Brevet FR3071609A1 — publié le 20190329

Procédé de détection de microorganismes dans un échantillon Description DOMAINE TECHNIQUE Le domaine technique de l'invention est la détection de microorganismes, notamment des levures, dans une matrice, en particulier une matrice solide ou liquide. ART ANTERIEUR L'utilisation de microorganismes tels des levures ou des bactéries, ou leurs dérivés, trouve de nombreuses applications dans de nombreux domaines. Dans le domaine de l'agroalimentaire, par exemple, l'utilisation de levures est répandue dans différents secteurs, tels la boulangerie, la production de vin, la brasserie ou encore la fabrication de produits laitiers. L'application de levures ou de bactéries concerne de nombreux aliments par le biais de probiotiques, ces derniers étant par exemple ajoutés à des céréales ou à des aliments pour animaux. En dehors de l'agroalimentaire, de nombreux domaines industriels peuvent mettre en oeuvre des microorganismes. Il s'agit par exemple de l'agriculture ou de l'horticulture, avec le développement de produits phytosanitaires ou de fertilisants plus respectueux de l'environnement, ou encore de la production de biocombustibles obtenus à partir de végétaux. D'autres applications concernent le domaine de la pharmacie et du diagnostic médical. Lorsque des levures sont incorporées dans un produit, par exemple un produit alimentaire, il peut être nécessaire de vérifier la quantité des levures ajoutées, à des fins de contrôle qualité. Les contrôles peuvent par exemple être élaborés au microscope, sur des échantillons. Il s'agit d'un contrôle fastidieux, effectué visuellement par un opérateur. Il est difficilement automatisable. De plus, le champ d'observation d'un microscope étant réduit, il est nécessaire de déplacer relativement l'échantillon par rapport au microscope de façon examiner une surface significative de l'échantillon. Les inventeurs ont proposé une alternative à cette méthode, de façon à effectuer détection automatisable de microorganismes, telles des levures, dans un échantillon complexe. L'objectif est par exemple d'obtenir une détermination rapide et automatisable du nombre, ou de la concentration, de levures présentes dans cet échantillon. EXPOSE DE L'INVENTION 2 Un premier objet de l'invention est un procédé de détection de microorganismes dans un échantillon, l'échantillon comportant également des particules dites alimentaires, formées à partir d'aliments, le procédé comportant les étapes suivantes : a) illumination de l'échantillon à l'aide d'une source de lumière, la source de lumière 5 émettant une onde lumineuse incidente se propageant vers l'échantillon selon un axe de propagation; b) acquisition, à l'aide d'un capteur d'image, d'une image de l'échantillon, formée dans un plan de détection, l'échantillon étant disposé entre la source de lumière et le capteur d'image, l'image acquise étant représentative d'une onde lumineuse d'exposition, à 10 laquelle est exposé le capteur d'image sous l'effet de l'illumination ; le procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend également les étapes suivantes : c) obtention d'une image d'observation de l'échantillon à partir de l'image acquise lors de l'étape b) et sélection, dans l'image d'observation, de régions d'intérêt, chaque région d'intérêt correspondant à une particule d'intérêt, susceptible de correspondre à un 15 microorganisme; d) détermination de positions radiales, dans un plan parallèle au plan de détection, des particules d'intérêt correspondant aux différentes régions d'intérêt sélectionnées; e) à partir de l'image acquise lors de l'étape b), application d'un opérateur de propagation, de façon à calculer au moins une grandeur caractéristique de l'onde lumineuse 20 d'exposition, à chaque position radiale déterminée lors de l'étape d), et cela à une pluralité de distances du plan de détection; f) formation d'un profil, représentant une évolution de la grandeur caractéristique calculée lors de l'étape e) selon un axe parallèle à l'axe de propagation et passant par chaque position radiale déterminée lors de l'étape d), chaque profil étant associé à une 25 particule d'intérêt; g) en fonction de chaque profil formé lors de l'étape f), identification des particules d'intérêt qui correspondent à un microorganisme parmi les particules d'intérêt sélectionnées lors de l'étape c). L'étape c) peut comporter les sous-étapes suivantes : ci) à partir de l'image acquise lors de l'étape b), application d'un opérateur de propagation, de façon à former une image complexe de l'échantillon, dans un plan de reconstruction dans lequel s'étend l'échantillon ; 3 cii) à partir de l'image complexe formée lors de la sous-étape ci), obtention de l'image d'observation de l'échantillon ; ciii) application d'un critère à l'image d'observation, de façon à sélectionner les régions d'intérêt correspondant à des particules d'intérêt, représentatives d'un microorganisme. 5 Par image complexe de l'échantillon, on entend une image représentant une expression complexe représentative de l'onde lumineuse d'exposition dans le plan de reconstruction. L'image d'observation est par exemple obtenue à partir du module et/ou de la phase de l'image complexe de l'échantillon. Lors de la sous-étape ciii), le critère appliqué peut être un critère morphologique, paramétré par 10 une forme et/ou une dimension, de telle sorte que les régions d'intérêt sélectionnées sont celles s'étendant, dans l'image d'observation, selon ladite forme et/ou selon ladite dimension. La sous-étape ciii) peut comporter, pour chaque région d'intérêt sélectionnée: - une définition d'un seuil de niveau de bruit ; - une définition d'un voisinage autour de la région d'intérêt ; 15 - une estimation d'un niveau de bruit dans le voisinage ; de façon à retenir les régions d'intérêt sélectionnées dans le voisinage desquelles le niveau de bruit est inférieur au seuil de niveau de bruit, les autres régions d'intérêt étant rejetées. La sous-étape ciii) peut comporter, pour chaque région d'intérêt sélectionnée : - une définition d'une plage d'acceptation de niveaux d'intensité ; 20 - un calcul d'un niveau d'intensité représentatif de chaque région d'intérêt ; de façon à retenir les régions d'intérêt sélectionnées pour lesquelles le niveau d'intensité est compris dans la plage d'acceptation, les autres régions d'intérêt étant rejetées. L'étape g) peut comporter une détermination d'au moins un paramètre de chaque profil, l'identification des microorganismes étant effectuée en fonction dudit paramètre. Le paramètre 25 est par exemple une valeur minimale du profil. L'étape e) peut comporter une formation d'une pile d'images complexes, chaque image complexe étant représentative d'une expression complexe de l'onde lumineuse d'exposition, dans un plan de reconstruction. Les images complexes de la pile d'image complexes sont de préférence formées selon des plans de reconstruction parallèles les uns aux autres, et 30 s'étendant entre le plan de détection et un plan de l'échantillon, selon lequel s'étend l'échantillon,et/ou de part et d'autre du plan de l'échantillon. Le procédé peut comporter une détermination du plan de l'échantillon en mettant en oeuvre un algorithme de focalisation numérique. 4 Lors de l'étape f), la propriété optique peut être obtenue à partir du module ou de la phase d'une expression complexe représentative de l'onde lumineuse d'exposition. Les microorganismes peuvent être des levures. L'échantillon peut être obtenu par broyage d'un aliment comportant des microorganismes. 5 Le procédé peut comporter une étape h) de comptage des microorganismes identifiés lors de l'étape g). Un autre objet de l'invention est un dispositif pour l'identification de microorganismes disposés dans un échantillon, le dispositif comportant: une source de lumière apte à émettre une onde lumineuse incidente se propageant 10 vers l'échantillon; un capteur d'image ; un support, configuré pour maintenir l'échantillon entre la source de lumière et le capteur d'image ; - un processeur, configuré pour recevoir une image de l'échantillon acquise par le capteur 15 d'image et à mettre en oeuvre les étapes c) à g) d'un procédé selon le premier objet de l'invention. D'autres avantages et caractéristiques ressortiront plus clairement de la description qui va suivre de modes particuliers de réalisation de l'invention, donnés à titre d'exemples non limitatifs, et représentés sur les figures listées ci-dessous. 20 FIGURES La figure 1 représente un exemple de dispositif selon l'invention. La figure 2 illustre les principales étapes d'un procédé permettant d'identifier des microorganismes, dans un échantillon comportant des particules n'étant pas des microorganismes, par exemple des particules formées à partir d'aliments. 25 La figure 3A est une image au microscope d'un échantillon utilisé lors d'essais expérimentaux. La figure 3B est une image d'observation de l'échantillon, représentant le module d'une image complexe. L'image complexe est obtenue par une reconstruction holographique à partir d'une image acquise selon une configuration sans lentille. L'image d'observation représentée sur la figure 3B montre une sélection de régions d'intérêt en fonction d'un premier critère 30 morphologique. La figure 3C est l'image d'observation de l'échantillon représentée sur la figure 3B, montrant une sélection de régions d'intérêt en fonction du premier critère morphologique ainsi que d'un 5 deuxième critère, basé sur une estimation d'un niveau de bruit dans un voisinage défini autour de chaque région d'intérêt sélectionnée suite à l'application du premier critère morphologique. La figure 3D est l'image d'observation de l'échantillon représentée sur la figure 3B, montrant une sélection de régions d'intérêt en fonction des premier et deuxième critères précédemment 5 évoqués, ainsi que d'un troisième critère basé sur l'intensité des pixels dans chaque région d'intérêt sélectionnée suite à l'application du premier et du deuxième critères. La figure 3E est une image d'observation de l'échantillon représentée sur la figure 3B, montrant une sélection de régions d'intérêt suite à l'application des premier, deuxième et troisième critères précédemment évoqués, ainsi que de l'analyse de profils tels que décrits en lien avec la 10 figure 4A. La figure 4A représente des profils du module d'images complexes reconstruites à différentes distances du plan de détection formé par le capteur d'image, chaque profil passant par le centre des régions d'intérêt, telles que représentées sur la figure 3D, correspondant soit à des microorganismes, soit à des particules n'étant pas des microorganismes, par exemple des 15 particules alimentaires. Chacun de ces profils représente une évolution, en fonction de la distance par rapport au plan de détection, du module d'une expression complexe de l'onde d'exposition, à laquelle est exposé le capteur d'image. La figure 4B représente respectivement, pour des particules correspondant et ne correspondant pas à des microorganismes, une plage de dispersion des profils tels que décrits en lien avec la 20 figure 4A. La figure 4C montre respectivement, pour des particules correspondant et ne correspondant pas à des microorganismes, une plage de variation de la valeur minimale du profil du module. La figure 5A représente des profils de phase d'images complexes reconstruites à différentes distances du plan de détection formé par le capteur d'image, chaque profil passant par le centre 25 des régions d'intérêt, telles que représentées sur la figure 3D, correspondant soit à des microorganismes, soit à des particules n'étant pas des microorganismes, par exemple des particules dites alimentaires. Chacun de ces profils représente une évolution, en fonction de la distance par rapport au plan de détection, de la phase d'une expression complexe de l'onde d'exposition, à laquelle est exposé le capteur d'image. La figure 5B représente respectivement, 30 pour des particules correspondant et ne correspondant pas à des microorganismes, une plage de dispersion des profils tels que décrits en lien avec la figure 5A. EXPOSE DE MODES DE REALISATION PARTICULIERS 6 La figure 1 représente un exemple de dispositif selon l'invention. Une source de lumière 11 est apte à émettre une onde lumineuse 12, dite onde lumineuse incidente, se propageant en direction d'un échantillon 10, selon un axe de propagation Z. L'onde lumineuse est émise selon une bande spectrale d'illumination 4X. 5 L'échantillon 10 est un échantillon que l'on souhaite caractériser. Selon cet exemple, l'échantillon a été prélevé à partir d'un mélange, destiné à la confection d'un aliment pour animal. Le mélange comporte des aliments, par exemple de la matière grasse, de la viande, et des fibres végétales, en particulier sous forme de farine. Le mélange peut également comporter des compléments alimentaires, par exemple des vitamines. Le mélange comporte également 10 des microorganismes, en particulier des bactéries ou levures, utilisées en tant que complément alimentaire, sous forme de probiotiques. Dans cet exemple, le mélange se présente sous la forme d'une pastille solide sèche, communément désigné par le terme "croquette", destinée à être vendue à destination d'un animal domestique. L'échantillon 10 se présente sous la forme d'une poudre, obtenue après broyage du mélange. La poudre comporte différentes particules, 15 correspondant : - soit à un aliment ou à un complément alimentaire, désignées par le terme "particules alimentaires" 100; - soit à des microorganismes 10m. Un objectif de l'invention est d'évaluer une quantité de microorganismes dans l'échantillon. Le 20 terme quantité désigne un nombre ou une concentration. Par microorganisme, on entend notamment une levure, une bactérie, une spore, un champignon ou une cellule, qu'il s'agisse d'une cellule eucaryote ou procaryote, ou une microalgue. L'échantillon 10 est, dans cet exemple, contenu dans une chambre d'analyse 15. La chambre d'analyse 15 est par exemple une chambre de type Gene Frame® d'épaisseur e=250 lm. 25 L'épaisseur e de l'échantillon 10, selon l'axe de propagation Z, varie typiquement entre 10 p.m et 1 cm, et est de préférence comprise entre 20 p.m et 500 p.m. L'échantillon s'étend selon au moins un plan P10, dit plan médian de l'échantillon, perpendiculaire à l'axe de propagation Z. Il est maintenu sur un support 10s à une distance d d'un capteur d'image 16. La concentration de microorganismes peut varier entre quelques millions à quelques dizaines 30 ou centaines de milliards de levures par gramme. La distance D entre la source de lumière 11 et la chambre fluidique 15 est de préférence supérieure à 1 cm. Elle est de préférence comprise entre 2 et 30 cm. Avantageusement, la source 7 de lumière, vue par l'échantillon, est considérée comme ponctuelle. Cela signifie que son diamètre (ou sa diagonale) est préférentiellement inférieur au dixième, mieux au centième de la distance entre la chambre fluidique 15 et la source de lumière. Sur la figure 1, la source de lumière est une diode électroluminescente. Elle est généralement associée à diaphragme 18, ou 5 filtre spatial. L'ouverture du diaphragme est typiquement comprise entre 5 p.m et 1 mm, de préférence entre 50 p.m et 500 p.m. Dans cet exemple, le diaphragme est fourni par Thorlabs sous la référence P150S et son diamètre est de 150 p.m. Le diaphragme peut être remplacé par une fibre optique, dont une première extrémité est placée face à la source de lumière 11 et dont une deuxième extrémité est placée en regard de l'échantillon 10. Le dispositif représenté sur la 10 figure 1 comporte également un diffuseur 17, disposé entre la source de lumière 11 et le diaphragme 18. L'usage d'un tel diffuseur permet de s'affranchir de contraintes de centrage de la source de lumière 11 par rapport à l'ouverture du diaphragme 18. La fonction d'un tel diffuseur est de répartir le faisceau lumineux, produit par une source de lumière élémentaire 11 selon un cône d'angle a. De préférence, l'angle de diffusion a varie entre 10° et 80°. 15 Alternativement, la source de lumière peut être une source laser, telle une diode laser. Dans ce cas, il n'est pas utile de lui associer un filtre spatial ou un diffuseur. De préférence, la bande spectrale d'émission 4X de l'onde lumineuse incidente 12 a une largeur inférieure à 100 nm. Par largeur de bande spectrale, on entend une largeur à mi-hauteur de ladite bande spectrale. 20 Selon un mode de réalisation, la source de lumière 11 comporte plusieurs sources de lumière élémentaires, chacune étant apte à émettre une onde lumineuse incidente dans une bande spectrale 44. De préférence, les bandes spectrales 4Xk des différentes sources de lumière élémentaires sont différentes les unes des autres. L'échantillon 10 est disposé entre la source de lumière 11 et un capteur d'image 16. Ce dernier 25 s'étend de préférence parallèlement, ou sensiblement parallèlement à un plan médian P10 de l'échantillon. Le terme sensiblement parallèlement signifie que les deux éléments peuvent ne pas être rigoureusement parallèles, une tolérance angulaire de quelques degrés, inférieure à 20° ou 10° étant admise. Dans cet exemple, l'échantillon s'étend selon un plan radial XY, perpendiculaire à l'axe de propagation Z. 30 Le capteur d'image 16 est apte à former une image /0 de l'échantillon 10 selon un plan de détection P0. Dans l'exemple représenté, il s'agit d'un capteur d'image comportant une matrice de pixels, de type CCD ou un CMOS. Le plan de détection Po s'étend de préférence 8 perpendiculairement à l'axe de propagation Z de l'onde lumineuse incidente 12. La distance d entre l'échantillon 10 et la matrice de pixels du capteur d'image 16 est préférentiellement comprise entre 50 p.m et 2 cm, de préférence comprise entre 100 p.m et 2 mm. On remarque, dans ce mode de réalisation, l'absence d'optique de grossissement ou de 5 formation d'image entre le capteur d'image 16 et l'échantillon 10. Cela n'empêche pas la présence éventuelle de microlentilles de focalisation au niveau de chaque pixel du capteur d'image 16, ces dernières n'ayant pas de fonction de grandissement de l'image acquise par le capteur d'image, leur fonction étant d'optimiser l'efficacité de détection. Sous l'effet de l'onde lumineuse incidente 12, les particules présentes dans l'échantillon peuvent 10 engendrer une onde diffractée 13, susceptible de produire, au niveau du plan de détection Po, des interférences, en particulier avec une partie de l'onde lumineuse incidente 12' transmise par l'échantillon. Par ailleurs, l'échantillon peut absorber une partie de l'onde lumineuse incidente 12. Ainsi, l'onde lumineuse 14, transmise par l'échantillon, et à laquelle est exposé le capteur d'image 16, désignée par le terme "onde d'exposition", peut comprendre : 15 - une composante 13 résultant de la diffraction de l'onde lumineuse incidente 12 par chaque particule de l'échantillon ; - une composante 12' résultant de la transmission de l'onde lumineuse incidente 12 par l'échantillon, une partie de cette dernière pouvant être absorbée dans l'échantillon. Ces composantes forment des interférences dans le plan de détection. Aussi, l'image acquise 20 par le capteur d'image comporte des figures d'interférences (ou figures de diffraction), dues aux différentes particules de l'échantillon. Un processeur 20, par exemple un microprocesseur, est apte à traiter chaque image /0 acquise par le capteur d'image 16, selon les étapes décrites ci-après. En particulier, le processeur est un microprocesseur relié à une mémoire programmable 22 dans laquelle est stockée une séquence 25 d'instructions pour effectuer les opérations de traitement d'images et de calculs décrites dans cette description. Le processeur peut être couplé à un écran 24 permettant l'affichage d'images acquises par le capteur d'image 16 ou calculées par le processeur 20. Une image /0 acquise par le capteur d'image 16, également appelée hologramme, ne permet pas d'obtenir une représentation suffisamment précise de l'échantillon observé. Comme décrit 30 en lien avec l'art antérieur, on peut appliquer, à chaque image acquise par le capteur d'image, un opérateur de propagation holographique h, de façon à calculer une grandeur représentative de l'onde lumineuse d'exposition 14. Il est alors possible de reconstruire une expression 9 complexe A de l'onde lumineuse 14 en tout point de coordonnées (x, y, z) de l'espace, et en particulier dans un plan de reconstruction Pz situé à une distance I z I du capteur d'image 16, dite distance de reconstruction, ce plan de reconstruction étant par exemple le plan P10 selon lequel s'étend l'échantillon, avec : 5 A (x, y, z) = 10(x, y, z) * h * désignant l'opérateur produit de convolution. L'opérateur de propagation h a pour fonction de décrire la propagation de la lumière entre le capteur d'image 16 et un point de coordonnées (x, y, z), situé à une distance I z I du capteur d'image. Il est alors possible de déterminer le module M (x, y, z) et/ou la phase (f) (x, y, z) l'onde lumineuse 14, à cette distance I z i, dite distance de reconstruction, avec : 10 - M(x, y, z) = abs [A (x, y, z)] ; - ço(x, y, z) = arg [A (x, y, z)]. Les opérateurs abs et ar g désignent respectivement le module et l'argument. L'opérateur de propagation est par exemple la fonction de Fresnel-Helmholtz, telle que : 1 1 h(x, y, z) = eJ27 Âexp(j7r x Az ). jAz 15 Autrement dit, l'expression complexe A de l'onde lumineuse 14, en tout point de coordonnées (x, y, z) de l'espace, est telle que : A (x, y, z) = M (x, y, z)e-nP(x'Y'z). Dans la suite de cette description, les coordonnées (x, y) désignent une position radiale dans un plan radial XY perpendiculaire à l'axe de propagation Z. La coordonnée z désigne une coordonnée selon l'axe de propagation Z. 20 L'expression complexe A est une grandeur complexe dont l'argument et le module sont respectivement représentatifs de la phase et de l'intensité de l'onde lumineuse 14 d'exposition détectée par le capteur d'image 16. Le produit de convolution de l'image /0 par l'opérateur de propagation h permet d'obtenir une image complexe AZ représentant une distribution spatiale de l'expression complexe A dans un plan de reconstruction Pz, s'étendant à une distance I z I du 25 plan de détection P0. Dans cet exemple, le plan de détection Po a pour équation z = O. L'image complexe AZ correspond à une image complexe de l'échantillon dans le plan de reconstruction P. Elle représente également une distribution spatiale bidimensionnelle de l'expression complexe de l'onde d'exposition 14. Un tel procédé, désigné par le terme reconstruction holographique, permet notamment de reconstruire une image du module ou de la phase de 30 l'onde lumineuse d'exposition 14 dans le plan de reconstruction. Pour cela, on peut former des images Mz et (pz représentant respectivement le module ou la phase de l'image complexe AZ, avec Mz = mod (AZ) et (pz = arg(Az). 10 Les inventeurs ont mis au point un procédé de détection de microorganismes, par exemple des levures, ce procédé étant décrit en lien avec la figure 2, et dont certains résultats sont illustrés sur les figures 3B à 3E, 4A à 4C, 5A et 5B. Ces résultats ont été obtenus selon les conditions expérimentales suivantes : 5 - Echantillon 10 : il est obtenu par broyage d'une croquette destinée à l'alimentation animale. Il comporte des levures de type Saccharomyces cerevisiae. La concentration est d'environ 3 1010 levures par gramme. - Source de lumière 11 : diode électroluminescente Cree MC-E Color, comportant trois diodes électroluminescentes pouvant être simultanément ou successivement activées, 10 chaque diode émettant respectivement dans les bandes spectrales 4X suivantes : 450nm - 465 nm ; 520nm - 535 nm ; 620nm - 630 nm. Dans les essais qui suivent, seule la bande spectrale 620nm - 630 nm a été mise en oeuvre. - Capteur d'image 16 : Capteur 8 bits CMOS monochrome 3884 x 2764 pixels, chaque pixel mesurant 1.67 p.m de côté, la surface de détection s'étendant sur environ 30 mm2. 15 Compte tenu de l'épaisseur de la chambre fluidique, le volume d'échantillon adressé par chaque image s'élève à 7.5 p.m3. - Distance D entre la source de lumière 11 et l'échantillon 10 : 5 cm. - Distance d entre l'échantillon 10 et le capteur d'image 16 : 1000 p.m. - Epaisseur e de la chambre fluidique 15 : 250 p.m. 20 - Diamètre de l'ouverture du filtre spatial 18 : 150 p.m. Les principales étapes du procédé d'identification et de numération des microorganismes présents dans l'échantillon sont : - L'acquisition, par le capteur d'image, d'une image /0 de l'échantillon dans une ou plusieurs bandes spectrales d'illumination. 25 - A partir de l'image acquise, l'application d'un opérateur holographique pour obtenir une image complexe représentative de l'onde lumineuse d'exposition 14, dans un plan de reconstruction. - La formation d'une image d'observation à partir de l'image complexe et sélection, sur l'image d'observation, de régions d'intérêt ROLL correspondant à des particules, dites 30 particules d'intérêt 101, chaque particule d'intérêt étant susceptible de correspondre à un microorganisme 10m. Cette sélection est effectuée en prenant en compte au moins un critère, par exemple un critère morphologique, et en appliquant le critère à l'image d'observation. 11 - La détermination de coordonnées radiales (xi, yi), de chaque région d'intérêt ROLL ainsi sélectionnée, le terme "radial" signifiant dans un plan parallèle au plan de détection. - A partir de l'image acquise /0, le calcul d'une grandeur caractéristique, par exemple le module ou la phase, de l'onde lumineuse d'exposition 14, à différentes distances de 5 l'échantillon, dites distances de reconstruction ; cela peut notamment passer par l'obtention d'une pile d'images complexes représentant l'onde lumineuse d'exposition 14, les images complexes s'étendant selon des plans parallèles disposés entre le plan de détection Po et le plan de l'échantillon P10. - Pour chaque coordonnée radiale correspondant à une région d'intérêt, le calcul d'un 10 profil représentant une évolution de la grandeur caractéristique en fonction de la distance de reconstruction, chaque profil étant associé à une particule d'intérêt. - A partir des profils respectivement associés à chaque particule d'intérêt, l'identification des particules d'intérêt correspondant à un microorganisme et des particules d'intérêt ne correspondant pas à un microorganisme. 15 Étape 100 : Acquisition d'une image /0 de l'échantillon 10 par le capteur d'image 16, cette image formant un hologramme. Un des intérêts de la configuration sans lentille, représentée sur la figure 1, est le large champ observé, permettant d'adresser simultanément un volume d'échantillon élevé. Cela permet d'observer simultanément plusieurs microorganismes, et ainsi d'obtenir une caractérisation rapide de l'échantillon. Le champ observé dépend de la taille du 20 capteur d'image, en étant légèrement inférieur à la surface de détection de ce dernier, du fait de l'espacement entre les pixels du capteur et l'échantillon. Le champ observé est généralement supérieur à 10 mm2, et est typiquement compris entre 10 mm2 et 50 mm2, ce qui est significativement plus élevé qu'avec un microscope. Étape 110: Formation d'une image d'observation. 25 Du fait de l'absence d'optique de formation d'image, l'image acquise /0 peut comporter un grand nombre de figures d'interférence, et peut ne pas être aisément exploitable pour identifier les particules présentes dans l'échantillon. Les particules sont plus facilement identifiables à partir d'une image complexe reconstruite, dans un plan de reconstruction, par application d'un opérateur de propagation holographique à l'image acquise. Dans cet exemple, cette image 30 complexe est notée A10. Elle est obtenue en effectuant une reconstruction holographique dans un plan de reconstruction à une image obtenue à partir de l'image acquise I. Le plan de reconstruction est avantageusement perpendiculaire à l'axe de propagation Z, et/ou parallèle 12 au plan de détection Po. Il s'agit de préférence d'un plan P10 selon lequel s'étend l'échantillon 10, par exemple un plan médian dans lequel s'étendent la majorité des particules. L'image complexe reconstruite A10 est une image complexe comportant des informations de phase et d'amplitude de l'onde lumineuse 14 à laquelle est exposé le capteur d'image 16. En 5 effet, c'est généralement dans ce plan que la résolution spatiale d'une image complexe reconstruite est la meilleure, un tel principe étant à la base des algorithmes dits de focalisation numérique. La coordonnée z du plan de de l'échantillon P10 est déterminée soit a priori, notamment lorsque la position de l'échantillon 10 est maîtrisée par rapport au capteur d'image 16, soit par le biais d'une focalisation numérique. La focalisation numérique permet de définir 10 un plan de focalisation Pfo,' en reconstruisant plusieurs images complexes, à différentes distances, et en définissant un critère de netteté de chaque image reconstruite. Le plan de focalisation Pfo,' correspond à celui dans lequel l'image reconstruite présente un critère de netteté optimal. Il correspond au plan médian de l'échantillon P10, dans lequel s'étend une majorité des microorganismes. L'image complexe A10 est alors formée dans un plan de 15 reconstruction P10 correspondant au plan de focalisation Pfoc'. Pour effectuer la reconstruction, une première solution est d'appliquer l'opérateur de propagation h à l'image acquise /0, ou à la racine carrée de l'image acquise j, éventuellement normalisée par la valeur moyenne /0 de l'image acquise. Cependant, l'image acquise /0 ne comporte pas d'information relative à la phase de l'onde d'exposition 14. De ce fait, la 20 reconstruction holographique s'effectue sur la base d'une information optique incomplète, basée uniquement sur l'intensité de l'onde lumineuse collectée sur le capteur d'image. Il en résulte l'apparition d'un bruit de reconstruction, affectant l'image complexe reconstruite. L'amélioration de la qualité de la reconstruction holographique a fait l'objet de nombreux développements, en mettant en oeuvre des algorithmes fréquemment dénommés « Phase 25 retrieval », permettant une estimation de la phase de l'onde lumineuse à laquelle le capteur d'image est exposé. Ce type d'algorithme permet de limiter le bruit de reconstruction affectant l'image complexe reconstruite A10. Un exemple d'algorithme utilisable est par exemple décrit dans US2012/0218379. Selon une possibilité, l'échantillon est illuminé successivement ou simultanément dans 30 différentes bandes spectrales Ailk, et on acquiert, dans le plan de détection P0, une image /0(Ailk) représentative de chaque bande spectrale. L'algorithme permet d'obtenir une image complexe 1110(Ailk) de l'échantillon 10, dans le plan de reconstruction P10, dans chaque bande 13 spectrale Adik. Les images complexes ainsi obtenues peuvent être combinées, par exemple en effectuant une moyenne, en chaque pixel, de leur module et de leur phase, ce qui permet de former l'image complexe A10. Alternativement, l'image complexe reconstruite est une image complexe 1110(Ailk) dans une bande spectrale Ailk. Un tel algorithme a été décrit dans la 5 publication S. N. A. Morel, A. Delon, P. Blandin, T. Bordy, O. Cioni, L. Hervé, C. Fromentin, J. Dinten, and C. Allier, "Wide-Field Lensfree Imaging of Tissue Slides," in Advanced Microscopy Techniques IV; and Neurophotonics II, E. Beaurepaire, P. So, F. Pavone, and E. Hillman, eds., Vol. 9536 of SPIE Proceedings (Optical Society of America, 2015) ainsi que dans la demande de brevet FR1554811 déposée le 28 mai 2015, et plus précisément dans les étapes itératives 100 à 500 10 décrites dans cette demande. On a montré que l'utilisation de deux ou trois bandes spectrales différentes permet d'obtenir une bonne qualité de reconstruction. Une autre possibilité, qui correspond au mode de réalisation préféré, est de reconstruire une image complexe en se basant sur une image acquise de l'échantillon lorsque ce dernier est illuminé dans une seule bande spectrale 4X. L'image complexe peut être obtenue en utilisant 15 un algorithme itératif tel que décrit dans la demande de brevet FR1652500 déposée le 23 mars 2016, et plus précisément selon les étapes 110 à 160 décrites dans ladite demande de brevet. Comme précédemment mentionné, l'image complexe reconstruite A10 correspond à une distribution bidimensionnelle de l'expression complexe de l'onde lumineuse d'exposition 14. A partir de cette image, on peut former une image d'observation I permettant une observation 20 de l'échantillon. L'image d'observation I est une distribution bidimensionnelle d'une grandeur obtenue à partir de l'image complexe. Il peut par exemple s'agir d'une image M10 du module de l'image complexe A10 ou une image cp, de la phase de l'image complexe A10. A partir de l'image d'observation, on peut effectuer une sélection de régions d'intérêt ROI1 représentatives de particules d'intérêt 101. Comme précédemment évoqué, une particule 25 d'intérêt ROI1 correspond à une particule d'intérêt 101 susceptible de correspondre à un microorganisme 10m. La figure 3A montre une image de l'échantillon précédemment décrit réalisée au microscope. Sur cette image, on peut observer des particules, se présentant sous la forme de points foncés. Les particules correspondant à un microorganisme sont encadrées par un cadre blanc. Bien que 30 longue et fastidieuse, l'observation de l'échantillon au microscope est précise, et peut être considérée comme une méthode de référence. 14 La figure 3B représente une image d'observation de l'échantillon, telle que précédemment décrite. L'image d'observation correspond ici au module de l'image de l'expression complexe de l'onde lumineuse d'exposition. Elle permet une représentation satisfaisante de l'échantillon, comparable à l'image réalisée au microscope. L'avantage de l'image d'observation est que le 5 champ observé est plus important, par exemple 20 fois plus important, que l'image réalisée au microscope muni d'un objectif x10. L'image représentée sur la figure 3B correspond à une partie d'une image d'observation, correspondant au champ du microscope. Etape 120: sélection de régions d'intérêt sur l'image d'observation. Cette étape vise à détecter, dans l'image d'observation, des régions d'intérêt ROI1, chaque 10 région d'intérêt correspondant à une particule d'intérêt 101. La détection de chaque région d'intérêt ROLL est effectuée soit manuellement par un opérateur, soit automatiquement, par une analyse morphologique sur l'image d'observation I, en mettant par exemple en oeuvre des algorithmes basés sur une corrélation spatiale avec des formes de régions d'intérêt prédéterminées peuvent également être mis en oeuvre. On prend en compte le fait que chaque 15 micro-organisme 10m peut être associé, dans l'image d'observation, à une région d'intérêt ROLL de forme prédéterminée, pouvant être aisément détectée. Il peut par exemple s'agir d'une forme circulaire ou ellipsoïdale, ou autre. Pour cela, le procédé peut détecter automatiquement chaque région d'intérêt ROLL en prenant compte un ou plusieurs critères morphologiques correspondant à un microorganisme. A chaque région d'intérêt ROLL détectée correspond au 20 moins une particule d'intérêt 101, susceptible de correspondre soit à un microorganisme 10m, soit à un autre type de particule 10e. L'image de la figure 3B montre une sélection de régions d'intérêt résultant d'une détection automatique de taches dont le diamètre est compris entre 3 p.m et 10 pm, et présentant une excentricité comprise entre 0.9 et 1, une excentricité de 1 correspondant à une tache circulaire. Ces critères de forme et de dimension correspondent à un 25 premier critère morphologique. Les régions d'intérêt sélectionnées, sur la base de premier critère, apparaissent sur la figure 3B sous la forme de taches claires. Les régions d'intérêt encadrées sont celles définies par la méthode de référence, en lien avec la figure 3A, comme correspondant à un microorganisme. On observe un nombre élevé de faux positifs, ces derniers correspondant aux taches claires non encadrées. On observe également quelques faux négatifs, 30 ces derniers correspondant à des taches sombres encadrées, non détectées par l'analyse morphologique, bien que correspondant à des microorganismes. Afin de réduire davantage le nombre de faux positifs, on a appliqué, aux régions d'intérêt détectées suite à l'application du premier critère morphologique, un deuxième critère d'analyse 15 d'image, basé, pour chaque région d'intérêt, sur une estimation d'un niveau de bruit à l'extérieur de la région d'intérêt, à la périphérie de cette dernière. Pour cela, autour de chaque région d'intérêt ROIi, on définit un voisinage V1. On estime ensuite l'écart type o-(Vi) de l'intensité des pixels dans chaque voisinage V1. L'écart type est supposé être représentatif du niveau de bruit. 5 Une région d'intérêt, détectée suite à l'application du premier critère, est confirmée lorsque le niveau de bruit dans le voisinage de cette dernière, est inférieur un certain seuil. Les régions d'intérêt ne satisfaisant pas au deuxième critère sont rejetées. La figure 3C représente les régions d'intérêt sélectionnées par l'application combinée du premier critère morphologique et du critère de niveau de bruit au voisinage de chaque région d'intérêt. Le nombre de faux positifs 10 est inférieur par rapport au résultat représenté sur la figure 3B. Afin de réduire davantage le nombre de faux positifs, on a appliqué, aux régions d'intérêt détectées suite à l'application des premier et deuxième critères, un troisième critère d'analyse d'image, basé sur une intensité moyenne (c'est-à-dire le niveau de gris moyen), des pixels de chaque région d'intérêt ROIi. Pour cela, on définit une plage d'acceptation, correspondant aux 15 intensités moyennes de régions d'intérêt correspondant aux microorganismes recherchés. Dans cet exemple, on considère qu'une région d'intérêt peut correspondre à un microorganisme lorsque son intensité moyenne est supérieure à 20, sur une plage de 256 niveaux de gris (8 bits). Les régions d'intérêt ne satisfaisant pas au troisième critère sont rejetées. La figure 3D représente les régions d'intérêt ROIi sélectionnées par l'application combinée des premier, 20 deuxième et troisième critères décrits ci-dessus. Le nombre de faux positifs est inférieur par rapport au résultat représenté sur la figure 3C. Pour chaque région d'intérêt ROIi ainsi sélectionnée, sur l'image d'observation I, on détermine une position dans le plan radial XY, c'est-à-dire dans un plan parallèle au plan de détection. La position (x1, yi) de chaque région d'intérêt ROIi peut par exemple être obtenue par le calcul de 25 son centroïde. L'étape 120 permet une sélection de régions d'intérêt ROIi, sur la base de l'image d'observation I, en prenant en compte un ou plusieurs critères. Les étapes suivantes, décrites ci-après, permettent d'affiner la sélection, de façon à identifier, parmi les régions d'intérêt sélectionnées, celles correspondant à un microorganisme. 30 Etape 130: construction d'une pile d'images complexes. Cette étape comporte une reconstruction de plusieurs images complexes en effectuant des reconstructions numériques à différentes distances z du plan de détection P0, et en particulier 16 entre le plan de détection Po et le plan de l'échantillon P10, et/ou de part et d'autre du plan de l'échantillon. Les inventeurs ont estimé qu'il était préférable d'obtenir des images complexes secondaires de part et d'autre de l'échantillon, de telle sorte que zin in REVENDICATIONS1. Procédé de détection de microorganismes (10m) dans un échantillon, l'échantillon comportant également des particules dites alimentaires (100), formées à partir d'aliments, le 5 procédé comportant les étapes suivantes : a) illumination de l'échantillon à l'aide d'une source de lumière (11), la source de lumière émettant une onde lumineuse incidente (12) se propageant vers l'échantillon (10) selon un axe de propagation (Z) ; b) acquisition, à l'aide d'un capteur d'image (16), d'une image (In) de l'échantillon (10), 10 formée dans un plan de détection (P0), l'échantillon étant disposé entre la source de lumière (11) et le capteur d'image (16), l'image acquise étant représentative d'une onde lumineuse (14) d'exposition, à laquelle est exposé le capteur d'image (16) sous l'effet de l'illumination ; le procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend également les étapes suivantes : 15 c) obtention d'une image d'observation (I) de l'échantillon à partir de l'image acquise lors de l'étape b) et sélection, dans l'image d'observation, de régions d'intérêt (R0I1), chaque région d'intérêt correspondant à une particule d'intérêt (101), susceptible de correspondre à un microorganisme (10m) ou à une particule alimentaire (100); d) détermination de positions radiales (xi, yi), dans un plan parallèle au plan de détection, 20 des particules d'intérêt (101) correspondant aux différentes régions d'intérêt sélectionnées; e) à partir de l'image acquise (In) lors de l'étape b), application d'un opérateur de propagation (h), de façon à calculer au moins une grandeur caractéristique (M, (p) de l'onde lumineuse d'exposition (14), à chaque position radiale (xi, yi) déterminée lors de 25 l'étape d), et cela à une pluralité de distances (z) du plan de détection (P0); f) formation d'un profil (M1(z), (pi(z)), représentant une évolution de la grandeur caractéristique calculée lors de l'étape e) selon un axe parallèle à l'axe de propagation (Z) et passant par chaque position radiale (xi, yi) déterminée lors de l'étape d), chaque profil étant associé à une particule d'intérêt (101); 30 g) en fonction de chaque profil formé lors de l'étape f), identification des particules d'intérêt qui correspondent à un microorganisme (10m) parmi les particules d'intérêt (101) sélectionnées lors de l'étape c). 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'étape c) comporte les sous-étapes suivantes : 21 ci) à partir de l'image acquise lors de l'étape b), application d'un opérateur de propagation (h), de façon à former une image complexe de l'échantillon (A10), dans un plan de reconstruction dans lequel s'étend l'échantillon ; cii) à partir de l'image complexe formée lors de la sous-étape ci), obtention de l'image d'observation (I) de l'échantillon ; ciii) application d'un critère à l'image d'observation obtenue lors de la sous-étape cii), de façon à sélectionner les régions d'intérêt (RO Ii) correspondant à des particules d'intérêt, représentatives d'un microorganisme ; 3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel lors de la sous-étape ciii), le critère appliqué est 10 un critère morphologique, paramétré par une forme et/ou une dimension, de telle sorte que les régions d'intérêt sélectionnées sont celles s'étendant, dans l'image d'observation, selon ladite forme et/ou selon ladite dimension. 4. Procédé selon la revendication 3, dans lequel la sous-étape ciii) comporte, pour chaque région d'intérêt (ROI i) sélectionnée: 15 - une définition d'un seuil de niveau de bruit ; - une définition d'un voisinage (V1) autour de la région d'intérêt ; - une estimation d'un niveau de bruit (o-(Vi)) dans ledit voisinage ; de façon à retenir les régions d'intérêt sélectionnées dans le voisinage desquelles le niveau de bruit est inférieur au seuil de niveau de bruit, les autres régions d'intérêt étant rejetées. 20 5. Procédé selon la revendication 3 ou la revendication 4, dans lequel la sous-étape ciii) comporte, pour chaque région d'intérêt (ROI i) sélectionnée : - une définition d'une plage d'acceptation de niveaux d'intensité ; - un calcul d'un niveau d'intensité représentatif de chaque région d'intérêt ; de façon à retenir les régions d'intérêt sélectionnées pour lesquelles le niveau d'intensité est 25 compris dans la plage d'acceptation, les autres régions d'intérêt étant rejetées. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'étape e) comporte une formation d'une pile d'images complexes (11,....Azmax), chaque image complexe correspondant à une expression complexe de l'onde lumineuse d'exposition (14), dans un plan de reconstruction, les images complexes de la pile d'images complexes étant respectivement 30 formées dans des plans de reconstruction s'étendant entre le plan de détection (P0) et le plan de l'échantillon (P10), selon lequel s'étend l'échantillon, et/ou de part et d'autre du plan de l'échantillon. 22 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'étape g) comporte une détermination d'au moins un paramètre de chaque profil, l'identification des microorganismes étant effectuée en fonction dudit paramètre. 8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel le paramètre est une valeur minimale du profil. 5 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel lors de l'étape f), la propriété optique est obtenue à partir du module d'une expression complexe représentative de l'onde lumineuse d'exposition (14). 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les microorganismes sont des levures. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'échantillon est obtenu par broyage d'un aliment comportant des microorganismes. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comportant une étape h) de comptage des microorganismes identifiés lors de l'étape g). 13. Dispositif pour l'identification de microorganismes (10m) disposés dans un échantillon (10), le dispositif comportant : une source de lumière (11) apte à émettre une onde lumineuse incidente (12) se propageant vers l'échantillon (10) ; un capteur d'image (16) ; un support (10s), configuré pour maintenir l'échantillon (10) entre la source de lumière (11) et le capteur d'image (16) ; un processeur (20), configuré pour recevoir une image (In) de l'échantillon acquise par le capteur d'image (16) et à mettre en oeuvre les étapes c) à g) d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12.25