Brevet FR3070857A1 — publié le 20190315

DOMAINE TECHNIQUE La présente invention concerne la Scléritine et son utilisation en tant qu'agent protecteur contre des agents toxiques. Le domaine de l'invention concerne l'industrie pharmaceutique ou 5 l'industrie cosmétique et plus spécifiquement pour la formulation de compositions pharmaceutiques ou cosmétiques destinées à protéger les cellules contre des agents toxiques. ETAT DE LA TECHNIQUE 10 Le domaine de la cosmétique est en constante recherche de nouvelles molécules ayant des effets cosmétiques ou dermatologiques. La demande du marché est de plus en plus orientée vers des produits naturels respectueux de l'environnement et de l'homme. Les coraux sont des organismes dont la physiologie cellulaire et 15 moléculaire est encore assez peu connue et qui vivent individuellement jusqu'à plusieurs décennies. Ils survivent sur de longues périodes, bien que constamment exposés aux attaques bactériennes, virales, fongiques, mais également aux aléas environnementaux de types climatiques ou liés à la pollution ; de nombreux organismes parasites ou prédateurs opportunistes ou 20 spécialisés constituent également une nuisance. La résistance des coraux à l'encontre de l'ensemble de ces effets nocifs préfigure donc une source potentielle de nouvelles molécules naturelles ayant des effets intéressants dans le domaine de la cosmétique, de la dermatologie, ou de la pharmaceutique. La Scléritine est une protéine qui a été isolée et caractérisée pour la 25 première fois en 2012 comme décrite dans la publication Debreuil et al. "Molecular cloning and characterization of first organic matrix protein from sclerites of red coral, Corallium rubrum J Biol Chem. 2012 Jun 1; 287 (23): 19367-76. Epub 2012 Apr 13. Cette protéine est extraite de la matrice organique des sclérites de 30 l'octocoralliaire, Corallium rubrum, plus communément dénommé corail rouge. La Scléritine est la protéine majoritaire de la fraction soluble dans l'EDTA de la matrice organique. La Scléritine est une protéine basique phosphorylée 2 sécrétée possédant une séquence de 135 acides aminés et un peptide signal de 20 acides aminés. EXPOSE DE L'INVENTION La présente invention propose l'utilisation de la Scléritine comme agent protecteur de cellules contre des agents toxiques. De manière surprenante, cette protéine issue d'un corail présente une activité protectrice des cellules contre des agents toxiques. De manière avantageuse, les agents toxiques sont de différents types tels 10 que des agents chimiques ou des agents physiques. Suivant un autre aspect, l'invention concerne une composition dermatologique et/ou cosmétique protectrice cutanée vis-à-vis d'agents toxiques caractérisée en ce qu'elle comprend de la Scléritine dans au moins un excipient ou véhicule adapté pour une application topique. 15 BRÈVE DESCRIPTION DES FIGURES ET SEQUENCES Les buts, objets, ainsi que les caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront mieux de la description détaillée d'un mode de réalisation de cette dernière qui est illustré par les figures d'accompagnement suivantes dans 20 lesquelles : Figure 1 : schéma de la structure générale de la protéine Scléritine recombinante. Les vingt premiers acides aminés représentent le peptide signal, clivé lors du processus de maturation intracellulaire de la protéine (donc non présent dans la protéine mature sécrétée). Les six histidines en C-terminal de la 25 protéine représentent le tag histidine (HISx6) utile pour le procédé de purification de la Scléritine recombinante. Figure 2 : graphes illustrant la viabilité de lignées cellulaires a) Endothéliales, b) Kératinocytes, c) Fibroblastes, exposées à la Scléritine à différentes doses sur 3 jours. 30 Figure 3 : graphe illustrant la viabilité de cellules endothéliales humaines exposées à un agent toxique (l'imidazole à 150mM final) en présence de doses croissantes de Scléritine sur 6 jours. 3 Figure 4 : graphe issu de la figure 3 illustrant le nombre total de cellules vivantes au jour 6 suivant les conditions de la figure 3. Figure 5: Photos au microscope inversé à contraste de phase de fibroblastes humains soumis à des rayonnements ultraviolets au jour 1, a) et 5 b) en présence de Scléritine à 44/ml, c) et d) en présence de BSA à 4µg/ml ou e) et f) en présence de PBS seul. (Grossissement de 80X pour les photos a, c et e du haut, et grossissement de 200X pour les photos b, d et f du bas) Figure 6: Photos au microscope inversé à contraste de phase de fibroblastes humains soumis à des rayonnements ultraviolets au jour 3 - a) et 10 b) en présence de Scléritine à 44/ml, c) et d) en présence de BSA à 4µg/ml ou e) et f) en présence de PBS seul (grossissement de 200X pour les photos a, c et e du haut, et grossissement 400X pour les photos b, d et f du bas). SEQ ID NO 1 : séquence nucléotidique naturelle de la Scléritine, 15 comprenant 468 nucléotides, référencée dans le catalogue GenBank du NCBI sous le numéro JQ652458. SEQ ID NO 2 : séquence de la Scléritine codon-optimisée, comprenant 486 nucléotides, obtenue par synthèse, pour une meilleure prise en charge transcriptionnelle par le système de production baculovirus/cellules d'insectes. 20 De plus, elle possède un ajout de 18 paires de bases à son extrémité 3' codant pour un tag histidine. La séquence optimisée possède, hors tag histidine, une identité de 346 paires de bases sur 468 au total avec la séquence naturelle, soit une homologie nucléotidique de 74 %. SEQ ID NO 3 : séquence protéique de 155 acides aminés de la Scléritine 25 naturelle. SEQ ID NO 4 : séquence protéique de la Scléritine recombinante codée à partir de la séquence optimisée SEQ ID NO 2. Hors tag histidine, elle possède 100 % d'homologie avec la séquence protéique naturelle. 30 EXPOSE DETAILLE DE MODES DE REALISATION PARTICULIERS Avant d'entamer une revue détaillée de modes de réalisation de l'invention, sont énoncées ci-après des caractéristiques optionnelles qui peuvent éventuellement être utilisées en association ou alternativement. 4 On rappelle tout d'abord que l'invention concerne l'utilisation de la Scléritine en tant qu'agent protecteur de cellules contre des agents toxiques. Avantageusement, suivant des variantes préférées, mais non limitatives, l'invention est telle que : 5 - les agents toxiques sont des agents chimiques ; - les agents chimiques sont choisis parmi des substances inorganiques, des composés organiques volatils, des agents oxydants, des bases et acides forts, des composés imidazolés. - les agents chimiques sont choisis parmi des agents chimiques d'origine biologique, parmi lesquels des toxines et venins animaux. - les agents chimiques sont choisis parmi des agents cytotoxiques chimiothérapeutiques, parmi lesquels des agents alkylants, des antimétabolites, des agents alcaloïdes, des antibiotiques anticancéreux. - les agents toxiques sont des agents physiques ; - les agents physiques sont des rayonnements ultraviolets ; - la Scléritine ne présente pas de cytotoxicité pour les cellules pour des doses inférieures ou égales à 4000ng/m1 ; - les cellules sont des cellules animales ; - les cellules sont des cellules de la peau ; - l'utilisation est faite pour la protection de la peau ; - les cellules sont des fibroblastes, des cellules endothéliales ou des cellules épithéliales notamment des kératinocytes ; - l'utilisation se fait par application topique ; - la viabilité des cellules exposées à un agent toxique en présence de Scléritine est supérieure de 30 % à la viabilité des cellules exposées à un agent toxique seul ; c'est-à-dire en absence de Scléritine, - la protéine de Scléritine présente une homologie d'au moins 90 % avec la séquence protéique SEQ ID NO 3; Suivant un autre aspect, l'invention concerne une composition dermatologique et/ou cosmétique protectrice cutanée vis-à-vis d'agents toxiques caractérisée en ce qu'elle comprend de la Scléritine dans au moins un excipient ou véhicule adapté pour une application topique. 5 Suivant un autre aspect, l'invention concerne un procédé non thérapeutique de protection de la peau face à des agents toxiques caractérisé en ce qu'il comprend l'application sur la peau d'une composition comprenant de 5 la Scléritine avant l'exposition ou le contact avec un agent toxique. L'invention concerne la Scléritine qui est une protéine de 135 acides aminés. Cette protéine est codée par un gène de séquence de nucléotides SEQ ID No 1. La séquence d'acide aminé de la Scléritine est illustrée en regard 10 de la séquence de nucléotide et reprise en figure 1. La Scléritine comprend un peptide signal de 20 acides aminés. Selon l'invention, la Scléritine est produite par transfection de cellules de mammifères ou préférentiellement par système baculovirus / cellules d'insectes. La production de la Scléritine est par exemple réalisée suivant le procédé décrit 15 dans la publication Buclez PO et al. "Rapid, scalable, and low-cost purification of recombinant adeno-associated virus produced by baculovirus expression vector system". Mol Ther Methods Clin Dev. 2016 May 11;3:16035. doi: 10.1038/mtm.2016.35. Pour la production, la Scléritine peut comprendre une étiquette de purification également appelée « tag » et par exemple un tag 20 histidine comprenant 6 histidines, placé à la suite de la séquence d'acide aminé de la Scléritine, comme illustré à la figure 1. Par ailleurs, le gène de la Scléritine peut avoir subi une optimisation de ces codons d'origine pour une meilleure prise en charge transcriptionnelle dans l'environnement interne des cellules d'insectes (lignées cellulaires productrices de type Sf9), comme illustrée par la 25 SEQ ID NO 2. Cette optimisation peut résulter d'une différence de séquences nucléotidiques pouvant atteindre 30 % comparativement à la séquence naturelle SEQ ID N01. L'invention s'étend à toutes les protéines comprenant au moins la séquence protéique SEQ ID NO 3 avec une homologie de 90 % 30 préférentiellement de 100 %. Selon l'invention, la Scléritine joue un rôle protecteur des cellules face à des agents toxiques. 6 Avantageusement, on entend par agent protecteur des cellules soumises à un agent toxique, un produit permettant aux cellules de conserver une viabilité à 6 jours au moins égale à 60 %. L'agent protecteur permet de contrer au moins partiellement les effets néfastes de l'agent toxique. Ainsi, selon l'invention, la 5 différence de viabilité des cellules au jour 6 est d'au moins 30 % entre les cellules soumises à un agent toxique en présence de Scléritine et les cellules soumises à un agent toxique sans Scléritine. On entend par agents toxiques, des agents chimiques ou des agents physiques qui sont toxiques pour les cellules c'est-à-dire qu'ils les 10 endommagent et notamment que la viabilité des cellules exposées à l'agent toxique est diminuée. Parmi les agents chimiques, on entend cytotoxique, c'est-à-dire des substances qui sont toxiques pour les cellules, éventuellement jusqu'à les détruire. 15 A titre d'exemple, les agents toxiques sont choisis parmi au moins l'un des suivants : - des agents chimiques, parmi lesquels des substances inorganiques, des composés organiques volatiles, des agents oxydants, des bases et acides forts, des composés imidazolés. 20 - des agents chimiques d'origine biologique, parmi lesquels des toxines et venins animaux - des agents cytotoxiques chimiothérapeutiques, parmi lesquels des agents alkylants, des antimétabolites, des agents alcaloïdes, des antibiotiques anticancéreux 25 parmi les agents physiques, on entend les rayonnements notamment les rayonnements ultraviolets dont les UVA (c'est-à-dire les rayonnements électromagnétiques de longueurs d'ondes comprises entre 400 et 315 nm), les UVB (c'est-à-dire les rayonnements électromagnétiques de longueurs d'ondes comprises entre 315 et 280 nm) et les UVC (c'est-à-dire les rayonnements 30 électromagnétiques de longueurs d'ondes comprises entre 280 et 100 nm). Les cellules protégées par la Scléritine sont des cellules eucaryotes animales, notamment des cellules humaines. 7 Préférentiellement, la Scléritine est utilisée comme agent protecteur de la peau. A titre d'exemple, les cellules animales comprennent les fibroblastes, les cellules épithéliales préférentiellement des kératinocytes ou les cellules 5 endothéliales. De manière surprenante, la Scléritine s'avère ne pas présenter de cytotoxicité envers lesdites cellules. C'est-à-dire que la Dose Létale médiane ou DL50 est supérieure à 4000ng/ml. Ces quantités sont des doses particulièrement élevées pour ce qui est de substances étrangères à la cellule. 10 Cette absence de toxicité présente un avantage notable de sorte que la Scléritine peut être envisagée pour des utilisations cosmétiques et/ou dermatologiques. Par ailleurs, la Scléritine présente un effet protecteur proportionnel à la dose administrée. 15 La Scléritine est avantageusement introduite dans une composition cosmétique et/ou dermatologique pour une protection cutanée vis-à-vis d'agents toxiques. La composition est destinée à une application topique. La composition comprend au moins un excipient ou véhicule adapté pour une application 20 topique. Selon le type de préparation désirée (pommades, crèmes, gels, pâtes, émulsions), la composition finale pourra comporter un ou plusieurs des excipients suivants : eau, vaseline blanche, paraffine (solide ou liquide), macrogols (ou polyéthylène glycol, PEG), vaseline hydratée au sesquioléate de sorbitane ou au monostéarate de glycérol (avec par exemple de l'acide 25 sorbique comme conservateur), cétomacrogol tamponné (avec par exemple de l'acide sorbique comme conservateur), crème hydrophile anionique (avec ou sans glycérol), oléate de décyle, carbomères (avec par exemple de l'aminométhyl propanol comme stabilisateur), cérat réfrigérant (cire d'abeille blanche, cires d'esters cétyliques), huiles végétales (par exemple l'huile de 30 sésame), oxyde de zinc (ZnO), talc, et tout autre excipient répondant favorablement à la pharmacopée européenne concernant les préparations pharmaceutiques. 8 Exemple 1 : Effet Exogène de la Scléritine - cytotoxicité Différentes lignées cellulaires humaines : endothéliales, kératinocytes et fibroblastes, sont mises en contact avec des doses croissantes de Scléritine : 0, 5 10Ong/m1 et 4000ng/ml. Les résultats sont présentés sur les graphes de la figure 2. Les cellules sont mises en culture dans les puits de plaque de culture. A t=24h les cellules sont mises en contact avec la Scléritine (formulée dans un 10 tampon HEPES 50 mM, NaCI 50 mM, pH 7.8) qui est introduite dans le milieu de culture complet à des doses de 0, 100 ou 4000 ng de Scléritine par ml de milieu de culture. Le jour de 1"ajout de la Scléritine est considéré dans les exemples comme le jour 0. 15 Chaque jour les cellules d'un puits sont soumises au comptage cellulaire après protocole de décollement à la trypsine-EDTA, et comptage par compteur automatique (type Countess, Life Technology). La viabilité cellulaire est quantifiée sur lame par ajout de bleu de Trypan (colorant vital) à la suspension cellulaire. 20 On constate qu'à t=3 jours, la viabilité des cellules exposées à la Scléritine est similaire ou légèrement inférieure à celle des cellules contrôle non exposées. Notamment, pour les cellules endothéliales au jour 3 : 78 % de viabilité pour les cellules exposées à 4000ng/m1 de Scléritine contre 85 % de viabilité 25 pour les cellules exposées à 10Ong/mIde Scléritine ou non exposées. Pour les kératinocytes au jour 3 : 90 % de viabilité pour les cellules exposées à 4000ng/m1 et 10Ong/m1 de Scléritine contre 92 % de viabilité pour les cellules non exposées. Pour les fibroblastes au jour 3 : 82 % de viabilité pour les cellules 30 exposées à 4000ng/ml, 88 % de viabilité pour les cellules exposées à 10Ong/m1 et 90 % de viabilité pour les cellules non exposées. 9 En conclusion, aucune cytotoxicité cellulaire de la Scléritine sur des cellules primaires humaines n'est identifiable (jusqu'aux doses de Scléritine de 4000 ng/ml de milieu de culture). 5 Exemple 2 : Effet Exogène de la Scléritine - protection contre des agents chimiques Des cellules endothéliales humaines primaires sont mises en contact avec des doses croissantes de Scléritine 0,44/ml, 0,2 pg/ml, 0,1 pg/m1 et 0,05 pg/m1 10 et un agent toxique appartenant à la famille des dérivés imidazolés : l'imidazole (CAS N° 288-32-4). Les cellules sont mises en culture dans les puits d'une plaque de culture. A t=24h les cellules sont mises en contact avec la Scléritine qui est introduite dans le milieu de culture complet aux différentes doses par ml de milieu de 15 culture. Le jour d'ajout de la Scléritine est considéré comme le jour 0. 24h après l'ajout de Scléritine, l'agent toxique (imidazole) est ajouté au milieu de culture pour une concentration finale dans le milieu de 150mM. L'ajout de l'agent toxique se fait au jour 1. 20 Chaque jour les cellules d'un puits sont soumises au comptage en suivant le protocole à la trypsine décrit précédemment. Les cellules sont observées sous microscope à contraste de phase et comptées, après protocole à la trypsine, chaque jour jusqu'au jour 6. Les résultats sont présentés sur les graphes de la figure 3. 25 On constate qu'au jour 6, la viabilité des cellules exposées à l'imidazole seul est proche de 10 % alors que celle des cellules exposées à l'imidazole en présence de Scléritine est comprise entre 58 et 68 % et que les cellules contrôle sans imidazole et sans Scléritine est de 78 %. Ces résultats sont illustrés en figure 3. 30 A la figure 4, le nombre de cellules vivantes au jour 6 est comparé selon les différentes conditions. La différence entre le nombre de cellules vivantes avec l'imidazole seul ou en présence de Scléritine est nettement visible. La Scléritine joue donc un rôle protecteur des cellules face à l'imidazole. 10 Exemple 3 : Effet Exogène de la Scléritine - protection contre des agents physiques 5 Des fibroblastes primaires humains sont exposés à des rayonnements ultraviolets en présence ou en absence de Scléritine. Les cellules sont mises en culture dans les puits de plaque de culture. A t=24h, le milieu de culture est retiré et remplacé par du PBS 1X (pour éviter les potentiels effets d'atténuations des radiations UV par les protéines sériques 10 solubles). Les cellules sont mises en contact avec la Scléritine dans du PBS 1X à une concentration finale de 4 pg/ml. Les cellules sont incubées 30 minutes à 37°C. Les cellules sont ensuite irradiées par des UtraViolets C à 254nm à une puissance de 1000pJ/cm2. 5 minutes après l'irradiation, un milieu de culture complet est ajouté dans les puits et les cellules sont mises en culture dans un 15 incubateur à 37°C et 5 % de CO2. Le jour d'ajout de la Scléritine est considéré comme le jour 0. L'irradiation aux UVC se fait également au jour 0. Les cellules d'un puits sont contrôlées à J1 et J3. 20 La figure 5 montre des photos au microscope inversé à contraste de phase (grossissement 80X pour les figures 5a, c et e, et grossissement 200X pour les figures 5b, d et f) de plaque de fibroblastes au jour 1 après irradiation en présence de 4µg/ml de Scléritine : figures 5 a) et b) , de BSA à 4pg/ml: figures 5 c) et d) ou de PBS seul : figures 5 e) et f) . 25 On constate que les fibroblastes sont endommagés avec le PBS seul ou supplémenté en BSA alors que leur aspect reste correct pour les fibroblastes en présence de Scléritine. La figure 6 montre des photos au microscope inversé à contraste de phase (grossissement 200X pour les figures 6a, c et e, et grossissement 400X 30 pour les figures 6b, d et f) de plaques de fibroblastes au jour 3 après irradiation en présence de 4µg/ml de Scléritine : figures 6 a) et b) , de BSA à 4pg/ml: figures 6 c) et d) ou de PBS seul : figures 6 e) et f) . 11 On constate au jour 1 que les fibroblastes irradiés en présence de Scléritine présentent un aspect typique des fibroblastes, c'est-à-dire fusiforme ou étoilée avec des prolongements très fins. Avec la BSA seule, les fibroblastes sont condensés, les prolongements sont réduits voir absents. De même avec le 5 PBS seul, les fibroblastes sont condensés et les prolongements sont réduits. Dès le jour 1, les fibroblastes irradiés en présence du PBS seul ou de BSA seule présentent un aspect typique des corps apoptotiques (mort cellulaire programmée). A ce stade, les tentatives de quantification des concentrations de cellules vivantes dans les condition avec BSA ou PBS seul échouent en raison 10 d'absence de cellules comptabilisables, probablement fortement fragilisées par le protocole d'irradiation. Il peut être clairement conclu que les fibroblastes sont endommagés avec le PBS seul ou le BSA seul alors que leur aspect reste correct en présence de Scléritine. Au jour 3, les constatations sont identiques et plus marquées encore ; les 15 fibroblastes irradiés en présence de Scléritine présentent un aspect typique des fibroblastes, c'est-à-dire fusiforme ou étoilée avec des prolongements très fins. Avec le BSA seul, les fibroblastes sont condensés, les prolongements sont réduits voir absents. De même avec le PBS seul, les fibroblastes sont condensés et les prolongements sont absents. Les fibroblastes irradiés en 20 présence du PBS seul ou du BSA seul présentent un aspect typique des corps apoptotiques. De même qu'au jour 1, les tentatives de quantification des concentrations de cellules vivantes dans les conditions avec BSA ou PBS seul échouent en raison d'absence de cellules comptabilisables, probablement fortement fragilisées par le protocole d'irradiation. 25 La Scléritine joue donc un rôle protecteur des cellules face à aux rayons ultraviolets C. Les ultraviolets C sont des rayonnements à faibles longueurs d'onde et sont donc extrêmement énergétiques. Cette énergie leur confère un pouvoir d'altération considérable sur les molécules biologiques. L'effet protecteur marqué de la Scléritine vis-à-vis des rayonnements UVC laisse 30 penser que l'effet de la Scléritine vis-à-vis des rayonnements UVB et UVA, moins énergétiques, REVENDICATIONS1. Scléritine pour son utilisation dans un traitement dermatologique en tant qu'agent protecteur pour des cellules contre des agents toxiques. 2. Scléritine pour son utilisation dans un traitement dermatologique selon la revendication précédente dans laquelle les agents toxiques sont des agents chimiques. 3. Scléritine pour son utilisation dans un traitement dermatologique selon la revendication précédente dans laquelle les agents chimiques sont choisis parmi des substances inorganiques, des composés organiques volatils, des agents oxydants, des bases et acides forts, des composés imidazolés. 4. Scléritine pour son utilisation dans un traitement dermatologique selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2 dans laquelle les agents chimiques sont choisis parmi des agents chimiques d'origine biologique, parmi lesquels des toxines et venins animaux. 5. Scléritine pour son utilisation dans un traitement dermatologique selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2 dans laquelle les agents chimiques sont choisis parmi des agents cytotoxiques chimiothérapeutiques, parmi lesquels des agents alkylants, des antimétabolites, des agents alcaloïdes, des antibiotiques anticancéreux. 6. Scléritine pour son utilisation dans un traitement dermatologique selon la revendication 1 dans laquelle les agents toxiques sont des agents physiques. 7. Scléritine pour son utilisation dans un traitement dermatologique selon la revendication précédente dans laquelle les agents physiques sont des rayonnements ultraviolets. 13 8. Scléritine pour son utilisation dans un traitement dermatologique selon l'une quelconque des revendications précédentes pour la protection de la peau. 5 9. Scléritine pour son utilisation dans un traitement dermatologique selon l'une quelconque des revendications précédentes pour laquelle les cellules sont des fibroblastes, des cellules endothéliales ou des cellules épithéliales, notamment des kératinocytes. 10 10. Scléritine pour son utilisation dans un traitement dermatologique selon l'une quelconque des revendications précédentes sous une forme adaptée à une administration topique. 11. Scléritine pour son utilisation dans un traitement dermatologique 15 selon l'une quelconque des revendications précédentes dans laquelle la protéine de Scléritine présente une homologie d'au moins 90 % avec la séquence protéique SEQ ID NO 3. 12. Composition dermatologique et/ou cosmétique protectrice cutanée 20 vis-à-vis d'agents toxiques caractérisée en ce qu'elle comprend de la Scléritine dans au moins un excipient ou véhicule adapté pour une application topique.