Brevet FR3065226A1 — publié le 20181019

Utilisation d'acide urique pour une culture cellulaire sous atmosphère aérobie non supplémentée en CO2. La présente invention concerne des milieux et procédés de culture cellulaire ou de culture intracellulaire de microorganismes et notamment la supplémentation des milieux de culture cellulaire classiques pour la culture cellulaire ou la culture intracellulaire de microorganismes permettant de mettre en oeuvre une culture sous atmosphère non supplémentée en CO2. La présente invention concerne plus particulièrement des milieux et procédés de culture autorisant la culture des cellules et la propagation intracellulaire de microorganismes, notamment de bactéries intracellulaires, de virus ou parasites qui s'y multiplient en l'absence de CO2. Les cultures cellulaires, que cela soit pour la culture de cellules eucaryotes seules ou utilisées comme support pour la culture et l'isolement de microorganismes, notamment de bactéries intracellulaires strictes et de virus, nécessitent souvent l'utilisation d'une atmosphère contenant du CO2, notamment dans de l'air contenant 5% de CO2. L'objectif est, par la présence de CO2 dans l'atmosphère de culture, de tamponner le milieu et équilibrer le pH en compensant l'augmentation de l'acidité dans le milieu de culture (production de H+) résultant du métabolisme cellulaire avec la production de 1-1CO3-. Cette augmentation d'acidité conduit autrement (en absence de CO2) à une mortalité des cellules. Cette supplémentation en CO2 est surtout nécessaire les 24 premières heures. Ensuite si la boite de culture est fermée hermétiquement ce besoin disparait. La culture de certains microorganismes tels que parasites tel que du genre Plasmodium nécessite en sus du CO2 l'utilisation d'azote ou 3065226 2 autre gaz inerte visant à abaisser davantage encore le taux d'oxygène à 10% ce qui nécessite par exemple l'utilisation d'étuves trigaz (N2 85%, 02 10%, CO2 5%). La mise en oeuvre de CO2 pour ce type de culture cellulaire 5 présente les inconvénients suivants. Tout d'abord, cela requière une installation couteuse en termes de dispositifs divers à utiliser (tuyaux, manodétendeurs, alarmes, enceintes d'incubateur spéciales, voire une étuve trigaz) ainsi que la consommation de fluide gazeux, le CO2 en bouteille représentant un 10 coût consommable non négligeable. De surcroit, lorsque cette production de cellules est utilisée pour l'isolement et la propagation de microorganismes dangereux exigeant des niveaux de sécurité élevés, notamment pour des bactéries intracellulaires et virus de classe 3, se pose le problème de l'utilisation 15 du CO2 dans un laboratoire de classe NSB3. Dans ces laboratoires, il n'est pas possible de faire entrer les fûts de CO2 et donc il est nécessaire de déployer un système de canalisations amenant le CO2 à l'intérieur depuis l'extérieur. Par ailleurs, une fuite de CO2 dans un laboratoire confiné présente des risques. En cas de fuite, le taux 20 d'oxygène diminue avec risque d'asphyxie pour le personnel. Dans tous les cas, cela justifie l'installation de détecteurs de CO2 branchés sur alarmes. Enfin, dans des zones mal équipées comme des laboratoires de campagne en expédition de terrain, l'utilisation de CO2 est impossible 25 tout autant que les matériels tels qu'étuves trigaz. Le but de la présente invention est de fournir des conditions améliorées alternatives de culture cellulaire permettant de se passer de la mise en oeuvre d'une culture cellulaire sous atmosphère CO2 et ainsi éviter toutes les contraintes de matériels mentionnées ci-dessus pour 30 cultiver des cellules et des microorganismes tel que bactéries 3065226 3 intracellulaires, virus et parasites qui se multiplient à l'intérieur des dites cellules le cas échéant. On a décrit dans WO 2014/064359 d'améliorer et faciliter les conditions de croissance en culture acellulaire des bactéries dont la 5 croissance est sensible à la tension en oxygène et notamment des bactéries qui tolèrent mal des tensions élevées d'oxygène et pour lesquelles une croissance optimale de la dite bactérie requière une atmosphère d'incubation à teneur en oxygène relativement réduite par rapport à la teneur en oxygène de l'air, lesdites bactéries étant 10 choisies parmi les bactéries anaérobies, y compris les bactéries anaérobies strictes, et les bactéries microaérophiles qui ne sont capables de cultiver que sous une atmosphère comprenant une concentration d'oxygène diminuée, le plus communément à environ 22,5%. 15 Dans WO 2014/064359, on a proposé d'ajouter certains composés antioxydants à savoir l'acide ascorbique, le glutathion et l'hydrosulfure de sodium dans un milieu de culture acellulaire pouvait permettre d'améliorer la croissance des dites bactéries et/ou de cultiver des dites bactéries en présence de quantités plus élevées d'oxygène. 20 Dans WO 2014/ 064359, on fournit donc un procédé de culture in vitro de bactéries en milieu de culture acellulaire, de telles bactéries anaérobies ou microaérophiles intracellulaires, caractérisé en ce que l'on ajoute dans le dit milieu de culture acellulaire un composé antioxydant choisi parmi l'acide ascorbique, le glutathion et 25 l'hydrosulfure de sodium, et l'on cultive la dite bactérie dans ledit milieu de culture en présence d'oxygène. Dans certaines conditions l'acide ascorbique apparait toxique et/ou trop acide vis à vis de certaines bactéries et/ou pour certain milieux de culture à fortes doses. Ceci a été mis en évidence 30 notamment pour Mycobacteriurn tuberculosis (1). D'autre part, le glutathion est très onéreux. 3065226 4 Dans WO 2015/162377, il a été décrit qu'un effet équivalent sur la croissance des dites bactéries anaérobies ou bactéries microaérophiles sensibles à l'oxygène pouvait également être obtenu en ajoutant dans le dit milieu de culture de l'acide urique (7,9-dihydro- 5 1H-purine-2,6,8(3H)-trione ou 2,6,8-trioxypurine) à la place des composés antioxydants décrits dans WO 2014/064259. L'acide urique, bien qu'ayant dans certaines conditions des propriétés antioxydantes, n'est pas classiquement utilisé en microbiologie à titre de composé antioxydant car dans certaines 10 conditions il présente au contraire des propriétés oxydantes (2). Selon la présente invention, on a découvert que l'ajout d'acide urique à forte dose dans un milieu de culture cellulaire permet d'éviter la mise en oeuvre d'une atmosphère de culture contenant du CO2. L'acide urique a des capacités de type anti-oxydantes mais on ne 15 pouvait prévoir qu'il pourrait jouer le rôle de tampon du milieu de culture cellulaire généralement dévolu au CO2. Il est possible qu'il protège les cellules d'un effet délétère de dérivés de l'oxygène, le temps que par leur activité propre de détoxification les cellules tamponnent elle-même le milieu. Cet effet non totalement élucidé ne 20 pouvait pas être déduit de l'état de l'Art. Plus précisément, la présente invention fournit un procédé de culture de cellules eucaryotes in vitro caractérisé en ce que l'on ajoute dans le milieu de culture cellulaire de l'acide urique et on réalise la culture sous une atmosphère d'air ambiant non supplémentée en CO2, 25 la multiplication des dites cellules étant apte à être améliorée par culture sous atmosphère supplémentée en CO2, notamment dans de l'air enrichi à 5% de CO2 notamment au moins dans les premières 24 heures, en l'absence d'acide urique dans le dit milieu de culture. Plus particulièrement, on réalise une culture intracellulaire de 30 microorganismes dans des dites cellules en dit milieu de culture 3065226 5 cellulaire contenant de l'acide urique sous une atmosphère d'air ambiant non supplémentée en CO2. De préférence, l'acide urique est mis en oeuvre à une concentration d'au moins 0,1 g/L, de préférence encore de 0,4 à 1 g/L. 5 Plus particulièrement, on réalise une culture intracellulaire d'un microorganisme choisi parmi les bactéries intracellulaires strictes, les virus et les parasites. Plus particulièrement, on réalise une culture intracellulaire d'un dit microorganisme dans un récipient ouvert sous une atmosphère d'air 10 ambiant non supplémenté en CO2 et on ferme le récipient après 24h de culture. Dans un mode de réalisation, on réalise une culture intracellulaire d'une bactérie intracellulaire stricte choisie parmi les genres Rickettsia, Orientia, Lawsonia, Coxiella, Ehrlichia, Chlamydia, 15 Chlarnydiophila, Anaplasma et Neorickettsia. Il s'agit là de bactéries intracellulaires strictes d'intérêt médical et vétérinaire. Plus particulièrement encore, on réalise une culture intracellulaire d'une bactérie intracellulaire stricte choisie parmi Coxiella burnetii et une espèce Rickettsia sp. 20 Dans un autre mode de réalisation, on réalise une culture intracellulaire d'un virus choisi parmi les familles Poxviridae, Herpesviridae, Adenoviridae, Papillornaviridae, Polyornaviridae, Parvoviridae, Picornaviridae, Caliciviridae, Astroviridae, Flaviviridae, Togaviridae, Coronaviridae, Pararnyxoviridae, Rhabdoviridae, 25 Filoviridae, Orthornyxoviridae, Arenaviridae, Bunyaviridae, Reoviridae, Hepadnaviridae et Retroviridae. Il s'agit là de virus d'intérêt médical et vétérinaire. Plus particulièrement encore, le virus est un adénovirus. 3065226 6 Dans un autre mode de réalisation, on réalise une culture d'un parasite choisi parmi Plasmodium, Apicornplexa et Leishrnania.Plus particulièrement encore, le dit parasite est Plasmodium falciparurn. Plus particulièrement encore, on réalise une culture de cellules 5 choisies parmi les lignées 3T6, 3T3, BA886, BHK21, Caco-2, CE, CLC, CRL1439, CRL1442, DF1, DH82, EC2, EC53, HEL, Hela, Hep2, HL60, HT29, 3774, Jurkat, L929, Mac Coy, MRC5, MSDHP, P388, Raw264, Tatoo, TF1, THP1, U937, VERO, MDCK, BGM, MA104, ViroE6 et CLNh11. Ces cellules sont appropriées pour la culture intracellulaire des 10 dits microorganismes excepté les parasites du genre Plasmodium pour lesquels on utilise des érythrocytes humains. Plus particulièrement encore, les cellules sont choisies parmi les cellules de fibroblastes humains de la lignée HEL, les cellules fibroblastiques de souris de la lignée L929, des cellules de reins de 15 singe de la lignée VERO et les cellules de type fibroblastes embryonnaires humain de la lignée MRC5, notamment pour réaliser la culture d'une bactérie intracellulaire ou un virus. Plus particulièrement encore, les dites cellules sont des érythrocytes humains (globules rouges) pour réaliser la culture 20 intracellulaire d'un parasite du genre Plasmodium, notamment Plasmodium falciparurn dans un milieu de culture contenant de l'acide urique sous une atmosphère non supplémentée en CO2 et non diminuée en 02. En revanche, en l'absence d'acide urique, la multiplication de Plasmodium falciparurn requiert une atmosphère supplémentée en CO2 25 et diminuée en oxygène, notamment une atmopshère trigaz 10%02, 85%N2 et 5%CO2, en l'absence d'acide urique dans le dit milieu de culture. La présente invention fournir également un milieu de culture utile pour un procédé selon l'invention caractérisé en ce qu'il comprend 30 un milieu de culture de base pour culture cellulaire, le dit milieu de culture de base étant enrichi en acide urique, le dit milieu de culture 3065226 7 de base étant apte à permettre la culture des dites cellules eucaryotes par culture sous atmosphère supplémentée en CO2, de préférence dans de l'air enrichi à 5% de CO2, en l'absence d'acide urique dans le dit milieu de culture de base. 5 Plus particulièrement, le milieu de culture selon l'invention comprend une concentration d'acide urique d'au moins 0,1 g/L, de préférence encore de 0,4 à 1 g/L. Dans un mode de réalisation, le dit milieu de culture de base est un milieu de culture cellulaire comprenant au moins les composants 10 suivants : - une pluralité des sels inorganiques choisis notamment parmi les chlorure de calcium, nitrate de calcium, nitrate ferrique, sulfate de magnésium, chlorure de potassium, bicarbonate de sodium, chlorure de sodium et phosphate de sodium, de préférence au moins 4 dits sels 15 inorganiques; - une pluralité d'acides aminés choisis notamment parmi les arginine, cystine, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, méthionine, phénylalanine, serine, thréonine, tryptophane, tyrosine, valine, asparagine, aspartate, glutamine, acide glutamique, proline, 20 sérine et valine, de préférence l'ensemble des dits acides aminés; - une pluralité de vitamines choisies notamment parmi les choline, acide folique, inositol, niacinamide, nicotinamide), acide pantothénique, pyridoxal, pyridoxine, riboflavine, thiamine, biotine, acide aminobenzoique et cobalamine, de préférence au moins 3 dites 25 vitamines ; et - une source d'hydrate de carbone, de préférence un sucre, notamment du glucose. Plus particulièrement encore, le dit milieu de culture de base est choisi parmi les milieux MEM (« Eagles Minimal Essential Medium »), 3065226 8 DMEM (« Dubelcco Modified Eagle Medium » ), RPMI (« Roswell Park Memorial Institute medium ») ou IMDM (« Iscove's Modified Dulbecco's Media ») ainsi que toutes leurs variantes Plus particulièrement, l'acide urique est mis en oeuvre sans 5 composé antioxydant additionnel dans le dit milieu de culture. D'autre caractéristiques et avantages de l'invention apparaitront à la lumière de la description détaillée des exemples de réalisations suivants se référant aux figures suivantes dans lesquelles : - les Figures 1A et 1B représentent la quantification par 10 cytométrie de flux avec le fenêtrage utilisé pour les cellules L929 et les billes fluorescentes (« B »). (Nombre de cellules /nombre de billes) x concentration de billes (1053 billes/pl) x facteur de dilution. La figure 1A représente les éléments comptés en taille structure (1 nuage billes et 1 nuage cellules) et la figure 1B représente la fluorescence 15 des éléments comptés (billes en P5 et cellules en P4) ; - les figures 2A, 2B et 2C représentent le comptage de cellules en ordonnée vs la durée de culture en abscisses (en jours) pour la culture des cellules L929 (figure 2A), MRC5 (figure 2B), ou HeL (figure 2C) dans différentes conditions de culture A à E explicitées ci-après ; 20 - les figure 3A et 3B représentent les croissances de Coxiella burnetii sur cellules HeL (figure 3A) et Rickettsia conorii sur la lignée cellulaire L929 (figure 3B) dans deux conditions : « UA »= présence d'acide urique dans le milieu sans CO2 dans l'atmosphère et « CO2 » = absence de d'acide urique dans le milieu et présence de CO2 dans 25 l'atmosphère; - la figure 4 représente la croissance de Plasmodium falciparurn sur les globules rouges A+ dans deux conditions, avec de l'acide urique dans des flacons fermés (courbe « B2 (UA) ») et sans acide urique dans des conditions de croissance standard (10% 02, 5% CO2 et 85% 30 N2) (courbe « A2 (CO2) »); et 3065226 9 - les figures 5A et 5B représentent les croissances d'Adenovirus sur des cellules MRC5 (figure 5A) et HeL (figure 5B) dans deux conditions, avec de l'acide urique dans des flasques fermées (courbe « B2 (UA) ») et sans acide urique dans des conditions de croissance 5 standard avec 5% de CO2 (courbe « A2 (CO2) »), la valeur p >0,05. Des lignées cellulaires de fibroblaste murin L292 et de fibroblastes humains HEL et MRC5 ont été utilisées. Ce sont les supports d'hôtes cellulaires nécessitant du CO2. L'étude a été menée en utilisant deux conditions de culture 10 suivantes. 1) Premièrement, des conditions de routine avec 5% de CO2 dans de l'air où toutes les lignées cellulaires ont été maintenues dans des flasques de culture cellulaire de 75 cm2 à 37°C dans du milieu DMEM (# 11960-069, Invitrogen Carlsbad, CA) supplémenté avec 10% de 15 sérum bovin foetal inactivé par la chaleur (à 56°C pendant 30 minutes) sous 5% de CO2 avant fermeture du flacon au bout de 24h. 2) La seconde condition comprenait le même milieu de base mais supplémenté par l'acide urique, préparé comme suit. L'acide urique (SIGMA-Aldrich, Life Science U2625-100G, St. 20 Quentin Fallavier Cedex 38297 France), à une concentration de 10 g dans 1 L de solution tampon PBS filtrée à 0,22 pm, pH ajusté à 7. La concentration d'acide urique dans le milieu final était de 2393,6 pM (403,2 mg/L), contrôlée et quantifiée en utilisant la technique enzymatique de l'uricase sur un analyseur modulaire Cobas 25 8000 (Roche diagnostics Indianapolis, USA). Dans le milieu complémenté en acide urique, les flacons ont été incubés à 37°C sans CO2, flacon fermé. 3065226 10 Pour les microorganismes, on a utilisé Coxiella burnetii (souche Nine mile II) pour infecter des cellules HEL et Rickettsia conorii (souche Seven) pour infecter des cellules L929. Pour les virus, on a utilisé un adénovirus de type C (souche 5 MR52008 1365148) qui infecte les cellules HEL et MRC5. On a infecté chaque cellule avec son microorganisme correspondant à une multiplicité d'infection (MOI) définie dans les deux conditions de culture précédemment citées. Avec les parasites, on a maintenu des parasites de Plasmodium 10 falciparurn (clone W2 résistant à la chloroquine d'Indochine, BEI Resources, NIAID, NIH, Virginie, USA, Ref. MRA-157) en culture continue dans du milieu RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA), supplémenté avec 10% de sérum humain (Abcys SA Paris, France) et tamponné avec du HEPES 25 mM et du NaHCO3 25 mM. 15 Les parasites ont été cultivés dans des globules rouges humains de type A+ dans des conditions atmosphériques contrôlées qui consistaient en 10% d'02, 5% de CO2 et 85% de N2 à 37°C. Le milieu a été changé tous les jours et la parasitémie a été contrôlée par examen au microscope des frottis sanguins avec un kit RALC) 555 (RAL 20 Diagnostics, Martillac, France). Lorsque les parasites atteignent les stades d'anneau, la parasitémie est ajustée à 2% et deux conditions sont testées: le milieu habituel dans des flasques de culture cellulaire de 25 cm2 et l'acide urique ajouté au milieu à la même concentration dans 25 cm2 de culture cellulaire Standard fermé. 25 Les essais ont été effectués en triplicat. On a surveillé l'absence de contamination chaque semaine en contrôlant tous les milieux de culture utilisés pour toute croissance bactérienne sur des milieux de culture géloses. A) Quantification, collecte de données et mesure de la croissance 30 cellulaire. 3065226 11 Les taux de croissance et les densités cellulaires finales ont été quantifiés par cytométrie de flux en utilisant une suspension de billes fluorescentes (Cytocount TM) comme population de référence. Le nombre absolu de cellules (cellules/pl) dans chaque condition de 5 culture a été calculé en utilisant l'équation suivante: (Nombre de cellules comptées/Nombre de billes comptées)x concentration en billes (1054 billes/pl) x Facteur de dilution (Les billes dont on connait la concentration servent d'étalons pour le comptage absolu des cellules) [5]. Les paramètres ont été ajustés en utilisant des concentrations 10 diluées des différents types cellulaires avec et sans billes. L'acquisition des données a été réalisée en fonction des paramètres de taille et de structure (FSC (diffusion directe) et SSC (dispersion latérale) afin de définir un portage fixe spécifique à chaque type de cellule. On a également utilisé le fluorochrome Sytox Dead Cell Stain TM 15 qui ne marque et ne colore que les cellules mortes, pour la cytométrie en flux (Molecular probes, life technologies USA) pour évaluer la viabilité des cellules. Après une période d'incubation appropriée, les cellules ont été décollées en utilisant 3 ml de trypsine pendant 5 minutes à 37°C puis remises en suspension dans leur milieu, le Sytox a 20 été ajouté et les échantillons ont été incubés pendant 10 minutes à température ambiante dans l'obscurité. Puis 25 pl de billes ont été ajoutées avant le passage des échantillons sur le cytomètre. Le nombre total d'événements enregistrés était de 20 000 pour le comptage cellulaire en utilisant un analyseur BD LSR Fortessa TM Cell Analyser 25 (Société BD Bioscience). Les données ont été analysées à l'aide du logiciel BD FACSDiva 6.2 (Société BD Bioscience). Le nombre d'événements a été calculé, et on a calculé le nombre de cellules dans 1 ml d'échantillon en suivant l'équation détaillée ci-dessus et ci-après. Des quantifications ont été effectuées aux jours 30 3=0, 7 et 14, après inoculation. La Figure 1 représente la quantification par cytométrie de flux avec le gating utilisé pour les cellules L929 et les billes fluorescentes. 3065226 12 (Nombre de cellules /nombre de billes) x concentration de billes (1053 billes/pl) x facteur de dilution. Sur les figures 1Aet 1B, les valeurs sont pour un tube fermé avec de l'acide urique (« UA ») à 3=7 jours. Sur la figure 1A, l'abscisse représente les propriétés optiques 5 reflétant la taille des cellules, P3 représente les débris cellulaires à exclure du comptage et l'ordonnée représente les propriétés reflétant la structure et la granulométrie des cellules, P4 représente l'auto fluorescence des cellules et P5 représente le pic de fluorescence des billes. 10 On voit que l'on peut discriminer billes et cellules permettant d'avoir un compte absolu de chaque population (billes et cellules). B) Quantification, collecte de données et mesure des bactéries intracellulaires et croissance de virus. On a répété les mêmes tests décrits ci-dessus après avoir infecté 15 les cellules avec deux bactéries intracellulaires différentes: Coxiella burnetii (souche Nine mile II) pour une culture avec les cellules HEL, Rickettsia conorii (souche Seven) pour une culture avec les cellules L929 et Adenovirus pour une culture avec les cellules HEL ou MRC5. Dans ces tests, la croissance bactérienne a été quantifiée en 20 utilisant qPCR ciblant des gènes spécifiques: I511 pour C. burnetii, R.co7 gen hypothical protein pour R. conorii (3,4,6) et le gène VTB2 pour l'adénovirus (7). Les valeurs de Ct de la PCR ont été corrélées à la charge bactérienne quantifiée par cytométrie de flux dans les conditions de 25 CO2 et d'acide urique et par la technique de dilution de point final TCID50 pour l'adénovirus. Les quantifications ont été effectuées au jour 0, 7, 14 et 21 post-inoculation. C) Quantification de la croissance des parasites 3065226 13 La croissance des parasites a été estimée par examen microscopique des frottis sanguins après coloration avec le kit RALC) 555. L'évolution de la croissance parasitaire a été surveillée pendant 5 jours après le début des dosages dans les deux conditions. Aux jours 2 5 et 4, les parasites ont été dilués à 1/10 et 1/5 respectivement pour prévenir la mort du parasite due à une parasitémie élevée. D) Analyses statistiques D'abord, des tests statistiques ont été effectués afin de montrer le besoin critique des cellules en CO2 pour la croissance. On a utilisé 10 un test de Mann-Whitney pour comparer le nombre moyen de cellules pour chaque lignée cellulaire de l'état de contrôle négatif (sans CO2 et sans acide urique) et la condition de routine avec 5% de CO2. Un autre essai a été effectué en comparant le nombre moyen de cellules entre la condition avec du CO2 à 5% et le CO2 dans un ballon ouvert. (Une 15 valeur p 0.05) entre la culture 3065226 15 des cellules L929 (figure 2A), MRC5 (figure 2B), ou HeL (figure 2C) pour les deux conditions de culture : seules les cellules cultivées avec 5% de CO2 flasque fermée après 24h et acide urique flasque fermée arrivent à croitre (respectivement courbes B et A). Pour toutes les 5 autres conditions testées (CO2 flasque ouverte en continu, sans CO2 flasque fermée, acide urique flasque ouverte respectivement courbes D, C et E), aucune croissance cellulaire n'est observée. On peut observer la croissance continue des lignées cellulaires confirmée par les valeurs aux jours 7 et 14. Toutes les lignées 10 cellulaires testées ont été suivies par des observations microscopiques avant quantification. Aucune modification ou anomalie de la forme ou de l'adhérence des cellules n'a été détectée dans les conditions de culture en présence d'acide urique pendant toute la période d'essai (courbes A) La sub-culture des cellules a été maintenue en routine 15 dans le laboratoire. Aucune contamination n'a été détectée dans aucun des tests. Pour les cultures en flacons ouverts (courbes D et E), plusieurs agrégats ont été détectés par cytométrie de flux ou sous microscope optique et les cellules étaient presque mortes et incapables de croître. En outre, aucune anomalie de la forme cellulaire ou de 20 l'adhérence n'a été observée et on a seulement détecté une croissance limitée des cellules dans des conditions dépourvues de CO2 et d'acide urique (courbes C). La croissance des microorganismes a été contrôlée par qPCR. La croissance de C. burnetii sur cellules HEL, R. conorii sur la lignée 25 cellulaire L929 et de P. falciparurn sur les érythrocytes était presque aux mêmes niveaux dans les deux conditions de culture et aucune différence significative n'a été observée entre les deux (respectivement p-valeur = 0,861, 0,683, 0,731) (Figures 3A-3B et 4A-4B). Les figure 3A et 3B représente la croissance de Coxiella burnetii 30 sur cellules HeL (figure 3A) cultivée dans les deux conditions, et la croissance de Rickettsia conorii sur la lignée cellulaire L929 (figure 3B) en présence d'acide urique en culture et en culture de routine avec 3065226 16 CO2, avec la valeur p >0,05 (courbe «A1( UA) »= présence d'acide urique dans le milieu sans CO2 dans l'atmosphère et courbe « B1 (CO2) » = absence d'acide urique dans le milieu et présence de CO2 dans l'atmosphère). L'axe X correspond aux temps de quantification en 5 jours. L'axe Y correspond au log de la charge bactérienne (les valeurs logarithmiques sont obtenues après conversion des valeurs du seuil de Cycle (Ct.) Sur la base des courbes standards réalisées avec dilution sérielle 1: 10). Les figures 4A et 4B représente la croissance de Plasmodium 10 falciparurn sur les globules rouges A+ («parasitémie en axe Y) dans les deux conditions, avec de l'acide urique dans des flacons fermés (courbe « B2 (UA) ») et sans acide urique dans des conditions de croissance standard (10% 02, 5% CO2 et 85% N2) (courbe « A2 (CO2) ») avec une valeur p >0,05. La diminution après chaque point de 15 temps (en jours sur l'axe des ordonnées) est due à la dilution du parasite avant de procéder à l'infection suivante. En ce qui concerne C. burnetii et R. conorii, tous les titrages bactériens étaient normaux et les bactéries pouvaient se multiplier normalement dans les deux conditions. Comme on l'a observé sur les 20 courbes de multiplication des bactéries testées sur les figures 3A-3B, les courbes en augmentation continue à chaque instant de l'infection attestent les taux de multiplication bactérienne. Pour les parasites, les courbes figure 4 montrent une croissance continue pendant 48 heures après l'infection. La diminution après ce 25 temps est due à la dilution du parasite avant de procéder à la prochaine infection. Après la dilution, la croissance du parasite redémarre et augmente normalement. Sur les figures 5A et 5B, la croissance de l'adénovirus était similaire dans les deux conditions sur les deux lignées cellulaires, et 30 aucune altération du cycle n'a pu être détectée. Les figures 5A et 5B représentent les croissances d'Adenovirus sur des cellules MRC5 (figure 3065226 17 5A) et HeL (figure 5B) dans deux conditions, avec de l'acide urique dans des flasques fermées (courbe « B2 (UA) ») et sans acide urique dans des conditions de croissance standard 5% de CO2 (courbe « A2 (CO2) »), la valeur p >0,05. L'axe X correspond aux temps de 5 quantification en jours. L'axe Y correspond au logarithme de la charge virale (les valeurs logarithmiques sont obtenues après conversion des valeurs du seuil Cycle (Ct.) sur la base des courbes standards réalisées avec dilution série 1: 10). Toutes les PCR effectuées trois fois ont montré une aptitude 10 virale optimale dans les deux conditions de culture. Les courbes virales de multiplication ont montré des augmentations typiques de la charge virale à partir du jour 0, atteignant leur valeur maximale au jour 7. Les titres viraux ont commencé une augmentation lente après le jour 7, tendant vers un plateau entre le jour 7 et le jour 14 et atteignant la 15 valeur la plus faible au jour 21. F) Conclusion. Pour toutes les lignées cellulaires testées, une incubation initiale sous 5% CO2 a pu être remplacée par l'ajout d'acide urique dans le milieu de culture à une concentration d'au moins 0.4 g/L en air 20 ambiant. Les cellules et microorganismes se sont multipliés sans altération physiologique de forme ou d'adhésion. 3065226 18 Références bibliographiques [1] Vilcheze Catherine, Travis Hartman, Brian Weinrick, and William R. Jacobs Jr*in Nat Commun. 2013; 4: 1881. 5 doi:10.1038/ncomms2898 [2] Yuri Y. Sautin and Richard J. Johnson inNucleosides Nucleotides Nucleic Acids. Jun 2008; 27(6): 608-619.uric acid:oxidantantioxydant pardox. [3] Fenollar, F., Fournier, P.E., Raoult, D. (2004) Molecular 10 detection of Coxiella burnetii in the sera of patients with Q fever endocarditis or vascular infection. J. Clin. Microbiol. 42(11), 4919-24. doi: 10.1128/JCM.42.11. [4] Harrus, S., Perlman-Avrahami, A., Mumcuoglu, K.Y., Morick, D., Baneth, G. (2011) Molecular detection of Rickettsia 15 massiliae, Rickettsia sibirica mongolitimonae and Rickettsia conorii israelensis in ticks from Israel. Clin Microbiol Infect 17(2), 176-80, Doi: 10.1111/j.1469-0691.2010.03224.x. [5] Khan, M.M.T., Pyle, B.H., Camper, A.K. 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Procédé de culture de cellules eucaryotes in vitro caractérisé en ce que l'on ajoute dans le milieu de culture cellulaire de l'acide urique et on réalise la culture sous une atmosphère d'air ambiant non supplémentée en CO2, les dites cellules étant telles que la multiplication des dites cellules est améliorée par culture sous atmosphère supplémentée en CO2 en l'absence d'acide urique dans le dit milieu de culture. 2. Procédé de culture cellulaire in vitro selon la revendication 1 10 caractérisé en ce qu'on réalise une culture intracellulaire de microorganismes dans des dites cellules en milieu de culture cellulaire contenant de l'acide urique sous une atmosphère d'air ambiant non supplémentée en CO2. 3. Procédé selon la revendication 1 ou2, caractérisé en ce que 15 l'acide urique est mis en oeuvre à une concentration d'au moins 0,4 g/L, de préférence encore de 0,4 à 1 g/L. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on réalise une culture intracellulaire d'un microorganisme choisi parmi les bactéries intracellulaires strictes, les virus et les parasites. 20 5. Procédé selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisé en ce qu'on réalise une culture intracellulaire d'un dit microorganisme dans un récipient ouvert sous une atmosphère d'air ambiant non supplémenté en CO2 et on ferme le récipient après 24heures de culture. 25 6. Procédé selon l'une des revendications 2 à 5, caractérisé en ce on réalise une culture intracellulaire d'une bactérie intracellulaire stricte choisie parmi les genres Rickettsia, Orientia, Lawsonia, Coxiella, Ehrlichia, Chlamydia, Chlamydiophila, Anaplasma et Neorickettsia. 3065226 21 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'on réalise une culture intracellulaire d'une bactérie intracellulaire stricte choisie parmi Coxiella burnetii et une espèce Rickettsia sp. 8. Procédé selon l'une des revendications 2 à 5, caractérisé en ce 5 qu'on réalise une culture intracellulaire d'un virus choisi parmi les familles Poxviridae, Herpesviridae, Adenoviridae,Papillomaviridae, Polyomaviridae, Parvoviridae, Picornaviridae, Caliciviridae, Astroviridae, Flaviviridae, Togaviridae, Coronaviridae, Paramyxoviridae, Rhabo'oviridae, Filoviridae, Orthomyxoviridae, Arenaviridae, Bunyaviridae, Reoviridae, Hepadnaviridae et Retroviridae. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le virus est un adénovirus. 10. Procédé selon l'une des revendications 2 à 5, caractérisé en ce qu'on réalise une culture intracellulaire d'un parasite choisi parmi 15 Plasmodium, Apicomplexa et Leishmania. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le dit parasite est Plasmodium falciparum. 12. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 9, caractérisé en ce qu'on réalise une culture de cellules choisies parmi les lignées3T6, 20 3T3, BA886, BHK21, Caco-2, CE, CLC, CRL1439, CRL1442, DF1, DH82, EC2, EC53, HEL, Hela, Hep2, HL60, HT29, 3774, Jurkat, L929, Mac Coy, MRC5, MSDHP, P388, Raw264, Tatoo, TF1, THP1, U937, VERO, MDCK, BGM, MA104, ViroE6 et CLNh11.4 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que les 25 cellules sont choisies parmi les cellules de fibroblastes humains de la lignée HEL, les cellules fibroblastiques de souris de la lignée L929, les cellules de reins de singe de la lignée Vero et les cellules de type fibroblastes embryonnaires humain de la lignée MRC5. 25 3065226 22 14. Procédé de culture selon l'une des revendications 10 ou 11 caractérisé en ce que les dites cellules sont des érythrocytes humains et on réalise une culture intracellulaire d'un parasite du genre Plasmodium, de préférence Plasmodium falciparum, dans un milieu de 5 culture contenant de l'acide urique sous une atmosphère non supplémentée en CO2 et non diminuée en 02. 15. Milieu de culture utile pour un procédé selon l'une des revendications 1 à 14 caractérisé en ce qu'il comprend un milieu de culture de base pour culture cellulaire, le dit milieu de culture de base 10 étant enrichi en acide urique, le dit milieu de culture de base étant apte à permettre la culture des dites cellules eucaryotes par culture sous atmosphère supplémentée en CO2 en l'absence d'acide urique dans le dit milieu de culture de base. 16. Milieu de culture selon la revendication 15 caractérisé en ce qu'il comprend une concentration d'acide urique d'au moins 0,1 g/L, de préférence encore de 0,4 à 1 g/L. 17. Milieu de culture selon la revendication 15 ou 16 caractérisé en ce que le dit milieu de culture de base est un milieu de culture cellulaire comprenant au moins les composants suivants : - une pluralité des sels inorganiques choisis notamment parmi les chlorure de calcium, nitrate de calcium, nitrate ferrique, sulfate de magnésium, chlorure de potassium, bicarbonate de sodium, chlorure de sodium et phosphate de sodium, de préférence au moins 4 dits sels inorganiques; - une pluralité d'acides aminés choisis notamment parmi les arginine, cystine, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, méthionine, phénylalanine, thréonine, tryptophane, tyrosine, valine, asparagine, aspartate, glutamine, acide glutamique, proline, sérine et valine, de préférence l'ensemble des dits acides aminés; 3065226 23 - une pluralité de vitamines choisies notamment parmi les choline, acide folique, inositol, niacinamide, nicotinamide (acide pantothénique, pyridoxal, pyridoxine, riboflavine, thiamine, biotine, acide aminobenzoique et cobalamine, de préférence au moins 3 dites 5 vitamines; et - une source d'hydrate de carbone, de préférence un sucre, notamment du glucose. 18. Milieu de culture selon la revendication 17 caractérisé en ce que le dit milieu de culture de base est choisi parmi les milieux MEM, 10 DMEM, RPMI et IMDM. 19. Milieu de culture selon l'une des revendications 15 à 18 caractérisé en ce qu'il ne contient pas de composé antioxydant additionnel dans le dit milieu de culture.