Brevet FR3067467A1 — publié le 20181214

Méthode prédictive rapide pour caractériser la radiosensibilité et/ou la réaction tissulaire d'un individu envers une irradiation Domaine technique de l'invention L'invention concerne le domaine de la radiobiologie médicale, et plus particulièrement le domaine des méthodes de laboratoire radiobiologiques. L'invention concerne une nouvelle méthode prédictive de la radiosensibilité cellulaire, tissulaire et clinique qui se base sur la détermination et le recoupement d'un paramètre et de critères cellulaires et enzymatiques ainsi qu'un kit de prédiction de la radiosensibilité cellulaire, tissulaire et clinique d'un individu. Etat de la technique Environ 1 à 15% des patients traités par radiothérapie pour un cancer montrent une réaction tissulaire (tel qu'une dermite ou une rectite) qui peut mettre en jeu le bon déroulement du traitement dans la mesure où elle peut conduire le médecin à décider l'arrêt du traitement radiothérapeutique avant la fin du protocole prévu. Par ailleurs, cette réaction tissulaire est un indicateur d'une sensibilité particulièrement élevée du patient au rayonnement ionisant. Ainsi, le traitement radiothérapeutique, même interrompu au moment de l'apparition des premiers signes tissulaires visibles, peut augmenter la morbidité voire la mortalité post-traitement des patients, non seulement parce que le cancer qu'il était censé traiter n'a pas pu être éradiqué complètement dû à l'arrêt prématuré du traitement, mais encore à cause de l'endommagement collatéral des tissus sains induit par le rayonnement lui-même. On sait également que la question de la sensibilité des tissus au rayonnement ionisant est inséparable de celles des mécanismes de réparation des dommages de l'ADN. En effet, au niveau cellulaire, le rayonnement ionisant peut casser certains types de liaisons chimiques en générant des radicaux libres (en particulier par peroxydation) et d'autres espèces réactives à l'origine des dommages de l'ADN. L'endommagement de l'ADN par des agressions endogènes ou exogènes (telles que les radiations ionisantes et les radicaux libres), peut aboutir à différents types de dommages de l'ADN en fonction notamment de l'énergie déposée : les dommages de bases, les cassures simple-brin et les cassures double-brin (CDB). Les CDB non réparées sont associées à la mort cellulaire, la toxicité et plus spécifiquement la radiosensibilité. Les CDB mal réparées sont associées à l'instabilité génomique, aux phénomènes mutagènes et à la prédisposition au 2 cancer. L'organisme dispose de systèmes de réparation spécifiques à chaque type de dommage de l'ADN. En ce qui concerne les CDB, les mammifères possèdent deux principaux modes de réparation : la réparation par suture (ligation des brins) et la réparation par recombinaison (insertion d'un brin homologue ou non-homologue). 5 On sait que la sensibilité des tissus au rayonnement ionisant est très variable d'un organe à l'autre et d'un individu à l'autre ; l'idée d'une « radiosensibilité intrinsèque » a été conceptualisée par Fertil et Malaise en 1981. Ainsi, les diverses études sur les effets thérapeutiques et les effets secondaires de la radiothérapie ont montré qu'il existe des individus qui jouissent d'une radiorésistance particulièrement élevée, et des individus qui 10 montrent au contraire une radiosensibilité qui peut aller d'un effet secondaire reconnu cliniquement mais sans conséquence jusqu'à un effet létal. Même en dehors de certains rares cas de radiosensibilité extrême, dont l'origine génétique semble avérée, la radiosensibilité semble découler d'une manière générale d'une prédisposition génétique : elle est donc propre à un individu. Il serait donc désirable de disposer d'une méthode 15 d'essai prédictive pour pouvoir déterminer la dose maximale cumulée qu'un individu donné tel qu'un patient donné peut recevoir sans risque. Cette question se pose en premier lieu en radiothérapie dans un contexte de fortes doses ionisantes. Toutefois, cette question est également susceptible de se poser pour toute autre exposition à de fortes doses ionisantes, équivalentes à celles utilisées en radiothérapie. 20 On sait que deux protéines de la famille des kinases, appelées couramment ATM et ATR, sont impliquées dans la détection, la réparation et la signalisation des CDB ; leur action nécessite au moins la présence d'une protéine connue sous la désignation BRCA1 et d'une cascade de phosphorylations ordonnée des différents substrats d'ATM (voir l'article de N. Foray et al., « A subset of ATM- and ATR-dependent phosphotylation events 25 requires the BRCA1 protein », paru dans The EMBO Journal vol. 22(11), p. 2860-2871 (2003)). L'essai a été entrepris d'utiliser l'enzyme ATM dans un modèle explicatif de la radiosensibilité cellulaire (voir Joubert et al., "DNA double-strand break repair defects in syndromes associated with acute radiation response ; At least two different assays to predict intrinsic radiosensitivity ?", paru dans Int. J. Radiat. Biol., vol. 84(2), p. 107-125 30 (2008)), et cela a permis d'identifier trois types de radiosensibilité : les cellules radiorésistantes (radiosensibilité dite de Groupe l), les cellules modérément radiosensibles (radiosensibilité dite de Groupe II), et les cellules extrêmement radiosensibles (radiosensibilité dite de Groupe III). De nombreux documents décrivent les conditions dans lesquelles l'ATM peut contribuer à 35 la détection et la réparation de l'endommagement de l'ADN (Gately et al « Characterization of ATM Expression, Localization, and Associated DNA-dependent Protein Kinase Activity » Molecular biology of the cell 1998; Khalil et al « ATM in focus: A 3 damage sensor and cancer target » biodiscovery, 2012 ; Bhatti et al « ATM protein kinase: the linchpin of cellular defenses to stress » Cellular and Molecular Life Science, 2011; Khoronenkova et Dianov, « ATM prevents DSB formation by coordinating SSB repair and cell cycle progression », PNAS 2014). 5 Ces derniers documents décrivent donc des voies de réparation des CDB induites par irradiation mais n'offrent aucune corrélation pour établir un lien avec les observations et diagnostics cliniques. La demande VVO 2015 / 121 596 Al décrit une méthode prédictive permettant de caractériser la radiosensibilité et la réaction tissulaire d'un patient envers un rayonnement ionisant thérapeutique. Plus particulièrement cette méthode inclut 10 l'irradiation d'un échantillon biologique, la détection et la quantification de foci nucléaires radioinduits sur du tissu conjonctif de type fibroblastique par l'utilisation d'au moins deux marqueurs de détection parmi pH2AX, pATM et MRE11. C'est la seule méthode de l'état de la technique qui permet de quantifier la radiosensibilité individuelle, d'évaluer le risque de réactions tissulaires post-radiothérapie, et qui puisse 15 être employé pour tout patient et tout type de rayonnement ionisant susceptible d'induire des CDB, et qui soit prédictif. Toutefois, cette méthode nécessite un équipement spécifique pour l'irradiation des échantillons cellulaires et la quantification des foci nucléaires radioinduits. En particulier, l'analyse des foci dans des cellules de type lymphocyte est assez difficile à cause de la petite taille de leur noyau et rend cette 20 méthode complexe et chronophage. Le problème que la présente invention cherche à résoudre est de proposer une méthode prédictive permettant de caractériser la radiosensibilité et la réaction tissulaire d'un individu tel qu'un patient envers un rayonnement ionisant, qui soit plus simple à utiliser que celle décrite dans le document VVO 2015 / 121 596 Al . 25 En particulier, la présente invention vise à proposer une nouvelle méthode prédictive rapide, simple et fiable de la radiosensibilité individuelle permettant d'effectuer un criblage des individus tels que des patients et de les orienter si le test est positif vers une méthode plus complète de la radiosensibilité tissulaire et clinique. 30 Objets de l'invention Les inventeurs ont constaté, et la méthode selon l'invention part de ce constat, que le marqueur pATM renseigne sur l'activation de la voie de suture par phosphorylation de H2AX et l'inhibition de la voie MRE11-dépendante. 4 Les inventeurs ont par ailleurs constaté que la quantité de pATM présente à l'état basal dans le cytoplasme et le noyau d'une cellule est fonction du type cellulaire étudié. De manière surprenante, les inventeurs ont aussi constaté que le statut de radiosensibilité d'un individu peut être facilement déterminé en fonction de la quantité de pATM présente 5 à l'état basal dans le cytoplasme et le noyau d'une cellule d'un type cellulaire donné, et ce, sans que cette cellule subisse un stress lié à un rayonnement ionisant induisant des CDB au sein de la cellule. On sait que l'efficacité et la rapidité de la réparation de l'ADN varie d'un individu à l'autre, et qu'il existe en outre des conditions génétiques particulières qui conduisent à une 10 radiosensibilité exceptionnelle. Selon l'invention le problème est résolu par une méthode basée sur : 1) la détection de la quantité de protéine ATM totale, cytoplasmique et nucléaire ; 2) un modèle mécanistique valable pour les cellules humaines notamment des cellules sanguines; 3) des tests fonctionnels quelle que soit la modalité thérapeutique. 15 De manière surprenante, les inventeurs ont découvert que la radiosensibilité d'un individu peut être prédite à partir de cellules non irradiées. De manière surprenante, les inventeurs ont découvert que la radiosensibilité d'un individu peut être prédite à partir de cellules prélevées dans le sang dudit individu. De manière surprenante, les inventeurs ont découvert que la radiosensibilité d'un individu 20 peut aussi être prédite à partir de cellules mucosales, de cellules épithéliales, de fibroblastes tels que ceux présents au niveau des bulbes capillaires, de l'épithélium de la face interne des joues ou issus de peau, dudit individu. De manière surprenante, les inventeurs ont découvert que la radiosensibilité d'un individu peut être prédite par un simple test ELISA, sans utiliser de techniques de comptage des 25 foci. La présente méthode s'applique à la détermination de la radiosensibilité par rapport à des fortes doses telles qu'habituellement utilisées dans la prise en charge des cancers par rayonnements ionisants (électrons, photons, protons, particules) tels qu'en protonthérapie ou en radiothérapie. En radiothérapie, les doses absorbées sont en générale comprises 30 entre 0,5 Gy et 6 Gy. Cette plage de dose correspond typiquement à une séance individuelle de traitement radiothérapeutique, le nombre de séances dépendant de la localisation, du type et du stade d'avancement de la tumeur. La dose pour une séance de traitement radiothérapeutique est souvent de l'ordre de 2 Gy. 5 Un premier objet de l'invention est un procédé pour caractériser la radiosensibilité d'un échantillon cellulaire d'un individu envers un rayonnement ionisant, ledit échantillon cellulaire ayant été obtenu à partir de cellules prélevées sur ledit individu, ledit procédé étant caractérisé en ce que 5 - la radiosensibilité est déterminée à partir de la quantité de la protéine ATM phosphorylée pATM à l'état basal to, - ledit procédé ne comprend pas d'irradiation dudit échantillon cellulaire. Avantageusement, on utilise pour la détermination de la quantité de la protéine pATM une 10 méthode immuno-enzymatique, tel qu'un test ELISA. Dans ce mode de réalisation avantageux, la quantité de la protéine pATM activée peut être détectée dans le cytoplasme et le noyau cellulaire par un test ELISA. Ces modes de réalisation sont adaptés à tout type d'échantillon cellulaire, mais de manière avantageuse, l'échantillon cellulaire est choisi parmi : 15 - un échantillon sanguin comprenant des lymphocytes ou des lymphoblastes, et - un échantillon issu d'une biopsie comprenant des fibroblastes. Un second objet de l'invention est un procédé pour caractériser la radiosensibilité d'un échantillon cellulaire d'un individu envers un rayonnement ionisant, ledit échantillon 20 cellulaire ayant été obtenu à partir de cellules prélevées sur ledit individu, dans lequel procédé (a) optionnellement, on isole des cellules nucléées cibles de l'échantillon cellulaire ; (b) on extrait les fractions totales ou les fractions cytoplasmiques et nucléaires ou les fractions nucléaires de l'échantillon cellulaire ; 25 (c) on détermine sur les dites fractions dudit échantillon cellulaire, la quantité de la protéine ATM phosphorylée pATM à l'état basal t0; (d) on détermine la radiosensibilité de l'échantillon cellulaire en utilisant au moins le nombre moyen pATM o (nuc normalisé) ou le nombre moyen pATM to (cyto+nuc normalisé) ou le nombre moyen pATM (0 (total normalisé) ; 30 et où - pATM (0 (nuc normalisé), exprimé en ppm, désigne la quantité moyenne de pATM présente dans le compartiment nucléaire à l'état basal to exprimée en ng divisée par la quantité totale de protéines cellulaires extraites dudit compartiment nucléaire exprimée en pg; 6 - pATM to (cyto+nuc normalisé), exprimé en ppm, désigne la quantité moyenne de pATM présente dans les compartiments cytoplasmiques et nucléaires à l'état basal to exprimée en ng divisée par la quantité totale de protéines cellulaires extraites desdits compartiments cytoplasmiques et nucléaires exprimée en pg; 5 - pATM to (total normalisé), exprimé en ppm, désigne la quantité totale moyenne de pATM extraite des cellules exprimée en ng divisée par la quantité totale de protéines extraites desdites cellules exprimée en pg. Avantageusement, les dites cellules nucléées cibles sont choisis parmi : des cellules mucosales, des cellules épithéliales, des lymphoblastes, des lymphocytes et des 10 fibroblastes, et encore plus préférentiellement parmi des lymphoblastes, des lymphocytes et des fibroblastes. Dans un autre mode de réalisation, la radiosensibilité d'un échantillon cellulaire d'un individu envers un rayonnement ionisant est déterminée sur des fibroblastes issus de biopsie dudit individu et dans lequel 15 - on considère que l'échantillon est radiorésistant si pATM to (nuc normalisé) k B, - on considère que l'échantillon est radiosensible si pATM to (nuc normalisé) REVENDICATIONS1 Procédé pour caractériser la radiosensibilité d'un échantillon cellulaire d'un individu envers un rayonnement ionisant, ledit échantillon cellulaire ayant été obtenu à partir de cellules prélevées sur ledit individu, ledit procédé étant caractérisé en ce que - la radiosensibilité est déterminée à partir de la quantité de la protéine ATM phosphorylée pATM à l'état basal to, - ledit procédé ne comprend pas d'irradiation dudit échantillon cellulaire. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel on utilise pour la détermination de la quantité de la protéine pATM une méthode immuno-enzymatique. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, dans lequel la quantité de la protéine ATM phosphorylée pATM est détectée par un test ELISA. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel l'échantillon cellulaire est choisi parmi : un échantillon sanguin comprenant des lymphocytes ou des lymphoblastes et un échantillon issu d'une biopsie comprenant des fibroblastes. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel (a) optionnellement, on isole des cellules nucléées cibles de l'échantillon cellulaire ; (b) on extrait les fractions totales ou les fractions cytoplasmiques et nucléaires ou les fractions nucléaires de l'échantillon cellulaire ; (c) on détermine sur les dites fractions dudit échantillon cellulaire, la quantité de la protéine ATM phosphorylée pATM à l'état basal t0; (d) on détermine la radiosensibilité de l'échantillon cellulaire en utilisant au moins le nombre moyen pATM o (nuc normalisé) ou le nombre moyen pATM o (cyto+nuc normalisé) ou le nombre moyen pATM (0 (total normalisé) ; et où - pATM (0 (nuc normalisé), exprimé en ppm, désigne la quantité moyenne de pATM présente dans le compartiment nucléaire à l'état basal to exprimée en ng divisée par la quantité totale de protéines cellulaires extraites dudit compartiment nucléaire exprimée en pg; 28 - pATM to (cyto+nuc normalisé), exprimé en ppm, désigne la quantité moyenne de pATM présente dans les compartiments cytoplasmiques et nucléaires à l'état basal to exprimée en ng divisée par la quantité totale de protéines cellulaires extraites desdits compartiments cytoplasmiques et nucléaires exprimée en pg; 5 - pATM to (total normalisé), exprimé en ppm, désigne la quantité totale moyenne de pATM extraite des cellules exprimée en ng divisée par la quantité totale de protéines extraites desdites cellules exprimée en pg. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel les dites cellules nucléées cibles sont choisis parmi : des cellules mucosales, des cellules 10 épithéliales, des lymphoblastes, des lymphocytes et des fibroblastes, et encore plus préférentiellement parmi des lymphoblastes, des lymphocytes et des fibroblastes. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel la radiosensibilité d'un échantillon cellulaire d'un individu envers un rayonnement 15 ionisant est déterminée sur des fibroblastes issus de biopsie dudit individu et dans lequel on considère que l'échantillon est radiorésistant si pATM to (nuc normalisé) k B, - on considère que l'échantillon est radiosensible si pATM to (nuc normalisé) 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel la radiosensibilité d'un échantillon cellulaire d'un individu envers un rayonnement ionisant est déterminée sur des fibroblastes issus de biopsie dudit individu et dans lequel 30 - on considère que l'échantillon est radiorésistant si pATM to (cyto+nuc normalisé) k C, - on considère que l'échantillon est radiosensible si pATM to (cyto+nuc normalisé) 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel la radiosensibilité d'un échantillon cellulaire d'un individu envers un rayonnement ionisant est déterminée sur des fibroblastes issus de biopsie dudit individu et dans lequel on considère que l'échantillon est radiorésistant si pATM to (total normalisé) k D, 10 - on considère que l'échantillon est radiosensible si pATM to (total normalisé) 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel la radiosensibilité d'un échantillon cellulaire d'un individu envers un rayonnement ionisant est déterminée sur des lymphoblastes et/ou des lymphocytes issus de cellules sanguines dudit individu et dans lequel 35 - on considère que l'échantillon est radiorésistant si pATM to (total normalisé) k A, - on considère que l'échantillon est radiosensible si pATM to (total normalisé) 12. Kit pour caractériser la radiosensibilité d'un échantillon cellulaire d'un individu envers un rayonnement ionisant, comprenant : a) des moyens d'extraction des fractions totales de l'échantillon cellulaire, b) des moyens de détermination sur les dites fractions dudit échantillon cellulaire de 10 la quantité de la protéine ATM phosphorylée pATM à l'état basal to. 13. Utilisation d'un kit selon la revendication 12 pour déterminer la radiosensibilité d'un échantillon cellulaire d'un individu envers un rayonnement ionisant.