Brevet FR3065225A1 — publié le 20181019

ADJUVANTS DEPOURVUS DE CYTOKINES POUR MILIEUX DE CULTURE CELLULAIRE, NOTAMMENT POUR FECONDATION IN VITRO, OU POUR LA CULTURE DE FOLLICULES, CELLULES GERMINALES MALES OU EMBRYONS La présente invention a pour objet des compositions utilisables en tant qu'adjuvants ou « boosters » pour milieux de culture cellulaire, notamment pour des follicules en cours de développement ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ainsi que pour la Fécondation in vitro (FIV) et le développement d'embryons, et plus généralement chez les mammifères, notamment les humains, éventuellement après décongélation de follicules ou de cellules mâles. Dans l'art antérieur sont décrits des exemples de compositions pour la culture in vitro de follicules ou de cellules de la lignée germinale mâle, ainsi que pour la fécondation de l'ovocyte et le développement de l'embryon. Dans certains de ces exemples, les compositions contiennent un ou plusieurs facteurs de croissance. C'est ainsi que dans le brevet européen EP 1.088.057 est décrite l'utilisation du GM-CSF pour la préparation d'un milieu destiné au développement d'embryons humains à un stade précoce jusqu'au stade blastocyste dans un programme de FIV. Dans le brevet européen EP 1.176.190 sont décrites des compositions pour la culture in vitro de follicules ou d'embryons, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins deux facteurs de croissance en association avec au moins un composé de la famille des corticoïdes impliqués dans la production énergétique chez les mammifères, et, le cas échéant, avec au moins un coenzyme clé du métabolisme énergétique, tel que le NAD/NADH et le NADP/NADPH. La présente invention découle de la mise en évidence par les Inventeurs de compositions utilisables comme adjuvants aussi bien pour la culture de follicules ou de cellules de la lignée germinale mâle, que pour la fécondation de l'ovocyte et le développement de l'embryon jusqu'au stade blastocyste et permettant lorsqu'elles sont mélangées avec une solution aqueuse contenant les éléments utilisés classiquement dans le cadre de la fécondation in vitro, ou de la culture de follicules, de cellules mâles, ou d'embryons d'améliorer le rendement par rapport à celui obtenu avec les compositions 1 3065225 actuellement sur le marché, ces nouvelles compositions étant notamment caractérisées en ce qu'elles ne comprennent pas de cytokines. La présente invention a donc pour objet des compositions sous toutes les formes possibles et notamment sous forme de liquide, de poudre ou de lyophilisat pour la 5 culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ou pour la fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes, ou pour le développement d'embryons, éventuellement après décongélation des follicules ou des spermatozoïdes caractérisées en ce qu'elles comprennent : 10 au moins deux composés choisi parmi le groupe constitué par : - un sel de zinc, de préférence un sel hydrosoluble tel que le chlorure de zinc ou le sulfate de zinc, notamment à une concentration de 0,1 à 3 1.1g/ml, de préférence à une concentration de 0,5 à 1,5 1.1g/ml, exprimée en zinc élément, - l'inositol sous l'une quelconque de ses formes stéréoisomériques, de préférence le 15 myo-inositol, ou sous forme de phosphate, de préférence l'inositol triphosphate, notamment sous forme de sel, notamment à une concentration de 1,8 à 18 mg/ml, de préférence à une concentration de 5 à 10 mg/ml, exprimée en inositol, - la carnitine sous l'une de ses formes stéréoisomériques, de préférence la Lcarnitine, un sel de carnitine de préférence le chlorhydrate, un dérivé de carnitine 20 de préférence l'acétylcarnitine ou un sel d'un dérivé de carnitine, de préférence sous la forme de chlorhydrate notamment à une concentration de 0,1 à 2 mg/ml, de préférence de 0,5 à 1 mg/ml, exprimée en carnitine base, - la mélatonine ou un analogue, un sel ou un solvate de mélatonine notamment à une concentration de 1041 à 10-5 M de préférence de 1049 à 10-6 M et notamment de 25 10-9 à 10-7 M exprimée en mélatonine base, - la cystine sous l'une de ses formes stéréoisomériques, de préférence la L-cystine, un sel de cystine de préférence le chlorhydrate, un dérivé de cystine de préférence l'acétylcystine ou un sel d'un dérivé de cystine, de préférence sous la forme de chlorhydrate, notamment à une concentration de 20 à 100 1.1g/m1 de cystine et de 30 préférence de 35 à 60 tg/ml exprimée en cystine base, - la cystéamine, un sel de cystéamine de préférence le chlorhydrate, un dérivé de cystéamine de préférence l'acétylcystéamine ou un sel d'un dérivé de cystéamine, de préférence sous la forme de chlorhydrate, notamment à une concentration de 2 3065225 1,5 à 15 ag/m1 de cystéamine et de préférence de 4 à 12 tg/ml exprimée en cystéamine base, et, le cas échéant, un ou plusieurs composés choisis parmi les composés de la famille des corticoïdes 5 et/ou un ou plusieurs coenzymes clés du métabolisme énergétique, tel que le NAD/NADH et le NADP/NADPH et compositions caractérisées en ce qu'elle sont dépourvues de cytokines. 10 Les compositions de l'invention peuvent être assimilées à des adjuvants, des compléments ou des "boosters". Il s'agit de compositions qui, une fois associées à d'autres éléments, permettent d'obtenir des milieux de culture. Dans les compositions de l'invention, les concentrations en sel de zinc correspondent à la quantité d'élément par volume. 15 De préférence, les concentrations en sel de zinc dans les compositions susmentionnées de l'invention sont comprises de 0,1 tg/ml à 3 pg/ml, de préférence de 0,5 pg/m1 à 1,5 pg/m1 exprimées en zinc élément. Les concentrations en zinc élément dans les compositions susmentionnées de l'invention sont notamment de 0,1 ; 0,2; 0,3 ; 0,4; 0,5 ; 0,6; 0,7; 0,8 ; 0,9; 1,0; 1,1 ; 20 1,2 ; 1,3 ; 1,4 ; 1,5 ; 2 ; 2,5 ou 3 pg/ml. Dans les compositions de l'invention, l'inositol peut notamment être présent sous forme de dérivés phosphatés d'inositol, tels que l'inositol mono-, di- ou triphosphate, ou sous forme de sels. Les concentrations indiquées en inositol correspondent à la quantité d'inositol par volume. 25 De préférence, les concentrations en inositol dans les compositions susmentionnées de l'invention sont comprises de 1,8 mg/mi à 18 mg/ml, de préférence de 5 à 10 mg/ml. Les concentrations en inositol dans les compositions susmentionnées de l'invention sont notamment de 1,8; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14; 15; 30 16; 17 ou 18 mg/ml. Dans les compositions de l'invention, la carnitine est sous la forme d'un énantiomère L et les concentrations en carnitine correspondent à la quantité de base par volume. 3 3065225 De préférence, les concentrations en carnitine dans les compositions susmentionnées de l'invention sont comprises de 0,1 mg/mi à 2 mg/ml, de préférence de 0,5 mg/mi à 1 mg/ml. Les concentrations en carnitine dans les compositions susmentionnées de 5 l'invention sont notamment de 0,1 ; 0,2; 0,3 ; 0,4; 0,5 ; 0,6; 0,7; 0,8 ; 0,9; 1,0; 1,1 ; 1,2 ; 1,3 ; 1,4 ; 1,5 ; 1,6 ; 1,7 ; 1,8 ; 1,9 ou 2,0 mg/ml. Dans les compositions de l'invention, la mélatonine est sous la forme d'un sel ou d'un solvate de mélatonine. Par sel de mélatonine, on entend tout sel avec un acide minéral ou organique tels 10 que les sels avec l'acide chlorhydrique, sulfurique, acétique, citrique, fumarique, hémisuccinique ou maléique. Des exemples de solvates incluent les hydrates et les alcoolates. Les analogues de mélatonine incluent les produits biologiquement actifs dont la formule chimique dérive de celle de la mélatonine. 15 Des analogues de la mélatonine sont aussi, par exemple, décrits dans les brevets WO 1989/001472, WO 2002/024181, EP 820768, EP 1476152. De préférence, dans les compositions de l'invention, les concentrations en mélatonine sont comprises entre 10-11 et 10-5 M plus préférentiellement entre 1019 et 10-6 M et notamment de 10-9 et 10-7 M concentrations exprimées en mélatonine base. 20 Les concentrations exprimées en mélatonine dans les compositions susmentionnées de l'invention sont notamment d'environ 10- 11, 5.10-11, 10-10, 5.10-10, 10-9, 5.10-9, 10-8, 5.10-8, 10-7, 5.10-7, 10-6, 5.10-6 ou 10-5 M. Chacune des deux molécules de cystéine qui sont reliées par un pont disulfure pour former la molécule de cystine peuvent se trouver sous la forme D ou L. 25 Les stéréoisomères possibles peuvent être utilisés pour la mise en oeuvre de la présente invention. La forme L-cystine est la forme préférée. Les sels de cystine peuvent être formés avec les acides minéraux comme l'acide chlorhydrique ou l'acide sulfurique. Parmi les dérivés de cystine on peut citer l'acétylcystine. 30 De préférence, dans les compositions de l'invention, les concentrations en cystine sont comprises entre 20 et 100 tg/ml de cystine et de préférence de 35 à 60 tg/ml exprimées en cystine base. 4 3065225 Les concentrations en cystine dans les compositions susmentionnées de l'invention sont notamment de 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 1001.1g/ml. 5 Les sels de cystéamine peuvent être formés avec les acides minéraux comme l'acide chlorhydrique ou l'acide sulfurique. Parmi les dérivés de cystéamine on peut citer l'acétylcystéamine. De préférence, dans les compositions de l'invention, les concentrations en cystéamine sont comprises entre 1,5 et 15 1.1g/m1 et de préférence entre 4 et 12 1.1g/m1 10 exprimées en cystéamine base. Les concentrations en cystéamine dans les compositions susmentionnées de l'invention sont notamment de 1,5 ; 2 ; 2,5 ; 3 ; 3,5 ; 4 ; 4,5 ; 5 ; 5,5 ; 6 ; 6,5 ; 7 ; 7,5 ; 8 ; 8,5 ; 9 ; 9,5 ; 10; 10,5; 11; 11,5; 12; 12,5 ; 13 ; 13,5; 14; 14,5 ou 15 1.1g/ml. 15 L'invention a plus particulièrement pour objet des compositions susmentionnées pour la culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ou pour la fécondation in vitro des ovocytes par les 20 spermatozoïdes, ou pour la culture d'embryons, éventuellement après décongélation des follicules ou des cellules mâles. Les compositions de l'invention apportent aux cellules en croissance et en différenciation des molécules régulatrices. Ainsi, ces compositions sont susceptibles de permettre la maturation des ovocytes 25 de mammifères et en particulier les ovocytes immatures humains ainsi que la maturation des cellules de la lignée germinale mâle. Elles peuvent aussi assurer le développement de l'embryon de mammifères et en particulier les embryons d'humain jusqu'au stade blastocyste, ce stade ayant un plus fort pourcentage d'implantation dans l'utérus que lorsque l'embryon est à un stade moins avancé. 30 Avantageusement, les compositions de l'invention contiennent les concentrations suivantes en principes actifs : - la concentration en zinc, particulièrement sous forme de chlorure ou de sulfate de zinc est d'environ 11.1g/m1 exprimée en élément, 5 3065225 - la concentration en inositol, particulièrement sous forme de myo-inositol est d'environ 5 mg/mi exprimée en inositol, - la concentration en L-carnitine, particulièrement sous forme de base ou de chlorhydrate est d'environ 0,6 mg/ml, exprimée en carnitine base. 5 - la concentration en mélatonine base est d'environ 10-7 M. - la concentration en cystine, particulièrement sous forme de L-cystine et plus particulièrement sous forme de chlorhydrate de L-cystine est d'environ 50 ug/m1 exprimée en cystine base, - la concentration en cystéamine, particulièrement sous forme de chlorhydrate est 10 d'environ 8 ug/ml, exprimée en cystéamine base. Avantageusement, les compositions selon l'invention sont caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins trois composés choisis parmi le groupe constitué par : 15 - un sel de zinc, de préférence un sel hydrosoluble tel que le chlorure de zinc ou le sulfate de zinc, notamment à une concentration de 0,1 à 3 ug/ml, de préférence à une concentration de 0,5 à 1,5 ug/ml, exprimée en zinc élément, - l'inositol sous l'une quelconque de ses formes stéréoisomériques, de préférence le myo-inositol, ou sous forme de phosphate, de préférence l'inositol triphosphate, 20 notamment sous forme de sel, notamment à une concentration de 1,8 à 18 mg/ml, de préférence à une concentration de 5 à 10 mg/ml, exprimée en inositol, - la carnitine sous l'une de ses formes stéréoisomériques, de préférence la L- carnitine, un sel de carnitine de préférence le chlorhydrate, un dérivé de carnitine de préférence l'acétylcarnitine ou un sel d'un dérivé de carnitine, de préférence 25 sous la forme de chlorhydrate notamment à une concentration de 0,1 à 2 mg/ml, de préférence de 0,5 à 1 mg/ml, exprimée en carnitine base, - la mélatonine ou un analogue, un sel ou un solvate de mélatonine notamment à une concentration de 1041 à 10-5 M de préférence de 1049 à 10-6 M et notamment de 10-9 à 10-7 M exprimée en mélatonine base. 30 - la cystine sous l'une de ses formes stéréoisomériques, de préférence la L-cystine, un sel de cystine de préférence le chlorhydrate, un dérivé de cystine de préférence l'acétylcystine ou un sel d'un dérivé de cystine, de préférence sous la forme de chlorhydrate notamment à une concentration de 20 à 100 tg/ml de cystine et de préférence de 35 à 60 tg/ml exprimée en cystine base, 6 3065225 la cystéamine, un sel de cystéamine de préférence le chlorhydrate, un dérivé de cystéamine de préférence l'acétylcystéamine ou un sel d'un dérivé de cystéamine, de préférence sous la forme de chlorhydrate notamment à une concentration de 1,5 5 à 15 1.1g/m1 de cystéamine et de préférence de 4 à 12 1.1g/m1 exprimée en cystéamine base. Avantageusement, les compositions selon l'invention sont caractérisées en ce qu'elles comprennent une quantité préférentiellement indiquée dans la présente 10 demande de chacun des composés mentionnés dans le groupe indiqué ci-dessus à savoir un sel de zinc, du myo-ionositol éventuellement sous forme de phosphate, de la L-carnitine ou de l'acétylcarnitine éventuellement sous forme de chlorhydrate, de la mélatonine, de la L-cystine ou de l'acétylcystine éventuellement sous forme de chlorhydrate et de la cystéamine ou de l'acétylcystéamine éventuellement sous forme 15 de chlorhydrate. Une forme préférée de composition selon l'invention comprend environ 1 1.1g/m1 de zinc, 5 mg/m1 d'inositol, 0,6 mg/m1 de L-carnitine base, 10-7 M de mélatonine base, 501.1g/m1 de L-cystine base et éventuellement 81.1g/m1 de cystéamine base. 20 L'invention a également pour objet les compositions susmentionnées pour culture in vitro, comprenant au moins un composé de la famille des corticoïdes, de préférence de l'hydrocortisone sous forme de sel hydrosoluble tel que l'hémisuccinate d'hydrocortisone, le succinate de sodium d'hydrocortisone et le phosphate de sodium d'hydrocortisone. De préférence, la concentration du sel d'hydrocortisone dans les 25 compositions susmentionnées est comprise entre 5 x 10-7 M et 10-6 M, et est notamment de 7 x 10-7 M, soit environ 350 ng/ml pour l'hémisuccinate d'hydrocortisone exprimé en hydrocortisone base. L'invention a également pour objet les compositions susmentionnées pour culture 30 in vitro, comprenant au moins un sel de zinc sous forme hydratée ou anhydre choisi parmi les sels suivants : chlorure de zinc, sulfate de zinc, gluconate de zinc, picolinate de zinc, citrate de zinc, acétate de zinc, lactate de zinc, stéarate de zinc, de préférence un sel hydrosoluble comme le sulfate de zinc ou le chlorure de zinc. 7 3065225 Avantageusement, les compositions définies ci-dessus contiennent des coenzymes clés du métabolisme énergétique susmentionnés, notamment à des concentrations telles que : 5 - la concentration de NAD/NADH soit d'environ 1 itg/ml, - la concentration de NADP/NADPH soit d'environ 1 itg/ml. L'invention a également pour objet les compositions susmentionnées pour culture 10 in vitro, comprenant au moins deux composés choisi parmi le groupe constitué par : - un sel hydrosoluble de zinc choisi parmi le sulfate de zinc ou le chlorure de zinc et/ou du myo-inositol et/ou de la mélatonine et/ou de la L-carnitine ou du chlorhydrate de L-carnitine et/ou de la L-cystine ou du chlorhydrate de L-cystine et/ou de la Lcystéamine ou du chlorhydrate de L-cystéamine et éventuellement 15 - de l'hémisuccinate d'hydrocortisone, et - du NAD/NADH et/ou du NADP/NADPH. L'invention concerne en particulier les compositions définies ci-dessus se présentant sous forme de lyophilisat, à savoir sous forme de compositions dont les différents constituants sont amenés à l'état sec, et sont susceptibles d'être remis en 20 solution en gardant leurs propriétés physico-chimiques et biologiques. A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour objet les lyophilisats susmentionnés, contenant : au moins deux composés choisis parmi le groupe constitué par : - un sel de zinc, notamment à une concentration de 0,1 à 3 pg/ml, de préférence à 25 une concentration de 0,5 à 1,5 ag/ml, exprimée en zinc élément, - l'inositol sous l'une quelconque de ses formes stéréoisomériques, de préférence le myo-inositol, notamment à une concentration de 1,8 à 18 mg/ml, de préférence à une concentration de 5 à 10 mg/ml, exprimée en inositol, - la carnitine sous l'une de ses formes stéréoisomérique, de préférence la L- 30 carnitine, un sel de carnitine de préférence le chlorhydrate, un dérivé de carnitine de préférence l'acétylcarnitine ou un sel d'un dérivé de carnitine, notamment à une concentration de 0,1 à 2 mg/ml, de préférence de 0,5 à 1 mg/ml, exprimée en carnitine base, 8 3065225 - la mélatonine ou un analogue, un sel acceptable ou un solvate de mélatonine notamment à une concentration de 10-11 à 10-5 M de préférence de 10-10 à 10-6 M et notamment de 10-9 à 10-7 M exprimée en mélatonine base, - la cystine sous l'une de ses formes stéréoisomériques, de préférence la L-cystine, 5 un sel de cystine de préférence le chlorhydrate, un dérivé de cystine de préférence l'acétylcystine ou un sel d'un dérivé de cystine, de préférence sous la forme de chlorhydrate notamment à une concentration de 20 à 100 1.1g/m1 de cystine et de préférence de 35 à 601.1g/m1 exprimée en cystine base et/ou 10 - la cystéamine, un sel de cystéamine de préférence le chlorhydrate, un dérivé de cystéamine de préférence l'acétylcystéamine ou un sel d'un dérivé de cystéamine, de préférence sous la forme de chlorhydrate notamment à une concentration de 1,5 à 15 pg/m1 de cystéamine et de préférence à 4 à 12 1.1g/m1 exprimée en cystéamine base 15 et éventuellement, le cas échéant, - au moins un composé de la famille des corticoïdes défini ci-dessus, tel que l'hémisuccinate d'hydrocortisone, - et/ou au moins un coenzyme clé du métabolisme énergétique défini ci-dessus, tel que le NAD/NADH et le NADP/NADPH 20 et compositions sous forme de lyophilisat caractérisées en ce qu'elle sont dépourvues de cytokines. L'invention a également pour objet l'application des compositions ou lyophilisats susmentionnés, en tant qu'adjuvants effecteurs pour la préparation de milieux pour la 25 culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ou pour la fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes, ou pour la culture d'embryons, éventuellement après décongélation des follicules ou des gamètes mâles, lesdits milieux de culture in vitro comprenant une composition 30 telle que définie ci-dessus, en mélange ou en association avec une solution aqueuse contenant les éléments utilisés classiquement dans le cadre de la fécondation in vitro, ou de la culture des follicules, cellules mâles, ou embryons. Lesdits éléments sont connus de l'homme de métier. Ils peuvent notamment être choisis parmi les sérums 9 3065225 albumines humaine ou bovine, le cas échéant recombinantes, et/ou les sels minéraux tels que KC1, NaC1, MgSO4, NaHCO3, Na2HPO4, KH2PO4. et/ou les molécules énergétiques telles que le glucose, le pyruvate, le citrate et le lactate, et/ou les aminoacides pour la biosynthèse des protéines, et/ou les bases puriques et 5 pyrimidiques pour la biosynthèse des acides nucléiques, et/ou des phospholipides ou du cholestérol pour la formation des membranes cellulaires, et/ou des vitamines, telles que des vitamines du groupe B, notamment la vitamine Bi, la vitamine B2, la vitamine B3, la vitamine B5, la vitamine B6, la vitamine B9, la vitamine B12 et/ou de la vitamine C et/ou de la vitamine E, et éventuellement de l'insuline et/ou 10 éventuellement au moins une autre substance contribuant au procédé de préparation du milieu de culture, en particulier un ou plusieurs facteurs de croissance choisis notamment parmi le GM-CSF, l'IGF-1, l'IGF-2, l'EGF, le TGF ou le LIF et de préférence le GM-CSF et/ou au moins un antibiotique. Dans ce qui suit, l'expression « en mélange » signifie que les compositions de 15 l'invention et la solution aqueuse contenant les éléments utilisés classiquement dans le cadre de la fécondation in vitro, ou de la culture des follicules, cellules mâles, ou embryons ne forment qu'une seule solution qui est le milieu de culture final après que l'une ait été versée dans l'autre alors que l'expression « en association » signifie que les deux formulations, à savoir l'invention et la solution aqueuse, sont présentes 20 ensemble, par exemple dans un kit, mais ne seront mélangées qu'au moment de leur utilisation. L'invention concerne également un procédé de préparation de milieux pour la culture in vitro définis ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mélange d'une composition selon l'invention agissant comme adjuvant, complément ou 25 «booster » (le cas échéant après dissolution dans un liquide approprié de ladite composition selon l'invention si elle se présente sous forme de poudre ou de lyophilisat) avec une solution contenant les éléments utilisés classiquement dans le cadre de la fécondation in vitro, ou de la culture de follicules, cellules mâles, ou embryons, lesdits éléments étant tels que définis ci-dessus. 30 Le liquide approprié peut être par exemple de l'eau distillée, du sérum physiologique, une solution de sérum albumine bovine ou humaine recombinante ou non, un mélange de ces différents ingrédients ou un milieu de culture classiquement utilisé. 10 3065225 L'invention concerne également des milieux pour la culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ou pour la fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes, ou pour la culture d'embryons, 5 éventuellement après décongélation des follicules ou des cellules mâles, lesdits milieux pour la culture in vitro étant tels qu'obtenus par le procédé consistant à associer une composition de l'invention sous forme de liquide, de poudre ou de lyophilisat avec une solution aqueuse contenant les éléments utilisés classiquement dans le cadre de la fécondation in vitro, ou de la culture des follicules, cellules mâles, ou embryons, une 10 liste non-limitative desdits éléments étant indiquée ci-dessus. Comme il apparaît dans les développements indiqués ci-dessus, les compositions selon l'invention constituent principalement des adjuvants ou "compléments" ou «booster » qui ne sont pas, en principe, destinés à être utilisés seuls comme milieux de 15 culture. Ils sont principalement destinés à être mélangés avec des solutions aqueuses contenant les éléments utilisés classiquement dans le cadre de la fécondation in vitro. Une liste non limitative de ces éléments a été indiquée précédemment. Ces solutions aqueuses peuvent être constituées par des milieux pour la culture in vitro qui pourraient être utilisées comme tels mais pour lesquels l'addition des 20 adjuvants, compléments ou «booster » selon l'invention permet d'améliorer les performances. Ces solutions aqueuses peuvent donc être des milieux de culture commerciaux comme ceux commercialisés sous les dénominations tels que Gl, G2, EmbryoGen, BlastoGen, Ferticult et HTF. 25 Ces solutions aqueuses contenant les éléments utilisés classiquement dans le cadre de la fécondation in vitro, ou de la culture de follicules, de cellules mâles, ou d'embryons peuvent également être des milieux de culture potentiels préparés par des biologistes du métier et pour lesquels les adjuvants, compléments ou «booster » selon l'invention permettent, comme indiqué ci-dessus et montré ci-après dans la partie 30 expérimentale, d'améliorer les performances et l'efficacité. L'invention a plus particulièrement pour objet les milieux pour la culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ou pour la fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes, ou pour la culture 11 3065225 d'embryons, éventuellement après décongélation des follicules ou des cellules mâles, lesdits milieux étant caractérisés en ce qu'ils comprennent les éléments constitutifs d'une composition selon l'invention telle que définie ci-dessus, en association ou en mélange avec des éléments susmentionnés utilisés classiquement dans le cadre de la 5 fécondation in vitro, ou de la culture de follicules, cellules mâles, ou embryons tels que définis ci-dessus. L'invention a également pour objet un procédé de maturation des follicules de mammifères en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus 10 dans lesdits follicules, et plus particulièrement de follicules humains, le cas échéant après décongélation des follicules préalablement congelés, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en culture in vitro de follicules prélevés chez la femelle, et plus particulièrement chez la femme, dans un milieu de culture tel que défini ci-dessus selon l'invention, avantageusement pendant environ 24 à 48 heures. 15 L'invention concerne également un procédé de maturation de cellules de la lignée germinale mâle de mammifères, et plus particulièrement humaines, le cas échéant après décongélation de cellules préalablement congelées, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en culture in vitro desdites cellules, dans un milieu de culture tel que défini ci-dessus selon l'invention, notamment pendant plusieurs jours, avantageusement 20 de 1 à 5 jours. L'invention a également pour objet un procédé de fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes, et plus particulièrement d'ovocytes et de spermatozoïdes d'origine humaine, le cas échéant après décongélation des spermatozoïdes préalablement congelés, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de 25 mise en culture in vitro des ovocytes et spermatozoïdes susmentionnés, dans un milieu de culture tel que défini ci-dessus selon l'invention, avantageusement pendant environ 1 jour à environ 2 jours. L'invention concerne également un procédé de développement d'embryons de mammifères, et plus particulièrement d'embryons humains, caractérisé en ce qu'il 30 comprend une étape de mise en culture in vitro desdits embryons, dans un milieu de culture tel que défini ci-dessus selon l'invention, de préférence pendant les 5 à 6 jours qui suivent la fécondation in vitro, avantageusement de manière à obtenir des embryons au stade de blastocystes. 12 3065225 De manière non limitative, l'invention concerne notamment les procédés tels que définis ci-dessus dans lesquels les mammifères peuvent être choisis parmi les primates, y compris les êtres humains, les ovins, les bovins, les porcins et chez les espèces animales en voie de disparition... 5 Avantageusement, les compositions de l'invention peuvent être utilisées à la fois pour la maturation de follicules ou celle des cellules de la lignée germinale mâle, la fécondation in vitro des ovocytes, et la maturation des embryons issus de ladite fécondation, notamment jusqu'au stade de blastocyste, éventuellement après décongélation des follicules ou des cellules mâles. 10 L'invention a également pour objet un kit (ou trousse) pour la préparation extemporanée d'un milieu de culture tel que défini ci-dessus selon l'invention, notamment dans le cadre de la mise en oeuvre d'un procédé susmentionné, ce kit comprenant : - une composition selon l'invention éventuellement sous forme de lyophilisat 15 et - une solution aqueuse contenant les éléments utilisés classiquement dans le cadre de la fécondation in vitro, ou de la culture de follicules, de cellules mâles, ou d'embryons, tels que les éléments définis ci-dessus, notamment un milieu commercialisé. 20 La présente invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée suivante d'exemples de milieux de culture préparés selon l'invention. A titre de solution aqueuse telle que définie ci-dessus, un milieu de culture préparé à partir des compositions selon l'invention peut comprendre principalement les composés choisis parmi les sels minéraux tels que KC1, NaC1, MgSO4, NaHCO3, 25 Na2HPO4, KH2PO4; les acides aminés essentiels ainsi que d'autres acides aminés tels que l'acide glutamique, la glycine, la taurine, la cystéine et la glutamine ; des oses et dérivés métaboliques, tels que glucose, pyruvate, lactate, acétate ; des vitamines, notamment des vitamines du groupe B et de la vitamine C ; des bases puriques et pyrimidiques ; de l'albumine ; des phospholipides ; du cholestérol ; de l'insuline et/ou 30 au moins une autre substance contribuant au procédé, en particulier un facteur de croissance ; des antibiotiques, tels que la pénicilline G, la streptomycine, la gentamycine ou un autre aminoside. 13 3065225 Cette invention, qui peut se présenter sous différentes formes (liquide, poudre, ou lyophilisat), peut être mélangée avant le conditionnement avec une solution liquide comprenant les éléments utilisés classiquement dans le cadre de la fécondation in vitro, ou de la culture de follicules, de cellules mâles, ou d'embryons, cette solution pouvant 5 être ainsi elle-même un milieu de culture prêt à l'emploi. Le milieu amélioré résultant du mélange sera destiné à la culture de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes, ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ou pour la fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes ou encore pour la culture d'embryons, éventuellement après décongélation des follicules, ou des 10 cellules mâles. Les compositions selon l'invention peuvent aussi être mélangées extemporanément avec une solution liquide comprenant les éléments utilisés classiquement dans le cadre de la fécondation in vitro, ou de la culture de follicules, de cellules mâles, ou d'embryons. La solution ainsi obtenue est un milieu de culture. 15 PARTIE EXPERIMENTALE : Sont décrites ci-après des compositions de formulations de l'adjuvant effecteur objet de la présente invention qui peuvent être utilisés pour la préparation de milieux pour la culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des 20 ovocytes contenus dans lesdits follicules, ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ou pour la fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes, ou pour la culture d'embryons, éventuellement après décongélation des follicules ou des cellules mâles. 25 Dans toutes les expérimentations suivantes, les principes actifs sont finalement utilisés aux concentrations suivantes : Zinc exprimé en élément = 11.1g/m1 Inositol exprimé en molécule = 5 mg/m1 L-carnitine exprimée en base = 0,6 mg/m1 30 Mélatonine exprimée en base = 10-7 M Cystine exprimée en base = 501.1g/m1 Cystéamine exprimée en base = 81.1g/m1 14 3065225 Nous avons choisi de préparer préalablement des compositions 100 fois plus concentrées que les concentrations citées ci-dessus. De ce fait, ces solutions sont à diluer extemporanément au 1/100ème dans un milieu de culture usuel lors de la réalisation des procédés pour leur application. 5 Toutes les opérations sont effectuées avec des matières premières stériles et en milieu stérile. Composition 1 10 Une solution préparée extemporanément en mélangeant un milieu de culture avec une composition selon l'invention contenant un sel de zinc et de la mélatonine est répartie dans des flacons de 1 ml, de telle façon que chaque flacon contienne 100 ltg de zinc élément et 10-5 M de mélatonine. Cette solution est à diluer au 1/100ème dans un milieu de culture lors de la réalisation des 15 procédés. Composition 2 Une solution préparée extemporanément en mélangeant un milieu de culture avec une composition selon l'invention contenant un sel de zinc, de l'inositol et de la mélatonine 20 est répartie dans des flacons de 1 ml, de telle façon que chaque flacon contienne 100 ltg de zinc élément, 500 mg d'inositol et 10-5 M de mélatonine. Cette solution est à diluer au 1/100ème dans un milieu de culture lors de la réalisation des procédés. 25 Composition 3 Une solution préparée extemporanément en mélangeant un milieu de culture avec une composition selon l'invention contenant un sel de zinc, de l'inositol, de la mélatonine et de la cystine est répartie dans des flacons de 1 ml, de telle façon que chaque flacon contienne 100 ltg de zinc élément, 500 mg d'inositol, 10-5 M de mélatonine et 5 mg de 30 cystine base. Cette solution est à diluer au 1/100ème dans un milieu de culture lors de la réalisation des procédés. Composition 4 15 3065225 Une solution préparée extemporanément en mélangeant un milieu de culture avec une composition selon l'invention contenant un sel de zinc, de l'inositol, de la mélatonine, de la cystine et de la carnitine est répartie dans des flacons de 1 ml, de telle façon que chaque flacon contienne 100 tg de zinc élément, 500 mg d'inositol, 10-5 M de 5 mélatonine, 5 mg de cystine base et 60 mg de L-carnitine base. Cette solution est à diluer au 1/100ème dans un milieu de culture lors de la réalisation des procédés. Composition 5 10 Une solution préparée extemporanément en mélangeant un milieu de culture avec une composition selon l'invention contenant un sel de zinc, de l'inositol, de la mélatonine, de la cystine, de la cystéamine et de la carnitine est répartie dans des flacons de 1 ml, de telle façon que chaque flacon contienne 100 tg de zinc élément, 500 mg d'inositol, 10-5 M de mélatonine, 5 mg de cystine base, 800 tg de cystéamine base et 60 mg de L- 15 carnitine base. Cette solution est à diluer au 1/100ème dans un milieu de culture lors de la réalisation des procédés. Composition 6 20 Une solution préparée extemporanément en mélangeant un milieu de culture avec une composition selon l'invention contenant un sel de zinc, de l'inositol et de la carnitine est répartie dans des flacons de 1 ml, de telle façon que chaque flacon contienne 100 tg de zinc élément, 500 mg d'inositol et 60 mg de L-carnitine base. Cette solution est à diluer au 1/100ème dans un milieu de culture lors de la réalisation des 25 procédés. Composition 7 Une solution préparée extemporanément en mélangeant un milieu de culture avec une composition selon l'invention contenant de l'inositol, de la mélatonine et de la cystine 30 est répartie dans des flacons de 1 ml, de telle façon que chaque flacon contienne 500 mg d'inositol, 10-5 M de mélatonine et 5 mg de cystine base. Cette solution est à diluer au 1/100ème dans un milieu de culture lors de la réalisation des procédés. 16 3065225 Composition 8 Une solution préparée extemporanément en mélangeant un milieu de culture avec une composition selon l'invention contenant un sel de zinc, de l'inositol, de la mélatonine et de la carnitine est répartie dans des flacons de 1 ml, de telle façon que chaque flacon 5 contienne 100 tg de zinc élément, 500 mg d'inositol, 10-5 M de mélatonine et 60 mg de L-carnitine base. Cette solution est à diluer au 1/100ème dans un milieu de culture lors de la réalisation des procédés. 10 Composition 9 Une solution préparée extemporanément en mélangeant un milieu de culture avec une composition selon l'invention contenant de l'inositol, de la mélatonine, de la cystine et de la carnitine est répartie dans des flacons de 1 ml, de telle façon que chaque flacon contienne 500 mg d'inositol, 10-5 M de mélatonine, 5 mg de cystine base et 60 mg de L- 15 carnitine base. Cette solution est à diluer au 1/100ème dans un milieu de culture lors de la réalisation des procédés. Les flacons des différentes compositions de 1 à 9 sont conservés à + 4°C ou lorsque leur 20 contenu est lyophilisé il est conservé à une température inférieure à - 20 °C. Essai 1) Maturation in vitro des ovocytes de mammifères En fonction du stade de la maturation des ovocytes, les « ovocytes au stade de la 25 vésicule germinative » ou les « ovocytes au stade de la métaphase I » sont mis en culture dans un milieu classique de maturation in vitro supplémenté avec deux ou plusieurs substances. Essai la) Ovocytes au stade de la vésicule germinative (VG) 30 On détermine le nombre d'ovocytes VG qui évoluent aux stades de la métaphase I (MI) ou de la métaphase II (MII). Dans cette expérience, 5 groupes sont utilisés 17 3065225 Groupe n°1 (témoin), les ovocytes VG sont placés dans des puits ne contenant que le milieu de culture. Groupe n°2, les ovocytes VG sont placés dans des puits contenant le milieu de culture et une composition selon l'invention contenant de la mélatonine et du zinc. 5 Groupe n°3, les ovocytes VG sont placés dans des puits contenant le milieu de culture et une composition selon l'invention contenant de la mélatonine, du zinc et de l'inositol. Groupe n°4, les ovocytes VG sont placés dans des puits contenant le milieu de culture et une composition selon l'invention contenant de la mélatonine, du zinc, de l'inositol et de la cystine. 10 Groupe n°5, les ovocytes VG sont placés dans des puits contenant le milieu de culture et une composition selon l'invention contenant de la mélatonine, du zinc, de l'inositol, de la cystine, de la cystéamine et de la carnitine. Les différents groupes d'ovocytes sont mis en culture dans la même étuve à 37°C dans une atmosphère contenant 5% de CO2. 15 Résultats On vérifie si l'addition des compositions selon l'invention qui comportent des substances telles que zinc, inositol, carnitine, mélatonine, cystine et/ou cystéamine entraîne une amélioration de la maturation des ovocytes VG au stade MI et MII au bout 20 de 24H et 48H de culture par rapport aux ovocytes VG mis en culture dans le milieu de culture seul. Essai lb) Ovocytes au stade métaphase I 25 Dans cette expérimentation, on détermine le nombre d'ovocytes qui évoluent en M II. On utilise le même protocole que précédemment en sélectionnant des ovocytes au stade MI. Résultats 30 On vérifie si l'addition des compositions selon l'invention apporte des améliorations de la maturation des ovocytes MI évoluant au stade MII en présence des compositions selon l'invention qui comportent des substances telles que zinc, inositol, carnitine, mélatonine, cystine et/ou cystéamine 18 3065225 Essai 2) Fécondation in vitro Pour évaluer l'influence des différentes substances (zinc, inositol, L-carnitine, mélatonine, cystine et cystéamine) contenues dans les compositions selon l'invention, 5 sur la fécondation in vitro, les expérimentations sont réalisées chez un mammifère. Pour ce faire, on sélectionne les ovules les plus matures et les meilleurs spermatozoïdes pour faciliter la fécondation et on évalue le nombre d'embryons formés après 48 heures de culture. Comme pour l'évaluation de la maturation in vitro, dans cette expérimentation on utilise 10 5 groupes. Dans chaque groupe, les ovocytes matures sont mis en présence d'environ 106 spermatozoïdes compétents dans un milieu de culture auquel on ajoute des compositions selon l'invention qui comportent des substances telles que zinc, inositol, carnitine, mélatonine, cystine et/ou cystéamine selon le même protocole que celui utilisé 15 précédemment. Résultats On vérifie si l'ajout des compositions selon l'invention qui comportent des substances 20 telles que zinc, inositol, carnitine, mélatonine, cystine et/ou cystéamine au milieu de culture améliore le pourcentage des ovules fécondés par rapport au groupe d'ovules présents dans le milieu de culture seul. Essai 3) Développement embryonnaire précoce 25 Pour évaluer les effets des compositions selon l'invention qui comportent des substances telles que zinc, inositol, carnitine, mélatonine, cystine et/ou cystéamine sur le développement embryonnaire précoce on utilise éventuellement la souche CF-1 de souris, car le nombre d'embryons évoluant au stade de blastocyste dans un milieu de culture usuel est faible. Ce modèle permet d'apprécier les effets bénéfiques de ces 30 substances sur le développement embryonnaire précoce. Dans cette expérimentation, on utilise le même protocole : 5 groupes d'embryons sont mis en culture dans différentes conditions. 19 3065225 Résultats On vérifie si l'ajout des compositions selon l'invention qui comportent des substances telles que zinc, inositol, camitine, mélatonine, cystine et/ou cystéamine entraîne une amélioration du développement des embryons à différents stades par rapport au groupe 5 contenant uniquement le milieu de culture. 10 15 20 25 30 20 REVENDICATIONS1. Composition sous forme de liquide, de poudre ou de lyophilisat pour la culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ou pour la fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes, ou pour le développement d'embryons, éventuellement après décongélation des follicules ou des cellules mâles caractérisée en ce qu'elle comprend : au moins deux composés ou au moins trois composés choisis parmi le groupe constitué par : un sel de zinc, de préférence un sel hydrosoluble tel que le chlorure de zinc ou le sulfate de zinc, l'inositol sous l'une quelconque de ses formes stéréoisomériques, de préférence le myo-inositol, ou sous forme de phosphate, de préférence l'inositol triphosphate, notamment sous forme de sel, la carnitine sous l'une de ses formes stéréoisomériques, de préférence la L- carnitine, un sel de carnitine de préférence le chlorhydrate, un dérivé de carnitine de préférence l'acétylcarnitine ou un sel d'un dérivé de carnitine, de préférence SOUS la forme de chlorhydrate, - la mélatonine ou un analogue, un sel acceptable ou un solvate de mélatonine, la cystine sous l'une de ses formes stéréoisomériques, de préférence la L-cystine, un sel de cystine de préférence le chlorhydrate, un dérivé de cystine de préférence l'acétylcystine ou un sel d'un dérivé de cystine, de préférence sous la forme de chlorhydrate, 21 3065225 - la cystéamine, un sel de cystéamine de préférence le chlorhydrate, un dérivé de cystéamine de préférence l'acétylcystéamine ou un sel d'un dérivé de cystéamine, de préférence sous la forme de chlorhydrate, et, le cas échéant, un ou plusieurs composés choisis parmi les composés de la famille des corticoïdes et/ou un ou plusieurs coenzymes clés du métabolisme énergétique, tel que le NAD/NADH et le NADP/NADPH 10 et en ce qu'elle est dépourvue de cytokine. 2. Composition sous forme de liquide pour la culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ou pour la fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes, ou pour le développement 15 d'embryons, éventuellement après décongélation des follicules ou des cellules mâles caractérisée en ce qu'elle comprend : au moins deux composés ou au moins trois composés choisis parmi le groupe constitué par : 20 une concentration de 0,5 à 1,5 tg/ml, exprimée en zinc élément, sulfate de zinc, notamment à une concentration de 0,1 à 3 tg/ml, de préférence à un sel de zinc, de préférence un sel hydrosoluble tel que le chlorure de zinc ou le 25 l'inositol sous l'une quelconque de ses formes stéréoisomériques, de préférence le myo-inositol, ou sous forme de phosphate, de préférence l'inositol triphosphate, notamment sous forme de sel, notamment à une concentration de 1,8 à 18 mg/ml, de préférence à une concentration de 5 à 10 mg/ml, exprimée en inositol, 30 la carnitine sous l'une de ses formes stéréoisomériques, de préférence la L- carnitine, un sel de carnitine de préférence le chlorhydrate, un dérivé de carnitine de préférence l'acétylcarnitine ou un sel d'un dérivé de carnitine, de préférence sous la forme de chlorhydrate, notamment à une concentration de 0,1 à 2 mg/ml, de préférence de 0,5 à 1 mg/ml, exprimée en carnitine base, 22 3065225 acceptable ou un solvate de mélatonine à 10-5 M de préférence de 100 à 10-6 M primée en mélatonine base, la cystine sous l'une de ses formes stéréoisomériques, de préférence la L-cystine, un sel de cystine de préférence le chlorhydrate, un dérivé de cystine de préférence l'acétylcystine ou un sel d'un dérivé de cystine, de préférence sous la forme de chlorhydrate, notamment à une concentration de 20 à 100 tg/ml de cystine et de 10 préférence de 35 à 60 tg/ml exprimée en cystine base, la cystéamine, un sel de cystéamine de préférence le chlorhydrate, un dérivé de cystéamine de préférence l'acétylcystéamine ou un sel d'un dérivé de cystéamine, de préférence sous la forme de chlorhydrate, notamment à une concentration de 15 1,5 à 15 ig/m1 de cystéamine et de préférence de 4 à 12 mg/mi exprimée en cystéamine base, et, le cas échéant, et/ou un ou plusieurs composés choisis parmi les composés de la famille des corticoïdes 20 un ou plusieurs coenzymes clés du métabolisme énergétique, tel que le NAD/NADH et le NADP/NADPH et en ce qu'elle est dépourvue de cytokine. 3. Composition selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce qu'elle comprend au 25 moins un composé de la famille des corticoïdes, de préférence de l'hydrocortisone sous forme de sel hydrosoluble tel que l'hémisuccinate d'hydrocortisone, le succinate de sodium d'hydrocortisone et le phosphate de sodium d'hydrocortisone. 4. Composition selon la revendication 1, 2 ou 3 caractérisée en ce qu'elle comprend 30 au moins un sel de zinc sous forme hydratée ou anhydre choisi parmi les sels suivants : chlorure de zinc, sulfate de zinc, gluconate de zinc, picolinate de zinc, citrate de zinc, acétate de zinc, lactate de zinc, stéarate de zinc, de préférence un sel hydrosoluble comme le sulfate de zinc ou le chlorure de zinc. la mélatonine ou un analogue, un sel notamment à une concentration de 10-1I et notamment de 10-9 à 10-7M ex 23 3065225 5. Composition selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme de lyophilisat. 6. Application des compositions selon l'une des revendications 1 à 5, en tant qu'adjuvants effecteurs pour la préparation de milieux pour la culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ou pour la fécondation in vitro des ovocytes par les Spermatozoïdes, ou pour la culture d'embryons, éventuellement après décongélation 10 des follicules ou des cellules mâles, lesdits milieux de culture in vitro comprenant une composition selon l'une des revendications 1 à 5 en mélange avec une solution aqueuse contenant les éléments utilisés dans le cadre de la fécondation in vitro, ou de la culture des follicules, cellules mâles, ou embryons, lesdits éléments étant choisis notamment parmi les sérums albumines humaine ou bovine, le cas échéant 15 recombinantes, et/ou les sels minéraux, et/ou les molécules énergétiques telles que le glucose, le pyruvate, le citrate et le lactate, et/ou les aminoacides pour la biosynthèse des protéines, et/ou les bases puriques et pyrimidiques pour la biosynthèse des acides nucléiques, et/ou des phospholipides ou du cholestérol pour la formation des membranes cellulaires, et/ou des vitamines, telles que des 20 vitamines du groupe B, notamment la vitamine Bl, la vitamine B2, la vitamine B3, la vitamine B5, la vitamine B6, la vitamine B9, la vitamine B12, et/ou de la vitamine C et/ou de la vitamine E, et éventuellement de l'insuline et/ou éventuellement un ou plusieurs facteurs de croissance choisis notamment parmi le GM-CSF, l'IGF-1, l'IGF-2, l'EGF, le TGF ou le LIF et de préférence le GM-CSF 25 et/ou au moins un antibiotique. 7. Milieux pour la culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ou pour la fécondation in vitro des 30 ovocytes par les spermatozoïdes, ou pour la culture d'embryons, éventuellement après décongélation des follicules ou des cellules mâles, lesdits milieux de culture in vitro étant tels qu'obtenus par le procédé consistant à associer une composition sous forme de liquide, de poudre ou de lyophilisat selon l'une des revendications 1 à 5 avec une solution aqueuse contenant les éléments utilisés dans le cadre de la 24 3065225 fécondation in vitro, ou lesdits éléments étant revendication 6. de la culture des follicules, cellules mâles, ou embryons, choisis notamment parmi les éléments décrits à la 8. Milieux pour la culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ou pour la fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes, ou pour la culture d'embryons, éventuellement 10 après décongélation des follicules ou des cellules mâles, lesdits milieux étant caractérisés en ce qu'ils comprennent les éléments d'une composition selon l'une des revendications 1 à 5 en mélange avec les éléments utilisés dans le cadre de la fécondation in vitro, ou de la culture des follicules, cellules mâles, ou embryons, lesdits éléments étant tels que définis dans la revendication 6. 15 9. Procédé in vitro de maturation de follicules de mammifères en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules et plus particulièrement de follicules humains, le cas échéant après décongélation des follicules préalablement congelés, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en culture in vitro de follicules prélevés chez la 20 femelle et plus particulièrement chez la femme, dans un milieu de culture selon la revendication 8, avantageusement pendant environ 24 à 48 heures. 10. Kit pour la préparation extemporanée d'un milieu selon la revendication 8, notamment dans le cadre de la mise en oeuvre d'un procédé selon la revendication 9, 25 caractérisé en ce qu'il comprend : - une composition sous forme de liquide, de poudre ou de lyophilisat selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, - et une solution aqueuse contenant les éléments utilisés dans le cadre de la culture de follicules, cellules mâles ou embryons, tels que définis dans la revendication 6. 5 25