Brevet FR3066501A1 — publié le 20181123

La présente invention concerne le domaine des sondes pour la détection et/ou la quantification de substances d'intérêt dans des échantillons biologiques. Elle a plus particulièrement pour objet de nouvelles particules inorganiques luminescentes, leur procédé de préparation et leur utilisation pour détecter et/ou doser la présence de protéines, d'anticorps, d'ADN, ARN et autres composés dans un échantillon biologique. La détection et/ou la quantification des concentrations de biomarqueurs, d'anticorps ou d'ADN et ARN dans des échantillons biologiques (sang, sérum, salive, urine, liquide cérébro-spinal, etc.) sont indispensables pour le diagnostic médical. Dans le domaine des diagnostics in vitro ou ex vivo, de l'analyse médicale et de la bioanalyse, un certain nombre de méthodes ont été proposées pour détecter et/ou doser la présence de substances spécifiques. Ces méthodes reposent, d'une manière générale, sur l'utilisation d'une sonde mise en oeuvre pour détecter et/ou quantifier une concentration en solution. Ces sondes sont couplées à des molécules, ADN ou protéines qui, directement ou via une série de réactions, vont se fixer à l'espèce moléculaire à analyser. Ensuite, les sondes qui ont réagi peuvent être détectées au moyen d'une ou plusieurs méthodes basées par exemple sur leur luminescence, leur absorbance, leur réactivité chimique, leur radioactivité, etc.. Les essais biochimiques les plus couramment mis en oeuvre sont des essais d'immuno-absorption enzymatique (en langue anglaise « Enzyme-Linked Immuno Assay » ou ELISA), qui reposent généralement sur l'utilisation de la peroxydase de raifort comme enzyme pour provoquer une réaction avec un substrat et quantifier la réaction chimique ayant lieu par mesure de l'absorbance du produit de la réaction dans la solution. Le choix du composé moléculaire auquel la sonde est couplée est déterminant pour l'efficacité de ces sondes. Plus précisément, l'efficacité de ces méthodes dépend de l'affinité spécifique du composé avec la substance cible. A titre d'exemples, les publications référencées [1] et [2] détaillent les caractéristiques de ces mécanismes. Les sondes luminescentes mènent généralement à une détection plus sensible que les sondes détectées par leur absorbance car, dans le premier cas, les mesures de l'intensité lumineuse se font sur fond noir, tandis que, dans le deuxième, il s'agit de mesurer une variation de l'intensité lumineuse (mesures sur fond clair). Les sondes luminescentes actuellement disponibles présentent plusieurs désavantages qui ne permettent pas d'exploiter pleinement leur potentiel en tant que sondes de diagnostic. 3066501 2 Parmi ces inconvénients, on peut citer par exemple le phénomène de photoblanchiment dans le cas de fluorophores organiques qui, suite à des modifications structurales irréversibles, se traduit pas une disparition de la fluorescence, ou encore le phénomène de clignotement de l'émission pour les nanocristaux de semi-conducteurs, ou « quantum 5 dots », les sondes cessant alors périodiquement d'émettre et étant par conséquent inadaptées pour produire un signal constant. D'autres inconvénients résultent par exemple de la largeur du spectre d'émission des sondes luminescentes. De fait, un spectre d'émission trop large rend difficile le filtrage du signal de fond éventuellement présent, et a une incidence sur la qualité du signal et, en particulier, sur le rapport signal à bruit. Il 10 convient également de prendre en compte, en plus des facteurs optiques qui contribuent à l'efficacité de la sonde dans un test biologique, le caractère pratique et la facilité d'utilisation de la sonde. Ainsi, certaines particules, comme c'est le cas des nanocristaux de semi-conducteurs, perdent leurs caractéristiques de luminescence après congélation, ce qui représente un inconvénient pour le stockage des agents bio-conjugués. La facilité de 15 couplage des sondes au composé moléculaire permettant de cibler les molécules souhaitées est également un aspect à prendre en considération pour le choix de la sonde adéquate. Ainsi, un certain nombre de particules, dont les nanocristaux de semi-conducteurs sont synthétisées dans des solvants organiques. Il en découle qu'une utilisation pour des applications biologiques nécessite des étapes supplémentaires de préparation de la surface 20 pour réaliser une dispersion dans l'eau de ces particules, processus qui peut être complexe à mettre en oeuvre et peu stable dans le temps. Par ailleurs, les propriétés colloïdales des particules/sondes sont déterminantes pour la conduite des essais biologiques. De fait, des solutions de bonne stabilité colloïdale sont à même de fournir des milieux pour les essais de bonne homogénéité, et dès lors une 25 meilleure reproductibilité au niveau des résultats de ces essais. Enfin, la complexité et le coût sont des aspects importants dans le choix des sondes pour le diagnostic. Par exemple, des nanoparticules d'or, et leurs propriétés en termes de résonance plasmonique de surface, ont été proposées comme sondes de diagnostic, mais n'ont pas percé comme sondes pour le diagnostic in vitro, possiblement à 30 cause de la complexité de la méthode de détection [3], ou éventuellement d'un coût élevé. Quant aux cristaux de semi-conducteurs, ils sont synthétisés dans des solvants organiques et requièrent des procédures de dispersion en milieu aqueux, ce qui rend leur synthèse 3066501 3 complexe et ainsi coûteuse. Leur fonctionnalisation avec des groupements chimiques permettant le couplage aux composés moléculaires de reconnaissance des molécules cibles repose en outre sur des liaisons chimiques faibles, ce qui limite par conséquent leur stabilité, ce qui est préjudiciable pour la reproductibilité de tests de détection. 5 A ce titre, les nanoparticules dopées par des ions de terres rares, telles que des nanoparticules de type YVO4:Eu, s'avèrent particulièrement avantageuses pour une mise en oeuvre à titre de sondes pour la détection/quantification de biomolécules. Des nanoparticules à base de vanadate d'yttrium dopé par des terres rares ont 10 par exemple été décrites de façon détaillée par Riwotzki et al. [4] et Huignard et al. [5]. Ces nanoparticules sont particulièrement avantageuses au regard de leur excellente photostabilité, qui autorise l'acquisition d'un signal constant et prolongé, et une absence de phénomène de clignotement de l'émission. De plus, elles présentent un spectre d'émission étroit et un grand décalage de Stokes de l'émission. Ces deux caractéristiques 15 permettent de filtrer efficacement le signal d'émission des nanoparticules en s'affranchissant des signaux parasites pour obtenir d'excellents rapports signal à bruit. Ces nanoparticules contiennent également plusieurs dizaines de milliers d'ions pouvant être excités et responsables de la luminescence. L'augmentation de l'intensité d'excitation induit ainsi une augmentation linéaire de la luminosité des particules, la saturation de 20 l'émission n'étant atteinte que pour des intensités impraticables. Enfin, ces nanoparticules ne perdent pas leur luminescence après congélation. La synthèse en milieu solvant organique de nanoparticules luminescentes dopées par des ions de terres rares a par exemple été proposée dans le document EP 1 232 226 ou dans les publications [6], [7] et [8]. 25 Il a également déjà été proposé la synthèse de ces nanoparticules luminescentes en milieu aqueux, par exemple par addition goutte-à-goutte de solutions de nitrates d'yttrium et d'europium à une solution d'orthovanadate (Na3VO4) ([9], [10], [11], [12] et [13]). Par ailleurs, les publications [14]-[19] proposent des méthodes de synthèse par 30 voie hydrothermale de nanoparticules d'YVO4 dopées par des ions de terres rares qui mettent en oeuvre à titre de précurseur du métavanate d'ammonium ou de l'orthovanadate. 3066501 4 On peut encore citer le document US 8 337 804 qui propose une méthode de préparation de nanoparticules à base d'ions orthovanadate V043-, par exemple de YVO4 :Eu, en mettant en oeuvre un milieu de réaction contenant de l'eau et au moins un polyol. 5 Quant au document EP 1 282 824, il décrit la mise en oeuvre de nanoparticules luminescentes inorganiques, modifiées en surface, à titre de sondes pour détecter une substance biologique ou autre substance organique. Les nanoparticules luminescentes, obtenues par les voies de synthèse connues 10 précitées, et mises en oeuvre en milieu aqueux, sont toutefois sujettes à des phénomènes de floculation, et ne permettent pas de conduire à des suspensions colloïdales stables. Dès lors, la quantité de nanoparticules en suspension est instable au cours du temps, et ne peut être déterminée de manière précise. Cette incertitude au niveau de la teneur en particules luminescentes dans les 15 suspensions colloïdales mises en oeuvre est hautement préjudiciable lors de leur utilisation à titre de sondes dans des méthodes de diagnostic, puisqu'elle vient impacter la reproductibilité des résultats obtenus, par exemple lors de la détection/quantification des concentrations en biomolécules de l'échantillon testé. En conséquence, les particules luminescentes dopées par des ions de terres 20 rares obtenues par les méthodes de l'état de l'art ne permettent pas de donner entière satisfaction pour une mise en oeuvre à titre de sondes de diagnostic. La présente invention vise précisément à proposer de nouvelles particules luminescentes et une nouvelle voie pour leur synthèse, permettant de pallier les 25 inconvénients précités. En particulier, l'invention propose un moyen d'accéder à des nanoparticules luminescentes présentant une stabilité colloïdale améliorée en milieu aqueux, et avantageusement avec une meilleure reproductibilité de leur synthèse et des étapes ultérieures de fonctionnalisation et de couplage à un agent moléculaire de ciblage. 30 Ainsi, l'invention concerne, selon un premier de ses aspects, une particule luminescente comprenant une nanoparticule de formule : A1,LnSO4(1-y)(PO4)y (I) 3066501 5 dans laquelle : . A est choisi parmi l'yttrium (Y), le gadolinium (Gd), le lanthane (La) et leurs mélanges; . Ln est choisi parmi l'europium (Eu), le dysprosium (Dy), le samarium (Sm), le 5 néodyme (Nd), l'erbium (Er), l'ytterbium (Yb) et leurs mélanges ; . 0 0,1 M). Le potentiel zêta des nanoparticules est déterminé avec un appareil DLS-Zeta Potential (Zetasizer Nano ZS90, Malvern). Les résultats des potentiels zêta mesurés pour 20 les nanoparticules des deux synthèses sont rassemblés dans le tableau 1 ci-après. Pour les observations par microscopie électronique à transmission (MET), des solutions diluées de nanoparticules sont déposées sur une grille en carbone. Les observations sont réalisées à l'aide d'un microscope Philips CM30 fonctionnant à 300 kV 25 avec une résolution de 0,235 nm. L'observation des nanoparticules par MET (figure 1) montre que les nanoparticules sont de forme ellipsoïde allongée. Les dimensions des nanoparticules sont déterminées à partir d'images de MET pour un ensemble d'environ 300 nanoparticules (figure 2). Les nanoparticules de l'invention présentent une longueur du grand axe, notée a, 30 comprise entre 20 et 60 nm, avec une valeur moyenne d'environ 40 nm, et une longueur du petit axe, notée b, comprise entre 10 et 30 nm, avec une valeur moyenne d'environ 20 nm. 3066501 27 Les images de MET (figure 1) ne permettent pas de distinguer des plans cristallins, ce qui est probablement attribuable au fait que la nanoparticule est constituée de plusieurs cristallites de taille plus faible que la taille de la nanoparticule. La nature majoritairement cristalline et polycristalline des nanoparticules est confirmée par des 5 expériences de diffraction de rayons X. Le diffractogramme des rayons X obtenu à l'aide d'un diffractomètre Philips X-pert avec la raie Kal du Cuivre (X=1,5418 À), est représenté en figure 3. L'intensité diffractée est enregistrée en utilisant un détecteur X' Celerator area detector (PANalytical). 10 La longueur de cohérence dans une direction cristallographique et donc la taille moyenne des cristallites constituant la nanoparticule dans cette direction cristallographique peut être estimée à partir de la largeur des pics dans le diffractogramme RX par application de la formule de Scherrer. Les valeurs de longueur de cohérence obtenues pour les différentes directions cristallographiques sont comprises entre 3 et 40 nm. La longueur de 15 cohérence dans au moins une direction cristallographique étant inférieure à la dimension de la nanoparticule dans cette direction, on peut en déduire que les nanoparticules sont d'une cristallinité imparfaite (polycristallinité, défauts ou porosité). Dans la direction (200) (Fig. 3, pic à 20-25°), la longueur de cohérence est de 10,2 nm, légèrement plus faible que la longueur de cohérence pour les nanoparticules de l'exemple 3 (11,1 nm). 20 EXEMPLE 2 (hors invention) S nthèse de nano s articules Yo 6Euo 4VO4 à s artir de métavanadate de sodium, sans contre-ions volumineux 25 Pour la synthèse par co-précipitation de sels métalliques, des nitrates d'yttrium et d'europium ont été utilisés comme sources d'ions )(3+ et Eu'. Comme source d'ions de métavanadate V03-, on utilise du métavanadate de sodium NaVO3, l'orthovanadate V043-, étant obtenu in situ suite à une réaction avec une base, ici l'hydroxyde de sodium, NaOH. Une solution aqueuse de 10 mL de NaVO3 à 0,1M et de 0,2M de NaOH 30 (solution 1) est fraichement préparée. 3066501 28 Un volume de 10 mL d'une autre solution de Y(NO3)3 et de Eu(NO3)3 à 0,1 M en ions (Y" + Eu') est ajoutée goutte à goutte à l'aide d'un pousse seringue dans la solution 1 à un débit de 1 mL/min. Le rapport en concentration molaire entre Y(NO3)3 et Eu(NO3)3 est choisi en 5 fonction du rapport entre ions Y3-P et Eu' souhaité dans la nanoparticule, typiquement le rapport molaire Y3-P :Eu" est de 0,6 : 0,4. Dès l'ajout de la solution Y(NO3)2/Eu(NO3)3, un précipité laiteux apparaît. La synthèse se poursuit jusqu'à l'ajout total de la solution Y(NO3)2/Eu(NO3)3. 10 La solution finale de 20 mL doit à présent être purifiée pour éliminer l'excès de contre ions. Pour ce faire, des centrifugations (typiquement trois) à 11000 g (Sigma 3K10, Bioblock Scientific) pendant 80 minutes suivies chacune d'une redispersion par sonification (Branson Sonifier 450 fonctionnant à 50 % avec une puissance de 400 W) sont utilisées jusqu'à atteindre une conductivité strictement inférieure à 100 1.1S.cm-1. 15 Résultat Une comparaison de la solution obtenue avec la solution de nanoparticules selon l'invention obtenue en exemple 1 (pour une même concentration finale en ions vanadate), aprèsl6 heures au repos, montre qu'à la différence de la solution de l'exemple 20 1, la solution est moins diffusante (moins blanche) ; un léger dépôt s'est formé au fond du flacon. Le potentiel zêta des nanoparticules, déterminé comme décrit en exemple 1, est présenté dans le tableau 1 ci-après. 25 EXEMPLE 3 (hors invention) S nthèse de nano s articules Yo 6Euo 4VO4 à s artir d'orthovanadate de sodium, sans contre-ions volumineux Pour la synthèse par co-précipitation de sels métalliques, des nitrates d'yttrium et d'europium ont été utilisés comme sources d'ions Y3-P et Eu'. Comme source d'ions 30 d'orthovanadate, V043-, est mis en oeuvre de l'orthovanadate de sodium Na3VO4. 3066501 29 Une solution aqueuse de 10 mL de Na3VO4 à 0,1M (solution 1) est fraichement préparée. Le pH est mesuré et ajusté si nécessaire pour atteindre une valeur comprise entre 12,6 et 13. Un volume de 10 mL d'une autre solution de Y(NO3)3 et de Eu(NO3)3 à 0,1 M 5 en ions (Y" + Eu') est ajoutée goutte à goutte à l'aide d'un pousse seringue dans la solution 1 à un flux de 1 mL/min. Le rapport en concentration molaire entre Y(NO3)3 et Eu(NO3)3 est choisi en fonction du rapport entre ions y3+ et Eu' souhaité dans la nanoparticule, typiquement le rapport molaire y3+ :Ed+ est de 0,6 : 0,4. 10 Dès l'ajout de la solution Y(NO3)2/Eu(NO3)3, un précipité laiteux apparaît. La synthèse se poursuit jusqu'à l'ajout total de la solution Y(NO3)2/Eu(NO3)3. La solution finale de 20 mL doit à présent être purifiée pour éliminer l'excès de contre-ions. Pour ce faire, des centrifugations (typiquement trois) à 11000 g (Sigma 3K10, 15 Bioblock Scientific) pendant 80 minutes suivies chacune d'une redispersion par sonification (Branson Sonifier 450 fonctionnant à 50 % à une puissance de 400 W) sont utilisées jusqu'à atteindre une conductivité strictement inférieure à 100 p.S.cm-1. Résultats 20 Une comparaison de la solution obtenue avec la solution de nanoparticules selon l'invention obtenue en exemple 1 (pour une même concentration finale en ions vanadate), après 16 heures au repos, montre qu'à la différence de la solution de l'exemple 1, la majorité des nanoparticules se sont déposées au fond du flacon ; la partie haute de la solution est presque transparente ce qui indique une absence de diffusion et donc de 25 nanoparticules en solution. Le potentiel zêta des nanoparticules, déterminé comme décrit en exemple 1, est présenté dans le tableau 1 ci-après. Le diffractogramme des rayons X obtenu à l'aide d'un diffractomètre Philips X-pert est représenté en figure 3. 30 De même que pour l'exemple 1, la taille moyenne des cristallites constituant la nanoparticule dans la direction cristallographique (200) peut être estimée par application de la formule de Scherrer, et donne une valeur comprise entre 3 et 40 nm. La taille des 3066501 30 cristallites étant globalement inférieure aux dimensions de la nanoparticule, on peut en déduire que les nanoparticules synthétisées selon l'exemple 3 sont également polycristallines. Exemples Exemple 1 (conforme à Exemple 2 (hors Exemple 3 (hors l'invention) invention) invention) Synthèse 1 Synthèse 2 Conductivité 93 80 53 66 (ttS/cm) pH 4,81 4,96 5,4 9,55 Potentiel zêta Ç -33,3 -34,6 -2,30 -18,00 5 TABLEAU 1 : comparaison du potentiel zêta Ç des nanoparticules obtenues selon l'exemple 1 conforme à l'invention (synthèse à base de métavanadate d'ammonium avec contre-ions volumineux), et selon les exemples 2 et 3 non conformes à l'invention (synthèse à base de métavanadate de sodium sans contre-ions volumineux et synthèse à 10 base d' orthovanadate sans contre-ions volumineux). La comparaison des potentiels zêta des nanoparticules obtenues selon les exemples 1 à 3 confirment que les nanoparticules selon l'invention (exemple 1) présentent une stabilité colloïdale améliorée avec gl>30 mV comparativement aux nanoparticules 15 obtenues sans cations tétraalkylammonium (exemples 2 et 3). EXEMPLE 4 Couplage des nanoparticules avec la protéine streptavidine 20 i. Greffage du citrate à la surface des nanoparticules A l'issue de la synthèse des nanoparticules selon l'exemple 1, on centrifuge la solution de nanoparticules à 17 000 g pendant 3 minutes, pour précipiter les éventuels agrégats de nanoparticules et on récupère le surnageant. 3066501 31 On prélève environ 250 !IL de particules Y0,6E110,4VO4 de concentration 5 mM en ions vanadate, et on les disperse dans 1 mL d'une solution d'eau distillée contenant l'ion citrate (concentration 0,2 M). La solution est ensuite sonifiée pendant 5 minutes puis centrifugée à 17 000 g 5 pendant 3 minutes. Cette étape est répétée 3 fois. A l'issue de ce greffage, les particules sont dispersées dans de l'eau distillée, solvant dans lequel elles sont stables. La fonctionnalisation des nanoparticules par du citrate peut être remplacée par une fonctionnalisation par du PAA (par exemple de degré de polymérisation compris entre 10 3 et 10000), en mettant en oeuvre un sel de PAA, comme par exemple un sel de sodium ou d' ammonium. En figure 4, sont représentés de manière schématique les nanoparticules de l'invention fonctionnalisées avec (a) du citrate et (b) du polyacide acrylique. 15 ii. Couplage des nanoparticules avec la streptavidine On centrifuge les nanoparticules (NPs) greffées avec les ions citrate à 16 000 g pendant 1 heure, puis le culot est récupéré. Le couplage des nanoparticules greffées en surface par du citrate avec la streptavidine est opéré suivant le protocole suivant : 20 1. Préparer fraichement une solution mixte de EDC 1/Sulfo-NHS 2 (concentration 30 et 30 mg/mL, respectivement) dans du tampon MES 3 (pH 5-6). 2. Disperser par sonification (bain ultrasons) le culot des NPs dans 250 !IL de la solution préparée en étape 1. Les pertes lors des centrifugations étant faibles, la 25 concentration en ions vanadate reste de l'ordre de 5 mM, ce qui donne une concentration en nanoparticules de 48 nM. (La concentration en vanadate des solutions de nanoparticules a été déterminée par dissolution des particules dans un milieu acide suivie d'une détermination colorimétrique de la concentration en ions vanadate, telle que décrite dans la 30 référence Abdesselem et al., ACS Nano 8, 11126-11137 (2014). La concentration molaire en nanoparticules a été déterminée à partir de la concentration en ions vanadate, comme décrit dans la référence Casanova et al., Appl. Phys. Lett 89, 253103 (2006)). 3066501 32 3. Incuber à 37°C pendant 30 min sous agitation (plateau agitateur). 4. Préparer une solution de streptavidine (SA) de 100 nM dans du tampon phosphate pH 7,4 avec NaC1 à 10 mM. Diluer la solution de streptavidine jusqu'à atteindre une concentration déterminée par le nombre de protéines greffées par nanoparticule 5 souhaité (pour un rapport streptavidine : NPs de 1:1, 5:1 et 10:1, choisir, respectivement des concentrations de 4,8 nM, 24 nM et 48 nM). Rajouter 250 !IL de cette solution à la solution de nanoparticules. 5. Laisser incuber entre 2 et 4h à température ambiante. 6. Rajouter 1 mL de PBST 4 et vortexer. 10 7. Faire une centrifugation de 6 500 g pendant 30 min et récupérer le culot pour éliminer les protéines non couplées aux NPs. Enlever totalement le surnageant. Redisperser les NPs couplées aux protéines dans lmL de PBST et sonifier au bain à ultrasons. Répéter cette étape deux fois. 8. Récupérer les NPs couplées aux protéines dans 250 !IL de PBS 5 avec 1 % de 15 B SA6. 9. Garder à 4°C pour utilisation immédiate ou aliquoter et garder à -80°C. Le couplage des nanoparticules avec la streptavidine est représenté 20 schématiquement en figure 5. Matériel mis en oeuvre pour l'essai de fonctionnalisation : 1 N-(3-Dimethylaminopropy1)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) (sigma, cat# E1769). 25 2N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt (Sulfo-NHS) (sigma, cat# 56485). 32-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) (10mM, pH 5-6). 4 Tampon phosphate salin pH 7,4 (10 mM NaC1)+ 0,05% Tween 20 (PBST). 5 Albumine de sérum de boeuf (B SA) (sigma, cat# A3059). 6 Tampon phosphate salin (PBS) (pH 7,4, 10 mM NaC1). 30 Le nombre de molécules de streptavidine (SA) par nanoparticule (NP), noté R, caractérisé à l'issue du protocole de couplage, est déterminé via le dosage de la streptavidine par la méthode dite de BCA, selon le protocole détaillé ci-dessus. 3066501 33 Protocole de caractérisation du rapport streptavidine : nanoparticules (SA :NPs) i. Dosage de la SA par la méthode dite de BCA Principe En milieu alcalin, les protéines réduisent Cu2+ en Cu. Le sel de l'acide bicinchoninique 5 (BCA) forme un complexe coloré avec les ions Cu2+. Ce complexe est quantifiable grâce à son absorption à 562 nm. Mode opératoire Kit de test BCA de chez ThermoFisher (PierceTM BCA Protein Assay Kit Cat. Num. 10 23225) - Préparation du réactif du test Cu2+/BCA selon le protocole du kit ThermoFisher. - Préparation de la SA pour la courbe d'étalonnage. Pour la courbe de calibration, le test est réalisé trois fois. Tubes Concentration finale en SA (ug/mL) A 2000 B 1500 C 1000 D 750 E 500 F 250 G 125 H 25 I 0 = blanc TABLEAU 2 : concentration en streptavidine des solutions d'étalonnage 25 Le mode opératoire est le suivant : - Prendre une plaque de 96 puits. Mettre 25 !IL de chaque tube d'étalon A à I (de concentration connue en SA) ou de protéines conjuguées aux nanoparticules à doser dans les puits correspondants. 30 - Rajouter 200 1.1.L du réactif du test Cu2+/BCA dans chaque puits. Homogénéiser, couvrir et laisser incuber 30 min à 37°C. 15 20 3066501 34 - Lire les absorbances (A) à 562 nm en fonction de la concentration finale en tenant compte de la dilution. Etablir la relation d'étalonnage A= f (Concentration SA en ug/mL) par régression linéaire. 5 La concentration des protéines conjuguées aux nanoparticules à doser est déduite à partir de l'équation de la régression linéaire obtenue avec la courbe d'étalonnage. ii. Caractérisation du rapport SA : NPs La concentration massique de la streptavidine obtenue avec le test de BCA est 10 convertie en concentration molaire via la formule suivante: [SA] molaire (M01 S lL e ) == Masse Molaire mole' Pour obtenir le rapport (R) du nombre de SA : NPs, nous appliquons enfin l'équation suivante : R = - raolire 15 Le tableau 3 ci-dessous rassemble les valeurs obtenues pour les différents rapports de concentration entre la solution de streptavidine et la solution de nanoparticules de départ. Rapports de concentration entre la solution de streptavidine et la solution de nanoparticules 1 :1 5 :1 10 :1 Nombre déterminé de molécules de streptavidine par 0,97 3,8 9,29 nanoparticule à l'issue du couplage 20 TABLEAU 3 : Caractérisation du couplage nanoparticule-streptavidine pour différents rapports de concentration entre la solution de streptavidine et la solution de nanoparticules. 25 Comme il ressort des résultats présentés dans le tableau 3, le nombre de molécules de streptavidine par nanoparticule après couplage, est du même ordre que le 3066501 rapport de concentration dans les solutions initiales, et indique ainsi un couplage de très bonne efficacité. Les nanoparticules ainsi couplées à la streptavidine peuvent être avantageusement utilisées dans une méthode de diagnostic in vitro en couplant les 5 nanoparticules à un anticorps biotinylé, comme illustré de manière schématique en figure 6. Alternativement, il est également possible de coupler directement des anticorps aux nanoparticules greffées avec des ions citrate. Dans ce cas, le même protocole que ci-dessus est à utiliser en remplaçant la solution de streptavidine par une solution d'anticorps. 10 Références [1] « Bioconjugate Techniques », GT Hermanson, Academic Press, 1996 ; [2] « Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity. A Practical 15 Guide to Technology for Quantitative Real-Time Analysis », Second Edition, Mason WT, Ed., Academic Press, 1999 ; [3] Nam et al., Science 301, 1884-1886 (2003) ; [4] Riwotzki et al., J. Phys. Chem. B 1998, 105, 12709-127 ; [5] Huignard et al., Chem. Mater. 2000, 12, 1090-1094 ; 20 [6] Riwotzki et al., Angew. Chem. 2001, 40(3), 573-576 ; [7] Lehmann et al., J. Am. Chem. Soc. 2004, 126(45), 14935-14942 ; [8] Riwotzki et al., J. Phys.Chem. BI, D3., 2000, 104, 2824-2828 ; [9] Huignard et al., Chem. Mater. 2000, 12, 10920-1094 ; [10] Giaume et al., Langmuir 2008, 24, 11018-11026 ; 25 [11] Huignard et al., Chem. Mater. 2002, 14, 2264-2269 ; [12] Riwotzki et al., J. Phys. Chem. B 1998, 102, 10129-10135 ; [13] Mialon et al., Acs Nano, 2008 - ACS Publication, vol. 2, No. 12, 2505- 2512 ; [14] Li et al., J. Phys. Chem. C 2008, 112, 6228-6231 ; 30 [15] Wu et al., J. Mater. Chem., 2003, 13, 1223-1228 ; [16] Liang et al., J. Alloys and Compounds 552 (2013) 289-293 ; [17] Wu et al., J. Phys. Chem. B 2006, 110, 15791-15796 ; 3066501 36 [18] Xu et al., Inorg. Chem. 2010, 49, 6706-6715 ; [19] Takeshita et al., Journal of Luminescence 128 (2008) 1515-1522. REVENDICATIONS1. Particule luminescente comprenant une nanoparticule de formule : Ai _xLn,,VO4(1-y)(PO4)y (I) dans laquelle : . A est choisi parmi l'yttrium (Y), le gadolinium (Gd), le lanthane (La) et leurs mélanges ; . Ln est choisi parmi l'europium (Eu), le dysprosium (Dy), le samarium (Sm), le néodyme (Nd), l'erbium (Er), l'ytterbium (Yb) et leurs mélanges ; . 0 2. Particule selon la revendication précédente, caractérisée en ce que lesdits cations tétraalkylammonium sont des cations de formule NR4+ avec R, identiques ou différents, représentant un groupe C1-C6-alkyl, en particulier C1-C4-alkyl et plus particulièrement Ci-C3-alkyl. 3. Particule selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que lesdits cations tétraalkylammonium sont choisis parmi le tétraméthylammonium, le tétraéthylammonium, le tétrapropylammonium, le tétrabutylammonium et leurs mélanges, en particulier lesdits 20 cations tétraalkylammonium sont des cations tétraméthylammonium. 4. Particule selon l'une quelconque des revendications précédentes, ladite naoparticule étant de formule (I') Al_xLnSO4(1-y)(PO4)y - (NR41z (I') dans laquelle : 25 . A est choisi parmi Y, Gd, La et leurs mélanges ; . Ln est choisi parmi Eu, Dy, Sm, Nd, Er, Yb et leurs mélanges ; . 0 5. Particule selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle y vaut 0. 6. Particule selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle A représente Y. 5 7. Particule selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle Ln représente Eu. 8. Particule selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ladite nanoparticule est de formule Yi_xEuxVO4. (NR4±), (III'), dans laquelle x, R et z sont tels que définis en revendication 4, en particulier de formule 10 Y0,6Eu0,4(VO4) - (NR412(III'), dans laquelle z est tel que défini en revendication 4. 9. Particule selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la nanoparticule de formule (I) est de forme ellipsoïdale allongée, en particulier présentant une longueur du grand axe, a, comprise entre 20 et 60 nm et une longueur du petit axe, b, comprise entre 10 et 30 nm. 15 10. Particule selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle présente un potentiel zêta, en valeur absolue, notée en milieu aqueux à pH de 5, supérieur à 30 mV. 11. Particule selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le produit entre le taux de dopage, x, en ions Ln, en particulier en Eu, et le rendement quantique de l'émission par la nanoparticule est maximisé, en particulier dans laquelle la nanoparticule présente une cristallinité imparfaite. 12. Particule selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ladite nanoparticule est couplée à au moins un agent de ciblage. 13. Procédé de préparation de particules luminescentes comprenant une 25 nanoparticule de formule : A1-xLnxV040-4PO4)y (I) dans laquelle : . A est choisi parmi l'yttrium (Y), le gadolinium (Gd), le lanthane (La) et leurs mélanges ; 30 . Ln est choisi parmi l'europium (Eu), le dysprosium (Dy), le samarium (Sm), le néodyme (Nd), l'erbium (Er), l'ytterbium (Yb) et leurs mélanges ; . 0 14. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes consistant en : (i) disposer d'une solution aqueuse, notée solution (1), comprenant des ions orthovanadate (V0431, et éventuellement des ions phosphates (P043-), et des cations 10 tétraalkylammonium ; (ii) ajouter à la solution aqueuse (1), une solution aqueuse, dite solution (2), comprenant lesdits précurseurs des éléments A et Ln, en particulier sous forme de sels, notamment de nitrates, dans des conditions propices à la formation par co-précipitation des nanoparticules de formule (I) ; et 15 (iii) récupérer les nanoparticules de formule (I) à la surface desquelles sont localisés des cations tétraalkylammonium, formées à l'issue de l'étape (ii). 15. Procédé selon la revendication 13 ou 14, dans lequel les cations tétraalkylammonium sont choisis parmi le tétraméthylammonium, le tétraéthylammonium, le tétrapropylammonium, le tétrabutylammonium et leurs mélanges, en particulier lesdits 20 cations tétraalkylammonium sont des cations tétraméthylammonium. 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 à 15 pour la préparation de particules telles que définies selon l'une quelconque des revendications 4 à 11. 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 à 16, dans lequel les ions orthovanadate (V043-) sont générés in situ par réaction d'un sel de métavanadate, en particulier du métavanadate d'ammonium (NE14\703), avec une base, en particulier une base source de cations tétraalkylammonium, et plus particulièrement avec un hydroxyde de tétraalkylammonium. 18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 à 17, caractérisé en 30 ce qu'il comprend en outre une ou plusieurs étapes de couplage des particules avec un ou plusieurs agents de ciblage. 3066501 40 .19. Suspension aqueuse colloïdale comprenant des particules, telles que définies selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, ou obtenues selon le procédé défini selon l'une quelconque des revendications 13 à 18. 20. Utilisation de particules telles que définies selon l'une quelconque des 5 revendications 1 à 12 ou obtenues selon le procédé défini selon l'une quelconque des revendications 13 à 18, ou d'une suspension aqueuse colloïdale de ces particules, à titre d'agent de diagnostic in vitro ou ex vivo. 21. Kit de diagnostic, comprenant au moins des particules telles que définies selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 ou telles qu'obtenues selon le procédé 10 défini selon l'une quelconque des revendications 13 à 18, ou une suspension aqueuse colloïdale de ces particules.