Brevet FR3070126A1 — publié le 20190222

EXTRAIT DE PSEUDOTSUGA MENZIESII, PROCEDE D'OBTENTION ET UTILISATIONS La présente invention se rapporte à un procédé d'extraction de molécules à partir d'une matière première dérivée de Pseudotsuga menziesii qui permet d'extraire à la fois au moins une molécule lipophile et au moins un composé polyphénolique . Le procédé permet d'obtenir dans une première phase, un concentrat qui contient au moins molécule lipophile et au moins un composé polyphénolique qui fait également l'objet de l'invention, puis la séparation des molécules d'intérêt conduit à l'obtention d'au moins un extrait de Pseudotsuga menziesii comprenant au moins une molécule lipophile et d'au moins un extrait de Pseudotsuga menziesii comprenant au moins un composé polyphénolique. Ces extraits font également l'objet de la présente invention, ainsi que leurs utilisations. Les extraits d'origine végétale sont de plus en plus utilisés dans l'industrie, spécialement dans les domaines médical, cosmétique et des compléments alimentaires. Parmi les matières premières utilisées, les plantes et fleurs ont été longtemps utilisées, mais plus récemment les recherches ont porté sur des produits dérivés des arbres, notamment des extraits de pins qui contiennent des molécules d'intérêts comme des polyphénols. C'est le cas en particulier de Pseudotsuga menziesii. Pseudotsuga menziesii également connu sous le nom de sapin de Douglas ou de Pin d'Oregon ou Pseudotsuga douglasii Carr ou Pseudotsuga taxifolia ou British Columbia Pine, est un arbre originaire de la zone occidentale du continent nord-américain. Découvert en 1792 par A. MENZIES, il a été importé en Europe en 1827, grâce à Sir D. DOUGLAS botaniste écossais. Sa première apparition en France date de 1842 où il a, d'abord, été installé dans des parcs. Depuis 1960, dans le cadre de la politique de reboisement engagée par l'Etat avec l'appui du Fonds Forestier National (créé en 1946), le Douglas a progressivement supplanté l'Epicéa, au point de devenir aujourd'hui la première essence de reboisement du territoire national. De ce fait, la France est le pays européen disposant de la ressource la plus importante en Douglas. II occupe aujourd'hui, une surface de 420 000 ha. Cinq territoires concentrent à elles seules plus de 70 % des peuplements de Douglas : la Nouvelle Aquitaine (Limousin), la Bourgogne- 2 Franche-Comté (Bourgogne), l'Auvergne-Rhône-Alpes (Auvergne), la Bretagne, le Rhône-Alpes et l'Occitanie (Midi-Pyrénées). Les résidus de bois, tels que les écorces, sont principalement exploités à des fins énergétiques. Néanmoins, le sapin de Douglas et notamment son écorce, est relativement riche en cires, en fibres, 5 en composés polyphénoliques incluant des lignanes, des flavonoïdes dont des flavonols tels que Quercetine / Dihydroquercetine (Taxifoline), des tanins condensés (J.F Hall, 1971; Kiehlmann et Li, 1995 ; Trivaleto et al. 2016). Cela en fait une matière première économiquement attrayante en raison des composés bioactifs qu'elle contient. Plus récemment, une étude plus complète sur la composition des écorces de Douglas a été 10 réalisée (Ferreira et al. 2015; Ferreira et al. 2016). Ces publications révèlent pour les écorces, un taux de cendre de 5.9% avec une majorité de Calcium et de Potassium ; une forte proportion de lignine (29.5%) et de subérine (22%) ainsi que de nombreux extractibles (divers polyphénols incluant des lignanes, des flavonoïdes (flavonols, tannins condensés...), des triterpènes, des phytostérols, des dérivés d'acide ferrulique, des acides gras et alcools gras 15 estérifiés...). Les polysaccharides des écorces de Douglas, sont majoritairement composés de glucose. Actuellement aucun procédé adapté n'existe pour l'extraction simultanée de ces molécules. En effet, les peu de procédés décrits dans l'art antérieur ne sont pas performants, ils sont difficilement industrialisables et ne permettent de valoriser qu'une partie des molécules 20 contenues dans la matière première, soit les polyphénols, soit les molécules lipophiles. C'est le cas par exemple du procédé décrit dans la demande US3131198 qui décrit un procédé d'extraction aqueuse de Taxifoline à partir d'écorces de Douglas et d'un procédé de purification à l'aide d'acétate de pentyle, et du procédé décrit dans la demande US3789058 qui décrit un procédé d'extraction de cires à partir d'écorces de Douglas à l'aide d'un mélange 25 d'alcanes dérivés de la pétrochimie. Ces procédés ne répondent pas aux critères de l'éco- extraction. Un objectif de l'invention est donc de pallier les inconvénients de l'art antérieur et de proposer un procédé efficace en terme de rendement, réalisable à l'échelle industrielle et respectueux de l'environnement, qui permet l'extraction simultanée d'une majorité des molécules d'intérêts contenues dans les produits dérivés de Pseudotsuga menziesii, de façon à pouvoir valoriser au maximum des coproduits de la filière. A cet effet l'invention vise un procédé d'extraction simultanée d'au moins une molécule lipophile et d'au moins un composé polyphénolique de Pseudotsuga menziesii, comprenant 3 au moins une étape d'extraction par percolation diffusion d'un solvant sous pression en réacteur lit fixe réalisée à partir d'une matière première dérivée de Pseudotsuga menziesii. Avantageusement, l'invention permet d'obtenir avec un seul et même procédé, l'extraction de molécules lipophiles et d'au moins un composé polyphénolique. 5 La mise en oeuvre du procédé selon l'invention permet d'obtenir un produit intermédiaire, un concentrat, qui comprend à la fois au moins une molécule lipophile et au moins un composé polyphénolique. La séparation des différentes phases de ce concentrat permet d'obtenir d'une part un extrait insoluble entre 2 et 8°C comprenant au moins une molécule lipophile et d'autre part un extrait soluble entre 2 et 8°C comprenant au moins un composé 10 polyphénolique. Le concentrat et les extraits font également l'objet de l'invention. Avantageusement, le procédé selon l'invention permet d'utiliser l'ensemble de la matière première, sans générer de co-produits non valorisables ou de déchets. Enfin, les extraits obtenus selon l'invention présentent des propriétés, en particulier : - L'extrait insoluble présente des propriétés physiques (hydrophobe ; texturant, 15 température de fusion comprise entre 63 et 65 °C; co-émulsifiant) et biologiques et peut donc être utilisé dans des compositions cosmétiques, ou produits d'entretien et/ou de nettoyage. - L'extrait soluble présente des propriétés antioxydantes, anti-inflammatoires et/ou antimicrobiennes, et peut donc être utilisé dans des compositions 20 cosmétiques, compléments alimentaires, compositions alimentaires ou produits de nettoyage. Par conséquent, l'invention a également pour objet ces utilisations. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront de la description en détails qui va suivre en regard des figures annexées sur lesquelles : 25 - La figure 1 est un histogramme représentant la cytotoxicité mesurée en fonction de la dilution d'un extrait soluble selon l'invention dans le milieu de culture des cellules, - La figure 2 est un histogramme représentant l'activité anti-inflammatoire d'un extrait soluble selon l'invention, mesurée en présence de LPS pour les dilutions 30 considérées comme non cytotoxiques. 4 DEFINITIONS Par « matière première dérivée de Pseudotsuga menziesii » au sens de l'invention on entend toute matière première issue de tout ou partie de l'arbre Pseudotsuga menziesii, notamment des écorces, des noeuds, des plaquettes, des souches, des racines et/ou des sciures. 5 Par « agro-solvant » au sens de l'invention on entend un solvant produit à partir de biomasses issues de l'agriculture. Par «extrait insoluble » ou « extrait insoluble entre 2 et 8°C » au sens de l'invention, on entend un extrait obtenu à partir d'une matière première dérivée de Pseudotsuga menziesii, insoluble dans le solvant d'extraction entre + 2 et + 8°C. 10 Par «extrait soluble » ou « extrait soluble entre 2 et 8°C » au sens de l'invention, on entend un extrait obtenu à partir d'une matière première dérivée de Pseudotsuga menziesii, soluble dans le solvant d'extraction entre +2 et +8°C. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION L'invention a donc pour objet un procédé d'extraction simultanée d'au moins une molécule 15 lipophile et d'au moins un composé polyphénolique de Pseudotsuga menziesii, comprenant au moins une étape d'extraction par percolation diffusion d'un solvant sous pression en réacteur lit fixe, réalisée à partir d'une matière première dérivée de Pseudotsuga menziesii. La matière première dérivée de Pseudotsuga menziesii est préférentiellement choisie parmi les écorces, noeuds, plaquettes, souches, racines et/ou sciures de Pseudotsuga menziesii. Elle 20 est collectée notamment au niveau de scieries, généralement après traitement des arbres abattus, de façon à pouvoir être assuré de sa qualité et de sa traçabilité. Préférentiellement, la matière première est issue de forêts et de scieries certifiées PEFC. De même, la matière première peut éventuellement être sélectionnée selon des caractéristiques particulières des arbres (comme l'âge des plantations, l'altitude des 25 plantations, la période d'abattage, etc...) identiques ou similaires pour assurer une meilleure reproductibilité des extraits obtenus. De façon préférée, la matière première dérivée de Pseudotsuga menziesii récoltée est séchée et/ou broyée. Le séchage permet de limiter la dégradation de la matière première et facilite le broyage. Le broyage est réalisé pour obtenir des particules de taille préférentiellement 30 comprise entre 0,05 et 10mm. Selon un mode de réalisation, entre 20 et 40% en poids des 5 particules ont une taille comprise entre 2 et 10 mm et entre 60 et 80% en poids des particules ont une taille comprise entre 0,05 et 2mm. La matière première, si elle n'est pas utilisée immédiatement après récolte et/ou séchage et/ou broyage, est préférentiellement entreposée dans un endroit sec. 5 La percolation sous pression en réacteur à lit fixe avec un solvant est une étape essentielle de procédé selon l'invention, car elle permet d'extraire à la fois les molécules lipophiles et des composés polyphénoliques contenus dans la matière première. Préférentiellement, l'extraction par percolation sous pression en réacteur à lit fixe est réalisée avec un solvant choisi parmi les solvants produits à partir de biomasses d'origine végétale, à savoir des agro- 10 solvants, des bio-solvants ou des solvants verts. Ce solvant peut notamment être choisi parmi le 2-methyltetrahydrofurane, l'acétate d'éthyle, le bio éthanol, l'eau et leurs mélanges. Selon un mode de réalisation particulièrement adapté, il s'agit du 2-methyltetrahydrofurane. La percolation diffusion du solvant sous pression en réacteur lit fixe peut être réalisée en mode dynamique ou en mode statique. Préférentiellement elle est réalisée à une pression comprise 15 entre 1 et 100 bars, encore plus préférentiellement entre 1 et 10 bars. La durée d'un procédé d'extraction est de 3 à 7h pour traiter 500kg de matière première, cette durée peut varier en fonction du diamètre de la cuve, du débit, du solvant et de la matière première. L'étape de percolation diffusion du solvant est préférentiellement suivie par une étape d'évaporation du solvant pour récupérer un concentrat comprenant au moins une molécule 20 lipophile et au moins un composé polyphénolique. Cette évaporation est réalisée préférentiellement par un système d'évaporation sous pression réduite et/ou température contrôlées. Le concentrat peut ensuite subir une winterisation, en particulier à des températures comprises entre 2 et 8°C. Cette étape permet de rendre insolubles les alcools gras, les acides 25 gras dont les longueurs de chaînes hydrogénocarbonées sont 22 atomes de carbones. Les constituants du concentrat peuvent ensuite être séparés en particulier sur la base de leur différence de solubilité à des températures comprises entre 2 et 8°C. Cette étape de séparation peut être réalisée par centrifugation. Elle conduit préférentiellement à l'obtention : 30 - d'une fraction liquide, soluble entre 2 et 8°C, comprenant des composés polyphénoliques et des molécules lipophiles de masses moléculaires inférieures à 600 Daltons comme des phytostérols ; cette fraction liquide peut 6 éventuellement être séchée, par exemple par lyophilisation ou atomisation ; et - d'une fraction solide, insoluble entre 2 et 8°C, comprenant des composés lipophiles incluant des acides gras et des alcools gras dont les longueurs de 5 chaînes hydrogénocarbonées sont 22 atomes de carbones. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le procédé comprend la mise en oeuvre des étapes suivantes : séchage et/ou broyage de la matière première dérivée de Pseudotsuga menziesii, extraction par percolation diffusion d'un solvant sous pression en réacteur à lit fixe, 10 évaporation du solvant pour récupérer un concentrat comprenant au moins une molécule lipophile et au moins un composé polyphénolique, winterisation du concentrat à des températures comprises entre 2 et 8°C, séparation des constituants du concentrat sur la base de leur différence de solubilité à des températures comprises en 2 et 8°C. 15 Le procédé selon l'invention comprend également préférentiellement une étape de recyclage du solvant d'extraction. De même la matière première épuisée en extractibles d'intérêts peut être utilisée comme combustible. Ainsi, le procédé selon l'invention limite la production de déchets. Le concentrat obtenu lors de la mise en oeuvre du procédé constitue également un objet de 20 l'invention. En particulier l'invention vise un concentrat obtenu à partir de matière première dérivée de Pseudotsuga menziesii, constitué par : au moins une molécule choisie parmi les polyphénols et/ou au moins un composé lipophile de masse moléculaire inférieure à 600 Da au moins une molécule lipophile choisie parmi les alcools gras et les acides gras à 25 longues chaînes ainsi que leurs esters. Préférentiellement le concentrat est obtenu au cours de la mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention. L'invention a également pour objet les extraits obtenus par la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. Ces extraits sont non dénaturés, biodégradables et sans contaminants. 30 Un premier extrait visé par l'invention est un extrait de Pseudotsuga menziesii soluble entre 2 et 8°C. Il comprend préférentiellement au moins une molécule choisie parmi les polyphénols 7 et au moins un composé lipophile de masse moléculaire inférieure à 600 Da notamment choisi parmi les phytostérols, encore plus préférentiellement, il comprend des polyphénols et des phytostérols. Parmi les polyphénols, l'extrait comprend préférentiellement au moins des polyphénols et préférentiellement au moins des flavonoïdes, en particulier des dihydrofavanol 5 et notamment de la Taxifoline (ou dihydroquercétine). Ledit extrait peut comprendre en particulier entre 5 et 15 grammes de polyphénols totaux pour 100 grammes de matière première initiale sèche. Selon un mode de réalisation particulièrement adapté, il comprend entre 1 et 6 grammes de dihydroflavonol pour 100 grammes de matière première initiale sèche et/ou entre 4 à 150mg de phytostérols pour 100 10 grammes de matière première initiale sèche. Préférentiellement, il comprend au moins 1g de taxifoline pour 100 grammes de matière première initiale sèche. L'extrait soluble selon l'invention comprend préférentiellement au moins une des molécules mentionnées dans le Tableau 1 ci-dessous, ou un mélange de plusieurs de ces molécules, et peut éventuellement toutes les contenir : 8 Composés identifies Numéro CAS Polyphénols Flavonoïdes - sous famille dihydroflavonol Taxifoline (dihydroquercetine) *' 480-18-2 Lignanes Matairésinol ou isomère * 580-72-3 Pinorésinol * 487-36-5 Phénols et Dérivés Phloroglucinol 108-73-6 Pheno1,3,4-dimethoxy 2033-89-8 1,3-benzenedio1,4-propyl 18979-60-7 Benzenepropano1,4-hydroxy-3-nnethoxy 2305-13-7 Acides et Aldéhydes aromatiques et Dérivés Vanilline 121-33-5 Acide vanilique 121-34-6 Acide isovanilique 645-08-9 Terpènes et Dérivés Alpha-pinène 80-56-8 Alpha-terpineol 98-55-5 Acide dehydroabiétique 1740-19-8 Acide abiétique 514-10-3 Phytostérols et Dérivés Stignnast-5-en-3-ol,oleate Non trouvé Ergost-5-en-3-ol,(3 beta)- 474-62-4 Beta sitosterol * 83-46-5 4-cannpestene-3-one 51014-22-3 Stignnast-4-en-3-one 1058-61-3 Gamma-sitostenone 84924-96-9 Acides Gras et Dérivés Acide azelaique 123-99-9 Acide n-hexadecanoique * 57-10-3 Acide linoleique 60-33-3 Acide oleique 112-80-1 Acide stéarique 57-11-4 Acide docosanoique 112-85-6 Acide tetracosanoique 557-59-5 Cis-acide vaccenique 506-17-2 Alcools Gras et Dérivés Tetracosanol 506-51-4 Alcool béhénique 661-19-8 Oses et Dérivés Beta-D-glucopyranose,1,6-anhydro- 498-07-7 Esters et dérivés Ester ethylique de l'acide docosanoique 5908-87-2 Ester ethylique de l'acide tetracosanoique 24634-95-5 Ferrulate-C22 * Non trouvé Ferrulate -C24 * Non trouvé Autres Bicyclo[3.1.1]hept-2-ene-2-carboxylic acid 19250-17-0 Tableau 1 * : Composé majoritaire dans les extraits : Composé quantifié par HPLC 9 L'extrait soluble peut être utilisé en l'état ou enrichi. A titre d'exemple, un enrichissement en Taxifoline est réalisable par filtration délipidante (par exemple en utilisant le filtre Zeta Plus - 3M) et/ou par adsorption sur résine macroporeuse (par exemple en utilisant de la résine FPX 66 ou XAD 16 HP). 5 Un autre extrait visé par l'invention est un extrait de Pseudotsuga menziesii insoluble entre 2 et 8°C. Il comprend préférentiellement au moins une molécule choisie parmi les alcools gras, les acides gras dont les longueurs de chaînes hydrogénocarbonées sont supérieures ou égales à 22 atomes de carbones et leurs esters (notamment des cires possédant un nombre de carbones supérieur ou égal à 40). 10 Le dit extrait insoluble peut comprendre en particulier entre 0,1 et 7 grammes d'alcools gras et/ou acides gras à longues chaînes et/ou leurs esters pour 100 grammes de matière première initiale sèche. L'extrait insoluble selon l'invention comprend préférentiellement au moins une des molécules mentionnées dans le Tableau 2 ci-dessous, ou un mélange de plusieurs de ces molécules, et 15 peut éventuellement toutes les contenir : 10 Composés identifiés Numéro CAS Acides Gras et Dérivés Mono-Acides Gras et Dérivés acide hexadécanoïque 57-10-3 acide hexadécanoïque-14 méthyl 2490-49-5 acide octadécanoïque (C18) 57-11-4 acide octadécadiénoïque (C18-2) 60-33-3 acide octadécénoïque (C18-1) 112-80-1 acide nonadécandque 646-30-0 acide methy1-18-methylnonadécanoic Non trouvé acide docosanoïque * 112-85-6 acid tricosanoïque 2433-96-7 acide tétracosanoïque * 557-59-5 acide pentacosanoïque 506-38-7 acide hexacosanoïque * 506-46-7 acide octacosanoïque 506-48-9 Di-Acides Gras et Dérivés acide hexadecanédioïque 505-54-4 acide octanedioïque 505-48-6 acide eicosanedioïque 42235-38-1 acide docosanedioïque 505-56-6 Alcools Gras et Dérivés docosanol * 661-19-8 tetracosanol * 506-51-4 Alcanes et Dérivés Heneicosane 629-94-7 Phytostérols et Dérivés beta sitosterol 83-46-5 Stigmastanol 83-45-4 stigmast-4-en-3one 1058-61-3 Tableau 2 * : Composé majoritaire dans les extraits L'extrait insoluble peut comprendre une fraction cires qui est constituée d'esters d'acides et 5 d'alcools gras dont les tailles sont comprises entre 40 et 50 atomes de carbone. Parmi ces différents esters 15 moles pour 100 moles ont une chaine carbonée inférieure ou égale à 42 atomes de carbone, 74 moles pour 100 moles ont une chaine carbonée composé de 44 à 46 atomes de carbone et 11 moles pour 100 moles ont une chaine carbonée supérieure ou égale à 48 atomes de carbone (proportion réalisée à partir d'un seul extrait). 10 Les extraits selon l'invention présentent de nombreuses efficacités qui permettent leur utilisation dans différents domaines. En particulier : 11 - L'extrait insoluble présente des propriétés physiques (hydrophobe ; texturant, température de fusion comprise entre 63 et 65 °C ; co-émulsifiant) et biologiques et peut donc être utilisé dans des compositions cosmétiques, ou produits d'entretien et/ou de nettoyage. 5 - L'extrait soluble présente des propriétés antioxydantes, anti-inflammatoires et/ou antimicrobiennes, et peut donc être utilisé dans des compositions cosmétiques, compléments alimentaires, compositions alimentaires ou produits de nettoyage. L'invention a donc également pour objet un extrait selon l'invention pour son utilisation 10 comme médicament, ainsi que l'utilisation d'un extrait selon l'invention dans des compositions cosmétiques, des compléments alimentaires ou des produits de nettoyage. Avantageusement, le procédé selon l'invention permet de valoriser des coproduits à faible valeur ajoutée, en développant des produits efficaces et utilisables pour différents secteurs. En effet, les dérivés du sapin de Douglas produits par l'exploitation du bois en scierie ont 15 initialement une faible valeur ajoutée, et sont principalement utilisés comme sources d'énergie combustibles. De plus le procédé selon l'invention est un éco-procédé d'extraction, c'est-à-dire un procédé vert respectueux de l'environnement, car il minimise le nombre d'étapes et les consommations énergétiques et utilise préférentiellement des solvants verts. De plus, le procédé selon l'invention peut permettre de favoriser la création de co-produits au 20 lieu de déchets pour intégrer la voie de la bio- ou agro-raffinerie. De plus l'extraction simultanée des molécules d'intérêt permet de réduite les opérations unitaires à mettre en oeuvre. Le procédé selon l'invention est un procédé sûr, robuste et contrôlé. L'invention est à présent illustrée par des exemples de procédé selon l'invention, et par des 25 résultats d'essais démontrant l'efficacité des extraits obtenus ainsi que des résultats d'essais comparatifs. EXEMPLES Pour l'analyse des extraits selon l'invention, les méthodes analytiques suivantes peuvent être utilisées. Ce sont ces méthodes qui ont été utilisées dans les exemples : 12 Dosage Méthode analytiques Polyphénols totaux Dosage colorimétrique par la méthode de Folin-Ciocalteu (Singleton and Rossi, 1965) Lecteur micro plaques FLUOstar OMEGA BMG LABTECH (765nm) Tannins condenses Dosage colorimétrique à la Vanilline/HCI (Broadhurst and Jones 1978). Spectrophotomètre UV/VIS Lambda 25 PerkinElmer (500nm) Proanthocyanidines Dosage colorimétrique Butanol/HCI (Scalbert et al. 1989) Spectrophotomètre UV/VIS Lambda 25 PerkinElmer (530nm) Taxifoline Identification : système HPLC-MS-MS [ pompe Shimadzu LC 10 ADvp avec un auto-injecteur SIL-Ht, four CTO-10ASvp, colonne Atlantis T3 (150 x 2,1mm i.d, 5u.m) (Waters). La détection est effectuée par un spectromètre de masse hybride triple quadrupole / trappe d'ions linéaire 4000 QTRAP® (Applied Biosystems) équipé d'une source d'ionisation Electrospray Turbo Ion Spray (ESI) et contrôlé par le logiciel Analyst 1.5 (Applied Biosystems) Quantification : par LC-DAD (Schimadzu LC-20AD/T LPGE KIT couplée SPD-M20A IVDD avec un colonne Luna 51.J. C18 100A 250x4.6mm Phénomenex ) Beta-sitostérol - CPG/MS : Matairésinol/pinorésinol Shimadzu GCMS-QP2010 SE Colonne Phenomenex ZB5 HT (25 m x 0.25 mm). Injection en mode SPLIT, rapport de division = 20, gradient de T°C 60 à 340 °C à 8°C/min Identification de CPG/MS : composés/ fraction soluble Shimadzu GCMS-QP2010 SE à 4°C Colonne Phenomenex ZB5 HT (25 m x 0.25 mm). Injection en mode SPLIT, rapport de division = 20, gradient de T°C 60 à 340 °C à 8°C/min Identification de CPG/MS : composés/fraction Shimadzu GCMS-QP2010 SE insoluble à 4°C Colonne pour analyse composition de la fraction insoluble à +4°C, après saponification et estérification : Colonne Phenomenex ZB5 HT (25 m x 0.25 mm). Composition des cires Chromatographie en Phase Gazeuse - FID Point de Fusion Stuart SMP3 (le gradient de T°C est fixé à 3°C/min à partir de 30°C) Tableau 3 13 Exemples de procédé et extraits obtenus Les exemples ont été réalisés à partir d'écorces de bois de Douglas. Le procédé mis en oeuvre est le suivant : - un procédé : réacteur type à lit fixe sous pression (100 bars) en mode statique 5 (ASE 350 - Accelerated Solvent Extractor System, Thermo Scientific Dionex), - un solvant : le 2-methyltetrahydrofurane (les volumes par extraits sont contrôlés automatiquement par l'ASE 350 et varient en fonction du nombre de cycles, du pourcentage de rinçage par cycle...) , - Quantité de Matière Première par cellules ASE 22m1: 5 à 12 grammes. 10 Un plan d'expérience a été mis en place. Le principe des plans d'expériences est de faire varier simultanément les niveaux (modalités) d'un ou plusieurs facteurs à chaque essai. Le nombre de facteurs à tester et leurs modalités permettent de définir le nombre et la nature des expériences à réaliser et ainsi de générer un domaine expérimental qu'il convient d'explorer à la fois uniformément et économiquement. 15 Le plan d'expériences qui a été utilisé est de type en carré hyper gréco-latin à 5 Facteurs et 4 Modalités par facteur (Tableau 4) : Granulométrie % Rinçage Température Temps/cycle de solvant d'extraction d'extraction par cycle Nombre de cycles FACTEURS de la Matière d'extraction d'extraction Première Modalité 1 0,5-1mm 70°C 5min 10% Modalité 2 1-2mm 50°C 7min 20% Modalité 3 2-5mm 80°C 9min 40% Modalité 4 Brut ( 5 3.25g/100g ; [béta-sitostérol] > 21 mg/100g...), on obtient un sous ensemble de 6 16 combinaisons du domaine expérimental qui sont censées répondre aux critères d'optimisation du procédé. Les 6 combinaisons testées pour valider le plan d'expériences sont présentées ci-dessous : Référence de l'essai de validation Granulométrie Température Temps/cycle %Rinçage/cycle Nombre de cycles E0558 2000-5000ktm 70°C 9 min 60 5 E0798 Brut 70°C 7 min 60 E0814 Brut 70°C 9 min 60 E0926 Brut 80°C 7 min 60 E0942 Brut 80°C 9 min 60 E1006 Brut 90°C 9 min 60 5 Tableau 7 5 Chacun de ces 6 essais de validation est réalisé et les performances sont évaluées par la mesure des réponses telles que : teneur en fraction insoluble entre 2 et 8 °C (Winterisation) ; teneur en polyphénols totaux (Folin); teneur en tannins condensés (test à la vanilline); teneur en Taxifoline (HPLC) ; teneur en B-sitostérol (CPG), activité anti-oxydante (test DPPH - test décrit dans la partie EFFET DES EXTRAITS OBTENUS). 10 Les résultats sont présentés ci-dessous : 17 Référenc e essai de validatio n Fraction Polyphénol s totaux en Tannins Condensés Taxifolin 13- Activité antioxydante (DPPH) en g eq. Ac. Ascorbique/100 g de MP insoluble à g éq. Ac. en g éq. e en sitostérol en 4°C (Cires...) en g /100g de MP Gallique Catéchine g/100g de MP mg/100 g de MP /100g de /100g de MP MP E0558 1,590 5,698 0,592 4,086 41,220 4,892 E0798 1,410 5,730 1,157 3,431 51,140 5,262 E0814 1,967 6,361 1,402 3,539 29,890 5,630 E0926 1,610 6,184 1,133 4,040 27,590 5,425 E0942 1,780 6,927 1,099 3,655 66,440 5,715 E1006 2,247 6,566 1,081 4,173 28,490 5,438 Tableau 8 Une caractérisation de la fraction soluble entre 2 et 8°C a été réalisée par HPLC et CPG sur l'échantillon E0814,Ies molécules listées ci-après y ont été identifiées : Taxifoline, Matairésinol, Pinorésinol, Phloroglucinol, Pheno1,3,4-dimethoxy, 1,3-benzenedio1,4-propyl, 5 Acide vanilique, Alpha-pinène, Acide dehydroabiétique, Stigmast-5-en-3-ol,oleate ; Ergost-5- en-3-ol,(3 beta)-; Beta sitosterol ; 4-campestene-3-one, Stigmast-4-en-3-one, Acide azelaique, Acide n-hexadecanoique, Acide linoleique, Acide stéarique, Acide tetracosanoique, Cis-acide vaccenique, Tetracosanol, Alcool béhénique, Ester ethylique de l'acide docosanoique, Ferrulate-C22, Ferrulate -C24. 10 Une caractérisation de la fraction insoluble entre 2 et 8°C a été réalisée par CPG sur l'échantillon E0814,Ies molécules listées ci-après y ont été identifiées : Acide hexadécanoïque, Acide hexadécanoïque-14 méthyl, Acide octadécanoïque (C18), Acide octadécadiénoïque (C18-2), Acide octadécénoïque (C18-1), Acide nonadécandque, Acide methy1-18- methylnonadécanoic, Acide docosanoïque, Acide tricosanoïque, Acide tétracosanoïque, Acide 15 pentacosanoïque, Acide hexacosanoïque, Acide octacosanoïque, Acide hexadecanédioïque, Docosanol , Tetracosanol , Heneicosane, Beta sitosterol, Stigmastanol, Stigmast-4-en-3one 18 Une caractérisation de la longueur des chaines carbonées des cires de la fraction insoluble entre 2 et 8°C a été réalisée sur l'échantillon E0814, les résultats sont présentés dans le tableau 9 ci-après : Longueur de la chaine Proportion en mole/ 100 moles carbonée C 40 6 C 42 9 C 44 26,5 C 46 47,2 C 48 9,1 C 50 2 Tableau 9 5 De plus, une analyse de la teneur en certaines molécules et l'activité biologique dans plusieurs extraits obtenus selon le procédé de l'invention avec différents solvants a été réalisée. Les concentrations minimales pouvant être retrouvées dans ces extraits sont présentées dans le tableau ci-dessous : Solvant extraction Fraction insoluble 4°C (Cires...) Polyphénols totaux Tannins Condensés Taxifoline 3- Activité antioxyda nte (DPPH) en g/100g d'extrait sec en g éq. Acide Gallique /100g d'extrait sec en g éq. Catéchine /100g d'extrait sec en g sitostérol en g /100g d'extrait sec en g /100g d'extrait sec eq. Acide Ascorbiq ue en g /100g d'extrait sec 2-Méthyl 10 à PA 30 20 20 0,5 30 tetrahydrofurane 40 à 100 bars Acétate d'éthyle 6 20 Bio-éthanol 20 10 Tableau 10 19 EFFETS DES EXTRAITS OBTENUS Des essais ont été menés pour démontrer l'efficacité des extraits obtenus selon l'invention. Ces essais ont porté sur les mesures suivantes : - Mesure de l'activité antioxydante 5 - Mesure de cytotoxicité - Mesure de l'activité anti-inflammatoire - Mesure de l'activité antibactérienne Test d'évaluation de l'activité Antioxydante : Test DPPH, 2,2-DIPHENYL-1-PICRYLHYDRAZYL L'activité antioxydante des extraits est évaluée en mesurant sa capacité à piéger le radical 10 libre DPPH. La réduction du DPPH se traduit par un changement de couleur de la solution qui passe du violet au jaune, entrainant ainsi une diminution de son absorbance à 517 nm. Par conséquent, plus cette diminution d'absorbance est importante, plus l'activité antioxydante de la solution mise en jeu est élevée. L'activité antioxydante peut être exprimée en concentration équivalente d'un composé antioxydant de référence (vitamine C, acide 15 chlorogénique...). La réaction mise en jeu est la suivante : Z + AH ZH + A' Avec : AH = composés polyphénoliques et Z.= DPPH (sous forme de radical libre) Evaluation de la cytotoxicité : Test MU (In vitro) 20 L'évaluation de la cytotoxicité des extraits a été réalisée par une mesure de la viabilité cellulaire grâce à la détermination de l'activité déshydrogénase mitochondriale. La cytotoxicité de principes actifs est évaluée par un test au MU (344,5-diméthylthiazol-2y1]- 2,5-diphényltétrazolium bromide) permettant une quantification rapide et sensible de la viabilité cellulaire HACAT (kératinocytes humains). Les sels de tétrazolium du réactif de MU 25 sont réduits, par des enzymes de type déshydrogénases mitochondriales, en cristaux insolubles violets de formazan. Les cristaux de formazan sont ensuite solubilisés par un solvant, le DMSO, et l'absorbance est mesurée par spectrophotométrie à 595 nm. La viabilité cellulaire est proportionnelle à l'activité enzymatique mitochondriale et par conséquent à la quantité de cristaux violets de formazan formés. 20 Evaluation de l'activité anti-inflammatoire : Dosage du NO (In vitro) L'estimation de l'activité anti-inflammatoire d'un extrait est basée sur sa capacité à réduire la production de monoxyde d'azote, NO, par des cellules RAW264.7 (macrophages murins) subissant une inflammation due au LPS (lipopolysaccharide). Le monoxyde d'azote produit est 5 dissous dans le milieu cellulaire sous la forme de nitrite NO2-. Cet ion est quantifié par une mesure d'absorbance à 535 nm, après ajout du réactif de Griess qui entraîne la formation d'une couleur rose en présence de NO2- (formation d'un sel de diazonium avec l'acide sulfanilique, qui donne une coloration rose avec a-naphthylamine). La quantité de NO2- est déterminée grâce à une gamme de nitrite de sodium NaNO2, elle est comparée au témoin 10 positif constitué par du L-nitroarginineméthylester (anti-inflammatoire) et au témoin négatif où il n'y a pas d'agent anti-inflammatoire. Evaluation de l'activité anti-bactérienne : L'estimation de l'activité antimicrobienne d'un extrait est basée sur sa capacité à inhiber la croissance d'une population microbienne (Staphylococcus oureus). L'extrait est mis en 15 présence d'une suspension de Staphylococcus oureus et incubé à 37°C pendant 24h, un suivi de la croissance bactérienne est effectué tout au long de ces 24h par mesure d'absorbance à 620nm. Si l'absorbance augmente au cours des 24h, il y a donc croissance de la suspension bactérienne ne révélant pas d'activité antimicrobienne, au contraire si l'absorbance n'évolue pas, l'extrait révèle une activité antimicrobienne. En parallèle de l'analyse, un témoin de 20 croissance de la souche est réalisé pour s'assurer de la bonne viabilité de la souche. Résultats obtenus Les résultats obtenus pour les extraits, ont été collectés. La teneur en polyphénols totaux a été déterminée par un dosage de Folin-Ciocalteu et exprimée en équivalent acide gallique. Les activités mesurées sont rapportées à une quantité 25 équivalente en polyphénols totaux présents dans l'extrait. Dans le Tableau 11 ci-après, il est indiqué la quantité en polyphénols totaux extraits à partir de 100g de matière première ainsi que l'activité antioxydante (exprimé en équivalent Vitamine C) et l'activité antimicrobienne mesurée envers Staphylococcus oureus qui sont associées. 21 Test Polyphénols totaux Activité antioxydante Antibactérien (Staph. Aureus) (g éq. Ac. Gallique (DPPH) (mg eq. Vitamine C/g de polyphénols) (Inhibition de croissance sur 24h à /100g de MP) partir de Xug de polyphénols/m1/500000 bactéries) Extrait selon 6,716 g 909,3 mg 630,4 'tg l'invention Tableau 11 De plus, parmi les polyphénols extraits, des tests d'activités anti-inflammatoires in vitro des extraits ont été réalisés tout en contrôlant leur cytotoxicité. Les résultats sont présentés sur les figures 1 et 2. La Figure 1 est un histogramme représentant la cytotoxicité mesurée en fonction de la dilution 5 de l'extrait dans le milieu de culture des cellules, et la Figure 2 est un histogramme représentant l'activité anti-inflammatoire mesurée en présence de LPS pour les dilutions considérées comme non cytotoxiques. Un effet cytotoxique notable ( REVENDICATIONS1. Procédé d'extraction simultanée d'au moins une molécule lipophile et d'au moins un composé polyphénolique de Pseudotsuga menziesii, comprenant au moins une étape d'extraction par percolation diffusion d'un solvant sous pression en réacteur à lit fixe, réalisée à partir d'une matière première dérivée de Pseudotsuga menziesii. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'extraction par percolation sous pression en réacteur à lit fixe est réalisée avec un solvant choisi parmi les solvants produits à partir de biomasses d'origine végétale. 3. Procédé selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que l'extraction par percolation diffusion sous pression en réacteur à lit fixe est réalisée avec un solvant choisi parmi le 2-methyltetrahydrofurane, l'acétate d'éthyle, l'éthanol, l'eau et leurs mélanges. 4. Procédé selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que la matière première dérivée de Pseudotsuga menziesii est constituée par des écorces, des noeuds, des plaquettes, des souches, des racines et/ou des sciures de Pseudotsuga menziesii. 5. Procédé selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que la matière première dérivée de Pseudotsuga menziesii est préalablement séchée et/ou broyée. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le broyage est réalisé pour obtenir des particules de taille comprise entre 0,05 et lOmm. 7. Procédé selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que la percolation diffusion du solvant sous pression en réacteur à lit fixe est réalisée en mode 20 dynamique ou en mode statique. 8. Procédé selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que la percolation diffusion du solvant sous pression en réacteur à lit fixe est réalisée à une pression comprise entre 1 et 100 bars. 9. Procédé selon l'une des précédentes revendications, caractérisée en ce qu'il comprend 25 la mise en oeuvre des étapes suivantes : séchage et/ou broyage de la matière première dérivée de Pseudotsuga menziesii, extraction par percolation diffusion d'un solvant sous pression en réacteur lit fixe, évaporation du solvant pour récupérer un concentrat comprenant au moins une molécule lipophile et au moins un composé polyphénolique, 30 winterisation du concentrat à des températures comprises entre 2 et 8°C, 30 séparation des constituants du concentrat sur la base de leur différence de solubilité à des températures comprises en 2 et 8°C. 10. Procédé selon la précédente revendication, caractérisé en ce que la séparation est réalisée par centrifugation. 5 11. Procédé selon l'une des revendications 9 ou 10, caractérisé en ce que la séparation est réalisée de façon à obtenir d'une part une fraction liquide, soluble entre 2 et 8°C, comprenant des composés de masses moléculaires inférieures à 600 Da et d'autre part une fraction solide, insoluble entre 2 et 8°C, comprenant des composés lipophiles majoritairement constituée par des alcools gras et des acides gras possédant des chaînes hydrogénocarbonées 10 de longueurs 22 atomes de carbones ainsi que de leurs esters. 12. Procédé selon la précédente revendication, caractérisé en ce que la fraction liquide est séchée. 13. Concentrat obtenu à partir de matière première dérivée de Pseudotsuga menziesii, constitué par : 15 au moins une molécule choisie parmi les polyphénols et/ou un composé lipophile de masse moléculaire inférieure à 600 Da au moins une molécule lipophile choisie parmi les alcools gras et les acides gras à longues chaînes ainsi que leurs esters. 14. Concentrat selon la précédente revendication, caractérisé en ce qu'il est obtenu au cours de la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une des revendications 1 à 12. 15. Extrait de Pseudotsuga menziesii soluble entre 2 et 8°C, obtenu par la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une des revendications 1 à 12. 16. Extrait selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une molécule choisie parmi les polyphénols et les phytostérols. 17. Extrait selon la revendication 15 ou 16, caractérisé en ce qu'il comprend entre 5 et 15 grammes de polyphénols totaux pour 100 grammes de matière première initiale sèche. 18. Extrait selon la revendication 15 ou 16, caractérisé en ce qu'il comprend entre 1 et 6 grammes de dihydroflavonol pour 100 grammes de matière première initiale sèche et/ou entre 4 à 150mg de phytostérols pour 100 grammes de matière première initiale sèche. 19. Extrait selon l'une des revendication 15 à 18, caractérisé en ce qu'il comprend au moins 1g de taxifoline pour 100 grammes de matière première initiale sèche. 31 20. Extrait de Pseudotsuga menziesii insoluble entre 2 et 8°C obtenu par la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une des revendications 1 à 12. 21. Extrait selon la revendication 20, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une molécule choisie parmi les alcools gras, les acides gras possédant des chaînes 5 hydrogénocarbonées de longueurs comprises entre 22 et 28 atomes de carbone ainsi que de leurs esters. 22. Extrait selon la revendication 21, caractérisé en ce qu'il comprend entre 0,1 et 7 grammes d'alcools gras et/ou acides gras à longues chaînes et/ou leurs esters pour 100 grammes de matière première initiale sèche. 10 23. Extrait selon l'une des revendications 15 à 22, pour une utilisation comme médicament. 24. Utilisation d'un extrait selon l'une des revendications 15 à 22, dans des compositions cosmétiques ou des compléments alimentaires ou des compositions alimentaires ou des produits de nettoyage.