et remplacé par la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant la cassette de sélection CATGFP est la SEQ ID NO : 103. Le gène mic/ n'étant pas délété, la séquence du gène mic/ SEQ ID NO :108 est présente dans le génome de la souche. 2. Suppression de la cassette de sélection SEQ ID NO :6: la souche Toxo tgmic3 KO obtenue est électroporée avec le plasmide pT-SAG1-CRE-Recombinase SEQ ID NO :15. L'enzyme exprimée transitoirement va permettre l'excision de la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6. Le protocole d'électroporation est similaire au protocole précédent. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Après 2 à 7 jours de culture, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique au DNAzol des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Toxo tgmic3 KO - 2G. 73 3. Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO : 19. Le gène mic/ n'étant pas délété, la séquence du gène mic/ SEQ ID NO :108 est présente dans le génome de la souche. Délétion par recombinaison homologue du gène tgmicl et son remplacement par la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6 encadrée par des séquences Lox N SEQ ID NO :5. Pour obtenir cette souche, la souche Toxo tgmic3 KO - 2G est électroporée avec le plasmide pTgMIC1-KO-CAT-GFP lox N SEQ ID NO :45 linéarisé par PciI, selon le protocole précédemment décrit. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture est remplacé et supplémenté par l'agent de sélection (chloramphénicol 20 1.1M), 24 heures après l'électroporation. 10 à 15 jours après sélection, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Toxo tgmic1-3 KO. 4. Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO: 19. Dans cette souche, le gène mic/ a été délété et remplacé par la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic/ délété contenant la cassette de sélection CATGFP est la SEQ ID NO : 104. 5. Suppression de la cassette de sélection SEQ ID NO :6: la souche Toxo tgmic1-3 KO obtenue est électroporée avec le plasmide pT-SAG1-CRE-Recombinase SEQ ID NO :15. L'enzyme exprimée transitoirement va permettre l'excision de la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Après 2 à 7 jours de culture, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique au DNAzol des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Toxo tgmic1-3 KO - 2G. Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO: 19. 74 Dans cette souche, le gène mic/ a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic/ délété contenant un seul site lox N SEQ ID NO : 5, est la SEQ ID NO : 92. Validation de la souche Toxo tguncl-3 KO - 2G par PCR Pour valider la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G des analyses PCR sont effectuées à partir de l'ADN génomique extrait au DNAzol à partir d'un culot parasitaire constitué de 107 parasites. Les amorces utilisées pour les PCR sont décrites dans la Figure 11-B et sont détaillées dans le Tableau 7 ci-dessous. Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose (Figure 6-B). Leur taille attendue et leur taille observée sont également décrites dans le Tableau 8 ci-dessous. Pour plus de clarté sur la figure 6-B, seules les 3 étapes de la réalisation sont représentées (tgmic3, tgmic3K0 CATGFP et tgmic3K0 loxP (2G) ou tgmicl, tgmic1K0 CATGFP et tgmic1K0 loxN(2G)), les résultats obtenus sont conformes aux tailles attendues. Tableau 7 : liste des amorces utilisées pour la validation des souches. Tgmic3 (mixl ) 5 TgMIC3 For SEQ ID NO 61: 6 TgMIC3 Rev SEQ ID NO 62: CCTCCGATGTGACTITTGGT GATCCTCGGAGCAAGTCAAC Validation 1 CN5 8 SEQ ID NO 63 : i ORF KO 3 ATACGAAGGGATTCGACGTG CATGFP 5 'Tgmic3 (mi R SEQ ID NO 25: x2) CC GTTTGGTGGATGTCTTCT Validation k ORF 1 HR Mic3 SEQ ID NO 64 KO CATGF SEQ ID NO 26: 4 RL ATATGCGGATGAGTGCTCGAA 3 'Tgmic3 (mix3) P F GCATCGACTTCAAGGAGGAC TT Cicatrice 9 Tgmic3 SEQ ID NO 65 : 1 Tgmic3 SEQ ID NO 66 : Tgmic3 loxN F GTGTGGAGACTTTTTACTTCGT 0 loxN R CCTCCGATGTGACTITTGGT (mix4) GTTAC Tgmic 1 3 TgMIC1 SEQ ID NO 55: 4 TgMIC1R SEQ ID NO 56: (mix5) For ATGCGCGCTATAAAGAATCG ev AGAAACAACGCCTGGCCCAT Validation 1 tgmic 1K SEQ ID NO 57 : i ORF SEQ ID NO 25 : KO 1 0 integ GTGCGATGACGTGGCTTCTCTATC CATGFP CC GTTTGGTGGATGTCTTCT 5 'Tgmic 1(mi x6) F ATGTGT R Validation k ORF SEQ ID NO 26 : 1 tgmic1K0 SEQ ID NO 58 : KO CATGF GCATCGACTTCAAGGAGGAC 2 integ R GATTCGCTTCGTCACTTCTGGTACG 3 ' Tgmic 1 (mix7) P F GATGC Cicatrice 7 Tgmic 1 SEQ ID NO 59 : 8 Tgmic 1 SEQ ID NO 60 : Tgmic 1 (mix8) loxN F CCCGTCTAGCAAGACCTCAA loxN R TCGGTGCTGCTCAGTAATTG 75 Tableau 8 : Taille attendue des amplicons (en paires de base) des différentes PCR de validation de la construction des souches KO de Toxoplasma gondii RH Toxo tgmic3 Toxo tgmic3 Toxo tgmic1-3 Toxo tgmic1-3 KO - 2G KO KO- 2G KO Tgmic3 (mixl) 808 - - - - Validation KO - 3253 - - - 5 ' Tgmic3(mix2) Validation KO 3 'Tgmic3 - 3309 - - - (mix3) Cicatrice Tgmic3 (mix4) 1596 2525 226 226 226 Tgmicl(mix5) 608 608 608 - - Validation KO 5 'Tgmicl - - - 3040 - (mix6) Validation KO 3 'Tgmicl - - - 3593 - (mix?) Cicatrice Tgmicl(mix8) 4198 4198 4198 3129 830 Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces 5 SEQ ID NO :61 et 6 SEQ ID NO : 62 (mix 1) permettent de mettre en évidence une bande à 808 paires de bases pour la souche RH, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène Tgmic3 dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans les souches Toxo tgmic3 KO, Toxo tgmic3 KO - 2G, Toxo tgmic1-3 KO et Toxo tgmic1-3 KO - 2G confirmant la suppression du gène dans ces souches. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces 13 SEQ ID NO :63 et j SEQ ID NO :25, et les amorces k SEQ ID NO :26 et 14 SEQ ID NO :64 (mix 2 et 3) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 3253 et 3537 paires de bases pour la souche Toxo tginic3 KO, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO :2 dans cette souche à la place du gène Tgmic3 SEQ ID NO :107. Cette bande n'est pas détectée dans les souches RH, Toxo tgmic3 KO - 2G, Toxo tgmic1-3 KO et Toxo tgmic1-3 KO - 2G confirmant l'absence du gène de sélection cat-e SEQ ID NO :2 au locus Tgmic 3 dans ces souches. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces 9 SEQ ID NO :65 et 10 SEQ ID NO :66 (mix 4) permettent de mettre en évidence différentes bandes conformément à la taille de bande attendue. Une bande à 1596 paires de bases pour la souche RH, confirme la présence du gène Tgmic3 SEQ ID NO :107 dans cette souche. Une bande de 2525 paires de 76 bases est mise en évidence pour la souche Toxo tginic3 KO confirmant la présence de la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 à la place du gène Tginic3. Enfin une bande de 226 paires de bases est mise en évidence pour les souches Toxo tginic3 KO - 2G, Toxo tgmic1-3 KO et Toxo tgmic1-3 KO - 2G confirmant la suppression du gène de sélection cote SEQ ID NO :2 dans ces souches, laissant une cicatrice loxP SEQ ID NO :12 dans le génome. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces 3 SEQ ID NO :55 et 4 SEQ ID NO :56 (mix 5) permettent de mettre en évidence une bande à 608 paires de bases pour les souches RH, Toxo tginic3 KO et Toxo tginic3 KO - 2G, conformément aux tailles de bandes attendues et confirmant la présence du gène Tgmicl SEQ ID NO :108 dans ces souches. Ces bandes ne sont pas détectées dans les souches Toxo tginic1-3 KO et Toxo tgmic1-3 KO - 2G confirmant la suppression du gène dans ces souches. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces 11 SEQ ID NO :57 et j SEQ ID NO :25, et les amorces k SEQ ID NO :26 et 12 SEQ ID NO :58 (mix 6 et 7) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 3040 et 3593 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène de sélection cat-e SEQ ID NO :2 dans cette souche à la place du gène tginic3 SEQ ID NO :107. Cette bande n'est pas détectée dans les souches sauvage RH de T gondii (référence ATCC : PRA-310), Toxo tgmic3 KO, Toxo tginic3 KO - 2G, et Toxo tgmic1-3 KO - 2G confirmant l'absence du gène de sélection cat-e SEQ ID NO :2 au locus Tgmicl dans ces souches. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces 7 SEQ ID NO :59 et 8 SEQ ID NO :60 (mix 8) permettent de mettre en évidence différentes bandes conformément à la taille de bande attendue. Une bande à 4198 paires de bases pour les souches RH, Toxo tginic3 KO et Toxo tginic3 KO - 2G confirme la présence du gène Tgmicl SEQ ID NO :108 dans ces souches. Une bande de 3129 paires de bases est mise en évidence pour la souche Toxo tgmic1-3 KO confirmant la présence de la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 à la place du gène Tgmicl. Enfin une bande de 830 paires de bases est mise en évidence pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G confirmant la suppression du gène de sélection cat-e SEQ ID NO :2 dans cette souche, laissant une cicatrice loxN SEQ ID NO :5 dans le génome. Les produits PCR « cicatrice » (mix 4 et 8) ont été séquences et les séquençages ont confirmés que : 77 - le gène Tgmic3 SEQ ID NO :107 a été supprimé et que la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a bien été supprimée par action de la Cre-Recombinase laissant une cicatrice LoxP SEQ ID NO :12 conforme à la séquence attendue (Figure 6-C). - le gène Tgmicl SEQ ID NO :108 a été supprimé et que la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a bien été supprimée par action de la CRE-Recombinase laissant une cicatrice LoxN SEQ ID NO :5 conforme à la séquence attendue (Figure 6-C). Validation de la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G par immunofluorescence Les tachyzoïtes sont cultivés 24h sur lamelles en verre recouvertes d'une monocouche de cellules HFF. Les cellules infectées ont été lavés 2 fois en PBS1X, et fixés par du formaldéhyde 4% pendant 30 min. Après 3 lavages en PBS1X, les cellules HFF infectées ont été perméabilisées avec 0,1% de Triton X-100 dans du PBS1X pendant 5 min. Après 3 lavages au PBS 1X, une étape de saturation est effectuée avec une solution de PBS 1X/SVF 10% pendant 30 min. Les cellules ont ensuite été incubées avec l'anticorps primaire dilué dans 2% SVF pendant 1 heure, lavées 3 fois au PBS1X puis incubées avec un anticorps secondaire dilué dans une solution de PBS/SVF 2% pendant 1 heure. Après 2 lavages au PBS1X, les lamelles en verre sont montés sur lame avec de l'Immu-MountTm et observés au microscope à fluorescence. L'anticorps primaire Tgmic3 utilisé est un anticorps qui permet de détecter l'expression de la protéine TgMIC3 SEQ ID NO : 121 dans le parasite (anticorps de lapin anti-mic3 : rnAb antiMIC3 s3) et l'anticorps secondaire commercial utilisé est l'Alexa fluor® 594 chèvre anti-lapin (Life technologies réf. A-11012). L'anticorps primaire Tgmicl utilisé est un anticorps qui permet de détecter l'expression de la protéine TgMIC1 SEQ ID NO : 122 dans le parasite (anticorps de souris anti-micl : mAb anti-MIC1 T104F8E12) et l'anticorps secondaire commercial utilisé est l'Alexa fluor® 594 chèvre anti-souris, Life technologies réf. A-11005). Les résultats montrent qu'aucune fluorescence n'est détectable au pôle apical du parasite révélant l'absence des protéines MIC1 et MIC3 dans des tachyzoïtes Toxo tgmic1-3 KO - 2G alors qu'une fluorescence au pôle apical du parasite de la souche sauvage démontre l' expression des protéines MIC1 et MIC3 (figure 7). Les résultats montrent que les parasites expriment une fluorescente verte reflétant l'expression de la protéine CATGFP SEQ ID NO : 120 suite à la réalisation des délétions de gènes (Toxo tgmic3 KO et Toxo tgmic1-3 KO) alors qu'après action de la Cre recombinase, 78 les souches Toxo tgmic3 KO - 2G et Toxo tgmic1-3 KO - 2G ne sont plus fluorescentes (suppression de de la cassette CATGFP) (Figure 7). Exemple 3 : Construction de la souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI Matériel et méthode L'haploïdie du génome de Toxoplasma gondii lors de la phase proliférative permet l'invalidation d'un gène en une seule recombinaison homologue. Culture des parasites Tous les tachyzoïtes de la souche de Toxoplasma gondii utilisés ont été produits en fibroblastes humains (HFF) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (SVF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine. Ils ont été récoltés après lyse mécanique des cellules hôtes par 3 passages en seringue 25G. Construction du plasmide Le plasmide pTgRopl6KO-Gral5HKI-CAT-GFP 1ox2272 SEQ ID NO: 67 (Figure 8) contient la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO : 6 comprenant le gène de sélection cat-e SEQ ID NO: 2, codant pour la protéine de fusion CAT-GFP conférant une résistance au chloramphénicol (CAT) et une fluorescence verte (GFP), sous le contrôle du promoteur de l'a-tubuline de Toxoplasma gondii SEQ ID NO: 3 pour permettre l'expression du gène dans le parasite. En aval du gène de sélection SEQ ID NO : 2, la séquence 3'UTR du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO: 4 est insérée. Cette séquence a pour objectif de stabiliser l'ARNm codant la protéine de fusion CAT-GFP. La cassette de sélection SEQ ID NO : 6 est encadrée par deux sites Lox2272 SEQ ID NO : 68, sites de reconnaissance spécifiquement reconnus par la Cre Recombinase et qui seront utilisés ultérieurement pour supprimer la cassette de sélection CAT-GFP. En aval du deuxième site Lox2272, une cassette d'expression du gène gral5H SEQ ID NO : 69 a été cloné. Cette cassette d'expression est constituée du promoteur de gral5H amplifié à partir de l'ADN génomique de la souche ME49 et du gène gral5HSEQ ID NO : 70 amplifié à 79 partir de l'ADN génomique de la souche ME49, incluant un tag HA en 3' SEQ ID NO: 72 pour faciliter la localisation et de la séquence 3'UTR du gène sagl de T gondii SEQ ID NO :4 amplifié à partir de l'ADN génomique de la souche RH. Ce plasmide permet donc la réalisation simultanée d'un mutant ropl6K0 1ox22 72 CATGFP 1ox22 72 et l'insertion de gra1511HA au locus rop16. Le plasmide pTgROP16-KO-CAT-tdTomato SEQ ID NO : 73 contient une cassette CATtdTomato SEQ ID NO :125 - encadrée par une séquence 5'HR du gène Tgrop16 SEQ ID NO : 99 et une séquence 3'HR du gène Tgrop16 SEQ ID NO: 100. Le clonage a été fait à partir du plasmide pTgROP16-KO-CAT-tdTomato SEQ ID NO : 73 digéré par les enzymes SphI et AgeI (6073pb). Ce clonage a nécessité 4 PCR indépendantes. La première PCR a permis l'amplification à partir du plasmide pCATGFP lox P SEQ ID NO : 38, d'une cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO: 6 comportant le promoteur aTubuline, le gène de sélection cat-e et la région 3'UTR de sagl de T gondii, avec ajout du site 1ox2272 SEQ ID NO: 68 avec les amorces tub F AgeI SEQ ID NO : 74 et 3 UTR 1ox2272 R SEQ ID NO : 75 (2090pb). La deuxième PCR a permis l'amplification à partir du plasmide pT230 2G gral5II SEQ ID NO :76, du promoteur gra1511 SEQ ID NO : 71 avec ajout en 5' du site 1ox2272 SEQ ID NO: 68 avec les amorces pGral5 F 1ox2272 SEQ ID NO: 77 et P Gral5 R SEQ ID NO: 78 (1975pb). La troisième PCR a permis l'amplification à partir du plasmide pT230 2G gral5II SEQ ID NO :76, du gène gra1511 HA avec le 3'UTR de sagl SEQ ID NO : 79 (2092 pb) avec les amorces Gral5F SEQ ID NO 126et UTR sag1 rop16 R SEQ ID NO 127. Les amorces utilisées pour la construction de ce plasmide sont répertoriées dans le tableau 9 ci-dessous. 80 Tableau 9 : Amorces utilisées pour la construction du plasmide pT230 2G Gral5II tub F AgeI SEQ ID NO : 74 : GTGATCCTGGTTGGACCGGT 3 UTR 1ox2272 R SEQ ID NO : 75: ATAACTTCGTATAAAGTATCCTATACGAAGTTATCGGTTCGACTAGAACAACTG pGral5 F 1ox2272 SEQ ID NO : 77 : CTTTATACGAAGTTATGGATCCACTAGTTGACTGCC P Gral5 R SEQ ID NO :78 : GTCACCATTGTTGAATGC Gral5F SEQ ID NO 126 : GCATTCAACAATGGTGAC UTR sagl rop16 R SEQ ID NO 127 : CGAATTTCGGGAGTTCTCGGGGGGGCAAGAATTGTG Ropl6F SEQ ID NO : 81 : GAACTCCCGAAATTCGTCAA Ropl6R SphI SEQ ID NO : 82 : AATACACGCGACCGCATGC La dernière PCR a permis l'amplification d'une partie de 3'Rop16 SEQ ID NO: 80 avec les amorces Ropl6F SEQ ID NO: 81 et Ropl6R SphI SEQ ID NO: 82 (570pb) sur le plasmide pTgrop16 KO CAT-tdTomato SEQ ID NO : 73 comme matrice. Les 4 fragments de PCR amplifiés ont été directement clonés dans le vecteur pTgrop16 KO CAT-tdTomato SEQ ID NO: 73 digéré par AgeI et SphI grâce à au kit In-Fusion® de Ozyme (In-Fusion® HD Cloning Kit - Clonetech). La technologie de clonage In-Fusion® permet le clonage en une étape sans purification ou digestion d'un ou de plusieurs produits de PCR dans un vecteur linéarisé. Des extrémités complémentaires aux extrémités des fragments adjacents sont ajoutées par PCR. La réaction se fait selon les recommandations du constructeur. Le plasmide obtenu est dénommé pTgRopl6KO-Gral5HKI-CAT-GFP 1ox2272 SEQ ID NO : 67. Le plasmide dénommé pTgRopl6KO-Gral5HKI-CAT-GFP 1ox2272 SEQ ID NO: 67 contient donc une cassette CAT- GFP SEQ ID NO: 6 et une cassette d'expression de gral5HAII SEQ ID NO: 69 , encadrées par une séquence 5'HR du gène Tgrop16 SEQ ID NO : 99 et une séquence 3'HR du gène Tgrop16 SEQ ID NO: 100. Construction de la souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI -2G La construction de la souche vivante atténuée de seconde génération, dénommée Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II M -2G, est faite en 2 étapes distinctes : 1. Délétion par recombinaison homologue du gène rop16 et son remplacement par la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO : 6 encadrée par des séquences Lox2272 SEQ ID NO : 38 et la cassette gral5II SEQ ID NO :69. 81 Pour obtenir cette souche, la souche Toxo tgmic3 KO - 2G est électroporée avec le plasmide pTgRopl6KO-Gral5HKI-CAT-GFP lox 2272 SEQ ID NO: 67 (20 1.1g ) linéarisé par PciI, selon le protocole précédemment décrit. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture est remplacé et supplémenté par l'agent de sélection (chloramphénicol 20 1.1M), 24 heures après l'électroporation. 10 à 15 jours après sélection, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II M. Dans cette souche, le gène rop16 a été délété et remplacé par la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 et la cassette d'expression de gral5HAII SEQ ID NO :69 . Ainsi, la séquence théorique au locus du gène rop16 délété contenant la cassette de sélection CATGFP et la cassette d'expression de gral5HAII est la SEQ ID NO : 112. Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO: 19. Dans cette souche, le gène mic/ a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic/ délété contenant un seul site lox N SEQ ID NO : 5, est la SEQ ID NO : 92. 2. Suppression de la cassette de sélection: la souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI obtenue est électroporée avec le plasmide pT-SAG1-CRE-Recombinase SEQ ID NO : 15 (Figure 2-C). L'enzyme exprimée transitoirement va permettre l'excision de la cassette de sélection CAT-GFP. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Après 2 à 7 jours de culture, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique au DNAzol des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI -2G. Dans cette souche, le gène rop16 a été délété et remplacé par la cassette d'expression de gral5HAII SEQ ID NO :69 et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène rop16 délété contenant la 82 cassette un seul site lox 2272 SEQ ID NO : 68 et la cassette d'expression de gral5HAII est la SEQ ID NO: 93. Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO: 19. Dans cette souche, le gène mic/ a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic/ délété contenant un seul site lox N SEQ ID NO : 5, est la SEQ ID NO : 92. Validation de la souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI -2G par PCR Pour valider la souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI 2G des analyses PCR sont effectuées à partir de l'ADN génomique extrait au DNAzol à partir d'un culot parasitaire constitué de 107 parasites. Les amorces utilisées pour les PCR sont décrites dans la Figure 11C et sont détaillées dans le Tableau 10 ci-dessous. Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d' agarose (Figure 9-B). Leur taille attendue et leur taille observée sont également décrites dans le Tableau 11 ci-dessous. 83 Tableau 10 : liste des amorces utilisées pour la validation de la souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI 2G. Amorce F Séquence Amorce R Séquence Tgrop16 (mixl) Rg 1 AGD rop 16CDS F SEQ ID NO: 83 Rg 2 AGD rop 16CDS R SEQ ID NO: 84 GTTTGAGGAAGCGCAAA AAG TGCTGTGATTTCGCAAGTT C Validatio n KO en amont (mix2) Rg 3 Rop 16K0 valid 5F1 SEQ ID NO: 85 Rg 4 Amont ropl6R SEQ ID NO: 86 ACCCCCTGACCCCTTGTC TG TCGTCGTGGTATTCACTCC A Validatio n KO en aval (mix3) Rg 5 Gral5 qPCR 2F SEQ ID NO: 87 Rg 6 Aval ropl6R SEQ ID NO: 88 CACGTACACAACCCATCT CG AAAACGAATGCGAAGGA AGA Cicatrice ropl6K0 gral5 loxP (mix4) Rg 7 cicropl 6 loxF SEQ ID NO: 89 Rg 8 cicropl 6 loxGra R SEQ ID NO: 90 CAGTACCAGCCACGTTAG CA CAAGCAATCTGTGGCAAA AA Gral5I/II (mix5) Gral5I/ H F SEQ ID NO: 109 Gral5I/ H F SEQ ID NO: 110 GTGCAAAGCCAACTTCCA CT GGACCTGGATCAGAGATC GT Tableau 11 : Taille attendue des amplicons (en paires de base) des différentes PCR de validation de la construction de la souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI 2G Toxo tgmicl- 3 KO - Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI Toxo tgmic1-3 KO 2G rop16 KO Gral5II KI -2G Tgrop16 (mixl) 1682 - - Validation KO 5'Tgrop16 - 2759 - (mix2) Validation KO 3' Tgrop16 - 2870 2870 (mix3) Cicatrice ropl6K0 gral5loxP (mix4) - 2550 321 Gral5I/II (mix5) 560 560 et 308 560 et 308 84 Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces rgl SEQ ID NO: 83 et rg2 SEQ ID NO: 84 (mix 1) permettent de mettre en évidence une bande à 1682 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène Tgrop16 dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans les souches Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI et Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI -2G confirmant la suppression du gène dans ces souches. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces rg3 SEQ ID NO: 85et rg4 SEQ ID NO: 86 (mix 2) permettent de mettre en évidence une bande à 2759 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI, conformément à la taille des bandes attendues et confirmant la suppression du gène Tgrop16 dans cette souche et l'insertion du gène de sélection CATGFP et gra1511 à la place du gène Tgrop16. Cette bande n'est pas détectée dans les souches Toxo tgmic1-3 KO - 2G et Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI -2G. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces rg5 SEQ ID NO: 87 et rg6 SEQ ID NO: 88 (mix 3) permettent de mettre en évidence une bande à 2870 paires de bases pour les souches Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI et Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI -2G, conformément à la taille des bandes attendues et confirmant la suppression du gène Tgrop16 dans cette souche et l'insertion du gène gra1511 à la place du gène Tgrop16. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G. Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces rg7 SEQ ID NO: 89 et rg8 SEQ ID NO: 90 (mix 4) permettent de mettre en évidence une bande de 2550 paires de bases pour la souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI confirmant la présence de la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO: 6 à la place du gène Tgrop16. Enfin une bande de 321 paires de bases est mise en évidence pour la souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI -2G confirmant la suppression du gène de sélection cat-e SEQ ID NO : 2 dans cette souche, laissant une cicatrice 1ox2272 SEQ ID NO : 68 dans le génome. Aucune bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tgmic1-3 KO - 2G. Le produit PCR « cicatrice » obtenue pour la souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI -2G (321 paires de bases) a été séquence et les séquençages ont confirmés que : - le gène Tgrop16 a été supprimé et que la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO: 6 a bien été supprimée par action de la Cre-Recombinase laissant une cicatrice Lox2272 SEQ ID NO : 68 conforme à la séquence attendue (Figure 9-C). 85 Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces SEQ ID NO: 109 et SEQ ID NO: 110 (mix 5) permettent de mettre en évidence une bande à 560 paires de bases pour les souches Toxo tgmic1-3 KO - 2G, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène Tggral5 dans cette souche. Une bande supplémentaire à 308 paires de bases est détectée dans les souches Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI et Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI -2G confirmant la présence du gène gral5HAII dans ces souches. Validation de la souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO Gral5II KI -2G par immunofluorescence Les tachyzoïtes sont cultivés 24h sur lamelles en verre recouvertes d'une monocouche de cellules HFF. Les cellules infectées ont été lavés 2 fois en PBS1X, et fixés par du formaldéhyde 4% pendant 30 min. Après 3 lavages en PBS1X, les cellules HFF infectées ont été perméabilisées avec 0,1% de Triton X-100 dans du PBS1X pendant 5 min. Après 3 lavages au PBS 1X, une étape de saturation est effectuée avec une solution de PBS 1X/SVF 10% pendant 30 min. Les cellules ont ensuite été incubées avec l'anticorps primaire dilué dans 2% SVF pendant 1 heure, lavées 3 fois au PBS1X puis incubées avec un anticorps secondaire dilué dans une solution de PBS/SVF 2% pendant 1 heure. Après 2 lavages au PBS1X, les lamelles en verre sont montés sur lame avec de l'Immu-MountTm et observés au microscope à fluorescence. L'anticorps primaire utilisé est l'anticorps de souris anti-HA qui permet de détecter l'expression de la protéine GRA1511-HA SEQ ID NO : 123 dans le parasite. L'anticorps secondaire est l'anticorps secondaire commercial : Alexa fluor® 594 chèvre anti lapin (Life Technologies A-11012). Les anticorps sont dilués au 1/1000 dans du PBS SVF 2%. Pour la souche sauvage Toxo tgmic1-3 KO 2G, aucune fluorescence rouge n'est observé au pôle apical du parasite révélant ainsi l'absence de la protéine GRA1511-HA. Au contraire, pour la souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO gral5II KI, une fluorescence rouge est observé démontrant la protéine GRA1511-HA. La souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO gral5II KI exprime une fluorescente verte reflétant l'expression de la protéine CATGFP SEQ ID NO : 120 alors qu'après action de la Cre recombinase, la souche Toxo tgmic1-3 KO rop16 KO gral5II KI 1ox2272 n'est plus fluorescente (Figure 10). 86 Exemple 4 : Construction de souches recombinantes de Toxo tgmic1-3 KO exprimant la protéine M2eGPI après intégration ciblée L'objectif de cette expérience est d'évaluer si les souches Toxo KO et Neo KO peuvent exprimer des antigènes hétérologues. Culture des parasites Tous les tachyzoïtes de la souche de Toxoplasma gondii utilisés ont été produits en fibroblastes humains (HFF) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (SVF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine. Ils ont été récoltés après lyse mécanique des cellules hôtes par 3 passages en seringue 25G. Construction des plasmides Plasmide pUC 4G2 ICreI Le plasmide pUC 4G2 ICreI SEQ ID NO : 156 a été construit pour permettre l'intégration d'un transgène hétérologue dans les souches Toxo tgmic1-3 KO 2G, Neo ncmic1-3 KO 2G et Toxo KO+ 2G. Le plasmide est notamment composé : 1- d'une cassette de sélection dhfr*-ty-tk SEQ ID NO: 229 (Donald & Roos, Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 Dec 15;90(24):11703-7; Scahill et al., (Mol Biochem Parasitol. 2008 Jan;157(1):73-82. Epub 2007 Oct 6.)), placée sous la dépendance du promoteur de dhfr* SEQ ID NO : 230 de T gondii et en aval de la séquence 3'UTR du gène dbfr* SEQ ID NO : 231 de Toxoplasma gondii. Cette cassette de sélection permet de coder la protéine de fusion DHFR*TYTK SEQ ID NO: 207 et permet une sélection positive par la pyriméthamine et une sélection négative par le ganciclovir. 2- d'une cassette d'expression constitué du promoteur de l'a-Tub8 SEQ ID NO: 128 (Soldati et al., Mol Cell Biol. 1995 Jan;15(1):87-93 - fusion d'une partie du promoteur de Tgsagl et Tgtub), d'un site de clonage multiple MCS pour permettre l'intégration future de transgène hétérologue et de la séquence 3'UTR du gène Tgsagl SEQ ID NO : 4 qui doit permettre de stabiliser l'ARNm du gène hétérologue. 87 La cassette de sélection dhfr*-ty-tk a été réalisée à partir de 3 fragments PCR obtenus avec les amorces du tableau 20: - L'amplification du premier fragment PCR SEQ ID NO : 129 a été effectuée sur le plasmide pUC18DHFR* SEQ ID NO: 130 (Donald & Roos 1993, même référence que précédemment) avec les amorces Dhtkl SEQ ID NO : 131 et Dhtk2 SEQ ID NO : 132 (674pb) et permet l'amplification de la fin de la séquence codante de DHFR* SEQ ID NO: 133 et d'ajouter la séquence codant le TY en 3' SEQ ID NO: 134. - La deuxième PCR a été effectuée sur une séquence synthétisée du gène codant la Thymidine Kinase de l'Human herpesvirus 1 (TK) SEQ ID NO: 135 avec les amorces Dhtk3 SEQ ID NO: 136 et Dhtk4 SEQ ID NO: 137 (1161pb) et permet l'amplification de la séquence codante de la Thymidine Kinase avec ajout de la séquence codant le TY en 5' SEQ ID NO : 138. - L'amplification du troisième fragment de PCR a été effectuée sur pUC18DHFR* SEQ ID NO: 130 avec les amorces Dhtk5 SEQ ID NO: 139 et Dhtk6 SEQ ID NO: 140 (363pb) et permet l'amplification de la fin de la séquence codante de la Thymidine Kinase et du 3'UTR de DHFR* SEQ ID NO: 141. Les deuxième et troisième fragments de PCR sont fusionnés par PCR chevauchante avec les amorces Dhtk3 SEQ ID NO: 136 et Dhtk6 SEQ ID NO : 140 (1501pb) pour donner la séquence SEQ ID NO :191. Enfin le premier fragment SEQ ID NO: 129 digéré par BamHI et BglII (646pb) et la fusion des deux autres PCR SEQ ID NO :191 digéré par BamHI et XbaI (1474pb) sont clonés dans le plasmide pUC18DHFR* SEQ ID NO: 130 digéré par BglII et XbaI (5258pb). Le plasmide obtenu est appelé pUC18DHFR*TYTK SEQ ID NO: 142. Tableau 20 : Liste de amorces utilisées Dla 1 AF DHERi SEQIDNO:131 Dlitlç 2 AF DHFR TYR SEQIDNO:112 IttBgl CTGAGAAGGGCGTGAAGA TC GTCAAGTGGATCCTGGTTAGTA F TGGACCTCGACAGCCATCTCCA TCTGGATTCG Dlitlç 3 TY HSVT KF SEQIDNO:115 GAGGTCCATACTAACCAG GATCCACTTGACATGGCTT CGTACCCCTGCCATCA Dlitlç 4 HSVT Kstop TAA R SEQIDNO:137 TTAGTTAGCCTCCCCCATCTCC C Dlitlç 5 AFHS VTK3 UTRD HFRF SEQIDNO:139 GGGAGATGGGGGAGGCTA ACTAACGGAAATACAGAA GCTGCCCGTCTCT Dlitlç 6 AF 3UTR DHFR SEQIDNO:141) xbaR TTTTTCTAGAATCCTGCAAGTG CATAGAAGGAA 88 La cassette d'expression est composée du promoteur de l'a-Tub8 SEQ ID NO : 128 (Soldati et al, 1995, même référence que précédemment), d'un site de clonage multiple pour permettre l'intégration future de transgène hétérologue et de la séquence 3'UTR du gène sagl SEQ ID NO : 4 qui doit permettre de stabiliser l'ARNm du gène hétérologue. La partie promotrice de l'a-Tub8 SEQ ID NO: 128 a été obtenue par PCR avec les amorces K7mcs1 SEQ ID NO :143 et K7mcs2 SEQ ID NO :144 (530pb) sur le pTUB8TY TAIL SEQ ID NO: 145 (Meissner et al., J Cell Sci. 2002;115:563-574). La séquence 3'UTR du gène sagl SEQ ID NO : 4 a été obtenue par PCR avec les amorces K7mcs3 SEQ ID NO :146 et K7mcs4 SEQ ID NO :147 (395 pb). Puis les deux fragments de PCR ont été fusionnés par PCR chevauchante avec les amorces K7mcs1 SEQ ID NO :143 et K7mcs4 SEQ ID NO :147 (914pb) pour donner la séquence SEQ ID NO :192. La PCR chevauchante SEQ ID NO :192 digérée par KpnI et SacI (902pb) a été clonée dans le pUC18 (plasmide commercial) KpnI SacI (2682pb). Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le tableau 12 ci-dessous. Le plasmide obtenu est le pUC 18 -Tub8MCS 3UTR SEQ ID NO :148. Tableau 12 : liste des amorces utilisées pour la construction de la cassette d'expression Amorce F Séquence Am orce R Séquence K7m csl pTUB8 MCS 4 F SEQ ID NO: 143 AAAGGTACCTCTAGAA GTATACTATTCGAAAAA CTAGTATCGATAAGCTT GAACAC K7mcs 2 Tub 8 SEQ ID NO: 144 Ter AACTTAAGAATTTTGTTTAAAC AGGG R K7m cs3 MCS 3UTR TER F SEQ ID NO: 146 K7mcs 4 MC SEQ ID NO: 147 TTTAAACAAAATTCTTA AGTTGCGGC S 3UT R TER R TTTGAGCTCTCTAGAATTTAAA TCCTAGG La cassette d'expression Tub8MCS 3UTR SEQ ID NO: 149 obtenue par digestion du pUC 18 -Tub8MCS 3UTR SEQ ID NO: 148 avec l'enzyme XbaI (890pb) a ensuite été clonée dans le plasmide pUC18 DHFR*TYTK SEQ ID NO: 142 digéré par XbaI et déphosphorylé (7378pb). Le plasmide obtenu a sa cassette d'expression Tub8MCS 3UTR transcrite en sens inverse par rapport à la cassette DHFR*TYTK. Le plasmide obtenu est nommé pUC4G2 SEQ ID NO : 150. Le fragment de PCR SEQ ID NO : 193 amplifié avec les amorces IcreIl SEQ ID NO : 151 et IcreI2 SEQ ID NO: 152 sur le pTsaglIcreI c43y SEQ ID NO: 153 (142pb) et le fragment de PCR SEQ ID NO: 194 amplifié avec les amorces IcreI3 SEQ ID NO: 154 et IcreI4 SEQ ID 89 NO: 155 sur le pUC4G2 SEQ ID NO: 150 (153pb) permettent l'ajout de la séquence c43 IcreI SEQ ID NO :157. Les deux fragments PCR SEQ ID NO: 193 et SEQ ID NO: 194 ont été directement clonés dans le plasmide pUC4G2 SEQ ID NO : 150 digéré par les enzymes de restriction Pml I et KasI (7990pb) avec la technique In-Fusion de Ozyme. Puis le fragment de PCR SEQ ID NO : 195 amplifié avec les amorces IcreI5 SEQ ID NO : 159 et IcreI6 SEQ ID NO : 160 sur le pTIcreI100 SEQ ID NO : 158 (546pb) et le fragment de PCR SEQ ID NO: 196 amplifié avec les amorces IcreI7 SEQ ID NO: 161 et IcreI8 SEQ ID NO : 162 sur le pTsaglIcreI c43y SEQ ID NO : 153 (133pb) permettent l'ajout de la séquence IcreI f3y SEQ ID NO: 163 dans le plasmide précédemment décrit digéré par les enzymes de restriction NsiI et Avril (7734pb). Le plasmide obtenu est nommé pUc4G2 IcreI SEQ ID NO : 164. Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le tableau 21 ci-dessous. Tableau 21 : Liste de amorces utilisées Ic PC R oz 4g mn 1F SEQ ID NO: 151 Ic oz4 g mn lIc reIr SEQ ID NO: 152 re AATACCGCATCAGGCGCCTAGAA re AAAACGTCGTGAGACAGTTTGGTGAGA TATCTTCAAAAGATATATAGC i 1 i 2 CCTGTTAAAAATAT Ic oz 4g mn 2 Icr eIF SEQ ID NO: 154 Ic oz4 g mn 2R SEQ ID NO: 155 re GTCTCACGACGTTTTGAACCCAGA re CGGATATGGTTACACGTG i3 i4 AGCTTCGCCAGGCTGTAAAT Ic oz SEQ ID NO: 159 Ic oz 4g 3 cre R SEQ ID NO: 160 re 4g CGCCTCCGTCCCATGCAT re CCAAACTGTCTCACGACGTT i5 3F i6 Ic oz 4g 4 FIc reI SEQ ID NO: 161 Ic oz 4g4 R avr H SEQ ID NO: 162 re CGTGAGACAGTTTGGCTAAAAATT TATTTTAAATAATCTTAT re GAGGCGCGCCAACCTAGGAGGGCCCG GGCGCCATGGC i 7 i 8 Plasmide pUC 4G2 IcreI M2eGPI SEQ ID NO: 164 Ce plasmide permettra la production d'une protéine de fusion sagl M2eGPI SEQ ID NO: 165, comprenant la protéine SAG1 de Toxoplasma gondii SEQ ID NO: 166, une répétition de 5 M2e (fragment Nter de la protéineM2 du virus d'Influenza) espacée par des linkers (Lee et al, 2015, PLoS ONE 10(9): e0137822. doi:10.1371/journal.pone.0137822) SEQ ID NO: 167 et en Cter une séquence d'ancrage en GPI de la protéine SAG1 de Toxoplasma gondii SEQ ID 90 NO : 169. L'amplification de 3 fragments PCR a été nécessaire pour cette construction. L'amplification du premier fragment de PCR SEQ ID NO : 197 a été effectuée sur l'ADN génomique de Toxoplasma gondii de la séquence codante de sagl SEQ ID NO : 170 avec les amorces da SEQ ID NO :171 et db SEQ ID NO :172 (906pb). La deuxième PCR SEQ ID NO : 198 a été effectuée sur une séquence synthétisée comprenant une répétition de 5 M2e SEQ ID NO :173 (Lee et al) avec les amorces dc SEQ ID NO :174 et dd SEQ ID NO :175 (588pb). Cette séquence M2e a été optimisée pour l'expression chez Toxoplasma gondii. L'amplification du troisième fragment de PCR SEQ ID NO : 199 a été effectuée sur l'ADN génomique de Toxoplasma gondii de la séquence codante de sagl (partie ancrage GPI) SEQ ID NO :176 avec les amorces de SEQ ID NO :177 et df SEQ ID NO :178 (98pb). Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le tableau 13 ci-dessous. Tableau 13 : liste des amorces utilisées pour la construction des plasmides pUC 4G2 IcreI M2eGPI Amo rce F Séquence Am orce R Séquence d a Ozsa gl SEQ ID NO: 171 d b Sag 1 M2e R SEQ ID NO: 172 4G F CTTGAATTCCCTGTTTAAACGACAAAA TGTTTCCGAAGGCAGTG TCAGCAAGGACCTAGGTGCAGCC CCGGCAA d M2e F SEQ ID NO: 174 d Oz M2e GPI R SEQ ID NO: 175 c CCTAGGTCCTTGCTGACTGA d GGCTGTTCCCGCAGCCGTAGAAT CGAGACCGAGGA d oZ GPI F SEQ ID NO: 177 d oZ GPI R SEQ ID NO: 178 e GCTGCGGGAACAGCCAGTCA f ACCATGGAAGCGGCCGCTTACGC GACACAAGCTGCGAT Les fragments de PCR ont été directement clonés dans le plasmide p4G2 ICreI SEQ ID NO: 156 digéré par les enzymes PmeI et NotI (8344pb) avec la technique In-Fusion de Ozyme. Plasmide pUC 4G2 Icre M2eGPI loxP SEQ ID NO: 179 Le site LoxP SEQ ID NO :12 a été introduit par PCR dans le plasmide PUC 4G2 IcreI M2eGPI SEQ ID NO: 164 digéré PciI et PmeI (8901 pb ). Le fragment de PCR SEQ ID NO: 91 200 obtenu avec les amorces aa SEQ ID NO :180 et ab SEQ ID NO :181 (438pb) et le fragment de PCR SEQ ID NO : 201 obtenu avec les amorces ac SEQ ID NO :182 et ad SEQ ID NO :183 (534pb) ont été clonés avec la technique In-Fusion de Ozyme dans le plasmide PUC 4G2 IcreI M2eGPI SEQ ID NO: 164 digéré PciI et PmeI. Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le tableau 14 ci-dessous. Tableau 14 : liste des amorces utilisées pour l'introduction du site loxP Amorce F Séquence Amorce R Séquence aa pUC4G PciI F SEQ ID NO: 180 ab Puc4G loxP R SEQ ID NO: 181 TATAGCATACATTATACGAAG TTATTAGTATACT TCTAGAGGATCC GCTGGCCTTTTGCTCACAT GT ac Puc4G loxP F SEQ ID NO: 182 TATAATGTATGCTATACGA AGTTATAAACT AGTATCGATAAGCTTG ad pUC4G PmeI R SEQ ID NO: 183 GAAACATTTTGTCGTTTAAAC - Plasmide pUC 4G2 Icre M2eGPI loxN SEQ ID NO: 184 Le site loxN SEQ ID NO : 5 a été introduit par PCR dans le plasmide PUC 4G2 IcreI M2eGPI SEQ ID NO: 164 digéré PciI et PmeI (8901 pb ). Le fragment de PCR SEQ ID NO: 202 obtenu avec les amorces aa SEQ ID NO : 180 et bb SEQ ID NO : 181 (438pb) et le fragment de PCR SEQ ID NO : 203 obtenu avec les amorces bc SEQ ID NO :182 et ad SEQ ID NO: 183 (534pb) ont été clonés avec la technique In-Fusion de Ozyme dans le plasmide PUC 4G2 IcreI M2eGPI SEQ ID NO : 164 digéré PciI et PmeI. Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le tableau 15 ci-dessous. 92 Tableau 15 : liste des amorces utilisées pour l'introduction du site loxN Amor ce F Séquence Amor ce R Séquence a a pUC4 G PciI SEQ ID NO: 180 b b Puc4 G loxN R SEQ ID NO: 185 F GCTGGCCTTTTGCTCACATGT TATAAGGTATACTATACGAAGTT ATTAGT ATACTTCTAGAGGATCC b Puc4 SEQ ID NO: 186 a pUC4 G PmeI R SEQ ID NO: 183 c G loxN F TATAGTATACCTTATACGAAGTTAT AAACTAG d GAAACATTTTGTCGTTTAAAC TATCGATAAGCTTG Construction des souches Toxo tgmic1-3 KO -2G M2eGPI intégration ciblée ou aléatoire. Intégration ciblée au site loxP La souche ToxoK0 mic1-3K0 2G est électroporée avec 20 1.1g des plasmides circulaires purifié pUC 4G2 IcreI M2eGPI loxP SEQ ID NO :179 et pTsagl Cre recombinase SEQ ID NO :15 selon le protocole précédemment décrit. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture est remplacé et supplémenté par l'agent de sélection (chloramphénicol 20 1.1M), 24 heures après l'électroporation. 10 à 15 jours après sélection, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Toxo tgmic1-3 KO -2G M2eGPI loxP. Intégration ciblée au site loxN La souche ToxoK0 mic1-3K0 2G est électroporée avec 20 1.1g des plasmides circulaires purifié pUC 4G2 IcreI M2eGPI loxN SEQ ID NO :184 et pTsagl Cre recombinase SEQ ID NO :15 selon le protocole précédemment décrit. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture est remplacé et supplémenté par l'agent de sélection (chloramphénicol 20 1.1M), 24 heures après l'électroporation. 10 à 15 jours après sélection, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Toxo tgmic1-3 KO -2G M2eGPI loxN. 93 Intégration aléatoire La souche ToxoK0 mic1-3K0 2G est électroporée avec 20 1.1g du plasmide linéarisé purifié pUC 4G2 IcreI M2eGPI loxP SEQ ID NO :179 ou pUC 4G2 IcreI M2eGPI loxN SEQ ID NO :184 selon le protocole précédemment décrit. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture est remplacé et supplémenté par l'agent de sélection (chloramphénicol 20 1.1M), 24 heures après l'électroporation. 10 à 15 jours après sélection, les parasites sont analysés pour l'expression de la protéine de fusion SAG1 M2eGPI SEQ ID NO : 165 (analyse sur la population totale). Validation Toxo tgmic1-3 KO -2G M2eGPI intégration ciblée par PCR Intégration ciblée au site loxP Deux PCR sont réalisées pour valider les clones ayant intégré de manière ciblée le plasmide. Pour valider des souches ayant intégré les plasmides pUC 4G2 IcreI M2eGPI loxP SEQ ID NO :179, des analyses PCR sont effectuées à partir de l'ADN génomique extrait au DNAzol à partir d'un culot parasitaire constitué de 107 parasites. Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le tableau 16 ci-dessous. Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d' agarose. Les clones ayant intégré le plasmide ont été validés par PCR avec les amorces ea SEQ ID NO : 187 et eb SEQ ID NO :188 par l'obtention du fragment SEQ ID NO :204 (1719pb). La seconde PCR permet de valider la localisation de l'insertion du plasmide au locus Tginic3 loxP. Les clones ayant intégré l'un des plasmides ont été validés par PCR avec les amorces ec SEQ ID NO :189 et eb SEQ ID NO :188 par l'obtention du fragment SEQ ID NO : 205 (2704 pb). Tableau 16 : liste des amorces utilisées pour la validation des clones Amorce F Séquence Amorce R Séquence ea seq TUB MCS F SEQ ID NO :187 eb seq 3utr MCS R SEQ ID NO: 188 AACCCGCGCAGAAGACATCC ATGGGGCACATGCTGCACGAA ec CN3 SEQ ID NO: 189 eb seq 3utr MCS R SEQ ID NO: 188 AGAGGTTGACACCGACAAAG ATGGGGCACATGCTGCACGAA 94 Intégration ciblée au site loxN Deux PCR sont réalisées pour valider les clones ayant intégré de manière ciblée l'un des plasmides. Pour valider des souches ayant intégré le plasmide pUC 4G2 IcreI M2eGPI loxN SEQ ID NO :184, des analyses PCR sont effectuées à partir de l'ADN génomique extrait au DNAzol à partir d'un culot parasitaire constitué de 107 parasites. Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le tableau 17 ci-dessous. Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose. Les clones ayant intégré l'un des plasmides ont été validés par PCR avec les amorces ea SEQ ID NO :187 et eb SEQ ID NO :188 (1719pb) par l'obtention du fragment SEQ ID NO : 204. La seconde PCR permet de valider la localisation de l'insertion du plasmide au locus Tgmicl loxN. Les clones ayant intégré l'un des plasmides ont été validés par PCR avec les amorces ed SEQ ID NO: 55 et eb SEQ ID NO: 54 (2366pb) par l'obtention du fragment SEQ ID NO: 206. Tableau 17 : liste des amorces utilisées pour la validation des clones Amorce F Séquence Amorce R Séquence ed Tg micl loxN SEQ ID NO: 190 eb seq 3utr MCS R SEQ ID NO: 188 CCCGTCTAGCAAGACCTCAA ATGGGGCACATGCTGCACGAA Analyse par cytométrie en flux. Le niveau d'expression de M2eGPI SEQ ID NO: 165 a été analysé pour différentes populations de parasites recombinants suite à un marquage spécifique avec un anticorps anti M2 (anti-influenza A virus M2 Protein antibody ab5416 - Abcam). L'expression du transgène M2eGPI est similaire ou légèrement supérieur pour des clones dont le transgène est inséré de manière ciblée (localisé au niveau des cicatrices LoxP et LoxN au locus de mic/ ou mic3 ) que pour des populations dont le transgène est inséré de manière aléatoire. Ce résultat démontre que la souche Toxo tgmic/-3 KO 2G est un vecteur d'expression optimisé pour l'expression de transgène. 95 Exemple 5 : Construction de souches recombinantes de Toxo tgmic1-3 KO exprimant la protéine CAT-GFP après intégration ciblée ou aléatoire du transgène cat-,gfp L'objectif de cette expérience est d'étudier le niveau d'expression du gène cat-gpf après intégration aléatoire ou ciblée au niveau du site LoxP ou LoxN du transgène. Culture des parasites Tous les tachyzoïtes de la souche de Toxoplasma gondii utilisés ont été produits en fibroblastes humains (HFF) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (SVF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine. Ils ont été récoltés après lyse mécanique des cellules hôtes par 3 passages en seringue 25G. Construction des plasmides Plasmide pUC 4G2 IcreI CAT-GFP LoxP SEQ ID NO .- 221 Le fragment CATGFP SEQ ID NO : 222 a été amplifié par PCR avec les amorces ca SEQ ID NO :223 et cb SEQ ID NO :224 ( 1488 pb) sur le pCATGFP SEQ ID NO : 9. Ce fragment de PCR a été cloné avec la technique In-Fusion de Ozyme dans le plasmide pUC 4G2 IcreI M2eGPI loxP SEQ ID NO: 179 a été digéré par PmeI et NotI (8372pb- remplacement de M2eGPI par CATGFP). Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le tableau 18 ci-dessous. Tableau 18 : liste des amorces utilisées pour la construction des plasmides pUC 4G2 IcreI CATGFP Amor ce F Séquence Amor ce R Séquence c a Oz CAT GFP 4G F SEQ ID NO : 223 c b Oz CAT GFP 4G R SEQ ID NO : 224 TTGAATTCCCTGTTTCGACAAAA TGCATGAGAA ACCATGGAAGCGGCCGCTTAATCGA GCGGGTCCTGG Plasmide pUC 4G2 IcreI CAT-GFP LoxN SEQ ID NO. 225 Le fragment CATGFP SEQ ID NO : 222 a été amplifié par PCR avec les amorces ca SEQ ID NO :223 et cb SEQ ID NO :224 ( 1488 pb) sur le pCATGFP SEQ ID NO : 9. Ce fragment de 96 PCR a été cloné avec la technique In-Fusion de Ozyme dans le plasmide pUC 4G2 IcreI M2eGPI loxN SEQ ID NO: 184 a été digéré par PmeI et NotI (8372pb- remplacement de M2eGPI par CATGFP). Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le tableau 18 ci-dessus. Construction des souches Toxo tgmic1-3 KO -2G CATGFP intégration ciblée ou aléatoire. Intégration ciblée au site loxP La souche ToxoK0 mic1-3K0 2G est électroporée avec 20 1.1g des plasmides circulaires purifié pUC 4G2 IcreI CATGFP loxP SEQ ID NO: 221 et pTsagl Cre recombinase SEQ ID NO : 15 selon le protocole précédemment décrit. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture est remplacé et supplémenté par l'agent de sélection (chloramphénicol 20 1.1M), 24 heures après l'électroporation. 10 à 15 jours après sélection, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Toxo tgmic1-3 KO -2G CATGFP loxP. Intégration ciblée au site loxN La souche ToxoK0 miel-3K° 2G est électroporée avec 20 1.1g des plasmides circulaires purifié pUC 4G2 IcreI CATGFP loxN SEQ ID NO: 225 et pTsagl Cre recombinase SEQ ID NO : 15 selon le protocole précédemment décrit. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture est remplacé et supplémenté par l'agent de sélection (chloramphénicol 20 1.1M), 24 heures après l'électroporation. 10 à 15 jours après sélection, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Toxo tgmic1-3 KO -2G CATGFP loxN. Intégration aléatoire La souche ToxoK0 mic1-3K0 2G est électroporée avec 20 1.1g du plasmide linéarisé purifié pUC 4G2 IcreI CATGFP loxP SEQ ID NO: 221 ou pUC 4G2 IcreI CATGFP loxN SEQ ID NO : 225 selon le protocole précédemment décrit. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture est remplacé et supplémenté par l'agent de sélection (chloramphénicol 20 1.1M), 24 heures après l'électroporation. 10 à 15 jours après sélection, les parasites sont 97 analysés pour l'expression de la protéine CATGFP SEQ ID NO : 120 (analyse sur la population totale). Validation Toxo tgmic1-3 KO -2G CATGFP intégration ciblée par PCR Intégration ciblée au site loxP Deux PCR sont réalisées pour valider les clones ayant intégré de manière ciblée le plasmide. Pour valider des souches ayant intégré les plasmides pUC 4G2 IcreI CATGFP loxP SEQ ID NO :221, des analyses PCR sont effectuées à partir de l'ADN génomique extrait au DNAzol à partir d'un culot parasitaire constitué de 107 parasites. Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le tableau 16 précédemment cité. Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d' agarose. Les clones ayant intégré le plasmide ont été validés par PCR avec les amorces ea SEQ ID NO : 187 et eb SEQ ID NO :188 et l'obtention d'un fragment SEQ ID NO :226 (1647pb). La seconde PCR permet de valider la localisation de l'insertion du plasmide au locus Tginic3 loxP. Les clones ayant intégré l'un des plasmides ont été validés par PCR avec les amorces ec SEQ ID NO :189 et eb SEQ ID NO :188 et l'obtention d'un fragment SEQ ID NO :227 (2600 pb). Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le tableau 16. Intégration ciblée au site loxN Deux PCR sont réalisées pour valider les clones ayant intégré de manière ciblée le plasmide. Pour valider des souches ayant intégré le plasmide pUC 4G2 IcreI CATGFP loxN SEQ ID NO :225, des analyses PCR sont effectuées à partir de l'ADN génomique extrait au DNAzol à partir d'un culot parasitaire constitué de 107 parasites. Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le tableau 17 précédemment cité. Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose. Les clones ayant intégré l'un des plasmides ont été validés par PCR avec les amorces ea SEQ ID NO : 187 et eb SEQ ID NO :188 et l'obtention d'un fragment SEQ ID NO :226 (1647pb) . Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le tableau 16. La seconde PCR permet de valider la localisation de l'insertion du plasmide au locus Tginicl loxN. Les clones ayant intégré l'un des plasmides ont été validés par PCR avec les amorces ed SEQ ID NO: 190 et eb SEQ ID NO: 188 et l'obtention d'un fragment SEQ ID NO :228 (2294 pb) . Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le tableau 17. 98 Analyse par cytométrie en flux Le niveau d'expression de CAT-GFP SEQ ID NO :120 a été analysé dans les différentes populations de parasites recombinants (Tableau 19). L'expression du transgène CATGFP est systématiquement légèrement supérieure pour des clones dont le transgène est inséré de manière ciblée (localisé au niveau des cicatrices LoxP et LoxN au locus de mic/ ou mic3 ) que pour des populations dont le transgène est inséré de manière aléatoire. Tableau 19 : Intensité moyenne géométrique de fluorescence des souches recombinantes CATGFP. Parasite Intensité moyenne géométrique Parasite Intensité moyenne géométrique de fluorescence (GFP) de fluorescence(GFP) ToxoK0 2G 912 ToxoK0 2G 912 ToxoK0 2G M2eGPI 6078 ToxoK0 2G M2eGPI 5496 loxP ciblé au locus mic3 loxN ciblé au locus mic3 ToxoK0 2G2G M2eGPI 4850 ToxoK0 2G2G M2eGPI 5340 loxP aléatoire 1 loxN aléatoire 1 ToxoK0 2G2G M2eGPI 1998 ToxoK0 2G2G M2eGPI 3978 loxP aléatoire 2 loxN aléatoire 2 ToxoK0 2G2G M2eGPI 4561 ToxoK0 2G2G M2eGPI 4936 loxP aléatoire 3 loxN aléatoire 3 ToxoK0 2G2G M2eGPI 5237 ToxoK0 2G2G M2eGPI 5268 loxP aléatoire 4 loxN aléatoire 4 ToxoK0 2G2G M2eGPI 4778 ToxoK0 2G2G M2eGPI 4519 loxP aléatoire 5 loxN aléatoire 5 ToxoK0 2G2G M2eGPI 4899 loxN aléatoire 6 Ce résultat démontre que la souche Toxo tgmic/-3 KO est un vecteur d'expression optimisé pour l'expression REVENDICATIONS1. Souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes mic/ et mic3 sont délétés contenant deux sites de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, lesdits sites de recombinaison spécifique étant au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés, le site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment de la Cre-recombinase, au locus du gène mic/ délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété. 2. Souche mutante selon la revendication 1, dans laquelle ladite souche mutante est une souche du genre Neospora spp., en particulier une souche de l'espèce Neospora caninum. 3. Souche mutante selon la revendication 1, dans laquelle ladite souche mutante est une souche du genre Toxoplasma spp., en particulier une souche de l'espèce Toxoplasma gondii. 4. Souche mutante selon l'une des revendications 1 à 3, dans laquelle les deux gènes mic/ et mic3 sont délétés, contenant deux sites de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique, au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés, le site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique, au locus du gène mic/ délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété, et ne contenant pas d'ADN hétérologue, autres que des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique, au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés, notamment ladite enzyme permettant une recombinaison spécifique étant la Crerecombinase, et les sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés étant choisis parmi : lox N de SEQ ID NO :5, lox P de SEQ ID NO :12 et lox 2272 de SEQ ID NO :68. 100 5. Souche mutante selon l'une des revendications 1 à 3, ladite souche contenant un ADN hétérologue au locus du gène mic/ délété ou au locus du gène mic3 délété, différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés, ledit ADN hétérologue étant flanqué : - d'un premier site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique, correspondant au site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique, au locus du gène mic/ délété ou au locus du gène mic3 délété et, - d'un second site de recombinaison spécifique identique audit premier site de recombinaison spécifique, correspondant au site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique, au locus du gène mic/ délété ou au locus du gène mic3 délété et, et les moyens nécessaires à sa transcription, notamment ladite enzyme permettant une recombinaison spécifique étant la Cre-recombinase et les sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant choisis parmi : lox N de SEQ ID NO : 5, lox P de SEQ ID NO: 12 et lox 2272 de SEQ ID NO : 68. 6. Souche mutante selon l'une des revendications 1 à 3,1adite souche contenant un ADN hétérologue au locus du gène mic/ délété ou au locus du gène mic3 délété, différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique au locus respectif de chacun des susdits gènes mic/ et mic3 délétés, ledit ADN hétérologue codant pour une protéine et étant flanqué : - d'un premier site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique correspondant au site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique au locus du gène mic/ délété ou à celui au locus du gène mic3 délété, et d'un second site de recombinaison spécifique identique audit premier site de recombinaison spécifique, correspondant au site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique, au locus du gène mic/ délété ou au locus du gène mic3 délété et, et les moyens nécessaires à l'expression protéique du susdit ADN hétérologue, 101 notamment ladite enzyme permettant une recombinaison spécifique étant la Crerecombinase et, les sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant choisis parmi : lox N de SEQ ID NO: 5, lox P de SEQ ID NO: 12 et lox 2272 de SEQ ID NO :68. 7. Souche mutante selon l'une des revendications 1 à 3, 5 et 6, contenant un ADN hétérologue au locus du gène mic/ délété ou au locus du gène mic3 délété, différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique, ladite enzyme étant la Crerecombinase, au locus respectif de chacun des susdits gènes mic/ et mic3 délétés et contenant trois sites de recombinaison spécifique qui sont respectivement: le site A correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic/ délété, le site B correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété, et le site C correspondant audit second site de recombinaison spécifique qui flanque ledit second ADN hétérologue identique audit premier site de recombinaison spécifique, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase correspondant au susdit site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic/ délété (site A) ou au susdit site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété (site B) lesdits trois sites de recombinaison spécifique A, B et C étant choisis parmi les sites suivants : lox N de SEQ ID NO :5, lox P de SEQ ID NO :12 et lox 2272 de SEQ ID NO :68, de manière à ce que - ledit site A et ledit site B sont différents, et - ledit site C est identique audit site A ou audit site B ; en particulier tels que - ledit site A est le site lox N SEQ ID NO :5 ledit site B est le site lox P SEQ ID NO :12, et - ledit site C est le site lox N SEQ ID NO :5, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant le site A; ou tels que 102 ledit site A est le site lox N SEQ ID NO :5 - ledit site B est le site lox P SEQ ID NO :12, et - ledit site C est le site lox P SEQ ID NO :12, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant le site B, ou tels que ledit site A est le site lox P SEQ ID NO :12 - ledit site B est le site lox N SEQ ID NO :5, et - ledit site C est le site lox P SEQ ID NO :12, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant le site A ; ou tels que ledit site A est le site lox P SEQ ID NO :12 ledit site B est le site lox N SEQ ID NO :5, et ledit site C est le site lox N SEQ ID NO :5, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant le site B. 8. Souche mutante selon l'une des revendications 3 à 7, dans laquelle ladite souche mutante est une souche mutante de Toxoplasma spp., et dans laquelle le gène ropl 61 est délété et contient un site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique au locus dudit gène ropl6I délété, ce susdit site étant différent dudit site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic/ délété et dudit site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic3 délété et ladite souche mutante comprenant un gène codant pour la protéine GRA15II, ainsi que les moyens nécessaires à l'expression de ladite protéine, au locus dudit gène ropl6I délété, ledit gène codant pour la protéine GRA15II au locus dudit gène ropl6I délété, étant flanqué en amont par le susdit site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique au locus dudit gène ropl6I délété, notamment dans laquelle ladite enzyme permettant une recombinaison spécifique est, la Cre-recombinase, et ledit site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique au locus dudit gène ropl6I délété, est un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase choisi parmi les sites suivants : lox N SEQ ID NO :5, lox P SEQ ID NO :12 et lox 2272 SEQ ID NO :68, 103 ce site de recombinaison spécifique étant différent des sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic/ délété et au locus du gène mic3 délété, ladite souche contenant trois sites de recombinaison spécifique qui sont respectivement : - le site A correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic/ délété le site B correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété, et - le site D correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus dudit gène ropl 61 délété en particulier tels que - ledit site A est le site lox N SEQ ID NO :5, ledit site B est le site lox P SEQ ID NO :12, - ledit site D est le site lox 2272 SEQ ID NO :68. 9. Souche mutante selon l'une des revendications 3, 5 à 8, dans laquelle ladite souche mutante est une souche mutante de Toxoplasma spp., ladite enzyme permettant une recombinaison spécifique est la Cre-recombinase, dans laquelle le gène rop16I est délété et ladite souche contient un site de recombinaison spécifique de la Crerecombinase, au locus dudit gène ropl6I délété, ladite souche contenant quatre sites de recombinaison spécifique qui sont respectivement: - le site A correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic/ délété - le site B correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété, et le site C correspondant audit second site de recombinaison spécifique qui flanque ledit ADN hétérologue identique audit premier site de recombinaison spécifique, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase correspondant au susdit site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic/ délété (site A) ou au susdit site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété (site B) le site D correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus dudit gène ropl 61 délété 104 tels que - ledit site A est le site lox N SEQ ID NO :5 ledit site B est le site lox P SEQ ID NO :12, - ledit site C est le site lox N SEQ ID NO :5, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant le site A, et ledit site D est le site lox 2272 SEQ ID NO :68; ou tels que ledit site A est le site lox N SEQ ID NO :5 ledit site B est le site lox P SEQ ID NO :12, ledit site C est le site lox P SEQ ID NO :12, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant le site B, et - ledit site D est le site lox 2272 SEQ ID NO :68. 10. Souche mutante selon l'une des revendications 1 à 3, 5 à 9, dans laquelle ledit ADN hétérologue code pour un antigène hétérologue immunogène de virus, de parasite ou de bactérie, et est en particulier constitué de la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 173, codant pour l'antigène du virus Influenza SEQ ID NO: 167. 11. Souche mutante selon l'une des revendications 3 à 10, dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Toxoplasma gondii choisi parmi une souche dans laquelle o le gène mic/ et le gène mic3 sont délétés et dans laquelle le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic/ délété est le site lox N SEQ ID NO : 5 et o le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété est le site lox P SEQ ID NO: 12. - une souche dans laquelle le gène mic /, le gène mic 3 et le gène ropl 61 sont délétés, et comprenant un gène codant pour la protéine GRA15II, ainsi que les moyens nécessaires à l'expression de ladite protéine, au locus dudit gène ropl6Idélété, ledit gène codant pour la protéine GRA15II au locus dudit gène ropl6I délété, étant flanqué en amont par un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, dans laquelle 105 o le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic/ délété est le site lox N SEQ ID NO : 5, et o le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété est le site lox P SEQ ID NO : 12, et o ledit site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase qui flanque en amont ledit gène codant pour la protéine GRA15II au locus du gène ropl6I délété, est le site lox 2272 SEQ ID NO :68. 12. Souche mutante selon l'une des revendications 2 ou 4, dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Neospora caninum et dans laquelle le gène mic/ et le gène mic3 sont délétés et dans laquelle - le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic/ délété est le site lox P SEQ ID NO : 12 et - le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété est le site lox N SEQ ID NO : 5. 13. Utilisation in vitro d'une souche mutante selon l'une des revendications 1 à 4 et 12, ne contenant pas d'ADN hétérologue différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés, pour l'insertion ciblée d'un ADN hétérologue. 14. Souche mutante de Sarcocystidae selon l'une des revendications 1 à 12, pour son utilisation comme médicament, en particulier comme vaccin ou immunostimulant. 15. Souche mutante de Toxoplasma spp., dans laquelle les gènes micl , mic3 et ropl 61 sont délétés, contenant trois sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés, le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic/ délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété et le site de recombinaison spécifique au locus du gène ropl 6I délété étant différent des sites de recombinaison spécifique situés aux loci des gènes mic/ et mic3 délétés et ladite souche contenant un ADN hétérologue au locus du gène mic/ délété ou au locus du gène mic3 délété ou au locus du gène ropl 6I délété, ledit ADN hétérologue étant différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de 106 recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des gènes micl, mic3 et ropl 61 délétés, de telle façon que : - lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic/ délété, il est flanqué : - d'un premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic/ délété (site A), et d'un second site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase (site C), identique au premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase situé au locus du gène mic/ délété (site A), - lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic3 délété, il est flanqué : - d'un premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic3 délété (site B), et d'un second site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase (site C), identique au premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase situé au locus du gène mic3 (site B) délété, o lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène ropl6I délété, il est flanqué : - d'un premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène ropl6I délété (site D), et - d'un second site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase (site C), identique au premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase situé au locus du gène rop16I (site D) délété, ladite souche comportant les éléments nécessaires à la transcription dudit ADN hétérologue, ou les moyens nécessaires à l'expression dudit ADN hétérologue lorsque ledit ADN hétérologue code pour au moins une protéine, 107 ladite souche mutante contenant alors quatre sites de recombinaison spécifique de la Crerecombinase définis de la manière suivante : - le site A correspondant audit site de recombinaison spécifique de la Crerecombinase au locus du gène mic/ délété le site B correspondant audit site de recombinaison spécifique de la Crerecombinase au locus du gène mic3 délété, et - le site C correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic/ délété (site A) lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic/ délété ou correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété (site B) lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic3 délété, ou correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène ropl6I délété (site D) lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène rop161 délété le site D correspondant audit site de recombinaison spécifique de la Crerecombinase au locus dudit gène ropl 61 délété tels que, lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène mici délété, - ledit site A correspond à un site lox N, SEQ ID NO : 5 ledit site B correspond à un site lox P, SEQ ID NO : 12 - ledit site C correspond à un site lox N, SEQ lD NO : 5 - ledit site D correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68; ou tels que lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic3 délété, ledit site A correspond à un site lox N, SEQ ID NO : 5 ledit site B correspond à un site lox P, SEQ ID NO: 12 ledit site C correspond à un site lox P, SEQ ID NO: 12 - ledit site D correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68; ou tels que lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène ropl6Idélété, - ledit site A correspond à un site lox N, SEQ ID NO : 5 ledit site B correspond à un site lox P, SEQ ID NO : 12 - ledit site C correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68 - ledit site D correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68.